BRPI0617341A2 - processo para o diagnàstico de doenÇas tromboembàlicas e doenÇas coronarianas - Google Patents

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Matthias Herrmann
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Abstract

<B>PROCESSO PARA O DIAGNàSTICO DE DOENÇAS TROMBOEMBàLICAS E DOENÇAS CORONARIANAS<D>A presente invenção refere-se a um processo para o diagnóstico in-vitro de doenças tromboembólicas e/ou doenças coronarianas, em que o nucleotídeo na posição 470 de um ácido nucléico que codifica para uma protema EGLN2 humana ou o aminoácido na posição 58 da proteína EGLN2 humana é determinado de uma amostra de uma pessoa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSOPARA O DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS TROMBOEMBÓLICAS E DOENÇAS CORONARIANAS".
A presente invenção refere-se a um processo para o diagnósticoin-vitro de doenças tromboembólicas e/ou doenças coronarianas, em que onucleotídeo na posição 470 de um ácido nucléico que codifica para uma pro-teína EGLN2 humana ou o aminoácido na posição 58 da proteína EGLN2humana é determinado de uma amostra de uma pessoa.
EGLN2, que com base em sua atividade HIF prolil hidroxilase,também é conhecido pelo nome proteína 1 contendo domínio Qrolil hidroxila-se (PHD1), pertence a um grupo de proteínas intimamente relacionadas dafamília do gene Egl-Nine, que apresenta uma estrutura genômica conserva-da consistindo em cinco exons codificadores. No caso de HIF (fator induzívelde hipóxia) trata-se de um regulador de transcrição, que assume um papel-chave em muitos aspectos da hemostase de oxigênio, sendo no entanto,ainda incerta a contribuição das isoformas EGLN EGLN1 (PHD1), EGLN2(PHD2) e EGLN3 (PHD3) para a regulação fisiológica de HIF (Appelhoff, R.J. e outros (2004) J. Biol. Chem. 279, 38458-38465, n° 37). Há relatos, deacordo com os quais todas as isoformas EGLN mostram um comportamentoespecífico e induzível da célula diferenciado, o que deveria permitir flexibili-dade na regulação da resposta de HIF à hipóxia. Isso significaria, que a ini-bição farmacológica específica de uma determinada isoenzima EGLN pode-ria ter o potencial para a modulação seletiva da resposta de HIF, que seriaútil em aplicações terapêuticas (Appelhoff, R. J. e outros, (2004), supra). Ainibição de EGLN2, por exemplo, deveria ativar a resposta de HIF ampla-mente através de uma série de espécies de células em condições de repou-so. Em contrapartida, através da inibição específica de EGLN3, a resposta àhipóxia deveria ser aumentada em determinados tecidos, que apresentamaltos níveis de expressão da enzima (Appelhoff, R. J. e outros (2004), su-pra). Gom isso, poderia ser possibilitado um tratamento de doenças isquêmi-cas/hipóxicas. Ao contrário de EGLN2 e EGLN3, sabe-se somente poucosobre o papel fisiológico de EGLN1.
PI0617341-1Para entender melhor um possível envolvimento de EGLN2 naocorrência e decurso de doenças coronarianas, foram efetuadas análises deassociação de genótipo-fenótipo com um grupo de pacientes bem caracteri-zado com respeito a uma variação no gene EGLN2 na posição 470 da se- qüência de referência EGLN2 publicada sob o número de referênciaNM_053046.2 de acordo com a presente invenção. Variantes genéticas dis-tintas do gene EGLN2 já são conhecidas como SNPs (single nucleotidepolymorphisms [= polimorfismos de nucleotídeos individuais]) e publicadassob hppt://www.ncbi.nlm.nih.qov/SNP/snp ref.cqi?locusld=112398).
Surpreendentemente, foi verificado, então, que uma variação donucleotídeo na posição 470, especialmente de citidina para timidina de umácido nucléico que codifica para a proteína EGLN2 humana ou do aminoáci-do na posição 58, especialmente de serina para Ieucina da proteína EGLN2humana, está relacionada com a ocorrência de doenças tromboembólicas e/ou doenças coronarianas.
