BRPI0618315A2 - seqüências de peptìdeo derivadas de neurotrofina - Google Patents

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Abstract

SEQUêNCIAS DE PEPTIDEO DERIVADAS DE NEUROTROFINA A presente invenção se refere à sequências de peptídeo capazes de estimular a diferenciação de células neuronais, a sobrevivência de células neurais e a plasticidade neural associada a memória e aprendizado. As sequências de peptideo da invenção são derivadas de proteínas que pertencem aos fatores neurotrófícos, tais como NGF, NT3, Nt4/5 e BDNF. A invenção também se refere à composições farmacêuticas compreendendo fragmentos de peptídeos e usos dos mesmos para o tratamento de uma doença ou condição em que os efeitos do estímulo da diferenciação de células neuronaís, a sobrevivência de células neuronais, estímulo da plasticidade neural associada a memória e aprendizado são benéficos para o tratamento.

Description

"SEQÜÊNCIAS DE PEPTÍDEO DERIVADAS DE NEUROTROFINA"
Campo da Invenção
A presente invenção relaciona-se a seqüências pep-tidicas capazes de estimular a diferenciação celular neuro-nal, sobrevivência celular neural e plasticidade neuronalassociada com memória e aprendizagem. As seqüências peptídi-cas da invenção são derivadas das proteínas pertencendo afatores neurotróficos, tais como NFG, NT3, NT4/5 e BDNF. Ainvenção também se relaciona as composições farmacêuticascompreendendo o referido fragmento peptídico e usos dos mes-mos para tratamento de uma doença ou condição em que os e-feitos da estimulação da diferenciação celular neuronal, so-brevivência celular neuronal, estimulação da plasticidadeneural associada com aprendizagem e memória são benéficaspara tratamento.
Antecedente da Invenção
O crescimento,· manutenção e regeneração de neurô-nios é regulado pelo menos em parte por certos fatores decrescimento polipeptídico, conhecido como neurotrofina(NTs), que se ligam e ativam receptores de superfícies celu-lares da família Trk tendo uma atividade tirosina quinaseintrínseca. Sob ligação da neurotrofina, esses receptoressão acreditados se tornarem autofosforilados em um ou maisresíduos, aminoácidos e subseqüentemente associado com molé-culas intracelulares importantes para a transdução de sinal(Para uma revisão, ver Ulrich & Schlessinger, Cell 1990,61:203-212; Chão, Neuron 1992, 9:583-593).
Neurotrofinas. são proteínas diméricas básicas al-tamente pequenas (aproximadamente 13 kDa) que profundamenteafetam o desenvolvimento do sistema nervoso em todas as es-pécies de vertebrados.
Fator de crescimento nervoso (NGF) é o primeiro emelhor membro CARACTERIZADO da família neurotrofina. Ele e-xiste dentro do SNC como um homodímero, e seu gene é locali-zado no cromossomo 1 (região p21-p22.1). NGF foi mostradopara promover a sobrevivência de neurônios sensórios primá-rios, e neurônios simpatéticos e colinérgicos do cérebro an-terior basal. Tem sido também sido demonstrado que NGF é umfator de proteção contra neurodegeneração induzida por axo-tomia e atrofia relacionada à idade. Tem sido sugerido queNGF desenvolve um papel na patofisiologia e farmacoterapiados distúrbios neurodegenerativas tal como doença de Alzhei-mer. Em adição, isto foi mostrado a diminuição da neurorege-neração significantemente nos neurônios hipocampos expostaspara glutamato nas concentrações tóxicas e preserva a morfo-logia celular (revisado por Salehi et al, 2004; Tuszynski,et al, Nat. Med. 11 de Junho de 2005; ll(6):551-5; Jakubows-ka-Dogru E., Gumusbas U Neurosci. Lett. 1 de Julho de 2005;382 (1-2) : 45-50; Walz R, et al Neurochem Res. 2005 Feb;30 (2) : 185-90; Hu Z et al. Neurobiol Dis. 200-5 Feb;18(1) :184-92).
Fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) éoutro membro bem caracterizado da família neurotrofina. 0gene BDNF está localizado no cromossomo 11, banda pl3. A es-trutura da proteína BDNF é similar com a estrutura do NGF.BDNF é mais abundante no SNC que NGF. Como NGF, BDNF é abun-dante no hipocampo, uma região do cérebro que mantém altograu de plasticidade neural no cérebro adulto, que essenci-almente associada com aprendizagem e memória. É notável quea regulação da expressão de ambos NGF e BDNF dentro do hipo-campo é, pelo menos parcialmente, controlada pelos sistemascolinérgicos e glutamatérgicos. Danos no hipocampo têm sidomostrados para levar a super-regulação da expressão de BDNF.Em adição, BDNF, similarmente a NGF, atua como um fato desobrevivência para os neurônios sensórios primários e coli-nérgicos do cérebro anterior basal. Adicionalmente, BDNF foiencontrado promover sobrevivência de uma grande variação daoutros tipos celulares neuronais, por exemplo, neurônios do-paminérgicos da substância negra, neurônios granulares cere-belares, motoneurônios, neurônios do locus ceruleus e célu-las ganglionais retinais, em que NGF não parece desempenharum papel vital.
Neurotrofina-3 (NT-3) tem uma estrutura altamentesimilar a ambos NGF e BDNF, entretanto,' a" expressão destefator de crescimento no sistema nervoso é um tanto diferentede NGF ou BDNF. Em contraste a NGF e BDNF o nivel de NT-3 noSNC é alto durante o desenvolvimento fetal e o cérebro recémnascido e é reduzido no cérebro adulto. Nivel NT-3 no hipo-campo de animais recém nascidos é significantemente mais al-ta que o nivel de outras neurotropinas. Baseado nesses des-cobrimentos foi proposto que NT-3 desempenha um papel cen-tral no desenvolvimento neuronal precoce e má função destaneurotrofina durante o desenvolvimento do cérebro pode levaras patologias do hipocampo tal como esquizofrenia. Como NGFe BDNF, NT-3 prolonga a sobrevivência dos neurônios sensó-rios primários, em particular células da crista neural, eele aumenta a sobrevivência dos neurônios dopaminérgicos(para revisão ver Shoval e Weizman, 2005).
O quarto membro descrito da família do fator decrescimento neurotrofina é neurotrofina 4/5 (NT-4/5). NT-4/5é como todas as outras neurotrofinas um potente fator de so-brevivência para células neuronais, em particular ele podeter sido mostrado promover a sobrevivência de neurônios sen-sórios da crista neural e placodes, motoneurônios, neurôniosdo cérebro anterior basal e locus ceruleus. Ele também servecomo um fato de diferenciação para neurônios do cérebro an-terior basal e motoneurônios. É envolvido na promoção da re-generação nervosa e atividade sinápticas dos neurônios hipo-campais (para revisão ver Shoval e Weizman, 2005).
Receptor do fator de crescimento nervoso (NGFR) ,também referido como p75NTR devido a sua massa molecular, é oreceptor ubíquo para todas as neurotrofinas. No tempo destadescoberta, NGFR foi considerado um tipo único de proteína.
Subseqüentemente, entretanto, uma grande superfamília de re-ceptores de fator de necrose tumoral foi encontrada para di-vidir a estrutural geral de NGFR (4 ligações ligante extra-celular, repetições ricas em cisteínas, ou RCs, e sinaliza-ção através de associação com, ou dissociação de, interato-res citoplasmáticos). A identificação desta superfamília a-judou a alucidar algumas funções biológicas do NGFR, inclu-indo seu último envolvimento no fator nuclear kappa-B e viasde apoptoses. NGFR/p é primariamente associado com mortecelular. Como um monômero, NGFR liga todos os NTs com baixaafinidade. Afinidade mais alta ligante dos NTs é alcançadapor associação dos fatores com receptor de massa molecularmais alta da família de receptor de quinase tropomiosina(família TRK),- TRKA (NTRKl), TRKB (NTRK2), e TRKC (NTRK3).TRKA, TRKB, e TRKC são específicos para NGF, NT-4/5 e BDNF,e NT-3, respectivamente. NT-3 também se liga a TRKA e TRKB,mas com afinidade significantemente menor (para revisão deNTs e seus receptores ver Bothwell, Science 272:506-507,1996, Carter e Lewin, Neuron 18:187-190, 1997, Bibel e Bar-de, Genes Dev. 14: 2919-2937, 2000).
Ligando NTs aos seus receptores e regulando sualigação é muito complexa e fortemente regulada durante o de-senvolvimento e o adulto. Neurotrofinas e seus receptoressão envolvidos ambos na regulação da função'normal do siste-ma nervoso e na patologia. Tem sido longamente aparente queo desenvolvimento de novos compostos que são capazes de au-mentar e/ou inibir a função de neurotrofinas e/ou atividadede seus receptores pode ser benéfico em termos de desenvol-vimento de novos medicamentos para tratamento de um númerogrande do sistema neural relacionada a doenças. Entretanto,a despeito desta longa necessidade sentida, tais compostostêm sido elusivos no melhor. Como moléculas grandes, a dis-tribuição terapêutica de níveis efetivos de neurotrofinaspor elas mesmas apresenta consideráveis, possivelmente insu-perável, desafios. Entretanto, neurotrofinas naturais podeminteragir com outros receptores, tal como o receptor p75 emneurônios, que é associada com apoptose neuronal e cresci-mento colapsado do cone. Entretanto, esforços prévios paradesenhar agonistas peptidomiméticos e/ou antagonistas de re-ceptores Trk têm também sido sem sucesso. Por exemplo, pep-tideos cíclicos derivados da alça 1 da neurotrofina NGF têmsido reportado a moderadamente mimetizar a atividade de so-brevivência de NGF. Entretanto, esses peptídeos parecem fun-cionar em um p75, de preferência receptor Trk, de maneiradependente (Longe et ai, J. Neurosci. Res. 1997, 48:1-17).Alguns peptídeos cíclicos NGF de alça 4 são referidos paramostrar a atividade de sobrevivência do tipo NGF que é blo-queado por um antagonista Trk. Entretanto, a resposta máximade sobrevivência induzida pelos peptídeos é reportada sersomente 10-15% da resposta máxima promovida pela neurotrofi-na NGF por ela mesma (Xie et al, J. Biol. Chem. 2000, 275:29868-29874; Mallartchouk et al, J. Biol. Chem. 2000, 275:9946-9956).
Versões diméricas bicíclicas e tricíclicas de pep-tídeos BDNF de alça 2 têm sido mostrado ter atividade do ti-po BDNF. De novo, entretanto, a resposta de sobrevivênciamáxima ele induzem é reportada ser somente 30% da respostamáxima promovida- neurotrofina natural. (O'Leary et al, J.Biol. Chem. 2003, 278: 225738-25744). Isto continua a exis-tir, então, um longo sentimento para composições que podemmodular (isto é, aumenta ou inibe) crescimento neuronal erecuperação. Também existe uma necessidade para processos emétodos (incluindo métodos terapêuticos) que efetivamentemodulam o crescimento neuronal e recuperação.
ReferênciasBibel, M.; Bardef Υ. Α., Genes Dev. 14:2 919-2 937, 2000.Bothwell, Μ. Science 272: 506-507, 1996Chão, Neuron 1992, 9:583-593
Carter, Β. D.; Lewin, G. R.: Neuron 18:187-190, 1997D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti T. e Calissano P..,
Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 1993, 90:10989-10993Jakubowska-Dogru, E., Gumusbas, U., Neurosci Lett. 2005,Jul 1;382 (1-2) :45-50
Hu Z et al, Neurobiol Dis. 2005 Feb; 18(1) : 184-92Lee et al. Curr. Opin. Neurobiol. 2001, 11: 281-286
Long et al, JV Neurosci. Res. 1997, 48:1-17Maliartchouk et al, J. Biol. Chem. 2000, 275:994 6-9956O'Leary et al, J. Biol. Chem. 2003, 278: 25738-25744Penkowa M., Giralt M., Lago N., Camats J., Carrasco J.,Hernandez J., Molinero A., Campbell IL., Hidalgo, J. ExpNeurol. 2003, 181:1301-48
Ronn LC, Ralets I. Hartz BP, Bech M, Berezin A, BerezinV, Moller A, Boek E, J. Neurosci. Methods, 2000, 100:25-32.Salehi A, Delcroix JD, Swaab DF, J. Neural Transm. 2004,111:323-45
Shoval G e Weizman A., Eur. Neuropsychopharm. 2005,15:319-329
Thomas K e Davies A., Curr. Biol. 2005. 15:R262-R264Tuszynski MH, et al, Nat. Med. 2005, Jun; 11(6):551-5
Ulrich & Schlessinger, Cell 1990, 61:203-212Walz R, et al Neurochem Res. 2005 Fev; 30(2):185-90Xie et al, J. Biol. Chem. 2000. 275:29868-29874..
Sumário da InvençãoA presente invenção relaciona-se a curtas seqüên-cias peptidicas derivadas de neutrofinas que são muito po-tentes em estimular a diferenciação celular neuronal, sobre-vivência celular neuronal e plasticidade neural associadacom aprendizagem e memória mediada por receptores de neutro-fina. De acordo com a invenção, as seqüências peptidicascompreendem um ou mais motivos aminoácidos comuns que sãoimportantes para atividade biológica dos peptídeos.
Então, no primeiro aspecto, a presente invençãorelaciona-se a uma seqüência peptidica isolada compreendendode 5 a 25 resíduos aminoácidos. contíguos, compreendendo omotivo aminoácido Xp1-D/E-T-xa1-C (motivo I)
Em que
Xp1 é um resíduo aminoácido hidrofóbico, e
Xa1 é K, R, S, A.
Em outro aspecto da invenção, uma seqüência pepti-dica compreendendo motivo (I) pode ainda compreenderou/ambos motivo (II) xp2- (xa) 1- (xa) 2-x+/"-xa2-G ou/e motivo(III) R/K-A/G-L/V/I-T/D-xa2-x+/ˉ
Em que
Xp2 é um resíduo aminoácido básico ou hidrofóbico
(xa) é qualquer resíduo aminoácido ou uma ligação,
x+/ˉ é um resíduo aminoácido carregado, e
Xa2 é qualquer resíduo aminoácido,
A invenção revela seqüências peptidicas particula-res derivadas de NGF, NT3, NT4/5 e BDNF que compreende pelomenos um dos motivos da acima e são capazes de estimular di-ferenciação celular neuronal, sobrevivência celular neuronale/ou plasticidade neural associada com aprendizagem e memó-ria .
Adicionalmente, a invenção relaciona-se a um com-posto compreendendo uma seqüência pêptídica compreendendopelo menos um dos motivos da acima, em particular um compos-to compreendendo uma seqüência derivada de NGF, NT3, NT4/5ou BDNF.
A invenção também se relaciona aos usos das se-qüências peptidicas e compostos compreendendo as mesmas parafabricação de um medicamento e/ou para a produção de um an-ticorpo. A invenção também se relaciona à composições farma-cêuticas compreendendo peptideos, compostos e/ou anticorposda invenção.
Métodos de estimulação de diferenciação celular deneurito, sobrevivência celular neuronal e/ou plasticidadeneuronal associada com aprendizagem e memória compreendendoutilizando peptideos, compostos, anticorpos e/ou composiçõesfarmacêuticas da invenção estão também no objetivo da prote-ção, bem como métodos de tratamento compreendendo adminis-tração a um indivíduo em necessidade de uma quantidade efe-tiva de um peptídeo, composto, anticorpo ou composição far-macêutica da invenção.
Descrição dos desenhos
Figura 1 demonstra o efeito dos peptideos deriva-dos de NGF, NGF-C2, NGF-D e NGF-E, no crescimento do neuritodos neurônios granulares cerebeláres (NGC).
Figura 2 demonstra o efeito de peptideos derivadosde NGF, NGF-Cl e NGF-EE, no crescimento de neurito de CGN.Figura 3 demonstra o efeito de peptideos derivadospor NGF, NGF-E, NGF-EE e NGF-N, na sobrevivência de CGN.
Figura 4 demonstra o efeito de um peptideo deriva-do de BDNF, BDNF-E, no crescimento de neurito de CGN.
Figura 5 demonstra o efeito de um peptideo deriva-do de BDNF, BDNF-EE; no crescimento de neurito de CGN.
