JPH05501352A - 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および 組成物発明の分野 本発明は、単子葉植物たとえばトウモロコシを遺伝学的に形質転換するための生 殖系、形質転換細胞の懸濁液から安定な遺伝学的形質転換体を選択する方法、お よび形質転換細胞から稔性植物を産生させる方法に関する。

形質転換方法の例には、核酸を細胞内に導入するマイクロプロジェクタイルボン バードメントの使用、ならびに選択可能および／またはスクリーニング可能なマ ーカー系たとえば抵抗性（たとえば抗生物質、除草剤等）を付与するかまたは他 の表現型で観察できる形質を含有する遺伝子の使用か包含される。他の態様にお いては、本発明は、トランスジェニック植物からの、安定な形質転換稔性単子葉 植物、配偶子および子孫の産主に関する。

関連技術の説明 人類の生活か狩猟採集期から脱して農耕期に入って以来、人類の創意工夫および 発明の主要な目標は、作物の収穫率の改善であり、植物の性質の改変および改良 であった。とくに、人類は、植物の味覚および／もしくは栄養を高めるため、収 穫率を増加させるため、また特殊な環境への適合性を増強させるため、植物の性 質の改変に努めてきたのである。

最近まで、作物および植物の改良はもっばら、所望の特性をもつ植物の選択的育 種に依存していた。初期の品種改良の成功は、所望の特性をもつ植物の発見と次 世代の繁殖へのその植物の使用からの、多分偶発的なものであったと思われる。

しかしながら、このような植物はその内部に異種の遺伝子相補体をもっていたこ とから、所望の形質をもつ親と同一の子孫か現れたとは考えがたい。

それにもかかわらず、形質遺伝に働く機構に関する知識の増加と、多種の親植物 を交配させた結果の経験的観察の両者から、制御された品種改良の技術は進歩し てきた。

分子生物学における最近の進歩は、人類による動物および植物生殖質の操作能力 を劇的に拡大させた。特定の表現型、たとえば抗生物質または除草剤抵抗性を与 える特異的ポリペプチドを制御する遺伝子の局在がある種の生殖質内に見出され 、それから単離された。さらに重要なことは、ある生物体から単離された遺伝子 を取り、それらを他の生物体に導入することが可能になったことである。この形 質転換は、遺伝子を供与する生物体と門、属または種の異なるレシピエンド生物 体に対しても可能である（異種形質転換）。

遺伝子工学技術を用いる外来遺伝子の導入により、所望の形質を植物ゲノムに遺 伝子操作する試みが行われてきた。これらの技術は、一部の植物系、とくに双子 葉植物種への適用は成功している。レシピエンド植物によるたなりＮＡの取り込 みは、アグロバクテリウム感染（３２）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）− 仲介ＤＮＡ取り込み（２５）、プロトプラストのエレクトロポレーション（Ｉ７ ）およびマイクロプロジェクタイルボンバードメント（２３）を含む様々な手段 で達成されている。残念ながら、単子葉植物種への外来遺伝子の導入、ついで形 質転換植物の再分化は、双子葉植物の形質転換および再分化よりもはるかに難し いことが明らかにされている。しかも、単子葉植物たとえばトウモロコシの形質 転換ついて極性トウモロコシの苗の産生の報告は、これまで全く発表されていな い。当然、この領域での成功例はなく、極性トランスジェニック植物の産生によ る形質転換体の市場への供給は達成されていない。この不首尾は、遺伝的特性の 改良方法にとくに大きな需要かあるトウモロコシの場合には、とくに憂うへきこ とであった。

遺伝学的に形質転換された単子葉植物種の開発に際しては、−股領域の多方面で 問題か生じている。たとえば、細胞内に核酸を導入し、さらに効率的な細胞培養 および最終的な稔性植物の再分化を可能にする一般的方法かない。わずかに限ら れた成功が報告されているのみである。

イネでは、たとえば、プロトプラストのエレクトロポレーションを用いたＤＮＡ の移入およびそれに続くトランスジェニック植物の再分化か、ごく最近報告され ている（４１）。また、トウモロコシの場合にも、プロトプラストのエレクトロ ポレーションを用いた形質転換が報告されている（たとえば１７参照）。

しかしなから、安定に形質転換された植物の回収には再現性かなかった。とくに 重大な欠陥は、トウモロコシの場合、産生じたわずかなトランスジェニック植物 も、極性をもたないことである（３８）。極性のあるトウモロコシの苗の再分化 か報告されてはいるか（３７，３９）、報告されたこれらの方法は非形質転換植 物の使用に限られている。しかも、プロトプラストからの植物の再分化には、そ れに固有の、重大な一連の欠点がある。

極性のある、形質転換されたトウモロコシの苗を得るための精力的な試みにもか かわらず、この点での成功の報告はこれまでない。

プロトプラストの使用を回避できる形質転換法は、マイクロプロジェクタイルボ ンバードメントである。レポーター遺伝子の一過性の発現がボンバードメントを 行ったタバコの花粉で報告されているが（４７）、マイクロプロジェクタイルボ ンバードメントによる安定な形質転換はいかなる植物種でもこれまで報告されて いない。ダイズ成長点の、Ｄ　Ｎ、Ａ被覆金粒子によるボンバードメントで、ト ランスジェニックな領域を含むキメラ植物を生じた。この導入遺伝子を含有する 子孫が低頻度で得られた（２７）。トウモロコシの未成熱狂の苗条成長点のボン バードメントで、その合成が調整遺伝子の導入によって誘発される可視マーカー 、アントシアニンを発現する組織領域か生じた（４６）。トウモロコシの細胞系 統パターンの分析では、このようなアプローチによるトウモロコシの生殖細胞系 の形質転換は難しいことか示唆されている（２８）。

単子葉植物の形質転換の成功を困難にする第二の問題は、安定な形質転換細胞の 同定に使用される有効なマーカー遺伝子系かないことによるものであった。マー カー遺伝子系とは、ＤＮＡの発現生成物の選択および／またはスクリーニングを 可能にする系である。形質転換細胞のアッセイとして使用するためには、選択ま たはスクリーニング可能な生成物は、レシピエンド細胞に導入された遺伝子構成 体からの生成物でなければならない。それてこそ、このようなマーカー遺伝子が 安定な形質転換体の同定に使用できる。

最も一般的に使用されるマーカー遺伝子系には、アミノグリコシドたとえばカナ マイシンに対する抵抗性を付与する遺伝子系がある。カナマイシン抵抗性は、イ ネ（５１）およびトウモロコシのプロトプラスト（３８）の両者で使用され成功 しているが、単子葉植物で用いるのは、高い内因性の抵抗性により、極めて困難 な選択剤であることには変わりがない（１９）。多くの単子葉植物種、とくにト ウモロコシはアミノグリコシドに対して高いレベルの内因性の抵抗性を有し、そ のため、この種類の化合物は、非形質転換組織から形質転換組織を再現性よく識 別するのには使用できない。したがって、形質転換植物細胞を再現性よく選択ま たはスクリーニングできる新しい方法かめられているのである。

したかって、単子葉植物種の遺伝的形質転換に対する改良された方法および／ま たはアプローチが見出されれば、本技術分野に大きな進歩をもたらすことは明白 である。さらに、単子葉植物の形質転換、たとえば、所望の外来遺伝子か導入さ れた安定な形質転換トウモロコシの稔性植物および子孫の産生を可能にする、ト ウモロコシ細胞の形質転換に関する新規なアプローチを提供することは、とくに 重要である。さらに、トウモロコシのような単子葉植物系に適用可能なマーカー 遺伝子系の同定は、この種の技術を一般的に応用するために有用な手段を提供す ることになる。したがって、安定な遺伝的形質転換単子葉植物たとえばトウモロ コシの製造のためのこれらのおよび他の技術の開発は、単子葉植物の品種改良に 革命的なアプローチを提供する可能性がある。

発明の要約 本発明は、安定に形質転換された単子葉植物とくにトウモロコシの細胞の製造、 ついで極性トランスジェニック植物および子孫の再分化のための方法および組成 物を提供し、従来技術における上述のおよび他の欠点の１または２以上を解消す ることを目指すものである。

したがって、本発明の特定の目的は、好ましくは２倍体であり、所望の遺伝子の そのゲノムへの導入により安定に形質転換されたトランスジェニック稔性単子葉 植物とくにトウモロコシの製造を可能にする技術を提供することにある。

すなわち、本発明は一般的に、トランスジェニック植物の製造方法に関する。本 明細書で用いられるトランスジェニック植物の語は、正常植物には多分存在しな い遺伝子もしくはＤＮＡ配列、与えられた細胞種では通常、転写もしくは翻訳（ 発現）されない遺伝子、または非形質転換植物中にも通常存在するがその発現を 変えることが望まれる遺伝子のような非形質転換植物中への導入が望まれる任意 の他の遺伝子もしくはＤＮＡ配列を包含する（これらに限定されるものではない が）外来遺伝子もしくはＤＮＡ配列か導入された植物を意味するものである。

導入できる遺伝子の例には、たとえば、他の種からのＤＮＡ配列もしくは遺伝子 のほか、さらに同種に由来するかもしくは存在するか、従来の生殖もしくは育種 技術ではなく遺伝子工学的手法でレシピエンド細胞に導入される遺伝子もしくは 配列が包含される。しかしながら、外来の語はまた、形質転換すべき細胞には通 常存在しないか、または形質転換ＤＮＡセグメントもしくは遺伝子に認められる ような形態、構造等では多分、事実上存在しない遺伝子、あるいは通常非形質転 換植物中にも存在するか、たとえば過剰発現か望まれる遺伝子をも意味するもの である。すなわち、「外来」遺伝子またはＤＮＡの語は、レシピエンド細胞中に 既に類似の遺伝子が存在するか否かとは無関係に、その細胞内に導入される任意 の遺伝子またはＤＮＡセグメントを意味するものである。

極性トランスジェニック植物の産生における第一工程は、ＤＮＡ組成物、たとえ ばベクター、プラスミド、線状ＤＮＡフラグメント等、レシピエンド単子葉植物 細胞に送達すべき成分の取得である。この種の細胞の形質転換に使用するための ＤＮＡセグメントはもちろん、一般的に、その細胞内への導入が望まれる遺伝子 または遺伝子群である。これらの遺伝子にはさらに所望により、プロモーター、 エンハンサ−、ポリリンカー、また調整遺伝子のような構造をも包含させること ができる。

本発明の実施に際して使用できるベクターの構築は本技術分野の熟練者にはよく 知られている（一般的には７９．８０参照）。好ましい構築体は一般に、ＣａＭ Ｖ３５Ｓプロモーターのような植物プロモーター（６８）もしくはＣａＭＶｌ　 ９Ｓ（６９）　、ｎｏｓ　（７０）　、Ａｄｈ　（７１）のような他のプロモー ター、スクロースシンターゼ（７２）、Ｒ遺伝子複合体関連プロモーター（５５ ）のほか、種細胞プロモーター（７３）のような組織特異的プロモーターおよび 組織特異的エンハンサ−（７４）をも包含するものである。構築体はまた、たと えばＴｒ７またはｎｏｓからの３′末端とともに、興味ある遺伝子を包含させて もよい。所望によりさらに、調整要素たとえばＡｄｈイントロン１（７６）、ス クロースシンターゼイントロン（７７）またはＴＭＶオメガ要素（７８）を含有 させることもできる。

ある種の要素は、関連した発現可能遺伝子か存在しなくても、ゲノム中に導入し た場合、有用性を発揮することかある。たとえば、Ａｃ、　ＤｓまたはＭｕのよ うなトランスポゾンは、それだけで遺伝子中に挿入か可能で、不安定な変異を生 じる。この不安定性は、植物または種子発育時に、変異遺伝子位置からその要素 が続いて切断されることによるらしい。トランスポゾン要素の使用に関する総説 には、参考文献５６および５７がある。これらの要素、とくにＡｃは、不活性化 （または活性化）により特定の形質の標識を付すために導入できる。標識された ならば、この形質をもつ遺伝子は、たとえばそのトランスポゾン配列をＰＣＲプ ライマーとして使用し、ＰＣＲ遺伝子クローニング技術により、クローン化する ことができる。同定されたならば、その特定の形質の全遺伝子を、所望により制 御および調節領域も含めて単離し、クローン化し、所望により再導入に先立って 操作することができる。

レシピエンド細胞の産生と使用が本発明の重要な態様であると考えられる。本明 細書で用いられる「レシピエンド細胞」の語は、形質転換ついで安定に形質転換 された稔性単子葉植物への再分化を受け容れる単子葉植物細胞を意味するもので ある。本発明者らは、しかしながら、形質転換操作に付された細胞集団中に存在 するすべての細胞が形質転換と再分化に成功する「レシピエンド細胞」ではない ことを提起したい。すなわち、本発明は、本明細書に開示された技術の適用によ り、安定な形質転換と再分化に成功するのに十分な数のレシピエンド細胞を含有 する集団の取得を可能にすることを提起するものである。

レシピエンド細胞を濃厚化することができるある種の技術が開示される。たとえ ば、Ｕ型カルスの増殖、ついでもろい胚形成組織の手操作での選択および培養に より、レシピエンド細胞の濃厚化が起こると考えられる。とくに本明細書中の表 １に示された培地を用いた懸濁培養でも、任意の与えられた集団中のレシピエン ド細胞対非レシピエンド細胞の比を改善することができる。

ＤＮＡを受け容れた細胞の発生頻度は低いものと考えられる。しかも、ＤＮＡセ グメントを受け容れたすべてのレシピエンド細胞で、ＤＮＡの植物ゲノム内への 安定な統合および／または発現が起こるとは到底考えられない。一部は、初期に 一過性の発現しか示さない可能性がある。しかしながら、事実上任意の単子葉植 物種からのある種の細胞が、本明細書に開示された技術の適用により、安定に形 質転換できることを提起するものである。

最も好ましい単子葉植物は、トウモロコシのような穀類である。トウモロコシに 関しては、近文系、優良近文系またはハイブリッド変種であれ一般的にトウモロ コシ変種には本発明の多くの技術が適用可能であることが提起される。しかしな がら、特定の変種または交雑種から発生したすべての細胞系か必ずしも同程度の 安定な形質転換能を示すものではないことか指摘されなければならない。たとえ ば、本発明は、Ａ１８８ｘＢ７３交雑から標準技術で発生させたＡ１．８８ＸＢ ７３細胞系によって例示される。以下に述へるように、５Ｃ７１６および５Ｃ８ ２として同定された系か、Ａ１８８Ｘ８７３交雑から発生した細胞系の例である 。しかしなから、同じ交雑から発生した他の多くの細胞系は、現在までのところ 、安定に形質転換可能であることは証明されていない。すなわち、同じ交雑から の細胞系であっても、直ちに安定な形質転換能が明白であるとはいえない（Ａ１ ８８ＸＢ７３の約１２の系統から２系統が安定に形質転換可能で、その系統の約 １６％か極性トランスジェニック植物を生じることが明らかにされた）。すなわ ち、特定の交雑種または変種に対する形質転換体の製造を望む場合には、一般的 に、その特定の交雑種または変種から幾つか（たとえば８〜１０）の細胞系を発 生させ、このように発生させた系統のすべてを本明細書に述べる形質転換プロト コールに付すことか望ましい。

形質転換体の同定能力を改善するため、興味ある発現可能遺伝子としてまたはそ れに付加して、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を使用する ことか望ましい。マーカー遺伝子は、マーカー遺伝子を発現する細胞の、マーカ ーをもたない細胞からの識別を可能にする表現型をコードする。このような遺伝 子は、マーカーか化学的手段たとえば選択剤（たとえば除草剤、抗生物質等）に よって選択可能な形質を付与するか否か、またそれか単純に観察もしくは試験に よって確認できる形質（たとえば、Ｒ−遺伝子座形質）によって同定できるか否 かに応じて、選択可能またはスクリーニング可能のいずれかのマーカーをコード できる。もちろん、適当なマーカー遺伝子の多くの例か本技術分野では知られて いて、本発明の実施に際して使用できる。

本発明との関連でその使用か考えられる選択可能マーカーには、それらに限定さ れるものではないが、カナマイシン抵抗性をコードしカナマイシンＧ１８等を用 いて選択できるｎｅｏ遺伝子（８２）；ビアラフすス抵抗性をコードするｂａｒ 遺伝子；グリフォセート抵抗性をコードする変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子（６ ７）；ブロモキシニルに対する抵抗性を付与するニトリラーゼ遺伝子（８３）； イミダゾリノンもしくはスルホニル尿素に対する抵抗性を付与する変異アセトラ クテートシンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（６７）；またはメトトレキセート抵抗性 ＤＨＰＲ遺伝子（６１）が包含される。変異ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を採用し た場合には、適当な葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ　；参考文献６２参照 ）の導入により、付加的な利益を実現できる。

スクリーニング可能なマーカーの例には、多様な発色性基質か知られている酵素 をコードするβ−グルクロニダーゼもしくはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）　、また は植物組織においてアントシアニン色素（赤色）の産生を調整する生成物をコー ドするＲ−遺伝子座遺伝子か包含される（５９）。

「選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子」の語にはまた、形質転 換細胞の同定または選択手段としてその分泌を検出できる分泌可能マーカーをコ ードする遺伝子も包含される。この種の例には、抗体との相互作用で同定できる 分泌可能な抗原や、また触媒的に検出てきる酵素等をコードするマーカーが包含 される。分泌可能な蛋白質には様々な種類のものがあり、たとえばＥＬＩＳＡに よって検出可能な小さな拡散性蛋白質、細胞外液中に検出できる小さな活性酵素 、または細胞壁に挿入もしくは捕捉される蛋白質が包含される。

もちろん、この開示に照らしてみれば、本技術分野の熟練者には、多数の他の使 用できる選択可能および／またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子が明らか であろう。すなわち、上述の説明は網羅的なものではなく、例示的なものである 。本発明は、ｂａｒおよび／またはＧＵＳ遺伝子の使用に関して詳細に例示する が、任意の他のスクリーニング可能または選択可能なマーカー遺伝子の作成およ び使用に適用できる技術が、本開示に照らして本技術分野の熟練者には明白であ ろう。

形質転換体を選択するための系に使用できるマーカー遺伝子の例示的な実施態様 には、ストレプトミセス属たとえばｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ種からのｂａｒ 遺伝子がある。ｂａｒ遺伝子は、除草剤ビアラフすスの活性成分、ホスフィノト リシン（ＰＰＴ）を不活性化するホスフィノトリシンアセチルトランスフェラー ゼ（ＦＡＴ）をコードする。

ＰＰＴはグルタミンシンテターゼを阻害しく２９．４７）、急速なアンモニアの 蓄積と細胞死を生じる。穀類の形質転換において遭遇した大きな困難性から（３ ６）、単子葉植物の場合にこの選択系の使用が成功するとは全く予期しがたいも のであった。

本発明の実施に際して、ビアラフオス抵抗性遺伝子の使用を所望の場合には、こ の目的でとくに有用な遺伝子はストレプトミセス属の種（ＡＴＣＣ番号２１，７ ０５）から得られるｂａｒ遺伝子であることが見出されている。ｂａｒ遺伝子は 単子葉植物以外の植物に関連して使用されていたことから（Ｉ　Ｏ，ｌ　ｌ）　 、ｂａｒ遺伝子のクローニングについては報告かある（２９．４５）。しかしな から、本明細書に開示された技術および本技術分野で知られている一般的組換え 技術を参照すれば、上述のまたは他の遺伝子の導入および使用が今や可能である 。

トウモロコシＲ遺伝子複合体からの遺伝子の使用がとくに有用なスクリーニング 可能なマーカーとして提起される。トウモロコシにおけるＲ遺伝子複合体は、大 部分の種子および植物組織におけるアントシアニン色素の産生を調整する作用を 有する蛋白質をコードする。トウモロコシ株は、１個から４個までのＲ対立遺伝 子をもつことができて、これらが結合して発育または組織特異的様式で色素形成 を調整する。本発明では、トウモロコシの形質転換にＲ遺伝子複合体からの遺伝 子を適用した。それが、生存していて、トウモロコシ中に天然に生じる生成物で あり、他の検定を必要とせずに視覚化されるからである。すなわち、このような 細胞に導入されたＲ遺伝子は赤い色素の発現を生じ、安定に導入されると赤いセ クターとして肉眼で評価できる。もしトウモロコシの系統がアンドシアニン生合 成経路における酵素的中間体に優性（Ｃ２，ＡＩ、Ａ２．ＢｚｌおよびＢｚ２） であるか、Ｒ遺伝子座で劣性であれば、その系統からの任意の細胞が形質転換の レシピエンドとして採用できる。これらの系統例には、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　２ ２およびＴＲ１１２におけるｒｇ−３ｔａｄｌｅｒ、　ｒ−ｇ　、　ｂ　、Ｐ　 １であるに５５誘導体がある。

本発明ではさらに、キメラ遺伝子の発現制御機構を提供するため、Ｒ遺伝子調整 領域のキメラ構築体への使用が提起される。Ｒ遺伝子座において、他の遺伝子座 よりも多様な表現型の発現が知られている（６３）。５′ないし構造Ｒ遺伝子の 領域から得られる調整領域は、たとえば昆虫抵抗性、除草剤耐性または他の蛋白 質コード領域の遺伝子の発現を指図するのに極めて価値のあることか期待される 。本発明の目的においては、様々なＲ遺伝子ファミリーのメンバーのどれもか成 功裡に使用できるものと考えられる（たとえば、Ｐ、Ｓ、Ｌｃ等）。しかしなが ら、一般的に最も好ましいのは、Ｓｎ　（とくにＳｎ：ｂｏ１３）であろう。Ｓ ｎはＲ遺伝子複合体の優性メンバーてあり、ある種の実生および植物細胞でアン ドシアニン色素の組織特異的沈着を調節する点てＲおよびＢ遺伝子座と機能的に 類似している。すなわち、その表現型はＲに類似する。

レシピエンド細胞に送達すべき特定のＤＮＡセグメントの選択は、多くの場合、 形質転換の目的に依存する。

収穫植物の形質転換の主たる目的のひとつは、その植物に、市場的に望ましい、 農業経営的に重要な形質を付加することである。このような形質には、それらに 限定されるものではないが、除草剤耐性、収穫率の増加、昆虫および疾病抵抗性 、物理的外観、食用部分含量および素質等が包含される。たとえば除草剤耐性を 内蔵する１種または２種以上の遺伝子の導入が望まれる場合がある。