Conseqüentemente, um objetivo da presente invenção refere-seao diagnóstico in-vitro ou diagnóstico in-vivo de doenças tromboembólicase/ou doenças coronarianas, no qual o nucleotídeo na posição 470 de umácido nucléico que codifica para a proteína EGLN2 humana ou o aminoácido na posição 58 da proteína EGLN2 humana é determinado de uma amostrade uma pessoa ou de um paciente.
Em uma forma de concretização preferida da presente invenção,trata-se no caso da doença tromboembólica de um acidente vascular cere-bral, de uma deficiência neurológica isquêmica reversível prolongada (PRIND) e/ou de um ataque isquêmico transitório (TIA) e no caso da doençacoronariana, de um infarto miocárdico.
Há um risco maior de um acidente vascular cerebral, de umaPRIND e/o um TIA, quando o nucleotídeo na posição 470 é determinadocomo timidina no DNA cromossomal ou uridina no mRNA ou o aminoácido na posição 58 é determinado como leucina. Caso, no entanto, o nucleotídeona posição 470 seja determinado como citidina ou o aminoácido na posição58 como serina, já um risco maior de um infarto miocárdico, especialmentede um infarto miocárdico prematuro.
O termo "EGLN2-C470C" no sentido da presente invenção, refe-re-se àquele grupo de indivíduos, que apresentam citidina nos dois alelos dogene que codifica para EGLN2 na posição 470 da seqüência de referênciaNM_053046.2, o que leva ao aminoácido serina na posição 58 da proteínacorrespondente. Esses indivíduos são homozigotos com respeito a essa va-riante de EGLN2. Conseqüentemente, o termo "EGLN2-C470T" refere-seàquele grupo de indivíduos, que apresentam citidina em um alelo do geneque codifica para EGLN2, o que leva à serina na posição 58 da proteína cor-respondente e apresentam timidina no outro alelo do gene que codifica paraEGLN2, o que leva à Ieucina na posição 58 da proteína correspondente. Es-ses indivíduos são heterozigotos com respeito a essa variante de EGLN2.
A seqüência de ácido nucléico da seqüência de referência quecodifica para a proteína EGLN2 humana apresenta preferentemente a se-qüência de ácido nucléico da SEQ ID NO: 1 e a seqüência de aminoácido daproteína EGLN2 humana, preferentemente a seqüência de aminoácido daSEQ ID NO: 2. No entanto, a presente invenção abrange também outras va-riante da EGLN2 humana, bem como os homólogos não humanos dasmesmas, tais como, por exemplo, homólogos de EGLN2 de outros mamífe-ros ou os homólogos de EGLN2 de Caenorhabdidis elegans, camundongoou rato, com a condição, de que na posição correspondente à posição 470da seqüência de referência haja uma permuta de nucleotídeos de citidinapara timidina e/ou na posição correspondente à posição 58 da seqüência dereferência, uma permuta de aminoácido de serina para Ieucina e além disso,com a condição, de que a proteína correspondente apresente uma atividadede prolil hidroxilase, especialmente uma atividade de HIF prolil hidroxilase. Aatividade da enzima pode ser medida, por exemplo, por meio de análise es-pectrométrica de massa, com a qual a oxidação de Pro, por exemplo, Pro564de HIF-Ia pode ser detectada ou de testes enzimáticos conhecidos pelotécnico.