Descrição Detalhada da Invenção
Seqüências peptidicas I
Um aspecto da invenção relaciona-se a uma seqüên-cia peptídica compreendendo de 5 a 25 resíduos aminoácidoscontíguos, compreendendo um motivo aminoácido (motivo I)
Xpl-D/E-T-Xal-C
Em que
Xpl é um resíduo aminoácido hidrofóbico, e
Xal é K, R, S ou A.
0 resíduo xpl do motivo (I) de acordo com a inven-ção pode ser qualquer resíduo hidrofóbico, entretanto, emuma modalidade preferida xpl é selecionado de Y, F ou I. En-tão, em uma modalidade preferida ele pode ser Y, em outra Fe ainda em outra modalidade preferida ele pode ser I.
A seqüência peptídica da invenção compreendendo omotivo do acima pode ainda compreender outro motivo aminoá-cido xp2-(xa) i-(xa) 2-x+/"-xa2-G (motivo II),
Em que
Xp2 é um resíduo aminoácido hidrofóbico ou básico,
(xa) é qualquer resíduo aminoácido ou uma ligação,
x+/" é um resíduo aminoácido carregado, e
xB2 é qualquer resíduo aminoácido.Então, outro aspecto da invenção relaciona-se auma seqüência peptidica da seguinte fórmula que compreendeambos os motivo (I) e motivo (II):
<formula>formula see original document page 12</formula>
Em que
X1 é qualquer residuo aminoácido
(x)n é uma ligação ou uma seqüência de quálquerresiduo aminoácido, em que η é um número inteiro de 1 a 5, exp1, xp2, xa1, xa2, (xa) , x+/" são como definidos nasreivindicações 1-9,
de acordo com a invenção xp2 do motivo (II) podeser qualquer residuo aminoácido hidrofóbico, entretanto, épreferido que Xp2 seja selecionado de A, L, P ou Y. Em outramodalidade xp2 pode ser um residuo aminoácido carregado, emuma modalidade preferida um residuo carregado positivamente,por exemplo, K, R ou H. Mais preferido residuo positivamentecarregado de acordo com a invenção é K.
O residuo da posição (xa) do motivo (II) é de a-cordo com a invenção qualquer residuo aminoácido, entretantoalguns resíduos aminoácidos podem ser preferidos nesta posi-ção, tais resíduos aminoácidos preferidos podem ser selecio-nados de A, E, F, I, L, R, S, T ou V. Em algumas modalidadespelo menos um dos resíduos aminoácidos nas posições (xa) po-dem estar ausentes e então o motivo (II) de acordo com a in-venção pode compreender 5 ou 4 resíduos aminoácidos. Em al-gumas modalidades a invenção relaciona-se a uma seqüênciaaminoácida que compreende um motivo xp2-(xa)-x+/_-xa2-G com-preendendo uma ligação peptidica em uma das posições (xa) ,ou a invenção relaciona-se a uma seqüência aminoácida quecompreende motivo xp2-x+/~-xa2-G em que ambos os resíduos (xa)são substituídos para ligações peptídicas. Em algumas moda-lidades ele pode ser preferido que um dos resíduos (xa) au-sentes, em outras modalidades ele pode ser preferido que am-bos (xa) são substituídos por ligações peptídicas.
De acordo com a invenção xa2 pode ser selecionadodos resíduos aminoácidos A, E, G, I, N, R, S ou T, e x+/~ po-dem ser selecionados de D, Ε, K, R ou H.
Além disso, a seqüência aminoácida do acima de a-cordo com a invençã.o pode ainda compreender motivo aminoáci-do
<formula>formula see original document page 13</formula>
(motivo III)
Em que
Xa3 é qualquer resíduo aminoácido, e
X+/~ é um resíduo aminoácido carregado..
Em motivo (III) o resíduo xa3 pode ser selecionadode A, D, R ou S, e X+/~ é selecionado de D, Ε, K, R ou H.
Consequentemente, outro aspecto da invenção rela-ciona-se a uma seqüência peptídica de pelo menos 15 resíduosaminoácidos contíguos que compreende todos os três dos moti-vos acima. Tal seqüência aminoácida pode de acordo com a in-venção ser definida pela seguinte fórmula:
<formula>formula see original document page 13</formula>
Em que
<formula>formula see original document page 13</formula>
Em queΧ1, Xpl, Xp2, Xa1, Xa2, Xa3(Xa), Χ+/" e (X)n são comodiscutidos acima, ou um fragmento da referida seqüência com-preendendo pelo menos 5 resíduos aminoácidos compreendendoum dos seguintes motivos:
XpI-D/E-T-XaI-C (motivo I),
Xp2-(Xa) i-(Xa) 2-X+/"-Xa2-G (motivo II) ou
R/K-A/G-L/V/I-T/D-Xa3-X+/~ (motivo III),
Em que xpl, xp2, xal, xa2, xa3(xa), x+/" são como defi-nidos nas reivindicações 1 a 14.
A seqüência peptídica do acima pode, por exemplo,compreender uma seqüência selecionada das seguintes seqüências:
YETKCRDPNPVDSG (SEQ ID NO:1)FETRCKEARPVKNG (SEQ ID NO:2)YETRCKADNAEEGGPGAG (SEQ ID NO:3)FETKCNPMGYTKEG (SEQ ID NO:4)RIDTACV (SEQ ID NO:5)RIDTSCV (SEQ ID NO:6)CVLSRKAVRRA (SEQ ID NO:7)CALSRKIGRT (SEQ ID NO:8)VCTLLSRTGRA (SEQ ID NO:9)VCTLTIKRGR (SEQ ID NO:10)SSHPIFHRGEFS (SEQ ID NO:11)YAEHKSHRGEYS (SEQ ID NO:12)SETAPASRRGELA (SEQ ID NO:13)HSDPARRGELS (SEQ ID NO:14)TFVKALTMDGKQAAWR (SEQ ID NO:15)TYVRALTSENNKLVGWR (SEQ ID NO:16)SYVRALTADAQGRVGWR (SEQ ID NO:17)SYVRALTMDSKKRIGWR (SEQ ID NO:18)RGIDSKHWNSY (SEQ ID NO:19)RGIDDKHWNSQCKTSQ (SEQ ID NO: 20)RGVDRRHWVSE (SEQ ID NO:21)RGIDKRHWNSQ (SEQ ID NO:22)RIDTACVCVLSRKAVRRA (SEQ ID NO:23)RIDTSCVCALSRKIGRT (SEQ ID NO:24)RIDTACVCTLLSRTGRA (SEQ ID NO:25)RIDTSCVCTLTIKRGR (SEQ ID NO:26)
Ou um fragmento, ou um variante ou um homólogo dosmesmos.
Será entendido que todas as seqüências acima SEQID NOs: 1-26 compreendem pelo menos um dos motivos (I), (II)ou (III) .
Em algumas modalidades uma seqüência peptidica dainvenção pode compreender uma seqüência selecionada das se-qüências identificadas como SEQ ID NOs: 5-22, tal como SEQID NO: 5 ou 6, ou por exemplo, uma seqüência selecionada dasseqüências identificadas como SEQ ID NOs: 7-10, ou~ uma se-qüência selecionada das seqüências identificadas como SEQ IDNOs: 11-14 ou SEQ ID NOs: 15-22, por exemplo, selecionadodas SEQ ID NOs: 15-18 ou SEQ ID NOs: 19-22.
A seqüência peptidica pode também compreender maisque uma das seqüências identificadas como SEQ ID NOs: 5-22.Tal seqüência peptidica pode ser, por exemplo, uma seqüênciaselecionada das seqüências identificadas como SEQ ID NOs: 1-4, ou uma seqüência selecionada da seqüência identificadacomo SEQ ID NOs: 23-26.
De acordo com a invenção as seqüências peptidicaspreferivelmente compreendem 5 a 25 resíduos aminoácidos. En-tão, em uma modalidade uma seqüência peptídica preferida po-de ter o comprimento na variação de 5 a 10 resíduos aminoá-cidos, tais como 6 a 9 resíduos aminoácidos, por exemplo 7 a8 resíduos aminoácidos, ou o comprimento da seqüência peptí-dica pode ser na' variação de 11 a 15 resíduos aminoácidos,tais como, por exemplo, 12 a 14 resíduos aminoácidos, porexemplo, 13 resíduos aminoácidos. O comprimento da seqüênciapeptídica preferida em outra modalidade pode ser na variaçãode 16 a 25 resíduos aminoácidos, por exemplo, 17 a 24 resí-duos aminoácidos, tais como 18-23, por exemplo, 19-22, elepode também ser 20 ou 21 resíduos aminoácidos. Entretanto,em algumas modalidades o comprimento da seqüência peptídicada invenção pode ser mais longa que o comprimento acima men-cionado, por exemplo, ele pode ser na variação de 26-50 re-síduos aminoácidos.
Como é mencionada acima a presente invenção rela-ciona-se a fragmentos, variantes e homólogos das seqüênciaspeptidicas descritas acima, que são definidas como segue:
i) um fragmentos que é uma seqüência que tem pelo'menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais prefe-rivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos70%, mais pref erivelmente pelo menos 80%, mais preferivel-mente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95% docomprimento de uma seqüência correspondendo a uma seqüênciacompreendendo o motivo da invenção em particular uma seqüên-cia selecionada compreendendo o motivo da invenção, em par-ticular uma seqüência selecionada das seqüências de SEQ IDNOs: 1-26. Preferivelmente, o fragmento compreende um motivoda invenção;
ii) uma variante é uma seqüência aminoácida tendopelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, maispreferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelomenos 90%, mais preferivelmente 95% de homologia a uma se-qüência compreendendo o motivo da invenção, em particular auma seqüência selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 1-26ou é uma seqüência aminoácida tendo pelo menos 60%, maispreferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelomenos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais prefe-rivelmente 95% unidos de aminoácidos positivos comparado auma seqüência compreendendo um motivo da invenção, em parti-cular uma seqüência de SEQ ID NOS: 1-26. Um aminoácido unidopositivo é definido aqui como uma identidade ou similaridadedefinida por propriedades físicas e/ou químicas dos aminoá-cidos tendo a mesma posição em duas seqüências comparadas.Aminoácidos unidos positivos preferidos da presente invençãosão KaR, EaD, LaM, QaE, I a V, I a L, A a S, Y a W,KaQ, SaT, N a S e Q a R. A homologia de uma seqüênciaaminoácida com outro aminoácido é definida como uma porcen-tagem de aminoácidos idênticos em duas seqüências combina-das. A homologia das seqüências pode ser calculada utilizan-do algoritmos bem conhecidos tais como BLOSUM 30, BLOSUM 40,BLOSUM 45, BLOSUM 50, BLOSUM 55, BLOSUM 60, BLOSUM 85, ouBLOSUM 90. Preferivelmente, o variante compreende um motivoda invenção;
iii) um homologo é uma seqüência aminoácida quetem menos que 60% mas mais então 30%, tal como 50-59%, porexemplo, 55%, tal como 40-49%, por exemplo, 45%, tal como330-39%, por exemplo, 35% homologia a uma seqüência compre-endendo um motivo da invenção, em particular uma seqüênciade SEQ ID NOs: 1-26. Preferivelmente, o homólogo compreendeum mot.ivo da invenção.
É presumido que fragmentos, variantes e homólogoscomo definido acima permanece pelo menos alguma atividadebiológica das seqüências originais, tal, por exemplo, ativi-dade biológica das seqüências de SEQ ID NOs: 1-26, por exem-plo, a capacidade de estimular a plasticidade neural com di-ferenciação celular neural e/ou associada com memória e a-prendizagem, capacidade de estimular a sobrevivência celu-lar, por exemplo, capacidade de inibir apoptose ou capacida-de de ativar um receptor da familia Trk.
Todas as seqüências descritas acima estão de acor-do com as seqüências de peptideo isoladas da invenção.
Pelo termo "seqüência peptídica isolada" é signi-ficada que a seqüência peptidica é uma entidade química in-dividual. A seqüência peptídica isolada pode ser uma seqüên-cia peptídica natural, sintética ou recombinante ou uma se-qüência preparada por meio de clivagem enzimática/química deum polipeptídeo/proteína maior. Pelo termo "natural" é sig-nificado uma seqüência peptídica que é uma parte do sistemametabólico do corpo e produzido in vivo. Pelo termo "recom-binante" é significado uma seqüência peptídica que é produ-zida por um método de tecnologia recombinante. Tal seqüênciapode ser produzida ambos in vivo e in vitro. Pelo termo"sintético" é uma seqüência que é produzida por meio de sín-tese química.
De acordo com a invenção a seqüência peptídica i-solada pode derivar da seqüência de uma proteína. 0 termo"derivado" significa que a seqüência peptídica isolada temuma seqüência aminoácida que é idêntica com um fragmento in-terno da seqüência aminoácida de uma proteína que foi utili-zada como um protótipo para fazer a referida seqüência pep-tídica isolada utilizando qualquer tecnologia conhecida natécnica, por exemplo, produção recombinante ou síntese química.
Então, uma seqüência peptídica da invenção podecompreender uma seqüência derivada da seqüência de uma pro-teína. Em uma modalidade a seqüência pode derivar de fatorde crescimento nervoso (NGF), por exemplo, da seqüência depolipeptídeo NGF identificado sob SwissProt Acc. No:NP_024 97; em outra modalidade as seqüências podem derivar deneurotrofina-3 (NT-3), por exemplo, da seqüência de polipep-tídeo NT-3 identificado sob SwissProt Acc. No: NP_002518; emainda outra modalidade a seqüência pode derivar de neurotro-fina-4/5 (NT-4/5), por exemplo, da seqüência de polipeptídeoNT-4/5 identificado sob SwissProt Acc. No:AAAV38176, ou elepode derivar do fator neurotrófico derivado de cérebro(BDNF), por exemplo, a partir da seqüência do polipeptídeoBDNF identificado sob SwissProt Acc. No: NP_733928.
Em uma modalidade preferida a invenção se relacio-na a uma seqüência derivada de NGF que pode ser selecionadodas seqüências identificadas como SEQ ID NOs :1, 5, 7, 11,15, 19 ou 23. Em outra modalidade preferida a invenção rela-ciona-se a uma seqüência derivada de NT3, referida seqüênciasendo selecionada das seqüências de SEQ ID NOs: 2, 6, 8, 12,16, 20 ou 24. Ainda em outra modalidade preferida, a inven-ção relaciona-se a uma seqüência derivada de NT4/5. Tal se-qüência pode ser selecionada das seqüências identificadascomo SEQ ID NOs: 3, 5, 9, 13, 17, 21 ou 25. Ainda, em outramodalidade preferida a invenção relaciona-se a uma seqüênciaderivada de seqüência de BDNF. A seqüência tardia pode serselecionada das seqüências identificadas como SEQ ID NOs: 4,6, 10, 14, 18, 22 ou 26.
No presente pedido o código de uma letra padrãopara resíduos aminoácidos é aplicado bem como o padrão docódigo de três letras. Abreviações para aminoácidos estão emacordo com as recomendações na Junta de Comissão IUPAC-IUBna Nomenclatura Bioquímica Eur. J. Biochem., 1984, vol. 184,pp 9-37. Através da descrição e reivindicações ou o códigode três letras ou o código de uma letra para aminoácidos na-turais são utilizados. Onde a forma L ou D não tenha sidoespecificada é para ser entendido que o aminoácido em ques-tão tem a forma natural L, cf. Pure & Appl. Chem. Vol.(56(5) pp 595-624 (1984) ou a forma D, de modo que os peptí-deos formados podem ser constituídos de aminoácidos de formaL, forma D, ou uma seqüência de formas L misturadas e formas D'.
Onde nada é especificado é entendido que o aminoá-cido C- terminal de um peptídeo da invenção existe como umácido carboxilico livre, este pode também ser especificadocomo "-0H"; Entretanto, o aminoácido C-terminal de um com-posto da invenção pode ser o derivado aminado, que é indica-do como "-NH2". Onde nada mais é declarado o aminoácido N-terminal de um polipeptídeo compreende um grupo amino livre,este pode também ser especificado como "H-".
Onde nada mais é especificado aminoácido pode serselecionado de qualquer aminoácido, de ocorrência natural ounão, tal como aminoácidos alfa, aminoácidos beta, e/ou ami-noácidos gama. De acordo, o grupo compreende mas não é limi-tado a: Ala, Vai, Leu, lie, Pro, Phe, Trp, Met, Gly, Ser,Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Asp, Glu, Lys, Arg, His Aib, Nal,.Sar, Orn, análogos de Lisina, DAP, DAPA e 4Hyp.
