BRPI0617735A2 - vìrus de influenza capazes de infectar canìdeos, usos dos mesmos - Google Patents

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J. Gibbs Paul
O. Donis Ruben
Katz Jacqueline
I. Klimov Alexander
P. Lakshmanan Nallakannu
Anne Lum Melissa
Ghislena Emiel Goovaerts Daniel
William Mellencamp Mark
J.Cox Nancy
L. Castleman William
J. Dubovi Edward
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Abstract

<B>VìRUS DE INFLUENZA CAPAZES DE INFECTAR CANìDEOS, USOS DOS MESMOS<D>A invenção em questão refere-se ao isolado do vírus de influenza que é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias no canídeo. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da presente invenção. A invenção em questão também refere-se a composições e métodos para identificar um vírus da invenção e diagnosticar a infecção de um animal com um vírus da invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VÍRUS DEINFLUENZA CAPAZES DE INFECTAR CANÍDEOS, USOS DOS MESMOS".
REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOSEste pedido de patente é uma continuação-em-parte do pedidoU. S. N° 11/409.416, depositado em 21 de abril de 2006; e este pedido rei-vindica prioridade para os U. S. N°s 60/728.449, depositado em 19 de outubrode 2005; 60/754.881, depositado em 29 de dezembro de 2005; 60/759.162,depositado em 14 de janeiro de 2006; 60/761.451, depositado em 23 de ja-neiro de 2006; e 60/779.080, depositado em 3 de março de 2006, a descri-ção de cada um deste é por este meio incorporada por referência aqui emsua totalidade, incluindo qualquer breve sumário, descrições detalhadas dainvenção, exemplos, reivindicações, resumo, figuras, tabelas, seqüências deácido nucléico, seqüências de aminoácido, e desenhos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
"Tosse de canil" ou traqueobronquite infecciosa (ITB) é uma in-fecção respiratória aguda, contagiosa em cães caracterizada principalmentepor tosse (Ford et al, 1998). ITB canina é considerada uma das doenças dasvias respiratórias infecciosas mais prevalecentes de cães no mundo, e sur-tos podem alcançar proporções epidêmicas quando os cães são alojados emambientes de população de alta densidade tais como canis. A maioria dossurtos é devido ao contato direto de cão-com-cão ou utilização de aerossolde secreções respiratórias (Ford et al, 1998). Os sinais clínicos são causa-dos através de infecção com um ou uma combinação de agentes bacteria-nos e virais que colonizam o epitélio do trato respiratório superior e inferior.Vírus de parainfluenza canina (CPiV) e bactérias de Bordetella bronchios-septiea são os organismos mais comuns isolados de cães afetados, masvários outros vírus tais como vírus de sinomose canina (CDV) e adenovírus-1 e-2 caninas (CAV-1, CAV-2), juntamente com bactérias tais como Streptococcussp., Pasteurella multicoda e Escherichia eoli, podem influenciar o curso eresultado clínicos (Ford et al, 1998). Embora surtos ocorram eficiente e rapi-damente em populações de alta densidade com morbidez alta, infecções res-piratórias complicadas e morte são incomuns. Embora pneumonia bacterianasecundária de ameaça à vida possa se desenvolver, a maior parte dos casosde ITB é autolimitante e soluciona-se sem qualquer tratamento (Ford et al,1998).
Em julho de 1992, uma infecção respiratória presumida ser "tos-se de canil" tornou-se epidêmica em várias pistas de galgo na Nova Inglater-ra, Flórida, West Virgínia, Wisconsin, Kansas, Colorado, Oklahoma e Arizo-na. De acordo com os veterinários, a maioria dos cães afetados teve umatosse moderada que se solucionou, mas mais que uma dúzia de galgos de-senvolveram uma pneumonia hemorrágica aguda seguida por morte rápida(Greyhound Daily News, 1999).
No final de 1998 ao início de 1999, vários surtos de "tosse decanil" ocorreram em canis de galgos de corrida ao longo do país, resultandoem fechamento obrigatório das pistas e quarentena de todos os galgos decorrida nos EUA durante várias semanas (Greyhound Daily News, 1999). Emuma pista na Flórida (Palma Beach Kennel Club), tosse foi registrada emquase 40 % da população de cães em um único dia (comunicação pessoalde Dr. William Duggar). Similar ao surto em 1992, a tosse resolveu-se namaioria dos galgos, mas 10 cães na Flórida morreram de uma síndrome depneumonia hemorrágica não-caracterizada de "tosse de canil" (Putnam,1999).
Em março-abril de 2003, outro surto de "tosse de canil" ocorreuem pistas de galgo nos EUA oriental. O surto é acreditado ter originado emcanis em quatro pistas na Flórida e causou a suspensão de corrida e qua-rentena dos cães durante quase três semanas. Quase 25 % dos cães napista em West Palm Beach foram afetados, enquanto quase 50 % dos 1400cães em Derby Lane em St. Petersburg desenvolveram tosse. Novamente, amaioria dos cães se restabeleceu, mas vários cães morreram da infecçãorespiratória. O impacto econômico estimado do surto respiratório na pista deDerby Lane sozinho foi 2 milhões de dólares.
Não há nenhum relatório publicado documentando a etiologia ouclinicopatologia dos surtos de "tosse de canil" em canis de galgo de corridaem 1992, 1998-1999, ou 2003. A suposição foi que as infecções tenham sidodevido a CPiV e/ou B. bronchiosseptica, as duas causas mais comuns detosse de canil. Comunicações insubstanciadas tais como sítios de rede atri-buíram as pneumonias hemorrágicas fatais relatadas em alguns dos cãescom tosse à infecção com Streptococcus equi β-hemolítica subespécie zoo-epidemicus, e referem-se à síndrome como "choque tóxico estreptocócicocanino".
Transmissão do vírus de uma espécie hospedeira para a outra éuma característica crucial da ecologia e epidemiologia de vírus de influenza(Webster, 1998). Dois mecanismos básicos de transmissão interespécies devírus de influenza são possíveis (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004).Uma é a transferência direta de um vírus essencialmente inalterado de umaespécie para a outra. Exemplos deste mecanismo incluem as recentes infecçõeshumanas com o subtipo de H5N1 do vírus de influenza aviária (Subbarao et al.,1998; Peiris et al., 2004; Guan et al., 2004) e possivelmente o pandêmico de1918, conhecido como influenza espanhola (Reid et al., 2004). O segundomecanismo é uma conseqüência da natureza segmentada do genoma deinfluenza. Co-infecção de um hospedeiro com vírus de espécies diferentespode resultar em reagrupamento dos genes virais segmentados e a geraçãode um recombinante com a habilidade de infectar outras espécies. Por e-xemplo, vírus novos gerados por reagrupamento de gene entre vírus de in-fluenza aviária e humana resultaram em pandêmico de influenza humana em1957 e 1968 (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004; Kawaoka et al., 1989).
A maioria das transmissões diretas do vírus de influenza inalte-rados da espécie hospedeira natural para uma espécie diferente são eventosterminais porque transmissão contínua entre indivíduos da espécie nova nãoocorre. Interações múltiplas de vírus-hospedeiro são necessárias para repli-cação e transmissão horizontal e fornecem uma barreira formidável contraperpetuação de vírus de influenza no hospedeiro novo (Webby et al., 2004).
Portanto, estabelecimento de linhagens hospedeiro-específicas novas devírus de influenza é incomum e tem apenas ocorrido em avícula doméstica,porcos, cavalos, e humanos (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004).Por causa da natureza séria da infecção do vírus de influenza,continua uma necessidade por métodos para diagnosticar, impedir e tratarinfecção por vírus de influenza.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A invenção em questão refere-se ao vírus de influenza isoladoque é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias nocanídeo. A invenção em questão também refere-se a composições e méto-dos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da pre-sente invenção. A invenção em questão também refere-se a composições emétodos para identificar um vírus da invenção e diagnosticar infecção de umanimal com um vírus da invenção.
Um aspecto da invenção refere-se a vacinas e métodos paraproteger caninos de influenza canina, kits compreendendo tais vacinas, emétodos para usar tais vacinas. Esta proteção inclui impedir, reduzir o risco,tardar o princípio, reduzir a expansão, melhorar, suprimir, e/ou erradicar ainfluenza e/ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) de seus sintomas. Éacreditado que as vacinas, kits, e métodos desta invenção sejam em geraladequados para o uso com caninos. Caninos incluem caninos selvagens, dejardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes, e raposas. Caninostambém incluem cães, particularmente cães domésticos, tais como, por e-xemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães de exposição, cãesde trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda, cães policiais,cães de corrida, e/ou cães de laboratório.
Esta invenção é também direcionada, em parte, a um métodopara proteger um canino de uma infecção do vírus de influenza (isto é, im-pedir, reduzir o risco, tardar o princípio, suprimir, melhorar, ou erradicar umainfecção do vírus de influenza). O método compreende administrar umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelomenos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígenode vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influ-enza de H7.
Esta invenção é também direcionada, em parte, a um métodopara proteger um canino de lesões respiratórias (isto é, impedir, reduzir orisco, tardar o princípio, suprimir, melhorar, ou erradicar lesões respiratórias)causadas por vírus de influenza canina. O método compreende administrarao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compre-endendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menosum antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno devírus de influenza de H7.
Esta invenção é também direcionada, em parte, a um métodopara proteger um canino de ter vírus de influenza canina em secreção nasalou oral (isto é, impedir, reduzir o risco, tardar o princípio, suprimir, melhorar,ou erradicar o vírus de influenza canina em secreção nasal ou oral) causadapor infecção do vírus de influenza canina. O método compreende administrarao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compre-endendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menosum antígeno de vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno devírus de influenza de H7.
Esta invenção é também direcionada, em parte, a uma vacinade influenza canina. Em algumas modalidades, por exemplo, a vacina com-preende uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um antíge-no de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígeno de vírus de influ-enza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7.
Esta invenção é também direcionada, em parte, a um kit paraproteger um canino de infecção do vírus de influenza. O kit compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo pelomenos um antígeno de vírus de influenza eqüina, pelo menos um antígenode vírus de influenza de H3, e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influ-enza de H7. Além disso, o kit compreende pelo menos um dos seguintes:
um aparelho para administrar a vacina ao canino,
um excipiente farmaceuticamente aceitável que auxilia na admi-nistração da vacina ao canino,
um excipiente farmaceuticamente aceitável que intensifica aresposta imune do canino à vacina,um alimento a ser consumido pelo canino simultaneamente coma vacina, e/ou
um medicamento a ser consumido pelo canino simultaneamentecom a vacina.
Outros benefícios da invenção das Requerentes serão evidentesa alguém versado na técnica ao ler este relatório descritivo.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figuras 1A-1B mostram relações filogenéticas entre os genes dehemaglutinina. Figura 1A mostra uma árvore de genes de HA de isoladosrepresentativos caninos, seres humanos, aviários, suínos, e eqüinos, inclu-indo A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4) como estranho. Figura 1B mostra umaárvore dos genes de HA de vírus de influenza canina com os genes de HAeqüinos contemporâneos e mais velhos, usando A/Duck/Ukraine/63 (H3)como estranho. Árvores filogenéticas foram deduzidas das seqüências denucleotídeo pelo método de junção de vizinhos e valores de análise de auto-carregador > 90% são mostrados. A barra denota o número de alterações denucleotídeo por comprimento de unidade das ramificações de árvores hori-zontais.
Figuras 2A-2B mostram detecção imuno-histoquímica de antí-geno de H3 de influenza nos pulmões. Seções do tecido pulmonar foramsondadas com um anticorpo monoclonal de camundongo para hemaglutininade H3 e ligação foi detectada através de reação de imunoperoxidase (preci-pitado marrom). Figura 2A mostra epitélio bronquial de um galgo com doen-ça espontânea. Antígeno de H3 viral foi detectado em citoplasma de célulaepitelial bronquial e em macrófagos em Iumens da via aérea e em espaçosalveolares. Figura 2B mostra epitélio bronquial de um cão 5 dias após inocu-lação com A/canine/Florida/43/2004 (H3N8). Antígeno de H3 viral foi detec-tado em citoplasma de célula epitelial bronquial. Barra de escala, 66 μιτι.
Figura 3 mostra as alterações histológicas características nosbrônquios de galgos que morreram de pneumonia hemorrágica associada àinfecção do vírus de influenza. Os tecidos são tingidos com H&E. Painel su-perior: Brônquio normal com células epiteliais ciliadas, células mucosas, ecélulas basais. Painel inferior: Brônquio de um galgo com influenza espontâ-nea. Há necrose e erosão das células epiteliais ciliadas bronquiais. Barra deescala, 100 μm.
Figuras 4A-4B mostram relações filogenéticas entre os genes de hemaglutinina de H3. Figura 4A mostra uma árvore filogenética dos genesde HA do vírus de influenza canina com os genes de HA eqüinos contempo-râneos e mais velhos. Figura 4B mostra uma árvore filogenética da proteínade HA do vírus de influenza canina com o HA eqüino contemporâneo e maisvelho. Árvores filogenéticas foram deduzidas de seqüências genéticas ou de aminoácido pelo método de junção de vizinho e valores de análise de auto-carregador >80 % são mostrados. A barra denota o número de alterações deaminoácido por comprimento de unidade das ramificações de árvores hori-zontais.
Figura 5 mostra proteína de H3 do vírus de influenza em células epiteliais de brônquios e glândulas bronquiais em pulmões de cães que mor-reram de pneumonia associada à infecção do vírus de influenza. Painéis su-periores: Erosão de células epiteliais bronquiais ciliadas nos brônquios. Te-cidos foram tingidos com H&E. Painéis inferiores: proteína de H3 do vírus deinfluenza nas células epiteliais de citoplasma bronquial (esquerda) e glându- Ia bronquial (direito). Tecidos foram tingidos com um anticorpo monoclonalpara influenza H3 detectado através de reação de imunoperoxidase (precipi-tado marrom) e contra-tingimento com hematoxilina.
Figuras 6A-6D mostram diagramas de amplificação de genes H3e Matriz (Figura 6A e Figura 6B) obtidos da amplificação de padrões de RNA transcritos serialmente diluídos 10 vezes in vitro. Curvas padrão de genesH3 e Matriz (Figura 6C e Figura 6D) construídas representando em gráfico olog de concentrações de RNA de partida contra o ciclo de limiar (Ct) obtidode cada diluição.
Figura 7 mostra sensibilidade de Directigen Flu A foi testada com matérias-primas de vírus serialmente diluídas 10 vezes incluindo A/Wyoming/3/2003 e A/canine/FL/242/2003. O triângulo roxo indica resultado positivo.BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQÜÊNCIAS
SEQ ID NO: 1 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PB2 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 2 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 1.
SEQ ID NO: 3 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PB1 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 4 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 3.
SEQ ID NO: 5 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de PA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 6 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 5.
SEQ ID NO: 7 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NS que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 8 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 7.
SEQ ID NO: 9 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NP que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 10 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 9.
SEQ ID NO: 11 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de NA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 12 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 11.
SEQ ID NO: 13 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de MA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 14 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 13.
SEQ ID NO: 15 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Florida/43/04) codificando uma proteína de HA que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 16 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 15.
SEQ ID NO: 17 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PB2 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 18 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 17.
SEQ ID NO: 19 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PB1 que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 20 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 19.
SEQ ID NO: 21 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de PA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 22 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 21.
SEQ ID NO: 23 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NS que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 24 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 23.
SEQ ID NO: 25 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NP que pode serusada de acordo com a presente invenção.SEQ ID NO: 26 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 25.
SEQ ID NO: 27 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de NA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 28 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 27.
SEQ ID NO: 29 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de MA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 30 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 29.
SEQ ID NO: 31 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (FL/242/03) codificando uma proteína de HA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 32 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 31.
SEQ ID NO: 33 é a forma madura da proteína de HA mostradana SEQ ID NO: 16 em que a seqüência de sinal de aminoácido 16 N-terminal foi removida.
SEQ ID NO: 34 é a forma madura da proteína de HA mostradana SEQ ID NO: 32 em que a seqüência de sinal de aminoácido 16 N-terminal foi removida.
SEQ ID NO: 35 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 36 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 37 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 38 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 39 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 41 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 42 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 43 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 44 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 45 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 46 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 47 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PB2 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 48 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 47.
SEQ ID NO: 49 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PB1 que podeser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 50 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 49.
SEQ ID NO: 51 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de PA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 52 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 51.
SEQ ID NO: 53 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NS que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 54 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 53.SEQ ID NO: 55 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NP que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 56 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 55.
SEQ ID NO: 57 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de NA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 58 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 57.
SEQ ID NO: 59 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de MA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 60 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 59.
SEQ ID NO: 61 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Miami/2005) codificando uma proteína de HA que pode serusada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 62 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 61.
SEQ ID NO: 63 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PB2 quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 64 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 63.
SEQ ID NO: 65 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PB1 quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 66 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 65.
SEQ ID NO: 67 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de PA quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 68 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 67.
SEQ ID NO: 69 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NS quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 70 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 69.
SEQ ID NO: 71 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NP quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 72 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 71.
SEQ ID NO: 73 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de NA quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 74 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 73.
SEQ ID NO: 75 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de MA quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 76 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 75.
SEQ ID NO: 77 é uma seqüência de nucleotídeo de um vírus deinfluenza canina (Jacksonville/2005) codificando uma proteína de HA quepode ser usada de acordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 78 é a seqüência de aminoácido codificada pelaSEQ ID NO: 77.
SEQ ID NO: 79 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 80 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 81 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 82 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 83 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 84 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 85 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 86 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 87 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
SEQ ID NO: 88 é um oligonucleotídeo que pode ser usado deacordo com a presente invenção.
REVELAÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Trata-se a invenção em questão do vírus de influenza isoladoque é capaz de infectar canídeos e causar doença das vias respiratórias. Emuma modalidade, um vírus de influenza da invenção compreende um polinu-cleotídeo que codifica uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidomostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18,20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68,70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou vari-ante das mesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo com-preende a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ IDNos: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53,55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variantedas mesmas. Vírus de influenza da presente invenção pode ter um subtipode HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, e H9, H10, H11, H12, H13, H14,H15, ou H16 ou um subtipo de NA de NI, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, OUΝ9. Em uma modalidade específica, um vírus de influenza da presente in-venção é um subtipo H3. Vírus pode ser isolado de cães infectados e culti-vado em células ou ovos de acordo com os métodos descritos aqui. Em umamodalidade exemplificada, o vírus de influenza é um vírus de influenza A.
Trata-se a invenção em questão dos polinucleotídeos que com-preendem todo ou parte de um gene ou genes ou um segmento genômicode um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidade, umpolinucleotídeo da invenção compreende um gene de hemaglutinina de in-fluenza (HA), gene de neuraminidase (NA), gene de nucleoproteína (NP),gene de proteína de matriz (MA ou M), gene de proteína de polimerase bási-ca (PB), gene de proteína de polimerase acídica (PA), gene de proteína não-estrutural (NS), ou um fragmento funcional ou variante de qualquer um des-tes genes. Em uma modalidade específica, um polinucleotídeo da invençãocompreende o gene de hemaglutinina (HA), ou um fragmento funcional ouvariante do mesmo. Em uma modalidade adicional, o gene de HA codificauma proteína de hemaglutinina que tem um ou mais dos seguintes: uma se-rina na posição 83; uma Ieucina na posição 222; uma treonina na posição328; e/ou uma treonina na posição 483, versus a seqüência de aminoácidode seqüência eqüina de H3 consenso. Em uma modalidade, o gene de HAcodifica um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácido mostrada nasSEQ ID NOs: 16, 32, 62, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogêni-co ou variante das mesmas. Em uma modalidade específica, o gene de HAcompreende uma seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 15,31, 61, ou 77.
Em uma modalidade, um polinucleotídeo da invenção codificaum polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qualqueruma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ouum fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em umamodalidade específica, o polinucleotídeo que codifica a seqüência de ami-noácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, ou 78, compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ IDNOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53,55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou umaseqüência que codifica um fragmento funcional e/ou imunogênico ou varian-
te de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,74, 76, ou 78. Desse modo, a invenção em questão refere-se às seqüênciasde polinucleotídeo que compreendem a seqüência de nucleotídeo mostradaem qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23,25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, OU
77, ou um fragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, dequalquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25,27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77.Em uma modalidade adicional específica, um polinucleotídeo da invenção
pode compreender: Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 3; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 5; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 7; Nucleotídeos1-1494 da SEQ ID NO: 9; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 11; Nucleotí-deos 1-756 da SEQ ID NO: 13; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 15; Nu-cleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 19; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO:21; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 23; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ IDNO: 25; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 29; Nucleotídeos 1-1695 daSEQ ID NO: 31; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 47; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 49; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 51; Nucleotí-deos 1-690 da SEQ ID NO: 53; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 55; Nu-cleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 57; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO:59; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 61; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ IDNO: 63; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 65; Nucleotídeos 1-2148 daSEQ ID NO: 67; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 69; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 71; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 73; Nucleotí- deos 1-756 da SEQ ID NO: 75; e Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 77.Seqüências de nucleotídeo e de aminoácido de seqüências virais de polinu-cleotídeo e de polipeptídeo contempladas dentro do escopo da presente in-venção foram também depositadas com os acessos de GenBank NDQ124147 a DQ124161 e DQ124190, a revelação destas é incorporada aquipor referência.
Trata-se a invenção em questão também dos polipeptídeos codi-ficados por polinucleotídeos de um vírus de influenza da presente invenção.Trata-se a invenção em questão também dos fragmentos funcionais e/ouimunogênicos e variantes dos polipeptídeos em questão. Polipeptídeos con-templados incluem proteína de HA, proteína de NA, proteína de NS1 nucleo-proteína, proteína básica de polimerase, proteína acídica de polimerase, eproteína de matriz de um vírus de influenza da invenção. Em uma modalida-de exemplificada, um polipeptídeo da invenção tem uma seqüência de ami-noácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64,66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênicoou variante das mesmas.
Trata-se a invenção em questão também das construtos de ex-pressão de polinucleotídeo que compreendem uma seqüência de polinucleo-tídeo da presente invenção. Em uma modalidade, um construto de expres-são da invenção compreende uma seqüência de polinucleotídeo que codificaum polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido mostradaem qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante dasmesmas. Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo que codifica aseqüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14,16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64,66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78 compreende a seqüência de nucleotídeo mos-trada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29,31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respecti-vãmente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional e/ou imu-nogênico ou variante de qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12,14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62,64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78. Desse modo, trata-se a invenção em ques-tão das construtos de expressão que compreendem uma seqüência de poli-nucleotídeo compreendendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qual-quer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27,29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou umfragmento ou variante, incluindo uma variante degenerada, de qualquer umadas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47,49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77. Em uma modali-dade preferida, um construto de expressão da presente invenção provê so-breexpressão de um polinucleotídeo da invenção operavelmente ligado.
Construtos de expressão da invenção em geral incluem elemen-tos reguladores que são funcionais na célula hospedeira intencionada naqual o construto de expressão é para ser expressado. Desse modo, umapessoa de habilidade usual na técnica pode selecionar elementos regulado-res para uso, por exemplo, em células hospedeiras humanas, células hos-pedeiras mamíferas, células hospedeiras de inseto, células hospedeiras delevedura, células hospedeiras bacterianas, e células hospedeiras de planta.Em uma modalidade, os elementos reguladores são os que são funcionaisem células caninas. Elementos reguladores incluem os promotores, seqüên-cias de terminação de transcrição, seqüências de terminação de translação,intensificadores, e elementos de poliadenilação. Como aqui usado, o termo"construto de expressão" refere-se a uma combinação de seqüências de á-cido nucléico que provêem transcrição de uma seqüência de ácido nucléicooperavelmente ligada. Como aqui usado, o termo "operavelmente ligado"refere-se a uma justaposição dos componentes descritos em que os compo-nentes estão em uma relação que os permite funcionar em sua maneira in-tencionada. Em geral, componentes operavelmente ligados estão em rela-ção contígua.
Um construto de expressão da invenção pode compreender umaseqüência de promotor operavelmente ligada a uma seqüência de polinucle-otídeo que codifica um polipeptídeo da invenção. Os promotores podem serincorporados em um polinucleotídeo usando técnicas padrão conhecidas natécnica. Múltiplas cópias de promotores ou múltiplos promotores podem serusados em um construto de expressão da invenção. Em uma modalidadepreferida, um promotor pode ser posicionado em volta da mesma distânciado sítio de começo de transcrição no construto de expressão como é do sítiode começo de transcrição em seu ambiente genético natural. Alguma varia-ção nesta distância é permitida sem diminuição substancial na atividade dopromotor. Um sítio de começo de transcrição é tipicamente incluso no cons-truto de expressão.
Preferivelmente, o promotor associado a um construto de ex-pressão da invenção provê sobreexpressão de um polinucleotídeo da inven-ção operavelmente ligado.
Promotores para uso com um construto de expressão da inven-ção em células eucarióticas podem ser de origem viral ou celular. Promoto-res virais incluem, mas não são limitados a, promotores de gene de citome-galovírus (CMV), promotores de SV40 precoces ou tardios, ou promotoresde gene do vírus de sarcoma Rous (RSV). Promotores de origem celular in-cluem, mas não são limitados a, promotor de gene de desmina e promotorde gene de actina. Promotores adequados para o uso com um construto deexpressão da invenção em células de levedura incluem, mas não são Iimita-dos a, promotor de 3-fosfoglicerato cinase, promotor de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, promotor de metalotioneína, promotor de álcool desi-drogenase-2, e promotor de hexocinase.
Se o construto de expressão vier a ser fornecido ou introduzidoem uma célula de planta, então promotores virais de planta, tais como, porexemplo, um vírus do mosaico de couve-flor (CaMV) 35S (incluindo o promo-tor de 35S de CaMV intensificado (vide, por exemplo patente U. S. N25.106.739 e An, 1997)) ou um promotor de 19S de CaMV pode ser usado.Outros promotores que podem ser usados paro construtos de expressão emplantas incluem, por exemplo, promotor de prolifera, promotor de Ap3, pro-motores de choque térmico, 1' ou 2'-promotor de T-DNA de A. tumefaciens,promotor de poligalacturonase, promotor de chalcona A sintase (CHS-A) depetúnia, promotor de PR-Ia de tabaco, promotor de ubiquitina, promotor deactina, promotor de gene de alcA, promotor de pin2 (Xu et al., 1993), promo-tor de Wipl de milho, promotor de gene de trpA de milho (Patente U. S. N25.625.136), promotor de gene de CDPK de milho, e promotor de SSU deRUBISCO (Patente U. S. N- 5.034.322) podem também ser usados. Promo- tores raiz-específicos, tais como quaisquer uma das seqüências de promotordescritas na Patente U. S. N- 6.455.760 ou patente U. S. N2 6.696.623, ounos pedidos de patente publicados U. S. N2s 20040078841; 20040067506;20040019934; 20030177536; 20030084486; ou 20040123349, pode ser u-sado com um construto de expressão da invenção. Promotores constitutivos (tais como o promotor de CaMV, ubiquitina, actina, ou de NOS), os promoto-res de maneira desenvolvida regulados, e os promotores induzíveis (taiscomo aqueles promotores que podem ser induzidos por calor, luz, hormô-nios, ou químicas) são também contemplados para o uso com construtos deexpressão de polinucleotídeo da invenção. Promotores tecido-específicos, por exemplo os promotores fruta-específicos, tais como o promotor de E8 detomate (número de acesso: AF515784; Good et al. (1994)) podem tambémser usados. Promotores semente-específicos tais como o promotor de umgene de β-faseolina (por exemplo, de feijão roxo) ou um gene de glicinina(por exemplo, de feijão-soja), e similares, podem também ser usados. Para expressão em sistemas procarióticos, um construto de expres-são da invenção pode compreender os promotores tais como, por exemplo,promotor de fosfatase alcalina, promotor de triptofano (trp), promotor deIambda PL, promotor de lactamase, promotor de lactose, promotor de phoA,promotor de T3, promotor de 17, ou promotor de tac (de Boer et al., 1983). Construtos de expressão da invenção podem opcionalmenteconter uma seqüência de terminação de transcrição, uma seqüência de ter-minação de translação, uma seqüência que codifica um peptídeo sinal, e/ouelementos intensificadores. Regiões de terminação de transcrição podemtipicamente ser obtidas da região não-transladada de 3' de uma seqüência de gene eucariótico ou viral. Seqüências de terminação de transcrição po-dem estar posicionadas a jusante de uma seqüência de codificação paraprover terminação eficiente. Uma seqüência de peptídeo sinal é uma se-qüência de aminoácido curta tipicamente presente no término amino de umaproteína que é responsável pela recolocação de um polipeptídeo madurooperavelmente ligado a uma gama extensiva de destinos celulares pós-translacionais, variando de um compartimento de organela específico a sítiosde ação de proteína e o ambiente extracelular. Produtos de gene alvejantespara um destino celular e/ou extracelular intencionado através do uso deuma seqüência de peptídeo sinal operavelmente ligada são contempladospara o uso com os polipeptídeos da invenção. Intensificadores clássicos sãoelementos de ação eis que aumentam a transcrição de gene e podem tam-bém ser incluídos no construto de expressão. Elementos intensificadoresclássicos são conhecidos na técnica, e incluem, mas não são limitados a,elemento intensificador de CaMV 35S, elemento intensificador de promotorprematuro de citomegalovírus (CMV), e elemento intensificador de SV40.Elementos intensificadores mediados por íntron que intensificam a expres-são de gene são também conhecidos na técnica. Estes elementos devemestar presentes dentro da região transcrita e devem ser dependente da ori-entação.
Seqüências de DNA que direcionam a poliadenilação de mRNAtranscrita do construto de expressão podem também ser incluídas no cons-truto de expressão, e incluem, mas não são limitadas a, um sinal de octopinasintase ou de nopalina sintase.
Construtos de expressão podem também incluir um ou genesmarcadores selecionáveis mais dominantes, incluindo, por exemplo, genesque codificam resistência a antibióticos e/ou resistência a herbicidas paraselecionar células transformadas. Genes de resistência a antibióticos podemprover resistência a um ou mais dos antibióticos a seguir: higromicina, ca-namicina, bleomicina, G418, estreptomicina, paromomicina, neomicina, eespectinomicina. Resistência à canamicina pode ser fornecida através deneomicina fosfotransferase (NPT II). Genes de resistência a herbicidas podemprover resistência a fosfinotricina acetiltransferase ou glifosato. Outros marca-dores usados para triagem de transformação celular incluem, mas não sãolimitados a, genes que codificam β-glucuronidase (GUS), β-galactosidase,luciferase, nopalina sintase, cloranfenicol acetiItransferase (CAT), proteínade fluorescência verde (GFP), ou GFP intensificada (Yang et al., 1996).
Trata-se a invenção em questão também dos vetores de polinu-cleotídeo compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo da invençãoque codifica um polipeptídeo da invenção. Sítios únicos da enzima de restri-ção podem ser incluídos nas terminações de 5' e 3' de um construto de ex-pressão ou polinucleotídeo da invenção para permitir inserção em um vetorde polinucleotídeo. Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a qualquerelemento genético, incluindo por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, cromos-somos, fago, vírus, e outros que são capazes de replicação quando associa-dos aos elementos de controle apropriados e que podem transferir seqüên-cias de polinucleotídeo entre as células. Vetores contêm uma seqüência denucleotídeo que permite o vetor replicar em uma célula hospedeira selecio-nada. Vários vetores estão disponíveis para expressão e/ou clonagem, eincluem, mas não são limitados a, pBR322, série de pUC, série de M13, sé-rie de pGEM, e vetores de pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA e Pro-mega, Madison, Wl).
Trata-se a invenção em questão também do oligonucleotídeo einiciadores, tais como iniciadores de reação em cadeia de polimerase (PCR)que podem hibridar com a uma seqüência de codificação ou não-codificaçãode um polinucleotídeo da presente invenção. Sondas de oligonucleotídeo dainvenção podem ser usadas nos métodos para detectar seqüências de ácidonucléico do vírus de influenza. Iniciadores de oligonucleotídeo da invençãopodem ser usados nos métodos de PCR e outros métodos que envolvemamplificação de ácido nucléico. Em uma modalidade preferida, uma sondaou iniciador da invenção pode hibridar com um polinucleotídeo da invençãosob condições rigorosas. Sondas e iniciadores da invenção podem opcio-nalmente compreender uma marcação detectável ou molécula repórter, taiscomo moléculas fluorescentes, enzimas, metade radioativa, e outros. Son-das e iniciadores da invenção podem ser de qualquer comprimento adequa-do para o método ou ensaio em que eles estão sendo empregados. Tipica-mente, as sondas e iniciadores da invenção serão 10 a 500 ou mais núcleo-tídeos em comprimento. As sondas e iniciadores que são 10 a 20, 21 a 30,31 a 40, 41 a 50, 51 a 60, 61 a 70, 71 a 80, 81 a 90, 91 a 100, ou 101 oumais nucleotídeos em comprimento são contemplados dentro do escopo dainvenção. Em uma modalidade, sondas e iniciadores são de 9, 10, 11, 12,13,14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 nucle-otídeos em comprimento. As sondas e iniciadores da invenção podem teridentidade de seqüência de nucleotídeo total (100 %) com a seqüência depolinucleotídeo, ou a identidade de seqüência pode ser menor que 100 %.Por exemplo, identidade de seqüência entre uma sonda ou iniciador e umaseqüência pode ser 99 %, 98 %, 97 %, 96 %, 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %,70 % ou qualquer outra identidade de seqüência de porcentagem contantoque a sonda ou iniciador possam hibridar sob condições rigorosas com umaseqüência de nucleotídeo de um polinucleotídeo da invenção. Sondas e ini-ciadores exemplificados da invenção incluem aqueles tendo a seqüência denucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO:45, e SEQ ID NO: 46, ou um fragmento funcional ou variante de qualqueruma das SEQ ID NOs: 35-46.
Como aqui usado, os termos "ácido nucléico", "polinucleotídeo",e "oligonucleotídeo" referem-se a um deoxirribonucleotídeo, ribonucleotídeo,ou um polímero de deoxirribonucleotídeo e de ribonucleotídeo misturado naforma uni ou bifilamentar, e a menos que do contrário limitado, abrangeriaanálogos conhecidos de nucleotídeos naturais que podem funcionar de umamaneira similar como os nucleotídeos de ocorrência natural. Seqüências depolinucleotídeo incluem a seqüência de filamento de DNA que pode sertranscrita no RNA e o filamento de RNA que pode ser transladado na proteí-na. A seqüência complementar de qualquer ácido nucléico, polinucleotídeo,ou oligonucleotídeo da presente invenção é também contemplada dentro doescopo da invenção. Seqüências de polinucleotídeo também incluem tantoas seqüências de comprimento total como também as seqüências mais cur-tas derivadas das seqüências de comprimento total. A invenção em questãotambém abrange aqueles polinucleotídeos que são complementares em se-qüência aos polinucleotídeos revelados aqui. Polinucleotídeos e polipeptí-deos da invenção podem ser fornecidos na forma purificada ou isolada.
Por causa da degeneração do código genético, uma variedadede seqüências de polinucleotídeo diferentes pode codificar um polipeptídeoda presente invenção. Uma tabela mostrando todos possíveis códons trigê-meos (e onde U também representa T) e o aminoácido codificado por cadacódon é descrita em Lewin (1985). Além disso, está bem dentro da habilida-de de uma pessoa treinada na técnica criar seqüências de polinucleotídeoalternativas que codificam os mesmo, ou essencialmente o mesmo, polipep-tídeos da invenção em questão. Estas seqüências de polinucleotídeo varian-tes degeneradas e alternativas estão dentro do escopo da. invenção emquestão. Como aqui usado, referências a "essencialmente a mesma" se-qüência refere-se às seqüências que codificam substituições, deleções, adi-ções, ou inserções de aminoácido que não alteram materialmente a ativida-de funcional e/ou imunogênica do polipeptídeo codificado pelos polinucleotí-deos da presente invenção.
Trata-se a invenção em questão também das variantes dos poli-nucleotídeos da presente invenção codificando os polipeptídeos da inven-ção. Seqüências variantes incluem aquelas seqüências em que um ou maisnucleotídeos da seqüência foram substituídos, deletados, e/ou inseridos. Osnucleotídeos que podem ser substituídos por nucleotídeos naturais de DNAtêm uma metade de base que pode incluir, mas não é limitada a, inosina, 5-fluorouracila, 5-bromouracila, hipoxantina, 1-metilguanina, 5-metilcitosina, ebase tritilada. A metade de açúcar do nucleotídeo em uma seqüência podetambém ser modificada e inclui, mas não é limitada a, arabinose, xilulose, ehexose. Além disso, a base de adenina, citosina, guanina, timina, e uracilados nucleotídeos pode ser modificada com grupos acetila, metila, e/ou tio.Seqüências que contêm as substituições, deleções, e/ou inserções de nu-cleotídeo podem ser preparadas e testadas usando técnicas padrão conhe-cidas na técnica.
Substituição de aminoácidos diferentes daqueles especificamen-te exemplificados ou naturalmente presentes em um polipeptídeo da inven-ção é também contemplada dentro do escopo da presente invenção. Porexemplo, aminoácidos não-naturais podem ser substituídos pelos aminoáci-dos de um polipeptídeo, desde que o polipeptídeo tendo os aminoácidossubstituídos retenha substancialmente a mesma atividade funcional que opolipeptídeo em que os aminoácidos não foram substituídos. Exemplos deaminoácidos não-naturais incluem, mas não são limitados a, ornitina, citrulina,hidroxiprolina, homosserina, fenilglicina, taurina, iodotirosina, ácido 2,4-dia-minobutírico, ácido α-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido γ-amino butírico, ácido ε-amino hexanóico, ácido 6-amino he-xanóico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiônico, norleucina,norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cistéico, τ-butilglicina, τ-butilala-nina, fenilglicina, cicloexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidosprojetistas tais como, - aminoácidos de β-metila, aminoácidos de C-metila,aminoácidos de N-metila, e análogos de aminoácido em geral. Aminoácidosnão-naturais também incluem aminoácidos tendo grupos laterais deriva-tizados. Além disso, quaisquer dos aminoácidos na proteína podem ser daforma D (dextrorrtatório) ou da forma L (levorrotatório). Variantes alélicas deuma seqüência de proteína de um polipeptídeo da presente invenção sãotambém abrangidas dentro do escopo da invenção.
