CA2364106A1 - Polynucleotide et proteine impliques dans la synaptogenese, variants de ceux-ci, et leurs applications therapeutiques et diagnostiques - Google Patents
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Description
POLYNUCLÉOTIDE ET PROTÉINE IMPLIQUÉS DANS LA
SYNAPTOGEN~SE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
b) Brève descriution de l'art antérieur L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les critères cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans l'ouvrage DSM-IV-TRT"" (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme.
Ä partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe ef al. (Human Molecular Genetics, 1999, 8:805-812) décrit 11 régions chromosomiques susceptibles d'être impliquées dans le développement de l'autisme parmi lesquelles une région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genet., 1999, 104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des patients atteints d'autisme et Milunsky et al. (Clin. Genet., 1999, 55:455-460) décrit des délétions en Xp22 chez des patients atteints de schizophrénie et suggère plus précisément l'implication d'une délétion en Xp22.3 dans le développemént de la cette maladie psychiatrique. Toutefois, ni le gène impliqué
dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
SYNAPTOGEN~SE, VARIANTS DE CEUX-CI, ET LEURS APPLICATIONS
THÉRAPEUTIQUES ET DIAGNOSTIQUES
CONTEXTE DE L'INVENTION
a) Domaine de l'invention La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations.
b) Brève descriution de l'art antérieur L'autisme est une maladie qui touche environ un enfant sur 1000 et principalement les garçons (de 4 à 23 garçons pour une fille selon les critères cliniques choisis). Les symptômes cliniques de l'autisme sont décrits dans l'ouvrage DSM-IV-TRT"" (Diagnostic and statistical manual of mental disorders, 2000, pages 70-75).
Les bases moléculaires de l'autisme sont actuellement inconnues. Des études ont déjà suggéré l'existence d'une composante génétique dans l'autisme.
Ä partir de résultats d'analyse de liaison, Philippe ef al. (Human Molecular Genetics, 1999, 8:805-812) décrit 11 régions chromosomiques susceptibles d'être impliquées dans le développement de l'autisme parmi lesquelles une région du chromosome Xp. D'autre part, Thomas et al. (Hum. Genet., 1999, 104:43-48) décrit des délétions du bras court du chromosome X chez des patients atteints d'autisme et Milunsky et al. (Clin. Genet., 1999, 55:455-460) décrit des délétions en Xp22 chez des patients atteints de schizophrénie et suggère plus précisément l'implication d'une délétion en Xp22.3 dans le développemént de la cette maladie psychiatrique. Toutefois, ni le gène impliqué
dans la maladie, ni la nature de la mutation ne sont mentionnés.
2 Les neuroligines (HNLs) sont des protéines d'adhésion cellulaire qui peuvent déclencher à elles seules la synaptogenèse c'est-à-dire la formation de synapses (Scheiffele et al., Cell, 2000, 101:657-669). Une protéine HNL4 (Human Neuroligline-4) a été décrite par Bollinger et al. (Biochem. J. 2001, 356:581-588) sans description génomique ni fonction biologique associée.
D'autre part, la base de données LOCUSLINKT"" (htta://www.ncbi.nim.nih.giov) du 13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951 des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en outre inconnue.
Au vu de ce qui précède, il est clair que la connaissance des bases moléculaires de l'autisme et tout particulièrement du gène impliqué dans la maladie est fortement souhaitée afin de permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques, de nouveaux médicaments et des tests diagnostiques.
II existe également un besoin concernant l'identification de la fonction biologique des neuroligines ainsi que l'identification de la séquence nucléique et protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL4.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également un gène codant pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4 et son homologue fonctionnel HLNS codé par un gène du chromosome Y, les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations, de même que des méthodes
D'autre part, la base de données LOCUSLINKT"" (htta://www.ncbi.nim.nih.giov) du 13 septembre 2001 fournit sous les numéros d'accession KIAA1260 et KIAA0951 des séquences incomplètes d'un gène de la neuroligine dont la fonction est en outre inconnue.
Au vu de ce qui précède, il est clair que la connaissance des bases moléculaires de l'autisme et tout particulièrement du gène impliqué dans la maladie est fortement souhaitée afin de permettre de développer de nouvelles approches thérapeutiques, de nouveaux médicaments et des tests diagnostiques.
II existe également un besoin concernant l'identification de la fonction biologique des neuroligines ainsi que l'identification de la séquence nucléique et protéique des neuroligines, notamment celle de la HNL4.
La présente invention répond à ces besoins et à d'autres besoins comme cela sera apparent à une personne versée dans le domaine à la lecture de la présente description de l'invention.
RÉSUMÉ DE L'INVENTION
La présente invention concerne l'identification d'un gène humain codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse et dont la mutation est associée chez l'homme au développement de maladies neurologiques et/ou à
une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques tels que l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'invention concerne également un gène codant pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines (HNLs) et plus particulièrement la protéine HNL4 et son homologue fonctionnel HLNS codé par un gène du chromosome Y, les applications diagnostiques et thérapeutiques liées à l'identification du gène et de ses mutations, de même que des méthodes
3 de tri de molécules interagissant avec les produits d'expression du gène selon l'invention.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène HLN4.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
La Figure 4 est un schéma qui montre la localisation chromosomique et l'évolution des gènes HNL4 et HNLS.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes Neuroligines humaines.
Les Figures 6a, 6b et 6c montrent le résultat de l'analyse par SSCP
(Single Strand Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène codant pour la protéine HNL4 ainsi que la séquence de cette mutation.
