BRPI0617607A2

BRPI0617607A2 - planta aloe transgÊnica, mÉtodo para a produÇço em uma planta de uma proteÍna biologicamente ativa exàgena À planta e mÉtodo para a produÇço de uma planta de aloe transgÊnica

Info

Publication number: BRPI0617607A2
Application number: BRPI0617607-0A
Authority: BR
Inventors: William J Lowther; Wen-Shuz Yeow; Kevin Lorick; Marisol Pages; Nicola J Lowter
Original assignee: Thegreencell Inc
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2011-07-26
Also published as: CN101313071A; DK1931792T3; US20120017336A1; CN102851306A; US20130061353A1; US20160160228A1; US8816154B2; ES2345359T3; US20090233273A1; CN101313071B; US9267149B2; JP5336849B2; JP2012196221A; AU2006292072B2; CN105106929A; AU2006292072A1; BRPI0617607B1; EP1931792A2; ATE474057T1; DE602006015492D1

Abstract

PLANTA ALCE TRANSGENICA, MÉTODO PARA A PRODUÇAO EM UMA PLANTA DE UMA PROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ATIVA EXàGENA À PLANTA E MÉTODO PARA A PRODUÇçO DE UMA PLANTA DE ALOE TRANSGÊNICA A presente invenção apresenta plantas de alce transgênicas e construtos recombinantes para a transformação de plantas de alce, cujos aspectos podem ser aplicados a outras monocotiledôneas. Os construtos recombinantes podemincluir uma ou mais seqúências de DNA que codificam as proteínas de mamífero e pelo menos um promotor capaz de dirigir a expressão de proteínas recombinantes em uma planta de aloe. A presente invenção também apresenta métodos para a construção e reprodução de uma planta de aloe transgênica. A presente invenção inclui métodos para a transfecção de uma planta de aloe com diversos genes de interesse simultaneamente. Os métodos de produção de plantas de aloe da invenção podem propiciar um potencial para a produção em massa barata e com mais segurança de alguns compostos biologicamente ativos incluindo compostos biofarmacêuticOs para a terapia, o diagnóstico e a prevenção de doenças, e são mais acessíveis aos países menos afluentes. Os métodos de produção de plantas de aloe também podem produzir proteínas para cosméticos.

Description

PLANTA ALOE TRANSGÊNICA, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO EMUMA PLANTA DE UMA PROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ATIVA EXÓGENA ÀPLANTA E MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE ALOETRANSGÊNICA

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOSO presente pedido de patente reivindica aprioridade e os benefícios do Pedido de Patente Norte-americano Provisório intitulado TRANSGENIC ALOE PLANTS FORPRODUCTION OF PROTEINS AND RELATED METHODS depositado em 26de setembro de 2005 e ao qual foi atribuído o N0 . de Série60/720.540, que é aqui incorporado em sua totalidade a títulode referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Sumário da Invenção

A presente invenção refere-se a plantastransgênicas monocotiledôneas e, mais particularmente, aplantas de aloe transgênicas, e aos métodos e às composiçõespara a produção de uma planta de aloe transgênica e aosmétodos para a extração de proteínas das plantas de aloetransgênicas.

Descrição da Técnica Relacionada:

Continua havendo um mercado crescente para asproteínas biologicamente ativas, muitas das quais sãoutilizadas para finalidades terapêuticas. Atualmente, sãodisponíveis mais de 160 medicamentos à base de proteínas.Cinqüenta medicamentos adicionais ou mais estão aguardando asua aprovação nos próximos anos. A demanda atual pelaprodução de proteína terapêutica já ultrapassa a capacidadeda indústria. Foi previsto que a indústria irá precisaraumentar a sua capacidade em quatro a cinco vezes parasuperar esse obstáculo. No entanto, as instalações para a-produção de proteínas terapêuticas são dispendiosas etipicamente levam muito tempo para serem construídas.Conseqüentemente, existe a necessidade de métodos de produçãoque sejam mais baratos e possam reduzir o tempo requeridopara acelerar a produção.

Alguns métodos de produção de proteínas à base deanimais são utilizados. No entanto, estes normalmenteintroduzem riscos à saúde por causa das doenças. Tais riscospodem surgir da contaminação cruzada com doenças que podemafetar o animal e o usuário final tal como um pacientehumano. Conseqüentemente, existe a necessidade de um métodode produção que elimine a possibilidade de contaminaçãocruzada entre o organismo de produção e o usuário final.

Além disso, muitos métodos de produção atuaisrequerem processamento extensivo a fim de extrair a proteínaterapêutica do animal ou de outro organismo hospedeiro em queela foi produzida e colocar o composto em uma condição ondeele possa ser utilizada por um paciente. Depois dapurificação, a proteína pode ser combinada com um adjuvanteou um outro material carreador para estabilizar a proteína epermitir a utilização por um paciente. No entanto, osprocessos de extração, purificação, ressuspensão entre outrosenvolvidos com o processamento de uma proteína terapêuticasão complexos e incômodos e podem não conduzir à utilizaçãoem países subdesenvolvidos geralmente com necessidade deterapêutica. Conseqüentemente, existe a necessidade demétodos de produção simplificados que possam eliminar oureduzir o processamento pós-extração de proteínasterapêuticas.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

As composições e os métodos de acordo com apresente invenção podem satisfazer muitas das necessidades edeficiências discutidas acima e irão propiciar melhorias evantagens adicionais tal como será reconhecido por um técnicono assunto no momento da revisão da presente descrição.Em um aspecto, a presente invenção pode apresentaruma planta de aloe transgênica que incorpora estavelmente umgene de interesse. Em outros aspectos, novos vetores econstrutos podem ser providos para integrar as seqüências deDNA de interesse no genoma de uma planta de aloe. A seqüênciade interesse pode codificar para uma proteína biologicamenteativa. A proteína biologicamente ativa pode consistir eminterferons, imunoglobulinas, linfocinas, fatores docrescimento, hormônios, fatores sangüíneos, antígenos dehistocompatibilidade, enzimas, proteínas cosméticas e outrasproteínas de mamíferos ou outras proteínas de interesse. Emalguns aspectos, as proteínas de interesse são proteínashumanas. As plantas de aloe de acordo com a presente invençãopodem transcrever e traduzir o gene de interesse na proteínade interesse. Em um aspecto, pelo menos parte da proteína deinteresse migra para uma porção central da folha de aloe. Emoutros aspectos, a proteína de interesse pode incluir umaseqüência de sinal para facilitar a sua translocação para aporção central da folha de aloe. Em outros aspectos, podemser providas novas metodologias para o isolamento de célulasindividuais a partir de uma planta de aloe. Contudo, emoutros aspectos, a presente invenção pode apresentar novosmétodos para a integração dos vetores em uma planta de aloe eem uma reprodução de tais plantas de aloe transgênicas.

As plantas de aloe transgênicas que produzemproteínas de mamíferos de acordo com a presente invençãopodem propiciar uma alternativa mais economicamente viávelpara a produção das proteínas de interesse tais como, porexemplo, várias proteínas biologicamente ativas e cosméticas.

Em um aspecto, as proteínas de interesse podem serlocalizadas e/ou concentradas dentro do gel da folha de aloe.Essa localização das proteínas de interesse pode simplificara remoção da proteína da planta. Nesse aspecto, a proteína deinteresse pode ser co-extraída juntamente com a extração dogel nativo dentro da porção central da folha de aloe.

Conseqüentemente, a presente invenção pode apresentar umaplanta transgênica a partir da qual as proteínas de interessesão geralmente mais facilmente acessíveis do que aquelas damaioria das plantas transgênicas tais como, por exemplo, otabaco e o milho. Além disso, a presente invenção podeapresentar um método eficiente para o isolamento deproteínas. Contudo, em outros aspectos, as proteínas deinteresse podem não estar particularmente localizadas dentroda planta de aloe. No entanto, a anatomia e a fisiologia daplanta de aloe podem ainda conferir determinadas vantagensadicionais para a produção da proteína de interesse tal comoserá reconhecido por um técnico no assunto no momento darevisão da presente descrição.

As plantas de aloe podem propiciar várias vantagensem relação aos métodos convencionais de produção dasproteínas de interesse em bactérias e leveduras. As vantagensdas plantas de aloe podem incluir a capacidade deprocessamento de proteínas de maneira que as bactérias eleveduras unicelulares simples não são muito adequadas e quepodem ser necessárias para produzir as proteínas na formadesejada. Esse processamento pode incluir a modificaçãoquímica, tal como através da glicosilação e do desdobramentode algumas proteínas, por exemplo. Além disso, em comparaçãocom outros métodos de produção de proteína à base de célulasanimais, a produção de plantas de aloe pode oferecer custos-benefícios significativos, vantagens de escalabilidade e umrisco reduzido de contaminação que pode ser prejudicial aosseres humanos.

Um gel modificado por proteína da porção central da-folha de aloe de uma planta de aloe transgênica de acordo coma presente invenção pode ser utilizado diretamente da plantade aloe. Isto pode evitar a necessidade de extraçãorelativamente complexa e dispendiosa das proteínas deinteresse dos materiais de planta nativa. Em alguns aspectos,o gel extraído da folha pode ser utilizado diretamente sem anecessidade de extração ou processamento da proteína. 0 gelpode estar na forma de seiva extraída mecanicamente de umaextremidade aberta de uma folha quebrada de uma planta dealoe transgênica.

A presente invenção pode apresentar alternativaseconomicamente viáveis para a produção de proteínas de sereshumanos e outros mamíferos que sejam biologicamente ativase/ou tenham aplicações cosméticas.

No momento da revisão da presente descrição, umtécnico no assunto irá reconhecer melhorias e vantagensadicionais da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 ilustra um exemplo da anatomia em seçãotransversal de uma folha de aloe;

a Figura 2 ilustra exemplos de métodos para ageração do tecido de calo;

a Figura 3 esboça diagramaticamente várias etapaspara a geração de uma planta de aloe transgênica;

a Figura 4 ilustra diagramaticamente componentes deum vetor de plasmídeo incluindo as informações sobreseqüência;

a Figura 5 relaciona as informações sobre seqüênciapara o promotor de ubiquitina do milho e destaca regiões dopromotor de ubiquitina;

as Figuras 6A e 6B ilustram a construção de umsistema de vetor de plasmídeo de acordo com os aspectos dapresente invenção;

as Figuras 7A a 7C ilustram a construção de umoutro sistema de vetor de plasmídeo de acordo com os aspectosda presente invenção;

a Figura 8 ilustra a construção de um sistema devetor de plasmídeo adicional de acordo com os aspectos dapresente invenção; e

a Figura 9 ilustra a construção de sistemas deintegração de acordo com os aspectos da presente invenção.

Todas as Figuras são ilustradas apenas para fins defacilitar a explanação dos ensinamentos básicos da presenteinvenção; as extensões das Figuras com respeito ao número, àposição, à seqüência, à relação e às composições das váriasrealizações serão explicadas ou estarão dentro da habilidadeda técnica após a revisão da seguinte descrição. Além disso,os vários protocolos, ferramentas e composições para aprática das invenções descritas estarão dentro da habilidadeda técnica após a revisão da descrição seguinte.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Conforme utilizado no relatório descritivo, "um" ou"uma" pode significar um ou mais. Conforme utilizado nasreivindicações, quando utilizadas conjuntamente com a palavra"que compreende", as palavras "um" ou "uma" podem significarum ou mais de um. Conforme utilizado na presente invenção,"um outro" pode significar pelo menos um segundo ou mais.

Conforme utilizado na presente invenção, uma"célula de aloe transformada" significa uma célula de plantaque é transformada com o DNA recombinante estavelmenteintegrado, não-natural, por exemplo, pela transformaçãomediada por Agrobacterium ou pelo bombardeamento utilizandomicropartículas revestidas com o DNA recombinante ou outrosmeios. Uma célula de Aloe transformada da invenção pode seruma célula de planta originalmente transformada que existecomo um microorganismo ou como uma célula de planta deprogênie que é regenerada como um tecido diferenciado, porexemplo, em uma planta de Aloe transgênica 10 com DNArecombinante estavelmente integrado, não-natural, ou sementeou pólen derivado de uma planta de Aloe transgênica deprogênie 10.

Conforme utilizado na presente invenção, umaplanta de aloe transgênica" significa uma planta de aloecujo genoma é alterado pela integração estável do DNArecombinante. Uma planta de aloe transgênica 10 inclui umaplanta de aloe regenerada de uma célula de aloe originalmentetransformada e as plantas de aloe transgênicas de progênie degerações ou de cruzamentos posteriores de uma planta aloetransformada 10.

Conforme utilizado na presente invenção, um "DNArecombinante" significa um DNA que foi desenhadogeneticamente e construído fora de uma célula incluindo o DNA que contém o DNA que ocorre naturalmente, cDNA, o DNAsintético e/ou outro DNA.

