ES2345359T3

ES2345359T3 - Plantas de aloe transgenicas para la produccion de proteinas y metodos relacionados.

Info

Publication number: ES2345359T3
Application number: ES06844187T
Authority: ES
Inventors: William J. Lowther; Wen-Shuz Yeow; Kevin Lorick; Marisol Pages; Nicola J Lowter
Original assignee: TheGreenCell Inc
Current assignee: TheGreenCell Inc
Priority date: 2005-09-26
Filing date: 2006-09-26
Publication date: 2010-09-21
Anticipated expiration: 2026-09-26
Also published as: US8008546B2; JP2012196221A; DE602006015492D1; US20160160228A1; HK1216387A1; US8816154B2; US20130061353A1; CN101313071A; US9267149B2; CN105106929A; BRPI0617607B1; US20090233273A1; ATE474057T1; US20120017336A1; WO2007035966A2; BRPI0617607A2; MX2008004001A; WO2007035966A3; DK1931792T3; EP1931792B1

Abstract

Planta de aloe transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante, comprendiendo dicho constructo un promotor, una secuencia que codifica para una proteína exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción; en la que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30; la proteína exógena se expresa a partir del constructo de ADN; y al menos una parte de la proteína exógena se traslada desde una célula de aloe hacia el gel de una hoja de aloe de la planta de aloe transgénica.

Description

Plantas de aloe transgénicas para la producción de proteínas y métodos relacionados.

Antecedentes de la invención Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una planta de aloe transgénica, a métodos para producir en plantas de aloe proteínas biológicamente activas exógenas a dichas plantas, y a métodos de producción de plantas de aloe transgéni-
cas.

Descripción de la técnica relacionada

Sigue habiendo un mercado en crecimiento para proteínas biológicamente activas, muchas de las cuales se usan para fines terapéuticos. En la actualidad, se encuentran disponibles más de 160 medicamentos a base de proteínas. Se espera que se aprueben más o menos cincuenta adicionales a lo largo de los dos próximos años. La demanda actual de producción de proteínas terapéuticas está ya sobrepasando la capacidad de la industria. Se ha predicho que la industria necesitará aumentar su capacidad en cuatro a cinco veces para superar este embotellamiento. Sin embargo, las instalaciones de producción para proteínas terapéuticas son caras y normalmente se tarda un largo tiempo en construir. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos de producción que sean menos caros y puedan reducir el tiempo requerido para incrementar la producción.

Se usan algunos métodos de producción de proteínas basados en animales. Sin embargo, éstos introducen frecuentemente riesgos para la salud a causa de enfermedades. Tales riesgos pueden surgir de la contaminación cruzada con enfermedades que pueden afectar tanto al animal como al usuario final tal como un paciente humano. Por consiguiente, existe una necesidad de un método de producción que elimine la posibilidad de contaminación cruzada entre el organismo de producción y el usuario final.

Además, muchos métodos de producción actuales requieren un procesamiento extenso con el fin de extraer la proteína terapéutica del animal u otro organismo huésped en el que se produjo y obtener el compuesto en un estado en el que puede utilizarse por un paciente. Tras la purificación, la proteína puede combinarse con un adyuvante u otro material vehículo para estabilizar la proteína y permitir la utilización por un paciente. Sin embargo, los procesos de extracción, purificación, resuspensión entre otros implicados con el procesamiento de una proteína terapéutica son complejos y engorrosos y pueden no ser propicios para su uso en países subdesarrollados que generalmente necesitan agentes terapéuticos. Por consiguiente, existe una necesidad de métodos de producción simplificados que puedan eliminar o reducir el procesamiento tras la extracción de proteínas terapéuticas.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona una planta de aloe transgénica que tiene las características según la reivindicación 1 de las reivindicaciones adjuntas.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de producción de una planta de aloe transgénica tal como se expone en la reivindicación 8 de las reivindicaciones adjuntas.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un método de producir en una planta una proteína biológicamente activa tal como se expone en la reivindicación 4 de las reivindicaciones adjuntas.

Las plantas de aloe transgénicas que producen proteínas de mamífero según la presente invención pueden proporcionar una alternativa más viable económicamente para la producción de proteínas de interés tales como por ejemplo diversas proteínas biológicamente activas y cosméticas. Las proteínas de interés se ubican y/o concentran dentro del gel de la hoja de aloe. Esta ubicación de las proteínas de interés puede simplificar la extracción de la proteína de la planta. En este aspecto, la proteína de interés puede coextraerse junto con la extracción del gel nativo dentro de la parte central de la hoja de aloe. Por consiguiente, la presente invención puede proporcionar una planta transgénica a partir de la cual las proteínas de interés se encuentran generalmente más fácilmente accesibles que las de la mayoría de plantas transgénicas tales como por ejemplo tabaco y maíz. Además, la presente invención puede proporcionar un método eficaz para aislar proteínas.

Las plantas de aloe pueden ofrecer diversas ventajas sobre los métodos convencionales para producir proteínas de interés en bacterias y levaduras. Las ventajas de las plantas 10 de aloe pueden incluir la capacidad para procesar proteínas de maneras que las bacterias y levaduras unicelulares simples son poco adecuadas y que pueden ser necesarias para producir las proteínas en la forma deseada. Este procesamiento puede incluir la modificación química, tal como mediante glicosilación, y el plegamiento de algunas proteínas, por ejemplo. Además, en comparación con otros métodos de producción de proteínas basados en células animales, la producción de plantas de aloe puede ofrecer beneficios de coste significativos, ventajas de ampliación a escala y un riesgo reducido de contaminación que puede ser perjudicial para los seres humanos.

Un gel modificado con proteínas de la parte central de la hoja de aloe de una planta de aloe transgénica según la presente invención puede usarse directamente a partir de la planta de aloe. Esto puede evitar la necesidad de extracción relativamente compleja y cara de las proteínas de interés de los materiales de la planta nativa. En algunos aspectos, el gel extraído de la hoja puede usarse directamente sin la necesidad de extracción o procesamiento de las proteínas. El gel puede estar en forma de la médula extraída mecánicamente desde un extremo abierto de una hoja rota de una planta de aloe transgénica.

La presente invención puede proporcionar alternativas viables económicamente para la producción de proteínas de seres humanos y otros mamíferos que son biológicamente activas y/o tienen aplicaciones cosméticas.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra un ejemplo de la anatomía en sección transversal de una hoja de aloe;

la figura 2 ilustra métodos a modo de ejemplo para generar tejido del callo;

la figura 3 resume de manera esquemática diversas etapas para generar una planta de aloe transgénica;

la figura 4 ilustra de manera esquemática los componentes de un vector plasmídico incluyendo la información de secuencia;

la figura 5 enumera la información de secuencia para el promotor de ubiquitina de maíz y destaca regiones del promotor de ubiquitina;

las figuras 6A y 6B ilustran la construcción de un sistema de vector plasmídico según aspectos de la presente invención;

las figuras 7A a 7C ilustran la construcción de otro sistema de vector plasmídico según aspectos de la presente invención;

la figura 8 ilustra la construcción de sistemas de vector plasmídico adicionales según aspectos de la presente invención; y

la figura 9 ilustra la construcción de sistemas de integración según aspectos de la presente invención.

Todas las figuras se ilustran para facilitar la explicación de las enseñanzas básicas de sólo la presente invención; las extensiones de las figuras con respecto al número, posición, secuencia, relación y composiciones de las diversas realizaciones se explicarán o estarán dentro de los conocimientos de la técnica tras la revisión de la siguiente descripción. Además, los diversos protocolos, herramientas, y composiciones para poner en práctica la invención dada a conocer estarán dentro de los conocimientos de la técnica tras la revisión de la siguiente descripción.

Descripción detallada de la invención

Tal como se usa en la memoria descriptiva, "un" o "una" puede significar uno/una o más. Tal como se usa en la(s) reivindicación/reivindicaciones, cuando se usan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "una" pueden significar uno/una o más de uno/una. Tal como se usa en el presente documento "otro/otra" puede significar al menos un/una segundo/segunda o más.

Tal como se usa en el presente documento una "célula de aloe transformada" significa una célula vegetal que se transforma con ADN recombinante, no natural, integrado de manera estable, por ejemplo mediante la transformación mediada por Agrobacterium o mediante bombardeo usando micropartículas recubiertas con ADN recombinante u otros medios. Una célula de aloe transformada de esta invención puede ser una célula vegetal originalmente transformada que existe como un microorganismo o como una célula vegetal de progenie que se regenera en el tejido diferenciado, por ejemplo en una planta 10 de aloe transgénica con ADN recombinante no natural, integrado de manera estable, o semilla o polen derivado de una planta 10 de aloe transgénica de progenie.

Tal como se usa en el presente documento una "planta de aloe transgénica" significa una planta de aloe cuyo genoma se ha alterado mediante la integración estable de ADN recombinante. Una planta 10 de aloe transgénica incluye una planta de aloe regenerada a partir de una célula de aloe originalmente transformada y plantas de aloe transgénicas de progenie de generaciones posteriores o cruces de una planta 10 de aloe transformada.

Tal como se usa en el presente documento "ADN recombinante" significa ADN se ha modificado mediante ingeniería genética y construido fuera de una célula incluyendo ADN que contiene ADN que se produce de manera natural, ADNc, ADN sintético y/u otro ADN.

Tal como se usa en el presente documento "promotor" significa ADN regulador para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor que puede iniciar la transcripción en células de aloe ya sea o no su origen una célula de aloe, por ejemplo, se conoce bien que los promotores de Agrobacterium son funcionales en células de aloe. Por tanto, los promotores vegetales incluyen ADN promotor obtenido de plantas, virus y bacterias de plantas tales como las bacterias Agrobacterium y Bradyrhizobium. Los ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que preferiblemente inician la transcripción en determinados tejidos, tales como hojas, raíces o semillas. Tales promotores se denominan como "de tejido preferido". Los promotores que inician la transcripción sólo en determinados tejidos se denominan como "específicos de tejido". Un promotor específico de "tipo de célula" principalmente dirige la expresión en determinados tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" o "represible" es un promotor que está bajo control ambiental. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden afectar a la transcripción mediante promotores inducibles incluyen condiciones anaerobias, o determinados productos químicos, o presencia de luz. Los promotores específicos de tejido, de tejido preferido, específicos de tipo de célula, e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones. El promotor puede incluir potenciadores u otros elementos que afectan a la iniciación de la transcripción, el sitio de comienzo de la transcripción, los niveles de transcripción, el sitio final de la transcripción, o cualquier procesamiento posterior del ácido ribonucleico resultante.

La expresión "constructo genético" tal como se usa en el presente documento se define como una secuencia de ADN que comprende una disposición sintética de al menos dos segmentos de ADN con el fin de crear una planta de aloe transgénica. En una realización específica, un segmento es una secuencia reguladora y otro segmento codifica para un producto génico.

Tal como se usa en el presente documento "ligado operativamente" significa la asociación de dos o más fragmentos de ADN en un constructo de ADN de modo que la función de uno, por ejemplo, ADN que codifica para proteínas, se controla por el otro, por ejemplo, un promotor, secuencia de terminación, etc.

El término "trascripción" tal como se usa en el presente documento se define como la generación de una molécula de ARN a partir de un molde de ADN.

El término "traducción" tal como se usa en el presente documento se define como la generación de un polipéptido a partir de un molde de ARN.

Tal como se usa en el presente documento "expresado" significa producido, por ejemplo, una proteína se expresa en una célula vegetal cuando su ADN relacionado se transcribe dando ARNm que se traduce dando la proteína.

