BRPI0618054A2 - planta, método para obter uma planta, que seja resistente a um patógeno de origem viral, bacteriana, fúngica ou oomiceto, e gene hsk de planta mutada - Google Patents
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Abstract
<B> PLANTA, MéTODO PARA OBTER UMA PLANTA, QUE SEJA RESISTENTE A UM PATóGENO DE ORIGEM VIRAL, BACTERIANA, FúNGICA OU OOMICETO, E GENE HSK DE PLANTA MUTADA<D> A presente invenção está relacionada a uma planta, a qual é resistente a um patógeno de origem viral, bacteriana, fúngica ou oomiceto, onde a planta possui um aumentado nível de homoserina como comparado a uma planta que não seja resistência ao referido patógeno, em partícula a organismos do phylium Oomycota. A invenção também está relacionada a um método para a obtenção de uma planta, a qual é resistente a um patógeno de origem viral, baçteriana, fúngica ou oomíceto, que compreende aumentar o nível endógeno de homoserina na planta.
Description
PLANTA, MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA, QUE SEJA RESISTENTE AUM PATÓGENO DE ORIGEM VIRAL, BACTERIANAf FÚNGICA OUOOMICETO, E GENE HSK DE PLANTA MUTADA
A presente invenção está relacionada a plantasresistentes a doenças, em particular plantas resistentes aorganismos da phylum Oomycota, os oomicetos. A invençãotambém está relacionada a genes vegetais que conferemresistência a doenças e a métodos de obter tais plantasresistentes a tais doenças para fornecer proteção contrapatógenos Oomycota.
A resistência de plantas a patógenos tem sidoestudada extensivamente, tanto quanto ao patógenoespecifico e ampla resistência. Em muitos casos aresistência é especificada pelos genes dominantes pararesistência. Muitos desses genes de resistência raça-especifico ou de resistência gene-gene têm sidoreconhecidos mediar o reconhecimento do patógeno medianteinteragir diretamente ou indiretamente com os produtosgenéticos da virulência ou outras moléculas provenientes dopatógeno. Esse reconhecimento leva a ativação de uma amplafaixa de diferentes respostas vegetais que impedem ocrescimento do patógeno.
Na geração das plantas existe um esforço constantepara identificar novas fontes dos genes dominantes deresistência principalmente monogênicos. Em cultivares comgenes de resistência única recém introduzidos, a proteçãocontra doenças é freqüentemente rapidamente quebrada,porque os patógenos envolvem e se adaptam numa altafreqüência e recuperam a capacidade para infectar a plantahospedeira. Portanto, é altamente necessária adisponibilidade de novas fontes de resistência a doenças.
Mecanismos alternativos de resistência atuam, porexemplo, através da modulação da resposta defensiva emplantas, tais como a resistência mediadas pelo gene miorecessivo em cevada ao pó do bolor do patógeno em Blumeriagraminis f.sp. hordei. Plantas portadoras de alelos imitadosdo gene MLO tipo selvagem apresentam quase completaresistência coincidente com o aborto da tentativa fúngicade penetração da parede celular das células epidérmicas aoataque simples. O gene MLO tipo selvagem desse modo atuacomo um regulador negativo da resposta patogênica. Istoestá descrito em W09804586.
Outros exemplos são os genes recessivos deresistência ao pó de mofo, encontrados numa classificaçãode perda da suscetibilidade ao Erysiphe cichora cearum. Trêsgenes foram clonados até o momento, denominado PMR6, quecodifica uma proteína tipo pectate lyase, PMR4 que codificauma syntase callose, e PMR5 que codifica uma proteína defunção desconhecida. Ambos os genes mio e pmr aparentamespecificamente conferir resistência ao pó de mofo e nãoaos oomicetos tais como os bolores felpudos.A resistência ampla a patógenos, ou formassistêmicas de resistência tais como SAR, têm sido obtidasatravés de dois modos principais. 0 primeiro é a mutação dereguladores negativos de defesa da planta e morte celular,tal como nos mutantes cpr, Isd e acd da Arabidopsis. 0segundo e através da superexpressão transgênica deindutores ou reguladores de defesa da planta, tal como emplantas que superexpressam NPRl .
A desvantagem desses mecanismos de resistênciaconhecidos é que, além da resistência patogênica, essasplantas freqüentemente apresentam detectáveis fenótiposadicionais e indesejáveis, tais como crescimento atrofiadoou a formação espontânea de células mortas.
É ura objetivo da presente invenção proporcionar umaforma de resistência que seja ampla, durável e nãoassociada com fenótipos indesejáveis.
Na pesquisa que levou à presente invenção, umaclassificação de mutante Arabidopsis thaliana foi realizadaquanto à suscetibilidade reduzida ao patógeno do bolorfelpudo Hyaloperonospora parasitica. Mutantes EMS foramgerados na altamente suscetível linhagem Arabidopsis Leredsl-2. Oito mutantes resistentes ao bolor felpudo (dmr)foram analisados em detalhes, correspondente a 6 diferenteslocais. A análise microscópica mostrou que em todos osmutantes o crescimento da H.parasitica foi severamentereduzido. A resistência de dmr3, dmr4 e dmr5 estavaassociada com a ativação constitutiva da defesa da planta.Além disso, dmr3 e dmr4, mas não dmr5, foram tambémresistentes ao Pseudomonas syringae e Golovinomycesorontii.
Em contraste, a aprimorada ativação da defesa da
planta não foi observada nos mutantes dmrl, dmr.2, e dmr6.os resultados dessa pesquisa foram descritos em Van Damme eoutros (2005) Molecular Plant-Microbe Interactions 18(6)583-592. Esse artigo, todavia, não revela a identificação ea caracterização dos genes DMR.
De acordo com a presente invenção, foi agoradescoberto que DMRl é um gene que codifica quinasehomoserina (HSK). Para a Arabidopsis cinco diferentesalelos dmrl mutantes foram seqüenciados cada um conduzindoa uma diferente medição aminoácido na proteína HSK. HSK éuma importante enzima chave na bio-síntese de aminoácidosmetionina, treonina e isoleucina e é, portanto, acreditadaser essencial. Os diversos mutantes dmrl apresentamdefeitos na HSK que induz as plantas a acumular homoserina.Os cinco diferentes alelos apresentam diferentes niveis deresistência que se correlacionam aos diferentes niveis deacumulação de homoserina nos mutantes.
A presente invenção proporciona desse modo umaplanta, a qual é resistente a um patógeno de origem viral,bacteriana, ou fúngica, caracterizada pelo fato de que aplanta possui um nivel alterado de homoserina comocomparado a uma planta que não é resistente ao referidopatógeno.
Essa forma de resistência é em particular eficazcontra patógenos de phylum Oomycota, tais como espéciesAlbugof Aphanomycesr Basidiophora , BremiafHyaloperonospora , Pachymetra, Paraperonospora, Perofascia,Peronophythoraf Peronosporaf Peronosclerosporaf PhytiumfPhytophthora f Plasmoparaf Protobremiaf Pseudoperonospora ,Sclerosporaf Viennotia.
