JP2000514289A

JP2000514289A - デキストラナーゼ活性を有する組換え酵素

Info

Publication number: JP2000514289A
Application number: JP10503764A
Authority: JP
Inventors: クリステンセン，トベ; クラウス，クローネフュグルサン; ハルカー，トーベン; ヨハンセン，シャルロッテ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-06-28
Filing date: 1997-06-30
Publication date: 2000-10-31
Also published as: CN1226283A; EP0910627A1; CA2258292A1; AU719536B2; AU3254597A; WO1998000529A1; US6156553A

Abstract

(57)【要約】本発明は、デキストラナーゼ活性を有する酵素をコードするクローン化されたDNA配列、該DNA配列を含む組換え発現ベクター、糸状菌宿主細胞、前記組換えデキストラナーゼを生産するための方法、並びに単離かつ精製された酵素に関する。本発明は、前記組換え酵素を含む組成物、オーラル・ケア組成物及び製品並びに歯垢の除去のための使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】デキストラナーゼ活性を有する組換え酵素発明の分野本発明は、デキストラナーゼ活性を有する酵素をコードするクローン化された DNA配列、該DNA配列を含む組換え発現ベクター、糸状菌宿主細胞、前記組換えデキストラナーゼを生産するための方法、並びに単離されかつ精製された酵素に関する。本発明は、組換え酵素を含む組成物、オーラルケア組成物並びに歯垢を除去するための製品及びその使用にも関する。発明の分野デキストラナーゼは、デキストラン中のα−１，６−グリコシド結合を分解する１，６−α−Ｄ−グルカン６−グルカノヒドロラーゼとしても知られるα−１，６−グルカナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．11）である。デキストラナーゼは、齲蝕、歯垢及び／又は歯石を防止するため並びに生の糖汁又はシュガーコーン及びテンサイのシロップの加水分解のための歯みがきの成分としての使用を含むいくつかの適用のために役立つことが知られている。いくつかの微生物、とりわけ、ペニシリウム(Penicillium)、パエシロマイセス（Paecilomyces）、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム（Fusarium）、スピカリア（Spicaria）、ベルチシリウム（Verticillium）、ヘルミントスポリウム（Helminthosporium）及びカエトミウム（Chaetomium）属の真菌；ラクトバチルス(Lactobacillus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、セルビブリオ（Cellvibrio）、サイトファガ(Cytophaga)、ブレビバクテリウム（Brevibact erium ）、シュードモナス(Pseudomonas)、コリネバクテリウム(Corynebacterium )、アルトロバクター（Arthrobacter）及びフラボバクテリウム（Flavobacteriu m ）属の細菌、並びにイースト、例えばリポマイセス・スタルケイ（Lipomyces s tarkeyi ）はデキストラナーゼを生産することができると知られている。生の糖汁を分解するための工業的酵素として販売される市販のデキストラナーゼは、パエシロマイセス種の株の発酵により生産されるNovo NordiskからのDext ranase 50Ｌである。デキストラナーゼ及びその適用に関する先行技術分献を以下に要約する。先行技術文献 EP 663 443（Centro de Ingenieria Genetica y Biotechnologia）は、ペニシリウム・ミニオルテウム（Penicillium minioluteum）由来のデキストラナーゼを記載する。そのデキストラナーゼは、イーストピキア・パストリス(Pichia pa storis )において異種的に発現させることができる。該組換え酵素は、55℃〜60 ℃の範囲の至適温度、13〜15％のＮ−グリコシル化率及び50℃で約7.6時間の半減期を有する。図面の簡単な記載図１は、プラスミドpCaHj483を示す。図２は、プラスミドpToC343を示す。図３は、プラスミドpToC325を示す。図４は、組換え及び野性型パエシロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces lil acinus ）デキストラナーゼのpHプロフィールを示す。図５は、組換え及び野性型パエシロマイセス・リラシヌスデキストラナーゼの温度プロフィールを示す。図６は、組換え及び野性型パエシロマイセス・リラシヌスデキストラナーゼの温度安定性を示す。図７は、37℃でのBHI中のＳ．ムタンス(S ．mutans)、Ａ．ビスコスス(A ．visc osus )及びＦ．ヌクレアトゥム（F ．nucleatum）の混合培養物についての間接的マルサス標準曲線を示す。図８は、発現プラスミドpJW111を示す。SP387プロモーター及びターミネーターが標識される。制限酵素部位及びそのプラスミド内でのそれらの相対的位置が示される。棒、β−ラクタマーゼ（ampR）及びデキストラナーゼ遺伝子は、転写の方向を示す矢印により表される。発明の概要本発明の目的は、糸状菌宿主細胞における異種生産によるパエシロマイセス・リラシヌスからの組換えデキストラナーゼを供することである。本発明者らは、最初に、パエシロマイセス・リラシヌスからデキストラナーゼ活性を有する酵素をコードする完全なDNA配列をクローン化し、それを、糸状菌宿主細胞において異種的に生産させた。前記酵素は、以前には、パエシロマイセス・リラシヌスにおいて同種的に生産されるだけであった。結果として、先行技術によれば、前記デキストラナーゼ活性を有する酵素を含む酵素産物は、他の酵素活性の混合物と一緒に生産される。適切な宿主内で組換えデキストラナーゼを異種的に作り出すことができることは、単一成分デキストラナーゼを供することが可能であるので、有利である。更に、それは、工業規模で本発明の単離されかつ精製された酵素を供することは容易にする。本発明の文脈において、用語“異種的”生産とは、もとのドナー生物と異なる宿主生物における組換え酵素の発現を意味する。用語“同種的”生産とは、もとの生物による野生型酵素の発現を意味する。プラスミドpToc325中に含まれる本発明のデキストラナーゼをコードする酵素番号：１に示される完全なDNA配列を、細菌株大腸菌DH５αに形質転換した。その株はDSM 10706の番号でDSMに寄託される。これは、以下に詳細に記載されよう。データベースアラインメントサーチにより、配列番号：１に示されるDNA配列が新規であることが見い出された。見い出された最高い相同性は、Mycotheque d e I'Universite’Catholique de Lovvain(MUCL)にブダペスト条約の規定により1 994年８月22日に寄託された上述のペニシリウム・ミニオルテウム（MUCL no．38 929）との59％であった。DNA及びアミノ酸配列は、EPO 663 443に開示される。第１の態様において、本発明は、デキストラナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構成物であって、該DNA配列が、ａ）配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列の部分をコードするデキストラナーゼ、又はｂ）ｉ）配列番号：１に記載されるDNA配列及び／又は大腸菌DSM10706から得ることができるDNA配列と少くとも80％の相同性を有するか、又は ii）配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか、又は iii）配列番号：１に記載のDNA配列を含むDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706 から得ることができるDNA配列を含むDNA配列によりコードされるポリペプチドと 80％の相同性を有するポリペプチドをコードするか、又は iv）パエシロマイセス・リラシヌス由来の配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列によりコードされる精製されたデキストラナーゼに対して生じた抗体と免疫学的反応性を有するポリペプチドをコードする、ａ）に規定されるDNA配列のアナログを含むことを特徴とするDNA構成物に関する。本文脈において、配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列の“アナログ”は、前記特性ｉ）〜iv）のうちの少くとも１つを有するデキストラナーゼ活性を示す酵素をコードするいずれかのDN A配列を示す。