BRPI0618208A2 - uso de anticorpos anti-cd40 - Google Patents

Abstract

<B>USO DE ANTICORPOS ANTI-CD4O<D>Métodos para o tratamento de um paciente humano para um câncer ou condição pré-maligna que está associada a células que expressam CD4O são fornecidos, em que o paciente humano é heterozigático ou homozigótico para Fc'yRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F). Também são fornecidos métodos de inibição da produção de anticorpo por células B em um paciente humano que é heterozigático ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F). Os métodos compreendendo a administração ao paciente humano de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum anticorpo anti-CD4O. Métodos e kits para a identificação de um paciente humano com um câncer ou condição pré-maligna que é tratável com um anticorpo anti-CD4O e que é refratário ao tratamento com rituximab (Rituxan«), bem comométodos e kits para a seleção de uma terapia com anticorpo para o tratamento de um paciente humano que tem um câncer ou condição pré-maligna que é refratário ao tratamento com rituximab (Rituxan«), também são fornecidos. Os métodos da presente invenção têm uso no tratamento de cânceres e condições pré-malignas que são associadas a células que expressam CD4O. Esses métodos são particularmente vantajosos com relação a cânceres e condições pré-malignas que são associadas a células que expressam tanto CD4O quanto CD2O, uma vez que os métodos permitem o tratamento de pacientes que têm câncer ou condição pré-maligna que é refratário à terapia com outros agentes oncoterapêuticos como anticorpos anti-CD2O.

Description

USO DE ANTICORPOS ANTI-CD40

Esta invenção relaciona-se a novos usos de anticorposanti-CD40, em particular no tratamento de cânceres econdições pré-malignas que são associadas com células queexpressam CD40.

Fundamento da invenção

Vários membros da família de fator de necrose tumoral(TNF) de ligantes e seus receptores correspondentes regulamo crescimento de células normais por indução de apoptose ouaumento da sobrevivência e proliferação celulares. É esseequilíbrio entre sinais apoptóticos e sinais desobrevivência è proliferação que mantém a homeostasiacelular normal. Pelo menos 26 receptores da família de TNFe 18 ligantes da família de TNF foram identificados atéhoje. As formas biologicamente ativas de ambos osreceptores e ligantes são trímeros de proteínas auto-montadas. Transmembrana e formas solúveis dos receptores eligantes foram identificadas. Embora os domíniosintracelulares dos receptores não partilhem homologia deseqüência, seus domínios extracelulares compreendem 40repetições de aminoácidos, ricas em cisteína. Seus sinaisde caudas citoplasmáticas por interação com dois gruposprincipais de proteínas intracelulares: fatores associadosa receptor de TNF (TRAFs) e proteínas que contêm domíniosde morte (DD). A interação entre pelo menos seis TRAFshumanos e sítios de ligação de TRAF na cauda citoplasmáticade alguns desses receptores inicia várias vias desinalização, que incluem AKT (a serina/treonina quinasereferida como proteína quinase B ou PKB), fator-KB nuclear(NF-KB), e proteína quinases ativadas por mitógeno (MAPK).Veja, por exemplo, a revisão por Younes e Kadin (2003) JClin. Oncol. 18:3526-3534.

0 membro de receptor da família de TNF CD40 é umantígeno de superfície celular de 50-55 kDa presente nasuperfície de células B humanas normais e neoplásicas,células dendríticas, monócitos, macrófagos, células T CD8+,células endoteliais, e células monocíticas e epiteliais, evários tumores sólidos, que incluem câncer de pulmão, mama,ovário, bexiga urinária e cólon. A ligação do ligante deCD40 (CD40L) ao antígeno de CD40 na membrana de célula Bfornece um sinal co-estimulante positivo que estimula aativação e proliferação da células B, resultando namaturação da célula B em célula plasmática que secretaaltos níveis de imunoglobulina solúvel. CD40 ativa TRAF-2,-3, -5 e -6, que supra-regulam diversas vias de sinalizaçãoapós encaixe de CD40 com CD40L (seja CD40L ligado amembrana ou CD40L solúvel), incluindo quinase regulada porsinal extracelular (ERK), quinase amino terminal c-jun(JNK), proteína quinase ativada por mitógeno p38 (MAPK),AKT e NF-KB (veja, por exemplo, Younes e Carbone (19 99)Int. J. Biol. Markers 14:135-143; van Kooten and Banchereau(2000) J. Leukoc. Biol. 67:2-17).

Células B malignas de todos os tipos de tumor delinhagem de células B expressam CD40 e parecem depender dasinalização de CD40 para sobrevivência e proliferação.Células transformadas de pacientes com linfomas de célulasB de baixo e alto grau, leucemia linfoblástica aguda decélula B, mieloma múltiplo, leucemia linfocítica crônica,Macroglobulinemia de Walsdenstrom, e doença de Hodgkinexpressam CD40. A expressão de CD40 é também detectada emleucemia mieloblástica aguda e 50% de linfomas relacionadosà AIDS.

Inúmeros carcinomas e sarcomas também exibem altosníveis de expressão de CD4 0, embora o papel da sinalizaçãode CD4 0 nessas células cancerosas seja bem menoscompreendido. Carcinomas que expressam CD40 incluemcarcinoma de bexiga urinária (Paulie e cols. (1989) JImmunol. 142:590-595; Braesch-Andersen e cols. (1989) JImmunol. 142:562-567), carcinoma de mama (Hirano e cols.(1999) Blood 93:2999-3007; Wingett e cols. (1998) BreastCâncer Res. Treat. 50:27-36); câncer de próstata (Rokhlin ecols. (1997) Câncer Res. 57:1758-1768), carcinoma de célularenal (Kluth e cols. (1997) Câncer Res. 57:891-899),carcinoma do nasofaringe não diferenciado (LTNPC)(Agathanggelou e cols. (1995) Am. J Pathol. 147:1152-1160),carcinoma de célula escamosa (SCC) (Amo e cols. (2000) Eur.J. Dermatol. 10:438-442; Posner e cols. (1999) Clin. CâncerRes. 5:2261-2270), carcinoma papilar da tireóide (Smith ecols. (1999) Thyroid 9:749-755), melanoma cutâneo maligno(van den Oord e cols. (1996) Am. J. Pathol. 149:19531961),carcinoma gástrico (Yamaguchi e cols. (2003) Int. J Oncol.23 (6) : 1697-702) , e carcinoma hepático (veja, por exemplo,Sugimoto e cols. (1999) Hepatology 30 (4):920-26, quediscute carcinoma hepatocelular humano). Para sarcomas queexpressam CD40, veja, por exemplo, Lollini e cols. (1998)Clin. Câncer Res. 4 (8) : 1843-849, que discute osteossarcomahumano e sarcoma de Ewing.

A sinalização de CD4 0 protege células B imaturas elinfomas de célula B de apoptose induzida por IgM ou Fas(veja, por exemplo, Wang e cols. (1995) J. Immunol.155:3722-3725). Células de linfoma de célula do mantoexpressam um alto nível de CD40, e a adição de ligante deCD40 exógeno mostrou melhorar sua sobrevivência erecuperação da apoptose induzida por fludarabina (Clodi ecols. (1998) Brit. J. Haematol. 103:217-219). O papel dasinalização de CD40 sobre a sobrevivência e proliferação decélulas B malignas torna o antígeno CD40 um alvo potencialpara a terapia anticâncer. De fato, anticorpos anti-CD40antagonistas inibem a proliferação e/ou diferenciação decélulas B malignas humanas in vitro (veja, por exemplo,Publicação de Pedido de Patente U.S. No. 20040109857). Alémdisso, modelos de murídeo de Iinfornas humanos agressivosdemonstram a eficácia in vivo de anticorpos anti-CD40 napromoção da sobrevivência animal. Veja, por exemplo,Funakoshi e cols. (1994) Blood 83:2787- 2794; Tutt e cols.(1998) J. Immunol. 161:3176-3185; e Szocinski e cols.(2002) Blood 100: 217-223.

O ligante CD40 (CD4 0L), também conhecido como CD154, éuma proteína de transmembrana de 32-33 kDa que tambémexiste em duas formas solúveis menores biologicamenteativas, de 18 kDa e 31 kDa, respectivamente (Graf e cols.(1995) Eur. J. Iwmunol. 25:1749- 1754; Mazzei e cols.(1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle e cols.(1996) J. Biol. Chem. 271:5965-5967). CD4 0L é expresso emcélulas T-helper CD4+ ativadas, mas não em repouso (Lane ecols. (1992) Eur. J. Immunol. 22:2573-2578; Spriggs e cols.(1992) J. Exp. Med. 176:1543-155 0; e Roy e cols. (1993) J.Immunol. 151:1-14). Tanto CD40 quanto CD40L foram clonadose caracterizados (Stamenkovi e cols. (1989) EMBO J. 8:1403-1410; Armitage e cols. (1992) Nature 357:80-82; Lederman eCOls. (1992) J. Exp. Med. 175:1091-1101; e Hollenbaugh ecols. (1992) EMBO J. 11:4313-4321). Veja também PatenteU.S. No. 5.945.513, que descreve CD4 0L humano. Célulastransf ectadas com o gene de CD40L e que expressam aproteína de CD4 0L em sua superfície podem despertar aproliferação de células B, e, junto com outros sinaisestimulatõrios, podem induzir a produção de anticorpo(Armitage e cols. (1992) supra; e Patente U.S. No.5.945.513). Pacientes com malignidades linfóides, doençasautoimunes, doença cardiovascular e trombocitemia essencialtêm níveis séricos elevados de CD40L solúvel (sCD40L) quenão são observados em indivíduos saudáveis. A expressãoconstitutiva de CD40L foi observada em um subconjunto depacientes com várias malignidades linfóides de células B,incluindo linfoma de célula do manto, linfoma folicular,Iinfoma da zona marginal, leucemia linfocítica crônica(CLL) , linfoma de células B grande difuso (DLBCL), linfomafolicular (FL), e linfoma de célula B infectada por HIV.

Veja, por exemplo, Clodi e cols. (1998) Br. J.Haematol. 103:270-275; Schaffner e cols. (1998) Blood91:2689-2697; Moses e cols. (1997) Nat. Med. 3:1242-1249;Trentin e cols. (1997) Câncer Res. 57:4940-4947; e Pham ecols. (2002) Immunity 16:37-50). CD40L pode ter um papelimportante na interação dependente de contato de célula decélulas B tumorais que expressam CD40 nos folículosneoplásicos ou células de Reed-Sternberg que expressam CD40em áreas de doença de Hodgkin (Carbone e cols. (1995) Am. JPathol. 147:912-922). No entanto, o mecanismo desinalização de CD4 0 mediada por CD4 0L que leva a respostasde sobrevivência versus morte celular de células B malignasnão é completamente conhecido. Por exemplo, em células deIinfoma folicular, a infra-regulação de molécula TRAIL queinduz apoptose (AP0-2L) (Ribeiro e cols. (1998) British J.Haematol. 103:684-689) e super-expressão de bcl-2, e nocaso de B-CLL, infra-regulação de CD95 (Fas/APO-1)(Laytragoon-Lewin e cols. (1998) Eur. J. Haematol. 61:266-271) foram propostas como mecanismos de sobrevivência. Emcontraste, evidência em Iinfoma folicular indica que aativação de CD4 0 leva à supra-regulação de TNF (Worm ecols. (1994) International Immunol. 6:1883-1890) emoléculas de CD95 (Plumas e cols. (1998) Blood 91:2875-2885) .

Anticorpos monoclonais humanos anti-CD40 e inúmerosusos destes são revelados em Pedidos de Patentes de co-propriedade publicados como WO 2005/044854, WO 2005/044304,WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307 e WO 2005/044294. Aqueles pedidos revelamespecificamente um anticorpo monoclonal anti-CD40 IgGlhumano, designado como CHIR-12.12, que foi gerado porimunização de camundongos transgênicos que sustentam olócus de cadeia pesada de IgGl humana e o lócus de cadeialeve κ humana (XenoCamundongo0 technology; Abgenix,Califórnia).

Como mostrado por análise FACS, CHIR-12.12 se ligaespecificamente a CD40 humano e pode evitar ligação CD40-ligante (CD4 0L). CHIR-12.12 pode competir por CD40L pré-ligado a CD4 0 de superfície celular. O anticorpo monoclonalCHIR-12.12 é um forte antagonista e inibe proliferação invitro mediada por CD40L de células B normais e malignas. 0anticorpo monoclonal CHIR-12.12 inibe diretamente asobrevivência e as vias de sinalização mediadas por CD40Lem linfócitos B humanos normais. In vitro, CHIR-12.12 matacélulas cancerosas primárias de pacientes com NHL (linfomanão Hodgkin) por ADCC. A atividade antitumor dose-dependente foi observada em um modelo de linfoma humano dexenoenxerto. CHIR-12.12 está atualmente em experimentos defase I para malignidades de célula B.

CD20 é um antígeno de superfície celular expressoprecocemente em diferenciação de célula B e permanece nasuperfície celular através do desenvolvimento da célula B.CD20 está envolvido na ativação de célula B, é expresso emníveis muito altos em células B neoplásicas, e é um alvoterapêutico clinicamente reconhecido (veja, por exemplo,Hooijberg e cols. (1995) Câncer Research 55: 2627).Anticorpos que visam CD20, como rituximab (Rituxan®), foramaprovados pela "U.S. Food and Drug Administração" para otratamento de linfoma não Hodgkin (veja, por exemplo, Boyee cols. (2003) Ann. Oncol. 14:520). Rituxan provou ser umtratamento eficaz para linfoma não Hodgkin (NHL) de graubaixo, intermediário e alto (NHL) e ativo em outrasmalignidades de células B (veja, por exemplo, Maloney ecols. (1994) Blood 84:2457-2466), McLaughlin e cols. (1998)J. Clin. Oncol. 16:2825-2833, Maloney e cols. (1997) Blood90:2188-2195, Hainsworth e cols. (2000) Blood 95:30523056,Colombat e cols. (2001) Blood 97:101-106, Coiffer e cols.(1998) Blood 92:19271932), Foran e cols. (2000) J. Clin.Oncol. 18:317-324, Anderson e cols. (1997) Biochem. Soe.Trans. 25:705-708, ou Vose e cols. (1999) Ann. Oncol.10:58a).

Embora o mecanismo exato de ação não seja conhecido, aevidência indica que os efeitos antilinfoma de Rituxan® sãoem parte devidos à citotoxicidade mediada por complemento(CMC), citotoxicidade mediada por células dependente deanticorpo (ADCC), inibição de proliferação celular, efinalmente indução direta de apoptose. ADCc é um mecanismode ação principal para vários anticorpos monoclonaiscomercializados e em pesquisa. Alguns pacientes, noentanto, tornam-se resistentes ao tratamento com Rituxan®(veja Witzig e cols. (2002) J Clin. Oncol. 20:3262, Grillo-Lopez e cols. (1998) J Clin. Oncol. 16:2825, ou Jazirehi ecols. (2003) Mol. Câncer Ther. 2:1183-1193). Por exemplo,alguns pacientes perdem expressão de CD20 em células Bmalignas após terapia com anticorpo anti-CD20 (Davis ecols. (1999) Clin. Câncer Res. 5:611). Além disso, 30% a50% dos pacientes com NHL de baixo grau não exibem respostaclinica a esse anticorpo monoclonal (Hainsworth e cols.(2000) Blood 95:3052-3056; Colombat e cols. (2001) Blood97:101-106). A atividade clínica de rituximab em NHL tambémmostrou ser correlacionada com o genótipo de FcyRIIIa dopaciente. Pacientes com o polimorfismo 158aa de FcyRIIIa deV/V ou V/F são mais responsivos a rituximab que aqueles comF/F (por exemplo, veja, Cartron e cols. (2002) Blood99 (3) : 754-758 ou DallOzzo e cols. (2004) Câncer Res.64:46644669). Para pacientes que desenvolvem resistência aesse anticorpo monoclonal, ou que têm um Iinfoma de célulaB que é resistente à terapia inicial com esse anticorpo,formas alternativas de intervenção terapêutica sãonecessárias.

Há, portanto, uma necessidade continuada por novosagentes terapêuticos e novas estratégias terapêuticas paracânceres e condições pré-malignas. Em particular, há umanecessidade por novas estratégias terapêuticas para otratamento de pacientes que são homozigóticos ouheterozigóticos para FcyRIIIa-158F e são refratários aotratamento com anticorpos anti-CD20, como rituximab(Rituxan®). Além disso, um anticorpo que pode matar célulasmalignas sem necessitar de um conjugado resultará em ummedicamento que é de menor custo e que pode ter menosefeitos colaterais.

Breve sumário da invenção

São fornecidos métodos para o tratamento de umpaciente humano para um câncer ou condição pré-maligna queestá associada a células que expressam CD40, em que opaciente humano é heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F). Os métodos compreendema administração ao paciente humano de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40. A invenção também fornece o uso de umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz deum anticorpo anti-CD40 na manufatura de um medicamento parao tratamento de um câncer ou condição pré-maligna que estáassociada a células que expressam CD40 em um pacientehumano heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa 158F(genótipo V/F ou F/F).

Também são fornecidos métodos de inibição de produçãode anticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F), que compreende a administração ao pacientehumano de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD40.

A invenção também fornece o uso de uma quantidade eficaz deum anticorpo anti-CD4 0 na manufatura de um medicamento parainibição da produção de anticorpo por células B em umpaciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIal58F (V/F ou F/F).

Métodos e kits para a identificação de um pacientehumano com um câncer ou condição pré-maligna que é tratávelcom um anticorpo anti-CD4 0 e que é refratário ao tratamentocom rituximab (Rituxan®) são também fornecidos. Em algumasmodalidades, os métodos compreendem: a) a identificação deum paciente humano com um câncer ou condição pré-malignaque está associada a células que expressam CD4 0 e que érefratária ao tratamento com rituximab (Rituxan®) ; e b) adeterminação do genótipo FcyRIIIa-158 do paciente humano(VN, V/F ou F/F) ; em que o paciente com câncer ou condiçãopré-maligna é tratável com um anticorpo anti-CD4 0 se opaciente humano é heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158 (genótipo V/F ou F/F) . A invenção também podeincluir a etapa de administração a um paciente humanoidentificado com o uso desse método de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40. Kits da presente invenção que fornecem aidentificação de um paciente humano com um câncer oucondição pré-maligna que é tratável com um anticorpo anti-CD4 0 compreendem reagentes para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano.

A invenção também fornece métodos e kits para aseleção de uma terapia com anticorpo para o tratamento deum paciente humano que tem um câncer ou condição pré-maligna que é refratário ao tratamento com rituximab(Rituxan®). Em algumas modalidades, os métodos compreendem:a) a identificação de um paciente humano que tem um câncerou condição pré-maligna que está associada a células queexpressam CD40 e que é refratário ao tratamento comrituximab (Rituxan®); e b) determinação do genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano (V/V, V/F ou F/F); emque, se o paciente humano é heterozigótico ou homozigóticopara FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), um anticorpoanti-CD40 é selecionado para o tratamento do câncer oucondição pré-maligna. A invenção também pode incluir aetapa de administração a um paciente humano identificadocom o uso desse método de uma quantidade terapeuticamenteou profilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40. Kitsda presente invenção que fornecem a seleção de uma terapiade anticorpo para o tratamento de um paciente humano quetem um câncer ou condição pré-maligna associada com célulasque expressam CD4 0 compreendem reagentes para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano.

A presente invenção também fornece métodos para otratamento de um paciente humano para um câncer ou condiçãopré-maligna que está associada a células que expressamCD40, em que os métodos compreendem a administração aopaciente humano de um anticorpo de internalização lenta. Emuma tal modalidade, uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 éadministrada ao paciente humano de modo que o anticorpoanti-CD40 não seja significativamente internalizado porcélulas que expressam CD4 0 após sua administração. Em umaoutra tal modalidade, uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 éadministrada ao paciente humano de modo que o anticorpoanti-CD40 permaneça substancialmente uniformementedistribuído na superfície de células que expressam CD4 0após sua administração. Ainda em uma outra modalidade, umanticorpo anti-CD4 0 é administrado ao paciente humano demodo que uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 estejapresente na superfície de células que expressam CD4 0 nopaciente humano após sua administração.

Anticorpos anti-CD40 para uso de acordo com a presenteinvenção se ligam especificamente ao antígeno de CD40. Emalgumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para uso nosmétodos da presente invenção, em particular, anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V humano, uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158F humano, uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V e FcyRIIIa-158F humano. Em algumas dessasmodalidades, os anticorpos anti-CD40 podem se ligar aqualquer um dos dois alótipos de aminoácido 158 de FcyRIIIa(V ou F) em células natural killer (NK) de um pacientehumano com características de ligação que são adequadaspara causar potente citoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). Anticorpos anti-CD40 adequados incluem,mas não são limitados a, anticorpos anti-CD40 que sãolivres de significante atividade agonista, incluindo, porexemplo, anticorpos anti-CD40 que são um antagonista desinalização CD40-CD40L em células que expressam CD40. Emalgumas modalidades, o anticorpo anti-CD40 é selecionado dogrupo que consiste em: a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12; b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12; c) um anticorpo monoclonal quecompreende uma seqüência de aminoãcidos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N° : 2, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°: 4, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:5, ambas as seqüências mostradasem Id. de Seq. N°: 2 e Id. de Seq. Nº :4, e ambas asseqüências mostradas em Id. de Seq. N°: 2 e Id. de Seq.N°: 5; d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucléico que compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.Nº:1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N0:3, e ambas asseqüências mostradas em Id. de Seq. N° :1 e Id. de Seq.Nº :3; e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12; f) um anticorpo monoclonalque se liga a um epitopo que compreende resíduos 82-87 daseqüência de CD40 humano mostrada em Id. de Seq. N°: 7 ouId. de Seq. N°: 9; g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopo que compreende resíduos 82-89 da seqüência de

CD40 humano mostrada em Id. de Seq. N0 :7 ou Id. de Seq.N°: 9; h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitiva; i) o anticorpo monoclonal do item a) anterior ou um anticorpo monoclonal de qualquer um dos itensanteriores c)-h), em que o anticorpo é recombinantementeproduzido; e j) um anticorpo monoclonal que é um fragmentode ligação a antígeno de um anticorpo monoclonal dequalquer um dos itens anteriores a)-i), em que o fragmento retém a capacidade de se ligar especificamente ao antígenoCD40 humano.

Os métodos da presente invenção têm uso no tratamentode cânceres e condições pré-malignas que são associadas comcélulas que expressam CD40. Exemplos incluem, semlimitação, cânceres da linhagem de célula B, malignidadeshematológicas de célula na B, por exemplo, leucemiamielocítica aguda, tumores sólidos, e cânceres ou condiçõespré-malignas que são associadas com células que expressamCD20. Os métodos da invenção são particularmente vantajososcom relação a cânceres e condições pré-malignas que sãoassociadas com células que expressam CD4 0 e CD2 0. Dessemodo, a presente invenção permite o tratamento de pacientesque têm um câncer ou condição pré-maligna que é refratãriaà terapia com outros agentes oncoterapêuticos, incluindoanticorpos anti-CD20 para pacientes que são homozigóticosou heterozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) .Breve descrição dos desenhos

Figuras 1A-1F mostram resultados de uma análise decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)(ADCC) em seis linhas de células.

Figuras 2A-2D mostram resultados de uma análise decitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)(ADCC) em células de paciente com CLL (n = 8) .

Figura 3 resume os resultados de uma análise de ADCCem células de pacientes com CLL (n=9).

Figura 4 mostra os resultados de uma análise de ADCCem células de pacientes com CLL, com o uso de células NKefetoras de dois diferentes doadores.

Figura 5 mostra os resultados de quantificação deexpressão em superfície de célula CD40 e CD20 em células depacientes com CLL e células B normais.

Figura 6 sumariza a atividade ADCC para células comexpressão em superfície de célula CD40 e CD20 quantifiçada.

Figura 7 é um gráfico em barras que mostra níveis deCHIR-12.12 ligado a superfície celular em linhas de célulasDaudi e ARH77.

Figura 8 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células depacientes com CLL por análise de FACS.

Figura 9 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células Bnormais por microscopia confocal de anticorpos rotuladoscom FITC.

Figura 10 mostra os resultados de investigação deinternalização de CHIR-12.12 e rituximab em células depacientes com CLL por microscopia confocal de anticorposrotulados com Alexa4 88.

Figura 11 resume a relação entre atividade de ADCC einternalização.

Figura 12 é um gráfico em barra que mostra percentagemde Iise máxima específica de células Daudi por CHIR-12.12ou rituximab por células efetoras NK purificadas dedoadores com diferentes genótipos de FcyRIIIa.

Figura 13 é um gráfico em barra que mostra a potênciade ADCC (ED50) de CHIR-12.12 ou rituximab sobre célulasDaudi por células efetoras NK purificadas de doadores comdiferentes genótipos de FcyRIIIa.

Figura 14 resume ADCC comparativo de CHIR-12.12 erituximab contra células de paciente com CLL (n=9) porcélulas NK humanas de doadores humanos de múltiplosgenótipos.

Descrição detalhada da invenção

Os inventores descobriram, de forma surpreendente, queos anticorpos anti-CD40, como CHIR-12.12., são capazes demediar potente citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC) de células alvo que expressam CD4 0 sobcondições em que outros anticorpos que medeiam ADCC sãomenos eficazes ou relativamente ineficazes. Ao contrário deoutros anticorpos, como rituximab (Rituxan®), anticorposanti-CD4 0 usados de acordo com a invenção podem se ligar aqualquer um dos dois alótipos de aminoácido 158 de FcyRIIIa(V ou F) em células natural killer (NK) de paciente humanocom características de ligação que são adequadas paracausar potente ADCC. Esse achado é inesperado e representaum avanço em nossa capacidade para tratar cânceres econdições pré-malignas por toda uma seção de um paciente.

Portanto, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, podemser usados no tratamento de cânceres e condições pré-malignas associadas com células que expressam CD-4 0 empacientes humanos heterozigóticos ou homozigóticos paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), além de pacienteshumanos homozigóticos para FcyRIIIa-158V (genótipo V/V).

A invenção assim fornece um método para o tratamentode um paciente humano para um câncer ou condição pré- maligna que está associada a células que expressam CD40, emque o referido paciente humano é heterozigótico ouhomozigõtico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), ométodo compreendendo a administração ao referido pacientehumano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40. Ainvenção também fornece o uso de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 na manufatura de um medicamento para o tratamentode um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD40 em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa 158F (genótipoV/F ou F/F).

Como acima observado, a atividade clínica de rituximabem NHL mostrou estar correlacionada com o genótipo deFcyRIIIa do paciente. Pacientes com o polimorfismo de 158aade FcyRIIIa de F/F são menos responsivos a rituximab queaqueles com V/V ou V/F (por exemplo, veja, Cartron e cols.(2002) Blood 99 (3) : 754-758 ou DallOzzo e cols. (2004)Câncer Res. 64:4664-4669. Portanto, a presente invenção évantajosa para o tratamento de cânceres e condições pré-malignas que não são responsivas ao tratamento com umanticorpo anti-CD20 como rituximab (Rituxan®).

Anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, podem serusados em métodos para a inibição da produção de anticorpopor células B em um paciente humano heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) , emadição a pacientes humanos homozigóticos para FcyRIIIa-158V(genótipo V/V).

Portanto, a invenção fornece um método de inibição deprodução de anticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F), que compreende a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-CD40, como CHIR-12.12. A invenção também fornece o uso3 0 de uma quantidade eficaz de um anticorpo anti-CD4 0 namanufatura de um medicamento para inibição da produção deanticorpo por células B em um paciente humanoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (V/F ouF/F) .

Não seria esperado por pessoa habilitada na técnicaque se pudesse inibir a produção de anticorpos por célulasB em um paciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F).

A presente invenção permite o regime de tratamentoselecionado para um paciente humano individual a serbaseado naquele genótipo de FcyRIIIa-158 do paciente poradministração de um anticorpo anti-CD4 0 que medeia ADCC.

A invenção fornece um método para a identificação deum paciente humano com câncer ou condição pré-malignatratável com um anticorpo anti-CD40 e que é refratária aotratamento com rituximab (Rituxan®), que compreende:

a) a identificação de um paciente humano com um câncerou condição pré-maligna que está associada a células queexpressam CD4 0 e que é refratário ao tratamento comrituximab (Rituxan®);

b) a determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 dopaciente humano (VN, V/F ou F/F);

em que o referido câncer ou condição pré-maligna étratável com um anticorpo anti-CD40 se o referido pacientehumano é heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIal58F(genótipo V/F ou F/F) . A invenção também pode incluir aetapa de administração a um paciente humano identificadocom o uso desse método de uma quantidade terapeuticamenteou profilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40.Esse método de identificação de um paciente humano comum câncer ou condição pré-maligna tratável com umanticorpo anti-CD40 pode ser facilmente realizável por umapessoa habilitada na técnica com o uso de um kitdiagnóstico adequado. 0 kit pode compreender reagentesadequados para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano. Portanto, a invenção também forneceum kit para a identificação de um paciente humano com umcâncer ou condição pré-maligna tratável com um anticorpoanti-CD40, que compreende reagentes para a determinação deum genótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano. Kitsadequados são descritos em maiores detalhes em outra partenesta especificação.

A invenção também fornece um método para seleção deuma terapia de anticorpo para tratamento de um pacientehumano que tem um câncer ou condição pré-maligna que érefratária ao tratamento com rituximab (Rituxan®), quecompreende:

a) a identificação de um paciente humano que tem umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD4 0 e que é refratária ao tratamento comrituximab (Rituxan®); e

b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (V/V, V/F ou F/F) ;em que, se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) ,um anticorpo anti-CD40 é selecionado para o tratamento doreferido câncer ou condição pré-maligna. Em particular, umanticorpo anti-CD40 pode ser selecionado em preferência aotratamento com rituximab (Rituxan®). A invenção também podeincluir a etapa de administração a um paciente humanoidentificado com o uso desse método de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD40.

Esse método de seleção de uma terapia de anticorpopara o tratamento de um paciente humano que tem um câncerou condição pré-maligna pode ser facilmente realizado poruma pessoa habilitada na técnica com o uso de um kitdiagnóstico adequado. O kit deve compreender reagentesadequados para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano. Portanto, a invenção também forneceum kit para a seleção de uma terapia de anticorpo paratratamento de um paciente humano que tem câncer ou condiçãopré-maligna associada com células que expressam CD4 0, quecompreende reagentes para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano.

Os inventores descobriram, de forma surpreendente, queos anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, não sãosignificativamente internalizados por células que expressamCD40 após administração. Ao contrário, anticorpos anti-CD40, como CHIR-12.12, são substancialmente uniformementedistribuídos na superfície de células que expressam CD40por um período de tempo significativo após a administração.Isso está em contraste com outros anticorpos, em particularanticorpos anti-CD20, como rituximab (Rituxan®).

A duração da ligação de CD40 na superfície de célulasque expressam CD40 e a distribuição uniforme do anticorpoanti-CD40 na superfície de células que expressam CD40permitem que o anticorpo anti-CD40 medeie potentecitotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) decélulas alvo que expressam CD40, via ligação a um FcR, comoFcyRIIIa em células natural killer (NK).

