BRPI0618359A2

BRPI0618359A2 - fabricação de vacinas que contêm antìgeno de superfìcie do vìrus da hepatite b e tensoativo

Info

Publication number: BRPI0618359A2
Application number: BRPI0618359-0A
Authority: BR
Inventors: Mario Contorni
Original assignee: Novartis Vaccines & Diagnostic
Priority date: 2005-11-08
Filing date: 2006-11-07
Publication date: 2011-08-23
Also published as: US20120107345A1; JP5232006B2; JP2013056940A; US20090155305A1; CA2628860A1; RU2008123006A; RU2444374C2; JP2009514942A; EP1948233A2; CN101330927A; US20140302087A1; WO2007054820A2; WO2007054820A3; GB0522765D0; CN101330927B; US8802111B2

Abstract

FABRICAçãO DE VACINAS QUE CONTEM ANTìGENO DE SUPERFìCIE DO VìRUS DA HEPATITE B E TENSOATIVO. Durante a preparaçâo de HBsAg para uso em uma vacina combinada, normalmente se adiciona um detergente não-iónico após o HBsAg ter sido purificado. No entanto, a adição de detergentes após a purificação do HBsAg não ideal, na medida em que ela exige uma etapa de processamento separada durante a fabricação. Dessa forma, a invenção os utiliza durante a purificação do HBsAg.

Description

FABRICAÇÃO DE VACINAS QUE CONTÊM ANTÍGENO DE SUPERFÍCIE DOVÍRUS DA HEPATITE B E TENSOATIVO

Todos os documentos aqui citados são incorporados porreferência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção pertence ao campo da fabricação devacinas combinadas, ou seja, vacinas que contêm imunógenosmistos de mais de um patógeno, de tal forma que aadministração da vacina pode imunizar simultaneamente umindivíduo contra mais de um patógeno. Em particular, elaestá relacionada ao uso de tensoativos durante a fabricaçãode vacinas combinadas.

FUNDAMENTOS DA TÉCNICA

Vacinas que contêm antígenos de mais de um organismopatogênico dentro de uma única dose são conhecidas como"multivalentes" ou vacinas de "combinação". Foram aprovadasvárias vacinas combinadas para uso humano na Europa e nosEstados Unidos, incluindo vacinas trivalentes para proteçãocontra difteria, tétano e coqueluche (vacinas "DTP"), evacinas trivalentes para proteção contra sarampo, caxumba erubéola (vacinas "MMR").

Vacinas combinadas oferecem aos pacientes a vantagemde receberem um número reduzido de injeções, o que leva àvantagem clínica de um aumento da aceitação (por exemplo,veja o capítulo 29 da referência 1), particularmente paravacinação pediátrica. Ao mesmo tempo, no entanto, elasapresentam dificuldades de fabricação em conseqüência defatores que incluem: incompatibilidade física e bioquímicaentre antígenos e outros componentes; interferênciaimunológica; e estabilidade.A inclusão de outros componentes além de antígenos emvacinas é necessária, mas pode trazer dificuldades.Tensoativos constituem um problema particular em vacinascombinadas, pois um antígeno pode exigir um tensoativo parauma atividade ótima, enquanto outro pode ser afetadonegativamente pela presença do tensoativo. Além disso, ainclusão de tensoativos em vacinas pediátricas épreocupante em alguns grupos de pacientes, embora otensoativo possa ser geralmente aceito como seguro.

De interesse particular no campo das vacinas são ostensoativos de ésteres de polioxietileno sorbitano,especialmente as espécies de polissorbato (também conhecidocomo "Tween 20", ou monolaurato de polioxietilenosorbitano) e polissorbato 8 0 (também conhecido como "Tween80", ou monooleato de polioxietileno sorbitano) .Polissorbato 20 é encontrado na vacina monovalente parahepatite A HAVRIX™, e polissorbato 80 é encontrado emvacinas combinadas como, por exemplo, TRIPEDIA™ e a sériede vacinas INFANRIX™. Esses dois tensoativos também têmsido utilizados para estabilizar vacinas líquidas derotavírus [2].

Os polissorbatos também têm sido usados na fabricaçãode vacinas combinadas que contêm antígeno de superfície dahepatite B ("HBsAg"), por exemplo, as referências 3 e 4revelam um processo para a produção de uma vacinatetravalente D-T-P-HBsAg na qual a interferência com ocomponente fosfolipídico do HBsAg é evitada por adição deum tensoativo não-iônico como, por exemplo, Tween 20, Tween80 ou Triton X-IOO. Os dados na Figure 2 das referências 3e 4 (aqui, Fig. 1) mostram que o tensoativo é necessáriopara a manutenção da antigenicidade de HBsAg, mas é menosimportante para os outros componentes. A maior concentraçãode tensoativo testada foi de 10 pg/ml com 20 µg/ml deHBsAg, e essa concentração também gerou a melhorantigenicidade.

No processo das referências 3 e 4, o detergente não-iônico é adicionado após o HBsAg ter sido purificado. Noentanto, a adição de detergentes após a purificação deHBsAg não é ótima, na medida em que ela exige uma etapa deprocessamento separada durante a fabricação, o que aumentao tempo de processamento e também o risco de introdução decontaminação no HBsAg. Se for usado um componentecontaminado na produção de uma vacina combinada, a perdaeventual será maior do que quando se produzem vacinasmonovalentes; por exemplo, se um componente de HBsAgcontaminado for misturado com um componente D-T-P limpo,toda a mistura de D-T-P-HBsAg deverá ser inutilizada, e nãoapenas o HBsAg.

Para vacinas combinadas que contêm tensoativos não-iônicos, portanto, existe ainda a necessidade de umprocesso de fabricação no qual o tensoativo não tenha queser adicionado como um componente separado durante oprocesso.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Ao invés de adicionar tensoativos não-iônicos aosantígenos após eles terem sido purificados [3,4], ainvenção os utiliza durante a purificação do antígeno.Dessa forma, o tensoativo pode efetuar sua função na vacinacombinada final, mas o risco de contaminação (e, portanto,também o risco de perda de toda a vacina combinada após elater sido preparada) é reduzido.

Dessa forma, a invenção fornece um processo para apreparação de uma vacina combinada, em que a vacinacompreende: (i) um tensoativo não-iônico, (ii) um antigenode superfície do vírus da hepatite B (HBV) , e (iii) umantigeno de pelo menos um patógeno não-HBV , e em que oprocesso compreende: (i) purificação do antigeno desuperfície do HBV de células de levedura recombinantes, emque a purificação inclui uma etapa na qual as células delevedura são rompidas na presença do tensoativo não-iônico,para gerar um componente de HBsAg purificado; e (ii)combinação do componente de HBsAg purificado com pelo menosum antigeno adicional de um patógeno diferente do HBV, paragerar a vacina combinada.

Para evitar as dificuldades de contaminação descritasacima, o processo não envolve uma etapa de adição dotensoativo não-iônico como um componente separado após apurificação do HBsAg. É possível que o tensoativo (ououtros tensoativos, iônicos ou não-iônicos) esteja presentenos outros componentes antigênicos com os quais o HBsAg écombinado para gerar a vacina combinada, mas é evitada aadição do tensoativo como um componente separado por sipróprio. Dessa forma, o tensoativo não é adicionado como umcomponente separado ao componente de HBsAg purificado, enão é adicionado durante a combinação dos antígenos.

A invenção também fornece um processo para apreparação de uma vacina combinada, em que a vacinacompreende: (i) um tensoativo não-iônico, (ii) um antigenode superfície do vírus da hepatite B (HBV) , e (iii) umantigeno de pelo menos um patógeno não-HBV, e em que oprocesso compreende a etapa de combinação de um antígeno desuperfície do HBV purificado com pelo menos um antígenoadicional de um patógeno diferente do HBVi para gerar avacina combinada, em que o antígeno de superfície do HBV purificado foi preparado por um processo em que células delevedura recombinantes que expressam HBsAg são rompidas napresença do tensoativo não-iônico. Novamente, a adiçãoseparada do tensoativo é evitada.

A invenção também fornece uma composição imunogênica que compreende: (i) um tensoativo não-iônico, (ii) umantígeno de superfície do vírus da (HBV) , e (iii) umantígeno de pelo menos um patógeno não-HBV, em que oantígeno de superfície do HBV foi preparado por um processoem que células de levedura recombinantes que expressam HBsAg foram rompidas na presença do tensoativo não-iônico.Novamente, o HBsAg foi preparado evitando-se a adiçãoseparada do tensoativo. Esse produto pode ser distinguidode produtos nos quais o HBsAg foi preparado por um processodiferente porque o tensoativo não-iônico usado durante a purificação pode ser retido dentro de uma partícula deHBsAg.

O tensoativo não-iônico

A invenção pode utilizar diversos tensoativos não-iônicos [5], e particularmente aqueles encontrados em formulações de vacinas. Preferem-se tensoativos orgânicos.Esses são tipicamente o produto de reação de um óxido dealquileno (por exemplo, óxido de etileno) com um álcoolgraxo, ácido graxo, alquilfenol, alquilamina ou outrocomposto apropriado que possua pelo menos um átomo dehidrogênio ativo. Para a maioria dos tensoativos, osalcoóis, aminas e ácidos mais comuns possuem um comprimentoda cadeia de carbono na faixa de C8-C18- Os alquilfenóismais comuns são nonilfenol e octilfenol. Tensoativos quecontêm resíduos de poli(oxietileno) são particularmentepreferidos.

Por exemplo, a invenção pode ser usada com tensoativosque incluem, sem limitação: os tensoativos de ésteres depolioxietileno sorbitano (normalmente denominados Tweens),especialmente polissorbato 20 e polissorbato 80;copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno(PO) e/ou óxido de butileno (BO) , vendidos sob o nomecomercial DOWFAX™, por exemplo, copolímeros lineares embloco EO/PO; octoxinóis, que podem variar em termos denúmero de grupos etóxi (óxi-1,2-etanodiil) de repetição,com octoxinol-9 (Triton X-100 ou t-octilfenoxipolietoxietanol) sendo de particular interesse;(octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40) ; éteresgraxos de polioxietileno de lauril, cetil, estearil e oleilalcoóis (conhecidos como tensoativos Brij), por exemplo,monolauril éter de trietilenoglicol (Brij 30); e ésteres desorbitano (normalmente denominados SPANs), por exemplo,trioleato de sorbitano (Span 85) e monolaurato desorbitano.

A invenção é particularmente adequada para uso compolissorbato 20. Esse tensoativo tem um perfil de segurançaestabelecido para administração a seres humanos, incluindodentro de vacinas.

Tensoativos podem ser classificados por seu "HLB"(equilíbrio hidrófilo/lipófilo). Tensoativos preferidos dainvenção possuem um HLB de pelo menos 10, preferivelmentepelo menos 15 e, mais preferivelmente, pelo menos 16.

O tensoativo não-iônico é um componente de composiçõesda invenção. Para evitar a administração de doses grandesdo tensoativo a um paciente, prefere-se que a concentraçãodo tensoativo na composição seja de, no máximo, 30 pg/ml,por exemplo, < 25 pg/ml, < 20 pg /ml, < 15 pg/ml, < 10 pg/ml, <5 pg/ml etc. Prefere-se uma concentração < 10 pg/ml.

Como alternativa à especificação de tensoativo,prefere-se que a quantidade do tensoativo na composiçãoseja menor do que 50 pg (por exemplo, < 40 pg, : < 30 pg, <25 pg, < 20 pg, < 15 g, < 10 pg etc.) para cada 100 pg deHBsAg. Da mesma forma, as referências 3 e 4 sugerem umaproporção de massa de tensoativo:HBsAg de menos de 50%.Prefere-se menos de 25 μg do tensoativo por 100 pg deHBsAg.

Como será mencionado com mais detalhe abaixo,processos da invenção preferidos utilizam um componentepré-misturado que inclui toxóides diftéricos e tetânicos.Esse componente de D-T é, preferência, substancialmentelivre de tensoativos não-iônicos e, em particular, é livrede polissorbatos 20 e 80. Do mesmo modo, um componente pré-misturado de D-T-Pw é livre de tensoativos não-iônicos, porexemplo, polissorbatos 20 e 80.

O antígeno de superfície do vírus da hepatite B

O vírus da hepatite B (HBV) é um dos agentesconhecidos que causam hepatite viral. O vírion do HBVconsiste em um núcleo interno circundado por umrevestimento externo de proteína ou capsídeo, e o núcleoviral contém o genoma do DNA viral. O principal componentedo capsídeo é uma proteína conhecida como antígeno desuperfície do HBV ou, mais comumente, wHBsAg", que étipicamente um polipeptídeo de 226 aminoácidos com um pesomolecular de -24 kDa. Todas as vacinas para hepatite Bexistèntes contêm HBsAg, e, quando esse antígeno éadministrado a um paciente normal, ele estimula a produçãode anticorpos anti-HBsAg que protegem contra a infecçãopelo HBV.

Para a fabricação de vacinas, o HBsAg pode ser feitode duas formas. O primeiro método envolve a purificação doantígeno em forma particulada do plasma de portadorescrônicos de hepatite B, na medida em que são sintetizadasgrandes quantidades de HBsAg no fígado que são liberadas nacorrente sangüínea durante uma infecção pelo HBV. A segundaforma envolve a expressão da proteína por métodos de DNArecombinante. O HBsAg para uso com o método da invenção éexpresso de forma recombinante em células de levedura.Leveduras adequadas incluem hospedeiros de Saccharomyces(como, por exemplo, S. cerevisiae) ou Hanensula (como, porexemplo, H. polimorpha).

Diferentemente do HBsAg nativo (ou seja, como noproduto purificado do plasma), o HBsAg expresso porleveduras é geralmente não glicosilado, e essa é a formamais preferida de HBsAg para uso com a invenção. O HBsAgexpresso por leveduras é altamente imunogênico, e pode serpreparado sem o risco contaminação de produtos sangüíneos.

