JPH03180175A

JPH03180175A - 無血清培地

Info

Publication number: JPH03180175A
Application number: JP1318439A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1989-12-07
Filing date: 1989-12-07
Publication date: 1991-08-06
Also published as: EP0432952A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】皮果±立赴且立立本発明は基礎合成培地に無機鉄化合物を増殖因子として
添加してなる無血清培地に関する。本発明の培地は、動
物細胞の培地として用いられる。

従来立技歪動物細胞を用いた物質生産において、細胞を培養する培
地の選択は非常に重要である。何故なら、生産物の生産
コストは培地の価格と、生産物の精製コストに依存する
からである。動物細胞の培養には、従来基礎合成培地に
１０％程度の動物血清を添加した培地が用いられてきた
。しかし、血清の添加は培地のコストを引き上げるのみ
ならず、血清中に含まれる高濃度のタンパク質によって
、生産物の精製コストも引き上げる。そこで血清を含ま
ない無血清培地が開発され、現在では物質生産を目的と
する場合には無血清培地が一般的になってきている。無
血清培地には種々の細胞増殖因子が添加されている６代
表的なものは、インスリン、エタノールアミン、亜セレ
ン酸、トランスフェリン、アルブミン、リポタンパク質
、種々のサイトカイン類等である。このうち、培地のコ
ストおよび生産物の精製コストを引き上げる要因となり
うるのはタンパク質性の増殖因子である。したがって、
より低タンパク質、究極的には無タンパク質の無血清培
地の開発が必須である。

基礎合成培地に添加する増殖因子のうち、比較的高価な
のはトランスフェリンである。トランスフェリンの増殖
因子としての役割は、細胞への効率的な鉄イオンの供給
であると考えられている〔木材、小沢°トランスフェリ
ンの生長促進作用”最新医学、第４０巻、第５５４−５
５９頁１９８５年及び日本組織培養学会編、“細胞成長
因子”第１５２−１５５頁１９８０年参照〕、高後高径
よって鉄結合型トランスフェリンがエンドサイト−シス
によって、細胞内に取り込まれ、細胞内で鉄イオンを遊
離した後、再び細胞外へ再分泌される、トランスフェリ
ンのリサイクリングモデルが提唱されている。

〔新津、高径“°鉄の膜透過障害による貧血”別冊医学
の歩み、メディカルトピックス第３巻、第１２４頁１９
８８年参照〕、すなわち、トランスフェリンは鉄イオン
を細胞内に、くりかえし供給しているというものである
。これに対し、Ｍｅ　ｔｈｅｒ及びＳａ　ｔ。

はＦ１２を基礎合成培地とした無血清培地において、ト
ランスフェリンの増殖促進効果は、高濃度の鉄イオンに
よって代替されることを示した（Ｊ、Ｐ、Ｍｅｔｈｅｒ
ａｎｄ　Ｇ、Ｈ，５ａｔｏ、エクスベリメント　セルリ
サーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）第１２０１！
、第１９１−２００頁１９７９年参照〕、さらにＫｏｖ
ａｒ及びＦｒａｎｅｋはマウスハイブリドーマの無血清
培地において、ＲＰＭ１ｌ６４０培地を基礎合成培地と
し５００μＨという非常に高濃度のクエン酸鉄を加える
ことによって、ハイブリドーマの無タンパク質無血清培
養が可能であることを報告している〔バイオテクノロジ
ー　レターズ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔ
ｅｒｓ）第９巻、第２５９−２６４頁１９８７年参照）
、シかし高濃度の鉄イオンは、細胞に障害を与えること
が知られており、より低濃度で効率よく鉄を供給するこ
とのできる無血清培地の開発が望まれていた。

本発明は、上記した事情に鑑み、より効率的な鉄供給形
態を把握して、汎用性の高い無血清培地を開発すること
を目的とするものである。さらに、望ましくは比較的簡
単な構造の鉄化合物の添加により、その目的が達成され
ることが望ましい、これに加えて、基礎合成培地の選択
が重要である。

