BRPI0617481A2 - composiÇço que compreende um sistema enzimÁtico acoplado - Google Patents

Abstract

<B>COMPOSIÇçO QUE COMPREENDE UM SISTEMA ENZIMÁTICO ACOPLADO <D>A presente invenção refere-se a uma composição que compreende um sistema enzimático acoplado para a produção rápida e eficiente de peróxido de hidrogénio através do acoplamento de um primeiro sistema enzimático capaz de gerar peróxido de hidrogênio, a um segundo sistema enzimático que utiliza o produto sem ser peróxido de hidrogênio do primeiro sistema enzimático e opcionalmente é capaz de gerar peróxido de hidrogênio adicional.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "COMPOSI-ÇÃO QUE COMPREENDE UM SISTEMA ENZIMÁTICO ACOPLADO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma composição que compre-ende um sistema enzimático acoplado para a produção rápida e eficiente deperóxido de hidrogênio através do acoplamento de um primeiro sistema en-zimático capaz de gerar peróxido de hidrogênio, com um segundo sistemaenzimáticos que utiliza o produto sem ser peróxido de hidrogênio do primeirosistema enzimático e é opcionalmente capaz de gerar mais peróxido de hi-drogênio.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

O mau odor oral e a descoloração dos dentes são condições queafetam muitas pessoas. O mau odor da cavidade oral é também conhecidocomo haütcse eu mau hálito. Geralmente, acredita-se que a causa destacondição seja pela presença de bactérias anaeróbicas, especialmente bacté-rias anaeróbicas gram-negativas, na boca. Estas bactérias gerarão compos-tos voláteis de enxofre (VSC) que são conhecidos por causarem o mau odordo hálito.

A placa dentária é um biofilme amarelado que se forma sobre osdentes. Se não for removida regularmente, pode levar a cavidades nos den-tes (cáries), gengivite e periodontite e eventualmente à perda dos dentes. Osmicro-organismos que formam o biofilme são quase todos bactérias, com acomposição variando através da localização na boca. A doença periodontalafeta o periodonto, que é o tecido envolvente e de sustentação em torno dodente (isto é, o Iigamento periodontal, a gengiva e o osso alveolar). A gengi-vite e a periodontite são distúrbios inflamatórios da gengiva e dos tecidosperiodontais mais profundos, respectivamente.

Hoje em dia, os consumidores estão muito interessados em tor-nar seus dentes mais brancos. Pessoas com dentes mais brancos são con-sideradas como tendo mais confiança pessoal e melhor aceitação social. Osdentes compreendem tanto uma camada de dentina interna quanto uma ca-mada de esmalte rígido externa. A camada de esmalte protege a camada dedentina interna e o tecido vivo e serve como a superfície de contato para amastigação de alimento sólido. A camada de esmalte é geralmente translú-cida e tem coloração ligeiramente esbranquiçada. É também consideradaporosa uma vez que os cristais de hidróxi apatita que compreendem o es-malte formam bastões ou prismas hexagonais microscópicos que possuemporos ou canais microscópicos entre os mesmos. Como um resultado destaestrutura porosa, os agentes de coloração e as substâncias descolorantes,tais como antibióticos, alimentos contendo materiais corantes, café, cola,chá, tabaco etc., podem permear o esmalte e aiterar sua superfície para teruma aparência de coloração amarela ou amarronzada.

Embora a boa higiene oral, quando atingida pela escovação dosdentes com um agente dentrifício de limpeza, possa ajudar a reduzir a inci-dência de coloração, gengivite, placa, doença periodontal e/ou mau hálito,esta não previne ou eiimina necessariamente a ocorrência dos mesmos. Osmicro-organismos contribuem tanto para o início quanto para a progressãode gengivite, placa, doença periodontal e/ou mau hálito. Assim, para prevenirou tratar estes estados de saúde, estes micro-organismos têm que ser su-primidos através de algum meio sem ser a simples esfregação mecânica.Em adição, a simples esfregação mecânica não será totalmente eficientepara remover todos os tipos de manchas e/ou para branquear os dentes.

As enzimas que pertencem à classe EC 1.1.3. são oxidorreduta-ses que utilizam oxigênio como receptor e grupos CH-OH constituem o doa-dor. A capacidade de tais oxigênio oxidorredutases de gerar peróxido de hi-drogênio, que possui um efeito antimicrobiano, tem sido utilizada para au-mentar a estabilidade ao armazenamento de certos produtos alimentíciosincluindo queijo, manteiga e suco de frutas como é descrito na JP-B-73/016612. Foi também sugerido que as oxidorredutases podem ser poten-cialmente úteis como absorvedores de oxigênio ou antioxidantes nos produ-tos alimentícios. A composição de branqueamento dos dentes que compre-ende oxidorredutase(s) é descrita na Patente U.S. N2 6.379.653, em que obranqueamento dos dentes foi obtido através do tratamento com glicose oxi-dase. A glicose oxidase é altamente específica para a glicose e requer apresença deste açúcar cariogênico que se degrada na boca em compostosresponsáveis pelas cáries.

A W097/06775 descreve composições orais que compreendempelo menos uma oxidorredutase. As oxidorredutases consideradas pelaW097/06775 incluem enzimas dentro das classes de enzimas que compre-endem as oxidases incluindo E. C. 1.1.3. E. C. 1.2.3, E.G. 1.3.3, E. C. 1.4.3,E. C. 1.5.3, E. C. 1.7.3, E. C. 1.8.3, E. C. 1.9.3, Iaccases e enzimas relacio-nadas compreendidas em E. C. 1.10.3 e peroxidases em E. C. 1.11. Ossubstratos que não são cariogênicos, tais como aminoácidos, álcool, álcoolde açúcar, tal como xilitol e sorbitol são considerados como substratos ade-quados para as oxidorredutases. Uma xilitol oxidase específica é descrita naJP 80892242, que é relatada oxidar o xilitol, o D-sorbitol, o D-galactitol, o D-manitol e o D-arabinitol na presença de oxigênio.

A inclusão de certas enzimas oxidativas nas composições oraistais como pastas dentais, colutórios e dentrifícios pode reduzir a placa e agengivite. As enzimas que foram utilizadas incluem como seus ingredientesativos, amiloglucosidase e glicose oxidase. Estas produzem peróxido de hi-drogênio partindo dos carboidratos que podem ser fermentados da dieta quepor sua vez converte tiocianato em hipotiocianito na presença da Iactopero-xidase salivar. O hipotiocianito resultante atua como um inibidor bacterianoatravés da interferência com o metabolismo celular. A sorbitol oxidase é co-nhecida, por exemplo, de Hiraga K. e outros "Molecular cloning and expres-sion of a gene encoding a novel sorbitol oxidase from Streptomyces sp. H-7775."; Biosci. Biotechnol. Biochem. 62: 347-353 (1998) que descreve a clo-nagem e a expressão da sorbitol oxidase de Streptomyces sp.

A maior parte de substitutos do açúcar aprovados para uso ali-mentício é constituída de compostos sintetizados artificialmente. Entretanto,são conhecidos alguns substitutos naturais do açúcar - incluindo sorbitol exilitol, que são encontrados em bagas, frutos, vegetais e cogumelos. Emboranaturais, podem ser produzidos sinteticamente na produção de alimentos emmassa, em custos de produção menores. Tanto o xilitol quanto o sorbitol sãoutilizados nas composições para cuidado oral tal como pasta de dente ougoma de mascar para fornecer um sabor doce e, no caso do xilitol, para di-minuir a produção de ácido láctico e aumentar a produção de saliva (HayesC. J Dent Educ. 65(10): 1106-1109 2001).

Muito embora uma grande quantidade de pesquisa tenha sidorealizada com a finalidade de encontrar composições úteis para o tratamentoe/ou para a prevenção de gengivite, placa, doença periodontal e/ou mau há-lito e/ou para o branqueamento dos dentes, composições eficientes adicio-nais e métodos de tratamento para estas finalidades ainda são desejáveis.

Detergentes para lavanderia e para lavar louças consistem emmisturas complexas de uma grande variedade de ingredientes, que incluemtipicamente um número de componentes tais como tensoativos iônicos e nãoiônicos, solventes, bruilders, perfumes, enzimas e componentes de bran-queamento. Em tais misturas complexas, os problemas de estabilidade noarmazenamento, particularmente de enzimas, são bem-conhecidos. Em al-guns casos os problemas de estabilidade estão relacionados com a estabili-dade física do detergente, embora em outros casos, se refiram à estabilida-de funcional dos ingredientes individuais no detergente. Os agentes debranqueamento tais como percarbonatos e perboratos, são comumente utili-zados em detergentes em pó em que, junto com os ativadores de branque-amento (por exemplo, tetra-acetiletilenodiamina (TAED) e nonanoiloxibenze-nossulfonato (NOBS)), atuam para gerar perácidos (por exemplo, ácido pe-racético), peróxido de hidrogênio e/ou outras espécies relacionadas após aadição de água durante o ciclo de lavagem. Os perácidos ou as outras espé-cies de oxigênio ativas atuam então para branquear ou alvejar certas man-chas no tecido ou na louça. Entretanto, não há um sistema de branqueamen-to ideal disponível para uso nas formulações líquidas aquosas. Em adição,há uma necessidade da produção de agentes de branqueamento (por e-xemplo, espécies de oxigênio ativas, peróxidos e perácidos) após a diluiçãodo detergente no líquido de lavagem de roupas para branquear e/ou alvejarmanchas.

Enzimas tais como as oxidases são, em particular, suscetíveisaos problemas de estabilidade no armazenamento na formulação detergentelíquida. Isto previne seu uso amplo em composições para limpeza de tecidose para manutenção da casa que envolvem ação alvejantea. A manutençãoda atividade enzimática da oxidase nos detergentes durante o armazena-mento tem sido um desafio, especialmente em detergentes que contêm ain-da componentes do substrato da oxidase. A presença tanto da oxidasequanto do substrato da oxidase resulta na geração de peroxigênio in situ.Isto resulta na menor estabilidade enzimática devido à oxidação das enzi-mas tanto em formulações líquidas quanto secas. Os peróxidos danificam asenzimas através de vários mecanismos tais como a oxidação de alguns dosresíduos de aminoácidos ou através da interação com os cofatores das en-zimas. Isto resulta freqüentemente em uma perda gradual da atividade. Nasformulações detergentes secas, as enzimas podem ser estabilizadas, porexemplo, através do encapsulamento das enzimas como descrito na WO96/02623.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a uma composição que compre-ende uma primeira enzima, um substrato para a primeira enzima e uma en-zima adicional e ao uso da mesma para branquear e/ou alvejar, por exem-plo, dentes, pele, pelos, tecidos ou papel, a um produto para cuidado oral e aum método para branquear e/ou alvejar dentes, ao uso como um conservan-te e como um agente antimicrobiano, ao uso em cosméticos, em detergen-tes, em tintas, em alimentos humanos e animais, na produção e na prepara-ção de alimentos humanos e animais e em pesticidas.

A presente invenção se baseia em uma sinergia surpreendenteque os presentes inventores descobriram quando um sistema de produçãode peróxido de hidrogênio que compreende uma primeira enzima, tal comouma poliol oxidase e um primeiro substrato, tal como um poliol, é acoplado aum sistema enzimático adicional, tal como um sistema da enzima oxidorre-dutase que utiliza o produto sem ser peróxido de hidrogênio gerado pelaprimeira oxidase (isto é, o segundo substrato) gerando opcionalmente maisperóxido de hidrogênio.

Foi descoberto que o acoplamento das primeira e segunda en-zimas (sistemas) aumenta enormemente a eficiência da produção de peróxi-do de hidrogênio partindo do primeiro sistema enzimático e pode resultar naprodução de peróxido de hidrogênio partindo tanto do primeiro quanto dosegundo substratos. O efeito é uma produção de peróxido de hidrogênioconsideravelmente maior e devido à sinergia surpreendente entre a primeiraoxidase e a enzima/oxidorredutase adicional, uma taxa muito maior de peró-xido de hidrogênio comparada com a que seria esperada partindo do siste-ma do primeiro substrato/primeira enzima oxidase isoladamente (ou do sis-tema enzimático oxidoredutase adicionai isoladamente). Isto é como se oacoplamento do sistema enzimáticos adicional 'carregasse de forma turbina-da' a primeira oxidase, forçando a produção do nível muito alto de peróxidode hidrogênio.

A primeira enzima é preferencialmente uma oxidase e é referidaaqui como urna primeira oxidase. üma oxidase preferida é a poliol oxidase,tal como a sorbitol oxidase.

A presente invenção fornece composições detergentes quecompreendem a composição, da invenção assim como métodos para uso dacomposição da invenção em composições detergentes líquidas para o bran-queamento e para a limpeza, por exemplo, de manchas coradas de alimentos.

Durante o desenvolvimento da presente invenção, foi descobertode forma surpreendente que as sorbitol oxidases eram adequadas para usonos sistemas de branqueamento que evitavam as desvantagens que atrapa-lham os sistemas de branqueamento utilizados atualmente.

O acoplamento da primeira oxidase a uma enzima adicionalpermite, portanto, a exploração completa da capacidade oxidativa associadaao primeiro substrato. Parece que a primeira oxidase atua como um 'elemen-to vital' que é substancialmente robusto em um ambiente detergente e, comodescrito aqui, permite a produção eficiente e rápida do poder de branquea-mento do peróxido de hidrogênio, especialmente quando acoplada a umaoxidorredutase adicional.

A presente invenção fornece em um aspecto uma composiçãoque compreende uma primeira oxidase, um primeiro substrato e uma oxidor-redutase, em que o primeiro substrato é oxidável pela primeira oxidase paraformar peróxido de hidrogênio e um segundo substrato e o segundo substra-to é oxidável pela oxidorredutase para formar peróxido de hidrogênio e umproduto.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um produto paracuidado oral que compreende uma composição de acordo com a invenção eingredientes utilizados nos produtos para cuidado oral.

Em um aspecto adicionai, a invenção fornece um produto cos-mético que compreende uma composição de acordo com a invenção e umou mais ingredientes utilizados nos produtos cosméticos.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um produto deter-gente que compreende uma composição de acordo com a invenção e um oumais ingredientes utilizados nos produtos detergentes.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um produto de tin-ta que compreende uma composição de acordo com a invenção e um oumais ingredientes utilizados nos produtos de tinta.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um produto pesti-cida que compreende uma composição de acordo com a invenção e um oumais ingredientes utilizados nos produtos pesticidas.

Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um produtoalvejante ou alvejante, tal como um produto alvejante ou alvejante para alve-jar ou branquear um tecido externo de mamífero, tal como pele, pelos oudentes que compreende uma composição de acordo com a invenção e in-gredientes utilizados nos produtos alvejantes e alvejantes adequados para aaplicação sobre o tecido externo de mamífero.

Em uma modalidade adicional, a invenção fornece um métodocosmético para alvejar ou branquear o tecido externo de mamífero que com-preende o contato do tecido externo de mamífero com uma composição deacordo com a invenção ou com o produto para alvejar e/ou branquear o teci-do externo de mamífero de acordo com a invenção em uma quantidade euma duração adequadas para alvejar e/ou branquear o tecido externo demamífero.

A invenção fornece ainda um medicamento que compreendeuma composição de acordo com a invenção.

A invenção fornece ainda uma bebida que pode ser ingerida quecompreende uma composição de acordo com a invenção, tal como um sucode fruta.

Em uma modalidade, a composição não compreende o primeirosubstrato, mas o primeiro substrato está naturalmente presente ou é adicio-nado na composição ou na matriz de aplicação.

A invenção fornece ainda um produto detergente ou alvejanteque compreende uma composição de acordo com a invenção e pelo menosum ingrediente adicional utilizado nos produtos detergentes ou alvejantes.

A invenção fornece ainda o uso da composição de acordo com ainvenção em um produto para cuidado oral com efeitos alvejantes e/ou alve-jantes dos dentes benéficos e/ou vida útil estendido e/ou efeitos antimicrobi-anos/antibacterianos antes ou durante o uso.

A invenção fornece ainda o uso de uma composição de acordocom a invenção em um produto comestível com efeitos pré-bióticos benéfi-cos quando consumido por um mamífero individual e/ou uma vida útil pro-longada.

A invenção fornece ainda o uso de uma composição de acordocom a invenção em um produto cosmético que possui uma vida útil prolon-gada e/ou é capaz de alvejar e/ou branquear o tecido externo de mamíferoe/ou possui um efeito antimicrobiano/antibacteriano quando aplicado na pelehumana.

A invenção fornece ainda o uso de uma composição de acordocom a invenção em um produto de tinta que exibe maior conservação antesou após a aplicação e/ou exibe propriedade anti-incrustante reduzida.

A invenção fornece ainda um método para a preparação de umacomposição que compreende a mistura de uma primeira enzima e um pri-meiro substrato e pelo menos uma enzima adicional, em que o primeirosubstrato é oxidável pela primeira enzima, tal como a sorbitol oxidase, paraformar peróxido de hidrogênio e um segundo substrato e o segundo substra-to pode ser convertido por pelo menos uma enzima adicional para formar umproduto.

A composição pode compreender um componente ou compo-nentes de matriz adequados aos quais a primeira enzima e pelo menos umaenzima adicional são misturadas. O primeiro substrato também pode sermisturado no componente de matriz ou, em uma modalidade faz parte ou atéconstitui todo o componente de matriz. O componente de matriz pode, por-tanto, consistir ou compreender o primeiro substrato.

A invenção fornece ainda um método para a preparação de umacomposição que compreende a mistura de uma primeira oxidase e um pri-meiro substrato e pelo menos uma oxidorredutase adicional, em que o pri-meiro substrato é oxidável pela primeira oxidase tal como a sorbitol oxidase,para formar peróxido de hidrogênio e um segundo substrato e o segundosubstrato é oxidável pela oxidorredutase para formar peróxido de hidrogênioe um produto.

A invenção fornece ainda o uso de uma composição de acordocom a invenção, na produção de um medicamento para o tratamento ou pa-ra a prevenção de um distúrbio médico selecionado dentre: doença gengival,gengivite, doença periodontal, síndrome do intestino irritável, intolerância àlactose, câncer de cólon, alto teor de colesterol no sangue, alta pressãosangüínea, hipertensão, infecção, inflamação e deficiências nutricionais.

A invenção fornece ainda um método de tratamento médico quecompreende a administração de uma composição de acordo com a invençãoou de um medicamento ou de produtos para cuidado oral de acordo com ainvenção a um paciente que necessita do tratamento ou da profilaxia.

A invenção fornece ainda um método de produção de peróxidode hidrogênio, o método compreendendo a mistura de uma primeira enzimae um primeiro substrato e pelo menos uma enzima adicional sob condiçõesadequadas para a produção de peróxido de hidrogênio a partir da oxidaçãodo primeiro substrato devido à atividade da primeira enzima e opcionalmentea produção de peróxido de hidrogênio adicional a partir da oxidação de umsegundo substrato devido à atividade de pelo menos uma enzima adicional,em que o segundo substrato é gerado pela oxidação do primeiro substratopela primeira oxidase e em que o segundo substrato é convertido em umproduto por pelo menos uma enzima adicional.

A invenção fornece ainda um método de produção de peróxidode hidrogênio, o método compreendendo a mistura de uma primeira oxidasee um primeiro substrato e pelo menos uma oxidorredutase adicional sobcondições adequadas para a produção de peróxido de hidrogênio partindotanto da oxidação do primeiro substrato devido à atividade da primeira oxi-dase quanto da produção de peróxido de hidrogênio a partir da oxidação deum segundo substrato devido à atividade de pelo menos uma oxidorredutaseadicional, em que o segundo substrato é gerado pela oxidação do primeirosubstrato pela primeira oxidase.

Ern um outro aspecto, a invenção fornece o uso de uma compo-sição de acordo com a invenção para branquear e/ou alvejar.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para alve-jar e/ou branquear os dentes, que compreende o contato dos dentes com umproduto para cuidado oral que compreende uma composição de acordo coma invenção em uma quantidade e um período de tempo adequados para al-vejar e/ou branquear os dentes.

A invenção fornece o uso de uma composição de acordo com ainvenção para branquear e/ou alvejar os dentes.

Embora os aspectos principais da invenção se refiram a um sis-tema enzimático acoplado, em algumas modalidades, tais como as modali-dades a seguir, a invenção fornece composições que compreendem umapoliol oxidase e um primeiro substrato, que são referidos aqui. Foi descober-to que o uso do sistema enzimáticos de poliol oxidase/primeiro substrato éaltamente benéfico nestas aplicações, tal como a produção de peróxido dehidrogênio partindo de um substrato que não pode ser fermentado, opcio-nalmente sem a diminuição do pH (por exemplo, como quando não acopladoa um sistema de oxidorredutase adicional) e as características antimicrobia-nas/bacterianas, antideterioração, alvejantes e alvejanteas são fornecidasdessa maneira.

A invenção fornece uma composição de tinta que compreendeuma poliol oxidase e um primeiro substrato, em que o primeiro substrato éoxidável pela poliol oxidase para formar peróxido de hidrogênio.

A invenção fornece uma composição cosmética que compreen-de uma poliol oxidase e um primeiro substrato, em que o primeiro substratoé oxidável pela poliol oxidase para formar peróxido de hidrogênio.

A invenção fornece uma composição de alimentos humanos ouanimais que compreende uma poliol oxidase e um primeiro substrato, emque o primeiro substrato é oxidável pela poliol oxidase para formar peróxidode hidrogênio, de forma que uma composição de alimentos humanos ou a-nimais é selecionada do grupo que consiste em: produtos laticínios, tais co-mo leite, creme, queijo, soro de leite; bebidas, tal como suco de fruta.

A invenção fornece uma composição de medicamento que com-preende uma poliol oxidase e um primeiro substrato, em que o primeirosubstrato é oxidável pela poliol oxidase para formar peróxido de hidrogênio,tal como quando o primeiro substrato é sorbitol ou preferencialmente xilitol.

A invenção fornece uma composição pesticida que compreendeuma poliol oxidase e um primeiro substrato, em que o primeiro substrato éoxidável pela poliol oxidase para formar peróxidos de hidrogênio.FIGURAS:

Figura 1: O plasmideo de expressão (pKB105-TAT-SOX-7775).Figura 2: O plasmideo "pKB105-CelA-Sox7775".

Figura 3: A velocidade inicial da produção de H2O2 utilizando ascomposições com um excesso entre 1x 3000x da enzima adicional (oxidor-redutase) comparada com a da primeira oxidase (SOX), que é medida aolongo de 5 minutos em 300 μΙ_ de ensaio ABTS. Foi observada uma sinergiadrástica com as enzimas adicionais tanto glicose oxidase quanto hexose o-xidase, com um aumento de até aproximadamente 250 - 300% na taxa deprodução peróxido de hidrogênio observada.

Figura 4: A velocidade inicial da produção de H2O2 utilizando ascomposições com um excesso entre 1x e 3000x da enzima adicional (oxidor-redutase) comparada com a da poliol oxidase, que é medida ao longo de 5minutos em 300 μΙ_ de ensaio ABTS. Foi observada uma sinergia drásticacom as enzimas adicionais tanto glicose oxidase quanto hexose oxidase,especialmente em dosagens maiores que 1x, tal como uma dosagem de pe-lo menos 2x das enzimas adicionais comparada com a da poliol oxidase.

