BRPI0618178A2 - métodos para adaptação de células de mamìferos - Google Patents
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Abstract
<B>MéTODOS PARA ADAPTAçãO DE CéLULAS DE MAMìFEROS<D>São fornecidos métodos de adaptação de células, por exemplo, células de mamíferos, a um processo de cultura de células. Quando as células adaptadas são modificadas geneticamente e usadas para a produção deproteínas, elas exibem características benéficas como, por exemplo, serem capazes de alcançar densidades celulares maiores e/ou obter um rendimento global maior da proteína produzida.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA ADAPTAÇÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS".
REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido é co-pendente, compartilha pelo menos um inventorem comum, e reivindica prioridade para o pedido provisório de patente U.S.número 60/732.818, depositado em 2 de novembro de 2005, cujo conteúdo éaqui incorporado por referência em sua totalidade.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Este pedido está relacionado de forma geral aos métodos deadaptação de células de mamíferos, por exemplo, células de mamíferos nãotransfectadas, para a produção de uma proteína terapêutica de interesse.Particularmente, este pedido está relacionado à adaptação de células demamíferos não transfectadas para desempenho superior em biorreatores.
Proteínas podem ser produzidas com a utilização de técnicasrecombinantes bem conhecidas. As células transformadas são comumentecultivadas em um ambiente controlado, por exemplo, um biorreator. A maiorparte das estratégias de fabricação comercial em grande escala empregaculturas de células em suspensão crescidas em grandes reatores de tanqueem agitação. A maioria das linhagens celulares, no entanto, não tem facil-mente um bom desempenho em processos de produção de proteína de altadensidade celular (por exemplo, processos de batelada alimentada) e/ou nãoconsegue alcançar as altas densidades celulares desejadas. Muitos inibido-res estão presentes ou se acumulam no meio de cultura de células duranteum ciclo de produção; esses inibidores podem ser subprodutos gerados porprocessos metabólicos como, por exemplo, Iactato ou amônia, dentre outros.As linhagens celulares tipicamente crescem e são mantidas, inicialmente,em condições que são projetadas para ajudar na propagação e/ou sobrevidadessas linhagens celulares. As condições usadas durante a produção deproteínas (por exemplo, condições encontradas em biorreatores de produ-ção), no entanto, podem ser bem diferentes, com, por exemplo, metabólitossecundários e/ou outros componentes presentes e/ou acumulados à medidaque a produção de proteína progride, o que pode ter efeitos deletérios po-tenciais sobre a linhagem celular. Como exemplos não limitantes, esses efei-tos deletérios podem compreender uma diminuição na densidade de célulasviáveis e/ou uma diminuição na titulação final, além de uma diminuição naquantidade e/ou qualidade da proteína produzida.
Na prática dos métodos comuns, são realizados vários experi-mentos para determinar se uma linhagem celular se adaptou ao crescimentoe/ou à produção em um processo de produção de proteína como, por exem-plo, um processo de batelada alimentada em um biorreator. Essa experimen-tação freqüentemente exige várias linhagens celulares clonais e/ou pools detransfecção, tipicamente seguidas por adaptação das células ao crescimentonos meios que serão usados em um biorreator de produção (por exemplo,uma suspensão sem soro ou um "meio definido"). Após a adaptação da li-nhagem celular, tipicamente são realizadas rodadas adicionais de rastrea-mento e de otimização em biorreatores de escala laboratorial. Os clones in-dividuais que exibem bons fenótipos de expressão na pesquisa preliminarsão então tipicamente submetidos à experimentação adicional para determi-nar quais clones também exibem características aceitáveis de crescimentoe/ou viabilidade em um biorreator, por exemplo, um biorreator de bateladaalimentada. Esses processos de rastreamento extensos são caros e particu-larmente trabalhosos para o profissional.
Portanto, são necessários métodos para a adaptação de célulasàs condições de produção de proteínas que incluem, sem limitação, as con-dições do biorreator. É necessário ainda um método de adaptação de célu-las hospedeiras não transfectadas, antes de serem transformadas de talforma que não haja efeitos prejudiciais, ou que esses sejam mínimos, emuma ou mais características da cultura de células (por exemplo, titulação,viabilidade, qualidade da proteína etc.) após a transfecção e transição paraas condições de produção de proteínas.SUMÁRIO
O presente pedido está relacionado aos métodos para a adapta-ção de células de mamíferos a um processo de produção de proteína de altadensidade como, por exemplo, um processo de batelada alimentada. Osprocessos da invenção podem envolver tanto células de mamíferos nãotransfectadas quanto células hospedeiras manipuladas geneticamente. Emcertas modalidades, as células de mamíferos não transfectadas são adapta-das às condições combinadas à produção, tais como aquelas usadas duran-te a produção de proteínas. Por exemplo, as células de mamíferos nãotransfectadas podem ser adaptadas a um meio de produção usado em umbiorreator durante um ciclo de produção.
Podem ser empregados diferentes métodos para adaptar as cé-lulas de mamíferos não transfectadas às condições de produção. Em certasmodalidades, as células são cultivadas em um meio de produção e/ou deadaptação. Em certas modalidades, as células são cultivadas em um meiode adaptação com a realização de ciclos repetitivos de divisão padronizados.Por exemplo, subpopulações das células podem ser passadas uma ou maisvezes, por exemplo, a cada três ou quatro dias. Em certas modalidades, ummeio de produção e/ou de adaptação geralmente possui níveis mais eleva-dos de nutrientes, vitaminas e/ou microelementos, comparado com uni meiode crescimento padronizado. Em certas modalidades, permite-se então queas células passem por um período de recuperação entre as passagens, noqual as células passadas crescem em um meio de crescimento padronizado,por exemplo, durante um dos ciclos, antes do retorno das células a um meiode produção e/ou de adaptação.
Em certas modalidades, as células são adaptadas por sua pas-sagem em modo de batelada realimentada, em que as subpopulações dascélulas são divididas ou passadas a cada sete ou oito dias. Em certas moda-lidades, a passagem das células após essa duração mais longa permite umacúmulo de metabólitos secundários no meio de cultura de células. Em cer-tas modalidades, as células adaptadas ganham tolerância e/ou começam arecolher esses metabólitos secundários. Em certas modalidades, esses me-tabólitos secundários compreendem inibidores e/ou metabólitos que tipica-mente se acumulam em um biorreator durante um ciclo de produção, como,por exemplo, Iactato e/ou amônia. Em certas modalidades, as células sãoadaptadas por crescimento em um meio que inclui um ou mais inibidoresque incluem, sem limitação, lactato, amônia, alanina, glutamina e/ou aceto-lactato. Em certas modalidades, esses inibidores e/ou metabólitos são con-sistentes com inibidores e/ou metabólitos tipicamente encontrados em umbiorreator durante um ciclo de produção.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas podem ser adaptadas ao serem cultivadas (e, opcionalmente, divididasa cada três ou quatro dias) em um meio de crescimento padronizado que ésuplementado com inibidores como, por exemplo, alanina, glutamina, aceto-lactato, amônia e lactato. Em certas modalidades, as células adaptadas des-sa forma são passadas a cada três ou quatro dias. Em certas modalidades,as concentrações desses inibidores correspondem às concentrações tipica-mente encontradas em um biorreator durante as condições usadas para aprodução de proteínas. Em certas modalidades, as concentrações dosmesmos inibidores incluem cerca de 2 a cerca de 10 g/l de lactato ou cercade 0,1 a cerca de 0,5 g/l de amônia, mimetizando as condições típicas dobiorreator. Em certas modalidades, as células adaptadas às condições dobiorreator por um ou mais métodos da presente invenção exibem certas ca-racterísticas ou fenótipos e/ou podem desenvolver esses fenótipos nos quaisas células começam a captar lactato e/ou outros metabólitos secundários, de tal forma que os níveis de lactato e/ou de outros metabólitos secundários naverdade diminuem durante um ou mais períodos de tempo durante o ciclo deprodução. Esses fenótipos podem ser rastreados, pois eles exibem qualida-des desejáveis em um biorreator de produção de batelada alimentada dealta densidade.
