BRPI0617265A2

BRPI0617265A2 - célula geneticamente modificada, processo para a produção da mesma, processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiÈnico, de ácido acético, de poliacrilatos, de ésteres de ácido acético, bem como o uso da referida célula

Info

Publication number: BRPI0617265A2
Application number: BRPI0617265-2A
Authority: BR
Inventors: Achim Marx; Volker F Wendisch; Doris Rittmann; Stefan Buchholz
Original assignee: Evonik Degussa Gmbh
Priority date: 2005-10-10
Filing date: 2006-10-09
Publication date: 2011-07-19
Also published as: US20090325248A1; EP2175024A3; CN101283095A; WO2007042494A3; DE102005048818A1; EP2175024A2; CN101974439A; DK2175024T3; WO2007042494A2; EP1934352A2; EP2175024B1

Abstract

<B>CéLULA GENETICAMENTE MODIFICADA, PROCESSO PARA A PRODUçãO DA MESMA, PROCESSO PARA A PRODUçãO DE áCIDO 3-HIDROXIPROPIÈNICO, DE áCIDO ACéTICO, DE POLIACRILATOS, DE éSTERES DE áCIDO ACéTICO, BEM COMO O USO DA REFERIDA CELULA.<D> A presente invenção refere-se a uma célula geneticamente modificada em relação ao seu tipo selvagem, que apresenta pelo menos uma das propriedades a) ou b): a) uma atividade aumentada em comparação com seu tipo selvagem de uma enzima E~ 1~, que catalisa a reação de piruvato para oxalacetato ou de uma enzima E~ 1b~, que catalisa a reação de fosfoenol-piruvato para oxalacetato, b) uma atividade aumentada em comparação com seu tipo selvagem de uma enzima E~ 2~, que catalisa a reação de aspartato para beta-alanina, em que a célula, além das propriedades a) ou b) é caracterizada por pelo menos uma das propriedades c) ou d): c) a célula geneti- camente modificada é capaz de centrifugar beta-alanina para fora da célula; d) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiónico. A invenção se refere também a processos para a produção de uma célula geneticamente modificada, às células geneticamente modificadas obteníveis por esses processos, processos para a produção de ácido 3-hidroxipropiónico, um processo para a produção de ácido acrilico, um processo para a produção de poliacrilatos, um processo para a produção de ésteres de ácido acrilico, bem como o uso de células para a produção de ácido 3-hidroxipropiónico.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "CÉLULAGENETICAMENTE MODIFICADA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DAMESMA, PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ÁCIDO 3-HIDRO-XIPROPIÔNICO, DE ÁCIDO ACÉTICO, DE POLIACRILATOS, DE ÉSTE-RES DE ÁCIDO ACÉTICO, BEM COMO O USO DA REFERIDA CÉLULA".

A presente invenção refere-se a uma célula geneticamente mo-dificada em relação ao seu tipo selvagem, processos para a produção deuma célula geneticamente modificada, as células geneticamente modifica-das, obteníveis por esses processos, processos para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico, um processo para a produção de poliacrilatos, um proces-so para a produção de ésteres de ácido acrílico, bem como o uso de célulaspara a produção de ácido 3-hidroxipropiônico.

Ácido acrílico é um composto de partida tecnicamente muito sig-nificativo. Ele serve, entre outros, para a produção de poliacrilatos, especi-almente de poliacrilatos reticulados parcialmente neutralizados, que no esta-do seco e no estado essencialmente anidro apresentam uma grande capaci-dade para a absorção de água. Esses poliacrilatos reticulados, designadoscomo "superabsorventes" podem absorver um múltiplo de seu próprio pesode água. Com base em sua alta capacidade de absorção, os polímeros ab-sorventes são apropriados para a incorporação em estruturas e objetos queabsorvem água, tais como, por exemplo, fraldas, produtos de incontinênciaou absorventes femininos. Nessa relação, é feita referência a Modern Supe-rabsorbent Polymer Technology; F. L. Buchholz, A. T. Graham, WiIey-VCH,1998.

Do mesmo modo, os ésteres de ácido acrílico, tais como, porexemplo, acrilato de metila e acrilato de butila, são compostos de partidaindustrialmente significativos, que são especialmente utilizados para a pro-dução de copolímeros. Esses copolímeros são utilizados, na maioria, naforma de dispersões de polímeros como adesivos, agentes de pintura oucoadjuvantes têxteis, de couro e papel.

A produção do ácido acrílico é efetuada tecnicamente em primei-ra linha através de oxidação catalítica, de dois estágios em fase gasosa depropileno, sendo que o propileno é novamente obtido através de dissociaçãotérmica de benzinas obtidas no processamento de petróleo em bruto. Emseguida, o ácido acrílico obtido dessa maneira é eventualmente esterificadomediante adição de álcoois.

A desvantagem do processo para a produção de ácido acrílicoem dois estágios, por um lado, é que as temperaturas usadas nos dois está-gios entre 300 e 450°C levam à formação de oligômeros e de outros produ-tos de craqueio indesejáveis. Isso tem como conseqüência, a obtenção deuma quantidade indesejavelmente alta de compostos com ponto de ebulição maior do que o do ácido acrílico ou de compostos, que se separam apenasdificilmente do ácido acrílico, tal como, por exemplo, ácido acético. Via deregra, esses compostos devem ser destilativamente separados do ácido a-crílico, o que leva novamente a uma outra carga térmica do ácido acrílico e àformação associada de dímeros e oligômeros. No entanto, um alto teor de dímeros de ácido acrílico ou oligômeros de ácido acrílico é desvantajoso,pois esses dímeros ou oligômeros, durante a produção de superabsorven-tes, são incorporados no polímero através de polimerização radical de ácidoacrílico na presença de reticuladores. No tratamento posterior da superfíciedas partículas de polímeros que é efetuado em seguida à polimerização, por exemplo, no âmbito de um reticulação superficial posterior, os dímeros inclu-ídos por polimerização, no entanto, são dissociados com formação de ácidoβ-hidroxipropiônico, que é desidratado com as condições da reticulação pos-terior formando ácido acrílico. Um alto teor de ácido acrílico dímero no ácidoacrílico utilizado para a produção dos superabsorventes leva, portanto, a que o teor de monômeros do ácido acrílico em um tratamento térmico dos polí-meros, tal como é efetuado na reticulação posterior, aumente.

Também outros compostos, muitas vezes tóxicos, ainda podemser detectados no ácido acrílico obtenível através da oxidação catalítica emfase gasosa. Nessas impurezas incluem-se, especialmente, aldeídos, queagem perturbando o decurso da polimerização, com a conseqüência, de queos polímeros ainda contêm quantidades consideráveis de componentes so-lúveis.Para resolver esses problemas, já foram descritas algumas pre-parações no estado da técnica (vide, por exemplo, a EP-A-O 574 260 ou DE-A-101 38 150).

Uma outra desvantagem deste processo convencional para aprodução de ácido acrílico, consiste em que o produto de partida (propileno)utilizado é produzido a partir de petróleo em bruto e, dessa maneira, de ma-térias-primas não recicladas, o que é grave do ponto de vista econômico,principalmente com respeito à obtenção cada vez mais complicada e princi-palmente mais cara de petróleo em bruto, principalmente a longo prazo.

Também aqui no estado da técnica, já são descritas algumaspreparações, para evitar esse problema.

Dessa maneira, o W0-A-03/62173 descreve a produção de áci-do acrílico, em que se forma inicialmente alfa-alanina fermentativamente apartir de piruvato, que é reagida depois, por meio da enzima 2,3-ami-nomutase, para beta-alanina. A beta-alanina é novamente reagida atravésde β-alanil-CoA, acrilil-CoA, 3-hidroxipropionil-CoA ou então através de se-mialdeído de ácido malônico, para ácido 3-hidroxipropiônico, do qual, apósuma desidratação, é obtido ácido acrílico.

O W0-A-02/42418 descreve um outro processo para a produção de, por exemplo, ácido 3-hidroxipropiônico a partir de matérias-primas reci-cladas. Nesse caso, o piruvato é inicialmente reagido para lactato, do qual,em seguida, se forma IactiI-CoA. Em seguida, o IactiI-CoA é reagido atravésde acrilil-CoA e 3-hidroxipropionil-CoA para ácido 3-hidroxipropiônico. Umaoutra rota descrita no W0-A-02/42418 para a produção de ácido 3-hidro- xipropiônico prevê a reação de glicose através de propionato, propionil-CoA,acrilil-CoA e 3-hidroxipropionil-CoA. Esse relatório descreve também a rea-ção de piruvato para ácido 3-hidroxipropiônico através de acril-CoA e malo-nil-CoA. O ácido 3-hidroxipropiônico obtido pelas respectivas rotas pode serreagido para ácido acrílico através de desidratação.

O WO-A-01/16346 descreve a produção fermentativa de ácido 3-hidroxipropiônico a partir de glicerol, no qual são utilizados micro-orga-nismos, os quais exprimem o gene dhaB de Klebsiella pneumoniae (um ge-ne, que codifica para desidratase de glicerina) e um gene, o qual codificapara uma desidrogenase de aldeído. Dessa maneira, o 3-hidroxipropiônico éformado a partir de glicerina através de 3-hidroxipropionilaldeído, que a se-guir, pode ser convertido para ácido acrílico por meio de desidratação.

A desvantagem dos processos fermentativos descritos acimapara a produção de ácido 3-hidroxipropiônico como compostos de partidapara a síntese do ácido acrílico, consiste entre outros, que a quantidade deácido 3-hidroxipropiônico formado na solução de fermentação é baixa de-mais, para utilizar essa solução de fermentação como material de partidapara uma produção de ácido acrílico em grande escala técnica de maneiraeconomicamente vantajosa.

A presente invenção tem como objetivo vencer as desvantagensresultantes do estado da técnica.

De modo especial, a presente invenção tem como objetivo dis-ponibilizar micro-organismos recombinantes ou sistemas de pelo menos doismicro-organismos recombinantes, que estão em condição ainda melhor, es-pecialmente ainda mais eficiente do que os micro-organismos descritos noestado da técnica, de produzir ácido hidroxipropiônico a partir de matérias-primas recicladas, especialmente de carboidratos e/ou glicerina, o qual, aseguir, pode ser convertido em ácido acrílico puro em uma cuidadosa reaçãode desidratação.

Uma contribuição para a resolução dos objetivos mencionadosacima, é prestada por uma célula geneticamente modificada em relação aseu tipo selvagem, que apresenta pelo menos uma, preferentemente duasdas propriedades a) e b):

a) uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%, de modo parti-cularmente preferido, em pelo menos 25%, além disso, preferentemente empelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo maispreferido possível, em pelo menos 500%, no máximo, preferentemente ematé 5.000%, de modo particularmente preferido, em até 2.500%, de uma en-zima Eia, que catalisa a reação de piruvato para oxalacetato ou de uma en-zima E1bl que catalisa a reação de fosfoenolpiruvato para oxalacetato, prefe-rentemente no entanto, de uma enzima E1a, que catalisa a reação de piruva-to para oxalacetato,

b) uma atividade aumentada em comparação com seu tipo

selvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%, de modo parti-cularmente preferido, em pelo menos 25%, além disso, preferentemente empelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo maispreferido, em pelo menos 500%, no máximo, preferentemente em até5.000%, de modo particularmente preferido, em até 2.500%, de uma enzimaE2, que catalisa a reação de aspartato para beta-alanina,

sendo que a célula, além das propriedades a) ou b), preferente-mente a) e b), é caracterizada por pelo menos uma das propriedades c) ou d):

c) a célula geneticamente modificada é capaz de centrifugar abeta-alanina para fora da célula;

d) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico.

Uma célula geneticamente modificada dessa maneira, é capaz,mesmo ou em combinação com outras células, que podem reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico, de formar ácido 3-hidroxipropiônico apartir de carboidratos ou glicerina, pois a beta-alanina formada pode ser rea-gida para ácido 3-hidroxipropiônico.

Por um "tipo selvagem" de uma célula designa-se preferivelmen-te uma célula, cujo genoma está presente em um estado, tal como se origi-nou naturalmente pela evolução. O termo é usado tanto para toda a célula,como também para genes individuais. Pelo termo "tipo selvagem" não sãoincluídas, portanto, especialmente aquelas células ou aqueles genes, cujasseqüências de genes foram pelo menos parcialmente modificadas pelo ho-mem por meio de processos recombinantes.

O termo "atividade aumentada de uma enzima" é preferente-mente entendido como atividade intracelular aumentada. A formulação "umaatividade aumentada de uma enzima em relação ao seu tipo selvagem"compreende especialmente também uma célula, cujo tipo selvagem não a-presenta nenhuma ou pelo menos nenhuma atividade comprovável dessaenzima e que somente após o aumento da atividade enzimática, por exem-plo, através de superexpressão, mostra uma atividade comprovável dessaenzima. Nessa relação, o termo "superexpressão" ou a formulação "aumentoda expressão" usada nas seguintes concretizações, abrange também o ca-so, de que uma célula de partida, por exemplo, uma célula de tipo selvagem, não apresenta ou pelo menos não apresenta nenhuma expressão compro-vável e uma expressão da enzima é induzida apenas por processos recom-binantes.