Conforme utilizado na presente invenção, o"promotor" significa o DNA regulador para a inicialização datranscrição. Um "promotor de planta" é um promotor comcapacidade de iniciar a transcrição em células de aloe quer asua origem seja uma célula de aloe ou não, por exemplo, é bemsabido que os promotores de Agrobacterium são funcionais emcélulas de aloe. Desse modo, os promotores de planta incluemo DNA do promotor obtido das plantas, dos vírus e dasbactérias das plantas tais como as bactérias Agrobacterium eBradyrhizobium. Os exemplos de promotores sob o controle dedesenvolvimento incluem os promotores que iniciampreferencialmente a transcrição em determinados tecidos, taiscomo as folhas, as raízes ou as sementes. Tais promotores sãodenominados como "preferidos de tecido". Os promotores queiniciam a transcrição somente em determinados tecidos são-denominados como "específicos de tecido". Um promotorespecífico de um "tipo de célula" dirige principalmente aexpressão em determinados tipos de células dentro de um oumais órgãos, por exemplo, células vasculares nas raízes ounas folhas. Um promotor "indutível" ou "repressível" é umpromotor que está sob o controle ambiental. Os exemplos decondições ambientais que podem afetar a transcrição porpromotores indutíveis incluem as condições anaeróbicas oudeterminados químicos, ou a presença de luz. Os promotoresespecíficos de tecido, preferidos de tecido, específicos detipos de células e os promotores indutíveis constituem aclasse de promotores "não-constitutivos". Um promotor"constitutivo" é um promotor que é ativo sob a maior partedas condições. O promotor pode incluir intensificadores ououtros elementos que afetem a iniciação da transcrição, osítio de início da transcrição, os níveis da transcrição, osítio de fim da transcrição ou qualquer pós-processamento doácido ribonucléico resultante.

O termo "construto genético", conforme utilizado napresente invenção, é definido como uma seqüência de DNA quecompreende um arranjo sintético de pelo menos dois segmentosde DNA para a finalidade de criar uma planta de aloetransgênica. Em uma realização específica, um segmento é umaseqüência reguladora e um outro segmento codifica um produtodo gene.

Conforme utilizado na presente invenção, "ligadosde modo operável" significa a associação de dois ou maisfragmentos de DNA em um construto de DNA de modo que afunção, por exemplo, de um DNA de codificação de proteína,seja controlada pelo outro, por exemplo, um promotor, umaseqüência de terminação, etc.

O termo "transcrição", conforme utilizado napresente invenção, é definido como a geração de uma moléculade RNA a partir de um molde de DNA.

O termo "tradução", conforme utilizado na presenteinvenção, é definido como a geração de um polipeptídeo de ummolde de RNA.

Conforme utilizado na presente invenção, "expresso"significa produzido, por exemplo, uma proteína é expressa em uma célula de planta quando o seu DNA cognato é transcritopara o mRNA que é traduzido para a proteína.

A presente invenção pode apresentar novas plantasde aloe transgênicas 10 que expressam várias proteínas deinteresse, pode apresentar métodos e composições para aprodução de plantas de aloe transgênicas 10, pode apresentarmétodos para a extração de proteínas das plantas de aloetransgênicas 10 e pode apresentar novas composições dasproteínas de interesse e componentes da planta de aloetransgênica 10. As proteínas de interesse produzidas deacordo com a presente invenção podem incluir um sinalsecretório para facilitar a sua acumulação na seiva 18 ou naseiva de uma folha de aloe 12. Em um aspecto, essa acumulaçãopode ocorrer, pelo menos em parte, dentro das célulasmusalegenosas da folha de uma planta de aloe transgênica 10.

A seiva 18 ou a polpa de uma folha de aloe 12inclui os componentes da folha que, pelo menos em parte, sãodenominados geralmente como "gel" quando extraídos da folhade aloe 12. Conforme utilizado na presente invenção, o "gel"irá se referir à seiva extraída 18 e a outros materiaisassociados que acompanham a seiva 18 enquanto ela é extraídada folha de aloe 12, independentemente do grau deprocessamento subseqüente. De acordo com um ou mais aspectosda presente invenção, o gel da folha de aloe 12 pode ter umacomposição modificada. Em um aspecto particular, a composiçãodo gel pode ser modificada de modo a incluir pelo menos umcomponente de proteína exógeno que é denominado como um "gelmodificado por proteína". A extração de um gel modificado porproteína com a(s) proteína(s) associada(s) de interesse podepropiciar proteínas facilmente acessíveis e/ou métodoseficientes para o isolamento de proteínas. O gel modificadopor proteína produzido e/ou extraído de acordo com a presenteinvenção pode ser utilizado diretamente sem a necessidade deextração da proteína.

Os aspectos da presente invenção são ilustrados demaneira geral nas Figuras 1 a 8 para finalidadesexemplificadoras. A presente invenção apresenta plantastransgênicas, composições e metodologias que são geralmenteaplicáveis ao gênero aloe da família Liliacae. Tipicamente, apresente invenção descrita com referência à aplicação naespécie é selecionada do grupo Aloe vera (barbadensismiller), Aloe ferox e Aloe arborescence para finalidadesexemplificadoras. 0 gênero Aloe inclui geralmente um grupo deplantas monocotiledôneas grandes, suculentas de roseta semcaule. Essas plantas são geralmente denominadas plantas dealoe 10 para as finalidades da presente descrição.

Vários compostos produzidos por plantas de aloeforam utilizados para finalidades medicinais. Essescompostos, quando presentes em um gel modificado porproteína, podem complementar as propriedades medicinais dasproteínas biologicamente ativas de uma planta de aloetransgênica 10 de acordo com a presente invenção. A Figura 1ilustra uma seção transversal através de uma folha 12 de umaplanta de aloe transgênica 10. As folhas da planta de aloetransgênica 10 incluem uma mistura gelatinosa, facilmenteextraível, de proteínas, carboidratos e água, e incluída nogel que é derivado principalmente da seiva 18. Essa misturagelatinosa fica situada principalmente na porção central deuma folha de aloe 12. Foi demonstrado que vários compostos nogel têm uma série de propriedades e de utilizaçõesmedicinais. Em um aspecto, o gel e/ou a seiva 18 estabilizauma proteína transgênica produzida por uma planta de aloetransgênica 10 e localizada no gel e/ou na seiva 18.

A Figura 1 ilustra particularmente a epiderme 14, ocórtex ou o mesófilo 16 e a seiva ou a polpa 18. A epiderme14 forma a camada externa de células da folha. Em um aspectoda presente invenção, uma planta de aloe transgênica podeincluir células de aloe em um ou em mais desses tecidos queincorporam transiente ou estavelmente um construto genéticoque é expresso pela célula de aloe. 0 córtex 16 inclui ascélulas ricas em cloroplastos bem como os feixes vasculares,o xilema e o floema. A seiva 18 é o parênquima esponjosocomposto quase que exclusivamente de células do córtexgrandes e, pelo menos em parte, representa o gel onde podeser vantajosa a incorporação ou a acumulação de uma ou maisproteínas transgênicas de interesse.

A epiderme 14 consiste tipicamente em uma únicacamada externa de células. Imediatamente abaixo da epiderme14, fica o córtex 16 incluindo a rede de feixes vasculares. 0suporte externo dos feixes vasculares é formado geralmentepelas células de revestimento. Os feixes vasculares sãocompostos por três tipos gerais de estruturas tubulares: oxilema, o floema e os túbulos pericíclicos grandesassociados. 0 xilema transporta a água e os minerais dasraízes à folha da planta. O floema transporta os amidos eoutros materiais sintetizados por toda a planta. Os túbulospericíclicos contêm um látex ou uma seiva que é muito rica emantraquinonas laxantes, especialmente a aloína. Asantraquinonas absorvem os raios ultravioletas do sol eimpedem o superaquecimento da porção central da folha de aloe12 que funciona geralmente como o órgão de armazenagem deágua da planta de aloe. A porção pericíclica dos feixesvasculares é aderente à epiderme 14, sendo que o restante dosfeixes vasculares se projeta na seiva 18. A porção maisinterna e principal da folha de aloe 12 é a seiva 18 que,pelo menos em parte, constitui o gel. Para finalidades deextração de gel, a epiderme 14 e o córtex 16 podem geralmenteser considerados como compreendendo o revestimento que contémo gel. O gel extraído, que compreende substancialmente aseiva 18, é uma substância tipicamente espessa e viscosa quetem sido historicamente aplicada topicamente na pele parafinalidades medicinais, por exemplo, tal como uma terapiapara queimaduras e feridas.

0 gel funciona geralmente como um reservatório demateriais para a planta de aloe. O córtex 16 sintetizatipicamente muitos dos carboidratos e das glicoproteínas quesão necessárias para a planta de aloe. Os carboidratossintetizados em excesso são transportados tipicamente a seiva18 para armazenagem em conjunto com a água e alguns minerais.Os carboidratos são transportados pelos vasos do floema aosgrandes vacúolos dentro das células do córtex 16 da seiva 18.A água é então atraída osmoticamente aos carboidratos,permitindo que a seiva 18 funcione como um órgão dearmazenagem de água da planta de aloe.

0 gel é extraído de um modo relativamente fácil aorasgar uma folha de aloe 12 ao longo de seu eixo longitudinale ao esmagar a folha para forçar o gel do revestimentocircunvizinho em direção ao rasgo. Materiais adicionais podemser extraídos dos tecidos da folha junto com o gel.

Visão Geral do Processo

As plantas de aloe transgênicas 10 de acordo comuma ou mais das presentes invenções incluem geralmente um oumais construtos de DNA incorporados estavelmente dentro daplanta para expressar uma ou mais proteínas de interesse. Ageração de uma planta de aloe transgênica 10 de acordo comuma ou mais das presentes invenções pode envolver uma-variedade de novas composições e métodos. Tipicamente, um oumais construtos de DNA são desenvolvidos para expressar umaou mais proteínas na planta de aloe transgênica 10. Em umaspecto, um único construto pode expressar um único mRNA. Emoutros aspectos, um único construto pode expressar um mRNAmúltiplo. Contudo, em outros aspectos, múltiplos construtospodem produzir um mRNA múltiplo. Cada mRNA pode produzir umou mais polipeptídeos.

Para introduzir os construtos nas plantas de aloe,as células de aloe ou o tecido de calo não-diferenciado sãoutilizados tipicamente tal como ilustrado geralmente naFigura 2. As células de aloe e o tecido de calo são derivadostipicamente dos tecidos do meristema da raiz ou da folha oude uma semente de uma planta de aloe. Os construtos de DNAsão introduzidos nas células de aloe utilizando uma variedadede técnicas e/ou construtos, tal como ilustradodiagramaticamente na Figura 3. Algumas técnicas serãoreconhecidas por um técnico no assunto no momento da revisãoda presente descrição. As células de aloe ou o tecido de caloque incorpora os construtos desejados são selecionadosutilizando várias técnicas. Tipicamente, o construto de DNAdeve incluir um marcador selecionável. Uma vez que oconstruto desejado tenha sido introduzido estavelmente nascélulas de aloe ou no tecido do calo, as mudas de planta dealoe são geradas tipicamente a partir das células de aloe oudo tecido do calo. As mudas de planta de aloe que se tornamas plantas de aloe transgênicas 10 viáveis que contêm osconstrutos de DNA podem produzir constitutivamente ouproduzir indutivamente a(s) proteína(s) desejada(s) deinteresse. A proteína de interesse pode ser localizada naplanta de aloe transgênica 10 ou pode ser encontradageralmente por toda a planta de aloe transgênica 10,dependendo da proteína particular que está sendo produzida-e/ou da presença ou ausência de uma seqüência de sinalassociada com a proteína. Dependendo do construto e/ou dasproteínas associadas particulares de interesse, a planta dealoe transgênica 10 pode ser então vegetativa ou sexualmentepropagada. As proteínas podem ser isoladas das plantas dealoe transgênicas 10 utilizando uma ampla faixa de técnicas.

As proteínas podem ser então adicionalmente isoladas e/ouadicionalmente processadas. Tal processamento pode incluir amodificação enzimática, a modificação química, a incorporaçãoem um adjuvante apropriado, entre outros processamentos queserão reconhecidos por um técnico no assunto no momento darevisão da presente descrição. Em um aspecto, as proteínaspodem ser processadas a partir de uma forma inativa(precursor) em uma forma ativa para as aplicações específicasda proteína particular.