Portanto, a invenção fornece um método para otratamento de um paciente humano para um câncer ou condiçãopré-maligna que está associada a células que expressamCD40, o método compreendendo a administração ao referidopaciente humano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 não seja significativamenteinternalizado por células que expressam CD40 após aadministração.

A invenção também fornece um método para o tratamentode um paciente humano para um câncer ou condição pré-maligna que está associada a células que expressam CD40, ométodo compreendendo a administração ao referido pacientehumano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 permaneça substancialmenteuniformemente distribuído na superfície de células queexpressam CD40 após administração.

A invenção também fornece um método para o tratamentode um paciente humano para um câncer ou condição pré-maligna que está associada a células que expressam CD40, ométodo compreendendo a administração ao referido pacientehumano de um anticorpo anti-CD40, de modo que umaquantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz doanticorpo anti-CD40 esteja presente na superfície decélulas que expressam CD40 no referido paciente humano apósa administração.

Esses aspectos da invenção envolvem, assim, aadministração a um paciente de um anticorpo deinternalização lenta. Por "anticorpo de internalizaçãolenta", entende-se um anticorpo que permanece disposto nasuperfície celular por um período de tempo significativo.Como a pessoa habilitada estará ciente, essa propriedadecontrasta com propriedades consideradas vantajosas paravárias aplicações terapêuticas que realmente requereminternalização de complexo anticorpo-receptor para que aterapia seja eficaz. Nesse contexto, um período de temposignificativo geralmente excede 3 horas, preferivelmente 6horas, mais preferivelmente 12 horas, mais preferivelmente24 horas, 36 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 120horas, 144 horas, 168 horas ou mais.

Preferivelmente, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelomenos 20%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%,pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos90%, ou mais do anticorpo inicialmente disposto nasuperfície de uma célula que expressa CD4 0 permanece,disposto na superfície da célula após o período de temposignificativo acima.

A internalização de anticorpos pode ser avaliada porvários ensaios. Por exemplo, linhas de células como a linhade células de Iinfoma Daudi, ou linha de células ARH77 MM,podem ser usadas para avaliar o efeito da ligação deanticorpo candidato em internalização. As células sãoincubadas com IgGl humana (anticorpo de controle) ou oanticorpo candidato em gelo (com 0,1% azida de sódio parabloquear a internalização) ou 37°C (sem azida de sódio) porum período de tempo, adequadamente 3 horas. Depois de umalavagem com tampão de coloração frio (por exemplo,PBS+l%BSA+0,1% azida de sódio), as células são coradas, porexemplo, com IgG-FITC anti-humana de cabra por 30 minutosem gelo. O grau de coloração pode ser então avaliado; nesseexemplo, a intensidade fluorescente média geométrica (MFI)pode ser registrada, como por FACS Calibur. Outros ensaiosadequados serão aqueles conhecidos por aqueles habilitadosna técnica (veja, por exemplo,

http : //www. abgenix. com/documents/SBS2003%20poster .pdf).

Em experimentos apresentados nos Exemplos 4 e 5 nestaespecificação, nenhuma diferença na MFI foi observada entrecélulas incubadas com CH12.12 em gelo na presença de azidade sódio ou a 37°C na ausência de azida de sódio (veja asFiguras 7-10). Esses dados mostram que CH12.12, apósligação a CD4 0, não é internalizado e continua a serapresentado na superfície celular por um tempo maior querituximab.

Um resumo de técnicas e procedimentos padrão que podemser empregados para utilizar a invenção é dado abaixo.Deve-se entender que esta invenção não é limitada àmetodologia particular, protocolos, linhas de célula,vetores e reagentes descritos. Deve-se também compreenderque a terminologia aqui usada é para o objetivo dedescrição de modalidades particulares apenas, e não sepretende que essa terminologia limite o escopo da presenteinvenção. A extensão da invenção é limitada apenas pelostermos das reivindicações em anexo.

Abreviações padrão para nucleotídeos e aminoácidos sãousadas nessa especificação.

A prática da presente invenção empregará, a menos queindicado de outra forma, técnicas convencionais de biologiamolecular, microbiologia, tecnologia de DNA recombinante eimunologia, que estão dentro da habilidade daqueles quetrabalham na técnica.

Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura.Exemplos de textos particularmente adequados para consultaincluem os seguintes: Sambrook e cols. (1989) MolecularCloning; A Laboratory Manual (2 a ed.); D. N Glover, ed.

(1985) DNA Cloning, Volumes I e II; M.J. Gait, ed. (1984)Oligonucleotide Synthesis; B.D. Hames & S.J. Higgins, eds.(1984) Nucleic Acid Hybridization; B.D. Hames & S.J.

Higgins, eds. (1984) Transeription and Translation; R.I.Freshney, ed. (198 6) Animal Cell Culture; Immobilized Cellsand Enzymes (IRL Press, 1986) ; B. Perbal (1984) A PraeticalGuide to Molecular Cloning; Methods in Enzymology series(Academic Press, Inc.), especialmente volumes 154 & 155;J.H. Miller e M.P. Calos, eds. (1987) Gene Transfer Vectorsfor Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Mayere Walker, eds. (1987) Immunochemieal Methods in Cell andMolecular Biology (Academic Press, London); Scopes (1987)Protein Purifieation: Principies and Practice (2a ed.;Springer Verlag, N.Y.); e D. M. Weir e C. C. Blackwell, eds.

(1986) Handbook of Experimental Immunologyr Volumes I-IV.Os métodos da invenção envolvem o uso de anticorpos

anti-CD4 0 no tratamento de cânceres e condições pré-malignas associadas com células que expressam CD4 0.

Por "CD4 0", "antígeno CD40" ou "receptor de CD40",entende-se a glicoproteína de transmembrana de 50-55 kDa dafamília de receptor de fator de necrose tumoral (TNF)(veja, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.674.492 e4.708.871; Stamenkovic e cols. (1989) EMBO 8:1403; Clark(1990) Tissue Antigens 36:33; Barclay e cols. (1997) TheLeucocyte Antigen Facts Book (2a ed. ; Academic Press, SanDiego)). Foram identificadas duas isoformas de CD40 humano,codificadas por variantes de transcrito combinadasalternativamente desse gene. A primeira isoforma (tambémconhecida como "isoforma longa" ou "isoforma 1") é expressacomo um polipeptídeo precursor de 277 aminoácidos (Id. deSeq. N°:9; relatada inicialmente como N0 de Acesso noGenBank CAA43045 e identificada como isoforma 1 no N0 deAcesso no GenBank NP_001241) , codificada por Id. de Seq.N°:8 (veja, NoS de Acesso no GenBank X60592 e NM_001250) ) ,que tem uma seqüência sinalizadora representada pelosprimeiros 19 resíduos. A segunda isoforma (também conhecidacomo a "isoforma curta" ou "isoforma 2") é expressa como umpolipeptídeo precursor de 203 aminoácidos (Id. de Seq.N0:7; N0 de Acesso no GenBank NP_690593) , codificada porId. de Seq. N0 :6 (N° de Acesso no GenBank NM_152854), quetambém tem uma seqüência sinalizadora representada pelosprimeiros 19 resíduos. Os polipeptídeos precursores dessasduas isoformas de CD4 0 humano compartilham em comum seusprimeiros 165 resíduos (ou seja, resíduos 1-165 de Id. deSeq. N°: 7 e Id. de Seq. N° : 9). 0 polipeptídeo precursor daisoforma curta (mostrada em Id. de Seq. N°:7) é codificadopor uma variante do transcrito (Id. de Seq. N0:6)desprovida de um segmento codificador, o que leva a umamudança na estrutura de tradução; a isoforma de CD4 0resultante contém um terminal C mais curto e distinto(resíduos 166-2 03 de Id. de Seq. N°:7) daquele contido naisoforma longa de CD4 0 (terminal C mostrado nos resíduos166-277 de Id. de Seq. N°: 9). Para as finalidades dapresente invenção, o termo "antígeno CD40", "antígeno desuperfície celular CD40", "receptor de CD40" ou "CD40"engloba tanto a isoforma curta quanto a longa de CD40. 0antígeno CD40 pode ser completa ou parcialmenteglicosilado.

Como apontado em outra parte nesta especificação, CD40é encontrado na superfície de células B humanas normais eneoplásicas, células dendríticas, monócitos, macrófagos,células T CD8+, células endoteliais, células monocíticas eepiteliais, e vários tumores sólidos, incluindo tumor depulmão, mama, ovário, bexiga urinaria, e cânceres de cólon.Células b malignas de tipos de tumor de linhagem de célulasB expressam CD40 e parecem depender da sinalização de CD40para sobrevivência e proliferação. Células transformadas depacientes com linfomas de células B de baixo e alto grau,leucemia Iinfoblástica aguda de célula B, mieloma múltiplo,leucemia linfocítica crônica, Macroglobulinemia deWalsdenstrom, e doença de Hodgkin expressam CD40. Aexpressão de CD40 é também detectada em leucemiamieloblástica aguda e 50% de linfomas relacionados à AIDS.

Inúmeros carcinomas e sarcomas também exibem altos níveisde expressão de CD40, embora o papel da sinalização de CD40nessas células cancerosas seja bem menos compreendido.Carcinomas que expressam CD40 incluem carcinoma de bexigaurinária, carcinoma de mama, câncer de próstata, carcinomade célula renal, carcinoma do nasofaringe não diferenciado(UNPC), carcinoma de célula escamosa (SCC), carcinomapapilar da tireóide, melanoma cutâneo maligno, carcinomagástrico, e carcinoma hepático.

Por "células que expressam CD40" entende-se qualquertipo de célula normal ou maligna que expresse níveisdetectáveis do antígeno CD40. Preferivelmente, as célulasque expressam CD4 0 são células que expressam níveisdetectáveis de antígeno CD40 de superfície celular. Métodospara a detecção da expressão de CD40 em células são bemconhecidos na técnica e incluem, sem limitação, técnicas dePCR, imunoistoquímica, citometria de fluxo, Western blot,ELISA, e outros. Esses métodos permitem a detecção de mRNAde CD40, antígeno CD40 e antígeno CD40 de superfíciecelular. A detecção de expressão de CD40 de superfíciecelular pode ser realizada como descrito no Exemplo 3 nestaespecificação, ou por outros métodos adequados.

A célula maligna pode ser uma célula B maligna. Por "célula B maligna" entende-se qualquer célula B neoplásica,incluindo, sem limitação, células B derivadas de linfomasque incluem linfomas de célula B de grau baixo, linfomasimunoblásticos, linfomas não Hodgkin, doença de Hodgkin,linfomas induzidos por vírus Epstein-Barr (EBV), e linfomasrelacionados à AIDS, bem como leucemias Iinfoblásticasagudas de célula B, mielomas, leucemias linfocíticascrônicas e outros.

Por "ligante de CD40" ou "CD40L", entende-seprimariamente a proteína de transmembrana de 32-33 kDa quetambém existe em duas formas menores solúveisbiologicamente ativas, de 18 kDa e 31 kDa, respectivamente(Graf e cols. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1749- 1754; Mazzeie cols. (1995) J. Biol. Chem. 270:7025-7028; Pietravalle ecols. (1996) J Biol. Chem. 271:5965-5967). CD4 0L humano étambém conhecido como CD154 ou gp39. Por "ligante de CD40"ou "CD40L", também se entende qualquer outro peptídeo,polipeptídeo ou proteína que possa ligar e ativar uma oumais vias de sinalização de CD40. Portanto, "ligantes deCD40" incluem, sem limitação, proteínas de ligante de CD40de comprimento total e variantes e fragmentos destas queretêm suficiente atividade para realizar a função deligação e estímulo da sinalização de CD4 0 em células queexpressam CD40. Modificações a um ligante de CD40 nativo,por exemplo, CD40L humano, incluem, sem limitação,substituições, deleções, truncações, extensões, proteínasde fusão, fragmentos, peptidomiméticos e outros.

Por "sinalização de CD40", entende-se qualquer uma dasatividades biológicas que resultam da interação de CD4 0 desuperfície celular com um ligante de CD40 ou outroagonista, como um anticorpo agonista. Exemplos desinalização de CD40 são sinais que levam à proliferação esobrevivência de células que expressam CD40, e estímulo deuma ou mais vias de sinalização de CD40 em células queexpressam CD40. Uma "via de sinalização de CD40" ou "via detransdução de sinal" deve significar pelo menos uma reaçãobioquímica, ou um grupo de reações bioquímicas, queresultam de interação do receptor de CD40 com um ligante deCD40, por exemplo, CD40L, e que geram um sinal que, quandotransmitido através da via de sinal, leva à ativação de umaou mais moléculas abaixo na cascata de sinalização. As viasde transdução de sinal envolvem inúmeras moléculas detransdução de sinal que levam à transmissão de um sinal doreceptor de CD40 de superfície celular por toda a membranaplasmática de uma célula, e através de uma ou mais em umasérie de moléculas de transdução de sinal, através docitoplasma da célula, e, em alguns casos, no núcleo dacélula. De interesse particular para a presente invençãosão vias de transdução de sinal de CD40, que incluem a viade sinalização de AKT, que leva à ativação de AKT, efinalmente à ativação de NF-κΒ por meio da via desinalização de NF-κΒ; e proteína quinase ativada por viasde sinalização de mitógeno (MAPK), incluindo a via desinalização de MEK/ERK e a via de sinalização de MEK/p38,que levam à ativação de ERK e p3 8, respectivamente.

Como acima observado, a presente invenção fornece ummétodo para o tratamento de um paciente humano para umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD40, em que o referido paciente humano éheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F), o método compreendendo a administração aoreferido paciente humano de uma quantidade terapeuticamenteou profilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40.

Por "paciente humano", entende-se um paciente humanoque é atingido, tem risco de desenvolver, ou está emrecaída de qualquer câncer ou condição pré-maligna que estáassociada com células que expressam CD40.

Por "câncer ou condição pré-maligna associada comcélulas que expressam CD40", entende-se qualquer um doscânceres de linhagem de célula B, malignidadeshematológicas de célula não B e tumores sólidos que sãoconhecidos por estarem associados com células que expressamCD40.

Os métodos da invenção são úteis no tratamentoterapêutico de cânceres de linhagem de células B. Oscânceres de linhagem de células B que são associados comcélulas que expressam CD40 incluem, sem limitação, leucemialinfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica(CLL), leucemia pró-linfocítica (PLL), leucemia linfociticapequena (SLL), leucemia ce célula pilosa, doença deHodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia deWaldenstrom, doença de cadeia pesada, e os linfomas, queincluem, sem limitação, linfoma linfocítico pequeno difuso,folicular, DLBCL, linfoma de tecido linfóide associado àmucosa, linfoma de célula B monocitóide, linfoma esplênico,granulomatose linfomatóide, linfomatose intravascular,linfoma imunoblástico, linfoma relacionado à AIDS, e outros.

Portanto, os métodos da invenção têm uso no tratamentode indivíduos que têm linfomas não Hodgkin relacionados àproliferação ou acúmulo anormal, incontrolável, de célulasB. Para as finalidades da presente invenção, tais linfomasserão denominados de acordo com o esquema de classificaçãode Working Formulation, que é aquele de linfomas de célulasB categorizados como de grau baixo, grau intermediário egrau elevado (veja "The Non-Hodgkin1S Lymphoma PathologicClassification Project", (1982) Câncer 49:2.112-2135).

Desse modo, linfomas de célula B de grau baixo incluemlinfoma linfocítico de célula pequena, linfoma folicular decélula pequena clivada e linfoma folicular misto de célulapequena clivada e de célula grande; linfomas de grauintermediário incluem linfoma folicular de célula grande,linfoma difuso de célula pequena clivada, linfoma difusomisto de célula pequena e grande e linfoma difuso de célulagrande; e linfomas de grau elevado incluem linfomaimunoblástico de célula grande, linfoma Iinfoblástico elinfoma de célula pequena não clivada do tipo de Burkitt enão Burkitt.Os métodos da invenção são úteis no tratamentoterapêutico de linfomas de célula B que são classificadosde acordo com o sistema "Revised European and AmericanLinfoma Classification (REAL)". Tais linfomas de célula Bincluem, mas não são limitados a, linfomas classificadoscomo neoplasias de célula B precursora, comoleucemia/linfoma Iinfoblástico B; neoplasmas de células Bperiféricas, incluindo leucemia linfocítica crônica/Iinfomalinfocitico pequeno de células B, linfomalinfoplasmacitóide/imunocitoma, linfoma de célula do manto(MCL), linfoma do centro do foliculo (folicular) (incluindolinfoma difuso de célula pequena, linfoma difuso misto decélula pequena e grande e linfoma difuso de célula grande) ,linfoma de célula B da zona marginal (incluindo os tiposextranodal, nodal e esplênico), plasmacitoma/mieloma,linfoma difuso de célula grande de células B do subtipomediastinico primário (tímico), linfoma de Burkitt, elinfoma de células B de grau elevado Burkitt-like; elinfoma de células B não classificáveis de graus baixos ouelevados.

Os métodos da invenção são úteis no tratamentoterapêutico da condição pré-maligna conhecida como MGUS(gamopatia monoclonal de significância indeterminada) .Aproximadamente 25% dos pacientes com MGUS desenvolvemmieloma múltiplo (MM) ou um distúrbio de célulasplasmáticas relacionado (Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc.68:26-36). A proliferação de células plasmáticas malignasna medula óssea, detecção de uma proteína monoclonal daurina ou sérica (proteína Μ) , anemia, hipercalcemia,insuficiência renal, e lesões ósseas líticas sãomanifestações clínicas de MM, enquanto MGUS é clinicamentereconhecido como a presença de proteína M no soro ou urinasem outras característica clínicas de MM (veja, porexemplo, Kyle e Lust (1989) Semin. Hematol. 26:176-200;

Greipp e Lust Stem Cells (1995) 13:10-21). Pacientes comMGUS são assintomáticos e têm medições estáveis de proteínaM (Kyle (1993) Mayo Clinic. Proc. 68:26-36). Um vez queMGUS é identificado em um indivíduo, a terapia demanutenção com um anticorpo anti-CD40 adequado, porexemplo, um anticorpo anti-CD40 antagonista, pode bloquearo desenvolvimento de mieloma múltiplo nesses pacientes.

Os métodos da presente invenção também são úteis parao tratamento terapêutico de malignidades hematológicas nãorelacionadas à célula B associadas com células queexpressam CD40, como leucemias mielocíticas agudas eoutros.

Os métodos da presente invenção são também úteis parao tratamento terapêutico de tumores sólidos. Tumoressólidos que são associados com células que expressam CD4 0incluem, sem limitação, câncer de ovário, pulmão (porexemplo, câncer de pulmão dos tipos de célula não pequenado carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma ecarcinoma de célula grande e câncer de pulmão de célulapequena), mama, cólon, rim (incluindo, por exemplo,carcinomas de células renais), bexiga, fígado (incluindo,por exemplo, carcinomas hepatocelulares) , gástrico,cervical, próstata, nasofaríngeo, tireóide (por exemplo,carcinoma papilar da tireóide) e cânceres cutâneos comomelanoma, e sarcomas (incluindo, por exemplo,osteossarcomas e sarcomas de Ewing).O câncer ou condição pré-maligna associada com célulasque expressam CD4 0 pode ser um câncer ou condição pré-maligna associada com um nível indesejável de sinalizaçãode CD40 em células que expressam CD4 0, ou o câncer ouassociado com células que expressam CD40. por "um câncer oucondição pré-maligna associada com um nível indesejável desinalização de CD40" entende-se um câncer ou condição pré-maligna cujo desenvolvimento ou progressão é associada comum nível indesejável de sinalização de CD40.

Por "um nível indesejável de sinalização de CD40",entende-se qualquer nível fisiologicamente indesejável desinalização de CD40 que pode ocorrer em células queexpressam CD4 0 em um paciente humano que tem um câncer oucondição pré-maligna.

O câncer ou condição pré-maligna pode ser um a câncerou condição pré-maligna associada com células que expressamCD20. Tais cânceres ou condições pré-malignas incluem, semlimitação, as malignidades de célula B aqui mencionadas.

A presente invenção é particularmente vantajosa emrelação a cânceres e condições pré-malignas que sãoassociadas com células que expressam CD40 e CD20, porque osnovos usos de anticorpos anti-CD40, como, CHIR-12.12, aquirevelado, discute problemas associados ao uso de anticorposanti-CD2 0, como Rituxan®. Em particular, a presenteinvenção permite o tratamento de pacientes que têm umcâncer ou condição pré-maligna que é refratária à terapiacom outros agentes oncoterapêuticos, incluindo anticorposanti-CD2 0, como Rituxan® para pacientes que sãohomozigóticos ou heterozigóticos para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F), como descrito em maiores detalhesnessa.

Nos métodos terapêuticos da presente invenção, pelomenos um anticorpo anti-CD4 0 como definido em outra seção éusado para promover uma resposta terapêutica positiva e comrelação a um câncer ou condição pré-maligna.

Por "resposta terapêutica positiva", com relação a umcâncer ou condição pré-maligna, entende-se uma melhora nocâncer ou condição pré-maligna em associação à atividadeterapêutica do anticorpo anti-CD-40, e/ou uma melhora nossintomas associados ao câncer ou condição pré-maligna. Ouseja, pode ser observado um efeito anti-proliferativo, aprevenção de crescimentos adicionais de tumores, redução notamanho do tumor, uma redução no número de célulascancerosas, e/ou uma diminuição em um ou mais dos sintomasassociados com células que expressam CD40. Portanto, porexemplo, uma resposta terapêutica positiva deve referir-sea uma ou mais das seguintes melhoria na doença: (1) umaredução no tamanho tumoral; (2) uma redução no número decélulas cancerosas (ou seja, neoplásicas); (3) um aumentona morte das células neoplásicas; (4) inibição da sobrevidada célula neoplásica; (4) inibição (ou seja, desaceleraçãoem alguma extensão, preferivelmente, interrupção) docrescimento tumoral; (5) inibição (ou seja, desaceleraçãoem alguma extensão, preferivelmente, interrupção) dainfiltração da célula cancerosa nos órgãos periféricos; (6)inibição (ou seja, desaceleração em alguma extensão,preferivelmente, interrupção) das metástases tumorais; (7)prevenção da proliferação tumoral; (8) um aumento da taxade sobrevida do paciente; e (9) algum grau de alivio de umou mais sintomas associados ao câncer.

Respostas terapêuticas positivas em qualquermalignidade pode ser determinada por critérios padronizadosde resposta específicos para aquela malignidade. Arespostas do tumor pode ser avaliada por alterações namorfologia tumoral (ou seja, carga tumoral global, tamanhotumoral, e outros) com o uso de técnicas de rastreamento,tais como ressonância nuclear magnética (RNM), exames daraios x, tomografia computadorizada (TC), imagens derastreamento ósseo, endoscopia, e coletas de amostras dotumor, incluindo aspiração da medula óssea (APM) e contagemde células tumorais na circulação. Além dessas respostasterapêuticas positivas, o indivíduo submetido à terapia como agente terapêutico anti-CD40 pode apresentar o efeitobenéfico de uma melhora nos sintomas associados à doença.

Desse modo, para tumores de células Β, o indivíduo podeapresentar uma diminuição nos denominados sintomas B, ouseja, suores noturnos, febre, perda de peso, e/ouurticária. Para condições pré-malignas, a terapia com umagente terapêutico anti-CD40 pode bloquear e/ou prolongar otempo antes do desenvolvimento de uma condição malignarelacionada, por exemplo, desenvolvimento de mielomamúltiplo em indivíduos que sofrem de gamopatia monoclonalde significância indeterminada (MGUS).

Uma melhoria na doença pode ser caracterizada como umaresposta completa. Por "resposta completa" entende-se umaausência de doença clinicamente detectável com normalizaçãode qualquer exame radiológico previamente anormal, damedula óssea e líquido cefalorraquidiano (LCR) ou proteínamonoclonal anormal no caso de mieloma. Uma resposta comoessa deve persistir por pelo menos 4 a 8 semanas, ou emdoença especifica, algumas vezes 6 a 8 semanas, após otratamento de acordo com os métodos da invenção.Alternativamente, uma melhora na doença pode sercategorizada como sendo uma resposta parcial. Por "respostaparcial" entende-se uma diminuição de pelo menos cerca de50% em toda a carga tumoral mensurável (ou seja, o númerode células malignas presentes no indivíduo, ou no volumemedido de massas tumorais ou a quantidade de proteínamonoclonal anormal) na ausência de novas lesões e quepersiste por 4 a 8 semanas como necessário. Em mieloma, umaresposta normal (25-50% de diminuição na proteína demieloma na urina) é também considerada uma resposta. Umaresposta como essa é aplicável somente a tumoresmensuráveis.

Por "dose terapeuticamente ou profilaticamente eficaz"ou "quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteeficaz", entende-se uma quantidade de anticorpo anti-CD40que, quando administrada, ocasiona uma resposta terapêuticapositiva com relação ao tratamento de um paciente com umcâncer ou condição pré-maligna associada com células queexpressam CD40. Dosagens adequadas são descritas em maioresdetalhes em outra parte nesta especificação. O método detratamento pode compreender uma única administração de umadose terapeuticamente eficaz ou múltiplas administrações deuma dose terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40,como descrito em maiores detalhes em outra parte nestaespecificação.

"Tumor", como aqui usado, refere-se a todo crescimentoe proliferação celulares neoplásicos, tanto malignos quantobenignos, e a todas as células e tecidos pré-cancerosos ecancerosos. "Neoplásicos", como aqui usado, refere-se aqualquer forma de crescimento celular desregulado ou nãoregulado, tanto maligno quanto benigno, que resulta emcrescimento anormal do tecido. Portanto, "célulasneoplásicas" incluem células malignas e benignas que têmcrescimento celular desregulado ou não regulado.

Os termos "câncer" e "canceroso" se referem oudescrevem a condição fisiológica em mamíferos que secaracteriza tipicamente por crescimento celulardesregulado. Exemplos de câncer incluem, sem limitação,linfoma e leucemia, e tumores sólidos. Por "câncerrelacionado com célula B" ou "câncer de linhagem de célulaB" entende-se qualquer tipo de câncer em que o crescimentocelular desregulado ou não regulado é associado com célulasB.

"Tratamento" é aqui definido como a aplicação ouadministração de um anticorpo anti-CD40 a um paciente, ou aaplicação ou administração de um anticorpo anti-CD4 0a umtecido ou linha de células isolada de um paciente, em que opaciente tem uma doença, um sintoma de uma doença ou umapredisposição para ter uma doença, em que a finalidade sejacurar, cicatrizar, aliviar, alterar, remediar, melhorar, ouafetar a doença, os sintomas da doença ou a predisposiçãopara a doença. Por "tratamento" também significa aaplicação ou administração de uma composição farmacêuticaque compreende os anticorpos anti-CD40a um paciente, ou aaplicação ou administração de uma composição farmacêuticaque compreende os anticorpos anti-CD4 0 a um tecido ou linhade células isolada de um paciente, que tenha uma doença, umsintoma de uma doença ou uma predisposição para ter umadoença, em que a finalidade seja curar, cicatrizar,aliviar, alterar, remediar, melhorar ou afetar a doença, ossintomas da doença ou a predisposição para ter a doença.

Por "atividade antitumoral" entende-se uma redução nataxa de proliferação ou acúmulo de células neoplásicasmalignas que expressam CD40 e, desse modo, um declínio nataxa de crescimento de um tumor existente ou em um tumorque surge durante a terapia, e/ou a destruição de célulasneoplásicas (tumorais) existentes ou células neoplásicasformadas recentemente e, assim, uma diminuição no tamanhoglobal de um tumor durante a terapia. A terapia com pelemenos um anticorpo anti-CD40 gera uma resposta fisiológicaque é benéfica com relação ao tratamento de estados dedoença associados com estímulo de sinalização de CD4 0 emcélulas que expressam CD40 em um humano.

Os métodos da invenção são particularmente úteis parao tratamento de cânceres e condições pré-malignas, queincluem aquelas acima listadas, que são refratárias aotratamento oncoterapêutico de primeira linha. O termo"oncoterapêutico" significa qualquer tratamento para câncercomo quimioterapia, cirurgia, terapia por radiação, terapiacom anticorpo anticâncer, e combinações desses. Exemplos detratamentos oncoterapêuticos são descritos em maioresdetalhes em outra parte nessa. Por "refratário", entende-se que o câncer em particular é resistente, ou nãoresponsivo a uma terapia com um agente oncoterapêuticoparticular. Um câncer pode ser refratário a uma terapia comum agente terapêutico particular a partir do início dotratamento com a terapia particular (ou seja, nãoresponsiva à exposição inicial ao agente terapêutico), oucomo um resultado do desenvolvimento de resistência aoagente terapêutico, durante um primeiro período detratamento com o agente terapêutico ou durante um período de tratamento subseqüente com o agente terapêutico.Portanto, a presente invenção é útil para o tratamento deum paciente humano que é refratário a uma terapia com umagente anticâncer, quando aquele paciente humano éresistente ou não responsivo à terapia com o agente anticâncer.

Os métodos da presente invenção envolvem o uso deanticorpos anti-CD40. "Anticorpos" são normalmenteglicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000dáltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) eduas cadeias pesadas idênticas (H) . Cada cadeia leve estáligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfetocovalente, embora o número de ligações dissulfeto varieentre as cadeias pesadas de isótipos diferentes deimunoglobulinas. Cada cadeia pesada e leve também tempontes dissulfeto dentro da cadeias espaçadas regularmente.Cada cadeia pesada tem em uma extremidade um domíniovariável (VH), seguido por diversos domínios constantes.Cada cadeia leve tem um domínio variável em uma extremidade(VI) e um domínio constante na outra extremidade; o domínioconstante da cadeia leve está alinhado com o primeirodomínio constante da cadeia pesada, e o domínio variável dacadeia leve está com o domínio variável da cadeia pesada.Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formemuma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve epesada. O termo "variável" se refere ao fato de que certasporções dos domínios variáveis diferem intensamente emtermos de seqüências entre anticorpos. As regiões variáveisconferem especificidade de ligação de antígeno. Os domíniosconstantes não estão diretamente envolvidos na ligação deum anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funçõesefetoras, como ligação de receptor Fc (FcR), participaçãodo anticorpo em toxicidade celular dependente de anticorpo,início de citotoxicidade dependente de complemento, edesgranulação de mastócitos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) dequalquer espécie de vertebrado podem ser designadas para umde dois tipos distintos, chamadas kappa (κ) e lambda (λ),com base nas seqüências de aminoácidos de seus domíniosconstantes.

Dependendo da seqüência de aminoácidos do domínioconstante de suas "cadeias pesadas", as imunoglobulinascompreendem classes diferentes. Há cinco classes principaisde imunoglobulinas humanas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, evárias destas podem ser ainda divididas em subclasses(isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 eIgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada quecorrespondem às diferentes classes de imunoglobulinas sãodenominados alfa, delta, épsilon, gama e mu,respectivamente. As estruturas da subunidade e asconfigurações tridimensionais de diferentes classes deimunoglobulinas são bem conhecidas. Isótipos diferentes têmdiferentes funções efetoras. Por exemplo, os isótipos deIgGl e IgG3 humanos têm atividade de citotoxicidade mediadapor células dependente de anticorpo (ADCC). AnticorposIgG1, em particular anticorpos IgGl humanos, sãoparticularmente úteis nos métodos da presente invenção.

"Células efetoras humanas" são leucócitos queexpressam um ou mais FcRs e realizam funções efetoras.