Aminoácidos podem ser em geral categorizados nas classes aseguir: não-polar, polar descarregado, básico, e acídico. Substituições con-servadoras por meio das quais um polipeptídeo da presente invenção quetem um aminoácido de uma classe é substituído com outro aminoácido damesma classe estão incluídos dentro do escopo da invenção em questãocontanto que o polipeptídeo que ainda tem a substituição retenha substanci-almente a mesma atividade funcional que o polipeptídeo que não tem asubstituição. Polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo tendo uma oumais substituições de aminoácido na seqüência são contemplados dentro doescopo da presente invenção. Tabela 11 abaixo fornece uma listagem deexemplos de aminoácidos que referem-se a cada classe. Abreviações deaminoácido de letra minúscula são definidas na Tabela 12.Fragmentos e variantes de polipeptídeos de vírus de influenzada presente invenção podem ser gerados usando métodos padrão conheci-dos na técnica e testados quanto à presença de função ou imunogenicidadeusando técnicas padrão conhecidas na técnica. Por exemplo, para testarfragmentos e/ou variantes de um polipeptídeo de neuraminidase da inven-ção, a atividade enzimática pode ser ensaiada. Desse modo, um artesãonormalmente versado pode facilmente preparar e testar fragmentos e varian-tes de um polipeptídeo da invenção e determinar se o fragmento ou varianteretém atividade com relação ao polipeptídeo de comprimento total ou umnão-variante.
Polinucleotídeos e polipeptídeos contemplados dentro do esco-po da invenção em questão podem também ser definidos em termos de fai-xas identidade e/ou similaridade mais particulares com aquelas seqüênciasda invenção especificamente exemplificadas aqui. A identidade de seqüên-cia tipicamente será maior que 60 %, preferivelmente maior que 75 %, maispreferivelmente maior que 80 %, até mesmo mais preferivelmente maior que90 %, e pode ser maior que 95 %. A identidade e/ou similaridade de umaseqüência pode ser 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63,64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83,84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, ou 99 % quandocomparada a uma seqüência exemplificada aqui. A menos que do contrárioespecificado, como aqui usado percentual de identidade e/ou similaridade deseqüência de duas seqüências pode ser determinado usando o algoritmo deKarlin e Altschul (1990), modificado como em Karlin e Altschul (1993). Um talalgoritmo é incorporado no programa NBLAST e XBLAST de Altschul et al.(1990). Pesquisas de BLAST podem ser executadas com o programa deNBLAST, contagem = 100, comprimento de palavra = 12, para obter as se-qüências com o percentual de identidade de seqüência desejado. Para obteralinhamentos intervalados para propósitos de comparação, Gapped BLASTpode ser usado como descrito em Altschul et al. (1997). Ao utilizar os pro-gramas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros predefinidos dos respecti-vos programas (NBLAST e XBLAST) podem ser usados. Vide sítio de redede NCBI/NIH.
A invenção em questão também contempla aquelas moléculasde polinucleotídeo que têm seqüências que são suficientemente homólogascom as seqüências de polinucleotídeo exemplificadas aqui para permitir hi-bridação com aquela seqüência sob condições rigorosas padrão e métodospadrão (Maniatis et al., 1982). Como aqui usado, condições "rigorosas" parahibridãção referem-se às condições em que hibridação é tipicamente reali-zada durante à noite a 20-25-C abaixo da temperatura de fundição (Tm) doDNA híbrido em 6x SSPE, solução de 5x Denhardt1 0,1 % SDS, 0,1 mg/mlde DNA desnaturado. A temperatura de fundição, Tm, é descrita pela fórmulaa seguir (Beltz et al., 1983):
Tm = 81,5°C + 16,6 Log[Na+] + 0,41 (% G+C) - 0,61 (% formamida)-600/comprimento do dúplex nos pares de base.
Lavagens são tipicamente realizadas como segue:
(1) Duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutosem 1x SSPE, 0,1 % SDS (lavagem de severidade baixa).
(2) Uma vez em Tm -20-C durante 15 minutos em 0,2x SSPE,0,1 % SDS (lavagem de severidade moderada).
Trata-se a invenção em questão também das proteínas virais epeptídeos codificados pelos genes de um vírus de influenza da presente in-venção. Em uma modalidade, a proteína viral é uma proteína de HA madura.Em uma modalidade específica, a proteína de HA madura compreende umou mais dos seguintes: uma serina na posição 82; uma Ieucina na posição221; uma treonina na posição 327; e/ou uma treonina na posição 482. Emuma modalidade exemplificada, a proteína de HA madura tem uma seqüên-cia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 33 ou SEQ ID NO: 34, ou umfragmento funcional e/ou imunogênico ou variante da SEQ ID NO: 33 ouSEQ ID NO: 34. Em outra modalidade, a proteína viral é uma proteína deNA, proteína de NS, proteína de PB, proteína de PA, ou proteína de MA. Asproteínas virais e peptídeos da invenção podem ser usados para gerar anti-corpos que especificamente ligam à proteína ou peptídeo. Proteínas virais epeptídeos da presente invenção podem também ser usados como imunóge-nos e em composições de vacina.
Trata-se a invenção em questão também das composições emétodos para induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza queé capaz de infectar um animal hospedeiro suscetível e causar doença dasvias respiratórias. A invenção pode ser usada para induzir uma resposta i-mune contra um vírus de influenza de qualquer subtipo em um animal hos-pedeiro suscetível. Por exemplo, o vírus de influenza pode ser um subtipo deHA de Η1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15,ou H16, e um subtipo de NA de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8, ou N9. Emuma modalidade, o subtipo de HA é H3 ou H5. Em uma modalidade adicio-nal, o subtipo de NA é N7 ou N8. Em uma modalidade específica, uma res-posta imune é induzida contra um vírus de influenza de subtipo H3N8. Emuma modalidade, o animal hospedeiro é um canídeo. Caninos incluem cani-nos selvagens, de jardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes,e raposas. Caninos também incluem cães, particularmente cães domésticos,tais como, por exemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães deexposição, cães de trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda,cães policiais, cães de corrida, e/ou cães de laboratório. Em uma modalida-de específica, o animal hospedeiro é um cão domesticado, tal como um gal-go. Em uma modalidade, um animal é administrado com uma quantidadeeficaz de uma composição imunogênica da presente invenção suficiente pa-ra induzir uma resposta imune contra um vírus de influenza da invenção. Aresposta imune pode ser uma resposta imune humoral e/ou celular. Em umamodalidade específica, a resposta imune é uma resposta imune protetoraque é capaz de impedir ou minimizar infecção viral no animal hospedeiroimunizado durante algum período de tempo subseqüente à imunização.Desse modo, trata-se a invenção em questão também de vacina e métodosque podem proporcionar a um animal vacinado uma resposta imune proteto-ra para um vírus da presente invenção.
Como descrito aqui, a vacina ou composições imunogênicas dainvenção em questão podem compreender vírus inteiro livre de célula, inclu-indo vírus atenuado ou inativado, ou porções do vírus, incluindo partículasde subvírion (incluindo "vacina tendida" em que um virion é tratado para re-mover alguns ou todos os lipídios virais), proteínas virais (incluindo proteínasindividuais e complexos macromoleculares de proteínas múltiplas), polipep-tídeos, e peptídeos, como também linhagens celulares infectadas por vírus,ou uma combinação de qualquer um destes. Vacina ou composições imuno-gênicas que compreendem linhagens celulares infectadas por vírus podemcompreender linhagens celulares múltiplas, cada uma infectada com umacepa viral diferente.
Em uma modalidade da invenção, um canino pode ser imuniza-do com um ou mais vacinas do vírus de influenza inativado (isto é, morto)e/ou atenuado vivo ou vacinas que compreendem um ou uma multiplicidadede antígenos do vírus de influenza de um ou mais isolados virais. Em umamodalidade, o vírus de influenza é um vírus de influenza canina. Em outramodalidade, o vírus de influenza é um vírus de influenza eqüina que codificaou expressa um polipeptídeo tendo pelo menos cerca de 90 %, ou pelo me-nos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou 97 %, ou 98 %, ou 99% ou mais identidade de seqüência de aminoácido com um polipeptídeo devírus de influenza canina. Em uma modalidade, um antígeno de influenzausado em uma vacina da presente invenção tem pelo menos cerca de 96 %identidade de seqüência com um antígeno de HA e/ou antígeno de NA deum vírus de influenza canina.
Um exemplo de uma vacina inativada é EQUICINE II® que foicomercializada por Intervet Inc. (Millsboro, DE, USA) como uma vacina líqui-da. EQUICINE II® contém vírus de influenza de A/Pennsylvania/63 inativado("A/Pa/63") e vírus de influenza de A/eqüino/Kentucky/93 ("A/KY/93") comcarbopol (isto é, HAVLOGEN® (Intervet Inc.)). Mais especificamente, umadose de EQUICINE II® contém: A/Pa/63 inativado a 106.0 EID50, A/KY/93inativado a 106.7 EID50, 0,25 % em volume de carbopol, e PBS suficientepara criar um volume total de 1 ml.
Outro exemplo de uma vacina inativada é vírus de influenza e-qüina A/eqüino/Ohio/03 ("Ohio 03"). Em algumas modalidades, uma tal vaci-na contém CARBIGEN® que é um adjuvante com base em polímero emulsi-ficado comercialmente disponível de MVP Laboratories, Inc. (Ralston, NE).Em tais vacinas, uma unidade de dosagem tipicamente compreende pelomenos cerca de 250 unidades de HA do vírus, de cerca de 250 a cerca de12.500 unidades de HA do vírus, ou de cerca de 1000 a cerca de 6200 uni- dades de HA do vírus. A concentração recomendada de CARBIGEN® é decerca de 5 a cerca de 30 % (em massa).
Um exemplo de uma vacina atenuada viva é influenza de eqüi-no/ Kentucky/91 ("A/KY/91") modificada viva na forma de uma vacina secadapor congelamento que pode ser reconstituída com água. Em algumas moda-lidades, esta reconstituição é conduzida usando água do tipo vacina suficientepara trazer a dosagem de vacina para um volume total de 1 ml. Aspectos detais vacinas são debatidos, por exemplo, nas Patentes U. S. N2s 6.436.408;6.398.774; e 6.177.082, que são incorporadas por referência em sua totali-dade nesta patente. Quando reconstituída, uma dose de uma tal vacina po-de, por exemplo, conter A/KY/91 a 107'2 TCID50 por ml, 0,015 grama de N-ZAMINE AS® por ml, 0,0025 grama de gelatina por ml, e 0,04 grama de Iacto-se D por ml. N-Z AMINE AS® é uma fonte refinada de aminoácidos e peptí-deos produzida por hidrólise enzimática de caseína. N-Z AMINE AS® é co-mercializada por Bio-Science de Kerry (Norwich, NY, USA).
Em uma modalidade preferida, a vacina compreende um antíge-no de influenza de H3 que tem pelo menos cerca de 93 % de homologia comFlorida/43/2004 nas seqüências de codificação de HA, tais como, por exem-plo, a cepa de eqüino/New Market/79. Homologia preferida é pelo menoscerca de 96 %, tais como, por exemplo, as cepas de eqüino/Alaska/1/91 eeqüino/Santiago/85. Nos exemplos que seguem, os antígenos de influenzaeqüino/Kentucky/91, eqüino-2/Kentucky/93, eqüino-1/Pennsylvania/63, e eqüi-no 0hio/03 foram incorporados nas vacinas. Vacinas preferidas também in-cluem vacinas que compreendem eqüino/Wisconsin/03, eqüino/Kentucky/02,eqüino/Kentucky/93, e eqüino/New Market 2/93. Nos exemplos que seguem,os vírus de H3N8 foram usados. Porém, é acreditado que outros vírus deinfluenza de H3 possam ser usados de acordo com esta invenção.
Vacinas atenuadas vivas podem ser preparadas através de mei-os convencionais. Tais meios em geral incluem, por exemplo, modificar ascepas patogênicas por passagem in vitro, adaptação ao frio, modificação dapatogenicidade do organismo através de manipulação genética, preparaçãode quimeras, inserção de antígenos em vetores virais, seleção de cepas dotipo selvagem não-virulentas, etc.
Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é deri-vada por passagem serial do vírus do tipo selvagem através da cultura decélulas, animais de laboratório, animais não-hospedeiros, ou ovos. A acumu-lação de mutação genética durante tal(is) passagem(ns) tipicamente leva àperda progressiva de virulência do organismo para o hospedeiro original.
Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é pre-parada por co-infecção de células permissíveis com um vírus mutante ate-nuado e vírus patogênico. O vírus recombinante resultante desejado tem asegurança do vírus atenuado com genes que codificam para antígenos pro- tetores do vírus patogênico.
Em algumas modalidades, a cepa de vírus atenuado vivo é pre-parada por adaptação ao frio. Um vírus adaptado ao frio tem uma vantagemde replicar-se apenas na temperatura encontrada no trato respiratório supe-rior. Um método de geração de um vírus de influenza eqüina adaptado ao frio foi descrito na Patente U. S. N2 6.177.082. Um vírus adaptado ao frioresultante desejado confere um ou mais dos fenótipos a seguir: adaptaçãoao frio, sensibilidade à temperatura, interferência dominante, e/ou atenua-ção.
Em algumas modalidades, a cepa do vírus atenuado vivo é pre- parada através de meios moleculares, tais como mutação, deleção, ou in-serção de ponto para converter um vírus patogênico em um vírus não-patogênico ou menos-patogênico comparado ao vírus original, ao mesmotempo preservando as propriedades protetoras do vírus original.
Em algumas modalidades, o vírus atenuado vivo é preparado clonando o candidato de genes de antígenos protetores em um genoma deum vírus não-patogênico ou menos-patogênico ou outro organismo.
Vacinas de vírus inativado (isto é, "morto") podem ser prepara-das inativando o vírus usando métodos convencionais. Tipicamente, tais va-cinas incluem excipientes que podem intensificar uma resposta imune, comotambém outros excipientes que são convencionalmente usados nas vacinas.Por exemplo, nos exemplos que seguem, EQUICINE II® compreende HA-VLOGEN®. Inativação do vírus pode ser realizada tratando o vírus com quí-micas de inativação (por exemplo, formalina, propiolactona beta ("BPL"),bromoetilamina ("ΒΕΑ"), e etilenimina binária ("BEI")) ou através de métodosnão-químicos (por exemplo, calor, congelamento/descongelamento, ou soni-cação) para incapacitar a capacidade de replicação do vírus.
Nos exemplos que seguem, eqüino/0hio/03 foi usado como umvírus de desafio. É conhecido ter cerca de 99 % de homologia com o isoladoFlorida/43/04, e foi mostrado para induzir sintomas de infecção e sorocon-versão em cães. Exemplo 18 ilustra a eficácia da vacina de influenza eqüinaem cães, mostrando inibição de titulações de hemaglutinação (ou "Hl" ou"HAI") em cães vacinados com antígeno de Ohio 03 inativado em uma com-posição de vacina compreendendo adjuvante de CARBIGEN®. Tabela 29mostra pré-vacinação, pós-vacinação, e pós-segunda vacinação de titula-ções, como também pós-desafio. Os resultados indicam titulações de Hl emcada pós-vacinação de estágio para os cães vacinados, com pequeno ounenhum aumento para controles. Tabela 30 ilustra os sinais clínicos, isola-mento de vírus e os resultados de histopatologia do mesmo estudo. Emboraanimais desafiados não mostrassem sinais clínicos, eliminações do vírus, ouhistopatologia positiva, as titulações de Hl positivas (Tabela 29) indicam titu-lações de anticorpo significativas em animais imunizados.
Deveria ser observado que outras vacinas de antígeno de vírusde influenza de H3 são abrangidas por esta invenção também. Aquelas des-critas neste relatório descritivo e nos exemplos a seguir são fornecidas parailustrar a invenção e suas modalidades preferidas, e não limitar o escopo dainvenção reivindicada.
Deve também ser observado que antígenos de influenza diferen-tes de antígenos de vírus de influenza de H3 podem ser usados de acordocom esta invenção. Tais antígenos incluem, por exemplo, aqueles de eqüi-no/PA/63 que é um subtipo de eqüino Α1 (H7N7). E contemplado que um oumais de tais antígenos possam ser usados com ou sem um ou mais antíge-nos de influenza de H3.
Em geral, a vacina é administrada em uma quantidade terapeu-ticamente eficaz. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quanti-dade suficiente para induzir uma resposta protetora no paciente canino con-tra o vírus alvo. Tipicamente, uma dosagem é "terapeuticamente eficaz" seimpedir, reduzir o risco, retardar o princípio, reduzir a expansão, melhorar,suprimir, ou erradicar a influenza ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) de seus sintomas. Sintomas de influenza típicos incluem, por exemplo, febre(para cães, tipicamente; ^ 39,4°C (> 103,0°F)), tosse, espirro, lesões histopa-tológicas, secreção ocular, secreção nasal, vômito, diarréia, depressão, per-da de peso, entalo, hemoptise, e/ou estertores audíveis. Outros sintomasfreqüentemente mais severos podem incluir, por exemplo, hemorragia nospulmões, mediastino, ou cavidade pleural; traqueíte; bronquite; bronquiolite;broncopneumonia suportiva; e/ou infiltração do forro epitelial e Iumens dasvias aéreas dos pulmões com neutrófilos e/ou macrófagos.
A vacina pode ser administrada como parte de uma terapia decombinação, isto é, uma terapia que inclui, além da própria vacina, adminis-trando um ou mais agentes ativos adicionais, adjuvantes, terapias, etc. Na-quela circunstância, deveria ser reconhecido que a quantidade de vacinaque constitui uma quantidade "terapeuticamente eficaz" pode ser menor quea quantidade de vacina que constituiria uma quantidade "terapeuticamenteeficaz" se a vacina fosse administrada sozinha. Outras terapias podem inclu-ir aquelas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, medicações antivi-rais, analgésicos, medicações redutoras de febre, expectorantes, medica-ções de anti-inflamação, anti-histamínicos, antibióticos para tratar infecçãobacteriana que resulta da infecção por vírus de influenza, repouso, e/ou ad-ministração de fluidos. Em algumas modalidades, a vacina desta invenção éadministrada em combinação com uma vacina de bordetella, vacina de ade-novírus, e/ou vacina do vírus de parainfluenza.
Em algumas modalidades, por exemplo, uma dose típica parauma vacina atenuada viva é pelo menos cerca de 103 pfu/canino, e mais tipi-camente de cerca de 103 a cerca de 109 pfu/canino. Nesta patente, "pfu" signifi-ca "unidades de formação de placa". Em algumas modalidades, uma dose típi-ca para uma vacina atenuada viva é pelo menos cerca de 103 TCID50/canino,e mais tipicamente de cerca de 103 a cerca de 109 TCID50/canino. Em algu-mas modalidades, uma dose típica para uma vacina atenuada viva é pelomenos cerca de 103 EID50/canino, e mais tipicamente de cerca de 103 a cer-ca de 109 EID50/canino. Em algumas modalidades, uma dose típica parauma vacina morta é pelo menos cerca de 40 unidades de HA1 tipicamente decerca de 40 a cerca de 10.000 unidades de HA, e mais tipicamente de cercade 500 a cerca de 6200 unidades de HA. Em algumas modalidades, a doseé de cerca de 6100 a cerca de 6200 unidades de HA.
Em algumas modalidades preferidas, a vacina compreende umavacina atenuada viva a uma concentração que é pelo menos cerca de 100'5pfu/canino maior que o nível de imunogenicidade. Em algumas modalidadespreferidas, a vacina compreende uma vacina atenuada viva a uma concen-tração que é pelo menos cerca de 10o'5 TCID50/canino maior que o nível deimunogenicidade. Em algumas modalidades preferidas, a vacina compreen-de uma vacina atenuada viva a uma concentração que é pelo menos cercade 100,5 EID50Zcanino maior que o nível de imunogenicidade.
O nível de imunogenicidade pode ser determinado experimen-talmente através de técnicas de estudo de titulação de dose de desafio emgeral conhecidas na técnica. Tais técnicas tipicamente incluem vacinar vá-rios caninos com a vacina em dosagens diferentes, e depois desafiar os ca-ninos com o vírus virulento para determinar a dose de proteção mínima.
Fatores que afetam o regime de dosagem preferido podem in-cluir, por exemplo, o tipo (por exemplo, espécies e raça), idade, peso, sexo,dieta, atividade, tamanho pulmonar, e condição do sujeito; a via de adminis-tração; a eficácia, segurança, e perfis de duração-de-imunidade da vacinaparticular usada; se um sistema de liberação é usado; e se a vacina é admi-nistrada como parte de um fármaco e/ou combinação de vacina. Desse mo-do, a dosagem de fato empregada pode variar para animais específicos, e,portanto, pode divergir acima das dosagens típicas expostas. Para determi-nar tais ajustes de dosagem está em geral dentro da habilidade daqueles natécnica usando meios convencionais. Deve também ser observado que vírusatenuados vivos são em geral autopropagadores; desse modo, a quantidadeespecífica de um tal vírus administrado não é necessariamente crítica.
É contemplado que a vacina pode ser administrada ao pacientecanino uma única vez; ou, alternativamente, duas ou mais vezes durantedias, semanas, meses, ou anos. Em algumas modalidades, a vacina é admi-nistrada pelo menos duas vezes. Em algumas tais modalidades, por exem-pio, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose (por exemplo,o reforço) sendo administrada pelo menos cerca de 2 semanas após a pri-meira. Em algumas modalidades, a vacina é administrada duas vezes, coma segunda dose sendo administrada não maior que 8 semanas após a pri-meira. A segunda dose é administrada de cerca de 2 semanas a cerca de 4anos após a primeira dose em algumas modalidades, de cerca de 2 a cercade 8 semanas após a primeira dose, ou de cerca de 3 a cerca de 4 semanasapós a primeira dose. Em algumas modalidades, a segunda dose é adminis-trada cerca de 4 semanas após a primeira dose. Nas modalidades acima, aprimeira e dosagens subseqüentes podem variar, tais como, por exemplo,em quantidade e/ou forma. Freqüentemente, porém, as dosagens são iguaispara a quantidade e forma. Quando apenas uma dose única for administra-da, a quantidade de vacina naquela dose sozinha em geral compreende umaquantidade terapeuticamente eficaz da vacina. Porém, quando mais de umadose for administrada, as quantidades de vacina naquelas doses podem jun-tas constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz.
Em algumas modalidades, a vacina é administrada antes do re-cipiente canino ter sido infectado com influenza. Em tais modalidades, a va-cina pode, por exemplo, ser administrada para impedir, reduzir o risco, outardar o princípio de influenza ou um ou mais (tipicamente dois ou mais) sin-tomas de influenza.
Em algumas modalidades, a vacina é administrada após o reci-piente canino ser infectado com influenza. Em tais modalidades, a vacinapode, por exemplo, melhorar, suprimir, ou erradicar a influenza ou um oumais (tipicamente dois ou mais) sintomas de influenza.
A composição preferida da vacina depende, por exemplo, se avacina é uma vacina inativada, vacina atenuada viva, ou ambas. Isto tam-bém depende do método de administração da vacina. É contemplado que avacina compreenderá um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveisconvencionais, adjuvantes, outros intensificadores de resposta imune, e/ouveículos (coletivamente referidos como "excipientes"). Tais excipientes sãoem geral selecionados para ser compatíveis com o(s) ingrediente(s) ativo(s)na vacina. Uso de excipientes é em geral conhecido àqueles versados natécnica.
O termo "farmaceuticamente aceitável" é adjetivamente usadopara significar que o substantivo modificado é apropriado para o uso em umproduto farmacêutico. Quando for usado, por exemplo, para descrever umexcipiente em uma vacina farmacêutica, o excipiente caracteriza como sen-do compatível com os outros componentes da composição e não desvanta-josamente deletério ao canino recipiente intencionado.
As vacinas podem ser administradas através de meios conven-cionais, incluindo, por exemplo, administração mucosa, (tais como intrana-sal, oral, intratraqueana, e ocular), e administração parenteral. Administraçãomucosa é freqüentemente em particular vantajosa para vacinas atenuadasvivas. Administração parenteral é freqüentemente particularmente vantajosapara vacinas inativadas.
Vacinas mucosas podem ser, por exemplo, formas de dosagemlíquida, tais como emulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires far-maceuticamente aceitáveis. Excipientes adequados para tais vacinas inclu-em, por exemplo, diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como,água, solução salina, dextrose, glicerol, lactose, sucrose, pó de amido, éste-res de celulose de ácidos alcanóicos, ésteres de alquila de celulose, talco,acido esteárico, estearato de magnésio, oxido de magnésio, sais de sódio ede cálcio de ácidos fosfóricos é sulfúricos, gelatina, goma acácia, alginato desódio, polivinilpirrolidona, e/ou poliálcool vinílico. Excipientes adicionais po-dem compreender vários agentes intumescentes, emulsificantes, suspenso-res, condimentos (por exemplo, adocicantes), e/ou aromatizantes.
Vacinas mucosas orais também podem, por exemplo, ser for-madas em comprimidos ou encapsuladas para administração conveniente.
Tais cápsulas ou comprimidos podem conter uma formulação de liberaçãocontrolada. No caso de cápsulas, comprimidos, e pílulas, as formas de do-sagem também podem compreender agentes tamponantes, tais como citratode sódio, ou carbonato ou bicarbonato de magnésio ou de cálcio. Comprimi-dos e pílulas podem ser adicionalmente preparadas com revestimentos enté-ricos.
É contemplado que a vacina pode ser administrada por meio deágua potável e/ou alimento do paciente canino. É também contemplado quea vacina pode ser administrada na forma de um medicamento ou brinquedo.
"Administração parenteral" inclui injeções subcutâneas, injeçõessubmucosais, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções in-traesternais, injeções transcutâneas, e infusão. Preparações injetáveis (porexemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis) podemser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando excipientes ade-quados, tais como veículos, solventes, dispersantes, agentes umectantes,agentes emulsificantes, e/ou agentes de suspensão. Estes tipicamente in-cluem, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol, óleo demilho, óleo de caroço de algodão, óleo de amendoim, óleo de gergelim, ál-cool benzílico, álcool benzílico, 1,3-butanodiol, solução de Ringer, soluçãode cloreto de sódio isotônica, óleos fixos insípidos (por exemplo, mono- oudiglicerídeos sintéticos), ácidos graxos (por exemplo, ácido oléico), dimetilacetamida, tensoativos (por exemplo, detergentes iônicos e não-iônicos),propileno glicol, e/ou polietileno glicóis. Excipientes adicionais podem incluirquantidades pequenas de outras substâncias auxiliares, tais como agentestamponantes de pH.
A vacina pode incluir um ou mais excipientes que intensificam aresposta imune de um paciente canino (que pode incluir uma resposta deanticorpo, resposta celular, ou ambas), assim aumentando a eficácia da va-cina. Uso de tais excipientes (ou "adjuvantes") pode ser particularmente be-néfico quando usar uma vacina inativada. O(s) adjuvante(s) pode(m) seruma substância que tem um efeito direto (por exemplo, citocina ou BacilléCalmette-Guerin ("BCG")) ou indireto (Iipossomas) nas células do sistemaimune do paciente canino. Exemplos de adjuvantes freqüentemente ade-quados incluem óleos (por exemplo, óleos minerais), sais metálicos (por e-xemplo, hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio), componentes bacteri-anos (por exemplo, lipossacarídeos bacterianos, adjuvantes de Freund, e/ouMDP), componentes de planta (por exemplo, Quil A), e/ou uma ou maissubstâncias que têm um efeito de veículo (por exemplo, bentonita, partículasde látex, lipossomas, e/ou Quil A, ISCOM). Como observado acima, adjuvan-tes adicionais incluem, por exemplo, CARBIGEN® e carbopol. Deveria serreconhecido que esta invenção abrange tanto as vacinas compreendendoum/uns adjuvante(s), como também vacinas que não compreendem nenhumadjuvante.
É contemplado que a vacina pode ser secada por congelamento(ou do contrário reduzida em volume líquido) para armazenamento, e depoisreconstituída em um líquido antes ou na hora da administração. Tal reconsti-tuição pode ser alcançada usando, por exemplo, água do tipo de vacina.
A presente invenção também compreende kits que são adequa-dos para uso na execução dos métodos descritos acima. O kit compreendeuma forma de dosagem compreendendo uma vacina descrita acima. O kittambém compreende pelo menos um componente adicional, e, tipicamente,instruções para usar a vacina com o(s) componente(s) adicional(is). 0(s)componente(s) adicional(is) pode(m), por exemplo, ser um ou mais compo-nentes adicionais (tais como, por exemplo, um ou mais dos excipientes, ali-mento, e/ou um medicamento debatidos acima) que possa ser misturadocom a vacina antes ou durante a administração. 0(s) componente(s) adicio-nal(is) pode(m) alternativamente (ou adicionalmente) compreender um oumais aparelhos para administrar a vacina ao paciente canino. Um tal apare-lho pode ser, por exemplo, uma seringa, inalador, nebulizador, pipeta, fór-ceps, ou qualquer veículo de liberação medicalmente aceitável. Em algumasmodalidades, o aparelho é adequado para administração subcutânea da va-cina. Em algumas modalidades, o aparelho é adequado para administraçãointranasal da vacina.
Outros excipientes e modos de administração conhecidos nastécnicas farmacêuticas ou biológicas podem também ser usados.
A vacina ou composições imunogênicas da invenção em ques-tão também abrangem construtos baseadas em vetor viral recombinante quepodem compreender, por exemplo, genes que codificam proteína de HA,proteína de NA, nucleoproteína, proteína básica de polimerase, proteína ací-dica de polimerase, e/ou proteína de matriz de um vírus de influenza da pre-sente invenção. Qualquer vetor viral adequado que possa ser usado parapreparar um constructo de vetor/vírus recombinante é contemplado para ouso com a invenção em questão. Por exemplo, vetores virais derivados deadenovírus, avipox, herpesvírus, vacínia, canaripox, entomopox, suinopox,vírus do Nilo Ocidental e similares conhecidos na técnica podem ser usadoscom as composições e métodos da presente invenção. Vetores de polinu-cleotídeo recombinante que codificam e expressam componentes podem serconstruídos usando técnicas de engenharia genética padrões conhecidas natécnica. Além disso, as várias composições de vacina descritas aqui podemser usadas separadamente e em combinação entre si. Por exemplo, imuni-zações primárias de um animal podem usar construtos baseados em vetorrecombinante, tendo componentes de cepa simples ou múltiplas, seguidopor aumentos secundários com as composições de vacina compreendendovírus inativado ou linhagens celulares infectadas por vírus inativado. Outrosprotocolos de imunização com as composições de vacina da invenção sãoevidentes às pessoas versadas na técnica e são contemplados dentro doescopo da presente invenção.
Trata-se a invenção em questão também dos vírus reagrupantecompreendendo pelo menos um gene ou segmento genômico de um vírusde influenza da presente invenção e o restante dos genes virais ou segmen-tos genômicos de um vírus de influenza diferente da invenção ou de um ví-rus de influenza diferente de um vírus da presente invenção. Vírus reagru-pante pode ser produzido para reagrupamento genético de ácido nucléico deum vírus de influenza de doador da presente invenção com ácido nucléicode um vírus de influenza de recipiente e depois selecionando o vírus reagru-pante compreendendo o ácido nucléico do vírus de doador. Métodos paraproduzir e isolar vírus reagrupante são bem conhecidos na técnica (Fields etal., 1996). Em uma modalidade, um vírus reagrupante da invenção compre-ende genes ou segmentos genômicos de um vírus de influenza humana,aviária, suína, ou eqüina. Um vírus reagrupante da presente invenção podeincluir qualquer combinação de ácido nucléico do vírus de influenza de doa-dor e recipiente contanto que o vírus reagrupante compreenda pelo menosum gene ou segmento genômico de um vírus de influenza de doador da pre-sente invenção. Em uma modalidade, um vírus de influenza de recipientepode ser um vírus de influenza eqüina.
Polipeptídeos naturais, recombinantes ou sintéticos de proteínasvirais, e seus fragmentos de peptídeo, podem também ser usados comocomposições de vacina de acordo com os métodos em questão. Em umamodalidade, uma composição de vacina compreende um polinucleotídeo ouum polipeptídeo de um vírus de influenza canina. Em uma modalidade, umacomposição de vacina compreende um polinucleotídeo que codifica um poli-peptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34,48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um frag-mento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas. Em uma moda-lidade específica, o polinucleotídeo que codifica a seqüência de aminoácidomostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou78, compreendem a seqüência de nucleotídeo mostrada nas SEQ ID NOs: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectivamente, ou uma seqüênciaque codifica um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante de qual-quer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou78. Em uma modalidade específica adicional, um polinucleotídeo da inven-ção pode compreender: Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 3; Nucleotí-deos 1-2148 da SEQ ID NO: 5; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 7; Nu-cleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 9; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO:11; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 13; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ IDNO: 15; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 19; Nucleotídeos 1-2148 daSEQ ID NO: 21; Nucleotídeos 1-657 da SEQ ID NO: 23; Nucleotídeos 1-1494 da SEQ ID NO: 25; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 29; Nucleotí-deos 1-1695 da SEQ ID NO: 31; Nucleotídeos 1-2277 da SEQ ID NO: 47;Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 49; Nucleotídeos 1-2148 da SEQ IDNO: 51; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO: 53; Nucleotídeos 1-1494 daSEQ ID NO: 55; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ ID NO: 57; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 59; Nucleotídeos 1-1695 da SEQ ID NO: 61; Nucleotí-deos 1-2277 da SEQ ID NO: 63; Nucleotídeos 1-2271 da SEQ ID NO: 65;Nucleotídeos 1-2148 da SEQ ID NO: 67; Nucleotídeos 1-690 da SEQ ID NO:69; Nucleotídeos 1 -1494 da SEQ ID NO: 71; Nucleotídeos 1-1410 da SEQ IDNO: 73; Nucleotídeos 1-756 da SEQ ID NO: 75; e Nucleotídeos 1-1695 daSEQ ID NO: 77. Em outra modalidade, uma composição de vacina compre-ende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostrada em qual-quer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28,30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante das mesmas.Em uma modalidade adicional, uma composição de vacina compreende umpolinucleotídeo ou um polipeptídeo de um vírus de influenza eqüina em queo polinucleotídeo ou polipeptídeo tem pelo menos cerca de 90 %, ou pelomenos cerca de 95 %, ou pelo menos cerca de 96 %, ou 97 %, ou 98 %, ou99 % ou mais identidade de seqüência com um polinucleotídeo ou polipeptí-deo de influenza canina. Em uma modalidade, polipeptídeos virais derivadosde cepas múltiplas podem ser combinados em uma composição de vacina epodem ser usados para vacinar um animal hospedeiro. Por exemplo, os po-lipeptídeos com base na proteína de HA viral de pelo menos duas cepas di-ferentes do vírus de influenza da invenção podem ser combinados na vaci-na. Os polipeptídeos podem ser homólogos a uma cepa ou podem compre-ender polipeptídeos "híbridos" ou "quiméricos" cuja seqüência de aminoáci-do é derivada de unir ou ligar polipeptídeos de pelo menos duas cepas dis-tintas. Procedimentos para preparar polipeptídeos virais são bem conhecidosna técnica. Por exemplo, polipeptídeos e peptídeos virais podem ser sinteti-zados usando métodos de síntese de fase sólida (Merrifield, 1963). Polipep-tídeos e peptídeos virais podem também ser produzidos usando técnicas deDNA recombinantes em que uma molécula de polinucleotídeo que codificauma proteína ou peptídeo viral é expressado em uma célula hospedeira, tais como bactéria, levedura, ou linhagens celulares mamíferas, e a proteína ex-pressa purificada usando técnicas padrão da técnica.
Composições de vacina da presente invenção também incluemcomposições de ácido nucléico desprotegidas. Em uma modalidade, um ácidonucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que codifica um HAe/ou uma proteína de NA de um vírus de infIuenza da presente invenção. Méto-dos para vacinação de ácido nucléico são conhecidos na técnica e são descri-tos, por exemplo, nas Patentes U. S. N-s 6.063.385 e 6.472.375. O ácidonucléico pode ser na forma de um plasmídeo ou um cassete de expressãode gene. Em uma modalidade, o ácido nucléico é fornecido encapsulado emum Iipossoma que é administrado a um animal.
Composições de vacina e imunógenos, tais como polipeptídeose ácidos nucléicos que podem ser usados de acordo com a presente inven-ção podem ser fornecidas com um veículo ou diluente farmaceuticamenteaceitável. Compostos e composições úteis na invenção em questão podemser formulados de acordo com os métodos conhecidos para preparar ascomposições farmaceuticamente úteis. As formulações são descritas emdetalhes em várias fontes que são bem conhecidas e facilmente disponíveisàqueles versados na técnica. Por exemplo, Remington's PharmaceuticalScience por E. W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company,19a ed., 1995, descreve formulações que podem ser usadas com relação àinvenção em questão. Em geral, as composições da invenção em questãoserão formuladas de modo que uma quantidade eficaz de um imunógenoseja combinada com um veículo adequado para facilitar a administração efi-caz da composição. As composições usadas nos métodos presentes podemtambém ser em uma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, for-mas de dosagem sólidas, semi-sólidas, e líquidas, tais como comprimidos,pílulas, pós, soluções líquidas ou suspensão, supositórios, soluções injetá-veis e infusíveis, e pulverizações. A forma preferida depende do modo inten-cionado de administração e aplicação terapêutica. As composições tambémpreferível mente incluem veículos e diluentes farmaceuticamente aceitáveisconvencionais que são conhecidos àqueles versados na técnica. Exemplosde veículos ou diluentes para o uso com os peptidomiméticos em questãoincluem, mas não são limitados a, água, solução salina, óleos incluindo óleomineral, etanol, sulfóxido de dimetila, gelatina, ciclodextranas, estearato demagnésio, dextrose, celulose, açúcares, carbonato de cálcio, glicerol, alumi-na, amido, e veículos e diluentes equivalentes, ou misturas de qualquer umdestes. Formulações de um imunógeno da invenção podem também com-preender agentes de suspensão, protetores, lubrificantes, tampões, conser-vantes, e estabilizantes. Para prover a administração de tais dosagens parao tratamento terapêutico desejado, as composições farmacêuticas da inven-ção vantajosamente compreenderão entre cerca de 0,1 % e 45 %, e especi-almente, 1 e 15 % em peso do imunógeno ou imunógenos com base no pe-so da composição total incluindo veículo ou diluente.
A vacina e composições imunogênicas da invenção em questãopodem ser preparadas por procedimentos bem conhecidos na técnica. Porexemplo, a vacina ou imunógenos são tipicamente preparados como injetá-veis, por exemplo, soluções líquidas ou suspensões. A vacina ou imunóge-nos são administrados de uma maneira que sejam compatíveis com a formu-lação de dosagem, e em tal quantidade como será terapeuticamente eficaz eimunogênica no recipiente. As dosagens ótimas e padrões de administraçãopara uma vacina particular ou formulação de imunógenos podem ser deter-minadas facilmente por uma pessoa versada na técnica.
Peptídeos e/ou polipeptídeos da presente invenção podem tam-bém ser fornecidos na forma de um constructo de peptídeo antigênico múlti-pio (MAP). A preparação de construtos de MAP foi descrita em Tam (1988).Construtos de MAP utilizam uma matriz de núcleo de resíduos de Iisina so-bre os quais múltiplas cópias de um imunógeno são sintetizadas (Posnett etal., 1988). Construtos de MAP múltiplos, cada um contendo os mesmos imu-nógenos ou diferentes, podem ser preparados e administrados em umacomposição de vacina de acordo com os métodos da presente invenção. Emuma modalidade, um constructo de MAP é fornecido e/ou administrado comum ou mais adjuvantes. Polipeptídeos de influenza da invenção podem tam-bém ser produzidos e administrados como estruturas de proteína macromo-lecular compreendendo um ou mais polipeptídeos. Pedido de Patente Publi-cado U. S. US2005/0009008 descreve métodos para produzir partículas se-melhantes a vírus como uma vacina para vírus de influenza.