Isolamento de células

Conforme mostrado na seqüência exemplificadorailustrada na Figura 2, as células de aloe ou os grupos decélulas de aloe são isolados tipicamente de uma planta dealoe antes da incorporação do construto desejado. Os tipos decélulas de aloe escolhidos geralmente para a incorporação deconstrutos de DNA são escolhidos geralmente com base em seupotencial regenerativo. As células meristemáticas domeristema do broto ou do meristema da raiz de uma planta dealoe ou de células de aloe embrionárias de uma semente dealoe podem ser utilizadas. No entanto, muitas partes daplanta de aloe retêm o potencial de crescer novamente ou deformar tecido de calo e também podem ser utilizadas. Ascélulas são isoladas ao empregar tipicamente uma gama detécnicas que serão reconhecidas por um técnico no assunto nomomento da revisão da presente descrição. Tipicamente, ascélulas são isoladas mecanicamente da planta de aloeutilizando um bisturi. Alternativamente, outras técnicasmecânicas ou diferentes destas podem ser utilizadas paraisolar as células necessárias, tal como será reconhecido porum técnico no assunto no momento da revisão da presentedescrição. Uma vez que uma célula de aloe ou um grupoapropriado de células de aloe é isolado, as células de aloecrescem tipicamente na cultura para formar o tecido de calo.

Embora determinadas técnicas possam não requerer que ascélulas de aloe sejam primeiramente cultivadas no tecido decalo, o tecido de calo fornece uma fonte de um conjunto decélulas de aloe não-diferenciadas que retém o potencial paragerar uma planta de aloe transgênica 10. O tecido de calocresce tipicamente em um meio sólido. No entanto, o tecido decalo também pode ser colocado em um meio de cultura liquido epode crescer em suspensão.

As células meristemáticas podem ser isoladas daspontas das raízes ou da folha de uma planta de aloe. Ascélulas de aloe meristemáticas também podem ser isoladas domeristema apical. Tipicamente, a planta de aloe a partir daqual os tecidos são isolados é uma planta de aloe jovem esaudável. A planta de aloe é selecionada tipicamente para queseja menor do que oito (8) polegadas com seis (6) brotosprimários ou menos. Uma ferida é formada tipicamente em umbroto de uma planta de aloe ao cortar a mesma em segmentos. Asuperfície ferida pode incentivar as células de aloe acrescer. Tipicamente, é principalmente na superfície de corteque o calo irá começar a crescer. Para isolar as células dealoe de uma folha de aloe 12, os segmentos são cortadostipicamente a partir da extremidade distai de um broto jovemem crescimento. As porções do segmento são então chapeadas emum meio de crescimento. 0 tecido do meristema apical do brotoé derivado de um corte de uma polegada da base de uma plantade aloe jovem. As folhas de aloe 12 são removidas do corte eo segmento é chapeado. As células de aloe do meristema sãoencontradas dentro do "corte". Elas são "selecionadas" ou"isoladas" por sua capacidade de continuar a crescer na placade cultura - formando tecido de calo ou brotos que seregeneram. As células de aloe meristemáticas isoladas uma vezsão então cultivadas em um meio apropriado e sob condiçõesque promovam a formação de tecido de calo.

O isolamento de células de aloe embrionárias dassementes envolve geralmente a remoção do revestimento dasemente para expor o embrião e a remoção mecânica das célulasde aloe desejadas do embrião. As sementes de aloe sãotipicamente esterilizadas e as cascas secas externas dasemente são removidas. Para remover mecanicamente as célulasde aloe de uma planta de aloe ou de um embrião de aloe, umbisturi é tipicamente utilizado. As células de aloeembrionárias, uma vez isoladas do revestimento da semente,são então cultivadas em um meio apropriado e sob condiçõesque promovam a formação do tecido de calo.

Quando o tecido de calo é desejado, as células dealoe isoladas crescem tipicamente sob condições que favorecema formação do tecido de calo, tal como será reconhecido porum técnico no assunto no momento da revisão da presentedescrição. Tipicamente, as células de aloe isoladas sãochapeadas e crescem em um meio nutriente sólido apropriadopara a formação de tecido de calo, com um tamanho deaproximadamente 1 cm de diâmetro antes da transformação. Ascélulas de aloe crescem tipicamente entre 23 e 26 grausCelsius. Os meios apropriados incluem um sólido ou líquidobase que inclui tipicamente nutrientes inorgânicossuplementares - ambos macroelementos (tais como nitrogênio,enxofre, fósforo, cálcio, magnésio e potássio) emicroelementos (tais como ferro, boro, cobalto, cobre, iodo,manganês, molibdênio e zinco); nutrientes orgânicos incluindoaçúcares (sacarose ou maltose) e vitaminas e cofatores•(tiamina, niacina, biotina, piridoxina, mio-inositol entreoutros); aminoácidos (tais como o hidrolisado de prolina e decaseína); bem como reguladores do crescimento principalmenteuma fonte de auxina (tipicamente ácido 1-naftalenoacético(NAA) , indol-3- ácido acético (IAA), ou ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)) e uma fonte de citocinina(tipicamente 6-benzil amino purina (BAP)). Esses meios evitaminas estão tipicamente comercialmente disponíveis emcomposições pré-formuladas com concentrações variáveis denutrientes e de vitaminas inorgânicas e são conhecidos, entreoutros, como meio de MS (Murashige-Skoog) , meio Gamborg oumeio Chu N6. Adicionalmente, as células que cresceram nasplacas de Petri requerem tipicamente que um suporte de matrizsólida, tal como o agar, seja adicionado aos meios decrescimento.

Formação de Construtos de DNA

Os construtos de DNA apropriados são introduzidostipicamente no tecido de calo derivado das células de aloeisoladas para permitir a produção da(s) proteína(s) deinteresse pela planta de aloe transgênica 10 resultante. Osconstrutos de DNA também podem ser introduzidos nas célulasde aloe isoladas ou nas plantas de aloe maduras, tal comopode ser reconhecido por um técnico no assunto no momento darevisão da presente descrição. Os construtos de DNA sãoincorporados tipicamente em um vetor tal como um plasmídeo ouum vírus para a propagação do construto e para a introduçãonas células de aloe. Um vetor de plasmídeo exemplificadorpode incluir o plasmídeo introduzido no mercado sob o nomecomercial pZErO pela Invitrogen (Carlsbad, Califórnia),ilustrado diagramaticamente na Figura 4 para finalidadesexemplif icadoras e pode incluir uma ou mais das unidadesfuncionais, por exemplo, desse plasmídeo.

Os construtos de DNA de acordo com a presente-invenção podem incluir uma seqüência de promotor que podefuncionar em uma célula de aloe, uma seqüência que codificauma proteína de interesse, uma seqüência de terminal e umsítio de início e de fim translacional que podem funcionar emuma célula de aloe. Esses componentes, quando configurados ecombinados corretamente, podem iniciar a transcrição do DNA ea tradução do mRNA e de sua terminação respectiva em umacélula de aloe. O construto de DNA também pode incluir umsinal de secreção. Alternativamente, algumas proteínas deinteresse, tais como, por exemplo, interferon, podem incluirum domínio, natural ou sintético, que alveja o interferonpara a secreção. O sinal de secreção é tipicamente clivado àmedida que a proteína sai da célula ou, em alguns casos, podeser retido pela proteína sem afetar substancialmente a funçãoda proteína. Os sinais secretórios podem ser adicionados auma variedade de proteínas que podem requerer sinaissecretórios para a translocação. Esses sinais secretóriospodem ser derivados de várias seqüências de secreção deplanta. 0 construto de DNA ou um vetor associado também podeincluir pelo menos um marcador selecionável. Em um aspecto, oconstruto de DNA pode incluir um primeiro marcadorselecionável para a propagação do vetor nas bactérias e ummarcador selecionável para o crescimento em células de aloe.Além disso, o construto de DNA pode incluir outros elementosreguladores para a expressão em células de aloe específicasna planta de aloe 10. Outros componentes do construto podemincluir elementos reguladores adicionais, tais como oslíderes 5' e os íntrons para intensificar a transcrição, asregiões 3' não-traduzidas (tais como os sinais e sítios depoliadenilação), DNA para peptídeos em trânsito. Aamplificação de uma seqüência de DNA desejada, tal como umaseqüência que codifica uma proteína terapêutica desejada,pode ser executada pela reação em cadeia de polimerase (vide-as Patentes U.S. N°. 4.683.202 e 5.928.906, cada uma dasquais é aqui incorporada a título de referência) . No momentoda revisão da presente descrição, um técnico no assunto iráreconhecer que os construtos de DNA, incluindo as seqüênciasde promotor, as seqüências reguladoras, as seqüências deestabilização, as seqüências de alvejamento e/ou asseqüências de terminação podem ser modificados para afetar asua função utilizando os métodos conhecidos por um técnico noassunto.

Conforme observado acima, tipicamente é utilizadoum promotor que é operável em uma célula de aloe. 0 promotorcontém tipicamente os elementos genéticos aos quais asproteínas e as moléculas reguladoras podem se ligar. Essasproteínas incluem tipicamente a RNA polimerase e outrosfatores da transcrição. 0 promotor é ligado de modo operávelem uma posição e/ou orientação funcional a uma seqüência deácido nucléico para controlar a iniciação e/ou a expressãotranscricional dessa seqüência. 0 promotor pode ou não serutilizado conjuntamente com um "intensificador", que serefere a uma seqüência reguladora com atuação em eisenvolvida na ativação transcricional de uma seqüência deácido nucléico.

Naturalmente, será importante empregar um promotore/ou um intensificador que dirija eficazmente a expressão dosegmento de DNA em pelo menos um tipo de célula de uma plantade aloe 10 em que a expressão é desejada. Um técnico noassunto de biologia molecular geralmente conhece a utilizaçãodos promotores, intensificadores e as combinações de tipos decélulas para a expressão da proteína, por exemplo, videSambrook et al. (1989), incorporado na presente invenção atítulo de referência. Os promotores empregados podem serconstitutivos, específicos de tecido, indutíveis e/ou úteissob condições apropriadas para dirigir a expressão de nívelelevado do segmento introduzido do DNA, tal como é vantajosona produção em grande escala de peptídeos e/ou proteínasrecombinantes. O promotor pode ser heterólogo ou endógeno. Osconstrutos de DNA requerem tipicamente os sinais reguladoresde iniciação e terminações transcricional e translacionalcapazes de funcionar nas células de aloe. Uma ampla variedadede seqüências que regulam a iniciação transcricional pode serutilizada. As seqüências de DNA que controlam a iniciação datranscrição podem advir de Agrobacterium, vírus ou plantas. Aregião de iniciação da transcrição viral 35S do vírus demosaico da couve-flor (35S-CaMV) pode ser utilizada para asplantas de aloe 10. Os promotores de plantas que podem serutilizados na planta de aloe 10 também podem incluir opromotor de subunidade pequeno de ribulose-1,5-bisfosfatocarboxilase (RUBISCO) de várias plantas monocotiledôneas oudicotiledôneas ou o promotor de ubiquitina do milho. Outrospromotores apropriados podem ser utilizados e podem serreconhecidos por um técnico no assunto no momento da revisãoda presente descrição. Se a regulação indutível for desejada,os domínios podem ser obtidos a partir de diferentes fontes,de modo que uma região reguladora de uma fonte seja combinadacom um domínio de ligação de polimerase de RNA de uma outrafonte. A regulação da expressão pode ser um estágioparticular do desenvolvimento de uma planta de aloetransgênica 10 em uma parte específica da planta de aloetransgênica 10 tais como as raízes, as folhas, as sementes,as flores, a seiva ou em uma combinação de partes da planta ede estágios em desenvolvimento. A regulação da expressão a umestágio particular do desenvolvimento ou do tecido poderequerer elementos adicionais do DNA, tal como seráreconhecido por um técnico no assunto no momento da revisãoda presente descrição.

Numerosos outros promotores que são ativos emcélulas de planta foram descritos na literatura e podem serúteis nas células de aloe. Estes incluem os promotorespresentes nos genomas de plantas, bem como os promotores deoutras fontes, incluindo: os promotores da sintase denopalina (NOS) e os promotores da síntese de octopina (OCS)carregados nos plasmídeos indutores de tumor de Agrobacteriumtumefaciens; e promotores de caulimovirus tais como o vírusde mosaico da couve-flor. Além disso, vários outrospromotores também foram identificados em várias referências,incluindo, mas sem ficar a eles limitadas, as Patentes U.S.N°. 5.858.742 e 5.322.938, que descrevem versões do promotorconstitutivo derivado do vírus de mosaico da couve-flor(CaMV35S); a Patente U.S. N°. 5.641.876, que descreve umpromotor de actina do arroz; a Publicação do Pedido dePatente 2002/0192813A1, que descreve os elementos 5', 3'íntron úteis no projeto de vetores eficazes da expressão deplantas; o Pedido de Patente U.S. N°. de Série 09/757.089,que descreve um promotor de aldolase de cloroplastos domilho; o Pedido de Patente U.S. N°. de Série 08/706.946, quedescreve um promotor de glutelina do arroz; o Pedido dePatente U.S. N°. de Série 09/757.089, que descreve umpromotor de aldolase do milho (FDA) ; e o Pedido de PatenteU.S. N°. de Série 60/310.370, que descreve um promotor dasintase de nicotianamina do milho, os quais são incorporadosna presente invenção a título de referência. Estes enumerosos outros promotores que funcionam em células deplantas podem ser operáveis em uma planta de aloe transgênicapara a expressão de proteínas terapêuticas desejadas.

