BRPI0618197A2

BRPI0618197A2 - formulaÇÕes farmacÊuticas estÁveis

Info

Publication number: BRPI0618197A2
Application number: BRPI0618197-0A
Authority: BR
Inventors: Iraldo Bello Rivero; Pedro Lopez Saura; Yanelda Garcia Vega; Hector Santana Milian; Ana Aguilera Barreto; Lorenzo Anasagasti Angulo; Rolando Paez Meireles
Original assignee: Ct Ingenieria Genetica Biotech
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-10-27
Publication date: 2013-01-08
Also published as: US8535657B2; ZA200804256B; PT1958643T; WO2007051431A3; EP1958643A2; CA2629895C; WO2007051431A2; CN101351219A; AU2006310918B2; CN104826094A; AR056586A1; KR20080065684A; RU2008121874A; CU23432B6; KR101363237B1; RU2403057C2; AU2006310918A1; US20090304628A1; ES2619632T3; JP2009513682A

Abstract

FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS ESTÁVEIS A presente invenção se refere às formulações farmacêuticas estáveis para serem aplicadas por via parental (líquidas ou liofilizadas), ou tópica (gel, ungüento ou creme) que compreendem diferentes quantidades dos interferons recombinantes gama e alfa em proporções potencializadoras para o tratamento de eventos patológicos que contemplam o crescimento celular não fisiológico benígno ou maligno de tecidos ou orgão.

Description

"FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS ESTÁVEIS" Campo da técnica

A presente invenção se refere à biotecnologia e às ciências médicas, em particular com formulações estabilizadas que contêm as interferons recombinantes gama e alfa em proporções potencializadoras da inibição do crescimento celular em diferentes tecidos ou órgãos dos seres humanos.

Estado da técnica anterior

A variedade de efeitos dos interferons tipo I (em inglês "Interferons", abreviado IFNs) cria um grande potencial terapêutico de aplicações. O emprego destes é benéfico no tratamento de vários tipos de câncer, entre os quais se incluem as leucemias (US 5830455), carcinomas basocelulares (US 5028422), carcinoma de células escamosas (US 5256410), câncer de mama (US 5024833), tumores gastrointestinais (US 5444064; 5814640), e queratose actínica (US 5002764). Diferentes tipos celulares mostram uma sensibilidade diferenciada aos IFNs, e as concentrações para inibir seu crescimento podem variar em uma categoria ampla (Bordem E., et ai. (1981) Progress in Hematology. vol XII, Brown EB., editor, 299-339), pelo que mostram diferenças quanto a sua capacidade para inibir o crescimento celular (Dahl H. (1983). Human interferon and cell growth inhibition. VII. Reversibility of interferon activities. J Interferon Res, 3:327- 332; Willson J.K.V., Bittner G, et al. (1984) Antiproliferative activity of human interferons against ovarian câncer cells grown in human tumor stem cell assay. JInterferon Rest 4:441-447; Hu R., Gan Y., et al. (1993) Evidence for multiple binding sites for several components of human lymphoblastoid interferon-alpha. J Biol Chemy 268:12591-12595), e a atividade antitumoral (Quesada JR., Talpaz M., et al. (1986) Clinicai toxicity of interferons in câncer patients: a review. JClin Oncol, 4:234-243).

O emprego dos IFNs na terapia do câncer não satisfez as expectativas que os ensaios in vitro e as propriedades destas potentes moléculas biológicas possuem. Diferentes regimes foram provados sem efeitos benéficos claros e de impacto (Strander H., y Oberg K., (1992) Clinicai use of interferons. Solid tumors INTERFERON. Principies and Medicai Applications. Editor Baron S., Coppenhaver DH., Dianzani F., Fleischmann WR., Jr. Hughes TK., Jr. Klimpel GR., Niesel DW., Staton GJ., and Tyring SK., 533-561).

Em um esforço para alcançar melhores efeitos nas terapias se empregaram doses altas de IFNs, mas a resposta potencial benéfica esperada não se consegue devido a vários fatores, entre eles as reações adversas que se produzem com ditas doses (Lane H. C. (1990) Interferon-alpha in patients with asymptomatic human immunodeficiency virus (HIV) infection. A randomized, placebo-controlled trial. Annals of internai Medicine, 112:805- 811).

Também se empregou os IFNs de forma combinada explodindo seus efeitos potencializadores. A combinação de IFN alfa e IFN gama foi descrita em cultivos de fibroblastos de quelóides em estudos in vitro (Tredget E. E., Wang R., et ai. (2000) Transforming growth fator-beta mRNA and protein in hypertrophic scar tissues and fibroblasts: antagonism by IFN- alpha and IFN-gama in vitro and in vivo. JInterferon Cytokine Resi 20:143- 151). Neste trabalho se menciona a utilização combinada dos IFNs alfa e gama, mas isto se faz in vitro e em células procedentes de quelóides em meninos. Estes autores não realizaram nenhum ensaio clínico e não avaliaram o efeito da combinação sobre células de adultos, que respondem menos aos interferons.

A patente EP 0107498 mostra a combinação dos interferons alfa e gama na linha celular de melanoma Hs294T, mas não se descreve este efeito em outros tipos de células como cultivos primários de carcinoma basocelular, de um glioblastoma (GL-5), ou de um carcinoma de laringe (ΗΕρ-2). A utilização alternada de IFN alfa natural e IFN gama recombinante também foi descrita como tratamento para as metástases no pulmão (Fujii A., Yui-En K., et ai. (1999) Preliminary results of the alternating administration of natural interferon-alpha and recombinant interferon-gamma for metastatic renal cell carcinoma BJU Int.; 84:399-404). A combinação de IFN alfa 2, ou alfa 4 ou o híbrido delta 4 alfa 2 Bgl II alfa 1 com IFN gama foi descrita nas linhas celulares RT4 (carcinoma de bexiga) e em A2182 (adenocarcinoma de pulmão) e possui um efeito antiproliferativo superior às outras combinações entre IFNs tipo I ou ao IFN gama sozinho, (Hubbell H. R., Craft J.A., et al. (1987) Synergistic antiproliferative effect of recombinant alpha-interferons with recombinant gamma-interferon. J Biol Response Mod, 6:141-153). Um efeito potencializador entre o IFN gama (1000 Ul/ml) e o IFN alfa 2 (1000 Ul/ml) foi demonstrado na linha celular A459 (tumor alveolar), (Martyre M. C, Beaupain R., et al. (1987) Potentiation of antiproliferative activity by mixtures of human recombinant IFN-alpha 2 and -gamma on growth of human câncer nodules maintained in continuous organotypic culture. Eur J Câncer Clin Oncol, 23:917-920), bem como em linhas celulares estabelecidas de carcinoma anaplástico de células grandes (Hand A., Pelin K., et al. (1993) Interferon-alpha and interferon-gamma combined with chemotherapy: in vitro sensitivity studies in non-small cell Iung câncer cell lines. Anticcmcev Drugs, 4:365-368).

A combinação de IFN alfa e IFN gama foi descrita em estudos com a linha celular HepG2, (Mizukoshi E., Kaneko S., et al. (1999) Upregulation of type I interferon receptor by IFN-gamma. J Interferon Cytokine Res, 19:1019-1023) e na linha celular AVA5 (Okuse C, Rinaudo J. A., et al. (2005) Enhancement of antiviral activity against hepatite C virus in vitro by interferon combination therapy. Antiviral Res, 65:23-34). Estes autores não determinam o efeito antiproliferativo, nem as proporções mais efetivas da combinação dos interferons alfa e gama na linha celular HepG2. Também se explorou o efeito potencializador, do TNF alfa e o IFN gama na linha celular Hepal-6 de um hepatoma murino (Sasagawa T., Hlaing M., et ai. (2000) Synergistic induction of apoptosis in murine hepatoma Hepal-6 cells by IFN-gama and TNF-alpha. Biochem BiopHys Res Común, 272:674-680).

Na patente US 5190751 se descreve a inibição do crescimento de linhas celulares de leucemias de tipo B e de tipo T pela combinação de IFN alfa e gama. Em nenhuma das linhas T avaliadas se observou potenciação do efeito, e em certas condições experimentais os efeitos das combinações são antagônicos. Na patente EP 010749 e em uma publicação (Czamiecki C. W., Fennie C. W., et ai. (1984) Synergistic antiviral and antiproliferative activities of Escherichia coli-derived human alpha, beta, and gamma interferons. J ViroL 49:490- 496), mostra-se também que a combinação dos IFNs alfa e gama nem sempre é potencializadora e pode chegar a ser antagônica. Descreve-se a eficácia das combinações em uma categoria muito ampla, mas não se demonstra. Isto indica que o emprego de combinações de IFN alfa e gama deve ser submetido a um processo de definição experimental o qual permita identificar que condição é a favorável para estabelecer uma combinação ótima para o tratamento de um crescimento celular inadequado em tecidos ou órgãos dados. Por tal motivo, para sustentar uma terapia e doses adequadas estas devem ser avaliadas em experimentos in vitro e em ensaios clínicos controlados.

Em um estudo com linhas celulares de Gliomas, o IFN gama afetou as características de malignidade tais como a proliferação e a migração das células tumorais estudadas (Knupfer M. M., Knupfer H., et al. (2001) Interferon-gamma inhibits growth and migration of A172 human glioblastoma cells. Anticancer Res, 21:3989-3994). Assim mesmo, informaram resultados negativos com o emprego de IFN gama para tratar os gliomas (Mahaley M. S., Bertsch L., Jr. et al. (1988) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. JNeurosurg, 69:826-829). O emprego de forma simultânea de IFN gama e IFN beta resultou ser eficaz na inibição do crescimento da linha celular GBM-18, um astrocitoma multidroga-resistente (Reddy P. G., et ai. (1991) Systemic gamma-interferon therapy for recurrent gliomas. J Natl CancerInsU 83:1307-1315). Descreveu-se, além disso, a combinação de IFN gama com alfa-difluorometilarnitina (DFMO) para o tratamento destes tumores (US 4499072). A patente US 5002879 descreve uma terapia similar utilizando DFMO junto a células assassinas ativadas por linfocinas e IL-2. Com respeito ao IFN alfa, sua combinação com outras drogas não teve efeitos favoráveis no tratamento dos gliomas, e mostrou toxicidade (Buckner J. C, Burch Ρ. A., et al (1998) Phase II trial of recombinant interferon-alpha-2a and eflornithine in patients with recurrent glioma. JNeurooncoL 36:65-70; Chang S. M., Barker F. G., et al. (1998) High dose oral tamoxifen and subcutaneous interferon alpha-2a for recurrent glioma. JNeurooncol, 37:169-176). Então, o tratamento deste tipo de tumor pode ser favorecido pelo uso combinado do IFN alfa e o IFN gama, sobre a base de uma adequada seleção das proporções de sua combinação baseada em experimentos in vitro e in vivo.

A laringe é o segundo lugar mais freqüente de câncer do trato aero-digestivo superior depois da cavidade oral. O carcinoma de laringe é o tumor mais freqüente de cabeça e pescoço e o câncer de laringe mais comum é o carcinoma de células escamosas (95% de todos os casos). A sobrevida nos casos de tumores T3 e T4 de laringe é de somente 5 anos, mais preferivelmente somente 30% dos pacientes submetidos a laringectomia (Djordjevic V., Milovanovic J., et al. (2004) Radical surgery of the malignant laryngeal tumors. Acta Chir Lugosl, 51:31-35). Demonstrou-se que a radioterapia e a quimioterapia não são efetivas para o tratamento deste carcinoma (Chen W., Guo X., et al. (2004) Long-term follow-up observation of clinicai therapy for laryngeal carcinoma recurrence and cervical metastasis Lin Chuang Er Bi Yan Hou Ke Za ZhL 18:536-537). No entanto, a poliquimioterapia junto ao emprego de IFN alfa resultou benéfica no tratamento do câncer de laringe (Mantz C. A., Vokes E. E., (2001) Sequential induction chemotherapy and concomitant chemoradiotherapy in the management of locoregionally advanced laryngeal câncer Ann Oncol, 12:343-347). A combinação de IL-2 e IFN alfa foi avaliada em um ensaio fase II como terapia para o carcinoma de laringe, mas os resultados não foram satisfatórios (Clayman G. L., Young G., et al. (1992) Detection of regulatory factors of lymphokine-activated killer cell activity in head and neck câncer patients treated with interleukin-2 and interferon alpha. Ann Otol Rhinol Laryngolr, 101:909-915). Poucos avanços existem na terapêutica dos tumores de laringe. O uso combinado dos IFNs alfa e gama poderia contribuir para melhorar as terapias existentes para combater este tipo de tumores.

