ES2393406T3 - Virus de la gripe capaces de infectar a cánidos, usos de los mismos - Google Patents

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William L. Castleman
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Abstract

Un virus de la gripe canina aislado que es capaz de infectar a un animal cánido, en el que dicho virus de la gripecomprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) que tiene una secuencia deaminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 78, o una secuencia madura del mismo en la que se ha retirado la secuenciaseñal de 16 aminoácidos N terminal de la secuencia de longitud completa.

Description

Virus de la gripe capaces de infectar a cánidos, usos de los mismos
Antecedentes de la invención
La “tos de las perreras” o traqueobronquitis infecciosa (ITB) es una infección respiratoria aguda, contagiosa en perros caracterizada principalmente por tos (Ford et al, 1998). La ITB canina se considera una de las enfermedades respiratorias infecciosas más prevalentes en perros en todo el mundo, y sus brotes pueden alcanzar proporciones epidémicas cuando los perros se alojan en ambientes de población de alta densidad tales como perreras. La mayoría de los brotes se deben a contacto directo entre perros o aerosolización de secreciones respiratorias (Ford et al, 1998). Las señales clínicas están provocadas por infección con uno o una combinación de agentes bacterianos y virales que colonizan el epitelio del tracto respiratorio superior e inferior. El virus paragripal canino (CPIV) y la bacteria Bordetella bronchiseptica son los organismos más habituales aislados de perros afectados, pero varios otros virus, tales como virus del moquillo canino (CDV) y adenovirus caninos 1 y 2 (CAV-1, CAV-2), junto con bacterias tales como Streptococcus sp., Pasteurella multicoda y Escherichia coli, pueden influir en el desarrollo clínico y resultado (Ford et al, 1998). Aunque los brotes se producen más eficaz y rápidamente en poblaciones de alta densidad con alta morbilidad, son poco habituales las infecciones respiratorias complicadas y muerte. Aunque puede desarrollarse neumonía bacteriana secundaria con peligro para la vida, la mayoría de los casos de ITB son autolimitantes y se resuelven sin ningún tratamiento (Ford et al, 1998).
En julio de 1992, una infección respiratoria que se suponía que era “tos de las perreras” se hizo epidémica en varios canódromos en Nueva Inglaterra, Florida, Virginia Occidental, Wisconsin, Kansas, Colorado, Oklahoma y Arizona. De acuerdo con los veterinarios, la mayoría de los perros afectados tenían una tos suave que se resolvió, pero más de doce galgos desarrollaron una neumonía hemorrágica aguda seguida de muerte rápida (Greyhound Daily News, 1999).
Desde finales de 1998 hasta principios de 1999, se produjeron varios brotes de “tos de las perreras” en perreras de galgos de carrera por todo el país, dando como resultado el cierre obligatorio de pistas y la cuarentena de todos los galgos de carrera en los Estados Unidos durante varias semanas (Greyhound Daily News, 1999). En una pista en Florida (Palm Beach Kennel Club), se registró tos en casi el 40% de la población de perros en un solo día (comunicación personal del Dr. William Duggar). De forma similar al brote de 1992, la tos se resolvió en la mayoría de los galgos, pero 10 perros en Florida murieron de un síndrome de neumonía hemorrágica no característico de la “tos de las perreras” (Putnam, 1999).
En marzo-abril de 2003, se produjo otro brote de “tos de las perreras” en canódromos en el Este de los Estados Unidos. Se cree que el brote se originó en perreras de cuatro pistas en Florida y provocó la suspensión de carreras y la cuarentena de los perros durante casi tres semanas. Casi el 25% de los perros en la pista West Palm Beach se vieron afectados, aunque casi el 50% de los 1400 perros en Derby Lane en San Petersburgo desarrollaron tos. De nuevo, la mayoría de los perros se recuperó, pero varios perros han muerto de la infección respiratoria. El impacto económico estimado del brote respiratorio en la pista de Derby Lane solamente fue de 2 millones de dólares.
No existen informes publicados que documenten la etiología o clinicopatología de la epidemia de “tos de las perreras” en perreras de canódromos en 1992, 1998-1999 o 2003. La suposición ha sido que las infecciones se debieron a “CPiV y/o B. brochiseptica, las dos causas más habituales de tos de las perreras. Informaciones infundadas tales como sitios web han atribuido las neumonías hemorrágicas letales notificadas en algunos de los perros con tos a infección con Streptococcus equi subespecie zooepidemicus 1-hemolítico, y hacen referencia al síndrome como “choque tóxico estreptocócico canino”.
La transmisión del virus de una especie hospedadora a otra es una característica crucial de la ecología y epidemiología del virus de la gripe (Webster, 1998). Son posibles dos mecanismos básicos de transmisión entre especies de virus de la gripe (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004). Uno es la transferencia directa de un virus esencialmente inalterado de una especie a otra. Los ejemplos de este mecanismo incluyen las infecciones humanas recientes con el subtipo H5N1 de virus de la gripe aviar (Subbarao et al., 1998; Peiris et al., 2004; Guan et al., 2004) y posiblemente la pandemia de 1918, conocida como gripe española (Reid et al., 2004). El segundo mecanismo es una consecuencia de la naturaleza segmentada del genoma de la gripe. La infección conjunta de un hospedador con virus de diferentes especies puede dar como resultado una nueva mezcla de los genes virales segmentados y la generación de un recombinante con la capacidad de infectar a otras especies. Por ejemplo, virus nuevos generados por redistribución génica entre virus de la gripe aviar y humana dieron como resultado las pandemias de gripe humana en 1957 y 1968 (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004; Kawaoka et al., 1989).
La mayoría de las transmisiones directas de virus de la gripe inalterados de la especie hospedadora natural a diferentes especies son acontecimientos terminales debido a que no se produce transmisión prolongada entre individuos de la nueva especie. Son necesarias múltiples interacciones virus-hospedador para replicación y transmisión horizontal y proporcionan una barrera formidable a la perpetuación de virus de la gripe en el nuevo hospedador (Webby et al., 2004). Por lo tanto, el establecimiento de nuevos linajes específicos de hospedador de
virus de la gripe es poco habitual y sólo se ha producido en aves domésticas, cerdos, caballos y seres humanos (Webster et al., 1992; Lipatov et al., 2004).
Debido a la naturaleza grave de la infección por virus de la gripe, sigue existiendo la necesidad de métodos para diagnosticar, prevenir y tratar la infección por virus de la gripe.
Breve sumario de la invención
La invención objeto concierne a un virus de la gripe aislado que es capaz de infectar cánidos y provocar enfermedad respiratoria en el cánido.
Específicamente, la invención es la siguiente:
1.
Un virus de la gripe canina aislado que es capaz de infectar a un animal cánido, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 78, o una secuencia madura de la misma en la que se ha retirado la secuencia señal de 16 aminoácidos N-terminal de la secuencia de longitud completa.
2.
El virus de la gripe de acuerdo con 1, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene el 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
3.
El virus de la gripe de acuerdo con 1, en el que dicho polipéptido de HA de dicho aislado viral comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 78.
4.
El virus de la gripe de acuerdo con 1, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, o dicho polinucleótido tiene el 98% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77.
5.
El virus de la gripe de acuerdo con 1, en el que dicho virus de la gripe está inactivado o atenuado.
6.
Una composición que comprende un inmunógeno de un virus de la gripe de 1, en la que dicho inmunógeno es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe que es capaz de infectar a un animal cánido, y en la que dicho inmunógeno comprende:
(a)
un polipéptido de HA como se ha definido en 1 o 3; y/o
(b)
un polinucleótido que codifica un polipéptido de HA como se ha definido en 1 o 3.
7.
La composición de acuerdo con 6, en la que dicho inmunógeno comprende virus completos sin células, o una parte de los mismos; un polinucleótido viral; una proteína viral; un polipéptido o péptido viral; una célula infectada por virus; una construcción basada en vector viral recombinante; un virus redistribuido; o ácido nucleico desnudo de dicho virus.
8.
La composición de acuerdo con 7, en la que dicha proteína, polipéptido o péptido viral comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene el 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
9.
La composición de acuerdo con 7, en la que dicho polinucleótido viral codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene el 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
10.
La composición de acuerdo con 7, en la que dicho polinucleótido viral comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, o un fragmento funcional de la misma.
11.
Una vacuna de gripe canina, en la que la vacuna comprende:
una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno de al menos un virus de la gripe de 1, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable,
en la que dicho antígeno comprende:
(a)
un polipéptido de HA como se ha definido en 1 o 3; y/o
(b)
un polinucleótido que codifica un polipéptido de HA como se ha definido en 1 o 3.
12.
La vacuna de acuerdo con 11, en la que el antígeno o los antígenos del virus comprenden uno o varios virus inactivados.
13.
La vacuna de acuerdo con 11, en la que el antígeno o los antígenos del virus comprenden uno o varios virus atenuados vivos.
14.
Un polinucleótido aislado que comprende todo o parte de un segmento genómico o gen de un virus de la gripe de 1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA como se ha definido en 1 o 3.
15.
El polinucleótido de acuerdo con 14, en el que dicho polinucléotido se formula en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
16.
Una construcción de expresión polinucleotídica que comprende un polinucleótido de 14.
17.
Un polipéptido de HA aislado codificado por un polinucleótido de 14.
18.
El polipéptido de acuerdo con 17, en el que dicho polipéptido se formula en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
Los beneficios de la invención de los solicitantes resultarán evidentes para un experto en la materia a partir de la lectura de la presente memoria descriptiva.
Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A-1B muestran relaciones filogenéticas entre los genes de hemaglutinina. La Figura 1A muestra un árbol de genes de HA de aislados caninos, humanos, aviares, porcinos y equinos representativos, incluyendo A/Budgerigar/Hokkaido/1/77 (H4) como grupo externo. La Figura 1B muestra un árbol de los genes de HA de virus de la gripe canina con genes de HA equinos contemporáneos y más antiguos, usando A/Pato/Ucrania/63 (H3) como grupo externo. Los árboles filogenéticos se infirieron a partir de secuencias de nucleótidos por el método de unión de vecinos y se muestran valores de análisis bootstrap �90%. La barra indica el número de cambios de nucleótidos por unidad de longitud de las ramas horizontales del árbol. Las Figuras 2A-2B muestran la detección inmunohistoquímica del antígeno H3 de la gripe en los pulmones. Las secciones tisulares de pulmón se exploraron con un anticuerpo monoclonal de ratón para hemaglutinina H3 y se detectó unión por reacción de inmunoperoxidasa (precipitado marrón). La Figura 2A muestra epitelio bronquial de un galgo con enfermedad espontánea. Se detectó antígeno viral H3 en citoplasma de células epiteliales bronquiales y en macrófagos en los lúmenes de las vías respiratorias y en espacios alveolares. La Figura 2B muestra epitelio bronquial de un perro 5 días después de inoculación con A/canino/Florida/43/2004 (H3N8). Se detectó antígeno viral H3 en citoplasma de células epiteliales bronquiales. Barra de escala, 66 !m. La Figura 3 muestra los cambios histológicos característicos en los bronquios de galgos que murieron de neumonía hemorrágica asociada con infección por virus de la gripe. Los tejidos se tiñen con hematoxilina y eosina. Panel superior: bronquio normal con células epiteliales ciliadas, células mucosas y células basales. Panel inferior: bronquio de un galgo con gripe espontánea. Hay necrosis y erosión de las células epiteliales ciliadas bronquiales. Barra de escala, 100 !m. Las Figuras 4A-4B muestran relaciones filogenéticas entre los genes de hemaglutinina H3. La Figura 4A muestra un árbol filogenético de los genes de HA de virus de la gripe canina con genes de HA equinos contemporáneos y más antiguos. La Figura 4B muestra un árbol filogenético de la proteína HA de virus de la gripe canina con HA equina contemporánea y más antigua. Los árboles filogenéticos se infirieron a partir de secuencias genéticas o de aminoácidos por el método de unión de vecinos y se muestran los valores de análisis bootstrap �80%. La barra indica el número de cambios de aminoácidos por unidad de longitud de las ramas horizontales del árbol. La Figura 5 muestra proteína H3 de virus de la gripe en células epiteliales de bronquios y glándulas bronquiales en pulmones de perros que murieron de neumonía asociada con infección por virus de la gripe. Paneles superiores: Erosión de células epiteliales bronquiales ciliadas en bronquios. Los tejidos se tiñeron con hematoxilina y eosina. Paneles inferiores: proteína H3 del virus de la gripe en el citoplasma de células epiteliales bronquiales (izquierda) y de glándulas bronquiales (derecha). Los tejidos se tiñeron con un anticuerpo monoclonal para H3 de la gripe detectado por reacción de inmunoperoxidasa (precipitado marrón) y se contratiñeron con hematoxilina. Las Figuras 6A-6D muestran representaciones de amplificación de genes de H3 y de matriz (Figura 6A y Figura 6B) obtenidas a partir de la amplificación de patrones de ARN transcritos in vitro diluidos en serie 10 veces. Se construyeron curvas patrón de genes de H3 y de matriz (Figura 6C y Figura 6D) representando el
logaritmo de las concentraciones de ARN de partida frente al ciclo umbral (Ct) obtenido de cada dilución. La Figura 7 muestra que la sensibilidad de Directigen Flu A se ensayó con reservas de virus diluido en serie 10 veces que incluían A/Wyoming/3/2003 y A/canino/FL/242/2003. El triángulo púrpura indica resultado positivo.
Breve descripción de las secuencias
SEC ID Nº: 1 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína PB2. SEC ID Nº: 2 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 1. SEC ID Nº: 3 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína PB 1. SEC ID Nº: 4 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 3. SEC ID Nº: 5 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína PA. SEC ID Nº: 6 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 5. SEC ID Nº: 7 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína NS. SEC ID Nº: 8 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 7. SEC ID Nº: 9 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína NP. SEC ID Nº: 10 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 9. SEC ID Nº: 11 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína NA. SEC ID Nº: 12 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 11. SEC ID Nº: 13 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína MA. SEC ID Nº: 14 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 13. SEC ID Nº: 15 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Florida/43/04) que codifica una proteína HA. SEC ID Nº: 16 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 15. SEC ID Nº: 17 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (FL/242/03) que codifica una proteína PB2. SEC ID Nº: 18 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 17. SEC ID Nº: 19 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (FL/242/03) que codifica una proteína PB 1. SEC ID Nº: 20 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 19. SEC ID Nº: 21 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (F/242/03) que codifica una proteína PA. SEC ID Nº: 22 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 21. SEC ID Nº: 23 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (F/242/03) que codifica una proteína NS. SEC ID Nº: 24 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 23. SEC ID Nº: 25 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (F/242/03) que codifica una proteína NP. SEC ID Nº: 26 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 25. SEC ID Nº: 27 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (FL/242/03) que codifica una proteína NA. SEC ID Nº: 28 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 27. SEC ID Nº: 29 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (FL/242/03) que codifica una proteína MA. SEC ID Nº: 30 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 29. SEC ID Nº: 31 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (FL/242/03) que codifica una proteína HA. SEC ID Nº: 32 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 31. SEC ID Nº: 33 es la forma madura de la proteína HA mostrada en SEC ID Nº: 16 en la que se ha retirado la secuencia señal de 16 aminoácidos N-terminal. SEC ID Nº: 34 es la forma madura de la proteína HA mostrada en SEC ID Nº: 32 en la que se ha retirado la secuencia señal de 16 aminoácidos N-terminal. SEC ID Nº: 35 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 36 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 37 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 38 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 39 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 40 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 41 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 42 es un oligonucleótido.
SEC ID Nº: 43 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 44 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 45 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 46 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 47 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína PB2. SEC ID Nº: 48 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 47. SEC ID Nº: 49 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína PB1. SEC ID Nº: 50 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 49. SEC ID Nº: 51 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína PA. SEC ID Nº: 52 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 51. SEC ID Nº: 53 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína NS. SEC ID Nº: 54 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 53. SEC ID Nº: 55 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína NP. SEC ID Nº: 56 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 55. SEC ID Nº: 57 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína NA. SEC ID Nº: 58 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 57. SEC ID Nº: 59 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína MA. SEC ID Nº: 60 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 59. SEC ID Nº: 61 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Miami/2005) que codifica una proteína HA. SEC ID Nº: 62 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 61. SEC ID Nº: 63 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína PB2. SEC ID Nº: 64 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 63. SEC ID Nº: 65 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína PB1. SEC ID Nº: 66 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 65. SEC ID Nº: 67 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína PA. SEC ID Nº: 68 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 67. SEC ID Nº: 69 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína NS. SEC ID Nº: 70 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 69. SEC ID Nº: 71 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína NP. SEC ID Nº: 72 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 71. SEC ID Nº: 73 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína NA. SEC ID Nº: 74 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 73. SEC ID Nº: 75 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína MA. SEC ID Nº: 76 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 75. SEC ID Nº: 77 es una secuencia de nucleótidos de un virus de la gripe canina (Jacksonville/2005) que codifica una proteína HA que puede usarse de acuerdo con la presente invención. SEC ID Nº: 78 es la secuencia de aminoácidos codificada por SEC ID Nº: 77. SEC ID Nº: 79 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 80 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 81 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 82 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 83 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 84 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 85 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 86 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 87 es un oligonucleótido. SEC ID Nº: 88 es un oligonucleótido.
Descripción detallada
La presente descripción se refiere a un virus de la gripe aislado que es capaz de infectar cánidos y provocar enfermedad respiratoria. Un virus de la gripe puede comprender un polinucleótido que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78 o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. El polinucleótido puede comprender la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77 o un fragmento o variante de la misma. El virus de la gripe puede tener un subtipo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8 y H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16 o un subtipo NA de N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. En una realización específica, un virus de la gripe de la presente invención es un subtipo H3. El virus puede aislarse de perros infectados y cultivarse en células o huevos de acuerdo con métodos descritos en este documento. En una realización ejemplar, el virus de la gripe es un virus de la gripe A.
La presente descripción también se refiere a polinucleótidos que comprenden todo o parte de un gen o genes o un segmento genómico de un virus de la gripe de la presente invención. Un polinucleótido puede comprender un gen de hemaglutinina de la gripe (HA), gen de neuraminidasa (NA), gen de nucleoproteína (NP), gen de proteína de la matriz (MA o M), gen de proteína básica de polimerasa (PB), gen de proteína ácida de polimerasa (PA), gen de proteína no estructural (NS) o un fragmento o variante funcional de cualquiera de estos genes. En una realización específica, un polinucleótido de la invención comprende el gen de hemaglutinina (HA). En la descripción, el gen de HA codifica una proteína de hemaglutinina que tiene uno o más de los siguientes: una serina en la posición 83; una leucina en la posición 222; una treonina en la posición 328; y/o una treonina en la posición 483, frente a la secuencia de aminoácidos de la secuencia consenso de H3 equina. El gen de HA puede codificar un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 16, 32, 62 o 78 o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. El gen de HA puede comprender una secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 15, 31, 61 o 77.
Un polinucleótido puede codificar un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78 o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. El polinucleótido puede codificar la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, comprender la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, respectivamente, o una secuencia que codifica un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. Por lo tanto, la descripción objeto se refiere a secuencias polinucleotídicas que comprenden la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, o un fragmento o variante, incluyendo una variante degenerada, de cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77. Los polinucleótidos de la descripción pueden comprender: Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 3; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 5; Nucleótidos 1-657 de SEC ID Nº: 7; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 9; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 11; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 13; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 15; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 19; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 21; Nucleótidos 1-657 de SEC ID Nº: 23; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 25; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 29; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 31; Nucleótidos 1-2277 de SEC ID Nº: 47; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 49; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 51; Nucleótidos 1-690 de SEC ID Nº: 53; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 55; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 57; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 59; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 61; Nucleótidos 1-2277 de SEC ID Nº: 63; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 65; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 67; Nucleótidos 1-690 de SEC ID Nº: 69; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 71; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 73; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 75; y Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 77. También se han depositado secuencias de nucleótidos y aminoácidos de secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas virales contempladas dentro del alcance de la presente descripción en GenBank con Nº de acceso DQ124147 a DQ124161 y DQ124190.
La descripción objeto también se refiere a polipéptidos codificados por polinucleótidos de un virus de la gripe. La descripción objeto también se refiere a fragmentos funcionales y/o inmunogénicos y variantes de los polipéptidos objeto. Los polipéptidos contemplados incluyen proteína HA, proteína NA, proteína NS, nucleoproteína, proteína básica de polimerasa, proteína ácida de polimerasa, y proteína de la matriz de un virus de la gripe. Un polipéptido de la descripción puede tener una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma.
La descripción objeto también se refiere a construcciones de expresión de polinucleótidos que comprenden una secuencia polinucleotídica. Una construcción de expresión de la descripción puede comprender una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66,
68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. El polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78 puede comprender la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, respectivamente, o una secuencia que codifica un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. Por lo tanto, la descripción objeto se refiere a construcciones de expresión que comprenden una secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, o un fragmento o variante, incluyendo una variante degenerada, de cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, S5, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77. Una construcción de expresión de la presente descripción posibilita la sobreexpresión de un polinucleótido unido operativamente de la descripción.
Las construcciones de expresión generalmente incluyen elementos reguladores que son funcionales en la célula hospedadora deseada en la que debe expresarse la construcción de expresión. Por lo tanto, un experto habitual en la materia puede seleccionar elementos reguladores para su uso en, por ejemplo, células hospedadoras humanas, células hospedadoras de mamífero, células hospedadoras de insectos, células hospedadoras de levadura, células hospedadoras bacterianas y células hospedadoras vegetales. En una realización, los elementos reguladores son elementos que son funcionales en células caninas. Los elementos reguladores incluyen promotores, secuencias de terminación de la transcripción, secuencias de terminación de la traducción, potenciadores y elementos de poliadenilación. Como se usa en este documento, la expresión “construcción de expresión” se refiere a una combinación de secuencias de ácido nucleico que posibilita la transcripción de una secuencia de ácido nucleico unida operativamente. Como se usa en este documento, la expresión “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición de los componentes descritos en la que los componentes están en una relación que les permite actuar de la manera deseada. En general, los componentes unidos operativamente están en una relación contigua.
Una construcción de expresión puede comprender una secuencia promotora unida operativamente con una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la invención. Los promotores pueden incorporarse en un polinucleótido usando técnicas convencionales conocidas en este campo. Pueden usarse múltiples copias de promotores o múltiples promotores en una construcción de expresión. Un promotor puede situarse aproximadamente a la misma distancia del sitio de inicio de la transcripción en la construcción de expresión que del sitio de inicio de la transcripción en su ambiente genético natural. Se permite cierta variación de esta distancia sin reducción sustancial de la actividad promotora. Típicamente se incluye un sitio de inicio de la transcripción en la construcción de expresión. Preferiblemente, el promotor asociado con una construcción de expresión de la invención posibilita la sobreexpresión de un polinucleótido unido operativamente de la invención.
Los promotores para su uso con una construcción de la expresión en células eucariotas pueden ser de origen viral o celular. Los promotores virales incluyen, pero sin limitación, promotores de genes de citomegalovirus (CMV), promotores tempranos o tardíos de SV40, o promotores de genes del virus del sarcoma de Rous (RSV). Los promotores de origen celular incluyen, pero sin limitación, promotor del gen de desmina y promotor del gen de actina. Los promotores adecuados para su uso con una construcción de expresión de la invención en células de levadura incluyen, pero sin limitación, promotor de 3-fosfoglicerato quinasa, promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, promotor de metalotioneína, promotor de alcohol deshidrogenasa-2 y promotor de hexoquinasa.
Si la construcción de la expresión debe proporcionarse o introducirse en una célula vegetal, entonces pueden usarse promotores virales vegetales, tales como, por ejemplo, un promotor de 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (incluyendo el promotor de 35S de CaMV potenciado (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
5.106.739
y An, 1997)) o un promotor de 19S de CaMV. Otros promotores que pueden usarse para construcciones de expresión en plantas incluyen, por ejemplo, promotor prolifera, promotor Ap3, promotores de choque térmico, promotor de ADN-T 1’ o 2’ de A. tumefaciens, promotor de poligalacturonasa, promotor de chalcona sintasa A (CHS-A) de petunia, promotor de PR-1 del tabaco, promotor de ubiquitina, promotor de actina, promotor del gen alcA, promotor de pin2 (Xu et al., 1993), promotor de Wipl del maíz, promotor del gen trpA del maíz (Patente de Estados Unidos Nº 5.626.136), promotor del gen CDPK del maíz y también puede usarse promotor de RUBISCO SSU (Patente de Estados Unidos Nº 5.034.322). Pueden usarse promotores específicos de raíz, tales como cualquiera de las secuencias promotoras descritas en la Patente de Estados Unidos Nº 6.455.760 o Patente de Estados Unidos Nº
6.696.623
o en las solicitudes de patente de Estados Unidos publicadas Nº 20040078841; 20040067506; 20040019934; 20030177536; 20030084486; o 20040123349, con una construcción de expresión. También se contemplan promotores constitutivos (tales como el promotor de CaMV, ubiquitina, actina o NOS), promotores regulados por el desarrollo y promotores inducibles (tales como los promotores que pueden inducirse por calor, luz, hormonas o compuestos químicos) para su uso con construcciones de expresión de polinucleótidos. También pueden usarse promotores específicos de tejidos, por ejemplo, promotores específicos de fruta, tales como el promotor E8 del tomate (número de acceso: AF515784; Good et al., (1994)). También pueden usarse promotores específicos de semilla tales como el promotor del gen de faseolina 1 (por ejemplo, de alubia) o un gen de glicina (por ejemplo, de soja) y otros.
Para la expresión en sistemas procariotas, una construcción de expresión puede comprender promotores tales como, por ejemplo, promotor de fosfatasa alcalina, promotor de triptófano (trp), promotor lambda PL, promotor de 1lactamasa, promotor de lactosa, promotor de phoA, promotor de T3, promotor de T7 o promotor de tac (de Boer et al., 1983).
Las construcciones de expresión pueden contener opcionalmente una secuencia de terminación de la transcripción, una secuencia de terminación de la traducción, una secuencia que codifique un péptido señal y/o elementos potenciadores. Pueden obtenerse típicamente regiones de terminación de la transcripción de la región no traducida 3’ de una secuencia de gen viral o eucariota. Las secuencias de terminación de la transcripción pueden situarse corriente abajo de una secuencia codificante para proporcionar una terminación eficaz. Una secuencia de péptido señal es una secuencia de aminoácidos corta típicamente presente en el extremo amino terminal de una proteína que es responsable del traslado de un polipéptido maduro unido operativamente a una amplia serie de destinos celulares postraduccionales, que varían desde un compartimento de orgánulo específico a sitios de acción proteica y el ambiente extracelular. Se contempla la dirección de productos génicos a un destino celular y/o extracelular deseado a través del uso de una secuencia de péptido señal unida operativamente para su uso con los polipéptidos de la invención. Son potenciadores clásicos elementos de acción en cis que aumentan la transcripción génica y también pueden incluirse en la construcción de expresión. Se conocen en la técnica elementos potenciadores clásicos e incluyen, pero sin limitación, el elemento potenciador de 35S de CaMV, el elemento potenciador de promotor temprano de citomegalovirus (CMV) y el elemento potenciador de SV40. También se conocen en la técnica elementos potenciadores mediados por intrón que potencian la expresión génica. Estos elementos deben estar presentes dentro de la región transcrita y dependen de la orientación.
En la construcción de expresión también pueden incluirse secuencias de ADN que dirigen la poliadenilación del ARNm transcrito a partir de la construcción de expresión, e incluyen, pero sin limitación, una señal de octopina sintasa o nopalina sintasa.
Las construcciones de expresión también pueden incluir uno o más genes marcadores seleccionables dominantes, incluyendo, por ejemplo, genes que codifican resistencia a antibióticos y/o resistencia a herbicidas para seleccionar células transformadas. Los genes de resistencia a antibióticos pueden proporcionar resistencia a uno o más de los siguientes antibióticos: higromicina, kanamicina, bleomicina, G418, estreptomicina, paromomicina, neomicina y espectinomicina. Puede proporcionarse resistencia a kanamicina por neomicina fosfotransferasa (NPT II). Los genes de resistencia a herbicidas pueden proporcionar resistencia a fosfinotricina acetiltransferasa o glifosato. Otros marcadores usados para exploración de transformación de células incluyen, pero sin limitación, genes que codifican 1-glucuronidasa (GUS), 1-galactosidasa, luciferasa, nopalina sintasa, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP) o GFP potenciada (Yang et al., 1996).
La presente descripción también se refiere a vectores polinucleotídicos que comprenden una secuencia polinucleotídica que codifica un polipéptido de la descripción. Pueden incluirse sitios de enzimas de restricción únicos en los extremos 5’ y 3’ de una construcción de expresión o polinucleótido de la invención para permitir la inserción en un vector polinucleotídico. Como se usa en este documento, el término “vector” se refiere a cualquier elemento genético, incluyendo por ejemplo, plásmidos, cósmidos, cromosomas, fago, virus y similares, con capacidad de replicación cuando se asocia con elementos de control apropiados y que puede transferir secuencias polinucleotídicas entre células. Los vectores contienen una secuencia de nucleótidos que permite que el vector se replique en una célula hospedadora seleccionada. Están disponibles varios vectores para expresión y/o clonación, e incluyen, pero sin limitación, pBR322, serie pUC, serie M13, serie pGEM y vectores pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, CA y Promega, Madison, WI).
La presente descripción también se refiere a sondas y cebadores oligonucleotídicos, tales como cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que pueden hibridar con una secuencia codificante o no codificante de un polinucleótido. Pueden usarse sondas oligonucleotídicas en métodos para detectar secuencias de ácido nucleico del virus de la gripe. Pueden usarse cebadores oligonucleotídicos en métodos de PCR y otros métodos que implican amplificación de ácidos nucleicos. Una sonda o cebador puede hibridar con un polinucleótido en condiciones rigurosas. Las sondas y cebadores pueden comprender opcionalmente un marcador detectable o molécula indicadora, tales como moléculas fluorescentes, enzimas, restos radiactivos y similares. Las sondas y cebadores pueden ser de cualquier longitud adecuada para el método o ensayo en el que se están empleando. Típicamente, las sondas y cebadores serán de 10 a 500 o más nucleótidos de longitud. Se contemplan sondas y cebadores que son de 10 a 20, de 21 a 30, de 31 a 40, de 41 a 50, de 51 a 60, de 61 a 70, de 71 a 80, de 81 a 90, de 91 a 100 o 101 o más nucleótidos de longitud. Las sondas y cebadores son de cualquiera de 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. Las sondas y cebadores pueden tener identidad de secuencia de nucleótidos completa (100%) con la secuencia polinucleotídica, o la identidad de secuencia puede ser menor del 100%. Por ejemplo, la identidad de secuencia entre una sonda o cebador y una secuencia puede ser del 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70% o cualquier otro porcentaje de identidad de secuencia, siempre que la sonda o cebador pueda hibridar en condiciones rigurosas con una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido. Las sondas y cebadores ejemplificados de la invención incluyen los que tienen la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 35, SEC ID Nº: 36, SEC ID Nº: 37, SEC ID Nº: 38, SEC ID Nº: 39, SEC ID Nº: 40, SEC ID Nº: 41, SEC ID Nº: 42, SEC ID Nº: 43, SEC ID Nº: 44, SEC ID Nº: 45 y
SEC ID Nº: 46, o un fragmento o variante funcional de cualquiera de las SEC ID Nº: 35-46.
Como se usa en este documento, las expresiones “ácido nucleico”, “polinucleótido” y “oligonucleótido” se refieren a un desoxirribonucleótido, ribonucleótido o un polímero mixto de desoxirribonucleótido y ribonucleótido en forma mono o bicatenaria y, a no ser que se limite de otro modo, abarcarían análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden actuar de una manera similar como nucleótidos de origen natural. Las secuencias polinucleotídicas incluyen la secuencia de cadena de ADN que puede transcribirse a ARN y la cadena de ARN que puede traducirse a proteína. También se contempla dentro del alcance de la invención la secuencia complementaria de cualquier ácido nucleico, polinucleótido u oligonucleótido de la presente invención. Las secuencias polinucleotídicas también incluyen tanto secuencias de longitud completa como secuencias más cortas derivadas de las secuencias de longitud completa. La presente descripción también abarca los polinucleótidos que son complementarios en secuencia a los polinucleótidos descritos en este documento. Los polinucleótidos y polipéptidos pueden proporcionarse en forma purificada o aislada.
Debido a la degeneración del código genético, una diversidad de secuencias polinucleotídicas diferentes pueden codificar un polipéptido. Se describe una tabla que muestra todos los tripletes codónicos posibles (y en los que U también significa T) y el aminoácido codificado por cada codón en Lewin (1985). Además, está dentro de la experiencia de una persona entrenada en la técnica crear secuencias polinucleotídicas alternativas que codifican los mismos, o esencialmente los mismos, polipéptidos de la descripción. Estas secuencias polinucleotídicas variantes y alternativas degeneradas están dentro del alcance de la descripción. Como se usa en este documento, las referencias a “esencialmente la misma” secuencia se refiere a las secuencias que codifican sustituciones, deleciones, adiciones o inserciones de aminoácidos que no alteran materialmente la actividad funcional y/o inmunogénica del polipéptido codificado por los polinucleótidos de la descripción.
La descripción también se refiere a variantes de los polinucleótidos de la descripción que codifican polipéptidos de la descripción. Las secuencias variantes incluyen las secuencias en las que uno o más nucleótidos de la secuencia se han sustituido, suprimido y/o insertado. Los nucleótidos que pueden sustituir nucleótidos naturales de ADN tienen un resto de base que puede incluir, pero sin limitación, inosina, 5-fluoroacilo, 5-bromouracilo, hipoxantina, 1metilguanina, 5-metilcitosina y bases tritiladas. El resto de azúcar del nucleótido en una secuencia también puede modificarse e incluye, pero sin limitación, arabinosa, xilulosa y hexosa. Además, las bases de adenina, citosina, guanina, timina y uracilo de los nucleótidos pueden modificarse con acetilo, metilo y/o grupos tio. Pueden prepararse secuencias que contienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos y ensayarse usando técnicas convencionales conocidas en la materia.
También se contempla dentro del alcance de la descripción la sustitución de aminoácidos distintos de los ejemplificados específicamente o presentes de forma natural en un polipéptido de la descripción. Por ejemplo, aminoácidos no naturales pueden sustituir a los aminoácidos de un polipéptido, siempre que el polipéptido que tiene los aminoácidos sustituidos conserve sustancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido en el que no se han sustituido los aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos no naturales incluyen, pero sin limitación, ornitina, citrulina, hidroxiprolina, homoserina, fenilglicina, taurina, yodotirosina, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-amino isobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-amino butírico, ácido y-amino butírico, ácido s-amino hexanoico, ácido 6amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, norleucina, norvalina, sarcosina, homocitrulina, ácido cisteico, 1-butilglicina, 1-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, 1-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como 1-metil aminoácidos, C-metil aminoácidos, N-metil aminoácidos y análogos de aminoácidos en general. Los aminoácidos no naturales también incluyen aminoácidos que tienen grupos laterales derivatizados. Además, cualquiera de los aminoácidos en la proteína puede ser de la forma D (dextrógira) o L (levógira). Se contemplan variantes alélicas de una secuencia proteica de un polipéptido.
Los aminoácidos pueden categorizarse generalmente en las siguientes clases: no polares, polares no cargados, básicos y ácidos. Las sustituciones conservativas por las que un polipéptido de la presente invención que tiene un aminoácido de una clase se reemplaza con otro aminoácido de la misma clase quedan dentro del alcance de la descripción siempre que el polipéptido que tenga la sustitución aún conserve sustancialmente la misma actividad funcional que el polipéptido que no tiene la sustitución. Dentro del alcance de la descripción se contemplan polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene una o más sustituciones de aminoácidos en la secuencia. La Tabla 11 posterior proporciona una lista de ejemplos de aminoácidos que pertenecen a cada clase. En la Tabla 12 se definen abreviaturas de aminoácidos de una letra.