A resistência está baseada em um nivel alterado dehomoserina nas plantas. Mais em particular, a resistênciaestá baseada em um nivel aumentado de homoserina na planta.Tais níveis aumentados podem ser conseguidos de diversosmodos.
Primeiro, a homoserina pode ser provida por meio deuma fonte externa. Segundo, o nível endógeno de homoserinapode ser aumentado. Isso pode ser conseguido através dorebaixamento da atividade enzimática do gene homoserinaquinase que leva a uma mais baixa conversão da homoserina edesse modo a uma acumulação dela. De modo alternativo, aexpressão da enzima homoserina quinase pode ser reduzida.Isso também leva a uma mais baixa conversão da homoserina edesse modo a uma acumulação dela. Um outro meio paraaumentar o nível endógeno de homoserina é mediante aumentarsua bio-síntese por meio da rota aspartato. A redução daexpressão do gene homoserina quinase pode propriamente serconseguido através de diversos modos, ou diretamente, talcomo pelo silenciamento do gene., ou indiretamente mediantemodificar as suas seqüências regulatórias ou medianteestimular a repressão do gene.
A modulação do gene HSK para rebaixar sua atividadeou expressão pode ser conseguida em diversos níveis.Primeiro, o gene endógeno pode ser diretamente mutado. Issopode ser conseguido através de um tratamento mutagênico. Demodo alternativo, um gene HSK modificado pode serintroduzido na planta por meio de técnicas trangênicas oumediante introgressão, ou a expressão de HSK pode serreduzida ao nível regulatório, por exemplo, mediantemodificar as seqüências regulatórias ou através dosilenciamento do gene.
Em uma modalidade da invenção, um aumento(acumulação) no nível de homoserina na planta é conseguidomediante administração de homoserina à planta. Isso é feitode modo adequado mediante tratar as plantas com L-homoserina, por exemplo, através da aspersão ou infiltraçãocom uma solução de homoserina.
O tratamento de uma planta com homoserina exógena éconhecido de WO 00/70016. Essa publicação revela como ahomoserina é aplicada a uma planta resultando num aumentona concentração de fenol na planta. A publicação não mostraque as plantas assim tratadas são resistentes a patógenos.De fato, WO 00/70016 não revela nem sugere que ura aumentona homoserina endógena possa levar à resistência apatógeno.
De modo alternativo, a homoserina endógena éaumentada mediante modular as rotas bio-sintéticas oumetabólicas dos aminoácidos da planta.
Em uma modalidade, a aumentada produção endógena éo resultado de uma reduzida expressão do gene HSK endógenoconduzindo desse modo a uma menor eficiência de conversãoda homoserina na forma de fosfo-homoserina e a subseqüentebio-síntese de metionina e treonina. Essa reduzidaexpressão de HSK é, por exemplo, o resultado de uma mutaçãono gene HSK que leva à reduzida estabilidade do mRNA ouproteína.
Em uma outra modalidade, a reduzida expressão podeser conseguida através da sub-regulação da expressão dogene HSK ou ao nível transcricional ou traducional, porexemplo, através do silenciamento do gene ou através demutações nas seqüências regulatórias que influenciam aexpressão do gene HSK. Um exemplo de um método de conseguiro silenciamento do gene é por meio de RNAi.
Em uma modalidade adicional o aumento do nível dahomoserina endógena pode ser obtido mediante induziralterações na bio-síntese ou no metabolismo da homoserina.Numa modalidade particular isto é conseguido através demutações na seqüência codificadora de HASK que resulta numaproteína HSK com uma reduzida atividade enzimáticaconduzindo desse modo a uma mais baixa conversão dahomoserina em fosfo-homoserina. Uma outra modalidade é asobre-regulação dos genes na rota aspartato induzindo umamaior produção e desse modo acúmulo da L-homoserina naplanta.
Essa invenção está baseada na pesquisa realizada arespeito da resistência a Hyaloperonospora parasitica inArabidopsis mas é um conceito geral que pode ser aplicadade modo mais generalizado em vegetais, em particular emplantas de colheita que sejam suscetíveis a infecções compatógenos, tais como Oomycota.
A invenção é adequada para um grande número dedoenças vegetais induzidas por oomicetos tais como, mas nãolimitado a, Bremia Iactucae em alface, Peronospora farinosaem espinafre, Pseudoperonospoxa cubensis em membros dafamília das Cucurbitaceae family, por exemplo, pepino,Peronospora destruidor de cebola, Hyaloperonosporaparasitica em membros da família das Brasicaceae , porexemplo, repolho, Plasmopara viticola em uvas, Phytophthorainfestans em tomate e batatas, e Phytophthora sojae nasoja.
0 nível de homoserina nessas outras plantas podeser aumentado com todas as técnicas descritas acima.Todavia, quando a modificação da expressão do gene em umaplanta é para ser conseguida através da modificaçãogenética do gene HSK ou por via da identificação demutações no gene HSK, e o gene não é ainda conhecido eleprecisa primeiramente ser identificado. Para gerar plantaspatógeno-resistente, em particular plantas de culturas,através da modificação genética do gene HSK ou por meio daidentificação das mutações no gene HSK, os genes HSKortólogos precisam ser isolados dessas espécies vegetais.Ortólogos são definidos como genes ou proteínasprovenientes de outros organismos que possuem a mesma função.
Diversos métodos são disponíveis para aidentificação das seqüências ortólogas em outras plantas.
Um método de identificação das seqüências HSKortólogas nas espécies vegetais, pode por exemplo,compreender a identificação de homoserina quinaseestruturas das espécies vegetais numa base de dados;designação de iniciadores para a ampliação do transcritohomoserina quinase completo ou cDNA; realizar experimentosde ampliação com os iniciadores para obter o correspondentetranscrito completo ou cDNA; e determinar a seqüêncianucleotídica do transcrito ou cDNA.
Métodos adequados para a ampliação do transcritocompleto ou cDNA em situações onde apenas parte daseqüência codificadora é conhecida são as técnicas PCRavançadas 5'RACE, 3'RACE, TAIL-PCR, RLM-RACE and vectorette PCR.
De modo alternativo, se não são disponíveisseqüências nucleotídicas para as espécies vegetais deinteresse, os iniciadores são designados no gene HSK de umaespécie vegetal intimamente relacionada com a planta deinteresse, com base nos domínios conservados comodeterminado pelo alinhamento de múltiplas seqüênciasnucleotídicas, e usadas para ampliar o PCR da seqüênciaortóloga. Tais iniciadores são adequadamente iniciadoresdegenerados.