Figura-5a: pET 24a - vetor de expressão da sorbitol oxidase(H7775).

Figura 5b. Expressão da Sorbitol oxidase ativa na cepa BL21(DE3) pLysS de E. coli:

a) Vetor de expressão contendo o fragmento de NdeI-BamHIde 1,27, que codifica o gene sintético SOX de Streptomy-ces,

b) Ensaio de atividade de cobertura em gel (PMS/NBT) utili-zando sorbitol com substrato. Controle negativo: Glicoseoxidase (GOX) na faixa 1, as faixas 2-10 são Iisados de cé-lulas de transformantes diferentes.

Figura 6. O constructo para expressão do suposto gene SOX nacepa de Streptomyces Iividans g3s3. O suposto gene SOX foi clonado naforma do fragmento da pCR NcoI-BamHI e inserido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em um aspecto a uma composi-ção que compreende uma primeira enzima tal como uma poliol oxidase (porexemplo, sorbitol oxidase), um primeiro substrato e uma enzima adicional talcomo uma oxidorredutase, em que o primeiro substrato é oxidável pela pri-meira oxidase, para formar peróxido de hidrogênio e um segundo substrato eo segundo substrato pode ser convertido pela enzima adicional para a ob-tenção de um produto.

Preferencialmente, a enzima adicional é uma oxidorredutase a-dicional e o segundo substrato é oxidável pela oxidorredutase para gerarperóxido de hidrogênio e o produto (adicional). i

A composição de acordo com a invenção pode ser aplicada paratodas as finalidades em que a produção de H2O2 é necessária, por exemplo,em aplicações em que o alvejamento e/ou o branqueamento é necessário oupara as finalidades antimicrobianas e especialmente em produtos em queingredientes não tóxicos e ambientalmente aceitáveis são desejados.

O Primeiro Substrato

No presente contexto, o termo "primeiro substrato" se refere aum substrato que é oxidável pela primeira enzima (tal como a primeira oxi-dase tal como a sorbitol oxidase) para gerar peróxido de hidrogênio e umsegundo substrato.

Em um aspecto da invenção, o primeiro substrato é um poliol, talcomo um ou mais substratos selecionados de álcoois de açúcar tais como osselecionados do grupo que consiste em D-sorbitol, D-xilitol, D-manitol, D-arabitol, glicerol, inositol, 1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol e 1,4-butanodiol.

Em uma modalidade, o primeiro substrato é um ou mais polióisselecionados do grupo que consiste em D-sorbitol ou D-xilitol.

Em uma modalidade, o primeiro substrato é D-sorbitol.

É reconhecido que açúcares e álcoois de açúcar que existemnos estereoisômeros D ou L, é a forma D que prevalece na natureza, e são,portanto, preferido em termos dos primeiro e segundo substratos como refe-rido aqui.

Em um aspecto adicional da invenção, o primeiro substrato é umadoçante não cariogênico tal como selecionado do grupo que consiste em D-sorbitol ou D-xilitol. Ainda em um aspecto adicional, o primeiro substrato é D-sorbitol. D-sorbitol e D-xilitol são essencialmente não cariogênicos e já sãoutilizados em produtos para cuidado oral, por exemplo, em goma de mascarcomo um adoçante artificial com resultados benéficos (Hayes C. J Dent E-duc. 65(10): 1106-1109 2001).

Em um aspecto, o primeiro substrato é um ou mais substratos deálcool de açúcar selecionados do grupo que consiste em sorbitol, xilitol, mal-titol, manitol, galactitol, isomalte, lactitol, arabitol e eritritol.

Em um aspecto, o primeiro substrato pode ser selecionado dogrupo que consiste em: ribitol, treitol, lixitol, alitol, altritol, gulitol, iditol, talitol,pentitol e hexitol.Em um aspecto, o primeiro substrato é um ou mais substratos deálcoois de açúcar selecionados do grupo que consiste em sorbitol, xilitol,maltitol, manitol, galactitol, isomalte, lactitol, arabitol, eritritol, glicerol, inositol,1,2-propanodiol, 1,3-butanodiol e 1,4-butanodiol.

Em um aspecto preferido da invenção, o primeiro substrato é oucompreende sorbitol.

Em um aspecto da invenção, o primeiro substrato é ou compre-ende xilitol.

A poliol oxidase e a oxidorredutase adicional são oxidases quesão capazes de gerar peróxido (H2O2).

O nível de poliol presente em uma composição de acordo com ainvenção dependerá da aplicação e da formulação utilizada. Para uso emprodutos para cuidado oral pode ser utilizado um alto nível de poliol, em queo poliol pode ser o ingrediente de matriz principal na composição. Os polióistambém podem formar um componente principal de formulações cosméticas.Em tais aplicações, os polióis podem ser adicionados como agentes umec-tantes. Os polióis também podem ser adicionados em detergentes tais comosabões, em que podem ter uma função umectante ou como um agente declarificação.

Entretanto, em algumas aplicações, tais como em algumas apli-cações de tinta e de detergente o poliol pode ser adicionado como um com-ponente mivoritário, suficiente para fornecer o primeiro substrato suficientepara a produção de peróxido de hidrogênio, mas não constituindo um com-ponente principal de matriz.

Portanto, por exemplo, o nível do primeiro substrato presente nacomposição da invenção, antes da oxidação no segundo substrato pode serentre aproximadamente 0,05% até aproximadamente 80% em p/p, tal comoentre 0,1% e aproximadamente 70% em p/p.

De forma adequada em uma modalidade, o nível de poliol pre-sente nos produtos para cuidado oral pode, portanto, ser entre aproximada-mente 1 até aproximadamente 80% em p/p, tal como entre aproximadamen-te 10 até aproximadamente 75% em p/p ou tal como entre aproximadamente20 até aproximadamente 70% em p/p.

De forma adequada em uma modalidade, o nível de poliol pre-sente nos produtos de tinta pode variar entre aproximadamente 0,01 até a-proximadamente 20% em p/p, tal como de aproximadamente 0,1 até aproxi-madamente 10% em p/p, tal como de aproximadamente 1 até aproximada-mente 5% em p/p.

De forma adequada em uma modalidade, o nível de poliol pre-sente em uma composição cosmética ou em produtos de acordo com a in-venção pode variar entre aproximadamente 1 até aproximadamente 50% emp/p, tal como entre aproximadamente 5 até aproximadamente 40% em p/pou tal como entre aproximadamente 10 até aproximadamente 40% em p/p. APatente U.S. Ns 7094395 descreve cosméticos que compreendem aproxi-madamente 8-32% de poliol (umectantes), tal faixa pode também ser utiliza-da nas composições da presente invenção.

De forma adequada, em modalidades adicionais, o nível de poli-ol presente nos produtos detergentes pode variar entre aproximadamente0,01% até aproximadamente 40% em p/p, tal como entre aproximadamente0,1% até aproximadamente 30%, tal como entre aproximadamente 1% atéaproximadamente 20%, tal como entre aproximadamente 1% até aproxima-damente 10% ou entre aproximadamente 1% e aproximadamente 5%.A Primeira Enzima

A primeira enzima é tipicamente uma enzima oxidase e é referi-da aqui como 'primeira oxidase'.

A primeira enzima, tal como a primeira oxidase pode ser deriva-da ou isolada de um organismo selecionado do grupo que consiste em: es-pécies de Streptomyces, Xanthomonas, Brevibacterium, Frankia, Nocardia,Janibacter, Burkholderia, Paracoccus, Chromabacterium, Thermobifida,Psuedomonas, Corynebacterium e Bacillus e homólogos das mesmas.

As primeiras oxidases adequadas podem incluir enzimas quesão categorizadas sob um número de Classificação de Enzima (E. C.) sele-cionado do grupo que consiste em: EC 1.1.3.14 catecol oxidase, EC 1.1.3.18álcool oxidase secundária, EC 1.1.3.41 xilitol oxidase, EC 1.1.3.13 álcooloxidase, EC 1.1.3.19 4-hidroximandelato oxidase, EC 1.1.3.20 álcool oxidasede cadeia longa, EC 1.1.3.40 D-manitol oxidase, EC 1.1.3.7 arilálcool oxida-se, EC 1.1.3.30 polivinilálcool oxidase, EC 1.1.3.21 glicerolalcooloxidase eEC 1.1.3.38 vanililálcool oxidase.

A JP 80892242 descreve uma xilitol oxidase que oxida xilitol, D-sorbitol, D-galactitol, D-manitol e D-arabinitol na presença de oxigênio.

Uma xilitol oxidase que pode ser obtida partindo de cepas deStreptomyces sp. (por exemplo, Streptomyces IKD472, FERM P14339) pos-suindo um pH ótimo em 7,5, é estável em pH 5,5 até 10,5 e a temperaturasaté 65°C; propriedades muito bem adequadas para as aplicações descritasaqui, tais como composições e produtos para cuidado oral e detergentes.

Em uma modalidade específica, a primeira enzima não é a xilitoloxidase que pode ser obtida partindo de cepas de Streptomyces sp. (porexemplo, Streptomyces IKD472, FERM P14339) possuindo um pH ótimo em7,5 e que é estável em pH 5,5 até 10,5 e a temperaturas de até 65°C.

Durante o desenvolvimento da presente invenção, foi descobertode forma surpreendente que as poliol oxidases tais como as sorbitol oxida-ses eram adequadas para uso em sistemas de branqueamento que evita-vam as desvantagens que atrapalham os sistemas de branqueamento atu-almente utilizados. Estas sorbitol oxidases incluem enzimas isoladas de or-ganismos tais como espécies de Streptomyees ou de Xanthomonas e homó-logos das mesmas. Entretanto, não é pretendido que a presente invençãoseja limitada a esta(s) sorbitol oxidase(s) específica(s) nem a qualquer(quaisquer) particular(es).

A sorbitol oxidase ("SOX" ou "SoX") é uma enzima que catalisa aconversão do sorbitol em glicose e peróxido de hidrogênio. As sorbitol oxida-ses são conhecidas e utilizadas em várias aplicações (Ver, por exemplo,Oda e Hiraga, Ann. NY Acad. Sci., 864: 454-457 [1998]; e Yamashita e ou-tros J. Biosci. Bioengin., 89: 350-360 [2000]). O sorbitol (D-glucitol, C6H14O6,PM 182,2, CAS 50-70-4) é comumente utilizado em formulações de produtoscom enzimas. Assim, a sorbitol oxidase fornece um agente bioalvejante a-traente para uso em detergentes que incorporam estas formulações de pro-dutos com enzimas contendo sorbitol.

Em uma modalidade, a primeira oxidase possui uma atividadeespecífica maior sobre o sorbitol quando comparada com aquela sobre oxilitol, tal como uma atividade específica de pelo menos aproximadamente1,5x ou de pelo menos aproximadamente 2x maior que a atividade específi-ca sobre o sorbitol quando comparada com aquela sobre o xilitol.

Em uma modalidade, a primeira oxidase possui uma atividadeespecífica sobre o sorbitol de pelo menos aproximadamente 5 unidades/mg.

A atividade específica da primeira oxidase sobre os substratossorbitol e xilitol pode ser determinada in vitro, tal como utilizando os ensaiosfornecidos nos exemplos ou alternativamente a atividade específica pode serdeterminada in situ, dentro da dita composição para cuidado oral.

Uma SOX preferida é uma oxidorredutase que utiliza FAD ligadocovalentemente como um cofator para a oxidação do sorbitol em glicose.Esta enzima oferece uma oportunidade exclusiva para seu uso potencialcomo um agente bioalvejante por si só, assim como utilizada em combina-ção com carboidrato oxidases tais como glicose oxidase e/ou hexose oxida-se (ver a WO 96/39851), (gluco)oligossacarídeo oxidase e carboidrato oxi-dase de M. nivale (ver a W099/31990).

Uma vantagem do uso de tais combinações é devido ao fato deque a SOX converte o sorbitol em glicose, que pode então ser convertida emgluconato pela glicose oxidase e/ou pela hexose oxidase, gerando assimdois mois de peróxido de hidrogênio por mol de sorbitol, como ilustrado a-baixo.

D-Sorbitol + O2 -> D-Glicose + H2O2

D-Glicose + O2 -> D-Gluconato + H2O2

Uma glicerol oxidase (GLOX) preferida é uma enzima encontra-da nos gêneros Penicillium e Botrytis (Ver, por exemplo, Lin e outros Enz.Micro. Technol., 18: 383-387 [1996]; e Uwajima e outros, Agric. Biol. Chem.,44: 399-406 [1989]). Esta enzima catalisa a conversão de glicerol e oxigênioem gliceraldeído e peróxido de hidrogênio como mostrado abaixo.

CH2OH-CHOH-CH2OH + O2 -> CH2OH-CHOH-CHO + H2O2O glicerol (glicerina, C3H8O3, PM 92,09, CAS 56-81-5) é comu-mente utilizado em formulações de produtos com enzimas, formulações parasabão e detergente, alimentos e bebidas, produtos farmacêuticos e é am-plamente utilizado em cosméticos e aplicações de cuidado pessoal. Assim, aglicerol oxidase fornece um agente bioalvejante atraente para uso em deter-gentes que incorporam estas formulações de produtos com enzimas conten-do glicerol.

Durante o desenvolvimento da presente invenção, a sorbitoloxidase foi isolada de Streptomyces Iividans (SC06147) (SEQ ID N-: 2) eStreptomyces sp. H7775 (SEQ ID NO 1) (Ver, Hiraga e outros, Biosci. Biote-ch. Biochem., 61: 1699-1704 [1997]). A sorbitol oxidase foi expressa tanto deforma intracelular quanto extracelular partindo destes organismos. O grupoprostético é um FAD ligado covalentemente (1 mol de FAD para 1 mol deSOX). Assim é uma flavoproteína, com máximo de absorção típico em 276,358 e 455 nm para a H7775 SOX, 345 nm para a SC06147 SOX (que é ex-pressa em S. lividans), que é indicativo de uma ligação histidina-flavina. Aflavina está funcionalmente envolvida na oxidação do sorbitol que é obser-vada pelas alterações desejadas nos espectros de UV-VIS. O FAD fica muitofortemente ligado com a proteína e oferece assim uma enzima estável paraaplicações de lavanderia.

O gene SOX foi clonado e sequenciado a partir da espécie deStreptomyces H-7775 (número de acesso do Genbank AB000519).

O gene da sorbitol oxidase proveniente da espécie de Strep-tomyces H-7775 (número de acesso do Genbank AB000519) compreendeum quadro aberto de leitura (ORF) de 1260 pb que codifica uma proteínaque possui 420 aminoácidos com PM teórico de 45.158 Dáltons. A enzima éestável durante 24 horas a 30°C, entre pH 7,5-10 com uma temperatura óti-ma de 50°C em pH 7,5. É também termoestável até 55°C. O homólogo maispróximo identificado para esta enzima é a xilitol oxidase (51% de homologia).A SOX é uma enzima eficiente para várias aplicações, incluindo detergentes,cuidado de tecidos, cuidado doméstico, cuidado oral (por exemplo, branque-amento e/ou limpeza dental), cuidado pessoal, processamento de tecidos,processamento de alimentos e limpeza industrial. Em adição, várias SOXspodem catalisar outros substratos tais como xilitol, manitol, arabitol, ribitol,eritritol, inositol, glicerol, propano diol e butano diol. Assim, esta enzima utili-za um espectro mais amplo de substratos, fornecendo flexibilidade no uso de substratos em várias aplicações.

Muitos destes primeiros substratos, que são fornecidos aqui, es-tão presentes em formulações para detergente, cuidado oral e cosméticastípicas ou podem ser adicionadas às mesmas.

A seqüência de aminoácidos da sorbitol oxidase de Streptomy- ces sp. H7775 é conhecida na técnica e é apresentada na SEQ ID Ns: 1.

Como indicado anteriormente, foi descoberto que a poliol oxida-se tal como as sorbitol oxidases utilizadas aqui é termicamente estável eestável ao longo de uma faixa ampla de pH. Na verdade, foi descoberto queo perfil de pH da sorbitol oxidase utilizada era compatível com o dos pHs necessariamente utilizados na indústria, assim como em detergentes e ou-tros agentes de limpeza.

Em adição, a poliol oxidase tal como a sorbitol oxidase fornecidapela presente invenção pode produzir preferencialmente açúcar tal comoglicose, isto é, um produto de aldeído que pode ser adicionalmente oxidado em ácido glucônico, um produto do ácido carboxílico, utilizando outras oxi-dases tal como a hexose oxidase ou a glicose oxidase que libera uma outramolécula de peróxido de hidrogênio partindo do sorbitol do substrato de par-tida. Similarmente é possível a oxidação de polióis tais como xilitol, arabitol,manitol, pela sorbitol oxidase, xilitol oxidase, manitol oxidase com o auxílio de oxigênio atmosférico com a formação do açúcar correspondente, tal comoxilose, arabinose, manose, respectivamente como o substrato secundáriopara a oxidação adicional por outras oxidases relevantes tais como hexoseoxidase, xilose oxidase, piranose oxidase, arabinose oxidase e manose oxi-dase.

Para uso em composições comestíveis e para cuidado oral, étambém vantajoso utilizar enzimas que são substancialmente ativas em pHsprevalecentes na boca, isto é, entre pH 5,0 até 9,0, preferencialmente entrepH 6,0 até 8,5, especialmente entre pH 6,4 até 7,5.

Em uma modalidade, a poliol oxidase é uma pentitol ou hexitoloxidase.

Em uma modalidade, a poliol oxidase não é uma triose oxidaseou não é uma glicerol oxidase.

É reconhecido que as enzimas podem ter atividade sobre maisde um substrato. Portanto, quando se refere a uma enzima pelo nome docomposto que esta oxida, por exemplo, sorbitol oxidase (sorbitol) ou hexoseoxidase (hexose) ou glicose oxidase (glicose), o nome se refere à classifica-ção que foi dada à enzima, tal como o número de EC ou ao nome que a en-zima é referida na técnica ou à atividade predominante quando comparadaao substrato para o qual a enzima possui a maior atividade específica. Sobeste aspecto, uma sorbitol oxidase possui uma atividade específica maiorsobre o sorbitol do que, por exemplo, sobre o xilitol. De forma adequada, asorbitol oxidase pode, em uma modalidade, catalisar também a oxidação devários polióis incluindo pelo menos dois do grupo que consiste em D-sorbitol,D-xilitol, D-manitol, D-arabitol, glicerol, inositol, 1,2-propanodiol, 1,3-butanodiol e 1,4-butanodiol.

Em uma modalidade, a poliol oxidase é selecionada do grupoque consiste em ribitol oxidase, treitol oxidase, xilitol oxidase, alitol oxidase,altritol oxidase, gulitol oxidase, iditol oxidase, talitol oxidase, pentitol oxidasee hexitol oxidase.

Em uma modalidade a poliol oxidase possui uma taxa de ativi-dade específica sobre o poliol que será denominado posteriormente, compa-rada com a atividade específica sobre um substrato alternativo, que é listadoaqui como o dito primeiro substrato ou o dito segundo substrato, excluindo osubstrato cujo poliol será denominado posteriormente, maior que 1, tal comomaior que aproximadamente 1,5, tal como maior que aproximadamente 2, talcomo maior que aproximadamente 3, tal como maior que aproximadamente4, tal como maior que aproximadamente 5, tal como maior que aproximada-mente 10. Em uma modalidade, a poliol oxidase possui uma taxa de ativida-de específica sobre o sorbitol comparada com a atividade específica sobreum substrato alternativo, maior que 1, tal como maior que aproximadamente1,5, tal como maior que aproximadamente 2, tal como maior que aproxima-damente 3, tal como maior que aproximadamente 4, tal como maior que a-proximadamente 5, tal como maior que aproximadamente 10, em que osubstrato alternativo é selecionado do grupo que consiste em: um açúcar talcomo maltose, hexose, glicose, manose, galactose, isomaltulose, lactose,arabinose, eritrose, pentose, xilose e triose, preferencialmente glicose; umatriose poliol, tal como glicerol; e xilitol.

Em uma modalidade, a poliol oxidase não é xilitol oxidase.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se exibe uma atividade maior sobre o sorbitol do que sobre o xilitol, tal comoo pelo menos uma vez e meia a mais de atividade, tal como pelo menos du-as vezes a mais de atividade. Na mesma modalidade ou em uma modalida-de diferente, a poliol oxidase possui não mais que três vezes a atividade so-bre o sorbitol quando comparada com aquela sobre o xilitol.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se é selecionada do grupo que consiste em: sorbitol oxidase, xilitol oxidase,maltitol oxidase, manitol oxidase, galactitol oxidase, isomalte oxidase, Iactitoloxidase, arabitol oxidase, arabitol oxidase e eritritol oxidase.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se possui uma atividade de oxidase (específica) de pelo menos aproxima-damente 5 unidades/g de proteína quando o respectivo substrato (por exem-plo, poliol) é utilizado, tal como um substrato selecionado do grupo que con-siste em: Sorbitol, xilitol, maltitol, manitol, galactitol, isomalte, lactitol, arabitol,arabitol e eritritol.

Uma primeira oxidase preferida, tal como a poliol oxidase é asorbitol oxidase ou uma enzima que exibe atividade sobre o sorbitol.

Em uma modalidade a primeira oxidase tal como a poliol oxidaseé a xilitol oxidase ou exibe atividade da xilitol oxidase.

Em uma modalidade a primeira oxidase tal como a poliol oxidaseé uma glicerol oxidase ou compreende atividade da glicerol oxidase.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se possui uma proporção de atividade específica sobre o respectivo poliolem relação ao açúcar correspondente maior que 1, tal como pelo menos a-proximadamente 1,5, tal como pelo menos aproximadamente 2, tal comopelo menos aproximadamente 3, tal como pelo menos aproximadamente 4,tal como pelo menos aproximadamente 5, tal como pelo menos aproxima-damente 10. Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxi-dase possui uma taxa de atividade específica sobre o respectivo poliol emrelação à glicose maior que aproximadamente 1, tal como pelo menos apro-ximadamente 1,5, tal como pelo menos aproximadamente 2, tal como pelomenos aproximadamente 3, tal como pelo menos aproximadamente 4, talcomo pelo menos aproximadamente 5, tal como pelo menos aproximada-mente 10.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se, tal como a sorbitol oxidase ou a xilitol oxidase é derivada ou obtida deuma cepa de Streptomyces, tal como de Streptomyces coelicolor oü de S-treptomyces sp. IKD472.

Em uma modalidade, a primeira oxidase tal como a poliol oxida-se, tal como a sorbitol oxidase é derivada ou obtida de uma cepa de Strep-tomyces coelicolor.

Em uma modalidade preferida, a primeira oxidase tal como apoliol oxidase, tal como a sorbitol oxidase, é um polipeptídeo que consisteem ou é derivado da SEQ ID NO 1 ou da SEQ ID NO 2 e homólogos, varia-ções ou fragmentos do mesmo.

Em uma modalidade, utilizando o ensaio fornecido pelo Exemplo6, a poliol oxidase possui atividade sobre D-sorbitol, D-xilitol, D-manitol, D-ribitol, mio-inositol e glicerol. Em uma modalidade adicional, que pode ser amesma ou diferente, a poliol oxidase possui atividade sobre 1,3 propanodiole/ou 1,2 propanodiol.

