BRPI0617411A2 - molÉcula de Ácido nuclÉico, isolada de coffea spp e vetor - Google Patents

Abstract

<B>MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, ISOLADA DE COFFEA SPP E VETOR<D>Esta descrição refere-se a moléculas de ácidos nucléjeos, isoladas de café (Co ffea spp.), compreendendo seqúências que codificam a manano sintetase ou a galactomanano galactosiltransferase. São também expostos processos nos quais esses polinucleotídeos são utilizados para regulação gênica e manipulação das moléculas de polissacarídeos de plantas de café, objetivando influenciar características de extração e outros aspectos de grãos de café.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULADE ÁCIDO NUCLÉICO, ISOLADA DE COFFEA SPP E VETOR".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao campo de biotecnologia a-grícola. Mais especialmente, a invenção refere-se a enzimas de plantasde café que participam no metabolismo de polissacarídeos, incluindo asíntese de galactomananos, e as seqüências de aminoácido que codifi-cam as mesmas.Antecedentes da Invenção

Por todo este pedido de patente, são feitas referências a vá-rias publicações, incluindo patentes, aplicações publicadas e artigos es-pecializados. Os conteúdos de cada uma destas publicações são aquiincorporados, em sua totalidade. Referências que não tenham sido intei-ramente especificadas neste pedido poderão ser encontradas no finaldeste relatório.

Uma das principais etapas no processamento de café é a tor-refação do grão verde. A etapa de torrefação é geralmente conduzidaem uma temperatura que varia de 170° a 230°C por 5 a 15 minutos e éresponsável por produzir a maior parte do aroma, sabor e cor, associa-dos à bebida de café (Yeretzian et aí., 2005). Dependendo do grau utili-zado para a torrefação, aproximadamente de 12-40% dos polissacarí-deos podem ser degradados nesta etapa (Redgwell et a!., 2002). A eta-pa de torrefação tem sido relatada como aquela em que o comprimentode muitos dos complexos formados por polímeros de polissacarídeos éalterado, o que pode aumentar a sua solubilidade (Redgwell et aí.,2002). Acredita-se que a fragmentação dos polissacarídeos do café afe-te favoravelmente as propriedades organolépticas da bebida, como sen-sação na boca (mouthfeeí) (llly e Viani 1995) e estabilidade da espuma(Nunes et aí., 1997). Acredita-se também que a decomposição dos po-lissacarídeos influencie indiretamente a ligação de compostos voláteisdo aroma, visto que alguns produtos da degradação de complexos for-mados por carboidratos participem na formação de melanoidinasdo grão torrado, uma classe de compostos cuja definição é deficiente e queconstituem mais 20% do peso seco do grão torrado (Charles-Bernard et al.,2005). A clivagem dos polissacarídeos, induzida pela torrefação, pode levartambém a aumento na quantidade de sólidos extraídos do grão de café, umapropriedade de importância fundamental para a produção de café solúvel.Adicionalmente, a fragmentação/degradação dos carboidratos, presentes nogrão de café, contribui também para a criação de um grupo importante demoléculas, responsáveis pelo sabor e aroma do café, via a reação de Mail-lard, associada à torrefação do café (Yeretzian et al, 2005).

Carboidratos constituem uma grande parcela do grão verde ma-duro do café (grão verde). Aproximadamente 48-55% do peso seco existenteno grão verde arábica (Coffea arabica) e robusta (C. canephora) são com-postos por carboidratos, alguns dos quais sob a forma de complexos polis-sacarídeos, enquanto que outras formas incluem mono e dissacarídeos Ii-vres (Clifford M.N., 1985 In Coffee: Botany, Biochemistry, and Production, pp374, ed. Clifford, M. and Willson, K., Croom Melm Ltd, London; Fischer et al.2001, Carbohydrate Research, 330, 93-101). Foram identificados três tiposprincipais de polímeros complexos à base de carboidratos no grão de café.Os polissacarídeos mais abundantes no grão são os galactomananos, rela-tados como representando até 25% da massa no grão verde maduro do ca-fé, ou seja, aproximadamente 50% dos carboidratos do grão. (Oosterveld etal., 2003 Carbohydrate Polymers 52, 285-2960). O segundo grupo mais a-bundante de polissacarídeos são os arabinogalactanos que compreendematé 35% dos polissacarídeos do grão verde (Oosterveld et al., 2003, supra).Os aproximadamente 16% restantes, dos polissacarídeos do grão verde A-rábica consistem primariamente em celulose e xiloglucanos (Oosterveld etal., 2003).

Os mananos, contendo hemiceluloses, são compostos por umacadeia principal formada por moléculas de manose com ligações beta 1 -4, eembora possam ser amplamente encontrados em plantas, os mananos têmsido considerados como um constituinte relativamente secundário nas pare-des da maioria dos tipos de plantas (Bacic, Harris e Stone 1988; Fry 2004;Somerville et al., 2004b). Algumas sementes contendo endosperma, comoaquelas de Leguminosae, Palmae e as espécies de Coffea de grande valorcomercial, possuem quantidades bem grandes de galactomananos nas pa-redes celulares das sementes contendo endosperma (Matheson 1990; Buc-keridge et. al., 2000; Pettolino et ai, 2001; Redgwell et ai, 2002; Hanford etai, 2003). Os galactomananos são caracterizados por cadeias de mananoque possuem moléculas únicas de galactosil anexadas por ligação (1-6) alfa.Os galactomananos do endosperma da semente aparentemente estão asso-ciados ao espessamento secundário da parede celular do endosperma (Pet-tolino et ai, 2001; Sunderland et ai, 2004; Somerville et al., 2004a) e acredi-ta-se que façam parte da reserva de energia da semente madura, papel aná-logo ao desempenhado pelo amido em endospermas de cereais (Reid1985). Outras funções que foram cogitadas para os galactomananos do en-dosperma incluem facilitar a inibição/germinação e proteger o embrião dasemente de dessecação (Reid e Bewley 1979). Outros principais polímerosda parede celular, formados por mananos, incluem os glucomananos quepossuem algumas das unidades de mananos, substituídas por resíduos deglicose com ligação beta-1,4, e os glucomananos com resíduos de galactosecom ligação alfa-1,6. Galactoglucamananos com níveis baixos de galactosesão constituintes importantes de paredes celulares espessadas Iignificadasde gimnospermas (Lundqvist, J. et ai, 2002) e podem ser também encontra-dos na fruta kiwi [Some texts missing on original document]em tecido (Schroder, R. et al., 2001; Sims, I. et al.,1997). Estudos recentes tiveram como objetivo confirmar a existência depolímeros de manano nas paredes celulares com espessamento secundáriode elementos do xilema, parênquima de xilema e fibras interfasciculares domodelo de angiospermas, Arabidopsis thaliana (Handford et al 2003). Elesdetectaram também níveis significativos de mananos nas paredes espessasde células epidérmicas de folhas e de tronco, e níveis mais baixos de mana-nos em outros tecidos examinados, indicando a presença difundida de ma-nanos em Arabidopsis.

Embora se saiba que os polímeros da celulose são sintetizadosna membrana plasmática, acredita-se que a maioria dos polissacarídeos nãocelulósicos é formada no aparelho de golgi e transportada, em seguida, atra-vés da membrana celular para o espaço apoplástico (Keegstra e Raikhel2001; Somerville, Bauer, Brininstool, Facette, Hamann, Milne, Osborne, Pa-redez, Persson, Raab, Vorwerk e Youngs 2005; Liepman, Wilkerson e Ke-egstra 2005b). Sabe-se que duas glicosiltransferases ligadas à membranaestão envolvidas na síntese dos galactomananos: uma (1,4)-beta-manosiltransferase ou manano sintase (MS), dependente de Mg++ e deGDP-Man e uma (1,6)-alfa-D-galactosiltransferase (GMGT), específica demanano, dependente de Mn++ e de UDP-Gal, e acredita-se que estas enzi-mas operem em conjunto muito estreitamente para determinar a distribuiçãoestatística de resíduos de galactosil ao longo do polímero de mananos (Ed-wards, Choo, Dickson1 Scott, Gridley e Reid 2004). A confirmação de quemananos são sintetizados no complexo de golgi foi obtida recentemente,utilizando anticorpos específicos de mananos para detectar a síntese in vitrode manano e, esta sustenta adicionalmente o modelo global no qual polissa-carídeos do tipo hemicelulose, como os galactomananos, são formados nocomplexo de golgi e transportados, em seguida, para a membrana celular esecretados na região apoplástica (Handford, Baldwin, Goubet, Prime, Miles,Yu e Dupree 2003; Somerville, Bauer, Brininstool, Facette, Hamann, Milne,Osborne, Paredez, Persson, Raab, Vorwerk e Youngs 2005).

A importância de uma proteína de ligação GMGT, presente nocomplexo de golgi, sobre a síntese de galactomananos do endosperma dasemente e, mais precisamente, sobre o controle do nível de modificação degalactose, foi demonstrada recentemente ao ser mostrado que a super ousubexpressão da proteína GMGT do Lotus japonicus causa modificaçõesnas proporções de galactose/manose na semente (Edwards, Choo, Dickson,Scott, Gridley e Reid 2004).

Até recentemente, os genes responsáveis pela síntese de ma·nanos da célula vegetal não eram conhecidos. O primeiro gene isolado quecodifica uma manano sintase, bioquimicamente demonstrado, foi o ManSproveniente de sementes de Cyamopsis tetragonoloba (guar) (Dhugga et ai,2004). O cDNA do CtManS foi isolado a partir de bibliotecas de EST, forma-das a partir de três estágios diferentes da semente da goma guar, uma se-mente que produz quantidades muito grandes de galactomananos. As ESTrelacionadas ao CtManS foram identificadas pelo levantamento de seqüên-cias com grande semelhança às de CeIA (celulose sintases que geram beta-1,3-glucanos) e Csl (proteínas semelhantes à celulose-sintase) de plantas.Os genes da Csl são significativamente semelhantes aos genes da CeIA eforam propostos anteriormente como possíveis genes para enzimas envolvi-das na síntese de hemiceluloses como os galactomananos (Cutler e Somer-ville, 1997; Richmond e Somerville, 2000; Hazen et al., 2002). A abundânciadas possíveis ESTs de manano sintase, em cada biblioteca de semente deguar, corresponde aos níveis de atividade de manano sintase, bioquimica-mente medidos em cada estágio, sugerindo que estas ESTs representavamuma manano sintase. Foi demonstrado que o cDNA da suposta manano sin-tase de guar codifica uma enzima funcional ao ser mostrado que embriõessomáticos de soja, os quais normalmente não possuem atividade detectávelde manano sintase, exibiram atividade significativa de manano sintasequando superexpressaram a seqüência de cDNA do CtManS (Dhugga et al.,2004). Foi constatado que a enzima funcional recombinante estava Iocaliza-da no complexo de golgi. No genoma da arabidopsis, existem mais de 25genes anotados como genes da Csl e estes são subdivididos em família deacordo com a homologia de suas seqüências. Foi conduzida recentementeuma avaliação funcional em proteínas recombinantes geradas a partir dealgumas seqüências de genes de Cs1 da arabidopsis Csl e foi determinadoque vários membros da família dos genes de CsIA que codificam proteínascom atividade de beta-manano sintase (Liepman et ai, 2005).

Há pouca informação disponível direcionada ao metabolismo depolímeros relacionados a mamano em café. Foram obtidos diversos cDNAaltamente relacionados que codificam alfa-galactosidase no grão de café e aexpressão deste gene no grão em desenvolvimento indica que este gene éinduzido durante a formação e expansão do endosperma (aproximadamente22-27 WAF (Semanas após a Fertilização)), e a expressão pode ser detec-tada também em folhas, flores, embriões zigóticos e, fracamente, em raízes(Marraccini etal., 2005). A relação galactose/manose de galactomananos dogrão de café reduz de uma relação de aproximadamente 1:2 a 1:7, em umestágio inicial do desenvolvimento do grão (11 WAF; semanas após fertiliza-ção), para uma relação de 1:7 a 1:40 próximo da maturidade em 31 WAF(Redgwell et al., 2003). Esta informação, juntamente com os dados de ex-pressão no desenvolvimento, para a alfa-galactosidase apresentada acima,levou à teoria de que esta alfa-galactosidase, produzida por este gene espe-cífico, poderia estar diretamente envolvida na redução do teor de galactosedos galactomananos do grão de café que se inicia em torno de 21-26 WAF econtinua até a maturidade do grão (Redgwell et ai, 2003). Foi obtido suportepara este modelo nas sementes em desenvolvimento de sena (Senna occi-dentalis), em que foi constatado que um aumento significativo em atividadede alfa-galactosidase coincide com a redução do teor de galactose de galac-tomananos da semente (Edwards et al., 1992). Suporte adicional ao envol-vimento de uma alfa-galactosidase na redução do teor de galactose foi obti-do subseqüentemente quando a alfa-galactosidase de sena foi expressa emsementes em desenvolvimento de Cyamopsis tetragonoloba (guar) com aajuda de um promotor específico para a semente (Joersbo etal., 2001). Se-mentes de guar possuem normalmente níveis altos de galactomananos comrelação muito alta de galactose/manano, porém sementes de guar produzi-das a partir de plantas que expressam alfa-galactosidase de sena revelaramreduções significativas no nível da relação galactose/manose nas sementesmodificadas de sena. Dois cDNA que codificam endobeta manases distintas(manA e manB) foram isolados também a partir de grão de café em germi-nação (Marraccini et al., 2001). Os genes correspondentes não foram ex-pressos no grão em desenvolvimento, porém ambos foram expressos duran-te a germinação, sendo os transcritos começando a serem detectados em10-15 dias após embebição. Essa observação sugere que estas duas mana-nases estão associadas à degradação de galactomananos durante a germi-nação e resulta na liberação de açúcares livres que agem, em seguida, tantocomo fonte de energia como reduzem carbono para a semente em germina-ção. A expressão de manA foi examinada, não sendo detectada expressãoem folhas, embriões somáticos, botões de flor ou raízes (Mârraccini et al.,2001).

Apesar da abundância de galactomananos no grão de café e aimportância implícita de enzimas que participam na síntese de galactomana-no, há pouca informação disponível sobre estes genes no café. Dessa for-ma, há necessidade para identificar, isolar e caracterizar as enzimas, genese elementos de regulação genética, envolvidos na via biossintética de galac-tomananos no café. Esta informação permitirá que a síntese de galactoma-nanos seja manipulada geneticamente, objetivando a transmissão de vanta-gens fenotípicas desejáveis, associadas à produção de galactomananos al-terados.

Sumário da Invenção

Uma característica da invenção apresenta uma molécula de áci-do nucléico isolada de Coffea spp., compreendendo uma seqüência de codi-ficação que codifica uma enzima da síntese de galactomanano, a qual podeser uma galactosiltransferase ou uma manano sintase. Em certas concreti-zações, a manano sintase compreende um domínio que conserva a seqüên-cia de aminoácidos QHRWS. Em outras concretizações, a manano sintasecompreende uma seqüência de aminoácidos com identidade acima de 75%com qualquer uma entre as SEQ ID NOS: 4-6 e, de preferência, compreendequalquer uma entre as SEQ ID NOS: 4-6. Especificamente, a seqüência co-dificadora compreende a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3.

Em outras concretizações, a enzima é uma galactosiltransferaseque possui uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 54% de identi-dade com a de galactosiltransferase de alfava ou galactosiltransferase deLotus japonicus. Em outras concretizações, a galactosiltransferase compre-ende uma seqüência de aminoácidos com pelo menos 75% de identidadecom qualquer uma entre as SEQ ID NOS: 15-18 e, de preferência, compre-ende qualquer uma entre as SEQ ID NOS: 15-18. Especificamente, a se-qüência codificadora compreende qualquer uma entre as SEQ ID NOS: 11-14.Em certas concretizações, a seqüência codificadora é uma es-trutura de leitura aberta de um gene, uma molécula de mRNA, produzida portranscrição de um gene ou uma molécula de cDNA produzida por transcriçãoreversa da molécula de mRNA.

Outra característica da invenção apresenta um oligonucleotídeocom 8 a 100 bases de extensão e que complementa um segmento da molé-cula de ácido nucléico supramencionada.

Outra característica da invenção apresenta um vetor compreen-dendo a seqüência codificadora da molécula de ácido nucléico descrita aci-ma. O vetor pode ser um vetor de expressão escolhido entre plasmídeo, fa-gomídeo, cosmídeo, bacmídeo, vetores bacterianos, de levedura e virais.Em certas concretizações, a seqüência codificadora da molécula de ácidonucléico é ligada operacionalmente a um promotor constitutivo. Alternativa-mente, ela é ligada operacionalmente a um promotor de indução. Em umaalternativa, a seqüência codificadora da molécula do ácido nucléico é ligadaoperacionalmente a um promotor específico de tecidos, o qual pode ser umpromotor específico de sementes em certas concretizações e mais especi-almente um promotor específico de semente de café.

Um outro aspecto da invenção apresenta uma célula hospedeiratransformada com o vetor supramencionado. A célula hospedeira pode serselecionada entre células de plantas, células bacterianas, células de fungos,células de insetos e células de mamíferos. É provida também uma célulafértil, produzida a partir de uma célula transformada.

Outra característica da invenção apresenta um método para mo- dular a extração de sólidos de grãos de café, compreendendo a modulaçãoda produção ou da atividade da enzima envolvida na síntese de galactoma-nanos dentro de sementes de café. As enzimas são, especificamente, a ga-Lactosiltransferase ou manano sintase, ou uma combinação destas. Em umaconcretização, a produção ou atividade da enzima envolvida na síntese degalactomananos é aumentada, por exemplo, aumentando a expressão deum gene que codifica a enzima ou pela introdução de um transgene que co-difica a enzima. Em outra concretização, a produção ou atividade da enzimaenvolvida na síntese de galactomananos é diminuída, por exemplo, interfe-rindo com a expressão de um gene que codifica a enzima.

Outras apresentações e vantagens da invenção serão entendi-das por referência aos desenhos, descrição detalhada e exemplos que seseguem.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1. Ilustração da estrutura do polímero galactomanano.Figura 2. Isolamento e caracterização das seqüências completascodificadoras de ácidos nucléicos que codificam manano sintases de Coffeacanephora e de Coffea arabica.

(A) Visão geral dos clones utilizados para identificar a seqüênciacompleta de ORF para o CcManS que codifica a manano sintase de C. ca-nephora e o CaManS que codifica a manano sintase de C. arabica. Foramobtidos quatro clones com cDNA parciais que cobriram a ORF completa doCcManS (consultar Exemplos): dois produtos de 5' RACE, pVC2 e pVC3,que contêm a seqüência codificadora da extremidade 5' do CcManS, e doisclones com cDNA parcial (pcccs46w24c19 e pcccs46w16i11), contendo orestante da extremidade 3' do CcManS. Os clones pVC4, pVC6 e pVC7 docDNA contêm seqüências amplificadas por PCR com seqüências de leituraaberta que codificam a manano sintase do café (Nota: O pVC4 contém umcódon de parada na pb 1118 pb em decorrência de um erro introduzido du-rante a etapa de amplificação por PCR1 conforme discutido nos exemplos).As anotações são as seguintes: pcccs46w16i11 = seqüências de inserçãodo clone de cDNA cccs46w16i11 (com dois íntrons e seqüências não codifi-cadoras na extremidade 3' no clone, removidos) de Coffea canephora (SEQID N0:7); pcccs46w24c19 = seqüências de inserção do clone decccs46w24c19 de Coffea canephora (SEQ ID N0:8); pVC2 (SEQ ID N0:9) =primeiro fragmento por RACE da Coffea canephora, var. Robusta (BP409),clonado em pCR-4-Topo; pVC3 (SEQ ID N0:10) = segundo fragmento porRACE, clonado em pCR-4-Topo; pVC4 (SEQ ID N0:1) = amplificação detoda a extensão do polinucleotídeo que codifica a manano sintase da Coffeacanephora, var. Robusta (BP409), clonado em pCR-4-Topo (este fragmentopossui um códon de parada em ORF); pVC6 (SEQ ID NO:2) = amplificaçãode toda a extensão do CcManS, um polinucleotídeo que codifica a mananosintase da Coffea canephora, var. Robusta (BP409), clonado em pCR-4-Topo; pVC7 (SEQ ID NO:3) = amplificação de toda a extensão do CaManS,um polinucleotídeo que codifica a manano sintase da Coffea arabica, var.Arabica (T2308), clonado em pCR-4-Topo.

(B) Alinhamento de todas as seqüências para CcManS (SEQ IDΝΟ.Ί e SEQ ID NO:2) e CaManS (SEQ ID NO:3), executado utilizando oprograma CLUSTALW (Pacote Lasergene1 DNASTAR) e otimizado manual- mente. Q nucleotídeo circundado na seqüência do pVC4 marcou a base quesofreu a mutação levando ao códon de parada na ORF deste clone. No en-tanto, é evidente que as outras três seqüências de cDNA que codificam essaregião, todas as quais obtidas de reações independentes de PCR, possuemum A em vez de um T nessa posição levando à proteína prevista. Por con-seguinte, acredita-se que este T, no pVC4, é decorrente de uma anomalia naPCR ou clonagem. As seqüências em cinza correspondem ao pVC6. As se-qüências de íntrons são registradas pela presença de uma linha preta acimadestas seqüências. Uma deleção na seqüência do pVC3 na posição 325 in-duz uma modificação na seqüência de leitura aberta e acredita-se que sejaum erro gerado durante a clonagem por RT-PCR desta seqüência.

Figura 3. Exibe a seqüência protéica completa do CcManS daCoffea canephora (SEQ ID NO:5). Esta seqüência protéica foi deduzida apartir da seqüência de cDNA codificada pelo pVC6 (SEQ ID NO:2).

