BRPI0618486B1

BRPI0618486B1 - Uso de células progenitoras multipotentes em adultos

Info

Publication number: BRPI0618486B1
Application number: BRPI0618486-3A
Authority: BR
Inventors: Robert Deans; Wouter Van't Hof; Richard Maziarz; Magdalena Kovacsovics; Philip Streeter
Original assignee: Abt Holding Company; Oregon Health And Science University
Priority date: 2005-11-09
Filing date: 2006-11-09
Publication date: 2021-11-30
Also published as: CN104873540B; RU2497530C2; US20060263337A1; CA3028315C; IL191317A0; KR20080092336A; IL249572B; CA2628254A1; EP1951294A1; CN104095878B; EP2684571B1; HUE055956T2; PH12015502169B1; HK1203058A1; US20210346429A1; IL249572A0; WO2007056578A1; PT2684571T; NZ596022A; HK1214166A1

Abstract

USO DE CÉLULAS NA MANUFATURA DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAMENTO ADJUNTIVO DE UM INDIVÍDUO EM RISCO PARA OU QUE SOFRE DE UMA DISFUNÇÃO IMUNE. Células isoladas são descritas que são células tronco não embrionárias, células germinativas não embrionárias, e células não germinativas. As células podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada um de pelo menos duas das linhagens endodérmica, ectodérmica, e mesodérmica. As células não provocam uma resposta imune prejudicial. As células podem modular respostas imunes. Como um exemplo, as células podem suprimir uma resposta imune em um hospedeiro gerado por células, tecidos, e órgãos alogênicos. Métodos são descritos para usar as células, por si só ou de maneira adjuntiva, para tratar indivíduos. Por exemplo, as células podem ser usadas de maneira adjuntiva à imunossupressão em terapia de transplante. Métodos para obter as células e composições para usá-las também são descritos.

Description

Referência aos Pedidos Relacionados

[001] Este pedido é uma continuação em parte do Pedido U. S. Serial No 11/269.736 depositado em 9 de Novembro de 2005, que é uma continuação em parte do Pedido U. S. Serial No 11/151.689 depositado em 13 de Junho de 2005, que é uma continuação em parte do Pedido U. S. Serial No 10/963.444 depositado em 11 de Outubro de 2004 (abandonado), que é uma continuação em parte do Pedido U. S. Serial No 10/048.757 depositado em 1 de Fevereiro de 2002, que é um pedido de estágio nacional U. S. de PCT/US00/21387 depositado em 4 de Agosto de 2000 e publicado em Inglês como WO 01/11011 em 15 de Fevereiro de 2001, que reivindica prioridade sob 35 U. S. C. § 119 (e) do Pedido Provisório U. S. Serial No 60/147.324 depositado em 5 de Agosto de 1999 e 60/164.650 depositado em 10 de Novembro de 1999, e uma continuação em parte do Pedido U. S. Serial No 10/467.963 depositado em 11 de Agosto de 2003, que é um pedido de estágio nacional U. S. de PCT/US02/04652 depositado em 14 de Fevereiro de 2002 e publicado em Inglês como WO 02/064748 em 22 de Agosto de 2002, que reivindica prioridade sob 35 U. S. C. § 119 (e) do Pedido Provisório U. S. Serial No 60/268.786 depositado em 14 de Fevereiro de 2001, 60/269.062 depositado em 15 de Fevereiro de 2001, 60/310.625 depositado em 7 de Agosto de 2001, e 60/343.836 depositado em 25 de Outubro de 2001, todos os quais, pedidos e publicações são incorporados aqui por referência em sua totalidade e dos quais o benefício total de prioridade é reivindicado para o presente pedido.

Campo da Invenção

[002] O campo da invenção é a imunomodulação por células progenitoras multipotentes em adultos (“MAPCs”) e seu uso para modular respostas imunes em terapias primárias e adjuntivas.

Fundamentos da Invenção

[003] O uso terapêutico de transplantes de órgãos, incluindo transplantes de medula óssea, tem aumentado constantemente desde seus primórdios. Ele tornou-se uma opção terapêutica importante para várias doenças, incluindo, mas não limitadas a, distúrbios hematológicos, imunológicos, e malignos.

[004] Infelizmente, os usos terapêuticos da transplantação freqüentemente são complicados, tornados ineficazes, ou impedidos por respostas imunes adversas geradas pelo transplante. Entre as reações adversas mais proeminentes encontradas como um resultado de terapias de transplante estão (i) a resposta do hospedeiro versus enxerto (“HVG”) (rejeição do transplante por um hospedeiro imune competente), e (ii) doença do enxerto versus hospedeiro (“GVHD”) (processos que ocorrem primariamente em um hospedeiro imunocomprometido quando ele é reconhecido como não próprio por células imunocompetentes de um enxerto).

[005] A rejeição ao enxerto em um hospedeiro pode ser evitada, naturalmente, por combinação perfeitamente do doador e do hospedeiro. Exceto para o tecido autólogo, entretanto, apenas gêmeos idênticos podem ser esperados serem verdadeiramente singênicos. As combinações perfeitas entre um doador individual e um outro hospedeiro/receptor individual são virtualmente inexistentes. Assim, o uso de tecido autólogo é o único modo diferente para fazer uma combinação perfeita. Infelizmente, o tecido hospedeiro não é tipicamente adequado ou não foi isolado diante da necessidade. Freqüentemente a necessidade para a terapia de transplante é, de fato, substituir o tecido danificado no hospedeiro. O uso de tecido singênico, portanto, embora uma solução eficaz para os problemas de resposta adversa do hospedeiro ao tecido enxertado, não seja no geral útil em aplicações práticas.

[006] Se a combinação singênica não é possível, os efeitos imunes adversos que surgem em terapias de transplante podem ser aliviados por combinação de um doador e hospedeiro alogênicos tão intimamente quanto possível. A classificação sangüínea e/ou tecidual é usada para combinar doadores e hospedeiros para fornecer a probabilidade mais elevada de sucesso terapêutico. Mesmo a combinação mais estrita de tecido alogênico, entretanto, não impede HVG sério, e, conseqüentemente, as terapias de transplante envolvem o uso de medicamentos de imunossupressão e imunossupressores, como debatido abaixo.

[007] Um outro método para evitar as complicações de HVG em terapias de transplante foi desativar o sistema imune do hospedeiro receptor. Isto foi realizado pelo uso da terapia de radiação, e/ou da quimioterapia imunossupressora, e/ou da terapia de anticorpo. A supressão resultante de respostas imunes do hospedeiro freqüentemente ajuda muito efetivamente o estabelecimento do enxerto (tal como medula óssea) no hospedeiro. Entretanto, a imunoablação ou supressão compromete as defesas imunes do hospedeiro. Isto resulta no hospedeiro que torna-se todo muito facilmente suscetível a infecções depois da exposição ainda menor a agentes infecciosos. As infecções resultantes são uma causa principal de morbidez e mortalidade entre indivíduos transplantados.

[008] O comprometimento do sistema imune do hospedeiro também causa ou exacerba um outro problema sério encontrado em terapias de transplante - doença do enxerto versus hospedeiro (“GVHD”). A GVHD ocorre quando o tecido doador contém células imunocompetentes que reconhecem as proteínas MHC do receptor como não próprias. Isto ativa as células T, e elas secretam citocinas, tais como IL-2 (interleucina 2), IFN Y (interferon gama), e TNF α (fator alfa de necrose tumoral). Estes sinais provocam um ataque imune em alvos receptores incluindo a pele, o trato GI, o fígado, e os órgãos linfóides (Ferrara e Deeg, 1991). A GVHD é particularmente um problema em transplantes de medula óssea, onde ela foi mostrada ser mediada primariamente por linfócitos T (Grebe e Streilein, 1976). De fato, aproximadamente 50 % de indivíduos com transplante de medula óssea desenvolvem GVHD aguda. Muitos destes indivíduos morrem (de 15 % a 45 %).

[009] Existem também outras disfunções, distúrbios, e doenças do sistema imune que surgem como patologias primárias e como efeitos secundários de outras patologias e/ou tratamentos destes. Estes incluem neoplasmas, patologias da medula óssea, patologias do sangue, distúrbios autoimunes, e alguns distúrbios inflamatórios, como debatido mais abaixo. A terapia primária e adjuntiva para estes distúrbios e doenças, como terapias primárias e adjuntivas para HVG e GVHD, freqüentemente envolvem o uso de medicamentos imunossupressores. Todas as terapias correntes têm desvantagens e efeitos colaterais. Medicamentos imunossupressores

[010] Muito esforço foi dirigido ao desenvolvimento de medicamentos para tratar estas disfunções do sistema imune para melhorar ou eliminar seus efeitos deletérios, sem causar efeitos colaterais prejudiciais adicionais. Houve algum progresso para este objetivo, e vários medicamentos foram desenvolvidos e estão em uso para prevenir e/ou tratar estas disfunções. A introdução do mais eficaz destes medicamentos marcou um grande avanço na prática médica de terapias de transplante; mas, nenhuma é ideal. De fato, nenhum dos medicamentos imunossupressores correntemente disponíveis para o uso clínico em terapias de transplante são inteiramente eficazes. Todos os medicamentos têm sérias desvantagens e efeitos colaterais deletérios, como resumido brevemente abaixo. Para revisão ver Farag (2004), “Chronic graft-versus-host disease: where do we go from here?,” Bone Marrow Transplantation 33: 569 a 577.

[011] Os corticosteróides, que são usados primariamente para tratar inflamação e doenças inflamatórias, são conhecidos serem imunossupressores e são considerados por muitos serem o melhor tratamento primário para HVG e GVHD. Eles inibem a proliferação de célula T e respostas imunes dependentes de célula T, pelo menos em parte, inibindo-se a expressão de certos genes de citocina envolvidos na ativação de célula T e resposta imune dependente de célula T.

[012] A ciclosporina está entre os medicamentos o mais freqüentemente usados para a imunossupressão e a prevenção de HVG e GVHD. Ela é fortemente imunossupressora em geral. Embora ela possa ser eficaz em reduzir reações imunes adversas em indivíduos transplantados, ela também enfraquece o sistema imune tanto que os indivíduos são deixados altamente vulneráveis a infecções. Conseqüentemente, os indivíduos são muito mais facilmente infectados por exposição a patógenos, e têm pouca capacidade para elevar uma resposta imune eficaz a infecções. Mesmo patógenos suaves depois podem ser potencialmente fatais. A ciclosporina também causa uma variedade de outros efeitos colaterais indesejáveis.

[013] O metotrexato também é amplamente usado na profilaxia e tratamento de HVG e GVHD, por si só ou em combinação com outros medicamentos. Estudos têm mostrado que, se ele for eficaz de qualquer modo, ele é aparentemente menos eficaz do que a ciclosporina. Como com a ciclosporina, o metotrexato causa uma variedade de efeitos colaterais, alguns dos quais podem ser deletérios à saúde do indivíduo.

[014] O FK-506 é um composto semelhante a macrolídeo. Similar à ciclosporina, ele é derivado de fontes fúngicas. Os efeitos imunossupressores de ciclosporina e FK-506 são similares. Eles bloqueiam eventos precoces da ativação de célula T por formação de um complexo heterodimérico com suas proteínas receptoras citoplasmáticas respectivas (isto é, ciclofilina e proteína de ligação de FK). Este depois inibe a atividade de fosfatase de calcineurina, deste modo inibindo enfim a expressão de proteínas reguladoras nucleares e genes de ativação de célula T.

[015] Outros medicamentos que foram usados para a imunossupressão incluem globulina antitimócito, azatioprina, e ciclofosfamida. Eles não provaram ser vantajosos. A rapamicina, um outro composto semelhante a macrolídeo que interfere com a resposta de células T a IL-2, também foi usada para bloquear a resposta imune ativada por célula T. O RS-61443, um derivado de ácido micofenólico, foi verificado inibir a rejeição ao aloenxerto em animais experimentais. A mizoribina, um nucleosídeo de imidazol, bloqueia a via biossintética de purina e inibe a proliferação de célula T e B estimulada por mitógeno em uma maneira similar à azatioprina e RS-61443. A desoxiespergualina, um análogo sintético de espergualina, foi verificado exercer propriedades imunossupressoras em modelos de transplantação pré clínicos. O anti-metabólito brequinar sódio é um inibidor de diidro-orotato desidrogenase e bloqueia a formação dos nucleotídeos uridina e citidina por intermédio de inibição da síntese de pirimidina. A berberina e seus sais farmacologicamente toleráveis foram usados como um imunossupressor para tratar a doenças autoimunes tais como reumatismo, para tratar alergias, e para prevenir a rejeição ao enxerto. Foi relatado que a berberina inibe a produção de anticorpo de célula B e no geral suprime respostas imunes humorais, mas não afeta a propagação de célula T. Ver a Patente Japonesa 07-316051 e a Patente U S No 6.245.781.

[016] Nenhum destes medicamentos imunossupressores, se usados sozinhos ou em combinação com outros agentes, são completamente eficazes. Todos eles no geral deixam os indivíduos ainda suscetíveis a HVG e GVHD e enfraquecem sua capacidade para defender contra a infecção. Isto os torna muito mais suscetíveis à infecção e muito menos capazes para combater infecções quando elas ocorrem. Além disso, todos estes medicamentos causam sérios efeitos colaterais, incluindo, por exemplo, toxicidade gastrointestinal, nefrotoxicidade, hipertensão, mielossupressão, hepatotoxicidade, hipertensão, e hipertrofia gengival, entre outros. Nenhum deles provou ser um tratamento completamente aceitável ou eficaz. Em resumo, dadas estas desvantagens, não existe no momento nenhum tratamento de base farmacêutica inteiramente satisfatório para a disfunção do sistema imune adversa e/ou respostas tais como HVG e GVHD.

[017] Já foi considerado que um tipo mais específico de imunossupressão pode ser desenvolvido sem estas desvantagens. Por exemplo, um agente que suprimiu ou eliminou as células T alorreativas, especificamente, seria eficaz contra a HVG e a GVHD (pelo menos para enxertos alogênicos) sem os efeitos colaterais deletérios que ocorrem com agentes que globalmente atacam e comprometem o sistema imune. Entretanto, até agora, nenhum de tal(is) agente(s) foi desenvolvido. Uso de Células Tronco Restritas na Transplantação

[018] O uso de células tronco em vez de ou juntamente com agentes imunossupressores recentemente atraiu interesse. Houve algumas observações encorajadoras nesta área. Uma variedade de células tronco foram isoladas e caracterizadas nos anos recentes. Elas variam daquelas de potencial de diferenciação altamente restrito e capacidade limitada para crescer em cultura àquelas com potencial de diferenciação aparentemente irrestrito e capacidade não limitada para crescer em cultura. O primeiro no geral foi o mais fácil para derivar e pode ser obtido de uma variedade de tecidos adultos. O último teve que ser derivado de células germinativas e embriões, e são chamados células tronco embrionárias (“ES”), células germinativas embrionárias (“EG”), e células germinativas. A célula tronco embrionária (“ES”) tem auto-renovação ilimitada e pode diferenciar em todos os tipos de tecido. As células ES são derivadas da massa celular interna do blastócito. As células germinativas embrionárias (“EG”) são derivadas de células germinativas primitivas de um embrião pós implantação. As células tronco derivadas de tecido adulto foram de valor limitado porque elas são imunogênicas, têm potencial de diferenciação limitado, e têm capacidade limitada para propagar em cultura. As células ES, EG, e germinativas não sofrem destas desvantagens, mas elas têm uma propensão marcante para formar teratomas em hospedeiros alogênicos, que surgem devido ao interesse por seu uso em tratamentos médicos. Por esta razão, existe pessimismo sobre sua utilidade em aplicações clínicas, apesar de seu potencial de diferenciação vantajosamente amplo. As células tronco derivadas de embriões também estão sujeitas a controvérsias éticas que podem impedir seu uso no tratamento de doença.

[019] Alguns esforços para encontrar uma alternativa para as células ES, EG, e germinativas têm focado em células derivadas de tecido adulto. Embora as células tronco adultas fossem identificadas na maioria dos tecidos de mamíferos, seu potencial de diferenciação é restrito e consideravelmente mais limitado do que aquele de células ES, EG, e germinativas. De fato muitas de tais células podem dar origem apenas a um ou alguns tipos de célula diferenciados, e muitas outras são restritas a uma única linhagem embrionária.

[020] Por exemplo, as células tronco hematopoiéticas podem diferenciar apenas para formar as células da linhagem hematopoiética, as células tronco neurais diferenciam em células apenas de origem neuroectodérmica, e as células tronco mesenquimais (“MSCs”) são limitadas a células de origem mesenquimal. Para as razões observadas acima com respeito a limitações, riscos, e controvérsias de e relativas a células ES, EG, e germinativas, uma porção substancial de trabalho no uso de células tronco em terapias de transplantação tem utilizado as MSCs. Os resultados dos últimos poucos anos aparecem para mostrar que os aloenxertos de MSCs não causam uma reação imune contra HVG, que é uma resposta invariavelmente observada quando outro tecido é transplantado entre indivíduos alogênicos. Além disso, os resultados sugerem que as MSCs enfraquecem a resposta imune de linfócito, pelo menos em algumas circunstâncias.

[021] Embora estes resultados imediatamente sugiram que as MSCs podem ser úteis para diminuir a HVG e/ou a GVHD que comumente acompanhariam a transplantação alogênica, os efeitos imunossupressores observados de MSCs foram altamente dependentes de dose, e doses relativamente altas foram necessárias para observar um efeito imunossupressor. De fato, a proliferação diminuída de linfócitos em ensaios de linfócito mistos in vitro foi “marcante” apenas em ou acima de uma razão de 1:10 de MSCs para linfócitos. Além disso, o efeito inibitório observado diminuiu e tornou-se inobservável conforme a dose de MSCs diminuiu, e em razões abaixo de 1:100 a presença de MSCs pareceu verdadeiramente estimular a proliferação das células T. Os mesmos efeitos de dose também foram observados em ensaios de proliferação de linfócito estimulado por mitógeno. Ver, para revisão, Ryan et al. (2005) “Mesenchymal stem cells avoid alogeneic rejection,” J. Inflammation 2: 8; Le Blanc (2003) “Immunomodulatory effects of fetal and adult mesenchymal stem cells,” Cytotherapy 5 (6): 485 a 489, e Jorgensen et al. (2003) “Engineering mesenchymal stem cells for immunotherapy,” Gene Therapy 10: 928 a 931. Os resultados adicionais são resumidos abaixo.

[022] Por exemplo, Bartholomew e colaboradores descobriram que as MSCs de babuíno não estimularam linfócitos alogênicos para proliferar in vitro e que as MSCs reduziram a proliferação de linfócitos estimulados por mitógeno em mais do que 50 % em ensaios de linfócito mistos in vitro. Eles mostraram ainda que a administração de MSCs in vivo prolongou a sobrevivência do enxerto cutâneo (em relação aos controles). Tanto os resultados in vitro quanto os resultados in vivo requereram uma dose alta de MSCs: razão de 1:1 com os linfócitos para os resultados in vitro. A quantidade de MSCs que seria necessária para aproximar-se a uma tal razão in vivo em seres humanos pode ser muito alta para obter, como uma matéria prática. Isto pode limitar a utilidade de MSCs. Ver Bartholomew et al. (2002): “Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo,” Experimental Hematology 30: 42 a 48.

[023] Maitra e colaboradores examinaram os efeitos de MSCs humanas no enxerto de células do sangue do cordão umbilical humanas alogênicas depois da co-infusão em camundongos NOD-SCID sub-letalmente irradiados. Eles descobriram que as MSCs humanas promoveram o enxerto e não ativaram as células T alogênicas em ensaios de proliferação in vitro. Eles também descobriram que as MSCs humanas suprimiram a ativação in vitro de células T humanas alogênicas por mitógenos. Os efeitos foram dependentes de dose e as razões relativamente altas foram necessárias para a supressão. (Maitra et al. (2004) Bone Marrow Transplantation 33: 597 a 604.)