Em uma modalidade, utilizando o ensaio fornecido pelo Exemplo6, a poliol oxidase não possui atividade sobre propileno glicol e/ou etilenoglicol.

A sorbitol oxidase (SOX) pode ser obtida partindo de micro-organismos adequados tais como Streptomyces. Hiragi K. e outros (Biosci.Biotechnol. Biochem. 62: 347-353(1998)) descrevem a produção da sorbitoloxidase recombinante em E. coli. Outras fontes são descritas, por exemplo,na Patente U.S. N2 5.741.687 e na Patente U.S. N2 5.472.862 em que édescrito um micro-organismo do solo de Sekigahara-cho, Fuwa-gun, GifuPrefecture, Japão, do gênero Xanthomonas, tal como Xanthomonas malto-philia TE3539 (FERM BP-4512). Outros exemplos de poliol oxidases sãomanitol oxidase (EC 1.1.3.40) dos caracóis Helix aspersa e Arion ater quecatalisa a oxidação de D-arabinitol, D-manitol e, até uma menor extensão, deD-glucitol (sorbitol) e xilitol oxidase (EC 1.1.3.41) de Streptomyces coelicolorque oxida a D-xilitol em xilose e HfeO2 e D-sorbitol em glicose e H2O2.

A primeira oxidase tal como a poliol oxidase, tal como uma sorbi-tol ou xilitol oxidase pode ser obtida partindo de uma fonte microbiana talcomo uma bactéria ou um fungo. Em particular partindo de bactérias classifi-cadas na classe Actinobacteria e na ordem Actinomycetales.

A primeira oxidase tal como a poliol oxidase, tal como uma sorbi-tol ou xilitol oxidase pode ser obtida partindo de espécies diferentes de S-treptomyces, Xanthomonas, Brevibacterium, Frankia, Nocardia, Janibacter,Burkholderia, Paracoccus, Chromabacterium, Thermobifida, Pseudomonas,Corynebacterium e Bacillus e homólogos das mesmas.

A primeira oxidase tal como a poliol oxidase, tal como uma sorbi-tol ou xilitol oxidase pode ser obtida partindo de uma cepa de Streptomyces,preferencialmente de uma cepa de Streptomyces coelicolor ou Streptomycessp. IKD472 (Yamashita, Mitsuo e outros, Journal of Bioscience and Bioengi-neering (2000), 89(4), 350-360) e de Streptomyces sp. H-7775. (Hiraga, Ka-zumi e outros, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry (1997), 61(10),1699-1704.).

A JP 09206072 descreve uma sorbitol oxidase de Streptomycese seu método de produção e uso, que pode também ser utilizada na presen-te invenção.

A JP 06169764 descreve uma sorbitol oxidase de Xanthomonasque também pode ser utilizada na presente invenção.Em um aspecto da invenção a primeira oxidase tal como a polioloxidase, tal como a sorbitol oxidase é derivada de uma cepa de Streptomyces.

Em um aspecto adicional, a primeira enzima, tal como a primeiraoxidase tal como a poliol oxidase, por exemplo, a sorbitol oxidase é produzi-da através de métodos recombinantes.

Em uma modalidadem, a primeira enzima/oxidase e a enzimaadicional são ativas à temperatura ambiente.

Em uma modalidade, a primeira enzima/oxidase e a enzima adi-cional são ativas na temperatura da boca ou do corpo, tal como aproxima-damente 37°C.

Embora seja reconhecido que o versado na técnica dosará aprimeira enzima/oxidase em um nível adequado (uma quantidade eficiente)para a finalidade requerida, é imaginado que em uma modalidade a primeiraoxidase esteja em um nível entre aproximadamente 0,1 e aproximadamente200.000 unidades por kg, tal como entre aproximadamente 0,1 e aproxima-damente 100.000 unidades por kg, tal como entre aproximadamente 1 e a-proximadamente 100.000 unidades por kg, tal como entre aproximadamente5 e aproximadamente 50.000 unidades por kg, tal como entre aproximada-mente 10 e aproximadamente 20.000 unidades por kg, tal como entre apro-ximadamente 100 e aproximadamente 10.000 unidades por kg. Outras faixasadequadas, para uso em alguma modalidade, incluem entre aproximada-mente 10 e aproximadamente 1.000 unidades por kg ou entre aproximada-mente 1 e aproximadamente 10.000 unidades por kg.

Em uma modalidade, que se refere a uma composição para cui-dado oral pode ser utilizada entre 1 e 10000 U (unidades)/100 g da primeiraoxidase. Dosagens em torno de 5-20 unidades por 100 g são também consi-deradas apropriadas para algumas modalidades.

Para uso em composições de alimentos humanos e animais, asfaixas de dosagens anteriores também podem ser apropriadas.

Em uma modalidade que se refere a uma composição de tintapodem ser utilizadas entre aproximadamente 10 e aproximadamente 10000U/100 g da primeira oxidase tal como a poliol oxidase. Dosagens em tomode 10-50 unidades por 100 g também são consideradas apropriadas paraalgumas modalidades.

Em uma modalidade que se refere a uma composição cosméticapodem ser utilizadas entre aproximadamente 1 e aproximadamente 10000U/100 g da primeira oxidase tal como a poliol oxidase. Dosagens em tornode 5-20 unidades por 100 g também são consideradas apropriadas para al-gumas modalidades.

Em uma modalidade que se refere a uma composição detergen-te, podem ser utilizadas entre aproximadamente 0,1 e aproximadamente10000 U/100 g da primeira oxidase tal como a poliol oxidase. Dosagens emtorno de 5-100 unidades por 100 g também são consideradas apropriadaspara algumas modalidades.

O Segundo Substrato

O segundo substrato é capaz de ser convertido pela (pelo me-nos uma) enzima adicional no produto. O segundo substrato pode ser, prefe-rencialmente, oxidado pela enzima adicional (oxidorredutase adicional) paragerar mais peróxido de hidrogênio e o produto.

No presente contexto o termo "segundo substrato" se refere aum substrato que é um resultado da oxidação do primeiro substrato e podeser convertido pela enzima adicional para formar o produto.

Em uma modalidade preferível, o termo "segundo substrato" serefere a um substrato que é um resultado da oxidação do primeiro substratopela primeira enzima e é oxidável pela oxidorredutase adicional para formarperóxido de hidrogênio e o produto.

O segundo substrato é, em um aspecto, um ou mais açúcares,tais como os açúcares selecionados do grupo que consiste em glicose, xilo-se, maltose, manose, galactose, isolmaltulose, lactose, arabinose e eritrose.

O segundo substrato é, em um aspecto, um ou mais açúcares,tais como os açúcares selecionados do grupo que consiste em ribose, lixose,alose, altrose, gulose, idose e talose.

O segundo substrato pode, portanto, ser ou compreender glico-se, por exemplo, quando o primeiro substrato for ou compreender sorbitol.

Devido à sinergia notável entre a primeira oxidase tal como apoliol oxidase e a enzima adicional tal como a oxidorredutase adicional, onível no estado estacionário do segundo substrato é tipicamente baixo. Nosprodutos para cuidado oral, assim como para as aplicações de conservan-tes, por exemplo, em tinta ou cosméticos, o baixo nível do segundo substratopode ser altamente vantajoso, particularmente quando o segundo substratofor um açúcar que pode ser fermentado ou cariogênico, isto é, compostosque podem favorecer ou 'alimentar' o crescimento de organismos prejudici-ais tais como micro-organismo/bactérias (por exemplo, bactérias cariogêni-cas na cavidade oral) ou algas e estrelas do mar (que se depositam sobretinta marítima, por exemplo). Portanto, não apenas a invenção fornece umaprodução altamente eficiente e volumosa de peróxido de hidrogênio, comopode também fornecer um sistema em que há um nível mínimo de substra-tos que podem ser fermentados, reduzindo a probabilidade de crescimentoindesejável de organismos prejudiciais.

Em uma modalidade, o nívèl do segundo substrato, que é gera-do pela primeira oxidase tal como um ou mais açúcares que podem ser fer-mentados ou cariogênicos, presente na composição de acordo com a inven-ção é menor que aproximadamente 50%, tal como menor que aproximada-mente 25%, tal como menor que aproximadamente 10%, tal como menorque aproximadamente 5%, tal como menor que aproximadamente 1%, talcomo menor que aproximadamente 0,5%, tal como menor que aproximada-mente 0,1%, tal como menor que aproximadamente 0,05%, tal como menorque aproximadamente 0,01% do nível (inicial) de poliol presente na compo-sição, que é medido através de uma proporção molar.

Em uma modalidade preferida, o segundo substrato é um açú-car.

Em uma modalidade, o açúcar é uma monossacarídeo hexose,tal como uma hexose selecionada do grupo que consiste em glicose, frutose,galactose, manose, sorbose.

Em uma modalidade, o açúcar é uma monossacarídeo pentose,tal como uma pentose selecionada do grupo que consiste em ribose, arabi-nose, xilose ou lixose.

Em uma modalidade, o açúcar é uma triose tal como aldotrioseou cetotriose.

Em uma modalidade, o açúcar é um dissacarídeo tal como saca-rose ou maltose.

A Enzima Adicional

A (pelo menos uma) enzima adicional é caracterizada pelo fatode que é capaz de converter o segundo substrato para a obtenção de umproduto.

A enzima adicional não é a mesma enzima ou a entidade enzi-mática, que a primeira enzima. Entretanto em uma modalidade, a enzimaadicional pode ser ligada à primeira enzima, por exemplo, a primeira e asenzimas adicionais podem ser coexpressas na forma de uma poliproteína.

A enzima adicional pode ser qualquer enzima que, dentro dacomposição de acordo com a invenção ou nas aplicações descritas aqui,seja capaz de converter o segundo substrato em um produto, cuja presençanão afete de forma prejudicial a produção de peróxido de hidrogênio a partirda oxidação do primeiro substrato pela primeira enzima.

Os exemplos de enzimas adicionais adequadas incluem glicosedesidrogenase (E.C: 1.1.1.118) que, quando fornecida com NAD+, resulta naprodução de D-glucono-1,5-lactona + NADH; glicose 1-desidrogenase (E.C:1.1.1.119) (NADP(+)), que, quando fornecida com NADP+, resulta na produ-ção de D-glucono-1,5-lactona + NADPH; glucoquinase (E.C. 2.7.1.2), quefosforila o grupo COOH da glicose para produzir glicose-6-fosfato; glucoqui-nase, que converte D-glicose + D-frutose <=> D-gluconolactona + D-glucitol.

Portanto, em uma modalidade, a composição pode compreendercompostos adicionais que são utilizados pela enzima adicional com o se-gundo substrato para produzir o(s) produto(s) - de forma adequada tal com-posto adicional pode, por exemplo, ser selecionado do grupo que consisteem NAD+, NADP+ ou frutose.

Em um aspecto preferido, a (pelo menos uma) enzima adicionalé uma (pelo menos uma) oxidorredutase adicional (também referida comooxidorredutase).

A oxidorredutase adicional é preferencialmente uma oxidasesem ser uma poliol oxidase. A oxidorredutase adicional não é a poliol oxida-se referida aqui dentro do contexto da primeira oxidase.

As oxidorredutases são enzimas que pertencem à classe EC1.x.x.x. Na presente invenção, as oxidorredutases utilizam um receptor deoxigênio, tal como CH-OH ou um aldeído ou oxo (EC 1.2.3.x).

Em uma modalidade preferida, as oxidorredutases no presentecontexto são enzimas que pertencem à classe EC 1.1.3. que atuam com ooxigênio como receptor. Por exemplo, a hexose oxidase (D-hexose:02-oxidorredutase, EC 1.1.3.5) é uma enzima que na presença de oxigênio écapaz de oxidar D-glicose e vários outros açúcares redutores incluindo mal-tose, Iactose e celobiose em suas Iactonas correspondentes com a hidrólisesubsequente nos respectivos ácidos aldobiônicos após a formação de peró-xido de hidrogênio. A oxidação catalisada pela hexose oxidase sobre a gli-cose e a galactose pode, por exemplo, ser ilustrada como a seguir:

D-Glicose + O2 -> δ-D-gluconolactona + H2O2 ou

D-Galactose + O2 γ-D-galactogalactona + H2O2

Em um outro aspecto da invenção a oxidorredutase é seleciona-da uma vez ou mais do grupo que consiste em hexose oxidase, glicose oxi-dase, carboidrato oxidase e oligossacarídeo oxidase tal como (gluco)oligos-sacarídeo oxidase. Em um aspecto adicional da invenção, a oxidorredutaseé uma ou mais enzimas que catalisam a oxidação de açúcares tais como asselecionadas do grupo que consiste em uma carboidrato oxidase, uma (glu-co)oligossacarídeo oxidase, uma piranose oxidase, uma hexose oxidase ouuma glicose oxidase. Em um aspecto adicional da invenção, a oxidorreduta-se é uma glicose oxidase e/ou uma hexose oxidase. Ainda em um aspectoadicional da invenção, a oxidorredutase é uma hexose oxidase.

Em uma modalidade preferida, a oxidorredutase é uma açúcaroxidase, tal como uma açúcar-oxidase selecionada do grupo que consisteem: carboidrato oxidase, oligossacarídeo oxidase, maltose oxidase, hexoseoxidase, glicose oxidase, manose oxidase, galactose oxidase, isolmaltuloseoxidase, Iactose oxidase, arabinose oxidase, eritrose oxidase, pentose oxi-dase, xilose oxidase, triose oxidase.

Em uma modalidade, a açúcar-oxidase é selecionada do grupoque consiste em: EC 1.1.3.4 glicose oxidase, EC 1.1.3.5 hexose oxidase, EC1.1.3.9 galactose oxidase, EC 1.1.3.10 piranose oxidase, EC 1.1.3.11 L-sor-bose oxidase e EC 1.1.3.40 D-manitol oxidase.

As oxidases adequadas podem ser identificadas sob o númerode Classificação de Enzima E.C. 1 (Oxidorredutases) de acordo com as re-comendações (1992) da International Union of Biochemistry and MolecularBiology (IUBMB) que são enzimas que catalisam oxidorreduções, em parti-cular, as oxidases listadas sob E.C. 1.1.3. ou E.C. 1.2.3, isto é, as oxidasesatuam sobre o oxigênio molecular (O2) e fornecem peróxido (H2O2), utilizan-do CH-OH ou um grupo aldeído ou oxo como um doador.

Uma glicose oxidase adequada pode se originar de Aspergillussp., tal como uma cepa de Aspergillus n/gerou de uma cepa de Cladospori-um sp., em particular, de Cladosporium oxysporum, especialmente Cl. oxys-porum CBS 163 descrita na WO 95/29996 (da Novo Nordisk A/S).

As hexose oxidases da alga marinha vermelha Chondrus crispus(comumente conhecida como musgo irlandês) (Sullivan e Ikawa, (1973), Bi-ochim. Biophys. Acts, 309, p. 11-22; Ikawa, (1982), Meth. In Enzymol. 89,carbohidrate metabolism parte D, 145-149) oxidam um amplo espectro decarboidratos, tais como D-glicose, D-galactose, maltose, celobiose, lactose,D-glicose 6-fosfato, D-manose, 2-desóxi-D-glucol, 2-desóxi-D-galactose, D-fucase, ácido D-glucurônico e D-xilose.

Ainda a alga marinha Iridophycus flaccidum produz hexose oxi-dases que podem ser facilmente extraídas, que oxidam vários mono- e dis-sacarídeos diferentes (Bean e Hassid, (1956), J. Biol. Chem, 218, p. 425;Rand e outros (1-972, J. of Food Science 37, p. 698-710).

O espectro amplo de substratos da hexose oxidase é vantajosoem associação com o branqueamento de dentes uma vez que a quantidadetotal do substrato que pode ser utilizado (isto é, carboidrato) presente na bo-ca é significativamente maior que para as enzimas relacionadas que possu-em propriedades catalíticas mais específicas.

A carboidrato oxidase de Microdochium nivale descrita na EP1041890 atua sobre vários açúcares, incluindo glicose, Iactose e xilose as-sim como sobre oligossacarídeos.

Uma outra oxidorredutase capaz de atuar sobre vários açúcarese oligossacarídeos é obtida partindo de Acremonium strictum (Lin e outrosBiochemica and Biophysica Acta 118 (1991)). Seu uso nas aplicações depanificação é descrito na JP 11056219.

Outros exemplos de oxidorredutases adequadas são glicose o-xidase (EC 1.1.3.4) e galactose oxidase (EC 1.1.3.9).

Em uma modalidade a oxidorredutase é uma ou mais seleciona-das do grupo que consiste em uma carboidrato oxidase, uma hexose oxida-se ou uma glicose oxidase.

Em uma modalidade, a oxidorredutase é uma hexose oxidase.Um outro exemplo de uma oxidorredutase adequada é hexoseoxidase (HOX) (EC 1.1.3.5) que pode ser obtida através do isolamento daenzima partindo de várias espécies de algas vermelhas tais como Iridophy-cus flaccidum (Bean e Hassid, 1956) e Chondrus crispus (Sullivan e outros1973). Em um aspecto preferido da invenção a HOX é obtida ou preparadacomo descrito na WO 01/38544. A HOX está disponível na Danisco A/S co-mo DairyHOX®.

A dosagem da oxidorredutase adicional pode estar dentro dasmesmas faixas que as referidas para a poliol oxidase anterior, embora sejareconhecido que em uma modalidade um excesso da oxidase adicional éadicionado, como referido aqui.

A Composição da Enzima

É preferido que sejam utilizadas as enzimas purificadas, taiscomo a sorbitol oxidase e/ou a oxidorredutase adicional, isto é, as enzimassão purificadas antes de serem adicionadas à composição da invenção. Apureza da enzima é preferencialmente determinada utilizando SDS-PAGE edensitometria. Uma enzima purificada é pelo menos aproximadamente 20%pura, tal como pelo menos aproximadamente 30% pura, tal como pelo me-nos aproximadamente 40% pura, tal como pelo menos aproximadamente50% pura. É reconhecido que uma enzima purificada pode, entretanto, serformulada com outras proteínas, por exemplo, misturada com agentes esta-bilizantes de proteínas tais como BSA ou outras enzimas, a avaliação dapureza da enzima, portanto, exclui as proteínas adicionadas à enzima apósa purificação.

A taxa de produção de peróxido de hidrogênio pode ser contro-lada, por exemplo, através da preparação de uma composição que compre-ende uma proporção especificada da quantidade eficiente da primeira enzi-ma/oxidase comparada com a da enzima/oxidorredutase adicional. Tipica-mente e como mostrado nos exemplos, um excesso crescente da enzi-ma/oxidorredutase adicional resulta na maior taxa de produção de peróxidode hidrogênio.

Em uma modalidade, a quantidade molar do peróxido de hidro-gênio total produzido (ou que pode ser produzido), é maior que a quantidademolar do primeiro substrato convertido (ou que pode ser convertido) no se-gundo substrato ou que a quantidade do primeiro substrato presente. Deforma adequada, a quantidade molar de peróxido de hidrogênio produzido(ou que pode ser produzido), é, em uma modalidade, entre mais que 100% emenos que ou igual a 200% da quantidade molar do primeiro substrato con-vertido (ou que pode ser convertido) no segundo substrato ou a quantidadedo primeiro substrato presente. O uso da presente invenção pode, portanto,permitir que até duas moléculas de peróxido de hidrogênio sejam produzidaspartindo de um primeiro substrato de sorbitol, quando comparado com o usode uma enzima sorbitol oxidase isoladamente. Em uma modalidade, a quan-tidade molar de peróxido de hidrogênio produzida (ou que pode ser produzi-da) é de até duas vezes a quantidade molar do peróxido de hidrogênio quepode ser produzido partindo de um sistema de poliol oxidase sem uma oxi-dorredutase adicional.

Em uma modalidade preferida, a quantidade da pelo menos umaenzima/oxidorredutase adicional comparada com a quantidade da primeiraenzima/oxidase, tal como a poliol oxidase (por exemplo, sorbitol oxidase)presente na composição de acordo com a invenção é maior que 1, que émedida pelo número respectivo de unidades da enzima presente na ditacomposição, tal como maior que aproximadamente 1,5, tal como maior queaproximadamente 2, tal como maior que aproximadamente 3, tal como maiorque aproximadamente 5, tal como maior que aproximadamente 10, tal comomaior que aproximadamente 20, tal como maior que aproximadamente 50,tal como maior que aproximadamente 100, tal como maior que aproximada-mente 150, tal como maior que aproximadamente 200, tal como maior queaproximadamente 300, tal como maior que aproximadamente 500, tal comomaior que aproximadamente 1000.

Uma vantagem adicional da composição de acordo com a inven-ção é a possibilidade de escolher uma combinação de enzimas e substratosque gerem o agente alvejante de peróxido de hidrogênio sem acumular ado-çantes ou açúcares cariogênicos como um produto.

Como um exemplo, a SOX catalisa a oxidação de D-sorbitol paraproduzir 1 mol de D-glicose e 1 mol de H2C>2. A oxidorredutase, tal comoHOX, catalisa a oxidação de D-glicose para produzir 1 mol de ácido D-glucônico e 1 mol de H2O2. O uso combinado de SOX e HOX gera assim 2mois de H2O2 partindo de 1 mol de substrato da sorbitol oxidase como é ilus-trado no esquema a seguir.

O resultado da reação enzimática de SOX é a glicose intermedi-ária, que é cariogênica, mas possui um tempo de vida curto uma vez que érapidamente convertida em ácido glucônico. Uma vantagem adicional dapresente invenção é que apenas um mol de ácido glucônico é formado paracada dois mois de peróxido de hidrogênio.

<formula>formula see original document page 33</formula><formula>formula see original document page 34</formula>

A reação apresentada acima representa a conversão de um po-Iiol no ácido correspondente, através de duas etapas enzimáticas consecuti-vas. É exemplificada a conversão de D-sorbitol em ácido glucônico. (1) D-sorbitol, (2) Catálise pela poliol oxidase (3) D-glicose (4) Catálise pela hexo-se oxidase, glicose oxidase, gluco-oligossacarídeo oxidase, carboidrato oxi-dase (5) D-glucono-1,5-lactona (6) Hidrólise em ambiente aquoso (7) ácidoD-glucônico.

A reação pode ser generalizada como:

Primeira Oxidase Oxidorredutase Adicional

Poliol -» açúcar lactona

Exemplos específicos adicionais incluem:

Sorbitol

Galactitol

Manitol

Lactitol

Xilitol

glicose -» D-glucono-1,5-lactona

galactose -> D-galactono-1,5-lactona*

Manose -» D-manono-1,5-lactona

Iactose -» -> D-lactonono-1,5-lactona

xilose -> D-xilono-1,5-lactona

*(ou a D-galacto-hexadialdose (se a galactose oxidase for utilizada) oxidaem C6)

O produto de Iactona é tipicamente convertido em um ácido emum ambiente aquoso. A primeira oxidase pode ser selecionada a partir dasdescritas aqui. A enzima oxidorredutase adicional é uma açúcar oxidase co-mo referido aqui, tal como hexose oxidase ou manose oxidase (para mano-se).