Fundamentalmente, obtém-se um aumento da atividade enzimá-tica pelo fato, de se aumentar o número de cópias da seqüência genética oudas seqüências genéticas, que codificam para a enzima, usam um promotorforte ou utiliza um gene ou alelo, que codifica para uma enzima correspon-dente com uma atividade aumentada e eventualmente combina essas medi-das. Células geneticamente modificadas de acordo com a invenção, sãoproduzidas, por exemplo, através de transformação, transdução, conjugação ou por uma combinação desses métodos com um vetor, que contém o genedesejado, um alelo desse gene ou partes do mesmo e um vetor que possibi-lita a expressão do gene. A expressão heteróloga é obtida especialmentepela integração do gene ou dos alelos no cromossoma da célula ou por umvetor que replica extracromossalmente.

A DE-A 100 31 999 mostra uma sinopse sobre as possibilidadespara aumentar a atividade enzimática em células no exemplo da piruvatocarboxilase, que nesse caso, é introduzida como referência e cujo teor publi-cado com respeito às possibilidades para aumentar a atividade enzimáticaem células, forma uma parte da publicação da presente invenção.

A expressão das enzimas ou genes mencionados acima e detodos os mencionados a seguir, pode ser comprovada com auxílio da sepa-ração do gel de proteína mono- e bidimensional e identificação óptica sub-sequente da concentração de proteína com software de avaliação corres-pondente no gel. Caso o aumento de uma atividade enzimática se baseieexclusivamente em um aumento da expressão do gene correspondente, en-tão a quantificação do aumento da atividade enzimática pode ser determina-da de maneira simples através da comparação das separações de proteínamono- ou bidimensionais entre tipo selvagem e célula geneticamente modifi-cada. Um método usual para a preparação dos géis de proteína em bacté-rias corineformes e para a identificação das proteínas, é o procedimentodescrito por Hermann et al. (2001) Electrophoresis 22: 1712-1723. Do mes-mo modo, a concentração de proteína pode ser analisada pela hibridação deWestern-Blot com um anticorpo específico para a proteína a ser comprovada(Sambrook et al., Molecular Cloning: a Iaboratory manual, 2a edição ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., EUA, 1989) eavaliação óptica subsequente com software correspondente para a determi-nação da concentração (Lohaus e Mayer (1989) Biospectrum 5: 32-39;Lottspeich (1999) Angewandte Chemie 111: 2630-2647). A atividade de pro-teínas que ligam DNA pode ser medida por meio de ensaios "DNA-Band-Shift" (também designados como retardo do gel) (Wilson et al. (2001) Jour-nal of Bacteriology, 183: 2151-2155). O efeito de proteínas que ligam DNAsobre a expressão de outros genes pode ser comprovado por diversos mé-todos bem descritos do ensaio do gene repórter (Sambrook et al., MolecularCloning: a Iaboratory manual, 2a edição Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y. EUA, 1989). As atividades enzimáticas in-tracelulares podem ser determinadas de acordo com diversos métodos des-critos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19) : 5624-5627;Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freedberg etal. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823). Conquanto não sejammencionados métodos concretos para a determinação da atividade de umadeterminada enzima nas concretizações seguintes, a determinação do au-mento da atividade enzimática e também a determinação da diminuição deuma atividade enzimática é preferentemente efetuada por meio dos métodosdescritos em Hermann et al. (Electrophoresis 22: 1712-1723 (2001)), Lohauset al. (Biospektrum 5: 32-39 (1998)),Lottspeich (Angewandte Chemie 111:2630-2647 (1999)) e Wilson et al. (Journal of Bacteriology 183: 2151-2155(2001)).

Caso o aumento da atividade enzimática seja realizado atravésda mutação do gene endógeno, então tais mutações podem ser produzidasou não-direcionalmente, tal como, por exemplo, através de radiação UV ouatravés de produtos químicos que provocam mutação ou visadamente pormeio de métodos de engenharia genética, tais como deleção (ões), inserção(ões) e/ou permuta(s) de nucleotídeos. Através dessas mutações obtêm-se células geneticamente modificadas. Mutantes de enzimas particularmentepreferidos são especialmente também aquelas enzimas, que não podemmais ser ou pelo menos em comparação com a enzima do tipo selvagem,inibidas em reação de retroalimentação reduzida.

Caso o aumento da atividade enzimática é realizada pelo au- mento da expressão de uma enzima, então aumenta-se, por exemplo, o nú-mero de cópias dos genes correspondentes ou muta-se a região do promo-tor e regulação ou o ponto de ligação do ribossomo, que se encontra a mon-tante do gene da estrutura. Da mesma maneira agem os cassetes de ex-pressão, que são incorporados a montante do gene da estrutura. Através de promotores induzíveis, é adicionalmente possível, aumentar a expressão acada momento desejado. Mas além disso, também os chamados "aumenta-dores" podem ser atribuídos ao gene da enzima como seqüências regulado-ras, que através de um melhor efeito recíproco entre a polimerase de RNA eDNA, causam também uma alta expressão do gene. Do mesmo modo, atra- vés de medidas para prolongar a vida dos m-RNA, a expressão melhora.Além disso, igualmente, a atividade enzimática é reforçada devido ao impe-dimento da degradação da proteína enzimática. Nesse caso, os genes ouconstruções de genes estão presentes ou em plasmídeos com diferente nú-mero de cópias ou estão integrados e amplificados no cromossomo. Alterna- tivamente, além disso, uma superexpressão dos respectivos genes pode serobtida através da modificação da composição do meio e evolução da cultura.O técnico encontra instruções para esse fim, entre outros, em Martin et al.(Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), em Guerrero et al., (Gene 138: 35-41(1994)), Tsuchiya e Morinaga (Bio/Technology 6: 428-430 (1988), em Eik-manns et al. (Gene 102: 93-98 (1991)), na EP-A-0.472.869, na US4.601.893, em Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9: 84-87 (1991)), emReinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132(19944)), em LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175: 1001-1007 (1993)),no WO-A-96/15246, em Malumbres et al. (Gene 134: 15-24 (1993)), na JP-A-10-229891, em Jensen e Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58:191-195 (1998)) e em compêndios de genética e biologia molecular conheci-dos. As medidas mencionadas acima levam, bem como as mutações, a célu-las geneticamente modificadas.

Para aumentar a expressão dos respectivos genes, utilizam-se,por exemplo, plasmídeos epissomais. Como plasmídeos prestam-se especi-almente aqueles, que são replicados em bactérias corineformes. Inúmerosvetores de plasmídeos conhecidos, tais como, por exemplo, pZ1 (Menkel etal., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKExI(Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)) ou pHS2-1 (Sonnen et al., Gene107: 69-74 (1991) baseiam-se nos plasmídeos crípticos pHM1519, pBL1 oupGA1. Outros vetores de plasmídeos, tais como, por exemplo, aqueles quese baseiam em pCG4 (US 4.483.160) ou pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMSMicrobiology Letters 66: 119-124 (1990) ou pAG1 (US 5.158.891), podemser utilizados da mesma maneira.

Além disso, também são adequados aqueles vetores de plasmí-deos. com cujo auxílio pode ser aplicado o processo da amplificação do ge-ne através da integração no cromossoma, tal como foi descrito, por exemplo,por Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132(1994)) para a duplicação ou amplificação do hom-thrB-Operon. Neste mé-todo, todo o gene é clonado para um vetor de plasmídeo, que pode ser repli-cado em um hospedeiro (tipicamente Escherichia coli), mas não em umCorynebacterium glutamicum. Como vetores, tomam-se em consideração,por exemplo, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)),pK18mob ou pK19mob (Schàfer et al., Gene 145: 69-73 (1994), pGEM-T(Promega Corporation, Madison1 Wisconsin, EUA), pCR2.1-TOPO (Shuman,Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84 (1994)), pCR®Blunt (Invitro-gen, Groningen, Países Baixos), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bacterio-Iogy 173: 4510-4516) ou pBGS8 (Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)). Ovetor de plasmídeo, que contém o gene a ser amplificado, é transformado,em seguida, através de conjugação ou transformação, na cepa de Coryne-bacterium glutamicum desejada. O método de conjugação é descrito, porexemplo, por Scháfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60:756-759 (1994). Métodos para a transformação são descritos, por exemplo,por Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362(1988)), Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989)) e Tauchet al. (FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994)). Após recombinaçãohomóloga por meio de uma ocorrência "reticulação", a cepa resultante con-tém pelo menos duas cópias do respectivo gene.

No caso das células de acordo com a invenção, trata-se prefe-rentemente de células geneticamente modificadas. Essas podem ser proca-riontes ou eucariontes. Nesse caso, pode tratar-se de células de mamíferos(tais como, por exemplo, células do homem), de células vegetais ou de mi-cro-organismos, como células de levedura, fungos ou células de bactérias,sendo que os micro-organismos são particularmente preferidos e as célulasde bactérias e células de levedura, são as mais preferidas.

Células de bactérias, de levedura e de fungos adequadas deacordo com a invenção, são todas aquelas células de bactérias, de levedurae de fungos, que estão depositadas na Deutschen Sammlung von Mikroor-ganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) (Coleção Alemã de Micro-organis-mos e Culturas de Células). Braunschweig, Alemanha, como cepas de bac-térias do tipo selvagem. Células de bactérias adequadas pertencem aos gê-neros, que são mencionados em http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm.

Células de levedura adequadas de acordo com a invenção, pertencem aque-Ies gêneros, que são mencionados sob http://www.dsmz.de/species/veasts.htm e fungos adequados de acordo com a invenção, são aqueles, que sãomencionados sob http://www.dsmz.de/sDecies/funqi/htm. Células particular-mente preferidas dai, são aquelas dos gêneros Corynebacterium, Brevibac-terium, Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces,Saccharomyees, Bacillus, Eseherichia e Clostridium, sendo particularmentepreferidos os Bacillus flavum, Bacillus lactofermentum, Escherichia coli, Sac- charomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugo-sa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens e Pichia posto-ris e o mais preferido é o Corynebacterium glutamicum.

No caso da enzima Eia trata-se preferentemente de uma carbo-xilase, de modo particularmente preferido, de uma piruvato carboxilase (nú- mero EC 6.4.1.1), que catalisa a reação de piruvato para oxalacetato. Genespara piruvato carboxilases (genes pyc) são clonados, por exemplo, de Rhi-zobium etli (Dunn et al„ J. Bacteriol. 178: 5960-5970 (1996), vide também oWO-A-99/53035), Bacillus subtillis (banco de genes N0 de acesso Z97025),Mycobacterium tuberculosis (banco de genes N0 de acesso Z83018), Pseu-domonas fluorescens (WO-A-99/53035) e de Methanobacterium thermoauto-trophicum (Mukhopadhyay, J. Biol. Chem. 273: 5155-5166 (1998)) e sequen-ciados. Além disso, a atividade da piruvato carboxilase foi comprovada emBrevibacterium lactofermentum (Tosaka et al., Agric. Biol. Chem. 43: 1513-1519 (1979)) e em Corynebacterium glutamicum (Peters-Wendisch et al., Microbiology 143: 1095-1103 (1997)). A seqüência de nucleotídeos do genepyc é descrita também na DE-A-100 31 999, DE-A-198 31 609, US6.171.833, US 6.403.351 e na US 6.455.284. Piruvato carboxilases preferi-das de acordo com a invenção, são aquelas piruvato carboxilases, que sãocloradas por genes selecionados do grupo abrangendo PC, Pcx, CG1516, CG1516, pyc-1, PYC2, AAR162Cp, pyrl, accC-2, pycA, pycA2, pca,Cg 10689, pyc, pycB, accC, oadA, acc e accCI, sendo o gene pyc particular-mente preferido. Piruvato carboxilases preferidas de acordo com a invenção,são descritas especialmente também na US 6.455.284, US 6.171.833, US6.884.606, US 6.403.351, US 6.852.516 e US 6.861.246. Fundamentalmen- te, no entanto, cada um dos genes pyc só podem ser utilizados de origemconcebível, indiferente se de bactérias, leveduras, animais, fungos ou plan-tas. Além disso, podem ser usados todos os alelos do gene pyc, especial-mente também aqueles, que resultam da degeneração do código genéticoou por mutações de sentido de função neutra ("sense mutations").

Uma piruvato carboxilase particularmente preferida de acordocom a invenção, é aquele mutante, que é descrito em "A novel methodologyemploying Corynebacterium glutamicum genome information to generate anew L-lysine-producing mutant" (Onishi et al., Applied Microbiology and Bio-technology 58 (2): 217-223 (2002)). Nessa mutação, o aminoácido prolina foisubstituído na posição 458 por serina. O teor revelado dessa publicação comrespeito as possibilidades para a produção de mutantes de piruvato carboxi-Iase é introduzido, nesse caso, como referência e forma uma parte da publi-cação da presente invenção. Células particularmente preferidas de acordocom a invenção, são portanto, aquelas, que apresentam o mutante da enzi-ma descrito acima como proteína exógena ou aquelas, que apresentam se-qüências de DNA exógenas, que codificam para uma tal enzima e que ex-primem essa enzima em quantidade satisfatória.

A produção de células com atividade aumentada de piruvatocarboxilase é detalhadamente descrita, entre outros, na DE-A-100 31 999 etambém na DE-A-198 31 609. O teor revelado desses impressos com respei-to às diferentes possibilidades para aumentar a atividade da piruvato carbo-xilase em células, especialmente em bactérias do gênero Corynebacterium éincluído, nesse caso, igualmente como referência e forma uma parte da pu-blicação da presente invenção.