La presente invención puede proporcionar plantas 10 de aloe transgénicas novedosas que expresan diversas proteínas de interés, puede proporcionar métodos y composiciones para producir plantas 10 de aloe transgénicas, puede proporcionar métodos para extraer proteínas de las plantas 10 de aloe transgénicas, y puede proporcionar composiciones novedosas de proteínas de interés y componentes de la planta 10 de aloe transgénica. Las proteínas de interés producidas según la presente invención pueden incluir una señal secretora para facilitar su acumulación en la médula 18 o la médula de una hoja 12 de aloe. En un aspecto, esta acumulación puede producirse, al menos en parte, dentro de las células mucilaginosas de la hoja de una planta 10 de aloe transgénica.

La médula 18 o la pulpa de una hoja 12 de aloe incluyen los componentes de la hoja que, al menos en parte, comúnmente se denominan el "gel" cuando se ha extraído de la hoja 12 de aloe. Tal como se usa en el presente documento, el "gel" hará referencia a la médula 18 extraída y otros materiales asociados que acompañan a la médula 18 cuando se extrae de la hoja 12 de de aloe independientemente del grado de procesamiento posterior. Según uno o más aspectos de la presente invención, el gel de la hoja 12 de aloe puede tener una composición modificada. En un aspecto particular, la composición del gel puede modificarse para incluir al menos un componente de proteína exógena que se denomina un "gel modificado con proteína". La extracción de un gel modificado con proteína con la(s) proteína(s)
asociada(s) de interés puede ofrecer proteínas fácilmente accesibles y/o métodos eficaces para aislar proteínas. El gel modificado con proteína producido y/o extraído según la presente invención puede usarse directamente sin necesidad de extracción de la proteína.

Los aspectos de la presente invención se ilustran en general en las figuras 1 a 8 para fines de ejemplo. La presente invención proporciona plantas transgénicas, composiciones y metodologías que son aplicables en general al género Aloe de la familia Liliacae. Normalmente, se describe la presente invención con referencia a su aplicación en las especies seleccionadas del grupo de Aloe vera (barbadensis miller), Aloe ferox y Aloe arborescence para fines de ejemplo. El género Aloe generalmente incluye un grupo de plantas monocotiledóneas suculentas en roseta sin tallo grandes. Estas plantas generalmente se denominan plantas 10 de aloe para fines de la presente descripción.

Se han usado diversos compuestos producidos por plantas de aloe para fines medicinales. Según la presente invención, cuando estos compuestos están presentes en un gel modificado con proteína pueden complementar las propiedades medicinales de proteínas biológicamente activas de una planta 10 de aloe transgénica. La figura 1 ilustra una sección transversal a través de una hoja 12 de una planta 10 de aloe transgénica. Las hojas de la planta 10 de aloe transgénica incluyen una mezcla gelatinosa fácilmente extraíble de proteínas, hidratos de carbono y agua incluida en el gel que se deriva principalmente de la médula 18. Esta mezcla gelatinosa principalmente se ubica en la parte central de una hoja 12 de aloe. Se ha demostrado que diversos compuestos en el gel tienen varias propiedades y usos medicinales. En un aspecto, el gel y/o la médula 18 estabilizan una proteína transgénica producida por una planta 10 de aloe transgénica y ubicada en el gel y/o la médula 18.

La figura 1 ilustra particularmente la epidermis 14, la corteza o mesofilo 16, y la médula o pulpa 18. La epidermis 14 forma la capa externa de las células de la hoja. En un aspecto de la presente invención, una planta de aloe transgénica puede incluir células de aloe en uno o más de estos tejidos que incorporan de manera transitoria o estable un constructo genético que se expresa por la célula de aloe. La corteza 16 incluye células ricas en cloroplastos así como los haces vasculares, xilema y floema. La médula 18 es el parénquima esponjoso compuesto casi exclusivamente de grandes células de corteza y, al menos en parte, representa el gel en el que puede ser ventajoso incorporar o acumular una o más proteínas transgénicas de interés.

La epidermis 14 normalmente consiste en una sola capa externa de células. Justo por debajo de la epidermis 14 está la corteza 16 incluyendo la red de haces vasculares. El soporte externo de los haces vasculares generalmente se proporciona por las células de la vaina. Los haces vasculares se componen de tres tipos generales de estructuras tubulares: el xilema, el floema, y los grandes túbulos pericíclicos asociados. El xilema transporta agua y minerales desde las raíces hasta la hoja de la planta. El floema transporta almidones y otros materiales sintetizados en todas partes de la planta. Los túbulos pericíclicos contienen un látex o savia que es muy elevada en las antraquinonas laxantes, especialmente aloína. Las antraquinonas absorben los rayos ultravioletas del sol y evitan el sobrecalentamiento de la parte central de la hoja 12 de aloe que generalmente funciona como órgano de almacenamiento de agua de la planta de aloe. La parte pericíclica de los haces vasculares se adhieren a la epidermis 14, mientras que el resto de los haces vasculares sobresalen en la médula 18. La parte más interna y principal de la hoja 12 de aloe es la médula 18 que, al menos en parte, constituye el gel. Para fines de la extracción del gel, generalmente puede considerarse que la epidermis 14 y la corteza 16 comprenden la vaina que contiene el gel. El gel extraído, comprendido sustancialmente por la médula 18, normalmente es una sustancia espesa y viscosa que históricamente se ha aplicado por vía tópica a la piel para fines medicinales, tales como por ejemplo como tratamiento para quemaduras y
heridas.

Generalmente, el gel funciona como una reserva de materiales de la planta de aloe. Normalmente, la corteza 16 sintetiza muchos de los hidratos de carbono y glicoproteínas que necesita la planta de aloe. Los hidratos de carbono sintetizados en exceso se transportan normalmente a la médula 18 para su almacenamiento junto con agua y algunos minerales. Los hidratos de carbono se transportan por los vasos del floema hacia las vacuolas grandes dentro de las células de la corteza 16 de la médula 18. Entonces, los hidratos de carbono atraen el agua por ósmosis permitiendo que la médula 18 funcione como órgano de almacenamiento de agua de la planta de aloe.

El gel se extrae de manera relativamente fácil rompiendo una hoja 12 de aloe a lo largo de su eje longitudinal y aplastando la hoja para obligar a salir al gel de la vaina circundante a través de la rotura. Pueden extraerse materiales adicionales de los tejidos de la hoja junto con el gel.

Visión general del procedimiento

Las plantas 10 de aloe transgénicas según una o más de las presentes invenciones generalmente incluyen uno o más constructos de ADN incorporados de manera estable dentro de la planta para expresar una o más proteínas de interés. Generar una planta 10 de aloe transgénica según una o más de las presentes invenciones pude implicar una variedad de composiciones y métodos novedosos. Normalmente, se desarrollan uno o más constructos de ADN para expresar una o más proteínas en la planta 10 de aloe transgénica. En un aspecto, un solo constructo puede expresar un solo ARNm. En otros aspectos, un solo constructo puede expresar múltiples ARNm. En aún otros aspectos, múltiples constructos pueden producir múltiples ARNm. Cada ARNm puede producir uno o más polipéptidos.

Para introducir los constructos en las plantas de aloe, normalmente se usan células de aloe o tejido de callo no diferenciado tal como se ilustra en general en la figura 2. Las células de aloe y el tejido de callo normalmente se derivan de la raíz o de los tejidos de meristemo de hoja o de una semilla de una planta de aloe. Los constructos de ADN se introducen en las células de aloe usando un intervalo de técnicas y/o constructos tal como se ilustra esquemáticamente en la figura 3. Los expertos en la técnica reconocerán algunas técnicas tras la revisión de la presente descripción. Las células de aloe o el tejido de callo que incorporan los constructos deseados, se seleccionan usando diversas técnicas. Normalmente, el constructo de ADN incluirá un marcador seleccionable. Una vez que el constructo deseado se ha introducido de manera estable en las células de aloe o el tejido de callo, normalmente se generan plántulas de aloe a partir de células de aloe o tejido de callo. Las plántulas de aloe que se transforman en plantas 10 de aloe transgénicas viables que contienen los constructos de ADN pueden o bien producir de manera constitutiva o bien producir de manera inducible la(s) proteína(s) deseada(s) de interés. La proteína de interés puede ubicarse en la planta 10 de aloe transgénica o puede encontrarse generalmente en todas partes de la planta 10 de aloe transgénica dependiendo de la proteína particular que se esté produciendo y/o la presencia o ausencia de una secuencia señal asociada con la proteína. Dependiendo del constructo particular y/o las proteínas de interés asociadas, la planta 10 de aloe transgénica puede entonces propagarse de manera vegetativa o sexual. Pueden aislarse las proteínas de las plantas 10 de aloe transgénicas usando una amplia gama de técnicas. Entonces, las proteínas pueden aislarse adicionalmente y/o procesarse adicionalmente. Tal procesamiento puede incluir modificación enzimática, modificación química, incorporación en un adyuvante adecuado, entre otros procesamientos que los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción. En un aspecto, las proteínas pueden procesarse a partir de un (precursor) inactivo en una forma activa para las aplicaciones específicas de la proteína
particular.

Aislamiento de células

Tal como se muestra en la secuencia a modo de ejemplo ilustrada en la figura 2, las células de aloe o grupos de células de aloe se aíslan normalmente a partir de una planta de aloe antes de la incorporación del constructo deseado. Los tipos de célula de aloe generalmente elegidos para incorporar los constructos de ADN se eligen generalmente basándose en su potencial regenerativo. También pueden usarse células meristemáticas del meristemo del brote o del meristemo de la raíz de una planta de aloe o células de aloe embrionarias de una semilla de aloe. Sin embargo, muchas partes de la planta de aloe conservan el potencial para volver a crecer o formar tejido de callo y también pueden utilizarse. Normalmente, las células se aíslan usando un intervalo de técnicas que los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción. Normalmente, las células se aíslan mecánicamente a partir de la planta de aloe usando un escalpelo. Alternativamente, pueden usarse otras técnicas mecánicas u otra manera para aislar las células necesarias tal como los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción. Una vez que se aísla una célula de aloe o grupo de células de aloe apropiado, las células de aloe se hacen crecer normalmente en cultivo para formar tejido de callo. Aunque determinadas técnicas pueden no requerir que las células de aloe se hagan crecer en primer lugar dando tejido de callo, el tejido de callo proporciona una fuente de conjunto de células de aloe no diferenciadas que conservan el potencial para generar una planta 10 de aloe transgénica. El tejido de callo normalmente se hace crecer en un medio sólido. Sin embargo, el tejido de callo también puede colocarse en un medio de cultivo líquido y hacerse crecer en suspensión.

Las células meristemáticas pueden aislarse de las puntas de las raíces u hoja de una planta de aloe. También pueden aislarse células de aloe meristemáticas del meristemo apical. Normalmente, la planta de aloe, de la que se aíslan los tejidos, es una planta de aloe sana joven. La planta de aloe normalmente se selecciona para que no sea más grande de ocho (8) pulgadas con seis (6) o menos brotes primarios. Normalmente se forma una herida en un brote de una planta de aloe al cortarla en segmentos. La superficie herida puede estimular el crecimiento de las células de aloe. Normalmente, el callo comenzará a crecer principalmente en la superficie del corte. Para aislar células de aloe de una hoja 12 de aloe, normalmente se cortan segmentos del extremo distal de un brote en crecimiento joven. Entonces, las partes del segmento se colocan en placa en un medio de crecimiento. El tejido de meristemo apical del brote se deriva de un corte de una pulgada desde la base de una planta de aloe joven. Se extraen las hojas 12 de aloe a partir del corte y el segmento se coloca en placa. Las células de aloe del meristemo se encuentran dentro del "corte". Éstas se "seleccionan" o "aíslan" por su capacidad para continuar creciendo en la placa de cultivo, formando tejido de callo o regenerando brotes. Entonces, una vez aisladas las células de aloe meristemáticas, se cultivan en medio apropiado y en condiciones que promueven la formación de tejido de callo.