Figura 4. Alinhamento de seqüências protéicas de seqüênciasde manano sintase do café com seqüências de outras manano sintases. Asseqüências protéicas do CcManS (SEQ ID NO: 5), deduzidas a partir dasseqüências do pVC4 e do pVC6 e a seqüência protéica do CaManS (SEQ IDNO: 6), deduzida a partir da seqüência do pVC7, foram alinhadas com prote-ínas de manano sintases de outras plantas, disponíveis no banco de dadosda NCBI1 empregando o CLUSTALW, seguido por uma etapa de otimizaçãomanual (Nota: o códon de parada no pVC4 na posição 345 está assinaladopor um círculo vermelho). Regiões relatadas como sendo conservadas em β-glicosiltransferases estão assinaladas por um * ou em caixa (conforme emDhugga et al. 2004). Aminoácidos assinalados em cinza representam os a-minoácidos mais freqüentemente encontrados naquela posição. Os númerosde acesso para as seqüências utilizadas são os CtManS (Cyamopsis tetra-gonoloba, AAR23313, SEQ ID NO:21), AtManS (Arabidpsis thaliana,CAB82941, SEQ ID NO:22) e IbManS (Ipomoea trifida, AAQ62572; SEQ IDNO:23) bioquimicamente caracterizados.

Figura 5. Exibe o alinhamento de seqüências da seqüência pro-téica (SEQ ID NO: 15) do unigene 122620 (SEQ ID NO:11) com duas se-qüências de GMGT de plantas, bioquimicamente caracterizadas. A ORFparcial do unigene 122620 (CcGMGTI) foi alinhada com as seqüências pro-téicas da GMGT do Lotus japonicus (número de acesso AJ567668, SEQ IDNO: 24) e da GMGT do aifava (Trigoneila foenum-graecum) (número de a-cesso AJ245478, SEQ ID NO: 25; observado como sendo um cDNA parcial),empregando o ClustaIW. Aminoácidos encontrados em duas ou mais se-qüências estão em cinza.

Figura 6. Exibe o alinhamento de seqüências da seqüência pro-téica (SEQ ID NO: 16) do unigene 122567 (SEQ ID NO: 12) com duas se-qüências de GMGT de plantas, bioquimicamente caracterizadas. A ORFparcial do unigene 122567 (CcGMGT2) foi alinhada com as seqüências pro-téicas da GMGT do Lotus japonicus (número de acesso AJ567668, SEQ IDNO: 24) e da GMGT do alfava (Trigonella foenum-graecum) (número de a-cesso AJ245478, SEQ ID NO:25; observado como sendo um cDNA parcialcDNA), empregando o ClustaIW. Aminoácidos encontrados em duas ou maisseqüências estão em cinza.

Figura 7. Representação esquemática dos três clones que codi-ficam dados de seqüência de ORF parcial ou completa para a GMGTase 1do café. O pcccs46w8o23 (SEQ ID NO:19) é um clone da biblioteca de ESTda C. canephora EST,o pVC10 (SEQ ID N0:20) contém a seqüência isoladapor 5' RACE e o pVC11 (SEQ ID NO: 13) contém o fragmento genômico daarábica, contendo a seqüência polipeptídica completa de uma GMGTase 1de arabica.Figura 8. Alinhamento das seqüências de DNA da GMGTase 1do pcccs46w8o23 (SEQ ID NO:19), pVC10 (SEQ ID N0:20) e do pVC11(SEQ ID NO:13) com a seqüência gerada "in-silico" do unigene #122620(SEQ ID NO:11). O alinhamento foi realizado utilizando o CLUSTALW e a-justado manualmente.

Figura 9. Alinhamento da seqüência protéica da CaGMGTase 1(SEQ ID NO: 17) com as seqüências protéicas mais homólogas encontradasno banco de dados público GenBank. O alinhamento foi realizado utilizandoo CLUSTALW. Números de acesso: CAB52246: [Trigonella foenum-graecum] Alfa-galactosiltransferase (SEQ ID NO:26); CAI11452: [Solanumtuberosum] Alfa-6-galactosiltransferase (SEQ ID NO:27); CAI11453: [Nicoti-ana benthamiana] Alfa-6-galactosiltransferase (SEQ ID NO:28); CAI11454:[Medicago truncatula] Alfa-6-galactosiltransferase (SEQ ID NO:29); A-BE79594: [Medicago truncatula] Galactosil transferase (SEQ ID N0:30);CAI79402: [Cyamopsis tetragonoloba] Galactomanano galactosiltransferase(SEQ ID NO:31); CAI79403: [Senna occidentalis] Galactomanano galactosil-transferase (SEQ ID NO:32); CAD98924: [Lotus corniculatus var. japonicus]Galactomanano galactosiltransferase (SEQ ID NO:33).

Figura 10. Alinhamento das seqüências de DNA da GMGTase 2do unigene #122567 (SEQ ID NO: 12) com a seqüência de DNA da GMGTa-se 2 do clone de cDNA pccc126f9 da C. canephora (CcGMGTase 2; SEQ IDN0:14), utilizando o CLUSTALW.

Figura 11. Alinhamento da seqüência protéica da CeGMGTase 2(SEQ ID NO: 18) com a da CaGMGTase 1 (SEQ ID NO: 17) e as seqüênciasprotéicas mais homólogas encontradas no banco de dados público Gen-Bank. O alinhamento foi realizado empregando o CLUSTALW. Números deacesso: CAB52246: [Trigonella foenum-graecum] Alfa-galactosiltransferase(SEQ ID NO:26); CAM1452: [Solanum tuberosum] Alfa-6-galactosiltrans-ferase (SEQ ID NO:27); CAM1453: [Nicotiana benthamiana] Alfa-6-galactosiltransferase (SEQ ID NO:28); CAI11454: [Medicago truncatula] Alfa-6-galactosiltransferase (SEQ ID NO:29); ABE79594: [Medicago truncatula]Galactosil transferase (SEQ ID N0:30); CAI79402: [Cyamopsis tetragonolo-ba] Galactomanano galactosiltransferase (SEQ ID NO:31); CAI79403: [Sen-na occidentalis] Galactomanano galactosiltransferase (SEQ ID NO:32);CAD98924: [Lotus corniculatus var. japonicus] Galactomanano galactosil-transferase (SEQ ID NO:33).

Figura 12. Dados de expressão por RT-PCR quantitativa deCaGMGTI em vários tecidos da Coffea canephora e da Coffea Arabica.

Descrição Detalhada de Concretizações Ilustrativas

Definições:

Vários termos relativos às moléculas biológicas e outras caracte-rísticas da presente invenção são utilizados por toda a exposição e reivindi-cações. Os termos terão supostamente os seus significados habituais nocampo de biologia e bioquímica molecular, a não ser que especificamentedefinidos de outra forma neste pedido de patente.

"Isolado" significa alterado "pelo homem" do estado natural. Seuma composição ou substância ocorrer na natureza, ela foi "isolada" se tiversido modificada ou removida de seu ambiente natural, ou ambos. Por exem-plo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo naturalmente presente em uma plan-ta ou animal vivo não é "isolado", porém o mesmo polinucleotídeo ou poli-peptídeo separado dos materiais com os quais co-existe em seu estado na-tural, é "isolado", conforme o termo é empregado neste pedido de patente.

"Polinucleotídeo", também referido como "molécula de ácido nu-cléico", refere-se geralmente a qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxir-ribonucleotídeo, sendo que este pode ser RNA ou DNA não modificados ouRNA ou DNA modificados. "Polinucleotídeos" incluem, entre outros, DNA defita única ou dupla, DNA composto por uma mistura de regiões de fita únicae duplas, RNA de fita única e dupla e RNA composto por regiões de fita úni-ca e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem serde fita única ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiõesde fita única e dupla. Ademais, "polinucleotídeo" refere-se a regiões de fitatripla, compreendendo RNA ou DNA ou ambos, RNA e DNA. O termo poli-nucleotídeo inclui também DNAs ou RNAs que contenham uma ou mais ba-ses modificadas e DNAs ou RNAs com cadeias principais modificadas paraestabilidade ou por outros motivos. Bases "modificadas" incluem, por exem-plo, bases tritiadas e bases incomuns como inosina. Uma variedade de mo-dificações pode ser efetuada ao DNA e RNA; dessa forma, "polinucleotídeo"engloba formas de polinucleotídeos modificadas química, enzimática ou me-tabolicamente, conforme tipicamente encontrados na natureza, bem como asformas químicas de DNA e RNA, características de vírus e células. "Polinu-cleotídeo" engloba também polinucleotídeos relativamente curtos, freqüen-temente referidos como oligonucleotídeos.

"Polipeptídeo" refere-se a qualquer peptídeo ou proteína com-posto por dois ou mais aminoácidos reunidos por ligações peptídicas ou li-gações peptídicas modificadas, ou seja, peptídeos isósteros. "Polipeptídeo"refere-se tanto aos de cadeias curtas, referidos comumente como peptídeos,oligopeptídeos ou oligômeros, como os de cadeias longas, geralmente refe-ridos como proteínas. Os polipeptídeos podem conter outros aminoácidosalém dos 20 aminoácidos que codificam genes. "Polipeptídeos" incluem se-qüências de aminoácidos modificadas por processos naturais, como proces-samento pós-traducional ou por técnicas de modificação química, as quaissão bem conhecidas na técnica. Estas modificações estão bem descritas emtextos básicos e em monografias mais detalhadas, bem como em uma volu-mosa literatura de pesquisa. As modificações podem ocorrer em qualquerlocal em um peptídeo, incluindo em sua cadeia principal, as cadeias lateraisde aminoácidos e na terminação amino ou carboxila. Será apreciado que omesmo tipo de modificação pode estar presente no mesmo ou em variadosgraus em diversos sítios em um determinado polipeptídeo. Ademais, um de-terminado peptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Os polipeptí-deos podem ser ramificados em resultado de ubiquitinação e podem ser cí-clicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados e comramificações cíclicas podem resultar de processos naturais pós-traducionaisou podem ser produzidos por métodos sintéticos. As modificações incluem,acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, ligação covalente de flavi-na, ligação covalente de porção heme, ligação covalente de um nucleotídeoou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado delipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, ligação cruzada, ciclização,formação de ligação dissulfeto, desmetilação, formação de ligações covalen-tes cruzadas, formação de cistina, formação de piroglutamato, formilação,gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação,iodização, metilação, miristilação, oxidação, processos proteolíticos, fosfori-lação, prenilação, racemização, selenilação, sulfação, adição de aminoáci-dos a proteínas, mediada por transferência de RNA, como arginilação e ubi-quitinação. Consultar por exemplo, Proteins - Structure and Molecular Pro-perties, 2- ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, Nova Iorque,1993, e Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives andProspects, páginas 1-12 em Posttranslational Covalent Modification of Prote-ins, B. C.Johnson, Ed., Academic Press, Nova York, 1983; Seifter et ai, "A-nalysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors", Meth Enzymol(1990) 182:626-646 e Rattan et ai, "Protein Synthesis: Posttranslational Mo-difications and Agintf, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62.

"Variante", conforme o termo é utilizado no presente, é um poli-nucleotídeo ou polipeptídeo que difere, respectivamente, de um polinucleotí-deo ou polipeptídeo de referência, porém que retém propriedades essenci-ais. A variante típica de um polinucleotídeo difere de outro em seqüência denucleotídeos. Modificações na seqüência de nucleotídeos da variante podemou não variar a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo codificadopelo polinucleotídeo de referência. Modificações de nucleotídeos podem re-sultar em substituições, acréscimos, exclusões, fusões e trucagens de ami-noácidos no polipeptídeo codificado pela seqüência de referência, conformediscutido abaixo. Uma variante típica de um polipeptídeo difere de outro poli-peptídeo de referência em seqüência de aminoácidos. As diferenças, geral-mente, são limitadas de forma que as seqüências do polipeptídeo de refe-rência e da variante são, no geral, estreitamente semelhantes e, em muitasregiões, idênticas. Uma variante e o polipeptídeo de referência podem diferirem seqüência de aminoácidos por uma ou mais substituições, acréscimosou exclusões em qualquer combinação. Um resíduo de aminoácido substitu-ído ou inserido pode ou não ser aquele codificado pelo código genético. Umavariante de um polinucleotídeo ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente,como em uma variante alélica, ou pode ser uma variante que não se sabeque ocorra naturalmente. Variantes que não ocorrem naturalmente de poli-nucleotídeos e de polipeptídeos podem ser produzidas por técnicas de mu-tagênese ou por síntese direta.

Em referência a plantas mutantes, os termos "mutante nula" ou"mutante com perda de função" são utilizados para designar um organismoou seqüência de DNA genômico contendo uma mutação que faz com que oproduto genético não seja funcional ou esteja, em grande parte, ausente.Estas mutações podem ocorrer nas regiões codificadoras e/ou reguladorasdo gene e podem ser modificações de resíduos individuais ou inserções ouexclusões de regiões do ácido nucléico. Elas podem ocorrer também nasregiões codificadoras e/ou reguladoras de outros genes que podem regularou controlar um gene e/ou proteína codificada de forma que a proteína nãoseja funcional ou esteja, em grande parte, ausente.

O termo "substancialmente a mesma" refere-se a seqüências deácido nucléico ou de aminoácidos com variações de seqüência que não afe-tam relevantemente a natureza da proteína (ou seja, a estrutura, caracterís-ticas de estabilidade, especificidade por substrato e/ou atividade biológica daproteína). Em referência especial a seqüências de ácido nucléico, o termo"substancialmente a mesma" pretende referir-se à região codificadora e asseqüências preservadas que orientam a expressão e refere-se basicamentea códons degenerados que codificam o mesmo aminoácido, ou códons al-ternados que codificam aminoácidos substitutos conservadores no polipeptí-deo codificado. Em referência a seqüências de aminoácidos, o termo "subs-tancialmente a mesma" refere-se geralmente a substituições e/ou variaçõesconservadoras em regiões do polipeptídeo que não estão envolvidas na de-terminação de estrutura ou função.

Os termos "percentual de identidade" e "percentual de seme-lhança" são utilizados também neste pedido em comparações entre seqüên-cias de aminoácidos e de ácidos nucléicos. Ao se referirem a seqüências deaminoácidos, "identidade" ou "percentual de identidade" referem-se ao per-centual dos aminoácidos da seqüência de aminoácidos em questão que cor-responderam a aminoácidos idênticos na seqüência comparada de aminoá-cidos por um programa de análise de seqüência. "Percentual de semelhan-ça" refere-se ao percentual dos aminoácidos da seqüência de aminoácidosem questão que corresponderam a aminoácidos idênticos ou conservados.Aminoácidos conservados são aqueles que diferem em estrutura, porém sãosemelhantes em propriedades físicas de forma que a troca de um pelo outronão alteraria de modo considerável a estrutura terciária da proteína resultan-te. Substituições conservadoras são definidas em Taylor (1986, J. Theor.Biol. 119:205). Ao se referir a moléculas de ácido nucléico, "percentual idên-tico" refere-se ao percentual dos nucleotídeos da seqüência de ácido nucléi-co em questão que corresponderam a nucleotídeos idênticos em um pro-grama de análise de seqüência.

"Identidade" e "semelhança" podem ser calculadas de imediatopor métodos conhecidos. Seqüências de ácido nucléico e de aminoácidospodem ser comparadas utilizando programas de computador que alinham asseqüências semelhantes do ácido nucléico ou de aminoácidos, sendo defini-das, dessa forma, as diferenças. Em métodos de escolha, os programasBLAST (NCBI) e parâmetros utilizados nos mesmos utilizados nos mesmossão empregados, e o sistema DNAstar (Madison, Wl) é utilizado para alinharfragmentos de seqüências das seqüências gênicas de DNA. No entanto, ali-nhamentos equivalentes e avaliações de semelhança/identidade podem serobtidos pelo uso de qualquer programa de computador padrão de alinha-mento. Por exemplo, o Pacote GCG Wisconsin, versão 9.1, disponibilizadopelo Genetics Computer Group em Madison, Wisconsin, e os parâmetrospadrão utilizados (pontuação por criação de intervalo = 12, pontuação porextensão de intervalo = 4) por este programa podem ser utilizados tambémpara comparar identidade e semelhança de seqüências.

"Anticorpos", conforme utilizados no presente, incluem anticor-pos policlonais e monoclonais, quiméricos, de cadeia simples e humaniza-dos, bem como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, Fab', F(ab')2 eFv), incluindo os produtos de um Fab ou outra biblioteca de expressão deimunoglobulinas. A respeito de anticorpos, os termos "imunologicamenteespecífico" ou "específico" referem-se a anticorpos que se ligam a um oumais epítopos de uma proteína de interesse, porém que não substancial-mente reconhecem e se ligam a outras moléculas em uma amostra contendouma população mista de moléculas biológicas antigênicas. Ensaios de sele-ção para determinar a especificidade de ligação de um anticorpo são bemconhecidos e praticados de rotina na técnica. Para discussão abrangentedos mesmos ensaios, consultar Harlow et ai. (Eds.), Antibodies A Labora-tory Manual·, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY(1988), Capítulo 6.

O termo "substancialmente puro" refere-se a um preparadocompreendendo pelo menos 50-60% em peso do composto de interesse(por exemplo, ácido nucléico, oligonucleotídeo, proteína, etc.). Mais prefe-rencialmente, o preparado contém pelo menos 75% em peso, e o mais pre-ferível, 90-99% em peso do composto de interesse. A pureza é determinadapor métodos apropriados para o composto de interesse (por exemplo, méto-dos cromatográficos, eletroforese em Agar rosa ou gel de poliacrilamida, a-nálise por HPLC e similares).

A respeito de moléculas de ácido nucléico de fita única, o termo"especificamente hibridizante" refere-se à associação entre duas moléculasde ácido nucléico de fita única, contendo seqüências suficientemente com-plementares que permita esta hibridizição sob condições predeterminadas,geralmente utilizadas na técnica (às vezes denominado "substancialmentecomplementar"). O termo refere-se, especialmente, à hibridização de umoligonucleotídeo com uma seqüência substancialmente complementar, con-tida em uma molécula de DNA de fita única ou RNA, que exclua hibridizaçãodo oligonucleotídeo com ácidos nucléicos de fita única de seqüência nãocomplementar.

"Seqüência codificadora" ou "região codificadora" refere-se auma molécula de ácido nucléico contendo a informação de seqüência ne-cessária para produzir um produto gênico, como um aminoácido ou polipep-tídeo, quando a seqüência é expressa. A seqüência codificadora pode com-preender seqüências não traduzidas (por exemplo, íntrons ou regiões nãotraduzidas 5' ou 3') dentro de regiões traduzidas, ou pode ser desprovidadestas seqüências não traduzidas intervenientes (por exemplo, conforme nocDNA).

"íntrori" refere-se a seqüências de polinucleotídeos em um ácidonucléico que não codifica informação relacionada à síntese protéica. Estasseqüências são transcritas em mRNA, porém são removidas antes que omRNA seja traduzido em uma proteína.

O termo "operacionalmente ligado" ou "operacionalmente inseri- do" significa que as seqüências reguladoras, necessárias para expressão daseqüência codificadora, estão situadas em uma molécula de ácido nucléiconas posições apropriadas, em relação à seqüência codificadora, que permitaa expressão da seqüência codificadora. A título de exemplo, um promotor éoperacionalmente ligado a uma seqüência codificadora quando o promotor écapaz de controlar a transcrição ou expressão desta seqüência codificadora.Seqüências codificadoras podem ser operacionalmente ligadas a promotoresou seqüências reguladoras em orientação sentido ou anti-sentido. O termo"operacionalmente ligado" é, às vezes, aplicado ao arranjo de outros ele-mentos de controle de transcrição (por exemplo, intensificadores) em umvetor de expressão.

Seqüências de controle de transcrição e de tradução são se-qüências reguladoras de DNA, como promotores, intensificadores, sinais depoliadenilação, terminadores e similares, provêem a expressão de uma se-qüência codificadora em uma célula hospedeira.

Os termos "promotor", "região promotora" ou "seqüência promo-tora" referem-se geralmente a regiões reguladoras de transcrição, as quaispodem ser encontradas no lado 5' ou 3' da região codificadora ou incluídasna região codificadora ou incluídas em íntrons. Um promotor é tipicamenteuma região reguladora do DNA capaz de se ligar à RNA polimerase, em umacélula, e de iniciar a transcrição de uma seqüência codificadora em sentidodescendente (direção 3'). A seqüência típica promotora 5' está ligada, na suaposição 3' terminal, pelo sítio de iniciação de transcrição e estende-se emsentido ascendente (direção 5') de forma a incluir o menor número de basesou elementos, necessário para iniciar a transcrição em níveis detectáveisacima de um fundo. No interior da seqüência promotora encontra-se o sítiode iniciação de transcrição (convenientemente definido por mapeamentocom S1 nuclease), bem como domínios de ligação de proteínas (seqüênciasde consenso), responsáveis pela ligação da RNA polimerase.

Um "vetor" é um replicon, como plasmídeo, fago, cosmídeo ouvírus, ao qual outro segmento de ácido nucléico pode ser operacionalmenteinserido de forma a ocasionar a replicação ou expressão do segmento.

O termo "constructo de ácido nucléico" ou "constructo de DNA"é, às vezes, utilizado para fazer referência a uma seqüência ou seqüênciascodificadoras, ligadas operacionalmente a seqüências reguladoras apropria-das e inseridas em um vetor para transformar uma célula. Este termo podeser utilizado alternadamente com o termo "DNA de transformação" ou"transgene". Este constructo de ácido nucléico pode conter uma seqüênciacodificadora para um produto gênico de interesse, juntamente com um genemarcador selecionável e/ou um gene repórter.

"Gene marcador" ou "gene marcador selecionável" é um genecujo produto gênico codificado confere uma característica que permite que acélula que o contenha possa ser selecionada entre células que não contêm ogene. Vetores utilizados para engenharia genética contêm tipicamente umou mais genes marcadores selecionáveis. Tipos de gene marcador selecio-nável incluem (1) genes de resistência a antibióticos, (2) genes de tolerânciaou resistência a herbicida e (3) genes marcadores metabólicos ou auxotrófi-cos que possibilitam que células transformadas sintetizem um componenteessencialmente, geralmente um aminoácido, o qual as células de outra for-ma não conseguiriam produzir.

"Gene repórter" é também um tipo de gene marcador. Ele codifi-ca tipicamente um produto gênico que pode ser analisado ou detectado pormeios convencionais de laboratório (por exemplo, atividade enzimática, fluo-rescência).

O termo "expressa", "expressado" ou "expressão" de um generefere-se à biossíntese de um produto gênico. O processo envolve transcri-ção do gene em mRNA e, em seguida, tradução do mRNA para um ou maispolipeptídeos, englobando todas as modificações pós-tradução que ocorremnaturalmente.