La Figure 7 est un schéma qui montre la localisation de la protéine HNL4 et les effets de la mutation sur HNL4.
La Figure 8 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 1) du gène humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 9 représente la séquence d'ADN complémentaire (SEQ ID NO: 2) du gène humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3) de la protéine humaine HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 11 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 4) du gène humain HNLS.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 5) du gène humain HNLS sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 6) de la protéine humaine HNL5 sauvage.
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 montre la région du chromosome Xp22.3 contenant le gène HLN4.
La Figure 2 montre un alignement protéique des Neuroligines humaines.
La Figure 3 est un schéma qui montre l'architecture protéique d'une synapse avec la localisation et les partenaires connus des Neuroligines.
La Figure 4 est un schéma qui montre la localisation chromosomique et l'évolution des gènes HNL4 et HNLS.
La Figure 5 est un schéma qui montre la structure génomique des gènes Neuroligines humaines.
Les Figures 6a, 6b et 6c montrent le résultat de l'analyse par SSCP
(Single Strand Conformational Polymorphism) d'une mutation du gène codant pour la protéine HNL4 ainsi que la séquence de cette mutation.
La Figure 7 est un schéma qui montre la localisation de la protéine HNL4 et les effets de la mutation sur HNL4.
La Figure 8 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 1) du gène humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 9 représente la séquence d'ADN complémentaire (SEQ ID NO: 2) du gène humain HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 10 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 3) de la protéine humaine HNL4 sauvage (non muté).
La Figure 11 représente la séquence génomique (SEQ ID NO : 4) du gène humain HNLS.
La Figure 12 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 5) du gène humain HNLS sauvage.
La Figure 13 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 6) de la protéine humaine HNL5 sauvage.
4 La Figure 14 représente la séquence d'ADN complémentaire (ADNc) (SEQ ID NO : 7) d'un transcrit alternatif du gène humain HNL5 sauvage.
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 8) correspondant à la séquence alternative de la Figure 14.
' La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la protéine humaine HNL4 mutée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la séquence génomique du gène HLN4 localisé en Xp22.3 ainsi que l'identification d'un homologue fonctionnel HNLS placé sur le chromosome Y localisé en Yq 11.22.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication de la protéine HNL4 dans la synaptogenèse c'est-à-dire la dernière étape du développement du système nerveux central.
Selon un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide isolé
ou purifié, qui, dans sa forme sauvage, est impliqué dans la synaptogenèse, dont au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques et plus particulièrement l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Préférablement, le polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement polypeptide consiste en la protéine HNL4 ou la protéine HLNS. Avantageusement, le polypeptide de l'invention comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6 ou de la SEQ ID N0:8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage HNL4 ou HNLS.
Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence peptidique substantiellement identique, au moins en partie, à la séquence peptidique de la protéine sauvage. II peut s'agir par exemple de polypeptides
La Figure 15 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 8) correspondant à la séquence alternative de la Figure 14.
' La Figure 16 représente la séquence en acides aminés (SEQ ID NO : 9) de la protéine humaine HNL4 mutée.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION
L'originalité de la présente invention porte sur l'identification de la séquence génomique du gène HLN4 localisé en Xp22.3 ainsi que l'identification d'un homologue fonctionnel HNLS placé sur le chromosome Y localisé en Yq 11.22.
L'invention concerne aussi l'identification de l'implication de la protéine HNL4 dans la synaptogenèse c'est-à-dire la dernière étape du développement du système nerveux central.
Selon un premier aspect, la présente invention vise un polypeptide isolé
ou purifié, qui, dans sa forme sauvage, est impliqué dans la synaptogenèse, dont au moins une mutation dans la séquence en acides aminés est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou maladies psychiatriques et plus particulièrement l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Préférablement, le polypeptide consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement polypeptide consiste en la protéine HNL4 ou la protéine HLNS. Avantageusement, le polypeptide de l'invention comprend une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8, et les séquences d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivées de la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6 ou de la SEQ ID N0:8.
L'invention concerne également les polypeptides "mutés" et les polypeptides "dérivés" de la protéine sauvage HNL4 ou HNLS.
Par "polypeptide dérivé" d'une protéine sauvage ou "variant" d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui possèdent une séquence peptidique substantiellement identique, au moins en partie, à la séquence peptidique de la protéine sauvage. II peut s'agir par exemple de polypeptides
5 modifiés chimiquement ayant une séquence peptidique 100% identique à une portion de la protéine sauvage. II peut s'agir aussi de polypeptides hybrides ayant une première portion 100% identique à une première portion de la protéine sauvage et une seconde portion aucunement/partiellement identique à une seconde portion de la protéine sauvage. II peut s'agir encore de polypeptides ayant une homologie totale/partielle avec une portion de la protéine sauvage.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution de un ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. II peut également s'agir d'une modification apportée par l'addition de chaînes carbonées fixées sur au moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la protéine humaine HNL4 ou HNLS. Selon un mode de réalisation privilégié, le polypeptide muté selon la présent invention possède la SEQ ID N0:9 ou une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID N0:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus particulièrement un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies psychiatriques.
Par polypeptides "mutés" dérivés d'une protéine sauvage, on entend tous les peptides qui ont été obtenus suite à une modification de ladite protéine sauvage, que ce soit une modification par addition, délétion ou substitution de un ou plusieurs des acides aminés de la protéine sauvage. II peut également s'agir d'une modification apportée par l'addition de chaînes carbonées fixées sur au moins un des acides aminés de la protéine sauvage ou sur au moins un des acides aminés des peptides pour lesquels il existe une substitution ou une modification de l'un des acides aminés par rapport à la protéine sauvage. Plus particulièrement, la présente invention couvre les peptides qui dérivent de la protéine humaine HNL4 ou HNLS. Selon un mode de réalisation privilégié, le polypeptide muté selon la présent invention possède la SEQ ID N0:9 ou une séquence d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 acides aminés consécutifs ou plus dérivée de la SEQ ID N0:9.