A patente US 5503828 descreve uma composição de interferons caracterizada por conter pelo menos 50% dos alelos de IFN alfa 2 e IFN alfa 8 e um ou mais espécies adicionais de IFNs de um grupo formado por IFN alfa 4, alfa 7, alfa 10, alfa 16, alfa 17, e alfa 21. Enquanto isso, a patente US 4503035 mostra uma preparação de algumas espécies de IFN alfa, mas que não inclui o alfa 1, alfa 5, alfa 14, e o IFN omega. Estas patentes não descrevem uma formulação formada pela combinação de IFN gama e IFN alfa 2 recombinantes.

A patente US 5762923 detalha uma composição líquida de Interferon dissolvida em água com um detergente não iônico e álcool benzílico em quantidades suficientes para estabilizar o IFN alfa que contém, além disso, um tampão ácido. Por outro lado, a patente US 4847079 descreve uma composição farmacêutica de Interferon e timerosal, enquanto isso a patente US 4675184 mostra um Interferon formulado com álcool poliídrico e um tampão orgânico como estabilizador e um portador convencional ou diluente de pH 3-6. A composição pode ter adicionalmente um tensoativo aniônico e/ou albumina como estabilizador. Nas patentes US 5236707 e US 5431909 se descreve o uso de aminas como estabilizantes (aminas primárias alifáticas) e sais orgânicos de lítio, que protegem da degradação ao Interferon e o estabilizam.

A patente US 4496537 se refere a formulações líquidas estáveis de interferon-alfa que incluem em sua composição albumina de soro humano, e alanina ou glicina, água e um sistema tampão capaz de manter o pH entre 6.5 e 8,0.

A patente US 5935566 descreve formulações aquosas estáveis de interferon-alfa que incluem em sua composição um sistema tampão capaz de manter o pH na margem de 4.5 a 7.1, polisorbato 80 como estabilizador, EDTA como agente quelante, cloreto de sódio como agente isotonizante, e m- cresol como preservativo antimicrobiano. A patente US 0170207 descreve formulações aquosas estáveis de interferon-alfa que incluem em sua composição um sistema tampão capaz de manter o pH na margem de 4.5 a 9,0, um agente estabilizador, um tensoativo não iônico e um regulador da pressão osmótica.

No pedido WO 89/04177 se descrevem formulações farmacêuticas líquidas de Interferon-gama que compreendem uma solução tampão que mantém o pH na margem de 4,0 a 6,0, um açúcar poli-hidroxilado como estabilizador e um detergente não iônico. A patente US 4895716 se refere a composições e processos para a estabilização do Interferon-gama com ácido lactobiônico em uma solução tampão de acetato/glicina.

A patente US 5676942 descreve composições farmacêuticas formadas por subtipos de interferons do tipo I obtidos de fontes naturais, mas não os combinam com o interferon gama e não definem as proporções dessas combinações, só descreve essas combinações para infecções virais e não para o tratamento de tumores.

Em nenhum dos alcances descritos anteriormente se utilizou, caracterizou ou mencionou uma formulação estabilizada que contenha os IFNs recombinantes gama e alfa 2 juntos em combinações potencializadoras. Existem potencialidades na utilização combinada de IFN gama e IFNs tipo I quando se misturam em proporções definidas para o tratamento do crescimento celular de diferentes graus de resistência às terapias estabelecidas e/ou suas combinações. Levando-se em conta estas premissas, faz-se necessário o desenvolvimento de formulações estáveis que contenham estes IFNs em proporções que permitam seu emprego de forma ampla, sensível, eficaz e segura, em indivíduos com formações celulares benignas ou malignas tais como necessitam. Isto permitirá um manejo melhor das combinações e torna mais viável o emprego na terapêutica dos pacientes que necessitam destes tratamentos. Explicação da invenção

A presente invenção resolve o problema mencionado anteriormente, proporcionando formulações farmacêuticas estáveis para serem aplicadas por via parenteral (líquidas ou liofilizadas), ou tópica (gel, ungüento ou creme) que compreendem diferentes quantidades dos interferons recombinantes gama e alfa em proporções potencializadoras. As referidas formulações são úteis para o tratamento de eventos patológicos que contemplam o crescimento celular não fisiológico benigno ou maligno de tecidos ou órgãos e que compreende, além disso, excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Estas formulações são o resultado dos ensaios in vitro com linhas celulares de diferente sensibilidade aos referidos IFNs e de ensaios clínicos em diferentes entidades oncológicas, bem como da avaliação de estabilidade físico-química e biológica dos IFNs gama e alfa 2 recombinantes em presença dos diferentes excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Em uma realização preferida, as formulações farmacêuticas estáveis liofilizadas se compõem dos IFN gama e alfa 2 recombinantes misturados junto a uma solução tampão capaz de manter o pH entre 4.9 e 7.5, a qual pode ser o acetato de amônia ou de sódio, o succinato de sódio, o fosfato de sódio e/ou potássio ou o citrato/fosfato de sódio. Estas formulações também estão compostas de pelo menos um componente selecionado de compostos de açúcares não redutores, aminoácidos, tensoativos e polímeros estabilizantes. Os açúcares não redutores podem ser a sacarose ou a trehalose; os aminoácidos podem ser a glicina, a histidina ou a leucina; enquanto que como tensoativos se descrevem ao polisorbato 20 ou o polisorbato 80 e como polímero estabilizante ao polietilenoglicol, um dextrano ou o amido hidroxietila.

Como uma materialização da invenção se define que a solução tampão deve ser empregada em uma faixa de concentração entre 10 e 20 mM; a sacarose ou a trehalose entre 5 e 100 mg/ml; a glicina, a histidina ou a leucina devem ser empregadas em uma faixa de concentração entre 1 e 20 mg/ml; o polissorbato entre 0,01 e 1 mg/ml, enquanto que o polietileno glicol, o dextrano, ou o amido hidroxietila, são empregados em uma faixa de concentração entre 5 e 50 mg/ml.

Em outra realização preferida da invenção, descrevem-se formulações farmacêuticas estáveis liofilizadas que contêm o IFN gama

Λ Λ

recombinante em uma faixa de concentração entre 5.6 χ 10 Ul e 1.4 χ 10 Ul

Λ

e ao IFN alfa 2 recombinante em uma faixa de concentração entre 6.8 χ 10

o

Ul e 1.7 χ 10 Ul, ou o IFN gama recombinante em uma faixa de

O Q

concentração entre 2,0 χ 10 Ul e 0,5 χ 10 Ul e ao IFN alfa 2 recombinante em uma faixa de concentração entre 12,0 χ IO8 Ul e 3,0 χ IO8 Ul, ou o IFN gama recombinante em uma faixa de concentração entre 4,0 χ IO8 Ul e 1,0 χ

o

Ul e ao IFN alfa 2 recombinante em uma faixa de concentração entre 80 χ

8 8

Ul e 20 χ 10 Ul; junto a 0,0802 g de di-hidrogênio fosfato de mono- potássio, 0,249 g de hidrogênio fosfato de di-sódio diidratado, 4 g de sacarose, 0,8 g de glicina, 0,03 g de Tween 20, 1 g de polietilenoglicol 6000, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

A definição de misturar o IFN gama recombinante em uma

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faixa de concentração entre 5.6 χ 10 Ul e 1.4 χ 10 Ul e o IFN alfa 2

• Q O

recombinante em uma faixa de concentração entre 6.8 χ 10 Ul e 1.7 χ 10 Ul,

em uma das formulações farmacêuticas estáveis liofilizadas se atingiu pelo resultado dos estudos da inibição do crescimento dos cultivos primários de fibroblastos procedentes de quelóides (Kel 5a, Kel 17a) e do CBC III; nos quais depois de uma análise de isobologramas se identificou a combinação de 100 Ul/ml (10 ng/ml) de IFN gama recombinante com 100 Ul/ml (0,5 ng/ml) de IFN alfa 2b recombinante que alcança reduzir o crescimento celular in vitro em um 21%, 43% e 47%, respectivamente (ver exemplos 1, 2 e 3, figuras 1, 2, 3, e 4, e tabela 1).

A mistura de IFN gama recombinante em uma faixa de

ς> o

concentração entre 2,0 χ 10 Ul e 0,5 χ 10 Ul e o IFN alfa 2 recombinante em uma faixa de concentração entre 12,0 χ IO8 Ul e 3,0 χ IO8 Ul para a formulação se definiu utilizando um ensaio clínico e alcance de casos tratados por compaixão. O ensaio clínico aleatorizado, controlado e a triplo-cegos avaliou a eficácia do tratamento intralesional (I.L.) em pacientes com carcinoma basocelular utilizando a formulação liofilizada estável composta pela referida combinação (ver exemplo 7, tabelas 9, 10, 11, e 12).

No alcance de casos tratados por compaixão, que também contribuiu para definir estas proporções, foram tratados casos de carcinoma epidermóide (paciente 1) e de CBC múltiplos, recidivantes e com enxertos prévios (paciente 2), (ver exemplo 8 figuras 5 a, b, c, d; paciente 1, e figuras 6 a, b, c; paciente 2, respectivamente).

A formulação que contém o IFN gama recombinante em uma faixa de concentração entre 4,0 χ IO8 Ul e 1,0 χ IO8 Ul e o IFN alfa 2 recombinante em uma faixa de concentração entre 80 χ IO8 Ul e 20 χ IO8 Ul foi definida com a análise dos resultados do estudo da inibição do crescimento das células do glioblastoma GL-5 pela combinação de 50 Ul/ml (5 ng/ml) de IFN gama recombinante com 100 Ul/ml (0,5 ng/ml) de IFN alfa 2b recombinante, com o que se atinge uma inibição do crescimento do 55% (exemplo 3). Também se levou em conta a análise do estudo com a linha celular HEp-2. Neste caso as quantidades de IFNs são de 5 Ul/ml (5 ng/ML) de IFN gama recombinante com 75 Ul/ml (0.375 ng/ML) de IFN alfa 2b recombinante. Com essa combinação ótima se consegue reduzir o crescimento celular in vitro em um 76% (ver exemplos 1, 2 e 3).

Também foram desenvolvidas formulações farmacêuticas líquidas estáveis. Nestas formulações se mantiveram as proporções dos IFNs gama e alfa recombinates descritas para as formulações liofilizadas, mas seus outros ingredientes farmacêuticos variaram para conseguir uma maior estabilidade para estas misturas dos IFNs.

Como resultado deste trabalho uma materialização da invenção descreve formulações farmacêuticas estáveis líquidas que compreendem uma solução tampão e pelo menos um componente selecionado de açúcares não redutores, aminoácidos, tensoativos, polímeros estabilizantes, compostos antioxidantes/quelantes e agentes isotonizantes. Estas formulações empregam um solvente aquoso que pode conter ou não agentes preservantes tal como a mistura de metila- e propil-parabeno.

Outra materialização da invenção consiste na definição de formulações farmacêuticas estáveis líquidas que empregam uma solução tampão capaz de manter o pH entre 4.9 e 6.5. Este tampão pode ser acetato de amônia ou de sódio, succinato de sódio, fosfato de sódio e/ou potássio, citrato/fosfato. Estas formulações podem empregar como tensoativos o polisorbato 20 ou polisorbato 80; como antioxidante/quelante o EDTA ou a cisteína-acetila; enquanto que como aminoácidos se pode incluir a histidina, L-arginina, L-alanina, glicina ou a lisina. Como polímero estabilizante se define a utilização do amido hidroxietila ou o dextrano e como agente isotonizante o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o propilenoglicol, o manitol, o glicerol, a sacarose ou a trehalose.