Pueden generarse fragmentos y variantes de polipéptidos de virus de la gripe usando métodos convencionales conocidos en la técnica y ensayarse con respecto a la presencia de función o inmunogenicidad usando técnicas convencionales conocidas en este campo. Por ejemplo, para ensayar fragmentos y/o variantes de un polipéptido de neuraminidasa de la invención, puede ensayarse la actividad enzimática. Por lo tanto, un experto habitual en la materia puede preparar y ensayar fácilmente fragmentos y variantes de un polipéptido y determinar si el fragmento o variante conserva actividad en relación con el polipéptido de longitud completa o uno no variante.
Los polinucleótidos y polipéptidos contemplados también pueden definirse con respecto a intervalos de identidad y/o similitud más particulares con las secuencias de la invención ejemplificadas específicamente en este documento. La
secuencia de identidad típicamente será mayor del 60%, preferiblemente mayor del 75%, más preferiblemente mayor del 80%, aún más preferiblemente mayor del 90% y puede ser mayor del 95%. La identidad y/o similitud de una secuencia puede ser del 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% en comparación con una secuencia ejemplificada en este documento. A no ser que se especifique de otro modo, como se usa en este documento el porcentaje de identidad y/o similitud de secuencia de dos secuencias puede determinarse usando el algoritmo de Karlin y Altschul (1990), modificado como en Karlin y Altschul (1993). Un algoritmo tal se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul et al. (1990). Pueden realizarse búsquedas de BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias con el porcentaje de identidad de secuencia deseado. Para obtener alineamientos con huecos para fines de comparación, puede usarse BLAST con huecos como se describe en Altschul et al. (1997). Cuando se utilizan programas BLAST y BLAST con huecos, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (NBLAST y XBLAST). Véase sitio web NCBI/NIH.
La descripción también contempla las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias que son suficientemente homólogas de las secuencias polinucleotídicas ejemplificadas en este documento para permitir la hibridación con esa secuencia en condiciones rigurosas convencionales y métodos convencionales (Maniatis et al., 1982). Como se usa en este documento, condiciones “rigurosas” para hibridación se refiere a condiciones en las que la hibridación se lleva a cabo típicamente durante una noche a 20-25 ºC por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del híbrido de ADN en SSPE 6x, solución de Denhardt 5x, SDS 0,1%, ADN desnaturalizado 0,1 mg/ml. La temperatura de fusión, Tm, se describe por la siguiente fórmula (Beltz et al., 1983):
Tm = 81,5 C+16,6 Log[Na+]+0,41(%G+C-0,61 (% de formamida)-600/longitud de la doble cadena en pares de bases.
Los lavados se llevan a cabo típicamente como sigue:
(1)
Dos veces a temperatura ambiente durante 15 minutos en SSPE 1x, SDS 0,1% (lavado de baja rigurosidad).
(2)
Una vez a Tm-20 C durante 15 minutos en SSPE 0,2x, SDS 0,1% (lavado de rigurosidad moderada).
La descripción también se refiere a proteínas y péptidos virales codificados por los genes de un virus de la gripe de la descripción. La proteína viral pueden ser una proteína HA madura. La proteína HA madura puede comprender uno
o más de los siguientes: una serina en la posición 82; una leucina en la posición 221; una treonina en la posición 327; y/o una treonina en la posición 482. La proteína HA madura puede tener una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 33 o SEC ID Nº: 34, o un fragmento o variante funcional y/o inmunogénico de SEC ID Nº: 33 o SEC ID Nº: 34. La proteína viral puede ser una proteína NA, proteína NS, proteína PB, proteína PA o proteína MA. Pueden usarse proteínas y péptidos virales para generar anticuerpos que se unen específicamente a la proteína
o péptido. También pueden usarse proteínas y péptidos virales de la presente invención como inmunógenos y en composiciones de vacunas.
La presente descripción también se refiere a composiciones y métodos para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe que es capaz de infectar a un animal hospedador susceptible y provocar enfermedad respiratoria. La descripción puede usarse para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe de cualquier subtipo en un animal hospedador susceptible. Por ejemplo, el virus de la gripe puede ser un subtipo de HA de H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16, y un subtipo de NA de N 1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 o N9. En una realización, el subtipo de HA es H3 o H5. El subtipo de NA puede ser N7 o N8. Puede inducirse una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe del subtipo H3N8. El animal hospedador puede ser un cánido. Los cánidos incluyen cánidos silvestres, de zoológico y domésticos, tales como lobos, coyotes y zorros. Los cánidos también incluyen perros, particularmente perros domésticos, tales como, por ejemplo, perros de compañía de raza pura y/o mestizos, perros de exhibición, perros de trabajo, perros pastores, perros de caza, perros guardianes, perros policía, perros de carreras y/o perros de laboratorio. El animal hospedador puede ser un perro domesticado, tal como un galgo. Puede administrarse a un animal una cantidad eficaz de una composición inmunogénica suficiente para inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe de la invención. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o celular. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria protectora que es capaz de prevenir o minimizar la infección viral en el animal hospedador inmunizado durante algún periodo de tiempo posterior a la inmunización. Por lo tanto, la descripción también se refiere a composiciones de vacuna y métodos que pueden proporcionar a un animal vacunado una respuesta inmunitaria protectora a un virus.
Como se describe en este documento, las composiciones de vacuna o inmunogénicas pueden comprender virus completos sin células, incluyendo virus atenuados o inactivados, o partes de virus, incluyendo partículas de subvirión (incluyendo “vacuna dividida” en la que se trata un virión para retirar algunos o todos los lípidos virales), proteínas virales (incluyendo proteínas individuales y complejos macromoleculares de múltiples proteínas), polipéptidos y péptidos, así como líneas celulares infectadas por virus, o una combinación de cualquiera de éstos. Las composiciones de vacuna o inmunogénicas que comprenden líneas celulares infectadas por virus pueden comprender múltiples líneas celulares, cada una infectada con una cepa viral diferente.
Puede inmunizarse un cánido con una o más vacunas de virus de la gripe inactivado (es decir, muerto) y/o vivo atenuado o vacunas que comprenden uno o múltiples antígenos de virus de la gripe de uno o más aislados de virus. El virus de la gripe puede ser un virus de la gripe canina. El virus de la gripe puede ser un virus de la gripe equina que codifica o expresa un polipéptido que tiene al menos aproximadamente un 90%, o al menos aproximadamente un 95%, o al menos aproximadamente un 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencias de aminoácidos con un polipéptido de virus de la gripe canina. Un antígeno de la gripe usado en una vacuna de la presente descripción puede tener al menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia con un antígeno de HA y/o antígeno de NA de un virus de la gripe canina.
Un ejemplo de una vacuna inactivada es EQUICINE II™, que se ha comercializado por Intervet Inc. (Millsboro, DE, Estados Unidos) como una vacuna líquida. EQUICINE II™ contiene virus de la gripe A/Pensilvania/63 inactivado (“A/Pa/63”) y virus de la gripe A/equino/Kentucky/93 (“A/KY/93”) con carbopol (es decir, HAVLOGEN® (Intervet Inc.)). Más específicamente, una dosis de EQUICINE II™ contiene: A/Pa/63 inactivado a 106,0 EID50, A/KY/93 inactivado a 106,7 EID50, carbopol 0,25% en volumen y suficiente PBS para crear un volumen total de 1 ml.
Otro ejemplo de una vacuna inactivada es virus de la gripe equina A/equino/Ohio/03 (“Ohio 03”). En algunas realizaciones, dicha vacuna contiene CARBIGEN™, que es un adyuvante basado en polímero emulsionado disponible en el mercado de MVP Laboratories, Inc. (Ralston, NE). En tales vacunas, una unidad de dosificación típicamente comprende al menos aproximadamente 250 unidades de HA del virus, de aproximadamente 250 a aproximadamente 12.500 unidades de HA del virus, o de aproximadamente 1000 a aproximadamente 6200 unidades de HA del virus. La concentración recomendada de CARBIGEN™ es de aproximadamente un 5 a aproximadamente un 30% (en masa).
Un ejemplo de una vacunada atenuada viva es gripe equina/Kentucky/91 (“A/KY/91”) viva modificada en forma de una vacuna liofilizada que puede reconstituirse con agua. Esta reconstitución puede realizarse usando agua de uso en vacunas suficiente para llevar la dosificación de la vacuna a un volumen total de 1 ml. Se analizan aspectos de tales vacunas en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 6.436.408; 6.398.774; y 6.177.082, que se incorporan por referencia en su totalidad en esta patente. Cuando se reconstituye, una dosis de dicha vacuna puede, por ejemplo, contener AlKY/91 a 107,2 DICT50 por ml, 0,015 gramos de N-Z AMINE AS™ por ml, 0,0025 gramos de gelatina por ml y 0,04 gramos de lactosa D por ml. N-Z AMINE AS™ es una fuente refinada de aminoácidos y péptidos producidos por hidrólisis enzimática de caseína. N-Z AMINE AS™ se comercializa por Kerry Bio-Science (Norwich, NY, Estados Unidos).
Las vacunas pueden comprender un antígeno de gripe H3 que tiene al menos aproximadamente un 93% de homología con Florida/43/2004 en secuencias codificantes de HA, tales como, por ejemplo, la cepa de equino/New Market/79. La homología preferida es al menos aproximadamente el 96%, tal como, por ejemplo, las cepas equino/Alaska/1/91 y equino/Santiago/85. En los ejemplos posteriores, se incorporaron en vacunas los antígenos de gripe equino/Kentucky/91, equino-2/Kentucky/93, equino-1/Pensilvania/63, y equino/Ohio/03. Las vacunas preferidas también incluyen vacunas que comprenden equino/Wisconsin/03, equino/Kentucky/02, equino/Kentucky/93 y equino/New Market2/93. En los ejemplos proporcionados a continuación, se usaron virus H3N8. Se cree, sin embargo, que pueden usarse otros virus de gripe H3.
Pueden prepararse vacunas atenuadas vivas por medios convencionales. Tales medios generalmente incluyen, por ejemplo, modificar cepas patógenas por pase in vitro, adaptación al frío, modificación de la patogenia del organismo por manipulación genética, preparación de quimeras, inserción de antígenos en vectores virales, selección de cepas de tipo de silvestre no virulentas, etc.
La cepa de virus atenuado vivo puede obtenerse por pase en serie del virus de tipo silvestre a través de cultivo celular, animales de laboratorio, animales no hospedadores o huevos. La acumulación de mutaciones genéticas durante tales pases típicamente conduce a una pérdida progresiva de virulencia del organismo para el hospedador original.
La cepa de virus atenuado vivo puede prepararse por co-infección de células permisibles con un virus mutante atenuado y virus patógeno. El virus recombinante resultante deseado tiene la seguridad del virus atenuado con genes que codifican antígenos protectores procedentes del virus patógeno.
La cepa de virus atenuado vivo puede prepararse por adaptación al frío. Un virus adaptado al frío tiene la ventaja de replicar solamente a la temperatura hallada en el tracto respiratorio superior. En la Patente de Estados Unidos Nº
6.177.082 se ha descrito un método para la generación de un virus de la gripe equina adaptado al frío. Un virus adaptado al frío resultante deseado confiere uno o más de los siguientes fenotipos: adaptación al frío, sensibilidad a temperatura, interferencia dominante y/o atenuación.
La cepa de virus atenuado vivo puede prepararse por medios moleculares, tales como mutación puntual, deleción o inserción para convertir un virus patógeno en un virus no patógeno o menos patógeno en comparación con el virus original, conservando a la vez las propiedades protectoras del virus original.
El virus atenuado vivo puede preparase clonando el candidato de genes de antígenos protectores en un genoma de un virus no patógeno o menos patógeno u otro organismo.
Pueden prepararse vacunas de virus inactivados (es decir, “muertos”) inactivando el virus usando métodos convencionales. Típicamente, tales vacunas incluyen excipientes que pueden potenciar una respuesta inmunitaria, así como otros excipientes que se usan convencionalmente en vacunas. Por ejemplo, en los ejemplos posteriores, EQUICINE II™ comprende HAVLOGEN®. La inactivación del virus puede conseguirse tratando el virus con compuestos químicos de inactivación (por ejemplo, formalina, beta propiolactona (“BPL”), bromoetilamina (“BEA”), y etilenimina binaria (“BEI”)) o por métodos no químicos (por ejemplo, calor, congelación/descongelación o sonicación) para desactivar la capacidad de replicación del virus.
En los ejemplos proporcionados a continuación, se usó equino/Ohio/03 como un virus de exposición. Se sabe que tiene aproximadamente el 99% de homología con aislados de Florida/43/04, y se ha mostrado que induce síntomas de infección y seroconversión en perros. El Ejemplo 18 ilustra la eficacia de vacunas de gripe equina en perros, mostrando titulaciones de inhibición de hemaglutinación (o “HI” o “HAI”) en perros vacunados con antígeno Ohio 03 inactivado en una composición de vacuna que comprende adyuvante CARBIGEN™. La Tabla 29 muestra titulaciones antes de la vacunación, después de la vacunación y después de la segunda vacunación, así como después de la exposición. Los resultados indican titulaciones de HI en cada etapa después de la vacunación para los perros vacunados, con poco o ningún aumento para los controles. La Tabla 30 ilustra las señales clínicas, aislamiento de virus y resultados de histopatología del mismo estudio. Aunque los animales expuestos no mostraron señales clínicas, difusión viral o histopatología positiva, las titulaciones de HI positivas (Tabla 29) indican titulaciones de anticuerpo significativas en animales inmunizados.
Debería tenerse en cuenta que la presente descripción también incluye otras vacunas de antígeno de virus de la gripe H3.
Debería observarse adicionalmente que pueden usarse antígenos de la gripe distintos de antígenos de virus de la gripe H3 de acuerdo con la presente descripción. Tales antígenos incluyen, por ejemplo, los de equino/PA/63, que es un subtipo A1 equino (H7N7). Se contempla que uno o más de tales antígenos pueden usarse con o sin uno o más antígenos de gripe H3.
En general, la vacuna se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” es una cantidad suficiente para inducir una respuesta protectora en el paciente canino contra el virus diana. Típicamente, una dosificación es “terapéuticamente eficaz” si previene, reduce el riesgo de, retarda la aparición de, reduce la proliferación de, alivia, suprime o erradica la gripe o uno o más (típicamente dos o más) de sus síntomas. Los síntomas de la gripe típicos incluyen, por ejemplo, fiebre (para perros, típicamente 103,0 ºF; 39,4 ºC), tos, estornudos, lesiones histopatológicas, descarga ocular, descarga nasal, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso, náuseas, hemoptisis y/o estertores audibles. Con frecuencia, los síntomas más graves pueden incluir, por ejemplo, hemorragia en los pulmones, mediastino o cavidad pleural; traqueítis; bronquitis; bronquiolitis; bronconeumonía supurativa; y/o infiltración del revestimiento epitelial y lúmenes de las vías respiratorias de los pulmones con neutrófilos y/o macrófagos.
La vacuna puede administrarse como parte de una terapia de combinación, es decir, una terapia que incluye, además de la propia vacuna, la administración de uno o más agentes activos, adyuvantes, terapias, etc., adicionales. En ese caso, debería reconocerse que la cantidad de vacuna que constituye una cantidad “terapéuticamente eficaz” puede ser menor que la cantidad de vacuna que constituiría una cantidad “terapéuticamente eficaz” si la vacuna fuera a administrarse sola. Otras terapias pueden incluir las conocidas en la técnica, tales como, por ejemplo, medicaciones antivirales, analgésicos, medicaciones reductoras de fiebre, expectorantes, medicaciones anti-inflamación, antihistamínicos, antibióticos para tratar infecciones bacterianas que resultan de la infección por virus de la gripe, reposo y/o administración de fluidos. Las vacunas pueden administrarse en combinación con una vacuna de Bordetella, vacuna de adenovirus y/o vacuna de virus paragripal.
Una dosis típica para una vacuna atenuada viva puede ser al menos aproximadamente 103 ufp/cánido; y más típicamente de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 ufp/cánido. En la presente descripción “ufp” significa “unidades formadores de placas”. Una dosis típica para una vacuna atenuada viva puede ser al menos aproximadamente 103 DICT50/cánido, y más típicamente de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 DICT50/cánido. Una dosis típica para una vacuna atenuada viva puede ser al menos aproximadamente 103 EID50/cánido, y más típicamente de aproximadamente 103 a aproximadamente 109 EID50/canino. Una dosis típica para una vacuna muerta puede ser al menos aproximadamente 40 unidades de HA, típicamente de aproximadamente 40 a aproximadamente 10.000 unidades de HA, y más típicamente de aproximadamente 500 a aproximadamente 6.200 unidades de HA. La dosis puede ser de aproximadamente 6.100 a aproximadamente 6.200 unidades de HA.
La vacuna puede comprender una vacuna atenuada viva a una concentración que es al menos aproximadamente 100,5 ufp/cánido mayor que el nivel de inmunogenicidad. La vacuna puede comprender una vacuna atenuada viva a una concentración que es al menos aproximadamente 100,5 DICT50/cánido mayor que el nivel de inmunogenicidad.
La vacuna puede comprender una vacuna atenuada viva a una concentración que es al menos aproximadamente 100,5 EID50/cánido mayor que el nivel de inmunogenicidad.
El nivel de inmunogenicidad puede determinarse experimentalmente por técnicas de estudio de titulación de dosis de exposición generalmente conocidas en este campo. Tales técnicas típicamente incluyen vacunar a varios cánidos con la vacuna a diferentes dosificaciones, y después exponer los cánidos al virus virulento para determinar la dosis protectora mínima.
Los factores que afectan al régimen de dosificación preferido pueden incluir, por ejemplo, el tipo (por ejemplo, especie y raza), edad, peso, sexo, dieta, actividad, tamaño de los pulmones y estado del sujeto; la vía de administración; la eficacia, seguridad y duración de perfiles de inmunidad de la vacuna particular usada; si se usa un sistema de suministro; y si la vacuna se administra como parte de una combinación de fármacos y/o vacunas. Por lo tanto, la dosificación empleada realmente puede variar para animales específicos y, por lo tanto, puede desviarse de las dosificaciones típicas expuestas anteriormente. La determinación de tales ajustes de dosificación generalmente está dentro de la experiencia de la técnica usando medios convencionales. Debería tenerse en cuenta que los virus vivos atenuados generalmente se autopropagan; por lo tanto, la cantidad específica administrada de dicho virus no es necesariamente crítica.
Se contempla que la vacuna puede administrarse al paciente canino una sola vez; o, como alternativa, dos o más veces durante días, semanas, meses o años. La vacuna puede administrarse al menos dos veces. La vacuna puede administrarse dos veces, administrándose la segunda dosis (por ejemplo, el refuerzo) al menos aproximadamente 2 semanas después de la primera. La vacuna puede administrarse dos veces, administrándose la segunda dosis no más de 8 semanas después de la primera. La segunda dosis puede administrarse de aproximadamente 2 semanas a aproximadamente 4 años después de la primera dosis, de aproximadamente 2 a aproximadamente 8 semanas después de la primera dosis, o de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 semanas después de la primera dosis. La segunda dosis puede administrarse aproximadamente 4 semanas después de la primera dosis. La primera y posteriores dosificaciones pueden variar, tal como, por ejemplo, en cantidad y/o forma. Con frecuencia, sin embargo, las dosificaciones son iguales en cuanto a cantidad y forma. Cuando se administra solamente una dosis sencilla, la cantidad de vacuna en esa dosis solamente comprende generalmente una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna. Cuando, sin embargo, se administra más de una dosis, las cantidades de vacuna en esas dosis juntas pueden constituir una cantidad terapéuticamente eficaz.
La vacuna puede administrarse antes de que el receptor canino se infecte con gripe. La vacuna puede, por ejemplo, administrarse para prevenir, reducir el riesgo de, o retardar la aparición de la gripe o uno o más síntomas de la gripe (típicamente dos o más).
La vacuna puede administrarse después de que el receptor canino se infecte con gripe. La vacuna puede, por ejemplo, aliviar, suprimir, o erradicar la gripe de uno o más síntomas de la gripe (típicamente dos o más).
La composición preferida de la vacuna depende de, por ejemplo, si la vacuna es una vacuna inactivada, vacuna viva atenuada, o ambas. También depende del método de administración de la vacuna. Se contempla que la vacuna comprenderá uno o más transportadores, adyuvantes, otros potenciadores de respuesta inmunitaria y/o vehículos farmacéuticamente aceptables convencionales (denominados colectivamente “excipientes”). Tales excipientes se seleccionan generalmente para ser compatibles con el principio o los principios activos en la vacuna. El uso de excipientes generalmente se conoce por los expertos en la materia.
La expresión “farmacéuticamente aceptable” se usa como adjetivo para indicar que el sustantivo modificado es apropiado para su uso en un producto farmacéutico. Cuando se usa, por ejemplo, para describir un excipiente en una vacuna farmacéutica, caracteriza al excipiente como compatible con los otros ingredientes de la composición y no desfavorablemente perjudicial para el cánido receptor deseado.
Las vacunas se pueden administrar por medios convencionales, incluyendo, por ejemplo, administración mucosa (tales como intranasal, oral, intratraqueal y ocular) y administración parenteral. La administración mucosa es con frecuencia particularmente ventajosa para vacunas atenuadas vivas. La administración parenteral también es con frecuencia particularmente ventajosa para vacunas inactivadas.
Las vacunas mucosas pueden ser, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, tales como emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Los excipientes adecuados para tales vacunas incluyen, por ejemplo, diluyentes inertes habitualmente usados en la técnica, tales como agua, solución salina, dextrosa, glicerol, lactosa, sacarosa, polvo de almidón, ésteres de celulosa de ácidos alcanoicos, ésteres de alquilo de celulosa, talco, ácido esteárico, estearato de magnesio, óxido de magnesio, sales de sodio y calcio de ácidos fosfóricos y sulfúricos, gelatina, goma arábiga, alginato sódico, polivinilpirrolidona, y/o alcohol polivinílico. Los excipientes también pueden comprender diversos agentes humectantes, emulsionantes, de suspensión, saporíferos (por ejemplo, edulcorantes) y/o perfumantes.
Las vacunas mucosas orales también pueden, por ejemplo, comprimirse o encapsularse para una administración conveniente. Tales cápsulas o comprimidos pueden contener una formulación de liberación controlada. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas de dosificación también pueden comprender agentes tamponantes, tales como citrato sódico, o carbonato o bicarbonato de magnesio o de calcio. Los comprimidos y píldoras adicionalmente pueden prepararse con recubrimientos entéricos.
Se contempla que las vacunas pueden administrarse mediante el agua para beber y/o alimento del paciente canino. Se contempla adicionalmente que las vacunas pueden administrarse en forma de una golosina o juguete.
La “administración parenteral” incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones submucosas, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intraesternales, inyecciones transcutáneas, e infusión. Las preparaciones inyectables (por ejemplo, suspensiones acuosas u oleaginosas inyectables estériles) pueden formularse de acuerdo con la técnica conocida usando excipientes adecuados, tales como vehículos, disolventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, y/o agentes de suspensión. Estos típicamente incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de cacahuete, aceite de sésamo, alcohol bencílico, alcohol bencílico, 1,3-butanodiol, solución de Ringer, solución isotónica de cloruro sódico, aceites fijos insípidos (por ejemplo, mono o diglicéridos sintéticos), ácidos grasos (por ejemplo, ácido oleico), dimetil acetamida, tensioactivos (por ejemplo, detergentes iónicos y no iónicos), propilenglicol, y/o polietilenglicoles. Los excipientes también pueden incluir pequeñas cantidades de otras sustancias adyuvantes, tales como agentes tamponantes de pH.
Las vacunas pueden incluir uno o más excipientes que potencian la respuesta inmunitaria de un paciente canino (que puede incluir una respuesta de anticuerpos, respuesta celular, o ambas), aumentando de este modo la eficacia de la vacuna. El uso de tales excipientes (o “adyuvantes”) puede ser particularmente beneficioso cuando se usa una vacuna inactivada. El adyuvante o adyuvantes pueden ser una sustancia que tenga un efecto directo (por ejemplo, citocina o Bacilo de Calmette-Guerin (“BCG”)) o indirecto (liposomas) en células del sistema inmunitario del paciente canino. Los ejemplos de adyuvantes con frecuencia adecuados incluyen aceites (por ejemplo, aceites minerales), sales metálicas (por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio), componentes bacterianos (por ejemplo, liposacáridos bacterianos, adyuvantes de Freund y/o MDP), componentes vegetales (por ejemplo, Quil A) y/o una o más sustancias que tengan un efecto vehículo (por ejemplo, bentonita, partículas de látex, liposomas, y/o Quil A, ISCOM). Como se ha observado anteriormente, los adyuvantes también incluyen, por ejemplo, CARBIGEN™ y carbopol. Debería reconocerse que la presente descripción abarca tanto vacunas que comprenden un adyuvante o adyuvantes, así como vacunas que no comprenden ningún adyuvante.
Se contempla que la vacuna puede liofilizarse (o reducirse de otro modo en volumen líquido) para almacenamiento, y después reconstituirse en un líquido antes o en el momento de la administración. Dicha reconstitución puede conseguirse usando, por ejemplo, agua de uso en vacunas.
La presente descripción comprende además kits que son adecuados para su uso en la realización de los métodos descritos anteriormente. El kit comprende una forma de dosificación que comprende una vacuna descrita anteriormente. El kit también comprende al menos un componente adicional y, típicamente, instrucciones para usar la vacuna con el componente o los componentes adicionales. El componente o los componentes adicionales pueden, por ejemplo, ser uno o más ingredientes adicionales (tales como, por ejemplo, uno o más de los excipientes analizados anteriormente, alimento y/o una golosina) que pueden mezclarse con la vacuna antes o durante la administración. El componente o los componentes adicionales pueden como alternativa (o adicionalmente) comprender uno o más aparatos para administrar la vacuna al paciente canino. Un aparato tal puede ser, por ejemplo, una jeringa, inhalador, nebulizador, pipeta, pinzas o cualquier vehículo de suministro médicamente aceptable. El aparato puede ser adecuado para administración subcutánea de la vacuna. El aparato puede ser adecuado para administración intranasal de la vacuna.
También pueden usarse otros excipientes y modos de administración conocidos en la técnica farmacéutica o biológica.
Las composiciones de vacuna o inmunogénicas de la presente descripción también abarcan construcciones basadas en vectores virales recombinantes que pueden comprender, por ejemplo, genes que codifican proteína HA, proteína NA, nucleoproteína, proteína básica de polimerasa, proteína ácida de polimerasa, y/o proteína de la matriz de un virus de la gripe de la presente descripción. Se contempla cualquier vector viral adecuado que pueda usarse para preparar una construcción de virus/vector recombinante para su uso con la descripción objeto. Por ejemplo, con las composiciones y métodos de la presente descripción pueden usarse vectores virales derivados de adenovirus, avipox, virus del herpes, vaccinia, viruela de los canarios, entomopox, viruela porcina, virus del Nilo Occidental y otros conocidos en la técnica. Pueden construirse vectores polinucleotídicos recombinantes que codifiquen y expresen componentes usando técnicas de ingeniería genética convencionales conocidas en este campo. Además, las diversas composiciones de vacuna descritas en este documento pueden usarse por separado y en combinación entre sí. Por ejemplo, las inmunizaciones primarias de un animal pueden usar construcciones basadas en vector recombinante, que tienen componentes de cepa sencilla o múltiple, seguido de refuerzos secundarios con composiciones de vacuna que comprenden virus inactivado o líneas celulares infectadas por virus inactivado. Para
los expertos en la materia serán evidentes otros protocolos de inmunización con las composiciones de vacuna de la descripción y se contemplan dentro del alcance de la presente descripción.
La descripción objeto también se refiere a virus redistribuidos que comprenden al menos un gen o segmento genómico de un virus de la gripe de la presente invención y el resto de genes virales o segmentos genómicos de un virus de la gripe diferente de la descripción o de un virus de la gripe distinto de un virus de la presente descripción. Pueden producirse virus redistribuidos por redistribución genética del ácido nucleico de un virus de la gripe donante de la presente descripción con el ácido nucleico de un virus de la gripe receptor y por la selección posterior del virus redistribuido que comprende el ácido nucleico del virus donante. Se conocen bien en la técnica métodos para producir y aislar virus redistribuidos (Fields et al., 1996). Un virus redistribuido puede comprender genes o segmentos genómicos de un virus de la gripe humano, aviar, porcino o equino. Un virus redistribuido puede incluir cualquier combinación de ácido nucleico de virus de la gripe donante y receptor siempre que el virus redistribuido comprenda al menos un gen o segmento genómico de un virus de la gripe donante de la presente invención. Un virus de la gripe receptor puede ser un virus de la gripe equina.
También pueden usarse polipéptidos naturales, recombinantes o sintéticos de proteínas virales, y fragmentos peptídicos de los mismos, como composiciones de vacuna de acuerdo con los métodos objeto. Una composición de vacuna puede comprender un polinucleótido o un polipéptido de un virus de la gripe canina. Una composición de vacuna puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante del mismo. El polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, puede comprender la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, respectivamente, o una secuencia que codifica un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. Un polinucleótido puede comprender: Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 3; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 5; Nucleótidos 1-657 de SEC ID Nº: 7; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 9; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 11; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 13; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 15; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 19; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 21; Nucleótidos 1-657 de SEC ID Nº: 23; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 25; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 29; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 31; Nucleótidos 1-2277 de SEC ID Nº: 47; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 49; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 51; Nucleótidos 1-690 de SEC ID Nº: 53; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 55; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 57; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 59; Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 61; Nucleótidos 1-2277 de SEC ID Nº: 63; Nucleótidos 1-2271 de SEC ID Nº: 65; Nucleótidos 1-2148 de SEC ID Nº: 67; Nucleótidos 1-690 de SEC ID Nº: 69; Nucleótidos 1-1494 de SEC ID Nº: 71; Nucleótidos 1-1410 de SEC ID Nº: 73; Nucleótidos 1-756 de SEC ID Nº: 75; y Nucleótidos 1-1695 de SEC ID Nº: 77. Una composición de vacuna puede comprender un polipéptido que tenga la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. Una composición de vacuna puede comprender un polinucleótido o un polipéptido de un virus de la gripe equina, en el que el polinucleótido o polipéptido tiene al menos aproximadamente el 90%, o al menos aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con un polinucleótido o polipéptido de gripe canina. En una composición de vacuna pueden combinarse polipéptidos virales que pueden derivar de múltiples cepas, y usarse para vacunar a un animal huésped. Por ejemplo, pueden combinarse en la vacuna polipéptidos basados en la proteína HA viral de al menos dos cepas diferentes de virus de la gripe. Los polipéptidos pueden ser homólogos de una cepa o pueden comprender polipéptidos “híbridos” o “quiméricos” cuya secuencia de aminoácidos deriva de unir o ligar polipéptidos de al menos dos cepas distintas. Se conocen bien en la técnica procedimientos para preparar polipéptidos virales. Por ejemplo, pueden sintetizarse polipéptidos y péptidos virales usando métodos de síntesis de fase sólida (Merrifield, 1963). También pueden producirse polipéptidos y péptidos virales usando técnicas de ADN recombinante en las que una molécula polinucleotídica que codifica una proteína o péptido viral se expresa en una célula huésped, tal como líneas celulares de mamíferos, bacterias o levaduras, y la proteína expresada se purifica usando técnicas convencionales de este campo.
Las composiciones de vacuna de la presente descripción también incluyen composiciones de ácido nucleico desnudo. Un ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína HA y/o una NA de un virus de la gripe. Se conocen en la técnica métodos para la vacunación de ácidos nucleicos y se describen, por ejemplo, en las Patente de Estados Unidos Nº 6.063.385 y 6.472.375. El ácido nucleico puede estar en forma de un plásmido o un casete de expresión génica. En una realización, el ácido nucleico se proporciona encapsulado en un liposoma que se administra a un animal.
Las composiciones de vacuna e inmunógenos, tales como polipéptidos y ácidos nucleicos, que pueden usarse de acuerdo con la presente descripción pueden proporcionarse con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los compuestos y composiciones útiles en la descripción objeto pueden formularse de acuerdo con métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Se describen formulaciones en detalle en varias fuentes que se conocen bien y están fácilmente disponibles para los expertos en la materia. Por ejemplo,
Remington's Pharmaceutical Science por E.W. Martin, Easton Pennsylvania, Mack Publilshing Company, 19ª ed., 1995, describe formulaciones que pueden usarse en relación con la presente invención. En general, las composiciones de la presente descripción se formularán de modo que se combine una cantidad eficaz de un inmunógeno con un vehículo adecuado para facilitar la administración eficaz de la composición. Las composiciones usadas en los presentes métodos también pueden estar en una diversidad de formas. Éstas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semisólidas y líquidas, tales como comprimidos, píldoras, polvos, soluciones o suspensiones líquidas, supositorios, soluciones inyectables e infundibles, y pulverizaciones. La forma preferida depende del modo deseado de administración y la aplicación terapéutica. Las composiciones también incluyen preferiblemente vehículos y diluyentes convencionales farmacéuticamente aceptables que se conocen por los expertos en la materia. Los ejemplos de vehículos o diluyentes para su uso con los peptidomiméticos objeto incluyen, pero sin limitación, agua, solución salina, aceites incluyendo aceite mineral, etanol, dimetil sulfóxido, gelatina, ciclodextranos, estearato de magnesio, dextrosa, celulosa, azúcares, carbonato cálcico, glicerol, alúmina, almidón y vehículos y diluyentes equivalentes, o mezclas de cualquiera de éstos. Las formulaciones de un inmunógeno de la descripción también pueden comprender agentes de suspensión, protectores, lubricantes, tampones, conservantes y estabilizadores. Para proporcionar la administración de tales dosificaciones para el tratamiento terapéutico deseado, las composiciones farmacéuticas de la descripción provechosamente comprenderán entre aproximadamente el 0,1% y el 45%, y especialmente, el 1% y el 15% en peso del inmunógeno
o inmunógenos basándose en el peso de la composición total incluyendo vehículo o diluyente.
Las composiciones de vacuna e inmunogénicas de la descripción objeto pueden prepararse por procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la vacuna o inmunógenos se preparan típicamente como inyectables, por ejemplo, soluciones o suspensiones líquidas. La vacuna o inmunógenos se administran de una manera que es compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz e inmunogénica en el receptor. Los patrones de dosificaciones y administración óptimos para una vacuna particular o formulación de inmunógenos pueden determinarse fácilmente por un experto en la materia.
También pueden proporcionarse péptidos y/o polipéptidos en forma de una construcción de péptido antigénico múltiple (MAP). La preparación de construcciones MAP se ha descrito en Tam (1988). Las construcciones MAP utilizan una matriz central de restos de lisina en la que se sintetizan múltiples copias de un inmunógeno (Posnett et al., 1988). Pueden prepararse múltiples construcciones MAP, conteniendo cada una inmunógenos iguales o diferentes, y administrarse en una composición de vacuna. Una construcción MAP puede proporcionarse con y/o administrarse con uno o más adyuvantes. También pueden producirse polipéptidos de gripe de la invención y administrarse como estructuras proteicas macromoleculares que comprenden uno o más polipéptidos. La Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada US2005/0009008 describe métodos para producir partículas de tipo viral como una vacuna para virus de la gripe.
De acuerdo con los métodos de la presente descripción, las composiciones de vacuna e inmunogénicas descritas en este documento se administran a hospedadores susceptibles, típicamente cánidos, y más típicamente perros domesticados, en una cantidad y manera eficaces para inducir inmunidad protectora contra la posterior exposición del hospedador a o infección por el virus. El animal hospedador puede ser un cánido. Los cánidos incluyen cánidos silvestres, de zoológico y domésticos, tales como lobos, coyotes y zorros. Los cánidos también incluyen perros, particularmente perros domésticos, tales como, por ejemplo, perros de compañía de raza pura y/o mestizos, perros de exhibición, perros de trabajo, perros pastores, perros de caza, perros vigilantes, perros policía, perros de carrera y/o perros de laboratorio. El animal hospedador puede ser un perro domesticado, tal como un galgo. Las vacunas o inmunógenos se administran típicamente por vía parenteral, mediante inyección, por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Otros modos adecuados de administración incluyen administración oral o nasal. Habitualmente, las vacunas o inmunógenos se administran a un animal al menos dos veces, con un intervalo de una
o más semanas entre cada administración. Sin embargo, se contemplan otros regímenes para las administraciones iniciales y de refuerzo de la vacuna o inmunógenos, y pueden depender del criterio del facultativo y el animal hospedador particular que se trate.