El aislamiento de las células de aloe embrionarias de las semillas generalmente implica extraer el recubrimiento de la semilla para exponer el embrión y la extracción mecánica de las células de aloe deseadas del embrión. Las semillas de aloe normalmente se esterilizan y se extraen las cáscaras exteriores de la semilla. Para extraer mecánicamente las células de aloe o bien de una planta de aloe o bien de un embrión de aloe, normalmente se usa un escalpelo. Entonces, las células de aloe embrionarias, una vez aisladas del recubrimiento de la semilla, se cultivan en un medio apropiado y en condiciones que promueven la formación de tejido de callo.

Cuando se desea tejido de callo, las células de aloe aisladas normalmente se cultivan en condiciones que favorecen la formación de tejido del callo tal como los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción. Normalmente, las células de aloe aisladas se colocan en placa y se hacen crecer en un medio nutritivo sólido apropiado para formar tejido de callo que tiene un tamaño de aproximadamente 1 cm de diámetro antes de la transformación. Normalmente las células de aloe se hacen crecer a entre 23 y 26 grados centígrados. Los medios adecuados incluyen un sólido o líquido base que normalmente incluirá nutrientes inorgánicos complementarios, tanto macroelementos (tales como nitrógeno, azufre, fósforo, calcio, magnesio y potasio), como microelementos (tales como hierro, boro, cobalto, cobre, yodo, manganeso, molibdeno y zinc); nutrientes orgánicos incluyendo azúcares (sacarosa o maltosa) y vitaminas y cofactores (tiamina, niacina, biotina, piridoxina, mioinositol entre otros); aminoácidos (tales como prolina y hidrolizado de caseína); así como reguladores del crecimiento principalmente una fuente de auxina (normalmente (NAA), ácido 1-naftalenacético, (IAA), ácido indol-3-acético, o ácido (2,4-D), 2,4-diclorofenoxiacético) y una fuente de citocinina (normalmente (BAP) 6-bencilaminopurina). Estos medios y vitaminas normalmente se encuentran comercialmente disponibles en composiciones formuladas previamente con concentraciones variables de nutrientes inorgánicos y vitaminas y se conocen, entre otros, como medios MS (Murashige-Skoog), medios Gamborg o medios Chu N6. Adicionalmente, las células hechas crecer en placas Petri normalmente requieren un soporte de matriz sólida tal como agar que va a añadirse a los medios de crecimiento.

Formación de constructos de ADN

Normalmente, se introducen constructos de ADN adecuados en tejido de callo derivado de células de aloe aisladas para permitir la producción de la(s) proteína(s) de interés por la planta 10 de aloe transgénica resultante. También pueden introducirse constructos de ADN en células de aloe aisladas o plantas de aloe maduras tal como los expertos en la técnica pueden reconocer con la revisión de la presente descripción. Normalmente, los constructos de ADN se incorporan en un vector tal como un plásmido o virus para propagar el constructo y para introducirlo en las células de aloe. Un vector plasmídico a modo de ejemplo puede incluir el plásmido comercializado con el nombre comercial pZErO de Invitrogen (Carlsbad, California), ilustrado esquemáticamente en la figura 4 para fines de ejemplo, y pueden incluir una o más de las unidades funcionales, por ejemplo, de este plásmido.

Los constructos de ADN según la presente invención pueden incluir una secuencia promotora que puede funcionar en una célula de aloe, una secuencia que codifica para una proteína de interés, una secuencia de terminación, y un sitio de iniciación y de parada de la traducción, de los que todos pueden funcionar en una célula de aloe. Estos componentes cuando se configuran y combinan de manera apropiada pueden iniciar la transcripción del ADN y la traducción del ARNm y su respectiva terminación en una célula de aloe. El constructo de ADN también puede incluir una señal de secreción. Alternativamente, algunas proteínas de interés, tales como por ejemplo interferón, pueden incluir un dominio, natural o sintético, que dirige al interferón para su secreción. La señal de secreción normalmente se escinde dado que la proteína deja la célula o, en algunos casos, la proteína pueden conservarla sin afectar sustancialmente la función de la proteína. Las señales secretoras pueden añadirse a una variedad de proteínas que pueden requerir señales secretoras para su translocación. Estas señales secretoras pueden derivarse de diversas secuencias de secreción de la planta. El constructo de ADN o un vector asociado también pueden incluir al menos un marcador seleccionable. En un aspecto, el constructo de ADN puede incluir tanto un primer marcador seleccionable para la propagación del vector en bacterias como un marcador seleccionable para el crecimiento en células de aloe. Además, el constructo de ADN puede incluir otros elementos reguladores así como para la expresión en células de aloe específicas en la planta 10 de aloe. Otros componentes del constructo pueden incluir elementos reguladores adicionales, tales como líderes en 5' e intrones para potenciar la transcripción, regiones no traducidas en 3' (tal como señales y sitios de poliadenilación), ADN para péptidos de tránsito. Amplificación de una secuencia de ADN deseada, tal como una secuencia que codifica para una proteína terapéutica deseada, puede lograrse mediante la reacción en cadena de la polimerasa (véanse las patentes estadounidenses n.^{os} 4.683.202 y 5.928.906). Con la revisión de la presente descripción, los expertos en la técnica reconocerán que los constructos de ADN, incluyendo las secuencias promotoras, las secuencias reguladoras, las secuencias de estabilización, las secuencias de direccionamiento y/o las secuencias de terminación pueden modificarse para afectar a su función usando métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Tal como se observó anteriormente, normalmente se utiliza un promotor que es operativo en una célula de aloe. Normalmente, el promotor contiene elementos genéticos a los que pueden unirse proteínas y moléculas reguladoras. Normalmente, estas proteínas incluyen ARN polimerasa y otros factores de transcripción. El promotor se liga operativamente en una ubicación y/u orientación funcional a una secuencia de ácido nucleico para controlar la iniciación de la transcripción y/o la expresión de esa secuencia. El promotor puede o no usarse conjuntamente con un "potenciador", que hace referencia a una secuencia reguladora que actúa en configuración cis implicada en la activación transcripcional de una secuencia de ácido nucleico.

Naturalmente, será importante emplear un promotor y/o potenciador que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en al menos un tipo de célula de una planta 10 de aloe en la que se desea la expresión. Los expertos en la técnica de la Biología Molecular generalmente conocen el uso de promotores, potenciadores, y combinaciones de tipos de células para la expresión de proteínas, por ejemplo, véase Sambrook et al. (1989). Los promotores empleados pueden ser constitutivos, específicos de tejido, inducibles, y/o útiles en las condiciones apropiadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como es ventajoso en la producción a gran escala de proteínas y/o péptidos recombinantes. El promotor puede ser heterólogo o endógeno. Normalmente, los constructos de ADN requieren señales reguladoras de iniciación y terminación de la transcripción y la traducción que puedan funcionar en células de aloe. Puede usarse una gran variedad de secuencias que regulan la iniciación de la transcripción. Las secuencias de ADN que controlan la iniciación de la transcripción pueden proceder de Agrobacterium, virus o plantas. Puede usarse la región de iniciación de la transcripción viral 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S-CaMV) para plantas 10 de aloe. Los promotores vegetales que pueden usarse en plantas 10 de aloe también pueden incluir el promotor de subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (RUBISCO) de diversas plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas o el promotor de ubiquitina de maíz. Pueden usarse otros promotores adecuados y los expertos en la técnica pueden reconocerlos con la revisión de la presente descripción. Si se desea la regulación inducible, pueden obtenerse dominios de diferentes fuentes de modo que una región reguladora de una fuente se combina con un dominio de unión de ARN polimerasa de otra fuente. La regulación de la expresión puede ser en una fase particular del desarrollo de una planta 10 de aloe transgénica en una parte específica de la planta 10 de aloe transgénica como raíces, hojas, semillas, flores, savia o en combinación de partes de plantas y fases de desarrollo. La regulación de la expresión en una fase del desarrollo o tejido particular puede requerir elementos de ADN adicionales que los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción.

En la bibliografía se han descrito numerosos promotores distintos que son activos en células vegetales y pueden ser útiles en células de aloe. Estos incluyen promotores presentes en genomas vegetales así como promotores de otras fuentes, incluyendo: promotores de nopalina sintasa (NOS) y promotores de octopina sintetasa (OCS) portados en plásmidos que inducen tumores de Agrobacterium tumefaciens; y promotores de caulimovirus tales como el virus del mosaico de la coliflor. Además, también se han identificado otros diversos promotores en diversas referencias, incluyendo, pero sin limitarse a, las patentes estadounidenses n.^{os} 5.858.742 y 5.322.938, que dan a conocer versiones del promotor constitutivo derivado del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S); patente estadounidense n.º 5.641.876, que da a conocer un promotor de actina de arroz; publicación de solicitud de patente estadounidense 2002/0192813A1 que da a conocer elementos en 5', en 3' y de intrón útiles en el diseño de vectores de expresión de plantas eficaces; solicitud de patente estadounidense n.º de serie 09/757.089, que da a conocer un promotor de aldolasa de cloroplasto de maíz; solicitud de patente estadounidense n.º de serie 08/706.946, que da a conocer un promotor de glutelina de arroz; solicitud de patente estadounidense n.º de serie 09/757.089, que da a conocer un promotor de aldolasa (FDA) de maíz; y solicitud de patente estadounidense n.º de serie 60/310.370, que da a conocer un promotor de nicotianamina sintasa de maíz. Éstos y numerosos promotores distintos que funcionan en células vegetales y pueden ser operativos en una planta de aloe transgénica para expresar las proteínas terapéuticas deseadas.

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Como un ejemplo particular, puede usarse el promotor de ubiquitina (SEQ. ID. N.º 44) de maíz. El promotor de ubiquitina de maíz es un elemento grande de casi 2 kb de longitud, compuesto de al menos tres regiones generales. Cuya secuencia se enumera en la figura 5 con las características particularmente relevantes marcadas. La primera parte del promotor de ubiquitina se ubica en la mayoría de regiones de unión a la matriz (MAR) que contienen 5', que son elementos que interaccionan con las histonas y otras proteínas nucleares y sirven para "desconectar" secuencias flanqueantes volviéndolas más fácilmente accesibles a la maquinaria transcripcional de la célula. También ayudan a aislar las unidades transcripcionales unas de otras, que es importante para evitar que la transcripción iniciada en un lugar se "ultralea" en una segunda secuencia. Esto puede ayudar a reducir el riesgo de crear mensajes antisentido.

La segunda parte contiene elementos potenciadores y el promotor real. Los elementos potenciadores unen factores de transcripción que son responsables de dirigir la maquinaria transcripcional, el complejo pol II, para unirlo al promotor e iniciar la transcripción. Mientras que el "promotor" se refiere específicamente a los elementos de ADN esenciales necesarios para interaccionar con la maquinaria de iniciación de la transcripción del núcleo, el término promotor se usa más generalmente para abarcar todos los elementos de ADN implicados con la iniciación de la transcripción, y en este caso se usa libremente el "promotor de ubiquitina" para hacer referencia a toda o modificaciones de la región de 2 kb, 5' con respecto al gen de interés clonado.

La tercera parte contiene un intrón de aproximadamente 1 kb. Los intrones son regiones de un gen transcrito que se extraen del mensaje traducido final, el ARNm, mediante el proceso de corte y empalme. También se ha encontrado que los intrones influyen directamente en la expresión génica, proporcionando elementos potenciadores alternativos, así como aumentando la traducción de proteínas facilitando la translocación de mensajes de ARN desde el núcleo hasta el citoplasma, un proceso ligado en parte al corte y empalme. Sin embargo, la presencia de intrones en sistemas transgénicos no siempre conduce a aumentos en la expresión de ARN o de los niveles de proteína traducida. En determinados aspectos, puede modificarse el intrón de ubiquitina para reducir el tamaño total de los vectores y para someter a ensayo su efecto sobre la expresión del gen transgénico en el aloe.