Em geral, o nucleotídeo específico na posição 470 pode ser de-terminado com um processo de seqüenciação de ácido nucléico, com umaanálise espectrométrica de massa do ácido nucléico, com um processo dehibridização e/ou um processo de amplificação. Exemplos de um processode seqüenciação de ácido nucléico são a seqüenciação pirose e/ou a se-qüenciação com auxílio de nucleotídeos com marcação radioativa e/ou fluo-rescente. Exemplos do processo de hibridização são a análise SouthernBlot, a análise Northern Blot e/ou um processo de hibridização em um mi-croarranjo de DNA. Exemplos de um processo de amplificação são uma aná-lise TaqMan, uma análise RNA-display diferencial e/ou uma análise diferen-cial de representação (Shi Μ. M. (2002) Am J Pharmacogenomics., 2(3),197-205; Kozian & Kirschbaum (1999) trends Biotechnol., 17(2), 73-8).
Além disso, a seqüência de aminoácido na posição 58 pode serdeterminada com um processo para a medição da quantidade da proteínaespecífica e/ou com um processo para a medição da atividade da proteínaespecífica. Exemplos de um processo para a medição da quantidade da pro-teína específica são uma análise Western Blot e/ou um teste ELISA. Exem-plos de um processo para a medição da atividade da proteína específica sãoum processo de teste in vitro e/ou um processo de teste in vitro para célulasinteiras com células humanas, animais, bacterianas ou de levedura, que emcada caso são todos conhecidos pelo técnico.
Além disso, a seqüência de aminoácido na posição 58 pode serdeterminada com um processo para a medição da quantidade da proteínaespecífica e/ou com um processo para a medição da atividade da proteínaespecífica. Exemplos de um processo para a medição da quantidade da pro-teína específica são uma análise Western blot e/ou um teste ELISA. Exem-plos de um processo para a medição da atividade da proteína específica sãoum processo de teste in vitro e/ou um processo de teste in vitro para célulasinteiras com células humanas, animais, bacterianas ou de levedura, que emcada caso são todos conhecidos pelo técnico.
Em um teste para comprovar como as respectivas variantes atu-am, por exemplo, em uma célula, em um tecido e/ou em um fluido corporal,especialmente nos componentes celulares do sangue, células endoteliais oumusculares. Preferencialmente, o teste para isolamento e/ou purificação doácido nucléico ou do DNA cromossomial ou da proteína do teste para umaoutra análise é realizada por uma autoridade familiarizada com o processo.
Em um outro estágio opcional, o perigo e/ou a idade de umapessoa de sofrer de uma doença tromboembólica e/ou uma doença corona-riana, pode ser determinado, tal como mostrado nos exemplos.
Em um outro estágio opcional, é possível determinar a dosagemde um medicamento contra uma doença tromboembólica e/ou de uma doen-ça coronariana.
Em geral, a variação genética encontrada no gene EGLN2 nosentido da presente invenção pode ser utilizada como marcador genéticopara a avaliação do risco e/ou do tratamento preventivo de uma doençatromboembólica e/ou doença coronariana (também conhecida pelo nome"doença cardiovascular"), especialmente de um infarto miocárdico prematu-ro, de um acidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou de doenças coro-narianas.
Além disso, a variação genética no sentido da presente inven-ção, pode ser utilizada como marcador genético para a adaptação da dosa-gem de uma substância ativa terapêutica para o tratamento de uma pessoa,de um indivíduo ou paciente e/ou para a identificação de pessoas, indivíduose/ou pacientes que participam ou são escolhidos para participar de estudosclínicos experimentais com um alto risco de doença tromboembólica e/oudoença coronariana, especialmente de um infarto miocárdico prematuro, umacidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou doenças coronarianas. Avariação genética no sentido da presente invenção, também pode ser utili-zada para a avaliação da tolerância, segurança e eficácia de uma substânciaativa farmacêutica em uma determinada pessoa, indivíduo ou paciente, aqual respectivamente, o qual pode ser tomado em consideração para umrespectivo tratamento das doenças mencionadas.
Além disso, a variação genética no sentido da presente inven- ção, também pode ser utilizada como parte de um teste com alta passagempara a detecção e para a avaliação de compostos farmaceuticamente efica-zes no tratamento das doenças mencionadas.A presente invenção também pode ser utilizada em cada casopara a identificação de fatores de risco das doenças mencionadas nas pes-soas, indivíduos ou pacientes a serem tratados ou aconselhados.