Também, de acordo com a invenção, modificações doscompostos/peptideos podem ser feitos, tal como, por exemplo,glicosilação e/ou acetilação dos aminoácidos.
Resíduos aminoácidos básicos estão de acordo com ainvenção representada por resíduos de aminoácidos Arg, Lys,e His, resíduos aminoáci.dos acídicos - pelos resíduos dosaminoácidos Glu e Asp. Resíduos aminoácidos e básicos cons-tituem um grupo de resíduos aminoácidos carregados. 0 grupode resíduos aminoácidos hidrofóbicos é representado pelosresíduos de aminoácidos Leu, lie, Vai, Phe, Trp, Tyr e Met.
Em uma modalidade variante pode ser entendido comoseqüências aminoácidas exibindo gradualmente diferindo daseqüência pré-determinada preferida, como o número e alvo deinserções, deleções e substituições incluindo substituiçõesconservativas aumentadas. Esta diferença é medida como umaredução em homologia entre a seqüência pré-determinada e ovariante.
Em um aspecto o termo "variante de uma seqüênciapeptídica" significa que os peptideos podem ser modificados,por exemplo, por substituição de um ou mais dos resíduos a-minoácidos. Ambos L-aminoácidos e D-aminoácidos podem serutilizados. Outra modificação pode compreender derivadostais com ésteres, açúcares etc. Exemplos são metil e acetilésteres.
Em outro aspecto, variantes dos fragmentos peptí-dicos de acordo com a invenção podem compreender, dentro damesma variante, ou fragmentos dos mesmos ou entre variantesdiferentes, ou fragmentos dos mesmos, pelo menos uma substi-tuição, tal como uma pluralidade de substituições introduzi-das independentemente de uma outra. Variantes do complexo,ou fragmentos dos mesmos podem então compreender substitui-ções conservadas independentemente de um outro, em que pelomenos uma glicina (Gly) do referido variante, ou fragmentosdos mesmos é substituído com um aminoácido selecionado dogrupo de aminoácidos consistindo de Ala, Vai, Leu, e Ilef eindependentemente do mesmo, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma alanina (Ala) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com um a-minoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindo deGly, Vai, Leu, e Ilef e independentemente do mesmo, varian-tes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos uma valina(Val) do referido variante, ou fragmentos dos mesmos é subs-tituido com um aminoácido selecionado do grupo de aminoáci-dos consistindo de Gly, Ala, Leu e lle, e independentementedo mesmo, variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelomenos uma leucina (Leu) do referido variante, ou fragmentosdos mesmos é substituído com um aminoácido selecionado dogrupo de aminoácidos consistindo de Gly, Ala, Val e lie, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma isoleucina (Ile) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com um a-minoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindo deGly, Ala, Val e Leu, e independentemente dos mesmos, varian-tes, ou fragmentos dos mesmos em que pelo menos um ácido as-pártico (Asp) do referido variante, ou fragmentos dos mesmosé substituído com um aminoácido selecionado do grupo de ami-noácidos consistindo de Glu, Asn, e Gln, e independentementedos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelomenos uma asparagina (Asn) dos referidos variantes, ou frag-mentos dos mesmos é substituído com um aminoácido seleciona-do do grupo de aminoácidos consistindo de Asp, Glu, e Gln, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos glutamina (Gln) dos referidos va-riantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com um ami-noácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindo deAsp, Glu, e Asn, e em que pelo menos uma fenilalanina (Phe)dos referidos variantes, ou fragmentos dos mesmos é substi-tuído com um aminoácido selecionado do grupo de aminoácidosconsistindo de .Tyr, Trp, His, -Pro, e preferivelmente sele-cionado do grupo de aminoácidos consistindo de Tyr e Trp, eindependentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, em que pelo menos uma tirosina (Tyr) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com um a-minoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindo dePhe, Trp, His, Pro, preferivelmente um aminoácido seleciona-do do grupo de aminoácidos consistindo de Phe e Trp, e inde-pendentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mes-mos, em que pelo menos uma arginina (Arg) do referido frag-mento é substituído com um aminoácido selecionado do grupode aminoácidos consistindo de Lys e His, e independentementedos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelomenos uma lisina (Lys) dos referidos variantes, ou fragmen-tos dos mesmos, é substituído com um aminoácido selecionadodo grupo de aminoácidos consistindo de Arg e His, e indepen-dentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dos mesmos,e independentemente dos mesmos, variantes, ou fragmentos dosmesmos, e em que pelo menos uma prolina (Pro) dos referidosvariantes, ou fragmentos dos mesmos é substituído com um a-minoácido selecionado do grupo de aminoácidos consistindo dePhe, Tyr, Trp e His, e independentemente dos mesmo, varian-tes, ou fragmentos dos mesmos, em que pelo menos uma cisteí-na (Cys) dos referidos variantes, ou fragmentos dos mesmossão substituídos com um aminoácido selecionado do grupo deaminoácidos consistindo de Asp, Glu, Lys, Arg, His, Asn,Gln, Ser, Thr, e Tyr.
Outros critérios para uma variante de uma seqüên-cia peptídica são discutidos acima.
É assim seguido do acima que o mesmo equivalentefuncional de um fragmento peptídico, ou fragmento do referi-do equivalente funcional pode compreender mais que uma subs-tituição aminoácida conservada de mais que um grupo de ami-noácidos conservados como definido áqui acima. 0 termo"substituição de aminoácido conservado" é utilizado sinoni-mamente aqui com o termo "substituição aminoácida homóloga".Os grupos de aminoácidos conservados são como o seguinte:
P, A, G (neutro, fracamente hidrofóbico)
S, T (neutro, hidrofilico)
Q, N (hidrofilico, aminoácido)
E, D (hidrofilico, acidico)
Η, K, R (hidrofilico, básico)
A, L, I, V, M, F, Y, W (hidrofóbico, aromático)
C (formando ligação cruzada)
Substituições conservadas podem ser introduzidasem qualquer posição de um peptideo pré-determinado preferidoda invenção ou fragmento do mesmo. Estas podem, entretantotambém ser desejável introduzir substituições não conserva-das, particularmente, mas não limitado a, uma substituiçãonão conservada em qualquer uma ou mais posições.
Uma substituição não conservada levando a formaçãode um fragmento funcionalmente equivalente do peptideo dainvenção pode, por exemplo, diferir substancialmente na po-laridade, por exemplo, um resíduo com uma cadeia lateral nãopolar (Ala, Leu, Pro, Trp, Vai, lie, Leu, Phe ou Met). subs-tituído por um resíduo com uma cadeia lateral polar tais co-mo Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, ou Gln ou um aminoácidocarregado tais como Asp, Glu, Arg, ou Lys, ou substituindoum resíduo carregado ou um polar para um não polar; e/ou ii)difere substancialmente no seu efeito na orientação do es-queleto peptídico tal como substituição de ou para Pro ouGly por outro resíduo; e/ou iii) difere substancialmente emcarga elétrica, por exemplo, substituição de um resíduo car-regado negativamente tal como Glu ou Asp por um resíduo po-sitivamente carregado tais como Lys, His ou Arg (e vice ver-sa) ; e/ou iv) difere substancialmente em volume estérico,por exemplo, substituição de um resíduo volumoso tais comoHis, Trp, Phe ou Tyr para um tendo uma cadeia lateral menor,por exemplo, Ala, Gly ou Ser (e vice versa).
Substituição de aminoácidos pode em uma modalidadeser feita baseada sob seus valores de hidrofobicidade e hi-drofilicidade e a similaridade relativa de substituintes dacadeia lateral aminoácida, incluindo carga, tamanho, e seme-lhantes. Substituições aminoácidas exemplares que tomam vá-rias das características precedentes em consideração são bemconhecidas por aqueles versados na técnica e incluem: argi-nina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina;glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.
De acordo com a presente invenção a seqüência pep-tídica isolada como descrito acima pode ser formulado comoum composto.
Um composto pode conter uma cópia única de uma se-qüência aminoácida individual selecionada de qualquer das-descritas acima, ou ele pode conter duas ou mais cópias detal seqüência aminoácida. Isto significa que composto da in-venção pode ser formulado como um monômero de uma seqüênciapeptidica, tal como contendo uma seqüência peptídica indivi-dual única, ou ela pode ser formulada como um multimero deuma seqüência peptidica, isto é, contendo duas ou mais se-qüências peptidicas individuais, em que as referidas peptí-dicas individuais podem ser representadas por duas ou maiscópias da mesma seqüência ou por duas ou mais seqüênciaspeptidicas individuais. O multimero pode também compreenderuma combinação da seqüência de tamanho completo e um ou maisfragmentos da referida seqüência. Em uma modalidade um com-posto pode conter duas seqüências aminoácidas, tal compostoé definido aqui como dimero, em outra modalidade um compostopode conter mais que duas seqüências aminoácidas, por exem-plo, três, quatro ou mais seqüências. A presente invençãopreferivelmente relaciona-se a compostos contendo duas ouquatro seqüências da invenção. Entretanto, compostos conten-do 3, 5, 6, 7, 8 ou mais seqüências estão também no objetivoda invenção.
Os fragmentos peptidicos formulados como dimerosou multimeros podem ter as seqüências aminoácidas idênticas,ou eles podem ter seqüências aminoácidas diferentes. Um e-xemplo de tal composto pode ser um composto contendo SEQ IDN0:1 e SEQ ID N0:2. Outro exemplo pode ser um composto con-tendo SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 4. Qualquer outra combinaçãodas seqüências da invenção podem também ser feitas. As se-qüências no composto podem ser conectadas a cada outra atra-vés de uma ligação peptidica, ou conectada a cada outra a-través de uma molécula ou grupo ligador.
Um composto da invenção pode conter duas ou maiscópias idênticas da mesma seqüência, por exemplo, duas có-pias de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs: 1-26, emque as seqüências estão conectadas a outra através de umamolécula ou grupo ligador. Um composto em que as seqüênciasestão conectadas através de um grupo ligador é preferido. Umexemplo de tal grupo ligador pode ser um ácido di-, tri- outetracarboxilico. Ácidos di-, tri- ou tetracarboxilicos a-quirais adequados e um método de produção de tal composto(um método unido a apresentação do ligante (LPA) é descritoem W000187 91 e W02005014623). Outro exemplo de um possívelligador pode ser o aminoácido lisina. Seqüências peptídicasindividuais podem ser ligadas a uma molécula núcleo, por e-xemplo, lisina, formando assim um multímero dendrítico (den-drímero) de uma(s) seqüência(s) peptídica(s) individual(s).Produção de dendrímeros é também bem conhecida na técnica(PCT/US90/02039, Lu et al, (1991) Mol. Immunol. 28:623-630;Defoort et al, (1992) Int. J. Pept. Prot. Res. 40:214-221;Drijfhout et al (1991) Int. J. Pept Prot Res. 37:27-32), edendrímeros são no presente amplamente utilizados na pesqui-sa e nas aplicações médicas. É uma modalidade preferida dainvenção prover um composto dendrímero compreendendo quatroseqüências aminoácidas individuais ligadas ao núcleo lisinada molécula. É também preferido que pelo menos uma das qua-tro seqüências aminoácidas individuais compreendem uma se-qüência aminoácida da fórmula definida acima. É mesmo maispreferido se todas as quatro seqüências aminoácidas de umcomposto dendrimérico individualmente compreenderem uma se-qüência aminoácida de fórmula definida acima.Compostos multiméricos da invenção são preferivel-mente formulados como dimeros LPA ou dendrimeros-lisina. En-tretanto, outros tipos de compostos multiméricos compreen-dendo duas ou mais seqüências individuais da invenção podemser preferidos dependendo das modalidades.II Atividade Biológica
Uma seqüência peptidica da invenção e compostocompreendendo uma seqüência da invenção possui atividade bi-ológica. A invenção preferivelmente relaciona-se a atividadebiológica selecionada da capacidade de
__ estimular a plasticidade neural associada comdiferenciação celular neural, por exemplo, crescimento deneurito ou diferenciação de precursores celulares neurais,
_ estimulando a plasticidade neural associada commemória e aprendizagem, por exemplo, plasticidade morfológi-ca e/ou eficácia sináptica,
_ estimulação de sobrevivência celular, por exem-plo, inibição da apoptose, e
_ modulação da atividade de um receptor de neuro-trofina, por exemplo, um receptor TRK ou p75 (NTR).
Então, em uma modalidade uma seqüência peptidicaisolada como descrito acima é capaz de ligar a um receptorde neurotrofina, que é receptor TRK selecionado de TRKA,TRKB e TRKC. Em uma modalidade preferida, o receptor podeser TRKA, em outra modalidade preferida o receptor pode serTRKB, em ainda outra modalidade preferida o receptor podeser TRKC.
Os autores "da presente invenção têm identificadoos motivos aminoácidos que estão presentes em todas as neu-rotrofinas (NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF) e atividade biológicaassociada de fragmentos peptídicos da presente invenção coma presença desses motivos em suas seqüências. Os motivos deacordo com a invenção são essenciais para ligação das se-qüências peptidicas da invenção a um receptor TRK, isto é,TRKA, B ou C. Receptores TRK são receptores principais nosistema nervoso que dirige a diferenciação de células neu-rais. Receptores TRK são também importantes para promoção dasobrevivência neuronal e são envolvidas na plasticidade neu-ral associada com aprendizagem e memória, isto é, TRKA, B ouC.
Como foi discutido acima os receptores de neuro-trofina desenvolve um importante papel no funcionamento nor-mal do sistema neural, entretanto, os receptores têm tambémsido associados com patologia. Então, tem sido demonstradoefeitos oncogênicos potentes do TRKB e descobrir uma funçãopró-sobrevivência especifica, a habilidade de TRKB para su-primir anoikis (apoptose resultando de perda de interaçõescélula-matriz), que podem contribuir para capacidade metas-tática de células tumorais, provendo uma explanação possívelpara a natureza agressiva de tumores humanos que super-expressam TRKB (Douma, S.; van Laar, T.; Zevenhoven, J. ;Meuwissen, R.; van Garderen, E.; Peeper, D.S.: Suppressionof anoikis and induction of metastasis by the neurotrophicreceptor TrkB. Nature 430:1034-1040, 2004); níveis aumenta-dos de certas neurotrofinas (por exemplo, BDNF) têm sido as-sociados com condições médicas tal como epilepsia (Binder etal, Trends Neurosci. 2001, 24:47-53).
Então, a capacidade de seqüências peptidicas dainvenção de ligação aos receptores de neurotrofina e modula-ção da atividade dos receptores serve para modular qualquerresposta biológica dependente da atividade dos receptoresambos em condições normais e na patologia. Conseqüentemente,a invenção provê um método de modular a atividade de um re-ceptor de neurotrofina, tal como da família TRK, compreen-dendo uso de uma seqüência peptídica isolada da invenção ouum composto compreendendo a referida seqüência. A expressão"atividade modulante de um receptor de neurotrofina" rela-ciona-se a ambos ativando e inibindo a atividade de um re-ceptor de neurotrofina. Em uma modalidade, a invenção rela-ciona-se a um método para ativar um receptor de neurotrofi-na, em outra modalidade a invenção relaciona-se a inibir umreceptor de neurotrofina. 0 receptor de neurotrofina pode emuma modalidade ser TRKA, em outra modalidade TRKB, e aindaoutra modalidade TRKC, e ainda, o receptor pode em algumasmodalidades ser p75 (NTR).
A seqüência peptídica isolada da invenção é capazde estimular a diferenciação celular neuronal. O termo "di-ferenciação neuronal" é entendido como ambos, diferenciaçãode células precursoras neurais, ou células tronco neurais, ediferenciação de neurônios, tal como maturação de neurôniosdiferenciados. Um exemplo, de tal diferenciação pode sercrescimento de neurito de neurônios imaturos, ramificação deneuritos, regeneração de neurônio. Em uma modalidade prefe-rida a invenção pode relacionar-se a estimular a diferencia-ção de precursor neural/células troncos ou neurônios imatu-ros, em outra modalidade preferida a invenção pode relacio-nar-se a estimulação do crescimento de neurito de neurôniosmaduros, por exemplo, neurônios que foram traumatizados massobreviventes. Então, a invenção também se relaciona a ummétodo para estimular a diferenciação celular neuronal com-preendendo o uso de uma seqüência peptidico da invenção oucomposto compreendendo a referida seqüência.