Em certas modalidades, as células adaptadas por um ou maismétodos da presente invenção são células hospedeiras que não foram trans-fectadas para produzir uma proteína de interesse. Em certas modalidades,essas células hospedeiras adaptadas são então pesquisadas em busca deuma ou mais características desejáveis. Em certas modalidades, após umasubpopulação ser pesquisada em busca de uma ou mais características de-sejáveis, as células podem ser manipuladas geneticamente (por exemplo,transfectadas) para criar uma linhagem celular que produz uma proteína deinteresse. Em certas modalidades, essa linhagem celular adaptada é colo-cada em um biorreator onde a linhagem celular facilmente se adapta a umprocesso de produção de proteína de alta densidade celular como, por e-xemplo, um processo de batelada alimentada. Em certas modalidades, emconseqüência da adaptação prévia das células hospedeiras não transfecta-das, por exemplo, células hospedeiras de mamíferos, a linhagem celularmanipulada geneticamente não precisa passar por uma transição de ummeio de crescimento padronizado para um meio de produção e/ou transi-ções com efeitos deletérios menores e/ou menos severos. Em certas moda-lidades, a adaptação prévia minimiza os efeitos deletérios potenciais sobre alinhagem celular, e ajuda a assegurar o desempenho da linhagem celular eacelera a cronologia do desenvolvimento. Em certas modalidades, essa li-nhagem celular adaptada pode captar metabólitos secundários durante ociclo de produção de proteínas. Aqueles habilitados na técnica de cultura decélulas podem facilmente determinar quais os componentes formam ummeio de crescimento padronizado e um meio de produção padronizado. Emcertas modalidades, as condições de crescimento e de produção de proteí-nas diferem na composição dos meios de cultura de células usados. Duranteas fases de crescimento e/ou de produção de proteínas, as condições de umbiorreator podem ser alteradas e/ou podem ser adicionados suplementos afim de aumentar a produtividade e/ou manter a viabilidade da linhagem celu-lar. Os suplementos podem incluir um meio de alimentação e/ou um ou maisaditivos. Aqueles habilitados na técnica serão capazes de selecionar suple-mentos de meios apropriados. Suplementos adicionais para os meios de-penderão do produto protéico desejado, dos parâmetros (por exemplo, com-ponentes, pH etc.) do meio de cultura de células, dos métodos empregadosao longo do processo de crescimento e/ou de produção, e ou de qualquerum dentre vários outros fatores conhecidos por aqueles habilitados na técnica.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas são adaptadas por um método que compreende o cultivo de células demamíferos não transfectadas em um meio de adaptação, a realização de umou mais ciclos repetitivos de divisão (por exemplo, a cada 3 ou 4 dias) quecompreendem a divisão das células de mamíferos não transfectadas nomeio de adaptação, um período de recuperação no qual as células são culti-vadas em um meio de crescimento padronizado, e o rastreamento das célu-las e seleção de uma subpopulação que exibe um fenótipo de crescimentoe/ou de viabilidade aprimorado, comparada com uma versão não adaptadadas células, quando cultivadas sob condições de um biorreator de produção.Em certas modalidades, as células são transfectadas com um gene que co-difica uma proteína de interesse, e cultivadas em um biorreator de produçãopara expressar a proteína de interesse. Em certas modalidades, um meio deadaptação contém níveis aumentados de nutrientes, vitaminas e/ou microe-lementos, comparado com o referido meio de crescimento padronizado. Emcertas modalidades, um meio de adaptação contém uma quantidade aumen-tada de metabólitos inibidores, comparado com um meio de produção pa-dronizado, antes da cultura de células.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas são adaptadas por um método que compreende o cultivo de células demamíferos não transfectadas em um meio de adaptação que foi suplemen-tado com produtos colaterais do metabolismo de carbono primário, a realiza-ção de um ou mais ciclos repetitivos de divisão que compreendem a divisãodas células de mamíferos não transfectadas aproximadamente a cada 3 ou 4dias no meio de adaptação, um período de recuperação no qual as célulassão cultivadas em um meio de crescimento padronizado, o acúmulo dos ní-veis dos produtos colaterais, e o rastreamento das células de mamíferos nãotransfectadas e a seleção de uma subpopulação que exibe um fenótipo a-primorado, comparada com uma versão não adaptada das células de mamí-feros não transfectadas, quando cultivadas no referido meio de adaptação.Em certas modalidades, esses produtos colaterais são um ou mais de Iacta-to, amônia, alanina, glutamina e/ou acetolactato. Em certas modalidades, olactato está presente inicialmente em uma concentração de cerca de 2 acerca de 10 g/l. Em certas modalidades, a amônia está presente inicialmenteem uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g/l. Em certas modali-dades, as células são adaptadas para recolher os referidos produtos colate-rais de fontes de carbono primário.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas são adaptadas por um método que compreende o cultivo de células demamíferos não transfectadas por uma duração de cerca de 7 ou 8 dias emum meio previamente condicionado que possui um acúmulo de pelo menosum metabólito inibidor, antes da divisão das células de mamíferos não trans-fectadas, e o rastreamento das células de mamíferos não transfectadas e aseleção de uma subpopulação que exibe um fenótipo aprimorado em umbiorreator de produção. Em certas modalidades, as células passam por umperíodo de recuperação por cultivo das células em um meio de crescimentopadronizado por uma duração de cerca de 3 a cerca de 4 dias, antes da divi-são das células. Em certas modalidades, um meio condicionado contém umacúmulo dos metabólitos inibidores por pelo menos um processo metabólicodas células de mamíferos não transfectadas. Em certas modalidades, essemetabólito inibidor é um ou mais de amônia, alanina, glutamina, acetolactatoe/ou lactato. Em certas modalidades, esses metabólitos inibidores são con-sistentes com aqueles encontrados em um biorreator de produção ao finalde um processo de batelada realimentada em escala comercial típico.
Qualquer um entre diversos procedimentos e/ou meios de cultu-ra adequados (por exemplo, meios de inóculo, meios de alimentação etc.)pode ser usado para o cultivo das células no processo de produção de prote-ínas. Podem ser usados tanto meios que contêm soro quanto meios que nãocontêm soro. Por exemplo, em certas modalidades, as células crescem emum meio definido. Em certas modalidades, as células crescem em um meiocomplexo. Além disso, um ou mais métodos de cultivo específicos podemser usados, alterados e/ou otimizados para o cultivo das células, como forapropriado para o tipo de célula e produto protéico específicos. Esses pro-cedimentos são bem conhecidos e compreendidos pelos profissionais e poraqueles habilitados na técnica de cultura de células. Outras características evantagens desta especificação ficarão evidentes a partir da descrição se-guinte de certas modalidades, e a partir das reivindicações.BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1a mostra a densidade de células viáveis de bateladaalimentada de sete dias.
A figura 1 b mostra densidade-padrão de células viáveis em divi-são.
A figura 1c mostra a densidade de células viáveis.
A figura 2a mostra a taxa de crescimento da linhagem celular deanticorpo monoclonal.
A figura 2b mostra densidade integral acumulada de células viá-veis durante batelada alimentada.
A figura 3 mostra densidades celulares de culturas de célulasadaptadas à ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 4 mostra a viabilidade de culturas de células adaptadasà ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 5 mostra IVCD acumulada de culturas de células adap-tadas à ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 6 mostra as densidades celulares de culturas de célulasadaptadas à ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 7 mostra a viabilidade de culturas de células adaptadasà ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 8 mostra IVCD acumulada de culturas de células adap-tadas à ausência de insulina e culturas de células de controle.
A figura 9 mostra taxa de consumo específico de Iactato de cul-turas de células adaptadas à ausência de Insulina e culturas de células decontrole.
DEFINIÇÕES
De acordo com uma convenção há muito estabelecida, os ter-mos "um" e "uma" significam "um ou mais", quando usados neste pedido,incluindo as reivindicações. Embora a invenção tenha sido descrita com cer-to grau de particularidade, é evidente que muitas alternativas, modificaçõese variações ficarão aparentes para aqueles habilitados na técnica à luz destaespecificação. Conseqüentemente, pretende-se que todas essas alternati-vas, modificações e variações, que se enquadram dentro do espírito e esco-po da invenção, sejam englobadas pelas reivindicações.
O termo "célula hospedeira" refere-se às células que são capa-zes de ser manipuladas geneticamente e/ou que são capazes de crescer esobreviver em um meio de cultura de células. Tipicamente, as células podemexpressar uma grande quantidade de uma proteína endógena ou heterólogade interesse, e podem tanto reter a proteína quanto secretá-la no meio decultura de células.
As células hospedeiras são tipicamente "células de mamíferos",que compreendem os exemplos não Iimitantes de células de vertebrados,incluindo células de rim de filhote de hamster (BHK), de ovário de hamsterchinês (CHO), de rim humano (293), células diplóides fetais normais de ma-caco rhesus (FRhL-2) e de mieloma murídeo (por exemplo, SP2/0 e NSO).Aqueles habilitados na técnica conhecerão outras células hospedeiras quepossam ser usadas de acordo com os métodos e as composições da pre-sente invenção.
O termo "meio de cultura de células" refere-se às células emuma solução que contém nutrientes para apoiar a sobrevida celular sob con-dições nas quais as células podem crescer e/ou produzir uma proteína dese-jada. O termo "meio de inoculáção" ou "meio de inóculo" refere-se a umasolução ou substância que contém nutrientes na qual uma cultura de célulasé iniciada. Em certas modalidades, uma cultura de células é suplementadaem uma ou mais vezes com um "meio de alimentação", com o qual as célu-las são alimentadas após o início da cultura. Em certas modalidades, um"meio de alimentação" contém nutrientes similares ao meio de inoculáção,mas é uma solução ou substância com a qual as células são alimentadasapós o início da cultura. Em certas modalidades, um meio de alimentaçãocontém um ou mais componentes que não estão presentes em um meio deinoculáção. Em certas modalidades, um meio de alimentação contém um oumais componentes que não estão presentes em um meio de inoculáção. Emcertas modalidades, um meio de alimentação é desprovido de um ou maiscomponentes presentes em um meio de inoculáção. Aqueles habilitados natécnica de cultura de células saberão, sem experimentação desnecessária,quais componentes constituem esses meios de inoculação e de alimentação.Tipicamente, essas soluções fornecem aminoácidos essenciais e não es-senciais, vitaminas, fontes de energia, lipídeos e/ou microelementos neces- sários a uma célula para o seu crescimento e sobrevida.