Um processo preferido para o diagnóstico de uma doença trom-boembólica e/ou doença coronariana no sentido da presente invenção, con-tém os seguintes estágios:
(a) obtenção de uma amostra, especialmente de uma célula, deum tecido, de um líquido corporal, de um componente celular do sangue, decélulas endoteliais ou de células musculares lisas, de uma pessoa a ser e-xaminada ou de um paciente a ser examinado;
(b) isolamento de uma sonda de ácido nucléico, especialmentede uma sonda de DNA da amostra;
(c) amplificação da posição 470 do gene EGLN2 abrangendo aregião específica com auxílio de iniciadores, especialmente dos iniciadores,tal como são mencionados nos exemplos;
(d) seqüenciação da região amplificada;
(e) análise da região seqüenciada, bem como
(f) avaliação do risco de uma doença tromboembólica e/ou deuma doença coronariana, especialmente de um infarto miocárdico prematu-ro, de um acidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou doenças coronari-anas.
Um processo alternativo para o diagnóstico de uma doençatromboembólica e/ou doença coronariana no sentido da presente invenção,contém os seguintes estágios:
(a) obtenção de uma amostra, especialmente de uma célula, umtecido, um líquido corporal, um componente celular do sangue, de célulasendoteliais ou células musculares lisas, de uma pessoa a ser examinada oude um paciente a ser examinado;
(b) isolamento da proteína EGLN2 da amostra;
(c) determinação do aminoácido na posição 58 da proteína E-GLN2 e
(d) avaliação do risco de uma doença tromboembólica e/ou deuma doença coronariana, especialmente de um infarto miocárdico prematu-ro, de um acidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou doenças coronari-anas.
Outros estágios preferidos são mencionados individualmente oujuntos nos exemplos e são incorporados, nesse caso, através de referênciapara cada estágio.
A presente invenção deve ser elucidada com as seguintes figu-ras, tabelas, seqüências e exemplos, sem, com isso, limitar o âmbito da in-venção.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1 mostra a seqüência de ácido nucléico do gene EGLN2humano com o número NCBI NM_053046. Os iniciadores utilizados para aamplificação da secção do gene com a variação genética C --> T na posição470 (em negrito) são sublinhados.
Figura 2 mostra a seqüência de aminoácido da EGLN2 humanaderivada da seqüência de ácido nucléico com o número NCBI NM_053046.A posição do aminoácido 58 na proteína EGLN2 está representada em ne-grito.
Figura 3 mostra a influência do genótipo EGLN2 na posição 470da seqüência de referência NM_05342.2, que leva às permutas de aminoá-cidos na posição 58 da proteína EGLN2, sobre a idade da ocorrência de do-enças coronarianas no grupo de pacientes. Nesse caso, os valores P abaixode 0,05 são estatisticamente relevantes.
DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 mostra a seqüência de nucléico da proteína E-GLN2 humana com o número NCBI NM_053046.
SEQ ID NO: 2 mostra a seqüência de aminoácido da EGLN2humana derivada da seqüência de ácido nucléico com o número NCBINM_053046.
SEQ ID NO: 3 mostra a primeira seqüência dos iniciadores dosnucleotídeos 444 - 463 da seqüência de referência NM_053046.2.
SEQ ID NO: 4: mostra a segunda seqüência dos iniciadores daseqüência complementar das bases 504 - 521 da seqüência de referência
NM_053046.2.