Um outro método confiável para avaliar uma dadaseqüência como sendo ortóloga HSK é pela identificação domelhor acaso recíproco. Uma seqüência HSK ortólogacandidata de uma dada espécie vegetal é identificada como omelhor acaso a partir das bases de dados DNA quando aprocura com a proteína HSK Arabidopsis ou seqüência DNA, ouaquela de uma outra espécie vegetal, usando um programaBlast. A seqüência nucleotídica ortóloga candidata obtidada dada espécie vegetal é usada para investigar homologia atodas as proteínas Arabidopsis presentes nas bases de dadosDNA (por exemplo, em NCBI ou TAIR) usando o método depesquisa BlastX. Se o melhor acaso e pontuação é para aproteína HSK da Arabidopsis, a dada seqüência DNA pode serdescrita como sendo um ortólogo, ou seqüência ortóloga.
HSK é codificada por um único gene em Arabidopsis earroz como deduzido a partir das seqüências genômicascompletas que estão publicamente disponíveis para essasespécies vegetais. Na maioria das outras espécies vegetaistestadas até o momento, HSK aparece estar codificado por umúnico gene, como determinado pela análise das seqüênciasmRNA e dados EST a partir das bases de dados públicas deCNA, exceto para batata, tabaco e álamo para as quais doishomólogos HSK foram identificados. Os genes ortólogos eproteínas são identificados nessas plantas através decomparações de nucleotídeo e aminoácidos com a informaçãoque está presente nas bases de dados públicas.
De modo alternativo, se não estão disponíveisseqüências DNA para as espécies vegetais desejadas, asseqüências ortólogas são isoladas através de hibridizaçãoheteróloga usando sondas DNA do gene HSK de Arabidopsis ouuma outra planta ou por meio de métodos PCR, fazendo uso dedomínios conservados na seqüência codificadora de HSK paradefinir os iniciadores. Para muitas espécies de plantações,seqüências parciais HSK mRNA são disponíveis que podem serusadas para designar iniciadores para em seguida amplificarpor PCR as completas seqüências mRNa ou genômicas para aanálise da seqüência de DNA.
Numa modalidade específica o ortólogo é um gene doqual a programa codificada apresenta pelo menos 50% deidentidade com a proteína HSK da Arabidopsis ou aquela deoutras proteínas HSK vegetais. Numa modalidade maisespecífica a homologia é de pelo menos 55%, maisespecificamente de pelo menos 60%, ainda maisespecificamente de pelo menos 65%, de pelo menos 70%, depelo menos 75%, de pelo menos 80%, de pelo menos 85%, depelo menos 90%, de pelo menos 95% ou de pelo menos 99%.
A Figura 1 mostra seqüências HSK ortólogas queforam identificada em bases de dados disponíveispublicamente e obtidas por ampliação PCR em cDNA esubseqüente seqüenciamento.
Após as seqüências HSK ortólogas seremidentificadas, a seqüência nucleotídica completa daseqüência regulatória e codificadora do gene é identificadaatravés de técnicas biológicas moleculares padrões. Paraisto, bibliotecas genômicas das espécies vegetais sãoclassificadas por hibridização DNA ou PCR com sondas ouiniciadores derivados a partir de gene homoserina quinaseconhecido, tal como as sondas e iniciadores descritosacima, para identificar os clones genômicos contendo o geneHSK. De modo alternativo, métodos avançados de PCR, taiscomo RACE mediado por RNA ligase (RLM-RACE) , podem serusados para amplificar diretamente o gene e seqüências cDNAdo DNA genômico ou mRNA reverso-transcrito. Oseqüenciamento DNA resulta por conseqüência nacaracterização do gene completo ou seqüência codificadora.
Uma vez a seqüência DNA do gene seja conhecida essainformação é usada para preparar os meios para modular aexpressão do gene homoserina quinase era qualquer um dosmodos descritos acima.
Mais em particular, para conseguir uma reduzidaatividade HSK a expressão do gene HSK pode ser sub-reguladaou a atividade enzimática da proteína HSK pode ser reduzidaatravés de substituições aminoácidos resultantes dasalterações nucleotídeo na seqüência codificadora do HSK.
Em uma modalidade particular da invenção, a sub-regulação da expressão do gene HSK é conseguida pelosilenciamento do gene usando RNAi. Para isso, plantastransgênicas são geradas expressando um construto HSK anti-sentido, um construto micro-RNA otimizado, um construto derepetição invertido, ou um construto combinado sentido-anti-sentido de modo a gerar dsRNA correspondentes ao HSKque conduza ao silenciamento do gene.
Numa modalidade alternativa, um ou mais reguladoresdo gene HSK são sub-reguladas (em caso de ativadorestranscricionais) por RNAi.
Numa outra modalidade os reguladores são supra-regulados (no caso de proteínas repressoras) por meio dasuperexpressão transgênica. A superexpressão é conseguidanuma modalidade particular mediante expressar proteínasrepressoras do gene HSK a partir de um promotor poderoso,por exemplo, o promotor 35S que é comumente usado embiotecnologia vegetal.
A sub-regulação do gene HSK pode ser tambémconseguida por mutagênese dos elementos regulatórios nopromotor, região terminadora, ou introns potenciais.Mutações na seqüência codificadora de HSK em muitos casosleva a substituições aminoácidos ou prematuros códons deparada que influenciam negativamente a expressão ou aatividade da enzima HSK codificada.
Essas e outras mutações que influenciam a expressãode HSK são induzidas em plantas mediante utilizar químicasmutagênicas tais como sulfonato de etil metano (EMS), porirradiação do material vegetal com raios gama ou nêutronsrápidos, ou através de outros meios. As alteraçõesnucleotídicas resultantes são aleatórias, mas numa grandecoleção de plantas mutagenizadas as mutações no gene HSK'podem ser facilmente identificadas mediante utilizar ométodo TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes)method (McCallum e outros (2000) Targeted screening forinduced mutations. Nat. Biotechnol. 18, 455-457, e Henikoffe outros (2004) TILLING. Traditional mutagenesis meetsfunctional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636). Osprincípios desse método estão baseados na amplificação PCRdo gene de interesse ao do DNA genômico de uma grandecoleção mutagenizada de plantas na geração M2. através doseqüenciamento do DNA ou pela procura por mutações pontuaisusando nuclease específica de fita única, tal como CEL-Inuclease (Till e outros, (2004) Mismatch cleavage bysingle-strand specific nucleases. Nucleic Acids Res. 32,2 632-2 641) as plantas individuais que possuem uma mutaçãono gene de interesse são identificadas.
Mediante classificar muitas plantas, uma grandecoleção de alelos mutantes é obtida, cada um produzindo umdiferente efeito na expressão do gene ou atividade daenzima. A expressão do gene ou a atividade da enzima podemser testados através da análise dos níveis do transcritoHSK (por exemplo, através de RT-PCR), quantificação dosníveis de proteína HSK com anticorpos ou através da análisede. aminoácido, medição do acúmulo de homoserina como umresultado da reduzida atividade HSK. Esses métodos são bemconhecidos por aqueles usualmente versados na técnica.