何故なら、増殖因子の活性の発現には細胞の基本代謝を
支える基礎合成培地の成分が重要な役割を果たすからで
ある。

本発明者らは、種々の鉄剤および種々の基礎合成培地に
ついて検討した結果、最良の組合わせを見出し、本発明
汽完戒するに至った。すなわち、本発明は、低価格で容
易に調製可能な汎用性のある無血清培地を提供すること
を目的とする。

ｉ　　　°　　るｔ−のすなわち、本発明は、基礎合成培地に無機鉄化合物を増
殖因子として添加した無血清培地が、動物細胞を効率よ
く増殖させ、生産物の精製も容易で、汎用性も高いこと
を見出し、本発明を完成したものである。しかも本発明
の無血清培地は、低価格で容易に調製することができる
。

本発明の基礎合成培地は、細胞の基本代謝を支える成分
、すなわち、アミノ酸、無機塩、Ｉｉ頬が主成分となっ
ている培地をいう。

しかし、特に本発明では、基礎合成培地ＥＲＤＦ　（Ｅ
ｎｒｉｃｈｅｄ　ＲＤ　Ｆ　）と無機鉄化合物との組合
わせにより、動物細胞の長期培養が可能な、無血清低タ
ンパク質、あるいは完全無タンパク質培地を提供するこ
とができる。ＥＲＤＦを基礎合成培地に用いたときに他
の基礎合成培地を用いたときに比べて著しく高い効果を
達成することができる。

ＥＲＤＦは、マウス主エローマＮＳＩの増殖を指標にし
て、村上らによって開発された公知の無血清培養用基礎
合成培地である〔層化、第５７５−５８３頁１９８４年
参照）、ＥＲＤＦは、ＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０、ダルベ
ツコ変法最少必須培地（ＤＭＥＭ）　、およびハムＦ１
２を２　：　１　：　１　（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の割合で
混合したものを基礎としくこの培地をＲＤＦという）、
アミノ酸濃度を３倍に、グルコース濃度を２倍に、ビタ
ミン類も濃度を高め、さらに培地の浸透圧を通常の培地
より５％高い２９０ｍ０５ｍ＋に調整している。

その組成を第１表に示す。

本発明におけるＥＲＤＦはこのような厳密な組成をいう
ものではなく、その目的及び効果が達成される限り、成
分一部の削除、追加、変更あるいは使用量の変更は可能
である。また、ＥＲＤＦにインスリン（Ｉ）、トランス
フェリン（Ｔ）、エタノ−ルアξン（Ｅ）、セレニウム
（Ｓ）（ＩＴＥＳ）を加えたＩＴＥＳ−ＥＲＤＦは、汎
用性の高い培地としてマウスハイプリドーマ、あるいは
ヒトハイプリドーマの培養に用いられているが！ＴＥＳ
−ＥＲＤＦはタンパク質濃度が高い（２５μｇ／ｌｄ）
ため本発明には用いられない、ＥＲＤＦ中には０．８μ
Ｈの硫酸鉄（ＩＩ）が含まれている。この鉄濃度ハ、Ｅ
ＲＤＦ（７）原処方ｉ’あるＲＰＭ１ｌ６４０：ＤＭＥ
Ｍ：　Ｆ１２＝２　：　１　：　１の混合培地と同じで
あり、最適化されているわけではない０本発明の無血清
培地は、ＥＲＤＦを基礎合成培地とし、さらに培地中の
無機鉄濃度を高め、培地１ｌ当り４０〜１００μＨに強
化したＩＥＳ−ＥＲＤＦ、あるいは無機鉄濃度を４０〜
１００μＨに強化したＥＳ−ＥＲＤＦが好ましい、また
、この培地中のタンパク質濃度を極めて低くし、例えば
基礎培地１２中にタンパク質５ｍｇ以下にするかあるい
は無タンパク質培地として用いてもよい、このようにす
ると、タンパク質の含量が少く、細胞生産物の精製が容
易である。