EXEMPLOS
DETECÇÃO DE SNP ATRAVÉS DE SEQUENCIACÂO E ANÁLISEOLIGONUCLEOTÍDEOS (INICIADORES) PARA A AMPLIFICACÃO:
Para detectar a permuta de nucleotídeos de C para T na posição470 na seqüência EGLN2 com o número de referência NM_053046.2, foramutilizados os seguintes iniciadores:
Iniciador 1: 5'- CTGTCCAGGAGTGCCTAGTG -3' (nucleotídeos444 - 463 da seqüência de referência NM_053046.2;
Iniciador 2: 5'- GGGCTGGCAGTGGTAGAG -3' (seqüência com-plementar das bases 504 - 521 da seqüência de referência NM_053046.2;PROTOCOLO DE PCR PARA A AMPLIFICACÃO:
Os reagentes utilizados eram provenientes de Applied Biosys-tems (Foster City, EUA): 20 mg de DNA genômico; 1 unidade (unit) de Taq-Gold DNA polimerase; 1 χ tampão Taq polimerase; 500 μΜ de dNTPs; 2,5mM de MgCI2; 200 nM de cada par de iniciadores de amplificação, tal comomostrado acima; H2O ad 5 μΙ.
PROGRAMA DE AMPLIFICACÃO DO PCR PARA A TIPIFICAÇÃO DO GE-NÓTIPO:
95°C, 10 minutos
95°C, 30 segundos
70°C, 30 segundos
95°C, 30 segundos
65°C, 30 segundos
95°C, 30 segundos
60°C, 30 segundos
95°C, 30 segundos
56°C, 30 segundos
72°C, 30 segundos
72°C, 10 minutos
4°C, 30 segundos
χ 2 ciclos;
χ 2 ciclos;
χ 2 ciclos;
χ 1 ciclo;
χ 40 ciclos;
χ 1 ciclo.PROTOCOLO PARA A MINISSEQUENCIACÃO E PARA A DETECÇÃO DE SNPS
Os reagentes utilizados eram provenientes de Applied Biosys-tems (Foster City, EUA): 2 μΙ de produto PCR purificado, 1,5 μΙ de kit termi-nador BigDye, 200 nM de um iniciador seqüenciador, tal como mostrado a-cima; H2O ad 10 μΙ.
PROGRAMA DE AMPLIFICACÃO PARA A SEQÜENCIACÂO:
96°C, 2 minutos χ 1 ciclo;
96°C, 10 segundos
55°C, 10 segundos
65°C, 4 minutos χ 30 ciclos;
72°C, 7 minutos
4°C, 30 segundos χ 1 ciclo;
ANÁLISE DOS PRODUTOS DE SEQÜENCIACÂO:
As seqüências foram analisadas com a Sequenz Analyse Soft-ware (Applied Biosystems, Foster City, EUA) para obter inicialmente os da-dos preliminares e depois processadas com o software Phred, Phrap, Polyp-hred e Consed. Phred, Phrap, Polyphred e Consed, escritos por Phill Green,Washington University (http://www.genome.washinqton.edu).
RESULTADOS
CARACTERÍSTICAS DO GRUPO DE PESSOAS
A tabela 1 mostra as características do grupo de pessoas examinadas.
TABELA 1
<formula>formula see original document page 10</formula><table>table see original document page 11</column></row><table>
FREQÜÊNCIA E DISTRIBUIÇÃO DAS VARIANTES DO GENE EGLN2
À tabela 2 mostra a freqüência e distribuição das variantes gené-ticas do gene EGLN2 na posição 470 da seqüência de referênciaNM_053046.2 no grupo de pacientes examinados.
TABELA 2
<table>table see original document page 11</column></row><table>
A seguir, são considerados apenas indivíduos com EGLN2-C470C (EGLN2 Ser58Ser) e EGLN2-C470T (EGLN2 Ser58Leu).
INFLUÊNCIA DAS VARIANTES EGLN2 SOBRE A OCORRÊNCIA DE IN-FARTO MIOCÁRDICO PREMATURO
A tabela 3 mostra a influência do genótipo EGLN2 na posição470 da seqüência de referência NM_053046.2 sobre a ocorrência do infartomiocárdico prematuro (em homens abaixo de 55 anos e em mulheres abaixode 60 anos) e do acidente vascular cerebral/PRIND (deficiência neurológicaisquêmica reversível £>rolongada)/TIA (ataque isquêmico transitório) do grupode pacientes examinados. Valores P abaixo de 0,05 são estatisticamenterelevantes.
