CZ258799A3 - Rostlina brambor, která má zlepšené charakteristiky skladování při nízké teplotě a způsob zlepšení těchto charakteristik - Google Patents

Abstract

Rostliny brambor, které vykazují v bramborové hlíze sníženou aktivitu hlízové fosforylázy α-glukanu typu L/GLTP/ a hlízové fosforylázy α-glukanu typu H/GHTP/. V hlízách, které vykazují sníženou aktivitou enzymy GLTP a aGHIP,je také zeslabena přeměna škrobu na cukry, zvláště, když se skladují při teplotě nižší nežje teplota 7°C. Redukce sládnutí brambor vyvolané nízkou teplotou umožňuje skladovat bramboiypři nižších teplotách, čímž se prodlouží doba vegetačního klidu, sníží se možnost výskytu nemocí aprodlouží se doba skladování. Způsoby produkce takových rostlin brarribor, které produkují hlízy, vakazující sníženou aktivitu enzymů GLTP aGHIP potlačením exprese genu zapoužití homologní antimediátorovéRNA, za použití ko-suprese, regulačních tlumicích sekvencí, chemických a proteinových inhibitorů nebo použitímmístně řízené mutageneze nebo izolace alternativních alel.

Description

Oblast vynálezu

Vynález se týká inhibice hromadění cukru v bramborách tím, že se v rostlinách brambor snižuje enzymatická aktivita hlízové fosforylázy α-glukanu typu L nebo hlízové fosforylázy aglukanu typu H.

Dosavadní stav techniky

Rostliny jsou vystaveny nežádoucímu působení řady faktorů, které zahrnují nemoci, prostředí a způsob skladování hlíz brambor (Solanum tuberosum), což reprezentuje hlavní determinanty kvality bramborových hlíz. Období vegetačního klidu mezi sklizní a klíčením je kritické pro udržení kvality bramborových hlíz. Brambory se většinou skladují při teplotě 7 °C až 12 °C. Skladování při teplotě 2 °C až 6 °C na rozdíl od skladování při teplotě 7 °C až 12 °C umožňuje dlouhé uchování, protože se omezí respirace, ztráta vlhkosti, mikrobiální infekce, náklady na vyhřívání a potřeba chemických inhibitotů klíčení (Burton, W.G. (1989) The Potato, Longman Scientific and Technical). Při nízkých teplotách brambory sládnou a výsledkem je vysoký obsah cukru, což přispívá k nepřijatelné hnědé nebo černé barvě produktu (Coffin et al. (1987) J. Food Sci. 52: 639-645; Weaver et al. (1978) Am. Pot. J. 55: 83-93). Cukry, které se v hlízách hromadí, jsou převážně glukóza, fruktóza a sacharóza. Když se brambory zahřívají během různých procesů vaření, jako je smažení, jsou to primárně glukóza a fruktóza (redukční cukry), které reagují prostřednictvím Maillardovy reakce s volnými aminoskupinami, což vede k vytvoření hnědých pigmentů (Burton, W.G. (1989) The Potato, Longman Scientific and Technical; Shallenberger et al., (1959) Agric. And Food Chem. 7: 274-277). Při karamelizaci sacharóza

9 9 9 · 9 ·· • · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 99999 99 99 99 99 dává vzniku černému zbarvení. Ideální obsah redukčního cukru je 0,1 % hmotnosti čerstvé hlízy, přičemž horní limit je 0,33%. Vyšší množství redukčních cukrů je dostatečné, aby se tvořily hnědé a černé pigmenty, které znehodnocují produkt (Davies and Viola (1992) Postharvest News and Information 3: 97-100) . Ačkoli při skladování při vyšší teplotě (7 °C až 12 °C) lze omezit hromadění redukčních cukrů, zvyšuje se možnost mikrobiální infekce a je nutné použít inhibitory klíčení. Vzhledem k negativnímu působení prostředí a k nebezpečí spojenému s použitím chemikálií, k vývoji patogenů, které jsou rezistentní vůči pesticidům, a ke skutečnosti, že použití současných inhibitorů klíčení může být brzy zakázáno, je nutné vytvořit odrůdu brambor, které vydrží stresové působení a dlouhodobé skladování v chladu, aniž se použijí chemikálie a aniž dojde k nahromadění redukčních cukrů, a které udrží škrob.

Metabolizmus cukrů je v rostlinné buňce komplexní proces. Jestliže se ovlivní řada různých enzymatických procesů může se potencionálně ovlivnit i hromadění redukčních cukrů během skladování. Inhibice rozkladu cukru bude omezovat tvorbu volného cukru. Ke zlepšení vlastností brambor během skladování mohou posloužit také jiné metody. Jsou to snížení obsahu cukru zahrnující opětnou syntézu škrobu za použití redukčních cukrů a odstranění cukrů prostřednictvím glykolýzy a respirace nebo přeměny cukru na jiné formy, které se nepodílí na Maillardově reakci. Řada enzymatických procesů je však vratná a úloha většiny enzymů, které se účastní metabolizmu cukrů, není zcela jasná. Je nutné stanovit enzymy, které umožní dosáhnout žádaných výsledků a jsou aktivní při nízké teplotě a umožňují zachování kvality brambor, jenž požadují výrobci, zpracovatelé a konzumenti.

Ukázalo se, že fosfofruktokináza (PFK) má důležitou úlohu při procesu sládnutí brambor vyvolané nízkou teplotou (Kruger, N. J. and Hammond, J. B. W. (1988) Plant Physiol. 86: 645-648; ap

Rees et al., (1988) Symp. Soc. Exp. Biol. 42: 377-393; Dixon et al., (1981) Phytochemistry 20: 969-972; Claassen et al., (1991) Plant Physiol. 95: 1243-1249). V publikaci apRees et al., (1988) Symp. Soc. Exp. Biol. 42: 377-393 se uvádí, že chlazení má disproporční účinek na různé způsoby metabolizmu cukrů v tom, že glykolýza se vzhledem citlivosti PFK na teplotu silně redukuje. Při snížení aktivity PFK pak vzroste dostupnost hexóza-fosfátů při produkci sacharózy. V publikaci Evropský patent č. 0438904 (Burrel et al, 31. Července 1991) se popisuje, že zvýšení aktivity enzymu PFK snižuje během skladování hromadění cukrů tím, že se glykolýzou nebo jiným metabolickým způsobem odstraní hexózy. Enzym PFK, který pocházel z bakterie E. coli, se exprimuje v hlízách brambor. Vynález nárokuje ochranu na rostoucí aktivitu PFK a snížený obsah sacharózy v hlízách, který se stanovoval v období sklizně. Ukázalo se však, že poměr difosforečnan : fosfotranferáza fruktózy-6-fosfátu (PFP) zůstává při nízké teplotě aktivní (Claassen et al., (1991) Plant Physiol. 95: 1243-1249). Aktivita PFP může produkovat fruktózu-6-fosfát pro glykolýzu, stejně jako PFK může přímo katalyzovat stejnou reakci, protože je závislá na dvou enzymech. Z těchto důvodů účinnost uvedené strategie zlepšení kvality brambor během skladování při nízkých teplotách je pochybná. Vzhledem k tomu, že při odstranění cukrů glykolýzou a během dalších metabolizmů brambory ztrácí svou hodnotnou suchou hmotu respirací, tento způsob není výhodný.

Dále se ukazuje, že enzym pyrofosforyláza ADP-glukózy (ADPGPP) má důležitou úlohu pří procesu sládnutí vyvolaném nízkou teplotou. V mezinárodní přihlášce WO 94/28149 (Barry et al, 18. Května 1994) se popisuje, že zvýšení aktivity ADPGPP snižuje hromadění cukrů během skladování tím, že dochází k opětné syntéze škrobu za použití redukčních cukrů. Enzym ADPGPP pocházející z bakterie E. coli se exprimoval v hlízách brambor. Jeho expresi řídil promotor indukovaný nízkou ·· ·· · · «· ·· • · · · · * · · · · ·· ·· teplotou a v přihlášce se nárokuje ochrana na skutečnost, že po uskladnění při nízké teplotě dochází ke zvýšení aktivity enzymu ADPGPP a ke snížení obsahu redukčního cukru v hlízách, což se testovalo při sklizni. Tato strategie však nevylučuje katabolizmus škrobu, ale místo toho zvyšuje rychlost opětné syntézy škrobu. Pak dochází ke katabolizmu cukrů prostřednictvím glykolýzy a respirace a opětné začlenění cukrů do škrobu je omezeno. Zvýšení aktivity ADPGPP není preferovaný způsob zlepšení vlastností skladovaných brambor, protože výsledkem je ztráta cenné suché hmoty brambor respirací. Opět se preferuje metoda redukce katabolizmu škrobu, přičemž zůstane zachována suchá hmota bramborových hlíz.

Věří se, že na rozkladu škrobu se podílí několik enzymů, mezi něž patří α-amyláza (endoamyláza), β-amyláza (exoamyláza), amyloglukozidáza a fosforyláza α-glukanu (fosforyláza škrobu). Zpomalení průběhu katabolizmu škrobu působí preventivně proti hromadění redukčních cukrů a minimalizuje se odstranění cukrů prostřednictvím glykolýzy a dalších metabolizmů.

Popisují se tři různé isozymy fosforylázy α-glukanu. Isozym hlízové fosforylázy α-l,4-glukanu typu L (EC 2.4.1.1) (GLTP) (Nakano, K. and Fukui, T. (1986) J. Biol. Chem. 266: 82308256) má nízkou afinitu k vysoce rozvětveným glukanům, jako je glykogen, a nachází se v amyoplastech. Monomer obsahuje 916 aminokyselin a při porovnání sekvence s fosforylázou ze svalů králíka a z bakterie E. colí vykazuje vysokou homologii 51 % respektive 40 % aminokyselin. Nukleotidová sekvence genu GLTP a aminokyselinová sekvence enzymu GLTP jsou uvedeny v sekvenci SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 2. Isozym H hlízové fosforylázy aglukanu typu H (EC 2.4.1.1) (GHTP) (Moři et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 18446-18453) má vysokou afinitu vůči glykogenu a nachází se v cytoplazmě. Gen kóduje 838 aminokyselin a vykazuje 63 % sekvenční homologii s fosforylázou typu L. Sekvence neobsahuje inzert obsahující 78 zbytků a N-terminální extenzi tvořenou 50 zbytky, která se ·· ·· ·· ·· ·· • · · · · · · · · • · · · · · · · · · nachází u polypeptidu typu L. Nukleotidová sekvence genu GHTP a aminokyselinová sekvence enzymu GHTP se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 4. Uvádí se, že třetí isozym (Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576) obsahuje 974 aminokyselin je vysoce homologní s hlízovou fosforylázou typu L. Celý polypeptid vykazuje 81 % homologii. Oblasti obsahující tranzitní peptid a sekvenci inzertu jsou však velice odlišné. Tento isozym se označil jako listová fosforyláza typu L, protože mRNA se hromadí ve stejném množství v listech a v hlízách, zatímco mRNA hlízové fosforylázy typu L se hromadí ve velké míře ve hlízách brambor a pouze ve velmi malém množství se objevuje také ve tkáni listů. Hlízová fosforyláza typu L je přítomná hlavně v hlízách a listová fosforyláza typu L se častěji vyskytuje v listech (Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567576). Nukleotidová sekvence genu listové fosforylázy typu L a aminokyselinová sekvence enzymu listové fosforylázy typu L se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 5a SEQ ID NO: 6.

Úloha různých enzymů rozkládajících škrob není jasná a objevují se konflitní výsledky. Například zeslabená exprese listové fosforylázy typu L (Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576) nemá podstatný vliv na hromadění škrobu. V publikaci Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576 se popisuje konstitutivní exprese antimediátorové RNA, která je specifická pro gen listové fosforylázy typu L, jejímž výsledkem je snížení aktivity fosforylázy α-glukanu typu L v listové tkáni, ale nemá žádný účinek ve tkáni hlíz brambor. Protože potlačení aktivity fosforylázy α-glukanu nemá podstatný vliv na hromadění škrobu v listech transgenních rostlin brambor, autor udělal závěr, že rozklad škrobu není katalyzován fosforylázou. Když se bere do úvahu vysoká homologie sekvencí mezi identifikovanými isozymy fosforylázy α-glukanu, očekává se • · · · ·· «· ·· • · ©··· ···· ·· · · ·· ···· ······ · · ·· ·· ·· «« ·· podobná negativní odpověď v případě isozymu typu H (GHTP) a hlízového isozymu typu L (GLTP).

Je nutné vytvořit rostliny brambor, které produkují hlízy vykazující během růstu a skladování při teplotě okolí a nízkých teplotách, zvláště když teplota klesne pod 7 °C, sníženou přeměnu škrobů na cukry.

Podstata vynálezu

Vynález uvádí, že zeslabení enzymatické aktivity hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) a hlízové fosforylázy aglukanu typu H (GHTP) v hlízách brambor vede během růstu a skladování k podstatnému snížení hromadění cukrů ve srovnání s bramborami divokého typu. Tyto výsledky jsou zvláště patrné při skladování při teplotě nižší než 10 °C a specificky při teplotě 4 °C. Je zřejmé, že metabolizmus cukrů v hlízách a snížení aktivity jediného enzymu se podílí na snížení hromadění cukru v hlíze. Ve světle výsledků uvedených v publikaci Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576 se uvádí, že zeslabená exprese listové fosforylázy typu L nemá podstatný vliv na hromadění škrobu v listech rostlin brambor.

Tento vynález poskytuje ohromné komerční výhody. Hlízy, kde se inhibuje nebo zeslabuje sládnutí vyvolané nízkou teplotou, se mohou skladovat, aniž v nich dojde k produkci velkého množství redukčních cukrů, což způsobuje nepřijatelné tmavnutí smažených bramborových produktů. Skladování hlíz při nízkých teplotách umožňuje dlouhodobé skladování, prodlužuje se období vegetačního klidu tím, že se omezí respirace a oddálí se klíčení a sníží se výskyt nemocní brambor.

Snížení aktivity GLTP a GHTP u rostlin brambor a hlíz může doprovázet libovolný počet známých metod, které bez omezení zahrnují antisense inhibici mRNA GLTP nebo GHTP, ko-supresi, místně řízenou mutagenezi genů GLTP nebo GHTP divokého typu, neupravenou rostlinou vynálezu se popisuje chemickou nebo proteinovou inhibici nebo programy šlechtění rostlin.

Vynález popisuje změněné rostliny brambor, které vykazují v hlízách sníženou aktivitu hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) nebo hlízové fosforylázy α-glukanu typu H (GHTP) produkovaných rostlinou ve srovnání s hlízami produkovanými brambor. V preferovaném provedení rostlina brambor transformovaná expresívní kazetou, která má sekvenci rostlinného promotoru operabilně spojenou se sekvencí DNA, která, v případě, že se v rostlinách přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu GLTP nebo genu GHTP. Jak se uvádí dále v textu sekvence DNA se může začlenit do expresívní kazety v sense nebo antisense orientaci. Rostliny brambor podle vynálezu mohou mít sníženou aktivitu jednoho enzymu GLTP nebo GHTP nezávisle na sobě nebo mohou vykazovat sníženou aktivitu obou enzymů.

Jak se uvádí shora v textu, zjistilo se, že snížení aktivity enzymů GLTP nebo GHTP v rostlinách brambor vede u hlíz brambor ke snížení hromadění cukrů zvláště během dlouhodobého skladování při teplotě pod 10 °C. Vynález dále popisuje způsoby snížení produkce cukru v hlízách, které produkuje rostlina brambor obsahující sníženou aktivitu enzymu GLTP nebo GHTP. V preferovaném provedení vynálezu takové metody zahrnují zavedení do rostliny brambor expresívní kazety, která má rostlinný promotor operabilně spojený se sekvencí DNA, jenž v případě, že se v rostlině přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu GLTP nebo genu GHTP. Jak se uvádí shora v textu sekvence DNA se může začlenit do expresívní kazety buď v sense nebo antisense orientaci.

Jak se popisuje v detailech dále v příkladech zlepšení charakteristik skladování při nízké teplotě se pozorovalo u odrůdy brambor Desiree, která se transformovala způsoby podle vynálezu. Přímé měření zdokonalených charakteristik skladování při nízkých teplotách se zprostředkovává snížením aktivity *· ·* ·· ·· ·· • · · · · · a · · a ·· a a · · · a a a ······· · a • a a a · a a a· a a ©· enzymu GLTP nebo GHTP detekované v bramborách při sklizni a během skladování při nízké teplotě. Vyvinuly se transformované odrůdy, kde celková aktivita fosforylázy α-glukanu vyjádřená jako mikromoly NADPH produkované miligramem proteinu za jednu hodinu v hlízách rostlin skladovaných při teplotě 4 °C po dobu 189 dní je o 70 % nižší než celková aktivita fosforylázy aglukanu v hlízách netransformovaných rostlin skladovaných za stejných podmínek.

Jiné relativně přímé měření zlepšení charakteristik chlazení při nízké teplotě je snížení sladkosti brambor, které se pozoruje po období uskladnění při nízké teplotě. Vyvinuly se transformované odrůdy brambor, kde součet koncentrací glukózy a fruktózy v hlízách skladovaných při teplotě 4 °C po dobu 91 dní je o 39 % nižší než je součet koncentrací glukózy a fruktózy v hlízách netransformovaných rostlin skladovaných za stejných podmínek.

Další měření zlepšení charakteristik chlazení při nízké teplotě demonstruje praktické výhody vynálezu. Jde o omezení tmavnutí bramborových lupínků během zpracování (vaření). Jak se popisuje shora v textu hromadění cukrů v bramborách během skladování při nízkých teplotách způsobuje nepřijatelné tmavnutí smaženého produktu. Omezené tmavnutí barvy při smažení se může kvantifikovat jako měření reflektance nebo skóre smažených bramborových lupínků. Způsoby měření skóre lupínků se uvádějí dále v textu. Vyvinuly se transformované odrůdy brambor, kde skóre lupínků hlíz rostlin skladovaných při teplotě 4 °C po dobu 124 dní je o 89 % vyšší než skóre lupínků hlíz netransformovaných rostlin skladovaných za stejných podmínek.

Snížením aktivity enzymu GLTP a/nebo GHTP v hlízách rostlin brambor, čímž se inhibuje hromadění cukrů během doby uskladnění při nízké teplotě, vynález umožňuje skladovat hlízy při nižší teplotě, než by bylo možné u brambor divokého typu stejného kultivaru. Jak se diskutuje shora v textu skladování * ·· ·· ·· • · · · 9 9 9 9 • ·· · · ··

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 ·· • 9 9 · • · · · • · ·· 99 brambor při nižší teplotě, než je tradičně užívána, může vést k prodloužení skladování, k prodloužení doby vegetačního klidu prostřednictvím snížení respirace a klíčení a ke snížení výskytu nemocí rostlin brambor. Je zřejmé, že odborník může zlepšit charakteristiky skladování při nízkých teplotách a může je měřit a kvantifikovat různými známými způsoby.

Vytvořily se rostliny brambor vykazující sníženou aktivitu hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) a hlízové fosforylázy α-glukanu typu H (GHTP) v hlízách, což se porovnává s aktivitou hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) a hlízové fosforylázy α-glukanu typu H (GHTP) v hlízách, které produkují netransformované rostliny brambor. Redukce aktivity fosforylázy α-glukanu je doprovázena transformací rostliny brambor expresivní kazetou, kde sekvence rostlinného promotoru je operabilně spojena se sekvencí DNA, jenž, v případě, že se v rostlinách přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu GLTP nebo genu GHTP. Ačkoli sekvence DNA je začleněna do expresivní kazety v antisense orientaci, snížení aktivity fosforylázy α-glukanu fosforylázy a-glukanu lze dosáhnout začleněním sekvence DNA do expresivní kazety buď v antisense nebo sense orientaci.

Potlačení exprese v závislosti na homologii

Řízení exprese genu za použití fragmentů v sense nebo antisense orientaci je standardní laboratorní praxe a popis lze také najít v literatuře. Antisense- a sense-suprese je způsob závislý na homologii sekvencí.

Vědecké články publikované během roku 1996 ukazují, že v případě transgenních rostlin existují stovky popisů nevyjadřování genů v závislosti na homologii. Mechanismus, který probíhá při nevyjadřování genů v závislosti na homologii není zcela znám, ale charakteristické znaky tohoto jevu se • 4 ·· ·· «· • 9 0 · ·· « «9 • 9

90 studovaly u mnoha rostlinných genů a dosažené výsledky se zveřejňovaly ( Meyer and Saedler (1996) Annu. Rev. Plant. Physiol. 47: 23-48; Matzke and Matzke (1995) Plant Physiol.

107: 679; Jorgensen, R.A. (1995) Scienec 268: 686-691,

Weintraub (1990) Scientific American 1: 34-40; Van der Krol et al., (1988) Gene 72: 45-50). Nevyjádření genu v závislosti na homologii je obecný jev, kterého je možno využít při řízení aktivity mnoha endogenních genů. Příklady genů vykazující zeslabenou expresi po zavedení homologní sekvence zahrnují reduktázu dihydroflavanolu (Van der Krol, (1990) Plant Cell 2: 291-299), polygalakturonidázu (Smith et al., (1990) Mol.Gen. Genet. 244: 447-481), syntázu fytoenu (Fray and Grierson (1993) Plant Mol. Biol. 22: 589-602), pektinsterázu (Seymour et al., (1993) Plant Mol. Biol. 23: 1-9), fenylalaninovou lyázu amoniaku (De Carvalho et al., (1992) EMBO J. 11: 25952602), β-l,3-glukanázu (Hart et al., (1992) Mol. Gen. Genetic. 235: 179-188), chitinázu (Dorlhac et al., (1994) Mol.Gen

Genetic. 243: 613-621) nitrátovou reduktázu (Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289) a syntázu chalkonu (Muller et al., (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136-146). Popisuje se, že transformace rostlin brambor Russet Burbank buď sense nebo antisense konstrukcemi genu obalového proteinu viru, který způsobuje rolování listů brambor, udílí rostlině rezistenci vůči infekci viru způsobujícího uvedené rolování listů (Kawchuk et al. (1991) Mol. Plant Microbe-Inter. 4: 247-253).

Při transferu homologické sense nebo antisense sekvence obvykla vznikají transformanti se zeslabenou expresí endogenního genu. Jak se v detailech popisuje v příkladech Transformované rostlin brambor vykazují fenotyp, který indikuje zeslabenou expresi enzymu GLTP nebo GHTP.

Při antisense-supresi se sestaví genová konstrukce nebo expresívní kazeta, která v případě, že je začleněna do buňky rostliny, vede k expresi RNA, jenž je komplementární sekvencí k mRNA produkované cílovým genem. Teoreticky je možné, že • 99 · · 9 • ·· • · «9 • · 9

999 99 •9 ·9

9 9 9

9 ·* • · « 9

9 9 · «9

99

9 9 9

9 9 9 »99 9 9 9

9 •9 99 komplementární sekvence RNA tvoří duplex, čímž se inhibuje translace proteinu. Teorie podporující sense a antisense inhibici se popisuje v literatuře zahrnující publikaci Antisense Research and Applications (CRC Press, 1993), pp. 125-148. Komplementární sekvence může být svou celou délkou ekvivalentem celé sekvence cílového genu, ale při práci je vhodnější a snadnější používat fragment. Například v publikaci Cannon et al. (1990) Plant Molecular Biology 15: 39-47 autor popisuje kódující sekvenci jako krátký fragment obsahující 41 párů baží, která je dostatečná pro dosažení inhibice genu. Patent USA č. 5,585,545 (Bennett et al., 17. Prosince 1996) popisuje inhibici genu kódující sekvencí, která obsahuje pouze 20 párů baží. V patentových dokumentech je možné najít řadu patentů, které popisují a nárokují ochranu pro způsob potlačení exprese genu tím, že se do organizmu zavede kódující sekvence. Mezi uvedené patenty spadá například Patent USA č. 5,545, 815 (Fisher et al., 13. Srpna 1996) a Patent USA č.

5,387,757 (Bridges et al., 7. Února 1995).

Potlačení exprese genu závislé na homologii antikódující sekvence se provádí podobným způsobem jako antisense-suprese, s tou výjimkou, že nukleotidová sekvence se začlení do expresivní kazety v normální sense orientaci. Řada patentů zahrnující USA patenty č. 5,034,323, 5,231,020 a 5,238,184 popisují zavedení antikódující sekvence, což vede k potlačení exprese genu.

Obě formy potlačení exprese genu závislé na homologii, ať už při sense- nebo antisense-supresi, je možné použít při zeslabení exprese enzymů GLTP nebo GHTP podle vynálezu. Například oba patenty US patent č. 5,585,545 (Bennet et al., 17. Prosince 1996) a US patent č. 5,451,514 (Boudet et al.

15. Září 1995) nárokují ochranu pro způsoby inhibice exprese genů nebo rekombinace sekvencí DNA, které je možné použít při potlačení exprese genů.