A quantidade de cada enzima presente na composição da in-venção ou a quantidade total de enzima presente ou adicionada à composi-ção ou aos produtos (aplicação) que é referida aqui dependerá das enzimasutilizadas e da formulação requerida, mas tipicamente pode variar de apro-ximadamente 0,0001% até aproximadamente 20%, tal como aproximada-mente 0,001% até aproximadamente 10%, tal como aproximadamente0,005% até aproximadamente 2%, tal como aproximadamente 0,01% atéaproximadamente 1% em peso da composição final.

Tipicamente, foi observado que o acoplamento das duas enzi-mas fornece aproximadamente 200-300% da taxa de produção de peróxidode hidrogênio comparado com um sistema de primeira enzima/primeirosubstrato isoladamente. Embora melhorias consideráveis no peróxido dehidrogênio tenham sido obtidas utilizando uma unidade equivalente à doseunitária tanto da poliol oxidase (tal como sorbitol oxidase) quanto da oxidor-redutase adicional tal como hexose ou glicose oxidase, a sinergia foi adicio-nalmente aumentada através da adição de um excesso da oxidorredutaseadicional à composição, resultando em mais peróxido de hidrogênio produzi-do e a uma taxa maior.

Em um aspecto da invenção, a composição compreende umasorbitol oxidase e uma hexose oxidase e como o primeiro substrato D-sorbitol.

Em um outro aspecto da invenção, a composição compreendeuma sorbitol oxidase e uma glicose oxidase e como o primeiro substrato D-sorbitol.

Em uma modalidade, tal como quando a oxidorredutase adicio-nal é HOX, a poliol oxidase, tal como sorbitol ou xilitol oxidase pode catalisara oxidação de D-xilitol para fornecer 1 mol de xilose e 1 mol de HhO2. Istopode ser particularmente vantajoso na modalidade em que há um poliol al-ternativo sem ser xilitol, tal como sorbitol, em que devido à baixa atividadeda HOX sobre a xilose, a xilose irá se acumular. A xilose é um compostopré-biótico. Assim, tais composições podem ser utilizadas nas composiçõesde alimentos humanos e animais ou em um medicamento ou na preparaçãode uma composição de alimento humano ou animal ou de um medicamento,para aumentar o conteúdo de xilose, enquanto também são obtidos os ou-tros efeitos benéficos da invenção.

O uso de poliol oxidase, tal como sorbitol oxidase ou xilitol oxi-dase e um poliol, tal como D-xilitol ou sorbitol, possui a vantagem de que oefeito antimicrobiano e/ou alvejante pelo H2O2 é obtido utilizando ingredien-tes não tóxicos e a adição de compostos cariogênicos tais como açúcar éevitada.

A Matriz de Composição

A composição de acordo com a invenção pode, de forma ade-quada, compreender outros materiais tipicamente utilizados nos produtos enas aplicações referidos aqui ou em outras aplicações/produtos adequados.

Os materiais de matriz são, de forma adequada, selecionadospara garantir a compatibilidade com as enzimas utilizadas na composiçãopara permitir que uma quantidade eficiente das enzimas seja utilizada.

O Produto

Como descrito anteriormente, uma modalidade preferida é quan-do a ação da enzima adicional sobre o segundo substrato gera mais peróxi-do de hidrogênio e um produto. O produto é, portanto, outro sem ser o peró-xido de hidrogênio.

Em uma modalidade, o produto obtido pela ação da enzima adi-cional sobre o segundo substrato pode ser mais que um único produto, istoé, podem ser produtos.

O acúmulo do produto na composição da invenção ou nas apli-cações descritas aqui, preferencialmente não afeta negativamente a taxa deprodução de peróxido de hidrogênio a partir da conversão do primeiro subs-trato pela primeira enzima. Na verdade, como os presentes inventores des-cobriram, a conversão do segundo substrato no produto remove eficiente-mente o segundo substrato que não somente aumenta enormemente a taxade produção de peróxido de hidrogênio afetando a atividade da primeira en-zima sobre o primeiro substrato, mas também reduz o acúmulo indesejávelpossível do segundo substrato.

Em uma modalidade preferida, o produto é obtido através daoxidação do segundo substrato pela oxidorredutase adicional e pode, porexemplo, ser uma Iactona (oxidação em C1), uma dialdose (oxidação em C5para pentoses, em C6 para hexose etc). Um exemplo é a D-galacto-hexadialdose produzida pela galactose oxidase ou um desidro-açúcar se aoxidação ocorrer em qualquer outra posição no meio da cadeia do açúcar.Um exemplo adicional é a 2-desidro-D-glicose produzida pela piranose oxi-dase através da oxidação da glicose em C2.

O produto pode ser selecionado do grupo que consiste em D-glucono-1,5-lactona, D-xilono-1,5-lactona, D-maltono-1,5-lactona, D-mano-no-1,5-lactona, D-galactono-1,5-lactona, D-hexadialdose, D-Iactono-1,5-lactona, D-arabono-1,5-lactona, D-eritrono-1,5-lactona, D-ribono-1,5-lactona,D-lixono-1,5-lactona, D-alono-1,5-lactona, D-altrono-1,5-lactona, D-gulono-1,5-lactona, D-idono-1,5-lactona, D-talono-1,5-lactona e a Iactona de isomal-tulose e possivelmente mais alguns produtos provenientes da oxidação dagalactose oxidase na posição C6 de açúcares.

Definições

A não ser que seja indicado de outra maneira, a prática da pre-sente invenção envolve técnicas convencionais comumente utilizadas nabiologia molecular, na microbiologia, na purificação de proteínas, na enge-nharia de proteínas, no sequenciamento de proteínas e de DNA, nos cam-pos do DNA recombinante e no uso e no desenvolvimento de enzimas indus-triais, dos quais todos estão dentro da perícia da técnica.

A não ser que seja definido de outra maneira aqui, todos os ter-mos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado queé comumente entendido por um versado na técnica à qual esta invenção serefere. Por exemplo, Singleton e Sainsbury, Dictionary of Microbiology andMolecular Biology, 2- Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); e Hale e Mar-gham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)fornecem a tais versados na técnica dicionários gerais de muitos dos termosutilizados na invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ouequivalentes aos descritos aqui encontrem uso na prática da presente inven-ção, os métodos e os materiais preferidos são descritos aqui. Consequente-mente, os termos definidos imediatamente abaixo são mais completamentedescritos com referência ao Relatório Descritivo como um todo. Ainda, comoutilizado aqui, os termos no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem a referên-cia no plural a não ser que o contexto indique claramente de outra maneira.

A não ser que seja indicado de outra maneira, os ácidos nucléicos são escri-tos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3'; as seqüências de ami-noácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino a car-bóxi, respectivamente. Deve ser entendido que esta invenção não está limi-tada à metodologia, aos protocolos e aos reagentes particulares descritos,uma vez que estes podem variar, dependendo do contexto que são utiliza-dos pelos versados na técnica.

É pretendido que cada limite numérico máximo fornecido ao Ion-go de todo este relatório descritivo inclua cada limite numérico inferior, comose tais limites numéricos inferiores fossem especialmente escritos aqui. Ca-da limite numérico mínimo fornecido ao longo de todo este relatório descriti-vo incluirá cada limite numérico máximo, como se tais limites numéricos má-ximos fossem especialmente escritos aqui. Cada faixa numérica fornecida aolongo de todo este relatório descritivo incluirá cada faixa numérica mais limi-tada que se encaixa dentro de tal faixa numérica mais ampla, como se taisfaixas numéricas mais limitadas fossem todas especialmente escritas aqui.

Quando se faz referência a um "respectivo substrato de poliol"de uma enzima, isso se refere ao substrato que a enzima utiliza, por exem-plo, o respectivo substrato da sorbitol oxidase é o sorbitol e o respectivosubstrato da xilitol oxidase é o xilitol.

Como utilizado aqui, o termo "compatível", significa que os mate-riais de matriz da composição (outros ingredientes) não reduzem a atividadeenzimática da(s) enzima(s) oxidase(s) fornecida(s) aqui até tal extensão quea(s) oxidases(s) não é/são eficiente(s) quando desejado durante situaçõesde usos normais. Os materiais da composição de limpeza específicos sãoexemplificados em detalhes posteriormente aqui.Como utilizado aqui, "quantidade eficiente de enzima" se refereà quantidade de enzima necessária para atingir a atividade enzimática re-querida na aplicação específica. Tais quantidades eficazes são facilmentedeterminadas por um versado na técnica e são baseadas em muitos fatores,tais como a variação de enzima particular utilizada, a aplicação de limpeza, acomposição específica da composição de limpeza e se uma composiçãolíquida ou seca (por exemplo, granular) é necessária e similares.

A homologia de aminoácidos e de polinucleotídeos pode ser de-terminada utilizando o algoritmo CIustaIW utilizando os ajustes padroniza-dos: ver http://www.ebi.ac.uk/emboss/alian/index.html, Método: EMBOSS:água (local): Abertura do Espaço = 10,0, Extensão do espaço = 0,5, utilizan-do Blosum 62 (proteína) ou DNAfuII para seqüências de nucleotídeos.

É preferível que quando se faz referência a "o segundo substratopode ser convertido por pelo menos uma enzima adicional para formar umproduto", que o segundo substrato é oxidável pela enzima adicional (oxidor-redutase) para formar peróxido de hidrogênio e um (o) produto.

O termo "variante(s)" como utilizado aqui no contexto de um po-lipeptídeo (seqüência), tal como a SEQ ID NO 1 e a SEQ ID NO 2 se referea um polipeptídeo que é preparado partindo do polipeptídeo original (paren-tal) ou utilizando a informação de seqüência do polipeptídeo, através da in-serção, da deleção ou da substituição de um ou mais aminoácidos na ditaseqüência, isto é, pelo menos um aminoácido, mas preferencialmente me-nos que aproximadamente 50 aminoácidos, tal como menos que aproxima-damente 40, menos que aproximadamente 30, menos que aproximadamente20 ou menos que aproximadamente 10 aminoácidos, tal como 1 aminoácido,1-2 aminoácidos, 1-3 aminoácidos, 1-4 aminoácidos, 1-5 aminoácidos.

O termo "homólogo(s)" como utilizado aqui no contexto de umaseqüência de polipeptídeo, tal como a SEQ ID NO 1 e a SEQ ID NO 2 serefere a um polipeptídeo que é pelo menos aproximadamente 70% homólo-go, tal como pelo menos aproximadamente 80% homólogo, tal como pelomenos aproximadamente 85% homólogo ou pelo menos aproximadamente90% homólogo, tal como pelo menos aproximadamente 95%, aproximada-mente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% ou aproxima-damente 99% homólogo à dita seqüência de polipeptídeo. A homologia entreduas seqüências de polipeptideos pode ser determinada utilizando o algo-ritmo de alinhamento CIustaIW utilizando os ajustes padronizados, que sãoreferidos aqui.

O termo "fragmento(s)" como utilizado aqui no contexto de umaseqüência de polipeptídeo, tal como a SEQ ID NO 1 e a SEQ ID NO 2 serefere a um polipeptídeo que consiste em apenas uma parte da seqüênciade polipeptídeo. Um fragmento pode, portanto, compreender ou consistir empelo menos aproximadamente 50%, tal como pelo menos aproximadamente60%, tal como pelo menos aproximadamente 70%, tal como pelo menos a-proximadamente 80%, tal como pelo menos aproximadamente 90% ou talcomo pelo menos aproximadamente 95% da dita seqüência de polipeptídeo.

A variante, o homólogo e o fragmento de acordo com a invençãomantêm, todos, pelo menos parte da atividade enzimática desejada (para afinalidade da presente invenção) da enzima original, tal como pelo menosaproximadamente 10%, pelo menos aproximadamente 20%, pelo menosaproximadamente 30%, pelo menos aproximadamente 40%, pelo menosaproximadamente 50%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menosaproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 80% pelo menos a-proximadamente 90% ou toda a atividade enzimática da enzima original.

Será reconhecido pelo versado na técnica que quando são iden-tificadas as enzimas preferidas para uso na composição e nos métodos dainvenção por suas SEQ IDs específicas, estas incluem enzimas que são de-rivadas dos ácidos nucléicos que codificam as SEQ IDs dos aminoácidoscorrespondentes quando expressos, em sua espécie hospedeira nativa ouem uma espécie hospedeira heteróloga e de forma que as enzimas possamser processadas co- ou pós-tradução.

O termo "aproximadamente" como utilizado aqui para se referir aconcentrações, atividades e condições etc. inclui e descreve especificamen-te os valores exatos e as faixas exatas referidas às mesmas.

O termo "poliol" como utilizado aqui se refere a um álcool de a-çúcar que compreende mais de um grupo hidroxila. O poliol é um termo dis-tinto de açúcar uma vez que os polióis contêm apenas grupos hidroxila(COH) e pertencem ao grupo geral alditóis, enquanto que os açúcares pos-suem grupos carbonila (COOH).

Os dissacarídeos e os monossacarídeos podem ambos formarálcoois de açúcar; entretanto, os álcoois de açúcar derivados de dissacarí-deos (por exemplo, Maltitol e lactitol) não são totalmente hidrogenados por-que apenas um grupo aldeído está disponível para redução. Em uma moda-lidade, o álcool de açúcar está completamente hidrogenado.

Os álcoois de açúcar são comumente adicionados aos alimentospor causa de seu menor teor calórico que os açúcares; entretanto, são tam-bém geralmente menos doces e são freqüentemente combinados com ado-çantes de alta intensidade. Estes também são adicionados à goma de mas-car porque não são metabolizados (isto é, quebrados) por bactérias na boca,então não contribuem para a formação de cáries. O maltitol, o sorbitol e oisomalte são alguns dos tipos mais comuns. Os álcoois de açúcar podem serformados sob condições redutoras suaves partindo de seus açúcares análo-gos.

Como utilizado aqui, o termo "oxidase" se refere a enzimas quecatalisam uma reação de oxidação/redução que envolve o oxigênio molecu-lar (O2) como o receptor de elétrons. Nestas reações, o oxigênio é reduzidoem água (H2O) ou peróxido de hidrogênio (H2O2). As oxidases constituemuma subclasse das oxidorredutases.

O termo "poliol oxidase" se refere a uma enzima que é capaz deoxidar um poliol no açúcar correspondente. A oxidação do poliol pela açãoda poliol oxidase resulta na produção de peróxido de hidrogênio.

Como utilizado aqui, o termo "glicose oxidase" ("Gox") se refereà enzima oxidase (EC 1.1.3.4) que se liga à beta-D-glicose (isto é, um isô-mero de açúcar com seis carbonos, glicose) e ajuda na quebra do açúcar emseus metabólitos. A GOx é uma proteína dimérica que catalisa a oxidação dabeta-D-glicose em D-glucono-1,5-lactona, que então hidrolisa em ácido glu-cônico com a redução concomitante do oxigênio molecular em peróxido dehidrogênio.

Como utilizado aqui, o termo "álcool oxidase" ("Aox") se refere àenzima oxidase (EC 5 1.1.3.13) que converte um álcool em um aldeído coma redução concomitante do oxigênio molecular em peróxido de hidrogênio.

Como utilizado aqui, o termo "colina oxidase" ("Cox") se refere auma enzima oxidase (EC 1.1.3.17) que catalisa a oxidação de quatro elé-trons da colina em glicina betaína, com o aldeído de betaína como um inter-mediário com a redução concomitante de duas moléculas do oxigênio mole-cular em duas moléculas de peróxido de hidrogênio.

Como utilizado aqui, o termo "hexose oxidase" ("Hox") se referea uma enzima oxidase (EC 1.1.3.5) que catalisa a oxidação de mono- e dis-sacarídeos em suas Iactonas correspondentes, com a redução concomitantedo oxigênio molecular em peróxido de hidrogênio. A hexose oxidase é capazde oxidar uma variedade de substratos incluindo D-glicose, D-galactose,maltose, celobiose e Iactose etc.

Como utilizado aqui, "glicerol oxidase" se refere a uma enzimaoxidase (EC 1.1.3.) que catalisa a oxidação do glicerol em gliceraldeído, coma redução concomitante do oxigênio molecular em peróxido de hidrogênio.

É reconhecido que a atividade de uma enzima dependerá dascondições e dos substratos disponíveis e, portanto, a atividade de uma en-zima pode diferir de uma condição de ensaio padronizado (ensaio in vitro),quando comparada àquela dentro da composição de acordo com a invençãoou ao uso de tal composição na aplicação desejada. Em uma modalidade, aatividade enzimática é determinada através de um ensaio in vitro como refe-rido nos exemplos. Alternativamente, a atividade de uma enzima é determi-nada in situ, isto é, na composição de acordo com a invenção e sob as con-dições em que a composição será utilizada. Os mesmos métodos analíticospodem ser utilizados para a determinação da atividade enzimática in situassim como para a atividade in vitro, o mesmo ensaio é realizado utilizandoa matriz da composição ou sob as condições em que a composição/o produ-to de acordo com a invenção é utilizado.

O termo "açúcar" como utilizado aqui se refere a monossacarí-deos, dissacarídeos e oligossacarídeos, hexose, tais como açúcares sele-cionados do grupo que consiste em lactose, maltose, sorbose, triose, pento-se, hexose, manose, glicose, galactose, xilose, frutose, isomaltose, eritrose.

Os açúcares contêm grupos aldeído (-CHO) ou grupos cetona(C=O), em que há ligações duplas de carbono-oxigênio, tornando os açúca-res reativos. Preferencialmente, o termo açúcar está conforme a (CH20)nem que η fica entre 3 e 6, tal como 3, 5 ou 6 ou 5 ou 6.

Os açúcares podem ser trioses, pentose ou hexose, preferenci-almente açúcares pentose ou hexose, preferencialmente na forma de cadeiafechada.

O açúcar pode ser selecionado do grupo que consiste em: saca-rose, frutose, glicose, galactose, maltose, lactose e manose.

Por "produto para cuidado oral" como utilizado aqui entende-seum produto que não é intencionalmente engolido para as finalidades de ad-ministração sistêmica de agentes terapêuticos, mas é mantido na cavidadeoral durante um período de tempo suficiente para entrar em contato comsubstancialmente todas as superfícies dentais e/ou tecidos da mucosa oralcom a finalidade de atividade oral. No contexto da presente invenção, o pro-duto para cuidado oral inclui ainda produtos para a limpeza de dentaduras,dentes artificiais e similares. O produto para cuidado oral pode ter qualquerforma física adequada tal como, por exemplo, pó, pasta, gel, líquido, un-guento, tablete de goma de mascar ou spray.

Como utilizado aqui, "composições para limpeza" e "formulaçõespara limpeza" se referem a composições que encontram uso na remoção decompostos indesejados de itens que serão limpos, tais como tecido, louça,lentes de contato, outros substratos sólidos, cabelos (xampu), pele (sabone-tes e cremes), dentes (líquidos para limpeza bucal, pastas de dentes) etc. Otermo abrange quaisquer materiais/compostos selecionados para o tipo par-ticular de composição para limpeza desejado e a forma do produto (por e-xemplo, composição líquida, em gel, em grânulos ou em spray), contantoque a composição seja compatível com a oxidase e outra(s) enzima(s) utili-zada^) na composição e quaisquer inibidores reversíveis da enzima nacomposição. A seleção específica de materiais para composições para lim-peza é facilmente feita considerando a superfície, o item ou o tecido que se-rá limpo e a forma da composição para as condições de limpeza durante o uso.

Os termos se referem ainda a qualquer composição que sejaadequada para a limpeza, o branqueamento, a desinfecção e/ou a esteriliza-ção de qualquer objeto e/ou superfície. É pretendido que os termos incluam,mas não estejam limitados às composições detergentes (por exemplo, de-tergentes para roupas líquidos e/ou sólidos e detergentes para tecidos finos;formulações para limpeza de superfícies duras, tais como para vidro, madei-ra, cerâmica e superfícies de balcões de metal e janelas; produtos de limpe-za para tapetes; produtos de limpeza para fornos; agentes de renovação detecidos; amaciantes de tecidos; e produtos para limpar manchas pré-lavagem para tecidos e lavanderia, assim como detergentes para louça).

Na verdade, o termo "composição para limpeza" como utilizadoaqui, inclui, a não ser que seja indicado de outra maneira, agentes de lava-gem para todas as finalidades ou para trabalho pesado na forma de pó, es-pecialmente detergentes para limpeza; agentes para lavagem para todas asfinalidades na forma líquida, de gel ou de pasta, especialmente os assimchamados tipos líquidos para trabalho pesado (HDL); detergentes líquidospara tecidos finos; agentes para lavagem de louça manual ou agentes paralavagem de louça para trabalho leve, especialmente aqueles do tipo com altaformação de espuma; agentes para lavagem de louça na máquina, incluindoos vários tipos em tablete, granulares, líquidos e agentes auxiliadores deenxágue para uso na limpeza doméstica e institucional; agentes de limpezae desinfetantes líquidos, incluindo os tipos antibacterianos para lavagem dasmãos, barras para limpeza, líquidos para limpeza bucal, produtos para lim-peza de dentaduras, xampus para carros ou tapetes, produtos para limpezade banheiros; xampus para cabelos e cremes rinses; géis para banho e es-pumas para banheira e produtos para limpeza de metais; assim como agen-tes auxiliadores de limpeza tais como aditivos de branqueamento e os tipos"removedores de manchas" ou pré-tratamento.Como utilizado aqui, os termos "composição detergente" e "for-mulação detergente" são utilizados em referência às misturas que são pre-tendidas para uso em um meio de lavagem para a limpeza de objetos sujos.Em algumas modalidades preferidas, o termo é utilizado em referência aostecidos de lavanderia e/ou artigos de vestuário (por exemplo, "detergentespara lavagem de roupas"). Em modalidades alternativas, o termo se refere aoutros detergentes, tais como os utilizados para lavar louças, talheres etc.(por exemplo, "detergentes para lavagem de louças"). Não é pretendido quea presente invenção seja limitada a qualquer formulação ou composição de-tergente particular. Na verdade, é pretendido que em adição à oxidase, otermo abranja detergentes que contêm tensoativos, transferase(s), enzimashidrolíticas, oxidorredutases, per-hidrolases, reforçadores de detergência,agentes alvejantes, ativadores de branqueamento, agentes azulantes e co-rantes fluorescentes, inibidores de formação de torta, agentes de mascara-ção, ativadores de enzimas, inibidores de enzimas, antioxidantes e solubili-zantes. Em algumas modalidades preferidas, as formulações detergentesincluem, mas não estão limitadas às apresentadas nos Pedidos de PatentesU.S. N— de Série 10/576.331 e 10/581.014, assim como a WO 05/52161 e aWO 05/056782 encontram uso na presente invenção. Entretanto, não é pre-tendido que a presente invenção seja limitada a qualquer(quaisquer) formu-lação(ões) detergente(s) particular(es), uma vez que qualquer formulaçãodetergente adequada encontra uso na presente invenção.