Los virus y células infectadas por virus en una formulación de vacuna pueden inactivarse o atenuarse usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden inactivarse o atenuarse virus completos y células infectadas mediante exposición a paraformaldehído, formalina, beta propiolactona (BPL), bromoetilamina (BEA), etilenimina binaria (BEI), fenol, luz UV, temperatura elevada, congelación y descongelación, sonicación (incluyendo ultrasonicación), y similares. La cantidad de virus completo sin células en una dosis de vacuna puede estar en el intervalo de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 5 mg, y más habitualmente pueden ser de aproximadamente 0,2 mg a aproximadamente 2 mg. La dosificación para formulaciones de vacuna que comprenden líneas celulares infectadas por virus habitualmente contendrán de aproximadamente 106 a aproximadamente 108 células por dosis, y más habitualmente de aproximadamente 5 x 106 a aproximadamente 7,5 x 107 células por dosis. La cantidad de inmunógeno peptídico o proteico en una dosis para un animal puede variar de aproximadamente 0,1 !g a 10000 !g, de aproximadamente 1 !g a 5000 !g, de aproximadamente 10 !g a 1000 !g, de aproximadamente 25 !g a 750 !g, de aproximadamente 50 !g a 500 !g, o de 100 !g a 250 !g, dependiendo del tamaño, edad, etc., del animal que recibe la dosis.
Una composición inmunogénica o de vacuna de la descripción, tal como virus o células infectadas por virus o proteínas o péptidos virales, pueden combinarse con un adyuvante, típicamente justo antes de la administración. Los adyuvantes contemplados para su uso en las formulaciones de vacuna incluyen treonil muramil dipéptido (MDP) (Byars et al., 1987), saponina, Corynebacterium parvum, adyuvante completo de Freund e incompleto de Freund, aluminio, o una mezcla de cualquiera de éstos. Se conoce bien en la técnica una diversidad de otros adyuvantes adecuados para su uso con los métodos y vacunas de la presente descripción tales como alumbre, y se contemplan para su uso con la descripción.
La descripción también se refiere a anticuerpos que se unen específicamente a una proteína o un péptido de la presente invención. Los anticuerpos de la descripción incluyen composiciones de anticuerpos monoclonales y policlonales. Preferiblemente, los anticuerpos de la descripción son anticuerpos monoclonales. En la descripción se contemplan anticuerpos completos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Por lo tanto, por ejemplo, los fragmentos de unión a antígeno adecuados incluyen fragmentos de anticuerpo Fab2, Fab y Fv. Los anticuerpos de la descripción pueden marcarse con un resto detectable, tal como una molécula fluorescente (por ejemplo, fluoresceína
o una enzima).
La presente descripción también se refiere a métodos y composiciones para la detección e identificación de un virus de la gripe de la invención y para el diagnóstico de infección de un animal con un virus de la gripe de la presente invención. Los métodos de la descripción incluyen detección de la presencia de gripe canina, en una muestra biológica de un animal. La detección de gripe canina en una muestra es útil para diagnosticar gripe canina en un animal. A su vez, esta información puede proporcionar la capacidad para determinar el pronóstico de un animal basándose en la distinción de niveles de gripe canina presentes a lo largo del tiempo, y puede ayudar a la selección de agentes terapéuticos y tratamientos para el animal, y ayudar a la supervisión de la terapia. El método también proporciona la capacidad para establecer la ausencia de gripe canina en un animal ensayado.
La capacidad para detectar gripe canina en un animal permite la evaluación de brotes de gripe canina en diferentes localizaciones geográficas. Esta información también permite la detección temprana de modo que los animales infectados puedan aislarse, para limitar la propagación de la enfermedad, y permite la intervención temprana para opciones de tratamiento. Además, tener esta información disponible puede proporcionar dirección al personal médico para prepararse para tratar grandes números de animales enfermos, incluyendo recopilar suministros médicos y, si están disponibles, vacunas.
En una realización, un método de la presente descripción implica la recogida de una muestra biológica de un animal de ensayo, tal como un cánido. La muestra biológica puede ser cualquier material biológico, incluyendo células, tejidos, piel, sangre completa, suero, plasma, aspirado de los pezones, lavado pulmonar, líquido cefalorraquídeo, saliva, sudor y lágrimas.
La muestra de ensayo del animal puede venir de un animal que se sospecha que tiene virus de la gripe canina, tanto si el animal muestra síntomas de la enfermedad como si no. También pueden proporcionarse muestras de control o recogerse de animales que se sabe que no tienen gripe canina. Pueden proporcionarse controles adicionales, por ejemplo, para reducir los resultados de falso positivo y falso negativo, y verificar que los reactivos en el ensayo detectan de forma activa el virus de la gripe canina A.
Además de detectar la presencia o ausencia de gripe canina en una muestra biológica, los métodos de detección usados en la descripción pueden detectar mutaciones en virus de la gripe canina, tales como cambios en la secuencia de ácido nucleico, que pueden resultar del ambiente, tratamiento farmacológico, manipulaciones genéticas o mutaciones, lesión, cambio de la dieta, envejecimiento, o cualquier otra característica o características de un animal. Las mutaciones también pueden provocar que la gripe canina A se vuelva resistente a un fármaco que antes era eficaz, o permitir que el virus infecte y se propague en una especie diferente de animal, o ser humano. Por ejemplo, se ha mostrado que el virus de la gripe aviar A infecta a otros animales y seres humanos.
Para detectar un virus de la gripe en un animal, el diagnóstico se facilita por la recogida de muestras de ensayo de alta calidad, su rápido transporte a una instalación de ensayo, y el almacenamiento apropiado, antes de los ensayos de laboratorio. El virus se detecta mejor en muestras de ensayo que contienen células infectadas y secreciones. Pueden tomarse muestras de ensayo para la detección directa de antígenos virales y/o el aislamiento de ácidos nucleicos y/o virus en cultivos celulares durante los primeros 3 días después de la aparición de síntomas clínicos. Varios tipos de muestras de ensayo son adecuados para diagnosticar infecciones virales del tracto respiratorio superior, incluyendo, pero sin limitación, hisopo nasal, hisopo nasofaríngeo, aspirado nasofaríngeo, lavado nasal e hisopos de garganta. Además de hisopos, pueden tomarse muestras de tejido o suero, y pueden realizarse también procedimientos invasivos.
Pueden recogerse muestras de ensayo respiratorias y transportarse en 1-5 ml de medio de transporte de virus. Están disponibles en el mercado varios medios que son satisfactorios para la recuperación de una amplia diversidad de virus. Las muestras de ensayo clínicas se añaden a un medio de transporte. Los hisopos nasales o nasofaríngeos también pueden transportarse en el medio de transporte de virus. Un ejemplo de un medio de transporte es 10 g de caldo de infusión de ternera y 2 g de fracción de albúmina bovina V, añadido a agua destilada
estéril a 400 m. También se pueden añadir antibióticos tales como 0,8 ml de solución de sulfato de gentamicina (50 mg/ml) y 3,2 ml de anfotericina B (250 !g/ml). El medio preferiblemente se esteriliza por filtración. También pueden usarse lavados nasales, tales como solución salina estéril (NaCl 0,85%) para recoger muestras de ensayo de virus respiratorios.
Pueden recogerse sueros en una cantidad de 1-5 ml de sangre completa de un animal en fase aguda, poco después de la aparición de síntomas clínicos, y preferiblemente no más tarde de 7 días. También se puede recoger una muestra de ensayo de suero de fase convaleciente, por ejemplo aproximadamente 14 días después de la aparición de los síntomas. Las muestras de ensayo de suero pueden ser útiles para detectar anticuerpos contra virus respiratorios en un ensayo de neutralización.
En algunos casos, pueden recogerse muestras de animales individuales durante un periodo de tiempo (por ejemplo, una vez al día, una vez a la semana, una vez al mes, dos veces al año o anualmente). Puede usarse la obtención de numerosas muestras de un animal individual, durante un periodo de tiempo, para verificar resultados de detecciones anteriores y/o para identificar respuesta o resistencia a un tratamiento específico, por ejemplo, un fármaco terapéutico seleccionado.
Los métodos de la presente descripción pueden usarse para detectar la presencia de uno o más agentes patológicos en una muestra de ensayo de un animal, y el nivel de cada agente patológico. Puede usarse cualquier método para detectar el agente patológico, incluyendo, pero sin limitación, ensayos de anticuerpos incluyendo ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA), hemaglutinación, e inhibición de ensayos de hemaglutinación (HI), y transferencia de Western. También pueden usarse métodos de cultivo celular conocidos. Pueden identificarse adicionalmente cultivos positivos usando inmunofluorescencia de cultivos celulares o ensayo de HI del medio de cultivo celular (sobrenadante).
Además, pueden usarse métodos para detectar ácidos nucleicos (ADN o ARN) o proteínas. Tales métodos incluyen, pero sin limitación, reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y ensayos de PCR de transcriptasa inversa (RT) y ensayos en tiempo real, y ensayos de protección de nucleasa cuantitativa. Existen kits de ensayo disponibles en el mercado disponibles para realizar estos ensayos. Por ejemplo, QIAGEN (Valencia, CA) vende un kit de RT-PCR de una etapa, y kit de extracción de ARN viral.
El método puede utilizar un anticuerpo específico para un virus o proteína viral de la descripción. Puede utilizarse un anticuerpo específico para una proteína HA de un virus de la descripción. Puede usarse un anticuerpo específico para una proteína NP de un virus de la descripción. Se obtiene una muestra adecuada, tal como de la región nasal o nasofaríngea, de un animal y se aísla el virus o la proteína viral de la misma. Los componentes virales se exploran después con respecto a la unión de un anticuerpo específico para una proteína, tal como HA o NP de un virus de la invención. Puede obtenerse una muestra de suero (u otra muestra que contenga anticuerpo) de un animal y explorarse el suero con respecto a la presencia del anticuerpo que se une a una proteína de un virus de la descripción. Por ejemplo, puede realizarse un ensayo ELISA en el que las paredes de la placa tengan proteína HA y/o NP, o un fragmento peptídico de la misma, unida a la pared. La pared de la placa después se pone en contacto con suero o anticuerpo de un animal de ensayo. La presencia de anticuerpo en el animal que se une específicamente a la proteína HA y/o NP es indicativa de que el animal de ensayo está infectado o se ha infectado con un virus de la gripe de la presente invención.
La presencia de un agente patológico puede detectarse determinando la presencia o ausencia de anticuerpos contra el agente, en una muestra biológica. Puede tardarse algún tiempo (por ejemplo meses) después de que un animal se infecte antes de que los anticuerpos puedan detectarse en un ensayo de sangre. Una vez formados, los anticuerpos habitualmente persisten durante muchos años, incluso después del tratamiento satisfactorio de la enfermedad. El hallazgo de anticuerpos para gripe canina A puede no indicar si la infección fue reciente o hace algún tiempo.
También pueden realizarse ensayos de anticuerpos en uno o más fluidos. Los ensayos de anticuerpos incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzima (ELISA), ensayos de anticuerpos fluorescentes indirectos (IFA), y transferencia de Western. Preferiblemente, se realizan ensayos de anticuerpos usando múltiples ensayos, por ejemplo ELISA o IFA seguido de transferencia de Western. Los ensayos de anticuerpo pueden realizarse en un proceso de dos etapas, usando un ensayo ELISA o IFA, seguido de un ensayo de transferencia de Western. ELISA se considera un ensayo más fiable y preciso que IFA, pero puede usarse IFA si no está disponible ELISA. El ensayo de transferencia de Western (que es un ensayo más específico) también puede realizarse en todos los animales, particularmente en los que han dado positivo o casi positivo (equívoco) en un ensayo ELISA o IFA.
Otros ensayos basados en anticuerpos que pueden usarse para la detección de virus de la gripe incluyen ensayos de inhibición de hemaglutinación. La actividad de hemaglutinación puede detectarse en una muestra biológica de un animal, usando glóbulos rojos de pollo o pavo como se ha descrito (Burleson et al., 1992 y Kendal et al., 1982). Puede ponerse en contacto una proteína o péptido de HA o gripe de la descripción con una muestra de ensayo que contiene suero o anticuerpo. Se añaden después glóbulos rojos (RBC) de un animal, tal como un pájaro. Si está presente anticuerpo para HA, entonces los RBC no se aglutinarán. Si el anticuerpo para HA no está presente, los
RBC se aglutinarán en presencia de HA. Se conocen en la técnica variaciones y modificaciones de los ensayos de inhibición de hemaglutinación convencionales y se contemplan dentro del alcance de la presente descripción.
La infección de un animal puede determinarse por aislamiento del virus de una muestra, tal como un hisopo nasal o nasofaríngeo. Puede realizarse aislamiento viral usando métodos convencionales, incluyendo cultivo celular e inoculación de huevos.
Puede usarse un ensayo basado en ácido nucleico para la detección de un virus de presente descripción. Puede obtenerse una muestra de ácido nucleico de un animal y someterse el ácido nucleico a PCR usando cebadores que generarán un producto de amplificación si el ácido nucleico contiene una secuencia específica para un virus de la gripe de la presente descripción. Puede usarse RT-PCR en un ensayo para el virus objeto. Puede usarse RT-PCR en tiempo real para ensayar con respecto a un virus de la gripe de la presente descripción. Se conocen en la técnica métodos de PCR, RT-PCR y PCR en tiempo real y se han descrito en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.683.202; 4.683.195; 4.800.159; 4.965.188; 5.994.056; 6.814.934; y en Saiki et al. (1985); Sambrook et al. (1989); Lee et al. (1993); y Livak et al. (1995). El ensayo de PCR puede usar oligonucleótidos específicos para un gen de matriz (MA) y/o gen de HA de la gripe. El producto de amplificación también puede secuenciarse para determinar si el producto tiene una secuencia de un virus de la gripe de la presente descripción. Pueden usarse otros ensayos basados en ácido nucleico para la detección y el diagnóstico de una infección viral por un virus de la descripción y tales ensayos se contemplan dentro del alcance de la presente descripción. Una muestra que contenga un ácido nucleico puede someterse a una amplificación basada en PCR usando cebadores directos e inversos cuando los cebadores son específicos para una secuencia génica o polinucleotídica viral. Si el ácido nucleico en la muestra es ARN, entonces puede realizarse RT-PCR. Para PCR en tiempo real, se utiliza una sonda detectable con los cebadores.
Se conocen conjuntos de cebadores específicos para el gen de hemaglutinina (HA) de muchos de los virus de la gripe en circulación, y se están desarrollando continuamente. El genoma del virus de la gripe es ARN monocatenario, y debe realizarse una copia de ADN (ADNc) usando una polimerasa de transcriptasa inversa (RT). La amplificación del genoma de ARN, por ejemplo usando RT-PCR, requiere un par de cebadores oligonucleotídicos, típicamente diseñados basándose en la secuencia de HA conocida de subtipos de gripe A y de neuraminidasa (NM)-1. Los cebadores pueden seleccionarse de modo que amplifiquen específicamente ARN de solamente un subtipo de virus. Pueden analizarse adicionalmente ADN generados por cebadores específicos de subtipo mediante técnicas de genética molecular tales como secuenciación. El ensayo se realiza preferiblemente con un control positivo, o se confirman los productos por secuenciación y comparación con secuencias conocidas. La ausencia de los productos de PCR diana (es decir, un resultado “negativo”) puede no descartar la presencia del virus. Los resultados de hisopos clínicos o cultivos celulares infectados pueden después ponerse a disposición a las pocas horas. Se describen ensayos de PCR y RT-PCR para virus de la gripe en Fouchier et al., 2000 y Maertzdorf et al., 2004.
La presente descripción también se refiere a métodos para explorar con respecto a compuestos o fármacos que tengan actividad antiviral contra un virus de la presente descripción. Pueden ponerse en contacto células infectadas con un virus de la descripción con un compuesto o fármaco de ensayo. Después se determina la cantidad de virus o actividad viral tras el contacto. Los compuestos o fármacos que muestran actividad antiviral pueden seleccionarse para evaluación adicional.
La presente descripción también se refiere a células aisladas infectadas por un virus de la gripe de la presente descripción. La célula puede ser una célula canina, tal como células epiteliales de riñón caninas.
La presente descripción también se refiere a células transformadas con un polinucleótido de la presente descripción que codifica un polipéptido de la descripción. Preferiblemente, la secuencia polinucleotídica se proporciona en una construcción de expresión de la descripción. Más preferiblemente, la construcción de expresión posibilita la sobreexpresión en la célula de un polinucleótido unido operativamente de la descripción. La célula puede transformarse con una secuencia polinucleotídica que comprende una secuencia que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional o variante de la misma. La célula puede transformarse con un polinucleótido que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, respectivamente, o una secuencia que codifica un fragmento o variante funcional de cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78. Por lo tanto, la presente descripción se refiere a células transformadas con una secuencia polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77 o un fragmento o variante, incluyendo una variante degenerada, de cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77.
La célula transformada puede ser una célula eucariota, por ejemplo, una célula vegetal, incluyendo protoplastos, o la célula transformada puede ser una célula procariota, por ejemplo, una célula bacteriana, tal como E. coli o B. subtilis. Las células animales incluyen células humanas, células de mamífero, células parcialmente caninas, células aviares y células de insectos. Las células vegetales, incluyen, pero sin limitación, células de dicotiledóneas, monocotiledóneas y coníferas.
La presente descripción también se refiere a plantas, incluyendo plantas transgénicas que expresan y producen una proteína o polipéptido viral de la presente invención. Se contemplan por la presente descripción plantas, tejidos vegetales, y células vegetales transformadas con o cultivadas para contener un polinucleótido de la descripción. Preferiblemente, un polinucleótido de la descripción se sobreexpresa en la planta, tejido vegetal o célula vegetal. Las plantas pueden usarse para producir composiciones de vacuna de la gripe de la presente descripción y las vacunas pueden administrarse a través del consumo de la planta (véase, por ejemplo, Patente de Estados Unidos Nº
5.484.719 y 6.136.320).
La presente descripción también se refiere a kits para detectar un virus o diagnosticar una infección por un virus de la presente descripción. Un kit puede comprender un anticuerpo de la descripción que se une específicamente a un virus de la gripe de la presente descripción, o una parte antigénica del mismo. Un kit puede comprender uno o más polipéptidos o péptidos de la presente descripción. Los polipéptidos pueden tener una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 33, 34, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76 o 78, o un fragmento funcional y/o inmunogénico o variante de la misma. Un kit puede comprender uno o más polinucleótidos u oligonucleótidos de la presente descripción. Los polinucleótidos pueden tener una secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77 o un fragmento o variante de la misma. Un kit puede comprender opcionalmente uno o más anticuerpos de control, polipéptidos o péptidos de control y/o polinucleótidos u oligonucleótidos de control. El anticuerpo, polipéptidos, péptidos, polinucleótidos y/u oligonucleótidos del kit pueden proporcionarse en un recipiente o envase adecuado.
La presente solicitud de descripción también se refiere al uso de perros mestizos como un modelo para infección y patogénesis del virus de la gripe. Puede inocularse a un perro mestizo un virus de la gripe, tal como un virus de la gripe canina de la presente descripción. Opcionalmente, pueden administrarse al perro agentes terapéuticos después de la inoculación. También puede administrarse al perro una composición para generar una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe antes de la inoculación con el virus. Pueden obtenerse muestras de tejido, sangre, suero y otras muestras biológicas antes y/o después de la inoculación y examinarse con respecto a la presencia de virus y patogénesis de tejido usando métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, PCR, RT-PCR, secuenciación de ácidos nucleicos e inmunohistoquímica.
Se depositaron cepas del virus de la gripe canina (designadas como “A/canino/Florida/43/2004” y “A/canino/Florida/242/2003”) en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, el 9 de octubre de 2006. Se depositaron cepas del virus de la gripe canina (designadas “canino/Jax/05” y “canino/Miami/05”), en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, el 17 de octubre de 2006. Las cepas del virus se han depositado en condiciones que aseguran que estará disponible el acceso a los cultivos durante el trámite de la presente patente a alguien que se ha determinado por el Comisario de Patentes y Marcas que tiene derecho a ello según 37 CFR 1.14 y 35 U.S.C. 122. El depósito estará disponible según se requiera por las leyes de patente extranjeras en países en los que se presenten homólogos de la patente objeto,
o su descendencia. Sin embargo, debe entenderse que la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para poner en práctica la invención objeto en menoscabo de los derechos de patente concedidos por la acción gubernamental.
Además, los depósitos de virus se almacenarán y se pondrán a disposición del público de acuerdo con las cláusulas del Tratado de Budapest para el Depósito de Microorganismos, es decir, se almacenarán con todo el cuidado necesario para mantenerlos viables y no contaminados durante un periodo de al menos cinco años después de la petición más reciente para proporcionar una muestra del depósito y, en cualquier caso, durante un periodo de al menos treinta (30) años después de la fecha de depósito o durante la vida ejecutable de cualquier patente que pueda expedirse que describa el cultivo. El depositante reconoce la obligación de reemplazar el depósito si el depositario fuera incapaz de proporcionar una muestra cuando se solicite, debido a la condición del depósito. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público del depósito del cultivo objeto se retirarán irrevocablemente tras la concesión de una patente que lo describa.
La tabla 57 ilustra las similitudes entre las secuencias de aminoácidos codificadas por los genes de hemaglutinina (o “HA”), neuraminidasa (o “NA”), y nucleoproteína (NP), del virus de la gripe canina identificado como A/canino/Florida/43/2004 (Cal/Fla/43/04) con aislados equinos de H3N8, así como el aislado de canino/Florida/242/2003.
En la medida en que los siguientes ejemplos se refieren a la materia objeto de las reivindicaciones, estos son ilustrativos de la presente invención. Por lo demás, los ejemplos se proporcionan para fines de información solamente.
Materiales y métodos para los Ejemplos 1-6
Recogida de sangre e hisopo nasal de galgos
Se recogieron muestras sanguíneas agudas y convalecientes por venopunción yugular de galgos normales o clínicamente enfermos en perreras de carrera que experimentaron brotes de enfermedad respiratoria. Las muestras convalecientes se recogieron de 4 a 12 semanas después de la muestra aguda. El suero se recogió y almacenó a 80 ºC. Se recogieron hisopos nasales y se situaron en medio de transporte Amies con carbón vegetal (Becton Dickinson Biosciences) en espera de su presentación para aislamiento bacteriano.
Examen post mórtem de galgos
Se realizaron exámenes post mórtem completos por el Servicio de Patología Anatómica en el Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad de Florida (UF CVM) en 5 de los 8 galgos que murieron en el brote de enero de 2004 en una pista de Florida. Se realizó un examen post mórtem de otro perro en una clínica veterinaria privada con presentación de tejidos al UF CVM para diagnóstico histopatológico. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra 10%, incluida en parafina, y se tiñeron secciones de 5 !m con hematoxilina y eosina para diagnóstico histopatológico o se procesaron para inmunohistoquímica como se describe posteriormente. Se presentaron tejidos no fijados para cultivo bacteriano y también se almacenaron a -80 ºC.
Ensayos serológicos para patógenos respiratorios virales caninos
Se presentaron muestras de suero agudas y convalecientes emparejadas al Laboratorio de Diagnóstico de Salud Animal (AHDL) en el Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad de Cornell para ensayos de neutralización de suero frente a virus del moquillo canino, adenovirus de tipo 2 y virus paragripal. Las titulaciones de anticuerpo se expresaron como la última dilución de suero que inhibía la infección viral de cultivos celulares. La seroconversión, definida como un aumento 4 veces en la titulación de anticuerpos entre la muestra aguda y convaleciente, indicó infección viral. No se detectaron seroconversiones para estos patógenos virales.
Ensayos microbianos para patógenos respiratorios bacterianos caninos
Se presentaron tejidos post mórtem e hisopos nasales emparejados al Servicio de Microbiología/Parasitología/Serología Clínica de Diagnóstico en el UF CVM para aislamiento e identificación bacteriana. Las muestras se cultivaron en medio no selectivo así como medio selectivo para especies de Bordetella (Regan-Lowe; Remel) y especies de Mycoplasma (Remel). Todos los cultivos se mantuvieron durante 21 días antes de que se informara de falta de crecimiento. También se presentaron hisopos nasales de algunos de los galgos al Departamento de Medicina Diagnóstica/Patobiología en el Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad del Estado de Kansas para cultivo bacteriano. De 70 perros clínicamente enfermos ensayados, se aisló Bordetella bronchiseptica de la cavidad nasal de un perro, mientras que se recuperó Mycoplasma spp. de la cavidad nasal de 33 perros. Se recuperó habitualmente Pasteurella multocida de la cavidad nasal de perros con descargas nasales purulentas. Dos de los perros que murieron en el brote de enero de 2004 tenían escaso crecimiento de Escherichia coli en los pulmones post mórtem, un perro tenía escaso crecimiento de E. coli y Streptococcus canis, y otro tenía escaso crecimiento de Pseudomonas aeruginosa y una levadura. No se aisló ni Bordetella bronchiseptica ni Mycoplasma de la tráquea o pulmones de perros que murieron.
Aislamiento de tejidos post mórtem
Se descongelaron tejidos congelados y se homogeneizaron en 10 volúmenes de medio esencial mínimo (MEM) complementado con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA) y antibióticos. Se retiraron los residuos sólidos por centrifugación y se inocularon los sobrenadantes en células cultivadas o en huevos de pollo embrionados de 10 días de edad. Los homogeneizados tisulares de galgos que murieron se inocularon en diversos cultivos celulares que soportaban la replicación de una amplia serie de patógenos virales. Los cultivos celulares incluyeron Vero (células epiteliales de riñón de mono verde africano, ATCC Nº CCL-81), A-72 (fibroblastos de tumor canino, CRL-1542), HRT-18 (células epiteliales rectales humanas, CRL-11663), MDCK (células epiteliales de riñón canino, CCL-34), células epiteliales de riñón canino primarias (AHDL, Universidad de Cornell), células epiteliales de pulmón canino primarias (AHDL), y células testiculares bovinas primarias (AHDL). Las células MDCK y HRT se cultivaron en MEM complementado con tripsina tratada con TPCK 2,5 !g/ml (Sigma); las líneas celulares restantes se cultivaron en MEM complementado con suero de ternero fetal 10% y antibióticos. Las células se cultivaron en matraces de 25 cm2 a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO2 5%. Se inoculó un cultivo de control con el MEM complementado. Los cultivos se observaron diariamente con respecto a cambios morfológicos y se recogieron 5 días después de la inoculación. Los fluidos y células recogidos se clarificaron por centrifugación y se inocularon en células nuevas como se ha descrito para la inoculación inicial; se realizaron dos pases ciegos. Se determinó la actividad de hemaglutinación en los sobrenadantes clarificados usando glóbulos rojos de pollo o pavo como se ha descrito (Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982). Para el aislamiento de virus en embriones de pollo, se inocularon 0,1 ml de homogeneizado tisular en el saco alantoideo y se incubó durante 48 horas a 35 ºC. Después de dos pases ciegos, se determinó la actividad de hemaglutinación en los fluidos alantoideos como se ha descrito
(Burleson et al., 1992; Kendal et al., 1982).
RT-PCR, secuenciación de nucleótidos y análisis filogenéticos
Se extrajo ARN total del sobrenadante de cultivo tisular o fluido alantoideo usando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN total (10 ng) se transcribió de forma inversa a ADNc usando un Kit de RT-PCR de una etapa (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó amplificación por PCR de la región codificante de los 8 genes virales de la gripe en el ADNc como se ha descrito previamente (Klimov et al., 1992a) usando conjuntos de cebadores específicos de genes universales. Los amplicones de ADN resultantes se usaron como moldes para secuenciación automática en un secuenciador de ADN automático Applied Biosystems 3100 usando química de terminador de colorante de secuenciación cíclica (ABI). Se analizaron las secuencias de nucleótidos usando el GCG Package©, Versión 10.0 (Accelyrs) (Womble, 2000). Se usó el Phylogeny Inference Package©, Versión 3.5 para estimar las filogenias y calcular los valores bootstrap de las secuencias de nucleótidos (Felsentein, 1989). Se compararon los árboles filogenéticos con los generados por análisis de unión de vecinos con el modelo Tamura-Nei gamma implementado en el programa MEGA© (Kumar et al., 2004) y se confirmaron por el programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauer Associates).
Inoculación experimental de perros
Se usaron cuatro beagles sin patógenos específicos de 6 meses de edad [(2 machos y 2 hembras (Liberty Research)]. El examen físico y los ensayos de sangre de línea basal incluyendo diferencial/recuento de células sanguíneas completas, panel de química de suero, y análisis de orina determinaron que los animales estaban sanos. Se alojaron juntos en una instalación mejorada por BSL 2 acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio. Las temperaturas rectales de línea basal se registraron dos veces diariamente durante 7 días. Los perros se anestesiaron por inyección intravenosa de propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg de peso corporal hasta efecto para intubación con tubos endotraqueales. Se inoculó a cada perro una dosis total de 106,6 dosis infecciosas de cultivo tisular medianas (DICT50) de virus A/Canino/Florida/43/2004 (Canino/FU04) (H3N8) con la mitad de la dosis administrada a la tráquea distal a través del tubo endotraqueal y la otra mitad administrada en la fosa nasal profunda a través de un catéter. Se realizaron exámenes físicos y registros de temperatura rectal dos veces al día durante 14 días después de la inoculación (p.i.). Se recogieron muestras sanguíneas (4 ml) por venopunción yugular los días 0, 3, 5, 7, 10 y 14 p.i. Se recogieron muestras de ensayo nasales y orofaríngeas con hisopos de poliéster (Fisher Scientific) de cada perro los días 0 a 5, 7, 10 y 14 p.i. Los hisopos se colocaron en medio de transporte viral (Remel) y se almacenaron a -80 ºC. Se sacrificaron dos perros (1 macho y 1 hembra) por inoculación intravenosa de solución Beuthanasia-D® (1 ml/5 kg de peso corporal; Schering-Plough Animal Health Corp) el día 5 p.i. y los 2 perros restantes el día 14 para examen post mórtem. Los tejidos para análisis histológico se procesaron como se ha descrito. Los tejidos para cultivo de virus se almacenaron a -80 ºC. Este estudio se aprobó por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Florida.
Difusión viral en perros inoculados de forma experimental
Se prepararon diluciones en serie de homogeneizados de pulmón y extractos de hisopo, preparados por clarificación del medio de transporte del hisopo por centrifugación, en MEM complementado con BSA al 0,5% y antibióticos. Se realizaron ensayos de placa como se ha descrito (Burlesson et al., 1992) usando monocapas de células MDCK en placas de cultivo tisular de 6 pocillos. Las monocapas celulares inoculadas se recubrieron con MEM complementado que contenía agarosa 0,8% y 1,5 !g/ml de TPCK-tripsina. Las células se cultivaron durante 72 horas a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO2 5% antes de la fijación y tinción con violeta de cristal. La concentración de virus se expresó como unidades formadoras de placas (UFP) por gramo de tejido o por hisopo.
Inmunohistoquímica
Se montaron secciones tisulares de pulmón de 5 !m desparafinadas y rehidratadas de los galgos y beagles en portaobjetos Bond-Rite™ (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) y se trataron posteriormente con proteinasa K (DakoCytomation, Carpenteria, CA) seguido de reactivo de bloqueo de peroxidasa (Kit de Peroxidasa Dako® EnVision™, Dako Corp.). Las secciones se incubaron con diluciones 1:500 de anticuerpos monoclonales para virus del moquillo canino (VMRD, Inc.), adenovirus canino de tipo 2 (VMRD, Inc.), virus paragripal canino (VMRD, Inc.) o gripe A H3 (Chemicon International, Inc.) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los controles incluyeron incubación de las mismas secciones con IgG de ratón (1 mg/ml, Serotec, Inc.), e incubación de los anticuerpos monoclonales con secciones de pulmón canino normales. Después del tratamiento con los anticuerpos primarios, las secciones se incubaron con reactivos de sustrato de peroxidasa e inmunoperoxidasa secundarios (Kit de Peroxidasa Dako® EnVision™, Dako Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se trataron con Clarificador nº 2 y Reactivo de Bluing (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI), se deshidrataron y se aplicaron cubreobjetos con Permount (ProSciTech).
Ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI)
Se incubaron muestras de suero con enzima destructora de receptor (RDE, Denka) (1 parte de suero: 3 partes de RDE) durante 16 horas a 37 ºC antes de la inactivación por calor durante 60 minutos a 56 ºC. El virus de la gripe A/Canino/FL/04 (H3N8) se cultivó en células MDCK durante 36-48 h a 37 ºC. Los sobrenadantes de cultivo de virus se recogieron, se clarificaron por centrifugación y se almacenaron a -80 ºC. El ensayo de HI se realizó como se ha descrito previamente (Kendal et al., 1982). En resumen, se añadieron 4 unidades de hemaglutinación de virus en 25 !l a un volumen igual de suero diluido en serie en pocillos de microtitulación y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de eritrocitos de pavo 0,5% v/v y las titulaciones de hemaglutinación se estimaron visualmente después de 30 minutos. El criterio de valoración de titulación de HI se definió como la última dilución de suero que inhibía completamente la hemaglutinación. La seroconversión se definió como aumento de 4 veces en titulación de HI entre muestras, convalecientes y agudas emparejadas. La seropositividad de una muestra sencilla se definió como una titulación de anticuerpo de HI 1:32.
Ensayo de microneutralización (MN)
Se detectaron respuestas de anticuerpo de suero neutralizador a A/Canino/FL/04 (H3N8) por un ensayo de MN como se ha descrito previamente (Rowe et al., 1999) excepto porque los sueros caninos se trataron con RDE como se ha descrito anteriormente antes del ensayo. El criterio de valoración de titulación se definió como la mayor dilución de suero que proporcionaba 50% de neutralización de 100 DICT50 de virus. La seroconversión se definió como aumento de 4 veces en titulación de MN entre muestras emparejadas agudas y convalecientes. La seropositividad de una muestra sencilla se definió como una titulación de MN 1:80.
A continuación se proporcionan ejemplos que ilustran procedimientos para poner en práctica la invención y la descripción adjunta. Estos ejemplos no deberían interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de disolvente son en volumen a no ser que se indique otra cosa.
EJEMPLO 1
En enero de 2004, se produjo un brote de enfermedad respiratoria en 22 galgos de carrera alojados en 2 perreras en una pista de Florida y la granja local que proporcionaba perros a estas perreras. Había aproximadamente 60 perros en cada edificio de perrera y 300 perros en la granja. El brote se produjo durante un periodo de 6 días después del cual no se identificaron nuevos casos. Catorce de los 22 perros tuvieron fiebres de 39,5 a 41,5 ºC, una tos blanda, con náuseas durante 10 a 14 días, y con el tiempo recuperación. De los 8 perros restantes, 6 perros aparentemente sanos murieron inesperadamente de hemorragia de la boca y nariz. Otros dos perros se sacrificaron en un periodo de 24 horas desde la aparición de la hemorragia de la boca y nariz debido a un rápido deterioro. Estos dos perros tenían fiebres de 41 ºC. Cuatro de las 8 muertes se produjeron en los edificios de perrera y 4 se produjeron en la granja. El cincuenta por ciento de las muertes se produjo el día 3 del brote. Los 22 perros variaban en edad de 17 meses a 4 años, pero el 73% eran de 17 a 33 meses de edad.