·· ♦· ·♦ ·· 99 ’ · ···· ···» ·· · · ·4 9 9 9 9 ¹ ··· · · · · ««· «··

2. Alternativní způsoby snížení aktivity enzymu GHTP a/nebo GLTP v hlízách

Ačkoli potlačení exprese v závislosti na homologii sekvencí je preferovanou metodou zeslabení aktivity enzymu GLTP nebo GHTP u rostlin brambor podle vynálezu, existuje řada běžně užívaných dostupných alternativních strategií, které umožňují zeslabit aktivitu produktu specifického genu. Když se do rostliny zavede příbuzný gen nebo promotor, může se vyvolat rychlá přeměna homologických endogenních transkriptů. Tento proces se nazývá ko-suprese a je zřejmé, že vykazuje podobnost s mechanizmem odpovědným za inhibici antimediátorové RNA (Jorgensen, R.A, (1995) Scienec 268: 686-691; Brusslan and Tobin (1995) Plant Molecular Biology 27: 809-813). Mohou se změnit různé regulační sekvence DNA (promotory, polyadenylační signály, místa post-transkripční úpravy) a nebo se mohou tyto sekvence použít při změně síly exprese (zesilovač, tlumič) specifické mRNA. Jiná strategie zeslabení exprese genu a jeho kódovaného proteinu je použití ribozymů, které jsou určeny ke specifickému štěpení cílové mRNA , což znemožňuje produkci plně funkčního proteinu (Hasselhoff, J. and W.L. Gerlach (1988) Nátuře 334: 585-591). Identifikace přirozeně se vyskytujících alel nebo vývoj alel enzymu metodami genetického inženýrství, o kterých se zjistilo, že jsou důležité při stanovení určité vlastnosti, může pozměnit sílu aktivity a může se jich dosáhnout i klasickými metodami šlechtění ( Ortiz and Huaman, Z. (1994) In : Potato Genetics. Bradshaw, J. E. and Mackay G.R. (eds.). Místně řízená mutageneze se často používá při změně aktivity určitého produktu genu. K mutagenezi strukturní kódující sekvence enzymu fosforylázy může docházet v bakterii E. coli nebo v jiných vhodných hostitelech a může se testovat redukovaná fosforolýza škrobu. V jiném případě se mohou identifikovat přirozeně se vyskytující alely fosforylázy s redukovanou afinitou a/nebo se specifickou aktivitou. Navíc aktivita určitého enzymu se může

* φ φ φφ φφ φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ změnit za použití různých inhibitorů. Tyto postupy se běžně používají a popisují se v různých protokolech, jako je Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. .

3. Varianty enzymů GLTP a GHTP a sekvence, které se používají při potlačení exprese závislé na homologii sekvencí

Jak se popisuje v kapitole Dosavadní stav techniky a v publikacích (Nakano, K. and Fukui, T. (1986) J. Biol. Chem. 266: 8230-8256; Moři et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 1844618453; Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576) u brambor existují tří známé isozymy fosforylázy aglukanu. Vynález popisuje zeslabení aktivity izozymů GLTP a/nebo GHTP. Zatímco se zdá, že geny GLTP a GHTP všech známých komerčních odrůd brambor jsou v podstatě identické, očekává se, že principy a metody podle vynálezu jsou účinné u rostlin brambor, které mají odlišné polynukleotidové sekvence v plné délce nebo subsekvence, které kódují polypeptidy, jenž vykazují enzymatickou aktivitu popsaných enzymů GLTP a GHTP katabolizující škrob. Termín „GLTP a „GHTP zahrnuje varianty popsané shora v textu. Tyto varianty mohou zahrnovat varianty nukleotidové sekvence GLTP nebo GHTP, které se liší od uvedených sekvencí, ale stále kódují stejný polypeptid, což je způsobeno degenerací kodonu, stejně jako varianty, které kódují proteiny rozeznávané protilátkami proti aminokyselinovým sekvencím GLTP a GHTP uvedeným v SEQ ID NO: a a 4.

Podobně pro odborníka je zřejmé, že potlačení exprese genu závislé na homologii sekvencí může být doprovázeno jinými kódujícími nebo antikódujícími sekvencemi než jsou ty uvedené jako příklad. Za prvé platí, že oblast GHTP nebo GLTP sekvence cDNA, ze které je odvozena kódující sekvence, není podstatná. Za druhé, jak se uvádí shora v textu délka použité kódující sekvence se může podstatně lišit. Dále není nutné, aby ··

99

9 9 9

9 99 • · · t·· 99 • 9 9 9 ·9 • · 9 9

9 9 9

9 9 9

9

99 antikódující nebo kódující sekvence byly shodné se sekvencemi cílového genu enzymů GLTP nebo GHTP, jehož exprese má být potlačena. Jak se popisuje v příkladech, pozorovalo se, že transformace rostlin brambor se sekvencemi kódující DNA odvozené z genu GHTP nezpůsobuje pouze podstatné potlačení aktivity genu GHTP, ale také se podílí na potlačení aktivity genu GLTP. Kódující sekvence genů GHTP a GLTP jsou z 56,8 % identické. Shodnost sekvencí mezi kódující sekvencí GLTP a odpovídající sekvencí listové fosforylázy α-glukanu popsané v publikaci Sonnewald et al., (1995) Plant Molecular Biology 27: 567-576 je 71,3 %. Zjistilo se, že do dnešní doby se nepozoroval jev kříženého zeslabení v případě, že se rostliny brambor transformovaly sekvencemi kódující DNA odvozené z genu GLTP. Tyto výsledky jasně ukazují, že absolutní shoda sekvencí mezi cílovým endogenním genem fosforylázy α-glukanu a rekombinantní DNA není podstatná. Což naznačuje skutečnost, že aktivita enzymu GLTP je potlačena kódující sekvencí, která vykazuje přibližně 57 % shodu s cílovou sekvencí enzymu GLTP. Odborníkovi je zřejmé, že antikódující nebo kódující sekvence jiné než jsou zde uvedeny a ty, které vykazují absolutní shodu se sekvencí cílového endogenního genu GLTP nebo GHTP, jsou účinné při potlačení endogenního genu GLTP nebo GHTP, když se začlení do buněk rostliny brambor. Použitelné antikódující nebo kódující sekvence se mohou lišit od příkladů kódujících sekvencí nebo od jiných sekvencí odvozených od sekvence endogenního genu GHTP nebo GLTP substitucemi konzervativních aminokyselin nebo rozdíly v procentech spárovaných nukleotidů nebo rozdíly aminokyselin v oblastech sekvencí, které jsou seřazeny z důvodů možnosti porovnání.

Patent USA č. 5,585,545 (Bennett et al., 17. Prosince 1996) diskutuje způsoby porovnání shody sekvencí polynukleotidů a polypeptidů, substitucí konzervativních aminokyselin a podmínky hybridizace, což ukazuje stupeň shody sekvencí. Relevantní části této diskuze jsou shrnuty zde v textu.

• 4 ·* ·· ·· ·· • · ···· « 9 · · ·· 9 9 99 9 9 9 9 • • 9 9 9 9 9 9 9 ··· ·· ·· ·· ·· ··

Procento shody sekvencí polynukleotidů a polypeptidů se může stanovit porovnáním dvou optimálně seřazených sekvencí ve srovnávacím okně, kde část polynukleotidové a polypeptidové sekvence může zahrnovat adice a delece. Aby se dosáhlo optimálního uspořádání dvou sekvencí, provádí se porovnání s referenční sekvencí. Shoda sekvencí vyjádřená v procentech se vypočítá a) stanovením počtu pozic, kde se u obou sekvencí objevují stejné báze nukleových kyselin nebo stejné aminokyselinové zbytky, tak se získá počet spárovaných pozic;

b) počet spárovaných pozic se vydělí celkovým počtem pozic ve srovnávacím okně; c) výsledek vynásobíme 100 a získáme hodnotu shody sekvencí. Optimální uspořádání sekvencí za účelem srovnání se může provést na počítači známým algoritmem (například GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA za použití Wisconsin Genteics Software Package, Gentics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI nebo BlastN a BlastF, který může poskytnout National Center for Biotechnology Information ) nebo postupným prohlédáváním.

Polypeptidy, které jsou v podstatě podobné, sdílí sekvence, jak se popisuje shora v textu. Pozice zbytků, které nejsou stejné, se mohou lišit změnami konzervativních aminokyselin. Konzervativní substituce aminokyselin se vztahují k vnitřní zaměnitelnosti zbytků, které mají podobné postranní řetězce. Skupina aminokyselin, které mají alifatické postranní řetězce, zahrnuje glycin, alanin, valin, leucin a isoleucin. Skupina aminokyselin, které mají alifatické hydroxylové postranní řetězce, zahrnuje serin a treonin. Skupina aminokyselin vykazující postranní řetězce obsahující amid zahrnuje asparagin a glutamin. Skupina aminokyselin, které mají aromatické postraní řetězce, zahrnuje fenylalanin, tyrozin a tryptofan. Skupina aminokyselin obsahující bazické postranní řetězce zahrnuje lyzin, arginin a histidin. Skupina aminokyselin, které mají v postranních řetězcích síru, zahrnují cystein a methionin.

*· ·* ·· • · ♦ · · · ·· · · ·· • · · · · · · • · · · · · • »· ·· ·· • · * * • ♦ · · ··· ··· • ♦ ·· ··

Další známka podstatné identity nukleotídových sekvencí je v případě, že dvě podstatně shodné molekuly spolu vzájemně specificky hybridizují za přísných podmínek. Přísné podmínky závisí na sekvenci a budou se lišit podle okolností. V obecném případě se přísné podmínky znamenají teplotu přibližně o 10 °C nižší než je teplota bodu tání (T_m) specifické sekvence při definované iontové síle roztoku a definovaném pH. T_m je teplota (při definované iontové síle roztoku a pH) při které 50 % cílové sekvence hybridizuje se zcela spárovanou sondou. T_m hybridu, která je funkcí délky a základního složení sondy, se může vypočítat způsobem, který se popisuje v publikaci Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.. V typickém případě přísné podmínky v protokolu Southernova přenosu zahrnují promývání při teplotě 65 °C 0,2 x SSC. Preferované podmínky promývání pro oligonukleotidové sondy jsou přibližně teplota 42 °C a roztok 6 x SSC.

4. Obecné způsoby

Při zavádění a expresi sekvence cizorodé DNA do buněk rostlin se používají různé metody. Uvedené způsoby zahrnují přípravu kódující cDNA enzymu fosforylázy α-glukanu a jejich zavedení do rostlinné buňky. 1) Z rostlin brambor se izoluje mRNA a z ní se připraví cDNA; 2) v cDNA se testuje přítomnost požadované sekvence; 3) aby došlo k expresi genů fosforylázy k požadované cDNA se připojí promotor v opačné orientaci; 4) buňky hostitelské rostliny se tranformují konstrukcí; 5) proběhne selekce a regenerace buněk, které přepisují obrácené sekvence.

DNA získaná z genů GLTP a GHTP z brambor se používá při vytvoření expresívních kazet, které vykazují rostlinný promotor operabilně spojený s kódující sekvencí DNA, která v případě, že se v rostlině přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu GLTP nebo genu GHTP. Jako nástroj pro přenos

-2 ·· ·· »· ·♦ ♦ · ♦ · · · ·»© • ·· · © Φ · 9 9 9 • · · ♦ · 99 99 999 ΦΦΦ Φ Φ 9 · φ •ΦΦ 99 99 99 99

DNA do stonkových explantátů výhonků rostlin brambor se používá mikororagnizmus Agrobacterium tumefaciens. Rostlina, která vznikla z transformovaného explantátů, přepisuje kódující DNA, jenž inhibuje aktivitu enzymu.

Zde popsané metody genového inženýrství jsou v oboru dobře známy a popisují se ve standardních publikacích, jako je Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.. V obecném případě enzymatické reakce, které zahrnují DNA ligázu, DNA polymerázu, restrikční endonukleázy a podobně, se provádějí podle specifikací výrobce.

5. Příprava cDNA GLTP a GHTP cDNA se připravuje z izolované mRNA z bramborových hlíz reverzní transkripcí. Primer se naváže na mRNA a volný 3'konec se pak může použít pro prodlužování sekvence pomocí enzymu reverzní transkriptázy. Enzym se podílí na obvyklém prodlužování ve směru 5'—>3', což je řízeno komplementárním párováním baží s templátovou mRNA za vzniku hybridní molekuly. Tato molekula obsahuje templátový řetězec baží RNA spárovaný s komplementárním řetězcem cDNA. Po degradaci původní mRNA se použila k syntéze řetězce komplementární DNA DNA polymeráza, čímž se jednořetězcová cDNA přemění a duplexovou DNA.

Po amplifikací DNA se za účelem zvýšení množství uvedené DNA v bakterii E. coli se dvouřetězcová cDNA začlení do vektoru. V typickém případě se provede identifikace klonů, které nesou požadovanou cDNA, buď hybridizaci nukleové kyseliny nebo imunologickou detekcí kódovaného proteinu, když se použije expresívní vektor. Tento způsob se může zjednodušit, jestliže jsou známy sekvence DNA genů GLTP a GHTP stejně jako jsou známy sekvence vhodných primerů (Brisson et al. (1989) The Plant Cell 1: 559-566; Fukui et al., 1991). Používané primery hybridizují s geny GLTP a GHTP. Očekává se, že amplifikací připravené cDNA reprezentují části genů GLTP a GHTP, aniž je • 9 99 99 • · 9 9 9 9 *· 9 · 99 • ··· 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 • ·· »9 99

9* 99

9 9 9 • 9 9 9

9 9 9 9 9 • 9

99 nutná další analýza. Bakterie E. colí transformované plazmidy pUC19, které nesou inzert DNA fosforylázy, se detekovaly selekcí podle barvy. Správné bakterie E. colí transformované plazmidy, které nenesou inzerty, rostou jako modré kolonie. Kmeny transformované plazmidy pBluescript nesoucí inzerty rostou jako kolonie bílé barvy. Aby se potvrdila přítomnost inzertů fosforylázy, sekvenovaly se plazmidy izolované z transformovaných bakterií E. colí.

6. Konstrukce vektoru

Připravená cDNA se začlenila v orientaci po směru transkripce nebo proti směru transkripce do expresívní kazety v expresívních vektorech, které jsou určeny pro transformaci rostlin brambor za účelem inhibice exprese genů GLTP a/nebo GHTP v hlízách brambor.

V případě antisense-suprese požadovaný rekombinantní vektor obsahuje expresívní kazetu určenou pro iniciaci transkripce kódující cDNA v rostlinách. Zahrnou se další sekvence, které umožňují, aby se vektor klonoval v bakteriálním nebo fágovém hostiteli.

Vektor bude s výhodou obsahovat prokaryontní počátek replikace, který má široké rozmezí hostitelů. Může se také použít selekční markér, což umožňuje selekci bakteriálních buněk, které nesou požadovanou konstrukci. Vhodné prokaryontní selekční markéry zahrnují rezistenci na antibiotika, jako je penicilín.

Jak je známo v oboru ve vektoru se mohou nacházet také jiné sekvence DNA kódující další funkce. Například v případě transformací mikroorganizmu Agrobacterium jsou za účelem následujícího transferu do rostlinných chromozomů zahrnuty sekvence T-DNA.

Za účelem exprese v rostlinách rekombinantí expresívní kazeta bude obsahovat mimo požadovaných sekvencí oblast rostlinného promotoru, místo iniciace transkripce (jestliže sekvence, •*•••<9 9 9 999 9» 99 99 99 99 která se má přepisovat jej neobsahuje) a sekvenci ukončení transkripce. Na 5'a 3'konci kazety se nacházejí jediná místa rozeznávaná restrikčními enzymy, jenž umožňují jednoduchou inzerci do existujícího vektoru. Sekvence, které řídí expresi eukaryontního genu jsou dobře známy v oboru.

Transkripce DNA na mRNA se reguluje oblastí DNA, která se nazývá pormotor. Promotorové oblast obsahuje sekvence bází, které signalizují RNA polymeráze, aby se připojila na DNA a tak inicijují přepis mRNA , přičemž jeden z řetězců DNA se použije jako templát. Vzniká odpovídající řetězec RNA. Elementy promotorové sekvence zahrnují TATA box (sekvence TATAAT), který se obvykle nachází 20 až 30 párů baží (bp) proti směru exprese (podle úmluvy -30 až -20 bp ve vztahu s místem počátku přepisu) od místa počátku přepisu. Ve většině případů je pro správnou iniciaci přepisu nutná přítomnost TATA boxu. TATA box je pouze element promotoru ve směru proti směru přepisu, jehož pozice je vzhledem k počátečnímu bodu relativně stabilní.

Sekvence CAAT boxu se nachází v pozici -75, ale může fungovat v různých vzdálenostech od počátečního bodu a v libovolné orientaci.

Další běžné promotorové elementy jsou GC box v pozici -90, který obsahuje sekvenci GGGCGG. Může se vyskytovat v několika kopiích a v libovolné orientaci.

Jiné sekvence umožňující tkáňovou specifitu odpovídají na signály prostředí nebo v promotorové oblasti je možné také najít maximální účinnost transkripce. Takové sekvence se často nachází 400 bp od místa počátku transkripce, ale mohou být vzdáleny až 2 000 bp a více. V heterogenních kombinacích promotor/strukturní gen se promotor s výhodou nachází v přibližně ve stejné vzdálenosti od heterogenního místa počátku přepisu, jako je od místa počátku přepisu v jeho přirozeném uspořádání. Mohou existovat některé odchylky v této vzdálenosti, aniž dojde ke ztrátě funkce promotoru.

·· ·· 44 ·4

4 · 4 · · · · · 4· 4 4·· · 4 · 4 4 ·· «·· ··« • 44444 4 · • Λ· ·· 44 ·4 ·· promotory promotor tkání (Bevan et al., 4638)

Určitý promotor, který se používá v expresívní kazetě není v případě vynálezu kritický. Je vhodný libovolný počet promotorů, které řídí přepis v rostlinných buňkách. Promotor může být buď konstitutivní nebo indukovatelný.

V literatuře se popisuje řada promotorů, které jsou aktivní v rostlinných buňkách. Mezi ně patří promotory syntázy nopalinu (NOS) a syntázy oktopinu (OCS) (které se nachází na plazmidech mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens vyvolávající tvorbu nádorů), promotory caulimovirů, jako jsou promotory mozaikového viru květáku (CaMV) 19S a 35S a 35Smozaikového viru krtičníku, světlem indukovaný z malé podjednotky ribulóza-1,5-bis-fosfátové karboxylázy (ssRUBISCO, často se vyskytující rostlinný polypeptid), promotor genu proteinu vázajícího chlorofyl a/b, atd. Všechny tyto promotory se používají při přípravě různých typů konstrukcí, které se exprimují v rostlinách, což se popisuje například v publikaci PCT WO8402913.

Ukázalo se, že promotor CaMV 35S používaný zde v příkladech, je vysoce aktivní a konstitutivně se exprimuje ve většině ;i986) Nucleic Acid Res. 14 (11):4625Je známa řada jiných genů, které jsou specifické pro hlízy brambor nebo posilují expresi. Patří sem geny ADPGPP nacházející se v hlízách brambor, velké a malé podjednotky (Muller et al., (1990) Mol. Gen. Genet. 224: 136-146). Jiné promotory, které lze použít podle vynálezu, zahrnují ty, které vykazují zesílenou nebo specifickou expresi v hlízách brambor a které jsou v normálním případě spojeny s expresí genů modifikovaných enzymů nebo enzymů biosyntézy škrobu nebo vykazují různé paterny exprese nebo se například exprimují v odlišném čase během vývoje hlíz. Příklady těchto promotorů zahrnují promotory genů na granale vázaných syntáz škrobu nebo jejich jiných forem, promotory genů větvících enzymů (Blennow, et al., (1991) Phytochemistry 30: 437-444; WO 9214827; WO

9211375), genů disproporčních enzymů (Takaha et al., (1993) J.

Biol. Chem. 26 8: 1391-1396), genů enzymů odstraňujících větvení, genu amylázy, genu fosforylázy škrobu (Nakano et al., (1989) J. Biochem. 106: 691-695; Moři et al., (1991) J. Biol. Chem. 266: 18446-18453), genu esterázy pektinu (Ebbelaar et al., (1993) Int. Symp. On Gen. Manip. Of Plant Metabolism and Growth, 29-31 March, Norwich UK Abstract #9), genu glykoproteinu o molekulové hmotnosti 40 000; genu ubiquitinu, genu inhibitoru aspartové proteinázy (Stukerlj et al., (1990) Nucl. Acids Res. 18: 46050), genu inhibitoru karboxypeptidázy, genu hlízové polyfenolové oxidázy (Shahar et al., (1992) Plant Cell 4: 135-147; GenBank číslo uložení M95196 a M95197), genu putativního inhibitoru trypsinu nebo jiné hlízové cDNA (Stiekema et al (1988) Plant Mol. Biol. 11: 255-269) a genů amyláz a sporaminů (Yoshida et al., (1992) Geneg 10: 255-259; Ohta et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 225: 369-378).

Mimo promotorové sekvence může expresívní kazeta také zahrnovat oblast ukončení přepisu, která se nachází od strukturního genu ve směru přepisu, aby došlo k jeho účinnému ukončení. Oblast ukončení přepisu je možné získat ze stejného genu jako promotorovou sekvenci nebo se může získat z odlišných genů. V příkladech se používá 3'terminační sekvence syntázy nopalinu NOS (Bevan et al., (1983) Nátuře (London) 304: 184-187).

Polyadenylační sekvence se také běžně přidávají do vektorových konstrukcí, jestliže mRNA kódovaná strukturním genem se má účině překládat (Alber and Kawasaki, (1982) Mol. And Appl. Genet. 1: 419-434). Věří se, že polyadenylace má účinek na stabilizaci mRNA. Polyadenylační sekvence zahrnují, ale nejsou omezeny na signál syntázy oktopinu mikroorganizmu Agrobacterium (Gielen et al., (1984) EMBO J. 3: 835-846) nebo signál syntázy oktopinu (Depicker et al., (1982) Mol. And Appl. Genet. 1: 561-573).

Vektor v typickém případě také obsahuje gen selekčního markéru, na základě kterého je možné v kultuře určit

transformované rostlinné buňky. V typickém případě gen markéru kóduje rezistenci na antibiotika. Tyto markéry zahrnují rezistenci na G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin a gentamycin. V příkladech se používá gen markéru, který udílí rezistenci na kanamycin. Po transformaci rostlinných buněk se tyto buňky obsahující vektor budou identifikovat na základě jejich schopnosti růst v kultivačním médiu, které obsahuje určitá antibiotika.

7. Transformace rostlinných buněk

Ačkoli v příkladech se stonkové explantáty výhonků rostlin brambor transformovaly inokulací mikroorganizmem Agrobacterium tumefaciens, které nesou kódující sekvenci spojenou s binárním vektorem, mohou se také pro transfer rekombinantní DNA použít způsoby přímé transformace, které jsou známy v oboru. Vektor se může zavést mikroinjekcí přímo do rostlinných buněk. V jiném případě se nukleové kyseliny mohou zavést do rostlinné buňky vysokorychlostní balistickou penetrací ve formě malých partikul!, které mají nukleovou kyselinu zakotvenou v matrici částice nebo na jejím povrchu. Může se použít fúze protoplastů s částicí, která má na svém povrchu lipid, jako jsou minibuňky, buňky nebo lysozomy nesoucí DNA. DNA se také může zavést do rostlinných buněk elektroporací, kde se na protoplasty rostlin působí elektroporací v přítomnosti plazmidů, které nesou expresívní kazetu.

Na rozdíl od způsobů přímé transformace se v příkladech uvádí transformace pomocí vektorů za použití mikroorganizmů Agrobacterium tumefaciens. Mikroorganizmus Agrobacterium tumefaciens je gram-negativní půdní bakterie, která způsobuje neoplastické onemocnění, které je známé u dvouděložních rostlin jako hálka koruny. Vyvolání nádoru je způsobeno plazmidy, které jsou známy jako Ti plazmidy. Ti plazmidy řídí v infikovaných rostlinách syntézu opinů. Agrobakterie využívají opiny jako zdroj uhlíku.

Bakterie nevstupují do rostliny, ale tranformují pouze část Ti plazmidu, která se nazývá T-DNA, jenž se stabilně začlení do rostlinného genomu, kde se exprimují funkce potřebné pro syntézu opinů a transformaci rostlinné buňky. Geny vir (virulence) na Ti plazmidech, které se nacházejí vně oblasti T-DNA, jsou nezbytné pro přenos T-DNA. Oblast vir se však nepřenáší. Ve skutečnosti oblast vir, ačkoli je nutná při přenosu T-DNA, nemusí být fyzicky spojena s T-DNA a může se nacházet na odděleném plazmidu.

Části T-DNA indukující nádor se mohou porušit nebo deletovat, aniž dojde ke ztrátě funkcí, které zabezpečují přenos a integraci. Proto mohou vznikat normální a zdravé transformované rostlinné buňky, které ztratily všechny vlastnosti nádorových buněk, ale stále nesou a exprimují určité oblasti T-DNA, zvláště hraniční oblasti T-DNA. Proto modifikované Ti plazmidy, ze kterých se deletovaly geny způsobující onemocnění, se mohou použít v rostlinách brambor jako vektory pro transfer antikódujících a kódujících genových konstrukcí podle vynálezu (Winnacker, Ernst L. (1987) From Genes to Clones. VHC Verlagsgesellshaft mbH, Federal Republic of Germany).

Transformace rostlinných buněk mikrooragnizrnem Agrobacterium a vytvoření celých rostlin v typickém případě zahrnuje buď společnou kultivaci mikrooragnizmu Agrobacterium s kultivovanými izolovanými protoplasty nebo transformaci nepoškozených buněk nebo tkání mikrooragnizrnem Agrobacterium.

V příkladech se stonkové explantáty z kultur výhonků brambor transformují mikrooragnizrnem Agrobacterium.

V jiném případě mozaikový virus květáku (CaMV) se může použít jako vektor při zavedení antikódující nebo kódující DNA do rostlin rodiny Solanaceae. US patent č. 4,407,956 (Howell, 4. Října 1983) popisuje například použití DNA mozaikového viru květáku jako rostlinného nástroje.

• · · · • · · · • · ··

8. Selekce a regenerace transformovaných rostlinných buněk

Po tranformaci se musí vybrat transformované rostlinné buňky nebo buňky nesoucí kódující nebo antikódující DNA. V typickém případě se používá selekční markér, jako je rezistence na antibiotika. V příkladech se transformované buňky vybraly na základě růstu na kultivačním médiu, které obsahuje kanamycin. Odborník ví, že může použít i jiné selekční markéry.