Preferivelmente, as células expressam pelo menos FcyRIII erealizam a função efetora de citotoxicidade mediada porcélulas dependente de anticorpo (ADCC). Exemplos deleucócitos humanos que medeiam ADCC incluem célulasmononucleares do sangue periférico (PBMC), células naturalkiller (NK), monócitos, macrófagos, eosinófilos eneutrófilos, preferindo-se PBMCs e células NK. Anticorposque têm atividade de ADCC são tipicamente do isótipo IgGlou IgG3. Além do isolamento de anticorpos IgGl e IgG3,anticorpos de mediação da ADCC podem ser sintetizadosprojetando-se uma região variável a partir de um fragmentode um anticorpo ou região variável não ADCC em uma regiãoconstante de isótipo IgGl ou IgG3.

Os termos "receptor Fc" ou "FcR" são usados paradescrever um receptor que se liga à região Fc de umanticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüêncianativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga aum anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui receptores dassubclasses FcyRI, FcyRII e FcyRIII, incluindo variantesalélicas e alternativamente formas combinadas dessesreceptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptorde ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), quetêm seqüências de aminoácidos similares que diferemessencialmente nos domínios citoplasmáticos destas. Oreceptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativaçãode imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domíniocitoplasmático. O receptor de inibição FcyRIIB contém ummotivo de inibição de imunorreceptor baseado em tirosina(ITIM) em seu domínio citoplasmático (veja Dacron (1997)Annu. Rev. Iwmunol. 15:203-234). FcRs são revisados emRavetch e Kinet (1991) Annu. Rev. Immunol. 9:457-492(1991);

Capei e cols. (1994) Immunomethods 4:25-34; e de Haas ecols. (1995) J. Lab. Clin. Med. 126:330-341. Outros FcRs,incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são aquienglobados pelo termo wFcR". 0 termo também inclui oreceptor neonatal, FcRn, que é responsável pelatransferência de IgGs maternas ao feto (Guyer e cols.(1976) J. Immunol. 117:587, e Kim e cols. (1994) J.Immunol. 24:249).

O termo "anticorpo" é usado em seu sentido mais amploe cobre anticorpos totalmente montados, fragmentos deanticorpo que retêm a capacidade de se ligarespecificamente ao antígeno CD40 (por exemplo, Fab,F(ab')2, Fv, e outros fragmentos), anticorpos de cadeiaúnica, diacorpos, quimeras de anticorpo, anticorposhíbridos, anticorpos biespecíficos, anticorpos humanizados,e outros, e peptídeos recombinantes que compreendem oscitados anteriormente. 0 termo "anticorpo" abrange tantoanticorpos monoclonais quanto policlonais.

Como aqui usado, "anticorpos anti-CD40" englobamqualquer anticorpo que reconheça especificamente o antígeno25 CD40. Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais anti-CD40, exibem uma forte afinidade deligação para o antígeno CD40. Tais anticorpos monoclonaisexibem uma afinidade por CD4 0 (Kd) de pelo menos IO"5 M,pelo menos 3 X IO"5 M, preferivelmente pelo menos IO"6 M, oupelo menos IO"7 Μ, mais preferivelmente pelo menos IO"8 M oupelo menos IO"12 M, quando medida usando um ensaio-padrãocomo, por exemplo, Biacore™. A análise Biacore é conhecidana técnica e são fornecidos detalhes no BlAapplicationsHandbook. Métodos descritos em WO 01/27160 podem ser usadospara modular a afinidade de ligação.

Por "reconhece especificamente" ou "se ligaespecificamente a", entende-se que o anticorpo anti-CD40não se liga a antigenos não relacionados, como o antígenoCD2 0.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V humano. Preferivelmente, um anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158V humano com uma afinidade (K0) de pelo menos cerca de0,5 μΜ quando medida com o uso de um ensaio-padrão como,por exemplo, Biacore™. Como revelado no Exemplo 6 nestaespecificação, o anticorpo CHIR-12.12 se liga a FcyRIIIa- 158V humano com uma afinidade (Kd) de 4 92 nM.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD40 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158F humano. Preferivelmente, um anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158F humano como uma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de12 μΜ quando medida com o uso de um ensaio-padrão comoBiacore™. Preferivelmente, o anticorpo anti-CD4 0 para usonos métodos da invenção se liga a FcyRIIIa-158F humano como uma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de 10 μΜ, pelo menoscerca de 8 μΜ, pelo menos cerca de 6 μΜ, pelo menos cercade 5 μΜ, pelo menos cerca de 4 μΜ, ou pelo menos cerca deμΜ. Como revelado no Exemplo 6 nessa, o anticorpo CHIR-12.12 se liga a FcyRIIIa-158F humano com uma afinidade (Kd)de 2 , 8 μΜ.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CD4 0 para usonos métodos da presente invenção, em particular anticorposmonoclonais, exibem uma forte afinidade de ligação porFcyRIIIa-158V e FcyRIIIa-158F humanos. Preferivelmente, umanticorpo anti-CD40 para uso nos métodos da invenção seliga a FcyRIIIa-158V humano como uma afinidade (Kd) de pelomenos cerca de 0,5 μΜ e se liga a FcyRIIIa-158F humano comouma afinidade (Kd) de pelo menos cerca de 12 μΜ, quandomedida com o uso de um ensaio-padrão como Biacore™.

Os anticorpos para uso nos métodos da presenteinvenção podem ser produzidos com o uso de qualquer métodode produção de anticorpo adequado conhecido por aqueles dehabilidade na técnica.

O anticorpo anti-CD4 0 usado nos métodos da presenteinvenção podem ser um anticorpo policlonal. Portanto, sorospoliclonais podem ser preparados por métodos convencionais.Em geral, inicialmente é usada uma solução contendo oantígeno de interesse (no caso, o antígeno CD40) paraimunizar um animal adequado, preferivelmente um camundongo,rato, coelho ou cabra. Preferem-se coelhos ou cabras para apreparação de soros policlonais em função do volume de soroque pode ser obtido e da disponibilidade de anticorposanti-coelho e anti-cabra rotulados.

Os soros desses animais imunizados pode ser rastreadoquanto à reatividade de anticorpo contra o antígenoinicial. Podem ser isolados linfócitos dos linfonodos ou decélulas esplênicas e podem ainda ser rastréados quanto àscélulas B pela seleção de células CD138-negativas e CD19-positivas. Em um aspecto, tais culturas de células B (BCCs)podem ser fundidas às células de mieloma para geraremhibridomas, como detalhado nessa.

Soros policlonais também podem ser preparados em umanimal transgênico, preferivelmente um camundongo possuindoloci de imunoglobulina humana. Em uma modalidade preferida,células Sf9 que expressam a proteína de interesse, (nessecaso, o antígeno CD40), são usadas como o imunógeno. Aimunização também pode ser realizada pela mistura ouemulsificação da solução contendo antígeno em sorofisiológico, preferivelmente em um adjuvante como, porexemplo, adjuvante completo de Freund, e injetando-se amistura ou emulsão por via parenteral (geralmente por viasubcutânea ou intramuscular). Uma dose de 50-200 pg/injeçãoé tipicamente suficiente. A imunização é geralmentereforçada 2-6 semanas mais tarde com uma ou mais injeçõesda proteína em soro fisiológico, preferivelmente usando oadjuvante incompleto de Freund. É possível,alternativamente, gerar anticorpos por imunização in vitrousando métodos conhecidos na técnica, o que, para asfinalidades desta invenção, é considerado equivalente àimunização in vivo. Anti-soros policlonais são obtidos porsangramento do animal imunizado em um recipiente de vidroou de plástico, incubação do sangue a 25°C por um hora,seguindo por incubação a 4 °C por 2-18 horas. 0 soro érecuperado por centrifugação (por exemplo, 1.000 χ g por 10minutos). Cerca de 20-50 ml por sangramento podem serobtidos de coelhos.

A produção das células Sf9 (Spodoptera frugiperda) érevelada na Patente U.S. N° 6.004.552, aqui incorporada porreferência. No caso de CD40, resumidamente, seqüências quecodificam CD4 0 humano são recombinadas em um baculovírususando vetores de transferência. Os plasmídeos são co-transfectados com DNA de baculovírus do tipo selvagem emcélulas Sf9. Células Sf9 recombinantes infectadas combaculovírus são identificadas e purificadas por clonagem.

0 anticorpo anti-CD40 usado nos métodos da presenteinvenção pode ser um anticorpo monoclonal. 0 termo"anticorpo monoclonal" (e "mAb") como aqui usado refere-sea um anticorpo obtido a partir de uma população deanticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os

anticorpos individuais que compreendem a população sãoidênticos, exceto quanto às possíveis mutações deocorrência natural que podem estar presentes em quantidadesmenores. O termo não se limita em relação à espécie doanticorpo e não requer a produção do anticorpo por qualquermétodo particular.

Ao contrário das preparações de anticorpo policlonal,que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidoscontra diferentes determinantes antigênicos (epitopos),cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um únicodeterminante (epitopo) no antígeno.

Por "epitopo" entende-se a parte de uma moléculaantigênica para a qual um anticorpo é produzido e à qual oanticorpo irá se ligar. Epitopos podem compreender resíduosde aminoácidos lineares (ou seja, os resíduos dentro doepitopo são dispostos seqüencialmente um após o outro deforma linear), resíduos de aminoácidos não lineares (aquidenominados "epitopos não lineares"; esses epitopos não sãodispostos seqüencialmente), ou resíduos de aminoácidostanto lineares quanto não lineares. Um anticorpo monoclonalanti-CD40 adequado para uso nos métodos da presenteinvenção será capaz de se ligar especificamente a umepitopo e, antígeno CD4 0 humano expresso na superfície deuma célula humana, ou seja, um epitopo que é exposto aoexterior da célula.

Os anticorpos monoclonais as serem usados de acordocom a presente invenção podem ser feitos pelo método dehibridoma primeiramente descrito por Kohler e cols. (1975)Nature 256:495, ou podem ser feitos pelo métodos de DNArecombinante (veja, por exemplo, Patente U.S. No.4.816.567). Anticorpos monoclonais também podem serisolados de bibliotecas de fago de anticorpo geradas com autilização das técnicas descritas, por exemplo, emMcCafferty e cols. (1990) Nature 348:552-554 (1990) e naPatente U.S. N0 5.514.548. Clackson e cols. (1991) Nature

352:624-628 e Marks e cols. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-5 97 descrevem o isolamento de anticorpos murídeos ehumanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago.Publicações subseqüentes descrevem a produção de anticorposhumanos de alta afinidade (na faixa de nM) porembaralhamento de cadeia (Marks e cols. (1992)

Bio/Technology 10:779-783), bem como infecção combinatõriae recombinação in vivo como estratégia para a construção debibliotecas de fago bem grandes (Waterhouse e cols. (1993)Nucleic. Acids Res. 21:2.265-2.266). Desse modo, essastécnicas são alternativas viáveis às técnicas tradicionaisde hibridoma de anticorpo monoclonal para o isolamento deanticorpos monoclonais.

No método tradicional de Kohler e cols. (1975) Nature256:495-496, tipicamente, um camundongo é imunizado com umasolução contendo um antígeno. A imunização pode serrealizada pela mistura ou emulsificação da solução contendoantígeno em soro fisiológico, preferivelmente em umadjuvante como, por exemplo, adjuvante completo de Freund,e injeção da mistura ou da emulsão por via parenteral.

Qualquer método de imunização conhecido na técnica pode serusado para se obter os anticorpos monoclonais da invenção.Após imunização do animal, o baço (e, opcionalmente, várioslinfonodos grandes) são removidos e dissociados em célulasúnicas. As células esplênicas podem ser rastreadas pelaaplicação de uma suspensão de células em uma placa ou poçorevestido com o antígeno de interesse. As células B queexpressam imunoglobulina ligada à membrana específica parao antígeno se ligam à placa e não saem com o enxágüe. Ascélulas B resultantes, ou todas as células esplênicasdissociadas, são então induzidas a se fundirem com célulasde mieloma para formarem hibridomas, e são cultivadas em ummeio seletivo. As células resultantes são plaqueadas pordiluição serial e são testadas quanto à produção deanticorpos que se ligam especificamente ao antígeno deinteresse (e que não se ligam aos antígenos nãorelacionados). Os hibridomas secretores de anticorpomonoclonal (mAb) selecionados são então cultivados in vitro(por exemplo, em frascos de cultura de tecido ou emreatores de fibra oca) ou in vivo (como ascites emcamundongos).Em um outro aspecto, culturas de célula B podem seravaliadas também para reatividade contra o antígenoinicial, preferivelmente. Tais avaliações incluem ensaioimunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) com a proteínaalvo/antIgeno, um ensaio de competição com anticorposconhecidos que se ligam ao antígeno de interesse, e ligaçãoin vitro a CHO transfectada transitoriamente ou outrascélulas que expressam o antígeno alvo.

Quando os anticorpos antagonistas anti-CD40 dainvenção tiverem que ser preparados usando métodos de DNArecombinante, o DNA que codifica os anticorpos monoclonaisserá prontamente isolado e seqüenciado usando procedimentosconvencionais (por exemplo, com a utilização de sondas deoligonucleotídeo que são capazes de se ligarespecificamente aos genes que codificam as cadeias pesadase leves de anticorpos murídeos). As células de hibridomaaqui descritas servem como uma fonte preferida de tal DNA.Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores deexpressão, que são então transfectados em célulashospedeiras como, por exemplo, células de E. coli, célulasCOS de símios, células de ovário de hamster chinês (CHO) oucélulas de mieloma que de outra forma não produzem aproteína de imunoglobulina, para se obter a síntese deanticorpos monoclonais nas células hospedeirasrecombinantes. Artigos de revisão sobre expressãorecombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpoincluem Skerra e cols. (1993) Curr. Opinion in Immunol.5:256 e Phickthun (1992) Immunol. Revs. 130:151.

Alternativamente, o anticorpo pode ser produzido em umalinha de células como uma linha de células CHO, comorevelado nas Patentes U.S. Nos 5.545.403; 5.545.405; e5.998.144, aqui incorporadas por referência. Resumidamente,a linha de células é transfectada com vetores capazes deexpressar uma cadeia leve e uma cadeia pesada,respectivamente. Pela transfecção de duas proteínas emvetores separados, podem ser produzidos anticorposquiméricos. Outra vantagem é a glicosilação correta doanticorpo.

Uma "célula hospedeira", como aqui usada, se refere a

um microorganismo ou uma célula ou linha de célulaseucarióticas cultivadas como uma entidade unicelular quepode ser, ou que foi, usada como receptora para um vetorrecombinante, ou outros polinucleotídeos de transferência,e inclui a prole da célula original que foi transfectada.

Entende-se que a prole de uma única célula pode não sernecessariamente completamente idêntica em morfologia ou emcomplemento de DNA genômico ou total à parente original, emfunção de uma mutação natural, acidental ou deliberada.

Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD40, como

CHIR-12.12, é produzido em células CHO com o uso do sistemade expressão gênica GS (Lonza Biologics, Portsmouth, NewHampshire), que utiliza glutamina sintetase como ummarcador. Veja, também as Patentes U.S. Nos 5.122.4 64;5.591.639; 5.658.759; 5.770.359; 5.827.739; 5.879.936;5.891.693; e 5.981.216; cujos conteúdos são aquiincorporados por referência em sua totalidade.

Anticorpos monoclonais para CD4 0 são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, as seções dedicadas ao antígenoda célula B em McMichael, ed. (1987; 1989) Leukocyte TypingIII and IV (Oxford University Press, Nova York) ; PatentesU.S. Nos 5.674.492; 5.874.082; 5.677.165; 6.056.959;Publicação Internacional Nos WO 00/63395, WO 02/28905 e WO02/28904; Gordon e cols. (1988) J. Immunol. 140:1.425;Valle e cols. (1989) Eur. J. Immunol. 19:1.463; Clark ecols. (1986) PNAS 83:4.494; Paulie e cols. (1989) J.Immunol. 14 2:590; Gordon e cols. (1987) Eur. J. Immunol.17:1.535; Jabara e cols. (1990) J. Exp. Med. 172:1.861;Zhang e cols. (1991) J. Immunol. 146:1.836; Gascan e cols.(1991) J. Immunol. 147:8; Banchereau e cols. (1991) Clin.Immunol. Spectrum 3:8; e Banchereau e cols. (1991) Science251:70; todos os quais são aqui incorporados porreferência.

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado engloba anticorpos quiméricos. Por anticorpos"quiméricos" significam anticorpos que são, principalmente,derivados com o uso de técnicas de ácidodesoxirribonucléico recombinante e que compreendemcomponentes tanto humanos (incluindo espéciesimunologicamente "relacionadas", por exemplo, chimpanzé)quanto não humanos. Desse modo, a região constante doanticorpo quimérico é, principalmente, substancialmenteidêntica à região constante de um anticorpo humano natural;a região variável do anticorpo quimérico é maispreferivelmente derivada de uma fonte não humana e tem aespecificidade antigênica desejada para o antígeno deinteresse (CD4 0). A fonte não humana pode ser qualquerfonte vertebrada que possa ser usada para gerar anticorpospara um antígeno CD40. Tais fontes não humanas incluem, semlimitação, roedores (por exemplo, coelho, rato, camundongoetc.; veja, por exemplo, a Patente U.S. N0 4.816.567, aquiincorporada por referência) e primatas não humanos (porexemplo, macaco do Velho Mundo, pongídeos etc.; veja, porexemplo, as Patentes U.S. Nos 5.750.105 e 5.756.096; aquiincorporadas por referência).

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado engloba anticorpos humanizados. Por "Humanizados"significa formas de anticorpos que contêm seqüência mínimaderivada de seqüências de imunoglobulina não humana. Namaioria dos casos, anticorpos humanizados sãoimunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) nas quaisresíduos de uma região hipervariável (também conhecida comoregião determinante de complementaridade ou CDR) doreceptor são substituídos por resíduos de uma regiãohipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador)como, por exemplo, camundongo, rato, coelho, ou primata nãohumano, tendo a especificidade, afinidade e capacidadedesejadas. A frase "região determinante decomplementaridade" se refere às seqüências de aminoácidosque em conjunto definem a afinidade e especificidade deligação da região Fv natural de um sítio de ligação nativode imunoglobulina. Veja, por exemplo, Chothia e cols.(1987) J. Mol. Biol. 196:901-917; Kabat e cols. (1991)"U.S. Dept. of Health and Human Services", Publicação doNIH N0 91-3242) . A frase "região constante" se refere àporção da molécula do anticorpo que confere funçõesefetoras. Em trabalho anterior sobre a produção deanticorpos não imunogênicos para uso em terapia de doençahumana, regiões constantes de camundongo foram substituídaspor regiões constantes humanas. As regiões constantes dosanticorpos humanizados do indivíduo foram derivadas deimunoglobulinas humanas. No entanto, esses anticorposhumanizados podem despertar uma resposta imune indesejada epotencialmente perigosa em humanos, e houve perda deafinidade.

A humanização pode ser essencialmente realizadaseguindo o método de Winter e colaboradores (Jones e cols.(1986) Nature 321:522-525; Riechmann e cols. (1988) Nature332:323-327; Verhoeyen e cols. (1988) Science 239:1.534-1.536), pela utilização de CDRs ou seqüências de CDR deroedor ou de roedor mutante como substituição para asseqüências correspondentes de um anticorpo humano. Vejatambém as Patentes U.S. Nos 5.225.539; 5.585.089;5.693.761; 5.693.762; 5.859.205; aqui incorporadas porreferência. Em alguns casos, os resíduos dentro das regiõesestruturais de uma ou mais regiões variáveis daimunoglobulina humana são substituídos pelos resíduos nãohumanos correspondentes (veja, por exemplo, as PatentesU.S. Nos 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; e 6.180.370).Além disso, anticorpos humanizados podem compreenderresíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ouno anticorpo doador. Essas modificações são feitas pararefinar ainda mais o desempenho do anticorpo (por exemplo,para obter a afinidade desejada). Em geral, o anticorpohumanizado irá compreender substancialmente todos de pelomenos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quaistodas, ou substancialmente todas, as regiões hipervariáveiscorrespondem aquelas de uma imunoglobulina não humana, etodas, ou substancialmente todas, as regiões estruturaissão aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. Oanticorpo humanizado opcionalmente também irá compreenderpelo menos uma porção de uma região constante deimunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulinahumana. Para mais detalhes, veja Jones e cols. (1986)Nature 331:522-525; Riechmann e cols. (1988) Nature332:323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596; aqui incorporados por referência. Conseqüentemente,tais anticorpos "humanizados" podem incluir anticorpos nosquais substancialmente menos de um domínio variável intactohumano foi substituído pela seqüência correspondente de umaespécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados sãotipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos deCDR e, possivelmente, alguns resíduos estruturais, sãosubstituídos por resíduos de sítios análogos em anticorposde roedores. Veja, por exemplo, as Patentes U.S. Nos5.225.539; 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 5.859.205. Vejatambém a Patente U.S. N0 6.180.370, e a PublicaçãoInternacional N0 WO 01/27160, em que são discutidosanticorpos humanizados e técnicas para a produção deanticorpos humanizados que melhoram a afinidade para umantígeno predeterminado.

Anticorpos anti-CD40 humanizados também podem serproduzidos com o uso da tecnologia "Human Engineering™"(Xoma Ltd., Berkeley, Califórnia).

Anticorpos monoclonais anti-CD40 humanizados incluemanticorpos como SGN-40 (Tai e cols. (2004) Câncer Res.64:2846-52; Patente U.S. No. 6.838.261), que é a formahumanizada do anticorpo anti-CD40 murídeo SGN-14 (Franciscoe cols. (2000) Câncer Res. 60:3225-31), e o anticorposrevelado na Publicação de Pedido de Patente U.S. No.2004/0120948; aqui incorporados em sua totalidade porreferência.

A presente invenção também pode ser praticada com ouso de anticorpos xenogênicos produzidos em um hospedeiromamífero não humano, mais particularmente um camundongotransgênico, caracterizados por Ioci endógenos inativadosde imunoglobulina (Ig) . Nesses animais transgênicos, genesendógenos competentes para a expressão de subunidades levese pesadas de imunoglobulinas do hospedeiro são tornadas nãofuncionais e substituídas com os Ioci análogos deimunoglobulina humana. Esses animais transgênicos produzemanticorpos humanos na ausência substancial de subunidadesleves ou pesadas de imunoglobulina do hospedeiro. Veja, porexemplo, Patentes U.S. Nos 5.877.397 e 5.939.598 aquiincorporadas por referência.

Portanto, em algumas modalidades, anticorpostotalmente humanos para CD4 0, por exemplo, são obtidos pelaimunização de camundongos transgênicos. Um dessescamundongo é obtido com o uso de tecnologia XenoMouse®(Abgenix; Fremont, Califórnia), e é revelado nas PatentesU.S. Nos 6.075.181, 6.091.001, e 6.114.598, todos aquiincorporados por referência. Por exemplo, para produzir oanticorpo CHIR-12.12, camundongos transgênicos para o lócusda cadeia pesada de IgGi humana e para o lócus da cadeialeve κ humana foram imunizados com células Sf9 queexpressam CD4 0 humano. Os camundongos também podem sertransgênicos para outros isótipos. Anticorpos anti-CD40totalmente humanos úteis nos métodos da presente invençãosão caracterizados por propriedades de ligação similaresàquelas exibidas pelo anticorpo monoclonal CHIR-12.12

Como acima observado, o termo "anticorpo" como aquiusado também engloba fragmentos de anticorpo que podem seligar a antígeno. "Fragmentos de anticorpos" compreendemuma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente aregião de ligação de antígeno ou a região variável doanticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpoincluem fragmentos Fab, Fab1, F(ab')2 e Fv; diacorpos;anticorpos lineares (Zapata e cols. (1995) Protein Eng.10:1,057); moléculas de anticorpo de cadeia única; eanticorpos multiespecíficos formados por fragmentos deanticorpo. A digestão com papaína de anticorpos produz doisfragmentos de ligação de antígeno idênticos, denominadosfragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação deantígeno e um fragmento "Fc" residual, cujo nome refletesua habilidade para cristalizar prontamente. 0 tratamentocom pepsina gera um fragmento F(ab')2 que tem dois sítiosde combinação de antígeno e ainda é capaz de entrecruzar oantígeno.

uFv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umsítio de reconhecimento e de ligação de antígeno completo.Essa região consiste em um dímero de um domínio variável decadeia leve e um de cadeia pesada em estreita associaçãonão covalente. É nessa configuração que as três CDRs decada domínio variável interage para definir um sítio deligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL.Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade deligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até mesmo umúnico domínio variável (ou metade de um Fv que compreendaapenas três CDRs específicas para um antígeno) tem ahabilidade de reconhecer e se ligar ao antígeno, embora emuma afinidade menor do que todo o sítio de ligação.O fragmento Fab também contém o domínio constante dacadeia leve e o primeiro domínio constante (ChI) da cadeiapesada. Fragmentos Fab diferem de fragmentos Fab' pelaadição de poucos resíduos no terminal carboxi do domínioCh1 de cadeia pesada que inclui uma ou mais cisteínas daregião de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designaçãoaqui utilizada para Fab1 em que o resíduo (s) de cisteínados domínios constantes abrigam um grupo tiol livre.Fragmentos Fab' são produzidos por redução da ponte dedissulfeto d cadeia pesada do fragmento F(ab')2- Também sãoconhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos deanticorpo.

Fragmentos de um anticorpo anti-CD40 são adequadospara uso nos métodos da invenção desde que eles retenham aafinidade desejada do anticorpo de comprimento total.Portanto, por exemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD40 irá reter a capacidade de se ligar ao antígeno deCD40. Tais fragmentos são caracterizados por propriedadessimilares ao anticorpo de comprimento total correspondente.

Portanto, por exemplo, um fragmento de um anticorpo anti-CD40 antagonista de comprimento total será preferivelmentecapaz de se ligar especificamente a um antígeno de CD4 0humano expresso na superfície de uma célula humana, e élivre de atividade agonista significativa mas exibeatividade antagonista quando ligado a um antígeno de CD4 0em uma célula que expressa CD4 0 humano. Tais fragmentos sãoaqui denominados fragmentos "de ligação de antígeno" .Fragmentos de um anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodosda invenção irão reter preferivelmente a capacidade de deligar a FcR ou FcRs relevantes. Portanto, por exemplo, umfragmento de um anticorpo anti-CD40 pode reter a capacidadede se ligar a FcyRIIIa. Portanto, por exemplo, um fragmentode um anticorpo anti-CD4 0 de comprimento total pode sercapaz de se ligar especificamente a um antígeno de CD40 desuperfície celular, e também capaz de se ligara FcyRIIIa emcélulas efetoras humanas, como células natural killer (NK).Tais fragmentos são aqui referidos como fragmentos de"ligação a FcR". Tais fragmento geralmente incluirão pelomenos parte do domínio constante da cadeia pesada.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção defragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, esses fragmentoseram derivados por meio de digestão proteolítica deanticorpos intactos (veja, por exemplo, Morimoto e cols.(1992) Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) e Brennan e cols. (1985) Science 229:81).No entanto, esses fragmentos podem agora ser produzidosdiretamente por células hospedeiras recombinantes. Porexemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados apartir de bibliotecas de fago de anticorpo discutidasacima. Alternativamente, fragmentos Fab1-SH podem serrecuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamentepara formar fragmentos F(ab')2 (Carter e cols. (1992)Bio/Technology 10:163-167). De acordo com outra abordagem,fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de umacultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicaspara a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentespara o profissional experiente.

Fragmentos de ligação de antígeno adequados de umanticorpo compreendem uma porção de um anticorpo decomprimento total, geralmente a região de ligação deantigeno ou variável deste. Exemplos de fragmentos deanticorpo incluem, sem limitação, fragmentos Fab, F(ab')2 eFv e moléculas de anticorpo de cadeia única. Por "Fab"entende-se um fragmento monovalente de ligação de antigenode uma imunoglobulina que é composto da cadeia leve e parteda cadeia pesada. Por F(ab')2 entende-se um fragmentobivalente de ligação de antigeno de uma imunoglobulina quecontém tanto cadeias leves quanto parte de ambas as cadeiaspesadas. Por "Fv de cadeia única" ou "sFv" entende-se fragmentos que compreendem os domínios Vh e Vl de umanticorpo, nos quais esses domínios estão presentes em umaúnica cadeia polipeptídica. Veja, por exemplo, as PatentesU.S. Nos 4.946.778, 5.260.203, 5.455.030 e 5.856.456, aquiincorporadas por referência. Geralmente, o polipeptídeo Fvainda compreende um vinculador polipeptídico entre osdomínios Vh e Vl que permite que o sFv forme a estruturadesejada para ligação de antigeno. Para uma revisão sobresFv, veja Pluckthun (1994) em The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies, Vol. 113, ed. Rosenburg e Moore(Springer-Verlag, Nova York), pp. 269-315. Fragmentos deligação de antigeno dos anticorpos antagonistas anti-CD40aqui revelados também podem ser conjugados a uma citotoxinapara causar a morte de células-alvo como aqui descritoabaixo.

Em algumas modalidades da invenção, o anticorpo anti-CD4 0 é um anticorpo anti-CD4 0 antagonista. Quando taisanticorpos se ligam a CD4 0 apresentado na superfície decélulas humanas, como células B humanas, eles não causamatividade agonista significativa. Em algumas modalidades,sua ligação a CD4 0 apresentada na superfície de célulashumanas resulta na inibição da proliferação e diferenciaçãodessas células humanas. Os anticorpos anti-CD40 adequadospara uso nos métodos da invenção incluem aqueles anticorposque podem exibir atividade antagonista contra célulashumanas normais e malignas que expressam o antigeno CD4 0 desuperfície celular.

Por "atividade agonista" entende-se que a substânciafunciona como um agonista. Um agonista combina com umreceptor em uma célula e inicia uma reação ou atividade queé similar ou igual àquela iniciada pelo ligante natural doreceptor. Um agonista de CD4 0 induz qualquer uma ou todas,sem limitação, as seguintes respostas: proliferação e/oudiferenciação de células B; supra-regulação de adesãointercelular por meio de tais moléculas como ICAM-1, E-seletina, VCAM, e outras; secreção de citocinas pró-inflamatórias, como IL-1, IL-6, IL-8, IL-12, TNF e outras;transdução de sinal através do receptor de CD40 por taisvias como TRAF (por exemplo, TRAF2 e/ou TRAF3) , MAPquinases como NIK (quinase indutora de NF-KB), I-kapa Bquinases (IKK cc/(3), fator de transcrição NF-KB, Ras e avia MEK/ERKi a via PI3K/AKT, a via P3 8 MAPK, e outras;transdução de um sinal anti-apoptótico por tais moléculascomo XIAP, mcl-1, bcl-x, e outras; geração de memória decélula B e/ou T; produção de anticorpo de célula B; trocade isotipo de célula B, supra-regulação de expressão desuperfície celular de MHC Classe II eCD80/86, e outros.