Aqueles versados na técnica podem utilizar ostestes usuais de patógenos para ver se o acúmulo dehomoserina é suficiente para induzir resistênciapatogênica.
Plantas com a desejada atividade ou expressão HSKreduzida são então retro-cruzadas ou cruzadas a outraslinhagens de geração para transferir apenas o desejado novoalelo ao interior da base da produção desejada.
A invenção também está relacionada a genes HSKmutados que codificam proteínas HSK com uma atividadeenzimática reduzida. Numa modalidade particular, a invençãoestá relacionada aos alelos dmrl, dmrl-1, dmrl-2, dmrl-3,dmrl-4 e diarl-5 .
Em uma outra modalidade, a invenção estárelacionada a versões mutadas dos genes HSK de Lactucasativa, Vitis vinifera, Cucumis sativus, Spinacia oleraceae Solanum lycopersieum como mostrado nas Figuras 10-14.A presente invenção demonstra que plantas possuindoum aumentado nivel de homoserina apresentam resistência apatógenos, em particular de origem oomiceto. Com esseconhecimento aqueles versados na técnica podem ativamentemodificar o gene HSK por meio de abordagens mutagênese outransgênica, mas também identificar até agora variantesnaturais desconhecidas numa dada espécie vegetal queacumula homoserina ou que possuem variantes do gene HSK quelevam a um aumento na homoserina, e utilizar essasvariantes naturais de acordo com a invenção.
No presente pedido os termos 'homoserina quinase' e'HSK' são usados de modo intercambiável.
A presente invenção está ilustrada nos exemplosapresentados a seguir os quais não são pretendidos alimitar a invenção em nenhum modo. Nos exemplos é feitareferência às Figuras apresentadas a seguir.
A Figura 1 apresenta o alinhamento das seqüênciasaminoácidos das proteínas HSK da Arabidopsis thaliana eortólogos do Citrus sinensis, Populus trichocarpa (1),Populus trichocarpa (2), Solanum tuberosum (2), VitisViniferaf Lactuca sativa, Solanum tuberosum (I)f SolanumIycopersicumf Nicotiana benthamiana, Ipomoea nilf Glycinemaxf Phaseolus Vulgarisf Cucumis sativusf SpinaeiaOleraceaf Pinus taedaf Zea maysf e Oryza sativa usando oprograma de alinhamento de seqüência múltipla CLUSTAL W(1.82) multiple (EBI). Abaixo das seqüências, osaminoácidos conservados estão indicados por pontos, e osaminoácidos idênticos estão indicados por asteriscos. Ostriângulos pretos e o texto correspondente indicam osaminoácidos que estão substituídos nos cinco mutantes dmrda Arabidopsis.
A tabela 2 mostra os números de acesso ao Genbank eidentificadores GenInfo da Arabidopsis HSK mRNA eseqüências aortólogas provenientes de outras especiesvegetais.
A Figura 2 mostra a porcentagem de formação deconidiophoro por meio de dois isolados de Hyaloperonosporaparasitica, Cala2 e Waco9, nos mutantes dmr1-1, dmrl-2,dmrl-3 e dmrl-4 e a linha parental, Ler edsl-2, 1 dias pós-inoculação. Os conidiophoros formados na linha parentalforam ajustados para 100%.
A Figura 3 é um gráfico da visão geral das trêsetapas principais na clonagem de DMRl. a) Mapeamentoinicial de dmrl resultou no posicionamento do local nobraço inferior do cromossomo 2 entre as posicoes 7,42 e7,56 Mb. Três marcadores inserto/apagamento (INDEL) foramdesignados (a posição dos marcadores F6P23, T23A1 e F5J6está indicada pelas linhas pretas). Esses marcadores foramusados para identificar recombinantes proveniente dediversas 100 plantas segregantes F2 e F3. Seqüênciasiniciadoras desses marcadores INDEL e marcadores adicionaispara identificar os pontos de ruptura nos recombinantescoletados se apresenta na Tabela 3. b) Um marcador,At2gl7270 (indicado pela linha cinza) , apresentou a maisforte ligação com resistência. 0 local de dmrl pode sertambém delimitado a uma região contendo 8 genes, at2gl7250-at2gl7290. Os oito genes foram amplificados e seqüenciadospara a procura de mutações nas seqüências codificadorasusando os iniciadores descritos na tabela 4. A análise daseqüência DNA de todos os 8 genes candidatos leva àdescoberta de mutações pontuais no gene At2gl7265 em todosos mutantes dmrl. c) Cada mutante dmrl possui uma mutaçãopontual numa posição diferente no gene At2gl7265, quecodifica homoserina quinase.
A Figura 4 mostra um desenhos esquemático daseqüência codificadora de HSK e as posições e substituiçõesnucleotídeo das 5 diferentes mutações dmrl na seqüênciacodificadora de HSK (as posições do nucleotídeo, indicadaspelos triângulos pretos, são relativas ao códon de partidaATG que começa na posição 1). A 5'UTR e 3'UTR são mostradospelas caixas cinza claro. Abaixo da seqüência nucleotídeo aseqüência proteína é mostrada. A proteína HSK contém umaseqüência putativa de trânsito para alvo em cloroplasto(parte cinza escuro). As alterações aminoácidos resultantesdas mutações 5 dmrl estão indicadas em seu número deposição aminoácido (aa) (triângulos pretos) na proteínaHSK.
A Figura 5 mostra a posição da enzima homoserinaquinase na rota aspartato para a bio-síntese dosaminoácidos treonina, metionina e isoleucina.
A Figura 6 mostra o número de conidióforos pormudas Ler edsl-2 5 dias pós-inoculação com dois diferentesisolados de H. parasitica, Waco9 e Cala2, As mudasinoculadas foram infiltradas com dH20, D-homoserina (5mM)ou L-homoserina (5 mM) a 3 dias pós-inoculação com opatógeno. As mudas tratadas com L-homoserina apresentau umacompleta ausência de formação de conidióforo e são dessemodo resistentes..
A Figura 7 mostra o crescimento e o desenvolvimentode H. parasitica em mudas tratadas com água, D-homoserina(5 mM), ou L-homoserina (5 mM) como analisado pormicroscopia em mudas manchadas com trypan blue.
A: Formação de conidióforo após tratamento HS emmudas Ler edsl-2 (ampliação 10X). Não foi detectadaformação de conidióforo após infiltração de L-homoserina,enquanto que as plantas controle apresentam abundantecriação de esporos.
B: Desenvolvimento Haustorial é influenciado porinfiltração de L-homoserina (5 mM) (ampliação 40x), mas nãoem plantas tratadas com água ou D-homoserina.
A Figura 8 e Figura 9 apresentam seqüêncianucleotideo e aminoácido do gene homoserina quinase(At2gl72 65, Nm_127281/ GI:18398362) e proteína (At2gl7265,NP_17 9318, GI:15227800) de Arabidopsis thaliana,respectivamente.