V případě, že rostliny se transformují mikroorganizmem Agrobacterium, může se při určení trans formantů, použít opiny. Exprese cizorodé DNA se může potvrdit detekcí RNA kódované začleněnou DNA za použití dobře známých metod, jako je hybridizací northernova přenosu. Samotnou začleněnou sekvenci DNA je možné určit hybridizací Southernova přenosu nebo polymerázovou řetězovou reakcí (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2^nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.).

V obecném případě po zjištění, že transformované rostliny nesou rekombinantí DNA, se regenerují celé rostliny.

V příkladech se stonkové a listové explantáty kultur výhonků brambor inokulovaly kulturou mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens, který nese požadovanou kódující DNA a kanamycinový markerový gen. Transformanti se vybraly na základě růstu na kultivačním médiu obsahujícím kanamycin. Po transferu na kultivační médium vhodné pro indukci výhonků se výhonky přenesly na růstové médium, které je vhodné pro zakořenění. Rostliny se pak přenesly do půdy a otužovaly se. Rostliny regenerované v kultuře se transplantovaly a nechaly se dozrát v podmínkách skleníku.

9. Analýza aktivity enzymů GHTP a GLTP u transformovaných hlíz Po regeneraci rostlin brambor transformovaných sekvencemi kódující DNA odvozené od genů GHTP a GLTP se zkoumala biochemie transformované tkáně hlíz několika způsoby. Metodou podle Steupa (Steup, M. (1990) Starch Degrading Enzymes in

„Methods in Plant Biochemistry Vol 3. P.M. Dey and Harborne, eds. Academie Press, London) (Tabulka č. 1) se zkoumala in vitro fosforolytická aktivita fosforylázy α-glukanu. Po elektroforetické separaci isoforem enzymu na polyakrylamidovém gelu obsahujícím glykogen (obrázek č. 7) se porovnala syntetická aktivita enzymu a množství enzymového proteinu. Syntéza škrobu pomocí isoforem typu L a H se stanovila po inkubaci glukosa-l-fosfátu se škrobovým primerem barvením gelu jódem (Steup, M. (1990) Starch Degrading Enzymes in „Methods in Plant Biochemistry Vol 3. P.M. Dey and Harborne, eds. Academie Press, London). Westernová analýza se provedla přenosem proteinu ze stejného neinkubovaného nativního gelu a kontaktem s polyklonálními protilátkami, které jsou specifické pro isoformy hlízové fosforylázy α-glukanu typu a H. Množství redukčních cukrů (glukóza a fruktóza) ve tkáni hlíz se kvantifikovalo HPLC ( tabulka č. 2, 3 a 4). Rozsah Maillardovi reakce, která přímo úměrná koncentraci redukčních cukrů v hlízách, se stanovil určením skóre lupínků po jejich smažení (tabulka č. 5 a obrázek č. 9).

10. Definice

Termín „přibližně tři měsíce, „přibližně čtyři měsíce a „přibližně šest měsíců znamená období tří měsíců plus nebo mínus dva týdny, období čtyř měsíců plus nebo mínus dva týdny a období šesti měsíců plus nebo mínus dva týdny.

Termín „antisense orientace znamená orientaci sekvence nukleové kyseliny ze strukturního genu, která se začlení do expresívní kazety opačným způsobem s ohledem na její přirozenou orientaci . V případě, že sekvence je dvouřetězcová, řetězec, který je při přirozeně se vyskytující orientaci templátovým řetězcem, se stává kódujícím řetězcem a opačně.

Termín „skóre lupínků hlíz znamená měření odrazu ve středu nakrájených lupínků brambor smažených při teplotě 96,1 °C na

sojovém oleji po dobu přibližně 3 minut do okamžiku, kdy se přestanou tvořit bubliny. Hodnoty se zaznamenávají na přístroji „Direct Reading Abridged Spectrophotometr model E15-FP od firmy Agtron (Agtron Inc. 1095 Spíce Island Drive #100, Sparks Nevada 89431) .

Termín „skladování při nízké teplotě nebo varianty uvedeného termínu znamená uchovávání hlíz při teplotě nižší než 10 °C, které lze dosáhnout chlazením nebo okolní teplotou.

Termín „endogenní ve spojení s geny fosforylázy a-glukanu rostliny brambor znamená přirozeně se vyskytující gen, který je přítomen v genomu rostliny brambor před zavedením expresivní kazety, která nese sekvenci DNA odvozenou z genu fosforylázy a-glukanu.

Termín „exprese znamená přepis a překlad strukturního genu tak, že dochází k syntéze proteinu.

Termín „heterogenní sekvence nebo „heterogenní expresivní kazeta je sekvence nebo kazeta pocházející z cizího druhu nebo v případě, že pochází ze stejného druhu, tak se podstatně liší od původní formy.

Termín „zlepšení charakteristik skladování při nízké teplotě zahrnuje bez omezení zlepšení v hodnotě skóre lupínků a ve snížení hromadění cukrů v hlízách, což se měří při sklizni nebo po období uskladnění při teplotě nižší než teplota 10 °C a dále zahrnuje zlepšení a výhody, které mohou vzniknout při skladování brambor při nižších teplotách, než jsou ty, které se užívají při tradičních způsobech uskladnění. Mezi tyto výhody patří prodloužení doby skladování brambor, prodloužení období vegetačního klidu pomocí snížené respirace a potlačení klíčení brambor a snížený výskyt nemocí. Jestliže se neprovádí zhodnocení specifickým měřením nebo testem, zlepšení charakteristiky skladování při nízké teplotě je rozdíl popsaných charakteristik vzhledem k charakteristice kontrolní, nezměněné rostlině brambor nebo rostlině brambor divokého typu.

Termín „změněný nebo varianta uvedeného termínu se používá, jestliže rostliny brambor nebo jejich hlízy se používají pro odlišení rostliny brambor nebo hlízy, která se změnila, a liší se tedy od přirozeně se vyskytující hlízy nebo rostliny tím, že se do ní zavedla nukleotidové sekvence ze stejného nebo odlišného druhu buď v sense nebo antisense orientaci, buď metodou genového inženýrství nebo metodami tradičního křížení rostlin, které zahrnují zavedení změněné strukturní nebo regulační sekvence; změnou přirozené nukleotidové sekvence místně řízenou mutagenezí nebo jiným způsobem; nebo ošetřením rostliny brambor chemickým nebo proteinovým inhibitorem. Termín „nezměněná rostlina brambor znamená kontrolní, přirozeně se vyskytující rostlinu nebo rostlinu divokého typu nebo hlízu, která nebyla změněna shora popsaným způsobem.

Termín „sekvence nukleové kyseliny nebo „segment nukleové kyseliny je jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových bází čtený od 5'do 3'konce. Zahrnuje samostatně se replikující plazmidy, infekční polymery DNA nebo RNA a nefunkční DNA nebo RNA.

Termín „operabilně spojený znamená funkční spojení mezi promotorem a druhou sekvencí, kde promotorové sekvence iniciuje transkripci RNA odpovídající druhé sekvence.

Termín „rostlina zahrnuje celou rostlinu, orgány rostliny (to znamená listy, stonky, kořeny atd.) semena a rostlinné buňky. Termín „promotor znamená oblast DNA od strukturního genu proti směru přepisu a podílí se na rozeznávání a navázání RNA polymerázy a jiných proteinů, což inicijuje transkripci. Termín „rostlinný promotor znamená promotor schopný iniciovat přepis v rostlinných buňkách.

Termín „snížená aktivita nebo jeho varianty znamenají enzymatickou aktivitu GLTP nebo GHTP v hlíze brambor, která zahrnuje snížení aktivity enzymu GLTP nebo GHTP vyplývající ze zeslabené exprese produktu genu GLTP nebo GHTP, sníženou • · · · ··· · φ •·· *· ·· ·· φ φ |· substrátovou afinitu enzymu GLTP nebo GHTP a sníženou katalytickou aktivitu enzymu GLTP nebo GHTP.

Termín „snížený nebo jeho varianty se může použít bez omezení v souvislosti s úrovní aktivity enzymu GLTP nebo GHTP v hlízách brambor a s tmavnutím lupínků brambor při smažení.

Není-li dále kvalifikováno specifickým měřením nebo testem, snížené množství nebo snížená aktivita znamená demonstrovatelný statisticky podstatný rozdíl popsané charakteristiky vztažené ke charakteristice kontrolní, nemodifikované rostlině brambor nebo rostlině divokého typu.

Termín „stres nebo jeho varianty se používají ve spojení se stresovým působením na rostliny brambor a hlíz, které zahrnují účinky prostředí, plodnost, vlhkost, teplotu, zpracování, nemoce, atmosférické podmínky a stárnutí, což se odráží na kvalitě rostlin a hlíz. Tyto podmínky mohou na rostliny působit ve všech stádiích cyklu života rostliny a na hlízy ve všech stádiích růstu a vývoje a během následné sklizně, přepravy, skladování a zpracování.

Termín „rezistence vůči stresu nebo jeho varianty znamená snížení účinku teploty, stárnutí, nemoci, fyzikálního zpracování, vlhkosti, chemických zbytků, prostředí, pesticidů a jiných stresů.

Termín „vhodný hostitel znamená mikroorganizmus nebo buňku, která je kompatibilní s rekombinantním plazmidem, se sekvencí DNA nebo s rekombinantní expresivní kazetou a umožní replikaci plazmidu, aby došlo k začlenění do jeho genomu nebo k jeho expresi.

Termín „nepřerušený znamená sekvenci DNA (například cDNA) obsahující otevřený čtecí rámec, který postrádá vnitřní nepřekládané sekvence.

Přehled obrázků na výkrese

44 44 44

4 4 4 4 4 4

4 44 4 4 4

4. ·······» ··· 4· 44 44 ·· ··

Na obrázku č. 1 je schématické znázornění kódující sekvence hlízové fosforylázy α-glukanu typu L začleněné do transformačního vektoru pBI121.

Na obrázku č. 2 je schématické znázornění kódující sekvence hlízové fosforylázy α-glukanu typu H začleněné do transformačního vektoru pBI121.

Na obrázku č. 3 je znázorněna základní struktura tří izolovaných isoforem fosforylázy glukanu. Tranzitní peptid (TS) a sekvence inzertu je charakteristická pro fosforylázu typu L a nenachází se u fosforylázy typu H. Procenta ukazují homologii sekvencí nukleových kyselin mezi jednotlivými isoformami.

Na obrázku č. 4 je schématické znázornění vnitřní přeměny cukrů v bramborách.

Na obrázku č. 5 je znázorněno porovnání aminokyselinových sekvencí tří isoforem fosforylázy nalezených v bramborách za účelem zjištění oblastí, do kterých je možné směrovat antisense konstrukci GLTP používanou v příkladech dále v textu. Tučným písmem jsou vyznačeny shodné aminokyseliny. Aminokyselinová sekvence listové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) je znázorněna nahoře (aminokyseliny 21 až 238 v sekvenci SEQ ID NO: 6), aminokyselinová sekvence hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) je znázorněna ve středu (aminokyseliny 49 až 266 sekvence SEQ ID NO: 2) a aminokyselinová sekvence hlízové fosforylázy α-glukanu typu H (GHTP) je dole (aminokyseliny 46 až 264 sekvence SEQ ID NO:

4) .

Obrázky č. 6A a 6B znázorňují srovnání nukleotidových sekvencí tří isoforem fosforylázy zjištěných u brambor za účelem zjištění oblastí, do kterých je možné směrovat antisense konstrukci GLTP používanou v příkladech dále v textu. Tučným písmem jsou vyznačeny shodné nukleotidy. Nukleotidová sekvence listové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) je znázorněna ·« » <

• · ·* ·· * « · ι · 99

9 9 9 · 9 9

9·9 ··· • · ·♦ ·· nahoře (nukleotidy 389 až 1045 v sekvenci SEQ ID NO: 5) , nukleotidová sekvence hlízové fosforylázy α-glukanu typu L (GLTP) je znázorněna ve středu (nukleotidy 338 až 993 sekvence SEQ ID NO: 1) a nukleotidová sekvence hlízové fosforylázy aglukanu typu H (GHTP) je dole (nukleotidy 147 až 805 sekvence SEQ ID NO: 3) .

Na obrázku č. 7 je northernův přenos polyadenylované RNA izolované z hlíz brambor divokého typu a linií 3,4,5 a 9 transformované hlízovou fosforylázou α-glukanu typu L (GLTP). Blot se hybridizoval s radioaktivně značenou sondou, která je specifická pro hlízovou fosforylázu α-glukanu typu L (GLTP).

Na obrázku č. 8 je northernův přenos celkové RNA izolované z hlíz brambor divokého typu a linií 1 a 2 transformované typu H. Blot se hybridizoval sondou, která je specifická pro fosforylázu α-glukanu typu H (GHTP).

Na obrázku č. 9 je smažený produkt získaný z (A) z brambor divokého typu a z transformantů hlízovou fosforylázou aglukanu typu L, (B) ATL1, (C) ATL3, (D) ATL4, (E) ATL5, (F) ATL9 na poli rostoucích hlíz po 86 dnech skladování při teplotě 4 °C (ATL znamená antisense hlízový transformant Ltypu).

Na obrázku č. 10 je znázorněna aktivita gelu a westernův blot isozymů typu L a H fosforylázy a-1,4-glukanu extrahované z hlíz divokého typu a z hlíz transformovaných antisense konstrukcí izoformy typu L.

Na obrázku č. 11 je znázorněna aktivita gelu a westernův blot a H fosforylázy a-1,4-glukanu extrahované typu a z hlíz transformovaných antisense fosforylázou a-glukanu s radioaktivně značenou isozymů typu L z hlíz divokého konstrukcí izoformy typu H.

Příklady provedení vynálezu • ·♦ ·· ·« ©· * · ♦ · · © •Μ © © ·© • · · © · · ·· ·· ♦ · ·

·· ··

Příklad 1

Tento příklad popisuje snížení aktivity enzymu GHTP a/nebo GLTP v hlízách rostlin brambor tím, že se transformují expresívními kazetami, které obsahují sekvence DNA odvozené od sekvencí genů GLTP a GHTP spojené s promotorem v antisense orientaci.

A. Izolace mRNA bramborových hlíz

Celková RNA brambor se izoluje při teplotě 4 °C za použití autoklávovaných činidel. Pochází z 1 g tkáně hlíz rozmělněné na jemný prášek v kapalném dusíku v misce s tloučkem. Prášek se přenesl do zkumavky corex o objemu 30 ml a přidal se 100 mM Tris-Cl, pH8,0, 100 mM NaCl a 10 mM EDTA (lOx TNE) obsahující 0,2 % (hmotnost/objem) SDS a 0,5 % (objem/objem) 2merkaptoetanolu. Ke směsi se přidal stejný objem fenolchloroform (1:1) a vzorek se jemně míchal na vortexu a pak se centrifugoval při teplotě 4°C na rotoru SS34 při 8 000 ot./min. po dobu 5 minut. Organická fáze se znovu extrahovala 0,5 objemem 10 x TNE, který obsahuje 0,2 % (hmotnost/objem) SDS a 0,5 % (objem/objem) 2-merkaptoetanolu a kombinované vodné fáze se extrahovaly chloroformem. Nukleové kyseliny se srážely z vodné fáze octanem sodným a absolutním etanolem. Centrifugací se vytvořil pelet, který se resuspendoval ve 3 ml lx TNE. Přidal se stejný objem 5 M LiCl a vzorky se skladovaly při teplotě -20 °C po dobu 4 hodin a pak se provedla centrifugace při 8 000 ot./min. na rotoru SS34 při teplotě 4 °C po dobu 10 minut. Pelet RNA se promyl 70 % etanolem, sušil se a resuspendoval se ve vodě upravené DEPC.

Póly(A⁺) RNA se izolovala za použití oligo(dT) celulózové (Boehringer Mannheim) kolonové chromatografie. Póly(A⁺) RNA se izolovala z celkové RNA resuspendované ve vodě, kde není přítomen enzym RNáza. Kolony se připravily za použití autoklávované kolony Bio-Rad Poly-Prep o objemu 10 ml, do které se přidalo 50 mg oligo(dT)celulózy v 1 ml pufru B, který • 9

I 4 » <

• 9 » 9 99 » 9 9 » 9 9 4 ·· 99 • * 9 9

999 999

9

99 obsahuje 20 mM Tris-Cl, pH7,4, O,1M NaCl, lmM EDTA a 0,1 % (hmotnost/objemem) SDS. Kolona se promyla 3 objemy 0,1 M NaOH s 5mM EDTA a pak vodou upravenou DEPC tak, aby hodnota pH výtoku z kolony byla menší než 8. Hodnota pH se stanovila papírkem. Kolona se pak promyla 5 objemy pufru A, který obsahuje 40 mM Tris-Cl, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM EDTA a 0,1 % (hmotnost/objem) SDS.

Vzorky RNA se zahřívaly při teplotě 65 °C po dobu 5 minut. V této době se přidalo 400 yul pufru A, který byl předehřátý na teplotu 65 °C. vzorek se promíchal a nechal se zchladit na teplotu místnosti po dobu 2 minut a pak se aplikoval na další kolonu. Shromáždil se eluát a zahřál se na teplotu 65 °C po dobu 5 minut, chladil se na teplotu místnosti po dobu 2 minut a znovu se nanesl na kolonu. Pak se kolona promyla 5 objemy pufru A a pak následovalo promytí pufrem B. Póly(A⁺) RNA se eluovala se 3 objemy 10 mM Tris-Cl, pH7,4, 1 mM EDTA a 0,05 % (hmotnost/objem) SDS. Frakce se sebraly a za použití testu s ethidiumbromidem se určily ty frakce, které obsahují RNA. Tento test se provedl na Petriho miskách s 1% agarózou připravenou v pufru TAE, který obsahuje EtBr. Srážela se RNA, resuspendovala se v 10 /Ul a množství RNA v 1 ^ul se stanovilo spektrofotometrem.

B. Izolace sekvencí DNA enzymu GLTP a GHTP

Nukleotidové sekvence využívané při vývoji antisense konstrukce se náhodně vybraly z 5'sekvence enzymu GLTP (SEQ ID NO: 1) a GHTP (SEQ ID NO: 3). Sekvence DNA, které se používají při vývoji antisense sekvencí se získaly polymerázovou řetězovou reakcí s reverzním přepisem. Vytvořily se specifické primery pro GLTP (SPL1 a SPL2) a GHTP (SPH1 a SPH2), které se navrhly podle publikovaných sekvencí (Brisson et al., (1989) The Plant Cell 1: 559-566; Fukui et al., 1991) pouze s malými změnami, aby mohlo dojít ke štěpení pomocí restrikčních enzymů:

• 9 0

9 0 9 •09

9

99

Primer SPL 1: 5 'ATTCGAAAAGCTCGAGATTTGCATAGA3' (SEQ ID NO: 7) (navíc GC tvoří místo rozeznávané restrikčním enzymem Xhol).

Primer SPL 2: 5'GTGTGCTCTCGAGCATTGAAAGC3' (SEQ ID NO: 8) (když se C zaměnilo za G vznikne místo rozeznávané restrikčním enzymem Xhol).

Primer SPH1:· 5' GTTTATTTTCCATCGATGGAAGGTGGTG3' (SEQ ID NO: 9) (přidala se sekvence CGAT a vzniklo místo rozeznávané restrikčním enzymem Clal).

Primer SPH2: 5 'ATAATATCCTGAATCGATGCACTGC3' (SEQ ID NO: 10) (G se zaměnilo za T a vzniklo místo rozeznávané restrikčním enzymem Clal).

Reverzní přepis se provedl v celkovém objemu reakce 15 ul, kde se nachází lx PCR pufr (10 mM Tris-Cl pH8,2, 50mM KC1, 0,001 % želatina, 1,5 mM MgClž), 670 ^uM každého dNTP, 6 ug celkové RNA bramborové hlízy Russet Burbank, každý primer o koncentraci 1 mM SPH1 a SPL2 nebo SPH1 a SPH2) a 200 jednotek reverzní transkriptázy viru Maloney myší leukemie (BRL). Reakce proběhla při teplotě 37 °C po dobu 30 minut, zastavila se zahříváním na teplotu 94 °C po dobu 5 minut a směs se nechala ochladit na ledu. Do 35 (Ul lx koncentrovaného pufru PCR reverzní transkripční reakce se přidalo 2,5 jednotek Taq DNA polymerázy (BRL). Na přístroji Perkin Elmer 480 proběhla amplifikace DNA v 30 cyklech s krokem denaturece při teplotě 94 °C po dobu 1 minuty, dále proběhl krok navázání primerů při teplotě 56 °C po dobu 1 minuty (SPL1 a SPL2) nebo při teplotě 58 °C (SPH1 a SPH2) a pak krok prodlužování při teplotě 72 °C po dobu 2 minut. PCR se zakončila konečným prodloužením při teplotě 72 °C po dobu 10 minut.

C. Konstrukce SP vektorů za účelem inhibice fosforylázy Tiby v rostlinných buňkách došlo k expresi kódujících konstrukcí, je nezbytné fúzovat geny do správných rostlinných regulačních oblastí. To doprovází klonování kódující DNA do plazmidového vektoru, který obsahuje potřebné sekvence.

• ·· * 9 9 • 99	9 9 9 9 9 9	9 9 9 9 9 9	·· • e 9 9	·· • 9 • 9
• 9 9	9 9	9 ·	9	9
99 99	99	99	99	99

Amplifikovaná DNA s tupými konci se klonovala do vektoru pUC19 za použití místa, které rozeznává restrikční enzym Smál. Rekombinantí plazmid se transformoval do buněk DH5a bakterie E. coli (BRL). Transformované buňky se nanesly na plotny na kultivační půdu LB (15 g/1 baktotyptonu, 5 g/1 kvasinkového extraktu, 10 g/1 NaCl, pH7,3 a přidal se 1,5 % agar) obsahující ampicilin v koncentraci 100 ug/ml. Selekce bakterií obsahující plazmidy se začleněnou sekvencí rostlinné fosforylázy se uskutečnila na základě rozdílu barvy. Polylinker a promotorové sekvence T3 a T7 RNA polymerázy se nacházejí v N-terminální oblasti fragmentu geny lacZ. Plazmidy pUC19, které neobsahují inzerty v polylinkeru rostou ve vhodných bakteriálních kmenech, jako jsou kolonie DH5a bakterie E. coli ve formě modrých kolonií. Selekce na základě barevné formy kolonií se provedla rozetřením 100 ul 2 % X-gal (připravené ve dimethylformamidu) na plotny LB obsahující 50 ug/ml ampicilinu 30 minut před nanesením transformantů. Kolonie obsahující plazmidy, které nenesou inzert, se po 12 až 18 hodinách inkubace při teplotě 37 °C zbarví do modra a kolonie, jejichž plazmid obsahuje inzerty zůstanou bílé. Izolovaný plazmid se sekvenoval, aby se potvrdila přítomnost inzertů fosforylázy. Sekvence se určily za použití sady „ABI Prism Dye Terminátor Cycle Sequencing Core Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) , M13 univerzálních a reverzních primerů a automatizovaného sekvenátoru DNA firmy ABI. Upravené plazmidy se izolovaly z 5 ml kultury kultivované přes noc rychlou alkalickou extrakcí (Birnboim et al. (1979) Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523). Orientace fragmenů SPL a SPH v pUC19 se stanovila štěpením restrikčními enzymy. Štěpily se rekombinantní vektory pUCl9 a binární vektor pBI121 (Clontech), proběhla elektroforéza na agarózovém gelu a fragmenty se čistily gelovou separací, jak se popisuje v publikaci Thuring et al. (1975) Analytical Biochemistry 66: 213-220).

• ·· ·· ·* *· · · · · · · • ·· · · ·· • · · · · ·· · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· • · ·« «·

Ligací se fúzovala kódující sekvence s binárním vektorem pBI121. Ligace obsahovala vektor pBI121, který se štěpil restrikčními enzymy BamHI a Sací a produkt SPL nebo SPH fosforylázové DNA, který vznikl štěpením subklónu pUC19 restrikčním enzymem BamHI a Sací. Ligovaná DNA se transformovala do buněk SCE E. coli DH5a a transformované buňky se nanesly na plotny s LB kultivační půdou obsahující ampicilin. Nukleotidové sekvence kódující DNA SPL a SPH jsou nukleotidy 338 až 993 sekvence SEQ ID NO: 1 a nukleotidy 147 až 799 sekvence SEQ ID NO: 3. Selekce pBI121, který obsahuje inzerty fosforylázy, se provedla pomocí primerů specifických pro CAMV a NOS.

Vzorky 1 a 2 reprezentují fragmenty DNA fosforylázy typu L a H se izolovaly z plotny po kultivaci přes noc. Tyto vzorky se inokulovaly do 5 ml kultivačního média LB a nechaly se růst přes noc při teplotě 37 °C. Plazmidy se extrahovaly rychlou alkalickou extrakcí a DNA se zavedla elektroporací do mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens.

Konstrukce se začlenily do vektoru pBI121, který obsahuje promotor CaMV 35S (Kay et al. (1987) Science 236: 1299-1302) a 3'terminátorovou sekvenci NOS (Bevan et al., (1983) Nátuře (London) 304: 184-187). Plazmid pBI121 obsahuje následující dobře charakterizované segmenty DNA. Fragment o velikosti 0,93 kb izolovaný z transpozonu Tn7, který kóduje rezistenci bakterií na spektinomycin/streptomycin a umožňuje selekci bakterií E. coli a Agrobacterium tumefaciens (Fling et al., (1985) Nucleic Acids Research 13 no. 19, 7095-7106). Tento fragment je spojen s chimérickým genem rezistence na kanamycin, který se je exprimován v rostlinách a umožňuje selekci transformované tkáně. Chimérický gen obsahuje 35S promotor (P-35S) mozaikového viru květáku o velikosti 0,35 kb (Oděli et al., (1985) Nátuře 313, 810-812), dále obsahuje gen fosfotransferázy neomycinu typu II (NPTII) o velikosti 0,83 kb a 3'nepřekládanou oblast genu syntetázy nopalinu (NOS 3') o velikosti 0,26 kb (Fraley et al., (1983) Porc. Nati. Acad. Sci. USA 80, 4803-4807). Další segment je 0,75 kb velký počátek replikace z plazmidu RK2 (ori-V) (Stalker et al., (1981) Mol. Gen. Genet. 181, 8-12). Je spojen se segmentem Sall a Pvul o velikosti 3,1 kb plazmidu pBR322, který obsahuje počátek replikace vhodný pro bakterii E.coli (ori-322) a místo pro konjugační přenos do buněk bakterie Agrobacterium tumefaciens. Dalším fragmentem je 0,36 kb Pvul fragment z plazmidu pTiT37, který obsahuje pravou hraniční oblast T-DNA nopalinu (Fraley et al., (1985) Bio/Technology 3, 629-635). Kódující sekvence se upravila za účelem exprese v hlízách tím, že gen je řízen konstitutivním tkáňově nespecifickým promotorem.