Em uma materialização preferida da presente invenção ocorre que as formulações farmacêuticas estáveis líquidas empregam uma solução tampão em uma faixa de concentração entre 10 e 100 mM; onde o polissorbato se emprega em uma faixa de concentração entre 0,01 e 1 mg/ml; o EDTA ou a cisteína-acetila se empregam em uma faixa de concentração entre 0,01 e 1 mg/ml; a histidina, L-arginina, L-alanina, glicina ou a lisina se empregam em uma faixa de concentração entre 1 e 20 mg/ml; o amido hidroxietila e o dextrano são empregados em uma faixa de concentração entre e 50 mg/ml e onde os agentes isotonizantes se encontram em quantidade suficiente para fazer a solução isotônica.

Outras materializações explicam as quantidades de todos os ingredientes farmacêuticos das formulações farmacêuticas estáveis líquidas necessários para a estabilidade biológica e físico-química das misturas dos IFNs gama e alfa recombinantes descritas anteriormente. Estas formulações líquidas contêm além dos IFNs, 0,708 g de acetato de sódio, 0,079 ml de ácido acético, 0,01 g de Tween 20, 5 g de manitol, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

Esta invenção define as proporções de misturas de IFNs gama e alfa que podem ser vantajosas para o tratamento do crescimento celular benigno ou maligno. Isto permitirá empregar dose menor, menos tempo de tratamento e manter os mesmos efeitos terapêuticos ou conseguir efeitos superiores a esses que se atingiram até hoje com o emprego dos interferons no tratamento dos tumores ou outros eventos de crescimento celular em órgãos e tecidos. Ao diminuir as doses se poderá esperar menos efeitos adversos ou de menor intensidade, que darão uma melhor qualidade de vida aos pacientes e permitirá obter os benefícios do uso destas drogas potentes.

A invenção define formulações da mistura de IFN gama e IFN alfa 2 recombinantes não descritas anteriormente que facilitam o manejo e uso clínico desta combinação terapêutica e sua comercialização.

As formulações farmacêuticas estáveis liofilizadas e líquidas que contêm misturas dos IFNs gama e alfa 2 recombinantes em proporções potencializadoras da inibição da proliferação descritas na invenção têm um amplo espectro de uso clínico.

Demonstra-se in vivo utilizando estas formulações que, em entidades oncológicas importantes, a combinação do IFN gama e o IFN alfa 2 recombinantes é efetiva utilizada de forma combinada simultânea e intratumoral. Esta combinação é capaz de ter efeitos iguais curativos sobre tumores em menor tempo e com um resultado estético superior ao que se obtém por seus componentes em separado.

O uso destas combinações permitirá contar com maiores possibilidades terapêuticas para combater o câncer.

Isto recorre em uma materialização da invenção onde se expõe que as formulações liofilizadas ou líquidas podem ser empregadas no tratamento de tumores sólidos benignos ou malignos utilizadas de formas independentes ou combinadas com quimioterapia, radioterapia ou a combinação destas.

A utilização destas formulações em combinação com outros agentes terapêuticos se sustenta nos resultados obtidos com o tratamento de um paciente com um tumor basocelular terebrante com a combinação de IFN gama e IFN alfa 2 recombinantes junto com Cisplatino (ver exemplo 10 e figura 9).

Descreve-se na invenção como o emprego combinado dos interferons gama e alfa 2 consegue reduzir e/ou curar tumores de prognóstico muito ruim e de efeitos estéticos deformantes.

De acordo com as características de várias entidades oncológicas e benignas onde predomina um crescimento não controlado das células constituintes do tecido ou órgão podem ser susceptíveis de serem tratadas com estas formulações tumores do tecido hematopoiético tais como as leucemias mielóides agudas, crônicas, linfocíticas agudas e linfocíticas crônicas, bem como as leucemias de células T, de células B, e o linfoma do sistema nervoso central. Também podem ser tratados os carcinomas de Iaringe5 a papilomatosis laríngea, o lipoma, o cisto epidermóide e intradérmico, o Iipossarcomaj o neurofibroma, e a hiperplasia sebácea. Podem ser beneficiados com o uso destas formulações tumores do sistema nervoso central e periférico como os astrocitomas, glioblastomas multiformes, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juvenis, gliomas misturados, oligodendrogliomas, gliomas do nervo ótico, tumores neuroectodermal primitivos, neuromas acústicos, cordomas, craniofaringiomas, meduloblastomas, meningiomas, neurofibromatose, pseudotumores de cérebro, esclerose tuberosa, tumores cerebrais metastáticos. Outros tumores susceptíveis de serem tratados são os hemangiomas cavernosos, adenomas hepatocelulares, as hiperplasias nodulares focais, tumores pineais, adenomas pituitários, tumores vasculares, carcinomatose meningeal, angiomas em forma de cereja, hiperplasia das glândulas sebáceas. Os tumores de pele como o carcinoma basocelular, o carcinoma de células escamosas, o dermatofibroma, o granuloma piogênico, o nevo dérmico, bem como queratose seborreica e queratose actínicas podem ser beneficiados pela terapia com estas formulações.

Outra materialização da invenção descreve que estas formulações também podem ser empregadas para o tratamento de eventos proliferativos como a flbrose, displasias e hiperplasias.

Segundo os resultados dos ensaios clínicos realizados e descritos nos exemplos 7, 8, e 10 como materialização da invenção se definem como vias de aplicação das formulações a intramuscular, intratumoral, e perilesionar.

Uma materialização a mais da presente invenção consiste em formulações farmacêuticas estáveis tópicas que contêm ao IFN gama em uma faixa de concentração entre 0,32 χ IO6 Ul e 0,08 χ IO6 Ul e ao IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 2,0 χ IO6 Ul e 0,5 χ IO6 Ul por grama de semi-sólido. Dentro destas formulações se descrevem o creme composto por IFN gama 2.2%, 0,58% IFN alfa, por 4% de álcool cetílico, 10% vaselina, 2% Tween 60, e 0,2% metilparabeno, propilparabeno. Também se definiu o ungüento composto por IFN gama 2.2%, 0,58% IFN alfa, 60% de petrolato sólido branco, 10% de petrolato líquido pesado, 3% de span 20, e 0,2% metilparabeno e propilparabeno. Finalmente se obteve a formulação de um gel composta por IFN gama 2.2%, 0,58% IFN alfa, 0,5% de Carbopol 940, 0,2% de metilparabeno e propilparabeno, 0,2% de hidróxido de sódio, 0,01% de etilenodiaminotetraacetato de cálcio dissódico, e 2% etanol.

Todas estas formulações são resistentes às flutuações de temperatura, o que é vantajosa para a fabricação do produto, seu transporte e armazenamento. As mesmas previnem a agregação dos interferons e por tanto apresentam menor risco de resultar imunogênicas durante o uso prolongando do produto.

As formulações de semi-sólidos permitem o emprego pelos próprios pacientes de forma segura e não invasiva.

Também é parte da presente invenção o emprego destas formulações estáveis tópicas no tratamento de tumores sólidos benignos ou malignos da pele ou mucosas utilizadas de formas independentes ou combinadas com quimioterapia, radioterapia ou a combinação destas.

Outro aspecto da presente invenção descreve que as formulações farmacêuticas estáveis tópicas podem ser empregadas para o e

tratamento de lipoma, cisto epidermóide, cisto intradérmico, lipossarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangiomas, hiperplasia nodular focai, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juvenis, meningiomas, tumores pineais, adenomas pituitários, tumores vasculares, carcinomatose meningeal, neurofibromatose, angiomas em forma de cereja, hiperplasia das glândulas sebáceas, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, dermatofibroma, granuloma piogênico, nevos dérmico, queratose seborreica, queratose actínicas, e condilomas. Outra materialização da invenção descreve a conformação de um jogo de reativos que contém um frasco de IFN gama recombinante, um frasco de IFN alfa recombinante às concentrações e relações descritas anteriormente, junto a uma quantidade suficiente de ampolas com água para injeção para a diluição e/ou ressuspensão dos IFNs, bem como seringas e agulhas adequadas para a administração simultânea dos IFNs prévia união em um das ampolas que contém a um dos IFNs.

Breve descrição das Figuras

Figura 1. Inibição do crescimento das células de cultivos primários de fibroblastos provenientes de biópsias de pacientes adultos com quelóides por lOOOUl/ml de IFN gama ou IFN alfa 2 recombinantes. Figura 2. Isobolograma da inibição do crescimento celular da

combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes sobre o cultivo primário de fibroblastos de quelóides (KeI5a).

Figura 3. Isobolograma da inibição do crescimento celular da combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes sobre o cultivo primário de fibroblastos de quelóides (KeI17a).

Figura 4. Isobolograma da inibição do crescimento celular da combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes sobre o cultivo primário de fibroblastos do CBCIIL

Figura 5. Isobolograma da inibição do crescimento celular da combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes sobre a linha celular do glioblastoma GL-5.

Figura 6. Isobolograma da inibição do crescimento celular da combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes sobre a linha celular do carcinoma de laringe HEp-2.

Figura 7. Paciente com carcinoma epidermóide tratado com a combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes.

Figura 8. Paciente com carcinoma basocelular recidivante tratado com a combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes.

Figura 9. Paciente com carcinoma basocelular recidivante tratado com a combinação de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes e cisplatino. A: antes do tratamento, B: depois de 1 ano de tratamento Exposição detalhada de modos de realização/Exemplos. Exemplo 1. Inibição do crescimento celular pelos IFNs gama ou alfa recombinantes sobre cultivos primários.

As biópsias de pele foram obtidas de pele normal e de pacientes que desenvolveram carcinomas basocelulares ou quelóides devido ao dano por cirurgia ou queimaduras. A mostra de tecido foi colocada imediatamente em meio DMEM para seu processamento com o objetivo de obter cultivos primários pelo processo de explantes.

Para a avaliação do efeito antiproliferativo dos IFNs gama e alfa recombinantes se utilizaram os seguintes cultivos: Cultivos primários de fibroblastos (CPF) de quelóides (1, 2, 5, 7, 8, 15, 17, 19, 20, 24, 26, 27, 31, 32), CPF de um carcinoma basocelular (CBC III) e CPF normais (FibN3 e FibN5). Os CPF se cultivaram em uma mistura de meios de cultivo RPMI- 1640/DMEM que continham gentamicina (50 μg/ml), e 12% de soro fetal bovino (SFB). Todos os cultivos foram incubados a 37°C em uma incubadora de CO2 com 5% de umidade.

Para determinar o efeito antiproliferativo dos IFNs, as células foram semeadas a 5 χ IO4 células/ml em placas de 96 pontos. Sincronizaram- se por mudança de meio fresco depois de 24 horas de serem semeadas. Ao fim de 96 horas de incubação em presença de diferentes concentrações dos IFNs se determinou a viabilidade de 3 réplicas por condição de avaliação utilizando o método de tingimento por cristal violeta medindo a absorvência a 580 nm e utilizando um leitor de placas. Os resultados forma definidos como a% de crescimento baseado na contagem de células viáveis:

% de crescimento - (AT72h-AC0h/AC72h-AC0h) χ 100.

AT72h = Absorvência das células tratadas 72h.

AC72h = Absorvência das células controles tratadas 72h.

ACOh = Absorvência das células antes de serem incubadas

com IFN.

Na figura 1 se mostra a ação antiproliferativa dos IFNs gama ou alfa recombinantes sobre o crescimento dos CPF de quelóides. Como se pode observar o IFN gama ou alfa 2b inibem a proliferação celular em vários cultivos primários, enquanto em outros estimulam seu crescimento. Como controles se avaliaram os cultivos primários FibN3 e FibN5, bem como de biópsia de um CBCIII, e linhas celulares como a HEp-2, U1752 e GL-5. Exemplo 2: Inibição do crescimento celular pelos IFNs gama ou alfa recombinantes sobre linhas celulares estabelecidas.