Como utilizado aqui, "composição para lavagem de louças" serefere a todas as formas de composições para limpeza de louças, incluindotalheres, que incluem, mas não estão limitadas às formas granulares e líqui-das. Não é pretendido que a presente invenção seja limitada a qualquer tipoparticular ou composição para louças. Na verdade, a presente invenção en-contra uso na limpeza de louças (por exemplo, louças, incluindo, mas nãolimitadas a pratos, copos, tigelas etc.) e talheres (por exemplo, utensílios,incluindo, mas não limitados a colheres, facas, garfos, utensílio para serviretc.) de qualquer material, incluindo, mas não limitado a louças, plástico, me-tais, porcelana, vidro, acrílico etc. O termo "louça" é utilizado aqui em refe-rência tanto a pratos quanto a talheres.

Como utilizado aqui, "desempenho de lavagem" de uma enzimase refere à contribuição de uma enzima à lavagem que fornece desempenhode limpeza adicional ao detergente sem a adição da enzima na composição.

O desempenho de lavagem é comparado sob condições de lavagem rele-vantes.

O termo "condições de lavagem relevantes" é utilizado aqui paraindicar as condições, particularmente a temperatura de lavagem, o tempo,mecânica da lavagem, concentração de espuma, tipo de detergente e dure-za da água, realmente utilizados nas limpezas domésticas em um segmentodo mercado de detergente.

O termo "maior desempenho de lavagem" é utilizado para indicarque um melhor resultado final é obtido na remoção de manchas dos itenslavados (por exemplo, tecidos ou louças e/ou talheres) sob condições delavagem relevantes ou que menos enzima, em uma base em peso, é neces-sária para a obtenção do mesmo resultado final em relação a uma outra en-zima.

O termo "desempenho de lavagem mantido" é indicado para in-dicar que o desempenho de lavagem de uma enzima, em uma base em pe-so, é de pelo menos 80% em relação a uma outra enzima sob condições delavagem relevantes.

O desempenho de lavagem de enzimas é convenientementemedido pela sua capacidade de remover certas manchas representativassob condições de teste apropriadas. Nestes sistemas de teste, outros fatoresrelevantes, tais como a composição do detergente, a concentração de es-puma, a dureza da água, mecânica da lavagem, o tempo, o pH e/ou a tem-peratura, podem ser controlados de tal maneira que as condições típicaspara a aplicação de limpeza doméstica em um certo segmento de mercadosejam imitadas.

Como utilizado aqui, o termo "desinfetante" se refere à remoçãode contaminantes das superfícies, assim como à inibição ou à morte de mi-cro-organismos sobre as superfícies dos itens. Não é pretendido que a pre-sente invenção seja limitada a qualquer superfície, item ou contaminante(s)ou micro-organismos particulares que serão removidos.Controle da reação

Ambas as reações de oxidação requerem a presença de oxigê-nio e assim não ocorreriam em um grau significativo contanto que a compo-sição seja mantida em um recipiente selado, tal como em um ambiente comoxigênio controlado (ambiente com oxigênio limitado), tal como na exclusãoda limitação ou na ausência de oxigênio molecular. Uma vez que o recipien-te é aberto e a composição é submetida ao ar atmosférico ou a uma fontealternativa de oxigênio molecular, a reação pode ocorrer.

A invenção fornece, portanto, ainda um produto embalado quecompreende a composição da invenção, em que a composição é mantidaem um ambiente com oxigênio controlado ou em um ambiente com oxigêniolimitado, tal como na ausência de oxigênio molecular (disponível), de forma aprevenir ou reduzir a produção de peróxido de hidrogênio dentro do dito pro-duto embalado.

Um método alternativo é o fornecimento da composição da in-venção em um ambiente com água controlada, em que o nível de água sejasuficientemente baixo para prevenir ou reduzir a produção de peróxido dehidrogênio dentro da composição ou de um produto embalado. De formaadequada o nível de água em tal composição pode ser menor que aproxi-madamente 2%, tal como menor que aproximadamente 1%, tal como menorque aproximadamente 0,5%, tal como menor que aproximadamente 0,2% oumenor que aproximadamente 0,1%.

Alternativamente a reação pode ser prevenida de ocorrer prema-turamente separando fisicamente os componentes de enzima e de substratoum dos outros através de métodos de compartimentalização bem-conhe-cidos na arte. Em uma modalidade, a reação é prevenida através da separa-ção do primeiro substrato do compartimento da composição compreendendoa primeira oxidase e a oxidorredutase adicional. O primeiro substrato podeser adicionado para ativar a composição ou pode fazer parte da matriz deaplicação, na forma de um ingrediente de rotina da dita matriz de aplicaçãoantes, durante ou depois da adição da composição. A invenção fornece, por-tanto, ainda uma primeira composição que compreende a primeira oxidase(tal como a poiiol oxidase) e a oxidorredutase adicional, como referido aqui,em um kit de partes, com uma composição adicional compreendendo o ditoprimeiro substrato, em que as ditas primeira e segunda composições sãoseparadas uma da outra.

Embora seja imaginado que a composição da invenção pode serfornecida na forma de dois ou mais sistemas de reator, para combinação nouso, é também considerado que tecnologias tais como encapsulamento oumicroencapsulamento podem ser empregadas para manter o componentede enzima da composição separado dos substratos. A liberação das micro-cápsulas pode ser ativada, por exemplo, através de força mecânica ou dilui-ção no uso da composição da invenção.

Em um aspecto, a composição de acordo com a invenção com-preende um kit de partes compreendendo pelo menos dois recipientes, emque o primeiro recipiente compreende a primeira oxidase e a oxidorredutaseadicional e um segundo recipiente que compreende o primeiro substrato.

Nas aplicações descritas aqui, tais como nas aplicações cosmé-ticas (também na aplicação para cuidado oral), em uma modalidade é vanta-joso compartimentalizar a composição da invenção, de forma que a produ-ção de peróxido de hidrogênio seja conseguida na aplicação, por exemplo,por fricção mecânica permitindo a liberação do sistema enzimático e deixan-do que este entre em contato com o primeiro substrato in situ durante a apli-cação, mas não durante o armazenamento.

Em um aspecto da invenção, o pH da composição fica entre 5 e9, preferencialmente entre 6 e 8. Quando a composição de acordo com ainvenção for um produto para cuidado oral é preferido utilizar a primeira oxi-dase tal como uma poliol oxidase, tal como SOX e uma oxidorredutase, queé substancialmente ativa no pH prevalecente na boca, isto é, em um pH en-tre (aproximadamente) 5 e (aproximadamente) 9, preferencialmente entreaproximadamente 6 e aproximadamente 8. É, além disso, preferido que aprimeira oxidase tal como a poliol oxidase, tal como a sorbitol oxidase e aoxidorredutase sejam ativas à temperatura ambiente ou à temperatura cor-poral.

Em uma modalidade, a primeira oxidase e/ou a oxidorredutaseadicional e quaisquer outras enzimas presentes podem ser imobilizadas.

Enzimas Adicionais e sistemas enzimáticos

A composição de acordo com a invenção pode compreenderenzimas adicionais tais como uma ou mais enzimas selecionadas do grupoque consiste em: peroxidases tais como Iactoperoxidase, laccases, amilo-glucosidase, arnilases tais como amiiases maltogênicas e não maltogênicas,tais como Novamil®, glucoamilase, dextranase, protease, lisozime, mutana-se, lipase, acil-transferase, tais como as acil-transferases descritas naW02004064537 e xilanase.

Em uma modalidade, a composição da invenção, tal como acomposição oral da invenção ou composições alternativas que são referidasaqui, compreendem tiocianato, permitindo assim a conversão do tiocianatoem hipotiocianato devido à produção de peróxido de hidrogênio. Para osprodutos para cuidado oral, há, tipicamente, Iactoperoxidase suficiente pre-sente na saliva na boca para converter tiocianato em hipotiocianato na pre-sença de peróxido de hidrogênio. Entretanto, a composição de acordo com ainvenção também pode compreender lactoperoxidase, para facilitar estaconversão, permitindo assim a produção de um agente antibacteriano efici-ente 7n situ.

É reconhecido que a taxa da liberação de peróxido de hidrogêniopode ficar limitada se a disponibilidade de oxigênio for limitante. É, portanto,considerado que o acoplamento do presente sistema enzimático a um siste-ma de produção de oxigênio pode ser apropriado.Aplicações

A composição de acordo com a invenção pode ser utilizada paratratar qualquer tipo de material em que o branqueamento e/ou o alvejamentoseja desejado, por exemplo, dentes, papel e tecidos.

Uma vantagem do uso desta combinação de enzimas para alve-jar e/ou branquear é que o efeito alvejante e/ou alvejante é obtido através douso de materiais não prejudiciais comparados com o uso anterior de agentesalvejantes, por exemplo, nos produtos para cuidado oral.

A composição de acordo com a invenção possui, além disso, umefeito antimicrobiano causado pelo peróxido de hidrogênio resultante. Umaspecto adicional da invenção se refere ao uso da composição de acordocom a invenção na fabricação de um produto para cuidado oral para o trata-mento ou para a prevenção de efeitos microbianos que se relacionam aomau hálito ou à periodontite.

Outros usos benéficos da presente composição são na conser-vação de alimentos em que a composição atua como um absorvedor de oxi-gênio utilizando dois mois de O2 toda vez que um mol de açúcar for utilizado.

Na área de cuidados pessoais, a composição da presente inven-ção pode ser adicionada à pasta de dentes, em particular, que clareiam osdentes, às soluções para limpeza bucal, aos produtos de limpeza de denta-duras, a sabão líquido, aos cremes e às loções para cuidado da pele, àsformulações para cuidado dos cabelos e para o cuidado do corpo e às solu-ções para limpeza de lentes de contato em uma quantidade eficiente paraatuar como um agente antibacteriano. A composição da presente invençãopode ainda ser um componente de uma composição detergente para roupasou de uma composição detergente para lavagem de louças e pode ser utili-zada como uma fonte de peróxido de hidrogênio. A composição detergentepara roupas pode compreender um tensoativo, a dita composição da presen-te invenção. A composição detergente para lavagem de louças pode com-preender a dita composição da presente invenção e um precursor de alve-jamento ou peroxiácido. A composição da presente invenção pode ser parti-cularmente útil para a remoção de manchas.Detergentes

O detergente (produto) de acordo com a invenção compreende acomposição de acordo com a invenção. Portanto, em uma modalidade a in-venção fornece o uso da composição da invenção em um produto detergen-te, tal como uma composição para limpeza, uma formulação para limpeza,uma composição detergente ou uma formulação detergente.O detergente (produto) pode ser utilizado como um agente alve-jante ou alvejante ou pode ser utilizado como um agente desinfetante ou tan-to um agente alvejante/alvejante quanto desinfetante.

O detergente (produto) pode compreender enzimas adicionaisou sistemas enzimáticos, como descrito aqui, em particular, peroxidases,proteases, amilases, lipases, acil-transferases e Iactoperoxidases (opcional-mente na presença de tiocianato).

Em uma modalidade, o produto detergente pode estar na formade uma composição para limpeza ou de uma formulação para limpeza.

Em uma modalidade, o produto detergente pode estar na formade uma composição detergente ou de uma formulação detergente.

O produto detergente pode ser uma composição para lavagemde louças.

Preferencialmente, o produto detergente de acordo com a inven-ção possui um maior desempenho de lavagem, sob as condições de lava-gem relevantes, quando comparado com um produto equivalente que nãocompreende a composição da invenção.

Em algumas modalidades, as formulações detergentes quecompreendem a composição da invenção e um agente de reforço do alveja-mento são utilizadas para produzir espécies de oxigênio ativas no líquido delavagem de ropuas para alvejar as manchas.

Em algumas modalidades, a composição detergente compreen-de ainda uma acil-transferase e seu substrato e é utilizada para produzir es-pécies de oxigênio ativas no líquido de lavagem de roupas para alvejar asmanchas.

Em um aspecto, a composição é uma composição comestível,tal como uma composição para cuidado oral, uma composição para medi-camento (administrada de forma oral) ou uma composição de alimento hu-mano e animal.

O termo 'composição comestível' se refere a composições que 1são para administração oral ou para consumo através da cavidade oral.

As composições comestíveis podem compreender um ou maisagentes aromatizantes, conservantes, ingredientes para obtenção de textu-ra, emulsificantes, adoçantes, umectantes e/ou agentes de ligação que (tipi-camente) foram aprovados para o consumo humano (ou de animais).Cuidado Oral

Em um aspecto da invenção, é fornecido um produto para cui-dado oral que compreende uma composição de acordo com a invenção eingredientes utilizados nos produtos para cuidado oral.

Em um aspecto adicional da invenção, é fornecido o produto pa-ra cuidado oral de acordo com a invenção compreende uma primeira enzi-ma, tal como uma poliol oxidase, tal como a sorbitol oxidase, uma enzimaadicional, tal como uma oxidorredutase adicional e um poliol, tal como sorbi-tol e ingredientes utilizados nos produtos para cuidado oral em que o efeitoantimicrobiano e/ou alvejante e/ou alvejante é desejado.

Os exemplos de produtos para cuidado oral incluem pasta dedentes, creme dental, gel ou pó dental, odôntico, colutórios, sprays bucais,formulações pré- ou pós-escovação, goma de mascar, pastilhas e bala.

O produto para cuidado oral pode compreender ainda ingredien-tes ativos tais como tiocianato, gluconato de zinco, lisozima, lactoferrina, Iac-toperoxidase e amiloglucosidase. Os ingredientes adicionais estão listadosna W097/06775 e incluem mediadores redox.

Em uma modalidade, a composição para cuidado oral/produtode acordo com a invenção compreende ainda fluoreto.

As pastas de dentes e os géis dentais incluem tipicamente in-gredientes tais como materiais de polimento abrasivo, agentes formadoresde espuma, agentes aromatizantes, umectantes, aglutinantes, espessantes,agentes adoçantes, agentes alvejantes/alvejantes/de remoção de manchas,água e opcionalmente enzimas.

As soluções para limpeza bucal, incluindo líquidos para remoçãode placa, compreendem tipicamente ingredientes tais como uma solução deágua/álcool, aroma, agente umectante, adoçante, agente de formação deespuma, corante e opcionalmente enzimas.

Goma de mascar: As composições adequadas para a prepara-ção de uma goma de mascar são descritas na W02005/006872 e na Paten-te U.S. Ns 4.564.519.

Quanto utilizada nos produtos para cuidado oral, a quantidadeda primeira oxidase tal como uma poliol oxidase, tal como a sorbitol oxidasee a enzima adicional (tal como a oxidorredutase adicional) deve ser umaquantidade segura e eficiente que significa uma quantidade alta o suficientepara modificar significativamente o estado de saúde que será tratado ou oefeito do resultado alvejante e/ou alvejante desejado, mas baixa o suficientepara evitar efeitos colaterais graves.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método paraalvejar e/ou branquear os dentes, que compreende o contato dos dentescom um produto para cuidado oral que compreende uma composição deacordo com a invenção em uma quantidade e um período de tempo adequa-do para alvejar e/ou branquear os dentes.

A presente invenção fornece uma composição para branquea-mento dos dentes segura que possui a vantagem sobre a da técnica anteriorpor fornecer o uso de uma primeira oxidase tal como uma poliol oxidase, talcomo a sorbitol oxidase que pode atuar sobre os substratos que não sãocariogênicos (isto é, substratos que não se degradam em açúcares cariogê-nicos tais como sacarose, glicose, frutose, maltose etc.).

Alimento e Produto Alimentício

A composição da invenção pode ser utilizada na desinfecçãogeral de alimentos e de ambientes de alimentos humanos e animais, taiscomo nas estruturas de produção, processamento de uma preparação, taiscomo salas de ordenha, unidades de produção de queijo, fábricas de pro-cessamento de carne, plantas de lavagem e processamento de vegetais efrutas, em restaurantes etc.

Nas fábricas de processamento de carne (isto é, carne animal,incluindo peixe), a composição da invenção pode ser utilizada na lavagem ena desinfecção de carcaças de animais e produtos alimentícios derivadosdas mesmas. O uso de um sistema de poliol oxidase/enzima adicional é par-ticularmente preferido uma vez que reduz o nível de açúcares fermentáveisdentro ou na superfície dos produtos de carne, reduzindo o crescimento demicro-organismos indesejáveis. A composição de acordo com a invençãopode compreender ainda silicatos alcalinos (US2004062851, incorporadaaqui como referência), tais como composições que são consideradas parti-cularmente úteis na descontaminação de produtos de carne. O uso de silica-tos alcalinos também aumentou as propriedades de retenção de água dacarne e dos produtos de carne e pode ser feito para aumentar a retenção dacomposição da invenção na carne e nos produtos de carne.

Uma vantagem adicional é a diminuição do pH causada pelaprodução de produtos ácidos adicionais, o que inibe também a produção demicro-organismos dentro ou na superfície da carne. Benefícios similares sãoobservados nas unidades de lavagem e processamento de vegetais e frutas.

A composição da invenção também pode ser utilizada nos ali-mentos humanos e alimentícios. O peróxido de hidrogênio é utilizado exten-sivamente como um agente antimicrobiano na produção de produtos laticí-nios e produtos de ovos. De forma adequada, a composição de acordo coma invenção pode ser adicionada ou pode ser um produto alimentício selecio-nado do grupo que consiste em: produtos laticínios, tais como leite, creme,queijo, soro do leite, iogurte, manteiga ou ovo, tal como gema do ovo ou cla-ra do ovo.

A diminuição do pH causada pelo acúmulo de produtos ácidosadicionais é também uma vantagem considerável em outros tipos de alimen-tos, tal como na produção de queijo, em que a diminuição rápida do pH au-menta a taxa de maturação do queijo, tal como queijos chedar e queijos du-ros italianos, reduzindo o tempo de maturação e de armazenamento. O pHmais baixo, portanto, contribui ainda para um sabor melhorado do queijo.

Em uma modalidade a composição da invenção é utilizada emuma bebida, tal como um suco de fruta. Os sucos de fruta compreendemtipicamente os primeiros substratos adequados, portanto, pode ser desne-cessário adicionar o primeiro substrato adicional no suco de fruta ou alterna-tivamente podem ser suplementado com os primeiros substratos referidos aqui.Além disso, o O2 é eliminado pela produção de xilose, que podeprevinir que o alimento estrague. Um benefício adicional é a diminuição dopH comparado com o de um sistema em que a SOX é utilizada isoladamen-te, em que nenhuma diminuição do pH é observada - a diminuição do pHtambém pode prevenir ou reduzir a deterioração dos alimentos.Produtos para Cuidado Pessoal

Na área de cuidados pessoais, a composição da presente inven-ção pode ser adicionada em um produto para cuidado pessoal sem ser osprodutos para cuidado oral, tais como produto de limpeza de dentaduras,sabão liquido, cremes e loções para cuidado da pele, formulações para cui-dado dos cabelos e para cuidado do corpo e soluções para limpeza de len-tes de contato em uma quantidade eficiente para atuar como um agente an-tibacteriano.

Produção de papel

A composição da invenção pode também ser utilizada para alimpeza de moinhos de papel, o peróxido de hidrogênio produzido oxida oscarboidratos nos ácidos correspondentes, que por sua vez acredita-se quequelam a parte catiônica dos sais inorgânicos de acordo com a quantidade.Isto possibilita uma melhor limpeza e/ou controle de sedimentos e para cor-rentes de água leva a uma redução na turbidez, a um melhor comportamen-to de assentamento, assim como uma redução na coloração, dos quais to-dos tornam os procedimentos de limpeza e controle de efluentes mais fáceise menos caros (ver a WO06/061018).

Cosméticos

A glicose oxidase foi utilizada como a base de um sistema con-servante comercial para cosméticos e artigos de higiene. Entretanto, a pre-sente invenção fornece um substituto adequado para o uso da glicose oxida-se uma vez que fornece um sistema mais eficiente para a produção de peró-xido de hidrogênio e/ou pode fornecer uma ação antimicrobiana/antibacte-riana eficiente quando em uso. Pode também fornecer um produto com fun-ção dual, que é um cosmético que clareia ou branqueia a pele durante o uso.

O sistema de Iactoperoxidase é utilizado em vários produtoscosméticos. A composição cosmética ou o produto de acordo com a inven-ção pode, portanto, compreender ainda Iactoperoxidase e tiocianato.

Os poiióis, tais como o sorbitol é tipicamente um componenteprincipal dos cosméticos ou pode ser adicionado nos cosméticos para forne-cer um substrato adequado para a poliol oxidase na composição de acordocom a invenção.

O uso da composição da invenção nos produtos cosméticos po-de fornecer um ou mais dos benefícios a seguir: conservação do cosméticoe da atividade microbiana/bacteriana quando aplicado na pele, efeito alve-jante/alvejante da pele.

Os ingredientes cosméticos incluem: antioxidantes, agentes deligação, emolientes, emulsificantes, umectantes, pigmentos, lubrificantes,conservantes, solventes, fragrâncias, tensoativos, substâncias de veículo,tais como um material com base inerte, estabilizantes e espessantes.

A composição/o produto da invenção pode ser utilizado na formade um ou mais dos produtos cosméticos selecionados do grupo que consisteem: batom, brilho labial, lápis Iabial e Tinta labial; base liquida; base em cre-me; pó; Rouge (blush ou blusher); bronzeador; Máscara; Delineador de o-Ihos e sobra de olhos; Esmalte para unhas; Corretores de manchas da pele;produtos para cuidado da pele tais como cremes e loções, por exemplo, parahidratar a face e o corpo; protetores solares e loções solares; produtos detratamento para reparar ou esconder imperfeições da pele.

Os cosméticos também podem ser descritos pela forma do pro-duto, assim como pela área para aplicação. Os cosméticos podem ser emul-sões líquidas ou em creme; pós, tanto pressionados como livres; dispersões;e cremes ou bastões anidros.

A composição/ões produtos de acordo com a invenção podemainda ser utilizados em técnicas cosméticas tal como alvejamento e/ou bran-queamento da pele.

Alvejamento da pele

A hidroquinona tem sido utilizada como um ingrediente nas pre-parações para alvejamento da pele. Entretanto, recentemente a US Envi-ronmental Protection Agency emitiu uma notificação de estabelecimento deregras proposto que estabeleceria que os produtos de fármacos para alve-jamento da pele vendidos no balcão (OTC) baseados em hidroquinona sãopotencialmente carcinogênicos e não são reconhecidos de forma geral comoseguros e eficientes (GRAS) e têm a marca falsificada.

As composições e os produtos de acordo com a invenção po-dem ser utilizados para a preparação de produtos à base de enzimas para oalvejamento da pele e, portanto, fornecem uma alternativa segura para o usoda hidroquinona.

Os produtos para o alvejamento da pele podem compreenderoutros agentes alvejantes, tais como extrato de alcaçuz, extrato de amora,arbutina, ácido cójico, extrato de uva-ursina, misturas de AHA1 ácidos salicí-clicos, ácido aloeléico, ácidos cítricos, ácidos lácticos, assim como matrizese protetores solares com base adequada.

Alvejamento dos cabelos

Para o alvejamento da coloração dos pelos é utilizado um agen-te oxidante químico. Os agentes oxidantes adequados são persulfatos, clore-tos e, acima de tudo, peróxido de hidrogênio ou produtos de adição dosmesmos com uréia, melamina e borato de sódio. Portanto, a composição dapresente invenção também pode ser utilizada como uma fonte alternativasegura de peróxido de hidrogênio para o alvejamento dos pelos.

