BRPI0618609A2 - biomarcadores para tratamento com anticorpo anti-nogo-a em danos à medula espinhal - Google Patents

Abstract

BIOMARCADORES PARA IRATAMENTO COM ANTICORPO ANTI-NOGO-A EM DANOS à MEDULA ESPINHAL. A presente invenção refer-se no nível de expressão gênica, à medula espinhal e o córtex motor danificados como os sítios primários de ação do tratamento com o anticorpo anti-Nogo-A aplicado de forma intrate- cal. A descrição fornece ainda processos para a previsão da resposta de um indivíduo a um medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A através da avaliação da expressão de pelo menos um gene selecionado de Caderina 2, 8,11; Efrina A3 ou B2, receptor de Eph A3 de A4; Semaforina 4A, 4D, 4F, 6A e 6B; Plexina B2; proteína de adição de cap (filamento de actina, similar à gelsolina); Caseína quinase 1 deita; Centractina; Gelsolina; proteína associada a microtúbulo tau; Neurofilamento 68; Miocilina; Olfacto- medina 1 ou 3; lnterferon gama; inibidor 1 da dissociação de Rho-GDP; pro- teína relacionada com a dihidropirimidinase (CRMP) 1, 2 ou 5; Sinucleina; Ai de ligação a PP de Amilóide beta (A4); proteína 1 ou 2 similar ao precur- sor de Amilóide beta (A4); Prostaglandina E sintase; receptor de Benzodia- zepina ou Biglicana.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "BIOMARCA- DORES PARA TRATAMENTO COM ANTICORPO ANTI-NOGO-A EM DA- NOS À MEDULA ESPINHAL".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se, de forma geral, ao teste analítico de amostras de tecidos in vitro e mais particularmente aos aspectos da ex- pressão gênica induzida pela administração do anticorpo anti-Nogo-A. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

Nogo-A desempenha uma função importante na inibição do cres- cimento de neuritos. Foi mostrado que os anticorpos cohtrà Nogo-A resultam na regeneração e na recuperação funcional de axônios após danos à medu- la espinhal.

Um número de estudos de obtenção do perfil da expressão gê- nica em microarranjos refere-se às alterações moleculares após danos à medula espinhal. Para uma revisão, vide Bareyre FM & Schwab ME, Trends Neurosci. 26: 555-563 (2003). Entretanto, continua a haver uma necessidade na ténica de biomarcadores periféricos precoces em relação à eficiência do tratamento com anticorpo anti-Nogo-A. Tais biomarcadores seriam úteis na diferenciação dos indivíduos que respondem dos que não respondem assim como na forma de um guia para a dosagem em uma unidade clínica.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO ,

A invenção fornece uma descrição das alterações moleculares resultantes da inibição da função de Nogo-A utilizando anticorpos anti-Nogo- A. Os genes e as vias funcionais afetadas pela inibição ou pela redução de Nogo-A foram identificados em um sistema in vivo utilizando uma aborda- gem genômica.

A invenção refere-se ainda a novos alvos moleculares para au- mentar a recuperação do sistema nervoso central, para aumentar a regene- ração de conexões neuronais e para aumentar a plasticidade neuronal e si- náptica em estados de saúde clínicos tais como, mas não exclusivamente, danos tal como trauma ou derrame, distúrbios neurodegenerativos tais co- mo, mas não exclusivamente, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, depressão e qualquer outro distúrbio em que uma patologia axonal ou dendrítica faz parte do pro- cesso de doença ou resulta da doença, tal como, mas não exclusivamente quaisquer distúrbios desmielinizantes, tal como esclerose múltipla. Esta refe- re-se ainda a novas indicações para o direcionamento de Nogo-A e/ou ge- nes e vias afetados como um resultado da inibição de Nogo-A tais como, mas não exclusivamente, distúrbios neurodegenerativos (doença de Alzhei- mer, doença de Parkinson, doença de Huntington, ALS), depressão e qual- quer outro distúrbio em que uma patologia axonal ou dendrítica faz parte do processo de doença ou resulta da doença, tal como, mas não exclusivamen- te, quaisquer distúrbios desmielinizante, tal como esclerose múltipla.

Em particular, a presente invenção refere-se a um método para a previsão da resposta de um indivíduo a um medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A, em que a expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 é avaliada antes e depois da administração do dito medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A e em que a dita expressão do dito pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do dito medi- camento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é comparada com a expressão do dito gene antes da dita administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A. Em uma modalidade particular, uma desregulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após, a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A quando comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é indicativa de uma resposta positiva (indivíduo que responde) à dita administração do me- dicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A. Em uma outra moda- lidade, a ausência de uma desregulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compre- ende um anticorpo anti-Nogo-A quando comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticor- po anti-Nogo-A é indicativa de uma ausência de resposta (indivíduo que não responde) à dita administração do medicamento que compreende um anti- corpo anti-Nogo-A. Em uma modalidade preferida, a dita desregulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é uma altera- ção na expressão que é maior ou igual a 1,2 vez e estatisticamente significa- tiva (p<0,05, teste t de Student) quando comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticor- po anti-Nogo-A. Em uma modalidade mais preferida, a expressão de pelo menos um gene de cada um dos grupos de genes de adesão, genes de ci- toesqueleto e de genes de sinalização é avaliada, em que o dito grupo de genes de adesão consiste em caderina 11, caderina 2, caderina 8, caderina 22, receptor de Eph A3, receptor de Eph A4, Efrina A3, Efrina B2, receptor de Eph B2, semaforina 4A, semaforina 4D, semaforina 4F, semaforina 6A, semaforina 6B, proteína associada ao domínio citoplasmático de semaF 3 e Plexina B2, em que o dito grupo de genes de citoesqueleto consiste em pro- teína de adição de cap (filamento de actina) similar à gelsolina, caseína qui- nase 1 delta, centractina, gelsolina, proteína associada a microtúbulo tau e neurofilamento 68 e em que o dito grupo de genes de sinalização consiste em inibidor de dissociação de Rho-GDP 1, proteína relacionada à dihidropi- rimidinase 2, proteína relacionada à dihidropirimidinase 1, proteína relacio- nada à dihidropirimidinase 5. Em uma outra modalidade, é avaliada a ex- pressão de todos os genes da Tabela 25.

Em uma modalidade da presente invenção, a desregulação da expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A quando compara- da com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é indicativa da demonstração da regeneração do sistema nervoso central.

Os métodos da invenção podem ser realizados in vitro.

É também abrangido na presente invenção o uso de um anticor- po anti-Nogo-A na produção de um medicamento para o tratamento de da- nos ao sistema nervoso central em uma população de pacientes, em que a população de pacientes é selecionada como descrito aqui. Preferencialmente, o anticorpo anti-Nogo-A é um anticorpo mo- noclonal totalmente humano (lgG4/0) que se liga ao epitopo do fragmento de Nogo-A humano partindo dos aminoácidos 342-357.

A presente invenção refere-se ainda a métodos para o tratamento de danos ao sistema nervoso central em um indivíduo com um anticorpo anti- Nogo-A, assim como a métodos para o diagnóstico da regeneração do sistema nervoso central em um indivíduo após a administração de um anti-Nogo-A.

Além disso, a presente invenção abrange ainda um kit para a realização dos métodos descritos aqui, o dito kit compreendendo pelo menos duas sondas, cada sonda sendo especificamente capaz de detectar a ex- pressão de um gene da Tabela 25, em que as ditas pelo menos duas sondas não detectam a expressão do mesmo gene.

Os genes e as vias moleculares afetados pela inibição de Nogo- A podem por si só ser terapeuticamente direcionados para distúrbios simila- res como aqueles que podem ser tratados pela terapia com anticorpo para Nogo-A. Alternativamente, novos agentes terapêuticos planejados para os genes e as vias afetados pela inibição de Nogo-A podem ser utilizados como terapias de "adição sobre" para aumentar o efeito terapêutico da inibição de Nogo-A. Em adição, os genes e as vias afetados pela inibição de Nogo-A fornecem indicações terapêuticas para a inibição de Nogo-A tais como, mas não exclusivamente, estados de saúde em que a plasticidade neuronal ou sináptica foi desafiada tal como distúrbios neurodegenerativos relacionados a danos cognitivos (doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington) e distúrbios psiquiátricos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As figuras dos desenhos representam modalidades preferidas com a finalidade de exemplo, não com a finalidade de limitação. Nas figuras, nume- rais de referência similares refere-sem aos mesmos elementos ou similares.

Figura 1. Enriquecimento dos produtos da transcrição relaciona- dos com a imunidade e com a defesa na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em T8.

Figura 2. Enriquecimento da via de sinalização mediada por cito- cinas e quimiocinas na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em T8.

Figura 3. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a cascata de Jak-stat na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em T8.

Figura 4. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a fosforilação oxidativa na direção de 11C7 após duas semanas de tratamento identificado por GSEA em T8.

Figura 5. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a transmissão sináptica na direção de 11C7 após duas semanas de tratamento identificado por GSEA em T8.

Figura 6. Enriquecimento dos produtos da transcrição relaciona- dos com a sinalização mediada por ECM na direção de IgG após uma se- mana de tratamento identificado por GSEA em T1-7.

Figura 7. Enriquecimento dos produtos da transcrição relaciona- dos com o metabolismo de lipídeos na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em T1 -7.

Figura 8. Enriquecimento dos produtos da transcrição relaciona- dos com a homeostase do fator de crescimento na direção de IgG após uma semana de tratamento identificado por GSEA em T1 -7.

Figura 9. Enriquecimento dos produtos da transcrição relaciona- dos com a imunidade e com a defesa na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em L1-5.

Figura 10. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a transdução de sinal na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em L1-5.

Figura 11. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a comunicação celular na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA em L1-5.

Figura 12. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a imunidade e com a defesa na direção de IgG após duas sema- nas de tratamento identificado por GSEA em L1-5. Figura 13. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a comunicação celular na direção de IgG após duas semanas de tratamento identificado por GSEA em L1 -5.

Figura 14. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a transmissão sináptica na direção de 11C7 após duas semanas de tratamento identificado por GSEA em L1-5.

Figura 15. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a doença de Huntington na direção de IgG após duas semanas de tratamento identificado por GSEA no córtex motor-somatossensorial.

Figura 16. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a sinalização mediada pelo receptor de EGF na direção de IgG após duas semanas de tratamento identificado por GSEA no córtex motor- somatossensorial.

Figura 17. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a sinalização mediada pelo receptor de. FGF na direção de IgG após duas semanas de tratamento identificado por GSEA no córtex motor- somatossensorial.

Figura 18. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a sinalização mediada pelo receptor de NGF na direção de IgG após duas semanas de tratamento identificado por GSEA no córtex motor- somatossensorial.

Figura 19. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a endocitose mediada pelo receptor na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 20. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a imunidade mediada por interferon na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 21. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a interação de ligante-receptor neuroativa na direção de IgG a- pós uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 22. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a imunidade mediada por macrófagos na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 23. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a sinalização de 111b na direção de IgG após uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 24. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a ativação de células B na direção de 11C7 após uma semana de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 25. Enriquecimento dos produtos da transcrição relacio- nados com a imunidade e com a defesa na direção de IgG após duas sema- nas de tratamento identificado por GSEA no sangue.

Figura 26. Regulação para mais de Cxcr4 e CxcM 2 (via de Slit- Robo) após uma semana de tratamento com 11C7 na medula espinhal.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Deve ser considerado que certos aspectos, modos, modalida- des, variação e caracterísitcas da invenção são descritos abaixo em vários níveis de detalhes com a finalidade de fornecer um entendimento substancial da presente invenção. Em geral, tal descrição fornece biomarcadores úteis para o diagnóstico e para o tratamento de indivíduos que necessitam dos mesmos. Conseqüentemente, os vários aspectos da presente invenção refe- re-sem aos métodos diagnósticos/teranósticos e aos kits para a identificação de indivíduos pré-dispostos à doença ou para classificar indivíduos em rela- ção à resposta aos fármacos, aos efeitos colaterais ou à dose ótima de fár- maco. Os métodos e os kits são úteis para o estudo da etiologia das doen- ças, para o estudo da eficiência do direcionamento do fármaco, para a previ- são da susceptibilidade do indivíduo a doenças e para a previsão da capaci- dade de resposta do indivíduo aos fármacos que se direcionam ao produto gênico. Conseqüentemente, várias modalidades particulares que ilustram estes aspectos estão a seguir.

Polinucleotídeos e Polipeptídeos da Invenção. A obtenção do perfil de expressão gênica em um modelo de danos à medula espinhal de rato foi realizada após o tratamento com o anticorpo monoclonal de camun- dongo anti-Nogo-A 11C7 e comparada com a IgG antilectina vegetal de ca- mundongo de controle após sete e 14 dias de tratamento em tecidos diferen- tes, resultando em 12 comparações diferentes. Os conjuntos de dados foram submetidos às análises a seguir: (1) restrição estatística (teste t de Welch p<0,05) e classificação por quantidade de vezes; e (2) análise de enriqueci- mento de conjunto de genes (GSEA), que é uma visão cêntrica da via dos dados primeiramente introduzidos por Mootha VK e outros, Nat. Genet. 34: 267-273 (2003) e recentemente por Subramanian e outros Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 102(43): 15545-50 (2005). As análises resultaram na identifica- ção de 24 vias significativamente afetadas pelo tratamento em três ou mais dos tecidos em cada ponto de tempo.

Classificados pelo tamanho do efeito do tratamento com base no número de genes expressos diferencialmente de forma significativa e a alte- ração de vezes dos 100 produtos da transcrição principais significativamente alterados em cada grupo de tratamento, a medula espinhal distai ao local da lesão (L1-5), o local da lesão (T8) e o sangue eram os tecidos mais afetados após uma semana de tratamento. L1-5, córtex motor-somatossensorial e medula espinhal proximal ao local da lesão (T1-7) eram as regiões mais afe- tadas após duas semanas de tratamento. Em cada um dos pontos de tempo, foi observado apenas um efeito mínimo no córtex frontal.

A GSEA identificou imunidade e defesa, metabolismo e fosforila- ção de proteínas, metabolismo de nucleosídeos, nucleotídeos e ácidos nu- cléicos, atividades neuronais e cascata de Jak-stat como as vias mais am- plamente afetadas especialmente. Todas estas vias foram afetadas em três até quatro tecidos concomitantemente.

O tratamento com anti-Nogo-A aplicado de forma intratecal após danos à medula espinhal no rato possui o maior efeito na medula espinhal. Os genes que promovem o guia de axônios e o crescimento de neuritos fo- ram regulados para mais, as sugestões inibidoras foram reguladas para me- nos na medula espinhal após o tratamento com anti-Nogo-A. Das vias rela- cionadas com o crescimento de neuritos/guia de axônios, a GSEA apontou a via de guia de axônios mediada por Slit-Robo como a mais freqüentemente afetada pelo tratamento com 11C7. Cxcl12 e Cxc4r, dois membros desta via foram regulados para mais por 11C7 de uma maneira combinada após uma semana de tratamento em todos os segmentos da medula espinhal estuda- dos. CxcM 2 e Cxc4r foram recentemente identificados como agentes princi- pais na definição da trajetória inicial de axônios motores de mamíferos du- rante o desenvolvimento por Lieberam I e outros, Neuron 47: 667-679 (2005). Esta descoberta sugere que esta via é afetada pelo tratamento com 11C7 e pode assim contribuir para o mecanismo de ação de anti-Nogo A durante a regeneração.

No local da lesão, a via de sinalização mediada pelo receptor de EGF foi regulada para mais por 11C7 após uma semana de tratamento, más regulada para menos após duas semanas de tratamento. No córtex motor, a via de sinalização mediada pelo receptor de EGF foi regulada para menos por 11C7 após uma semana e após duas semanas de tratamento. Ao todo 24 vias com enriquecimento significativo (q<0,001) foram identificadas como sendo afetadas pelo tratamento com anti-Nogo-A em três ou mais tecidos em cada ponto de tempo. As vias mais amplamente afetadas de forma global es- tavam relacionadas com a imunidade e a defesa, ao metabolismo e à fosfori- lação de proteínas e às atividades neuronais. A regulação para mais da transmissão sináptica se relacionava com os conjuntos de sondas na medula espinhal lombar após duas semanas de tratamento com anti-Nogo-A.

Os resultados confirmam no nível de expressão gênica a medula espinhal e o córtex motor danificados como os locais primários de ação do tratamento com o anticorpo anti-Nogo-A aplicada de forma intratecal. A aná- lise identificou novos candidatos moleculares e de vias como alvos possíveis do tratamento com anti-Nogo-A, tais como a miocilina e a via de split-robo. Os resultados também apontaram para o forte envolvimento das vias rela- cionadas à defesa imunológica no efeito do tratamento.

A análise de TAQMAN confirmou descobertas selecionadas em relação às proteínas secretadas Sfrp4, Mmp9 e miocilina.

Anticorpos Anti-Nogo. O Pedido de patente PCT publicado WO 00/31235 descreve vários anticorpos produzidos contra as proteínas Nogo e derivados das mesmas. Para exemplos de anticorpos anti-Nogo, incluindo anticorpos monoclonais e fragmentos dos mesmos e de métodos de uso dos mesmos, vide Bregman BS e outros, Nature 378: 498-501 (1995); Brosamle C e outros, J. Neurosci. 20: 8061-8068 (2000); Bareyre FM e outros, J. Neu- rosci. 22: 7097-7110 (2002); Chen e outros, Nature 403: 434-439 (2000);

Fiedler M e outros, Protein Eng. 15: 931-941 (2002); Merkler D e outros, J. Neurosci. 21: 3665-3673 (2001); Oertle T e outros, J. Neurosci. 23: 5393- 5406 (2003); Papadopoulos CM e outros, Ann. Neurol. (2002); e Von Me- yenburg J e outros, Exp. Neurol. 154: 583-594 (1998). Vide também, Wiess- ner C e outros, Em Pharmacology of Cerebral Ischemia, Krieglstein J & Klumpp S, eds. (2003) pp. 343-353; e Wiessner C e outros, J. Cereb. Blood Flow & Metab. 23: 154-165 (2003) para o uso de anticorpos anti-Nogo em um modelo de derrame. Foi mostrado que as doses do anticorpo anti-Nogo A utilizadas nos EXEMPLOS resultam na recuperação funcional no mesmo modelo. Liebscher e outros, Ann. Neurol. 58: 706-719 (2005). O pedido de patente PCT publicado WO 00/31235 descreve ainda dois anti-soros produ- zidos contra seqüências de Nogo A, AS Bruna e AS 472. Vide também o pedido de patente PCT publicado WO 2000/05364A1, que descreve anticor- pos para os fragmentos da proteína Nogo. Nos EXEMPLOS, anticorpo anti- Nogo-A 11C7: anticorpo monoclonal (mAb) de camundongo 11C7, produzido contra um peptídeo Nogo-A de 18aa correspondendo à seqüência de ami- noácidos de rato 623-640; utilizado a uma concentração de 3 mg/mL em PBS. O anticorpo de controle era uma IgG monoclonal de camundongo dire- cionada contra a Iectina vegetal a uma concentração de 3 mg/mL em PBS. As propriedades bioquímicas e de neutralização de ambos os anticorpos são descritas em Oertle T e outros, J. Neurosci. 23: 5393-5406 (2003). Em uma modalidade da invenção, o anticorpo anti-Nogo é um anticorpo monoclonal completamente humano (lgG4/ic) gerado partindo de camundongos que é reconstituído geneticamente com genes de imunoglobulina humana e que se liga ao epitopo do fragmento de Nogo-A humano partindo dos aa342-357. Vide os pedidos de patente PCT publicados WO 90/05191 e WO 00/31235.