O termo "característica da cultura de células", como aqui usado,refere-se a uma característica observável e/ou mensurável de uma culturade células. Os métodos e as composições da presente invenção são usadosvantajosamente para melhorar uma ou mais características da cultura de células. Em certas modalidades, a melhora de uma característica da culturade células compreende o aumento da magnitude de uma característica dacultura de células. Em certas modalidades, a melhora de uma característicada cultura de células compreende a diminuição da magnitude de uma carac-terística da cultura de células. Como exemplos não limitantes, uma caracte- rística da cultura de células pode ser o aumento do crescimento, o aumentoda viabilidade, o aumento da densidade de células viáveis integradas, o au-mento da titulação e/ou o aumento da produtividade celular específica. A-queles habilitados na técnica conhecerão outras características da cultura decélulas que podem ser melhoradas com o uso dos métodos e das composi- ções da presente invenção.
O termo "meio de crescimento" ou "meio de crescimento padro-nizado" refere-se a um meio que contém nutrientes e suplementos que per-mitem que células ou uma linhagem celular se dividam e cresçam. Em certasmodalidades, o termo "meio de produção" refere-se a um meio de cresci-mento enriquecido que permite que sejam expressos níveis elevados deuma proteína de interesse. Em certas modalidades, um meio de produçãogeralmente contém níveis mais elevados de nutrientes, vitaminas, microele-mentos e/ou outros componentes do meio, quando comparado com um meiode crescimento padronizado. O termo "meio de adaptação" refere-se a um meio que submete as células às condições de produção de proteínas queexistem em biorreatores (por exemplo, biorreatores de produção de estágiofinal), que prepara as células para as condições de produção de proteínase/ou que minimiza os efeitos potencialmente deletérios da transição das cé-lulas das condições de crescimento para as condições de produção de pro-teínas. Em certas modalidades, um meio de adaptação inclui a presença deum ou mais metabólitos secundários, por exemplo, aqueles gerados por pro-cessos metabólicos, incluindo, sem limitação, Iactato e/ou amônia. Em certasmodalidades, um meio de adaptação inclui um ou mais inibidores que inclu-em, sem limitação, lactato, amônia, alanina, glutamina e/ou acetolactato. Emcertas modalidades, um meio de adaptação compreende um meio de produ-ção. Em certas modalidades, um meio de adaptação simula uma ou maiscaracterísticas de um meio de produção. Em certas modalidades, a adapta-ção das células em um meio de adaptação resulta em células que exibemefeitos deletérios diminuídos ou menos severos quando essas células adap-tadas são mudadas de um meio de crescimento ou de adaptação para ummeio de produção. Esse meio de produção e/ou de adaptação pode sercombinado à produção, por exemplo, pela suplementação de meios de pro-dução com esses metabólitos e/ou inibidores e/oii pelo acúmulo desses me-tabólitos e/ou inibidores em uma cultura de células de longa duração.
O termo "meio definido", como aqui usado, refere-se a um meiono qual a composição do meio é conhecida e controlada.
O termo "meio complexo", como aqui usado, refere-se a ummeio que contém pelo menos um componente cuja identidade ou quantidadeé desconhecida ou não controlada.
O termo "linhagem celular" refere-se, geralmente, às célulashospedeiras primárias que foram transfectadas com DNA exógeno, por e-xemplo, DNA que codifica a proteína de interesse desejada. Em certas mo-dalidades, as células derivadas das células modificadas geneticamente for-mam a linhagem celular, e são colocadas em um meio de cultura de célulaspara crescer e produzir o produto protéico de interesse. Em algumas modali-dades, as células hospedeiras primárias são transfectadas com DNA exóge-no que codifica uma proteína desejada e/ou que contém seqüências de con-trole que ativam a expressão de seqüências ligadas, sejam elas endógenasou heterólogas. Em certas modalidades, uma linhagem celular compreendecélulas hospedeiras primárias que foram transfectadas com DNA exógeno eexpressam uma proteína de interesse heteróloga. Em certas modalidades,uma linhagem celular compreende células hospedeiras primárias que nãoforam transfectadas com DNA exógeno e expressam uma proteína de inte-resse endógena.
A "fase de crescimento" de um meio de cultura de células refere-se ao período em que as células passam por divisão rápida e crescem ex-ponencialmente, ou quase exponencialmente. As condições da fase de cres-cimento podem incluir uma temperatura em torno de 35°C a 42°C, geralmen-te em torno de 37°C. A duração da fase de crescimento e das condições decultura na fase de crescimento pode variar, mas geralmente é conhecida poraqueles habilitados na técnica de cultura de células. Tipicamente, durante afase de crescimento, as células crescem em um "meio de crescimento" ouem um "meio de crescimento padronizado". Em certas modalidades, ummeio de cultura de células em uma fase de crescimento é suplementadocom um meio de alimentação.
A "fase de transição" ocorre durante o período em que o meio decultura de células está sendo alterado das condições consistentes com afase de crescimento para condições consistentes com a fase de produção.Durante a fase de transição, fatores como temperatura, dentre outros, sãofreqüentemente alterados. Em certas modalidades, um meio de cultura decélulas em uma fase de transição é suplementado com um meio de alimen-tação. Os métodos da presente invenção são úteis para minimizar o efeitopotencialmente deletério da mudança de uma cultura de células das condi-ções da fase de crescimento para as da fase de produção.
A "fase de produção" ocorre após a fase de crescimento e a fasede transição. O crescimento exponencial das células já terminou, e a produ-ção de proteína é o objetivo principal. Tipicamente, durante a fase de produ-ção, as células crescem em um meio de produção. Um meio de produçãopode ser suplementado para iniciar a produção. Em certas modalidades, ummeio de cultura de células em uma fase de produção é suplementado comum meio de alimentação. Em certas modalidades, a temperatura do meio decultura de células durante a fase de produção é mais baixa, geralmente, doque durante a fase de crescimento. Como é conhecido na técnica, em mui-tos casos, essa temperatura diminuída facilita a produção de proteína. A fa-se de produção continua até que seja atingida uma meta desejada.
As frases "divisão", "passagem" e "subcultivo" referem-se aoprocesso de divisão de uma população de células em duas ou mais subpo-pulações. Por exemplo, uma população de células que cresce em um meiode cultura de células pode ser passada ou subcultivada por remoção de umasubpopulaçãò de células do meio de cultura de células, e diluição daquelasubpopulação até uma densidade menor de células viáveis. Em certas mo-dalidades, uma subpopulação de células pode ser diluída em um volumesimilar com meio fresco. Em certas modalidades, a subpopulação de célulasé diluída com um meio de cultura de células que é similar ou idêntico aomeio de cultura de células no qual a população de células original estavacrescendo. Por exemplo, caso a população de células original estivessecrescendo em um meio de produção, a subpopulação poderia ser diluídacom o mesmo meio de produção ou com um meio similar. Em certas modali-dades, a subpopulação de células é diluída com um meio de cultura de célu-las que difere do meio de cultura de células no qual a população de célulasoriginal estava crescendo. Por exemplo, caso a população de células originalestivesse crescendo em um meio de crescimento, uma subpopulação decélulas poderia ser diluída com um meio de produção ou de adaptação. Emcertas modalidades, a população de células original parou de crescer (porexemplo, parou de aumentar o número de células) antes da passagem ou dosubcultivo de uma subpopulação. Em certas modalidades, uma população épassada duas ou mais vezes durante o processo de adaptação. Por exem-plo, uma população pode ser passada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20 vezes ou mais durante o processo de adaptação. Aprática padronizada mantém a passagem ou "divisão" de um meio de culturade células a cada três ou quatro dias com o uso de um meio de crescimentopadronizado. Em certas modalidades, as células são adaptadas às condi-ções de produção de proteínas por crescimento de uma população de célu-las por um período de tempo mais longo, antes da passagem. Por exemplo,as células podem crescer 5, 6, 7, 8, 9, 1G, 11, 12, 13, 14 dias ou mais, antesde serem passadas.
O termo "densidade de células viáveis" refere-se ao número totalde células que sobrevivem no meio de cultura de células em certo volume. Otermo "viabilidade celular" refere-se ao número de células que estão vivas,comparado com o número total de células, tanto mortas quanto vivas, ex-presso em percentagem.
"Densidade de células viáveis integradas", "IVCD": o termo"densidade de células viáveis integradas" ou "IVCD", como aqui usado, refe-re-se à densidade média de células viáveis ao longo da cultura multiplicadapela quantidade de tempo em que a cultura foi realizada. Quando a quanti-dade de proteína produzida é proporcional ao número de células viáveis pre-sentes ao longo da cultura, a densidade de células viáveis integradas é umaferramenta útil para estimar a quantidade de proteína produzida ao longo dacultura.
Como aqui usado, o termo "anticorpo" inclui uma proteína quecompreende pelo menos um e, tipicamente, dois, domínios VH ou porçõesdestes, e/ou pelo menos um e, tipicamente, dois, domínios VL, ou porçõesdestes. Em certas modalidades, o anticorpo é um tetrâmero de duas cadeiaspesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina, em queas cadeias pesadas e leves de imunoglobulina estão interconectadas por,por exemplo, ligações dissulfeto. Os anticorpos, ou uma porção destes, po-dem ser obtidos de qualquer origem, que incluem, sem limitação, roedores,primatas (por exemplo, primata humano e não humano), camelídeos, bemcomo anticorpos produzidos de forma recombinante, por exemplo, anticor-pos quiméricos, humanizados e/ou gerados in vitro, como aqui descrito commais detalhes.