A determinação da atividade intracelular da piruvato carboxilaseé preferentemente efetuada de acordo com o processo descrito na disserta-ção de Petra Peters-Wendisch no Forschungszentrum Jülich GmbH "Anaple-rotische Reaktionen der PEP-CarboxyIase und der Pyruvat-Carboxylase imZentralstoffwechsel und bei der Aminosáureproduktion" (1996).

No caso da enzima Eib trata-se preferentemente de uma carbo-xilase, de modo particularmente preferido, de uma fosfoenolpiruvato carboxi-Iase (EC 4.1.1.31), que catalisa a reação de fosfoenolpiruvato para oxalace-tato. Fosfoenolpiruvato carboxilases preferidas de acordo com a invenção,são aquelas fosfoenolpiruvato carboxilases, que são codificadas pelos genesselecionados do grupo abrangendo F12M16.21, F14N22.13, K15M2.8, ppc,c1pA, pepC, capP, Cg11585 e pepC, sendo que o gene ppc é particularmen-te preferido. Genes ppc para fosfoenolpiruvato carboxilases do tipo selva-gem ou mutantes dessas enzimas são conhecidos, por exemplo, da US6.599.732, US 5.573.945, US 4.757.009, bem como da US 4.980.285. Aprodução de células com atividade aumentada de fosfoenolpiruvato carboxi-Iase é descrita, entre outros, na US 4.757.009. O teor revelado desse im-presso com respeito ao procedimento na superexpressão da fosfoenolpiru-vato carboxilase em micro-organismos, nesse caso, é igualmente incluído eforma uma parte da publicação da presente invenção. Além da superexpres-são da enzima, também podem ser aplicadas as outras medidas para o au-mento da atividade enzimática da fosfoenolpiruvato carboxilase, menciona-das em relação com a enzima Eia, entre outras, também a expressão de mu-tantes de enzimas. Mutantes particularmente preferidos nesta relação sãoaqueles, que não precisam de nenhuma ativação através da acetil-CoA e/ouque são inibidos em reação de retroalimentação com respeito ao ácido aspa-ragínico (para esse fim, vide especialmente a US 6.919.190). Fundamental-mente, em relação com a fosfoenolpiruvato carboxilase, também podem serutilizados genes correspondente de qualquer origem apenas concebível, in-diferente se de bactérias, leveduras, plantas, animais ou fungos. Além disso,também aqui podem ser utilizados todos os alelos do gene ppc, especial-mente também aqueles, que resultam da degeneração do código genéticoou através de mutações de sentido ("sense mutations") de função neutra.

A determinação da atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase épreferentemente efetuada de acordo com o processo descrito na dissertaçãode Petra Peters-Wendisch no Forschungszentrum Jülich GmbH "Anaplero-tische Reaktionen Corynebacterium glutamicum: Untersuchung zur Bedeu-tung der PEP-CarboxyIase und der Pyruvat-Carboxylase im Zentralstoffwe-chsel und bei der Aminosãureproduktion" (1996).

Sauer e Eikmanns (FEMS Microbiology Reviews 29: 765-794(2005)) mostram um resumo sobre as fosfoenolpiruvato carboxilases e piru-vato carboxilases.No caso da enzima E2 trata-se preferentemente de uma descar-boxilase, de modo particularmente preferido, de uma glutamato descarboxi-Lase ou de uma aspartato descarboxilase, sendo a mais preferida a 1-aspartato-1-descarboxilase (número EC 4.1.1.11), que é codificada pelo ge-ne panD. A aspartato descarboxilase catalisa a reação de aspartato parabeta-alanina. Genes para a aspartato descarboxilase (gene panD), entre e-Les, de Escherichia coli (FEMS Microbiology Letters 143: 247-252 (1996)),Photorhabdus Iuminescens subsp. Iaumondii1 Mycobacterium bovis subsp.bovis, bem como de inúmeros outros micro-organismos, já foram clonados esequenciados. Especialmente a seqüência de nucleotídeos do gene panD deCorynebacterium glutamicum está descrita na DE-A-198 55 313. Fundamen-talmente, podem ser utilizados genes panD de qualquer origem apenas con-cebível, indiferente se de bactérias, leveduras, plantas, animais ou fungos.Além disso, podem ser utilizados todos os alelos do gene panD, especial-mente também aqueles, que resultam da degeneração do código genéticoou de mutações de sentido (sense mutations) de função neutra.

Uma aspartato descarboxilase particularmente preferida de a-cordo com a invenção, além da aspartato descarboxilase de Corynebacteri-um glutamicum, é o mutante de Escherichia coli DV9 (Vallari e Rock, Journalof Bacteriology 164: 136-142 (1985)). O teor revelado dessa publicação comrespeito ao mutante mencionado acima é incluído, nesse caso, como refe-rência e forma uma parte da publicação da presente invenção.

A produção de células com atividade aumentada de aspartatodescarboxilase é detalhadamente descrita, entre outros, na DE-A-198 55314. Do mesmo modo, o teor revelado desses impressos com respeito àsdiferentes possibilidades para aumentar a atividade da aspartato descarboxi-lase em células, especialmente em bactérias do gênero Corynebacterium, éincluído como referência e forma uma parte da publicação da presente in-venção. Células particularmente preferidas de acordo com a invenção, sãoaquelas, que apresentam o mutante de enzima DV9 de Escherichia coli des-crito acima ou então, panD de Corynebacterium glutamicum ou aquelas, queapresentam seqüências de DNA, que codificam para uma dessas enzimas eque exprimem essa enzima em quantidade satisfatória.

A determinação da atividade da aspartato descarboxilase é efe-tuada de acordo com o processo de teste descrito por Dusch et al. (Appliedand Environmental Microbiology 65 (4): 1530-1539 (1999)) no capítulo com otítulo "Aspartate decarboxylase activity assay".

Conquanto se trate no caso das células de acordo com a inven-ção, de uma células de Corynebacterium glutamicum geneticamente modifi-cada, pode ser satisfatório que apenas a atividade da enzima E2 seja au-mentada, pois já o tipo selvagem dessas células apresenta uma atividade depiruvato carboxilase comparativamente alta. Contudo, prefere-se também nocaso da utilização de Corynebacterium glutamicum, que na célula de acordocom a invenção, tanto a atividade da enzima Eia, como também a atividadeda enzima E2 o tanto a atividade da enzima Eibl como também a atividadeda enzima E2 seja aumentada.

Além disso, as células de acordo com a invenção, são caracteri-zadas pelo fato, de que além das propriedades a) ou b), preferentemente a)e b), elas são caracterizadas por pelo menos uma das propriedades c) ou d):

a) a célula geneticamente modificada é capaz de centrifugar abeta-alanina para fora da célula;

b) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico.

O termo "ácido 3-hidroxipropiônico", tal como é utilizado aqui,abrange a forma protonizada do ácido 3-hidroxipropiônico do mesmo modocomo a forma desprotonizada do ácido 3-hidroxipropiônico (= 3-hidro-xipropionato) e misturas da forma protonizada e desprotonizada. O termo"centrifugar para fora" compreende tanto o transporte ativo, como também opassivo de beta-alanina para fora da célula para o meio que circunda a célu-la.

Células de acordo com a invenção, as quais preenchem a condi-ção c), são preferentemente caracterizadas pelo fato, de apresentarem en-zimas de transporte endógenas e/ou exógenas, preferentemente exógenasna membrana celular, as quais seletiva ou não seletivamente, de preferên-cia, seletiva, ativa ou passivamente, eventualmente na permuta por ou juntocom íons, tais como sódio, potássio ou cloro, podem centrifugar beta-alaninaatravés da membrana celular para fora, isto é, para a região externa da célu-la (= efluxo da beta-alanina da célula). Nesse caso, é particularmente prefe-rível de acordo com a invenção, que a célula geneticamente modificada a-presente um efluxo preferentemente aumentado em pelo menos 10%, demodo particularmente preferido em pelo menos 25%, além disso, preferen-temente em pelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, empelo menos 75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e domodo mais preferido possível, em pelo menos 500%, de modo máximo pos-sível até 5.000%, de modo particularmente preferido até 2.500% de beta-alanina da célula, em comparação com seu tipo selvagem. Nesse caso, umefluxo aumentado em 10% significa, que a célula geneticamente modificadacom as mesmas condições, especialmente com a mesma concentração debeta-alanina intracelular e extracelular em um intervalo de tempo definido, écapaz de centrifugar em torno de 10% mais beta-alanina para fora da célulaem comparação com seu tipo selvagem. Preferentemente, o efluxo aumen-tado é realizado por um aumento da atividade das enzimas de transportemencionadas acima, em que o aumento pode ser novamente efetuado atra-vés de técnicas já mencionadas em relação com as enzimas Eia, Eib e E2(mutação da enzima de transporte ou aumento da expressão do gene daenzima de transporte).

Enzimas de transporte preferidas nessa relação são, por exem-plo, as chamadas proteínas de resistência a múltiplos fármacos ("multi-drug-resistance") (proteínas MDR), por exemplo, com os genes ebrA e ebrB, bemcomo os chamados transportadores de efluxo de múltiplos fármacos ("multi-drug-efflux transportei"), em que os transportadores de efluxo de múltiplosfármacos, por exemplo, com os genes bit e bmr, são particularmente preferi-dos. Sistemas de transporte adequados para beta-alanina também são des-critos no "Handbook of Corynebacterium glutamicum", editor L. Eggeling eM. Bott1 CRC Press, Boca Raton, EUA, 2005, capítulo IV, "Genomic Analy-ses of Transporter Proteins in Corynebacterium glutamicum and Corynebac-terium efficiens", Β. Winnen, J. Felce e Μ. Η. Saier, Jr., páginas 149-186.Outros sistemas de transporte adequados para bela-alanina, especialmenteaqueles, que são codificados pelo gene cycA, são descritos em Schneider etal. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 65 (5): 576-582 (2004)). Além disso, siste-mas de transporte adequados para beta-alanina são descritos em Andersone Thwaites (J. Cell. Physiol. 204(2): 604-613 (2005)), Brechel e King (Bio-chem. J. 333: 565-571 (1998)), Guimbal et al. (Eur. J. Biochem. 234 (3): 794-800 (1995)), Munck e Munck (Biochim. Biophys. Acta 1235 (1): 93-99 (1995))e Shuttleworth e Goldstein (J. Exp. Zool. 231 (1): 39-44 (1984)).

Células de acordo com a invenção, que satisfazem a condiçãod), são capazes de reagir a beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico.Nesse caso, são concebíveis pelo menos duas variantes.

De acordo com a variante A, as células podem reagir a beta-alanina através de beta-alanil-CoA, acrilil-CoA e hidroxipropionil-CoA paraácido 3-hidroxipropiônico. Nesta relação é particularmente preferível, que acélula apresente uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%, de modo parti-cularmente preferido, em pelo menos 25%, além disso, preferentemente empelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo maispreferido possível, em pelo menos 500%, no máximo preferentemente até5.000%, de modo particularmente preferido até 2.500% de pelo menos uma,preferentemente de todas as seguintes enzimas E3 até Eq.

- de uma enzima E3, que catalisa a reação de beta-alanina parabeta-alanil-coenzima A,

- de uma enzima E4, que catalisa a reação de beta-alanil-coenzima A para acrilil-coenzima A,

- de uma enzima E5, que catalisa a reação de acrilil-coenzima Apara 3-hidroxipropionil-coenzima A,

- de uma enzima E6, que catalisa a reação de 3-hidroxipropionil-coenzima A para ácido 3-hidroxipropiônico.

Células geneticamente modificadas particularmente preferidasde acordo com a invenção, são nesse caso, aquelas, nas quais, eventual-mente adicionalmente ao aumento de pelo menos uma das atividades enzi-máticas Ei ou Eib, bem como E2, a atividade das seguintes enzimas ou com-binações de enzimas é aumentada: E3, E4, E5l E6, E3E4, E3E5, E3E6, E4E5,E4E6, E5E6, E3E4E5l E3E4E61 E3E5E6 ou E3E4E5E6.

O aumento da atividade enzimática das enzimas E3 até E6 podeser efetuada também aqui, através das técnicas mencionadas em relaçãocom as enzimas Eia, E1a e E2, tal como mutação ou aumento da expressãoda enzima.

Além disso, nessa relação é preferível, que a enzima

E3 seja uma coenzima A transferase (EC 2.8.3.1) ou coenzima Asintetase, preferentemente uma coenzima A transferase,

E4 uma beta-alanil-coenzima A-amônio Iisase (EC 4.3.1.6)E5 uma 3-hidroxipropionil-coenzima A desidratase (EC 4.2.1.-,especialmente EC 4.2.1.17) e

E6 uma coenzima A transferase (EC 2.8.3.1), 3-hidroxipropionil-coenzima A hidrolase (EC 3.1. 2. -) ou 3-hidroxibutiril-coenzima A hidrolase(EC 3.1.2.4), preferentemente uma coenzima A transferase.

Enzimas preferidas com uma atividade de coenzima-A transfera-se são aquelas de Megasphaera elsidenii, Clostridium propionicum Clostridi-um kluyeveri e também de Escherichia coli. Como exemplos de uma se-qüência de DNA que codifica para uma CoA transferase, sejam menciona-dos neste ponto a seqüência de Megasphaera elsidenii designada no WO-A-03/062173 com a SEQ ID n°: 24. Enzimas ademais preferidas são aquelasvariantes da CoA transferase, que são descritas no WO-A-03/062173.