De forma adequad.a uma composição para alvejamento dos ca-belos também pode ser utilizada para corar fibras de queratina e pode, por-tanto, conter pelo menos um precursor de corante assim como a composiçãoda presente invenção. A presente invenção se refere ainda a um processopara a coloração de fibras contendo queratina utilizando a composição dapresente invenção.

Tinta

O termo 'tinta' como utilizado aqui no contexto da presente in-venção se refere à família de produtos utilizados para proteger e/ou adicio-nar cor a um objeto ou superfície cobrindo a mesma com um revestimentopigmentado ou não pigmentado e incluem verniz, tintas para madeira, gomaIaca1 Iaca e esmalte. A tinta pode ser aplicada em quase todo o tipo de obje-to. A tinta é um produto semiacabado, uma vez que o produto final é o pró-prio artigo pintado.

A tinta pode ser utilizada na aplicação em que a tinta seca é ex-posta a um ambiente de água natural, tal como uma tinta marítima. As tintasmarítimas são utilizadas para prevenir ou reduzir a formação de sujeira so-bre os cascos de barcos e navios causado pelo crescimento de organismostais como algas, estreias do mar e similares.

A tinta pode ser uma tinta decorativa, por exemplo, utilizada nointerior ou no exterior de construções e outros objetos.

A tinta pode ser uma tinta protetora, que previne ou reduz o es-trago por micro-organismos da superfície ou do material sobre o qual a tintaé aplicada, tal como decomposição seca ou decomposição úmida.

A composição de acordo com a invenção pode ser utilizada co-mo um conservante na tinta. Alternativamente ou em adição, a composiçãopode ser utilizada em uma tinta para reduzir a formação de sujeira, tal comona tinta marítima, em que a produção de peróxido de hidrogênio produz umacamada oxidativa que previne ou reduz a adesão ou o crescimento de orga-nismos que se depositam sobre a superfície. Tais tintas que compreendem acomposição de acordo com a invenção oferecem uma solução de enzimasbenéfica para este problema uma vez que o peróxido de hidrogênio é produ-zido sem a adição ou o acúmulo significativo de substratos que podem serfermentados dentro da tinta, que podem realmente favorecer a antiformaçãode sujeira, especialmente se as enzimas dentro da tinta ficarem inativadas.Pesticidas

Os produtos pesticidas contêm geralmente não mais que 35%de peróxido de hidrogênio, que são então geralmente diluídos a 1% ou me-nos quando aplicados na forma de um spray ou de um líquido. O peróxido dehidrogênio é utilizado para muitas plantas de cultivo não alimentares e ali-mentares (por exemplo, frutas, nozes e vegetais), tanto internas quanto ex-ternas e antes e depois da colheita e para a desinfecção das unidades dearmazenamento de alimentos. As pragas-alvo são tipicamente micro-orga-nismos, incluindo fungos e bactérias que causam doenças às plantas. Ospesticidas contendo peróxido de hidrogênio, utilizados para prevenir e con-trolar os agentes patogênicos de plantas, são tipicamente aplicados na for-ma de um spray sobre a folhagem ou na forma de um banho de imersão nasmudas e nas raízes ou na forma de um tratamento do solo pré-plantio.

A composição de acordo com a invenção pode, portanto, serutilizada como um pesticida, diretamente, permitindo a produção de peróxidode hidrogênio in situ ou na forma de um sistema para a produção de peróxi-do de hidrogênio que pode ser subseqüentemente aplicado na superfícieapropriada.

Modalidades adicionais:

1. Uma composição que compreendeuma sorbitol oxidase, um primeiro substrato e uma oxidorreduta-

se,

em que o primeiro substrato é oxidável pela sorbitol oxidase paraformar peróxido de hidrogênio e um segundo substrato e o segundo substra-to é oxidável pela oxidorredutase para formar peróxido de hidrogênio e umproduto.

2. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 1, em que o primeiro substrato é um ou mais selecionados do grupoque consiste em D-sorbitol, D-xilitol, D-manitol, D-arabitol, glicerol, inositol,1,3-propanodiol, 1,3-butanodiol e 1,4-butanodiol.

3. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 2, em que o primeiro substrato é um ou mais selecionados do grupoque consiste em D-sorbitol ou D-xilitol.

4. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 3, em que o primeiro substrato é D-sorbitol.

5. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 1, em que a oxidorredutase é uma ou mais selecionadas do grupo queconsiste em hexose oxidase, glicose oxidase, carboidrato oxidase e oligos-sacarídeo oxidase.

6. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 5, em que a oxidorredutase é uma ou mais selecionadas do grupo queconsiste em uma carboidrato oxidase, uma hexose oxidase ou uma glicoseoxidase.

7. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 6, em que a oxidorredutase é uma hexose oxidase.

8. A composição de acordo com a invenção tal como na modali-dade 1, em que a sorbitol oxidase é derivada de uma cepa de Streptomyces.

9. A composição de acordo com a invenção tal como em quai-quer uma das modalidades 1-8, em que o pH da composição fica entre 5 e 9.

10. A composição de acordo com a invenção tal como em qual-quer uma das modalidades 1-9, em que o pH da composição fica entre 6 e 8.

11. A composição de acordo com a invenção tal como em qual-quer uma das modalidades 1-10, em que a sorbitol oxidase e a oxidorredu-tase são ativas à temperatura ambiente.

12. Um produto para cuidado oral que compreende uma compo-sição de acordo com a invenção tal como em qualquer uma das modalida-des 1-11 e os ingredientes utilizados nos produtos para cuidado oral.

13. O uso de uma sorbitol oxidase para branquear e/ou alvejar.

14. O uso de uma composição de acordo com a invenção talcomo em qualquer uma das modalidades 1-10 para branquear e/ou alvejar.

15. O uso de acordo com a invenção tal como em qualquer umadas modalidades 13-14 para branquear e/ou alvejar os dentes.

16. Um método para alvejar e/ou branquear os dentes, quecompreende o contato dos dentes com um produto para cuidado oral quecompreende uma composição de acordo com a invenção tal como em qual-quer uma das modalidades 1-10 em uma quantidade e um período de tempoadequados para alvejar e/ou branquear os dentes.

17. Sorbitol oxidase e D-xilitol para uso como um medicamento.

18. Um medicamento de acordo com a invenção tal como namodalidade 17, em que a sorbitol oxidase é derivada de uma cepa de Strep-tomyces.

19. Um produto para cuidado oral que compreende sorbitol oxi-dase e D-xilitol e ingredientes utilizados nos produtos para cuidado oral.

20. O uso de uma sorbitol oxidase e D-xilitol para branquear e/oualvejar os dentes.

EXEMPLOS

Os exemplos a seguir são fornecidos com a finalidade de de-monstrar e ilustrar adicionalmente certas modalidades e aspectos preferidosda presente invenção e não devem ser interpretados como Iimitantes do âm-bito da mesma.

Na descrição experimental a seguir, são aplicadas as abrevia-ções a seguir: 0C (graus Centígrados); rpm (revoluções por minuto); H2O(água); HCI (ácido clorídrico); aa (aminoácido); pb (par de bases); kb (par dequilobases); kD (quilodáltons); g (gramas); μ^ e ug (microgramas); mg (mili-gramas); ng (nanogramas); μΙ_ e uL (microlitros); mL (mililitros); mm (milíme-tros); nm (nanômetros); μηι e um (micrômetro); M (molar); mM (milimolar);μΜ e uM (micromolar); U (unidades); V (volts); PM (peso molecular); s (se-gundos); min (minutos); h (horas); MgCI2 (cloreto de magnésio); NaCI (clore-to de sódio); DO280 (densidade óptica em 280 nm); D06oo (densidade ópticaem 600 nm); EFT ("tempo de fermentação eficiente"); HDL (Líquido Deter-gente para Trabalho Pesado); EtOH (etanol); PBS (solução salina tampona-da com fosfato [NaCI a 150 mM, tampão fosfato de sódio a 10 mM, pH 7,2]);SDS (dodecil sulfato de sódio); Tris (tris(hidroximetil)aminometano); TAED(Ν,Ν,Ν'Ν'- tetra-acetiletilenodiamina); p/v (peso em relação ao volume); v/v(volume em relação ao volume); GOX e GOx (glicose oxidase); AOX e AOx(álcool oxidase); COX e Cox (colina oxidase); HOX e HOx (hexose oxidase);SOX e Sox (sorbitol oxidase); AATCC (American Association of Textile andColoring Chemists); WFK (wfk Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Alema-nha); Testfabrics (Testfabrics Inc, Pittston PA); ATCC (American Type Cultu-re Collection, Manassas, VA); Geneart (Geneart, Regesburg, Alemanha);Invitrogen (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA); Baker (J.T.Baker, Phiilipsburg,NJ); NAEF (NAEF, Press and Dies, Inc., Bolton Landing, NY); Fluka (FlukaChemie AG, Buchs1 Suíça); Prometric (Prometic Biosciences, Wayne NJ);Minolta (Konica Minolta. Glen Cove, NY); e Sigma (Sigma-AIdrich ChemicalCo., St. Louis, MO).

EXEMPLO 1: Construção de Cepas que Expressam Sorbitol O-xidase de Streptomyces sp. h-7775 em Streptomyces Iividans

A seqüência de proteína (SEQ ID NO: 1) da sorbitol oxidase foiobtida a partir da seqüência de aminoácidos publicada (Ver, por exemplo,Hiraga e outros, Biosci. Biotechnol. Biochem., 62: 4347-353 [1998]). A se-qüência sinal da via de argininas em par do gene SC06772 de Streptomycesceolicolor (SEQ ID NO: 3) foi obtida a partir da seqüência genômica comple-ta de Streptomyces coelicolor.

A sorbitol oxidase foi expressa em Streptomyces na forma deuma proteína de fusão da seqüência sinal da proteína SC06772 (SEQ IDNO: 3) e a sorbitol oxidase (SEQ ID NO: 1). Um sítio de restrição para Λ/colfoi introduzido na extremidade a 5' do DNA para as finalidades de clonagem,que resultou na adição de resíduos do aminoácido glicina na posição 2 (Ver,SEQ ID NO: 4).

Um sítio de restrição para SamHI também foi introduzido na ex-tremidade a 3' do DNA para as finalidades de clonagem. Os códons do genede fusão foram otimizados para a expressão em Streptomyees lividans. ODNA foi sintetizado pela Geneart. O fragmento de DNA abrangendo os doissítios de restrição (isto é, de Λ/col até SamHI (SEQ ID NO: 5)) foi clonado noplasmídeo de expressão em Streptomyees pKB105 (Ver, o Pedido de Paten-te U.S. Ns de Série 11/303.650, depositado em 16 de dezembro de 2005,incorporado como referência em sua totalidade) que foi cortado com SamHIcompletamente e com Λ/col parcialmente.

O plasmídeo de expressão (pKB105-TAT-SOX-7775; Figura 1)foi transformado na cepa g3s3 de Streptomyees lividans (Ver, o Pedido dePatente U.S. Ns de Série 11/305.650, supra) e três transfectantes foram se-lecionados e cultivados em meio TS durante 2-3 dias na presença de 50ug/mL de tiostreptona a 30°C. As células foram então transferidas para ummeio de produção isento de agentes antimicrobianos e o cultivo foi continua-do durante mais três dias. Então, 1 mL da cultura foi transferido para cadaum de dois tubos de cultura e as células foram removidas por centrifugaçãosob condições suficientes para separar as células dos sobrenadantes. Ossobrenadantes obtidos partindo destes dois tubos de cultura foram testadosem ensaios da atividade enzimática. Dois oligos (SEQ ID NO: 6 e SEQ IDNO: 7) foram obtidos na Invitrogen.

GCGCTAGCCGGCCCCCCGGCACAGGCCATGACCCCGGCCGAGAAGAA

CTGGG (SEQ ID NO: 6)

CAGGAAACAGCTATGAC (SEQ ID NO: 7)

Os iniciadores foram utilizados na PCR para a amplificação dogene da sorbitol oxidase e para fundir o gene da sorbitol oxidase com a se-quência sinal celA. A mistura da reação da PCR contendo DNA, dNTPs, ini-ciador e 4% de DMSO em 1x tampão foi aquecida a 98°C durante 4 minutospara desnaturar os moldes de DNA. A enzima Herculase® Il (Stratagene) foiadicionada no tubo e a reação da PCR foi realizada em 30 ciclos de 98°Cdurante 30 segundos, 62°C durante 30 segundos e 72°C durante 1 minuto e8 segundos. A extensão final a 72°C foi feita durante 5 minutos e a reaçãofoi resfriada a 4°C.

O fragmento da PCR resultante continha uma parte da seqüên-cia sinal celA, o gene da sorbitol oxidase e uma parte da seqüência do vetorcontendo dois sítios de enzimas de restrição (SEQ ID NO: 8).

O fragmento da PCR foi digerido com as enzimas de restriçãoNheI e BamHI para remover a parte da seqüência do vetor. O fragmento re-sultante foi então clonado no vetor de expressão pKB105 para gerar o plas-mídeo "pKB105-CelA-Sox7775" (Ver, a Figura 2). O plasmídeo de expressãofoi transformado na cepa g3s3 de Streptomyces Iividans e três transforman-tes foram selecionados e cultivados em meio TS durante 2-3 dias na presen-ça de 50 ug/mL de tiostreptona a 30°C. As células foram então transferidaspara um meio de produção isento de antibióticos e o cultivo foi continuadodurante mais três dias. Então, 1 mL da amostra foi transferido para cada umdos dois novos tubos de cultura e as células foram removidas e a enzima foipurificada como descrito no Exemplo 2.

EXEMPLO 2: Expressão do gene da sorbitol oxidase de Strep-tomvces sp. H-7775 na cepa BL21(DE3)pLvsS de E. coli.A seqüência de aminoácidos do gene da sorbitol oxidase do ge-ne SOX de Streptomyces sp. H-7775, publicada por Hiraga e outros 1998.Bioscience Biotech Biochem. 61: 1699-1704, 1998 foi recuperada do bancode dados de seqüências. Um gene sintético (com códons neutros) codificando o geneSOX de H-7775 foi utilizado para expressar o gene da sorbitol oxidase nacepa BL21(DE3)pLysS de E. coli. O vetor de expressão pET 24a com o geneSOX foi clonado na forma do fragmento de Ndel + Bam Hl. O plasmídeo re-sultante (Figura 5a) foi transformado e propagado nas células de E. coli Top10 (Invitrogen, USA). Os transformantes resistentes à canamicina con-tendo o gene SOX de 1,2 kb foram identificados através do método de PCRdireto com colônias. Os transformantes positivos em relação a SOX foramcultivados e o DNA plasmideal foi isolado. O DNA plasmideal contendo ogene SOX clonado foi então utilizado para transformar a cepa hospedeira BL21(DE3)pLysS. A reação de transformação inteira foi utilizada diretamentepara inocular frascos de 250 mL contendo 25 ml_ de LB + o antibiótico ca-namicina (50 ug/mL) e cloranfenicol (34 ug/mL). As culturas foram incubadasdurante a noite com agitação a 37°C. Um frasco de 2 litros contendo 500 mLde LB contendo canamicina (50 ug/mL) e cloranfenicol (34 ug/mL) foi inocu- lado com 25 mL da cultura mantida durante a noite e foi adicionalmentepermitida que crescesse durante 2 horas até atingir aproximadamente umaDO600 de 0,4-0,6 fase logarítmica média. O IPTG em uma concentração finalde 1 mM foi adicionado nas culturas. As culturas foram adicionalmente incu-badas durante mais 2 horas e então coletadas por centrifugação. Os péletes resultantes foram ressuspensas em tampão fosfato e as células foram pas-sadas através de uma prensa de French para o rompimento/lise das células.Os Iisados de células diferentes foram analisados em relação à atividade desox (ver a Tabela 1 abaixo) e fracionados por eletroforese em gel (condiçõesnativas & desnaturantes). Os Iisados de células foram fracionados em umgel nativo que foi adicionalmente testado em um ensaio de atividade de co-bertura em gel utilizando sorbitol como o substrato e um ensaio baseado naredução mediada por PMS de NBT. A figura 5b mostra a presença de umabanda de proteína corada distinta correspondente a uma flavoproteína, aproteína SOX que possui atividade em relação ao sorbitol. O PMS/NBT é umensaio para diagnóstico para flavoproteínas em que PMS = metossulfato defenazina é um mediador redox que é reduzido por FAD reduzido. A glicoseoxidase também é uma flavoproteína na faixa 1 figura 5b, mas não é ativaem relação ao sorbitol, assim, a ausência da banda corada. P10 é um trans-formante com o vetor pET24a vazio (sem o gene SOX) mostrando a ausên-cia da banda da proteína ativa de SOX. A ausência de uma banda corada nafaixa 1 mostrou que a glicose oxidase não é ativa em relação ao sorbitol, osubstrato utilizado na mistura para o ensaio de cobertura. Este ensaio pode,portanto, ser utilizado para determinar se a primeira oxidase tal como a polioloxidase da invenção não possui atividade significativa sobre o segundosubstrato.

<table>table see original document page 65</column></row><table>

Tabela 1: Atividade de SOX utilizando o (ensaio de ABTS/HRP) com 6 extra-tos diferentes de E. coli. O extrato P10 é um controle negativo com atividadede fundo.

A Tabela 1 mostra a produção da sorbitol oxidase com uma en-zima ativa em E. coli BL21(DE3)pLysS. O controle negativo mostrou umaatividade de fundo de 0,2 U/mg. A atividade enzimática foi aumentada atra-vés do aquecimento (H) dos extratos isentos de células P6H & P19H, indi-cando que uma etapa de tratamento térmico pode ser utilizada para a purifi-cação da proteína SOX. A SOX expressa por E. coli tem uma atividade es-pecífica similar à do trabalho previamente realizado por Kohei Oda & KazumiHiraga (Biosci Biotech Biochem 61: 1699-1704, 1997).

EXEMPLO 3: Expressão do suposto gene da sorbitol oxidase deStreptomyces coelicolorflividans na cepa S3G3 de Streptomyces Iividans

A gi|2838C)233|sp|Q92BU1|XYOA_STRCO de Streptomycescoelicolor comentada com uma provável xilitol oxidase (XOX) foi identificadapor buscas em blast como sendo mais próxima em relação à identidade deseqüência (entre 54-60% dependendo do alinhamento) ao gene da sorbitoloxidase de Streptomyces sp. H-7775. O local contendo o suposto gene XOXde Streptomyces coelicolor, SC06147, a seqüência ORFNames=SCIA9.11c,foi recuperado do banco de seqüências e vários iniciadores gênicos especí-ficos & e iniciadores flanqueadores foram utilizados para isolar o gene cor-respondente de S. Iividans pela PCR. A seqüência do genoma completo deStreptomyces Iividans ainda não está disponível, mas é quase idêntica à dogenoma totalmente sequenciado de S. coelicolor. A reação final da PCRconsistia nos Iniciadores us-sco1 5'gcccatatgaggcgacatcacggtcacc (SEQ IDNO: 9) e ls-sco1 5'ggatcctcagcccgcgagcacccc (SEQ ID NO: 10), o DNA ge-nômico de S. Iividans com o molde resultando na síntese de um fragmentoda PCR de 1,269 kb. As condições da PCR utilizadas nesta etapa final daPCR consistiam em 30 ciclos: desnaturação a 94°C durante 55 segundos,anelamento a 55°C durante 55 segundos, extensão durante 1-2 minutos a68°C. A polimerase utilizada é a Platinum Pfx DNA polimerase mais a solu-ção intensificadora da Invitrogen. O produto da PCR resultante foi clonadodiretamente em um vetor de E. coli PCR Blunt TOPO. Os iniciadores us-s15'gccatgggcgacatcacggtcaccaac (SEQ ID NO: 11) e Is-s1 5' atggatcctcagcccgcgagcacccc (SEQ ID NO: 12), foram utilizados em uma reação da PCRutilizando as mesmas condições como acima. O produto da PCR de 1,268kb foi digerido com NcoI-BamHI e o fragmento resultante foi clonado direta-mente em um vetor pK105 de Streptomyces digerido com Ncol + Bam Hl. Oconstructo final é o vetor de expressão denominado pSMM-SOX (S. lividans)na figura 6. O SOX clonado no PCR Blunt TOPO foi utilizado para verificar aseqüência de nucleotídeos do suposto gene SOX. Os 5 μΐ_ do DNA plasmi-deal (figura 6) foram utilizados para transformar protoplastos de Streptomy-ces g3s3. A reação de transformação foi plaqueada em placas R5 e incuba-da a 32°C durante 18 horas. Uma cobertura de ágar nutritivo mole contendotiostreptona foi vertida sobre as placas que foram adicionalmente incubadasdurante 3 dias. As colônias isoladas foram utilizadas para inocular um frascode 250 mL com 20 mL de meio TS-G contendo tiostreptona. Após 3 dias decuitivo com agitação a 30°C, alíquotas de 2 mL foram utilizadas para inocularum frasco de 250 mL contendo o meio de produção. Os péletes de célulasforam coletados por centrifugação, ressuspensos em tampão e rompidos. ATabela 2 mostra as atividades de SOX presentes nos extratos isentos decélulas provenientes de transformantes diferentes de Streptomyces.

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Tabela 2. Atividades de SOX dos extratos isentos de células provenientes de20 transformantes diferentes de Streptomyces que exibem quantidades deatividade variáveis. Ensaio da Atividade do Suposto SOX (ABTS/HRP)(U/mg).

O DNA e as seqüências de proteínas da sorbitol oxidase de S.coelicolor (SC06147) são mostrados como as SEQ ID NOs: 2 e 13, respec-tivamente.

EXEMPLO 4: Purificação da Sorbitol Oxidase

Neste Exemplo, são descritos os métodos utilizados para a puri-ficação da sorbitol oxidase produzida por S. Iividans (Ver, Exemplos 1 - 4). Asorbitol oxidase de Streptomyces Iividans fica localizada nos micélios. Assim,a enzima foi isolada através da Iise celular utilizando uma prensa de Frenchpartindo do extrato celular em tampão de Kpi a 100 mM, fosfato de potássio,pH 7,0. O extrato celular foi aquecido a 50°C durante uma hora, seguida pelacentrifugação suficiente para remover os restos celulares. O sobrenadantedo Iisado de células foi então misturado com sulfato de amônio a uma satu-ração de 32% para precipitar a fração de proteína contendo a sorbitol oxida-se. O precipitado de proteína foi mantido a 4°C durante a noite e então sepa-rado do líquido principal por centrifugação a 10.000 RPM utilizando uma cen-trífuga Sorvall e um rotor SLA-1500 da Sorvall.

O precipitado de proteína foi então lavado com uma solução desulfato de amônio saturada a 32%. O precipitado de proteína lavado foi dis-solvido novamente em tampão de Kpi e o material insolúvel foi descartado. Afração solúvel foi submetida à diálise contra tampão de Kpi a 25 mM, pH 7,0,durante a noite e então adicionalmente purificada utilizando cromatografiapor afinidade na resina laranja reativa (Prometic). Esta preparação de sorbi-tol oxidase parcialmente purificada e o Iisado de células do caldo de fermen-tação (EFT de 108 h) foram utilizados como amostras nos experimentos pa-ra o bioalvejamento. O peso molecular da enzima foi determinado comosendo de -45.000 Da por eletroforese em gel de SDS-PAGE. O grupo pros-tético é um FAD ligado covalentemente (1 mol de FAD para 1 mol de SOX).