Por atividade agonista "significativa" significa umaatividade agonista de pelo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%,60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, ou 100% maior do que aatividade agonista induzida por uma substância neutra ou umcontrole negativo, como medido em um ensaio de uma respostade célula B. Preferivelmente, atividade agonista"significativa" é um atividade agonista que é pelo menos 2vezes maior ou pelo menos 3 vezes maior do que a atividadeagonista induzida por uma substância neutra ou um controlenegativo, como medido em um ensaio de uma resposta decélula B. Desse modo, por exemplo, quando a resposta decélula B de interesse for proliferação de células B,atividade agonista "significativa" seria a indução de umnível de proliferação de células B que é pelo menos 2 vezesmaior ou pelo menos 3 vezes maior do que o nível deproliferação de células B induzido por uma substâncianeutra ou por um controle negativo. Em uma modalidade, umaimunoglobulina inespecífica, por exemplo, IgGl, que não seliga a CD4 0, serve como controle negativo. Uma substância"livre de atividade agonista significativa" exibiria umaatividade agonista de não mais que cerca de 25% maior doque a atividade agonista induzida por uma substância neutraou um controle negativo, preferivelmente no máximo cerca de20% maior, 15% maior, 10% maior, 5% maior, 1% maior, 0,5%maior ou até mesmo no máximo cerca de 0,1% maior do que aatividade agonista induzida por uma substância neutra ou umcontrole negativo, como medido em um ensaio de resposta decélula B.

Por "atividade antagonista" entende-se que asubstância funciona como um antagonista. Um anticorpoantagonista anti-CD4 0 da invenção evita ou reduz a induçãode qualquer uma das respostas induzidas por ligação doreceptor de CD4 0 a um ligante do agonista, particularmenteCD4 0L. Os antagonistas podem reduzir a indução de qualqueruma ou mais das respostas à ligação agonista em 5%, 10%,15%, 20%, 25%, 30%, 35%, pref erivelmente 40%, 45%, 50%,55%, 60%, mais pref erivelmente 70%, 80%, 85% e,principalmente, 90%, 95%, 99% ou 100%. Métodos para amedida da especificidade de ligação de ligante de CD40 eatividade antagonista do agente terapêutico anti-CD40, porexemplo, um anticorpo anti-CD40, são conhecidos na técnicae incluem, sem limitação, ensaios-padrão de ligaçãocompetitiva, ensaios para monitoramento da secreção deimunoglobulina por células B, ensaios de proliferação decélulas B, ensaios de proliferação de células Banchereau-Like-B, ensaios de célula T helper para a produção deanticorpo, co-estimulação de ensaios de proliferação decélulas B e ensaios para supra-regulação de marcadores daativação de célula B. Veja, por exemplo, tais ensaiosrevelados em WO 00/75348 e Patente U.S. No. 6.087.329, aquiincorporados por referência. Veja também, WO 2005/044854,WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307, e WO 2005/044294W0, cujosconteúdos são aqui incorporados em sua totalidade porreferência.

Antagonista/ausência de atividade agonista pode seravaliada por ensaios que mostram que CHIR-12.12 édesprovido de atividade agonista. Ensaios adequados sãomostrados nos ensaios descritos em US 5677165 (ChironCorporation).

Em uma modalidade da invenção, o anticorpo antagonistaanti-CD40 é livre de atividade agonista significativa emuma resposta celular. Em outra modalidade da invenção, oanticorpo antagonista anti-CD40 é livre de atividadeagonista significativa em ensaios de mais de uma respostacelular (por exemplo, proliferação e diferenciação, ouproliferação, diferenciação e, para células B, produção deanticorpo).

De interesse particular são anticorpos anti-CD40antagonistas que são livres de atividade agonistasignificativa como aqui definido mas exibem atividadeantagonista quando ligados ao antígeno CD4 0 em células Bhumanas. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-CD4 0 antagonista é livre de atividade agonistasignificativa em uma resposta de célula B. Em uma outramodalidade da invenção, o anticorpo anti-CD40 antagonista élivre de atividade agonista significativa em ensaios demais de uma resposta de célula B (por exemplo, proliferaçãoe diferenciação, ou proliferação, diferenciação, e produçãode anticorpo).

Qualquer um dos ensaios conhecidos na técnica pode serusado para determinar se um anticorpo anti-CD4 0 age como umantagonista de uma ou mais respostas de célula B. Emalgumas modalidades, o anticorpo anti-CD4 0 age como umantagonista de pelo menos uma resposta de célula Bselecionada do grupo que consiste em proliferação de célulaB, diferenciação de célula B, produção de anticorpo, adesãointercelular, geração de memória de célula B, troca deisotipo, supra-regulação de expressão de superfície celularde MHC Classe II eCD80/86, e secreção de citocinas pró-inflamatórias como IL-8, IL-12, e TNF. De interesseparticular são anticorpos antagonistas anti-CD40 que sãolivres de atividade agonista significativa com relação àproliferação de célula B quando ligados ao antígeno CD4 0humano na superfície de uma célula B humana.

0 anticorpo anti-CD40 pode ser um antagonista daproliferação de célula B induzida por CD40L solúvel ou desuperfície celular, como medido em um ensaio deproliferação de célula B. Ensaios de proliferação de célulaB adequados são conhecidos na técnica. Ensaios deproliferação de célula B adequados são também descritosabaixo. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD4 0antagonista estimula a proliferação de célula B em um nívelque é de não mais que cerca de 25% maior que a proliferaçãode célula B induzida por uma substância neutra ou controlenegativo, preferivelmente não mais que cerca de 20% maior,15% maior, 10% maior, 5% maior, 1% maior, 0,5% maior, ouainda não mais que cerca de 0,1% maior que a proliferaçãode célula B induzida por uma substância neutra ou controlenegativo.

Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD4 0 é umantagonista de proliferação de célula B que é induzida porum outro anticorpo anti-CD40, por exemplo, o anticorpoanti-CD4 0 S2C6, como medido em uma proliferação de célulaB, e o nível de proliferação de célula B estimulado pelooutro anticorpo anti-CD4 0 na presença do anticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não mais que cerca de 2 5% daproliferação de célula B induzida pelo outro anticorpoanti-CD40 na ausência do anticorpo anti-CD40 antagonista(ou seja, pelo menos 75% de inibição), preferivelmente nãomais que cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou até mesmonão mais que cerca de 0,1% da proliferação de célula Binduzida pelo outro anticorpo anti-CD40 na ausência doanticorpo anti-CD4 0 antagonista.Ainda em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 éum antagonista de proliferação de célula B que é induzidapela linha de células EL4B5 como medido em um ensaio deativação de célula B, e o nível de proliferação de célula Bestimulado pela linha de células EL4B5 na presença doanticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não mais que cerca de25% da proliferação de célula B induzida por essa linha decélulas na ausência do anticorpo anti-CD40 antagonista (ouseja, pelo menos 75% de inibição) , preferivelmente não maisque cerca de 20%, 15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou ainda não maisque cerca de 0,1% da proliferação de célula B induzida poressa linha de células na ausência do anticorpo anti-CD40antagonista.

Ainda em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 éum antagonista da produção de anticorpos induzida porcélula T humana por células B humanas como medido no ensaiode célula T helper humana para produção de anticorpo porcélulas B. Desse modo, o nível de produção do anticorpoIgG, produção do anticorpo IgM, ou produção do anticorpo

IgG e IgM por células B estimulada por células T napresença do anticorpo anti-CD4 0 antagonista é de não maisque cerca de 50% da produção do anticorpo respectivo porcélulas B estimuladas por células T na ausência doanticorpo anti-CD40 antagonista (ou seja, pelo menos 75% deinibição), preferivelmente não mais que cerca de 25%, 20%,15%, 10%, 5%, 1%, 0,5%, ou ainda não mais que cerca de 0,1%da produção do anticorpo respectivo por células Bestimuladas por células T na ausência do anticorpo anti-CD40 antagonista. Anticorpos anti-CD40 antagonistasadicionais incluem os anticorpos monoclonais referidos comoSD12, 3Α8 e 3C6, que são secretado por um hibridoma que temos números de acesso ATCC HB 11339, HB 12024 e HB 11340,respectivamente. Veja, por exemplo, Patente U.S. No.6.315.998, aqui incorporada em sua totalidade porreferência.

Por exemplo, os ensaios a seguir podem ser usados paraavaliar a atividade antagonista de um anticorpo anti-CD40.Células B humanas para esses ensaios podem ser obtidas, porexemplo, por isolação a partir tonsilas obtidas deindivíduos que se submetem a tonsilectomias, essencialmentecomo descrito em De Groot e cols. (1990) LymphokineResearch (1990) 9:321. Resumidamente, o tecido é dispersocom laminas de escalpo, células fagocíticas e NK sãoesvaziadas por tratamento com 5 mM L-Ieucina metil éster ecélulas T são removidas por um ciclo de roseteamento(ligação de dois ou mais eritrócitos não infectadas) comeritrócitos de carneiro (SRBC) tratados com brometo de 2-aminoetil isotiourônio. A pureza das preparações delinfócitos B resultantes pode ser avaliada por rotulagemimunofluorescente indireta com anti(CD20) mAb Bl (CoulterClone, Hialeah, FA) ou anti- (CD3) mAb 0KT3 (Ortho, Raritan,NJ) e um fragmento de F(ab')2 conjugado a FITC de coelhoanti-(camundongo Ig) (Zymed, San Francisco, CA), e análiseFACS.

Ensaio de proliferação de célula B

Células B (4 x 10^4 por cavidade) são cultivadas em 200μL IMDM suplementado com 10% soro fetal de bezerro emplacas de microtítulo de 96 cavidades de fundo plano. Ascélulas B são estimuladas pela adição de anticorpos anti-(IgM) imobilizados (Immunobeads; 5 μg/ml; BioRad, Richmond,Califórnia). Quando desejado, 100 U/ml de IL-2 recombinanteé adicionada. Concentrações variáveis de anticorposmonoclonais de teste (mAbs) são adicionadas no surgimentodas microculturas e a proliferação é avaliada no dia 3 pormedição da incorporação de (3H)-timidina depois de 18 horasde pulsos. Um anticorpo anti-CD40 antagonista não co-estimula significativamente a proliferação de células Bhumanas na presença de anti-IgM imobilizado ou na presençade anti-IgM imobilizado e IL-2.

Ensaio de proliferação de célula B semelhante a BanchereauPara testar a capacidade de anticorpos monoclonaisanti-CD4 0 para estimular a proliferação de células B etn umsistema de cultura análogo aquela descrito por Banchereau ecols. (1991) Science (1991) 251:70, células transfectantesde camundongo 3T 6 que expressam a forma alélica HR deFcyRII humano são usadas. Células B (2 χ IO4 por cavidade)são cultivadas em microcavidades de fundo plano na presençade 1 χ IO4 de células transfectantes (irradiadas com 5.000Rad) em 200 μΐ IMDM suplementado com 10% soro fetal debezerro e 100 U/ml de IL- 4 recombinante. Antes da adiçãodas células B, as células 3T6 aderem ao plástico de culturapor pelo menos 5 horas. mAbs anti-CD40 são adicionados emconcentrações que variam de 15 ng/ml a 2.000 ng/ml e aproliferação de células B é avaliada por medição daincorporação de timidina no dia 7, em 18 horas de pulsoscom [3H] timidina.

Inibição da proliferação de células B estimulaca por S2C6com o uso de mAbs anti-CD4 0 antagonistas

Anticorpos monoclonais antagonistas anti-CD4 0 (mAbs)também podem ser caracterizados por sua capacidade deinibir a estimulação da proliferação de células B por umanticorpo anti-CD40 como S2C6 (also conhecido como SGN-14,que é um agonista da estimulação por CD40 da proliferaçãode células B normais; Francisco e cols. (2000) Câncer Res.60:3225-3231) com o uso do ensaio de proliferação de célulaB acima descrito. Células B tonsilares humanas (4 χ IO4 porcavidade) são cultivadas em 200 μΐ em microcavidades napresença de anti-IgM ligada a glóbulos de Sefarose (5μg/ml) e mAb anti-CD40 S2C6 (1,25 μg/ml). Concentraçõesvariáveis de um mAb anti-CD40 de interesse são adicionadase a incorporação de [3H]-timidina é avaliada depois de 3dias. Como um controle anti-(glicocerebrosidase) mAb 8E4pode ser adicionado em concentrações similares. Barneveld ecols. (1983) Eur. J. Biochem. 134:585. Um anticorpo anti-CD40 antagonista pode inibir a co-estimulação daproliferação de células B humanas induzida por anti-IgM pormAb S2C6, por exemplo, em pelo menos 75% ou mais (ou seja,proliferação estimulada por S2C6 na presença de umanticorpo antagonista anti-CD40 é de não mais que 25%daquela observada na ausência do anticorpo antagonistaanti-CD4 0). Em contraste, nenhuma inibição significativadeve ser observada com quantidades equivalentes de mAb 8E4não relevante, direcionadas a β-glicocerebrosidase.Barneveld e cols., supra. Tal resultado indica que os mAbsanti-CD40 não liberam sinais estimuladores para aproliferação de células B humanas, mas, ao contrário, podeminibir sinais estimuladores exercidos ao despertar CD40 comum outro mAb.

Ensaio de ativação de células B com células EL4B5Zubler e cols. (1985) J. Immunol. (1985) 134:3662observou que um subclone mutante da linha do timoma decamundongo EL-4, conhecida como EL4B5, pode estimularfortemente as células B de origem murídea e humana paraproliferar e diferenciar em células plasmáticas quesecretam imunoglobulina in vitro. Essa ativação é antígeno-independente e ao restrito a MHC. Para estimulação ótima decélulas B humanas, a presença de sobrenadante de células Thumanas ativadas era necessária mas uma resposta de célulasB também ocorreu quando células EL4B5 foram pré-ativadascom forbol-12-miristato 13-acetato (PMA) ou IL-I. Zubler ecols. (1987) Immunological Reviews 99:281; e Zhang e cols.(1990) J. Immunol. 144:2955. A ativação de células B nessesistema de cultura é eficiente, experimentos de diluiçãolimitante mostram que a maioria das células B humanas podeser ativada para proliferar e diferenciar em células quesecretam anticorpo. Wen e cols. (1987) Eur. J. Immunol.17 : 887.

Células B (1.000 por cavidade) são cultivadas juntascom células irradiadas (5,000 Rad) EL4B5 (5 χ IO4 porcavidade) em placas de microtItulo de fundo plano em 200 μΐIMDM suplementado com 10% soro fetal de bezerro inativadopor calor, 5 ng/ml forbol-12- miristato 13-acetato (Sigma)e 5% de sobrenadante de célula T humana. mAbs sãoadicionados em concentrações variáveis no surgimento dasculturas e a incorporação de timidina é avaliada no dia 6depois de 18 horas de pulsos com [3H] - timidina. Para apreparação de sobrenadante de célula T, células Tpurificadas são cultivadas em uma densidade de 106/ml por36 horas na presença de 1 μg/ml PHA e 10 ng/ml PMA. Wen ecols. (1987) Eur. J. Immunol. (1987) 17:887. Sobrenadantede célula T é obtido por centrifugação das células eestocado a -20°C. A eficácia dos sobrenadantes de célula Tno aumento da proliferação de células B humanas em culturasde células B EL4B5 é testada e os sobrenadantes maiseficazes são reunidos para uso em experimentos. Quando daavaliação do efeito de um anticorpo anti-CD40 sobre aproliferação de célula B humana induzida por EL4B5, umanticorpo monoclonal como MOPC-141 (IgG2b) pode seradicionado como um controle.

Um anticorpo antagonista anti-CD40 pode inibir aproliferação de célula B estimulada pela linha de célulasEL4B5, por exemplo, em pelo menos 75% ou mais (ou seja,proliferação de célula B induzida por EL4B5 na presença deum anticorpo antagonista anti-CD40 é de não mais que 25%daquela observada na ausência do anticorpo antagonistaanti-CD40). Em contraste, um anticorpo de controle comoMOPC-141 pode não ter efeito significativo sobre aproliferação de célula B induzida por EL4B5.

Ensaio de célula T Helper humana para produção de anticorpopor células B

Um anticorpo antagonista anti-CD40 pode funcionar comoum antagonista da produção de imunoglobulina por células B.Um anticorpo anti-CD40 pode ser testado para esse tipo deatividade antagonista por avaliação da capacidade doanticorpo de inibir a produção de imunoglobulina porcélulas B que foram estimuladas em uma maneira dependentede contato com células T ativadas em um ensaio de célula Thelper. Dessa forma, placas de cultura de tecido de 96cavidades são revestidas com uma diluição de 1:500 defluido de ascite de anti-CD3 mAb CLB-T3/3 (CLB, Amsterdam,The Netherlands). Como indicado mAbs co-estimuladores sãoadicionados: mAbs anti-CD2 CLB-Tll.1/1 e CLB-T11.2/1 (CLB,Amsterdam, The Netherlands), ascite 1:1000 e mAb anti-CD28CLB-28/1 (CLB, Amsterdam, The Netherlands) .Subseqüentemente, células T tonsilares (irradiadas, 3.000Rad; 105 por cavidade) , células B tonsilares (104 porcavidade), e rIL-2 (20 U/ml) são adicionados. 0 primeirofinal volume de cada cultura de células é 200 μΐ. Depois de8 dias, as células são centrifugadas, e o sobrenadantelivre de células é coletado. As concentrações de IgM e IgGhumanas em amostras (diluídas) é estimada por ELISA comodescrito abaixo.

Em uma modalidade, células B tonsilares humanas(104/cavidade) são cultivadas junto com células Tpurificadas irradiadas (3.000 rad, 105/cavidade) em placasde 96 cavidades, revestidas com mAb anti-CD3 e com ou semdiferentes mAbs para co-estimular as células T. depois de 8dias de cultura os sobrenadantes são coletados para adeterminação da produção de imunoglobulina pelas células B.A produção de imunoglobulina pelas células B é avaliadapelo ensaio de ELISA descrito abaixo. 0 anticorpo anti-CD40de interesse é adicionado em concentrações variáveis dosurgimento das culturas. Como um controle, mAb MOPC-141pode ser adicionado.

Um anticorpo antagonista anti-CD4 0 pode inibir aprodução de anticorpo IgG e IgM de células B estimuladaspor células T humanas em pelo menos 50% ou mais (ou seja,produção de anticorpo induzida por células T por células Bna presença de um anticorpo antagonista anti-CD4 0 é de nãomais que 50% daquela observada na ausência do anticorpoantagonista anti-CD40). Em contraste, um anticorpo decontrole como MOPC-141 não deve ter qualquer efeitosignificativo sobre a produção de anticorpo induzida porcélulas T por células B.

Ensaio de ELISA para quantificação de imunoglobulina

As concentrações de IgM e IgG humanas são estimadaspor ELISA. Placas de ELISA de 96 cavidades são revestidascom 4 μg/ml de mAb de IgG anti-humana de camundongo MH 16-01 (CLB7 Amsterdam, The Netherlands) ou com 1,2 μg/ml demAb de IgM anti-humana de camundongo 4102 (Tago,Burlingame, CA) em 0,05 M tampão de carbonato (pH = 9,6),por incubação por 16 horas a 4°C. As placas são lavadas 3vezes com PBS-0,05% Tween-20 (PBS-Tween) e saturadas comBSA por 1 hora. Depois de 2 lavagens, as placas sãoincubadas por 1 hora a 37°C com diferentes diluições daamostras de teste. Depois de 3 lavagens, Ig ligada édetectada por incubação por 1 hora a 37°C com 1 μg/ml mAbde IgG anti-humana de camundongo rotulado com peroxidase MH16-01 (CLB) ou mAb de IgG anti-humana de camundongo MH 15-01 (CLB). As placas são lavadas 4 vezes e a atividade deperoxidase ligada é revelada pela adição de 0-fenilenodiamina como um substrato. Soro humano padrão (H00,CLB) é usado para estabelecer uma curva padrão para cadaensaio.

Anticorpos anti-CD40 antagonistas são conhecidos natécnica. Veja, por exemplo, o anticorpo anti-CD40 humanoproduzido pelo hibridoma designado F4-465 revelado nasPublicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 20020142358 e20030059427; aqui incorporados em sua totalidade porreferência. F4-465 foi obtido de camundongo HAC (Kuroiwa ecols. (2000) Nature Biotech. 10:1086 (2000)) e portanto,expressa a cadeia leve humana lambda. Veja também, WO2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294WO, cujos conteúdos são aqui incorporados em suatotalidade por referência.

Além da atividade antagonista, o anticorpo anti-CD40para uso nos métodos da presente invenção terápreferivelmente um outro mecanismo de ação contra umacélula alvo. Por exemplo, o anticorpo anti-CD4 0 terápreferivelmente atividade de ADCC. Alternativamente, asregiões variáveis do anticorpo anti-CD4 0 podem serexpressas em um outro isotipo de anticorpo que tematividade de ADCC. Também é possível conjugar formasnativas, formas recombinantes, ou fragmento de ligação aantIgenos de anticorpos anti-CD4 0 a uma citotoxina, umagente terapêutico, ou um íon de metal radioativo ouradioisótopo, como descrito em outra parte nessa.

Como explicado em outra parte nessa, os inventoresfizeram o achado surpreendente que, ao contrário de outrosanticorpos, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, sãocapazes de mediar potente citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC) de células alvo que expressam CD4 0 vialigação aos dois alótipos de FcyRIIIa de aminoácido 158 (Vou F) em células natural killer (NK) de paciente humano.Portanto, anticorpos anti-CD4 0, como CHIR-12.12, podem serusados no tratamento de cânceres e condições pré-malignasassociadas com células que expressam CD40 em pacienteshumanos heterozigóticos ou homozigóticos para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F) , além de pacientes humanoshomozigóticos para FcyRIIIa-158V (genótipo V/V). A presenteinvenção é especialmente vantajosa para o tratamento decânceres e condições pré-malignas que não são responsivasao tratamento com rituximab (Rituxan®) , porque a atividadeclínica de rituximab em NHL não está correlacionada com ogenótipo de FcyRIIIa do paciente.

Portanto, anticorpos anti-CD40 particularmentepreferidos para uso nos métodos da presente invenção sãoaqueles que, além da atividade antagonista, são capazes demediar ADCC de células que expressam CD4 0 por célulasefetoras humanas, como células natural killer (células NK)que expressam FcyRIIIa. Mais preferidos são aquelesanticorpos anti-CD40 que são capazes de se ligar aFcγRIIIa - 158F e FcγRIIIa-158V com alta afinidade, comodescrito também em outra parte nessa.

Anticorpos anti-CD40 particularmente preferidos sãoaqueles revelados em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307, e WO 2005/044294WO, cujos conteúdos são aquiincorporados em sua totalidade por referência.

De particular interesse para a presente invenção sãoanticorpos anti-CD40 antagonistas que partilha ascaracterísticas de ligação do anticorpo monoclonal CHIR-12.12 descrito em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO25 2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307, e WO 2005/044294. Tais anticorpos incluem, semlimitação os seguintes:

a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;

b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;c) um anticorpo monoclonal que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N0 :4, a seqüência mostrada em Id.

de Seq. N° :5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.N0 :2 e Id. de Seq. N0 :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N°:2 e Id. de Seq. N0:5;

d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada pela molécula de ácido nucleico quecompreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N0 :1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N0 :3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. N0 :1 e Id. de Seq.N0 : 3 ;

e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12;

f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N0:9;

g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. N0 :9;

h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompe t i t iva;

i) o anticorpo monoclonal do item a) ou um anticorpomonoclonal de qualquer um dos itens anteriores c)-h), emque o referido anticorpo é produzido de forma recombinante;ej) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de ligação específica ao referidoantígeno CD4 0 humano.

O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 é particularmentepreferido para uso nos métodos da presente invenção.

O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 foi descrito emdetalhes em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305,WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294. 0 anticorpo CHIR-12.12 pe um anticorpomonoclonal anti-CD40 totalmente humano do isotipo IgGlproduzido a partir da linha de células de hibridoma153.8E2.DlO.D6.12.12 (referida como a linha de células12.12) . A linha de células foi criada com o uso deesplenócitos de camundongos xenotípicos imunizados contendoo lócus de cadeia pesada de IgGl humana e o lócus de cadeiaK. humana (tecnologia XenoCamundongo®; Abgenix; Fremont,Califórnia). As células do baço foram fundidas com ascélulas de mieloma de camundongo SP2/0 (Sierra BioSource) .Os hibridomas resultantes foram subclonados várias vezespara criar a linha estável de células monoclonais 12.12.Outros anticorpos adequados para uso nos métodos dainvenção podem ser preparados de modo similar com o uso decamundongos transgênicos para lócus de imunoglobulinahumana, como descrito em outra parte nessa.

O anticorpo monoclonal CHIR-12.12 se liga a CD40solúvel em ensaios de tipo ELISA, evita a ligação deligante de CD4 0 a CD4 0 de superfície celular, e desloca oligante de CD4 0 pré-ligado, como determinado por ensaios decitometria de fluxo. Anticorpos CHIR 5.9 e CHIR-12.12competem um com o outro por ligação a CD40 mas não com15B8, o anticorpo anti-CD40 monoclonal descrito em PedidoProvisório U.S. No. de Série 60/237.556, intitulado "Human Anticorpos anti-CD40," depositado em 2 de outubro de 2000,e Pedido Internacional PCT No. PCT/US01/30857, tambémintitulado "Human Anti-CD40 Antibodies," depositado em 2 deoutubro de 2001 (Caso No. PP16092.003) e publicado como WO2002/028904, ambos aqui incorporados em sua totalidade porreferência. Quando testado in vitro para efeitos sobre aproliferação de células B a partir de indivíduos humanosnormais, CHIR-12.12 age como anticorpo anti-CD40antagonista. Além disso, CHIR-12.12 não induz forteproliferação de linfócitos humanos a partir de indivíduosnormais. O anticorpo é capaz de matar células alvo queexpressam CD40 por citotoxicidade celular dependente deanticorpo (ADCC). A afinidade de ligação de CHIR-12.12 porCD40 humano é 5x10~10 M, como determinado no ensaioBiacore™.

As seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos dasregiões variáveis do anticorpo são aqui fornecidas. maisparticularmente, as seqüências de aminoácidos para asregiões líder, variável, e constante para a cadeia leve ecadeia pesada para mAb CHIR-12.12 são apresentadas em Id. de Seq. N0:2 (seqüência completa para a cadeia leve de mAbCHIR-12.12), Id. de Seq. N°:4 (seqüência completa para acadeia pesada para mAb CHIR-12.12), e Id. de Seq. N°: 5(seqüência completa para a variante da cadeia pesada paramAb CHIR-12.12 apresentada em Id. de Seq. N° :4, em que avariante compreende uma substituição de serina pelo resíduode alanina na posição 153 de Id. de Seq. N° :4). Asseqüências de nucleotídeos que codificam a cadeia leve ecadeia pesada para mAb CHIR-12.12 são apresentadas em Id.de Seq. N0 :1 (seqüência codificadora para a cadeia levepara mAb CHIR-12.12) e Id. de Seq. N°: 3 (seqüênciacodificadora para a cadeia pesada para mAb CHIR-12.12).Hibridomas que expressam o anticorpo CHIR-12.12 foramdepositados com a ATCC com a designação de depósito depatente de PTA-5543.

Anticorpos anti-CD40 para uso nos métodos da presenteinvenção incluem anticorpos que diferem do anticorpomonoclonal CHIR-12.12 mas que retêm as CDRs, e anticorposcom uma ou mais adições, deleções, ou substituições deaminoácidos. Os anticorpos anti-CD40 para uso nos métodosda presente invenção também põem ser anticorposdesimunizados, particularmente anticorpos anti-CD40antagonistas desimunizados, que podem ser produzidos comodescrito, por exemplo, na Publicação Internacional Nos. WO98/52976 e WO 0034317; aqui incorporadas por referência.Dessa forma, resíduos nos anticorpos anti-CD40 antagonistasda invenção são modificados de modo a tornar os anticorposnão ou menos imunogênicos a humanos embora retenham suaatividade antagonista para células humanas que expressamCD4 0, em que tal atividade é medida por ensaios mostradosem outra parte nessa. Também incluídas no escopo dapresente invenção são proteínas de fusão que compreendem umanticorpo de interesse, por exemplo, um anticorpo anti-CD4 0antagonista ou um anticorpo anti-CD40L antagonista, ou umfragmento desses, cujas proteínas de fusão podem sersintetizadas ou expressas a partir de vetores depolinucleotldeos correspondentes, como é conhecido natécnica. Tais proteínas de fusão são descritas comreferência a conjugação de anticorpos como mostrados emoutra parte nessa.

Qualquer anticorpo conhecido que tem a especificidadede ligação de interesse pode ter variações de seqüênciaproduzidas com o uso de métodos descritos, por exemplo, nasPublicações de Patente Nos. EP 0983303 Al, WO 00/34317, eWO 98/52976, aqui incorporadas por referência. Por exemplo,foi mostrado que as seqüências na CDR podem fazer umanticorpo se ligar a MHC Classe II e despertar uma respostade célula T helper indesejada. Uma substituiçãoconservadora pode permitir que o anticorpo retenha aatividade de ligação, embora perca sua habilidade paradesencadear uma resposta indesejada de célula T. Qualqueruma dessas substituições conservadoras ou não conservadoraspode ser feita usando métodos reconhecidos na técnica, taiscomo aqueles aqui apresentados em outra seção, e osanticorpos resultantes também podem ser usados nos métodosda presente invenção. Os anticorpos variantes podem sertestados rotineiramente quanto à atividade antagonista, porexemplo, atividade antagonista, afinidade e especificidadeutilizando-se os métodos aqui descritos.

Por exemplo, variantes de seqüência de aminoácidos deum anticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, oanticorpo monoclonal CHIR-12.12, podem ser preparadas pormutações na seqüência de DNA clonado que codifica oanticorpo de interesse. Métodos para mutagênese ealterações nas seqüência de nucleotídeos são bem conhecidosna técnica. Veja, por exemplo, Walker e Gaastra, eds.(1983) "Techniques in Molecular Biology" (MacMillanPublishing Company, Nova York); Kunkel (1985) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel e cols. (1987) MethodsEnzymol. 154:367; Sambrook e cols. (1989) MolecularCloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NovaYork); Patente U.S. N0 4.873.192; e as referências nelacitadas; aqui incorporados por referência. Um guia sobrecomo adequar substituições de aminoácidos que não afetem aatividade biológica do polipeptídeo de interesse pode serencontrado no modelo de Dayhoff e cols. (1978) no Atlas ofProtein Sequence e Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.Substituições conservadores como, por exemplo, a troca deum aminoácido com outro que possui propriedades similares,podem ser preferidas. Exemplos de substituiçõesconservadoras incluem, sem limitação, Gly<=>Ala,Val<=>Ile<=>Leu, Asp<=>Glu, Lys<=>Arg, Asn<=>Gln ePhe < = >Trp< = >Tyr.

Na construção de variantes de um anticorpo deinteresse, por exemplo, um polipeptídeo de anticorpo anti-CD40 são feitas modificações de tal forma que as variantescontinuem a possuir a atividade desejada, ou seja,afinidade de ligação similar, e, no caso de anticorposanti-CD40 antagonista, que sejam capazes de se ligarespecificamente a um antígeno CD40 humano expresso nasuperfície de uma célula humana, e sendo livres deatividade agonista significativa, mas exibam atividadeantagonista quando ligadas a um antígeno CD4 0 em uma célulaque expressa CD40 humano. Obviamente, quaisquer mutaçõesfeitas no DNA que codifica o polipeptídeo variante nãodevem colocar a seqüência fora do quadro de leitura e,preferivelmente, não criarão regiões complementares quepossam produzir estrutura de mRNA secundária. Veja aPublicação de Pedido de Patente EP N° 75.444.