この場合、ｂａｒおよびグリフォセート抵抗性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子がよい 例である。導入できる強力な昆虫抵抗性遺伝子には、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕ ｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ結晶トキシン遺伝子があり（８６）　、これは鱗翅目また は鞘翅目の昆虫のような有害生物に対する抵抗性を付与する。

強力な殺虫活性を特徴とする蛋白質、たとえばササゲトリブシンインヒビター（ ＣｐＴｌ　；　８８　）をコードする遺伝子は根食い虫防除剤として利用され、 アバーメクチンをコードする遺伝子はとくにトウモロコシ機素い虫防除剤として 宵月なことが明らかにされている（８４．８５）。レクチンをコードする遺伝子 が殺虫作用を付与しくたとえば、大麦、小麦胚芽アグルチニン、イネレクチン、 参考文献８１参照）、一方、抗かび作用を付与できる他の遺伝子もある（たとえ ば、ヘベイン、キチナーゼ、たとえば参考文献６５参照）。

Ｗｉｎｄｅｒ　Ｆｌｏｕｎｄｅｒの蛋白質（８７）のような「抗凍結」蛋白質の 導入による低温に対する抵抗性を増大させる意味での利点の実現も提起される。

結局、単子葉植物ゲノムへの導入に最も望ましい「遺伝形質」は、所望の形質（ たとえば、ニーカー当たりの収穫の増加）をコードし、新規なプロモーターもし くはエンハンサ−等のほか、多分同種もしくは組織特異的（たとえば、根特異的 ）プロモーターまたは制御要素の制御下に導入される同種の遺伝子または遺伝子 ファミリーである。

すなわち、本発明は、任意の発現可能遺伝子で植物細胞を形質転換することによ り特定の利益を実現することを意図するものであり、マーカー遺伝子の使用に限 定することを意図するものではない。本明細書において用いられる「発現可能遺 伝子」の語は、蛋白質に翻訳され、興味ある形質等を発現できる任意の遺伝子で あり、選択可能、スクリーニング可能または非選択可能マーカー遺伝子に限定さ れない。本発明はまた、必ずしもマーカー遺伝子ではない発現可能遺伝子をマー カー遺伝子と組み合わせて用いる場合、形質転換に同一のまたは別種のＤＮＡセ グメント上の別個の遺伝子を使用することも意図している。後者の場合には、共 形質転換を最大にするため、異なるベクターがレシピエンド細胞に同時に送達さ れる。

ある実施態様においては、レシピエンド細胞は、培養して増殖させたのちに選択 される。この方法による場合、培養細胞は固体支持体上または液体懸濁液の形で 生育させるのが好ましい。いずれの場合も、栄養素は培地の形で細胞に供給され 、環境条件は制御される。アミノ酸、塩類、糖類、ホルモンおよびビタミンから なる多種の組織培養培地か使用できる。本発明の実施に用いられる培地の大部分 はある類似の成分からなり（たとえば以下の表１参照）、培地は、想定される特 定の適用によって組成およびその成分比を変動させる。たとえば、様々な細胞種 が通常、２種以上の培地中で増殖するが、増殖培地によって異なる増殖速度、異 なる形態を示すものである。

ある培地では、細胞は生存できるが、分裂しない。

植物細胞の培養に適当な培地は既に多くの種類が報告されている。これらの培地 の例としては、Ｃｈｕらによって報告されたＮ６培地（５）およびＭＳ培地（３ ０）をあげることができるが、これらに限定されるものではない。レシピエンド 細胞の調製例の実施態様では、本発明者らはこれらの培地を改良した（表１参照 ）。この目的で好ましいホルモンは、ディカンバまたは２．４−Ｄである。しか しながら、ＮＡＡ＋またはＮＡＡ＋２．４−Ｄを含めた他のホルモンも使用でき る。これらのおよび他の基礎培地の改良は、特定の生育段階でのレシピエン１・ 細胞の増殖を促進できる。

トウモロコシのレシピエンド細胞を懸濁培養で培養する実施態様の例では、たと えば１［型カルス不定胚非成細胞を用い、小さな（１０−３０１１）　、等直径 の、細胞質の濃密な細胞を選択し、この細胞をホルモン含有培地中での懸濁培養 によって増殖させ、苗条および根の分化を促進する一連の培地中に継代培養し、 最後にその植物をハードニングし、土壌内での生育のために代謝的に調整する。

形質転換に使用するためには、懸濁培養細胞を凍結保存し、ある期間保存したの ち、形質転換用の細胞として使用する。

凍結保存法の例示的な実施態様には、懸濁培養液に凍結保護剤を徐々に添加して 最終濃度をジメチルスルホキシド１０％、ポリエチレングリコール（６０００Ｍ Ｗ）１０％、プロリン０．２３％およびグルコース０．２３％にする工程か包含 される。混合物をついで、１分間に０．５°Ｃの速度で一３５°Ｃに冷却する。

４５分間等温に保ったのち、サンプルを液体窒素に入れる（Ｗｉｎｔｅｒｓ　ｇ ＩＫｉｎｇ（４９）の改良法：およびＦｉｎｋｅｌら（１５）　）　、凍結保存 された材料から懸濁培養を再開するには、細胞を急速に解凍し、Ｒｈｏｄｅｓら （３８）によって報告されたものと類似のフィーダープレート上にピペットて添 加すればよい。

所望のＤＮＡセグメント、たとえば発現可能遺伝子からなるＤＮＡセグメントに よる形質転換のためのレシピエン）・細胞として使用できる培養植物細胞の一実 施態様には、たとえばトウモロコシ細胞、さらに特定ずればＺｅａ　ｍａｙｓ　 Ｌからの細胞か包含される。体細胞には様々のタイプのものかある。不定胚形成 相細胞は胚形成により、植物の再分化を誘導できる体細胞の一例である。不定胚 非形成細胞はこのような様式では反応しない細胞である。

不定胚非形成細胞の例には、ある種のブラック・メギジカン・スィート（ＢＭＳ ）　トウモロコシ細胞かあり、これらはｎｅｏ遺伝子を用いるマイクロプロジェ クタイルボンバードメントついでアミノグリコシド、カナマイシンによる選択で 成功裡に形質転換された（２２）。しかしなから、このＢＭＳ培養体か再生可能 であることは見出されず、カナマイシンの一般的使用はトウモロコシの内因性抵 抗性により妨害されることがある（１９）。

他のレシピエンド細胞標的としては、それらに限定されるものではないが、成長 点細胞、■およびＩＩ型カルス、ならびに配偶子細胞たとえば小胞子および花粉 が包含される。花粉ならびにその前駆体細胞、小胞子は、遺伝的形質転換のため のレシピエンド細胞として、または受精時に導入される外来ＤＮＡを運搬するベ クターとして機能させることができる。直接的な花粉の形質転換によれば、細胞 培養が不要になる。成長点細胞（すなわち、連続的な細胞分裂か可能で、未分化 細胞の外観によって特徴づけられ、通常、根の先端、茎の頂端、側芽等の成長点 もしくは組織に認められる）は、また他のレシピエンド細胞を提供する。それら の未分化成長ならびに器官分化能および分化全能性のために、単一の形質転換成 長点細胞は、全形質転換植物として回収できる。実際、不定胚形成能細胞懸濁培 養は未分化状態での連続細胞分裂能を保持し、培地環境によって制御されるｉｎ 　Ｖｉｔｒｏ成長点細胞系として提案される。

本発明の関連において、たとえば形質転換用レシピエンド細胞として有用な不定 胚形成能をもつトウモロコシカルスおよび懸濁培養体の発生については、１９８ ６年７月６日付出願の米国特許出願０６／８７７．０３３号に記載されている。

この記載を参考として本明細書に導入する。

形質転換ＤＮＡセグメントを細胞内に導入する方法については多くの方法がある が、すべてがＤＮＡを植物細胞に送達するのに適しているわけではない。適当な 方法とは、実際にそれによってＤＮＡが細胞内にできる任意の方法であり、たと えばアグロバクテリウム感染、またはＰＥＧ仲介形質転換、エレクトロポレーシ ョンもしくはＤＮＡ被覆粒子の加速等による直接ＤＮＡ送達法が包含される。加 速法は一般的に好ましく、たとえばマイクロプロジェクタイルボンバードメント 等が包含される。

エレクトロポレーションはトウモロコシのプロトプラストの形質転換に使用され ている。

形質転換ＤＮＡセグメントを植物細胞に送達する方法の例には、マイクロプロジ ェクタイルボンバードメントかある。この方法では、非生物学的粒子か核酸で被 覆され、噴射力て細胞内に送達される。粒子の例には、タングステン、金、白金 等からなる粒子かある。

マイクロプロジェクタイルボンバードメントのとくに有利な点は、単子葉植物を 、再現性よ（、安定に形質転換する有効な手段であるほかに、プロトプラストの 単離（８）や、アグロバクテリウム感染への感受性を必要としないことである。

ＤＮＡの加速によるトウモロコシ細胞への送達方法の例示的な実施態様としては 、ＤＮＡで被覆された粒子を、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンのよう なスクリーンにより、懸濁培養したトウモロコシ細胞で覆ったフィルター表面上 へ推進させるのに使用できるＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　Ｄｅｌ ｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍの利用がある。

ボンバードメントのためには、懸濁した細胞を好ましくはフィルター上で濃縮す る。粒子を打ち込まれる細胞を含むフィルターは、マイクロプロジェクタイル停 止プレート下の適当な位置に配置される。所望により、発射装置と打ち込まれる 細胞の間に１個または２個以上のスクリーンを配置することもできる。ここに記 載された技術を用いることにより、ボンバードメントされたスクリーン上に、マ ーカーを一時的に発現する１００個までもしくはそれ以上の細胞集塊（細胞巣） を得ることができる。ボンバードメント４８時間後、外来遺伝子生成物を発現す る細胞の単位細胞集中の数は多くの場合１〜１０、平均２〜３の範囲である。

上述の任意の方法で、レシピエンド細胞に外来ＤＮＡの送達を行ったのちの好ま しい工程は、その後の培養および植物再分化のための形質転換細胞の同定である 。この工程には、スクリーニング可能な形質についての培養体の直接のアッセイ またはボンバードメントされた培養体の１種もしくは２種以上の選択剤への暴露 が包含される。

スクリーニング可能なマーカー形質の例としては、トウモロコシのＲ遺伝子座の 制御下に産生ずる赤色色素がある。この色素は、この段階での増殖を指示できる 栄養培地を含む固体支持体上で細胞を培養し、細胞をたとえば１８°Ｃおよび１ ８０　μＥ　ｍ−”　５ｅｃ−’以上でインキュベートし、着色したコロニー（ 細胞の可視集合体）から選択することによって検出される。これらの細胞はさら に、懸濁してまたは固体培地上で培養することもできる。

形質転換細胞の同定方法の実施態様の例には、ボンバードメントされた細胞を選 択剤たとえば代謝阻害剤、抗生物質、除草剤等に暴露する方法が包含される。形 質転換され、使用した選択剤に対する抵抗性を付与するマーカー遺伝子か安定に 挿入された細胞は、培養すると増殖し、分裂する。感受性細胞はその後の培養を 受け容れることかできない。

ｂａｒ−ビアラフオス選択系を使用するためには、ボンバードメントされたフィ ルター上の細胞を非選択性液体培地に再懸濁し、培養しくたとえば１〜２週間） 、１〜３ｍｇ／ｌのビアラフオスを含存する固体培地で覆ったフィルターに移す 。１〜３ｍｇ／ｌの範囲が通常好ましいが、本発明の実施に当たっては０．１〜 ５０ｍｇ／ｌの範囲で有用性が認められるものと考えられる。ボンバードメント に使用されるフィルターの種類にはとくに制限はないと考えられ、任意の固体、 多孔性、不活性支持体とすることができる。

選択剤への暴露後も生存する細胞は、植物の再分化を支持する細胞中で培養する 。適当な培地の例にはＭＳ培地の改良培地がある（表１）。組織をホルモン含有 基礎培地に約２〜４週間維持し、ホルモンを含まない培地に移す。２〜４週後、 苗条の発生が他の培地へ移す時期のシグナルとなる。

再分化には通常、形質転換カルスから、より成熟した植物への以後の発達段階の 間に適当な栄養素およびホルモン性シグナルを与えるように組成を改良した一連 の培地が必要になる。生育している小植物を土壌に移し、たとえば相対温度約８ ５％、　Ｃｏ２６００ｐｐｍ　、光２５０マイクロアインシュタイン「２ｓ１に 環境を＃御したチャンバー内でハードニングする。植物は、生育チャンバー内ま たは温室で生育させるのが好ましい。再分化には通常約３〜１２週を要する。再 分化時には、細胞は組織培養容器中、固体培地上で生育させる。このような容器 の例示的実施態様としてはペトリ皿を挙げることができる。

再分化植物は約１９〜２８°Ｃて生育させるのか好ましい。

再分化植物か苗条および根の発生段階に到達したのち、更なる成長および試験の ために温室に移すことかできる。

外来ＤＮＡを、単独でまたはマーカー遺伝子と組合わせて適用することにより、 レシピエンド細胞に送達された形質か再分化植物に存在することを確認するため には、上記遺伝子の発現のアッセイか、たとえば再分化植物の部分の試験によっ て行われる。アッセイされる部分の例には葉かある。典型的な形質転換体アッセ イには、再分化植物または植物抽出物を形質転換遺伝子生成物による作用を受け る基質と接触させる方法がある。この発育段階では、このようなアッセイによっ て植物か致死的な影響を受けることはない。植物の小部分の除去が、植物の死や その後の生育への妨害を生じることはない。

一つの試験では、Ａ１８８ｘＢ７３懸濁培養系（ＳＣ８２）の形質転換体からＲ ８植物を再分化させたところ、これらの植物はカルスおよび培養体を誘導したハ イブリッドＡ１８８ｘＢ７３のゲッタイブの期待された表現型を示した。この植 物は種子誘導Ａ１８８植物と高さく３〜５フイート高）は類似していたが、茎お よび支柱根におけるアントシアニンの蓄積のようなり７３の形質ならびに直立葉 の存在が認められた。形質転換植物のある形質がそれらのソースのものとは異な り、実際にある種の変異か起こる可能性のあることも考えられる。

実施態様の一例では、形質転換カルス由来の再分化植物が、温室に移したのちも 順調に生育し、成熟に達する割合は９７％であった（７６中７３）。−例では、 Ｒ。

植物から少なくとも５０の生存子孫か回収された。Ｒ。

の穂を種子誘導Ｂ７３植物からの花粉で受粉させることにより、形質転換植物と 種子誘導植物との戻し交配を行ってＲ８植物の極性を試験したところ、穀粒の発 生を認めた。しかしながら、形質転換植物上の穀粒は、穀粒分化の停止と植物の 未成熟老化により胚レスキューを必要とすることに留意すべきである。

胚の再分化を助けるため、受粉１０〜２０日後に表面の非感染穀粒から胚を切除 し、培養する。この段階での培養に使用される培地の一実施態様は、ＭＳ塩、２ ％スクロース、および５．５　ｇ／ｌアガロースからなる。胚レスキューの例示 的実施態様においては、大きな胚（長さ３ｍｍ以上と定義される）は直接適当な 培地上で発芽させる。

それよりも小さい胚は、上記成分とともに１０−５Ｍアブシジン酸を含存する培 地上で１週間培養し、ついでホルモンを含まない培地に移して発芽させる。

子孫を形質転換植物から回収し、植物の部分たとえば葉に、適当な基質を局所適 用し、外来発現可能遺伝子の発現を試験することができる。ｂａｒ形質転換植物 の場合は、形質転換親植物（Ｒｏ）およびそれらの子孫（Ｒ１）をｉｎ　Ｖｉｔ ｒＯ酵素アッセイで評価して、植物中に機能的ＦＡＴ活性が認められた場合には 、葉に除草剤Ｂｏｓｔａを局所適用したのちにも、ビアラフオス関連壊死を示さ なかった。−実験では、試験した２８の子孫の５０％（Ｎ＝１４）かＦＡＴ活性 を示した。試験したＰＡＴ陽性子孫はすへてｂａｒを含有し、この酵素の存在と ビアラフオス抵抗性か、マーカー遺伝子の生殖系による伝達と関連していること か確認された。カルスおよび親形質転換体（Ｒｏ）の非キメラ性は、生殖系伝達 、ならびにカルス、Ｒ，Ｍ物および形質転換遺伝子について分離されたＲ３子孫 における同一のサザンブロットハイプリダイセーションパターンおよび形質転換 ＤＮＡの強度によって示唆された。

本技術分野でよく知られた技術を使用することにより外来遺伝子の存在を決定す るためには、ゲノムＤＮＡをカルス細胞系および植物から単離することかできる 。多分、細胞内の配列の再配列または欠失により、常に完全な配列か存在すると は限らないことに注意すべきである。

本発明者らは、他の研究音速か成功しなかった捻挫トランスジェニック・トウモ ロコシ植物の産生に成功した。

本発明の方法の態様には、それらに限定されるものではないか、特定の成長パタ ーンを助ける培地を使用したレシピエンド細胞の懸濁培養体の生育、形質転換の 効率的な検出を可能にする選択系の選択、外来ＤＮＡを含む遺伝子ベクターの細 胞内導入を促進する方法の改良、形質転換細胞から高頻度で植物を再分化させる 方法の発明、ならびに生存および繁殖か可能なトランスジェニック植物の産生、 か包含される。

定義 ■型−固く、増殖か遅く、異形のカルス（不定胚形成／器官形成）で、有機化さ れた組織の領域に分裂活性を維持している。

ＩＩ型−柔らかく、増殖か早い、不定胚形成能を有するカルスで、濃厚な細胞質 を存する等直径の小細胞の集合体からなる。胚柄によって基底のカルスに結合し た小さな胚様体を含むことが多い。

達てきる生物体細胞 スのＤＮＡ −な（同型接合）生物体 を有する植物。例としては、トウモロコシ、イネ、小麦、オート麦、および大麦 のような穀類かある。

非不定胚分化カルスー未分化胚の形成を誘導できない、しばしば高度に空胞化し た細胞からなる。

表現型−ゲッタイブと環境の相互作用から生じる、生物体によって表現された形 質 たな遺伝子暗号の取得 トランスジェニック−新しいＤＮＡ配列か挿入された生物体 図面の簡単な説明 図１．ボンバードメント実験に用いられるプラスミド（ベクター）の模式的表示 ニブラスミドの名称は（Ａ）ｂａｒを含むｐＤＰＧＩ　６５、および（Ｂ）ｕｉ ｄＡ　（β−グルクロニダーセをコードする遺伝子（ＧＵＳ））を含むｐＤＧ２ ０８である。記号は、各種制限部位、制限エンドヌクレアーゼによって切断され る位置、Ｅ、ＥｃｏＲＩ　；　Ｈ，ＨｉｎｄＩＩ［；　Ｂ。

ＢａｍＨＩ　：　Ｓ、　ＳａｍＩを示す。（Ｃ）　ｐＤＰＧＩ　６５　（Ｄ）　 ｐＤＧ２０８にさらに詳細な地図を示す。（Ｅ）には、ｐＤＧ　１４１としても 知られ、５′非コードおよび５′コ一ド配列がＫｏｚａｋコンセンサス配列およ び旧ｎｄＩＩＩ制限部の導入によって修飾されたｐＡＧＵＳ　１の制限地図を示 す。（Ｆ）には、Ｓｎ：ｂｏｌ　３　ｃＤＮＡを含むプラスミド、ｐＤＰＧ２３ ７の制限地図、（Ｇ）には、Ｒｓｎ　ｃＤＮＡが３５ＳプロモーターおよびＴｒ ７の３′末端とともに導入されたプラスミド、ｐＤＰＧ２３２の地図を示す。

図２．ヒアラフオスを含む選択プレート上て発生する細胞コロニーの外観：この ようなコロニーはホンバードメント後６〜７週で出現する。（Ａ）　１　ｍｇ／ ｌビアラフオス上で選択された５Ｃ８２ピアラフナス抵抗性コロニー、（Ｂ）　 １　ｍｇ／ｌビアラフオス上で選択され、維持された不定胚分化５Ｃ８２ビアラ フオス抵抗性カルス。

図３．Ｅ１−Ｅｌｌと命名された不定胚分化５Ｃ８２力ルス形質転換体および非 選択対照（ＥＯ）におけるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（Ｆ ＡＴ）活性、２５μｇの蛋白抽出物を各レーンに負荷した。

Ｂ１３はＢＭＳ−ｂａｒ形質転換体である。ＢＭＳはブラック・メキシカン・ス ィート・トウモロコシである。異なる形質転換体の活性はバンドの強度をベース にして約１０倍変動した。

図４．ビアラフオス抵抗性５Ｃ８２カルス単離体Ｅｌ〜Ｅ１１におけるｂａｒ遺 伝子の挿入：　ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ■で消化したＥ１〜Ｅｌｌおよび非選 択対照（ＥＯ）からのゲノムＤＮＡ　（４μｇ／消化物）のＤＮＡゲルプロット 。左側および右側に分子量をｋｂて示す。プロットはｐＤＰＧｌ　６５からのｓ ｘｐ標識ｂａｒ　（約２５　Ｘ　１０　’　Ｃｅｒｅｎ−ｋｏｖ　ｃｐｍ）とハ イブリダイズした。１および５コピーと指摘したレーンは二倍体ゲノムを指示し 、それぞれｐＤＰＧ１６５からＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄｌＩＩて遊離された１、 　９　ｋｂ　ｂａｒ発現単位１．９および９．５９ｇを含有する。

図５．Ｒ０植物の蛋白抽出物中のＰＡＴ活性：Ａｌ８８ｘＢ７３の懸濁培養から の４つの形質転換された、再分化可能なカルス系、５Ｃ２８（ＥＩ　Ｏ，Ｅｌ　 ｌ。

Ｅ　２／Ｅ　５およびＥ３／Ｅ４／Ｅ６）それぞれから誘導された植物抽出物に ついてＦＡＴ活性を試験した（Ｅ２／Ｅ５およびＥ　３／Ｅ　４／Ｅ　６の名称 は、相当するＤＮＡゲルプロットハイブリダイゼーションパターンをもつ形質転 換細胞系を示す。単離体は培養および選択過程で恐らく分離されたものと思われ る）。非形質転換Ｂ７３およびブラック・メキシカン・スィート（ＢＭＳ）細胞 培養ｂａｒ形質転換体がらの蛋白抽出物を対照として包含させた。各反応当たり 計約５０μｇの蛋白質を使用した。