Exemplos de fragmentos de ligação englobados pelo termo"fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem, sem limitação,(i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domíniosVL1 VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente quecompreende dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na regiãode dobradiça; (iii) um fragmento Fd, que consiste nos domínios VH e CH1;(iv) um fragmento Fv1 que consiste nos domínios VL e VH de um único braçode um anticorpo, (v) um fragmento dAb, que consiste em um domínio VH;(vi) um domínio variável da cadeia pesada de camelídeo ou camelizado (V-HH); (vii) um Fv de cadeia única (scFv); (viii) um anticorpo biespecífico; e (ix)um ou mais fragmentos de uma molécula de imunoglobulina fundidos a umaregião Fc. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VHsejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos com o usode métodos recombinantes, por um vinculador sintético que permite que elessejam feitos como uma cadeia protéica única na qual as regiões VL e VH separeiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de ca-deia única (scFv); veja, por exemplo, Bird e cols. (1988) Science 242: 423-26; Huston e cols. (1988) Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 85: 5.879-83). Essesanticorpos de cadeia única também são englobados dentro do termo "frag-mento de ligação de antígeno" de um anticorpo. Esses fragmentos podemser obtidos com a utilização de técnicas convencionais conhecidas por aque-les habilitados na técnica, e os fragmentos são avaliados quanto à função damesma forma que é feita para anticorpos intatos.
O "fragmento de ligação de antígeno" pode, opcionalmente, ain-da incluir uma porção que aumenta uma ou mais características, por exem-plo, estabilidade, função de célula efetora ou fixação de complemento. Porexemplo, o fragmento de ligação de antígeno pode ainda incluir uma porçãopeguilada, albumina ou uma região constante de uma cadeia pesada e/ouleve.
Com exceção dos anticorpos "biespecíficos" ou "bifuncionais",entende-se que todos os sítios de ligação a um anticorpo são idênticos. Umanticorpo "biespecífico" ou "bifuncional" é um anticorpo artificial híbrido quepossui dois pares diferentes de cadeia pesada/leve e dois sítios de ligaçãodiferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de diver-sos métodos, incluindo a fusão de hibridomas ou a ligação de fragmentosFab1. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny e cols., J. Immunol. 148, 1.547-1.553 (1992).
O termo "rastrear" ou "rastreamento" refere-se a um método deseleção de uma subpopulação de células com certo fenótipo que exibe umaou mais características vantajosas. Em certas modalidades, uma linhagemcelular é rastreada quanto a uma ou mais características da cultura de célu-las que são vantajosas em um processo de produção de proteína que inclu-em, sem limitação, o aumento do crescimento, o aumento da viabilidade, oaumento da densidade de células viáveis integradas, o aumento da titulação,e/ou o aumento da produtividade celular específica. Em certas modalidades,uma linhagem celular é rastreada quanto a uma ou mais características dacultura de células que são vantajosas em um processo de biorreator de bate-Iada alimentada, por exemplo, crescimento e/ou viabilidade fortes.
O termo "biorreator" refere-se a um vaso no qual um meio decultura de células pode estar contido e cujas condições internas podem sercontroladas durante o período de cultivo, por exemplo, pH e temperatura.Aqueles habilitados na técnica conhecerão condições do biorreator úteise/ou apropriadas que possam ser controladas, bem como métodos de con-trole destas condições do biorreator. Um "biorreator de produção" refere-se aum biorreator que é utilizado durante um processo de produção de proteína.Por exemplo, um biorreator de produção pode compreender um vaso degrande escala comercial do qual uma grande quantidade de proteína podeser produzida, embora um biorreator de produção não se limite a esses va-sos de grande escala comercial. Em certas modalidades, o volume de umbiorreator é de pelo menos 1 litro, e pode ser de 10, 100, 250, 500, 1.000,2.500, 5.000, 8.000, 10.000, 12.000 litros ou mais, ou qualquer volume den-tro desse intervalo. Além disso, os biorreatores que podem ser usados inclu-em, sem limitação, um biorreator de tanque agitado, um reator de leito fluidi-ficado, biorreator de fibra oca ou roller bottle.
Os termos "produtos colaterais secundários" e "metabólitos se-cundários" referem-se às pequenas moléculas tipicamente geradas em con-seqüência da atividade metabólica celular. Como é do conhecimento daque-les habilitados na técnica, esses produtos colaterais secundários são fre-qüentemente prejudiciais ao crescimento e/ou viabilidade celulares. Dessemodo, sua minimização ou eliminação de uma cultura de células é desejável.Exemplos não limitantes de produtos colaterais secundários incluem Iactatoe íons amônio. Em certas modalidades, as células são adaptadas às condi-ções de produção de proteínas por crescimento da célula na presença des-ses produtos colaterais secundários. Em certas modalidades, as células a-daptadas às condições de produção de proteínas exibem a habilidade pararecolher esses produtos colaterais secundários, de tal forma que os níveisde produtos colaterais secundários diminuem ao longo do tempo. Aqueleshabilitados na técnica de cultura de células conhecerão outros produtos cola-terais metabólicos que podem ser usados para adaptar as células de acordocom a presente invenção.
Uma "cultura em batelada alimentada" (fed batch) refere-se a ummétodo de cultivo de células no qual inicialmente as células são inoculadasem um biorreator com um meio de inóculo. O meio de cultura de células éentão suplementado em um ou mais pontos ao longo do ciclo de produçãocom um meio de alimentação que contém componentes nutricionais e/ououtros suplementos.
A "cultura em batelada" (batch) refere-se a um método de cultivode células no qual as células são inoculadas em um biorreator com todos osnutrientes e suplementos necessários para todo o ciclo de produção. Nãosão adicionados nutrientes, meios etc. ao meio de cultura de células após oinício da cultura de células.
Uma "cultura de perfusão" refere-se a um método de cultivo decélulas que é diferente de um método de cultura em batelada ou em batela-da alimentada, no qual a cultura não é terminada, ou não é necessariamenteterminada, antes do isolamento e/ou da purificação da proteína expressa deinteresse, e no qual novos nutrientes e outros componentes são periódica oucontinuamente adicionados à cultura, durante o qual a proteína expressa éperiódica ou continuamente coletada. A composição dos nutrientes adicio-nados pode ser alterada durante a evolução da cultura de células, depen-dendo das necessidades das células, das necessidades para uma produçãoótima de proteínas, e/ou de qualquer um dentre diversos outros fatores co-nhecidos por aqueles habilitados na técnica.
O termo "batelada realimentada" (batch-refeed) refere-se a ummodo de operação de um biorreator ou um método de passagem de células.
Em certas modalidades, um processo de batelada realimentada compreendea passagem das células a cada 7 ou 8 dias, comparado com outros modosem biorreatores nos quais as células não são passadas ou são passadasmenos freqüentemente. Em uma escala menor que emprega métodos pa-dronizados de divisão, as células são geralmente passadas mais cedo, porexemplo, a cada 3 ou 4 dias, comparada com a batelada realimentada. Emcertas modalidades, os métodos de batelada realimentada são usados paraadaptar uma cultura de células a fim de que ela obtenha uma melhora dascaracterísticas da cultura de células que inclui, sem limitação, um aumentoda taxa de crescimento, um aumento da viabilidade, um aumento da densi-dade de células viáveis integradas, um aumento da titulação, e/ou um au-mento da produtividade celular específica. Em certas modalidades, um pro-cesso de batelada realimentada utiliza um meio de cultura mais enriquecidoe/ou um meio que contém metabólitos secundários e/ou outros inibidores, afim de adaptar as células às condições de produção de proteínas. O termo"metabólitos secundários" refere-se aos subprodutos de processos metabóli-cos de funções celulares.
O termo "expressão" refere-se à transcrição e à tradução queocorrem dentro de uma célula hospedeira. O nível de expressão está rela-cionado, geralmente, à quantidade de proteína que está sendo produzidapela célula hospedeira.
O termo "proteína" ou "produto protéico" refere-se a uma oumais cadeias de aminoácidos. Como aqui usado, o termo "proteína" é sinô-nimo de "polipeptídeo" e, como é geralmente entendido na técnica, refere-sea pelo menos uma cadeia de aminoácidos ligada por meio de ligações peptí-dicas seqüenciais. Em certas modalidades, uma "proteína de interesse" éuma proteína codificada por uma molécula de ácido nucléico exógeno quefoi transformada em uma célula hospedeira. Em certas modalidades, nasquais a "proteína de interesse" é codificada por um DNA exógeno com oqual a célula hospedeira foi transformada, a seqüência de ácidos nucléicosdo DNA exógeno determina a seqüência de aminoácidos. Em certas modali-dades, uma "proteína de interesse" é uma proteína codificada por uma mo-lécula de ácido nucléico que é endógena à célula hospedeira. Em certasmodalidades, a expressão dessa proteína de interesse endógena é alteradapor transfecção de uma célula hospedeira com uma molécula de ácido nu-cléico exógeno que pode, por exemplo, conter uma ou mais seqüências re-guladoras e/ou codificar uma proteína que aumenta a expressão da proteínade interesse. Os métodos e as composições da presente invenção podemser usados para produzir quaisquer proteínas de interesse, que incluem,sem limitação, proteínas que possuem propriedades farmacêuticas, diagnos-ticas, agrícolas e/ou qualquer uma dentre várias outras propriedades úteisem aplicações comerciais, experimentais e/ou em outras aplicações. Além disso, uma proteína de interesse pode ser uma substância terapêutica pro-téica. Especificamente, uma substância terapêutica protéica é uma proteínaque possui um efeito biológico sobre uma região no corpo sobre a qual atuaou em uma região no corpo sobre a qual atua remotamente através de in-termediários. Exemplos de substâncias terapêuticas protéicas serão discuti-dos com mais detalhes abaixo. Em certas modalidades, as proteínas produ-zidas com o uso dos métodos e/ou das composições da presente invençãopodem ser processadas e/ou modificadas. Por exemplo, uma proteína a serproduzida de acordo com a presente invenção pode ser glicosilada.