A Figura 10 mostra a seqüência nucleotideo eaminoácido previstas da seqüência codificadora dahomoserina quinase (CDS) e proteína, respectivamente, deLactuca sativa.
A Figura 11 mostra a seqüência nucleotideo eaminoácido previstas da seqüência codificadora dahomoserina quinase (CDS) e proteína, respectivamente, deVitis vinifera.
A Figura 12 mostra a seqüência nucleotideo eaminoácido previstas da seqüência codificadora dahomoserina quinase (CDS) e proteína, respectivamente, deCucumis sativus.
A Figura 13 mostra a seqüência nucleotideo eaminoácido previstas da seqüência codificadora dahomoserina quinase (CDS) e proteína, respectivamente, daSpinacia oleracea.
A Figura 14 mostra a seqüência nucleotideo eaminoácido previstas da seqüência codificadora dahomoserina quinase (CDS) e proteína, respectivamente, daSolanum lycopersicum.
Exemplos
Exemplo 1
Caracterização do gene responsável pela resistência apatógeno em mutantes dmr
Van Damme e outros, 2005, supra revela quatromutantes, dmrl-1, dxnrl-2, dmrl-3 e dmrl-4 que sãoresistentes a H. parasitica. 0 nível de resistência podeser avaliado mediante contagem dos conidióforos por folhadamuda sete dias pós-inoculação com o isolado H. parasiticaCala2 (obtido do Dr. E. Holub (Warwick HRI, Wellesbourne,UK ou Dr. G. Van den Ackerveken, Department of Biology,University of Utrecht., Utrecht, NL) . Para a linhagemparental, Ler edsl-2 (Parker e outros, 1996, Plant Cell8:2033-2046), que é altamente suscetível, o número deconidióforos é ajustado a 100%. A redução na formação deconidióforo nos mutantes dmrl infectados comparado às mudasda linhagem parental é mostrado na Figura 2.
De acordo com a invenção, o gene responsável pelaresistência a H.parasitica nos mutantes cdmrl de van Dammee .outros, 2005, supra, foi clonado por meio de umacombinação de mapeamento e seqüenciamento dos genescandidatos.
DMRl foi isolado através de clonagem baseado nomapa. Os mutantes dmrl foram cruzados ao mutante FN2Colesterol-O para gerar uma população mapeada. 0 mutanteFN2 é suscetível ao isolado de H.parasitica Cala2, devido auma rápida mutação neutrônica no gene RPP2A (Sinapidou eoutros, 2004, Plant J. 38:898-909). Todos os 5 mutantesdmrl carregam mutações recessivas únicas como as plantas Fleram suscetíveis, e aproximadamente um quarto das plantasF2 apresentaram resistência a H.parasitica.O procedimento de clonagem de DMRl é ilustrado naFigura 3 e descrito em mais detalhes adiante. A posição nomapa do local dmrl foi primeiramente determinada pelagenotipagem de 48 plantas resistentes F2 a seremposicionadas no braço inferior do cromossomo 2. A partir daclassificação adicional para novos recombinantes em 650plantas F2 ~90 plantas F2 recombinantes entre doismarcadores INDEL (inserção/apagamento) em BAC T24I12 a 7,2Mb e BAC F5J6 a 7,56 Mb (de acordo com a versão 5.0 deliberação do genoma Arabidopsis TIGR de janeiro de 2004)foram identificados, o que permitiu mapear o gene a umaregião contendo um contingente de 5 BACs.
As plantas F2 foram genotipadas e a geração F3 foifenotipada a fim de refinar o mapa de posicionamento dedmrl. A mutação de dmrl pode ser mapeada a uma região ~130kb (abrangendo 3 sobreposições de clones BAC: F6P23, T23A1e F5J6) entre dois marcadores INDEL situados em BAC F6P23,a 7,42 Mb e F5J6 a 77,56 Mb (de acordo com a versão 5.0 deliberação do genoma Arabidopsis TIGR de janeiro de 2004).Isso resultou numa área de 30 genes putativos candidatospara o local dmrl, entre os genes Arabidopsis com oscódigos TAIR AT2gl7060 e AT2gl7380. Marcadores deseqüências polimórficas amplificadas adicionalmenteclivadas (CAPS) foram projetados com base nos SPNs ligadosaos genes AT2gl7190, AT2gl7200, AT2gl7270, At2gl7300,At2gl7310 e At2gl7360.As análises dos 5 recombinantes remanescentes nessaregião com esses dados de marcador CAPS deixam 8 genescandidatos, At2gl7230 (NM_127277, GI : 30679913)At2gl7240 (NMJL27278, GI : 30679916) , At2gl7250(NM_12727 9, GI : 22325730) , At2gl7260 (NM_127280,GI:30679922) , At2gl7265 (NMJL27281, GI : 18398362 ),At2gl7270 (NMJL27282, GI : 30679927 ), At2gl7280(NMJL27283, GI : 42569096), At2gl7290 (NMJL27284, GI:30679934 ). O seqüenciamento de todos os 8 genes resultouna descobertas de mutações pontuais no gene codificadorAT2gl7265 nos cinco alelos dmrl; dmrl-1, dmrl-2, drnrl-3,dmrl-4 e dmrl-5, demonstrando claramente que At2gl72 65 éDMRl. A Figura 3 mostra um esquema de dmrl com mutaçõespontuais de diferentes alelos.
At2gl7265 codifica a enzima homoserina quinase(HSK) de longe o único gene Arabidopsis que apresenta essafunção.
Na ArabidopsisHSK é codificada por um único gene,At2gl7265 (Lee & Leustek, 1999, Arch. Biochem. Biophys.372: 135-142). HSK é a quarta enzima na rota aspartatorequerida para a bio-sintese dos aminoácidos metionina,treonina e isoleucina. HSK catalisa a fosforilação dahomoserina a fosfato de homoserina (Figura 5).
Exemplo 2
Análise de Aminoácido
O fosfato de homoserina é um intermediário naprodução de metionina, isoleucina e treonina naArabidopsis. Uma vez que a homoserina quinase tem um papelimportante na produção de aminoácidos, os níveis deaminoácido livre foram determinados na linhagem parentalLer edsl-2 e em quatro diferentes mutantes dmrl. Para istoaminoácidos provenientes de folhas totais foram extraídoscom 80% metanol, seguido por uma segunda extremidade com20% metanol. Os extratos combinados foram secados edissolvidos em água. Após a adição do padrão interno, osaminoácidos S-amino-etil-cisteína (SAEC) foram detectadosatravés de cromatografia de troca iônica automatizada comderivação pós-coluna ninhydrin em um AminoTac JOEL JLC-500/V (Tóquio, Japão).