アナログDNA配列は、 − 配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列の部分的配列に基づいて、デキストラナーゼ活性を示す酵素を生産する他の又は関連する（例えば同じ）生物から、例えば本明細書に記載される手順を用いて単離することができ、これにより、例えば本明細書に示されるDNA 配列の対立遺伝子又は種変異体であり得、 − 配列番号：１に示されるDNA配列のいずれかの部分的DNA配列に基づいて、例えばそのDNA配列によりコードされるデキストラナーゼの他のアミノ酸配列を生じさせないが、その酵素の生産のための宿主生物のコドン用法に対応するヌクレオチド置換の導入により、又は異なるアミノ酸配列を生じさせることができるヌクレオチド置換の導入により、作製することができる。しかしながら、後者の場合、アミノ酸変換は、好ましくは、そのポリペプチドのホールディング又は活性に大きな影響を与えない保存性のアミノ酸置換、少しの欠失、典型的には１〜約30アミノ酸のもの；少しのアミノ-もしくはカルボキシル末端伸長、約20〜2 5残基までの小さなリンカーペプチド、又は精製を容易にする小さな伸長例えばポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープもしくは結合ドメインである小さな性質のものである。一般には、Fordら（1991）(Protein Expression and Purifi cation 2，95〜107)を参照のこと。保存性の置換の例は、塩基性アミノ酸（例えばアルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えばグルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えばロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えばフェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、及び小さなアミノ酸（例えばグリシン、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン）の群の中である。これらの置換は、分子の機能に重要な領域以外で行うことができ、なお活性な酵素を作り出すことは当業者に明らかであろう。本発明のDNA構成物によりコードされるポリヌクレオチドの活性に本質的なアミノ酸、及びそれゆえ好ましくは置換されないアミノ酸は、当該技術で周知の手順、例えば部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発（Cunningham及びWells，(1989)，Science 244 ，1081〜1085）に従って同定することができる。後者の技術において、変異は分子中の各々の残基において導入され、そして生じた変異分子は、その分子の活性に重要でないアミノ酸残基を同定するために生物学的（即ちデキストラナーゼ）活性）についてテストされる。基質−酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学又はオートアフィニティーラベリングのような技術により決定される結晶構造の分析によっても決定することができる。例えばde Vosら（1992）（Science 25 5，306〜312；Smithら、（1992）(J．Mol．Biol.224，899〜904)；Wlodaverら（ 1992）(FEBS Lett.，309，59〜64)を参照のこと。配列番号：１に示されるDNA配列及び／又は寄託された株大腸菌DSM 10706に形質転換されたDNA配列の部分をコードするタンパク質内のいずれかの部分的DNA配列を、本発明の組換えデキストラナーゼをコードする全体のDNA配列を単離するために用いることができることが理解されるであろう。（配列番号：１に示されるDNA配列から予想される）アミノ酸配列を配列番号：２に示す。先のｉ）に言及される相同性は、第２の配列からの第１の配列の派生を示す２つの配列間の同一性の程度として決定される。相同性は、適切には、GCGプログラムパッケージ(Needleman，S．B.及びWunsch，C．D.，(1970)，Jowrnal of Mol ecular Biology，48，p.443〜453)に供されるGAPのような当該技術で周知のコンピュータープログラムにより決定することができる。DNA配列比較のための次の設定：5.0のGAPクリエーションペナルティー及び0.3のGAPエクステンションペナルティーでGAP（Version8）を用いて、DNA配列のコーディング領域は、配列番号：１に示されるDNA配列のコーディング領域又は大腸菌DSM 10706内のプラスミドから得ることができるDNA配列のコーディング領域と、好ましくは少くとも80％、例えば少くとも90％、好ましくは少くとも95％、特に少くとも99％の同一性の程度を示す。先のii）に言及されるハイブリダイゼーションは、類似するDNA配列が、後の材料及び方法セクションに詳細に記載される特定の条件下でデキストラナーゼをコードするDNA配列と同じプローブにハイブリダイズすることを示す。通常、類似するDNA配列は、そのDNA配列に対して高い相同性を有し、例えば配列番号：１に示されるDNA配列又は本発明のデキストラナーゼをコードする大腸菌DSM 10706中のプラスミドから得ることができるDNA配列に対して少くとも80％の相同性を有し、例えば少くとも90％、好ましくは95％、例えば少くとも99％の相同性を、配列番号：１に示される前記DNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706中のプラスミドから得ることができるDNA配列に対する相同性を有する。先のiii）に言及される相同性は、第２の配列からの第１の配列の派生を示す２つの配列間の同一性の程度として決定される。相同性は、適切には、GCGプログラムパッケージ(Needleman，S．B.及びWunsch，C．D.，(1970)，Jowrnal of M olecular Biology，48，p.443〜453)に供されるGAPのような当該技術で周知のコンピュータープログラムにより決定することができる。DNA配列比較のための次の設定：5.0のGAPクリエーションペナルティー及び0.3のGAPエクステンションペナルティーでGAPを用いて、DNA配列のコーディング領域は、配列番号：１に示されるDNA配列のコーディング領域又は大腸菌DSM 10706内のプラスミドから得ることができるDNA配列のコーディング領域と、好ましくは少くとも80％、例えば少くとも90％、好ましくは少くとも95％、特に少くとも99％の同一性の程度を示す。先の特性iv）との関連における用語“由来”とは、DSM 10706の株により生産されるデキストラナーゼを示すばかりでなく、株DSM 10706から単離されたDNA配列によりコードされるデキストラナーゼ及び前記DNA配列で形質転換された宿主生物内で生産されたデキストラナーゼも示す。免疫反応性は、以下の“材料及び方法”セクション内に記載される方法により決定することができる。更なる態様において、本発明は、本発明のDNA構成物を有する発現ベクター、該DNA構成物又は発現ベクターを含む細胞並びにデキストラナーゼ活性を示す酵素を生産する方法であって、前記酵素の生産を許容する条件下で前記細胞を培養し、そしてその培養物から前記酵素を回収することを含む方法に関する。本発明の目的は、本発明の組換えデキストラナーゼが富化された酵素調製物を供することでもある。更に、本発明は、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、抗微生物酵素、及びそれらの混合物の群から選択される酵素活性を示す酵素を更に含むオーラルケア組成物を供する。最後に、本発明は、本発明の組換えデキストラナーゼの使用に関する。本発明の酵素又は該酵素を含む本発明の組成物は、齲蝕、歯垢及び／又は歯石を防ぐために用いることができる。発明の詳細な記載クローニング本発明のデキストラナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列は、便利には、本明細書に開示されるDNA配列に基づいて調製された合成オリゴヌクレオチドプローブの使用により、適切なソース、例えば以下に言及される生物のいずれかからのDNAから単離することができる。例えば、適切なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号：１に示されるヌクレオチド配列及び／又は大腸菌DSM 10706内のプラスミドから得ることができるヌクレオチド配列、又は配列番号：２に示されるアミノ酸配列もしくはそのいずれかの適切なサブ配列に基づいて調製することができる。この方法によれば、配列番号：２の一部であるこれらのペプチドをコードすることができるプライマーがデザインされる。次に、クローンされるべき遺伝子のフラグメントはこれらのプライマーの使用によりPCR増幅される。これらのフラグメントは完全な遺伝子をクローン化するためのプローブとして用いられる。スクリーニング法のより詳細な記載は以下の実施例１及び２に供される。