De acordo com os métodos da invenção em questão, a vacina ecomposições imunogênicas aqui descritas são administradas a hospedeirossuscetíveis, tipicamente canídeos, e mais tipicamente cães domesticados,de uma quantidade e maneira eficazes para induzir imunidade protetora con-tra desafio subseqüente ou infecção do hospedeiro pelo vírus. Em uma mo-dalidade, o animal hospedeiro é um canídeo. Caninos incluem caninos sel-vagens, de jardim zoológico, e domésticos, tais como lobos, coiotes, e rapo-sas. Caninos também incluem cães, particularmente cães domésticos, taiscomo, por exemplo, cães de companhia puros e/ou mestiços, cães de expo-sição, cães de trabalho, cães de matilha, cães de caça, cães de guarda,cães policiais, cães de corrida, e/ou cães de laboratório. Em uma modalida-de específica, o animal hospedeiro é um cão domesticado, tal como um gal-go. As vacinas ou imunógenos são tipicamente administrados parenteral-mente, através de injeção, por exemplo, ou subcutânea, intraperitoneal ouintramuscularmente. Outros modos adequados de administração incluemadministração oral ou nasal. Usualmente, as vacinas ou imunógenos sãoadministrados a um animal pelo menos duas vezes, com um intervalo deuma ou mais semanas entre cada administração. Porém, outros regimes sãocontemplados para as administrações iniciais e de reforço da vacina ou imu-nógenos, e podem depender do julgamento do médico e do animal hospe-deiro particular sendo tratado.
Vírus e células infectadas por vírus em uma formulação de vaci-na podem ser inativados ou atenuados usando métodos conhecidos na téc-nica. Por exemplo, vírus inteiro e células infectadas podem ser inativados ouatenuados mediante exposição a paraformaldeído, formalina, propiolactonabeta (BPL)1 bromoetilamina (ΒΕΑ), etilenimina binária (BEI), fenol, luz UV,temperatura elevada, congelamento - descongelamento, sonicação (incluin-do ultra-sonicação), e similares. A quantidade de vírus inteiro livre de célulaem uma dose de vacina pode ser na faixa de cerca de 0,1 mg a cerca de 5mg, e mais usualmente é de cerca de 0,2 mg a cerca de 2 mg. A dosagempara formulações de vacina que compreendem linhagens celulares infecta-das por vírus usualmente conterá de cerca de 106 a cerca deΊ08 células pordose, e mais usualmente de cerca de 5 χ 106 a cerca de 7,5 χ 107 células pordose. A quantidade de proteína ou imunógeno de peptídeo em uma dosepara um animal pode variar de cerca de 0,1 pg a 10000 pg, ou cerca de 1 pga 5000 pg, ou cerca de 10 pg a 1000 pg, ou cerca de 25 pg a 750 pg, oucerca de 50 pg a 500 pg, ou 100 pg a 250 pg, dependendo do tamanho, ida-de, etc., do animal recebendo a dose.
Uma composição imunogênica ou de vacina da invenção, talcomo vírus ou células infectadas por vírus ou proteínas ou peptídeos virais,pode ser combinada com um adjuvante, tipicamente só antes da administra-ção. Adjuvantes contemplados para o uso nas formulações de vacina inclu-em dipeptídeo de muramila de treonila (MDP) (Byars et al., 1987), saponina,Cornebacterium parvum, adjuvante completo de Freund e incompleto deFruend, alumínio, ou uma mistura de qualquer um destes. Uma variedade deoutros adjuvantes adequados para o uso com os métodos e vacinas da in-venção em questão, tais como alume, é bem conhecida na técnica e é con-templada para o uso com a invenção em questão.
Trata-se a invenção em questão também dos anticorpos queespecificamente ligam a uma proteína ou um peptídeo da presente invenção.Anticorpos da invenção em questão incluem composições de anticorpos mo-noclonais e policlonais. Preferivelmente, os anticorpos da invenção em ques-tão são anticorpos monoclonais. Anticorpos inteiros e fragmentos de ligaçãode antígenos dos mesmos são contemplados na presente invenção. Dessemodo, por exemplo, fragmentos de ligação de antígenos adequados incluemfragmentos de anticorpo de Fab2, Fab e Fv. Anticorpos da invenção podemser marcados com uma metade detectável, tais como uma molécula fluores-cente (por exemplo, fluoresceína ou uma enzima).
Trata-se a invenção em questão também dos métodos e com-posições para detecção e identificação de um vírus de influenza da invençãoe para diagnose de infecção de um animal com um vírus de influenza dapresente invenção. Os métodos da invenção incluem detecção da presençade influenza canina, èm uma amostra biológica de um animal. A detecção deinfluenza canina em uma amostra é útil para diagnosticar influenza caninaem um animal. Por sua vez, esta informação pode fornecer a habilidade paradeterminar a prognose de um animal com base nos níveis distintivos de in-fluenza canina presente com o passar do tempo, e pode ajudar na seleçãode agentes e tratamentos terapêuticos para o animal, e ajudar no monitora-mento da terapia. O método também fornece a habilidade para estabelecer aausência de influenza canina em um animal testado.
A habilidade para detectar influenza canina em um animal per-mite avaliação das epidemias de influenza canina em localizações geográfi-cas diferentes. Esta informação também permite detecção prematura deforma que os animais infectados possam ser isolados, limitar à expansão dadoença, e permite intervenção prematura para opções de tratamento. Alémdisso, tendo esta informação disponível pode prover direção ao pessoal mé-dico para preparar para tratar números grandes de animais doentes, incluin-do montagem de materiais médicos, e, se disponíveis, vacinas.
Em uma modalidade, um método da presente invenção envolvea coletânea de uma amostra biológica de um animal de teste, tal como umcanino. A amostra biológica pode ser qualquer material biológico, incluindo,células, tecido, cabelo, sangue total, soro, plasma, aspirado de mamilo, la-vagem pulmonar, fluido cérebro-espinhal, saliva, suor e lágrimas.
A amostra de teste animal pode vir de um animal suspeito de tervírus de influenza canina, se ou não o animal exibe sintomas da doença.Amostras de controle podem também ser fornecidas ou colhidas de animaisconhecidos estarem livres de influenza canina. Controles adicionais podemser fornecidos, por exemplo, para reduzir resultados falso-positivos e falso- negativos, e verificar quais os reagentes no ensaio são ativamente detecto-res de vírus de influenza canina A.
Além de detectar a presença ou ausência de influenza caninaem uma amostra biológica, os métodos de detecção usados na invençãopodem detectar mutações em vírus de influenza canina, tais como altera- ções na seqüência de ácido nucléico que podem ser o resultado do ambien-te, tratamento de fármaco, manipulações ou mutações genéticas, lesão, alte-ração na dieta, envelhecimento, ou qualquer/quaisquer outra(s) característi-ca(s) de um animal. Mutações podem também leva influenza canina A setornar resistente a um fármaco que era antigamente eficaz, ou permitir o ví- rus infectar e propagar-se em uma espécie diferente de animal, ou ser hu-mano. Por exemplo, vírus de influenza aviária A foi mostrado infectar outrosanimais e seres humanos.
Em uma modalidade para detectar um vírus de influenza em umanimal, diagnose é facilitada pela coletânea de espécimes de alta qualidade, seu transporte rápido para uma facilidade de testagem, e armazenamentoapropriado, antes da testagem em laboratório. O vírus é melhor detectadoem espécimes que contêm células infectadas e secreções. Em uma modali-dade, espécimes para a detecção direta de antígenos virais e/ou para ácidosnucléicos e/ou isolamento de vírus em culturas de célula são tiradas durante os 3 primeiros dias após o princípio dos sintomas clínicos. Vários tipos deespécimes são adequados para diagnosticar infecções de vírus do trato res-piratório superior, incluindo, mas não limitados a, esfregaço nasal, esfregaçonasofaríngeo, aspirado nasofaríngeo, lavagem nasal e esfregaços da gar-ganta. Além de esfregaços, amostras de tecido ou soro podem ser tiradas, e procedimentos invasivos podem também ser executados.
Em uma modalidade, espécimes respiratórios são colhidos etransportados em 1-5 ml de meios de transporte de vírus. Vários meios quesão satisfatórios para o restabelecimento de uma ampla variedade de vírusestão comercialmente disponíveis. Espécimes clínicos são adicionados aomeio de transporte. Esfregaços nasais ou nasofaríngeos podem também sertransportados para o meio de transporte de vírus. Um exemplo de um meiode transporte é 10 gm de caldo de infusão de carne de vitela e 2 gm de fra-ção de albumina bovina V, adicionados à água destilada estéril a 400 m. An-tibióticos tais como 0,8 ml de solução de sulfato de gentamicina (50 mg/ml) e3,2 ml de anfotericina B (250 pg/ml) podem também ser adicionados. O meioé preferivelmente esterilizado através de filtração. Lavagens nasais, tais co- mo solução salina estéril (0,85 % de NaCI), podem também ser usadas paracolher os espécimes de vírus respiratórios.
Em uma modalidade, os soros são colhidos em uma quantidadede 1-5 ml de sangue total de um animal de fase aguda, logo após o princípiodos sintomas clínicos, e preferivelmente não depois que 7 dias. Um espéci- me de soro de fase convalescente pode também ser colhido, por exemploem cerca de 14 dias após o princípio dos sintomas. Espécimes de soro po-dem ser úteis para detectar anticorpos contra vírus respiratórios em um testede neutralização.
Em algumas circunstâncias, as amostras podem ser colhidasdurante um certo tempo de animais individuais (por exemplo, uma vez aodia, uma vez por semana, uma vez por mês, bianual ou anualmente). Nume-rosas amostras podem ser usadas obtendo de um animal individual, duranteum certo tempo, para verificar os resultados de detecções mais prematuras,e/ou identificar resposta ou resistência a um tratamento específico, por e- xemplo, um fármaco terapêutico selecionado.
Os métodos da presente invenção podem ser usados para de-tectar a presença de um ou mais agentes patológicos em uma amostra deteste de um animal, e o nível de cada agente patológico. Qualquer métodopara detectar o agente patológico pode ser usado, incluindo, mas não limitadoa, ensaios de anticorpo incluindo ensaios imunoabsorventes ligados à enzima(ELISAs), testes de anticorpo fluorescente indiretos (IFA), hemaglutinação, eensaios de inibição de hemaglutinação (Hl), e análise de Western blot. Méto-dos de célula-cultura conhecidos podem também ser usados. Culturas posi-tivas podem ser também identificadas usando imunofluorescência de cultu-ras de célula ou ensaio de Hl do meio de cultura de célula (sobrenadante).
Além disso, os métodos para detectar ácido nucléico (DNA ouRNA) ou proteína podem ser usados. Tais métodos incluem, mas não sãolimitados a, reação em cadeia de polimerase (PCR)1 e testes de PCR detranscriptase reversa (RT) e testes de tempo real, e ensaios de proteção denuclease quantitativos. Há kits de teste comercialmente disponíveis paraexecutar estes ensaios. Por exemplo, QIAGEN (Valença, CA) vende um kitde RT-PCR de uma etapa, e kit de extração de RNA viral.
Em uma modalidade, o método utiliza um anticorpo específicopara um vírus ou proteína viral da invenção. Em uma modalidade específica,um anticorpo específico para uma proteína de HA de um vírus da invenção éutilizado. Em outra modalidade, um anticorpo específico para uma proteínade NP de um vírus da invenção é usado. Uma amostra adequada, tal comoda região nasal ou nasofaríngea, é obtida de um animal e vírus ou proteínaviral é dele isolada(o). Os componentes virais são depois triados para liga-ção de um anticorpo específico a uma proteína, tal como HA ou NP, de umvírus da invenção. Em outra modalidade, uma amostra de soro (ou outraamostra contendo anticorpo) é obtida de um animal e o soro triado para apresença de anticorpo que liga a uma proteína de um vírus da invenção. Porexemplo, um ensaio de ELISA pode ser executado onde as paredes de pla-ca têm proteína de HA e/ou de NP, ou um fragmento de peptídeo da mesma,ligado à parede. A parede de placa é depois contatada com soro ou anticor-po de um animal de teste. A presença de anticorpo no animal que especifi-camente liga à proteína de HA e/ou de NP é indicativa que o animal de testeé infectado ou foi infectado com um vírus de influenza da presente invenção.
Em uma modalidade, a presença de um agente patológico é de-tectada determinando a presença ou ausência de anticorpos contra o agen-te, em uma amostra biológica. Pode ocupar algum tempo (por exemplo, me-ses) após um animal seja infectado antes de pudessem ser detectados anti-corpos em um exame de sangue. Uma vez formados, os anticorpos usual-mente persistem por muitos anos, até mesmo após tratamento com sucessoda doença. Anticorpos encontrando para influenza canina UM pode não indi-car se a infecção era recente, ou algum dia no passado.
Teste de anticorpo pode também ser feito em fluido(s). Ensaiosde anticorpo incluem ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs),ensaios de anticorpo fluorescente indiretos (IFA), e análise de Western blot.Preferivelmente1 teste de anticorpo é feito usando ensaios múltiplos, por e-xemplo, ELISA ou IFA seguido por western blot. Os ensaios de anticorpopodem ser feitos em um processo de duas etapas, usando um ensaio deELISA ou IFA, seguido por um ensaio de western blot. ELISA é consideradoum ensaio mais seguro e preciso que IFA, mas IFA pode ser usado se ELI-SA não estiver disponível. O teste de western blot (que é um teste mais es-pecífico) pode também ser feito em todos os animais, particularmente aque-les que foram testados positivos ou positivos incertos (equívocos) em umensaio de ELISA ou de IFA.
Outros testes com base em anticorpo que podem ser usadospara detecção de vírus de influenza incluem ensaios de inibição de hemaglu-tinação. Atividade de hemaglutinação pode ser detectada em uma amostrabiológica de um animal, usando células sangüíneas vermelhas de galinha ouperu como descrito (Burleson et al., 1992 e Kendal et al., 1982). Em umamodalidade, uma influenza ou uma proteína de HA ou peptídeo da invençãoé contatado(a) com uma amostra de teste contendo soro ou anticorpo. Célu-las sangüíneas vermelhas (RBC) de um animal, tal como um pássaro, sãodepois adicionadas. Se o anticorpo para HA estiver presente, então as RBCnão se aglutinarão. Se o anticorpo para HA não estiver presente, as RBC seaglutinarão na presença de HA. Variações e modificações para ensaios deinibição de hemaglutinação padrão são conhecidas na técnica e contempla-das dentro do escopo da presente invenção.
Infecção de um animal pode também ser determinada por iso-lamento do vírus de uma amostra, tal como um esfregaço nasal ou nasofa-ríngeo. Isolamento viral pode ser executado usando métodos padrão, inclu-indo cultura de célula e inoculação de ovo.Em uma modalidade adicional, um ensaio com base em ácidonucléico pode ser usado para detecção de um vírus da presente invenção.Em uma modalidade, uma amostra de ácido nucléico é obtida de um animale o ácido nucléico submetidos à PCR usando iniciadores que gerarão umproduto de amplificação se o ácido nucléico contiver uma seqüência especí-fica para um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modalidadeespecífica, RT-PCR é usado em um ensaio para o vírus em questão. Emuma modalidade exemplificada, RT-PCR de tempo real é usado para ensaiarum vírus de influenza da invenção. Métodos de PCR, RT-PCR e de PCR detempo real são conhecidos na técnica e foram descritos nas Patentes U. S.N2s 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; 4.965.188; 5.994.056; 6.814.934; e emSaiki et al. (1985); Sambrook et al. (1989); Lee et al. (1993); e Livak et al.(1995). Em uma modalidade, o ensaio de PCR usa oligonucleotídeos especí-ficos para um gene Matriz (MA) e/ou gene HA de influenza. O produto deamplificação pode ser também seqüenciado para determinar se o produtotem uma seqüência de um vírus de influenza da presente invenção. Outrosensaios com base em ácido nucléico podem ser usados para detecção ediagnose de infecção viral por um vírus da invenção e tais ensaios são con-templados dentro do escopo da presente invenção. Em uma modalidade,uma amostra contendo um ácido nucléico é submetida a uma amplificaçãobaseada em PCR usando iniciadores diretos e reversos onde os iniciadoressão específicos para um polinucleotídeo viral ou seqüência de gene. Se oácido nucléico na amostra for RNA, então RT-PCR pode ser executada. Pa-ra PCR de tempo real, uma sonda detectável é utilizada com os iniciadores.
Conjuntos de iniciador específico para o gene de hemaglutinina(HA) de muitos dos vírus de influenza circulantes são conhecidos, e estãosendo desenvolvido continuamente. O genoma de vírus de influenza é RNAunifilamentar, e uma cópia de DNA (cDNA) deve ser feita usando uma poli-merase de transcriptase reversa (RT). A amplificação do genoma de RNA,por exemplo, usando RT-PCR, requer um par de iniciadores de oligonucleo-tídeo, tipicamente projetado em base da seqüência de HA conhecida de sub-tipos de influenza A e de neuraminidase (NM)-I. Os iniciadores podem serselecionados de modo que eles especificamente amplificarão o RNA de a-penas um subtipo de vírus. DNAs gerados usando iniciadores subtipo-específicos podem ser também analisados por técnicas genéticas molecula-res tais como seqüenciação. O teste é preferivelmente operado com um con-trole positivo, ou produtos são confirmados por seqüenciação e comparaçãocom seqüências conhecidas. A ausência dos produtos de PCR alvos (isto é,um resultado "negativo") pode não descartar a presença do vírus. Resultadospodem depois ser disponibilizados dentro de algumas horas de esfregaços clíni-cos ou culturas de células infectadas. Testes de PCR e RT-PCR para vírus deinfluenza A são descritos por Fouchier et al., 2000 e Maertzdorf et al., 2004.
Trata-se a invenção em questão também dos métodos para triarcompostos ou fármacos que têm atividade antiviral contra um vírus da pre-sente invenção. Em uma modalidade, células infectadas com um vírus dainvenção são contatadas com um composto de teste ou fármaco. A quanti-dade de vírus ou atividade viral seguindo o contato é depois determinada.Aqueles compostos ou fármacos que exibem atividade antiviral podem serselecionados para avaliação também.
Trata-se a invenção em questão também das células isoladasinfectadas com um vírus de influenza da presente invenção. Em uma modali-dade, a célula é uma célula canina, tal como células epiteliais renais caninas.
Trata-se a invenção em questão também das células transfor-madas com um polinucleotídeo da presente invenção que codifica um poli-peptídeo da invenção. Preferivelmente, a seqüência de polinucleotídeo éfornecida em um construto de expressão da invenção. Mais preferivelmente,o construto de expressão provê sobreexpressão na célula de um polinucleo-tídeo da invenção operavelmente ligado. Em uma modalidade, a célula étransformada com uma seqüência de polinucleotídeo compreendendo umaseqüência que codifica a seqüência de aminoácido mostrada em qualqueruma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ouum fragmento funcional ou variante das mesmas. Em uma modalidade es-pecífica, a célula é transformada com um polinucleotídeo que codifica a se-qüência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,68, 70, 72, 74, 76, ou 78 compreendem a seqüência de nucleotídeo mostra-da nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31,47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, respectiva-mente, ou uma seqüência que codifica um fragmento funcional ou variantede qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,76, ou 78. Desse modo, trata-se a invenção em questão das células trans-formadas com uma seqüência de polinucleotídeo que compreende a se-qüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3,5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59,61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou um fragmento ou variante, incluindouma variante degenerada, de qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9,11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63,65, 67, 69, 71, 73, 75, OU 77.
A célula transformada pode ser uma célula eucariótica, por e-xemplo, uma célula de planta, incluindo protoplastos, ou a célula transforma-da pode ser uma célula procariótica, por exemplo, uma célula bacteriana talcomo E. coli ou B. subtilis. Células animais incluem células humanas, célulasmamíferas, células parcialmente caninas, células aviárias, e células de inse-to. Células de planta incluem, mas não são limitadas a, células de dicotile-dônea, monocotiledônea, e de conífera.
Trata-se a invenção em questão também das plantas, incluindoplantas transgênicas que expressam e produzem uma proteína viral ou poli-peptídeo da presente invenção. Plantas, tecidos de planta, e células de plan-ta transformadas ou criadas para conter um polinucleotídeo da invenção sãocontemplados pela presente invenção. Preferivelmente, o polinucleotídeo dainvenção é sobre-expressado na planta, tecido de planta, ou célula de plan-ta. As plantas podem ser usadas para produzir composições de vacina deinfluenza da presente invenção e as vacinas podem ser administradas atra-vés do consumo da planta (vide, por exemplo, patentes U. S. N-s 5.484.719e 6.136.320).
Trata-se a invenção em questão também dos kits para detectarum vírus ou diagnosticar uma infecção por um vírus da presente invenção.Em uma modalidade, um kit compreende um anticorpo da invenção que es-pecificamente liga a um vírus de influenza da presente invenção, ou umaporção antigênica do mesmo. Em outra modalidade, um kit compreende umou mais polipeptídeos ou peptídeos da presente invenção. Em uma modali-dade específica, os polipeptídeos têm uma seqüência de aminoácido mos-trada em qualquer uma das SEQ ID N2s 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico ou variante dasmesmas. Em uma modalidade adicional, um kit compreende um ou mais po-linucleotídeos ou oligonucleotídeos da presente invenção. Em uma modali-dade específica, os polinucleotídeos têm uma seqüência de nucleotídeo
mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,
75, ou 77, ou um fragmento ou variante dos mesmos. Um kit pode opcional-mente compreender um ou mais anticorpo de controle, polipeptídeo ou pep-tídeo de controle, e/ou polinucleotídeo ou oligonucleotídeo de controle. Oanticorpo, polipeptídeos, peptídeos, polinucleotídeos, e/ou oligonucleotídeosdo kit podem ser fornecidos em um recipiente ou pacote adequado.
O pedido de patente em questão também refere-se ao uso decães mestiços como um modelo para infecção e patogênese do vírus de in-fluenza. Em uma modalidade, um cão mestiço é inoculado com um vírus deinfluenza, tal como um vírus de influenza canina da presente invenção. Op-cionalmente, o cão pode ser administrado com agentes terapêuticos subse-qüente à inoculação. O cão pode também ser administrado com uma com-posição para gerar uma resposta imune contra um vírus de influenza antesde inoculação com vírus. Tecido, sangue, soro, e outras amostras biológicaspodem ser obtidas antes e/ou após inoculação e examinadas pela presençade vírus e patogênese de tecido usando métodos conhecidos na técnica in-cluindo, mas não limitados a, PCR, RT-PCR, seqüenciação de ácido nucléi-co, e imuno-histoquímica.
Cepas de vírus de influenza canina (designados como "A/canine/Florida/43/2004" e "A/canine/Florida/242/2003") foram depositadas com Ame-rican Type Culture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, em9 de outubro de 2006. Cepas de vírus de influenza canina (designados como"canine/Jax/05" e "canine/Miami/05"), foram depositadas com American TypeCulture Collection (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, em 17 de ou-tubro de 2006. As cepas de vírus em questão foram depositadas sob condi-ções que asseguram que acesso às culturas estarão disponíveis durante apendência deste pedido de patente ao determinado pelo Commissioner ofPatents and Trademarks a ser intitulado a este sob 37 CFR 1.14 e 35 U.S.C.122. O depósito estará disponível como requerido pelas leis de patentes es-trangeiras em países nos quais as contrapartes do pedido de patente emquestão, ou sua progênie, forem depositados. Porém, deveria ser entendidoque a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticara invenção em questão em derrogação dos direitos de patente concedidospor ação governamental.
Também, os depósitos do vírus em questão serão armazenadose ficarão disponíveis ao público de acordo com as providências do Tratadode Budapeste para o Depósito de Microorganismos, isto é, serão armazena-dos com todo o cuidado necessário para mantê-lo viável e incontaminadodurante um período de pelo menos cinco anos após a mais recente solicita-ção para a provisão de uma amostra do depósito, e em todo caso, duranteum período de pelo menos trinta (30) anos após a data de depósito ou paraa vida exeqüível de qualquer patente que possa emitir a revelação da cultu-ra. O depositante reconhece o dever de substituir o depósito se o depósitonão prover uma amostra quando requerido, devido à condição do depósito.Todas as restrições na disponibilidade para o público do depósito de culturaem questão serão irrevogavelmente removidos na concessão de uma paten-te que a revela.
Tabela 57 ilustra as similaridades entre as seqüências de ami-noácido codificadas pelos genes de hemaglutinina (ou "HA"), neuraminidase(ou "NA"), e nucleoproteína (NP) do vírus de influenza canina identificadoscomo A/canine/Florida/43/2004 (Ca/Fla/43/04) com isolados de H3N8 eqüi-no, como também o isolado de canine/Florida/242/2003.
Qualquer elemento de qualquer modalidade revelada aqui podeser combinado com qualquer outro elemento ou modalidade revelada aqui etais combinações são especificamente contempladas dentro do escopo dapresente invenção.
Todas as patentes, pedidos de patente, pedidos provisórios, epublicações referidas ou citadas aqui são incorporadas por referência emsua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, desde que eles não se-jam incompatíveis com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 1-6COLETA DE SANGUE E DE ESFREGACO NASAL DE GALGOS.
Amostras de sangue agudas e convalescentes foram colhidasatravés de venipunctura jugular de galgos clinicamente doentes ou normais emcanis de corrida que experimentam epidemias de doença das vias respiratórias.Amostras convalescentes foram colhidas 4 a 12 semanas após a amostra agu-da. Soro foi colhido e armazenado a -809C. Esfregaços nasais foram colhidose colocados em meio de transporte de Amies com submissão pendente emcarvão (Becton Dickinson Biosciences) para isolamento bacteriano.
AUTÓPSIA DE GALGOS.
Autópsias completas foram executadas pelo Serviço de Patolo-gia Anatômico na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade daFlórida (UF CVM) em 5 dos 8 galgos que morreram pela epidemia de janeiro2004 em uma pista da Flórida. Autópsia de outro cão foi executada em umaclínica veterinária privada com submissão dos tecidos a UF CVM para diag-nose histopatológica. Tecidos foram fixados em 10 % de formalina tampona-da neutra, embebida em parafina, e seções de 5 μηι foram tingidas com he-matoxilina e eosina para diagnose histopatológica ou processadas para Imu-no-histoquímica como descrito abaixo. Tecidos não-fixados foram submeti-dos à cultura bacteriana e também armazenados a -80°C.TESTE SOROLOGICOS PARA PATOGENOS RESPIRATÓRIOS VIRAISCANINOS.
Amostras de soro agudas e convalescentes pareadas foramsubmetidas ao Laboratório de Diagnóstico de Saúde de Animais (AHDL) naFaculdade de Medicina Veterinária da Universitária de Cornell para ensaiosde neutralização de soro contra vírus de sinomose canina, adenovírus tipo 2,e vírus de parainfluenza. Titulações de anticorpo foram expressadas como aúltima diluição de soro que inibiu infecção viral das culturas de célula. Sero-conversão, definida como um aumento ^ que 4 vezes em titulação de anti-corpo entre a amostra aguda e convalescente, indicou infecção viral. Ne-nhuma seroconversão para estes patógenos virais foi detectada.TESTES MICROBIANOS PARA PATÓGENOS RESPIRATÓRIOS BACTE-RIANOS CANINOS.
Esfregaços nasais e tecidos pós-morte pareados foram subme-tidos ao Serviço de Diagnóstico Clínico de Microbiologia/Parasitologia/ Soro-Iogia na UF CVM para isolamento bacteriano e identificação. As amostrasforam cultivadas em meios não-seletivos como também meios seletivos paraespécies de Bordetella (Regan-Lowe; Remei) e espécies de Mycoplasma(Remei). Todas as culturas foram retidas durante 21 dias antes de relatarnenhum crescimento. Esfregaços nasais de alguns dos galgos foram tam-bém submetidos ao Departamento Diagnóstico de Medicina/Patobiologia naFaculdade de Medicina Veterinária da Universitária do Estado de Kansaspara cultura bacteriana. De 70 cães doentes clinicamente testados, Bordetel-la bronchiosseptica foi isolada da cavidade nasal de 1 cão, enquanto Myco-plasma spp. foi restabelecido da cavidade nasal de 33 cães. Pasteurella mul-tocida foi comumente restabelecido da cavidade nasal de cães com secre-ções nasais purulentas. Dois dos cães que morreram pela epidemia de janei-ro de 2004 tiveram crescimento escasso de Escherichia coli na autópsia dospulmões, um cão teve crescimento escasso de E. coli e Streptococcus canis, e o outro teve crescimento escasso de Pseudomonas aeruginosa e uma le-vedura. Nem Bordetella bronchiosseptica nem Mycoplasma foi isolado datraquéia ou pulmões de cães que morreram.ISOLAMENTO DE VIRUS DE TECIDOS POS-MORTE.
Tecidos congelados foram descongelados e homogeneizadosem 10 volumes de meio de essencial mínimo (MEM) suplementado com 0,5% de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos. Restos sólidos foramremovidos por centrifugação e os sobrenadantes foram inoculados sobrecélulas cultivadas ou em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade.Homogeneizados de tecido de galgos que morreram foram inoculados emculturas de célula diversas que suportaram a replicação de uma faixa vastade patógenos virais. As culturas de célula incluíram Vero (células epiteliaisde rim de macaco verde africano, ATCC N- CCL-81), A-72 (fibroblastos detumores caninos, CRL-1542), HRT-18 (células epiteliais retais humanas,CRL-11663), MDCK (células epiteliais renais caninas, CCL-34), células epi-teliais renais caninas primárias (AHDL, Universidade de Cornell), células epi-teliais pulmonares caninas primárias (AHDL), e células testiculares bovinas primárias (AHDL). Células de MDCK e de HRT foram cultivadas em MEMsuplementado com 2,5 ug/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma); as li-nhagens celulares restantes foram cultivadas em MEM suplementado com10 % de soro de bezerro fetal e antibióticos. Células foram crescidas emfrascos de 25 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. Uma cultura de controle foi inoculada com o MEM suplementado. Asculturas foram observadas diariamente quanto às alterações morfológicas eforam colhidas em 5 dias pós-inoculação. Os fluidos e células colhidos foramclarificados através de centrifugação e inoculados sobre células frescas co-mo descrito para a inoculação inicial; duas passagens cegas foram executa- das. Atividade de hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foi deter-minada usando células sangüíneas vermelhas de galinha ou peru como des-crito (Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982). Para isolamento do vírus emembriões de galinha, 0,1 ml de homogeneizado de tecido foi inoculado nosaco alantóico e incubado durante 48 horas a 35°C. Duas passagens cegas na atividade de hemaglutinação nos fluidos alantóicos foram determinadascomo descrito (Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982).RT-PCR, SEQÜENCIAÇÂO DE NUCLEOTÍDEO, E ANALISES FILOGENE-TICAS.
RNA total foi extraído de sobrenadante de cultura de tecido oufluido alantóico usando o kit de RNeasy (Qiagen, Valença, CA) de acordocom as instruções do fabricante. O RNA total (10 ng) foi transcrito reversopara cDNA usando um kit de RT-PCR de uma etapa (Qiagen, Valença, CA)de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCR da regiãode codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previamente exe-cutada como descrito (Klimov et al., 1992a), usando conjuntos de iniciadorgene-específico universais. Os amplicons de DNA resultante foram usadoscomo modelos para seqüenciação automatizada em um seqüenciador deDNA automatizado de Applied Biosystems 3100 usando química de termina-dor de tintura de seqüenciação em ciclo (ABI). As seqüências de nucleotídeoforam analisadas usando GCG Package©, Versão 10.0 (AcceIyrs) (Womble,2000). O Phylogeny Inference Package© Versão 3.5 foi usado para estimaras filogenias e calcular os valores de autocarregador das seqüências de nu-cleotídeo (Felsenstein, 1989). Árvores filogenéticas foram comparadas àsgeradas mediante análise de junção de vizinhos com o modelo Tamura-Neigama implementado no programa de MEGA© (Kumar et al., 2004) e confir-mado pelo programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauér Associates).INOCULACÃO EXPERIMENTAL DOS CÃES.
Quatro Bigles livres de patógenos específicos de 6 meses deidade [(2 machos e 2 fêmeas (Liberty Research)] foram usados. Exame físi-co e exames de sangue de linha base incluindo contagem/diferencial de cé-lula sangüínea completo, painel de química de soro, e urinálise determina-ram quais animais eram saudáveis. Eles foram alojados juntos em uma ins-talação de BSL 2-reforçada credenciada pela Associação para Avaliação eCredenciamento de Cuidado de Animal de Laboratório. Temperaturas retaisde linha base foram registradas duas vezes diariamente durante 7 dias. Oscães foram anestesiados por injeção intravenosa de propofol (Diprivan®,Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg do peso do corpo para efeito) para intu-bação com tubos endotraqueanos. Cada cão foi inoculado com uma dosetotal de 10^6,6 doses infecciosas de cultura de tecido mediana (TCID50) devírus de A/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) (H3N8) com metade dadose administrada na traquéia distai através do tubo endotraqueano e a ou-tra metade administrada na passagem nasal profunda através de um cateter.Exames físicos e registros de temperatura retal foram executados duas ve-zes diariamente durante 14 dias pós-inoculação (p.i.)· Amostras de sangue(4 ml) foram colhidas através de venipunctura jugular nos dias 0, 3, 5, 7, 10,e 14 p.i. Espécimes nasais e orofaríngeos foram colhidos com esfregaços depoliéster (Fisher Scientific) de cada cão nos dias 0 a 5, 7, 10, e 14 p.i. Osesfregaços foram colocados em meio de transporte viral (Remei) e armaze-nados a -809C. Dois cães (1 macho e 1 fêmea) foram eutanizados por inocu-lação intravenosa de solução de Beuthanasia-D® (1 mU5 kg do peso docorpo; Schering-Plough Animal Health Corp) no dia 5 p.i. e os 2 cães restan-tes no dia 14 para autópsia. Tecidos para análise histológica foram proces-sados como descrito. Tecidos para cultura de vírus foram armazenados a -80°C. Este estudo foi aprovado pelo University of Florida Institutional AnimalCare and Use Committee.
PROPAGAÇÃO^DO VÍRUS DE CÃES EXPERIMENTALMENTE INOCULADOS.
Diluições seriais de homogeneizados pulmonares e extratos deesfregaço, preparadas por clarificação dos meios de transporte de esfregaçoatravés de centrifugação, foram fixadas em MEM suplementado com 0,5 %de BSA e antibióticos. Ensaios de placa foram executados como descrito(Burleson et al., 1992) usando monocamadas de células de MDCK em pla-cas de cultura de tecido de 6 cavidades. Monocamadas de células inocula-das foram revestidas com MEM suplementado contendo 0,8 % de agarose e1,5 ug/mL de TPCK-tripsina. Células foram cultivadas durante 72 horas a37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2 antes da fixaçãoe fingimento com violeta cristal. Concentração do vírus foi expressada comounidades de formação de placa (PFU) por grama de tecido ou por esfregaço.
IMUNO-HISTOQUÍMICA.
Seções de tecido pulmonar de 5 μm desparafinizadas e reidra-tadas dos galgos e bigles foram montadas em lâminas de Bond-Rite® (Ri-chard-AIlan Scientific, Kalamazoo, Ml) e subseqüentemente tratadas comproteinase K (DakoCytomation, Carpenteria, CA) seguido por reagente debloqueio de peroxidase (Kit de Dako® EnVision® Peroxidase, Dako Corp.).As seções foram incubadas com diluições de 1:500 de anticorpos monoclo-nais para vírus de sinomose canina (VMRD, Inc.), adenovírus canino tipo 2(VMRD, Inc.), vírus de parainfluenza canina (VMRD, Inc.), ou H3 de influen-za A (Chemicon International, Inc.) durante 2 horas em temperatura ambien-te. Controles incluíram incubação das mesmas seções com IgG de camun-dongo (1 mg/ml, Serotec1 Inc.), e incubação dos anticorpos monoclonais comseções pulmonares caninas normais. Seguindo tratamento com os anticor-pos primários, as seções foram incubadas com imunoperoxidase secundáriae reagentes de substrato de peroxidase (Kit de Dako® EnVision® Peroxida-se, Dako Corp.) de acordo com as instruções do fabricante. As seções foramcontratingidas com hematoxilina, tratadas com Clarificador #2 e Reagente deAnil (Richard-AIlan Scientific, Kalamazoo, Ml), desidratadas, e lâminas decobertura aplicadas com Permount (ProSciTech).
ENSAIO DEJNIBICÂO DE HEMAGLUTINAÇÃO (Hl).
Amostras de soro foram incubadas com enzima destruidora dereceptor (RDE, Denka) (1 parte de soro: 3 partes de RDE) durante 16 horasa 37-C antes da inativação a calor durante 60 minutos a 56QC. Vírus de in-fluenza A/Canine/FL/04 (H3N8) foi crescido em células de MDCK por 36-48h a 379C. Os sobrenadantes de cultura de vírus foram colhidos, clarificadosatravés de centrifugação, e armazenados a -80QC. O ensaio de Hl foi execu-tado como previamente descrito (Kendal et al., 1982). Brevemente, 4 unida-des de hemaglutinação de vírus foram adicionadas em 25 μΙ a um volumeigual de soro serialmente diluído em cavidades de microtitulação e incuba-dos em temperatura ambiente durante 30 minutos. Um volume igual de 0,5% v/v de eritrócitos de peru foi adicionado e as titulações de hemaglutinaçãoforam estimadas visualmente após 30 minutos. A titulação de Hl de pontoterminal foi definida como a última diluição de soro que completamente inibiua hemaglutinação. Seroconversão foi definida como o aumento 2: 4 vezes natitulação de Hl entre amostras agudas e convalescentes pareadas. Soroposi-ENSAIO DE MICRONEUTRALIZAÇÃO (MN).
Respostas de anticorpo de soro neutralizante para A/Canine/FL/04(H3N8) foram detectadas por um ensaio de MN como previamente descrito(Rowe et al., 1999) exceto que os soros caninos foram tratados com RDEcomo descrito acima antes do ensaio. A titulação de ponto terminal foi defi-nida como a diluição mais alta de soro que deu 50 % de neutralização de100 TCID50 de vírus. Seroconversão foi definida como aumento ^ 4 vezesem titulação de MN entre as amostras agudas e convalescentes pareadas.Soropositividade de uma amostra simples foi definida como uma titulação deMN > 1:80.