Enzimas adequadas com uma atividade de beta-alanil-CoenzimaA-amônio Iiase são, por exemplo, aquelas de Clostridium propionicum. Se-qüências de DNA, as quais podem codificar para uma tal enzima, podem serobtidas, por exemplo, a partir de Clostridium propionicum, tal como descritono exemplo 10 do WO-A-03/062173. A seqüência de DNA1 que codifica paraa beta-alanil-Coenzima A-amônio Iiase de Clostridium propionicum, é men-cionada no WO-A-03/062173 como SEQ ID n°: 22.Enzimas adequadas com uma atividade de 3-hidroxipropil-coenzima A desidratase são especialmente aquelas enzimas, que são codi-ficadas por genes selecionados do grupo abrangendo ECHS1, EHHADH,HADHA1 CG4389, CD6543, CG6984, CD8778, ech-1, ech-2, ech-3, ech-5,ech-6, ech-7, FCAALL. 314, FCAALL.21, FOX2, ECII2, ECII1 paaF, paaG,yfcX, fadB, faoA, fadBlx, phaB, echA9, echA17, fad-1, fad-2, fad-3, paaB,echA7, dcaE, hcaA, RSp0671, RSp0035, RSp0648, RSp0647, RS03234,RS03271, RS04421, RS04419, RS02820, RS02946, paaG2, paaG1, ech,badK, crt, ydbS, eccH2, pimF, paaG3, fabJ-1, caiD-2, fabJ-2, ysiB, yngF, yusL, phaA, phaB, fucA, caiD, ysiB, echA3, echA5, echA6, echA7, echA8,echA14, echA15, echA16, echA17, echA18.1, echA19, echA20, echA21, e-chA2, echA4, echA9, echA11, echAIO, echA12, echA13, echA18, echA1,fadB-1, echA8-1, echA12-2, fadB-2, echA16-2, Cg10919, fadB1, SCF41.23,SCD10.16, SCK13.22, SCP8.07c, StBAC16H6.14, SC5F2A15, SC6A5.38, faoA, hbdl, crt, hbd-1, hbd-2, hbd-5, fad-4, hbd-10, fad-5, hbdl, paaF-1, pa-aF-2, paaF-3 paaF-4, paaF-5, paaF-6 e paaF-7. Como exemplos de 3-hidroxipropionil-coenzima A desidratase adequadas de acordo com a inven-ção, sejam mencionadas especialmente aquelas de Chloroflexus aurantia-cus, Candida rugosa, Rhodosprillium rubrum e Rhodobacter capsulates. Umexemplo particular de uma seqüência de DNA que codifica para uma 3-hidroxipropionil-Coenzima A desidratase é descrita, por exemplo, no WO-A-02/42418 como SEQ ID n° 40.

A produção de células geneticamente modificadas, nas quaispelo menos uma, preferentemente todas as atividades enzimáticas E3 até E6 foi ou foram aumentadas, é descrita, por exemplo, nos exemplos do WO-A-02/42418 e do WO-A-03/062173. O teor relatado desses dois impressos comrespeito ao aumento das atividades dessas enzimas nas células é introduzi-do, nesse caso, como referência e forma uma parte da publicação da pre-sente invenção.

De acordo com a variante B, as células podem reagir a beta-alanina através de semialdeído de ácido malônico para ácido 3-hidroxipro-piônico. Nesta relação, é particularmente preferível, que a célula apresenteuma atividade aumentada em comparação com seu tipo selvagem, preferen-temente aumentada em pelo menos 10%, de modo particularmente preferidoe pelo menos 25%, além disso, preferentemente em pelo menos 50%, alémdisso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos 75%, além disso, pre-ferentemente em pelo menos 100% e do modo mais preferido possível empelo menos 500%, no máximo preferentemente até 5.000%, de modo parti-cularmente preferido até 2.500%, de pelo menos uma das, preferentementedas duas enzimas E7 e E8:

- de uma enzima E7, que catalisa a reação de beta-alanina parasemialdeído de ácido malônico,

- de uma enzima E8, que catalisa a reação de semialdeído deácido malônico para ácido 3-hidroxipropiônico.

Nesse caso, células geneticamente modificadas particularmentepreferidas de acordo com a invenção, são aquelas, nas quais, eventualmen-te adicionalmente ao aumento de pelo menos uma das atividades enzimáti-cas Eia ou Eib, bem como E2, a atividade das seguintes enzimas ou combi-nações de enzimas é aumentada: E7, E8 e E7E8.

O aumento da atividade enzimática das enzimas E7 e E8 podeser efetuado também aqui, através de técnicas mencionadas em relaçãocom a enzima E1a, Eib e E2, tal como mutação ou aumento da expressãoenzimática.

Nesta relação, prefere-se, além disso, que a enzima

E7 seja uma beta-alanin-2-oxoglutarato aminotransferase (EC2.6.1.19) ou uma taurin-2-oxoglutarato transaminase (2.6.1.55), preferente-mente uma beta-alanin-2-oxoglutarato aminotransferase e

E8 seja uma 3-hidroxipropionato desidrogenase (EC 1.1.1.59) ou3-hidroxi-butirato desidrogenase (EC 1.1.1.30), preferentemente, no entanto,uma 3-hidroxipropionato desidrogenase (EC 1.1.1.59).

Os genes da beta-alanin-2-oxoglutarato aminotransferase são,por exemplo, conhecidos de Neurospora crassa ("Über die beta-Alanin-alpha-Ketoglutarat-Transaminase", Aurich und Hoppe-Seyler's, Z. Physiol.Chem. 326: 25-33 (1961)). Outras informações em relação aos genes dessaenzima de outros micro-organismos, podem ser especialmente deduzidas dabase de dados KEGG GENE (KEGG = Kyoto Encyclopedia of Genes andGenomes). Os genes da 3-hidroxipropionato desidrogenase o da 3-hidroxibutirato desidrogenase dos mais diversos micro-organismos tambémpodem ser deduzidos da Base de dados KEGG GENE.

Quando as células de acordo com a invenção satisfazem a exi-gência d), então é preferível, além disso, que a célula apresente um efluxodiminuído em comparação com seu tipo selvagem, preferentemente diminuí-do em pelo menos 10%, de modo particularmente preferido em pelo menos25%, além disso, preferentemente em pelo menos 50%, além disso, de mo-do ainda mais preferido, em pelo menos 75%, além disso, preferentementeem pelo menos 100% e do mais preferido possível em pelo menos 500%, nomáximo preferentemente até 5.000%, de modo particularmente preferido até2.500%, de beta-alanina. Nesse caso, um efluxo diminuído em 10% significa,que a célula geneticamente modificada em comparação com seu tipo selva-gem com as mesmas condições, especialmente com a mesma concentraçãode beta-alanina intracelular e extracelular, em um intervalo de tempo defini-do, é capaz de centrifugar menos beta-alanina para fora da célula. Preferen-temente, o efluxo diminuído é realizado por uma diminuição da atividade dasenzimas de transporte mencionadas acima, sendo que a diminuição podeser efetuada através da mutação da enzima de transporte ou diminuição daexpressão do gene da enzima de transporte. Também pode ser vantajoso,que sejam utilizadas como células, que satisfazem a condição d), aquelascélulas, cujo tipo selvagem não é capaz de centrifugar beta-alanina para forada célula.

As células de acordo com a invenção, são capazes, sozinhas(quando a condição d) está satisfeita) ou então em combinação com outrosmicro-organismos que podem produzir ácido 3-hidroxipropiônico a partir debeta-alanina (quando a condição c) está satisfeita), de formar ácido 3-hidroxipropiônico a partir de piruvato.

Partindo do piruvato como ponto de partida para a produção dabeta-alanina, são concebíveis, então, novamente, duas diferentes formas deconcretização das células de acordo com a invenção.

De acordo com a primeira forma de concretização das células deacordo com a invenção, essas são capazes de produzir o piruvato necessá-rio para a produção da beta-alanina também a partir de glicerina como fontede carbono.

Nessa relação é particularmente preferível, que a célula de a -cordo com a invenção, apresente uma atividade aumentada em comparaçãocom seu tipo selvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%,de modo particularmente preferido em pelo menos 25%, além disso, prefe-rentemente em pelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido,em pelo menos 75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% edo modo mais preferido possível, em pelo menos 500%, no máximo, prefe-rentemente em até 5.000%, de modo particularmente preferido, em até2.500%, de pelo menos uma, preferentemente de todas as seguintes enzi-mas Eg até E22'.

- de uma enzima Eg, que facilita a difusão de glicerina para ointerior da célula,

- de uma enzima E10, que catalisa a reação de glicerina para gli-cerol-3-fosfato,

- de uma enzima En, que catalisa a reação de glicerol-3-fosfatopara fosfato de di-hidroacetona,

- de uma enzima E12, que catalisa a transferência de enxofrepara o receptor de enxofre tioredoxina 1,

- de uma enzima E13, que catalisa a hidrólise de fosfolipídeoscom formação de álcoois e glicerina,

- de uma enzima E14, que catalisa o transporte de glicerol-3-fosfato para o interior da célula na permuta por fosfato;

- de uma enzima E15, que catalisa a reação de fosfato de di-hidroxiacetona para 3-fosfato de glicerol aldeído,

- de uma enzima Ei6, que catalisa a reação de 3-fosfato de glice-rol aldeído para 1,3-bifosfoglicerato,

- de uma enzima Ei7, que catalisa a reação de 1,3-bifosfoglice-rato para 3-fosfoglicerato,

- de uma enzima Eie, que catalisa a reação de 3-fosfogliceratopara 2-fosfoglicerato,

- de uma enzima E19, que catalisa a reação de 2-fosfogliceratopara fosfoenolpiruvato,

- de uma enzima E2o, que catalisa a reação de fosfoenolpiruvatopara piruvato,

- de uma enzima E2i, que catalisa a reação de glicerina para di-hidroxiacetona,

- de uma enzima E22, que catalisa a reação de di-hidroxiacetonapara fosfato de di-hidroxiacetona.

Nesse caso, células geneticamente modificadas particularmentepreferidas de acordo com a invenção, são aquelas, nas quais, eventualmen-te adicionalmente ao aumento de uma ou várias das atividades enzimáticasEia ou Eib, bem como E2 e eventualmente de uma ou várias das atividadesenzimáticas E3 até Ee ou E7 e Es, a atividade das seguintes enzimas oucombinações de enzimas é aumentada: Eg, Ei0, E11, Ei2, Ei3, Eu, Ei5, Ei6,E-I7, E18, Ei9i E20, E2i, E22, E10Eii, sendo que um aumento de uma ou váriasdas atividades enzimáticas selecionadas do grupo consistindo em E9, E10,Eu, E13, E14, E2i e E22 é particularmente preferido e um aumento das ativida-des enzimáticas Ei0 e En é o mais preferido possível.

Nessa relação, é especialmente preferido, que a enzima

E9 é uma aquagliceroporina (facilitador de glicerol), que é prefe-rentemente codificada pelo gene glpF,

E10 é uma glicerol quinase (EC 2.7.1.30), que é preferentementecodificada pelo gene glpK,

E11 é uma glicerol-3-fosfato desidrogenase (EC 1.1.99.5), prefe-rentemente uma glicerol-3-fosfato desidrogenase dependente de FAD1 emque a glicerol-3-fosfato desidrogenase é preferentemente codificada pelogene glpA, pelo gene glpB, pelo gene glpC ou pelo gene glpD, de modo par-ticularmente preferido, pelo gene glpD,

E12 é uma transferase de enxofre, que é codificada pelo genegipE,

Ε12 é glicerolfosfato diesterase (EC 3.1.4.46), que é preferente-mente codificada pelo gene glpQ,

Eu é uma glicerol-3-fosfato permease, que é preferentementecodificada pelo gene glpT,

E15 é uma triose-fosfato isomerase (EC 5.3.1.1),Ei6 é uma gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.12),E17 é uma fosfoglicerato quinase (EC 2.7.2.3),Eis é uma fosfoglicerato mutase (EC 5.4.2.1),Ei9é uma enolase (EC 4.2.1.11),

E2O é uma piruvato quinase (EC 2.7.1.40)E21 é uma glicerol desidrogenase (EC 1.1.1.6), que é preferen-temente codificada pelo gene gldA e

E22 é uma di-hidroxiacetona quinase (EC 2.7.1.29), que é prefe-rentemente codificada pelo gene dhaK.

As seqüências de genes das enzimas mencionadas acima, sãoconhecidas na literatura e podem ser deduzidas, por exemplo, da Base dedados KEGG GENE, dos bancos de dados do National Center for Biotechno-Iogy Information (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, EU-A) ou do banco de dados da seqüência de nucleotídeos da European Mole-cular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemanha ou Cambridge1Reino Unido). Além disso, o gene gap que codifica a gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), ogene tpi que codifica para a triose-fosfato isomerase (Eikmanns (1992),Journal of Bacteriology 174: 6076-6086) e o gene pgk que codifica para a 3-fosfoglicerato quinase (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086), são conhecidos de outras fontes.