Estudaram-se as linhas celulares humanas Jurkat (ATCC, TIB- 152), GL-5 (Perea S.E., et ai. (1993) Acta Cient Venez, 44:22-27), HEp-2 (ATCC, CCL23). As células GL-5 foram cultivadas em DMEM, e as HEp-2 em MEMCANE contendo gentamicina (50 μg/ml) e 10% SFB. As Jurkat foram incubadas em meio RPMI com gentamicina e 10% SFB. Todos os cultivos foram incubados a 37°C em uma incubadora de CO2 com 5% de umidade.

Para fazer as determinações do efeito antiproliferativo as células GL-5 e as HEp-2 foram semeadas a 3 xlO4 células/ml. No caso das Jurkat estas foram semeadas a 105 células /ml.

Depois de 72 horas de incubação em presença de diferentes concentrações dos IFNs se determinou a viabilidade de 3 réplicas por condição de avaliação utilizando o método de tingimento por cristal violeta medindo a absorvência a 580 nm e utilizando um leitor de placas. Os resultados foram definidos como a porcentagem (%) de crescimento baseado na contagem de células viáveis segundo se descreve no exemplo 1.

Como se observa na tabela 1 e na figura 1, as linhas celulares HEp-2 (carcinoma de laringe) e o GL-5, que prove de um glioblastoma, são muito sensíveis ao IFN gama e não ao IFN alfa.

Tabela 1. Inibição do crescimento celular por 1000 Ul/ml de IFN gama ou IFN alfa 2b sobre linhas celulares.

IFNs Média Desvio Padrão SD Coeficicntc de Variação CV Replicatas Kusaios HEp-2 IFNAlfa 2 65% 13,68% 0,211 6 2 IFN gama 18% 6,26% 0,357 6 2 GL-5 IFNAlfa 2 71% 20,26% 0,287 6 2 IFN gama 24% 10,21% 0,421 4 2 ITe ρ G2 IFN Alfa 2 103% 13,17% 0,128 6 1 IFNgama 106% 21,67% 0,204 6 1 Jurkat IFNAlfa 2 60% 5,28% 0,088 3 1 IFN gama 107% 16,89% 0,157 3 1

Na tabela 1 se observa que a linha HepG2 (Hepatoma) não é

sensível a estes IFNs e que na linha celular Jurkat (linfoma Τ), o IFN alfa é o mais efetivo, resultado que coincide com o emprego exitoso do IFN alfa 2 no tratamento de tumores de tecido linfóide.

Exemplo 3: Combinações dos IFNs gama e alfa recombinantes mais efetivas com ação antiproliferativa sobre os cultivos primários e linhas celulares.

Utilizando os CPF do CBC-III e os quelóides Kel-5a e Kel-17a e as linhas celulares HEp-2 e GL-5, realizaram-se estudos de combinações de IFNs gama e alfa 2b recombinantes, para definir misturas ótimas com atividade potencializadora da inibição do crescimento celular. Os dados obtidos nos estudos foram analisados construindo curvas de isobologramas.

Dos estudos de isobologramas dos CPF provenientes de biópsias de quelóides em adultos (kel 5a e kel 17a) se definiu que a combinação ótima potencializadora para a inibição do crescimento deve ser composta de 100 Ul/ml (10 ng/ML) de IFN gama 100 Ul/ml (0,5 ng/ML) de IFN alfa 2b. Com essa combinação se consegue reduzir o crescimento celular in vitro em um 21% (Kel 5a) e em um 43% (kel 17a) (figuras 2 e 3).

O isobolograma da figura 4 mostra que a combinação de 100 Ul/ml (10 ng/ml) de IFN gama com 100 Ul/ml (0. 5 ng/ml) de IFN alfa 2b é potencializadora e a mais eficaz para reduzir o crescimento celular in vitro do CBC III em uns 47%.

Segundo o isobolograma que é mostrado na figura 5, a combinação ótima potencializadora para inibir o crescimento das células do GL-5 é de 50 Ul/ml (3 ng/ml) de IFN gama com 600 Ul/ml de IFN a2b (5 ng/ML) de IFN alfa 2b. Com essa combinação se consegue reduzir o crescimento celular in vitro em uns 55%.

O isobolograma representado na figura 6 mostra a combinação ótima potencializadora de IFN gama e alfa para obter o melhor efeito antiproliferativo sobre as células HEp-2. As quantidades de IFNs são de 5 Ul/ml (0,5 ng/ml) de IFN gama com 75 Ul/ml (0.375 ng/ml) de IFN alfa 2b. Com essa combinação ótima se consegue reduzir o crescimento celular in vitro em uns 76%.

Exemplo 4: Efeito do pH, as espécies iônicas e a concentração da solução tampão na estabilidade da mistura dos interferons alfa-2b e gama em solução aquosa.

Para estudar a estabilidade das formulações liofilizadas e líquidas das composições potencializadoras dos interferons gama e alfa recombinantes, prepararam-se diferentes formulações diluindo o interferon gama e o alfa de seu correspondente Ingrediente Farmacêutico Ativo (IFA) em diferentes formulações de prova: soluciones tampões, mistura de soluções tampões com excipientes individuais e mistura de soluções tampões com vários excipientes. Mostras representativas das ampolas das diferentes formulações foram submetidas a diferentes tratamentos para avaliar a estabilidade dos interferons: Ciclos de congelamento-descongelamento, liofmalização, agitação a 37°C, efeito da luz e da temperatura. Depois dos diferentes tratamentos, a estabilidade físico-química foi avaliada mediante diferentes ensaios: aparência física, eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), cromatografía líquida em fase inversa (RP-HPLC) e cromatografía de exclusão molecular (SE-HPLC). A estabilidade biológica foi avaliada mediante ensaios imuno-enzimáticos em fase sólida (ELISA) específicos para cada interferon e mediante ensaio biológico de inibição do efeito citopatogênico.

Todos estes estudos de desenho de formulação foram realizados com a mistura de concentrações intermédia dos interferons (0,5 MUI de IFN gama e 3,0 MUI de IFN alfa 2b). Com as variantes finais de formulação obtidas (preparadas em duplicado) prepararam-se as composições potencializadoras e se avaliou sua estabilidade.

Características organolépticas: Determinou-se mediante análises da aparência da formulação (se se mantinha incolor, transparente e sem agregação de proteínas). No caso de ser liofilizada a formulação, também se analisou a aparência do produto liofilizado.

Conteúdo de umidade: O conteúdo de umidade residual do produto liofilizado foi determinado mediante a técnica de titulação iodométrica de Karl Fischer, empregando um medidor de umidade Radiometer (Modelo TIM 550).

Estabilidade química: A pureza das proteínas e a magnitude da degradação foram determinadas mediante cromatografía líquida de alta resolução em fase inversa (RP- HPLC) em uma coluna C8 Vydac equipada com um guarda-coluna C8 Vydac (Vydac, Hesperia, CA) usando um sistema HPLC Merck-Hitachi equipado com um sistema de liberação de solventes, um detector de arranjo de diodo, um forno e um sistema de manejo de dados. A pureza das proteínas também foi determinada mediante eletroforeses em gel de poliacrilamida.

Determinação de agregados: A agregação do IFN gama e do IFN alfa 2b recombinantes foi medida por cromatografía líquida de alta resolução de exclusão molecular (SE-HPLC) mediante uma coluna Superdex- 75 HR 10/30 (Amersham PHarmacia Biotech AB, Sweden) usando um sistema HPLC Merck-Hitachi equipado com um sistema de libertação de solventes, um detector de arranjo de diodo, um forno e um sistema de manejo de dados. A determinação de agregados covalentes foi determinada mediante eletroforeses em gel de poliacrilamida.

ELISA de interferon alfa: Este ensaio foi desenvolvido em nosso laboratório (H. Santana., Espino Y., et ai. (1999) A sandwich-type enzyme-linked immunosorbent assay for the analysis of recombinant human interferon a-2b. Biotechnology Techniques, 13, 341-346). O ensaio emprega anticorpos monoclonais e foi realizado de acordo com a metodologia relatada. A medição é relatada aqui como porcentagem (%) da atividade ELISA residual do interferon alfa-2b nas diferentes mostras tratadas das diferentes variantes de formulação, tomando a atividade ELISA na mostra inicial igual a 100%.

ELISA de interferon gama: Este ensaio foi desenvolvido em nosso laboratório (Bouyón R., Santana H., et al. (2003) Development and validation of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for recombinant human gamma interferem. Journal of Immunoassay and Immunochemistryi 24:1-10). O ensaio emprega anticorpos monoclonais e foi realizado de acordo com a metodologia relatada. A medição é relatada aqui como porcentagem (%) da atividade ELISA residual do interferon gama nas diferentes mostras tratadas das diferentes variantes de formulação, tomando a atividade ELISA na mostra inicial igual a 100%.

Atividade biológica mediante ensaio de titulação antiviral: A medição da atividade biológica foi realizada segundo descreve Ferrero J., Ochagavia ME., et al. (1994, Titulación de Ia actividad antiviral dei interferon utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnologia Aplicada, 11:34-42). O cálculo da atividade biológica foi realizou de acordo com que descreve Ferrero J., Duany L., et al. (1997, Nuevo programa de cálculo, cuantificación de Ia actividad antiviral de interferons mediante Ia inhibición do efeito citopatogénico utilizando el sistema de equipos SUMA. Biotecnologia Aplicada, 14: 267-269). A atividade biológica é relatada aqui como porcentagem da atividade biológica residual, tomando a atividade biológica da mostra inicial igual a 100%.

Para conhecer o efeito do pH na estabilidade dos ingredientes ativos, prepararam-se diferentes formulações contendo 0,5 MUI de IFN gama e 3,0 MUI de IFN alfa 2b em diferentes soluciones tampões; ou seja, tampão citrato/fosfato, tampão fosfato, tampão citrato e tampão acetato.

As formulações contendo as misturas de IFN gama e de IFN alfa2b recombinantes com as soluciones tampões foram preparadas e submetidas a ciclos de congelamento-descongelamento ou armazenadas à temperatura de 45°C e analisadas por ELISA em determinados intervalos de tempo. As formulações foram preparadas de forma tal que o pH estivesse entre 4 e 8, e todas as soluciones tampões se encontravam a uma concentração de 0,1 M. As tabelas 2, 3 e 4 reportam os resultados dos ensaios realizados depois de 3 ciclos de congelamento-descongelamento e a determinados intervalos de tempo, de 3 a 12 dias à temperatura de 45 °C. Tabela 2. Estabilidade a 45°C e durante ciclos de congelamento- descongelamento de mistura de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes (0,5 MUI IFN gama e 3,0 MUI IFN alfa 2b) em solução aquosa em tampão citrato/fosfato 0,1 M a diferentes pH. Concentração de IFN gama e IFN alfa 2b em porcentagem (%).

CONGELAMENTO- DESCONGELAMENTO INCUBAÇÃO A45°C ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISA IFNa T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D IFN/4 100 2690650IU/M L 25,9 73,0 4,5 ND ND 78,5 69,9 36,9 IFN/5 100 3820902 I U/ML 82,1 86,5 5,4 ND ND 81,4 62,6 31,7 IF N/6 100 3532107IU/ML 63,3 82,7 36,5 5,5 3,6 79,8 61,0 38,5 IF N/7 100 3532100 I U/M L 63,0 82,4 44,4 26,4 14,0 78,0 63,1 32,0 IFN/8 100 3179500 I U/ML 55,1 76,7 37,6 21,6 11,5 82,5 60,3 34,2

D= Dias; ND = não determinável;

IFN/4= formulação em tampão citrato/fosfato pH 4,0; IFN/5= formulação em tampão citrato/fosfato pH 5,0

IFN/6= formulação em tampão citrato/fosfato pH 6,0; IFN/7= formulação em

tampão citrato/fosfato pH 7,0

IFN/8= formulação em tampão citrato/fosfato pH 8,0.