あるいは、デキストラナーゼ活性を示す酵素をコードする本発明のDNA配列は、 − 適切なベクター内で、パエシロマイセス・リラシヌスからのDNAライブラリーをクローン化し、 − 前記ベクターで、適切な宿主細胞を形質転換し、 − 前記DNAライブラリー内でクローンによりコードされた関心の酵素のいずれかを発現するための適切な条件下で前記宿主細胞を培養し、 − これらのクローンにより生産される酵素のいずれかのデキストラナーゼ活性を決定することにより、陽性クローンについてスクリーニングし、そして − これらのクローンから酵素をコードするDNAを単離することを含む一般的方法により単離することができる。その一般的方法は、その内容が引用により本明細書に組み込まれるWO93/11249 に更に開示される。本発明の組換えデキストラナーゼをコードするDNA配列は、例えば、ドナー生物のcDNAライブラリーをスクリーニングし、そして適切な酵素活性（即ちその酵素がAZCL−Dextranを加水分解する能力により規定されるデキストラナーゼ活性）を発現するクローンについて選択することにより単離することができる。次にその適切なDNA配列は、標準的な手順によりそのクローンから単離することができる。デキストラナーゼ配列の寄託本発明のデキストラナーゼをコードするパエシロマイセス・リラシヌスの株から得られた完全な全長のDNA配列を、プラスミドpUC19内に含まれる細菌大腸菌DH ５αの株に形質転換した。該バクテリアは、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、Deutshe Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH．(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig Federa l Republic of Germany)（DSM）に、本発明者らにより寄託された。寄託日： 1996年６月７日寄託者の番号：NN49245＝TOC 1065 DSM名：大腸菌DSM番号10706 ブダペスト条約下の国際寄託機関であるDeutshe Sammlung von Mikroorganism en und Zellkulturen GmbH．は、前記条約の規則及び規定、特に規則９に従って、前記寄託の永続性を許容する。その寄託へのアクセスは、37 C.F.R．Par．1.1 4及び35 U.S.C．Par．122下で合衆国特許庁及び商標庁の長官により決定された者に、この特許出願の係属中、利用できるであろう。また、上述の寄託はEPC規則28に従う微生物に関する欧州特許出願の要求を満足する。上述の寄託は単離されたバクテリアの実質的に純粋な培養物を供する。その寄託は、対象の出願の副本又はその子が出願された国の外国特許法により必要に応じて利用できる。しかしながら、その寄託された株の利用性は、政府により付与された特許権の低下において本発明を実施するための許可を構成しないことが理解されるはずである。デキストラナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列は、例えば、標準的な方法により、上述の寄託された株から単離することができる。微生物源相同な酵素、即ち類似するDNA配列をコードするDNA配列が他の微生物、例えば以下の糸状菌、イースト又はバクテリアから得ることができることが予想される。例えば、そのDNA配列は、パエシロマイセスの株、例えばパエシロマイセス・リラシヌス、又はペニシリウムの株、例えばペニシリウム・リラシヌム(Penicil lium lilacinum )もしくはペニシリウム・ミニオルテウム(Penicillium miniolut emu )、アスペルギルス(Aspergillus)、フサリウム（Fusarium）、スピカリア（S picaria ）、ペルチシリウム（Verticillium）、ヘルミントスポリウム（Helmint hosporium ）もしくはカエトミウム（Chaetomium）；ラクトバチルス(Lactobacil lus )、ストレプトコッカス(Streptococcus)、セルビブリオ(Cellvibrio)、サイトファガ(Cytophaga)、ブレビバクテリウム（Brevibacterium）、シュードモナス(Pseudomonas)、コリネバクテリウム(Corynebacterium)、アルトロバクター（Arthrobacter ）及びフラボバクテリウム（Flavobacterium）；イースト、例えばリポマイセス・スタルケイ（Lipomyces starkeyi）由来のものであり得る。デキストラナーゼの生産デキストラナーゼをコードするDNA配列は、実質的に、組換え発現ベクターに挿入することができる。これは、便利には組換えDNA手順にかけることができるいずれかのベクターであり得、そしてベクターの選択は、しばしば、それが導入されるべき宿主細胞によるであろう。これにより、ベクターは、自己複製ベクター、即ち染色体外存在物として存在し、その複製が染色体の複製と独立しているベクター、例えばプラスミドであり得る。あるいは、ベクターは、宿主細胞内に導入した時に宿主細胞ゲノム内に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであり得る。ベクターにおいて、デキストラナーゼをコードするDNA配列は、適切なプロモーター及びターミネーター配列に作用可能に連続されるべきである。プロモーターは、選択された宿主細胞内で転写活性を示すいずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して同種又は異種のいずれかであるタンパク質をコードする遺伝子由来であり得る。デキストラナーゼをコードするDNA配列、プロモーター及びターミネーターを各々連結するため、及びそれらを適切なベクターに挿入するために用いられる手順は当業者に公知である（例えば、Sambrookら（1989）、Mo lecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)。デキストラナーゼをコードするDNA配列で形質転換される宿主細胞は、好ましくは糸状菌である。特に、その細胞は、アスペルギルス(Aspergillus)の種、最も好ましくはアスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）もしくはアスペルギルス・ニゲル(Aspergillus niger)、又はフサリウム（Fusarium）の株、例えばフサリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporium)、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）（完全状態においてGibberella zeae、以前にはSphaeria zeae、異名はGibberella roseum及びGibberella rosem f ．sp．ce realis ）の株、もしくはフサリウム・スルフレウム（Fusariumsulphureum）(完全状態においてGibberella puricaris、異名はFusarium trichothecioides，Fus arium bactridioides ，Fusarium sambucium，Fusarium roseum、及びFusarium roseum var．graminearum )、フサリウム・セレアリス（Fusariumcerealis）( 異名はFusarium crokkwellnse)、もしくはフサリウム・ベネナトゥム（Fusarium venenatum ）の株に属し得る。宿主細胞は、有利には、（Novo Nordisk A/Sからの）WO96/00787に記載されるＦ．グラミネアルム（F ．graminearum）、例えばフサリウム・グラミネアルムAT CC20 334として寄託された株であり得る。その株ATCC20 334は、以前に、フサリウム・グラミネアルムとして誤って分類された(Yoder，W．及びChristianson，L ．1997)。RAPDベースの及び伝統的な分類学的分析は、現在、Quorn真菌、ATCC20 334の本当の同定がフサリウムベネナトゥム（Fusarium venenatum）Nirenburg株、novであることを示した。以下の実施例において、デキストラナーゼの発現は、宿主細胞としてＡ．オリザエ及びＦ．ベネナトゥムを用いて示される。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞はプロテアーゼマィナス株のプロテアーゼ欠損である。これは、例えば、欠失された“alp”と呼ばれるアルカリプロテアーゼ遺伝子を有するプロテアーゼ欠損株アスペルギルス・オリザエ JaL 125であり得る。この株は、（Novo Nordisk A/Sからの）PCT/DK97/00135に記載される。糸状菌細胞は、プロトプラスト形成及び該プロトプラストの形質転換、次の細胞壁の再生により、それ自体周知の方法で形質転換することができる。宿主微生物としてのアスペルギルスの使用は、その内容が引用により本明細書に組み込まれるEP 238 023（Novo Nordisk A/S）に記載される。本発明の酵素を生産する方法なお更なる態様において、本発明は、本発明による酵素を生産する方法であって、前記酵素をコードするDNA配列で形質転換された適切な宿主細胞を、該酵素の生産を許容する条件下で培養し、そしてその培養物から生じた酵素を回収することを特徴とする方法に関する。