Células geneticamente modificadas, nas quais pelo menos uma,de modo particularmente preferido, pelo menos duas, além disso, preferen- temente pelo menos três e do modo mais preferido, todas as atividades dasenzimas Eg até E22 foi aumentada pelas técnicas acima em relação com asenzimas E1a, E1b e E2 (mutação da enzima ou aumento da expressão da en-zima) podem ser produzidas com os genes conhecidos das enzimas Eg atéE22· Essas células estão em condição, de serem cultivadas na presença deglicerina como única fonte de carbono (ou então junto com carboidratos co-mo outra fonte de carbono).

Além do aumento de uma ou várias das atividades das enzimasE9 até E22, nessa relação também pode ser vantajoso, que as células de a-cordo com a invenção, exprimam os seguintes genes, preferencialmente demaneira heteróloga:

- o gene glpG ou o gene b3424,

- o gene glpX ou o gene 3925,

- o gene dhaR, o gene ycgU ou o gene b1201,

- o gene fsa, o gene mipB, o gene ybiZ ou o gene B0825,

- o gene talC, o gene fsaB, o gene yijG ou o gene b3946.

As seqüências de nucleotídeos desses genes podem ser nova-mente deduzidas de Base de dados KEGG GENE, dos bancos de dados doNational Center for Biotechnology Information (NCBI) do National Library ofMedicine (Bethesda, MD, EUA) ou do banco de dados da seqüência de nu-cleotídeos do European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidel-berg, Alemanha ou Cambridge1 Reino Unido).

De acordo com uma segunda forma de concretização das célu-las de acordo com a invenção, essas estão em condição de não obter o pi-ruvato necessário para a produção da beta-alanina ou pelo menos apenasem pequena extensão a partir de glicerina. Neste caso, a produção do piru-vato nas células é efetuada principalmente através da glicólise. Tais célulaspodem ser cultivadas em um meio nutritivo, o qual contém carboidratos, talcomo, por exemplo, glicose, como fonte de carbono.

Nesse caso, é preferível, que as células de acordo com a inven-ção, eventualmente além de uma atividade aumentada de uma, preferente-mente de todas as enzimas E9 até E22 mencionadas acima, apresentem umaatividade aumentada em comparação com seu tipo selvagem, aumentadaem pelo menos 10%, de modo particularmente preferido em pelo menos25%, além disso, preferentemente em pelo menos 50%, além disso, de mo-do ainda mais preferido, em pelo menos 75%, além disso, preferentementeem pelo menos 100% e do modo mais preferido possível, em pelo menos500%, do modo máximo, preferentemente até 5.000%, de modo particular-mente preferido até 2.500%, de pelo menos uma, preferentemente de todasas seguintes enzimas E16 até E20 e E23 até E27:

- de uma enzima E23, que facilita a difusão de glicerina para ointerior da célula,

- de uma enzima E24, que catalisa a reação de glicose para a-D-glicose-6-fosfato,

- de uma enzima E25, que catalisa a reação de a-D-glicose-6-fosfato para p-D-frutose-6-fosfato,

- de uma enzima E26, que catalisa a reação de p-D-frutose-6-fosfato para β-D-frutose-l ,6-bifosfato,

- de uma enzima E27, que catalisa a reação de p-D-frutose-1,6-bifosfato para glicerol aldeído-3-fosfato e fosfato de di-hidroxiacetona,

- de uma enzima E16, que catalisa a reação de glicerol aldeído-3-fosfato para 1,3-bifosfoglicerato,

- de uma enzima E17, que catalisa a reação de 1,3-bifosfogli-cerato para 3-fosfoglicerato,

- de uma enzima E1S, que catalisa a reação de 3-fosfogliceratopara 2-fosfoglicerato,

- de uma enzima Eig, que catalisa a reação de 2-fosfogliceratopara fosfoenolpiruvato e

- de uma enzima E20, que catalisa a reação de fosfoenolpiruvatopara piruvato.

Células geneticamente modificadas particularmente preferidasde acordo com a invenção, neste caso, são aquelas, nas quais eventualmen-te adicionalmente ao aumento de um ou várias das atividades das enzimasEia ou E1b e eventualmente de uma ou várias das atividades das enzimas E3até E6 ou E7 e E8, a atividade das seguintes enzimas ou combinações deenzimas é aumentada: Ei6, Ei7, Ei8, E19, E2o, E23, E24, E25, E26, E27 eE16Ei7E18Ei9E20E23E24E25E26E27.Nesta relação, é especialmente preferível, que a enzimaE23 seja um transportador de glicose, preferentemente um trans-portador de glicose codificado por um gene selecionado do grupo abrangen-do glutl, gluP o fucP ou uma glicose permease (2.7.1.69),

E24 seja uma glicoquinase (2.7.1.2),

E25 seja uma glicose-6-fosfato isomerase (EC 5.3.1.9),

E26 seja uma 6-fosfofrutose quinase (EC 2.7.1.11),

E27 seja uma frutose-bisfosfato aldolase (EC 4.1.2.13),

E16 seja uma gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (EC 1.2.1.12),

E17 seja uma fosfoglicerato quinase (EC 2.7.2.3),Eis seja uma enolase (EC 4.2.1.11) eE20 seja uma piruvato quinase (EC 2.7.1.40).As seqüências de nucleotídeos desses genes podem ser nova-mente deduzidas da Base de dados KEGG GENE, dos bancos de dados doNational Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library ofMedicine (Bethesda, MD, EUA) ou do banco de dados da seqüência de nu-cleotídeos da European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidel-berg, Alemanha ou Cambridge, Reino Unido).

Além disso, em relação com essa segunda forma de concretiza-ção da célula de acordo com a invenção, é preferível, que além das enzimasEia ou E^ e/ou E2 mencionadas acima, bem como eventualmente pelo me-nos uma das enzimas E3 até Εβ, E7 ou E8, bem como Ei2 até E27, também aatividade de enzimas do sistema fosfotransferase tenha sido aumentada.Nessa relação, prefere-se especialmente, que os genes ptsl e ptsM sejamreforçados, preferentemente superexprimidos nas células de acordo com ainvenção. Nesta relação, faz-se referência especialmente a US 6.680.187 e6.818.432, cujo teor revelado com respeito às possibilidades para a super-expressão dos genes ptsl ou ptsM foi introduzido, nesse caso, como refe- rência e forma uma parte da publicação da presente invenção.

Além disso, nas células de acordo com a invenção, independen-te do fato se elas utilizam glicerina ou glicose como fonte de matéria nutritivaprimária e também independente do fato, se elas formam ácido 3-hidroxipro-piônico sozinhas ou em combinação com outras células através de semial-deído de ácido malônico ou através de beta-alanil-coenzima A1 acrilil-coenzima A e 3-hidroxipropionil-coenzima A, a atividade da aspartato amino-transferase (EC 2.6.1.1.A) pode estar aumentada. A seqüência do gene cor-respondente (aspB) pode ser deduzida, entre outros, da Base de dadosKEGG GENE.

Além disso, nas células de acordo com a invenção, é preferívelreduzir a atividade de enzimas,

E28 que catalisam a reação de oxaloacetato para fosfoenolpiru-vato, tal como, por exemplo, a fosfoenolpiruvato-carbóxi quinase (EC4.1.1.49) (vide também a DE-A-199 50 409),

E29 que catalisam a reação de piruvato para acetato, tal como,por exemplo, a piruvato quinase (EC 1.2.2.2) (vide também a DE-A-199 51 975),E30 que catalisam a reação de a-D-glicose-6-fosfato para β-D-frutose-6-fosfato (vide também a US 09/396.478),

E31 que catalisam a reação de beta-alanina para carnosina, co-mo, por exemplo, a carnosina sintase (EC 6.3.2.11),

E32 que catalisam a reação de beta-alanina para alfa-alanina,como, por exemplo, a alanina-aminomutase,

E33 que catalisam a reação de beta-alanina para (R)-panto-tenato, como, por exemplo, a pantotenato-beta-alanina Iigase (EC 6.3.2.1),

E34 que catalisam a reação de beta-alanina para N-carbonil-beta-alanina, como, por exemplo, a beta-ureidopropionase (EC 3.5.1.6),

E35 que catalisam a reação de piruvato para lactato, como, porexemplo, a I-Iactato desidrogenase (EC 1.1.1.27) ou a lactato-malato-trans-hidrogenase EC 1.1.99.7),

E36 que catalisam a reação de piruvato para acetil-coenzima A,como, por exemplo, a piruvato desidrogenase (EC 1.2.1.51),

E37 que catalisam a reação de piruvato para acetilfosfato, como,por exemplo, a piruvato oxidase (EC 1.2.3.3),

E38 que catalisam a reação de piruvato para acetato, como, porexemplo, a piruvato desidrogenase (EC 1.2.2.2),

E39 que catalisam a reação de piruvato para fosfoenolpiruvato,como, por exemplo, a fosfoenolpiruvato sintase (EC 2.7.9.2) ou a piruvato-fosfato diquinase (EC 2.7.9.1) e/ou

E40 que catalisam a reação de piruvato para alanina, como, porexemplo, a alanina transaminase (2.6.1.2) ou a alanina-oxoácido transami-nase (EC 2.6.1.12),

preferentemente em pelo menos 10%, de modo particularmentepreferido em pelo menos 25%, além disso, preferentemente em pelo menos50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos 75%, alémdisso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo mais preferido pos-sível, em pelo menos 500%, no máximo preferentemente até o máximo de5.000%, particularmente até o máximo de 2.500%, sendo particularmentepreferida a redução das enzimas E2e, E30, E33, E35, E36 e E40.

O termo "reduzir" nessa relação, descreve a redução ou desli-gamento da atividade intracelular de uma ou mais enzimas em uma célula,que são codificadas pelo DNA correspondente, em que se utiliza, por exem-plo, um promotor fraco ou se utiliza um gene ou alelo, que codifica para umaenzima correspondente com uma baixa atividade ou se inativa o gene cor-respondente e se combinam eventualmente essas medidas.

De acordo com uma forma de concretização particular das célu-las de acordo com a invenção, pode ser especialmente conveniente, promo-ver visadamente a via de pentose-fosfato, por exemplo, aumentando a ativi-dade da glicose-6-fosfato desidrogenase (EC 1.1.1.49) e da 6-fosfogluconatodesidrogenase (EC 1.1.1.44) e inibindo simultaneamente a glicólise, por e-xemplo, reduzindo a atividade da glicose-6-fosfato isomerase, tal como estaé descrita no WO-A-01/07626.

De acordo com uma forma de concretização particular da célulade acordo com a invenção, nesta a atividade da glutamato desidrogenase(EC 1.4.1.4) é aumentada por uma das técnicas mencionadas em relaçãocom a enzima Eia, Eib e E2. Os genes dessa enzima de inúmeros micro-organismos também podem ser deduzidos na Base de dados KEGG GENE.Além disso, na US 6.355.454 e no WO-A-OO/53726 são descritos genes daglutamato desidrogenase e possibilidades para a superexpressão dessa en-zima. O teor revelado desses impressos com respeito à execução da super-expressão da glutamato desidrogenase em células, é incluída nesse caso,como referência e forma uma parte da publicação da presente invenção.

Além disso, no caso das células geneticamente modificadas, deacordo com a invenção, é preferível, que essa beta-alanina e alfa-alanina seformem na proporção de peso de pelo menos 2 :1, de modo particularmentepreferido 3: 1 e além disso, preferentemente pelo menos 4:1. Nesse caso,uma formação de beta-alanina e alfa-alanina na proporção de peso de pelomenos 2 : 1 significa, que as células formam, formam preferentemente pelomenos duas vezes mais beta-alanina como alfa-alanina dentro de um espa-ço de tempo de 29 horas a 37°C e liberam para o meio nutritivo que envolveas células.

Nessa relação é particularmente preferível, que nessas célulasde acordo com a invenção,

- a atividade da glutamato desidrogenase (EC 1.4.1.4) é aumen-tada e

- a atividade da piruvato carboxilase (EC 6.4.1.1) é aumentada e

- a atividade da aspartato descarboxilase (EC 4.1.1.11) é au-mentada e

- a atividade da glicose-6-fosfato isomerase (EC 5.3.1.9) é redu-zida.

A presente invenção refere-se especialmente a uma célula gene- ticamente modificada, que apresenta uma atividade de piruvato carboxilaseaumentada (EC 6.4.1.1), preferentemente pela expressão do mutante descri-to em "A novel methodology employing Corynebacterium glutamicum geno-me information to generate a new L-Lysine-producing mutanf (Ohnishi et al.,Applied Microbiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002)) e

uma atividade de aspartato descarboxilase aumentada (EC4.1.1.11), preferentemente por uma aspartato descarboxilase de Corynebac-terium glutamicume pelo menos uma das, preferentemente todas as seguintes pro-priedades:

- atividade da coenzima A transferase aumentada (EC 2.8.3.1),

- atividade de beta-alanil-coenzima A-amônio Iisase aumentada(EC 4.3.1.6) e

- atividade de 3-hidroxipropionil-coenzima A desidratase aumen-tada (EC 4.2.1. - especialmente EC 4.2.1.17).