Em algumas modalidades preferidas da invenção poderelacionar-se a atividade das seqüências peptidicas em cone-xão com aprendizagem e memória. Em particular, em uma moda-lidade preferida a invenção relacionar-se a capacidade dasseqüências peptidicas estimulam a plasticidade morfológicade neurônios, por exemplo, formação da espinha dorsal, emoutra modalidade preferida a invenção pode relacionar-se acapacidade de seqüências para promover a eficácia sináptica.Então, a invenção ainda relaciona-se a um método para esti-mular a memória e/ou aprendizagem compreendendo utilizandouma seqüência peptidica da invenção e/ou composto compreen-dendo a referida seqüência. A invenção relaciona-se a ambas,memória de curto termo e memória de longo termo.
Uma seqüência peptidica da invenção é também capazde estimular a sobrevivência celular neuronal. A invençãorelacionar-se a capacidade de estimular a sobrevivência ce-lular neuronal ambos devido ao trauma e devido a uma doençadegenerativa. Conseqüentemente, a invenção ainda relaciona-se a um método para estimular a sobrevivência celular, pre-ferivelmente sobrevivência celular neuronal compreendendouso de uma seqüência peptídica da invenção e/ou compostocompreendendo o mesmo.
As seqüências peptidicas da invenção e compostoscompreendendo o mesmo são biologicamente ativos ambos comosubstâncias solúveis/móveis do meio de crescimento celular esubstâncias imóveis do substrato do crescimento celular. Emalgumas modalidades ele pode ser preferido ao uso de umasubstância peptídica ou composto compreendendo a mesmo comosubstrato celular. Entretanto, seqüências peptidicas solú-veis ou compostos compreendendo as mesmas são mais preferi-dos .
Exemplos não limitados de atividade biológica dasseqüências peptidicas da invenção e compostos compreendendoos mesmos são descritos no pedido (ver especificação da in-venção abaixo e Exemplos).
Estimulação do crescimento de neurito
Substâncias com o potencial de promover o cresci-mento de neurito bem como estimular a regeneração e/ou dife-renciação de células neuronais, tal como certos fatores tró-ficos endógenos, são alvos principais na pesquisa para com-postos que facilitam, por exemplo, regeneração neuronal eoutras formas de plasticidade neuronal. Para avaliar o po-tencial do presente composto, a habilidade de estimular ocrescimento de neurito relacionado a sinalização, interferecom adesão celular, estimula .crescimento de neurito, regene-ração de nervos, pode ser investigado. Compostos da presenteinvenção são mostrados promover crescimento de neurito e éassim considerado serem bons promotores da regeneração dasconexões neuronais, e thereby da recuperação funcional apósdanos bem como promotores da função neuronal em outras con-dições onde tal efeito, é requerido.
No presente contexto "diferenciação" é relacionadoao processo de maturação de neurônios e extensão de neuri-tos, que tomam lugar após a última divisão dos referidosneurônios. Os compostos da presente invenção podem ser capa-zes de parar a divisão celular neural e iniciar a maturaçãodas referidas células, tal como iniciação da extensão dosneuritos. De outra forma, "diferenciação" é relacionada ainiciação do processo de transformação genética, bioquímica,morfológica e fisiológica de células progenitoras neuronais,células neurais imaturas ou células tronco embrionárias paraformação de células tendo características funcionais de cé-lula neuronal normal como tais características são definidasna técnica. A invenção define "célula neural imatura" comouma célula que tem pelo menos uma característica de célulaneural aceita na técnica como um traço característico para acélula neural.
De acordo com a presente invenção um composto com-preendendo pelo menos uma das seqüências peptídicas acima écapaz de estimular o crescimento de neurito. A invenção con-cerns a melhoria/estimulação do crescimento do neurito talcomo cerca de 50% a 75% de.melhoria/estimulação acima do va-lor do crescimento do neurito de células controle/não esti-muladas ou mais estimulação, tal como entre 100%-150%, porexemplo, cerca de 125%, tal como entre 150%-200%, por exem-plo, cerca de 175%, tal como entre 250%-300%, por exemplo,cerca de 275%, tal como entre 300%-350%, por exemplo, cercade 325%, tal como entre 350%-400%, por exemplo, cerca de375%, tal como entre 400%-450%, por exemplo, cerca de 425%,tal como entre 450%-500%, 500%-600% ou mais que 600%.
Estimação da capacidade de um composto candidatoestimular o crescimento de neurito pode ser feito utilizandoqualquer método conhecido ou ensaio para estimação do cres-cimento do neurito tal como, por exemplo, o um descrito noExemplo 1 do presente pedido.
De acordo com a invenção um composto tem atividadeneuritogênica, ambos como um componente imóvel insolúvel dosubstrato de crescimento celular e como um componente solú-vel do meio de crescimento celular. No presente contexto "i-móvel" significa que o composto é ligado/anexado a uma subs-tância que é insolúvel em água ou uma solução aquosa e assimse torna insolúvel em tal solução também. Para aplicaçõesmédicas ambos, compostos insolúveis e solúveis, são conside-rados pelo pedido, entretanto, compostos solúveis são prefe-ridos. Sob "composto solúvel" é entendido um composto, que ésolúvel em água ou uma solução aquosa.
Estimulação da sobrevivência neuronal
Substâncias com o potencial para aumentar célulasneuronais para sobreviver devido ao dano bem como inibir adegeneração e/ou apoptose de células neuronais no trauma edoença, são alvos principais na pesquisa para compostos can-didatos para novos medicamentos para tratamento de doençasneurodegenerativas tais como doenças de Alzheimer ou Parkin-son. Para avaliar o potencial dos presentes peptideos, a ha-bilidade em estimular a sobrevivência relacionada a sinali-zação, interfere com apoptoses relacionadas a reações celu-lares, estimulo a regeneração de nervos pode ser investiga-do. Compostos da presente invenção são mostrados para promo-ver sobrevivência celular neural e diminuir a perda celulare assim considerada ser candidatos para promoção de regene-ração de conexões neurais no cérebro e/ou no sistema neuralperiférico, e assim de recuperação funcional após danos de-vido trauma ou doença bem como promoção de função neuronalem quaisquer outras condições onde tal efeito é requerido.
No presente contexto "sobrevivência" é relacionadoao processo associado com manutenção e/ou recuperação dafunção celular após o dano da célula. Os compostos da pre-sente invenção podem ser capazes de parar ou atenuar os pro-cessos de comprometimento celular com a morte, tal como ini-bindo a apoptose de células neurais iniciadas por dano celu-lar devido a trauma ou doença. De outra forma, "sobrevivên-cia" é relacionada a inibição dos processo associadas com odano celular levando a morte celular e iniciação dos proces-sos de transformação genética, bioquímica, morfológica e fi-siológica ou reconstrução de células, em particular célulasneuronais, tais como células progenitoras, células neuraisimaturas ou células tronco embrionárias ou células neuraismaduras tendo características funcionais normais na técnica.
A invenção define "célula neural imatura" como uma célulaque tem pelo menos uma característica da célula neural' acei-ta na técnica como um traço características para a célula neural.De acordo com a presente invenção um composto com-preendendo pelo menos as seqüências peptidicas acima é capazde estimular a sobrevivência celular neural. A invenção re-laciona-se a estimulação da sobrevivência celular neural talcomo cerca de 75% de estimulação acima do valor de sobrevi-vência de células controle/não estimuladas, por exemplo,50%, tal como 150%, por exemplo, 100%, tal como cerca de250, por exemplo, 200%, tal como cerca de 350%, por exemplo,300%, tal como cerca de 450%, por exemplo, 400%, tal comocerca de 500%.
A estimação da capacidade de um composto candidatopara estimular a sobrevivência celular neural pode ser feitopor uso de qualquer método conhecido ou ensaio para estima-ção de sobrevivência celular, tal como, por exemplo, um des-crito no Exemplo 2 do pedido presente.
De acordo com a invenção um composto tem sobrevi-vência promovendo atividade ambos, como composto insolúvelou solúvel. No presente contexto "insolúvel" significa que ocomposto é ligado/anexado a uma substância que é insolúvelem água ou uma solução aquosa e assim o composto se tornainsolúvel em tal solução também. Por aplicações médicas am-bos, os compostos insolúveis e solúveis são considerados pe-lo pedido, entretanto, entretanto compostos solúveis sãopreferidos. Sob "composto solúvel" é entendido um composto,que é solúvel em água ou uma solução aquosa.
III Produção de seqüências peptidicas individuais
As seqüências peptidicas da presente invenção po-dem ser preparadas por quaisquer métodos sintéticos conven-cionais, tecnologias de DNA recombinante, clivagem enzimáti-ca de proteínas de comprimento inteiro que as seqüênciaspeptídicas são derivadas de, ou uma combinação dos referidosmétodos.
Preparação Recombinante
Então, em uma modalidade os peptídeos da invençãosão produzidos por uso de tecnologias de DNA recombinante.
A seqüência de DNA codificando um peptídeo ou aproteína de comprimento inteiro correspondente o peptídeooriginado de pode ser preparado sinteticamente por métodospadrões estabilizados, por exemplo, o método de fosfoamidinadescrito por Beaucage e Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett.22:1859-1869, ou o método descrito por Matthes et al, 1984,EMBO J. 3:801-805. De acordo com o método fosfoamidina, oli-gonucleotídeos são sintetizados, por exemplo, em um sinteti-zador DNA automático, purificado, anelado, ligado e clonadoem vetores adequados.
A seqüência DNA codificando um peptídeo pode tam-bém ser preparado por fragmentação das seqüências DNA codi-ficando a proteína de comprimento inteiro correspondente depeptídeo original, utilizando DNAase I de acordo com o pro-tocolo padrão (Sambrook et al, Molecular cloning: A Labora-tory manual 2a ed. , CSHL Press, Cold Spring Harbor, NI,1989). A presente invenção relaciona-se a proteínas de com-primento inteiro selecionado dos grupos de proteínas acimaidentificados. 0 DNA codificando as proteínas de comprimentointeiro da invenção pode alternativamente ser fragmentas u-tilizando endonucleases de restrição específicas. Os frag-mentos de DNA são ainda purificados utilizando procedimentospadrões descritos em Sambrook et al, Molecular cloning: ALaboratory manual 2a ed. CSHL Press, Cold Spring Harbor, NI,1989.
A seqüência de DNA codificando uma proteína decomprimento inteiro pode também ser de origem genômica oucDNA, por exemplo, obtida por preparação de uma bibliotecagenômica ou cDNA e selecionando para seqüências de DNA codi-ficando para toda ou parte da proteína de comprimento intei-ro por hibridização utilizando padrões oligonucleotídeossintéticos de acordo com técnicas padrões (cf. Sambrook etal, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold S-pring Harbor, 198 9) . A seqüência de DNA pode também ser pre-parada por reação de polimerase em cadeia utilizando inicia-dores específicos, por exemplo, como descrito em US4.683.202 ou Saiki et al, 1988, Science 239:487-491.
A seqüência de DNA é então inserida em um vetor deexpressão recombinante, que pode ser qualquer vetor, que po-de convenientemente ser sujeito a procedimentos de DNA. Aescolha do vetor sempre dependerá da célula hospedeira emque ele possa ser introduzido. Então, o vetor pode ser umvetor autonomicamente replicante, isto é, vetor que existecomo uma entidade extracromossomal, a replicação do qual éindependente da replicação cromossomal, por exemplo, umplasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um qual, quan-do introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no ge-noma da célula hospedeira e replicado junto com o(s) cromos-somo (s) no qual ele tem sido integrado.No vetor, a seqüência de DNA codificando um peptí-deo ou uma proteína de comprimento inteiro deve ser.de ma-neira operável conectada a uma seqüência promotora adequada.O promotor pode ser qualquer seqüência DNA. O promotor podeser qualquer seqüência DNA, que mostra atividade transcri-cional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivadade genes codificando proteínas ou homólogas ou heterólogas acélula hospedeira. Exemplos de promotores adequados para di-recionar a transcrição da seqüência de DNA codificante emcélulas mamíferas são o promotor SV 40 (Subramani et al,
1981, Mol. Cell. Biol. 1:854-864), o promotor MT-I (gene me-talotioneína) (Palmiter et al, 1983, Science 222:809-814) oupromotor principal tardio adenovírus 2. Um promotor adequadopara uso em células de inseto é o promotor poliedrina (Vasu-vedan et al, 1992, FEBS Lett. 311:7-11). Promotores adequa-dos para uso em células hospedeiras leveduras incluem promo-tores de genes glicolíticos de levedura (Hitzeman et al,1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber e Kawasaki,1982, J. Mol. Appl. Gen. l:.419-434) ou genes álcool deidro-genases (Young et al, 1982, em Genetic Engineering of Micro-organisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., PlenumPress, Nova Iorque), ou promotores o TPIl (US 4.599.311) ouADH2-4c (Russell et al, 1983, Nature 304:652-654). Promoto-res adequados para uso em células hospedeiras em fungos fi-lamentosos são, por exemplo, o promotor ADH3 (McKnight etal, 1985, EMBO J. 4:2093-2099) ou o promotor tpiA.
A seqüência DNA codificante pode também ser deforma orperável conectada a um terminador adequado, tal comoo terminador do hormônio de crescimento humano (Palmiter etal, supre citado) ou promotores (para hospedeiros fúngicos)o TPIl (Alber e Kawasaki, supre citado) ou ADH3 (McKnight etal, supre citado). O vetor pode ainda compreender elementostal como sinais de poliadenilação (por exemplo, região de SV40 ou o adenovirus 5 Elb), seqüências reforçadoras transcri-cional (por exemplo, reforçador SV 40) e seqüências reforça-doras transcricional (por exemplo, um codificando adenovirusVA RNAs).
O vetor de expressão recombinante pode ainda com-preender uma seqüência DNA permitindo o vetor para replicarna célula hospedeira em questão. Um exemplo de tal uma se-qüência (quando a célula hospedeira é uma célula mamífera) éa origem SV 4 0 de replicação. O vetor pode também compreen-der um marcador selecionável, por exemplo, um gene o produtodo qual complemento um defeito na célula hospedeira, tal co-mo o gene codificando para diidrofolato redutase (DHFR) ouum que confira resistência a um fármaco, por exemplo, neomi-cina, hidromicina ou metotrexato.
Os procedimentos utilizados para ligar as seqüên-cias de DNA codificando os peptídeos ou proteínas de compri-mento inteiro, o promotor e o terminador, respectivamente, epara inserir os mesmos nos vetores adequados contendo a in-formação necessária para replicação, são bem conhecidos pe-los versados na técnica (cf, por exemplo, Sambrook et al,supre citado).
Para obter os peptídeos recombinantes da invençãocodificando seqüências DNA pode ser úteis fundidas com umasegunda seqüência codificando peptidica e uma seqüência co-dificando o sitio de clivagem de protease, dando uma cons-trução de DNA codificando a proteína de fusão, em que o sí-tio de clivagem de protease codificando a seqüência posicio-nada entre o fragmento HBP e DNA codificando segundo peptí-deo, inserido em um vetor de expressão recombinante, e ex-pressa em células hospedeiras recombinantes. Em uma modali-dade, o referido segundo peptídeo selecionado de, mas nãolimitado pelo grupo compreendendo glutationa-S-redutase, ti-mosina de bezerro, tioredoxina bacteriana ou ubiquitina na-tural humana ou variantes sintéticos, ou peptídeos dos mes-mos. Em outra modalidade, uma seqüência peptidica compreen-dendo um sítio de clivagem de protease pode ser o Fator Xa,com a seqüência aminoácida IEGR, enteroquinase, com a se-qüência aminoácida DDDDK, trombina, com a seqüência aminoá-cida LVPR/GS, ou Acharombacter Iyticusr com a seqüência ami-noácida XKX, sítio de clivagem.
A célula hospedeira em que o vetor de expressão éintroduzido pode ser qualquer célula que é capaz de expres-sar os peptídeos ou proteínas de comprimento inteiro, e épreferivelmente uma célula eucariótica, tais como célulasinvertebradas (inseto) ou células vertebradas, por exemplo,Xenopus laevis oocytes ou células mamíferas, em particularinsetos e células mamíferas. Exemplos de linhagens de célu-las mamíferas adequadas são linhagens HEK293 . (ATCC CRL-1573), COS (ATCC CRL-1650), BHK (ATCC CRL-1632, ATCC CCL-10)ou CHO (ATCC CCL-61). Métodos de transfecção de células ma-míferas e expressando seqüências de DNA introduzidas em cé-lulas são descritas em, por exemplo, Kaufman e Sharp, J.Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621; Southern e Berg, 1982, J.Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al, 1982, Proc. Natl.Acad. Sei. EUA 79: 422-426; Wigler et al, 1978, Cell 14:725;
Corsaro e Pearson, 1981, em Somatic Cell Genetics 7, p. 603;Graham e van der Eb, 1973, Viról. 52:456; e Neumann et al,1982, EMBO J. 1:841-845.