Tabela 3. Estabilidade a 45°C e durante ciclos de congelamento- descongelamento de mistura de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes (0,5 MUI IFN gama e 3,0 MUI IFN alfa 2b) em solução aquosa em tampão fosfato 0,1 M a diferentes valores pH. Concentração de IFN gama e IFN alfa 2b em porcentagem (%). CONGELAMENTO/DESCONGELAMENTO INCUBAÇõ A 45UC ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISA IFNa T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D IF N/5 100 3549425 IU/ML 90,2 83,5 67,3 47,6 25,4 74,1 53,9 32,6 IFN/6 100 3459600 I U/ML 67,8 75,6 42,4 28,6 10,5 82,7 59,6 41,1 IFN/7 100 3523210 I U/ML 57,9 80,4 40,5 21,5 8,1 73,6 52,9 33,0 IFN/8 100 3321090IU/M L 57,2 78,5 26,1 10,7 6,5 74,9 59,0 37,3

D= Dias; Μ) = não determinável;

IFN/5= formulação em tampão fosfato pH 5,0.; IFN/6= formulação em tampão fosfato pH 6,0.

IFN/7= formulação em tampão fosfato pH 7,0.; IFN/8= formulação em tampão fosfato pH 8,0

Os dados contidos nestas tabelas indicam que as formulações com valores de pH entre 5 e 8 mostraram uma adequada estabilidade durante os ciclos de congelamento-descongelamento, preferivelmente para os pH próximos a 5 e a 7 e nos tampões acetato, fosfato e citrato-fosfato. A estabilidade térmica em solução aquosa foi maior em valores de pH entre 5 e 5.6, preferivelmente nos tampões acetato e fosfato.

Os dados contidos na tabela 5 indicam que as formulações de maior concentração do tampão mostraram maior estabilidade durante os ciclos de congelamento-descongelamento do que as de menor concentração em pH 5.5, particularmente para o IFN gama nos diferentes tampões ensaiados. No entanto, os resultados da estabilidade térmica foram melhores a pH 5.5 nos tampões acetato e depois em fosfato e não se observou dependência da concentração. A estabilidade térmica em tampão citrato- fosfato foi maior em baixas concentrações do tampão. Tabela 4. Estabilidade a 45°C e durante ciclos de congelamento- descongelamento de mistura de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes (0,5 MUI IFN gama e 3,0 MUI IFN alfa 2b) em solução aquosa em tampão citrato e tampão acetato 0,1 M a diferentes valorizes pH. Concentração de IFN gama e IFN alfa 2b em porcentagem (%).

CONGELAMENTO- DESCONGELAMENTO INCUBAÇÃO A 45°C ; ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISAIFNa T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D IFN/C4 100 2690650 I U/ML 11,9 77,0 1,3 ND ND 66,9 49,9 27,0 IFN/C5 100 3820902 IU/ML 64,6 78,1 2,7 ND ND 71,3 56,6 41,8 IFN/C6 100 3532107IU/ML 65,8 66,9 12,0 5,9 ND 61,5 43,7 28,2 IFN/A4 100 3532100IU/M L 87,1 82,3 65,9 46,4 27,9 64,5 46,6 29,0 IFN/A5 100 3179500 I U/ML 86,1 79,7 59,4 45,9 24,0 68,3 47,9 30,7 IFN/A5.6 100 3179500 I U/ML 74,8 75,0 50,8 31,3 18,9 67,7 48,3 27,6

D= Dias; ND = não determinável;

IFN/C4= formulação em tampão citrato pH 4,0., IFN/C5= formulação em tampão citrato pH 5,0, IFN/C6= formulação em tampão citrato H 6,0, IFN/A4= formulação em tampão acetato pH 4,0, IFN/A5= formulação em tampão acetato pH 5,0, IFN/A5.6= formulação em tampão acetato pH 5.6. Tabela 5. Estabilidade a 45°C e durante ciclos de congelamento- descongelamento de mistura de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes (0,5 MUI IFN gama e 3,0 MUI IFN alfa 2b) em solução aquosa a pH 5.5 em tampões citrato-fosfato, fosfato e acetato a 0,1 M e a diferentes concentrações da solução tampão. Concentração de IFN gama e IFN alfa 2b em porcentagem (%).

CONGELAMENTO-

INCUBAÇÃO A 45UC DESCONGELAMENTO ELISA IFNy ELISA IFNa ELISA IFNy ELISA IFNa T=O 3D 6D 12D 3D 6D 12D IFN/C-F25 100 59,2 77,2 62,8 21,7 27,9 67,2 59,9 38,7 2690650 IU/ML IFN/C-F50 100 61,9 79,6 45,5 26,4 16,6 71,9 62,3 36,1 3820902 iU/ML IFN/C-F100 100 63,3 82,7 36,5 5,5 3,6 79,8 61,0 38,5 3532107 IU/ML IFN/Fk25 100 70,9 73,0 71,2 50,9 30,5 61,4 54,4 36,8 3532100 lU/ML )FN/Fk50 100 79,7 75,9 69,1 48,7 28,7 63,6 52,9 31,6 3179500 IU/ML IFN/Fk100 100 90,2 83,5 67,3 47,6 25,4 74,1 53,9 32,6 3179500 IU/ML IFN/Fna 25 100 70,3 77,6 68,4 47,3 24,3 63,6 56,1 37,7 3532100 IU/ML IFN/Fna 50 100 82,8 80,1 60,8 46,5 21,4 71,3 53,1 34,6 3179500 IU/ML IFN/FNa100 100 87,9 86,5 73,9 42,0 32,5 74,7 52,9 35,0 3179500 IU/ML IFN/A25 100 62,6 66,3 73,4 45,3 34,2 63,1 44,3 28,4 3532100 IU/ML IFN/A50 100 69,3 69,0 67,3 42,9 29,7 65,6 51,9 33,2 3179500 IU/ML IFN/A100 100 76,4 77,1 52,6 30,1 22,8 70,5 49,0 26,8 3179500IU/ML

D: Dias; ND: não determinável; IFN/C-F25: formulação em tampão citrato-

fosfato pH 5.5 e a 25 MM; IFN/C-F50: formulação em tampão citrato-fosfato pH 5.5 e a 50 mM; IFN/C-F100: formulação em tampão citrato-fosfato pH 5.5 e a 100 mM; IFN/Fk25: formulação em tampão fosfato de potássio pH 5.5 e a MM; IFN/Fk50: formulação em tampão fosfato de potássio pH 5.5 e a 50 MM; IFN/FklOO: formulação em tampão fosfato de potássio pH 5.5 e a 100 MM; IFN/FNa25: formulação em tampão fosfato de sódio pH 5.5 e a 25 mM; IFN/FNa 50: formulação em tampão fosfato de sódio pH 5.5 e a 50 mM; IFN/FNa 100: formulação em tampão fosfato de sódio pH 5.5 e a 100 mM; IFN/A25: formulação em tampão acetato pH 5.5 e a 25 mM; IFN/A50: formulação em tampão acetato pH 5.5 e a 50 mM; IFN/A100: formulação em tampão acetato pH 5.5 e a 100 mM.

Exemplo 5. Formulação Iiofilizada (1.4 χ IO6 Ul de IFN gama e 1.7 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola).

Composição: IFN gama 2.8 χ IO8 Ul, IFN alfa 2b 3.4 χ IO8 Ul, di-hidrogênio fosfato de mono-potássio 0,0802g, hidrogênio fosfato de di- sódio diidratado 0,249 g, sacarose 4 g, glicina 0,8 g, Tween 20 0,03 g, polietilenoglicol 6000 1 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml.

Todos os componentes exceto os interferons foram medidos e dissolvidos com água para injeção. O pH da solução é checado e se for necessário, ajustado ao valor de 7.2 ± 0,2 com ácido acético diluído (1:2) ou com IM de NaOH. Os ingredientes farmacêuticos ativos de IFN gama e IFN alfa 2b foram adicionados e diluídos até a concentração apropriada. A solução foi filtrada de forma estéril e dispensada em ampolas as quais lhes sobrepuseram os tampões para a liofinalização em uma área classe 100. As ampolas são transportadas através de um túnel classe 100 e localizados na máquina de liofilizar onde se realiza o processo de liofinalização. Finalmente os bulbos são tampados e selados; e o produto é armazenado entre 2 e 8°C. A tabela 6 mostra os principais parâmetros do ciclo de liofinalização empregado.

Tabela 6. Resumo dos parâmetros do ciclo de liofinalização, cronograma de temperatura por etapas.

Etapasdosciclos Temperatura Duração Congelamento -45 0C 2 h -20 0C 2 h -45 0C 6 h Secagem primária -35 0C 12 h Secagem secundária 25 0C 12 h

Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras

e se analisou o conteúdo de umidade residual do produto, o conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b contido por ELISA, a atividade biológica, a pureza por RP-HPLC e a aparência tanto do produto liofilizado como do reconstituído. Os resultados são apresentados na tabela 7.

Tabela 7. Dados de umidade residual do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LIOFILIZADA: 1.4 MUI IFN gama/ampola e 1.7 MUI IFN alfa 2b/ampola.

Tempo (mês) Umidade ELiSA : Atividade antiviral Pureza RP-HPLC residual <%) IFNy ^g/frasc o*) IFNa ^g/frasco* ) lU/frasc 0* Total (%) IFNy (%) IFNa (%) Descrição inicial 1.4 315,8 21,9 2,51 97,8 90,6 7,2 STI 1 - 291,2 24,7 3,78 96,4 87,7 8,7 STI 3 - 307,5 23,5 3,17 97,7 87,9 9,8 STI 6 2.6 279,1 22,6 2,89 97,0 88,9 8,2 STI

*0 volume de enchido foi de 0,5 ml/ampola; STI: Liofilizado branco uniforme; depois da reconstituição, uma solução transparente incolor, essencialmente livre de partículas visíveis.

Exemplo 6. Formulação liofílizada (0,5 χ IO6 UI de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampoia).

Composição: IFN gama 1,0 χ IO8 Ul, IFN alfa 2b 6,0 χ IO8 Ul, di-hidrogênio fosfato de mono-potássio 0,0802g, hidrogênio fosfato de di- sódio diidratado 0,249 g, sacarose 4 g, glicina 0,8g, Tween 20 0,03 g, polietilenoglicol 6000 1 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml. O processo de preparação foi o mesmo que se descreveu na formulação liofílizada do exemplo 5.

Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras e se analisou o conteúdo de umidade residual do produto, de IFN gama e IFN alfa 2b por ELISA, a atividade biológica, a pureza por RP-HPLC e a aparência tanto do produto liofilizado como do reconstituído. Os resultados são apresentados na tabela 8.

Tabela 8. Dados de umidade residual do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LIOFILIZADA: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampola. _

Tempo (mês) Umidade residual {%) ELISA Atividade antiviral Pureza RP-HPLC Descrição IFNy ^g/frasco*) IFNa ^g/frasco*) IU/ frasco* total % IFNa IFNy (%) (%) Inicial 1,3 93,7 38,5 3,15 97,5 28,1 69,4 STI 1 - 104,5 43,9 4,41 96,8 29,5 67,3 STI 3 - 98,5 36,4 2,69 97,1 27,6 69,5 STI 6 1,9 108,2 44,0 3,91 96,9 28,8 68,1 STI

*0 volume de enchido foi de 0,5 ml/ampola; Antiv.: Antiviral; STI: Liofilizado branco uniforme; depois da reconstituição, uma solução transparente incolor, essencialmente livre de partículas visíveis.

Exemplo 7: Ensaio Clínico com a formulação farmacêutica Iiofilizada (0,5 χ IO6 UI de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola). Aplicação intralesional no CBC.

A formulação farmacêutica liofilizada estável descrita no exemplo 6 foi empregada na realização de um ensaio clínico aleatoriamente, controlado e a triplo-cegos que incluiu 59 pacientes com diagnóstico clínico e histológico de CBC de qualquer localização e tipo de pele com lesões de um diâmetro menor do que quatro centímetros. Os mesmos foram designados de forma aleatória a três grupos de tratamento. As lesões foram tratadas intralesionalmente com IFN alfa 2b recombinante (1,5 xlO6 Ul/ml); IFN gama recombinante (0,25 χ IO6 Ul/ml) ou a formulação liofilizada estável (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b recombinantes por ampola) à metade da dose, grupo I, II e III, respectivamente, três vezes por semanas, durante três semanas consecutivas, continuando durante mais 9 semanas uma vez por semana ou até o desaparecimento total da lesão, momento em que se determinou a eficácia do tratamento desde o ponto de vista clínico.