O termo "titulação", como aqui usado, refere-se à quantidade total de proteína expressa de forma recombinante produzida por uma culturade células em certa quantidade de volume de meio. A titulação é tipicamenteexpressa em unidades de miligramas ou microgramas de proteína por milili-tro de meio.
Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que os métodosaqui revelados podem ser usados para o cultivo de muitas das células demamíferos conhecidas usadas e cultivadas rotineiramente na técnica, ouseja, os métodos aqui revelados não se limitam ao uso apenas na presenteespecificação.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES DA INVENÇÃO
Foi descoberto que células de mamíferos, por exemplo, célulasde mamíferos não transfectadas, incluindo, por exemplo, células de ováriode hamster chinês, podem ser adaptadas a ambientes consistentes com ascondições de um biorreator de produção para aprimorar o crescimento celu-lar durante a produção subseqüente de uma proteína de interesse. Todosesses métodos também são aplicáveis tanto às células de mamíferos nãotransfectadas quanto às células de mamíferos transfectadas (por exemplo,células de mamíferos transfectadas com um cDNA ou construção genômicaque causa a expressão, como a partir de um vetor de expressão, de umaproteína recombinante desejada). A presente invenção pode ser usada paraadaptar as células para a produção vantajosa de qualquer proteína terapêu-tica, como, por exemplo, enzimas, receptores, anticorpos farmacêutica oucomercialmente relevantes (por exemplo, anticorpos monoclonais e/ou poli-clonais), proteínas de fusão Fc, citocinas, hormônios, fatores reguladores,fatores de crescimento, fatores da coagulação, agentes de ligação de antí-geno etc. Aqueles habilitados na técnica conhecerão outras proteínas quepodem ser produzidas de acordo com a presente invenção, e serão capazesde usar os métodos aqui revelados para a produção dessas proteínas.
Os métodos da presente invenção para adaptação de célulasnão transfectadas de mamíferos possuem o potencial para a identificação delinhagens celulares que geram produtividades superiores e/ou exibem carac-terísticas superiores de produção de proteínas. Além disso, os métodos dapresente invenção podem ajudar na identificação de linhagens celularescandidatas adequadas mais rapidamente e com menos esforços, compara-dos com os procedimentos padronizados dè desenvolvimento de linhagenscelulares. Por exemplo, os processos padronizados para a identificação decandidatos a linhagem celular tipicamente exigem vários experimentos emdiferentes escalas e testes adicionais de robustez.
As células hospedeiras, antes de serem transformadas, sãoconsideradas não transfectadas. Tradicionalmente, quando se cria uma novalinhagem celular para desenvolvimento, as células hospedeiras não transfec-tadas foram inicialmente transfectadas, ou transformadas, com DNA exóge-no para expressar uma proteína de interesse. Com o uso desses métodosanteriores, as células hospedeiras não eram geralmente experimentadas oualteradas antes da transfecção; a experimentação e a pesquisa sobre o de-senvolvimento da linhagem celular começavam após as células hospedeirasterem sido manipuladas geneticamente para a produção de um produto pro-téico.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas podem ser adaptadas às condições de produção de proteínas comdesempenho superior em processos de biorreator em batelada, de bateladaalimentada e/ou de perfusão de acordo com um ou mais métodos da presen-te invenção. Em certas modalidades, essas células adaptadas são capazesde manter um fenótipo aprimorado, por exemplo, exibir um crescimento maisvigoroso, aumento da viabilidade, aumento da densidade de células viáveisintegradas, aumento da titulação, aumento da produtividade celular específi-ca e/ou densidades celulares mais elevadas através desse desenvolvimento.Certas modalidades dos métodos da invenção aqui descritos podem ser em-pregadas para adaptar as células de mamíferos não transfectadas a um pro-cesso de produção de proteínas em batelada, de batelada alimentada e/oude perfusão que possui um desempenho superior.
Qualquer um dentre vários meios comercialmente disponíveiscomo, por exemplo, Meio Essencial Mínimo (MEM, Sigma), F10 de Ham(Sigma) ou Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Sigma) podeser usado como o meio de base. Esses meios de base podem então ser su-plementados com aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, microelementose/ou outros componentes para a produção dos meios de crescimento e/oude produção. Em certas modalidades, as células podem ser adaptadas porcultivo de células transfectadas ou não transfectadas de mamíferos em ummeio de produção similar ou idêntico a um meio de produção. Em certasmodalidades, as células são adaptadas por crescimento das células sobcondições similares ou idênticas às condições tipicamente encontradas sobcondições de produção em um biorreator (por exemplo, em um meio consis-tente com o meio tipicamente encontrado em um biorreator) operado emmodo de batelada, em modo de batelada alimentada e/ou em modo de per-fusão. Em certas modalidades, as células a serem adaptadas são não trans-fectadas. Em certas modalidades, as células a serem adaptadas foramtransfectadas com uma molécula de ácido nucléico exógeno, por exemplo,uma molécula de ácido nucléico que expressa uma proteína de interesse.
Em certas modalidades, uma ou mais características da cultura de célulassão aperfeiçoadas durante a fase de produção de proteína por adaptaçãodas células às condições de produção de proteínas, antes da transfecçãocom uma molécula de ácido nucléico exógeno. Em certas modalidades, essacaracterística aprimorada da cultura de células inclui, sem limitação, aumen-to do crescimento, aumento da viabilidade celular global, aumento da densi-dade de células viáveis integradas, aumento da titulação e/ou aumento daprodutividade celular específica. Um meio de produção é tipicamente maisenriquecido do que um meio de crescimento e é, por exemplo, suplementadocom níveis mais elevados de nutrientes, vitaminas, microelementos e/ou ou-tros componentes dos meios, comparado com um meio de crescimento.
É uma prática típica na técnica as células serem cultivadas con-tinuamente em meio de crescimento durante o desenvolvimento da linhagemcelular e não entrarem em contato com meio de produção até o início de umensaio de produção de batelada alimentada. Em certas modalidades, a a-daptação de células de mamíferos não transfectadas em um meio de produ-ção de proteínas e/ou sob condições de produção de proteínas antes datransfecção, e não em meio de crescimento e/ou sob condições de cresci-mento, minimiza os efeitos potencialmente deletérios da transição das célu-las de um ambiente para outro, por exemplo, das condições de crescimentopara as condições de produção de proteínas pós-transfecção.
Em certas modalidades, os métodos da presente invenção sãoúteis para a geração de uma linhagem de células hospedeiras que é adapta-da às condições de produção de proteínas. Essa linhagem adaptada de cé-lulas hospedeiras é capaz de ser transfectada com qualquer uma dentre di-versas proteínas de interesse. Em certas modalidades, essa linhagem adap-tada de células transfectadas é colocada diretamente em condições de pro-dução de proteínas. Em certas modalidades, essa linhagem adaptada decélulas transfectadas cresce até uma densidade celular desejada e/ou umnúmero de células desejado durante uma fase de crescimento, quando en-tão a linhagem celular passa por uma transição até uma fase de produçãode proteínas. De acordo com a presente invenção, essa linhagem adaptadade células transfectadas exibe efeitos deletérios menores e menos severosdurante a fase de transição, comparada com uma linhagem não adaptada decélulas transfectadas.
Em certas modalidades, a fim de produzir uma proteína de inte-resse, as células hospedeiras adaptadas são transfectadas com uma molé-cula de ácido nucléico exógeno. Em certas modalidades, uma molécula deácido nucléico introduzida na célula codifica a proteína que se deseja ex-pressar de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, umamolécula de ácido nucléico contém uma seqüência reguladora ou codificaum produto gênico que induz ou intensifica a expressão da proteína deseja-da pela célula. Como exemplo não limitante, um produto gênico desse tipopode ser um fator de transcrição que aumenta a expressão da proteína deinteresse.
Em certas modalidades, um ácido nucléico que dirige a expres-são de uma proteína é introduzido estavelmente na célula hospedeira. Emcertas modalidades, um ácido nucléico que dirige a expressão de uma prote-ína é introduzido transitoriamente na célula hospedeira. Aqueles habilitadosna técnica serão capazes de escolher quando se introduzir estável ou transi-toriamente o ácido nucléico na célula com base em necessidades experi-mentais, comerciais ou em outras necessidades.