Além disso, a presente invenção refere-se especialmente à célu-la geneticamente modificada, que apresenta

- uma atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase aumentada (EC4.1.1.31) e

- uma atividade de aspartato descarboxilase aumentada (EC4.1.1.11), preferentemente por uma asparato descarboxilase de Corynebac-teríum glutamicume pelo menos uma das, preferentemente todas as seguintes pro-priedades:

- uma atividade da coenzima A transferase aumentada (EC2.8.3.1),

- uma atividade da beta-alanil-coenzima A-amônio Iisase aumen- tada (EC 4.3.1.6) e

- uma atividade da 3-hidroxipropionil-coenzima A desidrataseaumentada (EC 4.2.1. - especialmente EC 4.2.1.17).

A presente invenção refere-se também a uma célula genetica-mente modificada, que apresenta

- uma atividade de piruvato carboxilase aumentada (EC 6.4.1.1),preferentemente pela expressão do mutante descrito em "A novel methodo-Iogy employing Corynebacterium glutamicum genome information to genera-te a new L-Lysine-producing mutanf (Ohnishi et al., Applied Microbiologyand Biotechnology 58: 217-223 (2002)) eatividade de aspartato descarboxilase aumentada (EC 4.1.1.11),preferentemente por uma asparato descarboxilase de Corynebacterium glu-tamicume pelo menos uma das, preferentemente todas as seguintes pro-priedades:

- atividade da beta-alanin-2-oxoglutarato-amino transferase au-mentada (EC 2.6.1.19) e

- atividade da 3-hidroxipropionato desidrogenase aumentada(EC 1.1.1.59).

Além disso, a presente invenção refere-se especialmente a umacélula geneticamente modificada, que apresenta

- atividade de fosfoenolpiruvato carboxilase aumentada (EC4.1.1.31) e

- atividade de aspartato descarboxilase aumentadas (EC4.1.1.11), preferentemente por uma asparato descarboxilase de Corynebac-terium glutamicum

e pelo menos uma das, preferentemente todas as seguintes pro-priedades:

- atividade da 3-hidroxipropionato desidrogenase aumentada(EC 1.1.1.59).

A presente invenção refere-se também a uma célula genetica-mente modificada, que contém

- atividade de piruvato carboxilase aumentada (EC 6.4.1.1), pre-ferentemente pela expressão do mutante descrito em "A novel methodologyemploying Corynebacterium glutamicum genome information to generate anew L-Lysine-producing mutanf (Ohnishi et al., Applied Microbiology andBiotechnology 58: 217-223 (2002)) e

atividade de aspartato descarboxilase aumentada (EC 4.1.1.11),preferentemente por uma asparato descarboxilase de Corynebacterium glu-tamicum

e pelo menos uma das, preferentemente todas as seguintes pro-priedades:

- atividade da glicerol-3-fosfato desidrogenase aumentada (EC1.1.99.5), preferentemente por uma glicerol-3-fosfato desidrogenase, que écodificada pelo gene glpD e

- atividade de glicerol quinase aumentada (EC 2.7.1.30), prefe-rentemente por uma glicerol quinase, que é codificada pelo gene glpK,sendo que no caso das células trata-se, nesse caso, preferen-temente de micro-organismos da cepa Corynebacterium glutamicum.

Uma outra contribuição para a resolução dos objetivos mencio-nados acima é prestada pelos processos para a produção de uma célulageneticamente modificada, que é caracterizada por pelo menos uma daspropriedades C) ou D):

A) a célula geneticamente modificada é capaz de centrifugarbeta-alanina para fora da célula,

B) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico,abrangendo pelo menos um, preferentemente dois dos estágios dos proces-sos A) e B):

C) aumento da atividade de uma enzima Eia em uma célula,que catalisa a reação de piruvato para oxalaceato, ou deuma enzima Eib, que catalisa a reação de fosfoenolpiruva-to para oxalacetato,

D) aumento da atividade de uma enzima E2 em uma célula,que catalisa a reação de aspartato para beta-alanina.

No caso das enzimas Eia, Eib e E2 trata-se preferentemente da-quelas enzimas, que já foram descritas em relação com as células de acordocom a invenção. O aumento das atividades das enzimas mencionadas acimaé preferentemente efetuado de acordo com os processos genéticos descritosem relação com as células de acordo com a invenção e também meio des-crito em relação com as células de acordo com a invenção. Como células,nas quais a atividade das enzimas Eia ou E^ e/ou E2 é aumentada, utilizam- se preferentemente aqueles gêneros e cepas, que já foram mencionadosacima em relação com as células geneticamente modificadas de acordo coma invenção.Células utilizadas de modo particularmente preferido no proces-so de acordo com a invenção, são aquelas dos gêneros Corynebacterium1Brevibacterium1 Bacillus1 Lactobacillus, Lactococcus, Candida1 Pichia1 Kluve-romyces, Saccharomyces, Bacillus1 Escherichia e Clostridium, em que Bacil-Ius flavum, Bacillus Iactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cere-visiae, Kluveromyces Iactis1 Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacte-rium glutamicum, Corynebacterium efficiens e Pichia postoris, além disso,são preferidos e Corynebacterium glutamicum é ou são os mais preferidos.Especialmente no processo de acordo com a invenção, podem ser utilizadascélulas selecionadas do grupo que consiste nas cepas do tipo selvagemCorynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium acetoglutami-cum ATCC15806, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Coryne-bacterium thermoaminogenes FERM BP-1539, Corynebacterium melasseco-Ia ATCC17965, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium Iacto-fermentum ATCC13869 e Brevibacterium divaricatum ATCC14020. Alémdisso, preferem-se bactérias já geneticamente modificadas, nas quais a ati-vidade de pelo uma das enzimas E3 até E25 ou então uma das atividades dasenzimas E1a, Eib ou E2 são aumentadas e eventualmente uma ou várias dasatividades das enzimas E26 até E3B são reduzidas. Entre essas células gene-ticamente modificadas prefere-se especialmente a cepa Corynebacteriumglutamicum ATCC13032 DM1727 (Georgi et al., Metabolic Engineering 7:291-301 (2005)), que apresenta uma piruvato carboxilato exógena com umamutação de aminoácido na posição 458 (substitui prolina por serina, vide "Anovel methodoly employing Corynebacterium glutamicum genome informati-on to generate a new L-lysine-producing mutanf (Ohnishi et al., Applied Mi-crobiology and Biotechnology 58: 217-223 (2002)).

Células, que estão em condição de centrifugar beta-alanina parafora da célula (e que dessa maneira satisfazem a condição C)), são prefe-rentemente aquelas células, que em comparação com seu tipo selvagem,apresentam um efluxo aumentado, preferentemente aumentado em pelomenos 10%, de modo particularmente preferido em pelo menos 25%, alémdisso, preferentemente em pelo menos 50%, além disso, de modo aindamais preferido, em pelo menos 75%, além disso, preferentemente em pelomenos 100% e do modo mais preferido possível, em pelo menos 500%, nomáximo preferentemente em 5.000%, de modo particularmente preferido em2.500%, de beta-alanina da célula, sendo que esse efluxo aumentado é pre-ferentemente possibilitado por uma atividade aumentada de uma enzima,que catalisa o efluxo de beta-alanina para fora da célula. Células, que estãoem condição, de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico (e dessamaneira satisfazer a condição D)), são especialmente aquelas células, nasquais a atividade de pelo menos uma, preferentemente de todas as enzimasE3 até Ee descritas em relação com as células de acordo com a invenção, oucélulas, nas quais a atividade de pelo menos uma, preferentemente das du-as enzimas E7 e E8 descritas em relação com as células de acordo com ainvenção, é aumentada.

Além disso, de acordo com a invenção é preferível, que o pro-cesso para a produção de células geneticamente modificadas também com-preenda outros estágios de processos, tais como, por exemplo, o aumentoda atividade de uma ou várias das enzimas Eg até E27 descritas em relaçãocom as células de acordo com a invenção, ou a redução da atividade dasenzimas E28 até E40 descritas em relação com as células de acordo com ainvenção.

As células geneticamente modificadas obteníveis pelo processodescrito acima, também contribuem para a resolução dos objetivos mencio-nados acima. Essas estão em condição, sozinhas ou então em combinaçãocom outras células de carboidratos ou de glicerina, de formar ácido 3- hidroxipropiônico.

Uma outra contribuição para a resolução dos objetivos mencio-nados acima é prestada por um processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico, abrangendo os estágios do processo

i) de pôr as células geneticamente modificadas, de acordocom a invenção, que apresentam a propriedade c) ou C), em contato comum meio nutritivo contendo carboidratos ou glicerina com condições, nasquais, a partir dos carboidratos ou da glicerina forma-se a beta-alanina, quepelo menos parcialmente chega da célula ao meio nutritivo, de maneira quese obtém um meio nutritivo contendo uma beta-alanina,

ii) pôr o meio nutritivo contendo a beta-alanina em contatocom uma outra célula, que é capaz de absorver a beta-alanina e reagir paraácido 3-hidroxipropiônico.

Como células capazes de absorver beta-alanina e reagir paraácido 3-hidroxipropiônico, são especialmente preferidas aquelas células, nasquais a atividade de pelo menos uma, preferentemente de todas as enzimasE3 até Ee ou então de células, nas quais a atividade de pelo menos uma,preferentemente das duas enzimas E7 e Ee em relação ao tipo selvagem foipreferentemente aumentada. Essas células são descritas, por exemplo, noW0-A-02/42418 e no WO-A-03/62173. Além disso, particularmente são pre-feridas aquelas células, nas quais adicionalmente a essas atividades enzi-máticas, também foi aumentada a atividade das enzimas, as quais aumen-tam o transporte ou efluxo de beta-alanina para o interior das células. Nessarelação prefere-se especialmente o transportador GABA GAT-2, bem como osistema de transporte codificado pelo gene cycA, que é descrito em Schnei-der et al., (Appl. Microbiol. Biotechnol. 65: 576-582 (2004)).

As células geneticamente modificadas, de acordo com a inven-ção, podem ser postas em contato com o meio nutritivo no estágio do pro-cesso i) continua ou descontinuamente no processo em batelada (cultivo emconjunto) ou no processo em batelada alimentada (processo de alimentação)ou processo em batelada alimentada repetido (processo de alimentação re-petitivo) com a finalidade de produzir beta-alanina e dessa maneira cultiva-das. É concebível, também, um processo semicontínuo, tal como é descritona GB-A-1009370. Um resumo sobre conhecidos métodos de cultivo sãodescritos no compêndio de Chmiel ("Bioprozesstechnik 1. Einführung in dieBioverfahrenstechnik" (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no com-pêndio de Storhas ("Bioreaktoren und periphere Einrichtungen", Vieweg Ver-lag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).

O meio de cultura a ser utilizado precisa satisfazer de maneiraadequada às reivindicações das respectivas cepas. Descrições de meios decultura de diversos micro-organismos estão contidas no compêndio "Manualof Methods for General Bacteriology" da American Society of Bacteriology(Washington D.C., EUA, 1981).

Como fonte de carbono podem ser utilizados açúcares e carboi-dratos, tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose,melaço, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como, por exemplo, óleo desoja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de linhaça, álcoois, tais co-mo, por exemplo, glicerina e etanol e ácidos orgânicos, tal como, por exem-plo, ácido acético. Essas substâncias podem ser utilizadas individualmente ou como mistura. A utilização de carboidratos, especialmente monossacarí-deos, oligossacarídeos ou polissacarídeos, tais como descritos na US6.01.494 e US 6.136.576, de C5-açúcares ou de glicerina é particularmentepreferida.

Como fonte de nitrogênio podem ser utilizados compostos orgâ- nicos contendo nitrogênio, tais como peptonas, extrato de levedura, extratode carne, extrato de malte, .água de fonte de milho, feijão de soja e uréia oucompostos inorgânicos, tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio, fos-fato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio. As fontes de ni-trogênio podem ser utilizadas individualmente ou como mistura.

Com fonte de fósforo podem ser utilizados ácido fosfórico, di-hidrogenofosfato de potássio ou hidrogenofosfato dipotássico ou os sais con-tendo sódio correspondentes. Além disso, o meio de cultura precisa contersais de metais, tal como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato deferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, substâncias decrescimento essenciais, tais como aminoácidos e vitaminas podem ser utili-zadas adicionalmente às substâncias mencionadas acima. Ao meio de cultu-ra podem ser acrescentados, além disso, pré-estágios adequados. As subs-tâncias de aplicação mencionadas podem se acrescentadas à cultura naforma de uma preparação única ou acrescentadas de maneira adequadadurante o cultivo.

Para o controle do pH da cultura utilizam-se compostos básicos,tais como (hidrogeno)carbonato de sódio, hidróxido de sódio, hidróxido depotássio, amoníaco ou água amoniacal ou compostos ácidos, tais como áci-do fosfórico ou ácido sulfúrico de maneira adequada. Para o controle do de-senvolvimento de espuma podem ser utilizados antiespumantes, tais como,por exemplo, ésteres poliglicólicos de ácido graxo. Para a manutenção daestabilidade de plasmídeos o meio pode ser acrescido de substâncias deefeito seletivo, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter as condi-ções aeróbicas, introduzem-se oxigênio ou misturas gasosas contendo oxi-gênio, tal como, por exemplo, ar, na cultura. A temperatura da cultura encon-tra-se normalmente em 20°C até 45°C e preferentemente em 25°C até 40°C. Especialmente quando são utilizadas células, as quais podem transformarglicerina como substrato, pode ser preferível, utilizar como células aquelascélulas, que são descritas na US 6.803.218 e aumentar nessas células aatividade das enzimas Eia ou Eib (bem como eventualmente das outras en-zimas E3 até E20). Neste caso, as células podem ser cultivadas a temperatu-ras na faixa de 40 até 100°C.