Conseqüentemente, a invenção é relevante para os danos cere- brais isquêmicos (derrame), para os danos cerebrais traumáticos (ferimentos na cabeça), para esclerose múltipla (MS), para esclerose lateral amiotrófica (ALS), para a doença de Alzheimer. A invenção é também relevante pára a regeneração axonal e maior estímulo de crescimento após danos às fibras nervosas; várias doenças do sistema nervoso periférico e central, doenças neurodegenerativas tais como doença de Alzheimer, doença de Parkinson, ALS, patologias similares a Lewy ou outras demências em geral, doenças após trauma craniano, cerebral ou medular, derrame ou uma doença desmi- elinizante incluindo esclerose múltipla, desmielinização monofásica, encefa- lomielite, Ieucoencefalopatia multifocal, panencefalite, doença de Marchiafa- va-Bignami, mielmólise pontina, adreriolèucodistrofia, doença de PeIizaeus- Merzbacher, degeneração de Spongy, doença de Alexander, doença de Ca- navan, Ieucodistrofia metacromática e doença de Krabbe; distúrbios oculares degenerativos envolvendo a degeneração das células da retina ou da córnea incluindo retinopatias isquêmicas, neuropatia óptica isquêmica anterior, neu- rite óptica, degeneração macular relacionada com a idade, retinopatia diabé- tica, edema macular cistóide, retinite pigmentosa, doença de Stargardt, de- generação retinal viteliforme de Best, amaurose congênita de Leber e outras degenerações hereditárias da retina, miopia patológica, retinopatia da pre- maturidade, neuropatia óptica hereditária de Leber, os efeitos posteriores de transplante de córnea ou de cirurgia refrativa de córnea, ceratite de herpes.

Definições. As definições de certos termos que são utilizados neste relatório descritivo são fornecidos abaixo. As definições de outros ter- mos podem ser encontradas no glossário fornecido pelo U.S. Department of Energy, Office of Science, Human Genome Project (http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human Genome/qlossarv/). Na práti- ca da presente invenção, muitas técnicas convencionais na biologia molecu- lar, na microbiologia e no DNA recombinante são utilizadas. Estas técnicas são bem-conhecidas e são explicadas, por exemplo, em Current Protocofs in Molecular Biology, Vols. I-Ill1 Ausubel, ed. (1997); Sambrook e outros, Mole- cular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover D, ed. (1985); Oligonucleotide Syn- thesis, Gait1 ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames & Higgins, eds. (1985); Transcription and Translation, Hames & Higgins, eds. (1984); Animal Cell. Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Praetieal Guide to Molecular Cloningr, a série, Method in EnzymoL (Academic Press, Inc., 1984); Gene Transfer Veetors for Mam- malian Cells, Miller & Calos, eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1987); e Methods in Enzymology, Vols. 154 e 155, Wu & Grossman e Wu, Eds., respectivamente.

Como utilizado aqui, o termo "anticorpo" inclui, mas não está limitado a, por exemplo, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, anti- corpos humanizados ou quiméricos e fragmentos de anticorpos bioíogica- mente funcinais suficientes para a ligação do fragmento de anticorpo à prote- ína. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo é um anticorpo anti-Nogo.

É pretendido que o termo "amostra biológica" inclua, mas não está limitado a, por exemplo, tecidos, células e fluidos biológicos isolados de um indivíduo, assim como tecidos, células e fluidos presentes em um indiví- duo. Nos EXEMPLOS, as amostras biológicas são amostras do sistema ner- voso central. Entretanto, é previsto o uso de outras amostras biológicas. As "amostras biológicas" adequados são, por exemplo, sangue, soro, linfa, célu- las endoteliais, escarro, urina, fezes ou sêmen. São particularmente ade- quados para os métodos da invenção o fluido intersticial do sistema nervoso central (SNC) e/ou o fluido cerebrospinhal.

Como utilizado aqui, o termo "resposta clínica" significa qualquer uma ou todas as seguintes: uma medida quantitativa da resposta, nenhuma resposta e resposta adversa (isto é, efeitos colaterais).

Como utilizado aqui, o termo "teste clínico" significa qualquer estudo de pesquisa planejado para coletar dados clínicos sobre as respostas a um tratamento particular e inclui, mas não está limitado aos testes clínicos de fase I, fase Il e fase III. Métodos padronizados são utilizados para definir a população de pacientes e para inscrever indivíduos.

Como utilizado aqui, o termo "quantidade eficiente" de um com- posto é uma quantidade suficiente para atingir um efeito terapêutico e/ou profilático desejado, por exemplo, uma quantidade que resulta da prevenção ou de um decréscimo nos sintomas associados com, uma doença que está sendo tratada. A quantidade de composto administrada ao indivíduo depen- derá do tipo e da gravidade da doença e das características do indivíduo, tais como saúde geral, idade, sexo, peso corporal e tolerância a fármacos. Dependerá ainda do grau, da gravidade e do tipo de doença. O versado na ténica será capaz de determinar as dosagens apropriadas dependendo des- tes e de outros fatores. Tipicamente, uma quantidade eficiente dos compos- tos da presente invenção, suficiente para atingir um efeito terapêutico ou profilático varia de aproximadamente 0,000001 mg por quilograma em peso corporal por dia até aproximadamente 10.000 mg por quilograma em peso corporal por dia. Uma faixa preferida varia de aproximadamente 0,0001 mg por quilograma ém peso corporal por dia até aproximadamente 1.000 mg por quilograma em peso corporal por dia. Uma outra dosagem preferida varia de aproximadamente 0,01 mg por quilograma em peso corporal por dia até a- proximadamente 100 mg por quilograma em peso corporal por dia. Os com- postos da presente invenção também podem ser administrados em combi- nação com cada outro ou com um ou mais compostos terapêuticos adicio- nais. Nos EXEMPLOS, foi mostrado que as doses de anticorpo anti-Nogo A utilizadas nos EXEMPLOS resultam na recuperação funcional no mesmo modelo. Liebscher e outros, Ann. Neurol. 58: 706-719 (2005). Vide ainda o pedido de patente PCT publicado WO 2000/05364A1, que descreve anticor- pos para fragmentos da proteína Nogo.

Como utilizado aqui, "expressão" inclui, mas não está limitado a um ou mais dos seguintes: transcrição do gene no mRNA precursor; junção e outro junção do mRNA precursor para produzir mRNA maduro; estabilidade do mR- NA; tradução do mRNA maduro em proteína (incluindo uso de códons e dispo- nibilidade de mRNA); e glicosilação e/ou outras modificações do produto da tradução, se necessário, para a expressão e para a função apropriadas.

Como utilizado aqui, o termo "gene" significa um segmento de DNA que contém toda a informação para a biossíntese regulada de um pro- duto de RNA, incluindo promotores, éxons, íntrons e outras regiões não tra- duzidas que controlam a expressão.

Como utilizado aqui, o termo "genótipo" significa uma seqüência 5' a 3' sem estar em fase de par(es) de nucleotídeo(s) em um ou mais sítios polimórficos em um lócus em um par de cromossomos homólogos em um indivíduo. Como utilizado aqui, genótipo inclui um genótipo completo e/ou um subgenótipo.

Como utilizado aqui, o termo "lócus" significa uma localização em um cromossomo ou uma molécula de DNA que corresponde a um gene ou a uma característica física ou fenotípica.

Como utilizado aqui, o termo "isogene" significa as fôrmas dife- rentes de um certo gene que existem na população.

Como utilizado aqui, o termo "mutante" significa qualquer varia- ção que pode ser herdada do tipo selvagem que é o resultado de uma muta- ção, por exemplo, um polimorfismo isolado de nucleotídeo. O termo "mutan- te" é utilizado de forma intercambiável com os termos "marcador", "biomar- cador" e "alvo" ao longo de todo o relatório descritivo.

Como utilizado aqui, o termo "estado de saúde médico" inclui, mas não está limitado a qualquer estado de saúde ou doença manifestada na forma de um ou mais sintomas físicos e/ou psicológicos para os quais o tratamento é desejável e inclui doenças e outros distúrbios previamente e recém-identificados.

Como utilizado aqui, o termo "par de nucleotídeos" significa os nucleotídeos encontrados em um sítio polimórfico nas duas cópias de um cromossomo de um indivíduo.

Como utilizado aqui, o termo "sítio polimórfico" significa uma po- sição dentro de um lócus em que pelo menos duas seqüências alternativas são encontradas em uma população, cuja mais freqüente possui uma fre- qüência de não mais que 99%.

Como utilizado aqui, o termo "população" pode ser qualquer grupo de pelo menos dois indivíduos. Uma população pode incluir, por e- xemplo, mas não está limitada a uma população de referência, um grupo de populações, uma população familiar, uma população clínica e uma popula- ção do mesmo sexo.

Como utilizado aqui, o termo "em fase" significa, quando aplica- do a uma seqüência de pares de nucleotídeos para dois ou mais sítios poli- mórficos em um lócus, que a combinação de nucleotídeos presentes nestes sítios polimórficos em uma única cópia do lócus é conhecida.

Como utilizado aqui, o termo "polimorfismo" significa qualquer vari- ação de seqüência presente em uma freqüência >1% em uma população. A variação de seqüência pode estar presente em uma freqüência significativa- mente maior que 1 % tal como 5% ou 10% ou maior. Ainda, o termo pode ser um sítio polimórfico. Os polimorfismos incluem substituições, inserções, dele- ções de nucleotídeos e microssatélites e podem, mas não precisam, resultar em diferenças détectáveis na expressão gênica ou na função da proteína.

Como utilizado aqui, o termo "polinucleotídeo" significa qualquer RNA ou DNA, que pode ser DNA ou RNA não modificado ou modificado. Os polinucleotídeos incluem, sem limitação, DNA de filamento simples e duplo, DNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e duplo, RNA de filamento simples e duplo, RNA que é uma mistura de regiões de filamento simples e duplo e moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ter filamento simples ou, mais tipicamente, filamento duplo ou uma mistura de regiões de filamento simples e duplo. Em adição, polinucleotídeo refere-se a regiões de filamento triplo que compreendem RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. O termo polinucleotídeo inclui ainda DNAs ou RNAs contendo uma ou mais bases modificadas e DNAs ou RNAs com estruturas principais modificadas em relação à estabilidade e por outras razões.

Como utilizado aqui, o termo "polipeptídeo" significa qualquer polipeptídeo que compreende dois ou mais aminoácidos ligados um aos ou- tros através de ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres de peptídeos. Polipeptídeo refere-se tanto a cadeias curtas, comumente referidas como peptídeos, glicopeptídeos ou oligômeros quanto a cadeias mais longas, geralmente referidas como proteínas. Os polipeptí- deos podem conter aminoácidos sem ser os 20 aminoácidos codificados pe- Ios genes. Os polipeptídeos incluem seqüências de aminoácidos modifica- das através de processos naturais, tal como o junção pós-tradução ou atra- vés de técnicas de modificação química que são bem-conhecidas na ténica. Tais modificações são bem-descritas em textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma volumosa literatura de pesquisa.

Como utilizado aqui, o termo "população padronizada de refe- rência" significa uma população caracterizada por uma ou mais característi- cas biológicas, por exemplo, capacidade de resposta a fármacos, genótipo, haplotipo, fenótipo etc.

Como utilizado aqui, o termo "perfil de expressão gênica padro- nizado de referência" é o padrão de expressão de um ou mais genes obser- vados em uma população padronizada de referência ou em um único indiví- duo antes da administração de um composto.

Como utilizado aqui, o termo "indivíduo" significa que preferenci- almente o indivíduo é um mamífero, tal como um ser humano, mas também pode ser um animal, incluindo, mas não limitado a animais domésticos (por exemplo, cães, gatos e similares), animais de fazenda (por exemplo, vacas, ovelha, porcos, cavalos e similares) e animais de laboratório (por exemplo, macacos tais como macacos cinomolgos, ratos, camundongos, porquinhos- da-índia e similares).

Como utilizado aqui, uma "amostra de teste" significa uma amos- tra biológica obtida de um indivíduo de interesse. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser um fluido biológico (por exemplo, soro), amostra de células ou tecido ou ácido nucléico ou polipeptídeo isolado derivado do mesmo.

Como utilizado aqui, o termo "desregulação" significa uma alte- ração que é maior ou igual a 1,2 vez e estatisticamente significativa (p<0,05, teste t de Student) partindo do controle. Por exemplo, uma alteração de 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 ou 5 vezes.

Como utilizado aqui, a administração de um agente ou de um fármaco a um indivíduo ou um paciente inclui a auto-administração e a ad- ministração por um outro. Será também considerado que é pretendido que os vários modos de tratamento ou de prevenção de estados de saúde médi- cos que são descritos signifiquem "substancial", que inclui total, mas tam- bém menos que o tratamento ou a prevenção total e em que algum resultado biológica ou medicinalmente relevante é atingido.

Os detalhes de uma ou mais modalidades da invenção são a- presentados na descrição em anexo a seguir. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui possam ser utilizados na prática ou no teste da presente invenção, os métodos e materiais preferi- dos são descritos agora. Outras características, objetivos e vantagens da invenção serão evidentes partindo da descrição e das reivindicações. No relatório descritivo e nas reivindicações em anexo, as formas singulares in- cluem os referentes no plural a não ser que o contexto indique claramente de outra maneira. A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos utilizados aqui possuem o mesmo significado como é comumente entendido por um versado comum na ténica à qual esta invenção pertence. Todas as referências citadas aqui são incorporadas aqui como referência em sua totalidade e para todas as finalidades até a mesma extensão como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicada como estando incorporada como referência em sua totalidade para todas as finalidades.

Amplificação de Uma Região Gênica Alvo. A(s) região(ões)-alvo(s) pode(m) ser amplificada(s) utilizando qualquer método de amplificação direcio- nado ao oligonucleotídeo, incluindo, mas não limitado à reação em cadeia da polimerase (PCR) (Patente U.S. N- 4.965.188), à reação em cadeia da Iigase (LCR) (Barany e outros, Proc. NatL Acad. Sei. USA, 88: 189-193 (1991); pedido de patente PCT publicado WO 90/01069) e ao ensaio de ligação de oligonucle- otídeo (OLA) (Landegren e outros, Science, 241: 1077-1080 (1988)). Os oligo- nucleotídeos úteis como iniciadores ou sondas em tais métodos devem se hi- bridizar especificamente a uma região do ácido nucléico que contém ou fica adjacente ao sítio polimórfico. Outros procedimentos de amplificação de ácidos nucléicos conhecidos podem ser utilizados para amplificar a região alvo incluin- do os sistemas de amplificação baseados na transcrição. (Patente U.S. N9 5.130.238; EP 0 329 822; Patente U.S. N2 5.169.766, pedido de patente PCT publicado WO 89/06700) e métodos isotérmicos (Walker e outros, Proc. Nati Acad. Sci., USA, 89: 392-396 (1992).

Hibridização de Oligonucleotídeo Específico ao Alelo a Um Ge- ne-Alvo, A hibridização de um oligonucleotídeo específico ao alelo a um po- linucleotídeo-alvo pode ser realizada com ambas as entidades em solução ou tal hibridização pode ser realizada quando o oligonucleotídeo ou o polinu- cleotídeo-alvo está afixado covalente ou não covalentemente a um suporte sólido. A ligação pode ser mediada, por exemplo, através de interações de anticorpo-antígeno, poli-L-Lisina, estreptavidina ou avidina-biotina, pontes de sal, interações hidrofóbicas, ligações químicas, reticulação por UV, cozimen: to etc. O oligonucleotídeo específico ao alelo pode ser sintetizado diretamen- te sobre o suporte sólido ou ligado ao suporte sólido subseqüente à síntese. Os suportes sólidos adequados para uso nos métodos de detecção da in- venção incluem substratos feitos de silício, vidro, plástico, papel e similares, que podem ser formados, por exemplo, em cavidades (como em placas de 96 cavidades), lâminas, folhas, membranas, fibras, chips, placas e contas. O suporte sólido pode ser tratado, revestido ou derivatizado para facilitar a i- mobilização do oligonucleotídeo específico ao alelo ou o ácido nucléico-alvo.

O genótipo ou o haplotipo para o gene de um indivíduo também podem ser determinados através da hibridização de uma amostra nucléica contendo uma ou ambas as cópias do gene aos arranjos e subarranjos tais como os descritos no WO 95/11995. Os arranjos conteriam uma bateria de oligonucleotídeos específicos ao alelo que representam cada um dos sítios polimórficos que serão incluídos no genótipo ou no haplotipo.

Vide, ainda, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Segunda Ed., Sambrook, Fritsch & Maniatis, ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989); DNA Cloning, Volumes I e II, Glover DN ed. (1985); Oligonu- cleotide Synthesis, Gait MJ ed. (1984); Nucleic Acid Hybridization, Hames BD & Higgins SJ, eds., 1984).

Sistema de Computador para Armazenamento ou Exibição dos Dados de Expressão Gênica ou de Polimorfismos. A invenção fornece ainda um sistema de computador para o armazenamento e para a exibição de dados determinados para o gene. Os dados de polimorfismo é uma informação que inclui, mas não está limitada, por exemplo, à localização de sítios polimórficos; à variação de seqüência nestes sítios; à freqüência de polimorfismos em uma ou mais populações; aos genótipos e/ou haplotipos diferentes determinados para o gene; à freqüência de um ou mais destes genótipos e/ou haplotipos em uma ou mais populações; a qualquer(quaisquer) associação(ões) conhecida(s) entre uma característica e um genótipo ou um haplotipo para o gene. O sistema de computador compreende uma unidade de junção de computador, um dis- play de exibição e um banco de dados contendo os dados de polimorfismo. Os dados de polimorfismo incluem os polimorfismos, os genótipos e os haplotipos identificados para um certo gene em uma população de referência. Em uma modalidade preferida, o sistema de computador é capaz de produzir uma exibi- ção que mostra o padrão de expressão gênica organizado de acordo com de acordo com suas relações evolutivas.

Além disso, o computador pode executar um programa que gera vistas (ou telas) exibidas em um dispositivo de exibição e com o qual o usuá- rio pode interagir com a vista e analisar grandes quantidades de informação, em relação ao gene e sua variação genômica, incluindo a localização cro- mossômica, a estrutura agênica e a família gênica, os dados de expressão gênica, os dados de polimorfismos, os dados de seqüências genéticas e os dados clínicos e os dados populacionais (por exemplo, dados sobre a origem etnogeográfica, as resposta clínicas e o padrão de expressão gênica para uma ou mais populações). Os dados de polimorfismos descritos aqui podem ser armazenados como parte de uma base de dados relativa (por exemplo, um exemplo de um banco de dados em Oracle ou um conjunto de arquivos ASCII flat). Estes dados de polimorfismo podem ser armazenados no disco rígido do computador ou podem, por exemplo, ser armazenados em um CD- ROM ou em um um ou mais outros dispositivos de armazenamento que po- dem ser acessados pelo computador. Por exemplo, os dados podem ser ar- mazenados em um ou mais bancos de dados em comunicação com o com- putador através de uma rede.

No EXEMPLO abaixo, a normalização dos dados foi realizada como a seguir: Valores abaixo de 0 foram ajustados em 0,1. Cada medida foi dividida pelos 50,0 por cento de todas as medidas em tal amostra. Finalmen- te, a normalização por gene foi realizada através da normalização em rela- ção ao valor de expressão da mediana de amostras "naíve".

No EXEMPLO 1, os genes expressos de forma diferencial entre o veículo e os tratamentos foram identificados dentro de cada experimento com base nas restrições a seguir: (1) Restrições pré-filtração: Os conjuntos de sondas incluídos na análise adicional tinham marcações presentes em 4/6 das réplicas em qualquer condição. A intensidade dos sinais de dados brutos tinha que ser no mínimo 50 em pelo menos um dos grupos de trata- mento. (2) Restrição estatística: p<0,05 (teste t de Welch (paramétrico)). A restrição estatística similar era sempre aplicada em grupos diferentes que seriam comparados e é mencionada em cada comparação.

