BRPI0617599A2 - processo de desacilação catalisada por enzimas de derivados clorados de açúcar - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE DESACILAçãO CATALISADA POR ENZIMAS DE DERIVADOS CLORADOS DE AçúCAR. Que consiste em um processo para a produção de triclorogalactosacarose, no qual a desacilação de sacarose-6-éster é obtida ao submeter a mistura de reação, após a cloração, a neutralização e o ajuste do pH entre 6,5 e 7, à desacilação, por meio do uso de uma enzima lípase ou de uma enzima protease, de uma forma livre ou imobilizada.
Description
PROCESSO DE DESACILAÇÃO CATALISADA POR ENZIMAS DE DERIVADOSCLORADOS DE AÇÚCAR"
Campo Técnico
Trata-se a presente invenção de um processo inovador euma estratégia original para a produção de 1,6-dicloro-1-6-dideoxi-beta-fructofuranosil-4-cloro-4-deoxi-galactopiranosídeo (TGS), que envolve adesacilação enzimática de TGS 6-O-protegido obtido após a reação de cloração.
Fundamentos da Invenção
As estratégias dos métodos da técnica anterior deprodução de 4, 1', 6'-triclorogalactosacarose (TGS) geralmente envolvem acloração de sacarose-6-éster por meio do uso do reagente Vilsmeier-Haackderivado de sacarose-6-éster clorada, para a formação de 6-acetil-4,16'-triclorogalactosacarose, por meio do uso de diversos agentes de cloração, como,por exemplo, oxicloreto de fósforo, cloreto de oxalila, pentacloreto de fósforo, etc.,e uma amida terciária, como, por exemplo, dimetilformamida (DMF). Após a ditareação de cloração, a massa de reação é neutralizada até atingir o pH entre 7,0 e7,7, por meio do uso de hidróxidos alcalinos apropriados de cálcio, sódio, etc. OpH da massa neutralizada é então aumentado para 9,5 ou mais, paradesesterificar/desacetilar 6-acetil-4,1', 6'-triclorogalactosacarose para formar 4,1',6'-triclorogalactosacarose, por meio do uso de hidróxidos alcalinos de cálcio,sódio, potássio, etc. Esta desesterificação/desacilação alcalina envolve aexposição dos reagentes a um pH adverso, na faixa alcalina, o que leva àdestruição de uma quantidade significativa de dimetilformamida (DMF), que é umacara contribuição, afetando adversamente sua recuperação após a reação.
No processo da técnica anterior, a mistura de reaçãotambém fica exposta durante o processo de desacilação a temperaturasadversas, que levam à destruição do próprio produto 4, 1', 6'-triclorogalactosacarose (TGS).Conseqüentemente, existe a necessidade de apresentarum método de desacilação que não exponha a dimetilformamida (DMF) àdestruição. Um método foi desenvolvido para a obtenção da desacilaçãoenzimática, a um pH que não exponha a dimetilformamida (DMF) à destruição.
Descrição Detalhada da Invenção
A desacilação enzimática foi descrita por Palmer e outros,em 1995, na Patente Norte-Americana No. 5445951, para a preparação dederivados parcialmente acilados de sacarose, por meio da desacilação catalisadapor enzimas de ésteres de sacarose a partir de um éster de sacarose selecionadodo grupo que consiste em octa-acilato de sacarose, hepta-acilato de sacarose ehexa-acilato de sacarose, em um meio orgânico anidro, com uma enzima ou comuma combinação de enzimas, que possa catalisar a desacilação do dito éster desacarose, para produzir um derivado de sacarose parcialmente desacilado, tendogrupo(s) hidroxila livre na(s) posição/posições pré-selecionada(s), e recuperar oderivado de sacarose parcialmente desacilado resultante.
Não há conhecimento de outro relatório a respeito dadesacilação enzimática de um éster de sacarose ou de seusderivados/precursores.