Como um exemplo particular, o promotor deubiquitina (SEQ ID N°. 44) do milho pode ser utilizado. Opromotor de ubiquitina do milho é um elemento grande, comquase 2 kb de comprimento, composto por pelo menos trêsregiões gerais. A sua seqüência é relacionada na Figura 5 com-as características particularmente relevantes etiquetadas. Aprimeira seção do promotor de ubiquitina que fica situada naextremidade superior 51 contém as regiões de fixação damatriz (MARs) que são os elementos que interagem com oshistóricos e outras proteínas nucleares e servem para "formarlaços" nas seqüências de flanqueamento, tornando as mesmasmais facilmente acessíveis à maquinaria transcricional dacélula. Eles também ajudam a isolar as unidadestranscricionais umas das outras, o que é importante paraimpedir que a transcrição iniciada em um lugar "seja lida" emuma segunda seqüência. Isto pode ajudar a reduzir o risco dacriação de mensagens anti-sentido.

A segunda seção contém os elementos dointensificador e o promotor real. Os elementos dointensificador ligam os fatores da transcrição que sãoresponsáveis por dirigir a maquinaria transcricional, ocomplexo pol II, para se ligar ao promotor e iniciar atranscrição. Embora o "promotor" se refira especificamenteaos elementos essenciais do DNA necessários para interagircom a maquinaria de iniciação da transcrição do núcleo, otermo promotor é utilizado de maneira mais genérica de modo aenglobar todos os elementos do DNA envolvidos com a iniciaçãoda transcrição e, neste caso, o "promotor de ubiquitina" éutilizado livremente para significar qualquer região de 2kbou as modificações de 5' para o gene clonado de interesse.

A terceira seção contém um íntron deaproximadamente 1 kb. Os íntrons são as regiões de um genetranscrito que são removidas da mensagem traduzida final, omRNA, através do processo de encaixe. Também foi verificadoque os íntrons influenciam diretamente a expressão de genes,fornecendo elementos do intensificador alternativos, bem comoao aumentar a tradução da proteína, facilitando atranslocação de mensagens do RNA do núcleo ao citoplasma - um-processo ligado em parte à montagem de genes. No entanto, apresença dos íntrons em sistemas transgênicos nem sempreresulta em aumentos na expressão do RNA ou nos níveis deproteína traduzida. Em determinados aspectos, o íntron deubiquitina pode ser modificado de modo a reduzir o tamanhototal dos vetores e para avaliar o seu efeito na expressãotransgênica de genes na aloe.

Em outros aspectos da presente invenção, pode serdesejada a expressão preferencial em tecidos verdes da plantade aloe. Os promotores de interesse para tais utilizaçõespodem incluir aqueles de genes tais como a subunidade pequenade ribulose-1,5-bisfosfato carboxilase (Rubisco) deArabidopsis thaliana (Fischhoff et al. (1992) Plant Mol Biol.20:81-93) aldolase e ortofosfato piruvato dicinase (PPDK)(Taniguchi et al. (2000) Plant Cell Physiol. 41(1):42-48).

Conforme observado acima, os promotores podem seralterados de modo a conterem "seqüências de intensificador"múltiplas para ajudar na elevação da expressão de genes. Taisintensificadores são conhecidos no estado da técnica. Aoincluir uma seqüência de intensificador com tais construtos,a expressão da proteína selecionada pode ser intensificada.

Esses intensificadores são freqüentemente encontrados em 5'para o início da transcrição em um promotor que funciona emcélulas eucarióticas, mas podem ser freqüentementeintroduzidos a montante (5') ou a jusante (3') da seqüênciade codificação. Em alguns casos, estes elementosintensif icadores 5' são íntrons. Os íntrons 5' do gene daactina 1 do arroz são particularmente úteis comointensificadores (vide a Patente U.S. N°. 5.641.876) e daactina 2 do arroz, o íntron do gene de desidrogenase doálcool do milho, o íntron do gene da proteína de choquetérmico 70 do milho (Patente U.S. N°. 5.593.874) e o geneencolhido 1 do milho.

Os construtos de acordo com os aspectos da presenteinvenção podem incluir um elemento 31 que contém tipicamenteum sinal e um sítio de poliadenilação. Os elementos 3' bemconhecidos incluem aqueles dos genes de Agrobacteriumtumefaciens tais como os n°. 3 ' , tml 31, tmr 3', tms 31, ocs3', tr7 3', descritos, por exemplo, na Patente U.S. N°. 6.090. 627, incorporada na presente invenção a título dereferência; os elementos 31 dos genes de plantas tais como aproteína de choque térmico 17 (Hspl7 3') do trigo (Triticumaesèvitum) , um gene de ubiquitina do trigo, um gene dafrutose-1,6-bifosfatase do trigo, um gene de glutelina doarroz, um gene de lactato desidrogenase do arroz e um gene debeta-tubulina do arroz, sendo que todos são descritos noPedido de Patente U.S. 2002/0192813A1, incorporado napresente invenção a título de referência; e o gene debifosfato ribulose carboxilase (rbs 3') da ervilha (Pisumsativum) e os elementos 31 dos genes dentro da plantahospedeira.

Uma proteína de interesse pode ser codificada porum gene estrutural incorporado no construto de DNA. 0 geneestrutural pode ser um gene de mamífero ou partes de um genede mamífero. Os genes estruturais de interesse podemcodificar interferons, imunoglobulinas, linfocinas, fatoresdo crescimento, hormônios, fatores sangüíneos, antígenos dehistocompatibilidade, enzimas ou outras proteínas. Aseqüência para interferon alfa 2 é relacionada para exemplosde finalidades como a SEQ ID N°. 33. Os genes estruturaistambém podem codificar proteínas de marcadores tais como aproteína verde fluorescente (GFP) de águas-vivas. A seqüênciade DNA dos genes estruturais pode ser modificada parapermitir a expressão de nível elevado em uma planta de aloe10. A polarização de códon para a planta de aloe 10 podediferir da polarização de códon na espécie original da qual o'gene estrutural foi isolado. 0 gene estrutural nativo podeser desenhado para otimizar a produção da proteína codificadana planta de aloe 10. Além disso, a seqüência de DNA do geneestrutural pode ser desenhada de modo a propiciar aglicosilação apropriada nas plantas de aloe 10 que nãointerfere na estrutura da proteína.

A terminação da transcrição e da tradução pode serprovida por uma variedade de seqüências de terminaçãotranscricionais e translacionais que podem funcionar em umaplanta de aloe 10. Em um aspecto, as seqüências de terminaçãopodem incluir a seqüência de genes da nopalina sintase (NOS)de Agrobacterium. Em outro aspecto, a seqüência de terminaçãopode ser derivada das seqüências de terminação de genes e deproteínas de aloe nativos.

Um gene do marcador será integrado freqüentementeno construto de DNA. 0 gene do marcador pode permitir que ascélulas que contêm o gene estrutural de interesse sejamselecionadas da população de todas as células que não contêmo gene do marcador. Os genes do marcador podem incluirenzimas ou outras proteínas que conferem resistência àcanamicina, cloranfenicol, G418 e gentamicina, entre outros.

Ainda outras seqüências específicas do DNA podem sernecessárias se, por exemplo, o Agrobacterium for utilizadocomo um vetor. Outras regiões podem estar presentes se o DNAfor alvejado a um tipo específico de célula.

Conforme mencionado acima, os construtos de DNAtambém podem incluir um sinal de secreção. Os construtostambém podem incluir uma seqüência de translocação quecodifica um peptídeo de sinal que pode alvejar a proteínaterapêutica para a remoção da célula em que a proteína foiformada. Várias seqüências de sinal foram identificadas naliteratura, as quais são funcionais nas plantas e, maisparticularmente, funcionais nas plantas monocotiledôneas taiscomo as plantas de aloe. Estas podem ser integradas de modooperável nos construtos ou dentro dos genes de interesse. Emum aspecto, a seqüência secretória de alfa amilase (SEQ. IDN°. 29) do arroz (Oryza sativa) pode ser utilizada. Essaseqüência de sinal é caracterizada em "The alpha-amylasegenes in Oryza sativa" Mol Gen Genet., abril de 1990;221(2):235-44, cuja descrição é aqui incorporada a título dereferência em sua totalidade. Alternativamente, alguns genesde interesse, tais como, por exemplo, o interferon, podemincluir um domínio, natural ou sintético, que alveja ointerferon para a secreção. 0 sinal de secreção é tipicamenteclivado à medida que a proteína sai da célula ou, em algunscasos, pode ser retido pela proteína sem afetarsubstancialmente a função da proteína. Os sinais secretóriospodem ser adicionados a uma variedade de proteínas que podemrequerer sinais secretórios para a translocação. Essasseqüências secretórias podem ser derivadas de váriasseqüências de secreção de plantas.

As Figuras 6A e 6B ilustram um conjunto de exemplosde construtos para a produção de uma proteína de interesse apartir de uma planta Aloe. Os construtos de plasmídeo sãoetiquetados como pzUI (TGC9) . TGC9 inclui o promotor deubiquitina de comprimento total que dirige a expressão dointerferon alfa 2 humano, e pzUEK (TGC12) (SEQ ID N°. 38), opromotor de ubiquitina de comprimento total que dirige aexpressão de uma proteína de fusão que contém eGFP (proteínaverde fluorescente intensificada) (SEQ ID N°. 31) e aproteína de resistência ã canamicina. A proteína de fusãocombina as propriedades de seleção de ambas as proteínas(seleção e visualização) em uma.

Conforme ilustrado, o plasmídeo pzl (TGC8) foicriado pela amplificação de PCR do gene de interferon alfa 2humano utilizando os primers de PCR, cada um dos quaiscontendo dois sítios de enzima de restrição distintos (vide aTabela I para a seqüência de primer) . O gene de interferonamplificado (IFN) tem os sítios de flanqueamento 51 PstI eBamHI e SacI e Xhol 3 1 . O IFN gerado por PCR foi entãoclonado como um fragmento de PstI/Xhol no vetor de pZErO paracriar o construto pzl (TGC8) e para introduzir os sítiosBamHI e SacI para a clonagem subseqüente. Esse construtocontém o gene IFN alfa de comprimento total e a sua seqüênciade sinal, responsável por dirigir a secreção da proteína deIFN da célula. Isto é ilustrado no Slide 3. Esses clonesgerados por PCR foram arranjados em seqüência para confirmara ausência de quaisquer mutações de DNA.

Conforme ilustrado, o vetor de plasmídeo pzUI(TGC9) foi criado pela clonagem a jusante do gene de IFN alfa2 do promotor de ubiquitina de comprimento total. 0 fragmentode PstT/XhoX de IFN foi liberado de pzl (TGC8) e ligado empzU (TGCl) para criar o construto pzUI (TGC9) . Isto éilustrado no Slide 3.

Conforme ilustrado, o gene de eGFP foi amplificadopor PCR utilizando um conjunto de primers contendo os sítiosde restrição de BairiHI (extremidade 5') e de XhoI (extremidade3') (vide a Tabela I para a seqüência de primer) . Esse genede eGFP gerado por PCR foi criado sem um códon de interrupção(para permitir finalmente a expressão de uma proteína defusão eGFP-kan) . Desse modo, a tradução não termina no finalda seqüência de eGFP. 0 fragmento amplificado por PCR foidigerido com as enzimas de restrição BamHI e XhoI e ligadonos sítios de BairiHI e XhoI de pZErO, criando o pzEnostop(TGClO) . Isso é ilustrado no Slide 3. Os clones gerados porPCR foram arranjados em seqüência para confirmar a ausênciade quaisquer mutações de DNA.

Conforme ilustrado, pzEK (TGCll) gera um construtode fusão entre o gene eGFP e o gene resistente à canamicina.'eGFP foi liberado como um fragmento de BaMil/XhoI depzEnostop (TGClO) e ligado em pzK (TGC4) para criar oconstruto ρζΕΚ (TGCll). 0 gene de eGFP é clonado no quadro ede 5' a kan/nos (SEQ ID N°. 35).

Conforme ilustrado, um fragmento de BanHI/Xbal depzEK (TGCll) que contém o cassete de eGFP/kan/nos, foiclonado nos sítios BamHI e XbaI de pzUI (TGC9) a fim depermitir a expressão do gene da fusão de eGFP/kan. Aseqüência de IFN é desse modo removida. Esse novo construto,pzUEK (TGC12), expressa a proteína de fusão de eGFP/kan dopromotor de ubiquitina de comprimento total (ilustrado noSlide 4). Essa proteína de fusão retém as características decada uma das proteínas individuais e tem, desse modo, obenefício óbvio de funcionar como um marcador visual e comoum agente seletivo.