L'invention vise aussi les polypeptides (et les fragments de ceux-ci) qui sont codés par les séquences nucléotidiques mentionnés ci-après.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un polynucléotide isolé ou purifié
codant pour un polypeptide tel que défini précédemment et plus particulièrement un polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse dans lequel une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de maladies mentales ou de maladies psychiatriques.
6 Par "isolé ou purifié", on entend les molécules qui ont été altérées par l'homme de leur état natif, c.-à-d., si une telle molécule existe dans la nature, elle a été changée et/ou retirée de son environnement initial. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé". Toutefois, le même polynucléotide ou polypeptide lorsque séparé de son environnement normal et/ou obtenu par clonage, amplification et/ou par synthèse chimique est considéré selon la présente invention comme étant "isolé". D'ailleurs, un polynucléotide ou polynucléotide qui est introduit dans un organisme par transformation, manipulation génétique ou par n'importe quelle autre méthode de recombinaison est "isolé" même si il est présent dans ledit organisme.
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN
possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées (ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. II va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux-polynucléotides selon la présent invention Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 ou pour un fragment de cette protéine.
Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:1, la SEQ ID N0:2, la SEQ ID N0:4, la SEQ ID N0:5, la SEQ ID N0:7, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ
ID N0:1 ou la SEQ ID N0:2.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour une protéine HLN4 mutée et il est muté de telle sorte que la mutation provoque une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide de l'invention comprend la SEQ ID N0:1 et la mutation consiste est une insertion
Par "polynucléotide" on entend toute séquence ou molécule d'ADN, d'ARN
possédant deux nucléotides et plus, incluant les séquences nucléiques codant pour un gène entier. Le terme polynucléotide englobe toutes les molécules d'acides nucléiques qui se retrouvent à l'état naturel ou artificiel. Ceci inclut les molécules d'ADN, les molécules d'ARN, les ADNc, les séquences exprimées (ESTs), les séquences artificielles et tous les fragments de ceux-ci. II va de soi que les définitions "dérivé", "variant" et "muté" s'appliquent également aux-polynucléotides selon la présent invention Selon un mode de réalisation préférentiel, le polynucléotide selon l'invention code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 8 ou pour un fragment de cette protéine.
Préférablement, le polynucléotide comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par: la SEQ ID N0:1, la SEQ ID N0:2, la SEQ ID N0:4, la SEQ ID N0:5, la SEQ ID N0:7, et les séquences d'au moins d'au moins 20, d'au moins 50 et d'au moins 100 nucléotides consécutifs ou plus dérivées de la SEQ
ID N0:1 ou la SEQ ID N0:2.
Selon un autre mode de réalisation, le polynucléotide code pour une protéine mutée non fonctionnelle. Préférablement, le polynucléotide code pour une protéine HLN4 mutée et il est muté de telle sorte que la mutation provoque une terminaison précoce de la protéine. Plus préférablement, le polynucléotide de l'invention comprend la SEQ ID N0:1 et la mutation consiste est une insertion
7 d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9 (ORF).
Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison précoce de la protéine (D396stop).
Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage etlou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera pas décrite plus en détail.
Les polypeptides et polynucléotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-4.97).
Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en la protéine HNL4 ou la protéine HLNS. Des exemples de polynucléotides non mutés sont donnés précédemment.
L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL4. Préférablement les cellules dans lequel le polynucléotide est inséré
sont des cellules souches. Des exemples de polynucléotides satisfaisant sont données précédemment.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant:
a) l'utilisation de cellules souches du patient;
b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine NHL4; et ' c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, les polynucléotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer dans les cellules et le mode et la quantité de polynucléotides ou de cellules devant être administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la séquence exacte des polynucléotides; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Le procédé
comprend au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène;
- la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé comprend:
a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN
messager.
Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse) pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale. Selon un mode de réalisation préféré, le kit comprend au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide, ces éléments permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; et/ou ü) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse.
5 Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL4 ou la protéine HLNS.
10 Avantageusement, le gène code, dans sa forme sauvage, pour une protéine comprenant la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8. Plus préférablement, le gène comprend la SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:4.
La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger ouvre la porte à la découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter la maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide codé par le polynucléotide tel que défini précédemment, ou l'activité
biologique du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé de tri comprend:
a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
L'exemple qui suit permettra de mettre en 'évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLE
L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4 et HNL5 sont spécifiques des primates bien qu'absents chez les singes du nouveau monde.
Alors que tous les gènes du chromosome Y ont commencé à diverger de leur homologue sur le chromosome X il y a 40 millions d'années, le gène HNL5 est le plus fortement conservé (Table 1 ).
Table 1: conservation des gnes HNL4 et HNL5 au cours de l'volution.