D. Transformace/regenerece rostlin

Vektory SPL a SPH se transformovaly do kultivarů brambor Desiree postupem, který se popisuje v publikaci De Block , M. (1988) Theoretical and Applied Genetics 76: 767-774. Aby došlo k transformaci brambor „Desiree, sterilní výhonky kultur „Desiree se udržovaly v testovacích zkumavkách, které obsahují 8 ml kultivačního média Sl (podle Murashige a Skooga (MS) kultivační médium je doplněno 2 % sacharózou a 0,5 g/1 MES pH 5,7 a 6 g/1 phytagarem). Když rostlinky dosáhly výšky 5 cm, odřízly se jedním řezem kolem báze kousky listů a inokulovaly se kulturou mikroorganizmu Agrobacterium tumefaciens kultivovanou přes noc v ředění 1:1. Stonkové explantáty se kultivovaly společně po dobu 2 dní při teplotě 20 °C v kultivačním médiu Sl (De Block, M. (1988) Theoretical and Applied Genetics 76: 767-774). Pak se explantáty přenesly do kultivačního média S4 (kultivační médium MS, které neobsahuje sacharózu, doplněný 0,5 g/1 MES pH 5, 7, 200 mg/1, 0,5 g/1 PVP, 20 g/1 manitolu, 20 g/1 glukózy, 40 mg/1 adeninu, 1 mg/1 trans zeatinu, 0,1 mg/1 ΝΑΆ, lg/1 karbenicilinu, 50 mg/1 kanamycinu, 6 g/1 phytagaru) a kultivovaly se po dobu 1 » * · 4 ·· ♦· týdne a dále po dobu dvou týdnů, aby se indukovala tvorba kalusu.

Po třech týdnech se explantáty přenesly do kultivačního média S6 (kultivační médium S4, které neobsahuje NAA a obsahuje poloviční koncentraci (500 mg/1) karbenicilinu) Po dalších dvou týdnech kultivace se explentáty přenesly do S8 kultivačního média (kultivační médium S6, který obsahuje karbenicilin v koncentraci 250 mg/1 a 0,01 mg/1 kyseliny giberelové, GA3), aby se podpořila tvorba klíčků. Klíčky se začaly tvořit přibližně po dvou týdnech od přenosu do kultivačního média S8, které vyvolává tvorbu klíčků. Tyto klíčky se odstřihly a přenesly se do zkumavek s kultivačním médiem Sl, které je vhodné pro zakořenění. Po přibližně 6 týdnech znásobení kořenů v kořenícím kultivačním médiu se rostliny přenesly do půdy a postupně se otužovaly.

Rostliny Desiree regenerované v kultuře se přenesly do květníků o objemu 3,78 1 a nechaly se dozrát v podmínkách skleníku. Sklidily se hlízy a nechaly se zkorkovatět při teplotě místnosti po dobu dvou dní. Shromáždily se všechny hlízy, jejichž délka je větší než 2 cm, a skladovaly se při teplotě 4 °C při vysoké vlhkosti.

E. Experimenty na poli

Netransformované kontroly, rostliny exprimující konstrukci SPL a rostliny exprimující konstrukci SPH se pomnožily na poli v jediném replikačním náhodném režimu. Všechny rostliny se nechaly růst vedle sebe na poli a vystavily se působení stejného pesticidu, hnojivá a režimu zavlažování. Sklidily se hlízy a skladovaly se při teplotě 10 °C po dobu 2 týdnů, pak se z každé linie náhodně vybraly frakce hlíz a skladovaly se při teplotě 4 °C.

F. Analýza cukru φφφ · · φ · • φφ · φ φφ • φ · · · « · φ · · · · · · ·· · ·· φφ Φ·

Φ· Φ· • · · · φ φ · φ ··φ · · · φ φ ·· ··

Hlízy se skladovaly při teplotě 4 °C a bezprostředně po té, aniž se uchovávaly při teplotě místnosti, se provedla analýza cukrů. Ze střední části každé hlízy se po délce uřízly nepoškozené plátky (1 cm silné, šířka byla různá, odpovídala vnějšímu rozměru hlízy), tak jsou zastoupeny všechny tkáně hlízy. Při každé sklizni se plátky ze středu hlízy ze čtyř hlíz pro každý klon (3 replikáty) nakrájely na 1 cm kostičky a za účelem analýzy se vybralo náhodně 15 gramů tkáně. Fosforyláza glukanu (uvedeno dále v textu) a cukry se extrahovaly 15 ml pufru Tris (50 mM, pH 7,0), který obsahuje 2 mM bisiřičitan sodný, 2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF a 10 % (hmotnost/hmotnost) glycerolu, v polytronovém homogenizátoru při teplotě 4 °C. Extrakty se centrifugovaly při teplotě 4 °C (30 OOOg po dobu 30 minut) a obsah redukčních cukrů (glukóza a fruktóza) se měřil v 10 krát ředěném supernatantu za použití vysokovýkonné kapalinové chromatografie spojené s detektorem indexu odrazu. Tato separace se uskutečnila při teplotě 80 °C na koloně Aminex HPX 87C (Borad) o rozměrech 30 x 0,78 cm, kdy se jako mobilní fáze použila voda s průtokovou rychlostí 0,6 ml/min. Kalibrace přístroje se provedla autentickými standardy d-glukózy a d-fruktózy.

G. Analýza aktivity fosofrylázy a-glukanu

Hlízy skladované při teplotě 4 °C se podrobily analýze aktivity fosforylázy α-glukanu a isozymů, aniž došlo před extrakcí a analýzou k jejich ohřátí na teplotu místnosti. Metodou popsanou v publikaci (Steup, M. (1990) Starch Degrading Enzymes in „Methods in Plant Biochemistry Vol 3. P.M. Dey and Harborne, eds. Academie Press, London) se testovala in vitro fosforolytická aktivita fosforylázy glukanu. Vzorky extraktů získané za účelem analýzy cukrů (uvedeno shora v textu) se přidaly do reakčního média, které spojuje fosforolýzy škrobu s redukcí NADP pomocí sekvenčního působení fosfoglukomutázy a dehydrogenázy glukóza-6-fosfátu.

·* ·· ·» ·· ·* • · ···· ···· «· · · #· · · · · • ··· ·· · · ··>· ··· »··»·» · φ ·· ·· ·· ·· ·· stechiometrická ze škrobového dvojpaprskovým délce 340 nm.

Rychlost redukce NADP během reakce je s rychlostí produkce glukóza-l-fosfátu substrátu. Redukce NADP se sledovala spektrofotometrem Varian Cary při vlnové

Množství proteinu v extraktu se stanovilo metodou popsanou v publikaci Bradford, Μ. M. (1976) A rapid and sensitive method for quantification of microgram quantities of protein utilízing the principle of protein dye binding. Anal. Biochem. 72: 243-254.

Gely aktivity fosforylázy glukanu se připravily v podstatě podle publikace (Steup, M. (1990) Starch Degrading Enzymes in „Methods in Plant Biochemistry Vol 3. P.M. Dey and Harborne, eds. Academie Press, London). Proteiny se separovaly na přirozených polyakrylových gelech (8,5 %) obsahující 1,5 % glykogen. Pak proběhla elektroforéza při napětí 80 V po dobu 15 hodin při teplotě 4 °C). Gely se inkubovaly po dobu 1 až 2 hodin při teplotě 37 °C v pufru 0,1 M citrátu s NaOH (pH 6,0) obsahující 20 mM glukóza-l-fosfát a 0,05 % (hmotnost/objem) hydrolyzovaného bramborového škrobu. Gely se promyly a Za účelem analýzy westernovým elektroforéza proteinů na polyakrylamidových gelech, které obsahují glykogen, jak se popisuje shora v textu. Proteiny se elektroblotováním přenesly na nitrocelulózu a bloty se testovaly použitím polyklonálních protilátek proti GJTP a GLTP. Imunobloty se vyvijely antikráličími sekundárními protilátkami spojenými s alkalickou fosfatázou (Sigma).

obarvily se roztokem jódu. přenosem se provedla

H. Stanovení barvy lupínků

Pět transgenních linií brambor exprimující kódující sekvenci GLTP, dvě transgenní linie brambor exprimující kódující sekvenci GHTP, kontrolní linie Desiree a dvě kontrolní linie transformované T-DNA vektoru pBI121 se nechaly růst na poli v Albertě v Kanadě. Hlízy se sklidily a skladovaly se při • 4 • Φ ·· • · • ΦΦ 4Φ ·· ·· • · · · • · ··

ΦΦΦ · φ · · • · · · φ

ΦΦ ·· • · · · • · · ·

ΦΦΦ ΦΦ· • · teplotě 10 °C a 4 °C. U všech linií brambor se určila barva lupínků tak, že se z reprezentativních vzorků z každé linie vyřízly středy a smažily se na sojovém oleji při teplotě 99,1 °C po dobu 3 minut, až se přestaly tvořit bubliny.

1. Výsledky

Z rostlin stejného kultivaru (Desiree), stejného stáří rostoucí vedle sebe za stejných podmínek růstu se sklidily všechny hlízy. Northernova analýza hlíz vykazuje podstatnou redukci transkriptu GLTP v transgenních rostlinách, které exprimují homologický kódující transkript (obrázek č. 5). Testy fosforylázy glukanu ukazují, že se při sklizni snížila aktivita (umol NADPH na mg proteinu za hodinu) (tabulka č. 1), což přetrvává u transgenních rostlin exprimujících GLTP kódující DNA alespoň 6 měsíců po sklizni. Výsledky uvedené v tabulce č. 1 ukazují, že aktivita fosforylázy a-glukanu v hlízách skladovaných při teplotě 4 °C po dobu 189 dní se snížila vzhledem ke kontrolnímu kmeni divokého typu přibližně o 16 až 70 % v závislosti na transformovaných druzích brambor, . Gely aktivity a analýza westernovým blotem ukazuje specifickou redukci exprese u homologických enzymů a menší zeslabení exprese v případě heterologních enzymů (obrázek č. 8) . Specifita vůči homologickým produktům může vyplývat z rozdílů mezi fosforylázami (obrázek č. 3 a 4).

Analýza hlíz při sklizni (den 0) ukazuje, že hlízy exprimující antisense transkript GLTP vykazují až 5 krát menší množství redukčních cukrů než kontrolní hlízy (tabulka č. 2) . Dále po 91 dnech skladování při teplotě 4 °C transformované hlízy obsahují o 28 až 39 % nižší koncentrace redukčních cukrů ve srovnání s kontrolním kmenem divokého typu. Koncentrace glukózy a fruktózy se podstatně snížily u hlíz, které exprimují kódující transkript GLTP (tabulka č. 6A a 6B) . Tyto výsledky naznačují, že snížená aktivita GLTP zpomaluje v hlízách katabolickou přeměnu škrobu na redukční cukry,

zatímco u kontrolních hlíz pokračuje hromadění cukrů. Vztah mezi celkovou aktivitou fosforylázy a koncentrací redukčních cukrů není přímý, což naznačuje , že jisté isozymy fosforylázy mohou mít důležitější úlohu při katabolizmu škrobu a že specifické zeslabení exprese určitého isozymu fosforylázy může být výhodnější než v případě jiného isozymu a/nebo že se na snížení množství redukčních cukrů podílejí zatím neurčené interakce.

Transgenní rostliny brambor exprimující kódující transkripty GLTP nebo GHTP rostly na poli a jejich hlízy se skladovaly při teplotě 4 °C. Zbarvení lupínků, které je ve vztahu s obsahem cukru, se stanovilo před uskladněním při nízké teplotě a po 86 a 124 dnech skladování při nízké teplotě. Došlo k podstatnému zlepšení (zesvětlení) zbarvení lupínků hlíz ze všech transgenních rostlin, které exprimují antisense transkript GLTP vzhledem ke kontrolním hlízám (tmavší zbarvení), které se skladují při stejných podmínkách (tabulka č. 5 a obrázek č. 9). Také se zlepšilo skóre lupínků alespoň o 4,3 body respektive o 8,9 bodů, jenž pocházejí z hlíz rostlin brambor „Desiree, které exprimují transkript GLTP. Tato skutečnost se stanovila měřením na Direct Reading Abridged Spectrofotometr model E-15-FP od fimry Agtron ( Agtron lne. 1095 Špice Island Drive #100, Sparks Nevada 89431), které následuje po skladování při teplotě 10 °C a 4 °C podobu 86 dní. Skóre lupínků transformantů GLTP měřené po 124 dnech skladování při teplotě 4 °C se zlepšilo o 44 % až 89 % vzhledem k rostlinám divokému typu (tabulka č. 5).

Kultivar brambor Desiree není požadován pro výrobu lupínků, protože obsahuje velké množství cukrů a během skladování při nízké teplotě rychle sládne. Nicméně u transformovaných brambor Desiree došlo k podstatnému zlepšení zbarvení smažených lupínků. Očekává se, že největšího zesvětlení se dosáhne, jestliže se způsob podle vynálezu aplikuje na odrůdy brambor, které se používají pro komerční zpracování.

Analýza hlíz skladovaných při teplotě 10 °C a 4 °C ukazuje, že tyto hlízy exprimující antisense transkript GHTP poskytují lupínky, které jsou po smažení světlejší než lupínky z kontrolních hlíz, což ukazuje, že tvorba redukčních cukrů je nižší (tabulka č. 5) . Výsledky ukazující heterologní a homologickou redukci fosforylázové aktivity (obrázky č. 10 a 11) indikují, že zlepšení může být výsledkem redukce jedné nebo dvou hlízových fosforyláz. Tyto výsledky však naznačují, že fosforyláza typu L má důležitější úlohu při katabolizmu přeměny škrobu na redukční cukry.

Dále výsledky ukazují, že rozdíly v množství redukčních cukrů (tabulka č. 2) a skóre lupínků (tabulka č. 5) u hlíz rostlin divokého typu a rostlin exprimujících antimediátorovou RNA fosforylázy přetrvávají během dlouhodobého skladování. Jak ukazuje tabulka č. 5 skóre lupínků je přibližně stejné 86 den a 124 den. Po 49 dnech a 91 dnech skladování při teplotě 4 °C (tabulka č. 2) není patrný další vzrůst koncentrací redukčních cukrů. Tato rovnováha v koncentraci cukrů pravděpodobně souvisí s kinetikou hlízových fosforyláz. Schopnost udržovat nižší množství cukrů umožní prodloužit dobu skladování alespoň o několik měsíců. V současné době se brambory určené pro zpracování obvykle skladují maximálně tři až šest měsíců při teplotě 10 °C až 12 °C, pak hromadění cukrů dosáhne hodnoty, která negativně ovlivní jejich kvalitu. Čerstvý produkt se pak musí dovážet dokud není dostupné brambory z další sklizně. Prodloužení doby skladování umožní snížení nákladů na dovoz. Tabulka č. 6 znázorňuje zlepšení různých charakteristik skladování hlíz brambor při nízké teplotě, které se tranformovaly kódující DNA vzhledem ke kontrolním rostlinám, jenž nejsou tranformovány. Toto zlepšení se vyjadřuje v procentech. Uvedená kódující DNA se odvodila ze sekvence genu GLTP (ATL3-ATL9) a ze sekvence genu GHTP (ATH1 a ATH2) . Z výsledků uvedených v tabulce č. 6 je zřejmé, že podstatné zlepšení charakteristik chlazení hlíz při nízké teplotě je

možné dosáhnout způsobem podle vynálezu. Zvláště pozoruhodné jsou procenta zlepšení skóre lupínků ve srovnání s rostlinami divokého typu, kterého se dosáhlo při skladování při teplotě 4 °C po dobu přibližně čtyř měsíců (124 dní) . Zjistilo se 89 % zlepšení v hodnotě skóre lupínků ve srovnání s rostlinami divokého typu. Zlepšené hodnoty skóre lupínků ukazuje na komerční využití vynálezu. To znamená, že snížení sladkosti hlíz vyvolané nízkou teplotou umožňuje skladování při nižší teplotě, aniž dojde k nepřijatelnému tmavnutí bramborových produktů po úpravě smažením.

Snížení akumulace cukru transformovaných linií brambor vzhledem k rostlinám divokého typu jak u hlíz právě sklizených tak u hlíz skladovaných po dobu 91 dní také ukazuje podstatné výhody vynálezu. Snížené hromadění cukru se vztahuje k pozorovanému zlepšení skóre lupínků a také odráží zlepšení specifické hmotnosti hlíz, což je další míra kvality hlíz. Dokonce už při sklizni se u transformovaných rostlin vzhledem k rostlinám divokého typu vykazuje zlepšení skóre lupínků a snížení hromadění cukrů. Pak výhody vynálezu se neomezují na zlepšení, ke kterým dojde po prodlouženém období skladování při nízké teplotě, ale které je prokazatelné i během období sklizně. V tomto smyslu se vynález neomezuje pouze na zlepšení charakteristik skladování při nízké teplotě, ale také se zdůrazňuje zlepšeni charakteristik kvality hlíz, jako je skóre lupínků nebo hromadění cukrů, ke kterému dochází v době sklizně, což vede k včasnějšímu zrání.

S ohledem na specifická zlepšení uvedená v tabulce č. 6, je možné vidět, že transformanty typu GLTP (ATL3-ATL9) vykazují až 66 %, 70 % a 69 % snížení aktivity fosforylázy a-glukanu vzhledem k divokému typu při sklizni a při skladování po dobu 91 a 189 dní. Většina také při sklizni a při skladování po dobu 91 a 189 dní vykazuje zlepšení o 10 a 30 % vzhledem k divokému typu. Při skladování po dobu 91 a 189 dní transformanty typu GHTP (ATH1 a ATH2) vykazují vzhledem ·· · · ·· • · k divokému typu až 28 % a 39 % zlepšení a v obecném případě toto zlepšení je alespoň 10 %.

Transformanty typu GLTP vykazují při sklizni a při skladování po dobu 91 dní vzhledem k divokému typu až 80 % a 39 % snížení hromadění cukru. Při sklizni všechny transformanty typu GLTP vykazují alespoň 10 % a alespoň 30 % zlepšení. 91 den všechny transformanty vykazují alespoň 10 % zlepšení a většina vykazuje alespoň 30 % zlepšení.

Transformanty typu GLTP vykazují vzhledem k divokému typu při sklizni až 46 % zlepšení hodnot skóre lupínků a při skladování po dobu 86 dní se hodnota zlepší o 89 % a při skladování po dobu 124 dní se hodnota zlepší také o 89 %. Skoro všechny transformanty vykazují při sklizni alespoň 10 % a 30 % zlepšení při skladování po dobu 86 a 124 dní. Alespoň jeden z transformantů typu GHTP vykazuje vzhledem k divokému typu při sklizni alespoň 5 % zlepšení a 10 % zlepšení při skladování po dobu 86 a 124 dní. Při skladování po dobu 124 dní alespoň jeden z transformantů typu GHTP vykazuje až 25 % zlepšení hodnoty skóre lupínků.

Výsledky jasně ukazují, že je možné snadno dosáhnout podstatná zlepšení charakteristik skladování při nízké teplotě způsobem podle vynálezu. Výsledky budou kolísat mimo jiné podle pozice rekombinantní kódující a nekódující DNA začleněné v rostlinném genomu a podle počtu začlenění. Je důležité poznamenat, že navzdory kolísání výsledků mezi různými transformovanými liniemi, výsledky mezi vzorky jedné transformované linie brambor kolísají velmi málo (uvedeno v tabulkách č. 1 až 5). Výsledky získané pro všechny transformované linie rostlin brambor, které se úspěšně transformovaly kódující DNA GHTP nebo GLTP se uvádějí v tabulce č. 6. Všechny transformanty vykazují alespoň částečné zlepšení jedné nebo více charakteristik skladování při nízké teplotě, jako je zlepšení hodnot skóre lupínků (světlejší barva při zpracování vařením) a snížení hromadění cukru, a většina z nich vykazuje podstatné • ·

I •» ·· · · 4 4 • · 4 4 4 4 · • 4 · 4 4 4 4 zlepšení. Na základě skutečnosti, že ve vzorcích se nachází velké množství pozitivních transformantů, se očekává, že rostliny brambor transformované způsobem podle vynálezu se mohou snadno testovat, aby se určily transformované linie, které vykazují podstatné zlepšení charakteristik skladování při nízké teplotě. Za použití způsobu podle vynálezu je možné snadno vytvořit a vybrat transformanty, které mají podstatně zlepšené charakteristiky skladování při nízké teplotě. Tyto transformanty vykazují nejvyšší relativní zlepšení vzhledem ke kontrolám divokého typu a proto se mohou použít pro vývoj nových komerčních odrůd brambor.

Tabulka č. 1

Účinky antisense transkriptů na aktivitu fosforylázy glukanu měřené v enzymatických extraktech z hlíz „Desiree pěstovaných na poli.

Aktivita fosforylázy glukanu Doba skladování při teplotě 4°C (dny)
klon	0	49	91	140	189
	/umol NADPH na mg proteinu za	hodinu
Wť	10, 50	11,83	9, 94	11, 90	13, 04
ATL3	4,90	4,86	4, 49	4,73	4,88
ATL4	11, 45	7,17	8, 09	11,32	10, 99
ATL5	3, 58	3, 56	2,97	4,59	4,79
ATL 9	3, 59	3, 88	3, 84	4,72	3, 98
LSD0,05 b	1,97	2, 94	1,59	2, 34	2,58
LSDo, oi	2,87	4,28	2,31	3, 41	3, 75
klonc		0, 01d
WT vs ATL		0, 01
Dny		NS
Klon x dny		0,05

WT	11,49	8,90	12, 66	13, 66
ATH-1	10, 40	9, 69	10, 79	10,10
ATH-2	6,46	6, 40	6, 56	8,38
LSDo,osb	2, 02	0, 41	3, 00	NS
LSDo, 01	4,78	0, 95	NS	NS
klonc	0, 01
WT vs ATL	0, 01
Dny	0, 05
Klon x	NS
dny
aWT, netransformované hlízy podstatný rozdíl při množství období skladování. c zdroje hladina významnosti v případě	divokého typu. bLSD, nejmenší 0,05 nebo 0,01 v případě každého odchylek faktoriálové analýzy. d indikovaných zdrojů variací.

Tabulka č. 2

Účinky antisense transkriptu GLTP na sládnutí na poli pěstovaných hlíz „Desiree vyvolané nízkou teplotou.

Redukční cukry (glukóza a fruktóza)
	Doba skladování	při teplotě 4 °C (dny)
Klon	0	49		91
	^ímol NADPH na mg proteinu	za	hodinu
Wta	5, 63	31,8		28, 0
ATL3	1, 88	17,3		17,3
ATL4	1,11	14,3		20, 1
ATL 5	1,51	18,3		17,0
ATL9	1,36	17,3		18, 5
WT vs ATLb	0, 01	0, 01		0, 05

Klon' ·« 99 • · · 4 » 9 · 4

0, 01^d

Dny 0,01

Klon x dny NS ^aWT, netrans formované hlízy divokého typu. ^bortogonální porovnání v případě ANOVA při každém období skladování. ^c zdroje odchylek faktoriálové analýzy. ^d hladina významnosti v případě indikovaných zdrojů variací.

Tabulka č. 3

Účinky antisense transkriptu GLTP na hromadění fruktózy na poli pěstovaných hlíz „Desiree vyvolané nízkou teplotou.

Fruktóza
	Doba skladování	při teplotě 4 °C (dny)
Klon		0	49	91
		^Umol NADPH na	mg proteinu za	hodinu
Wta		3, 53	15,10	12,20
ATL3		1,21	8,40	8,79
ATL4		0, 79	7,22	8, 56
ATL5		0, 61	10, 00	8, 09
ATL9		0, 54	8, 38	8, 72
WT vs	ATLb	0, 01	0, 01	NS
Klonc			0, 01d
Dny			0, 01
Klon	x dny		NS

^aWT,netransformované hlízy divokého typu. ^bortogonální porovnání v případě ANOVA při každém období skladování. ^c zdroje odchylek faktoriálové analýzy. ^d hladina významnosti v případě indikovaných zdrojů variací.

Tabulka č. 4 • * β ·

Účinky antisense transkriptu GLTP na hromadění glukózy na poli pěstovaných hlíz „Desiree vyvolané nízkou teplotou.

glukóza
	Doba skladování při teplotě 4 °C	(dny)
Klon		0	49	91
		mg na gram	čerstvé hmotnosti
Wta		2, 10	16, 60	15, 90
ATL3		0, 68	8,94	8,49
ATL4		0, 32	7,07	11,06
ATL5		1, 05	8, 33	8,91
ATL9		0, 83	8,87	9,78
WT vs	ATLb	0, 01	0, 01	0, 05
Klonc			0, 01d
Dny			0, 01
Klon	x dny		NS

^aWT, netrans formované hlízy divokého typu. ^bortogonální porovnání v případě ANOVA při každém období skladování. ^c zdroje odchylek faktoriálové analýzy. ^d hladina významnosti v případě indikovaných zdrojů variací.