En otros aspectos de la presente invención, puede desearse la expresión preferencial en tejidos verdes de la planta de aloe. Los promotores de interés para tales usos pueden incluir aquéllos de genes tales como la subunidad pequeña de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa (Rubisco) de Arabidopsis thaliana (Fischhoff et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20:81-93), aldolasa y piruvato ortofosfato dicinasa (PPDK) (Taniguchi et al. (2000) Plant Cell Physiol. 41(1):42-48).

Tal como se observó anteriormente, los promotores pueden alterarse para contener "secuencias potenciadoras" múltiples para ayudar a elevar la expresión génica. En la técnica se conocen tales potenciadores. Incluyendo una secuencia potenciadora con tales constructos, puede potenciarse la expresión de la proteína seleccionada. Estos potenciadores a menudo se encuentran en 5' con respecto al inicio de la transcripción en un promotor que funciona en células eucariotas, pero a menudo pueden insertarse aguas arriba (5') o aguas abajo (3') de la secuencia codificante. En algunos casos, estos elementos de potenciación en 5' son intrones. Particularmente útiles como potenciadores son los intrones en 5' de los genes de actina de arroz 1 (véase la patente estadounidense n.º 5.641.876) y de actina de arroz 2, el intrón del gen de alcohol deshidrogenasa de maíz, el intrón del gen de proteína 70 de choque térmico de maíz (patente estadounidense n.º 5.593.874) y el gen 1 de maíz superdulce (shrunken).

Los constructos según aspectos de la presente invención pueden incluir un elemento en 3' que normalmente contiene una señal y un sitio de poliadenilación. Los elementos en 3' bien conocidos incluyen aquéllos que proceden de los genes de Agrobacterium tumefaciens, genes tales como nos 3', tml 3', tmr 3', tms 3', ocs 3', tr7 3', por ejemplo dados a conocer en la patente estadounidense n.º 6.090.627; los elementos en 3' de genes vegetales tales como proteína 17 de choque térmico de trigo (Triticum aesevitum) (Hsp17 3'), un gen de ubiquitina de trigo, un gen de fructosa-1,6-bifosfatasa de trigo, un gen de glutelina de arroz, un gen lactato deshidrogenasa de arroz y un gen de beta-tubulina de arroz, todos los cuales se dan a conocer en la solicitud de patente estadounidense publicada 2002/0192813 A1; y el gen de ribulosa bifosfato carboxilasa de guisante (Pisum sativum) (rbs 3'), y los elementos 3' de los genes dentro de la planta huésped.

Una proteína de interés puede codificarse por un gen estructural incorporado en el constructo de ADN. El gen estructural puede ser un gen de mamífero o partes de un gen de mamífero. Los genes estructurales de interés pueden codificar para interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento, hormonas, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, enzimas, u otras proteínas. La secuencia para el interferón alfa 2 se enumera para fines de ejemplo como SEQ. ID. N.º 33. Los genes estructurales también pueden codificar para proteínas marcadoras como la proteína fluorescente verde (GFP) de medusa. La secuencia de ADN de los genes estructurales puede modificarse para permitir la expresión de alto nivel en una planta 10 de aloe. La preferencia codónica para la planta 10 de aloe puede diferir de la preferencia codónica en la especie original a partir de la que se aisló el gen estructural. El gen estructural nativo puede modificarse mediante ingeniería genética para optimizar la producción de la proteína codificada en las plantas 10 de aloe. Además, la secuencia de ADN del gen estructural puede modificarse mediante ingeniería genética para proporcionar la glicosilación apropiada en plantas 10 de aloe que no interfiere con la estructura de la proteína.

La terminación de la transcripción y la transducción pueden proporcionarse mediante una variedad de secuencias de terminación de la transcripción y la traducción que pueden funcionar en una planta 10 de aloe. En un aspecto, las secuencias de terminación pueden incluir la secuencia del gen de nopalina sintetasa (NOS) de Agrobacterium. En otro aspecto, la secuencia de terminación puede derivarse de las secuencias de terminación de genes y proteínas de aloe nativos.

A menudo se integrará un gen marcador en el constructo de ADN. El gen marcador puede permitir que se seleccionen células, que contienen el gen estructural de interés, de la población de todas las células que no contienen el gen marcador. Los genes marcadores pueden incluir enzimas u otras proteínas que proporcionan resistencia a kanamicina, cloranfenicol, G418 y gentamicina y entre otros. Pueden ser necesarias aún otras secuencias de ADN específicas si por ejemplo se usa Agrobacterium como vector. Pueden estar presentes otras regiones si el ADN ha de dirigirse a un tipo de célula específico.

Tal como se hizo referencia anteriormente, los constructos de ADN también pueden incluir una señal de secreción. Los constructos también pueden incluir una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal que puede dirigir a la proteína terapéutica para su extracción de la célula en la que se formó la proteína. En la bibliografía se han identificado diversas secuencias señal que son funcionales en plantas y, más particularmente, funcionales en plantas monocotiledóneas tales como plantas de aloe. Éstas pueden integrarse operativamente en los contractos o dentro de los genes de interés. En un aspecto, puede utilizarse la secuencia secretora de alfa-amilasa (SEQ. ID NO. 29) de arroz (Oryza sativa). Esta secuencia señal se caracteriza en "The alpha-amylase genes in Oryza sativa" Mol Gen Genet., abril de 1990; 221(2):235-44. Alternativamente, algunos genes de interés, tales como por ejemplo interferón, pueden incluir un dominio, natural o sintético, que dirige al interferón para su secreción. La señal de secreción normalmente se escinde cuando la proteína abandona la célula o, en algunos casos, la proteína puede retenerla sin afectar sustancialmente a la función de la proteína. Pueden añadirse señales secretoras a una variedad de proteínas que pueden requerir señales secretoras para su translocación. Estas secuencias secretoras pueden derivarse de diversas secuencias de secreción de plantas.

Las figuras 6A a 6B ilustran un conjunto de constructos a modo de ejemplo para producir una proteína de interés a partir de una planta de aloe. Las construcciones de plásmido se marcan como pzUI (TGC9). TGC9 incluye el promotor de ubiquitina de longitud completa que dirige la expresión del interferón alfa 2 humano, y pzUEK (TGC12) (SEQ. ID. N.º 38), el promotor de ubiquitina de longitud completa que dirige la expresión de una proteína de fusión que contiene eGFP (proteína fluorescente verde potenciada) (SEQ. ID. N.º 31) y la proteína de resistencia a kanamicina. La proteína de fusión combina las propiedades de detección de ambas proteínas (selección y visualización) en una.

Tal como se ilustra, se creó el plásmido pzI (TGC8) mediante amplificación por PCR del gen de interferón alfa 2 humano usando cebadores de PCR que contenían, cada uno, dos sitios de enzima de restricción distintos (véase la tabla 1 para la secuencia de los cebadores). El gen de interferón (IFN) amplificado tiene sitios flanqueantes en 5' PstI y BamHI y en 3' SacI y XhoI. Entonces, se clonó el IFN generado por PCR como un fragmento de PsiI/XhoI en el vector pZErO para crear el constructo pzI (TGC8) e introducir los sitios BamHI y SacI para su posterior clonación. Este constructo contiene el gen de IFN alfa de longitud completa y su secuencia señal, responsable de dirigir la secreción de la proteína IFN desde la célula. Esto se representa en la transparencia 3. Se secuenciaron estos clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Tal como se ilustra, se creó el vector plasmídico pzUI (TGC9) clonando el gen IFN alfa 2 en el sentido de 3' del promotor de ubiquitina de longitud completa. Se liberó el fragmento de PstI/XhoI de IFN de pzI (TGC 8) y se ligó en pzU (TGC1) para crear el constructo pzUI (TGC9). Esto se representa en la transparencia 3.

Tal como se ilustra, se amplificó por PCR el gen de eGFP usando un conjunto de cebadores que contenían sitios de restricción BamHI (extremo 5') y XhoI (extremo 3') (véase la tabla I para la secuencia de los cebadores). Este gen de eGFP generado por PCR se creó sin un codón de parada (para permitir en última instancia la expresión de una proteína de fusión eGFP-kan). Por tanto, la traducción no termina al final de la secuencia de eGFP. Se digirió el fragmento amplificado por PCR con las enzimas de restricción BamHI y XhoI y se ligó en los sitios BamHI y XhoI de pZErO, creando pzEnostop (TGC10). Esto se representa en la transparencia 3. Se secuenciaron los clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Tal como se ilustra, pzEK (TGC11) genera un constructo de fusión entre el gen de eGFP y el gen de resistencia a kanamicina. Se liberó eGFP como un fragmento de BamHI/XhoI de pzEnostop (TGC10) y se ligó en pzK (TGC4) creando el constructo pzEK (TGC11).

\hbox{El gen de eGFP
se clona en marco y en 5' con respecto a kan/nos  (SEQ. ID. N.º
35).}

Tal como se ilustra, se clonó un fragmento de BamHI/XbaI de pzEK (TGC11) que contenía el casete eGFP/kan/nos, en los sitios BamHI y XbaI de pzUI (TGC9) con el fin de permitir la expresión del gen de fusión eGFP/kan. Por tanto, se elimina la secuencia de IFN. Este nuevo constructo, pzUEK (TGC12), expresa la proteína de fusión eGFP/kan a partir del promotor de ubiquitina de longitud completa (representado en la transparencia 4). Esta proteína de fusión conserva las características de cada una de las proteínas individuales, y así tiene el beneficio obvio de funcionar tanto como marcador visual como agente de selección en uno.

Las figuras 7A a 7C ilustran otro conjunto de constructos a modo de ejemplo para producir una proteína de interés a partir de una planta de aloe. Los vectores ilustrados permiten la expresión de dos genes, como un solo transcrito, mientras que aún se traducen en dos proteínas distintas. Para lograr esto, se separan los dos genes entre sí mediante un elemento IRES de intervención (secuencia interna de entrada a ribosoma) (SEQ. ID. N.º 34). El elemento IRES proporciona un segundo sitio interno, para la unión a ribosoma y la traducción. Este segundo sitio permite que los transcritos clonados en 3' con respecto al elemento IRES, se traduzcan por separado. Estos vectores, concretamente pzUSEIrK (TGC18) (SEQ. ID. N.º 43) y pzUIIrK (TGC19) (SEQ. ID. N.º 39), se construyeron en fases, permitiendo en última instancia la expresión de eGFP o IFN (respectivamente) conjuntamente con el marcador de resistencia a kanamicina.

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Tal como se ilustra, se creó el vector pzEnostart (TGC13) amplificando en primer lugar eGFP mediante PCR (tabla I para secuencias de cebadores) usando cebadores que contenían los sitios de enzima de restricción BamHI (extremo 5') y SacI (extremo 3'). Este producto de PCR se clonó como un fragmento de BamHI/SacI en pZErO. El gen eGFP en este constructo carece de un sitio de inicio de la traducción ATG, ya que esta proteína se expresa como una fusión con la secuencia señal de alfa-amilasa (véase la construcción de pzSE, TGC14). Esto se representa en la transparencia 5. Se secuenciaron estos clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de
ADN.