形質転換された宿主細胞を培養するのに用いる培地は、問題の宿主細胞を増殖させるのに適したいずれかの慣用的な培地であり得る。その発現されたデキストラナーゼは、便利には、培養培地中に分泌され得る、そして遠心又はろ過によりその培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩によりその培地のタンパク質含有成分を沈殿させ、次にイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等のようなクロマトグラフィー手順を行うことを含む公知の手順によりそこから回収することができる。酵素本発明は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列又はそのフラグメントを本質的に有するデキストラナーゼ活性を有する単離された組換え酵素にも関する。質量分析は、その組換えデキストラナーゼの平均質量が約65.3kDであることを示した。組換えデキストラナーゼの至適pHは、野生型デキストラナーゼの至適pHに等しい3.5〜5.5の範囲にあることが見い出された（図４を参照のこと）。組換え及び野生型デキストラナーゼの両方の至適温度はpH5.5において約60℃であることが見い出された（図２を参照のこと）。更に、組換え及び野生型デキストラナーゼはpH5.5及びpH７において60℃で安定であった。70℃においてはほんの少しの残存活性が観察された。オーラル・ケア組成物なお更なる態様において、本発明は、オーラル・ケア製品内の成分として役立つオーラル・ケア組成物に関する。本発明のオーラル・ケア組成物は、適切には、0.001KDU〜1000KD U/ml、好ましくは0.01KDU/ml〜500KDU/ml、特に0.1KDU/ml〜100KDU/mlの範囲における、最終的なオーラル・ケア製品中の酵素活性として計算した酵素活性に等しい組換えパエシロマイセス・リラシヌスデキストラナーゼの量を含み得る。オーラル・ケア組成物中にデキストラナーゼ活性以外の酵素活性を含むことも本発明により考慮される。考慮される酵素活性は、ムタナーゼ、オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、例えばWO95/10602（Novo Nordisk A/S）に記載されるコプリヌス種（Coprinus sp. ）ペルオキシダーゼもしくはラクトペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、例えばパパイン、酸性プロテアーゼ（例えば、 WO95/02044（Novo Nordisk A/S）に記載の酸性プロテアーゼ）、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、例えばアミログルコシダーゼ、例えばAMG（Nov o Nordisk A/S）、抗微生物酵素、及びそれらの混合物を含む酵素の群からの活性を含む。オーラル・ケア製品オーラル・ケア製品は、いずれかの適切な物理的形態（即ち粉末、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等）を有し得る。“オーラル・ケア製品”は、齲蝕を防ぎ、歯垢及び歯石の形成を防ぎ、歯垢及び歯石を除去し、歯の病気を防ぎ及び／又は治療する等により、ヒト及び動物の口の中の口の衛生を維持し又は改善するために用いることができる製品として定義することができる。少くとも本発明の文脈において、オーラル・ケア製品は、義歯及び人工歯等を洗浄するための製品も含む。このようなオーラル・ケア製品の例は、練り歯みがき、デンタルクリーム、ゲルもしくは歯みがき粉、オドンチック(odontic)、口洗浄剤、ブラッシング前もしくは後のそそぎ製剤、チューインガム、ロゼンジ、及びキャンディーを含む。練り歯みがき及び歯用ゲルは、典型的には、研磨材料、発泡剤、芳香剤、湿潤剤、バインダー、シックナー、甘味剤、白色化／漂白／染色除去剤、水及び任意に酵素を含む。歯垢除去液を含む口洗浄剤は、典型的には、水／アルコール溶液、芳香剤、湿潤剤、甘味料、発泡剤、着色料、及び任意に酵素を含む。研磨剤研磨材料も本発明の歯みがき製品に組み込むことができる。本発明によれば、研磨材料は、アルミナ及びその水和物、例えばαアルミナ三水和物、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、アルミノシリケート、例えばか焼ケイ酸アルミニウム及びケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、ケイ酸ジルコニウム、及び粉末状プラスチック、例えばポリビニルクロライド、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉末状ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及びエアロゲル等を含む。また、研磨剤として適するのは、ピロリン酸カルシウム、水不溶性アルカリメタホスフェート、リン酸二カルシウム、及び／又はその二水和物、オルトリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、粒状ヒドロキシアパタイト等である。これらの物質の混合物を用いることも可能である。オーラル・ケア製品により、研磨製品は、０〜70重量％、好ましくは１〜70重量％で存在する。練り歯みがきのために、研磨材料成分は、典型的には、最終的な練り歯みがき製品の10〜70重量％の範囲にある。例えば練り歯みがきからの水の損失を防ぐために湿潤剤が用いられる。本発明によるオーラル・ケア製品に用いるための適切な湿潤剤は、次の化合物及びその混合物：グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール(PEG)、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４ −ブタンジオール、水素化され部分的に水和されたポリサッカライド等を含む。湿潤剤は、一般に、練り歯みがきの重量で０％〜80％、好ましくは５〜70％で存在する。シリカ、デンプン、トラガカントガム、キサンタンガム、トチャカの抽出物、アルギネート、ペクチン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロリドンが、歯みがき製品の安定化を助ける適切なシックナー及びバインダーの例として言及することができる。シックナーは、練り歯みがきクリーム及びゲル中に、0.1〜20重量％の量で存在し得、そしてバインダーは最終製品の0.01〜10重量％の範囲で存在し得る。発泡剤発泡剤セッケン、アニオン、カチオン、非イオン、両性イオン性及び／又は双性イオン性界面活性剤を用いることができる。これらは、最終製品の重量で０％〜15％、好ましくは0.1〜13％、より好ましくは0.25〜10％のレベルで存在し得る。界面活性剤界面活性剤は、それらが本酵素に不活性化効果を発揮しない範囲でのみ適切である。界面活性剤は、脂肪アルコールスルフェート、10〜20炭素原子を有するスルホン酸化モノグリセリドもしくは脂肪酸、脂肪酸−アルブミン縮合製品、脂肪酸アミド及びタウリンの塩及び／又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩を含む。甘味剤適切な甘味料はサッカリンを含む。芳香剤芳香剤、例えばスペアーミントは、通常、0.01％〜約５重量％、特に0.1〜５重量％のような少量で存在する。白色化／漂白剤白色化／漂白剤はH₂O₂を含み、最終製品の重量に基づいて計算して５％未満、好ましくは0.25〜４％の量で加えることができる。白色化／漂白剤は、酵素、例えばオキシドレダクターゼであり得る。適切な歯の漂白酵素は、WO97/06775（Novo Nordisk A/S）に記載される。水水は、通常、例えば練り歯みがきをなめらかにする量で加えられる。更なる剤更なる水溶性抗細菌剤、例えばクロルヘキシジン、ジグルコネート、ヘキセチジン、アレキシジン、第４アンモニウム抗細菌化合物及び特定の金属イオンの水溶性ソース、例えば亜鉛、銅、銀及びスズ（例えば塩化亜鉛、銅及びスズ、並びに硝酸銀）も含まれ得る。フッ化物ソース、染料／着色料、防腐剤、ビタミン、pH調節剤、抗齲食剤、脱感作剤等として用いることができる化合物の添加も本発明により考慮される。酵素本発明のオーラル・ケア製品に及びオーラル・ケア製品に用いられる他の本質的構成物は酵素である。酵素は、生きている系における化学反応の生物学的触媒である。酵素は、それらが中間の酵素−基質複合体を形成するよう機能することによりその基質と組み合わさる。次にこの複合体は反応産物及びその特異的酵素機能を続ける遊離した酵素に変換される。酵素は、口腔の洗浄に用いる場合、いくつかの利点を与える。プロテアーゼは、歯の表面上に吸着し、生ずる歯垢の第一層である包皮を形成する唾液タンパク質を分解する。リパーゼを伴うプロテアーゼは、細菌の細胞壁及び膜の構造成分を形成するタンパク質及び脂質を溶解することにより細胞を破壊する。デキストラナーゼは、細菌の接着のためにマトリックスを形成する細菌により作られる有機骨格構造を分解する。プロテアーゼ及びアミラーゼは、歯垢形成を防ぐだけでなく、カルシウムに結合する炭水化物−タンパク質複合体を分解し、石灰化を防ぐことにより、結石の発達を防止する。