Tabulka č. 5

Průměrná barva lupínků na poli pěstovaných hlíz „Desiree. Rozsah barvy lupínků se stanovil za použití Agtronmetru, který

se podobá přístroji smažených brambor. U t čísla tím světlejší hodnotě indexu.	užívanému ohoto indexu produkt, ale	v průmyslu k měření barvy platí, že čím vyšší hodnota
barva není	přímo úměrná
Teplota a doba skladování, a měření přístrojem Agtron3
Sklizeň	86 dní	8 6 dní	124 dní
	10 °C	4 °C	4 °C
wF 26	25, 3	15,4	17,1

• · · ♦ ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 • ··· · 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · ·*· ♦· ·♦ »· ·· ··

ATL3C	25	37, 4	26,7	30, 8
ATL4	35	43, 7	29, 1	32,3
ATL5	36	29, 6	24, 7	24, 6
ATL 9	38	38,7	24,3	26, 6
ATHld	26	49, 7	17, 5	21,4
ATH2	29	31,2	15, 6	15, 9
GMP1®	31		15, 7	15,7
GMP2	35		16, 7	16, 6

aAgtron Inc. 1095 Spíce Island Drive	#100, Sparks Nevada 89431.
Agtron model E	-15-FP	(omezený spektrofotometr pro	přímé
odečítání. Měří	odraz	ve dvou	modech spektra	(blízko
infračervenému a	zelené).	Výsledky	reprezentují měření	6 až 8
lupínků ze tří	náhodně	vybraných	hlíz, jejichž průměr je
přibližně 3 až 4	cm.

^bWT, negativní kontrola, netransformované hlízy divokého typu.

^CATL, hlízy transformované hlízovou fosforylázou α-glukanu typu

L.

^CATH, hlízy transformované hlízovou fosforylázou α-glukanu typu

H.

^eGMP, negativní kontrola, hlízy transformované pBI121 T-DNA.

Tabulka č. 6 Souhrn výsledků

vzorek	% snížení aktivity	% snížení	% zlepšení skóre
	fosforylázy a-	hromadění	lupínků vzhledem
	glukanu vzhledem	cukru	k divokému typu
	k divokému typu	vzhledem
		k divokému
		typu

► ·« • · ι I ·«

	Při sklizni	91 dní	189 dní	Při sklizni	91 dní	Při sklizni	86 dní	124 dní
ATL3	53	55	63	67	38	-4	73	80
ATL4	-9	19	16	80	28	35	89	89
ATL5	66	70	63	73	39	38	60	44
ATL9	66	61	69	76	34	46	58	56
ATH1	n/a	-9	26	n/a	n/a	0	14	25
ATH2	n/a	28	39	n/a	n/a	12	1	-7

-ř

Literatura

Ecker and Davis (1986) Proč. Nati. Acad. Sci. 83: 5373-5376 Kawchuk et al. (1990) Molecular Plant-Microbe Interactions 3: 301-307

Laemmli, U.K. (1970) Nátuře (London) 227: 680-685

Lin et al. (1988) Plant Physiol. 86: 1131-1135

Loiselle et al. (1990) American Potato Journal 67: 633-646

Lynch et al. (1992) Can. J. Plant Sci. 72: 535-543 Smith et al. (1988) Nátuře 334: 724-726

Sowokinos, J. (1990) In: The molecular and Cellular Biology of the Potato. M.A. Mayo nad W.D. Parks (eds.) • ·* *· 99 ·* · · 9 9 9 9 • ·♦ 9 4 99

9« 9 4 9 9

999 94 94 9«

99

4 9 9

9 4 9

9 • 9 99

Sekvenční protokol (1) Obecné informace:

(i)	Přihlašovatel: Department of	Agriculture	and Agri-
	Food Canada
(ii)	Název vynálezu: Rostlina	brambor	vykazuj ící
	zlepšení charakteristiky skladování hlíz	v chladu.
(iii)	Počet sekvencí: 10
(iv)	Adresa:

(A) Adresa: McKay-Carey and Company (B) Ulice: 2125 Commerce Plače, 10155-102^nd Street (C) Město: Edmonton (D) Stát: Alberta (E) Země: Kanada (F) Kód: T5J 4G8 (v) Forma zápisu počítačem:

(A)	Tup média	: disketa
(B)	Počítač:	IBM kompatibilní
(C)	Operační	systém: PC-DOS(MS-DOS
(D)	Software:	Patentln #1.0, verze

(vi) Informace o přihlašovateli:

	(A)	Číslo přihlášky: WO
	(B)	Datum podání: 10.února 1998
	(C)	Klasifikace:
(vil)	Informace o předchozím přihlašovateli:
	(A)	Číslo přihlášky: US 60/036, 946
	(B)	Datum podání: 10. Února 1997
(vil)	Informace o předchozím přihlašovateli:
	(A)	Číslo přihlášky: US 08/868,786
	(B)	Datum podání: 4. Června 1997

(viii) Informace o patentovém zástupci:

(A) Jméno: McKay-Carey, Mary Jane (B) Číslo registrace: 3790 (C) Reference: 24002WO0 • 99

9 9 • 99

9 9 • 9 9

9 9 9 9

99 • 9 9 9 • * 99

9 9 9

9 9 9

99

999 ···

9

99 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: (403) 424 0222 (B) FAX: (403) 421 0834 (2) Informace o SEQ ID NO: 1:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 3101 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organizmus: Solanum tuberosum (ix)Znaky:

(A)	Název/klíč: CDS
(B)	Pozice: 44 .. 2944
(C)	Jiné informace: produktem je bramborová hlízové
	fosforylázy α-glukanu typu L

(ix)Znaky:

(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Pozice: 194 .. 2941 (ix)Znaky:

(A) Název/klíč: sig_peptid (B) Pozice: 44 .. 193 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

ATCACTCTCA TTCGAAAAGC TAGATTTGCA TAGAGAGCAC AAA ATG GCG ACT GCA 55

Met Ala Thr Ala -50

AAT GGA GCA Asn Gly Ala

CAC His

TTG Leu

TTC AAC

CAT TAC AGC TCC AAT

TCC AGA TTC ATC

103

Phe

Asn -40

His

Tyr

Ser

Ser

Asn -35

Ser

Arg

Phe

Ile

-45

CAT

TTC

ACT

TCT

AGA

AAC

ACA

AGC

TCC

AAA

TTG

TTC

CTT

ACC

AAA

ACC

151

His

Phe

Thr

Ser

Arg

Asn

Thr

Ser

Ser

Lys

Leu

Phe

Leu

Thr

Lys

Thr

-30

-25

-20

-15

TCC

CAT

TTT

CGG

AGA

CCC

AAA

CGC

TGT

TTC

CAT

GTC

AAC

AAT

ACC

TTG

199

Ser

His

Phe

Arg

Arg

Pro

Lys

Arg

Cys

Phe

His

Val

Asn

Asn

Thr

Leu

-10

-5

1

AGT

GAG

AAA

'ATT

CAC

CAT

CCC

ATT

ACT

GAA

CAA

GGT

GGT

GAG

AGC

GAC

247

Ser

Glu

Lys

Tle

His-

His

Pro

Ile

Thr

Glu

Gin

Gly

Gly

Glu

Ser

Asp

10-15 ·♦ 99 • 9 9 9 « 9 99

9 9

9 9 • 9 99 • 9 9 9 • 9 9 9

999 999

CTG AGT TCT TTT

GCT Ala TTC Phe

CCT GAT GCC Pro Asp Ala 25 ACA CCT GTA

GCA Ala TTC Phe

TCT Ser TCT Ser

ATT ACC Ile Thr 30 CCT GAA

TCA AGT ATC

AAA Lys CTC Leu 50

295 343

Leů TAC Tyr 35

Ser 20 CAT His

Ser Phe gca' gaa

Ser AGG Arg

Ser TTT Phe

Ile GAG Glu

Ala

Glu

Thr 40

Pro Val

Pro 45

Glu

CCT

AAG

GCA

TTC

TTT

GCA

ACA

GCT

CAA

AGT

GTT

CGT

GAT

TCG

CTC

CTT

391

Pro

Lys

Ala

Phe

Phe

Ala

Thr

Ala

Gin

Ser

Val

Arg

Asp

Ser

Leu

Leu

55

60

65

ATT

AAT

TGG

AAT

GCT

ACG

TAT

GAT

ATT

TAT

GAA

AAG

CTG

AAC

ATG

AAG

439

Ile

Asn

Trp

Asn

Ala

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Glu

Lys

Leu

Asn

Met

Lys

70

75

80

CAA

GCG

TAC

TAT

CTA

TCC

ATG

GAA

TTT

CTG

CAG

GGT

AGA

GCA

TTG

TTA

487

Gin

Ala

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Phe

Leu

Gin

Gly

Arg

Ala

Leu

Leu

85

90

> Λ

95

AAT

GCA

ATT

GGT

AAT

CTG

GAG

CTT

ACT

GGT

GCA

TTT

GCG

GAA

GCT

TTG

535

Asn

Ala

Ile

Gly

Asn

Leu

Glu

Leu

Thr

Gly

Ala

Phe

Ala.

Glu

Ala

Leu

100

105

110

AAA

AAC

CTT

GGC

CAC

AAT

CTA

GAA

AAT

GTG

GCT

TCT

CAG

GAA

CCA

GAT

583

Lys

Asn

Leu

Gly

His

Asn

Leu

Glu

Asn

Val

Ala

Ser

Gin

Glu

Pro

Asp

115

120

125

13 0

GCT

GCT

CTT

GGA

AAT

GGG

GGT

TTG

GGA

CGG

CTT

GCT

TCC

TGT

TTT

CTG

631

Ala

Ala

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

Arg

Leu

Ala

Ser

Cys

Phe

Leu

135

140

145

GAC

TCT

TTG

GCA

ACA

CTA

AAC

TAC

CCA

GCA

TGG

GGC

TAT

GGA

CTT

AGG

679

Asp

Ser

Leu

Ala

Thr

Leu

Asn

Tyr

Pro

Ala

Trp

Gly

Tyr

Gly

Leu

Arg

150

155

160

TAC

AAG

TAT

GGT

TTA

TTT

AAG

CAA

CGG

ATT

ACA

AAA

GAT

GGT

CAG

GAG

727

Tyr

Lys

Tyr

Gly

Leu

Phe

Lys

Gin

Arg

Ile

Thr

Lys

Asp

Gly

Gin

Glu

165

170

175

GAG

GTG

GCT

GAA

GAT

TGG

CTT

GAA

ATT

GGC

AGT

CCA

TGG

GAA

GTT

GTG

775

Glu

Val

Ala

Glu

Asp

Trp

Leu

Glu

Ile

Gly

Ser

Pro

Trp

Glu

Val

Val

180

185

190

AGG

AAT

GAT

GTT

TCA

TAT

CCT

ATC

AAA

TTC

TAT

GGA

AAA

GTC

TCT

ACA

823

Arg

Asn

Asp

Val

Ser

Tyr

Pro

Ile

Lys

Phe

Tyr

Gly

Lys

Val

Ser

Thr

195

200

205

210

GGA

TCA

GAT

GGA

AAG

AGG

TAT

TGG

ATT

GGT

GGA

GAG

GAT

ATA

AAG

GCA

871

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Arg

Tyr

Trp

Ile

Gly

Gly

Glu

Asp

Ile

Lys

Ala

215.

220

225

GTT

GCG

TAT

GAT

GTT

CCC

ATA

CCA

GGG

TAT

AAG

ACC

AGA

ACC

ACA

ATC

919

Val

Ala

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

Tyr

Lys

Thr

Arg

Thr

Thr

Ile

230

235

240

AGC

CTT

CGA

CTG

TGG

TCT

ACA

CAG

GTT

CCA

TCA

GCG

GAT

TTT

GAT

TTA

967

Ser

Leu

Arg

Leu

Trp

Ser

Thr

Gin

Val

Pro

Ser

Ala

Asp

Phe

Asp

Leu

245

250

255

• ·« ·· · * • »· • * · · • · ·

9 9 9 ·· · · · « • ·*

9

9 ♦ 9

99

9 9 9

9 9 9

999 999 ·

99

TCT GCT TTC AAT

GCT Ala

GGA Gly

GAG Glu 265

CAC His

ACC Thr

AAA GCA TGT GAA GCC CAA GCA

1015

Ser

Ala 260

Phe

Asn

Lys

Ala

Cys 270

Glu

Ala

Gin

Ala

AAC

GCT

GAG

AAG

ATA

TGT

TAC

ATA

CTC

TAC

CCT

GGG

GAT

GAA

TCA

GAG

1063

Asn

Ala

Glu

Lys

Ile

Cys

Tyr

Ile

Leu

Tyr

Pro

Gly

Asp

Glu

Ser

Glu

275

280

285

290

GAG

GGA

AAG

ATC

CTT

CGG

TTG

AAG

CAA

CAA

TAT

ACC

TTA

TGC

TCG

GCT

1111

Glu

Gly

Lys

Ile

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Gin

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala

295

300

305

TCT

CTC

CAA

GAT

ATT

ATT

TCT

CGA

TTT

GAG

AGG

AGA

TCA

GGT

GAT

CGT

1159

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Ile

Ser

Arg

Phe

Glu

Arg

Arg

Ser

Gly

Asp

Arg

310

315

A .

320

ATT

AAG

TGG

GAA

GAG

TTT

CCT

GAA

AAA

GTT

GCT

GTG

CAG

ATG

AAT

GAC

1207

Ile

Lys

Trp

Glu

Glu

Phe

Pro

Glu

Lys

Val

Ala

Val

Gin

Met

Asn

Asp

325

330

335'

ACT

CAC

CCT

ACA

CTT

TGT

ATC

CCT

GAG

CTG

ATG

AGA

ATA

TTG

ATA

GAT

1255

Thr

His

Pro

Thr

Leu

Cys

Ile

Pro

Glu

Leu

Met

Arg

Ile

Leu

Ile

Asp

340

345

350

CTG

AAG

GGC

TTG

AAT

TGG

AAT

GAA

GCT

TGG

AAT

ATT

ACT

CAA

AGA

ACT

1303

Leu

Lys

Gly

Leu

Asn

Trp

Asn

Glu

Ala

Trp

Asn

Ile

Thr

Gin

Arg

Thr

355

360

365

370

GTG

GCC

TAC

ACA

AAC

CAT

ACT

GTT

TTG

CCT

GAG

GCA

CTG

GAG

AAA

TGG

1351

Val

Ala

Tyr

Thr

Asn

His

Thr

Val

Leu

Pro

Glu

Ala

Leu

Glu

Lys

Trp

375

380

385

AGT

TAT

GAA

TTG

ATG

CAG

AAA

CTC

CTT

CCC

AGA

CAT

GTC

GAA

ATC

ATT

1399

Ser

Tyr

Glu

Leu

Met

Gin

Lys

Leu

Leu

Pro

Arg

His

Val

Glu

Ile

Ile

390

395

400

GAG

GCG

ATT

GAC

GAG

GAG

CTG

GTA

CAT

GAA

ATT

GTA

TTA

AAA

TAT

GGT

1447

Glu

Ala

Ile

Asp

Glu

Glu

Leu

Val

His

Glu

Ile

Val

Leu

Lys

Tyr

Gly

405

410

415

TCA

ATG

GAT

CTG

AAC

AAA

TTG

GAG

GAA

AAG

TTG

ACT

ACA

ATG

AGA

ATC

1495

Ser

Met

Asp

Leu

Asn

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Thr

Thr

Met

Arg

Ile

420

425

430

TTA

GAA

AAT

TTT

GAT

CTT

CCC

AGT

TCT

GTT

GCT

GAA

TTA

TTT

ATT

AAG

1543

Leu

Glu

Asn

Phe

Asp

Leu

Pro

Ser

Ser

Val

Ala

Glu

Leu

Phe

Ile

Lys

435

440

445

·

450

CCT

GAA

ATC

TCA

GTT

GAT

GAT

GAT

ACT

GAA

ACA

GTA

GAA

GTC

CAT

GAC

1591

Pro

Glu

Ile

Ser

Val

Asp

Asp

Asp

Thr

Glu

Thr

Val

Glu

Val

His

Asp

455

460

465

AAA

GTT

GAA

GCT

TCC

GAT

AAA

GTT

GTG

ACT

AAT

GAT

GAA

GAT

GAC

ACT

1639

Lys

Val

Glu

Ala

Ser

Asp

Lys

Val

Val

Thr

Asn

Asp

Glu

Asp

Asp

Thr

470

475

480

56&

• Φ ·· * · ΦΦ • · · φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦ ΦΦ ·· ·· • φ φ • φ φ φ φφφ φφφ φ φ

ΦΦ ΦΦ

GGT AAG AAA ACT AGT GTG AAG

ATA GAA GCA Ile Glu Ala 490

GCT GCA GAA AAA GAC ATT

1687

Gly

Lys

Lys Thr 485

Ser

Val

Lys

Ala

Ala Glu 495

Lys

Asp

Ile

GAC

AAG

AAA

ACT

ccc

GTG

AGT

CCG

GAA

CCA

GCT

GTT

ATA

CCA

CCT

AAG

1735

Asp

Lys

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Pro

Glu

Pro

Ala

Val

Ile

Pro

Pro

Lys

500

505

510

AAG

GTA

CGC

ATG

GCC

AAC

TTG

TGT

GTT

GTG

GGC

GGC

CAT

GCT

GTT

AAT

1783

Lys

Val

Arg

Met

Ala

Asn

Leu

Cys

Val

Val

Gly

Gly

His

Ala

Val

Asn

515

520

525

530

GGA

GTT

GCT

GAG

ATC

CAT

AGT

GAA

ATT

GTG

AAG

GAG

GAG

GTT

TTC

AAT

1831

Gly

Val

Ala

Glu

Ile

His

Ser

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

Glu

Val

Phe

Asn

535

540 > A,

545

GAC

TTC

TAT

GAG

CTC

TGG

CCG

GAA

AAG

TTC

CAA

AAC

AAA

ACA

AAT

GGA

1879

Asp

Phe

Tyr

Glu

Leu

Trp

Pro

Glu

Lys

Phe

Gin

Asn

Lys.

Thr

Asn

Gly

550

555

560

GTG

ACT

CCA

AGA

AGA

TGG

ATT

CGT

TTC

TGC

AAT

CCT

CCT

CTT

AGT

GCC

1927

Val

Thr

Pro

Arg

Arg

Trp

Ile

Arg

Phe

Cys

Asn

Pro

Pro

Leu

Ser

Ala

565

570

575

ATC

ATA

ACT

AAG

TGG

ACT

GGT

ACA

GAG

GAT

TGG

GTC

CTG

AAA

ACT

GAA

1975

Ile

Ile

Thr

Lys

Trp

Thr

Gly

Thr

Glu

Asp

Trp

Val

Leu

Lys

Thr

Glu

580

585

590

AAG

TTG

GCA

GAA

TTG

CAG

AAG

TTT

GCT

GAT

AAT

GAA

GAT

CTT

CAA

AAT

2023

Lys

Leu

Ala

Glu

Leu

Gin

Lys

Phe

Ala

Asp

Asn

Glu

Asp

Leu

Gin

Asn

595

600

605

610

GAG

TGG

AGG

GAA

GCA

AAA

AGG

AGC

AAC

AAG

ATT

AAA

GTT

GTC

TCC

TTT

2071

Glu

Trp

Arg

Glu

Ala

Lys

Arg

Ser

Asn

Lys

Ile

Lys

Val

Val

Ser

Phe

615

620

625

CTC

AAA

GAA

AAG

ACA

GGG

TAT

TCT

GTT

GTC

CCA

GAT

GCA

ATG

TTT

GAT

2119

Leu

Lys

Glu

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ser

Val

Val

Pro

Asp

Ala

Met

Phe

Asp

630

635

640

ATT

CAG

GTA

AAA

CGC

ATT

CAT

GAG

TAC

AAG

CGA

CAA

CTG

TTA

AAT

ATC

2167

Ile

Gin

Val

Lys

Arg

Ile

His

Glu

Tyr

Lys

Arg

Gin

Leu

Leu

Asn

Ile

645

650

655

TTC

GGC

ATC

GTT

.TAT

CGG

TAT

AAG

AAG

ATG

AAA

GAA

ATG

ACA

GCT

GCA

2215

Phe

Gly

Ile

Val

Tyr

Arg

Tyr

Lys

Lys

Met

Lys

Glu

Met

Thr

Ala

Ala

660

-

665

670

GAA

AGA

AAG

ACT

AAC

TTC

GTT

CCT

CGA

GTA

TGC

ATA

TTT

GGG

GGA

AAA

2263

Glu

Arg

Lys

Thr

Asn

Phe

Val

Pro

Arg

Val

Cys

Ile

Phe

Gly

Gly

Lys

675

680

685

690

GCT

TTT

GCC

'ACA

TAT

GTG

CAA

GCC

AAG

AGG

ATT

GTA

AAA

TTT

ATC

ACA

2311

Ala

Phe

Ala

Thr

Tyr

Val

Gin

Ala

Lys

Arg

Ile

Val

Lys

Phe

Ile

Thr

695

700

705

99 99 99

9 9 9 9 9 9 9 • 9 99 9999

999 99 99 99 99 99

GAT GTT

GGT GCT ACT ΑΤΑ AAT CAT GAT

CCA. GAA

ATC GGT GAT

CTG Leu

TTG Leu

2359

Asp

Val

Gly

Ala 710

Thr

Ile

Asn His

Asp 715

Pro

Glu

Ile

Gly

Asp 720

AAG

GTA

GTC

TTT

GTG

CCA

GAT TAC

AAT

GTC

AGT

GTT

GCT

GAA

TTG

CTA

2407

Lys

Val

Val

Phe

Val

Pro

Asp Tyr

Asn

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Leu

Leu

725

730

735

ATT

CCT

GCT

AGC

GAT

CTA

TCA GAA

CAT

ATC

AGT

ACG

GCT

GGA

ATG

GAG

2455

Ile

Pro

Ala

Ser

Asp

Leu

Ser Glu

His

Ile

Ser

Thr

Ala

Gly

Met

Glu

740

745

750

GCC

AGT

GGA

ACC

AGT

AAT

ATG AAG

TTT

GCA

ATG

AAT

GGT

TGT

ATC

CAA

2503

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Asn

Met Lys

Phe

Ala

Met

Asn

Gly

Cys

Ile

Gin

755

760

A .

765 s

770

ATT

GGT

ACA

TTG

GAT

GGC

GCT AAT

GTT

GAA

ATA

AGG

GAA

GAG

GTT

GGA

2551

Ile

Gly

Thr

Leu

Asp

Gly

Ala Asn

Val

Glu

Ile

Arg

Glu

Glu

Val

Gly

775

780

785

GAA

GAA

AAC

TTC

TTT

CTC

TTT GGT

GCT

CAA

GCT

CAT

GAA

ATT

GCA

GGG

2599

Glu

Glu

Asn

Phe

Phe

Leu

Phe Gly

Ala

Gin

Ala

His

Glu

Ile

Ala

Gly

790

795

800

CTT

AGA

AAA

GAA

AGA

GCT

GAC GGA

AAG

TTT

GTA

CCT

GAT

GAA

CGT

TTT

2647

Leu

Arg

Lys

Glu

Arg

Ala

Asp Gly

Lys

Phe

Val

Pro

Asp

Glu

Arg

Phe

805

810

815

GAA

GAG

GTG

AAG

GAA

TTT

GTT AGA

AGC

GGT

GCT

TTT

GGC

TCT

TAT

AAC

2695

Glu

Glu

Val

Lys

Glu

Phe

Val Arg

Ser

Gly

Ala

Phe

Gly

Ser

Tyr

Asn

820

825

830

TAT

GAT

GAC

CTA

ATT

GGA

TCG TTG

GAA

GGA

AAT

GAA

GGT

TTT

GGC

CGT

2743

Tyr

Asp

Asp

Leu

Ile

Gly

Ser Leu

Glu

Gly

Asn

Glu

Gly

Phe

Gly

Arg

835

840

845

850

GCT

GAC

TAT

TTC

CTT

GTG

GGC AAG

GAC

TTC

CCC

AGT

TAC

ATA

GAA

TGC

2791

Ala

Asp

Tyr

Phe

Leu

Val

Gly Lys

Asp

Phe

Pro

Ser

Tyr

Ile

Glu

Cys

855

860

865

CAA

GAG

AAA

GTT

GAT

GAG

GCA TAT

CGC

GAC

CAG

AAA

AGG

TGG

ACA

ACG

2839

Gin

Glu

Lys

Val

Asp

Glu

Ala Tyr

Arg

Asp

Gin

Lys

Arg

Trp

Thr

Thr

870

875

880

ATG

TCA

ATC

TTG

AAT

ACA

GCG GGA

TCG

TAC

AAG

TTC

AGC

AGT

GAC

AGA

2887

Met

Ser

Ile

Leu

Asn

Thr

Ala Gly

Ser

Tyr

Lys

Phe

Ser

Ser

Asp

Arg

885

-

890

895

ACA

ATC

CAT

GAA

TAT

GCC

AAA GAC

ATT

TGG

AAC

ATT

GAA

GCT

GTG

GAA

2935

Thr

Ile

His

Glu

Tyr

Ala

Lys Asp

Ile

Trp

Asn

Ile

Glu

Ala

Val

Glu

900

905

910

ATA

GCA

TAA

GAGGGGGAAG TGAATGAAAA ATAACAAAGG CACAGTAAGT

2984

Ile Ala *

915

AGTTTCTCTT TTTATCATGT GATGAAGGTA TATAATGTAT GTGTAAGAGG ATGATGTTAT 3044 TACCACATAA TAAGAGATGA AGAGTCTCAT TTTGCTTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 3101 *9 • 9 · • 9 99 99 99

9 9 9 9 9 · • 99 · 9 9 9

99 999 999

9 9 9 9

99 99 99 (2) Informace o SEQ ID NO: 2:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 967 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2

Met Ala -50

Thr

Ala

Asn.