O HBsAg estará geralmente na forma de partículassubstancialmente esféricas (diâmetro médio de cerca de 20nm) , que inclui uma matriz lipídica que compreendefosfolipídeos. Partículas de HBsAg expresso em leveduraspodem incluir fosfatidilinositol, que não é encontrado emvírions do HBV natural. As partículas também podem incluiruma quantidade atóxica de LPS a fim de estimular o sistemaimunológico [6].

0 HBsAg é preferivelmente de HBV do subtipo adw2.

Muitos métodos para a purificação de HBsAg sãoconhecidos na técnica (por exemplo, veja as referências 7-33) . Esses métodos são revelados para uso na produção depreparações monovalentes de HBsAg, mas, diferentemente dométodo revelados nas referências 3 e 4, nenhum deles estárelacionado à purificação de HBsAg especificamente para usoem vacinas combinadas. Qualquer um desses e de outrosprocessos pode ser usado, desde que o processo sejaadequado para a purificação do antígeno após a expressão emcélulas de leveduras recombinantes, em que a purificaçãoinclui uma etapa na qual as células de levedura sãorompidas na presença do tensoativo não-iônico.

Um método preferido para a purificação do HBsAgenvolve, após ruptura das células: ultrafiltração,cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia portroca aniônica; ultracentrifugação; dessalinização efiltração estéril. Os lisados podem ser precipitados após aruptura das células (por exemplo, com o uso de umpolietileno glicol), deixando o HBsAg em solução, prontopara ultrafiltração. Após purificação, o HBsAg pode ser submetido à diálise(por exemplo, com cisteína) , que pode ser usada pararemover quaisquer conservantes mercuriais como, porexemplo, timerosal, que possam ter sido usados durante apreparação do HBsAg [30,34]. As quantidades de HBsAg são tipicamente expressas emmicrogramas, e uma quantidade típica de HBsAg por dose devacina é de 10 μg.

Além da seqüência "S", um antígeno de superfície podeincluir toda ou parte de uma seqüência pré-S, por exemplo, toda ou parte de uma seqüência pré-Sl e/ou pré-S2.Os antigenos não-HBV

As composições imunogênicas da invenção incluem pelomenos um antígeno protetor de pelo menos um patógeno não-HBV. Os patógenos diferentes do HBV podem ser virais e/oubacterianos.

Patógenos virais típicos incluem, sem limitação:poliovírus; vírus da hepatite A; vírus influenza; vírus dosarampo; vírus da caxumba; vírus da rubéola; e vírus davaricela zoster.

Patógenos bacterianos típicos incluem, sem limitação:

Corynebacterium diphtheriae; Clostridium tetani; Bordetellapertussis; Haemophilus influenzae, incluindo o tipo b ecepas não tipáveis; Neisseria meningitidis, incluindosorogrupos A, B, C, W135 e/ou Y; Streptococcus pneumoniae, incluindo os sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F; eMoraxella catarrhalis.

Corynebacterium diphtheriae causa a difteria. A toxinadiftérica pode ser tratada (por exemplo, com o uso deformalina ou formaldeído) para remover a toxicidade, retendo a habilidade para induzir anticorpos antitoxinaespecíficos após a injeção. Esses toxóides diftéricos sãousados em vacinas contra difteria, e são revelados com maisdetalhe no capítulo 13 da referência 1. Toxóides diftéricospreferidos são aqueles preparados por tratamento com formaldeído. O toxóide diftérico pode ser obtido porcrescimento de C. diphtheriae em meio de crescimento (porexemplo, meio de Fenton ou meio de Linggoud e Fenton) , quepode ser suplementado com extrato bovino, seguido portratamento com formaldeído, ultrafiltração e precipitação.

O material com toxóide pode então ser tratado por umprocesso que compreende filtração estéril e/ou diálise.

O Clostridium tetani causa o tétano. A toxina tetânicapode ser tratada para gerar um toxóide protetor. Ostoxóides são usados em vacinas contra o tétano, e sãorevelados com mais detalhes no capitulo 27 da referência 1.Toxóides tetânicos preferidos são aqueles preparados portratamento com formaldeído. O toxóide tetânico pode serobtido por crescimento de C. tetani em meio de crescimento(por exemplo, um meio de Latham derivado de caseínabovina), seguido por tratamento com formaldeído,ultrafiltração e precipitação. 0 material pode então sertratado por um processo que compreende filtração estérile/ou diálise.

A Bordetella pertussis causa a coqueluche. Osantígenos de pertussis em vacinas são celulares (célulainteira, na forma de células inativadas de B. pertussis,wP1) ou acelulares ("aP"). A preparação de antígenoscelulares de pertussis está bem documentada [por exemplo,veja o capítulo 21 da referência 1], por exemplo, ele podeser obtido por inativação por calor de cultura de fase I deB. pertussis. Quando forem usados antígenos acelulares, sãoincluídos um, dois ou (preferivelmente) três dos seguintesantígenos: (1) toxina de pertussis detoxifiçada (toxóide depertussis ou "PT"), (2) hemaglutinina filamentosa ("FHA"),(3); pertactina (também conhecido coma a "proteína damembrana externa de 69 quilodáltons"). Esses três antígenossão preparados preferivelmente por isolamento de cultura deB. pertussis desenvolvida em meio líquido modificado deStainer-Scholte. PT e FHA podem ser isolados do caldo defermentação (por exemplo, por adsorção em gel dehidroxiapatita), enquanto pertactina pode ser extraída dascélulas por tratamento com calor e floculação (por exemplo,com o uso de cloreto de bário) . Os antígenos podem serpurificados em etapas sucessivas de cromatografia e/ouprecipitação. PT e FHA podem ser purificados porcromatografia hidrofóbica, cromatografia por afinidade ecromatografia por exclusão de tamanho. Pertactina pode serpurificada por cromatografia por troca iônica,cromatografia hidrofóbica e cromatografia por exclusão detamanho. FHA e pertactina podem ser tratados comformaldeído antes de serem usados de acordo com a invenção.PT é preferivelmente detoxificado por tratamento comformaldeído e/ou glutaraldeído. Como alternativa a esseprocedimento de detoxificação química, o PT pode ser um PTmutante no qual a atividade enzimática foi reduzida pormutagênese [35], mas a detoxificação por tratamento químicoé preferida.

O Haemophilus influenzae do tipo b ("Hib") causameningite bacteriana. Vacinas contra o Hib se baseiamtipicamente no antígeno do sacarídeo capsular [por exemplo,veja o capítulo 14 da referência 1], cuja preparação é bemdocumentada [por exemplo, referências 36 a 45] . 0 sacarídeode Hib é conjugado a uma proteína transportadora, a fim deaumentar sua imunogenicidade, especialmente em crianças.Proteínas transportadoras típicas são toxóide tetânico,toxóide diftérico, o derivado CRM197 do toxóide diftérico,a proteína D de H. influenzae, e um complexo protéico damembrana externa do meningococo do sorogrupo B. O toxóidetetânico é o veículo preferido, como usado no produtonormalmente denominado "PRP-T". PRP-T pode ser feito porativação de um polissacarídeo capsular do Hib com o uso debrometo de cianogênio, acoplamento do sacarídeo ativado aum vinculador de ácido adípico (como, por exemplo, (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida), tipicamente o salde sal de cloridrato), e depois reação da entidadevinculador-sacarídeo com uma proteína transportadora detoxóide tetânico. A porção sacarídica do conjugado podecompreender fosfato de polirribosilribitol (PRP) decomprimento total preparado por bactérias Hib e/oufragmentos de PRP de comprimento total. Podem ser usadosconjugados com uma proporção de sacarídeo:proteína (p/p)entre 1:5 (ou seja, proteína em excesso) e 5:1 (ou seja,sacarídeo em excesso), por exemplo, proporções entre 1:2 e5:1 e proporções entre 1:1,25 e 12:5. Em vacinaspreferidas, no entanto, a proporção de peso de sacarídeopara proteína transportadora é entre 1:2,5 e 1:3,5. Emvacinas nas quais está presente o toxóide tetânico tantocomo antígeno quanto como proteína transportadora, aproporção de peso de sacarídeo para proteína transportadorano conjugado pode ser entre 1:0,3 e 1:2 [46] . Aadministração do conjugado de Hib preferivelmente resultaem uma concentração de anticorpo anti-PRP > 0,15 μg/ml e,mais preferivelmente, > 1 μg/mlí e esses são os limiares daresposta-padrão.

A Neisseria meningitidis causa meningite bacteriana.Com base no polissacarídeo capsular do organismo, foramidentificados vários sorogrupos de N. meníngitidis,incluindo os sorogrupos A, B, C, Η, I, K, L, 29E, W135, X,Y e Z. Os sorogrupos mais associados à doença são A, B, C,W135 e Y. As vacinas atuais contra os sorogrupos A, C, W135e Y se baseiam nos antígenos sacaridicos capsulares, masessa abordagem não é adequada ao sorotipo B e, portanto, emseu lugar são usados antígenos protéicos e vesículas demembrana externa. Os sacarídeos capsulares são conjugados aproteínas transportadoras a fim de aumentar aimunogenicidade. Proteínas transportadoras típicas são otoxóide tetânico, o toxóide diftérico, o derivado CRM197 dotoxóide diftérico, e a proteína D de H. influenzae. Aporção sacarídica do conjugado pode compreender sacarídeode comprimento total preparado a partir de meningococose/ou fragmentos destes. Os sacarídeos do sorogrupo C podemser preparados por cepas OAc+ ou OAc-. Para os sacarídeosdo sorogrupo A, preferivelmente pelo menos 50% (porexemplo, pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais) dosresíduos de manosamina são O-acetilados na posição C-3.Podem ser usados conjugados meningocócicos com umaproporção de sacarídeo:proteína (p/p) entre 1:10 (ou seja,proteína em excesso) e 10:1 (ou seja, sacarídeo emexcesso), por exemplo, proporções entre 1:5 e 5:1, entre1:2,5 e 2,5:1 ou entre 1:1,25 e 1,25:1. A administração deum conjugado preferivelmente resulta em um aumento natitulação de um ensaio sérico bactericida (SBA) para osorogrupo relevante de pelo menos 4 vezes e,preferivelmente, pelo menos 8 vezes. As titulações de SBApodem ser medidas com o uso de complemento de filhote decoelho ou complemento humano [4 7].

O Streptococcus pneumoniae causa meningite bacteriana.Como ocorre para Hib e meningococo, as vacinas existentesse baseiam em sacarídeos capsulares. Prefere-se incluirsacarídeos de mais de um sorotipo de S. pneumoniae e,particularmente, pelo menos os sorotipos 6B, 14, 19F e 23F.Sorotipos adicionais são preferivelmente selecionados de:1, 3, 4, 5, 7F, 9V e 18C. Por exemplo, misturas depolissacarídeos de 23 sorotipos diferentes são amplamenteusadas, bem como vacinas de conjugados com polissacarídeosentre 5 e 11 sorotipos diferentes [48]. Por exemplo,PrevNar™ [4 9] contém antígenos conjugados de setesorotipos (4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F) . Os sacarídeossão conjugados preferivelmente a proteínas transportadoras[por exemplo, referências 50 a 52] . Proteínastransportadoras típicas são o toxóide tetânico, o toxóidediftérico, o derivado CRM197 de toxóide diftérico e aproteína D de H. influenzae. Os sacarídeos no produtoPrevNar™ são conjugados individualmente a CRMl97 poraminação redutora, com 2 pg de cada sacarídeo por dose de0,5 ml (4 pg de sorotipo 6B) . Como alternativa ao uso deantígenos sacarídicos de pneumococo, a composição podeincluir um ou mais antígenos polipeptídicos. Sãodisponíveis seqüências genômicas para várias cepas depneumococo [53,54], e podem ser submetidas à vacinologiareversa [55-58] para a identificação de antígenospolipeptídicos adequados [59,60]. Por exemplo, a composiçãopode incluir um ou mais dos seguintes antígenos: PhtA,PhtD, PhtB, PhtE, SpsA, LytB, LytC, LytA, Spl25, SplOl,Spl28, Spl30 e Spl30, como definidos na referência 61. Acomposição pode incluir mais de um (por exemplo, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 13 ou 14) desses antígenos. Emalgumas modalidades, a composição pode incluir antígenostanto sacarídicos e polipeptídicos de pneumococo. Essespodem ser usados em mistura simples ou o antígenosacarídico pneumocócico pode ser conjugado a uma proteínapneumocócica. Proteínas transportadoras adequadas paraessas modalidades incluem os antígenos protéicospneumocócicos listados acima [61] .

A Moraxella catarrhalis causa otite média e sinusite,e é uma causa ocasional de laringite. As vacinas estãoatualmente sob investigação, como revisado na referência 62.

Como o HBV, o HAV causa hepatite. As vacinas contra oHAV são reveladas no capítulo 15 da referência 1. Umcomponente de HAV preferido se baseia no vírus inativado, ea inativação pode ser obtida por tratamento com formalina.O vírus pode se desenvolver em fibroblastos diplóidespulmonares embriológicos humanos, por exemplo, células MRC-5. Uma cepa preferida do HAV é HM175, embora CR326F tambémpossa ser usada. As células podem crescer sob condições quepermitam o crescimento viral. As células são lisadas, e asuspensão resultante pode ser purificada por ultrafiltraçãoe cromatografia por permeação em gel.