Gene pair Ks KA ~~ Ks/KA DNA Protein SAquence dlv~rgencedivergencecompared _ (%) (%,~ (nucleotidesj ~ , Croup 4 GYG2/GYG2P' 0.11 0.06 1.8 7 1 2 . 525 ARSD/ARSDf'" 0.09 0.07 1.3 7 13 846 ARSFJARSEP' 0.05 0.04 1.2 4 9 615 PRKXIY 0,07 0.03 2.3 5 8 1020 HNL4/5 0.079 0.012 6.456 3 2 2451 STS/STSP' 0 .12 0 .10 1. 2 1 1 1 B 8 5 2 KAL1/KALP' 0.07 0.06 1.2 6 12 1302 AMELX/Y __0.07 0.07 1.0 7 12 576 Croup 3 ~ "' T84X/Y 0.29 0.04 7.3 7 7 135 EIF1AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432 ZFX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394 DFFRX/Y 0 . 0 . 6 . 1 1 9 7 6'71 DBX/Y 0.36 0.04 9.0 12 9 1932 CASK/CASKP' 0.24 0.22 1.1 15 32 156 UTX/Y 0.26 0.08 3,3 12 16 4066 Croup 2 UBE1X/Y ' 0.5$ 0.07 8.3 16 13 693 .
SMCX/Y 0.52 0.08 6.5 17 15 4623 Croup r RPS4X/Y 0.97 0.05 ~ 19 18 18 7g2 RBMX/Y 0.94 0.25 3.S 29 38 1188 SOX3lSRY 1.25 0.19 6.6 2B 29 264 PCDHX/Y 0_006 0.008 0.808 1 2 2850 Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes (KA) de tous les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y.
Le rapport 25 KS/KA est une indication de la conservation des gènes. KS est le taux de substitution synonyme par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la séquence de la protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme qui représente les modifications qui changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1 alors le gène n'est pas conservé car il y a autant de modification synonymes et non-synonymes.
C'est le cas pour les 30 couples X/Y possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y
(par ex.
KAL1/KALP*). Si KS/KA >1, alors le gène varie au cours de l'évolution mais la protéine est bien conservée. C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la variation génétique entre ces gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences protéiques de HNL4 et HNLS.
Pour la détection de mutations sur le gène HNL4, les étapes suivantes ont été utilisées:
Matériels et Méthodes Identification de la séguence des Qènes HNL4 et HNL5 L'isolement des gènes HNL4 et HNL5 a été effectué par l'analyse informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par l'arnpli~cation des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux.
Analyse informatique Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du génome humain (http://genome.usc.edu et http//www.ensembl.org/
genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le marqueur génétique qui montre la liaison la plus significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et al.
(1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était localisé
dans un gène putatif KIAA1260 et qu'il y existait un homologue putatif localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de la séquence génomique.
Une analyse par alignement de séquence (BLAST) et un arbre phylogénétique regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de . la famille des neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4 et HNLS.
Analyse des transcrits HNL4 et HNL5 Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes (n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux.
Les ADNc complets des ARNm HNL4 et HNLS ont été retrotranscrits, amplifiés et directement séquencés. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et le séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
Séauencaae des gènes HNL4 et HNL5 chez les sujets autistes et Asperger Chaque exon des gènes HNL4 et HNL5 a été amplifié et séquencé à partir de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués dans le Tableau 3.
Tableau 2. Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et séquencer les ADNc de HNL4 et HNLS.
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
Exons 4-6 HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces dégénérées, utilisation du code universel : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Tableau 3. Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les gnes HNL4 et HNLS.
Exons Amorces Squences Exon 1 HNL4 HNLXE1 F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC
Exon 1 HNLS HNLYE1 F GGGGTGCTTCTTTTGGGAGGCT
Exon 2 HNL4/5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG
Exon 3 HNL4/5 HNLXYE3F TGTGTTTCCGTACTTGGCTTT
Exon 4 HNL4 HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT
Exon 4 HNLS HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT
Exon 5 HNL4/5 HNLXYESdF TGTCCRCAATTTTGCACCTGC
HNLXYESdR AGGAYAGTGATACCCCAACA
Exon 6 HNL4/5 HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces code universel : M(AC), R(AG), dgnres, utilisation W(AT), S(CG), du Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont été amplifiées.
Ainsi, 44 garçons et 22 filles autistes ont été testés pour la majorité de la partie codante HNL4/5.
Chez une famille suédoise, une mutation insT1186 provoquant une terminaison précoce D396stop de la protéine a été identifiée. Elle est localisée dans l'exon 5 de HLN4 et, par conséquent, engendre la production d'une protéine tronquée dépourvue de son domaine transmembranaire essentiel pour sa fonction de protéine d'adhésion. Cette mutation coïncide parfaitement avec le syndrome en ce qu'elle est présente chez la mère et les deux enfants atteints alors qu'elle est absente chez le frère sain. Plus précisément, un des enfants présente le syndrome d'Asperger (DSM-IV-TRT"", 2000, pages 80-84) alors que le second est autiste. De plus, cette mutation est apparue de novo car elle est absente chez les grands parents maternels.
D'autre part, le ratio garçon/fille, lequel est de quatre pour l'autisme et de neuf pour de Syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle 5 HLN4/5 influe sur la synaptogenèse et la mutation de HLN4/5 constitue un facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans 10 la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première mutation décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose tuberculeuse, etc.).
Cette mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire puisque cette mutation provoque une terminaison précoce de la protéine (D396stop).
Les polypeptides et polynucléotides selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé approprié. Ils peuvent notamment être obtenus par synthèse chimique mais il est également possible de les obtenir par voie biologique en utilisant notamment différents vecteurs dans les cultures cellulaires appropriées tel que cela sera décrit ci-après. Les peptides selon la présente invention peuvent se présenter sous forme déglycosylée, ou glycosylée, si cela est nécessaire. Une personne versée dans le domaine de l'invention saura obtenir différents polynucléotides/polypeptides et elle saura également déterminer quels sont, parmi les polynucléotides/polypeptides obtenus, ceux qui ont une activité biologique adéquate.