No EXEMPLO 1, o método de Análise de Enriquecimento do Conjunto Gênico (GSEA) foi utilizado para analisar os dados de microarran- jo. Os genes com níveis de expressão abaixo de 100 em mais de 75% dos chips são descartados como pouco ou não expressos. Os resultados dos microarranjos são então analisados em uma série de comparações em pares entre os conjuntos de condição (por exemplo, tratados vs. controle). Cada nível de expressão relativa ao gene sob a condiçãoi e a condiçã02 é compu- tado como uma proporção de expressão ri

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em que μi,j é o valor médio de expressão para o gene i sob a condiçãoj. Os genes são então classificados de acordo com suas proporções de expressão de forma que tais genes com maior expressão sob condiçãoi que sob a con- dição2 fiquem no topo da lista. Depois, a compilação dos conjuntos de genes disponíveis é projetada sobre a lista classificada. Esta etapa em essência aplica a príori o conhecimento biológico aos dados experimentais para a i- dentificação de genes funcionalmente relacionados que são expressos de uma maneira coordenada. Os conjuntos de genes são processados um por vez. Para o conjunto gênico G cada proporção de expressão ri é marcada 'no' no conjunto gênico se o gene, e G e 'fora' do gene se o genej ∉ G. Um teste de soma de classificação de Wilcoxon de duas caudas é calculado pa- ra determinar se os genes marcados 'no' conjunto gênico G estão enriqueci- do no topo ou no final da lista classificada. O método de taxa de descoberta falsa de Storey JD & Tibshirani R, Proc Natl Acad Sci USA 100: 9440-9445 (2003) é aplicado para transformar os valores de ρ nos valores de q corrigi- dos pelo teste múltiplo. O produto da GSEA é uma lista de valores de q (qh q2, ..·, qn) e marcações (I1, I2, ..., In), Ii ϵ e (topo,final) que corresponde aos conjuntos gênicos disponíveis Ν. O valor de q pequeno q, indica que os ge- nes no conjunto gênico Gisão significativamente enriquecidos no topo ou riò final da lista de proporções de expressão.

O EXEMPLO 2 fornece ainda uma descrição de um método de análise de GSEA.

Kits da Invenção. Deve ser entendido que os métodos da inven- ção descritos aqui podem geralmente compreender adicionalmente o uso de um kit de acordo com a invenção. A invenção fornece kits de detecção de áci- dos nucléicos e de polipeptídeos úteis para a haplotipagem e/ou para a geno- tipagem em um indivíduo. Tais kits são úteis para a classificação dos indiví- duos. De forma geral, os métodos da invenção podem ser realizados ex-vivo e tais métodos ex-vivo são especificamente considerados pela presente inven- ção. Ainda, quando um método da invenção puder incluir etapas que podem ser praticadas sobre o corpo humano ou de animais, os métodos que com- preendem apenas tais etapas que não são praticadas sobre o corpo humano ou de animais são especificamente considerados pela presente invenção.

Os kits da invenção são úteis para a detecção da presença de um polipeptídeo ou de um ácido nucléico correspondente a um marcador da invenção em uma amostra biológica, por exemplo, qualquer fluido corporal incluindo, mas não limitado, por exemplo, a soro, plasma, linfa, fluido cístico, urina, fezes, fluido cerebrospinhal, fluido acítico ou sangue e incluindo amos- tras de biópsia de tecido corporal. Por exemplo, o kit pode compreender um composto ou um agente marcado capaz de detecar um polipeptídeo ou um mRNA que codifica um polipeptídeo que corresponde a um marcador da in- venção em uma amostra biológica e a meios para a determinação da quanti- dade do polipeptídeo ou do mRNA na amostra, por exemplo, um anticorpo que se liga ao polipeptídeo ou a uma sonda de oligonucleotídeo que se liga ao DNA ou ao mRNA que codifica o polipeptídeo.

Para os kits baseados em anticorpos, o kit pode compreender, por exemplo, (1) um primeiro anticorpo, por exemplo, ligado a um suporte sólido, que se liga a um polipeptídeo que corresponde a um marcador ou à invenção; e, opcionalmente; (2) um segundo anticorpo diferente que se liga ao polipeptídeo ou ao primeiro anticorpo e é conjugado a um marcador que pode ser detectado.

Para os kits baseados em oligonucleotídeos, o kit pode compre- ender, por exemplo, (1) um oligonucleotídeo, por exemplo, um oligonucleotí- deo marcado de forma detectável, que se hibridiza com uma seqüência de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo correspondente a um marcador da invenção; ou (2) um par de iniciadores úteis para a amplificação de uma molécula de ácido nucléico que compreende a um marcador da invenção.

O kit também pode compreender, por exemplo, um agente tam- ponante, um preservante ou um agente estabilizador de proteínas. O kit po- de compreender ainda componentes necessários para a detecção do mar- cador que pode ser detectável, por exemplo, uma enzima ou um substrato. O kit pode conter ainda uma amostra de controle ou uma série de amostras de controle, que podem ser analisadas e comparadas com a amostra de tes- te. Cada componente do kit pode estar encerrado dentro de um recipiente individual e todos os vários recipientes podem estar dentro de uma única embalagem, junto com instruções para a interpretação dos resultados dos ensaios realizados utilizando o kit. Em uma modalidade preferida, tal kit pode compreender ainda meios para coleta de amostras de DNA. Os kits da in- venção podem conter um produto escrito sobre o dentro do recipiente do kit. O produto escrito descreve como utilizar os reagentes contidos no kit, por exemplo, como utilizar os biomarcadores da presente invenção na determi- nação de uma estratégia para a prevenção ou para o tratamento de um es- tado de saúde médico em um indivíduo. Em várias modalidades, o uso dos reagentes pode ser de acordo com os métodos da invenção. Em uma moda- lidade, o reagente é um chip de gene para a determinação da expressão gênica de genes relevantes.

Correlação de um Indivíduo com uma População de Referência Padronizada. Para deduzir uma correlação entre a resposta clínica a um tra- tamento e um padrão de expressão gênica, é necessária a obtenção dos dados sobre as respostas clínicas exibidas por uma população de indivíduos que receberam o tratamento, isto é, uma população clínica. Estes dados clí- nicos podem ser obtidos através da análise retrospectiva dos resultados de teste(s) clínico(s). Alternativamente, os dados clínicos podem ser obtidos através do planejamento e da realização de um ou mais novos testes clíni- cos. A análise dos dados de populações clínicas é útil para definir popula- ções de referência padronizadas que, por sua vez, são úteis para a classifi- cação de indivíduos em relação à inscrição em testes clínicos ou em relação à seleção do tratamento terapêutico. Em uma modalidade preferida, os indi- víduos incluídos na população clínica foram classificados em relação à exis- tência do estado de saúde médico de interesse. A classificação dos indiví- duos potenciais pode incluir, por exemplo, um exame físico padronizado ou um ou mais testes de laboratório. Alternativamente, a classificação dos indi- víduos pode incluir o uso de um padrão de expressão gênica. Por exemplo, o padrão de expressão gênica é útil como critérios de classificação em que há uma forte correlação entre o padrão de expressão gênica e a susceptibili- dade ou a gravidade da doença. Tal população de referência padronizada compreendendo indivíduos que compartilham a(s) característica(s) de perfil de padrão de expressão gênica. Por exemplo, a(s) característica(s) de ex- pressão gênica do biomarcador, é(são) útil(úteis) nos métodos da presente invenção para a comparação com o nível medido de um ou mais produtos de expressão gênica em um certo indivíduo. Este(s) produto(s) da expressão gênica útil(úteis) nos métodos da presente invenção inclui(em), mas não es- tá(ão) limitado(s), por exemplo, ao mRNA característico associado com tal grupo de genótipo particular ou com o produto da expressão gênica do poli- peptídeo de tal grupo de genótipo. Em uma modalidade, um indivíduo é classificado ou atribuído a um grupo ou a uma classe de genótipo particular com base na similaridade entre os níveis medidos de um ou mais biomarca- dores no indivíduo e o nível do um ou mais biomarcadores observado em uma população de referência padronizada.

Em uma modalidade da invenção, um tratamento terapêutico de interesse é administrado a cada indivíduo em uma população de teste e a resposta de cada indivíduo ao tratamento é medida utilizando um ou mais critérios pré-determinados. É considerado que em muitos casos, a popula- ção de teste exibirá uma faixa de respostas e que o investigador escolherá o número de grupos que respondem (por exemplo/baixo, médio, alto) constitu- ídos pelas várias respostas. Em adição, o gene para cada indivíduo na popu- lação de teste é genotipado e/ou haplotipado, o que pode ser feito antes ou após a administração do tratamento.

Métodos de análises estatísticas, que podem ser utilizados, são descritos em Fisher LD & vanBelle G, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, Nova York, 1993). Esta análise pode ainda incluir um cálculo de regressão de quais sítios polimórficos no gene contribuem mais significativamente com as diferenças no fenótipo.

Um método alternativo para a descoberta das correlações entre o conteúdo de haplotipo e as respostas clínicas utiliza modelos de previsão baseados em algoritmos de otimização para minimzação de erros, um dos quais é um algoritmo genético (Judson R, "Genetic Algorithms and Their U- ses in Chemistry" em Reviews in Computational Chemistry, Vol. 10, pp 1-73, Lipkowitz KB e Boyd DB, eds, (VCH Publishers, Nova York, 1997). O anela- mento simulado (Press e outros, Numerical Recipes em C: The Art of Scien- tific Computing, Cap. 10 (Cambridge University Press, Cambridge, 1992), redes neuronais (Rich E & Knight K, Artificial Intelligence, 2a Edição, Cap. 10 (McGraw-Hill, Nova York, 1991), métodos de diminuição do gradiente padro- nizado (Press e outros, supra Cap. 10) ou outras abordagens globais ou Io- cais também podem ser utilizadas.

As correlações também podem ser analisadas utilizando as téc- nicas de análise de variação (ANOVA) para determinar o quanto a variação nos dados clínicos é explicado pelos subconjuntos diferentes dos sítios poli- mórficos no gene. A ANOVA é utilizada para testar hipótese em relação do fato de que uma variável de resposta é causada por ou se correlaciona com, uma ou mais características ou variáveis que podem ser medidas. Vide, Fi- sher LD & vanBelle G, Biostatistics: A Methodology for the Health Sciences (Wiley-lnterscience, Nova York, 1993), Cap. 10.

Após ambos os dados clínicos e de polimorfismos terem sido obtidos, as correlações entre a resposta do indivíduo e o conteúdo de genó- tipo ou de haplotipo são criadas. As correlações podem ser produzidas de várias maneiras. Em um método, os indivíduos são agrupados por seu genó- tipo ou haplotipo (ou par de haplotipos) (também referido como um grupo de polimorfismo) e então as médias e os desvios-padrão de respostas clínicas exibidos pelos membros de cada grupo de polimorfismo são calculados.

O versado na ténica pode construir um modelo matemático que prevê a resposta clínica como uma função do genótipo ou do haplotipo par- tindo das análises descritas anteriormente. A identificação de uma associa- ção entre uma resposta clínica e um genótipo ou um haplotipo (ou par de haplotipos) para o gene pode ser a base para o planejamento de um método de diagnóstico para determinar aqueles indivíduos que irão ou não respon- der ao tratamento ou alternativamente, irão responder em um nível menor e assim podem requerer mais tratamento, isto é, uma dose maior de um fár- maco. O método de diagnóstico pode tomar uma de várias formas: por e- xemplo, um tesde direto de DNA (isto é, a genotipagem ou a haplotipagem de um ou mais dos sítios polimórficos no gene), um teste sorológico ou uma medida de exame físico. O único requerimento é que haja uma boa correla- ção entre os resultados do teste de diagnóstico e o genótipo ou o haplotipo fundamental. Em uma modalidade preferida, o método de diagnóstico utiliza o método de haplotipagem de previsão descrito anteriormente.

Medicina Preventiva. A invenção refere-se ainda ao campo da medicina preventiva em que os ensaios de diagnóstico, os ensaios prognós- ticos e os testes clínicos de monitoramento são utilizados para as finalidades de prognóstico (de previsão) para tratar profilaticamente um indivíduo. Con- seqüentemente, um aspecto da invenção refere-se aos ensaios de diagnós- tico para a determinação da expressão de moléculas de biomarcadores as- sim como da atividade das moléculas de biomarcadores, no contexto de uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro, células, tecido) para determi- nar assim se um indivíduo é afligido pela doença ou pelo distúrbio ou está em risco de desenvolver um distúrbio, associado com a expressão ou a ati- vidade aberrante da molécula de biomarcador.

A invenção fornece ainda ensaios prognósticos (ou de previsão) para a determinação se um indivíduo está em risco de desenvolver um dis- túrbio associado com a expressão ou a atividade da molécula dè biomarca- dor. Tais ensaios podem ser utilizados para a finalidade de prognóstico ou de previsão para tratar profilaticamente dessa maneira um indivíduo antes do início de um distúrbio caracterizado por ou associado com um polipeptí- deo biomarcador.

Os níveis de certos polipeptídeos em um tecido particular (ou no sangue) de um indivíduo podem ser indicativos da toxicidade, da eficiência, da taxa de eliminação ou da taxa de metabolismo de um certo fármaco quando administrado ao indivíduo. Os métodos descritos aqui também po- dem ser utilizados para determinar os níveis de tais polipeptídeos nos indiví- duos para auxiliar na previsão da resposta de tais indivíduos a estes fárma- cos. Um outro aspecto da invenção fornece métodos para a determinação da atividade do polipeptídeo mutante em um indivíduo para dessa maneira se- lecionar compostos terapêuticos ou profiláticos apropriados para tal indiví- duo. Os métodos da presente invenção permitem a seleção de compostos (por exemplo, fármacos) para o tratamento terapêutico ou profilático de um indivíduo baseado no genótipo do indivíduo (por exemplo, no genótipo do indivíduo verificado para determinar a capacidade do indivíduo de responder a um composto particular).

Ensaios Prognósticos. A ligação de um composto prognóstico a uma molécula de biomarcador, por exemplo, um polipeptídeo biomarcador ou um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo biomarcador, pode ser utilizada para a identificação de um indivíduo que possui ou está em risco de desenvolver um distúrbio associado com a expressão ou a atividade do poli- peptídeo biomarcador (que é descrito anteriormente). Um composto prog- nóstico é qualquer composto que se liga a ou se associa com uma molécula de biomarcador, incluindo, mas não limitado, por exemplo, a um anticorpo antipolipeptídeo biomarcador, uma molécula pequena, um ácido nucléico, um polipeptídeo, um oligossacarídeo, um lipídeo ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, os ensaios prognósticos podem ser utilizados para a identificação de um indivíduo que possui ou está em risco de desen- volver a doença ou o distúrbio. Assim, a invenção fornece um método para a identificação de uma doença ou de um distúrbio associado com a expressão ou com a atividade do biomarcador em que uma amostra de teste é obtida de um indivíduo e a ligação ou a atividade do composto prognóstico é detec- tada, em que a presença de uma alteração da ligação ou da atividade do composto prognóstico é diagnostica para um indivíduo que possui ou está em risco de desenvolver uma doença ou um distúrbio associado com a ex- pressão ou com a atividade do biomarcador. Como utilizado aqui, uma "a- mostra de teste" refere-se a uma amostra biológica obtida de um indivíduo de interesse. Por exemplo, uma amostra de teste pode ser um fluido biológi- co (por exemplo, soro), uma amostra de células ou um tecido ou um ácido nucléico isolado ou um polipeptídeo derivado do mesmo.

Além disso, os ensaios prognósticos descritos aqui podem ser utilizados para determinar se um indivíduo pode receber a administração de um composto (por exemplo, um agonista, um antagonista, um imitador de peptídeo, um polipeptídeo, um peptídeo, um ácido nucléico, uma molécula pequena, ou um outro candidato a fármaco) para tratar uma doença ou um distúrbio associado ao biomarcador. Como utilizado aqui, a administração de um composto a um indivíduo ou a um paciente inclui a auto-administração e a administração por um outro. Em uma modalidade, os ensaios prognósticos descritos aqui são utilizados para determinar se um indivíduo responderá a um composto. Por exemplo, tais métodos podem ser utilizados para determi- nar se um indivíduo pode ser eficientemente tratado com um composto tera- pêutico em relação a um distúrbio associado ao biomarcador (isto é, condição médica associada ao biomarcador). Assim, a invenção fornece métodos para a determinação do fato de um indivíduo poder ser eficientemente tratado com um composto em relação a um distúrbio associado com a expressão ou com a atividade do biomarcador em que uma amostra de teste é obtida e a molécula de biomarcador é detectada utilizando um composto prognóstico (por exem- plo, em que a presença ou o nível alterado de expressão da molécula de bio- marcador comparado com o nível de expressão do biomarcador em uma refe- rência é diagnóstico para um indivíduo que pode receber a administração do composto para tratar um distúrbio associado com o biomarcador.

Há um número de doenças em que o grau dè superexpressão (ou de subexpressão) de certas moléculas de biomarcador, isto é, doença ou estado de saúde médico associado com o biomarcador, é conhecido como sendo indicativo do fato de que um indivíduo desenvolverá uma doença. As- sim, o método de detecção de um biomarcador em uma amostra pode ser utilizado como um método de previsão do fato de que um indivíduo desen- volverá uma doença. O nível de um ou mais biomarcadores em uma amostra de tecido ou de sangue adequada de um indivíduo em risco de desenvolver a doença é determinado e comparado com um controle adequado, por e- xemplo, o nível em indivíduos que não estão em risco de desenvolver a do- ença. O grau até o qual um ou mais biomarcadores é superexpresso (ou subexpresso) na amostra comparado com o controle pode ser uma previsão da probabilidade de que o indivíduo desenvolverá a doença. Quanto maior a superexpressão (ou subexpressão) em relação ao controle, maior a probabi- lidade do indivíduo de desenvolver a doença.

Os métodos descritos aqui podem ser realizados, por exemplo, através da utilização de kits para diagnóstico pré-embalados compreenden- do pelo menos um reagente de sonda, por exemplo, o anticorpo antipolipep- tídeo biomarcador descrito aqui, que pode ser convenientemente utilizado, por exemplo, em um ajuste clínico para diagnosticar pacientes que exibem sintomas ou histórico familiar de uma doença ou indisposição envolvendo um biomarcador da invenção. Além disso, qualquer tipo de célula ou tecido em que um biomarcador da invenção é expresso pode ser utilizado nos en- saios prognósticos descritos aqui.

Monitoramento da Eficiência Clínica. O monitoramento da influ- ência de agentes (por exemplo, fármacos, compostos) sobre a expressão ou a atividade de um biomarcador (por exemplo, a capacidade de modular a proliferação e/ou a diferenciação aberrante de células) pode ser aplicado na seleção de fármacos básicos e nos testes clínicos. Por exemplo, a eficiência de um agente determinada por um ensaio de seleção como descrito aqui para aumentar a expressão do gene biomarcador, os níveis de proteína ou regular para mais a atividade do biomarcador, pode ser monitorada em tes- tes clínicos de indivíduos que exibem menor expressão do gene biomarca- dor, níveis de proteína ou atividade do biomarcador regulada para menos. Alternativamente, a eficiência de um agente determinado por um ensaio de seleção para diminuir a expressão do gene biomarcador, os níveis de proteí- na ou para regular para menos a atividade do biomarcador, pode ser monito- rada em testes clínicos de indivíduos que exibem maior expressão do gene biomarcador, níveis de proteína ou atividade do biomarcador regulada para mais. Em tais testes clínicos, a expressão ou a atividade de um biomarcador e, preferencialmente, de outros genes que foram implicados, por exemplo, em um distúrbio proliferativo e cânceres, pode ser utilizada como uma "leitu- ra" ou um marcador da capacidade de resposta de uma célula particular.

Por exemplo, genes, incluindo genes que codificam um biomarca- dor da invenção, que são modulados nas células através do tratamento com um agente (por exemplo, composto, fármaco ou pequena molécula) que modu- la a atividade de um biomarcador (por exemplo, identificada em um ensaio de seleção como descrito aqui) podem ser identificados. Assim, para estudar o efeito de agentes sobre os distúrbios de proliferação celular, por exemplo, em um teste clínico, as células podem ser isoladas e o RNA preparado e analisado em relação aos níveis de expressão de um biomarcador e outros genes impli- cados.no distúrbio. Os níveis de expressão gênica (isto é, um padrão de ex- pressão gênica) podem ser quantificados pela análise de Northern blot ou por RT-PCR, como descrito aqui ou alternativamente através da medida da quanti- dade de proteína produzida, por um dos métodos como descrito aqui ou atra- vés da medida dos níveis de atividade de um gene ou de outros genes. Desta maneira, o padrão de expressão gênica pode servir como um marcador, indica- tivo da resposta fisiológica das células para o agente. Conseqüentemente, esta condição de resposta pode ser determinada antes e em vários pontos de tempo durante o tratamento do indivíduo com o agente.