（最終練り歯みがき組成物の重量％での）本発明のオーラル・ケア組成物から生産される練り歯みがきは、典型的には、以下の成分：研摩材料 10〜70％湿潤剤０〜80％シックナー 0.1〜20％バインダー 0.01〜10％甘味料 0.1〜５％発泡料０〜15％白色化剤０〜５％酵素 0.0001〜20％を含む。本発明の特定の実施形態において、オーラル・ケア製品は、ａ）10〜70％研磨剤ｂ）０〜80％湿潤剤ｃ）0.1〜20％シックナーｄ）0.01〜10％バインダーｅ） 0.1〜５％甘味料ｆ）０〜15％発泡剤ｇ）０〜５％白色化剤ｉ）0.0001％〜20％酵素を含む、6.0〜約8.0の範囲のpHを有する練り歯みがきである。ｉ）に言及される酵素は、本発明の組換えデキストラナーゼ及び練り歯みがき等に用いることが知られている上述の他の型の酵素を含む。（最終的な口洗浄組成物の重量％における）本発明のオーラル・ケア組成物から作られる口洗浄剤は、典型的には、次の成分：０〜20％湿潤剤０〜２％界面活性剤０〜５％酵素０〜20％エタノール０〜２％他の成分（例えば、芳香剤、甘味料活性成分、例えばフルオライド）０〜70％水を含む。口洗浄組成物は、適切な緩衝液、例えばpH域６〜7.5のクエン酸ナトリウム又はリン酸ナトリウムで緩衝され得る。口洗浄剤は、希釈されない形態（即ち使用前に希釈しなければならない）であり得る。製造の方法本発明のオーラル・ケア組成物及び製品は、経口用製品の分野において一般的な方法を用いて作ることができる。使用本発明によれば、組換えデキストラナーゼ又はそれを含む組成物は、歯垢の形成を防ぎ、もしくは歯垢を除去するためのヒト及び／又は動物のためのオーラル・ケア製品における使用；糖汁又はシロップの加水分解のための使用；食物、飼料及び／又はペット食品における使用を含むいくつかの適用のために役立つ。材料及び方法材料微生物大腸菌DSM 10706：特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従って、Deutsche Sammlung von Mikroorgan ismen und Zellkulturen GmbH.，(Mascheroder Weg lb，D-38124 Braunschweig Federal Republic of Ger many)（DSM）に寄託した。Ａ．オリザエ JaL 125：マーカーとしてＡ．オリザエpyrG遺伝子を用いて（G ．May（“Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi”(1992)，p．1〜 28，Eds．J．R．Kinghorn and Twrner；Blackie Academic and Professional）に記載される）ワン・ステップ・遺伝子置換法により削除された（Murakami Kら（1991）(Agric．Biol．Chem．55，p．2807〜2811）により記載される）“alp” と呼ばれるアルカリプロテアーゼ遺伝子を有する、Institute for Fermention（ Osaka；17〜25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawa-ku，Osaka，Japan）から利用できるアスペルギルス・オリザエIFO4/77。フサリウムCC1〜３：フサリウムＡ３／５（ATCC 20334）(Wiebeら、1992，Myc ological Research 96：555〜562；Wiebeら、1991，Mycological Research 95： 1284〜1288；Wiebeら、1991，Mycological Research 96：555〜562)は、高度に分枝したコロニー変異体である。株ATTC 20334は、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum ）ATTC 20334としてWO96/00787に言及される株である。株 ATCC 20334は以前にF．graminearumとして間違って分類された（Yoder and Chri stianson，(1997)）。RAPDベース及び伝統的な分析は、Quorn真菌ATCC 20334のフサリウム・ベネナトゥムNirenburg sp．novへの本当の同一性を示す。大腸菌DH５α 大腸菌株JM101 プラスミド及びベクター： pCaHj483（図１） pToC343 （図２） pToC325 （図３） pICAMG／Term（EP 238 023） pUC19（Yanish-Perronら（1985），Gene 33，p 103〜119） pJW111：大腸菌株JM101において構築され、増幅された発現プラスミド（図８）。 pDM181：フサリウム発現プラスミド（Jonesら（1996））は、SP387プロモーター及びターミネーター、並びにBasta耐性を与えるbar遺伝子（Thompsonら（1987 ），EMBO，6（9）：2519〜2514）をコードする単一ベクターである。Swa Ｉ及びP ac Ｉのための２つの制限部位を、クローニングを容易にするためにSP387調節配列間に導入した。酵素：パエシロマイセス・リラシヌスにより生産されたDextranase L50（Novo Nordi sk A/S）。アクロモバクター(Achromobacter)からのリシル特異的プロテアーゼNOVO ZYM 234^TM（Novo Nordisk A/S）培地、基質及び溶液 YPG培地：１％イーストエキス、２％バクトトリプトン及び２％グルコース YPD：10ｇイーストエキス、20ｇペプトン、H₂Oで900ml、オートクレーブして1 00mlの20％グルコース（滅菌ろ過）を加えた。 Dextran 500（Pharmacia） AZCL−デキストラン（Mega Zyme） pCRII（Invitrogen TA Cloning Kit） Britton-RobinsonBuffer DAPI：４’６−ジアミド−２−フェニルインドール（Sigma Ｄ−9542） BHI ：Brain Heart Infusionブイヨン Vogel's／Basta培地：Vogel's塩(Vogel，H.J．(1964)，Am．Nat．98：436-446 )，25mM NaNO₃，５mg／ml Basta(Hoechst)，25ｇ／Ｌスクロース、25ｇ／Ｌ不活性寒天、pH6.0 M400Da培地：１リッター当り50ｇのマルトデキストリン、2.0ｇのMgSO₄−７H₂O，2.0ｇのKH₂PO₄，4.0ｇのクエン酸、8.0ｇのイーストエキス、2 .0ｇの尿素、及び0.5mlの微量金属液。その培地を５Ｎ NaOHでpH6.0に調節する。微量金属液は、１リッター当り14.3ｇのZnSO₄−７H₂O，2.5ｇのCuSO₄−５H₂O ，0.5ｇのNiCl₂−６H₂O，13.8ｇのFeSO₄−７H₂O，8.5ｇのMmSO₄−H₂O、及び3.0 ｇのクエン酸から構成される。発芽培地：12.1g／ＬのNaNO₃，25ｇ／Ｌのコハク酸（二ナトリウム塩）、１ｇ／Ｌのグルコース及び１Ｘ Vogel's塩をpH6.0に調節。 STC：0.8Ｍソルビトール、25mM Tris pH8.0，50mM CaCl₂ SPTC：40％ PEG 4000，0.8Ｍソルビトール、25mM Tris pH8.0，50mM CaCl₂ 装置： 10kDaカットオフ限外ろ過カセット（Alpha Minisette from Filtron）。フェニル−セファロースFF（high sub）カラム（Pharmacia） Seitz EK１フィルタープレートＱ−セファロースFFカラム（Pharmacia） Applied Biosystems 473 Aプロテインシーケンサー２ｌ Kieler発酵槽 OlympusモデルBX50顕微鏡 Malthus Flex；Ｍ2060（Malthus Instrument Limited）プライマー：方法：デキストラナーゼ活性アッセイデキストラナーゼ活性アッセイは、アルカリ性３，５−ジニトロサリチル酸でのデキストランからの還元糖の遊離（540nmの吸光度）を測定する。条件：40℃でpH5.4で0.1Ｍ酢酸ナトリウム中2.5％のDextran500（Pharmacia）。酵素濃度約１DU/ml。１DUは、１時間に１mgのマルトースに等価な還元糖の量を作り出す酵素の量である。デキストラナーゼ活性は、AZCL−デキストラン(Mega Zyme)を用いても測定することができる。0.1M酢酸ナトリウム、pH5.5又は50mM Britton-Robinson緩衝液中0.4％のAZCL−デキストラン500mlを、Milli Ｑろ過したH₂Oで希釈した100μｌの酵素サンプルに加え、40℃で10分、インキュベートした。次にそのサンプルを 15,000ｇで２分、遠心し、200μｌの上清をマイクロタイタープレートのウェルに加え、595nmの吸光度を測定する。パエシロマイセス・リラシヌスからの野生型デキストラナーゼの分子キャラクタリゼーション質量分析精製された野生型デキストラナーゼの質量分析を、VG Analytical TofSpecにおけるマトリックスアシスティドレーザー吸収イオン化time-of-flightマススペクトロメトリーを用いて行った。