タンパク質含量をを低くする場合、培地中に例えばイン
スリンを５μｇ／ｒｄ程度（無機鉄濃度を４０〜１００
μＭ　ニ強化したＩＥＳ−ＥＲＤＦ）とするとよい、ま
た、全く無タンパク質培地の場合は、例えば、無機鉄濃
度を４０〜１００μＭ／ｊ！にて強化したＢＳ−ＥＲＤ
Ｆを用いるとよい、このような培地を用いても、ハイプ
リドーマ等の動物細胞の長期継代培養が可能である。さ
らに抗体産生量もＩＴＥＳ−ＥＲＤＦと差がない、ＩＥ
Ｓ−ＥＲＤＦで培養可能な細胞は無機鉄強化ＩＴＥＳ−
ＥＲＤＦおよび無機鉄強化ＥＳ−ＥＲＤＦ中で継代培養
可能である。したがって、この無機鉄強化無血清培地は
ＳＦ３やＮＳＩ、あるいはＸ６３のような親株由来のマ
ウスバイプリドーマの培養に適している。無機鉄として
は硫酸鉄、塩化鉄、硝酸鉄あるいはこれらの水和物を用
いることができる。

なお、本発明における培地の略称において、■はインス
リンを、Ｔはトランスフェリンを、Ｅはエタノールアミ
ンを、Ｓはセレニウムを表わし、ＥＲＤＦＯ前に付した
表示はこれらの成分を含有することを示す（例　ＥＳ−
ＥＲＤＦ−エタノ−ルアξン及びセレニウムを含有する
ＥＲＤＦ）。

また、培地のＲＤＦのＲはＲＰ　Ｍ　Ｉ　１６４０を、
ＤはＤＭＥＭを、ＦはハムＦ１２をそれぞれ表わし、Ｒ
ＤＦがこれらの培地より構成されることを示す。

以下に、本発明を実施例にて具体的に説明する。

２施貫１（１）細胞Ｋａｗａｋａｍｉ　ｅｔ　ａｌ、が樹立した抗ウシラク
トフェリン抗体分泌マウスハイブリドーマＨＢ　８８５
２を用いた〔ジャーナルオプデイリイ　サイエンス（Ｊ
、Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ、）、第７０巻、第７５２−７５
９頁１９８７年参照〕、このハイブリドーマはＩｇＧ型
抗体を分泌する。細胞は１０％ＦＣ３（フロー社）を含
むＥＲＤＦ（極東製薬）で継代培養した。細胞の継代培
養には、底面積２５ｃｊのティシュカルチャーフラスコ
（コーニング２５１０２５）を使用した。培養は５％炭
酸ガス／９５％空気、湿度９０％以上、３７°Ｃで行っ
た。

（２）ハイブリドーマの無血清培養基礎合成培地には、インスリン（５μｓ／ｄ、ノボ社二
相性インスリン）、エタノールアミン（２０μＨ１シグ
マ社）およびセレニウム〈亜セレン酸ナトリウム、２５
ｎＭ、シグマ社）（ＩＥＳ）、あるいはエタノールアミ
ンおよびセ・レニウム（ＥＳ）を添加したＥＲＤＦ　（
極東製薬）を用いた。鉄剤としては、硫酸鉄（■）７水
和物、塩化鉄（■）、硝酸鉄（■）９水和物、（いずれ
も和光純薬）を用いた。ＨＢ８８５２を無血清培地へ移
行する際には、継代に用いたＦｅ２の影響を避けるため
に、インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン
、セレニウムを含むＥＲＤＦ　（ＩＴＥＳ−ＥＲＤＦ）
で１週間以上ハイブリドーマを継代培養した後、ＩＴＥ
Ｓを含まないＥＲＤＦで細胞を３回洗浄し、使用した。