Alternativamente, células fúngicas (incluindo cé-lulas de levedura) podem ser utilizadas como células hospe- deiras. Exemplos de células de levedura adequadas incluemcélulas de Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomyces spp. ,em particular cepas de Saccharomyees eerevísiae. Exemplos deoutras células fúngicas são células de fungos filamentosos,por exemplo, Aspergillus spp. ou Neurospora spp., em parti- cular cepas de Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. Ouso de Aspergillus spp. para a expressão de proteínas é des-crito, por exemplo, EP 238 023.
Os meios utilizados para cultura as células podemser qualquer meio convencionado adequado para crescimento de células mamíferas, tais como um soro contendo ou soro livrede meio contendo suplementos apropriados, ou um meio adequa-do para crescimento de células de inseto, levedura ou fun-gos. Meios adequados são disponíveis de fornecedores comer-ciais ou podem ser preparados de acordo com as fórmulas pu- blicadas (por exemplo, em catálogos da Coleção de CulturaTipo Americana).
Os peptídeos ou proteínas de comprimento inteirorecombinantemente produzidos pelas células podem então serrecuperados do meio de cultura por procedimentos convencio-nados incluindo separação de células hospedeiras do meio porcentrifugação ou filtração, precipitando os componentes pro-teináceos do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal,por exemplo, sulfato de amônio, purificação por uma varieda-de de procedimentos cromatográficos, por exemplo, HPLC, cro-matografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, ousemelhantes.
Preparação Sintética
Os métodos para produção sintética de peptideossão bem conhecidos na técnica. Descrições detalhadas bem co-mo avisos práticos para produção de peptideos sintéticos po-dem ser encontradas em Synthetic Peptides: A User's Guide(Advances in Molecular Biology), ed. Grant G. A., Oxford U-niversity Press, 2002, ou em: Pharmaceutical Formulation:Development of Peptides and Proteins, eds. Frokjaer e Hovga-ard, Taylor e Francis., 1999.
Peptideos podem, por exemplo, ser sintetizados poruso do químico Fmoc e com cisteínas protegidas por Acm. Apóspurificação por HpLC de fase reversa, peptideos pode aindaser processados para obter, por exemplo, isoformas modifica-das C- ou N-terminal. Os métodos para ciclização e modifica-ção terminal são bem conhecidos na técnica e descritos emdetalhes nos manuais citados acima.
Em uma modalidade preferida às seqüências peptídi-cas da invenção são produzidas sinteticamente, em particu-lar, por um método de Seqüência Assistida de Síntese de Pep-tídeo (SAPS).Por peptideos SAPS podem ser sintetizados ou emgrupos em um recipiente de polietileno equipado com um fil-tro de polipropileno para filtração ou na versão de fluxocontinuo do método de fase sólida de poliamida (Dryland, A.
e Sheppard, R. C. (1986) J. Chem. Soe. Perkin Trans. I, 125-137) em um sintetizador de peptideo completamente automati-zado utilizando 9-fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc) ou tert-Butiloxicarbonil (Boc) como grupo protetor N-a-amino e gru-pos de proteção comuns adequados para funcionalidade da ca-deia lateral.
Quando sintetizadas seqüências peptidicas indivi-duais podem então ser formuladas como multimeros utilizandotécnicas bem conhecidas na arte, por exemplo, dimeros de se-qüências podem ser obtidos pelo método LPA descrito em WO00/18791, polímeros dendriméricos por síntese de MAP descri-to em PCT/US90/02 03 9.
IV Anticorpo
É um objetivo da presente invenção prover um anti-corpo, fragmento ligante de antígeno ou proteína recombinan-20 te do mesmo capaz de reconhecer e seletivamente ligar a umepítopo em NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF, o referido epítopo com-preendendo um motivo da invenção ou uma seqüência seleciona-da de SEQ ID NOs: 1-26, ou um fragmento da referida seqüên-cia .
Pelo termo "epítopo" é entendido o grupo específi-co de átomos (em uma molécula de antígeno) que é reconhecidapor (aquele do antígeno) anticorpos (assim causando uma res-posta imune). 0 termo "epítopo" é o equivalente ao termo"determinante antigênico". 0 epítopo pode compreender 3 oumais resíduos aminoácidos, tais como, por exemplo, 4, 5, 6,7, 8 resíduos aminoácidos, localizados em estreita proximi-dade, tal como dentro de uma seqüência aminoácida contígua,ou localizada nas partes distantes da seqüência aminoácidade um antígeno, mas devido a folha de proteína ter sido a-proximado a cada outro.
Moléculas de anticorpo pertencem a uma família deproteínas de plasma chamadas imunoglobulinas, cujo bloqueiode construção básica, a folha ou domínio de imunoglobulina,é utilizado em várias formas em muitas moléculas do sistemaimune e outros sistemas de reconhecimento biológico. Uma i-munoglobulina típica tem quatro cadeias polipeptídicas, con-tendo uma região de ligação de antígeno conhecida como umaregião variável e uma região não variante conhecida como aregião constante.
Anticorpos nativos e imunoglobulinas são usualmen-te glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 15.0.000daltons, compostas de duas cadeias leves idênticas (L) e du-as cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve é ligadaa uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente,enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as ca-deias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulinas. Ca-da cadeia pesada e leve também tem regularmente pontes dedissulfeto de espaços intercadeia. Cada cadeia pesada tem emuma terminação um domínio variável (VH) seguido por um núme-ro de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domíniovariável em uma terminação (VL) e um domínio constante emsua outra terminação. 0 domínio constante da cadeia leve éalinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada,e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domíniovariável da cadeia pesada. Resíduos aminoácidos particularessão acreditados formar uma interface entre os domínios vari-áveis de cadeia leve e pesada (Novotny J., & Haber E. Proc.Natl. Acad. Sei. EUA 82 (14): 4592-6, 1985).
Dependendo das seqüências aminoácidas do domínioconstante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem serdeterminadas em diferentes classes. Existem pelo menos cinco(5) principais classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE,IgG e IgM, e várias dessas podem ser ainda divididas em sub-classes (isotipos), por exemplo, IgG-If IgG-2, IgG-3f e IgG-4; IgA-I e IgA-2. Os domínios constantes de cadeia pesadaque correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas sãochamadas alfa (a), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ), um (μ),respectivamente. As cadeias leves de anticorpos podem serdeterminadas para um de dois tipos claramente distintos,chamadas kappa (κ) e lambda (λ) , baseada em uma seqüênciaaminoácida de sua cadeia constante. As estruturas de subuni-dades e configurações tri-dimensionais de diferentes classesde imunoglobulinas são bem conhecidos.
O termo "variável" no contexto do domínio variáveldos anticorpos refere-se ao fato de que certas porções dosdomínios variáveis diferem extensivamente na seqüência entreanticorpos. Os domínios variáveis são para ligação e deter-minam a especificidade de cada anticorpo particular para seuantígeno particular. Entretanto, a variabilidade não é i-gualmente distribuída através dos domínios variáveis de an-ticorpos. É concentrado em três segmentos chamados regiõesdeterminantes de complementariedade (CDRs) também conhecidascomo regiões hipervariáveis em ambas dos domínios variáveisde cadeia leve e cadeia pesada.
As porções mais altamente conservadas de domíniosvariáveis são chamadas de regiões conservadas ("framework" -FR). Os domínios variáveis das cadeias pesada e leve nativasde cada compreendem quatro regiões FR, amplamente uma adoçãode uma configuração de folha β-pregueada, conectada por trêsCDRs, que formam alças conectantes, e em alguns casos for-mando parte da estrutura β-pregueada. Os CDRs em cada cadeiasão mantidos juntos em íntima proximidade por regiões FR e,com os CDRs de outra cadeia, contribuem para a formação dosítio ligador de antígeno dos anticorpos. Os domínios cons-tantes não são envolvidos diretamente na ligação de um anti-corpo ao antígeno, mas exibem várias funções efetoras, talcomo participação do anticorpo na toxicidade celular depen-dente de anticorpo.
Um anticorpo que é contemplado para uso na presen-te invenção então pode estar em qualquer de uma variedade deformas, incluindo uma imunoglobulina inteira, um fragmentode anticorpo tais como Fv, Fab, e fragmentos similares, umanticorpo de cadeia única que inclui as regiões determinan-tes de complementariedade de domínio variável (CDR), e asformas semelhantes, todos dos quais caem sob o termo amplo"anticorpo", como aqui utilizado. A presente invenção con-templa o uso de qualquer especificidade de um anticorpo, po-liclonal ou monoclonal, e não é limitado a anticorpos quereconhecem e reagem com um antigeno especifico. Em modalida-des preferidas, no contexto de ambos os métodos, terapêuticoe de seleção descritos abaixo, um anticorpo ou fragmento domesmo é utilizado de forma a ser imunoespecífico para um an-tigeno ou epitopo da invenção.
O termo "fragmentos de anticorpo" refere-se a umaporção de um anticorpo de comprimento inteiro, geralmente aligante de antigeno ou região variável. Exemplos de fragmen-tos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 eFv. Digestão de anticorpos por papaina produz dois fragmen-tos de ligação de antigeno idênticos, chamados de fragmentoFab, cada um com um sitio ligador de antigeno, e um fragmen-to "Fc" residual, assim chamado por sua habilidade de cris-talizar facilmente. Tratamento com pepsina produz um frag-mento F(ab')2 que tem dois fragmentos ligadores de antigenoque são capazes de antigeno de ligação cruzada, e um resíduode outro fragmento (que é chamado pFc'). Fragmentos adicio-nais podem incluir dianticorpos, anticorpos lineares, molé-cuias de anticorpo de cadeia única, e anticorpos multiespe-cíficos formados de fragmentos de anticorpos. Como aqui uti-lizado, "fragmento funcional" com respeito a anticorpos, re-fere-se a fragmentos Fv, F(ab) e F(ab')2.
0 termo "fragmento de anticorpo" é utilizado aquide forma sinônimo cóm o termo "fragmento ligador de antige-no".
Fragmentos de anticorpos podem ser tão pequenosquanto cerca de 4 aminoácidos, 5 aminoácidos, 6 aminoácidos,7 aminoácidos, 9 aminoácidos, cerca de 12 aminoácidos, cercade 15 aminoácidos, cerca de 17 aminoácidos, cerca de 18 ami-noácidos, cerca de 20 aminoácidos, cerca de 25 aminoácidos,cerca de 30 aminoácidos ou mais. Em geral, um fragmento deanticorpo da invenção pode ter qualquer tamanho superior aolimite de forma que ele tenha propriedades similares ou imu-nológicas relativas a anticorpo que se liga com especifici-dade a um epitopo compreendendo uma seqüência peptidica se-lecionada de qualquer das seqüências identificadas aqui comoSEQ ID NO: 1-22, ou um fragmento das referidas seqüências.Então, no contexto da presente invenção o termo "fragmentode anticorpo" é idêntico ao termo "fragmento ligador de an-tígeno".
Fragmentos de anticorpo retêm alguma habilidade deseletivamente se ligar com seu antigeno ou receptor. Algunstipos de fragmentos de anticorpos são definidos como segue:
(1) Fab é o fragmento que contém um fragmento li-gador de antigeno monovalente de uma molécula de anticorpo.Um fragmento pode ser produzido por digestão de anticorpointeirocom a enzima papaina para produzir uma cadeia de luzintacta e uma porção de uma cadeia pesada.
(2) Fab' é o fragmento de uma molécula de anticor-po pode ser obtida por tratar todo o anticorpo com pepsina,seguida por redução, para produzir uma cadeia leve intacta euma porção de cadeia pesada. Dois fragmentos Fab' são obti-dos por molécula anti-anticorpo.
Fragmentos Fab'diferem de fragmentos Fab pela adi-ção de uns poucos resíduos co carbóxi terminal do domínioCH1 de cadeia pesada incluindo uma ou mais cisteinas da re-gião dobradiça do anticorpo.
(3) (Fab')2 é o fragmento de um anticorpo que podeser obtido pelo tratamento de anticorpo total com a enzimapepsina sem redução subseqüente.
(4) F(ab')2 é um dimero de dois fragmentosFab'mantidos juntos por duas ligações dissulfeto.
Fv é o fragmento de anticorpo mínimo que contém umcompleto reconhecimento de antígeno e sítio de ligação. Estaregião consiste de um dimero de um domínio variável de ca-deia pesada e um leve em uma associação justa, não covalente(dimero VH-VL) . Esta está nesta configuração que os três C-DRs de cada domínio variável interage para definir um sítiode ligação de antígeno na superfície do dimero VH-VL. Cole-tivamente, os seis CDRs conferem especificidade de ligaçãode antígeno ao anticorpo. Entretanto, mesmo um domínio vari-ável único (ou metade de um Fv compreendendo somente trêsCDRs específicos para um antígeno) tem a habilidade de reco-nhecer e ligação ao antígeno, embora em menor afinidade queo sítio de ligação total.
(5) Anticorpo de cadeia única ("SCA"), definidacomo uma molécula geneticamente construída contendo a regiãovariável da cadeia leve, a região variável da cadeia pesada,ligada por um ligador polipeptídeo adequado como uma molécu-la de cadeia única geneticamente fusionada. Tais anticorposde cadeia única são também referidos como "cadeia única Fv"ou fragmentos de anticorpos "sFv". Geralmente, o polipeptí-deo Fv ainda compreende um ligador polipeptídeo entre os do-minios VH e VL que permite o dFv formar a estrutura desejadapara ligação de antigeno. Para uma região de sFV ver Pluck-thun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113:269-315 eds. Rosenburg e Moore, Springer-Verlag, NI, 1994.
O termo "dianticorpos" refere-se a um pequenofragmento de anticorpo com dois sítios de ligação de antige-no, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de ca-deia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeialeve (VL) na mesma cadeia polipeptídica (VH-VL). Pelo uso deum ligador que é muito curto para permitir' emparelhamentoentre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são for-çados a parear com os domínios complementares de outra ca-deia e criam dois sítios de ligação de antigeno. Dianticor-pos são descritos mais completamente em, por exemplo, EP404.097; WO 93/11161, e Hollinger et al, Proc. Natl. Acad.
Sci., EUA, 90:6444-6448 (1993).
A invenção contempla ambos, anticorpos policlonaise monoclonais, fragmentos ligadores de antigeno e proteínasrecombinantes dos mesmos que são capazes de ligar um epítopode acordo com a invenção.
A preparação de anticorpos policlonais é bem-conhecida por aqueles versados na técnica. Ver, por exemplo,Green et al, 1992. Production of Polyclonal Antisera, em:Immunochemical Protocols (ed, Manson), páginas 1-5 (HumanaPress); Coligan et al, Production of Polyclonal Antisera inRabbits, Rats Mice and Hamsters, em: Current Protocols inImmunologu, seção 2.4.1, que são aqui incorporados por refe-rência.A preparação de anticorpos monoclonais da mesmaforma é convencional. Ver, por exemplo, Kohler & Milstein,Nature, 256:495-7 (1975); Coligan, et al, seções 2.5.1-2.6.7; e Harlow et al, em: Antibodies: . A Laboratory Manual,página 726, Cold Spring Harbor Pub. (1988). Anticorpos mono-clonais podem ser isolados e purificados de culturas de hi-bridomas por uma variedade de técnicas bem estabelecidas.Tais técnicas de isolamento incluem cromatografia por afini-dade com Proteína A Sefarose, cromatografia de exclusão portamanho, e cromatografia de troca iônica. Ver, por exemplo,Coligan et al, seções 2.7.1-2.7.12 e seções 2.9.1-2.9.3;Barnes et al., Purification of Immunoglobulin G (IgG). Em:Methods in Molecular Biology, 1992, 10:79-104, Humana Press,NI.