[024] Recentemente, Le Blanc e colaboradores relataram tratar com êxito um indivíduo com GVHD aguda de Grau IV, que usualmente é fatal, por administração de MSCs “haploidênticas de terceira parte”. O indivíduo foi um menino de 9 anos de idade com leucemia linfoblástica aguda, que estava em sua terceira remissão. Inicialmente, o indivíduo foi tratado com radiação e ciclofosfamida e depois fornecido com células do sangue que foram idênticas a suas próprias células nos locos HLA-A, HLA-B, e HLA-Drbeta1. Estas foram obtidas de um doador feminino não relacionado. Apesar do tratamento agressivo, incluindo dosagem com uma variedade de imunossupressores, em 70 dias depois do transplante o indivíduo desenvolveu GVHD aguda de Grau IV. Ele foi freqüentemente afligido por infecções bacterianas, virais, e fúngicas invasivas.

[025] Sob estas circunstâncias claramente terríveis, um transplante de célula tronco sangüínea alternativo foi experimentado. As MSCs haploidênticas foram isoladas da mãe do indivíduo e expandidas in vitro durante três semanas. As células foram colhidas e 2 x 106 células por quilograma foram administradas ao indivíduo intravenosamente. Não houve nenhum sinal de toxicidade associada com as MSCs, nem houve nenhum efeito colateral substancial. Muitos sintomas resolveram dentro de alguns dias depois do transplante; mas, a doença residual foi evidente. Depois de várias injeções intravenosas adicionais de MSCs pelo uso dos mesmos métodos, os sintomas do indivíduo e GVHD foram completamente resolvidos. O indivíduo foi ainda livre de doença um ano depois da descarga. De acordo com os autores, em sua experiência, este indivíduo é único em sobrevivência à GVHD desta severidade. Os resultados relatados por Le Blanc et al. são tanto promissores quanto animadores, e devem ser um impulso para o desenvolvimento de terapias eficazes que utilizam as células tronco. Le Blanc et al. (2004) “Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells,” Lancet 363: 1439 a 1441.

[026] Não obstante, estes resultados, incluindo aqueles de Le Blanc e colaboradores, revelam falhas potenciais de MSCs. As células precisam ser administradas com modalidades imunossupressoras tradicionais que depois continuarão a causar respostas imunes deletérias. As necessidades de dosagem para as MSCs aparentemente precisarão ser muito altas para serem eficazes, que incorrerão maior custo, mais dificuldade em administração, maior risco de toxicidade e outros efeitos colaterais prejudiciais, e outras desvantagens.

[027] Devido a estas limitações de terapias relacionadas à transplantação com base em célula tronco corrente, existe claramente uma necessidade forte por células progenitoras que podem ser usadas para todos - ou pelo menos a maioria - os hospedeiros receptores sem requerer uma combinação halotípica hospedeiro-receptor. Além disso, existe uma necessidade para células de “atividade específica” maior de modo que elas sejam terapeuticamente eficazes em doses mais baixas e sua administração não apresenta os problemas associados com os regimes de dosagem alta necessários para resultados benéficos pelo uso das MSCs. E, existe uma necessidade para células que têm potencial de diferenciação essencialmente ilimitado para formar células que ocorrem no organismo de interesse.

[028] Conseqüentemente, houve uma necessidade para células que têm a capacidade de auto-renovação e diferenciação de células ES, EG, e germinativas mas não são imunogênicas; não formam teratomas quando aloenxertadas ou xenoenxertadas a um hospedeiro; não apresentam outros problemas de segurança associados com células ES, EG, e germinativas; retêm as outras vantagens de células ES, EG, e germinativas; são fáceis para isolar a partir de fontes prontamente disponíveis, tais como placenta, cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, sangue, e medula óssea; podem ser armazenadas seguramente durante períodos prolongados; podem ser obtidas facilmente e sem risco aos voluntários, doadores ou indivíduos, e outros que fornecem consentimento; e não acarretam as dificuldades técnicas e logísticas envolvidas na obtenção e operação com as células ES, EG, e germinativas.

[029] Recentemente, um tipo de célula, chamado aqui células progenitoras multipotentes em adultos (“MAPCs”), foi isolado e caracterizado (ver, por exemplo, a Patente U S No 7.015.037, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade). (“MAPCs” também podem ser referidas como “MASCs.”) Estas células fornecem muitas das vantagens de células ES, EG, e germinativas sem muitas de suas desvantagens. Por exemplo, MAPCs são capazes de cultura indefinida sem perda de seu potencial de diferenciação. Elas mostram enxerto e diferenciação eficientes, a longo prazo ao longo de linhagens desenvolventes múltiplas em camundongos NOD-SCID e deste modo sem evidência de formação de teratoma (freqüentemente observada com as células ES, EG, e germinativas) (Reyes, M. e C. M. Verfaillie (2001) Ann N Y Acad Sci. 938: 231 a 235).

Sumário da Invenção

[030] Em algumas de suas formas de realização, portanto, a invenção fornece células que: (i) são células tronco não embrionárias, células germinativas não embrionárias, e células não germinativas; (ii) podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; (iii) não provocam uma resposta imune deletéria na introdução a um indivíduo não singênico; e (iv) podem modular uma resposta imune na introdução em um indivíduo. Em certas formas de realização sob este aspecto, a invenção fornece células que, além do precedente, são imunossupressoras. Além disso, várias formas de realização da invenção fornecem células de acordo com o precedente que têm propriedades imunomoduladoras que são úteis para tratar, tal como para impedir, prevenir, melhorar, reduzir, diminuir, minimizar, eliminar, e/ou curar respostas imunes e/ou processos deletérios em um hospedeiro. Em algumas formas de realização da invenção as células são usadas sob este aspecto sozinhas ou juntamente com outros agentes e modalidades terapêuticos como as modalidades terapêuticas primárias. Em algumas formas de realização da invenção as células são usadas em uma modalidade terapêutica adjuntiva em que elas podem ser usadas como o único agente terapêutico ou juntamente com outros agentes terapêuticos. Em algumas formas de realização da invenção as células são usadas, sozinhas ou com outros agentes ou modalidades terapêuticos, tanto em uma ou mais modalidades terapêuticas primárias quanto em uma ou mais modalidades terapêuticas adjuntivas.

[031] As células de acordo com a invenção são descritas em maior detalhe aqui e no geral são referidas aqui como “células progenitoras multipotentes em adultos” e pelo acrônimos “MAPC” (singular) e “MAPCs” (plural). Deve ser avaliado que estas células são células não ES, não EG, e não germinativas, e que elas têm a capacidade para diferenciar em tipos de célula de pelo menos duas das três linhagens de camada germinativa primitivas (ectoderma, mesoderma, e endoderma), por exemplo, em células de todas as três linhagens primitivas.

[032] Por exemplo, as MAPCs podem formar as células que seguem e outras células das linhagens destas: células mesodérmicas esplâncnicas, células musculares, células ósseas, células de cartilagem, células endócrinas, células exócrinas, células endoteliais, células formadoras de cabelo, células formadoras dos dentes, células mesodérmicas viscerais, células hematopoiéticas, células estromais, células estromais da medula, células neuronais, células neuroectodérmicas, células epiteliais, células oculares, células pancreáticas, e células semelhantes a hepatócito, entre muitas outras. Entre as células formadas por MAPCs estão osteoblastos, condroblastos, adipócitos, células do músculo esquelético, miócitos esqueléticos, células epiteliais biliares, células acinares pancreáticas, células mesangiais, células do músculo liso, células do músculo cardíaco, cardiomiócitos, osteócitos, células formadoras do tubo vascular, oligodendrócitos, neurônios, incluindo neurônios serotonérgicos, GABAérgicos, dopaminérgicos, células gliais, células microgliais, células pancreáticas epiteliais, células epiteliais intestinais, células epiteliais hepáticas, células epiteliais cutâneas, células epiteliais do rim, células epiteliais renais, células da ilhota pancreática, fibroblastos, hepatócitos, e outras células das mesmas linhagens como o precedente, entre muitas outras.

[033] As MAPCs têm atividade de telomerase necessária para a auto-renovação e considerada ser necessária para manter um estado indiferenciado. No geral elas também expressam oct 3/4. O oct 3/4 (oct 3A em seres humanos) é de outro modo específico para as células ES, EG, e germinativas. Ele é considerado ser um marcador de células indiferenciadas que têm amplas capacidades de diferenciação. O oct 3/4 também é no geral considerado ter um papel em manter uma célula em um estado indiferenciado. O oct 4 (oct 3 em seres humanos) é um fator de transcrição expressado no embrião de pré gastrulação, embrião de estágio de clivagem inicial, células da massa celular interna do blastócito, e células de carcinoma embrionário (“EC”) (Nichols, J. et al. (1998) Cell 95: 379 a 391), e é infra-regulado quando células são induzidas a diferenciar. O gene oct 4 (oct 3 em seres humanos) é transcrito em pelo menos duas variantes de união em seres humanos, oct 3A e oct 3B. A variante de união de oct 3B é encontrada em muitas células diferenciadas ao passo que a variante de união de oct 3A (também previamente designada oct 3/4) é relatada ser específica para a célula tronco embrionária indiferenciada. Ver Shimozaki et al. (2003) Development 130: 2505 a 2512. A expressão de oct 3/4 desempenha um papel importante na determinação de etapas precoces em embriogênese e diferenciação. O oct 3/4, em combinação com rox 1, causa a ativação transcricional da proteína ligadora de Zn rex 1, que também é necessária para manter as células ES em um estado indiferenciado (Rosfjord, E. e Rizzino, A. (1997) Biochem Biophys Res Commun 203: 1795 a 1802; Ben-Shushan, E. et al. (1998) Mol Cell Biol 18: 1866 a 1878).

[034] As MAPCs no geral também expressam outros marcadores considerados serem específicos para células tronco primitivas. Entre estes estão rex 1, rox 1, e sox 2. O rex 1 é controlado por oct 3/4, que ativou a expressão a jusante de rex 1. O rox 1 e o sox 2 são expressados em células não ES.

[035] Várias formas de realização da invenção fornecem métodos para usar MAPCs para evitar, impedir, tratar, melhorar, reduzir, diminuir, minimizar, eliminar, e/ou curar uma doença e/ou uma resposta imune adversa e/ou processos em um indivíduo. Certas formas de realização da invenção fornecem métodos para usar as células por si só como uma modalidade terapêutica primária. Em algumas formas de realização da invenção as células são usadas juntamente com um ou mais outros agentes e/ou modalidades terapêuticas como a modalidade terapêutica primária. Em algumas formas de realização da invenção as células são usadas como uma modalidade terapêutica adjuntiva, isto é, como um adjunto para uma outra, modalidade terapêutica primária. Em algumas formas de realização as células são usadas como o único agente ativo de uma modalidade terapêutica adjuntiva. Em outras as células são usadas como uma modalidade terapêutica adjuntiva juntamente com um ou mais outros agentes ou modalidades terapêuticas. Em algumas formas de realização as células são usadas tanto como agentes e/ou modalidades terapêuticos primários quanto como adjuntivos. Em ambos os aspectos, as células podem ser usadas sozinhas na modalidade primária e/ou na adjuntiva. Elas também podem ser usadas juntamente com outros agentes ou modalidades terapêuticos, na modalidade primária ou na adjuntiva ou ambas.

[036] Como debatido acima, um tratamento primário, tal como um agente terapêutico, terapia, e/ou modalidade terapêutica, alveja (isto é, é intencionado a agir em) a disfunção primária, tal como uma doença, que deve ser tratada. Um tratamento adjuntivo, tal como uma terapia e/ou uma modalidade terapêutica, pode ser administrado em combinação com um tratamento primário, tal como um agente terapêutico, terapia, e/ou modalidade terapêutica, para agir na disfunção primária, tal como uma doença, e suplementar o efeito do tratamento primário, aumentando deste modo a eficácia global do regime de tratamento. Um tratamento adjuntivo, tal como um agente, terapia, e/ou modalidade terapêutica, também pode ser administrado para agir em complicações e/ou efeitos colaterais de uma disfunção primária, tal como uma doença, e/ou aqueles causados por um tratamento, tal como um agente terapêutico, terapia, e/ou modalidade terapêutica. Com referência a qualquer um destes usos, um, dois, três, ou mais tratamentos primários podem ser usados juntamente com um, dois, três, ou mais tratamentos adjuntivos.

[037] Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas a um indivíduo antes do início de uma disfunção, tal como uma doença, efeito colateral, e/ou resposta imune deletéria. Em algumas formas de realização as células são administradas enquanto a disfunção está desenvolvendo. Em algumas formas de realização as células são administradas depois que a disfunção foi estabelecida. As células podem ser administradas em qualquer estágio no desenvolvimento, persistência, e/ou propagação da disfunção ou depois que ela regride.

[038] Como debatido acima, as formas de realização da invenção fornecem células e métodos para a terapia primária ou adjuntiva. Em certas formas de realização da invenção, as células são administradas a um indivíduo alogênico. Em algumas formas de realização elas são autólogas para o indivíduo. Em algumas formas de realização elas são singênicas para o indivíduo. Em algumas formas de realização as células são xenogênicas para um indivíduo. Se alogênicas, autólogas, singênicas, ou xenogênicas, em várias formas de realização da invenção as MAPCs são fracamente imunogênicas ou são não imunogênicas no indivíduo. Em algumas formas de realização as MAPCs têm imunogenicidade suficientemente baixa ou são não imunogênicas e são suficientemente livres de respostas imunes deletérias em geral, que quando administradas a indivíduos alogênicos elas podem ser usadas como células doadoras “universais” sem a classificação e a combinação de tecido. De acordo com várias formas de realização da invenção as MAPCs também podem ser armazenadas e mantidas em bancos de célula, e assim podem ser mantidas disponíveis para o uso quando necessário.

[039] Em todos estes aspectos e outros, as formas de realização da invenção fornecem MAPCs de mamíferos, incluindo em uma forma de realização os seres humanos, e em outras formas de realização os primatas não humanos, ratos e camundongos, e cachorros, porcos, cabras, ovelha, cavalos, e vacas. As MAPCs preparadas de mamíferos como descrito acima podem ser usadas em todos os métodos e outros aspectos da invenção descritos aqui.

[040] As MAPCs de acordo com várias formas de realização da invenção podem ser isoladas de uma variedade de compartimentos e tecidos de tais mamíferos, incluindo mas não limitados a, medula óssea, sangue, baço, fígado, músculo, cérebro, e outros debatidos abaixo. As MAPCs em algumas formas de realização são cultivadas antes do uso.

[041] Em algumas formas de realização as MAPCs são geneticamente engendradas, tal como para melhorar suas propriedades imunomoduladoras. Em algumas formas de realização as MAPCs geneticamente engendradas são produzidas por cultura in vitro. Em algumas formas de realização as MAPCs geneticamente engendradas são produzidas de um organismo transgênico.

[042] Em várias formas de realização as MAPCs são administradas a um indivíduo por qualquer via para a liberação eficaz de produtos terapêuticos celulares. Em algumas formas de realização as células são administradas por injeção, incluindo injeção local e/ou sistêmica. Em certas formas de realização as células são administradas dentro de e/ou em proximidade ao sítio da disfunção que elas são intencionadas a tratar. Em algumas formas de realização, as células são administradas por injeção em um local não em proximidade ao sítio da disfunção. Em algumas formas de realização as células são administradas por injeção sistêmica, tal como injeção intravenosa.

[043] Em algumas formas de realização, as MAPCs são administradas uma vez, duas vezes, três vezes, ou mais do que três vezes até que um efeito terapêutico desejado seja obtido ou a administração não pareça mais ser provável a fornecer um benefício ao indivíduo. Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas continuamente durante um período de tempo, tal como por gotejamento intravenoso. A administração de MAPCs pode ser durante um curto período de tempo, durante dias, durante semanas, durante meses, durante anos, ou durante períodos mais longos de tempo.

[044] Os parágrafos numerados que seguem descrevem algumas formas de realização ilustrativas da invenção que exemplificam alguns de seus aspectos e características. Eles não são exaustivos em ilustrar seus muitos aspectos e formas de realização, e assim não são de nenhum modo limitativos da invenção. Muitos outros aspectos, características, e formas de realização da invenção são descritos aqui. Muitos outros aspectos e formas de realização estarão facilmente evidentes àqueles habilitados na técnica na leitura do pedido e fornecem a devida consideração à luz completa da técnica anterior e conhecimento no campo.

[045] Os parágrafos numerados abaixo são auto- referentes. A frase “de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue” refere-se a todos os parágrafos numerados precedentes e todos os que seguem e seus conteúdos. Todas as frases da forma “de acordo com #” são referências diretas àquele parágrafo numerado, por exemplo, “de acordo com 46.” significa de acordo com o parágrafo 46. nesta coleção de parágrafos numerados. Todas as referências cruzadas são combinatórias, exceto para as redundâncias e as inconsistências de escopo. As referências cruzadas são usadas explicitamente para fornecer uma descrição concisa que mostra a inclusão das várias combinações da matéria objeto entre si.

[046] 1. Um método de tratar uma disfunção imune em um indivíduo, que compreende: administrar a um indivíduo provavelmente a sofrer, sofrendo, ou que tem sofrido de uma disfunção imune, por uma via eficaz e em uma quantidade eficaz para tratar a disfunção imune, as células (MAPCs) que: são células tronco não embrionárias, células germinativas embrionárias, ou células germinativas; podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; não provocam uma resposta imune deletéria no indivíduo; e são eficazes para tratar a disfunção imune.

[047] 2. Um método para tratamento adjuntivo de um indivíduo, que compreende: administrar a um indivíduo provavelmente a sofrer, sofrendo, ou que tem sofrido de uma disfunção imune, por uma via eficaz e em uma quantidade eficaz para tratar a disfunção imune, as células (MAPCs) que: não são células tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, ou células germinativas; podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; não provocam uma resposta imune deletéria no indivíduo; e são eficazes para tratar a disfunção imune, em que as células são administradas de maneira adjuntiva a um ou mais outros tratamentos administrados ao indivíduo para tratar a mesma coisa, para tratar algo diferente, ou ambos.

[048] 3. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas.

[049] 4. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células expressam telomerase.

[050] 5. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são positivas para oct 3/4.

[051] 6. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células têm sofrido pelo menos 10 a 40 duplicações celulares em cultura antes de sua administração ao indivíduo.

[052] 7. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são células mamíferas.

[053] 8. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são células humanas, de cavalo, vaca, cabra, ovelha, porco, rato, ou camundongo.

[054] 9. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são células humanas, de rato, ou camundongo.

[055] 10. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são células humanas.

[056] 11. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são derivadas de células isoladas de qualquer um de tecido placentário, tecido do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, medula óssea, sangue, tecido do baço, tecido do timo, tecido do cordão espinhal, tecido adiposo, e tecido do fígado.

[057] 12. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são derivadas de células isoladas de qualquer um de tecido placentário, tecido do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, medula óssea, sangue, e tecido do baço.

[058] 13. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são derivadas de células isoladas de qualquer um de tecido placentário, tecido do cordão umbilical, sangue do cordão umbilical, medula óssea, ou sangue.

[059] 14. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são derivadas de células isoladas de qualquer um ou mais de medula óssea ou sangue.

[060] 15. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são alogênicas ao indivíduo.

[061] 16. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são xenogênicas ao indivíduo.

[062] 17. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são autólogas ao indivíduo.

[063] 18. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue em que o indivíduo é um mamífero.

[064] 19. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue em que o indivíduo é um animal de estimação mamífero, um animal de criação mamífero, um animal de pesquisa mamífero, ou um primata não humano.

[065] 20. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo é um ser humano.

[066] 21. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma ou mais doses que compreendem 104 a 108 das ditas células por quilograma da massa do indivíduo.

[067] 22. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma ou mais doses que compreendem 105 a 107 das ditas células por quilograma da massa do indivíduo.

[068] 23. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma ou mais doses que compreendem 5 x 106 a 5 x 107 das ditas células por quilograma da massa do indivíduo.