Um gene que codifica uma proteína de interesse pode opcional-mente ser ligado a um ou mais elementos reguladores de controle genético.Em algumas modalidades, um elemento de controle genético dirige a ex-pressão constitutiva da proteína. Em algumas modalidades, pode ser usadoum elemento de controle genético que fornece a expressão indutívèl de umgene que codifica a proteína de interesse. O uso de um elemento de controlegenético indutível (por exemplo, um promotor indutível) permite a modulaçãoda produção da proteína na célula. Exemplos não Iimitantes de elementosindutíveis de controle genético potencialmente úteis para uso em células eu-carióticas incluem elementos regulados por hormônios (veja, por exemplo,Mader, S. e White, J.H., Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 90: 5.603-5.607, 1993),elementos regulados por Iigantes sintéticos (veja, por exemplo, Spencer,D.M. e cols., Science 262: 1.019-1.024, 1993) e elementos regulados porradiação ionizante (veja, por exemplo, Manome1Y. e cols., Biochemistry 32:10.607-10.613, 1993; Datta, R. e cols., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A. 89:10.149-10.153, 1992). Sistemas reguladores com especificidade celular adi-cionais ou outros sistemas reguladores conhecidos na técnica podem serusados de acordo com os métodos e as composições aqui descritos.
Qualquer proteína que possa ser expressa em uma célula hos-pedeira pode ser produzida de acordo com os métodos e as composições dapresente invenção. A proteína pode ser expressa por um gene que seja en-dógeno à célula hospedeira, ou por um gene heterólogo que seja introduzidona célula hospedeira. A proteína pode ser uma que ocorre na natureza, oupode, alternativamente, ter uma seqüência que foi projetada ou selecionadapela mão do homem. Uma proteína a ser produzida pode ser montada a par-tir de fragmentos de proteína que ocorrem individualmente na natureza. Adi-cional ou alternativamente, a proteína projetada pode incluir um ou maisfragmentos que não sejam de ocorrência natural.
Qualquer célula hospedeira suscetível à cultura de células, e àexpressão de proteínas, pode ser utilizada de acordo com a presente inven-ção. Em certas modalidades, as células hospedeiras são células de mamífe-ros como, por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO). Outrosexemplos não Iimitantes de células de mamíferos que podem ser usadas deacordo com a presente invenção incluem a linhagem de células de mielomade camundongo BALB/c (NSO/I, ECACC Ns: 85110503); células de retino-blastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden1Pasies Baixos)); linhagem decélulas de rim de macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL1651); linhagem de células embriológicas de rim humano (293 ou 293 célu-las subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham e cols.,J. Gen Virol., 36: 59 (1977)); células de rim de filhotes de hamster (BHK,ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês +/-DHFR (CHO, Urlaube Chasin, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 77: 4.216 (1980)); células de sertolide camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251 (1980)); células derim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africa-no (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano(HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); célulasde fígado de rato buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonareshumanas (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC C-CL51); células TRI (Mather e cols., Annals Ν. Y. Acad. Sci., 383: 4.468(1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de células de hepato-ma humano (Hep G2).
Em certas modalidades, células (por exemplo, células de mamí-feros não transfectadas) são adaptadas pelo cultivo de células em meio decrescimento suplementado com inibidores. Em certas modalidades, essesinibidores incluem inibidores que são tipicamente encontrados quando ascélulas crescem sob condições de produção de proteínas. Exemplos nãoIimitantes desses inibidores incluem lactato, amônia, alânina, glutamina e/ouacetolactato. Aqueles habilitados na técnica conhecerão outros inibidoresque podem ser usados de acordo com a presente invenção para adaptar ascélulas às condições de produção de proteínas.
Em certas modalidades, as células (por exemplo, células demamíferos não transfectadas) são adaptadas pelo cultivo de células em ummeio de adaptação que não possui ou que possui uma concentração reduzi-da de um ou mais componentes tradicionalmente encontrados em meios deprodução. Por exemplo, os meios de produção tradicionais tipicamente con-têm insulina em uma concentração de cerca de 10 mg/l ou mais. Desse mo-do, em certas modalidades, as células são adaptadas pelo cultivo das célu-las em um meio de adaptação que não possui insulina. Em certas modalida-des, as células são adaptadas pelo cultivo de células em um meio de adap-tação que contém insulina em uma concentração menor do que uma con-centração de insulina tradicionalmente encontrada em meios de produção.Aqueles habilitados na técnica conhecerão outros componentes que estãotipicamente presentes em meios de produção, e serão capazes de usar mé-todos da presente invenção para adaptar células aos meios que não possu-em ou que possuem uma concentração reduzida desses componentes.
Em certas modalidades, células são adaptadas por cultivo (porexemplo, cultivo contínuo) de células de mamíferos não transfectadas em meio de crescimento suplementado com um ou mais inibidores. Exemplosnão Iimitantes desses inibidores incluem produtos colaterais secundários defontes de carbono primário. Por exemplo, alguns produtos colaterais secun-dários incluem, sem limitação, lactato, alanina, glutamina, acetolactato e/ouamônia. Em certas modalidades, as concentrações desses produtos colate- rais secundários presentes e/ou adicionadas a um meio de adaptação simu-lam aquelas tipicamente encontradas nas condições do biorreator como, porexemplo, cerca de 2,0 a cerca de 10,0 g/l de lactato e/ou cerca de 0,1 a cer-ca de 0,5 g/l de amônia. Em certas modalidades, as células são adaptadassob condições nas quais a concentração de lactato no meio de adaptação éde cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 g/l ou maiores. Adi-cional ou alternativamente, em certas modalidades, as células são adapta-das sob condições nas quais a concentração de amônia no meio de adapta-ção é de cerca de 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3,1,4, 1,5 g/l ou maiores.
Em certas modalidades, as células individuais de mamíferos nãotransfectadas e/ou subpopulações de células de mamíferos não transfecta-das que foram adaptadas às condições de produção de proteínas de acordocom um ou mais métodos da presente invenção podem exibir fenótipos con-sistentes com a captação desses produtos colaterais secundários, de talforma que os níveis de produtos colaterais secundários na verdade diminu-em ao longo do tempo. Em certas modalidades, essas células adaptadasnão transfectadas de mamíferos retêm a habilidade para recolher produtoscolaterais secundários após terem sido transfectadas com uma molécula deácido nucléico exógeno para a produção de uma proteína de interesse. Emcertas modalidades, essas células adaptadas de mamíferos transfectadasgeralmente têm um melhor desempenho em um processo subseqüente deprodução de proteínas (por exemplo, um processo de biorreator de bateladaalimentada) em relação às células de mamíferos não transfectadas que nãocaptam os produtos colaterais e/ou que não foram adaptadas para captaresses produtos colaterais secundários. Por exemplo, essas células adapta-das de mamíferos transfectadas têm um melhor desempenho em processossubseqüentes de produção de proteínas em batelada, de batelada alimenta-da e/ou de perfusão. Em um reator de produção (por exemplo, um reator deprodução de batelada alimentada), esses produtos colaterais secundáriospodem freqüentemente se acumular até níveis que são geralmente inibido-res para um aumento adicional do crescimento e/ou da viabilidade das célu-las. Em certas modalidades, as.subpopulações de células de mamíferos nãotransfectadas que foram adaptadas de acordo com os métodos da presenteinvenção crescem em um meio suplementado e podem ter um bom cresci-mento sob as condições inibidoras e estressantes tipicamente encontradasem um biorreator de produção.
Como é conhecido na técnica de cultura de células, em muitoscasos, a temperatura de uma cultura de células é diminuída quando a culturade células é mudada das condições de crescimento para as condições deprodução de proteínas. Em certas modalidades, as células são adaptadaspor cultivo das células em uma temperatura que conduz à produção de umproduto protéico. Em certas modalidades, as células são adaptadas ao se-rem cultivadas em uma temperatura de cerca de 31 °C, embora os métodosda presente invenção não se limitem a essa temperatura. Por exemplo, ascélulas podem ser adaptadas ao serem cultivadas em uma temperatura decerca de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 ou 45°C. Aqueles habilitados na técnica conhece-rão temperaturas adequadas à produção de proteínas, e essas temperaturaspodem depender, pelo menos em parte, da linhagem celular, da proteína aser produzida, de outras condições de cultura, e/ou de qualquer outro fatorconsiderado importante por aqueles habilitados na técnica.
Em certas modalidades, as células são adaptadas por cultivocontínuo de células de mamíferos não transfectadas por uma duração maislonga em um modo "de batelada realimentada". Em certas modalidades, ascélulas não transfectadas são adaptadas por esses métodos de adaptação"de batelada realimentada". Em certas modalidades, as células transfecta-das são adaptadas por esses métodos de adaptação "de batelada realimen-tada". Operações típicas de cultura de células podem empregar um regimede gerenciamento de culturas de células por divisão, passagem ou subculti-vo de uma cultura de células a cada três ou quatro dias. Em certas modali-dades dos métodos de adaptação "de batelada realimentada", as células demamíferos não transfectadas são cultivadas por durações mais longas, pordades, as células de mamíferos são cultivadas por 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14 dias ou mais, antes de serem subcultivadas. Essas culturas de dura-ção mais longa possuem o efeito duplo de adaptação das células às condi-ções de produção de proteínas pelo aumento da densidade celular e/ou peloacúmulo de níveis mais elevados de metabólitos secundários no meio condi-cionado ao qual as células podem ser adaptar.