Selon un autre aspect, l'invention concerne tout vecteur (de clonage etlou d'expression) et tout hôte cellulaire (procaryote ou eucaryote) transformé par un tel vecteur, et comprenant les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence de nucléotides codant pour un peptide selon l'invention.
Selon un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un peptide de l'invention, par transformation d'un hôte cellulaire à l'aide d'un vecteur d'expression (plasmide, cosmide, virus, etc) comprenant les séquences d'ADN codant pour les peptides de l'invention, suivie de la mise en culture de l'hôte cellulaire ainsi transformé, et de la récupération du peptide dans le milieu de culture. L'utilisation de vecteurs pour l'expression de protéines et de peptides dans les cellules d'un hôte, notamment l'humain, est bien connue et ne sera pas décrite plus en détail.
Les polypeptides et polynucléotides de la présente invention peuvent aussi être utilisés pour préparer des anticorps polyclonaux ou monoclonaux capables de se fixer (préférablement de manière spécifique) sur au moins un polypeptide/polynucléotide objet de l'invention. La présente invention vise donc également de tels anticorps purifiés qui peuvent être obtenus par des techniques très bien connues comme par exemple la technique décrite par Kolher et Milstein (Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature (1975), 262:495-4.97).
Selon un autre aspect, l'invention concerne le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Plus particulièrement, l'invention vise l'utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse. Préférablement, la protéine consiste en une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement le polypeptide consiste en la protéine HNL4 ou la protéine HLNS. Des exemples de polynucléotides non mutés sont donnés précédemment.
L'invention vise aussi une méthode de traitement comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine HNL4. Préférablement les cellules dans lequel le polynucléotide est inséré
sont des cellules souches. Des exemples de polynucléotides satisfaisant sont données précédemment.
Selon un aspect connexe, l'invention vise un procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, le procédé comprenant:
a) l'utilisation de cellules souches du patient;
b) l'insertion, dans le génome des cellules souches, d'un polynucléotide codant pour un polypeptide fonctionnel impliqué dans la synaptogenèse tel que la protéine NHL4; et ' c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
Une personne versée dans le domaine saura adapter les méthodes de traitement ci-dessus mentionnées et déterminer, en fonction de plusieurs facteurs, les polynucléotides devant être utilisés, le moyen pour les insérer dans les cellules et le mode et la quantité de polynucléotides ou de cellules devant être administrés. Parmi les facteurs pouvant influencer ses choix l'on retrouve: la nature du traitement, la séquence exacte des polynucléotides; le stade de la maladie; la condition, l'âge et le poids du patient, etc.
Selon un autre aspect, l'invention porte aussi sur un procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale tels que l'autisme ou le Syndrome d'Asperger. Le procédé
comprend au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène;
- la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé comprend:
a) l'amplification d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène; et b) la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN
messager.
Un aspect connexe du procédé de l'invention concerne un kit (trousse) pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale. Selon un mode de réalisation préféré, le kit comprend au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par: une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide, ces éléments permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment de ce gène ou dans la séquence d'un ARN messager de ce gène; et/ou ü) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse.
5 Préférablement, le gène auquel il est fait référence dans le procédé et le kit code, dans sa forme sauvage, pour une protéine d'adhésion cellulaire, plus préférablement pour une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines et encore plus préférablement pour la protéine HNL4 ou la protéine HLNS.
10 Avantageusement, le gène code, dans sa forme sauvage, pour une protéine comprenant la SEQ ID N0:3, la SEQ ID N0:6, la SEQ ID N0:8. Plus préférablement, le gène comprend la SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:4.
La connaissance du gène impliqué dans une prédisposition au développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger ouvre la porte à la découverte de nouvelles molécules permettant de prévenir, contrôler ou traiter la maladie. Ainsi, selon un autre aspect, l'invention vise un procédé de tri de molécules pouvant permettre de moduler l'activité biologique d'un polypeptide codé par le polynucléotide tel que défini précédemment, ou l'activité
biologique du polypeptide tel que défini précédemment. Selon un mode de réalisation privilégié, le procédé de tri comprend:
a) la mise en contact dudit polypeptide avec une molécule susceptible de moduler son activité biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
L'exemple qui suit permettra de mettre en 'évidence d'autres caractéristiques et avantages de la présente invention.
EXEMPLE
L'étude phylogénétique montre que les gènes HNL4 et HNL5 sont spécifiques des primates bien qu'absents chez les singes du nouveau monde.
Alors que tous les gènes du chromosome Y ont commencé à diverger de leur homologue sur le chromosome X il y a 40 millions d'années, le gène HNL5 est le plus fortement conservé (Table 1 ).
Table 1: conservation des gnes HNL4 et HNL5 au cours de l'volution.
Gene pair Ks KA ~~ Ks/KA DNA Protein SAquence dlv~rgencedivergencecompared _ (%) (%,~ (nucleotidesj ~ , Croup 4 GYG2/GYG2P' 0.11 0.06 1.8 7 1 2 . 525 ARSD/ARSDf'" 0.09 0.07 1.3 7 13 846 ARSFJARSEP' 0.05 0.04 1.2 4 9 615 PRKXIY 0,07 0.03 2.3 5 8 1020 HNL4/5 0.079 0.012 6.456 3 2 2451 STS/STSP' 0 .12 0 .10 1. 2 1 1 1 B 8 5 2 KAL1/KALP' 0.07 0.06 1.2 6 12 1302 AMELX/Y __0.07 0.07 1.0 7 12 576 Croup 3 ~ "' T84X/Y 0.29 0.04 7.3 7 7 135 EIF1AX/Y 0.32 0.01 32 9 2 432 ZFX/Y 0.23 0.04 5.8 7 7 2394 DFFRX/Y 0 . 0 . 6 . 1 1 9 7 6'71 DBX/Y 0.36 0.04 9.0 12 9 1932 CASK/CASKP' 0.24 0.22 1.1 15 32 156 UTX/Y 0.26 0.08 3,3 12 16 4066 Croup 2 UBE1X/Y ' 0.5$ 0.07 8.3 16 13 693 .