A presente invenção se refere à desacilação enzimáticade TGS 6-O-protegido obtido após a reação de cloração durante a preparação doadoçante artificial, TGS. As modalidades da mistura da reação de cloração quepode ser submetida ao processo descrito na presente invenção incluem, mas nãoficam limitadas a um fluxo de tratamento obtido após a mistura de sacarose-6-éster com um agente de cloração, conforme descrito por Mufti e outros, em 1983,na Patente Norte-Americana No. 4.380.476, por Walkup e outros, em 1990, naPatente Norte-Americana No. 4.980.463, por Jenner e outros, em 1982, naPatente Norte-Americana No. 4.362.869, por Tulley e outros, em 1989, na PatenteNorte-Americana No. 4.801.700, por Rathbone e outros, em 1989, na PatenteNorte-Americana No. 4.826.962, por Bornemann e outros, em 1992, na PatenteNorte-Americana No. 5.141.860, por Navia e outros, em 1996, na Patente Norte-Americana No. 5.498.709, por Simpson, em 1989, na Patente Norte-AmericanaNo. 4.889.928, por Navia1 em 1990, na Patente Norte-Americana No. 4.950.746,por Neiditeh e outros, em 1991, na Patente Norte-Amerieana No. 5.023.329, porWalkup e outros, em 1992, 5.089.608, por Dordiek e outros, em 1992, na PatenteNorte-Amerieana No. 5.128.248, por Khan e outros, em 1995, na Patente Norte-Amerieana No. 5.440.026, por Palmer e outros, em 1995, na Patente Norte-Amerieana No. 5.445.951, por Sankey e outros, em 1995, na Patente Norte-Amerieana No. 5.449.772, por Sankey e outros, em 1995, na Patente Norte-Amerieana No. 5.470.969, por Navia e outros, em 1996, na Patente Norte-Americana No. 5.498.709, por Navia e outros, em 1996 e na Patente Norte-Americana No. 5.530.106. A desacilação enzimática é realizada no fluxo detratamento obtido conforme mencionado acima, após a neutralização da massada reação clorada, após ou sem o isolamento intermediário do TGS 6-0-protegido. O solvente, a amida terciária presente na massa da reaçãoneutralizada, não se decompõe devido à reação enzimática e, portanto, resulta narecuperação melhorada do dito solvente.
Na presente invenção, a massa da reação clorada, após areação de cloração, é neutralizada com uma base apropriada. Quando o pH écontrolado durante a neutralização abaixo de 6,0, o complexo TGS formado aindatem o grupo protegido intacto na 6! posição. O desagrupamento da 6! posição érealizado com ou sem isolamento do dito composto. Outras várias referênciastambém apontam que o desagrupamento pode ser efetuado com ou sem amidaterciária, bem como outros solventes e condições aquosas.
A presente invenção descreve a desacilação na 6aposição por meio do uso de um processo enzimático, no qual a enzima remove,seletivamente, o grupo protegido na presença ou na ausência da amida terciária,incluindo dimetilformamida (DMF), que é utilizada na reação de cloração.
O processo da presente invenção também funciona bempara a desacilação de modalidades que não são resultantes de uma reação decloração, como, por exemplo, uma solução simples de TGS-6-éster puro.A desacilação catalisada por enzima é bastanteconhecida e as enzimas proteolíticas e as enzimas lípases realizam as reaçõesde desacilação e acilação sob condições benignas de reação e é amplamentedivulgado por Soedjak HS1 Spradlin JE (1994). Biocatalysis 11: 241-248; TherisodM. Klibanov AM (1986) J. Am. Chem. Soe. 108: 5638- 5640; B. Cambou e A.M.Klibanov1 J. Am. Chem. SOC., 106, 2687(1984); Kirpal S Bisht, Pure & Appl.Chem., Vol. 68, No. 3, pp. 749-752, 1996; F.J. Ploul; M.A. Crucesl,Biotechnology Letters 21: 635-639, 1999. Na presente invenção, após aneutralização da massa de reação, o pH é ajustado a 6,5, por meio do uso de uma base apropriada. A enzima lípase é então lentamente adicionada à massade reação sob agitação, à temperatura ambiente. A quantidade de enzimaadicionada à massa de reação varia entre 10% e 40% em peso/volume,dependendo das condições da reação e da atividade enzimática. O teor de amidaterciária na massa de reação neutralizada varia entre aproximadamente 10% e 40%. A mistura de reação é agitada continuamente por um período de 10 a 60horas, de preferência, entre 16 e 20 horas. A conversão de TGS 6-O-protegidoem TGS é monitorada por cromatografia em camada delgada (TLC). Após acompleta desacilação, a mistura de reação é levada para o isolamento do TGS,por meio de cromatografia de afinidade. O TGS isolado é então cristalizado por meio do uso de métodos apropriados.