O poliovírus causa a poliomielite. Em vez de usarvacina de poliovírus oral, a invenção utiliza vacina depoliovírus inativado (IPV) , o que é revelado com maisdetalhe no capítulo 24 da referência 1. Os poliovírus podemcrescer em cultura de células, e uma cultura preferidautiliza uma linhagem de células Vero, derivadas de rim demacaco. Células Vero podem ser convenientementemicroportadores cultivados. Após o crescimento, os vírionspodem ser purificados com o uso de técnicas comoultrafiltração, diafiltração e cromatografia. Antes daadministração aos pacientes, os poliovírus devem serinativados, o que pode ser obtido por tratamento comformaldeído. A poliomielite pode ser causada por um de trêstipos de poliovírus. Os três tipos são similares e causamsintomas idênticos, mas são antigenicamente muitosdiferentes, e a infecção por um tipo não protege contra ainfecção por outros. Prefere-se, portanto, usar trêsantígenos de poliovírus na invenção: poliovírus do Tipo 1(por exemplo, cepa Mahoney) , poliovírus do Tipo 2 (porexemplo, cepa MEF-1) e poliovírus do Tipo 3 (por exemplo,cepa Saukett). Os vírus preferivelmente crescem, sãopurificados e inativados individualmente, e são entãocombinados para gerar uma mistura trivalente para uso com ainvenção. As quantidades de IPV são tipicamente expressasna unidade "DU" (a "unidade de antígeno D" [63] ) .

Antígenos para proteção contra os vírus do sarampo,caxumba e rubéola são tipicamente vírus vivos, comoencontrado em vacinas monovalentes e trivalentes ("MMR")conhecidas. As vacinas contra o vírus do sarampo sãodescritas com mais detalhe no capítulo 19 da referência 1.As vacinas contra o vírus da caxumba são descritas com maisdetalhe no capítulo 20 da referência 1. As vacinas contra ovírus da rubéola são descritas com mais detalhe no capítulo26 da referência 1. As cepas típicas do vírus do sarampoincluem: Moraten; Connaught; Schwarz; Edmonston-Zagreb;CAM-70; AIK-C; TD97; Leningrad-16; Shanghai-191; etc. Ascepas Schwarz e Moraten são as mais comuns para uso nos EUAe na Europa. As cepas típicas do vírus da caxumba incluem:Jeryl Lynn; RIT 4385; Urabe; Hoshino; Rubini; Leningrad-3;Leningrad-Zagreb; Miyahara; Torii; NK M-46; S-12 etc. Ascepas Jeryl Lynn, RIT 4385, Urabe e Leningrad-Zagreb são ascepas mais comuns em todo o mundo. As cepas típicas dovírus da rubéola incluem: RA27/3; Matsuba; TCRB 19;Takahashi; Matsuura; TP-336 etc. A cepa RA27/3 é a maiscomumente usada no mundo ocidental.

Os antígenos de VZV para proteção contra a varicelasão tipicamente vírus vivos, com base na cepa Oka do vírus.As vacinas contra o VZV são descritas com mais detalhe nocapítulo 28 da referência 1.

Os antígenos do vírus influenza são descritos com maisdetalhe nos capítulos 17 e 18 da referência 1. De um modogeral, as vacinas contra o vírus influenza podem se basearno vírus vivo ou no vírus inativado, e vacinas inativadaspodem se basear no vírus inteiro, no vírus "dividido" ou emantígenos de superfície purificados (incluindohemaglutinina e neuraminidase). Os vírus usados parapreparar as vacinas podem crescer em ovos ou em culturas decélulas. As cepas da vacina contra influenza mudam deestação para estação. No período atual interpandêmico, asvacinas tipicamente incluem duas cepas de influenza A (H1N1e H3N2) e uma cepa de influenza B, e vacinas trivalentessão típicas. A invenção também pode utilizar vírus de cepaspandêmicas (ou seja, cepas para as quais os que recebem avacina e a população humana geral são imunologicamentevirgens) como, por exemplo, as cepas dos subtipos H2, H5,H7 ou H9 (em particular do vírus influenza A) , e vacinaspara influenza para cepas pandêmicas podem ser monovalentesou podem ser baseadas em uma vacina trivalente normalsuplementada por uma cepa pandêmica. O vírus influenza podeser uma cepa re-classifiçada e pode ter sido obtido portécnicas de genética reversa. O vírus pode ser atenuado. Ovírus pode ser sensível à temperatura. O vírus pode seradaptado ao frio.

Os componentes antigênicos desses patógenos para usoem vacinas são comumente denominados por nomes abreviados:"D" para toxóide diftérico; "T" para toxóide tetânico; "P"para antígenos de pertussis, com "Pa" sendo acelular e "Pw"sendo celular; "Hib" para sacarídeo capsular de H.influenzae b; "MenA", "MenB", "MenC", "MenW" e "MenY" paraos respectivos sorogrupos meningocócicos; "IPV" parapoliovírus inativado; e "Spn" para pneumococo.

Quando se combinam componentes antigênicos com HBsAgpara a preparação de uma composição multivalente, osantígenos podem ser adicionados individualmente, ou podemser pré-misturados antes de serem combinados com o HBsAg.Quando são usados antígenos DeT, prefere-se utilizar umcomponente pré-misturado de D-T. Esse componente bivalentepode ser usado nos processos da invenção; por exemplo, elepode ser combinado com o HBsAg para fazer um componentetrivalente D-T-HBV. Alternativamente, o componente de D-Tpode ser combinado com antígenos adicionais diferentes deHBV (por exemplo, com antígenos acelulares de pertussis), eaquele componente pode então ser combinado com HBsAg etc.Quando são usados antígenos D, T e Pw, prefere-se utilizarum componente pré-misturado de D-T-Pw, e depois usar essecomponente durante os processos da invenção.Quando é incluído um adjuvante nas composições dainvenção, ele também poderá ser adicionado em váriosestágios. Tipicamente, os antígenos terão sido combinadoscom os adjuvantes, antes de serem usados nos processos dainvenção (por exemplo, uma mistura bivalente D-T terá sidoadsorvida a um adjuvante (s) de sal de alumínio, antes deser utilizada nos processos da invenção, o que pode serconvenientemente obtido preparando-se os toxóidesseparadamente, adsorvendo-se cada um deles separadamente aoadjuvante de hidróxido de alumínio, e depois misturando-seos dois toxóides adsorvidos (opcionalmente com um adjuvanteadicional) para gerar o material para uso no processo dainvenção), mas também é possível adicionar o adjuvante apósos antígenos terem sido misturados, ou adicionar osantígenos a um adjuvante (por exemplo, começar com umadjuvante aquoso, depois adicionar os antígenos,individualmente ou pré-misturados). Como descrito abaixo, ocomponente de HBsAg é preferivelmente adsorvido a umadjuvante de fosfato de alumínio, antes de ser combinadoaos componentes antigênicos não-HBV.

Composições da invenção preferidas incluem pelo menosantígenos D, T e P (veja as referências 3 e 4) além doHBsAg. Composições particularmente preferidas são asseguintes combinações:

- HBsAg, D, T.

- HBsAg, D, T, Pw.

- HBsAg, D, T, Pw, Hib.

- HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC.

- HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC, MenW 135.- HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC, MenY.-HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC, MenW135, MenY.

-HBsAg, D, T, Pa. -HBsAg, D, T, Pa, Hib. -HBsAg, D, T, Pa, poliovírus. -HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib.

-HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenC.

-HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenC, MenA.

-HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenC, MenY.

-HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenC, MenWl35.

-HBsAg, D I T, Pa, poliovírus, Hib, MenC, MenA,MenW13 5, MenY.

- HBsAg, Hib.

- HBsAg, vírus da Hepatite A.

Essas composições podem consistir nos antígenoslistados, ou podem ainda incluir antígenos de patógenosadicionais. Dessa forma, eles podem ser usadosseparadamente ou como componentes de vacinas adicionais.

Em algumas modalidades da invenção, a composição não éuma D-T-Pa-HBV-IPV pentavalente [3 0] . Dessa forma, acomposição pode incluir um componente Pw e/ou pelo menos umconjugado.

Adjuvantes

Composições imunogênicas preferidas da invençãoincluem um adjuvante, e esse adjuvante preferivelmentecompreende um ou mais sais de alumínios e, particularmente,um adjuvante de fosfato de alumínio e/ou um adjuvante dehidróxido de alumínio.

Os componentes antigênicos usados nos processos dainvenção preferivelmente incluem adjuvantes de alumínioantes de serem usados no processo, ou seja, eles são "pré-misturados" ou "pré-adsorvidos" ao(s) adjuvante(s).

Em composições que compreendem HBsAg e um toxóidediftérico, o toxóide diftérico pode ser adsorvido em umadjuvante de hidróxido de alumínio.

Em composições que compreendem HBsAg e um toxóidetetânico, o toxóide tetânico pode ser adsorvido em umadjuvante de hidróxido de alumínio, mas isso não énecessário (por exemplo, adsorção entre 0-10% do toxóidetetânico total pode ser usada).

Em composições que compreendem HBsAg e um antígeno depertussis de célula inteira, o antígeno wP épreferivelmente combinado a um adjuvante de hidróxido dealumínio e/ou a um adjuvante de fosfato de alumínio.

Em composições que compreendem HBsAg e antígeno(s)acelular(es) de pertussis, o(s) antígeno(s) de pertussispode ser adsorvido em um ou mais adjuvantes de sal dealumínio, ou pode ser adicionado em um estado nãoadsorvido.

Quando pertactina estiver presente em uma composição,ela será preferivelmente adsorvida em um adjuvante dehidróxido de alumínio antes de ser usada no processo dainvenção. PT e FHA podem ser adsorvidos em um adj uvante dehidróxido de alumínio ou em um de fosfato de alumínio,antes de serem usados no processo da invenção. Emmodalidades preferidas, PT, FHA e pertactina são pré-adsorvidos separadamente ao hidróxido de alumínio, antes deserem usados no processo da invenção.

Em composições que compreendem HBsAg e antígenos deHib, o conjugado de Hib pode ser não adsorvido, mas ele épreferivelmente adsorvido a um adjuvante de fosfato dealumínio [64]. A adsorção desta é particularmente útil emvacinas que compreendem antígenos D-T-Pw-Hib-HBsAg. Outrosantígenos conjugados (por exemplo, de meningococo e depneumococo) podem ser adsorvidos de modo similar a um salde alumínio (por exemplo, fosfato) ou podem ser nãoadsorvidos [65].

Antígenos de IPV são tipicamente não adsorvidos aqualquer adjuvante antes de serem usados em um processo dainvenção, mas podem se tornar adsorvidos em adjuvante(s) dealumínio que se origina com outros componentes.

O HBsAg na composição pode ser adsorvido em fosfato dealumínio com a utilização dos métodos descritos nareferência 66. A adsorção ao fosfato de alumínio contrastacom o produto conhecido ENGERIX-B™ (no qual o HBsAg éadsorvido ao hidróxido de alumínio) , mas é igual à queocorre nos produtos HEPACCINE™ e RECOMBIVAX™. Comomencionado na referência 67, o fosfato de alumínio pode serum adjuvante melhor para HBsAg do que o hidróxido dealumínio. Embora o HBsAg possa ser adsorvido a um adjuvantede hidróxido de alumínio na vacina final (como no produtoconhecido ENGERIX-B™) ou possa permanecer não adsorvido,ele geralmente será adsorvido a um adjuvante de fosfato dealumínio. Além disso, ele é preferivelmente pré-adsorvidoao fosfato de alumínio, antes de ser usado no processo dainvenção.

Quando um processo da invenção utilizar um componenteno qual os toxóides diftéricos e tetânicos tenham sidomisturados antes de serem combinados com o HBsAg, essamistura D-T preferivelmente conterá um adjuvante dehidróxido de alumínio, ao qual os antígenos DeT estãoadsorvidos.

Quando um processo da invenção utilizar um componenteno qual toxóide diftérico, toxóide tetânico e antígeno depertussis de célula inteira tenham sido misturados antes deserem combinados com o HBsAgi essa mistura D-T-Pwpreferivelmente conterá tanto um adjuvante de hidróxido dealumínio, ao qual os antígenos DeT estão adsorvidos,quanto um adjuvante de fosfato de alumínio.

Adjuvantes de alumínio em uso atualmente sãotipicamente denominados adjuvantes de "hidróxido dealumínio" ou de "fosfato de alumínio". Esses são nomes deconveniência, no entanto, uma vez que nenhum deles é umadescrição precisa do verdadeiro composto químico presente(por exemplo, veja o capítulo 9 da referência 68) . Ainvenção pode usar qualquer um dos sais de "hidróxido" ou"fosfato" que são de uso geral como adjuvantes.

Os adjuvantes conhecidos como "hidróxido de alumínio"são tipicamente sais de oxihidróxido de alumínio, que sãonormalmente pelo menos parcialmente cristalinos. 0oxihidróxido de alumínio, que pode ser representado pelafórmula AlO(OH), pode ser distinguido de outros compostosde alumínio, por exemplo, hidróxido de alumínio (Al(OH)3),por espectroscopia infravermelha (IR), em particular pelapresença de uma banda de adsorção a 1.070 cm"1 e um forteressalto a 3.090-3.100 cm"1 (capítulo 9 da referência 68).

Os adjuvantes conhecidos como "fosfato de alumínio"são tipicamente hidroxifosfatos de alumínio, quefreqüentemente também contêm uma pequena quantidade desulfato. Eles podem ser obtidos por precipitação, e ascondições de reação e as concentrações durante aprecipitação influenciam o grau de substituição de hidroxilpor fosfato no sal. Os hidroxifosfatos geralmente possuemuma proporção molar de P04/A1 entre 0,3 e 0,99. Oshidroxifosfatos podem ser distinguidos do AlPO4 exato pelapresença de grupos hidroxil. Por exemplo, uma banda deespectro IR a 3.164 cm"1 (por exemplo, quando aquecido até200°C) indica a presença de grupos hidroxil estruturais(capítulo 9 da referência 68).