SMCX/Y 0.52 0.08 6.5 17 15 4623 Croup r RPS4X/Y 0.97 0.05 ~ 19 18 18 7g2 RBMX/Y 0.94 0.25 3.S 29 38 1188 SOX3lSRY 1.25 0.19 6.6 2B 29 264 PCDHX/Y 0_006 0.008 0.808 1 2 2850 Ce tableau regroupe les taux de substitutions synonymes (KS) et non synonymes (KA) de tous les gènes connus du chromosome X possédant un homologue sur le chromosome Y.
Le rapport 25 KS/KA est une indication de la conservation des gènes. KS est le taux de substitution synonyme par site synonyme qui représente les modifications qui ne changent pas la séquence de la protéine. KA est le taux de substitution non synonyme par site non synonyme qui représente les modifications qui changent la séquence de la protéine. Si le rapport KS/KA = 1 alors le gène n'est pas conservé car il y a autant de modification synonymes et non-synonymes.
C'est le cas pour les 30 couples X/Y possédant un pseudogène non fonctionnel sur le chromosome Y
(par ex.
KAL1/KALP*). Si KS/KA >1, alors le gène varie au cours de l'évolution mais la protéine est bien conservée. C'est le cas pour le couple HNL4/5 indiquant que la variation génétique entre ces gènes est soumise à une pression de sélection qui conserve les séquences protéiques de HNL4 et HNLS.
Pour la détection de mutations sur le gène HNL4, les étapes suivantes ont été utilisées:
Matériels et Méthodes Identification de la séguence des Qènes HNL4 et HNL5 L'isolement des gènes HNL4 et HNL5 a été effectué par l'analyse informatique des séquences de la région Xp22.3 et Yq11.22 et par l'arnpli~cation des transcrits complets à partir d'ARNm de cerveaux.
Analyse informatique Une étude systématique des gènes de la région Xp22.3, proche du microsatellite DXS996, a été effectuée à partir des données du séquençage du génome humain (http://genome.usc.edu et http//www.ensembl.org/
genomecentral). Le microsatellite DXS996 est le marqueur génétique qui montre la liaison la plus significative avec l'autisme dans l'analyse de Philippe et al.
(1999, précité). Nous avons identifié, que ce marqueur génétique était localisé
dans un gène putatif KIAA1260 et qu'il y existait un homologue putatif localisé sur le chromosome Y. La séquence partielle des ADNc des gènes codant pour KIAA1260 et KIAA0951 a été déduite à partir de la séquence génomique.
Une analyse par alignement de séquence (BLAST) et un arbre phylogénétique regroupant les autres neuroligines humaines a été effectué pour définir que KIAA1260 et KIAA0951 sont des nouveaux membres de . la famille des neuroligines que nous appelons dorénavant HNL4 et HNLS.
Analyse des transcrits HNL4 et HNL5 Des ARN totaux de cerveaux humains provenant de différents hommes (n=5) et femmes (n=5) ont été isolés à partir de biopsies de cortex frontaux.
Les ADNc complets des ARNm HNL4 et HNLS ont été retrotranscrits, amplifiés et directement séquencés. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification et le séquençage sont indiqués dans les Tableaux 2 et 3.
Séauencaae des gènes HNL4 et HNL5 chez les sujets autistes et Asperger Chaque exon des gènes HNL4 et HNL5 a été amplifié et séquencé à partir de l'ADN génomique. Le nom et la séquence de chaque amorce sont indiqués dans le Tableau 3.
Tableau 2. Noms et séquences des amorces utilisés pour amplifier et séquencer les ADNc de HNL4 et HNLS.
Exons 1-6 HNLXY1 ACCCCGCGTGAAGATGAAATG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
Exons 4-6 HNLXY10 TCCTGGATCAGATTCAAGCAC
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Exons 2-6 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces dégénérées, utilisation du code universel : M(AC), R(AG), W(AT), S(CG), Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Tableau 3. Noms et séquences des amorces utilisés pour séquencer les gnes HNL4 et HNLS.
Exons Amorces Squences Exon 1 HNL4 HNLXE1 F ATTCTTTAAGAAAACTGTCAGC
Exon 1 HNLS HNLYE1 F GGGGTGCTTCTTTTGGGAGGCT
Exon 2 HNL4/5 HNLXYE2F GGATGTGGATGCAGATTTGAA
HNLXE2Rbis GTATTGTTTTCTGTTCCAGTG
Exon 3 HNL4/5 HNLXYE3F TGTGTTTCCGTACTTGGCTTT
Exon 4 HNL4 HNLXYE4F ACCAAAAATCTCTTGTGTTCT
Exon 4 HNLS HNLYE4F AACAAAAATGTCCTGTGTTCT
Exon 5 HNL4/5 HNLXYESdF TGTCCRCAATTTTGCACCTGC
HNLXYESdR AGGAYAGTGATACCCCAACA
Exon 6 HNL4/5 HNLXYE6Fbis AGAGCAGATTGTAACTTCCTG
HNLXYE6dR GAGGGATAGGARGGGAAATAG
Pour les amorces code universel : M(AC), R(AG), dgnres, utilisation W(AT), S(CG), du Y(CT), K(GT), V(ACG), H(ACT), D(AGT), B(CGT), N(ACGT) Afin de tester ce gène chez des sujets autistes, la structure génomique des différentes HNLs a été définie et les parties codantes (Exon 2-Exon 6) ont été amplifiées.