O uso de enzimas lípases ou enzimas proteolíticas, para adesacilação de TGS 6-O-protegido em TGS, pode ser na sua forma nativa ou naforma imobilizada. Quando a enzima imobilizada é utilizada, a enzima é filtradaapós o término da desacilação. Esta enzima recuperada também pode ser reutilizada. Além disso, a enzima imobilizada também pode ser empacotada emuma coluna e a massa de reação pode ser passada através da coluna e adesacilação in situ do TGS 6-O-protegido pode ser realizada. Estas enzimaspodem ser imobilizadas em ou sobre suportes poliméricos sintéticos que incluem,por exemplo, mas não ficam limitados a suportes a base de náilon, poliacrílico,poliestireno ou poliacrilamida; ou suportes orgânicos naturais ou semi-sintéticos,como, por exemplo, aqueles baseados em polissacarídeos, que incluem, porexemplo, mas não ficam limitados a celulose, amido, dextrano, agár-agár,quitosana, quitina, etc; ou suportes inorgânicos, como, por exemplo, aquelesbaseados em carbono, sílica, zircônia, alumina, fosfato de zircônio, etc.
A fonte das enzimas lípases pode ser de origem animal,vegetal ou microbiana, de preferência, de origem microbiana ou bacteriana, como,por exemplo, Bacillus thermocatenulatusis, Pseudomonas aeruginosa, etc., deorigem fúngica, como, por exemplo, Penicillium Roquefortii, Asperigillus niger,Asperigillus oryzae, Rhizopus niveus, Candida rugosa, Rhizomucor miheii,Candida antartctica, etc.
Durante o processo da presente invenção, o TGS produtonão fica exposto a quaisquer condições adversas de temperatura ou pH, tal comono caso dos processos convencionais de desacilação, por meio do uso de ácido eálcali. A perda de produto é mínima comparada com qualquer outra forma deprocesso de desacilação.
Durante o processo da presente invenção, a amidaterciária não fica exposta a quaisquer condições adversas de temperatura ou pH,tal como no caso dos processos convencionais de desacilação, por meio do usode ácido e álcali. Conseqüentemente, de forma alguma ocorre a decomposiçãoda amida terciária. Portanto, o rendimento da recuperação da amida terciáriaaumenta significativamente.
Abaixo, são descritos exemplos que ilustram ofuncionamento da presente invenção, sem limitar, de qualquer maneira, o âmbitoda mesma. Os reagentes, a proporção dos reagentes utilizados, a variedade dascondições de reação descritas, as enzimas utilizadas e algo do gênero sãoapresentados apenas a título de ilustração e o âmbito da presente invençãoengloba seus reagentes análogos e condições de reação análogas, bem comoreações de natureza genérica análoga. Em geral, qualquer alternativaequivalente, que seja evidente para os especialistas versados na técnica deprodução de sacarose clorada, será incluída no âmbito do presente relatóriodescritivo. Conseqüentemente, a citação de um acetato abrangerá qualquer grupoéster equivalente que possa desempenhar a mesma função no contexto dapresente invenção, e a utilização de uma enzima abrangerá qualquer alternativaque possa fornecer a ação ou a ação análoga da enzima aqui descrita sobcondições análogas de reação. Várias outras adaptações das modalidades serãofacilmente previsíveis por aqueles especialistas versados nesta técnica e quetambém estão incluídas no âmbito do presente relatório descritivo. Uma citaçãona forma singular pretende também incluir o seu plural, a menos que o contextonão permita isso, ou seja: a utilização da expressão "um solvente orgânico" paraextração abrange a utilização de um ou mais de um solvente orgânico, sejasucessivamente ou em combinação, como uma mistura.