Simultaneamente com a formação de beta-alanina ou separa-damente deste estágio de processo, o meio nutritivo contendo beta-alanina éposto em contato com as outras células, as quais estão em condição, deabsorver a beta-alanina e reagir para ácido 3-hidroxipropiônico. Neste caso,as células de acordo com a invenção e as outras células podem ser cultiva-das juntas em um meio nutritivo, de maneira que a beta-alanina distribuídapelas células de acordo com a invenção, é absorvida quase in statu nascen-dii pelas outras células e reagida para ácido 3-hidroxipropiônico.

Mas também é concebível, formar inicialmente um meio nutritivocontendo beta-alanina, separar deste as células de acordo com a invenção esomente depois pôr este meio nutritivo contendo beta-alanina em contatocom as outras células. No entanto, prefere-se particularmente o cultivo si-multâneo das células de acordo com a invenção e das outras.

O processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico de a-cordo com a invenção, pode abranger como outro estágio do processo iii),também a purificação do ácido 3-hidroxipropiônico finalmente obtido do meionutritivo. Essa purificação pode ser efetuada por qualquer processo de puri-ficação conhecido pelo técnico. Dessa maneira, por exemplo, podem serutilizados processos de sedimentação, filtração ou centrifugação, para sepa-rar as células. O ácido 3-hidroxipropiônico do meio nutritivo contendo ácido3-hidroxipropiônico, libertado de células pode ser isolado através de extra-ção, destilação, permuta de íons, eletrodiálise ou cristalização.

A purificação do ácido 3-hidroxipropiônico da solução nutritiva éefetuada continuamente de acordo com uma concretização particular doprocesso de acordo com a invenção, sendo que nessa relação prefere-se,além disso, efetuar também a fermentação continuamente, de maneira quetodo o processo da reação enzimática dos produtos de partida com forma-ção de ácido 3-hidroxipropiônico até a purificação do ácido 3-hidroxipro-piônico possa ser efetuado continuamente a partir do meio nutritivo. Para apurificação contínua do ácido 3-hidroxipropiônico do meio nutritivo, este écontinuamente conduzido através de um dispositivo para a separação dascélulas utilizadas na fermentação, preferentemente através de um filtro comum tamanho de espaço em uma faixa de 20 até 200 kDa, no qual se realizauma separação de sólido/líquido. É concebível, também, a utilização de umacentrífuga, de um dispositivo de sedimentação adequado ou de uma combi-nação desses dispositivos, sendo particularmente preferível, separar pelo menos uma parte das células inicialmente através de sedimentação e emseguida, aduzir o meio nutritivo parcialmente libertado pelas células, a umdispositivo de ultracentrifugação ou centrifugação.

O produto de fermentação enriquecido com respeito a sua pro-porção de ácido 3-hidroxipropiônico é admitido em uma instalação de sepa- ração preferentemente de multiestágios após a separação das células. Nes-sa instalação de separação são previstos vários estágios de separação co-nectados em série, dos quais desembocam em cada caso canalizações derealimentação, que são reconduzidos para o segundo tanque de fermenta-ção. Além disso, dos respectivos estágios de separação saem derivações.Os estágios de separação individuais podem trabalhar pelo princípio da ele-trodiálise, da osmose invertida, da ultrafiltração ou da nanofiltração. Via deregra, no caso dos estágios de separação individuais trata-se de dispositivosde separação de membrana. A seleção dos estágios de separação individu-ais resulta do tipo e volume dos subprodutos de fermentação e resíduos desubstratos.

Além da separação do ácido 3-hidroxipropiônico por meio de eletrodiálise, osmose invertida, ultrafiltração ou nanofiltração, em cujo decur-so é obtida uma solução de ácido 3-hidroxipropiônico aquosa como produtofinal, o ácido 3-hidroxipropiônico também pode ser separado do meio nutriti-vo libertado das células por processos de extração, sendo que neste caso,finalmente, obtém-se o ácido 3-hidroxipropiônico puro. Para separar o ácido 3-hidroxipropiônico através de extração, o meio nutritivo, no qual o ácido 3-hidroxipropiônico está presente como sal de amônio, pode ser acrescido, porexemplo, de aminas orgânicas com ponto de ebulição elevado. Em seguida,a mistura obtida dessa maneira é aquecida, desprendendo-se amoníaco eágua e o ácido 3-hidroxipropiônico é extraído para a fase orgânica. Este pro- cesso designado como "salt-splitting" é mostrado no WO-A-02/090312, cujoteor revelado com respeito à separação de ácido 3-hidroxipropiônico de mei-os nutritivos, neste caso, é introduzido como referência e forma uma parteda publicação do presente pedido.

Uma contribuição para a resolução do objetivo inicialmente men- cionado, também é prestada por um processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico, abrangendo o estágio do processo do contato de uma cé-lula de acordo com a invenção, que apresenta a propriedade d) ou D), comum meio nutritivo contendo carboidratos o glicerina com condições, nasquais, a partir dos carboidratos ou da glicina, forma-se o ácido 3-hidroxipro-piônico. O cultivo é essencialmente efetuado do mesmo modo como no pro-cesso para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico descrito acima, sendoque, no entanto, neste caso, são utilizadas células geneticamente modifica-das, de acordo com a invenção, que podem reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico. Células de acordo com a invenção, que estão em condi-ção para este fim, já foram detalhadamente descritas acima.

Como outro estágio do processo, também este processo para aprodução de ácido 3-hidroxipropiônico pode abranger a purificação do ácido3-hidroxipropiônico do meio nutritivo.

Além disso, um processo para a produção de ácido acrílico con-tribui para a resolução dos objetivos mencionados acima, abrangendo osestágios do processo

I) produção de ácido 3-hidroxipropiônico pelos processosdescritos acima, eventualmente seguida de um ou váriosestágios de purificação,II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico formando-se á-cido acrílico.

A desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico pode ser fundamen-talmente efetuada em fase líquida ou na fase gasosa, preferindo-se uma de-sidratação da fase líquida. Além disso, prefere-se de acordo com a invenção,que a desidratação seja efetuada na presença de um catalisador, sendo queo tipo do catalisador utilizado depende do fato, se é efetuada uma reação dafase gasosa ou uma da fase líquida. Como catalisadores de desidrataçãotomam-se em consideração tanto catalisadores ácidos, como também alcali-nos. Catalisadores ácidos são preferidos especialmente devido a baixa ten-dência à formação de oligômeros. O catalisador de desidratação pode serutilizado tanto como catalisador homogêneo, como também heterogêneo.Em seguida à desidratação, obtém-se uma fase contendo ácido acrílico, quepode ser eventualmente purificada por outros estágios de purificação, espe-cialmente por processos de destilação, processos de extração o processosde cristalização ou então por uma combinação desses processos.

Uma outra contribuição para a resolução dos objetivos mencio-nados acima é prestada também por um processo para a produção de polia-crilatos, abrangendo os estágios do processo

I) produção de ácido 3-hidroxipropiônico por um dos proces-sos descritos acima, eventualmente seguida de um oumais estágios de purificação,

II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico com formaçãode ácido acrílico de acordo com os processos descritos a-cima, eventualmente seguida de um ou mais estágios depurificação,

III) polimerização radical do ácido acrílico.

A polimerização radical do ácido acrílico é efetuada por proces-sos de polimerização conhecidos pelo técnico e pode ser efetuada tanto emuma emulsão ou suspensão, como também em solução aquosa. Além disso,na polimerização podem estar presentes outros comonômeros, especialmen-te reticuladores. De modo particular, prefere-se a polimerização radical doácido acrílico obtido no estágio do processo II) em forma pelo menos parci-almente neutralizada na presença de reticuladores. Nessa polimerização sãoobtidos hidrogéis, que depois podem ser triturados, moídos e eventualmentesuperficialmente modificados, especialmente superficialmente reticulados.Os polímeros obtidos dessa maneira prestam-se especialmente para a apli-cação como superabsorventes em artigos higiênicos, tais como, por exem-plo, fraldas ou absorventes femininos.

Uma contribuição para a resolução dos objetivos mencionadosacima é prestada também por um processo para a produção de ésteres deácido acrílico, abrangendo os estágios do processo

I) produção de ácido 3-hidroxipropiônico por um dos proces-sos descritos acima, eventualmente seguida de um maisestágios de purificação,

II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico com formaçãode ácido acrílico de acordo com um dos processos descri-tos acima, eventualmente seguida de um ou mais estágiosde purificação,

III) esterificação do ácido acrílico.

A esterificação do ácido acrílico é efetuada por processos deesterificação conhecidos pelo técnico, de modo particularmente preferidopelo fato, de que o ácido acrílico obtido no estágio do processo II) é postoem contato com álcoois, preferentemente com metanol, etanol, 1-propanol,2-propanol, n-butanol, terc-butanol ou iso-butanol e aquecido a uma tempe-ratura de pelo menos 50°C, de modo particularmente preferido, pelo menos100°C. A água formada na esterificação pode ser eventualmente removidada mistura de reação através da adição de agentes auxiliares de separaçãoadequados por meio de destilação azeotrópica.

Uma outra contribuição para a resolução dos objetivos mencio-nados acima é prestada pela utilização de uma célula geneticamente modifi-cada em relação ao seu tipo selvagem, que apresenta pelo menos uma, pre-ferentemente duas das propriedades a) e b):

a) uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%, de modo parti-cularmente preferido, em pelo menos 25%, além disso, preferentemente empelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo maispreferido possível, em pelo menos 500%, no máximo, preferentemente ematé 5.000%, de modo particularmente preferido, em até 2.500%, de uma en-zima E1a, que catalisa a reação de piruvato para oxalacetato ou de uma en-zima E1b, que catalisa a reação de fosfoenolpiruvato para oxalacetato, prefe-rentemente no entanto, de uma enzima Eia, que catalisa a reação de piruva-to para oxalacetato,

b) uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem, preferentemente aumentada em pelo menos 10%, de modo parti-cularmente preferido, em pelo menos 25%, além disso, preferentemente empelo menos 50%, além disso, de modo ainda mais preferido, em pelo menos75%, além disso, preferentemente em pelo menos 100% e do modo maispreferido, em pelo menos 500%, no máximo, preferentemente em até5.000%, de modo particularmente preferido, em até 2.500%, de uma enzimaE2, que catalisa a reação de aspartato para beta-alanina, para a produção deácido 3-hidroxipropiônico.

A presente invenção é detalhadamente elucidada com base nasfiguras e exemplos não-restritivos.

A figura 1 mostra o esquema de reação para a formação de be-ta-alanina a partir da glicose ou glicerina através de piruvato, oxalacetato easpartato.

A figura 2 mostra o esquema de reação para a formação de áci-do 3-hidroxipropiônico a partir de beta-alanina através de beta-alanil-coenzima A, acrilil-coenzima A e 3-hidroxipropionil-coenzima A ou através desemialdeído de ácido malônico.

A figura 3 mostra o vetor de plasmídeo pVWex1-panD.

A figura 4 mostra o vetor de plasmídeo pVWex1-glpKDE.c.

A figura 5 mostra o vetor de plasmídeo pVWex1-panD-glpKDE.c.

Exemplo

Foi produzida uma célula geneticamente modificada da cepaCorynebacterium glutamicum, em que foram exprimidos os genes heterólo-gos glpK, glpD e os genes homólogos pyc e panD. Nesse caso, procedeu-setal como segue:

Como cepas de partida utilizaram-se a cepa do tipo selvagemATCC13032 (depositado na Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH, Braunschweig com o número DSM 20300) e a cepaDM1727. A cepa DM1727 foi descrita por Georgi et al. (Metabolic Enginee-ring 7: 291-301 (2005)) e representa uma cepa de Corynebacterium glutami-cum geneticamente modificada, que apresenta uma atividade aumentada dapiruvato carboxilase em relação à cepa do tipo selvagem. Essa atividadeaumentada da enzima é atribuída a uma mutação do aminoácido na posição458 (permuta de prolina por serina). Para isso, vide também "A novel me-thodology employing Corynebacterium glutamicum genome information togenerate a new L-lysine-producing mutant" (Ohnishi et al., Applied Microbio-Logy and Biotechnology 58: 217-223 (2002)).

1. Produção dos vetores de plasmídeos

Inicialmente foram sintetizados os dois seguintes iniciador PCR

(o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases no genoma E. coliMG1655 (GenBank Reference Sequence NC 000913 U00096), pontos deinserção são impressos em negrito):glpKrev: 5'TCTAGATTTATTCGTCGTGTTCTTCCCACGCC (SEQ ID n° 2) (onucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases 4113737 no genomaMG1655, o ponto de inserção corresponde a um ponto de inserção Xbal)glpKfon 5'GGGACGTCGACAAGGAGATATAGATGACTGAAAAAAAATATATC(SEQ ID n0 3) (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases4115245 no genoma MG1655, o ponto de inserção corresponde a um pontode inserção Sa 11)

Os iniciadores corresponderam às bases 4113737 até 4113762e 4115225 até 4115245 do gene glpK de E. coli. Com esses iniciadores, foipossível amplificar um fragmento de 1533 pares de bases de DNA cromos-somal de E. coli por meio de PCR segundo o método padronizado de Innis etal. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, AcademicPress) para iniciadores homólogos, não-degenerados, o qual foi isolado, talcomo descrito por Eikmanns et al. (Microbiology, 140: 1817-1828 (1994)).