Ainsi, 44 garçons et 22 filles autistes ont été testés pour la majorité de la partie codante HNL4/5.
Chez une famille suédoise, une mutation insT1186 provoquant une terminaison précoce D396stop de la protéine a été identifiée. Elle est localisée dans l'exon 5 de HLN4 et, par conséquent, engendre la production d'une protéine tronquée dépourvue de son domaine transmembranaire essentiel pour sa fonction de protéine d'adhésion. Cette mutation coïncide parfaitement avec le syndrome en ce qu'elle est présente chez la mère et les deux enfants atteints alors qu'elle est absente chez le frère sain. Plus précisément, un des enfants présente le syndrome d'Asperger (DSM-IV-TRT"", 2000, pages 80-84) alors que le second est autiste. De plus, cette mutation est apparue de novo car elle est absente chez les grands parents maternels.
D'autre part, le ratio garçon/fille, lequel est de quatre pour l'autisme et de neuf pour de Syndrome d'Asperger corrobore cette observation selon laquelle 5 HLN4/5 influe sur la synaptogenèse et la mutation de HLN4/5 constitue un facteur de prédisposition aux maladies mentales, notamment l'autisme et le Syndrome d'Asperger.
L'identification de cette mutation Stop dans un gène spécifique des primates, porté par le chromosome X chez deux sujets autistes et impliqué dans 10 la synaptogenèse est une des premières mutations fonctionnelles identifiées dans une maladie psychiatrique. Cette mutation est en outre la première mutation décrire associée à l'autisme sans autre signe clinique (X fragile, sclérose tuberculeuse, etc.).
Claims (53)
1. Polynucléotide isolé ou purifié codant pour un polypeptide impliqué, dans sa forme sauvage, dans la synaptogenèse, caractérisé en ce qu'une mutation au moins de ce polynucléotide est associée au développement de maladies neurologiques et/ou à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
2. Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
3. Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite protéine appartient à la famille des neuroligines humaines.
4. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est muté de manière à coder pour une protéine mutée non fonctionnelle.
5. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ladite protéine est la HNL4 ou la HLN5.
6. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il code pour une protéine comprenant une séquence choisie dans le groupe constitué par: la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO:8 et les fragments de cette protéine.
7. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisie dans le groupe constitué
par: la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:7 et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés desdites séquences.
par: la SEQ ID NO:1, la SEQ ID NO:2, la SEQ ID NO:4, la SEQ ID NO:5, la SEQ ID NO:7 et les séquences d'au moins 20 nucléotides consécutifs dérivés desdites séquences.
8. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la protéine est la HLN4 et en ce que ledit polynucléotide est muté de telle sorte que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
9. Polynucléotide selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
10. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production d'une protéine défectueuse dépourvue de sa partie transmembranaire.
11. Polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger.
12. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
13. Polypeptide isolé ou purifié, caractérisé en ce qu'il est impliqué dans la synaptogenèse, et en ce que la présence d'au moins une mutation dans la séquence en acide aminé dudit polypeptide est associée à une prédisposition au développement de désordres mentaux ou de maladies psychiatriques.
14. Polypeptide selon la revendication 12 ou 13, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine d'adhésion cellulaire.
15. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce qu'il consiste en une protéine appartenant à la famille des Neuroligines humaines.
16. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 15, caractérisé en ce qu'il consiste en la protéine HNL4 ou la protéine HLN5.
17. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 16, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence choisi dans le groupe constitué
par: la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8, et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou de la SEQ ID NO:8.
par: la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8, et les séquences d'au moins 20 acides aminés consécutifs de la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou de la SEQ ID NO:8.
18. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 17, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de ladite protéine.
19. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 18, caractérisé en ce que ladite mutation engendre une protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
20. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 14, caractérisé en ce que ladite mutation provoque une terminaison D396stop de la protéine.
21. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 12 à 20, caractérisé en ce que ladite mutation est associée à une prédisposition du développement de l'autisme ou du Syndrome d'Asperger.
22. Procédé pour détecter des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou une maladie mentale, comprenant au moins une des étapes suivantes:
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment dudit gène ou dans la séquence d'un ARN messager dudit gène;
- la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse
- la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment dudit gène ou dans la séquence d'un ARN messager dudit gène;
- la détection de la présence d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la détection d'une mutation dans une protéine impliquée dans la synaptogenèse;
- la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse
23. Procédé selon la revendication 22, comprenant:
- l'amplification d'un gène codant dans sa forme sauvage (non mutée) pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène;
- la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager.
- l'amplification d'un gène codant dans sa forme sauvage (non mutée) pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, l'amplification d'un fragment dudit gène ou l'amplification d'un ARN messager dudit gène;
- la détection d'une mutation dans la séquence dudit gène, dans la séquence dudit fragment ou dans la séquence dudit ARN messager.
24. Procédé selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que le gène code dans sa forme sauvage pour une protéine d'adhésion cellulaire.