TABELA 3
<table>table see original document page 11</column></row><table><table>table see original document page 12</column></row><table>
RESULTADOS:
1. Os pacientes com EGLN2-C470C mostraram uma freqüênciaestatisticamente mais alta para infarto miocárdico prematuro em comparaçãocom pacientes com EGLN2-C470T.
2. Os pacientes com EGLN2-C470T mostraram um aumentosignificativo do risco de sofrer de um acidente vascular cerebral, PRIND e/ouTIA em comparação com pacientes com EGLN2-C470C.
INFLUÊNCIA DAS VARIANTES EGLN2 SOBRE A IDADE DOS PACIENTESCOM DOENÇAS CORONARIANAS
A figura 3 mostra a influência de um genótipo EGLN2 na posição470 da seqüência de referência NM_053042.2 sobre a idade da ocorrênciade doenças coronarianas no grupo de pacientes.
RESULTADO:
Foi descoberta uma dependência significativa da idade dos pa- cientes com EGLN2-C470C (EGLN2 Ser58Ser) para a ocorrência prematurade doenças coronarianas em comparação com a idade dos pacientes comEGLN2-C470T (EGLN2 Ser58Leu).
CONCLUSÃO:
As associações estatisticamente significativas apresentadas a-cima entre as variantes genéticas do gene que codifica para EGLN2 e/ou daproteína EGLN2 são uma nítida indicação sobre o envolvimento das varian-tes genéticas na ocorrência de doenças tromboembólicas e/ou doenças co-ronarianas. Conseqüentemente, as variantes genéticas representam marca-dores biológicos para o prognóstico de doenças tromboembólicas e/ou do-enças coronarianas, especialmente para o prognóstico de doenças trombo-embólicas e/ou doenças coronarianas, especialmente para o prognóstico doinfarto miocárdico prematuro e/ou do acidente vascular cerebral, PRIND e/ou TIA.SEQ ID NO: 1
1 gctttcccct gcctgcctgt ctctagtttc tctcacatcc ctttttttttttcctttctc
61 tagccaccct gaagggtccc ttcccaagcc cttagggacc gcagaggacttggggaccag
121 caagcaaccc ccagggcacg agaagagctc ttgctgtctgccctgcctca ccctgcccca
181 cgccaggccc ggtggccccc agctgcatca agtggaggcggaggaggagg cggaggaggg
241 tggcaccatg ggcccgggcg gtgccctcca tgcccgggggatgaagacac tgctgccatg
301 gacagcccgt gccagccgca gcccctaagt caggctctccctcagttacc agggtcttcg
361 tcagagccct tggagcctga gcctggccgg gccaggatgggagtggagag ttacctgccc
421 tgtcccctgc tcccctccta ccactgtcca ggagtgcctagtgaggcctc ggcagggagt
481 gggaccccca gagccacagc cacctctacc actgccagccctcttcggga cggttttggc
541 gggcaggatg gtggtgagct gcggccgctg cagagtgaaggcgctgcagc gctggtcacc
601 aaggggtgcc agcgattggc agcccagggc gcacggcctgaggcccccaa acggaaatgg
661 gccgaggatg gtggggatgc cccttcaccc agcaaacggccctgggccag gcaagagaac721 caggaggcag agcgggaggg tggcatgagc tgcagctgcagcagtggcag tggtgaggcc
781 agtgctgggc tgatggagga ggcgctgccc tctgcgcccgagcgcctggc cctggactat
841 atcgtgccct gcatgcggta ctacggcatc tgcgtcaaggacagcttcct gggggcagca
901 ctgggcggtc gcgtgctggc cgaggtggag gccctcaaacggggtgggcg cctgcgagac
961 gggcagctag tgagccagag ggcgatcccg ccgcgcagcatccgtgggga ccagattgcc
1021 tgggtggaag gccatgaacc aggctgtcga agcattggtgccctcatggc ccatgtggac
1081 gccgtcatcc gccactgcgc agggcggctg ggcagctatgtcatcaacgg gcgcaccaag