A proporção molar de P04/A13+ de um adjuvante defosfato de alumínio será geralmente entre 0,3 e 1,2,preferivelmente entre 0,8 e 1,2 e, mais preferivelmente,0,95 ± 0,1. O fosfato de alumínio será geralmente amorfo,particularmente para sais de hidroxifosfato. Um adjuvantetípico é hidroxifosfato de alumínio amorfo, com umaproporção molar de P04/A1 entre 0,84 e 0,92, incluída em0,6 mg de Al3+/ml. O fosfato de alumínio será geralmenteparticulado. Diâmetros típicos das partículas estão nafaixa de 0,5 - 20 μπι (por exemplo, cerca de 5 - 10 pm) apósqualquer adsorção de antígeno.

0 PZC do fosfato de alumínio está inversamenterelacionado ao grau de substituição de hidroxil porfosfato, e esse grau de substituição pode variar,dependendo das condições de reação e da concentração dereagentes usadas para a preparação do sal por precipitação.0 PZC também é alterado por mudança da concentração de íonsfosfato livres em solução (mais fosfato = PZC mais ácido)ou por adição de um tampão como, por exemplo, um tampão dehistidina (torna o PZC mais básico). Fosfatos de alumíniousados de acordo com a invenção terão geralmente um PZCentre 4,0 e 7,0, mais preferivelmente entre 5,0 e 6,5, porexemplo, cerca de 5,7.

Uma solução de fosfato de alumínio usada para prepararuma composição da invenção pode conter um tampão (porexemplo, um tampão de fosfato ou de histidina ou um tampãoTris), mas isso nem sempre é necessário. A solução defosfato de alumínio é preferivelmente estéril e livre depirogênios. A solução de fosfato de alumínio pode incluiríons livres de fosfato aquoso, por exemplo, presentes emuma concentração entre 1,0 e 20 mM, preferivelmente entre 5e 15 mM e, mais preferivelmente, cerca de 10 mM. A soluçãode fosfato de alumínio também pode compreender cloreto desódio. A concentração de cloreto de sódio estápreferivelmente na faixa de 0,1 a 100 mg/ml (por exemplo,0,5-50 mg/ml, 1-20 mg/ml, 2-10 mg/ml) e, maispref erivelmente, cerca de 3 ± 1 mg/ml. A presença de NaClfacilita a medida correta do pH, antes da adsorção deantígenos.

Em algumas modalidades, a invenção pode excluircomposições que compreendem uma emulsão óleo-em-água quecontêm uma mistura de polissorbato 80, Span 85 e esqualeno[69]. Em algumas modalidades, a invenção pode excluircomposições que compreendem uma mistura de um óleo, um a-tocoferol e polissorbato 80 [70]. Em algumas modalidades, ainvenção pode excluir composições que compreendem umadjuvante de saponina (como, por exemplo, QS21) e umtensoativo não-iônico (como, por exemplo, polissorbato 40,60 ou 80) . Em algumas modalidades, a invenção pode excluircomposições que compreendem um adjuvante de saponina, umóleo metabolizável e um tensoativo não-iônico [71] . Emalgumas modalidades, a invenção pode excluir composiçõesque compreendem um adjuvante de saponina, uma emulsão óleo-em-água e um esterol [72] . Em algumas modalidades, ainvenção pode excluir composições que compreendem 3d-MPL,QS21 e uma emulsão óleo-em-água [73].

Combinação de HBsAg purificado com antígenos adicionais

Os processos da invenção incluem uma etapa na qualHBsAg purificado é combinado com pelo menos um antlgeno depelo menos um patógeno diferente do HBV.

Os antígenos podem ser combinados individualmente emsérie, ou podem ser pré-misturados e adicionados emconjunto. Por exemplo, uma vacina tetravalente de DTP-HBsAgpode ser feita por um processo que envolve a adição serialde HBsAg, antígenos D, TePa um vaso, ou por pré-misturade antígenos D, T e P, e depois combinando-se o HBsAg e amistura de DTP.

Componentes antigênicos podem ser combinados emqualquer ordem adequada.

Os antígenos dos patógenos diferentes do HBV podemcompreender um tensoativo, o qual pode ser o mesmo oudiferente do tensoativo não-iônico usado durante apurificação do HBsAg. Os processos da invenção sãoparticularmente úteis quando os outros componentesantigênicos compreenderem um tensoativo, na medida em quesão evitadas múltiplas etapas separadas para a adição detensoativo. Preferem-se os processos nos quais um ou maisdos componentes diferentes de HBV compreendem polissorbato80.

Quando forem incluídos toxóides diftéricos e tetânicosem uma composição da invenção, eles serão preferivelmentepré-misturados, antes de serem combinados com o HBsAg.Dessa forma, o processo da invenção envolve a combinação deum primeiro componente que compreende HBsAg, com um segundocomponente que compreende antígenos DeT. Do mesmo modo,quando toxóide diftérico, toxóide tetânico e antígenos depertussis de célula inteira forem incluídos em umacomposição, eles serão preferivelmente pré-misturados e,assim, o processo da invenção envolve a combinação de umprimeiro componente que compreende HBsAg com um segundocomponente que compreende antígenos D, T e Pw.

Quando for usada uma mistura de D-T, a proporção detoxóide diftérico para toxóide tetânico nas vacinas dainvenção será normalmente entre 2:1 e 3:1 (medida emunidades Lf), preferivelmente entre 2,4:1 e 2,6:1 e, maispreferivelmente, 2,5:1.

Quando foi incluído um adjuvante nas composições dainvenção, ele também poderá ser adicionado em váriosestágios. Tipicamente, os antígenos terão sido combinadoscom os adjuvantes antes de serem usados nos processos dainvenção (por exemplo, uma mistura bivalente D-T terá sidoadsorvida ao(s) adjuvante(s) de sal de alumínio, antes deser usada nos processos da invenção), mas também é possíveladicionar o adjuvante após os antígenos terem sidomisturados, ou adicionar os antígenos a um adjuvante (porexemplo, começar com um adjuvante aquoso e depois adicionaros antígenos, tanto individualmente quanto pré-misturados).Como descrito acima, o componente de HBsAg pode seradsorvido a um adjuvante de fosfato de alumínio, antes deser combinado aos componentes antigênicos diferentes deHBV.

A vacina combinadaAs composições da invenção podem compreender: (a) umcomponente antigênico; e (b) um componente não antigênico.O componente antigênico pode compreender ou consistir nosantígenos revelados acima. 0 componente não antigênico podeincluir veículos, adjuvantes, excipientes, tampões etc.,como descrito com mais detalhe acima. Esses componentes nãoantigênicos podem ter várias fontes. Eles podem estarpresentes em um dos materiais de antígeno ou de adjuvanteutilizados durante a fabricação, ou podem ser adicionadosseparadamente daqueles componentes.

Composições preferidas da invenção incluem um ou maisveículos e/ou excipientes farmacêuticos.

Para controle da tonicidade, prefere-se incluir um salcomo, por exemplo, um sal de sódio. Prefere-se o cloreto desódio (NaCl)7 que pode estar presente entre 1 e 20 mg/ml.

As composições terão geralmente uma osmolalidade entre200 mOsm/kg e 400 mOsm/kg, preferivelmente entre 240-360mOsm/kg, e estarão preferivelmente dentro da faixa de 280-32 0 mOsm/kg. A osmolalidade foi previamente relatada comonão tendo impacto sobre a dor causada pela vacinação [74],mas, todavia, prefere-se manter a osmolalidade nesseintervalo.

As composições da invenção podem incluir um ou maistampões. Tampões típicos incluem: um tampão de fosfato; umtampão Tris; um tampão de borato; um tampão de succinato;um tampão de histidina; ou um tampão de citrato. Os tampõestipicamente serão incluídos na faixa de 5-20 mM.

O pH de uma composição da invenção estará geralmenteentre 5,0 e 7,5 e, mais tipicamente, entre 5,0 e 6,0 parauma estabilidade ótima ou, quando estiver presente umtoxóide diftérico e/ou um toxóide tetânico, entre 6,0 e7,0. Portanto, o processo da invenção pode incluir umaetapa de ajuste do pH do volume de vacina, antes daembalagem.

As composições da invenção são preferivelmenteestéreis.

As composições da invenção são preferivelmente nãopirogênicas, contendo, por exemplo, < 1 EU (unidade deendotoxina, uma medida-padrão) por dose e, preferivelmente, < 0,1 EU por dose.

As composições da invenção preferivelmente não contêmglúten.

Em função da natureza adsorvida do HBsAg, o produto devacina final pode ser uma suspensão com uma aparência turva. Essa aparência significa que uma possívelcontaminação microbiana não será facilmente visível e,portanto, a vacina preferivelmente contém um agenteantimicrobiano. Isso é particularmente importante quando avacina for embalada em recipientes multidoses.Antimicrobianos preferidos para inclusão são 2-fenoxietanole timerosal. Prefere-se, no entanto, não utilizarconservantes mercuriais (por exemplo, timerosal) durante oprocesso da invenção, Dessa forma, entre 1 e todos oscomponentes usados no processo podem ser substancialmente livres de conservante mercurial (particularmente umcomponente bivalente de D-T; um componente de IPV; umcomponente conjugado). No entanto, a presença dequantidades residuais pode ser inevitável caso umcomponente (particularmente HBsAg) tenha sido tratado anteriormente com um conservante desse tipo. Por segurança,no entanto, prefere-se que a composição final contenhamenos de cerca de 25 ng/ml de mercúrio. Maispreferivelmente, o produto de vacina final não contémtimerosal detectável. Isso geralmente pode ser obtido porremoção do conservante mercurial de uma preparação deantígeno, antes de sua adição no processo da invenção, ouevitando-se o uso de timerosal durante a preparação doscomponentes usados para a produção da composição.

Quando for usada uma mistura bivalente D-T durante umprocesso da invenção, ela deverá ser livre de timerosal. Emalgumas modalidades, a mistura D-T pode incluir 2-fenoxietanol, mas em outras ela é livre tanto de timerosalquanto de 2-fenoxietanol. Quando for usada uma misturatrivalente D-T-Pw durante um processo da invenção, elapoderá ser livre de 2-fenoxietanol, mas poderá incluirtimerosal.

Durante a fabricação, a diluição de componentes paragerar concentrações finais desejadas será realizadanormalmente com WFI (água para injeção).

A concentração de fosfato de alumínio em umacomposição da invenção, expressa em termos de Al3+, épreferivelmente menor do que 5 mg/ml, por exemplo, < 4mg/ml, < 3 mg/ml, < 2 mg/ml, < 1 mg/ml etc.

A concentração de HBsAg em uma composição da invençãoé preferivelmente menor do que 60 μg/ml, por exemplo, < 55μg/ml, < 50 μg/ml, < 4 5 μg/ml, < 4 0 μg/ml etc. Umaconcentração de cerca de 20 μg/ml é típica.

A concentração de toxóide diftérico em uma composiçãoda invenção é tipicamente de pelo menos 50 UI/ml.

A concentração de toxóide tetânico em uma composiçãoda invenção é tipicamente de pelo menos 100 Ul/ml.

A proporção de toxóide diftérico para toxóide tetânicoem composições da invenção é normalmente entre 2:1 e 3:1(medida em unidades Lf), preferivelmente entre 2,4:1 e2,6:1 e, mais preferivelmente, 2,5:1.

A quantidade de antígeno wP em composições da invençãoé tipicamente pelo menos 8 Ul/ml.

A quantidade de conjugado de Hib em composições dainvenção, medida como sacarídeo, é tipicamente entre 10 e30 μg/ml.

A quantidade de antígeno de HAV, medida em EU(Unidades Elisa), é tipicamente de pelo menos 600 EU/ml.

A quantidade de antígeno de IPV depende do sorotipo dacepa. Para um vírus do tipo 1, uma composição tipicamentecontém cerca de 80 DU/ml. Para um vírus do tipo 2, umacomposição tipicamente contém cerca de 16 DU/ml. Para umvírus do tipo 3, uma composição tipicamente contém cerca de65 DU/ml.

A quantidade de um conjugado meningocócico emcomposições da invenção, medida como sacarídeo, étipicamente entre 5 e 25 pg/ml para cada sorogrupo.

A quantidade de um conjugado pneumocócico emcomposições da invenção, medida como sacarídeo, étipicamente entre 2 e 20 μg/ml para cada sorotipo.

As composições da invenção são administradas aospacientes preferivelmente em doses de 0,5 ml. Referênciasàs doses de 0,5 ml serão subentendidas como incluindo umavariância normal, por exemplo, 0,5 ml ± 0,05 ml.

A invenção pode fornecer material a granel adequadopara embalagem em doses individuais, que podem então serdistribuídas para administração aos pacientes. Asconcentrações mencionadas acima são tipicamenteconcentrações na dose embalada final e, dessa forma, asconcentrações na vacina a granel podem ser maiores (porexemplo, para serem reduzidas até as concentrações finaispor diluição).

As composições da invenção estarão geralmente na formaaquosa.

Material residual dos componentes antigênicosindividuais também pode estar presente em quantidadesresiduais na vacina final produzida pelo processo dainvenção. Por exemplo, caso seja usado formaldeído para opreparo dos toxóides diftéricos, tetânicos e de pertussis,o produto de vacina final poderá reter quantidadesresiduais de aldeído (por exemplo, menos do que 10 pg/ml,preferivelmente < 5 pg/ml). Meios ou estabilizantes podemter sido usados durante a preparação de poliovírus (porexemplo, meio 199), e esses podem passar à vacina final. Damesma forma, aminoãcidos livres (por exemplo, alanina,arginina, aspartato, cisteína e/ou cistina, glutamato,glutamina, glicina, histidina, prolina e/ou,

hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,fenilalanina, serina, treonina, triptofano, tirosina e/ouvalina), vitaminas (por exemplo, colina, ascorbato etc.),fosfato dissódico, fosfato monopotássico, cálcio, glicose,sulfato de adenina, vermelho fenol, acetato de sódio,cloreto de potássio etc. podem ser retidos na vacina finala < 100 pg/ml, preferivelmente < 10 pg/ml, cada. Outroscomponentes de preparações de antígenos como, por exemplo,neomicina (por exemplo, sulfato de neomicina,particularmente do componente de IPV), polimixina B (porexemplo, sulfato de polimixina B, particularmente docomponente de IPV) etc. também podem star presentes emquantidades subnanograma por dose. Um possível componenteadicional da vacina final que se origina nas preparações deantígenos surge da purificação subtotal dos antígenos.Pequenas quantidades de proteínas e/ou DNA genômico de B.pertussis, C. diphtheriae, C. tetani e S. cerevisiae podem,portanto, estar presentes. Para minimizar as quantidadesdesses componentes residuais, as preparações de antígenossão preferivelmente tratadas para removê-los, antes de osantígenos serem usados no processo da invenção.