9.5%, 35,3% e 5,3% das lesões do grupo com IFN alfa 2b, IFN gama e a formulação (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola) respectivamente diminuíram em menos de 50% o tamanho da lesão. No resto das lesões se observou 90,5%; 57.9% e 94,7% (grupo I, II e III, respectivamente) de resposta objetiva (desaparecimento total ou diminuição em mais do 50% do tamanho inicial). Nenhuma das lesões progrediu (ver tabela 9).

No estrato dos "pacientes que não terminaram o tratamento", observa-se uma ligeira superioridade do tratamento com a formulação que contém os IFNs gama e alfa 2b recombinantes em suas proporções potencializadoras do efeito antiproliferativo (17% de diferença com respeito ao tratamento com IFN alfa 2b e 27% de diferença com respeito ao tratamento com IFN gama). No estrato dos "pacientes com menos de 11 semanas de tratamento", observa-se superioridade da formulação (aproximadamente 30% de diferença com respeito ao gama e 27% com respeito ao alfa 2b) e a proporção de Respostas Completas é muito superior (> 40% de superioridade com respeito ao IFN alfa 2b e > 30% com respeito ao tratamento com IFN gama). Com menos de 12 injeções se conseguiu um 100% de respostas favoráveis (delas 50% de RC) no grupo da terapia com a formulação, enquanto que nos outros 2 tratamentos a porcentagem de resposta favorável foi de 67% (delas 33.3% de RC), ou seja, se consegue aproximadamente 33% de diferença a favor da terapia combinada. Ver tabela 9. Tabela 9. Avaliação da resposta clínica estratificando de acordo com χ*

tempo de tratamento com a FORMULAÇÃO LIOFILIZADA: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampola._

Variáveis IFN alfa IFN gama Formulação ... . . P(Fisher) Trata- mento com Termi- naron Completa 7 (41,2%) 17(100%) 4 (33,3%) 9 (75,0%) 8 (50%) 16(100%) I-Il P= 0.060 Ill-Il P= 0.067 Parcial 10 (58,8%) 5 (41,7%) 8 (50%) Estable 0 (0%) 3 (25,0%) 0 (0%) Trata- mento sem Termi- naron Completa 0 (0%) 2 (50%) 0 (0%) 2 (40%) 0 (0%) 2 (66.7%) I-Il p= 1.000 Ill-Il P= 1.000 Parcial 2 (50%) 2 (28,6%) 2 (66.7%) Estable 2 (50%) 3 (60%) 1 (33,3%) Tempo de trata- mento >= 11 semanas Completa 6 (37,5%) 16(100%) 2 (20,0%) 7 (70%) 3 (27.3%) 11 (100%) I-Il P= 0.046* Ill-Il P= 0.090 Parcial 10 (62,5%) 5 (50,0%) 8 (72.7%) Estável 0 (0%) 3 (30%) 0 (0%) Tempo de trata- mento < 11 semanas Completa 1 (20%) 3 (60%) 2 (28,6%) 4(57,1%) 5 (62.5%) 7 (87.5%) I-Il P= 0.689 Ill-Il p= 0.230 Parcial 2 (40%) 2 (28,6%) 2 (25.0%) Estável 2 (40%) 3 (42,9%) 1 (12,5%) < 12 Injeções recebidas Completa 1 (33,3%) 2 (66,7%) 2 (33,3%) 4 (66,7%) 3 (50%) 6(100%) I-Il p= 1.000 Ill-Il p= 0,455 Parcial 1 (33,3%) 2 (33,3%) 3 (50%) Estável 1 (33,3%) 2 (33,3%) 0 (0%) >12 Injeções recebidas Completa 6 (33,3%) 17(94,4%) 2 (18,2%) 7 (63,6%) 5 (38.5%) 12 I-Il p= 0.054 Ill-Il p= 0.142 Parcial 11 (61,1%) 5 (45,4%) 7 (53.8%) Estável 1 (5,6%) 4 (36,4%) 1 (7,7%)

Como podemos observar na Tabela 10, com a formulação liofilizada estável que contém os IFNs gama e alfa 2b recombinantes se conseguem obter respostas completas mais rapidamente do que com os interferons em separados, com uma diferença de aproximadamente 4 semanas antes em relação ao IFN alfa.

Tabela 10. Avaliação do tempo até a resposta completa. Tratamento com a formulação liofilizada: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampola. _______

Tempo em RC IFN gama (N = IFNalfa Formulação I P (Kruskai- (semanas) -;17) ■■ (N = 21) (N = 19) ; Wallis) Tempo em RC (semanas) IFN gama (N =·. 17) ; IFNalfa . ; (N = 21) Formulação (N = 19) P (Kruskal- Waliis) Média ± RQ 9,0 ±7,5 12,0 ± 1,0 8,5 ±5,8 0,507

Em nenhum caso tratado se observou a formação de quelóide,

pelo contrário todos os casos tiveram uma boa cicatrização da lesão com sensibilidade normal, elasticidade normal ou ligeiramente diminuída e ausência de secura, fragilidade e aspereza. Com respeito à cor, na maioria dos pacientes tratados com a formulação (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola) se observou uma coloração normal no lugar tratado (47.4%), resultando no dobro do que foi observado no grupo com IFNa (28.6%). Ao concluir o tratamento, no grupo tratado com a formulação se observou uma porcentagem maior de lesões planas (63.2%) com respeito ao grupo tratado com IFN alfa 2b somente (52.4%) o qual se mostra na Tabela 11.

Tabela 11. Avaliação estética ao final do tratamento. Tratamento com a formulação liofllizada: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampola.

Variáveis FN gama (N=17) IFN alfa :. (N=21)) Formulação (N=19) Cor Normocromia 8 (47,1%) 6 (28,6%) 9 (47,4%) Leve hipocromia 1 (5,9%) 4(19%) 6(31,6%) Hipocromia 1 (5,9%) 2 (9,5%) 1 (5,3%) Leve hipercromia 7 (41,2%) 8 (38,1%) 3(15,8%) Hypercromia - 1 (4,8%) - Volume Lesão plana 12(70,6%) 11(52,4%) 12(63,2%) Leve hipertrofia 5(29,4%) 10(47,6%) 7(36,8%)

A combinação de interferons não potencializou os eventos

adversos pois não foram detectadas diferenças significativas entre os grupos de tratamentos, em relação à produção ou intensidade dos mesmos. Em general foram leves (71.2%) ou moderados e bem tolerados. Não foram apresentados eventos adversos graves nem muito graves. (Tabela 12). Tabela 12. Freqüência de eventos adversos (% com respeito ao número total de ocorridas). Tratamento com a formulação liofilizada: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampoIa.

<ko Çí.

Eventos IFN gama IFN alfa Formulação Total Febre 31 (60,8%) 15(38,5%) 11 (26,2%) 57 (43,2%) Mialgias 2 (3,9%) 15(38,5%) 13(31,0%) 30 (22,7%) Calafrios 10(19,6%) 5(12,8%) 9(21,4%) 24(18,2%) Fraqueza 4 (7,8%) 1 (2,6%) 5(11,9%) 10 (7,6%) Artralgias 1 (2,6%) 3(7,1%) 4 (3,0%) Prurido 3 (5,9%) — 3 (2,3%) Perda de peso -- 2(5,1%) — 2(1,5%) Alergia 1 (2,0%) — 1 (0,8%) Trombocitopenia — 1 (2,4%) 1 (0,8%) Leucopenia -- — 1 (2,4%) 1 (0,8%) Total de eventos 39 (29,5%) 39 (29,5%) 43 (32,3%) 133(100%)

Como se pode observar nesta tabela os eventos adversos mais freqüentes em cada grupo de tratamento foram: febre (38.5%; 60.8% e 26.2%), mialgias (38.5%; 3.9% e 31%) e calafrios (12.8%; 19.6% e 21.4%) com IFN alfa, IFN gama e a combinação, respectivamente. O total de eventos adversos apresentados foi ligeiramente superior no grupo de pacientes tratados com IFN gama.

Em- general, o tratamento combinado conseguiu 32% de superioridade de respostas completas, com menos 25% de injeções em relação ao tratamento com IFN alfa e aproximadamente 4 semanas antes. Não potencializou os eventos adversos e não se encontrou nenhuma reincidência ao longo do ano de finalização do tratamento nos pacientes que obtiveram resposta completa. Desde o ponto de vista cosmético, o resultado foi muito bom resultando em lesões planas e normocrômicas em sua maioria. Exemplo 8: Resultados do uso compasional da mistura de IFNs gama e alfa 2b recombinantes em pacientes afetados por tumores de pele não susceptíveis de tratamentos padrões. Relato de casos. Paciente 1

Iniciais: EPR HC: 302396 Idade: 82 anos Sexo: Masculino

APP: n/r

Enviado ao Instituto nacional de Oncologia e Radiobiologia (INOR) em 17/10/01 por lesão tumoral da pele da região anterior do Tórax, tinha recebido tratamento por eletrofulguração que depois disto cresceu em forma ulcerosa, tendo sido operado em 03/07/01. Resultado: carcinoma espinocelular incompletamente ressecado. Chega com persistência tumoral no lugar de origem de 3 cm em forma de úlcera com bordas elevadas. Ao exame físico não apresentou gânglios metastáticos regionais. Indicou-se radioterapia sobre o tumor, terminando-a em 29/01/02:60Co 50 Gy + Raios X 12 Gy. Dose total tumor 62Gy. Um mês depois mostrava tumor fixo na clavícula e no terço inferior do músculo estemocleidomastoídeo que em pouco tempo continuou crescendo rapidamente, mostrando em 04/03/02 grande lesão ulcerada de 10 χ 8 cm sobre o terço interno da clavícula direita, base do pescoço e parte do externo, tudo até a parte anterior do tórax. Propuseram-lhe tratamento cirúrgico. Pelos 82 anos de idade e ter elevado risco cirúrgico, o familiar nega que seja operado. Depois, lhe propuseram tratamento com IFN intralesional. Pelo tamanho do tumor 12.5 χ 9 cm fixo no osso e músculo e 1-1.5 cm de espessura, (figura 7a) planificou-se em três setores de perímetro, infiltrando 1.5 ml de solução em aproximadamente 5 cm de tecido (1.5 χ 1.5 χ 1.5) em uma dose de 0,5 χ IO6 Ul de IFN gama + 6 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b em 6 ml de água para injeção, três vezes por semana por três semanas, cada setor.

Na quinta aplicação do produto (segunda semana) decide-se dobrar a dose de IFN gama (1 χ

IO6 Ul) por ausência de efeitos adversos limitantes e tratando de obter maior resultado de um tumor tão grande baseado na informação prévia do estudo clínico onde se evidenciou a potencialização do efeito de ambos interferons nas referidas doses. Ao todo o paciente recebeu 27 aplicações para uma dose total de 25 χ

IO6 Ul de IFN gama + 162 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b em dois meses de tratamento.

Na quinta aplicação apreciamos um aplainamento da borda da lesão até o nível da pele normal, (figura 7b). Um mês depois de começar o tratamento, o paciente relata dor intensa do membro superior direito observando-se infiltração do plexo nervoso braquial, exposição, necrose e fratura da clavícula. Até a aplicação #20 se observou que nos lugares injetados parou o crescimento tumoral, não assim no centro onde cresceu em forma lobulada, (figura 7c). Condição mantida na aplicação 24, além de aparecer sépsis e necrose no centro da úlcera tumoral. Exatamente dois meses depois de começado o tratamento (aplicação #27) sofreu intenso sangramento arterial por infiltração da artéria subclavia; a hemoglobina do paciente diminuiu até 80 g/L pela qual decidimos interromper o tratamento por 15 dias, ao final dos quais regressou por continuar sangrando e ter astenia progressiva. Faleceu dois meses depois por ruptura arterial e os lugares injetados se mantiveram sem crescimento. Nas primeiras oito aplicações se registraram alguns eventos adversos como febre (39°C), calafrios, eritema perilesional e astenia mas todos de intensidades leves e de curta duração.