A análise de aminoácidos de quatro diferentesmutantes dmrl e da linhagem parental. Ler edsl-2apresentaram uma acumulação de homoserina nos mutantesdmrl, enquanto que esse aminoácido intermediário não foidetectável na linhagem parental Ler edsl-2. Não houveredução no nível de metionina, isoleucina e treonina nosmutantes dmrl (Tabela 1).
Tabela 1
Concentração (em pmol/mg peso puro) de homoserina,metionina, treonina e isoleucina nas partes acima do solode' mudas de 2 semanas de idade da linhagem parental Leredsl-2 e dos mutantes dmrl-1, dmrl-2, dmrl-3, e drnrl-4.<table>table see original document page 26</column></row><table>
Devido à reduzida atividade da HSK nos mutantesdmrl, a homoserina se acumula. Esse efeito pode ser aindaestimulado por um influxo mais forte de aspartato aointerior da rota que conduz a um nível ainda maior dehomoserina. A alta concentração de homoserina no substratopode ainda permitir suficiente fosforilação da HSK mutadatal que os níveis de metionina, isoleucina e treonina nãosejam reduzidos nos mutantes dmrl e na linhagem parental,Ler edsl-2 (Tabela 1).
Exemplo 3
Resistência patógeno é conseguida pela aplicação de L-homoserina
Para testar se o efeito é específico para ahomoserina o estéreo-isômero D-homoserina foi testado.
Mudas integrais foram infiltradas com água, 5 mM D-homoserina e 5 mM L-homoserina. Apenas tratamento com oaminoácido natural L-homoserina resultou na resistência aH.paxasitica. Mudas tratadas com água ou D-homoserina nãoapresentaram uma grande redução no crescimento de patógenoe foram suscetíveis a H.parasitica. A infiltração foiaplicada a dois acessos Arabidopsis, Ler edsl-2 e Ws edsl--1, suscetíveis a Cala2 e Waco9/ respectivamente. A formaçãode conidióforo foi determinada como um indicador para a.suscetibilidade a H. parasitica. Os conidióforos foramcoritados 5 dias pós-inoculação com H.parasitica e 2 diaspós-infiltrção com água, D-homoserina ou L-homoserina.(Figura 6) . A infiltração L-homoserina claramente resultana redução da formação de conidióforo e resistência aH.parasitica. Isto foi também confirmado pelo estudo docrescimento do patógeno em planta por manchamento portryptan blue de mudas de Arabidopsis. As plantas foraminoculadas com isolado Cala2. dois dias depois as plantasforam tratadas por infiltração com água, 5 mM D-homoserina,e 5 mM L-homoserina. Os sintomas foram pontuados 5 diaspós-inoculação e mostrou claramente que apenas as mudasinfiltradas com L-homoserina apresentaram um crescimento depatógeno fortemente reduzido e sem formação de conidióforo(Figura 7) .
A análise microscópica mostrou que apenas em folhastratadas com L-homoserina a haustoria, estruturasalimentares que são produzidas por H.parasitica durante oprocesso de infecção, são perturbadas. Novamente é mostradoque níveis aumentados de homoserina na planta levam àresistência ao patógeno.Exemplo 4
Identificação de ortólogos HSK em produção
1. Classificação de bibliotecas com base na homologia deseqüência
as seqüências nucleotideo e aminoácidos do genehomoserina quinase e proteína de Arabidopsis thaliana sãomostradas nas Figuras 8 e 9.
Bibliotecas publicas de seqüências nucleotideo eaminoácidos foram comparadas com as seqüências da Figura 8e 9. Essa comparação resultou na identificação dascompletas seqüências codificadoras de HSK e seqüênciasaminoácidos previstas no Citrus sinensis, Populustrichocarpa (1), Populus trichocarpa (2), Solanum tuberosum(2), Solanum tuberosum (I)r Nicotiana benthamiana, Ipomoeanil, Glycine max, Phaseolus vulgaris, Pinus taeda, Zeamays, e Oryza sativa. A informação da seqüência dasproteínas ortólogas assim identificadas é dada na Figura 1.Para muitas outras espécies vegetais ortólogas fragmentosde DNA podem ser identificados por BlastX como melhoresacasos recíprocos para a Arabidopsis ou outras seqüênciasde proteína HSK vegetal.
2. Identificação de ortólogos por meio de hibridizaçãoheteróloga
A seqüência DNA da HSK da Arabidopsis thaliana comomostrado na Figura 8 é usada como uma sonda para procurarpor seqüências homólogas mediante hibridização ao DNA ouquaisquer espécies vegetais usando métodos utilizando essemétodo genes ortólogos são detectados pela . hibridizaçãosouthern em DNA digerido por enzima de restrição ou porhibridização a bibliotecas genômicas ou cDNA. Essastécnicas são bem conhecidas por aqueles usualmente versadosna técnica. Como uma sonda alternativa a seqüência DNA daHSK de quaisquer outras espécies mais intimamenterelacionada pode ser usada como uma sonda.3. Identificação de ortólogos por meio de PCR
Para muitas espécies de colheitas, seqüências degene ou mRNA da HSK são disponíveis as quais são usadaspara designar iniciadores para em seguida amplificar porPCR a completa seqüência cDNA ou genômica. Quandoseqüências 5' e 3' são disponíveis a seqüência internaperdida é amplificada por PCR por meio de um iniciadordireto 5' específico e iniciador reverso 3' . No caso ondeapenas seqüências 5', interna ou 3' são disponíveis, ambosos iniciadores direto e reverso são designados. Emcombinação com iniciadores poliarticuladores plasmídeosdisponíveis, os insertos são amplificados a partir debibliotecas genômicas e cDNA das espécies vegetais deinteresse. Num modo similar, a perda de seqüências 5' e 3'são amplificadas por técnicas PCR avançadas; 5'-RACE, 3'-RACE, TAIL-PCR, RLM-RACE ou vetorete PCR.
Como um exemplo o seqüenciamento do cDNA da HSK deLactuca sativa (alface) é provido. A partir da base dedados EST Genbank em NCBI diversos ESTs Lactuca foramidentificados usando a ferramenta tblastn começando com aseqüência aminoácido HSK da Arabidopsis. 0 agrupamento ealinhamento das ESTs resultou numa seqüência de consensopara um fragmento 5' de HSK e um para um fragmento 3' deHASK. Para obter o completo cDNA de HSK da alface o kitRLM-RACE (Ambion) foi usado no nRNA proveniente de mudas dealface. A seqüência 5' mRNA foi obtida mediante utilizar uminiciador que foi projetado na seqüência 3' HSK de consensoderivada de ESTs (RISla: GCCTTCTTCACAGCATCCATTCC) e osiniciadores 5'RACE proveniente do kit. A seqüência 3'RACEfoi obtida mediante utilizar dois iniciadores projetados nofragmento 5'RACE (Let3RACE0Ut: CCGTTGCGGTTAATGAGATT, eLet3RACEInn: TCGTGTTGGTGAATCCTGAA) e os iniciadores 3' RACEproveniente do kit. Com base na seqüência montada novosiniciadores foram projetados para amplificar a completacodificação da HSK a partir de cDNA para fornecer aseqüência nucleotidica e seqüência proteína derivada comoapresentado na Figura 10. Uma abordagem similar foi usada para Solanum Iycopersicum (Figura 14) e Vitis vinifera(Figura 11).