Quando for utilizado um componente de IPV, elegeralmente terá se desenvolvido em células Vero. A vacinafinal preferivelmente contém menos do que 10 ng/ml,preferivelmente < 1 ng/ml, por exemplo, < 500 pg/ml ou < 50pg/ml de DNA de células Vero, por exemplo, menos do que 10ng/ml de DNA de células Vero, ou seja, um comprimento > 50pares de base.

Embalagem das composições da invenção

Após combinação dos HBsAg e dos adjuvantes, osprocessos da invenção podem compreender uma etapa deextração e embalagem de uma amostra de 0,5 ml da mistura emum recipiente. Para situações multidoses, quantidades dedoses múltiplas serão extraídas e embaladas em conjunto emum único recipiente.

Os processos da invenção podem compreender a etapaadicional de embalagem da vacina em recipientes parautilização. Recipientes adequados incluem frascos eseringas descartáveis (preferivelmente, aquelas estéreis).Quando uma composição da invenção for embalada em frascos,esses serão feitos preferivelmente de um material de vidroou plástico. O frasco é preferivelmente esterilizado antesde a composição ser adicionada a ele. Para evitar problemascom pacientes sensíveis ao látex, os frascos sãopreferivelmente lacrados com uma tampa sem látex. O frascopode incluir uma única dose de vacina, ou pode incluir maisde uma (um frasco "multidoses") , por exemplo, 10 doses.Quando se utiliza um frasco multidoses, cada dose deve serretirada com uma agulha e uma seringa estéreis sobcondições rigorosamente assépticas, tendo-se o cuidado deevitar a contaminação do conteúdo do frasco. Frascospreferidos são feitos de vidro.

Um frasco pode ter uma tampa (por exemplo, uma travaLuer) adaptada de tal forma que uma seringa pré-preenchidapossa ser inserida na tampa, o conteúdo da seringa possaser expelido no frasco (por exemplo, para reconstituirmaterial liofilizado nele contido), e o conteúdo do frascopossa ser removido de volta para a seringa. Após remoção daseringa do frasco, uma agulha pode então ser anexada, e acomposição pode ser administrada a um paciente. A tampaestá localizada preferivelmente dentro de um lacre ou umaproteção, de tal forma que o lacre ou a proteção tenha queser removida antes que a tampa possa ser acessada.

Quando a composição for embalada em uma seringa, aseringa normalmente não terá uma agulha a ela anexada,embora uma agulha separada possa ser fornecida com aseringa para montagem e utilização. Preferem-se agulhas desegurança. Agulhas com calibre de 23 com 2,54 centímetros,25 com 2,54 centímetros e 25 com 1,588 centímetro sãotípicas. As seringas podem ser fornecidas com rótulosdestacáveis nos quais podem ser impressos o número do lotee a data de validade do conteúdo, para facilitar oregistro. O êmbolo na seringa preferivelmente tem uma travapara evitar que o êmbolo seja removido acidentalmentedurante a aspiração. As seringas podem ter uma tampa e/ouêmbolo de borracha de látex. Seringas descartáveis contêmuma única dose de vacina. A seringa geralmente terá umatampa para lacrar a ponta, antes da anexação de uma agulha,e a tampa da ponta é feita preferivelmente de borracha debutil. Caso a seringa e a agulha sejam embaladasseparadamente, a agulha será preferivelmente adaptada comuma proteção de borracha de butil. Prefere-se a borracha debutil cinza. Seringas preferidas são aquelascomercializadas sob o nome comercial de "Tip-Lok"™.

Quando é utilizado um recipiente de vidro (porexemplo, uma seringa ou um frasco), prefere-se utilizar umrecipiente feito vidro de borossilicato, em vez de um vidrode cal sodada.

Após uma composição ter sido embalada em umrecipiente, o recipiente poderá então ser colocado em umacaixa para distribuição, por exemplo, dentro de uma caixade papelão, e a caixa será rotulada com detalhes da vacina,por exemplo, seu nome comercial, uma lista dos antígenos navacina (por exemplo, "hepatite B recombinante" etc.), orecipiente de apresentação (por exemplo, "SeringasDescartáveis Pré-Preenchidas Tip-Lok" ou "Frascos de DoseÚnica 10x0,5 ml"), sua dose (por exemplo, "cada umacontendo uma dose de 0,5 ml"), avisos (por exemplo,"Somente para uso adulto" ou "Somente para usopediátrico"), uma data de validade, uma indicação (porexemplo, "imunização ativa contra infecção pelo vírus dahepatite B (HBV) causada por todos os subtipos conhecidospara pacientes com insuficiência renal (incluindo em pacientes em pré-hemodiálise e em hemodiálise), a partir daidade de 15 anos" etc.), um número de patente etc. Cadacaixa pode conter mais de uma vacina embalada, por exemplo,cinco ou dez vacinas embaladas (especialmente parafrascos). Caso a vacina esteja contida em uma seringa, a embalagem poderá mostrar uma figura da seringa.

A vacina pode ser embalada juntamente (por exemplo, namesma caixa) com um folheto que inclui detalhes da vacina,por exemplo, instruções para administração, detalhes dosantígenos contidos, da vacina etc. As instruções também podem conter avisos, por exemplo, para manter uma soluçãode adrenalina prontamente disponível em caso de reaçãoanafilática após a vacinação etc.

A vacina embalada é estocada preferivelmente entre 2ºCe 8°C. Ela não deve ser congelada.

As vacinas podem ser fornecidas na forma totalmentelíquida (ou seja, em que todos os componente antigênicosestão em uma solução ou suspensão aquosa) durante afabricação, ou elas podem ser preparadas em uma forma naqual alguns componentes estejam na forma líquida e outros na forma liofilizada. Dessa forma, uma vacina final podeser preparada de forma extemporânea no momento de usomisturando-se em conjunto dois componentes: (a) um primeirocomponente que compreende antígenos aquosos; e (b) umsegundo componente que compreende antígenos Iiofilizados. Os dois componentes estão preferivelmente em recipientesseparados (por exemplo, frascos e/ou seringas), e ainvenção fornece um kit que compreende os componentes (a) e(b) . Esse formato é particularmente útil para vacinas queincluem um componente conjugado, particularmente conjugadosHib e/ou meningocócicos e/ou pneumocócicos, na medida emque esses podem ser mais estáveis na forma liofilizada.Dessa forma, os conjugados podem ser liofilizados antes deseu uso com invenção. Componentes adicionais também podemser adicionados antes da Iiofilização, por exemplo,estabilizantes. Estabilizantes preferidos para inclusão sãolactose, sacarose e manitol, além de misturas destes, porexemplo, misturas de lactose/sacarose, misturas desacarose/manitol etc. dessa forma, a vacina final podeconter lactose e/ou sacarose. 0 uso de misturas desacarose/manitol pode acelerar o processo de secagem.

Dessa forma, a invenção fornece um processo para apreparação de uma vacina combinada com dois recipientes,que compreende as seguintes etapas:

- preparação de uma vacina combinada aquosa, comodescrita acima, mas em que aqueles um ou mais antígenos nãoincluem um antígeno sacarídico capsular conjugado;

- a embalagem da referida vacina combinada em umprimeiro recipiente (por exemplo, uma seringa);

- preparação de um antígeno sacarídico capsularconjugado na forma liofilizada;

- embalagem do referido antígeno liofilizado em umsegundo recipiente (por exemplo, um frasco); eembalagem do primeiro recipiente e do segundorecipiente juntos em um kit.

O kit pode então ser distribuído aos médicos.Os componentes de D, Τ, P e HBsAg estãopreferivelmente na forma líquida.Métodos de tratamento e administração da vacina

As composições da invenção são adequadas paraadministração a pacientes humanos, e a invenção fornece ummétodo de despertar uma resposta imunológica em umpaciente, que compreende a etapa de administração de umacomposição da invenção ao paciente.

A invenção também fornece uma composição da invençãopara uso em medicina.

A invenção também fornece o uso de: (i) HBsAgpurificado por células de levedura recombinantes, em que oprocesso de purificação envolve a ruptura das células delevedura na presença de um tensoativo não-iônico, e (ii) umou mais antígenos não-HBV, na fabricação de um medicamentopara administração a um paciente.

As composições imunogênicas da invenção sãopreferivelmente vacinas, para uso na prevenção e/outratamento, pelo menos, de infecção pelo vírus da hepatiteB. Pacientes que receberam composições da invençãopreferivelmente possuem uma titulação sérica anti-HBsAg GM≥ 500 mUI/ml, medida 6 semanas após a primeira imunização.Mais preferivelmente, a titulação é > 500 mUI/ml, quandomedida após 12 meses. A fim de obter eficácia plena, um esquema típico deimunização primária para uma criança pode envolver aadministração de mais de uma dose. Por exemplo, as dosespodem ocorrer em: 0 e 6 meses (o tempo 0 sendo a primeiradose) ; em 0, 1, 2 e 6 meses; no dia 0, 21° dia, e depoisuma terceira dose entre 6 e 12 meses; em 2, 4 e 6 meses; em3, 4 e 5 meses; em 6, 10 e 14 semanas; ou em 0, 1, 2, 6 e12 meses.

As composições também podem ser usadas como doses dereforço, por exemplo, para crianças, no segundo ano devida. As composições também podem ser administradas porinjeção intramuscular, no braço ou na perna.

As vacinas produzidas pela invenção podem seradministradas aos pacientes ao mesmo tempo em que umavacina separada de conjugado pneumocócico como, porexemplo, Prevnar™.

Quando as composições da invenção incluírem umadjuvante baseado em alumínio, poderá ocorrer deposição doscomponentes durante a estocagem. Portanto, a composiçãodeve ser agitada antes da administração a um paciente. Acomposição agitada será uma suspensão branca turva.

Vacinas preferidas

As composições imunogênicas multivalentes específicasda invenção incluem:

- Uma composição pentavalente que compreende HBsAg, D,T, Pa e IPV. A vacina está na forma aquosa. Ela incluiadjuvantes tanto de hidróxido de alumínio quanto de fosfatode alumínio. HBsAg é adsorvido ao fosfato de alumínio. D, Te Pa são adsorvidos ao hidróxido de alumínio. Quantidadespor ml: cerca de 50 Lf de toxóide diftérico; cerca de 20 Lfde toxóide tetânico; cerca de 50 pg de PT; cerca de 50 pgde FHA; cerca de 16 pg de pertactina; cerca de 20 pg deHBsAg; cerca de 80 DU de poliovírus do tipo 1; cerca de 16DU de poliovírus do tipo 2; cerca de 64 DU de poliovírus dotipo 3. Dose: cerca de 0,5 ml. Pode ser apresentada emseringa pré-preenchida.- Uma composição pentavalente que compreende HBsAg, D,T, Pa e IPV. A vacina está na forma aquosa. Ela incluiadjuvantes tanto de hidróxido de alumínio quanto de fosfatode alumínio. HBsAg é adsorvido ao fosfato de alumínio. D, Te Pa são adsorvidos ao hidróxido de alumínio. Quantidadespor ml: pelo menos 60 UI de toxóide diftérico; pelo menos80 UI de toxóide tetânico; cerca de 50 pg de PT; cerca de50 pg de FHA; cerca de 16 pg de pertactina; cerca de 20 pgde HBsAg; cerca de 80 DU de poliovírus do tipo 1; cerca de16 DU de poliovírus do tipo 2; cerca de 64 DU de poliovírusdo tipo 3. Dose: cerca de 0,5 ml. Pode ser apresentada emseringa pré-preenchida.

- Uma composição tetravalente que compreende HBsAg, D,T e Pw. Os componentes estão na forma aquosa. Ela incluiadjuvantes tanto de hidróxido de alumínio quanto de fosfatode alumínio. HBsAg é adsorvido ao fosfato de alumínio. D eT são adsorvidos ao hidróxido de alumínio. A composiçãoinclui timerosal, mas preferivelmente não contém 2-f enoxietanol. Quantidades por ml: pelo menos 60 UI detoxóide diftérico; pelo menos 120 UI de toxóide tetânico;pelo menos 8 UI de Pw; cerca de 20 μg de HbsAg. Dose: cercade 0,5 ml.

- Uma composição pentavalente que compreende HBsAg, D,T, Pw e um conjugado de Hib-T. Os componentes de HBsAg, D,T e Pw estão na forma aquosa; o Hib-T está liofilizado. Elainclui adjuvantes tanto de hidróxido de alumínio quanto defosfato de alumínio. DeT são adsorvidos ao hidróxido dealumínio. HBsAg e Hib-T são adsorvidos ao fosfato dealumínio. O Hib-T liofilizado inclui lactose. 0 componenteaquoso pode incluir timerosal. Quantidades por ml: pelomenos 60 UI de toxóide diftérico; pelo menos 120 UI detoxóide tetânico (mais entre 5-25 μg de toxóide tetânicocomo veículo em Hib-T); pelo menos 8 UI de Pw; cerca de 20μ9 de HBsAg; cerca de 5 pg de Hib-T, medido como sacarídeo.

Dose: cerca de 0,5 ml.