EXEMPLO 5: Estabilidade e Desempenho de Alvejamento de SOX em Con-dições de Lavagem de Roupas HDL

Neste Exemplo, são descritos métodos para a determinação daestabilidade e do desempenho de alvejamento de SOX nas condições delavagem de roupas com detergente líquido da AATCC. Nestes experimentos,é utilizado o detergente padronizado da AATCC (American Association ofTextile Chemists and Colorists Heavy Duty Liquid Detergent Version 2003sem agente de brilho; os componentes-chave incluem alcano sulfonato line-ar, álcool etoxilado, propanodiol, ácido cítrico, ácido graxo, soda cáustica eágua; Testfabrics).

São utilizadas três amostras de tecido de algodão que podemser alvejadas com suco (STC CFT CS-15), vinho (STC CFT CS-3) e chá(STC CFT BC-3). As amostras de tecido são cortadas em círculos de 15 mmcom um furador de tecidos (Modelo B equipado com um cortador de moldede 1,58 cm (5/8"); Modelo 93046; NAEF).Os discos isolados de amostras de tecido são colocados em ca-da poço de uma microplaca de 24 poços (Costar 3526). Um (1) mL de solu-ção de lavagem pH 8, contendo por litro, 1,5 mL de detergente AATCC HDL,sorbitol a 75-100 mM, dureza de 6 gpg (diluído da solução de dureza esto-que de 15000 gpg contendo cloreto de cálcio a 1,735 M e cloreto de magné-sio a 0,67 M) e 0,05% de TAED (tetra-acetiletilenodiamina, Fluka) é adicio-nado em cada poço. Cinco até quinze (5-50 μL) microlitros de sorbitol oxida-se parcialmente purificada ou de sorbitol oxidase obtida partindo de uma cor-rida de fermentação tardia (108 h EFT "tempo de fermentação eficiente")produzidos como descrito nos Exemplos 1 e 2, são adicionados com umapipeta de deslocamento positivo em 3-8 poços em uma coluna. A hexoseoxidase ou a glicose oxidase é adicionada a 0,5, 5, 50, 500, 1000 e 1500 U.Os poços de controle não continham enzima. A microplaca foi coberta comuma tampa de plástico e folha de alumínio a 37°C com rotação suave a 100rpm durante 14 h. As placas são então removidas do agitador e testadas emrelação à presença de peróxido de hidrogênio com tiras de teste para peró-xido (Baker).

Cem microlitros (100 μL) de carbonato de sódio a 0,1 mM sãoadicionados em cada poço para aumentar o pH para 10. As microplacas sãoincubadas com rotação durante mais 90 min e os sobrenadantes removidospor aspiração. Cada poço é lavado três (3) vezes com 1,5 mL de PBS deDulbecco, pH 7,3 e três (3) vezes com 1,5 mL de água destilada. Cada discoé removido de seu poço e seco durante a noite entre folhas de toalhas depapel e não expostos à luz direta. Os discos são inspecionados visualmentee então analisados com um Refletometer CR-200 (Minolta) calibrado em umIadrilho branco padronizado. Os valores médios de L são calculados como aporcentagem de liberação de sujeira (% de SR = 100% X (Refletância final -Refletância inicial)/(Refletância de um padrão branco - Refletância inicial).

Os resultados preliminares confirmam que a composição de sor-bitol oxidase/hexose oxidase é estável em um sistema de detergente líquidotípico e é capaz de produzir uma concentração eficiente de peróxido de hi-drogênio na presença de seu substrato sorbitol misturado com o detergentee oxigênio atmosférico disponível. Em adição, o peróxido de hidrogênio ge-rado pela composição na presença de um agente de reforço de alvejamento(isto é, TAED) é capaz de auxiliar no alvejamento de manchas coradas típi-cas tais como mirtilo, chá e vinho.

EXEMPLO 6: Estudo da Faixa de Substratos da Sorbitol Oxidase

A sorbitol oxidase obtida utilizando os métodos descritos nosExemplos 3 - 4, foi testada para observar sua atividade com vários substra-tos de poliol. Todos os substratos utilizados no ensaio estavam a 55 mM emtampão fosfato a 100 mM pH 7,0 a 25°C. A atividade relativa utilizando sorbi-tol como (++++++ = 100%) é mostrada abaixo na Tabela 1. Em adição a es-tes substratos, é considerado que outros substratos, incluindo, mas não limi-tados ao glicerol, encontrarão uso na presente invenção.

<table>table see original document page 70</column></row><table>

EXEMPLO 7: Determinação da atividade de SOX, HOX e GOX.

As glicose oxidases possuem a capacidade de oxidar a glicosepara produzir peróxido de hidrogênio. Os exemplos são carboidrato oxidase,gluco-oligossacarídeo oxidase e glicose oxidase. A hexose oxidase tambémpode ser classificada como uma glicose oxidase, embora esta tenha tipica-mente uma especificidade mais ampla, com atividade significativa sobre ou-tras hexoses assim como dissacarídeos, tal como a maltose.

Definições de unidade

1 unidade de poliol (POX) corresponde ã quantidade de enzima,que sob as condições especificadas resulta na conversão de 1 μηιοΙ do poli-ol especificado por minuto, com a produção resultante de 1 μηιοΙ de peróxidode hidrogênio (H2O2).1 unidade de sorbitol oxidase (SOX) corresponde à quantidadede enzima, que sob as condições especificadas resulta na conversão de 1μmοl de sorbitol por minuto, com a produção resultante de 1 μmοl de peróxi-do de hidrogênio (H2O2).

Definição: 1 unidade de hexose oxidase (HOX) corresponde àquantidade de enzima que sob as condições especificadas resulta na con-versão de 1 μmol de glicose ou de um açúcar hexose alternativo, por minuto,com a produção resultante de 1 μmol de peróxido de hidrogênio (H2O2).

Definição: 1 unidade de glicose oxidase (gluOX) corresponde àquantidade de enzima que sob as condições especificadas resulta na con-versão de 1 μmol de glicose por minuto, com a produção resultante de 1μmol de peróxido de hidrogênio (H2O2).

Ensaio da atividade de SOX, HOX ou GOX em placas para mi-crotitulação (300 μL)

Os substrato ABTS corante da peroxidase da rábano silvestrecomumente utilizado foi incorporado no ensaio, medindo a produção deH2O2 obtida por HOX ou GOX, respectivamente. ABTS serve como um subs-trato cromogênico para a peroxidase. A peroxidase em combinação comH2O2 facilita o transporte de elétrons do corante cromogênico, que é oxidadoem um composto intensamente verde/azul.

Ensaio in vitro

Uma mistura de ensaio continha 266 μL de sorbitol (Sigma P-5504, 0,055 M em tampão fosfato de sódio a 0,1 M, pH 6,3), (ou um substra-to alternativo, por exemplo, xilitol), 12 μL de ácido 2,2'-Azino-bis(3-etil-benzotiozolina-6-Sulfônco) (ABTS) (Sigma A-9941, 5 mg/ml_ de solução a-quosa), 12 μΙ_ de peroxidase (POD) (Sigma P-6782, 0,1 mg/mL em tampãofosfato de sódio a 0,1 M, pH 6,3) e 10 μι de solução aquosa de enzima(SOX ou HOX).

O ensaio é realizado a 25°C.

A incubação foi iniciada pela adição de glicose. A absorbânciafoi monitorada em 405 nm em uma leitora de ELISA. Uma curva padrão, ba-seada nas concentrações variáveis de H2O2, foi utilizada para o cálculo daatividade enzimática de acordo com a definição anterior.

As reações que são ilustradas utilizando sorbitol podem ser des-critas da maneira a seguir:

sorbitol + O2 + -> glicose + H2O2 (1)

glicose + O2 + H2O ->· ácido glucônico + H2O2 (2)

H2O2 + 2ABTS (incolor) + 2 H+ 2 H2O + 2ABTS (azul/verde) (3)

A reação (1) é catalisada pela enzima (SOX).

A reação (2) é catalisada pela enzima (HOX ou GOX).

A reação (3) é catalisada pela enzima (POD).

Em relação à reação (2) GOOX e MnCO são também enzimascapazes de catalisar esta reação.

Para os ensaios Ίη situ' pode ser necessário diluir a matriz antesde realizar o ensaio, de forma que o efeito de substâncias interferentes quereagem de forma inespecífica com os componentes do ensaio fique pequenoo suficiente para ser omitido. Alternativamente, a composição de matriz podeser preparada excluindo a(s) substância(s) interferente(s).

EXEMPLO 8: Atividade relativa sobre xilitol e sorbitol

A finalidade era medir a diferença na atividade da sorbitol oxida-se sobre D-sorbitol e D-xilitol. O ensaio de ABTS foi utilizado como descritoanteriormente para medir a taxa de produção de H2O2 em que tanto o D-sorbitol quanto o D-xilitol estavam em excesso. A mesma quantidade de en-zima, que é preparada nos exemplos anteriores foi utilizada em ambos oscasos. A tabela abaixo mostra a atividade relativa sobre os dois substratos(fornecida em valores percentuais). A enzima utilizada era como a preparadanos Exemplos 3 & 4.

<table>table see original document page 72</column></row><table>

EXEMPLO 9. Sinergia entre as duas enzimas

As Três Enzimas Utilizadas Neste Exemplo eram:

1. Hexose oxidase: Hoxypure®, disponível na Danisco A/S.

2. A sorbitol oxidase de S. coelicolor (SC06147) foi obtida co-mo descrito nos exemplos 3-4 anteriores.

3. Glicose oxidase: Sigma G7141.

No exemplo abaixo, as quantidades de enzima são fornecidascomo quantidades unitárias.

Uma unidade de HOX é a quantidade de enzima que produziu1 μmol de H2O2Anin quando os substratos estavam em excesso.

Uma unidade de GOX é a quantidade de enzima que produziu1 μmol de H202/min quando os substratos estavam em excesso.

Uma unidade de SOX é a quantidade de enzima que produziu1 μmol de H2O2Zmin quando os substratos estavam em excesso.

Obervação. Nos exemplos abaixo, apenas a SOX terá substra-tos em excesso. O açúcar gerado será o fator Iimitante para a enzima se-cundária. Como citado acima a atividade é fornecida na forma de uma por-centagem do valor de SOX que catalisa D-sorbitol quando tanto o D-sorbitolquanto o oxigênio estão em excesso.

As velocidades iniciais foram medidas ao longo de 5 minutos emum ensaio de 300 μι. de ABTS (como descrito anteriormente). A produçãoda taxa de produção de peróxido de hidrogênio foi extrapolada partindo deuma curva padrão. A atividade medida, mostrada na Figura 3 e na Figura 4 éfornecida na forma de um valor percentual. 100% é definido como a taxa deprodução de peróxido de hidrogênio pela sorbitol oxidase isoladamente,quando os substratos D-sorbitol e oxigênio estão em excesso (Curvas develocidade linear).

EXEMPLO 10: COMPRIMIDO MASTIGÁVEL

A composição de enzima é preparada através da adição de 1unidade de SOX (como preparada nos Exemplos 1-4) e a hexose oxidase oua glicose oxidase é adicionada a 0,5, 5, 50, 500, 1000 e 1500 U por microli-tro de tampão fosfato de sódio a 100 mM, pH 6,7, sorbitol a 50 mM. A com-posição aquosa de enzima é utilizada para preparar um comprimido masti-gável. Um comprimido contendo a composição de enzima e composiçõespara goma são preparados utilizando ingredientes de base convencionaiscomo apresentado abaixo (os ingredientes listados em termos de % em pe-so).

Um comprimido contendo a composição de enzima e as compo-sições para goma são preparados utilizando os ingredientes de base comoapresentado abaixo (os ingredientes listados em termos de % em peso).

Composição de enzima 0,5% (fornecida como parte do componente deágua)

<table>table see original document page 74</column></row><table>

O comprimido mastigável é preparado através da fervura de I-somalte, Lycasin, água, gordura, mistura de mono e diglicerídeos, glicerina elecitina a 1310C após o que a glicerina é adicionada e a mistura é resfriada a30°C (HOX) ou a 60°C (GOX). Depois disso, o bicarbonato de sódio, a com-posição de enzima, o fosfato dicálcico e o restante dos ingredientes são adi-cionados. Depois disso, a mistura resfriada à temperatura ambiente (23°C)foi moída em pó e comprimida em um comprimido utilizando uma prensapara comprimidos.

Eficiência da Redução de Placa In Vivo

O comprimido mastigável é testado em relação à redução deplaca em 2 e em 5 horas após a mastigação por voluntários humanos utili-zando placa cultivada in vivo em um aparato de retenção intraoral sobre pla-cas de hidroxiapatita. A microscopia confocal é utilizada para visualizar equantificar as alterações na cobertura da placa e na ultraestrutura da placa.A remoção de placa também foi medida através de microscopia luminosaconvencional corando a placa antes e depois do tratamento com o indicadorcristal violeta e medindo as alterações na intensidade de cor. O Image ProAnalysis Software é utilizado para realizar a análise das imagens e as medi-ções quantitativas. A intensidade de cor foi medida e utilizada para determi-nar a remoção de manchas. Quanto maior a intensidade maior é a eficiênciade limpeza.

EXEMPLO 11: GOMA DE MASCAR

Os ingredientes a seguir podem ser combinados para prepararuma goma de mascar que compreende a composição da invenção:Base para goma 31,20%

Sorbitol 28,08%

xilitol 5,23%

Composição de enzima 1,00% (ver o exemplo anterior)

AcessuIfameK 0,16%

Aspartame 0,16%

Pó de mentol 1,00%

Aroma líquido 0,47%

Isomalte PF 11,70%

Isomalte DC 16,00%

Agentes antiformação de torta* 4,00%25 Aroma 2,00%

* Estearato de magnésio, talco, sílica-gel.EXEMPLO 12: TINTA À BASE DE ÁGUA

Os ingredientes a seguir podem ser combinados para prepararuma tinta à base de água que compreende a composição da invenção:Composição de enzima 0,5%

Sorbitol 0,5%

Pigmento 15%<table>table see original document page 76</column></row><table>

*podem incluir os seguintes dependendo do tipo de tinta: agente de disper-são, agente de suspensão, dispersante, desespumante, agente umectante,agente de coalescência, vários materiais de enchimento, tensoativo, cobioci-das, espessantes, coconservantes, látex.

EXEMPLO 13: TINTA À BASE DE ÓLEO

Os ingredientes a seguir podem ser combinados para prepararuma tinta à base de óleo que compreende a composição da invenção:

Composição de enzima 0,5%, dissolvida em 80% de sorbitol

<table>table see original document page 76</column></row><table>

*podem incluir os seguintes dependendo do tipo de tinta: agente de disper-são, agente de suspensão, dispersante, desespumante, agente umectante,agente de coalescência, materiais de enchimento, tensoativo, cobiocidas,espessantes, coconservantes, látex.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Danisco A/S

<120> COMPOSIÇÃO QUE COMPREENDE UM SISTEMA ENZIMÁTICO ACOPLADO

<130> 16318PCT00

<160> 13

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1

<211> 420

<212> PRT

<213> Streptomyces sp. H7775

<400> 1

Met Thr Pro Ala Glu Lys Asn Trp Ala Gly Asn Ile Thr Phe Gly Ala

1 5 10 15

Lys Arg Leu Cys Val Pro Arg Ser20

Ala Ala Ser Gly Ala Val Arg Pro35 40

Val Arg Glu Leu Arg Glu Thr Val25 30

Leu Gly Thr Arg His Ser Phe Asn45

Thr Val Ala Asp Thr Ser Gly Asp His Val Ser Leu Ala Gly Leu Pro50 55 60

Arg Val Val Asp Ile Asp Val Pro Gly Arg Ala Val Ser Leu Ser Ala65 70 75 80

Gly Leu Arg Phe Gly Glu Phe Ala Ala Glu Leu His Ala Arg Gly Leu85 90 95

Ala Leu Ala Asn Leu Gly Ser Leu Pro His Ile Ser Val Ala Gly Ala100 105 110

Val Ala Thr Gly Thr His Gly Ser Gly Val Gly Asn Arg Ser Leu Ala115 120 125

Gly Ala Val Arg Ala Leu Ser Leu Val Thr Ala Asp Gly Glu Thr Arg130 135 140

Thr Leu Arg Arg Thr Asp Glu Asp145 150

Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser165

Phe Glu Val Arg Gln Trp Val Tyr180

Ala Ala Arg Phe Asp Glu Val Met195 200

Phe Thr Asp Trp Arg Pro Gly Pro210 215

Phe Ala Gly Ala Val Val Ser Leu155 160

Leu Glu Leu Asp Leu Val Pro Ala170 175

Glu Asp Leu Pro Glu Ala Thr Leu185 190

Ser Ala Ala Tyr Ser Val Ser Val205

Val Gly Gln Val Trp Leu Lys Gln220

Arg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu225 230 235 240Gly Ala . Arg Leu . Ala 245 Asp Gly Pro Arg His 250 Pro Val Pro Gly Met 255 ProAla Gly Asn Cys 260 Thr Ala Gln Gln Gly Val 265 Pro Gly Pro Trp 270 His GluArg Leu Pro 275 His Phe Arg Met Glu 280 Phe Thr Pro Ser Asn 285 Gly Asp GluLeu Gln 290 Ser Glu Tyr Phe Val 295 Ala Arg Ala Asp Ala 300 Val Ala Ala TyrGlu 305 Ala Leu Ala Arg Leu 310 Arg Asp Arg Ile Ala 315 Pro Val Leu Gln Val 320Ser Glu Leu Arg Thr 325 Val Ala Ala Asp Asp 330 Leu Trp Leu Ser Pro 335 AlaHis Gly Arg Asp 340 Ser Val Ala Phe His 345 Phe Thr Trp Val Pro 350 Asp AlaAla Ala Val 355 Ala Pro Val Ala Gly Ala 360 Ile Glu Glu Ala 365 Leu Ala ProPhe Gly 370 Ala Arg Pro His Trp 375 Gly Lys Val Phe Ser 380 Thr Ala Pro GluVal 385 Leu Arg Thr Leu Tyr 390 Pro Arg Tyr Ala Asp 395 Phe Glu Glu Leu Val 400Gly Arg His Asp Pro 405 Glu Gly Thr Phe Arg 410 Asn Ala Phe Leu Asp 415 ArgTyr Phe Arg Arg 420 <210> <211> <212> <213> 2 418 PRT Streptomyces coelicolor <400> 2 Met 1 Gly Asp Ile Thr 5 Val Thr Asn Trp Ala 10 Gly Asn Ile Thr Tyr 15 ThrAla Lys Glu Leu 20 Leu Arg Pro His Ser 25 Leu Asp Ala Leu Arg 30 Ala LeuVal Ala Asp 35 Ser Ala Arg Val Arg 40 Val Leu Gly Ser Gly 45 His Ser PheAsn Glu 50 Ile Ala Glu Pro Gly Asp 55 Gly Gly Val Leu 60 Leu Ser Leu AlaGly 65 Leu Pro Ser Val Val 70 Asp Val Asp Thr Ala 75 Ala Arg Thr Val Arg 80Val Gly Gly Gly Val 85 Arg Tyr Ala Glu Leu 90 Ala Arg Val Val His 95 AlaArg Gly Leu Ala 100 Leu Pro Asn Met Ala 105 Ser Leu Pro His Ile 110 Ser ValAla Gly Ser 115 Val Ala Thr Gly Thr 120 His Gly Ser Gly Val 125 Gly Asn GlySer Leu Ala Ser Val Val Arg Glu Val Glu Leu Val Thr Ala Asp Gly130 135 140

Ser Thr Val Val Ile Ala Arg Gly Asp Glu Arg Phe Gly Gly Ala Val145 150 155 160

Thr Ser Leu Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ser Leu Thr Leu Asp Leu165 170 175

Glu Pro Ala Tyr Glu Met Glu Gln His Val Phe Thr Glu Leu Pro Leu180 185 190

Ala Gly Leu Asp Pro Ala Thr Phe Glu Thr Val Met Ala Ala Ala Tyr195 200 205

Ser Val Ser Leu Phe Thr Asp Trp Arg Ala Pro Gly Phe Arg Gln Val210 215 220

Trp Leu Lys Arg Arg Thr Asp Arg Pro Leu Asp Gly Phe Pro Tyr Ala225 230 235 240

Ala Pro Ala Ala Glu Lys Met His Pro Val Pro Gly Met Pro Ala Val245 250 255

Asn Cys Thr Glu Gln Phe Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu Arg Leu260 265 270

Pro His Phe Arg Ala Glu Phe Thr Pro Ser Ser Gly Ala Glu Leu Gln275 280 285

Ser Glu Tyr Leu Met Pro Arg Glu His Ala Leu Ala Ala Leu His Ala290 295 300

Met Asp Ala Ile Arg Glu Thr Leu Ala Pro Val Leu Gln Thr Cys Glu305 310 315 320

Ile Arg Thr Val Ala Ala Asp Ala Gln Trp Leu Ser Pro Ala Tyr Gly325 330 335

Arg Asp Thr Val Ala Ala His Phe Thr Trp Val Glu Asp Thr Ala Ala340 345 350

Val Leu Pro Val Val Arg Arg Leu Glu Glu Ala Leu Val Pro Phe Ala355 360 365

Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Thr Val Pro Ala Gly Glu Leu370 375 380

Arg Ala Leu Tyr Pro Arg Leu Ala Asp Phe Gly Ala Leu Ala Gly Ala385 390 395 400

Leu Asp Pro Ala Gly Lys Phe Thr Asn Ala Phe Val Arg Gly Val Leu405 410 415

Ala Gly

<210> 3

<211> 47

<212> PRT

<213> Streptomyces coelicolor

<4 00> 3

Met Thr Glu Val Ser Arg Arg Lys Leu Met Lys Gly Ala Ala Val Ser1 5 10 15Gly Gly Ala Leu 20 Ala Leu Pro Ala Leu 25 Gly Ala Pro Pro Ala 30 Thr AlaAla Pro Ala 35 Ala Gly Pro Glu Asp 40 Leu Pro Gly Pro Ala 45 Ala Ala <210> <211> <212> <213> 4 468 PRT Streptomyces sp . H7775 <400> 4 Met Gly 1 Thr Glu Val 5 Ser Arg Arg Lys Leu 10 Met Lys Gly Ala Ala Val 15 Ser Gly Gly Ala 20 Leu Ala Leu Pro Ala 25 Leu Gly Ala Pro Pro 30 Ala ThrAla Ala Pro 35 Ala Ala Gly Pro Glu 40 Asp Leu Pro Gly Pro 45 Ala Ala AlaMet Thr 50 Pro Ala Glu Lys Asn 55 Trp Ala Gly Asn Ile 60 Thr Phe Gly Ala Lys Arg 65 Leu Cys Val Pro 70 Arg Ser Val Arg Glu 75 Leu Arg Glu Thr Val 80Ala Ala Ser Gly Ala 85 Val Arg Pro Leu Gly 90 Thr Arg His Ser Phe 95 AsnThr Val Ala Asp 100 Thr Ser Gly Asp His 105 Val Ser Leu Ala Gly 110 Leu ProArg Val Val 115 Asp Ile Asp Val Pro 120 Gly Arg Ala Val Ser 125 Leu Ser AlaGly Leu 130 Arg Phe Gly Glu Phe 135 Ala Ala Glu Leu His 140 Ala Arg Gly LeuAla Leu 145 Ala Asn Leu Gly 150 Ser Leu Pro His Ile 155 Ser Val Ala Gly Ala 160 Val Ala Thr Gly Thr 165 His Gly Ser Gly Val 170 Gly Asn Arg Ser Leu 175 AlaGly Ala Val Arg 180 Ala Leu Ser Leu Val 185 Thr Ala Asp Gly Glu 190 Thr ArgThr Leu Arg 195 Arg Thr Asp Glu Asp 200 Phe Ala Gly Ala Val 205 Val Ser LeuGly Ala 210 Leu Gly Val Val Thr 215 Ser Leu Glu Leu Asp 220 Leu Val Pro AlaPhe Glu 225 Val Arg Gln Trp Val 230 Tyr Glu Asp Leu 235 Pro Glu Ala Thr Leu 240Ala Ala Arg Phe Asp 245 Glu Val Met Ser Ala 250 Ala Tyr Ser Val Ser 255 ValPhe Thr Asp Trp 260 Arg Pro Gly Pro Val 265 Gly Gln Val Trp Leu 270 Lys GlnArg Val Gly Asp Glu Gly Ala Arg Ser Val Met Pro Ala Glu Trp Leu

27 5 280 285Gly Ala Arg Leu Ala Asp Gly Pro Arg His Pro Val Pro Gly Met Pro290 295 300

Ala Gly Asn Cys Thr Ala Gln Gln Gly Val Pro Gly Pro Trp His Glu305 310 315 320

Arg Leu Pro His Phe Arg Met Glu Phe Thr Pro Ser Asn Gly Asp Glu325 330 335

Leu Gln Ser Glu Tyr Phe Val Ala Arg Ala Asp Ala Val Ala Ala Tyr340 345 350

Glu Ala Leu Ala Arg Leu Arg Asp Arg Ile Ala Pro Val Leu Gln Val355 360 365

Ser Glu Leu Arg Thr Val Ala Ala Asp Asp Leu Trp Leu Ser Pro Ala370 375 380

His Gly Arg Asp Ser Val Ala Phe His Phe Thr Trp Val Pro Asp Ala385 390 395 400

Ala Ala Val Ala Pro Val Ala Gly Ala Ile Glu Glu Ala Leu Ala Pro405 410 415

Phe Gly Ala Arg Pro His Trp Gly Lys Val Phe Ser Thr Ala Pro Glu420 425 430

Val Leu Arg Thr Leu Tyr Pro Arg Tyr Ala Asp Phe Glu Glu Leu Val435 440 445

Gly Arg His Asp Pro Glu Gly Thr Phe Arg Asn Ala Phe Leu Asp Arg450 455 460

Tyr Phe Arg Arg465

<210> 5

<211> 1415

<212> DNA

<213> Artificial

<223> Seqüência de nucleotídeos da fusão entre a seqüência-sinal e

SEQ ID N0 1.