A seguir são exemplos que ilustram os procedimentos para pra-ticar a invenção. Estes exemplos não deveriam ser interpretados como Iimi-tativos. Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mis-tura de solvente são em volume a menos que do contrário observado.EXEMPLO 1
o Em janeiro de 2004, uma epidemia de doença das vias respira-tórias ocorreu em 22 galgos de corrida alojados em 2 canis em uma pista deFlórida e a fazenda local forneceu os cães estes canis. Havia cerca de 60cães em cada instalação do canil e 300 cães na fazenda. A epidemia ocor-reu em um período de 6 dias após o qual nenhum caso novo foi identificado.Quatorze dos 22 cães tiveram febres de 39,5 a 41,59C, uma tosse suave deentalos durante 10 a 14 dias, e restabelecimento eventual. Dos 8 cães res-tantes, 6 cães aparentemente saudáveis morreram inesperadamente comhemorragia da boca e nariz. Dois outros cães foram eutanizados dentro dehoras do princípio da hemorragia da boca e nariz devido à deterioraçãorápida. Ambos destes cães tiveram febres de 419C. Quatro das 8 mortes o-correram nas instalações de canil e 4 ocorreram na fazenda. Cinqüenta porcento das mortes ocorreram no dia 3 da epidemia. Os 22 cães variaram emidade de 17 meses a 4 anos, mas 73% tinham 17 a 33 meses de idade.
Duas síndromes clínicas foram evidentes: uma enfermidademais moderada caracterizada por febre inicial e depois tosse durante 10-14dias (14 cães) com restabelecimento subseqüente, ou uma morte peragudaassociada à hemorragia no trato respiratório (8 cães para uma taxa de mor-talidade de 36 %). Autópsias foram executadas em 6 dos 8 casos fatais. To- dos os cães tiveram hemorragia extensiva nos pulmões, mediastino, e cavi-dade pleural. Exame histológico do trato respiratório revelou que além dahemorragia pulmonar, todos os cães tiveram traqueíte, bronquite, bronquioli-te, e broncopneumonia supurativa (Figura 3). O forro epitelial e Iumens davia aérea nestes tecidos foram infiltrados por neutrófilos e macrófagos. Ho-mogeneizados pulmonares preparados destes cães foram inoculados emuma variedade de linhagens celulares de macaco, humanas, bovinas, e ca-ninas por cultura de vírus. O homogeneizado pulmonar de um cão causouefeitos citopáticos nas células epiteliais de rim canino de Madin-Darby(MDCK) cultivadas na presença de tripsina, e nas células sangüíneas verme- lhas de galinha aglutinadas de sobrenadante da cultura de células. Evidênciapreliminar de um tipo de vírus de influenza A foi provido por um ELISA co-mercial para detecção da nucleoproteína de vírus de influenza AeB, e poranálise de PCR usando iniciadores específicos para o gene Matriz do vírusde influenza A. Além disso, a atividade de hemaglutinação foi inibida por an- ti-soros de referência para influenza A eqüina subtipo H3, mas não atravésde anti-soros específicos para influenza A humana subtipos H1-H11 e H13(Tabela 3). Para caracterizar as propriedades moleculares do vírus, determi-naram-se as seqüências de nucleotídeo dos 8 segmentos de RNA do geno-ma viral. Comparações de seqüência com genes de vírus de influenza co- nhecidos e análises filogenéticas indicaram que os 8 genes do isolado cani-no eram muito similares àqueles do vírus de influenza A eqüina contemporâ-nea (H3N8), com o qual eles compartilharam > 96-97 % de identidade deseqüência (Figura 1A, Tabela 4). Em contraste, os genes representativos deisolado de influenza A aviário, suína, e humana tiveram > 94 % de identidade que o isolado canino (Tabela 4). Estes dados identificados o isolado caninoA/Canine/Florida/43/2004 (Canine/FL/04) como uma vírus de H3N8 de influ-enza A estritamente relacionado às linhagens contemporâneas do vírus deinfluenza eqüina. Considerando que todos os genes do isolado canino eramde origem do vírus de influenza eqüina, concluíram-se que o genoma inteirode um vírus de influenza eqüina tinha sido transmitido ao cão.EXEMPLO 2
Para investigar o papel do vírus de Canine/FL/04 nas observa-ções clínicas e patológicas nos galgos, executaram-se tingimento imuno-histoquímico (IHC) em tecidos pulmonares usando um anticorpo monoclonalpara H3 de influenza A. Antígeno de H3 viral foi detectado consistentementeno citoplasma de células epiteliais bronquiais e bronquiolares, células epite-liais da glândula bronquial, e macrófagos em Iumens da via aérea e espaçosalveolares (Figura 2A). Estes dados suportam uma diagnose de infecçãopulmonar com vírus de influenza do subtipo H3 em múltiplos cães.EXEMPLO 3
Para determinar o envolvimento de um vírus semelhante a Ca-nine/FL/04 na etiologia da epidemia de doença das vias respiratórias, anali-saram-se soros agudos e convalescentes pareados de 11 cães doentes e 16contatos assintomáticos por inibição de hemaglutinação (HI) e microneutrali-zaçãò (MN). Seroconversão, definida como uma elevação de £ 4 vezes natitulação de anticorpo para Canine/FL/04 da fase aguda a convalescente,ocorreu em 8 de 11 (73 %) cães doentes em ambos os ensaios (Tabela 1).Seroconversão ocorreu em 6 de 16 (38 %) contatos assintomáticos no en-saio de Hl, enquanto 8 de 16 (50 %) soroconvertidos no ensaio de MN (Ta-bela 1). Os dados de seroconversão demonstraram infecção dos cães comum vírus semelhante a Canine/FL/04 que coincidiu temporalmente com oprincípio da doença das vias respiratórias na maioria dos animais.
As amostras de soro simples foram colhidas 3 meses após aepidemia de uns 46 cães assintomáticos adicionais alojados com os cãesdoentes. Destes, 43 (93 %) eram soropositivos em ambos os ensaios. Paraa população total de 73 cães testados, 93 % eram soropositivos em ambosos ensaios, incluindo 82 % (9/11) dos cães doentes e 95 % (59/62) dos conta-tos saudáveis. A soroprevalência alta em cães sem história da doença das viasrespiratórias indica que a maioria das infecções com vírus de influenza canina ésubclínica e sugere expansão eficiente do vírus entre os cães. Não é conhecidose as infecções subclínicas contribuíram para a expansão do vírus.
EXEMPLO 4
Para melhor entender a capacidade do vírus de Canine/FL/04para infectar cães, quatro bigles de 6 meses de idade criados para o propó-sito foram cada um inoculados com 106,6 doses infecciosas de cultura detecido mediana (TCID50) pelas vias intratraqueana e intranasal. Todos oscães desenvolveram uma febre (> 39°C de temperatura retal) para os 2 pri-meiros dias pós-inoculação (p.i.), mas nenhum exibiu sintomas respiratóriostais como tosse ou secreção nasal em um período de observação de 14 di-as. Eliminação de vírus foi examinada por quantificação de vírus em esfre-gaços nasais e orofaríngeos. Apenas 2 dos 4 cães propagaram quantidadesdetectáveis de vírus. Um cão propagou vírus nos dias 1 e 2 p.i. (1,0-2,5 Iogi0PFU por esfregaço), enquanto que o outro cão propagou vírus durante 4 diassucessivos após inoculação (1,4-4,5 Iogi0 PFU por esfregaço). Autópsia de 2cães no dia 5 p.i. revelou traqueíte necrotizante e hiperplástica, bronquite, ebronquiolite similares às encontradas na doença espontânea em galgos,mas não houve nenhuma hemorragia pulmonar ou broncopneumonia. Anti-geno de H3 viral foi detectado no citoplasma de células epiteliais dos brôn-quios, bronquíolos, e glândulas bronquiais por IHC (Figura 2B). Vírus infec-ciosos restabeleceram-se do tecido pulmonar de um dos cães. Autópsia dos2 cães restantes no dia 14 p.i. mostrou alterações histológicas mínimas nostecidos respiratórios, nenhum antígeno de H3 viral por IHC1 e nenhum resta-belecimento do vírus dos homogeneizados pulmonares. Seroconversão nes-tes 2 últimos cães foi detectada em ensaios de MN pelo dia 7 p.i., com umaumento adicional de 2-3 vezes nas titulações de anticorpo pelo dia 14. Es-tes resultados estabeleceram a suscetibilidade dos cães à infecção com Ca-nine/FL/04, como comprovado pela resposta febril, presença de antígenoviral e vírus infeccioso no parenquima pulmonar, achados histopatológicostípicos para influenza, e seroconversão. A insuficiência para reproduzir do-ença severa e morte nos bigles experimentalmente inoculados não é surpre-endente uma vez que uma proporção grande dos galgos naturalmente infec-tados foi assintomática.
EXEMPLO 5
Para investigar se um vírus semelhante a Canine/FL/04 de influ-enza circulou entre populações de galgo na Flórida antes da epidemia dejaneiro de 2004, soros arquivais de 65 galgos de corrida foram testados paraa presença de anticorpos para Canine/FL/04 usando os ensaios de Hl e deMN. Não houve nenhum anticorpo detectável em 33 cães amostrados de1996 a 1999. De 32 cães amostrados entre 2000 e 2003, 9 eram soropositi-vos em ambos os ensaios - 1 em 2000, 2 em 2002, e 6 em 2003 (Tabela 5).Os cães soropositivos estavam localizados em pistas de Flórida envolvidasem epidemias de doença das vias respiratórias de etiologia desconhecida de1999 a 2003, sugerindo que um vírus semelhante a Canine/FL/04 pudesseter sido o agente causativo daquelas epidemias. Para investigar esta outrapossibilidade, examinaram-se os tecidos arquivais de galgos que morreramde broncopneumonia hemorrágica em março de 2003. Homogeneizadospulmonares inoculados em células de MDCK e embriões de galinha de um cãorenderam vírus de influenza de H3N8, denominado A/Canine/Florida/242/2003(Canine/FL/03). Análise da seqüência do genoma completo de Canine/FL/03revelou > 99 % de identidade a Canine/FL/04 (Tabela 4), indicando que vírussemelhante a Canine/FL/04 tinha infectado galgos antes de 2004.
EXEMPLO 6
De junho a agosto de 2004, as epidemias de doença das viasrespiratórias ocorreram em milhares de galgos de corrida em 14 pistas naFlórida, Texas, Alabama, Arkansas, West Virgínia, e Kansas.
Funcionários em algumas destas pistas estimaram que pelomenos 80 % de sua população de cães tiveram doença clínica. A maioriados cães teve sinais clínicos de febre (£ 39QC) e tosse similar aos cães pelaepidemia de janeiro de 2004, mas muitos cães também tiveram uma secre-ção nasal mucopurulenta. Mortes múltiplas foram relatadas mas uma taxa demortalidade precisa não pôde ser determinada.
Coletaram-se soros agudos e convalescentes pareados de 94cães localizados em 4 pistas da Flórida: 56 % destes cães tiveram aumentode ≥ 4 vezes nas titulações de anticorpo para Canine/FL/04, e 100 % eramsoropositivos (Tabela 6). Soros convalescentes de 29 cães em West Virgíniae Kansas também tiveram anticorpos para Canine/FL/04. Isolou-se vírus deinfluenza A (H3N8) dos pulmões de um galgo que morreu de broncopneu-monia hemorrágica em uma pista no Texas. Análise de seqüência do genomainteiro deste isolado, denominado A/Canine/Texas/1/2004 (Canine/TX/04), reve-lou ^ 99 % de identidade a Canine/FU04 (Tabela 4). O isolamento de trêsvírus de influenza estritamente relacionados de casos caninos fatais em umperíodo de 13 meses e de localizações geográficas diferentes, junto com aevidência sorológica substancial de infecção difundida entre galgos de corri-da, sugeriu circulação contínua de um vírus semelhante a Canine/FL/04 napopulação de cães.
Análise filogenética dos genes de HA de Canine/FL/03, Cani-ne/FL/04, e Canine/TX/04 mostrou que eles constituem um grupo monofiléti-co com suporte autopromotor robusto que foi claramente distinto dos genesde H3 contemporâneos de vírus eqüinos isolados em 2002 e 2003 (Figura1B). Análise filogenética e comparações de seqüência de nucleotídeo pare-adas dos outros 7 segmentos genômicos suportaram a segregação dos ge-nes caninos estritamente relacionados como uma sublinhagem distinta àlinhagem de vírus eqüino (dados não mostrados, e Tabela 4). O agrupamen-to dos genes de influenza canina como um grupo monofilético separado dainfluenza eqüina é também suportado pela presença de 4 alterações de ami-noácido de assinatura no HA (Tabela 2). Junto com os resultados sorológi-cos de 2003 e 2004, estes dados são consistentes com um evento detransmissão de vírus simples de cavalos para cães com expansão horizontalsubseqüente do vírus na população de galgo. Porém, introduções repetidasdesta única linhagem de vírus de influenza de uma espécie de reservatório nãoidentificada não pode ser excluída formalmente, improvável como pode ser.
O HA viral é um determinante crítico da especificidade de espé-cie hospedeira do vírus de influenza (Suzuki et al., 2000). Para identificarresíduos dentro de HA que pode estar associado à adaptação ao hospedeirocanino, comparou-se a seqüência de aminoácido deduzida de HAs caninosàquelas de vírus eqüinos contemporâneos. Quatro alterações de Diferençasde aminoácido as seqüências de aminoácido de consenso de HA maduraseqüinas e caninas: N83S, W222L, I328T, e N483T (vide Tabela 2). Os víruscaninos têm uma deleção de aminoácido quando comparados às seqüênciaseqüinas de consenso. Portanto, a posição de aminoácido 7 na seqüênciaeqüina de HA é a posição 6 na seqüência canina de HA, posição de aminoá-cido 29 na seqüência eqüina de HA é a posição 28 na seqüência canina deHA, posição de aminoácido 83 na seqüência eqüina de HA é a posição 82na seqüência canina de HA, etc. Desse modo, os quatro aminoácidos substi-tuídos estão na posição 82, 221, 327, e 482 da seqüência de aminoácidomostrada na SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 34. A substituição de serina porasparagina na posição de seqüência de consenso 83 é uma alteração designificação funcional desconhecida uma vez que vários resíduos polaressão encontrados nas moléculas de H3 de outras espécies. A isoleucina estri-tamente conservada na posição de seqüência de consenso 328 próxima dosítio de clivagem do HA de H3 foi substituída por treonina. O papel pivotanteda clivagem de HA por proteases hospedeiras em patogênese sugere queesta alteração merece estudo adicional. A substituição de Ieucina por tripto-fano na posição de seqüência de consenso 222 é bastante notável porquerepresenta uma alteração não-conservadora adjacente para a cavidade deligação do ácido siálico que poderia modular a função do receptor (Weis etal., 1988). De forma interessante, Ieucina na posição 222 não é única paraHA de H3 canino uma vez que é tipicamente encontrada nos subtipos de HAH4, H8, H9, e H12 (Nobusawa et al., 1991; Kovacova et al., 2002). A substi-tuição de Ieucina pode ser mais compatível com especificidade de vírus parahospedeiros mamíferos uma vez que infecções de suínos com subtipo H4(Karasin et al., 2000) e seres humanos e suínos com vírus de subtipo H9(Peiris et al., 1999) foram relatadas. A substituição de asparagina com treo-nina na posição de seqüência de consenso 483 resultou na perda de umsítio de glicosilação na subunidade de HA2 que é conservada em todos ossubtipos de HA (Wagner et al., 2002). Embora a importância destas altera-ções de aminoácido no HA para adaptação de um vírus eqüino para cãespermaneça a ser determinada, alterações de aminoácido similares foramobservadas previamente em associação com transferência de interespécies(Videiras et al., 1998; Matrosovich et al., 2000). Diferenças de aminoácidoentre outras proteínas virais de influenza da invenção e seqüência de con-senso eqüina são mostradas na Tabelas 19 a 25.
A fonte do vírus de influenza eqüina que inicialmente infectou osgalgos de corrida permanece especulativa. Canis em pistas de corridas degalgo não ficam localizados próximos de cavalos ou pistas de corridas decavalos, sugerindo que o contato entre galgos e cavalos propagadores nãoseja uma explanação suficiente para as múltiplas epidemias em estados di-ferentes em 2004. Uma fonte potencial de exposição ao vírus eqüino é a a-limentação de carne de cavalo para galgos, cuja dieta é suplementada comcarne bruta provida pelas casas de empacotamento que confere carcaças,incluindo cavalos que poderiam portar influenza. Precedentes para este mo-do de infecção incluem relatórios de transmissão interespécies de vírus deinfluenza aviário de H5N1 para porcos e felídeos de jardim zoológico alimen-tados com carcaças de galinha infectadas (Webster, 1998; Keawcharoen et.al., 2004; Kuiken et al., 2004). Embora esta seja uma via plausível para aintrodução inicial de influenza eqüina em cães, não explica as recentes epi-demias de influenza múltiplas em milhares de cães em estados diferentes. Oestudo de inoculação experimental demonstrou a presença de vírus naspassagens nasais e orofaringe de cães, embora em titulações modestas.Não obstante, estes resultados indicam que propagação é possível, e que atransmissão de cão-para-cão do vírus através de aerossóis de gotículagrandes, fomitas, ou contato mucoso direto poderia representa um papel naepizootiologia da doença.
A transferência interespécies de um vírus de influenza mamíferointeiro para uma espécie mamífera não relacionada é um evento raro. Estu-dos anteriores forneceram evidência sorológica ou virológica limitada, masnão ambos, de infecção transiente de cães com vírus de influenza humana A(H3N2) (Nikitin et al., 1972, Kilbourne, et al., 1975; Chang et al., 1976; Hou-ser et. al., 1980). Porém, não houve nenhuma evidência de circulação contínuano hospedeiro canino. Embora transferência direta do vírus de influenza suínode porcos para pessoas esteja bem documentada (Dacso et al., 1984; Kimuraet al., 1998; Patriarca et al., 1984; Top et al., 1977), não há nenhuma evidênciapara adaptação dos vírus suínos em hospedeiros humanos. Neste relatório,forneceram-se evidência virológica, sorológica e molecular para transmissãointerespécies de um vírus de influenza A eqüina inteiro (H3N8) para outras es-pécies mamíferas, o cão. Substituições únicas de aminoácido no vírus caninoHA, acopladas com confirmação sorológica de infecção de cães em múltiplosestados nos EUA, sugerem adaptação do vírus ao hospedeiro canino. Uma vezque cães são um animal de companhia primário para seres humanos, estesachados têm implicações com a saúde pública; cães podem prover uma fon-te nova para transmissão de vírus de influenza A nova para seres humanos.
TABELA 1. Resposta de anticorpo para A/Canine/-florida/43/2004 (H3N8).
<table>table see original document page 71</column></row><table>
a vários cães com sinais clínicos da doença.
b Número de cães assintomáticos alojados em contato com cães clinicamen-te doentes.
c Ensaio de inibição de hemaglutinação (HI) usando vírus de A/Canine/ Flori-da/43/2004.
d Ensaio de microneutralização (MN) usando vírus de A/Canine/Florida/43/ 2004.
e Porcentagem de cães com pelo menos um aumento de 4 vezes na titula-ção de anticorpo em soros agudos e convalescentes pareados.
f Porcentagem de cães com uma titulação de anticorpo positiva (titulação deHl > 32: titulação de MN £ 80) nos soros convalescentes.
Titulação de anticorpo de média geométrica para os soros convalescentes.TABELA 2. Diferenças de aminoácido entre as hemaglutininas de H3 caninas e eqüinas.
<table>table see original document page 72</column></row><table>
* Resíduo de aminoácido (código de letra minúscula) e posição no HA de H3maduro. O código de aminoácido é: A = alanina, D = ácido aspártico, G =glicina, I = isoleucina, K = lisina, L = leucina, M = metionina, N = asparagina,R = arginina, S = serina, T = treonina, V = valina, W = triptofano.
Denota nenhuma alteração dos HAs de H3 eqüino de consensos.
TABELA 3. Inibição de Hemaglutinação de um isolado viral por anti-soros de referência para subtipos de HA diferentes.
<table>table see original document page 73</column></row><table>
a Titulação de inibição de hemaglutinação para isolado viral de cão #43.
b Anti-soros policlonais que foram produzidos em furões, enquanto que todosos outros anti-soros foram produzidos em ovelhas ou cabras.<table>table see original document page 74</column></row><table>Tabela 4
<table>table see original document page 75</column></row><table>TABELA 5. Titulações de anticorpo para A/canine/Florida/43/2004 (H3N8) em soro de galgo colhido de 1996 a 2003. <table>table see original document page 76</column></row><table>
O ano de coleta da amostra de soro de galgos de corrida na Flórida.Titulações de anticorpo de ensaio de microneutralização para cães soropo-sitivos, incluindo a faixa para os seis cães de soropositivos de 2003.
TABELA 6. Resposta de anticorpo para A/canine/Florida/43/2004 (H3N8) em galgos de corrida em 4 pistas da Flórida em junho de 2004.
<table>table see original document page 76</column></row><table>
a Vários cães clinicamente doentes testados por Hl usando A/canine/ Flori-da/43/2004 (H3N8).
b Porcentagem de cães com aumento £ 4 vezes na titulação de anticorpoentre soros agudos e convalescentes.
c Porcentagem de cães com uma titulação de anticorpo positivo (titulação de
Hl > 16) nos soros convalescentes.
d Titulação de anticorpo de média geométrica para os soros convalescentes.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA OS EXEMPLOS 7-11
Tecidos Caninos
Autópsias foram executadas pelo Serviço de Patologia Anatômi-co na Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade da Flórida em 6cães de raça mista que morreram em abril/maio de 2005 durante uma epi-demia de influenza em uma instalação de abrigo no nordeste da Flórida, eem um animal de estimação Yorkshire Terrier que morreu em maio de 2005durante uma epidemia de influenza em uma clínica veterinária no sudeste daFlórida. Tecidos foram fixados em 10 % de formalina tamponada neutro,embebidos em parafina, e seções de 5 μιτι foram tingidas com hematoxilinae eosina para diagnose histopatológica. Tecidos não-fixados foram armaze-nados em análises virológicas pendentes a -80QC.
EXTRAÇÃO DE RNA DE AMOSTRAS DE TECIDO CANINAS
Tecidos pulmonares congelados de cada um de os 7 cães foramdescongelados e homogeneizados em meio de essencial mínimo (MEM) su-plementado com 0,5 % albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos (gen-tamicina e ciprofloxacina) usando moedor de tecido descartável (Kendall,Lifeline Medicai Inc., Danbury, CT). RNA total foi extraído usando um kit co-mercial (Kit de RNeasy® Mini, QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com asinstruções do fabricante e eluído em um volume final de 60 μΙ de tampão.RNA total foi também extraído de tecido pulmonar colhido de cães sem do-ença das vias respiratórias.RT-PCR DE TEMPO REAL
Uma RT-PCR de tempo real quantitativa de uma etapa foi exe-cutada em RNA total extraído das amostras de tecido caninas usando o kitde RT-PCR QuantiTect® Probe contendo ROX como uma tintura de referên-cia passiva (QIAGEN Inc., Valença, CA). Brevemente, 2 conjuntos de inicia-dor-sonda foram usados para detecção de seqüências de influenza A emcada amostra (TABELA 7). Um conjunto de iniciador-sonda foi seletivo paraseqüências de gene de hemaglutinina canina (H3). O outro conjunto de inici-ador-sonda alvejou uma região altamente conservada do gene matriz (M) dovírus de influenza do tipo A. Para cada reação de RT-PCR de tempo real, 5pl de RNA total extraído foram adicionados a uma mistura de reação conten-do 12,5 μΙ de 2X Mistura Mestre de RT-PCR de Sonda de QuantiTech®,0,25 μΙ de QuantiTech® RT Mix, iniciadores diretos e reversos (concentraçãofinal de 0,4 μΜ para cada), sonda (concentração final de 0,1 μΜ) e água livrede RNase em um volume final de 25 μΙ. Os Reagentes de Controle de RNARibossômicos TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usadosde acordo com as instruções do fabricante para detecção de rRNA de 18Scomo um controle interno endógeno para a presença de RNA extraído dasamostras de tecido caninas.
RT-PCR quantitativa de tempo real de uma etapa foi executadanas misturas de reação em um Sistema de QPCR Mx3000P® (Stratagene,La Joila, CA). Condições de ciclismo incluíram uma etapa de transcrição re-versa a 50-C durante 30 minutos, uma etapa de desnaturação inicial a 95-Cdurante 15 minutos para ativar a DNA polimerase de HotStarTaq®, e amplifi-cação durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificação incluiu desnaturação a94-C durante 15 segundos seguido por anelamento/extensão a 60-C durante1 minuto. Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de onda de emissãoa 518 nm) e de VIC (comprimento de onda de emissão a 554 nm) foram re-gistrados no término de cada ciclo. O ciclo de limiar (Ct) foi determinado a-justando a fluorescência de limiar (dR) em 1000 em cada experimento indivi-dual. O programa de software de Mx3000P® versão 2.0 (Stratagene, La Jol-la, CA) foi usado para aquisição e análise dos dados. Amostras foram consi-deradas positivas para vírus de influenza A quando o ciclo de limiar (Ct) parao gene de H3 ou M foi 3 unidades menor que o Ct para tecidos pulmonaresde cães sem doença das vias respiratórias. O controle positivo consistiu emamplificação de RNA extraído de vírus de A/canine/FL7242/03 (H3N8).
ISOLAMENTO DE VÍRUS EM CÉLULAS DE MDCK
Tecidos pulmonares congelados de cada um dos 7 cães foramdescongelados e homogeneizados em 10 volumes do Meio de Eagle Modifi-cado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 0,5 % (BSA) e antibióticos(gentamicina e ciprofloxacina). Restos sólidos foram removidos por centrifu-gação e os sobrenadantes foram inoculados sobre células de rim canino deMadin-Darby (MDCK) cultivadas em DMEM suplementado com 1 pg/mL detripsina tratada com TPCK (Sigma-AIdrich Corp., St. Louis, MO) e antibióti-cos (gentamicina e ciprofloxacina). Células foram crescidas em frascos de25 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. As cul-turas foram observadas diariamente para alterações morfológicas e foramcolhidas em 5 dias pós-inoculação. As culturas colhidas foram clarificadaspor centrifugação e os sobrenadantes inoculados sobre células de MDCKfrescas como descrito para a inoculação inicial; foram executadas duas pas-sagens adicionais para amostras que não mostraram evidência de vírus deinfluenza através de hemaglutinação ou RT-PCR. Atividade de Hemaglutinaçãonos sobrenadantes clarificados foi determinada usando 0,5 % de células san-güíneas vermelhas de peru como previamente descrito (Burleson, F., et al.,1992; Kendal, P., et al., 1982). RT-PCR foi executada como descrito abaixo.
ISOLAMENTO DE VÍRUS EM OVOS GALINHA EMBRIONADOS
Homogeneizados foram preparados de tecidos pulmonares con-gelados como descrito acima para inoculação de células de MDCK. Os ho-mogeneizados (0,2 ml) foram inoculados no saco alantóico de ovos de gali-nha embrionados de 10 dias de idade. Após 48 horas de incubação a 35°C,os ovos foram esfriados para 4°C durante a noite antes de colher o fluidoalantóico. Atividade de hemaglutinação nos sobrenadantes clarificados foideterminada usando 0,5 % de células sangüíneas vermelhas de peru como15 previamente descrito (Burleson, F., et al., 1992; Kendal, P., et al., 1982). RT-PCR foi executada como descrito abaixo. Foram executadas duas passa-gens adicionais em ovos embrionados para amostras que não mostraramevidência de vírus de influenza após a inoculação inicial.
RT-PCR, SEQÜENCIAÇÃO DE NUCLEOTÍDEO, E ANÁLISES FlLOGENÉ-TICAS
RNA viral foi extraído de sobrenadante de MDCK ou fluido alan-tóico usando o Mini Kit Viral de RNA QIAamp® (QIAGEN Inc., Valença, CA)de acordo com as instruções do fabricante. O RNA viral foi transcrito reversopara cDNA usando o kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (QIAGEN Inc., Va-lença, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCRda região de codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previ-amente executada como descrito (Klimov, A., et al., 1992b), usando conjun-tos de iniciador gene-específico universais (seqüências de iniciador disponí-vel sob solicitação). Os amplicons de DNA resultante foram usados comomodelos para seqüenciação automatizada no seqüenciador de DNA automa-tizado ABI PRISM® 3100 usando química de terminador de tintura de se-qüenciação de ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram analisa-das as seqüências de nucleotídeo usando Lasergene 6 Package® (DNAS-TAR, Inc., Madison1 Wl). O programa de software PHYLIP© versão 3.5 foiusado para estimar as filogenias e calcular os valores de autocarregador dasseqüências de nucleotídeo (Felsenstein, J., 1989). Árvores filogenéticas fo-ram comparadas às geradas por análise de junção de vizinhos com o mode-lo Tamura-Nei implementado no programa de MEGA© (Kumar, S., et al.,2004) e confirmado pelo programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauer Associates,Inc., Sunderland, MA).
ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HI)
As amostras de soro foram incubadas com enzima destruidoresde receptor (RDE, DENKA SEIKEN Co., Ltd., Tóquio, Japão) (1 parte de so-ro: 3 partes de RDE) durante 16 horas a 37°C antes da inativação de calordurante 30 minutos a 56°C. Vírus de influenza A/Canine/Jacksonville/05(H3N8) foi cultivado em células de MDCK por 72 h a 37°C em 5 % de CO2.Os sobrenadantes de cultura de vírus foram colhidos, clarificados através decentrifugação, e armazenados a -80°C. Todos os outros vírus usados no en-saio de Hl foram crescidos em ovos de galinha embrionados de 10 dias deidade cujo fluido alantóico foi colhido e armazenado a -80°C. O ensaio de Hlfoi executado como previamente descrito (Kendal, P., et al., 1982). Breve-mente, 4 unidades de hemaglutinação de vírus foram adicionadas em 25 μΙ aum volume igual de soro serialmente diluído em placas de plástico de 96cavidades e incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos. Umvolume igual de 0,5 % de eritrócitos de peru foi adicionado e as titulações dehemaglutinação foram estimadas visualmente após 30 minutos. O pontoterminal titulação de Hl foi definido como a última diluição de soro que com-pletamente inibiu a hemaglutinação.
EXEMPLO 7 - CASOS CLÍNICOS
Em abril e maio de 2005, uma epidemia de doença das vias res-piratórias previamente descrita (Crawford, P. C. et al., 2005) ocorreu emcães alojados em uma instalação de abrigo no nordeste da Flórida. A epi-demia envolveu pelo menos 58 cães que variam em idade de 3 meses a 9anos, e incluiu cães de sangue puro como também raças misturadas. Ossinais clínicos mais comuns foram secreção nasal purulenta e uma tossedurante 7 a 21 dias. Dos 43 cães que tiveram doença clínica por > 7 dias, 41tinham titulações de anticorpo de Hl para canine/FL/04 (H3N8) variando de32 a > 1024. Pelo menos 10 cães progrediram para pneumonia, dos quais 6foram eutanizados. Estes 6 cães de raça mista incluíram 3 machos e 3 fê-meas variando em idade de 4 meses a 3 anos. A duração dos sinais clínicosvariou de 2 a 10 dias na hora da eutanásia. Sob autópsia, estes cães tiveramcongestão pulmonar e edema. Exame histológico do trato respiratório reve-lou rinite, traqueíte, bronquite, bronquiolite, e broncopneumonia supurativa.Houve necrose de célula epitelial e erosão na traquéia, brônquios, bronquío-los, e glândulas bronquiais. Os tecidos respiratórios foram infiltrados porneutrófilos e macrófagos.
Em maio de 2005, uma epidemia de doença das vias respirató-rias ocorreu em 40 cães de estimação em uma clínica veterinária no sudesteda Flórida. Os sinais clínicos mais comuns foram secreção nasal purulenta euma tosse durante 10 a 30 dias. Dos 40 cães, 17 eram soropositivos paracanine/FL/04 (H3N8) com titulações de anticorpo de Hl variando de 32 a >1024. Seroconversão ocorreu em 10 cães para os quais soros agudos econvalescentes pareados estavam disponíveis. Três cães progrediram parapneumonia. Um destes cães, um Yorkshire Terrier macho de 9 anos de ida-de, morreu 3 dias após o princípio dos sinais clínicos. Este cão teve traque-obronquite, edema pulmonar e congestão, e broncopneumonia severa. Simi-lar aos 6 cães do abrigo, houve necrose de célula epitelial e erosão das viasaéreas e infiltrados neutrófilos nos tecidos.
EXEMPLO 8 - RT-PCR E TEMPO REAL E ISOLAMENTO VIRAL
Tecidos pulmonares dos 7 cães foram analisados através deensaios de RT-PCR quantitativo de tempo real que detectam o gene M dotipo de influenza Aeo gene H3 do vírus de influenza A canina de H3N8. Ospulmões de todos os 7 cães eram positivos tanto para gene M de influenza Aquanto gene H3 de influenza canina (Tabela 8). Após 3 passagens em célu-las de MDCK, vírus de H3N8 do subtipo influenza A foi isolado dos pulmõesde um cão do abrigo que morreu após 3 dias de pneumonia. Este vírus foinomeado A/canine/Jacksonville/05 (H3N8) (canine/Jax/05). Após 2 passa-gens em ovos de galinha embrionados, vírus de H3N8 do subtipo influenza Arestabeleceu-se dos pulmões do cão de estimação que também morreu a-pós 3 dias de pneumonia. Este vírus foi nomeado A/canine/Miami/05 (H3N8)(canine/Miami/05).
EXEMPLO 9 - ANÁLISES GENÉTICA DOS ISOLADOS DE H3N8 INFLUENZAA CANINA
Análises de seqüência de canine/Jax/05 e canine/Miami/05 reve-laram que seus genes de hemaglutinina (HA) foram 98 % idênticos aos iso-lados de canine/FL/04, canine/TX/04, e canine/lowa/05 restabelecidos dospulmões de galgos de corrida que morreram de pneumonia durante as epi-demias de influenza em pistas em 2004 e 2005 (Crawford, P. C. et al., 2005;Yoon K-Y. et al., 2005). Além disso, os genes de HA de caniné/Jax/05 e ca-nine/Miami/05 eram 98 % idênticos ao vírus de influenza eqüina contempo-râneos isolado após o ano 2000. Comparações filogenéticas dos genes deHA mostraram que os vírus canine/Jax/05 e canine/Miami/05 foram agrupa-dos com os isolados de galgo canine/FL/04, canine/TX/04, e canine/lowa/05e isolados eqüinos contemporâneos, formando um grupo distinto dos isola-dos de vírus eqüino mais velhos no início de 1990 (Figura 4). Além disso, osisolados canine/Jax/05, canine/Miami/05, e canine/lowa/05 estavam relacio-nados mais estritamente a canine/Tx/04 que a canine/FL/04 ou cani-ne/FL/03. Os isolados de 2005 formaram um subgrupo que parece se ramifi-car dos vírus caninos mais prematuros de 2003 e 2004 com diferenças emaproximadamente 10 sítios informativos de parcimônia. Estas diferenças su-portam a hipótese que vírus de influenza canina esteja sendo transmitidohorizontalmente de cão-para-cão ao invés de ser periodicamente reintrodu-zido de uma fonte externa. A acumulação de mutações de 2003 a 2005 ilus-tra o processo contínuo de adaptação que o vírus tem que sofrer após sertransmitido a um hospedeiro novo, como é esperado ter acontecido para osvírus de influenza canina.Haviam substituições de aminoácido conservadas em todos os 6isolados caninos que os diferenciaram dos vírus de influenza eqüina con-temporâneos (Tabela 9). Estas substituições conservadas eram 115M, N83S,W222L, I328T, e N483T. Comparações filogenéticas da proteína de HA ma-dura mostraram que o vírus de canine/Jax/05, canine/Miami/05, e cani-ne/lowa/05 formaram um subgrupo com o isolado de canine/TX/04 (Figura4). Havia 3 alterações de aminoácido (L118V, K261N, e G479E) que diferen-ciaram este subgrupo dos outros vírus caninos (Tabela 9). Havia 2 altera-ções de aminoácido (F79L e G218E) que diferenciaram os isolados de 2005de sal// raiz de canine/TX/04. Além disso, os isolados de 2005 dos cães não-galgos, canine/Jax/05 e canine/Miami/05, diferiram dos isolados de galgocanine/lowa/05 por uma alteração de aminoácido, R492K. Por fim, cani-ne/Jax/05 diferiu de canine/Miami/05 em um aminoácido simples, S107P.Em todos os outros vírus de H3N8 eqüinos e caninos, S é conservado naposição 107 com exceção de A/Eqüino/Jilin/1/89 que tem um T (Guo Y. et.al., 1992).
EXEMPLO 11 - ANÁLISES ANTIGÊNICAS DOS ISOLADOS DE H3N8 DEINFLUENZA CANINA
Testes de inibição de hemaglutinação (HI) foram executadosusando um painel de antígeno de vírus de influenza eqüina mais velhos econtemporâneos e os vírus de influenza canina, e o soro colhido em 2005 decavalos e cães que tinham sido infectados com vírus de influenza (TABELA10). Soro de furões imunizados contra canine/FL/04 foi também incluso nasanálises. As titulações de anticorpo de Hl em soro eqüino foram 8-16 vezesmais altas quando testadas com vírus eqüinos contemporâneos comparadosaos isolados mais velhos, mas diminuíram em pelo menos 4 vezes quandotestados com os vírus caninos. O soro canino foi não-reativo com os víruseqüinos mais velhos, mas as titulações de anticorpo aumentaram 4 vezesquando testadas com isolados eqüinos e caninos contemporâneos. Isto foitambém observado para o soro de furões imunizados contra vírus de influ-enza canina. Estes padrões de //sero-reatividade demonstraram a similari-dade antigênica entre os vírus de influenza caninas e vírus de influenza e-qüina contemporâneos e foram consistentes com as análises filogenéticas.As titulações de anticorpo em soros de eqüino, canino, e furão para os isola-dos de canine/Miami/05 foram similares às para os isolados caninos de 2003e 2004. Porém, as titulações foram 2-4 vezes mais baixas para os isoladosde canine/Jax/05. Isto sugere que canine/Jax/05 é antigenicamente distintodo outro isolado canino que pode ser se referido em parte à alteração doaminoácido simples na posição 107 no HA maduro.<table>table see original document page 85</column></row><table><table>table see original document page 86</column></row><table>TABELA 9. Comparação de aminoácido do HA maduro para vírus de influenza canina e vírus de influenza eqüina contem- porâneos.
<table>table see original document page 87</column></row><table>Tabela 10. Titulações de anticorpo em soro de eqüino, canino, e furão pa- ra vírus de influenza eqüina mais velhos e vírus de influenza caninas con- temporâneos. <table>table see original document page 88</column></row><table>
a Titulações de anticorpo foram determinadas em um ensaio de inibição dehemaglutinação executado com diluições seriais de soro eqüino, canino, ousoro de furão e o vírus listado na coluna de antígeno.b Soro de furões imunizados com vírus de canine/FL/04.
MATERIAIS E MÉTODOS EXEMPLARES PARA OS EXEMPLOS 12-15Inóculo de Vírus de Influenza Canina.