- Uma composição heptavalente que compreende HBsAg, D,T, Pw e três conjugados: um conjugado de Hib-T, umconjugado de MenA e um conjugado de MenC. Os componentes deHBsAg, D, T e Pw estão na forma aquosa; os três conjugadosestão Iiofilizados. Ela inclui adjuvantes tanto dehidróxido de alumínio quanto de fosfato de alumínio. DeTsão adsorvidos ao hidróxido de alumínio. HBsAg é adsorvidoao fosfato de alumínio. 0 componente liofilizado podeincluir lactose e/ou sacarose. O componente aquoso podeincluir timerosal. Quantidades potenciais por ml: pelomenos 60 UI de toxóide diftérico; pelo menos 120 UI detoxóide tetânico (mais entre 5-25 pg de toxóide tetânicocomo veículo em Hib-T); pelo menos 8 UI de Pw; cerca de 20ug de HBsAg; cerca de 5 pg de cada conjugado, medido comosacarídeo. Dose: cerca de 0,5 ml.

Essas composições podem ser usadas como vacinas por sipróprias, ou como componentes de vacinas adicionais. Porexemplo, a invenção fornece uma composição hexavalente quecompreende a composição pentavalente HBsAg-D-T-Pa--IPVdescrita acima, mais um conjugado de Hib-T liofilizado. 0Hib-T liofilizado preferivelmente não é adsorvido a um salde alumínio. A invenção também fornece uma composiçãoheptavalente que compreende a composição pentavalenteHBsAg-D-T-Pa-IPV descrita acima, mais conjugados de Hib-Tliofilizado e MenC. A invenção também fornece umacomposição octavalente que compreende a composiçãopentavalente HBsAg-D-T-Pa-IPV descrita acima, maisconjugados de Hib-T liofilizado, MenC e MenY. A invençãotambém fornece uma composição pentavalente que compreende acomposição tetravalente HBsAg-D-T-Pw descrita acima, maisum conjugado de Hib-T liofilizado. A invenção tambémfornece uma composição heptavalente que compreende acomposição tetravalente HBsAg-D-T-Pw descrita acima, maisuma mistura liofilizada de conjugado de Hib-T, conjugado deMenA e conjugado de MenC. As vacinas finais podem serpreparadas por reconstituição dos materiais liofilizadoscom os materiais aquosos que contêm HBsAg no momento douso, e os componentes liofilizados e aquosos sãopreferivelmente embalados em conjunto em um kit, comodescrito acima.

Processos da invenção específicos incluem aqueles quecompreendem as seguintes etapas:

- Purificar o HBsAg de acordo com a invenção, adsorvero HBsAg ao adjuvante de fosfato de alumínio; obter umamistura bivalente D-T sem timerosal com adjuvante dehidróxido de alumínio; obter PT, FHA e pertactina para ocomponente de Pa; obter antígenos IPV, como um pool dostipos 1, 2 e 3, preferivelmente sem adjuvante de sal dealumínio; combinar D-Ti Pa, IPV e HBsAg, em qualquer ordem,para gerar uma combinação pentavalente final;opcionalmente, embalar em uma seringa.

- Purificar HBsAg de acordo com a invenção, adsorver oHBsAg ao adjuvante de fosfato de alumínio; obter a misturatrivalente D-T-Pw sem 2-fenoxietanol, contendo timerosalcom adjuvantes de hidróxido de alumínio e de fosfato dealumínio; combinar D-T-Pw e HBsAg para gerar a combinaçãotetravalente; opcionalmente, embalar em seringa;opcionalmente, embalar em combinação com componente(s)conjugado(s) Iiofilizado(s), por exemplo, Hib-T, MenA,MenC.

- Purificar HBsAg de acordo com a invenção; adsorverHBsAg ao adjuvante de fosfato de alumínio; obter a misturatrivalente D-T-Pw sem 2-fenoxietanol, contendo timerosal,com adjuvantes de hidróxido de alumínio e de fosfato dealumínio; obter conjugado de Hib-T liofilizado; combinar D-T-Pw e HBsAg para gerar o componente tetravalente aquoso;embalar o componente tetravalente aquoso em um frasco devidro; embalar Hib-T e/ou MenC e/ou MenY liofilizados em umfrasco de vidro; combinar os dois frascos a seremapresentados em um kit único para reconstituição para geraruma vacina combinada pentavalente. Os frascos de vidropodem ser de vidro do tipo I e possuir tampas de borrachade butil.

- Purificar HBsAg de acordo com a invenção; adsorverHBsAg ao adjuvante de fosfato de alumínio; obter a misturatrivalente D-T-Pw sem 2-fenoxietanol, contendo timerosal,com adjuvantes de hidróxido de alumínio e de fosfato dealumínio; obter antígenos IPV, como um pool dos tipos 1, 2e 3, preferivelmente sem adjuvante de sal de alumínio;combinar D-T-Pw, IPV e HBsAg em qualquer ordem, para gerara combinação pentavalente final; opcionalmente, embalar emuma seringa; opcionalmente, embalar em combinação comcomponente(s) conjugado(s) Iiofilizado(s), por exemplo,Hib-T, MenA, MenC.

Podem ser acrescentados componentes adicionais emqualquer estágio, por exemplo, cloreto de sódio,adjuvantes, conservantes etc. Esses processos podem serusados, por exemplo, para a preparação das vacinasdescritas acima.

As diferentes etapas do processo podem ser realizadassubstancialmente ao mesmo tempo, ou podem ser efetuadasseparadamente. Elas podem ser realizadas no mesmo local ouem locais diferentes, até mesmo em países diferentes; porexemplo, a purificação do HBsAg pode ocorrer em um localdiferente da liofilização de Hib-T.

Proteínas transportadoras para os conjugados

Os antígenos sacarídicos conjugados incluem umaproteína transportadora, à qual o sacarídeo é anexado deforma covalente, tanto diretamente quanto através de um15 vinculador. Informações gerais sobre as técnicas deconjugação podem ser encontradas na referência 45.

São conhecidas várias proteínas para uso comotransportadoras, e proteínas transportadoras preferidas sãotoxinas ou toxóides bacterianos, tais como toxóidediftérico ou toxóide tetânico. Outras proteínastransportadoras adequadas incluem, sem limitação, o mutanteCRM197 da toxina diftérica [75-77], a proteína da membranaexterna de N. meningitidis [78], peptídeos sintéticos [79,80], proteínas de choque térmico [81,82], proteínas depertussis [83,84], citocinas [85], linfocinas [85],hormônios [85], fatores de crescimento [85], proteínasartificiais que compreendem vários epitopos de células TCD4+ humanas de vários antígenos derivados de patógenos[86] , tais como Nl9 [87] , proteína D de H. influenza[88,89], proteína de superfície pneumocócica PspA [90],pneumolisina [91], proteínas de captação de ferro [92],toxina A ou B de C. difficile [93], proteínas de S.agalactiae [94] etc.

A anexação de um sacarídeo a um veículo é feitapreferivelmente por meio de um grupo -NH2, por exemplo, nacadeia lateral de um resíduo de lisina em uma proteínatransportadora, ou de um resíduo de arginina. A anexaçãoaos grupos -SH (por exemplo, na cadeia lateral de umacisteína) também é possível.

Preferem-se conjugados com uma proporção de sacarídeo-proteína (p/p) entre 1:5 (ou seja, proteína em excesso) e5:1 (ou seja, sacarídeo em excesso).

As composições podem incluir uma pequena quantidade deveículo livre. Desconsiderando-se qualquer veículo incluídocomo um antígeno separado, o veículo não conjugado épreferivelmente de, no máximo, 5% da quantidade total daproteína transportadora na composição como um todo e, maispreferivelmente, está presente em menos do que 2% por peso.

É possível incluir mais de um tipo de proteínatransportadora em uma composição, por exemplo, para reduziro risco de supressão do veículo.

A proteína transportadora usada para conjugados de N.meningitidis pode ser a proteína D de H. influenzae. Essaproteína é descrita em detalhe nas referências 95 e 96, eseu uso como proteína transportadora em conjugados édescrito na referência 97. 0 termo "proteína D" incluifragmentos da proteína de comprimento total nativa, comorevelada na referência 97, e também proteínas de fusão quecompreendem a proteína D de comprimento total ou essesfragmentos (por exemplo, uma fusão de um fragmento daproteína NSl do vírus influenza e um fragmento de proteínaD). Os fragmentos reterão a habilidade para converterantígenos sacarídicos T-independentes em um antígeno T-dependente quando a eles conjugados. Fragmentos típicosirão incluir pelo menos 1/3 do terminal N da proteína D. Aproteína pode ser convenientemente expressa em E. coli[96], e esse material recombinante é preferido para uso coma invenção [97].

Geral

O termo "que compreende" engloba "que inclui", bemcomo "que consiste"; por exemplo, uma composição "quecompreende" X pode consistir exclusivamente em X ou podeincluir alguma coisa adicional, por exemplo, X + Y.

A palavra "substancialmente" não exclui"completamente"; por exemplo, uma composição que seja"substancialmente livre" de Y pode ser completamente livrede Y. Quando necessário, a palavra "substancialmente" podeser omitida da definição da invenção.

0 termo "cerca de", em relação a um valor numérico x,significa, por exemplo, χ ± 10%.

A menos que especificado de forma diferente, umprocesso que compreende uma etapa de mistura de dois oumais componentes não exige qualquer ordem de misturaespecífica. Dessa forma, os componentes podem sermisturados em qualquer ordem. Quando houver trêscomponentes, dois componentes poderão ser combinados unscom os outros, e depois a combinação poderá ser combinadacom o terceiro componente etc.

Quando um antígeno é descrito como sendo "adsorvido" aum adjuvante, prefere-se que pelo menos 50% (por peso)daquele antígeno seja adsorvido, por exemplo, 50%, 60%,70%, 80%, 90%, 95%, 98% ou mais. Prefere-se que o toxóidediftérico e o toxóide tetânico sejam, ambos, totalmenteadsorvidos, ou seja, que nenhum deles seja detectável nosobrenadante. A adsorção total do HBsAg pode ser usada.

As quantidades de toxóide diftérico podem serexpressas em unidades internacionais (UI). Por exemplo, oNIBSC fornece o "Diphtheria Toxoid Adsorbed ThirdInternational Standard 1999" [98,99], que contém 160 UI porampola. Como alternativa ao sistema de UI, a unidade "Lf"("unidades de floculação" ou a "dose-limite de floculação")é definida como a quantidade de toxóide que, quandomisturada com uma Unidade Internacional de antitoxina,produz uma mistura de floculação ótima [100]. Por exemplo,o NIBSC fornece "Diphtheria Toxoid, Plain" [101], quecontém 300 LF por ampola, e também fornece "The IstInternational Reference Reagent For Diphtheria Toxoid ForFlocculation Test" [102], que contém 900 LF por ampola.

As quantidades de toxóide tetânico podem ser expressasem unidades internacionais (UI) . Por exemplo, o NIBSCfornece o "Tetanus Toxoid Adsorbed Third InternationalStandard 2000" [103, 104] , que contém 469 UI por ampola.Alternativamente ao sistema de UI, a "unidade Lf"("unidades de floculação" ou a "dose-limite de floculação")é definida como a quantidade de toxóide que, quandomisturada com uma Unidade Internacional de antitoxina,produz uma mistura de floculação ótima [100]. Por exemplo,o NIBSC fornece "The Ist International Reference Reagentfor Tetanus Toxoid For Flocculation Test" [105], que contém1.000 LF por ampola.As quantidades de antígenos wP podem ser expressas emunidades internacionais (UI) . Por exemplo, o NIBSC forneceo "Third International Standard For Pertussis Vaccine"[106] , que contém 4 6 UI por ampola. Cada ampola contém o resíduo liofilizado de alíquotas de 2,0 ml de uma soluçãoaquosa que continha 10 litros de suspensão bacteriana(equivalente a 180 unidades de opacidade em termos doPadrão de Opacidade U.S.) diluídos com oito litros detampão M/15 de Sorensen, pH 7,0. Alternativamente ao sistema de UI, a unidade "OU" ("unidades de opacidade")também é usada (por exemplo, 4 OU eqüivale aaproximadamente 1 UI).

As quantidades de conjugados são geralmenteapresentadas em termos de massa de sacarídeo (ou seja, a dose do conjugado (veículo + sacarídeo) como um todo émaior do que a dose estabelecida) a fim de evitar variaçõescausadas pela escolha do veículo.

Quando forem usados materiais animais (e,particularmente, bovinos) na cultura de células, eles deverão ser obtidos de fontes livres de encefalopatias

espongiformes transmissíveis (TSEs) e, em particular,livres de encefalopatia espongiforme bovina (BSE).

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOSA Figura 1 é uma cópia da Figura 2 das referências 3 e4, que estabelecem que a figura ilustra "antigenicidade eimunogenicidade com base em um método de adsorção no qual aamostra I é uma amostra na qual é adicionado um excesso degel de hidróxido de alumínio após uma combinação de cadacomponente da vacina estar completo, e a amostra 2 é umaamostra na qual o referido adsorvente da mesma concentraçãoé adicionado previamente, antes do término da combinação".As figuras IA e IB ilustram a antigenicidade relativa dasamostras 1 e 3, respectivamente. As figuras IC e IDilustram o nível relativo de formação de anticorpos contracada antígeno das amostras 1 e 2, respectivamente.

A Figura 2 mostra resultados de western blot para aestabilidade de HBsAg em uma composição. Na Figura 2A, asraias são: (1) tampão de amostra Laemmli (LSB); (2)marcadores de PM; (3-5) 1 μ3 de três preparações separadasde HBsAg de controle; (6-8) sobrenadante de três lotespentavalentes separados; (9-10) LSB. Nas Figuras 2B e 2C,- as raias são: (1) marcadores de PM; (2-4) 1 μg de trêspreparações separadas de HBsAg de controle; (5-7)sobrenadante de três lotes pentavalentes separados,estocados por 2 semanas a 2-8°C; (8-10) sobrenadante detrês lotes pentavalentes separados, estocados por 2 semanasa 36-38°C. Na Figura 2D, as raias são: (1) marcadores dePM; (2) HBsAg de controle; (3-5) sobrenadante de três lotespentavalentes separados.