図６．ｂａｒでプローブされた形質転換カルスおよび相当するＲ０植物からのゲ ノムＤＮＡのＤＮＡゲルプロット分析：５Ｃ２８細胞のマイクロプロジェクタイ ルボンバードメント形質転換に使用したプラスミド、ｐＤＰＧ１６５から、ゲノ ムＤＮＡをＥＣＯＲＩおよび旧ｎｄＩ［［で消化し、１、９　ｋｂ　ｂａｒ発現 単位（ＣａＭＶ）　３５　Ｓプロモーター−ｂａｒＴｒ７　３’末端）を遊離さ せ、ｂａｒとハイブリダイズした。左側および右側に分子量をｋｂで示す。Ｅ３ ／Ｅ４／Ｅ６．ＥＩ　Ｉ、Ｅ２／Ｅ５およびＥＩＯ（７）符号を付したレーンは 、カルス（Ｃ）またはＲ０植物ＤＮＡいずれか５μｇを含有した。対照レーンは 非形質転換Ａ１８８ＸＢ７３植物からのＤＮＡを含有した。「１コピー」と記し たレーンは、ｐＤＰＧｌ　６５からの、１．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ ｌｉ［フラグメント２．３　ｐｇを含有した。二倍体ゲノム当たりｌコピーであ る。

図７．Ｅ２／Ｅ５　Ｒ，植物の分離子孫のＦＡＴ活性とＤＮＡゲルプロット：（ Ａ）１０の子孫（レーンａ〜ｊ）および非形質転換対照植物（レーンｋ）のＦＡ Ｔ活性の分析。記号ａ、ｂ−ｈ、ｉ、およびｊのレーンは別個の親Ｒ８植物の子 孫からの蛋白抽出物を含有させた。

カルスと指摘したレーンはＥ　２／Ｅ　５カルスからの蛋白抽出物を含有させた 。各反応当たり計約２５μｇの蛋白質を使用した。ＣＢ）　Ａで分析したＩＯの 子孫から単離したゲノムＤＮＡのＤＮＡゲルプロット分析。ゲノムＤＮＡ（５μ ｇ／レーン）をＳｍａ　Ｉで消化し、ｐＤＰＧ１６５からのｂａｒを含有する０ 、　６　ｋｂフラグメントを遊離させ、ｂａｒプローブとハイブリダイズした。

Ｒｏと付記したレーンは子孫ａの親Ｒ０からのＤＮＡを含有させた。「１コピー 」と記したレーンはＳｍａ　Ｉで消化したｐＤＰＧＩ　６５を含有し、二倍体ゲ ノム当たり０．６　ｋｂフラグメント約１コピー（０，８ｐｇ）に相当する。

図８．ｂａｒ−形質転換５Ｃ８２カルス系統Ｙ１８におけるＧＵＳ活性の組織化 学的確認：完全なＧＵＳコード配列を含有する、このビアラフオス抵抗性カルス 系統Ｙ１８についてボンバードメント３カ月後のＧＵＳ活性を試験した。この図 では、カルスの分別染色が観察された。

図９．ヒアラフオス抵抗性５Ｃ７１６単離体Ｒ１〜Ｒ２１における外来遺伝子の 挿入：（Ａ）Ｒ１−Ｒ２１の記号を付したＡ１８８ＸＢ７３の懸濁培養体から単 離された形質転換体（ＳＣ７１６）からのゲノムＤＮＡ（６μｇ／消化）のＤＮ Ａゲルプロットを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＴｆｌで消化し、３２ｐＨ識ｂａ ｒプローブ（約１０×１０　’　Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　ｃｐｍ）とハイブリダイズ した。左側および右側に分子量をｋｂで示す。二倍体ゲノム当たり２コピーのｂ ａｒ発現単位は、ｐＤＰＧｌ　６５からの１．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ ｌｌＩフラグメント５．７　ｐｇである。（Ｂ）　Ａからのプロットを洗浄し、 ！！ｐ標識ＧＵＳプローブ（約３５×１０　’　Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　ｃｐｍ）と ハイブリダイゼーションを行わせた。ｐＤＰＧ２０８からの２．１ｋｂ　ＧＵＳ 含有ＥｃｏＲＩ　／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの２コピーは６．３９ｇである 。

図１０．　形質転換Ｒ８およびＲ１植物中に導入された遺伝子の機能的発現＝（ Ａ）形質転換Ｒ０植物のＢａｓ　ｔａ′１抵抗性。Ｂａ５ｔａ”溶液を非形質転 換Ａ１８８ｘＢ７３植物（左）およびトランスジェニックＲ０Ｅ３／Ｅ４／Ｅ６ 植物（右）の葉の中央の広い（約４ｘ８ｃｍ）領域に適用した。（Ｂ）形質転換 Ｒ１植物のＢａ５ｔａ”抵抗性。

Ｂａ５ｔａＲ溶液を同じく、４つの植物、２つはｂａｒを含まない植物（左）お よび２つはｂａｒを含む植物（右）である。除草剤はＲＩ植物の茶葉の４カ所す なわち中肋の各側２カ所除草剤はＲＡＭ物の茶葉の４カ所すなわち中肋の各側２ カ所の１ｃｍの円に適用した。写真は適用６日後に撮影した。（Ｃ）トランスジ ェニックＲ０植物の葉組織におけるＧＵＳ活性。共形質転換カルス系統Ｙ１３（ 化した植物の葉組織におけるＧＵＳ活性の組織化学的確認。Ｂａｒ　＝　Ｉ　Ｃ ｍｏ　（Ｄ）　（Ｃ）に示したＹ１３植物からの葉セグメントを、明視野レンズ 下の表面視野で観察した光学顕微鏡写真。ＧＵＳ活性は、葉組織を通して多くの 細胞種に観察された（倍率＝２３０ｘ）。（Ｅ）対照植物の（Ｄ）の場合と同じ 光学顕微鏡写真。

図１１．　成熟Ｒ０植物、発育した穀粒および子孫：（Ａ）Ｅ２／Ｅ５カルスか ら再分化した成熟Ｒ０植物。

（Ｂ）胚レスキューによりＥ２／Ｅ５植物から誘導された子孫；右が抵抗性遺伝 子をもつ分離体、左がその遺伝子を欠く分離体。（Ｃ）形質転換Ｒ１植物からの 花粉を用いてＲ７３の穂に受粉させ多数の種子が回収された。（Ｄ）Ｒ１植物か らの形質転換された穂を非形質転換対照植物からの花粉と交配した。

好ましい態様の説明 初めて、極性トランスジェニックトウモロコシ植物か産生され、ｉｎ　ｖｉｔｒ ｏ遺伝子形質転換に基づく作物の改良に新しい見通しの窓が開けたのである。本 発明者らは、体細胞からトランスジェニック植物に至る全過程の多くの工程を結 合し、改良することによって、他の研究者が失敗した改良に成功した。本明細書 に開示された方法は、統合された過程の各部分であるが、例示の目的で、外来Ｄ ＮＡのレシピエンドとしての細胞の培養、レシピエンド細胞の凍結保存、ＤＮＡ を細胞に送達させるためのベクターの構築、ＤＮＡの細胞への送達、形質転換の 成功の検定、安定な形質転換体の単離に必要であれば選択剤の使用、形質転換か らの植物の再分化、これらの植物の遺伝子発現および外米ＤＮＡ配列の同定のた めの検定、トランスジェニック植物が極性であるかどうかの確認、ならびにトラ ンスジェニック植物の子孫の産生に、さらに分割する。本発明はまた、形質転換 トウモロコシ細胞、それによって産生されるトランスジェニック植物および花粉 に関する。

Ａ１組織培養 組織培養には、培地と制御された環境か要求される。

「培地」とは、細胞をｉｎ　ｖｉｔｒｏで、すなわち完全な生存生物体の外部で 増殖させるために用いられる多数の栄養素混合物をいう。培地は通常、大部分の 細胞種の増殖に必要な各種範嗜の成分（塩、アミノ酸、ホルモン、糖、緩衝剤） の懸濁液である。しかしながら、それぞれの特定の細胞種は、増殖のために特定 の範囲の成分比を要求し、至適な増殖のためにはさらに特定の範囲の処方を要求 する。細胞の増殖速度も同じく、その細胞種の増殖を可能にする培地のどのよう な配列て培養を開始するかによっても変動する。

栄養培地は液体として調整されるか、これはこの液体を固体支持体を与えること か可能な材料に加えることによって固化してもよい。寒天はこの目的のために最 も共通に使用される。組織培養で植物細胞を増殖させるのに適当な固体支持体の 適当な種類には、ＢａｃｔｏａｇａｒおよびＧｅｌｇｒｏかある。

一部の細胞は、液体懸濁液中でも固体培地上でも、生育し、分裂する。本明細書 に開示されるように、トウモロコシ細胞は懸濁液中で生育するが、植物の再分化 には、発生段階のある時点て液体から固体培地に移すことか必要になる。培養細 胞の分化の型および程度は使用される培地の種類のみてなく、環境、たとえばｐ Ｈによっても影響されるか、また、培地が固体であるか液体であるかによっても 影響される。表１にはレシピエンド細胞の創製および植物の再分化に有用な各種 培地の組成を例示する。

Ｂ、形質転換用レシピエンドととする細胞の懸濁培養トウモロコシ細胞の懸濁培 養体を調製し、凍結保存する能力は、それによって形質転換のための細胞を再現 性よく成功裡に調製するための手段を提供する点において、本発明の重要な態様 であると考えられる。

以下に述べる研究は、形質転換および再分化が可能なトウモロコシ細胞の懸濁培 養体を生成させるために、本発明者らによりその適用に成功した技術を説明する ものである。様々な異なる種類のトウモロコシが本発明者らによって開発され、 本発明の多様な、とくに懸濁培養体の発生を包含する態様の実施に用いられてい る。以下の表１には、本発明のこれらの態様の実施にあたり、本発明者らによっ て好んで用いられた培地の組成を示す。

Ｂａｃｔｏａｇａｒ ｃａｘｇｒｏ” ０　参考文献３０に記載されたＭＳ培地。参考文献３゜に記載された培地は通常 、ＮＨ４Ｎｏｚを１．６４　ｇ／ｌから１、５５　ｇ／ｌに減量し、ピリドキシ ン塩酸塩、ニコチン酸、ミオイノシトールおよびグリシンを省くことによって改 良される。

＋；存在、−＝不存在、■＝ビタミン ”　ＮＡＡ＝ナフトール酢酸 Ｉ　ＡＡ＝インドール酢酸 ２−ＩＰ＝２−イソペンチルアデニン ＢＡＰ＝６−ベンジルアミノプリン ＡＢＡ＝アブシジン酸 °００　参考文献６に記載の基礎培地 例１：形質転換に使用するためのＧ［［（Ａ１８８Ｘｂ７３）７１６　（ＳＣ７ １６と命名）の懸濁培養の開始この例には、以下に記載する様々の形質転換研究 に使用された、５Ｃ７１６と命名の懸濁培養トウモロコシの発生について説明す る。細胞培養の開始に用いられたＩＩ型組織は、１　ｍｇ／ｍｌの２．　４−Ｄ 　（２０１；表１参照）を加えたＮ６を基本にした培地上にブレーティングした Ａ１８８ＸＢ７３の未成熟胚から誘導した。門型カルスは、速やか増殖している 、もろい不定胚形成細胞の肉眼による選択で開始させた。カルス開始６月内に懸 濁を開始した。懸濁を開始させたカルスから選択された組織は極めて未分化のＩ Ｉ型カルスからなり、この未分化組織の特徴は、その下に層をなす柔らかく、も ろい未分化組織をともに伴う胚発生の最も初期段階のものである。

約１ｇの組織を液体培地２０ｍ１に加えた。この例では、液体培地は、様々の徐 放性ホルモンカプセル処置を加えた培地４０２とした（以下の例１２参照）。こ れらのカプセル処置には、２．４−Ｄ、ＮＡＡ、２．４−Ｄ十ＮＡＡおよび２Ｎ ＡＡカプセルが包含された。一つのフラスコは、異なる４０２培地それぞれとホ ルモン配合物について開始した。７日ごとに細胞懸濁液の小部分を新しいフラス コに移すことにより、新鮮培地に植え継いだ。

これには、最初のフラスコを撹拌して細胞（培養容器のそこに沈む傾向にある） を懸濁させ、フラスコを横に傾け、濃厚な細胞および細胞集合体をわずかに沈積 させた。

ついで、この沈積した細胞のプールから、４ｍｌの調整培地とともに、充填細胞 １ｍｌを取り出した。この移送には、滅菌した１０ｍ１の、尖端の広いピペット （Ｆａｌｃｏｎ　７３０４）を使用した。ピペットの尖端を簡単に通らない極め て大きい細胞集合体は除外した。ホルモンカプセルを添加した場合には、それも 同時に新しいフラスコに移した。

約７週後に、緩やかな不定胚形成細胞集合体が大部分を占めるようになり、各培 養液中のフラグメントは「分散ｊと呼ばれる状態に到達した。最高の比率の不定 胚形成細胞集合体が生成した処置は４０２培地＋ＮＡＡカプセルであった。培養 体が分散状態になり、充填細胞容量の増加で測定してほぼ２〜３日ごとに倍増す る早い速度で増殖し始めたのちに、各培養液から１ｍｌの充填細胞接種材料を、 １０ｍ１の尖端の狭いピペット（Ｆａｌｃｏｎ　７５５１）を使用して４０１培 地中に移した。これらの移送はほぼ３、５　日コトｉ：実７ｉｅｉシタ。４０２ 培地＋２．４−Ｄ＋ＮＡＡカプセルからの接種材料はまた、４０９培地（４０２ 培地−２，４−Ｄ＋１０ｍｇディカンバ）中、ココナツツ水（Ｇｉｂｃｏ　８７ ０−８　］　３０ＡＧ）　１ｍｌを添加または添加しないでの培養の開始にも使 用した。

最も分散した培養体を２週、２月または５月後に凍結保存した。

ココナツツ水を添加した４０９培地上で生育した培養体は、８月後に凍結保存か ら取り出し、解凍し、ＢＭＳをフィーダ一層として用いた固体２０１培養培地（ ３８）上で２週間培養し、ココナツツ水を含まない４０９培地に移した。培養体 は、上述の方法で、４０９培地を用い、毎週２回継代して維持した。

例２：形質転換に使用するための（Ａ１８８ＸＢ７３）６２　（ＳＣ８２と命名 ）の懸濁培養の開始この例には、以下に記載する様々の形質転換研究に使用され 、５Ｃ８２と命名された他の細胞系の発生について説明する。５Ｃ８２の発生に 際して、懸濁培養の開始に用いられる接種材料は、１３．２　ｍｇ／ｍｌのディ カンバを含存するＮ６を基本にした培地（２２７）（表１）上にブレーティング した未成熟胚から誘導したＩＩ型カルスから肉眼で選択した。ｉｆ型カルスの開 始３月内に懸濁培養を開始した。その高度に前胚的な形態により、肉眼検査で識 別可能なカルスの少量（５０〜１００ｍｇ）を、より成熟したまたは組織化され た構造から分離し、様々のＧｔ［（Ａ１８８ｘＢ７３）７１６懸濁培養（４種の カプセル処置添加４０２培地、および４０９培地）からの滅菌濾過調整培地５ｍ ｌを含む５０ｍ１のフラスコ中に接種した。

１週後、この５ｍｌの培養液を、メツシュア１０ミクロンの篩に通し、１５０ｍ １のフラスコ中、確立されたＧＩＩ（Ａ１８８ＸＢ７３）７１６培養からの、相 当する新鮮な滅菌濾過調整培地２０ｍ１の接種に使用した。１週またはそれ以上 増殖させたのち、充填細胞２ｍｌを上述の方法で新たな培地に継代した。この方 法で４０９上に維持された懸濁培養体は、ついで３月以内に凍結保存した。

４０９上に維持された最初の細胞系（再接種された凍結保存培養体ではない）は １〜２月後に使用し、安定な形質転換および選択が達成された（ｐｌ下の表２参 照）。凍結保存培養体は、実験６で使用した（以下の表２参照）。

Ｃ１徐放性植物ホルモンカプセル 放射標識植物ホルモン（２，４−ＤおよびＮＡＡ）の運命の追跡研究から、懸濁 培養培地中に存在する補助物質の大部分は２日以内にトウモロコシ細胞によって 吸収されることがわかった。このホルモンの欠失の問題は、少量の補助物質を１ 日おきに加えることによって解決できる。しかしながら、大規模の生産では、培 養体への添加は時間のかかる作業であり、また培養容器の蓋を頻回に開閉する必 要から、汚染の危険も増大する。要約すれば、これらのカプセルは通常、結晶状 態の植物ホルモンからなり、それがシリコン制御膜に囲まれたシリコンマトリッ クス中に封入されている。ホルモンの放出速度は、分散可能面の大きさおよび膜 の厚さによって調整される。

これらは、１）ホルモンの許容される、予測可能な速度での供給（たとえば２０ 〜１００μｇ／２０ｍ１培養培地／日）、２）液体または固体培養培地に使用す るのに便利な大きさくたとえば０．５〜１．５　ｃｍの長さ）、３）耐久性があ り、オートクレーブで容易に滅菌可能、ならびに、４）使用時まで乾燥して保存 可能、などの利点かある。

この組成物は、植物組織培養のための植物ホルモンまたは選択剤の、所望の試剤 の結晶を含有する内部マトリックスからの外部制御膜を通しての制御された放出 に関与する。好ましい態様の組成物においては、所望の試剤の乾燥結晶３０％か 室温加硫（ＲＴＶ）シリコン７０％（Ｗ／Ｗ）と混合され、ついで所望の試剤の 所望の速度での放出に適当な直径と壁厚を有するシリコンチューブに注入する（ 徐放性カプセルに関連して使用される好ましい試剤は２．４−ＤおよびＮＡＡで あり、好ましい直径は０．０６２“ＩＤＸ０．０１２５“ＯＤである）。

ＲＴＶシリコンをついで、室温でまたは加硫工程を加速するために高温で重合さ せる。内部マトリックスを加硫したのち、チューブを適当な長さに切断し、チュ ーブの末端をＲＴＶシリコンで密閉する。本発明の関連で使用される場合の好ま しい長さは、約０．５　ｃｍである。末端シールを重合させたのち、得られたカ プセルはそのまま保存するか、または高速排出サイクルで１５分間オートクレー ブ処理して滅菌状態で永久に保存できる。使用前に膜を横切る安定な拡散勾配を 確率させるためにカプセルを平衡化してもよく、また、平衡化しないでそのまま 使用することもできる。

もっと放出速度か遅い他の組成物には、所望の物質の結晶を水またはシリコン油 のような液体に懸濁し、これを比較的非透過性のチューブ、たとえばＮｙｌｏｎ 　−１１に封入したものかある。この貯蔵部からの放出速度は、ついでチューブ に様々な大きさの孔を開け、孔の上部のシリコンの窓部をシリコン医学用接着剤 で塞ぐことにより調整できる。この場合も、カプセルはオートクレーブで滅菌し 、使用時まで乾燥させて保存できる。

徐放性ホルモンカプセルの製造に際し、本発明者らによって用いられた技術の例 は次の通りである。

１、２ｇのＤｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　ＭＤＸ　−４−４２１０医薬用エラストマ ーおよび０．２　ｇ　（７）Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｍ　Ｄ　Ｘ　−４−４２ １０硬化剤を１０＋ｎｌのシリンジ中に秤量し、その底部にプラスチックキャッ プで栓をした。

２．４１１ミクロンのステンレス鋼の篩で篩過して塊を除いた２、４−Ｄ（また はＮＡＡ）６００ｇを同じシリンジに加え、エラストマーおよび硬化剤と完全に 混合した。

３．１０ｍ１シリンジおよびその内容をついで真空遠心分離器中で脱ガスして気 泡を除去した。

４、　培地ジューロメーター（５０５ｈｏｒｅ　Ａ）のＤｏｗＣｏｒｎｉｎｇ　 ５ｉｌａｓｔｉｃ医薬用シリコンチユーブ（０，０６２″１ＤＸＯ，０Ｉ２５“ ＯＤ）を１０〜３０分アセトンに浸種して予め膨潤させる。

５、　１０ｍ１シリンジの末端からプラスチックキャップの栓を外し、脱ガスし たシリコン−２，４−Ｄ混合物を、予め膨潤させ、短時間空気流を吹き込んで過 剰のアセトンを除去したチューブ中に押し出した。

６、　充填したチューブの両端を次にクランプで閉し、チューブを一夜５０°Ｃ に加熱しくアセトンの沸点＝５６．５°Ｃ）、重合を加速した。

７、　チューブをついで、長さ０．５　ｃｍに切断した。

８、　チューブ切片の末端をＤｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ａ型置薬用接着剤で密閉 し、２４時間乾燥させた。

９、　完成したカプセルをオートクレーブで１５〜２０分乾燥し、使用時まで乾 燥状態で保存した。

１０、使用前に、カプセルを２５ｍ１の滅菌ｌ〜ｌｏｍＭＫＨＣｏ、中で４８時 間振盪して予め平衡化するか、または平衡化することなく培養液に添加できる。

Ｄ、凍結保存方法 凍結保存は、それにより細胞培養体の将来の使用のための維持および保存が可能 になることから、重要である。

細胞懸濁液は、既決の方法（１５，４９）の改良法を用いて凍結保存した。凍結 保存プロトコールは、この間同じく０℃に保持された細胞懸濁液を攪拌しながら １時間を要して予め冷却した（０°Ｃ）濃厚凍結保護剤混合物の滴加からなる。

添加された凍結保護剤の容量は、最初の細胞懸濁液の容量と同して（１１添加９ 、凍結保護添加剤の最終濃度は、１０％ジメチルスルホキシド、１０％ポリエチ レングリコール（６０００ＭＷ）　、　０．２３Ｍプロリンおよび０．２３Ｍグ ルコースであった。混合物を０°Ｃで３０分間平衡化させた。この間、細胞懸濁 液／凍結保護剤混合物は、２ｍｌポリエチレン低温バイアル中、１、５　ｍｌ　 （０，５ｍｌ充填細胞容量）の部分に分割した。このチューブを０．５℃／分で 一８℃まで冷却し、この温度に維持して氷晶を形成させた。

細胞外氷晶形成か肉眼で確認されたならば、チューブを０．５°Ｃ／分で一８° Ｃから一３５°Ｃまて冷却した。チューブをこの温度に４５分保持した（細胞集 塊全体の均一な凍結誘導脱水を保証するため）。この時点で、細胞はその浸透圧 容量をほとんど失い（すなわち、細胞内に残った遊離水はほとんどない）、保存 のために安全に液体窒素内に漬けることができた。−３５°Ｃから一１９６°Ｃ への急速な冷却速度によっても、細胞内に残った遊離水はほとんどないことから 、細胞内に大きな固着した氷の結晶が生成するのは妨げられた。細胞を液体窒素 内に保存すると、細胞が効果的に固定化され、長期の保存が存寄でない点まで代 謝過程を減衰させる。