Fueron evidentes dos síndromes clínicos: una enfermedad más leve caracterizada por fiebre inicial y después tos durante 10-14 días (14 perros) con recuperación posterior, o una muerte peraguda asociada con hemorragia en el tracto respiratorio (8 perros para una tasa de mortalidad del 36%). Se realizaron exámenes post mórtem en 6 de los 8 casos letales. Todos los perros tenían hemorragia extensiva en los pulmones, mediastino y cavidad pleural. El examen histológico del tracto respiratorio reveló que además de la hemorragia pulmonar, todos los perros tenían traqueítis, bronquitis, bronquiolitis y bronconeumonía supurante (Figura 3). El revestimiento epitelial y el lumen de las vías respiratorias en estos tejidos se infiltraron por neutrófilos y macrófagos. Se inocularon homogeneizados de pulmón preparados a partir de estos perros en una diversidad de líneas celulares de mono, humanas, bovinas y caninas para cultivo de virus. El homogeneizado pulmonar de un perro provocó efectos citopáticos en células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) cultivadas en presencia de tripsina, y el sobrenadante de cultivo celular aglutinó glóbulos rojos de pollo. Se proporcionaron pruebas preliminares de un virus de la gripe de tipo A por un ELISA comercial para detección de la nucleoproteína de virus de la gripe A y B, y por análisis de PCR usando cebadores específicos para el gen de la matriz del virus de la gripe A. Además, la actividad de hemaglutinación se inhibió por antisuero de referencia contra la gripe equina A subtipo H3, pero no por antisueros específicos para gripe humana A subtipos H1-H11 y H13 (Tabla 3). Para caracterizar las propiedades moleculares del virus, los inventores determinaron las secuencias de nucleótidos de los 8 segmentos de ARN del genoma viral. Las comparaciones de secuencias con genes de virus de la gripe conocidos y los análisis filogenéticos indicaron que los 8 genes del aislado canino eran más similares a los de virus de la gripe equina contemporánea A (H3N8), con los que compartían 9697% de identidad de secuencia (Figura 1A, Tabla 4). Por el contrario, los genes representativos de aislados de gripe aviar, porcina y humana A tuvieron 94% de identidad con el aislado canino (Tabla 4). Estos datos identificaron el aislado canino A/Canino/Florida/43/2004 (Canino/FL/04) como un virus de gripe A H3N8 cercanamente relacionado a linajes contemporáneos de virus de la gripe equina. Puesto que todos los genes del aislado canino eran de origen de virus de gripe equina, los inventores concluyeron que se había transmitido al perro el genoma completo de un virus de gripe equina.
EJEMPLO 2
Para investigar el papel del virus Canino/FL/04 en las observaciones clínicas y patológicas en los galgos, los inventores realizaron tinción inmunohistoquímica (IHC) en tejidos pulmonares usando un anticuerpo monoclonal para gripe A H3. El antígeno viral H3 se detectó sistemáticamente en el citoplasma de células epiteliales bronquiales y bronquiolares, células epiteliales de glándulas bronquiales y macrófagos en lúmenes de las vías respiratorias y espacios alveolares (Figura 2A). Estos datos confirman un diagnóstico de infección pulmonar con virus de la gripe del subtipo H3 en múltiples perros.
EJEMPLO 3
Para determinar la implicación de un virus de tipo Canino/FL/04 en la etiología del brote de enfermedad respiratoria, los inventores analizaron sueros emparejados agudos y convalecientes de 11 perros enfermos y 16 contactos asintomáticos por inhibición de hemaglutinación (HI) y microneutralización (MN). La seroconversión, definida como un aumento de 4 veces en titulación de anticuerpos para Canino/FL/04 de la fase aguda a la convaleciente, se produjo en 8 de 11 (73%) perros enfermos en ambos ensayos (Tabla 1). La seroconversión se produjo en 6 de 16 (38%) contactos asintomáticos en el ensayo de HI, mientras que 8 de 16 (50%) se seroconvirtieron en el ensayo de MN (Tabla 1). Los datos de seroconversión demostraron infección de los perros con un virus de tipo Canino/FL/04 que coincidió temporalmente con la aparición de enfermedad respiratoria en la mayoría de los animales.
Se recogieron muestras de suero sencillas 3 meses después del brote de 46 perros asintomáticos adicionales alojados con los perros enfermos. De estos, 43 (93%) fueron seropositivos en ambos ensayos. Para la población total de 73 perros ensayados, 93% fueron seropositivos en ambos ensayos, incluyendo 82% (9/11) de los perros enfermos y 95% (59/62) de los contactos sanos. La seroprevalencia alta en perros sin historial de enfermedad respiratoria indica que la mayoría de las infecciones con virus de la gripe canina son subclínicas y sugiere propagación eficaz del virus entre perros. No se sabe si las infecciones subclínicas contribuyen a la propagación del virus.
EJEMPLO 4
Para entender mejor la capacidad de virus Canino/FL/04 para infectar perros, se inoculó a cuatro beagles de 6 meses de edad criados para este fin con 106,6 dosis infecciosas de cultivo tisular medianas (DICT50) cada uno por las vías intratraqueal e intranasal. Todos los perros desarrollaron una fiebre (temperatura rectal 39 ºC) durante los primeros 2 días después de la inoculación (p.i.), pero ninguno mostró síntomas respiratorios tales como tos o descarga nasal durante un periodo de observación de 14 días. Se examinó la difusión viral mediante cuantificación de virus en hisopos nasales y orofaríngeos. Solamente en 2 de los 4 perros se difundieron cantidades detectables de virus. En un perro se difundió virus los días 1 y 2 p.i. (1,0-2,5 log10 UFP por hisopo), mientras que en el otro perro se difundió el virus durante 4 días consecutivos después de la inoculación (1,4-4,5 log10 UFP por hisopo). La examen post mórtem de 2 perros el día 5 p.i. reveló necrotización y traqueítis, bronquitis y bronquiolitis hiperplásica similar a la hallada en la enfermedad espontánea en galgos, pero no hubo hemorragia pulmonar ni bronconeumonía. Se detectó antígeno viral H3 en el citoplasma de células epiteliales de bronquios, bronquiolos y glándulas bronquiales por IHC (Figura 2B). Se recuperó virus infeccioso del tejido pulmonar de uno de los perros. La examen post mórtem de los 2 perros restantes el día 14 p.i. mostró cambios histológicos mínimos en tejidos respiratorios, ausencia de antígeno viral H3 por IHC, y ausencia de recuperación de virus de homogeneizados pulmonares. Se detectó seroconversión en estos últimos dos perros en ensayos de MN el día 7 p.i. con un aumento adicional de 2 a 3 veces en titulaciones de anticuerpos el día 14. Estos resultados establecieron la susceptibilidad de perros a la infección con Canino/FL/04, como se demuestra por la respuesta febril, presencia de antígeno viral y virus infeccioso en el parénquima pulmonar, hallazgos histopatológicos típicos para gripe, y seroconversión. La incapacidad de reproducir enfermedad grave y muerte en los beagles inoculados de forma experimental no es sorprendente puesto que una gran proporción de los galgos infectados de forma natural eran asintomáticos.
EJEMPLO 5
Para investigar si un virus de la gripe de tipo Canino/FL/04 había circulado entre poblaciones de galgos en Florida antes del brote de enero de 2004, se ensayaron sueros de archivo de 65 galgos de carrera con respecto a la presencia de anticuerpos para Canino/FL/04 usando los ensayos de HI y MN. No hubo anticuerpos detectables en 33 perros de los que se tomaron muestras de 1996 a 1999. De 32 perros de los que se tomaron muestran entre 2000 y 2003, 9 eran seropositivos en ambos ensayos – 1 en 2000, 2 en 2002 y 6 en 2003 (Tabla 5). Los perros seropositivos se localizaron en pistas de Florida implicadas en brotes de enfermedad respiratoria de etiología desconocida de 1999 a 2003, lo que sugiere que un virus de tipo Canino/FL/04 podría haber sido el agente causante de esos brotes. Para investigar esta posibilidad adicionalmente, los inventores examinaron tejidos de archivo de galgos que murieron de bronconeumonía hemorrágica en marzo de 2003. Los homogeneizados de pulmón inoculados en células MDCK y embriones de pollo de un perro produjeron virus de la gripe H3N8, denominado A/Canino/Florida/252/2003 (Canino/FL/03). El análisis de la secuencia del genoma completo de Canino/FL/03 reveló >99% de identidad con Canino/FL/04 (Tabla 4), lo indica que los virus de tipo Canino/FL/04 habían infectado galgos antes de 2004.
EJEMPLO 6
De junio a agosto de 2004, se produjeron brotes de enfermedad respiratoria en miles de galgos de carrera en 14 pistas en Florida, Texas, Alabama, Arkansas, Virginia Occidental y Kansas.
Los oficiales en algunas de estas pistas estimaron que al menos 80% de su población canina tuvo enfermedad clínica. La mayoría de los perros tuvieron señales clínicas de fiebre ( 39 ºC) y tos similar a los perros del brote de enero 2004, pero muchos perros también tuvieron una descarga nasal mucopurulenta. Se informó de múltiples muertes pero no pudo determinarse una tasa de mortalidad precisa.
Los inventores recogieron suero emparejado agudo y convaleciente de 94 perros localizados en 4 pistas de Florida: 56% de estos perros tuvieron aumentos de 4 veces en titulaciones de anticuerpos para Canino/FL/04 y 100% fueron seropositivos (Tabla 6). Los sueros convalecientes de 29 perros en Virginia Occidental y Kansas también tuvieron anticuerpos para Canino/FL/04. Los inventores aislaron virus de la gripe A (H3N8) de los pulmones de un galgo que murió de una bronconeumonía hemorrágica en una pista en Texas. El análisis de secuencia del genoma completo de este aislado, llamado A/Canino/Texas/1/2004 (Canino/TX/04), reveló 99% de identidad con Canino/FL/04 (Tabla 4). El aislamiento de tres virus de la gripe cercanamente relacionados de casos caninos letales durante un periodo de 13 meses y de diferentes localizaciones geográficas, junto con las pruebas serológicas sustanciales de infección generalizada entre galgos de carrera, sugirió la circulación prolongada de un virus de tipo Canino/FL/04 en la población de perros.
El análisis filogenético de los genes de HA de Canino/FL/03, Canino/FL/04 y Canino/TX/04 mostró que constituyen un grupo monofilético con soporte de bootstrap robusto que era claramente distinto de los genes H3 contemporáneos de virus equinos aislados en 2002 y 2003 (Figura 1B). El análisis filogenético y comparaciones de secuencias de nucleótidos por pares de los otros 7 segmentos genómicos apoyaron la segregación de los genes caninos como un sublinaje distinto más cercanamente relacionado con el linaje de virus equino (datos no mostrados y Tabla 4). El agrupamiento de los genes de la gripe canina como un grupo monofilético separado de gripe equina también se vio apoyado por la presencia de 4 cambios de aminoácidos distintos en la HA (Tabla 2). Junto con los resultados serológicos de 2003 y 2004, estos datos son coherentes con un acontecimiento de transmisión de un solo virus de caballos a perros con propagación horizontal posterior del virus en la población de galgos. Sin embargo, introducciones repetidas de este linaje único de virus de la gripe a partir de una especie portadora no identificada no puede excluirse formalmente, aunque sea improbable.
La HA viral es un determinante crítico de especificidad de especies hospedadoras de virus de la gripe (Suzuki et al., 2000). Para identificar restos dentro de HA que puedan estar asociados con la adaptación al hospedador canino, los inventores compararon la secuencia de aminoácidos deducida de HA caninas con las de virus equinos contemporáneos. Cuatro cambios de aminoácidos diferencian las secuencias de aminoácidos consenso de HA equina y canina madura: N83S, W222L, I328T y N483T (véase Tabla 2). Los virus caninos tienen una deleción de aminoácidos en comparación con las secuencias equinas consenso. Por lo tanto, la posición de aminoácido 7 en la secuencia equina de HA es la posición 6 en la secuencia canina de HA, la posición de aminoácido 29 en la secuencia equina de HA es la posición 28 en la secuencia canina de HA, la posición de aminoácido 83 en la secuencia equina de HA es la posición 82 en la secuencia canina de HA, etc. Por lo tanto, los cuatro aminoácidos sustituidos están la posición 82, 221, 327 y 482 de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 33 y SEC ID Nº: 34. La sustitución de asparagina con serina en la posición de secuencia consenso 83 es un cambio de importancia funcional desconocida, puesto que se encuentran diversos restos polares en moléculas H3 de otras especies. La isoleucina estrictamente conservada en la posición de secuencia consenso 328 cerca del sitio de escisión de la HA H3 se ha reemplazado por treonina. El papel principal de escisión de HA por proteasas del hospedador en patogénesis sugiere que este cambio merece un estudio adicional. La sustitución de triptófano por leucina en la posición de secuencia consenso 222 es bastante notable debido a que representa un cambio no conservativo adyacente al bolsillo de unión de ácido siálico que podría modular la función receptora (Weis et al., 1998). Resulta interesante que la leucina en la posición 222 no es única de HA H3 canina puesto que se encuentra típicamente en los subtipos de HA H4, H8, H9 y H12 (Nobusawa et al., 1991; Kovacova et al., 2002). La sustitución de leucina puede ser más compatible con la especificidad del virus por hospedadores mamíferos, puesto que se ha informado de infecciones de cerdos con virus de subtipo H4 (Karasin et al., 2000) y seres humanos y cerdos con subtipo H9 (Peiris et al., 1999). La sustitución de asparagina con treonina en la posición de secuencia consenso 483 dio como resultado la pérdida de un sitio de glicosilación en la subunidad HA2 que se conserva en todos los subtipos de HA (Wagner et al., 2002). Aunque la importancia de estos cambios de aminoácidos en la HA para adaptación de un virus equino a perros aún debe determinarse, se han observado cambios de aminoácidos similares previamente en asociación con transferencia entre especies (Vines et al., 1998; Matrosovich et al., 2000). En las Tablas 19 a 25 se muestran diferencias de aminoácidos entre otras proteínas virales de la gripe de la invención y secuencias consenso equinas.
La fuente del virus de la gripe equina que inicialmente infectó a los galgos de carrera sigue siendo especulativa. Las perreras en los canódromos no se localizan cerca de caballos o hipódromos, lo que sugiere que el contacto entre galgos y caballos con supresión no es una explicación suficiente para los múltiples brotes en diferentes estados en 2004. Una fuente de exposición potencial al virus equino es la alimentación con carne de caballo a galgos, cuya
dieta se complementa con carne cruda proporcionada por plantas empaquetadoras que entregan cadáveres, incluyendo caballos que podrían portar gripe. Los precedentes para este modo de infección incluyen informes de transmisión entre especies de virus de la gripe aviar HSN1 a cerdos y félidos de zoológico alimentados con cadáveres de pollos infectados (Webster, 1998; Keawcharoen et al., 2004; Kuiken et al., 2004). Aunque ésta es una
5 vía plausible para la introducción inicial de gripe equina en perros, no explica los múltiples brotes de gripe recientes en miles de perros en diferentes estados. El estudio de inoculación experimental de los inventores demostró la presencia de virus en las fosas nasales y orofaringe de perros, aunque a titulaciones modestas. No obstante, estos resultados indican que la difusión es posible, y que la transmisión de perro a perro de virus por aerosoles de gotas grandes, fomites o contacto directo de mucosa podría desempeñar un papel en la epizootiología de la enfermedad.
10 La transferencia entre especies de un virus de la gripe de mamífero completo a una especie de mamífero no relacionada es un acontecimiento poco habitual. Estudios anteriores han proporcionado pruebas serológicas o virológicas limitadas, pero no ambas, de infección transitoria de perros con virus de la gripe humana A (H3N2) (Nikitin et al., 1972, Kilboume, et al., 1975; Chang et al., 1976; Houser et al, 1980). Sin embargo, no hubo pruebas
15 de circulación prolongada en el hospedador canino. Aunque la transferencia directa de virus de la gripe porcina de cerdos a personas está bien documentada (Dacso et al., 1984; Kimura et al., 1998; Patriarca et al., 1984; Top et al., 1977), no existen pruebas de la adaptación de los virus porcinos en los hospedadores humanos. En este informe, los inventores proporcionan pruebas virológicas, serológicas y moleculares de transmisión entre especies de un virus de la gripe equina A (H3N8) completo a otra especie de mamífero, el perro. Las sustituciones de aminoácidos únicas en
20 la HA de virus canino, junto con la confirmación serológica de infección de perros en múltiples estados de los Estados Unidos, sugieren adaptación del virus al hospedador canino. Puesto que los perros son un animal de compañía primario para los seres humanos, estos hallazgos tienen implicaciones para la salud pública; los perros pueden proporcionar una nueva fuente de transmisión de nuevos virus de la gripe A a seres humanos.
Tabla 1. Respuesta de anticuerpos a A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8).
Perros Enfermos (11)a
Contactos Sanos (16)b
Respuesta
Hlc SNd HI SN
Seroconversión (%)e
73 73 38 50
Seropositivo (%)f
82 82 100 100
Titulación media geométricag
329 424 268 431
a Número de perros con señales clínicas de enfermedad. b Número de perros asintomáticos alojados en contacto con perros clínicamente enfermos. c Ensayo de inhibición de hemaglutinación (HI) usando A/Canino/Florida/43/2004. d Ensayo de microneutralización (MN) usando virus A/Canino/Florida/43/2004. e Porcentaje de perros con un aumento al menos 4 veces de titulación de anticuerpos en sueros emparejados agudos y convalecientes.f Porcentaje de perros con una titulación de anticuerpos positiva (titulación de HI 32: titulación de MN 80) en el suero convaleciente. g Titulación de anticuerpos media geométrica para el suero convaleciente.
Tabla 2. Diferencias de aminoácidos entre las hemaglutininas H3 canina y equina
H3 equina consenso
Can/FL/03 Can/FL/04 Can/TX/04 Importancia potencial funcional
G7*
D -† - D también se encuentra en HA H3 humana y de pato
I29
- M M I se conserva en HA H3 de todas las especies
N83
S S S Diversos aminoácidos polares presentes en esta posición en HA H3 de otras especies
S92
- N - N está presente en algunas HA H3 de pato
L118
- - V L se conserva en todas las HA H3
W222
L L L W se conserva en la mayoría de HA H3 de todas las especies; localizada cerca del sitio de unión al receptor
A272
V A V V está presente en algunos aislados equinos recientes.
I328
T T T T se conserva estrictamente en todas las HA H3 aviares, porcinas o humanas
N483
T T T N aparece en todos los H3 y otros subtipos de HA. El reemplazo da como resultado pérdida de un sitio de glicosilación.
K541
- R - Cambio conservativo de aminoácido básico
* Resto de aminoácido (código de una letra) y posición en la HA H3 madura. El código de aminoácidos es: A=alanina, D=ácido aspártico, G=glicina, I=isoleucina, K=lisina, M=metionina, N=asparagina, R=arginina, S=serina, T=treonina, V=valina, W=triptófano. † Indica ausencia de cambio de las HA H3 equinas consenso.
Tabla 3. Inhibición de hemaglutinación de un aislado de virus por antisueros de referencia para diferentes subtipos de HA
Antisueros de referencia
Especificidad de HA Titulación de HIa
Puerto Rico/8/34
H1 5
Porcino/lowa15/30
H1 5
Singapur/01/57
H2 5
Shanghai/11/87
H3b 5
Equino/Miami/1/63
H3 160
Pato/Checoslovaquia/56
H4 5
Charrán/Sudáfrica/61
H5 5
Pavo/Massachussetts/65
H6 5
Gripe Aviar/Holandés/27
H7 5
Gripe Aviar/Rostock/34
H7 5
Equino/Praga/1/56
H7 5
Pavo/Ontario/6118/68
H8 5
Codorniz/Hong Kong/G1/97
H9b 5
Pollo/Hong Kong/G9/97
H9b 5
Pollo/Alemania/49
H10 5
Pato/Inglaterra/56
H11 5
Gaviota/Maryland/704/77
H13 5
Suero de oveja normal
- 5
Suero de hurón normal
- 5
a Titulación de inhibición de hemaglutinación para aislado de virus del perro nº 43. b Se produjeron antisueros policlonales en hurones, mientras que todos los otros antisueros se produjeron en ovejas o cabras.
Tabla 4. Homología de secuencia de genes de A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8) para cepas equinas, aviares, porcinas y humanas de gripe A
Gen
Equina Aviar Porcina Humana
PB2 DQ124147
96,9 (98,7)a Eq/ Kentucky/2/8 M73526 88,6 (96,8) Ánade/ Alberta/98/85 AY633315 87,9 (96,8) Por/ Ontario/01911-1/99 AF285892 86,2 (96,4) PR/8/34 (HK/213/03) AF389115 (AY576381)
PB1 DQ124148
97,1 (98,8) Eq/ Tennessee/5/86 M25929 83,9 (97,1) Po/ Columbia Británica/04 (Gaviota/Md/704/77) AY61675 (M25933) 83,9 (97,1) Por/ Corea/S109/04 (Por / Saskatch/ 18789/02) AY790287 (AY619955) 83,9 (97,1) WSN/33 (Sing/1/57) J02178 (M25924)
PA DQ124149
96,3 (97,5) M26082 Eq/Tennesee/5/86 87,0 (94,3) Po/Chile/ 4591/02 (Avestruz/SA/ 08103/95) AY303660 (AF508662) 84,3 (94,6) Por/ Hong Kong/126/02 M26081 83,8 (93,4) Taiwán/ 2/70 (Vietnam/ 1203/04) AY21 0199 (AY818132)
HA (H3) DQ124190
97,4(97,1) Eq/FL/ 1/93 L39916 80,7 (89,0) Pt/ Noruega/1/03 AJ841293 80,0 (87,7) Por/ Ontario/42729a/01 AY619977 81,8 (87,9) HK/1/68 AF348176
NP DQ124150
96,6 (97,9) Eq/ Tennesee/5/86 M30758 87,9 (95,1) Po/Chile/ 176822/02 AY303658 85,4 (93,5) Por / Ontario/42729a/0 1 (Por/Fujian/1/2003) AY619974 (AY747611) 84,7 (93,0) HK/ 1073/99 (Hong Kong /538/97) AF255742 (AF255751)
NA (N8) DQ124151
96,8 (97,0) Eq/ Tennessee/5/86 L06538 84,0 (85,2) Pt/NJ/ 2000 L06583 nab nab
M DQ124152
97,9 (95,7) Eq/ Tennessee/5/86 (Eq/ Kentucky/92) M63529 (AF001683) 94,1 (94,0) Pv/Mn/ 833/80 AF001683 93,7 (93,5) Por/ Saskatchewan/ 18789/02 M63527 91,2 (95,4) WSN/33 (Hong Kong/ 1073/99) J02177 (AJ278646)
Tabla 4. Homología de secuencia de genes de A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8) para cepas equinas, aviares, porcinas y humanas de gripe A
Gen
Equina Aviar Porcina Humana
NS DQ124153
97,5 (95,7) Eq/Tn/ 5/86 (Eq/Kentucky/ 92) M80973 (AF001671) 92,0 (90,4) Án/NY/ 6750/78 M80945 91,1 (89,1) Por/ China/8/78 (Por/ Corea/s452/04 ) M80968 (AY790309) 91,4 (90,0) Brevig Mission/1/18 AF333238
a Porcentaje de identidad de secuencia de nucleótidos y aminoácidos (entre paréntesis) de genes de A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8) con el gen más homólogo de aislados de virus de la gripe de la especie, seguido de los números de acceso de base de datos de secuencia de Genbank. b No aplicable: No se ha informado nunca de neuraminidasa N8 en virus humanos o porcinos.
Tabla 5. Titulaciones de anticuerpos para A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8) en suero de galgos recogido de 1996 a 2003.
Añoa
1996
1997 1998 2000 2002 2003
Nº de perros ensayados
8 6 19 4 6 22
Nº de perros seropositivos
0 0 0 1 2 6
Titulaciones de anticuerpob
512 232.524 280-2242
a El año de recogida de la muestra de suero de galgos de carrera en Florida. b Titulaciones de anticuerpo de ensayo de microneutralización para perros seropositivos, incluyendo el intervalo para los seis perros seropositivos de 2003.
Tabla 6. Respuesta de anticuerpo a A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8) en galgos de carrera en 4 pistas de Florida en junio de 2004.
Respuesta
Pista A Pista B Pista C Pista D
Número de perros ensayadosa
37 10 22 25
Seroconversión (%)b
46 90 100 64
Seropositivo (%)c
100 100 100 100
Titulación media geométricad
401 512 290 446
a Número de perros clínicamente enfermos ensayados por HI usando A/Canino/Florida/43/2004 (H3N8). b Porcentaje de perros con aumento 4 veces de titulación de anticuerpos entre sueros agudos y convalecientes. c Porcentaje de perros con una titulación de anticuerpos positiva (titulación de HI >16) en los sueros convalecientes. d Titulación de anticuerpos media geométrica para los sueros convalecientes.
Materiales y métodos para los Ejemplos 7-11
5 Tejidos caninos
Se realizaron exámenes post mórtem por el Servicio de Patología Anatómica en el Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad de Florida en 6 perros de raza mestiza que murieron en abril/mayo de 2005 durante un brote de
10 gripe en una instalación de refugio en el noreste de Florida, y en un perro Yorkshire Terrier mascota que murió en mayo de 2005 durante un brote de gripe en una clínica veterinaria en el sureste de Florida. Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra 10%, se incluyeron en parafina y se tiñeron secciones de 5 !m con hematoxilina y eosina para diagnóstico histopatológico. Los tejidos no fijados se almacenaron a -80 ºC hasta sus análisis virológicos.
15 Extracción de ARN de muestras de tejido canino
Se descongelaron tejidos pulmonares congelados de cada uno de los 7 perros y se homogeneizaron en medio esencial mínimo (MEM) complementado con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA) y antibióticos (gentamicina y
20 ciprofloxacina) usando una picadora de tejido desechable (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). Se extrajo ARN total usando un kit comercial (Kit RNeasy® Mini, QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyó en un volumen final de 60 !l de tampón. También se extrajo ARN total de tejido pulmonar recogido de perros sin enfermedad respiratoria.
25 RT-PCR en tiempo real
Se realizó una RT-PCR en tiempo real cuantitativa de una etapa en ARN total extraído de las muestras de tejido canino usando el Kit de RT-PCR de sonda QuantiTect® que contiene ROX como un colorante de referencia pasivo (QIAGEN Inc., Valencia, CA). En resumen, se usaron 2 conjuntos de cebadores-sonda para detección de 30 secuencias de gripe A en cada muestra (Tabla 7). Un conjunto de cebador-sonda fue selectivo para secuencias génicas de hemaglutinina (H3) canina. El otro conjunto de cebador-sonda se dirigió a una región altamente
conservada del gen de matriz (M) de virus de la gripe de tipo A. Para cada reacción de RT-PCR en tiempo real, se añadieron 5 !l de ARN total extraído a una mezcla de reacción que contenía 12,5 !l de Mezcla Maestra de RT-PCR de sonda QuantiTect® 2X, 0,25 !l de mezcla RT QuantiTect®, cebadores directo e inverso (concentración final 0,4 !M para cada uno), sonda (concentración final de 0,1 !M) y agua sin RNasa en un volumen final de 25 !l. Los Reactivos de Control de ARN Ribosomal TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detección de ARNr 18S como un control interno endógeno con respecto a la presencia de ARN extraído de las muestras de tejido canino.
Se realizó RT-PCR en tiempo real de una etapa cuantitativa en las mezclas de reacción en un Sistema QPCR Mx3000P® (Stratagene, La Jolla, CA). Las condiciones de ciclación incluyeron una etapa de transcripción inversa a 50 ºC durante 30 minutos, una etapa de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 15 minutos para activar la ADN polimerasa HotStarTaq®, y amplificación durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificación incluyó desnaturalización a 94 ºC durante 15 segundos seguido de hibridación/extensión a 60 ºC durante 1 minuto. Las señales fluorescentes FAM (longitud de onda de emisión 518 nm) y VIC (longitud de onda de emisión 554 nm) se registraron a final de cada ciclo. El ciclo umbral (Ct) se determinó estableciendo la fluorescencia umbral (dR) a 1000 en cada experimento individual. Para la adquisición de datos y el análisis se usó el programa de software Mx3000P® versión 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA). Las muestras se consideraron positivas para virus de gripe A cuando el ciclo umbral (Ct) para el gen H3 o M fue 3 unidades más pequeño que el Ct para tejidos pulmonares de perros sin enfermedad respiratoria. El control positivo consistió en amplificación de ARN extraído de virus A/canino/FL1242/03 (H3N8).
Aislamiento de virus en células MDCK
Se descongelaron tejidos pulmonares congelados de cada uno de los 7 perros y se homogeneizaron en 10 volúmenes de Medio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) complementado con 0,5% (BSA) y antibióticos (gentamicina y ciprofloxacina). Se retiraron los residuos sólidos por centrifugación y los sobrenadantes se inocularon en células de riñón canino Madin-Darby (MDKC) cultivadas en DMEM complementado con tripsina tratada con TPCK 1 !g/ml (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) y antibióticos (gentamicina y ciprofloxacina). Las células se cultivaron en matraces de 25 cm2 a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO2 5%. Los cultivos se observaron diariamente con respecto a cambios morfológicos y se recogieron a los 5 días después de inoculación. Los cultivos recogidos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se inocularon en células MDCK nuevas como se ha descrito para la inoculación inicial; se realizaron dos pases adicionales para muestras que no mostraron pruebas de virus de la gripe por hemaglutinación o RT-PCR. La actividad de hemaglutinación en los sobrenadantes clarificados se determinó usando glóbulos rojos de pavo 0,5% como se ha descrito previamente (Burleson, F. et al., 1992; Kendal, P. et al., 1982). Se realizó RT-PCR como se describe posteriormente.
Aislamiento de virus en huevos de pollo embrionados
Se prepararon homogeneizados a partir de tejidos pulmonares congelados como se ha descrito anteriormente para inoculación de células MDCK. Los homogeneizados (0,2 ml) se inocularon en el saco alantoideo de huevos de pollo embrionados de 10 días de edad. Después de 48 horas de incubación a 35 ºC, los huevos se enfriaron a 4 ºC durante una noche antes de recoger el fluido alantoideo. La actividad de hemaglutinación en los sobrenadantes clarificados se determinó usando glóbulos rojos de pavo 0,5% como se ha descrito previamente (Burleson, F. et al., 1992; Kendal, P. et al., 1982). Se realizó RT-PCR como se describe posteriormente. Se realizaron dos pases adicionales en huevos embrionados que no mostraron pruebas de virus de la gripe después de la inoculación inicial.
RT-PCR, secuenciación de nucleótidos y análisis filogenéticos
Se extrajo ARN viral de sobrenadante de MDCK o fluido alantoideo usando el Kit QIAamp® de ARN Viral Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN viral se transcribió de forma inversa a ADNc usando el Kit de RT-PCR de Una Etapa QIAGEN® (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó amplificación por PCR de la región codificante de los 8 genes virales de la gripe en el ADNc como se ha descrito previamente (Klimov, A. et al., 1992b), usando conjuntos de cebadores específicos para genes universales (secuencias de los cebadores disponibles bajo demanda). Los amplicones de ADN resultantes se usaron como moldes para secuenciación automática en el secuenciador de ADN automático ABI PRISM® 3100 usando química de terminador de colorante de secuenciación cíclica (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias de nucleótidos se analizaron usando el Lasergene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Se usó el programa de software PHYLlP Versión 3.5© para estimar las filogenias y calcular los valores de bootstrap de las secuencias de nucleótidos (Felsenstein, J., 1989). Los árboles filogenéticos se compararon con los generados por análisis de unión a vecinos con el modelo Tamura-Nei implementado en el programa MEGA© (Kumar, S. et al., 2004) y se confirmó por el programa PAUP© 4.0 Beta (Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA).
Ensayo de inhibición de hemaglutinación
Se incubaron muestras de suero con enzima destructora de receptor (RDE, DENKA SEIKEN Co., Ltd., Tokio, Japón) (1 parte de suero: 3 partes de RDE) durante 16 horas a 37 ºC antes de inactivación por calor durante 30 minutos a
56 ºC. Se cultivó virus de la Gripe A/Canino/Jacksonville/05 (H3/N8) en células MDCK durante 72 horas a 37 ºC en CO2 5%. Se recogieron sobrenadantes de cultivo de virus, se clarificaron por centrifugación y se almacenaron a -80 ºC. Todos los otros virus usados en el ensayo HI se cultivaron en huevos de pollo embrionados de 10 días de los que se recogió fluido alantoideo y se almacenó a -80 ºC. El ensayo HI se realizó como se ha descrito previamente (Kendal, P. et al., 1982). En resumen, se añadieron 4 unidades de hemaglutinación de virus en 25 !l a un volumen igual de suero diluido en serie en placas de plástico de 96 pocillos y se incubaron a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió un volumen igual de eritrocitos de pavo 0,5% y las titulaciones de hemaglutinación se estimaron visualmente después de 30 minutos. El criterio de valoración de titulación de HI se definió como la última dilución de suero que inhibía completamente la hemaglutinación.
EJEMPLO 7 – CASOS CLÍNICOS
En abril y mayo de 2005, se produjo un brote de enfermedad respiratoria previamente descrito (Crawford, P.C. et al., 2005) en perros alojados en una instalación de refugio en el noreste de Florida. El brote implicó al menos 58 perros que variaban en edad de 3 meses a 9 años, e incluyó perros de raza pura así como razas mestizas. Las señales clínicas más habituales fueron descarga nasal purulenta y una tos durante 7 a 21 días. De los 43 perros que tuvieron enfermedad clínica durante 7 días, 41 tuvieron titulaciones de anticuerpo de HI para canino/FL4/04 (H3N8) que variaba de 32 a >1024. Al menos 10 perros progresaron a neumonía, de los que 6 fueron sacrificados. Estos 6 perros de raza mixta incluían 3 machos y 3 hembras que variaban en edad de 4 meses a 3 años. La duración de las señales clínicas varió de 2 a 10 días en el momento del sacrificio. En la examen post mórtem, estos perros tenían congestión pulmonar y edema. El examen histológico del tracto respiratorio reveló rinitis, traqueítis, bronquitis, bronquiolitis y bronconeumonía supurante. Hubo necrosis de células epiteliales y erosión en la tráquea, bronquios, bronquiolos y glándulas bronquiales. Los tejidos respiratorios estaban infiltrados por neutrófilos y macrófagos.
En mayo de 2005, se produjo un brote de enfermedad respiratoria en 40 perros mascotas en una clínica veterinaria en el sureste de Florida. Las señales clínicas más habituales fueron descarga nasal purulenta y una tos durante 10 a 30 días. De los 40 perros, 17 fueron seropositivos para canino/FL/04 (H3N8) con titulaciones de anticuerpo de HI que variaban de 32 a >1024. Se produjo seroconversión en 10 perros para los que estaban disponibles sueros emparejados agudos y convalecientes. Tres perros progresaron a neumonía. Uno de estos perros, un Yorkshire Terrier macho de 9 años de edad, murió 3 días después de la aparición de señales clínicas. Este perro tenía traqueobronquitis, edema y congestión pulmonar y bronconeumonía grave. De forma similar a los 6 perros del refugio, hubo necrosis celular epitelial y erosión de las vías respiratorias e infiltraciones de neutrófilos en los tejidos.
EJEMPLO 8 – RT-PCR EN TIEMPO REAL Y AISLAMIENTO VIRAL
Se analizaron tejidos pulmonares de los 7 perros por ensayos de RT-PCR en tiempo real cuantitativos que detectan el gen M de gripe de tipo A y el gen H3 de virus de gripe A H3N8 canina. Los pulmones de los 7 perros fueron positivos tanto para el gen M de gripe A como para el gen de gripe H3 canina (Tabla 8). Después de 3 pases en células MDCK, se aisló virus de gripe A subtipo H3N8 de los pulmones de un perro de refugio que murió después de 3 días de neumonía. Este virus se llamó A/canino/Jacksonville/05 (H3N8) (canino/Jax/05). Después de 2 pases en huevos de pollo embrionados, se recuperó virus de gripe A subtipo H3N8 de los pulmones del perro mascota que también murió después de 3 días de neumonía. Este virus se denominó A/canino/Miami/05 (H3N8) (canino/Miami/05).