（３）結果＾、　　　　■　によるバイブ　　−マ果硫酸鉄（ＩＩ）をＩＢＳ−ＥＲＤＦに添加して、ハイブ
リドーマを培養した。ＥＲＤＦ中にもともと含まれる硫
酸鉄（ＩＩ）の濃度は、０．８μＨである。この実験で
は、ＩＥＳ−ＥＲＤＦに硫酸鉄（ＩＩ）をもとの鉄濃度
の５〜１００倍（４〜８０μＭ）添加した。第１図に示
すように、硫酸鉄（ｎ）の添加量が増加するに従って、
ハイブリドーマの増殖が促進され、４０μ阿あるいは８
０μＨの硫酸鉄（■）を添加した培地中では、培養６日
後の細胞密度は？、２Ｘ１０’／ｄニ達シタ。

Ｂ、４　　　の　　のハイフ悄　−マ鉄則の種類によって、ハイブリドーマの増殖が影響を受
けるか否かを検討するために、それぞれ８０μＨの硫酸
鉄（■）、塩化鉄（■）、硝酸鉄（■）、フェリシアン
酸カリウム（ＫｓＦｅ（ＣＮ）ｉ）を添加したＩ　ＥＳ
−ＥＲＤＦ中で、ハイブリドーマＨＢ８８５２を培養し
た。第２図に示すように、培養３日後、６日後ともに、
硫酸鉄（ＩＩ）添加培地中でのハイブリドーマの細胞密
度が最も高い値を示し、６日後には８．２Ｘ１０’／−
に達した。塩化鉄（Ｉｌｌ）および硝酸鉄（Ｉｌｌ）も
硫酸鉄（ＩＩ）と同程度の増殖促進効果を示した。６日
後の到達細胞密度はそれぞれ？、８　Ｘ　１０’／−お
よび７．３　Ｘ　１０’／−であった。

ＥＳ−ＥＲＤＦに８０μＨの硫酸鉄（ＩＩ）を添加し、
ハイブリドーマＨＢ８８５２を培養した。第３図に示す
ように、インスリンを含まない、完全無タンパク質培地
（Ｅ　Ｓ　　Ｆｅ５Ｏ４）中でもハイブリドマは良好な
増殖を示した。

裏嵐朋１８０μＨの硫酸鉄（ＩＩ）を添加したＩ　ＥＳ−ＥＲＤ
Ｆ、あるいはＥＳ−ＥＲＤＰＩ（ｌｄに、ハイブリドー
マをＩ　Ｘ　１０’／Ｍ１の密度で浮遊させ、ティシュ
カルチャーフラスコにまきこんだ、その後、３〜４日毎
に細胞密度を測定し、新鮮な培地で細胞密度をＩ　Ｘ　
１０’／ｄとなるように希釈して培養を継続した。細胞
は１７日日間化培養した。

（２）因果８０μＨの硫酸鉄（ＩＩ）を含むＩ　ＥＳ−ＥＲＤＦ、
あるいはＥＳ−ＥＲＤＦ中でハイブリドーマＨＢ８８５
２を継代培養した結果を第４図に示す、　１７日間の培
養中に細胞の増殖速度が低下することはなかった。マウ
スハイブリドーマＨＢ８８５２は、インスリンのみをタ
ンパク質として含む、無機鉄強化ｒＥｓ−ＥＲＤＦ、あ
るいはタンパク質を全く含まない無機鉄強化ＥＳ−ＥＲ
ＤＦ中で、インスリン及びトランスフェリンを含むＩＴ
ＥＳ−ＥＲＤＦ中と同様に継代培養することが可能であ
った。

ＨＢ８８５２を硫酸鉄（ｎ）強化Ｉ　ＥＳ−ＥＲＤＦ、
ＥＳ−ＥＲＤＦ、あるいは１０％ＦＣ３添加ＥＲＤＦに
０．５Ｘ１０’／ｄの密度でティシュカルチャーフラス
コにまきこみ３日間培養後、培養上清中に分泌されたＩ
ｇＧをＥＬＩＳＡ（イムニッケ亀ストリイ（Ｉｍｍｕｎ
ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第８巻、第８７１−８７４頁、
１９７１年参照〕で測定した。