[069] 24. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma ou mais doses que compreendem 2 x 107 a 4 x 107 das ditas células por quilograma da massa do indivíduo.

[070] 25. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além das ditas células, um ou mais fatores são administrados ao dito indivíduo.

[071] 26. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além das ditas células, um ou mais fatores de crescimento, fatores de diferenciação, fatores de sinalização, e/ou fatores que aumentam orientação são administrados ao dito indivíduo.

[072] 27. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além das ditas células, uma ou mais citocinas são administradas ao dito indivíduo.

[073] 28. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas a um indivíduo de maneira adjuntiva a um outro tratamento que é administrado antes, ao mesmo tempo como, ou depois que as ditas células são administradas.

[074] 29. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva à administração ao indivíduo de um ou mais agentes imunossupressores.

[075] 30. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[076] 31. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante de um rim, coração, pulmão, fígado, ou outro órgão, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[077] 32. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante de medula óssea, veia, artéria, músculo, ou outro tecido, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[078] 33. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante de células do sangue, células da ilhota, ou outras células de regeneração de tecido ou órgão, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[079] 34. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante de célula do sangue, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[080] 35. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo deve receber ou recebeu um transplante de medula óssea, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[081] 36. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo foi, será, ou está sendo tratado com um ou mais agentes imunossupressores, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[082] 37. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo foi, será, ou está sendo tratado com um ou mais de um corticosteróide, ciclosporina A, um agente imunossupressor semelhante à ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimócito, azatioprina, rapamicina, FK-506, e um agente imunossupressor semelhante a macrolídeo exceto FK- 506, rapamicina, e um agente imunossupressor de anticorpo monoclonal (isto é, um imunossupressor que é um anticorpo monoclonal imunossupressor ou é um agente que compreende um anticorpo monoclonal, inteiro ou em uma ou mais partes, tal como uma proteína quimérica que compreende um Fc ou um sítio de ligação de Ag de um anticorpo monoclonal), em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[083] 38. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que além do tratamento com as ditas células, o indivíduo foi, será, ou está sendo tratado com um ou mais de um corticosteróide, ciclosporina A, azatioprina, rapamicina, ciclofosfamida, FK- 506, ou um agente imunossupressor de anticorpo monoclonal, em que as ditas células são administradas de maneira adjuntiva a este.

[084] 39. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva à administração ao indivíduo de um ou mais agentes antibióticos.

[085] 40. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva à administração ao indivíduo de uma ou mais agentes anti-fúngicos.

[086] 41. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva à administração ao indivíduo de um ou mais agentes anti-virais.

[087] 42. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva à administração ao indivíduo de qualquer combinação de dois ou mais de quaisquer agentes imunossupressores e/ou agentes antibióticos e/ou agentes anti-fúngicos e/ou agentes anti-virais.

[088] 43. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva a uma terapia de transplante para tratar uma resposta do hospedeiro versus enxerto no indivíduo que está enfraquecendo ou pode enfraquecer a eficácia terapêutica do transplante e/ou é ou pode resultar em rejeição ao transplante.

[089] 44. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas a um indivíduo tendo um sistema imune enfraquecido, tal como um ou mais de um sistema imune comprometido e/ou um sistema imune extirpado.

[090] 45. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas a um indivíduo de maneira adjuntiva à terapia de radiação ou quimioterapia ou uma combinação de radiação e quimioterapia que foram, estão sendo, ou serão administradas ao indivíduo.

[091] 46. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas a um indivíduo de maneira adjuntiva a um regime de entrada de terapia de radiação ou quimioterapia ou uma combinação de radiação e quimioterapia.

[092] 47. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o sistema imune do indivíduo foi enfraquecido, comprometido, e/ou ou extirpado por terapia de radiação, quimioterapia, ou uma combinação de radiação e quimioterapia.

[093] 48. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo é o receptor de um transplante de célula do sangue ou medula óssea não singênico, o sistema imune do indivíduo foi enfraquecido ou extirpado por terapia de radiação, quimioterapia, ou uma combinação de radiação e quimioterapia, e o indivíduo está em risco para desenvolver ou desenvolveu a doença do enxerto versus hospedeiro.

[094] 49. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo é o receptor de um transplante de célula do sangue ou medula óssea não singênico, o sistema imune do indivíduo foi enfraquecido ou extirpado por terapia de radiação, por quimioterapia, ou por uma combinação de terapia de radiação e quimioterapia, e medicamentos imunossupressores estão sendo administrados ao indivíduo, em que além disso o indivíduo está em risco para desenvolver ou desenvolveu doença do enxerto versus hospedeiro e as ditas células são administradas ao dito indivíduo para tratar a doença do enxerto versus hospedeiro de maneira adjuntiva a um ou mais dos outros tratamentos (isto é: o transplante, a terapia de radiação, a quimioterapia, e/ou os medicamentos imunossupressores).

[095] 50. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo será ou é o receptor de um transplante não singênico e está em risco para ou desenvolveu uma resposta do hospedeiro versus enxerto, em que as ditas células são administradas para tratar a resposta do hospedeiro versus enxerto.

[096] 51. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um neoplasma e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[097] 52. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um neoplasma de células do sangue ou da medula óssea e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[098] 53. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um neoplasma benigno de células da medula óssea, um distúrbio mieloproliferativo, uma síndrome mielodisplásica, ou uma leucemia aguda e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[099] 54. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um neoplasma benigno de células da medula óssea e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0100] 55. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um distúrbio mieloproliferativo e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0101] 56. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um ou mais de leucemia mielocítica crônica (“CML”) (também chamada leucemia granulocítica crônica (“CGL”)), mielofibrose agnogênica, trombocitemia essencial, policitemia rubra, ou outro distúrbio mieloproliferativo e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0102] 57. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma síndrome mielodisplásica e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0103] 58. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma leucemia aguda e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0104] 59. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um ou mais de mieloma múltiplo agudo, leucemia mieloblástica, leucemia mielocítica crônica (“CML”), leucemia pró mielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda pré B, leucemia linfocítica crônica (“CLL”), linfoma de célula B, leucemia de célula pilosa, mieloma, leucemia linfoblástica aguda T, linfoma de célula T periférica, outras leucemias linfóides, outros linfomas, ou outra leucemia aguda e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0105] 60. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma anemia ou outro distúrbio do sangue e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0106] 61. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de hemoglobinopatias, talassemia, síndrome do definhamento da medula óssea, anemia de célula falsiforme, anemia aplásica, anemia de Fanconi, ou uma anemia hemolítica imune e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0107] 62. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um ou mais de anemia refratária, anemia refratária com sideroblastos anelados, anemia refratária com blastos em excesso, anemia refratária com blastos em excesso em transformação, leucemia mielomonocítica crônica, ou outra síndrome mielodisplásica e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0108] 63. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de anemia de Fanconi e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0109] 64. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma disfunção imune e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste. 65. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma deficiência imune congênita e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0110] 66. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma disfunção, distúrbio, ou doença autoimunes e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0111] 67. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma ou mais das disfunções autoimunes que seguem: doença de Crohn, síndrome de Guillain-Barre, lúpus eritematoso (também chamado “SLE” e lúpus eritematoso sistêmico), esclerose múltipla, miastenia grave, neurite óptica, psoríase, artrite reumatóide, doença de Graves, doença de Hashimoto, tireoidite de Ord, diabete melito (tipo 1), síndrome de Reiter, hepatite autoimmune, cirrose biliar primária, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo (“APS”), síndrome de opsoclonus-mioclonus (“OMS”), arterite temporal, encefalomielite disseminada aguda (“ADEM” e “ADE”), síndrome de Goodpasture, granulomatose de Wegener, doença celíaca, pênfigo, poliartrite, e anemia hemolítica autoimune quente e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0112] 68. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma ou mais das disfunções autoimunes que seguem: doença de Crohn, lúpus eritematoso (também chamado “SLE” e lúpus eritematoso sistêmico), esclerose múltipla, miastenia grave, psoríase, artrite reumatóide, doença de Graves, doença de Hashimoto, diabete melito (tipo 1), síndrome de Reiter, cirrose biliar primária, doença celíaca, poliartrite, e anemia hemolítica autoimune quente e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0113] 69. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma ou mais das doenças que seguem consideradas terem um componente autoimune: endometriose, cistite intersticial, neuromiotonia, esclerodermia, esclerodermia sistêmica progressiva, vitiligo, vulvodinia, doença de Chagas, sarcoidose, síndrome da fadiga crônica, e disautonomia e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0114] 70. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de uma doença inflamatória e as ditas células são administradas adjuntivas a um tratamento deste.

[0115] 71. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais outros agentes farmaceuticamente ativos.

[0116] 72. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais outros agentes imunossupressores.

[0117] 73. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais de um corticosteróide, ciclosporina A, um agente imunossupressor semelhante à ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimócito, azatioprina, rapamicina, FK-506, e um agente imunossupressor semelhante a macrolídeo exceto FK-506, rapamicina, e um agente imunossupressor de anticorpo monoclonal.

[0118] 74. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais de um corticosteróide, ciclosporina A, azatioprina, ciclofosfamida, rapamicina, FK-506, e um agente imunossupressor de anticorpo monoclonal.

[0119] 75. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais agentes antibióticos.

[0120] 76. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende uma ou mais agentes antifúngicos. 77. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma formulação que compreende um ou mais agentes antivirais.

[0121] 78. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo por uma via parenteral.

[0122] 79. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo por qualquer uma ou mais das vias parenterais que seguem: injeção intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intraespinhal, intratecal, intraóssea, intraarticular, intrasinovial, intracutânea, intradérmica, subcutânea, e intramuscular.

[0123] 80. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas por qualquer uma ou mais das vias parenterais que seguem: injeção intravenosa, intraarterial, intracutânea, intradérmica, subcutânea, e intramuscular.

[0124] 81. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas por qualquer uma ou mais das vias parenterais que seguem: injeção intravenosa, intraarterial, intracutânea, subcutânea, e intramuscular.

[0125] 82. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo através de uma agulha hipodérmica por uma seringa.

[0126] 83. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo através de um cateter.

[0127] 84. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas por implantação cirúrgica.

[0128] 85. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo por implantação pelo uso de um procedimento artroscópico.

[0129] 86. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo dentro de ou sobre um suporte.

[0130] 87. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma forma encapsulada.

[0131] 88. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são formuladas adequadamente para a administração por qualquer uma ou mais das vias que seguem: oral, retal, epicutânea, ocular, nasal, e pulmonar.

[0132] 89. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma dose.

[0133] 90. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas ao indivíduo em uma série de duas ou mais doses em sucessão.

[0134] 91. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas em uma única dose, em duas doses, ou em mais do que duas doses, em que as doses são as mesmas ou diferentes, e elas são administradas com intervalos iguais ou desiguais entre elas.

[0135] 92. Um método de acordo com qualquer um do precedente ou do que segue, em que as ditas células são administradas durante um período de menos do que um dia a uma semana, uma semana a um mês, um mês a um ano, um ano a dois anos, ou mais do que dois anos.

[0136] 93. Um método para tratamento de uma disfunção imune em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo que sofre de uma disfunção imune, por uma via e em uma quantidade eficaz para tratar a disfunção imune no indivíduo, as células que: são células tronco não embrionárias, células germinativas embrionárias, ou células germinativas; podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; não provocam uma resposta imune deletéria no indivíduo; e são eficazes para tratar a disfunção imune no indivíduo.

[0137] 94. Um método para tratamento adjuntivo de uma disfunção imune em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo que sofre de uma disfunção imune, por uma via e em uma quantidade eficaz para tratar a disfunção imune no indivíduo, as células que: são células tronco não embrionárias, células germinativas embrionárias, ou células germinativas; podem diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; não provocam uma resposta imune deletéria no indivíduo; e são eficazes para tratar a disfunção imune no indivíduo, em que as células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva a um ou mais outros tratamentos que estão sendo administrados ao indivíduo para tratar a mesma disfunção imune, para tratar uma ou mais outras disfunções, ou ambos.

[0138] Outros aspectos da invenção são descritos em ou são óbvios a partir da divulgação que segue, e estão dentro do âmbito da invenção.

Breves Descrições das Figuras

[0139] A Figura 1 é uma representação esquemática dos estudos de perfilamento transcricional que foram realizados para gerar (identificar) marcadores com base em gene e receptor de superfície que distinguem entre as MAPCs da invenção e outras células tronco e progenitoras que são de linhagem mais comprometida. Os experimentos resultaram em um painel de 75 marcadores tendo expressão diferente de 10 vezes entre as culturas de MSC e as MAPCs.

[0140] A Figura 2 é um conjunto de gráficos que mostram a diferenciação de tri-linhagem de MAPCs de rato rotulados com GFP. Os resultados mostram que as MAPCs podem diferenciar em células de todas as três linhagens embrionárias. Como ainda descrito abaixo, para a diferenciação endotelial, as MAPCs foram cultivadas em placas revestidas com fibronectina na presença de fator B de crescimento endotelial vascular (VEGF-B). Para a diferenciação de hepatócito, as células foram cultivadas em placas revestidas com matrigel e tratadas com o fator 4 de crescimento de fibroblasto (FGF 4) e o fator de crescimento de hepatócito (HGF). A diferenciação neuronal foi induzida por tratamento seqüencial com FGF básico (bFGF), tanto com FGF 8 quanto Sonic Hedgehog (SHH), e com o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Depois de duas semanas, o mRNA foi extraído de células e aplicado à análise de qPCR pelo uso de iniciadores específicos para a detecção de vários marcadores de linhagem. Em todos os ensaios, as células cultivadas na ausência de citocinas que induzem a linhagem serviram como controles. Os níveis de expressão de marcadores de linhagem foram primeiro normalizados ao nível de expressão de um gene de controle interno (GAPDH) que é não afetado durante a diferenciação. O sucesso da diferenciação depois foi avaliado pelo cálculo da expressão relativa nas células diferenciadas ou nas de controle comparadas aos níveis na linhagem parenteral do rato, pelo uso de um aumento de mais do que 5 vezes na expressão relativa como um corte para a diferenciação bem sucedida. As MAPCs de rato diferenciadas exibiram expressão significante dos marcadores endoteliais, fator de von Willebrand, e PECAM-1 (painel de topo); dos marcadores hepáticos albumina, citoqueratina-18, e HNF-1a (painel intermediário); e dos marcadores neuronais/de astrócito GFAP, nestina, e NF-200 (painel de fundo).

[0141] A Figura 3 é um par de gráficos de barra que mostram imunogenicidade baixa (painel de topo) e imunossupressividade (painel de fundo) de MAPCs em reações de linfócito mistas (MLR), como descrito mais abaixo. No painel de topo: B + B = doador B + doador B; B + A = doador B + doador A; B + K = doador B + doador K; B + R = doador B + doador R; B + T = doador B + doador T; doador B + PHA; B + BMPC = doador B + MAPC. O mesmo resultado foi obtido com doze doadores diferentes. No painel de fundo: doador W + doador W; doador W + doador A; doador W + doador T; doador W + MSC; doador W + MAPC (17); doador W + PHA; doador W + doador A + MSC; doador W + doador A + MAPC (17); doador W + doador T + MSC; doador W + doador T + MAPC (17); doador W + doador P + MSC; doador W + doador P + MAPC (17). PHA é fitoemaglutinina (controle positivo para ativação de célula T).

[0142] A Figura 4 é um gráfico que mostra que as MAPCs podem suprimir a proliferação de células T estimuladas por ConA como descrito no Exemplo 6. O título “LN Apenas” designa os resultados para controlar as reações que omitem as MAPCs. Os números para MAPCs indicam como muitas células foram usadas nos ensaios.

[0143] A Figura 5A é um gráfico que mostra os efeitos imunossupressores de MAPCs de Lewis em reações de linfócito mistas, como descrito no Exemplo 7. A caixa na Figura 5A enumera o número de MAPCs em cada reação. Na caixa, R designa as células respondedoras e S designa as células estimuladoras (esplenócitos irradiados de ratos DA).

[0144] A Figura 5B é um gráfico que mostra os efeitos imunossupressores de MAPCs de Sprague-Dawley em reações de linfócito mistas, como descrito no Exemplo 7. Os títulos e abreviações são os mesmos como na Figura 5A.

[0145] A Figura 6 é um gráfico que mostra que a infusão de MAPCs não afeta adversamente a saúde de receptores como determinado por sua taxa respiratória. O gráfico é descrito ainda no Exemplo 8.

[0146] A Figura 7 é um gráfico de barra que representa os resultados de um experimento que demonstra a capacidade de MAPCs para suprimir uma resposta imune de entrada. O gráfico mostra que as MAPCs são fortemente imunossupressores em MLRs, tanto quando elas são adicionadas ao mesmo tempo como o ativador de célula T (estimulador) (Dia 0, lado esquerdo do gráfico), quanto quando elas são adicionadas 3 dias depois da adição do ativador de célula T (estimulador) (Dia 3, lado direito do gráfico). Os detalhes dos experimentos são descritos ainda no Exemplo 10.

[0147] A Figura 8 é um gráfico de barra que mostra que a inibição de MAPC de proliferação de célula T em MLRs é reversível. Os resultados são expostos como a média cpm +/- SD de cultura em triplicata. O gráfico é descrito ainda no Exemplo 11.

[0148] A Figura 9 é um gráfico que mostra que as MAPCs inibem GVHD como descrito no Exemplo 13.

Definições

[0149] Como usado aqui, certos termos têm os significados apresentados abaixo.

[0150] “Um” significa um ou mais; pelo menos um.

[0151] “Adjuntiva” significa juntamente, juntamente com, além de, em combinação com, e semelhantes.

[0152] “Co-administrador” pode incluir administração simultânea ou seqüencial de dois ou mais agentes.

[0153] “Citocinas” referem-se a fatores celulares que induzem ou realçam o movimento celular, tal como orientação de MAPCs ou outras células tronco, células progenitoras, ou células diferenciadas. As citocinas também podem estimular tais células a dividirem.

[0154] “Deletério” significa, como usado aqui, prejudicial. Por via de ilustração, “resposta imune deletéria” significa, como usado aqui, uma resposta imune prejudicial, tais como aquelas que estão carecendo ou são muito fracas, aquelas que são muito fortes, e/ou aquelas que são mal orientadas. Entre as respostas imunes deletérias estão as respostas imunes prejudiciais que ocorrem em doenças imunes. Os exemplos incluem a falta de respostas imunes em doenças imunodeficientes, e as respostas imunes exageradas e/ou mal orientadas em doenças autoimunes. Também entre as respostas imunes deletérias estão as respostas imunes que interferem com o tratamento medicinal, incluindo as respostas imunes normais diferentes. Os exemplos incluem respostas imunes envolvidas na rejeição de transplantes e enxertos, e a resposta de células imunocompetentes em transplantes e enxertos que ocasionam a doença do enxerto versus hospedeiro.

[0155] “Fatores de diferenciação” referem-se a fatores celulares, tais como fatores de crescimento, que induzem o comprometimento de linhagem.

[0156] “Disfunção” significa, como usado aqui, um distúrbio, doença, ou efeito deletério de um processo normal diferente. Por via de ilustração, uma disfunção imune inclui doenças imunes, tais como doenças autoimunes e deficiências imunes. Ela também inclui as respostas imunes que interferem com o tratamento medicinal, incluindo as respostas imunes normais diferentes que interferem com o tratamento medicinal. Os exemplos de tais disfunções incluem as respostas imunes envolvidas na rejeição de transplantes e enxertos, e a resposta de células imunocompetentes em transplantes e enxertos que ocasionam a doença do enxerto versus hospedeiro.

[0157] “Células EC” refere-se a células de carcinoma embrionário.