As completas seqüências codificadoraas da HSKproveniente de mais de 10 diferentes espécies vegetaisforam identificadas a partir de bases de dados genômicos eEST. A partir do alinhamento das seqüências DNA, asreferências conservadas na seqüência de codificação foramselecionadas para o projeto de degenerar iniciadoresoligonucleotídeos {para os nucleotídeos degenerados asabreviações são de acordo com os símbolos nucleotídeo IUBque são códigos padrões usados por todas as empresas quesintetizam oligonucleotídeos; G = Guanina, A = Adenina, T =Timina, C = Citosina, R = A ou G, Y = C ou T, M=A ou C7 K= G ou T, S = C ou G7 W=A ou Τ, B = C ou G or T, D=G ouA ou Τ, H = A ou C ou Τ, V = A ou C ou G7 N = A ou C ou Gou T) .
0 procedimento para obter seqüências do cDNA da HSKinterna de uma dada especie vegetal é como a seguir:
1. mRNA é usolado usando métodos padrões,
2. cDNA é sintetizado usando um iniciador oligo dTe métodos padrões,
3. utilizando oligonucleotídeos diretos e reversosuma reação PCR é realizada,
4. Fragmentos PCR são separados através deeletroforese gel agarose padrão e fragmentos do tamanhoesperado são isolados do gel,
5. Fragmentos PCR isolados são clonados num vatorplasmídeo usando métodos padrões,
6. Plasmídeos com tamanhos corretos de insertos,como determinados por PCR, são analisados através doseqüenciamento do DNA,
7. Análise da seqüência usando blastX revela quaisfragmentos contêm as corretas seqüências HSK internas,8. A seqüência DNA interna pode então ser usadaspara designar iniciadores gene- e espécies-especificos para5' e 3' RACE para obter a completa seqüência codificadorade HSK por meio de RLM-RACE (como descrito acima).
Como um exemplo o seqüenciamento do cDNA da HSK deCucumis sativus (pepino) é provido. Para pepino duascombinações iniciadoras foram bem sucedidas na amplificaçãode uma expansão da seqüência de codificação interna apartir do cDNA; combinação 1: iniciador FlKom:(GAYTTCYTHGGMTGYGCCGT) e MlRC (GCRGCGATKCCRGCRCAGTT), ecombinação 2: iniciador MlKom (AACTGYGCYGGMATCGCYGC) eRlKom (CCAT DCCVGGAATCAANGGVGC) . Após clonagem eseqüenciamento dos fragmentos amplificados de pepino osiniciadores HSK-especificos foram designados para 51 RACE(CucSRACEOut : AGAGGATTTTTACTAAGTTTATTCGTG e Cuc5RACEInn:AGACATAATCTCCCAAGCCATCA) e 3' RACE (Cuc3RACE0ut :TGATGGCTTGGGAGATTATGTCT e Cuc3RACEInn:CAÇGAATAAACTTAGTAAAAATCCTCT). Finalmente a completaseqüência cDNA da HSK do pepino foi amplificada eseqüenciada (Figura 12) . Uma abordagem similar foi usadapara espinafre, Spinacia Oleracea (Figura 13).
Ortólogos identificados como descritos nesseexemplo podem ser modificados usando técnicas bemconhecidas para induzir mutações que reduzam a expressão ouatividade da HSK. De modo alternativo., a informaçãogenética dos ortólogos podem ser usadas para projetarveículos para o silenciamento do gene. Todas essasseqüências são então usadas para transformar ascorrespondentes plantas de colheita para obter plantas quesão resistentes a Oomycota.
Exemplo 5
Redução da expressão homoserina quinase em Arabidopsls pormeio de RNAi
A produção de linhagens silenciadas de HSK foiconseguida na Arabidopsis por RNAi. Um construto contendodois fragmentos ~750bp do exon HSK em direções opostas foitransformado de modo bem sucedido no acesso ArabidopsisCol-O. Os transformantes foram analisados quanto aresistência a H.parasitica, isolado Waco9. diversaslinhagens transgêniças foram obtidas que conferemresistência a H.parasitica. A análise da expressão HSK eacumulação homoserina confirmam que nas linhagenstransformadas o gene HSK é silenciado, resultando emresistência a H.parasitica.
Exemplo 6
Mutação das sementes
Sementes de espécies vegetais de interesse sãotratadas com um mutagênico a fim de introduzir mutaçõespontuais randômicas no genoma. As plantas imitadas sãocrescidas para produzir sementes e a geração seguinte éclassificada quanto a aumentada acumulação de homoserina.Isso é conseguido mediante avaliar os níveis do aminoácidohomoserina, mediante monitorar o nível da expressão do geneHSK, ou pela pesguisa guanto a mutações sem sentido no geneHSK através do tem TILLING, por meio do següenciamento DNA,ou por meio de gualguer outro método para identificaralterações do nucleotídeo.
As plantas selecionadas são homozíguas ou sãotornadas homozíguas por auto-fertilização ou inter-cruzamento. As plantas homozíguas selecionadas comaumentados níveis de homoserina são testadas guanto aaumentada resistência ao patógeno de interesse paraconfirmar a aumentada resistência a doença.
Exemplo 7
Transferência de um alelo mutado aos fundamentos de umadesejada colheita
A introgressão do desejado alelo mutante numacolheita é conseguida mediante classificação de cruzamentoe genotípica do alelo mutante. Esse é um procedimentopadrão na atual geração de auxiliar de marcador decolheitas.
Tabelas
Tabela 2
Números GI (identificador Genlnfo) e número de acessoGenbank para Etiguetas de Següência Expressas - ExpressedSeguence Tags (ESTs) e següências mRNA de nRNA de HSK deArabidopsis e següências ortólogas provenientes de outrasespécies vegetais.
Um número GI (identificador GenInfof algumas vezesescrito em caixa baixa, "gi") é um único inteiro queidentifica uma seqüência particular. O número GI é umasérie de dígitos que são consignados consecutivamente paracada gravação de seqüência processada por NCBI. O número GIirá desse modo se alterar a cada momento que a seqüência sealtera. O NCBI consigna números GI para a totalidade dasseqüências processadas em Entrez, incluindo seqüênciasnucleotídicas provenientes de DDBJ/EMBL/GenBank, seqüênciasproteínas provenientes de SWISS-PROT, PIR e muitas outras.0 número GI fornece desse modo um identificador único deseqüência que é independente da fonte da base de dados queespecifica uma seqüência exata. Se uma seqüência no GenBanké modificada, ainda que por meio de um único par base, umnovo número GI pe consignado para a seqüência atualizada. 0número de acesso permanece o mesmo. Desse modo, areferência aos números GI na tabela proporciona umaidentificação clara e não ambígua da seqüênciacorrespondente.<table>table see original document page 36</column></row><table><table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table>
Tabela 3
Seqüências iniciadoras de marcadores de inserção/apagamento(INDEL, diferença de tamanho indicada em colchetes) eseqüências polimórficas amplificadas clivadas (CAP, sitiopolimórfico de restrição indicado em colchetes) usadas nomapeamento do local de DMRl.