細胞害溶液の解凍は、低温チューブを液体窒素から取り出し、それを４２°Ｃの 滅菌水中で約２分間攪拌したる。

最後の氷晶が溶けたならば、直ちにチューブの加熱をやめ、組織の加熱を防止し た。細胞懸濁液（まだ凍結保護剤混合物中にある）をピペットでフィルター上に 取り、アガロース固定化８ＭＳ細胞の層（回復時に保育作用を示すフィーダ一層 ）の上で休止させた。溶液がフィルターを通して拡散するに従い、凍結保護剤の 希釈が起こり、栄養素が回復中の細胞の方向に向かって拡散した。続いて解凍細 胞の増殖が認められたならば、増殖している組織を新鮮な培養培地に移した。細 胞培養体は、十分な細胞集塊が再び得られたならば（通常１〜２週内）、直ちに 液体懸濁培地に戻した、液体中で培養体が再確立したならば（通常さらに１〜２ 週内）、形質転換実験に使用した。必要に応じて、前に凍結保存した培養体を再 び保存のために凍結することもできる。

Ｅ、外来遺伝子からなるＤＮＡセグメント前述のように、宿主細胞へＤＮＡを運 ぶＤＮＡセグメントを構築する方法には、本技術分野の熟練者にはよく知られた いくつかの方法がある。ここで使用されるベクターの一般的な構築体は、プロモ ーター、他の調整領域、構造遺伝子、および３′末端からなるプラスミドである 。

ｂａｒ遺伝子をコードするＤＮＡセグメントは、レシピエンド細胞中にビアラフ オス抵抗性を導入するために使用されたｐＤＰＧｌ　６５と称するプラスミド中 に構築された（図ＩＡおよびＣ参照）　ｏ　ｂａｒ遺伝子はｓｔｒｅｐｔｏｍｙ ｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕ　ｓからクローン化され（５３）　、プラスミ ドｐｌＪ　４１０１中５５９　ｂｐ　ＳａｍＩフラグメントとして存在する。こ の遺伝子のコード領域の配列は発表されている配列（４５）と同一である。プラ スミドｐＤＰＧ１６５の創製に際して、ｐｌＪ　４１０１からのＳａｍ　Ｉフラ グメントを、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）　３５　Ｓプロモータ ー（Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ。

ＥｎｇｌａｎｄのＲ，Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎによって恵与されたｐＢｌ　２２１． １から誘導）、ポリリンカー、ならびにＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆ ａｃｉｅｎｓからの転写７　（Ｔｒ７）３’末端（Ｃａｌｇｅｎｅ。

Ｉｎｃ、、　Ｄａｖｉｓ、　ＣＡのり、　５ｔａｌｋｅｒからの恵与された３′ 末端）を含むｐＵｃ１９−ベースのベクターにリゲートさせた。

これらの実験には、ＧＵＳをコードするその他のベクター、ｐＤＰＧ２０８を使 用した（図ＩＢおよびＤ）。これはＧＵＳのコード配列およびＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ−ｅｎｓからのｎｏｓ３’末端を含有するｐＡＧ ＵＳ　１　（Ｕｎｉｖｅｒｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｕｔａｈ、　５ａｌｔ　Ｌａｋｅ 　Ｃ１ｔｙ、　ＵＴのＪ、　５ｋｕｚｅｓｋｉによって恵与された）からの２． １　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　／ＥｃｏＲＩ　７ラグメントを用いて構築された。ｐＡ ＧＵＳ　ｌ中では、ＧＵＳの５′非コードおよび５′コ一ド配列は、Ｋｏｚａｋ 　ｃｏｎｓｅｎ−ＳＵＳ配列（２４）の取り込み、ならびにその遺伝子のコード 領域への新たなＨｉｎｄＩ［［制限部位６ｂｐの導入により修飾された（図ＩＥ 参照）　、　ｐＡＧＵｓ　１からの２．１　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ フラグメントは、ｐＵｃ１９ベースのベクターｐｃＥＶ１　（Ｃａｌｇｅｎｅ、 　Ｉｎｓ、、　Ｄａｖｉｓ、　ＣＡから恵与された）の３、６　ｋｂ　ＢａｍＨ Ｉ　／　ＥｃｏＲＩフラグメントにリゲートさせた。

ｐＣＥＶ　１からの３．６　ｋｂ　ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩフラグメントは ｐＵｃ１９およびトウモロコシＡｄｈ　１から最初のイントロンに隣接したカリ フラワーモザイクウィルスの４３０ｂｐ３５Ｓプロモーターを含有する。

本発明に関連して使用されるＲ遺伝子複合体に関して、最も好ましいベクターは 、カリフラワーモザイクウィルスからの３５３プロモーター、トウモロコシＡｄ ｈ　１から最初のイントロン、Ｋｏｚａｋ　ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ配列、Ｓｎ：ｂ ｏｌ　３ｃＤＮＡ、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓからの転写７３′末端を含有する。ｐＤＰＧ２３７　（図ＩＦ参照）の製造の ためには、Ｓｎ：ｂｏｌ３のｃＤＮＡクローンをＳ、　Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ（ ｙａｌｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　ＵＳＡ）から入手した。Ｓｎのゲノムクロ ーンは、ＨｉｎｄＩ［Ｉによる完全消化、ラムダアームへのリゲーション、およ びｉｎ　ｖｉｔｒｏ充填を行ったＳｎ：ｂｏｌ３のゲノムＤＮＡから単離した。

クローン化対立遺伝子、Ｒ−ｎ　ｊおよびＲ−ｓｃ　（５４）の２領域へのブラ ークハイプリダイセーションは、制限消化によって分析した。ｐＳｎ　７．０か らの２ｋｂ　Ｓｓｔ　−ＨｉｎｃＩＩフラグメントは、Ｓｎ：ｂｏｌ３の光照射 胚盤節のＲＮＡからラムダに確立されたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング に使用した。ｃＤＮＡクローンの配列および制限酵素地図が確立された。

このｃＤＮＡクローンは、ｂａｒ発現ベクター、ｐＤＰＧｌ　６５（上記参照） について記載され、３５Ｓカリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ポリリ ンカー、およびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからの転 写７３′末端を含有する同じ植物発現ベクターに挿入した。このプラスミド、ｐ ＰＤＧ２３２はこのｃＤＮＡクローンをポリリンカー領域に挿入して作成した。

ｐＰＤＧ２３２の制限酵素地図は図ＩＧに示す。好ましいベクター、ｐＤＰＧ２ ３７は、ｐＤｐＧ２３２からａｖａｌ　−ＥｃｏＲＩによるｃＤＮＡクローンお よびＴＲ７３’末端の除去およびｐＤＰＧ２０８からのＢａｍＨＩ　／ＥｃｏＲ Ｉフラグメントとのリゲーションにより作成された。

リゲーションは次のようなりａｍＨＩリンカ−ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＴＧ ＧＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＣＧＣＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＡＧＴＴＣＧ ＡＡＧＧＧＣＴの存在下に行われた。

ｐＤＰＧ２３７の最終構築体は、図ＩＦに示すように、カリフラワーモザイクウ ィルス３５Ｓプロモーター、Ａｄｈｌから最初のイントロン、Ｋｏｚａｋ　ｃｏ ｎｓｅｎｓｕｓ配列、ＢａｍＨＩリンカ−１Ｓｎ：ｂｏｌ　３のｃＤＮＡ、およ びＴｒ７　３’末端を含有した。

その他のベクターは標準的な遺伝子操作技術を用いて製造された。たとえば、ｐ ＤＰＧｌ　２８と命名されたベクターはｎｅｏコード配列〔ネオマイシンホスフ ォトランスフェラーゼ（ＡＰＲ（３”）　−１１）　］を包含するように構築さ れた。プラスミドｐＤＰＧ１２８はＣａＭＶからの３５３プロモーター、Ｔｎ５ （６６）からのネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子およびＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃ−ｉｅｎｓからのＴｒ７ターミネーターを 含有する。他のベクター、ｐＤＰＧｌ　５４は、結晶トキシン遺伝子を包含し、 同じく標準的な技術によって製造された。プラスミドｐＤＰＧ１５４は３５Ｓプ ロモーター、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓｖａｒ、　ｋｕｒ ｓｔａｋｉ　ＨＤ　２６３の結晶トキシン蛋白質の全コード領域、およびＴｒ７ 　ｎ５（６６）からのネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ遺伝子およびＡ ｇｒｏｂａｃ−ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓからのＴｒ７プロモータ ーを含有する。

各種の縦列ベクターも製造された。たとえば、ｂａｒ／ａｒｏＡ縦列ベクターは 、変異ＥＰＳＰシンターゼａｒｏＡ発現単位（６４）を含むプラント末端３．２ ｋｂ　ＤＮＡフラグメントを、プラント化し脱リン酸化したＮｄｅ　ｌ切断ｐＤ ＰＧ１６５にリゲーションして作成された（Ｎｄｅ　ｌは、ｂａｒ発現単位のＴ ｒ７　３’末端の約２００ｂｐ下流に唯一の制限切断部位を導入する）。ｂａｒ に対して両方向にａｒｏＡを有する形質転換体か同定された。

７、ＤＮＡを細胞に送達する好ましい方法プロトプラストの単離またはＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｄ　Ｎ　Ａの導入を要求しないＤＮＡ送達系には、マイク ロプロジェクタイルボンバードメント（８，２３）がある。極性トランスジェニ ック植物を産生できる可能性のある数種の標的細胞かある。すなわち、花粉、小 胞子、成長点、および不定胚分化能細胞かわずかな例である。トウモロコシでの 生殖系の形質転換は、これらの種のいずれのボンバードメントによってもこれま で報告されていない。

外来ＤＮＡ構築体を植物細胞に導入する新しく発見された技術の一つにマイクロ プロジェクタイルボンバードメントの使用がある。この技術の詳細および各種植 物細胞への外来ＤＮＡの導入のためのその技術の使用に関してはＫｌｅｉｎ、　 １９８９　、　Ｗａｎｇら、１９８８およびＣｈｒｉｓｔｏｕら、１９８８　（ ２２，５０，８）か論じている。マイクロプロジェクタイルボンバードメントに よる細胞内へのＤＮＡ送達の効率を測定する一つの方法に、ボンバードメントを 受けた細胞中における、酵素、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の一過性発現を 用いる方法がある。この方法では、ＧＵＳ酵素の合成を指図するＤＮＡ構築体で 植物細胞にボンバードメントを行う。

マイクロプロジェクタイルボンバードメントを行う装置も入手できる。市販品に はＢｉｏｌｉｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｓ、（現在はＤＵＰｏｎｔ）製の装置かあるか 、他のマイクロプロジェクタイルおよび加速方法も本発明の範囲に包含される。

もちろん、他の「遺伝子ガン」も細胞中へのＤＮＡの導入に使用できる。

マイクロプロジェクタイルボンバードメント法にいくつかの改良か本発明者らに よって行われた。たとえば、ボンバードメント装置の停止プレートの下部、すな わち、ガンと細胞の間にステンレス鋼のスクリーンを挿入した。

さらに、マイクロプロジェクタイル上にＤＮＡを沈着させるための現在の技術か 、本発明者らによって改良された。

例３：マイクロブロジエクタイルボンバードメントボンバードメントのためには 、もろい、不定胚形成能のあるＩＩ型カルス（１）を、本質的に例１および２に 上述したような未成熱狂から開始させた。カルスは、２ｍｇ／ｌのグリシン、２ ．９　ｇ／ｌのプロリン、１００ｍｇ／ｌのカセイン氷解物、１３．２　ｍｇ／ 　１のデイカンノくまたは１ｍｇ／ｌの２．４−Ｄ、２０ｇ／ｌのスクロースを 含有し、ｐＨを５．８に調整し、２ｇ／ＩのＧｅｌｇｒｏ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｃｈ ｅｍｉｃａｌｓ）で体から開始した懸濁培養体をボンバードメントに使用した。

５Ｃ８２の場合、懸濁培養体５Ｃ８２は３力月培養維持したｌｌｆｆ１カルスか ら開始した。５Ｃ８２細胞（例１参照）は、約４カ月液体培地中で増殖させたの ち、ボンノく一ドメントに付した（表２、実験＃１および＃２参照）。

５Ｃ８２細胞はまた、懸濁培養開始後５力月で凍結させ、５カ月間凍結保存し、 解凍し、ボンバードメントに使用した（実験＃６）。

懸濁培養体５Ｃ７１６の場合には（例２参照）、５力月培養維持したＩＩ型カル スから開始した。５Ｃ７１６細胞は、５力月液体培地中で培養し、８カ月間凍結 保存し、解凍し、２力月後にボンバードメント実験＃４および＃５に使用した。

５Ｃ９４は、ｌＯカ月齢の［ｒ’ｆｌカルスから開始し、ボンバードメント前に ５力月液体培地中で培養した（実験＃３）。

ボンバードメント前に、最近継代した懸濁培養細胞をメツシュ１０００μｍのス テンレス鋼の篩で篩過した。

篩を通過した細胞集塊の分画から、約０．５　ｍｌの充填細胞容量（ＰＣＶ）を ５ｃｍのフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ＃　４　）上にピペットで取り、ブフナー 濾斗て真空濾過した。フィルターを２．５　ｍｌの懸濁培養培地で湿らせた７ｃ ｍのフィルター　（Ｗｈａｔｍａｎ＃　４　）　３枚を含むペトリ皿に移した。

細胞懸濁液か固定化されたフィルターを含む皿を、ナイロンマイクロプロジェク タイルの停止に使用されたレキサンプレートの下部６ｃｍに配置した。ＤＮＡに 関しては、２種以上のプラスミドを用いる場合には、Ｋｌｅｉｎら（１９８７） の記載したプロトコールを改良して、プラスミドＤＮＡを等モル比でタングステ ン粒子（平均直径約１．２　μｍ、　ＧＴＥ　５ｙｌｖａｎｉａ）上に沈殿させ た。改良操作では、タングステンをエタノール中６５°Ｃで１２時間インキュベ ートしたのち、沈殿に使用した。沈殿混合物には、１．２５ｍｇのタングステン 粒子、２５μｇのプラスミドＤＮＡ、１．　Ｉ　ＣａｚＣｌおよび８．７ｍＭス ペルミジンを含有し、総容量５７５μｌとした。上記順序で成分を加えたのちに 、混合物を４°Ｃで１０分間攪拌し、５分間遠心分離しく５００ＸＧ）、上澄液 ５５０μｍを傾瀉した。残った懸濁液２５μｍから１μｍのサンプルをボンバー ドメントのためにマイクロプロジェクタイル上にピペットで加えた。

懸濁細胞の各プレートを２８インチＨｇの真空で２回のボンバードメントを行っ た。Ａ１８８ｘＢ７３およびＡ１８８ＸＢ８４の不定胚分化能のある細胞懸濁液 のボンバードメントを行うには、１００μｍまたは１０００μｍのステンレス鋼 のスクリーンを、焦点の数を増大させ、一方それらのサイズていしプレートのを 低減させ、またボンバードメントを受ける組織の障害を緩和するために、約２． ５　ｃｍ下部に配置した。ボンバードメント後、懸濁細胞と支持フィルターを固 体培地に移すか、または細胞をフィルターから爬き落として液体培養培地に再び 懸濁した。

トウモロコシの不定胚分化能がある細胞の懸濁培養液を、ｂａｒ含有プラスミド 、ｐＤＰＧｌ　６５単独、またはＧＵＳをコードするプラスミド、ｐＤＰＧ２０ ８　（図１）と組合わせてボンバードメントに付した。ＧＵＳプラスミドが含ま れている実験では、ボンバードメントを受けた細胞を含む２枚のフィルターを、 ボンバードメント４８時間後に組織学的に染色した。フィルター当たりの一過性 にＧＵＳを発現する焦点（細胞の集塊）の数は少なくとも１０００であった。一 過性発現細胞を定量するために設計された２つの別の研究Ｃ３Ｃ２８（Ａ１８８ ＸＢ７３）懸濁培養体を使用〕においては、フィルター当たりのＧＵＳ染色焦点 の平均数および標準偏差は１４７２±２１１および２９３０±（それぞれｎ＝３ および４）であった。ＧＵＳを発現した各焦点中の細胞数は平均して２〜３（１ 〜ＩＯの範囲）であった。ＧＵＳをコードする遺伝子で形質転換された細胞の検 出には組織学的染色を使用することができるが、これらの細胞は染色後にはもは や増殖せず、分裂しない。安定な形質転換体を検出し、さらに、それをたとえば 植物にまで成育させるためには、生存能を損なわない選択系が要求される。

Ｇ、形質転換細胞の同定方法 いずれの実験でも、わずかなパーセントの細胞のみにＤＮＡが挿入されるものと 考えられる。したがって、ＤＮＡを受容し、それがそれらのゲノムに統合された 細胞を同定するための、より効率的な系を得るために、安定に形質転換された細 胞の選択手段の利用が望まれる。

このような方法の一実施態様例には、宿主細胞に、ある種の試剤、たとえば抗生 物質または除草剤に対する抵抗性を付与するマーカー遺伝子を導入する方法があ る。すなわち、形質転換された可能性がある細胞をその試剤に暴露する。生存細 胞の集団では、一般的に、細胞には抵抗性を付与する遺伝子が挿入され、生存に 十分なレベルで発現している。細胞はさらに、外来ＤＮＡの安定な挿入を確認す るために試験できる。不定胚分化能のある懸濁培養体を用いた場合、安定な形質 転換体は、一過性発現焦点１０００当たり約１の頻度で回収される。この操作の 特定の実施態様は例５に示す。

穀類、たとえばトウモロコシの形質転換における困難性の一つは、全能性培養体 からの形質転換細胞の効率的な選択剤がないことである（３６）。安定な形質転 換体はボンバードメントを受けた不定胚分化能をもたないブラックメキシカンス イート（ＢＭＳ）　トウモロコシ懸濁培養細胞から、ｎｅｏ遺伝子とアミノグリ コシド、カナマイシンでの選択を用いて、回収された（２２）。このアプローチ は多くの単子葉植物が高濃度のアミノグリコシドに非感受性であることから、限 界がある（１２゜１９）。形質転換体を同定する選択剤としてのアミノグリコシ ドの使用に成功するには、細胞増殖の段階、暴露時間、および抗生物質の濃度が 決定的な因子となる（２６，５１．５２）。さらに、不定胚分化能をもつトウモ ロコシ培養体からの安定な形質転換体の選択におけるアミノグリコシド、カナマ イシンまたはＧ４１８の使用は、本発明者らの経験によれば、ｎｅｏ遺伝子を含 まない抵抗性カルスの単離を生じることか多い。

抵抗性の検討て示唆が得られた除草剤の一つはスペクトルの広い除草剤、ビアラ フオスである。ビアラフオスは、ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏ ｐｉｃｕｓによって産生されるトリペプチド抗生物質であり、ホスフィノトリシ ン（ＰＰＴ）、Ｌ−グルタミン酸の類縁体および２個のＬ−アラニン残基からな る。細胞内ペプチダーゼによってアラニン残基が除去されると、ＰＰＴが遊離し 、これは、アンモニア同化および窒素代謝に関与する重要な酵素であるグルタミ ンシンテターゼ（ＧＳ）の強力な阻害剤である（３３）。ＰＰＴによる植物中の ＧＳの阻害は、アンモニアの急速な蓄積を生じ、植物細胞の死を招く。

ビアラフオスを産生ずる生物体は、ｂａｒ遺伝子によってコードされる酵素、ホ スフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＦＡＴ）も合成する。ホスフィ ノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＦＡＴ）をコードする除草剤抵抗性遺 伝子の使用は、この遺伝子をＳｔｒｅｐｔｏ−ｍｙＣｅＳ　ｖｉｒｉｄｏｃｈｒ ｏｍｏｇｅｎｅｓから単離したＤＥ３６４２８２９Ａに記載されている。この酵 素は、ＰＰＴの遊離アミノ基をアセチル化し自家中毒を防止する（４５）。

ｂａｒ遺伝子はクローン化され（２９，４５）、）ランスジェニックなタバコ、 トマトおよびジャガイモ（１０）、ならびにＢｒａｓｓｉｃａ　（１１）に発現 している。以前の報告では、この抵抗性遺伝子を発現したトランスジェニック植 物が、温室で、市販のＰＰＴおよびビアラフオスに対して完全な抵抗性を示した とある。

ＰＣＴ出願Ｗ○８７１００１４１には、グルタミンシンテターゼ阻害剤の作用に 対する植物細胞および植物の保護方法の利用に関するものである。この出願には また、これの、所定の植物に除草剤抵抗性を発生させる方法への利用が記載され ている。除草剤Ｂ　Ａ　Ｓ　Ｔ　Ａ　（Ｈｏｅｃｈｓｔ、ホスフィノトリシン） またはＨｅｒｂｉａｃｅ（Ｍｅｉｊｉ　５ｅｉｋａ、ビアラフオス）に対する抵 抗性をコードする遺伝子は、アグロバクテリウム関せんによってタバコ（Ｎｉｃ ｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ　Ｐｅｔｉｔ　Ｈａｖｅｎ　５ＲＩ）　、ジ ャガイモ（ＳｏｌａｎｕｍＴｕｂｅｒｓｕｍ　ｃｖ　Ｂｅｎｏｌｉｍａ）　、お よびトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓ　ｉ−ｃｕｍ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）に導入さ れ、除草剤の適用に対する植物抵抗性が付与されたという。

ＤＮＡを植物宿主細胞に送達できるベクターの実施態様の例には、プラスミドｐ ＤＰＧＩ　６５がある。このプラスミドは、図ＩＡおよびＩｃに例示されている 。遺伝子形質転換の目的でこのプラスミドの最も重要な成分は、形質転換細胞の 選択マーカーとして働＜　ｂａｒ遺伝子である。