"Endógeno" refere-se a qualquer constituinte, por exemplo, umgene ou ácido nucléico, ou polipeptídeo que podem ser encontrados natu-ralmente no interior do organismo especificado.

Região "heteróloga" de um constructo de ácido nucléico é umsegmento (ou segmentos) identificável da molécula de ácido nucléico emuma molécula maior que não está presente em associação à molécula maiorna natureza. Dessa forma, quando a região heteróloga compreende um ge-ne, o gene estará geralmente ladeado por DNA que não flanqueia o DNAgenômico no genoma do organismo de origem. Em outro exemplo, uma re-gião heteróloga é um constructo no qual a própria seqüência codificadoranão é encontrada em natureza (por exemplo, cDNA em que a seqüência co-dificadora gênica contém íntrons ou seqüências sintéticas com códons dife-rentes daqueles do gene nativo). Variações alélicas ou eventos de mutaçãoque ocorrem naturalmente não originam uma região heteróloga de DNA,conforme definida neste pedido. O termo "constructo de DNA", conforme de-finido acima, é utilizado também em referência a uma região heteróloga, es-pecialmente uma construída para uso em transformação de uma célula.

Uma célula foi "transformada" ou "transfectada", por DNA exó-geno ou heterólogo, quando este DNA foi introduzido no interior da célula. ODNA de transformação pode ser ou não integrado (ligado covalentemente)ao genoma da célula. Em células de procariotes, levedura e de mamíferos,por exemplo, o DNA de transformação pode ser mantido em um elementoepissomal como um plasmídeo. A respeito de células eucarióticas, uma célu-la estavelmente transformada é aquela na qual o DNA de transformação in-tegrou-se a um cromossomo de forma que é herdado por células filhas atra-vés de replicação cromossômica. Essa estabilidade é demonstrada pela ca-pacidade da célula eucariótica de estabelecer linhagens de células ou clonescompreendendo uma população de células filhas contendo o DNA de trans-formação. Um "clone" é uma população de células derivadas de uma únicacélula ou ancestral comum, por mitose. Uma "linhagem celular" é um clonede uma célula primária com capacidade de crescimento estável in vitro pormuitas gerações.

"Grão", "semente" ou "fava" refere-se a uma unidade de repro-dução da planta em floração, capaz de desenvolver-se em outra desta plan-ta. Conforme utilizados no presente, especialmente a respeito de plantas decafé, os termos são utilizados como sinônimos e alternativamente.

"Enzima de síntese de galactomananos" e "gene de síntese degalactomananos" referem-se a uma proteína ou enzima, e o gene que codifi-ca a mesma, envolvida na síntese de polímeros de galactomanano. Enzimasde síntese de galactomananos incluem manano sintases e galactosiltransfe-rases. Da mesma forma, genes de síntese de galactomananos incluem ge-nes que codificam manano sintases e galactosiltransferases.

Conforme utilizado neste pedido, o termo "planta" inclui referên-cia a plantas inteiras, órgãos de planta (por exemplo, folhas, caules, partesaéreas, raízes), sementes, pólen, células vegetais, organelas de células ve-getais e progênie dos mesmos. Partes de plantas transgênicas deverão serentendidas no escopo da invenção, compreendendo, por exemplo, célulasvegetais, protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, caules,sementes, pólen, frutos, folhas ou raízes que se originam de plantas trans-gênicas ou de sua progênie.

Descrição:

Galactomanano é um polissacarídeo abundante e componentesignificativo do grão maduro de café. Em virtude de sua grande presença nogrão maduro de café, acredita-se que o seu papel é de manter a integridadedo grão. De acordo com essa idéia, acredita-se que galactomananos, junta-mente com outros componentes sacarídeos no grão de café, tenham partici-pação nas características de extração do café em água, as quais podem afe-tar as características físicas e químicas do café resultante. Enzimas de sín-tese de galactomananos, como manano sintases e galactosiltransferases,são importantes enzimas envolvidas no metabolismo deste polissacarídeo.Uma característica da presente invenção apresenta moléculasde ácido nucléico, provenientes de café, que codificam manano sintases egalactosiltransferases. cDNAs que codificam manano sintases completas deCoffea canephora (pVC4, pVC6) são expostos no presente como SEQ IDNOS: 1 e 2, respectivamente, e são referidos como CcManS. Um cDNA quecodifica uma manano sintase completa de Coffea arabica (pVC7) é expostaneste pedido como SEQ ID NO:3 e é referido como CaManS. Clones gêni-cos parciais são expostos como SEQ ID NOS: 7, 8, 9 e 10, respectivamente,conforme discutido na descrição da Figura 2A e nos exemplos. Adicional-mente, as presentes moléculas de ácido nucléico incluem cDNAs que codifi-cam galactomanano galactosiltransferases, as quais, em alguns casos, sãoseqüências com aproximadamente 54% de identidade com uma galactosil-transferase de alfava e, em alguns casos, seqüências com aproximadamen-te 54% de identidade com uma galactosiltransferase de Japonicus. Em al-gumas concretizações, estes cDNAs incluem as seqüências providas nasSEQ ID NOS: 11 ou 13, referidos como CcGMGT 1, e SEQ ID NOS: 12 ou14, referidos como CcGMGT2.

Outra característica da invenção refere-se às proteínas produzi-das por expressão destas moléculas de ácido nucléico e os seus usos. Asseqüências deduzidas de aminoácidos da proteína do CcManS, produzidapor tradução da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:2, estão expostas neste pedidocomo SEQ ID NOS: 4 e 5, respectivamente. A seqüência deduzida de ami-noácidos da proteína do CaManS, produzida por tradução da SEQ ID NO:3,é exposta neste pedido como SEQ ID NO:6. As seqüências deduzidas deaminoácidos da proteína do CcGMGTI, produzida por tradução da SEQ IDNO:11 ou SEQ ID NO:13 são expostas neste pedido como SEQ ID NOS: 15e 17, respectivamente. As seqüências deduzidas de aminoácidos da proteí-na do CcGMGT2, produzida por tradução da SEQ ID NO:12 ou SEQ IDNO:14, são expostas neste pedido como SEQ ID NOS: 16 e 18, respectiva-mente. A tabela abaixa lista os polinucleotídeos e proteínas codificadas su-pramencionados.<table>table see original document page 25</column></row><table>Outras características ainda da invenção rêferem-se a usos dasmoléculas de ácido nucléico e de polipeptídeos codificados em cultivo deplantas e manipulação genética de plantas e, em última instância, na mani-pulação de propriedades do grão de café.

Embora polinucleotídeos que codificam enzimas da síntese degalactomananos de Coffea canephora e Coffea arabica estejam descritos eexemplificados neste pedido, esta invenção pretende englobar ácidos nu-cléicos e proteínas codificadas de outras espécies de Coffea, suficientemen-te semelhantes para que sejam utilizados alternativamente com os polinu-cleotídeos e proteínas do C. canephora e Coffea arábica, para as finalidadesdescritas abaixo. De acordo com o mesmo, quando as enzimas da síntesede galactomananos, "manano sintase" e "galactomanano galactosiltransfera-se" (ou "galactosiltransferase") forem referidas neste pedido, estes termospretendem englobar todas as manano sintases e galactosiltransferases deCoffea que tenham as características gerais físicas, bioquímicas e funcionaisdescritas neste pedido, e de polinucleotídeos que as codificam, a não serque especificamente declarado de outra forma.

Consideradas em termos de suas seqüências, polinucleotídeosde manano sintase da invenção incluem variantes alélicas e mutantes natu-rais das SEQ ID NOS: 1-3, os quais podem ser possivelmente encontradosem variedades diferentes de C. canephora e Coffea arabica, e homólogosdas of SEQ ID NOs: 1-3, os quais podem ser possivelmente encontrados emespécies diferentes de café. Os polinucleotídeos de galactosiltransferaseincluem variantes alélicas e mutantes naturais das SEQ ID NOS: 11-14, osquais podem ser possivelmente encontrados em variedades diferentes de C.canephora e Coffea arabica, e homólogos das SEQ ID NOs: 11-14, os quaispodem ser possivelmente encontrados em espécies diferentes de café. Emvista de estas variantes e homólogos supostamente possuírem certas dife-renças em seqüência de nucleotídeos e aminoácidos, há moléculas isoladasde ácido nucléico, codificadoras de manano sintase, e moléculas de ácidonucléico, codificadoras de galactosiltransferase, que codificam, respectiva-mente, polipeptídeos com, pelo menos, em torno de 75% (e em ordem cres-cente de preferência, 76%, 77%, 78%, 79%, 70%, 81%, 82%, 83%, 84%,85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,98% e 99%) de identidade com o polipeptídeo codificado das SEQ ID NOS:4, 5 ou 6, no caso de manano sintases, e das SEQ ID NOS: 15, 16, 17 ou 18no caso de galactosiltransferase. Em vista da variação natural de seqüênciaspossivelmente existente entre manano sintases e galactosiltransferases, edos genes que as codificam em variedades e espécies diferentes de café,qualquer técnico no assunto esperaria encontrar esse nível de variação, em-bora mantendo ainda as propriedades únicas dos polipeptídeos e polinucleo-tídeos da presente invenção. Essa expectativa é decorrente, em parte, dadegeneração do código genético, bem como do êxito evolucionário conheci-do de variações conservadoras de seqüência de aminoácidos que não alte-ram de modo considerável a natureza da proteína codificada. De acordo como mesmo, estas variantes e estes homólogos são substancialmente osmesmos de um outro e são abrangidos pela presente invenção.

As seções a seguir expõem os procedimentos gerais envolvidosna prática da presente invenção. A medida que materiais específicos sãomencionados, o mesmo é meramente para fins ilustrativos e não pretendemrestringir a invenção. A não ser que especificado de outra forma, são utiliza-dos procedimentos gerais de bioquímica e de biologia molecular, como a-queles descritos em Sambrook et ai, Molecular Cloning, Cold Spring HarborLaboratory (1989) ou Ausubel et al. (eds), Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons (2005).

Moléculas de ácido nucléico. proteínas e anticorpos:

Moléculas de ácido nucléico da invenção podem ser preparadaspor dois métodos gerais: (1) Podem ser sintetizadas a partir de trifosfatos denucleotídeo apropriados, ou (2) Podem ser isoladas de fontes biológicas. Osdois métodos utilizam protocolos bem conhecidos na técnica.

A disponibilidade de informação sobre seqüência de nucleotí-deos, como o cDNA com as SEQ ID NOS: 1-3 (ou fragmentos representadospelas SEQ ID NOS: 7-10) ou 11-14 (ou fragmentos representados pelasSEQ ID NOS: 19 e 20) permite o preparo de uma molécula isolada de ácidonucléico da invenção por síntese de oligonucleotídeõs. Oligonucleotídeossintéticos podem ser preparados pelo método de fosforamidita, empregadono Sintetizador de DNA 38A da Applied Biosystems ou em equipamentossemelhantes. O constructo resultante pode ser purificado de acordo commétodos conhecidos na técnica, como cromatografia líquida de alto desem-penho (HPLC). Polinucleotídeos longos de fita dupla, como uma molécula deDNA da presente invenção, precisam ser sintetizados em etapas, em decor-rência de limitações impostas pelo tamanho, inerentes dos métodos atuaisde síntese de oligonucleotídeos. Dessa forma, por exemplo, uma moléculalonga de fita dupla pode ser sintetizada sob a forma de vários segmentosmenores de complementaridade apropriada. Segmentos complementaresassim produzidos podem ser anelados de forma que cada segmento possuaterminais coesos apropriados para ligação de um segmento adjacente.Segmentos adjacentes podem ser ligados pelo anelamento de terminais co-esos na presença de DNA ligase, objetivando construir uma molécula longainteira de fita dupla. Uma molécula de DNA sintética assim construída podeser clonada e amplificada em um vetor apropriado.

De acordo com a presente invenção, ácidos nucléicos com onível apropriado de homologia de seqüência com parte ou todas as regiõescodificadoras e/ou reguladoras de polinucleotídeos, codificadores da enzimada síntese de galactomananos, podem ser identificados por hibridização econdições para lavagem de rigor apropriado. Será apreciado por técnicos noassunto que a abordagem supramencionada, quando aplicada a seqüênciasgênicas, além de possibilitar o isolamento de seqüências codificadoras deenzimas que metabolizam o polissacarídeo, permite também o isolamentode promotores e de outras seqüências reguladoras do gene, associados agenes de enzimas que metabolizam o polissacarídeo, apesar de as própriasseqüências reguladoras poderem não compartilhar de homologia suficienteque possibilite uma hibridização adequada.

Como ilustração típica, as hibridizações podem ser executadas,de acordo com o processo de Sambrook et ai, utilizando uma solução dehibridização compreendendo: 5X SSC, 5X reagente de Denhardt, SDS a1,0%, 100 pg/rnl de DNA fragmentado de esperma de salmão, pirofosfato desódio a 0,05% e até 50% de formamida. A hibridização é conduzida em 37-42°C por, pelo menos, seis horas. Após a hibridização, os filtros são lavadosda forma como segue: (1) 5 minutos em temperatura ambiente em 2X SSC eSDS a 1%; (2) 15 minutos em temperatura ambiente em 2X SSC e SDS a0,11%; (3) 30 minutos-1 hora em 37°C in 2X SSC e SDS a 0,1% SDS; (4) 2horas em 45-55°C em 2X SSC e SDS a 0,1%, trocando a solução a cada 30minutos.

Uma fórmula comum para cálculo das condições de rigor reque-ridas para obter a hibridização entre moléculas de ácido nucléico de homo-Iogia de seqüência especificada (Sambrook et al., 1989) é a seguinte:

Tm = 81,5°C + 16,6 Log [Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,63 (% de for-mamida) - 600/#bp em duplex.

Como ilustração da fórmula acima, utilizando [Na+] = [0,368] e50% de formamida, com teor de GC de 42% e tamanho médio de sonda de200 bases, a Tm é de 57°C. A Tm de um duplex de DNA diminui em 1 -1,5°C a cada 1% de diminuição em homologia. Por conseguinte, alvos comidentidade de seqüência acima de 75% seriam observados utilizando umatemperatura de hibridização de 42°C. Em uma concretização, a hibridizaçãoocorre em 37°C e a lavagem final, em 42°C; em outra concretização, a hibri-dização ocorre em 42°C e a lavagem final, em 50°C; e ainda em outra con-cretização, a hibridização ocorre em 42°C e a lavagem final, em 65°C, comas soluções de hibridização e de lavagem acima. Condições de alto rigorincluem hibridização em 42°C, na solução acima de hibridização, e lavagemfinal em 65°C em 0,1 X SSC e SDS a 0,1% por 10 minutos.

Ácidos nucléicos da presente invenção podem ser mantidos soba forma de DNA em qualquer vetor conveniente de clonagem. Em uma con-cretização preferida, os clones são mantidos em vetor plasmídeo de clona-gem/expressão como o pGEM-T (Promega Biotech, Madison, Wl), pBlues-cript (Stratagene, La Jolla, CA), pCR4-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) oupET28a+ (Novagen, Madison, Wl), todos estes podendo ser propagados emuma célula hospedeira adequada de E. coli.Moléculas de ácidos nucléicos da invenção incluem cDNA, DNAgenômico, RNA1 e fragmentos dos mesmos, que podem ser de fita única,dupla ou até mesmo tripla. Por conseguinte, esta invenção provê oligonucle-otídeos (fitas de DNA ou RNA de orientação sentido ou anti-sentido) comseqüências capazes de se hibridizar com pelo menos uma seqüência deuma molécula de ácido nucléico da presente invenção. Estes oligonucleotí-deos são úteis como sondas para detecção de genes que codificam a enzi-ma de síntese de galactomananos ou mRNA em amostras de teste de tecidode plantas, por exemplo, por amplificação por PCR ou para regulação positi-va ou negativa de expressão de genes codificadores de enzima de síntesede galactomananos, na tradução, ou antes, do mRNA para proteínas. Méto-dos nos quais oligonucleotídeos ou polinucleotídeos, codificadores da enzi-ma de síntese de galactomananos, podem ser utilizados como sonda paraestes ensaios incluem, entre outros: (1) hibridização in situ; (2) hibridizaçãode Southern (3) hibridização de northern; e (4) reações variadas de amplifi-cação como reações em cadeia de polimerase (PCR, incluindo RT-PCR) ereações em cadeia de Iigase (LCR).

Os oligonucleotídeos com seqüências capazes de hibridizarcom, pelo menos, uma seqüência de uma molécula de ácido nucléico dapresente invenção incluem oligonucleotídeos anti-sentido. Podem ser utiliza-dos oligonucleotídeos anti-sentido direcionados a regiões específicas domRNA, fundamentais para tradução. O uso de moléculas anti-sentido paradiminuir níveis de expressão de um gene predeterminado é bem conhecidona técnica. Moléculas anti-sentido podem ser providas in situ pela transfor-mação de células vegetais com uma construção de DNA, a qual, na transcri-ção, produz as seqüências de RNA anti-sentido. Estes constructos podemser criados para produzir seqüências anti-sentido de extensão completa ouparcial. Este efeito silenciador de gene pode ser intensificado pela superpro-dução transgênica tanto de RNA sentido como anti-sentido da seqüênciacodificadora do gene de forma que uma quantidade alta de dsRNA é produ-zida (por exemplo, consultar Waterhouse et ai, 1998, PNAS 95: 13959-13964). A esse respeito, foi constatado que dsRNA contendo seqüênciasque correspondam a, pelo menos, em parte ou a todo, um íntron eram parti-cularmente efetivas. Em uma concretização, parte ou toda a fita anti-sentidoda seqüência codificadora da manano sintase ou galactosiltransferase é ex-pressa por um transgene. Em outra concretização, fitas sentido e anti-sentido de hibridização de parte ou de toda a seqüência codificadora da ma-nano sintase ou da seqüência codificadora de galactosiltransferase são ex-pressas transgenicamente. Em outra concretização, genes da manano sinta-se ou genes da galactosiltransferase, ou ambos, podem ser silenciados pelouso de RNA pequeno interveniente (siRNA; Elbashir et ai., 2001, Genes Dev.15(2): 188-200), empregando materiais e métodos à disposição no mercado(por exemplo, Invitrogen, Inc., Carlsbad CA).

Polipeptídeos codificados por ácidos nucléicos da invenção po-dem ser preparados em uma variedade de maneiras, de acordo com méto-dos conhecidos. Se produzidos in situ, os polipeptídeos podem ser purifica-dos de fontes apropriadas, por exemplo, sementes, pericarpos ou outras par-tes da planta.

Alternativamente, a disponibilidade de moléculas de ácido nu-cléico que codificam os polipeptídeos permite a produção das proteínas, uti-lizando métodos de expressão in vitro, conhecidos na técnica. Por exemplo,cDNA ou gene pode ser clonado em um vetor apropriado de transcrição invitro, como pSP64 ou pSP65, para transcrição in vitro, seguido por traduçãolivre de células, em um sistema adequado de tradução livre de células, comogerme de trigo ou reticulócitos de coelho. Sistemas de transcrição e traduçãoin vitro estão à disposição no mercado, fornecidos, por exemplo, por Prome-ga Biotech, Madison, Wl, BRL, Rockville, MD ou Invitrogen, Carlsbad, CA.

De acordo com uma concretização preferida, quantidades maio-res de polipeptídeos podem ser produzidas por expressão em um sistemaprocariótico ou eucariótico adequado. Por exemplo, parte ou toda moléculade um DNA, como o cDNA com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:3, ou qual-quer uma entre as SEQ ID NOS: 11-14, pode ser inserida em um vetor plas-mídeo adaptado para expressão em célula de bactéria (como E. coii) ou cé-lula de levedura (como Saccharomyces cerevisiaé), ou em vetor baculovíruspara expressão em célula de inseto. Estes vetores compreendem os ele-mentos reguladores necessários para expressão do DNA na célula hospe-deira, posicionados de tal maneira que permita expressão do DNA na célulahospedeira. Estes elementos reguladores, requeridos para expressão, inclu-em seqüências de promotores, seqüências de iniciação de transcrição e,opcionalmente, seqüências de intensificadores.

Os polipeptídeos produzidos por expressão genética em sistemaprocariótico ou eucariótico recombinante podem ser purificados de acordocom métodos conhecidos na técnica. Em uma concretização preferida, umsistema de expressão/secreção à disposição no mercado pode ser utilizado,pelo qual a proteína recombinante é expressa e, posteriormente, secretadada célula do hospedeiro, sendo posteriormente purificada do meio circundan-te. Uma abordagem alternativa envolve a purificação da proteína recombi-nante por separação por afinidade, por exemplo, pela interação imunológicacom anticorpos que se ligam especificamente à proteína recombinante.

Os polipeptídeos da invenção, preparados pelos métodos su-pramencionados, podem ser analisados de acordo com procedimentos con-vencionais.

Polipeptídeos purificados de café ou produzidos por recombina-ção podem ser utilizados para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais,fragmentos ou derivados de anticorpos, conforme definidos no presente. Sealém de formarem anticorpos contra toda a proteína recombinante, análisesdas proteínas ou análises pela técnica de Southern ou de clonagem (consul-tar abaixo) indicarem que os genes clonados pertencem a uma família multi-gene, então, anticorpos específicos de membros desta família, formadospara peptídeos sintéticos, correspondentes a regiões não preservadas daproteína, poderão ser gerados.

Estojos compreendendo um anticorpo da invenção para qual-quer propósito entre os descritos acima são incluídos também no escopo dainvenção. De modo geral, este estojo inclui um antígeno de controle para oqual o anticorpo é imuno-específico.