<table>table see original document page 40</column></row><table>Tabela 4
Seqüências iniciadoras usadas para amplificação eseqüenciamento de oito genes DMRl candidatos para os quais
os códigos TAIR e GI estão indicados.
<table>table see original document page 41</column></row><table>
Claims (37)
1. PLANTA, que é resistente a um patógeno de origemviral, bacteriana, fúngica ou oomiceto, caracterizada por aplanta possuir aumentado nivel de homoserina como comparadoa uma planta que não é resistente ao referido patógeno.
2. Planta, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada por o patógeno ser um organismo do PhyliumOomycota.
3. Planta, de acordo com a reivindicação 2,caracterizada por o patógeno ser de uma espécie AlbugofAphanomyces, Basidiophora , Bremia, Hyaloperonospora,Pachymetra , Paraperonospora , Perofascia , PeronophythorafPeronospora, Peronosclerosporar Phytiumf PhytophthorafPlasmoparaf Protobremia , Pseudoperonospora , Sclerospora ,Viennotia.
4. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 2 e 3, caracterizada por a planta e opatógeno serem selecionados a partir de Bremia lactueae noalface, Peronospora farinosa no espinafre,Pseudoperonospora eubensis em membros da família dasCucurbitaceae, por exemplo, pepino, Peronospora destruetorna cebola, Hyaloperonospora paras itica em membros dafamília das Brasicaceae, por exemplo, por exemplo, repolho,Plasmopara vitieola na uva, Phytophthora infestans notomate e batata, e Phytophthora sojae na soja.
5. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada por possuir uma mutaçãoem seu gene homoserina quinase que influencia a atividadehomoserina quinase da enzima codificada.
6. Planta, de acordo com a reivindicação 5,caracterizada por a mutação no gele da homoserina quinaseconduzir a uma substituição aminoácido na proteínacodificada.
7. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada por possuir uma mutaçãonas seqüências regulatórias de seu gene homoserina quinaseque influencia a expressão da homoserina quinasecodificada.
8. Plantas, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada por possuir em seugenoma um construto silenciador do gene com base no genehomoserina quinase que influencia a expressão da homoserinaquinase codificada.
9. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1 a 4, caracterizada por possuir genessupraregulados na rota aspartato que leva a um aumento nonível da homoserina endógena na planta.
10. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser um geneortólogo do gene At2gl7265 da Arabidopsis (NM_127281,GI:18398362) como mostrado na Fig. 8.
11. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser um genehomoserina quinase como identificado na lista da Tabela 2.
12. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser o genehomoserina quinase da Lactuca sativa possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura-10.
13. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o genoma ser o genehomoserina quinase da Vitis vinifera possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura-11.
14. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser o genehomoserina quinase da Cucumis sativus possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácidos como mostrado naFigura 12.
15. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser o genehomoserina quinase da Spinacia oleracea possuindo aseqüência nucleotidica e seqüência aminoácidos comomostrado na Figura 13.
16. Planta, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 5 a 8, caracterizada por o gene ser o genehomoserina quinase da Solanum lycopersicum possuindo aseqüência nucleotidica e seqüência aminoácidos comomostrado na Figura 14.
17. MÉTODO PARA OBTER UMA PLANTA, QUE SEJARESISTENTE A UM PATÓGENO DE ORIGEM VIRAL, BACTERIANA,FÚNGICA OU OOMICETO, caracterizado por compreender aumentaro nivel endógeno de homoserina na planta.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado por o aumento do nivel endógeno de homoserinana planta ser conseguido através da administração externade homoserina à planta.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18,caracterizado por a homoserina ser administrada à plantaatravés do tratamento das mudas mediante aspersão ouinfiltração com homoserina.
20. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado por o aumento do nivel endógeno de homoserinana planta ser conseguido através da mutação do genehomoserina quinase da planta.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado por a mutação resultar em uma ou maisalterações aminoácidos que conduzem a uma mais baixaatividade da homoserina quinase.
22. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 20 e 21, caracterizado por a mutação serefetuada através do tratamento mutagênico da planta, emparticular com um mutagênico ou radiação.
23. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado por o aumento do nível endógeno de homoserinana planta ser conseguido através da redução da expressão dogene homoserina quinase da planta.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado por a redução da expressão do gene homoserinaquinase da planta ser conseguido através do silenciamentodo gene ou RNAi.
25. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado por a redução da expressão do gene homoserinaquinase da planta ser conseguido através da mutagênese deelementos regulatórios na região promotora, regiãoterminadora ou um intron.
26. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado por a redução da expressão do gene homoserinaquinase da planta ser conseguida mediante superexpressão deproteínas repressoras do gene homoserina quinase.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26,caracterizado por o gene homoserina quinase ser expresso apartir do promotor 35S.
28. Método, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado por a redução da expressão do gene homoserinaquinase da planta ser conseguida através de silenciamentoou mutação dos genes da planta que codificam a atividadehomoserina quinase ou de proteínas regulatórias.
29. Método, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado por o aumento do nível endógeno de homoserinana planta ser conseguido mediante induzir alterações narota aspartato.
30. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 21 a 29, caracterizado por o gene homoserinaquina.se a ser mutado é um gene ortólogo do gene At2gl7265da Arabidopsis (NM_127281, GI:18398362) como mostrado naFig. 8.
31. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado por o gene ortólogo ser o gene homoserinaquinase de Lactuca sativa possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura 10.
32. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado por o gene ortólogo ser o gene homoserinaquinase de Vitis vinifera. possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura 11
33. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado por o gene ortólogo ser o gene homoserinaquinase de Cucumis sativus possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura 12.
34. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado por o gene ortólogo ser o gene homoserinaquinase de Spinacia oleracea possuindo a seqüêncianucleotidica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura-13.
35. Método, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado por o gene ortólogo ser o gene homoserinaquinase de Solanum lycopersicum possuindo a seqüêncianucleotídica e seqüência aminoácido como mostrado na Figura 14.
36. GENE HSK DE PLANTA MUTADA, caracterizado porcodificar uma homoserina quinase que possui uma reduzidaatividade enzimática.
37. Gene HSK de planta mutada, de acordo com areivindicação 36, caracterizado por ser selecionado apartir do grupo que compreende alelos dmrl, dmrl-1, dmrl-2,dmr1-3, dmr1-4 e dmr1-5.
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