例４：ビアラフォスを用いるｂａｒ形質転換体の選択最初の実験（例３参照）に 用いた懸濁培養体（Ｓ０８２と命名）は、Ａ１８８Ｘｂ７の不定胚分化能のある ［［型カルスから誘導された。ホンバードメント後（例３参照）、フィルター上 の細胞を非選択的液体培地に再懸濁し、１〜２週間培養し、１〜３ｍｇ／ｌのビ アラフオスを含む固体培地上に載せたフィルターに移送した。選択時の組織生育 の阻害程度は、フィルター上の細胞密度および使用ビアラフオスの濃度に依存し た。プレートした密度（ｏ、５　ＰＣＶ、／：ｙイル９−）　ては、１　ｍｇ／ 　１　（７）ビアラフオス上で培養される細胞の増殖は、部分阻害（非選択的増 殖の約３０〜５０％）を受けたのみで、この組織の多くは３〜４週後、不連続な 凝集（直径約５　ｍｍ）として同一の培地に移送された。３ｍｇ／ｌのビアラフ オスを含む培地では、最初の選択フィルター上で、細胞の増殖は著しく阻害され 、（非選択的増殖の約１０％）、最初のフィルターから組織を移送しないでも選 択は実施できた。

いずれの選択プロトコールによっても（ｌまたは３ｍｇ／ｌビアラフオス）、ｐ ＤＰＧｌ　６５をもつ、ボンバードメントを受けた５Ｃ８２の選択プレート上に は、ボンバードメント後約６〜７週で、抵抗性コロニーか発生した（ＩＮ２Ａ） 。ビアラフオス抵抗性カルスは、選択培地上でも維持され、増殖した。この組織 の多くは不定胚分化能を示した（図２Ｂ）。形質転換を試みなかった懸濁培養体 からの細胞を添加したプレート上にはコロニーの生育は起こらなかった。これら は、ｂａｒ遺伝子かない細胞はビアラフオス抵抗性ではないという予想を確認す る対照である。

固体支持体のコロニーは、この支持体上にプレートした細胞の増殖および分裂に よって形成される可視細胞群である。コロニーは図２Ａのベトリ皿上に認めるこ とができる。この図では、増殖できる細胞は、除草剤ビアラフオスに対して抵抗 性の細胞で、この抵抗性は、ｂａｒ遺伝子の挿入および発現によって生じる。図 ２Ｂは、選択培地上に維持されたビアラフオス抵抗性培養体の形態を示し、増殖 は不定胚分化能力かあることを示している。

図２に示したコロニー形成細胞に、実際にｂａｒ遺伝子が導入されていたことの 確認として、ビアラフオス抵抗性カルス系統のｂａｒ遺伝子生成物、ホスフィノ トリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＦＡＴ）活性について、薄層クロマトグ ラフィーにより分析した。５Ｃ２８ボンバードメント実験から単離された１１の カルス系統（Ｅｌ〜１１）からの蛋白抽出物は、図３から明らかなようにＦＡＴ 活性を包含し、この活性レベルは各単離体間で約１０倍の変動があった。

ｂａｒ遺伝子の存在の、別のさらに直接的な確認か、可能性のある形質転換体の ゲノムＤＮＡのゲルＤＮＡプロットによる分析で得られた（図４）。ゲルを電気 泳動させたＤＮＡのソースは、Ｅｌ〜１１と命名したビアラフオス抵抗性カルス 系統および非選択対照、ＥＯである（図Ｉはｂａｒ遺伝子プラスミド内の酵素切 断部位を示すす）。ＤＮＡかゲルを通して電気泳動され、ナイロン膜に移送され たのち、得られたプロットをプラスミドｐＤＰＧ１６５からの２２ｐ標識ｂａｒ 遺伝子配列と、ハイブリダイゼーションさせた。プロット当たり使用した放射能 は約２５　Ｘ　１０　＠Ｃｅｒｎｋｏｖｃｐｍであった。「１」および「５」コ ピーと指示された図４のレーンは、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ［酵素の適用 によりプラスミドｐＤＰＧ１６５から放出される１、　９　ｋｂ　ｂａｒ発現単 位それぞれ１．９および９．５ｐｇを含む。これらの量は二倍体ゲノム当たり約 １および５コピーに相当する。

１１種のビアラフオス抵抗性単離体すべてからのゲノムＤＮＡが、図４に示すよ うにｂａｒハイブリダイズ配列を含有した。すべての単離体における２ｋｂより もわずかに大きい移動を示すフラグメントへのハイブリダイゼーションは、この ｂａｒブローブブレパレーションに含まれたｐＵｃ　１９の夾雑によるものであ ろう。同じゲノムＤＮＡと異なるｂａｒブローブブレバレーションを用いた以後 の実験では、このようなハイブリダイゼーシヨンは起こらなかった。１１の単離 体中８個での１．９　ｋｂフラグメントへのハイブリダイゼーションは、これら の単離体か１９ｋｂｂａｒ発現単位の完全なコピーを含むことを指示している。

完全単位の推定コピー数は、１または２（Ｅｌ、Ｅ７．Ｅ８．ＥＩＯ，Ｅｌｌ） から約２０（Ｅ３．Ｅ４．Ｅ６）までの範囲であった。単離体Ｅ２およびＥ５に おけるｂａｒプローブとのハイブリダイゼーションは１個の高分子量フラグメン ト（約３　ｋｂ）にのみ起こった。

ＦＡＴコード配列が単離体Ｅ２およびＥ５において完全であったことを確立する ため、ゲノムＤＮＡを、ＦＡＴ構造遺伝子（図ＩＡ）を含む５５９ｂｐフラグメ ントを放出するＳｍａ　Ｉ消化に付し、２２ｐ標識ｂａｒを用いてＤＮＡゲルプ ロット分析を実施した。この分析で、ｂａｒの単一の完全なコピーの存在が確認 された。これらの単離体におけるＰＡＴの発現は、３５ＳプロモーターまたはＴ ｒ７　３’末端には依存しないのかもしれない。一部の単離体のハイブリダイゼ ーションパートナ−は同一であった（Ｅ２およびＥ５　；Ｅ７およびＥ８；Ｅ３ ．Ｅ４およびＥ６）。したがって、一部の単離体は独立の形質転換によって生じ たものではなく、選択時に分離した形質転換体を示す可能性がある。

７種のハイブリダイゼーションパターンは独特で、７個の独立した単一細胞の形 質転換が起こったことを示すものと思われる。７つの形質転換体のハイブリダイ ゼーションパターンおよび強度は４か月の培養の間に変化せず、挿入された配列 の安定性が明らかである。７つの独立した形質転換体は２つの別個のボンバード メント実験から誘導されたものである。４つの独立した形質転換体は、単離体Ｅ ２／Ｅ５．Ｅ３／Ｅ４／Ｅ５．ＥｌおよびＥ　７／Ｅ　８てあり、ボンバードメ ント実験＃１の計４個の最初のフィルターから回収され、３つの別の独立した形 質転換体、Ｒ９，ＥＩＯ，Ｅｌｌは、実験＃２においてボンバードメントを受け た６枚のフィルターに由来する組織から選択されたものである。これらのデータ は表２にまとめる。

他の不定胚分化能のある懸濁培養体についての検討ても類似の結果が得られた。

凍結保存細胞から再開始した５Ｃ８２培養体（実験＃６）またはＡ１８８ＸＢ８ ４（ＳＣ９４）懸濁培養体いずれを用いても、多数の独立した形質転換体か回収 された（それぞれ１９およびＩ８、表２）。すへての形質転換体がｂａｒ遺伝子 を含有し、ＦＡＴを発現した。ｂａｒハイブリダイズ配列のコピー数およびＦＡ Ｔ発現のレベルは、上述の研究の場合に匹敵するものであった。

例５・５Ｃ７１６懸濁培養から誘導された細胞系へのｂａｒ遺伝子の挿入 ５Ｃ７１，６と命名したＡ１８８ｘＢ７３懸濁培養体について（例１参照）も、 ボンバードメント研究およびその後の分析を実施した。得られた形質転換植物に ついて、ｂａｒ遺伝子の挿入を分析した。この分析の実施にあたっては、ゲノム ＤＮＡをＲ１〜Ｒ２１単離体から取得し、ＤＮＡ６μｇを制限エンドヌクレアー ゼＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩ［［で消化し、ｂａｒ遺伝子をプローブとして使 用してＤＮＡゲルプロット分析を実施した。図９には、分子量をｋｂて左右に示 す。非形質転換対照はｒＲＯＪ　と命名し、右方へ最後のカラムは、二倍体ゲノ ムあたりｂａｒ遺伝子発現単位の２コピー相当量を含有する。使用したＤＮＡロ ードについては、二倍体ゲノムあたり２コピーのｂａｒ発現単位がプラスミドｐ ＤＰＧ１６５からの１．９　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄフラグメント５．７１ ）ｇである。ゲルプロットで分離されたＤＮＡを３２ｐ−標識ｂａｒプローブに ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションにおける標識活性は約１０　ｘ 　１０　’　Ｃｅｒｅｎｋｏｖ　ｃｐｍてあった。Ａでは１完全なりａｒ発現単 位の存在が、ゲル中での１．９　ｋｂバンドへのｂａｒプローブのハイブリダイ ゼーションから推察される。

例６：ＧＵＳの挿入と発現の検定 例５て述べた５Ｃ７１６形質転換体への、ＧＵＳコード遺伝子の挿入およびその 発現をさらに分析した。組織化学的検定によって測定されたように、４種の５Ｃ ７１６形質転換体（Ｒ５，Ｒ７，Ｒ１６，およびＲ２１）は、ボンバードメント ３カ月後にも検知可能なＧＵＳ活性を示した。４種の共発現カルス系統で観察さ れた発現パターンは異なっている。与えられた形質転換体をサンプリングした範 囲でのＧＵＳ活性をもつ細胞数は約５％から約９０％に及び、さらにこれらの細 胞内でのＧＵＳ活性のレベルも変換した。ｂａｒとハイブリダイズしたゲノムプ ロット（図９Ａ）を洗浄し、図９Ｂに示すように３２Ｐ標識ＧＵＳ配列でブロー ビングして、共挿入頻度をめた。ｐＤＰＧｌ　６５からｂａｒ発現単位を切り出 すＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ［は、ｐＤＰＧ２０８からも、ＧＵＳコード配 列およびｎｏｓ３’末端を含有する２、１ｋｂフラグメントを遊離させた。

独立したｂａｒ形質転換体の１７個はＧＵＳプローブにハイブリダイズする配列 を含有したが、３個の、Ｒ２゜Ｒ１４およびＲ１９にはその配列は含まれていな かった。

ＧＵＳ活性か検出された形質転換体（Ｒ５，Ｒ７゜Ｒ１６およびＲ２１）は、Ｇ ＵＳ構造遺伝子（図９Ｂ）を含有する２、１ｋｂ　ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ フラグメントの完全なコピーをもっていた。ｂａｒにハイブリダイズする多数の フラグメントを含有する形質転換体（Ｒ１，Ｒ５゜Ｒ２１）は、同じく、ＧＵＳ をコードする遺伝子にハイブリダイズする、匹敵する数のフラグメントも含んて いた（図９ＡおよびＢ）。この観察は、Ａ１８８ＸＢＭＳプロトプラストのＰＥ Ｇ仲介形質転換（Ｌｙｚｎｉｋら、１９８９）および８ＭＳ懸濁細胞の本発明者 らによって行われたボンバードメント仲介形質転換において、独立のプラスミド を用いて報告している結果と一致する。

Ｈ０共形質転換 共形質転換はマーカーおよび他の興味ある遺伝子または遺伝子群を含むベクター を用いて達成できる。別法として、異なるベクターたとえばプラスミドに興味あ る異なる遺伝子を含有させ、プラスミドをレシピエンド細胞に同時に送達させる ことかてきる。この方法を用いれば、マーカーか導入させた細胞の何パーセント かは、他の興味ある遺伝子も受容することか考えられる。以下の例から明らかな ように、マーカーによって選択された細胞のすへててはないか、細胞に同時に提 供された他の興味ある遺伝子を発現する細胞かある。たとえば、例７ては、独立 の形質転換体２０巾１７に可動な共形質転換が起こり（表２参照）、共発現は２ ０中４に認められた。一部の形質転換体では、形質転換細胞間の発現に変動が認 められた。

例７：５Ｃ８２懸濁培養から誘導された細胞系へのｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ遺 伝子の共挿入および共発現別個のプラスミドで形質転換した凍結保存５Ｃ８２細 胞を（ＳＣ７１６について記載したように）再開始して選択したビアラフオス抵 抗性単離体中、この実験では（実験４６２表２）１９個の独立の形質転換体が選 択された。これらの単離体における共挿入および共発現の頻度は５Ｃ７１６単離 体について述べた結果（表２）と類似していた。これらの形質転換体におけるＧ ＵＳ染色パターンは５Ｃ７１６形質転換体の共発現について述へた結果と同様に 変動した。完全なＧＵＳコート配列を含有した形質転換体、Ｙ１３は、図８に示 すように様々なレベルに変動するＧＵＳ活性を示した。この種類の発現パターン は共形質転換した８ＭＳ細胞についても以前に報告されている。単一の形質転換 体からの細胞において検出される活性が変動するのは、ＧＵＳ基質の不等な侵入 、差別発現、メチル化、または一部の細胞での遺伝子の不存在によるものであろ う。

これらの結果は、ｂａｒ遺伝子およびＧＵＳ遺伝子を含有する２種類のプラスミ ドでホンバードメントを行って細胞の一部には、これらの両遺伝子が存在するこ とを示している。共形質転換が起こったのである。ここに記載だ共形質転換例は 表２にまとめる。非選択遺伝子の共形質転換頻度は７７％、共発現頻度は１８％ であった。

■、形質転換細胞からの植物の再分化 農業に利用するためには、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける細胞の形質転換は、これら の新しい方法の商業的利用に向けての一歩にすぎない。植物を形質転換細胞から 再分化しなければならない。そして、再分化植物は、野外で作物を実らせること かできる完全な植物に発育しなければならない。この目的では、極性のある植物 が要求される。ここに開示される本発明は、形質転換細胞から、極性のあるトウ モロコシ植物の産生にはじめて成功した（図１１Ａ参照）。

一つの効率的な再分化系には、０．２５　ｍｇ／　Ｉの２，４−ジクロロフェノ キシ酢酸およびｌ　Ｏ，Ｏｍｇ／　ｌの６−ペンソルーアミノブリンを含有する ＭＳ　（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　＆Ｓｋｏｏｇ、　ｌ　９６２　）培地への、不定 胚分化能かあるカルスの移送か包含される。組織はこの培地に約２週間維持し、 ついてホルモンを含まないＭＳ培地に移す（Ｓｈｉｌ］　ｉｔｏら、１９８９） 。ホルモンを含まない培地上で２〜４週後に発生する苗条は、１％スクロースを 含有ＭＳ培地をＰｌａｎｔ　Ｃｏｎ”容器中２ｇ／ｌのＧｅｌｇｒｏ”で固化し た培地に移した。ここで発根が生じた。

他の可動な再分化計画では、不定胚分化能のあるカルスを、６％スクロースを含 有し、ホルモンを含まないＮ６（Ｃｈｕら、１９７５）培地に移しくＡｒｍｓｔ ｒｏｎｇ　＆Ｇｒｅｅｎ、１９８５）、２週間後に、上述のようにホルモンを含 まないＭＳ培地に移す。再分化は蛍光（２５０マイクロアインシユタイン・ｍ− ２・５−１）下、２５°Ｃで実施した。約２週後に、発生した小植物を土壌に移 し、生育チャンバー（８５％相対湿度、６００　ｐｐｍ　ＣＯ２，２５０マイク ロアインシユタイン・ｍ−２・５−１）でハードニングを行い、生育室または温 室のいずれかで成熟にまで成長させた。

形質転換細胞からの植物の再分化には、組織培養技術の詳細に対する注意深い配 慮か必要である。主要な因子の一つは、組織培養培地の選択である。懸濁培養に おける植物細胞の成育を支持する培地は多いが、ある培地は他の培地に比へて、 異なる発生段階において良好な成長をもたらす。しかも、異なる細胞系は、特定 の培地に対して異なる反応を示す。さらに複雑なことに、形質転換を経てカルス から開始された細胞、そして最終的には植物として温室に至るまでの処置には、 変数のきわめて多いアプローチが必要になる。多様な種類の培地の一連の使用、 異なる培地の順序立てた使用が、それぞれの細胞系から生じた形質転換植物のプ ロポーションを至適にするために必要である。表３には、発生の異なる段階にお ける細胞への、組織培養培地の組合わせの順序立った適用を例示する。可動な進 歩は再分化された植物の総数によって確認される。

同じ培地群を使用しても、細胞系によって成功率（植物数）の変動することか明 らかである。総成功率にも変動がある。系ＡＯＩ−１５で、全体として最大数の 植物か産生じている（しかしなから、組織は限られているので、すべての系に対 して培地のすべての組合わせか使われているわけてはないので、全体の比較には 限界かある）。

一般的に、少なくとも最初に、細胞系に使用する好ましい実施態様は、再分化培 地連鎖の第２のカラムに示した組合わせ（培地２２７，１７１，１０１，５０１ ）である。培地２２７は、実験の選択部分、たとえばカルスをビアラフオスの存 在下で増殖させる場合に使用して、優れた培地である。この培地はホルモン、デ ィカンバを金回する。他の培地では、ＮＡＡおよび２．４−Ｄかホルモンである 。液体培地中では、これらは、通常、制御放出のためにカプセル中に封入されて いる（以下の例１２参照）。

すなわち、表１から明らかなように、各種の培地か、形質転換過程の様々な段階 での植物の発生にとくに適用てきるように改良されている。たとえば、選択剤の 適用後に培地１７１中で細胞を継代培養すると、きわめて小さな胚が生成する。

さらに、培地中にＢＡＰが存在すると、根の発生か促進されると考えられている 。ミオイノシトールは細胞壁の合成に有用と考えられる。培地１０１に移すと、 苗条の延長および根の発生か進行する。

１０１および１０５には、再分化の初期段階に要求されるホルモンは含まれてい ない。

再分化植物の移送は、Ｃ１ａｒｋ　（１９８２，参考文献６）によって開発され た栄養溶液から適合させた寒天固化培地、培地５０１中て完結させるのか好まし い。この培地の組成は、植物としての最後の成育のために温室に移すことかでき るように、成育中の植物のハードニングを促進する。この培地の塩濃度は、初期 段階に用いられる３種類の培地の場合とは著しく異なっているが、これは植物に それ自身の代謝経路が発生するようにしたものである。独立した成長へ向けての これらの工程は、植物か組織培養容器（たとえばペトリ皿、植物用の筒）から温 室へ移送する前に必要である。

初期の５Ｃ８２および５Ｃ７１６の実験から誘導された形質転換カルス系統の約 ５０％が試験した経路で再分化可能である。７つの独立の５Ｃ８２形質転換体か ら４つ、２０の独立の５Ｃ７１６形質転換体から１０が、トランスジェニック植 物に再分化した。

５Ｃ７１６の１３の独立した形質転換細胞系および２つの対照系を追跡した。１ ３中１０の形質転換体が再分化に成功した。計４５８の小植物が再分化したが、 時間的、空間的拘束から、２１９の形質転換植物か（再分化体の総数の約４８％ ）、ソイルレスミックス（下記参照）に移された。約１８５の植物が生存し得た 。１２種類の再分化プロトコールについて検討し、各経路で再分化した植物数の 量的評価を行った（表３）。培地１７１または１７３に移す前に、２０１，５２ ，１６３または２０５（培地の記号については表１参照）上で組織を成熟させる ことには有意義な利点はないように思われた。

大多数の植物は、不定胚分化能のあるカルスを２２７から直接１７１または１７ ３に継代培養することによって発生した。これらの小植物は外因性補助剤を添加 しないでも、発根し、ついで小植物は、５Ｃ８２から再分化した形質転換体の多 くに必要であったことから、ソイルレスミックスに移した。

使用したソイルレスミックスには、Ｐｒｏ　Ｍｉｘ、　Ｍｉｃｒｏ−ｍａｘ、　 Ｏｓｍｏｃｏｔｅ　１４−１４−１４およびｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅがある。Ｐ ｒｏ　Ｍｉｘは市販の製品で、肥沃度と多孔性の増大に、また混合物の重量を軽 くするのに使用される。これは混合物に嵩をもたせる材料である。Ｏｓｍｏｃｏ ｔｅは他の市販製品で、窒素−リン−カリの比率が１４：１４：１４の徐放性の 肥料である。

Ｍｉｃｒｏｍａｘは別の市販肥料で、すべての必須微量栄養素を含んでいる。フ ィルミックスの調製には、Ｐｒｏ　Ｍｉｘ　３ベール（３ｆｔ”）　、ｖｅｒｍ ｉｃｕｌｉｔｅ　１０ガロン（容量）、ｏｓｍｏｃｏｔｅ　７ポンド、Ｍｉｃｒ ｏｍａｘ４６　ｍｌの割合で使用した。

フィルミックスには、初期の実生および植物生育時の欠乏症の可能性を低減させ るために、可溶性の鉄を１回または２回、補給した場合もある。

形質転換５Ｃ８２の選択された細胞系の再分化では、°７６の植物が生成してフ ィルミックスに移され、７３が生存した。植物は６つのビアラフオス抵抗性単離 体か再分化され、クローン的に独立の７つの形質転換の４つであった。１８種類 のプロトコールで７６の植物の再分化に成功した（表４）。細胞系の闇での形態 の差は、プロトコールよる再分化への適否か考えられる。

再分化の前に、カルスはａ）デイカンバもしくは２゜４−Ｄを含有するＮ６ヘー ス培地、またはｂ）２．４−Ｄ含有ＭＳヘース培地に、移した。これらの工程は 、成熟に先立って、さらに胚様体を発育させたものである。

高レベルの（５〜１０ｍｇ／１）ＢＡＰを含む成熟培地の大部分は苗条の発生を 促進し、増殖を生じた。５ｈｉｌｌｉｔ。

ら、工９８９によって報告されているように、低２，４−Ｄ　（０，２５ｍｇ／ 　ｌ　）および高ＢＡＰ　（１０ｍｇ／ｌ）のＭＳベース培地は、再分化にきわ めて効果的なことがわ同様に、１ａｍ　ＮＡＡ、１μｍ　ＩＡＡ、２μｍ２−Ｉ Ｐおよび５ｍｇ／Ｉ　ＢＡＰを含有するＭＳベースの培地（ＣｏＢａｒら、１９ ８７の改良）は、これらの形質転換体の植物への再分化を促進した。何れの再分 化プロトコールによっても、回収された小植物が５ｃｍに成長したのちは、Ｇｅ ｌｇｒｏで固化したＣ１ａｒｋ、　１９８２の栄養溶液に移した。発根の遅い植 物は、苗条の基部を０．３％ＩＢＡ　３μｍの小滴で処置し、発根を刺激した。