1141 gccatggtgg cgtgttaccc aggcaacggg ctcgggtacgtaaggcacgt tgacaatccc
12 01 cacggcgatg ggcgctgcat cacctgtatc tattacctgaatcagaactg ggacgttaag
1261 gtgcatggcg gcctgctgca gatcttccct gagggccggcccgtggtagc caacatcgag
1321 ccactctttg accggttgct cattttctgg tctgaccggcggaaccccca cgaggtgaag
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1501 cagccgccta cgcccaccta gtggccagtc ccagagccgcatggcagaca gcttaaatga
1561 cttcaggaga gccctgggcc tgtgctggct gctccttccctgccaccgct gctgcttctg
1621 actttgcctc tgtcctgcct ggtgtggagg gctctgtctgttgctgagga ccaaggagga
1681 gaagagacct ttgctgcccc atcatggggg ctggggttgtcacctggaca gggggcagcc
1741 gtggaggcca ccgttaccaa ctgaagctgg gggcctgggtcctaccctgt ctggtcatga
1801 ccccattagg tatggagagc tgggaggagg cattgtcacttcccaccagg atgcaggact
1861 tggggttgag gtgagtcatg gcctcttgct ggcaatggggtgggaggagt acccccaagt
1921 cctctcactc ctccagcctg gaatgtgaag tgactccccaacccctttgg ccatggcagg
1981 caccttttgg actgggctgc cactgcttgg gcagagtaaaaggtgccagg aggagcatgg
2041 gtgtggaagt cctgtcagcc aagaaataaa agtttacctcagagctgcaa aaaaaaaaaa
2101 aaaaaaaaaa aSEQ ID NO: 2mdspcqpqplsqalpqlpgssseplepepgrarmgvesylpcpllpsyhcpgvpseasagsgtpratatsttasplrdgfggqdggelrplqsegaaalvtkgcqrlaaqgarpeapkrkwaedggdapspskrpwarqenqeaereggmscscssgsgeasaglmeealpsaperlaldyivpcmryygicvkds flgaalggrvlaevealkrggirlrdgqlvsqrai p prsirgdqiawveghepgcrsigalmahvdavirh cagrlgs yvingrtkamvacypgnglgyvr:hvdnphgdgrcitciyylnqnwdvkvhggllqifpegrpwanieplfdrll
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seq id no: 31 ctgtccagga gtgcctagtseq id no: 41 gggctggcag tggtagag

Claims (22)

1. Processo para o diagnóstico in-vitro de doenças tromboembó-licas e/ou doenças coronarianas, no qual o nucleotídeo na posição 470 deum ácido nucléico que codifica para a proteína EGLN2 humana ou o amino-ácido na posição 58 da proteína EGLN2 humana é determinado de uma a-mostra de uma pessoa.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual a doençatromboembólica é selecionada do acidente vascular cerebral, deficiêncianeurológica isquêmica reversível prolongada (PRIND) e/ou de ataque is-quêmico transitório (TIA).
3. Processo de acordo com a reivindicação 1, no qual, no casoda doença coronariana, se trata de infarto miocárdico.
4. Processo de acordo com a reivindicação 2, no qual o nucleo-tídeo da posição 470 é determinado como timidina no DNA cromossomal ouuracila no mRNA ou o aminoácido na posição 58 é determinado como Ieuci-na como fator de risco para acidente vascular cerebral, PRIND e/ou TIA.
5. Processo de acordo com a reivindicação 3, no qual o nucleo-tídeo da posição 470 é determinado como citidina ou o aminoácido na posi-ção 58 é determinado como serina como fator de risco para infarto miocárdi-co, especialmente infarto miocárdico prematuro.
6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-5, no qualo ácido nucléico que codifica para a proteína EGLN2 humana apresenta aseqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 1.
7. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 -5, no quala proteína EGLN2 humana apresenta a seqüência de aminoácido da SEQ IDNO: 2.
8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 -4 e 6, noqual o nucleotídeo na posição 470 é determinado com um processo, sele-cionado do grupo consistindo em um processo de seqüenciação de ácidonucléico, de uma análise espectrométrica de massa do ácido nucléico, deum processo de hibridização e/ou em um processo de amplificação.
9. Processo de acordo com a reivindicação 8, no qual o proces-so de seqüenciação de ácido nucléico é selecionado do grupo, selecionadoda pirossequenciação e/ou da seqüenciação com auxílio de nucleotídeoscom marcação radioativa e/ou fluorescente.
10. Processo de acordo com a reivindicação 8, no qual o pro-cesso de hibridização é selecionado do grupo consistindo na análise Sou-thern blot, a análise Northern Blot e/ou um processo de hibridização em ummicroarranjo de DNA.
11. Processo de acordo com a reivindicação 8, no qual o pro-cesso de amplificação é selecionado do grupo consistindo em uma análiseTaqMan1 uma análise RNA-display diferencial e/ou uma análise diferencialde representação.
12. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-3, 5 e 7,no qual a seqüência de aminoácido na posição 58 é determinada com umprocesso, selecionado do grupo consistindo em um processo para a medi-ção da quantidade de proteína específica e/ou um processo para a mediçãoda atividade da proteína específica.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, no qual a quan-tidade da proteína específica é medida com um processo, selecionado dogrupo consistindo em uma análise Western Blot e/ou um teste ELISA.
14. Processo de acordo com a reivindicação 12, no qual a ativi-dade da proteína específica é medida em um processo de teste in-vitro ouem um processo de teste in-vitro para células inteiras com células humanas,animais, bacterianas ou de levedura.
15. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-14, noqual a amostra é selecionada do grupo consistindo em uma célula, um tecidoe/ou um líquido corporal.
16. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-15, noqual em um segundo estágio é determinado o risco de uma pessoa de sofrerde uma doença tromboembólica e/ou de uma doença coronariana.
17. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-15, noqual em um segundo estágio é determinada a dosagem de um medicamen-to.
18. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-17, queabrange os seguintes estágios:(a) obtenção de uma amostra de uma pessoa a ser examinada;(b) isolamento de uma sonda de ácido nucléico, especialmente de uma sonda de DNA1 da amostra;(c) amplificação da posição 470 do gene EGLN2 abrangendo aregião específica com auxílio de iniciadores;(d) seqüenciação da região amplificada;(e) análise da região seqüenciada, bem como(f) avaliação do risco de uma doença tromboembólica e/ou deuma doença coronariana, especialmente de um infarto miocárdico, de umacidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou doenças coronarianas.
19. Processo de acordo com a reivindicação 18, no qual, no ca-so do infarto miocárdico, se trata de um infarto miocárdico prematuro.
20. Processo de acordo com a reivindicação 18 ou 19, no qualos iniciador são selecionados de SEQ ID NO: 3 e/ou SEQ ID NO: 4.
21. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-3, 5, 7 ou-12-17, que abrange os seguintes estágios:(a) obtenção de uma amostra, especialmente de uma célula, de um tecido, de um líquido corporal, de um componente celular do sangue, decélulas endoteliais ou de células musculares lisas, de uma pessoa a ser e-xaminada ou de um paciente a ser examinado;(b) isolamento da proteína EGLN2 da amostra;(c) determinação do aminoácido na posição 58 da proteína E-GLN2e(d) avaliação do risco de uma doença tromboembólica e/ou deuma doença coronariana, especialmente de um infarto miocárdico prematu-ro, de um acidente vascular cerebral, de PRIND, TIA e/ou doenças coronari-anas.
22. Processo de acordo com a reivindicação 20, no qual, no ca-so do infarto miocárdico se trata de um infarto miocárdico prematuro.
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