Além disso, a região constante de um anticorpo, porexemplo, um anticorpo anti-CD40 antagonista pode ser mutadapara alterar a função efetora de diversas formas. Porexemplo, consulte a Patente U.S. N° 6.737.056 Bl e aPublicação do Pedido de Patente U.S. N° 2004/0132101 Al,que revela mutações Fc que otimizam a ligação de anticorpoaos receptores Fc.

Preferivelmente, variantes de um anticorpo dereferência, por exemplo, um anticorpo antagonista anti-CD40têm seqüências de aminoácidos que possuem pelo menos 70% ou75% de identidade de seqüência, preferivelmente pelo menos80% ou 85% de identidade de seqüência, mais preferivelmentepelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou 95% de identidade deseqüência para seqüência de aminoácidos para a molécula deanticorpo antagonista anti-CD40, por exemplo, o anticorpomonoclonal CHIR-12.12 aqui descrito, ou a uma porção maiscurta da molécula de anticorpo de referência. Maispreferivelmente, as moléculas compartilham pelo menos 96%,97%, 98% ou 99% de identidade de seqüência. Para asfinalidades da presente invenção, o percentual deidentidade de seqüência é determinado usando o algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman usando uma pesquisade espaços afins com uma penalidade de espaço aberto de 12e uma penalidade de extensão de espaço de 2, matriz BLOSUMde 62. O algoritmo de pesquisa de homologia de Smith-Waterman é ensinado em Smith e Waterman (1981) Adv. Appl.Math. 2:482-489. Uma variante pode, por exemplo, diferir dodo anticorpo de referência, por exemplo, anticorpoantagonista anti-CD40 por apenas 1 a 15 resíduos deaminoácidos, apenas 1 a 10 resíduos de aminoácidos como,por exemplo, 6-10, apenas 5, apenas 4,3,2 ou até mesmo 1resíduo de aminoácido.

Com relação ao alinhamento ótimo de duas seqüências deaminoácidos, o segmento contíguo da seqüência deaminoácidos variante pode ter resíduos de aminoácidosadicionais ou resíduos de aminoácidos deletados com relaçãoà seqüência de aminoácidos de referência. O segmentocontíguo usado para comparação com a seqüência deaminoácidos de referência incluirá pelo menos 20 resíduosde aminoácidos contíguos, e pode ter 30, 40, 50 ou maisresíduos de aminoácidos. Podem ser feitas correções para aidentidade de seqüência associadas às substituiçõesconservadoras ou espaços de resíduos (veja algoritmo depesquisa de homologia de Smith-Waterman).

A estrutura química precisa de um polipeptídeo capazde se ligar especificamente ao CD4 0 e que retém atividadeantagonista, particularmente quando ligado ao antígeno CD4 0em células alvo, depende de diversos fatores. Como gruposamino e carboxil ionizáveis estão presentes na molécula, umpolipeptídeo específico pode ser obtido como um sal ácidoou básico ou em forma neutral. Todas essas preparações queretêm sua atividade biológica quando colocadas em condiçõesambientais adequadas estão incluídas na definição deanticorpos antagonistas anti-CD40 como aqui usada. Alémdisso, a seqüência de aminoácidos primária do polipeptídeopode ser aumentada por derivação usando porções de açúcar(glicosilação) ou por outras moléculas suplementares, taiscomo lipídeos, fosfato, grupos acetil e semelhantes. Elatambém pode ser aumentada por conjugação com sacarídeos.Certos aspectos desse aumento são obtidos através desistemas de processamento pós-tradução do hospedeiroprodutor; outras dessas modificações podem ser introduzidasin vitro. Em qualquer evento, tais modificações estãoincluídas na definição de um anticorpo anti-CD40 aquiusada, desde que as propriedades antagonistas do anticorpoanti-CD4 0 não sejam destruídas. Espera-se que taismodificações possam afetar quantitativa ou qualitativamentea atividade, aumentando ou diminuindo a atividade dopolipeptídeo, nos vários ensaios. Além disso, resíduos deaminoácidos individuais na cadeia podem ser modificados poroxidação, redução ou outra derivação, e o polipeptídeo podeser clivado para a obtenção de fragmentos que retenhamatividade. Tais alterações que não destroem a atividadeantagonista não removem a seqüência de polipeptídeos dadefinição de anticorpos anti-CD40 de interesse como aquiusada.

A técnica fornece uma diretriz substancial em relaçãoà preparação e ao uso de variantes de polipeptídeo. Napreparação das variantes do anticorpo anti-CD4 0, aqueleshabilitados na técnica podem determinar prontamente quaismodificações ao nucleotídeo ou à seqüência nativa deaminoácidos resultarão em uma variante que seja adequadapara uso como um componente terapeuticamente ativo de umacomposição farmacêutica usada nos métodos da presenteinvenção.

o anticorpo anti-CD4 0 para uso nos métodos da invençãopreferivelmente possui pelo menos uma das seguintesatividades biológicas in vitro e/ou in vivo: inibição dasecreção de imunoglobulina por células B periféricashumanas normais estimulada por células T; inibição dasobrevida e/ou proliferação de células B periféricashumanas normais estimulada por células que expressam CD40Lou ligante de CD40 solúvel (sCD40L); inibição da sobrevidae/ou proliferação de células B periféricas humanas normaisestimulada por células T de Jurkat; inibição de sinaisintracelulares antiapoptóticos de "sobrevida" em qualquercélula estimulada por sCD4 0L ou CD40L de fase sólida; einibição da transmissão do sinal de CD40 em qualquer célulamediante ligação com SCD4 0L ou CD40L de fase sólida,anergia e/ou indução de tolerância de células alvo queportam CD40 ou células que portam ligantes cognatos paraCD40 incluindo, sem limitação, células T e células B,indução da expansão ou ativação de células T reguladorasCD4+CD25+ (veja, por exemplo, rejeição de tecido específicapara aloantígeno de doador via interferência CD40-CD40L,van Maurik e cols. (2002) J. Immunol. 169:5401-5404),citotoxicidade via qualquer mecanismo (incluindo, semlimitação, citotoxicidade mediada por células dependentesde anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente decomplemento (CDC), infra-regulação da proliferação, e/ouapoptose em células alvo), modulação da secreção decitocina de célula alvo e/ou expressão de molécula desuperfície celular, e combinações desses.

Ensaios para tais atividades biológicas podem serrealizados como aqui descrito em pedidos provisóriosintitulados nAntagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies andMethods for Their Use", depositado em 4 de novembro de2003, 26 de novembro de 2003 e 27 de abril de 2004, ePedidos de Patente U.S. designados Nos 60/517.337 (ProcessoN° PP2 0107.001 (035784/258442)), 60/525.579 (Processo N°PP20107.002 (035784/271525)), e 60/565.710 (Processo N°PP20107.003 (035784/277214)), respectivamente, e Pedido dePatente Internacional N° PCT/US2004/037152 (Processo N°PP20107.004 (035784/282916)), publicado como WO

2005/044854, também intitulado nAntagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use",depositado em 4 de novembro de 2004; cujos conteúdos sãoaqui incorporada em sua totalidade por referência. Vejatambém os ensaios descritos em Schultze e cols. (1998)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:8200-8204; Denton e cols.(1998) Pediatr. Transplant. 2:6-15; Evans e cols. (2000) JImmunol. 164:688697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl.49:17-22; Lederman e cols. (1996) Curr. Opin. Hematol.3:77-86; Coligan e cols. (1991) Current Protocols inImmunology 13:12; Kwekkeboom e cols. (1993) Immunology79:439-444; e Patentes U.S. Nos 5.674.492 e 5.847.082, aquiincorporadas por referência.

Um ensaio representativo para detectar anticorposantagonistas anti-CD40 específicos para os epitopos deantígeno CD4 0 aqui identificados é um "ensaio competitivode ligação". Ensaios competitivos de ligação são ensaiossorológicos nos quais desconhecidos são detectados equantificados quanto à sua habilidade para inibir a ligaçãode um ligante conhecido rotulado ao seu anticorpoespecifico. Esse também é denominado ensaio competitivo deinibição. Em um ensaio competitivo de ligaçãorepresentativo, polipeptídeo CD40 rotulado é precipitadopor anticorpos candidatos em uma amostra, por exemplo, emcombinação com anticorpos monoclonais despertados contra umou mais epitopos dos anticorpos monoclonais da invenção.

Anticorpos Anti-CD40 que reagem especificamente com umepitopo de interesse podem ser identificados porrastreamento de uma série de anticorpos preparados contrauma proteína CD40 ou fragmento da proteína que compreende oepitopo particular da proteína CD40 de interesse. Porexemplo, para CD40 humano, epitopos de interesse incluemepitopos que compreendem resíduos de aminoácidos linearese/ou não lineares da isoforma curta de CD40 humano (veja N0de Acesso no GenBank NP 690593) apresentada em Id. de Seq.N°:10, codificada pela seqüência apresentada em Id. de Seq.N0 :9; (veja, também No. de Acesso GenBank NM 152854), ou daisoforma longa de CD4 0 humano (veja N0s de Acesso noGenBank CAA43045 e NP_001241, apresentada em Id. de Seq.N°:12, codificada pela seqüência apresentada em Id. de Seq.N°:11; veja, GenBank Nos. de Acesso X60592 e NM 001250).

Alternativamente, ensaios competitivos de ligação comanticorpos antagonistas anti-CD40 identificados previamenteadequados poderiam ser usados para selecionar anticorposmonoclonais comparáveis aos anticorpos identificadospreviamente.

Anticorpos empregados em tais imunoensaios podem serrotulados ou não rotulados. Anticorpos não rotulados podemser empregados em aglutinação; anticorpos rotulados podemser empregados em uma ampla variedade de ensaios, queempregam uma ampla variedade de rótulos. A detecção daformação de um complexo antígeno-anticorpo entre umanticorpo anti-CD4 0 e um epitopo de interesse pode serfacilitada pela anexação de uma substância detectável aoanticorpo. Meios de detecção adequados incluem a utilizaçãode rótulos, tais como radionuc1Ideos, enzimas, coenzimas,substâncias fluorescentes, substâncias quimioluminescentes,cromógenos, substratos ou co-fatores de enzimas, inibidoresde enzimas, complexos de grupo prostético, radicais livres,partículas, corantes, e semelhantes. Exemplos de enzimasadequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatasealcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplosde complexos de grupo prostético adequados incluemestreptavidinibiotina e avidina/biotina; exemplos demateriais fluorescentes adequados incluem umbeliferona,fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina,diclorotriazinilamina fluoresceína, cloreto de dansila ouficoeritrina; um exemplo de um material luminescente éluminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluemluciferase, luciferina e aequorina; e exemplos de materialradioativo adequado incluem 125I, 131I, 35S ou 3H. Taisreagentes rotulados podem ser usados em diversos ensaiosbem conhecidos, tais como radioimunoensaios, imunoensaiosenzimáticos, por exemplo, ELISA, imunoensaiosfluorescentes, e semelhantes. Veja, por exemplo, asPatentes U.S. Nos 3.766.162, 3.791.932, 3.817.837 e4.233.402.

É também possível construir um anticorpo para teratividade de ADCC aumentada. Em particular, a metade determinal carboxi do domínio CH2 é crítica para ADCC mediadaatravés do receptor FcRIII. Uma vez que CH2 e regiões dedobradiça têm um importante papel em funções efetoras, umaséries de anticorpos de domínios múltiplos que contêm CH2extra e/ou regiões de dobradiça pode ser criada einvestigada para quaisquer mudanças na potência efetora(veja, Greenwood, J., Gorman, S. D., Routledge, POREXEMPLO, Lloyd, I.S. & Waldmann , H., Ther Immunol. 1994Oct;1 (5) :247-55) . Uma abordagem alternativa pode ser aconstrução de domínios extra em paralelo, por exemplo,através da criação de dímeros por construção de umacisteína na cadeia H de uma Ig quimérica (veja, Shopes B.(1992) J. Immunol. 1992 1; 148(9): 2918-22). Além disso,mudanças para aumentar a atividade de ADCC podem serconstruídas por introdução de mutações na região Fc (veja,por exemplo, US 6.737.056 BI), que expressa células emlinhas de células deficientes de fucosil transferase (veja,for exemplo, US2003/0115614), ou efetuando outras mudançaspara a glicosilação do anticorpo (veja, por exemplo, US6.602.684) .

A presente invenção é especialmente vantajosa para otratamento de cânceres e condições pré-malignas queexpressam CD4 0, em que um paciente é homozigótico ouheterozigótico para genótipo FcyRIIIa-158F.

Como aqui usado, "anticorpo anti-CD20" englobaqualquer anticorpo que reconheça especificamente o antígenode superfície celular CD20, incluindo anticorpospoliclonais, anticorpos monoclonais, anticorpos de cadeiaúnica, e fragmentos desses como Fab, F(ab')2/ Fv, e outrosfragmentos que retêm a função de ligação de antígeno doanticorpo anti-CD20 parente. De interesse particular juntocom os métodos da presente invenção são anticorpos anti-CD20 ou fragmentos de ligação a antígeno desses que têm aspropriedades de ligação exibidas pelo anticorpo monoclonalIDEC-C2B8 (Biogen IDEC Inc., Cambridge, MA).

Em algumas modalidades, o anticorpos anti-CD40 usadonos métodos da invenção exibe atividade terapêutica maispotente que o anticorpo monoclonal anti-CD20 quiméricoIDEC-C2B8, em que a atividade terapêutica é avaliada comquantidades equivalentes desses anticorpos em um modelo detumor de xenoenxerto de camundongo usando linhas de célulasde mieloma ou linfoma humanas. IDECC2B8 (IDECPharmaceuticals Corp., San Diego, Califórnia;

comercialmente disponível sob o nome comercial Rituxan®,também referido como rituximab) é um anticorpo monoclonalanti-CD20 quimérico que contém IgGl humana e regiõesconstantes kapa com regiões variáveis de murídeo isoladasde um anticorpo monoclonal anti-CD20 de murídeo, IDEC-2B8(Reff e cols. (1994) Blood 83:435-445). Rituxan® élicenciado para o tratamento de linfoma de célula B debaixo grau em recidiva ou linfoma não Hodgkin folicular(NHL). A descoberta de anticorpos com atividade terapêuticasuperior, em partícula antitumor, comparados a rituxan®pode melhorar drasticamente os métodos de terapia paracânceres e condições pré-malignas, como Iinfomas de cleulaB, particularmente linfoma não Hodgkin de célula B.

Modelos de tumor de xenoenxerto de camundongo incluemaqueles que usam as linhas de células humanas de linfoma deBurkitt conhecidas como Namalwa e Daudi. Modalidadespreferidas avaliam a atividade antitumor em um modelo detumor de xenoenxerto de camundongo estagiado que usa alinha de células de linfoma humano Daudi como aqui descritoabaixo no Exemplo 7. Um modelos de tumor de xenoenxerto decamundongo estagiado que usa using a linha de células delinfoma Daudi ê mais eficaz na distinção da eficáciaterapêutica de um anticorpo dado que é um modelo nãoestagiado, uma vez que a dosagem de anticorpo de modeloestagiado é iniciada apenas depois que o tumor tenhaatingido um tamanho mensurável. No modelo não estagiado, adosagem de anticorpo é iniciada geralmente em cerca de 1dia de inoculação do tumor e antes de um tumor palpávelestar presente. A capacidade de um anticorpo para superarRituxan® (ou seja, para exibir atividade terapêuticaaumentada) em um modelo estagiado é uma forte indicação deque o anticorpo será mais terapeuticamente eficaz queRituxan®. Além disso, no modelo de Daudi, anti-CD20, o alvopara Rituxan® é expresso na superfície celular e um nívelmais alto que é CD40.

Por "quantidade equivalente" do anticorpo anti-CD4 0 dainvenção e Rituxan® entende-se que a mesma dose ou dosemenor em mg é administrada com base no peso. Portanto,quando o anticorpo anti-CD40 é dosado a 0,01 mg/kg de pesocorporal do camundongo usado no modelo, Rituxan® é tambémdosado a 0,01 mg/kg de peso corporal do camundongo. De modosimilar, quando o anticorpo anti-CD40 é dosado a 0,1, 1, ou10 mg/kg de peso corporal do camundongo usado no modelo, oRituxan® é também dosado a 0,1, 1, ou 10 mg/kg,respectivamente, do peso corporal do camundongo.

Quando administrados no modelo de tumor de xenoenxertode camundongo, alguns anticorpos anti-CD4 0 resultam emvolume tumoral significativamente menor que uma quantidadeequivalente de Rituxan®. Por exemplo, o anticorpomonoclonal totalmente humano CHIR-12.12 exibe um aumento depelo menos 20% na atividade anti-tumor em relação àquelaobservada com uma dose equivalente de Rituxan quandoavaliado no modelo de tumor de xenoenxerto de camundongoestagiado usando a linha de células de linfoma humano Daudina maneira descrita no Exemplo 7 nessa, e pode exibir umaumento de até 50% a 60% na atividade antitumoral nesseensaio. Essa atividade antitumor aumentada é refletida namaior redução no volume tumoral observada com o anticorpoanti-CD40 da invenção quando comparado à dose equivalentede Rituxan® ou na indução de respostas mais completas.

Portanto, por exemplo, dependendo da extensão do tempo apósa inoculação do tumor, o anticorpo monoclonal CHIR-12.12pode exibir um volume tumoral que é de cerca de um terço acerca de metade daquele observado para uma dose equivalentede Rituxan®.

Uma outra diferença na eficácia do anticorpo é amedição in vitro da concentração de anticorpo necessáriapara obter a Iise máxima das células tumorais in vitro napresença de células NK. Por exemplo, o anticorpos anti-CD40da invenção atinge Iise máxima de células Daudi em uma EC50de menos que 1/2, e pref erivelmente 1/4, e maispreferivelmente, 1/10 da concentração de Rituxan®. Essetipo de medição é também descrita nos Exemplos nessa.

Anticorpos anti-CD40 que se beneficiam de ter eficáciasignificativamente maior que quantidades equivalentes deRituxan® nos ensaios acima descritos podem incluir:

a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;

b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;

c) um anticorpo monoclonal que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N0:4, a seqüência mostrada em Id.de Seq. N°: 5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.

N°: 2 e Id. de Seq. N0 :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N°:2 e Id. de Seq. N0:5;

d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleicoque compreende uma seqüência de nucleotídeos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N°: 3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. N°: Ie Id. de Seq. N°:3;

e)um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linha

de células de hibridoma 12.12;

f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N0 :9;

g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD4 0 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. N° : 9;

h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitiva;

i) o anticorpo monoclonal do item a) ou um anticorpomonoclonal de qualquer um dos itens anteriores c)-h), emque o referido anticorpo é produzido de forma recombinante;e

j) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente ao referidoantígeno CD4 0 humano.

A presente invenção fornece um método para aidentificação de um paciente humano com um câncer oucondição pré-maligna tratável com um anticorpo anti-CD40,que compreende:

a) a identificação de um paciente humano com umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD40; e

b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (V/V, V/F ou F/F);

em que o referido câncer ou condição pré-maligna étratável com anticorpo anti-CD4 0 se o referido pacientehumano é heterozigõtico ou homozigótico para FcyRIIIa 158F(genótipo V/F ou F/F) . o câncer ou condição pré-malignapode ser refratária ao tratamento com rituximab (Rituxan®) .

Uma vez que um paciente humano com um câncer oucondição pré-maligna tratável com um anticorpo anti-CD40foi identificado, aquele paciente humano pode ser entãotratado com um anticorpo anti-CD40. Assim, o método podeincluir a etapa adicional de (c) administração a umpaciente humano identificado como heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) deuma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficazde um anticorpo anti-CD40.

Esse método de identificação de um paciente humano comum câncer ou condição pré-maligna tratável com um anticorpoanti-CD40 pode ser facilmente realizado por uma pessoahabilitada na técnica com o uso de um kit diagnósticoadequado. O kit deve compreender reagentes adequados para adeterminação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano. Portanto, a invenção também fornece um kit para aidentificação de um paciente humano com um câncer oucondição pré-maligna tratável com um anticorpo anti-CD40,que compreende reagentes para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano. Kits adequados sãodescritos em maiores detalhes em outra parte nessa.

A invenção também fornece um método para seleção deuma terapia de anticorpo para tratamento de um pacientehumano que tem um câncer ou condição pré-maligna, quecompreende:

(a) a identificação de um paciente humano que tem umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD40; e

(b) determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158 deum paciente humano (VN, V/F ou F/F) ,

em que se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) ,um anticorpo anti-CD40 é selecionado para o tratamento doreferido câncer ou condição pré-maligna. 0 câncer oucondição pré-maligna pode ser refratária ao tratamento comrituximab (Rituxan®).

Uma vez que uma terapia com anticorpo anti-CD4 0 paratratamento de um paciente humano que tem um câncer oucondição pré-maligna foi selecionado, aquele pacientehumano pode ser então tratado com um anticorpo anti-CD40.Portanto, o método pode incluir a etapa adicional de (c)administração a um paciente humano identificado comoheterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipoV/F ou F/F) de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40.

Esse método de seleção de uma terapia de anticorpopara tratamento de um paciente humano que tem um câncer oucondição pré-maligna também pode ser facilmente realizadopor uma pessoa habilitada na técnica com o uso de um kitdiagnóstico adequado. O kit deve compreender reagentesadequados para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano. Portanto, a invenção também forneceum kit para a seleção de uma terapia de anticorpo paratratamento de um paciente humano que tem um câncer oucondição pré-maligna associada com células que expressamCD40, que compreende reagentes para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de paciente humano.

Por "tratável com um anticorpo anti-CD40" entende-seque o paciente humano (ou seja, um indivíduo com câncer oucondição pré-maligna), quando tratado com o anticorpo anti-CD4 0, deve se beneficiar de uma "resposta terapêuticapositiva" (como definido em outra parte nessa) com relaçãoao câncer ou condição pré-maligna para qual o tratamento épensado.

Qualquer método para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano que usa uma amostrabiológica obtida do paciente humano é contemplado.

Por exemplo, a invenção fornece um kit para uso nadeterminação do genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano, que inclui um microarranjo que compreende pelomenos um marcador de 10 ou mais nucleotídeos de comprimentoe de uma seqüência adequada para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano. RNA ou DNArotulado é hibridizado a marcadores complementares noarranjo e então detectados por rastreamento de laser. Asintensidades de hibridização para cada marcador no arranjosão determinadas e convertidas a um valor quantitativo querepresenta níveis de expressão relativos do gene. A seleçãode seqüências de marcador e comprimentos pode serfacilmente realizada por pessoa habilitada. A seqüência denucleotídeos s que codificam os alótipos de FcyRIIIa-158 Fe V é conhecida. Portanto, a pessoa habilitada podeselecionar marcadores que, sob as condições experimentaisadequadas, permitam a determinação do genótipo FcyRIIIa-158das seqüências alvo.

Técnicas para a síntese desses arranjos que usammétodos de síntese mecânica são descritos, por exemplo, naPatente U.S. No. 5.384.261, aqui incorporada em suatotalidade por referência. Embora uma superfície de arranjoa plana seja preferida, o arranjo pode ser fabricado em umasuperfície virtualmente de qualquer formato ou até mesmo emvárias superfícies. Os arranjos podem ser peptídeos ouácidos nucleicos em glóbulos, géis, superfíciespoliméricas, fibras como fibras óticas, vidro ou qualqueroutro substrato adequado, veja, Patentes U.S. Nos.5.770.358, 5.789.162, 5.708.153, 6.040.193 e 5.800.992,cada uma dessas é aqui incorporada em sua totalidade paratodos os objetivos. Os arranjos podem ser embalados em umatal forma que permita o diagnóstico ou outra manipulação deum dispositivo completo. Veja, por exemplo, Patentes U.S.Nos. 5.856.174 e 5.922.591, aqui incorporadas porreferência.Por exemplo, a invenção também fornece um kit para usona determinação de um genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano, que compreende oligonucleotídeos adequados para usocomo iniciadores em amplificação catalisada por polimeraseda região do gene ou mRNA que codifica amino ácido 158 deFcγRIIIa. A seleção das seqüências do iniciador ecomprimentos pode ser facilmente realizada por pessoahabilitada. A seqüência de nucleotídeos do gene e mRNAhumano que codifica os alótipos de FcyRIIIa-158 F e V éconhecida. Portanto, a pessoa habilitada pode selecionarmarcadores que, sob as condições experimentais adequadas,permitam a amplificação da região do gene ou mRNA quecodifica o aminoácido 158 de FcyRIIIa. A seqüênciaamplificada pode ser então seqüenciada com o uso de métodosconhecidos para determinar genótipo FcyRIIIa-158 dopaciente.

Um outro método para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158' de um paciente humano é o uso de um métodobaseado em ácido nucleico que detecta fragmentação de DNAque é característica do genótipo FcyRIIIa-158 do pacientehumano's. Quando do uso de eletroforese em géis de agarose,DNA de cada genótipo de FcγRIIIa-158 tem um padrãocaracterístico. Portanto, a invenção também fornece um kitpara uso na determinação de um genótipo FcyRIIIa-158 de umpaciente humano, que compreende uma ou mais enzimas derestrição adequadas para a determinação de um genótipoFcyRIIIa-158 de um paciente humano. Enzimas de restriçãoadequadas são conhecidas na técnica (por exemplo, veja,Koene e cols., Blood, 1997, Vol. 90, No. 3, p. 1109-1114).

Os kits da invenção também podem incluir instruçõesque indicam como usar o kit para a determinação de umgenótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano. 0 kit tambémpode compreender, por exemplo, um agente de tamponamento,um conservante, ou um agente de estabilização de proteína.Cada componente do kit pe comumente colocado em umrecipiente individual, e todos os vários recipientes estãoem um único pacote junto com instruções que indicam comousar o kit para a determinação de um genótipo FcyRIIIa-158de um paciente humano.

A invenção fornece o uso de anticorpos anti-CD40 namanufatura de medicamentos para o tratamento de câncer oucondição pré-maligna associada com células que expressamCD4 0, como descrito em outra parte nessa.

Os anticorpos anti-CD4 0 dessa invenção sãoadministrados em uma concentração que é terapeuticamenteeficaz para evitar ou tratar um câncer ou condição pré-maligna associada com células que expressam CD40. Paraatingir esse objetivo, os anticorpos podem ser formuladosusando diversos veículos e/ou excipientes aceitáveisconhecidos na técnica. 0 anticorpo anti-CD40 pode seradministrado por uma via de administração parenteral.Tipicamente, os anticorpos são administrados por injeção,por via tanto intravenosa quanto subcutânea. Métodos parase obter essa administração são conhecidos por aqueleshabilitados na técnica.

A administração intravenosa ocorre preferivelmente porinfusão ao longo de um período de cerca de meia hora a 1hora a cerca de 10 horas (menos que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9, ou 10 horas) . As infusões subseqüentes podem seradministradas ao longo de um período de cerca de 1 a cercade 6 horas, incluindo, por exemplo, cerca de 1 a cerca de 4horas, cerca de 1 a cerca de 3 horas ou cerca de 1 a cercade 2 horas ou manos que uma hora. Alternativamente, a dosepode ser administrada por via subcutânea.

Uma composição farmacêutica da invenção é formuladapara ser compatível com sua via de administração desejada.Soluções ou suspensões usadas para aplicação parenteral,podem incluir os seguintes componentes: um diluente estérilcomo água para injeção, solução de soro fisiológico;agentes antibacterianos, tais como álcool benzilico oumetil parabenos; antioxidantes, como ácido ascórbico oubissulfito de sódio; agentes quelantes, tais como ácidoetilenodiaminatetraacético; tampões, tais como acetatoscitratos ou fosfatos, e agentes para o ajuste datonicidade, tais como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pHpode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácidoclorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parenteralpode ser embalada em ampolas, seringas descartáveis oufrascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico.

Os anticorpos anti-CD40 são fornecidos tipicamente portécnica-padrão dentro de um tampão farmaceuticamenteaceitável, por exemplo, soro fisiológico estéril, águatamponada estéril, combinações dos anteriores etc. Métodospara a preparação de agentes administráveis por viaparenteral são descritos em Remington's PharmaceuticalSciences (18a ed. ; Mack Publishing Company, Eaton,Pennsylvania, 1990), aqui incorporado por referência. Vejatambém, por exemplo, WO 98/56418, que descreve formulaçõesfarmacêuticas estabilizadas de anticorpo adequadas para usonos métodos da presente invenção.A quantidade de pelo menos um anticorpo anti-CD40 aser administrada é facilmente determinada por aqueleshabilitados na técnica. Fatores que influenciam o modo deadministração e a respectiva quantidade de pelo menos umanticorpo anti-CD40 incluem, sem limitação, a severidade dadoença, a história da doença, a idade, peso, altura, saúdee condição física do indivíduo submetido à terapia ouresposta à infusão de anticorpo. Da mesma forma, aquantidade de anticorpo anti-CD40 a ser administrada,dependerá do modo de administração e de se o indivíduo serásubmetido a uma dose única ou a múltiplas doses desseagente antitumoral. Geralmente, uma dosagem maior deanticorpo anti-CD40 pe preferida com peso crescente doindivíduo que se submete à terapia.

Para uma dose única de anticorpo anti-CD40 a seradministrada está na faixa de cerca de cerca de 0,3 mg/kg acerca de 50 mg/kg, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 40mg/kg, de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cercade 0,1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 0,5 mg/kg acerca de 30 mg/kg, de cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg,de cerca de 3 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, de cerca de 3mg/kg a cerca de 25 mg/kg, de cerca de 3 mg/kg a cerca de20 mg/kg, de cerca de 5 mg/kg a cerca de 15 mg/kg.

Portanto, por exemplo, a dose pode ser 0,3 mg/kg, 0,5mg/kg, 1 mg/kg, 1,5 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 5mg/kg, 7 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30mg/kg, 35 mg/kg, 40 mg/kg, 45 mg/kg, ou 50 mg/kg, ou outrasdoses dentro da faixa de cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 50mg/kg.

O tratamento de um indivíduo com uma quantidadeterapeuticamente eficaz de um anticorpo pode incluir umtratamento único ou, preferivelmente, pode incluir umasérie de tratamentos. Portanto, Em outra modalidade dainvenção, o método compreende a administração de múltiplasdoses de anticorpo anti-CD40. O método pode compreender aadministração de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25,30, 35, 40, ou mais doses terapeuticamente eficazes de umacomposição farmacêutica que compreende um anticorpo anti-CD40. A freqüência e duração da administração de múltiplasdoses das composições farmacêuticas que compreendemanticorpo anti-CD40 pode ser facilmente determinada porpessoa habilitada na técnica sem experimentação indevida. Amesma dose terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40 pode ser administrada pela duração de um período detratamento. Alternativamente, doses terapeuticamenteeficazes diferentes de um anticorpo anti-CD40 pode seradministrada pela duração de um período de tratamento.

Em um exemplo, um indivíduo é tratado com anticorpoanti-CD40, na faixa entre cerca de 0,1 a 20 mg/kg de pesocorporal, uma vez por semana, por cerca de 1 a 10 semanas,preferivelmente entre cerca de 2 a 8 semanas, maispreferivelmente entre cerca de 3 a 7 semanas e, ainda maispreferivelmente, por cerca de 4, 5 ou 6 semanas. 0tratamento pode ocorrer em intervalos de a cada 2 a 12meses para a prevenção de recidivas, ou mediante umaindicação de recidiva. Será também observado que a dosagemeficaz de anticorpo usada para tratamento pode aumentar oudiminuir ao longo de uma série de tratamento em particular.