Métodos de manipulação in vítro e in vivo de anti-corpos monoclonais são bem conhecidos por aqueles versadosna técnica. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a seremutilizados em acordo com a presente invenção podem ser fei-tos pelo método de hibridoma primeiro descrito por Kohler eMilstein, 1975, Nature 256, 495-7, ou podem ser por métodosrecombinantes, por exemplo, como descrito em EUA 4.816.567.Os anticorpos monoclonais para uso com a presente invençãopodem também ser isolados de bibliotecas de fago anticorpoutilizando as técnicas descritas em Clackson et al, 1991,Nature 352:624-628, bem como em Marks et al, 1991, J Mol Bi-ol 222:581-597. Outro método envolve humanização de um anti-corpo monoclonal por meios recombinantes para gerar anticor-pos contendo seqüências específicas humanas e reconhecíveis.Ver, para revisão, Holmes et al, 1997, J Immunol 158:2192-2201 e Vaswani et al, 1998, Annals Allergy, Asthma & Immunol81:105-115.
O termo "anticorpo monoclonal" como aqui utilizadorefere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticor-pos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos indi-viduais compreendendo a população são idênticos exceto parapossível ocorrência natural de mutações que podem estar pre-sentes em menores quantidades. Anticorpos monoclonais sãoaltamente específicas, sendo direta contra um único sítioantigênico. Além disso, em contraste as preparações de anti-corpos policlonais convencionais que tipicamente incluem an-ticorpos diferentes direcionados contra determinantes dife-rentes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionadocontra um determinante único no antígeno. Em adição a suaespecificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos comisso eles são sintetizados por cultura de hibridoma, nãocontaminado por outras imunoglobulinas. 0 modificador "mono-clonal" indica o caráter do anticorpo indica o caráter doanticorpo como sendo obtido de uma população substancialmen-te homogênea de anticorpos, e não é para ser construído comoprodução requerente do anticorpo por qualquer método parti-cular.
Os anticorpos monoclonais aqui especificamente in-cluem anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que umaporção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica ou homóloga asseqüências correspondentes em anticorpos derivados de umaespécie particular ou pertencente a uma classe ou subclasse,enquanto o resíduo da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólo-gos as seqüências correspondentes em anticorpos derivados deoutras espécies ou pertencendo a outra classe ou subclassede anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, deforma que eles exibem a atividade biológica desejada (EUA4.816.567); Morrison et al, 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. 81:6851-6855.
Métodos de fazer fragmentos de anticorpos são tam-bém conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Harlow e Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora-tory, NI, 1988, aqui incorporado por referência). Fragmentosde anticorpos da presente invenção podem ser preparados porhidrólises proteolíticas do anticorpo ou por expressão em E.coli de DNA codificando o fragmento. Fragmentos de anticorpopodem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína de mé-todos convencionais de anticorpos inteiros. Por exemplo,fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagemenzimática de anticorpos com pepsina para prover um fragmen-to 5S denotado F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda cliva-do utilizando um agente redutor tiol, e opcionalmente umgrupo bloqueador para os grupos sulfidrila resultando declivagem de ligações dissulfetos, para produzir fragmentos3.5S Fab'monovalentes. Alternativamente, uma clivagem enzi-mática utilizando pepsina produz dois fragmentos monovalen-tes Fab' e um fragmento Fc diretamente. Esses métodos sãodescritos, por exemplo, em EUA 4.036.945 e EUA 4.331.647, ereferências contidas aqui. Essas patentes são aqui incorpo-radas em suas totalidades por referência.Outros métodos de clivagem de anticorpos, tal comoseparação de cadeias pesadas para formar fragmentos de ca-deias leve-pesadas monovalentes, ainda clivagem de fragmen-tos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticaspossa também ser utilizados, contanto que os fragmentos seligam ao antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.Por exemplo, fragmentos Fv compreendem uma associação de ca-deias VH e VL. Essa associação pode ser monovalente ou a ca-deia variável podem ser ligadas por uma ligação dissulfetointermolecular ou ligação cruzada por químicos, tal comoglutaraldeído. Preferivelmente, os fragmentos Fv compreendemcadeias VH e VL conectadas por um ligador peptídico. Essasproteínas de ligação de antígeno de cadeia única (sFv) sãopreparados por construção de um gene estrutural compreenden-do seqüências de DNA codificando os domínios VH e VL conec-tados por um oligonucleotídeo. 0 gene estrutural é inseridoem um vetor de expressão, que é subseqüentemente introduzidoem uma célula hospedeira tal como E. coli. As células hospe-deiras recombinantes sintetizam uma cadeia polipeptídica ú-nica com um peptídeo ligador ligando os dois domínios V. Mé-todos para produção de sFvs são descritos, por exemplo, porWhitlow, et al, 1991, Em: Methods: A Companion to Methods inEnzymology, 2:97; Bird et al, 1988, Science 242:423-426; EUA4.946.778; e Pack et al, 1993, BioTechnology 11:1271-77.
Outra forma de um fragmento de anticorpo é um pep-tídeo codificando uma região determinante de complementarie-dade única (CDR). Peptídeos CDR ("unidades de reconhecimentomínimo") são sempre envolvidos no reconhecimento e ligaçãodo antígeno. Peptideos CDR podem ser obtidos por clonagem ouconstrução de genes codificando o CDR em um anticorpo de in-teresse. Tais genes são preparados, por exemplo, por uso dareação em cadeia da polimerase para sintetizar a região va-riável do RNA de células produtoras de anticorpo. Ver, porexemplo, Larrick et al, Methods: a Companion to Methods inEnzymology, Vol. 2, página 106 (1991).
A invenção contempla formas humanas e não humani-zadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino). Tais anticorpos humanizados são imunoglobulinas quiméricas, ca-deias de imunoglobulinas ou fragmentos dos mesmos (tais comoFv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subseqüências ligantes deantigeno de anticorpos) que contêm uma seqüência animal de-rivada de imunoglobulina não humana, tal como seqüência re-conhecedora epitopo. Para a maior parte, anticorpos humani-zados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recipiente) emque resíduos de uma região determinante de complementarieda-de (CDR) do recipiente são substituídos por resíduos de umCDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal comocamundongo, rato ou coelho tendo a especificidade, afinidadee capacidade desejada. Anticorpo(s) humanizado(s) contendouma seqüência(s) de anticorpo(s) mínimo(s) da invenção, talcomo uma seqüência(s) reconhecendo o(s) epitopo(s) descri-to (s) aqui, é uma das modalidades preferidas da invenção.
Em alguns exemplos, resíduos da região conservadaFv da imunoglobulina humana são substituídos por correspon-derem resíduos não humanos. Além disso, anticorpos humaniza-dos podem compreender resíduos que são encontrados nem norecipiente do anticorpo nem em CDR importado ou seqüênciasda região conservada. Essas modificações são feitas para a-inda refinar e aperfeiçoar o desempenho do anticorpo. Em ge-ral, anticorpos humanizados serão compreendidos substancial-mente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domíniosvariáveis, em que todos ou substancialmente todos das regi-ões CDR correspondentes àqueles de uma imunoglobulina nãohumanas e todos ou substancialmente todos das regiões FR sãoaquelas de uma seqüência consensa de imunoglobulina humana.O anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pe-lo menos uma porção de uma região constante imunoglobulina(Fc), tipicamente que de uma imunoglobulina humana. Para de-talhes adicionais, ver: Jones et al, 1986, Nature 321, 522-525; Reichmann et al, 1988, Nature 332, 323-329; Presta,1992, Curr Op Struct Biol 2:593-596; Holmes et al, 1997, JImmunol 158:2192-2201 e Vaswani, et al, 1998, Annals Al-lergy, Asthma & Immunol 81:105-115.
A geração de anticorpos podem ser alcançadas porqualquer método padrão na técnica para produção de anticor-pos policlonais e monoclonais utilizando fragmentos naturaisou recombinantes de NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF humanos, o refe-rido fragmento compreendendo uma seqüência selecionada deSEQ ID NO:1-26, como um antígeno. Tais anticorpos podem sertambém geradas utilizando variantes, homólogos ou fragmentosde seqüências peptídicas de SEQ ID NOs:1-26, os referidosvariantes, homólogos e fragmentos são seqüências peptídicasimunogênicas que encontram os seguintes critérios:
(i) sendo uma seqüência aminoácida contígua de pe-lo menos 5 aminoácidos;
(ii) compreendendo um motivo da invenção.
Os anticorpos podem também ser produzidos in vivopelo indivíduo a ser tratado, por exemplo, pela administra-ção de um fragmento imunogênico de acordo com a invenção pa-ra o referido indivíduo. Conseqüentemente, a presente inven-ção ainda relaciona-se a uma vacina compreendendo um frag-mento imunogênico descrito acima.
0 pedido também se relaciona a um método para pro-dução de um anticorpo da invenção do referido método compre-endendo um passo de prover um fragmento imunogênico descritoacima.
A invenção relata ambos os anticorpos, que são ca-pazes de modular, tal como aumentar ou atenuar, função bio-lógica de NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF, em particular uma funçãorelacionada à diferenciação celular neural, sobrevivênciae/ou plasticidade, e a um anticorpo, que pode reconhecer eespecificamente ligar as proteínas tardias sem modular a a-tividade biológica da mesma.
A invenção relata o uso dos anticorpos acima para1) aplicações terapêuticas quando a modulação da atividadede NGF, NT-3, NT-4/5, BDNF humana, é benéfica para tratamen-to, 2) detectar e/ou monitorar as proteínas tardias in vitroe/ou in vivo para propósitos de diagnóstico, 3) propósitosde "pesquisa.
V Composição Farmacêutica
A invenção também se relaciona a uma composiçãofarmacêutica compreendendo um ou mais dos compostos defini-dos acima, em que o composto é capaz de estimular o cresci-mento do neurito e/ou diferenciação celular neural, sobrevi-vência de células neurais e/ou estimulação da aprendizageme/ou memória. Então, a invenção relaciona-se uma composiçãofarmacêutica capaz de estimular a diferenciação de célulasneuronais e/ou estimulação da regeneração de células neuro-nais, e/ou estimulação da plasticidade neuronal em conexãocom aprendizagem e memória, e/ou estimulação da sobrevivên-cia de células neurais.
No presente contexto o termo "composição farmacêu-tica"e utilizado sinonimamente com o termo "medicamento".
Em uma composição as seqüências peptidicas podemser formuladas como compreendendo fragmentos de peptideo in-dividuais isolados ou multimeros ou dimeros dos mesmos comodiscutido acima.
A composição farmacêutica pode ter os efeitos des-critos acima nas células in vitro ou in vivo, em que a com-posição é administrada a um paciente.
o medicamento da invenção compreende uma quantida-de efetiva de um ou mais dos compostos .como definido acima,ou uma composição como definido acima em combinação com osaditivos farmáceuticamente aceitáveis. Tal medicamento podeadequadamente ser formulado para administração oral, percu-tânea, intramuscular, intravenosa, intracranial, intratecal,intracerebroventricular, intranasal ou pulmonar.
Estratégias no desenvolvimento da formulação demedicamento e composições baseados nos compostos da presenteinvenção geralmente correspondem a estratégias de formulaçãopara qualquer outro produto fármaco baseado em proteína.Problemas potenciais e o guia requerido para superar essesproblemas são dados com vários livros textos, por exemplo,"Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processingand Delivery Systems", Ed. A.K. Banga, Technomic PublishingAG, Basel, 1995.
Injetáveis são usualmente preparados ou como solu-ções líquidas ou suspensões, formas sólidas adequadas parasolução em, ou suspensão em, antes líquida para injeção. Apreparação pode também ser emulsifiçada. 0 ingrediente ativoé sempre misturado com excipientes que são farmaceuticamenteaceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipien-tes adequados são, por exemplo, água, salina, dextrose, gli-cerol·,' etanol ou semelhantes, e combinações dos mesmos. Emadição, se desejado, a preparação pode conter quantidadesmenores de substâncias auxiliares tais como agentes umedeci-do ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, ou que au-mentam a efetividade ou transporte da preparação.
Formulações dos compostos da invenção podem serpreparados por técnicas conhecidas pela pessoa versada natécnica. As formulações podem conter veículos farmaceutica-mente aceitáveis e excipientes incluindo microesferas, Ii-possomas, microcápsulas, nanopartículas ou.semelhantes.
A preparação pode adequadamente ser administradapor injeção, opcionalmente no local, onde o ingrediente ati-vo é para exercer seus efeitos. Formulações- adicionais quesão adequadas por outros modos de administração incluem su-positórios, nasal, pulmonar e, em alguns casos, formulaçõesorais. Para supositórios, ligadores tradicionais e veículosincluem polialquileno glicóis ou triglicerideos. Tais supo-sitórios podem ser formados de misturas contendo o(s) ingre-diente (s) ativo(s) na variação de 0,5% a 10%, preferivelmen-te 1,2%. Formulações orais incluem tais excipientes normal-mente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos demanitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina só-dica, celulose, carbonato de magnésio, e semelhantes. Essascomposições tomam forma de soluções, suspensões, comprimi-dos, pílulas, cápsulas, formulações de liberação controladaou pós e geralmente contêm 10-95% de ingrediente(s) ati-vo (s), preferivelmente 25-70%.
Outras formúlações são tais adequadas para admi-nistração nasal e pulmonar, por exemplo, inaladores e aerossóis.
O composto ativo pode ser formulado como formasneutras ou sais. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluemsais de adição ácida (formadas com os grupos aminos livresdo composto peptídeo) e que são formadas com ácidos inorgâ-nicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfóri-co, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, ácido oxá-lico, ácido tartárico, ácido mandélico, e semelhantes. Saisformados com o grupo carboxil livre pode também ser derivadode bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos desódio, potássio, amônio, cálcio, ou férrico, e tais basesorgânicas como isopropilamino, trietilamina, 2-etilamino e-tanol, histidina, procaína, e semalhantes.
As preparações são administradas em uma forma com-patível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade co-mo será terapeuticamente efetiva. A quantidade a ser admi-nistrada depende do paciente a ser tratado, incluindo, porexemplo, o peso e idade do paciente, a doença a ser tratadae o estágio de doença. Variações de dosagens adequadas sãopor quilo de peso corporal normalmente na ordem de várioscem μg de ingrediente ativo pode administração com uma vari-ação preferida de cerca de 0,1 pg a 5000 pg por quilo de pe-so corporal. Utilizando formas monoméricas dos compostos, asdosagens adequadas são sempre na variação de 0,1 pg a 5000pg por quilo de peso corporal, tal como na variação de cercade 0,1 pg a 3000 pg por quilo de peso corporal, e especial-mente na variação de cerca de 0,1 yg a 1000 pg por quilo depeso corporal. Utilizando formas multiméricas dos compostos,as dosagens adequadas são sempre na variação de cerca de 0,1pg a 1000 pg por quilo de peso corporal, tal como na varia-ção de cerca de 0,1 pg a 750 yg por quilo de peso corporal,e. especialmente na variação de cerca de 0,1 pg a 500 pg porquilo de peso corporal tal como a variação de cerca de 0,1ug a 250 pg por quilo de peso corporal. Em particular quandose administra dosagem nasalmente menor são utilizados quequando administrados por outras vias. Administração pode serfeita uma vez ou pode ser seguida por administrações subse-qüentes. A dosagem também dependerá da via de administraçãoe variará com a idade e peso do paciente a ser tratado. Umadosagem preferida de formas multiméricas pode ser no inter-valo de 1 mg 70 mg por 70 kg por peso corporal.
Para algumas indicações uma aplicação localizadaou substancialmente localizada é preferida.
Alguns dos compostos da presente invenção são su-ficientemente ativos, mas para alguns dos outros, o efeitoserá aumentado se a preparação ainda compreender aditivose/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Tais aditivos eveículos serão conhecidos na técnica. Em alguns casos, serávantajoso incluir um composto, que promove distribuição dasubstancia ativa para seu alvo.
Em muitos exemplos, será necessário administrar aformulação em múltiplas vezes. Administração pode ser umainfusão contínua, tais como infusão intraventricular ou ad-ministração em mais doses tais como mais vezes por dia, dia-riamente, mais vezes por semana, semanalmente etc. É prefe-rido que a administração do medicamento é iniciada antes ouimediatamente após o indivíduo ter sido sujeito ao(s) fa-tor (s) que podem levar a morte celular. Preferivelmente omedicamento é administrado dentro de 8 horas do fator come-ço, tal como dentro de 5 horas do fator começo. Muitos doscompostos exibiram um efeito de longo termo segundo o qualadministração dos compostos podem ser conduzidos com longosintervalos, tal com 1 semana ou 2 semanas.