[0158] “Quantidade eficaz” no geral significa uma quantidade que fornece o efeito local ou sistêmico desejado. Por exemplo, uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para efetuar um resultado clínico benéfico ou desejado. As quantidades eficazes podem ser fornecidas todas de uma vez em uma única administração ou em quantidades fracionárias que fornecem a quantidade eficaz em várias administrações. Por exemplo, uma quantidade eficaz de MAPCs pode ser administrada em uma ou mais administrações e pode incluir qualquer quantidade pré selecionada de células. A determinação exata do que seria considerado uma quantidade eficaz pode ser fundamentada em fatores individuais para cada indivíduo, incluindo seu tamanho, idade, lesão, e/ou doença ou lesão que é tratada, e quantidade de tempo desde que a lesão ocorreu ou a doença começou. Uma pessoa habilitada na técnica será capaz de determinar a quantidade eficaz para um indivíduo dado com base nestas considerações que são rotineiras na técnica. Assim, por exemplo, o técnico habilitado nesta técnica, tal como um médico, com base nas propriedades conhecidas de MAPCs como divulgado aqui e na técnica, juntamente com uma consideração dos fatores precedentes, será capaz de determinar a quantidade eficaz de MAPCs para um indivíduo dado. Como usado aqui, “dose eficaz” significa o mesmo como “quantidade eficaz.”

[0159] “Células EG” refere-se a células germinativas embrionárias.

[0160] “Enxertar” refere-se ao processo de contato celular e incorporação em um tecido existente de interesse in vivo.

[0161] “População enriquecida” significa um aumento relativo em números de MAPCs em relação a outras células ou constituintes em uma população inicial, tal como um aumento em números de MAPCs em relação a um ou mais tipos de célula que não MAPC em cultura, tal como cultura primária, ou in vivo.

[0162] “Células ES” refere-se a células tronco embrionárias.

[0163] “Expansão” refere-se à propagação de uma célula ou células sem diferenciação.

[0164] “Anemia de Fanconi” como usado aqui significa o mesmo como anemia Fanconi, uma doença hereditária.

[0165] “GVHD” refere-se à doença do enxerto versus hospedeiro, que significa os processos que ocorrem primariamente em um hospedeiro imunocomprometido quando ele é reconhecido como não próprio por células imunocompetentes de um enxerto.

[0166] “HVG” refere-se à resposta do hospedeiro versus enxerto, que significa os processos que ocorrem quando um hospedeiro rejeita um enxerto. Tipicamente, a HVG é provocada quando um enxerto é reconhecido como estranho (não próprio) por células imunocompetentes do hospedeiro.

[0167] “Isolada” refere-se a uma célula ou células que não são associadas com uma ou mais células ou um ou mais componentes celulares que são associados com a célula ou células in vivo.

[0168] “MAPC” é um acrônimo para “célula progenitora multipotente de adulto.” Ela refere-se a uma célula não ES, não EG, não germinativa que pode dar origem a linhagens celulares de mais do que uma camada germinativa, tal como todas as três camadas germinativas (isto é, endoderma, mesoderma, e ectoderma). As MAPCs também têm atividade de telomerase. Elas podem ser positivas para oct 3/4 (por exemplo, oct 3A humano). Elas também podem expressar rex 1 e rox 1. Além disso, elas podem expressar sox 2, SSEA 4, e/ou nanog. O termo “adulto” em MAPC não é restritivo. Ele apenas denota que estas células são células não ES, EG, ou germinativas. Tipicamente, como usado aqui, MAPC é singular e MAPCs é plural. As MAPCs também foram referidas como as células tronco multipotentes adulto (MASCs). Ver a Patente U. S. No 7.015.037, que é aqui incorporada por referência para a divulgação de MAPC/MASC e métodos de isolamento e crescimento desta.

[0169] “MASC,” ver MAPC.

[0170] “MNC” refere-se a células mononucleares.

[0171] “Modalidade” significa um tipo, caminho, via preferencial, ou método, tal como, uma modalidade terapêutica; isto é, um tipo de terapia.

[0172] “MSC” é um acrônimo para células tronco mesenquimais.

[0173] “Multipotente” com respeito a MAPCs, refere-se à capacidade para dar origem a linhagens celulares de mais do que uma camada germinativa, tal como todas as três camadas germinativas primitivas (isto é, endoderma, mesoderma, e ectoderma) na diferenciação.

[0174] “Persistência” refere-se à capacidade de células para resistir a rejeição e permanecer e/ou aumentar em número com o passar do tempo (por exemplo, dias, semanas, meses, ou anos) in vivo.

[0175] “Progenitor” como usado em células progenitoras multipotentes em adultos (MAPCs) indica que estas células podem dar origem a outras células tais como as células diferenciadas adicionais. O termo não é limitativo e não limita estas células a uma linhagem particular.

[0176] “Auto-renovação” refere-se à capacidade para produzir células tronco filhas duplicadas tendo potencial de diferenciação que é idêntico àqueles a partir do qual eles originaram-se. Um termo similar usado neste contexto é “proliferação.”

[0177] Um “indivíduo” é um vertebrado, tal como um mamífero, tal como um ser humano. Mamíferos incluem, mas não são limitados a, seres humanos, animais de criação, animais relacionados ao esporte, e animais de estimação. Os indivíduos em necessidade de tratamento por métodos da presente invenção incluem aqueles que sofrem de um distúrbio, disfunção, ou doença (tal como uma deficiência ou disfunção imune, tal como HVG e GVHD), ou um efeito colateral do mesmo, ou um tratamento deste, que podem beneficiar-se da administração de MAPCs como um tratamento primário ou um adjuntivo.

[0178] “Transplante” como usado aqui significa a introdução em um indivíduo, células, tecidos, ou órgãos. O transplante pode ser derivado do indivíduo, da cultura, ou de uma fonte que não o indivíduo.

[0179] “Tratar,” “tratando,” ou “tratamento” inclui tratar, impedir, melhorar, inibir, ou curar uma deficiência, disfunção, doença, ou outro processo que resulta em um efeito deletério, tal como uma deficiência, disfunção, doença do sistema imune, ou outro processo que afeta de forma prejudicial as funções ou as propriedades do sistema imune ou que interfere com uma terapia.

Descrição Detalhada da Invenção Introdução

[0180] As MAPCs são muito prometedoras para tratar a doença por técnicas de transplantação celular, tais como para a regeneração de tecido e órgão, tanto quando usadas sozinhas quanto quando usadas em combinação com outros tratamentos. Entre os obstáculos potenciais para realizar o compromisso de MAPCs para tratar as doenças, e para a regeneração de tecido e órgão, estão as reações imunes adversas que tipicamente complicam ou impedem o sucesso em terapias de transplantação, tais como as terapias de transplantação de sangue e medula óssea e transplantação de órgão sólido. Proeminentes entre estas complicações imunes estão a rejeição ao enxerto por um sistema imune do hospedeiro (referida aqui como resposta do hospedeiro versus enxerto e como “HVG”) e o dano sistêmico a um hospedeiro imunocomprometido que resulta quando células imunocompetentes em um enxerto são ativadas por contato com componentes não próprios do hospedeiro (referido aqui como doença do enxerto versus hospedeiro e como “GVHD”).

[0181] Foi verificado (como descrito em maior detalhe em outra parte aqui) que as MAPCs não provocam uma resposta imune em hospedeiros alogênicos. Assim, a transplantação de MAPCs a um hospedeiro alogênico não deve causar rejeição ao enxerto alogênica (isto é, HVG).

[0182] Além disso, também foi verificado que as MAPCs alogênicas podem ser administradas a um hospedeiro em concentração alta sem efeitos deletérios na respiração, sugerindo que a aglutinação e/ou deposição indevidos nos pulmões não ocorrem.

[0183] Além disso, foi verificado (como descrito em maior detalhe em outra parte aqui) que as MAPCs podem modular respostas imunes. Em particular sob este aspecto, foi verificado que as MAPCs podem suprimir respostas imunes, incluindo mas não limitadas a respostas imunes envolvidas, por exemplo, em HVG e GVHD, para citar apenas duas. Em um particular ainda mais detalhado sob este aspecto, foi verificado que as MAPCs podem suprimir a proliferação de células T, mesmo na presença de células T estimuladoras potentes, tais como Concanavalina A e células estimuladoras alogênicas.

[0184] Além disso, foi verificado que mesmo quantidades relativamente pequenas de MAPCs podem suprimir estas respostas. De fato, apenas 3 % de MAPCs em reações de linfócito mistas é suficiente para reduzir a resposta de célula T aos estimuladores potentes em 50 % in vitro.

[0185] Conseqüentemente, em certos aspectos da invenção sob este aspecto, algumas das formas de realização fornecem composições e métodos e semelhantes para tratar, melhorar, e/ou curar ou eliminar, reações imunes adversas, tais como aquelas que ocorrem em terapias de transplantação.

[0186] A imunogenicidade baixa de MAPCs alogênicas, sua capacidade para suprimir respostas imunes adversas, e sua atividade específica elevada as tornam particularmente valiosas para terapias adjuntivas no tratamento de doenças com um componente imune adverso. Entre tais doenças estão as doenças autoimunes em que, tipicamente, a disfunção do sistema imune próprio do indivíduo causa a doença. As MAPCs também são úteis como produtos terapêuticos adjuntivos imunossupressores para tratar respostas imunes adversas que ocorrem em terapia de transplantação. Os exemplos incluem HVG em hospedeiros imunocompetentes e GVHD em hospedeiros imunocomprometidos. As MAPCs ainda podem ser úteis em terapia imunossupressora adjuntiva no tratamento de uma variedade de neoplasmas, anemias e distúrbios do sangue, e no tratamento de certas doenças inflamatórias. As doenças sob este aspecto são debatidas em maior detalhe abaixo.

[0187] Pelo uso dos métodos descritos aqui para o isolamento, caracterização, e expansão de MAPC, juntamente com a divulgação aqui em propriedades imunossupressoras de MAPCs, as MAPCs podem ser usadas para prevenir, suprimir, ou diminuir distúrbios, disfunções, ou doenças imunes, incluindo, por exemplo, reações imunes adversas, tais como aquelas que resultaram de outras terapias, incluindo aquelas que complicaram as terapias de transplantação, tais como HVG e GVHD. Tais distúrbios, disfunções, e doenças também incluem distúrbios imunes congênitos e doenças autoimunes, entre outros.

[0188] As MAPCs são úteis sob estes aspectos e outros tanto como agentes e modalidades terapêuticos primários quanto adjuntivos. As MAPCs podem ser usadas terapeuticamente sozinhas ou juntamente com outros agentes. As MAPCs podem ser administradas antes, durante, e/ou depois de tais agentes. Do mesmo modo, se usadas sozinhas ou com outros agentes, as MAPCs podem ser administradas antes, durante, e/ou depois de um transplante. Se administradas durante o transplante, as MAPCs podem ser administradas juntamente com o material transplantado ou separadamente. Se administradas separadamente, as MAPCs podem ser administradas seqüencial ou simultaneamente com o transplante. Além disso, as MAPCs podem ser administradas diante do transplante e/ou depois do transplante.

[0189] Outros agentes que podem ser usados em combinação com MAPCs, em terapias de transplantação em particular, incluem os agentes imunomoduladores. Uma variedade de tais agentes são descritos em outra parte aqui. Em certas formas de realização da invenção, os agentes imunomoduladores são agentes imunossupressores, tais como aqueles descritos em outra parte aqui. Entre tais agentes estão os corticosteróides, ciclosporina A, compostos imunossupressores semelhantes à ciclosporina, azatioprina, ciclofosfamida, e metotrexato.

[0190] As MAPCs podem ser administradas aos hospedeiros por uma variedade de métodos como debatido em outra parte aqui. Em certas formas de realização as MAPCs são administradas por injeção, tal como por injeção intravenosa. Em algumas formas de realização as MAPCs são encapsuladas para a administração. Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas in situ. Os exemplos incluem administração in situ de MAPCs na transplantação de órgão sólido e no reparo de órgão. Estas e outras formas de administração são debatidas abaixo.

[0191] Em algumas formas de realização da invenção, as MAPCs são administradas em doses medidas pela razão de MAPCs (células) à massa corporal (peso). Alternativamente, as MAPCs podem ser administradas em doses de um número fixo de células. A dosagem, as vias de administração, as formulações, e semelhantes são debatidas em maior detalhe em outra parte aqui. Mecanismos de Ação

[0192] Sem estar limitado a qualquer um ou mais mecanismos explanatórios para as propriedades imunomoduladoras e outras, atividades, e efeitos de MAPCs, vale a pena notar que elas podem modular as respostas imunes através de uma variedade de modalidades. Por exemplo, as MAPCs podem ter efeitos diretos em um enxerto ou hospedeiro. Tais efeitos diretos são primariamente uma questão de contato direto entre as MAPCs e as células do hospedeiro ou enxerto. O contato pode ser com membros estruturais das células ou com constituintes em seu ambiente imediato. Tais mecanismos diretos podem envolver contato direto, difusão, captação, ou outros processos bem conhecidos àqueles habilitados na técnica. As atividades e efeitos diretos das MAPCs podem ser limitados espacialmente, tal como a uma área de deposição local ou a um compartimento corpóreo acessado por injeção.

[0193] As MAPCs também podem “orientar” em resposta a sinais de “orientação”, tais como aqueles liberados em sítios de lesão ou doença. Visto que a orientação freqüentemente é mediada por sinais cuja função natural é recrutar as células aos sítios onde reparos são necessários, o comportamento de orientação pode ser uma ferramenta poderosa para concentrar as MAPCs aos alvos terapêuticos. Este efeito pode ser estimulado por fatores específicos, como debatido abaixo.

[0194] As MAPCs também podem modular processos imunes por sua resposta aos fatores. Isto pode ocorrer adicional ou alternativamente à modulação direta. Tais fatores podem incluir fatores de orientação, mitógenos, e outros fatores estimulatórios. Eles também podem incluir fatores de diferenciação, e fatores que provocam processos celulares particulares. Entre os últimos estão fatores que causam a secreção por células de outros fatores específicos, tais como aquelas que estão envolvidas no recrutamento de células, tais como células tronco (incluindo as MAPCs), a um sítio de lesão ou doença.

[0195] As MAPCs, além do precedente ou alternativamente a este, podem secretar fatores que agem em células endógenas, tais como células tronco ou células progenitoras. Os fatores podem agir em outras células para causar, realçar, diminuir, ou suprimir suas atividades. As MAPCs podem secretar fatores que agem em células tronco, progenitoras, ou diferenciadas fazendo com que estas células dividam e/ou diferenciem. As MAPCs que orientam-se a um sítio onde o reparo é necessário podem secretar fatores tróficos que atraem outras células ao sítio. Deste modo, as MAPCs podem atrair células tronco, progenitoras, ou diferenciadas a um sítio onde elas são necessárias. As MAPCs também podem secretar fatores que fazem com que tais células dividam ou diferenciem.

[0196] A secreção de tais fatores, incluindo fatores tróficos, pode contribuir para a eficácia de MAPCs em, por exemplo, limitar dano inflamatório, limitar permeabilidade vascular, melhorar sobrevivência celular, e causar e/ou aumentar orientação de células de reparo aos sítios de dano. Tais fatores também podem afetar a proliferação de célula T diretamente. Tais fatores também podem afetar células dendríticas, diminuindo-se suas atividades fagocíticas e de apresentação de antígeno, que também podem afetar a atividade de célula T.

[0197] Por estes e outros mecanismos, as MAPCs podem fornecer efeitos imunomoduladores benéficos, incluindo, mas não limitados a, supressão de reações imunes, respostas, funções, doenças indesejáveis e/ou deletérias, e semelhantes. As MAPCs em várias formas de realização da invenção fornecem propriedades imunomoduladoras e efeitos benéficos que são úteis por si só ou em terapia adjuntiva para evitar, impedir, reduzir, diminuir, melhorar, aliviar, tratar, eliminar e/ou curar processos imunes e/ou condições deletério. Tais processos e condições incluem, por exemplo, doenças autoimunes, anemias, neoplasmas, HVG, GVHD, e certos distúrbios inflamatórios, como descrito em maior detalhe em outra parte aqui. As MAPCs são úteis sob estes outros aspectos particularmente em mamíferos. Em várias formas de realização da invenção sob este aspecto, as MAPCs são usadas terapeuticamente em indivíduos humanos, freqüentemente de maneira adjuntiva a outras terapias. Administração de MAPC Preparações de MAPC

[0198] As MAPCs podem ser preparadas a partir de uma variedade de tecidos, tais como células da medula óssea, como debatido em maior detalhe em outra parte aqui.

[0199] Em muitas formas de realização as preparações de MAPC são clonalmente derivadas. Em princípio, as MAPCs nestas preparações são geneticamente idênticas entre si e, se propriamente preparadas e mantidas, são livres de outras células.

[0200] Em algumas formas de realização preparações de MAPC que são menos puras do que estas podem ser usadas. Embora raras, populações menos puras podem surgir quando a etapa de clonagem inicial requer mais do que uma célula. Se estas não são todas MAPCs, a expansão produzirá uma população mista em que as MAPCs são apenas uma de pelo menos dois tipos de células. Mais freqüentemente populações mistas surgem quando as MAPCs são administradas em mistura com um ou mais outros tipos de células.

[0201] Em muitas formas de realização a pureza de MAPCs para a administração a um indivíduo é de cerca de 100 %. Em outras formas de realização ela é de 95 % a 100 %. Em algumas formas de realização ela é de 85 % a 95 %. Particularmente no caso de misturas com outras células, a porcentagem de MAPCs pode ser de 25 % a 30 %, 30 % a 35 %, 35 % a 40 %, 40 % a 45 %, 45 % a 50 %, 60 % a 70 %, 70 % a 80 %, 80 % a 90 %, ou 90 % a 95 %.

[0202] O número de MAPCs em um volume dado pode ser determinado por procedimentos e instrumentação bem conhecidos e de rotina. A porcentagem de MAPCs em um volume dado de uma mistura de células pode ser determinada por muitos dos mesmos procedimentos. Células pode ser facilmente contadas manualmente ou pelo uso de um contador de célula automático. Células específicas podem ser determinadas em um volume dado pelo uso de manchamento específico e examinação visual e por métodos automáticos pelo uso de reagente de ligação específico, tipicamente anticorpos, rótulos fluorescentes, e um separador de célula ativado por fluorescência.

[0203] A imunomodulação de MAPC pode envolver MAPCs indiferenciadas. Ela pode envolver MAPCs que estão comprometidas a uma via de diferenciação. Tal imunomodulação também pode envolver MAPCs que diferenciaram em uma célula tronco menos potente com potencial de diferenciação limitado. Ela também pode envolver MAPCs que diferenciaram em um tipo de célula terminalmente diferenciado. O melhor tipo ou mistura de MAPCs será determinado pelas circunstâncias particulares de seu uso, e será uma questão de projeto de rotina para aqueles habilitados na técnica para determinar um tipo ou combinação eficazes de MAPCs. Formulações

[0204] A escolha da formulação para administrar as MAPCs para uma aplicação dada dependerá de uma variedade de fatores. Proeminentes entre estes serão as espécies de indivíduo, a natureza do distúrbio, disfunção, ou doença que são tratados e seu estado e distribuição no indivíduo, a natureza de outras terapias e agentes que estão sendo administrados, a via ideal para a administração das MAPCs, capacidade de sobrevivência de MAPCs por intermédio da via, o regime de dosagem, e outros fatores que estarão evidentes àqueles habilitados na técnica. Em particular, por exemplo, a escolha de carregadores adequados e outros aditivos dependerá da via exata de administração e da natureza da forma de dosagem particular, por exemplo, forma de dosagem líquida (por exemplo, se a composição deve ser formulada em uma solução, uma suspensão, gel ou um outra forma líquida, tal como uma forma de liberação por tempo ou forma preenchida com líquido).

[0205] Por exemplo, a sobrevivência celular pode ser um determinante importante da eficácia de terapias com base em célula. Isto é verdade tanto para terapias primárias quanto adjuntivas. Uma outra preocupação surge quando sítios alvo são inóspitos à semeadura celular e crescimento celular. Isto pode impedir acesso ao sítio e/ou enxerto de MAPCs terapêuticas. Várias formas de realização da invenção compreendem medidas para aumentar a sobrevivência celular e/ou para superar problemas apresentados por barreiras à semeadura e/ou crescimento.