Vetores, células, tecidos e plantas:Também são apresentados, de acordo com a presente invenção,vetores e estojos para produção de células hospedeiras transgênicas, con-tendo um polinucleotídeo ou oligonucleotídeo codificador da enzima de sín-tese de galactomanano, ou variantes desta, em orientação sentido ou anti-sentido, ou gene repórter e outros constructos, sob controle de promotoresou de outras seqüências reguladoras da enzima que metaboliza o polissaca-rídeo. Células hospedeiras adequadas incluem, entre outras, células deplantas, células de bactérias, células de levedura e de outros fungos, célulasde insetos e células de mamíferos. Vetores de transformação de uma amplavariedade destas células hospedeiras são bem conhecidos dos especialistasna técnica. Eles incluem, entre outros, plasmídeos, cosmídeos, baculovírus,bacmídeos, cromossomos artificiais de bactérias (BACs), cromossomos arti-ficiais de levedura (YACs)1 bem como outros vetores de bactérias, levedurae vírus. Estojos para produção de células hospedeiras transgênicas conte-rão, tipicamente, um ou mais vetores apropriados e instruções para produ-ção das células transgênicas utilizando o vetor. Os estojos podem incluir a-inda um ou mais componentes adicionais, como meio de cultura para cultivodas células, reagentes para execução da transformação das células e rea-gentes para testes das células transgênicas quanto expressão do gene, paracitar somente alguns dos mesmos.

A presente invenção inclui plantas transgênicas, compreendendouma ou mais cópias de um gene codificador de enzima de síntese de galac-tomananos, ou seqüências de ácido nucléico que inibem a produção ou fun-ção de uma enzima endógena de síntese de galactomanano de uma planta.Isso é obtido pela transformação de células da planta com um transgene quecompreende parte de toda a seqüência codificadora da enzima de síntese degalactomananos, ou mutante, anti-sentido ou variante desta, incluindo RNA,controlados por seqüências reguladoras recombinantes, conforme descritoabaixo. Espécies transgênicas de plantas de café são preferidas e incluem,entre outras, C. abeokutae, C. arabica, C. arnoldiana, C. aruwemiensis, C.bengalensis, C. canephora, C. congensis C. Dewevrei, C. excelsa, C. euge-nioides e C. heterocalyx, C. kapakata, C. khasiana, C. Iibérica, C. moioun-dou, C. rasemosa, C. salvatrix, C.sessiflora, C. stenophylla, C. travencoren-sis, C. wíghtiana e C. zanguebariae. Plantas de qualquer espécie são incluí-das também na invenção; estas incluem, entre outras, espécies de tabaco,Arabidopsis e outras espécies propícias a laboratórios, de cultivo de cereais,como de milho, trigo, arroz, soja, cevada, centeio, aveia, sorgo, alfafa, cravoe similares, plantas produtoras de óleo, como canola, açafroa, girassol, a-mendoim, cacau e similares, de cultivo de vegetais, como tomate tomatillo,batata, pimenta, berinjela, beterraba, cenoura, pepino, alface, ervilha e simi-lares, plantas de horticultura, como áster, begônia, crisântemo, delphinium,petúnia, zínia, grama e gramados e similares.

Plantas transgênicas podem ser geradas empregando métodosde transformação de plantas convencionais, conhecidos por especialistas natécnica. Estes incluem, entre outros, vetores Agrobacterium, tratamento compolietilenoglicol de protoplastos, liberação biolística de DNA, microfeixe delaser UV, vetores de gemini vírus, outros vetores de vírus de plantas, trata-mento com fosfato de cálcio de protoplastos, eletroporação de protoplastosisolados, agitação de suspensões de células em solução com microcontas,revestidas com DNA de transformação, agitação de suspensão de célulasem solução com fibras de silicone, revestidas com DNA de transformação,captação direta de DNA, captação de DNA, mediada por lipossomo, e simila-res. Há publicações dos mesmos métodos na técnica. Consultar, por exem-plo, Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach & Weissbach, eds.,1988); Methods in Plant Molecular Biology (Schuler & Zielinski, eds., 1989);Plant Molecular Biology Manual (Gelvin, Schilperoort, Verma, eds., 1993) eMethods in Plant Molecular Biology - A Laboratory Manual (Maliga, Klessig,Cashmore, Gruissem & Varner, eds., 1994).

O método de transformação depende da planta a ser transfor-mada. Vetores de Agrobacterium são freqüentemente utilizados para trans-formar espécies dicotiledôneas. Vetores binários de Agrobacterium incluem,entre outros, BIN19 e derivados deste, a série de vetores pBI e os vetoresbinários pGA482, pGA492, pLH7000 (GenBank Accession AY234330) equalquer um adequado entre os vetores pCAMBIA (derivados dos vetorespPZP, construídos por Hajdukiewicz, Svab & Maliga, (1994) Plant Mol Biol25: 989-994, fornecidos por CAMBIA, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601,Austrália ou por intermédio da rede mundial no endereço CAMBIA.org).Quanto à transformação de espécies monocotiledôneas, o bombardeamentobiolístico com partículas revestidas com DNA de transformação e fibras desilicone, revestidas com DNA de transformação, são freqüentemente úteispara transformação nuclear. Alternativamente, vetores "superbinários" deAgrobacterium foram utilizados com êxito para a transformação de arroz,milho e de várias outras espécies de monocotiledôneos.

Os constructos de DNA para transformação de uma planta sele-cionada compreendem uma seqüência codificadora de interesse, ligada ope-racionalmente a seqüências reguladoras 5' (por exemplo, promotores e se-qüências reguladoras de tradução) e 3' (por exemplo, terminadores) apropri-adas. Em uma concretização, podem ser utilizadas seqüências codificadorasda enzima dè síntese de galactomananos, sob controle de seus próprios e-Iementos reguladores 5' e 3'. Em outras concretizações, seqüências codifi-cadoras da enzima de síntese de galactomananos e reguladoras são troca-das para alterar o perfil do polissacarídeo da planta transformada para me-lhorar fenótipos, por exemplo, referentes a sabor, aroma ou outra caracterís-tica, como vapor do café produzido.

Em uma concretização, a região codificadora do gene é posicio-nada sob um poderoso promotor constitutivo, como o promotor 35S do Vírusdo Mosaico da Couve-Flor (CaMV) ou o promotor 35S do vírus do mosaicodo figwort. Outros promotores constitutivos, cujo uso é contemplado na pre-sente invenção, incluem, entre outros: promotores de T-DNA manopina sin-tetase, nopalina sintase e octopina sintase. Em outras concretizações, umpromotor poderoso de monocotiledôneas é utilizado, por exemplo, o promo-tor de ubiquitina do milho, o promotor de actina do arroz ou o promotor detubulina do arroz (Jeon et ai, Plant Physiology. 123: 1005-14, 2000).

Plantas transgênicas que expressam seqüências codificadorasda enzima da síntese de galactomananos, sob um promotor induzível, sãocontempladas também como estando no escopo da presente invenção.Promotores de indução de plantas incluem o promotor repressor/operadorcontrolado de tetraciclina, os promotores de gene de choque por calor, pro-motores induzidos por estresse (por exemplo, ferida), promotores de genede resposta de defesa (por exemplo, genes de fenilalanina amônia liase),promotores de genes induzidos por lesão (por exemplo, genes de paredecelular rica em hidroxiprolina), promotores de genes induzidos quimicamente(por exemplo, genes de nitrato redutase, genes de glucanase, genes de chi-tinase, etc.) e promotores de gene induzido por escuro (por exemplo, geneda asparagina sintetase), para citar alguns dos mesmos.

O uso de promotores específicos de tecidos e de desenvolvi-mento é contemplado também na presente invenção. Exemplos não restriti-vos de promotores específicos de sementes incluem Cim 1 (mensagem indu-zida por citocinina), cZ19B1 (zeína de 19 kDa de milho), milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) e celA (celulose sintase) (Pedido de Patente U.S. Ser. Ng09/377 648), beta-faseolina de feijão, napina, beta-conglicina, Iectina de so-ja, cruciferina, zeína de 15 kDa de milho, zeína de 22 kDa de milho, zeína de27 kDa de milho, g-zeína, ceráceo, shrunken 1, shrunken 2e globulina 1, Ie-gumina 11S de grão de soja (Báumlein et ai, 1992) e proteína de reserva desemente 11S de C. canephora (Marraccini et al., 1999)1. Consultar tambémWO 00/12733, na qual são expostos promotores preferidos de sementes degenes de final 1 e final2. Outros promotores específicos da semente de Cof-fea podem ser utilizados também, incluindo, entre outros, o promotor do ge-ne da oleosina, exposto no pedido de patente, de posse comum e tambémem aguardo de aprovação, PCT N9 US2006/026121, o promotor do gene dadehidrina, exposto no pedido de patente, de posse comum e também emaguardo de aprovação PCT N- US2006/026234, e o promotor do gene da 9-cis-epoxicarotenóide dioxigenase, de posse comum e também em aguardode aprovação PCT N- US2006/34402. Exemplos de outros promotores es-pecíficos de tecido incluem, entre outros: os promotores do gene de subuni-dade pequena da ribulose bifosfato carboxilase (RuBisCo) (por exemplo, opromotor da subunidade pequena do café, conforme descrito por Marraciniet al., 2003) ou promotores do gene da proteína de ligação a/b de clorofila(CAB) de expressão em tecido fotossintético e os promotores de gene daglutamina sintetase específica de raiz, quando for desejada a expressão emraízes.

A região codificadora é ligada operacionalmente também a umaseqüência reguladora apropriada 3'. Em concretizações nas quais a seqüên-cia reguladora nativa 3' não é utilizada, a região de poliadenilação de nopali-na sintetase pode ser utilizada. Outras regiões reguladoras 3' úteis incluem,entre outras, a região de poliadenilação de octopina sintase.

A região codificadora selecionada, sob controle de elementosreguladores apropriados, é ligada operacionalmente a um marcador nuclearde resistência a fármaco, como resistência à canamicina. Outros sistemasde marcador selecionável que podem ser utilizados incluem genes que con-ferem resistência a antibióticos ou herbicidas (por exemplo, resistência àhigromicina, sulfoniluréia, fosfinotricina ou glifosato) ou genes que conferemcrescimento seletivo (por exemplo, fosfomanose isomerase que possibilitacrescimento de células de plantas com base em manose). Genes de marca-dor selecionável incluem, sem restrição, genes que codificam resistência aantibióticos, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase Il (ΝΕ-Ο), dihidrofalto redutase (DHFR) e higromicina fosfotransferase (HPT), bemcomo genes que conferem resistência a compostos herbicidas, comoEPSPS resistente a glifosato e/ou glifosato oxidorredutase (GOX), Bromoxi-nil nitrilase (BXN) de resistência a bromoxinil, genes AHAS de resistência aimidazolinonas, genes de resistência à sulfoniluréia e genes de resistência a2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D).

Em certas concretizações, promotores e outras seqüências regu-ladoras de expressão, englobadas pela presente invenção, são operacio-nalmente ligados a genes repórteres. Genes repórteres, cujo uso é contem-plado na invenção, incluem, entre outros, genes codificadores da proteínaVerde fluorescente (GFP), proteína Vermelha fluorescente (DsRed), ProteínaCiano Fluorescente (CFP), Proteína Amarela Fluorescente (YFP), ProteínaLaranja de Cerianthus Fluorescente (cOFP), fosfatase alcalina (AP), β-lactamase, cloranfenicol acetiItransferase (CAT), adenosina desaminase (A-DA), aminoglicosídeo fosfotransferase (neor, G418r) dihidrofalto redutase(DHFR), higromicina-B-fosfotransferase (HPH), timidina quinase (TK), IacZ(que codifica α-galactosidase) e xantina guanina fosforribosiltransferase(XGPRT)1 Beta-Glucuronidase (gus), Fosfatase Alcalina Placentária (PLAP),Fosfatase Alcalina Embriônica Seeretada (SEAP) ou Lueiferase de Vaga-lume ou de Bactéria (LUG). Conforme ocorre com muitos dos procedimentosconvencionais, associados com a prática da invenção, artesões habilidososestarão cientes de seqüências adicionais que podem atender à função demarcador ou repórter.

Modificações adicionais de seqüência são conhecidas na técni-ca, objetivando intensificar a expressão gênica em um hospedeiro celular.Estas modificações incluem eliminação de seqüências que codificam sinaissupérfluos de poliadenilação, sinais nos sítios de splice (remoção) de éxon-íntron, repetições semelhantes a transposon e outras destas seqüênciasbem caracterizadas que podem ser danosas à expressão do gene. Alternati-vamente, se necessário, o teor de G/C da seqüência codificadora pode serajustado para níveis médios para um dado hospedeiro de célula de planta decafé, conforme calculado por referência a genes conhecidos que se expres-sam em uma célula de planta de café. Além disso, quando possível, a se-qüência codificadora é modificada para evitar estruturas previstas de mRNAsecundário com a forma de grampo. Uma alternativa para intensificar a ex-pressão gênica é utilizar seqüências líderes 5'. Seqüências líderes de tradu-ção são bem conhecidas na técnica e incluem os derivados de ação eis (ô-mega1) da seqüência líder 5' (ômega) do vírus do mosaico de tabaco, as se-qüências líderes 5' do vírus do mosaico do capim bromo, do vírus do mosai-co de alfafa e do vírus do mosaico do nabo amarelo.

As plantas são transformadas e posteriormente selecionadaspara uma ou mais propriedades, incluindo a presença do produto do trans-gene, do mRNA codificador do transgene ou de um fenótipo alterado associ-ado à expressão do transgene. Deve ser reconhecido que o volume de ex-pressão, bem como o padrão temporal específico da expressão dos trans-genes em plantas transformadas pode variar dependendo da posição de suainserção no genoma nuclear. Estes efeitos relacionados à posição são bemconhecidos na técnica. Por esse motivo, vários transformantes nuclearesdevem ser regenerados e testados quanto à expressão do transgene.Métodos:

Os ácidos nucléicos e polipeptídeos da presente invenção po-dem ser utilizados em qualquer um de vários métodos, através dos quais aprodução dos produtos protéicos, em plantas de café, pode ser moduladapara afetar vários traços fenotípicos, por exemplo, para intensificar o sabor,vapor (propriedade física) e/ou aroma da bebida de café ou de produtos decafé, produzidos em última instância a partir do grão, ou para melhora nasqualidades de produção dos grãos. Por exemplo, uma diminuição no teor degalactomananos ou alteração da estrutura do galactomanano supostamentemelhora bastante a recuperação de sólidos no processo de produção de ca-fé instantâneo.

A melhora do perfil de polissacarídeos do grão de café ou deoutras características pode ser obtida por (1) cultivo clássico ou (2) técnicasde engenharia genética, e pela combinação dessas duas abordagens. Asduas abordagens podem ser consideravelmente melhoradas pelo isolamentoe caracterização de um gene codificador de enzima da síntese de galacto-mananos, de acordo com a presente invenção. Por exemplo, os genes codi-ficadores da manano sintase ou da galactosiltransferase podem ser mapea-dos geneticamente e Locos de Traços Quantitativos (QTL), envolvidos nosabor do café, podem ser identificados. Seria possível então determinar seestes QTL estão correlacionados com a posição de genes relacionados coma manano sintase ou galactosiltransferase. Alelos (alótipos), de genes queafetam o metabolismo de polissacarídeos, podem ser identificados tambéme analisados para determinar se a presença de alótipos específicos está for-temente correlacionada com a síntese de galactomananos. Esses marcado-res podem ser utilizados para auxiliar programas de cultivo assistido de mar-cadores. Uma terceira vantagem do isolamento de polinucleotídeos envolvi-dos na síntese de galactomananos é a geração de dados de expressão paraestes genes durante a maturação do grão de café, em variedades com ní-veis altos e baixos de galactomananos. Essa informação pode ser utilizadapara direcionar a escolha de genes a serem utilizados em manipulação ge-nética destinada à geração de novas plantas de café transgênicas que au-mentaram ou diminuíram níveis de galactomananos no grão maduro.

Em uma característica, a presente invenção apresenta métodospara alterar o perfil de galactomananos em uma planta, preferencialmentecafé, compreendendo o aumento ou diminuição de quantidade ou atividadede uma ou mais enzimas da síntese de galactomananos na planta. Concreti-zações específicas da presente invenção provêem métodos para aumentarou diminuir a produção de manano sintase.

Em uma concretização, plantas de café podem ser transforma-das com um polinucleotídeo codificador de manano sintase, como um cDNAcompreendendo a SEQ ID NO: 2 ou 3, ou 11-14, com a finalidade de super-produzir manano sintase ou galactosiltransferase, respectivamente, em vá-rios tecidos de café. Em uma concretização, as plantas de café são constru-ídas para um aumento geral em produção de manano sintase, por exemplo,através do uso de um promotor como o promotor de subunidade pequena(SSU) RuBisCo ou promotor CaMV35S, ligado funcionalmente a um gene demanano sintase. Em outra concretização, plantas de café são construídaspara um aumento geral em produção de galactosiltransferase, por exemplo,através do uso de um promotor como o promotor de subunidade pequena(SSU) RuBisCo ou o promotor CaMV35S, ligado funcionalmente a um genede galactosiltransferase. Em algumas concretizações, a modificação de plan-tas de café pode ser construída para aumentar tanto a produção de mananosintase como de galactosiltransferase. Em outra concretização destinada alimitar a produção da manano sintase ou da galactosiltransferase no órgãopenetrado de interesse, ou seja, o grão, um promotor específico do grão po-de ser utilizado, especialmente um dos promotores específicos de grão deCoffea, descritos acima.

Plantas que exibem perfis alterados de galactomananos podemser selecionadas quanto a variantes que ocorrem naturalmente de mananosintase ou galactosiltransferase. Por exemplo, plantas mutantes com perdade função (nula) podem ser criadas ou selecionadas de populações de plan-tas mutantes disponíveis atualmente. Será apreciado também por especialis-tas na técnica que populações de plantas mutantes podem ser selecionadastambém quanto a mutantes com superexpressão ou subexpressão de umaenzima em particular que metaboliza polissacarídeos, como uma enzima dasíntese de galactomananos, utilizando um ou mais métodos entre os descri-tos neste pedido. Populações de mutantes podem ser produzidas por muta-gênese química, mutagênese por radiação e inserções de transposon ou deT-DNA, ou direcionando lesões induzidas locais em genomas (TILLING,consultar, por exemplo, Henikoff et al., 2004, Plant Physiol. 135(2): 630-636;Gilchrist & Haughn, 2005, Curr. Opin. PIantBioI. 8(2): 211-215). Os métodosde produção de populações de mutantes são bem conhecidos na técnica.

Os ácidos nucléicos da invenção podem ser utilizados para iden-tificar formas mutantes de enzimas da síntese de galactomananos em váriasespécies de plantas. Em espécies como milho ou Arabidopsis, em que linhasde inserção de transposon estão disponíveis, iniciadores de oligonucleotí-deos podem ser criados para selecionar linhas para inserções nos genes deenzimas da síntese de galactomananos. Através de cultivo, uma linhagemde plantas pode ser, então, desenvolvida, heterozigótica ou homozigótica dogene interrompido.

Uma planta pode ser construída também para exibir um fenótiposemelhante ao observado em mutantes nulos, criados por técnicas mutagê-nicas. Um mutante transgênico nulo pode ser criado pela expressão de umaforma mutante de uma enzima da síntese de galactomananos a fim de sercriado um "efeito dominante negativo". Enquanto que não limitando a inven-ção a qualquer um único mecanismo, esta proteína mutante competirá coma proteína do tipo selvagem por proteínas de interação ou outros fatores ce-lulares. Exemplos deste tipo de efeito "dominante negativo" são bem conhe-cidos tanto para sistemas de insetos como para de vertebrados (Radke etal,1997, Genetics 145: 163-171; Kolch et al., 1991, Nature 349: 426-428).

Outro tipo de mutante transgênico nulo pode ser criado pela ini-bição da tradução do mRNA codificador da enzima da síntese de galacto-mananos "silenciando o gene após a tradução". Estas técnicas podem serutilizadas para regular para baixo a manano sintase em um grão de planta e,dessa forma, alterar o perfil de polissacarídeos. Por exemplo, um gene codi-ficador de enzima da síntese de galactomananos das espécies, direcionadopara regulação para baixo, ou fragmento deste, pode ser utilizado para con-trolar a produção da proteína codificada. Moléculas anti-sentido de extensãocompleta podem ser utilizadas para essa finalidade. Alternativamente, po-dem ser utilizados oligonucleotídeos anti-sentido, direcionados para regiõesespecíficas do mRNA, fundamentais para a tradução. O uso de moléculasanti-sentido para diminuir níveis de expressão de um gene predeterminado éconhecido na técnica. Moléculas anti-sentido podem ser providas in situ pelatransformação de células da planta com uma construção de DNA que, natranscrição, produz seqüências anti-sentido de RNA. Estes constructos po-dem ser criados para produzir seqüências anti-sentido de extensão completaou parcial. Esse efeito que silencia o gene pode ser intensificado pela super-produção transgênica do RNA de orientação sentido e anti-sentido da se-qüência que codifica o gene, de forma que uma quantidade grande de dsR-NA seja produzida (por exemplo, consultar Waterhouse et ai, 1998, PNAS95: 13959-13964). A esse respeito, foi constatado que dsRNA contendo se-qüências que correspondem a, pelo menos, parte ou todo um íntron é parti-cularmente efetivo. Em uma concretização, parte ou toda a fita anti-sentidoda seqüência que codifica a manano sintase é expressa por um transgene.Em outra concretização, parte ou toda a fita anti-sentido da seqüência quecodifica a manano sintase é expressa por um transgene.

Em outra concretização, genes codificadores da síntese de ga-lactomananos podem ser silenciados pelo uso de uma variedade de outrastécnicas de silenciamento de gene (silenciamento de RNA), pós-transcri-cional, que estão atualmente disponíveis para sistemas de plantas. O silen-ciamento de RNA envolve o processamento de RNA de fita dupla (dsRNA)em 21-28 fragmentos pequenos de nucleotídeos por uma enzima à base deRNase H ("Dicer" ou "D/cer-semelhante"). Os produtos da clivagem, siRNA(RNA pequeno interveniente) ou miRNA (micro-RNA) são incorporados acomplexos manipuladores de proteínas que regulam a expressão gênica demaneira específica para seqüência (para revisões de silenciamento de RNAem plantas, consultar Horiguchi, 2004, Differentiation 72: 65-73; Baulcombe,2004, Nature 431: 356-363; Herr, 2004, Biochem. Soe. Trans. 32: 946-951).