A Figura 3 mostra a variação de pH ao longo do tempopara uma composição pentavalente.

A Figura 4 mostra resultados de western blot para aestabilidade de HBsAg em uma composição octavalente. NasFiguras 4A e 4B: a raia 1 contém marcadores de PM; a raia 2contém um controle de HBsAg a 1 μg/ml; a raia 3 contém osobrenadante da composição octavalente. Na Figura 4B: araia 4 contém LSB; a raia 5 contém o mesmo controle que araia 2; a raia 6 contém um extrato de DOC/TCA.

MÉTODOS PARA A PRÁTICA DA INVENÇÃOExpressão e purificação de HBsAgFoi preparado um hospedeiro de levedura H. polimorphaque codifica HBsAg [107,108]. Cem litros de meio forampreparados em um fermentador de 3 00 litros, e inoculadoscom a levedura. A fermentação prosseguiu até que as célulasestivessem presentes a 100 gramas/litro. Nesse estágio,como o hospedeiro é metiloptrófico, foi adicionado metanol,e a fermentação foi interrompida. 0 volume da cultura finalfoi de 160-170 litros. As células foram coletadas do meiode cultura por centrifugação.

Em vez de adicionar tensoativos não-iônicos ao HBsAgapós a purificação, como descrito nas referências 3 e 4, otensoativo foi usado durante a purificação da proteína. Emparticular, as células de levedura coletadas foramsuspensas em tampão fosfato contendo polissorbato 20 0,1-0,2% e 10 mM de EDTA. A suspensão foi resfriada e rompidausando um homogeneizador líquido de alta pressão.

A suspensão de células homogeneizada foi entãoclarificada por centrifugação. Após adição de NaCl aosobrenadante, foi adicionado polietileno glicol lentamente,até uma concentração de 3-5% por precipitação. A soluçãofoi agitada por 5 minutos, deixada em repouso por 3 0minutos, e centrifugada por 10 minutos. Foi acrescentadomais PEG lentamente ao sobrenadante até 8-10%, agitado edeixado em repouso por 2 horas. Essa solução foicentrifugada por 10 minutos.

Silica fumada foi adicionada ao sobrenadante em umaconcentração de 1-2%. A solução foi agitada por 12 minutos,centrifugada, e o precipitado foi dissolvido completamenteem um tampão de bórax contendo desoxicolato de sódio. Apósagitação por 100-120 minutos em um banho-maria, a soluçãofoi centrifugada e o sobrenadante foi coletado. 0sobrenadante foi carregado em uma coluna de DEAE que haviasido equilibrada com tampão Tris/Cl a uma taxa de fluxo de200ml/min, e eluido com tampaão Tris/Cl, contendo soluçãode NaCl. Foi adicionado cloreto de césio à DEAE7 eluído atéuma concentração de 1,2 g/ml, e a solução foi centrifugadaa 40.000 rpm. O pool dessalinizado de CsCl foi diluído compBS até uma concentração de proteína de 4 00 μg/ml, foiacrescentada formalina até uma concentração de 0,025%, e amistura foi deixada em repouso por 72 horas. Finalmente, aformalina residual foi removida com o uso de PBS.

Dessa forma, o HBsAg foi purificado com inclusão depolissorbato 20, mas o tensoativo foi adicionado antes daruptura das células recombinantes, em vez de ser adicionadoapós o antígeno ter sido purificado.

Vacinas multivalentes totalmente líquidas

HBsAg expresso em levedura, toxóide diftérico, toxóidetetânico e antígenos de pertussis de célula inteira foramadicionados a uma suspensão de um adjuvante de sal dealumínio. O pH da mistura foi ajustado, e depois foiacrescentado um conjugado de Hib-CRM197, de tal forma queele não fosse adsorvido ao adjuvante de alumínio. Esseprocesso gerou uma vacina pentavalente com a seguintecomposição:

<table>table see original document page 53</column></row><table><table>table see original document page 54</column></row><table>

Em um trabalho adicional, conjugados meningocócicos-CRM197 separados de cada um dos sorogrupos C, W135 e Yforam adicionados após o componente CRM-Hib a fim de geraruma vacina octavalente:

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Um parâmetro importante para a estabilidade e eficáciada vacina é a percentagem de hidrólise de conjugado de Hib,com o limite clínico sendo de 25% de sacarídeo livre (areferência 109 relata que a proporção de 20% não afetou aimunogenicidade clínica). Esse parâmetro foi medido navacina pentavalente por HPAEC-PAD, o que permite aquantificação direta de carboidratos não conjugados aníveis picomolares, com separação mínima e nitidez. Aanálise se concentrou na quantidade de sacarídeo livre.

A quantidade de sacarídeo livre foi avaliada eexpressa como uma percentagem da quantidade total. Osresultados foram os seguintes:

<table>table see original document page 55</column></row><table>

Um máximo de 25% de sacarídeo livre é clinicamenteaceitável. Todos os valores ficaram abaixo desse limite, eficaram abaixo de 6,5% por até 4 semanas a 2-8°C. Sobcondições de estresse térmico (4 semanas a 36-38°C), foiobservado um nível maior, mas ainda bem abaixo do valor de25%, com o máximo sendo de 11,6% para o lote 1. Um trabalhoanterior sobre vacinas multivalentes contra o Hibdemonstrou que um mês de estocagem a 36-38°C gera maishidrólise de CRM-Hib do que dois anos de estocagem a 2-8°C.Assim, pode-se esperar uma hidrólise aceitável ao longo deuma escala de tempo de pelo menos a 2 anos sob condições<table>table see original document page 56</column></row><table>normais de estocagem.

Também foi realizada análise HPAEC-PAD do sacarídeolivre após 6 meses a 2-8°C. Os dados foram os seguintes:

<table>table see original document page 56</column></row><table>

Dessa forma, há somente um pequeno aumento napercentagem de sacarídeo livre em 6 meses, comparado com 4semanas, com valores ainda bem abaixo do valor de 25%.Portanto, CRM197-Hib é muito estável nas três formulações.

A Figura 3A mostra a variação do PH na vacinapentavalente ao longo de 6 meses para três lotes estocadosa 2-8°C. A Figura 3B mostra a variação do pH ao longo de 4semanas para três lotes estocados a 36-38°C. A 2-8°C, o pHficou estável ao longo de 6 meses, enquanto, sob condiçõesde estresse térmico, houve uma ligeira queda de 0,1 unidadede pH após 2 semanas, e uma ligeira queda adicional após 4semanas. Mesmo assim, todos os valores de pH permaneceramdentro da faixa aceita de 6,0-7,0.

A osmolaridade de todos os três lotes pentavalentesficou entre 312 e 315 mOsm/kg, centralmente dentro dafaixa-alvo de 240-360 mOsm/kg para vacinas injetáveis.

A avaliação da potência e da imunogenicidade deantígenos é importante para avaliar a eficácia da vacinacombinada. Foi avaliada a potência dos antígenos dedifteria, tétano e de pertussis na vacina pentavalente, efoi testada a imunogenicidade tanto de CRM-Hib quanto deHBsAg. A análise por ELISA foi efetuada para avaliar onível de anticorpos específicos após imunização. Aimunogenicidade de HBsAg foi realizada com o uso de ummodelo de camundongo e um esquema de imunização diferenteem relação àquele usado para a potência de HBV.

Os valores da potência de DTP foram os seguintes:

<table>table see original document page 57</column></row><table>

Para cada um desses três antígenos, os resultados doteste de potência estão todos significativamente acima doslimites inferiores aceitos, e esses resultados indicam boaeficácia para esses três antígenos.

Para avaliar a imunogenicidade do HBsAgi grupos de 10camundongos CD1 receberam a vacina pentavalente por injeçãosubcutânea (0,5 ml, diluído a 1:4 em soro fisiológico) nosdias 0 e 14. Os camundongos foram sangrados no 21° dia, eos anticorpos específicos para HBsAg foram avaliados porELISA, usando: (a) o teste "Enzygnost Anti-HBs II" (DadeBehring) ou (b) o teste "Ausab EIA" (Abbott) . Esses testesELISA possuem formatos diferentes e sensibilidadesdiferentes ao HBsAg. Os valores da média geométrica datitulação (GMT) não são, portanto, comparáveis entre osdois testes. No entanto, dentro de escopo de cada teste, osvalores da GMT para os soros foram ótimos. Os resultadosforam os seguintes:

<table>table see original document page 57</column></row><table><table>table see original document page 58</column></row><table>

Todos os valores de GMT obtidos com a realização dessetipo de ensaio de imunogenicidade em camundongos sãomaiores do que os valores relatados na literatura. Apercentagem de responsivos é consistentemente mais elevadapara ambos os antígenos em um nível ótimo de -100%.

Para avaliar a imunogenicidade de Hib, grupos de 8camundongos CDl receberam a vacina pentavalente por injeçãosubcutânea (0,5 ml, diluído a 1:4 em soro fisiológico) nosdias 0, 10 e 20. Os camundongos foram sangrados no 34° dia,e os anticorpos específicos para Hib foram avaliados porELISA. Os resultados foram os seguintes:

<table>table see original document page 58</column></row><table>

A adsorção de HBsAg ao adjuvante de alumínio é umfator importante para a imunogenic idade da vacina, e esseparâmetro foi medido por immunoblot. O procedimento deimmunoblot seguido foi essencialmente o seguinte: um volumede 1 ml de sobrenadante da vacina foi precipitado porDOC/TCA e desnaturado com LSB, e depois carregado em umSDS-PAGE de acrilamida 12%; 1 μg de cada lote de HBsAg foicarregado como controle; uma preparação de anticorpo decabra anti-HBsAg foi usada como anticorpo primário (diluídaa 1:1.000), e um conjugado POD anti-cabra (diluído 1:2.500)foi usado como anticorpo secundário.Resultados para a vacina pentavalente são mostrados naFigura 2. As raias 6-8 da Figura 2A mostram que não háHBsAg solúvel detectável na composição no momento zero, eas raias 5-10 das Figuras 2B e 2C confirmam que isso permanece ocorrendo após 2 semanas e 4 semanas de estocagema 2-8°C ou 36-38°C. Em três lotes diferentes, -99% de HBsAgpermaneceram adsorvidos no adjuvante sob essas váriascondições.

Foi realizado um teste adicional de estabilidade após 6 meses de estocagem a 2-8°C (Figura 2D) . A adsorçãopermaneceu a -99% para cada um dos três lotes.

Os controles positivos usados na Figura 2 continham 1μg de HBsAg. Foi observada uma única banda correspondendoao peptídeo S (24 kDa), mais uma banda característica de agregados (-45 kDa). Pré-S2 não foi observado.

A vacina octavalente também foi testada quanto àadsorção de HBsAg de forma similar. Uma amostra de 1 ml foicentrifugada a 3.500 rpm por 10 minutos. O sobrenadante foiremovido para um tubo fresco e precipitado com DOC/TCA. O pélete foi re-suspenso em 200 μΐ de tampão de extração,fervido por 5 minutos, e centrifugado a 1.300 rpm por 10minutos. Vinte μΐ desse extrato e o sobrenadanteprecipitado com DOC/TCA foram carregados em um SDS-PAGE 12%para Western-Blot.

A Figura 4A mostra a vacina octavalente no momentozero, e a Figura 4B mostra a vacina após 8 meses deestocagem a 2-8°C. A ausência de qualquer coloraçãosignificativa nas raias 3 e 6 da Figura 4B (certamentemenos coloração do que a observada com 1 μg de HBsAg nas raias de controle 2 e 5) mostra que a adsorção de HBsAgpermanece estável ao longo desse período de estocagem.

Vacina multivalente líquida/liofilizada

São coletados três componentes antigênicos da seguinteforma:

-UM COMPONENTE TRIVALENTE D-T-Pw: foi preparado umcomponente de D-T-Pw que inclui toxóide diftérico adsorvidoa um adjuvante de hidróxido de alumínio, toxóide tetânico,também adsorvido a um adjuvante de hidróxido de alumínio eantígenos de pertussis de célula inteira. 0 componente deD-T-Pw também inclui um adjuvante de fosfato de alumínio.Esse componente contém timerosal, mas não contém 2-fenoxietanol.

- UM COMPONENTE DE HBsAg: o HBsAg é expresso epurificado por uma levedura recombinante, e é adsorvido emum antígeno de fosfato de alumínio [110].

- UM COMPONENTE DE CONJUGADO Hib: o polissacarídeo deHib é preparado a partir de Hib, cepa 20752 e, apósativação com brometo de cianogênio e derivatização com umespaçador de hidrazida adípica, é acoplado de formacovalente a um toxóide tetânico através de uma condensaçãode carbodiimida, em uma proporção de peso desacarídeo: veículo de 1:3. O conjugado é adsorvido a umadjuvante de fosfato de alumínio [64], e depois liofilizadocom lactose.

O componente de D-T-Pw é misturado com o componente deHBsAg. O nível de HBsAg é de 20 pg/ml. O nível de D é ≥ 60UI. O nível de T é ≥ 120 UI. 0 nível de Pw é ≥ 8 UI. Amistura tetravalente, na forma de uma suspensão brancaturva, é embalada em forma aquosa em frascos de vidros comuma tampa de borracha de butil, para conter 1 dose (0,5ml) , 2 doses (1 ml) ou 10 doses (5 ml) . O componente de Hibliofilizado também é colocado em frascos. A quantidade depó por frasco é medida para gerar 5 pg/ml (medida comosacarídeo) após reconstituição, com 1 dose, 2 doses ou 10doses por frasco.

Os dois frascos são embalados em conjunto. As caixascontêm 1 frasco de cada componente (em frascos de doseúnica ou em frascos multidoses) ou 100 frascos de cadacomponente.