Expressão Gênica e Classificação dos Indivíduos. Os níveis de controle padronizados de um produto da expressão gênica são determina- dos através da medida da expressão gênica em grupos de controle diferen- tes. Os níveis de expressão gênica do grupo de controle são então compa- rados com o nível medido de um produto da expressão gênica em um certo indivíduo. Este produto da expressão gênica poderia ser o mRNA caracterís- tico associado com o do grupo do genótipo particular ou com o produto da expressão gênica do polipeptídeo de tal grupo de genótipo. O indivíduo pode ser classificado ou atribuído a um grupo de genótipo particular com base em quão similares os níveis medidos foram comparados com os níveis de con- trole para um certo grupo.

Como um versado na ténica entenderá, haverá um certo grau de incerteza envolvido na produção desta determinação. Portanto, os desvios- padrão dos níveis do grupo de controle podem ser utilizados para produzir uma determinação de probabilidade e o método desta invenção podem ser aplicados ao longo de uma faixa ampla de determinações de grupos de ge- nótipos baseados na probabilidade. Assim, por exemplo, e não com a finali- dade de limitação, em uma modalidade, se o nível medido do produto da expressão gênica se encaixar dentro de 2,5 desvios-padrão da média de qualquer um dos grupos de controle, então tal indivíduo pode ser atribuído para tal grupo de genótipo. Em uma outra modalidade se o nível medido do produto da expressão gênica se encaixar dentro de 2,0 desvios-padrão da média de qualquer um dos grupos de controle então tal indivíduo pode ser atribuído a tal grupo de genótipo. Ainda em uma outra modalidade, se o nível medido do produto da expressão gênica se encaixar dentro de 1,5 desvio- padrão da média de qualquer um dos grupos de controle então tal indivíduo pode ser atribuído a tal grupo de genótipo. Ainda em uma outra modalidade, se o nível medido do produto da expressão gênica for de 1,0 ou menos des- vios-padrão da média de qualquer um dos níveis de grupos de controle en- tão tal indivíduo pode ser atribuído a tal grupo de genótipo.

Assim, este processo permite a determinação, com vários graus de probabilidade, de que em qual grupo um indivíduo específico deve ser colocado e tal atribuição a um grupo de genótipo determinaria então a cate- goria de risco na qual o indivíduo deve ser colocado.

Detecção da Expressão Gênica do Biomarcador. Um exemplo de método para a detecção da presença ou da ausência de polipeptídeo ou de ácido nucléico mutante da invenção em uma amostra biológica envolve a ob- tenção de uma amostra biológica de um indivíduo de teste e o contato da a- mostra biológica com um composto ou com um composto capaz de detectar o polipeptídeo ou ó ácido nucléico mutante (por exemplo, mRNA, DNA genômi- co) que codifica o polipeptídeo mutante da invenção, de forma que a presença do gene mutante é detectada na amostra biológica. Um composto para a de- tecção do mRNA mutante ou do DNA genômico mutante é uma sonda de áci- do nucléico marcada capaz de se hibridizar com o mRNA mutante ou com o DNA genômico mutante. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um ácido nucléico mutante de comprimento completo ou uma parte do mes- mo, tal como um oligonucleotídeo de pelo menos 5, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de comprimento e suficiente para se hibridizar especifica- mente sob condições estringentes com o mRNA mutante ou com o DNA ge- nômico mutante. Outras sondas adequadas para uso nos ensaios de diagnós- tico da invenção são descritas aqui. Um exemplo de um composto para a de- tecção de um polipeptídeo mutante da invenção é um anticorpo produzido contra o polipeptídeo mutante da invenção, capaz de se ligar ao polipeptídeo mutante, preferencialmente um anticorpo com uma marcação que pode ser detectada. Os anticorpos podem ser policlonais ou mais preferencialmente, monoclonais. Um anticorpo intacto ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab ou F(ab')2) pode ser utilizado. É pretendido que o termo "marcado", em relação à sonda ou ao anticorpo, abranja a marcação direta da sonda ou do anticorpo através do acoplamento (isto é, da ligação física) de uma substância que pode ser detectada com a sonda ou com o anticorpo, assim como a mar- cação indireta da sonda ou do anticorpo através da reatividade com um outro composto que é marcado diretamente. Os exemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secun- dário marcado de forma fluorescente e a marcação da extremidade de uma sonda de DNA com biotina de forma que esta possa ser detectada com es- treptavidida marcada de forma fluorescente. Ou seja, o método de detecção da invenção pode ser utilizado para detectar o mRNA, o polipeptídeo ou o DNA genômico mutante da invenção em uma amostra biológica in vitro assim como in vivo. Por exemplo, as técnicas in vitro para a detecção do mRNA mu- tante incluem hibridizações de Northern e hibridizações in situ. As técnicas in vitro para a detecção do polipeptídeo mutante da invenção incluem os ensaios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISAs), Western blots, imunoprecipita- ções e imunofluorescência. As técnicas in vitro para a detecção do DNA ge- nômico mutante incluem hibridizações de Southern. Além disso, as técnicas in vivo para a detecção do polipeptídeo mutante incluem a introdução em um indivíduo de um anticorpo antipolipeptídeo mutante marcado. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radiativo cuja presença e loca- lização em um indivíduo podem ser detectadas através de técnicas de forma- ção de imagem. Em uma modalidade, a amostra biológica contém moléculas de polipeptídeo do indivíduo de teste. Alternativamente, a amostra biológica pode conter moléculas de mRNA do indivíduo de teste ou moléculas de DNA genômico do indivíduo de teste. Uma amostra biológica preferida é uma a- mostra de leucócitos de sangue periférico isolada através de meios conven- cionais de um indivíduo.

Na prática da presente invenção, muitas técnicas convencionais na biologia molecular, na bioquímica de proteínas, na biologia celular, na imunologia, na microbiologia e no DNA recombinante são utilizadas. Estas técnicas são bem-conhecidas e são explicadas, por exemplo, em Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I-III1 Ausubel, Ed. (1997); Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição (Cold S- pring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I e II, Glover1 Ed. (1985); Oligonucleotide Syn- thesis, Gait, Ed. (1984); Nucleie Aeid Hybridization, Hames & Higgins, Eds. (1985); Transeription and Translation, Hames & Higgins, Eds. (1984); Animal Cell Culture, Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Praetieal Guide to Molecular Cloning-, the series, Me- th. Enzymol., (Academie Press, Inc., 1984); Gene Transfer Veetors for Mammalian Cells, Miller & Calos, Eds. (Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, 1987); e Meth. Enzymol., Vols. 154 e 155, Wu & Grossman e Wu, eds., respectivamente. Os métodos para detectar e para medir os níveis de mRNA (isto é, o nível de transcrição gênica) e os níveis de produtos da expressão gênica de polipeptídeo (isto é, o nível de tradução gênica) são bem-conheci- dos na ténica e incluem o uso de microarranjos de nucleotídeos e métodos de detecção de polipeptídeos envolvendo espectrômetros de massa e/ou técnicas de detecção e de quantificação de anticorpos. Vide também, Stra- chan & Read, Human Molecular Genetics, Segunda Edição. (John Wiley e Sons, Inc., Nova York, 1999).

As técnicas para a detecção da expressão gênica dos genes des- critos por esta invenção incluem, mas não estão limitadas a Northern blots, RT-PCT, PCR em tempo real, extensão de iniciadores, proteção da RNase, obtenção de perfil de expressão de RNA e técnicas relacionadas. As técnicas para a detecção da expressão gênica pela detecção dos produtos de proteína codificados pelos genes descritos por esta invenção incluem, mas não estão limitados, por exemplo, a anticorpos que reconhecem os produtos de proteína, western blots, imunofluorescência, imunoprecipitação, ELISAs e técnicas rela- cionadas. Estas técnicas são bem-conhecidas pelos versados na ténica. Sambrook J. e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Terceira Edi- ção (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 2000). Em uma modalidade, a técnica para a detecção da expressão gênica inclui o uso de um chip gênico. A construção e o uso de chips gênicos são bem- conhecidos na ténica. Vide, as Patentes U.S. N- 5.202.231; 5.445.934; 5.525.464; 5.695.940; 5.744.305; 5.795.716 e 5.800.992. Vide também, Johnston M, Curr. Biol., 8: R171-174 (1998); Iyer VR e outros, Science, 283: 83-87 (1999) e Elias Ρ, "New human genome 'chip' is a revolution in the offing" Los Angeles Daily News (3 de outubro de 2003).

No EXEMPLO 1 abaixo, as hibridizações em microarranjos fo- ram realizadas como recomendado pelo fabricante do sistema de microar- ranjo (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia; Expression analysis technical ma- nual). Seis amostras de cada grupo de tratamento foram individualmente hibridizadas (sem agrupamento) no conjunto de arranjo de sondas de ex- pressão gênica do genoma de rato RAE230 2.0 contendo >31.000 conjuntos de sondas (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Califórnia, USA).

O cDNA de filamento duplo foi sintetizado com uma quantidade de partida de aproximadamente 5 pg do RNA total de comprimento completo utilizando o Superscript Choice System (Invitrogen Life Technologies) na presença de um iniciador de oligonucleotídeo T7-(dT)24 DNA. Após a sínte- se, o cDNA foi purificado através da extração com fenol/clorofórmio/isoami- lálcool e da precipitação com etanol. O cDNA purificado foi então transcrito in vitro utilizando o BioArray® High Yield RNA Transcript Labelling Kit (EN- ZO) na presença de ribonucleotídeos biotinilados na forma de cRNA marca- do com biotina. O cRNA marcado foi então purificado em uma resina de afi- nidade (RNeasy, Qiagen), quantificado e fragmentado. Uma quantidade de aproximadamente 10 pg de cRNA marcado foi hibridizada durante aproxi- madamente 16 horas a 45SC a um arranjo de sonda de expressão. O arranjo foi então lavado e corado duas vezes com estreptavidina-ficoeritrina (Mole- cular Probes) utilizando a GeneChip Fluidoics Workstation 400 (Affymetrix). O arranjo foi então verificado duas vezes utilizando um scanner a laser con- focai (GeneArray Scanner, Agilent) resultando em uma imagem verificada pelo scanner. Este ".dat-file" resultante foi processado utilizando programa MAS5 (Affymetrix) em um ".cel-file". Os dados brutos foram convertidos em níveis de expressão utilizando uma "intensidade-alvo" de 150.

Determinação da Transcrição do Gene Marcador. A determinação do nível do produto de expressão de um gene marcador em uma amostra bio- lógica, por exemplo, no tecido ou nos fluidos corporais de um indivíduo, pode ser realizada de várias maneiras. Muitos métodos de detecção da expressão utilizam RNA isolado. Para os métodos in vitro, qualquer técnica de isolamen- to de RNA que não seleciona contra o isolamento de mRNA pode ser utilizada para a purificação do RNA das células. Vide, por exemplo, Ausubel e outros, ed., Curr. Prot. MoL Biot (John Wiley & Sons, NY, 1987-1999).

Em uma modalidade, é determinado o nível do produto de ex- pressão de mRNA de um gene marcador. Os métodos para medir o nível de um mRNA específico são bem-conhecidos na ténica e incluem análise de Northern blot, PCR com transcrição inversa e PCR quantitativa em tempo real ou através da hibridização a um arranjo ou um microarranjo de oligonu- cleotídeos. Em outras modalidades mais preferidas, a determinação do nível de expressão pode ser realizada através da determinação do nível do produ- to de expressão de proteína ou de polipeptídeo do gene em fluidos corporais ou em amostras de tecidos incluindo, mas não limitadas a sangue ou soro.

Em uma modalidade particular, o nível de mRNA correspondente a um marcador pode ser determinado tanto in situ quanto através de forma- tos in vitro em uma amostra biológica utilizando métodos conhecidos na té- nica. Adicionalmente, grandes números de amostras de tecido podem ser facilmente processados utilizando técnicas bem-conhecidas pelos versados na ténica, tal como, por exemplo, o processo de isolamento de RNA em uma única etapa da Patente U.S. N2 4.843.155.

O mRNA isolado pode ser utilizado nos ensaios de hibridização ou de amplificação que incluem, mas não estão limitados às análises de Southern ou Northern, às análises de PCR e aos arranjos de sondas. Um método de diagnóstico preferido para a detecção dos níveis de mRNA en- volve o contato do mRNA isolado com uma molécula de ácido nucléico (son- da) que pode se hibridizar com o mRNA codificado pelo gene que será de- tectado. A sonda de ácido nucléico pode ser, por exemplo, um cDNA de comprimento completo ou uma parte do mesmo, tal como um oligonucleotí- deo de pelo menos 7, 15, 30, 50, 100, 250 ou 500 nucleotídeos de compri- mento e suficiente para se hibridizar especificamente sob condições estrin- gentes a um mRNA ou a um DNA genômico que codifica um marcador da presente invenção. Outras sondas adequadas para uso nos ensaios de di- agnóstico da invenção são descritas aqui. A hibridização de um mRNA com a sonda indica qüe o marcador em questão está sendo expresso.

Em um formato, o mRNA é imobilizado sobre uma superfície só- lida e colocado em contato com uma sonda, por exemplo, através da corrida do mRNA isolado em um gel de agarose e da transferência do mRNA do gel para uma membrana, tal como nitrocelulose. Em um formato alternativo, a(s) sonda(s) é(são) imobilizada(s) sobre uma superfície sólida e o mRNA é co- locado em contato com a(s) sonda(s), por exemplo, em um arranjo de chip gênico Affymetrix. Um versado na ténica pode facilmente adaptar métodos de detecção de mRNA conhecidos para uso na detecção do nível de mRNA codificado pelos marcadores da presente invenção.

Um método alternativo para a determinação do nível de mRNA correspondente a um marcador da presente invenção em uma amostra en- volve o processo de amplificação de ácidos nucléicos, por exemplo, através da RT-PCR (a modalidade experimental apresentada por Mullis, Patente U.S. N° 4.683.232); de reação em cadeia da ligase, Barany (1991), supra-, de replicação de seqüência auto-sustentada, Guatelli e outros, Proc. NatL-Acad. Sei, USA, 87: 1874-1878 (1990); do sistema de amplificação transcricional, Kwoh e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86: 1173-1177 (1989); da Q-Beta Replicase, Lizardi e outros, Biol. Technology, 6: 1197 (1988); da replicação de círculo rolante, Patente U.S. N- 5.854.033; ou de qualquer outro método de amplificação de ácidos nucléicos, seguido pela detecção das moléculas amplificadas utilizando técnicas bem-conhecidas pelos versados na ténica. Estes esquemas de detecção são especialmente úteis para a detecção das moléculas de ácidos nucléicos se tais moléculas estiverem presentes em números muito baixos. Como utilizado aqui, os iniciadores de amplificação são definidos como sendo um par de moléculas de ácidos nucléicos que po- de se anelar às regiões a 5' ou a 3' de um gene (filamentos positivo e nega- tivo, respectivamente ou vice-versa) e contém uma região curta no meio. Em geral, os iniciadores de amplificação possuem aproximadamente 10-30 nu- cleotídeos de comprimento e flanqueiam uma região de aproximadamente 50-200 nucleotídeos de comprimento. Sob condições apropriadas e com re- agentes apropriadas, tais iniciadores permitem a amplificação de uma molé- cula de ácido nucléico que compreende a seqüência de nucleotídeos flan- queada pelos iniciadores.

Como citado anteriormente, a RT-PCR (PCR quantitativa em tempo real) é uma maneira de avaliar os níveis de expressão gênica, por exemplo, dos genes da invenção (por exemplo, daqueles que contêm SNPs e polimorfismos de interesse). O ensaio de RT-PCR utiliza uma transcriptase reversa de RNA para catalisar a síntese de um filamento de DNA partindo de um filamento de RNA, incluindo um filamento de mRNA. O DNA resultante pode ser especificamente detectado e quantificado e este processo pode ser utilizado para determinar os níveis de espécies específicas de mRNA. Um método para fazer isso é conhecido sob a Marca Registrada TAQMAN (PE Applied Biosystéms, Foster City, CA) e explora a atividade da nuclease a 5' da DNA polimerase AMPLITAQ GOLD® para clivar uma forma específica da sonda durante uma reação da PCR. Esta é referida como uma sonda TAQ- MAN®. Vide Luthra e outros, Am. J. Pathol., 153: 63-68 (1998)). A sonda consiste em um oligonucleotídeo (geralmente -20 mer) com um corante re- pórter a 5' e um corante inibidor de fluorescência a 3'. O corante repórter fluorescente, tal como FAM (6-carboxifluoresceína), está ligado de forma covalente à extremidade a 5' do oligonucleotídeo. O repórter sofre inibição de fluorescência por TAMRA (6-carbóxi-N,N,N',N'-tetrametilrodamina) ligada através de um braço Iigante que fica localizado na extremidade a 3'. Vide Kuimelis e outros, Nucl. Acids Symp. Ser., 37: 255-256 (1997) e Mullah e outros, Nucl. Acids Res., 26(4): 1026-1031 (1998)). Durante a reação, a cli- vagem da sonda separa o corante repórter e o corante de decaimento, resul- tando na maior fluorescência do repórter.

O acúmulo de produtos da PCR é detectado diretamente através do monitoramento do aumento na fluorescência do corante repórter. Vide Heid e outros, Genome Res., 6(6): 986-994 (1996). As reações são caracte- rizadas pelo ponto no tempo durante a ciclagem quando a amplificação de um produto da PCR é primeiramente detectada ao invés da quantidade do produto da PCR acumulado após um número fixo de ciclos. Quanto maior o número de cópias inicial do ácido nucléico-alvo, mais rápido um aumento significativo na fluorescência é observado, (Gibson e outros, Genome Res., 6:995-1001 (1996)).

Quando a sonda estiver intacta, a proximidade do corante repór- ter ao corante de decaimento resulta na supressão da fluorescência do re- pórter primariamente pela transferência de energia do tipo Fõrster. Vide La- kowicz e outros, J. Biol. Chem., 258: 4794-480I (1983)). Durante a PCR, se o alvo de interesse estiver presente, a sonda se anela especificamente entre os sítios dos iniciadores para frente e para trás. A atividade nucleolítica 5'-3' da DNA polimerase AMPLITAQ GOLD® cliva a sonda entre o repórter e o agente de inibição de fluorescência somente se a sonda se hibridizar com o alvo. Os fragmentos da sonda são então deslocados do alvo e a polimeriza- ção do filamento continua. Este processo ocorre em cada ciclo e não interfe- re com o acúmulo exponencial do produto. A extremidade a 3' da sonda é bloqueada para prevenir a extensão da sonda durante a PCR.

A referência passiva é um corante incluído no tampão TAQ- MAN® e não participa no ensaio da nuclease a 5'. A referência passiva for- nece uma referência interna à qual o sinal do corante repórter pode ser nor- malizado durante a análise dos dados. A normalização é necessária para corrigir as flutuações fluorescentes causadas por alterações na concentra- ção ou no volume.

A normalização é realizada através da divisção da intensidade de emissão do corante repórter pela intensidade de emissão da referência passiva para a obtenção de uma proporção definida como Rn (repórter nor- malizado) para um certo tubo de reação.

O valor de ciclo limite ou Ct é o ciclo em que um aumento esta- tisticamente significativo em ARn é primeiramente detectado. Em um gráfico de Rn vs. número de ciclos, o ciclo limite ocorre quando a aplicação de de- tecção de seqüência começa a detectar o aumento no sinal associado com um crescimento exponencial do produto da PCR.