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisé
en ce que ladite protéine appartient à la famille des Neuroligines humaines.
en ce que ladite protéine appartient à la famille des Neuroligines humaines.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 25, caractérisé
en ce que ladite protéine est la HNL4 ou la HLN5.
en ce que ladite protéine est la HNL4 ou la HLN5.
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé
en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou la SEQ ID NO:8.
en ce que ledit gène code dans sa forme sauvage pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou la SEQ ID NO:8.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé
en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:4.
en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:4.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 26, caractérisé
en ce que ladite protéine est la HLN4 et en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
en ce que ladite protéine est la HLN4 et en ce que ladite mutation provoque une terminaison précoce de la protéine.
30. Procédé selon la revendication 29, caractérisé en ce que ladite mutation occasionne la production de ladite protéine dépourvue de sa partie transmembranaire.
31. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 30, caractérisé
en ce que ledit gène consiste en la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
en ce que ledit gène consiste en la SEQ ID NO:1 et en ce que ladite mutation est une insertion d'une thymine en position 1186 à partir de la position 465 de la Figure 9.
32. Procédé selon l'une quelconque des revendications 22 à 31, caractérisé
en ce que le désordre ou la maladie mentale consiste en l'autisme ou le Syndrome d'Asperger.
en ce que le désordre ou la maladie mentale consiste en l'autisme ou le Syndrome d'Asperger.
33. Kit pour la détection des désordres biochimiques altérant la formation des synapses, d'une prédisposition au développement de pathologies psychiatriques et/ou d'une maladie mentale, et/ou pour le diagnostic d'une maladie mentale, le kit comprenant au moins un des éléments choisi dans le groupe constitué par:
une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment dudit gène ou dans la séquence d'un ARN messager dudit gène;
et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse.
une sonde, un anticorps, un réactif et un support solide permettant:
i) la détection d'une mutation dans la séquence d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, dans la séquence d'un fragment dudit gène ou dans la séquence d'un ARN messager dudit gène;
et/ou ii) la mesure de l'activité biologique d'une protéine impliquée dans la synaptogenèse.
34. Kit selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit gène code pour une protéine comprenant la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6 ou la SEQ ID NO:8.
35. Kit selon la revendication 33 ou 34, caractérisé en ce que ledit gène comprend la SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:4.
36. Kit selon l'une quelconque des revendications 33 à 35, caractérisé en ce que ladite protéine comprend une séquence choisi dans le groupe constitué par:
la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8,
la SEQ ID NO:3, la SEQ ID NO:6, la SEQ ID NO:8,
37. Utilisation d'un polynucléotide non muté codant pour une protéine impliquée dans sa forme sauvage dans la synaptogenèse pour le traitement ou la prévention des pathologies biochimiques ou des maladies mentales.
38. Utilisation selon la revendication 37, caractérisée en ce que ladite protéine est une protéine d'adhésion cellulaire.
39. Utilisation selon la revendication 37 ou 38, caractérisée en ce que ladite protéine appartient à la famille des Neuroligines humaines.
40. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 37 à 39, caractérisée en ce que ladite protéine est la NHL4.
41. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 37 à 40, caractérisée en ce que ladite maladie mentale est l'autisme ou le Syndrome d'Asperger.
42. Procédé de tri de molécules permettant de moduler l'activité biologique du polypeptide codé par le polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 11 ou l'activité biologique du polypeptide selon l'une des revendications 12 à 21, comprenant:
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
a) la mise en contact dudit polypeptide ou d'une cellule recombinante le contenant avec une molécule susceptible de moduler son activité
biologique;
b) la mesure de l'activité biologique dudit polypeptide; et c) l'évaluation de l'activité mesurée à l'étape b) par rapport à une mesure de l'activité biologique dudit polypeptide en absence de ladite molécule.
43. Méthode de traitement d'une maladie mentale ou neurologique comprenant l'insertion dans au moins une portion des cellules d'un patient malade d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse.
44. Méthode selon la revendication 43, caractérisé en ce que lesdites cellules sont des cellules souches.
45. Méthode selon la revendication 43 ou 44, caractérisé en ce que ladite maladie mentale est l'autisme ou le Syndrome d'Asperger.
46. Méthode selon l'une quelconque des revendications 43 à 45, caractérisé
en ce l'on insère un gène codant pour une protéine NHL4 fonctionnelle.
en ce l'on insère un gène codant pour une protéine NHL4 fonctionnelle.
47. Méthode selon la revendication 46, caractérisé en ce que la protéine NHL4 possède la SEQ ID NO:3.
48. Procédé de transformation de cellules souches d'un patient présentant une mutation d'un gène codant pour une protéine impliquée dans la synaptogenèse, caractérisé par a) l'utilisation de cellules souches dudit patient;
b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
b) l'insertion dans le génome desdites cellules souches d'un polynucléotide codant pour un polypeptide impliqué dans la synaptogenèse; et c) la réimplantation chez le patient de cellules transformées selon l'étape b).
49. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux purifiés reconnaissants spécifiquement au moins un des polynucléotides définis aux revendications 1 à
11 et/ou au moins un des polypeptides définis aux revendications 12 à 21.
11 et/ou au moins un des polypeptides définis aux revendications 12 à 21.
50. Anticorps selon la revendication 49, caractérisés en ce qu'ils sont humanisés.
51. Vecteur de clonage ou d'expression comprenant une séquence polynucléotidique selon la revendication 1 ou un fragment de celle-ci.
52. Un vecteur selon la revendication 51, caractérisé en ce que ledit vecteur est choisi parmi les plasmides, les cosmides ou les phages.
53. Cellule hôte comprenant un vecteur selon la revendication 51 ou 52.
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