Esse fragmento de PCR foi clonado no vetor de plasmídeopGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, EUA) obtendo-se umvetor de plasmídeo pGEM-T-glpKEC.

Subseqüentemente, foram sintetizados os dois iniciadores PCRseguintes (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases no geno-ma MG1655 da E. coli, pontos de inserção são impressos em negrito e aregião cursiva marca um ponto de ligação de ribossomo):

glpDfor: 5'TCTAGAAAGGAGATATAGATGGAAACCAAAGATCTG(SEQ ID n° 4) (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases3560036 no genoma MG1655, o ponto de inserção corresponde a um pontode corte Xbal)

glpDrev: 5'GTTAATTCTAGATTACGACGCCAGCGATAA (SEQ.ID n° 5) (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases 3561541 nogenoma MG1655, o ponto de corte corresponde a um ponto de corte Xbal)

Os iniciadores corresponderam às bases 3560036 até 3560053e 3561524 até 3561541 do gene plpD de E. coli. Com esses iniciadores foipossível amplificar um fragmento de 1524 pares de bases de DNA cromos-somal de E. coli por meio de PCR segundo o método padronizado de Innis etal. (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, AcademicPress) para iniciadores homólogos, não-degenerados, o qual foi isolado, talcomo descrito por Eikmanns et al. (Microbiology 140:1817-1828 (1994).

Esse fragmento de PCR foi clonado no vetor de plasmídeopGEM-T (Promega Corporation, Madison1 Wisconsin1 EUA) obtendo-se ovetor de plasmídeo pGEM-T-glpDE.c.

Em seguida, o fragmento do par de bases 1524 foi recortadocom Xball do vetor de plasmídeo pGEM-T glpDE.c e clonado no vetor deplasmídeo pGEM-T-glpKEC. cortado com SpeI-SAP (SAP = fosfatase alcalinade camarão) mantendo o vetor de plasmídeo pGEM-T-glpKDEC. Em seguida,o fragmento glpKDE.c. foi recortado por meio de Sall e clonado no vetor deplasmídeo pVWExI cortado com Sall (esse plasmídeo de expressão foidescrito por Peters-Wendisch et ai., Journal of Molecular Microbiology andBiotechnology 3: 295-300 (2001) obtendo-se o vetor de plasmídeo pVWExI-glpKDEC.

Subseqüentemente, os dois iniciadores PCR seguintes foramsintetizados (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases no ge-noma de Corynebacterium glutamicum (NC003450), pontos de inserção sãoimpressos em negrito e regiões cursivas marcam um ponto de ligação doribossomo):

NCg10133fOr: 5'GGACACTAGTAAGGAGATATAGATGCTGCGCACCATCCTC (SEQ. ID n° 6) (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par debases 145570 no genoma de Corybacterium glutamicum, o ponto de inser-ção corresponde a um ponto de inserção Spel).

NCg10133rev.: 5'CTAAAACGGGTACCCTAAATGCTTCTCGACGTC(SEQ. ID n° 7) (o nucleotídeo sublinhado corresponde ao par de bases147980 no genoma de Corybacterium glutamicum, o ponto de inserção cor-responde a um ponto de inserção Kpnl).

Os iniciadores corresponderam às bases 247570 até 147588 e147964 até 147980 do gene panD de C. glutamicum. Com esses iniciadoresfoi possível amplificar um fragmento de aproximadamente 430 pares de ba-ses de DNA cromossomal de C. glutamicum por meio de PCR segundo ométodo padronizado por Innis et al. (PCR protocols. A guide to methods andapplications, 1990, Academic Press), o qual foi isolado, tal como descrito porEikmanns et al. (Microbiology 140: 1817-1828 (1994)).

Esse fragmento de PCR foi clonado no vetor de plasmídeopGEM-T (Promega Corporation, Madisonl Wisconsin1 EUA) obtendo-se umvetor de plasmídeo pGEM-T-panD.

Em seguida, o fragmento panD foi recortado por meio de Spel eKpnl de pGEM-T-panD e clonado no vetor de plasmídeo pVWExI cortadocom Xbal e Kpnl1 obtendo-se o vetor de plasmídeo pVWExI-panD. Alémdisso, o fragmento panD cortado do pGEM-T-pand por meio de Spel e Kpnlfoi clonado no vetor de plasmídeo pVWExI -glpKDE.c. cortado com Xbal eKpnl1 obtendo-se o vetor de plasmídeo pVWExI-panD-glpKDEC. (SEQ. ID n° 1).

Os vetores de plasmídeos pVWExI-panD, pVWExI-glpKDE.c. epVWExI-panD-glpKDE.c. (SEQ. ID n° 1) são mostrados nas figuras 3 a 5.

2. Transformação das célulasNas cepas de partida inicialmente mencionadas, os plasmídeosde expressão pVWExI, pVWExI-panDc.g., pVWExI-glpKDEC. e pVWExI-glpKDE.c.panDc.G. foram introduzidos por meio de eletroporação (segundovan der Rest et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 541-545 (1999)).

3. Cultivo das célulasCom glicose como fonte de carbono.As cepas transformadas com esses plasmídeos foram cultivadasem meio CGXII, o qual foi descrito por Georgi et al. (Metabolic Engineering7: 291-301 (2005)) e por Marx et al. (US 6.355.454). O meio continha 40 g/kgde glicose.

A concentração de alfa- ou beta-alanina foi comprovada pormeio de HPLC. O método foi descrito por Georgi et al. (Metabolic Enginee-ring 7: 291-301 (2005)) e por Marx et al. (US 6.355.454). Para a identificaçãodo sinal da alfa-alanina ou beta-alanina foi utilizado um padrão correspon-dente.

Depois de um cultivo das células por 29 horas foram medidas asseguintes concentrações de alfa-alanina e beta-alanina no meio nutritivo:

<table>table see original document page 48</column></row><table>

3.2. Com qlicerina como fonte de carbonoAs cepas transformadas com esses plasmídeos foram cultivadasem meio CGXII1 o qual foi descrito por Georgi et al. (Metabolic Engineering7: 291-301 (2005)) e por Marx et al. (US 6.355.454). O meio continha 9 g/kgde glicerina.

A concentração de alfa- ou beta-alanina foi comprovada por

meio de HPLC. O método foi descrito por Georgi et al. (Metabolic Enginee-ring 7: 291-301 (2005)) e por Marx et al. (US 6.355.454). Para a identificaçãodo sinal da alfa-alanina ou beta-alanina foi utilizado um padrão correspon-dente.

Depois de um cultivo das células por 24 horas foram medidas asseguintes concentrações de alfa-alanina e beta-alanina no meio nutritivo:

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Claims

1. Célula geneticamente modificada em relação ao seu tipo sel-vagem, caracterizada pelo fato de que apresenta pelo menos uma das pro-priedades a) ou b):a) uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem de uma enzima Eia, que catalisa a reação de pi-ruvato para oxalacetato ou de uma enzima Eib, que catali-sa a reação de fosfoenolpiruvato para oxalacetato,b) uma atividade aumentada em comparação com seu tiposelvagem de uma enzima E2, que catalisa a reação de as-partato para beta-alanina,sendo que as células, além das propriedades a) ou b), é caracte-rizada por pelo menos uma das propriedades c) ou d):c) a célula geneticamente modificada é capaz de centrifugarbeta-alanina para fora da célula,d) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico.

2. Célula de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelofato de que a enzima Ei é uma piruvato carboxilase.

3. Célula de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadapelo fato de que a atividade aumentada da enzima Ei é através de uma mu-tação do gene piruvato carboxilase do tipo selvagem da célula.

4. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,caracterizada pelo fato de que a enzima E2 é uma aspartato descarboxilase.

5. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizada pelo fato de que apresenta a propriedade d), em que a célulaapresenta uma atividade aumentada em comparação com seu tipo selva-gem, de pelo menos uma das seguintes enzimas E3 até Eq.- de uma enzima E3, que catalisa a reação de beta-alanina parabeta-alanil-coenzima A,- de uma enzima E4, que catalisa a reação de beta-alanil-coenzima A para acrilil-coenzima A,- de uma enzima Es, que catalisa a reação de acrilil-coenzima Apara 3-hidroxipropionil-coenzima A,- de uma enzima Εβ, que catalisa a reação de 3-hidroxipropionil-coenzima A para ácido 3-hidroxipropiônico.

6. Célula de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelofato de que a enzimaE3 é uma coenzima A transferase ou coenzima A sintetase,E4 é uma beta-alanil-coenzima A-amônio lisase,E5 é uma 3-hidroxipropionil-coenzima A desidratase eΕβ é uma coenzima A transferase, 3-hidroxipropionil-coenzima Ahidrolase ou 3-hidroxibutiril-coenzima A hidrolase.

7. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,caracterizada pelo fato de que apresenta a propriedade d), em que a célulaapresenta uma atividade aumentada em comparação com seu tipo selvagemde pelo menos uma das seguintes enzimas E7 e Ee-"- de uma enzima E7, que catalisa a reação de beta-alanina parasemialdeído de ácido malônico,- de uma enzima E8, que catalisa a reação de semialdeído deácido malônico para ácido 3-hidroxipropiônico.

8. Célula de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelofato de que a enzimaE7 é uma beta-alanin-2-oxoglutarato aminotransferase eEe é uma 3-hidroxipropionil desidrogenase ou 3-hidroxibutiratodesidrogenase.

9. Célula de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8,caracterizada pelo fato de que a célula apresenta uma atividade de fosfoglu-coisomerase reduzida em comparação com seu tipo selvagem.

10. Processo para a produção de uma célula geneticamentemodificada, que apresenta por pelo menos uma das propriedades C) ou D):A) a célula geneticamente modificada é capaz de centrifugarbeta-alanina para fora da célula,B) a célula geneticamente modificada é capaz de reagir beta-alanina para ácido 3-hidroxipropiônico,caracterizado pelo fato de que abrange pelo menos um, prefe-rentemente dois dos estágios dos processos A) e B):A) aumento da atividade de uma enzima Eia em uma célula,que catalisa a reação de piruvato para oxalacetato ou de uma enzima Eiblque catalisa a reação de fenolenol piruvato para oxalacetato ouB) aumento da atividade de uma enzima E2 em uma célula,que catalisa a reação de aspartato para beta-alanina.

11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizadopelo fato de que a enzima Eia é uma piruvato carboxilase e a enzima Eib éuma fosfoenolpiruvato carboxilase.

12. Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracteri-zado pelo fato de que a enzima E2 é uma aspartato descarboxilase.

13. Célula, caracterizada pelo fato de que pode ser obtida porum processo como definido em qualquer uma das reivindicações 10 a 12.

14. Processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico, ca-racterizado pelo fato de que os estágiosi) de pôr uma célula como definido em uma das reivindica-ções 1 a 9 ou 13, que apresenta a propriedade c), em con-tato com um meio nutritivo contendo carboidratos ou glice-rina com condições, nas quais a partir dos carboidratos ouda glicerina, se forma beta-alanina, que pelo menos emparte chega da célula ao meio nutritivo, de maneira que seobtém um meio nutritivo contendo beta-alanina;ii) pôr o meio nutritivo contendo a beta-alanina em contatocom uma outra célula, que é capaz de absorver a beta-alanina e reagir para ácido 3-hidroxipropiônico.

15. Processo para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico, ca-racterizado pelo fato de que compreende o estágio do processo de pôr umacélula como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 e 13, a qualapresenta a propriedade d), em contato com carboidratos ou glicerina con-tendo meio nutritivo com condições, nas quais se forma ácido 3-hidroxipro-piônico a partir dos carboidratos ou da glicerina.

16. Processo para a produção de ácido acrílico, caracterizadopelo fato de que compreende os estágios deI) produção de ácido 3-hidroxipropiônico por um processocomo definido na reivindicação 14 ou 15;II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico com formaçãode ácido acrílico.

17. Processo para a produção de poliacrilatos, caracterizado pe-lo fato de que compreende os estágiosI) produção de ácido 3-hidroxipropiônico por um processocomo definido na reivindicação 14 ou 15,II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico com formaçãode ácido acrílico,III) polimerização radical do ácido acrílico.

18. Processo para a produção de ésteres de ácido acrílico, ca-racterizado pelo fato de que compreende os estágiosI) produção de ácido 3-hidroxipropiônico por um processocomo definido na reivindicação 15 ou 16,II) desidratação do ácido 3-hidroxipropiônico com formaçãode ácido acrílico,III) esterifícação do ácido acrílico.

19. Uso de uma célula geneticamente modificada em relação aoseu tipo selvagem, que apresenta pelo menos uma das propriedades a) ou b):a) uma atividade de uma enzima Eia, que catalisa a reaçãode piruvato para oxalacetato ou de uma enzima Eu,, quecatalisa a reação de fosfoenolpiruvato para oxalacetatoaumentada em comparação com seu tipo selvagem,b) uma atividade de uma enzima E2, que catalisa a reação deaspartato para beta-alanina aumentada em comparaçãocom seu tipo selvagem,caracterizado pelo fato de que é para a produção de ácido 3-hidroxipropiônico.