RNAs pequenos intervenientes podem ser sintetizados quimica-mente ou transcritos e amplificados in vitro e, em seguida, liberados para ascélulas. A liberação pode ser efetuada através de micro-injeção (Tuschl T etai, 2002), transfecção química (Agrawal N et al., 2003), eletroporação outransfecção catiônica mediada por Iipossomo (Brummelkamp TR et al., 2002;Elbashir SM et al., 2002), ou por qualquer outro meio disponíveis na técnica,fato que será apreciado pelo artesão com habilidade. Alternativamente, osiRNA pode ser expresso de modo intracelular pela inserção de modelos deDNA para siRNA nas células de interesse, por exemplo, por meio de umplasmídeo, (Tuschl T et al., 2002), e pode ser especificamente direcionadapara células selecionadas. RNAs pequenos intervenientes foram introduzi-dos com êxito em plantas. (Klahre U et ai, 2002).

Um método de preferência de silenciamento de RNA na presen-te invenção é o uso de RNAs curtos com a forma de grampo (shRNA). Umvetor contendo uma seqüência de DNA codificadora para uma seqüência desiRNA particularmente desejada é liberado em uma célula-alvo por meiocomum. Uma vez na célula, a seqüência de DNA é transcrita continuamenteem moléculas de RNA que se enlaçam de novo sobre si mesmas e formamestruturas com forma de grampo por meio de pareamento de bases intramo-lecular. Estas estruturas com forma de grampo, uma vez processadas pelacélula, são equivalentes a moléculas de siRNA e são utilizadas, pela célula,para mediar o silenciamento do RNA da proteína desejada. Vários construc-tos de utilidade especial para silenciar RNA em plantas são descritos porHoriguchi, 2004, supra. Este constructo compreende, tipicamente, um pro-motor, uma seqüência do gene-alvo que deve ser silenciado, na orientação"sentido", um espaçador, a seqüência anti-sentido da seqüência do gene-alvo, e um terminador.

Um outro tipo ainda de mutante nulo sintético pode ser criadotambém pela técnica de "co-supressão" (Vaucheret êt ai, 1998, Plant J.16(6): 651-659). Células de plantas são transformadas com uma cópia dogene endógeno, direcionado para repressão. Em muitos casos, isso resultana repressão completa do gene nativo, bem como do transgene. Em umaconcretização, um gene codificador de enzima da síntese de galactomana-no, proveniente da espécie da planta de interesse, é isolado e utilizado paratransformar células daquela mesma espécie.

Plantas mutantes ou transgênicas, produzidas por qualquer umdos métodos precedentes, são apresentadas também em conformidade coma presente invenção. As plantas são, de preferência, férteis e, desse modo,podem ser úteis para fins de cultivo. Assim, mutante ou plantas que exibemum ou mais dos fenótipos desejáveis supramencionados podem ser utiliza-dos para o cultivo de plantas, ou diretamente aplicadas em agricultura ouhorticultura. Elas poderão ter utilidade também como ferramentas de pesqui-sa para a elucidação posterior da participação de enzimas metabolizadorasde polissacarídeos e os seus efeitos sobre perfis de polissacarídeos e, des-sa forma, afetarem o sabor, aroma e outras características de sementes decafé. Plantas contendo um transgene ou uma mutação especificada podemser cruzadas também com plantas contendo um transgene complementar ougenótipo para produção de plantas com fenótipos intensificados ou combi-nados.

Os exemplos seguintes são fornecidos para descrever a inven-ção mais detalhadamente. Os exemplos são apresentados para fins ilustrati-vos e não pretendem limitar a invenção.

Exemplo 1

Materiais e métodos para Exemplos subseqüentes

Material de plantas. Foram colhidas cerejas de Coffea cane-phora (BP409, 2001) de árvores no campo do Centro Indonésio de Pesquisade Café e Cacau (ICCRI), Indonésia. Imediatamente após a colheita, as ce-rejas foram congeladas em nitrogênio líquido e enviadas, a seguir, congela-das em gelo seco para o local designado para processamento posterior. Asamostras foram congeladas a -25°C para o transporte e, armazenadas, emseguida, a -80°C até o uso.

Análise de seqüências de DNA. Para seqüenciamento deDNA, DNA recombinante de plasmídeo foi preparado e seqüenciado de a-cordo com métodos convencionais. Foi realizada a análise por computador, empregando o programa DNA Star (Lasergene). Foram verificadas homolo-gias de seqüência contra banco de dados do GenBank, utilizando programasBLAST (Altschul et al. 1990).

Preparo de cDNA. cDNA foi preparado a partir de RNA total eoligo dT(18) (Sigma), da forma como segue: 1 µg da amostra de RNA total mais 50 ng de oligo dT até completar 12 μl de volume final com água tratadacom DEPC. Essa mistura foi incubada subseqüentemente a 70°C por 10 mine, então, resfriada rapidamente em gelo. Em seguida, 4 μl do primeiro tam-pão de fita (5x, Invitrogen), 2 μl de DTT (0,1 M, Invitrogen) e 1 μl de misturade dNTP (10 mM cada, Invitrogen) foram acrescentados. Estas misturas de reação foram pré-incubadas a 42°C por 2 min antes de ser acrescentado 1μl de SuperScript III Rnase H-Transcriptase reversa (200U/μl, Invitrogen). Ostubos foram incubados, subseqüentemente, a 25°C por 10 min e, depois, a42°C por 50 min, seguido por inativação enzimática por aquecimento a 70°Cpor 10 min. As amostras de cDNA geradas foram diluídas, em seguida, dez vezes em água estéril e armazenadas a -20°C para uso em alguns dos ex-perimentos, como 5' RACE, isolamento de clones de cDNA em toda exten-são e QRT-PCR.

Reações de 5' RACE (Amplificacão Rápida de Extremidades de cDNA)

A fim de recuperar a seqüência codificadora 5' da manano sinta- se, foram conduzidos duas rodadas de 5' RACE. O RNA utilizado para a sín-tese do cDNA, em experimentos de 5' RACE, é do grão de Coffea canepho-ra (BP409) no estágio amarelo. Os experimentos de 5' RACE foram condu-zidos empregando métodos que seguem estreitamente os métodos descritosno estojo para o equipamento de 5' RACE do Estojo de Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA (Invitrogen). Resumidamente, o cDNA utilizadoneste experimento foi purificado inicialmente para remover quaisquer nucleo-tídeos não incorporados (uma vez que eles interfeririam na reação de acom-panhamento de dC). Essa etapa foi levada a cabo pela purificação do cDNAda 5' RACE em colunas S.N.A.P. (Invitrogen), precisamente de acordo comas instruções fornecidas pelo fabricante. Uma vez purificado, o cDNA foi re-cuperado em 50 μΙ de água esterilizada e, em seguida, armazenado a -20°Cantes de ser utilizado para 5'RACE PCR.

Os experimentos de 5' RACE começaram todos por acompa-nhamento de TdT do cDNA purificado na S.N.A.P. A poli reação de acompa-nhamento de dC foi a seguinte: 25 μΙ de reações foram configuradas com 5μΙ do cDNA purificado, 11,5 μΙ de água tratada com DEPC, 5 μΙ 5x de tam- pão de acompanhamento de TdT (Invitrogen) e 2,5μΙ de dCTP a 2 mM. Asreações foram incubadas em seguida a 94°C por 3 minutos, seguido por res-friamento no gelo. 1 μΙ de TdT foi acrescentado então e a reação foi incuba-da por 10 minutos a 37°C. As reações foram finalizadas pelo aquecimentopor 10 minutos a 65°C e recolocadas em gelo.

A primeira rodada de reações de 5' RACE foi executada em vo-lume final de 50 μΙ, conforme segue: 5 μΙ de cada cDNA acompanhado, 5 μΙ10 χ de tampão de PCR (Tampão ThermoPoI), 400 nM do Iniciador GeneEspecífico 1 e iniciadores AAP (consultar as Tabelas 1 e 2, para informaçõessobre iniciadores), 200 μΜ de cada dNTP e 2,5 U de Taq DNA polimerase(BioLabs). As condições da primeira rodada de ciclos de PCR foram: 94°Cpor 2 min; em seguida, 40 ciclos of 94°C por 1 min, temperatura de anela-mento anotada na Tabela 2 por 1 min e 72°C por 2 min para 40 ciclos. Umaetapa final adicional de alongamento foi efetuada a 72°C por 7 min. Os pro-dutos da PCR foram, então, analisados por eletroforese em gel agarose ecorados com corante de brometo de etídio.

A segunda rodada de reações de PCR foi conduzida em volumefinal de 50 μΙ, conforme segue: 5μΙ do produto da Primeira Rodada de PCRdiluído a 1%; 5 μΙ 10 χ tampão de PCR (tampão LA Il Mg++ plus), 200 nM doIniciador Gene Específico 2 e iniciadores AUAP (consultar as Tabelas 1 e 2para informações sobre os iniciadores específicos utilizados), 200 μΜ decada dNTP, 0,5 U de DNA polimerase Takara LA Taq (Cambrex Bio Scien-ce). O protocolo para os ciclos foi: 94°C por 2 min; em seguida, 40 ciclos de94°C por 1 min, a temperatura de anelamento anotada na Tabela 2 por 1 mine 72°C por 1 min 30 segundos. Uma etapa final adicional de alongamento foiefetuada a 72°C por 7min. Os produtos da PCR foram, então, analisados poreletroforese em gel agarose e corados com corante de brometo de etídio.

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 1. Lista de iniciadores utilizados para experimentos de 5'RACE<table>table see original document page 48</column></row><table>São fornecidos iniciadores, temperaturas de anelamento e onúmero de ciclos para as várias reações de PCR 5' RACE. As seqüênciasde DNA dos iniciadores são fornecidas acima, na Tabela 1.Isolamento de cDNA contendo as seqüências codificadoras completas(ORF completa) para ManS de coffea canephora e coffea arábica, utili-zando iniciadores genes-específicos.

As seqüências existentes de cDNA e as novas seqüências 5',obtidas de 5' RACE, foram utilizadas para criar dois iniciadores genes-específicos nas seqüências UTR 5' e 3' para amplificar as seqüências ORFcompletas de ManS (pVC4, pVC6 e pVC7). O cDNA utilizado para isolar asseqüências ORF completas está anotado na Tabela 3 (Semente, estágioamarelo, BP409; e Semente, estágio amarelo, T2308), e as seqüências dosiniciadores específicos para cada reação de PCR são fornecidas na Tabela4. As reações de PCR foram realizadas em reações de 50 μl, conforme se-gue: 5μl de cDNA (Tabela 3 e 4), 5 μl 10 χ tampão de PCR (Tampão La PCRII Mg"1"1" plus), 800 nM de cada iniciador gene-específico, 200 μΜ de cadadNTP e 0,5 U de DNA polimerase Takara LA Taq (Cambrex Bio Science).Após a desnaturação a 94°C por 2 min, a amplificação consistiu em 35 ciclosde 1 min a 94°C, 1 min e 30 segundos na temperatura de anelamento (47°C)e 3 min a 72°C. Uma etapa adicional de alongamento foi realizada a 72°Cpor 7 min. Os produtos da PCR foram, então, analisados por eletroforese emgel agarose e corados com corante de brometo de etídio. Fragmentos dotamanho esperado foram então clonados em pCR4-TOPO, empregando oEstojo de Clonagem para Seqüenciamento TOPO TA (Invitrogen), de acordocom as instruções fornecidas pelo fabricante. Os insertos dos plasmídeosgerados foram então inteiramente seqüenciados.

<table>table see original document page 49</column></row><table>

Tabela 3. Isolamento de seqüências de cDNA, codificadoras de toda aextensão das seqüências protéicas para manano sintase de Coffea ca-nephora (CcManS) e manano sintase de Coffea arabica (CaManS).

O cDNA específico, iniciadores, temperatura de anelamento daPCR1 utilizados para amplificar as seqüências ORF completas são apresen-tados. Estes cDNAs foram sintetizados conforme descrito nos métodos.

<table>table see original document page 50</column></row><table>

Tabela 4. Seqüências dos iniciadores utilizados para a amplificação deseqüências de cDNA que codificam toda a extensão das seqüênciasprotéicas da CcManS e CaManS.

Análise de expressão de CcManS, utilizando RT-PCR quanti-tativa (Q-RT-PCR)

O cDNA utilizado para estes experimentos foi preparado de a-cordo com os métodos descritos acima (robusta; C. canephora BP 409, dilui-ção de 1/1000; amostra de cDNA de arabica; C. arabica T-2308, diluição de1/1000, amostra de cDNA). Foi realizada TaqMan-PCR, conforme recomen-dado pelo fabricante (Applied Biosystems, Perkin-Elmer). Resumidamente,foram configuradas reações de 25 μΙ em placas de reação (Placa de reaçãocom 96 poços MicroAmp Optical da Applied Biosystems ref.: N801-0560).Cada reação continha 12,5 μΙ de mistura AmpIiTaq Gold Master, 2,5 μl dosdois iniciadores (estoque a 8 μΜ, final a 800 nM na reação), 2,5 μl de sondaMGB TaqMan (estoque a 2 μΜ, final a 200 nM na reação) e 5 μΙ de amostrade DNA, além de água. A água e o Dna foram acrescentados inicialmente àsplacas e, em seguida a "Mistura Específica" (Mistura AmpIiTaq Gold Master+ iniciadores e sonda TaqMan) é acrescentada. As reações foram concluí-das em temperatura ambiente e as amplificações de Taq somente iniciaramquando o Taq é ativado pela liberação do anticorpo ligado em temperaturasaltas, isto é, HotStart (Início Quente). O tampão TaqMan contém AmpEra-se® UNG (Uracil-N-glicosilase), ativa durante os primeiros 2 min a 50°C e é,em seguida, inativada a 95°C no início dos ciclos da PCR. As condições uti-lizadas para os ciclos foram (Equipamento de PCR em Tempo Real 7500 -Applied Biosystems) 50°C 2 minutos, 95°C 10 minutos, em seguida, 40 ci-cios de 95°C 15 segundos e 60°C 1 minuto. Cada reação foi conduzida emtriplicata, sendo calculado o valor Ct médio para as três reações.

Os iniciadores e sondas TaqMan utilizados foram criados com oprograma de computador INICIADOR EXPRESS (Applied Biosystems). Osiniciadores e sonda MGB de manano sintase, utilizados para os experimen-tos de Q-PCR, são 124613-F1, 124613-R1 e 124613MGB1 (consultar a ta-bela 5). A quantificação foi conduzida utilizando o método de quantificaçãorelativa (RQ), empregando o gene da proteína ribossômica expressa consti-tutivamente CcRpl39 como a referência. Nesse caso, o Ct médio é calculadopara os genes CcManSyn (gene em teste) e CcRpl39 (gene de referência), apartir das réplicas efetuadas para cada gente em cada amostra de tecido. Ovalor RQ (2 deltaCt; com delta Ct = CcManS Ct - CcRpl39 Ct), que é uma me-dida da diferença entre as duas amostras, é calculado em seguida. A fim deutilizar o método de quantificação relativa, é necessário demonstrar que aeficiência da amplificação para o gene em tese é equivalente à eficiência daamplificação para a seqüência de referência (seqüência de cDNA rpl39), uti-lizando o iniciador especificado e os conjuntos de sonda (eficiência de ampli-ficação próxima de 1, ou seja, 100%). Para determinar essa equivalênciarelativa, DNA de plasmídeo contendo as seqüências apropriadas de cDNAsofreram diluições de 1/1000, 1/10.000, 1/100.000 e 1/1.000.000, sendo utili-zadas as condições descritas acima para a Q-PCR, a inclinação da curva Ct= f (Log de quantidade de DNA) foi calculada para cada conjunto de plamí-deo/iniciador!sonda TaqMan. Conjuntos de plasm\deos/iniciadores/sondaTaqMan que forneceram curvas com inclinações próximas de 3,32, repre-sentando 100% de eficiência, são considerados aceitáveis. Os conjuntos deplasm ídeo/iniciador/sonda TaqMan aqui utilizados obtiveram valores aceitá-veis de Ct = f(Log de quantidade de DNA).

<table>table see original document page 51</column></row><table>

Tabela 5. Lista de iniciadores utilizados para experimentos de Q-PCR.

Exemplo 2Identificação de cDNA codificador de manano sintase em C. canephora

Foram identificadas mais de 47.000 seqüências EST a partir devárias bibliotecas de café, efetuado com RNA isolado proveniente de folhasjovens e do grão e de tecidos do pericarpo de cerejas, colhidas em estágiosdiferentes de desenvolvimento. EST sobrepostas foram subseqüentemente"agrupadas" em "unigenes" (ou seja, contigs), sendo as seqüências anota-das por levantamento de BLAST de cada seqüência individual contra o ban-co de dados de proteínas não redundantes do NCBI.

Galactomananos contribuem bastante para o peso seco do grãode café maduro e acredita-se que desempenhem um importante papel noacesso ou capacidade de extração de moléculas presentes no interior dogrão, por exemplo, açúcares. Foram seguidos métodos para isolar um dosprincipais genes envolvidos na síntese de galactomananos, ou seja, mananosintase, e para estudar a expressão deste gene no desenvolvimento do grãode café. A seqüência protéica da manano sintase da goma guar, caracteri-zada bioquimicamente (CtManS1 Cyamopsis tetragonoloba, número de a-cesso AAR23313; Dhugga et. ai, 2004), foi utilizada para buscar o nossoconjunto 'unigene' de seqüências de DNA, empregando o algoritmo tblastn(Altschul et. ai, 1990). Esta busca revelou um unigene com um nível muitoalto de homologia (unigene #124613). Consultar a Tabela 6. Foram isoladasas duas EST mais longas neste unigene e estas foram completadas seqüen-ciadas: foi constatado que uma, o inserto em pcccs46w16i11, possuía umaextensão com 1779 pb; enquanto que a segunda, um inserto empcccs46w24c19, tinha extensão com 1349 pb. Uma análise de alinhamentoentre estas duas seqüências indicou que havia duas seqüências de íntron nocDNA of pcccs46w16i11. Conforme anotado no gráfico da Figura 2A, um dosíntrons estava na extremidade 5' desse clone, enquanto que a outra seqüên-cia de íntron, muito menor, estava no meio da ORF do cDNA. Quando asseqüências dos íntrons foram removidas da seqüência de consenso paraestes dois clones de cDNA, uma ORF parcial de 423 aminoácidos foi revela-da; no entanto, a extensão total da proteína da guar possui 526 aminoácidosde comprimento. Dessa forma, o cDNA da ManS do café não estava comple-to e faltavam mais de 309 pares de base (ou seja, codificando 103 aminoá-cidos mais o UTR 5').

<table>table see original document page 53</column></row><table>

Tabela 6. Distribuição in silico de ESTs da manano sintase do café.

Número de ESTs da manano sintase (unigene 124613) encon-trado em cada uma das diferentes bibliotecas de EST de Coffea canephora.

Exemplo 3

Extensão completa da seqüência da ManS

O clone pcccs46w16i11 codifica uma parte significativa da se-qüência da ManS do café, dessa forma, foi utilizada para criar iniciadoresespecíficos para uso na técnica bem estabelecida de caminhar assistido deiniciador genômico. O primeiro experimento produziu um fragmento comcomprimento de 1084 bp (pJMc2), o qual estendeu a região intrônica emmais 1000 bp. No entanto, como a nova seqüência não continha qualquerinformação de seqüência sobre o próximo éxon, este fragmento não produ-ziu qualquer novo dado de seqüência sobre a ORF. Experimentos posterio-res de caminhar genômico não geraram novas seqüências em orientaçãoascendente (upstream).

Foi conduzido 5' RACE PCR1 conforme descrito no Exemplo 1,para isolar a região codificadora 5' que estava faltando deste gene. Isso foiobtido utilizando os iniciadores específicos do gene, RNAi-Pr2-GSP1 eManSynt GWR249-GSP2. O resultado foi um fragmento de PCR com 300pares de base, o qual foi clonado no vetor pCR-4-ΤΟΡΟ e seqüenciado emseguida. A seqüência obtida (pVC2; CcManS Racel) possuía 259 bp decomprimento e sobrepunha a extremidade 5' do clone de cDNA pcccs46w16i11(figura 2, apresentando 99 pb da seqüência sobreposta). No entanto, foi de-terminado estar faltando a este fragmento de RACE a extremidade 5' destegene. Por conseguinte, um novo 5' RACE PCR foi conduzido, utilizando ini-ciadores genes-específicos, ManSRace2 e ManSRaceI. Este produziu umfragmento de PCR com aproximadamente 400 pares de base, o qual foi cio-nado em vetor pCR-4-T0P0 e seqüenciado em seguida. A seqüência obtida(pVC3 CcManS Race2) possuía 340 bp de comprimento e sobrepunha aextremidade 5' do fragmento CcManS Racel (Figura 2A, apresentando 38pb da seqüência sobreposta).

Os vários clones, conforme mostrados na figura 2A, permitiram ageração do alinhamento de DNA1 apresentado na figura 2B, o qual mostra asseqüências sobrepostas dos mesmos clones. Essa informação sobre a se-qüência de DNA foi utilizada para encontrar a ORF completa para a mananosintase de café, CcManS. A partir da recém-isolada seqüência 5' da ManSde café (CcManS Race2) e da extensão praticamente completa da seqüên-cia de codificação no cDNA pcccs46w16i11, foram criados dois novos inicia-dores (ManS-Am3 e ManS-Am2, Tabela 7) que eram capazes de amplificarespecificadamente a seqüência completa ORF da manano sintase de café,empregando cDNA proveniente do RNA de C. canephora (BP-409) ou Cof-fea arabica (T2308), isolado do grão em estágio de desenvolvimento amare-lo (Tabela 7). Este experimento de amplificação por PCR resultou na gera-ção das seqüências de cDNA que estão contidas nos plasmídeos pVC4 (ro-busta cDNA), pVC6 (robusta cDNA) e pVC7 (Arabica cDNA), respectivamen-te (Figura 2B). A análise de seqüências do inserto do pVC4 indicou que estecDNA tinha 1898 bp e que codificava um polipeptídeo de 530 aminoácidos(peso molecular estimado de 61,29 kDa). Nota: Foi constatado que a se-qüência de DNA do inserto no pVC4 exibia uma troca de base, ocasionandoum códon de parada na ORF. Conforme é explicado na legenda da Figura2B, esta troca de base é um erro da PCR e não é codificada pela seqüênciagenômica correspondente. A análise de seqüências dos insertos do pVC6 epVC7 demonstrou que estas seqüências de cDNA possuíam 1897 pb decomprimento e que cada uma exibia uma ORF completa de 1590 pb, codifi-cando polipeptídeos de 530 aminoácidos com peso molecular estimado de61,3 kDa e 61,15 kDa, respectivamente.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Tabela 7. Seqüências dos iniciadores utilizados para a amplificação deseqüências de cDNA que codificam toda a extensão das seqüênciasprotéicas da CcManS.