EJEMPLO 9 – ANÁLISIS GENÉTICOS DE LOS AISLADOS DE GRIPE CANINA A H3N8
Los análisis de secuencia de canino/Jax/05 y canino/Miami/05 revelaron que sus genes de hemaglutinina (HA) eran 98% idénticos a los aislados de canino/FL/04, canino/TX/04 y canino/Iowa/05 recuperados de los pulmones de galgos de carrera que murieron de neumonía durante brotes de gripe en las pistas en 2004 y 2005 (Crawford, P.C. et al., 2005; Yoon K-Y. et al., 2005). Además, los genes de HA de canino/Jax/05 y canino/Miami/05 fueron 98% idénticos a virus de la gripe equina contemporáneos aislados después del año 2000. Las comparaciones filogenéticas de los genes de HA mostraron que los virus canino/Jax/05 y canino/Miami/05 se agrupaban con los aislados de galgo canino/FL/04, canino/TX/04 y canino/Iowa/05 y aislados equinos contemporáneos, formando un grupo definido de los virus equinos más antiguos aislados a principios de los años 90 (Figura 4). Además, los aislados de virus canino/Jax/05, canino/Miami/05 y canino/Iowa/05 estaban más cercanamente relacionados a canino/Tx/04 que a canino/FL/04 o canino/FL/03. Los aislados de 2005 formaron un subgrupo que parece ramificarse de los virus caninos anteriores de 2003 y 2004 con diferencias en aproximadamente 10 sitios informativos de parsimonia. Estas diferencias apoyan la hipótesis de que el virus de la gripe canina se transmite de forma horizontal de perro a perro en lugar de reintroducirse periódicamente desde una fuente externa. La acumulación de mutaciones de 2003 a 2005 ilustra el proceso continuado de adaptación que el virus debe experimentar después de transmitirse a un nuevo hospedador, como se espera que haya sucedido para los virus de gripe canina.
EJEMPLO 10 – ANÁLISIS DE AMINOÁCIDOS DE LOS AISLADOS DE GRIPE CANINA A H3N8
Hubo sustituciones de aminoácidos conservados en los 6 aislados caninos que los diferenciaban de virus de gripe equina contemporáneos (Tabla 9). Estas sustituciones conservadas fueron I15M, N83S, W222L, 1328T y N483T. 5 Las comparaciones filogenéticas de la proteína HA madura mostraron que los virus canino/Jax/05, canino/Miami/05 y canino/Iowa/05 formaban un subgrupo con el aislado canino/TX/04 (Figura 4). Hubo 3 cambios de aminoácidos (L118V, K261N y G479E) que diferenciaron este subgrupo de los otros virus caninos (Tabla 9). Hubo 2 cambios de aminoácidos (F79L y G218E) que diferenciaron los aislados de 2005 de su raíz de canino/TX/04. Además, los aislados de 2005 de perros no galgos, canino/Jax/05 y canino/Miami/05, difirieron del aislado de galgo de
10 canino/Iowa/05 en un cambio de aminoácido, R492K. Finalmente, canino/Jax/05 difirió de canino/Miami/05 en un solo aminoácido, S107P. En todos los demás virus equinos y caninos H3N8, S se conserva en la posición 107 excepto para A/Equino/Jilin/1/89 que tiene una T (Guo Y. et. al., 1992).
EJEMPLO 11 – ANÁLISIS ANTIGÉNICOS DE LOS AISLADOS DE GRIPE CANINA A H3N8
15 Se realizaron ensayos de inhibición de hemaglutinación (HI) usando un panel de antígenos de virus de la gripe equina contemporáneos y más antiguos y los virus de gripe canina, y suero recogido en 2005 de caballos y perros que se habían infectado con virus de la gripe (Tabla 10). También se incluyó suero de hurones inmunizados contra canino/FL/04 en los análisis. Las titulaciones de anticuerpo de HI en suero equino fueron de 8 a 16 veces mayores
20 cuando se ensayaron con virus equinos contemporáneos en comparación con aislados más antiguos, pero se redujeron en al menos 4 veces cuando se ensayaron con los virus caninos. El suero canino no fue reactivo con los virus equinos más antiguos, pero las titulaciones de anticuerpo aumentaron 4 veces cuando se ensayaron con aislados equinos contemporáneos y aislados caninos. Esto también se observó para el suero de hurones inmunizados contra virus de la gripe canina. Estos patrones serorreactivos demostraron la similitud antigénica entre
25 los virus de gripe canina y virus de gripe equina contemporáneos y fueron coherentes con los análisis filogenéticos. Las titulaciones de anticuerpos en sueros equinos, caninos, y de hurón para el aislado de canino/Miami/05 fueron similares a las de los aislados caninos de 2003 y 2004. Sin embargo, las titulaciones fueron de 2 a 4 veces menores para el aislado de canino/Jax/05. Esto sugiere que canino/Jax/05 es antigénicamente distinto de los otros aislados caninos, lo que puede estar relacionado en parte con el cambio de un solo aminoácido en la posición 107 en la HA
30 madura.
Tabla 7. Sondas y cebadores para análisis de RT-PCR en tiempo real cuantitativa para el gen de la matriz de virus de gripe A y el gen H3 de gripe canina A (H3N8).
Cebador
Diana Secuencia Aplicación
Ca-H3-F387
H3 (nt 387-406) 5’-tatgcatcgctccgatccat-3’ (SEC ID Nº: 79) Cebador directo para H3
Ca-H3-R487
H3 (nt 487-467) 5’-gctccacttcttccgttttga-3’ (SEC ID Nº: 80) Cebador inverso para H3
Ca-H3-P430
H3 (nt 430-459) FAM-aattcacagcagagggattcacatggacag -BHQ1 (SEC ID Nº: 81) Sonda TaqMan®
FluA-M-F151
M (nt 151-174) 5’-catggartggctaaagacaagacc-3’a (SEC ID Nº: 82) Cebador directo para M
FluA-M-R276
M (nt 276-253) 5’-agggcattttggacaaakcgtcta-3’ (SEC ID Nº: 83) Cebador inverso para M
FluA-M-P218
M (nt 218-235) FAM -acgcTcaccgTgcccAgt-BHQ1b (SEC ID Nº: 84) Sonda TaqMan®
a La letra r subrayada representa nucleótido a o g y la letra k subrayada representa nucleótido g o t. b Las letras en mayúsculas representan restos de ácido nucleico bloqueados.
Tabla 8. RT-PCR en tiempo real cuantitativa y aislamiento viral realizado en tejidos pulmonares de perros que murieron de neumonía durante brotes de enfermedad respiratoria en un refugio y clínica veterinaria en Florida.
ID del perro
Localización Duración de enfermedad clínica RT-PCR en tiempo real Aislamiento del Virus
M (Ct)
HA (Ct)
Control positivo de A/canino/FL/242/03
28,15 27,36
1079
Refugio (NE FL) 2 días 29,81 28,84 ninguna
1078
Refugio (NE FL) 3 días 30,37 29,71 3º pase de MDCK
318
Refugio (NE FL) 9 días 33,89 32,97 ninguna
320
Refugio (NE FL) 10 días 39,44 37,09 ninguna
319
Refugio (NE FL) 6 días 33,87 32,23 ninguna
1080
Refugio (NE FL) 6 días 38,87 38,23 ninguna
374
Clínica veterinaria (SE FL) 3 días 24,05 22,65 2º pase de huevo
Tabla 9. Comparación de aminoácidos de la HA madura para virus de gripe canina y virus de gripe equina contemporáneos
Aminoácido
7
15 54 78 79 83 92 107 118 159 218 222 261 328 479 483 492 541
A/equino/KY/5/02
G I N V F N S S L N G W K 1 G N R K
A/equino/MA/213/03
- - - A - - - - - S - - - - - - - -
A/equino/OH/1/03
D - K A - - - - - S - - - - - - - -
A/canino/FL/242/03
- M K A - S - - - S - L - T - T - -
A/canino/FL/43/04
- M K A - S N - - S - L - T - T - R
A/canino/TX/1/04
- M K A - S - - V S - L N T E T - -
A/canino/lowa/05
- M K A L S - - V S E L N T E T - -
A/canino/Miami/05
- M K A L S - - V S E L N T E T K -
A/canino/Jacksonville/05
- M K A L S - P V S E L N T E T K -
Tabla 10. Titulaciones de anticuerpos en suero equino, canino y de hurón para virus de gripe equina contemporáneos y más antiguos y virus de gripe canina.
Titulaciones de anticuerpo de sueroa
Antígenos
Equino Canino Hurónb
equino/Miami/63
40 <10 16
equino/Ky/86
40 40 32
equino/KY/92
40 <10 32
equino/NY/99
320 40 128
equino/KY/05/02
320 160 256
equino/MA/213/03
640 160 512
equino/OH/01/03
640 160 512
canino/FL/03
160 160 512
canino/FL/04
160 80 512
canino/Tx/04
160 160 512
canino/Miami/05
160 80 256
canino/Jax/05
40 40 128
a Las titulaciones de anticuerpo se determinaron en un ensayo de inhibición de hemaglutinación realizado con diluciones en serie de suero equino, canino o de hurón y los virus enumerados en la columna de antígenos.b Suero de hurones inmunizados con virus canino/FL/04.
Materiales y métodos ejemplares para los Ejemplos 12-15
Inóculo de virus de gripe canina
5 El inóculo de virus se preparó mediante inoculación de células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (MDCK) con una reserva de A/canino/FL/43/04 (H3N8) que representa el pase 3 del aislado original previamente descrito (Crawford et al., 2005). Las células MDCK inoculadas en Medio Esencial Mínimo de Dulbecco (DMEM) complementado con tripsina tratada con TPCK 1 !g/ml (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) y antibióticos
10 (gentamicina y ciprofloxacina) se cultivaron en matraces de 250 cm2 a 37 ºC en una atmósfera humidificada que contenía CO2 5%. Los cultivos se observaron diariamente con respecto a cambios morfológicos y se recogieron a los 5 días después de la inoculación. Los cultivos recogidos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se almacenaron a -80 ºC a la espera de la inoculación de perros. Se usó una alícuota de sobrenadante para determinación de titulación de virus por el método de Reed y Muench. La titulación fue 107 dosis infecciosas de
15 cultivo tisular medianas (DICT50) de A/canino/Florida/43/2004 (canino/FL/04) por ml.
Inoculación experimental
Se usaron ocho perros mestizos criados en colonia de 4 meses de edad (Marshall BioResources, North Rose, NY)
20 (4 machos y 4 hembras) para el estudio de inoculación experimental aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales de la Universidad de Florida. Los pesos corporales de los perros variaban de 13 a 17 kg. Los perros estaban sanos basándose en exámenes físicos, ensayos sanguíneos de línea basal y registro de temperaturas corporales durante 2 semanas antes de la inoculación. Ninguno de los perros se había expuesto previamente a virus de gripe canina basándose en ensayos de serología realizados en muestras de suero
25 emparejadas recogidas en el momento de la llegada a las instalaciones y 2 semanas después. Los perros se anestesiaron por inyección intravenosa de propofol (Diprivan®, Zeneca Pharmaceuticals, 0,4 mg/kg de peso corporal hasta efecto) para intubación con tubos endotraqueales. Se inoculó a seis perros (3 machos y 3 hembras) con 107 DICT50 cada uno de virus canino/FL/04 en 5 ml de solución salina estéril administrada en la tráquea distal a través de un catéter de goma de diámetro pequeño insertado en el tubo endotraqueal. Se inoculó de forma simulada a dos
30 perros (1 macho y una hembra) con un volumen igual de solución salina estéril. Los perros de control inoculados con simulación se alojaron en una habitación diferente de los perros inoculados con virus y les cuidó un personal diferente. Se realizaron exámenes físicos y registros de temperatura rectal dos veces al día durante 6 días después de la inoculación (p.i.).
35 Recogida de hisopo faríngeo y rectal
Para supervisar la difusión viral, se recogieron muestras de ensayo orofaríngeas dos veces al día de cada perro los días 0 a 6 p.i. usando hisopos de poliéster (Fisher Scientific International lnc., Pittsburgh, PA). Los hisopos se situaron en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) que contenía albúmina de suero bovino
40 0,5% (BSA). Se recogieron hisopos rectales de cada perro diariamente desde los días 0 a 6. Se prepararon extractos de hisopos por clarificación del medio de transporte de hisopo por centrifugación. Se ensayó una alícuota de extracto de hisopo inmediatamente con respecto a nucleoproteína de virus de gripe A usando el kit de inmunoensayo comercial Directigen™ (BD, Franklin Lakes, NJ) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El extracto restante se almacenó a -80 ºC a la espera de otros ensayos virológicos.
Exámenes post mórtem
El día 1 p.i. se sacrificaron un perro inoculado con simulación y un perro inoculado con virus por inoculación intravenosa de solución Beuthanasia-D® (1 ml/5 kg de peso corporal; Schering-Plough Animal Health Corp). Se sacrificó de forma similar a un perro inoculado con virus cada día desde los días 2 a 5 p.i. El día 6 p.i., se sacrificaron los perros inoculados con simulación e inoculados con virus restantes. Se analizaron exámenes post mórtem completas por uno de los investigadores (WLC). Los tejidos se fijaron en formalina tamponada neutra 10%, se incluyeron en parafina y se tiñeron secciones de 5 !m con hematoxilina y eosina para diagnóstico histopatológico
o se procesaron para inmunohistoquímica como se describe posteriormente. Se presentaron tejidos de pulmón no fijados al Servicio de Microbiología/Parasitología/Serología Clínica Diagnóstica en el Colegio de Medicina Veterinaria de la Universidad de Florida para aislamiento e identificación bacteriana. Las muestras se cultivaron en medio no selectivo así como medio selectivo para especies de Bordetella (Regan-Lowe; Remel, Lenexa, KS) y especies de Mycoplasma (Remel). Todos los cultivos se mantuvieron durante 21 días antes de que se notificara ausencia de crecimiento. Los tejidos no fijados también se almacenaron a -80 ºC a la espera de análisis virológicos.
Inmunohistoquímica
Se montaron secciones tisulares de tráquea y pulmón de 5 !m desparafinadas y rehidratadas en portaobjetos Bond-Rite™ (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) y posteriormente se trataron con proteinasa K (DAKOCytomation Inc., Carpenteria, CA) seguido de reactivo de bloqueo de peroxidasa (Kit de Peroxidasa DAKO®EnVision™, DAKO Corp., Carpenteria, CA). Las secciones se incubaron con una dilución 1:500 de anticuerpo monoclonal para gripe A H3 (Chemicon International, Inc., Ternecula, CA) durante 2 horas a temperatura ambiente. Los controles incluyeron incubación de las mismas secciones con IgG de ratón (1 mg/ml, Serotec, Inc. Raleigh, NC) e incubación del anticuerpo monoclonal con secciones de pulmón canino normales. Después del tratamiento con el anticuerpo primario, las secciones se incubaron con inmunoperoxidasa secundaria y reactivos de sustrato de peroxidasa (Kit de Peroxidasa DAKO®EnVision™, DAKO Corp.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina, se trataron con Clarificador nº 2 y Reactivo Azul (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI), se deshidrataron y se aplicaron cubreobjetos con Permount (ProSciTech, Queensland, Australia).
Extracción de ARN de hisopos y tejidos
Se descongelaron tejidos pulmonares y traqueales de cada perro y se homogeneizaron en medio esencial mínimo (MEM) complementado con albúmina de suero bovino 0,5% (BSA) y antibióticos (gentamicina y ciprofloxacina) usando una picadora de tejido desechable (Kendall, Lifeline Medical Inc., Danbury, CT). Se extrajo ARN total de los homogeneizados tisulares así como extractos de hisopos orofaríngeos y rectales usando un kit comercial (kit RNeasy® Mini, QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluyó en un volumen final de 60 !l de tampón.
RT-PCR en tiempo real
Se realizó una RT-PCR en tiempo real cuantitativa de una etapa en el ARN total usando el Kit de RT-PCR de Sonda QuantiTec® que contenía ROX como un colorante de referencia pasivo (QIAGEN Inc., Valencia, CA) y un conjunto de cebador-sonda que se dirigía a una región altamente conservada del gen de matriz (M) del virus de la gripe de tipo A (Payungporn S. et al., 2006a; Payungporn S. et al., 2006b). Para cada reacción de RT-PCR en tiempo real, se añadieron 5 !l de ARN total extraído a una mezcla de reacción que contenía 12,5 !l de Mezcla Maestra de RT-PCR de Sonda QuantiTech® 2X, 0,25 !l de Mezcla de RT QuantiTech®, cebadores directo e inverso (concentración final de 0,4 !M para cada uno), sonda (concentración final de 0,1 !M) y agua sin RNasa en un volumen final de 25 !l. Los Reactivos de Control de GAPDH TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante para detección de GAPDH como un control interno endógeno con respecto a la presencia de ARN extraído del hisopo y muestras tisulares y como un control de normalización.
Se realizó RT-PCR en tiempo real de una etapa cuantitativa en las mezclas de reacción en un Sistema de QPCR Mx3000P® (Stratagene, La Jolla, CA). Las condiciones de ciclación incluyeron una etapa de transcripción inversa a 50 ºC durante 30 minutos, una etapa de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 15 minutos para activar la ADN polimerasa HotStarTaq® y amplificación durante 40 ciclos. Cada ciclo de amplificación incluyó desnaturalización a 94 ºC durante 15 segundos seguido de hibridación/extensión a 60 ºC durante 1 minuto. Las señales fluorescentes de FAM (longitud de onda de emisión 518 nm) y VIC (longitud de onda de emisión 554 nm) se registraron al final de cada ciclo. El ciclo umbral (Ct) se determinó estableciendo la fluorescencia umbral (dR) a 1000 en cada experimento individual. Para la adquisición y el análisis de datos se usó el programa de software Mx3000P® versión 2.0 (Stratagene, La Jolla, CA). El control positivo consistió en amplificación de ARN extraído de virus A/canino/FL/242/03 (H3N8). Los resultados se normalizaron dividiendo el valor de Ct de M por el valor Ct de GAPDH correspondientes para cada muestra.
Re-aislamiento de virus de tejidos
Se descongelaron tejidos de pulmón y tráquea congelados de perros inoculados con virus y se homogeneizaron en 10 volúmenes de DMEM complementado con BSA 0,5% y antibióticos. Se retiraron residuos sólidos por centrifugación y se inocularon sobrenadantes en células MDCK cultivadas en DMEM complementado con tripsina tratada con TPCK 1 !g/ml (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) y antibióticos como se ha descrito anteriormente. Las células se cultivaron en matraces de 25 cm2 a 37 ºC en una atmósfera humidificada que tenía CO2 5%. Los cultivos se observaron diariamente con respecto a cambios morfológicos y se recogieron a los 5 días después de la inoculación. Los cultivos recogidos se clarificaron por centrifugación y los sobrenadantes se inocularon en células MDCK nuevas como se ha descrito para la inoculación inicial; se realizaron dos pases adicionales para muestras que no mostraron pruebas de virus de la gripe por hemaglutinación o RT-PCR. La actividad de hemaglutinación en los sobrenadantes clarificados se determinó usando glóbulos rojos de pavo 0,5% como se ha descrito previamente (Crawford et al., 2005). Se realizó RT-PCR como se describe posteriormente.
RT-PCR, secuenciación de nucleótidos y análisis filogenéticos
Se extrajo ARN viral de sobrenadante de MDCK usando el Kit de ARN Viral QIAamp® Mini (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN viral se transcribió de forma inversa a ADNc usando el Kit de RT-PCR QIAGEN® OneStep (QIAGEN Inc., Valencia, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizó amplificación por PCR de la región codificante de los 8 genes de virus de la gripe en el ADNc como se ha descrito previamente (Crawford et al., 2005) usando conjuntos de cebadores específicos de genes universales (las secuencias de cebadores están disponibles bajo demanda). Los amplicones de ADN resultantes se usaron como moldes para secuenciación automática en el secuenciador de ADN automático ABI PRISM® 3100 usando química de terminador de colorante de secuenciación cíclica (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se analizaron las secuencias de nucleótidos usando el Láser-gene 6 Package® (DNASTAR, Inc., Madison, WI). Las secuencias de nucleótidos para virus recuperadas de perros infectadas se compararon con las secuencias del virus en el inóculo para determinar si se había producido cualquier cambio durante la replicación en el tracto respiratorio.
EJEMPLO 12-ENFERMEDAD CLÍNICA
Los 6 perros inoculados con virus desarrollaron una fiebre transitoria (temperatura rectal 39 ºC) durante los primeros 2 días p.i., pero ninguno mostró señales respiratorias tales como tos o descarga nasal durante el periodo de observación de 6 días. Los perros inoculados con simulación permanecieron clínicamente sanos.
EJEMPLO 13-DIFUSIÓN VIRAL
Se detectó nucleoproteína de gripe A en el hisopo orofaríngeo recogido de uno de los perros inoculados con virus a las 24 horas p.i. Los hisopos orofaríngeos recogidos de un perro a las 72, 84 y 120 horas p.i. y otro perro a las 108, 120 y 132 horas p.i., eran positivos para virus por RT-PCR en tiempo real cuantitativa (Tabla 11). El número absoluto de copias de genes M de gripe por !l de extracto de hisopo aumentó con el tiempo de 3 a 6 días p.i. No se detectaron virus en los hisopos rectales.
EJEMPLO 14-EXÁMENES POST MÓRTEM
A diferencia de la infección experimental anterior usando Beagles sin patógenos específicos (Crawford et al., 2005), los perros mestizos inoculados con virus tuvieron neumonía como se demuestra por análisis globales e histológicos de los pulmones de los días 1 a 6 p.i. Además de neumonía, los perros tenían rinitis, traqueítis, bronquitis y bronqueolitis similar a la descrita en perros infectados de forma natural (Crawford et al., 2005). Hubo necrosis epitelial y erosión del revestimiento de las vías respiratorias y glándulas bronquiales con infiltración de neutrófilos y macrófagos de los tejidos submucosos (Figura 5, paneles superiores). La inmunohistoquímica detectó antígeno viral H3 en las células epiteliales de bronquios, bronquiolos y glándulas bronquiales (Figura 5, paneles inferiores). No estaba presente superinfección bacteriana. Los tejidos respiratorios de los 2 perros inoculados con simulación fueron normales.
EJEMPLO 15-REPLICACIÓN VIRAL EN TRÁQUEA Y PULMONES
La tráquea y los pulmones fueron positivos para virus por RT-PCR en tiempo real cuantitativa en todos los perros de 1 a 6 días p.i. (Tabla 12). El número absoluto de copias de genes M de gripe por !l de homogeneizado de tráquea aumentó de 1 a 5 días p.i., después se redujo el día 6. El número absoluto de copias de genes M por !l de homogeneizado de pulmón se redujo de 1 a 6 p.i. En general, la tráquea contenía un log10 más virus que el pulmón en cada uno de los 6 días p.i.
Tabla 11. Detección de difusión viral en la orofaringe de perros mestizos inoculados con virus de la gripe canina por RT-PCR en tiempo real cuantitativa.
ID de perro
Tiempo p.i. (horas)a Relación M/GAPDHb Gen de matriz (copias / l)c
860
72 1,20 1,57E+02
84
1,30 8,25E+02
120
1,23 1,47E+03
894
108 1,17 1,17E+02
120
1,41 1,37E+02
132
1,27 3,74E+02
a Tiempo en el que se recogieron hisopos orofaríngeos de los perros después de inoculación con virus A/canino/FL/43/04 (H3N8).b Se calcularon las relaciones de normalización dividiendo el M (Ct) por el GAPDH (Ct) para cada extracto de hisopo. c El número absoluto de copias de genes de matriz por !l de extracto de hisopo.
Tabla 12. Detección de replicación viral en la tráquea y pulmón de perros mestizos inoculados con virus de la gripe canina por RT-PCR en tiempo real cuantitativa.
ID de perro
Tiempo p.i. (horas)a Relación M/GAPDHb Gen de matriz (copias / l)c
Pulmón
Tráquea Pulmón Tráquea
797
24 1,20 1,43 8,22E+05 3,11E+04
801
48 1,33 0,99 1,15E+05 6,52E+06
789
72 1,44 1,12 2,39E+04 1,56E+05
819
96 1,40 1,27 3,19E+04 1,43E+05
860
120 1,59 1,04 3,48E+03 1,17E+06
894
144 1,70 1,15 4,78E+02 1,50E+03
a Tiempo en el que se recogieron los tejidos de los perros después de inoculación con virus A/canino/FL/43/04 (H3N8).b Se calcularon las relaciones de normalización dividiendo el M (Ct) por el GAPDH (Ct) para cada homogeneizado tisular c El número absoluto de copias de genes de matriz por !l de homogeneizado tisular.
Materiales y métodos ejemplares para el Ejemplo 16
5 Cepas de virus
Se propagaron cepas de virus de la gripe canina así como los de origen aviar, equino y humano (enumerados en la Tabla 15) en huevos embrionados o células MDCK y su infectividad se valoró por dilución de puntos finales en
10 embriones de pollo, o ensayo en placa. Se realizó una cuantificación rápida de virus por el ensayo de hemaglutinación usando eritrocitos de pavo.
Muestras de ensayo de diagnóstico
15 Se ensayó un total de 60 tejidos de pulmón canino recogidos de casos sospechosos de enfermedad respiratoria viral durante el año 2005 con respecto a la presencia de virus de la gripe canina.
Extracción de ARN de muestras de tejido canino
20 Se homogeneizaron bloques de tejido pulmonar que pesaban entre 20 y 30 mg en una picadora de tejido desechable (Kendal). Se extrajo ARN total usando un kit comercial (Kit RNeasy Mini, Qiagen, Valencia, CA) y se eluyó en un volumen final de 60 !l, siguiendo las recomendaciones del fabricante.
Diseño de cebadores y sondas
25 Se realizaron múltiples alineamientos de secuencia de los genes H3 y M de diversos subtipos y de diversas especies usando el programa CLUSTAL X (Versión 1.8). Se seleccionaron cebadores y sonda de matriz (M) de las regiones conservadas de las secuencias conocidas correspondientes a diferentes subtipos de virus de gripe A, mientras que el conjunto de sonda y cebadores específicos de gen de hemaglutinina H3 se seleccionaron para coincidir
30 específicamente con genes de virus de la gripe equina y canina A y no coincidir con los genes aviares y humanos homólogos (Tabla 13). Se usó un software de diseño de cebadores (OLIGOS Versión 9.1) y las herramientas de análisis basadas en la web proporcionadas por EXIQON (http://Inatools.com) para el cálculo de Tm y la predicción de la estructura secundaria así como la autohibridación. Se usó una región conservada de un gen de ARNr 18S como control interno endógeno con respecto a la presencia de ARN extraído de muestra de tejido canino. Para la
35 detección en tiempo real de ARNr 18S en muestras de tejido se usaron los Reactivos de Ensayo TaqMan® Pre
Desarrollado para ARNr 18S Eucariota (VIC/TAMRA) (Applied Biosystems).
Condición de RT-PCR en tiempo real
Se realizó una RT-PCR en tiempo real de una etapa usando el Kit de RT-PCR de Sonda Quantitect que contenía ROX como un colorante de referencia pasivo (Qiagen, Valencia, CA). En cada reacción de RT-PCR en tiempo real, se usaron 5 !l de muestra de ARN como un molde para combinar con una mezcla de reacción que contenía 10 !l de Mezcla Maestra de RT-PCR de Sonda QuantiTech 2X, 0,2 !l de Mezcla de RT QuantiTech, cebadores (concentración final 0,4 !M para el gen H3 o concentración final 0,6 !M para el gen M), sonda (concentración final 0,1 !M para el gen H3 o concentración final 0,2 !M para el gen M) y agua sin RNasa en un volumen final de 20 !l. Se realizó RT-PCR en tiempo real de una etapa en el sistema QPCR en Tiempo Real Mx3005P (Stratagene). Las condiciones de ciclación incluyeron una etapa de transcripción inversa a 50 ºC durante 30 minutos. Después de una etapa de desnaturalización inicial a 95 ºC durante 15 minutos para activar la ADN polimerasa HotStarTaq, se realizó amplificación durante 40 ciclos incluyendo desnaturalización (94 ºC durante 15 segundos) e hibridación/extensión (60 ºC durante 30 segundos). Se obtuvieron las señales fluorescentes de FAM (longitud de onda de emisión 516 nm para H3 y detección M) y VIC (longitud de onda de emisión 555 nm para detección de ARNr 18S) una vez por ciclo al final de la etapa de extensión. Las adquisiciones y análisis de datos del ensayo de PCR en tiempo real se realizaron usando el software Mx3005P versión 2.02 (Stratagene).
Especificidad de conjunto de cebadores/sonda de H3 para gripe canina (H3N8) y universalidad de conjunto de cebadores/sonda de M para virus de la gripe de tipo A
Para ensayar la especificidad de cada conjunto de cebadores/sonda, se usó ARN extraído de varios subtipos conocidos de virus de gripe A como un molde en el ensayo de RT-PCR en tiempo real (Tabla 15).
Patrón de ARN para determinación del rendimiento de RT-PCR en tiempo real
Se usaron los genes de virus de gripe canina A (A/canino/Florida/242/2003(H3N8)) para generar los amplicones de PCR para H3 (nt 1-487) y M (nt 1-276) usando cebadores unidos con promotor T7 (Tabla 13). Después se usaron los amplicones de PCR purificados de genes H3 y M como moldes para transcripción in vitro usando el Sistema de Transcripción in vitro T7 Riboprobe (Promega) siguiendo las recomendaciones del fabricante. La concentración de los ARN transcritos se calculó midiendo la absorbancia a 260 nm. Los ARN se diluyeron después en serie 10 veces variando de 108 a 10 copias/!l para realizar los ensayos de sensibilidad. Además, se generó una curva patrón representando el logaritmo de las concentraciones del molde de ARN inicial (copias/!l) frente al ciclo umbral (Ct) obtenido de cada dilución para determinar el rendimiento global de RT-PCR en tiempo real.
Ensayos de sensibilidad comparativos entre RT-PCR en tiempo real y kit de ensayo Directigen Flu A
Se usaron virus de reserva de dos cepas virales incluyendo A/Wyoming/3/2003 (H3N2) a 106,67 EID50/ml (HA=64) y A/canino/Florida/242/2003(H3N8) a 107,17 EID50/ml (HA=16) para el ensayo de umbral de detección. Se usaron diluciones logarítmicas de muestras de ensayo en solución salina tamponada con fosfato (PBS) (125 !l) en un kit de detección de antígenos de gripe A rápido, Directigen Flu A, (Becton, Dickinson and Company), siguiendo las instrucciones del fabricante. Cada dispositivo de ensayo Directigen Flu A tiene un punto de antígeno de gripe H1N1 en el centro de la membrana que se desarrolla como un punto púrpura e indica la integridad del ensayo, que se basa en un anticuerpo monoclonal para la nucleoproteína (NP). El desarrollo de un triángulo púrpura que rodea al punto es indicativo de la presencia de NP de gripe en la muestra ensayada. La intensidad de la señal púrpura del triángulo se puntuó como + (perfil de triángulo), ++ (triángulo coloreado claro), +++ (triángulo púrpura oscuro) y ++++ (triángulo púrpura muy oscuro). Se extrajo ARN viral en alícuotas de 125 !l de cada dilución de virus usando Kit de ARN Viral QIAamp Mini (Qiagen, Valencia, CA) y eluyendo en un volumen final de 50 !l. Se ensayó un volumen de 5 !l de los ARN virales extraídos por RT-PCR en tiempo real para el ensayo de sensibilidad comparativo con Kit Directigen Flu A.
EJEMPLO 16
El ensayo de RT-PCR en tiempo real para gripe canina se basa en información de tres sondas moleculares que se dirigen a ARNr 18S de célula hospedadora así como M y H3 del genoma de virus de la gripe A (Tabla 14). La amplificación del gen hospedador es un indicador de la calidad e integridad de la muestra de ensayo. Se espera que las muestras clínicas, de necropsia o de laboratorio que contienen virus de gripe canina (H3N8) produzcan señal de amplificación con las tres sondas. Las muestras de ensayo que produjeron la señal de amplificación con sondas de ARNr 18S y M pero negativas para H3 serían indicativas de un subtipo H3 de virus de la gripe de origen humano, porcino o aviar o de subtipos no H3. Estos casos poco habituales podrían resolverse por RT-PCR usando cebadores universales de HA para generar ADNc de amplicón que puede analizarse por secuenciación. Las muestras de ensayo recogidas y manipuladas de forma apropiada que carecen de virus de gripe A producen solamente señal de amplificación de ARNr 18S. Las situaciones en las que solamente la sonda de ARNr 18S y las sondas de H3 producen señal de amplificación son indicativas de una técnica defectuosa, a no ser que se pruebe otra cosa. Debe
demostrarse un falso negativo con sondas M o falso positivo para H3. Finalmente, las muestras de ensayo que no producen señales de amplificación con las tres sondas son indicativas de recogida de muestras defectuosas, degradación, extracción de ARN inadecuada o la presencia de inhibidores de las polimerasas usadas en PCR.
Para ensayar la especificidad del conjunto de sondas/cebador de H3 para virus de gripe canina A (H3N8) y la universalidad del conjunto de cebadores/sonda de M para gripe de tipo A, se ensayaron varios subtipos de virus de gripe A por RT-PCR en tiempo real. Los resultados muestran que el conjunto de cebadores/sonda de H3 produjo una señal de la amplificación positiva solamente con gripe canina (H3N8). No se observaron falsos positivos significativos o señales de amplificación no específicas en otros subtipos o cepas de H3 humana. El conjunto de cebadores/sonda de M produjo señal de amplificación positiva con todas las cepas ensayadas (Tabla 15). Estos resultados indicaron que los cebadores/sonda de H3 detectan específicamente virus de la gripe canina A (H3N8), mientras que los cebadores/sonda de M detectan múltiples subtipos de gripe de tipo A.
El rendimiento de ensayos de RT-PCR en tiempo real se evaluó por dilución de ARN transcritos in vitro de M y H3. Como se esperaba, el ciclo umbral (Ct) aumentó en relación directa con la dilución de los patrones de ARN. Las señales fluorescentes pueden detectarse en diluciones convencionales de ARN de M y H3 tan bajas como 103 y 102 copias/!l, respectivamente (Figura 6A y 6B). Las curvas patrón de genes M y H3 se construyeron representando el logaritmo de las concentraciones de ARN de partida frente al ciclo umbral (Ct) obtenido de cada dilución (Figura 6C y 6D). La pendiente de la curva patrón se usa para determinar la eficacia de reacción de PCR, que es teóricamente exponencial; 100% de eficacia de amplificación implicaría duplicación de la concentración de amplicón en cada ciclo. Las curvas patrón con una pendiente entre aproximadamente -3,1 y -3,6, son típicamente aceptables para la mayoría de las aplicaciones que requieren cuantificación precisa (eficacia de reacción 90-110%). Un valor Rc es el ajuste de todos los datos a la representación de la curva patrón. Si todos los datos quedan perfectamente en la línea, el Rc será 1,00. A medida que los datos quedan más lejos de la línea, el Rc se reduce. Un valor de Rc 0,985 es aceptable para la mayoría de los ensayos. La curva patrón de M reveló una pendiente de -3,576 (eficacia = 90,4%) y Rc = 1,00 mientras que la curva patrón de H3 produjo una pendiente de -3,423 (eficacia = 95,9%) y Rc = 0,999. Estos valores indican eficacia de amplificación satisfactoria y rendimiento global de los ensayos de RT-PCR en tiempo real. Los inventores atribuyen la menor eficacia y sensibilidad de conjunto de cebadores/sonda de M en comparación con conjunto de cebadores/sonda de H3 a la degeneración N veces de secuencias de cebador de M requeridas para asegurar amplia cobertura de variabilidad de secuencias del gen M entre virus de múltiples subtipos, hospedadores y linajes.