Gly -45

Ala

His

Leu

Phe

Asn -40

His

Tyr

Ser

Ser

Asn -35

Ser

Arg

Phe

Ile

His

Phe

Thr

Ser

Arg

Asn

Thr

Ser

Ser

Lys

Leu

Phe

-30

-25

-20

Leu

Thr

Lys

Thr

Ser

His

Phe

Arg

Arg

Pro

Lys

Arg

Cys

Phe

His

Val

-15

-10

-5

Asn

Asn

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Ile

His

His

Pro

Ile

Thr

Glu

Gin

Gly

1

5

10

Gly

Glu

Ser

Asp

Leu

Ser

Ser

Phe

Ala

Pro

Asp

Ala

Ala

Ser

Ile

Thr

15

20

25

30

Ser

Ser

Ile

Lys

Tyr

His

Ala

Glu

Phe

Thr

Pro

Val

Phe

Ser

Pro

Glu

35

40

45

Arg

Phe

Glu

Leu

Pro

Lys

Ala

Phe

Phe

Ala

Thr

Ala

Gin

Ser

Val

Arg

50

55

60

Asp

Ser

Leu

Leu

Ile

Asn

Trp

Asn

Ala

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Glu

Lys

65

70

75

Leu

Asn

Met

Lys

Gin

Ala

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Phe

Leu

Gin

Gly

80

85

90

Arg

Ala

Leu

Leu

Asn

Ala

Ile

Gly

Asn

Leu

Glu

Leu

Thr

Gly

Ala

Phe

95

100

105

110

Ala

Glu

Ala

Leu

Lys-

Asn

Leu

Gly

His

Asn

Leu

Glu

Asn

Val

Ala

Ser

115

120

125

Gin

Glu

Pro

Asp

Ala

Ala

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

Arg

Leu

Ala

130 135 140

Ser Cys Phe Leu Asp Ser Leu Ala Thr Leu Asn Tyr Pro Ala Trp Gly 145 150 155

4 0 9 9 9 9 · 9 9 ·· 0 9 9 9 0 9*9 « 9«9 «« 9 · ··· 990

999900 · · ·· · · ·· ·· · *

Tyr Gly Leu Arg Tyr Lys Tyr Gly Leu

Phe

Lys

Gin 170

Arg

Ile

Thr

Lys

160

165

Asp

Gly

Gin

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Asp

Trp

Leu

Glu

Ile

Gly

Ser

Pro

175

180

185

190

Trp

Glu

Val

Val

Arg

Asn

Asp

Val

Ser

Tyr

Pro

Ile

Lys

Phe

Tyr

Gly

195

200

205

Lys

Val

Ser

Thr

Gly

Ser

Asp

Gly

Lys

Arg

Tyr

Trp

Ile

Gly

Gly

Glu

210

215

220

Asp

Ile

Lys

Ala

Val

Ala

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

Tyr

Lys

Thr

225

230

235

Arg

Thr

Thr

Ile

Ser

Leu

Arg

Leu

Trp

SeY

'Thr

Gin

Val

Pro

Ser

Ala

240

245

250

Asp

Phe

Asp

Leu

Ser

Ala

Phe

Asn

Ala

Gly

Glu

His

Thr

Lys

Ala

Cys

255

260

265

270

Glu

Ala

Gin

Ala

Asn

Ala

Glu

Lys

Ile

Cys

Tyr

Ile

Leu

Tyr

Pro

Gly

275

280

285

Asp

Glu

Ser

Glu

Glu

Gly

Lys

Ile

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Gin

Tyr

Thr

290

295

300

Leu

Cys

Ser

Ala

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Ile

Ser

Arg

Phe

Glu

Arg

Arg

305

310

315

Ser

Gly

Asp

Arg

Ile

Lys

Trp

Glu

Glu

Phe

Pro

Glu

Lys

Val

Ala

Val

320

325

330

Gin

Met

Asn

Asp

Thr

His

Pro

Thr

Leu

Cys

Ile

Pro

Glu

Leu

Met

Arg

335

340

345

350

Ile

Leu

Ile

Asp

Leu

Lys

Gly

Leu

Asn

Trp

Asn

Glu

Ala

Trp

Asn

Ile

355

360

365

Thr

Gin

Arg

Thr

Val

Ala

Tyr

Thr

Asn

His

Thr

Val

Leu

Pro

Glu

Ala

370

375

380

Leu

Glu

Lys

Trp

Ser

Tyr

Glu

Leu

Met

Gin

Lys

Leu

Leu

Pro

Arg

His

385

390

395

Val

Glu

Ile

Tle

Glu

Ala

Ile

Asp

Glu

Glu

Leu

Val

His

Glu

Ile

Val

400

-

405

410

Leu

Lys

Tyr

Gly

Ser

Met

Asp

Leu

Asn

Lys

Leu

Glu

Glu

Lys

Leu

Thr

415

420

425

430

Thr

Met

Arg

Ile

Leu

Glu

Asn

Phe

Asp

Leu

Pro

Ser

Ser

Val

Ala

Glu

•

435

440

445

·· ·« ·· ·· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 Λ 9 9 9 9

99 99 99 99 99

Leu

Phe

Ile

Lys

Pro

Glu

Ile

Ser

Val

Asp

Asp

Asp

Thr

Glu

Thr

Val

450

455

460

Glu

Val

His

Asp

Lys

Val

Glu

Ala

Ser

Asp

Lys

Val

Val

Thr

Asn

Asp

465

470

475

Glu

Asp

Asp

Thr

Gly

Lys

Lys

Thr

Ser

Val

Lys

Ile

Glu

Ala

Ala

Ala

480

485

490

Glu

Lys

Asp

Ile

Asp

Lys

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Pro

Glu

Pro

Ala

Val

495

500

505

510

Ile

Pro

Pro

Lys

Lys

Val

Arg

Met

Ala

Asn

Leu

Cys

Val

Val

Gly

Gly

515

520

525

His

Ala

Val

Asn

Gly

Val

Ala

Glu

Ile

5 Λ His

Ser

Glu

Ile

Val

Lys

Glu

530

535

540

Glu

Val

Phe

Asn

Asp

Phe

Tyr

Glu

Leu

Trp

Pro

Glu

Lys

Phe

Gin

Asn

545

550

555

Lys

Thr

Asn

Gly

Val

Thr

Pro

Arg

Arg

Trp

Ile

Arg

Phe

Cys

Asn

Pro

560

565

570

Pro

Leu

Ser

Ala

Ile

Ile

Thr

Lys

Trp

Thr

Gly

Thr

Glu

Asp

Trp

Val

575

580

585

590

Leu

Lys

Thr

Glu

Lys

Leu

Ala

Glu

Leu

Gin

Lys

Phe

Ala

Asp

Asn

Glu

595

600

605

Asp

Leu

Gin

Asn

Glu

Trp

Arg

Glu

Ala

Lys

Arg

Ser

Asn

Lys

Ile

Lys

610

615

620

Val

Val

Ser

Phe

Leu

Lys

Glu

Lys

Thr

Gly

Tyr

Ser

Val

Val

Pro

Asp

625

630

635

Ala

Met

Phe

Asp

Ile

Gin

Val

Lys

Arg

Ile

His

Glu

Tyr

Lys

Arg

Gin

640

645

650

Leu

Leu

Asn

Ile

Phe

Gly

Ile

Val

Tyr

Arg

Tyr

Lys

Lys

Met

Lys

Glu

655

660

665·

670

Met

Thr

Ala

Ala

Glu

Arg

Lys

Thr

Asn

Phe

Val

Pro

Arg

Val

Cys

Ile

675

680

685

Phe

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Ala

Thr

Tyr

Val

Gin

Ala

Lys

Arg

Ile

Val

690

-

695

700

Lys

Phe

Ile

Thr

Asp

Val

Gly

Ala

Thr

Ile

Asn

His

Asp

Pro

Glu

Ile

705

710

715

Gly

Asp

Leu

Leu

Lys

Val

Val

Phe

Val

Pro

Asp

Tyr

Asn

Val

Ser

Val

720

*

725

730

44 44 44 • 4 4 4 4444

4 44 4 4 4 4

4 4 4 4 44 4 494

4 4 4 4 4

44 44 44 • ·· ·· · φ • ·· • · 4 4

4 4

444 44

Ala 735

Glu Leu

Leu

Ile

Pro 740

Ala

Ser

Asp

Leu

Ser 745

Glu

His

Ile

Ser

Thr 750

Ala

Gly

Met

Glu

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Asn

Met

Lys

Phe

Ala

Met

Asn

755

760

765

Gly

Cys

Ile

Gin

Ile

Gly

Thr

Leu

Asp

Gly

Ala

Asn

Val

Glu

Ile

Arg

770

775

780

Glu

Glu

Val

Gly

Glu

Glu

Asn

Phe

Phe

Leu

Phe

Gly

Ala

Gin

Ala

His

785

790

795

Glu

Ile

Ala

Gly

Leu

Arg

Lys

Glu

Arg

Ala

Asp

Gly

Lys

Phe

Val

Pro

800

805

810

Asp

Glu

Arg

Phe

Glu

Glu

Val

Lys

Glu

Pňe'

Val

Arg

Ser

Gly

Ala

Phe

815

820

825

830

Gly

Ser

Tyr

Asn

Tyr

Asp

Asp

Leu

Ile

Gly

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

Glu

835

840

845

Gly

Phe

Gly

Arg

Ala

Asp

Tyr

Phe

Leu

Val

Gly

Lys

Asp

Phe

Pro

Ser

850

855

860

Tvr

Ile

Glu

Cys

Gin

Glu

Lys

Val

Asp

Glu

Ala

Tyr

Arg

Asp

Gin

Lys

865

870

875

Arg

Trp

Thr

Thr

Met

Ser

Ile

Leu

Asn

Thr

Ala

Gly

Ser

Tyr

Lys

Phe

880

885

890

Ser

Ser

Asp

Arg

Thr

Ile

His

Glu

Tyr

Ala

Lys

Asp

Ile

Trp

Asn

Ile

895

900

905

910

Glu

Ala

Val

Glu

Ile

Ala

ir

915 (2) Informace ο SEQ ID NO: 3:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 2655 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (vi) Původní zdroj:

(A) Organizmus: Solanum tuberosum (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 12 ..2528 • · (C) Jiné informace: produktem je bramborová hlízové fosforylázy α-glukanu typu H (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Pozice: 12 ..2525 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:

GTTTATTTTC C ATG GAA GGT GGT GCA AAA TCG AAT GAT GTA· TCA GCA GCA 50

Met Glu Gly Gly Ala Lys Ser Asn Asp Val Ser Ala Ala

10

CCT ATT GCT CAA CCA CTT TCT

GAA GAC CCŤ ACT GAC ATT GCA

TCT Ser

AAT Asn

98

Pro

Ile 15

Ala Gin

Pro Leu

Ser 20

Glu Asp

Pro

Thr

Asp 25

Ile

Ala

ATC

AAG

TAT

CAT

GCT

GAA

TAT

ACT

CCT

CAT

TTT

TCT

CCT

TTC

AAG

TTT

146

Ile

Lys

Tyr

His

Ala

Gin

Tyr

Thr

Pro

His

Phe

Ser

Pro

Phe

Lys

Phe

30

35

40

45

GAG

CCA

CTA

CAA

GCA

TAC

TAT

GCT

GCT

ACT

GCT

GAC

AGT

GTT

CGT

GAT

194

Glu

Pro

Leu

Gin

Ala

Tyr

Tyr

Ala

Ala

Thr

Ala

Asp

Ser

Val

Arg

Asp

50

55

60

CGC

TTG

ATC

AAA

CAA

TGG

AAT

GAC

ACC

TAT

CTT

CAT

TAT

GAC

AAA

GTT

242

Arg

Leu

Ile

Lys

Gin

Trp

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Lys

Val

65

70

75

AAT

CCA

AAG

CAA

ACA

TAC

TAC

TTA

TCA

ATG

GAG

TAT

CTC

CAG

GGG

CGA

290

Asn

Pro

Lys

Gin

Thr

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Tyr

Leu

Gin

Gly

Arg

80

85

90

GCT

TTG

ACA

AAT

GCA

GTT

GGA

AAC

TTA

GAC

ATC

CAC

AAT

GCA

TAT

GCT

338

Ala

Leu

Thr

Asn

Ala

Val

Gly

Asn

Leu

Asp

Ile

His

Asn

Ala

Tyr

Ala

95

100

105

GAT

GCT

TTA

AAC

AAA

CTG

GGT

CAG

CAG

CTT

GAG

GAG

GTC

GTT

GAG

CAG

386

Asp

Ala

Leu

Asn

Lys

Leu

Gly

Gin

Gin

Leu

Glu·

Glu

Val

Val

Glu

Gin

110

115

120

125

GAA

AAA

GAT

GCA

GCA

TTA

GGA

AAT

GGT

GGT

TTA

GGA

AGG

CTC

GCT

TCA

434

Glu

Lys

Asp

Ala

Ala

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

Arg

Leu

Ala

Ser

130

135

140

TGC

TTT

CTT

GAT

TCC

ATG

GCC

ACA

TTG

AAC

CTT

CCA

GCA

TGG

GGT

TAT

482

Cys

Phe

Leu

Asp

Ser

Met

Ala

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Ala

Trp

Gly

Tyr

145

150

155

GGC

TTG

AGG

TAC

AGA

TAT

GGA

CTT

TTT

AAG

CAG

CTT

ATC

ACA

AAG

GCT

530

Gly

Leu

Arg

Tyr

Arg

Tyr

Gly

Leu

Phe

Lys

Gin

Leu

Ile

Thr

Lys

Ala

160

165

170

• · • *

GGG Gly

CAA Gin 175

GAA Glu

GAA Glu

GTT Val

CCT Pro

GAA Glu 180

GAT Asp

TGG Trp

TTG Leu

GAG Glu

AAA Lys 185

TTT Phe

AGT Ser

CCC Pro

TGG Trp

578

GAA

ATT

GTA

AGG

CAT

GAT

GTT

GTC

TTT

CCT

ATC

AGG

TTT

TTT

GGT

CAT

626

Glu

Ile

Val

Arg

His

Asp

Val

Val

Phe

Pro

Ile

Arg

Phe

Phe

Gly

His

190

195

200

205

GTT

GAA

GTC

CTC

CCT

TCT

GGC

TCG

CGA

AAA

TGG

GTT

GGT

GGA

GAG

GTC

674

Val

Glu

Val

Leu

Pro

Ser

Gly

Ser

Arg

LVS

Trp

Val

Gly

Gly

Glu

Val

210

215

220

CTA

CAG

GCT

CTT

GCA

TAT

GAT

GTG

CCA

ATT

CCA

GGA

TAC

AGA

ACT

AAA

722

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

Tyr

Arg

Thr

Lys

225

230

·> >

235

AAC

ACT

AAT

AGT

CTT

CGT

CTC

TGG

GAA

GCC

AAA

GCA

AGC

TCT

GAG

GAT

770

Asn

Thr

Asn

Ser

Leu

Arg

Leu

Trp

Glu

Ala

Lys

Ala

Ser

Ser

Glu

Asp

240

245

250'

TTC

AAC

TTG

TTT

CTG

TTT

AAT

GAT

GGA

CAG

TAT

GAT

GCT

GCT

GCA

CAG

818

Phe

Asn

Leu

Phe

Leu

Phe

Asn

Asp

Gly

Gin

Tyr

Asp

Ala

Ala

Ala

Gin

255

260

265

CTT

CAT

TCT

AGG

GCT

CAG

CAG

ATT

TGT

GCT

GTT

CTC

TAC

CCT

GGG

GAT

866

Leu

His

Ser

Arg

Ala

Gin

Gin

Ile

Cys

Ala

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Asp

270

275

280

285

GCT

ACA

GAG

AAT

GGA

AAA

CTC

TTA

CGG

CTA

AAG

CAA

CAA

TTT

TTT

CTG

914

Ala

Thr

Glu

Asn

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Gin

Phe

Phe

Leu

290

295

300

TGC

AGT

GCA

TCG

CTT

CAG

GAT

ATT

ATT

GCC

AGA

TTC

AAA

GAG

AGA

GAA

962

Cys

Ser

Ala

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Ile

Ala

Arg

Phe

Lys

Glu

Arg

Glu

305

310

315

GAT

GGA

AAG

GGT

TCT

CAC

CAG

TGG

TCT

GAA

TTC

CCC

AAG

AAG

GTT

GCG

1010

Asp

Gly

Lvs

Gly

Ser

His

Gin

Trp

Ser

Glu

Phe

Pro

Lys

Lys

Val

Ala

320

325

V

330

ATA

CAA

CTA

AAT

GAC

ACA

CAT

CCA

ACT

CTT

ACG

ATT

CCA

GAG

CTG

ATG

1058

Xle

Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

His

Pro

Thr

Leu

Thr

Ile

Pro

Glu

Leu

Met

335

340

345

CGG

TTG

CTA

ATG

GAT

GAT

GAA

GGA

CTT

GGG

TGG

GAT

GAA

TCT

TGG

AAT

1106

Arg

Leu

Leu·

Met

Asp

Asp

Glu

Gly

Leu

Gly

Trp

Asp

Glu

Ser

Trp

Asn

350

355

360

365

ATC

ACT

ACT

AGG

ACA

ATT

GCC

TAT

ACG

AAT

CAT

ACA

GTC

CTA

CCT

GAA

1154

Xle

Thr

Thr

Arg

Thr

Ile

Ala

Tyr

Thr

Asn

His

Thr

Val

Leu

Pro

Glu

370

375

380

GCA

CTT

GAA.

AAA

TGG

TCT

CAG

GCA

GTC

ATG

TGG

AAG

CTC

CTT

CCT

AGA

1202

Ala

Leu

Glu

Lys

Trp

Ser

Gin

Ala

Val

Met

Trp

Lys

Leu

Leu

Pro

Arg

385

390

395

• φ • · tt t · · · « φφ · · ·· φ · · · · · ¹ φ · φ · · <

φ ΦΦ ·♦ ··

CAT His

ATG GAA

ATC Ile

ATT GAA GAA

ATT Ile 405

GAC Asp

AAA CGG TTT GTT

GCT Ala

ACA Thr

ATA Ile

1250

Met

Glu 400

Ile

Glu

Glu

Lys

Arg

Phe

Val 410

ATG

TCA

GAA

AGA

CCT

GAT

CTT

GAG

AAT

AAG

ATG

CCT

AGC

ATG

CGC

ATT

1298

Met

Ser

Glu

Arg

Pro

Asp

Leu

Glu

Asn

Lys

Met

Pro

Ser

Met

Arg

Ile

415

420

425

TTG

GAT

CAC

AAC

GCC

ACA

AAA

CCT

GTT

GTG

CAT

ATG

GCT

AAC

TTG

TGT

1346

Leu

Asp

His

Asn

Ala

Thr

Lys

Pro

Val

Val

His

Met

Ala

Asn

Leu

Cys

430

435

440

445

GTT

GTC

TCT

TCA

CAT

ACG

GTA

AAT

GGT

GTT

GCC

CAG

CTG

CAT

AGT

GAC

1394

Val

Val

Ser

Ser

His

Thr

Val

Asn

Gly

Val

Ala

Gin

Leu

His

Ser

Asp

450

455 5 Λ

460

ATC

CTG

AAG

GCT

GAG

TTA

TTT

GCT

GAT

TAT

GTC

TCT

GTA

TGG

CCC

ACC

1442

Ile

Leu

Lys

Ala

Glu

Leu

Phe

Ala

Asp

Tyr

Val

Ser

Val

Trp

Pro

Thr

465

470

475

AAG

TTC

CAG

AAT

AAG

ACC

AAT

GGT

ATA

ACT

CCT

CGT

AGG

TGG

ATC

CGA

1490

Lys

Phe

Gin

Asn

Lys

Thr

Asn

Gly

Ile

Thr

Pro

Arg

Arg

Trp

Ile

Arg

480

485

490

TTT

TGT

AGT

CCT

GAG

CTG

AGT

CAT

ATA

ATT

ACC

AAG

TGG

TTA

AAA

ACA

1538

Phe

Cys

Ser

Pro

Glu

Leu

Ser

His

Ile

Ile

Thr

Lys

Trp

Leu

Lys

Thr

495

500

505

GAT

CAA

TGG

GTG

ACG

AAC

CTC

GAA

CTG

CTT

GCT

AAT

CTT

CGG

GAG

TTT

1586

Asp

Gin

Trp

Val

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu

Leu

Ala

Asn

Leu

Arg

Glu

Phe

510

515

520

525

GCT

GAT

AAT

TCG

GAG

CTC

CAT

GCT

GAA

TGG

GAA

TCA

GCC

AAG

ATG

GCC

1634

Ala

Asp

Asn

Ser

Glu

Leu

His

Ala

Glu

Trp

Glu

Ser

Ala

Lys

Met

Ala

530

535

540

AAC

AAG

CAG

CGT

TTG

GCA

CAG

TAT

ATA

CTG

CAT

GTG

ACA

GGT

GTG

AGC

1682

Asn

Lys

Gin

Arg

Leu

Ala

Gin

Tyr

Ile

Leu

His

Val

Thr

Gly

Val

Ser

545

550

555

ATC

GAT

CCA

AAT

TCC

CTT

TTT

GAC

ATA

CAA

GTC

AAA

CGT

ATC

CAT

GAA

1730

Ile

Asp

Pro

Asn

Ser

Leu

Phe

Asp

Ile

Gin

Val

Lys

Arg

Ile

His

Glu

560

565

570

TAC

AAA

AGG

CAG

CTT

CTA

AAT

ATT

CTG

GGC

GTC

ATC

TAT

AGA

TAC

AAG

1778

Tyr

Lys

Arg

Gin

Leu

Leu

Asn

Ile

Leu

G-ly

Val

Ile

Tyr

Arg

Tyr

Lys

575

580

585

AAG

CTT

AAG

GGA

ATG

AGC

CCT

GAA

GAA

AGG

AAA

AAT

ACA

ACT

CCT

CGC

1826

Lys

Leu

Lys

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

Glu

Arg

Lys

Asn

Thr

Thr

Pro

Arg

590

595

600

605

ACA

GTC

ATG

ATT

GGA

GGA

AAA

GCA

TTT

GCA

ACA

TAC

ACA

AAT

GCA

AAA

1874

Thr

Val

Met

Ile

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Ala

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ala

Lys

610

615

620

• 9 • · · · • · · · · ·· · · • · 9 · · · • · · · · • 9 · ·

CGA Arg

ATT GTC Ile Val

AAG CTC GTG ACT GAT GTT GGC

GAC Asp

GTT GTC

AAT Asn 635

AGT Ser

GAC Asp

Lys 625

Leu

Val

Thr Asp

Val 630

Gly

Val

Val

CCT

GAC

GTC

AAT

GAC

TAT

TTG

AAG

GTG

GTT

TTT

GTT

CCC

AAC

TAC

AAT

Pro

Asp

Val

Asn

Asp

Tyr

Leu

Lys

Val

Val

Phe

Val

Pro

Asn

Tyr

Asn

640

645

650

GTA

TCT

GTG

GCA

GAG

ATG

CTT

ATT

CCG

GGA

AGT

GAG

CTA

TCA

CAA

CAC

Val

Ser

Val

Ala

Glu

Met

Leu

Ile

Pro

Gly

Ser

Glu

Leu

Ser

Gin

His

655

660

665

ATC

AGT

ACT

GCA

GGC

ATG

GAA

GCA

AGT

GGA

ACA

AGC

AAC

ATG

AAA

TTT

Ile

Ser

Thr

Ala

Gly

Met

Glu

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Asn

Met

Lys

Phe

670

675

«>

680 ·*,

685

GCC

CTT

AAT

GGA

TGC

CTT

ATC

ATT

GGG

ACA

CTA

GAT

GGG

GCC

AAT

GTG

Ala

Leu

Asn

Gly

Cys

Leu

Ile

Ile

Gly

Thr

Leu

Asp

Gly

,Ala

Asn

Val

690

695

700

GAA

ATT

AGG

GAG

GAA

ATT

GGA

GAA

GAT

AAC

TTC

TTT

CTT

TTT

GGT

GCA

Glu

Ile

Arg

Glu

Glu

Ile

Gly

Glu

Asp

Asn

Phe

Phe

Leu

Phe

Gly

Ala

705

710

715

ACA

GCT

GAT

GAA

GTT

CCT

CAA

CTG

CGC

AAA

GAT

CGA

GAG

AAT

GGA

CTG

Thr

Ala

Asp

Glu

Val

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Asp

Arg

Glu

Asn

Gly

Leu

720

725

730

TTC

AAA

CCT

GAT

CCT

CGG

TTT

GAA

GAG

GCA

AAA

CAA

TTT

ATT

AGG

TCT

Phe

Lys

Pro

Asp

Pro

Arg

Phe

Glu

Glu

Ala

Lys

Gin

Phe

Ile

Arg

Ser

735

740

745

GGA

GCA

TTT

GGG

ACG

TAT

GAT

TAT

AAT

CCC

CTC

CTT

GAA

TCA

CTG

GAA

Gly

Ala

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Asn

Pro

Leu

Leu

Glu

Ser

Leu

Glu

750

755

760

765

GGG

AAC

TCG

GGA

TAT

GGT

CGT

GGA

GAC

TAT

TTT

CTT

GTT

GGT

CAT

GAT

Gly

Asn

Ser

Gly

Tyr

Gly

Arg

Gly

Asp

Tyr

Phe

Leu

Val

Gly

His

Asp

770

775

780

TTT

CCG

AGC

TAC

ATG

GAT

GCT

CAG

GCA

AGG

GTT

GAT

GAA

GCT

TAC

AAG

Phe

Pro

Ser

Tyr

Met

Asp

Ala

Gin

Ala

Arg

Val

Asp

Glu

Ala

Tyr

Lys

785

790

795

GAC

AGG

AAA

AGA

TGG

ATA

AAG

ATG

TCT

ATA

CTG

AGC

ACT

AGT

GGG

AGT

Asp

Arg

Lys

Arg

Trp

Ile

Lys

Met

Ser

Ile

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Ser

800

805

810

GGC

AAA

TTT

AGT

AGT

GAC

CGT

ACA

ATT

TCT

CAA

TAT

GCA

AAA

GAG

ATC

Gly

Lys

Phe

Ser

Ser

Asp

Arg

Thr

Ile

Ser

Gin

Tyr

Ala

Lys

Glu

Ile

815

820

825

TGG

AAC

ATT

SCC

GAG

TGT

CGC

GTG

CCT

TGA

GCACACTTCT GAACCTGGTA

Trp

Asn

Ile

Ala

Glu

Cys

Arg

Val

Pro

*

830 835

TCTAATAAGG ATCTAATGTT CATTGTTTAC TAGCATATGA ATAATGTAAG TTCAAGCACA acatgctttc ttatttccta ctgctctcaa gaagcagtta tttgttg