Tal como se ilustra, se sintetizó la única cadena de la secuencia señal del gen de alfa-amilasa y luego se convirtió en doble cadena completándola usando PCR (tabla 1 para secuencias de cebadores). Entonces se digirió la secuencia señal con las enzimas de restricción PstI y BamHI y se clonó en pzEnostart (TGC13). Esto se representa en la transparencia 5. Se clonó la secuencia señal en marco, en 5' con respecto a eGFP, y proporciona el sitio de iniciación de la traducción para la fusión de secuencia señal-eGFP. Se secuenciaron los clones pzSE (TGC14) resultantes para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Tal como se ilustra, se construyó el vector pzUSE (TGC15) para unir la fusión de secuencia señal de alfa-amilasa (ss)-eGFP con el promotor de ubiquitina. Se clonó el casete génico que contenía el ss-eGFP de pzSE (TGC14) como un fragmento de PstI/SacI en pzUI (TGC9). Esto reemplaza el casete génico de IFN (liberado de pzUI (TGC9) mediante digestión con enzimas de restricción PstI y SacI) creando pzUSE (TGC15). Esto se representa en la transparencia 5.

Tal como se ilustra, se amplificó el elemento IRES mediante PCR (tabla I para secuencias de cebadores) a partir de pIRES2-EGFP (Clontech, BD Biosciences) con cebadores que contenían los sitios de restricción SacI (extremo 5') y XhoI (extremo 3'). Se clonó el elemento IRES amplificado como un fragmento de SacI/XhoI en pZErO para crear pzIr (TGC16). Esto se representa en la transparencia 6. Se secuenciaron estos clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Tal como se ilustra, entonces se clonó el elemento IRES a partir de pzIr (TGC16) como un fragmento de SacI/XhoI en pzK (TGC4) creando pzIrK (TGC17). Colocando así el IRES en el sentido de 5' del casete génico de kan/nos.

Tal como se ilustra, se clonó el casete génico de IRES-kan/nos como un fragmento de SacI/XbaI en pzUSE (TGC15) creando pzUSEIrK (TGC18). Esto se representa en la transparencia 6. Este constructo expresa eGFP como una fusión con la secuencia señal de alfa-amilasa, dirigiendo el eGFP para su secreción a partir de la célula. Esto hace posible monitorizar visualmente el tráfico y la acumulación de proteínas dentro de la planta transformada. Este vector también expresa la proteína de resistencia a kanamicina (traducida a partir del elemento IRES interno) y permite su selección en plantas transgénicas.

Tal como se ilustra, también se clonó el casete génico de IRES-kan/nos como un fragmento de SacI/XbaI en pzUI (TGC9) creando pzUIIrK (TGC19). Esto se representa en la transparencia 7. Este constructo expresa IFN alfa 2 con una secuencia señal para su secreción. Este vector también expresa la proteína de resistencia a kanamicina (traducida a partir del elemento IRES interno) y permite su selección en plantas transgénicas. Tanto TGC18 como TGC19 expresan dos genes como un solo transcrito, eliminando la necesidad de un segundo promotor, y reduciendo así el tamaño total de cada vector. Esto es importante ya que al disminuir el tamaño total de los constructos transfectados aumenta la eficiencia con la que estos elementos pueden trasladarse al núcleo, conduciendo a la integración estable y la selección de plantas transgénicas. Un solo sistema de promotor también reduce el riesgo de alterar la expresión de gen flanqueante u otras situaciones que podrían afectar en última instancia a la expresión de transgén.

Los plásmidos enumerados anteriormente pueden sustituir otras secuencias codificantes de interés para el interferón alfa. Tal como los expertos en la técnica reconocerán, éstos pueden sustituirse en el mismo locus o en otras ubicaciones en los plásmidos.

Según aspectos de la presente invención, también puede integrarse una secuencia que codifica para protrombina (SEQ. ID. N.º 36) en un vector plasmídico tal como se ilustra esquemáticamente en la figura 8. Protrombina es la proteína precursora de trombina. Se escinde en 2 sitios mediante el factor X activado para liberar trombina activada, una proteína de coagulación que convierte el fibrinógeno soluble en cadenas insolubles de fibrina. Se amplificó el casete génico de protrombina (1874 pares de bases) usando cebadores PCR (tabla I para la secuencia de los cebador). Se liberó el casete génico de eGFP a partir del vector pzUSEIrK (TGC18) mediante la enzima de restricción BamHI. Posteriormente, se eliminaron las proyecciones en 5' resultantes con nucleasa Mung Bean para crear extremos romos. Los extremos romos se desfosforilaron usando fosfatasa intestinal de ternero (CIP) incubando a 50 grados centígrados durante 2 horas, antes de ligar durante la noche con el casete génico de protrombina a 15 grados centígrados. Esto creó pzUSTIrK (TGC20) (SEQ. ID. N.º 42). Se secuenciaron los clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Según aspectos de la presente invención, también puede integrarse una secuencia que codifica para dermicidina (DCD) (SEQ. ID. N.º 30) en un vector plasmídico tal como se ilustra esquemáticamente en la figura 8. Dermicidina era un péptido antimicrobiano de amplio espectro recientemente notificado que se encontró expresado constitutivamente en las glándulas sudoríparas. Esta proteína se secreta en el sudor y se transporta a la superficie epidérmica. El casete génico de DCD amplificado por PCR tiene sitios de enzima de restricción BamHI flanqueantes (tabla I para la secuencia de los cebadores). Se ligó el casete génico de DCD digerido con BamHI en el sitio BamHI del vector pzUSEIrK (TGC18) que solía estar ocupado por eGFP, creando el vector pzUSDIrK (TGC21) (SEQ. ID. N.º 40). Se secuenciaron los clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Según aspectos de la presente invención, también puede integrase una secuencia que codifica para una hormona de crecimiento humana (hGH) (SEQ. ID. N.º 32) en un vector plasmídico tal como se ilustra de esquemáticamente en la figura 8. Se creó el casete génico de hGH mediante amplificación por PCR con sitios de enzima de restricción BamHI flanqueantes (tabla I para la secuencia de los cebador). Entonces, se ligó el casete génico de hGH digerido con BamHI en el sitio BamHI del vector pzUSEIrK (TGC18) que solía estar ocupado por eGFP, creando el vector pzUSHIrK (TGC22) (SEQ. ID. N.º 41). Se secuenciaron los clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

Según aspectos de la presente invención, también puede integrarse una secuencia que codifica para interferón gamma humano (hIFNg) en un vector plasmídico tal como se ilustra esquemáticamente en la figura 8. Se creó el casete génico de hIFNg mediante amplificación por PCR con sitios de enzima de restricción BamHI flanqueantes (tabla I para la secuencia de los cebadores). Entonces, se ligó el casete génico de hIFNg digerido con BamHI en el sitio BamHI del vector pzUSEIrK (TGC18) que solía estar ocupado por eGFP, creando el vector pzUSIfgIrK (TGC23) (SEQ. ID. N.º 37). Se secuenciaron los clones generados por PCR para confirmar la ausencia de cualquier mutación de ADN.

TABLA I Lista de secuencias de cebadores usadas para crear otros genes expresados

1

2

Estas secuencias pueden contener su propia secuencia señal. Al igual que se demostró que la secuencia en interferón alfa puede funcionar en una planta de aloe, también puede demostrarse que las secuencias señal nativas dentro de protrombina, dermicidina (DCD), hormona de crecimiento humana (hGH), e interferón gamma humano (hIFNg) son funcionales en una planta de aloe. A pesar de esto, estas secuencias que codifican para proteínas pueden clonarse en un vector que contiene la secuencia señal de alfa-amilasa tal como se ilustra en los ejemplos de la figura 8.

En el desarrollo de los constructos de referencia anteriores, se hicieron crecer todos los vectores usados para la transformación en 250 ml de LB con zeocina 50 \mug/l y se aislaron usando el método de CsCl. Entonces, se usaron los vectores en estudios de transfección transitoria para garantizar la expresión apropiada de cada constructo. Se realizó la transfección usando la pistola génica en maíz, tabaco y aloe, y se monitorizó la expresión visualmente para determinar la expresión de eGFP o mediante rt-PCR para determinar la expresión de o bien IFN o bien kan.

Transformación

Tras generarse los constructos de ADN que incluyen el gen de interés y diversas unidades funcionales incorporadas en vectores, se introducen los constructos de ADN en las células de aloe usando varias técnicas que los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción. Generalmente, se diseñan estos constructos de ADN para promover la formación de plantas 10 de aloe transformadas de manera estable. En la técnica se conocen numerosos métodos para transformar células vegetales con ADN recombinante y pueden usarse en la presente invención. Algunos métodos para la incorporación de constructos de ADN contenidos en vectores en células o tejidos de aloe para crear transformantes de aloe estables pueden incluir infección con A. tumefaciens o A. rhizogenes, infección con virus deficientes en replicación, transformación biolística, transformación de protoplastos, transferencia génica en polen, inyección en órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros, o métodos similares. Actualmente, dos de los métodos usados más comúnmente para la transformación de plantas son la transformación mediada por Agrobacterium y la transformación biolística. Normalmente, las células o tejidos de callo de aloe transformados se hacen crecer en medio nutritivo apropiado para seleccionar las células transformadas. Frecuentemente, un medio de selección incluye una toxina u otro factor de selección que destruye las células no transformadas. Diversos cambios de medio permitirán la producción de plantas 10 de aloe que contienen el gen de interés tal como los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción.

En la práctica de la transformación, el ADN normalmente se introduce en sólo un pequeño porcentaje de las células vegetales diana en un experimento de transformación cualquiera. Se usan genes marcadores para proporcionar un sistema eficaz para la identificación de aquellas células que se transforman de manera estable recibiendo e integrando un constructo de ADN transgénico en sus genomas. Los genes marcadores preferidos proporcionan marcadores selectivos que confieren resistencia a un agente selectivo, tal como un antibiótico o herbicida. Cualquiera de los herbicidas a los que las plantas de esta invención pueden ser resistentes son agentes útiles para marcadores selectivos. Las células potencialmente transformadas se exponen al agente selectivo. En la población de células supervivientes estarán aquellas células en las que, generalmente, el gen que confiere resistencia se integra y expresa en niveles suficientes para permitir la supervivencia celular. Las células pueden someterse a prueba adicionalmente para confirmar la integración estable del ADN exógeno. Los genes marcadores selectivos usados comúnmente incluyen aquéllos que confieren resistencia a antibióticos tales como kanamicina y paromomicina (nptII), higromicina B (aph IV) y gentamicina (aac3 y accC4) o resistencia a herbicidas tales como glufosinato (bar orpat) y glifosato (aroA o EPSPS). Ejemplos de tales seleccionables se ilustran en las patentes estadounidenses n.^{os}. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 y 6.118.047. También pueden emplearse marcadores seleccionables que proporcionan una capacidad para identificar visualmente los transformantes, por ejemplo, un gen que expresa una proteína coloreada o fluorescente tal como una luciferasa o proteína fluorescente verde (GFP) o un gen que expresa una beta-glucuronidasa o gen uidA (GUS) para los que se conocen diversos sustratos cromogénicos.

En general es útil introducir ADN recombinante de manera aleatoria, es decir, en una ubicación no específica, en el genoma de una línea de planta diana. En casos especiales, puede ser útil dirigir la inserción del ADN recombinante con el fin de lograr una integración específica de sitio, por ejemplo, reemplazar un gen existente en el genoma, usar un promotor existente en el genoma de la planta, o insertar un polinucleótido recombinante en un sitio predeterminado que se sabe que es activo para la expresión génica. Existen varios sistemas de recombinación específicos de sitio, que se sabe que hacen funcionar implantes, incluyen cre-lox tal como se da a conocer en la patente estadounidense n.º 4.959.317 y FLP-FRT tal como se da conocer en la patente estadounidense n.º 5.527.695, ambas se tratan en más detalle a continuación.