La sensibilidad del ensayo de RT-PCR en tiempo real también se comparó con el ensayo de detección rápida de antígenos comercial (Directigen Flu A). Se analizaron diluciones logarítmicas de A/Wyoming/3/2003 (H3N2) y A/canino/Florida/242/2003(H3N8) con Directigen Flu A y por RT-PCR en tiempo real. Los resultados de Directigen Flu A mostraron que las sensibilidades contra ambas cepas virales son una dilución de aproximadamente 100 veces de los virus de reserva usados en estos experimentos (Figura 7). Las señales (color púrpura) generadas por las muestras de virus canino (A/canino/Florida/242/2003: 106,x UFP/ml) fueron mucho más débiles que las halladas en virus humano (A/Wyoming/3/2003: 107,x UFP/ml), de acuerdo con la menor concentración de virus en estas muestras. Como alternativa, la menor señal para virus de la gripe podría atribuirse a la especificidad molecular de anticuerpos monoclonales contra la NP; es decir, escasa conservación de los aminoácidos dentro del epítopo de NP de virus de gripe canina A.
La RT-PCR en tiempo del gen de M produjo valores de Ct por encima del umbral con equivalentes a 10 y 30 UFP de virus por reacción de A/canino/Florida/242/2003 y A/Wyoming/3/2003, respectivamente (Tabla 16). Las diferencias entre el valor de sensibilidad de 2 cepas virales se debe a las diferencias en las titulaciones virales originales. La comparación de detección de genes H3 entre virus de gripe canina y humana no se realizó debido a que los cebadores/sonda de H3 en el ensayo de RT-PCR en tiempo real de los inventores amplifica exclusivamente virus de gripe canina A. La RT-PCR era 105 veces más sensible que el kit de detección rápida de antígenos.
Para evaluar el rendimiento del ensayo de RT-PCR en muestras de ensayo de necropsia de perros con enfermedad respiratoria aguda, se ensayaron sesenta muestras de tejido de pulmón canino presentadas durante el año 2005 con respecto a la presencia de virus de gripe canina A por RT-PCR en tiempo real. Un total de 12 de 60 muestras (20%) fueron positivas con ambos genes M y H3 mientras que las 48 muestras restantes produjeron resultado negativo para el gen tanto M como H3. Se realizaron intentos de aislamiento de virus por inoculación de células MDCK y huevos, para evaluar la especificidad del ensayo en tiempo real; 2 de 12 muestras que fueron positivas para gripe canina por RT-PCR produjeron virus de gripe canina (datos no mostrados, manuscrito en preparación). Aunque todos los tejidos se recogieron de perros con un historial de enfermedad respiratoria grave, la mayoría de las muestras no produjeron virus de gripe canina por PCR en tiempo real o aislamiento convencional, lo que sugiere una alta incidencia de otros patógenos respiratorios tales como Bordetella bronchiseptica, virus del moquillo canino o paragripal. El ensayo de RT-PCR en tiempo real de una etapa en este documento proporciona un enfoque rápido, sensible y rentable para detección de virus de gripe canina A (H3N8). El diagnóstico de laboratorio rápido de infecciones por virus de gripe canina A (H3N8) en la etapa temprana de la enfermedad puede producir información relevante para tratamiento clínico de paciente e instalaciones.
Tabla 13: Cebadores y sondas usados para detección de RT-PCR en tiempo real y transcripción in vitro.
Nombre de Oligo
Tipo Diana Secuencia Aplicación
Ca-H3-F387
Cebador directo H3 (nt 387406) 5’-tatgcatcgctccgatccat-3’ (SEC ID Nº: 79) PCR en tiempo real
Ca-H3-R487
Cebador inverso H3 (nt 487467) 5’-gctccacttcttccgttttga-3’(SEC ID Nº: 80)
Ca-H3-P430
Sonda TaqMan H3 (nt 430459) FAM-aattcacagcagagggattcacatggacag-BHQ1 (SEC ID Nº: 81)
FluA-M-F151
Cebador Directo M (nt 151174) 5’-catggartggctaaagacaagacc-3’ (SEC ID Nº: 82) PCR en tiempo real
FluA-M-R276
Cebador inverso M (nt 276253) 5’-agggcattttggacaaakcgtcta-3’ (SEC ID Nº: 83)
FluA-M-P218
Sonda LNA TaqMan M (nt 218235) FAM-acgcTcaccgTgcccAgt-BHQ1 (SEC ID Nº: 84)
H3-F1
Cebador directo H3 (nt 114) 5’-tattcgtctcagggagcaaaagcagggg-3’ (SEC ID Nº: 85) Transcripción In vitro
T7/H3-R490
Cebador inverso T7/H3 (nt 487-467) 5’-tgtaatacgactcactatagggctccacttcttccgttttga-3’ (SEC ID Nº: 86)
M-F1
Cebador directo M (nt 1-15) 5’-gatcgctcttcagggagcaaaagcaggtag-3’(SEC ID Nº: 87) Transcripción In vitro
T7/M-R276
Cebador inverso M (nt 276253) 5’-tgtaatacgactcactatagggcattttggacaaagcgtc-3’ (SEC ID Nº: 88)
* Nota: Mayúsculas =restos de LNA (Ácido Nucleico Bloqueado), r = a o g, k= g o t, subrayado= secuencia promotora de T7.
Tabla 14: Interpretación del ensayo de RT-PCR en tiempo real
Interpretación
Resultados
M
H3 ARNr 18S
Positivo para virus de gripe canina A (H3N8)
+ + +
Positivo para virus de gripe A (subtipo desconocido)
+ - +
Negativo para virus de gripe
- - +
Error en extracción de ARN o presencia de inhibidor de PCR
- - -
Tabla 15: Ensayo de especificidad de conjunto de cebadores/sonda de H3 canino y ensayo de universalidad de conjunto de cebadores/sonda de M con varios subtipos de virus de gripe A
Subtipos
Nombre de la Cepa Hospedador Detección de RT-PCR en tiempo real
Gen H3 (Ct)
Gen M (Ct)
H1
A/Ohio/1983 Humano Sin Ct 15,40
A/WSN/1933
Humano Sin Ct 20,09
H3
A/Wyoming/3/2003 Humano Sin Ct 28,85
A/Victoria/3/1975
Humano Sin Ct 16,62
A/canino/FL/ 242/2003
Canino 28,43 29,25
H4
Pavo/MN/ 1066/1980 Aviar Sin Ct 17,49
Muestra clínica*
Aviar Sin Ct 20,87
H5
A/Pollo/ Tailandia/CUK2/2004 Aviar Sin Ct 20,13
A/Faisán/NJ/ 1335/1998
Aviar Sin Ct 16,64
H6
Muestra clínica* Aviar Sin Ct 19,52
H10
Muestra clínica* Aviar Sin Ct 25,64
Muestra clínica*
Aviar Sin Ct 19,59
H11
Muestra clínica* Aviar Sin Ct 15,72
Muestra clínica*
Aviar Sin Ct 24,55
* Obsérvese que los subtipos de muestras clínicas se confirmaron por secuenciación de nucleótidos.
Tabla 16: Ensayos de sensibilidad comparativos para detección de virus de gripe A entre RT-PCR en tiempo real y Directigen Flu A
Diluciones de virus
Directigen Flu A RT-PCR en tiempo real de M (Ct)
A/canino/242/03
A/Wyoming/3/03 A/canino/242/03 A/Wyoming/3/2003
10-1
++ ++++ 22,42 19,48
10-1
+ +++ 25,85 22,66
10-3
- - 29,27 25,76
10-4
No realizado No realizado 32,66 28,66
10-5
No realizado No realizado 35,48 33,14
10-6
No realizado No realizado 37,51 35,06
10-7
No realizado No realizado 39,09 36,44
10-8
No realizado No realizado Sin Ct 38,93
Tabla 17
Clase de Aminoácido
Ejemplos de Aminoácidos
No polar Polar no cargadoÁcido Básico
Ala, Val, Leu, lle, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln Asp, Glu Lys, Arg, His
Tabla 18
Símbolo de Letra
Aminoácido Símbolo de Letra Aminoácido
A
Alanina M Metionina
B
Asparagina o ácido aspártico N Asparagina
C
Cisteína P Prolina
D
Ácido aspártico Q Glutamina
E
Ácido glutámico R Arginina
F
Fenilalanina S Serina
G
Glicina T Treonina
H
Histidina V Valina
I
Isoleucina W Triptófano
K
Lisina Y Tirosina
L
Leucina Z Glutamina o ácido glutámico
Tabla 19. Diferencias de aminoácidos entre proteínas PB2 de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
5
K K E
12
S L L
37
G G E
175
R R I
374
L I I
375
R R K
447
Q Q H
Tabla 20. Diferencias de aminoácidos entre proteínas PB1 de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
114
V I I
154
D G G
221
A T T
317
M I I
459
I I V
682
I I V
Tabla 21. Diferencias de aminoácidos entre proteínas PA de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
27
D N N
62
I V V
213
R K K
337
A T T
343
A E E
345
L I I
353
K R R
Tabla 21. Diferencias de aminoácidos entre proteínas PA de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
400
T T A
450
V I I
460
M M I
673
R R K
675
N D D
*Basado en genes disponibles de virus aislados entre 1963 y 1998.
Tabla 22. Diferencias de aminoácidos entre proteínas NP de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
16
G D D
157
A T T
214
R R K
285
V V I
286
A T T
359
A T T
375
D D N
384
R K K
452
R K K
Tabla 23. Diferencias de aminoácidos entre proteínas NA de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
9
A/T T A
12
S F F
20
L I I
40
G R R
42
G D D
46
N K K
52
E E K
61
R K K
69
N S S
72
E K K
201
V I I
261
I V V
301
I I V
396
N D D
397
L P P
Tabla 24. Diferencias de aminoácidos entre proteínas M1 de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
M1 161
S S A
M1 208
K/Q R R
*Basado en genes disponibles de virus aislados entre 1963 y 1998.
Tabla 25. Diferencias de aminoácidos entre proteínas NS1 de virus de gripe canina y equina H3N8
Posición
Consenso Equino * Canino/FL/03 Canino/FL/04
44
K R R
59
R H H
71
E K K
86
A T T
88
R R L
140
R G G
216
P S S
*Basado en genes disponibles de virus aislados entre 1963 y 1998.
5 EJEMPLO 17 – DESARROLLO DE MODELO DE EXPOSICIÓN A GRIPE CANINA
Se observó que el virus de gripe canina (influenza canina) que se aisló de brotes de gripe en Florida era un virus de la gripe de tipo H3N8, y cercanamente relacionado a una cepa de virus de la gripe equina, A/equino/Ohio/03
10 (Crawford et al., SCIENCE Vol. 309, septiembre de 2005, incorporado por referencia en su totalidad en la presente patente). En este estudio se investigó el potencial de usar el virus de gripe equina cepa A/equino/Ohio/03 para inducir enfermedad de tipo gripal en perros.
Procedimiento:
Se obtuvieron diez beagles de 13 semanas de edad de ambos sexos de un proveedor comercial, y se alojaron en jaulas individuales en una instalación BSL-2. Los perros se asignaron aleatoriamente a dos grupos de 5 perros cada uno. Como se muestra en la Tabla 26, se sometió a un grupo a una exposición intratraqueal, y el otro grupo se sometió a una exposición oronasal. Los perros se expusieron a las 14 semanas de edad.
Tabla 26: Diseño Experimental
Grupo
Número de Perros Vía de exposición
1
5 Intratraqueal
2
5 Oronasal
Se usó un virus de gripe equina A/equino/Ohio/03 crecido en cultivo celular como el virus de exposición. Para
10 exposición intratraqueal, el virus de exposición se administró mediante un tubo de suministro, que consistía en un tubo traqueal con manguito (Tamaño 4,0/4,5, Sheridan, Estados Unidos) y tubo de alimentación (tamaño 5 Fr, 1,7 mm, 40,64 cm de longitud, Kendall, Estados Unidos) en un volumen de 0,5 a 1,0 ml. Para exposición oronasal, el virus de exposición (107 a 108 DICT50 por perro) se administró como una nebulización usando un nebulizador (nebulizador ultrasónico DeVilbiss Ultra-Neb®99, Sunrise Medical, Estados Unidos) en un volumen de 2 a 3 ml.
15 Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición. Se recogieron muestras de suero de cada perro el día cero (antes de la exposición) y los días 7 y 14 después de la exposición para determinar la titulación de HI usando un virus de gripe equina H3N8 con un protocolo convencional (SAM 124, CVB, USDA, Ames, lA). Todos los perros se sacrificaron de forma humanitaria y se
20 recogieron tejidos pulmonares en formalina tamponada al 10% para evaluación histopatológica.
Resultados:
Los resultados de este experimento se resumen en la Tabla 27. Se observaron señales clínicas relacionadas con la
25 gripe en varios perros después de la exposición. Estas señales incluyeron fiebre (>103 ºF; >39,4º) y tos. Dos de 5 perros (es decir, 40%) tuvieron fiebres (>103 ºF; >39,4º) en el Grupo 1, en comparación con 1 de 5 (es decir, 20%) perros en el Grupo 2. Un perro del grupo de exposición oronasal tuvo estornudos, y otro tuvo tos después de la exposición. Se observó un intervalo de titulación de HI de 10 a 80, con una titulación media geométrica (GMT) de 20 para el Grupo 1. Se observó un intervalo de titulación de 40 a 160, con una GMT de 86, para el Grupo 2. Un perro de
30 cada grupo tuvo lesiones histopatológicas compatibles con o patognómicas para gripe.
Tabla 27. Exposición a gripe canina – señales clínicas, aislamiento del virus, resultados de histopatología y resultados de serología
ID dePerro*
Método deexposición* SeñalesClínicas Aislamiento de virus LesiónMicroscópica(histopatología) Serología (titulación de HI)
Hisoponasal/oral
Raspadotraqueal Tejidospulmonares Antes de laexposición 7 días despuésde la exposición 14 días despuésde la exposición
AAH
Intratraqueal ninguna negativo negativo negativo negativo 10 10 20
ADB
Intratraqueal ninguna negativo negativo negativo negativo 10 80 20
ADC
Intratraqueal Fiebre* negativo negativo negativo negativo 10 20 20
AEB
Intratraqueal Fiebre negativo negativo negativo positivo 10 40 20
AEE
Intratraqueal ninguna negativo negativo negativo inconcluyente 10 20 10
AAE
Oronasal ninguna negativo negativo negativo negativo 10 80 80
AAG
Oronasal ninguna negativo negativo negativo negativo 10 40 80
ABY
Oronasal Estornudoocasional, tosocasional negativo negativo negativo positivo 10 80 160
ADY
Oronasal Fiebre,estornudoocasional negativo negativo negativo negativo 10 80 80
ADZ
Oronasal ninguna negativo negativo negativo negativo 10 80 160
* Los animales se expusieron a un aislado de gripe equina Ohio 03.** Temperatura rectal 103 ºF; 39,4º
EJEMPLO 18 – EFICACIA DE UNA VACUNA DE VIRUS DE GRIPE EQUINA PARA PERROS
Se observó que el virus de gripe canina (influenza canina) de brotes de gripe en Florida era un virus de la gripe de tipo H3N8, y estaba cercanamente relacionado con el virus de la gripe equina, A/equino/Ohio/03 basándose en la similitud de la secuencia. El siguiente estudio se realizó para determinar la eficacia de una vacuna de virus de gripe equina inactivado experimental.
Procedimiento:
Se obtuvieron nueve beagles de 7 semanas de edad de ambos sexos de un proveedor comercial, y se alojaron en jaulas individuales en una instalación BSL-2. Estos perros se asignaron aleatoriamente a dos grupos, como se resume en la Tabla 28:
Tabla 28: Diseño Experimental
Grupo
Número de Perros Tratamiento
1
5 Vacuna
2
4 Control
15 El primer grupo consistía en 5 perros, que se vacunaron con una vacuna de virus de gripe equina A/equino/Ohio/03 con adyuvante CARBIGEN™ a las 8 y 12 semanas de edad por vía subcutánea (SQ). El A/equino/Ohio/03 se inactivó por etilenimina binaria (“BEI”) usando un método convencional. Cada dosis de la vacuna contenía CARBIGEN™ 5% en masa, 4096 unidades de HA del virus inactivado, suficiente PBS para llevar al volumen total de la dosis a 1 ml, y suficiente NaOH para ajustar el pH a un valor comprendido entre 7,2 y 7,4. Se recogieron muestras de suero de todos los perros el día de la primera y segunda vacunación y día 7 y 14, después de la primera y segunda vacunación y antes de la exposición para determinar la titulación de HI usando un protocolo convencional de virus de gripe equina H3N8 (SAM 124, CVB, USDA, Ames, lA). A las 3 semanas después de la segunda vacunación, los 5 perros vacunados y el segundo grupo (es decir, el grupo de control) que consistía en 4 perros de edad coincidente se expusieron por vía oronasal a un virus de gripe equina A/equino/Ohio/03 desarrollado en cultivo celular (107 a 108
25 DICT50 por perro) en un volumen de 1-2 ml por dosis. El virus de exposición se administró a los perros como una nebulización usando un nebulizador (nebulizador ultrasónico DeVilbiss Ultra-Neb®99, Sunrise, Medical, Estados Unidos). Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición. Se sacrificaron de forma humanitaria cinco perros (3 vacunados y 2 controles) 7 días después de la exposición y 4 perros (2 controles y 2 vacunados) 14 días después de la exposición para la recogida de tejidos pulmonares en formalina tamponada al 10% para la evaluación histopatológica.
Resultados:
Los resultados de este experimento se resumen en las Tablas 29 y 30. Todos los perros vacunados se
35 seroconvirtieron después de la vacunación. Se observó un intervalo de titulación de HI de 40 a 640, con la GMT de 129, durante el periodo posterior a la vacunación con virus de gripe equina A/equino/Ohio/03 y se observó una titulación de HI de 160 a 320, con una titulación media geométrica de 211 con aislado de gripe canina, A/canino/Florida/242/03. Dos de 6 vacunados tuvieron una fiebre de >39,4 ºC (>103 ºF) durante un día y no se observaron otras señales clínicas en ninguno de los perros después de la exposición.
Conclusión:
Todos los perros vacunados respondieron a la vacuna de gripe equina con adyuvante CARBIGEN™ inactivada. Los resultados de titulación de HI con un aislado de virus de la gripe canina sugieren que la vacuna de gripe equina
45 inactivada indujo un nivel detectable de anticuerpo con reacción cruzada para virus de gripe canina. Incluso aunque el virus de exposición usado para esto no indujo ninguna enfermedad clínica observable en perros beagles, basándose en la titulación de HI con un aislado de virus de gripe canina, se concluyó que podría usarse la vacuna equina inactivada en perros para inducir anticuerpos de reacción cruzada, que podrían potencialmente proteger a los perros contra la enfermedad “gripe canina” causada por virus de gripe canina de tipo H3N8.
Tabla 29. Serología – Titulaciones de HI antes y después de la vacunación y después de exposición
Perro*
Grupo Titulaciones de HI
Prevacunación
Después de la 1ª vacunación Después de la 2ª vacunación Después de exposición*
7-d
14-d 7-d 14-d 21-d 7-d 14-d
AKT
Vacunado** <10 40 80 640 640 640 320 320
ALH
Vacunado** <10 40 80 320 160 160 80 ***
ALU
Vacunado** <10 40 80 320 160 160 80 80
ANJ
Vacunado** <10 40 80 320 160 80 320 ***
ANU
Vacunado** <10 40 80 320 160 80 160 ***
AJW
Control <10 <10 <10 <10 <10 < 10 10 ***
Tabla 29. Serología – Titulaciones de HI antes y después de la vacunación y después de exposición
Perro*
Grupo Titulaciones de HI
Prevacunación
Después de la 1ª vacunación Después de la 2ª vacunación Después de exposición*
7-d
14-d 7-d 14-d 21-d 7-d 14-d
AKR
Control <10 <10 <10 <10 <10 < 10 10 ***
ALZ
Control <10 <10 <10 <10 <10 < 10 20 20
ARC
Control <10 <10 <10 <10 <10 < 10 10 10
* Los animales se expusieron a un aislado de gripe equina Ohio 03 ** Se usó vacuna de virus de gripe equina inactivado con adyuvante CARBIGEN™ Ohio 03 para la vacunación *** Sacrificado 7 días después de la exposición.
Tabla 30. Exposición a gripe canina* -señales clínicas, aislamiento de virus, resultados de histopatología
ID de Perro*
Grupo de tratamiento Señales Clínicas Aislamiento de virus Lesión Microscópica (histopatología)
Hisopo nasal
Raspado traqueal Tejidos pulmonares
AKT
Vacunado** ninguna negativo negativo negativo negativo
ALH
Vacunado** ninguna negativo negativo negativo negativo
ALU
Vacunado** ninguna negativo negativo negativo negativo
ANJ
Vacunado** ninguna negativo negativo negativo negativo
ANU
Vacunado** ninguna negativo negativo negativo negativo
AJW
Control ninguna negativo negativo negativo negativo
AKR
Control ninguna negativo negativo negativo negativo
ALZ
Control ninguna negativo negativo negativo negativo
ARC
Control ninguna negativo negativo negativo negativo
* Los animales se expusieron a un aislado de gripe equina Ohio 03 ** Se usó vacuna de virus de gripe equina Ohio 03 inactivado con adyuvante CARBIGEN™ para la vacunación
EJEMPLO 19 – EFICACIA DE UNA VACUNA DE VIRUS DE GRIPE EQUINA PARA PERROS
5 El virus de gripe equina aislado de brotes de gripe en Florida se caracterizó como cercanamente relacionado con varios aislados de virus de gripe equina de tipo H3N8. Mediante análisis de similitud de secuencia de aminoácidos y ADN se demostró que el virus de gripe canina es muy similar a un virus de gripe equina, A/equino/Ohio/03. El siguiente estudio se realizó en perros para determinar la eficacia de vacunas de gripe equina disponibles en el mercado en perros.
10 Procedimiento:
Se usaron 20 mestizos y 20 beagles de aproximadamente 16 meses de edad de ambos sexos en el estudio. Los perros se asignaron aleatoriamente a 6 grupos (Tabla 31) de 6-7 perros cada uno. Los perros en los grupos 1 y 4 se 15 vacunaron con una vacuna de gripe equina con adyuvante inactivada disponible en el mercado (EQUICINE II™, Intervet Inc., Millsboro, DE) a los 16 y 17 meses de edad por vía subcutánea (SQ). Los perros de los grupos 2 y 5 se vacunaron con una vacuna de gripe equino/Kentucky/91 viva modificada en un volumen de 1 ml por vía intranasal (un orificio nasal). Se recogieron muestras sanguíneas el día de la vacunación, día 7 y 14 después de la primera vacunación (grupos 1, 2, 4 y 5) y después de la segunda vacunación (grupos 1 y 4) para determinar la titulación de
20 HI usando un virus de gripe equina H3N8 y un virus de gripe canina usando un protocolo convencional (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA).
Los vacunados (a los 72 días después de la vacunación final) y los controles se expusieron por vía oronasal a una cepa de virus de gripe equina A/equino/Ohio/03 desarrollada en cultivo celular (107 a 108 DICT50 por perro) en un 25 volumen de 1-2 ml. El virus de exposición se administró a los perros como una nebulización usando un nebulizador (nebulizador ultrasónico DeVilbiss Ultra-Neb®99, Sunrise Medical, Estados Unidos). Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con la gripe durante 12 días después de la exposición. Los hisopos nasales y orofaríngeos se recogieron en medio MEM de Earl con antibióticos (neomicina y polimixina B) diariamente del día 1 al día 12 después de la exposición para el aislamiento de virus. La presencia de virus en los hisopos indica que el
30 animal excreta el virus en secreciones nasales/orales. Todos los perros se sacrificaron de forma humanitaria el día 12 después de la exposición y se recogieron tejidos pulmonares en formalina tamponada al 10% para la evaluación histopatológica.
Tabla 31. Diseño experimental.
Grupo
Número de perros Raza Tratamiento Número de dosis Vía de vacunación
1
7 Beagle EQUICINE II™ ** 2 Subcutánea
2
7 Beagle A/KY/91*** 1 Intranasal
3
6 Beagle Control N/A* N/A*
4
7 Mestiza EQUICINE II™ 2 Subcutánea
5
7 Mestiza A/KY/91 1 Intranasal
6
6
Mestiza Control N/A* N/A*
* No aplicable ** EQUICINE II™ se comercializa por Intervet Inc. como una vacuna líquida. EQUICINE II™ contiene virus de la gripe A/Pensilvania/63 inactivado (o “A/Pa/63”) y virus de gripe A/equino/Kentucky/93 (o “A/KY/93”) con carbopol (es decir, HALOGEN® (Intervet Inc.)). Más específicamente, una dosis de EQUICINE II™ contiene: A/Pa/63 inactivado a 106,0 EID50, A/KY/93 inactivado a 106,7 EID50, carbopol 0,25% en volumen y suficiente PBS para crear un volumen total de 1 ml. ** A/KY/91 es una vacuna liofilizada que se reconstituyó con agua. Dicha reconstitución se realizó usando agua de uso en vacunas suficiente para llevar la dosificación de vacuna a un volumen total de 1 ml. La vacuna contenía virus de gripe equino/Kentucky/91 o (“A/KY/91”), y se analiza en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 6.436.408; 6.398.774; y 6.177.082, que se incorporan por referencia en su totalidad en la presente patente. Cuando se reconstituye, una dosis de la vacuna contenía A/KY/91 a107,2 DICT50 por ml, 0,015 gramos de N-Z AMINE AS™ por ml, 0,0025 gramos de gelatina por ml y 0,04 gramos de D lactosa por ml. N-Z AMINE AS™ es una fuente refinada de aminoácidos y péptidos producidos por hidrólisis enzimática de caseína. N-Z AMINE AS™ se comercializa por Kerry Bio-Science (Norwich, NY, Estados Unidos).
Resultados:
5 Todos los perros vacunados se seroconvirtieron después de la vacunación y las titulaciones de HI variaron de 10 a 80 para perros del grupo de vacuna EQUICINE II™ en comparación con 10 a 40 para los perros del grupo de vacuna A/KY/91 usando un virus de gripe equina (tipo H3N8).
Las muestras recogidas a las 2 semanas después de la vacunación (después de la segunda vacunación para
10 vacuna EQUICINE II™) se analizaron para la determinación de la titulación de HI con una gripe canina así como con un virus de gripe equina (tipo H3N8). Los resultados de HI se muestran en la Tabla 32. Las señales clínicas incluyen fiebre (>103 ºF, >39,4 ºC), tos ocasional y descarga nasal leve observada después de la exposición.
Tabla 32. Serología – Titulaciones de HI a las 2 semanas después de la vacunación
Grupo
Número de perros Raza Tratamiento Titulación de HI con
Virus de gripe equina
Virus de gripe canina
Intervalo
GMT Intervalo GMT
1
7 Beagle Equicine II™ 10-80 36 10-80 33
2
7 Beagle A/KY/91 10-20 12 20-160 54
3
6 Beagle Control N/A* N/A* N/A* N/A*
4
7 Mestiza Equicine II™ 40-80 54 40-80 50
5
7 Mestiza A/KY/91 10-40 24 40-80 49
6
6
Mestiza Control N/A* N/A* N/A* N/A*
* No aplicable
15 Entre los beagles, 2 de 6 perros en el grupo de vacuna EQUICINE II™ (Grupo 1), 1 de 7 perros en el grupo de vacuna A/KY/91 (Grupo 2) y 2 de 6 perros en el grupo de control (Grupo 3) tuvieron fiebre. Uno de 6 perros en el Grupo 3 (control) fue positivo para virus en el sobrenadante de cultivo celular de material de hisopo nasal por ensayo de hemaglutinación con glóbulos rojos de pollo 0,25% (CRBC). Uno de 6 perros en el grupo de control (Grupo 3) y 1 de 7 perros en el grupo de vacuna A/KY/91 (Grupo 2) tuvo descarga nasal leve durante el periodo de observación
20 posterior a la exposición. No hubo diferencias estadísticamente significativas (P > 0,05) entre grupos de control y vacuna para perros beagles.
Entre los mestizos, 5 de 7 perros en el grupo de vacuna EQUICINE II™ (Grupo 4), 1 de 7 perros en el grupo de vacuna A/KY/91 (Grupo 5) y 5 de 6 perros en el grupo de control (Grupo 6) tuvieron fiebre. Un perro de cada uno del
25 Grupo 4 y 6 tuvo una descarga nasal leve, y un perro del Grupo 5 tuvo una tos ocasional. Dos de 7 perros en el grupo de vacuna EQUICINE II™ (Grupo 4) y 3 de 6 perros en el grupo de control (Grupo 6) fueron positivos para virus de la gripe en el hisopo nasal por ensayo de HA. Ninguno de los perros del grupo A/KY/91 (Grupo 5) fue positivo para virus de la gripe en los materiales de hisopo nasal.
Conclusión:
Por serología, se demostró que la vacunación de perros con vacunas de gripe equina disponibles en el mercado estimuló una respuesta de anticuerpos contra la gripe de nivel moderado. Puede haber algunas diferencias entre
5 razas en el desarrollo de señales clínicas relacionadas con gripe en perros después de una exposición a virus de la gripe de tipo H3N8. La vacuna de gripe equina atenuada viva (A/KY/91) proporcionó una protección significativa (P<0,05) de desarrollo de enfermedad clínica en temperatura rectal en mestizos. Además, la vacuna viral atenuada viva evitó la supresión de virus de la gripe en las secreciones nasales.
EJEMPLO 20 – DESARROLLO DE MODELO DE EXPOSICIÓN A GRIPE CANINA
En vista de los informes de que la inducción de enfermedad en cánidos para fines de estudio no ha demostrado ser satisfactoria, se investigó el potencial para usar un virus de LA gripe canina, H3N8, para desarrollar un modelo de exposición a gripe canina en perros en el siguiente estudio.
15 Procedimiento:
Se obtuvieron diez mestizos de ambos sexos de un proveedor comercial, y se alojaron en jaulas en una instalación BSL-2. Los perros se asignaron aleatoriamente a dos grupos de 5 perros cada uno. Como se muestra en la Tabla 33, un grupo se sometió a una exposición intratraqueal/intranasal y el otro grupo se sometió.
Tabla 33: Diseño Experimental
Grupo
Número de Perros Vía de exposición
1
5 Intratraqueal/Intranasal
2
5 Oronasal
Los perros se expusieron aproximadamente a las 12 semanas de edad. Se usó virus de gripe canina (A/canino/Florida/242/03) desarrollado en huevo de pollo embrionado como virus de exposición. Cada perro recibió
25 un total de aproximadamente 107,2 DICT50 de virus en un volumen de 2 ml (para vía oronasal) o 4 ml (vía intratraqueal/intranasal).
Para la exposición intratraqueal/intranasal, en primer lugar se administraron 3 ml del virus de exposición a la tráquea, seguidos de 5 ml de PBS usando un tubo de suministro, que consistía en un tubo traqueal con manguito (Tamaño 4,5/5,0, Sheridan, Estados Unidos) y un tubo de alimentación (tamaño 5 Fr, 1,7 mm; 41 cm (16 pulgadas) de longitud, Kendall, Estados Unidos) y se administró 1 ml de virus de exposición, seguido de 3 ml de aire atmosférico en los orificios nasales usando una jeringa.
Para exposición oronasal, el virus de exposición se administró como una nebulización usando un nebulizador
35 (Nebulair™, DVM Pharmaceuticals, Inc., Miami, FL) en un volumen de aproximadamente 2 ml. Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con la gripe durante 14 días después de la exposición. Los perros se sacrificaron el día 14 después de la exposición y se recogieron muestras tisulares (pulmón y tráquea) en formalina tamponada al 10% para el examen histopatológico.
Resultados:
Todos los perros en los grupos 1 y 2 desarrollaron señales clínicas de gripe canina en un periodo de 24 a 48 horas. Cada perro tuvo 2 o más de las siguientes señales: fiebre (>103,0 ºF; >39,4 ºC), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso, náuseas,
45 hemoptisis y estertores audibles. Los tejidos pulmonares de 5 de 5 perros del grupo 1 y 4 de 5 perros del grupo 2 tuvieron lesiones histopatológicas que incluían uno o más de los siguientes: bronconeumonía supurante difusa, bronquitis/bronquiolitis con tapones de exudado neutrófilo en los lúmenes y agregación de células mononucleares notable en mucosa y tejido peribronquiolar, exudado mixto dentro de alvéolos con grandes números de macrófagos espumosos, infiltración linfocítica y plasmacítica, así como de células granulocíticas y engrosamiento de septos alveolares con proliferación de neumocitos de tipo II compatibles con o patognómicos para una infección de virus de la gripe. Las muestras del tejido de la tráquea fueron normales.
Conclusión:
55 Puede usarse un aislado de gripe canina H3N8 tal como el usado en el presente estudio para inducir enfermedad de gripe canina en perros usando uno de los métodos descritos en el presente estudio o un método similar.
EJEMPLO 21 – DESARROLLO DE MODELO DE EXPOSICIÓN A GRIPE CANINA
En el siguiente estudio se investigó adicionalmente el potencial para usar un virus de gripe canina, H3N8, para desarrollar un modelo de exposición a gripe canina en perros.
Procedimiento:
Se obtuvieron quince mestizos de 17 a 18 semanas de edad y cinco beagles de 15 semanas de edad de proveedores comerciales, y se alojaron en jaulas en una instalación BSL-2. Los mestizos se asignaron de forma aleatoria a 3 grupos (Grupos 1 a 3) de 5 perros cada uno. Todos los beagles se asignaron a un grupo (Grupo 4) como se muestra en la Tabla 34.
Tabla 34. Diseño Experimental
Grupo
Raza Número de Perros Dosis de virus de exposición
1
Mestizos 5 106,8 DICT50
2
Mestizos 5 105,8 DICT50
3
Mestizos 5 104,8 DICT50
4
Beagles 5 106,8 DICT50
Los perros se expusieron por vía oronasal a un virus de gripe canina virulento, A/Canino/Florida/242/2003 (aislado
10 de pulmón de un galgo con enfermedad de gripe canina (proporcionado por la Dr. Cynda Crawford en la Universidad de Florida)). El virus de exposición se administró como una nebulización usando un nebulizador (Nebulair™) en un volumen de aproximadamente 2 ml. Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición.
15 Resultados:
El ochenta por ciento (4 de 5) de los perros en los Grupos 1 y 4, 100% de los perros en los Grupos 2 y 3, desarrollaron señales clínicas de gripe canina en un periodo de 48 horas. Cada perro tuvo una o más de las siguientes señales clínicas: fiebre (>103,0 ºF; >39,4 ºC), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga
20 nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso, náuseas y estertores. Las señales clínicas observadas en beagles fueron generalmente más leves y de ciclo corto en comparación con los mestizos.
Conclusión:
25 Puede usarse un aislado de gripe canina H3N8 tal como el usado en el presente estudio para inducir enfermedad de tipo gripe canina o de tipo tos de las perreras en perros usando el método descrito en el presente estudio o un método similar con un intervalo de dosis de exposición de 104,8 a 106,8 DICT50. Hubo algunas diferencias en las señales clínicas observadas en mestizos y beagles. En general, los beagles tienden a tener señales clínicas relacionadas con gripe más leves en comparación con mestizos.
30 EJEMPLO 22 – ESTUDIO DE EFICACIA DE VACUNA DE GRIPE CANINA
El siguiente estudio se realizó para evaluar la eficacia de una vacuna de gripe equina H3N8 en perros frente a virus de gripe canina. 35 Procedimiento:
Se obtuvieron diecisiete mestizos de 14 semanas de edad y diez beagles de 8 semanas de edad de proveedores comerciales. Los perros se asignaron aleatoriamente a 5 grupos como se muestra en la Tabla 35 y se alojaron en
40 una instalación de investigación.