As Figuras 7A a 7C ilustram um outro conjunto deexemplos de construtos para a produção de uma proteína deinteresse a partir de uma planta Aloe. Os vetores ilustradospermitem a expressão de dois genes, como um único transcrito,sendo ainda ao mesmo tempo traduzidos em duas proteínasdistintas. Para realizar isto, os dois genes são separados umdo outro por um elemento da IRES de intervenção (seqüênciainterna de entrada de ribossomo) (SEQ ID N0. 34). O elementoda IRES forma um segundo sítio interno, para a fixação doribossomo e a tradução. Esse segundo sítio permite que ostranscritos clonados 3' ao elemento da IRES sejam traduzidosseparadamente. Esses vetores, a saber, pzUSEIrK (TGC18) (SEQID N°. 43) e pzUIIrK (TGCl9) (SEQ ID N°. 39), foramconstruídos em estágios, permitindo finalmente a expressão deeGFP ou de IFN (respectivamente) juntamente com o marcador deresistência à canamicina.

Conforme ilustrado, o vetor de pzEnostart (TGCl3)foi criado primeiramente através da amplificação de eGFP por*PCR (vide a Tabela I para as seqüências de primer) utilizandoos primers que contêm os sítios da enzima de restrição deBarriHl (extremidade 5') e SacI (extremidade 3')· Esse produtode PCR foi clonado como um fragmento de Bantíl/SacI em pZErO.0 gene de eGFP nesse construto não tem um sítio de começo datradução de ATG, uma vez que essa proteína é expressa comouma fusão com a seqüência de sinal de alfa amilase (vide aconstrução de pzSE, TGC14). Isso é ilustrado no Slide 5.Esses clones gerados por PCR foram arranjados em seqüênciapara confirmar a ausência de quaisquer mutações de DNA.

Conforme ilustrado, o cordão único da seqüência desinal do gene de alfa amilase foi sintetizado e o seu cordãofoi então dobrado por preenchimento utilizando PCR (vide aTabela I para as seqüências de primer) . A seqüência de sinalfoi então digerida com as enzimas de restrição PstI e BanMI eclonada em pzEnostart (TGC13). Isso é ilustrado no Slide 5. Aseqüência de sinal foi clonada em quadro, 5' para eGFP, eforma o sítio de iniciação da tradução para a fusão do eGFPda seqüência de sinal. Os clones de pzSE resultantes (TGC14)foram arranjados em seqüência para confirmar a ausência dequaisquer mutações de DNA.

Conforme ilustrado, o vetor de pzUSE (TGC15) foiconstruído para ligar a fusão da seqüência de sinal alfaamilase de (ss)-eGFP com o promotor de ubiquitina. 0 cassetedo gene que contém o ss-eGFP de pzSE (TGC14) foi clonado comoum fragmento de PstI/SacI em pzUI (TGC9) . Isto substitui ocassete do gene de IFN (liberado de pzUI (TGC9) ao digerircom as enzimas de restrição PstI e Saci) criando o pzUSE(TGCl5). Isso é ilustrado no Slide 5.

Conforme ilustrado, o elemento da IRES foiamplificado por PCR (vide a Tabela I para as seqüências deprimer) de pIRES2-EGFP (Clontech, BD Biosciences) com osprimers que contêm os sítios de restrição SacI (extremidade5' ) e XhoI (extremidade 3')· 0 elemento da IRES amplificadofoi clonado como um fragmento de SacI/XhoI em pZErO paracriar o pzlr (TGCl6) . Isso é ilustrado no Slide 6. Essesclones gerados por PCR foram arranjados em seqüência paraconfirmar a ausência de quaisquer mutações de DNA.

Conforme ilustrado, o elemento da IRES de pzlr(TGC16) foi então clonado como um fragmento de Sacl/Xhol nopzK (TGC4) para criar o pzIrK (TGC17) posicionando, dessemodo, o IRES a montante do cassete do gene de kan/nos.

Conforme ilustrado, o cassete do gene de IRES-kan/nos clonado como um fragmento de Sacl/Xbal em pzUSE(TGC15) para criar o pzUSEIrK (TGC18) . Isso é ilustrado noSlide 6. Este construto expressa o eGFP como uma fusão com aseqüência de sinal de alfa amilase, alvejando o eGFP para asecreção da célula. Isto torna possível monitorar visualmenteo trânsito e a acumulação de proteínas dentro da plantatransformada. Esse vetor também expressa a proteína deresistência ã canamicina (traduzida do elemento interno deIRES) e permite a seleção em plantas transgênicas.

Conforme ilustrado, o cassete do gene de IRES-kan/nos também foi clonado como um fragmento de SacI/XbaI empzUI (TGC9) para criar o pzUIIrK (TGC19) . Isso é ilustrado noSlide 7. Esse construto expressa o IFN alfa 2 com umaseqüência de sinal para a secreção. Esse vetor tambémexpressa a proteína de resistência à canamicina (traduzida doelemento interno de IRES) e permite a seleção em plantastransgênicas. Ambos TGCl8 e TGCl9 expressam dois genes comoum transcrito único, eliminando a necessidade de um segundopromotor e reduzindo desse modo o tamanho total de cadavetor. Isto é importante, uma vez que a diminuição do tamanhototal dos construtos transfectados aumenta a eficiência comque estes elementos podem se translocar ao núcleo, conduzindoa uma integração estável e à seleção de plantas transgênicas.

Um sistema de promotor único também reduz o risco derompimento da expressão do gene de flanqueamento ou outrassituações que possam finalmente afetar a expressão detransgenes.

Os plasmídeos acima relacionados podem substituiroutras seqüências de codificação de interesse para alfainterferon. Tal como será reconhecido por um técnico noassunto, estes podem ser substituídos no mesmo lõcus ou emoutras posições nos plasmídeos.

Uma seqüência de codificação de protrombina (SEQ IDN°. 36) também pode ser integrada em um vetor de plasmídeo deacordo com os aspectos da presente invenção, tal comoilustrado diagramaticamente na Figura 8. A protrombina é aproteína precursora para a trombina. Ela é clivada em doissítios pelo Fator X ativado para liberar a trombina ativada,uma proteína de coagulação que converte o fibrinogêniosolúvel em cordões de fibrina insolúveis. 0 cassete do genede protrombina (1874 pares bases) foi amplificado utilizandoos primers de PCR (vide a Tabela I para a seqüência deprimer) . O cassete do gene de eGFP foi liberado do vetor depzUSEIrK (TGC18) pela enzima de restrição BamHI. Assaliências 5' resultantes foram removidas subseqüentementecom a nuclease de Mung Bean para criar extremidades semcorte. As extremidades sem corte foram desfosforiladasutilizando a fosfatase intestinal de vitela (CIP) por meio deincubação a 5 0 graus Celsius por duas horas, antes da ligaçãoaté a manhã seguinte com o cassete do gene de protrombina a15 graus Celsius. Isso criou o pzUSTIrK (TGC20) (SEQ ID N°.42) . Os clones gerados por PCR foram arranjados em seqüênciapara confirmar a ausência de quaisquer mutações de DNA.

Uma seqüência de codificação de Dermicidina (DCD)(SEQ. ID N°. 30) também pode ser integrada em um vetor deplasmídeo de acordo com os aspectos da presente invenção,conforme também ilustrado diagramaticamente na Figura 8. Adermicidina era um peptídeo antimicrobiano de amplo espectrorelatado recentemente encontrado expresso constitutivamentenas glândulas sudoríparas. Essa proteína é secretada no suore é transportada até a superfície da epiderme. 0 cassete dogene de DCD amplificado por PCR tem os sítios deflanqueamento da enzima de restrição de BamHI (vide a TabelaI para a seqüência de primer). O cassete do gene de DCDdigerido por BamHI foi ligado ao sítio do vetor BairiHI depzUSEIrK (TGC18) que costumava ser ocupado pelo eGFP, criandoo vetor de pzUSEIrK (TGC21) (SEQ ID N°.40). Os clones geradospor PCR foram arranjados em seqüência para confirmar aausência de quaisquer mutações de DNA.

Uma seqüência de codificação do Hormônio doCrescimento humano (hGH) (SEQ ID N°.32) também pode serintegrada em um vetor de plasmídeo de acordo com os aspectosda presente invenção, conforme também ilustradodiagramaticamente na Figura 8. 0 cassete do gene de hGH foicriado pela amplificação de PCR com o f lanqueamento dossítios da enzima de restrição de BamHI (vide a Tabela I paraa seqüência de primer). Então, o cassete do gene de hGHdigerido por BaiftHI foi ligado ao sítio de BamHI do vetor depzUSEIrK (TGC18) que costumava ser ocupado pelo eGFP, criandoo vetor de pzUSHIrK (TGC22) (SEQ ID N°.41). Os clones geradospor PCR foram arranjados em seqüência para confirmar aausência de quaisquer mutações de DNA.

Uma seqüência de codificação de interferon gamahumano (hlFNg) também pode ser integrada em um vetor deplasmídeo de acordo com os aspectos da presente invenção,conforme também ilustrado diagramaticamente na Figura 8. 0cassete do gene de hlFNg foi criado pela amplificação de PCRcom flanqueamento dos sítios da enzima de restrição de BairiHI(vide a Tabela I para a seqüência de primer). 0 cassete dogene de hlFNg digerido por BarriHI foi então ligado ao sítio deBairiHI do vetor de pzUSEIrK (TGC18) que costumava ser ocupadopelo eGFP, criando o vetor de pzUSIfglrK (TGC23) (SEQ ID N°.37) . Os clones gerados por PCR foram arranjados era seqüênciapara confirmar a ausência de quaisquer mutações de DNA.

Tabela I - Lista das seqüências de primerutilizadas para criar outros genes expressos

<table> table see orginal document page 34</column></row><table>Essas seqüências podem conter a sua própriaseqüência de sinal. Similarmente à seqüência em alfainterferon que foi demonstrada como operável em uma planta dealoe, também foi demonstrado que as seqüências de sinalnativas dentro da protrombina, Dermicidina (DCD), Hormônio doCrescimento humano (hGH) e interferon gama humano (hlFNg)podem ser funcionais em uma planta de aloe. De qualquermaneira, essas seqüências de codificação da proteína podemser clonadas em um vetor que contém a seqüência de sinal dealfa amilase tal como nos exemplos ilustrados da Figura 8.

No desenvolvimento dos construtos referidos acima,todos os vetores utilizados para a transformação cresceram em250 ml de LB, 50 ug/L de zeocina e foram isolados utilizandoo método de CsCl. Os vetores foram então utilizados emestudos de transfecção transientes para assegurar a expressãoapropriada de cada construto. A transfecção que utiliza oinjetor de gene foi executada no milho, no tabaco e no aloe,e a expressão foi monitorada visualmente para a expressão deeGFP ou por rt-PCR para a expressão de IFN ou.de kan.

Transformação

Depois que os construtos de DNA incluindo o gene deinteresse e funcional de várias unidades de funçãoincorporadas em vetores são gerados, os construtos de DNA sãointroduzidos nas células de aloe ao utilizar uma série detécnicas que serão reconhecidas por um técnico no assunto nomomento da revisão da presente descrição. Esses construtos deDNA são geralmente desenhados para promover a formação deplantas de aloe estavelmente transformadas 10. Numerososmétodos para transformar as células de planta com DNArecombinante são conhecidos no estado da técnica e podem serutilizados na presente invenção. Alguns métodos para aincorporação dos construtos de DNA contidos nos vetores emcélulas ou em tecidos de aloe para a criação detransformantes de aloe estáveis podem incluir a infecção comA. tumefaciens ou A. rhizogenes, a infecção com os vírusdeficientes na replicação, a transformação biolística, atransformação de protoplastos, a transferência do gene nopólen, a injeção em órgãos reprodutores, a injeção emembriões imaturos, ou métodos similares. Atualmente, dois dosmétodos mais geralmente utilizados para a transformação deplantas são a transformação mediada por Agrobacterium e atransformação biolística. As células de aloe ou os tecidos decalo transformados crescem tipicamente no meio nutrienteapropriado para a seleção de células transformadas.

Normalmente, um meio de seleção inclui uma toxina ou outrofator de seleção que mata as células não-transformadas.Várias mudanças de meio irão permitir a produção de plantasde aloe 10 que contenham o gene de interesse, conforme seráreconhecido por um técnico no assunto no momento da revisãoda presente descrição.