Para administração ao paciente, o material D-T-Pw-HBsAg aquoso é puxado para uma seringa, e introduzido nofrasco de conjugado liofilizado. Após o materialliofilizado ser reativado, ele é colocado de volta para aseringa através de uma agulha nova, para gerar uma vacinapentavalente pronta para administração aos pacientes. Podemser usados vários esquemas de 3 doses de imunizaçãoprimária: 2, 4 e 6 meses; 3, 4 e 5 meses; ou 6, 10 e 14semanas. A vacina também pode ser usada como reforço nosegundo ano de vida.

Os frascos de 10 doses geram material suficiente paraa imunização de 10 pacientes por um único frasco. Areconstituição usa uma primeira seringa, e depois as dosesindividuais são extraídas com seringas novas, uma dose porseringa. Em um arranjo alternativo (menos preferido), as 10doses são retiradas em uma única seringa, com a agulhasendo trocada entre pacientes.

Será entendido que a invenção foi descrita somentecomo exemplo, e que podem ser feitas modificações dentro doescopo e do espírito da invenção.REFERÊNCIAS(cujos conteúdos são aqui incorporados por referência)[1] "Vaccines" (eds. Plotkm & Orenstein). 4a edição, 2004ISBN 0-7216-9688-0.

[2] Patente U.S. 6.616.931.

[3] WO 02/055105.

[4] US 2004/0048336.

[5] "Nonionic Surfactants: Organic Chemistry". Nico M. vanOs, ed. ISBN: 0-824-79997-6.

[6] Vanlandschoot e cols. (2005) J. Gen. Virol. 86:323 31.

[7] Hillman (1993) páginas 17-40 de "Hepatitis B vaccinesin clinicai practice" ISBN 0-8247-8780.

[8] Gerin e cols. (1969) J. Virol. 4: 763.

[9] Gerin e cols. (1969) J. Virol. 7: 569.

[10] Siebke e cols. (1972) Acta Pathol. Microbiol. Scan.sect. B, 80: 935.

[11] Pillot e cols. (1976) J. Microbiol. 4: 205.

[12] Duimel & Krijnen (1972) Vox Sang 23: 249.

[13] Neurath e cols, (1974) PNAS USA 71: 2.663.

[14] Charm & Wong (1975) Biotechnol. Bioeng. 16: 593.

[15] Patente U.S. 4.857.317.

[16] Patente U.S. 4.683.294.

[17] Houwen e cols. (1975) J. Iwmunol. Methods 8: 185.

[18] Sitrin e cols. (1993) páginas 83-101 de "Hepatitis Bvaccines in clinicai practice" ISBN 0-8247-8780-3.

[19] Wampler e cols. (1985) PNAS USA 82: 6.830-4.

[20] Chi e cols. (1994) Ann. N.Y. Acad. Sei. 721: 365-73.

[21] Agraz e cols. (1994) J. Chromatogr. A 672: 25-33.

[22] Mason e cols. (1992) PNAS USA 89: 11.745-9.

[23] Deml e cols. (1999) J. Virol. Methods 79: 205-17.

[24] Ibarra e cols. (1999) J. Chromatogr. B Biomed. Sei.Appl. 735: 271-7.

[25] WO 90/10058.

[26] Pedido de Patente Japonesa JP 63239234.

[27] Patente U.S. 4.694.074.

[28] EP-0341733.

[29] Patente U.S. 5.242.812.

[30] WO 02/12287.

[31] Pedido de Patente Russa RU-2128707.

[32] Hardy e cols. (2000) J. Biotechnol. 77: 157-67.

[33] Dogan e cols. (2000) Biotechnol. Frog. 16: 435-41.

[34] WO 03/066094.

[35] Rappuoli e cols. (1991) TIBTECH 9: 232-238.

[36] Ramsay e cols. (2001) Lancet 357(9251): 195-196.

[37] Lindberg (1999) Vaccine 17 Supl. 2: S28-36.

[38] Buttery & Moxon (2000) J. R. Coll. Physicians Lond.34: 163-168.

[39] Ahmad & Chapnick (1999) Infect. Dis. Clin. North Am.13: 113-133, vii.

[40] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47: 563-567.

[41] Patente européia 0477508.

[42] Patente U.S. 5.306.492.

[43] WO 98/42721.

[44] "Conjugate Vaccines" (eds. Cruse e cols.) ISBN3805549326, particularmente vol. 10: 48-114.

[45] Hermanson (1996) "Bioconjute Techniques" ISBN:0123423368 ou 012342335X.

[46] WO 96/40242.

[47] WHO Tech. Rep. Ser. 594: 51, 1976.

[48] Zielén e cols. (2000) Infect. Immun. 68: 1.435-1.440.

[49] Darkes & Plosker (2002), Paediatr. Drugs 4: 609-630.[50] Watson (2000) Pediatr. Infect. Dis. 19: 331-332.

[51] Rubin (2000) Pediatr. Clin. North Am. 47: 269 285.

[52] Jedrzejas (2001) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65: 187-207.

[53] Tettelin e cols. (2001) Science 293: 498-506.

[54] Hoskms e cols. (2001) J. Bacteriol. 183: 5.709-5.717.

[55] Rappuoli (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3: 445-450.

[56] Rappuoli (2001) Vaccine 19: 2.688-2691.

[57] Masignani e cols. (2002) Expert. Opin. Biol. Ther. 2:895 905.

[58] Mora e cols. (2003) Drug. Discov. Today. 8: 459-464.

[59] Wizemann e cols. (2001) Infect. Immun. 69: 1.593-1.598.

[60] Rigden e cols. (2003) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol.38: 143-168.

[61] WO 02/22167.

[62] Mc Miehael & Green (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs4: 953-8.

[63] Módulo 6 de "WHO's The immunological basis forimmunization series" (Robertson).

[64] WO 97/00697.

[65] WO 02/00249.

[66] Patente U.S. 6.013.264.

[67] Patente U.S. 4.624.918.

[68] "Vaccine Design: The Subunity and Adjuvant Approach"(eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X).

[69] WO 90/14837.

[70] Patente U.S. 6.146.632.

[71] WO 99/11241.<table>table see original document page 65</column></row><table>immunization series" (Galazka)

[101] Código NIBSC: 69/017. [102] Código NIBSC: DIFT. [103] Sesardice cols. (2002) Biologi cais: 30 49-68.[104] Código NIBSC: 98/552. [105] Código NIBSC: TEFT. [106] Código NIBSC: 66/303. [107] Diminsky e cols. (1997) Vaccine 15: 637-47.[108] Heijtink e cols. (2002) Vaccine 20: 2.191-6.[109] Stargess e cols. (1999) Vaccine 17: 1.169-1.178[110] WO 93/24148.

Claims

1. Processo para a preparação de uma vacina combinadaem que a vacina compreende: (i) um tensoativo não-iônico;(ii) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B(HBV), e (iii) um antígeno de pelo menos um patógeno não-HBV, e o processo caracterizado pelo fato de compreender:(i) a purificação do antígeno de superfície do HBV podecélulas de levedura recombinantes, em que a purificaçãoinclui uma etapa na qual as células de levedura sãorompidas na presença do tensoativo não-iônico, para gerarum componente de HBsAg purificado; e (ii) a combinação docomponente de HBsAg purificado com pelo menos um antígenoadicional de um patógeno não-HBV, para gerar a vacinacombinada.

2. Processo para a preparação de uma vacina combinada,em que a vacina compreende: (i) um tensoativo não-iônico,(ii) um antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBV)(HBsAg), e (iii) um antígeno de pelo menos um patógeno não-HBV, e o processo caracterizado pelo fato de compreender aetapa de combinação de um HBsAg purificado com pelo menosum antígeno adicional de um patógeno não-HBV, para gerar avacina combinada, em que o HBsAg foi preparado por umprocesso no qual células de levedura recombinantes queexpressam HBsAg foram rompidas na presença do tensoativonão-iônico.

3. Composição imunogênica caracterizada pelo fato decompreender (i) um tensoativo não-iônico, (ii) um antígenode superfície do vírus da hepatite B (HBV) , e (iii) umantígeno de pelo menos um patógeno não-HBV, em que oantígeno de superfície do HBV foi preparado por um processoem que células de levedura recombinantes que expressamHBsAg foram rompidas na presença do tensoativo não-iônico.

4. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2 e 3, caracterizada pelo fato de queo tensoativo não-iônico inclui resíduos de poli(oxieteno).

5. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 4, caracterizada pelo fato de que otensoativo não-iônico é um éster de polioxietilenosorbitano.

6. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 5, caracterizada pelo fato de que otensoativo não-iônico é polissorbato 20.

7. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizada pelofato de que o tensoativo não-iônico está presente noproduto final a < 30 μ9/ιη1.

8. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizadapelo fato de que o tensoativo não-iônico está presente noproduto final a < 50 μ9 para cada 100 pg de HBsAg.

9. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelofato de que: (i) pelo menos um patógeno não-HBV inclui C.diphteriae e C. tetani-, (ii) os antígenos desses doispatógenos são um toxóide diftérico e um toxóide tetânico; e(iii) os toxóides diftéricos e tetânicos estão inicialmentepresentes na forma misturada que é substancialmente livrede polissorbato 20.

10. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9,caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície doHBV é não glicosilado.

11. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10,caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície doHBV está na forma de partículas que incluem uma matrizlipídica que compreende fosfolipídeos.

12. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11,caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície doHBV é de HBV do subtipo adw2.

13. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ou 12,caracterizada pelo fato de que o antígeno de superfície doHBV está presente na composição final a cerca de 10 μg pordose.

14. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou-13, caracterizada pelo fato de que a vacina inclui umconjugado de Hib, um conjugado meningocócico e/ou umconjugado pneumocócico.

15. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a composição finalé selecionada de: uma composição trivalente HBsAg, D, T;uma composição tetravalente HBsAg, D, T, Pw; uma composiçãopentavalente HBsAg, D, T, Pw, Hib; uma composiçãoheptavalente HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC; umacomposição octavalente HBsAg, D, T, Pw, Hib, MenA, MenC,MenW135; uma composição octavalente HBsAg, D, T, Pw, Hib,MenA, MenC, MenY; uma composição nonavalente HBsAg, D, T,Pw, Hib, MenA, MenC, MenW135, MenY; uma composiçãotetravalente HBsAg, D, T, Pa; uma composição pentavalenteHBsAg, D, T, Pa, Hib; uma composição pentavalente HBsAg, D, T, Pa, poliovírus; uma composição hexavalente HBsAg, D, T,Pa, poliovírus, Hib; uma composição heptavalente HBsAg, D,T, Pa, poliovírus, Hib, MenC; uma composição octavalenteHBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenCi MenA; umacomposição octavalente HBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib,MenC, MenY; uma composição octavalente HBsAg, D, T, Pa,poliovírus, Hib, MenC, MenW135; uma composição decavalenteHBsAg, D, T, Pa, poliovírus, Hib, MenC, MenA, MenW135,MenY; uma composição bivalente HBsAg, Hib; e uma composiçãobivalente HBsAg, vírus da hepatite A.

16. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14 ou 15, caracterizada pelo fato de que a composiçãofinal inclui um adjuvante de fosfato de alumínio e/ou umadjuvante de hidróxido de alumínio.

17. Processo ou composição, de acordo com qualquer umadas reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,-13, 14, 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que acomposição final inclui adjuvantes tanto de fosfato dealumínio quanto de hidróxido de alumínio.

18. Processo ou composição, de acordo com areivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que aconcentração de Al3+ na composição final é < 5 mg/ml.

19. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que oprocesso compreende a adição de um componente pré-misturadode D-T.

20. Processo, de acordo com qualquer uma dasreivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,-14, 15, 16, 17, 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que oprocesso compreende a adição de um componente pré-misturadode D-T-Pw.

21. Processo, de acordo com a reivindicação 20,caracterizado pelo fato de que o componente pré-misturadode D-T-Pw inclui adjuvantes tanto de fosfato de alumínioquanto de hidróxido de alumínio.

22. Uso de (i) HBsAg purificado por células delevedura recombinantes, em que o processo de purificaçãoenvolve a ruptura das células de levedura na presença detensoativo não-iônico, e (ii) um ou mais antígenos não-HBVcaracterizado pelo fato de ser na fabricação de ummedicamento para administração a um paciente

23. Kit para a preparação de uma composiçãopentavalente caracterizado pelo fato de que: a composiçãopentavalente compreende antígenos HBsAg, D, T, Pw e umconjugado de Hib-T; os antígenos DeT são adsorvidos ao umadjuvante de hidróxido de alumínio; o HBsAg e Hib-T sãoadsorvidos a um adjuvante de fosfato de alumínio; oscomponentes de HBsAg, D, T e Pw estão em forma aquosa em umprimeiro recipiente; o Hib-T está em forma liofilizada emcombinação com lactose em um segundo recipiente, e o HBsAgfoi preparado por um processo em que células de levedurarecombinantes que expressam HBsAg foram rompidas napresença do tensoativo não-iônico.

24. Kit para a preparação de uma composiçãoheptavalente caracterizado pelo fato de que: a composiçãoheptavalente compreende HBsAg, D, T, Pw, um conjugado deHib-T, um conjugado de MenA e um conjugado de MenC; oscomponentes de HBsAg, D, T e Pw estão em forma aquosa em umprimeiro recipiente; os três conjugados estão na formaliofilizada em um segundo recipiente; o primeiro recipientetambém inclui adjuvantes tanto de hidróxido de alumínioquanto de fosfato de alumínio, em que os antígenos DeTsão adsorvidos ao hidróxido de alumínio e o HBsAg éadsorvido ao fosfato de alumínio; e o HBsAg foi preparadopor um processo em que células de levedura recombinantesque expressam HBsAg foram rompidas na presença dotensoativo não-iônico.

25. Kit, de acordo com a reivindicação 24,caracterizado pelo fato de que o primeiro recipienteadicionalmente inclui timerosal.