O inóculo de vírus foi preparado por inoculação de células epite-Iiais de rim canino de Madin-Darby (MDCK) com uma matéria-prima deA/canine/FL^AM (H3N8) representando passagem 3 do isolado originaldescrito previamente (Crawford et al., 2005). As células de MDCK inocula-das nos Meios Essenciais Mínimos de Dulbecco (DMEM) suplementadoscom 1 pg/mL de tripsina tratada com TPCK (Sigma-AIdrich Corp., St. Louis,MO) e antibióticos (gentamicina e ciprofloxacina) foram cultivadas em fras-cos de 250 cm2 a 37°C em uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2.As culturas foram observadas diariamente para alterações morfológicas eforam colhidas em 5 dias pós-inoculação. As culturas colhidas foram clarifi-cadas por centrifugação e os sobrenadantes foram armazenados em inocu-lação pendente de -80QC dos cães. Uma alíquota de sobrenadante foi usadapara determinação da titulação de vírus pelo método de Reed e Muench. Atitulação foi 107 doses infecciosas de cultura de tecido mediana (TCID50) deA/canine/Florida/43/2004 (canine/FL/04) por ml.
INOCULAÇÃO EXPERIMENTAL.
Oito cães mestiços com colônias de 4 meses de idade (MarshallBioResources, North Rose, NY) (4 machos e 4 fêmeas) foram usados para oestudo de inoculação experimental aprovado por University of Florida Institu-tional Animal Care and Use Committee. Os pesos dos corpos dos cães vari-aram de 13 a 17 kg. Os cães eram saudáveis com base em exames físicos,exames de sangue de linha base, e registro de temperaturas do corpo du-rante 2 semanas antes da inoculação. Todos os cães eram livres de exposi-ção anterior ao vírus de influenza canina com base nos testes de sorologiaexecutados nas amostras de soro colhidas depois na hora da chegada nainstalação e 2 semanas. Os cães foram anestesiados por injeção intraveno-sa de propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg do peso docorpo para efeito) para intubação com tubos endotraqueanos. Seis cães (3machos e 3 fêmeas) foram cada inoculados com 107 TCID50 de vírus de ca-nine/FL704 em 5 ml de solução salina estéril administrada na traquéia distaiatravés de um cateter de borracha de diâmetro pequeno inserido no tuboendotraqueano. Dois cães (1 macho e 1 fêmea) foram pseudo-inoculadoscom um volume igual de solução salina estéril. Os cães de controle pseudo-inoculados foram alojados em um quarto diferente dos cães inoculados comvírus e cuidados por pessoal diferente. Exames físicos e registros de tempe-ratura retal foram executados duas vezes diariamente durante 6 dias pós-inoculação (p.i.).
COLETÂNEA DE ESFREGACO FARÍNGEO E RETAL.
Espécimes orofaríngeos foram colhidos duas vezes diariamentede cada cão nos dias 0 a 6 p.i. para monitorar a eliminação do vírus usandochumaços com haste de poliéster (Fisher Scientific Internacional Inc., Pitts-burgh, PA). Os esfregaços foram colocados em 1 ml de solução salina estériltamponada com fosfato (PBS) contendo 0,5 % de albumina de soro bovino(BSA). Os esfregaços retais foram colhidos diariamente de cada cão dosdias O a 6. Extratos de esfregaço foram preparados por clarificação dos mei-os de transporte de esfregaço através de centrifugação. Uma alíquota deextrato de esfregaço foi testada imediatamente para nucleoproteína de vírusde influenza A usando o kit de imunoensaio comercial Directigen® (BD,Franklin Lakes1 NJ) de acordo com as instruções do fabricante. O extratorestante foi armazenado a -80°C pendendo outros ensaios virológicos.
AUTÓPSIAS.
No dia 1 p.i., um cão pseudo-inoculado e um cão inoculado comvírus foram submetidos à eutanásia por inoculação intravenosa de soluçãode Beuthanasia-D® (1 mL/5 kg de peso do corpo; Schering-Plough AnimalHealth Corp). Um cão inoculado com vírus foi similarmente submetido à eu-tanásia cada dia dos dias 2 a 5 p.i. No dia 6 p.i., o cão pseudo-inoculado e ocão inoculado com vírus restantes foram submetidos à eutanásia. Autópsiascompletas foram executadas por um dos investigadores (WLC). Tecidos fo-ram fixados em 10 % de formalina tamponada neutro, embebidos em parafi-na, e seções de 5 pm foram tingidas com hematoxilina e eosina para diag-nose histopatológica ou processadas para Imuno-histoquímica como descritoabaixo. Tecidos pulmonares não-fixados foram submetidos ao Serviço deDiagnóstico de Microbiologia Clínica/Parasitologia/Sorologia na Faculdadede Medicina Veterinária da Universidade da Flórida para isolamento bacteri-ano e identificação. As amostras foram cultivadas em meios não-seletivoscomo também meios seletivos para espécies de Bordetella (Regan-Lowe;Remei, Lenexa, KS) e espécies de Mycoplasma (Remei). Todas as culturasforam mantidas durante 21 dias antes de relatarem nenhum crescimento.Tecidos não-fixados foram também armazenados a -80°C pendendo análi-ses virológicas.
IMUNO-HISTOQUÍMICA.
Seções de tecido da traquéia e pulmão de 5 pm desparafiniza-dos e reidratados foram montadas em lâminas de Bond-Rite® (Richard-AIlanScientific, Kalamazoo, Ml) e subseqüentemente tratadas com proteinase K(DAKOCytomation Inc., Carpenteria, CA) seguido por reagente de bloqueiode peroxidase (Kit de Peroxidase DAKO® EnVision®, DAKO Corp., Carpen-teria, CA). As seções foram incubadas com uma diluição de 1:500 de anti-corpo monoclonal para H3 de influenza A (Chemicon International, Inc., Ter-necula, CA) durante 2 horas em temperatura ambiente. Controles incluíramincubação das mesmas seções com IgG de camundongo (1 mg/ml, Serotec,Inc. Raleigh, NC), e incubação do anticorpo monoclonal com seções pulmo-nares caninas normais. Seguindo tratamento com o anticorpo primário, asseções foram incubadas com reagentes de substrato de imunoperoxidase ede peroxidase secundários (Kit Peroxidase Dako® EnVision®, Dako Corp.)de acordo com as instruções do fabricante. As seções foram contra-tingidascom hematoxilina, tratadas com Clarificador #2 e Reagente de Anil (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, Ml), desidratadas, e lâminas de cobertura apli-cadas com Permount (ProSciTech, Queensland, Austrália).
EXTRAÇÃO DE RNA DE ESFREGACOS E TECIDOS.
Tecidos pulmonares e traqueanos de cada cão foram desconge-lados e homogeneizados em meio essencial mínimo (MEM) suplementadocom 0,5 % de albumina de soro bovino (BSA) e antibióticos (gentamicina eciprofloxacina) usando moedor de tecido descartável (Kendall, Lifeline Medi-cai Inc., Danbury, CT). RNA total foi extraído dos homogeneizados de tecidocomo também extratos de esfregaços orofaríngeos e retais usando um kitcomercial (RNeasy® Mini Kit, QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo com asinstruções do fabricante e eluídos em um volume final de 60 μΙ de tampão.RT-PCR DE TEMPO REAL.
Uma RT-PCR quantitativa de uma etapa de tempo real foi exe-cutada no RNA total usando o kit de RT-PCR de Sonda de QuantiTect® con-tendo ROX como uma tintura de referência passiva (QIAGEN Inc., Valença,CA) e um conjunto de iniciador-sonda que alvejou uma região altamenteconservada do gene matriz (M) de vírus de influenza do tipo A (PayungpornS. et al., 2006a; Payungporn S. et al., 2006b). Para cada RT-PCR de temporeal reação, 5 μΙ de RNA total extraído foram adicionados a uma mistura dereação contendo 12,5 μΙ de 2X Mistura Mestre de RT-PCR de Sonda deQuantiTech®, 0,25 μΙ de Mistura de RT de QuantiTech®, iniciadores diretose reversos (concentração final de 0,4 μΜ para cada), sonda (0,1 μΜ de con-centração final) e água livre de RNase em um volume final de 25 μΙ. Os Re-agentes de Controle de TaqMan® GAPDH (Applied Biosystems, Foster City,CA) foram usados de acordo com as instruções do fabricante para detecçãode GAPDH como um controle interno endógeno para a presença de RNAextraído do esfregaço e amostras de tecido e como um controle de normalização.
RT-PCR quantitativa de uma etapa de tempo real foi executadanas misturas de reação em um Sistema de QPCR de Mx3000P® (Stratage-ne, La Jolla, CA). Condições de ciclismo incluíram uma etapa de transcriçãoreversa a 509C durante 30 minutos, uma etapa de desnaturação inicial a95QC durante 15 minutos para ativar a DNA polimerase de HotStarTaq®, eamplificação durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificação incluiu desnatura-ção a 949C durante 15 segundos seguido por anelamento/extensão a 60SCdurante 1 minuto. Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de onda deemissão a 518 nm) e de VIC (comprimento de onda de emissão 554 nm)foram registrados no término de cada ciclo. O ciclo de limiar (Ct) foi determi-nado ajustando a fluorescência de limiar (Dr) a 1000 em cada experimentoindividual. O programa de software de Mx3000P® versão 2.0 (Stratagene, LaJolla, CA) foi usado para aquisição e análise dos dados. O controle positivoconsistiu em amplificação de RNA extraído de vírus de A/canine/FLy242/03(H3N8). Os resultados foram normalizados dividindo o valor de Ct de M pelovalor de Ct de GAPDH correspondente por cada amostra.
ISOLAMENTO DE RE DE VÍRUS DOS TECIDOS.
Tecidos do pulmão e da traquéia congelados de cães inoculadoscom vírus foram descongelados e homogeneizados em 10 volumes deDMEM suplementados com 0,5 % de BSA e antibióticos. Restos sólidos fo-ram removidos por centrifugação e sobrenadantes foram inoculados sobrecélulas de MDCK cultivadas em DMEM suplementados com 1 μg/mL de trip-sina tratada com TPCK (Sigma-AIdrich Corp., St. Louis, MO) e antibióticoscomo descrito acima. Células foram cultivadas em frascos de 25 cm2 a 37°Cem uma atmosfera umedecida contendo 5 % de CO2. As culturas foram ob-servadas diariamente para alterações morfológicas e colhidas em 5 diaspós-inoculação. As culturas colhidas foram clarificadas por centrifugação eos sobrenadantes inoculados sobre as células de MDCK frescas como des-crito para a inoculação inicial; foram executadas duas passagens adicionaispara amostras que não mostraram evidência de vírus de influenza atravésde hemaglutinação ou RT-PCR. Atividade de hemaglutinação nos sobrena-dantes clarificados foi determinada usando 0,5 % de células sangüíneasvermelhas de peru como previamente descrito (Crawford et al., 2005). RT-PCR foi executada como descrito abaixo.
RT-PCR. SEQÜENCIAÇÂO DE NUCLEOTÍDEO. E ANÁLISES FlLOGENÉ-TICAS.
RNA viral foi extraído do sobrenadante de MDCK usando o Mi-niKit Viral de RNA de QIAamp® (QIAGEN Inc., Valença, CA) de acordo comas instruções do fabricante. O RNA viral foi transcrito reverso para o cDNAusando o Kit de RT-PCR de Uma Etapa de QIAGEN® (QIAGEN Inc., Valen-ça, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Amplificação de PCR daregião de codificação dos 8 genes virais de influenza no cDNA foi previa-mente executada como descrito (Crawford et al., 2005), usando conjuntos deiniciador gene-específico universais (seqüências de iniciador disponível sobsolicitação). Os amplicons de DNA resultante foram usados como modelospara seqüenciação automatizada no seqüenciador de DNA automatizado deABI PRISM® 3100 usando química de terminador de tintura de seqüenciaçãode ciclo (Applied Biosystems, Foster City, CA). Foram analisadas as seqüên-cias de nucleotídeo usando o Lasergene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madi-son, Wl). As seqüências de nucleotídeo para vírus restabelecidos de cães in-fectados foram comparadas às seqüências do vírus no inóculo para determi-nar se qualquer alteração ocorreu durante a replicação no trato respiratório.
EXEMPLO 12 - DOENÇA CLÍNICA
Todos os 6 cães inoculados com vírus desenvolveram uma fe-bre transiente (£ 39°C de temperatura retal) para os primeiros 2 dias p.i.,mas nenhum exibiu sinais respiratórios tais como tosse ou secreção nasalno período de observação do dia 6. Os cães pseudo-inoculados permanece-ram clinicamente saudáveis.
EXEMPLO 13 - PROPAGAÇÃO DO VÍRUS
Nucleoproteína de influenza A foi detectada no esfregaço orofa-ríngeo colhido de um dos cães inoculados com vírus a 24 horas p.i. Os es-fregaços orofaríngeos colhidos de um cão em 72, 84, e 120 horas p.i., e ou-tro cão em 108, 120, e 132 horas p.i., eram positivos para vírus através deRT-PCR quantitativa de tempo real (Tabela 11). O número absoluto de có-pias de gene M de influenza por μΙ de extrato de esfregaço aumentou com otempo de 3 para 6 dias p.i. Nenhum vírus foi detectado nos esfregaços retais.
EXEMPLO 14 - AUTÓPSIAS
Em contraste com a infecção experimental anterior usando Bi-gles livres de patógenos específicos (Crawford et al., 2005), os cães mesti-ços inoculados com vírus tiveram pneumonia como comprovado por análisestotais e histológicas dos pulmões dos dias 1 a 6 p.i. Além de pneumonia, oscães tiveram rinite, traqueíte, bronquite, e bronquiolite similares às descritasem cães naturalmente infectados (Crawford et al., 2005). Houve necrose epi-telial e erosão do forro das vias aéreas e glândulas bronquiais com infiltraçãode neutrófilos e macrófagos dos tecidos submucosais (Figura 5, painéis su-periores). Imuno-histoquímica detectou antígeno de H3 viral nas células epi-teliais de brônquios, bronquíolos, e glândulas bronquiais (Figura 5, painéisinferiores). Nenhuma superinfecção bacteriana estava presente. Os tecidosrespiratórios dos 2 cães pseudo-inoculados estavam normais.
EXEMPLO 15 - REPLICACÂO DE VÍRUS EM TRAQUÉIA E PULMÕES
A traquéia e pulmões eram positivos para vírus através de RT-PCR quantitativa de tempo real em todos os cães de 1 para 6 dias p.i. (Ta-bela 12). O número absoluto de cópias de gene M de influenza por μΙ dehomogeneizado de traquéia aumentou de 1 a 5 dias p.i., depois diminuiu nodia 6. O número absoluto de cópias de gene M por μΙ de homogeneizadopulmonar diminuiu de 1 a 6 dias p.i. Em geral, a traquéia continha £ um Iogi0mais vírus que o pulmão em cada um dos 6 dias p.i.<table>table see original document page 95</column></row><table>
a Tempo que foram colhidos os esfregaços orofaríngeos dos cães seguindoinoculação com vírus de A/canine/FL/43/04 (H3N8).
b Razões de normalização foram calculadas dividindo o M (Ct) pelo GAPDH(Ct) para cada extrato de esfregaço.
c O número absoluto de cópias de gene Matriz por uL de extrato de esfregaço.
<table>table see original document page 95</column></row><table>
a Tempo que foram colhidos os tecidos dos cães seguindo inoculação comvírus de A/canine/FU43/04 (H3N8).b Razões de normalização foram calculadas dividindo o M (Ct) pelo GAPDH(Ct) para cada homogeneizado de tecido.
c O número absoluto de cópias de gene Matriz por uL de homogeneizado detecido.
MATERIAIS E MÉTODOS EXEMPLARES PARA O EXEMPLO 16CEPAS DE VÍRUS
Cepas de vírus de influenza canina como também aquelas deorigem aviária, eqüina e humana (listadas na Tabela 15) foram propagadasem ovos embrionados ou células de MDCK e sua infecciosidade foi tituladapor diluição de ponto terminal em embriões de galinha, ou ensaio de placa.Quantificação de vírus rápida foi executada através de ensaio de hemagluti-nação usando eritrócitos de células sangüíneas vermelhas de peru.ESPÉCIMES DIAGNÓSTICOS
Um total dos 60 tecidos de pulmão canino colhidos de casossuspeitos de doença das vias respiratórias virais durante o ano de 2005 foitestado para a presença de vírus de influenza canina.EXTRAÇÃO DE RNA DE AMOSTRAS DE TECIDO CANINAS
Blocos de tecido pulmonar pesando entre 20 e 30 mg foram ho-mogeneizados em um moedor de tecido descartável (Kendal). RNA total foiextraído usando um kit comercial (Mini Kit de RNeasy, Qiagen, Valença, CA)e eluído em um volume final de 60 μΙ, seguindo as recomendações do fabri-cante.
PROJETO DE INICIADORES E DE SONDAS
Alinhamentos de seqüência múltiplos dos genes H3 e M de vá-rios subtipos e de espécies diversas foram executados usando o programaCLUSTAL X (Versão 1.8). Iniciadores de matriz (M) e sonda foram selecio-nados das regiões conservadas das seqüências conhecidas que correspon-dem aos subtipos diferentes de vírus de influenza A, enquanto o conjunto deiniciadores gene-específicos e de sonda de hemaglutinina de H3 foi selecio-nado para especificamente emparelhar genes do vírus de influenza A eqüinae canina e desemparelhar os genes aviários e humanos homólogos (Tabela13). Software de projeto de iniciador (OLIGOS Versão 9.1) e as ferramentasde análise com base em rede fornecidas por EXIQON (http://lnatools.com)foram usados para cálculo de Tm e predição da estrutura secundária comotambém auto hibridação. Uma região conservada de um gene de rRNA de18S foi usada como controle interno endógeno para a presença de RNA ex-traído da amostra de tecido canina. Os Reagentes de Ensaio Pré-desen-volvidos de TaqMan® para rRNA Eucariótico de 18S (VIC/TAMRA) (AppliedBiosystems) foram usados para a detecção de tempo real de rRNA de 18Sem amostras de tecido.
CONDIÇÃO DE RT-PCR DE TEMPO REAL
Uma RT-PCR de tempo real de uma etapa foi executada usando
kit de Sonda de RT-PCR de Quantitect contendo ROX como uma tintura dereferência passiva (Qiagen, Valença, CA). Em cada reação de RT-PCR detempo real, 5 μl de amostra de RNA foram usados como um modelo paracombinar com uma mistura de reação contendo 10 μΙ de 2X Mistura Másterde RT-PCR de Sonda de QuantiTech, 0,2 μΙ de Mistura de RT de QuantiTe-ch, iniciadores (0,4 μΜ conc. final para gene de H3 ou 0,6 μΜ de conc. finalpara gene M), sonda (0,1 μΜ conc. final para gene H3 ou 0,2 μΜ de conc.final para gene M) e água livre de RNase em um volume final de 20 μΙ. RT-PCR de tempo real de uma etapa foi executada no Sistema de QPCR deTempo real de Mx3005P (Stratagene). Condições de ciclismo incluíram umaetapa de transcrição reversa a 50-C durante 30 minutos. Após uma etapa dedesnaturação inicial a 95eC durante 15 minutos para ativar a DNA polimera-se de HotStarTaq, amplificação foi executada durante 40 ciclos incluindodesnaturação (94QC durante 15 segundos) e anelamento/extensão (609Cdurante 30 segundos). Os sinais fluorescentes de FAM (comprimento de on-da de emissão a 516 nm para detecção de H3 e de M) e de VIC (comprimen-to de onda de emissão a 555 nm para detecção de rRNA de 18S) foram ob-tidos uma vez por ciclo ao término da etapa de extensão. Aquisição de da-dos e análise do ensaio de tempo real de PCR foram executadas usando osoftware de Mx3005P versão 2.02 (Stratagene).ESPECIFICIDADE DE CONJUNTO DE INICIADORES / SONDA DE H3 PA-RA INFLUENZA CANINA (H3N8) E UNIVERSALIDADE DE CONJUNTO DEINICIADORES / SONDA DE M PARA TIPO DE VÍRUS DE INFLUENZA A
Para testar a especificidade de cada conjunto de iniciado-res/sonda, RNA extraído de vários subtipos conhecidos de vírus de influenzaA foram usados como um modelo no ensaio de RT-PCR de tempo real (Ta-bela 15).
PADRÃO DE RNA PARA DETERMINAÇÃO DO DESEMPENHO DE RT-PCR DE TEMPO REAL
Os genes de vírus de influenza A canina (A/canine/Florida/242/2003 (H3N8)) foram usados para gerar oS amplicons de PCR para H3 (nt 1-487)e M (nt 1-276) usando iniciadores ligados com promotor T7 (Tabela 13). DepoisoS amplicons de PCR purificado de genes de H3 e M foram usados comomodelos para transcrição in vitro usando Sistema de Transcrição de T7 deRibossonda in vitro (Promega) seguindo as recomendações do fabricante. Aconcentração dos RNAs transcritos foi calculada medindo absorbância a 260nm. Os RNAs foram depois serialmente diluídos 10 vezes, variando de 108 a10 cópias / μΙ para executar os testes de sensibilidade. Além disso, uma cur-va padrão foi gerada representando em gráfico o Iog das concentrações ini-ciais de RNA modelo (cópias / μΙ) versus o ciclo de limiar (Ct) obtido de cadadiluição para determinar o desempenho geral de RT-PCR de tempo real.TESTES DE SENSIBILIDADE COMPARATIVOS ENTRE RT-PCR DE TEM-PO REAL E KIT DE TESTE DE DIRECTIGEN FLU A
Vírus de matéria-prima de duas cepas virais incluindo A/Wyoming/3/2003 (H3N2) a 106'67 EID50ZmL (HA=64) e A/canine/Florida/ 242/2003 (H3N8)a 107,17 EID50/mL (HA=16) foram usados para o ensaio de limiar de detecção.Diluição logarítmica de espécimes em solução salina tamponada com fosfato(PBS) (125 μΙ) foi usada em um kit de detecção de antígeno de influenza Arápido, Directigen Flu A, (Becton, Dickinson e Company) seguindo as instru-ções do fabricante. Cada dispositivo de teste de Directigen Flu A tem umamancha de antígeno de influenza de H1N1 no centro da membrana que de-senvolve como um ponto roxo e indica a integridade do teste que é com ba-se em um anticorpo monoclonal para a nucleoproteína (NP). O desenvolvi-mento de um triângulo roxo que circunda o ponto é indicativo da presença deinfluenza NP no espécime testado. A intensidade do sinal roxo do triângulofoi registrada como + (esboço de triângulo), ++ (triângulo suavemente colori-do), +++ (triângulo roxo-escuro) e ++++ (triângulo roxo-muito-escuro). RNAviral foi extraído 125 μΙ alíquotas de cada diluição de vírus usando MiniKitViral de RNA de QIAamp (Qiagen, Valença, CA) e eluindo em um volumefinal de 50 μΙ. Um volume de 5 uL dos RNAs virais extraídos foi testado atra-vés de RT-PCR de tempo real para teste de sensibilidade comparativo como kit Directigen Flu A.
EXEMPLO 16
O ensaio de RT-PCR de tempo real para influenza canina contacom informação de três sondas moleculares que alvejam rRNA de 18S decélula hospedeira como também M e H3 do genoma de vírus de influenza A(Tabela 14). Amplificação do gene hospedeiro é um repórter de qualidade deespécime e integridade. Amostras clínicas, de necropsia ou de laboratóriocontendo o vírus de influenza canina (H3N8) são esperadas dar o sinal deamplificação com as três sondas. Espécimes que conferem o sinal de ampli-ficação com sondas de rRNA de M e 18S mas negativas para H3 seriam in-dicativos de um vírus de influenza subtipo H3 de origem humana, suína ouaviária ou de subtipos não-H3. Estes casos raros poderiam ser solucionadospor RT-PCR usando iniciadores universais de HA para gerar cDNA de am-plicon que pode ser analisado através de seqüenciação. Espécimes corre-tamente colhidos e manipulados desprovidos do vírus de influenza A rendemsinal de amplificação de 18S de rRNA apenas. Situações em que apenas asonda de rRNA de 18S e as sondas de H3 rendem sinal de amplificação sãoindicativas de técnica defeituosa, a menos que do contrário provado; ou umfalso negativo com sondas de M ou falso positivo para H3 necessitam serdemonstrados. Por fim, espécimes não rendendo sinais de amplificação comas três sondas são indicativos de coletânea de amostra defeituosa, degrada-ção, extração de RNA defeituosa ou a presença de inibidores as polimerasesusadas em PCR.Para testar a especificidade do conjunto de iniciadores/sonda deH3 para o vírus de influenza A canina (H3N8) e a universalidade do conjuntode iniciadores/sonda de M para tipo de influenza A, vários subtipos de vírusde influenza A foram testados através de RT-PCR de tempo real. Os resul-tados mostram que conjunto de iniciadores/sonda de H3 rendeu um sinal deamplificação positivo apenas com influenza canina (H3N8). Não foi observa-do nenhum sinal de amplificação falso positivo significativo ou não-específicoem outros subtipos ou cepas humanas de H3. O conjunto de iniciado-res/sonda de M rendeu sinal de amplificação positivo com todas as cepastestadas (Tabela 15). Estes resultados indicaram que os iniciadores/sondade H3 especificamente detectam vírus de influenza A canina (H3N8) en-quanto que os iniciadores/sonda de M detectam subtipos múltiplos do tipo devírus de influenza A.
O desempenho dos ensaios de RT-PCR de tempo real foi avali-ado por diluição de ponto terminal de RNAs transcritos in vitro de M e H3.Como esperado, o ciclo de limiar (Ct) aumentou em correlação direta com adiluição dos padrões de RNA. Os sinais fluorescentes podem ser detectadosem diluições ods padrões de RNA de M e H3 tão baixos quanto 103 e 102cópias/μL-, respectivamente (Figura 6A e 6B). As curvas padrão de genes Me H3 foram construídas representando em gráfico o Iog de concentrações deRNA de partida versus o ciclo de limiar (Ct) obtido de cada diluição (Figura6C e 6D). O declive da curva padrão é usado para determinar a eficiência dareação de PCR que é teoricamente exponencial; 100% de eficiência de am-plificação implicaria em dobrar a concentração de amplicon a cada ciclo. Ascurvas padrão com um declive entre cerca de -3,1 e -3,6 são tipicamenteaceitáveis para a maioria das aplicações que requerem quantificação precisa(90-110 % de eficiência de reação). Um valor de Rsq é o ajuste de todos osdados ao diagrama de curva padrão. Se todos os dados perfeitamente fica-rem na linha, o Rsq será 1,00. À medida que os dados caem também da li-nha, Rsq diminui. Um valor de Rsq £ 0,985 é aceitável para a maioria dosensaios. A curva padrão de M revelou um declive de -3,576 (eficiência =90,4 %) e Rsq = 1,00, enquanto que curva padrão de H3 rendeu um declivede -3,423 (eficiência = 95,9 %) e Rsq = 0,999. Estes valores indicam eficiên-cia de amplificação satisfatória e desempenho geral dos ensaios de RT-PCRde tempo real. Atribuiram-se a eficiência inferior e sensibilidade do conjuntode iniciadores/sonda de M quando comparado ao conjunto de iniciado-res/sonda de H3 à degeneração de N vezes das seqüências de iniciador deM requeridas para assegurar cobertura vasta da variabilidade de seqüênciasde gene M ao longo dos vírus de múltiplos subtipos, hospedeiros e linhagens.
A sensibilidade de ensaio de RT-PCR de tempo real foi tambémcomparada com o ensaio de detecção de antígeno rápido comercial (DirectigenFlu A). Diluições logarítmicas de A/Wyoming/3/2003 (H3N2) e A/canine/ Flo-rida/242/2003(H3N8) foram analisadas com Directigen Flu A e através deRT-PCR de tempo real. Os resultados de Directigen Flu A mostraram que assensibilidades contra ambas as cepas virais são diluição de aproximada-mente 100 vezes dos vírus de matéria-prima usados nestes experimentos(Figura 7). Os sinais (cor roxa) gerados pelas amostras de vírus canino(A/canine/Florida/242/2003: 106.x PFU/ml) foram muito mais fracos que a-queles encontrados em vírus humano (A/Wyoming/3/2003: 107.x PFU/ml),de acordo com a concentração de vírus inferior nestas amostras. Alternati-vãmente, sinal inferior para influenza canina poderia ser atribuído à especifi-cidade molecular dos anticorpos monoclonais versus NP; isto é, conserva-ção ruim dos aminoácidos dentro do epítopo de NP do vírus de influenza Acanina.
RT-PCR de tempo real do gene M renderam valores de Ct aci-ma do limiar com equivalentes de vírus PFU 10 e 30 por reação deA/canine/Florida/242/2003 e A/Wyoming/3/2003, respectivamente (Tabela16). As diferenças entre o valor de sensibilidade de 2 cepas virais, porque asdiferenças nas titulações virais originais. A comparação de detecção de geneH3 entre vírus de influenza canina e humana não foi executada porque osiniciadores/sonda de H3 no ensaio de RT-PCR de tempo real amplifica ex-clusivamente vírus de influenza A canina. RT-PCR foi 105 vezes mais sensí-vel que o kit de detecção de antígeno rápido.Para avaliar o desempenho do teste de RT-PCR em espécimesde necropsia de cães com doença das vias respiratórias aguda, foram testa-das sessenta amostras de tecido pulmonar canino submetidas durante o anode 2005 à presença de vírus de influenza A canina através de RT-PCR detempo real. Um total de 12 entre 60 amostras (20 %) eram positivas com ge-nes M e H3, enquanto que as 48 amostras restantes renderam resultadonegativo para gene M e H3. Tentativas de isolamento de vírus foram condu-zidas por inoculação de célula ovo e MDCK, para avaliar a especificidade doensaio de tempo real; 2 de 12 amostras que eram positivas para RT-PCR deinfluenza canina renderam vírus de influenza canina (dados não mostrados,manuscrito na preparação). Embora todos os tecidos tenham sido colhidosde cães com uma história de doença severa das vias respiratórias, a maioriadas amostras não rendeu nenhum vírus de influenza canina por PCR detempo real ou isolamento convencional, sugerindo uma incidência alta deoutros patógenos respiratórios tais como Bordetell bronchiseptica, sinomosecanina ou vírus de parainfluenza. O ensaio de RT-PCR de tempo real deuma etapa aqui prové um método rápido, sensível e custo-eficaz para detec-ção de vírus de influenza A canina (H3N8). Diagnose de laboratório rápidadas infecções por vírus de influenza A canina (H3N8) no estágio prematuroda doença pode prover informação relevante para o paciente clínico e ge-renciamento de aparelho.<table>table see original document page 103</column></row><table>Tabela 14: Interpretação do ensaio de RT-PCR de tempo real <table>table see original document page 104</column></row><table>
Tabela 15: Teste de especificidade de conjunto de iniciadores/sonda de H3 canino e teste de universalidade de conjunto de iniciadores/sonda de M com vários subtipos de vírus de influenza A <table>table see original document page 104</column></row><table>
* Observe que subtipos de amostras clínicas foram confirmados através deseqüenciação de nucleotídeo.Tabela 16: Testes de sensibilidade comparativ influenza A em RT-PCR de tempo real e Direcos para detecção de vírus de tigen Flu A
<table>table see original document page 105</column></row><table>
Tabela 17. <table>table see original document page 105</column></row><table><table>table see original document page 106</column></row><table>Tabela 20. Diferenças de aminoácido entre proteínas de PB1 de vírus de influenza eqüina e canina de H3N8
<table>table see original document page 107</column></row><table>
Tabela 21. Diferenças de aminc influenza eqüina e canina de H3
<table>table see original document page 107</column></row><table>Tabela 22. Diferenças de aminoácido entre proteínas de NP de vírus de influenza eqüina e canina de H3N8
<table>table see original document page 108</column></row><table> Tabela 23. Diferenças de aminoácido entre proteínas de NA de vírus de influenza eqüina e canina de H3N8
<table>table see original document page 108</column></row><table>Tabela 24. Diferenças de aminoácido entre proteínas de M1 de vírus de influenza eqüina e canina de H3N8
<table>table see original document page 109</column></row><table>
*Com base em genes disponíveis de isolados virais entre 1963 e 1998.
Tabela 25. Diferenças de aminoácido entre proteínas de NS1 de vírus de influenza eqüina e canina de H3N8 <table>table see original document page 109</column></row><table>
* Com base em genes disponíveis de isolados virais entre 1963 e 1998.
EXEMPLO 17 - DESENVOLVIMENTO MODELO DE DESAFIO DE INFLUEN-ZA CANINA.
O vírus de influenza canina (influenza canina), que foi isolado deepidemias de influenza na Flórida, foi observado ser um vírus de influenzado tipo H3N8, e estritamente relacionado à cepa de vírus de influenza eqüi-na, A/eqüino/Ohio/03 (Crawford et al., SCIENCE Vol. 309, setembro de2005, incorporado por referência em sua totalidade nesta patente). O poten-cial de uso da cepa de vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03 para in-duzir doença com base em influenza em cães foi investigado neste estudo.
PROCEDIMENTO:
Foram obtidos dez bigles 13 semanas de idade de sexo mistode um fornecedor comercial, e alojados em jaulas individuais em uma insta-lação de BSL-2. Os cães foram atribuídos fortuitamente a dois grupos de 5cães cada. Como mostrado na Tabela 26, um grupo foi submetido a um de-safio intratraqueano, e o outro grupo foi submetido a um desafio oronasal.<table>table see original document page 110</column></row><table>
Um vírus de influenza eqüina A/eqüino/Ohio/03 cultivado em cul-tura de células foi usado como o vírus de desafio. Para desafio intratraquea-no, o vírus de desafio foi administrado por meio de um tubo de liberação queconsistiu em um tubo traqueano embanhado (Tamanho 4,0/4,5, Sheridan,USA) e tubo de alimentação (tamanho 5Fr, 1,7 mm, 16 polegadas (41 cm)em comprimento, Kendall, USA) em 0,5 a 1,0 ml de volume. Para desafiooronasal, o vírus de desafio (107 a 108 TCID50 por cão) foi administrado co-mo uma névoa usando um nebulizador (nebulizador ultra-sônico de DeViI-biss Ultra-Neb®99, Sunrise Medicai, USA) em um volume de 2 a 3 ml.
Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados àinfluenza durante dias 14 pós-desafio. Foram colhidas amostras de soro decada cão no dia zero (antes do desafio), e dias 7 e 14 pós-desafio para de-terminar a titulação de Hl usando um vírus de influenza eqüina de H3N8 comum protocolo padrão (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA). Todos os cães fo-ram humanitariamente eutanizados e os tecidos do pulmão foram colhidosem 10% de formalina tamponada para avaliação histopatológica.
RESULTADOS: '
Os resultados deste experimento estão resumidos na Tabela 27.Sinais clínicos relacionados à influenza foram observados em alguns cães a -pós-desafio. Estes sinais incluíram febre (>103°F; >39,4°C) e tosse. Dois dos 5cães (isto é, 40 %) tiveram febres (>103°F; >39,4eC) no Grupo 1, comparado a1 de 5 (isto é, 20 %) cães no Grupo 2. Um cão do grupo de desafio oronasalteve espirro, e outro teve tosse seguindo o desafio. Uma faixa de titulação deHl de 10 a 80, com uma titulação de média geométrica (GMT) de 20, foi ob-servada para o Grupo 1. Uma faixa de titulação de 40 a 160, com uma GMTde 86, foi observada para o Grupo 2. Um cão de cada grupo teve lesões histo-patológicas compatíveis ou patognômicas para influenza.Tabela 27
<table>table see original document page 111</column></row><table>EXEMPLO 18 - EFICÁCIA DE UMA VACINA DE VÍRUS DE INFLUENZAEQÜINA PARA CÃES.
O isolado viral de influenza canina (influenza canina) de epide-mias de influenza na Flórida foi observado ser um vírus de influenza do tipoH3N8, e foi referido estritamente ao vírus de influenza eqüina, A/eqüino/ O-hio/03, com base na similaridade de seqüência. O estudo a seguir foi condu-zido pára determinar a eficácia de uma vacina de vírus de influenza eqüinainativada experimental.
PROCEDIMENTO:
Foram obtidos nove bigles de 7 semanas de idade de sexo mis-to de um fornecedor comercial, e alojados em jaulas individuais em uma ins-talação de BSL-2. Estes cães foram atribuídos fortuitamente a dois grupos,como resumido na Tabela 28:
<table>table see original document page 112</column></row><table>
O primeiro grupo consistiu em 5 cães, que foram vacinados comuma vacina de A/eqüino/Ohio/03 de vírus de influenza eqüina inativado, comadjuvante de CARBIGEN®, a 8 e 12 semanas de idade por meio de via sub-cutâneo (SQ). O A/eqüino/Ohio/03 foi inativado através de etilenimina binária("BEI") usando um método padrão. Cada dose da vacina continha 5 % emmassa de CARBIGEN®, 4096 unidades de HA do vírus inativado, PBS sufi-ciente para trazer o volume total da dose para 1 ml, e NaOH suficiente paraajustar o pH para entre 7,2 e 7,4. Foram colhidas amostras de soro de todosos cães no dia da primeira e da segunda vacinação e dia 7 e 14, pós-primeira e segunda vacinação, e o pré-desafio para determinar a titulação deHl usando um protocolo padrão de vírus de influenza eqüina de H3N8 (SAM124, CVB, USDA, Ames, IA). Em 3 semanas pós-segunda vacinação, os 5cães vacinados e o segundo grupo (isto é, o grupo de controle) consistindoem 4 cães com idade equiparada foram desafiados oronasalmente com umvírus de influenza eqüina crescido em cultura de células A/eqüino/Ohio/03(107,0 a 108,0 TCID50 por cão) em um volume por dose de 1-2 ml. O vírus dedesafio foi administrado aos cães como uma névoa usando um nebulizador(nebulizador ultra-sônico de DeViIbiss Ultra-Neb®99, Sunrise Medicai, USA).Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influenza por14 dias pós-desafio. Cinco cães (3 vacinados e 2 controles) 7 dias pós-desafio e 4 cães (2 controles e 2 vacinados) 14 dias pós-desafio foram hu-manitariamente eutanizados para coleta dos tecidos pulmonares em 10 % deformalina tamponada para avaliação histopatológica.
RESULTADOS:
Os resultados deste experimento estão resumidos nas Tabelas29 e 30. Todos os cães vacinados soroconverteram-se seguindo a vacina-ção. Uma faixa de titulação de Hl de 40 a 640, com o GMT de 129, foi ob-servada durante o período de pós-vacinação com vírus de influenza eqüinaA/eqüino/Ohio/03, e uma titulação de Hl de 160 a 320, com uma titulação demédia geométrica de 211, foi observada com isolado de influenza canina,A/canine/Florida/242/03. Dois de 6 vacinados tiveram uma febre de >39,4°C(>103°F) por um dia e nenhum outro sinal clínico foi observado em quais-quer dos cães seguindo desafio.