Na prática da transformação, o DNA é introduzidotipicamente somente em uma pequena porcentagem de células deplanta alvo em qualquer experiência de transformação. Osgenes do marcador são utilizados para prover um sistemaeficiente para a identificação das células que sãotransformadas estavelmente ao receber e integrar um construtode DNA transgênico em seus genomas. Os genes do marcadorpreferidos fornecem os marcadores seletivos que conferemresistência a um agente seletivo, tal como um antibiótico ouum herbicida. Qualquer um dos herbicidas aos quais as plantasda presente invenção podem ser resistentes são agentes úteispara marcadores seletivos. As células potencialmentetransformadas são expostas ao agente seletivo. Na populaçãode células sobreviventes, estarão as células em que,geralmente, o gene que confere resistência é integrado eexpresso em níveis suficientes para permitir a sobrevivênciadas células. As células podem ser testadas adicionalmentepara confirmar a integração estável do DNA exógeno. Os genesdo marcador seletivos comumente utilizados incluem aquelesque conferem resistência a antibióticos, tais como acanamicina e a paromomicina (nptll), higromicina B (aph IV) egentamicina (aac3 e aacC4), ou resistência a herbicidas, taiscomo o glufosinato (bar orpat) e glifosato (aroA ou EPSPS).Os exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustradosnas Patentes U.S. N°. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e6.118.047, as quais são incorporadas na presente invenção atítulo de referência. Os marcadores selecionáveis quepropiciam a capacidade de identificar visualmente ostransformantes também podem ser empregados, por exemplo, umgene que expressa uma proteína colorida ou fluorescente talcomo uma luciferase ou proteína verde fluorescente (GFP), ouum gene que expressa um beta-glicuronidase ou um gene de uidA(GUS) para o qual vários substratos cromogênicos sãoconhecidos.

Em geral, é útil introduzir aleatoriamente o DNArecombinante, isto ê, em uma posição não-específ ica, nogenoma de uma linhagem de planta alvo. Em casos especiais,pode ser útil alvejar a inserção de DNA recombinante a fim deatingir a integração específica de sítio, por exemplo, parasubstituir um gene existente no genoma, para utilizar umpromotor existente no genoma da planta ou para introduzir umpolinucleotídeo recombinante em um sítio predeterminadoconhecido como sendo ativo para a expressão do gene. Existemdiversos sistemas de recombinação específicos de sítio, osquais são conhecidos para executar implantes, incluem cre-loxcomo descrito na Patente U.S. N°. 4.95 9.317 e FLP-FRT comodescrito na Patente U.S. N°. 5.527.695, sendo que ambos sãoincorporados na presente invenção a título de referência esão discutidos mais detalhadamente abaixo.Para o sistema de transformação de planta á base deAgrobacterium, os elementos adicionais presentes emconstrutos de transformação irão incluir seqüências de limiteesquerdo e direito de T-DNA para facilitar a incorporação dopolinucleotídeo recombinante no genoma da planta. Com ainfecção com Agrobacterium (A. tumefaciens) , o tecido de calode aloe é incubado por uma hora à temperatura ambiente comuma cultura até a manhã seguinte de Agrobacterium incluindo ovetor que incorpora o construto de DNA. O Agrobacteriumcresce no meio de seleção apropriado. O meio de seleçãoinclui tipicamente estreptomicina e canamicina. O meio deseleção também pode conter acetosiringona. A acetosiringona auma concentração de 50 uM a 250 uM aumenta tipicamente aeficiência de infectividade da monocotiledônea. Após ocrescimento nos meios de seleção, o tecido de aloe infectadopode ser transferido ao meio em placas de Petri sem nenhumaseleção por dois (2) dias no escuro a 25 graus Celsius. Ummeio exemplif icador apropriado pode ser o meio de MS comacetosiringona. A cefotaxima pode ser então adicionada pordois (2) dias para matar o Agrobacterium. As células sãonovamente chapeadas no meio contendo 50 mg/L de canamicinapara selecionar as células de aloe transformadas e parainduzir os fatores de crescimento de brotos (0,2 mg/L de NAA,2 mg/L de BAP) por quatro (4) semanas, dezesseis horas naluz. Os brotos regenerados podem ser então transferidos aomeio de enraizamento (1/2 MS com 0,2 mg/L de NAA) paradesenvolver raízes (após aproximadamente quatro a seissemanas) antes de serem transferidos ao solo.

Com a transformação biolística, as células de aloeou o tecido de calo são bombardeados diretamente com oconstruto do vetor. Várias realizações e aspectos datransformação biolística são descritos nas Patentes U.S. No.5.015.580 (soja); 5.550.318 (milho); 5.538.880 (milho);5.914.451 (soja); 6.160,208 (milho); 6.399.861 (milho) e6.153.812 (trigo) e a transformação mediada por Agrobacteriumé descrita nas Patentes U.S. N°. 5.159.135 (algodão);5.824.877 (soja); 5.591.616 (milho); e 6.384.301 (soja), as quais são incorporadas na presente invenção a título dereferência. Além disso, uma variedade do aparelho detransformação biolística pode ser utilizada tal como, porexemplo, um sistema de aplicação de partículas Biolistic PDS-1000/He junto à Bio-Rad, Inc. Nesta abordagem, o vetor e o construto de DNA associado podem ser ligados ao ouro ou àsoutras partículas e ser acionados diretamente nas células dealoe. As células de aloe bombardeadas crescem sem seleção porquatro dias no escuro antes de serem transferidas ao meio deseleção. Outra vez, o meio de seleção pode incluir 50 mg/L decanamicina. Os transformantes começam a ser tipicamenteformados dentro de oito a doze semanas e podem sertransferidos aos meios de brotamento e enraizamento por oitoa doze semanas adicionais. Uma vez que as raízes começam a seformar, as mudas de planta podem ser transferidas ao solo. A transformação também pode ser conseguida aoutilizar uma variedade de outras técnicas. Tais técnicasincluem a infecção viral que utiliza sistemas de vetor viralcomprometidos com a replicação, a eletroporação,particularmente das células do calo ou dos protoplastos quecresceram em cultura líquida, e transferência mediada por PRGou lipídeos nos protoplastos. A seleção para ostransformantes pode então seguir as mesmas etapas básicas queaquela esboçada para a transformação biolística.

Uma vez introduzidos nos tecidos de calo de aloe, os construtos podem ser incorporados no material genético daplanta, tal como ilustrado de maneira geral na Figura 3. Emoutros aspectos, os construtos podem ser estavelmenteintegrados na célula fora do material genético das plantas dealoe 10. Dependendo do construto, a proteína de interesseprincipal pode não ser expressa ausente de alguma forma deindução da transcrição. Em um aspecto, os construtos, uma vezintroduzidos nas células de aloe, podem dirigir a síntese deproteínas ou transportar aos tecidos específicos da planta dealoe 10. Tipicamente, isto ocorre quando uma seqüência desinal de alvejamento é incluída na proteína de interesse.

Integração Específica de Sítio (Cre-Lox)

Em um aspecto, a presente invenção pode utilizar aintegração específica de sítio ou a excisão dos construtos deDNA introduzidos em uma planta de aloe. Uma vantagem daintegração ou da excisão específica de sítio é que ela podeser utilizada para superar os problemas associados com astécnicas de transformação convencionais, em que os construtosde transformação se integram tipicamente aleatoriamente em umgenoma hospedeiro em cópias múltiplas. Essa inserçãoaleatória do DNA introduzido no genoma das célulashospedeiras pode ser letal se um DNA estranho for inserido emum gene essencial. Além disso, a expressão de um transgenepode ser influenciada pelos "efeitos da posição" causadospelo DNA genômico circunvizinho. Adicionalmente, por causadas dificuldades associadas com as plantas que possuem cópiasmúltiplas do transgene, incluindo o silenciamento de genes, arecombinação e a herança imprevisível, é tipicamentedesejável o controle do número da cópia dos construtos de DNAintroduzidos no genoma da planta de aloe transgênica 10,desejando freqüentemente somente a inserção de uma únicacópia do construto de DNA.

A integração específica de sítio ou a excisão detransgenes ou de partes dos transgenes pode ser conseguidanas plantas por meio da recombinação homóloga (vide, porexemplo, a Patente U.S. N°. 5.527.6 95, incorporadaespecificamente na presente invenção a título de referênciaem sua totalidade) . A recombinação homóloga é uma reaçãoentre qualquer par de seqüências de DNA que têm uma seqüênciade nucleotídeos similar, onde as duas seqüências interagem(recombinam) para a formação de uma nova espécie de DNArecombinante nova. A freqüência da recombinação homólogaaumenta à medida que o comprimento das seqüências de DNA donucleotídeo compartilhadas aumenta, e é maior com asmoléculas de plasmídeo linearizadas do que com as moléculasde plasmídeo circularizadas. A recombinação homóloga podeocorrer entre duas seqüências de DNA que são menos do queidênticas, mas a freqüência da recombinação declina à medidaque a divergência entre as duas seqüências aumenta.

As seqüências de DNA introduzidas podem seralvejadas através da recombinação homóloga, ao ligar umamolécula de DNA de interesse às seqüências que compartilhamde homologia com as seqüências endógenas da célulahospedeira. Uma vez que o DNA penetra na célula de aloe, asduas seqüências homólogas podem interagir para introduzir oDNA introduzido no sítio onde as seqüências de DNA genômicashomólogas foram encontradas. Portanto, a escolha dasseqüências homólogas contidas no DNA introduzido irádeterminar o sítio onde o DNA introduzido é integrado atravésda recombinação homóloga. Por exemplo, se a seqüência de DNAde interesse for ligada a seqüências de DNA que compartilhamde homologia a um gene de cópia única de uma célula de aloehospedeira, a seqüência de DNA de interesse será introduzidaatravés da recombinação homóloga somente nesse único sítioespecífico. No entanto, se a seqüência de DNA de interessefor ligada às seqüências de DNA que compartilham de homologiaa um gene de cópias múltiplas da célula eucarióticahospedeira, então a seqüência de DNA de interesse pode serintroduzida através da recombinação homóloga em cada um dossítios específicos onde uma cópia do gene é encontrada.O DNA pode ser introduzido no genoma hospedeiro pormeio de uma reação de recombinação homóloga que envolve umaúnica recombinação reciproca (tendo por resultado a inserçãodo comprimento inteiro do DNA introduzido) ou através de umarecombinação recíproca dupla (tendo por resultado a inserçãosomente do DNA situado entre os dois eventos derecombinação). Por exemplo, se for pretendida a introdução deum gene estranho no sítio genômico onde um gene selecionadoestá localizado, o DNA introduzido deverá conter asseqüências homólogas ao gene selecionado. Um único evento derecombinação homóloga deve resultar então na introdução daseqüência de DNA introduzida inteira no gene selecionado.Alternativamente, um evento de recombinação dupla pode serconseguido ao flanquear cada extremidade da seqüência de DNAde interesse (a seqüência que deve ser introduzida no genoma)com as seqüências de DNA homólogas ao gene selecionado. Umevento de recombinação homóloga que envolve cada uma dasregiões de flanqueamentos homólogas irá resultar na inserçãodo DNA estranho. Desse modo, apenas as seqüências de DNAsituadas entre as duas regiões que compartilham de homologiagenômica se tornam integradas no genoma.

Embora as seqüências de DNA introduzidas possam seralvejadas para a inserção em um sítio genômico específicoatravés da recombinação homóloga, nos eucariotas superiores,a recombinação homóloga é um evento relativamente raro emcomparação aos eventos de inserção aleatória. Nas células dealoe, as moléculas de DNA estranhas encontram as seqüênciashomólogas no genoma da planta de aloe e se recombinam em umafreqüência de aproximadamente 0,5-4,2 vezes IO"4. Desse modo,qualquer célula transformada que contiver uma seqüência deDNA introduzida integrada através da recombinação homóloga,também irá provavelmente conter numerosas cópias dasseqüências de DNA introduzidas aleatoriamente integradas. Ummodo de evitar essas inserções aleatórias é a utilização deum sistema de recombinase específica de sítio. Em geral, umsistema de recombinase específica de sítio consiste em trêselementos: dois pares da seqüência de DNA (as seqüências derecombinação específicas de sítio) e uma enzima específica (arecombinase específica de sítio). A recombinase específica desítio irá catalisar uma reação de recombinação somente entreduas seqüências de recombinação específicas de sítio.

Uma série de sistemas de recombinase específicos desítio diferente poderia ser empregada de acordo com apresente invenção, incluindo, mas sem ficar a eles limitada,o sistema de Cre/lox de bacteriófago Pl (Patente U.S. N°.5.658. 772, incorporada especificamente na presente invençãoa título de referência em sua totalidade), o sistema deFLP/FRT de levedura (Golic e Lindquist, 1989), a recombinasede Gin do fago Um (Maeser e Kahmann, 1991) , a recombinase dePin de E. coli (Enomoto et al., 1983) e o sistema de R/RS doplasmídeo pSRl (Araki et al. , 1992). O bacteriófago Cre/loxPl e os sistemas FLP/FRT de levedura constituem dois sistemasparticularmente úteis para a integração específica de sítioou a excisão dos transgenes. Nesses sistemas, uma recombinase(Cre ou FLP) irá interagir especificamente com a suaseqüência de recombinação específica de sítio respectiva (loxou FRT, respectivamente) para inverter ou excisar asseqüências de intervenção. A seqüência para cada um dessesdois sistemas é relativamente curta (34 bp para lox e 47 bppara FRT) e, portanto, conveniente para a utilização comvetores de transformação.