よく発達した根糸をもつ植物はソイルレスミックスに移して、制御された環境の チャンバー内で成育させたのち、温室に移した。

Ｊ、Ｒｏ　Ｒ，植物における外米ＤＮＡの挿入とＤＮＡ発現の検定 トランジェニックＲ０およびＲ３植物における形質転換遺伝子の発現を検討する 研究を行った。５Ｃ８２ＲＯおよびＲ１植物の葉にＰＰＴを含む市販除草剤処方 を局所適用して、ＦＡＴの機能的活性を評価した。ＦＡＴの高レベル（Ｅ２／Ｅ ５）または低レベル（Ｅ３／Ｅ４）を含有するＲ６植物の葉では壊死は認められ なかった。

除草剤処理したＥ　３／Ｅ　４／Ｅ　６および対照の葉を１ＯＡに示す。除草剤 は、ｂａｒて分離したＥ　２／Ｅ　５子孫の葉にも適用した。図１０Ｂに示すよ うに、ｂａｒを発現するＲ１植物の葉では除草剤の適用６日後、壊死は認められ なかったが、ｂａｒをもたないＲ１植物では壊死損傷が発現した。適用後３０日 まで形質転換された葉には壊死は観察されなかった。

４つの再分化能のある形質転換５Ｃ８２カルス、それぞれからの２１のＲ０ｗＬ 物について、ｂａｒ遺伝子生成物ＦＡＴの発現を、薄層クロマトグラフィーによ って分析した。植物の葉からの蛋白抽出物について試験した。各カルス系から再 分化された１つの植物についてのＦＡＴ活性を図５に示す。

試験した２Ｉの植物のすべてがＦＡＴ活性をもっていた。さらに、活性レベルは 植物がそれから再分化されたカルス系でのレベルに匹敵するものであった。非形 質転換植物はＦＡＴ活性を示さなかった（ＦＡＴクロマトグラムからのオートラ ジオグラフには、アセチル化ＰＰＴの期待される位置にバンドは見当らない）。

植物の葉からの蛋白抽出液を含むレーンにはないバンドがＥＭＳのレーンに認め られるが、これはアーティファクトによるものと考えられる。

遺伝子か細胞に送達され、挿入されたことを確認するための他の方法として、ゲ ノム（染色体）ＤＮＡを、非形質転換植物、４つの不定胚再分化能のあるカルス 系統、および各カルス系統由来の２つのＲ８植物から単離した。

図６は、４つの形質転換カルス（Ｃ）およびそれらから誘導されたＲ０植物から のゲノムＤＮＡのゲルプロット分析の結果を例示するものである。形質転換カル ス、および形質転換カルスから再分化したＲ６植物のすへてがｂａｒプローブに ハイブリダイズする配列を含有し、ｂａｒに相補性のＤＮＡ配列の存在が指示さ れる。さらに、金側で、植物ＤＮＡに認められたハイブリダイゼーションパター ンは、相当するカルスＤＮＡのハイブリダイゼーション像と、パターンおよび強 度で同一であった。

Ｅ　３／Ｅ　４／Ｅ　６カルスおよび所望のＲ０植物からのＤＮＡは、１．９　 ｋｂ　ｂａｒ発現単位（カリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター−ｂ ａｒ−アグロバクテリウム転写７３′末端）の完全なコピー約２０個、ならびに 多数の他のｂａｒ−ハイブリダイズフラグメントを含有していた。Ｅｌｌカルス および植物ＤＮＡは、完全発現単位１〜２コピー、および他の不完全なハイブリ ダイズフラグメント５〜６個を含んでいた。ＥＩＯカルスおよび植物は完全なり ａｒ発現単位１〜２コピーを含有した。

Ｅ２／Ｅ５　ＤＮＡは、プローブにハイブリダイズする約３ｋｂの単一のフラグ メントを含有した。すへての植物で観察されたハイブリダイズ配列か染色体ＤＮ Ａに挿入されていることを確認するため、それぞれの独立の形質転換体から誘導 された１つの植物について非消化ゲノムＤＮＡをＤＮＡゲルプロットハイブリダ イゼーションによって分析した。ｂａｒに対するハイブリダイゼーションは高分 子量ＤＮＡにのみ観察され、ｂａｒかトウモロコシゲノム中に挿入されているこ との証拠である。

植物を図８に示す共発現カルス系、Ｙ１３から再分化させた。Ｙ１３（実験＃６ ２表２）から再分化した植物についてＧＵＳ活性を検定し、１つの植物からの葉 の組織化学的染色を図１０Ｃ，Ｄ、Ｅに示す。表皮、ガード、葉肉および維管束 鞘を含む多くの種類の細胞かＧＵＳ活性に対して陽性の染色を示した。染色強度 は維管束で最も高かった。試験した再分化植物からのすべての葉のサンプル（５ １５）が非選択遺伝子を発現し、非発現葉セクターも観察された。Ｙ１３および ３つの対照植物からの葉組織抽出物については蛍光法で（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　 。

１９８７）、ＧＵＳ活性も検定した。試験した３つのＹ１３植物それぞれからの ２つの相対する葉で検出された活性は、対照の葉の少なくとも１００倍高かった 。

例８：アッセイの一般法 ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＦＡＴ）活性の存在を検出す る方法は、薄層クロマトグラフィー法を用いた。

このような検出の一例か図５に示されており、図５には、潜在的に形質転換され た細胞のホモジエネート及び形質転換されておらずピアラフオス選択にもさらさ れていないコントロール細胞から調製された各種蛋白抽出物について、ＰＰＴ及 び１４０−アセチルコエンザイムＡとのインキュベーションによるアッセイが示 されている。

−レーン当り、２５μｇの蛋白抽出物か負荷されている。

レーンＥｌ−Ｅ１１のソースは５Ｃ８２形質転換体であり、Ｂ１３はＢＭＳ　（ ブラックメキシカンスウィートコーン非胚形成性）　ｂａｒ形質転換体である。

ＥＯは非選択且つ非形質転換コントロールである。

矢印で示した位置から判るように（”Ｃ−Ｎ−ＡｃＰＰＴの移動か期待される位 置）、非形質転換コントロールを除く全てのレーンは、適当な移動性を持って活 性を持っていた。形質転換体での活性の変動は、バンドの相対強度による測定で は、約１０倍であった。このアッセイの結果から、ＦＡＴをコードするｂａｒ遺 伝子の発現が確認された。植物組織中のＦＡＴ活性の分析については、葉組織１ ００−２００ｍｇを焼結したガラスホモジナイザーで抽出し、前述したようにし てアッセイを行った。

ＧＵＳ活性は、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルグルクロニドを用いた 方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ、　１９８７　）により組織化学的に評価した。基質 添加１８−２４ｈ後にブルー細胞について組織のスコアー付けを行った。４−メ チルウンベリフェリルグルクロニドを用いた方法（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　１９８ ７）により、蛍光分析を実施した。

以下のようにして、ＤＮＡゲルプロット分析を実施した。

５ｈｕｒｅ　ｅｔ、　ａｌ、　、１９８３の変法を用いて、ゲノムＤＮＡを単離 した。モーター及び乳棒を用いてＮ２液中で、約１ｇのカルス組織を微細な粉末 にした。粉末化した組織を抽出バッフ’ｙ　（７，０Ｍ尿素、０．３５　Ｍ　Ｎ ａＣ１，０、０５Ｍ　Ｔｒｊｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，０，０１Ｍ　ＥＤＴＡ、 １％ザルコシン）’４ｍｌと十分に混合した。組織／バッファーホモジェネート を、４ｍｌフェノール／クロロホルムで抽出した。水層を遠心分離し、Ｍｉｒａ ｃｌｏｔｈに通し、４．４Ｍアンモニウムアセテート（ｐＨ５，２）の１／Ｉ　 Ｏ容量及び等量のイソプロパツールを用いて２回沈澱させた。沈澱物を７０％エ タノールで洗浄し、２００−５００μＩＴ　Ｅ　（０，０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＭＣ Ｉ、０．ＯＩＭ　ＥＤＴＡ。

ｐＨ８，０’Ｉに再懸濁させた。植物組織は、上記の方法を用いたＤＮＡの単離 のためにも用いた。

ゲノムＤＮＡを３倍過剰の制限酵素で消化し、０．８％アガロース（ＦＭＣ）で 電気泳動し、ｌ０ＸＳＣＰ（２０Ｘ５ＣＰ　：　２Ｍ　ＮａＣ１，０，６Ｍ　リ ン酸二ナトリウム、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ二ナトリウム）を用いてＮｙｔｒａｎ （Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒと５ｃｈｕｅｌｌ）に移した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ。

１９７５）。

６ＸＳＣＰ、１０％デキストランスルフェート、２％ザルコシン及び５００　ｕ 　ｇ／ｍｌヘパリン（Ｃｈｏｍｅｔ、　ｅｔａｔ、）中で６５°Ｃでフィルター をプレハイブリダイズした。

１００μｇ／ｍｌの変性サケ精液ＤＮＡと２２ｐ−ラベル化プローブを含む６× ＳＣＰ中で６５°Ｃて一晩、フィルターをハイブリダイズした。

ｐＤＰＧｌ　６５のＳｍａｌ断片０．６　ｋｂとｐＣＥＶ　５のＢａｍＨＩ　／ ＥｃｏＲＩ断片１．　Ｒ３ｋｌ）とをランダムプライニング反応（Ｆｅｉｎｂｅ ｒｇ　ａｎｄ　Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、　１９８３　：　Ｂａｅｈｒｉｎｇｅｒ −Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に用いて、ＦＡＴあるいはＧＵＳをコードする配列を検出 するためのラベル化プローブを作成した。

フィルターを２ＸＳＣＰ、１％ＳＰＳて６５°Ｃて３０分間洗浄し、Ｋｏｄａｋ 　ＸＡＲ５フイルムを用いてオートラジオグラフィーにより視覚化した。第２プ ローブと再ハイブリダイゼーションを行う前に、フィルターを蒸留水中で１０分 間ボイルし、最初のプローブを除き、次いで上記したようにしてプレハイブリダ イズした。

例９．除草剤適用 用いた除草剤Ｂａ５ｔ　ＴＸｌｌは、２００ｇ／ｌグルホシネート及びホスフィ ノスリシンのアンモニウム塩を含んでいた。０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ　− ２０を含む２％Ｂａ５ｔａ溶液（Ｖ／Ｖ）で若い葉を染色した。この製剤の適用 割合いは０、５−１％であった。

図１０Ａでは、非形質転換Ａ１８８ｘＢ７３植物（レフト）及びトランスジェニ ックＲ０Ｅ３／Ｅ４／Ｅ６植物（ライト）の葉の中心の広い面積（約４　ｘ　８ 　ｃｍ）にＢａ５ｔａ■溶液を適用した。図１０Ｂでは、４つのＲ１植物の葉に Ｂａ５ｔａを適用した。２つはｂａｒなしであり、他の２つはｂａｒを含む植物 である。それぞれの葉に４つの位置で１ｃｍ四方にＲ１植物に除草剤を適用した 。また、中央脈のそれぞれのサイドにも適用した。適用６日後、写真を取った。

Ｋ、ｈランスジェニック植物の稔性 子孫を回収するために、産生され遺伝子的に形質転換されたトウモロコシ植物（ Ｒｏと命名）を種子から得られる非形質転換植物の花粉と戻し交配し、ｂａｒを 含み発現した子孫（Ｒ＋　と命名）を回収した。

本発明の重要な１つの局面は、遺伝子的に形質転換された極性トウモロコシ植物 （Ｒｏ）と子孫（Ｒ１）とを最初に生産することである。これらは、形質転換さ れた胚形成性細胞から再生される。Ｒ１植物は、Ｒ０植物の戻し交配の結果得ら れるものである。

トランスジェニックＲ０の授粉は、仁の分化の結果の非形質転換Ｂ７３花粉とと もに種を出す。更に、非形質転換Ｂ７３花粉と授粉した雌性花序の雌蕊のある花 から仁は進化したものである。５Ｃ８２の形質転換Ｒ，植物の仁は、授粉後、約 １０−１４日間正常に進化するが、その後、仁は進化をやめ、くずれる。この時 、はとんどの植物は、老朽化する。多くの植物、すなわち３７Ｅ２／Ｅ５植物の ８．２２Ｅ１０植物の２、及び６Ｅ１１植物の３で、全部で１５３の仁が散発的 に進化した（表５）。生存した子孫を、胚レスキューにより、Ｅ２／Ｅ５植物１ １及びＥＩＯ植物１から回収した。

５Ｃ７１６Ｒ，植物を種子由来の８７３植物と戻し交配した。現在まで、３５の 成熟５Ｃ７１６Ｒ，植物から９の植物（４つの独立カルスラインを示す）が５１ の仁を生じ、そのうちの３１が２０種子を産生した（表５）。

５Ｃ７１６植物で進化したほとんどの仁は、胚レスキューを必要としなかった。

しばしば、仁は３０−４０日間で進化し、そのいくつかは土壌中で発芽した。残 りの種子はＭＳ−基礎培地中で発芽し、発芽をモニターし、２゜３日後に土壌中 に移した。５Ｃ８２Ｒ，植物に比べて、５Ｃ７１６Ｒｏ植物で仁の進化か観察さ れ、更にいくつかの５Ｃ７１６植物の巧から花粉が裂開し、この花粉のいくつか はｉｎ　ｖｒｔｒｏで発芽した（Ｐｆａｂｌｅｒｌ　９６７　）　。外来遺伝子 のトランスミッションか、５Ｃ７１６ＲＩイア−及び非形質転換イアの５Ｃ７１ ６Ｒ，花粉でみられた。

形質転換Ｒ１植物から得られた花は、Ｂ７３イア−の授粉に用い、多くの種子が 回収された（図１１Ｃ）。更に、非形質転換植物の花粉と交配したＲ１植物の形 質転換穂を図１１Ｄに示す。Ｒ３世代の稔性特性が、非形質転換イア−を極性化 する花粉の能力及びＲ１イアが非形質転換植物の花粉により極性化する能力によ り、確認さＥ２／Ｅ５Ｒ０植物の子孫４０の全部について、ＦＡＴ活性をアッセ イし、そのうちのＩＯを図７Ａに示した。アッセイした３６の子孫のうち１８は ＦＡＴ活性を有していた。Ｐ、　Ａ　Ｔ活性をアッセイしたこのｌｏの子孫のゲ ノムＤＮＡについて、ＤＮＡゲルプロットハイブリダイゼーションにより、図７ Ｂに示したように、ｂａｒの存在を分析した。

ＦＡＴを発現した６つの子孫は、カルスとＲ６植物で検出されたと同じｂａｒの シングルコピーを含んでいた。

４つのＦＡＴネガティブ子孫は、ｂａｒとハイブリダイズする配列を含んでいな かった。１つの一連のアッセイで、３６の子孫のうちの１８でのｂａｒ遺伝子産 物の存在が、Ｅ　２／Ｅ　５　Ｒ，植物で見られるｂａｒのシングルコピーのｌ ＝１分離を示し、シングルドミナントトレイトとしてのＦＡＴ発現の遺伝と一致 している。遺伝の主要パターンは、ＦＡＴをコードする遺伝子の少なくとも１つ のコピーの植物中に存在することを示す。ＥＩＯＲＯ植物から回収されたシング ル子孫について、ＦＡＴ活性のポジティブをテストした。

本明細書に記載した方法により、形質転換Ｒ０およびＲ１植物が得られ、これら は活性ＦＡＴを産生じた。これらは、Ｂｏｓｔａ　（Ｐ　Ｐ　Ｔ）を植物の葉に 適用し、これによりネクローシス（組織え死）が起こるか否かを測定して、決定 した。植物によってＦＡＴか産生されている場合には、葉組織はネクローシスか ら保護される。ＦＡＴを高レベルで発現するＲ８植物（Ｅ　２／Ｅ　５）又はレ ベルの発現植物（Ｅ　３／Ｅ　４／Ｅ　６）でネクローシスが観察されなかった （図１ＯＡ）。

ｂａｒのために分離するＲ１子孫の葉に除草剤を適用した。この研究ては、ｂａ ｒを含みｂａｒを発現するＲ１植物てはネクローシスか観察されなかったか、ｂ ａｒ遺伝子を欠＜　Ｒ＋植物ではネクローシスか見られた。図１０Ｂに示されて いる。

ｂａｒの分離は、植物の高さ、房の形態などのＲ３植物の表現特性とは関連して いなかった。図９Ｂでは、右側の植物のｂａｒを含み、左側の植物は含んでいな い。更に、Ｒ３植物のほとんとは、Ｒ０植物より大きい。

５Ｃ７１６形質転換体より回収された２３Ｒ０種子のうち、１６のうち１０かＰ ＡＴ活性を示した。カルスラインＲ１８を示すＲ０植物のＩＯ子孫のうち４つで ＦＡＴ活性か検出され、カルスラインＲ９を代表するＲ、植物の６の子孫のうち ６かＦＡＴ活性を示した。

Ｌ、胚レスキュー 胚レスキューが必要な場合、授粉１０−２０日後に仁表面から進化中の仁を切り 出し、ＭＳ塩、２％シュクロース及び５．５　ｇ／　Ｉ　５ｅａｋｅｎアガロー スを含むメディウム中で培養した。大きな胚（＞　３　ｍｍ）はメゾイム中で発 芽した。小さな胚は、１０−’Ｍアブシシン酸を含むメディウム中で約１週間培 養し、発芽のためにホルモンフリーの培地に移した。いくつかの胚は、バクテリ アが混入し、これらの胚はセフオキチン３００μｇ／ｍｌを含む培地に移した。

進化した植物は、Ｒ，植物の作成に用いた。

例１１：胚レスキュー ７つの５Ｃ８２Ｅ２／Ｅ５植物及び１つの５Ｃ８２ＥＩＯ植物から回収された子 孫は、胚レスキューにより維持した。この方法は、Ｒｏ植物で進化した仁の胚を 切出すことからなる。胚の大きさは長さか約０．５−４　ｍｍであった。小さな 胚をアブシソン酸を含む成熟培地上て培養し、大きな胚は発芽培地で直接培養し た。５Ｃ８２Ｒｏ植物から回収された４０の子孫のうち２つが図ｌｌ５Ｃ８２形 質転換体からのＲ０植物のほとんどは、Ａ１８８ＸＲ７３ハイブリツト表現型を 示した。植物は、Ａ１８８植物からの種子と大きさは同じであり（３−５フイー ト）、茎におけるアントシアニン蓄積、プロップ根などのＲ７３の特徴を存して おり、アラライトな葉を有していた。多くの植物は、カルスラインから再生され たにもかかわらず、アブノーマルな表現型を存していた。

多くの表現型は全てのＲ０植物に共通であったが、いくつかは、特定のカルスラ インから再生される植物にユニークなものであった。このような特性は、世代ル ートによらず現われ、また培養時間にもよらなかった。

非形質転換コントロール植物はこの培養からは再生されず、従って表現型上は比 較できなかった。雌蕊のある花か、Ｅｌｌの１つの（１／６）房、いくつかのＥ ＩＯ（３／２２）及びほとんど１／３のＥ２／Ｅ５　（１２／３７）植物で進化 した。第１及び第２のイヤーは、はとんどのＥ２／Ｅ５．Ｅｌ　Ｏ，及びＥｌｆ 植物で進化し、成熟Ｅ　２／Ｅ　５植物は図１ＩＡに示した。５Ｃ８２形質転換 体から再生された植物の房から取られた朽及び取られた朽の限られた数は、花粉 を裂開しなかった。いくつかの特徴的表現型は、Ｅ　３／Ｅ　４／Ｅ　６植物の イヤーの欠除、すべてのＥｌｌ植物で見られるグラツシイー表現型（２１０−ン 狭い葉）などの特定のカルスラインから再生される植物にユニークなものであっ た。

全ての５Ｃ８２植物は、老朽化し、葉は２週間後にネクローシスとなった。５Ｃ ８２形質転換細胞ラインから再生されたＲ８植物は、未成熟で老朽化し、典型的 には、進化中の仁が成熟する前に老朽化した。子孫（Ｒ＋世代）を回収するため には胚レスキューが必要であった。

Ｒ１世代におけるｂａｒの分離は、植物の高さ、房の形態などのＲ３植物の表現 型の生存性と関係はしていない。

図１１Ｂでは、右側の植物はｂａｒを含んでおり、左側の植物はｂａｒを含んで いない。更に、Ｒ３植物のほとんどはＲ０植物より元気である。形質転換子孫（ Ｒ１）も房を作成し、Ｒ２植物か回収された。

インデペンデント５Ｃ７１６形質転換体から再生された植物２１９のうち、約３ ５が成熟した（表５）。５Ｃ７１６植物は表現型の違いを示さなかった。これら の植物はより均一であり、アブノーマルなものはあまりなかった。これら植物の 表現型は、ボンバードしなかった５Ｃ７１８の凍結保存した培養物から再生され たコントロール植物に似ていた。植物の高さは３から６フイードであり、多くは ５から６フイートの間であった。はとんどの成熟植物は、多くは大きな房及び第 １及び第２のイヤーを産生じた。５Ｃ８２植物と同じ低い度合いでアンサーイク スクルージョンが生じたが、これらからは少量の花粉が裂開した。成熟した５Ｃ ７１６植物の多くは３０日後まで表われなかった。５Ｃ７１６植物の５Ｃ８２植 物よりも改良された特徴は、サスペンションカルチャーの間の違いによるもので あろう。

参考文献 触１ｍｔ＠ｎ６＠　Ｌ　Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ　Ｃ−Ｌ、ｌ　Ｇｒｅｅｎ　Ｃ−Ｅ −（１９１５５）　−Ｐ１ａｎｔａ１６４：２０フー２１４゜ Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　２．　Ｂａｔ、ｔｉｎｏ　Ｐ、Ｊ、、（１９７５）、　Ｅ ｏｔａｎｙ　１５：１−１６゜Ｒ＠ｔ＠ｘ＠ｒｓａ＊　３．　Ｃａｒｌｓｓｏｎ 　Ｊ、、　Ｄｒｅｖｉｎ　Ｈ，、Ａｘ＠ｎ　Ｒ＋（１９７８１゜Ｂｉｏｃｈｍｍ Ｊ、１７コ：７２コ。