Para el sistema de transformación de plantas basado en Agrobacterium tumefaciens, los elementos adicionales presentes en los constructos de transformación incluirán secuencias del borde derecho e izquierdo del T-ADN para facilitar la incorporación del polinucleótido recombinante en el genoma de la planta. Con la infección con agrobacterium (A. tumefaciens), se incuba el tejido de callo de aloe durante 1 hora a temperatura ambiente con un cultivo durante la noche de agrobacterium incluyendo el vector que incorpora el constructo de ADN. El Agrobacterium se hace crecer en un medio de selección apropiado. Normalmente el medio de selección incluye estreptomicina y kanamicina. El medio de selección también puede contener acetosiringona. La acetosiringona a una concentración de 50 \muM a 250 \muM normalmente aumenta la eficacia de la infectividad en monocotiledóneas. Tras hacer crecer en los medios de selección, el tejido de aloe infectado puede transferirse a los medios en placas Petri sin selección durante dos (2) días en la oscuridad a 25 grados centígrados. Un medio adecuado a modo de ejemplo puede ser medios MS con acetosiringona. Entonces, puede añadirse cefotaxima durante dos (2) días para destruir el agrobacterium. Entonces, las células se colocan en placas nuevamente en medios que contienen kanamicina 50 mg/l para seleccionar células de aloe transformadas y factores de crecimiento que inducen brotes (NAA 0,2 mg/l, BAP 2 mg/l) durante cuatro (4) semanas, 16 horas de luz. Entonces, pueden transferirse los brotes que se regeneran al medio de enraizamiento (1/2 MS con NAA 0,2 mg/l) para desarrollar raíces (tras aproximadamente de 4 a 6 semanas) antes que transferirse al suelo.

Con la transformación biolística, se bombardean directamente tejido de callo o células de aloe con el constructo del vector. Diversas realizaciones y aspectos de la transformación biolística se dan a conocer en las patentes estadounidenses n.^{os} 5.015.580 (soja); 5.550.318 (maíz); 5.538.880 (maíz); 5.914.451 (soja); 6.160.208 (maíz); 6.399.861 (maíz) y 6.153.812 (trigo) y la transformación mediada por Agrobacterium se describe en las patentes estadounidenses n.^{os} 5.159.135 (algodón); 5.824.877 (soja); 5.591.616 (maíz); y 6.384.301 (soja). Además, pueden usarse una variedad de aparatos para transformación biolística tal como por ejemplo un sistema de suministro de partículas PDS-1000/He biolístico de Bio-Rad, Inc. En este enfoque, pueden unirse el vector y el constructo de ADN asociado a oro u otras partículas y dispararse directamente en las células de aloe. Las células de aloe bombardeadas se cultivan sin selección durante 4 días en la oscuridad antes de transferirse a los medios de selección. De nuevo, los medios de selección pueden incluir kanamicina 50 mg/l. Normalmente, los transformantes comienzan a formarse en el plazo de 8-12 semanas y pueden transferirse a los medios de enraizamiento y de brotación durante unas 8-12 semanas más. Una vez que las raíces han comenzado a formarse, las plántulas pueden transferirse al suelo.

También puede lograrse la transformación usando una variedad de otras técnicas. Tales técnicas incluyen infección viral usando sistemas de vectores virales comprometidos en la replicación, electroporación particularmente de células de callo o protoplastos hechos crecer en cultivo líquido, y transferencia en protoplastos mediada por PEG o lípidos. Entonces, la selección de transformantes podría seguir las mismas etapas básicas que se explicaron resumidamente para la transformación biolística.

Una vez introducido en los tejidos de callo de aloe, los constructos pueden incorporarse en el material genético de la planta tal como se ilustra de manera general en la figura 3. En otros aspectos, los constructos pueden integrarse de manera estable en la célula fuera del material genético de plantas 10 de aloe. Dependiendo del constructo, la proteína de interés puede o no expresarse de alguna forma ausente de la inducción de la transcripción. En un aspecto, los constructos una vez introducidos en las células de aloe pueden dirigir la síntesis de proteínas o el transporte a tejidos específicos de la planta 10 de aloe. Normalmente, esto se produce cuando se incluye una secuencia señal de direccionamiento en la proteína de interés.

Integración específica de sitio (Cre-Lox)

En un aspecto, la presente invención puede utilizar integración o escisión específica de sitio de constructos de ADN introducidos en una planta de aloe. Una ventaja de la integración o escisión específica de sitio es que puede usarse para superar problemas asociados con técnicas de transformación convencionales, en las que los constructos de transformación normalmente se integran de manera aleatoria en el genoma de un huésped en múltiples copias. Esta inserción al azar de ADN introducido en el genoma de células huésped puede ser letal si el ADN foráneo se inserta en un gen esencial. Además, la expresión de un transgén puede verse influida por los "efectos de posición" provocados por el ADN genómico circundante. Además, debido a las dificultades asociadas con las plantas que tienen múltiples copias del transgén, incluyendo silenciamiento génico, recombinación y herencia impredecible, normalmente se desea controlar el número de copias de los constructos de ADN insertados en el genoma de plantas 10 de aloe transgénicas, deseando a menudo sólo la inserción de una sola copia del constructo de ADN.

La integración o escisión específica de sitio de transgenes o partes de transgenes puede lograrse en plantas por medio de recombinación homóloga (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 5.527.695). La recombinación homóloga es una reacción entre cualquier par de secuencias de ADN que tienen una secuencia similar de nucleótidos, en la que las dos secuencias interaccionan (se recombinan) para formar una nueva especie de ADN recombinante. La frecuencia de la recombinación homóloga aumenta a medida que la longitud de las secuencias de ADN de nucleótidos compartidos aumenta, y es mayor con moléculas de plásmido linealizado que con moléculas de plásmidos circularizados. La recombinación homóloga puede producirse entre dos secuencias de ADN que son menos que idénticas, pero la frecuencia de recombinación disminuye a medida que la divergencia entre las dos secuencias aumenta.

Las secuencias de ADN introducidas pueden dirigirse mediante recombinación homóloga uniendo una molécula de ADN de interés a las secuencias que comparte homología con las secuencias endógenas de la célula huésped. Una vez que el ADN entra en la célula de aloe, las dos secuencias homólogas pueden interaccionar para insertar el ADN introducido en el sito en el que se ubicaron las secuencias de ADN genómico homólogas. Por tanto, la elección de las secuencias homólogas contenidas en el ADN introducido determinará el sitio en el que se integra mediante recombinación homóloga. Por ejemplo, si la secuencia de ADN de interés se une a secuencias de ADN que comparten homología con una sola copia del gen de una célula de aloe huésped, la secuencia de ADN de interés se insertará mediante recombinación homóloga en sólo aquél sitio específico. Sin embargo, si la secuencia de ADN de interés se une a secuencias de ADN que comparten homología con gen de múltiples copias de la célula eucariota huésped, entonces la secuencia de ADN de interés puede insertarse mediante recombinación homóloga en cada uno de los sitios específicos en los que se ubica una copia del gen.

Puede insertarse ADN en el genoma del huésped mediante una reacción de recombinación homóloga que implica o bien una sola recombinación recíproca (dando como resultado la inserción de la longitud entera del ADN introducido) o mediante una doble recombinación recíproca (dando como resultado la inserción de sólo el ADN ubicado entre los dos acontecimientos de recombinación). Por ejemplo, si se desea insertar un gen foráneo en el sitio genómico en el que se ubica un gen seleccionado, el ADN introducido debe contener secuencias homólogas al gen seleccionado. Entonces, un solo evento de recombinación homóloga daría como resultado que se insertara la secuencia de ADN introducida completa en el gen seleccionado. Alternativamente, puede lograrse un acontecimiento de recombinación doble flanqueando cada extremo de la secuencia de ADN de interés (la secuencia que pretende insertarse en el genoma) con secuencias de ADN homólogas al gen seleccionado. Un acontecimiento de recombinación homóloga que implica cada una de las regiones flanqueantes homólogas dará como resultado la inserción del ADN foráneo. Por tanto, sólo aquellas secuencias de ADN ubicadas entre las dos regiones que comparten homología genómica se integrarán en el genoma.

Aunque las secuencias de ADN introducidas pueden dirigirse para su inserción en un sitio genómico específico mediante recombinación homóloga, la recombinación homóloga en eucariotas superiores es un acontecimiento relativamente poco común en comparación con los acontecimientos de inserción al azar. En células de aloe, las moléculas de ADN foráneo encuentran secuencias homólogas en el genoma de la planta de aloe y se recombinan a una frecuencia de aproximadamente 0,5-4,2 x 10^{-4}. Por tanto, cualquier célula transformada que contenga una secuencia de ADN introducida integrada mediante recombinación homóloga también contendrá probablemente numerosas copias de secuencias de ADN introducidas integradas de manera aleatoria. Una forma de evitar estas inserciones al azar es utilizar un sistema de recombinasa específica de sitio. En general, un sistema de recombinasa específica de sitio consiste en tres elementos: dos pares de secuencia de ADN (las secuencias de recombinación específicas de sitio) y una enzima específica (la recombinasa específica de sitio). La recombinasa específica de sitio catalizará una reacción de recombinación sólo entre dos secuencias de recombinación específicas de sitio.

Según la presente invención pueden emplearse varios sistemas de recombinasa específica de sitio diferentes, incluyendo, pero sin limitarse a, el sistema Cre/lox de bacteriófago P1 (patente estadounidense n.º 5.658.772, el sistema FLP/FRT de levadura (Golic y Lindquist, 1989), la recombinasa Gin del fago Mu (Maeser y Kahmann, 1991), la recombinasa Pin de E. coli (Enomoto et al., 1983), y el sistema R/RS del plásmido pSR1 (Araki et al., 1992). Los sistemas cre/lox de bacteriófago P1 y FLP/FRT de levadura constituyen dos sistemas particularmente útiles para la integración o escisión específica de sitio de transgenes. En estos sistemas, una recombinasa (Cre o FLP) interaccionará específicamente con su respectiva secuencia de recombinación específica de sitio (lox o FRT, respectivamente) para invertir o eliminar las secuencias que intervienen. La secuencia de cada uno de estos dos sistemas es relativamente corta (34 pb para lox y 47 pb para FRT) y por tanto, conveniente para su uso con vectores de transformación.

La figura 8 ilustra un protocolo a modo de ejemplo particular que usa un sistema de recombinasa Flp/Frt y Cre/Loxp. En un sistema de este tipo, pueden usarse recombinasas específicas de sitio de bacteriófago y levaduras como herramientas para manipular el ADN tanto en el tubo de ensayo como en organismos vivos. Las combinaciones de recombinasas/sitio de recombinación incluyen Cre-Lox, FLP-FRT, y R-RS, en las que Cre, FLP y R son recombinasas, y Lox, FRT, y RS son los sitios de recombinación. Para usar este sistema, se genera una planta que contiene los sitios específicos para la recombinación. Se crea una planta 10 de aloe transgénica original mediante la transfección de un vector, la expresión de un marcador seleccionable y se modifica mediante ingeniería genética para contener sitios Frt y Lox en tándem. Tanto los sitios Ftr como Lox consisten en tres elementos, una secuencia espaciadora de ocho (8) nucleótidos entre dos (2) repeticiones invertidas de trece (13) nucleótidos cada una. Las repeticiones invertidas sirven como el dominio de unión de ADN para la recombinasa específica, mientras que el elemento espaciador es variable pero esencial para la recombinación homóloga. Alterando el elemento espaciador de o bien los sitios LoxP o bien FRT, pueden crearse múltiples sitios distintos para la recombinación. Alternando los sitios Frt y Lox, puede crearse un sistema que permite integraciones dirigidas a múltiple sitios (tal como se explica resumidamente en la figura 8). Este sistema puede tener varias ventajas. Se minimiza la alteración de genes endógenos tras la generación de la planta original inicial. Se aumenta la eficiencia de la transformación mediante la expresión de recombinasas específicas de sitio. El uso de los sitios lox y ftr en tándem permite la eliminación selectiva de marcadores de selección mientras que se conserva el gen de interés. Y una vez que se ha creado la planta original, se potencia la propagación celular y el potencial regenerativo. Sin embargo, la planta original es la primera etapa y se crea siguiendo métodos de transformación convencionales (biolística o Agrobacterium). Se crean plantas transgénicas posteriores mediante cotransfección de un vector que contiene tanto un sitio LoxP como Frt así como el gen de interés y un marcador seleccionable, junto con un vector que expresa la recombinasa Cre. La expresión de la recombinasa Cre induce la recombinación homóloga a través de los sitios LoxP del vector y la planta original. Los transformantes se seleccionan mediante la expresión de marcadores seleccionables y se inducen para regenerar. La transformación posterior con un vector que expresa recombinasa Flp puede eliminar el marcador seleccionable y permitir la integración posterior en otros sitios Loxp.