A Figura 8 ilustra um protocolo exemplificadorparticular que utiliza um sistema de recombinase de Flp/Frt eCre/Loxp. Em tal sistema, as recombinases específicas dejsítio do bacteriófago e das leveduras podem ser utilizadascomo ferramentas para manipular o DNA no tubo de teste e emorganismos vivos. As combinações do sitio derecombinases/recombinação incluem Cre-Lox, FLP-FRT e R-RS,onde Cre, FLP e R são as recombinases e Lox, FRT e RS são ossítios de recombinação. Para utilizar esse sistema, é geradauma planta transgênica contendo os sítios específicos para arecombinação. Uma planta de aloe transgênica 10 paterna écriada ao transfectar um vetor, que expressa um marcadorselecionãvel e é projetada para conter os sítios de Frt e deLox em tandem. Os sítios de Frt e de Lox consistem em trêselementos, uma seqüência de espaçador com oito (8)nucleotídeos entre duas (2) repetições invertidas de treze(13) nucleotídeos cada uma. As repetições invertidas servemcomo o domínio de ligação do DNA para a recombinaseespecífica, sendo que o elemento do espaçador é variável, masessencial para a recombinação homóloga. Ao alterar o elementodo espaçador dos sítios de LoxP ou de FRT, múltiplos sítiosdistintos para a recombinação podem ser criados. Ao alternaros sítios de Frt e de Lox, um sistema que permite integraçõesdirigidas por múltiplos sítios pode ser criado (tal comoesboçado na Figura 8). Esse sistema pode ter uma série devantagens. O rompimento de genes endógenos é minimizado apósa geração da planta inicial paterna. A eficiência datransformação é aumentada pela expressão das recombinasesespecíficas de sítio. A utilização dos sítios de Iox e frt emtandem permite a remoção seletiva dos marcadores de seleçãoao reter o gene de interesse. E uma vez que uma plantapaterna tenha sido criada, a propagação celular e o potencialregenerativo são intensificados. A planta paterna, noentanto, é a primeira etapa e é criada ao seguir os métodosde transformação padrão (biolísticos ou Agrobacterium). Asplantas transgênicas subseqüentes são criadas pela co-transfecção de um vetor que contém um sítio de LoxP e de Frtbem como o gene de interesse e um marcador selecionãvel,juntamente com um vetor que expressa a recombinase de Cre. Aexpressão da recombinase de Cre induz a recombinação homólogaatravés dos sítios de LoxP do vetor e da planta paterna. Ostransformantes são selecionados pela expressão de marcadoresselecionáveis e são induzidos à regeneração. A transformaçãosubseqüente com um vetor que expressa a recombinase de Flppode remover o marcador selecionável e permitir umaintegração subseqüente em outros sítios de Loxp.

Produção de plantas viáveis

Depois da transformação das células de Aloe ou dostecidos de Aloe, as células de Aloe ou os tecidos de Aloetransformados podem crescer como mudas de planta. As célulasde aloe que sobrevivem à exposição ao agente seletivo ou ascélulas de aloe com uma marcação positiva em um ensaio deseleção podem ser cultivadas em um meio de regeneração ecolocadas para maturar como plantas de aloe transgênicas 10.As mudas de planta de aloe em desenvolvimento regeneradas dascélulas de aloe transformadas podem ser transferidas àmistura de crescimento de plantas e podem ser fortalecidas,por exemplo, em uma câmara ambientalmente controlada aaproximadamente 85% de umidade relativa, 600 ppm de CO2 e 25-250 microeinstein IrT2S"1 de luz, antes da transferência a umaestufa ou câmara de crescimento para a maturação. As plantasde aloe transformadas 10 são regeneradas de aproximadamenteseis semanas a dez meses depois que um transformante éidentificado, dependendo do tecido inicial. A planta de aloetransformada regenerada 10 ou a sua semente ou plantas deprogênie podem ser tipicamente testadas quanto à expressão doDNA recombinante.

A regeneração de uma planta de aloe transgênica 10do tecido de calo ou tecido de meristema não-diferenciadofransformado envolve principalmente a manipulação dos fatoresde crescimento auxina e cinetina. A primeira etapa consistena promoção do crescimento do broto. O meio que induz aformação de broto contém tipicamente uma baixa concentraçãode auxina (0,2 mg/L de NAA) e uma concentração relativamenteelevada de citocinina (2 mg/L de BAP). A concentração deaçúcar reduzida para 2% de sacarose (que afeta a pressãoosmótica) também pode ajudar na regeneração da planta. Ascélulas no meio de formação de broto são colocadas emincubadoras a 25°C com um ciclo de doze horas/dia de luz. Osbrotos que começam a se formar são excisados do calo primáriodepois que atingem um comprimento de aproximadamente 2 cm esão colocados no meio de enraizamento. Esses brotos tambémpodem ser mantidos no meio de formação de broto paraincentivar o desenvolvimento de brotos adicionais. O meio deenraizamento promove o desenvolvimento da raiz e contémtipicamente meio de MS e uma concentração relativamentebaixa de auxina (0,2 mg/L de NAA). Depois que as raízescomeçam a se desenvolver (1 a 2 cm), as mudas de planta podemser transferidas ao solo e aclimatadas, ao reduzirgradualmente a umidade relativa. Uma vez geradas, as plantasde aloe transgênicas 10 podem ser propagadas pelos métodos depropagação clonal de semente ou de outra maneira, conformeserá reconhecido por um técnico no assunto no momento darevisão da presente descrição.

Extração e Purificação de Proteínas a Partir dePlantas ou Células de Plantas

As proteínas ou as enzimas estruturais introduzidasatravés dos vetores nas células de plantas e nas plantaspodem ser encontradas em vários tecidos da planta de aloe 10,incluindo raízes, tubérculos, folhas, sementes, flores, seivaou em uma combinação de partes da planta e estágios dedesenvolvimento. Em um aspecto, a proteína ou as proteínas deinteresse estão concentradas na matriz gelatinosa na porçãocentral da folha. Em um outro aspecto, a proteína ou asproteínas de interesse são biologicamente ativas e propiciamalgum grau de efeito medicinal quando extraídas da folha dealoe 12. Em um outro aspecto, a proteína ou as proteínas deinteresse e pelo menos uma proteína de aloe nativa,carboidrato e/ou outro composto encontrado na matrizgelatinosa age sinergisticamente para propiciar um tratamentodesejado para um paciente. A extração da proteína pode serfeita a partir da biomassa total ou de um tecido particular.

A extração da proteína das células de planta pode incluirmétodos físicos e químicos. A extração da proteína das folhasou da seiva pode envolver a filtração, a ultracentrifugação,a extração química e a cromatografia por afinidade.

Em um aspecto, a proteína de interesse pode seacumular dentro do gel da folha da planta de aloetransformada 10. Essa região é constituída principalmente deágua, aproximadamente 99%, e é livre de proteasesprejudiciais. A extração do gel é uma técnica estabelecidaque é compreendida por um técnico no assunto. Algumas dasproteínas, particularmente as cosméticas, podem serutilizadas para suplementar diretamente o gel de aloe e podemnunca ter que serem isoladas individualmente do gel.

EXEMPLOS

Metodologias para a Isolamento de Células de

Plantas

Em um primeiro exemplo, o tecido do meristema dobroto para a utilização direta ou para a iniciação do calo éisolado do talo de aloe, Aloe vera, Aloe ferox ou Aloearborescence. As seções da folha são removidas e o talo écortado lateralmente através do eixo longitudinal da folha dealoe. 0 tecido é esterilizado com uma mistura de Tween 20(0,05%) e hipoclorito (5%) por dez minutos, seguido portrinta segundos em etanol, enxágüe por três vezes em águaestéril. As seções são então chapeadas com a superfícieexposta voltada para as laterais da placa em meio de MS comágar (0,8 a 1%) contendo várias concentrações dos fatores decrescimento, auxina e citocinina e 2 a 3% de sacarose. Ascondições de crescimento variam dependendo do processodesejado. A cultura do calo sem desenvolvimento do broto éiniciada tipicamente ao provocar o crescimento dessas seçõesem NAA (2-5 mg/l) sem BAP ou com baixa concentração de BAP(0,2 mg/l). As células não-diferenciadas começam a crescer aolongo das áreas do talo de corte e podem ser subcultivadas emantidas em pratos separados. A indução de broto pode seriniciada diretamente ao colocar tais fragmentos no meio deformação de broto - meio de MS contendo 0,2 mg/L de NAA (ou0,2 mg/L de IAA) e 2 mg/L de BAP. Tanto o NAA quanto o IAAtrabalham como uma fonte de auxina e há uma faixa deconcentrações de auxinas e citocininas que produzem efeito.

As células de calo dos embriões imaturos são desenvolvidas apartir das sementes comercialmente disponíveis. As sementessão primeiramente esterilizadas (etanol por trinta segundos,5% de hipoclorito mais 0,05% de Tween 20 por quinze minutos eenxágüe por três vezes em água estéril). As sementesesterilizadas são então deixadas até a manhã seguinte a 4graus Celsius em água. O embrião imaturo é isolado ao removero revestimento da semente. Um pequeno corte é feito em umcanto da semente com formato triangular e o embrião éespremido para fora. Isto é então chapeado no meio de MS quecontém apenas a auxina (2-5 mg/L de NAA) para induzir o calo,ou auxina e citocinina (0,2 mg/L de NAA, 2 mg/L de BAP) parainduzir a propagação do calo e do broto. A concentração deaçúcar é tipicamente de 2 a 3%.

As células de calo do meristema apical do broto sãodesenvolvidas a partir de um corte de segmento de um a doiscentímetros da base da nova planta de aloe 10 com todas asfolhas removidas. A superfície do fragmento é esterilizada enovamente chapeada em 1% de ãgar com o meio de MS e auxina ecitocinina (2 mg/L de NAA, 0,2 mg/L de BAP) .

A indução das células de calo se inicia dentro deuma a duas semanas. As células podem então ser isoladasdessas culturas e ser utilizadas como o material, de partidapara a transformação.

Construtos de DNA

i. Vetor de Interferon de Ubiquitina pBI121 (pBI-

UI) .

O vetor binário do Agrobacterium pBI121 foiutilizado como a cadeia principal para a criação de pBI-UI. 0gene de interferon alfa 2 humano com seqüência de sinal foiamplificado a partir das células de ser humano 293 utilizandoos primers específicos do gene que contêm sítios de restriçãode 5' PstI e de 31 Sacl/Xhol. O 587 pelo produto de PCR deinterferon foi clonado em pZErO e arranjado em seqüência. O1962 pelo elemento do promotor de ubiquitina (Ubi) do milhotambém foi clonado em pZErO pela amplificação da região dovetor de pUBI-GFP e a clonagem nos sítios de restrição de 5'HindIII e de 3' PstI. 0 fragmento de Ubi foi então subclonadono vetor de interferon de pZero utilizando HindIII/PstI(pZErO UI) . 0 cassete de interferon de Ubi intacto foi entãosubclonado em pBI121 utilizando HindIII/SacI e removendo opromotor de CaMV 35S e o gene de GUS, resultando no pBI UI.Esse vetor retém as regiões de limite direito e esquerdo doelemento T necessárias para a infecção e a transformaçãomediadas por Agrobacterium e expressa o gene de resistência àcanamicina (NPTII) sob o controle do promotor de Nos.

ii. Canamicina de IRES do Interferon de Ubiquitinade pZErO (pZ UIIK)

Esse vetor foi criado pela clonagem do promotor deUbi no vetor de clonagem de pZErO. Atrás desse fragmento, foiclonado um cassete contendo interferon alfa 2 humano juntocom uma IRES (seqüência de entrada ribossômica interna) e ogene de resistência à canamicina. Essa unidade é expressacomo um único transcrito, mas é traduzida como duas proteínasdistintas (devido ao segundo sítio de iniciação translacionalfornecido pela IRES). Isto permite que o marcadorselecionável e o interferon sejam expressos sob o controle dopromotor de Ubi.

iii. O sistema de plasmídeo duplo que emprega asrecombinases de Cre e de Flp.

Uma planta paterna é gerada primeiramente, a qualexpressa o marcador selecionável que tem os sítios de cre ede flp para a integração alvejada. Uma transfecção secundáriaque introduz os vetores com os genes de interesse é alvejadaaos sítios de cre. O material genético não desejado é entãoremovido utilizando o flp.