1922

1970

2018

2066

2114

2162

2210

2258

2306

2354

2402

2450

2498

2548

2608

2655 • · · · ·· ·· ·· • · ···· ···· • · · ··· · · · · (2) Informace o SEQ ID NO: 4:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 839 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4

Met 1

Glu Gly Gly

Ala 5

Lys

Ser Asn Asp

Val 10

Ser

Ala

Ala

Pro

Ile 15

Ala

Gin

Pro

Leu

Ser

Glu

Asp

Pro

Thr

Asp

Ile

Ala

Ser

Asn

Ile

Lys

Tyr

20

25

30

His

Ala

Gin

Tyr

Thr

Pro

His

Phe

Ser

Pro

Phe

Lys

Phe

Glu

Pro

Leu

35

40

45

Gin

Ala

Tyr

Tyr

Ala

Ala

Thr

Ala

Asp

Ser

Val

Arg

Asp

Arg

Leu

Ile

SO

55

60

Lys

Gin

Trp

Asn

Asp

Thr

Tyr

Leu

His

Tyr

Asp

Lys

Val

Asn

Pro

Lys

65

70

75

80

Gin

Thr

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Tyr

Leu

Gin

Gly

Arg

Ala

Leu

Thr

85

90

95

Asn

Ala

Val

Gly

Asn

Leu

Asp

Ile

His

Asn

Ala

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

100

105

110

Asn

Lys

Leu

Gly

Gin

Gin

Leu

Glu

Glu

Val

Val

Glu

Gin

Glu

Lys

Asp

115

120

125

Ala

Ala

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

Arg

Leii

Ala

Ser

Cys

Phe

Leu

130

135

140

Asp

Ser

Met

Ala

Thr

Leu

Asn

Leu

Pro

Ala

Trp

Gly

Tyr

Gly

Leu

Arg

145

150

155

160

Tyr

Arg

Tyr

Gly

Leu-

Phe

Lys

Gin

Leu

Ile

Thr

Lys

Ala

Gly

Gin

Glu

165

170

175

Glu

Val

Pro

Glu

Asp

Trp

Leu

Glu

Lys

Phe

Ser

Pro

Trp

Glu

Ile

Val

180 185 190

Arg His Asp *Val Val Phe Pro Ile Arg Phe Phe Gly His Val Glu Val 195 200 205 • ·

Leu

Pro 210

Ser

Gly

Ser

Arg

Lys 215

Trp Val

Gly

Gly Glu 220

Val

Leu

Gin

Ala

Leu

Ala

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

Tyr

Arg

Thr

Lys

Asn

Thr

Asn

225

230

235

240

Ser

Leu

Arg

Leu

Trp

Glu

Ala

Lys

Ala

Ser

Ser

Glu

Asp

Phe

Asn

Leu

245

250

255

Phe

Leu

Phe

Asn

Asp

Gly

Gin

Tyr

Asp

Ala

Ala

Ala

Gin

Leu

His

Ser

260

265

270

Arg

Ala

Gin

Gin

Ile

Cys

Ala

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Asp

Ala

Thr

Glu

275

280

285

Asn

Gly

Lys

Leu

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Gin'Phe

Phe

Leu

Cys

Ser

Ala

290

295

300

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Ile

Ala

Arg

Phe

Lys

Glu

Arg

Glu

Asp

Gly

Lys

305

310

315

320

Gly

Ser

His

Gin

Trp

Ser

Glu

Phe

Pro

Lys

Lys

Val

Ala

Ile

Gin

Leu

325

330

335

Asn

Asp

Thr

His

Pro

Thr

Leu

Thr

Ile

Pro

Glu

Leu

Met

Arg

Leu

Leu

340

345

350

Met

Asp

Asp

Glu

Gly

Leu

Gly

Trp

Asp

Glu

Ser

Trp

Asn

Ile

Thr

Thr

355

360

3 65

Arg

Thr

Ile

Ala

Tyr

Thr

Asn

His

Thr

Val

Leu

Pro

Glu

Ala

Leu

Glu

370

375

380

Lys

Trp

Ser

Gin

Ala

Val

Met

Trp

Lys

Leu

Leu

Pro

Arg

His

Met

Glu

385

390

395

400

Ile

Ile

Glu

Glu

Ile

Asp

Lys

Arg

Phe

Val

Ala

Thr

Ile

Met

Ser

Glu

405

410

415

Arg

Pro

Asp

Leu

Glu

Asn

Lys

Met

Pro

Ser

Met

Arg

Ile

Leu

Asp

His

420

425

430

Asn

Ala

Thr

Lys

Pro

Val

Val

His

Met

Ala

Asn

Leu

Cys

Val

Val

Ser

435

440

445

Ser

His

Thr'

Val

Asn

Gly

Val

Ala

Gin

Leu

His

Ser

Asp

Ile

Leu

Lys

450

-

455

'460

Ala

Glu

Leu

Phe

Ala

Asp

Tyr

Val

Ser

Val

Trp

Pro

Thr

Lys

Phe

Gin

465

470

475

480

Asn

Lys

Thr

Asn

Gly

Ile

Thr

Pro

Arg

Arg

Trp

Ile

Arg

Phe

Cys

Ser

*

485

490

495

Pro

Glu

Leu

Ser

His

Ile

Ile

Thr

Lys

Trp

Leu

Lys

Thr

Asp

Gin

Trp

500

505

510

Val

Thr

Asn

Leu

Glu

Leu

Leu

Ala

Asn

Leu

Arg

Glu

Phe

Ala

Asp

Asn

515 520 525 • 4

68

• 9 9 *·

9 9

Ser

Glu

Leu

His

Ala

Glu

Trp

Glu

Ser

Ala

Lys

Met

Ala

Asn

Lys

Gin

530

535

540

Arg

Leu

Ala

Gin

Tyr

Ile

Leu

His

Val

Thr

Gly

Val

Ser

Ile

Asp

Pro

545

550

555

560

Asn

Ser

Leu

Phe

Asp

Ile

Gin

Val

Lys

Arg

Ile

His

Glu

Tyr

Lys

Arg

565

570

575

Gin

Leu

Leu

Asn

Ile

Leu

Gly

Val

Ile

Λ Tyr

s Arg

Tyr

Lys

Lys

Leu

Lys

580

585

590

Gly

Met

Ser

Pro

Glu

Glu

Arg

Lys

Asn

Thr

Thr

Pro

Arg

Thr

Val

Met

595

600

605

Ile

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Ala

Thr

Tyr

Thr

Asn

Ala

Lys

Arg

Ile

Val

610

615

620

Lys

Leu

Val

Thr

Asp

Val

Gly

Asp

Val

Val

Asn

Ser

Asp

Pro

Asp

Val

625

630

635

640

Asn

Asp

Tyr

Leu

Lys

Val

Val

Phe

Val

Pro

Asn

Tyr

Asn

Val

Ser

Val

645

650

655

Ala

Glu

Met

Leu

Ile

Pro

Gly

Ser

Glu

Leu

Ser

Gin

His

Ile

Ser

Thr

660

665

670

Ala

Gly

Met

Glu

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Asn

Met

Lys

Phe

Ala

Leu

Asn

675

680

685

Gly

Cys

Leu

Ile

Ile

Gly

Thr

Leu

Asp

Gly

Ala

Asn

Val

Glu

Ile

Arg

690

695

700

Glu

Glu

Ile

Gly

Glu

Asp

Asn

Phe

Phe

Leu

Phe

Gly

Ala

Thr

Ala

Asp

705

710

715’

720

Glu

Val

Pro

Gin

Leu

Arg

Lys

Asp

Arg

Glu

Asn

Gly

Leu

Phe

Lys

Pro

725

730

735

Asp

Pro

Arg

Phe

Glu

Glu

Ala

Lys

Gin

Phe

Ile

Arg

Ser

Gly

Ala

Phe

740

*

745

750

Gly

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Asn

Pro

Leu

Leu

Glu

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

Ser

755

760

765

Gly

Tyr

Gly

Arg

Gly

Asp

Tyr

Phe

Leu

Val

Gly

His

Asp

Phe

Pro

Ser

770

775

780

Tyr

Met

Asp

Ala

Gin

Ala

Arg

Val

Asp

Glu

Ala

Tyr

Lys

Asp

Arg

Lys

785

790

795

800

Arg

Trp

Ile

Lys

Met

Ser

Ile

Leu

Ser

Thr

Ser

Gly

Ser

Gly

Lys

Phe

805

810

81S

Ser

Ser

Asp

Arg

Thr

Ile

Ser

Gin

Tyr

Ala

Lys

Glu

Ile

Trp

Asn

Ile

820

825

830

99 49 • · · · · 9 9 9 9 « · 9 4 9 4 9···

99« · · · · · · · * · * • 9 9 « · 9 9

Ala Glu Cys Arg Val Pro 835 • · · 9 9 9 9 9

9 9 99 99 9 9 99 9 9 (2) Informace o SEQ ID NO: 5:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 3171 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (ví) Původní zdroj:

(A) Organizmus: Solanum tuberosum (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 87 ..3011 (C) Jiné informace: produktem je bramborová listová fosforylázy α-glukanu typu L (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: mat_peptid (B) Pozice: 330 ..3008 (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: sig_peptid (C) Pozice: 87..329 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:

TTTTTTTTTT CAACATGGAC AACAATTATT TTGATTAAAT TTTGTATCTA AAAATTTAGC

ATTTTGAAAT TCAGTTCAGA GACATC ATG GCA ACT TTT GCT GTC TCT GGA TTG Met Ala Thr Phe Ala Val Ser Gly Leu -81 -80 -75

AAC TCA ATT'TCA AGT ATT TCT AGT TTT AAT AAC AAT TTC AGA AGC AAA Asn Ser Ile Ser Ser Ile Ser Ser Phe Asn Asn Asn Phe Arg Ser Lys “7 0 -65 _ a i\

161

• · ·

AAC TCA Asn Ser -55

AAC ATT

TTG Leu

TTG AGT

AGA AGG Arg Arg

AGG Arg

ATT TTA TTG TTC AGT TTT

209

Asn

Ile

Leu

Ser -50

Ile

Leu -45

Leu

Phe

Ser

Phe

AGA

AGA

AGA

AGA

AGA

AGT

TTC

TCT

GTT

AGC

AGT

GTT

GCT

AGT

GAT

CAA

257

Arg

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Phe

Ser

Val

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Asp

Gin

-40

-35

-30

-25

AAG

CAG

AAG

ACA

AAG

GAT

TCT

TCC

TCT

GAT

GAA

GGA

TTT

ACA

TTA

GAT

305

Lys

Gin

Lys

Thr

Lys

Asp

Ser

Ser

Ser

Asp

Glu

Gly

Phe

Thr

Leu

Asp

-20

-15

-10

GTT

TTT

CAG

CCG

GAC

TCC

ACG

TCT

GTT

TTA

TCA

AGT

ATA

AAG

TAT

CAC

353

Val

Phe

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

Ser

Val

Leu

Ser

Ser

Ile

Lys

Tyr

His

-5

1

--.

5

GCT

GAG

TTC

ACA

CCA

TCA

TTT

TCT

CCT

GAG

AAG

TTT

GAA

CTT

CCC

AAG

401

Ala

Glu

Phe

Thr

Pro

Ser

Phe

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Glu

Leu

Pro

Lys

10

15

20

GCA

TAC

TAT

GCA

ACT

GCA

GAG

AGT

GTT

CGA

GAT

ACG

CTC

ATT

ATA

AAT

449

Ala

Tyr

Tyr

Ala

Thr

Ala

Glu

Ser

Val

Arg

Asp

Thr

Leu

Ile

Ile

Asn

25

30

35

40

TGG

AAT

GCC

ACA

TAC

GAA

TTC

TAT

GAA

AAG

ATG

AAT

GTA

AAG

CAG

GCA

497

Trp

Asn

Ala

Thr

Tyr

Glu

Phe

Tyr

Glu

Lys

Met

Asn

Val

Lys

Gin

Ala

45

50

55

TAT

TAC

TTG

TCT

ATG

GAA

TTT

CTT

CAG

GGA

AGA

GCT

TTA

CTC

AAT

GCT

545

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Phe

Leu

Gin

Gly

Arg

Ala

Leu

Leu

Asn

Ala

60

65

70

ATT

GGT

AAC

TTG

GGG

CTA

ACC

GGA

CCT

TAT

GCA

GAT

GCT

TTA

ACT

AAG

593

Ile

Gly

Asn

Leu

Gly

Leu

Thr

Gly

Pro

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Thr

Lys

75

80

85

CTC

GGA

TAC

AGT

TTA

GAG

GAT

GTA

GCC

AGG

CAG

GAA

CCG

GAT

GCA

GCT

641

-

Leu

Gly

Tyr

Ser

Leu

Glu

Asp

Val

Ala

Arg

Gin

Glu

Pro

Asp

Ala

Ala

90

95

100

,

TTA

GGT

AAT

GGA

GGT

TTA

GGA

AGA

CTT

GCT

TCT’

TGC

TTT

CTG

GAC

TCA

689

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

Arg

Leu

Ala

Ser

Cys

Phe

Leu

Asp

Ser

105

110

115

120

ATG

GCG

ACA

CTA

AAC

TAC

CCT

GCA

TGG

GGC

TAT

GGA

CTT

AGA

TAC

CAA

737

Met

Ala

Thr

Leu

Asn

Tyr

Pro

Ala

Trp

Gly

Tyr

Gly

Leu

Arg

Tyr

Gin

125

-

130

135

TAT

GGC

CTT

TTC

AAA

CAG

CTT

ATT

ACA

AAA

GAT

GGA

CAG

GAG

GAA

GTT

785

Tyr

Gly

Leu

Phe

Lys

Gin

Leu

Ile

Thr

Lys

Asp

Gly

Gin

Glu

Glu

Val

140

145

150

GCT

GAA

AAT

TGG

CTC

GAG

ATG

GGA

AAT

CCA

TGG

GAA

ATT

GTG

AGG

AAT

833

Ala

Glu

Asn

Trp

Leu

Glu

Met

Gly

Asn

Pro

Trp

Glu

Ile

Val

Arg

Asn

155

160

165

• ·

71

• · • · · · «

• «

9 9 9 «· ··

• • ♦

GAT

ATT

TCG

TAT

CCC

GTA

AAA

TTC

TAT

GGG

AAG

GTC

ATT

GAA

GGA

GCT

881

Asp

Ile

Ser

Tyr

Pro

Val

Lys

Phe

Tyr

Gly

Lys

Val

Ile

Glu

Gly

Ala

170

175

180

GAT

GGG

AGG

AAG

GAA

TGG

GCT

GGC

GGA

GAA

GAT

ATA

ACT

GCT

GTT

GCC

929

Asp

Gly

Arg

Lys

Glu

Trp

Ala

Gly

Gly

Glu

Asp

Ile

Thr

Ala

Val

Ala

185

190

195

200

TAT

GAT

C-TC

CCA

ATA

CCA

GGA

TAT

AAA

ACA

AAA

ACA

ACG

ATT

AAC

CTT

977

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

Tyr

Lys

Thr

Lys

Thr

Thr

Ile

Asn

Leu

205

210

215

CGA

TTG

TGG

ACA

ACA

AAG

CTA

GCT

GCA

GAA

GCT

TTT

GAT

TTA

TAT

GCT

1025

Arg

Leu

Trp

Thr

Thr

Lys

Leu

Ala

Ala

Glu

Ala

Phe

Asp

Leu

Tyr

Ala

220

225

230

TTT

AAC

AAT

GGA

GAC

CAT

GCC

AAA

GCA

TAT

GAG

GCC

CAG

AAA

AAG

GCT

1073

Phe

Asn

Asn

Gly

Asp

His

Ala

Lys

Ala

Tyr

Glu

Ala

Gin

Lys

Lys

Ala

235

240

245

GAA

AAG

ATT

TGC

TAT

GTC

TTA

TAT

CCA

GGT

GAC

GAA

TCG

CTT

GAA

GGA

1121

Glu

Lys

Ile

Cys

Tyr

Val

Leu

Tyr

Pro

Gly

Asp

Glu

Ser

Leu

Glu

Gly

250

255

260

AAG

ACG

CTT

AGG

TTA

AAG

CAG

CAA

TAC

ACA

CTA

TGT

TCT

GCT

TCT

CTT

1169

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

Gin

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala

Ser

Leu

265

270

275

280

CAG

GAC

ATT

ATT

GCA

CGG

TTC

GAG

AAG

AGA

TCA

GGG

AAT

GCA

GTA

AAC

1217

Gin

Asp

Ile

Ile

Ala

Arg

Phe

Glu

Lys

Arg

Ser

Gly

Asn

Ala

Val

Asn

285

290

295

TGG

GAT

CAG

TTC

CCC

GAA

AAG

GTT

GCA

GTA

CAG

ATG

AAT

GAC

ACT

CAT

1265

Trp

Asp

Gin

Phe

Pro

Glu

Lys

Val

Ala

Val

Gin

Met

Asn

Asp

Thr

His

300

305

310

CCA

ACA

CTT

TGT

ATA

CCA

GAA

CTT

TTA

AGG

ATA

TTG

ATG

GAT

GTT

AAA

1313

Pro

Thr

Leu

Cys

Ile

Pro

Glu

Leu

Leu

Arg

Ile

Leu

Met

Asp

Val

Lys'

315

320

325

GGT

TTG

AGC

TGG

AAG

CAG

GCA

TGG

GAA

ATT

ACT

CAA

AGA

ACG

GTC

GCA

1361

Gly

Leu

Ser

Trp

Lys

Gin

Ala

Trp

Glu

Ile

Thr

Gin

Arg

Thr

Val

Ala

330

335

340

TAC

ACT

AAC

CAC

ACT

GTT

CTA

CCT

GAG

GCT

CTT

GAG

AAA

TGG

AGC

TTC

1409

Tyr

Thr

Asn

His

Thr

Val

Leu

Pro

Glu

Ala

Leu

Glu

Lys

Trp

Ser

Phe

345

350

355

360

ACA

CTT

CTT

GGT

GAA

CTG

CTT

CCT

CGG

CAC

GTG

GAG

ATC'

ATA

GCA

ATG

1457

Thr

Leu

Leu

Gly

Glu

Leu

Leu

Pro

Arg

His

Val

Glu

Ile

Ile

Ala

Met

365

370

375

ATA

GAT

GAG.

GAG

CTC

TTG

CAT

ACT

ATA

CTT

GCT

GAA

TAT

GGT

ACT

GAA

1505

Ile

Asp

Glu

Glu

Leu

Leu

His

Thr

Ile

Leu

Ala

Glu

Tyr

Gly

Thr

Glu

380

385

390

GAT Asp

CTT Leu

GAC Asp 395

TTG Leu

TTG Leu

CAA GAA

AAG Lys 400

CTA Leu

AAC Asn

CAA Gin

ATG Met

AGG ATT CTG GAT

1553

Gin

Glu

Arg 405

Ile

Leu

Asp

AAT

GTT

GAA

ATA

CCA

AGT

TCT

GTT

TTG

GAG

TTG

CTT

ATA

AAA

GCC

GAA

1601

Asn

Val

Glu

Ile

Pro

Ser

Ser

Val

Leu

Glu

Leu

Leu

Ile

Lys

Ala

Glu

410

415

420

GAA

AGT

GCT

GCT

GAT

GTC

GAA

AAG

GCA

GCA

GAT

GAA

GAA

CAA

GAA

GAA

1649

Glu

Ser

Ala

Ala

Asp

Val

Glu

Lys

Ala

Ala

Asp

Glu

Glu

Gin

Glu

Glu

425

430

435

440

GAA

GGT

AAG

GAT

GAC

AGT

AAA

GAT

GAG

GAA

ACT

GAG

GCT

GTA

AAG

GCA

1697

Glu

Gly

Lys

Asp

Asp

Ser

Lys

Asp

Glu

Glu

Thr

Glu

Ala

Val

Lys

Ala

445

45ý

455

GAA

ACT

ACG

AAC

GAA

GAG

GAG

GAA

ACT

GAG

GTT

AAG

AAG

GTT

GAG

GTG

1745

Glu

Thr

Thr

Asn

Glu

Glu

Glu

Glu

Thr

Glu

Val

Lys

Lys

Val

Glu

Val

460

465

470

GAG

GAT

AGT

CAA

GCA

AAA

ATA

AAA

CGT

ATA

TTC

GGG

CCA

CAT

CCA

AAT

1793

Glu

Asp

Ser

Gin

Ala

Lys

Ile

Lys

Arg

Ile

Phe

Gly

Pro

His

Pro

Asn

475

480

485

AAA

CCA

CAG

GTG

GTT

CAC

ATG

GCA

AAT

CTA

TGT

GTA

GTT

AGC

GGG

CAT

1841

Lys

Pro

Gin

Val

Val

His

Met

Ala

Asn

Leu

Cys

Val

Val

Ser

Gly

His

490

495

500

GCA

GTT

AAC

GGT

GTT

GCT

GAG

ATT

CAT

AGT

GAA

ATA

GTT

AAG

GAT

GAA

1889

Ala

Val

Asn

Gly

Val

Ala

Glu

Ile

His

Ser

Glu

Ile

Val

Lys

Asp

Glu

505

510

515

520

GTT

TTC

AAT

GAA

TTT

TAC

AAG

TTA

TGG

CCA

GAG

AAA

TTC

CAA

AAC

AAG

1937

Val

Phe

Asn

Glu

Phe

Tyr

Lys

Leu

Trp

Pro

Glu

Lys

Phe

Gin

Asn

Lys

525

530

535

ACA

AAT

GGT

GTG

ACA

CCA

AGA

AGA

TGG

CTA

AGT

TTC

TGT

AAT

CCA

GAG

1985

Thr

Asn

Gly

Val

Thr

Pro

Arg

Arg

Trp

Leu

Ser

Phe

Cys

Asn

Pro

Glu

540

545

550

TTG

AGT

GAA

ATT

ATA

ACC

AAG

TGG

ACA

GGA

TCT

GAT

GAT

TGG

TTA

GTA

2033

Leu

Ser

Glu

Ile

Ile

Thr

Lys

Trp

Thr

Gly

Ser

Asp

Asp

Trp

Leu

Val

555

560

565

AAC

ACT

GAA

AAA

TTG

GCA

GAG

CTT

CGA

AAG

TTT

GCT

GAT

AAC

GAA

GAA

2081

Asn

Thr

Glu

Lys

Leu

Ala

Glu

Leu

Arg

Lys

Phe

Ala

Asp

Asn

Glu

Glu

570

575

580

CTC

CAG

TCT

GAG

TGG

AGG

AAG

GCA

AAA

GGA

AAT

AAC

AAA

ATG

AAG

ATT

2129

Leu

Gin

Ser

Glu

Trp

Arg

Lys

Ala

Lys

Gly

Asn

Asn

Lys

Met

Lys

Ile

585

590

595

600

GTC

TCT

CTC

ATT

AAA

GAA

AAA

ACA

GGA

TAC

GTG

GTC

AGT

CCC

GAT

GCA

2177

Val

Ser

Leu

Ile

Lys

Glu

Lys

Thr

Gly

Tyr

Val

Val

Ser

Pro

Asp

Ala

605

610

615

ATG TTT

GAT Asp

GTT Val 620

CAG Gin

ATC Ile

AAG Lys

CGC Arg

ATC Ile 625

CAT His

GAG Glu

TAT Tyr

AAA AGG CAG CTA

2225

Met

Phe

Lys

Arg 630

Gin

Leu

TTA

AAT

ATA

TTT

GGA

ATC

GTT

TAT

CGC

TAT

AAG

AAG

ATG

AAA

GAA

ATG

2273

Leu

Asn

Ile

Phe

Gly

Ile

Val

Tyr

Arg

Tyr

Lys

Lys

Met

Lys

Glu

Met

635

640

645

AGC

CCT

GAA

GAA

CGA

AAA

GAA

AAG

TTT

GTC

CCT

CGA

GTT

TGC

ATA

TTT

2321

Ser

Pro

Glu

Glu

Arg

Lys

Glu

Lys

Phe

Val

Pro

Arg

Val

Cys

Ile

Phe

650

655

660

GGA

GGA

AAA

GCA

TTT

GCT

ACA

TAT

GTT

CAG

GCC

AAG

AGA

ATT

GTA

AAA

2369

Gly

Gly

Lys

Ala

Phe

Ala

Thr

Tyr

Val

Gin

Ala

Lys

Arg

Ile

Val

Lys

665

670

675

680

TTT

ATC

ACT

GAT

GTA

GGG

GAA

ACA

GTC

AAC

CAT

GAT

CCC

GAG

ATT

GGT

2417

Phe

Ile

Thr

Asp

Val

Gly

Glu

Thr

Val

Asn

His

Asp

Pro.