Ｒ＠ｆ＠ｒｓｎｃ榔　４．　Ｃｈｏ＋ｘａｔ　Ｐ、＃、、Ｗａｓｓｌ＠ｒ　Ｓ、 、Ｄｅｌｌａｐａｒｔａ　Ｓ、Ｌ。

（１９７８）、藷ＢＯＪ　６３２９５−３０２゜Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　Ｓ、Ｃｈ ｕ　Ｃ，Ｃ，、Ｗａｎｑ　Ｃ，Ｃ，、Ｓｕｎ　Ｃ，Ｓ、、　Ｈｓｕ　Ｃ，、Ｙｉ ｎＫ、Ｃ，、Ｃｈｕ　Ｃ，Ｙ、、　ＢＬ　Ｆ、Ｙ、　（１９７５１，５ｃｉａｎ ｔｉａＳｉｎｉｃａ　１１１６５９−６６８゜ｎｍｔｍｒ＠ｒｓｃ＊　＆、Ｃ１ ａｒｋ、　Ｒ，（１９８２１，Ｊ、　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　？１ｕｔｒｉｔｉｏｎ ５！１０３９゜ Ｒａｆｅｒ＠ｎＣ・７．　Ｃａ＋ｎａｉ　Ｌ、、　Ｇａｃｃｉｏｔｔｉ　Ｄ、、 　Ｈｉａｔｔ　Ｗ、Ｒ，。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｇ＝、　Ｒｏｌｌ＠　Ｒ，Ｅ、、　５ｔａＬｋ＠ｒ　Ｄ、　 （１９８５１゜Ｎａｔｕｒｅ　コ１７：７４Ｌ−７４４；　Ｃ０ｎｑｅｒ、Ｂ、 Ｖ、、１ａｖａ）ｃ。

ＦＪ、、　Ａｆｚａ、　Ｒ，、Ｅｒｄｓｌｓｋｙ、　Ｋ、　（１９１１７１，Ｐ ｌａｎｔＣａｌｌ　Ｒａｐ　６：３４５−３４７Ｒｓｆｓｒ＊ｎａｓ　＠、Ｃｒ Ｌｓｔｏｕ　Ｐ、、　ＭｃＣａｂ＠Ｄ、Σ、、　５ｖａｉｎ　Ｗ、Ｆ。

（１４１８１，Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１１７：６〕１−６７４゜Ｒａｆ ａｒｅｎｃｅ　９．　ＤＥ　コロ４２　Ｂ２９　＾Ｒ＠ｆｓｒ＊ｎｃ＠　１Ｇ、 　Ｄｏ　Ｂｌｏｃｋ、Ｍ、、Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ　Ｊ、、Ｖａｎｄｉｗｉａｌｅ 　Ｍ、。

Ｄｏｃｋｘ　Ｊ、、　Ｔｈｏｅｎ　Ｃ，、Ｇａ５５ａＬａ　Ｖ、　Ｍｏｖｖａ　 Ｎ、Ｒ＋。

Ｔｈｏｒｎｐｓｏｎ　Ｃ，、Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｑｕ　Ｍ、、Ｌａａｍａｎｓ　 Ｊ。

（１９８７１、ＥＭＢＯＪ−６＝２５１３−２５１８；　ｓｅｅ　ａｌｓｏ　Ｐ ＣＴＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒ　ＷＯ８７１０５６２９，ｐｕｂｌ ｉｓｈｅｄ９／２４／８７゜ Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　１１．Ｄａ　Ｂｌｏｃｋ、　Ｍ、、　Ｂｏｔｔａｒｍａｎ 　Ｊ、、　Ｖａｎｄｉｗｉａｌｅ　Ｍ、ｒＤｏｃｋｘ　Ｊ−、Ｔｈｏａｎ　Ｃ， 、Ｇｏｓｓａｌａ　Ｖ、　Ｍｏｖｖａ　Ｎ、Ｒ，。

Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｃ＋、Ｖａｎ　Ｍａｎセａｑｕ　Ｍ、、　Ｌｅ＠！１ｌａｎ ｓ　Ｊ−（１９８９）、Ｆｌｙ＊ｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　９１：６９４−７０１゜ ＰｈｙｓｘｏＬ　９０：２１７−２２３゜Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　１３．　Ｄｅｌ ａｎｎａｙ　ｘ−、ＬａＶａｌｌ＠ｅ　Ｂ、Ｊ、、　ＰｒＯｋｇＣｈ　Ｒ，に、 ＩＦｕｃｈｓ　Ｒ−Ｌ、、　５ｉｎｓ　Ｓ、Ｒ，、Ｇｒｅａｎｐｌａｔｅ　ｊ、 Ｒ，。

Ｍａｒｒｏｎｅ　Ｐ、Ｇ＋、　Ｄｏｄｓｏｎ　Ｒ，Ｂ、、　Ａｕｇｕｇｔｉｎ＊ 　Ｊ＋Ｊ、。

Ｌａｙｔｏｎ　Ｊ−Ｇ、、　Ｆｉｓｃｈｈｏｆｆ　Ｄ、Ａ、　（１９８９）。

ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌ　フ：１２６５−１２６９゜Ｒ・ｃ＠ｒ＠ｚｔａ−１４ ，Ｆｅｉｎｂａｒｇ　Ａ、Ｐ、、Ｖｏｇｅｌｓｔｅ支ｎ　Ｂ、（１９８３）、Ａ ｎａｌＢｉｏｃｈｅｍ　１３２＝６−４３− Ｒ，Ｔ、　ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏ１５：８０７−８１：ｉ。

Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　１フ、　Ｆｒｏｍｍ　Ｍ、Ｅ、、Ｔａｙｌｏｒ　Ｌ、Ｐ、 、Ｗａｌｂｏｔ　Ｖ、（１９１１＋６）。

Ｎａｔｕｒｇａ　コ１２＝７９１−７９３゜Ｒ＊１！ａｒｅｎａ＠１ｇ、Ｈａｕ ｑｈｎ　Ｇ−Ｗ、、　Ｓｍ１ｔｈ　Ｊ−、Ｍａｚｕｒ　Ｂ、。

Ｓｏｍｓｒｖｉｌｌｅ、Ｃ，（１９８Ｂ）、Ｍｏ１．（ｊａｎ　（：ｅｎｅｔＲ ｓｆ＠ｒｅｎａｓ　！Ｊ、Ｈａｕｐｔｍａｎｎ　Ｒ，Ｍ、Ｖａｓｉｌ　Ｖ、、　 ０ｚｉａｓ−Ａｉｋｉｎｓ　Ｐ、、Ｔａｂａａｉｚａｄ＠ｈ　Ｚ、、Ｒｏｇａｒ ｓ　Ｓ＋Ｇ＋、Ｆｒａｌｅｙ　Ｒ，Ｔ、。

Ｈｏｒｓｃｈ　Ｒ，Ｂ、、　Ｖａｓｉｌ　１．に、（１９８８）、　Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ　８６：６０２−６０６゜Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　２０．　工ＰＲ Ｆ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｎｏ。

９００３］Ａ Ｒｅｆｅｒ＠ｎｃｅ　２１＋Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ　Ｒ，Ａ、（１９８７］、ＰＩ 　Ｍｏｂ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐｒ５＝３８７−４０５゜ Ｒ＠ｆｓｒ＠ｎｃｓ　２２．　Ｋｌｅｉｎ　Ｔ、Ｍ＋、　Ｋｏｒｎｓｔ＠ｉｎ　 Ｌ、、　５ａｎｆｏｒｄ　Ｊ、Ｃ−。

ＦｒｏｍｒｎＭ、Ｅ、（１９Ｂ９）、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　９１：４４ ０−Ｒ＠ｅ＠ｒ＠ｎＣ＠　２コ＋　Ｋｌｅｉｎ　Ｔ＋Ｍ−、Ｋｏｒｎｓｔｅｉｎ 　Ｌ、、５ａｎｆｏｒｄ　Ｊ、Ｃ−。

ＦｒｏＸＩｔｎ　Ｍ、Ｅ−（１９８７）、　Δ！ａｔｕｒｎ　コ２７：７０−７ ３゜ヌ・ｆｓｒ＠ｎｃ・　２４．　Ｋｏｚａｋ　Ｍ、（１９８４）、　Ｎｕｃｌ 　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｍｓ　１２：Ｂ５フーＲｅｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　２ツ、　Ｌｏｒｚ 　Ｈ−、Ｂａｋｅｒ　Ｂ−、５ｃｈａｌｌ　Ｊ、（１９８５）、　Ｍｏ１Ｇｔａ ｎ　ＧＱｎＱｔ　１９９＝１７８−１８２゜ｉｎｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　２６＋Ｌｙｚ ｎｉｋ　Ｌ、Ａ、、　Ｒｙａｎ　Ｒ−Ｄ、、　Ｒ１ｔｃｈｉ＠Ｓ、ｗ、。

ｌｏｄｇｅｓ　Ｔ＋に、（１９８９Ｊ、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ　Ｅヱｏ１１３：１ ５１−４６゜ Ｒａｆａｒｅｎｃｅ　２７＋　ＭｃＣａｂ＠　Ｄ、Ｅ、、Ｓｗａｉｎ　Ｗ、Ｆ、 、Ｍａｒｔｉｎ＠ｌｌ　Ｂ、Ｊ、。

Ｃｒ１ｓｔｏｕ　Ｐ　（１９８８）、　ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌ　６：９２３− シぽ５ｒｓｎｃ＠２８．　ＭｃＤａｎｉ＠ｌ　Ｃ−Ｎ−、Ｐｏ＊ｔｈｉｇ　Ｒ， Ｓ、（１９８８）。

Ｐｌａｎｔａ　’ｊ−７５＝１コー２２゜Ｒ＠ｆｓｒ＠ｎｃｅ　２９．　Ｍｕｒ ａｋａｍｉ　Ｔ、、　Ａｎｚａｉ　Ｈ，、工ｍａｉ　Ｓ−、５ａｔｏｈ　Ａ、。

Ｎａｑａｏｋａ　Ｋ、、　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｃ−Ｊ、（１９８６）、Ｍｏｌ　 Ｇａｎ（：ａｎｅｔ　２０５：４２−．５０゜Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ｎａｓ　３０．　Ｍ ｕｒａｓｈｉｇｅ　Ｔ、、　５ｋｏｏｑ　Ｐ、　（１９６２）、Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ　１５：４７コー４９７゜ Ｒａｆａｒ＠ｎｃｅ　３１．　Ｎａ１ｓｏｎ　Ｒ＋Ｓ、、　ＭａＣｏｒｍｉｃｋ 　Ｓ、Ｍ、、　Ｄｅｌａｎｎａｙ　Ｘ、。

Ｄｕｂａ　Ｐ、、　Ｌａｙｔｏｎ　Ｊ、、　Ａｎｄｓｒｓａｎ　Ｅ、Ｊ、。

Ｋａｎｉａｗｓｋａ　Ｍ、、　Ｐｒｏｋｓｃｈ　Ｒ，に、、　Ｈｏｒｓｃｈ　Ｒ ，Ｂ、。

Ｒｏｑｅｒｓ　Ｓ、Ｇ、、　Ｆｒａｌａｙ　Ｒ，Ｔ、　Ｂｅａｃｈｙ　Ｒ，Ｎ。

（１９８８）＋　ＥｉｏｌＴｏｃｈｎｏ１６：４０１−４０９゜Ｒｅｆｅｒｅｎ ａａ　３２．　Ｍａｓｔｅｒ、　Ｅ、Ｗ、　ｅｔ　ａｎ、、（１９８４）、）Ｌ ｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　３５＝３８７−４１３゜Ｒｅｆｅｒｅｎａａ　３ ３．　Ｏｇａｗａ、Ｙ＋　ａＬ　ａｌ　（１９７］）、　Ｓｃｉ、Ｒｅｐ、、Ｍ ｅｉｊａＳｅｉｋａ　１３：４２−４８゜ Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　３４．　ＰＣＴ　Ｎｏ、ＷＯ８７／−００１４１Ｒ＠ｆｓ ｒｓｎａｓ　３５．　Ｐｆａｈｌｅｒ　Ｐ、Ｌ、（１９６７）、Ｃａｎ　Ｊ、　 Ｅｏｔ　４５：８］６−８４５゜ Ｒ＠ｆ＊ｒｓｎａｓ　３ｇ、　Ｐｏｔｒｙｋｕｓ　工、　（１９Ｂ９１　Ｔｒｅ ｎｄｓ　Ｅｉｏｔｅｃｈｎｏ１７：２６９−２７３゜ Ｒｅｆ＠ｒｅｎｃｅ　３７．　Ｐｒ１ｏｌｉ　ＬｏＭ、、　５ｏｎｄａｈＬ　Ｍ 、Ｒｏ（１９８９）。

ｓｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ　７：５８９−５９４゜Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ｎｃｓ　３Ｂ−Ｒ ｈｏｄｅｓ　Ｃ−Ａ、、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｄ、Ａ、、　Ｍｅｔｔｌｅｒ工、Ｊ、 。

Ｍａｓｃａｒａｎｈａｓ　Ｄ、、Ｄｅ七ｍｅｒ　Ｊ、Ｊ、（１９８８）。

５ｃｉｅｎｃｅ　２４０：２０４−２０７゜Ｒ＊ｆ＊ｒ＊ｚｓｃ＊　３９．　５ ｈｉｌｌｉｔｏ　Ｒ−Ｄ、、　Ｃａｒｓｗｅｌｌ　Ｇ、に−、ＪｏｈｎｓｏｎＣ ，Ｍ、、ＤｉＭａｉｏ　Ｊ、Ｊ、、Ｈａｒｍｓ　Ｃ，？、（１９８９）。

ＥｉｏｌＴａｃｈｎｏｌ　７：５８４−５８７−Ｒ＠ｆ＠ｒｅｎｃ＊　４０．　 ５ｈａｈ　Ｄ、Ｍ、、Ｈｏｒｓｃｈ　Ｒ，Ｂ、、Ｋｌｅｅ　Ｈ，Ｊ−、Ｋ１５ｈ ｏｒｅ（、Ｍｌ、Ｗｉｎｔｅｒ　Ｊ、Ａ、、Ｔｕｎｅｒ　Ｎ−Ｅ、、Ｈｉｒｏｎ ａｋａＣ，Ｍ、、５ａｎｄｅｒｓ　Ｐ、Ｒ，、Ｇａ５５ｅｒ　Ｃ，Ｓ、、Ａｙｋ ｅｎヒＳ−、Ｓｉｅｇａｌ　Ｎ、Ｒ＋、Ｒｏｑｅｒｓ　Ｓ、Ｇ、、Ｆｒａｌｅｙ 　Ｒ，Ｔ。

（１９８６）、５ｃｉｅｎｃｅ　２１３：４７ニー４８１゜Ｒ＠ｆ＠ｒ＠！ＩＣ ＠　４工＋　Ｓｈｉｍａｍｏセｏ　Ｋ、、Ｔｅｒａｄａ　Ｒ，、工ｚａｗａ’ｒ 、。

Ｆｕｊｉｍｏｔｏ　Ｈｏ　（１９８９）、　ｎａｔｕｒｅ　コ１Ｂ＝２７４−２ ７６゜Ｒ＠ｆｅｒ＠ｎｃｅ　４２−　５ｈｕｒａ　Ｍ、、Ｗｅｓｌａｒ　Ｓ、、 Ｆｅｄａｒｏｆｆ、Ｎ、（１９８］）。

Ｃａ１ｌ　３５：２２５−２３３゜ Ｒｅｆｅｒｅｎａａ　４３−　５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｅ、Ｍ、（１９７５）、　Ｊ 　Ｍｏｌ　Ｅｉｏｌ　９８：５０１−５１７゜ Ｒｅｆ＠ｒ＠ｎｃ＊　４４．　５ｚｏｋａ、υ、ｓ、ｐａｔａｎセ　４．３９４ ，４４８Ｒｅｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　４５．　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ　Ｃ，に、、Ｍｏｖｖ ａ　Ｎ−Ｒ，、Ｔｉｚａｒｄ　Ｒ，。

Ｃｒａｍｅｒｉ　Ｒ，、Ｄａｖｉａｓ　Ｊ、Ｅ、、Ｌａｕｗｅｒａｙｓ　Ｍ−。

Ｂｏｔｔａｒｍａｎ　Ｊ、（１９８７］　、Ｅ：ＭＢＯＪ　６：２５１９−２６ ２３゜Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　４６．　Ｔｏｍｅｓ　Ｄ−（１９９０）、　Ａｎｎ ｕａｌ　ＭａｔｉｎｇＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ、２６ｔｈ　Ａｎｎｕａｌ　Ｃｏ ｒｎ　ＢｒｅｅｄｅｒｓＳｃｈｏｏｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　工１ｌｉ ｎｏｉｓ、Ｆｅｂｒｕａｒｙ２６−２７．ＰＰ−７−９゜ Ｒ＠ｅ＠！？＠ｎＣ＠　４７−　Ｔ′ｗｅｌｌ　Ｄ、ｐ　Ｋｌａｉｎ　Ｔ−Ｍ、 ｔ　Ｅ’ｒｏｒｎｒａ　Ｍ−Ｅ、ｔＭｃＣｏｒｍｉｃｋ　Ｓ、（１９８９）、Ｐ ｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ１９４：１２７０−１２７４゜ Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　４Ｂ、Ｖａａｃｋ　Ｍ、、Ｒｅｙｎａ＠ｒｔｓ　Ａ＋、Ｈ ｏｆヒａ　Ｈ，、ＪａｎｓｅｎｓＳ、、Ｄｏ　Ｂａｕｃｋａｌｅ＊ｒ　Ｍ、、Ｄ ｅａｎ　Ｃ−、Ｚａｂａａｕ　Ｍ、。

Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ　Ｍ、、Ｌｅ＠ｍａｎｓ　Ｊ、（１９８７）、　Ｎａｔ ｕｒｅ３２８：３３−３７゜ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　４９．　Ｗｉｔｈ＠ｒｓ　Ｌ−Ａ、、Ｋｉｎｇ　Ｐ、Ｊ− （１９７９）、ＰｌａｎｔＰｈｙｓ工ｏＬ　６４：６７５−６７８゜Ｒｅｆｅｒ ｅ１５ｃｅ　５０．　Ｗｏｎｇ、Ｙ、Ｃ−ｅｔ　ａＬ−（１９８８）、Ｐｌａｎ ｔ　Ｍｏｌ　ＥｉｏｌＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　５１＋　Ｙａｎｇ　Ｈ，、Ｚｈａｎ ｇ　Ｍ、Ｈ，、Ｄａｖａｙ　Ｍ、Ｒ，、ＭｕｌｌｉｑａｎＢ、Ｊ、、　Ｃｏｃｋ ｉｎｇ　Ｅ、Ｃ，（１９８８１，Ｐｌａｎｔ　Ｃａ１ｌ　Ｒｅｐ７：４：２１− ４２５゜ Ｒ＠ｆ＊ｒ＊ｚ＋ｃｓ　５２＋　Ｚｈａｎｇ　Ｍ、Ｈ，、Ｙａｎｇ　Ｈ，、Ｒｅ ｃｈ　Ｅ、Ｌ、、ＧｏｌｄｓＴ−Ｊ、、Ｄａｖｉｄ　Ａ＋Ｓ、、Ｍｕ工ｌｉｇａ ｎ　Ｂ、Ｊ、、ＣｏｃｋｉｎｇＥ、Ｃ０，Ｄａｖｅｙ　Ｅ、Ｒ，（１９８８）、 Ｐｌａｎｔ　Ｃａ１ｌ　Ｒｅｐ７：３７９−３８４゜ Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　５３．　Ｗｈｉｔａ、Ｊ、、Ｃｈａｎｇ、５．Ｐ、、Ｂｉ ｂｂ、Ｍ、Ｊ、、Ｂｉｂｂ。

Ｍ、、７＋　（ｘ９９ｏ）、ｗｕｃｘ　ｘｃｉａｓ　ｐｅｇ、ＸＪＬ！工０６２ ゜Ｒ＠ｆ＠ｒｅｎｃｅ　５４．　Ｄｓｌｌａｐｏｒｔａ、Ｓ、、Ｇｒｅｅｎｂｌ ａｔｔ、ニー、に＠ｒｍｉｃｌｅ。

Ｊ、、Ｎ１ｃｋｓ、Ｊ、Ｂ−、Ｗａｇｓｌｅｒ、Ｓ−（１９８８）ｉｎＣｈｒｏ ｍｏｓｏｍｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ：　Ｉｍｐａｃ ｔｏ！　Ｎｅｗ　Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、１ａｔｈ　５ｔａｄｌ＊ｒ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃｓＳｙｒａｐｏｓｉｕｍ、Ｊ−Ｐ＋　Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ａｐ ｐｅｌｓ。

＠ｄｓ　（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＝　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒａｓｇ）、ｐｐ、２６コー ２８２゜ Ｒ＠ｒ＠ｒ＠ｎｅ＠　ｓｓ＋　Ｃｈａｎｄｌｅｒ、Ｖ、Ｌ、、Ｒａｄｉｃｅｌｌ ａ、Ｊ、Ｐ、、Ｒｏｂｂｉｎｓ。

Ｐ、Ｐ、、Ｃｈｅｎ、Ｊ、、Ｔｕｒｋｓ、Ｄ、（１９８９）、Ｔｈｅｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ｉ＝１１７５−１１８３Ｒ＠ｆｓｒ＊ｎｅ＠　５６．　Ｄｏｒｉｎ ｇ、Ｈ＋Ｐ＋　ａｎｄ　ＳセａｒＬｉｎｇｅｒ　（１９８６）、Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｓｔ、２０：１７５−２００ｎ＊ｔ＊ｒ＠ｎｃｍ　５７．　Ｆ ｅｄ＊ｒ：ｏｆｆ、Ｎ、（１９８９）、”Ｍａｉｚ＠Ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌａ ＥＬ＠ｍ＠ｎｔｓ”、支ｎ　Ｍｏｂｉｌｅ　ＤＮＡ、　Ｗｏｗｓ、Ｍ、Ｍ−ａｎ ｄＢｅｒｇ、Ｄ、Ｅ＋、ａｄｓ、、Ａｍａｒ−Ｓａｃ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

Ｗａｓｈ、、ｏ、ｃ、、ｐｐ、３７７−４１１、ｉ＠ｆ＊ｒｓｎｃ＊　５ｇ、　 ５ｈａｐｉｒｏ、Ｊ、Ａ、（１９８コ）、Ｍｏｂｉｌｔａ　Ｇａｎｅ仁ｉｃＥｌ ｅｍａｎ仁ｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ。

Ｒ＠ｆ＠ｒ＠ＩＩＣ＠　５９．　ＤｅｌｌａｐＯｒｔａ、Ｓ、Ｌ、、Ｇｒｅｅｎ ｂｌａｔｔ、工、河、。

Ｋａｒｍｉｃｌｅ、Ｊ＋、Ｉ（ｉｃｋｓ、Ｊ、Ｂ、、ａｎｄ　Ｗ＠５ｓＬａｒ、 Ｓ。

（１９８８）、５ｔａｄｌｅｒ　！；ｙｒａｐｏｓｉｕｍ　１１：２６］−２８ ２−Ｒ＊ｆ＠ｒｓｎｃ＊　６Ｇ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ　１５４，２０４（９／１１／８５１　。