Em conexão com o uso em guias nervosos, a adminis-tração pode ser contínua ou em pequenas porções baseadas naliberação controlada do(s) composto(s) ativo(s). Além disso,precursores podem ser utilizados para controlar a taxa deliberação e/ou sítio de liberação. Outros tipos de implantese bem como administração oral pode similarmente ser baseadosob liberação controlada e/ou uso de precursores.Como discutido acima, a presente invenção relacio-na-se ao tratamento de indivíduos para indução de diferenci-ação, estimulando regeneração, plasticidade e sobrevivênciade células neurais in vitro e in vivo, o referido tratamentoenvolvendo administração de uma quantidade efetiva de um oumais compostos como acima definidos.
Outra estratégia para administração é implantar ouinjetar células capazes de expressar e secretar o compostoem questão. Dessa forma o composto pode ser produzido na Io-cação onde ele vai agir.
VI Tratamento
Em um aspecto adicional, a presente invenção rela-ciona-se aos referidos peptídeos, fragmentos, ou variantesdos mesmos para uso na indução de diferenciação e/ou estimu-lação de regeneração, plasticidade e/ou sobrevivência de cé-lulas neurais. O uso é para o tratamento para prevenir doen-ças e condições do sistema nervoso central e periférico, edos músculos ou de vários órgãos.
Tratamento pelo uso dos compostos/composições deacordo com a invenção é em uma modalidade útil para induzirdiferenciação, modulação da proliferação, estimulação da re-generação, plasticidade neuronal e sobrevivência de célulassendo implantadas ou transplantadas. Isto é particularmenteútil quando utilizando compostos tendo um efeito de longotermo.
Então, o tratamento compreende tratamento e/ouprofilaxia de morte de celular em relação a doenças ou con-dições do sistema nervoso central e periférico, tais como,danos nervosos pós-operatórios, danos nervosos traumáticos,por exemplo, resultando de injúria do cordão espinhal, de-feito da mielinização das fibras nervosas, danos pós-isquêmicos, por exemplo, resultando de um derrame, demênciasmulti-infarto, esclerose múltipla, degeneração nervosa asso-ciada com diabetes mellitus, degeneração neuro-muscular, es-quizofrenia, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, oudoença de Huntington.
Também, em relação a doenças ou condições dos mús-culos incluindo condições com função defeituosa de conexõesneuro-musculares, tais como distúrbios musculares atróficosgenéticos ou traumáticos; ou para o tratamento de doenças oucondições de vários órgãos, tais com condições degenerativasdas gônadas, do pâncreas, tal como diabetes mellitus I e II,do rim, tal como nefrose dos compostos de acordo com a in-venção podem ser utilizados parà induzir diferenciação, mo-dulação da proliferação, estimulação da regeneração, plasti-cidade neuronal e sobrevivência, isto é, estimulação da so-brevivência.
Em ainda uma modalidade o uso do composto e/oucomposição farmacêutico é para a estimulação da habilidadede aprendizagem e/ou da memória de curto e/ou longo termo.
Em particular o composto e/ou composição farmacêu-tica da invenção pode ser utilizada no tratamento de condi-ções clinicas, tal como psicose, tais como condições psicó-ticas orgânicas senis e pré-senis, psicoses alcoólicas, psi-coses de drogas, condições psicóticas orgânicas transientes,doença de Alzheimer, lipidoses cerebrais, epilepsia, paresiageral [sifilis], degeneração hepatolenticular, coréia deHuntington, doença de Jakob-Creutzfeldt, esclerose múltipla,doença de Pick do cérebro, sifilis, distúrbios esquizofrêni-cos, psicoses afetivas, distúrbios neuróticos, distúrbios depersonalidade, incluindo neurose de caráter, distúrbio depersonalidade não psicótica associada com sindromes orgâni-cas cerebrais, distúrbio de personalidade paranóide, perso-nalidade fanática, personalidade paranóide (distúrbio), tra-ços paranóides, desvio e distúrbio sexual, retardamento men-tal, doença no sistema nervoso e senso de órgãos, anomaliascognitivas, doença inflamatória do sistema nervoso central,tais como meningite, encefalite; degenerações cerebrais taiscomo doença de Alzheimer, doença de Pick, degeneração senildo cérebro, comunicação hidrocéfalo, hidrocéfalo obstrutivo,doença de Parkinson incluindo outra doença extra-piramidal edistúrbios do movimento anormal, doença espinocerebelar, a-taxia cerebelar, de Maria, Sanger-Brown, dissinergia cerebe-lar mioclônica, degeneração cerebelar primária, tal como a-trofia muscular espinhal, atrofia muscúlar espinhal familar,juvenil e adulto, doença neuronal motora, esclerose lateralamiotrófica, doença neuronal motora, paralisia bulbar pro-gressiva, paralisia pseudobulbar, esclerose lateral primá-ria, outras doenças celulares do corno anterior, doença ce-lular do corno anterior, não especificado, outras doenças docordão espinhal, siringomielia - e siringobulbia, mielopatiasvasculares, infarto agudo do cordão espinhal (embólico) (nãoembólico), trombose arterial do cordão espinhal, edema docordão espinhal, mielopatia necrótica subaguda, degeneraçãodo cordão espinhal combinada subaguda em doenças classifica-das em outro lugar, mielopatia, mielite induzida por fárma-co, induzida por radiação, distúrbio do sistema nervoso au-tonômico, distúrbio do sistema autonômico periférico, simpa-tético, parassimpatético, ou vegetativo, disautonomia fami-liar [sindrome Riley-Day] , neuropatia autonômico periféricaidiopática, sincope ou sindrome do sinus carótida, distrofiaou paralisia simpatética cervical; neuropatia autonômica pe-riférica em distúrbios classificados do outro lugar, amiloi-dose, doenças do sistema nervoso periférico, lesões do plexobraquial, sindrome da costela cervical, sindrome costoclavi-cular, sindrome anterior do escaleno, sindrome da saida to-rácica, neurite braquial ou radiculite, incluindo em recém-nascido. Neuropatia inflamatória e tóxica, incluindo poli-neurite infectiva aguda, sindrome de Guillain-Barre, poli-neurite pós-infecciosa, polineuropatia em doença vascularcolágena, distúrbios afetando múltiplas estruturas do olho,endoftalmite purulenta, doenças do ouvido e processos mas-tóides, anormalidade de órgãos e tecidos leves em recém-nascidos, incluindo no sistema nervoso, complicações da ad-ministração de anestésico ou outra sedação em trabalho edistribuição, doenças na pele incluindo' infecção, problemade circulação insuficiente, injúrias, incluindo após cirur-gia, injúria de esmagadura, queimaduras, injúrias a nervos ecordão espinhal, incluindo divisão do nervo, lesão em conti-nuidade (com ou sem ferida aberta), neuroma traumática (comou sem ferida aberta), paralisia transiente traumática (comou sem ferida aberta) ,. picada ou laceração acidental duranteprocedimento médico, injúria do nervo ótico e vias, injúriado nervo ótico, segundo nervo craniano, injúria do quiasmoóptico, injúria das vias ópticas, injúria do córtex visual,cegueira não especifiçada, injúria de outros(s) nervo(s)craniano(s),' injúria de outros nervos não especificados. En-venenamento por drogas, medicamentos e substâncias biológi-cas, distúrbios musculares atróficos genéticos ou traumáti-cos; ou para o tratamento de doenças ou condições de váriosórgãos, tais como condições degenerativas das gônadas, dopâncreas, tais como diabetes mellitus do tipo I e II, dorim, tal como nefrose.
Um aspecto adicional da invenção é um processo deproduzir uma composição farmacêutica, compreendendo misturade uma quantidade efetiva de um ou mais composto da inven-ção, ou uma composição farmacêutica de acordo com a invençãocom um ou mais aditivos ou veículos farmaceuticamente acei-táveis, e administrar uma quantidade efetiva de pelo menosum do referido composto, ou referida composição farmacêuticaao paciente.
Em uma modalidade do processo como mencionado aci-ma, os compostos são utilizados em combinação com um dispo-sitivo prostético, em que o dispositivo é úm guia prostéticonervoso. Então, em um aspecto adicional, a presente invençãorelaciona-se a um guia prostético nervoso, caracterizado na-quele que compreende um ou mais dos compostos da composiçãofarmacêutica como definido acima. Guias nervosos são conhe-cidos na técnica.
Outro aspecto da invenção relaciona-se ao uso deum composto como definido acima. Em particular o uso de umcomposto de acordo com a invenção é para a produção de umacomposição farmacêutica. A composição farmacêutica é prefe-rivelmente para o tratamento ou profilaxia de qualquer dasdoenças e condições mencionadas acima.
Em ainda um aspecto adicional a invenção relacio-na-se a um método de tratamento de uma doença ou condiçãocomo discutido acima por administração de um composto comoaqui definido.
Exemplos
Métodos
Crescimento de neurito de neurônios primários emcultura
Neurônios cerebelares dissociadas foram isoladosde ratos de 7 dias de idade. Cerebelo foi isolado do cérebroem solução de Krebs Ringer modificada gelada, limpado dosvasos sangüíneos, grossamente homogeneizado por corte e en-tão tripsinizado. As células dissociadas foram lavadas empresença de DNAse 1 e inibidor de tripsina de soja. Neurô-nios hipocampais pós-natal ou neurônios granulares cerebela-res (CGN) foram plaqueados em uma densidade de 10.000 célu-las/cm2 em lâminas de câmeras Lab-Tex Permanox de 8 poços emmeio Neurobasal suplementado com 0,4% (p/v) de albumina sé-rica bovina (BSA; Sigma-Aldrich), 2% (v/v) de suplementoNeurobasal B27, 1% (v/v) de glutamax, 100 U/mL de penicili-na, 100 pg/mL de estreptomicina e 2% de HEPES IM (todos dáGibco, BRL) . Após 24 horas, os neurônios foram fixados, comformaldeído 4% (v/v) por 20 minutos e assim imunocorado uti-lizando anticorpos primários de coelho contra GAP-43 e anti-corpos Ig anti-coelho secundário Alexa-Fluor. Imagens de pe-lo menos 200 neurônios para cada grupo em cada experimentoindividual foram obtidas sistematicamente por microscopia deflurorescência assistida por computados como previamentedescrito (Ronn et al, 2000). Brevemente, uma microscopia in-vertido Nikon Diaphot com uma objetiva Nikon Plan 20x (Ni-kon, Tóquio, Japão) acoplada a uma câmara de video (GrundigElectronics, Alemanha) foi utilizado por gravações. Um pro-grama de embalagem do Prima desenvolvido baseou-se na deter-minação do crescimento de neurito (Ronn et al, 2000).
Sobrevivência celular neuronal em cultura primáriaCulturas primárias de CGN foram plaqueadas em umadensidade de 100.000 células/cm2 em lâminas Permanox de 8poços revestidas com poli-L-lisina em meio Neurobasal-A(Gibco BRL) suplementado com 2% (v/v) de B27, 0,5% (v/v) deglutamax, 100 unidades/mL de penicilina, 100 μg/mL de es-treptomicina e KCl, dando a concentração final de KCl nomeio 40 mm. Vinte e quatro horas após plaqueados, citosina-D-arabinofuranosida (Ara-C; Sigma-Aldrich) foi adicionada auma concentração final de 10 pm para evitar a proliferaçãode células gliais, após o qual os neurônios foram permitidosdiferenciar por um adicional de 6 dias a 37° C. Morte celu-lar apoptótica foi induzida por lavar duas vezes e mudar omeio para Meio Eagle Básico (BME; Gibco BRL) suplementadocom 1% (v/v) de glutamina, 100 U/mL de penicilina e 100ug/mL de estreptomicina, 3,5' g de d-glicose/L e 1% (v/v) depiruvato de sódio (Gibco BRL) junto com várias concentraçõesde peptídeo. Assim a concentração de potássio nas culturasfoi reduzida a 5 mm de KCl. Dois dias após a indução de a-poptose, as células foram fixadas.com 4% (v/v) de formaldeí-do e coradas com Hoechst 33258 (D'Merllo et al, 1993).
Modelo de Injúria Cerebral Traumática
Uma injúria cerebral focai no córtex fronto-parietal direito foi feito por aplicar um pedaço de gelo se-co (-78° C) diretamente no crânio por 30 segundo em camun-dongos e 60 segundos em ratos, como previamente descrito emdetalhes (Penkowa et al, 2003).
Processamento tissular
Histoquimica e imunohistoquímica foram feitas emseções de corte de órgãos tomados de animais fixados. Ratose camundongos foram profundamente anestesiados com Brietal ecorado por perfusão cardíaca com salina contendo heparina(0,9% de NaCl, 3 mL/L de heparina 5000 IU) por 2 minutos se-guido por fixação com fixador de Zamboni (pH 7.4) por 4-8minutos dependendo no tamanho de animal". Para investigaçãoimunohistoquímica, cérebros foram dissecados e pós-fixadosem de Zamboni por 2-3 horas, deidratado em álcool graduadoseguido por xilol e subseqüentemente embebido em parafinaantes de ser cortado em 3 μπ\ das seções frontais através daárea total da crio lesão. Para o desenvolvimento de epítopoinduzido por calor, as seções foram fervidas em tampão ci-trato (pH 6 ou 9) em um.forno microondas por 10 minutos se-guido por incubação em 10% em soro cabra (In Vitro, Fredens-borg, Dinamarca) em soro de burro (código BP- 005.1; The Bin-ding Site, Birmingham, RU) em solução salina tamponada comtris (TBS)/Nonidet Ρ-40 (0,01%) por 30 minutos em temperatu-ra ambiente. Seções com tecidos de camundongo utilizadas pa-ra incubação com anticorpos derivados de camundongo monoclo-nais foram também incubados com Soluções Bloqueadoras A+B dokit HistoMouse-SP para extinguir IgG de camundongo endógena(Zymed, CA, EUA).
Imunohistoquimica e histoquimica
Seguindo o tratamento . como descrito acima, seçõesforam incubadas por uma noite a 5o C com um dos seguintesanticorpos primários: proteína acídica fibrilar glial anti-vaca policlonal de coelho (GFAP) 1:250 (um marcador de as-trócitos; DakoCytomation); monoclonal de camundongo anti-8-hidroxideoxiguanosina (8-OH-dG) diluído com 1:100 em soro decabra (um marcador para oxidação de DNA; Chemicòn, Temacula,CA, EUA);. 0 anticorpo primário foi detectado com anticorpossecundários biotinilados, incubados com complexo estreptavi-dina-biotina-peroxidase por 30 min. Lectina de tomate bioti-nilada (Sigma, Vallensbaek, DK) foi utilizado como um marca-dor para microglia/macrófagos. 0 corante lectina foi aindadesenvolvida por uso de um complexo de estreptavidina-biotina-peroxidase (StreptBCComplex/HRP; DakoCytomation,Glostrup, DK)- como descrito pelo fabricante e desenvolvidopor 30 minutos em temperatura ambiente (TA) . 0 produto dareação de lectina foi visualizado por uso de 0,015% H2O2 em3,3'-diaminobenzidina/TBS (DAB/TBS) com DAB como cromogênio.
Peptídeos derivados NGF
NGF-C2CVLSRKAVRRASEQ ID NO:7
NGF-DETKCRDPNPVDSGSEQ ID NO:27 (laa N-truncado SEQID NO:1)
NFG-ERGIDSKHWNSYSEQ ID NO:19
NGF-ClRIDTACVSEQ ID NO:5
NGF-EETFVKALTMDGKQAAWRSEQ ID NO:15
NGF-NSSHPIFHRGEFSSEQ ID NO:11
Peptideo derivados de BDNFBDNF-ERGIDKRHWNSQSEQ ID NO:22BDNF-EESYVRALTMDSKKRIGWRSEQ ID NO:18Resultados
Exemplo 1: Estimulação do crescimento do neurito
CGN preparada como descrito acima foram tratadoscom concentrações diferentes (3-81 pg/mL) de peptideos NGF-C2, NGF-D, NGF-E, BGF-C1, NGF-EE, BDNF-E ou BDNF-EE.
Nas Figuras 1, 2, 4 e 5 pode ser visto que pepti-deos NGF-C2 (motivo II), NGF-E (motivo III), NGF-Cl (motivoI), NGF-EE (motivo III), BDNF-E (motivo III) ou BDNF-EE (mo-tivo III) compreendendo todos os motivos estruturais indica-dos significantemente estimularam o crescimento de neuritode neurônios primários em cultura. Em contraste, peptideoNGF-D, que está ausente no residuo hidrofóbico essencial domotivo I, não.tem atividade neuritogênica (Fig. 1).