EXEMPLO 1
Cloração de sacarose-6-acetato
Em um frasco de reação de 5 litros, 1250 ml dedimetilformamida (DMF) foram adicionados e resfriados a uma temperatura entre0°C e 5°C. Depois disso, foram adicionados, lentamente, 635g de pentacloreto defósforo (5,4 moles), sob agitação, mantendo-se a temperatura da massa dereação inferior a 30°C. A massa também foi resfriada a uma temperatura inferior aO0C e a sacarose-6-acetato em dimetilformamida (DMF) foi lentamenteadicionada, a uma temperatura entre 0°C e 5°C. Em seguida, a massa de reaçãofoi aquecida a uma temperatura de 80°C e mantida por um período de uma hora,e depois também foi aquecida a uma temperatura de 100°C e mantida por umperíodo de 6 horas e, finalmente, foi aquecida a uma temperatura entre 1100C e115°C e mantida por um período entre 2 e 3 horas. O progresso da reação foicontrolado por análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Depois disso, a mistura de reação foi resfriada a umatemperatura entre -5°C e -8°C e uma solução de hidróxido de sódio 20% foiadicionada lentamente, de modo a levar o pH da massa entre 5,5 e 6,5. Orendimento obtido por este método foi de 55,4% de teor de sacarose.EXEMPLO 2
Desacetilação enzimática de 6-O-acetil-TGS porenzimas lípases
A massa de reação, 1,5 litro, contendo 15g de TGS 6-0-acetilado preparado conforme descrição no Exemplo 1, foi neutralizada por meiodo uso de uma pasta de hidróxido de cálcio 50% até atingir o pH 7,5. A massa dereação neutralizada foi diluída a 6 litros, por meio do uso de água. O teor dedimetilformamida (DMF) foi de 33% na massa neutralizada. Foram isolados 84gde enzima lípase de Aspergillus oryzae ATCC 26850; acrescentou-se NCIM 1212à mistura de reação sob agitação contínua, à temperatura ambiente. A reação foicontinuada durante várias horas e a formação de TGS e o desaparecimento deTGS 6-O-acetilado foram monitorados por cromatografia em camada delgada(TLC). Ao final de 42 horas, obteve-se a desacilação de até 98,4%.
Após a desacilação, a massa foi levada para o isolamentode TGS, por meio de métodos apropriados.
EXEMPLO 3
Desacetilação enzimática de 6-O-acetil-TGS porenzimas lípases imobilizadas em Eudragit RL100
Em um experimento, 2,5 litros da massa de reaçãocontendo 80g de TGS 6-O-acetilado foram neutralizados por meio do uso de umapasta de hidróxido de cálcio 50% até atingir o pH 7,5. A massa de reaçãoneutralizada foi diluída a 6 litros por meio do uso de água. O teor dedimetilformamida (DMF) foi de 33% na massa neutralizada. Foram adicionados àmistura de reação, 120g de enzimas lípases imobilizadas em Eudragit RL100 sobagitação contínua a uma temperatura entre 25°C e 30°C, que normalmente é atemperatura ambiente. A reação foi continuada durante várias horas e aformação de TGS e o desaparecimento de TGS 6-O-acetilado foram monitoradospor cromatografia em camada delgada (TLC). Ao final de 24 horas, obteve-se adesacilação de até 98,3%.
A massa foi então filtrada e levada para o isolamento deTGS. A enzima obtida na torta de filtro foi lavada com água e armazenada paraser reutilizada.
EXEMPLO 4
Desacetilação enzimática de 6-0-acetil-TGS porenzimas lípases imobilizadas em Eudragit RL 100 empacotadas em umacoluna
Em um experimento, 12g de enzimas imobilizadas foramempacotados em uma coluna de vidro de 2 cm de diâmetro e 8 cm de altura. Aentrada da coluna foi conectada ao ponto de distribuição de uma bombaperistáltica e a saída foi conectada a um frasco contendo 500 ml de massaneutralizada, que continha 5 g de 6-O-acetil. A entrada da bomba peristálticatambém foi conectada à massa neutralizada. A massa neutralizada foi circulada auma taxa de fluxo de 5 ml/minuto, através do leito de lípase imobilizada, durante 6horas.
A cromatografia em camada delgada (TLC) foi realizada acada hora para ver o grau de desacetilação ocorrendo no frasco. Após 6 horas,foi observada uma desacetilação superior a 98%.
Após o término da desacetilação de 6-O-acetil-TGS emTGS1 o leito da enzima imobilizada foi lavado com água deionizada e foiarmazenada em acetona 10% em água, até nova utilização.