Ｒｅｆ＠ｒ＠ｎｃｓ　１５１　Ｔｈ１ｌｌｅｔ、Ｊ、、Ａｂｓｉｌ、Ｊ、、Ｓセ ｏｎｅ、Ｓ、Ｒ，。

Ｐｉｃｔｅｔ、Ｒ，（１９８Ｂ）、ＪＥｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２６３！Ｌ２５００ −Ｒ＊ｆ＊ｒ＠ｎｃｓ　６２＋　Ｅｕｒｏｐａａｎ　Ｐａｔｅｎｔ　Ａｐｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ　ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒ　０２１８５７１Ａ２．ｐ ｕｂｌｉｓｈｅｄ　Ａｐｒｉｌ　１５゜Ｒ＠ｆ＠ｒｅｎｃｅ　６３＋　Ｃｏｏ、 Ｅ、Ｈ，、Ｎａｕｆｆａｒ、Ｍ＋Ｇ、、ａｎｄ　Ｈｏｉｓｉｎｇセｏｎ。

Ｄ、Ａ、（１９８８）、ｉｎ　Ｃｏｒｎ　ａｎｄ　Ｃｏｒｎ　Ｉｍｐｒｏｖｅｍ ｅｎｔ。

Ｓｐｒａｇｕａ、Ｇ、Ｆ−ａｎｄ　Ｄｕｄｌａｙ、Ｊ、Ｗ、、＠ｄｓ、、ｐｐ− Ｒ＊ｆｅｒ＊ｎｃ＊　６４．　Ｃｏｍａｉ、Ｌ−、ＴＪ、Ｓ、Ｐａｔｅｎｔ　４ ，５３５，０６０；　ａｎｄ　ＡＴＣＣｄａｐｏｓｉセ　３９２５６− Ｒａｆ＠ｒ＊ｎａｓ　６５．　Ｂａｒｋａｉ−Ｇｏｌａｎ、Ｒ−、Ｍｉｒｅｌｍ ａｎ、Ｄ、、５ｈａｒｏｎ、Ｎ。

（１９７Ｂ）Ａｒｃｈ、ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ　１１６：１９−１２４Ｒ＠ｆ＠ｒ ｅｎｃｅ　６（ａ、Ｂｅｒｇ、Ｄ−Ｅ−、Ｅｇｎａｒ、Ｃ−、Ｈｉｒｇｃｈａｌ 、Ｂ、Ｊ−。

Ｈｏｗａｒｄ、　Ｊ、、　Ｊｏｒｇ＠ｎ５ａｎ、　Ｒ，、ａｎｄ　Ｔｉ５ｉｔｙ 、　Ｔ、Ｄ。

（１９８０）　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ４ ５：４４Ｇ−４６５ Ｒｅｆｅｒｅｎａａ　６７、Ｗｉｎｃｈｅｓ、に、Ａ−Ｗ、、Ｃｏｎｎｏｒ−１ Ｊａｒｄ、Ｄ、Ｖ、。

Ｈａｗ＠ｉｉ、Ｃ，Ａ、ＭｃＤｏｎ＊ｌｌ、Ｒ，Ｅ、、Ｓａセｏ、Ｓ、Ｊ、。

ｃａｓｓｓｒ、Ｃ，Ｓ、、Ｆｉｇｃｈｈｏｆｆ、Ｄ、Ａ、、Ｒ＠、Ｃ，Ｂ、。

Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ，Ｔ、、）！ｏｒｓｃｈ、Ｒ，Ｂ、（１９８８１Ｂｉｏ／１ａ ｃｈｎｏｌ　６：９１５−９２２゜Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　４＠、　Ｏｄ＠ｌｌ、 Ｊ、Ｔ、、Ｎａｇｙ、Ｆ−ｐ　ｃｈｕａ、Ｈ，Ｈ−（１９日５）Ｎａｔｕｒｅ　 ３１コニ８１０−１１１１２゜Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｓ＋９−　Ｌａｗｔｏｎ、 Ｍ、Ａ、、Ｔｉａｒｎａｙ、Ｍ、Ａ、、Ｎａｋａｍｕｒａ、工、。

Ａｒ＋ｄａｒｓｏｎ、Ｅ、、Ｋｏｍ＠ｄａ、Ｙ、、Ｄｕｂｓ、Ｐ、。

Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｎ、、Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ，Ｔ、、Ｂ＠ａｃｈｙ、Ｒ，Ｎ。

（１９８７）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｂ、Ｅｘｏｌ、９：３１５−３２４゜Ｒｅｆｅ ｒｅｎｃｅ　フＯ＋　Ｅｂｓｒｔ、Ｐ−Ｒ，、Ｈａ、Ｓ、Ｂ、、Ａｎ、Ｇ、（１ ９８７）、ＰＮＡＳ＃４：５７４５−５７４９゜ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　フＬ　Ｗａｌｋｅｒ、Ｊ、Ｃ，、Ｈｏｗａｒｄ、Ｅ、Ａ、 、Ｄａｎｎｉｓ、Ｅ、Ｓ、ｒＰｅａｃｏｃｋ、Ｗ、Ｊ、（１９８７）、ＰＮＡＳ 　８４：６６２４−６６２８゜Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　７２．　Ｙａｎｇ、Ｎ＋５ −、Ｒｕ５ｓｅｌｌ、Ｄ＋　（１９９０１，ＰＥＡ！；Ｒ＠ｆｆ＠ｒｓｎｃａ　 ７コ、　Ｃｏｎｋｌｉｎｇ、Ｍ＋Ａ、、Ｃｈａｎｇ、Ｃ，Ｌ、、Ｙａｍａｍｏ七 〇。

Ｙ、Ｔ、、にｏｏｄｍａｎ、Ｈ，Ｍ−（１９９０）、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ。

９３：１２０３−１２１１゜ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　７４．　Ｆｒｏｍｍ、Ｈ，、Ｋａｔａｇｉｒｉ、Ｆ＋、Ｃ ｈｕａ、Ｎ、！（。

（１９８９）、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎ仁　Ｃｏ１ユ　１：９７７−９８４−Ｒｅｆｅ ｒｅｎｃｅ　７５．　工ｎｇａｌｂｒｅｃｈｔ、工、Ｌ＋Ｗ、、Ｍｅｒｍａｎ、 Ｌ、Ｍ＋Ｆ＋。

Ｄｅｋｅｙｓ＠ｒ、Ｒ６Ａ＋、Ｖａｎ　Ｍｏｎセａｇｕ、Ｍ＋Ｃ，。

Ｄ＊ｐｉｃｋａｒ、Ａ、Ｇ、（１９８９）、Ｔｈｇａ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ工 ：６７１−６８０；　Ｂａｖａｎ、Ｍ＋、Ｂａｒｎｅｓ、Ｗ＋Ｍ、。

Ｃｈｉｌｔｏｎ、Ｍ、Ｄ、（１９８３）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒａｇ。

ユ１：コ６９−３１ｉ１５＋ Ｒ＠ｅ＠ｒ＠ｔｔｃ＠　７１　ＣａＬｌｉｓ、Ｊ、、Ｆｒｏｗｎ、Ｍ、、ＷａＬ ｂｏｔ、ｖ、（１９８７）。

Ｇａｎｇｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ、ユニ１１８コー１２００゜１ｎｆｅｒ＠ ｎｃｅ　７７、Ｖａｇｉｌ、　Ｖ、、Ｃ１ａｎｃｙ、　Ｍ、、Ｆｅｒｌ、Ｒ，Ｊ 、、　Ｖａｓｉｌ。

工、に、、Ｈａｎｎａｈ、Ｌ、Ｃ，（１９８９１，Ｐｌａｎ仁Ｐｈｙｓｉｏｌ。

９１：１５７５−１５７９゜ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　７＋ｉ−Ｇａ１ｌｉｃ、Ｄ、Ｒ，、Ｌｕｃａｓ、Ｗ、Ｊ、 、Ｗａｌｂｏｔ、Ｖ。

（１９８９）、デｈ＠　Ｐｌａｎむ　Ｃａ１ｌ　１＝３０１−３１１、Ｒｅｆｅ ｒｅｎｃｅ　７９．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、 、　ａｎｄ　Ｍａｎｉａｔｕｓ。

Ｔ、（１９８９）　、　Ｍｏ１ｔａｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎｑ、　Ａ　Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ　２ｎｄ　ａｄ。

Ｒ＠ｃ＠ｒ＠ｎｃ＠　８Ｇ、Ｇａ１ｖｉｎ、Ｓ、Ｅ、、５ｃｈｉｌｐａｒｏｏｒ ｔ、Ｒ＋Ａ、、Ｖａｒｍａ。

Ｄ−ｐ＋ｓ、、　ａｄｓ、　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ　（１９９０）。

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＩＬ　Ｇａヒａｈｏｕｇａ、Ａ、Ｍ、、Ｄａｗａｙ、Ｆ、 Ｍ、、Ｄｏｖｅ、Ｊ、。

Ｆｅｎｔｏｎ、　Ｋ、Ａ、、　Ｄｕｓｚｔａｉ、　Ａ＋（１９８４）、　Ｊ　５ ｃｉＦｏｏｄ　Ａｇｒｉｃ　ｊ５：３７３−３８０Ｒｅｆ＠ｒ＠ｎｃｅ　＠２． 　Ｐｏｔｒｙｋｕｇ、工、、５ａｕｌ、Ｍ、Ｗ−、Ｐ＠七ｒｕｇｋａ、Ｊ、。

Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ、Ｊ、、５ｈｉｌｌｉｔｏ、Ｒ−Ｄ、（１９８５）、Ｍｏ １Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ　１９９＝１８３（８８Ｒｓｆｆ＊ｒｓｎａ＊　８３．　 ５ｔａｌｋａｒ、Ｄ−Ｍ、、Ｍａｌｙｊ、Ｌ、Ｄ、、ＭｃＢｒｉｄａ、に−Ｅ。

（１９８８）、Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｕｍ　２６３：６３１０−６３１４Ｒ＠ｆ＠ ｒａｎａｅ　ｌＩ４＊　工ｋａｄａ、Ｈ−，Ｋｏｔａｋｉ、Ｈ，、Ｏｍｕｒａ、 ５．（１９８７］、ＪＥａｃｔｅｒｉｏｌ　ｉ６９：５６１５−５６２１゜Ｒｅ ｆｅｒｅｎｃｅ　＠５−　Ａｖｅｒｍ＊ｃｔｘｎ　ａｎｄ　ＡｂａＷＩ＠Ｃｔ１ ．ｎ−（１ｓｓ９）ｗ＋ｃ。

Ｃａｍｐｂａｌｌ、＠ｄ＋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　８Ｇ、Ｗａｔｒｕｄ、Ｌ、５．、Ｐａｒｌａｋ、Ｆ＋Ｊ− 、Ｔｒａｎ、Ｍ、−Ｔ、。

Ｋｕｓａｎｏ、　Ｋ、、　Ｍａｙ＠ｒ、Ｅ、Ｊ、、　Ｍｉｉｎａｒ−Ｗｉｄｅｍ ａｎｎ。

Ｍ、Ａ、、Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ、に、Ｇ、、Ｎａｌｇｏｎ、Ｄ、Ｒ−。

Ｋｒ＠ｉｔｉｎｇｅｒ、　Ｊ、Ｐ、、ａｎｄ　Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ。

（１９８５）　、ｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　 ｔｈｅＥｎｖｉｒｏｎｒｎｅｎｔ、Ｈ，Ｏ＋　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ　ａセ　ａｌ ＋、＠ｄｓ、。

Ａｍ、５ｏｃ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ＋、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ、Ｃ。

Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　＋１７．　Ｃｕｔｌｅｒ、Ａ、Ｊ、、Ｓａｌｅｅｍ、Ｍ、 、ＫｅｎｄｅｌＬ、Ｅ、。

Ｇｕｓｔａ、Ｌ、Ｖ、、Ｇａｏｒｇｅｓ、Ｆ、、Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、Ｇ＋Ｌ。

（１９８９）、Ｊ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ　１コ５：コ５１−３５４゜Ｒ ｅｆｅｒｅｎｃｅ　８Ｂ、Ｈｉｌｄａｒ、Ｖ、Ａ、、Ｇａｔｅｈｏｕｇａ、Ａ、 Ｍ、Ｒ，、Ｓｈａｅｒｍａｎ。

Ｓ、Ｅ、、Ｂａｒｋｅｒ、Ｒ，Ｆ、、Ｂｏｕｌｔａｒ、Ｄ、（１９８７）Ｎａｔ ｕｒｅ　３３０＝１６０−１６３゜Ｆ■Ｇ、３ ＥＩ　Ｅ２　Ｅ３　Ｅ４　ＥＳ　Ｅ６　Ｅ７　ＥＳ　Ｅ９　Ｅｌｏ　Ｅｌｌ　Ｅ Ｏ８１Ｆ−＃　−・　−・　・ ε１０　Ｅｌｌ　Ｅ２７ＥＳＥ３／Ｅシロ　Ｂ７３　８ＭＳ　ＢＡＲＭＷ　＋ｋ ｂ）　ＭＷＩｋｂｌ 響・・―響　＃　９ ２．０−２．０ Ｆ■〔、）ｔ “− Ｆ−Ｇ、１０Ａ Ｆ■Ｇ、１０Ｉｔ ＦＩＧ、ｌ［）Ｕ　Ｆ■Ｇ、１０Ｅ ＦＩＧ、１１ノへ 補正書の翻訳文提出書　（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．稔性のトランスジェニック単子葉植物の産生方法において、 （ａ）単子葉植物に発現させることを所望の、またはそのゲノム内に導入を所望 の成分のＤＮＡ組成物を調製し、（ｂ）レシピエント単子葉植物細胞によるＤＮ Ａの取り込みが可能な条件下に、上記ＤＮＡ組成物とレシピエント単子葉植物細 胞を接触させ、 （ｃ）ＤＮＡ成分を受容したレシピエント細胞から植物を再分化させ、ついで （ｄ）所望のＤＮＡ成分を含有する稔性のトランスジェニック植物を同定する、 各工程からなる方法 ２．単子葉植物細胞は、トウモロコシ、イネ、小麦、オート麦、または大麦の細 胞である「請求項１」記載の方法 ３．レシピエント細胞は、カルス細胞、配偶子細胞、または成長点細胞である「 請求項１」記載の方法４．レシピエント細胞は、懸濁培養体から得られる細胞で ある「請求項１」記載の方法 ５．懸濁培養体は、不定胚分化能があるカルスから調製される「請求項４」記載 の方法 ６．カルスはＩＩ型カルスである「請求項５」記載の方法 ７．レシピエント細胞をＤＮＡ組成物と接触させる前に、さらにレシピエント細 胞を包含する植物細胞組成物を調製する工程を含む「請求項１」記載の方法８． 植物細胞組成物は、 （ａ）不定胚分化能があるカルスを調製し、（ｂ）そのカルスからレシピエント 細胞とする細胞を選択する、 ことによって調製する「請求項７」記載の方法９．ＤＮＡ組成物と接触させる前 に、懸濁培養液中で、さらに選択されたカルス細胞を培養する「請求項８」記載 の方法 １０．植物細胞組成物はＤＮＡ組成物と接触させる前に、凍結保存に付す「請求 項７」記載の方法１１．ＤＮＡ組成物は置換可能な要素からなる「請求項１」記 載の方法 １２．置換可能な要素は、Ａｃ，ＤＳまたはＭｕ要素である「請求項１１」記載 の方法 １３．ＤＮＡ組成物は外来遺伝子からなる「請求項１」記載の方法 １４．外来遺伝子は選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子からな る「請求項１３」記載の方法１５．選択可能またはスクリーニング可能なマーカ ー遺伝子はｎｅｏ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、変異ＥＰＳＰシンター ゼ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、アセトラクトンシンターゼ遺伝子、またはＲ複 合体からの遺伝子である「請求項１４」記載の方法 １６．外来遺伝子はトウモロコシの遺伝子である「請求項１４」記載の方法 １７．外来遺伝子は所望の形質をコードする遺伝子である「請求項１４」記載の 方法 １８．外来遺伝子は、除草剤抵抗性遺伝子、昆虫抵抗性遺伝子、抗凍結蛋白質遺 伝子、または抗かび遺伝子である「請求項１７」記載の方法 １９．ＤＮＡ組成物はプラスミドである「請求項１」記載の方法 ２０．ＤＮＡ組成物は外来遺伝子と操作性に連結したプロモーターおよび３′領 域である「請求項１３」記載の方法 ２１．プロモーターは、ＣａＭＶ　３５Ｓ，ＣａＭＶ　１９Ｓ，ｎｏｓ，Ａｄｈ ，スクロースシンターゼ、Ｒ−対立遺伝子または根細胞プロモーターである「請 求項２０」記載の方法２２．レシピエント細胞は２種以上の外来遺伝子で共形質 転換される「請求項１３」記載の方法２３．少なくとも２個の外来遺伝子が同じ ＤＮＡセグメント上に配置され、レシピエント細胞はこのセグメントと接触させ る「請求項２２」記載の方法２４．ＤＮＡ成分を受容したレシピエント細胞は、 再分化の前に選択される「請求項１」記載の方法２５．細胞は選択培地と接触さ せてインキュベートすることによって選択される「請求項２４」記載の方法２６ ．レシピエント細胞はビアラフォス抵抗性遺伝子を含むＤＮＡ組成物と接触させ 、ビアラフォス抵抗性遺伝子を受容した細胞をビアラフォスまたはＰＰＴからな る選択培地上で選択する「請求項２５」記載の方法２７．レシピエント細胞はマ イクロプロジェクタイルボンバードメントの使用によりＤＮＡ組成物と接触させ る「請求項１」記載の方法 ２８．レシピエント細胞によるＤＮＡ組成物の取り込みは、ＤＮＡ組成物をその 上に被覆した粒子をスクリーンを通し、細胞内に通過させる、細胞のマイクロプ ロジェクタイルボンバードメントによって達成される「請求項２７」記載の方法 ２９．粒子はタングステンまたは白金からなる「請求項２８」記載の方法 ３０．レシピエント細胞は不定胚分化能があるトウモロコシの細胞である「請求 項１」記載の方法３１．稔性のトランスジェニック植物は稔性のトランスジェニ ックなトウモロコシ植物である「請求項１」記載の方法 ３２．レシピエント細胞から植物を再分化するにあたり、 （ａ）ＤＮＡを受容したレシピエント細胞を不定胚分化促進ホルモンからなる培 地中で、カルスの有機化が認められるまで培養し、 （ｂ）細胞を組織の有機化を促進するホルモンを包含する培地に移し、 （ｃ）細胞を上記ホルモンを含まない培地で継代培養して、苗条の延長と根の発 生を促し、ついで（ｄ）細胞を最小培地に移して植物のハードニングを行う、 各工程からなる「請求項１」記載の方法３３．不定胚分化促進ホルモンはディカ ンバである「請求項３２」記載の方法 ３４．不定胚分化促進ホルモンは２，４−Ｄである「請求項３２」記載の方法 ３５．組織の有機化を促進培地は、ＢＡＰ、ミオイノシトールおよび２，４−Ｄ からなる「請求項３２」記載の方法 ３６．組織の有機化を促進培地は、ＡＢＰ、ＢＡＰ、ＮＡＡ、ＩＡＡ、２−１Ｐ 、またはミオイノシトールからなる「請求項３２」記載の方法 ３７．工程（ｃ）で用いられる培地はミオイノシトールを包含する「請求項３２ 」記載の方法 ３８．細胞にさらに発根を刺激するホルモンを適用する「請求項３２」記載の方 法 ３９．発根を刺激にＩＢＡを適用する「請求項３８」記載の方法 ４０．最小培地はＣｌａｒｋ培地からなる「請求項３２」記載の方法 ４１．トランスジェニックなトウモロコシ植物を産生する方法において、 （ａ）１種または２種以上のホルモンを含む培地からなる懸濁培養液中で、不定 胚分化能を有するトウモロコシ細胞を生育させ、 （ｂ）所望の遺伝子をコードするＤＮＡセグメントを調製し、 （ｃ）上記ＤＮＡセグメントを不定胚分化能を有するレシピエントトウモロコシ 細胞に導入し、ついで（ｄ）上記レシピエントトウモロコシ細胞から植物を再分 化する、 各工程からなる方法 ４２．植物は稔性である「請求項４１」記載の方法４３．稔性のトランスジェニ ックなトウモロコシ植物４４．さらに外来遺伝子の発現が可能な「請求項４３」 記載の稔性のトランスジェニックなトウモロコシ植物 ４５．外来遺伝子は所望の形質をコードする「請求項４４」記載の稔性のトラン スジェニックなトウモロコシ植物 ４６．外来遺伝子は、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子から なる「請求項４４」記載の稔性のトランスジェニックなトウモロコシ植物４７． 「請求項１」から「請求項４２」のいずれかによって製造されたトランスジェニ ック植物４８．「請求項４３」記載の植物の子孫４９．「請求項４８」記載の植 物から得られた種子５０．「請求項４３」記載の植物から得られた細胞５１．植 物細胞培養液に選択剤の制御された放出を与える方法において、 （ａ）選択剤が導入された制御放出性マトリックスを調製し、 （ｂ）植物細胞培養体を調製するために植物細胞を所望の培地中または培地上で 培養し、 （ｃ）選択剤を含有する制御放出性マトリックスを、培地中に選択剤が放出され るように、培地と接触させて配置する、 各工程からなる方法 ５２．選択剤は、天然もしくは合成植物ホルモンまたはそれらの類縁体からなる 「請求項５１」記載の方法５３．植物ホルモンは２，４−ＤまたはＮＡＡからな る「請求項５１」記載の方法 ５４．制御放出性マトリックスは、シリコンマトリックス内に選択剤が包埋され てなる「請求項５１」記載の方法 ５５．シリコンマトリックスは室温加硫シリコンからなる「請求項５４」記載の 方法 ５６．制御放出性マトリックスは、外部チューブ内に分散され、制御放出性カプ セルを形成する「請求項５１」記載の方法 ５７．外部チューブの少なくとも一部は、選択剤に対して透過性である「請求項 ５６」記載の方法５８．透過性チューブはシリコンベースのチューブである「請 求項５７」記載の方法 ５９．外部チューブはシリコンでシールされた開口部からなる「請求項５８」記 載の方法 ６０．制御放出性マトリックスは、培地に導入する前に滅菌しておく「請求項５ １」記載の方法