Tabla 35. Diseño experimental
Grupo
Edad Número de perros Tratamiento Número de dosis Edad de vacunación (semanas)
1
14 semanas 7 Vacunado 2 14 y 18
2
14 semanas 5 Vacunado 1 18
3
14 semanas 5 Control - -
4
8 semanas 5 Vacunado 2 8 y 12
5
8 semanas 5 Control - --
La vacuna usada en el presente estudio fue una vacuna de virus de gripe equina (A/equino/KY/02) inactivado con adyuvante HAVLOGEN®. Para preparar esta vacuna, el virus se inactivó por etilenimina binaria (BEI) usando un
45 método convencional. Cada dosis de vacuna contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 6144 unidades de HA del virus inactivado, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1% (v/v) de rojo de fenol, suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a 7,2 y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml.
Los perros en los Grupos 1 y 4 se vacunaron con 2 dosis de la vacuna. La segunda dosis (es decir, el refuerzo) se
50 administró 4 semanas después de la primera. Los perros en el Grupo 2 se vacunaron con 1 dosis a las 18 semanas de edad. Se recogieron muestras de sangre para evaluar la titulación de HI usando un protocolo convencional (por ejemplo, SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA) con un aislado de gripe canina H3N8 los días cero (antes de la
vacunación), 7 y 14 después de la primera y segunda vacunaciones. Aproximadamente 5 días antes de la exposición, los perros se mudaron a una instalación BSL-2 y se alojaron en jaulas individuales.
Todos los perros vacunados y de control de edad coincidente se expusieron por vía oronasal a un virus de gripe canina virulento (107,7 DICT50 de A/Canino/Florida/242/2003 por perro) a las 2 semanas después de la segunda vacunación de los Grupos 1 y 4 y la primera vacunación del Grupo 2. El virus de exposición se administró como una nebulización usando un nebulizador (Nebulair™) a 2 ml por perro. Los perros se observaron con respecto a las señales clínicas relacionadas con gripe durante 17 días después de la exposición. Se recogieron hisopos nasales y orofaríngeos en tubos que contenían 2 ml de medio de transporte de virus para aislamiento de virus desde el día -1 (es decir, un día antes de la exposición) a 17 días después de la exposición. Todos los perros se sacrificaron el día 17 después de la exposición y se recogieron muestras de pulmón y traqueales en formalina tamponada al 10% para histopatología. Se recogieron muestras sanguíneas los días 7 y 14 después de la exposición para determinación de titulación de HI. Las asignaciones de puntuación de señales clínicas usadas para la observación posterior a exposición se muestran en la Tabla 36.
Resultados:
Todos los perros en los grupos de vacunación de 2 dosis (Grupo 1 y 4) desarrollaron respuestas de titulación de anticuerpo de HI al aislado de virus de gripe canina (Tabla 37). Después de la exposición, un aumento de aproximadamente 4 veces en la titulación el día 14 después de la exposición en todos los grupos indicó indirectamente en todos los grupos que todos los perros se habían expuesto al virus de exposición. Todos los perros mostraron una o más de las siguientes señales de gripe canina: fiebre (>103,0 ºF; >39,4 ºC), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso y disnea. Las vacunas tuvieron señales clínicas menos graves, en comparación con controles de edad coincidente (Tabla 38). Hubo una reducción significativa de las señales clínicas debido a la vacunación de 2 dosis en perros tanto de 8 semanas de edad (P = 0,040) como de 14 semanas de edad (P = 0,003) (Grupos 4 y 1 respectivamente). En este experimento, la vacunación de una dosis no proporcionó una reducción significativa (P = 0,294) en señales clínicas (Grupo 2).
Se muestran resultados de aislamiento de virus en la Tabla 39. Entre los perros de 14 semanas de edad, se aisló virus de gripe canina de muestras de hisopo recogidas de 2 de 7 perros (29%) del grupo de vacuna de 2 dosis (Grupo 1), 3 de 5 perros (60%) del grupo de vacuna de 1 dosis (Grupo 2) y 5 de 5 perros (100%) del grupo de control (Grupo 3). Entre perros de 8 semanas de edad, el virus se aisló de 1 de 5 perros (20%) del grupo de vacuna de 2 dosis (Grupo 4) y 4 de 5 perros (80%) del grupo de control (Grupo 5). Hubo una reducción significativa (P = 0,003) en el número de perros positivos para virus de gripe canina en muestras de hisopo debida a la vacunación de 2 dosis (Grupos 1 y 4) en comparación con los controles no vacunados (Grupos 3 y 5). Aunque hubo una reducción en el número de perros (60% frente a 100%) positivos para virus de gripe canina en muestras de hisopo entre el grupo de vacuna de 1 dosis (Grupo 2) y el grupo de control (Grupo 3), la diferencia no fue estadísticamente significativa (P = 0,222).
Se realizó una evaluación histopatológica de muestras tisulares de pulmón y traqueales con respecto a lesiones para identificar lesiones compatibles con o patognómicas para la enfermedad de gripe canina. Esto incluye, por ejemplo, determinación de si existen uno o más de los siguientes: áreas con bronconeumonía supurante; peribronquitis/peribronquiolitis con agregación de células mononucleares (linfocitos, células plasmáticas); presencia de tapones de residuos celulares granulocíticos en los lúmenes; hiperplasia de epitelio respiratorio; exudado mixto en los alvéolos con gran cantidad de células granulocíticas y residuos celulares; agregados de macrófagos (espumosos), células plasmáticas y linfocitos; y engrosamiento de septos alveolares con proliferación de neumocitos de tipo II.
La Tabla 40 proporciona un resumen del alcance de las lesiones en este experimento para los perros. Entre perros de 14 semanas de edad, las lesiones pulmonares fueron menos extensas y menos graves en 5 de 7 perros en el grupo de vacunación de 2 dosis (grupo 2) y 4 de 5 perros en el grupo de vacunación de una dosis (grupo 1). Todos los perros de control (grupo 3) tuvieron lesiones graves y extensas que sugieren ausencia de protección. No hubo diferencia en las lesiones traqueales debido a vacunación de 1 o 2 dosis entre perros de 14 semanas de edad. Entre perros de 8 semanas de edad, no hubo diferencia en lesiones pulmonares entre perros vacunados con 2 dosis y de control. Ninguno de los perros tuvo ninguna lesión traqueal.
Conclusión:
Los resultados de este estudio demuestran que: (1) el virus de gripe equina H3N8 inactivado puede inducir respuestas de anticuerpo HI reactivo de forma cruzada con virus de gripe canina en perros vacunados, (2) el uso de una vacuna de virus de gripe equina H3N8 puede reducir la gravedad de la enfermedad por virus de gripe canina en perros y (3) el uso de un vacuna de virus de gripe equina H3N8 puede reducir la excreción de virus en secreciones nasales y/u orales.
Tabla 36. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Temperatura
<103,0 °F(<39,4 °C)
0
103,0-103,9 °F (39,4-39,94 ºC)
2
104,0-104,9 °F(40,0-40,5 °C)
3
>105,0 °F(>40,6 °C)
4
Tos
Sin tos
0
Ocasional
2
Paroxístico
4
Estornudos
Sin estornudos
0
Ocasional
1
Paroxístico
2
Descarga nasal
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Descarga ocular
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Hemoptisis
No
0
Sí
5
Depresión
No
0
Sí
1
Anorexia
No
0
Sí
1
Señales respiratorias
Ninguna
0
Estertores
3
Disnea
4
Jadeo
5
Expectorado mucoso
No
0
Sí
2
Vómitos
No
0
Sí
1
Anomalías fecales
No
0
Sí
1
Tabla 37. Serología – Titulaciones de Inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Edad (semanas) Tratamiento Número de dosis Titulación de HI
Días después de la primera vacunación de los grupos 1 y 4
Días después de exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
1
921 14 Vacunado 2 <10 <10 10 20 40 20 160 320
1
926 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 40 40 80 80 > 640
1
931 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 10 20 20 80 >640
1
955 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 10 40 40 160 320
Tabla 37. Serología – Titulaciones de Inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Edad (semanas) Tratamiento Número de dosis Titulación de HI
Días después de la primera vacunación de los grupos 1 y 4
Días después de exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
1
011 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 10 20 40 160 320
1
013 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 20 40 40 160 320
1
019 14 Vacunado 2 <10 <10 <10 10 20 40 80 >640
2
922 14 Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 <10 >640 >640
2
953 14 Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 <10 320 >40
2
015 14 Vacunado 1 <10 <10 <10 < 10 <10 <10 320 >640
2
016 14 Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 <10 160 320
2
017 14 Vacunado 1 <10 <10 <10 < 10 <10 <10 320 >640
3
923 14 Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 160
3
012 14 Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 40 320
3
014 14 Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 160
3
018 14 Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 40 160
3
01A 14 Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 160
4
406 8 Vacunado 2 <10 <10 10 40 80 80 160 > 640
4
407 8 Vacunado 2 <10 20 20 40 40 40 320 >640
4
504 8 Vacunado 2 <10 <10 10 20 20 80 160 >640
4
704 8 Vacunado 2 <10 <10 10 40 80 160 160 > 640
4
705 8 Vacunado 2 <10 <10 <10 40 80 160 160 > 640
5
404 8 Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
5
405 8 Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 80 80
5
610 8 Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 20 40
5
702 8 Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
5
703 8 Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 40 160
*Primera vacunación -Grupos 1 y 4 ** Segunda vacunación -Grupos 1 y 4; Primera vacunación -Grupo 2 ***Día de exposición
Tabla 38. Análisis de puntuaciones clínicas de enfermedad de gripe canina total
Grupo
Tratamiento Número de dosis de vacuna Edad en la primera vacunación de los grupos 1 y 4 Puntuación media total por perro P-valor*
1
Vacunado 2 14 semanas 8,7 0,003 (Grupo 1 frente a 3)
2
Vacunado 1 14 semanas (estos perros se vacunaron una vez, cuando tenían 18 semanas de edad) 21,8 0,294 (Grupo 2 frente a 3)
3
Control 14 semanas (estos perros no estaban vacunados) 25,4
4
Vacunado 2 8 semanas 2,0 0,040 (Grupo 4 frente a 5)
5
Control 8 semanas (estos perros no estaban vacunados) 5,4
*Analizado usando un procedimiento NPARIWAY de SAS® Versión 8.2 (los grupos de vacuna se compararon usando el ensayo de suma de rangos Wilcoxon)
Tabla 39. Difusión viral
NºGrupo
ID deperro Edad(semanas) Tratamiento Númerode dosisdevacuna Días después de la exposición
-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
1
921 14 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
1
926 14 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
1
931 14 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
1
955 14 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
1
011 14 Vacunado 2 N N P N N P N N N N N N N N N N N N N
1
013 14 Vacunado 2 N N N N N P N N N N N N N N N N N N N
1
019 14 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
2
922 14 Vacunado N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
2
953 14 Vacunado N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
2
015 14 Vacunado N N N P N P P N N N N N N N N N N N N
2
016 14 Vacunado N N N P N P P N N N N N N N N N N N N
2
017 14 Vacunado N N N N P P N N N N N N N N N N N N N
3
923 14 Control N/A N N N N N N P N N N N N N N N N N N N
3
012 14 Control N/A N N N P N P N N N N N N N N N N N N N
3
014 14 Control N/A N N P N N P P N N N N N N N N N N N N
3
018 14 Control N/A N N N P P P N N N N N N N N N N N N N
3
01A 14 Control N/A N N N P P P P N N N N N N N N N N N N
4
406 8 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
4
407 8 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
4
504 8 Vacunado 2 N N N P N N N N N N N N N N N N N N N
4
704 8 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
4
705 8 Vacunado 2 N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
Tabla 39. Difusión viral
NºGrupo
ID deperro Edad(semanas) Tratamiento Númerode dosisdevacuna Días después de la exposición
-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
5
404 8 Control N/A N N P P N N P N N N N N N N N N N N N
5
405 8 Control N/A N N N P N N P N N N N N N N N N N N N
5
610 8 Control N/A N N N N N N N N N N N N N N N N N N N
5
702 8 Control N/A N N N P N N N N N N N N N N N N N N N
5
703 8 Control N/A N N N N N N P N N N N N N N N N N N N
Tabla 40. Evaluación histopatológica de muestras tisulares
Nº Grupo
ID de perro Edad (semanas) Tratamiento Número de dosis Lesión Microscópica (Histopatología)
Pulmones
Tráquea
1
921 14 Vacunado 2 +/ -
1
926 14 Vacunado 2 - +/
1
931 14 Vacunado 2 - -
1
955 14 Vacunado 2 +/ -
1
011 14 Vacunado 2 +/ -
1
013 14 Vacunado 2 +/ +/
1
019 14 Vacunado 2 +/ +/
2
922 14 Vacunado 1 +/ -
2
953 14 Vacunado 1 +/ +/
2
015 14 Vacunado 1 +/ +
2
016 14 Vacunado 1 - -
2
017 14 Vacunado 1 +/ +/
3
923 14 Control N/A + +/
3
012 14 Control N/A + -
3
014 14 Control N/A + -
3
018 14 Control N/A + -
3
01A 14 Control N/A + +/
4
406 8 Vacunado 2 +/ -
4
407 8 Vacunado 2 - -
4
504 8 Vacunado 2 +/ -
4
704 8 Vacunado 2 - -
4
705 8 Vacunado 2 - -
5
404 8 Control N/A - -
5
405 8 Control N/A - -
5
610 8 Control N/A +/ -
5
702 8 Control N/A +/ -
5
703 8 Control N/A - -
“+” Lesión grave coherente o patognómica para una infección de gripe “+/-” Lesión suave (no concluyente) “-” Normal
EJEMPLO 23 – ESTUDIO DE EFICACIA DE VACUNA DE GRIPE CANINA Se realizó el siguiente estudio para determinar la eficacia de una vacuna de gripe equina H3N8 multivalente contra
5 virus de gripe canina en perros. Procedimiento: Se obtuvieron diecisiete beagles de 15 semanas de edad de un proveedor comercial. Los perros se asignaron
10 aleatoriamente a 3 grupos como se muestra en la tabla 41, y se alojaron en una instalación de investigación.
Tabla 41. Diseño experimental
Grupo
Número de perros Tratamiento Número de dosis Edad en la vacunación (semanas)
1
7 Vacunado 2 15 y 19
2
5 Vacunado 1 19
3
5 Control - --
La vacuna usada en este estudio fue una vacuna de gripe equina (A/equino/KY/ 02, A/equino/KY/93 y A/equino/NM/2/93) inactivada con adyuvante HAVLOGEN®. Para preparar esta vacuna, los virus se inactivaron por
15 etilenimina binaria (BEI) usando un método convencional. Cada dosis de vacuna contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 2048 unidades de HA de cada uno de los virus inactivados, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1 % (v/v) de rojo de fenol, suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a 7,2, y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml.
Los perros en el grupo 1 se vacunaron con 2 dosis de la vacuna. La segunda dosis (es decir, refuerzo) se administró
20 4 semanas después de la primera dosis. Los perros en el grupo 2 se vacunaron con una dosis de vacuna a las 19 semanas de edad. Se recogieron muestras sanguíneas para evaluar la titulación de HI usando un protocolo convencional con un aislado de gripe canina H3N8 los días cero (antes de la vacunación), 7 y 14 después de la primera y segunda vacunaciones. Siete días antes de la exposición, los perros se movieron a una instalación BSL-2 y se alojaron en jaulas individuales.
25 Todos los perros vacunados y de control con edad coincidente se expusieron por vía oronasal a un virus de gripe canina virulento (107,3 DICT50 de A/canino/Florida/242/2003 por perro) a las 2 semanas después de la segunda
vacunación del grupo 1 y primera vacunación del grupo 2. El virus de exposición se administró como una nebulización usando un nebulizador (Nebulair™) a 2 ml por perro. Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición. Todos los perros se sacrificaron el día 14 después de la exposición, y se recogieron muestras de pulmón y tráquea en formalina tamponada al 10% para
5 histopatología. Se recogieron muestras sanguíneas los días 7 y 14 después de la exposición para determinación de titulación de HI. Las asignaciones de puntuaciones de señal clínica usadas para la observación después de la exposición se muestran en la Tabla 42.
Resultados:
10 Todos los perros vacunados desarrollaron respuestas de titulación de anticuerpo HI al aislado de virus de gripe canina (Tabla 43). Después de la exposición, un aumento de aproximadamente 4 veces de la titulación de HI el día 14 después de la exposición en comparación con la titulación de HI antes de la exposición en todos los grupos indica indirectamente que todos los perros se expusieron al virus de exposición. Todos los perros mostraron señales de
15 enfermedad de gripe canina demostrando cada perro una o más de las siguientes señales clínicas: fiebre (>103,0 °F; >39,4 °C), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso y disnea. Las vacunas tuvieron señales clínicas menos graves, en comparación con controles de edad coincidente (Tabla 44). Hubo una reducción significativa (P = 0,028) en las señales clínicas debido a la vacunación de 2 dosis en perros (grupo 1). La vacunación de una dosis no proporcionó una reducción
20 significativa (P = 0,068) en señales clínicas (grupo 2).
Como en el Ejemplo 22, se realizó evaluación histopatológica de muestras tisulares de pulmón y traqueales con respecto a lesiones para identificar lesiones compatibles con o patognomónicas para enfermedad de gripe canina. La Tabla 45 proporciona un sumario del alcance de las lesiones en este experimento para los perros. Entre perros
25 de 15 semanas de edad, la vacunación de perros con 1 dosis o 2 dosis evitó las lesiones pulmonares en todos los perros. Cuatro de 5 perros de control (80%) tuvieron bronconeumonía supurante grave coherente con una enfermedad gripal. Uno de 7 perros del grupo de vacuna de 2 dosis (grupo 1) y 1 de 5 perros del grupo de control (grupo 3) tuvieron lesiones de tráquea leves que sugieren traqueítis que podría atribuirse a enfermedad gripal.
30 Conclusión:
Los resultados de este estudio demuestran que 1) el virus de gripe equina H3N8 inactivado puede inducir respuestas de anticuerpo de HI reactivo de forma cruzada con virus de gripe canina en perros vacunados, y 2) el uso de una vacuna de virus de gripe equina H3N8 puede reducir la gravedad de la enfermedad del virus de la gripe canina en
35 perros.
Tabla 42. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Temperatura
<103,0 °F (<39,4 °C)
0
103,0 -103,9 °F (39,439,94 ºC)
2
104,0-104,9 °F (40,040,50 ºC)
3
>105,0 °F(>40,6 °C)
4
Tos
Sin tos
0
Ocasional
2
Paroxística
4
Estornudos
Sin estornudos
0
Ocasional
1
Paroxísticos
2
Descarga nasal
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Descarga ocular
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Hemoptisis
No
0
Sí
5
Tabla 42. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Depresión
No
0
Sí
1
Anorexia
No
0
Sí
1
Señales respiratorias
Ninguna
0
Estertores
3
Disnea
4
Jadeos
5
Expectorado mucoso
No
0
Sí
2
Vómitos
No
0
Sí
1
Anomalías fecales
No
0
Sí
1
Tabla 43. Serología -titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamient o Número de dosis Titulación de HI
Días después de la primera vacunación de Grupo 1
Días después de la exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
1
ALK Vacunado 2 <10 <10 20 20 80 40 160 320
1
AMF Vacunado 2 <10 <10 10 20 20 40 160 320
1
AKY Vacunado 2 <10 20 20 20 40 40 160 80
1
ALC Vacunado 2 <10 10 10 10 40 40 160 160
1
ALL Vacunado 2 <10 <10 10 10 40 20 160 320
1
ALM Vacunado 2 <10 <10 10 20 40 40 80 160
1
AMU Vacunado 2 <10 20 40 40 40 40 40 160
2
ALA Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 10 320 160
2
AMA Vacunado 1 <10 <10 <10 < 10 <10 20 >640 80
2
APD Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 10 >640 320
2
APG Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 10 320 80
2
APT Vacunado 1 <10 <10 <10 <10 <10 10 320 320
3
ALT Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 160
3
AMS Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
3
AKX Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 20 80
3
ALX Control N/A <10 <10 <10 < 10 <10 <10 80 80
3
AMI Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 80
* Primera vacunación -Grupo 1 ** Segunda vacunación -Grupo 1; Primera vacunación -Grupo 2 *** Día de exposición
Tabla 44. Análisis de puntuaciones clínicas de enfermedad de gripe canina total
Grupo
Tratamiento Número de dosis Edad a la primera vacunación de Grupo 1 Puntuación media total por perro P-valor*
1
Vacunado 2 15 semanas 6,3 0,028 (Grupo 1 frente a 3)
2
Vacunado 1 15 semanas (estos perros se vacunaron una vez, cuando tenían 19 semanas de edad) 14,2 0,068 (Grupo 2 frente a 3)
3
Control - 15 semanas (estos perros no se vacunaron) 24,4 -
* Analizado usando un procedimiento NPARIWAY de SAS® Versión 8,2 (los grupos de vacuna se compararon usando el ensayo de suma de rangos Wilcoxon)
Tabla 45. Evaluación histopatológica de muestras tisulares
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Número de dosis Lesión microscópica (Histopatología)
Pulmón
Tráquea
1
ALK Vacunado 2 - +/
1
AMF Vacunado 2 - -
1
AKY Vacunado 2 - -
1
ALC Vacunado 2 - -
1
ALL Vacunado 2 - -
1
ALM Vacunado 2 - -
1
AMU Vacunado 2 - -
2
ALA Vacunado 1 - -
2
AMA Vacunado 1 - -
2
APD Vacunado 1 - -
2
APG Vacunado 1 - -
2
APT Vacunado 1 - -
3
ALT Control N/A +/ -
3
AMS Control N/A + -
3
AKX Control N/A + -
3
ALX Control N/A + +/
3
AMI Control N/A - -
"+" Lesión grave coherente o patognómica para una infección de gripe "+/-" Lesiones leves (no concluyente) "-" Normal
EJEMPLO 24 – ESTUDIO DE EFICACIA DE VACUNA DE GRIPE CANINA
5 El siguiente estudio se realizó para determinar: (1) la eficacia de vacunas de gripe equina H3N8 multivalentes frente a monovalentes contra virus de gripe canina en perros, y (2) el efecto de la vía de administración en la eficacia de la vacuna.
10 Procedimiento:
Se obtuvieron treinta mestizos de 10 semanas de edad de un proveedor comercial. Los perros se asignaron aleatoriamente a 6 grupos como se muestra en la Tabla 46, y se alojaron en una instalación de investigación.
Tabla 46. Diseño experimental
Grupo
Número de perros Tratamiento Vía de vacunación Número de dosis Edad en la vacunación (semanas)
1
5 VAX-1 IN 2 10 y 14
2
5 VAX-2 SQ 2 10 y 14
3
5 VAX-2 IN 2 10 y 14
4
5 VAX-3 SQ 2 10 y 14
5
5
VAX-3 IN 2 10 y 14
6
5 Control - - -
Se usaron tres tipos de vacunas (VAX-1, VAX-2, y VAX-3). La VAX-1 fue una vacuna monovalente de virus de gripe equina (A/Equino/KY/02) inactivado con adyuvante HAVLOGEN®, y cada dosis contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 6144 unidades de HA del virus inactivado, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1% (v/v) de rojo de fenol, suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a 7,2, y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml. La VAX-2 fue una
5 vacuna monovalente de virus de gripe equina (A/equino/KY/02) inactivado con adyuvante HAVLOGEN®, y cada dosis de vacuna contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 4096 unidades de HA del virus inactivado, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1% (v/v) de rojo de fenol, suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a 7,2, y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml. La VAX-3 fue una vacuna multivalente de gripe equina (A/equino/KY/02, A/equino/KY/93, y A/equino/NM/2/93) inactivada con adyuvante HAVLOGEN®, y contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 2048 unidades de HA de virus inactivado por cepa, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1% (v/v) de rojo de fenol, suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a 7,2, y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml. Todos los virus de la gripe usados para la formulación de vacuna se inactivaron por etilenimina binaria (BEI) usando un método convencional.
15 Las vacunas y vías de administración para cada grupo se describen en la Tabla 46. Todos los perros en los grupos vacunados se vacunaron por la vía intranasal (IN) o la subcutánea (SQ), y cada perro recibió dos dosis. La segunda dosis (es decir, refuerzo) se administró cuatro semanas después de la primera dosis. Se recogieron muestras sanguíneas para evaluar la titulación de HI usando un protocolo convencional con un aislado de gripe canina H3N8 los días 0 (antes de la vacunación), 7 y 14 después de la primera y segunda vacunaciones. Siete días antes de la exposición, los perros se movieron a una instalación BSL-2 y se alojaron en jaulas individuales.
Todos los perros vacunados y de control de edad coincidente se expusieron por vía oronasal a un virus de gripe canina virulento (107,4 DICT50 de A/Canino/Florida/242/2003 por perro) a las 2 semanas después de la segunda vacunación. El virus de exposición se administró como una nebulización usando un nebulizador (Nebulair™) en un
25 volumen de 2 ml por día. Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición. Se recogieron muestras sanguíneas los días 7 y 14 después de la exposición para determinación de la titulación de HI. Todos los perros se sacrificaron el día 14 después de la exposición, y se recogieron muestras de pulmón y tráquea en formalina tamponada 10% para histopatología. Las asignaciones de puntuación de señal clínica usadas para la observación después de exposición se muestran en la Tabla 47.
Resultados:
Todos los perros vacunados por la vía SQ desarrollaron respuestas de titulación de anticuerpo de HI al aislado de virus de gripe canina, independientemente del tipo de vacuna (Tabla 48). Ninguno de los perros de los grupos de
35 vacunación IN (es decir, grupos 1, 3 y 5) desarrollaron respuestas de titulación de anticuerpos de HI al aislado de virus de gripe canina, independientemente del tipo de vacuna, durante el periodo posterior a la vacunación. Hubo, sin embargo, un aumento de 4 veces en la titulación el día 14 después de la exposición en todos los perros indirectamente, lo que indica que todos los perros se expusieron al virus de exposición (Tabla 47).
Todos los perros mostraron una o más de las siguientes señales clínicas de gripe canina: fiebre (>103,0 °F; >39,4 °C), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión, pérdida de peso y disnea. Las vacunas tuvieron señales clínicas menos graves, en comparación con controles de edad coincidente (Tabla 49). Hubo una reducción significativa de las señales clínicas en perros vacunados con VAX-3 por la vía SC (grupo 4). En este experimento, la administración IN de VAX-1, VAX-2 o VAX-3
45 no proporcionó una reducción significativa de señales clínicas de virus de gripe canina.
Como en los Ejemplos 22 y 23, se realizó evaluación histopatológica de muestras tisulares de pulmón y traqueales con respecto a lesiones para identificar lesiones compatibles con o patognómicas para enfermedad de gripe canina. La Tabla 50 proporciona un sumario del alcance de las lesiones en este experimento para los perros. Cinco de 5 perros de control (grupo 6) tuvieron lesiones pulmonares coherentes con una infección de gripe. Dos de 5 perros vacunados con VAX-2 por la vía SC (grupo 2) y 3 de 5 perros vacunados con VAX-3 por la vía SC (grupo 4) estaban sin ninguna lesión pulmonar relacionada con gripe. Todos los perros que recibieron la vacuna por la vía intranasal, independientemente del tipo de vacuna, tuvieron lesiones pulmonares graves coherentes con una infección de gripe. Las lesiones de la tráquea observadas en este estudios fueron muy leves.
55 Conclusión:
Los resultados de este estudio demuestran que: (1) el virus de gripe equina H3N8 inactivado puede inducir respuestas de anticuerpo de HI reactivo de forma cruzada con virus de gripe canina en perros vacunados por la vía SQ, (2) la administración intranasal de vacuna monovalente (VAX-1 y VAX-2) o multivalente (VAX-3) no fue eficaz en perros, y (3) la administración subcutánea de vacuna multivalente (VAX-3) proporcionó una reducción significativa (P=0,016) en la gravedad de enfermedad de virus de gripe canina en perros.
Tabla 47. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Temperatura
<103, °F(<39, °C)
0
1030 -103.9 °F (39,4-39,94 ºC
2
104,0-104,9 °F (40,0-40,50 ºC
3
Tabla 47. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Temperatura
>105,0 °F(>40,6 °C)
4
Tos
Sin tos
0
Ocasional
2
Paroxística
4
Estornudos
Sin estornudos
0
Ocasional
1
Paroxísticos 2
Descarga nasal
Sin descarga 0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Descarga ocular
Sin descarga 0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Hemoptisis
No 0
Sí
5
Depresión
No 0
Sí
1
Anorexia
No 0
Sí
1
Señales respiratorias
Ninguna
0
Estertores
3
Disnea
4
Jadeos
5
Expectorado mucoso
No 0
Sí
2
Vómitos
No
0
Sí
1
Anomalías fecales
No
0
Sí
1
Tabla 48.
Serología-titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Nº de dosis Titulación de HI
Días después de la vacunación
Días después de exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
1
248 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 40
1
501 Vacunado IN 2 <10 10 <10 <10 <10 <10 160 160
1
502 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
1
469 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
1
46A Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 80
Tabla 48. Serología-titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Nº de dosis Titulación de HI
Días después de la vacunación
Días después de exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
2
232 Vacunado SQ 2 <10 <10 <10 20 20 40 320 640
2
511 Vacunado SQ 2 <10 10 10 20 20 20 160 640
2
514 Vacunado SQ 2 <10 <10 40 40 80 40 160 320
2
461 Vacunado SQ 2 <10 10 10 20 20 20 >640 >640
2
463 Vacunado SQ 2 <10 10 40 80 80 40 80 320
3
246 Vacunado IN 2 <10 10 <10 <10 <10 <10 40 40
3
505 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 80
3
506 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
3
464 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 80
3
465 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
4
23B Vacunado SQ 2 <10 10 10 40 40 20 160 160
4
247 Vacunado SQ 2 <10 <10 <10 20 20 20 160 320
4
508 Vacunado SQ 2 <10 10 40 40 80 80 320 320
4
512 Vacunado SQ 2 <10 <10 20 20 80 80 320 160
4
516 Vacunado SQ 2 <10 10 10 20 80 80 160 >640
5
503 Vacunado IN 2 <10 10 <10 <10 <10 <10 80 160
5
513 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 80
5
462 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 < 10 80 320
5
466 Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 80
5
46B Vacunado IN 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
6
236 Control - 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
6
504 Control - 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 160 160
6
507 Control - 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
6
515 Control - 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
6
468 Control - 2 <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 160
* Primera vacunación ** Segunda vacunación *** Día de exposición
Tabla 49. Análisis de puntuaciones clínicas de enfermedad de gripe canina totales
Grupo
Tratamiento Vía de vacunación Puntuación media total por perro P-valor*
1
VAX-1 IN 35.2 0,500 (grupo 1 frente a 6)
2
VAX-2 SQ 31,0 0,345 (grupo 2 frente a 6)
3
VAX-2 IN 39,4 0,631 (grupo 3 frente a 6)
4
VAX-3 SQ 13,0 0,016 (grupo 4 frente a 6)
Tabla 49. Análisis de puntuaciones clínicas de enfermedad de gripe canina totales
Grupo
Tratamiento Vía de vacunación Puntuación media total por perro P-valor*
5
VAX-3 IN 42,6 0,790 (grupo 4 frente a 6)
6
Control - 36,8 -
* Analizado usando un procedimiento NPARIWAY de SAS® Versión 8.2 (los grupos de vacuna se compararon usando el ensayo de suma de rangos Wilcoxon)
Tabla 50. Evaluación histopatológica de muestras tisulares
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Número de dosis Lesión microscópìca (Histopatología)
Pulmón
Tráquea
1
248 Vacunado IN 2 + -
1
501 Vacunado IN 2 + -
1
502 Vacunado IN 2 + -
1
469 Vacunado IN 2 + +
1
46A Vacunado IN 2 + +
2
232 Vacunado SQ 2 + -
2
511 Vacunado SQ 2 + -
2
514 Vacunado SQ 2 - -
2
461 Vacunado SQ 2 + -
2
463 Vacunado SQ 2 - -
3
246 Vacunado IN 2 + -
3
505 Vacunado IN 2 + -
3
506 Vacunado IN 2 + +
3
464 Vacunado IN 2 + -
3
465 Vacunado IN 2 + +
4
23B Vacunado SQ 2 - -
4
247 Vacunado SQ 2 +/ -
4
508 Vacunado SQ 2 - -
4
512 Vacunado SQ 2 - +/
4
516 Vacunado SQ 2 + +
5
503 Vacunado IN 2 + +/
5
513 Vacunado IN 2 + +
5
462 Vacunado IN 2 + +/
5
466 Vacunado IN 2 + +
5
46B Vacunado IN 2 + -
6
236 Control - 2 + -
6
504 Control - 2 + +
6
507 Control - 2 + +
6
515 Control - 2 + +/
6
468 Control - 2 + +
"+" Lesión grave coherente o patognómica para una infección de gripe "+/-" Lesión leve (no concluyente) "-" Normal
EJEMPLO 25 – ESTUDIO DE EFICACIA DE VACUNA DE GRIPE CANINA
La enfermedad de gripe canina está causada por un virus de gripe H3N8 (CIV). CIV está cercanamente relacionado con los virus H3N8 equinos (Crawford et al., 2005) e infecta a todos los perros expuestos. Aproximadamente el 80% 5 de los perros expuestos desarrollan señales clínicas. En el siguiente estudio se determinó la eficacia de una vacuna de virus de gripe equina H3N8 inactivado y una vacuna de virus de gripe canina.
Procedimiento:
10 Se usaron treinta y cinco beagles y cinco mestizos en el presente estudio. Los beagles se asignaron aleatoriamente a tres grupos (Tabla 51). Todos los mestizos se asignaron al grupo de control (grupo 3). Todos los perros se alimentaron con una dieta de crecimiento convencional y el agua estuvo disponible a voluntad.
Tabla 51. Diseño experimental
Grupo
Tratamiento Vía de vacunación Número de perros Edad en la vacunación (semanas) Exposición
1
VAX-1 IM 15 8 y12 Sí
2
VAX-2 SC 5 -8 y 12 Sí
3
Control N/A 20 N/A Sí
15 Los perros en los grupos 1 y 2 se vacunaron con VAX-1 o 2-VAX (Tabla 51). VAX-1 era una vacuna de virus de gripe equina (A/equino/KY/02) inactivado con adyuvante HAVLOGEN®. Para la preparación de la vacuna, el virus de la vacuna se inactivó por etilenimina binaria (BEI) usando un método convencional. Cada dosis de vacuna contenía HAVLOGEN® (10% v/v), 6144 unidades de HA del virus inactivado, 0,1% (v/v) de timerosal 10%, 0,1% (v/v) de rojo de fenol y suficiente PBS para llevar el volumen de dosis total a 1 ml y suficiente NaOH para ajustar el pH de 6,8 a
20 7,2.
VAX-2 era una vacuna de antígeno de gripe con adyuvante CARBIGENTM inactivado (A/canino/F1/43/2004). El A/canino/FI/43/2004 se inactivó por etilenimina binaria (“BEI”) usando un método convencional. Cada dosis de la vacuna contenía un 5% en masa de CARBIGENTM, aproximadamente 1280 unidades de HA del virus inactivado, 25 suficiente PBS para llevar el volumen total de la dosis a 1 ml, y suficiente NaOH para ajustar el pH a un valor comprendido entre 7,2 y 7,4. Se recogieron muestras de suero de todos los perros el día de la primera y segunda vacunación, el día 7 y 14 después de la primera y segunda vacunaciones, y antes de la exposición para determinar las titulaciones de HI usando un protocolo convencional de virus de gripe equina H3N8 (SAM 124, CVB, USDA, Ames, IA). Siete días antes de la exposición, los perros se movieron a una instalación ABSL-2 y se alojaron en jaulas
30 individuales.