Exemplo 2: Estimulação da sobrevivência celular
neuronal
Exame do efeito de diferentes peptideos na sobre-vivência de neurônios foi feita ambos in vivo e in vitro.
Para experimentos in vitro culturas de neurôniosCGR foram preparadas como acima e tratadas com diferentesconcentrações de NGF-E, NGF-EE ou NGF-N.Da Figura 3 pode ser visto que todos os peptideostestados significantemente promoveram a sobrevivência de CGNna cultura.
Experimentos in vivo - Uma injúria cerebral focaino córtex fronto-parietal foi feita por aplicação de uma pe-ça de gelo seco (-78°C) diretamente no crânio por 30 segun-dos em camundongos e 60 segundos em ratos, como previamentedescrito em detalhes (Penkowa et al, 2003). Uma injúria ce-rebral focai no córtex fronto-parietal direito foi feito poraplicar um pedaço de gelo seco (-78oC) diretamente no crâniopor 30 segundos em camundongos e 60 segundos em ratos, comopreviamente descrito em detalhes (Penkowa et al, 2003). Se-guindo tratamento, como descrito abaixo, seções foram incu-badas por uma noite a 5°C com um dos seguintes anticorpos primários: proteína acídica fibrilar glial anti-vaca poli-clonal de coelho (GFAP) 1:250 (um marcador de astrócitos;DakoCytomation); monoclonal de camundongo anti-8-hidroxideoxiguanosina (8-OH-dG) diluído com 1:100 em soro decabra (um marcador para oxidação de DNA; Chemicon, Temacula,CA, EUA);. O anticorpo primário foi detectado com anticorpossecundários biotinilados, incubados com complexo estreptavi-dina-biotina-peroxidase por 30 min. Lectina de tomate bioti-nilada (Sigma, Vallensbaek, DK) foi utilizada como um marca-dor para microglia/macrófagos. O corante lectina foi ainda desenvolvido por uso de um complexo de estreptavidina-biotina-peroxidase (StreptBCComplex/HRP; DakoCytomation,Glostrup, DK) como descrito pelo fabricante e desenvolvidopor"30 minutos em temperatura ambiente (TA) . O produto dareação de lectina foi visualizado por uso de 0,015% H2O2 em3,3'-diaminobenzidina/TBS (DAB/TBS) com DAB como cromogênio.Animais foram tratados no dia (-1), 1 e 3 seguindo a lesãocom um peptideo (10 mg/kg/injeção) subcutaneamente injetada.
O tratamento de ratos lesionados com o peptideoBDNF-EE resulta na inibição de estresse oxidativo como re-fletido como imunocoloração por 8-hidroxideoxiguanosina, ummarcador para oxidação de DNA, inibição da ativação de mi-croglia como refletido por ligação de lectina de tomate, ummarcador de microglia ativada e na ativação de astrócitoscorticais como refletidos por imunocoloração para GFAP.
Exemplo 3: Ligação de NGF e BDNF derivados de pep-tideos para TrkA, TrkB, TrkC e P75.
Análise de Ressonância de Plámons de Superfície(RPS)
Análise da ligação de peptídeos derivados de NGF,NGF-C2, NGF-E, NGF-EE e peptídeos derivados de NGF e BDNF,BDNF-Cl, BDNF-C2, BDNF-E, BDNF-EE, e BDNF para receptoresTrk, TrkA, TrkB, TrkC, e o receptor P75 foi feito por Resso-nância de Plámon de Superfície (SPR) utilizando um instru-mento BIOlite (Biacore AB, Uppsala, Suíça) a 25°C utilizandotampão de corrida HBS-EP, contendo 10 mM de Hepes, p.H 7.4,150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA e 0,005% P20. Os receptores Tr-kA, TrkB e TrkC e p7 5NTR foram imobilizados em um sensor dechip, CM4, utilizando um kit acoplado a amina como segue: ochip foi ativado por 20 pL de solução de ativação, N-hidroxisuccinimida (NHS) e N-etil-N'-(3-dietilaminopropil)-carbodiimida (EDC), a proteína foi imobilizada utlizando 30μL de uma mistura de 4 μL (0,5 pg/mL) de proteína em 50 μLde tampão de acetato de sódio 10 mM (pH 4.0); e o chip foibloqueado por 35 μL de solução bloqueadora (etanolamina-HCl). O receptor de superfície foi regenerado entre injeções ligantes com 15 μL de NaCl 2 mM ou glicina-HCl 10 mM, pH2.5. Nos presentes experimentos uma taxa de fluxo de 5μL/min foi utilizada.
A curva correspondente a diferença entre ligaçãoaos receptores Trk ou o receptor p75NTR e um chip branco foi utilizado para análises.
Constantes de afinidade (KD) calculadas são mos-
tradas na tabela 1.
<table>table see original document page 77</column></row><table>Listagem de Seqüência
<110> Copenhagen university
<120> Seqüências Peptídicas derivadas de Neurotrofina
<130> P1058PC00
<160> 26
<170> Patentln version 3.4
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro vai Asp ser Gly1 5 10
<210> 2
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Phe Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys Asn Gly1 5 10
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro1 5 10 15
Ala Gly
<210> 4
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Phe Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<21Β> Homo sapiens
<400> 7
Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg Ala1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg Ala1 5 10
<210> 10
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser1 5 10<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala1 5 10
<210> 14
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser1 5 10
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg1 5 10 15
<210> 16
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu Val Gly Trp1 5 10 15
Arg
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly TrpArg
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp1 5 10 15
Arg
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr1 5 10
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys Thr Ser Gln1 5 10 15
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Arg Gly Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu1 5 10
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser Gln1 5 10
<210> 23<211> 18<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu Ser Arg Lys Ala Val Arg1 5 10 15
Arg Ala
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu Ser Arg Lys Ile Gly Arg1 5 10 15
Thr
<210> 25
<211> 17
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly Arg1 5 10 15
Ala
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg1 5 10 15

Claims (53)

1. Seqüência de peptideo isolada consistindo de 10a 25 resíduos de aminoácidos contíguos, CARACTERIZADA pelofato de compreender o motivo aminoácido de fórmula Xi- xpl-D/E-T-xb1-C- (x) n-Xp2- (xa) - (xB) -x+/"-xb2-G- (x)nem que:X1 é qualquer resíduo aminoácido(x)n é uma ligação ou uma seqüência de quaisquerresíduos aminoácidos, em que η é um número inteiro de 1 a 5, xpl é Y ou I,xp2 é um resíduo aminoácido hidrofóbico ou básico,xal é K, R, S, A,xa2 é qualquer resíduo aminoácido,(xa) é qualquer resíduo aminoácido ou uma ligação,x+/" é um resíduo aminoácido carregado,ou fragmento do mesmo.
2. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que xp2 é A, L,P ou Y.
3. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com asreivindicações 1, CARACTERIZADA pelo fato de que xp2 é K.
4. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que (xa) é umresíduo aminoácido selecionado de A, E, F, I, L, R, S, T ouV.
5. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de. que pelo menosum dos resíduos (xa) é uma ligação.
6. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que xa2 é um re-síduo de aminoácido selecionado de A, E, G, I, N, R, S, ouT.
7. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que x+/" é sele-cionado de D, Ε, K, R ou H.
8. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência de peptideo é capaz de es-timular o crescimento de neuritos.
9. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência de peptideo é capaz de es-timular a plasticidade neural, tal plasticidade neural asso-ciada com aprendizagem e/ou memória.
10. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência de peptideo é capaz de es-timular a diferenciação celular, tal como diferenciação decélula tronco neural ou diferenciação de célula tumoral.
11. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência de peptideo é capaz de mo-dular a atividade de um receptor de neurotrofina.
12. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a referidaseqüência é capaz de ativar um receptor de neurotrof ina..
13. Seqüência de peptídeo isolada, de acordo com areivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a referidaseqüência é capaz de inibir um receptor de neurotrofina.
14. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comas reivindicações 12 ou 13, CARACTERIZADA pelo fato de que oreceptor de neurotrofina é Trk A, Trk B ou Trk C.
15. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comas reivindicações 12 ou 13, CARACTERIZADA pelo fato de que oreceptor de neurotrofina é p75Trk.
16. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes 12-15,CARACTERIZADA pelo fato de que a referida seqüência peptídi-ca é capaz de estimular a sobrevivência celular.
17. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes, CARACTERIZADA pelofato de que a referida seqüência é selecionada das seguintesseqüências de aminoácidosYETKCRDPNPVDSG (SEQ ID NO:l),YETRCKADNAEEGGPGAG (SEQ ID NO:3),RIDTSCVCALSRKIGRT (SEQ ID NO:24),RIDTACVCTLLSRTGRA (SEQ ID NO:25),RIDTSCVCTLTIKRGR (SEQ ID NO:26),ou fragmentos, ou variantes das mesmas.
18. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que o fragmentoé uma seqüência aminoácida compreendendo pelo menos 10 resí-duos aminoácidos de qualquer das seqüências identificadascomo SEQ ID Nos: 1, 3, 24, 25, ou 26.
19. Seqüência de peptídeo isolada, de acordo com areivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que a varianteé uma seqüência aminoácida que tem pelo menos 60% de homolo-gia a qualquer das seqüências identificadas como SEQ ID Nos:-1, 3, 24, 25, ou 26.
20. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comas reivindicações 18 e 19, CARACTERIZADA pelo fato de que aseqüência de aminoácido é capaz de pelo menos uma atividadebiológica de uma seqüência de peptideo selecionada de qual-quer das seqüências identificadas na reivindicação 17.
21. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que a atividade biológica é selecionada da capacidade de estimular a dife-renciação celular, estimular a plasticidade neural associadacom aprendizagem e memória, estimular à sobrevivência celu-lar, modular a atividade de um receptor de neurotrofina.
22. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes 1 a 21,CARACTERIZADA pelo fato de que a referida seqüência é deri-vada de fator de crescimento do nervo (NGF).
23. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 22, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciaé SEQ ID Nos:1.
24. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes 1 a 21,CARACTERIZADA pelo fato de que a referida seqüência é deri-vada de neurotrofina-3 (NT-3).
25. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 24, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciaé SEQ ID Nos:24.
26. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes 1 a 21,CARACTERIZADA pelo fato de que a referida seqüência é deri-vada de neurotrofina-4/5 (NT-4/5).
27. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 26, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciaé selecionada de seqüências identificadas como SEQ ID Nos:3ou 25.
28. Seqüência de peptideo isolada, de acordo comqualquer das reivindicações antecedentes 1 a 21,CARACTERIZADA pelo fato de que a referida seqüência é deri-vada de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
29. Seqüência de peptideo isolada, de acordo com areivindicação 28, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüênciaé SEQ ID Nos:26.
30. Composto CARACTERIZADO pelo fato de compreen-der uma seqüência de peptideo isolada de qualquer das rei-vindicações antecedentes 1-29.
31. Composto, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de peptideo éformulada como monômero consistindo da cópia única de umaseqüência de peptideo individual.
32. Composto, de acordo com a reivindicação 30,CARACTERIZADO pelo fato de que a seqüência de peptideo éformulada como um multimero consistido de duas ou mais có-pias de uma seqüência de peptideo individual, tal como umdimero ou tetrâmero de uma seqüência de peptídeo individual.
33. Composto, de acordo com a reivindicação 32,CARACTERIZADO pelo fato de que o multímero é um dendrimero.
34. Uso de uma seqüência de peptídeo individual,de acordo com qualquer das reivindicações 1-29 ou um compos-to de acordo com as reivindicações 30-33, CARACTERIZADO pelofato de ser para fabricação de um medicamento.
35. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fa-to de compreender uma seqüência de peptídeo individual con- forme descrito em qualquer das reivindicações 1-29 e/ou com-posto conforme descrito nas reivindicações 30-33.
36. Método de estimulação do crescimento de neuri-to, sobrevivência celular neuronal e/ou inibição da motili-dade celular CARACTERIZADO pelo fato de compreender o uso de um peptídeo conforme descrito em qualquer das reivindicações-1-29, composto conforme descrito nas reivindicações 30-33,ou composição farmacêutica conforme descrito na reivindica-ção 35.
37. Uso de uma seqüência de peptídeo individual, de acordo com qualquer das reivindicações 1-29, composto deacordo com as reivindicações 30-33, ou composição farmacêu-tica de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelofato de ser para estimular a diferenciação celular, sobrevi-vência celular, plasticidade celular neural e/ou indução de apoptose celular.
38. Uso de uma seqüência de peptídeo individual,de acordo com qualquer das reivindicações 1-29, composto deacordo com as reivindicações 30-33, ou composição farmacêu-tica de acordo com a reivindicação 35, CARACTERIZADO pelofato de ser para tratar uma condição ou doença, em que a es-timulação da diferenciação celular, sobrevivência celular,plasticidade celular neural e/ou indução de apoptose celularé benéfica para tratamento.
39. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umacondição ou doença do sistema nervoso central e periférico.
40. Uso, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é sele-cionada de dano pós-operatório no nervo, dano traumático nonervo, mielinação prejudicada de fibras nervosas, danos pós-isquêmicos, tais como após derrame cerebral, degeneração donervo associada a diabetes mellitus, distúrbios que afetam orelógio circadiano ou transmissão neuro-muscular.
41. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato da condição ou doença ser seleciona-da a partir de condições ou doenças dos músculos incluindocondições com função prejudicada de conexões neuro-musculares, tais como após transplante de órgão, ou tais co-mo distúrbios traumáticos ou genéticos de músculo atrófico.
42. Uso, de acordo com a reivindicação 41,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é câncer.
43. Uso, de acordo com a reivindicação 42,CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é qualquer câncerenvolvendo neoangiogênese.
44. Uso, de acordo com a reivindicação 43,CARACTERIZADO pelo fato de que o câncer é um câncer do sis-tema neural.
45. Uso, de acordo com a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato de que a condição ou doença é umacapacidade para aprender diminuída e/ou uma memória diminuí-da.
46. Uso, de acordo com a reivindicação 45,CARACTERIZADO pelo fato da condição ou doença ser doença deParkinson, doença de Alzheimer, doença de Huntington ou de-mência tal como demência multienfarte.
47. Uso, de acordo com. a reivindicação 39,CARACTERIZADO pelo fato da condição ou doença ser uma doençamental, tal como um distúrbio de pensamento e/ou de humor,distúrbios neuropsiquiátricos incluindo bipolar (BDP), dis-túrbios afetivos unipolares relacionados geneticamente, dis-túrbios delusionais, parafrenia, psicose paranóide, esquizo-frenia, distúrbio esquizotípico, distúrbio esquizoafetivo,distúrbios afetivos unipolares relacionados geneticamente eesquizoafetivo bipolar, psicose psicogênica, catatonia, dis-túrbios afetivos unipolares relacionados geneticamente e pe-riódico bipolar, psicose ciclóide, distúrbio da personalida-de esquizóide, distúrbio da personalidade paranóide, distúr-bios afetivos unipolares geneticamente relacionados e bipo-lares, e subtipos de distúrbio afetivo unipolar.
48. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato da condição ou doença serem os danosno corpo devido ao consumo de álcool.
49. Uso, de acordo com a reivindicação 38,CARACTERIZADO pelo fato da condição ou doença ser uma doençade prion.
50. Uso de uma seqüência de peptídeo, de acordocom qualquer das reivindicações 1-29, CARACTERIZADO pelo fa-to de ser para produção de um anticorpo.
51. Anticorpo capaz de reconhecer e ligar-se a umepitopo, CARACTERIZADO pelo fato de compreender o motivo a-minoácido conforme definido na reivindicação 1.
52. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 51,CARACTERIZADO pelo fato do referido anticorpo ser capaz dereconhecer um epitopo compreendendo ou compreendido porqualquer uma das seqüências identificadas como SEQ ID Nos:-1,3, 24-26.
53. Método de tratamento, CARACTERIZADO pelo fatode compreender a administração a um indivíduo em necessidadede uma quantidade efetiva de uma seqüência de peptídeo con-forme definido nas reivindicações 1-29, de um composto con-forme definido nas reivindicações 30-33, de uma composiçãofarmacêutica conforme definida na reivindicação 35 e/ou umanticorpo conforme definido na reivindicação 51 ou 52.
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