Conclusões: Obteve-se resposta clínica nos lugares injetados, duradoura por pelo menos dois meses, efeitos adversos sem importância. Paciente 2

Iniciais: LGR HC: 158390 Idade: 65 anos Sexo: Feminino

APP: n/r.

Paciente que padece de múltiplos carcinomas basais em todo o rosto. Reexaminada e irradiada várias vezes da pálpebra inferior do olho esquerdo com enxertos, onde agora mostra reincidência tumoral de 5 mm de diâmetro na borda da pálpebra e outra lesão plana cicatricial por baixo da pálpebra para o pômulo, (figura 8a). A alternativa de tratamento seria nova cirurgia com os inconvenientes de já ser um caso multitratado. Na pálpebra superior desse mesmo olho tem outro carcinoma basal de 7 mm que não foi &

tratado anteriormente.

Em 08/05/02 se propõe tratamento com IFN intralesional (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama + 3 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b em 4 ml, três vezes por semana por três semanas). Ao todo o paciente recebeu 10 aplicações para uma dose total de 35 χ IO6 Ul de interferon (5 χ IO6 Ul de IFN gama + 30 χ IO6 Ul - de IFN alfa 2b). Na quarta infiltração, a lesão plana cicatricial tinha desaparecido e na pálpebra tinha uma úlcera necrosada no lugar do tumor, (figura 8b). Dois meses depois do tratamento não se observou tumor na pálpebra, e desaparecimento da lesão plana cicatricial do pômulo (figura 8c). Como efeito à distância, observamos redução de 50% do carcinoma basal da pálpebra superior do olho esquerdo que não foi tratado diretamente com IFN e

A

foi operado. TRES anos depois a paciente permanece ainda controlada das lesões infiltradas com IFN.

Registraram-se alguns eventos adversos de intensidades leves e de curta duração como febre (39°C), calafrios e quemose no olho tratado que se aliviou com estímulos frios.

Conclusões: Paciente com resposta clínica completa até agosto do 2005 (último controle), com efeitos adversos mínimos. Exemplo 9. Formulação Iiofilizada (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama e 10 χ IO6 UI de IFN alfa 2b a por ampola).

Composição: IFN gama 1,0 χ IO8 Ull IFN alfa 2b 20 χ IO8 Ul, di-hidrogênio fosfato de mono-potássio 0,0802 g, hidrogênio fosfato de di- sódio diidratado 0,249 g, sacarose 4 g, glicina 0,8 g, Tween 20 0,03 g, polietilenoglicol 6000 1 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml. O processo de preparação foi o mesmo que se descreveu na formulação liofilizada do exemplo 5.

Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras e se analisou o conteúdo de umidade residual do produto, de IFN gama e de IFN alfa 2b por ELISA, a atividade biológica, a pureza por RP-HPLC e a aparência tanto do produto liofilizado como do reconstituído. Os resultados são apresentados na tabela 13.

Tabela 13. Dados de umidade residual do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LIOFILIZADA: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 10,0 MUI IFN alfa 2b/ampola.

Tempo (mês) Umidacle Residual % ELISA AlWKlade Pureza RP-HPLC Descrição IFNyW frasco*) IFNa (μ^ fiasco*) Antwiral (IU/ fiasco*) Total (%) IFNy (%) IFNa (%) Inicial 0,9 94,0 1422 12,90 98,8 43,7 55,1 STl 1 - 105,5 133,2 8,37 97,7 40,8 56,9 STl 3 - 102,1 129,4 11,55 97,6 43,0 54,5 STI 6 1,7 91,7 137,1 9,13 95,4 39,4 57,0 sn

Exemplo 10. Emprego da formulação liofilizada estável composta por 0,5 MUI IFN gama/ampola e 10,0 MUI IFN alfa 2b/ampola em combinação com Cisplatino. Relato de caso. Paciente 4

Iniciais: JGA HC: Idade: 33 anos Sexo: Masculino APP: n/r Paciente inscrito no INOR por carcinoma de células basais que penetra pelo ângulo interno do olho esquerdo várias vezes operado e irradiado. Agora tem tumor ulcerado que chega até os ossos da base do crânio (figura 9a) comprovado por tomografia axial computadorizada (TAC) observa-se cavidade nos ossos próprios do nariz e da parede interna da órbita, fetidez insuportável que sai pela fossa nasal esquerda e secreção amarela purulenta pelo mesmo lugar. Pela extensão da lesão se decidiu fazer tratamento combinado de quimioterapia sistêmica com cisplatino a dose de 6 ciclos com intervalos de 21 dias e ao mesmo tempo a formulação (0,5 MUI IFN gama/ampola e 10,0 MUI IFN alfa 2b/ampola) infiltrada localmente 3 vezes por semana por três semanas.

Ao final da terceira aplicação, já se observava resposta parcial importante ao ponto de permitir a abertura da hedidita palpebral e a diminuição da fetidez. Apresentava ao mesmo tempo quemose de moderada intensidade. No mês se vê resposta clínica completa. Esta resposta se mantém ao terminar a quimioterapia. Os eventos adversos foram poucos, um pouco de febre e calafrios e dor referida no lugar da cicatriz da lesão. Um ano depois o paciente mantém a resposta clínica completa (figura 9b). Exemplo 11. Formulação líquida (1.4 χ IO6 Ul de IFN gama e 1.7 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola).

Composição: IFN gama 2.8 χ IO8 Uli IFN alfa 2b 3.4 χ IOsUIl acetato de sódio 0,708 g, ácido acético 0,079 ml, Tween 20 0,01 g, manitol 5 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml.

Todos os componentes exceto os interferons foram medidos e dissolvidos com água para injeção. O pH da solução é checado e, se for necessário, ajustado ao valor de 5.5 ± 0,2 com ácido acético diluído (1:2) ou com 1 M de NaOH. Os ingredientes farmacêuticos ativos de IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes foram adicionados e diluídos até a concentração apropriada. A solução foi filtrada de forma estéril. A formulação foi dispensada em recipientes que são tampados e selados em uma área classe 100. Finalmente o produto é armazenado entre 2 e 8°C.

Depois de fabricada a formulação, armazenaram-se as mostras por um período de seis meses a 2 e 8 0C. Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras e se analisou o pH, o conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b por ELISA, a atividade biológica, a pureza por RP-HPLC e a clareza da solução. Os resultados são apresentados na tabela 14. Tabela 14. Dados de pH do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LÍQUIDA: 1.4 MUI IFN gama/ampola e 1.7 MUI IFN alfa 2b/ampola.

Tempo (mês) EUSA Atividade Pureza RP-HPLC PH IFNy {μ^ ftasoo*) IFNa (pg/ fiasco*) Antiviral IU/ ftasoo* Tofal (%) IFNy (%) IFNa (%) Descrição Inicial 5,58 3052 24,9 3,66 96,9 88,1 8,8 STl 1 5,43 279,1 212 3,21 97,2 87,9 9,3 sn 3 5,56 285,4 20,7 2,47 95,8 89,7 7,1 STl 6 5,45 293,0 23,9 3,39 95,5 88,1 8,4 sn

*0 volume de enchido foi de 0,5 ml/ampola; Antiv.: Antiviral, STI: Uma solução transparente incolor, essencialmente livre de partículas visíveis. Exemplo 12. Formulação líquida (0,5 χ IO6 Ul de IFN gama e 3,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola).

Composição: IFN gama 2,0 χ IOs Ul, IFN alfa 2b 12,0 χ IO8 Ul, acetato de sódio 0,708 g, ácido acético 0,079 ml, Tween 20 0,01 g, manitol 5 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml. O processo de preparação foi o mesmo que se descreveu na Formulação líquida do exemplo 11.

Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras e se analisou por ELISA o conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, a pureza por RP- HPLC e a clareza da solução. Os resultados são apresentados na tabela 15.

Tabela 15. Dados de pH do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LÍQUIDA: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 3,0 MUI IFN alfa 2b/ampola. Tempo (mêses) PH EUSA Adüty Pureza. P-HPLC Descrição IFNy (pg/ fiasco*) IFNa^ frasco*) Antiviai (ILMaT) Tolal (%) IFNy (%) IFNa ' (%) Inilial 5,55 109,4 38,2 4,25 97,6 58,3 29,3 STl 1 5,37 103,7 39,5 2,73 97,1 59,8 27,3 STl 3 5,49 95,0 42,9 3,35 97,3 70,2 27,1 STl 6 5,58 94,9 36,2 3,91 96,8 58,5 28,3 sn

*0 volume de enchido foi de 0,5 ml/ampola.; STI: Uma solução transparente incolor, essencialmente livre de partículas visíveis.

Exemplo 13. Formulação líquida (0,5 χ IO6 UI de IFN gama e 10 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por ampola).

Composição: IFN gama 2,0 χ IO8 Ul, IFN alfa 2b 40 χ IO8 Ul, acetato de sódio 0,708 g, ácido acético 0,079 ml, Tween 20 0,01 g, manitol 5 g, água para injeção quantidade suficiente para 100 ml. O processo de preparação foi o mesmo que descrito na Formulação líquida do exemplo 11.

Em determinados intervalos de tempo foram tomadas amostras e se analisou o conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b por ELISA, a atividade biológica, a pureza por RP- HPLC e a clareza da solução. Os resultados são apresentados na tabela 6.

Tabela 16. Dados de pH do produto, conteúdo de IFN gama e IFN alfa 2b, a atividade biológica, pureza por RP-HPLC. Temperatura 5°C. FORMULAÇÃO LÍQUIDA: 0,5 MUI IFN gama/ampola e 10,0 MUI IFN alfa 2b/ampola.

Tempo (meses) PH EUSA AáK/ity Purily RP- ; HPLC Deserção IFNy (μ^ . fiasco*) IFNcx (fjgf fiasco*) AntMrd (lU/frasco*) Total (%) IFNy (%) IFNa (%) Inicial 5,53 91,9 138,2 12,41 98,0 39,1 58,9 STI 1 5,57 93,7 121,5 8,73 97,5 41,7 55,9 sm 3 5,49 105,0 142,9 9,46 95,8 38,2 58,6 sn 6 5,51 99,8 134,7 10,93 97,5 42,5 42,5 sn

*0 volume de enchido foi de 0,5 ml/ampola; STI: Uma solução transparente incolor, essencialmente livre de partículas visíveis.

Exemplo 14. Formulação semi-sólida (0.16 χ IO6 Ul de IFN gama e 1,0 χ IO6 Ul de IFN alfa 2b por grama de semi-sólido).

Formulação farmacêutica para a aplicação tópica, preferivelmente em forma de creme, ungüento ou gel. A preparação farmacêutica contém interferon gama e interferon alfa 2 recombinante como princípio ativo.

A composição é de 1.6 χ IO7 Ul de IFN gama e de 1 χ IO8 Ul de IFN alfa 2b, quantidade suficiente para 100 gramas de semi-sólido. Preparação de creme:

Para preparar o creme se funde a vaselina sólida e o álcool cetílico a 75°C e os misturam com constante agitação, esta mesma é mantida até o final do processo, uma vez homogeneizada a mistura se incorpora o tween 60. Por outro lado se dissolve o metil e o propil parabeno em água a 90°C e os incorpora à mistura anterior quando a temperatura tiver diminuído até 75°C. Posteriormente a emulsão é esfriada lentamente até 37°C e se incorpora a solução aquosa que contém o IFN gama e IFN alfa 2b recombinantes. O creme resultante é armazenado a 4°C em tubos de 15g (ver tabela 17).

Tabela 17. Ingredientes da formulação do creme.