CONCLUSÃO:
Todos os cães vacinados responderam à vacina de influenzaeqüina inativada, com adjuvante de CARBIGEN®. A titulação de Hl resultacom um vírus de isolado de influenza canina sugerindo que a vacina de in-fluenza eqüina inativada induziu um nível detectável de anticorpo reativotransversal para o vírus de influenza canina. Embora o vírus de desafio usa-do aqui não induza nenhuma doença clínica notável em cães bigles, combase na titulação de Hl com um vírus de isolado de influenza canina, foi con-cluído que vacina eqüina inativada poderia ser usada em cães para induziranticorpos reativos cruzados, que poderiam proteger cães potencialmentecontra doença de "influenza canina" causada pelo vírus de influenza caninado tipo H3N8.<table>table see original document page 114</column></row><table>
*os animais foram desafiados com um isoladode influenza equina ohio 03
** vacina de ohio 03 de virus de influenza equinainativado com adjuvantede CARBIGEN®
*** eutanizado 7 dias pos-desafio<table>table see original document page 115</column></row><table>
* Os animais foram desafiados com um isolado de influenza equina Ohio 03
** Vacina de Ohio 03 de virus de influenza equina inativado com adjuvante de CARBIGEN® foi usada para vacinacaoEXEMPLO 19 - EFICÁCIA DE UMA VACINA DE VIRUS DE INFLUENZAEQÜINA PARA CÃES.
O vírus de influenza canina isolado de epidemias de influenza naFlórida foi caracterizado estar estritamente relacionado a vários isolados devírus de influenza eqüina do tipo H3N8. Pela análise de similaridade de se-qüência de DNA e de aminoácido foi demonstrado que o vírus de influenzacanina é bem parecido a um vírus de influenza eqüina, A/eqüino/Ohio/03. Oestudo a seguir foi conduzido em cães para determinar a eficácia de vacinasde influenza eqüina comercialmente disponíveis em cães.
PROCEDIMENTO:
Cerca de 20 cães mestiços de 16 meses de idade e 20 bigles desexo misto foram usados no estudo. Os cães foram atribuídos fortuitamentea 6 grupos (Tabela 31) de 6-7 cães cada. Cães nos grupos 1 e 4 foram vaci-nados com uma vacina de influenza eqüina inativado comercialmente dispo-nível com adjuvante (EQUICINE®, Intervet Inc., Millsboro, DE) a 16 e 17 me-ses de idade por meio de via subcutânea (SQ). Os cães nos grupos 2 e 5que foram vacinados com uma vacina de influenza eqüino/Kentucky/91 vivomodificado em um 1 ml de volume por meio de via intranasal (uma só nari-na). Amostras de sangue foram colhidas no dia da vacinação, dia 7 e 14pós- primeira vacinação (grupos 1, 2, 4, e 5) e pós- segunda vacinação (gru-pos 1 e 4) para determinar a titulação de Hl usando um vírus de influenzaeqüina de H3N8 e um vírus de influenza canina usando por um protocolopadrão (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA).
Vacinados (em 72 dias pós-vacinação final) e os controles foramdesafiados oronasalmente com uma cepa de vírus de influenza eqüina cul-tivada em cultura de células A/eqüino/Ohio/03 (1070 a 1080 TCID50 por cão)em um volume de 1-2 ml. O vírus de desafio foi administrado aos cães co-mo névoa usando um nebulizador (nebulizador ultra-sônico de DeViIbissUltra-Neb®99, Sunrise Medicai, USA). Os cães foram observados para si-nais clínicos relacionados à influenza por 12 dias pós-desafio. Os esfregaçosnasais e orofaríngeos foram colhidos no meio de MEM de Earl com antibió-ticos (neomicina e polimixina B) diariamente do dia -1 ao dia 12 pós-desafiopara isolamento de vírus. A presença de vírus nos esfregaços indica que oanimal está excretando o vírus em secreções nasais/orais. Todos os cãesforam humanitariamente eutanizados no dia 12 pós-desafio e os tecidospulmonares foram colhidos em 10 % de formalina tamponada para avaliaçãohistopatológica.
Tabela 31. Projeto experimental
<table>table see original document page 117</column></row><table>
* Não aplicável
** EQUICINE II® é comercializado por Intervet Inc. como uma vacina líquida.EQUICINE II® contém vírus de influenza A/Pennsylvania/63 inativado (ou"A/Pa/63") e vírus de influenza A/eqüino/Kentucky/93 (ou "A/KY/93") comcarbopol (isto é, HAVLOGEN® (Intervet Inc.)). Mais especificamente, umadose de EQUICINE II® contém: A/Pa/63 inativado a 1060 EID50, A/KY/93 ina-tivado a 106'7 EID50, 0,25 % em volume de carbopol, e PBS suficiente paracriar um volume total de 1 ml.
*** A/KY/91 é uma vacina secada por congelamento que foi reconstituídacom água. Tal reconstituição foi conduzida usando água do tipo para vacinasuficiente para trazer a dosagem de vacina para um volume total de 1 ml. Avacina continha vírus de influenza eqüino/Kentucky/91 (ou "A/KY/91"), e édebatida, por exemplo, nas patentes U. S. Nos. 6.436.408; 6.398.774; e6.177.082, que são incorporadas por referência em sua totalidade nesta pa-tente. Quando reconstituída, uma dose da vacina continha A/KY/91 a 107,2TCID50 por ml, 0,015 grama de N-Z AMINE AS® por ml, 0,0025 de gramagelatina por ml, e 0,04 grama de Iactose de D por ml. N-Z AMINE AS® é umafonte refinada de aminoácidos e peptídeos produzida por hidrólise enzimáti-ca de caseína. N-Z AMINE AS® é comercializada por Kerry Bio-Science(Norwich, NY, USA).
RESULTADOS:
Todos cães vacinados soroconverteram-se seguindo a vacina-ção e as titulações de Hl variaram de 10 a 80 para cães do grupo de vacinade EQUICINE II® comparadas a 10 a 40 para os cães do grupo de vacina deA/KY/91 usando um vírus de influenza eqüina (tipo H3N8).
As amostras colhidas em 2 semanas pós-vacinação (pós-segunda vacinação para vacina de EQUICINE II®) foram analisadas paradeterminação da titulação de Hl com uma influenza canina como tambémcom um vírus de influenza eqüina (tipo de H3N8). Os resultados de Hl sãomostrados na Tabela 32. Os sinais clínicos incluem febre (>103°F; >39,4gC),tosse ocasional, e secreção nasal moderada observados seguindo o desafio.
Tabela 32. Soroloçia - Titulações de Hl em 2 semanas pós vacinação
<table>table see original document page 118</column></row><table>
* Não aplicável
Entre os bigles, 2 de 6 cães no grupo de vacina de EQUICINE Il® (Grupo 1), 1 dos 7 cães no grupo vacina de A/KY/91 (Grupo 2) e 2 de 6cães no grupo de controle (Grupo 3) tiveram febre. Um de 6 cães no Grupo 3(controle) era positivo para vírus no sobrenadante de cultura de célula dematerial de esfregaço nasal através de ensaio de hemaglutinação com 0,25% de células sangüíneas vermelhas de galinha (CRBC). Um de 6 cães nogrupo de controle (Grupo 3) e 1 de 7 cães no grupo de vacina de A/KY/91 (Grupo2) tiveram secreção nasal moderada durante o período de observação de pós-desafio. Não houve nenhuma diferença significativa estatística (P > 0,05) entreos grupos de controle e de vacina para cães da raça bigles.
Entre os cães mestiços, 5 de 7 cães no grupo de vacina deEQUICINE II® (Grupo 4), 1 de 7 cães no grupo de vacina de A/KY/91 (Grupo5) e 5 de 6 cães no grupo de controle (Grupo 6) tiveram febre. Um cão decada um do Grupo 4 e 6 teve uma secreção nasal moderada, e um cão doGrupo 5 teve uma tosse ocasional. Dois de 7 cães no grupo de vacina deEQUICINE II® (Grupo 4) e 3 de 6 cães no grupo de controle (Grupo 6) erampositivos para vírus de influenza no esfregaço nasal através de ensaio deHA. Nenhum dos cães do grupo de A/KY/91 (Grupo 5) era positivo para vírusde influenza nos materiais de esfregaço nasal.CONCLUSÃO:
Mediante sorologia, foi demonstrado que vacinação de cãescom vacinas de influenza eqüina comercialmente disponíveis estimulou umaresposta de anticorpo de influenza nível moderado. Pode haver alguma dife-rença de raça no desenvolvimento de sinais clínicos relacionados à influenzaem cães seguindo um desafio com vírus de influenza do tipo H3N8. A vacinade influenza eqüina atenuada viva (A/KY/91) forneceu uma proteção signifi-cativa (P < 0,05) de desenvolvimento da doença clínica em temperatura retalem cães mestiços. Também, a vacina viral atenuada viva impediu a propa-gação do vírus de influenza nas secreções nasais.
EXEMPLO 20 - DESENVOLVIMENTO DE MODELO DE DESAFIO DE IN-FLUENZA CANINA
Em vista dos relatórios que induzir doença em caninos para pro-pósitos de estudo não tiveram sucesso, o potencial para usar um vírus deinfluenza canina, H3N8, para desenvolver um modelo de desafio de influen-za canina em cães foi investigado no estudo a seguir.
PROCEDIMENTO:
Dez cães mestiços de sexo misto foram obtidos de um fornece-dor comercial, e alojados em jaulas em uma instalação de BSL-2. Os cãesforam atribuídos fortuitamente a dois grupos de 5 cães cada. Como mostra-do na Tabela 33, um grupo foi submetido a um desafio intratraquea-no/intranasal, e o outro grupo foi submetido.
<table>table see original document page 120</column></row><table>
Os cães foram desafiados em aproximadamente 12 semanas deidade. Vírus de influenza canina cultivado em ovo de galinha embrionado(A/canine/Florida/242/03) foi usado como vírus de desafio. Cada cão rece-beu um total de cerca de 107,2 TCID50 de vírus em ou 2 ml (para via orona-sal) ou 4 ml (via intratraqueana/intranasal) de volume.
Para desafio intratraqueano/intranasal, 3 ml do vírus de desafioforam administrados primeiro na traquéia, seguido por 5 ml de PBS usandoum tubo de liberação que consistiu em um tubo traqueano embanhado (Ta-manho 4,5/5,0, Sheridan1 USA) e tubo de alimentação (tamanho 5Fr, 1,7mm; 41 cm (16 polegadas) em comprimento, Kendall, USA), e 1 ml de vírusde desafio, seguido por 3 ml de ar atmosférico foram administrados nas na-rinas usando uma seringa.
Para desafio oronasal, o vírus de desafio foi administrado comouma névoa usando um nebulizador (Nebulair®, DVM Pharmaceuticals, Inc.,Miami, FL) em cerca de 2 ml de volume. Os cães foram observados parasinais clínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. Os cães fo-ram eutanizados no dia 14 pós-desafio, e amostras de tecido (pulmão e tra-quéia) foram colhidas em 10 % de formalina tamponada para exame histopa-tológico
RESULTADOS:
Todos cães nos grupos 1 e 2 desenvolveram sinais clínicos deinfluenza canina dentro de 24 a 48 horas. Cada cão teve 2 ou mais dos si-nais clínicos a seguir: febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular so-rosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito,diarréia, depressão, perda de peso, entalo, Hemoptise, e estertores audíveis.Tecidos pulmonares de 5 de 5 cães do grupo 1 e 4 de 5 cães do grupo 2tiveram lesões histopatológicas que incluíram um ou mais dos seguintes:broncopneumonia supurativa difusa, bronquite/bronquiolite com tampões deexsudato neutrofílico nos Iumens e agregação de células mononuclearesmarcadas no tecido mucosa e peribronquiolar, exsudato misturado dentrodos alvéolos com números grandes de macrófagos espumosos, plasma Iin-focelular e celular como também infiltração de célula granulocítica, e espes-samento de septos alveolares com proliferação de pneumócitos do tipo Ilcompatível ou patognômica para uma infecção do vírus de influenza. As a-mostras de tecido de traquéia eram normais.
CONCLUSÃO:
Um isolado de influenza canina de H3N8 tal como o usado nesteestudo pode ser usado para induzir doença de influenza canina em cães u-sando um dos métodos descritos neste estudo ou um método similar.EXEMPLO 21 - DESAFIO DE MODELO DE DESENVOLVIMENTO DE IN-FLUENZA CANINA
O potencial para usar um vírus de influenza canina, H3N8, paradesenvolver um modelo de desafio de influenza canina em cães foi tambéminvestigado no estudo a seguir.
PROCEDIMENTO:
Quinze cães mestiços de 17 - 18 semanas de idade e cinco bi-gles de 15 semanas de idade foram obtidos de fornecedores comerciais, eforam alojados em jaulas em uma instalação de BSL-2. Os cães mestiçosforam atribuídos fortuitamente a 3 grupos (Grupos 1 a 3) de 5 cães cada.Todos os bigles foram atribuídos a um grupo (Grupo 4) como mostrado naTabela 34:
Tabela 34. Projeto experimental <table>table see original document page 121</column></row><table>Os cães foram desafiados oronasalmente com um vírus de in-fluenza canina virulento, A/Canine/Florida/242/2003 (isolado de pulmão deum cão galgo com doença de influenza canina (fornecido por Dr. CyndaCrawford na Universidade de Flórida)). O vírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) em cerca de 2 ml devolume. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados à influ-enza por 14 dias pós-desafio.
RESULTADOS:
Oitenta por cento (4 de 5) dos cães nos Grupos 1 e 4, 100 % dos cães nos Grupos 2 e 3, desenvolveram sinais clínicos de influenza cani-na dentro de 48 horas. Cada cão teve um ou mais dos sinais clínicos a se-guir: febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopuru-lenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão,perda de peso, entalo, e estertores. Os sinais clínicos observados nos bigles foram em geral mais moderados e de curso curto comparados aos cãesmestiços.
CONCLUSÃO:
Um isolado de influenza canina de H3N8 tal como o usado nesteestudo pode ser usado por induzir doença semelhante à influenza canina ou tosse canil em cães usando o método descrito neste estudo ou um métodosimilar com uma faixa de dose de desafio de 104'8 a 106,8 TCID50. Houve al-gumas diferenças nos sinais clínicos observados em cães mestiços e bigles.Em geral, bigles tendem a ter sinais clínicos relacionados à influenza maismoderados comparados aos cães mestiços.
EXEMPLO 22 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CA-NINA.
O estudo a seguir foi conduzido para avaliar a eficácia de umavacina de influenza eqüina de H3N8 em cães contra vírus de influenza canina.
PROCEDIMENTO:
Dezessete cães mestiços de 14 semanas de idade e dez biglesde 8 semanas de idade foram obtidos de fornecedores comerciais. Os cãesforam atribuídos fortuitamente a 5 grupos como mostrado na Tabela 35, e<table>table see original document page 123</column></row><table>
A vacina usada neste estudo era uma vacina de vírus de influ-
enza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02).Para preparar esta vacina, o vírus foi inativado através de etilenimina binária(BEI) usando um método padrão. Cada dose de vacina continha HAVLO-GEN® (10 % v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10% de timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar
o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dose total para
1 ml.
Os cães nos Grupos 1 e 4 foram vacinados com 2 doses da va-cina. A segunda dose (isto é, o reforço) foi administrada 4 semanas após aprimeira. Os cães no Grupo 2 foram vacinados com 1 dose em 18 semanasde idade. Amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titulação de Hlusando um protocolo padrão (por exemplo, SAM 124, CVB, USDA, Ames,IA) com um isolado de influenza canina de H3N8 nos dias zero (antes davacinação), 7, e 14 pós primeira e segunda vacinações. Cerca de 5 dias an-tes do desafio, os cães foram movidos para uma instalação de BSL-2 e alo-jados em jaulas individuais.
Todos os vacinados e cães de controle com idade equiparadaforam desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento(107,7 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação dos Grupos 1 a 4 e primeira vacinação do Grupo 2. Ovírus de desafio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador(Nebulair®) a 2 ml por cão. Os cães foram observados para sinais clínicosrelacionados à influenza por 17 dias pós-desafio. Esfregaços nasais e orofa-ríngeos foram colhidos em tubos contendo 2 ml de meio de transporte devírus para isolamento de vírus do dia -1 (isto é, um dia antes do desafio) aodia 17 pós-desafio. Todos os cães foram eutanizados no dia 17 pós-desafioe amostras pulmonares e traqueanas foram colhidas em 10 % de formalinatamponada para histopatologia. Foram colhidas amostras de sangue nosdias 7 e 14 pós-desafio para determinação da titulação de Hl. As tarefas decontagem de sinal clínico usadas para a observação pós-desafio estão mos-tradas na Tabela 36.
RESULTADOS:
Todos os cães nos grupos de vacinação de 2 doses (Grupo 1 e4) desenvolveram respostas de titulação de anticorpo de Hl ao vírus de iso-lado de influenza canina (Tabela 37). Seguindo o desafio, cerca de um au-mento de 4 vezes na titulação no dia 14 pós-desafio em todos os grupos in-diretamente indicou que todos os cães foram expostos ao vírus de desafio.Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais a seguir de influenza canina:febre; >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosa ou mucopurulenta,secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, depressão, perdade peso, e dispnéia. Vacinados tiveram sinais clínicos menos severos, com-parados aos controles com idade equiparada (Tabela 38). Houve uma redu-ção significativa nos sinais clínicos devido à vacinação de 2 doses em am-bos os cães de 8 semanas de idade (P = 0,040) e 14 semanas de idade (P =0,003) (Grupos 4 e 1 respectivamente). Neste experimento, a vacinação deuma dose não forneceu uma redução significativa (P = 0,294) nos sinais clí-nicos (Grupo 2).
Resultados de isolamento de vírus estão mostrados na Tabela39. Entre os cães de 14 semanas de idade, o vírus de influenza canina foiisolado das amostras de esfregaço colhidas de 2 de 7 cães (29 %) do grupode vacina de 2 doses (Grupo 1), 3 de 5 cães (60 %) do grupo de vacina de 1dose (Grupo 2), e 5 de 5 cães (100 %) do grupo de controle (Grupo 3). Entreos cães 8 semanas de idade, o vírus foi isolado de 1 de 5 cães (20 %) dogrupo de vacina de 2 doses (Grupo 4), e 4 de 5 cães (80 %) do grupo decontrole (Grupo 5). Houve uma redução significativa (P = 0,003) no númerode cães positivos para vírus de influenza canina em amostras de esfregaçodevido à vacinação de 2 doses (Grupos 1 e 4) comparado aos controles não-vacinados (Grupos 3 e 5). Embora houvesse uma redução no número decães (60 % vs. 100 %) positivos para vírus de influenza canina em amostrasde esfregaço entre o grupo de vacina de 1 dose (Grupo 2) e o grupo de con-trole (Grupo 3), a diferença não era estatisticamente significativa (P = 0,222).
Avaliação histopatológica de amostras de tecido pulmonar e tra-queano para lesões foi conduzida para identificar lesões compatíveis ou pa-tognômicas para doença de influenza canina. Esta inclui, por exemplo, de-terminação se um ou mais dos seguintes existem: áreas com broncopneu-monia supurativa; peribronquite/peribronquiolite com agregação de célulasmononucleares (linfócitos, células plasmáticas); presença de tampões derestos celulares granulocíticos nos lúmens; hiperplasia do epitélio respirató-rio; exsudato misturado nos alvéolos com quantidade grande de células gra-nulocíticas e restos celulares; agregados (espumosos) de macrófagos, célu-las plasmáticas, e linfócitos; e espessamento dos septos alveolares com pro-liferação de pneumócitos do tipo II.
Tabela 40 fornece um sumário da extensão das lesões nesteexperimento para os cães. Entre os cães de 14 semanas de idade, as lesõespulmonares eram menos extensivas e menos severas em 5 de 7 cães nogrupo de vacinação de 2 doses (Grupo 2), e 4 de 5 cães no grupo de vaci-nação de 1 dose (Grupo 1). Todos cães de controle (Grupo 3) tiveram lesõesseveras e extensivas sugestivas de nenhuma proteção. Não houve nenhumadiferença nas lesões traqueanas devido à vacinação de 1 ou 2 doses entreos cães de 14 semanas de idade. Entre os cães 8 semanas de idade, nãohouve nenhuma diferença nas lesões pulmonares entre os cães com vacinade 2 doses e de controle. Nenhum dos cães teve qualquer lesão traqueana.
CONCLUSÃO:
Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vírus de influ-enza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas de anticorpo de Hlreativas cruzadas de vírus de influenza canina em cães vacinados, (2) usode uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a severi-dade da doença do vírus de influenza canina em cães, e (3) uso de uma va-cina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a excreção de vírusem secreções nasais e/ou orais.
Tabela 36. Sinais clínicos e sistema de classificação
<table>table see original document page 126</column></row><table>Tabela 36. Sinais clínicos e sistema de classificação
<table>table see original document page 127</column></row><table><table>table see original document page 128</column></row><table>Tabela 37. continuação
<table>table see original document page 129</column></row><table>TABELA 38. Análise das contagens clínicas totais da doenca de influenza canina
<table>table see original document page 130</column></row><table>Tabela 39
<table>table see original document page 131</column></row><table><table>table see original document page 132</column></row><table>Tabela 40. Avaliação histopatológica das amostras de tecido
<table>table see original document page 133</column></row><table>"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza"+/-" Lesão moderada (inconclusa)"-" Normal
EXEMPLO 23 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CA-NINA
O estudo a seguir foi conduzido para determinar a eficácia deuma vacina de influenza eqüina multivalente de H3N8 contra vírus de influ-enza canina em cães.PROCEDIMENTO:
Dezessete bigles de 15 semanas de idade foram obtidos de umfornecedor comercial. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 3 gruposcomo mostrado na Tabela 41, e alojados em uma instalação de pesquisa.
<table>table see original document page 134</column></row><table>
A vacina usada neste estudo foi uma vacina de influenza eqüinainativada com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02, A/eqüino/KY/93, e A/eqüino/NM/2/93). Para preparar esta vacina, os vírus foram inativa-dos através de etilenimina binária (BEI) usando um método padrão. Cadadose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 2048 unidades de HA decada um do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) defenol vermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS sufi-ciente para trazer o volume de dose total para 1 ml.
Os cães no Grupo 1 foram vacinados com 2 doses da vacina. Asegunda dose (isto é, reforço) foi administrada 4 semanas após a primeiradose. Os cães no Grupo 2 foram vacinados com 1 dose de vacina em 19semanas de idade. Amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titula-ção de Hl usando um protocolo padrão com um isolado de influenza caninade H3N8 nos dias zero (antes da vacinação), 7, e 14 pós-primeira e pós-segunda vacinações. Sete dias antes do desafio, os cães foram removidospara uma instalação de BSL-2 e alojados em jaulas individuais.
Todos cães de controle vacinados e de idade equiparada foramdesafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento (107'3TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segundavacinação do Grupo 1 e pós-primeira vacinação do Grupo 2. O vírus de de-safio foi administrado como uma névoa usando um nebulizador (Nebulair®) a2 ml por cão. Os cães foram observados para sinais clínicos relacionados àinfluenza durante 14 dias pós-desafio. Todos os cães foram eutanizados nodia 14 pós-desafio, e amostras de pulmão e traquéia foram colhidas em 10% de formalina tamponada para histopatologia. As amostras de sangue fo-ram colhidas nos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação da titulação deHl. As tarefas de contagem de sinal clínico usadas para a observação pós-desafio estão mostradas na Tabela 42.
RESULTADOS:
Todos cães vacinados desenvolveram respostas de titulação deanticorpo de Hl ao isolado de vírus de influenza canina (Tabela 43). Seguin-do o desafio, cerca de um aumento de 4 vezes na titulação de Hl no dia 14pós-desafio comparado indiretamente à titulação de Hl pré-desafio em todos osgrupos indica que todos os cães foram expostos ao vírus de desafio. Todos oscães exibiram sinais doença de influenza canina com cada cão demonstrandoum ou mais dos sinais clínicos a seguir: febre >39,4°C (>103,0°F), tosse,secreção ocular sorosa ou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou muco-purulenta, vômito, diarréia, depressão, perda de peso, e dispnéia. Vacinadostiveram sinais clínicos menos severos, comparados aos controles com idadeequiparada (Tabela 44). Houve uma redução significativa (P = 0,028) nossinais clínicos devido à vacinação de 2 doses em cães (Grupo 1). Uma vaci-nação de dose não forneceu uma redução significativa (P = 0,068) nos sinaisclínicos (Grupo 2).
Como no Exemplo 22, avaliação histopatológica de amostras detecido pulmonar e traqueano para lesões foi conduzida para identificar aslesões compatíveis ou patognômicas para doença de influenza canina. Ta-bela 45 fornece um sumário da extensão das lesões neste experimento paraos cães. Entre cães de 15 semanas de idade, a vacinação de cães com 1dose ou 2 doses impediu as lesões pulmonares em todos os cães. Quatro de5 cães de controle (80 %) tiveram broncopneumonia supurativa severa con-sistente com uma doença de influenza. Um dos 7 cães do grupo de vacinade 2 doses (Grupo 1) e 1 de 5 cães do grupo de controle (Grupo 3) tiveramlesões de traquéia moderadas sugestivas de traqueíte que poderiam ser a-tribuídas à doença de influenza.
CONCLUSÃO:
Os resultados deste estudo demonstram que 1) Vírus de influ-enza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas reativas cruzadas doanticorpo de vírus de influenza canina Hl em cães vacinados, e 2) Uso deuma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 pode reduzir a severidadeda doença do vírus de influenza canina em cães.
Tabela 42. Sinais clínicos e sistema de contagem <table>table see original document page 136</column></row><table>Tabela 42. Sinais clínicos e sistema de contagem
<table>table see original document page 137</column></row><table><table>table see original document page 138</column></row><table><table>table see original document page 139</column></row><table>Tabela 45. Avaliação histopatológica das amostras de tecido
<table>table see original document page 140</column></row><table>
"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza"+/-" Lesões moderadas (inconclusas)"-" Normal
EXEMPLO 24 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CANINA
O estudo a seguir foi conduzido para determinar: (1) a eficáciadas vacinas de influenza eqüina de H3N8 monovalente versus multivalentecontra vírus de influenza canina em cães, e (2) o efeito da via de administra-ção na eficácia da vacina.PROCEDIMENTO:
Trinta cães mestiços de 10 semanas de idade foram obtidos deum fornecedor comercial. Os cães foram atribuídos fortuitamente a 6 gruposcomo mostrado na Tabela 46, e alojados em uma instalação de pesquisa.
<table>table see original document page 141</column></row><table>
Três tipos de vacinas (VAX-1, VAX-2, e VAX-3) foram usados. OVAX-1 era uma vacina monovalente de vírus de influenza eqüina inativadocom adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02), e cada dose continhaHAVLOGEN® (10 % v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1 %(v/v) de 10 % de timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficientepara ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume dedose total para 1 ml. O VAX-2 era uma vacina monovalente de vírus de in-fluenza eqüina inativado com adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02),e cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10 % v/v), 4096 unidades deHA do vírus inativado, 0,1 % (v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenolvermelho, NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficientepara trazer o volume de dose total para 1 ml. O VAX-3 era uma vacina multi-valente de influenza eqüina inativada com adjuvante de HAVLOGEN®,(A/eqüino/KY/02, A/eqüino/KY/93, e A/eqüino/NM/2/93), e continha HAVLO-GEN® (10 % v/v), 2048 unidades de HA de vírus inativado por cepa, 0,1 %(v/v) de 10 % timerosal, 0,1 % (v/v) de fenol vermelho, NaOH suficiente paraajustar o pH em 6,8 a 7,2, e PBS suficiente para trazer o volume de dosetotal para 1 ml. Todos os vírus de influenza usados para a formulação devacina foram inativados através de etilenimina binária (BEI) usando um mé-todo padrão.
As vacinas e vias de administração para cada grupo são descri-tas na Tabela 46. Todos cães nos grupos vacinados foram vacinados pormeio da via intranasal (IN) ou via subcutânea (SQ)1 e cada cão recebeu 2doses. A segunda dose (isto é, reforço) foi administrada 4 semanas após aprimeira dose. As amostras de sangue foram colhidas para avaliar a titulaçãode Hl usando um protocolo padrão com um isolado de infIuenza canina deH3N8 nos dias zero (antes da vacinação), 7, e 14 pós-primeira e pós-segunda vacinações. Sete dias antes do desafio, os cães foram movidos dauma instalação de BSL-2 e alojados em jaulas individuais.
Todos os cães vacinados e de controle de idade equiparada fo-ram desafiados oronasalmente com um vírus de influenza canina virulento(107,4 TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segunda vacinação. O vírus de desafio foi administrado como uma névoausando um nebulizador (Nebulair®) em um volume de 2 ml por dia. Os cãesforam observados para sinais clínicos relacionados à influenza por 14 diaspós-desafio. As amostras de sangue foram colhidas nos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação de titulação de Hl. Todos os cães foram eutani-zados no dia 14 pós-desafio, e amostras do pulmão e da traquéia foram co-lhidas em 10 % de formalina tamponada para histopatologia. As tarefas decontagem de sinal clínico usadas para a observação pós-desafio estão mos-tradas na Tabela 47.RESULTADOS:
Todos os cães vacinados por meio da via de SQ desenvolveramrespostas de titulação de anticorpo de Hl para o isolado de vírus de influenzacanina, independente do tipo de vacina (Tabela 48). Nenhum dos cães dosgrupos de vacinação IN (isto é, Grupos 1, 3, e 5) desenvolveram respostasde titulação de anticorpo de Hl para o vírus de isolado de influenza canina,independente do tipo de vacina, durante o período de pós vacinação. Porém,houve um aumento de 4 vezes na titulação 14 pós-desafio em todos os cãesindiretamente, indicando que todos os cães foram expostos ao vírus de de-safio (Tabela 47).
Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais clínicos a seguirde influenza canina: febre >39,4°C (>103,0°F), tosse, secreção ocular sorosaou mucopurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréi-a, depressão, perda de peso, e dispnéia. Vacinados tiveram sinais clínicosmenos severos, comparados aos controles com idade equiparada (Tabela49). Houve uma redução significativa nos sinais clínicos em cães vacinadoscom VAX-3 por meio da via de SQ (Grupo 4). Neste experimento, adminis-tração de IN ou VAX-1, VAX-2, ou VAX-3 não forneceu uma redução signifi- cativa nos sinais clínicos de vírus de influenza canina.
Como nos Exemplos 22 e 23, avaliação histopatológica das a-mostras de tecido pulmonar e traqueana para lesões foi conduzida para i-dentificar lesões compatíveis ou patognômica para doença de influenza ca-nina. Tabela 50 fornece um sumário da extensão das lesões neste experi-mento para os cães. Cinco dos 5 cães de controle (Grupo 6) tiveram consis-tência de lesões pulmonar com uma infecção de influenza. Dois dos 5 cãesvacinados com VAX-2 por meio da via SC (Grupo 2) e 3 dos 5 cães vacina-dos com VAX-3 por meio da via de SC (Grupo 4) estavam livres de qualquerlesão pulmonar relacionada à influenza. Todos os cães que receberam avacina por meio da via intranasal, independente do tipo de vacina, tiveramlesões pulmonares severas consistentes com uma infecção de influenza. Aslesões de traquéia observadas neste estudo eram muito moderadas.
CONCLUSÃO:
Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vírus de influ-enza eqüina inativado de H3N8 pode induzir respostas reativo cruzadas deanticorpo de Hl do vírus de influenza canina em cães vacinados por meio davia SQ, (2) administração intranasal de vacina monovalente (VAX-1 e VAX-2) ou multivalente (VAX-3) não foi eficaz em cães, e (3) administração sub-cutânea de vacina multivalente (VAX-3) forneceu uma redução significativa(P = 0,016) na severidade da doença de vírus de influenza canina em cães.Tabela 47. Sinais clínicos e sistema de contagem <table>table see original document page 144</column></row><table>Tabela 47. Sinais clínicos e sistema de contagem
<table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table>Tabela 48. -continuação-
<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>
* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 8.2(os grupos de vacina foram comparados usando o teste de soma de classifi-cação de Wilcoxon)
<table>table see original document page 148</column></row><table>Tabela 50. Avaliação histopatológica das amostras de tecido
<table>table see original document page 149</column></row><table>
"+" Lesão severa consistente ou patognômica para uma infecção de influenza"+/-" Lesão moderada (inconclusa)"-" Normal
EXEMPLO 25 - ESTUDO DE EFICÁCIA DA VACINA DE INFLUENZA CA-NINA
Doença de influenza canina é causada por um vírus de influenzade H3N8 (CIV). CIV é muito estritamente relacionado ao vírus de H3N8 e-qüino (Crawford et al., 2005) θ infeta todos os cães expostos. Cerca de 80 %dos cães expostos desenvolvem sinais clínicos. No estudo a seguir a eficá-cia de uma vacina de vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 e umavacina de vírus de influenza canina foi determinada.
PROCEDIMENTO:
Trinta e cinco bigles e cinco cães mestiços foram usados nesteestudo. Bigles foram atribuídos fortuitamente a três grupos (Tabela 51). To-dos os cães mestiços foram atribuídos ao grupo de controle (Grupo 3). To-dos os cães foram alimentados com uma dieta de crescimento padrão e á-gua estava disponível à vontade.
<table>table see original document page 150</column></row><table>
Os cães nos Grupos 1 e 2 foram vacinados com VAX-1 ou VAX-2(Tabela 51). VAX-1 era uma vacina de vírus de influenza eqüina inativadocom adjuvante de HAVLOGEN®, (A/eqüino/KY/02). Para preparação da va-cina, o vírus de vacina foi inativado através de etilenimina binária (BEI) u-sando um método padrão. Cada dose de vacina continha HAVLOGEN® (10%v/v), 6144 unidades de HA do vírus inativado, 0,1% (v/v) de 10% timero-sal, 0,1% (v/v) de fenol vermelho e PBS suficiente para trazer o volume dedose total para 1 ml e NaOH suficiente para ajustar o pH em 6,8 a 7,2.
VAX-2 era uma vacina de antígeno de influenza canina inativa-da, com adjuvante de CARBIGEN®, (A/canine/FI/43/2004). O A/canine/FI/43/2004 foi inativado através de etilenimina binária ("BEI") usando um méto-do padrão. Cada dose da vacina continha 5 % em massa de CARBIGEN®,aproximadamente 1280 unidades de HA do vírus inativado, PBS suficientepara trazer o volume total da dose para 1 ml, e NaOH suficiente para ajustaro pH para entre 7,2 e 7,4. As amostras de soro de todos os cães foram co-lhidas no dia das primeira e segunda vacinações, dias 7 e 14 pós-primeira epós-segunda vacinações, e no pré-desafio para determinar as titulações deHl usando um protocolo padrão de vírus de influenza eqüina de H3N8 (SAM124, CVB, USDA, Ames, IA). Sete dias antes do desafio, os cães foram mo-vidos para uma instalação de ABSL-2 e alojados em jaulas individuais.
Todos cães vacinados e de controle de idade equiparada foramdesafiados oronasalmente com vírus de influenza canina virulento (107,2TCID50 de A/Canine/Florida/242/2003 por cão) em 2 semanas pós-segundavacinação. O vírus de desafio foi administrado como uma névoa (2 ml/cão)usando um nebulizador (Nebulair®). Os cães foram observados para sinaisclínicos relacionados à influenza por 14 dias pós-desafio. Esfregaços nasaise orofaríngeos foram colhidos diariamente em tubos contendo 2 ml de meiode transporte de vírus para isolamento do vírus do dia -1 (isto é, um dia an-tes de desafio) ao dia 14 pós-desafio. Amostras de sangue foram colhidasnos dias 7 e 14 pós-desafio para determinação de titulação de Hl. As tarefasde contagem de sinal clínico usadas para observação de pós-desafio sãomostradas na Tabela 52.RESULTADOS:
Todos cães vacinados (Grupos 1 e 2) desenvolveram respostasde titulação de anticorpo de Hl ao vírus de isolado de influenza canina (Ta-bela 53). Todos os cães exibiram um ou mais dos sinais a seguir de influen-za canina: febre >39,4°C (>103,00F), tosse, secreção ocular sorosa ou mu-copurulenta, secreção nasal sorosa ou mucopurulenta, vômito, diarréia, de-pressão, e anorexia. Vacinados tinham sinais clínicos menos severos, com-parados aos controles com idade equiparada (Tabela 54). Houve uma redu-ção significativa (P < 0,001) nos sinais clínicos em cães vacinados com VAX-1 (Grupo 1) ou VAX-2 (Grupo 2).
Os resultados do isolamento de vírus estão mostrados nas Ta-belas 55 e 56. Seguindo um desafio de vírus de influenza canina virulento, ovírus de influenza canina foi isolado de 5 de 15 (33 %) cães do Grupo 1(VAX-1), 0 de 5 (0 %) cães do Grupo 2 (VAX-2) e 17 de 20 (85 %) de contro-les (Grupo 3). Tanto a vacina de influenza eqüina inativada (VAX-1) como avacina de vírus de influenza canina (VAX-2) demonstraram uma reduçãosignificativa (Ρ = 0,004) na eliminação do vírus em secreções nasais ou orais
ou ambas (Tabela 55) comparados aos controles.
CONCLUSÃO:
Os resultados deste estudo demonstram que: (1) vacinas de vírus de influenza eqüina inativado de H3N8 e de vírus de influenza caninapodem induzir respostas reativas de anticorpo de Hl de vírus de influenzacanina em cães vacinados, (2) uso de uma vacina de vírus de influenza e-qüina de H3N8 ou de vírus de influenza canina pode reduzir a severidade dadoença do vírus de influenza canina em cães, e (3) uso de uma vacina de vírus de influenza eqüina de H3N8 ou de vírus de influenza canina pode re-duzir a excreção de vírus em secreções nasais e/ou orais.
<table>table see original document page 152</column></row><table>Tabela 52. Sinais clínicos e sistema de classificação
<table>table see original document page 153</column></row><table><table>table see original document page 154</column></row><table><table>table see original document page 155</column></row><table><table>table see original document page 156</column></row><table>Tabela 54. Análise das contagens clínicas totais de doença de influenza canina
<table>table see original document page 157</column></row><table>
* Analisado usando um procedimento de NPARIWAY de SAS® Versão 9.1 ps grupos de vacina foram comparados usando o procedimento de GLM)
Tabela 55. Eliminação do vírus pós-desafio
<table>table see original document page 157</column></row><table>
* Analisado usando um procedimento de FREQ de SAS® (Versão 9.1) e va-lor P associado ao teste exato de Fisher<table>table see original document page 158</column></row><table><table>table see original document page 159</column></row><table><table>table see original document page 160</column></row><table><table>table see original document page 161</column></row><table><table>table see original document page 162</column></row><table>
As palavras "compreendem", "compreende", e "compreendendo"nesta patente (incluindo as reivindicações) são para ser interpretadas inclu-sivamente ao invés de exclusivamente. Esta interpretação é intencionada serigual à interpretação que estas palavras são dadas sob lei de patentes dosEstados Unidos.