[0206] Os exemplos de composições que compreendem MAPCs incluem preparações líquidas, incluindo suspensões e preparações para administração intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração injetável), tal como suspensões ou emulsões estéreis. Tais composições podem compreender uma mistura de MAPCs com um carregador, diluente, ou excipiente adequados tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose, ou semelhantes. As composições também podem ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares tais como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, agentes de gelação ou realçadores de viscosidade, conservantes, agentes flavorizantes, cores, e semelhantes, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Textos padrão, tais como “REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCE,” 17a edição, 1985, incorporado aqui por referência, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.

[0207] As composições da invenção freqüentemente são convenientemente fornecidas como preparações líquidas, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, ou composições viscosas, que podem ser tamponadas a um pH selecionado. Preparações líquidas são normalmente mais fáceis para preparar do que géis, outras composições viscosas, e composições sólidas. Adicionalmente, composições líquidas são um pouco mais convenientes ao administrador, especialmente por injeção. Composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de viscosidade apropriada para fornecer períodos de contato mais longos com tecidos específicos.

[0208] Vários aditivos freqüentemente serão incluídos para realçar a estabilidade, esterilidade, e isotonicidade das composições, tais como conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, e tampões, entre outros. A prevenção da ação de microorganismos pode ser garantida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e semelhantes. Em muitos casos, será desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, e semelhantes. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser realizada pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio, e gelatina. De acordo com a presente invenção, entretanto, qualquer veículo, diluente, ou aditivo usado teriam que ser compatíveis com as células.

[0209] Soluções, suspensões, e géis de MAPC normalmente contêm uma quantidade maior de água (preferivelmente água purificada, esterilizada) além das células. Quantidades menores de outros ingredientes tais como ajustadores de pH (por exemplo, uma base tal como NaOH), emulsificadores ou agentes dispersantes, agentes tamponantes, conservantes, agentes umectantes e agentes gelatinizantes (por exemplo, metilcelulose) também podem estar presentes.

[0210] Tipicamente, as composições serão isotônicas, isto é, elas terão a mesma pressão osmótica como sangue e fluido lacrimal quando propriamente preparadas para a administração.

[0211] A isotonicidade desejada das composições desta invenção pode ser realizada pelo uso de cloreto de sódio, ou outros agentes farmaceuticamente aceitáveis tais como dextrose, ácido bórico, tartrato de sódio, propileno glicol, ou outros solutos inorgânicos ou orgânicos. Cloreto de sódio é preferido particularmente para tampões contendo íons sódio.

[0212] A viscosidade das composições, se desejado, pode ser mantida no nível selecionado pelo uso de um agente espessante farmaceuticamente aceitável. Metilcelulose é preferida porque ela é facilmente e economicamente disponível e é fácil para preparar. Outros agentes espessantes adequados incluem, por exemplo, goma xantana, carboximetil celulose, hidroxipropil celulose, carbômero, e semelhantes. A concentração preferida do espessante dependerá do agente selecionado. O ponto importante é usar uma quantidade, que alcançará a viscosidade selecionada. Composições viscosas são normalmente preparadas a partir de soluções pela adição de tais agentes espessantes.

[0213] Um conservante ou estabilizador celular farmaceuticamente aceitáveis podem ser utilizados para aumentar a vida de composições de MAPC. Se tais conservantes são incluídos, está bem dentro da competência do técnico habilitado selecionar composições que não afetarão a viabilidade ou eficácia das MAPCs.

[0214] Aqueles habilitados na técnica reconhecerão que os componentes das composições devem ser quimicamente inertes. Isto não apresentará nenhum problema àqueles habilitados em princípios químicos e farmacêuticos. Problemas podem ser facilmente evitados por referência aos textos padrão ou por experimentos simples (não envolvendo experimentação indevida) pelo uso de informação fornecida pela divulgação, os documentos citados aqui, e no geral disponíveis na técnica.

[0215] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação das células utilizadas na prática da presente invenção na quantidade necessária do solvente apropriado com várias quantidades dos outros ingredientes, conforme desejado.

[0216] Em algumas formas de realização, as MAPCs são formuladas em uma forma injetável de dosagem unitária, tal como uma solução, suspensão, ou emulsão. Formulações farmacêuticas adequadas para injeção de MAPCs tipicamente são soluções e dispersões aquosas estéreis. Carregadores para formulações injetáveis podem ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes.

[0217] O técnico habilitado pode determinar facilmente a quantidade de células e aditivos opcionais, veículos, e/ou carregador em composições a serem administradas nos métodos da invenção. Tipicamente, quaisquer aditivos (além das células) estão presentes em uma quantidade de 0,001 a 50 % em peso em solução, tal como em solução salina tamponada com fosfato. O ingrediente ativo está presente na ordem de microgramas a miligramas, tal como cerca de 0,0001 a cerca de 5 % em peso, preferivelmente cerca de 0,0001 a cerca de 1 % em peso, o mais preferivelmente cerca de 0,0001 a cerca de 0,05 % em peso ou cerca de 0,001 a cerca de 20 % em peso, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 % em peso, e o mais preferivelmente cerca de 0,05 a cerca de 5 % em peso.

[0218] Para qualquer composição a ser administrada a um animal ou ser humano, e para qualquer método particular de administração, é preferido determinar portanto: toxicidade, tal como por determinação da dose letal (LD) e LD50 em um modelo de animal adequado, por exemplo, roedor tal como camundongo ou rato; e, a dosagem da(s) composição(ões), concentração de componentes nesta(s), e cronometragem da administração da(s) composição(ões), que evocam uma resposta adequada. Tais determinações não requerem experimentação indevida a partir do conhecimento do técnico habilitado, esta divulgação, e os documentos citados aqui. E, o tempo para administrações seqüenciais pode ser determinado sem experimentação indevida.

[0219] Em algumas formas de realização as MAPCs são encapsuladas para a administração, particularmente onde a encapsulação realça a efetividade da terapia, ou fornece vantagens no manejo e/ou vida de prateleira. A encapsulação em algumas formas de realização onde ela aumenta a eficácia de imunossupressão mediada por MAPC, como um resultado, também pode reduzir a necessidade para terapia com medicamento imunossupressor.

[0220] Também, a encapsulação em algumas formas de realização fornece uma barreira para um sistema imune do indivíduo que pode reduzir ainda uma resposta imune do indivíduo às MAPCs (que no geral não são imunogênicas ou são apenas fracamente imunogênicas em transplantes alogênicos), reduzindo deste modo qualquer rejeição ao enxerto ou inflamação que podem ocorrer na administração das células.

[0221] Em uma variedade de formas de realização onde as MAPCs são administradas em mistura com células de um outro tipo, que são mais tipicamente imunogênicas em um ambiente alogênico ou xenogênico, a encapsulação pode reduzir ou eliminar respostas imunes adversas do hospedeiro às células que não MAPC e/ou GVHD que podem ocorrer em um hospedeiro imunocomprometido se as células mistas são imunocompetentes e reconhecem o hospedeiro como não próprio.

[0222] As MAPCs podem ser encapsuladas por membranas, assim como cápsulas, antes da implantação. É considerado que qualquer um dos muitos métodos de encapsulação celular disponíveis pode ser utilizado. Em algumas formas de realização, as células são individualmente encapsuladas. Em algumas formas de realização, muitas células são encapsuladas dentro da mesma membrana. Em formas de realização em que as células devem ser removidas a seguir da implantação, uma estrutura de tamanho relativamente grande que encapsula muitas células, tal como dentro de uma única membrana, pode fornecer um meio conveniente para a recuperação.

[0223] Uma variedade ampla de materiais podem ser usados em várias formas de realização para a microencapsulação de MAPCs. Tais materiais incluem, por exemplo, cápsulas poliméricas, microcápsulas de alginato-poli-L-lisina-alginato, cápsulas de poli-L-lisina alginato de bário, cápsulas de alginato de bário, fibras ocas de poliacrilonitrila/cloreto de polivinila (PAN/PVC), e fibras ocas de polietersulfona (PES).

[0224] Técnicas para a microencapsulação de células que podem ser usadas para a administração de MAPCs são conhecidas àqueles de habilidade na técnica e são descritas, por exemplo, em Chang, P., et al., 1999; Matthew, H. W., et al., 1991; Yanagi, K., et al., 1989; Cai Z. H., et al., 1988; Chang, T. M., 1992 e na Patente U. S. No 5.639.275 (que, por exemplo, descreve uma cápsula biocompatível para a manutenção a longo prazo de células que estavelmente expressam moléculas biologicamente ativas. Métodos adicionais de encapsulação estão na Publicação de Patente Européia No 301.777 e Pat. U. S. Nos 4.353.888; 4.744.933; 4.749.620; 4.814.274; 5.084.350; 5.089.272; 5.578.442; 5.639.275; e 5.676.943. Todos os precedentes são incorporados aqui por referência em partes relativas à encapsulação de MAPCs.

[0225] Certas formas de realização incorporam MAPCs em um polímero, tal como um biopolímero ou polímero sintético. Os exemplos de biopolímeros incluem, mas não são limitados a, fibronectina, fibina, fibrinogênio, trombina, colágeno, e proteoglicanos. Outros fatores, tais como as citocinas debatidas acima, também podem ser incorporados no polímero. Em outras formas de realização da invenção, as MAPCs podem ser incorporadas nos interstícios de um gel tridimensional. Um grande polímero ou gel, tipicamente, será cirurgicamente implantado. Um polímero ou gel que pode ser formulado em partículas ou fibras pequenas o bastante pode ser administrado por outras vias comuns, mais convenientes, não cirúrgicas.

[0226] Composições farmacêuticas da invenção podem ser preparadas em muitas formas que incluem tabletes, cápsulas de gelatina duras ou moles, soluções aquosas, suspensões, e lipossomos e outras formulações de liberação lenta, tais como géis poliméricos formados. As composições farmacêuticas líquidas orais podem estar na forma de, por exemplo, suspensões aquosas ou oleosas, soluções, emulsões, xaropes, ou elixires, ou podem ser apresentadas como um produto seco para a constituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais composições farmacêuticas líquidas podem conter aditivos convencionais tais como agentes de suspensão, agentes emulsificantes, veículos não aquosos (que podem incluir óleos comestíveis), ou conservantes. Uma forma de dosagem oral pode ser formulada tal que células são liberadas no intestino depois de atravessar o estômago. Tais formulações são descritas na Patente U. S. No 6.306.434 e nas referências contidas nesta.

[0227] As composições farmacêuticas adequadas para a administração retal podem ser preparadas como supositórios de dose unitária. Os carregadores adequados incluem solução salina e outros materiais comumente usados na técnica.

[0228] Para a administração por inalação, células podem ser convenientemente liberadas de um insuflador, nebulizador ou um pacote pressurizado ou outro meio conveniente de liberação de um pulverizador aerossol. Os pacotes pressurizados podem compreender um propulsor adequado tal como diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono, ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelo fornecimento de uma válvula para liberar uma quantidade medida.

[0229] Alternativamente, para a administração por inalação ou insuflação, um meio pode tomar a forma de uma composição de pó seco, por exemplo, uma mistura em pó de um modulador e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. A composição em pó pode ser apresentada na forma de dosagem unitária, por exemplo, em cápsulas ou cartuchos ou, por exemplo, gelatina ou cartelas a partir das quais o pó pode ser administrado com a ajuda de um inalador ou insuflador. Para a administração intra-nasal, as células podem ser administradas por intermédio de uma pulverização líquida, tal como por intermédio de um atomizador de garrafa plástica. Outros Ingredientes Ativos

[0230] As MAPCs podem ser administradas com outros agentes farmaceuticamente ativos. Em algumas formas de realização um ou mais de tais agentes são formulados juntamente com MAPCs para a administração. Em algumas formas de realização as MAPCs e o um ou mais agentes estão em formulações separadas. Em algumas formas de realização as composições que compreendem as MAPCs e/ou o um ou mais agentes são formulados com referência ao uso adjuntivo entre si.

[0231] As MAPCs podem ser administradas em uma formulação que compreende um agente imunossupressor, tal como qualquer combinação de qualquer número de um corticosteróide, ciclosporina A, um agente imunossupressor semelhante à ciclosporina, ciclofosfamida, globulina antitimócito, azatioprina, rapamicina, FK-506, e um agente imunossupressor semelhante a macrolídeo exceto FK-506 e rapamicina. Em certas formas de realização, tais agentes incluem um corticosteróide, ciclosporina A, azatioprina, ciclofosfamida, rapamicina, e/ou FK506. Agentes imunossupressores de acordo com o precedente podem ser os únicos tais agentes adicionais ou podem ser combinados com outros agentes, tais como outros agentes observados aqui. Outros agentes imunossupressores incluem Tacrolimus, Micofenolato mofetil, e Sirolimus.

[0232] Tais agentes também incluem agentes antibióticos, agentes antifúngicos, e agentes antivirais, para citar apenas algumas outras substâncias e composições farmacologicamente ativas que podem ser usadas de acordo com formas de realização da invenção.

[0233] Os antibióticos ou compostos anti-micóticos típicos incluem, mas não são limitados a, penicilina, estreptomicina, anfotericina, ampicilina, gentamicina, canamicina, ácido micofenólico, ácido nalidíxico, neomicina, nistatina, paromomicina, polimixina, puromicina, rifampicina, espectinomicina, tetraciclina, tilosina, zeocina, e cefalosporinas, aminoglicosídeos, e equinocandinas.

[0234] Outros aditivos deste tipo dizem respeito ao fato de que as MAPCs, como outras células tronco, a seguir da administração a um indivíduo podem “orientar” a um ambiente favorável para seu crescimento e função. Tal “orientação” freqüentemente concentra as células em sítios onde elas são necessárias, tais como sítios de distúrbio, disfunção, ou doença imunes. Várias substâncias são conhecidas para estimular a orientação. Elas incluem fatores de crescimento e agentes de sinalização tróficos, tais como citocinas. Elas pode ser usadas para promover a orientação de MAPCs aos sítios terapeuticamente alvejados. Elas podem ser administradas a um indivíduo antes do tratamento com MAPCs, juntamente com MAPCs, ou depois que as MAPCs são administradas.

[0235] Certas citocinas, por exemplo, alteram ou afetam a migração de MAPCs ou suas contrapartes diferenciadas aos sítios em necessidade de terapia, tais como sítios imunocomprometidos. As citocinas que podem ser usadas sob este aspecto incluem, mas não são limitadas a, fator 1 derivado de célula estromal (SDF-1), fator de célula tronco (SCF), angiopoietina 1, fator de crescimento derivado de placenta (PIGF), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), citocinas que estimulam a expressão de moléculas de adesão endotelial tais como ICAMs e VCAMs, e citocinas que causam ou facilitam a orientação.

[0236] Elas podem ser administradas a um indivíduo como um pré tratamento, junto com MAPCs, ou depois que as MAPCs foram administradas, para promover orientação aos sítios desejados e para obter efeito terapêutico melhorado, por orientação melhorada ou por outros mecanismos. Tais fatores podem ser combinados com MAPCs em uma formulação adequada para que eles sejam administrados juntas. Alternativamente, tais fatores podem ser formulados e administrados separadamente.

[0237] A ordem de administração, formulações, doses, freqüência de dosagem, e vias de administração de fatores (tais como as citocinas debatidas acima) e MAPCs no geral variará com o distúrbio ou doença que é tratado, sua severidade, o indivíduo, outras terapias que estão sendo administradas, o estágio do distúrbio ou doença, e fatores prognósticos, entre outros. Regimes gerais que foram estabelecidos para outros tratamentos fornecem uma estrutura para determinar a dosagem apropriada em terapia adjuntiva ou direta mediada por MAPC. Estes, juntamente com a informação adicional fornecida aqui, permitirão que o técnico habilitado determine os procedimentos de administração apropriados de acordo com formas de realização da invenção, sem experimentação indevida. Vias

[0238] As MAPCs podem ser administradas a um indivíduo por qualquer uma de uma variedade de vias conhecidas àqueles habilitados na técnica que podem ser usadas para administrar células a um indivíduo.

[0239] Entre métodos que podem ser usados sob este aspecto em formas de realização da invenção estão métodos para administrar MAPCs por uma via parenteral. Vias de administração parenteral úteis em várias formas de realização da invenção incluem, entre outras, administração por injeção intravenosa, intraarterial, intracardíaca, intraespinhal, intratecal, intraóssea, intraarticular, intrasinovial, intracutânea, intradérmica, subcutânea, e/ou intramuscular. Em algumas formas de realização injeção intravenosa, intraarterial, intracutânea, intradérmica, subcutânea e/ou intramuscular são usadas. Em algumas formas de realização injeção intravenosa, intraarterial, intracutânea, subcutânea, e/ou intramuscular são usadas.

[0240] Em várias formas de realização da invenção as MAPCs são administradas por injeção sistêmica. A injeção sistêmica, tal como injeção intravenosa, oferece uma das vias mais simples e menos invasivas para administrar MAPCs. Em alguns casos, estas vias podem requerer doses de MAPC altas para a efetividade e/ou orientação ideais pelas MAPCs aos sítios alvo. Em uma variedade de formas de realização as MAPCs podem ser administradas por injeções alvejadas e/ou localizadas para garantir efeito ideal nos sítios alvo.

[0241] As MAPCs podem ser administradas ao indivíduo através de uma agulha hipodérmica por uma seringa em algumas formas de realização da invenção. Em várias formas de realização, as MAPCs são administradas ao indivíduo através de um cateter. Em uma variedade de formas de realização, as MAPCs são administradas por implantação cirúrgica. Ainda sob este aspecto, em várias formas de realização da invenção, as MAPCs são administradas ao indivíduo por implantação pelo uso de um procedimento artroscópico. Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas ao indivíduo dentro de ou sobre um suporte sólido, tal como um polímero ou gel. Em várias formas de realização, as MAPCs são administradas ao indivíduo em uma forma encapsulada.

[0242] Em formas de realização adicionais da invenção, as MAPCs são adequadamente formuladas para a liberação oral, retal, epicutânea, ocular, nasal, e/ou pulmonar e são administradas conseqüentemente. Dosagem

[0243] As composições podem ser administradas em dosagens e por técnicas bem conhecidas àqueles habilitados nas ciências médicas e veterinárias tomando em consideração tais fatores como a idade, sexo, peso, e condição do indivíduo particular, e a formulação que será administrada (por exemplo, sólido vs. líquido). Doses para seres humanos ou outros mamíferos podem ser determinadas sem experimentação indevida pelo técnico habilitado, a partir desta divulgação, dos documentos citados aqui, e do conhecimento no técnica.

[0244] A dose de MAPCs apropriada para ser usada de acordo com várias formas de realização da invenção dependerá de numerosos fatores. Ela pode variar consideravelmente por diferentes circunstâncias. Os parâmetros que determinarão doses ideais de MAPCs a serem administradas para a terapia primária e adjuntiva no geral incluirão alguns ou todos os que seguem: a doença que é tratada e seu estágio; as espécies do indivíduo, sua saúde, sexo, idade, peso, e taxa metabólica; a imunocompetência do indivíduo; outras terapias que são administradas; e complicações potenciais esperadas da história ou genótipo do indivíduo. Os parâmetros também podem incluir: se as MAPCs são singênicas, autólogas, alogênicas, ou xenogênicas; sua potência (atividade específica); o sítio e/ou distribuição que devem ser alvejados para que as MAPCs sejam eficazes; e tais características do sítio tais como acessibilidade a MAPCs e/ou enxerto de MAPCs. Parâmetros adicionais incluem co-administração com as MAPCs de outros fatores (tais como fatores de crescimento e citocinas). A dose ideal em uma situação dada também tomará em consideração o modo em que as células são formuladas, o modo que elas são administradas, e o grau ao qual as células serão localizadas nos sítios alvo a seguir da administração. Finalmente, a determinação de dosagem ideal necessariamente fornecerá uma dose eficaz que nem está abaixo do limiar de efeito benéfico máximo nem acima do limiar onde os efeitos deletérios associados com a dose de MAPCs pesam mais que as vantagens da dose aumentada.