<400> 5

ccatgggcac cgaggtctcc cgccgcaagc tgatgaaggg cgcggcggtg tcgggcggcg 60

cgctggcgct gccggccctc ggcgccccgc ccgccaccgc ggcgccggcc gccggccccg 120aggacctccc gggccccgcc gccgccatga ccccggccga gaagaactgg gccggcaaca 180tcaccttcgg cgccaagcgc ctgtgcgtcc cgcgctccgt ccgcgagctg cgcgagaccg 240tggccgcctc cggcgccgtg cgcccgctgg gcacccgcca ctcgttcaac accgtcgccg 300acacctccgg cgaccacgtg tcgctggccg gcctgccgcg cgtcgtcgac atcgacgtcc 360cgggccgggc cgtgtccctg tccgccggcc tgcgcttcgg cgagttcgcc gccgagctgc 420acgcccgcgg cctggccctg gccaacctgg gctccctgcc gcacatctcc gtggcgggcg 480cggtcgccac cggcacccac ggctccggcg tcggcaaccg ctccctggcg ggcgccgtcc 540gcgccctgtc cctggtcacc gccgacggcg agacccgcac cctgcgccgc accgacgagg 600acttcgccgg cgccgtcgtg tccctgggcg ccctgggcgt cgtcacctcc ctggagctgg 660acctggtccc ggccttcgag gtccgccagt gggtctacga ggacctgccc gaggccaccc 720tggccgcccg cttcgacgag gtcatgtccg ccgcctactc cgtgtccgtg ttcaccgact 780ggcgcccggg cccggtcggc caggtctggc tgaagcagcg cgtcggcgac gagggcgccc 840gctccgtcat gccggccgag tggctgggcg cccgcctggc cgacggcccg cgccacccgg 900tccccggcat gcccgccggc aactgcaccg cccagcaggg cgtcccgggc ccgtggcacg 960agcgcctgcc gcacttccgc atggagttca ccccgtccaa cggcgacgag ctgcagtccg 1020agtacttcgt cgcccgcgcg gacgccgtcg cggcctacga ggcgctggcc cgcctgcgcg 1080accgcatcgc cccggtcctg caggtctccg agctgcgcac cgtcgccgcc gacgacctgt 1140ggctgtcccc ggcccacggc cgcgactccg tcgccttcca cttcacctgg gtcccggacg 1200ccgccgccgt cgccccggtc gccggcgcca tcgaqgaggc cctggccccg ttcggcgccc 1260gcccgcactg gggcaaggtg ttctccaccg cccccgaggt cctgcgcacc ctgtacccgc 1320gctacgccga cttcgaggag ctggtcggcc gccacgaccc cgagggcacc ttccgcaacg 1380ccttcctcga ccgctacttc cgccgctgag gatcc 1415

<210> 6

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

<4 4 0> 6

gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg gg 52

<210> 7

<211> 52

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

caggaaacag ctatgac 17

<210> 8

<211> 1370

<212> DNA

<213> Seqüência de nucleotideos codificando a fusão entre a sequência-sinal

e SEQ ID N° 1 com sitios RE introduzidos

<400> 8

gcgctagccg gccccccggc acaggccatg accccggccg agaagaactg ggccggcaac 60

atcaccttcg gcgccaagcg cctgtgcgtc ccgcgctccg tccgcgagct gcgcgagacc 120

gtggccgcct ccggcgccgt gcgcccgctg ggcacccgcc actcgttcaa caccgtcgcc 180

gacacctccg gcgaccacgt gtcgctggcc ggcctgccgc gcgtcgtcga catcgacgtc 240

ccgggccggg ccgtgtccct gtccgccggc ctgcgcttcg gcgagttcgc cgccgagctg 300

cacgcccgcg gcctggccct ggccaacctg ggctccctgc cgcacatctc cgtggcgggc 360gcggtcgcca ccggcaccca cggctccggc gtcggcaacc gctccctggc gggcgccgtc 420

cgcgccctgt ccctggtcac cgccgacggc gagacccgca ccctgcgccg caccgacgag 480

gacttcgccg gcgccgtcgt gtccctgggc gccctgggcg tcgtcacctc cctggagctg 540

gacctggtcc cggccttcga ggtccgccag tgggtctacg aggacctgcc cgaggccacc 600

ctggccgccc gcttcgacga ggtcatgtcc gccgcctact ccgtgtccgt gttcaccgac 660

tggcgcccgg gcccggtcgg ccaggtctgg ctgaagcagc gcgtcggcga cgagggcgcc 720

cgctccgtca tgccggccga gtggctgggc gcccgcctgg ccgacggccc gcgccacccg 780

gtccccggca tgcccgccgg caactgcacc gcccagcagg gcgtcccggg cccgtggcac 840

gagcgcctgc cgcacttccg catggagttc accccgtcca acggcgacga gctgcagtcc 300

gagtacttcg tcgcccgcgc ggacgccgtc gcggcctacg aggcgctggc ccgcctgcgc 960

gaccgcatcg ccccggtcct gcaggtctcc gagctgcgca ccgtcgccgc cgacgacctg 1020

tggctgtccc cggcccacgg ccgcgactcc gtcgccttcc acttcacctg ggtcccggac 1080

gccgccgccg tcgccccggt cgccggcgcc atcgaggagg ccctggcccc gttcggcgcc 1140

cgcccgcact ggggcaaggt gttctccacc gcccccgagg tcctgcgcac cctgtacccg 1200

cgctacgccg acttcgagga gctggtcggc cgccacgacc ccgagggcac cttccgcaac 1260

gccttcctcg accgctactt ccgccgctga ggatccgagc tccagctttt gttcccttta 1320

gtgagggtta attgcgcgct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 1370

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

<400> 9

gcccatatga gcgacatcac ggtcacc 27

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

<400> 10

ggatcctcag cccgcgagca cccc 24

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

<400> 11

gccatgggcg acatcacggt caccaac

27<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador PCR

<400> 12

atggatcctc agcccgcgag cacccc

<210> 13

<211> 1268

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SOX de Streptomyces Iividans e Streptomyces coelicor com a adi-ção dos sítios de clonagem NCO1 na metionina inicial

<400> 13

gccatgggcg acatcacggt caccaactgg gccggcaaca tcacgtacac ggcgaaggaa 60ctgctgcggc cgcactccct ggacgcgctg cgggccctgg tggcggacag cgccagggtg 120cgggtgctgg gcagcgggca ctccttcaac gagatcgccg agccgggcga cgggggtgtc 180ctgctgtcgc tggcgggcct gccgtccgtg gtggacgtgg acacggcggc ccgtacggtg 240cgggtcggcg gcggtgtgcg gtacgcggag ctggcccggg tggtgcacgc gcggggcctg 300gcgctgccga acatggcctc gctgccgcac atctcggtcg ccgggtcggt ggccaccggc 360acccacggtt cgggggtggg caacggttcg ctggcctcgg tggtgcgcga ggtggagctg 420gtcaccgcgg acggttcgac cgtggtgatc gcgcggggcg acgagcggtt cggcggggcg 480gtgacctcgc tcggcgcgct gggcgtggtg acgtcgctca cactcgacct ggagccggcg 540tacgagatgg aacagcacgt cttcaccgag ctgccgctgg ccgggttgga cccggcgacg 600ttcgagacgg tgatggcggc ggcgtacagc gtgagtctgt tcaccgactg gcgggcgccc 660ggtttccggc aggtgtggct gaagcggcgc accgaccggc cgctggacgg tttcccgtac 720gcggccccgg ccgccgagaa gatgcatccg gtgccgggca tgcccgcggt gaactgcacg 780gagcagttcg gggtgccggg gccctggcac gagcggctgc cgcacttccg cgcggagttc 840acgcccagca gcggtgccga gttgcagtcg gagtacctga tgccccggga gcacgccctg 900gccgccctgc acgcgatgga cgcgatacgg gagacgctcg cgccggtgct ccagacctgc 960gagatccgca cggtcgccgc cgacgcgcag tggctgagcc cggcgtacgg gcgggacacc 1020gtggccgcgc acttcacctg ggtcgaggac acggcggcgg tgctgccggt ggtgcggcgg 1080ctggaggagg cgctcgtccc cttcgcggcc cgtccgcact gggggaaggt gttcaccgtc 1140ccggcgggcg agctgcgtgc gctgtacccg cggctggccg acttcggggc gctggccggg 1200gcgctggacc cggcggggaa gttcaccaac gcgttcgtgc gcggggtgct cgcgggctga 1260

ggatccat 1268

Claims (62)

1. Composição que compreende uma primeira oxidase, um pri-meiro substrato e pelo menos uma oxidorredutase adicional, em que o pri-meiro substrato é oxidável pela primeira oxidase para formar peróxido dehidrogênio e um segundo substrato; e o segundo substrato pode ser conver-tido por pelo menos uma oxidorredutase adicional para formar um produto;em que o segundo substrato é oxidável pela oxidorredutase adi-cional para formar peróxido de hidrogênio e o dito produto.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que o pri-meiro substrato é um poliol.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que opoliol é um pentitol ou um hexitol.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que opoliol é selecionado do grupo que consiste em hexitol, pentitol, sorbitol, xili-tol, maltitol, manitol, galactitol, isomalte, lactitol, arabitol, eritritol e ribitol.

5. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o poliolé xilitol.

6. Composição de acordo com a reivindicação 4, em que o poliolé sorbitol.

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o segundo substrato é um açúcar.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, em que o açú-car é um monossacarídeo ou um dissacarídeo.

9. Composição de acordo com a reivindicação 8, em que o açú-car é selecionado do grupo que consiste em glicose, xilose, maltose, mano-se, galactose, isomaltose, lactose, arabinose, eritrose e ribose.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, em que o a-çúcar é xilose ou glicose.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 10, em que a primeira oxidase é uma poliol oxidase.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, em que aprimeira oxidase é selecionada do grupo que consiste em hexitol oxidase,pentitol oxidase, sorbitol oxidase, xilitol oxidase, maltitol oxidase, manitol o-xidase, galactitol oxidase, isomalte oxidase, Iactitol oxidase, arabitol oxidase,eritritol oxidase e ribitol oxidase.

13. Composição de acordo com a reivindicação 11 ou 12, emque a primeira oxidase possui uma atividade de poliol oxidase (específica)de pelo menos 5 unidades/g de proteína quando se utiliza o respectivo subs-trato de poliol.

14. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 13, em que a poliol oxidase é sorbitol oxidase ou xilitol oxidase.

15. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 14, em que a poliol oxidase possui uma taxa de atividade específi-ca sobre o respectivo poliol no açúcar correspondente maior que 1.

16. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 15, em que a poliol oxidase possui uma taxa de atividade específi-ca sobre o respectivo poliol em glicose maior que 1.

17. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 16, em que a poliol oxidase possui uma atividade específica maiorsobre o sorbitol quando comparada com aquela sobre o xilitol.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 17, em que a poliol oxidase é derivada de uma cepa de Strep-tomyces ou Xanthomonas.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 18, em que a primeira oxidase compreende uma seqüência de poli-peptídeo SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 2 ou um homólogo, uma variante ouum fragmento da mesma.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, em que aprimeira oxidase consiste em uma seqüência de polipeptídeo SEQ ID NO: 1ou SEQ ID NO: 19.

21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 11 a 20, em que o nível de atividade da primeira oxidase presente nacomposição (ou adicionada à composição) fica entre aproximadamente 0,1 eaproximadamente 200.000 unidades por kg da dita composição.

22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 21, em que a oxidorredutase adicional é uma açúcar oxidase.

23. Composição de acordo com a reivindicação 22, em que aaçúcar-oxidase é selecionada do grupo que consiste em: carboidrato oxida-se, oligossacarídeo oxidase, maltose oxidase, hexose oxidase, glicose oxi-dase, manose oxidase, galactose oxidase, isolmaltulose oxidase, Iactoseoxidase, arabinose oxidase, eritrose oxidase, pentose oxidase, xilose oxida-se e triose oxidase.

24. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 22 ou 23, em que a açúcar-oxidase é selecionada do grupo que consis-te em: EC 1.1.3.4 glicose oxidase, EC 1.1.3.5 hexose oxidase, EC 1.1.3.9galactose oxidase, EC 1.1.3.10 piranose oxidase, EC 1.1.3.11 L-sorboseoxidase e EC 1.1.3.40 D-manitol oxidase.

25. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 24, em que a quantidade de pelo menos uma oxidorredutase adi-cional comparada à quantidade da primeira oxidase tal como a poliol oxidasepresente na dita composição é maior que 1, como medida pelo número res-pectivo de unidades de enzima presentes na dita composição.

26. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 25, em que a presença do produto obtido partindo do segundosubstrato não reduz a taxa de produção de peróxido de hidrogênio a partirda oxidação do primeiro substrato pela primeira oxidase.

27. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 26, em que o produto obtido partindo do segundo substrato é umalactona, uma dialdose ou um desidro açúcar.

28. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 27, em que a composição é comestível, preferencialmente umacomposição alimentícia.

29. Composição de acordo com qualquer uma das reivindica-ções 1 a 28 para uso como um medicamento.

30. Produto para cuidado oral que compreende uma composiçãocomo definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 29 e pelo menos umingrediente adicional utilizado nos produtos para cuidado oral.

31. Produto para cuidado oral de acordo com a reivindicação 30,em que o produto para cuidado oral está na forma selecionada do grupo queconsiste em: goma de mascar, um líquido para limpeza bucal, um spray bu-cal, um trocisco, uma pastilha, um produto refrescante bucal, um spray nasale uma pasta oral.

32. Produto para cuidado oral de acordo com a reivindicação 30ou 31, que compreende xilitol e/ou sorbitol.

33. Produto cosmético que compreende a composição como de-tinido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28 e pelo menos um ingredi-ente adicional utilizado nos produtos cosméticos.

34. Produto para alvejamento da pele, dos pelos ou dos dentesque compreende a composição como definido em qualquer uma das reivindi-cações 1 a 28 e pelo menos um ingrediente adicional utilizado nos produtospara alvejamento e/ou branqueamento da pele, dos cabelos ou dos dentes.

35. Processo cosmético para alvejar e/ou branquear tecido ex-terno de mamífero, que compreende o contato do tecido externo de mamífe-ro com uma composição como definido em qualquer uma das reivindicações-1 a 28 ou um produto como definido em qualquer uma das reivindicações 30a 34 em uma quantidade e uma duração adequadas para alvejar e/ou bran-quear o tecido externo de mamífero.

36. Processo cosmético de acordo com a reivindicação 35, emque o tecido externo de mamífero é selecionado do grupo que consiste emdentes, cabelos e pele.

37. Detergente ou produto alvejante, adequado para uso em te-cido que não é vivo, que compreende a composição como definido em qual-quer uma das reivindicações 1 a 28 e pelo menos um ingrediente adicionalutilizado em detergente ou produtos alvejantes.

38. Produto de tinta, tal como uma tinta marítima, decorativa ouprotetora, que compreende a composição como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 28 e pelo menos um ingrediente adicional utilizadoem tinta.

39. Pesticida que compreende a composição como definido emqualquer uma das reivindicações 1 a 28 e pelo menos um ingrediente adi-cional utilizado em pesticidas.

40. Alimento humano ou animal que compreende a composição como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28.

41. Uso de uma composição como definido em qualquer umadas reivindicações 1 a 28 ou de um produto para cuidado oral de acordocom qualquer uma das reivindicações 30 a 32, para a produção de peróxidode hidrogênio.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito usoocorre em um produto para cuidado oral para fornecer efeitos de alvejamen-to e/ou branqueamento dos dentes e/ou vida útil estendida e/ou efeitos anti-microbianos/antibacterianos antes ou durante o uso.

43. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito uso ocorre em um produto comestível para fornecer efeitos pré-bióticos benéfi-cos quando consumido por um indivíduo mamífero e/ou uma vida útil prolon-gada.

44. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito usoocorre em um produto cosmético para fornecer uma vida útil prolongada e/oué capaz de alvejar e/ou branquear tecido externo de mamífero e/ou possuium efeito antimicrobiano/antibacteriano quando aplicado na pele humana.

45. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito usoocorre em um detergente para aumentar as capacidades alvejantes, alvejan-teas ou desinfetantes do detergente quando utilizado em um material quenão é vivo.

46. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito usoocorre em um produto de tinta que exibe melhor conservação antes ou apósa aplicação.

47. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito uso ocorre em um produto pesticida que exibe maior capacidade de prevenir,reduzir ou matar pragas microbianas.

48. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que o dito usoocorre em um produto alimentício, tal como produtos laticínios, tais como 1 leite, creme, queijo, soro de leite, iogurte, manteiga ou ovo, tal como gemade ovo ou clara de ovo.

49. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que a composi-ção é utilizada para a desinfecção geral de alimento humano ou animal ouambientes de alimentos humanos ou animais, tais como a lavagem de frutase vegetais ou a lavagem e a desinfecção de carcaças de animais e produtosalimentícios derivados das mesmas.

50. Processo para a preparação de uma composição como defi-nido em qualquer uma das reivindicações anteriores, que compreende a mis-tura de uma primeira oxidase como definida em qualquer uma das reivindi-cações anteriores e um primeiro substrato como definido em qualquer umadas reivindicações anteriores e pelo menos uma oxidorredutase adicionalcomo definido em qualquer uma das reivindicações anteriores e uma matrizadequada.

51. Processo de acordo com a reivindicação 50, em que a matrixé comestível.

52. Processo de acordo com a reivindicação 50 ou 51, em que acomposição é selecionada do grupo que consiste em um medicamento, umproduto para cuidado oral e uma bebida.

53. Processo de acordo com a reivindicação 50 ou 51, em que acomposição é um produto alimentício, tal como produtos laticínios, tais comoleite, creme, queijo, soro de leite, iogurte, manteiga ou ovo, tal como gemade ovo e clara de ovo.

54. Processo de acordo com a reivindicação 50, em que a matrizé um ingrediente ou um produto detergente ou alvejante.

55. Processo de acordo com a reivindicação 50, em que a matrizé uma tinta, tal como uma tinta marítima ou decorativa.

56. Processo de acordo com a reivindicação 50, em que a matrizé uma matriz pesticida.

57. Uso de uma composição como definida nas reivindicações 1a 28, na produção de um medicamento para o tratamento ou para a preven-ção de um distúrbio médico selecionado dentre: doença gengival, gengivite,síndrome do intestino irritável, intolerância à lactose, câncer de cólon, altoteor de colesterol no sangue, alta pressão sangüínea, hipertensão, infecção,inflamação e deficiências nutricionais.

58. Produto embalado que compreende a composição como de-finido em qualquer uma das reivindicações 1 a 28, em que a dita composiçãoé mantida em um ambiente com oxigênio limitado dentro do dito produtoembalado de forma a prevenir ou reduzir a produção de peróxido de hidro-gênio dentro do dito produto embalado.

59. Kit de partes que compreende os componentes a seguir:primeira enzima, pelo menos uma enzima adicional e um primeiro substrato,em que a primeira enzima e o primeiro substrato estão isolados um do outro,em que o primeiro substrato é oxidável pela primeira oxidase para formarperóxido de hidrogênio e um segundo substrato; e o segundo substrato podeser convertido por pelo menos uma oxidorredutase adicional para formar umproduto; em que o segundo substrato é oxidável pela oxidorredutase adicio-nal para formar peróxido de hidrogênio e o dito produto.

60. Processo de produção de peróxido de hidrogênio, o proces-so compreendendo a mistura de uma primeira oxidase e um primeiro subs-trato e pelo menos uma oxidorredutase adicional e uma matriz adequada,sob condições adequadas para a produção tanto de peróxido de hidrogênioquanto de um segundo substrato a partir da oxidação do primeiro substratodevido à atividade da primeira oxidase, em que o segundo substrato podeser convertido por pelo menos uma oxidorredutase adicional em peróxido dehidrogênio adicional e o produto.

61. Processo de acordo com a reivindicação 60, em que a etapade mistura compreende a mistura dos componentes do kit de partes comodefinido na reivindicação 59.

62. Processo de acordo com a reivindicação 60 ou 61, em que odito processo compreende a exposição da composição contida dentro doproduto embalado como definido na reivindicação 57 a um fornecimento exó-geno de oxigênio.