A descrição detalhada acima das modalidades preferidas é in-tencionada apenas para familiarizar outros versados na técnica com a inven-ção, seus princípios, e sua aplicação prática de forma que outros versadosna técnica possam adaptar e aplicar a invenção em suas numerosas formas,como elas podem ser melhores adaptadas aos requerimentos de um usoparticular. Portanto, esta invenção não é limitadà às modalidades acima, epode ser variadamente modificada.
Deveria ser entendido que os exemplos e modalidades descritosaqui são para propósitos ilustrativos apenas e que várias modificações oualterações na luz da mesma serão sugeridas às pessoas versadas na técni-ca e serão incluídas dentro do espírito e esfera deste pedido de patente.REFERENCIAS
Patente U. S. N2 5.106.739
Patente U. S. N2 5.034.322
Patente U. S. N2 6.455.760
Patente U. S. Na 6.696.623
Patente U. S. N2 4.683.202
Patente U. S. N24.683.195
Patente U. S. N2 4.800.159
Patente U. S. N2 4.965.188
Patente U. S. N2 5.994.056
Patente U. S. N2 6.814.934
Patente U. S. N2 6.436.408
Patente U. S. N2 6.398.774
Patente U S. N2 6 177.082
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20040078841
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20040067506
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20040019934
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20030177536
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20030084486
Pedido de Patente Publicado U. S. N2 20040123349
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<110> Crawford, Patti CynthiaGibbsl E- Paul J.Dubovi, Bdward J-Doxii s, Ruben OmarKatz, Jacgueline M.Klimcrv, Alexander I.Lakshmanan, Hallakannu P.Lum, Melissa AnneGoovaerts, Daniel Ghislena EmielMellencamp,. Mark William
<120> VÍRUS DE INFLUENZA CAPAZES DE INFECTAR CANÍDEOS, USOS DOSMESMOS
<130>
<l50> US 11/409,416<151> 2006-04-21
<150> US 60/728,449<151> 2005-10-19
<150> US 60/754,881<1S1> 2005-12-29
<150> US 60/759,162<151> 2006-01-14
<150> US 60/761,451<151> 2006-01-23
<150> US 60/779,080<151> 2006-03-03
<160> 88
<170> patente em versão 3.3
<210> ι
<211> 2277<212> DHA
<2i3> Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1)..(2277)
<400> 1
atg gag aga ata gaa gaa ctg aga gat ctg atg tta caa tcc cgc acc 48
Met Glu Arg Ile Glu Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr1 5 10 15
cgc gag ata cta aca aaa act act gtg gac cac atg gcc ata ate aag 96
Arg Glu Xle Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys20 25 30
aaa tac aca tca gaa aga caa gag aag aac cct gea ctt agg atg aaa 144
Lys Tyr Thr Ser Glu Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys35 40 45
tgg atg atg gca atg aaa tac cca att aca gca gat aag agg ata atg 192
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Xle Thr Ala Asp Lys Arg He Met
50 55 1 60
gag atg att cct gag aga aat gaa cag ggt caa acc ctt tgg age aaa 240
Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys
65 70 75 80
acg aac gat gct ggc tca gac cgc gta atg gta tca cct ctg gca gtg
Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val
85 90 95
aca tgg tgg aat agg aat gga cca aca acg age aca att cat tat cca 336
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro
100 105 110
aaa gtc tac aaa act tat ttt gaa aag gtt gaa aga ttg aaa cac gga 384
Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly
115 120 125
act ttt ggc ccc gtt cat ttt agg aat caa gtc aag ata aga cga aga 432
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg
130 135 140
gtt gat gta aac cct ggt cac gcg gac etc agt gcc aaa gaa gca caa 480
Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln
145 150 155 160
gat gtg ate atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc ata att 528
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Ile Ile
165 170 175
cta aca tcg gaa tca caa cta aca ata acc aaa gag aaa aag gaa gaa 576
Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu
180 185 190
ctt cag gac tgc aaa att gct ccc ttg atg gta gca tac atg cta gaa 624
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro L>eu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu
195 200 205
aga gag ttg gtc cga aaa aca agg ttc etc cea gta gca ggc gga aca 672
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Ala Gly Gly Thr
210 215 220
age agt gta tac att gaa gtg ttg cat ctg act cag gga aca tgc tgg 720
Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp
225 230 235 240
gag caa atg tac acc cca gga gga gaa gtt aga aac gat gat att gat 768
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp
245 250 255
caa agt tta att att gca gcc cgg aac ata gtg aga aga gcg aca gta 816
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val
260 265 270
tca gca gat cca cta gca tcc cta ctg gaa atg tgc cac agt aca cag 864
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met CJys His Ser Thr Gln275 280 285
att ggt gga ata agg atg gta gac ate ctt aag cag aat cca aca gag 912
Ile Gly Gly Ile Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu
290 295 300
gaa caa gct gtg gat ata tgc aaa gea gea atg gga ttg aga att ageGlu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser
960
305 310 315 320
tca tca ttc age ttt ggt gga ttc acc ttc aaa aga aca agt gga tca 1008Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
tca gtc aag aga gaa gaa gaa atg ctt acg ggc aac ctt caa aca ttg 1056Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350
aaa ata aga gtg cat gag ggc tat gaa gaa ttc aca atg gtc gga aga 1104
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg355 360 365
aga gea aca gcc att ate aaa aag gea acc aga aga ttg att caa ttg 1152Arg Ala Thr Ala Ile Ile Lys Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu370 375 380
ata gta agt ggg aga gat gaa caa tca att gct gaa gea ata att gta 1200Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val385 390 395 400
gcc atg gtg ttt tcg caa gaa gat tgc atg ata aaa gea gtt cga ggc 1248
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly405 410 415
gat ttg aac ttt gtt aat aga gea aat cag cgt ttg aac ccc atg cat 1296Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His420 425 430
caa ctc ttg agg cat ttc caa aaa gat gea aaa gtg ctt ttc cac aat 1344Gln Leu Leu Axg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe His Ãsn435 440 445
tSS 99a att Saa ccc ate gac aat gta atg ggg atg att gga ata ttg 1392Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu450 455 460
cct gac atg acc cca age acc gag atg tca ttg aga gga gtg aga gtc 1440Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val465 470 475 480
age aaa atg gga gtg gat gag tac tcc age act gag aga gtg gtg gtg 1488Ser Lys Met Qly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val485 490 495
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aaa gac ate aat gat tta aaa caa tat gac agt gat gag cca gaa gea 1200Lys Asp Ile Asn Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Ala385 390 395 400
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<212> PRT
<zi3> vírus Influenza
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<213> vírus Influenza
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aaa gat gga aga gta att gga cag act gat ata agt ttc aat ggg gga 816
Lys Asp Gly Arg Val Ile Gly Gln Thr Asp Ile Ser Phe Asn Gly Gly260 265 270
cac ata gag gag tgt tct tgt tac ccc aat gaa ggg aag gtg gaa tgc 864
His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asn Glu Gly Lys Val Glu Cys275 280 285
ata tgc agg gac aat tgg act gga aca aat aga cca gtt ctg gta ata 912
Ile Cys Arg Asp Asn Trp Thr Gly Thr Asn Arg Pro Val Leu Val Ile290 295 300
tct tct gat cta tcg tac aca gtt gga tat ttg tgt gct ggc att ccc 960
Ser Ser Asp Leu Ser Tyr .Thr Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Ile Pro305 310 315 320
act gac act cct agg gga gag gat agt caa ttc aca ggc tca tgt aca 1008Thr Asp Thr Pro Arg Gly Glu Asp Ser Gln Phe Thr Gly Ser Cys Thr325 330 335
agt cct ttg gga aat aaa gga tac ggt gta aaa ggt ttc ggg ttt cga 1056Ser Pro Leu Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg340 345 350
caa gga act gac gta tgg gcc gga agg aca att agt agg act tca aga 1104Gln Gly Thr Asp Val Trp Ala Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg355 360 365
tca gga ttc gaa ata ata aaa ate agg aat ggt tgg aca cag aac agt 1152Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn Ser
370 375 380
aaa gac caa ate agg agg caa gtg att ate gat gac cca aat tgg tca
Lys Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Aep Pro Asn Trp Ser
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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435 440 445
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450 455 460
ttt gac ate gat aag atg taaPhe Asp Ile Asp Lys Met465 470
<210> 12
<211> 470
<212> PRT
<213> Virus influenza
<400> 12
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Ala Ile Gly Phe Ala Ser Leu Gly1 5 10 15
Ile Leu Ile Ile Asn Val Ile Leu His Val Val Ser Ile Ile Val Thr20 25 30
Val Leu Val Leu Asn Asn Asn Arg Thr Asp Leu Asn Cys Lys Gly Thr35 40 45
Ile Ile Arg Lys Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Ile Thr Gln50 55 6P
Trp Tyr Asn Thr Ser Thr Ile Lys Tyr Ile Glu Arg Pro Ser Asn Glu65 70 75 80
Tyr Tyr Met Asn Asn Thr Glu Pro Leu Cys Glu Ala Gln Gly Phe Ala85 90 95
1200
1248
1296
1344
1392
1413
Pro Phe Ser Lys Asp Asn Gly Ile Arg Ile Gly Ser Arg Gly His Val100
105
110
Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Val Ser Cys Ser Pro Ser Glu Cys Arg115 120 125
Thr Phe Phe ,Leu Thr Gln Gly Ser Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn130 135 140
Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser Val Lys145 150 155 160
Xle Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ser Val Ala165 170 175
Trp Ser Ala Thr Ala Cys His Asp Gly Lys Lys Trp Met Thr Val Qly180 185 190
Val Thr Gly Pro Asp Asn Gln Ala Ile Ala Val Val Asn Tyr Gly Gly195 200 205
Val Pro Val Asp Ile Ile Asn Ser Trp Ala Gly Asp Ile Leu Arg Thr210 215 220
Gln Glu Ser Ser Cys Thr Cys Ile Lys Gly Asp Cys Tyr Trp Val Met225 230 235 240
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260
265
270
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Ser Pro Leu
Gly Asn Lys Gly Tyr Gly Val Lys Gly Phe Gly Phe Arg340 345 350
Gln Gly Thr Asp Val Trp Ala Gly Arg Thr Ile Ser Arg Thr Ser Arg355 360 365
Ser Gly Phe Glu Ile Ile Lys Ile Arg Asn Gly Trp Thr Gln Asn Ser370 375 380
Lys Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Asp Pro Asn Trp Ser385 390 395 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Thr Leu Pro Val Glu Leu Thr Lys Lys Gly405 410 415
Cys Leu Val Pro Cys Phe Trp Val Glu Met Ile Arg Gly Lys Pro Glu420 425 430
Glu Thr Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val435 440 445
Asp His Lys Ile Ala Ser Trp Ser Trp His Asp Gly Ala Ile Leu Pro450 455 460
Phe Asp Ile Asp Lys Met465 470
<210> 13
<211> 982
<212> DWA<213>
Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1) . . (756)
<400> 13
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65 70 75 80
caa aat gcc Ctt agt gga aac gga gat cca aac aac atg gac aga gca 288
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
gct agg cag atg gta cag gca atg aga acc att ggg acc cac cct age 672
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250
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<210> 14<211> 252<212> PRT <213> Vírus Infiuenza
<400> 14
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Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly lie Leu Gly Phe Val Phe50 55 60
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Gln Asn Ala Leu Ser Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala85 90 95
Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala100 105 110
Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg145 150 155 160
Ala His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lye Ala Met Glu <31η Met180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met <31u Val Ala Ser Arg195 200 205
Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser210 215 220Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gln Arg Phe Lys245 250
<210> 15
<211> 1698
<212> DNA
<2i3> vírus Influenza
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1698)
<400> 15
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Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly130 135 140
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450 455 460
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aac cga ttt cag ate aaa ggt gta gag ttg aaa tca ggc tac aaa gatAsn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp515 520 525
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1584
tgg ata ttg tgg att tca ttc gcc ata tca tgc ttc tta att tgç gtt 1632
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val530 535 540
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Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cye Gln Arg Gly Asn Ile Arg545 550 555 560
1698
<210> 16<211> 565<212> PRT<213> Vírus<400> 16
Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser15 10 15
Gln Asn Pro Ile Ser Gly Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His20 25 30His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Met Ser Asp Asp Gln35 40 45
Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly50 55 60
Lys Ile Cys Asn Lys Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr65 70 75 80
Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Phe Gln Tyr85 90 95
Glu Ser Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Asn Ala Phe Ser Asn Cys100 105 110
Tyr Pro Tyr Asp Ile Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala115 120 125
Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly130 135 140
Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp145 150 155 160
Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly Ser Ser Tyr165 170 175
Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu180 185 190
Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys195 200 205
Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser210 215 220
Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly225 230 235 240
Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp245 250 255
Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr260 265 270Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Ala Pro275 280 285
Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser290 295 300
Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys305 310 315 320
Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg325 330 335
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly340 345 350
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe355 360 365
Àrg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser370 375 380
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile385 390 395 400
Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu405 410 415
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys420 425 430
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val (Ala Leu Glu Asn435 440 445
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu450 455 460
Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly465 470 475 480
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile485 490 495
Arg Thr Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Arg Asp500 505
Glu Ala Leu Asn510Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp515 520 525
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val
530 535 540
Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Aan Ile Arg
545 550 555 560
Cys Asn Ile Cys Ile565
<210> 17
<211> 2277
<212> DNA
<213> virusinfluenza<220>
<221> CDS
<222> (1) . . (2277)
<220>
<221> misc_feature
<222> (731) . . (731)
<223> O 'Xaa" em localização 731 se estende para Val1 ou Ile
<400> 17atg gag aga ata aaa gaa ctg aga gat ctg atg tta caa tcc cgc acc 48Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr1 5 10 15
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gag atg att cct gag aga aat gaa cag gga caa acc ctt tgg age aaa 240Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys65 70 75 80
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aca tgg tgg aat agg aat gga cca aca acg age aca att cat tat -cca 336Thr Trp Trp Aen Arg Asn Gly Pro Thr Thr Ser Thr Ile His Tyr Pro100 105 110aaa gtc tac aaa act tat ttt gaa aag gtt gaa aga ttg aaa cac gga 384Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly115 120 125
acc ttt ggc ccc gtt cat ttt agg aat caa gtc aag ata aga cga aga 432Thr Phe Gly Pro Val Hie Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg130 · 135 140
gtt gat gta aac cct ggt cac gcg gac ctc agt gcc aaa gaa gca caa 480Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln145 150 155 160
gat gtg ate atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc aga att 528Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile165 170 175
cta aca tcg gaa tca caa cta aca ata acc aaa gag aaa aag gaa gaa 576Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu180 185 190
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age agt gta tac att gaa gtg ttg cat ctg act cag gga aca tgc tgg 720Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp225 - 230 235 240
gag caa atg tac acc cca gga gga gaa gtt aga aac gat gat att gat 768Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp245 250 255
caa agt tta att att gca gcc cgg aac ata gtg aga aga gcg aca gta 816Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val260 265 270
tca gca gat cca cta gca tcc cta ctg gaa atg tgc cac agt aca cag 864Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His. Ser Thr Gln275 280 285
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tca tca ttc age ttt ggt gga ttc acc ttc aaa aga aca agt gga tca 1008Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
tca gtc aag aga gaa gaa gaa atg ctt acg ggc aac ctt caa aca ttg 1056Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350aaa ata aga gtg cat gag ggc tat gaa gaa ttc aca atg gtc gga aga 1104Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Tlir Met Val Gly Arg355 360 365
aga gca aca gcc att ate aga aag gea acc aga aga ttg att caa ttg 1152Arg Ala Thr Ala Ile Ile Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu370 375 380
ata gta agt ggg aga gat gaa caa tca att gct gaa gca ata att gta 1200Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val385 390 395 400
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Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leμ Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr690 695 700
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<210> 18 <211> 759 <212> PRT <213> Vírus Influenza<220> <221> mi se feature<222> (731) . (731)<223> The ' Xaa' at<400> 18
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Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Glu Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp245 250 255Gln Ser Leu Ile lie. Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val260 265 270
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Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser305 310 315 320
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Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe645 650 6S5
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<210> 19<211> 2274
<212> DNA
<213> Virus Influenza
<220><221><222>
CDS
(1) . . (2274)
<400> 19
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48
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96
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144
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192
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240
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288
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336
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384
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432
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<210> 20<211> 757<212> PRT<213> Vírus Infjuenza<400> 20
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<210> 21
<211> 2151
<212> DNA
<2i3> Virus infiuenza
<220><221> CDS
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<400> 21
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act ata aga caa gaa atg gcc agt aga ggc etc tgg gat tcc ttt cgt 576
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Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Arg Phe Glu Ile Thr195 2b0 205
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aaa gac ate aat gat tta aaa caa tat gac agt gat gag cca gaa aca 1200Lys Asp Ile Asn Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Thr385 390 395 400
agg tet ctt gea agt tgg att caa agt gag ttc aac aaa gct tgt gag 1248Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile Gln Ser Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu405 410 415
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Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys705 710 715
<210> 22<211> 716<212> PRT<213> Vírus Influenza<400> 22
Met Glu Asp Phe Val Arg Glxi Cys Phe Asn Pro Met Ile Val Glu Leu1 5 10 15
Ala Glu Lys Ala Met Lys Glu Tyr Gly Glu Asn Pro Lys Ile Glu Thr20 25 30
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Ser Gly Asp Pro Asn Ala Leu Leu Lys His Arg Phe Glu Ile Ile Glu65 70 75 80
Gly Arg Asp Arg Thr Met Ala Trp Thr Val Val Asn Ser Ile Cys Asn85 90 95
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Lys Glu Asn Arg Phe Val Glu Ile Gly Val Thr Arg Arg Glu Val His115 120 125
Ile Tyr Tyr Leu Glu Lys Ala Asn Lys Ile Lys Ser Glu Lys Thr His130 135 140
Ile His Ile Phe Ser Phe Thr Gly Glu Glu Met Ala Thr Lys Ala Asp145 150 155 160
Tyr Thr Leu Asp Glu Glu Ser Arg Ala Arg Ile Lys Thr Arg Leu Phe165 170 175
Thr Ile Arg Gln Glu Met Ala ser Arg Gly Leu Trp Asp Ser Phe Arg180 185 190Gln Ser Glu Arg Gly Glu Glu Thr Ile Glu Glu Arg Plie Glu Ile Thr195 200 205
Gly Thr Met Arg Lys Leu Ala Asn Tyr Ser Leu Pro Pro Asn Phe Ser210 215 220
Ser Leu Glu Asn Phe Arg Val Tyr Val Asp Gly Phe Glu Pro Asn Gly225 230 235 240
Cys Ile Glu Ser Lys Leu Ser Gln Met Ser Lys Glu Val Asn Ala Arg245 250 255
Ile Glu Pro Phe Ser Lys Thr Thr Pro Arg Pro Leu Lys Met Pro Gly260 ' 265 270
Gly Pro Pro Cys His Gln Arg Ser Lys Phe Leu Leu Met Asp Ala Leu275 280 285
Lys Leu Ser Ile Glu Asp Pro Ser His Glu Gly Glu Gly Ile Pro Leu290 295 300
Tyr Asp Ala Ile Lys Cys Met Lys Thr Phe Phe Gly Trp Lys Glu Pro305 310 315 320
Ser Ile Val Lys Pro His Glu Lys Gly Ile Asn Pro Asn Tyr Leu Gln325 330 335
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Lys Asp Ile Asn Asp Leu Lys Gln Tyr Asp Ser Asp Glu Pro Glu Thr385 390 395 400
Arg Ser Leu Ala Ser Trp Ile Gln Ser Glu Phe Asn Lys Ala Cys Glu405 410 415
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Glu Ser Met Ile Glu Ala Glu Ser Ser Val Lys Glu Lys Asp Met Thr595 600 605
Lys Glu Phe Phe Glu Asn Lys Ser Glu Thr Trp Pro Ile Gly Glu Ser610 615 620
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Leu Ala Lys Ser Val Phe Asn Ser Leu Tyr Ala Ser Pro Gln Leu Glu645 650 655
Gly Phe Ser Ala Glu Ser Arg Lys Leu Leu Leu Ile Val Gln Ala Leu660 665 670Arg Asp Asp Leu Glu Pro Gly Thr Phe Asp Xle Gly Gly Leu Tyr Glu675 680 685
Ser Ile Glu Glu Cys Leu Ile Asn Asp Pro Trp Val Leu Leu Asn Ala690 695 700
Ser Trp Phe Asn Ser Phe Leu Thr His Ala Leu Lys705 710 715
<210> 23
<211> 838
<212> DNA
<213> Vírus |nf|uen2a
<22D>
<221> CDS<222> (1) . . (657)
<4 00> 23
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ata cta ctt aga gcc ttc acc gaa gaa gga gea gtc gtt ggc gaa att 480Val Gly Glu Ile160
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24219PRX
Vírus Influenza
<400> 24
Met Asp Ser Asn Tbr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp 5 10 15
His Val Arg Lys Arg Phe Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe20 25 30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser35 40 45
Thr Leu Gly Leu Aep Ile Glu Thr Ala Thr His Ala Gly Lys Gln Ile50 55 ' 60
Val Glu Gln Ile Leu Glu Lys Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr65 70 75 80
Ile Leu Leu145
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<210><211><212><213>
Ile Ala Ser Val Pro Thr Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Asp85 90 95
Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Thr100 105 110Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile115 120 125
Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Glu Gly Leu Glu Thr Leu130 135 140
Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Val Val Gly Glu Ile145 150 155 160
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Arg Ile Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser Hie Glu195 200 205
Asn Gly Arg Pro Ser Phe Pro Ser Lys Gln Lys210 215
<210> 25<211> 1497
<212> DNA
<213 > vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1)..<1497)
<400> 25
atg gcg tct caa ggc acc aaa cga tcc tat gaa cag atg gaa act gatMet Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp15 10 15
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85 90 95
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275 280 285
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Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe
290 295 300
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gac agt taa 1497
Asp Ser
<210> 26<211> 498<212> PRT
<213 > virus influenza
<400> 26
Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp15 10 15Gly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met20 2S 30
Val Gly Gly Ile Gly Arg Phe Tyr Val Gln Met Cys Thr Glu Beu Lys35 40 45
Leu Asn Asp His Glu Gly Arg Leu Ile Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu50 55 60
Arg Met Val Leu Ser Ala Phe Asp Glu Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu65 70 75 80
Glu His Pro Ser Ala Gly Lys Asp Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile85 90 95
Tyr Arg Arg Lys Asp Gly Lys Trp Met Arg Glu Leu Ile Leu His Asp100 105 IlO
Lys Glu Glu Ile Met Arg Ile Trp Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp115 120 125
Ala Thr Ala Gly Leu Thr Hiβ Met Met Ile Trp His Ser Asn Leu Asn130 135 140
Asp Thr Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val Arg Thr Gly Met Asp145 150 155 160
Pro Arg Met Cys Ser Leu Met Gln Gly Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser165 170 175
Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg195 200 205
Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met Cys Asn210 215 220
Ile Leu Lys Gly Lys Phe Gln Thr Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp225 230 235 240
Gln Val Arg Glu Gly Arg Asn Pro Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu245 250 255Ile Phe Leu Ala Arg Ser Ala Leu Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His260 265 270
Lys Ser Cys Leu Pro Ala Cys Val Tyr Gly Leu Ala Val Thr Ser Gly275 280 285
Tyr Asp Phe Glu Lys Glu Gly Tyr Ser Leu Val Gly Ile Asp Pro Phe290 295 300
Lys Leu Leu Gln Asn Ser Gln Ile Phe Ser Leu Ile Arg Pro Lys Glu305 310 315 320
Asn Pro Ala His Lys Ser Gln Leu Val Trp Met Ala Cys His Ser Ala325 330 335
Ala Phe Glu Asp Leu Arg Val Leu Asn Phe Ile Arg Gly Thr Lys Val340 345 350
Ile Pro Arg Gly Gln Leu Thr Thr Arg Gly Val Gln Ile Ala Ser Asn355 360 365
Glu Asn Met Glu Thr Ile Asp Ser Ser Thr Leu Glu Leu Arg Ser Lys370 375 380
Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg Ser Gly Gly Asn Thr Ser Gln Glh Arg385 390 395 400
Ala Ser Ala Gly Gln Ile Ser Val Gln Pro Thr Phe' Ser Val Gln Arg405 410 415
Asn Leu Pro Phe Glu Arg Ala Thr Ile Met Ala Ala Phe Thr Gly Asn420 425 430
Thr Glu Gly Arg Thr Ser Asp Met Arg Thr Glu Ile Ile Arg Met Met435 440 445
Glu Asn Ala Lys Ser Glu Asp Val Ser Phe Gln Gly Arg Gly Val Phe450 455 460
Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp465 470 475 480
Met Ser Asn Glu Gly Ser Tyr Phe Phe Gly Asp Asn Ala 51u Glu Phe485 490 495Asp Ser
<210> 27<211> 1410<212> DHA
<213>
Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (I)..(1410)
<400> 27
atg aat cca aat caa aag ata ata aca att gga ttt gca tca ttg ggg 48
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Phe Ala Ser Leu Gly1 5 10 15
ata tta ate att aat gtc att ctc cat gta gtc age att ata gta aca 96
Ile Leu Ile Ile Asn Val Ile Leu His Val Val Ser Ile Ile Val Thr
20 25 30
gta ctg gtc ctc aat aac aat aga aca gat ctg aac tgc aaa ggg acg 144
Val Leu Val Leu Asn Asn Asn Arg Thr Asp Leu Asn Cys Lys Gly Thr35 40 45
ate ata aga gag tac aat gaa aca gta aga gta gaa aaa att act caa 192
Ile Ile Arg Glu Tyr Asn Glu Thr Val Arg Val Glu Lys Ile Thr Gln50 55 60
tgg tat aat acc agt aca att aag tac ata gag aga cct tca aat gaa 240
Trp Tyr Asn Thr Ser Thr Ile Lys Tyr Ile Glu Arg Pro Ser Asn Glu65 70 75 80
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Tyr Tyr Met Asn Asn Thr Glu Pro Leu Cys Glu Ala Gln Gly Phe Ala85 90 95
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<210> 28
<211> 470
<212> PRT
<2i3> Vírus Influenza
<400> 28
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<210> 29<211> 982<212> DNA
<2i3> vírus Influenza
<220>
<221> CDS
<222 > (1)..(756)
<400> 29
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<210> 30
<211> 252
<212> PRT
<213> vírus Influenza
<400> 30
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1 5 10 15
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<2i3> Vírus Influenza
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<213> Vírus Influenza
<400> 33
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Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn420 425 430Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu435 440 445
Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly450 455 460
Cys Phe Lys Ile Tyir His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile465 470 475 480
Arg Thr Gly Tiir Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn485 490 495
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys Asp500 505 510
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val515 520 525
Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile Arg530 535 540
Cys Asn Ile Cys Ile545
<210> 34
<211> 549
<212> PRT
<2i3> V|-ms Infiuenza
<400> 34
Gln Asn Pro Ile Ser Asp Asn Asn Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His1 5 10 15
His Ala Val Ala Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Ser Asp Asp Gln20 25 30
Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ile Ser Met Gly35 40 45
Lys Ile Cys Asn Lys Ser Tyr Arg Ile Leu Asp Gly Arg Asn Cys Thr50 55 60
Leu Ile Asp Ala Met Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Ala Phe Gln Tyr65 70 75 80
Glu Ser Trp Asp Leu Phe Ile Glu Arg Ser Ser Ala Phe Ser Asn Cys85 90 95Tyr Pro Tyr Asp Xle Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Ile Val Ala100 105 110
Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Thr Ala Glu Gly Phe Thr Trp Thr Gly115 120 125
Val Thr Gln Asn Gly Arg Ser Gly Ala Cys Lys Arg Gly Ser Ala Asp130 135 140
Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr Lys Ser Gly. Ser Ser Tyr145 150 155 . 160
Pro Thr Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Lys Asn Phe Asp Lys Leu165 170 175
Tyr Ile Trp Gly Ile His His Pro Ser Ser Asn Gln Glu Gln Thr Lys180 185 190
Leu Tyr Ile Gln Glu Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr Lys Arg Ser195 200 205
Gln Gln Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Leu Val Arg Gly210 215 220
Gln Ser Gly Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly Asp225 230 235 240
Ile Leu Met Ile Asn Ser Asn Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly Tyr245 250 255
Phe Lys Leu Lys Thr Gly Lys Ser Ser Val Met Arg Ser Asp Val Pro260 265 270
Ile Asp Ile Cys Val Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Ser275 280 285
Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Lys Val Thr Tyr Gly Lys Cys290 295 300
Pro Lys Tyr Ile Arg Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg305 310 315 320
Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly He Phe Gly Ala Ile Ala Gly325 330 335
Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Phe340 345 350
Arg Tyr Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys Ser355 360 365
Thr Gln Ala Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Val Ile370 375 380
Glu Arg Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys Glu Phe Ser Glu385 390 395 400
Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr Lys405 410 415
Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu Asn420 425 430
Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ala Glu Met Asn Lys Leu Phe Glu435 440 445
Lys Thr Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Gly Gly450 455 460
Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys Ile Gly Ser Ile465 470 475 480
Arg Thr Gly Thr Tyr Asp His Tyr Ile Tyr Arg Asp Glu Ala Leu Asn485 490 495
Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu LyB Ser Gly Tyr Lys Asp500 505 510
Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Ile Cys Val515 520 525
Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn Ile Arg530 535 540
Cys Asn Ile Cys Ile545
<2X0> 35<211> 9
<212> DNA
<213> Virus Influenza
<400> 35gagagttgg
<210> 36<211> 9<212> DNA
<213> Virus lnfluenza
<400> 36ccgttggtc
<210> 37
<211> 9
<212> DNA
<2Χ3> Vírus Influenza
<400> 37caaaccaga
<210> 38
<211> 9
<212> DNA
<213> Virus Infiuenza
<400> 38agaactggg
<210> 39
<211> 15
<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<400> 39tatgagagtt gggac
<210> 40<211> 15<212> DNA
<213> vírus Influenza
<400> 40agaccgttgg tcaga
<210> 41
<211> 15
<212> DNA
<213> Virus Influenza
<400> 41aagcaaacca gagga<210> 42<211> 15<212> DNA
<2ΐ3> V(rus infiuenza
<400> 42ataagaactg ggaca
<210> 43<211> 9<212> DNA
<2ΐ3> Virus infiuenza
<400> 43acaatgagt
<210> 44
<211> 15
<212> DNA
<213> V{rus Influenza
<400> 44aaaacaatga gtgat
ι
<210> 45<211> 9<212> DNA
<2ΐ3> vírus Influenza
<400> 45gatgtaccc
<210> 46
<211> 15
<212> DNA
<2ΐ3> vírus Influenza
<400? 46tcagatgtac ccata
<210> 47
<211> 2280
<212> DNA
<2ΐ3> vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (X).- (2280)
<400> 47
atg gag aga ata aaa gaa ctg aga gat ctg atg tta caa tcc cgc accMet Glu Arg Xle Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thrcgc gag ata cta aca aaa act act gtg gac cac atg gcc ata ate aag 96Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys20 25 30
aaa tac aca tca gga aga caa gag aag aac cct gea ctt agg atg aaa 144Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys35 40 45
tgg atg atg gea atg aaa tac cca att aca gea gat aag agg ata atg 192Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met50 55 60
gag atg att cct gag aga aat gaa cag gga caa acc ctt tgg age aaa 240Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys65 70 75 80
acg aac gat gct ggc tca gac cgc gta atg gta tca cct ctg gea gtg 2 88Thr Asn Asp Ala Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val85 90 95
aca tgg tgg aat agg aat gga cca aca acg aac aca att cat tat cca 336Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Asn Thr Ile His Tyr Pro100 105 110
aaa gtc tac aaa act tat ttt gaa aag gtt gaa aga ttg aaa cac gga 384Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly115 120 125
acc ttt ggc ccc gtt cat ttt agg aat caa gtc aag ata aga cga aga 432Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg Arg Arg130 135 140
gtt gat gta aac cct ggt cac gcg gac ctc agt gct aaa gaa gea caa 480Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln145 150 155 160 t
gat gtg ate atg gaa gtt gtt ttc cca aat gaa gtg gga gcc aga att 528Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile165 170 175
cta aca tca gaa tca caa cta aca ata acc aaa gag aaa aag gaa gaa 576Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu180 185 190
ctt cag gac tgc aaa att gct ccc ttg atg gta gea tac atg cta gaa 624Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu195 200 205
aga gag ttg gtc cga aaa aca agg ttc ctc cca gta gta ggc gga aca 672Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Val Gly Gly Thr210 215 220
age agt gta tac att gaa gtg ttg eat ctg act cag gga aca tgc tgg 720Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp225 230 235 240
gag caa atg tac acc cca gga gga aaa gtt aga aac gat 760Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Lys Val Arg Asn Asp
gat att gatAsp He Asp
768245 250 255
caa agt tta att att gca gcc cgg aac ata gtg aga aga gca aca gta 816
Gln Ser Leu Xle Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val260 265 270
tca gca gat cca cta gca tcc cta ctg gaa atg tgc cac agt aca cag 864
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln275 280 285
att ggt gga aca agg atg gta gac ate ctt aag cag aac cca aca gag 912
Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu290 295 300
gaa caa gct gtg gat ata tgc aaa gca gca atg gga ttg aga att age 960
Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser305 310 315 ,320
tca tca ttc age ttt ggt gga ttc acc ttc aaa agg aca agt gga tca 1008
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
tca gtc aag aga gaa gaa gaa atg ctt acg ggc aac ctt caa aca ttg 1056
Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350
aaa ata aga gtg cat gag ggc tat gaa gaa ttc aca atg gtc gga aga 1104
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg355 360 365
aga gca aca gcc att ate aga aag gca acc aga aga ttg att caa ttg 1152
Arg Ala Thr Ala Ile Ile Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu370 375 380
ata gta agt ggg aíga gat gaa caa tca att gct gaa gca ata att gta 1200
Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val385 390 395 400
gcc atg gtg ttt tcg caa gaa gat tgc atg ata aaa gca gtt cga ggc 1248
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly.405 410 415
gat ttg aac ttt gtt aat aga gca aat cag cgt ttg aac ccc atg cat 1296Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His420 425 430
caa ctc ttg agg cat ttc caa aaa gat gca aaa gtg ctt ttc caa aat 1344Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn435 440 445
tgg gga att gaa ccc ate gac aat gta atg ggg atg att gga ata ttg 1392Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu450 455 460
cct gac atg acc cca age acc gag atg tca ttg aga gga gtg aga gtc 1440Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val465 470 475 480
age aaa atg gga gtg gat gag tac tcc age act gag aga gtg gtg gtg 1488Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val485 490 495
age att gac cgt ttt tta aga gtt cgg gat caa agg gga aac ata cta 1536
Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Xle Leu
500 505 510
ctg tcc cct gaa gaa gtc agt gaa aca caa gga acg gaa aag ctg aca 1584
Deu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr515 520 525
ata att tat tcg tca tca atg atg tgg gag att aat ggt ccc gaa tca 1632
Ile Ile Tyr Ser Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser530 535 540
gtg ttg gtc aat act tat caa tgg ate ate aga aac tgg gaa att gta 1680
Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ile Val545 550 555 560
aaa att cag tgg tca cag gac ccc aca atg tta tac aat aag ata gaa 1728
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr ABn Lys Ile Glu.565 570 575
ttt gaa cca ttc caa tcc ctg gtc cct agg gcc acc aga age caa tac 1776
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln Tyr
580 585 590
age ggt ttc gta aga acc ctg ttt cag caa atg cga gat gta ctt gga 1824
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly595 600 605
aca ttt gat act gct caa ata ata aaa ctc etc cct ttt gcc gct gct 1872
Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala610 615 620
cct ccg gaa cag agt agg atg cag ttc tet tet ttg act gtt aat gta 1920
Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val625 630 635 640
aga ggt tcg gga atg agg ata ctt gta aga ggc aat tcc cca gtg ttc 1968Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Phe645 650 655
aac tac aat aaa gtc act aaa agg ctc aca gtc ctc gga aag gat gea 2016Asn Tyr Asn Lys Val Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala
660 665 670
ggt gcg ctt act gag gac cca gat gaa ggt acg gct gga gta gag tet 2064
Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser675 680 685
gct gtt cta aga ggg ttt ctc att tta ggt aaa gaa aac aag aga tat 2112
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr690 695 700
ggc cca gea cta age ateGly Pro Ala Leu Ser Ile705 710
aaa gcc aat gta cta attLys Ala Asn Val Leu Ile
aat gaa ctt age aaa cttAsn Glu Leu Ser Lys Leu715
ggg caa ggg gac gta gtgGly Gln Gly Asp Val Val
gea aaa ggg gag 2160Ala Lys Gly Glu720
ttg gta atg aaa 2208Leu Val Met Lys725 730 735
cgg aaa cgt gac tct age ata ctt act gac age cag aca gcg acc aaa 2256Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys740 745 750
agg att cgg atg gcc ate aat tag 2280
Arg Xle Arg Met Ala Ile Asn755
<210> 48
<211> 759
<212 > PRT
<213=. V|-rus Influenza
<400> 48
Met Glu Arg Ile Lys Glu Leu Arg Asp Leu Met Leu Gln Ser Arg Thr1 5 10 15
Arg Glu Ile Leu Thr Lys Thr Thr Val Asp His Met Ala Ile Ile Lys20 25 30
Lys Tyr Thr Ser Gly Arg Gln Glu Lys Asn Pro Ala Leu Arg Met Lys35 40 45
Trp Met Met Ala Met Lys Tyr Pro Ile Thr Ala Asp Lys Arg Ile Met50 55 60
Glu Met Ile Pro Glu Arg Asn Glu Gln Gly Gln Thr Leu Trp Ser Lys65 70 75 80
Thr Asn Asp Alá Gly Ser Asp Arg Val Met Val Ser Pro Leu Ala Val85 90 95
Thr Trp Trp Asn Arg Asn Gly Pro Thr Thr Asn Thr Ile His Tyr Pro100 105 110
Lys Val Tyr Lys Thr Tyr Phe Glu Lys Val Glu Arg Leu Lys His Gly115 120 125
K
Thr Phe Gly Pro Val His Phe Arg Asn Gln Val Lys Ile Arg. Arg Arg130 135 140
Val Asp Val Asn Pro Gly His Ala Asp Leu Ser Ala Lys Glu Ala Gln145 150 155 160
Asp Val Ile Met Glu Val Val Phe Pro Asn Glu Val Gly Ala Arg Ile165 170 175Leu Thr Ser Glu Ser Gln Leu Thr Ile Thr Lys Glu Lys Lys Glu Glu180 185 190
Leu Gln Asp Cys Lys Ile Ala Pro Leu Met Val Ala Tyr Met Leu Glu195 200 205
Arg Glu Leu Val Arg Lys Thr Arg Phe Leu Pro Val Val Gly Gly Thr210 215 220
Ser Ser Val Tyr Ile Glu Val Leu His Leu Thr Gln Gly Thr Cys Trp225 230 235 240
Glu Gln Met Tyr Thr Pro Gly Gly Lys Val Arg Asn Asp Asp Ile Asp245 250 255
Gln Ser Leu Ile Ile Ala Ala Arg Asn Ile Val Arg Arg Ala Thr Val260 265 270
Ser Ala Asp Pro Leu Ala Ser Leu Leu Glu Met Cys His Ser Thr Gln275 280 285