[0245] A dose ideal de MAPCs para algumas formas de realização estará na faixa de doses usadas para a transplantação de medula óssea autóloga, mononuclear. Para preparações regularmente puras de MAPCs, doses ideais em várias formas de realização variarão de 104 a 108 células MAPC/kg de massa do receptor por administração. Em algumas formas de realização a dose ideal por administração estará entre 105 a 107 células MAPC/kg. Em muitas formas de realização a dose ideal por administração será de 5 x 105 a 5 x 106 células MAPC/kg. Por via de referência, doses mais altas no precedente são análogas às doses de células nucleadas usadas em transplantação de medula óssea mononuclear autóloga. Algumas das doses mais baixas são análogas ao número de células CD34+/kg usadas em transplantação de medula óssea mononuclear autóloga.

[0246] Deve ser avaliado que uma única dose pode ser liberada toda de uma vez, fracionariamente, ou continuamente durante um período de tempo. A dose inteira também pode ser liberada a um único local ou difundida fracionariamente sobre vários locais.

[0247] Em várias formas de realização, as MAPCs podem ser administradas em uma dose inicial, e depois mantidas por administração adicional de MAPCs. As MAPCs podem ser administradas por um método inicialmente, e depois administradas pelo mesmo método ou um ou mais métodos diferentes. Os níveis de MAPC do indivíduo podem ser mantidos pela administração contínua das células. Várias formas de realização administram as MAPCs inicialmente ou para manter seu nível no indivíduo ou ambos por injeção intravenosa. Em uma variedade de formas de realização, outras formas de administração, são usadas, dependendo da condição do indivíduo e outros fatores, debatidos em outra parte aqui.

[0248] É observado que indivíduos humanos são tratados no geral mais do que animais experimentais; mas, o tratamento no geral tem uma duração proporcional à duração do processo de doença e à efetividade do tratamento. Aqueles habilitados na técnica considerarão isto no uso dos resultados de outros procedimentos realizados em seres humanos e/ou em animais, tais como ratos, camundongos, primatas não humanos, e semelhantes, para determinar doses apropriadas para os seres humanos. Tais determinações, com base nestas considerações e considerando a orientação fornecida pela presente divulgação e pela técnica anterior permitirão que o técnico habilitado trabalhe deste modo sem experimentação indevida.

[0249] Regimes adequados para a administração inicial e outras doses ou para administrações seqüenciais podem todos ser os mesmos ou podem ser variáveis. Regimes apropriados podem ser determinados pelo técnico habilitado, a partir desta divulgação, dos documentos citados aqui, e do conhecimento na técnica.

[0250] A dose, freqüência, e duração do tratamento dependerá de muitos fatores, incluindo a natureza da doença, o indivíduo, e outras terapias que podem ser administradas. Conseqüentemente, uma variedade ampla de regimes podem ser usados para administrar MAPCs.

[0251] Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas a um indivíduo em uma dose. Em outras as MAPCs são administradas a um indivíduo em uma série de duas ou mais doses em sucessão. Em algumas outras formas de realização em que as MAPCs são administradas em uma única dose, em duas doses, e/ou mais do que duas doses, as doses podem ser as mesmas ou diferentes, e elas são administradas com intervalos iguais ou desiguais entre elas.

[0252] As MAPCs podem ser administradas em muitas freqüências em uma faixa ampla de tempos. Em algumas formas de realização, as MAPCs são administradas durante um período de menos do que um dia. Em outra forma de realização elas são administradas durante dois, três, quatro, cinco, ou seis dias. Em algumas formas de realização as MAPCs são administradas uma ou mais vezes por semana, durante um período de semanas. Em outras formas de realização elas são administradas durante um período de semanas por um a vários meses. Em várias formas de realização elas podem ser administradas durante um período de meses. Em outras elas podem ser administradas durante um período de um ou mais anos. No geral as durações do tratamento serão proporcionais à duração do processo de doença, à efetividade das terapias que são aplicadas, e à condição e resposta do indivíduo que é tratado. Usos Terapêuticos de MAPCs Imunomoduladoras

[0253] As propriedades imunomoduladoras de MAPCs podem ser usadas no tratamento de uma variedade ampla de distúrbios, disfunções e doenças, tais como aqueles que, intrinsecamente, como um efeito secundário ou como um efeito colateral de tratamento, apresentam-se com processos e efeitos deletérios do sistema imune. Várias ilustrações são debatidas abaixo.

[0254] Muitas formas de realização sob este aspecto envolvem a administração de MAPCs a um indivíduo que tem um sistema imune enfraquecido (ou comprometido), como a única terapia ou como terapia adjuntiva com um outro tratamento. Em uma variedade de formas de realização sob este aspecto as MAPCs são administradas a um indivíduo de maneira adjuntiva à terapia de radiação ou quimioterapia ou uma combinação de radiação e quimioterapias que foram, estão sendo, ou serão administradas ao indivíduo. Em muitas tais formas de realização, a terapia de radiação, quimioterapia, ou uma combinação de radiação e quimioterapias são parte de uma terapia de transplante. E em uma variedade de formas de realização as MAPCs são administradas para tratar uma resposta imune deletéria, tal como HVG ou GVHD.

[0255] Em uma variedade de formas de realização sob este aspecto, o indivíduo é o receptor de um transplante de célula do sangue ou célula da medula óssea, não singênico, tipicamente alogênico, o sistema imune do indivíduo foi enfraquecido ou extirpado por terapia de radiação, quimioterapia, ou uma combinação de radiação e quimioterapia, medicamentos imunossupressores estão sendo administrados ao indivíduo, o indivíduo está em risco para desenvolver ou desenvolveu doença do enxerto versus hospedeiro, e as MAPCs são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva a qualquer um ou mais do transplante, da terapia de radiação e/ou da quimioterapia, e os medicamentos imunossupressores para tratar, tal como melhorar, parar, ou eliminar, doença do enxerto versus hospedeiro no indivíduo. Neoplasmas

[0256] O termo “neoplasma” no geral denota distúrbios envolvendo a proliferação clonal de células. Os neoplasmas podem ser benignos, isto quer dizer, não progressivos e não recorrentes, e, neste caso, no geral não são potencialmente fatais. Os neoplasmas também podem ser malignos, isto quer dizer, que eles progressivamente pioram, difundem, e, como uma regra, são potencialmente letais e freqüentemente fatais.

[0257] Em várias formas de realização, as MAPCs são administradas a um indivíduo que sofre de um neoplasma, adjuntiva a um tratamento deste. Por exemplo, em algumas formas de realização da invenção sob este aspecto, o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um neoplasma de células do sangue ou da medula óssea e tem sofrido ou sofrerá um transplante de sangue ou medula óssea. Pelo uso dos métodos descritos aqui para isolamento, caracterização, e expansão de MAPC, juntamente com as divulgações aqui em propriedades imunossupressoras de MAPCs, as MAPCs são administradas para tratar, tal como para prevenir, suprimir, ou diminuir, as reações imunes deletérias, tais como HVG e GVHD, que podem complicar a terapia de transplantação.

[0258] Em uma variedade de formas de realização que envolvem terapias de transplante, as MAPCs podem ser usado sozinhas para um propósito imunossupressor, ou juntamente com outros agentes. As MAPCs podem ser administradas antes, durante, ou depois de um ou mais transplantes. Se administradas durante o transplante, as MAPCs podem ser administradas separadamente ou junto com o material transplantado. Se separadamente administradas, as MAPCs podem ser administradas seqüencial ou simultaneamente com os outros materiais transplantados. Além disso, as MAPCs podem ser administradas bem diante do transplante e/ou bem depois de, alternativamente a ou além da administração em ou aproximadamente ao mesmo tempo como a administração do transplante.

[0259] Outros agentes que podem ser usados em combinação com MAPCs, em terapias de transplantação em particular, incluem agentes imunomoduladores, tais como aqueles descritos em outra parte aqui, particularmente agentes imunossupressores, mais particularmente aqueles descritos em outra parte aqui, especialmente sob este aspecto, um ou mais de um corticosteróide, ciclosporina A, um composto imunossupressor semelhante à ciclosporina, azatioprina, ciclofosfamida, metotrexato, e um agente imunossupressor de anticorpo monoclonal.

[0260] Entre distúrbios neoplásicos de medula óssea que são tratados com MAPCs em formas de realização da invenção sob este aspecto estão distúrbios mieloproliferativos (“MPDs”); síndromes mielodisplásicas (ou estados) (“MDSs”), leucemias, e distúrbios linfoproliferativos incluindo mieloma múltiplo e linfomas.

[0261] MPDs são distinguidos por proliferação aberrante e autônoma de células na medula. O distúrbio pode envolver apenas um tipo de célula ou vários. Tipicamente, MPDs envolvem três linhagens celulares e são eritrocíticas, granulocíticas, e trombocíticas. O envolvimento das três linhagens varia de uma MPD a uma outra e entre ocorrências dos tipos individuais. Tipicamente, elas são diferentemente afetadas e uma linhagem celular é afetada predominantemente em um neoplasma dado. MPDs não são claramente malignas; mas, elas são classificadas como neoplasmas e são caracterizadas por aberrantes, de auto-replicação de células precursoras hematopoiéticas na medula. MPDs têm o potencial, entretanto, para desenvolverem em leucemias agudas.

[0262] MDSs como MPDs são distúrbios clonais, e elas são caracterizadas por aberrantes, de auto-replicação de células precursoras hematopoiéticas na medula. Como MPDs, elas podem desenvolver em leucemias agudas. A maioria, mas nem todas as MDSs manifestam citopenias sangüíneas periféricas (leucemia mielomonocítica crônica é a exceção), ao passo que MPDs não.

[0263] As manifestações laboratoriais e clínicas destes distúrbios pode variar com seu curso e entre ocorrências individuais. As manifestações podem sobrepor, e pode ser difícil fazer uma certa diagnose que distingue uma doença de todas as outras. A diagnose de neoplasmas de células da medula óssea hematopoiéticas assim requer cuidado especial, de modo a não diagnosticar mal como um distúrbio benigno um que é, na realidade, extremamente maligno.

[0264] As doenças que seguem estão entre os distúrbios mieloproliferativos (MPDs) que podem ser tratados com MAPCs, típica ou de maneira adjuntiva, em várias formas de realização da invenção: leucemia mielocítica crônica (“CML”)/leucemia granulocítica crônica (“CGL”), mielofibrose agnogênica, trombocitemia essencial, e policitemia rubra.

[0265] As doenças que seguem estão entre as síndromes mielodisplásicas (MDSs) que podem ser tratadas com MAPCs, típica ou de maneira adjuntiva, em várias formas de realização da invenção: anemia refratária, anemia refratária com sideroblastos anelados, anemia refratária com blastos em excesso, anemia refratária com blastos em excesso em transformação, e leucemia mielomonocítica crônica.

[0266] As doenças que seguem estão entre os distúrbios linfoproliferativos, incluindo mielomas múltiplos e linfomas que podem ser tratados com MAPCs, típica e de maneira adjuntiva, em várias formas de realização da invenção: leucemia linfoblástica aguda pré B, leucemia linfocítica crônica (“CLL”), linfoma de célula B, leucemia de célula pilosa, mieloma, mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda T, linfoma de célula T periférico, outras leucemias linfóides, e outros linfomas.

[0267] Também entre neoplasmas que podem ser tratados com MAPCs, típica e de maneira adjuntiva, em uma variedade de formas de realização da invenção estão os que seguem: um neoplasma benigno de células da medula óssea, um distúrbio mieloproliferativo, uma síndrome mielodisplásica, ou uma leucemia aguda; leucemia mielocítica crônica (“CML”) (também chamada leucemia granulocítica crônica (“CGL”)), mielofibrose agnogênica, trombocitemia essencial, policitemia rubra, outros distúrbios mieloproliferativos, mieloma múltiplo agudo, leucemia mieloblástica, leucemia pró mielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda pré B, leucemia linfocítica crônica (“CLL”), linfoma de célula B, leucemia de célula pilosa, mieloma, leucemia linfoblástica aguda T, linfoma de célula T periférica, outras leucemias linfóides, outros linfomas, ou outra leucemia aguda.

[0268] As MAPCs podem ser administradas de maneira adjuntiva a um tratamento para qualquer uma das doenças precedentes. Tratamentos que envolvem Imunoablação ou Comprometimento

[0269] Leucemias agudas freqüentemente são difíceis para tratar por métodos que foram eficazes para outras malignidades. Isto é parcialmente devido à mobilidade de células da medula óssea, incluindo aquelas de um neoplasma. Parcialmente ela pode ser devidos à distribuição difusa da medula óssea por todo o esqueleto. E parcialmente ela é devido, sem dúvida, à natureza das células propriamente ditas e sua transformação.

[0270] No momento, um tratamento padrão para malignidades hematológicas envolve a ablação de todas as células hematopoiéticas no indivíduo. Não existe nenhum modo para fazer isto sem também extirpando as células hematopoiéticas saudáveis do indivíduo. Tipicamente, o indivíduo é tratado pelo uso de quimiorradioterapia em doses suficientemente altas para matar virtualmente todas as células da medula óssea, tanto normais quanto neoplásicas. Os efeitos colaterais do tratamento são severos, e seus efeitos nos indivíduos são desagradáveis, dolorosos, e física e emocionalmente debilitantes. O tratamento não apenas extirpa o tecido e células doentes, mas ele também eviscera o sistema hematopoiético e sistema imune do indivíduo. O tratamento os deixam comprometidos, dependentes de transfusões, e deste modo altamente suscetíveis à infecção que mesmo uma exposição de outro modo menor a um agente infeccioso pode ser fatal.

[0271] A capacidade hematopoiética normal é restaurada depois por transplantes de sangue periférico ou medula óssea autólogos ou alogênicos. Infelizmente, o sistema imune do indivíduo não apenas é severamente comprometido pelo tratamento ablativo, mas, também no caso de transplantação alogênica, por imunossupressão intencional para impedir a rejeição do transplante e garantir o enxerto e proliferação nas novas células tronco hematopoiéticas que repopularão a medula do indivíduo e regenerarão os sistemas hematopoiéticos e imunes do indivíduo.

[0272] Muitas complicações foram encontradas na realização de tais transplantes para regenerar os sistemas hematopoiéticos e imunes em um hospedeiro imunocomprometido. Uma é a rejeição por células imuno competentes residuais e processos no hospedeiro, referida aqui como resposta HVG. Uma outra é provocada por células imunocompetentes no enxerto, referida aqui como GVHD.

[0273] Estas complicações podem ser evitadas pelo uso de material de doador singênico ou autólogo. Entretanto, doadores singênicos no geral são raros e transplantes autólogos têm um risco elevado de recorrência da doença. Por esta razão, transplantes no geral usam células e tecidos alogênicos obtidos de um doador compatível com HLA. Infelizmente este procedimento resulta em GVHD, que varia de suave a severa na preponderância daqueles que recebem esta forma de terapia. Se não pelo menos melhoradas, estas reações imunes resultarão na falha da terapia de transplante, e por si só podem ser fatais ao indivíduo.

[0274] Uma variedade de agentes foram desenvolvidos para suprimir respostas imunes que melhoram as complicações do enxerto, tais como HVG e GVHD, como debatido aqui acima. Alguns são suficientemente eficazes para reduzir reações imunes adversas a um nível manejável em algumas terapias de transplante, tais como transplantação da medula óssea e sangue periférico. Estes agentes melhoraram a prognose para indivíduos transplantados, a alguma extensão; mas, nenhum deles é completamente eficaz, e todos eles têm falhas preferivelmente substanciais.

[0275] Foi verificado (como descrito em maior detalhe em outra parte aqui) que as MAPCs não provocam uma resposta imune em hospedeiros alogênicos. A transplantação de MAPCs a um hospedeiro alogênico, assim, não causa rejeição ao enxerto alogênica (isto é, HVG).

[0276] Além disso, também foi verificado que as MAPCs alogênicas podem ser administradas a um hospedeiro em concentração alta sem efeitos deletérios na respiração.

[0277] Além disso, foi verificado, (como descrito em maior detalhe em outra parte aqui) que as MAPCs podem modular respostas imunes. Em particular sob este aspecto, foi verificado que as MAPCs podem suprimir respostas imunes, incluindo mas não limitadas a respostas imunes envolvidas, por exemplo, na resposta HVG e GVHD, para citar apenas duas. Ainda em um particular mais detalhado sob este aspecto, foi verificado que as MAPCs podem suprimir a proliferação de células T, mesmo na presença de células T estimuladoras potentes, tais como Concanavalina A e células estimuladoras alogênicas ou xenogênicas.

[0278] Além disso, foi verificado que mesmo quantidades relativamente pequenas de MAPCs podem suprimir estas respostas. De fato, apenas 3 % de MAPCs em reações de linfócito mistas é suficiente para reduzir a resposta de célula T em 50 % in vitro.

[0279] Conseqüentemente, as formas de realização da invenção fornecem composições e métodos e semelhantes para tratar, tais como para melhorar, e/ou curar ou eliminar, neoplasmas, tais como neoplasmas de células hematopoiéticas, particularmente aquelas da medula óssea.

[0280] Entre estes estão aqueles que são distúrbios mieloproliferativos (MPDs), tais como leucemia mielocítica crônica (também chamada “leucemia granulocítica crônica” e “CGL”), mielofibrose agnogênica, trombocitemia essencial, policitemia rubra; síndromes mielodisplásicas (MDSs), tais como anemia refratária, anemia refratária com sideroblastos anelados, anemia refratária com blastos em excesso, anemia refratária com blastos em excesso em transformação, leucemia mielomonocítica crônica; e neoplasmas claramente malignos - as leucemias agudas - tais como leucemia mieloblástica aguda, leucemia mielogenosa crônica (CML), leucemia pró mielocítica aguda, leucemia linfoblástica aguda B, CLL, linfoma de célula B, leucemia de célula pilosa, mieloma, leucemia linfoblástica aguda T, linfoma de célula T periférica, e outras leucemias linfóides e linfomas.

[0281] As MAPCs podem ser administradas de maneira adjuntiva a um tratamento para qualquer uma das doenças precedentes. Anemias e Outros Distúrbios do Sangue

[0282] Em várias formas de realização da invenção, as MAPCs podem ser usadas para tratar uma anemia ou outro distúrbio do sangue, freqüentemente de modo adjuntivo. Entre várias formas de realização sob este aspecto são formas de realização em que as MAPCs são usadas para tratar as anemias e/ou distúrbios do sangue que seguem, unicamente ou, tipicamente, de maneira adjuntiva: hemoglobinopatias, talassemia, síndrome do definhamento da medula óssea, anemia de célula falsiforme, anemia aplásica, ou uma anemia hemolítica imune. Também, os distúrbios incluem anemia refratária, anemia refratária com sideroblastos anelados, anemia refratária com blastos em excesso, anemia refratária com blastos em excesso em transformação, leucemia mielomonocítica crônica, ou outra síndrome mielodisplásica, e em algumas formas de realização, anemia de Fanconi.

[0283] As MAPCs podem ser administradas de maneira adjuntiva a um tratamento para qualquer uma das doenças precedentes. Doenças Imunes

[0284] As formas de realização da invenção dizem respeito ao uso de imunomodulação de MAPC para tratar uma disfunção, distúrbio, ou doença imunes, unicamente, ou como uma terapia adjuntiva. Formas de realização sob este aspecto dizem respeito a deficiências imunes congênitas e disfunções, distúrbios, e doenças autoimunes. Várias formas de realização, sob este aspecto, dizem respeito ao uso de MAPCs para tratar, unicamente ou de maneira adjuntiva, doença de Crohn, síndrome de Guillain-Barre, lúpus eritematoso (também chamado “SLE” e lúpus eritematoso sistêmico), esclerose múltipla, miastenia grave, neurite óptica, psoríase, artrite reumatóide, doença de Graves, doença de Hashimoto, tireoidite de Ord, diabete melito (tipo 1), síndrome de Reiter, hepatite autoimmune, cirrose biliar primária, síndrome do anticorpo antifosfolipídeo (“APS”), síndrome de opsoclonus-mioclonus (“OMS”), arterite temporal, encefalomielite disseminada aguda (“ADEM” e “ADE”), síndrome de Goodpasture, granulomatose de Wegener, doença celíaca, pênfigo, poliartrite, e anemia hemolítica autoimune quente.