質量分析測定のために、２mlのサンプルを２ml の飽和マトリックス溶液(0.1％ TFA：アセトニトリル（70：30）)中α−シアノ −４−ヒドロキシケイ皮酸）と混合し、２mlのその混合物を標的プレート上にスポットした。質量分析機に導入する前に、エバポレーションによりその溶媒を除去する。サンプルを取り除き、域値のレーザー出力で４nsレーザーパルス(337nm )によりイオン化し、そして25kVの加速電圧によりフィールド・フリーフライトチューブに加速する。1850 Ｖにセットしたマイクロチャンネルプレートによりイオンを検出する。ヒドロキシアパタイトディスク（HA）の調製ヒドロキシアパタイト錠剤を、250mgのヒドロキシアパタイトを錠剤ダイ内で約5,900kg（13,000lbs）の圧力で５分、圧縮した。次にその錠剤を４時間、600 ℃で焼成し、最後に滅菌脱イオン水で水和した。ヒドロキシアパタイトディスク（HA）のプラークコーティングヒドロキシアパタイトディスク（HA）を乾燥滅菌(121℃，２bar，20分)し、37 ℃で18時間、フィルター滅菌した唾液でコートした。HAディスクをビーカー内の滅菌ラック内におき、0.2％スクロースを含むBrain Heart Infusion broth(BHI) をディスクを覆うビーカー内に注いだ。接種直前に滅菌Na₂S(pH7.0)を加えて５ｇ／ｌの最終濃度にした。好気的に増殖させた(BHI，37℃，24時間)ストレプトコッカス・ムタンス、アクチノマイセス・ビスコスス及びフンバクテリウム・ヌクレアトゥムを、約10⁶cfu／mlの濃度での接種物として用いた。そのディスクを少し撹拌しながら４日間、37℃で好気的にインキュベートした。プラークのためのMalthus法 Malthus法は、Johnstonら（1995）（Journal of Microbiologic al Methods 2 1，p．15〜26）及びJohansemら（1995）(Journal of Applied Bacteriology 78 ，p．297〜303)に基づく。ポリメラーゼ鎖反応(PCR) PCR反応は、Advantage cDNA PCRコアキット（Clonetech，PaloAlto）からの構成物、0.1mgのpToC343及び50pmolの各々のプライマーｏ−dex SwaＩ｛GCATTTAA ATATG CGT TGG CCT GGT｝及びｏ−dex PacＩ｛CGTTAAT TAA TCA TTC AAT GCT C CA GTC｝を、次のサイクル：４分、95℃の１サイクル；（１分、95℃，１分、60℃，２分、72℃）の25サイクル；５分、72℃の１サイクルで含む。実施例実施例１野生型デキストラナーゼの精製ステップ１：限外ろ過１ｌのDextranase 50Ｌ（Novo Nordisk A/S）を8ｌの50mM Na−アセテート／H Cl，pH5.4と混合した。その混合物を10kDaのカットオフ限外ろ過カセット(Alpha Minisette from Filton)で約0.5ｌに濃縮した。更に８ｌの50mM Na−アセテート／HCl，pH5.4を加え、その酵素を再び約0.5ｌに濃縮した。ステップ２：フェニル−セファロースFFでのクロマトグラフィー飽和硫酸アンモニウムを、最終硫酸アンモニウム濃度1.0Ｍまで加えた。そのp Hを、３％ NaOHでpH6.0に調節し、その酵素をSeitz EK１フィルタープレートでろ過した、EK１−ろ液を半分づつに分けた。１ｌフェニル−セファロースFF（hign sub）カラムを25mM Na−アセテート／ HCl，1.0Ｍ(NH₄)₂SO₄，pH6.0で平衡化した。EK１−ろ液の半分をそのカラムに適用し、そのカラムを非結合性タンパク質を除くために平衡化緩衝液の５カラム容量で洗った。デキストラナーゼを溶出するために、５カラム容量にわたる硫酸アンモニウム勾配(1.0Ｍ→0.0Ｍ)をそのカラムに適用した。フェニル−セファロースFFカラムステップをEK−１−ろ液の他方の半分でくり返した。デキストラナーゼ活性を有する画分をプールした。ステップ３：Ｑ−セファロースFFでのクロマトグラフィーそのプールした画分を10kDカットオフ限外ろ過カセットで約250 mlに濃縮した。限外ろ過した酵素を数回の緩衝液交換で10mM Na−アセテート／ HCl，pH6.0に対して透析した。１ｌのＱ−セファロースFFカラムを20mMのNa−アセテート／HCl,pH6.0で平衡化した。その酵素をカラムに適用し、そのカラムをOD₂₈₀シグナルがベースラインにもとるまで、平衡化緩衝液で洗った。デキストラナーゼ酵素を５カラム容量にわたって直線状NaCl勾配（0→75mM）で溶出した。そのカラムからの画分を、デキストラナーゼ活性について分析し、デキストラナーゼ活性を有する画分をSDS−PAGEにより分析した。少くとも90％の純度であると判断された画分を精製されたデキストラナーゼとしてプールした。最後に、その酵素を0.20μフィルターを通してろ過した。実施例２野生型デキストラナーゼのＮ末端配列決定Ｎ末端アミノ酸配列決定： Applied Biosystems 473AプロテインシーケンサーにおいてＮ末端アミノ酸配列決定を行った。還元されたペプチド及びＳ−カルボキシメチル化デキストラナーゼを作るために、材料及び方法セクションに記載されるように精製した野生型デキストラナーゼ（500mg 超）を、37℃で16時間、1.3Ｍ尿素を含む40mM NH₄HCO₃内のアクロモバクター（20mg）からのリシル特異的プロテアーゼで消化した。生じたペプチドを、0.1％ＴFA水溶液中0.08％のTFAを含む80％２−プロパノールの直線勾配で溶出するVydac Ｃ₁₈カラムを用いる逆相HPLCにより分離した。ペプチドを、Ｎ末端アミノ酸配列決定にかける前に、0.1％ TFA水溶液中0.08 ％のTFAを含む80％アセトニトリルの直線勾配で溶出するVydac Ｃ₁₈カラムを用いて逆相HPLCにより再び精製した。決定されたアミノ酸配列を以下に示す。Xaaは未決定の残基を示し、AsyはAsp とAsnとを区別できない残基を示す。Ｎ末端：デキストラナーゼの実際の直線的Ｎ末端アミノ酸配列決定は、互いに食い違った３つの配列を示した。その配列は、各々Asp１，Gln３及びAsn４で始まる比２：１：２において見い出された。ペプチド１：ペプチド２：ペプチド３：ペプチド４：ペプチド５：ペプチド６：ペプチド７：ペプチド８：ペプチド９：ペプチド10：ペプチド11：実施例３パエシロマイセス・リラシヌスからのデキストラナーゼ遺伝子のクローニングパエシロマイセス・リラシヌスからのデキストラナーゼ遺伝子のクローニングは、実施例２に記載の部分的アミノ酸配列の知識に基づいた。ペプチド３，４及び６をコードすることができる縮重PCRプライマーをデザインした。両方向に同じ配列をコードするプライマーを作った。６つのプライマーの全ての組合せをパエシロマイセス・リラシヌスからの染色体DNAでのPCR反応に用いた。これらの反応のいくつかはデキストラナーゼ遺伝子の部分をコードするDNAフラグメントを生じた。これらのフラグメントをゲノムサザンでのプローブとして用いた。６kb のBamH Iフラグメントをハイブリダイズし、次にクローン化して配列決定した。全ての試験管内DNA作業は、標準的な手順（Sambrookら、Molecular Cloning；A Laboratory Manual，2n d Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）に従って行った。 PCR フラグメント以下のプライマーを合成した。プライマー8001及び8002は、一方向又は他の方向において、ペプチド番号：３のアミノ酸14−20をコードする。プライマー8003及び8004はペプチド番号：４のアミノ酸５−11をコードし、そしてプライマー8005及び8006はペプチド番号：６のアミノ酸１−６をコードする。パエシロマイセス・リラシヌスLi−３からの染色体DNAを、本質的にYeltonら（Proc．Natl．Acad．Sci.,(1984)，81，p．1470 〜1474）に記載されるように調製した。 PCR反応は、プライマーの全ての組合せで、標準的手順に従って行った。プライマーセット8001／8006及び8003／8002は、ベクターpCRII(Invitrogen TAC lon ing Kit)内でのクローニング及びApplied Biosystems，DNA Sequencerでの配列決定に基づきデキストラナーゼ遺伝子の部分を含むことを示したフラグメントを供した。プライマーセット8001／8006で得られたフラグメントは約0.9kbであった。このフラグメントの端の配列決定は、ペプチド番号：２をコードするDNA配列を示した。 8003／8002で得られたフラグメントは約0.6kbであった。配列決定は、ペプチド５，１及び８をコードする配列がこのフラグメント内に含まれることを示した。ゲノムクローン BamH Ｉ，BglII，EcoR Ｉ，HindIII，Sal Ｉ，Xba Ｉ及びXho Ｉでのパエシロマイセス・リラシヌス切断からの染色体DNAのサザンブロットを行い、³²Ｐ標識したP CRフラグメントとハイブリダイズさせた。両方のフラグメントが約６kb BamH Ｉフラグメントにハイブリダイズした。pUC19内にクローン化したパエシロマイセス・リラシヌスからの約６kb BamHＩフラグメントのライブラリーを作った。そのライブラリーを、PCRフラグメントの１つとのコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、陽性プラスミドpToC325(図２を参照のこと)を単離した。