Producción de planta viable

Tras la transformación de células de aloe o tejidos de aloe, las células de aloe transformadas pueden hacerse crecer hasta plántulas. Las células de aloe que sobreviven a la exposición al agente selectivo, o las células de aloe que han dado positivo en un ensayo de detección, pueden cultivarse en medios de regeneración y permitírseles madurar dando plantas 10 de aloe transgénicas. Las plántulas de aloe en desarrollo regeneradas a partir de células de aloe transformadas pueden transferirse a una mezcla de crecimiento de planta, y aclimatarse, por ejemplo, en una cámara de ambiente controlado a aproximadamente una humedad relativa del 85%, CO_{2} 600 ppm, y 25-250 microeinsteins m^{-2}s^{-1} de luz, antes de transferirse a un invernadero o cámara de crecimiento para su maduración. Las plantas 10 de aloe transformadas se regeneran desde aproximadamente 6 semanas hasta 10 meses tras identificarse un transformante, dependiendo del tejido inicial. La planta 10 de aloe transformada regenerada o su semilla o plantas de progenie pueden normalmente someterse a prueba para determinar la expresión del ADN recombinante.

La regeneración de una planta 10 de aloe transgénica a partir de un tejido de callo o tejido de meristemo no diferenciado transformado implica principalmente manipular los factores de crecimiento auxina y kinetina. La primera etapa es promover el crecimiento de brotes. Normalmente el medio de inducción de brotes contiene una baja concentración de auxina (NAA 0,2 mg/l) y una concentración relativamente alta de citocinina (BAP 2 mg/l). La concentración de azúcar reducida hasta el 2% de sacarosa (que afecta a la presión osmótica) también puede ayudar a la regeneración de la planta. Las células en el medio de brotación se colocan en incubadoras a 25ºC con un ciclo de luz de 12 h/día. Los brotes que comienzan a formarse, se cortan del callo primario después de alcanzar una longitud de aproximadamente 2 cm y se colocan en medio de enraizamiento. Estos brotes también pueden mantenerse en medio de brotación para estimular el desarrollo de brotes adicionales. El medio de enraizamiento promueve el desarrollo de la raíz y normalmente contienen medio ½ MS y una concentración relativamente baja de auxina (NAA 0,2 de mg/l). Después de que las raíces comienzan a desarrollarse (1-2 cm), las plántulas pueden transferirse al suelo y aclimatarse reduciendo gradualmente la humedad relativa. Una vez generadas, las plantas 10 de aloe transgénicas pueden propagarse mediante siembra, métodos de propagación clonal, o de otra forma que los expertos en la técnica reconocerán con la revisión de la presente descripción.

Extracción y purificación de proteínas de plantas o células vegetales

Las proteínas estructurales o enzimas introducidas mediante vectores en células vegetales y plantas pueden encontrarse en diversos tejidos de la planta 10 de aloe incluyendo raíces, tubérculos, hojas, semillas, flores, savia o en una combinación de partes de la planta y fases de desarrollo. En un aspecto, la proteína o las proteínas de interés se concentran en la matriz gelatinosa en la parte central de la hoja. En otro aspecto, la proteína o las proteínas de interés son biológicamente activas y proporcionan cierto grado de efecto medicinal cuando se extraen de la hoja 12 de aloe. En otro aspecto, la proteína o las proteínas de interés y la al menos una proteína de aloe nativa, hidrato de carbono y/u otro compuesto encontrado de la matriz gelatinosa actúan de manera sinérgica para proporcionar un tratamiento deseado para un paciente. La extracción de proteínas puede ser de la biomasa total o un tejido particular. La extracción de proteínas a partir de células vegetales puede incluir métodos físicos y químicos. La extracción de proteínas a partir de las hojas o savia puede implicar filtración, ultracentrifugación, extracción química y cromatografía de afinidad.

En un aspecto, la proteína de interés puede acumularse dentro del gel de la hoja de la planta 10 de aloe transformada. Esta región es principalmente agua, aproximadamente el 99%, y está libre de proteasas perjudiciales. La extracción del gel es una técnica establecida que los expertos en la técnica entenderán. Algunas de las proteínas, particularmente cosméticas, pueden usarse para complementar el gel de aloe directamente y pueden no necesitar aislarse nunca individualmente del gel.

Ejemplos Metodologías para el aislamiento de células vegetales

En un primer ejemplo, se aísla el tejido de meristemo de brote para su uso directo o para sus iniciación a callo a partir del tallo del aloe, ya sea Aloe vera, Aloe ferox o Aloe arborescente. Se extraen las secciones de la hoja y se corta el tallo lateralmente a través del eje longitudinal de la hoja de aloe. El tejido se esteriliza con una mezcla de Tween 20 (0,05%) e hipoclorito (5%) durante 10 min., seguido de 30 segundos de etanol, aclarar 3x con agua estéril. Entonces se colocan en placas las secciones con la superficie expuesta tendida de medio lado a la placa en medio MS con agar (0,8-1%) conteniendo diversas concentraciones de los factores de crecimiento, auxina y citocinina, y el 2-3% de sacarosa. Las condiciones de cultivo varían dependiendo del procedimiento deseado. El cultivo de callo sin desarrollo de brote normalmente se inicia haciendo crecer estas secciones en NAA (2-5 mg/l) sin BAP o con baja concentración de BAP (0,2 mg/l). Las células no diferenciadas comienzan a crecer junto con las zonas del tallo cortado y pueden subcultivarse y mantenerse en placas separadas. La inducción de brotes puede iniciarse directamente colocando tales fragmentos en medio de brotación, medios MS que contienen NAA 0,2 mg/l (o IAA 0,2 mg/l) y BAP 2 mg/l. Tanto NAA como IAA funcionan como una fuente de auxina y existe un intervalo de concentraciones tanto de auxinas como de citocininas que tienen efecto. Las células de callo procedentes de embriones inmaduros se desarrollan a partir de semillas comercialmente disponibles. En primer lugar se esterilizan las semillas (etanol 30 s, hipoclorito al 5% más Tween 20 al 0,05% durante 15 min. y se aclaró 3x en agua estéril). Entonces, las semillas esterilizadas se dejan durante la noche a 4 grados centígrados en agua. Se aísla el embrión inmaduro extrayendo el recubrimiento de la semilla. Se realiza un pequeño corte en una esquina de la semilla de forma triangular y se aplasta para obligar a salir al embrión. Entonces, esta se coloca en placa en medios MS que contienen o bien auxina sola (NAA 2-5 mg/l) para inducir el callo, o bien auxina y citocinina (NAA 0,2 mg/l, BAP 2 mg/l) para inducir el callo y la propagación de brotes. La concentración de azúcar es normalmente del 2-3%.

Las células de callo del meristemo apical de brote se desarrollan a partir de un segmento de uno a dos centímetros cortado desde la base de la planta 10 de aloe joven con todas las hojas extraídas. Se esteriliza la superficie del fragmento y se recolocan en placa en agar al 1% con medios MS y auxina y citocinina (NAA 2 mg/l, BAP 0,2 mg/l).

La inducción de células de callo inicia en el plazo de 1-2 semanas. Entonces, las células pueden aislarse de estos cultivos y usarse como material de partida para la transformación.

Constructos de ADN i. Vector pBI121-ubiquitina-interferón (pBI-UI)

Se usó el vector binario de Agrobacterium pBI121 como la estructura principal para la creación de pBI-UI. Se amplificó el gen de interferón alfa 2 humano con secuencia señal a partir de células 293 humanas usando cebadores específicos de gen que contenían sitios de restricción en 5' PstI y en 3' SacI/XhoI. Se clonó el producto de PCR de interferón de 587 pb en pZErO y se secuenció. También se clonó el elemento de promotor de ubiquitina (Ubi) de 1962 pb de maíz en pZErO amplificando la región del pUBI-GFP y clonando en sitios de restricción en 5' HindIII y en 3' PstI. Entonces, se subclonó el fragmento Ubi en el vector de interferón pZero usando HindIII/PstI (pZErO UI). Entonces se subclonó el casete de interferón Ubi intacto en pBI121 usando HindIII/SacI y eliminando el promotor CaMV 35S y el gen GUS dando como resultado pBI UI. Este vector conserva las regiones de borde del elemento T derecho e izquierdo necesarias para la infección y la transformación mediadas por agrobacterium y expresa el gen de resistencia a kanamicina (NPTII) bajo el control del promotor Nos.

ii. pZErO-ubiquitina-interferón-IRES-kanamicina. (pZ UIIK)

Se creó este vector clonando el promotor de Ubi en el vector de clonación pZErO. Detrás de este fragmento se clonó un casete que contenía interferón alfa 2 humano junto con una IRES (secuencia interna de entrada a ribosoma) y el gen de resistencia a kanamicina. Esta unidad se expresa como un solo transcrito pero traducido como dos proteínas distintas (debido al segundo sitio de iniciación de la traducción proporcionado por la IRES). Esto permite que se exprese tanto el marcador seleccionable como el interferón bajo el control del promotor de Ubi.

iii. El sistema de plásmido doble que emplea recombinasas Cre y Flp

En primer lugar se genera una planta original que expresa el marcador seleccionable que tiene los sitios cre y flp para su integración dirigida. Una transfección secundaria que introduce vectores con genes de interés se dirige a los sitios cre. Entonces, se elimina el material genético no deseado usando flp.