Introdução de Construtos de DNA em Células de

Plantas Isoladas

i. Tranferência de genes mediada por Agrobacterium

A cepa LB44 04 de Agrobacterium (Invitrogen,Carlsbad, CA) foi sujeita à eletroporação com o vetor de pBIUI e os clones positivos foram selecionados nas placas deágar LB que contêm 50 ug/ml de canamicina e 100 ug/ml deestreptomicina. Os clones individuais cresceram até a manhãseguinte a 30 graus Celsius em meio LB contendo 250 uM deacetosiringona. A infecção ocorre através da submersão dosfragmentos ou calos de planta nas culturas até a manhãseguinte, transferência a seco em papel filtro estéril echapeamento em placas de ágar de MS contendo 250 uM deacetosiringona a 25 graus Celsius no escuro. Dois dias após ainfecção, o tecido foi transferido às placas de ágar de MScontendo 200 uM de cefotaxima para matar o Agrobacterium. Otecido é então transferido às placas de ágar de MS contendo50 mg/L de canamicina e 0,2 mg/L de NAA e 2 mg/L de BAP paraselecionar os transformantes e induzir a regeneração dobroto. 0 tecido cresce em doze horas de luz a 25 grausCelsius. Os brotos adventícios crescem até alcançaremaproximadamente 2 cm de comprimento antes de serem excisadose replantados em meios de enraizamento com seleçãocontinuada. As mudas de planta que expressam os genes deinteresse são testadas quanto aos níveis de expressão e sãotransferidas ao solo.

ii. Transferência de genes biolística

Partículas de ouro (0,6 a 1 um) são revestidas como vetor que inclui o construto de DNA. As partículas de ourosão lavadas quinze minutos em etanol a 7 0% porturbilhonamento e encharcamento, seguido por três lavagens emágua estéril. As partículas de ouro são então novamentesuspensas em glicerol a 50% a uma concentração de 60 mg/ml.Para revestir o DNA do vetor nas partículas lavadas, 3 mg departículas são adicionados a um tubo de microfuga de 1,5 ml.A isto são adicionados 5 ul de DNA a uma concentração de 1ug/ul, 50 ul de 2,5 M de CaCl2 e 20 ul de espermidina 0,1 Mde espermidina, e turbilhonados por dois a três minutos. Istoé colocado em repouso, girado por um a dois segundos, e olíquido é removido. A isto são adicionados 14 0 ul de etanol a7 0%, girados, e o líquido é descartado. A isto, sãoadicionados 140 ul de etanol a 100%, girados, e o líquido édescartado. Ao material precipitado, são adicionados 48 ul deetanol a 100%, e eles são novamente suspensos suavemente. 0aparelho injetor de genes (PDS 1000/He, Bio-Rad Laboratories,Inc., Hercules, CA) é esterilizado utilizando etanol a 70%. 0aparelho injetor de genes foi montado utilizando a distânciade abertura mais curta entre o suporte macrocarregador e atela de interrupção (ajuste recomendado). As partículasrevestidas de ouro (8 ul) são introduzidas com pipeta nocentro dos macrocarregadores. A distância alvo foi ajustadadependendo do tecido alvo (tecido de 6 cm, calo de 9 cm) comum disco de ruptura de 600 a 1100 psi.

Em um primeiro exemplo, seguindo o bombardeamento,as células foram chapeadas em placas de ágar de MS contendo 2mg/L de NAA sem seleção por uma semana no escuro a 25 grausCelsius. As células foram então transferidas às placas deágar de MS contendo 50 mg/L de canamicina para a seleção eauxina (2 mg/L de NAA) e citocinina (0,2 mg/L de 6-benzilaminopurina) por quatro a cinco semanas adicionais. Ascélulas crescem por doze horas na luz a 25 graus Celsius.

Em um segundo exemplo, o bombardeamento demicroprojétil foi executado em uma placa de MS (4 g/L de saisde MS, 1 mg/L (1000X) de carga de vitamina de MS, 2 mg/L deNAA, 100 mg/L de mio-inositol, 2,76 g/L de prolina, 30 g/L desacarose, 100 mg/L de hidrolisado de caseína, 36,4 g/L desorbitol, 36,4 g/L de manitol, 2,5 g/L de gelrita, pH 5,8). Ocalo bombardeado foi deixado em MSOSM por uma hora após obombardeamento e foi então transferido ao meio de iniciaçãode MS (4 g/L de sais de MS, 1 mg/L (1000X) de carga devitamina de MS, 2 mg/L de NAA, 100 mg/L de mio-inositol, 2g/L de prolina, 30 g/L de sacarose, 100 mg/L de hidrolisadode caseína, 2,5 g/L de gelrita, pH 5,8). Após sete a dez diasem MS, o calo bombardeado foi transferido ao meio de seleçãode MSS (4 g/L de sais de MS, 1 mg/L (1000X) de carga devitamina de MS, 2 mg/L de NAA, 100 mg/L de mio-inositol, 30g/L de sacarose, 2,5 g/L de gelrita, pH 5,8) com 50 mg/L decanamicina para a seleção de células transformadas. Após trêssemanas, as partes do calo individuais foram transferidas aomeio de MSS fresco. Dentro de seis a oito semanas dobombardeamento, os clones resistentes à canamicina emergiramdas partes do calo selecionadas.

iii. Protoplasto

Os protoplastos são células de planta que não têm asua parede celular externa. A vantagem da criação dessascélulas é o aumento da eficiência da transfecção, e taiscélulas podem se fundir umas às outras para a formação de umhíbrido de célula somático. Os híbridos de célula somáticospodem misturar genes das plantas diferentes, chegandopotencialmente em algo completamente novo.

A técnica para utilizar os protoplastos de acordocom a presente invenção pode incluir o crescimento dascélulas em cultura líquida (dois a três dias na fase decrescimento logarítmica). As células são então giradas(gravidade de 1000 vezes por cinco minutos) . As células sãonovamente suspensas em uma solução que contém celulase,macerozima e pectoliase. São agitadas até a manhã seguinte a25 graus Celsius no escuro. São centrifugadas (gravidade de600 vezes por cinco minutos) e é removido o sobrenadante. Osprotoplastos são novamente suspensos no meio de cultura e sãogirados mais uma vez para remover resquícios de enzimas. Osprotoplastos não podem ser armazenados ou propagados e devemser utilizados para a transfecção ou a fusão de célulassomáticas relativamente rápida.

Produção de Plantas Viáveis que Contêm Construtosde DNA

Em um primeiro exemplo, transformantes bemsucedidos são selecionados inicialmente por sua resistência atoxinas celulares, por exemplo, a canamicina. As célulasestavelmente transfectadas devem expressar o marcador daresistência e o gene de interesse, tal como, por exemplo, uminterferon que codifica o gene, bem como poder regenerar aplanta intacta. 50 mg/L de canamicina são adicionados àsplacas de ágar de MS para iniciar a seleção. O curso daseleção depende em parte da velocidade com que as células sereplicam, mas isto pode levar entre seis a dez semanas.Durante este tempo, o tecido transformado é induzido aregenerar pela adição de 0,2 mg/L de NAA e 2 mg/L de BAP àsplacas de ágar de MS e pelo incentivo ao desenvolvimento debroto com um ciclo de doze horas/dia de luz (com pressão daseleção continuada). À medida que os brotos adventicioscomeçam a se desenvolver, eles podem ser testados quanto ãexpressão de genes a aproximadamente 2 cm de comprimento. Osbrotos que expressam produtos de gene desejados (tal comotestado por RT-PCR, por transferência Western e pelo ensaiobiológico) são transferidos subseqüentemente às placas deágar de MS para induzir a formação da raiz (1/2 de MS mais0,2 mg/L de NAA)..

Em um segundo exemplo, a regeneração do calotransgênico é realizada ao transferir aproximadamente 15partes pequenas (aproximadamente 4 mm) ao Meio de RegeneraçãoI (4,3 g/L de sais de MS, 1 ml/L (1000X) de carga de vitaminade MS, 100 mg/L de mio-inositol, 60 g/L de sacarose, 3 g/L degelrita, pH 5,8) com adição de canamicina esterilizada porfiltro (50 mg/l) e incubação por duas a três semanas a 25graus Celsius no escuro. Os embriões somáticos amadurecidossão transferidos à luz no Meio de Regeneração II paragerminação (4,3 g/L de sais de MS, 1 ml/L (1000X) de carga devitamina de MS, 100 mg/L de mio-inositol, 30 g/L de sacarose,3 g/L de gelrita, pH 5,8) com adição de canamicinaesterilizada por filtro (50 mg/l).

Claims

1. PLANTA ALOE TRANSGÊNICA, caracterizada pelofato de compreender um construto de DNA recombinante quecompreende um promotor, uma seqüência que codifica a proteínaexõgena, uma seqüência de terminação e uma seqüência detranslocação que codifica um peptídeo de sinal de secreção,em que a proteína exógena é uma proteína de mamíferoselecionada a partir de interferons, imunoglobulinas,linfocinas, fatores de crescimento de mamíferos, hormônios demamíferos, fatores do sangue, e antígenos dehistocompatibilidade;em que a proteína exógena é expressa do construtode DNA, e pelo menos uma porção da proteína exógena étranslocada de uma célula de aloe para o gel de uma folha dealoe da planta de aloe transgênica.

2. PLANTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a proteína exógena é umaproteína de mamífero selecionada de α-interferon, γ-interferon, protrombina, dermicidina e hormônio decrescimento humano.

3. PLANTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a proteína exõgena éa-interferon, γ-interferon ou hormônio de crescimento humano.

4. PLANTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que o promotor é promotor deubiquitina do milho

5. PLANTA, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de que a seqüência de translocação éa seqüência secretora de alfa amilase do arroz.

6. PLANTA, de acordo com a reivindicação 4,caracterizada pelo fato de que a seqüência de translocação éa seqüência secretora de alfa amilase do arroz.

7. MÉTODO PARA A PRODUÇÃO EM UMA PLANTA DE UMAPROTEÍNA BIOLOGICAMENTE ATIVA EXÓGENA À PLANTA, sendo que Odito método é caracterizado pelo fato de compreender:a provisão de uma planta transgênica que compreendeum construto de DNA recombinante que compreende um promotor,uma seqüência que codifica a proteína exógena, uma seqüênciade terminação e uma seqüência de translocação que codifica umpeptídeo de sinal de secreção;o cultivo da planta de modo que a proteína exógenado construto de DNA seja expressa; ea extração da proteína da planta,em que a planta é aloe, o construto de DNA contémum peptídeo de sinal de secreção de modo que pelo menos umaporção da proteína exógena seja translocada para o gel dasfolhas de aloe; ea proteína exógena é uma proteína de mamíferoselecionada a partir de interferons, imunoglobulinas,linfocinas, fatores de crescimento de mamíferos, hormônios demamíferos, fatores do sangue, e antígenos dehistocompatibilidade.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que o promotor é promotor deubiquitina do milho.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a proteína exógena é umaproteína de mamífero selecionada de α-interferon, γ-interferon, protrombina, dermicidina e hormônio decrescimento humano.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de que a seqüência de translocação éa seqüência secretora de alfa amilase do arroz

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação-7,caracterizado pelo fato de compreender a etapa de geraçãode planta transgênica pelo processo que compreende:obtenção de células de aloe embriônicas de umasemente de aloe;crescimento das células de aloe em cultura paraformar um calo em um meio nutriente que contém ácido 1-naftalenoacético (NAA) ou ácido indol-3-acético (IAA) e 6-benzilaminopurina (BAP);transformação do calos com o construto de DNArecombinante;seleção para as células de aloe transformadas quecontêm o construto de DNA recombinante enquanto o calo écultivado em um meio de crescimento e seleção que compreende-0,2 mg/L de NAA ou IAA e 2 mg/mL de BAP;crescimento em um meio de enraizamento quecompreende 0,2 mg/L de NAA, um broto regenerado no meio decrescimento e seleção; euma vez que as raízes tenham começado a se formar,a transferência da plantinha ao solo.

12 . MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UMA PLANTA DE ALOETRANSGÊNICA, para produzir na planta uma proteínabiologicamente ativa exõgena a planta, sendo que o método écaracterizado pelo fato de compreender:o cultivo de calo não-diferenciado de células dealoe em um meio nutriente que contém ácido 1-naftalenoacético(NAA) ou ácido indol-3-acético (IAA) e 6-benzilaminopurina(BAP) ;a introdução no calo de um construto de DNArecombinante que compreende um promotor, uma seqüência quecodifica a proteína exógena, uma seqüência de terminação euma seqüência de translocação que codifica um peptídeo desinal de secreção;o crescimento do calo em um meio de crescimento eseleção que compreende 0,2 mg/L de NAA ou IAA e 2 mg/mL deBAP;o crescimento em um meio de enraizamento quecompreende 0,2 mg/L de NAA e um broto regenerado no meio decrescimento e seleção; euma vez que as raízes tenham começado a se formar,a transferência da plantinha ao solo.em que a proteína exógena é uma proteína demamífero selecionada a partir de interferons,imunoglobulinas, linfocinas, fatores de crescimento demamíferos, hormônios de mamíferos, fatores do sangue, eantígenos de histocompatibilidade.

13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que a proteína exógena é umaproteína de mamífero selecionada de α-interferon, γ-interferon, protrombina, dermicidina e hormônio decrescimento humano.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o calo é de semente de aloe.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que tecido do calo é bombardeadodiretamente com o construto de DNA recombinante.