Para a realização de medidas quantitativas, diluições em série de um cRNA (padrão) são incluídas em cada experimento com a finalidade de construir uma curva-padrão necessária para a quantificação acurada e rápida do mRNA. A fim de estimar a capacidade de reprodução da técnica, a amplificação da mesma amostra de cRNA pode ser realizada várias vezes.

Outras tecnologias para a medida do estado transcricional de uma célula produzem grupos de fragmentos de restrição de complexidade limitada para a análise eletroforética, tais como os métodos que combinam a digestão dupla com enzimas de restrição com iniciadores em fase (vide, por exemplo, a EP 0 534858 A1) ou os métodos que selecionam fragmentos de restrição com sítios próximos a uma extremidade de mRNA definida. Vide, por exemplo, Prashar e outros, Proc. NatL Acad. Sci., USA, 93(2): 659-663 (1996)).

Outros métodos obtêm amostragens estatísticas de grupos de cDNA, tal como através do seqüenciamento de bases suficientes, por exem- plo, 20-50 bases, em cada um dos vários cDNAs para a identificação de ca- da cDNA ou através do seqüenciamento de marcações curtas, por exemplo, 9-10 bases, que são geradas em posições conhecidas em relação a um pa- drão de via final de mRNA definido. Vide, por exemplo, Velculescu, Science, 270: 484-487 (1995). O(s) nível(veis) de cDNA nas amostras é(são) quantifi- cado^) e a média, o valor médio e o desvio-padrão de cada cDNA são de- terminados utilizando meios estatísticos padronizados bem-conhecidos pelos versados na ténica. Bailey NTJ, Statistical Methods In Biology, Terceira Edi- ção (Cambridge University Press, 1995).

Alternativamente, o nível de expressão pode ser fornecido na forma de um nível de expressão relativo. Para a determinação de um nível de expressão relativo de um gene marcador, o nível de expressão do mar- cador é determinado para 10 ou mais amostras de amostras biológicas nor- mais versus doentes, preferencialmente 50 ou mais amostras, antes da de- terminação do nível de expressão para a amostra em questão. O nível médio de expressão de cada um dos genes analisados no número maior de amos- tras é determinado e este é utilizado como um nível de expressão de linha de base para o marcador. Um nível de expressão do marcador determinado para a amostra de teste (nível absoluto de expressão) é então dividido pelo valor médio de expressão obtido para tal marcador. Isto fornece um nível de expressão relativo. Preferencialmente, as amostras utilizadas na determina- ção da linha de base serão provenientes de indivíduos que não possuem o polimorfismo. A escolha da fonte de células é dependente do uso do nível de expressão relativo. Utilizando a expressão observada nos tecidos normais como um escore de expressão médio auxilia na validação do fato do marca- dor analisado ser específico (versus células normais). Em adição, à medida que mais dados são acumulados, o valor de expressão médio pode ser revi- sado, fornecendo valores de expressão relativos melhorados com base nos dados acumulados.

Determinação da Tradução do Gene Biomarcador. Em uma outra modalidade da presente invenção, é detectado um polipeptídeo que corres- ponde a um marcador. A detecção do produto da expressão do polipeptídeo biomarcador (também conhecido como, biomarcador, marcador, proteína marcadora ou polipeptídeo marcador) do gene biomarcador nos fluidos corpo- rais ou nos tecidos pode ser utilizada para determinar a presença ou a ausên- cia do polimorfismo e o nível relativo do produto de expressão do polipeptídeo biomarcador pode ser utilizado para determinar se o polimorfismo está pre- sente em um estado homozigoto ou heterozigoto (e, conseqüentemente, a categoria de risco do indivíduo). Ou seja, em uma outra modalidade da pre- sente invenção, é detectado um polipeptídeo que corresponde a um marcador (isto é, polipeptídeo biomarcador). O nível deste produto de expressão gênica do polipeptídeo biomarcador nos fluidos corporais ou na amostra de tecido pode ser determinado através de quaisquer meios conhecidos na ténica.

Métodos de Detecção Imunológica. A expressão da proteína co- dificada pelo(s) gene(s) da invenção pode ser detectada por uma sonda que pode ser marcada de forma detectável ou que pode ser marcada subse- qüentemente. De forma geral, a sonda é um anticorpo que reconhece a pro- teína expressa. Uma variedade de formatos pode ser empregada para de- terminar se uma amostra contém uma proteína biomarcadora que se liga a um certo anticorpo. Os métodos de ensaios imunológicos úteis na detecção de polipeptídeos biomarcadores da presente invenção incluem, mas não es- tão limitados a, por exemplo, "dot blotting", "western blotting", chips de prote- ínas, ensaios de ligação competitivos e não competitivos com proteínas, en- saios imunoabsorventes ligados à enzima (ELISA), imunohistoquímica, se- paração de células ativada por fluorescência (FACS) e outros comumente utilizados e amplamente descritos na literatura científica e de patentes e mui- tos empregados comercialmente. Um versado na ténica pode facilmente a- daptar métodos de detecção de proteínas/anticorpos conhecidos para uso na determinação do fato das células expressarem um marcador da presente invenção e a concentração relativa de tal produto da expressão de polipeptí- deo específico no sangue ou em outros tecidos corporais. As proteínas de indivíduos podem ser isoladas utilizando técnias que são bem-conhecidas pelos versados na ténica. Os métodos de isolamento de proteínas emprega- dos podem, por exemplo, ser aqueles descritos em Harlow & Lane, Antibodi- es: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, Nova York, 1988)).

Um anticorpo intacto ou um fragmento do mesmo, por exemplo, Fab ou F(ab')2 pode ser utilizado. Os fragmentos de anticorpos, que reconhe- cem epitopos específicos, podem ser gerados através de técnicas conheci- das. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não estão limitados aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos através da digestão com pepsi- na da molécula de anticorpo e aos fragmentos Fab que podem ser gerados através da redução das pontes dissulfeto dos fragmentos F(ab')2. Alternativa- mente, podem ser construídas bibliotecas de expressão de Fab (vide Huse e outros, Science, 246: 1275-1281 (1989)), para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos de Fab monoclonais com a especificidade desejada.

É pretendido que o termo "marcada", em relação à sonda ou ao anticorpo, abranja a marcação direta da sonda ou do anticorpo por acopla- mento, isto é, ligando fisicamente, uma substância detectável à sonda ou ao anticorpo, assim como a marcação indireta da sonda ou do anticorpo através da reatividade com um outro reagente que é marcado diretamente. Os e- xemplos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário utilizando um anticorpo secundário marcado de forma fluorescente e a mar- cação da extremidade de uma sonda de DNA com biotina de forma que essa possa ser detectada com a estreptavidina marcada de forma fluorescente. Os anticorpos monoclonais (mAbs), que são populações homo- gêneas de anticorpos para um antígeno particular, podem ser obtidos atra- vés de qualquer técnica que forneça a produção de moléculas de anticorpo por cepas de células contínuas em cultura. Estas incluem, mas não estão limitadas à técnica de hibridoma de Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); e Patente U.S. N2 4.376.110; à técnica de hibridoma de células B humanas de Kosbor e outros, Immunol. Today, 4: 72 (1983); Cole e outros, Proc. NatL Acad. Sci., USA, 80: 2026-2030 (1983); e à técnica de hibridoma de EBV, Cole e outros, Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, pp. 77- 96 (Alan R. Liss, Inc., 1985). Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgG e qualquer subclasse das mesmas. O hibridoma que produz o mAb desta invenção pode ser culti- vado in vitro ou in vivo. A produção de altos títulos de mAbs in vivo torna es- te método de produção atualmente preferido.

Além disso, as técnicas desenvolvidas para a produção de "anti- corpos quiméricos" (vide Morrison e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 81: 6851-6855 (1984); Neuberger e outros, Nature, 312: 604-608 (1984); e Ta- keda e outros, Nature, 314: 452-454 (1985)), através do junção dos genes de uma molécula de anticorpo de camundongo de uma especificidade de antígeno apropriada junto com os genes de uma molécula de anticorpo hu- mano de atividade biológica apropriada podem ser utilizadas. Um anticorpo quimérico é uma molécula em que partes diferentes são derivadas de espé- cies de animais diferentes, tais como as que possuem uma região variável ou hipervariável derivada de um mAb murino e uma região constante de i- munoglobulina humana.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anti- corpos de cadeia simples, Patente U.S. N- 4.946.778; Bird, Science, 242: 423- 426 (1988); Huston e outros, Proc. Natl Acad. Sei. USA, 85: 5879-5883 (1988); e Ward e outros, Nature, 334: 544-546 (1989), podem ser adaptradas para a produção de anticorpos de cadeia simples com genes expressos de forma diferencial. Os anticorpos de cadeia simples são formados através da ligação de fragmentos de cadeias pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácido, resultando em um polipeptídeo de cadeia simples.

Mais preferencialmente, as técnicas úteis para a produção de "anticorpos humanizados" podem ser adaptadas para a produção de anti- corpos para as proteínas, os fragmentos ou os derivados das mesmas. Tais técnicas são descritas nas Patentes U.S. N- 5.932.448; 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089; 5.530.101; 5.569.825; 5.625.126; 5,633.425; 5.789.650; 5.661.016; e 5.770.429. Os fragmentos de anticorpo, que reco- nhecem epitopos específicos, podem ser gerados através dé técnicas co- nhecidas. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não estão limitados aos fragmentos F(ab')2 que podem ser produzidos através da digestão com pepsina da molécula de anticorpo e dos fragmentos Fab que podem ser ge- rados através da redução das pontes dissulfeto dos fragmentos F(ab')2. Al- ternativamente, às bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas (vide Huse e outros, Science, 246: 1275-1281 (1989)), para permitir o rápido auxílio na identificação fácil de fragmentos de Fab monoclonais com a espe- cificidade desejada.

Em um formato, os anticorpos ou os fragmentos de anticorpos podem ser utilizados em métodos, tais como como Western blots ou técnicas de imunofluorescência, para a detecção das proteínas expressas. Em tais casos, é geralmente preferível imobilizar o anticorpo ou as proteínas sobre um suporte sólido. Os suportes ou os veículos em fase sólida adequados incluem qualquer suporte capaz de se ligar a um antígeno ou a um anticor- po. Os suportes ou os veículos bem-conhecidos incluem vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran, náilon, amilases, celuloses naturais e mo- dificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetita.

A extensão até a qual as proteínas conhecidas são expressas em uma amostra biológica é determinada pelos métodos de ensaio imunoló- gico que utilizam os anticorpos descritos anteriormente. É particularmente preferido, para a facilidade de detecção, o ELISA em sanduíche, para o qual existe um número de variações, das quais todas são pretendidas para uso nos métodos e nos ensaios da presente invenção. Por exemplo, em um en- saio para frente típico, o anticorpo não marcado é imobilizado sobre um substrato sólido e a amostra que será testada é colocada em contato com a molécula ligada após um período de incubação adequado, durante um perí- odo de tempo suficiente para permitir a formação de um complexo binário de anticorpo-antígeno. Neste ponto, um segundo anticorpo, marcado com uma molécula repórter capaz de induzir um sinal detectável, é então adicionado e incubado, permitindo tempo suficiente para a formação de um complexo ter- nário de anticorpo-antígeno-anticorpo marcado. Qualquer material não rea- gido é lavado e a presença do antígeno é determinada através da observa- ção de um sinal ou pode ser quantificada através da comparação com uma amostra de controle contendo quantidades conhecidas de antígeno. Varia- ções no ensaio para frente incluem o ensaio simultâneo, em que tanto a a- mostra quanto o anticorpo são adicionados simultaneamente ao anticorpo ligado e um ensaio inverso em que o anticorpo marcado e a amostra que será tratada são primeiramente combinados, incubados e adicionados ao anticorpo não marcado ligado à superfície. Estas técnicas são bem-conheci- das pelos versados na ténica e a possibilidade de variações mínimas será rapidamente evidente. Como utilizado aqui, é pretendido que "ensaio em sanduíche" abranja todas as variações sobre a técnica básica de dois sítios. Para os ensaios imunológicos da presente invenção, o único fator Iimitante é que o anticorpo marcado tem que ser um anticorpo que é específico para a proteína expressa pelo gene de interesse.

Eletroforese em Gel Bidimensional. As proteínas podem ser se- paradas por sistemas de eletroforese em gel bidimensionais e então identifi- cadas e/ou quantificadas. A eletroforese em gel bidimensional é bem- conhecida na ténica e envolve tipicamente a focalização isoelétrica ao longo de uma primeira dimensão seguida pela eletroforese SDS PAGE ao longo de uma segunda dimensão. (Vide, por exemplo, Hames e outros, Gel Electro- phoresis of Proteins: A Practical Approaeh (IRL Press, NY, 1990); Shev- chenko e outros, Proc NatL Aead. Sei. USA, 93: 14440-14445 (1996); Sagli- occo e outros, Yeast, 12: 1519-1533 (1996); e Lander, Science 274: 536-539 (1996)). Os eletroferogramas resultantes podem ser analisados através de várias técnicas, incluindo técnicas de espectrometria de massa, western blot- ting e análise de immunoblot utilizando anticorpos policlonais e monoclonais e microsseqüenciamento interno e N-terminal. Utilizando estas técnicas, é possível identificar uma fração substancial de todas as proteínas produzidas sob certas condições fisiológicas, inclusive em células, por exemplo, em Ie- veduras, expostas a um fármaco ou em células modificadas, por exemplo, através da deleção ou da superexpressão de um gene específico.

Espectroscopia de Massa. A identidade e o nível de expressão do polipeptídeo biomarcador podem ser ambos determinados utilizando a técnica de espectroscopia de massa (MS). A metodologia de análise baseada na MS é utilizada para a análise do polipeptídeo biomarcador isolado assim como para a análise do polipeptídeo biomarcador em uma amostra biológica. Os formatos de MS para uso na análise de um polipeptídeo biomarcador incluem técnicas de ionização (I), tais como, mas não limitadas a MALDI, ESI contínuo ou em pul- sos e métodos relacionados, tal como ionspray ou termospray e impacto de aglomerado massivo (MCI). Tais fontes de íons podem ser combinadas com os formatos de detecção, incluindo TOF de reflectron linear ou não linear, quadru- pole isolado ou múltiplo, setor magnético isolado ou múltiplo, ressonância de ciclotron de íons com transformação de Fourier (FTICR), captura de íons e combinações dos mesmos tal como captura de íons/TOF. Para a ionização, várias combinações de matrizes/comprimentos de ondas (MALDI) ou combina- ções de solventes (ESI) podem ser empregadas. Os níveis de subatomoles de proteína foram detectados, por exemplo, utilizando ESI MS (Valaskovic e ou- tros, Science, 273: 1199-1202 (1996)) e MALDI MS (Li e outros, J. Am. Chem. Soc., 118: 1662-1663(1996)).

Para a análise de MS, o polipeptídeo biomarcador pode ser so- lubilizado em um sistema de soluções ou de reagentes apropriado. A sele- ção de um sistema de soluções ou de reagentes, por exemplo, um solvente orgânico ou inorgânico, dependerá das propriedades do polipeptídeo bio- marcador e do tipo de MS realizado e se baseia nos métodos bem- conhecidos na ténica. Vide, por exemplo, Vorm e outros, Anal. Chem., 61: 3281 (1994) para MALDI; e Valaskovic e outros, Anal. Chem., 67: 3802 (1995), para ESI. A MS dos peptídeos é também descrita, por exemplo, no Pedido de Patente PCT Internacional N2 WO 93/24834 e na Patente U.S. N2 5.792.664. É selecionado um solvente que minimiza o risco de que o poli- peptídeo biomarcador seja decomposto pela energia introduzida para o pro- cesso de vaporização. Um risco reduzido da decomposição do polipeptídeo biomarcador pode ser atingido, por exemplo, embebendo a amostra em uma matriz. Uma matriz adequada pode ser um composto orgânico tal como um açúcar, por exemplo, uma pentose ou uma hexose ou um polissacarídeo tal como celulose. Tais compostos são decompostos termoliticamente em CO2 e H2O de forma que nenhum resíduo seja formado que possa levar a rea- ções químicas. A matriz também pode ser um composto inorgânico, tal como nitrato de amônio, que é decomposto essencialmente sem deixar qualquer resíduo. O uso destes e outros solventes é conhecido pelos versados na ténica. Vide, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.062.935.

A MS por eletrospray foi descrita por Fenn e outros, J. Phys. Chem., 88: 4451 -4459 (1984); e no Pedido de Patente PCT N2 WO 90/14148; e os pedidos de patente atuais são resumidos nos artigos de revisão. Vide Smith e outros, Anal. Chem., 62: 882-89 (1990); e Ardrey, Spectroscopy, 4: 10-18 (1992). Com ESI, a determinação dos pesos moleculares em quantidades fen- tomolares de amostra é muito acurada por causa da presença devários picos de íons, dos quais todos podem ser utilizados para o cálculo da massa.

A Dessorção a Laser Auxiliada por Matriz (MALDI) é um método preferido entre os métodos de MS contidos aqui. Os métodos para a realização de MALDI são bem-conhecidos pelos versados na ténica. Vários métodos para aumentar a resolução também são conhecidos. Por exemplo, a resolução em MALDI-TOF-MS pode ser aumentada através da redução do número de coli- sões de alta energia durante a extração de íons. Vide, por exemplo, Juhasz e outros, Analysis, Anal. Chem., 68: 941-946 (1996); vide também, por exemplo, as Patentes U.S. N2s 5.777.325; 5.742.049; 5.654.545; 5.641.959; 5.654.545 e 5.760.393 para as descrições de MALDI e protocolos de extração retardada. MALDI-TOF: MS foi descrita por Hillenkamp e outros, Burlingame & McCIoskey, eds., pp. 49-60 (Elsevier Science Publ., 1990).

Em uma modalidade preferida, o nível da proteína biomarcadora em uma amostra biológica, por exemplo, fluido corporal ou amostra de teci- do, pode ser medido através de métodos de espectrometria de massa (MS) incluindo, mas não limitados às técnicas conhecidas na ténica como dessor- ção/ionização a laser auxiliada por matriz, espectrometria de massa de tem- po de vôo (MALDI-TOF-MS) e superfícies aumentadas para dessor- ção/ionização a laser, espectrometria de massa de tempo de vôo (SELDI- TOF-MS) como detalhado adicionalmente abaixo.

Técnica de Detecção de Proteína por MASLDI-TOF-MS. Em al- gumas modalidades preferidas, a detecção de proteínas ou de produtos da expressão gênica de polipeptídeos em uma amostra biológica, por exemplo, fluido corporal ou amostra de tecido, é realizada através de MS, especial- mente dessorção/ionização a laser auxiliada por matriz, espectrometria de massa de tempo de vôo (MASLDI-TOF-MS). Estas técnicas foram utilizadas para analisar macromoléculas, tais como proteínas ou biomoléculas e utili- zam a química da superfície de sondas para amostras que possibilita a cap- tura seletiva e a dessorção de analitos, incluindo macromoléculas intactas, diretamente da superfície da sonda no gás (fase de vapor) e nas modalida- des mais preferidas sem matriz química adicionada.

Em outras modalidades pode ser utilizada uma variedade de ou- tras técnicas para a detecção de marcadores utilizando espectrometria de massa. Vide Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Hillenkamp, ed., pp. 354-362 (1988); Bordeaux Mass Spectrometry Conference Report, Karas & Hillenkamp, Eds., pp. 416-417 (1988); Karas & Hillenkamp, Anal. Chem., 60: 2299-2301 (1988); e Karas e outros, Biomed Environ Mass Spec- trum, 18: 841-843 (1989). O uso de feixes de laser em TOF-MS é mostrado, por exemplo, nas Patentes U.S. N- 4.694.167; 4.686.366; 4.295.046; e 5.045.694, que são incorporadas aqui como referência em suas totalidades. Outras técnicas de MS permitem a volatilização bem-sucedida de biopolíme- ros de alto peso molecular, sem fragmentação e possibilitaram que uma am- pia variedade de macromoléculas biológicas fosse analisada por espectro- metria de massa.