EXEMPLO 5
Desacetilação enzimática de 6-O-acetil-TGS pelaenzima alcalase, uma enzima proteolíticaFoi recolhido 1,0 L de massa neutralizada após cloração,contendo 10g de TGS 6-O-acetilado para a reação enzimática. A massa dereação neutralizada foi diluída a 3 litros por meio do uso de água. Foramadicionados 200 ml de Alcalase 2,4L, uma enzima comercialmente obtida junto àNovozymes, derivada de B. Iichenformisl à mistura de reação, sob agitaçãocontínua, a uma temperatura entre 25°C e 30°C. A reação foi continuada durantevárias horas e a formação de TGS e o desaparecimento de TGS 6-O-acetiladoforam monitorados por cromatografia em camada delgada (TLC). Ao final de 36horas, obteve-se a desacilação de até 96,4%. Após a desacilação, a massa foilevada para o isolamento de TGS, por meio de métodos apropriados.
Claims (7)
1. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, caracterizado pelo fato de, no dito processo, umderivado clorado de uma sacarose 6-O-protegida em uma solução serdesprotegido por meio do uso da ação de uma enzima capaz de remover o grupode proteção.
2. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de:a. a dita sacarose 6-O-protegida compreender um ou maisentre: sacarose-6-acetato, sacarose-6-benzoato, sacarose-6-propionato,sacarose-6-laurato, saca rose-6-g luta rato, sacarose-6-palmitato e algo do gênero;b. a dita solução incluir uma solução de sacarose 6-0-protegida clorada pura, ou (ii) um fluxo de tratamento obtido em um processo deprodução de um composto de sacarose clorada.
3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de:a. o dito fluxo de tratamento compreender um ou mais deum processo para a produção de uma sacarose clorada, incluindo um processode cloração da sacarose ou um processo de cloração da sacarose 6-O-protegida,e;b. o dito composto de sacarose clorada incluir uma oumais de uma sacarose clorada, incluindo uma triclorogalactosacarose, umadiclorogalactosacarose, uma tetraclorogalactosacarose ou algo do gênero.
4. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fatode o dito processo de cloração compreender a reação de um derivado desacarose com um mais de um reagente de cloração, por meio de um ou mais deum processo, incluindo:a. a reação da sacarose 6-O-protegida dissolvida empiridina com cloreto de sulfurila, ou;b. a reação da sacarose 6-O-protegida com cloreto detionila, na presença de fosfina de trifenila e 1,1,2-tricloroetano, ou;c. a reação da sacarose 6-O-protegida, incluindosacarose-6-éster, com um reagente Vilsmeier-Haack1 cuja fórmula geral é[HCIC=N+R2]Cr ou [HPOCI2OC+=N+R2]CI", sendo que R representa um grupoalquila, de preferência, um grupo etila ou um grupo metila.
5. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fatode, no dito processo, a ação de uma enzima capaz de remover o grupo deproteção ser derivada de uma enzima lípase ou de uma enzima protease.
6. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fatode a dita enzima lípase ou a dita enzima protease ser uma enzima livre ouimobilizada.
7. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM COMPOSTO DESACAROSE CLORADA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fatode compreender as seguintes etapas:a. clorar a sacarose-6-acetato contida em (i) uma soluçãoou (ii) um fluxo de tratamento obtido em um processo de produção de sacaroseclorada com um regente de cloração selecionado do grupo que consiste em umreagente Vilsmeier-Haack, cloreto de sulfurila ou cloreto de tionila;b. ajustar o pH do fluxo de tratamento da etapa (a) dapresente reivindicação entre aproximadamente 6,5 e 7,0;c. desacilar o TGS 6-O-protegido formado no fluxo detratamento da etapa (i) ou da etapa (ii), colocando o mesmo em contato com aenzima lípase livre ou imobilizada ou com a enzima protease livre ou imobilizada,de preferência, acompanhado de agitação em um recipiente de reação ou derecirculação, através de um leito de enzima empacotada em uma coluna, depreferência, à temperatura ambiente, entre aproximadamente 25 e 30 grausCelsius, durante um período de tempo suficiente, para a obtenção da máximadesacilação possível, superior a 95%;d. separar o TGS de um ou mais de um componenteindesejado do fluxo de tratamento da etapa (c) da presente reivindicação.
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