[0285] Formas de realização particulares entre estas dizem respeito à doença de Crohn, lúpus eritematoso (também chamado “SLE” e lúpus eritematoso sistêmico), esclerose múltipla, miastenia grave, psoríase, artrite reumatóide, doença de Graves, doença de Hashimoto, diabete melito (tipo 1), síndrome de Reiter, cirrose biliar primária, doença celíaca, poliartrite, e anemia hemolítica autoimune quente.

[0286] Além disso, as MAPCs são usadas em uma variedade de formas de realização sob este aspecto, unicamente e, tipicamente, de maneira adjuntiva, para tratar uma variedade de doenças consideradas terem um componente autoimune, incluindo mas não limitadas às formas de realização que podem ser usadas para tratar endometriose, cistite intersticial, neuromiotonia, esclerodermia, esclerodermia sistêmica progressiva, vitiligo, vulvodinia, doença de Chagas, sarcoidose, síndrome da fadiga crônica, e disautonomia.

[0287] Os distúrbios hereditários do sistema imune incluem Imunodeficiência Combinada Severa (SCID) incluindo mas não limitada a SCID com Deficiência de Adenosina Desaminase (ADA-SCID), SCID que é X-ligado, SCID com ausência de Células T & B, SCID com ausência de Células T, Células B Normais, Síndrome de Omenn, Neutropenias incluindo mas não limitadas a Síndrome de Kostmann, Mielocatexia; AtaxiaTelangiectasia, Sindrome do Linfócito Nu, Imunodeficiência Variável Comum, Síndrome de DiGeorge, Deficiência de Adesão de Leucócito; e Distúrbios de fagócitos (fagócitos são células do sistema imune que podem ingerir e matar organismos estranhos) incluindo mas não limitados à Síndrome de Chediak-Higashi, Doença Granulomatosa Crônica, Deficiência de Actina em Neutrófilo, Disgênese Reticular.

[0288] As MAPCs podem ser administradas de maneira adjuntiva a um tratamento para qualquer uma das doenças precedentes. Doenças Inflamatórias

[0289] Adicionalmente, em uma variedade de formas de realização da invenção, as MAPCs podem ser usadas para tratar a doenças inflamatórias, como um único agente ou de maneira adjuntiva. Em muitas tais formas de realização as MAPCs podem ser usadas para tratar estados inflamatórios sérios, tais como aqueles que surgem de reação alérgica aguda, ou auxiliares a outras doenças ou tratamentos. Na maioria dos casos, no momento, o uso de MAPCs sob este aspecto é limitado aos casos agudos em que o indivíduo está em risco de grande incapacidade ou perda ou vida.

[0290] As MAPCs podem ser administradas de maneira adjuntiva a um tratamento para qualquer uma das doenças precedentes. MAPCs como Descrito na Patente U. S. No 7.015.037

[0291] As MAPCs humanas são descritas na técnica. Os métodos de isolamento de MAPC para seres humanos e camundongo são conhecidos na técnica. Portanto agora é possível para uma pessoa de habilidade na técnica obter aspirados de medula óssea, biópsias do cérebro ou fígado, e outros órgãos, e isolar as células pelo uso de técnicas de seleção positivas ou negativas disponíveis àqueles de habilidade no ramo, que contam com os genes que são expressados (ou não expressados) nestas células (por exemplo, por ensaios funcionais ou morfológicos tais como aqueles divulgados nos pedidos de referência acima, que foram incorporados aqui por referência). Tais métodos são descritos, por exemplo, na Patente U. S. No 7.015.037, os conteúdos da qual são incorporados aqui por referência para sua descrição de MAPCs e métodos de preparação. Isolamento e Crescimento de MAPCs como descrito em PCT/US00/21387

[0292] Os métodos de isolamento de MAPC para seres humanos e camundongo são conhecidos na técnica. Eles são descritos, por exemplo, na Patente U S No 7.015.037, PCT/US00/21387 (publicado como WO 01/11011), e PCT/US02/04652 (publicado como WO 02/064748), e estes métodos, junto com a caracterização de MAPCs divulgada nesta, são incorporados aqui por referência.

[0293] As MAPCs foram inicialmente isoladas da medula óssea, mas foram subseqüentemente estabelecidas de outros tecidos, incluindo cérebro e músculo (Jiang, Y. et al., 2002). Assim, as MAPCs podem ser isoladas de fontes múltiplas, incluindo sangue da medula óssea, placenta, cordão umbilical e medula espinhal, músculo, cérebro, fígado, cordão espinhal, sangue ou pele. Por exemplo, as MAPCs podem ser derivadas de aspirados da medula óssea, que podem ser obtidos por meios padrão disponíveis àqueles de habilidade na técnica (ver, por exemplo, Muschler, G. F., et al., 1997; Batinic, D., et al., 1990). Fenótipo de MAPCs Humanas Sob Condições Descritas na Patente U. S. No 7.015.037

[0294] A análise imunofenotípica por FACS de MAPCs humanas obtidas depois de 22 a 25 duplicações celulares indicou que as células não expressam CD31, CD34, CD36, CD38, CD45, CD50, CD62E e - P, HLA-DR, Muc18, STRO-1, cKit, Tie/Tek; e expressam níveis baixos de CD44, HLA classe I, e β2-microglobulina, mas expressam CD10, CD13, CD49b, CD49e, CDw90, Flk1 (N > 10).

[0295] Uma vez que as células sofreram > 40 duplicações em culturas semeadas novamente em cerca de 2 x 103/cm2, o fenótipo tornou- se mais homogêneo, e nenhuma célula expressou HLA classe I ou CD44 (n = 6). Quando as células foram cultivadas em confluência mais alta, elas expressaram níveis altos de Muc18, CD44, HLA classe I e β2- microglobulina, que é similar ao fenótipo descrito para MSC (N = 8) (Pittenger, 1999).

[0296] A imunoistoquímica mostrou que as MAPCs humanas cultivadas em cerca de 2 x 103/cm2 de densidade de semeadura expressaram EGF-R, TGF-R1 e -2, BMP-R1A, PDGF-R1a e -B, e que uma subpopulação pequena (entre 1 e 10 %) de MAPCs mancharam com anticorpos anti-SSEA4 (Kannagi, R, 1983).

[0297] Pelo uso de arranjos de cDNA Clontech o perfil de gene expressado de MAPCs humanas cultivadas em densidades de semeadura de cerca de 2 x 103 células/cm2 para 22 e 26 duplicações celulares foi determinado:

[0298] A. As MAPCs não expressaram CD 31, CD 36, CD 62E, CD 62P, CD 44-H, cKit, Tie, receptores para IL 1, IL 3, IL 6, IL 11, G CSF, GM-CSF, Epo, Flt3-L, ou CNTF, e níveis baixos de mRNA de HLA classe I, CD 44-E e Muc-18.

[0299] B. As MAPCs expressaram mRNA para as citocinas BMP1, BMP5, VEGF, HGF, KGF, MCP1; os receptores de citocina Flk1, EGF-R, PDGF-R1α, gp130, LIF-R, activina-R1 e -R2, TGFR-2, BMP-R1A; os receptores de adesão CD 49c, CD 49d, CD 29; e CD 10.

[0300] C. As MAPCs expressaram mRNA para hTRT e TRF1; o fator de transcrição de domínio de POU oct 4, sox 2 (requerido com oct 4 para manter o estado indiferenciado de ES/EC, Uwanogho D., 1995), sox 11 (desenvolvimento neural), sox 9 (condrogênese) (Lefebvre V., 1998); fatores de transcrição de homeodomínio: Hox-a4 e -a5 (especificação do esqueleto cervical e torácico; organogênese do trato respiratório) (Packer AI, 2000), Hox-a9 (mielopoiese) (Lawrence H, 1997), Dlx4 (especificação de prosencéfalo e estruturas periféricas da cabeça) (Akimenko MA, 1994), MSX1 (mesoderma embrionário, coração e músculo de adulto, condro- e osteogênese) (Foerst-Potts L. 1997), PDX1 (pâncreas) (Offield MF, 1996).

[0301] D. A presença de mRNA de oct 4, LIF-R, e hTRT foi confirmada por RT-PCR.

[0302] E. Além disso, RT-PCR mostrou que mRNA de rex 1 e mRNA de rox 1 foram expressados em MAPCs.

[0303] Oct 4, rex 1 e rox 1 foram expressados em MAPCs derivadas de medula humana e de murino e a partir do fígado e cérebro de murino. As MAPCs humanas expressaram LIF-R e foram manchadas positivamente com SSEA 4. Finalmente, níveis de mRNA de oct 4, LIF-R, rex 1 e rox 1 foram verificados aumentar em MAPCs humanas cultivadas além de 30 duplicações celulares, que resultaram em células fenotipicamente mais homogêneas. Ao contrário, as MAPCs cultivadas em densidade alta perderam a expressão destes marcadores. Isto foi associado com a senescência antes de 40 duplicações celulares e perda de diferenciação para células exceto os condroblastos, osteoblastos, e adipócitos. Assim, a presença de oct 4, combinado com rex 1, rox 1, e sox 2, correlacionou com a presença das células mais primitiva em culturas de MAPCs.

[0304] Os métodos para cultivar as MAPCs são bem conhecidos na técnica. (Ver por exemplo, Patente U. S. No 7.015.037, que é aqui incorporada por referência como para os métodos para cultivar as MAPCs.) A densidade para cultivar as MAPCs pode variar de cerca de 100 células/cm2 ou cerca de 150 células/cm2 a cerca de 10.000 células/cm2, incluindo cerca de 200 células/cm2 a cerca de 1500 células/cm2 a cerca de 2000 células/cm2. A densidade pode variar entre as espécies. Adicionalmente, a densidade ideal pode variar dependendo das condições de cultura e da fonte de células. Isto está dentro da habilidade do técnico habitual para determinar a densidade ideal para um conjunto dado de condições de cultura e células.

[0305] Também, as concentrações de oxigênio atmosféricas eficazes de menos do que cerca de 10 %, incluindo cerca de 3 a 5 %, podem ser usadas em qualquer tempo durante o isolamento, crescimento, e diferenciação de MAPCs em cultura.

[0306] A presente invenção é adicionalmente descrita por via dos Exemplos ilustrativos, não limitantes que seguem. EXEMPLOS EXEMPLO 1: MAPCs humanas (a partir de Células Mononucleares da Medula Óssea)

[0307] As células mononucleares da medula óssea foram obtidas a partir de aspirados de medula óssea a partir da crista ilíaca posterior de > 80 voluntários humanos saudáveis. Dez a 100 centímetros cúbicos da medula óssea foram obtidos de cada indivíduo. As células mononucleares (“MNCs”) foram obtidas da medula óssea por centrifugação em um gradiente de densidade de Ficoll-Paque (Sigma Chemical Co., St Louis, MO). As MNCs da medula óssea foram incubadas com micropérolas de CD 45 e Glicoforina A (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA) durante 15 minutos e células CD 45+ GlyA+ removidas colocando-se a amostra na frente de um ímã SuperMACS. As células eluídas são 99,5 % de CD 45- GlyA-.

[0308] A supressão de células CD 45+ GlyA+ resultou na recuperação de células CD 45- GlyA- que constituíram aproximadamente 0,05 a 0,10 % das células mononucleares da medula óssea totais. As células foram selecionadas que não expressam o antígeno de leucócito comum CD 45, ou o marcador do precursor de eritróide glicoforina A (GlyA). As células CD 45- GlyA- constituem 1/103 células mononucleares da medula. As células CD 45- GlyA- foram plaqueadas em reservatórios revestidos com fibronectina em 2 % de FCS, EGF, PDGF-BB, dexametasona, insulina, ácido linoleico, e ácido ascórbico. Depois de 7 a 21 dias, grupos pequenos de células aderentes desenvolveram-se. Pelo uso de ensaios de diluição limitantes, a freqüência de células que dão origem a estes grupos aderentes é 1/5 x 103 células CD 45- GlyA-. Quando as colônias apareceram (cerca de 103 células), as células foram recuperadas por tripsinização e plaqueadas novamente a cada 3 a 5 dias em uma diluição de 1:4 sob as mesmas condições de cultura. As densidades das células foram mantidas entre 2 a 8 x 103 células/cm2. EXEMPLO 2: MAPCs de Camundongo

[0309] Todos os tecidos foram obtidos de acordo com normas de procedimento da University of Minnesota IACUC. As células mononucleares de BM (BMMNC) foram obtidas por separação de Ficoll Hypaque. A BM foi obtida de camundongos ROSA26 ou camundongos C57/BL6 de 5 a 6 semanas de idade. Alternativamente, o tecido do músculo e cérebro foi obtido de 129 camundongos de 3 dias de idade. Os músculos das partes proximais de membros anteriores e posteriores foram cortados e completamente picados. O tecido foi tratado com 0,2 % de colagenase (Sigma Chemical Co., St Louis, MO) durante 1 hora a 37 ° C, seguido por 0,1 % de tripsina (Invitrogen, Grand Island, NY) durante 45 minutos. As células depois foram trituradas vigorosamente e atravessaram um filtro de 70 μm. Suspensões de célula foram coletadas e centrifugadas durante 10 minutos a 1600 rpm. O tecido do cérebro foi dissecado e picado completamente. As células foram dissociadas por incubação com 0,1 % de tripsina e 0,1 % de DNAse (Sigma) durante 30 minutos a 37 ° C. As células depois foram trituradas vigorosamente e atravessaram um filtro de 70 μm. Suspensões de célula foram coletadas e centrifugadas durante 10 minutos a 1600 rpm.

[0310] Suspensões de BMMNC ou músculo ou cérebro foram plaqueadas a 1 x 105/cm2 em meio de expansão [2 % de FCS em meio essencial mínimo de Dulbecco com baixo teor de glicose (LG-DMEM), 10 ng/ml de cada um de fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e fator inibitório de leucemia (LIF)] e mantidas a 5 x 103/cm2. Depois de 3 a 4 semanas, as células recuperadas por tripsina/EDTA foram suprimidas de células CD 45+ GlyA+ com pérolas micromagnéticas. As células CD 45-G1yA- resultantes foram plaqueadas novamente a 10 células/reservatório em placas de 96 reservatórios revestidas com FN e foram expandidas em densidades de célula entre 0,5 e 1,5 x 103/cm2. O potencial de expansão de MAPCs foi similar não obstante do tecido a partir do qual elas foram derivadas. EXEMPLO 3: MAPCs de Rato

[0311] BM e MNCs de ratos Sprague Dawley, Lewis, ou Wistar foram obtidas e plaqueadas sob condições similares àquelas descritas para as mMAPCs. EXEMPLO 4: Clonalidade de MAPCs de Camundongo e Rato

[0312] Para demonstrar que as células diferenciadas foram derivadas de célula única e MAPCs são de fato células multipotentes “clonais”, culturas foram feitas em que as MAPCs foram transduzidas com um vetor retroviral. As MAPCs indiferenciadas e sua progênie foram descobertas terem o retrovírus inserido no mesmo sítio no genoma.

[0313] Estudos foram feitos pelo uso de duas MAPCs de ROSA26 independentemente derivadas, duas MAPCs de C57BL/6, e uma população de rMAPC expandida para 40 a > 90 PDs, assim como com o camundongo “clonal” transduzido em eGFP e rMAPCs “clonais”. Nenhuma diferença foi observada entre células transduzidas e não transduzidas em eGFP. De nota, a expressão de eGFP persistiu em MAPCs diferenciadas.

[0314] Especificamente, BMMNCs de murino e rato cultivadas em FN com EGF, PDGF-BB, e LIF durante três semanas foram transduzidas em dois dias seqüenciais com um vetor oncorretroviral de eGFP. Mais tarde, células CD 45+ e GlyA+ foram suprimidas e as células sub- cultivadas em 10 células/reservatório. BMMNCs de rato transduzidas em eGFP foram expandidas para 85 PDs. Alternativamente, as MAPCs de camundongo expandiram para 80 PDS foram usadas. Subculturas de MAPCs indiferenciadas foram geradas por plaqueamento de 100 MAPCs a partir de culturas mantidas para 75 PDs e expandindo-as novamente a > 5 x 106 células. As MAPCs expandidas foram induzidas para diferenciar in vitro ao endotélio, neuroectoderma, e endoderma. A diferenciação da linhagem foi mostrada por manchamento com anticorpos específicos para estes tipos de célula. EXEMPLO 5: MAPCs Humanas não são Imunogênicas

[0315] Células tronco mesenquimais demonstraram imunogenicidade baixa in vitro e a capacidade para enxertar através de receptores alogênicos (Di Nicola, M. et al. (2002) Blood 99: 3838 a 3843; Jorgensen, C. et al. (2002) Gene Therapy 10: 928 a 931; Le Blanc, K. et al. (2003) Scandinavian Journal of Immunology 57: 11 a 20; McIntosh, K. et al. (2000) Graft 6: 324328; Tse, W. et al. (2003) Transplantation 75: 389 a 397).

[0316] A Figura 3 mostra que as MAPCs humanas exibiram imunogenicidade in vitro baixa e são imunossupressoras quando adicionadas a MLRs de célula T potentes diferentes (Tse, W. et al. (2003)). Os resultados foram compatíveis através de todos os pares de doador e respondedor testados.

[0317] As células respondedoras e estimuladoras foram preparadas para estes experimentos e as MLRs foram realizadas de acordo com os procedimentos descritos por Tse, W. et al. (2003). EXEMPLO 6: MAPCs Modulam as Respostas de Célula T

[0318] A capacidade de MAPCs para modular, e neste caso suprimir, a responsividade imune é ilustrada por ensaios de proliferação de célula T, por exemplo, que podem ser realizados como segue. Preparação de Células T Respondedoras

[0319] As células respondedoras foram preparadas a partir de linfonodos de ratos de Lewis. Os linfonodos foram cirurgicamente removidos dos ratos e imediatamente colocados em 3 a 5 ml de meios (RPMI completo ou DMEM completo) em placas de Petri de 60 x 15 mm. Os linfonodos foram dispersados através de um filtro de náilon (pelo uso do êmbolo manual de uma seringa). As dispersões foram carregadas em tubos de 50 ml e centrifugadas a 1.250 rpm durante 8 minutos. Os sobrenadantes resultantes (meios) foram descartados. As pelotas (contendo as células) foram recolocadas em suspensão em meios frescos (RPMI completo ou DMEM completo). As células foram lavadas três vezes, e depois recolocadas em suspensão em meios frescos. As densidades da célula recolocada em suspensão foram determinadas contando-se o número de células em um volume conhecido desta. As células foram mantidas em gelo. Antes do uso, as células foram recolocadas em suspensão em meios (RPMI completo ou DMEM completo) em uma densidade de 1,25 x 106 células/ml. Preparação de MAPCs

[0320] As MAPCs foram preparadas a partir de ratos de Lewis ou a partir de ratos Sprague-Dawley e depois congeladas como descrito acima. Elas foram descongeladas e depois irradiadas a 3000 rad. As células irradiadas depois foram recolocadas em suspensão em meios (RPMI completo ou DMEM completo) até as densidades de 0,4 x 106 células/ml, 0,8 x 106 células/ml, e 1,6 x 106 células/ml. Preparação de Concanavalina A

[0321] A Concanavalina A (“ConA”) foi usada para ativar as células T. A ConA foi dissolvida em PBS (RPMI completo ou DMEM completo) até concentrações finais de 0 (PBS apenas) 10, 30, e 100 μg/ml. Procedimento de Ensaio

[0322] Cada ponto de dados é fundamentado em pelo menos três determinações.