Todos los perros vacunados y de control de edad coincidente se expusieron por vía oronasal a virus de gripe canina virulento (107,2 DICT50 de A/Canino/Florida/242/2003 por perro) a las 2 semanas después de la segunda vacunación. El virus de exposición se administró como una nebulización (2 ml/perro) usando un nebulizador 35 (NEBULAIR™). Los perros se observaron con respecto a señales clínicas relacionadas con gripe durante 14 días después de la exposición. Se recogieron hisopos nasales y orofaríngeos diariamente en tubos que contenían 2 ml de medio de transporte de virus para aislamiento de virus del día -1 (es decir, un día antes de la exposición) al día 14 después de la exposición. Se recogieron muestras sanguíneas los días 7 y 14 después de la exposición para determinación de titulación de HI. Las asignaciones de puntuación de señal clínica usadas para observación
40 posterior a la exposición se muestran en la Tabla 52.
Resultados:
Todos los perros vacunados (grupos 1 y 2) desarrollaron respuestas de titulaciones de anticuerpo de HI para el
45 aislado de virus de gripe canina (Tabla 53). Todos los perros mostraron una o más de las siguientes señales de gripe canina: fiebre (> 103,0 °F,> 39,4 °C), tos, descarga ocular serosa o mucopurulenta, descarga nasal serosa o mucopurulenta, vómitos, diarrea, depresión y anorexia. Los vacunados tuvieron señales clínicas menos graves, en comparación con controles de edad coincidente (Tabla 54). Hubo una reducción significativa (P <0,001) en señales clínicas en perros vacunados con VAX-1 (grupo 1) o VAX-2 (grupo 2).
50 Se muestran resultados de aislamiento de virus en las Tablas 55 y 56. Después de una exposición a virus de gripe canina virulento, el virus de gripe canina se aisló de 5 de 15 (33%) perros de grupo 1 (VAX-1), 0 de 5 (0%) perros del grupo 2 (VAX-2) y 17 de 20 (85%) controles (grupo 3). Los vacunados tanto con vacuna de gripe equina inactivada (VAX-1) como con virus de gripe canina (VAX-2) demostraron una reducción significativa (P = 0,004) en difusión viral
55 en secreciones nasales u orales o ambas (Tabla 55) en comparación con los controles.
Conclusión:
Los resultados de este estudio demuestran que: (1) las vacunas de virus de gripe equina H3N8 inactivado y virus de 60 gripe canina pueden inducir respuestas de anticuerpo HI reactivo a virus de gripe canina en perros vacunados, (2) el
uso de una vacuna de virus de gripe canina o virus de gripe equina H3N8 puede reducir la gravedad de la enfermedad por virus de gripe canina en perros, y (3) el uso de una vacuna de virus de gripe canina o virus de gripe equina H3N8 puede reducir la excreción de virus en secreciones nasales y/u orales.
Tabla 52. Señales clínicas y sistema de puntuación
Señales clínicas
Puntuación por día
Temperatura
<103,0 ºF (<39,4 ºC)
0
103,0 – 103,9 ºF (39,4 – 39,94 ºC)
2
104,0-104,9 °F (40,0-40,5 °C)
3
>105,0 °F (>40,6 °C)
4
Tos
Sin tos
0
Ocasional
2
Paroxística
4
Estornudos
Sin estornudos
0
Ocasional
1
Paroxísticos
2
Descarga nasal
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Descarga ocular
Sin descarga
0
Serosa ligera
1
Serosa copiosa
1
Mucopurulenta ligera
2
Mucopurulenta copiosa
3
Hemoptisis
No
0
Sí
5
Depresión
No
0
Sí
1
Anorexia
No
0
Sí
1
Señales respiratorias
Ninguna
0
Estertores
3
Disnea
4
Jadeos
5
Expectorado mucoso
No
0
Sí
2
Vómitos
No
0
Sí
1
Anomalías fecales
No
0
Sí
1
Tabla 53. Serología –Titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Titulación de HI
Días después de vacunación
Días después de exposición
0*
7 14 28** 35 42*** 7 14
1
AYS Vacunado IM <10 <10 <10 20 40 40 80 >640
1
AZV Vacunado IM <10 <10 <10 20 40 40 160 >640
1
BAD Vacunado IM <10 <10 <10 40 40 80 80 320
1
BAE Vacunado IM <10 <10 10 20 20 20 40 320
1
BAH Vacunado IM <10 <10 10 10 40 40 160 >640
1
BAJ Vacunado IM <10 <10 10 20 80 80 40 320
1
BAN Vacunado IM <10 10 10 20 40 40 40 320
1
BBN Vacunado IM <10 10 10 20 80 80 40 320
1
BBT Vacunado IM <10 <10 <10 20 40 40 40 160
1
BBY Vacunado IM <10 <10 <10 20 80 80 160 >640
1
BCS Vacunado IM <10 10 40 40 160 160 160 160
1
BCZ Vacunado IM <10 10 10 20 80 40 160 160
1
BDP Vacunado IM <10 <10 <10 20 40 40 80 >640
1
BEE Vacunado IM <10 10 20 40 80 80 160 320
1
BEY Vacunado IM <10 <10 10 10 40 40 160 160
2
AZH Vacunado SC <10 <10 10 20 80 80 160 160
2
AZT Vacunado sc <10 <10 10 10 40 80 320 >640
2
BBC Vacunado sc <10 <10 20 40 160 160 80 160
2
BCM Vacunado SC <10 <10 10 20 80 40 80 160
2
BEB Vacunado SC <10 <10 <10 10 20 40 80 160
3
AYT Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 320
3
AZJ Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 20 160
3
AZL Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 160
3
AZN Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 160 160
3
BAB Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 320
Tabla 53. Serología – Titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Titulación de HI
Días después de vacunación
Días después de exposición
0*
7 14 28" 35 42*** 7 14
3
BBD Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 320 >640
3
BBU Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 160 160
3
BBZ Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 20 160
3
BCC Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 320
3
BCD Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 >640
3
BCG Control N/A <10 <14 <10 <10 <10 <10 40 >640
3
BCI Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 20 320
3
BCL Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 >640
Tabla 53. Serología – Titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID de perro Tratamiento Vía de vacunación Titulación de HI
Días después de vacunación
Días después de exposición
0*
7 14 28" 35 42*** 7 14
3
BCV Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 40 320
3
BDU Control N/A <10 <10 <10 <10 <10 <10 80 >640
3
MFI Control N/A NT NT NT NT <10 <10 80 320
3
MFJ Control N/A NT NT NT NT <10 <10 40 320
3
MFK Control N/A NT NT NT NT <10 <10 80 320
3
MFR Control N/A NT NT NT NT <10 <10 80 320
3
MFS Control N/A NT NT NT NT <10 <10 160 >640
* Primera vacunación **Segunda vacunación *** Día de exposición
Tabla54. Análisis de mutaciones clínicas de enfermedad gripal canina totales
Grupo
Tratamiento Puntuación media total por perro P-valor*
1
VAX-1 9,1 < 0,001 (grupo 1 frente a3)
2
VAX-2 5,4 < 0,001 (grupo 2 frente a 3)
3
Control 24,1 -
*Analizado usando un procedimiento NPARIWAY de SAS® Versión 9.1 (los grupos de vacunas se compararon usando el procedimiento GLM)
Tabla 55. Difusión viral después de exposición
Grupo
Tratamiento Porcentaje de perros que excretaron el virus P-valor*
1
VAX-1 33% (5/15) 0,004 (grupo 1 frente a 3)
2
VAX-2 0% (0/5) 0,004 (grupo 2 frente a 3)
3
Control 85% (17/20) -
* Analizado usando un procedimiento FREQ de SAS® (Versión 9.1) y P-valor asociado con ensayo exacto de Fisher
Tabla 56. Serología – Titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID deperro Tratamiento Vía devacunación Días después de exposición
-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
1
AYS Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
AZV Vacunado IM N N N P N N N N N N N N N N N N
1
BAD Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BAE Vacunado IM N N N P P N N N N N N N N N N N
1
BAH Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BAJ Vacunado IM N N N P N N N N N N N N N N N N
1
BAN Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BBN Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BBT Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BBY Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BCS Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BCZ Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BDP Vacunado IM N N N P N N N N N N N N N N N N
1
BEE Vacunado IM N N N N N N N N N N N N N N N N
1
BEY Vacunado IM N N N P N N N N N N N N N N N N
2
AZH Vacunado SC N N N N N N N N N N N N N N N N
2
AZT Vacunado SC N N N N N N N N N N N N N N N N
2
BBC Vacunado SC N N N N N N N N N N N N N N N N
2
BCM Vacunado SC N N N N N N N N N N N N N N N N
2
BEB Vacunado SC N N N N N N N N N N N N N N N N
3
AYT Control N/A N N N N N N N N N N N N N N N N
3
AZJ Control N/A N N N N N P P N N N N N N N N N
3
AZL Control N/A N N N N N N P N N N N N N N N N
Tabla 56. Serología – Titulaciones de inhibición de hemaglutinación
Nº Grupo
ID deperro Tratamiento Vía devacunación Días después de exposición
-1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
3
AZN Control N/A N N N P N N N N N N N N N N N N
3
BAB Control N/A N N N P N N N N N N N N N N N N
3
BBD Control N/A N N N N N N N N N N N N N N N N
3
BBU Control N/A N N N N N N P N N N N N N N N N
3
BBZ Control N/A N N N P N N P N N N N N N N N N
3
BCC Control N/A N N N P N P N N N N N N N N N N
3
BCD Control N/A N N N N N P P N N N N N N N N N
3
BCG Control N/A N N N P N P N N N N N N N N N N
3
BCI Control N/A N N N P P P N N N N N N N N N N
3
BCL Control N/A N N N P P N P N N N N N N N N N
3
BCV Control N/A N N N P P N N N N N N N N N N N
3
BDU Control N/A N N N P P N N N N N N N N N N N
3
MFI Control N/A N N N P P P P N N N N N N N N N
3
MFJ Control N/A N N N P N N N N N N N N N N N N
3
MFK Control N/A N N N P N N N N N N N N N N N N
3
MFR Control N/A N N N N N N N N N N N N N N N N
3
MFS Control N/A N N N P P P N N N N N N N N N N
N-Sin virus aislado de hisopos orales o nasalesP - Virus aislado de hisopos nasales u orales o nasales y orales.
Tabla 57. Similitudes de secuencias de aminoácidos de genes de hemaglutinina, neuraminidasa y nucleoproteína entre virus de la gripe
Gen (Canino/Florida/43/2004)
Similitud de secuencia de aminoácidos Gen de virus de la gripe usado para comparación
Hemaglutinina
88 Equino/Argelia/72
HA
90 Equino/Sao Paulo/6/69
HA
91 Equino/Miami/1/63
HA
93 Equino/Newmarket/79
HA
94 Equino/Kentucky/1/81
HA
95 Equi-2/Ludhiana/87
HA
96 Equino/Alaska/1/91
HA
97 Equino/Tennessee/5/86
HA
98 Equino/Kentucky/5/02
HA
99 Equino/Ohio/1/2003
HA
99 Canino/Florida/242/2003
Neuraminidasa
88 Eq/Argelia/72
NA
90 Equino/Sao Paulo/6/69
NA
91 Equino/Miami/1/63
NA
93 Equino/Newmarket/79
NA
94 Equino/Kentucky/1/81
NA
95 Equi-2/Ludhiana/87
NA
96 Equino/Santiago/85
NA
97 Equino/Tennessee/5/86
NA
98 Equino/Kentucky/5/2002
NA
99 Equino/Ohio/1/2003
NA
99 Canino/Florida/242/2003
Nucleoproteína ("NP")
94 equi/Miami/1/63
NP
97 Equino/Kentucky/1/81
NP
99 Equino/Kentucky/5/02
NP
99 Equino/Ohio/1/2003
NP
99 Canino/Florida/242/2003
Las palabras “comprender”, “comprende” y “que comprende” en la presente patente (incluyendo las reivindicaciones) deben interpretarse de forma inclusiva en lugar de exclusiva.
5 Se pretende que la descripción detallada anterior de realizaciones preferidas solamente informe a otros expertos en la materia de la invención, sus principios y su aplicación práctica de modo que otros expertos en la materia puedan adaptar y aplicar la invención en sus numerosas formas, según puedan adaptarse mejor a los requisitos de un uso particular. La presente invención, por lo tanto, no se limita a las realizaciones anteriores, y puede modificarse de diversas formas.
BIBLIOGRAFÍA
Patente de Estados Unidos Nº 5.106.739
Patente de Estados Unidos Nº 5.034.322
Patente de Estados Unidos Nº 6.455.760
Patente de Estados Unidos Nº 6.696.623
Patente de Estados Unidos Nº 4.683.202
Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195
Patente de Estados Unidos Nº 4.800.159
Patente de Estados Unidos Nº 4.965.188
Patente de Estados Unidos Nº 5.994.056
Patente de Estados Unidos Nº 6.814.934
Patente de Estados Unidos Nº 6.436.408
Patente de Estados Unidos Nº 6.398.774
Patente de Estados Unidos Nº 6.177.082
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20040078841
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20040067506
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20040019934
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20030177536
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20030084486
Publicación de solicitud de Estados Unidos Nº 20040123349
Greyhound Daily News, 1/28/99. National Greyhound Association (NGA), Abilene, Kansas. http:
//www.NGAgrey-hounds.com.
Comunicación personal, Dr. William Duggar, veterinarian at Palm Beach Kennel Club, West Palm Beach, Florida. Altschul, S. F. et al. (1990) "Basic Local Alignment Search Tool" J. Mol. Biol. 215: 402-410. Altschul, S. F. et al. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST: A New Generation of Protein Database Search
Programs" Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402. An, G. (1987) "Binary Ti vectors for plant transformation and promoter analysis" Methods Enzymol. 153: 292
305. Beltz, G. A., Jacobs, K. A., Eickbush, T. H., Cherbas, P. T., Kafatos, F. C. (1983) "Isolation of multigene families
and determination of homologies by filter hybridization methods" Methods of Enzymology, R. Wu, L. Grossman and K. Moldave [eds.] Academic Press, New York 100: 266-285. Burleson, F. et al. (1992) Virology: A Laboratory Manual (Academic Press). Byars, N.E., A.C. Allison (1987) "Adjuvant formulation for use in vaccines to elicit both cell-mediated and humoral
immunity" Vaccine 5: 223-228. Crawford, P.C. et al. (2005) "Transmission of equine influenza virus to dogs" Science 310: 482-485. Chang, C.P. et al. (1976) "Influenza virus isolations from dogs during a human epidemic in Taiwan" Int J
Zoonoses 3: 61-64.
Dacso, C.C. et al. (1984) "Sporadic occurrence of zoonotic swine influenza virus infections" J Clin Microbiol 20: 833-835. de Boer, H. A., Comstock, L. J., Vasser, M. (1983) "The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp
and lac promoters" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(1): 21-25. Felsenstein, J. (1989) Cladistics 5: 164. Fields et al. (1946) Fields Virology, 3rd ed., Lippincott-Raven publishers. Ford, R.B., Vaden, S.L (1998) "Canine infectious tracheobronchitis" In Infectious Diseases of the Dog and Cat,
2nd edition, C.E. Greene, editor, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA, pp. 33-38. Fouchier et al., (2000) Journal of Clinical Microbiology 38 (11): 4096-4101. Good, X. et al. (1994) "Reduced ethylene synthesis by transgenic tomatoes expressing S-adenosylmethionine
hydrolase" Plant Molec. Biol. 26: 781-790. Guan, Y. et al. (2004) "H5N1 influenza: a protean pandemic threat" Proc Natl Acad Sci U S A 101: 8156-8161. Guo, Y. et al. (1992) "Characterization of a new avian-like influenza A virus from horses in China" Virology 188:
245-255.
Houser, R.E. et al. (1980) "Evidence of prior infection with influenza A/Texas/77 (H3N2) virus in dogs with clinical parainfluenza" Can J Comp Med 44: 396-402. Karasin, A.I. et al. (2000) "Isolation and characterization of H4N6 avian influenza viruses from pigs with
pneumonia in Canada" J Virol 74: 9322-9327.
Karlin S. and Altschul, S. F. (1990) "Methods for Assessing the Statistical Significance of Molecular Sequence Features by Using General Scoring Schemes" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268. Karlin S. and Altschul, S. F. (1993) "Applications and Statistics for Multiple High-Scoring Segments in Molecular
Sequences" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877.
Kawaoka, Y. et al., (1989) "Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics" J Virol 63: 4603-4608. Keawcharoen, J. et al. (2004) "Avian influenza H5N1 in tigers and leopards" Emerg infect Dis 10: 2189-2191. Kendal, A. P. et al. (1982) In Concepts and Procedures for Laboratory-based Influenza Surveillance. A. P.
Kendal, M. S. Pereira, J. J. Skehel, Eds. (U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease
Control and Prevention and Pan-American Health Organization, Atlanta, GA, Estados Unidos) pp. B17-B35. Kilbourne, E.D. et al. (1975) "Demonstration of antibodies to both hemagglutinin and neuraminidase antigens of H3N2 influenza A virus in domestic dogs" Intervirology 6: 315-318.
Kimura, K. et al. (1998) "Fatal case of swine influenza virus in an immunocompetent host" Mayo Clin Proc 73:
243-245. Klimov, A. I. et al. (1992a) "Sequence changes in the live attenuated, cold-adapted variants of influenza A/Leningrad/ 134/57 (H2N2) virus" Virology 186: 795-797.
Klimov A. et al. (1992b) "Subtype H7 influenza viruses: comparative antigenic and molecular analysis of the HA-,
M-, and NS-genes." Arch Virol. 122: 143-161. Kovacova, A. et al. (2002) "Sequence similarities and evolutionary relationships of influenza virus A hemagglutinins" Virus Genes 24: 57-63.
Kuiken, T. et al. (2004) "Avian H5N1 influenza in cats" Science 306: 241. Kumar, S. et al. (2004) "MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment" Brief Bioinform 5: 150-163.
Lee, L.G. et al. (1993) "Allelic discrimination by nick-translation PCR with fluorogenic probes" Nucleic Acids Res. 21(16): 3761-3766. Lewin, B. (1985) Genes II, John Wiley & Sons, Inc., p. 96.
Lipatov, A.S. et al. (2004) "Influenza: emergence and control" J Virol 78: 8951-8959. Livak, K. J. et al. (1995) "Oligonucleotides with fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleic acid hybridization" PCR Methods Appl. 4(6): 357-362.
Maniatis, T., E.F. Fritsch, J. Sambrook (1982) "Nuclease Bal31" Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Matrosovich, M. et al. (2000) "Early alterations of the receptor-binding properties of H1, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals" J Virol 74: 8502-8512.
Maertzdorf et al., (2004) Clin Microbiol. 42(3): 981-986. Merrifield, R.B. (1963) "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide" J. Amer. Chem. Soc.
85: 2149-2154.
Nikitin, A. et al. (1972) "Epidemiological studies of A-Hong Kong-68 virus infection in dogs" Bull World Health Organ 47: 471-479. Nobusawa, E. et al. (1991) "Comparison of complete amino acid sequences and receptor-binding properties
among 13 serotypes of hemagglutinins of influenza A viruses" Virology 182: 475-485.
Patriarca, P.A. et al. (1984) "Lack of significant person-to person spread of swine influenza-like virus following fatal infection in an immunocompromised child" Am J Epidemiol 119: 152-158. Payungporn S. et al. (2006a) "Detection of canine influenza A virus (H3N8) RNA by realtime RT-PCR" (in
preparation for Journal of Clinical Microbiology).
Payungporn S, et al. (2006b) "Isolation and characterization of influenza A subtype H3N8 viruses from dogs with respiratory disease in a shelter and veterinary clinic in Florida" (in preparation for Emerging Infectious Diseases). Peiris, M. et al. (1999) "Human infection with influenza H9N2" Lancet 354: 916-917. Peiris, J.S. et al. (2004) "Re-emergence of fatal human influenza A subtype H5N1 disease" Lancet 363: 617-619. Posnett, D. N. et al. (1988) "A Novel Method for Producing Anti-peptide Antibodies" J. Biol. Chem. 263(4): 1719
1725. Putnam, Bob (February 10, 1999) "Two illnesses seen in death of dogs" St. Petersburg Times. Reid, A.H. et al. (2004) "Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus" Nat
Rev Microbioll2: 909-914.
Rowe, T. et al. (1999) "Detection of antibody to avian influenza A (H5N1) virus in human serum by using a combination of serologic assays" J Clin Microbiol 37: 937-943. Saiki, R. (1985) "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for
diagnosis of sickle cell anemia" Science 230: 1350-1354. Sambrook, J. et al. (1989) "Plasmid Vectors" In: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Edition, pp. 1.82
1.104. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York.
Subbarao, K. et al. (1998) "Characterization of an avian influenza A (H5N1) virus isolated from a child with a fatal respiratory illness" Science 279: 393-396.
Suzuki, Y. et al. (2000) "Sialic acid species as a determinant of the host range of influenza A viruses" J Virol 74: 11825-11831.
Tarn, J. P. (1988) "Synthetic Peptide Vaccine Design: Synthesis and Properties of a High-Density Multiple Antigenic Peptide System" PNAS USA 85(15): 5409-5413.
Top, Jr., F.H. et al. (1977) "Swine influenza A at Fort Dix, New Jersey (January-February 1976). IV. Summary
and speculation" J Infect Dis 136 Suppl: S376-S380. Vines, A. et al. (1998) "The role of influenza A virus hemagglutinin residues 226 and 228 in receptor specificity and host range restriction" J Virol 72: 7626-7631.
Wagner, R. et al. (2002) "N-Glycans attached to the stem domain of haemagglutinin efficiently regulate influenza
A virus replication" J Gen Virol 83: 601-609. Webby, R. etal. (2004) "Molecular constraints to interspecies transmission of viral pathogens" Nat Med 10: S77- S81.
Webster, R.G. (1998) "Influenza: an emerging disease" Emerg Infect Dis 4: 436-441. Webster, R.G. et al. (1992) "Evolution and, ecology of influenza A viruses" Microbiol Rev 56: 152-179. Weis, W. et al. (1988) "Structure of the influenza virus haemagglutinin complexed with its receptor, sialic acid"
Nature 333: 426-431. Womble, D.D. (2000) "GCG: The Wisconsin Package of sequence analysis programs" Methods Mol Biol 132: 3
22.
Xu,D., McElroy, D.,Thornburg, R. W., Wu, R. et al. (1993) "Systemic induction of a potato pin2 promoter by wounding, methyl jasmonate, and abscisic acid in transgenic rice plants" Plant Molecular Biology 22: 573-588. Yang, T. T. et al. (1996) "Optimized Codon Usage and Chromophore Mutations Provide Enhanced Sensitivity
with the Green Fluorescent Protein" Nucleic Acid Research 24(22): 4592-4593. Yoon K-Y. et al. (2005) "Influenza virus infection in racing greyhounds" Emerg Infect Dis. 11: 1974-1975. LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Crawford, Patti Cynthia Gibbs, E. Paul J. Dubovi, Edward J. Donis, Ruben Omar Katz, Jacqueline M. Klimov, Alexander I. Lakshmanan, Nallakannu P. Lum, Melissa Anne Goovaerts, Daniel Ghislena Emiel Mellencamp, Mark William
<120> Materiales y métodos para combatir enfermedades respiratorias en cánidos
<130> UF-445XC2
<150> US 11/409.416
<151>
<150> US 60/728.449
<151>
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<151>
<150> US 60/759.162
<151>
<150> US 60/761.451
<151>
<150> US 60/779.080
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<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(756)
<400> 75
<210> 76
<211> 252
<212> PRT
<213> Virus de la gripe
<400> 76
<210> 77
<211> 1698 5 <212> ADN
<213> Virus de la gripe
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1698)
<400> 77
<210> 78
<211> 565
<212> PRT
<213> Virus de la gripe
<400> 78
<210> 79 <211> 20 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 79 tatgcatcgc tccgatccat
20
<210> 80 <211> 21 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 80 gctccacttc ttccgttttg a
21
<210> 81 <211> 30 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 81 aattcacagc agagggattc acatggacag
30
<210> 82. <211> 24 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<220> <221> variación <222> (7).. (7) <223> r = a o g
<400> 82 catggartgg ctaaagacaa gacc
24
<210> 83 <211> 24 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<220> <221> variación <222> (18)..(18) <223> k = g o t
<400> 83 agggcatttt ggacaaakcg tcta
24
<210> 84 <211> 18 <212> ADN <213> Virus de la gripe <400> 84 acgctcaccg tgcccagt
18
<210> 85 <211> 28 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 85 tattcgtctc agggagcaaa agcagggg
28
<210> 86 <211> 42 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 86 tgtaatacga ctcactatag ggctccactt cttccgtttt ga
42
<210> 87 <211> 30 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 87 gatcgctctt cagggagcaa aagcaggtag
30
<210> 88 <211> 40 <212> ADN <213> Virus de la gripe
<400> 88 tgtaatacga ctcactatag ggcattttgg acaaagcgtc
40

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un virus de la gripe canina aislado que es capaz de infectar a un animal cánido, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido de hemaglutinina (HA) que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID Nº: 78, o una secuencia madura del mismo en la que se ha retirado la secuencia señal de 16 aminoácidos N terminal de la secuencia de longitud completa.
  2. 2.
    El virus de la gripe de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
  3. 3.
    El virus de la gripe de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido HA de dicho aislado viral comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 78.
  4. 4.
    El virus de la gripe de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus de la gripe comprende un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75
    o 77, o dicho polinucleótido tiene 98% o más de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77.
  5. 5.
    El virus de la gripe de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho virus de la gripe está inactivado o atenuado.
  6. 6.
    Una composición que comprende un inmunógeno de un virus de la gripe de la reivindicación 1, en la que dicho inmunógeno es capaz de inducir una respuesta inmunitaria contra un virus de la gripe que es capaz de infectar a un animal cánido, y en la que dicho inmunógeno comprende:
    (a)
    un polipéptido HA como se ha definido en la reivindicación 1 o reivindicación 3, y/o
    (b)
    un polinucleótido que codifica un polipéptido HA como se ha definido en la reivindicación 1 o reivindicación 3.
  7. 7.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 6, en la que dicho inmunógeno comprende virus completo sin células, o una parte del mismo; un polinucleótido viral; una proteína viral, un polipéptido o péptido viral; una célula infectada por virus; una construcción basada en vector viral recombinante; un virus redistribuido; o ácido nucleico desnudo de dicho virus.
  8. 8.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicha proteína, polipéptido o péptido viral comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene un 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
  9. 9.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho polinucleótido viral codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76, o un fragmento funcional y/o inmunogénico de la misma, o dicho polinucleótido codifica un polipéptido que tiene un 95% o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 64, 66, 68, 70, 72, 74 o 76.
  10. 10.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 7, en la que dicho polinucleótido viral comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en cualquiera de SEC ID Nº: 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75 o 77, o un fragmento funcional de la misma.
  11. 11.
    Una vacuna de gripe canina, en la que la vacuna comprende:
    una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno de al menos un virus de la gripe de la reivindicación 1, y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable, en la que dicho antígeno comprende:
    (a)
    un polipéptido de HA como se ha definido en la reivindicación 1 o reivindicación 3, y/o
    (b)
    un polinucleótido que codifica un polipéptido de HA como se ha definido en la reivindicación 1 o reivindicación 3.
  12. 12.
    La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el antígeno o los antígenos virales comprenden uno o varios virus inactivados.
  13. 13.
    La vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, en la que el antígeno o los antígenos virales comprenden uno o varios virus atenuados vivos.
  14. 14.
    Un polinucleótido aislado que comprende todo o parte de un segmento genómico o gen de un virus de la gripe de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de HA como se ha definido en la reivindicación 1 o reivindicación 3.
    5 15. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 14, en el que dicho polinucleótido se formula en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
  15. 16. Una construcción de expresión polinucleotídica que comprende un polinucleótido de la reivindicación 14. 10 17. Un polipéptido de HA aislado codificado por un polinucleótido de la reivindicación 14.
  16. 18. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 17, en el que dicho polipéptido se formula en un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220133877A1 (en) * 2019-02-27 2022-05-05 University Of Rochester Multivalent Live-attenuated Influenza Vaccine for Prevention and Control of Equine Influenza Virus (EIV) in Horses

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ562661A (en) * 2005-04-21 2010-04-30 Univ Florida Materials and methods for respiratory disease control in canines
US20080241184A1 (en) * 2005-08-25 2008-10-02 Jules Maarten Minke Canine influenza vaccines
US7682619B2 (en) 2006-04-06 2010-03-23 Cornell Research Foundation, Inc. Canine influenza virus
US7674469B2 (en) 2006-10-25 2010-03-09 Internet International B.V. Feline influenza vaccine and method of use
WO2011112593A1 (en) * 2010-03-10 2011-09-15 Intervet International B.V. Method for protecting against disease caused by secondary pathogens
CN101838708B (zh) * 2010-03-30 2012-07-18 华南农业大学 一种检测犬流感的方法
CN102220293B (zh) * 2011-05-26 2012-12-19 中国农业科学院上海兽医研究所 犬流感重组病毒及其制备方法和应用
CN103242433B (zh) * 2012-02-14 2016-12-14 中国医学科学院病原生物学研究所 一种腺病毒非结构蛋白免疫原、其抗体及应用
US10080792B2 (en) 2013-09-23 2018-09-25 Engen Bio, Inc. Influenza vaccine and therapy
CN104436157A (zh) 2013-09-23 2015-03-25 恩金生物有限公司 流感疫苗和治疗
CA2967532A1 (en) 2014-11-24 2016-06-02 Intervet International B.V. Inactivated equine influenza virus vaccines
JP2015120709A (ja) * 2015-01-09 2015-07-02 ラボラトリオ アヴィメキシコ エスエー ディーイー シーヴィーＬａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ａｖｉ−Ｍｅｘ，Ｓ．Ａ． Ｄｅ Ｃ．Ｖ． 遺伝子組み換え不活性化ウィルスベクターワクチン
CN104911150B (zh) * 2015-05-27 2018-05-01 华南农业大学 一种h3n2犬流感病毒的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及其单克隆抗体的制备与应用
CN106636475B (zh) * 2017-03-01 2020-05-22 中国农业大学 一种检测北美h3n8亚型犬流感病毒的引物组及其应用
WO2021236488A1 (en) * 2020-05-18 2021-11-25 Thomas Jefferson University Viral sample collection
MX2023003961A (es) * 2020-10-08 2023-06-02 Controlpoint Inc Metodos y aparatos para detectar infecciones respiratorias.
CN112410467A (zh) * 2020-11-23 2021-02-26 深圳市赛格诺生物科技有限公司 一种检测甲型和乙型流感病毒的冻干型荧光rt-pcr试剂及方法
WO2024196133A1 (ko) * 2023-03-21 2024-09-26 고려대학교 산학협력단 교차 면역원성을 갖는 h3 아형 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신
KR102746574B1 (ko) 2023-11-27 2024-12-24 김태윤 반려동물의 호흡기 건강 개선용 조성물
KR20250108327A (ko) 2024-01-08 2025-07-15 건국대학교 산학협력단 반려동물 치료를 위한 코삽입관 고정장치
US12233100B1 (en) 2024-10-31 2025-02-25 Tae Yoon Kim Composition for improving respiratory health of companion animals

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5034322A (en) 1983-01-17 1991-07-23 Monsanto Company Chimeric genes suitable for expression in plant cells
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5106739A (en) 1989-04-18 1992-04-21 Calgene, Inc. CaMv 355 enhanced mannopine synthase promoter and method for using same
US5994056A (en) 1991-05-02 1999-11-30 Roche Molecular Systems, Inc. Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection
US5612487A (en) 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
RU2193065C2 (ru) * 1994-03-14 2002-11-20 Мерк энд Ко. Инк. Конструкция днк (варианты), днк-вектор, иммуногенная композиция против вируса гриппа, способ индукции иммунного ответа, вакцина и способ вакцинации
GB9524395D0 (en) 1995-11-29 1996-01-31 Nickerson Biocem Ltd Promoters
EP0954582A1 (en) * 1996-04-29 1999-11-10 Andreas Prof. Zurbriggen Polynucleotide vaccine against canine distemper
FR2750865B1 (fr) * 1996-06-27 1998-12-04 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus canin, notamment contre la maladie de carre, la rage ou le virus parainfluenza de type 2
US6252139B1 (en) 1996-07-18 2001-06-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of increasing growth and yield in plants
US6063385A (en) 1997-11-07 2000-05-16 Wisconsin Alumni Research Foundation DNA vaccine for parvovirus
US6472375B1 (en) 1998-04-16 2002-10-29 John Wayne Cancer Institute DNA vaccine and methods for its use
GB9809666D0 (en) * 1998-05-06 1998-07-01 Isis Innovation Modified viruses
US6177082B1 (en) 1998-08-13 2001-01-23 The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Cold-adapted equine influenza viruses
ATE317431T1 (de) 1998-11-24 2006-02-15 Pioneer Hi Bred Int Wurzelspezifische promotoren und ihre anwendung
EP1035209A1 (en) * 1999-03-06 2000-09-13 ARTEMIS Pharmaceuticals GmbH Stable recombinant influenza viruses free of helper viruses
GB9916794D0 (en) * 1999-07-16 1999-09-22 Isis Innovation In vitro virus reconstitution
CA2380514A1 (en) * 1999-07-30 2001-02-08 George Gow Brownlee Attenuated influenza virus useful as vaccine
US6398774B1 (en) 1999-09-29 2002-06-04 Heska Corporation Intranasal delivery system
DE19960843A1 (de) 1999-12-16 2001-06-28 Florian Grundler Wurzelspezifischer Promotor
AU2001249300B2 (en) * 2000-04-03 2006-02-16 The University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Cold-adapted equine influenza viruses
CA2412621A1 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 American Cyanamid Company Rescue of canine distemper virus from cdna
US6455760B1 (en) 2000-11-16 2002-09-24 The Salk Institute Of Biological Studies Expression of flavin-containing monoxygenases in plants
US20040067506A1 (en) 2000-12-04 2004-04-08 Ben Scheres Novel root specific promoter driving the expression of a novel lrr receptor-like kinase
HU228690B1 (en) * 2001-07-27 2013-05-28 Wyeth Corp West nile vaccine
KR101113432B1 (ko) * 2002-02-13 2012-02-29 위스콘신 얼럼나이 리서어치 화운데이션 인플루엔자 바이러스 벡터의 패키징을 위한 신호
US7285656B2 (en) 2002-04-26 2007-10-23 Her Majesty The Queen In Right Of Canada, As Represented By The Minister Of Natural Resources Canada, Canadian Forest Service Root-specific conifer gene promoter and its use
DK1499348T3 (en) * 2002-04-26 2015-01-05 Medimmune Llc PROCEDURE FOR PREPARING INFECTIOUS INFLUENZA B-VIRA IN CELL CULTURE
AU2003294533A1 (en) * 2002-12-19 2004-07-14 Universite Laval Molecular methods and compositions for detecting and quantifying respiratory viruses
US20040123349A1 (en) 2002-12-20 2004-06-24 Qi Xie SINAT5, an Arabidopsis thaliana gene promotes ubiquitin related degradation
JP2004285019A (ja) * 2003-03-25 2004-10-14 Kyoto Prefecture 生体外異物の不活化方法
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
CA2551489C (en) * 2003-12-23 2013-09-03 Gregory Duke Multi plasmid system for the production of influenza virus
WO2006073436A2 (en) * 2004-04-29 2006-07-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Mass tag pcr for multiplex diagnostics
NZ562661A (en) * 2005-04-21 2010-04-30 Univ Florida Materials and methods for respiratory disease control in canines

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20220133877A1 (en) * 2019-02-27 2022-05-05 University Of Rochester Multivalent Live-attenuated Influenza Vaccine for Prevention and Control of Equine Influenza Virus (EIV) in Horses
US12350328B2 (en) * 2019-02-27 2025-07-08 University Of Rochester Multivalent live-attenuated influenza vaccine for prevention and control of equine influenza virus (EIV) in horses

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JP6220361B2 (ja) 2017-10-25
EP1945659B1 (en) 2012-08-15
NZ735684A (en) 2020-04-24
IL226253A0 (en) 2013-06-27
HK1118563A1 (en) 2009-02-13
KR20130048800A (ko) 2013-05-10
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CA2626489A1 (en) 2007-04-26
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