Glu

Ile

Gly

685

690

695

GAT

CTT

TTG

AAG

GTT

GTA

TTT

GTT

CCT

GAT

TAC

AAT

GTC

AGT

GTA

GCA

2465

Asp

Leu

Leu

Lys

Val

Val

Phe

Val

Pro

Asp

Tyr

Asn

Val

Ser

Val

Ala

700

705

710

GAA

GTG

CTA

ATT

CCT

GGT

AGT

GAG

TTG

TCC

CAG

CAT

ATT

AGT

ACT

GCT

2513

Glu

Val

Leu

Ile

Pro

Gly

Ser

Glu

Leu

Ser

Gin

His

Ile

Ser

Thr

Ala

715

720

725

GGT

ATG

GAG

GCT

AGT

GGA

ACC

AGC

AAC

ATG

AAA

TTT

TCA

ATG

AAT

GGC

2561

Gly

Met

Glu

Ala

Ser

Gly

Thr

Ser

Asn

Met

Lys

Phe

Ser

Met

Asn

Gly

730

735

740

TGC

CTC

CTC

ATC

GGG

ACA

TTA

GAT

GGT

GCC

AAT

GTT

GAG

ATA

AGA

GAG

2609

Cys

Leu

Leu

Ile

Gly

Thr

Leu

Asp

Gly

Ala

Asn

Val

Glu

Ile

Arg

Glu

745

750

755

760

GAA

GTT

GGA

GAG

GAC

AAT

TTC

TTT

CTT

TTC

GGA

GCT

CAG

GCT

CAT

GAA

2657

Glu

Val

Gly

Glu

Asp

Asn

Phe

Phe

Leu

Phe

Gly

Ala

Gin

Ala

His

Glu

765

770

775

ATT

GCT

GGC

CTA

CGA

AAG

GAA

AGA

GCC

GAG

GGA

AAG

TTT

GTC

CCG

GAC

2705

Ile

Ala

Gly

Leu

Arg

Lys

Glu

Arg

Ala

Glu

Gly

Lys

Phe

Val

Pro

Asp

780

785

790

CCA '

AGA

TTT

GAA.

GAA

GTA

AAG

GCG

TTC

ATT

AGG

ACA

GGC

GTC

TTT

GGC

2753

Pro

Arg

Phe’

Glu

Glu

Val

Lys

Ala

Phe

Ile

Arg

Thr

Gly

Val

Phe

Gly

795

800

805

ACC

TAC

AAC

TAT

GAA

GAA

CTC

ATG

GGA

TCC

TTG

GAA

GGA

AAC

GAA

GGC

2801

Thr

Tyr

Asn

Tyr

Glu

Glu

Leu

Met

Gly

Ser

Leu

Glu

Gly

Asn

Glu

Gly

810

815

820

TAT

GGT

CGT-

GCT

GAC

TAT

TTT

CTT

GTA

GGA

AAG

GAT

TTC

CCC

GAT

TAT

2849

Tyr

Gly

Arg

Ala

Asp

Tyr

Phe

Leu

Val

Gly

Lys

Asp

Phe

Pro

Asp

Tyr

825

830

835

840

Ί4 ·· 44

4 4

4 4 • 4 4 4

4 · • 4 44

44 • 4 4 4

4 4 4

444 444 • 4

44

ATA GAG TGC CAA

GAT AAA GTT GAT

GAA GCA

TAT CGA GAC CAG AAG AAA

2897

Ile Glu Cys

Gin

Asp 845

Lys

Val

Asp

Glu

Ala 850

Tyr

Arg

Asp

Gin Lys 855

Lys

TGG ACC AAA

ATG

TCG

ATC

TTA

AAC

ACA

GCT

GGA

TCG

TTC

AAA TTT

AGC

2945

Trp Thr Lys

Met

Ser

Ile

Leu

Asn

Thr

Ala

Gly

Ser

Phe

Lys Phe

Ser

860

865

870

AGT GAT CGA

ACA

ATT

CAT

CAA

TAT

GCA

AGA

GAT

ATA

TGG

AGA ATT

GAA

2993

Ser Asp Arg

Thr

Ile

His

Gin

Tyr

Ala

Arg

Asp

Ile

Trp

Arg Ile

Glu

875

880

885

CCT GTT GAA

TTA

CCT

TAA

AAGTTAGCCA GTTAAAGGAT GAAAGCCAAT

3041

Pro Val Glu

Leu

Pro

★

890 .

TTTTTCCCCC TGAGGTTCTC CCATACTGTT TATTAGTACA TATATTGTCA ATTGTTGCTA 3101

CTGAAATGAT AGAAGTTTTG AATATTTACT GTCAATAAAA TACAGTTGAT TCCATTTGAA 3161

AAAAAAAAAA

3171

• · · φ · · • · 14

1 Φ • 4

11 1 4 4 ·

4 4 4

444 ··· • Φ

Φ· ΦΦ (2) Informace ο SEQ ID ΝΟ: 6:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 975 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6

Met Ala Thr

Phe Ala

Val

Ser -75

Gly Leu

Asn

Ser

Ile -70

Ser

Ser

Ile

Ser

-81

-80

Ser

Phe

Asn

Asn

Asn

Phe

Arg

Ser

Lys

Asn

Ser

Asn

Ile

Leu

Leu

Ser

-65

-60

-55

-50

Arg

Arg

Arg

Ile

Leu

Leu

Phe

Ser

Phe

Arg

Arg.

Arg

Arg

Arg

Ser

Phe

-45

-40

-35

Ser

Val

Ser

Ser

Val

Ala

Ser

Asp

Gin

Lys

Gin

Lys

Thr

Lys

Asp

Ser

-30

-25

-20

Ser

Ser

Asp

Glu

Gly.

Phe

Thr

Leu

Asp

Val

Phe

Gin

Pro

Asp

Ser

Thr

-15

-10

-5

Ser

Val

Leu

Ser

Ser

Ile

Lys

Tyr

His

Ala

Glu

Phe

Thr

Pro

Ser

Phe

1

5

10

15

Ser Pro Glu Lys Phe Glu Leu Pro Lys Ala Tyr Tyr Ala Thr Ala Glu 20 25 30 ·· • · • · • · · • · • ·· ·· ·· • ♦ · · · · 4 • 9 9 · · • · · »

99 »* · ··· ···

Ser

Val

Arg

Asp

Thr

Leu

Ile

Ile

Asn

Trp

Asn

Ala

Thr

Tyr

Glu

Phe

35

40

45

Tyr

Glu

Lys

Met

Asn

Val

Lys

Gin

Ala

Tyr

Tyr

Leu

Ser

Met

Glu

Phe

50

55

60

Leu

Gin

Gly

Arg

Ala

Leu

Leu

Asn

Ala

Ile

Gly

Asn

Leu

Gly

Leu

Thr

65

70

75

Gly

Pro

Tyr

Ala

Asp

Ala

Leu

Thr

Lys

Leu

Gly

Tyr

Ser

Leu

Glu

Asp

80

85

90

95

Val

Ala

Arg

Gin

Glu

Pro

Asp

Ala

Ala

Leu

Gly

Asn

Gly

Gly

Leu

Gly

100

105

110

Arg

Leu

Ala

Ser

Cys

Phe

Leu

Asp

Ser

Met

^Ala

Thr

Leu

Asn

Tyr

Pro

115

120

125

Ala

Trp

Gly

Tyr

Gly

Leu

Arg

Tyr

Gin

Tyr

Gly

Leu

Phe

Lys

Gin

Leu

130

135

140

Ile

Thr

Lys

Asp

Gly

Gin

Glu

Glu

Val

Ala

Glu

Asn

Trp

Leu

Glu

Met

145

150

155

Gly

Asn

Pro

Trp

Glu

Ile

Val

Arg

Asn

Asp

Ile

Ser

Tyr

Pro

Val

Lys

160

165

170

175

Phe

Tyr

Gly

Lys

Val

Ile

Glu

Gly

Ala

Asp

Gly

Arg

Lys

Glu

Trp

Ala

180

185

190

Gly

Gly

Glu

Asp

Ile

Thr

Ala

Val

Ala

Tyr

Asp

Val

Pro

Ile

Pro

Gly

195

200

205

Tyr

Lys

Thr

Lys

Thr

Thr

Ile

Asn

Leu

Arg

Leu

Trp

Thr

Thr

Lys

Leu

210

215

220

Ala

Ala

Glu

Ala

Phe

Asp

Leu

Tyr

Ala

Phe

Asn

Asn

Gly

Asp

His

Ala

225

230

235

Lys

Ala

Tyr

Glu

Ala

Gin

Lys

Lys

Ala

Glu

Lys

Ile

Cys

Tyr

Val

Leu

240

245

250

255

Tyr

Pro

Gly

Asp

Glu

Ser

Leu

Glu

Gly

Lys

Thr

Leu

Arg

Leu

Lys

Gin

260

265

270

Gin

Tyr

Thr

Leu

Cys

Ser

Ala

Ser

Leu

Gin

Asp

Ile

Ile

Ala

Arg

Phe

275

-

280

--

285

Glu

Lys

Arg

Ser

Gly

Asn

Ala

Val

Asn

Trp

Asp

Gin

Phe

Pro

Glu

Lys

295

300

290

Val Ala Val Gin Mec Asn Asp Thr His Pro Thr Leu Cys Ile Pro Glu 305 . 310 315

•« ·4 • 4 4 9 • 9 9 4

4 94 4

4 • 4 99

Leu Leu Arg Ile Leu Met Asp Val 320 325

Trp Glu Ile Thr Gin Arg Thr Val 340

Pro Glu Ala Leu Glu Lys Trp Ser 355

Pro Arg His Val Glu Ile Ile Ala 370 375

Thr Ile Leu Ala Glu Tyr Gly Thr 385 390

Lys Leu Asn Gin Met Arg Ile Leu 400 405

Val Leu Glu Leu Leu Ile Lys Ala 420

Lys Ala Ala Asp Glu Glu Gin Glu 435

Asp Glu Glu Thr Glu Ala Val Lys 450 455

Glu Thr Glu Val Lys Lys Val Glu 465 470

Lys Arg Ile Phe Gly Pro His Pro 480 485

Ala Asn Leu Cys Val Val Ser Gly 500

Ile His Ser Glu Ile Val Lys Asp 515

Leu Trp Pro Glu Lys Phe Gin Asn 530 535

Arg Trp Leu Ser Phe Cys Asn Pro 545 550

Trp Thr Gly Ser Asp Asp Trp Leu 560 - 565

Leu Arg Lys Phe Ala Asp Asn Glu 580

Ala Lys Gly Asn Asn Lys Met Lys ’ 595

Lys Gly Leu Ser Trp Lys Gin Ala 330 335

Ala Tyr Thr Asn His Thr Val Leu 345 350

Phe Thr Leu Leu Gly Glu Leu Leu 360 365

Met Ile Asp Glu Glu Leu Leu His 380

Glu Asp Leu Asp Leu Leu Gin Glu 395

Asp Asn' Val Glu Ile Pro Ser Ser 410 415

Glu Glu Ser Ala Ala Asp Val Glu 425 430

Glu Glu Gly Lys Asp Asp Ser Lys 440 445

Ala Glu Thr Thr Asn Glu Glu Glu 460

Val Glu Asp Ser Gin Ala Lys Ile 475

Asn Lys Pro Gin Val Val His Met 490 495

His Ala Val Asn Gly Val Ala Glu 505 510

Glu Val Phe Asn Glu Phe Tyr Lys 520 525

Lys Thr Asn Gly Val Thr Pro Arg 540

Glu Leu Ser Glu Ile Ile Thr Lys 555

Val Asn Thr Glu Lys Leu Ala Glu 570 575

Glu Leu Gin Ser Glu Trp Arg Lys 585 590

Ile Val Ser Leu Ile Lys Glu Lys 600 605 • · · · • · · · ··· ··· • · ·· ··

Pro

Arg

630

Lys

Cys

Ile

Glu

Ser

710

Ser

Met

Ile

Ala

Val

790

Val

Asn

Pro

Gin

Lys

870

Arg

Asp Ala Met Phe Asp 615

Gin Leu Leu Asn Ile 635

Glu Met Ser Pro Glu 650

Ile Phe Gly Gly Lys 665

Val Lys Phe Ile Thr 680

Ile Gly Asp'Leu Leu 695

Val Ala Glu Val Leu 715

Thr Ala Gly Met Glu 730

Asn Gly Cys Leu Leu 745

Arg Glu Glu Val Gly 760

His Glu Ile Ala Gly 775

Pro Asp Pro Arg Phe 795

Phe Gly Thr Tyr Asn 810

Glu Gly Tyr Gly Arg 825

Asp Tyr Ile Glu Cys 840

Lys Lys Trp Thr Lys 855

Phe Ser Ser Asp Arg 875

Ile Glu Pro Val Glu 890 • ·* ·· ·» »· · » · ♦ » • ·. » » ·· • · · · · « · • · · · · · ·*· ·· »· ·· ·*

Val Gin Ile Lys 620

Phe Gly Ile Val

Glu Arg Lys Glu 655

Ala Phe Ala Thr 670

Asp Val Gly Glu 685

Lys Val Val Phe 700

Ile Pro Gly Ser

Ala Ser Gly Thr 735

Ile Gly Thr Leu 750

Glu Asp Asn Phe 765

Leu Arg Lys Glu 780

Glu Glu Val Lys

Tyr Glu Glu Leu 815

Ala Asp Tyr Phe 830

Gin Asp Lys Val 845

Met Ser Ile Leu 860

Thr Ile His Gin

Leu Pro * ·· · · ·· ·« • * * * · ···· ·· · · ·· · · « · ······ φ © ·· ·* ·· ·· «9 (2) Informace o SEQ ID NO: 7:

(i)	Popis sekvence: (A) Délka: 27 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární
(ii)	Typ molekuly: DNA (genomová)
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	Pozitivní: ne
(V)	Typ fragmentu: vnitřní
(Ví)	Původní zdroj: (A) Organizmus: Solanum tuberosum
(ix)	Znaky:

(A) Název/klíč: CDS (B) Pozice: 1 ..27 (C) Jiné informace: Funkce= primer/označení= SPL1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:

ATTCGAAAAG CTCGAGATTT GCATAGA 27 (2) Informace o SEQ ID NO: 8:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 27 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární

(ii)	Typ molekuly: DNA (genomová)
(iii)	Hypotetická: ne
(iv)	Pozitivní: ne
(V)	Typ fragmentu: vnitřní
(Vi)	Původní zdroj: (A) Organizmus: Solanum tuberosum
(ix)	Znaky: (A) Název/klíč: misc_rys (B) Pozice: 1 .. 27

• · * · · · · · · *♦« »· 99 99 99 99 (C) Jiné informace: funkce= primer/označení= SPL2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:

GTTTATTTTC CATCGATGGA AGGTGGT 27 (2) Informace o SEQ ID NO: 9:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 23 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

(A) Organizmus: Solanum tuberosum (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: misc_rys (B) Pozice: 1 ..23 (C) Jiné informace: funkce^ primer/označení= SPH1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:

GTGTGCTCTC GAGCATTGAA AGC 23 (2) Informace o SEQ ID NO: 10:

(i) Popis sekvence:

(A) Délka: 25 párů baží (B) Typ: nukleová kyselina (C) Druh řetězce: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: ne (iv) Pozitivní: ne (v) Typ fragmentu: vnitřní (vi) Původní zdroj:

• ·· ·© ·· ···· · » 9 9 9 9 9 9 « 99 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 999 999

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 99 (A) Organizmus: Solanum tuberosum (ix) Znaky:

(A) Název/klíč: misc_rys (B) Pozice: 1 .. 25 (C) Jiné informace: funkce= primer/označení= SPH2 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

ATAATATCCT GAATCGATGC ACTGA

Claims (52)

1. Rostlina brambor, které má zlepšené charakteristiky skladování při nízké teplotě, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje upravenou rostlinu brambor, jenž vykazuje ve hlízách produkovaných rostlinou vzhledem k hlízám produkovaným neupravenou rostlinou brambor sníženou aktivitu enzymu fosforylázy α-glukanu vybraného ze skupiny zahrnující hlízovou fosforylázu α-glukanu typu L (GLTP) a hlízovou fosforylázu α-glukanu typu H (GHTP).

2. Rostlina brambor podle nároku 1, vyznačující se tím, že se transformovala expresívní kazetou, která má sekvenci rostlinného promotoru operabilně spojenou se sekvencí DNA, která v případě, že se v rostlině přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu fosforylázy α-glukanu vybrané ze skupiny zahrnující gen GLTP a GHTP.

3. Rostlina brambor, která má zlepšené charakteristiky skladování při nízké teplotě, vyznačuj ící se tím, že zahrnuje rostlinu brambor transformovanou expresívní kazetou, kde sekvence rostlinného promotoru je operabilně spojena se sekvencí DNA obsahující alespoň 20 nukleotidů genu kódujícího fosforylázu α-glukanu vybranou ze skupiny zahrnující hlízovou fosforylázu α-glukanu typu L (GLTP) a hlízovou fosforylázu α-glukanu typu H (GHTP).

4. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že kódovaná fosforyláza α-glukanu je GLTP.

5. Rostlina brambor podle vyznačující se tím, že α-glukanu je GHTP.

6. Rostlina

9 9

I « 99 * 9 · « * · ··· 99 99 99 ·· *9 > 9 · · » 9 9 9

-ZMĚNĚNÝ list nároku 3, kódovaná fosforyláza nároku 3, kódovaná fosforyláza brambor podle vyznačující se tím, že α-glukanu obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.

7. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že sekvence DNA obsahuje alespoň 20 nukleotidů genu kódujícího fosforylázu a-glukanu,, jak je znázorněno v SEQ ID NO: 1.

8. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že kódovaná fosforyláza α-glukanu obsahuje aminokyselinovou sekvence znázorněnou v SEQ ID NO: 4.

9. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že sekvence DNA obsahuje alespoň 20 nukleotidů genu kódujícího fosforylázu a-glukanu jak znázorňuje SEQ ID NO: 3.

10. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že sekvence DNA obsahuje nukleotidy 338 až 993 sekvence SEQ ID NO: 1.

11. Rostlina brambor podle nároku 3, vyznačující se tím, že sekvence DNA obsahuje nukleotidy 147 až 799 sekvence SEQ ID NO: 3.

• ·· ·· • 44 * · 4 4 • 4 4 4 «π<( ·4· 4 4«

444 44 ··

12. Rostlina brambor podle libovolného z nároků 2 až 11, vyznačující se tím, že sekvence DNA je spojena s promotorovou sekvencí v antisense orientaci.

13. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách rostliny měřené při sklizni je alespoň o 10 % nižší než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se měří také při sklizni.

14. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačuj íc i se ti m, že součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách rostliny měřené při sklizni je alespoň o 30 % nižší, než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se měří také při sklizni. 15. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačuj íc i se ti m, že součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách rostliny měřené při sklizni je alespoň o 80 % nižší, než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se měří také při sklizni. 16. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačuj íc í se t í m, že součet koncentrace

glukózy a fruktózy v hlízách rostliny skladované při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíce je alespoň o 10 % nižší, než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se skladují za stejných podmínek.

ΦΦ ► « ·· φφ «φ : ·..

:: ” φφ φφ »

17. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíce je alespoň o 30 % nižší, než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se skladují za stejných podmínek.

18. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíce je alespoň o 39 % nižší, než součet koncentrace glukózy a fruktózy v hlízách netransformované rostliny, které se skladují za stejných podmínek.

19. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny při sklizni vyjádřená jako pmol NADPH na mg proteinu za hodinu je alespoň o 10 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy a-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny při sklizni.

20. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny při sklizni vyjádřená jako pmol NADPH na mg proteinu za hodinu je alespoň o 30 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy a-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny při sklizni.

21. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny při sklizni • ·« ·· · · • ·· • · · • · · ♦ ·· ·· *· ·«

9 9 9 <

• · ·♦ • · · J 9

9 » ,Λ. .

·· ·♦ · Λ

NlNÝÍIST’ vyjádřená jako μπιοί NADPH na mg proteinu za hodinu je alespoň o 66 % nižší než je celková aktivita fosforylázy a-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny při sklizni.

22. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců a vyjádřená jako μπιοί NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 10 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

23. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců vyjádřená jako μπιοί NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 30 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

24. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců vyjádřená jako μπιοί NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 70 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

25. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců vyjádřená jako μπιοί • · ·· • · · • · • ·· • * ·· ► · « « » · · 1 • · · · · · *ι ui

NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 10 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

26. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců vyjádřená jako pmol NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 28 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

27. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 6 měsíců vyjádřená jako ymol NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 10 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

28. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 6 měsíců vyjádřená jako pmol NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 30 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

29. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 6 měsíců vyjádřená jako pmol ·· ·· ·· ·· 9·

LIST alespoň o 69 % nižší,

NADPH na miligram proteinu za hodinu je než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

30. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 6 měsíců vyjádřená jako pmol NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 10 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

31. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 6 měsíců vyjádřená jako pmol NADPH na miligram proteinu za hodinu je alespoň o 39 % nižší, než je celková aktivita fosforylázy α-glukanu měřená v hlízách netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

32. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny měřené při sklizni je alespoň o 5 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny měřené také při sklizni.

33. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny měřené při sklizni je alespoň o 30 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny měřené také při sklizni.

» ·· • · 4 • · « £·« ··· y^EN^Ý-iiST

34. Rostlina vyznačuj íc rostliny měřené při skóre lupínků hlíz sklizni.

brambor podle í se tím, že skóre sklizni je alespoň o 46 netransformované rostliny nároku 4, lupínků hlíz % vyšší, než je měřené také při

35. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny měřené při sklizni je alespoň o 5 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny měřené také při sklizni.

36. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny měřené při sklizni je alespoň o 10 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny měřené také při sklizni.

37. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců je alespoň o 5 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

38. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců je alespoň o 30 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

39. Rostlina brambor vyznačující se tím, rostliny skladovaných při teplotě podle nároku 4, ž e skóre lupínků hlíz 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců je alespoň o 89 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

40. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců je alespoň o 5 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

41. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 3 měsíců je alespoň o 10 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

42. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 4 měsíců je alespoň o 5 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

43. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 4 měsíců je alespoň o 30 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

44. Rostlina brambor podle nároku 4, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladovaných při teplotě 4 °C po dobu přibližně 4 měsíců je alespoň o 89 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

« 9« • 9 • · · • 9 9 • 9 9 9 « 9 9 9 9 9 9 9 9 9 • 9 fl

99 99 • *

i.hZměkěnpž ÚST

45. Rostlina brambor vyznačující se tím, rostliny skladovaných při teplotě měsíců je alespoň o 5 % vyšší, podle nároku 5, ž e skóre lupínků hlíz 4 °C po dobu přibližně 4 než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

46. Rostlina brambor podle nároku 5, vyznačující se tím, že skóre lupínků hlíz rostliny skladované při teplotě 4 °C po dobu přibližně 4 měsíců je alespoň o 25 % vyšší, než je skóre lupínků hlíz netransformované rostliny skladovaných za stejných podmínek.

47. Způsob zlepšení charakteristik skladování bramborové hlízy při nízké teplotě, vyznačující se tím, že zahrnuje provedení rostliny brambor, která se upravila tak, aby se v hlízách snížila aktivita enzymy fosforylázy a-glukanu vybrané ze skupiny zahrnující hlízovou fosforylázy a-glukanu typu L (GLTP) a hlízovou fosforylázu α-glukanu typu H (GHTP).

48. Způsob podle nároku 47, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení expresívní kazety do rostliny brambor, přičemž sekvence rostlinného promotoru je operabilně spojena se sekvencí DNA, která v případě, že se v rostlině přepisuje, inhibuje expresi endogenního genu fosforylázy α-glukanu vybraného ze skupiny zahrnující gen GLTP a GHTP.

49. Způsob zlepšení charakteristik skladování bramborové hlízy při nízké teplotě, vyznačující se tím, že zahrnuje zavedení expresívní kazety do rostliny brambor, kde sekvence rostlinného promotoru je operabilně spojena se sekvencí DNA, jenž obsahuje alespoň 20 nukleotidů genu kódujícího fosforylázu α-glukanu vybranou ze skupiny

• ·· 44 • 4 · • · » • ·· 4 · 4 4 4 • · «5 44 44 • 4

wsVičfíCjfjÝ USP zahrnující hlízovou fosforylázu a-glukanu hlízovou fosforylázu α-glukanu typu H (GHTP) typu L (GLTP)

50. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že kódovanou fosforylázou α-glukanu je GLTP.

51. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že kódovanou fosforylázou α-glukanu je GHTP.

52. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že kódovaná fosforyláza α-glukanu obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 2.

53. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že sekvence DNA obsahuje alespoň 20 nukleotidů genu kódujícího fosforylázu α-glukanu znázorněnou v SEQ ID NO:

1.

54. Způsob podle nároku 49, vyznačuj ící se tím, že kódovaná fosforyláza α-glukanu obsahuje aminokyselinovou sekvenci znázorněnou v SEQ ID NO: 4.

55. Způsob polde nároku 49, vyznačuj ící se tím, že sekvence DNA obsahuje alespoň 20 nukleotidů

genu kódujícího 3. fosforylázu α-glukanu znázorněnou v SEQ ID NO: 56. Způsob polde nároku 49, v y z n a č u j í c í s e tím, že sekvence DNA obsahuje nukleotidy 338 až 993 SEQ ID NO: 1.

. “í^ĚN^ý us?

• · ·· ·«

57. Způsob polde nároku 49, vyzná č ují c i s e tím, že sekvence DNA obsahuje nukleotidy 147 až 799 SEQ ID NO: 3. 58. Způsob podle libovolného z nároků 48 až 57, v y značuj ící se tím, že sekvence DNA je

spojena s promotorovou sekvencí v antisense orientaci.