[0323] 20 μl de cada uma das soluções de ConA foram adicionados aos reservatórios de placas microtituladoras (96 reservatórios, fundo plano), seguido por 80 μl/reservat0rio das células respondedoras e 100 μl/reservat0rio das MAPCs. As placas foram incubadas a 37 ° C em incubadoras umedecidas sob 5 % de CO2 durante 4 a 5 dias. As placas foram pulsadas com 1 μCi/reservat0rio de 3H timidina durante as últimas 14 a 18 horas de cultura. Depois, as células foram automaticamente colhidas em filtros de fibra de vidro pelo uso de uma máquina de colheita Tomtec. A captação de timidina foi quantificada em um contador de cintilação de micro- placa. Os resultados foram expressados como contagens médias por minuto (CPM) +/- SD.

[0324] As concentrações finais de ConA nos meios de crescimento nos reservatórios foram de 0, 1, 3,16, e 10 μg/ml. As MAPCs estavam presentes nos reservatórios nas quantidades de 0, 0,4, 0,8, e 1,6 x 105 células/reservatório.

[0325] Os resultados, descritos abaixo, são ilustrados na Figura 4. Resultados

[0326] Quantidades crescentes de ConA resultaram em um estímulo dependente de dose da proliferação de célula T (Figura 4, LN apenas). As MAPCs de Lewis inibiram a proliferação das células T estimuladas por ConA. A inibição dependeu da dose de MAPCs. A inibição máxima, 50 %, ocorreu na dose mais alta de MAPCs usadas nestes experimentos e com doses baixas e intermediárias de ConA. Estes resultados são exibidos graficamente na Figura 4 e mostram que as MAPCs suprimem a proliferação de células T ativadas. EXEMPLO 7: MAPCs Suprimem a Proliferação de Células T Estimuladas

[0327] A capacidade de MAPCs para suprimir a proliferação de respostas proliferativas de célula T singênicas e não combinadas (alogênicas) é demonstrada pelos resultados de reações de linfócito mistas. O exemplo abaixo mostra os efeitos supressivos de MAPCs em células T de ratos de Lewis estimuladas por esplenócitos irradiados a partir de ratos DA. MAPCs de ratos de Lewis singênicos e ratos Sprague- Dawley não combinados (alogênicos) ambas inibiram respostas de célula T em uma maneira dependente de dose. Os experimentos foram realizados como segue. Preparação de Células T Respondedoras

[0328] As células respondedoras foram preparadas a partir dos linfonodos de ratos de Lewis como descrito acima. Células Estimuladoras de Baço Irradiadas

[0329] Os baços foram cirurgicamente removidos dos ratos DA. Os esplenócitos depois foram isolados dos baços essencialmente como descrito acima para o isolamento de células respondedoras a partir dos linfonodos de ratos de Lewis. As células de baço isoladas foram irradiadas a 1800 rad. As células depois foram recolocadas em suspensão a 4 x 106/ml e mantidas em gelo até que elas fossem usadas. Preparação de MAPCs

[0330] As MAPCs singênicas foram preparadas a partir de ratos de Lewis como descrito acima. As MAPCs não combinadas (alogênicas) foram preparadas a partir de ratos Sprague-Dawley do mesmo modo. Tanto MAPCs de Lewis quanto Sprague-Dawley foram irradiadas a 3000 rad, depois recolocadas em suspensão em meio RPMI completo em densidades de 0,03 x 106/ml, 0,06 x 106/ml, 0,125 x 106/ml, 0,25 x 106/ml, 0,5 x 106/ml, 1 x 106/ml, e 2 x 106/ml. Procedimento de Ensaio

[0331] Os reservatórios de placa microtituladora de 96 reservatórios foram carregados com: 100 μl de MAPCs (nas diluições indicadas acima) ou 100 μl de meio; 50 μl de um estoque de célula estimuladora ou controle; 50 μl de cada um de um estoque de célula respondedora ou controle; e meios (RPMI completo ou DMEM completo) conforme necessário para igualar volumes totais a um volume final de 200 μl/reservat0rio. Placas microtituladoras de fundo plano de 96 reservatórios foram usadas para todos os ensaios.

[0332] Cada ponto de dados é fundamentado em pelo menos três determinações.

[0333] As placas foram incubadas a 37 ° C em incubadoras umedecidas sob 5 % de CO2 durante 45 dias. As placas foram pulsadas com 1 μCi/reservat0rio de 3H timidina durante as últimas 14 a 18 horas de cultura. Depois, as células foram automaticamente colhidas em filtros de fibra de vidro pelo uso de uma máquina de colheita Tomtec. A captação de timidina foi quantificada em um contador de cintilação de micro-placa. Os resultados foram expressados como contagens médias por minuto (CPM) +/- SD. Resultados

[0334] A exposição de células T derivadas dos linfonodos de ratos de Lewis (Respondedores) a células estimuladoras que consistem de esplenócitos irradiados a partir de ratos DA (Estimuladores) resultou em respostas proliferativas muito robustas de células respondedoras, como mostrado nas Figuras 5A e 5B, para “nenhuma MAPC”.

[0335] A adição de doses crescentes de MAPCs de Lewis singênicas (Figura 5A) e MAPCs de Sprague-Dawley de terceira parte não combinadas (alogênicas) (Figura 5B) resultou em uma inibição significante e dependente de dose da ativação de célula T. Níveis máximos de inibição foram ~ 80 %. Mesmo nas doses mais baixas de MAPCs, houve 40 a 50 % de inibição.

[0336] Não houve nenhuma incorporação de 3H timidina nos controles, mostrando que a incorporação foi devido unicamente à proliferação de células T respondedoras ativadas, como mostrado nas Figuras 5A e 5B.

[0337] Em resumo, os resultados mostram que as MAPCs singênicas e de terceira parte (alogênicas) suprimem a proliferação de célula T mesmo na presença de esplenócitos ativadores potentes de ratos não combinados. Nestes experimentos, a inibição chegou ao ponto máximo quando houve números similares (200.000 células) de cada um dos estimuladores, respondedores, e MAPCs na reação.

[0338] Sob estas condições, houve ~ 80 % de inibição. Houve inibição muito substancial em razões muito mais baixas de MAPCs para as outras células na reação. Por exemplo, em 1,5 % de MAPCs, houve 50 % de inibição (3.000 MAPCs versus 200.000 de cada um dos tipos de células). Os resultados demonstram não apenas que as MAPCs têm um efeito imunossupressor forte, mas também que um número relativamente pequeno de MAPCs é suficiente para inibir um número relativamente grande de células T competentes mesmo na presença de ativadores de célula T muito potentes. EXEMPLO 8: MAPCs São Seguras

[0339] O risco imediato principal de injeção intravenosa de grandes números de células é o acúmulo de grupos de célula nos pulmões que resulta em angústia respiratória e pode causar parada cardíaca. Para mostrar a segurança de MAPCs sob este aspecto, nós medimos os efeitos de injeção intravenosa de MAPCs em taxa respiratórias em ratos Buffalo.

[0340] As MAPCs foram preparadas a partir de ratos de Lewis como descrito acima (“MAPCs de Lewis”). Os esplenócitos também foram preparados a partir de ratos de Lewis como descrito acima para o uso como controles (“Esplenócitos de Lewis”).

[0341] Um rato de Lewis fêmea serviu como o doador de esplenócito para cada grupo (condição experimental). Dois ratos Buffalo fêmeas foram usadas como receptores para cada grupo (condição experimental).

[0342] As células foram administradas aos ratos como indicado abaixo. Os dados são exibidos graficamente na Figura 6. A concordância de pontos de dados aos ratos individuais como numerado abaixo é enumerada na legenda vertical no lado direito da Figura 6. Todos os ratos foram ratos Buffalo. 1,1, 1,210 x 106 MAPC de Lewis por rato 2,1, 2,25 x 106 MAPC de Lewis por rato 3,1, 3,22,5 x 106 MAPC de Lewis por rato 4,1, 4,21,2 x 106 MAPC de Lewis por rato 5,1, 5,210 x 106 Esplenócitos de Lewis por rato 6,1, 6,25 x 106 Esplenócitos de Lewis por rato 7,1, 7,22,5 x 106 Esplenócitos de Lewis por rato 8,1, 8,21,2 x 106 Esplenócitos de Lewis por rato

[0343] Como indicado acima, os ratos foram injetados com 1,2, 2,5, 5, ou 10 milhões de MAPCs ou 1,2, 2,5, 5, ou 10 milhões de esplenócitos. Isto correspondeu a 5, 10, 25, ou 50 milhões de células/kg. As taxas respiratórias foram medidas antes (0 min) e em 1, 5, e 10 min depois da injeção intravenosa das MAPCs ou esplenócitos. As taxas respiratórias foram medidas durante 20 segundos e as contagens foram multiplicadas por 3 para derivar as taxas respiratórias por minuto. As taxas respiratórias de rato normais estão entre 60 e 140/min. Resultados

[0344] Todos os animais sobreviveram depois de injeções de célula intravenosas. Nenhuma diferença ou tendência significante foi observada nas taxas respiratórias sob as condições diferentes. Os resultados são mostrados na Figura 6. Taxas respiratórias iniciais (0 min) foram levemente reduzidas porque os animais foram anestesiados antes que as células fossem injetadas. Em cada ponto no tempo, medições foram agrupadas sem nenhuma tendência aparente.

[0345] Em resumo, a injeção intravenosa de 5 a 50 milhões de MAPCs/kg não causou nenhuma mudança em taxas respiratórias ou mortalidade em qualquer um dos ratos sob qualquer uma das condições. Os resultados mostram que a injeção intravenosa de MAPCs é segura mesmo em doses altas. EXEMPLO 9: Expressão de MAPC de Marcadores Imunes

[0346] A natureza imunomoduladora de MAPCs foi caracterizada ainda determinando-se marcadores reguladores imunes em MAPCs, tais como aqueles descritos por Barry et al. (2005). Os marcadores foram determinados pelo uso de anticorpos específicos do marcador e análise de FACS.

[0347] As MAPCs da medula óssea de rato foram isoladas, cultivadas, e colhidas como descrito acima. Para a análise de FACS, as células foram colocadas em suspensão em 1 a 2 x 108 células/ml em PBS. 200 μl da suspensão de célula foram adicionado a cada um de uma série de tubos de polipropileno 12 x 75. Um anticorpo específico do marcador ou um controle foi adicionado a cada um dos tubos, e eles depois foram incubados durante 15 a 20 minutos na temperatura ambiente. No final do período de incubação, 2 ml de PBS foram adicionados a cada tubo e eles depois foram centrifugados a 400 x g durante 5 minutos. Sobrenadantes foram descartados e as células foram recolocadas em suspensão em cada tubo em 100 μl de PBS. Um anticorpo secundário rotulado fluorescente foi adicionado a cada tubo em um volume apropriado, e os tubos foram novamente incubados durante 15 a 20 minutos na temperatura ambiente, este tempo no escuro. Depois, 2 ml de PBS foram adicionados a cada tubo e eles foram novamente centrifugados a 400 x g durante 5 minutos. Os sobrenadantes foram descartados, e as células em cada tubo foram recolocadas em suspensão em 200 μl de PBS e depois foram mantidas em gelo até que analisadas por FACS.

[0348] Os resultados são enumerados e apresentados graficamente na Tabela 1. Como mostrado na tabela, as MAPCs de rato são: (a) positivas para MHC classe I, CD 11c, CD 29, e CD 90, e (b) negativas para MHC classe II, CD 11b, CD 31, CD 40, CD 45, CD 54, CD 80, CD 86, CD 95, e CD 106. Os resultados negativos foram validados para cada anticorpo por manchamento positivo de células de controle, incluindo células do sangue periférico e endoteliais de rato. Estes padrões de expressão de marcador, como para ambos os marcadores que são detectados em MAPCs e aqueles que não foram detectados, são completamente compatíveis com a seção transversal imunoestimulatória baixa de MAPCs. Tabela 1 - Detecção de Marcadores Relacionados à Célula Imune em MAPCs

EXEMPLO 10: MAPCs Suprimem Células T Previamente Estimuladas em MLRs Células

[0349] As células respondedoras foram preparadas a partir dos linfonodos de ratos de Lewis como descrito acima. Os esplenócitos, preparados a partir de ratos Buffalo ou DA, como descrito acima, foram usados como estimuladores. As MAPCs foram preparadas como descrito acima. Procedimentos

[0350] As MAPCs foram adicionadas a um primeiro grupo de MLRs ao mesmo tempo como esplenócitos (como foi feito nos Exemplos precedentes). Além disso, as MAPCs foram adicionadas a um segundo grupo de MLRs que foram configuradas identicamente ao primeiro grupo. Entretanto, as MAPCs no segundo grupo foram adicionadas 3 dias depois da adição dos esplenócitos (ou controle). Assim, no primeiro grupo, as MAPCs foram adicionadas antes que as células T começassem a proliferar em resposta aos esplenócitos. No segundo grupo, as MAPCs foram adicionadas quando a resposta de célula T aos esplenócitos foi encaminhada durante 3 dias. Todas as placas foram incubadas durante um total de 4 dias, depois pulsadas com 3H timidina e colhidas, como descrito nos Exemplos precedentes. Os experimentos de outro modo foram realizados como descrito para as MLRs nos Exemplos precedentes.

[0351] Cada ponto de dados é fundamentado em pelo menos três determinações. Resultados

[0352] Como pode ser observado a partir do lado direito da Figura 7, as MAPCs suprimem fortemente a proliferação de célula T em MLRs quando elas são adicionadas três dias depois da estimulação por esplenócitos alogênicos. A comparação dos lados esquerdo e direito da Figura 7 mostra que as MAPCs suprimem fortemente a reação de proliferação de entrada. Quantitativamente, os resultados mostram para as células Buffalo que as MAPCs adicionadas 3 dias após a estimulação suprimiram a proliferação de célula T em 50 % comparadas aos controles (lado direito da figura), e 75 % quando adicionadas ao mesmo tempo como os esplenócitos estimulatórios (lado esquerdo da figura). Similarmente, para células DA, as MAPCs adicionadas 3 dias após a estimulação suprimiram a proliferação de célula T em 33 % comparadas aos controles (lado direito da figura), e 70 % quando adicionadas ao mesmo tempo como os esplenócitos estimulatórios (lado esquerdo da figura).

[0353] Em todos os casos, o grau de imunossupressão por MAPCs dependeu, em geral, do número de MAPCs que foram adicionadas à reação. Em outras palavras, a imunossupressão dependeu da dose de MAPCs adicionadas às MLRs.

[0354] As publicações citadas acima são incorporadas aqui por referência em sua totalidade como para a matéria objeto específica para a qual elas foram citadas. EXEMPLO 11: A Inibição de MAPC de Linfócitos T é Reversível

[0355] As células T foram cultivadas com estimuladores de esplenócito alogênicos durante 13 dias na presença ou ausência de MAPCs irradiadas. A seguir da cultura de 13 dias, as células T foram recuperadas e plaqueadas novamente com esplenócitos alogênicos irradiados, com ou sem MAPCs, e cultivadas durante 4 dias.

[0356] A proliferação de células T que foi inibida pela presença de MAPCs irradiadas durante o período de cultura primária foi restaurada quando as MAPCs estavam ausentes durante a cultura secundária. A presença de MAPCs na cultura secundária inibiu a proliferação de célula T comparavelmente àquela na cultura primária, com até 90 % de inibição em uma razão de 1:2 de MAPCs para células T. Os resultados, apresentados na Figura 8, demonstram claramente que a inibição da proliferação de célula T por MAPCs em MLRs é reversível, e que as MAPCs inibem respostas proliferativas de célula T tanto primárias quanto secundárias. EXEMPLO 12: MAPCs Previnem GVHD

[0357] A capacidade de MAPCs para suprimir GVHD foi demonstrada em um modelo de rato como segue. As células T de doadores de rato Buffalo serviram como o “enxerto” em receptores de rato de Lewis x Buffalo. As células de enxerto Buffalo foram ativadas pelas células de Lewis “estranhas” no hospedeiro, levando à GVHD no modelo.

[0358] Os ratos receptores F1 (Lewis x Buffalo) foram subletalmente irradiados no Dia 0 com uma única dose de 600 rad. No mesmo dia eles foram injetados intravenosamente com 2 x 107 células da medula óssea e 10 x 107 células T (esplenócitos) a partir de ratos Buffalo doadores. Os ratos foram monitorados 3x/semana quanto aos sinais de GVHD, avaliados por postura, atividade, textura da pele, pele, e perda de peso.

[0359] O Grupo 1 não recebeu nenhuma MAPC. O Grupo 2 recebeu 2,5 x 106 MAPCs no Dia 1. O Grupo 3 recebeu 2,5 x 106 MAPCs em cada um do Dia 1 e Dia 8. Houve cinco ratos em cada grupo. Os resultados são mostrados na Figura 9. A administração de MAPC claramente melhorou as taxas de sobrevivência. Quarenta por cento dos ratos no Grupo 2 e sessenta por cento dos ratos no Grupo 3 sobreviveram ao final do experimento (42 dias), ao passo que todos os ratos que não recebem MAPCs (Grupo 1) não resistiram à GVHD pelo dia 21.

Claims

1. Uso de células, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de um medicamento para tratamento adjuntivo de um indivíduo humano em risco para ou que sofre de uma disfunção imune em que as células são células progenitoras adultas multipotentes derivadas de medula óssea humana (MAPC), em que as células não são células tronco embrionárias, células germinativas embrionárias, ou células germinativas; podem se diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma de pelo menos duas das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas; expressam telomerase, são positivas para oct3/4, sofreram pelo menos 40 duplicações em cultura, são alogênicas ao indivíduo e não provocam uma resposta imune deletéria no indivíduo; são eficazes para tratar a disfunção imune no indivíduo.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as ditas células podem se diferenciar em pelo menos um tipo de célula de cada uma das linhagens embrionárias endodérmicas, ectodérmicas, e mesodérmicas.

3. Uso de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as ditas células são administradas ao indivíduo de maneira adjuntiva a um outro tratamento que é administrado antes, ao mesmo tempo como, ou depois que as ditas células são administradas.

4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o medicamento é manufaturado para entregar 104 a 108 das ditas células por quilograma da massa do indivíduo em uma ou mais doses.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o medicamento é manufaturado para uso por um indivíduo que receberá ou recebeu um transplante e estará em risco para ou desenvolveu uma resposta do hospedeiro versus enxerto ou doença do enxerto versus hospedeiro, e as ditas células são administradas de maneira adjuntiva ao transplante.

6. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o transplante é um transplante de órgão, o indivíduo está em risco para ou desenvolveu uma resposta do hospedeiro versus enxerto, e as ditas células são administradas de maneira adjuntiva ao transplante para tratar a resposta do hospedeiro versus enxerto.

7. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o medicamento é manufaturado para uso por um indivíduo que é ou será tratado por radiação ou quimioterapia ou uma combinação de radiação e quimioterapia, enfraquecendo o sistema imune do indivíduo, e tratamento com as ditas células é adjuntivo à radiação, à quimioterapia, ou à combinação das duas.

8. Uso de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que medicamento é manufaturado para administração a um indivíduo tendo um sistema imune comprometido.

9. Uso de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que medicamento é manufaturado para administração a um indivíduo que será ou está sendo tratado com um agente imunossupressor, e o dito tratamento com as ditas células é adjuntivo a este.

10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um ou mais de um neoplasma, uma anemia ou outro distúrbio do sangue, e uma disfunção imune, em que o tratamento com as ditas células é adjuntivo a um tratamento deste.

11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo está em risco ou está sofrendo de um ou mais de um distúrbio mieloproliferativo, uma síndrome mielodisplásica, leucemia, mieloma múltiplo, um linfoma, uma hemoglobinopatia, uma talassemia, uma síndrome do definhamento da medula óssea, anemia de célula falsiforme, anemia aplásica, anemia de Fanconi, uma anemia hemolítica imune, uma deficiência imune congênita, ou uma disfunção autoimune, em que o tratamento com as ditas células é adjuntivo a um tratamento deste.