（２）因果ＨＢ　８８５２を硫酸鉄（ＩＩ）強化ＩＥＳ−ＥＲＤＦ
、硫酸鉄（ＩＩ）強化ＢＳ−ＥＲＤＦ、アルイハｌｏ％
ＦＣ３添加ＥＲＤＦ中で培養した。培養３日後に培地中
で分泌された抗体（ＩｇＧ）ｆｉ度をＥＬＩＳＡで測定
した結果を第２表に示す。標準として用いた１０％ＦＣ
３添加ＥＲＤＦ中での細胞あたりの抗体分泌濃度は０．
２１６（μｇ／１０’細胞）であった。

これに対して、硫酸鉄（ＩＩ）強化Ｉ　ＥＳ−ＥＲＤＦ
、および硫酸鉄（Ｉｆ）強化ＥＳ−ＥＲＤＦ中での抗体
産生量は、１０％ＦＣ３添加ＥＲＤＦ中での産生量の２
倍以上に達した。

第２表無血清培地中でのＨＢ８８５２による抗体分泌量Ｐｅ５
ｏ、強化ＩＥＳ−ＥＲＤＦ２０．０３７．８０．５２９ＦｅＳＯ，強化ＢＳ−ＥＲＤＦ１５．０２７．３０．５４９１０％ＦＣ５添加ＥＲＤＦ１４．０６４．８０．２１６発１影１九果本発明は、基礎培地に無機鉄化合物を増殖因子として添
加してなる新規な無血清培地を提供するものである０本
発明の培地によると動物細胞を血清培地を使用したとき
と同様に効率よく培養することができ、血清培地を使用
したときよりも生産物の精製が容易であり、また培地の
調製も経済的に有利に行うことができる。

特に、本発明では基礎合成培地としてＥＲＤＦを用いる
と有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、硫酸鉄（ＩＩ）をＩＥＳ−ＥＲＤＦに添加し
てハイブリドーマを培養したときの硫酸鉄（ｎ）濃度と
増殖促進効果との関係を示す。第２図は、各種鉄塩を添加して培養したときの鉄塩の種
類とハイブリドーマの増殖促進効果との関係を示す。第３図は、硫酸鉄（１ｌ）を添加し無タンパク質培地中
で培養した時のハイブリドーマの増殖促進効果を示す。第４図は、硫酸鉄（ＩＩ）を添加し、継代培養したとき
のハイブリドーマの増殖促進速度の変化を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）基礎合成培地に無機鉄化合物を増殖因子として添
加してなる無血清培地。
（２）無血清培地がＥＲＤＦである特許請求の範囲第（
１）項記載の無血清培地。
（３）無機鉄化合物が硫酸鉄、硝酸鉄及び塩化鉄よりな
る群から選択された無機鉄化合物の１種又は２種以上で
ある特許請求の範囲第（１）項または第（２）項記載の
無血清培地。
（４）無機鉄化合物の濃度が基礎合成培地１ｌ当り４０
マイクロモルから１００マイクロモルである特許請求の
範囲第（１）項乃至第（３）項のいずれかに記載の無血
清培地。
（５）基礎合成培地が増殖因子としてエタノールアミン
及び／又は亜セレン酸を含む培地である特許請求の範囲
第（１）項乃至第（４）項のいずれかに記載の無血清培
地。
（６）基礎合成培地が１ｌ中に５ｍｇ以下のタンパク質
を含む培地である特許請求の範囲第（１）項乃至第（５
）項のいずれかに記載の無血清培地。
（７）タンパク質がインスリンである特許請求の範囲第
（１）項乃至第（６）項のいずれかに記載の無血清培地
。
（８）基礎合成培地がタンパク質を全く含まない培地で
ある特許請求の範囲第（１）項乃至第（５）項のいずれ
かに記載の無血清培地。
（９）基礎合成培地がトランスフェリンを全く含まない
培地である特許請求の範囲第（１）項乃至第（７）項の
いずれかに記載の無血清培地。