Estas seqüências protéicas foram, então, alinhadas com a se-qüência protéica da manano sintase da goma guar, caracterizada bioquimi-camente (CtManS), bem como duas das seqüências mais estreitamente re-lacionadas, encontradas no banco de dados do GenBank1 o produto de umaque não tinha sido caracterizada (ou seja, I. Trifida). O resultado desse ali-nhamento (Figura 4) mostra que a seqüência da ManS da Coffea canephora(CcManS; pVC6) exibe 74,7%, 65,9% e 58,7% de identificação com as se-qüências da C. tetragonoloba, A. thaliana e I. Trifida, respectivamente. A se-qüência da arabidopsis, neste alinhamento, é denominada também AtCSLA9(gene n° 9 da família A da proteína semelhante à arabidopsis celulose sinta-se), tendo sido demonstrado recentemente que a proteína codificada poreste gene atua na síntese de manano e, em menor extensão, atua na sínte-se de glucomanano (Liepman, A., Wilkerson, C., Keegstra, K. 2005 Expres-sion of cellulose synthase-like (CsI) genes in insect cells reveals the CsIAfamiiy members encode mannan synthases. Proc. Natl. Acad. Sei. 102,2221-2226). Os altos níveis de identidade entre as seqüências protéicas docafé e da goma guar sustentam bastante o argumento de que as seqüênciasCcManS and CaManS codificam a proteína responsável pela síntese de ma-nano no grão de café. Cabe observar também que as seqüências de ManSdo Coffea canephora (pVC6) e Coffea arabica (pVC7) compartilham 98,5%de identidade e que possuem somente diferença em 12 nucleotídeos, tradu-zidos em uma diferença de 8 aminoácidos. Talvez estas diferenças sutis nasproteínas manano sintase contribuam para a diferença de taxas de extração,cuja existência é geralmente conhecida entre esses dois tipos de café.

Foi efetuado um alinhamento das seqüências de DNA inseridasno pVC4 (CcManS), pVC6 (CcManS) e pVC7 (CaManS) com seqüências decDNA da MansS do C. tetragonoloba (AAR23313) e A. thaliana (CAB82941),empregando ClustaIW. Este alinhamento de DNA revelou que as seqüênciasdo café, conforme observado acima, eram praticamente idênticas. Por outrolado, a seqüência do C. tetragonoloba exibiu homologia de aproximadamen-te 67% com as seqüências de manano sintase do café, e a da A. thaliana,aproximadamente 55% de homologia com as seqüências de manano sintasedo café (CAB82941). Ademais, as regiões de identidade estavam espalha-das regularmente por toda as seqüências e, dessa forma, não foram consta-tadas regiões muito longas contíguas de identidade entre as seqüências docafé e do guar e as seqüências do arabidopsis.Exemplo 4

Análise de expressão do CcManS

A fim de assegurar que o gene CcManS codifica um membro dafamília de celulose sintase-semelhante (Csl), com atividade de manano sin-tase, foi demonstrado que este gene expressa somente no(s) tecido(s) queexibe(m) um nível alto de síntese de manano e galactomanano. A expressãodo CcManS foi estudada em vários tecidos de arabica e de robusta, empre-gando RT-PCR quantitativa. Os resultados obtidos demonstram claramenteque a manano sintase é não só altamente como praticamente exclusivamen-te expressa no grão tanto da robusta como da arabica, com o grão T2308 daarabica aparentando ter níveis ligeiramente mais altos de expressão da ma-nano sintase do que o grão BP409 da robusta. Isso sugere que pode haverníveis mais altos de atividade da manano sintase no grão da arabica em re-lação ao grão da robusta, especialmente no desenvolvimento tardio do grão.Essa diferença em atividade levaria a níveis mais altos e/ou estruturas dife-rentes dos mananos/galactomananos encontrados no grão da arabica. Estasdiferenças explicariam, de modo geral, o nível mais alto de dificuldade, expe-rimentado na extração de material sólido de grão torrefeito ou processado,da arabica em relação ao grão da robusta.

Foi detectada discreta, ou nenhuma, expressão de manano sin-tase, empregando QRT-PCR, no caule, raízes, folhas e tecidos do pericarpoe flores da arabica T2308 ou robusta BP409. A amostra de robusta verdepequena era a única amostra de grão que não apresentou expressão gênicade manano sintase detectável e esse fato está em acordo com resultadosanteriores que revelaram esse estágio/amostra particular da robusta nãoexpressa ainda outros genes específicos do endosperma, como as oleosinas(consultar, por exemplo, o Pedido de patente, de posse comum e tambémem aguardo de aprovação NQ. 60/696 445). Em resumo, todos os dados deexpressão de manano sintase revelam que a manano sintase é exclusiva-mente, ou praticamente exclusivamente, expressa no grão de café em está-gios tardios de desenvolvimento, quando o endosperma está em formaçãoou desenvolvimento. De acordo com esse achado, EST de manano sintasefoi detectada somente nas bibliotecas formadas com RNA extraído de grãonos estágios tardios de desenvolvimento e não nas bibliotecas formadascom RNA extraído de estágios iniciais de cerejas de café, tecidos de peri-carpo de cereja de café ou de tecidos de folhas (consultar a Tabela 6). Nogeral, os dados de expressão de manano sintase são compatíveis com ateoria de que o gene da manano sintase codifica a principal enzima envolvi-da na síntese de galactomananos no grão de café.

<table>table see original document page 57</column></row><table>

ND = não detectado

Tabela 8 . Expressão relativa de CcManS versus CcRpl39

Exemplo 5

Identificação de cDNA codificador de UDP-GaI Dependentede Manano Específico (1,6)-alfa-D-Galactosiltransferase (GMGT) em C.canephora

Uma segunda enzima envolvida nia síntese de galactomananosé a enzima Mn+* dependente, UDP-GaI dependente manano específico(1,6)-alfa-D-galactosiltransferase (GMGT; (Edwards, Choo, Dickson, Scott,Gridley e Reid 2004). Acredita-se que a GMGT junto com a manano sintaseoperem em associação estreita, possivelmente sob a forma de complexo,visando a formação de galactomananos.

A seqüência protéica de uma proteína GMGT, bioquimicamentecaracterizada, de Lotus japonicus (número de acesso AJ567668) foi utilizadapara buscar o conjunto 'unigene' de seqüências de DNA, empregando o al-goritmo tblastn (Altschul et. al, 1990). Esta busca revelou dois unigenes comalto nível de homologia (unigene n9 122567 e unigene ne 122620). A Tabela9 exibe o número de EST encontrado para cada unigene nas diferentes bi-bliotecas de C. canephora. Em vista de ESTs do unigene 122620 serem so-mente encontradas na semente e de ESTs do unigene 122567 serem so-mente encontradas na folha, é provável que o unigene ne122620 representeum gene que codifique uma GMGT específica do grão de café. Seguindoesse raciocínio, acredita-se que esta proteína GMGT (CcGMGTI) opere coma CcManS, descrita neste pedido, para sintetizar a grande maioria dos galac-tomananos do grão de café. Por outro lado, o gene representado pelo unige-ne nQ 122567 codifica possivelmente outra proteína GMGT do café(GMGT2), a qual é associada com a síntese de galactomananos em outrostecidos do café, como na folha.

Os alinhamentos de cada unigene são apresentados nas Figuras5 e 6. A ORF da CcGMGTI ORF, codificada pelo unigene 122620, demons-trou possuir 54,3% de identidade com a seqüência protéica do alfava e53,6% de identidade com a seqüência protéica do Japonicus. A ORF daCcGMGT2, codificada pelo unigene 122567 demonstrou possuir 62,8% deidentidade com a seqüência protéica do alfava e 63,8% de identidade com aseqüência protéica do Japonicus.

Equipado com estas seqüências parciais de cDNA, o cDNA emtoda extensão pode ser isolado para cada gene, empregando as técnicasbem estabelecidas de 5' RACE e caminhar assistido de iniciador genômico.O cDNA em toda extensão de GMGT1 pode ser utilizado para expressaruma proteína ativa GMGT do grão de café em tecidos de plantas, como café,e em organismos de modelo de superexpressão, para gerar proteínas paraanálise funcional com a proteína manano sintase do café. As proteínas Cc-MansS e CcGMGT do café podem ser expressas em níveis altos na mesmaplanta, levedura ou célula bacteriana, podendo levar à geração de quantida-des substanciais de galactomananos produzidos por estes tipos diferentesde células.<table>table see original document page 59</column></row><table>

Tabela 9. Distribuição in silico de ESTs de GMGT de café.

É fornecido o número de ESTs de GMGT encontrado, para cadaunigene, nas várias bibliotecas de Coffea canephora.

Exemplo 6

Isolamento de seqüência de DNA codificadora da seqüênciapolipeptídica completa da GMGTase 1

O Exemplo 5 apresentou a descoberta de uma seqüência parcialde cDNA que codifica a UDP-GaI dependente manano específica (1,6)-alfa-D-galactosiltransferase, CcGMGTase 1 (CcGMTGI) de grão de C. canepho-ra. A fim de confirmar a seqüência n- 122620 do unigene,m apresentada noExemplo 5, a segunda EST mais longa naquele unigene (pcccs46w8o23) foicompletamente seqüenciada. Para obter dados de seqüência para CcGMG-Tase 1, no sentido ascendente da extremidade 5' da seqüência parcial decDNA do pcccs46w8o23, 5' RACE foi conduzido com os iniciadores GMGT-30w15m14-RACE 4 e GMGT-30w15m14-RACE 2 (consultar a Tabela 10para informações sobre as seqüências). Utilizando RNA isolado do grão decerejas, provenientes da arabica T2308, no estágio "amarelo", foi preparadocDNA, conforme descrito anteriormente nos métodos para este pedido depatente. Foi acrescentado, em seguida, um poli dC de cauda ao cDNA daarabica, empregando a enzima TdT e utilizada na reação de 5' RACE, sobas condições descritas na seção de métodos. A primeira rodada de 5' RACEutilizou os iniciadores GMGT-30w15m14-RACE 4 e ΑΑΡ, e a segunda roda-da de 5' RACE, os iniciadores GMGT-30w15m14-RACE 2 e AUAP. A tempe-ratura de anelamento, em ambas as reações, foi de 60°C. O resultado foi umfragmento de aproximadamente 1,0 - 1,1 quilobase de pares, que foi clona-do no vetor pCR-4-ΤΟΡΟ e seqüenciado em seguida.<table>table see original document page 60</column></row><table>

Tabela 10. Lista de iniciadores utilizados para experimentos de 5'RACEPCR.

O 5' RACE gerou o clone pVC10 que continha um inserto de1120 bp. A análise da seqüência completa deste produto de 5' RACE reve-lou que ele codificou a região N-terminal da GMGTase 1 do café. A seqüên-cia ORF completa da GMGTase 1 do café foi amplificada com êxito por PCRcomo um fragmento único do DNA genômico da variedade T-2308 arabica,utilizando um novo conjunto de iniciadores de PCR, criados a partir da ex-tremidade final 5' do pVC10 e a região 3' não codificadora do cDNApcccs46w8o23. Estes oligonucleotídeos específicos para GMGTase 1,GMGT-FwdI e GMGT-Rev (Tabela 11) foram então utilizados para amplifi-car por PCR um fragmento contendo a seqüência ORF completa da GMG-Tase 1 do DNA genômico da arabica T-2308 que tinha sido purificado detecido de folha, de acordo com o método descrito anteriormente (Crouzillat etal. 1996 Theor. AppL Genet. 93, 205-214). A reação de PCR foi realizada em50μΙ de reação, conforme segue: 5 μΙ de gDNA, 5 μΙ 10 χ tampão de PCR(Tampão ThermoPoI), 400nM de cada iniciador gene-específico, 200 μΜ decada dNTP e 0,5 U de Taq DNA polimerase (Biolabs). Após a desnaturação a 94°C por 2 min, a amplificação consistiu em 40 ciclos a 94°C, 1,5 minutosa 58°C e 3 minutos a 72°C. Foi efetuada uma etapa final adicional de alon-gamento a 72°C por 7 min. Os produtos da PCR foram então analisados poreletroforese em gel agarose e corados com brometo de etídio. Fragmentosdo tamanho esperado (~ 1700 pb) foram clonados, em seguida, no pCR4-TOPO, empregando o Estojo de Clonagem para Seqüenciamento TOPO TA(Invitrogen), de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante. Os in-sertos dos plasmídeos gerados foram, então, inteiramente seqüenciados. Aanálise de seqüências do clone obtido (pVC11; CaGMGTaseI) revelou quea GMGTase 1 não contém íntrons na maior parte da seqüência codificadoradeste gene (íntrons podem ocorrer ainda nas regiões codificadoras finais 5'ou 3' deste gene).

<table>table see original document page 61</column></row><table>

Tabela 11. Seqüências dos iniciadores utilizados para a amplificação de

uma seqüência genômica que codifica toda extensão da seqüência pro-téica da CaGMGTI.

Os três clones utilizados para obter a seqüência de polipeptí-deos em toda a extensão da GMGTaseI do café são apresentados na Figu-ra 7. As seqüências de DNA geradas foram alinhadas utilizando o programaCLUSTAL W (Figura 8). Esse alinhamento mostra que há algumas diferen-ças nas seqüências obtidas de ácido nucléico. No entanto, somente duasdas diferenças de base, na região da seqüência de aminoácidos, resultamem trocas de aminoácidos (a posição 432 possui L versus Pea posição 445possui E versus G). A seqüência completa de aminoácidos, codificada por pVC11, foi alinhada em seguida com as seqüências de DNA mais homólo-gas, encontradas no banco de dados público GenBank. O resultado destealinhamento de seqüências de aminoácidos é mostrado na Figura 9. A se-qüência da CaGMGTase 1 é altamente relacionada com a galactomananogalactosiltransferase do Senna occidentalis (65% de identidade) e possuiaproximadamente 56-57,6% de identidade com a maioria das outras se-qüências protéicas na Figura 3, sustentando a anotação da seqüência depolipeptídeos em toda a extensão da CaGMGTase 1 como uma Galactoma-nano galactosiltransferase.Exemplo 7

Caracterização de cDNA codificador da seqüência polipeptídica com-pleta da GMGTase 2

O Exemplo 5 apresentou também a descoberta de uma seqüên-cia parcial de cDNA, codificadora da UDP-GaI dependente manano específi-co (1,6)-alfa-D-galactosiltransferase, CcGMGTase 2 (CcGMGT2) de folhasde C. canephora. Essa seqüência de unigene (unigene nQ 122567) foi gera-da utilizando três seqüências EST homólogas. A fim de confirmar os dadosde seqüência do unigene e ampliar os dados de seqüência para cobrir a ex-tremidade 3' da seqüência, o clone de EST mais longo, naquele conjunto deunigene, foi seqüenciado (clone pcccl26f9). O alinhamento da seqüênciacompleta de DNA do pcccl26f9 versusa seqüência do unigene n9 122567 éapresentado na Figura 10. Conforme esperado, a seqüência completa depcccl26f9 continha a extremidade 3' da CcGMGTase 2, conforme indicadopela presença de uma poli-cauda A. A ORF codificada pelo pcccl26f9 conti-nha também a região N-terminal da GMGTase 2. A seqüência de DNA, naextremidade 5' do pcccl26f9, é praticamente idêntica à do unigene. No en-tanto, um exame mais minucioso da seqüência do unigene revela que o pri-meiro códon de metionina da seqüência do pcccl26f9 (ATG) era efetivamen-te ATC na seqüência do unigene e, dessa forma, a seqüência de aminoáci-dos do N-terminal, obtida da seqüência de DNA do unigene, não foi obser-vada. A seqüência de aminoácidos, codificada pelo pcccl26f9, foi, então, ali-nhada com várias das seqüências mais estreitamente relacionadas no bancode dados público GenBank (Figura 11). O exame deste alinhamento indicaque, embora as seqüências da GMGTase 1 e da GMGTase 2 do café te-nham regiões significativas de homologia (possuem aproximadamente 52%de identidade), elas são codificadas claramente por genes diferentes. Estealinhamento mostrou também, mais uma vez, que a GMGTase 2 do café étambém altamente relacionada a um grupo de proteínas, anotadas comogalactosiltransferases. Em conclusão, a evidência aqui apresentada indicaque o clone de cDNA, isolado da biblioteca de EST de folha de café (pcc-cl26f9), codifica a seqüência polipeptídica completa de uma GMGTase decafé, expressa na folha de café.

Exemplo 8

Análise de expressão da GMGTase 1 do café

Os níveis de expressão da GMGTase 1 em vários tecidos dearabica e de robusta foram analisados utilizando RT-PCR quantitativa e aabordagem de quantificação relativa (expressão relativa a rpl39). O métodoempregado foi semelhante ao descrito anteriormente para medir a expressãoda manano sintase no grão do café. Os conjuntos específicos utilizados deiniciadores e de sonda são apresentados na Tabela 12. Medições da eficiên-cia de amplificação do conjunto iniciador/sonda TaqMan demonstraram queeles se enquadram em um intervalo aceitável de eficiência. O cDNA foi pre-parado, conforme descrito anteriormente neste pedido, utilizando o SuperS-cript Ill (Invitrogen).

<table>table see original document page 63</column></row><table>

Tabela 12. Seqüências dos iniciadores e sondas, utilizados para os ex-perimentos de RT-PCR quantitativa.

Os resultados são apresentados na Figura 12 e demonstram quea GMGTase I é expressa primariamente no grão de robusta e arabica. Curi-osamente, há uma diferença de aproximadamente 10 vezes no valor de RQencontrado para as amostras de cDNA testadas de arabica em relação às derobusta. É possível que esta diferença de expressão possa contribuir paraalguma variação no nível e/ou estrutura de galactomananos no grão das du-as espécies. É também observado que a expressão da GMGTase 1 na ro-busta é mais alta no estágio amarelo. Esse fato contrasta com o observadocom a arabica, no qual a expressão mais alta é encontrada nos estágios degrão verde pequeno e de grão verde grande. A expressão da GMGTase 1 foidetectada também em níveis mais baixos na maioria dos tecidos testados,mais uma vez com expressão mais alta sendo detectada na arabica do quena robusta. Finalmente, observa-se que o padrão de expressão, constatadopara GMGTase 1, reflete o padrão de expressão constatado para a expres-são de manano sintase. Como estas duas proteínas operam em conjunto nasíntese de galactomananos, os dados de expressão da GMGTase 1 susten-tam mais ainda que a GMGTase 1 é uma importante participante na síntesede galactomananos do grão de café.Referências:

AltschuI S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zliang Z., Miller W. and LipmanD.J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database seatchprograms. Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402.

Bacic A, Harris P5 Stone B (1988) Structure and function of plant cell walls. In J Priess,ed, The biochemistry of plants; a comprehensive treatise, Vol 14 Carbohydrates,Aeademic Press, New York, pp 297-371

Buekeridge M, Pessosa dos Santos H, Tine M (2000) Mobilization of storage cell wallpolysaccharides in seeds. Plant Physiol Bioehem 38: 141-156

Charles-Bernard M, Kraehenbuehl K5 Rytz A, Roberts D (2005) Interaetions betweenvolatile and non-volatile eoffee components, 1. Screening of non-votetile components. JAgric Food Chem 53: 4417-4425

Crouzillat D., Lereeteau E., Petiard V., Morera J., Rodriguez H., Walker D., PhilipsW.R.R., Schnell J., Osei J. and Fritz P. (1996). Theobroma eaeao L.: a genetic Iinkagemap and quantitative trait Ioei analysis. TheorAppl Genet. 93: 205-214.

Cutler S, Somerville C (1997) Cloning in silico. Curr Biol 7: R108-RI11

Dhugga KS, Barreiro R, Whitten B5 Stecea K, Hazebroek J5 Randhawa GS, Dolan M,Kinney AJ, Tomes D, Niehols S, Anderson P. (2004) Guar seed beta-mannan synthase is amember of the cellulose synthase super gene family, Science. 2004 Jan 16 ;303(5656):363-6.