Superfícies Aumentadas para a Dessorção/ionização a Laser (SELDI). Em uma modalidade preferida da presente invenção, são utilizadas outras técnicas que empregam novas composições de elementos de sondas de MS com superfícies que permitem que o elemento de sonda participe ati- vamente na captura e retenção de analitos específicos, descritas como Es- pectrometria de Massa por Afinidade (MAS). Vários tipos de novos elemen- tos de sonda de MS foram planjeados com Superfície Aumentada para Cap- tura por Afinidade (SEAC). Vide Hutchens & Yip, Rapid Commun. Mass Spectrom., 7: 576-580 (1993). Os elementos de sonda de SEAC foram utili- zados de forma bem-sucedida para recuperar e obter classes diferentes de biopolímeros, particularmente proteínas, através da exploração do que é co- nhecido sobre as estruturas de superfície das proteínas e o reconhecimento molecular bioespecífico.

Em uma outra modalidade preferida da presente invenção, o méto- do de detecção que será utilizado com os métodos desta invenção utiliza uma categoria geral de elementos de sonda, isto é, meios que apresentam amostras com superfícies aumentadas para a dessorção/ionização a laser (SELDI). Vide as patentes de SELDI Patentes U.S. N2s 5.719.060; 5.894.063; 6.020.208; 6.027.942; 6.124.137; e o Pedido de Patente U.S. N2 2003/0003465.

Um polipeptídeo de interesse pode ser ligado diretamente a um suporte através de um ligante. Quaisquer Iigantes conhecidos pelos versados na ténica como sendo adequados para a ligação de peptídeos ou aminoáci- dos a suportes, diretamente ou através de um espaçador, podem ser utiliza- dos. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser conjugado a um suporte, tal como uma conta, através de um espaçador variável. Os ligantes, incluem, Iigantes de amida de Rink (vide, por exemplo, Rink, Tetrahedron Lett., 28: 3787 (1976)); ligantes de cloreto de tritila (vide, por exemplo, Leznoff, Ace Chem. Res. 11: 327 (1978)); e ligantes de Merrifield. (Vide, por exemplo, Bodanskye outros, Peptide Synthesis, Segunda Edição (Academic Press, Nova York, 1976)). Por exemplo, são conhecidos ligantes de tritila. (Vide, por exemplo, as Patentes U.S. N25 5.410.068 e 5.612.474). Os ligantes de tritil amino também são conhecidos. (Vide, por exemplo, a Patente U.S. N2 5.198.531). Outros ligantes incluem aqueles que podem ser incorporados em proteínas de fusão e expressos em uma célula hospedeira. Tais Iigantes podem ser aminoácidos, substratos de enzimas selecionados ou qualquer peptídeo adequado. O Iigan- te pode ser feito, por exemplo, através da seleção apropriada de iniciadores quando o ácido nucléico é isolado. Alternativamente, podem ser adicionados através de modificação pós-tradução da proteína de interesse.

Uso de uma Ferramenta de Pino para Imobilizar um Polipeptí- deo. A imobilização de um polipeptídeo de interesse a um suporte sólido uti- lizando uma ferramenta de pino pode ser particularmente vantajosa. As fer- ramentas de pino incluem as descritas aqui ou conhecidas de outra maneira na ténica. Vide, por exemplo, o Pedido de Patente U.S. N- de Série 08/786.988 e 08/787.639; e o Pedido de Patente PCT Internacional N2 WO 98/20166. Uma ferramenta de pino em um arranjo, por exemplo, um arranjo 4x4, pode ser aplicada em cavidades contendo os polipeptídeos de interes- se. Quando a ferramenta de pino possuir um grupo funcional ligado a cada ponta do pino ou a um suporte sólido, p>or exemplo, contas funcionalizadas ou contas paramagnéticas, são ligadas a cada pino, os polipeptídeos em uma cavidade podem ser capturados (capacidade de 1 pmol). Os polipeptí- deos de interesse, particularmente polipeptídeos biomarcadores, podem ser imobilizados devido ao contato com a ferramenta de pino. Uma imobilização adicional pode ser o resultado da aplicação de um campo elétrico à ferra- menta de pino. Vide, por exemplo, Juhasz e outros, Analysis, Anal. Chem., 68: 941-946 (1996) e vide também, por exemplo, as Patentes U.S. N- 5.777.325; 5.742.049; 5.654.545; 5.641.959; e 5.760.393 para descrições de MALDI e protocolos de extração retardada. As ferramentas de pino podem ser úteis para a imobilização dos polipeptídeos de interesse de uma maneira distribuída espacialmente sobre um arranjo. Tal arranjo que pode ser distri- buído ou pré-distribuído espacialmente são úteis em uma variedade de pro- cessos, incluindo, por exemplo, o controle de qualidade e os diagósticos de seqüências de aminoácidos. As ferramentas de pino descritas nos Pedidos de Patente U.S. N- 08/786.988 e 08/787.639 e no Pedido de Patente PCT Internacional N2 WO 98/20166 são ferramentas de fornecimento em série ou paralelas que podem ser empregadas para gerar arranjos de vários elemen- tos de polipeptídeos sobre a superfície de um suporte sólido fixo.

Outros Aspectos da Condição Biológica. Em várias modalidades da presente invenção, os aspectos da condição de atividade biológica ou os as- pectos mistos podem ser medidos com a finalidade de se obter respostas a fármacos e de vias. As atividades das proteínas relevantes para a caracteriza- ção da função celular podem ser medidas e as modalidades desta invenção podem ser basear em tais medidas. As medidas de atividade podem ser reali- zadas através de quaisquer meios funcionais, bioquímicos ou físicos apropria- dos para a atividade particular que será caracterizada. Quando a atividade en- volver uma transformação química, a proteína celular pode ser colocada em contato com substratos naturais e a taxa de transformação pode ser medida. Quando a atividade envolver a associação em unidades multiméricas, por e- xemplo, a associação de um complexo de ligação de DNA ativado com o DNA1 a quantidade de proteína associada ou as conseqüências secundárias da as- sociação, tais como as quantidades de mRNA transcrito, podem ser medidas. Ainda, quando apenas uma atividade funcional for conhecida, por exemplo, como no controle do ciclocelular, o desempenho da função pode ser observa- do. Entretanto, conhecidas e medidas, as alterações nas atividades de proteína formam os dados de resposta analisados pelos métodos desta invenção. Em modalidades alternativas e não limitantes, os dados de resposta podem ser formado de aspectos mistos da condição biológica de uma célula. Os dados de resposta podem ser formados, por exemplo, partindo de alterações nas abun- dâncias de certos mRNA, de alterações nas abundâncias de certas proteínas e de alterações nas atividades de certas proteínas.

Os EXEMPLOS a seguir são apresentados com a finalidade de ilustrar mais completamente as modalidades preferidas da invenção. Estes EXEMPLOS não devem de forma alguma ser interpretados como limitantes do âmbito da invenção, que é definido pelas reivindicações em anexo.

EXEMPLO 1

ESTUDO EXPLORATÓRIO GENÔMICO EM UM MODELO DE DANOS À MEDULA ESPINHAL DE RATO APÓS TRATAMENTO COM ANTICORPO ANTI-NOGO A 11C7; ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM MICROAR- RANJO

Finalidade. A finalidade deste EXEMPLO é mostrar as altera- ções na expressão gênica resultantes do tratamento com anticorpo anti- Nogo-A após danos à medula espinhal em ratos para a identificação dos candidatos a biomarcador de eficiência de tratamento, do mecanismo de ação ou de quaisquer efeitos adversos potenciais.

Planejamento do estudo. A parte em vida do EXEMPLO foi reali- zada com a seguir: Um total de 40 ratos Lewis adultos fêmeas (Rattus nor- vegicus, 160-190 g) foi obtido de uma colônia de criação Isenta de Agente Patogênico Específico (SPF) (R. Janvier, Le Genest-St-lsle, França) e man- tido na forma de gurpos de 4 - 6 animais em gaiolas padronizadas (tipo 4, Macrolon, lndulab, Hanstedt1 Alemanha) em um ciclo de luz/escuridão de 12 horas em um regime padronizado de alimentação e água ad libitum.

Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em cinco grupos: Dois dos 16 sofreram hemissecção espinhal e receberam IgG ou anticorpo anti-Nogo A (11C7). O terceiro grupo, um grupo "naíve" de outo, não sofreu cirurgia e não recebeu qualquer tratamento, como a seguir: Grupos de tratamento:

1) 7 dias tratados com IgG

2) 7-dias tratados com Nogo-A

3) 14 dias tratados com IgG

4) 14 dias tratados com Nogo-A

5) Controles "naíve"

Os animais receberam códigos com números aleatórios e os pesquisadores não podiam conhecer os tratamentos ao longo de todas as etapas e fases do experimento. Todos os tratamentos, procedimento cirúrgi- co e sacrifício e a análise de dados inicial foram realizados de maneira cega. Os anticorpos receberam os códigos "cor-de-laranja" e "amarelo".

Anticorpos. Anticorpo anti-Nogo-A 11C7: Anticorpo monoclonal (mAb) de camundongo 11C7, produzido contra um peptídeo Nogo-A de 18aa correspondente à seqüência de rato dos aminoácidos 623-640; utilizado a uma concentração de 3 mg/mL em PBS. O anticorpo de controle era uma IgG monoclonal de camundongo direcionada contra a Iectina vegetal utiliza- da a uma concentração de 3 mg/mL em PBS. As propriedades bioquímicas e de neutralização de ambos os anticorpos são descritas em Oertle T e outros, J. Neurosci. 23: 5393-5406 (2003).

Procedimentos cirúrgicos. Os animais foram anestesiados com uma injeção subcutânea de Hypnorm (120 μ17200 g em peso corporal Jans- sen Pharmaceutics, Beerse, Bélgica) e Dormicum (0,75 mg em 150 μΙ_ por 200 g em peso corporal Roche Pharmaceuticals, Basle, Suíssa). Um un- güento oftálmico contendo vitamina A (Blache, Chauvin Novopharm AG, Su- íssa) foi aplicado para proteger os olhos da desidratação durante o procedi- mento operatório relativamente longo.

Uma lesão com formato em T para incluir a metade dorsal da medula espinhal com as projeções principais assim como dorso-lateral e ventro-medial do CST com tesoura para iridectomia e uma lâmina pontiagu- da afiada foi feita no nível torácico T8.

Um cateter intratecal fino (de calibre 32 da RECATHCO, Allison Park, Pennsylvania, USA) foi inserido partindo do nível lombar L2/L3 e empur- rado até T9, fornecendo anticorpos através de minibombas osmóticas (5 μL/h, 3,1 μg/μL, Alzet® 2ML2, Charles River Laboratories, Les Oncins, França) no local dgjesão durante 2 semanas. Após a cirurgia, os animais foram mantidos sobre um bloco de aquecimento termostático até completamente acordados. Não foram fornecidos analgésicos ou antibióticos para não influenciar nos resul- tados. A solução de Ringer (Fresenius Kabi AG, Stans, Suíssa) foi fornecida simultaneamente quando os animais exibiam sinais de desidratação.

Sacrifício. Após 1 e 2 semanas respectivamente, os ratos foram ligeiramente anestesiados com Isoflurano e dacapitados. Os animais "naíve" foram safrificados junto com o grupo de uma semana.

1 mL de sangue total foi coletado em um tubo com EDTA, mistu- rado, diluído com 1 mL de NaCI a 0,9% transferido para um tubo contendo Fas. A mistura foi congelada em gelo seco. Aproximadamente 1 mL de san- gue total foi coletado em um tubo com Lith/Hep, misturado e mantido em gelo antes de ser centrifugado a 2000x g durante 10 min (resfriado). O so- brenadante (plasma) foi congelado em gelo seco.

O cérebro e a medula espinhal foram expostos, foram tiradas amostras dos domínios de tecido específicos e congeladas imediatamente em gelo seco.

Animais experimentais. Número de animais por grupo e sexo: 8 fêmeas/grupo, total 40. Idade: 8-9 semanas. Peso: 160-190 g.

TABELA 1

Planejamento do estudo, alocação dos animais e dosaqens dos itens de teste.

<table>table see original document page 54</column></row><table>

Amostragem de tecidos. Foram tiradas amostras dos tecidos a

seguir:

1) Medula espinhal torácica no nível da lesão (T8)

2) Medula espinhal torácica acima da lesão (T1 -17)

3) Medula espinhal cervical

4) Medula espinhal lombar

5) Cérebro - córtex frontal

6) Cérebro - córtex motor e somatossensorial

7) Cérebro - córtex occipital

8) Cérebro - estriado

9) Cérebro - hipocampo

10) Tronco cerebral

12) DRGs lombar

13) Células sangüíneas

14) Soro

15) CSF

As amostras foram armazenadas em gelo seco e subseqüente- mente em um freezer intenso a -80°C até o uso adicional. As amostras de tecidos a seguir foram processadas para a obtenção do perfil de expressão gênica e analisadas:

1) Medula espinhal torácica no nível da lesão (T8)

2) Medula espinhal torácica acima da lesão (T1-T7)

3) Medula espinhal lombar

4) Cérebro - córtex frontal

5) Cérebro - córtex motor e somatossensorial

6) Sangue células

O cérebro foi dividido em dois hemisférios e o esquerdo foi man- tido intacto para a confirmação adicional das descobertas em microarranjo utilizando hibridização in s/Yu/imunohistoquímica enquanto que o direito era utilizado para a dissecação.

Extração e purificação do RNA. Sucintamente, o RNA total foi obtido através da extração com tiocianato de guanidínio ácido-fenol- clorofórmio (Trizol, Invitrogen Life Technologies) partindo de cada seção de tecido congelado e o RNA total foi então purificado em uma resina de afini- dade (Rneasy, Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante e quanti- ficado. O RNA total foi quantificado através da absorbância em λ = 260 nm (A2eonm) e a pureza foi estimada pela razão A260nm/A280nm· A integridade das moléculas de RNA foi confirmada através de eletroforese em gel de agarose não desnaturante utilizando o Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologi- es, Palo Alto, Califórnia, USA). Uma alíquota de cada amostra de RNA indi- vidual foi mantida para a confirmação da descoberta em microarranjo atra- vés de PCR à base de fluorescência em tempo real (TAQMAN; Applera). O RNA foi armazenado a -80°C até a análise.

Experimento de microarranjo. Todas as hibridizações em micro- arranjo foram realizadas como recomendado pelo fabricante do sistema de microarranjo (Affymetrix, Santa Clara, Califórnia; Manual técnico da análise de expressão). Seis amostras de cada grupo de tratamento foram individu- almente hibridizadas (sem agrupar) no conjunto de arranjo de sondas de expressão gênica do genoma de rato RAE230 2.0 contendo >31.000 conjun- tos de sondas (Affymetrix, Inc., Santa Clara, Califórnia, USA).

O cDNA de filamento duplo foi sintetizado com uma quantidade inicial de aproximadamente 5 pg de RNA total de comprimento completo uti- lizando o Superscript Choice System (Invitrogen Life Technologies) na pre- sença de um iniciador de oligonucleotídeo T7-(dT)24 DNA. Após a síntese, o cDNA foi purificado através da extração com fenol/clorofórmio/álcool isoamí- Iico e da precipitação com etanol. O cDNA purificado foi então transcrito in vitro utilizando o BioArray® High Yield RNA Transcript Labelling Kit (ENZO) na presença de cRNA marcado com biotina na forma de ribonucleotídeos biotinilados. O cRNA marcado foi então purificado em uma resina de afinida- de (RNeasy, Qiagen), quantificado e fragmentado. Uma quantidade de apro- ximadamente 10 pg de cRNA marcado foi hibridizada durante aproximada- mente 16 horas a 45QC com um arranjo de sondas de expressão. O arranjo foi então lavado e corado duas vezes com estreptavidina-ficoeritrina (Mole- cular Probes) utilizando a GeneChip Fluidoics Workstation 400 (Affymetrix). O arranjo foi então verificado duas vezes utilizando um scanner a laser con- focal (GeneArray Scanner, Agilent) resultando em uma imagem verificada. Este ".dat-file" resultante foi processado utilizando o programa MAS5 (Affy- metrix) em um ".cel-file". Os dados brutos foram convertidos em níveis de expressão utilizando uma "intensidade-alvo" de 150.

Análise dos dados. A análise dos dados iniciais do conjunto de dados para os tecidos da medula espinhal T8 (no nível dos danos) e próxi- mos aos danos, T1 -7 foi realizada de forma cega. A análise resultou na iden- tificação de amostras codificadas de "cor-de-laranja" como o grupo tratado com 11C7 após o qual o código foi revelado e a identidade da amostra foi confirmada. O restante da análise não era cego.

Controle de qualidade. As medidas de qualidade a seguir foram estudadas para cada amostra: Fator de medida, fundo, porcentagem de o- corrências presentes, proporção de AFFX-GAPDH 3': AFFX-GAPDH 5', va- riância de AFFX-GAPDH 3', proporção de AFFX-Beta-actina 3': AFFX-Beta- actina 5'. Foi prestada atenção à homogeneidade dos dados. A média e o desvio-padrão do nível de ruído de fundo determinaram o valor de restrição dos dados brutos utilizados na análise conseqüente. A variância de GAPDH 3' é uma medida da variação entre amostras individuais e pode ser utilizada como uma orientação para uma diferença de vezes confiável.

Análise dos componentes principais. A análise dos componentes principais (PCA) incluindo todos os conjuntos de sondas no Genoma de Rato 2.0 (n=15.866) como variáveis foi realizada para identificar microarranjos fora da curva após a transformação de Iog e a centralização dos dados utili- zando o software Simca-P 10.0 (Umetrics1 Umeâ, Suécia). Após a remoção de pontos técnicos fora da curva, a PCA foi repetida utilizando GeneSpring (Silicon Genetics, Redwood City, Califórnia, USA) versão 7,0.

Normalização dos dados. Após QC, os dados de microarranjo normalizados de MAS5 foram importados para GeneSpring versão 7.0. (Sili- con Genetics). Experimentos individuais foram gerados para cada tecido se- paradamente. Cada experimento foi normalizado como a seguir: Valores menores que 0 foram ajustados em 0,1. Cada medida foi dividida por 50% de todas as medidas em tal amostra. Finalmente, a normalização por gene foi realizada através da normalização em um valor de expressão da mediana das amostras "naíve".

Identificação dos genes expressos de forma diferencial. Os ge- nes expressos de forma diferencial entre o veículo e os tratamentos foram identificados dentro de cada experimento com base nas restrições a seguir: (1) Restrições pré-filtração: Os conjuntos de sondas incluídos na análise adi- cionado tinham que ser marcados como presentes em 4/6 das réplicas em qualquer condição. A intensidade de sinal dos dados brutos tinha que ser no mínimo 50 em pelo menos um dos grupos de tratamento. (2) Restrição esta- tística: p<0,05 (teste t de Welch (paramétrico)). A restrição estatística similar era sempre aplicada em grupos diferentes que seriam comparados e é men- cionada em cada comparação.

Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA). Uma implementação no laboratório do método de Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes foi utilizada para analisar os dados do microarranjo. Os genes com níveis de expressão menores que 100 em mais de 75% dos chips são descartados como pouco ou não expressos. Os resultados do mi- croarranjo são então analisados em uma série de comparações em pares entre os conjuntos de condição (por exemplo, tratados vs. controles). O nível de expressão relativo de cada gene sob a condição1 e a C0ndiçã02 é compu- tado como uma razão de expressão r,

em que μi,j é o valor médio de expressão para o gene /' sob a condição·,. Os genes são então classificados de acordo com suas razões de expressão de forma que os genes com expressão maior sob a condiçãoi que a condição2 ficam no topo da lista. Depois, a coleção de conjuntos de genes disponíveis é projetada na lista classificada. Esta etapa em essência aplica a priori o co- nhecimento biológico aos dados experimentais para a identificação dos ge- nes funcionalmente relacionados que são expressos de uma maneira coor- denada. Os conjuntos de genes são processados um por vez. Para o conjun- to de genes G cada razão de expressão η é marcada como 'dentro' do con- junto de genes se o gene, e G e como 'fora' do conjunto de genes se o genej e G. Um teste de soma de classificação de Wilcoxon de duas caudas é cal- culado para determinar se os genes marcados como 'dentro' do conjunto de genes G são enriquecidos no topo ou no final da lista classificada. O método de taxa de descoberta falsa de Storey JD & Tibshirani R, Proc Natl Acad Sci USA 100: 9440-9445 (2003) é aplicado para transformar os valores de ρ em valores de q corrigidos em vários testes. O resultado da GSEA é uma lista de valores de q (qi, q2, ..., W e marcações (Ih I2, ..., In), A e .(topo, final) que correspondem ao conjunto de genes disponíveis N. Um valor de q pequeno qi indica que os genes no conjunto de gens G, são significativamente enri- quecidos no topo ou no final da lista de razões de expressão.