Ile Gly Gly Thr Arg Met Val Asp Ile Leu Lys Gln Asn Pro Thr Glu290 295 300
Glu Gln Ala Val Asp Ile Cys Lys Ala Ala Met Gly Leu Arg Ile Ser305 310 315 320
Ser Ser Phe Ser Phe Gly Gly Phe Thr Phe Lys Arg Thr Ser Gly Ser325 330 335
Ser Val Lys Arg Glu Glu Glu Met Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu340 345 350
Lys Ile Arg Val His Glu Gly Tyr Glu Glu Phe Thr Met Val Gly Arg355 I 360 365
Arg Ala Thr Ala Ile Ile Arg Lys Ala Thr Arg Arg Leu Ile Gln Leu370 375 380
Ile Val Ser Gly Arg Asp Glu Gln Ser Ile Ala Glu Ala Ile Ile Val385 390 395 400
Ala Met Val Phe Ser Gln Glu Asp Cys Met Ile Lys Ala Val Arg Gly405 410 415Asp Leu Asn Phe Val Asn Arg Ala Asn Gln Arg Leu Asn Pro Met His420 425 430
Gln Leu Leu Arg His Phe Gln Lys Asp Ala Lys Val Leu Phe Gln Asn435 440 445
Trp Gly Ile Glu Pro Ile Asp Asn Val Met Gly Met Ile Gly Ile Leu450 455 460
Pro Asp Met Thr Pro Ser Thr Glu Met Ser Leu Arg Gly Val Arg Val465 470 475 480
Ser Lys Met Gly Val Asp Glu Tyr Ser Ser Thr Glu Arg Val Val Val485 490 495
Ser Ile Asp Arg Phe Leu Arg Val Arg Asp Gln Arg Gly Asn Ile Leu500 505 510
Leu Ser Pro Glu Glu Val Ser Glu Thr Gln Gly Thr Glu Lys Leu Thr515 520 525
Ile Ile Tyr Sex Ser Ser Met Met Trp Glu Ile Asn Gly Pro Glu Ser530 535 ' 540
Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile Ile Arg Asn Trp Glu Ile Val545 550 555 560
Lys Ile Gln Trp Ser Gln Asp Pro Thr Met Leu Tyr Asn Lys Ile Glu565 570 575
Phe Glu Pro Phe Gln Ser Leu Val Pro Arg Ala Thr Arg Ser Gln'Tyr580 SiBS 590
Ser Gly Phe Val Arg Thr Leu Phe Gln Gln Met Arg Asp Val Leu Gly595 600 605
Thr Phe Asp Thr Ala Gln Ile Ile Lys Leu Leu Pro Phe Ala Ala Ala610 615 620
Pro Pro Glu Gln Ser Arg Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Val Asn Val625 630 635 640
Arg Gly Ser Gly Met Arg Ile Leu Val Arg Gly Asn Ser Pro Val Ph.e645 650 655Asn Tyx Asn Lys Val Thr Lys Arg Leu Thr Val Leu Gly Lys Asp Ala660 665 670
Gly Ala Leu Thr Glu Asp Pro Asp Glu Gly Thr Ala Gly Val Glu Ser675 680 685
Ala Val Leu Arg Gly Phe Leu Ile Leu Gly Lys Glu Asn Lys Arg Tyr690 695 700
Gly Pro Ala Leu Ser Ile Asn Glu Leu Ser Lys Leu Ala Lys Gly Glu705 710 715 720
Lys Ala Asn Val Leu Ile Gly Gln Gly Asp Val Val Leu Val Met Lys725 730 735
Arg Lys Arg Asp Ser Ser Ile Leu Thr Asp Ser Gln Thr Ala Thr Lys740 745 750
Arg Ile Arg Met Ala Ile Asn755
<210> 49<211> 2274
<212> DNA
<213> Virus influenza
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(2274)
<400> 49
atg gat gtc aat ccg act cta ctt ttc tta aag gtg cca gcg caa aat 48
Met Ásp Val Asn Pro Thr Leu Leu Phe Leu Lys Val Pro Ala Gln Asn1 5 10 15
gct ata age aca aca ttc cct tat act gga gat cct ccc tac agt cat 96
Ala Ile Ser Thr Thr Phe Pro Tyr Thr Gly Asp Pro Pro Tyr Ser His20 25 30
gga aca ggg aca gga tac acc atg gat act gtc aac aga aca cac caa 144
Gly Thr Gly Thr Gly Tyr Thr Met Asp Thr Val Asn Arg Thr His Gln35 40 45
tat tca gaa aaa ggg aaa tgg aca aca aac act gag att gga gea cca 192
Tyr Ser Glu Lys Gly Lys Trp Thr Thr Aen Thr Glu Ile Gly Ala Pro50 55 60
caa ctt aat cca ate gat gga cca ctt cct gaa gac aat gaa cca agt 240
Gln Leu Asn Pro Ile Asp Gly Pro Leu Pro Glu Asp Asn Glu Pro Ser65 70 75 80ggg tac gcc caa aca gat tgt gta ttg gaa gca atg gct ttc ctt gaa 288
Gly Tyr Ala Gln Thr Asp Cys Val Leu Glu Ala Met Ala Phe Leu Glu85 90 95
gaa tcc cat ccc gga ate ttt gaa aat tcg tgt ctt gaa acg atg gag 336
Glu Ser Hls Pro Gly Ile Phe Glu Asn Ser Cys Leu Glu Thr Met Glu100 105 110
gtg att cag cag aca aga gtg gac aaa cta aca caa ggc cga caa act 384
Val Ile Gln Gln Thr Arg Val Asp Lys Leu Thr Gln Gly Arg Gln Thr115 120 125
tat gat tgg acc ttg aat agg aat caa cct gcc gca aca gca ctt gct 432
Tyr Asp Trp Thr Leu Asn Arg Asn Gln Pro Ala Ala Thr Ala Leu Ala130 135 140
aat acg att gaa gta ttc aga tca aat ggt ctg acc tcc aat gaa tcg 480
Asn Thr Ile Glu Val Phe Arg Ser Asn Gly Leu Thr Ser . Asn Glu Ser145 150 155 160
ggg aga ttg atg gac ttc ctc aaa gat gtc atg gag tcc atg aac aag 528
Gly Arg Leu Met Asp Phe Leu Lys Asp Val Met Glu Ser Met Asn Lys165 170 175
gag gaa atg gaa ata aca aca cac ttc caa cgg aag aga aga gta aga 576
Glu Glu Met Glu Ile Thr Thr His Phe Gln Arg Lys Arg Arg Val Arg180 185 190
gac aac atg aca aag aga atg ata aca cag aga acc ata gga aag aaa 624
Asp Asn Met Thr Lys Arg Met Ile Thr Gln Arg Thr Ile Gly Lys Lys195' 200 205
aaa caa cga tta age aga aag age tat cta ate aga aca tta acc cta 672
Lys Gln Arg Leu Ser Arg Lys Ser Tyr Leu Ile Arg Thr Leu Thr Leu210 215 220
aac aca atg acc aag gac gct gag aga ggg aaa ttg aãa cga cga gca 720
Asn Thr Met Thr Lys Asp Ala Glu Arg Gly Lys Leu Lys Arg Arg Ala225 230 235 240
ate gct acc cca ggg atg cag ata aga gga ttt gta tat ttt gtt gaa 768
Ile Ala Thr- Pro Gly Met Gln Ile Arg Gly Phe Val Tyr Phe Val Glu245 250 255
aca cta gct cga aga ata tgt gaa aag ctt gaa caa tca gga ttg cca 816
Thr Leu Ala Arg Arg Ile Cys Glu Lys Leu Glu Gln Ser Gly Leu Pro260 265 270
gtt ggc ggt aat gag aaa aag gcc aaa ctg gct aat gtc gtc aga aaa 864
Val Gly Gly Asn Glu Lys Lys Ala Lys Leu Ala Asn Val Val Arg Lys275 280 285
atg atg act aat tcc caa gac act gaa ctc tcc ttc acc ate act ggg 912
Met Met Thr Asn Ser Gln Asp Thr Glu Leu Ser Phe Thr Ile Thr Gly290 295 300
gac aat acc aaa tgg aat gaa aat cag aac cea cgc ata ttc ctg gca 960
Asp Asn Thr Lys Trp Asn Glu Asn Gln Asn Pro Arg Ile Phe Leu Ala305 310 315 320atg ate aca tac ata act aga gat cag cca gaa tgg ttc aga aat gtt 1008Met Ile Thr Tyr Ile Thr Arg Asp Gln Pro Glu Trp Phe Arg Asn Val325 330 335
cta age att gea ccg att atg ttc tca aat aaa atg gea aga ctg ggg 1056
Leu Ser Ile Ala Pro Ile Met Phe Ser Asn Lys Met Ala Arg Leu Gly340 345 350
aaa gga tat atg ttt gaa age aaa agt atg aaa ttg aga act caa ata 1104
Lys Gly Tyr Met Phe Glu Ser Lys Ser Met Lys Leu Arg Thr Gln Ile355 360 365
cca gea gaa atg cta gea age att gac cta aaa tat ttc aat gat tca 1152Pro Ala Glu Met Leu Ala Ser Ile Aep Leu Lys Tyr Phe Asn Asp Ser370 375 380
aca aaa aag aaa att gaa aag ata cga cca ctc ctg gtt gac ggg act 1200
Thr Lys Lys Lys Ile Glu Lys Ile Arg Pro Leu Leu Val Asp Gly Thr385 390 395 400
gct tca ctg agt cct ggc atg atg atg gga atg ttc aac atg ttg age 1248
Ala Ser Leu Ser Pro Gly Met Met Met Gly Met Phe Asn Met Leu Ser405 410 415
act gtg ctg ggt gta tcc ata tta aac ctg ggc cag agg aaa tat aca 1296Thr Val Leu Gly Val Ser Ile Leu Asn Leu Gly Gln Arg Lys Tyr Thr420 425 430
aag acc aca tac tgg tgg gat ggt ctg caa tca tcc gat gac ttt gct 1344
Lys Thr Thr Tyr Trp Trp Asp Gly Leu Gln Ser Ser Asp Asp Phe Ala435 440 445
ttg ata gtg aat gcg cct aat cat gaa gga ata caa gct gga gta gac 1392Leu Ile Val Asn Ala Pro Asn His Glu Gly Ile Gln Ala Gly Val Asp450 455 460
aga ttc tat aga act tgc aaa ctg gtc ggg ate aac atg age aaa aag 1440Arg Phe Tyr Arg Thr Cys Lys Leu Val Gly Ile Asn Met Ser Lys Lys465 470 475 480
aag tcc tac ata aat aga act gga aca ttc gaa ttc aca age ttt ttc 1488Lys Ser Tyr Ile Asn Arg Thr Gly Thr Phe Glu Phe Thr Ser Phe Phe485 490 495
tac cgg tat ggt ttt gta gec aat ttc age atg gaa cta ccc agt ttt 1536Tyr Arg Tyr Gly Phe Val Ala Asn Phe Ser Met Glu Leu Pro Ser Phe500 505 510
ggg gtt tcc gga ata aat gaa tet gea gac atg age att gga gtg aca 1584Gly Val Ser Gly Ile Asn Glu Ser Ala Asp Met Ser Ile Gly Val Thr515 520 525
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Gln Met Ala Leu Gln Leu Phe Ile Lys Asp Tyr Arg Tyr Thr Tyr Arg545 550 555 560tgc cat aga ggt gat acc cag ata caa acc aga aga tct ttt gag ttg 1728
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Met Ala Ser Gln Gly Thr Lys Arg Ser Tyr Glu Gln Met Glu Thr Asp
1 5 10 15
ggg gaa cgc cag aat gca act gaa ate aga gea tct gtc gga agg atg 96
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
tac aga aga aaa gat ggg aaa tgg atg agg gaa ctc ate ctc cat gat 336
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100 105 110
aaa gaa gaa ate atg aga ate tgg cgt cag gcc aac aat ggt gaa gac 384
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130 135 140
gac acc aca tac caa aga aca agg gct ctt gtt cgg act ggg atg gat 480
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145 150 155 160
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165 170 175
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Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu
180 185 190
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Asp Ser
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Ile Gly Gln Ser Pro Asn Val Tyr Gln Ala Arg Phe Glu Ser Val Ala165 170 175
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960Ser Ser Asp Leu Ser Tyr Tbr Val Gly Tyr Leu Cys Ala Gly Xle Pro305 310 315 320
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aag gac caa ate agg agg caa gtg att ate gat gac cca aat . tgg tca 1200Lya Asp Gln Ile Arg Arg Gln Val Ile Ile Asp Asp Pro Asn Trp Ser385 390 395 400
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<212> PRT
<213> vírus Infiuenza
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<213 > vírus Influenza
<220>
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<400> 60
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<220>
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115 120 125
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Ile Ala Ser Val Pro Ala Ser Arg Tyr Leu Thr Asp Met Thr Leu Asp85 90 95
Glu Met Ser Arg Asp Trp Phe Met Leu Met Pro Lys Gln Lys Val Thr100 105 110
Gly Ser Leu Cys Ile Arg Met Asp Gln Ala Ile Met Asp Lys Asn Ile115 120 125
Ile Leu Lys Ala Asn Phe Ser Val Ile Phe Glu Arg Leu Glu Thr Leu130 135 140
Ile Leu Leu Arg Ala Phe Thr Glu Glu Gly Ala Vgil Val Gly Glu Ile145 150 155 160
Ser Pro Leu Pro Ser Leu Pro Gly His Thr Asn Glu Asp Val Lys Asn165 170 175
Ala Ile Gly Val Leu Ile Gly Gly Leu Lys Trp Asn Asp Asn Thr Val180 185 190
Arg Ile Ser Glu Thr Leu Gln Arg Phe Ala Trp Arg Ser Ser His Glu195 200 205
Asn Gly Arg Pro Ser Phe Pro Ser Lys Gln Lys Arg Lys Met Glu Arg210 215 220
Thr Ile Lys Pro Glu Ile225 230
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<212> DHA
<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1)..(1497)
<400> 71
atg gcg tct caa ggc acc aaa cga tcc tat gaa cag atg gaa act gat
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ggg gaa cgc cag aat gca act gaa ate aga gea tct gtc gga agg atgGly Glu Arg Gln Asn Ala Thr Glu Ile Arg Ala Ser Val Gly Arg Met20 25 30 gtg gga gga ate gga cgg Val Gly Gly Ile Gly Arg 35 ttt Phe tat Tyr 40 gtc Val cag atg tgt act gag ctt aaa Gln Met Cys Thr Glu Leu Lys 45 144cta Leu aac Asn 50 gac Asp cat gaa ggg His Glu Gly cgg Arg 55 ctg Leu att Ile cag aac age ata aca ata gaá Gln Asn Ser Ile Thr Ile Glu 60 192agg Arg 65 atg Met gtg Val ctt tcg Leu Ser gea Ala 70 ttc Phe gac Asp gaa Glu aga aga aac aag tat ctc gag Arg Arg Asn Lys Tyr Leu Glu 75 80 240gag Glu cat His ccc agt gct ggg Pro Ser Ala Gly 85 aaa Lys gac Asp cct Pro aag aaa acg gga ggc ccg ata Lys Lys Thr Gly Gly Pro Ile 90 95 288tac aga Tyr Arg aga Arg aaa gat Lys Asp 100 ggg Gly aaa Lys tgg Trp atg agg gaa ctc ate ctc cat gat Met Arg Glu Leu Ile Leu His Asp 105 110 336aaa Lys gaa Glu gaa Glu 115 ate atg Ile Met aga Arg ate Ile tgg Trp 120 cgt cag gcc aac aat ggt gaa gac Arg Gln Ala Asn Asn Gly Glu Asp 125 384gct Ala act Thr 130 gct ggt ctt Ala Gly Leu act Thr cat His 135 atg Met atg Met ate tgg cac tcc aat ctc aat Ile Trp His Ser Asn Leu Asn 140 432gac Asp 145 acc Thr aca tac caa aga Thr iyr Gln Arg 150 aca Thr agg Arg gct Ala ctt gtt cgg act ggg atg gat Leu Val Arg Thr Gly Met Asp 155 160 480CCC Pro aga Arg atg Met tgc tet Cys Ser 165 ctg Leu atg Met caa Gln ggc Gly tca acc ctc cca cgg aga tet Ser Thr Leu Pro Arg Arg Ser 170 175 528gga gcc Gly Ala gct ggt gct gea Ala Gly Ala Ala 180 gta Val áaa Lys ggc gtt gga aca atg gta atg gaa Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu 185 190 576ctc Leu ate Ile aga Arg 195 atg ate Met Ile aag Lys cgc Arg gga Gly 200 ata Ile aat gat cgg aat ttc tgg aga Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg 205 624ggt gaa Gly Glu 210 aat ggt cga aga Asn Gly Arg Arg acc Thr 215 aga Arg att gct tat gaa aga atg tgc aat Ile Ala Tjrr Glu Arg Met Cys Asn 220 672ate Ile 225 ctc Leu aaa Lys ggg aaa Gly Lys ttt Phe 230 cag Gln aca Thr gea gea caa cgg gct atg atg gac Ala Ala Gln Arg Ala Met Met Asp 235 240 720cag Gln gtg Val agg gaa ggc cgc Arg Glu Gly Arg 245 aat Asn CCt Pro gga aac gct gag att gag gat ctc Gly Asn Ala Glu Ile Glu Asp Leu 250 255 768att Ile ttc Phe ttg Leu gea cga Ala Arg tca Ser gea Ala ctt Leu att ttg aga gga tca gta gcc cat Ile Leu Arg Gly Ser Val Ala His 816260 265 270
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1497<210> 72
<211> 498
<212> PRT
<213> V,'ms |nf|uenza
<400> 72
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Gly Ala Ala Gly Ala Ala Val Lys Gly Val Gly Thr Met Val Met Glu180 185 190
Leu Ile Arg Met Ile Lys Arg Gly Ile Asn Asp Arg Asn Phe Trp Arg195 200 205Gly Glu Asn Gly Arg Arg Thr Arg Ile Ala Tyr Glu Arg Met CyB Asn210 215 220
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Glu Leu Ser Asp Glu Lys Ala Thr Asn Pro Ile Val Pro Ser Phe Asp465 470 475 480
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Asp Ser
<210> 73<2ll> 1413<212> DHA
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Vírus Influenza
<220> ,
<221> CDS
<222> (1)..(1413)
<400 > 73
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Glu Thr Thr Ile Trp Thr Ser Ser Ser Ser Ile Val Met Cys Gly Val435 440 445
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<212> DNA<213>
Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1)..(756)
<400> 75
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gacgatggtc attttgtcaa catagagetg gagta 981<210> 76<211> 252<212> PRT<213> Vírus Influenza<400> 76
Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Tyr Val Leu Ser Ile Pro1 5 10 15
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Ala Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr35 40 45
Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val65 70 75 80
Gln Asn Ala Leu Ser Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Arg Ala85 90 95
Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile Thr Phe His Gly Ala100 105 110
Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met115 120 125
Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly Thr Val Thr Thr Glu Val Ala Phe130 135 140
Gly Leu Val Cya Ala Thr Cys Glu Gln Ile Ala Asp Ser Gln His Arg145 150 155 160
Ser His Arg Gln Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu Ile Arg His <31u165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu <3ln Met180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Arg195 200 205Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met Arg Thr Ile Gly Thr His Pro Ser210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asp Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gln Ala Tyr225 230 235 240
Gln Lys Arg Met Gly Val Gln Met Gla Arg Phe Lys245 250
<210> 77<211> 1698
<212> DNA
<213> Vírus Influenza
<220>
<221> CDS<222> (1) . . (1698)
<400> 77
atg aag aca acc att att tta ata cta ctg acc cat tgg gcc tac agt 48Met Lys Thr Thr Ile Ile Leu Ile Leu Leu Thr His Trp Ala Tyr Ser1 5 10 15
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Claims (117)

1. Vírus de influenza isolado, caracterizado pelo fato de que écapaz de infectar um animal canídeo.
2. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza tem um sorotipo de HA de H3.
3. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza tem o sorotipo H3N8.
4. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza compreende um polinucleotí-deo que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostra-da em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,-24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,-74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico da mesma, ou odito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo 99 % ou maior de identi-dade de seqüência com a seqüência de aminoácido mostrada em qualqueruma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,-32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
5. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza compreende um polinucleotí-deo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQID NOs: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53,-55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou o dito polinucleotídeo tem-98 % ou maior de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeomostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19,-21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,-75, ou 77.
6. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza é o isolado viral designadocomo A/canine/Florida/43/ 2004 ou o isolado viral designado como A/canine/Florida/242/2003.
7. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza é o isolado viral designadocomo canine/Jax/05 ou o isolado viral designado como canine/Miami/05.
8. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza é inativado ou atenuado.
9. Vírus de influenza de acordo com a reivindicação 1, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza é fornecido em um veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável.
10. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que com-preende todo ou parte de um segmento genômico ou gene de um vírus deinfluenza como definido na reivindicação 1.
11. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreende todo ou parte deum gene de influenza selecionado do grupo que consiste em um gene deneuraminidase, um gene de nucleoproteína, um gene de proteína de matriz,um gene proteína básica de polimerase, um gene proteína acídica de poli-merase, um gene de proteína não-estrutural, e um gene de hemaglutinina.
12. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza compreende um polinucleotí-deo que codifica um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácido mostra-da em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22,-24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72,-74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico da mesma, ou odito polinucleotídeo codifica um polipeptídeo tendo 99 % ou maior de identi-dade de seqüência com a seqüência de aminoácido mostrada em qualqueruma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30,-32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
13. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo fato de que o dito vírus de influenza compreende um polinucleotí-deo tendo a seqüência de nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53,-55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, ou 77, ou o dito polinucleotídeo tem-98 % ou maior de identidade de seqüência com a seqüência de nucleotídeomostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, 19,-21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73,-75, ou 77.
14. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado pelo fato de que o dito polinucleotídeo é formulado em um veículo oudiluente farmaceuticamente aceitável.
15. Construto de expressão de polinucleotídeo, caracterizadopelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindi-cação 10.
16. Construto de expressão de polinucleotídeo, caracterizadopelo fato de que pode hibridar com uma seqüência de codificação ou não-codificação de um polinucleotídeo como definido na reivindicação 10.
17. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracte-rizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo hibrida com a dita seqüênciasob condições de severidade alta.
18. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracte-rizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo é 10 a 500 nucleotídeos, 10 anucleotídeos, 21 a 30 nucleotídeos, 31 a 40 nucleotídeos, 41 a 50 nucleo-tídeos, 51 a 60 nucleotídeos, 61 a 70 nucleotídeos, 71 a 80 nucleotídeos, 81a 90 nucleotídeos, ou 91 a 100 nucleotídeos em comprimento.
19. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracte-rizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende uma moléculamarcadora ou repórter detectável.
20. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracte-rizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo tem de cerca de 90 por centoa 100 por cento de identidade de seqüência de nucleotídeo com um polinu-cleotídeo compreendendo todo ou parte de um segmento genômico ou genede um vírus de influenza como definido na reivindicação 1.
21. Oligonucleotídeo de acordo com a reivindicação 16, caracte-rizado pelo fato de que o dito oligonucleotídeo compreende uma seqüênciade nucleotídeo mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38,-39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, ou 88.
22. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato de que é codifi-cado por um polinucleotídeo como definido na reivindicação 10.
23. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do pelo fato de que o dito polipeptídeo é selecionado do grupo que consisteem uma proteína de hemaglutinina, uma proteína de neuraminidase, umanucleoproteína, uma proteína de matriz, uma proteína básica de polimerase,uma proteína acídica de polimerase, e uma proteína não-estrutural.
24. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do pelo fato de que o dito polipeptídeo compreende a seqüência de aminoá-cido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,-18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,-68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico damesma.
25. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22, caracteriza-do pelo fato de que o dito polipeptídeo é formulado em um veículo ou diluen-te farmaceuticamente aceitável.
26. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende umimunógeno de um vírus de influenza como definido na reivindicação 1, emque o dito imunógeno é capaz de induzir uma resposta imune contra um ví-rus de influenza que é capaz de infectar um animal canídeo.
27. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracteriza-da pelo fato de que o dito imunógeno compreende vírus inteiro livre de célu-la, ou uma porção do mesmo; um polinucleotídeo viral; uma proteína viral;um polipeptídeo ou peptídeo viral; uma célula infectada por vírus; um cons-tructo com base em vetor viral recombinante; um vírus reagrupante; ou ácidonucléico desprotegido do dito vírus.
28. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracteriza-da pelo fato de que a dita proteína, polipeptídeo, ou peptídeo virais compre-endem uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48,-50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um fragmentofuncional e/ou imunogênico da mesma, ou o dito polinucleotídeo codifica umpolipeptídeo tendo 99 % ou maior de identidade de seqüência com a se-qüência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6,-8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58,-60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78.
29. Composição de acordo com a reivindicação 27, caracteriza-da pelo fato de que o dito polinucleotídeo viral codifica um polipeptídeo com-preendendo uma seqüência de aminoácido mostrada em qualquer uma dasSEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34,-48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, ou 78, ou um frag-mento funcional e/ou imunogênico da mesma.
30. Composição de acordo com a reivindicação 26, caracteriza-da pelo fato de que é formulada em um veículo ou diluente farmaceutica-mente aceitável.
31. Método para induzir uma resposta imune em um animal con-tra um vírus de influenza capaz de infectar um animal canídeo, caracterizadopelo fato de que compreende administrar ao dito animal uma quantidade efi-caz de uma composição como definida na reivindicação 26.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita composição compreende uma proteína, polipeptídeo,ou peptídeo virais compreendendo uma seqüência de aminoácido mostradaem qualquer uma das SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24,-26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74,-76, ou 78, ou um fragmento funcional e/ou imunogênico da mesma.
33. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita composição compreende um vírus de influenza ouuma porção do dito vírus que é capaz de infectar um animal canídeo.
34. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o dito vírus de influenza é selecionado do grupo que consis-te em isolado viral designado como A/canine/Florida/43/2004, isolado viraldesignado como A/canine/Florida/242/2003, isolado viral designado comocanine/Jax/05 ou isolado viral designado como canine/Miami/05, ou uma por-ção de qualquer um dos ditos isolados virais.
35. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita resposta imune é uma resposta imune protetora queimpede ou inibe infecção do dito animal por um vírus de influenza.
36. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o dito vírus de influenza tem um sorotipo de HA selecionadode H3.
37. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o dito vírus de influenza tem o sorotipo H3N8.
38. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita composição também compreende um adjuvante.
39. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que o dito animal é um canídeo.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, caracterizadopelo fato de que o dito animal canídeo é um cachorro domesticado.
41. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita composição é administrada parenteralmente.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizadopelo fato de que a dita composição é administrada subcutânea, intraperito-neal, ou intramuscular.
43. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizadopelo fato de que a dita composição é administrada nasal ou oralmente.
44. Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizadopelo fato de que o dito vírus de influenza é inativado ou atenuado.
45. Anticorpo isolado, caracterizado pelo fato de que especifi-camente se liga a um epítopo de um polipeptídeo como definido na reivindi-cação 22.
46. Anticorpo de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo é um anticorpo monoclonal.
47. Anticorpo de acordo com a reivindicação 45, caracterizadopelo fato de que o dito anticorpo liga a uma proteína de hemaglutinina.
48. Anticorpo de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que a dita proteína de hemaglutinina é uma Proteína de hema-glutinina de H3.
49. Anticorpo de acordo com a reivindicação 47, caracterizadopelo fato de que a dita proteína de hemaglutinina compreende uma seqüên-cia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 32, SEQ IDNO: 62, ou SEQ ID NO: 78.
50. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende:a) um vírus de influenza que é capaz de infectar um animal ca-nídeo; oub) um polinucleotídeo compreendendo todo ou parte de umsegmento genômico ou gene de um vírus de influenza da reivindicação 1.
51. Célula de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelofato de que a dita célula é uma célula de animal canídeo.
52. Método para detecção de um vírus de influenza que é capazde infectar um animal canídeo, caracterizado pelo fato de que compreendeobter uma amostra biológica de um animal e triar a dita amostra para a pre-sença de um anticorpo ou um ligando que liga a uma proteína, polipeptídeo,ou peptídeo de um vírus de influenza como definido na reivindicação 1.
53. Método para detecção de um vírus de influenza que é capazde infectar um animal canídeo, caracterizado pelo fato de que compreendeobter uma amostra de ácido nucléico de um animal, e contatar a dita amos-tra de ácido nucléico com um oligonucleotídeo como definido na reivindica-ção 16, e determinar se o dito oligonucleotídeo híbrida sob condições rigoro-sas com o dito ácido nucléico.
54. Método para triar para um composto que possui atividadeantiviral contra um vírus de influenza que é capaz de infectar um animal ca-nídeo, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma célula infec-tada ou compreendendo um vírus como definido na reivindicação 1, com umcomposto de teste e determinar se o dito composto de teste inibe atividadedo dito vírus na dita célula.
55. Vírus reagrupante, caracterizado pelo fato de que compre-ende pelo menos um gene, segmento genômico, ou um polinucleotídeo deum vírus de influenza como definido na reivindicação 1.
56. Vírus reagrupante de acordo com a reivindicação 55, carac-terizado pelo fato de que o dito vírus reagrupante é formulado em um veículoou diluente farmaceuticamente aceitável.
57. Vírus isolado, caracterizado pelo fato de que compreendeum ou mais polinucleotídeos em que o(s) dito(s) um ou mais polinucleotí-deos codificam uma proteína do vírus de influenza canina selecionada dogrupo que consiste em HA, NA, NP, MA, PB1, PB2, PA, e NS, ou um frag-mento funcional ou imunogênico da mesma.
58. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que o(s) dito(s) um ou mais polinucleotídeos compreendem uma se-qüência de nucleotídeo selecionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs:-1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57,-59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, e 77.
59. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de HA tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16, 32, 62, e 78.
60. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de NA tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 12, 28, 58, e 74.
61. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de NP tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 10, 26, 56, e 72.
62. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de MA tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 14, 30, 60, e 76.
63. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de PB1 tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 4, 20, 50, e 66.
64. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de PB2 tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 2, 18, 48, e 64.
65. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de PA tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 6, 22, 52, e 68.
66. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que a dita proteína de NS tem uma seqüência de aminoácido sele-cionada do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 8, 24, 54, e 70.
67. Vírus de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelofato de que é fornecido em um veículo ou diluente farmaceuticamente acei-tável.
68. Método para detecção de um vírus de influenza que é capazde infectar um animal canídeo, caracterizado pelo fato de que compreendeobter uma amostra contendo ácido nucléico de um animal, e contatar a ditaamostra de ácido nucléico com um iniciador de oligonucleotídeo direto e re-verso que especificamente liga a um polinucleotídeo ou seqüência de genedo dito vírus sob condições suficientes para a geração de um produto deamplificação se o ácido nucléico contiver uma seqüência à qual os ditos ini-ciadores se ligam; e detectar o dito produto de amplificação.
69. Método de acordo com a reivindicação 68, caracterizadopelo fato de que o dito iniciador de oligonucleotídeo é um oligonucleotídeoque híbrida com uma seqüência de codificação ou não-codificação de umpolinucleotídeo compreendendo todo ou uma parte de um segmento genô-mico ou gene de um vírus de influenza que é capaz de infectar um animalcanídeo.
70. Método para proteger um canino de uma infecção do vírusde influenza, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao caninouma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
71. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus de influenza eqüina compreen-de(m) um/uns vírus inativado(s).
72. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus de influenza eqüina compreen-de(m) um/uns vírus vivo(s) atenuado(s).
73. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que a vacina compreende antígenos de vírus de influenza eqüi-na de mais de um isolado viral.
74. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que a vacina compreende pelo menos um antígeno de um vírusde influenza de H7.
75. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada subcutaneamente.
76. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada intranasalmente.
77. Método de acordo com a reivindicação 70, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada em combinação com pelo menosuma vacina selecionada do grupo que consiste em uma vacina de bordetellla,vacina de adenovírus, e vacina do vírus de parainfluenza.
78. Método para proteger um canino de uma infecção do vírusde influenza de H3, caracterizado pelo fato de que compreende administrarao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compre-endendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelomenos um antígeno de vírus de influenza de H7, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a dita vacina compreende um ou mais antígenos de um ou maisdos isolados virais de influenza canina a seguir: A/canine/Florida/43/2004, A/canine/Florida/242/ 2003, canine/Jax/05, e canine/Miami/05.
80. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina compreende pelo menos um antígeno de um vírusde influenza de H7.
81. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus de influenza de H3 compreen-de(m) um/uns vírus inativado(s).
82. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelofato de que a dita vacina compreende um ou mais antígenos de um ou mais dosisolados virais de influenza canina a seguir: A/canine/Florida/43/2004, A/canine/Florida/242/2003, canine/Jax/05, e canine/Miami/05.
83. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus de influenza de H3 compreen-de(m) um/uns vírus vivo(s) atenuado(s).
84. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina compreende pelo menos um antígeno de um isola-do viral isolado de um canino infectado.
85. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina compreende antígenos de mais de um isolado viral.
86. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada subcutaneamente.
87. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada intranasalmente.
88. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino uma vez.
89. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino pelo menos duas vezes.
90. Método de acordo com a reivindicação 89, caracterizadopelo fato de que uma segunda dose da vacina é administrada ao canino decerca de 2 a cerca de 8 semanas após a primeira dose.
91. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada em combinação com pelo menosuma vacina selecionada do grupo que consiste em uma vacina de bordetella,vacina de adenovírus, e vacina de vírus de parainfluenza.
92. Método para proteger um canino de lesões respiratórias cau-sadas por vírus de influenza canina, caracterizado pelo fato de que compre-ende administrar ao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de umavacina compreendendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
93. Método de acordo com a reivindicação 92, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino antes do canino ser in-fectado com vírus de influenza canina.
94. Método para proteger um canino de lesões respiratórias cau-sadas por vírus de influenza canina, caracterizado pelo fato de que compre-ende administrar ao canino uma quantidade terapeuticamente eficaz de umavacina compreendendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelomenos um antígeno de vírus de influenza de H7, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
95. Método de acordo com a reivindicação 94, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino antes do canino ser in-fectado com vírus de influenza canina.
96. Método para proteger um canino de ter vírus de influenzacanina em secreção nasal ou oral causada por infecção do vírus de influenzacanina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao caninouma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
97. Método de acordo com a reivindicação 96, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino antes do canino ser in-fectado com vírus de influenza canina.
98. Método para proteger um canino de ter vírus de influenzacanina em secreção nasal ou oral causada por infecção do vírus de influenzacanina, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao caninouma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina compreendendo:pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelomenos um antígeno de vírus de influenza de H7, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
99. Método de acordo com a reivindicação 98, caracterizadopelo fato de que a vacina é administrada ao canino antes do canino ser in-fectado com vírus de influenza canina.
100. Vacina de influenza canina, caracterizada pelo fato de quea vacina compreende:uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um an-tígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelo menos um antígeno de vírus deinfluenza de H7, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
101. Vacina de acordo com a reivindicação 100, caracterizadapelo fato de que compreende um ou mais antígenos de um ou mais dos iso-lados virais de influenza canina a seguir: A/canine/Florida/43/2004,A/canine/Florida/242/ 2003, canine/Jax/05, e canine/Miami/05.
102. Vacina de acordo com a reivindicação 100, caracterizadapelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus compreende(m) um/uns vírus ina-tivado(s).
103. Vacina de acordo com a reivindicação 102, caracterizadapelo fato de que compreende um ou mais antígenos de um ou mais dos iso-lados virais de influenza canina a seguir: A/canine/Florida/43/2004, A/canine/Florida/242/ 2003, canine/Jax/05, e canine/Miami/05.
104. Vacina de acordo com a reivindicação 100, caracterizadapelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus compreende(m) um/uns vírus vi-vo(s) atenuado(s).
105. Vacina de influenza canina, caracterizada pelo fato de quea vacina compreende:uma quantidade terapeuticamente eficaz de um antígeno de ví-rus de influenza eqüina, epelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
106. Vacina de acordo com a reivindicação 105, caracterizadapelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus de influenza eqüina compreen-de(m) um/uns vírus inativado(s).
107. Vacina de acordo com a reivindicação 105, caracterizadapelo fato de que o(s) antígeno(s) de vírus compreende(m) um/uns vírus vi-vo(s) atenuado(s).
108. Kit para proteger um canino de infecção do vírus de influ-enza, caracterizado pelo fato de que compreende:uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina com-preendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza eqüina, epelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em:um aparelho para administrar a vacina ao canino,um excipiente farmaceuticamente aceitável que auxilia na admi-nistração da vacina ao canino,um excipiente farmaceuticamente aceitável que intensifica a res-posta imune do canino à vacina,um alimento a ser consumido pelo canino simultaneamente coma vacina, eum medicamento para ser consumido pelo canino simultanea-mente com a vacina.
109. Kit de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelofato de que compreende um aparelho para subcutaneamente administrar avacina ao canino.
110. Kit de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelofato de que compreende um aparelho para intranasalmente administrar avacina ao canino.
111. Kit para proteger um canino de uma infecção do vírus deinfluenza de H3, caracterizado pelo fato de que compreende:uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina com-preendendo pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelomenos um antígeno de vírus de influenza de H7, epelo menos um componente selecionado do grupo que consiste em:um aparelho para administrar a vacina ao canino,um excipiente farmaceuticamente aceitável que auxilia na admi-nistração da vacina ao canino,um excipiente farmaceuticamente aceitável que intensifica a res-posta imune do canino à vacina,um alimento a ser consumido pelo canino simultaneamente coma vacina, eum medicamento para ser consumido pelo canino simultanea-mente com a vacina.
112. Kit de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelofato de que compreende duas doses da vacina, e as duas doses juntascompreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina.
113. Kit de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelofato de que compreende um aparelho para subcutaneamente administrar avacina ao canino.
114. Kit de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelofato de que compreende um aparelho para intranasalmente administrar avacina ao canino.
115. Uso de um imunógeno de um vírus de influenza como defi-nido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para preparação deuma composição farmacêutica, vacina e/ou kit para detecção de um vírus de influenza que é capaz de infectar um animal canídeo, para induzir uma res-posta imune em um animal contra um vírus de influenza capaz de infectarum animal canídeo
116. Uso de pelo menos um antígeno de vírus de influenza e-qüina, caracterizado pelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica, vacina e/ou kit para proteger um canino de uma infecção dovírus de influenza, de lesões respiratórias causadas por vírus de influenzacanina e/ou de ter vírus de influenza canina em secreção nasal ou oral cau-sada por infecção do vírus de influenza canina.
117. Uso de pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H3 e/ou pelo menos um antígeno de vírus de influenza de H7, caracterizadopelo fato de que é para preparação de uma composição farmacêutica, vaci-na e/ou kit para proteger um canino de uma infecção do vírus de influenzade H3 para proteger um canino de lesões respiratórias causadas por vírusde influenza canina e/ou de ter vírus de influenza canina em secreção nasal ou oral causada por infecção do vírus de influenza canina.
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