Edwards M, Choo T, Diekson C, Seott C, Gridley M, Reid J (2004) The seeds of Lotudjaponicus lines txansformed with sense, antisense, and sense/antisense galactomannangalactosyltransferase constmcts have structurally altered galactomannans in theirendosperm cell walls. Plant Physiol 134: 1153-1162

Edwards M, Seott C, Gidley M5 Reid J (1992) Control of mannose/galaetose ratio duringgalactomannan formation in developing legume seeds. Planta 187: 67-74

Fiseher M, Reimann S, Trovato V, Redgwell RJ (2001) Polysaccharides of green Arabicaand Robusta eoffee beans. Carbohydrate Research 330: 93-101

Fry S (2004) Primary cell wall metabolism: teacking the careers of wall polywers in livingplant cells. New Phytologist 161: 641-675

Handford M, Baldwin T, Goubet F, Prime T, Miles J, Yu X5 Dupree P (2003) Localizationand characterization of cell wall mannan polysaccharised in Arabidopsis thaliana. Planta218: 27-36Nunes F, Coimbra M, Duarte A, Delgadillo I (1997) J Agric Food Chem 45: 3238-3243

Oosterveld A, Harmsen JS, Voragen AGJ, Schols HA (2003) Extraction andcharacterization of polysaccharides frorn green and roasted Coffea arabica beans.Carbohydrate Polymers 52: 285-296

Pettolino F1 Hoogenraad N, Ferguson C5 Baeic A, Johnson Ej Stone B (2001) A (1-4)-beta-mannan speeifie monoclonal antibody and its use in the immunocytoehemicallocation of galactomannans. Planta 214: 235-242

Redgwell R, Curti D, Rogers J, Nicolas Ps Fiseher M (2003) Changes to thegalactose/mannose ratio in galactomannans during coffee bean (Coffea arabica L.)development: implieations for in vivo modifícation of galaetomannan synthesis. Planta217: 316-326

Redgwell RJ, Trovato V5 Curti D, Fischer M (2002) Effeet of roasting on degradation andstructural features of polysaecharises in Arabica coffee beans. Carbohydrate Research 337:421-431

Reid J (1985) Structure and function in legume-seed polysaccharides. In C Brett, JHillman, eds, Bioehemistry of plant cell walls, Cambridge University Press3 Cambridge, pp 259-268

Reid J3 Bewley J (1979) A dual role for the endosperm and its galaetomannan reserves inthe genninative physiology of fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) an endospermieleguminous seed. Planta 147: 145-150

Riclimond TA, Somerville CR (2000) The cellulose synthase superfamily. Plant Physiol124: 495-498

Schroder, R., Nieolas, P., Vineent3 S., Fischer, M, Reymond3 S.3 and Redgewell3 R.(2001), Purification and characterization of a galactoglucomannan from kiwi firuit(Aetinidia deliciosa) Carbohydr Res. 331,291-306

Sims, I. and Craik, D., and Bacic, A. (1997) Structural characterization ofgalactoglucomannan secreted by suspension-cultured cells of Nicotiana plumbaginifoliaCarbohydrRes 303, 79-92

Somerville C, Bauer S3 Brininstool G, Facette M3 Hamann T, Milne J, Osborne E3 ParedezA, Persson S, Raab T, Vorwerk S, Youngs H (2004a) Toward a systems approach tounderstanding plant cell walls. Science 306: 2206-2211

Somerville C, Bauer S3 Brininstool G, Facette M, Hamann T3 Milne J3 Osbome E3 ParedezA, Persson S, Raab T, Vorwerk S, Youngs H (2004b) Toward a systems approach tounderstanding plant cell walls. Science 306: 2206-2211

Somerville C, Bauer S, Brininstool G3 Faeette M3 Hamann T3 Milne J, Osborne E3 ParedezA, Persson S, Raab T3 Vorwerk S, Youngs H (2005) Toward a systems approach tounderstanding plant cell walls. Science 306: 2206-2211Sunderland Ρ, Hallet I, MacRea Β, Fischer Μ, Redgwell R (2004) Cytochemistry andimmunolocalization of polysaccharides and proteoglyeans in the endosperm of greenArabiea eoffee beans. Protoplasma 223: 203-211

Yeretzian Cj Jordan A, Badoud R, Lindinger W (2005) From the green bean to the eoffeecup: investigating eoffee roasting by on-line monitoring of volatiles. Eur Food ResTechnol 214: 92-104LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<210><211><212><213><220><221><222><223>

1898DNA

Coffea canephora

característica mista(1118)..(1118)Mutação de A por T.Um N é mostrado nesta seqüência

<400>

1

ctgctcattg ccctcagctc ctaagggctc tatcattttg gcttcaagtt caagttcttc

ttcaccttca aaaaagcatt tcgttgctcc acttccacaa tcatagcetg ataaaatgag

aaactcagtt tctctagagt ccgagccaga ggtaaattta tatgatgata ctggcagaag

tctcagccaa gcatgggacc gtatacgagt tcctataatt gtgccaattc tgcggtttgc

tttatatgta tgcatagcaa tgtctgttat gcttttcatt gaacgggcgt acatggcgat

tgtgattgga tgtgtcaagt gcttgggaag gaaacgatat accaagtata atcttgatgc

cataaaagaa gacctagagc aaaacagaaa ctatcctatg gtgctggtcc aaatacccat

gtttaacgaa aaagaggtct ataaactctc aattggagct gcatgtgggc tttcatggcc

atcagataga ttaatagttc aggttcttga tgactccacg aatgaagtcc tgcgggcatt

ggtggagttg gagtgtcaaa gatggataga gaaaggggtg aatgtggagt atgaaacaag

gaacaacagg aatggttata aagcaggtgc acttcgggat ggtctaaaaa ggccatatgt

tgaaggttgt gagtttgtcg tcatttttga tgcagacttc cagcctgagg aggactttct

gtggagaaca gtgcctfcatc ttcttgaaaa cccagagctg gctttggktc aagcccgatg

gaaatttgta aatgcaaatg aatgtttaat gacgcggott caggagatgt cactagacta

tcacttcagt gtggagcaag aagtaggctc gtcaacatgt tcattctttg ggtttaatgg

aactgccggt gtatggagga tccaagcagt aagtgatgct ggtggatgga aagataggaccacggttgag gatatggacc tfcgcagtaag ggctagcctt aagggttgga aattcatctt

tStBSgagat ttatctgtca aaaatgaact tccaagcact ttcaaggctt atagatttca

gcagcatcga tggtcgtgtg gcccagccaa tctcttcnga aaaatgttca aagaaattct

ccttfcgtgag cgtgtgtcca tctggaagaa atfcccatgtc atctatgcct tcttctttgt

gaggaagata gttgcacact gggttacttt tttcttctac tgcattgtga tcccagcaac

tatcttagtt cctgaagtgc atcttccaaa gccaatagca gtttatctgc cagcaaccat

tacacttctt aatgcagcta gcactccaag gtccttgcat ctactcgtgt tctggatact

gtttgagaat gtcatgtccc tccatcgatc caaagcagca attataggac ttttagaagc

cagccgagtt aacgagtgga ttgtgacgga aaagcttgga aacgcattga agcaaaagta

60

120

ISO

240

300

360

420

480

540

600

660

720

7 BO

840

900

9601020

1080

1X40

1200

1260

1320

1380

1440

1500cagcatcccc aaagtatcta agagaccaag atcacgaatt gcagaaagga tccacttttt 1560

ggagctgata atgggaatgt atatgctgca ctgtgctttc tacaacatga tctttgcaaa 1620

cgatcatttc ttcatatacc tgttacttca agcaggggct ttcttcacaa tagggcttgg 1680

ttacattgga acaattgtcc ctacttaaga agctaggcat accgaaaata aagcctccaa 1740

aaggacaagc aggctgctgg aagctactgt catttggtat atccatctag tagcatacta 1800

ctaagtcatg gtattatttt tcaatgttct ttatactgag tgtcctcaag ggtctctgca 1860

cttcgggccc cccttaatat agacgagtac agcaagtc 1898

<210> 2

<211> 1897

<212> DNA

<213> Coffea canephora

<400> 2

tgctcattgc cctcagctcc taagggctct atcattttgg cttcaagttc aagttcttçt 60

tcaccttcaa aaaagcattt cgttgcttca cttccacaat tatagcctga taagatgaga 120

aactcagttt ttctagagcc cgagccagag gtaaatttat atgatgatac tggcagaagt 180

ctcagccaag catgggaccg tatacgagtt cctataattg tgccgattct gcggtttgct 240

ttatatgtat gcatagcaat gtctgttatg cgtttcattg aacgggtgta catggcgatt 300

gtgattggat gtgtcaagtg cttgggaagg aaacgatata ccaagtataa tcttgatgcc 360

ataaaagaag acctagagca aaacagaaac tatcctatgg tgctggtcca aatacccatg 420

tttaacgaaa aagaggtcta taaactctca attggagctg catgtgggct ttcatggcca 480

tcagatagac taatagttca ggttcttgat gactccacga atgaagtcct gcgggcattg 540

Stggagttgg agtgtcaaag atggatagag aaaggggtga atgtgaagta tgaaacaagg 600

aacaacagga atggttataa agcaggtgca cttcgggatg gtctaaaaaa gccatatgtt 66 0

gaagattgtg agttcgtcgt catttttgat gcagacttcc agcctgagga ggactttctg 720

tggagaacag tgccttatct tcttgaaaac ccagagctgg ctttggttca agcccgatgg 780

aaatttgtaa atgcaaatga atgtttaatg acgcggcttc aggagatgcc actagactat 840

cacttcagtg tggagcaaga agtaggctcg tcaacatgtt cattctttgg gtttaatgga 900

actgccggtg tatggaggat ccaagcagta agcgatgctg gtggatggaa agataggacc 960

acggttgagg atatggacct tgcagtaagg gctagcctta agggctggaa attcatcttt 1020

gtgggagatt tatctgtcaa aaatgaactt ccaagcactt tcaaggctta tagatttcag 1080

cagcatcgat ggtcgtgtgg cccagccaat ctcttcagaa aaatgttcaa agaaattctc 1140

•ctttgtgagc gtgtgtccat ctggaagaaa ttccatgtca tctatgcctt ctcctttgtg 1200

aggaagatag ttgcacactg ggttactttt ttcttctact gcatcgtgat cccagcaact 1260

atcttagttc ctgaagtgca tcttccaaag ccaatagcag tttatctgcc agcaaccatt 1320

acacttctta atgcagctag cactccaagg tccttgcatc tactcgtgtt ctggatactg 1380tttgagaatg tcatgtccct ccatcgatcc aaagcagcaa ttataggact tttagaagcc 1440

agccgagtta acgagtggat tgtgacggaa aagcttggaa acgcattgaa gcaaaagtac 15 00

agcatcccca aagtatctaa gagaccaaga tcacgaattg cagaaaggat ccactttttg 1560

gagctgataa tgggaatgta tatgctgcac tgtgctttct acaacatgat ctttgcaaac 1620

gatcatttct tcatatacct gttacttcaa gcaggggctt tcttcataat agggcttggt 1680

tacattggaa caattgtccc tacttaagaa gctaggcata ccgaaaataa agcctccaaa 174 0

aggacaagca ggctgctgga agctactgtc atttggtata tccatcttgt agcatactac 1800

taagtcatgg tattattttt caatgttctt tatactgtgt gtcctcaagg gtctctgcac 1860

ttcgggcccc cctcaatata gacgagtaca gcaagtc 1897

<210> 3

<211> 1897

<212> DNA

<213> Coffea canephora

<400> 3

tgctcattgc cctcagctcc taagggctct atcattttgg cttcaagttc aagttcttct 60

tcaccttcaa aaaagcattt cgttgcttca cttcoacaat tatagcctga taagatgaaa 120

aactcagttt ttctagagcc cgagccagag gtaaatttat atgatgatac tggcagaagt 180

ctcagccaag catgggaccg tatacgagtt cctataattg tgccgattct gcggtttgct 24 0

ttatatgtat gcatagcaat gtctgttatg cttfctcatcg aacgggtgta catggcgatt 300

gtgattggat gtgtcaagtg cttgggaagg aaacgatata ccaagtataa tcttgatgcc 360

ataaaagaag acctagagca aaacagaaac tatcctatgg tgctggtcca aatacccatg 420

tttaacgaaa aagaggtcta taaactctca attggagctg catgtgggct ttcacggcca 480

tcagatagac taatagttca ggttcttgat gactccacga atgaagtcct gcgggcattg 540

gtggagttgg agtgtcaaag atggatagag aaaggggtga atgtgaagta tgaaacaagg 600

aacaacagga atggttataa agcaggtgca cttcgggatg gtctaaaaaa gccatatgtt 660

gaagattgtg agtttgtcgt catttttgat gcagacttcc agcctgagga ggactttctg 720

tggagaacag tgccttatct tcttgaaaac ccagagctgg ctttggttca agcccgatgg 780

aaatttgtaa atgcaaatga atgtttaatg acgcggcttc aggagatgtc actagactat 840

cacttcagtg tggagcaaga agtaggctcg tcaacatgtt cattctttgg gtttaatgga 900

actgccggtg tatggaggat ccaagcagta agtgatgctg gtggatggaa agataggacc 960

acggttgagg atatggacct tgcagtaagg gctagcctta agggttggaa attcatcttt 1020

gtgggagatt tatctgtcaa aaatgaactt ccaagcactt tcaaggctta tagatttcag 1080

cagcatcgat ggtcgtgtgg cccagccaat ctcttcagaa aaatgttcaa agaaattctc 1140

ctttgtgagc gtgtgtccat ctggaagaaa ttccatgtca tctatgcctt cttctttgtg 1200

aggaagatag ttgcacactg ggttactttt ttcttctact gcatcgtgat cccagcaact 1260atcttagttc ctgaagtgca tcttccaaag ccaatagcag tttatccgcc agcaaccattacacttctta atgcagctag cactccaagg tccttgcatc tactcgtgtt ctggatactgtttgagaatg tcatgtccct ccatcgatcc aaagcagcaa ttataggact tttagaagccagccgagtta acgagtggat tgtgacggaa aagcttggaa acgcattgaa gcaaaagtacagcatcccca aagtatctaa gagaccagga tcacgaattg cagaaaggat ccactttttggagctgataa tgggaatgta tatgctgcac tgtgctttct acaacctgat ctttgcaaacgatcatttct tcatataccc gttacttcaa gcaggggctt tcttcataat agggcttggttacattggaa caattgtccc tacttaagaa gctaggcãfca ccgaaaataa agcctccaaaaggacaagca ggctgctgga agctactgtc atttggtata tccatcttgt agcatactactaagtcatgg tattattttt caatgttctt tatactgtgt gtcctcaagg gtctctgcacttcgggcccc ccttaatata gacgagtaca gcaagtc

<210> 4

<211> 530

.<212> PRT

<213> Coffeacanephora

<220>

<221> CARACTERÍSTICA MISTA

<222> (335).. (335)

<223> Neste ponto, é gerado um códon de parada pela mutação, em se-

qüência de ácido nucléico, por T em vez de A.

<400> 4

Met Arg Asn Ser Val Ser Leu Glu Ser Glu Pro Glu Val Asn Leu Tyr1 5 10 15

Asp Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Gln Ala Trp Asp Arg Ile Arg Val20 25 30

Pro Ile Ile Val Pro Ile Leu Arg Phe Ala Leu Tyr Val Cys Ile Ala35 40 45

Met Ser Val Met Leu Phe Ile Glu Arg Ala Tyr Met Ala Ile Val Ile50 55 60

Gly Cys Val Lye Cys Leu Gly Arg Lys Arg Tyr Thr Lys Tyr Asn Leu65 70 75 80

Asp Ala Ile Lys Glu Asp Leu Glu Gln Asn Arg Asn Tyr Pro Met Val85 90 95

Leu Val Gln Ile Pro Met Phe Asn Glu Lys Glu Val Tyr Lys Beu Ser100 105 110

Ile Gly Ala Ala Cys Gly Leu Ser Trp Pro Ser Asp Arg Leu Ile Val115 120 125

Gln Val Leu Asp Asp Ser Thr Asn Glu Val Leu Arg Ala Leu Val Glu130 135 140

Leu Glu Cys Gln Arg Trp Ile Glu Lys Gly Val Asn Val Glu Tyr Glu145 150 155 160

Thr Arg Asn Asn Arg Asn Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Arg Asp Gly165 170 175

13201380144015001560162016801740180018601897Leu Lys Arg Pro Tyr Val Glu Gly Cys Glu Phe Val Val Ile Phe Asp180 185 190

Ala Asp Phe Gln Pro Glu Glu Asp Phe Leu Trp Arg Thr Val Pro Tyr195 200 205

Leu Leu Glu Asn Pro Glu Leu Ala Leu Val Gln Ala Arg Trp Lys Phe210 215 220

Val Asn Ala Asn Glu Cys Leu Met Thr Arg Leu Gln Glu Met Ser Leu225 230 235 240

Asp Tyr His Phe Ser Val Glu Gln Glu Val Gly Ser Ser Thr Cys Ser245 250 255

Phe Phe Gly Phe Asn Gly Thr Ala Gly Val Trp Arg Ile Gln Ala Val260 265 270

Ser Asp Ala Gly Gly Trp Lys Asp Arg Thr Thr Val Glu Asp Met Asp275 280 285

Leu Ala Val Arg Ala Ser Leu Lys Gly Trp Lys Phe Ile Phe Val Gly290 295 300

Asp Leu Ser Val Lys Asn Glu Leu Pro Ser Thr Phe Lys Ala Tyr Arg305 310 315 320

Phe Gln Gln Kis Arg Trp Ser Cys Gly Pro Ala Asn Leu Phe Xaa Lys325 330 335

Met Phe Lys Glu Ile Leu Leu Cys Glu Arg Val Ser Ile Trp Lys Lys340 345 350

Phe His Val Ile Tyr Ala Phe Phe Phe Val Arg Lys Ile Val Ala His355 360 365

Trp Val Thr Phe Phe Phe Tyr Cys Ile Val Ile Pro Ala Thr Ile Leu370 375 380

Val Pro Glu Val His Leu Pro Lys Pro Ile Ala Val Tyr Leu Pro Ala385 390 395 400

Thr Ile Thr Leu Leu Asn Ala Ala Ser Thr Pro Arg Ser Leu His Leu405 410 415

Leu Val Phe Trp Ile Leu Phe Glu Asn Val Met Ser Leu His Arg Ser420 425 430

Lys Ala Ala Ile Ile Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg Val Asn Glu Trp435 440 445

Ile Val Thr Glu Lys Leu Gly Asn Ala Leu Lys Gln Lys Tyr Ser Ile450 455 460

Pro Lys Val Ser Lys Arg Pro Arg Ser Arg Ile Ala Glu Arg Ile His465 470 475 480

Phe Leu Glu Leu Ile Met Gly Met Tyr Met Leu His Cys Ala Phe Tyr485 490 495

Asn Met Ile Phe Ala Asn Asp His Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Leu Gln500 505 510

Ala Gly Ala Phe Phe Thr Ile Gly Leu Gly Tyr Ile Gly Thr Ile Val515 520 525

Pro Thr530<210> 5

<211> 530

<212> PRT

<213> Coffea canephora

<400> 5

Met Arg Asn Ser Val Phe Leu Glu Pro Glu Pro Glu Val Asn Leu Tyr1 5 10 15

Asp,Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Gln Ala Trp Asp Arg Ile Arg Val20 25 30

Pro Ile Ile Val Pro Ile Leu Arg Phe Ala Leu Tyr Val Cys Ile Ala35 40 45

Met Ser Val Met Arg Phe Ile Glu Arg Val Tyr Met Ala Ile Val Ile50 55 60

Gly Cys Val Lys Cys Leu Gly Arg Lys Arg Tyr Thr Lys Tyr Asn Leu65 70 75 80

Asp Ala Ile Lys Glu Asp Leu Glu Gln Asn Arg Asn Tyr Pro Met Val85 90 95

Leu Val Gln Ile Pro Met Phe Asn Glu Lys Glu Val Tyr Lys Leu Ser

100 105 110

Ile Gly Ala Ala Cys Gly Leu Ser Trp Pro Ser Asp Arg Leu. Ile Val115 120 125

Gln Val Leu Asp Asp Ser Thr Asn Glu Val Leu Arg Ala Leu Val Glu130 135 140

Leu Glu Cys Gln Arg Trp Ile Glu Lys Gly Val Asn Val Lys Tyr Glu145 150 155 160

Thr Arg Asn Asn Arg Asn Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Arg Asp Gly165 170 175

Leu Lys Lys Pro Tyr Val Glu Asp Cys Glu Phe Val Val Ile Phe Asp180 185 190

Ala Asp Phe Gln Pro Glu Glu Asp Phe Leu Trp Arg Thr Val Pro Tyr195 200 205

Leu Leu Glu Asn Pro Glu Leu Ala Leu Val Gln Ala Arg Trp Lys Phe210 215 220

Val Asn Ala Asn Glu Cys Leu Met Thr Arg Leu Gln Glu Met Pro Leu225 230 235 240

Asp Tyr His Phe Ser Val Glu Gln Glu Val Gly Ser Ser Thr Çys Ser245 250 255

Phe Phe Gly Phe Asn Gly Thr Ala GIy Val Trp Arg Ile Gln Ala Val260 265 270

Ser Asp Ala Gly Gly Trp Lys Asp Arg Thr Thr Val Glu Asp Met Asp275 280 285

Leu Ala Val Arg Ala Ser Leu Lys Gly Trp Lys Phe Ile Phe Val Gly290 295 300Asp Leu Ser Val Lys Asn Glu Leu Pro Ser Thr Phe Lys Ala Tyr Arg305 310 315 320

Phe Gln Gln His Arg Trp Ser Cys Gly Pro Ala Asn Leu Phe Arg Lys325 330 335

Met Phe Lys Glu Ile Leu Leu Cys Glu Arg Val Ser Xle Trp Lys Lys340 345 350

Phe His Val Ile Tyr Ala Phe Ser Phe Val Arg Lys Ile Val Ala His355 360 365

Trp Val Thr Phe Phe Phe Tyr Cys Ile Val Ile Pro Ala Thr Ile Leu370 375 380

Val Pro Glu Val His Leu Pro Lys Pro Ile Ala Val Tyr Leu Pro Ala385 390 395 400

Thr Ile Thr Leu Leu Asn Ala Ala Ser Thr Pro Arg Ser Leu His Leu405 410 415

Leu Val Phe Trp Ile Leu Phe Glu Asn Val Met Ser Leu His Arg Ser420 425 430

Lys Ala Ala Ile Ile Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg Val Asn Glu Trp435 440 445

Ile Val Thr Glu Lys Leu Gly Asn Ala Leu Lys Gln Lys Tyr Ser Ile450 455 460

Pro Lys Val Ser Lys Arg Pro Arg Ser Arg Ile Ala Glu Arg Ile His465 470 475 480

Phe Leu Glu Leu Ile Met Gly Met Tyr Met Leu His Cys Ala Phe Tyr485 490 495

Asn Met Ile Phe Ala Asn Asp His Phe Phe Ile Tyr Leu Leu Leu Gln500 505 510

Ala Gly Ala Phe Phe Ile Ile Gly Leu Gly Tyr Ile Gly Thr Ile Val515 520 525

Pro Thr

Met Arg Asn Ser Val Phe Leu Glu Pro Glu Pro Glu Val Asn Leu Tyr1 5 10 15.