Introducción de constructos de ADN en células vegetales aisladas i. Transferencia génica mediada por Agrobacterium

Se sometió a electroporación la cepa de Agrobacterium LB4404 (Invitrogen, Carlsbad, CA) con el vector pBI UI y se seleccionaron los clones positivos en placas de agar LB que contenían kanamicina 50 \mug/ml y estreptomicina 100 \mug/ml. Se hicieron crecer clones individuales durante la noche a 30 grados centígrados en medios LB que contenían acetosiringona 250 \muM. La infección tuvo lugar sumergiendo fragmentos de planta o callo en cultivo durante la noche, secando en papel de filtro estéril, y colocando en placas de agar MS que contenían acetosiringona 250 \muM a 25 grados centígrados en la oscuridad. Dos días tras la infección, se transfirió el tejido a placas de agar MS que contenían cefotaxima 200 \muM para destruir el Agrobacterium. Entonces se transfiere el tejido a placas de agar MS que contienen kanamicina 50 mg/l y NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/l para seleccionar transformantes e inducir la regeneración de brotes. Se hace crecer el tejido en 12 horas de luz a 25 grados centígrados. Se hacen crecer los brotes adventicios hasta que alcanzan aproximadamente 2 cm de longitud antes de cortarse y volver a plantarse en medios de enraizamiento con selección continuada. Se someten a ensayo las plántulas que expresan genes de interés para determinar los niveles de expresión y se transfieren al suelo.

ii. Transferencia génica biolítistica

Se recubren partículas de oro (0.6 - 1 \mum) con el vector que incluye el constructo de ADN. Se lavan las partículas de oro 15 minutos en etanol al 70% agitando con vórtex y remojando, seguido de 3 lavados en agua estéril. Entonces, se resuspenden las partículas de oro en glicerol al 50% hasta una concentración de 60 mg/ml. Para recubrir el ADN de vector en las partículas lavadas, se añaden 3 mg de partículas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. A esto se le añaden 5 \mul de ADN a una concentración de 1 \mug/\mul, 50 \mul de CaCl_{2} 2,5 M, y 20 \mul de espermidina 0,1 M, y se agita con vórtex durante 2-3 min. Se permite que esto sedimente, se centrifuga durante 1-2 s y se extrae el líquido. A esto se le añaden 140 \mul de etanol al 70%, se centrifuga, y se desecha el líquido. A esto se le añaden 140 \mul de etanol al 100%, se centrifuga y se desecha el líquido. Al precipitado se le añaden 48 \mul de etanol al 100% y se resuspende suavemente. Se esteriliza el aparato de pistola génica (PDS 1000/He, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA) usando etanol al 70%. Se ensambló el aparato de pistola génica usando la distancia de separación más corta entre el soporte del macroportador y el tamiz tope (configuración recomendada). Se pipetean las partículas de oro recubiertas (8 \mul) en el centro de los macroportadores. Se fijó la distancia objetivo dependiendo del tejido diana (6 cm de tejido, 9 cm de callo) con un disco de ruptura 600-1100 psi.

En un primer ejemplo, tras el bombardeo se colocaron las células en placas de agar MS que contenían NAA 2 mg/l sin selección durante 1 semana en la oscuridad a 25 grados centígrados. Entonces, se transfirieron las células a placas de agar que contenían kanamicina 50 mg/l para la selección y auxina (NAA 2 mg/l) y citocinina (6-bencilaminopurina 0,2 mg/l) durante 4-5 semanas más. Se hicieron crecer las células durante 12 horas a la luz a 25 grados
centígrados.

En un segundo ejemplo, se llevo a cabo bombardeo con microproyectiles en una placa de MS (sales MS 4 g/l, disolución madre de vitaminas MS 1 mg/l (1000X), NAA 2 mg/l, mioinositol 100 mg/l, prolina 2,76 g/l, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de caseína 100 mg/l, sorbitol 36,4 g/l, manitol 36,4 g/l, gelrite 2,5 g/l, pH 5,8). Se dejó el callo bombardead en MSOSM durante 1 hora tras el bombardeo y luego se transfirió a medio de iniciación MS (sales MS 4 g/l, disolución madre de vitaminas MS 1 mg/l (1000X), NAA 2 mg/l, mioinositol 100 mg/l, prolina 2 g/l, sacarosa 30 g/l, hidrolizado de caseína 100 mg/l, gelrite 2,5 g/l, pH 5,8). Tras 7-10 días en MS, se transfirió el callo bombardeado al medio de selección MSS (sales MS 4 g/l, disolución madre de vitaminas MS 1 mg/l (1000X), NAA 2 mg/l, mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, gelrite 2,5 g/l, pH 5,8) con kanamicina 50 mg/l para seleccionar células transformadas. Tras 3 semanas, se transfirieron partes de callos individuales a medio MSS reciente. En el plazo de 6-8 semanas del bombardeo, surgieron clones resistentes a kanamicina de las partes de callo seleccionadas.

iii. Protoplasto

Los protoplastos son células vegetales que carecen de su pared celular externa. La ventaja de crear estas células es aumentar la eficacia de la transfección y tales células pueden fusionarse entre sí formando un híbrido de células somáticas. Los híbridos de células somáticas pueden mezclar los genes de diferentes plantas llegando potencialmente a algo completamente nuevo.

La técnica para usar protoplastos según la presente invención puede incluir hacer crecer las células en cultivo líquido (2-3 días en fase de crecimiento logarítmico). Entonces, las células se sedimentan por centrifugación (1000 x gravedad durante 5 min.). Se resuspenden las células en una disolución que contiene celulasa, macerozima y pectoliasa. Se agita durante la noche a 25 grados centígrados en la oscuridad. Se centrifuga (600 x gravedad durante 5 min.) y se extrae el sobrenadante. Se resuspenden los protoplastos en medio de cultivo y se centrifugan una vez más para eliminar trazas de enzimas. Los protoplastos no pueden almacenarse ni propagarse y deben usarse para la transfección o fusión de células somáticas de manera relativamente rápida.

Producción de plantas viables que contienen constructos de ADN

En un primer ejemplo, se seleccionan transformantes satisfactorios inicialmente para su resistencia a toxinas celulares, por ejemplo kanamicina. Las células transfectadas de manera estable deben expresar tanto el marcador de resistencia como el gen de interés, tal como por ejemplo un gen que codifica para interferón, así como poder regenerar la planta intacta. Se añade kanamicina 50 mg/l a las placas de agar MS para iniciar la selección. El transcurso de la selección depende en parte de la velocidad con que las células se replican pero puede tardar entre 6 y 10 semanas. Durante este tiempo, se induce el tejido transformado a regenerarse añadiendo NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/l a las placas de agar MS y estimulando el desarrollo de brotes con un ciclo de luz de 12 h/día (con presión de selección continua). A medida que los brotes adventicios comienzan a desarrollarse, pueden someterse a ensayo para determinar la expresión génica a aproximadamente 2 cm de longitud. Posteriormente se transfieren brotes que expresan productos génicos deseados (tal como se somete ensayo mediante RT-PCR, inmunotransferencia de tipo Western, y ensayo biológico) a placas de agar MS para inducir la formación de raíces (1/2 MS más NAA 0,2 mg/l).

En un segundo ejemplo, la regeneración del callo transgénico se logra transfiriendo aproximadamente 15 partes pequeñas (aproximadamente 4 mm) al medio I de regeneración (sales MS 4,3 g/l, disolución madre de vitaminas MS 1 ml/l (1000X), mioinositol 100 mg/l, sacarosa 60 g/l, gelrite 3 g/l, pH 5,8) con kanamicina esterilizada añadida con filtro (50 mg/l) e incubando durante 2-3 semanas a 25 grados centígrados en la oscuridad. Se transfieren embriones somáticos maduros a la luz en el medio II de regeneración para su germinación (sales MS 4,3 g/l, disolución madre de vitaminas MS 1 ml/l (1000X), mioinositol 100 mg/l, sacarosa 30 g/l, gelrite 3 g/l, pH 5,8) con kanamicina esterilizada añadida con filtro (50 mg/l).

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<120> PLANTAS DE ALOE TRANSGÉNICAS PARA LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS Y MÉTODOS RELACIONADOS

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<170> PatentIn versión 3.3

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<223> oligonucleótido sintético

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<212> ADN

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<223> oligonucleótido sintético

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<212> ADN

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<223> oligonucleótido sintético

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<212> ADN

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 33

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> oligonucleótido sintético

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\newpage

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 36

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 37

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\hskip0,8cm

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<210> 38

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<211> 4178

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

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\hskip0,8cm

43

\hskip0,8cm

44

\hskip0,8cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4663

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip0,8cm

46

\hskip0,8cm

47

\hskip0,8cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4463

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip0,8cm

49

\hskip0,8cm

50

\hskip0,8cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

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<211> 4784

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip0,8cm

52

\hskip0,8cm

53

\hskip0,8cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

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<211> 5991

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<212> ADN

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<213> Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip0,8cm

55

\hskip0,8cm

56

\hskip0,8cm

57

\hskip0,8cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4888

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligonucleótido sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip0,8cm

59

\hskip0,8cm

60

\hskip0,8cm

61

\hskip0,8cm

62

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

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<211> 1963

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<223> oligonucleótido sintético

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<400> 44

\hskip0,8cm

63

Claims

1. Planta de aloe transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante, comprendiendo dicho constructo un promotor, una secuencia que codifica para una proteína exógena, una secuencia de terminación, y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción;

en la que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30;

la proteína exógena se expresa a partir del constructo de ADN; y

al menos una parte de la proteína exógena se traslada desde una célula de aloe hacia el gel de una hoja de aloe de la planta de aloe transgénica.

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2. Planta según la reivindicación 1, en la que el promotor es promotor de ubiquitina de maíz (SEQ. ID. N.º
44).

3. Planta según la reivindicación 1 ó 2, en la que la secuencia de translocación es la secuencia secretora de alfa-amilasa (SEQ. ID. N.º 29) de arroz (Oryza sativa).

4. Método para producir en una planta una proteína biológicamente activa exógena a la planta, comprendiendo dicho método:

proporcionar una planta transgénica que comprende un constructo de ADN recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica para la proteína exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción,

cultivar la planta de modo que se exprese la proteína exógena a partir del constructo de ADN; y

extraer la proteína de la planta

en el que la planta es aloe,

el constructo de ADN contiene un péptido señal de secreción de modo que al menos una parte de la proteína exógena se traslada hacia el gel de las hojas de aloe, y la proteína exógena se extrae en el gel de la hoja, y

la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30.

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5. Método según la reivindicación 4, en el que el promotor es promotor de ubiquitina de maíz (SEQ. ID. N.º
44).

6. Método según la reivindicación 4 ó 5, en el que la secuencia de translocación es la secuencia secretora de alfa-amilasa (SEQ. ID. N.º 29) de arroz (Oryza sativa).

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-6, que comprende la etapa de generar la planta transgénica mediante un procedimiento que comprende:

obtener células de aloe embrionarias a partir de una semilla de aloe;

hacer crecer las células de aloe en cultivo para formar un callo en un medio nutritivo que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y 6-bencilaminopurina (BAP);

transformar el callo con el constructo de ADN recombinante;

seleccionar células de aloe transformadas que contienen el constructo de ADN recombinante mientras que se hace crecer el callo en un medio de brotación y selección que comprende IAA o NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/ml;

hacer crecer en un medio de enraizamiento que comprende NAA 0,2 mg/l, un brote regenerado en el medio de brotación y selección; y

una vez que las raíces han comenzado a formarse, transferir la plántula al suelo.

\newpage

8. Método de producción de una planta de aloe transgénica para producir en la planta una proteína biológicamente activa exógena a la planta, comprendiendo el método:

cultivar callo no diferenciado de células de aloe en un medio nutritivo que contiene ácido 1-naftalenacético (NAA) o ácido indol-3-acético (IAA) y 6-bencilaminopurina (BAP);

introducir en el callo un constructo de ADN recombinante que comprende un promotor, una secuencia que codifica para la proteína exógena, una secuencia de terminación y una secuencia de translocación que codifica para un péptido señal de secreción;

hacer crecer el callo en un medio de brotación y selección que comprende IAA o NAA 0,2 mg/l y BAP 2 mg/ml;

una vez que las raíces han comenzado a formarse, transferir la plántula al suelo;

en el que la proteína exógena es una proteína de mamífero seleccionada de interferones, inmunoglobulinas, linfocinas, factores de crecimiento de mamífero, hormonas de mamífero, factores sanguíneos, antígenos de histocompatibilidad, protrombina codificada por la SEQ. ID. N.º 36 y dermicidina codificada por la SEQ. ID. N.º 30.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el callo es de semilla de aloe.

10. Método según la reivindicación 8 ó 9, en el que el tejido de callo se bombardea directamente con el constructo de ADN recombinante.