Alterações na dosagem podem resultar e se tornar aparentesa partir dos resultados de ensaios diagnósticos, como aquidescrito.

Portanto, em uma modalidade, o regime de dosageminclui uma primeira administração de uma doseterapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD40 nos dias 1,8, 15 e 22 de um período de tratamento.

Em outra modalidade, o regime de dosagem inclui umregime de dosagem que tem uma primeira administração de umadose terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpoanti-CD40 diariamente ou nos dias 1, 3, 5 e 7 de uma semanaem um período de tratamento; um regime de dosagem queinclui uma primeira administração de uma doseterapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD4 0 nos dias 1 e 3-4 de uma semana em uma período detratamento; e um regime de dosagem preferido que incluiruma primeira administração de uma dose terapeuticamenteeficaz de pelo menos um anticorpo anti-CD4 0 no dia 1 de umasemana em uma período de tratamento. 0 período detratamento pode compreender 1 semana, 2 semanas, 3 semanas,um mês, 2 meses, 3 meses, 6 meses, ou um ano. Os períodosde tratamento podem ser subseqüentes ou separados um dooutro por uma semana, 2 semanas, um mês, 3 meses, 6 meses,ou um ano.

Em outras modalidades, a dose terapeuticamente eficazinicial de um anticorpo anti-CD40 como aqui definida emoutra seção, pode estar na faixa de dosagem mais baixa (ouseja, cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg) com dosessubseqüentes se situando dentro da faixa de dosagem maiselevada (ou seja, de cerca de 20 mg/kg a cerca de 50mg/kg).

Em modalidades alternativas, a dose terapeuticamenteeficaz inicial de um anticorpo anti-CD40 como aqui definidaem outra seção, pode estar na faixa de dosagem mais alta(ou seja, cerca de 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg) com dosessubseqüentes se situando dentro da faixa de dosagem maisbaixa (ou seja, de cerca de 0,3 mg/kg a cerca de 20 mg/kg).Portanto, em algumas modalidades da invenção, a terapia comanticorpo anti-CD4 0 é iniciada pela administração de uma"dose de ataque" do anticorpo ao indivíduo que necessita deterapia. Por "cose de ataque" entende-se uma dose inicialdo anticorpo anti-CD4 0 que é administrada ao indivíduo, emque a dose do anticorpo administrada se situa dentro dafaixa de dosagem mais elevada (ou seja, de cerca de 20mg/kg a cerca de 50 mg/kg) . A "dose de ataque" pode seradministrada como uma administração única, por exemplo, umainfusão única na qual o anticorpo ou o fragmento de ligaçãode antígeno deste é administrado IV, ou como administraçõesmúltiplas, por exemplo, infusões múltiplas nas quais oanticorpo é administrado IV, desde que a "dose de ataque"completa seja administrada aproximadamente dentro de umperíodo de 24 horas. Após a administração da "dose deataque", o indivíduo recebe então uma ou mais dosesterapeuticamente eficazes adicionais do anticorpoantagonista anti-CD40. Doses terapeuticamente eficazessubseqüentes podem ser administradas, por exemplo, deacordo com um esquema de dosagem semanal, ou uma vez a cadaduas semanas, uma vez a cada três semanas ou uma vez a cadaquatro semanas. Nessas modalidades, as dosesterapeuticamente eficazes subseqüentes geralmente se situamdentro da faixa de dosagem mais baixa (ou seja, 0,3 mg/kg acerca de 20 mg/kg).Alternativamente, em algumas modalidades, após a "dosede ataque", as doses terapeuticamente eficazes subseqüentesdo anticorpo anti-CD4 0 são administradas de acordo com um"esquema de manutenção", no qual a dose terapeuticamenteeficaz do anticorpo é administrada uma vez ao mês, uma veza cada 6 semanas, uma vez a cada dois meses, uma vez a cadasemanas, uma vez a cada três meses, uma vez a cada 14semanas, uma vez a cada quatro meses, uma vez a cada 18semanas, uma vez a cada cinco meses, uma vez a cada 22semanas, uma vez a cada seis meses, uma vez a cada 7 meses,uma vez a cada 8 meses, uma vez a cada 9 meses, uma vez acada 10 meses, uma vez a cada 11 meses ou uma vez a cada 12meses. Nessas modalidades, as doses terapeuticamenteeficazes do anticorpo anti-CD40 se situam dentro da faixade dosagem mais baixa (ou seja, 0,003 mg/kg a cerca de 20mg/kg), particularmente quando as doses subseqüentes sãoadministrados em intervalos mais freqüentes, por exemplo,uma vez a cada duas semanas até uma vez a cada mês, ou sesituam na faixa de dosagem mais elevada (ou seja, de cercade 20 mg/kg a cerca de 50 mg/kg), particularmente quando asdoses subseqüentes são administradas em intervalos menosfreqüentes, por exemplo, quando as doses subseqüentes sãoadministradas com intervalo de cerca de um mês a cerca de12 meses.

Os anticorpos anti-CD40 presentes nas composiçõesfarmacêuticas aqui descritas para uso nos métodos dainvenção podem ser nativos ou obtidos por técnicasrecombinantes, e podem ser de qualquer fonte, incluindofontes mamíferas, tais como, por exemplo, camundongo, rato,coelho, primata, porco e humana. Preferivelmente, taispolipeptídeos são derivados de uma fonte humana e, maispreferivelmente, são recombinantes, proteínas humanas delinhas de células de hibridoma.

As composições farmacêuticas úteis nos métodos da invenção podem compreender variantes biologicamente ativasdos anticorpos antagonistas anti-CD4 0 da invenção, comodescrito em outra parte nessa.

Qualquer composição farmacêutica que compreenda umanticorpo anti-CD40 possuindo as propriedades de ligaçãoaqui descritas como o componente terapeuticamente ativopode ser usada nos métodos da invenção. Desse modo,composições líquidas, liofilizadas ou secas por vaporizaçãoque compreendem um ou mais dos anticorpos anti-CD40 dainvenção podem ser preparadas como uma solução ou suspensãoaquosa ou não aquosa para administração subseqüente a umindivíduo de acordo com os métodos da invenção. Cada umadessas composições compreenderá pelo menos um dosanticorpos anti-CD4 0 como um componente terapêutica ouprof ilaticâmenfce ativ©. Por ""componente terapêutica ouprofilaticamente ativo" significa que o anticorpo anti-CD40é especificamente incorporado na composição para produziruma resposta terapêutica ou profilática desejada comrelação ao tratamento, prevenção ou diagnóstico de umadoença ou condição em um indivíduo quando a composiçãofarmacêutica é administrada àquele indivíduo.Preferivelmente, as composições farmacêuticas compreendemagentes estabilizantes apropriados, agentes de volume, ouambos, para minimizar problemas associados à perda deestabilidade da proteína e da atividade biológica durante apreparação e estocagem.Podem ser adicionados formulantes às composiçõesfarmacêuticas que compreendem um anticorpo anti-CD4 0 dainvenção. Esses formulantes podem incluir, sem limitação,óleos, polímeros, vitaminas, carboidratos, aminoácidos,sais, tampões, albumina, tensoativos ou agentes de volume.Preferivelmente, carboidratos incluem açúcar ou álcoois deaçúcar, tais como mono-, di- ou polissacarídeos ou glicanoshidrossolúveis. Os sacarídeos ou glicanos podem incluirfrutose, glicose, manose, sorbose, xilose, maltose,sacarose, dextrana, pululana, dextrina, α, β e γciclodextrina, amido solúvel, amido de hidroxietila ecarboximetilcelulose, ou misturas destes. "Álcool deaçúcar" é definido como um hidrocarboneto C4 a C5 com umgrupo hidroxila, e inclui galactitol, inositol, manitol,xilitol, sorbitol, glicerol e arabitol. Esses açúcares ouálcoois de açúcar podem ser usados individualmente ou emcombinação. A concentração de açúcar ou álcool de açúcar éentre 1,0% e 7% p/v, mais preferivelmente entre 2,0% e 6,0%p/v. Preferivelmente, aminoácidos incluem formas levógiras(L) de carnitina, arginina e betaína; no entanto, podemser adicionados outros aminoácidos. Polímeros preferidosincluem polivinilpirrolidona (PVP) com um peso molecularmédio entre 2.000 e 3.000, ou polietileno glicol (PEG) comum peso molecular médio entre 3.000 e 5.000. Tensoativosque podem ser adicionados à formulação são mostrados nas EPNos 270.799 e 268.110.

Adicionalmente, os anticorpos podem ser modificadosquimicamente por conjugação covalente a um polímero paraaumentar sua meia-vida na circulação, por exemplo.

Polímeros preferidos e métodos para anexá-los aos peptídeossão mostrados nas Patentes U.S. Nos 4.766.106; 4.179.337;4.495.285; e 4.609.546; as quais são aqui incorporadas porreferência em suas totalidades. Polímeros preferidos sãopolióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG). PEG ésolúvel em água em temperatura ambiente e tem a fórmulageral: R(O--CH2--CH2)nO-R, em que R pode ser hidrogênio, ouum grupo de proteção como, por exemplo, um grupo alquil oualcanol. Preferivelmente, o grupo de proteção tem entre 1 e8 carbonos, mais preferivelmente é metil. 0 símbolo η é umnúmero inteiro positivo, preferivelmente entre 1 e 1.000,mais pref erivelmente entre 2 e 500. 0 PEG tem um pesomolecular médio preferido entre 1.000 e 40.000, maispreferivelmente entre 2.000 e 20.000, principalmente entre3.000 e 12.000. Pref erivelmente, PEG tem pelo menos umgrupo hidroxi, mais preferivelmente é um grupo hidroxiterminal. É esse grupo hidroxi que é preferivelmenteativado para reagir com um grupo amino livre no inibidor.No entanto, será compreendido que o tipo e a quantidade dosgrupos reativos podem ser variados para se obter umPEG/anticorpo conjugado de forma covalente da presenteinvenção.

Polióis polioxietilados hidrossolúveis também sãoúteis na presente invenção. Eles incluem sorbitolpolioxietilado, glicose polioxietilada, glicerolpolioxietilado (POG), e semelhantes. POG é preferido. Umarazão é porque a estrutura central do glicerol do glicerolpolioxietilado é a mesma estrutura central de ocorrêncianatural, por exemplo, em animais e humanos em mono-, di-,triglicerídeos. Portanto, essa ramificação não serianecessariamente vista como um agente estranho no corpo. 0POG tem um peso molecular preferido na mesma faixa que o dePEG. A estrutura para POG é mostrada em Knauf e cols.

(1988) J. Bio. Chem. 263:15.064-15.070, e uma discussão deconjugados de POG/IL-2 é encontrada na Patente U.S. N04.766.106, ambos aqui incorporados por referência em suastotalidades.

Outro sistema de liberação de medicamentos paraaumento da meia-vida circulatória é o lipossomo. Métodospara a preparação de sistemas de liberação de lipossomo sãodiscutidos em Gabizon e cols. (1982) Câncer Research42:4.734; Cafiso (1981) Biochem. Biophys. Acta 649:129; eSzoka (1980) Ann. Rev. Biophys. Eng. 9:467. Outros sistemasde liberação de medicamentos são conhecidos na técnica esão descritos, por exemplo, em Poznansky e cols. (1980)Drug Delivery Systems (R.L. Juliano, ed. , Oxford, NovaYork), pp. 253-315; Poznansky (1984) Pharm. Revs. 36:277.

Os formulantes a serem incorporados em uma composiçãofarmacêutica devem fornecer a estabilidade do anticorpoanti-CD40. Ou seja, o anticorpo anti-CD40 deve reter suaestabilidade física e/ou química e ter a atividadebiológica desejada, ou seja, uma ou mais das atividadesantagonistas aqui definidas anteriormente, incluindo, semlimitação, inibição da secreção de imunoglobulina porcélulas B periféricas humanas normais estimulada porcélulas T; inibição da sobrevida e/ou proliferação decélulas B periféricas humanas normais estimulada porcélulas T de Jurkat; inibição da sobrevida e/ouproliferação de células B periféricas humanas normaisestimulada por células que expressam CD40L ou ligante CD40solúvel solúvel (sCD40L); inibição de sinais intracelularesantiapoptóticos de "sobrevida" em qualquer célulaestimulada por SCD40L ou CD40L de fase sólida; inibição datransmissão do sinal de CD40 em qualquer célula medianteligação com sCD40L ou CD40L de fase sólida; e inibição daproliferação de células B humanas malignas, como observadoem outra seção desta especificação.

Métodos para o monitoramento da estabilidade daproteína são bem conhecidos na técnica. Veja, por exemplo,Jones (1993) Adv. Drug Delivery Rev. 10:29-90; Lee, ed.

(1991) Peptide and Protein Drug Delivery (Mareei Dekker,Inc., Nova York, Nova York) ; e os ensaios de estabilidadeaqui revelados abaixo. Geralmente, a estabilidade daproteína é medida em uma temperatura escolhida por umperíodo de tempo especificado. Em modalidades preferidas,uma formulação farmacêutica de anticorpo estável forneceestabilidade do anticorpo anti-CD40 quando estocada emtemperatura ambiente (cerca de 25°C) por pelo menos 1 mês,pelo menos 3 meses ou, pelo menos, 6 meses, e/ou é estávelem cerca de 2-8°C por pelo menos 6 meses, pelo menos 9meses, pelo menos 12 meses, pelo menos 18 meses, pelo menos24 meses.

Uma proteína como um anticorpo, quando formulada emuma composição farmacêutica, é considerada como retendo suaestabilidade física em certo momento caso ela não mostresinais visuais (ou seja, descoloração ou perda detransparência) ou sinais mensuráveis (por exemplo, com ouso de cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) oudispersão da luz UV) de precipitação, agregação e/oudesnaturação naquela composição farmacêutica. Com relação àestabilidade química, uma proteína como um anticorpo,quando formulada em uma composição farmacêutica, éconsiderada como retendo sua estabilidade química em certomomento se as medidas da estabilidade química foremindicativas de que a proteína (ou seja, o anticorpo) retéma atividade biológica de interesse naquela composiçãofarmacêutica. Métodos para o monitoramento das alteraçõesna estabilidade química são bem conhecidos na técnica eincluem, sem limitação, métodos para detectar quimicamenteformas alteradas da proteína resultantes de picotes,usando, por exemplo, SDS-PAGE, SEC e/ou ionização pordessorção da matriz assistida por laser/espectrometria demassa por tempo de vôo; e degradação associada àsalterações na carga molecular (por exemplo, associada àdesamidação), usando, por exemplo, cromatografia por trocaiônica. Veja, por exemplo, os métodos aqui reveladosabaixo.

Um anticorpo anti-CD40 quando formulado em umacomposição farmacêutica, é considerado como retendo umaatividade biológica desejada em certo momento se aatividade biológica desejada naquele momento for de cercade 30%, preferivelmente for de cerca de 20% da atividadebiológica desejada exibida no momento em que a composiçãofarmacêutica foi preparada, como determinado em uma análiseadequada para a atividade biológica desejada. Análises paraa medida da atividade biológica desejada dos anticorposanti-CD40 aqui revelados podem ser realizadas como descritonos Exemplos aqui apresentados. Veja também os ensaiosdescritos em Schultze e cols. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci.USA 92:8.200-8.204; Denton e cols. (1998) Pediatr.Transplant. 2:6-15; Evans e cols. (2000). J. Iwmunol.164:688-697; Noelle (1998) Agents Actions Suppl. 49:17-22;Lederman e cols. (1996) Curr. Opin. Hematol. 3:77-86;Coligan e cols. (1991) Current Protocols in Immunology13:12; Kwekkeboom e cols. (1993) Immunology 79:439-444; enas Patentes U.S. Nos 5.674.492 e 5.847.082, aquiincorporadas por referência.

Em algumas modalidades da invenção o anticorpo anti-CD4 0 é formulado como uma formulação farmacêutica liquida,a composição farmacêutica líquida. 0 anticorpo anti-CD40pode ser preparado com o uso de qualquer método conhecidona técnica, incluindo aqueles métodos revelados acima. Emuma modalidade, o anticorpo anti-CD40 é produzido de formarecombinante em uma linha de células CHO.

Quando o anticorpo anti-CD4 0 é estocado antes de suaformulação, ele pode ser congelado, por exemplo, a < 200C,e então descongelado em temperatura ambiente para posteriorformulação. A formulação farmacêutica líquida compreendeuma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD4 0. A quantidade de anticorpo presente na formulação levaem consideração a via de administração e o volume de dosedesej ado.

Dessa forma, a composição farmacêutica líquidacompreendo anticorpo anti-CD4 0 em uma concentração de cercade 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml, cerca de 0,5 mg/ml acerca de 4 0,0 mg/ml, cerca de 1,0 mg/ml a cerca de 3 0,0mg/ml, cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, cerca de5,0 mg/ml a cerca de 20,0 mg/ml, ou cerca de 15,0 mg/ml acerca de 25,0 mg/ml. Em algumas modalidades, a composiçãofarmacêutica líquida compreendo anticorpo anti-CD40 em umaconcentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 5,0 mg/ml,cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 10,0 mg/ml, cerca de 10,0mg/ml a cerca de 15,0 mg/ml, cerca de 15,0 mg/ml a cerca de20,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml,cerca de 25,0 mg/ml a cerca de 30.0 mg/ml, cerca de 30,0 mg/ml a cerca de 35,0 mg/ml, cerca de 35,0 mg/ml a cerca de40,0 mg/ml, cerca de 40,0 mg/ml a cerca de 4 5,0 mg/ml, oucerca de 45,0 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml. Em outrasmodalidades, a composição farmacêutica líquida compreendoanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 15,0

mg/ml, cerca de 16,0 mg/ml, cerca de 17,0 mg/ml, cerca de18,0 mg/ml, cerca de 19,0 mg/ml, cerca de 20,0 mg/ml, cercade 21,0 mg/ml, cerca de 22,0 mg/ml, cerca de 23,0 mg/ml,cerca de 24,0 mg/ml, ou cerca de 25,0 mg/ml. A composiçãofarmacêutica liquida compreendo anticorpo anti-CD40 e um

tampão que mantém o pH da formulação na faixa de cerca depH 5,0 a cerca de pH 7,0, incluindo cerca de pH 5,0, 5,1,5,2, 5,3, 5,4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3,6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, e outros valores nafaixa de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0. Em algumasmodalidades, o tampão mantém o pH da formulação na faixa decerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,5, cerca de pH 5,0 a cercade pH 6,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH5,5 a cerca de 7,0, cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5, oucerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0.

Qualquer tampão adequado que mantenha o pH daformulação líquida de anticorpo anti-CD40 na faixa de cercade pH 5,0 a cerca de pH 7,0 pode ser usado na formulação,desde que a estabilidade físico-química e atividadebiológica desejada do anticorpo sejam retidas como apontadoacima. Tampões adequados incluem, sem limitação, ácidosconvencionais e sais desses, em que o contra-íon pode ser,por exemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio, ou magnésio.Exemplos de ácidos convencionais e sais desses que podemser usados para tamponar a formulação farmacêutica liquidaincluem, sem limitação, tampões de ácido succínico ousuccinato, ácido cítrico ou citrato, ácido acético ouacetato, ácido tartárico ou tartarato, ácido fosfórico oufosfato, ácido glucônico ou gluconato, ácido glutâmico ouglutamato, ácido aspártico ou aspartato, ácido maleico oumaleato, e ácido málico ou malato. A concentração do tampãona formulação pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM,incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM, 25 mM, 3 0 mM, 35 mM, 4 0 mM, 4 5 mM, 5 0 mM, ou outrosvalores na faixa de cerca de 1 mM a cerca de 5 0 mM. Emalgumas modalidades, a concentração do tampão na formulaçãoé de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14mM, 15 mM, ou outros valores na faixa de cerca de 5 mM acerca de 15 mM.

Em algumas modalidades da invenção, a formulaçãofarmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 e tampão desuccinato ou tampão de citrato em uma concentração quemantém o pH da formulação na faixa de cerca de pH 5,0 acerca de pH 7,0, preferivelmente cerca de pH 5,0 a cerca depH 6,5. por "tampão de succinato" ou "tampão de citrato"entende-se um tampão que compreende um sal de ácidosuccínico ou um sal de ácido cítrico, respectivamente. Emuma modalidade preferida, o contra-íon de succinato oucitrato é o cátion sódio, e assim o tampão é succinato desódio ou citrato de sódio, respectivamente. No entanto,qualquer cátion deve ser eficaz. Outros cãtions desuccinato ou citrato possíveis incluem, sem limitação,potássio, amônio, cálcio, e magnésio. Como acima observado,a concentração do tampão de succinato ou citrato naformulação pode ser de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM,incluindo cerca de 1 mM, 2 mM, 5 mM, 8 mM, 10 mM, 15 mM, 20mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, ou outrosvalores na faixa de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Emalgumas modalidades, a concentração de tampão na formulaçãoé de cerca de 5 mM a cerca de 15 mM, incluindo cerca de 5mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14mM, ou cerca de 15 mM. Em outras modalidades, a formulaçãofarmacêutica líquida compreendo anticorpo anti-CD40 em umaconcentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml,ou cerca de 5,0 mg/ml a cerca de 25,0 mg/ml, e tampão desuccinato ou citrato, por exemplo, tampão de succinato desódio ou citrato de sódio, em uma concentração de cerca de1 mM a cerca de 20 mM, cerca de 5 mM a cerca de 15 mM,preferivelmente cerca de 10 mM.

Quando é desejável para a formulação farmacêuticalíquida que seja próxima de isotônica, a formulaçãofarmacêutica líquida que compreendo anticorpo anti-CD4 0 eum tampão pode compreender também uma quantidade de umaagente de isotonicidade suficiente para tornar a formulaçãopróxima de isotônica. Por "próxima de isotônica" entende-seque a formulação aquosa tem uma osmolaridade de cerca de240 mmol/kg a cerca de 360 mmol/kg, preferivelmente cercade 24 0 a cerca de 34 0 mmol/kg, mais preferivelmente cercade 250 a cerca de 33 0 mmol/kg, ainda mais preferivelmentecerca de 260 a cerca de 320 mmol/kg, still maispreferive lmente cerca de 270 a cerca de 310 mmol/kg.Métodos de determinação da isotonicidade de uma solução sãoconhecidos por aqueles habilitados na técnica. Veja, porexemplo, Setnikar e cols. (1959) J Am. Pharm. Assoc. 48:628.

Aqueles habilitados na técnica estão familiarizadoscom vários solutos farmaceuticamente aceitáveis úteis emfornecer isotonicidade em composição farmacêuticas. Oagente de isotonicidade pode ser qualquer reagente capaz deajustar a pressão osmótica de uma formulação farmacêuticalíquida da presente invenção a um valor quase igual àquelede um fluido corporal. É desejável usar um agente deisotonicidade fisiologicamente aceitável. Portanto, aformulação farmacêutica líquida que compreende a quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40 e um tampãotambém pode compreender componentes que podem ser usadospara fornecer isotonicidade, por exemplo, cloreto de sódio;aminoácidos como alanina, valina, e glicina; açúcares eálcoois de açúcares (polióis), incluindo, sem limitação,glicose, dextrose, frutose, sacarose, maltose, manitol,trehalose, glicerol, sorbitol, e xilitol; ácido acético,outros ácidos orgânicos ou seus sais, e quantidadesrelativamente menores de citratos ou fosfatos. A pessoa dehabilidade comum é ciente de agentes adicionais que sãoadequados para fornecer tonicidade ótima da formulação líquida.

Em algumas modalidades preferidas, a formulaçãofarmacêutica líquida que compreende um anticorpo anti-CD40e um tampão também compreende cloreto de sódio como oagente de isotonicidade. A concentração de cloreto de sódiona formulação dependerá da contribuição de outroscomponentes para a tonicidade. Em algumas modalidades, aconcentração de cloreto de sódio é de cerca de 50 mM acerca de 3 00 mM, cerca de 5 0 mM a cerca de 250 mM, cerca de50 mM a cerca de 200 mM, cerca de 50 mM a cerca de 175 mM,cerca de 50 mM a cerca de 150 mM, cerca de 75 mM a cerca de175 mM, cerca de 75 mM a cerca de 150 mM, cerca de 100 mM acerca de 175 mM, cerca de 100 mM a cerca de 200 mM, cercade 100 mM a cerca de 150 mM, cerca de 125 mM a cerca de 175mM, cerca de 125 mM a cerca de 150 mM, cerca de 130 mM acerca de 170 mM, cerca de 130 mM a cerca de 160 mM, cercade 135 mM a cerca de 155 mM, cerca de 140 mM a cerca de 155mM, ou cerca de 145 mM a cerca de 155 mM. Em uma talmodalidade, a concentração de cloreto de sódio é de cercade 15 0 mM. Em outra modalidades, a concentração de cloretode sódio é de cerca de 150 mM, o tampão é succinato desódio ou citrato de sódio em uma concentração de cerca de 5mM a cerca de 15 mM, a formulação farmacêutica líquidacompreende uma quantidade terapeuticamente eficaz doanticorpo anti-CD4 0 e a formulação tem um pH de cerca de pH5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0,ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5. Em outrasmodalidades, a formulação farmacêutica líquida compreende oanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 0,1mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml ou cerca de 5,0 mg/ml a cercade 25,0 mg/ml, cerca de 150 mM de cloreto de sódio, e cercade 10 mM de succinato de sódio ou citrato de sódio, em umpH de cerca de pH 5,5.

A degradação de proteína devida acongelamento/descongelamento ou corte mecânico durante oprocesso da formulação farmacêutica líquidas da presenteinvenção pode ser inibida por incorporação de tensoativosna formulação para diminuir a tensão de superfície em umainterface solução-ar. Portanto, em algumas modalidades, aformulação farmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, um tampão,e também compreende um tensoativo. Em outras modalidades, aformulação farmacêutica líquida compreende um anticorpoanti-CD40, um tampão, um agente de isotonicidade, e tambémcompreende um tensoativo.

Tensoativos típicos empregados são tensoativos nãoiônicos, incluindo ésteres de polioxietileno sorbitol comopolissorbato 80 (Tween 80) e polissorbato 20 (Tween 20) ;

ésteres de polioxipropileno-polioxietileno como Pluronic

F68; álcoois de polioxietileno como Brij 35; simeticona;

polietileno glicol such as PEG400; lisofosfatidilcolina; epolioxietileno-p-t-octilfenol como Triton X-100. A

estabilização clássica de fármacos por tensoativos ou emulsificantes é descrita, por exemplo, em Levine e cols.

(1991) J. Parenteral Sei. Technol. 45 (3) :160-165, aquiincorporado por referência. Um tensoativo preferidoempregado na prática da presente invenção é polissorbato

80. Quando um tensoativo é incluído, ele é tipicamenteadicionado em uma quantidade de cerca de 0,001 % a cerca de1,0% (w/v), cerca de 0,001% a cerca de 0,5%, cerca de0,001% a cerca de 0,4%, cerca de 0,001% a cerca de 0,3%,cerca de 0,001% a cerca de 0,2%, cerca de 0,005% a cerca de0,5%, cerca de 0,005% a cerca de 0,2%, cerca de 0,01% acerca de 0,5%, cerca de 0,01% a cerca de 0,2%, cerca de0,03% a cerca de 0,5%, cerca de 0,03% a cerca de 0,3%,cerca de 0,05% a cerca de 0,5%, ou cerca de 0,05% a cercade 0,2%.

Portanto, em algumas modalidades, a formulaçãofarmacêutica líquida compreende uma quantidadeterapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CD40, o tampão ésuccinato de sódio ou citrato de sódio em uma concentraçãode cerca de 1 mM a cerca de 50 mM, cerca de 5 mM a cerca de25 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 15 mM; a formulação temum pH de cerca de pH 5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0a cerca de pH 6,0, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,5; ea formulação também compreende um tensoativo, por exemplo,polissorbato 80, em uma quantidade de cerca de 0,001% acerca de 1,0% ou cerca de 0,001% to cerca de 0,5%. Taisformulações podem compreender opcionalmente um agente deisotonicidade, como cloreto de sódio em uma concentração decerca de 50 mM a cerca de 3 00 mM, cerca de 50 mM a cerca de200 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 150 mM. Em outrasmodalidades, a formulação farmacêutica líquida compreendoanticorpo anti-CD40 em uma concentração de cerca de 0,1mg/ml a cerca de 50,0 mg/ml ou cerca de 5,0 mg/ml a cercade 25,0 mg/ml, incluindo cerca de 20,0 mg/ml; cerca de 50mM a cerca de 200 mM de cloreto de sódio, incluindo cercade 150 mM de cloreto de sódio; succinato de sódio oucitrato de sódio a cerca de 5 mM a cerca de 20 mM,incluindo cerca de 10 mM de succinato de sódio ou citratode sódio; cloreto de sódio em uma concentração de cerca de50 mM a cerca de 200 mM, incluindo cerca de 150 mM; eopcionalmente um tensoativo, por exemplo, polissorbato 80,em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 1,0%,incluindo cerca de 0,001% a cerca de 0,5%; em que aformulação farmacêutica líquida tem um pH de cerca de pH5,0 a cerca de pH 7,0, cerca de pH 5,0 a cerca de pH 6,0,cerca de pH 5,0 a cerca de pH 5,5, cerca de pH 5,5 to cercade pH 6,5, ou cerca de pH 5,5 a cerca de pH 6,0.

A formulação farmacêutica líquida pode seressencialmente livre de quaisquer conservantes e outrosveículos, excipientes, ou estabilizantes apontados acima.Alternativamente, a formulação pode incluir um ou maisconservantes, por exemplo, agentes antibacterianos,veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ouestabilizantes acima descritos desde que eles não afetam deforma adversa a estabilidade físico-química do anticorpoanti-CD4 0. Exemplos de veículos aceitáveis, excipientes, eestabilizantes incluem, sem limitação, agentes detamponamento adicionais, co-solventes, tensoativos,antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina,agentes quelantes como EDTA, complexos de metal (porexemplo, complexos Zn-proteína), e polimeros biodegradáveiscomo poliésteres. Uma discussão da formulação e seleção deveículos farmaceuticamente aceitáveis, estabilizantes, eisomolitos pode ser encontrada em Remington'sPharmaceutical Sciences (18th ed.; Mack Publishing Company,Eaton, Pennsylvania, 1990), aqui incorporada porreferência.

"Veículos", como aqui usados, incluem veículos,excipientes ou estabilizadores farmaceuticamenteaceitáveis, que são atóxicos para a célula ou mamífero queestá sendo exposto a ele nas dosagens e concentraçõesempregadas. Freqüentemente, o veículo fisiologicamenteaceitável é uma solução aquosa com pH tamponado. Exemplosde veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampõescomo fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos;antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos combaixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos deaminoácidos); proteínas, tais como albumina sérica,gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como,por exemplo, polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais comoglicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina;monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos,incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantescomo, por exemplo, EDTA; álcoois de açúcar, tais comomanitol ou sorbitol; contra-íons formadores de sal como,por exemplo, sódio; e/ou tensoativos não iônicos como, porexemplo, TWEEN, polietileno glicol (PEG) e Plurônicos.