Resultados. A análise dos dados iniciais do conjunto de dados para tecidos da medula espinhal T8 (no nível do dano) e próximos ao dano, T1-7 foi realizada de forma cega. A análise resultou na identificação de a- mostras codificadas de "cor-de-laranja" como o grupo tratado com 11C7 a- pós o qual o código foi revelado e a identidade da amostra foi confirmada. O restante da análise não era cega.

Medula espinhal T8 (No nível do dano). O teste t de Welch com- parando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 643 e 449 genes expressos diferencialmente após uma semana e duas se- manas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,93±1,06 após uma semana de tratamento e 1,31 ±0,07 após duas semanas de tratamento. As 100 altera- ções de expressão gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na TABELA 4 e após duas semanas de tratamento, na TABELA 5 no EXEMPLO 2. 90% dos 20 produtos da transcrição principais estavam regula- dos para menos em uma semana após o tratamento com 11C7 (enquanto que dos expressos diferencialmente totais, 41% estavam regulados para menos). De forma interessante, entre estes havia 7 produtos da transcrição codifican- do proteínas relacionadas com a matriz extracelular (ECM) e a cura e/ou a cicatrização de feridas (precursor da asporina, dermatopontina, colágeno), 2 proteínas tipo "frizzled" secretadas (Sfrl2 e 4), duas proteínas de ligação a IGF (Igfbp 5 e 6, reguladores negativos de IGF) e miocilina/TIGR, que foi recente- mente mostrado que inibe o crescimento de neuritos e que é regulado para mais na formação de cicatriz crônica da glia após danos ao SNC. Jurynec MJ e outros, MoL Cell. Neurosci. 23: 69-80 (2003).

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou ao todo 30 vias com enriquecimento significativo de produtos da transcrição enriquecidos de forma diferencial após uma semana de trata- mento (TABELA 16 no EXEMPLO 3). O enriquecimento mais significativo foi observado nos produtos da transcrição relacionados com a imunidade e com a defesa (figura 1), na via de sinalização mediada por citocinas e quimioci- nas (figura 2) e na cascata de Jak-stat (figura 3) todos na direção de 11C7. Das vias relacionadas com o sistema nervoso, as atividades neuronais, a neurogênese e a transmissão sináptica nervo-nervo foram reguladas para menos (q<0,001) e a orientação de axônios mediados por Slit-Robo (q=0,018) regulada para mais nos animais tratados com 11C7.

Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram significativamente menores que após 1 semana de tratamento. Apenas um produto da transcrição era >1,5 vez regulado significativamente de forma dife- rencial (gene 3 que responde a p53, 1,6 vez regulado para mais após 11C7). A GSEA identificou 19 vias em que o enriquecimento significativo de produtos da transcrição expressos de forma diferencial foi observado. A fosforilação oxidativa (figura 4), o transporte de elétrons/íons/cátions, a coagulação san- güínea, o junção pré-mRNA e a transmissão sináptica (figura 5) estavam entre as vias mais significativamente afetadas (TABELA 21 no EXEMPLO 3).

Medula espinhal T1-7 (Próximo ao local do dano). O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 566 e 579 genes expressos de forma diferencial após uma se- mana e duas semanas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,43±0,17 após uma semana de tratamento e 1,56±0,98 após duas semanas de trata- mento. As 100 alterações de expressão gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na TABELA 18 e após duas semanas de trata- mento, na TABELA 19 no EXEMPLO 3.

As maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 repetiam o tema observado no local do dano: oito das 20 alterações principais estavam relacionadas com ECM (lumican, colágenos 1a1-2 e 5a1, fibulina 2, tetranectina, glicoproteína de Matriz SC1/ECM2) e reguladas para menos após o tratamento com 11C7. Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram ligeiramente maiores que após 1 semana de tra- tamento. Algumas das maiores alterações estavam relacionadas com a re- gulação para menos dos produtos da transcrição que codificam proteínas expressas nos linfócitos.

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo em cinco vias após uma semana de tratamento (TABELA 18, EXEMPLO 3). Nenhuma via era significativa- mente afetada (q<0,001) após duas semanas de tratamento. As vias mais significativamente afetadas após uma semana eram a sinalização mediada por ECM, o metabolismo de lipídeos, ácidos graxos e esterol e a homeosta- se de fator de crescimento (figuras 6 até 8).

Medula espinhal L1-5 (Distai ao local do dano). O teste t de Wel- ch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 re- sultou em 1303 e 1301 genes expressos de forma diferencial após uma se- mana e duas semanas de tratamento, respectivamente. A alteração de ve- zes média das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,72±0,5 após uma semana de tratamento e 1,91 ±2,0 após duas semanas de trata- mento. As 100 alterações de expressão gênica principais após uma semana de tratamento são listadas na Tabela 1-5 e após duas semanas de tratamen- to, na TABELA 21 no EXEMPLO 3.

As maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 estavam relacionadas com os produtos da transcrição expressos por linfócitos (Similar à região da cadeia C da Ig gama-2C (LOC362795), mRNA, inibidor de protease de leucócitos secretores, selectina de linfócitos, Iipocali- na 2, trombomodulina, quimiocina (motivo C-X-C) Iigante 12) e como regula- dos para mais, poderiam implicar em um maior tráfego de linfócitos para dentro do tecido após o tratamento com 11C7. Ainda, Sfrp4 e efrina B1 eram regulados para mais após 11C7. Após duas semanas de tratamento, os pro- dutos da transcrição alterados significativamente principais incluíam o recep- tor acoplado com a proteína G do receptor nuclear MrgAIO RF-amida (Mr- ga10) e o co-ativador 3 do receptor nuclear assim como produtos da trans- crição relacionados com a imunidade que foram regulados para menos após 11C7. Um número grande de alterações significativas estava relacionado com a transmissão sinápticas ou com a circulação de vesículas sinápticas (seqüência 6 do mRNA relacionada com a sinaptogênese, glicoproteína 2 b de vesícula sinápticas, sinaptoporina) e era regulado para mais após 11C7.

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo em 58 vias após uma semana de tratamento (TABELA 19, EXEMPLO 3) e 48 vias (TABELA 20, EXEMPLO 3) após duas semanas de tratamento. As vias mais significativamente afetas eram imunidade e defesa, transdução de sinal e comunicação celular após uma semana de tratamento (todas reguladas para mais em 11C7; figuras 8 até 10) e imunidade e defesa, comunicação celular e transmissão sinápticas após duas semanas de tratamento (figuras 11 até 13). De forma interessan- te, a via relacionada com a imunidade e a defesa era altamente significati- vamente enriquecida na direção do tratamento com IgG (regulada para me- nos após o tratamento com 11 Cl) após duas semanas de tratamento. As transmissões sinápticas, as atividades neuronais e as vias relacionadas com a liberação de neurotransmissores eram significativamente enriquecidas (re- guladas para mais) após duas semanas de tratamento com 11C7.

Córtex Motor-Somatossensorial. O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 574 e 910 genes expressos de forma diferencial após uma semana e duas sema- nas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,42±0,19 após uma semana de tratamento e 1,46±0,09 após duas semanas de tratamento. As 100 alte- rações de expressão gênica principais após uma semana de tratamento es- tão listadas na TABELA 20 e após duas semanas de tratamento, na TABELA 21 no EXEMPLO 3.

70% das 100 alterações principais no córtex motor/somatossen- sorial após uma semana tratamento eram ESTs complicando assim a inter- pretação dos dados. Entre os produtos da transcrição conhecidos alterados principais estavam, entretanto, a proteína A9 de ligação ao cálcio S100 (cal- granulina B, expressa por macrófagos, regulada para mais 3 vezes após 11C7) e Crmp5 (proteína 5 mediadora de resposta à Colapsina, regulada para mais após 11C7), As proteínas mediadoras de resposta à Colapsina (CRMPs) são altamente expressas no cérebro em desenvolvimento em que fazem parte em vários aspectos da diferenciação neuronal. No adulto, são expressas em áreas de neurogênese persistente. Veyrac A e outros, Eur. J. Neurosci. 21: 2635-2648 (2005). Após duas semanas de tratamento, 80% das 100 alterações principais eram ESTs.

Com base na análise corrigida com vários testes, a GSEA não identificou vias com enriquecimento significativo de produtos da transcrição expressos de forma diferencial após uma semana de tratamento. Após duas semanas de tratamento, a via de fosforilação oxidativa exibiu um enriqueci- mento significativo de genes expressos de forma diferencial (q<0,001; TA- BELA 21, EXEMPLO 3). De forma interessante, a doença de Huntington, as vias de sinalização de EGF, FGF e NGF estavam todas afetadas, mas esta- vam fora do nível de significância recomendado (q<0,04 vs q<0,001). Todas estavam reguladas para menos após o tratamento com 11C7 (figuras 14 até 17). O número pequeno de vias afetadas é provavelmente um reflexo do grande número de ESTs expressos de forma diferencial neste conjuto de dados que não podem ser atribuídos a qualquer via.

Córtex frontal. O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 657 e 275 genes ex- pressos de forma diferencial após uma semana e duas semanas de trata- mento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alte- rações de vezes principais era de 1,3±0,3 após uma semana de tratamento e 1,2±0,05 após duas semanas de tratamento. As 100 alterações de expres- são gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na Ta- bela 1-9 e após duas semanas de tratamento, na Tabela 1-10 no Anexo-1.

Apenas 13 produtos da transcrição após uma semana e 10 após duas se- manas de tratamento eram >1,3 vez expressos de forma diferencial, indi- cando assim uma resposta de expressão gênica muito fraca ao tratamento.

Entre as alterações >1,3 vez estavam a proteína A9 de ligação ao cálcio S100 (calgranulina B) expressa por macrófagos, o oncogene c-fos, Dusp6 e Egr-1 relacionadas à diferenciação celular após uma semana e a estatmina 1, Nr2f2, o receptor 27 acoplado à proteína Gea proteína básica oligodendrocítica associada com a mielina (Mobp; regulada para mais 1,28 vez após 11C7) após duas semanas de tratamento.

A GSEA não foi realizada para o conjunto de dados do córtex frontal por causa do pequeno número de alterações significativas.

Sangue. O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 389 e 427 genes expressos de forma diferencial após uma semana e duas semanas de tratamento, res- pectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 2,1 ±0,56 após uma semana de tratamento e 1,80±0,40 após duas semanas de tratamento. As 100 alterações de expres- são gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na Ta- bela 1-11 e após duas semanas de tratamento, na Tabela 1-12 no Anexo-1. Entre as maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 estavam a regulação para mais das metaloproteinases de matriz Mmp8 e Mmp9, Hipk3, do inibidor de protease de leucócitos secretores (também regulado para mais após uma semana em L1-5) e a calgranulina A.

Após duas semanas de tratamento, similar à proteína de ligação beta- amilóide (LOC362545), o mRNA e a proteína de inibição de Creb estavam regulados para menos após 11C7 e a mGluR8 neuroprotetora e Sfrp4 rela- cionada com a apoptose reguladas para mais após 11C7.

Com base na análise corrigida com vários testes, a GSEA identifi- cou seis vias com enriquecimento significativo de produtos da transcrição ex- pressos de forma diferencial após uma semana de tratamento (q<0,001; Ane- xo-2, Tabela 1-7). A endocitose, o tráfego de proteína intracelular, a endocito- se mediada por receptor (figura 18), o transporte geral de vesículas, a imuni- dade mediada por interferon (figura 19), a interação de ligante-receptor neuro- ativo (figura 20), a via de sinalização de mapk, a imunidade mediada por ma- crófagos (figura 21), seguidos por Il-Ib e a ativação de células B (figuras 22 e 23, respectivamente) eram as vias mais afetadas. De forma interessante, a direção do enriquecimento em todos os mencionados anteriormente exceto a interação de ligante-receptor neuroativo, era na direção de 11C7. Isto indica a regulação para mais dos produtos da transcrição- relacionados com tais vias após o tratamento com 11C7. Após duas semanas de tratamento, oito vias exibiam um enriquecimento significativo de genes expressos de forma dife- rencial (q<0,001; Anexo-2, Tabela 1-8). O metabolismo e a modificação de proteínas, imunidade e defesa (figura 24) e modificação de proteínas estavam entre as vias afetadas principais. Todas exceto uma via após duas semanas de tratamento no sangue eram enriquecidas na direção de IgG.

Discussão. A finalidade deste EXEMPLO era identificar as altera- ções relacionadas com o tratamento no rato após a hemissecção da medula espinhal após uma semana e duas semanas de tratamento com anticorpo monoclonal de camundongo anti-Nogo-A 11C7 em comparação com o trata- mento de controle, anticorpo IgG de camundongo contra a Iectina vegetal.

Após uma semana de tratamento, as alterações na expressão gênica mais significativas em termos de número e de grandeza foram obser- vadas distais ao local do dano (L1-5) seguidas pelas.no local do dano (T8) e no sangue, enquanto no córtex frontal, no córtex motor-somatossensorial e na medula espinhal proximal ao local do dano (Τ1-7) eram claramente me- nos afetadas (TABELA 2). Após duas semanas de tratamento, o maior ta- manho de efeito em termos de expressão gênica foi observado em L1-5 se- guido por um efeito relativamente similar no córtex motor-somatossensorial, na medula espinhal proximal ao local do dano (T1 -7) e no sangue. Clara- mente foi observado menor efeito pelo tratamento em T8 e no córtex frontal após duas semanas de tratamento (TABELA 2).

TABELA 2

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A classificação do tamanho do efeito é a classificação dos teci- dos estudados com base no número de alterações significativas da expres- são gênica e na alteração de vezes média das 100 alterações de expressão gênica principais em tal tecido.

Um efeito muito forte por 11C7 foi observado no local da lesão regulando para menos os produtos da transcrição relacionados com a matriz extracelular e com a cicatrização de feridas após uma semana de tratamen- to. O precursor da asporina, a dermatopontina, a glicoproteína-2 associada com microfibrila e vários colágenos estavam entre as alterações reguladas para menos principais assim como dois receptores de membrana (frizzled) secretados relacionados as proteínas Sfrp2 e Sfrp4 cuja expressão foi ob- servada como sendo correlacionada com a apoptose. Foi observado que a miocilina/TIGR, uma glicoproteína secretada com expressão regulada para mais na cicatrização crônia da glia após danos ao SNC e na inibição do crescimento de neuritos sobre os neurônios de gânglios de raiz dorsais in vivo (Jurynec MJ e outros, Mol. Cell. Neurosci. 23: 69-80 (2003)) era 2,67 vezes regulada para menos após uma semana de tratamento com 11C7. É sugerido que a miocilina é uma nova molécula de inibição do crescimento de neuritos inibida pelo tratamento com anti-Nogo-A.

Outras alterações relacionadas com a orientação do crescimento de neuritos/axônios incluíam os produtos da transcrição relacionados com a via de orientação de axônios mediada por Slit-Robo que codificam o Iigante de quimiocina (motivo C-X-C) e o receptor 4 de quimiocina (motivo C-X-C) identificado por GSEA (q<0,02). Cxcl12 e CXCR4 exibiam uma regulação para mais combinada em todos os segmentos da medula espinhal estuda- dos após uma semana de tratamento com 11C7 (figura 25). Foi mostrado que a ativação de Cxcr4 por seu Iigante solúvel CxcM 2 (SdfI) influencia na motilidade do cone de crescimento e na extensão de neuritos in vitro (Ara- kawa Y e outros, J. Cell. Biol. 161: 381-391 (2003); Pujol F e outros,. J. Cell Sei. 118: 1071-1080 (2005); Xiang Y e outros, Nat. Neurosci. 5: 843-848 (2002)). De forma interessante, foi sugerido que esta ação é mediada pela via Rho/ROCK de forma que uma baixa concentração de CxcM 2 estimulava uma via dependente de Rho que mediava a facilitação do alongamento de axônios. Arakawa Y e outros, J. Cell. Biol. 161: 381-391 (2003). Recente- mente, foi mostrado que a via de sinalização de quimiocinas Cxcl12-CXCR4 define a trajetória inicial de axônios motores de mamíferos durante o desen- volvimento. Lieberam I e outros, Neuron 47: 667-679 (2005). A descoberta dos presentes inventores sugere, que esta via poderia ser regulada para mais como um resultado do tratamento com 11C7 e pode assim contribuir para o mecanismo de ação de anti-Nogo A durante a regeneração.

No nível dos genes individuais, mas não identificados por GSEA, ocorriam alterações relacionadas com a via mediada por semaforina- colapsina: proteínas 4 e 5 Crmp4/5 de resposta a sema A/semaforina 3A e à colapsina que medeiam sugestões de repulsão aos cones de crescimento em migração foram observadas reguladas para menos após 1 semana de tratamento em T8 e no córtex motor-somatossensorial.

A GSEA foi primeiramente descrita por Mootha VK e outros, Nat. Genet. 34: 267-273 (2003) como um método para a identificação das altera- ções transcricionais coordenadas entre os grupos de genes funcionalmente relacionados em dados de microarranjos. O método de Análise de Enriqueci- mento do Conjunto de Genes foi implementado no laboratório com vários refi- namentos da metodologia original [RD-2005-50762]. Freqüentemente, nos dados de microarranjos, alterações no nível de produtos da transcrição isola- dos permanecem insignificantes devido às baixas alterações de vezes en- quanto um grande número de tais alterações que afetam uma via inteira seria significativo. Devido às baixas alterações de vezes observadas no sistema nervoso em geral (mais provavelmente devido a um grande efeito de diluição gênica de populações celulares heterogêneas), a abordagem de GSEA seria particularmente interessante quando são interpretados os dados que se origi- nam dos tecidos nervosos. A informação de via introduzida na GSEA neste estudo foi coletada partindo de uma variedade dé fontes, incluindo bancos de dados disponíveis publicamente (KEGG) e de propriedade (Celera, Pathart). O resumo das 24 vias com enriquecimento do conjunto gênico significativo (q<0,001) em três ou mais tecidos é apresentado na TABELA 3.

As-vias mais amplamenta afetadas como um todo eram imuni- dade e defesa (4 tecidos), metabolismo e fosforilação de proteínas (4), me- tabolismo de nucleosídeos, nucleotídeos e ácidos nucléicos (4) atividades neuronais (4) e cascata Jak-stat (4).

A GSEA revelou neste estudo um efeito muito evidente nas vias de defesa imunológica, incluindo a sinalização mediada por células B e T, a ativação de células B, a imunidade mediada por macrófagos, células NK as- sim como mediada por neutrófilos, a via receptor do tipo Toll e a via de sina- lização mediada por citocinas e quimiocinas. De forma interessante, a via mediada por imunidade e defesa foi enriquecida na direção de 11C7 após uma semana de tratamento, mas na direção de IgG após duas semanas de tratamento. O mesmo padrão foi observado também em todas as outras vias relacionadas com o mecanismo imunológico, tais como as vias de imunidade mediadas por células B1 células T e células NK. O efeito significativo sobre as vias relacionadas com a imunidade foi observado mais comumente na medula espinhal no local da lesão (T8) e distai ao mesmo (L1-5) e no san- gue, onde a direção do enriquecimento era paralela àquela dos tecidos da medula espinhal. Embora não estudado em detalhes de forma microscópica, isto sugere um aumento nos linfócitos, nos macrófagos e nas células NK após uma semana de tratamento com 11C7 tanto no sangue quanto na me- dula espinhal danificada em comparação com os animais tratados com IgG e possivelmente um maior tráfego de linfócitos para dentro da medula espinhal danificada. Uma vez que os anticorpos que se direcionam para a parte ex- tracelular de Nogo-A (Nogo-66) foram sugeridos como tendo potencial tera- pêutico em um modelo animal de esclerose múltipla (Karnezis T e outros, Nat. Neurosci. 7: 736-744 (2004); Fontoura P e outros, J. Immunol. 173: 6981-6992 (2004)), o envolvimento possível dos mecanismos relacionados com a imunidade na ação dos compostos tem interesse especial.