Em certas modalidades, as células de mamíferos não transfec-tadas podem ser cultivadas continuamente sob condições "combinadas àprodução". Em certas modalidades, as células não transfectadas podem sercultivadas com ciclos repetitivos de cultura de células sob condições combi-nadas à produção, seguidos por passagem das subpopulações das célulasapós 3 ou 4 dias sob "recuperação" ou por condições padronizadas de cres-cimento, com a opção de utilizar um meio de crescimento. Em certas moda-lidades, uma população é passada várias vezes durante o processo de a-daptação. Por exemplo, uma população pode ser passada, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 vezes ou mais durante o proces-so de adaptação. Em certas modalidades, as células são adaptadas às con-dições de produção de proteínas por crescimento de uma população de cé-lulas por um período de tempo mais longo, antes da passagem. Por exem-plo, as células podem crescer 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 dias ou mais,antes de serem passadas. Essas subpopulações passadas podem ser ras-treadas quanto a uma ou mais características desejáveis. Em certas modali-dades, após vários ciclos dé adaptação repetitiva ou contínua, surgirão sub-populações de células que exibem características superiores que incluem,por exemplo, crescimento e/ou viabilidade aperfeiçoada em relação à popu-lação de partida não adaptada, nas condições combinadas à produção. Alémdisso, em certas modalidades, certas subpopulações começarão a recolherprodutos colaterais, por exemplo, lactato, de tal forma que o nível desse pro-duto colateral diminui ao longo do tempo, aumentando o desempenho da-quela linhagem celular em um biorreator de produção. Em certas modalida-des, uma ou mais subpopulações rastreadas de células que exibem uma oumais características desejáveis (por exemplo, forte crescimento) são entãotransformadas para a produção de uma proteína de interesse, e depois assubpopulações transfectadas são colocadas em condições de produção deproteínas (por exemplo, condições consistentes com aquelas às quais ascélulas foram adaptadas).
Em certas modalidades, as células crescem de acordo comqualquer um dos métodos de cultura de células descritos nos Pedidos dePatente U.S. Nos de Série 11/213.308, 11/213.317 e 11/213.633, cada umdos quais foi depositado em 25 de agosto de 2005, e cada um dos quais éaqui incorporado por referência em sua totalidade. Por exemplo, em certasmodalidades, as células podem crescer em um meio de cultura no qual aconcentração cumulativa de aminoácidos é maior do que cerca de 70 mM.
Em certas modalidades, as células podem crescer em um meio de cultura noqual a proporção molar entre a concentração cumulativa de glutamina a con-centração cumulativa de asparagina é menor do que cerca de 2. Em certasmodalidades, as células podem crescer em um meio de cultura no qual aproporção molar entre a concentração cumulativa de glutamina e a concen-tração cumulativa de aminoácidos totais é de menos do que cerca de 0,2.
Em certas modalidades, as células podem crescer em um meio de cultura noqual a proporção molar entre a concentração cumulativa de íons inorgânicose a concentração cumulativa de aminoácidos totais é entre cerca de 0,4 a 1.Em certas modalidades, as células podem crescer em um meio de cultura noqual a concentração combinada de glutamina cumulativa e de asparaginacumulativa é entre cerca de 16 e 36 mM. Em certas modalidades, as célulaspodem crescer em um meio de cultura que contém duas, três, quatro ou to-das as cinco das condições de meio citadas anteriormente. O uso dessesmeios permite a presença de níveis elevados de produção de proteínas ereduz o acúmulo de certos fatores indesejáveis, tais como amônio e/ou Iacta-to.
Em algumas modalidades, as células crescem sob uma ou maisdas condições descritas no Pedido Provisório de Patente U.S. Ns de Série60/830.658, depositado em 13 de julho de 2006 e aqui incorporado por refe-rência em sua totalidade. Por exemplo, em algumas modalidades, as célulascrescem em um meio de cultura que contém manganês em uma concentra-ção entre aproximadamente 10 e 600 nM. Em algumas modalidades, as cé-lulas crescem em um meio de cultura que contém manganês em uma con-centração entre aproximadamente 20 e 100 nM. Em algumas modalidades,as células crescem em um meio de cultura que contém manganês em umaconcentração de aproximadamente 40 nM. O uso desses meios no cresci-mento de glicoproteínas resulta na produção de uma glicoproteína com umpadrão de glicosilação aprimorado (por exemplo, um número maior de resí-duos de açúcar ligados covalentemente em uma ou mais cadeias de oligos-sacarídeos).
Os componentes e/ou suplementos do meio de produção e domeio de crescimento podem ser facilmente determinados por aqueles habili-tados na técnica de cultura de células. Como é conhecido na técnica, oscomponentes e/ou suplementos podem variar, dependendo da célula hospe-deira usada e da proteína de interesse desejada. Além disso, as condições ea quantidade de produtos colaterais produzida podem ou irão variar com di-ferentes condições do biorreator e com cada linhagem celular diferente. Opresente pedido é ainda ilustrado pelos exemplos não Iimitantes que serãoapresentados a seguir. Quaisquer modificações que possam ser necessáriasao longo da adaptação de células de mamíferos ao meio de cultura de célu-las para a produção de proteínas diferentes estão incluídas na técnica decultura de células.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Adaptação de células não transfectadas de ovário de hamsterchinês às condições combinadas à produção
Células CHOK1 não transfectadas foram cultivadas em condi-ções padronizadas de batelada realimentada de 3 dia/4 dia em meio decrescimento, com componentes listados na Tabela 1 abaixo, ou cultivadasem um modo de batelada realimentada de 7 dias em meio de produção enri-quecido, com componentes listados na Tabela 2 abaixo, por vários ciclos. Ascélulas foram cultivadas a 37°C em um volume de trabalho de 10 a cerca de30 ml. Os números de células do experimento são mostrados nas Figuras 1a e 1b. Em torno do 58e dia do método de batelada realimentada da figura1 a, as células foram passadas por 9 dias, em vez de 7, e a passagem sub-seqüente não cresceu bem. Após a passagem ruim de 7 dias, no entanto, ascélulas foram capazes de se recuperar.
TABELA 1
<table>table see original document page 32</column></row><table><table>table see original document page 33</column></row><table><table>table see original document page 34</column></row><table>
Tabela 2
<table>table see original document page 34</column></row><table><table>table see original document page 35</column></row><table><table>table see original document page 36</column></row><table>
As células foram então avaliadas em um ensaio de produção debatelada alimentada, em que o volume de trabalho era entre 10 e 30 ml. Ascélulas foram cultivadas a 37°C por quatro dias, e depois a temperatura foialterada para 31 eC até o 12s dia, quando o ensaio terminava. A densidade ea viabilidade celular foram comparadas, e os resultados são ilustrados nafigura 1c. As células cultivadas em modo de batelada realimentada de 7 diasexibiram densidades celulares maiores do que as células cultivadas em mo-do de batelada realimentada padronizado de 3 dias/4 dias. Da mesma forma,dois grupos diferentes de células que foram adaptadas para o crescimentoem meio de produção, com os componentes listados na Tabela 3 abaixo,obtiveram densidades celulares maiores do que a população de partida nãoadaptada de controle.<table>table see original document page 37</column></row><table><table>table see original document page 38</column></row><table><table>table see original document page 39</column></row><table>
Exemplo 2: Adaptação da linhagem celular transfectada às condições com-binadas à produção
Uma linhagem celular que expressa os genes da cadeia pesadae leve de um anticorpo monoclonal foi cultivada sob condições padronizadasde batelada realimentada de 3 dias/4 dias, usando meio de crescimento pa-dronizado, com os componentes listados na Tabela 1, ou duas versões demeio de produção, "A" e "Β". O meio de produção A, com os componenteslistados na Tabela 2, foi moderadamente enriquecido em relação ao meio decrescimento, e o meio de produção B, com os componentes listados na Ta-bela 4 abaixo, foi significativamente enriquecido em relação ao meio decrescimento. Os efeitos de metotrexato (MTX) também foram testados nomeio de produção "B; 1,5 μΜ de MTX foi adicionado em uma cultura commeio de produção "B", e não na outra. As células foram cultivadas a 37°Cem um volume de trabalho de 10 a cerca de 30 ml. As taxas de crescimentodurante a adaptação nesses meios são mostradas na figura 2a.
TABELA 4
<table>table see original document page 39</column></row><table><table>table see original document page 40</column></row><table><table>table see original document page 41</column></row><table>
Após a cultura contínua nesses meios, as linhagens celularesforam avaliadas em um ensaio de produção de batelada alimentada, no qualas células foram avaliadas no meio de produção B, ilustrado na figura 2b. Ascélulas foram cultivadas a 37°C por quatro dias, e depois a temperatura foialterada para 31°C até o 129 dia, quando o ensaio foi terminado. Os resulta-dos indicam que as linhagens celulares que superexpressam a proteína re-combinante também podem ser adaptadas sob condições combinadas àprodução para se obter características de crescimento superiores em umensaio de produção de batelada alimentada.
Exemplo 3: Adaptação de células não transfectadas de ovário de hamsterchinês às condições de insulina baixa
A insulina tem um impacto direto sobre o metabolismo de glicosepelas células de mamíferos. O consumo rápido de glicose na cultura de célu-las está freqüentemente associado à excreção de ácido lático como dejetometabólico. O ácido lático pode inibir o crescimento celular e possui efeitosnegativos sobre a viabilidade celular. A insulina também é, segundo relatos,um fator de crescimento para células de mamíferos.