Ingredientes % IFNy 2,2 IFNa 0,58 Álcool cetílico 4 Vaselina 10 Tween 60 2 Metil parabeno, propil parabeno 0,2 Agua purificada c,s,p, 81,2

Preparação de ungüento:

Em um recipiente se dissolvem os parabenos na água a 90°C e se deixa esfriar até 37°C. Em outro recipiente se mistura o petrolato líquido e o Span 20 em constante agitação. Posteriormente, mistura-se o conteúdo de ambos recipientes e quando a temperatura tiver diminuído por volta dos 37°C se incorpora o IFN gama e o IFN alfa 2b recombinantes, mantendo a agitação constante. Depois se incorpora o petrolato branco até conseguir homogeneização. O ungüento resultante é armazenado a 4°C em tubos de 15 g (ver tabela 18).

Tabela 18. Ingredientes da formulação do ungüento.

Ingredientes % IFNy 2,2 IFNa 0,58 Petrolato Sólido Branco 60 Petrolato líquido pesado 10 Span 20 3 Metil e propil parabeno 0,2 Água purificada c.s.p. 24,02

Preparação de gel:

Em um recipiente se dissolve o EDTA e em outro se dissolve os parabenos em álcool e se adiciona o propilenoglicol. Depois se misturam estas soluções em agitação constante e se incorpora lentamente o carbopol 940 com agitação rápida e vigorosa até obter uma dispersão turva sem presença de grumos. Prepara-se aparte, em um recipiente adequado uma solução de hidróxido de sódio IN com as gramas de soda e se adiciona lentamente com agitação à dispersão que contém o resto dos componentes da formulação. Posteriormente se incorpora o IFN gama e o IFN alfa 2b com agitação suave. Uma vez formada o gel se envasa em tubos de 15 g a 4°C (ver tabela 19).

Tabela 19. Ingredientes da formulação do gel._

Ingredientes % IFNy 2,2 IFNa 0,58 Carbopol 940 0,5 Propilenoglicol 10 Metilparabeno e propilparabeno 0,2 Hidróxido de sódio 0,2 Etilenodiaminotetraacetato cálcico de dissódio (EDTA) 0,01 Etanol 2 Água purificada c.s.p. 84,31

Claims

1. Formulações farmacêuticas estáveis para serem aplicadas por via parenteral (líquidas ou liofilizadas), ou tópica (gel, ungüento ou creme) caracterizada pelo fato de que compreendem diferentes quantidades dos interferons recombinantes gama e alfa em proporções potencializadoras para o tratamento de eventos patológicos que contemplam o crescimento celular não fisiológico benigno ou maligno de tecidos ou órgãos e de que compreendem, além disso, excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

2. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma solução tampão e pelo menos um componente selecionado de compostos de açúcares não redutores, aminoácidos, tensoativos e polímeros estabilizantes.

3. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que se emprega uma solução tampão capaz de manter o pH entre 4.9 e 7.5 tais como acetato de amônia ou de sódio, succinato de sódio, fosfato de sódio e/ou potássio e citrato/fosfato de sódio e em que são empregados como açúcares não redutores a sacarose ou a trehalose; como aminoácidos a glicina, histidina ou leucina; como tensoativos o polissorbato 20 ou o polissorbato 80 e como polímero estabilizante o polietilenoglicol, o dextrano ou o amido hidroxietila.

4. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo fato de que se emprega uma solução tampão em uma faixa de concentração entre 10 e 20 mM; onde a sacarose ou a trehalose são empregadas em uma faixa de concentração entre 5 e 100 mg/ml; onde a glicina, histidina ou leucina são empregadas em uma faixa de concentração entre 1 e 20 mg/ml; onde o polisorbato é empregado em uma faixa de concentração entre 0,01 e 1 mg/ml e em que o polietilenoglicol, o dextrano, ou o amido hidroxietila, são empregados em uma faixa de concentração entre .5 e 50 mg/ml.

5. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 5.6 χ 10 Ul e 1.4 χ 10 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 6.8 χ IO8 Ul e 1.7 χ IO8 Ul, 0,0802 g de di-hidrogênio fosfato de mono-potássio, 0,249 g de hidrogênio fosfato de di-sódio diidratado, 4 g de sacarose, 0,8 g de glicina, 0,03 g de Tween 20, 1 g de polietilenoglicol 6000, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

6. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 2,0 χ IO8 Ul e 0,5 χ IO8 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 12,0 χ IO8 Ul e 3,0 χ IO8 Ul, 0,0802 g de di-hidrogênio fosfato de mono-potássio, 0,249 g de hidrogênio fosfato de di-sódio diidratado, 4 g de sacarose, 0,8 g de glicina, 0,03 g de Tween 20, 1 g de polietilenoglicol 6000, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

7. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 4,0 χ IO8 Ul e 1,0 χ IO8 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 80 χ IO8 Ul e 20 χ IO8 Ul, 0,0802 g de di-hidrogênio fosfato de mono-potássio, 0,249 g de hidrogênio fosfato de di-sódio diidratado, 4 g de sacarose, 0,8 g de glicina, 0,03 g de Tween 20, 1 g de polietilenoglicol 6000, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

8. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma solução tampão e pelo menos um componente selecionado de compostos de açúcares não redutores, aminoácidos, tensoativos, polímeros estabilizantes, compostos antioxidantes/quelantes e agentes isotonizantes. Esta formulação líquida emprega um solvente aquoso que pode conter ou não agentes preservantes tal como a mistura de metil- e propil- parabeno.

9. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 8, caracterizadas pelo fato de que se emprega uma solução tampão capaz de manter o pH entre 4,9 e 6,5 tais como acetato de amônia ou de sódio, succinato de sódio, fosfato de sódio e/ou potássio, citrato/fosfato e pelo fato de que se empregam como tensoativos o polissorbato 20 ou polissorbato 80; como antioxidante/quelante o EDTA ou a cisteína-acetila; como aminoácidos a histidina, L-arginina, L-alanina, glicina ou a lisina; como polímero estabilizante o amido hidroxietila ou o dextrano e como agente isotonizante o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, o propilenoglicol, o manitol, o glicerol, a sacarose ou a trehalose.

10. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 9, caracterizadas pelo fato de que se emprega uma solução tampão em uma faixa de concentração entre 10 e 100 mM; e em que o polissorbato é empregado em uma faixa de concentração entre 0,01 e 1 mg/ml; onde o EDTA ou a cisteína-acetila é empregada em uma faixa de concentração entre 0,01 e 1 mg/ml; a histidina, L-arginina, L-alanina, glicina ou a lisina são empregadas em uma faixa de concentração entre 1 e 20 mg/ml; o amido hidroxietila e o dextrano são empregados em uma faixa de concentração entre 5 e 50 mg/ml e onde os agentes isotonizantes se encontram em quantidade suficiente para fazer a solução isotônica.

11. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 5.6 χ IO8 Ul e 1.4 χ IO8 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 6.8 χ IO8 Ul e 1.7 χ IO8 Ull 0,708 g de acetato de sódio, 0,079 ml de ácido acético, 0,01 g de Tween 20, 5 g de manitol, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

12. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 2,0 χ 10 Ul e 0,5 χ 10 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 12,0 χ 10 Ul e 3,0 χ 10 Ul, 0,708 g de acetato de sódio,0,079 ml de ácido acético, 0,01 g de Tween 20, 5 g de manitol, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

13. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que é composta por IFN gama em uma faixa de concentração entre 4,.0 χ 10 Ul e 1,0 χ 10 Ul e IFN alfa 2 em uma faixa de concentração entre 80 χ 10 Ul e 20 χ 10 Ul 0,708 g de acetato de sódio, 0,079 ml de ácido acético, 0,01 g de Tween 20, 5 g de manitol, e água para injeção quantidade suficiente para 100 ml e para 0,5 ml, 1 ml, 5 ml e 10 ml nas respectivas proporções equivalentes.

14. Formulações farmacêuticas de acordo com as reivindicações da 1 a 13, caracterizadas pelo fato de que são para o tratamento de tumores sólidos benignos ou malignos utilizadas de formas independentes ou combinadas com quimioterapia, radioterapia ou a combinação destas.

15. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 14, caracterizadas pelo fato de que são para o tratamento de carcinomas de laringe, papilomatose laríngea, leucemia mielóide aguda, leucemia mielóide crônica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemias de células T, leucemias de células B, linfoma do sistema nervoso central, lipoma, cisto epidermóide, cisto intradérmico, lipossarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangioma cavernoso, adenoma hepatocelular, hiperplasia nodular focai, astrocitomas, glioblastomas multiformes, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juvenis, gliomas misturados, oligodendrogliomas, gliomas do nervo ótico, cordomas, craniofaringiomas, meduloblastomas, meningiomas, tumores pineais, adenomas pituitários, tumores neuroectodermal primitivos, as hiperplasias nodulares focais, tumores pingais, adenomas pituitários, tumores vasculares, carcinomatose meningeal, angiomas em forma de cereja, hiperplasia das glândulas sebáceas, carcinoma basocelular, o carcinoma de células escamosas, o dermatofibroma, o granuloma piogênico, o nevo dérmico, bem como queratose seborreica e queratose actínicas.

16. Formulações farmacêuticas de acordo com as reivindicações da 1 a 13, caracterizadas pelo fato de que são para o tratamento de eventos proliferativos tais como fibroses, displasias e hiperplasias.

17. Formulações farmacêuticas de acordo com as reivindicações da 1 a 13, caracterizada pelo fato de que são administradas intramuscular, intratumoral, e perilesionar.

18. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que compreendem o IFN gama recombinante em uma margem de concentrações entre 0,32 Ul χ IO6 Ul e 0,08 Ul χ IO6 e IFN alfa 2 recombinante em uma margem de concentrações entre 2,0 χ IO0 Ul e 0,5 χ IO6 Ul por grama de semi-sólido.

19. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, na forma de creme, caracterizada pelo fato de que compreende 2.2% IFN gama, 0,58% IFN alfa 2b, 4% de álcool cetílico, 10% Vaselina, 2% Tween 60, 0,2% metilparabeno, propilparabeno e 81.2% de água purificada, csp.

20. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, na forma de ungüento, caracterizada pelo fato de que compreende 2,2% IFN gama, 0,58% IFN alfa 2, 60% de petrolato sólido alvo, 10% de petrolato líquido pesado, 3% de Span 20, 0,2% metilparabeno e propilparabeno e 24,02% de água purificada, csp.

21. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 18, na forma de gel, caracterizada pelo fato de que compreende 2.2% IFN gama, 0,58% IFN alfa 2, 0,5% de Carbopol 940, 0,2% de metilparabeno e propilparabeno, 0,2% de hidróxido de sódio, 0,01% de etilenodiaminotetraacetato de cálcio dissódico, 2% etanol e 84.3 l%de água purificada, csp.

22. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação da 18 a 21, caracterizadas pelo fato de que são para o tratamento de tumores sólidos benignos ou malignos da pele ou mucosas utilizadas de formas independentes ou combinadas com quimioterapia, radioterapia ou a combinação destas.

23. Formulações farmacêuticas de acordo com a reivindicação 22, caracterizadas pelo fato de que são para o tratamento de lipoma, cisto epidermóide, cisto intradérmico, lipossarcoma, neurofibroma, hiperplasia sebácea, hemangiomas, hiperplasia nodular focai, ependimomas, ganglioneuromas, astrocitomas pilocíticos juvenis, meningiomas, tumores pineáis, adenomas pituitários, tumores vasculares, carcinomatose meningeal, neurofibromatose, angiomas em forma de cereja, hiperplasia das glândulas sebáceas, carcinoma basocelular, carcinoma de células escamosas, dermatofibroma, granuloma piogênico, nevo dérmico, queratose seborreica, queratose actínicas, e condilomas.

24. Formulação farmacêutica de acordo com as reivindicações da5a7edall al3, caracterizada pelo fato de que está em uma apresentação farmacêutica que contém uma ou mais ampolas de IFN gama recombinante com as correspondentes ampolas de IFN alfa 2 recombinante, na qual se procede a misturar o conteúdo das ampolas com os IFNs de forma tal que se mantenham as concentrações de IFNs gama e alfa 2 recombinantes definidas nas reivindicações mencionadas e em que, além disso, a apresentação farmacêutica contém ampolas de água para injeção, seringas e agulhas suficientes para realizar a mistura dos IFNs e a aplicação da mesma às pessoas pacientes desta.