A administração "em combinação com" um ou mais agentesterapêuticos adicionais inclui a administração simultânea(concomitante) e consecutiva em qualquer ordem.

Depois de a formulação farmacêutica líquida ou outracomposição farmacêutica aqui descrita ser preparada, elapode ser liofilizada para evitar degradação. Métodos para aliofilização de composições líquidas são conhecidos paraaqueles habilitados na técnica. Imediatamente antes de serutilizada, a composição pode ser reconstituída com umdiluente estéril (solução de Ringer, água destilada ou sorofisiológico estéril, por exemplo) que pode incluiringredientes adicionais. Com a reconstituição, a composiçãoé administrada preferivelmente aos indivíduos com o usodaqueles métodos que são conhecidos por aqueles habilitadosna técnica.Em algumas modalidades, o anticorpos anti-CD40 podeser administrado em combinação com pelo menos uma outraterapia conhecida para câncer, incluindo, sem limitaçãocirurgia, terapia por radiação, quimioterapia, terapia comcitocina ou outro anticorpo monoclonal destinado a serutilizado no tratamento do tumor sólido de interesse, emque a terapia para câncer adicional é administrada antes,durante ou subseqüentemente à terapia com anticorpo anti-CD40. Desse modo, quando as terapias combinadascompreenderem a administração de um anticorpo anti-CD40 emcombinação com a administração de outro agente terapêuticocomo com quimioterapia, terapia com citocina ou outroanticorpo monoclonal, os métodos da invenção englobarão aco-administração, usando formulações separadas ou uma únicaformulação farmacêutica, ou a administração consecutiva emqualquer ordem, em que preferivelmente há um período detempo em que ambos agentes ativos (ou todos) exercemsimultaneamente suas atividades terapêuticas. Quando osmétodos da presente invenção compreende regimesterapêuticos combinados, essas terapias poderão ser dadassimultaneamente, ou seja, o anticorpo anti-CD4 0 éadministrado concomitantemente ou dentro do mesmo intervalode tempo que a outra terapia para câncer (ou seja, asterapias acontecem concomitantemente, mas o anticorpo anti-CD40 não é administrado precisamente ao mesmo tempo que aoutra terapia para câncer). Alternativamente, o anticorpoanti-CD40 da presente invenção também pode ser administradoantes ou subseqüentemente à outra terapia de câncer. Aadministração seqüencial das diferentes terapiasanticancerigenas pode ser realizada independentemente dofato de o indivíduo tratado responder à primeira série deterapia para diminuir a possibilidade de remissão ourecidiva. Quando as terapias combinadas compreenderem aadministração do anticorpo anti-CD40 em combinação comadministração de um agente citotóxico, preferivelmente oanticorpo anti-CD40 é administrado antes da administraçãodo agente citotóxico.

Dessa maneira, os anticorpos anti-CD40 sãoadministrados em combinação com pelo menos uma outraterapia para câncer, incluindo, sem limitação, cirurgia, ouprocedimentos cirúrgicos (por exemplo, esplenectomia,hepatectomia, linfadenectomia, leucoforese, transplante decélulas, e outros), terapia por radiação, quimioterapia,opcionalmente em combinação com transplante autólogo demedula óssea, em que agentes quimioterápicos adequadosincluem, sem limitação, fludarabina ou fosfato defludarabina, clorambucil, vincristina, pentostatina, 2-clorodesoxiadenosina (cladribina), ciclofosfamida,doxorrubicina, prednisona, e combinações destes, porexemplo, regimes contendo antraciclina, tais como CAP(ciclofosfamida, doxorrubicina mais prednisona), CHOP(ciclofosfamida, vincristina, prednisona maisdoxorrubicina), VAD (vincristina, doxorrubicina, maisdexametasona), MP (melfalan mais prednisona), e outrosagentes citotóxicos e/ou terapêuticos usados emquimioterapia, tais como mitoxantrona, daunorrubicina,idarrubicina, asparaginase, e antimetabólitos, incluindo,sem limitação, citarabina, metotrexato, 5-fluorouracildecarbazina, 6- tioguanina, 6-mercaptopurina, e nelarabina;outra terapia anticancerígena com anticorpo monoclonal (porexemplo, alemtuzumab (Campath®) ou outro anticorpo anti-CD52 que tem como alvo a glicoproteína da superfíciecelular CD52 em células B malignas); rituximab (Rituxan®) ,o anticorpo totalmente humano HuMax-CD20, R-1594, IMMU-106,TRU-015, AME-133, tositumomab/l-131 tositumomab (Bexxar®),ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) , ou qualquer outroanticorpo terapêutico anti-CD20 que tem como alvo oantígeno CD20 em células B malignas; anticorpo anti-CD19(por exemplo, MT103, um anticorpo bi-específico); anticorpoanti-CD22 (por exemplo, o anticorpo humanizado monoclonalepratuzumab); bevacizumab (Avastin®) ou outro anticorpoanticancerígeno que tem como alvo fator de crescimentoendotelial vascular humano; anticorpo anti-CD22 que temcomo alvo o antígeno CD22 em células B malignas (porexemplo, o anticorpo monoclonal BL-22, uma toxina alfa-CD22) ; anticorpo α-Μ-CSF que tem como alvo fatorestimulante de colônia de macrófagos; anticorpos que têmcomo alvo o ativador do receptor do fator-kappa-B nuclear(RANK) e seu ligante (RANKL) , que são hiper-expressos nomieloma múltiplo; anticorpo anti-CD23 que tem como alvo oantígeno CD23 em células B malignas (por exemplo, IDEC-152) ; anti-CD80 anticorpo que tem como alvo o antígeno CD80(por exemplo, IDEC-114); anticorpo anti-CD38 que tem comoalvo o antígeno CD3 8 em células B malignas; anticorpos quetêm como alvo receptores principais do complexo dehistocompatibilidade de classe II (anticorpos anti-MHC)expressos em células B malignas; outros anticorpos anti-CD4 0 que têm como alvo o antígeno CD4 0 em células Bmalignas (por exemplo, SGN-40); e anticorpos que têm comoalvo o receptor 1 do ligante indutor de apoptoserelacionado ao fator de necrose tumoral (TRAIL-Rl) (porexemplo, o anticorpo monoclonal agonista humano HGS-ETRl) eTRAIL-R2 expresso em diversos tumores sólidos e em tumoresde origem hematopoiética); terapia anticancerígena baseadaem molécula pequena, incluindo, sem limitação, inibidoresde microtubulo e/ou da topoisomerase (por exemplo, oinibidor mitótico dolastatina e análogos de dolastatina; oagente de ligação à tubulina T900607; XL119; e o inibidorde topoisomerase aminocamptotecina) , SDX-105 (hidrocloretode bendamustina), ixabepilona (um análogo de epotilona,também denominado BMS-247550), inibidores da proteínaquinase C, por exemplo, midostaurina ((PKC-412, CGP 41251N-benzoilstaurosporina), pixantrona, eloxatin (um agenteantineoplásico), ganite (nitrato de gálio), Thalomid®(talidomida), derivados imunomoduladores de talidomida (porexemplo, revlimid (anteriormente revimid)), Affinitak™(inibidor anti-senso de proteína quinase C-alfa), SDX-101(R-etodolac, que induz apoptose de linfócitos malignos) ,análogos de segunda geração do nucleosídeo purina como, porexemplo, clofarabina, inibidores da produção da proteínaBcl-2 por células cancerosas (por exemplo, os agentes anti-senso oblimersen e Genasense®), inibidores do proteassoma(por exemplo, Velcade™ (bortezomib)), inibidores demolécula pequena de quinase (por exemplo, CHIR-258) ,inibidores de molécula pequena de VEGF (por exemplo, ZD-64 74), inibidores de molécula pequena de proteína de choquetérmico (HSP) 90 (por exemplo, 17-AAG), inibidores demolécula pequena de histona desacetilases (por exemplo,citodiferenciação híbrida/polar HPC) agentes tais como oácido suberanilohidroxâmico (SAHA) e FR-901228) e agentesapoptóticos tais como Trisenox® (trióxido arsênico) eXcytrin® (motexafin gadolínio); terapias anticancerígenasbaseadas em vacina/imunoterapia, incluindo, sem limitação,abordagens de vacinas (por exemplo, Id-KLH, oncofago,vitaletina), imunoterapia personalizada ou imunoterapiaativa em idiotipo (por exemplo, Imunoterapia PersonalizadaMyVax®, chamada anteriormente GTOP-99), Promune® (CpG 7909,a agonista sintético para receptor 9 toll-like (TLR9)) ,terapia com interferon-alfa, terapia com interleucina-2(IL-2), terapia com IL-12, terapia com IL-15 e terapia comIL-21; terapia com esteróide; ou outra terapiaanticancerígena; em que a terapia anticancerígena adicionalé administrada antes, durante ou subseqüentemente à terapiacom anticorpo antagonista anti-CD40.

Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD40 sãoadministrados em combinação com bortezomib (VELCADE®), emparticular para o tratamento de mieloma múltiplo. WO2005/044855 A2 revela que a combinação de CHIR-12.12 comtratamento de bortezomib aumenta a eficácia da inibição docrescimento tumoral em modelos experimentais de mielomamúltiplo.

Em uma modalidade, os anticorpos anti-CD4 0 sãoadministrados em combinação com IL-2, em particular para otratamento de linfoma de célula B. WO 2005/044294 A2 revelaque a combinação de CHIR-12.12 com tratamento de IL-2resultou em atividade antitumor aditiva contra tumores deNamalwa.

Portanto, a invenção fornece o uso de uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 na manufatura de um medicamento para otratamento de um câncer ou condição pré-maligna que estáassociada a células que expressam CD40 em um pacientehumano heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F), em que o medicamento é coordenadocom tratamento com pelo menos uma outra terapia paracâncer.

Por "coordenado", entende-se que o medicamento quecompreendo anticorpo anti-CD40 deve ser usado antes,durante ou após o tratamento do indivíduo com pelo menosuma outra terapia para câncer.

A invenção também fornece o uso de um anticorpo anti-CD40 na manufatura de um medicamento para o tratamento deum paciente humano para u um câncer ou condição pré-malignaque está associada a células que expressam CD40, em que oreferido paciente humano é heterozigótico ou homozigóticopara FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) e foi pré-tratadocom pelo menos um outro agente oncoterapêutico.

Por "pré-tratado" ou "pré-tratamento" significa que oindivíduo recebeu uma ou mais outras terapias para câncer(ou seja, foi tratado com pelo menos uma outra terapia paracâncer), antes de receber o medicamento que compreende oanticorpo anti-CD40. "Pré-tratado" ou "pré-tratamento"inclui indivíduos que foram tratados com pelo menos umaoutra terapia para câncer em um intervalo de 2 anos, em umintervalo de 18 meses, em um intervalo de 1 ano, em umintervalo de 6 meses, em um intervalo de 2 meses, em umintervalo de 6 semanas, em um intervalo de 1 mês, em umintervalo de 4 semanas, em um intervalo de 3 semanas, em umintervalo de 2 semanas, em um intervalo de 1 semana, em umintervalo de 6 dias, em um intervalo de 5 dias, em umintervalo de 4 dias, em um intervalo de 3 dias, em umintervalo de 2 dias, ou até mesmo em um intervalo de 1 dia,antes do início do tratamento com o medicamento quecompreende o anticorpo anti-CD40. Não é necessário que oindivíduo tenha respondido ao pré-tratamento com a terapiapara câncer anterior, ou com as terapias anteriores. Dessemodo, o indivíduo que recebe o medicamento que compreende oanticorpo antagonista anti-CD40 poderia ter respondido ounão (ou seja, o câncer foi refratário), ao pré-tratamentocom a terapia para câncer anterior, ou a uma ou mais dasterapias para câncer anteriores, em que o pré-tratamentocompreendeu múltiplas terapias para câncer. Exemplos deoutras terapias para câncer para as quais um indivíduo podeter recebido pré-tratamento antes de receber o medicamentoque compreende o anticorpo anti-CD40 incluem, semlimitação, cirurgia; terapia por radiação; quimioterapia,opcionalmente em combinação com transplante autólogo demedula óssea, em que agentes quimioterápicos adequadosincluem, sem limitação, aqueles aqui descritos e em WO2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294; outra terapia com anticorpo monoclonalanticâncer, incluindo, sem limitação, aqueles anticorposanticâncer aqui descritos e em WO 2005/044854, WO2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307, e WO 2005/044294; terapia decâncer com base em molécula pequena, incluindo, semlimitação, as moléculas pequenas aqui descritas e em WO2005/044854, WO 2005/044304, WO 2005/044305, WO2005/044306, WO 2005/044855, WO 2005/044307, e WO2005/044294; terapias para câncer com base emvacina/imunoterapia, incluindo, sem limitação, aquelas aquidescritas e em WO 2005/044854, WO 2005/044304, WO2005/044305, WO 2005/044306, WO 2005/044855, WO2005/044307, e WO 2005/044294; terapia com esteróide; outraterapia para câncer; qualquer combinação desses.

"Tratamento", no contexto do uso coordenado de umanticorpo anti-CD4 0 com uma ou mais de outras terapias paracâncer, é aqui definido como a aplicação ou administraçãodo anticorpo anti-CD4 0 ou da outra terapia para câncer a umindivíduo, ou a aplicação ou administração a um tecidoisolado ou linha de células de um paciente, em que opaciente tem uma doença, um sintoma de uma doença, ou umapredisposição para o desenvolvimento de uma doença, em queo objetivo é o de curar, cicatrizar, aliviar, alterar,remediar, melhorar, ou afetar a doença, os sintomas dadoença, ou a predisposição em relação ao desenvolvimento dadoença. Por "tratamento" também entende-se a aplicação ouadministração de uma composição farmacêutica que compreendeo anticorpo anti-CD4 0 ou outra terapia para câncer a umpaciente, ou a aplicação ou administração de uma composiçãofarmacêutica que compreende o anticorpo anti-CD40 ou outraterapia para câncer a um tecido ou linha de célulasisolada de um paciente, que tem uma doença, um sintoma deuma doença ou uma predisposição para ter uma doença, em quea finalidade seja a curar, cicatrizar, aliviar, alterar,remediar, melhorar, ou afetar a doença, os sintomas dadoença ou a predisposição para a doença.

Em algumas modalidades, a terapia de combinaçãofornece uma melhoria sinérgica na eficácia terapêutica emrelação aos agentes terapêuticos individuais quandoadministrados isoladamente. 0 termo "sinergia" é usado paradescrever um efeito combinado de dois ou mais agentesativos que é maior que a soma dos efeitos individuais decada agente ativo respectivo. Portanto, quando o efeitocombinado de dois ou mais agentes resulta em "inibiçãosinérgica" de uma atividade ou processo, por exemplo,crescimento tumoral, entende-se que a inibição da atividadeou processo é maior que a soma dos efeitos inibidores decada agente ativo respectivo. 0 termo "efeito terapêuticosinérgico" refere-se a um efeito terapêutico observado comuma combinação de duas ou mais terapias em que o efeitoterapêutico (como medido por qualquer um de inúmerosparâmetros) é maior que a soma dos efeitos terapêuticosindividuais observados com as terapias individuaisrespectivas.

Vários aspectos e modalidades da presente invençãoserão agora descritos em maiores detalhes por via exemploapenas. Deve-se perceber que modificação de detalhe podeser feita sem fugir do escopo da invenção.

EXPERIMENTAL

O anticorpo anti-CD4 0 usado nos exemplos abaixo éCHIR-12.12. A produção, seqüenciamento e caracterização doanticorpo CHIR-12.12 é descrita em detalhes nos pedidos depatente internacionais publicados como WO 2005/044854, WO2005/044304, WO 2005/044305, WO 2005/044306, WO2005/044855, WO 2005/044307, e WO 2005/044294. A linha dehibridoma 153.8E2.D10.D6.12.12 (CMCC#12056) que expressa oanticorpo CHIR-12.12 foi depositada com a "American TypeCulture Collection "[ATCC; 10801 University Blvd.,Manassas, Virgínia 20110-2209 (USA)] sob o número deDepósito de Patente PTA-5543.

Exemplo 1: Análise de ADCC em linhas de células

CHIR-12.12 e rituximab foram comparados para suaatividade de ADCC relativa contra várias linhas de célulasB malignas que expressam antígenos CD40 e CD20, incluindolinhas de células de Iinfoma (Daudi, Namalwa) , linhas decélulas de mieloma múltiplo (ARH77, IM-9), uma linha decélulas B-ALL (CCRF-SB), e uma linha de células B-CLL(EHEB).

A eficácia de ADCC e potência medidas como Iisepercentual máxima e ED50, respectivamente, foram comparadaspara CHIR-12.12 e rituximab. Os resultados dessesexperimentos são mostrados nas Figuras IA-IF. Para todas aslinhas de células alvo, CHIR-12.12 foi um mediador maispotente e eficaz de ADCC que rituximab. Nas seis linhas decélulas testadas, o número de moléculas CD20 de superfíciecelular por célula era de 2,6 a 30,8 vezes maior que deCD40. Esses dados mostram que a despeito de apresentarmenos moléculas de CD40 que CD20, linhas de células Bmalignas são mais eficazmente lisadas por CHIR-12.12 querituximab.

Exemplo 2: Análise de ADCC em células de pacientes com CLL

A atividade de ADCC relativa de CHIR-12.12 e rituximabcontra células de CLL primária ex vivo de 8 pacientes foicomparada. CHIR-12.12 exibiu maior ADCC que rituximabcontra CLL de todos os pacientes (veja, Figura 2A-D eFigura 3). Os percentuais médios de Iise máxima por CHIR-12.12 e rituximab foram de 49 ± 16% e 31 ± 14%,respectivamente. CHIR12.12 foi mais que 10 vezes maispotente que rituximab, como medido por valores de ED50(14,1 μΜ versus 155,5 μΜ, respectivamente).

Desenho de experimento de citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC)

Células alvo: células de paciente com CLL,5.00O/cavidade. Células efetoras: células NK humanasnormais purificadas, 50.000/cavidade. Proporção E:T: 10.concentração de Abs: 0,00001, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, Ieμg/ml. Tempo de incubação: 4 horas. Meio de cultura:RPMI (w/o fenol vermelho) + 10% FBS + 1% P/S. Dispositivode cultura: placa de fundo redondo de 96 cavidades,leitura: liberação de Calceína AM medida por "ArbitraryFluorescent Units" (AFU) com 485 nm excitação/535 nmemissão. Cálculo: % de Iise especifica = 100 χ (AFU teste —AFU de liberação espontânea 1) / (AFU de liberação máxima 2— AFU espontânea). Controle negativo: Calceína liberada porcélulas alvo na ausência de anticorpo ou célula NK.Controle positivo: Calceína liberada por células alvo comIise por detergente (1% NP40).

Os resultados ilustrados nas Figuras 2 e 3 mostram queCHIR-12.12 medeia maior ADCC que rituximab contra célulasde paciente com CLL. A magnitude da diferença de ADCC podedepender das células alvo ou das células doadoras NK masfoi observada contra todas as amostras de paciente. Quandocélulas de CLL de paciente único foram testadas com doisdiferentes doadores de NK, CHIR-12.12 mediou maior ADCC querituximab para ambas células NK doadoras, embora amagnitude da ADCC diferencial não tenha sido idêntica(veja, Figura 4) . A base mecânica para essa ADCC superiordeve incluir os níveis de expressão relativos dos antígenosalvo (CD20 e CD40), a extensão da internalização doanticorpo, e a afinidade do anticorpo para o receptor deFcyIIIa em células NK. Portanto, a influência dessesfatores na atividade de ADCC de CHIR12.12 e rituximab foiinvestigada.

Exemplo 3: Quantificação de moléculas de CD40 e CD20 desuperfície celular

A densidade quantitativa de CD20 e CD40 em células deCLL (Exemplo 3) e o grau de internalização de anticorpo(Exemplo 4) foram investigados como razões potenciais paraa diferença acima descrita na atividade de ADCC. Aatividade relativa de ADCC de CHIR-12.12 e rituximab contracélulas de CLL primárias ex vivo de 9 pacientes foicomparada. CHIR-12.12 exibiu maior ADCC que rituximabcontra CLL de todos os pacientes (veja, Figura 2A-D eFigura 3) . Os percentuais médios de Iise máxima por CHIR-12.12 e rituximab foram de 48 ± 15% e 30 ± 14%,respectivamente. CHIR12.12 foi mais que 10 vezes maispotente que rituximab, como medido por valores de ED50 (13,2 μΜ versus 147,2 μΜ, respectivamente, Figura 6).

A maior atividade de ADCC e eficácia de CHIR-12.12 nãofoi dependente de uma maior densidade de moléculas de CD40de superfície celular, uma vez que foram números 1,3 a 14vezes maiores de moléculas CD20 que CD40 na superfíciecelular (veja, Figura 5 e Figura 6).

Métodos

As células foram pré-incubadas com IgGl humana a 1mg/ml em tampão de coloração (PBS contém 1% BSA, 0,1% NaAzida) para bloquear sítios de ligação não específicos.

Elas foram incubadas por 3 0 minutos a 40C (em gelo). Entãocontrole de isotipo de IgGl humana conjugada a FITC, CHIR-12.12 conjugado a FITC, ou rituximab conjugado a FITC foramadicionados a 100, 10, 1, 0,1 pg/ml, e as células foramincubadas por 30 minutos a 40C (em gelo) . As células foramlavadas com tampão de coloração (PBS+l%FBS+0,1% Azida desódio), e analisadas por FACS Calibur.

A média geométrica de intensidade de fluorescência foimedida por FACS. Moléculas de "Equivalent SolubleFluorchrome" (MESF) foram então calculadas com base nacurva padrão estabelecida por glóbulos FITC calibrados.

Exemplo 4: CHIR-12.12 não induz internalização após ligaçãoa CD40 em linhas de células

Daudi, uma linha de células de Iinfoma, e ARH7 7, umalinha de células de MM, foram usadas to para avaliar oefeito da ligação de CHIR-12.12 sobre a internalização.Células foram incubadas com IgGl humana (anticorpo decontrole) ou CHIR-12.12 a 1 pg/mL em gelo (com 0,1% azidade sódio para bloquear a internalização) ou 37°C (sem azidade sódio) por 3 horas. Depois de uma lavagem com tampão decoloração frio (PBS + 1% BSA + 0,1% azida de sódio), ascélulas foram coradas com IgG-FITC anti-humana de cabra por30 minutos em gelo. A média geométrica de intensidadefluorescente (MFI) foi registradas por FACS Calibur.Nenhuma diferença na MFI foi observada entre as célulasincubadas com CHIR-12.12 em gelo na presença de azida desódio ou a 37°C na ausência de azida de sódio (Figura 7) .Esses dados mostram que CHIR-12.12, com ligação a CD4 0, nãoé internalizado e continua a ser apresentado na superfíciecelular.

Exemplo 5: Internalização de CHIR-12.12 e Rituximab apósligação a células de paciente com CLL : FÀCS e microscopiaconfocal

Metodologia de microscopia confocal

As células foram incubadas com Alexa 488 ou CHIR-12.12conjugado a FITC, rituximab, e IgGl a 10 pg/ml, por 3 horasa 40°C (com 0.1% azida de Na) ou 37°C (w/o azida de Na) . Ascélulas foram então lavadas e fixadas com 2% formaldeldo, 5min em temperatura ambiente. As células foram então lavadase colocadas em laminas revestidas com poli-L-lisina,montadas, e seladas e então analisadas por imagem confocal.Resultados

Os resultados desses experimentos são ilustrados naFigura 8 (FACS) e Figuras 9 e 10 (microscopia confocal). Osresultados desses experimentos são resumidos na Figura 11.Esses estudos de internalização de anticorpo que usamcélulas primárias de CLL conduzidos por citometria de fluxoe microscopia confocal mostram que com ligação a CD4 0 a37°C, CHIR-12.12 permanece uniformemente distribuído nasuperfície celular, mesmo depois de 3 horas. Em contraste,depois de ligação a 37°C, rituximab é redistribuído em capse internalizado. Esses dados sugerem que a potenteatividade de ADCC de CHIR-12.12 pode ser relacionada a suacapacidade de se apresentar uniformemente na superfície decélulas alvo, permitindo ótima interação com célulasefetoras. Esses resultados sugerem que CHIR12.12 pode sereficaz na mediação de potente ADCC contra células CLL invivo.

Exemplo 6: Análise Biacore de ligação de FcyRIIIa porRituxan® e CHIR-12.12

As afinidade de alelos aal58F e aal58V de FcyRIIIa porCHIR-12.12 e rituximab foi comparada por análise padrãoBiacore®. CHIR-12.12 ligou o alelo aal58F com uma afinidade4,6 vezes maior quando comparado com rituximab (KD de 2,8μΜ versus 13 μΜ, respectivamente). Os resultados desses experimentos são resumidos na tabela a seguir:

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Exemplo 7: O efeito de polimorfismo de ΡσμΗΙΙΙα sobre ADCCpor células efetoras NK

A citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC) (ADCC) é um mecanismo de ação principal para váriosanticorpos monoclonais comercializados e de pesquisa.Rituximab (Rituxan®), comercializado para o tratamento delinfoma folicular não Hodgkin (NHL) e ativo em outrasmalignidades de células B, tem ADCC como um de seusmecanismos de ação primários. Notavelmente, a atividade clínica de rituximab em NHL mostrou estar correlacionadacom o genótipo FcyRIIIa. Pacientes com o polimorf ismo deFcyRIIIa 158aa de V/V ou V/F são mais responsivos arituximab que aqueles com F/F (por exemplo, veja, Cartron ecols. (2002) Blood 99 (3) : 754-758 ou DallOzzo e cols. (2004) Câncer Res. 64:4664-4669).

Nesses experimentos, células NK efetoras purificadasde doadores múltiplos humanos que expressam váriospolimorfismos de FcyRIIIa aal58 foram avaliadas com o usoda linha de células Daudi de linfoma humano como as células alvo (veja, Figuras 12 e 13) . Como ilustrado por aquelasfiguras, CHIR-12.12 induziu potente ADCC com células NK detodos os três genótipos. As ED50S de CHIR-12.12 para Iiseda linha de células Daudi foram 4, 2, e 0,4 μΜ para F/F,V/F e V/V, respectivamente (Figura 13). As ED50S derituximab para Iise da linha de células Daudi foram 53, 21,e 9 μΜ para F/F, V/F, e V/V, respectivamente (Figure 13).

As células NK efetoras purificadas de doadoresmúltiplos humanos que expressam vários polimorfismos deFcyRIIIa aal58 foram também avaliadas com o uso de célulasde paciente com CLL como as células alvo(veja, Figura 14).CHIR-12.12 foi um mediador mais potente de ADCC querituximab contra todas as células de paciente com CLLtestadas (Figura 14). Esses dados sugerem que CHIR-12.12 éum mediador mais potente de ADCC que rituximab, mesmo comcélulas NK do genótipo aal58 V/F ou F/F.

Esses achados são surpreendentes porque seria esperadoque CHIR12.12 seria significativamente menos potente emensaios de ADCC que usam células NK com o polimorfismo deFcyRIIIa 158aa de F/F ou V/F que aquelas com V/V.

Novamente, a atividade clinica de rituximab em NHL mostrouestar correlacionada com o genótipo de FcyRIIIa. Pacientescom o polimorfismo de FcyRIIIa 158aa de V/V ou V/F são maisresponsivos a rituximab que aqueles com F/F. Rituximab étambém um anticorpo monoc lonal IgGl que se liga a umantígeno expresso na superfície de células B, e assim seriaesperado que CHIR-12.12 apresentasse a mesma preferênciapara o polimorfismo FcyRIIIa-158 V. ao contrário,constatou-se que CHIR-12.12 induz potente ADCC com célulasNK de todos os três genótipos.

Muitas modificações e outras modalidades das invençõesaqui apresentadas ocorrem àqueles habilitados na técnica,aos quais essas invenções pertencem, tendo o benefício dosensinamentos apresentados nas descrições anteriormenteapresentadas e nos desenhos associados. Portanto, deve-seentender que as invenções não se limitam às modalidadesespecíficas reveladas e que modificações e outrasmodalidades estão incluídas dentro do escopo dasreivindicações em anexo aqui reveladas. Embora sejam aquiempregados termos específicos, eles são utilizados apenasem um sentido genérico e descritivo e não com finalidadelimitante.