Asp Asp Thr Gly Arg Ser Leu Ser Gln Ala Trp Asp Arg Ile Arg Val20 25 30

Pro Ile Ile Val Pro Ile Leu Arg Phe Ala Leu Tyr Val Cys Ile Ala35 40 45

Met Ser Val Met Leu Phe Ile Glu Arg Val Tyr Met Ala Ile Val Ile50 55 60

Gly Cys- Val Lys Cys Leu Gly Arg Lys Arg Tyr Thr Lys Tyr Asn Leu65 70 75 80

530

<210><211><212><213>

530PRT

Coffea canephora

<400>Asp Ala Ile Lys Glu Asp Leu Glu Gln Asn Arg Aan Tyr Pro Met Val

85 90 95

Leu Val Gln Ile Pro Met Phe Asn Glu Lys Glu Val Tyr Lys Leu Ser

100 105 110

Ile Gly Ala Ala Cys Gly Leu Ser Arg Pro Ser Asp Arg Leu Ile Val

115 120 125

Gln Val Leu Asp Asp Ser Thr Asn Glu Val Leu Arg Ala Leu Val Glu

130 135 140

Leu Glu Cys Gln Arg Trp Ile Glu Lys Gly Val Asn Val Lys Tyr Glu

145 150 155 160

Thr Arg Asn Asn Arg Asn Gly Tyr Lys Ala Gly Ala Leu Arg Asp Gly

165 170 175

Leu Lys Lys Pro Tyr Val Glu Asp Cys Glu Phe Val Val Ile Phe Asp

180 185 190

Ala Asp Phe Gln Pro Glu Glu Asp Phe Leu Trp Arg Thr Val Pro Tyr

195 200 205

Leu Leu Glu Asn Pro Glu Leu Ala Leu Val Gln Ala Arg Trp Lys Phe

210 215 220

Val Asn Ala Asn Glu Cys Leu Met Thr Arg Leu Gln Glu Met Ser Leu

225 230 235 240

Asp Tyr His Phe Ser Val Glu Gln Glu Val Gly Ser Ser Thr Cys Ser

245 250 255

Phe Phe Gly Phe Asn Gly Thr Ala Gly Val Trp Arg Ile Gln Ala Val

260 265 270

Ser Asp Ala Gly Gly Trp Lys Asp Arg Thr Thr Val Glu Asp Met Asp

275 280 285

Leu Ala Val Arg Ala Ser Leu Lys Gly Trp Lys Phe Ile Phe Val Gly

290 295 300

Asp Leu Ser Val Lys Asn Glu Leu Pro Ser Thr Phe Lys Ala Tyr Arg

305 310 315 320

Phe Gln Gln His Arg Trp Ser Cys Gly Pro Ala Asn Leu Phe Arg Lys

325 33.0 335

Met Phe Lys Glu Ile Leu Leu Cys Glu Arg Val Ser Ile Trp Lys Lys

340 345 350

Phe His Val Ile Tyr Ala Phe Phe Phe Val Arg Lys Ile Val Ala His

355 360 365

Trp Val Thr Phe Phe Phe Tyr Cys Ile Val Ile Pro Ala Thr Ile Leu

370 375 380

Val Pro Glu Val His Leu Pro Lys Pro Ile Als Val Tyr Pro Pro Ala

385 390 395 400

Thr Ile Thr Leu Leu Asn Ala Ala Ser Thr Pro Arg Ser Leu His Leu

405 410 415

Leu Val Phe Trp Ile Leu Phe Glu Asn Val Met Ser Leu His Arg Ser

420 425 430Lys Ala Ala Ile Ile Gly Leu Leu Glu Ala Ser Arg Val Asn Glu Trp435 440 445

Ile Val Thr Glu Lys Leu Gly Asn Ala Leu Lys Gln Lys Tyr Ser Ile450 455 460

Pro Lys Val Ser Lys Arg Pro Gly Ser Arg Ile Ala Glu Arg Ile His465 470 475 480

Phe Leu Glu Leu Ile Met Gly Met Tyr Met Leu His Cys Ala Phe Tyr485 490 495

Asn Leu Ile Phe Ala Asn Asp His Phe Phe Ile Tyr Pro Leu Leu Gln500 505 510

Ala Gly Ala Phe Phe Ile Ile Gly Leu Gly Tyr Ile Gly Thr Ile Val515 520 525

Pro Thr530

<210> 7 <211> XXXX <212> DNA <213> Coffea canephora <210> 8 <211> XXXX <212> DNA <213> Coffea canephora <210> 9 <211> XXXX <212> DNA <213> Coffea canephora <210> 10 <211> XXXX <212> DNA <213> Coffea canephora SEQ ID NO: 11 <213> Nome do organismo : : Coffea<400> Fita de pré-seqüência:

atattatttt gaggggtact ggatggaaat cgtggggacg ctggagaaca tcaccgacgc60

gtacacgggg atcgagaagc gggagaggag attgaggagg aggcatgcag agagagtggg120

ggagagttat ggtaaggtgt gggaggagca ccttaaggac gctgggtatg ggagggggag180

ttggaggaga ccgttcatga ctcacttcac ggggtgtcag ccttgtagcg gggaccacaa240

ccagatgtac tctgggcagt cttgctggga tgcgatgcaa attgctctga attttgcaga300

taatcaggtg cttaggagat atgggttcgt gcaccgggat ctattggata cgtccaccgt360cttgcctctg ccgttcgatt acccggcatc ggaccttgtt gaaggcgctt cctagacata420

ttttattcta accaacagtt tcctagtttt gtaccatcat cggaggcttt acgagtagta480

tcafctttttt ttttaatctc tgaaacgatt agtatcatat agaaagaagg tatatcagat540

ttatgaaact atactactgt tgctttagta gtatcatttt gacggttatg ggctcttagt600

agtaagtgat tgcatatata tatatttcgt ttttcatttt ttgggcaccc tggagatgta660

ttttctctgt tgtaagttaa agttggggg689

<212> Tipo : DNA

<211> Comprimento: 689 Nome da seqüência: CcGMGTl (Unigene 122620) Descrição da seqüência:Códon padronizado

Nome da seqüência: CcGMGTl (Unigene 122620)SEQ ID NO:12

<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:

ctctctcctc gtaaaaaaaa caagaagcaa cagtaaagcc ggccagccat ctctaaagat60

aaagctcaga ccaaacaatc atcatatatt tccagagata gcagcaggtc gtacttcctc120

gctgtatttg tctccatggt actcgtcttt gtcatatgtt ccttgacaga aactttgccc180

agtttccaaa ataggatttc aactaccggt gctgatacct gtaacggcga accaccagcc240

gtaaatcgaa cccacgaccc taaagaagcc actttttacg acgaacccga gctaacctac300

acgctaggca aaaccatcaa agactgggac aagaagagaa agtcctggct aaaccttcat360

ccctcgttcg ccgcgggtgc cgacacacgt attctcatcg tgacggggtc tcagccttcg420

ccatgcaaga atcccatcgg ggatcatcta ctcctgaggt gtttcaagaa caaggctgat480

tattccagaa tccacggcta cgatatcttt tacaacaccg catgtttaga coccaagctg540

tgcaacgttt gggctaaggt agctttaatt cgggctgcca tggtggccca cccggaagca600

gagtggatct ggtggatgga ctccgatgct gtctttactg acatgtactt taaagttccg660

ttacagaggt acaagcagca taatctggtt gttcccggct ggcccgacat ggtttacgag720aagaagagtt gggtttctct aaataccggg agtttcttca cgagaaattg tcagtggtct780

ttggattttt tggatgcctg ggctcgtatg agcccccgaa gccctgatta caagttctgg840

agtgaaactt taatgtcta859

<212> Tipo: DNA

<211> Comprimento: 859

Nome da seqüência : CcGMGT2 (Unigene 122567)Descrição da seqüência:Códon padronizado

Nome da seqüência: CcGMGT2 (Unigene 122567)SEQ ID NO:13<213> Nome do organismo: Coffea arabica

<400> Fita de pré-seqüência :

agacagcagc caccatgcct aagcacaaca gcctcctccg caccaaaacc tcgtcgtttt60

tctccagctg ctttctttac gccgccggaa cttccgcttc ctttttgtta gcctgggcct120

tctggtcctt cttcagtagc cccgccccat ctgcgaatcc ctctttctcg aggggcctag180

cttccgaggc tgccctcagc tgccccgccg ggaaagcggg tcacaaccgg agctacgatc240

cgcccgaccc gactttctat gacgacccgg aattgagcta caccattgag aagaccatoa300

agaactggga tgagaagagg cgggagtggc tcgagaagca tccctcgttc gccgccggag360

cagctgacag gattttaatg gtcacgggtt ctcaggcgac gccctgcaag aacccgatcg420

gggatcactt gctgttgagg ttcttcaaga ataaggcgga ctactgcagg atccacggct480

acgatatctt ctacaacacc gtgctgctgc agccgaagat gttctcgttt tgggcaaaaa540

tgcctgccgt gaaagcggtc atgttggccc atccggaggc ggagtggatc tggtgggtag600

attcagacac agccttcacc gacatggact tcacgctgcc gctggatcgc tacaaggccc660

ataatttagt ggtccacggc tggcctcact tgattcacag ggagaagagc tggacggggc720

tgaacgcggg agtgtttctg atgcgcaact gtcagtggtc aatggatttc atggaagaat780

gggcgagcat ggggcctcaa gccccggagt acgacaaatg gggcgtgatt cagcggacga840

cgttcaagga caagacgttt ccggagtcag acgatcagac ggggttggct tatctgatcc900tgaaagagag agagaaatgg gggaacaaaa tttacatgga ggatgaatat tattttgagg960

ggtactggat ggaaatcgtg gggacgctgg agaacatcac cgacgcgtac acggggatcg1020

agaagcggga gaggaggttg aggaggaggc atgcagagag agtgggggag agttatggta1080

aggtgtggga ggagcacctt aaggacgctg ggtatgggag ggggagttgg aggagaccgt1140

tcatgactca cttcacgggg tgtcagcctt gtagcgggga ccacaaccag atgtactctg1200

gacagtcttg ctgggatgcg atgcaaattg ctctgaattt tgcagataat caggtgctta1260

ggagatatgg gttcgtgcac cgggatttat tggatacgtc caccgtcccg cctctgccgt1320

tcgattaccc agcatcggac cttgttggag gcgcttccfca gaaatatttt attctaacca1380

actgttaagt agttttgtac catcatcgga ggctttacta gtagtatcat tattgattta1440

tgaaacggtt agtatcatat agaaagaagg tatatcatat ttatgaaact atactactgt1500

tacttaacta gtatcatttt gaaggttatg ggctcttaat agtaagtgat tgcatatgta1560

tttcgttttt catttttttg ggcaccctgg agatgtattt tctctgttgt aagttaaaag1620

tcgggg1626

<212> Tipo: DNA

<211> Comprimento: 1626

Nome da seqüência: pVCll (CaGMGTl) nucléicoSEQ ID NO:14<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:

ctctctcttt ggcaaaaaaa caagaagcaa cagtaaagcc ggccagccat gtctagagct60

aaagctcaga ccaaacaatc atcatatatt tccagagãta gcagcaggtc gtacttcctc120

gctgtatttg tctccatggt actcgtcttt gtcatatgtt ccttgacaga aactttgcccIBO

agtttccaaa ataggatttc aactaccggt gctgatacct gtaacggcga accaccagcc240

gtaaatcgaa cccacgaccc taaagaagec actttttacg acgaacccga gctaacctac300

acgctaggca aaaccatcaa agactgggac aagaagagaa agtcctggct aaaccttcat360

ccctcgttcg ccgcgggtgc cgacacacgt attctcatcg tgacggggtc tcagccttcg420

ccatgcaaga atcccatcgg ggatcatcta ctcctgaggt gtttcaagaa caaggctgat480tattccagaa tccacggcta cgatatcttt tacaacaccg catgtttaga ccccaagctg540

tgcaacgttt gggctaaggt agctttaatt cgggctgcca tggtggccca cccggaagca600

gagtggatct ggtggatgga ctccgatgct gtctttactg acatgtactt taaagttccg660

ttacagaggt acaagcagca taatctggtt gttcccggct ggcccgacat ggtttacgag720

aagaagagtt gggtttctct aaataccggg agtttcttca cgagaaattg tcagtggtct780

ttggattttt tggatgcctg ggctcgtatg agcccccgaa gccctgatta caagttctgg840

agtgaaactt taatgtctac gctttcggat aagatgttcc cgggagcaga tgagcagtcg900

tctttggttt atttgctgtt gacagaaaag aagaaatggg gggataagat ttatttagag960

aatcagtacg acttgagctc ttattgggta ggcgtagttg gaaagcttga taaatttacg1020

aggacggagg ctgacgcaga gaagaatttg cccttgctaa ggaggagaag ggcggaggtg1080

gtgggcgaga gcgttggtga ggtgtgggag aagtacttgg aaaataatac cgctagcgag1140

ggtaaacggc cgtttattac gcatttcacg ggatgccagc cctgcagcgg aaaccatgac1200

ccctcctacg ttggaaatac ctgctgggat gcaatggaga ggactctgaa ttatgctgat1260

aatcaggtcc ttcgtaactt gggttttgtg cacagggata taagccgtgg ctcttacgtt1320

ttacccctag cctttgattt tccatcggaa gtgctgcaaa gaaagaaatc cggtgaagaa1380

tataacaggt gaataaatcc ctccgtttta gtgctgttta tagattatag cagccagcag1440

gacttgggcc ctgaaaattc agtatctcag aaaaaaaatg acagtgaaat tgagagagca1500

aaaatgtttt cacaagcttg tcgtggtaaa ttcctcagta attgagtgaa tttoaagata1560

cttatatttg ttgccacgaa atttgttgat gctttttcct gttggtcaac aaaatcgaat1620

tgattgagtg tgctttttaa taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1680

aaaaaaaaaa aaaaa1695

<212> Tipo: DNA

<211> Comprimento: 1695

Nome da seqüência: CcGMGT2 (ccc!26f9) nucléicoSEQ ID NO:15

<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:

YYFBGYWMEI VGTLENITDA YTGIEKRERR LRRRHAERVG ESYGKVWEEH LKDAGYGRGS60

WRRPFMTHFT GCQPCSGDHN QMYSGQSCWD AMQIALNFAD NQVLRRYGFV HRDLLDTSTV120

LPLPFDYPAS DIiVEGAS137

<212> Tipo : PRT

<211> Comprimento: 137

Nome da seqüência: CcGMGTl (codificada pelo Unigene 122620)Descrição da seqüência :

SEQ ID NO:16

<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:

TFYDEPELTY TLGKTIKDWD KKRKSWLNLH PSFAAGADTR ILIVTGSQPS PCKNPIGDHL60

LLRCFKNKAD YSRIHGYDIF YNTACLDPKL CNVWAKVALI RAAMVAHPEA EWIWWMDSDA120

VFTDMYFKVP LQRYKQHNLV VPGWPDMVYE KKSWVSLNTG SFFTRNCQWS LDFLDAWARM180

SPRSPDYKFW SETLMS196

<212> Tipo: PRT

<211> Comprimento: 196

Nome da seqüência: CcGMGT2 (codificada pelo Unigene 122567)Descrição da seqüência:

SEQ ID NO:17

<213> Nome do organismo: Coffea arabica

<400> Fita de pré-seqüência:

MPKHNSLLRT KTSSFFSSCF LYAAGTSASF LLAWAFWSFF SSPAPSANPS FSRGLASEAA60

LSCPAGKAQK NRSYDPPDPT FYDDPELSYT IEKTIKNWDE KRREWLEKHP SFAAGAADRI120

LMVTGSQATP CKNPIGDHLL LRFFKNKADY CRIHGYDIFY HTVLLQPKMF SFWAKMPAVK180

AVMLAHPEAE WIWWVDSDTA FTDMDFTLPL DRYKAHNLW HGWPHLIHRE KSWTGLNAGV240

FLMRNCQWSM DFMEEWASMG PQAPEYDKWG VIQRTTFKDK TFPESDDQTG LAYLILKERE300

KWGNKIYMED EYYFEGYWME IVGTLENITD AYTGIEKRER RLRRRHAERV GESYGKVWEE360

HLKDAGYGRG SWRRPFMTHF TGCQPCSGDH NQWYSGQSCW DAMQIALNFA DNQVLRRYGF420

VHRDLLDTST VPPLPFDYPA SDLVGGAS448

<212> Tipo: PRT

<211> Comprimento: 448

Nome da seqüência: proteína pVCll (CaGMGTl)SEQ ID NO:18<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:MSRAKAQTKQ SSYISRDSSR SYPLAVFVSM VLVPVICSLT ETLPSFQNRI STTGADTCNG60

EPPAVNRTHD PKEATFYDEP ELTYTLGKTI KDWDKKRKSW LNLHPSFAAG ADTRXLIVTG120

SQPSPCKNPI GDHLLLRCFK NKADYSRIHG YDXFYNTACL DPKLCNVWAK VALIRAAMVA180

HPEAEWIWWM DSDAVFTDMY FKVPLQRYKQ HNLWPGWPD MVYEKKSWVS LNTGSFFTRN240

CQWSLDFLDA WARMSPRSPD YKFWSETLMS TLSDKMFPGA DEQSSLVYLL LTEKKKWGDK300

IYLENQYDLS SYWVGWGKL DKFTRTEADA EKNLPLLRRR RAEWGESVG EVWEKYLENN360

TASEGKKPFI THFTGCQPCS GNHDPSYVGN TCWDAMERTL NYADNQVLRN LGFVKRDXSR420

GSYVLPLAFD FPSEVLQRKK SGEEYNR447

<212> Tipo: PRT

<211> Comprimento: 447

Nome da seqüência: proteína CcGMGT2 (cccl26f9)

SEQ ID NO:19

<213> Nome do organismo: Coffea canephora

<400> Fita de pré-seqüência:

attttgaggg gtactggatg gaaatcgtgg ggacgctgga gaacatcacc gacgcgtaca60

cggggatcga gaagcgggag aggagattga ggaggaggca tgcagagaga gtgggggaga120

gttatggtaa ggtgtgggag gagcacctta aggacgctgg gtatgggagg gggagttgga180

ggagaccgtt catgactcac ttcacggggt gtcagccttg tagcggggac cacaaccaga240

tgtactctgg gcagtcttgc tgggatgcga tgcaaattgc tctgaatttt gcagataatc300

aggtgcttag gagatatggg ttcgtgcacc gggatctatt ggatacgtcc accgtcttgc360

ctctgccgtt cgattacccg gcatcggacc ttgttgaagg cgcttcctag acatatttta420

ttctaaccaa cagtttccta gttttgtacc atcatcggag gctttacgag tagtatcatt400

tttttttttt ttttaatttc tgaaacgatt agtatcatat agaaagaagg tatatcagat540

ttatgaaact atactactgt tactttacta gtatcatttt gacggttatg ggctctttgt600

agtgagtgat tgcatatata cttcgttttt catttttttg ggcaccctgg agatgtattt660

tctctgttgt aagttaaaag tcgggggtct tataaagtgt taatgcatgt actatatatg720

ttgtacttgt ttttttttaa aaaaaaaatt cttttttgtt gggggtttaa aaaaaaaaaa780

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a801

<212> Tipo: DNA<211> Comprimento: 801

Nome da seqüência: cccs46w8o23 nucléicoSEQ ID NO:20

<213> Nome do organismo: Coffea arabica

<400> Fita de pré-següência:

agacagcagc caccatgcct aagcacaaca gcctcctccg caccaaaacc tcgtcgtttt60

tctccagctg ctttctttac gccgccggaa cttccgcttc ctttttgtta gcctgggcct120

tctggtcctt cttcagtagc cccgccccat ctgcgaatcc ctctttctcg aggggcctàg180

cttccgaggc tgccctcagc tgccccgccg ggaaagcggg tcacaaccgg agctacgatc240

cgcccgaccc gactttctat gacgacccgg tattgagcta caccattgag aagaccatca300

agaactggga tgagaagagg cgggagtggc tcgagaagca tcccfccgttc gcçgccggag360

cagctgacag gattttaatg gtcacgggtt ctcaggcgac gccctgcaag aácccgatcg420

gggatcactt gctgttgagg ttcttcaaga gtaaggcgga ctactgcagg atccacggct480

acgatatctt ctacaacacc gtgctgctgc agccgaggat gttctcgttt tgggcaaaaa540

tgcctgccgt gaaagcggtc atgttggccc atccggaggc ggagtggatc tggtgggtag600

attcagacgc agccttcacc gacatggact tcacgctgcc gctggatcgc tacaaggccc660

ataatttagt ggtccacggc tggcctcact tgattcacag ggagaagagc tggacggggc720

tgaacgcggg agtgtttctg atgcgcaact gtcagtggtc aatggatttc atggaagaat780

gggcgagcat ggggcctcaa gcctcggagt acgacaaatg gggcgtgatt cagcggacga840

cgttcaagga caagacgttt ccggagtcag acgatcagac ggggttggct tatctgatcc900

tgaaagagag agagaaatgg gggaacaaaa tttacatgga ggatgaatat tattttgagg960

ggtgctggat ggaaatcgtg gggacgctgg agaacatcac cgacgcgtac acggggatcg1020

agaagcggga gaggagattg aggaggaggc atgcagagag agtgggggag agttatggta1080

aggtgtggga ggagcacctt aaggacgctg ggtatgggag1120

<212> Tipo: DNA

<211> Comprimento: 1120

Nome da seqüência: pVClO (GMGT-RACEl3) nucléico

A presente invenção não está restrita às concretizações expostase exemplificadas acima, porém é capaz de variação e modificação, abrangidaspelas reivindicações anexadas.

Claims (5)

1. Molécula de ácido nucléico, isolada de Coffea spp., caracteri-zada pelo fato de que compreende uma seqüência codificadora que codificauma galactosiltransferase, em que a galactosiltransferase compreende umaseqüência de aminoácidos mais do que aproximadamente 75% idêntica aqualquer uma de SEQ ID NOS: 15 a 18

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a galactosiltransferase compreende qualqueruma das SEQ ID NOS: 15 a 18.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID NOS:-11 a 14.

4. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende a seqüên-cia codificadora da molécula de ácido nucléico como definida na reivindica-ção 1.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode que a seqüência codificadora da molécula de ácido nucléico é ligada ope-racionalmente a um promotor selecionado do grupo que consiste em promo-tor constitutivo, promotor de indução, promotor específico de tecidos, promo-tor específico de semente.RESUMOPatente de Invenção: "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO, ISOLADA DECOFFEA SPP E VETOR".Esta descrição refere-se a moléculas de ácidos nucléicos, isola-das de café (Coffea spp.), compreendendo seqüências que codificam a ma-nano sintetase ou a galactomanano galactosiltransferase. São também ex-postos processos nos quais esses polinucleotídeos são utilizados para regu-lação gênica e manipulação das moléculas de polissacarídeos de plantas decafé, objetivando influenciar características de extração e outros aspectos degrãos de café.