pToC325の2994bpを配列決定し、そのDNA配列及び予想されるアミノ酸配列を各々配列番号：１及び配列番号：２に示す。大腸菌DH５αに形質転換したpToC 325を株番号10706としてDSMに寄託した。実施例４アスペルギルス・オリザエにおける組換えデキストラナーゼの発現。その遺伝子をＡ．オリザエ発現ベクターpCaHj483にクローン化したデキストラナーゼの開始及び停止コドンにおいて制限酵素部位を導入した。生じたデキストラナーゼ発現プラスミドをＡ．オリザエ株に形質転換した。形質転換体を単離し、デキストラナーゼの発現について分析した。 pCaHj483 の作製 pCaHj483（図１を参照のこと）を、以下のフラグメントから構築した：ａ）EcoR Ｉ及びXba Ｉで切断したベクターpToC65（WO91/17243）。ｂ）amdS遺伝子（C．M．Corrickら(1987)，Gene 53，63〜71）を有するＡ．ニジュランスからの2.7kb Xba Ｉフラグメント。amdS遺伝子は、真菌の形質転換において選択マーカーとして用いられる。amdS遺伝子は、その遺伝子内に通常存在するBamH Ｉ部位が破壊されるように改変されている。これは、プライマー：5'-A GAAATCGGGTATCCTTTCAG-3’（配列番号：21を参照のこと）を用いるサイレント点変異を導入することによって行われた。ｃ）Ａ．ニジュランスtpi遺伝子のmRNAの５’非翻訳端をコードする配列の60b p DNAフラグメントに融合したＡ．ニゲルNA２プロモーターを有する0.6kb EcoR Ｉ／BamH Ｉフラグメント。NA２プロモーターは、プラスミドpNA２（EP−Ｂ−0 3 83 779(Novo Nordisk A/S)）から単離し、PCRにより60bp tpi配列に融合させた。60bp tpi配列をコードするプライマーは次の配列：号：22を参照のこと）を有する。ｄ）Ａ．ニゲルグルコアミラーゼ転写ターミネーターを有する675bp Xba Ｉフラグメント。そのフラグメントは、プラスミドpICAMG／Term（Novo Nordisk A/S からのEP 238 023）から単離した。フラグメントｃのBamH Ｉ部位を、pIC19Rリンカー（BamH ＩからXba Ｉ）によりフラグメントｄ上の転写ターミネーターの前においてXba Ｉ部位に連結した。デキストラナーゼのpCaHj483へのクローニング BamH Ｉ及びXho Ｉ部位を、以下のプライマー：を用いてPCRにより、デキストラナーゼ遺伝子のATGの前及び終止コドンの後のri gthに導入した。その遺伝子を、PCR誤差をチェックするため再び配列決定し、そして発現ベクターpCaHj483内にBamH Ｉ及びXho Ｉ部位によりクローン化した。生じたデキストラナーゼ発現プラスミドをpToC343と呼び、図３に示す。 pToC343 のＡ．オリザエ形質転換体Ａ．オリザエJaL 125をEP 0 238 023に記載されるようにpToC343で形質転換した。形質転換体を、唯一の窒素源としてアセトアミドを使用するそれらの能力により選択した。最小アセトアミドプレートでの分生子での２回の再単離の後、その形質転換体を、10ml YPD中で30℃で４日、発酵させた。発酵ブイヨンのサンプルをSDS−PAGEに適用した。そのゲルをクーマシーブリリアントブルーにより染色した。約65kDのバンドが、形質転換体からのブイヨン中に見え、JaL 125中のブイヨン中では見えなかった。 65kDタンパク質を生産する３つの形質転換体を２リッターKieler発酵槽中で、５日間、マルトデキストリン含有培地中で発酵させて、デキストラナーゼの成分を酵素により決定した。その形質転換体は発酵ブイヨン中に11,000DU／mlまで生産し、形質転換されていない宿主は100DU／ml未満を生産した。実施例５組換えデキストラナーゼの精製：培養ブイヨンをろ過し、Amicon Cell(膜カットオフ：10kDa)で濃縮した。そのサンプルをMilli Ｑろ過したH₂Oで希釈し、pHをpH7.5に調節した。次にサンプルを、20mMリン酸ナトリウムpH7.5で平衡化したＱ−Sepharoseカラム(Pharmacia) に充填し、20mMリン酸ナトリウム中０〜0.5Ｍ NaClの直線勾配で溶出した。デキストラナーゼ含有画分をプールし、(NH₄)₂SO₄を１Ｍの濃度まで加え、１Ｍの(NH₄)₂SO₄で平衡化したフェニル−セファロースカラム(Pharmacia)に充填した。１〜０Ｍの(NH₄)₂SO₄の直線勾配でデキストラナーゼを溶出した。精製された組換えデキストラナーゼのＮ末端アミノ酸配列を、Ｎ末端のタンパク質配列決定により確認した。実際に、２つのＮ末端アミノ酸配列が見い出された；１つはAsp１で始まり（Asp-Gln-Gln-Asn-Gln-）及び１つはAsn４で始まり(A sn-Gln)、２：３の比率であった。実施例６デキストラナーゼの分子量野生型酵素に似た精製された組換えデキストラナーゼは、SDS−PAGEから約65k Daの分子量を有した。これは、マトリックスアシスティドレーザー吸収イオン化 time-of-flight質量分析測定により確認した。ここで、分子量約65kDaが観察された。野生型デキストラナーゼの質量分析は、平均分子量約65.3kDaを示した。実施例７組換え及び野生型デキストラナーゼのpHプロフィール：酵素サンプルを種々のpHで50mM Britton-Robinson緩衝液中のAZCL−デキストランとインキュベートした。組換え体及び野生型デキストラナーゼの両方は至適 pHが約pH６を有した（図４を参照のこと）。実施例８組換え及び野生型デキストラナーゼの温度プロフィール：酵素サンプルを種々の温度において、0.1Ｍ酢酸ナトリウムpH5. 5中でAZCL−デキストランとインキュベートした。組換え体及び野生型酵素は、6 0℃辺りの至適温度で同様の温度プロフィールを有する。実施例９組換え及び野生型デキストラナーゼの温度安定性：酵素サンプルを、30分、pH5.5又はpH７で、5OmM Britton-Robinson緩衝液中で種々の温度でプレインキュベートした。次に、そのサンプルを、0.1Ｍ酢酸ナトリウム中で10倍に希釈して、次に、その残存活性を測定した。pH5.5及びpH７の両方で、２つの酵素についての比較できる温度安定性を得た。デキストラナーゼは60℃において安定である。70℃でのインキュベーションの後、ほとんど残存活性は観察されなかった（図６を参照のこと）。実施例10 歯垢に対する組換えデキストラナーゼプラークバイオフィルムを、先の材料及び方法セクションに記載されるように、唾液をコートしたヒドロキシアパタイトディスク上で嫌気的に増殖させた。そのプラークは、ストレプトコッカス・ムタンス（SFAG，CBS 350.71）、アクチノマイセス・ビスコスス(DSM 43329)及びフソバクテリウム・ヌクレアトゥムSubsp ．ポリホルフム(DSM 20482)の混合培養物であった。プラークを有するHAディスクを、１Ｋ DU／mlの組換えパエリオマイセス・リラシヌスデキストラナーゼを含む酢酸緩衝液(pH5.5)に移し、２分、回転させた（対照として滅菌緩衝液を用いた）。酵素処理の後、HAディスクをDAPI染色し、又はMalthus細胞に移した。生きている接着細胞を計数する時に、間接的インピーダンス測定を用いた(Mal thus Flexi M2060，Malthus Instrument Limited)。インピーダンス測定のために、３mlのBHIを間接的Malthus細胞の外部チャンバーに移し、0.5mlの滅菌KOH（O.1M）を内部チャンバーに移した。プラークを有するHAディスクを、デキストラナーゼ処理の後、リン酸緩衝液で少し洗い、外部チャンバーに移した。Malthusにおける検出時間（dt）を、cfu／mlをdtに関連づける較正曲線の使用によりコロニー数に交換した（図７を参照のこと）。較正曲線を、その混合した培養物から調製した一連の10倍希釈率により作製した。各々の希釈ステップのコンダクタンスdtをBHIにおいて決定し、BHI中のdtへの10倍希釈のcfu／mlに関する較正曲線を、その混合培養物について作製した。 HAディスクからのプラークの除去も蛍光顕微鏡により決定し、ディスクを酵素処理の後、DAPI（３mM)で染色し、20℃で５分、暗所でインキュベートした。DAP Iで染色された細胞を、200Ｗ水銀ランプ及びUVフィルターを備えたOlympusモデルBX50顕微鏡上のＸ100油浸漬蛍光対物レンズで検査した。その結果を、インピーダンス測定により得られた定量的データと比較した。唾液処理したHA表面上の生きている細胞の数を、デキストラナーゼ処理の後、 Malthus法により決定した。これを表１に示す。しかしながら、Malthus法により、酵素の殺細菌活性又はプラークの酵素的除去の間を区別することはできない。それゆえ、その表面上の生きている細菌の減少は、DAPI染色により評価される表面からのプラークの同時の除去と比較されなければならない。表１：インピーダンス測定により決定した唾液処理したヒドロキシアパタイトからの酵素によるプラーク除去(pH5.5，２分)。デキストラナーゼでの処理の後、蛍光顕微鏡によりプラークの重要な除去を決定した。これにより、組換えデキストラナーゼは接着細胞の量を減少させた。