Todas as publicações e pedidos de patente mencionadosnessa são aqui incorporados por referência na mesmaextensão como se cada publicação ou pedido de patenteindividual fosse específica e individualmente indicado paraser incorporado por referência.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Aukerman, Sharon LeaLuqman, Mohammad

<120> Usos de anticorpos anti-CD40

<130> PP028162.0002(319129)

<150> 60/732,730<151> 2005-11-01

<160> 9

<170> Fast SEQ para Windows versão 4.0

<210> 1<211> 720<212> DNA

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Seqüência codificadora para cadeia leve de anticorpoanti-CD40 humano CHIR-12.12

<221> CDS

<222> (1)...(720)

<400> 1

atg gcg ctc cct gct cag ctc ctg ggg ctg cta atg ctc tgg gtctct 48

Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp ValSer

1 5 10 15

gga tcc agt ggg gat att gtg atg act cag tct cca ctc tcc ctgacc 96

Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser LeuThr

20 25 30

gtc acc cct gga gag ccg gcc tcc ate tcc tgc agg tcc agt cagage 144

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser GlnSer

35 40 45

ctc ctg tat agt aat gga tac aac tat ttg gat tgg tacaag 192

ctg cagLeu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu GlnLys

50 55 60

cca ggg cag tct cca cag gtc ctg ate tet ttg ggt tet aat cgggcc 240

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn ArgAla

65 70 75

80

tcc ggg gtc cct gac agg ttc agt ggc agt gga tca ggc aca gatttt 288

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspPhe

85 90 95

aca ctg aaa ate age aga gtg gag gct gag gat gtt ggg gtt tattac 336

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val TyrTyr

100 105 110

tgc atg caa gct cga caa act cca ttc act ttc ggc cct ggg accaaa 3 84

Cys Met Gln Ala Arg Gln Thr Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly ThrLys

115 120 125

gtg gat ate aga cga act gtg gct gea cca tct gtc ttc ate ttcccg 432

Val Asp Ile Arg Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile PhePro

130 135 140

cca tct gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgcctg 480

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val CysLeu

145 150 155

160

ctg aat aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtggat 528

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys ValAsp

165 170 175

aac gcc ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag caggac 576Asn Ala LeuAsp

age aag gacaaa 624Ser Lys AspLys

195

gea gac taccag 672Ala Asp TyrGln

210

ggc ctg agetag 720

Gly Leu Ser

225

Gln Ser Gly180

age acc tacSer Thr Tyr

gag aaa cacGlu Lys His

tcg ccc gtcSer Pro Val230

Asn Ser Gln185

age etc ageSer Leu Ser200aaa gtc tacLys Val Tyr215

aca aag ageThr Lys Ser

Glu Ser Val

age acc ctgSer Thr Leu

gcc tgc gaaAla Cys Glu220

ttc aac aggPhe Asn Arg235

Thr Glu Gln

190acg ctg ageThr Leu Ser205

gtc acc catVal Thr His

gga gag tgtGly Glu Cys

<210> 2<211> 239<212> PRT

<213> Seqüência artificial<22 0 >

<223> Cadeia leve de anticorpo anti-CD40 humano CHIR-12.12<400> 2

Met Ala Leu Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp ValSer

15 10 15

Gly Ser Ser Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser LeuThr

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser GlnSer

35 40 45

Leu Leu Tyr Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu GlnLys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Val Leu Ile Ser Leu Gly Ser Asn ArgAla

65 70 75

80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspPheThr Leu LysTyr

Cys Met GlnLys

115

Val Asp IlePro

130Pro Ser AspLeu145160

Leu Asn AsnAsp

Asn Ala LeuAsp

Ser Lys AspLys

195

Ala Asp TyrGln

210Gly Leu Ser225

85

Ile Ser Arg100

Ala Arg Gln

Arg Arg Thr

Glu Gln Leu150

Phe Tyr Pro

165Gln Ser Gly

180

Ser Thr Tyr

Glu Lys His

Ser Pro Val230

Val Glu Ala105

Thr Pro Phe120

Val Ala Ala135

Lys Ser Gly

Arg Glu Ala

Asn Ser Gln185

Ser Leu Ser

200Lys Val Tyr

215

Thr Lys Ser

90

Glu Asp Val

Thr Phe Gly

Pro Ser Val140

Thr Ala Ser155

Lys Val Gln170

Glu Ser Val

Ser Thr Leu

Ala Cys Glu220

Phe Asn Arg235

95

Gly Val Tyr

110Pro Gly Thr

125

Phe Ile Phe

Val Val Cys

Trp Lys Val175

Thr Glu Gln

190Thr Leu Ser

205

Val Thr His

Gly Glu Cys

<210> 3<211> 2016<212> DNA

<213> Seqüência artificial<22 0 >

<223 > Seqüência codificadora para cadeia pesada deanticorpo anti-CD40 humano CHIR-12.12 (com íntrons)

<400> 3

atggagtttg

ccagtgtcag

gtgcagttgg

gagactctcc

tgtgcagcct

ccaggctcca

ggcaaggggc

ataccatgca

gactccgtga

gctgtatctg

ggctgagctg ggttttcctt gttgctattt taagaggtgt60

tggagtctgg gggaggcgtg gtccagcctg ggaggtccct120

ctggattcac cttcagtagc tatggcatgc actgggtccg180

tggagtgggt ggcagttata tcatatgagg aaagtaatag240

agggccgatt caccatctcc agagacaatt ccaagatcac300caaatgaacaagatgggggtatagcagcacctcctcagcaagtaccaaggctctgggggcacagcggcccggtgtcgtggaactcaggcggtcctcaggactctactcccccagacctacatctgcaacgtggtgagaggccagcacaggcctggacgcatcccggctattcttcacccggaggcctctgttccccaggctctgggcagggggcaggtgctgggctcagataagcccaccccaaaggccaagattccagtaactcccaatcatgcccaccgtgcccaggtggtgccctagagtagcctgctccatctcttcctcagcaccaaacccaaggacaccctcatgtgagccacgaagaccctgaaatgccaagacaaagccgcgctcaccgtcctgcaccaggaaaagccctcccagcccccatgtgcgagggccacatggacatgtaccaacctctgtccctaatcccgggaggagatgaccatcccagcgac

gcctcagaac360

ctgggcctga420

gcccatccgt480

tgggctgcct540

ccctgaccag600

tcagcagcgt660

tgaatcacaa720

gagggagggt780

gcagtcccag840

cccgccccac900

cacaggctag960

cctgccaaga1020

aactctccac1080

cttctctctg1140

aagccagccc1200

atccagggac1260

tgaactcctg1320

gatctcccgg1380

ggtcaagttc1440

ggaggagcag1500

ctggctgaat1560

cgagaaaacc1620

gaggccggct1680

cagggcagcc1740

agaaccaggt1800

tgaggacacgctactggggccttccccctgggtcaaggaccggcgtgcacggtgaccgtggcccagcaacgtctgctggatccagggcagtcatgctcaggtgcccctaagccatatccgtccctcagctcagagcccaaaggcctcgccaggccccagcgggggaccgtacccctgaggaactggtacgtacaacagcaggcaaggagtatctccaaagcggcccacccccgagaaccacagcctgacc

gctgtgtattcagggaacccgcgcccgctatacttccccgaccttcccggccctccagcaaccaaggtggagccaggctccaaggcaggcggagagggtccccaggccctggaggaccctcggacaccttatcttgtgacctccagctcacgggtgctgacagtcttccttcacatgcgttggacggcgtcgtaccgtgtacaagtgcaaccaaaggtggtctgccctgacaggtgtacatgcctggtca

actgtgcgagtggtcaccgtgcaagagcacaaccggtgacctgtcctacagcttgggcacacaagagagtagcgctcctgcccgtctgccttctggctttgcacacaaaggcccctgaccctctcctcccaaaactcacaaggcgggacacacgtccacccttccccccaggtggtggacggaggtgcatggtcagcgtcggtctccaacgacccgtggggagtgaccgcccctgcccccaaggcttctaatcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagaccacgcctccc 1860

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtggacaagagcagg 1920

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgcacaaccactac 1980

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga2016

<210> 4<211> 469

<212> PRT

<213> Seqüência artificial

<220>

<223> Cadeia pesada de anticorpo anti-CD40 humano CHIR-12.12

<400> 4

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu ArgGly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val ValGln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ThrPhe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys GlyLeu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr HisAla

65 70 75

80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser LysIle

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr AlaVal

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro AspTyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr LysGly

130 135 140

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Lys Ser Thr Ser GlyGly

145 150 155

160Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu ProVal

165 170 175

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His ThrPhe

180 185 190

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser ValVal

195 200 205

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys AsnVal

210 215 220

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu ProLys

225 230 235

240

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro GluLeu

245 250 255

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys AspThr

260 265 270

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val AspVal

275 280 285

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp GlyVal

290 295 300

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr AsnSer

305 310 315

320

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp TrpLeu

325 330 335

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu ProAla

340 345 350

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg GluPro

355 360 365

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys AsnGln

370 375 380

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp IleAla

385 390 395

400

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys ThrThr

405 410 415Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser LysLeu

420 425 430

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser CysSer

435 440 445

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser LeuSer

450 455 460

Leu Ser Pro Gly Lys465

<210> 5<211> 469<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Cadeia pesada de variante de anticorpo anti-CD40humano CHIR-12.12

<400> 5

Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu ArgGly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val ValGln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe ThrPhe

35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys GlyLeu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Glu Glu Ser Asn Arg Tyr HisAla

65 70 75

80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser LysIle

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr AlaVal

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Gly Ile Ala Ala Pro Gly Pro AspTyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr LysGlyPro Ser ValGly145160

Thr Ala AlaVal

Thr Val SerPhe

Pro Ala ValVal

195

Thr Val ProVal

210Asn His LysLys225240

Ser Cys AspLeu

Leu Gly GlyThr

Leu Met IleVal

275

Ser His GluVal

290Glu Val HisSer305320

Thr Tyr ArgLeu

Asn Gly LysAla

Pro Ile GluPro

355

Gln Val TyrGln

370Val Ser LeuAla

Phe Pro Leu150

Leu Gly Cys165

Trp Asn Ser180

Leu Gln Ser

Ser Ser Ser

Pro Ser Asn230

Lys Thr His

245Pro Ser Val

260

Ser Arg Thr

Asp Pro Glu

Asn Ala Lys310

Val Val Ser

325Glu Tyr Lys

340

Lys Thr IleThr Leu ProThr Cys Leu

9/16

135

Ala Pro Ser

Leu Val Lys

Gly Ala Leu185

Ser Gly Leu

200Leu Gly Thr

215

Thr Lys Val

Thr Cys Pro

Phe Leu Phe265

Pro Glu Val

280Val Lys Phe

295

Thr Lys Pro

Val Leu Thr

Cys Lys Val345

Ser Lys Ala

360Pro Ser Arg

375

Val Lys Gly

140

Ser Lys Ser155

Asp Tyr Phe170

Thr Ser Gly

Tyr Ser Leu

Gln Thr Tyr220

Asp Lys Arg

235Pro Cys Pro250

Pro Pro Lys

Thr Cys Val

Asn Trp Tyr300

Arg Glu Glu

315Val Leu His330

Ser Asn Lys

Lys Gly Gln

Glu Glu Met380

Phe Tyr Pro

Thr Ser Gly

Pro Glu Pro175

Val His Thr

190Ser Ser Val

205

Ile Cys Asn

Val Glu Pro

Ala Pro Glu255

Pro Lys Asp

270Val Val Asp

285

Val Asp Gly

Gln Tyr Asn

Gln Asp Trp335

Ala Leu Pro

350Pro Arg Glu

365

Thr Lys Asn

Ser Asp Ile385 390 395

400

Val Glu Trp Glu Ser Asn GlyThr

405

Pro Pro Val Leu Asp Ser AspLeu

420

Thr Val Asp Lys Ser Arg TrpSer

435

Val Met His Glu Ala Leu HisSer

450 455

Leu Ser Pro Gly Lys465

395

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

410 415

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

425 430

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

440 445

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

460

<210> 6<211> 612<212> DNA<213> Homo sapiens

<220>

<221> Características mis.<222> (0)...(0)

<223> Seqüência codificadora para isoforma curta de CD4 0humano

<221> CDS

<222> (1)...(612)

<400> 6

atg gtt cgt ctg cctacc 4 8

Met Val Arg Leu ProThr

1 5

gct gtc cat cca gaacta 96

Ala Val His Pro GluLeu

20

ata aac agt cag tgcgtg 144

Ile Asn Ser Gln CysVal

35

ctg cag tgc gtc ctcLeu Gln Cys Val Leu

10

cca ccc act gca tgcPro Pro Thr Ala Cys25

tgt tct ttg tgc cagCys Ser Leu Cys Gln40

tgg ggc tgc ttg ctgTrp Gly Cys Leu Leu

15

aga gaa aaa cag tacArg Glu Lys Gln Tyr30

cca gga cag aaa ctgPro Gly Gln Lys Leu

45agt gac tgcgaa 192Ser Asp CysGlu

50

age gaa ttccac 240Ser Glu PheHis6580

aaa tac tgcacc 288Lys Tyr CysThr

tca gaa acaacg 336Ser Glu ThrThr

agt gag gccggc 3 84Ser Glu AlaGly

115

ttt ggg gtcgag 432Phe Gly ValGlu

130

ccc tgc ccaaaa 4 80Pro Cys ProLys145160

tgt cac cctggt 528Cys His ProGly

aca gag ttcThr Glu Phe

cta gac accLeu Asp Thr70

gac ccc aacAsp Pro Asn85

gac acc ateAsp Thr Ile100

tgt gag ageCys Glu Ser

aag cag attLys Gln Ile

gtc ggc ttcVal Gly Phe150

tgg aca aggTrp Thr Arg165

act gaa acgThr Glu Thr55

tgg aac agaTrp Asn Arg

cta ggg cttLeu Gly Leu

tgc acc tgtCys Thr Cys105

tgt gtc ctgCys Val Leu120gct aca gggAla Thr Gly135

ttc tcc aatPhe Ser Asn

tcc cca ggaSer Pro Gly

gaa tgc cttGlu Cys Leu60

gag aca cacGlu Thr His75

cgg gtc cagArg Val Gln90

gaa gaa ggcGlu Glu Gly

cac cgc tcaHis Arg Ser

gtt tet gatVal Ser Asp140

gtg tca tetVal Ser Ser155

tcg gct gagSer Ala Glu170

cct tgc ggtPro Cys Gly

tgc cac cagCys His Gln

cag aag ggcGln Lys Gly95

tgg cac tgtTrp His Cys110tgc tcg cccCys Ser Pro125

acc ate tgcThr Ile Cys

gct ttc gaaAla Phe Glu

age cct ggtSer Pro Gly175gat ccc cat cat ctt cgg gatggt 576

Asp Pro His His Leu Arg AspGly

180

ctt tat caa aaa ggt ggc caa612

Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln195

<210> 7<211> 203<212> PRT

<213> Homo sapiens

cct gtt tgc cat cct ctt ggt gct

Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala

185 190

gaa gcc aac caa taa

Glu Ala Asn Gln *200

<400> 7

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu LeuThr

1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln TyrLeu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys LeuVal

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys GlyGlu

50 55 60

Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His GlnHis

65 70 75

80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys GlyThr

85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His CysThr

100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser ProGly

115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile CysGlu

130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe GluLys

145 150 155

160Cys His Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro GlyGly

165 170 175

Asp Pro His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly AlaGly

180 185 190

Leu Tyr Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln195 200

<210> 8

<211> 834

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Características mis.<222> (0)...(0)

<223> Seqüência codificadora para isoforma longa de CD4 0humano

<221> CDS<222> (1)...(834)

<400> 8

atg gtt cgt ctg cct ctg cag tgc gtc ctc tgg ggc tgc ttg ctgacc 4 8

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu LeuThr

15 10 15

gct gtc cat cca gaa cca ccc act gca tgc aga gaa aaa cag taccta 96

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln TyrLeu

20 25 30

ata aac agt cag tgc tgt tct ttg tgc cag cca gga cag aaa ctggtg 144

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys LeuVal

35 40 45

agt gac tgc aca gaggaa 192

Ser Asp Cys Thr GluGlu

50

age gaa ttc cta gaccac 240

ttc act gaa acg gaaPhe Thr Glu Thr Glu55

acc tgg aac aga gag

tgc ctt cct tgc ggtCys Leu Pro Cys Gly60

aca cac tgc cac cagSer Glu PheHis6580

aaa tac tgcacc 288Lys Tyr CysThr

tca gaa acaacg 336Ser Glu ThrThr

agt gag gccggc 384Ser Glu AlaGly

115

ttt ggg gtcgag 432Phe Gly ValGlu

130

ccc tgc ccaaaa 4 8 0Pro Cys ProLys145160

tgt cac cctcag 528Cys His ProGln

gca ggc acactg 576Ala Gly ThrLeu

aga gcc ctgate 624Arg Ala LeuIle

Leu Asp Thr70

gac ccc aacAsp Pro Asn85

gac acc ateAsp Thr Ile100

tgt gag ageCys Glu Ser

aag cag attLys Gln Ile

gtc ggc ttcVal Gly Phe150

tgg aca ageTrp Thr Ser

165aac aag actAsn Lys Thr180

gtg gtg ateVal Val Ile

Trp Asn Arg

cta ggg cttLeu Gly Leu

tgc acc tgtCys Thr Cys105

tgt gtc ctgCys Val Leu120gct aca gggAla Thr Gly135

ttc tcc aatPhe Ser Asn

tgt gag accCys Glu Thr

gat gtt gtcAsp Val Val185

ccc ate atePro Ile Ile

Glu Thr His75

cgg gtc cagArg Val Gln90

gaa gaa ggcGlu Glu Gly

cac cgc tcaHis Arg Ser

gtt tet gatVal Ser Asp140

gtg tca tetVal Ser Ser155

aaa gac ctgLys Asp Leu170

tgt ggt cccCys Gly Pro

ttc ggg atePhe Gly Ile

Cys His Gln

cag aag ggcGln Lys Gly95

tgg cac tgtTrp His Cys110tgc tcg cccCys Ser Pro125

acc ate tgcThr Ile Cys

gct ttc gaaAla Phe Glu

gtt gtg caaVal Val Gln175

cag gat cgg

Gln Asp Arg

190ctg ttt gcc

Leu Phe Ala195 200 205

ctc ttg gtg ctg gtc ttt ate aaa aag gtg gcc aag aag cca accaat 672

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro ThrAsn

210 215 220

aag gcc ccc cac ccc aag cag gaa ccc cag gag ate aat ttt cccgac 720

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe ProAsp

225 230 235

240

gat ctt cct ggc tcc aac act gct gct cca gtg cag gag act ttacat 768

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr LeuHis

245 250 255

gga tgc caa ccg gtc acc cag gag gat ggc aaa gag agt cgc atetca 816

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg IleSer

260 265 270

gtg cag gag aga cag tga834

Val Gln Glu Arg Gln *275

<210> 9<211> 277<212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 9

Met Val Arg Leu Pro Leu Gln Cys Val Leu Trp Gly Cys Leu LeuThr

1 5 10 15

Ala Val His Pro Glu Pro Pro Thr Ala Cys Arg Glu Lys Gln TyrLeu

20 25 30

Ile Asn Ser Gln Cys Cys Ser Leu Cys Gln Pro Gly Gln Lys LeuVal

35 40 45

Ser Asp Cys Thr Glu Phe Thr Glu Thr Glu Cys Leu Pro Cys GlyGlu

50 55 60Ser Glu Phe Leu Asp Thr Trp Asn Arg Glu Thr His Cys His GlnHis

65 70 75

80

Lys Tyr Cys Asp Pro Asn Leu Gly Leu Arg Val Gln Gln Lys GlyThr

85 90 95

Ser Glu Thr Asp Thr Ile Cys Thr Cys Glu Glu Gly Trp His CysThr

100 105 110

Ser Glu Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu His Arg Ser Cys Ser ProGly

115 120 125

Phe Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile CysGlu

130 135 140

Pro Cys Pro Val Gly Phe Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe GluLys

145 150 155

160

Cys His Pro Trp Thr Ser Cys Glu Thr Lys Asp Leu Val Val GlnGln

165 170 175

Ala Gly Thr Asn Lys Thr Asp Val Val Cys Gly Pro Gln Asp ArgLeu

180 185 190

Arg Ala Leu Val Val Ile Pro Ile Ile Phe Gly Ile Leu Phe AlaIle

195 200 205

Leu Leu Val Leu Val Phe Ile Lys Lys Val Ala Lys Lys Pro ThrAsn

210 215 220

Lys Ala Pro His Pro Lys Gln Glu Pro Gln Glu Ile Asn Phe ProAsp

225 230 235

240

Asp Leu Pro Gly Ser Asn Thr Ala Ala Pro Val Gln Glu Thr LeuHis

245 250 255

Gly Cys Gln Pro Val Thr Gln Glu Asp Gly Lys Glu Ser Arg IleSer

260 265 270

Val Gln Glu Arg Gln275

Claims (60)

1. Método para o tratamento de um paciente humanopara um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD40, caracterizado pelo fato que oreferido paciente humano é heterozigótico ou homozigóticopara FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F), o métodocompreendendo a administração ao referido paciente humanode uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamenteeficaz de um anticorpo anti-CD40.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer de linhagem de células B.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2,caracterizado pelo fato de que o referido câncer delinhagem de células B é selecionado do grupo que consisteem leucemia Iinfoblástica aguda (ALL), leucemia linfociticacrônica (CLL), leucemia pró-Iinfocítica (PLL), leucemialinfocitica pequena (SLL), leucemia ce célula pilosa,doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia deWaldenstrom, doença de cadeia pesada, e os linfomas comolinfoma linfocítico pequeno difuso, folicular, DLBCL,linfoma de tecido linfóide associado à mucosa, linfoma decélula B monocitóide, linfoma esplênico, granulomatoselinfomatóide, linfomatose intravascular, linfomaimunoblástico e linfoma relacionado à AIDS.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade hematológica decélula não B.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4,caracterizado pelo fato de que a referida malignidadehematológica de célula não B é leucemia mielocitica aguda.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um tumor sólido.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6,caracterizado pelo fato de que o referido tumor sólido éselecionado do grupo que consiste em ovário, pulmão (porexemplo, câncer de pulmão de célula não pequena docarcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinomade célula grande e câncer de pulmão de célula pequena) ,mama, cólon, rim (incluindo, por exemplo, carcinomas decélulas renais), bexiga, fígado (incluindo, por exemplo,carcinomas hepatocelulares), gástrico, cervical, próstata,nasofaríngeo, e tireóide (por exemplo, carcinoma papilar datireóide), cânceres cutâneos como melanoma, e sarcomas(incluindo, por exemplo, osteossarcomas e sarcomas deEwing).

8. Método, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer ou condição pré-malignaassociada com células que expressam CD20.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade de célula B.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer ou condição pré-malignaassociada com células que expressam tanto CD40 quanto CD20.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade de célula B.

12. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD4 0 é administrado por uma via de administraçãoparenteral.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é administrado por via intravenosa ou subcutânea.

14. Uso de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40caracterizado para a manufatura de um medicamento para otratamento de um câncer ou condição pré-maligna que estáassociada a células que expressam CD4 0 em um pacientehumano heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIa-158F(genótipo V/F ou F/F).

15. Uso, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer de linhagem de célula B.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 15,caracterizado pelo fato de que o referido câncer delinhagem de células B é selecionado do grupo que consisteem leucemia Iinfoblástica aguda (ALL), leucemia linfociticacrônica (CLL), leucemia pró-Iinfocítica (PLL), leucemialinfocitica pequena (SLL), leucemia de célula pilosa,doença de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia deWaldenstrom, doença de cadeia pesada, e os linfomas comolinfoma linfocítico pequeno difuso, folicular, DLBCL,linfoma de tecido linfóide associado à mucosa, linfoma decélula B monocitóide, Iinfoma esplênico, granulomatoselinfomatóide, linfomatose intravascular, linfomaimunoblástico e linfoma relacionado à AIDS.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade hematológica decélula não B.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 17,caracterizado pelo fato de que a referida malignidadehematológica de célula não B é leucemia mielocitica aguda.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um tumor sólido.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 19,caracterizado pelo fato de que o referido tumor sólido éselecionado do grupo que consiste em ovário, pulmão (porexemplo, câncer de pulmão de célula não pequena docarcinoma de células escamosas, adenocarcinoma e carcinomade célula grande e câncer de pulmão de célula pequena) ,mama, cólon, rim (incluindo, por exemplo, carcinomas decélulas renais), bexiga, fígado (incluindo, por exemplo,carcinomas hepatocelulares), gástrico, cervical, próstata,nasofaríngeo, e tireóide (por exemplo, carcinoma papilar datireóide), cânceres cutâneos como melanoma, e sarcomas(incluindo, por exemplo, osteossarcomas e sarcomas deEwing).

21. Uso, de acordo com a reivindicação 14,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer ou condição pré-malignaassociada com células que expressam CD20.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade de célula B.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 21,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é um câncer ou condição pré-malignaque é associada com células que expressam tanto CD4 0 quantoCD20.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 23,caracterizado pelo fato de que o referido câncer oucondição pré-maligna é uma malignidade de célula B.

25. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24, caracterizadopelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 éadministrado por uma via de administração parenteral.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 25,caracterizado pelo fato de que o referido medicamento éformulado para administração por via intravenosa ousubcutânea.

27. Método para a inibição de produção de anticorpopor células B em um paciente humano heterozigótico ouhomozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) ,caracterizado pelo fato que compreende a administração aoreferido paciente humano de uma quantidade eficaz de umanticorpo anti-CD40.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humanotem um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD4 0.

29. Uso de uma quantidade eficaz de um anticorpoanti-CD4 0 na manufatura de um medicamento caracterizadopara a inibição de produção de anticorpo por células B emum paciente humano heterozigótico ou homozigótico paraFcyRIIIa-158F (V/F ou F/F).

30. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28ou 29, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpoanti-CD4 0 é um anticorpo monoclonal humano.

31. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 30,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpomonoclonal anti-CD40 humano compreende uma região constantede cadeia pesada de IgGl humana.

32. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 31,caracterizado pelo fato de que a referida região constantede cadeia pesada de IgGl humana compreende a seqüência deaminoácidos apresentada em Id. de Seq. N0:4 ou Id. de Seq.N0 : 5 .

33. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o referidoanticorpo anti-CD40 é livre de significante atividadeagonista.

34. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32 ou 33, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD40 é um antagonista desinalização de CD40-CD40L em células que expressão CD40.

35. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que oreferido anticorpo anti-CD4 0 é selecionada do grupo queconsiste em:a) o anticorpo monoclonal CHIR-12.12;b) o anticorpo monoclonal produzido pela linha decélulas de hibridoma 12.12;c) um anticorpo monoclonal que compreende umaseqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consistena seqüência mostrada em Id. de Seq. N°:2, a seqüênciamostrada em Id. de Seq. N° :4, a seqüência mostrada em Id.de Seq. N° :5, ambas seqüências mostradas em Id. de Seq.N° :2 e Id. de Seq. N° :4, e ambas seqüências mostradas emId. de Seq. N°:2 e Id. de Seq. N°:5;d) um anticorpo monoclonal que tem uma seqüência deaminoácidos codificada por uma molécula de ácido nucleicoque compreende uma seqüência de nucleotideos selecionada dogrupo que consiste na seqüência mostrada em Id. de Seq.N° :1, a seqüência mostrada em Id. de Seq. N° :3, e ambasseqüências mostradas em Id. de Seq. N° :1 e Id. de Seq.N° : 3;e) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopocapaz de ligar o anticorpo monoclonal produzido pela linhade células de hibridoma 12.12;f) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-87 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N°:7 ou Id. de Seq. N°:9;g) um anticorpo monoclonal que se liga a um epitopoque compreende resíduos 82-89 da seqüência de CD40 humanomostrada em Id. de Seq. N0:7 ou Id. de Seq. N0 :9;h) um anticorpo monoclonal que compete com oanticorpo monoclonal CHIR-12.12 em um ensaio de ligaçãocompetitivo;i) o anticorpo monoclonal do item anterior a) ou umanticorpo monoclonal de qualquer um dos itens anterioresc)-h), em que o referido anticorpo é recombinantementeproduzido; ej) um anticorpo monoclonal que é um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo monoclonal de qualquerum dos itens anteriores a)-i), em que o referido fragmentoretém a capacidade de se ligar especificamente a antígenohumano CD4 0.

36. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é o anticorpo monoclonal CHIR-12.12.

37. Método ou uso, de acordo com a reivindicação 35,caracterizado pelo fato de que o referido fragmento deligação a antígeno é selecionado do grupo que consiste emum fragmento Fab, um fragmento F(ab')2/ um fragmento Fv eum fragmento Fv de cadeia única.

38. Método para identificação de um paciente humanocom um câncer ou condição pré-maligna tratável com umanticorpo anti-CD4 0 e que é refratária ao tratamento comrituximab (Rituxan®), caracterizado pelo fato quecompreende:a) a identificação de um paciente humano com umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD4 0; eb) a determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158do paciente humano (VN, V/F ou F/F);em que o referido câncer ou condição pré-maligna étratável com um anticorpo anti-CD40 se o referido pacientehumano é heterozigótico ou homozigótico para FcyRIIIal58F(genótipo V/F ou F/F).

39. Método para a seleção de uma terapia comanticorpo para o tratamento de um paciente humano que temcâncer ou condição pré-maligna que é refratária aotratamento com rituximab (Rituxan®), caracterizado pelofato que compreende:a) a identificação de um paciente humano com umcâncer ou condição pré-maligna que está associada a célulasque expressam CD4 0 e que é refratário ao tratamento comrituximab (Rituxan®); eb) a determinação do referido genótipo FcyRIIIa-158do paciente humano (VN, V/F ou F/F);em que se o referido paciente humano é heterozigóticoou homozigótico para FcyRIIIa-158F (genótipo V/F ou F/F) ,um anticorpo anti-CD4 0 é selecionado para o tratamento doreferido câncer ou condição pré-maligna.

40. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 ou 39, caracterizadopelo fato de que o referido paciente humano é refratário auma terapia com um agente anticâncer.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano érefratário a uma terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano éresistente a terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

43. Método, de acordo com a reivindicação 41,caracterizado pelo fato de que o referido paciente humano énão responsivo a terapia com um anticorpo monoclonal anti-CD20.

44. Método, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 41, 42 ou 43, caracterizado pelo fato de queo referido anticorpo monoclonal anti-CD20 é rituximab(Rituxin®).

45. Kit para identificação de um paciente humano comum câncer ou condição pré-maligna tratável com um anticorpoanti-CD40, caracterizado pelo fato que compreende reagentespara a determinação do genótipo FcyRIIIa-158 de um pacientehumano.

46. Kit para a seleção de uma terapia com anticorpopara o tratamento de um paciente humano que tem um câncerou condição pré-maligna que é associada com células queexpressam CD40, caracterizado pelo fato que compreendereagentes para determinação do genótipo FcyRIIIa-158 de umpaciente humano.

47. Kit de acordo com a reivindicação 45 ou 46,caracterizado por incluir um micro-arranjo que compreendepelo menos um marcador de 10 ou mais nucleotídeos decomprimento e de uma seqüência adequada para a determinaçãodo genótipo FcyRIIIa-158 de um paciente humano.

48. Kit, de acordo com a reivindicação 45 ou 46,caracterizado pelo fato de compreender oligonucleotídeosadequados para uso como iniciadores em amplificaçãocatalisada por polimerase da região genômica que codificaaminoácido 158 de FcyRIIIa.

49. Kit, de acordo com a reivindicação 45 ou 46,caracterizado por compreender uma ou mais enzimas derestrição adequadas para a determinação do genótipoFcγRIIIa-158 de um paciente humano.

50. Método para o tratamento de um paciente humanopara um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD40, o método caracterizado pelofato que compreende a administração ao referido pacientehumano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 não seja significativamenteinternalizado por células que expressam CD40 após aadministração.

51. Método para o tratamento de um paciente humanopara um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD40, o método caracterizado pelofato que compreende a administração ao referido pacientehumano de uma quantidade terapeuticamente ouprofilaticamente eficaz de um anticorpo anti-CD40, de modoque o anticorpo anti-CD40 permaneça substancialmenteuniformemente distribuído na superfície de células queexpressam CD40 após administração.

52. Método para o tratamento de um paciente humanopara um câncer ou condição pré-maligna que está associada acélulas que expressam CD4 0, o método caracterizado pelofato que compreende a administração ao referido pacientehumano um anticorpo anti-CD40, de modo que uma quantidadeterapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpoanti-CD40 esteja presente na superfície de células queexpressam CD4 0 no referido paciente humano apósadministração.

53. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,caracterizado pelo fato de que o referido método ou usoresulta em citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC) de células que expressam CD4 0 por células naturalkiller (NK) que expressam FcyRIIIa de um paciente humano.

54. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é mais potente que rituximab (Rituxin®) em um ensaiode citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC),em que o ensaio compreende a incubação de células queexpressam CD40 e células que expressam CD20 com célulasnatural killer (NK) isoladas humanas na presença doanticorpo relevante.

55. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 OU 52,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 é mais potente que rituximab (Rituxan®) em um modelode tumor de xenoenxerto de camundongo.

56. Método, de acordo com a reivindicação 55,caracterizado pelo fato de que o referido modelo de tumorde xenoenxerto de camundongo usa a linha de células deIinfoma humano Daudi de uma linha de células de mieloma.

57. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,CD4 0 se liga a CD4 0 humano com uma afinidade (Kd) de pelomenos cerca de IO"6 M a pelo menos cerca de IO"12 M.

58. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD4 0 se liga a FcyRIIIa-158V humano com uma afinidade (KD)de pelo menos cerca de 0,5 μΜ.

59. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD4 0 se liga a FcyRIIIa-158F humano com uma afinidade (KD)de pelo menos cerca de 12 μΜ.

60. Método ou uso, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28,-29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51 ou 52,caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-CD40 se liga a FcyRIIIa-158V humano com uma afinidade (KD)de pelo menos cerca de 0,5 μΜ, e se liga a FcyRIIIa-158Fhumano com uma afinidade (KD) de pelo menos cerca de 12 μΜ.