As células da linhagem de células hospedeiras CHOK1 foramretiradas de meios de crescimento normais (contendo 10 mg/l nucelina), eforam colocadas em meios completamente desprovidos de insulina. Apósuma fase Iog inicial na qual as células demonstraram crescimento diminuído,a taxa de crescimento eventualmente se elevou até uma taxa comparávelàquela da cultura de CHOK1 de controle em meios contendo insulina, suge-rindo que as células cultivadas na ausência de insulina se adaptaram a es-sas condições. A viabilidade das células não foi afetada e permaneceu nafaixa de 90 por toda a adaptação. Essa adaptação continuou por aproxima-damente 100 duplicações da população. Quando as células CHOK1-insulinaadaptadas foram empilhadas e depois descongeladas, elas mantiveram suahabilidade para crescer em meios sem insulina. As células CHOK1 de con-trole descongeladas em meios sem insulina apresentaram uma da taxa de crescimento, sugerindo que a adaptação K1-insulina realmente alterou ascélulas, permitindo que elas crescessem independente da insulina exógena.Investigações em andamento incluem a combinação do fenótipo sem insuli-na com o fenótipo de adaptação de passagem de 7 dias.
O primeiro ensaio de produção de batelada alimentada foi orga-nizado em um formato de pH não ajustado. O experimento incluiu célulasCHOK1 não adaptadas em meios de produção padronizados (20 mg/ml denucelina) como controle positivo, e células CHOK1 não adaptadas cultivadasem meios de produção sem insulina como controle negativo. As célulasCHOK1 adaptadas sem insulina foram cultivadas em meios de produçãosem insulina. A insulina foi incluída nos meios de alimentação no 39 e no 7Qdias (em uma concentração final de 0,006 mg/ml). O exame dos dados suge-re que as células CHOK1 adaptadas crescem em meios sem insulina e pos-suem características de crescimento, viabilidade e IVCD muito similares,quando comparadas com a amostra de controle positivo de CHOK1 (veja asFiguras 3-5). A amostra de controle negativo de CHOK1 mostrou uma redu-ção da taxa de crescimento (veja a figura 3). Esses resultados confirmamque as células CHOK1 adaptadas ao crescimento sem insulina são ineren-temente diferentes das células CHOK1 não adaptadas, considerando suahabilidade para crescem bem em meios que não contêm insulina.
As células CHOK1 adaptadas sem insulina foram então avalia-das em um segundo experimento de batelada alimentada, sob condições com controle de pH. Nesse experimento, as células CHOK1 não adaptadase as células CHOK1 adaptadas sem insulina foram organizadas em trêscondições separadas. A primeira condição continha insulina tanto no meiode base quanto no meio de alimentação (50 mg/l e 0,006 mg/ml, respectiva-mente), simbolizados nas Figuras 6-9 como (+/+). A segunda condição con-tinha meios de base sem insulina, com uma alimentação contendo insulina(simbolizada por (-/+) nas Figuras 6-9), e a terceira condição continha meiosde base sem insulina e meios de alimentação sem insulina (simbolizados por(-/-) nas Figuras 6-9). As células CHOK1 adaptadas sem insulina demons-tram crescimento, viabilidade e IVCD melhores quando cultivadas em meiossem insulina, comparadas com as células CHOK1 não adaptadas (veja asFiguras 6-9). Parece que as linhagens celulares adaptadas CHOK1-insulinaproduzem menos Iactato e consumem quase completamente todo o Iactatoque produzem (veja a figura 9). Essa eliminação de um subproduto prejudi-cial produz uma cultura de células mais saudável e é observada como umfenótipo muito promissor. Esse fenótipo promissor fornece melhores condi-ções de crescimento e permite que as células alcancem densidades maioresdo que o controle associado. Deve-se observar que esse fenótipo está dire-tamente relacionado à eliminação de insulina dos meios, uma vez que aslinhagens celulares adaptadas CHOK1 -insulina possuem taxas de produçãode lactato similares à amostra de controle quando cultivadas em meios quecontêm insulina.
O Exemplo 3 demonstra que a adaptação de células CHOK1 auma condição sem insulina leva a fenótipos desejáveis quando as célulassão cultivadas em modos de produção industrialmente relevantes. Os fenóti-pos metabólicos aprimorados levam a um aumento do crescimento celular eda viabilidade, que supostamente possuem um impacto positivo significativosobre a produtividade volumétrica de uma cultura de células CHO recombi-nantes.
Embora certas modalidades da especificação tenham sido aquidescritas, a descrição acima é meramente ilustrativa. Poderão ocorrer modi-ficações adicionais das modalidades aqui apresentadas por aqueles habilita-dos na técnica de cultura de células, e considera-se que todas essas modifi-cações estão incluídas dentro do escopo das modalidades, como definidaspelas reivindicações em anexo.
Claims (30)
1. Método para a adaptação de células às condições de produ-ção de proteínas que compreende:- o cultivo das células em um meio de adaptação;- o rastreamento das células e a seleção de uma subpopulaçãode células que exibe uma característica aprimorada da cultura de célulasquando a subpopulação cresce sob condições de produção de proteínas,cuja característica difere de uma característica da cultura de células corres-pondente que seria observada em células que crescem em um meio que nãoé um meio de adaptação, em que a característica aprimorada da cultura decélulas é selecionada do grupo que consiste em: aumento do crescimento,aumento da viabilidade, aumento da densidade de células viáveis integra-das, aumento da titulação, aumento da produtividade celular específica ecombinações destas.
2. Método da reivindicação 1, que ainda compreende a etapa depassagem das células antes da etapa de rastreamento.
3. Método da reivindicação 2 ou 3, em que a etapa de passagemcompreende a passagem das células duas ou mais vezes, antes da etapa derastreamento.
4. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que aetapa de passagem compreende a passagem das células após aproxima-damente 3 ou 4 dias no meio de adaptação.
5. Método de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que aetapa de passagem compreende a passagem das células após aproxima-damente 7 ou 8 dias no meio de adaptação.
6. Método de qualquer uma das reivindicações 1-5, que aindacompreende a etapa de cultivo das células em um meio que não é um meiode adaptação após a etapa de passagem.
7. Método da reivindicação 6, em que o meio que não é um meiode adaptação é um meio de crescimento padronizado.
8. Método de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que ascélulas não são transfectadas.
9. Método de qualquer uma das reivindicações 1-7, em que ascélulas foram transfectadas para expressar uma proteína de interesse.
10. Método da reivindicação 9, em que a proteína de interesse éum anticorpo.
11. Método da reivindicação 9, em que a proteína de interesse éuma substância terapêutica protéica.
12. Método de qualquer uma das reivindicações 1-11, em que omeio de adaptação compreende um meio de produção.
13. Método da reivindicação 12, em que o meio de produçãocompreende um nível aumentado de um ou mais componentes do meio,quando comparado com um meio de crescimento padronizado, o componen-tes do meio selecionado do grupo que consiste em: nutrientes, vitaminas,microelementos, e combinações destes.
14. Método de qualquer uma das reivindicações 1-13, em que omeio de adaptação compreende um metabólito secundário selecionado dogrupo que consiste em: lactato, amônia, e combinações destes.
15. Método da reivindicação 14, em que o metabólito secundárioé adicionado ao meio de adaptação no começo da cultura de células.
16. Método da reivindicação 14 ou 15, em que o nível do meta-bólito secundário é aumentado à medida que a cultura de células progride.
17. Método da reivindicação 16, em que ó nível do metabólitosecundário aumenta em conseqüência da atividade metabólica das células.
18. Método da reivindicação 16 ou 17, em que o nível do meta-bólito secundário aumenta através da adição do metabólito secundário à cul-tura de células.
19. Método de qualquer uma das reivindicações 14-18, em que asubpopulação de células selecionada capta um metabólito secundário, de talforma que o nível do metabólito diminui quando as células adaptadas cres-cem em um meio de produção.
20. Método de qualquer uma das reivindicações 1-19, em que omeio de adaptação compreende um ou mais inibidores selecionados do gru-po que consiste em: lactato, amônia, alanina, glutamina, acetolactato, ecombinações destes.
21. Método de qualquer uma das reivindicações 14-20, em quelactato está presente em uma concentração de cerca de 2 a cerca de 10 g/l.
22. Método da reivindicação 21, em que Iactato está presente nocomeço da cultura de células em uma concentração de cerca de 2 a cercade 10 g/l.
23. Método de qualquer uma das reivindicações 14-20, em queamônia está presente em uma concentração de cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g/l.
24. Método da reivindicação 23, em que amônia está presenteno começo da cultura de células em uma concentração de cerca de 0,1 acerca de 0,5 g/l.
25. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,em que o meio de adaptação é desprovido de insulina.
26. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,em que o meio de adaptação inclui insulina em uma concentração menor doque cerca de 10 mg/l.
27. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,em que as células são de mamíferos.
28. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,em que as condições de produção de proteínas compreendem as condiçõesusadas em um biorreator.
29. Método da reivindicação 28, em que o biorreator é um bior-reator de produção.
30. Método de qualquer uma das reivindicações precedentes,em que as condições de produção de proteínas compreendem o cultivo dascélulas em um processo de batelada alimentada de produção de proteína.
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2006
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