結果として、活性は、プラークの除去として観察され、プラーク中の細胞に対する殺細菌活性として観察されなかった。実施例11 フサリウム・ベネナトゥムにおける組換えパエシロマイセス・リラシヌスデキストラナーゼの発現Ｆ．ベネナトゥムのためのデキストラナーゼ発現プラスミドの作製デキストラナーゼを、プライマーｏ−dex Swa(配列番号：25)及びｏ−dexPac( 配列番号：26)を用いて発現プラスミドpToC343からPCR増幅した（材料及び方法を参照のこと）。生じた1860ntアンプリコンをSwa Ｉ及びPac Ｉで消化し、同じ２つの酵素で直鎖状にしたpDM18に連結した。その構成物を大腸菌内に導入し、生じたコロニーを、デキストラナーゼコーディング領域を含むものを同定するためにコロニーハイブリダイゼーションによりスクリーニングした。このスクリーンから、プラスミドpJW111を選択した（図８）。pJW111における挿入物のDNA配列決定は、これがデキストラナーゼ遺伝子であること及びその配列がpToC343中のデキストラナーゼ遺伝子のものと同一であることを決定した。フサリウム・ベネナトゥムの形質転換プラスミドpJW111を、以下の通り、CC１−３で示すフサリウムＡ３／５の形態学的変異体（ATCC 20334）に導入した： 28℃，150rpmで２〜４日間、発芽培地中で株ATTC 20334 CC１- ３を増殖させることにより分生子を作った。分生子をMiraclothを通してろ過し、遠心により濃縮し、そして滅菌水に再度懸濁した。YPG培地50mlに10⁸分生子を接種し、そして24℃，150rpmで14時間、インキュベートした。生じた菌糸を20ml のNOVO ZYM 234溶液(1.0Ｍ MgSO₄中2.5mg／ml）に再度懸濁し、28℃で80rpmで15 〜45分間、消化した。30mlのSTCを加え、プロトプラストを10分間、1500rpm（So rvall RT 6000セントリフュージ）でペレット化した。STC洗浄ステップを２回、くり返した。プロトプラストをml当り約５×10⁷プロトプラストの濃度でSTC：SP TC：DMSO(８：２：0.1）中に懸濁した。プラスミドDNA(２〜20mg)を200mlのプロトプラストに加え、氷上で30分、インキュベートした。２mlのSPTCをゆっくりと加え、次に室温で20分、インキュベートした。40℃における50mlの溶かされたオーバーレイ（１×Vogel's塩、25mM Na NO₃，0.8Ｍスクロース、１％低融点アガロース）を形質転換反応に加えた。サンプルを反転することにより混合し、２つの空の150mmペトリ皿間に分離した。24 時間後、25mlのオーバーレイナ10mg／ml Bastaを各々のプレートに加えた。プレートを室温でインキュベートした。デキストラナーゼ活性の発現 16の形質転換体をVogel's／Bastaに移し、室温で７日間、成長させた。125ml フラスコ中の20mlのＭ400Da培地に、Vogel's／Bastaプレートからの菌糸体の１c m²断片を接種した。培養物を30℃，150rpmで７日間、インキュベートした。培養サンプルを遠心し、その上清を（上述の通り）デキストラナーゼについてアッセイした。最も生産の多い形質転換体を、デキストラナーゼ活性アッセイ及びSDS ／PAGE分析により選択した。デキストラナーゼバンドは10〜27％勾配トリス−グリシンゲルで約60kDに流れた。Ｎ末端配列決定は、Ｆ．ベネナトゥムにおいて発現されたデキストラナーゼが、100％正確にAsn-Gln-Ala-Leu-に処理されたのに対し、Ａ．オリザエにより生産されたデキストラナーゼはその40％が不正確に処理されてＮ末端配列Asp-Gln- Gln-Asn-Gln-Ala-Leu-を作り出した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 9/46 Ｃ１２Ｎ 9/46 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:80） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:77） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ハルカー，トーベンデンマーク国，デーコー―2880 バクスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ (72)発明者ヨハンセン，シャルロッテデンマーク国，デーコー―2880 バクスバエルト，ノボアレ，ノボノルディスクアクティーゼルスカブ

Claims

【特許請求の範囲】１．デキストラナーゼ活性を示す酵素をコードするDNA配列を含むDNA構成物であって、該DNA配列が、ａ）配列番号：１に記載のDNA配列、及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列のデキストラナーゼコーディング部分、又はｂ）ｉ）配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列と80％の相同性を有するか、 ii）配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列と同じオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズするか、 iii）配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列を含むDNA配列によりコードされるポリペプチドと少くとも80％の相同性を有するポリペプチドをコードするか、もしくは iv）パエシロマイセス・リラシヌス由来の配列番号：１に記載のDNA配列及び／又は大腸菌DSM 10706から得ることができるDNA配列によりコードされる精製されたデキストラナーゼに対して生ずる抗体と免疫学的に反応するポリペプチドをコードする、ａ）に規定されるDNA配列のアナログを含むことを特徴とするDNA構成物。２．前記DNA配列が、真菌微生物、例えば糸状菌又はイーストから得ることができることを特徴とする請求項１に記載のDNA構成物。３．前記DNA配列が、パエシロマイセスの株、例えばパエシロマイセス・リラシヌスから、又はペニシリウムの株、例えばペニシリウム・リラシヌムもしくはペニシリウム・ミニオルテゥムから得ることができることを特徴とする請求項２に記載のDNA構成物。４．前記DNA配列が、パエシロマイセス・リラシヌスの核酸ライブラリーから単離され、又は該ライブラリーに基づき生産されることを特徴とする請求項３に記載のDNA構成物。５．請求項１〜４のいずれかに記載のDNA構成物を含む組換え発現ベクター。６．請求項１〜４のいずれかに記載のDNA構成物又は請求項５に記載の組換え発現ベクターを含む細胞。７．糸状菌であることを特徴とする請求項６に記載の細胞。８．前記細胞が、アスペルギルス属の株、特にアスペルギルス・ニゲルもしくはアスペルギルス・オリザエの株、フサリウム属の株、例えばフサリウム・オキシスポルム、フサリウム・グラミネアルム、フサリウム・スルフレウム、フサリウム・セレアリスもしくはフサリウム・ベネアトゥムの株、ペニシリウム属の株、例えばペニシリウム・リラシヌムもしくはペニシリウム・ミニオルテゥム、又はパエシロマイセス属の株、例えばパエシロマイセス・リラシヌスに属することを特徴とする請求項７に記載の細胞。９．デキストラナーゼ活性を示す組換え酵素を生産するための方法であって、該方法が、請求項１〜４のいずれかに記載のDNA構成物又は請求項５に記載のベクターの発現を許容する条件下で、適切な培養培地中で、請求項６〜８のいずれかに記載の宿主細胞を培養するステップと、その培養物から前記酵素を回収するステップと、を含むことを特徴とする方法。 10．請求項１〜４のいずれかに記載のDNA構成物によりコードされるデキストラナーゼ活性を有する組換え酵素。 11．請求項９に記載の方法により生産された組換え酵素。 12．請求項10又は11のいずれかに記載の組換えデキストラナーゼを含む組成物。 13．請求項10もしくは11に記載の酵素又は請求項12に記載の組成物を含み、オーラル・ケア製品に貫用的に用いられる成分を更に含むオーラル・ケア製品。 14．歯みがき剤、例えば練り歯みがき、歯みがき粉又は口内洗浄剤であることを特徴とする請求項13に記載のオーラル・ケア製品。 15．ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミローゼ、抗微生物酵素、及びそれらの混合物からなる群から選択される酵素活性を更に含む請求項13又は14のいずれかに記載のオーラル・ケア製品。 16．歯垢の形成を防止するため又は歯垢を除去するための、請求項10もしくは 11に記載の組換えデキストラナーゼ、請求項12に記載の組成物、又は請求項13もしくは14に記載のオーラル・ケア製品の使用。 17．糖汁又はシロップの加水分解のための請求項10もしくは11に記載の組換えデキストラナーゼ又は請求項12に記載の組成物の使用。 18．動物のためのオーラル・ケア製品のための、請求項10もしくは11に記載の組換えデキストラナーゼ、請求項12に記載の組成物、又は請求項13もしくは14に記載のオーラル・ケア組成物の使用。 19．食物、飼料及び／又はペット食品における請求項10もしくは11に記載の組換えデキストラナーゼ又は請求項12に記載の組成物の使用。