Outras vias significativamente enriquecidas afetadas em mais de três tecidos estudados incluem a apoptose e a via de sinalização da apopto- se, a coagulação do sangue, a sinalização mediada por adesão celular, a sinalização mediada por proteínas de matriz extracelular, a homeostase de fator de crescimento, oncogene, a fosforilação oxidativa e as transmissões sinápticas. A direção de enriquecimento na maior parte das vias era similar à observada nas vias relacionadas com o sistema imunológico, para 11C7 a- pós uma semana de tratamento, mas na direção de IgG após duas semanas de tratamento. Uma exceção interessante é a via de transmissão sináptica, em que após uma semana de tratamento a via é regulada para menos após o tratamento com 11C7, mas regulada para mais após duas semanas de tratamento. As vias de atividades neuronais e de transmissão sináptica se- guiam o mesmo padrão e estavam significativamente afetadas na medula espinhal no nível de T8 e L1 -5.

A identificação das várias vias de fatores de crescimento, inclu- indo as vias de sinalização de EGF, FGF, NGF, PDGF e TGF beta na ação do anticorpo anti-Nogo-A é interessante partindo de vários pontos: A ativa- ção do receptor de EGF foi recentemente relatada como sendo o mediador dos sinais inibidores partindo da mielina e do sulfato de condroitina na rege- neração de axônios e a inibição da sinalização do receptor de EGF resultou na regeneração do nervo óptico após danos. He Z & Koprivica V, Annu. Rev.

Neurosci. 27: 341-368 (2004); Koprivica V e outros, Science 310: 106-110 (2005). No presente conjunto de dados, a via de sinalização mediada pelo receptor de EGF era regulada para mais no sangue e em L1-5 após 1 sema- na de tratamento com 11C7, mas de forma interessante regulada para me- nos no córtex motor-somatossensorial após 2 semanas de tratamento com 11C7. A via de sinalização de PDGF era concomitantemente regulada para mais após uma semana de tratamento por 11C7 na medula espinhal em to- dos os três níveis estudados (T8, T1-7, L1-5).

TABELA 3

Vias com enriquecimento do conjunto de genes significativo em três ou mais tecidos

<table>table see original document page 69</column></row><table> TABELA 3

<table>table see original document page 70</column></row><table> TABELA 3

<table>table see original document page 71</column></row><table>

Conclusão. Os resultados confirmam no nível de expressão gê- nica a medula espinhal danificada e o córtex motor como os sítios primários de ação do tratamento com o anticorpo anti-Nogo-A aplicado de forma intra- tecal. A análise identificou novos candidatos moleculares e de vias como alvos possíveis do tratamento com anti-Nogo-A, tais como a miocilina e a via de Slit-Robo. Os resultados também apontavem para o forte envolvimento das vias relacionadas com a defesa imunológica no efeito do tratamento.

As proteínas secretadas Sfrp4, Mmp9 e a miocilina foram sele- cionadas para serem adicionalmente estudadas como marcadores candida- tos do efeito do tratamento.

Foi realizada a confirmação com TAQMAN das descobertas se- lecionadas. Todos os produtos da transcrição selecionados foram confirma- dos (Sfrp2, Sfrp4, miocilina, precursor da asporina, dermatopontina, Mmp9).

EXEMPLO 2

ESTUDO EXPLORATÓRIO GENÔMICO EM UM MODELO DE DANOS À MEDULA ESPINHAL DE RATO APÓS O TRATAMENTO COM O ANTI- CORPO ANTI-NOGO A 11C7; ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA EM Ml- CROARRANJO. CONTINUAÇÃO

Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA): A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) foi realizada co- mo descrito por Mootha VK e outros, Nat. Genet. 34: 267-273 (2003). Sucin- tamente, a GSEA determina se os membros de um certo conjunto de genes estão enriquecidos dentre os genes expressos de forma diferencial principais entre duas classes. Primeiramente, os genes são ordenados com base em uma medida de diferença. Esta pode ser a diferença em termos das duas classes dividida pela soma dos desvios-padrão das duas classes de diag- nóstico, mas outras medidas de diferenças também podem ser utilizadas.

Para cada conjunto de genes, é feita uma medida de enriqueci- mento chamada de ES. Esta é uma estatística de Kolmogorov-Smirnov nor- malizada. Considerar os genes R1,.., RN que estão ordenados com base na medida de diferença entre as duas classes e um conjunto de genes S con- tendo os membros G. É definido

<formula>formula see original document page 72</formula>

se Ri não for um membro de S ou

<formula>formula see original document page 72</formula>

se Ri for um membro de S. É então computada uma soma de corrida ao lon- go de todos os genes Ν. A ES é definida como

<formula>formula see original document page 72</formula>

ou o desvio positivo máximo observado da soma de corrida. A ES é medida para cada conjunto de genes considerado. Os conjuntos de genes se basei- am na informação das vias da Celera, Pathart e de KEGG. Para determinar se qualquer um dos conjuntos gênicos fornecido exibe associação com a distinção de fenótipo da classe, as marcações das classes são permutadas 1.000 vezes, cada vez registrando a ES máxima ao longo de todos os con- juntos de genes. Sob este aspecto, está sendo testada uma única hipótese. A hipótese nula é que nenhum conjunto de genes está associado com a dis- tinção de classes. Resultados. A análise de dados inicial do conjunto de dados pa- ra os tecidos da medula espinhal T8 (no nível de danos) e proximal ao dano, T1-7 foi realizado de forma cega. A análise resultou na identificação de a- mostras codificadas de "cor-de-laranja" como o grupo tratado com 11C7 a- pós o que o código foi revelado e a identidade da amostra foi confirmada. O restante da análise não era cego.

Medula espinhal T8 (no nível da lesão). O teste t de Welch com- parando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 643 e 449 genes expressos de forma diferencial após uma semana e duas semanas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,93±1,06 após uma semana de tratamento e 1,31 ±0,07 após duas semanas de tratamento. As 20 alterações dê expressão gênica principais após uma semana de trata- mento estão listadas na TABELA 4 e após duas semanas de tratamento, na TABELA 5. 90% dos 20 produtos da transcrição principais estavam regula- dos para menos em uma semana após o tratamento com 11C7 (enquanto que naqueles expressos de forma diferencial totais, 41% estavam relgulados para menos). De forma interessante, entre estes havia 7 produtos da trans- crição codificando proteínas relacionadas com a matriz extracelular (ECM) e com a cura e/ou a cicatrização de feridas (precursor da asporina, dermato- pontina, colágeno), 2 proteínas similares a frizzled secretadas (Sfrl2 e 4), duas proteínas de ligação a Igf (Igfbp 5 e 6, reguladores negativos de lgf) e miocilina/TIGR, que foi recentemente mostrada como inibindo o crescimento de neuritos e que é regulada para mais na cicatrização crônica da glia após danos ao SNC. Jurynec MJ e outros, Moi CeH Neurosci. 23: 69-80 (2003).

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo nos produtos da transcrição rela- cionados com imunidade e defesa, através da sinalização mediada por cito- cinas e quimiocinas, cascata de Jak-stat, inibição da apoptose e em 90 ou- tras vias após uma semana de tratamento com 11C7 (TABELA 4). Das vias relacionadas com o sistema nervoso, as atividades neuronais, a neurogêne- se e a transmissão sináptica nervo-nervo eram reguladas para menos e a orientação de oxônios mediada por Slit-Robo era regulada para mais nos animais tratados com 11C7.

TABELA 4

20 alterações da expressão qênica principais na medula espinhal no nível da lesão (T8) após uma semana de tratamento com o anticorpo monoclonal

<table>table see original document page 74</column></row><table> TABELA 4

<table>table see original document page 75</column></row><table>

TABELA 5

<table>table see original document page 75</column></row><table> TABELA 5

<table>table see original document page 76</column></row><table> TABELA 5

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 77</column></row><table> TABELA 5

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 78</column></row><table>

Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram significativamente menores que após 1 semana de tratamento. Somente um produto da transcrição era >1,5 vez significativamente regulado de forma diferencial (gene 3 que resposnde a p53, 1,6 vez regulado para mais após 11C7). A GSEA identificou 45 vias em que o enriquecimento significativo dos produtos da transcrição expressos de forma diferencial era observado. A fosforilação oxidativa, o transporte de elétrons/íons/cátions, o junção de mRNA e a transmissão sináptica estavam entre as vias mais significativa- mente afetadas (TABELA 6).

TABELA 6

<table>table see original document page 79</column></row><table> TABELA 6

20 alterações da expressão qênica principais na medula espinhal no nível da lesão (T8) após duas semanas de tratamento com o anticorpo monoclo- nal de camundongo anti-Nogo A 11C7

<table>table see original document page 80</column></row><table>

TABELA 7

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IgG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (o<0,05)

<table>table see original document page 80</column></row><table> TABELA 7

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 81</column></row><table> TABELA 7

<table>table see original document page 82</column></row><table>

Medula espinhal T1-7 (Proximal ao local da lesão). O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 566 e 579 genes expressos de forma diferencial após uma se- mana e duas semanas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,43±0,17 após uma semana de tratamento e 1,56±0,98 após duas semanas de trata- mento. As 20 alterações da expressão gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na TABELA 8 e após duas semanas de trata- mento, na TABELA 9.

As maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 repetiram o tema observado no local da lesão: oito das 20 alterações principais estavam relacionadas com ECM (lumicana, colágenos 1a1-2 e 5a1, fibulina 2, tetranectina, glicoproteína de matriz SC1/ECM2) e reguladas para menos após tratamento com 11C7. Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram significativamente maiores que após 1 semana de tratamento. Algumas das maiores alterações estavam relacionadas com a regulação para menos dos produtos da transcrição que codificam proteínas expressas em linfócitos.

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo em 35 vias após uma semana de tratamento (TABELA 10) e em 3 vias (TABELA 11; q<0,05; 32 p<0,05) após duas semanas de tratamento. As vias mais significativamente afetadas eram a sinalização mediada por ECM, o metabolismo de lipídeos e a homeostase de fator de crescimento após uma semana e o transporte de íons, a homeos- tase de fator de crescimento e o término da transcrição de mRNA após duas semanas de tratamento. TABELA 8

<table>table see original document page 83</column></row><table> TABELA 8

<table>table see original document page 84</column></row><table>

TABELA 9

<table>table see original document page 84</column></row><table> TABELA 9

20 alterações da expressão gênica principais na medula espinhal em T1-7 (proximal ao local da lesão) após duas semanas de tratamento com o anti- corpo monoclonal de camundongo anti-Nogo A 11C7

<table>table see original document page 85</column></row><table> TABELA 10

GSEA realizada no conjunto de dados T1-7. Vias com genes enriquecidos não tratados com IqC ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 86</column></row><table> <table>table see original document page 87</column></row><table>

TABELA 11

<table>table see original document page 87</column></row><table>

Medula espinhal L1-5 (Distai ao local da lesão). O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 1303 e 1301 genes expressos de forma diferencial após uma semana e duas semanas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,72±0,5 após uma semana de tratamento e 1,91 ±2,0 após duas semanas de trata- mento. As 20 alterações da expressão gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na TABELA 12 e após duas semanas de trata- mento, na TABELA 13.

As maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 repetiram o tema observado no local da lesão: oito das 20 alterações principais estavam relacionadas com ECM (lumicana, colágenos 1a1-2 e 5a1, fibulina 2, tetranectina, Glicoproteína de matriz SC1/ECM2) e reguladas para menos após tratamento com 11C7. Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram significativamente maiores que após í semana de tratamento. Algumas das maiores alterações estavam relacionadas com a regulação para menos dos produtos da transcrição que codificam proteínas expressas em linfócitos.

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo em 151 vias após uma semana de tratamento (TABELA 14) e 116 vias (TABELA 15) após duas semanas de tratamento. De forma muito interessante, a via relacionada com imunidade e defesa estava altamente significativamente enriquecida na direção dos trata- dos com IgG (regulada para menos após tratamento com 11C7) após duas semanas de tratamento, enquanto que os produtos da transcrição nas vias relacionadas com a transmissão sináptica, com as atividades neuronais e com a liberação de neurotransmissores estavam significativamente enrique- cidas (reguladas para mais) após o tratamento com 11C7.

TABELA 12

<table>table see original document page 88</column></row><table> <table>table see original document page 89</column></row><table>

TABELA 13

20 alterações da expressão gênica principais na medula espinhal em L1-5 (distai ao local da lesão) após duas semanas de tratamento com o anticor- po monoclonal de camundongo anti-Nogo A 11C7

<table>table see original document page 89</column></row><table> <table>table see original document page 90</column></row><table>

TABELA 14

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 90</column></row><table> TABELA 14

<table>table see original document page 91</column></row><table> TABELA 14

<table>table see original document page 92</column></row><table> TABELA 14

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0.05)

<table>table see original document page 93</column></row><table> TABELA 14

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 94</column></row><table> TABELA 14

<table>table see original document page 95</column></row><table> TABELA 15

<table>table see original document page 96</column></row><table> <table>table see original document page 97</column></row><table> TABELA 15

<table>table see original document page 98</column></row><table> TABELA 15

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após duas semanas de tratamento (q<0.05)

<table>table see original document page 99</column></row><table> Córtex Motor-Somatossensorial, O teste t de Welch comparando o grupo tratado com IgG com o grupo tratado com 11C7 resultou em 1303 e 1301 genes expressos de forma diferencial após uma semana e duas sema- nas de tratamento, respectivamente. A alteração média de vezes das 100 maiores alterações de vezes principais era de 1,72±0,5 após uma semana de tratamento e 1,91 ±2,0 após duas semanas de tratamento. As 20 altera- ções da expressão gênica principais após uma semana de tratamento estão listadas na TABELA 12 e após duas semanas de tratamento, na TABELA 13.

As maiores alterações em uma semana após o tratamento com 11C7 repetiram o tema observado no local da lesão: oito das 20 alterações principais estavam relacionadas com ECM (lumicana, colágenos 1a1-2 e 5a1, fibulina 2, tetranectina, Glicoproteína de matriz SC1/ECM2) e reguladas para menos após tratamento com 11C7. Após duas semanas de tratamento, as alterações de vezes eram ligeiramente maiores que após 1 semana de tratamento. Algumas das maiores alterações estavam relacionadas com a regulação para menos dos produtos da transcrição que codificam as proteí- nas expressas nos linfócitos.

A Análise de Enriquecimento do Conjunto de Genes (GSEA) i- dentificou um enriquecimento significativo em 151 vias após uma semana de tratamento (TABELA 14) e 116 vias (TABELA 15) após duas semanas de tratamento. As vias mais significativamente afetadas eram a sinalização me- diada por ECM, o metabolismo de lipídeos e a homeostase de fator de cres- cimento após uma semana e o transporte de íons, a homeostase de fator de crescimento e o término da transcrição de mRNA após duas semanas de tratamento.

EXEMPLO 3

LISTAS DAS VIAS COM GENE DE ENRIQUECIMENTO SIGNIFICATIVO IDENTIFICADAS ATRAVÉS DA ANÁLISE DE ENRIQUECIMENTO DOS CONJUNTOS DE GENES (GSEA) TABELA 16

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IaG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (g<0,05)

<table>table see original document page 101</column></row><table> TABELA 16

<table>table see original document page 102</column></row><table> TABELA 16

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos

nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (g<0.05)

<table>table see original document page 103</column></row><table> TABELA 16

<table>table see original document page 104</column></row><table> TABELA 17

GSEA realizada no conjunto de dados de T8. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após duas semanas de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 105</column></row><table> TABELA 17

<table>table see original document page 106</column></row><table>

TABELA 18

<table>table see original document page 106</column></row><table> TABELA 18

<table>table see original document page 107</column></row><table>

TABELA 19 <table>table see original document page 107</column></row><table> TABELA 20 <table>table see original document page 107</column></row><table> TABELA 20

<table>table see original document page 108</column></row><table> TABELA 20 GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com aenes enriauecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (a<0.05)

<table>table see original document page 109</column></row><table> TABELA 20

<table>table see original document page 110</column></row><table> TABELA 20

<table>table see original document page 111</column></row><table> TABELA 20

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tratados com IqG ou com 11C7 após uma semana de tratamento (q<0,05) Nome da Via Fonte da Via Conjuntos valor de q Direção do Enri-

de sondas quecimento

<table>table see original document page 112</column></row><table> TABELA 20

<table>table see original document page 113</column></row><table>

TABELA 21 <table>table see original document page 113</column></row><table> TABELA 21

GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com genes enriquecidos nos tra- tados com IgG ou com 11C7 após duas semanas de tratamento (q<0.05)

<table>table see original document page 114</column></row><table> TABELA 21

<table>table see original document page 115</column></row><table> TABELA 21 GSEA realizada no conjunto de dados de L1-5. Vias com qenes enriquecidos nos tra- tados com IqG ou com 11C7 após duas semanas de tratamento (q<0,05)

<table>table see original document page 116</column></row><table> TABELA 21

<table>table see original document page 117</column></row><table> EXEMPLO 4

VIAS COM ENRIQUECIMENTO SIGNIFICATIVO DOS CONJUNTOS GÊ- NICOS EM TRÊS OU MAIS TECIDOS

TABELA 22. Vias com enriquecimento significativo dos conjuntos gênicos em três ou mais tecidos. <table>table see original document page 118</column></row><table> <table>table see original document page 119</column></row><table>

EXEMPLO 5

VIAS DE ORIENTAÇÃO DE AXÔNIOS E DE FATORES DE CRESCIMEN- TO IDENTIFICADAS POR GSEA AFETADAS PELO TRATAMENTO COM O ANTICORPO ANTI-NOGO A TABELA 23. Vias de orientação de axônios e de fatores de crescimento identifi- cadas por GSEA afetadas pelo tratamento com o anticorpo anti-Nogo-A.

<table>table see original document page 120</column></row><table>

EXEMPLO 6

VIAS E GRUPOS DE GENES AFETADOS DE FORMA COORDENADA POR UM NOCAUTE DE NOGO A EM CEPAS DE CAMUNDONGOS SV129 e BL6 PURAS E COM O TRATAMENTO COM O ANTICORPO ANTI-NOGO A NO MODELO DE DANOS À MEDULA ESPINHAL DE RATO

Nogo-A (200 kDa, 1163 aa) difere de Nogo-B (55 kDa, 357 aa) pela inserção de um éxon grande de 787 aa (éxon 3). Um camundongo no- cauteado para Nogo-A foi gerado através da recombinação homóloga que é descrita por Simonen e outros (2003). Os camundongos nocauteados para Nogo-A quiméricos foram retrocruzados com camundongos Sv129 ou ca- mundongos BL/6 durante pelo menos 10 gerações. A análise com marcador de cepas congênicas de velocidade (Màrkel e outros, 1997) foi utilizada du- rante o retrocruzamento. O cruzamento congênico de velocidade ou a produ- ção congênica auxiliada por marcador, utiliza marcadores de microssatélites para acompanhar a herança dos segmentos cromossômicos de cada cepa.

Os camundongos ótimos para cruzamento são selecionados pelo maior nível de marcadores para cada cepa. Os camundongos utilizados no presente estudo tinham características fundamentais de C57BL/6 100% puras de a- cordo com seu perfil de marcadores e características fundamentais >99% puras em relação à cepa 129X1/SvJ.

As medulas espinhais lombares de três camundongos machos "naíve", sem lesões, do tipo selvagem e nocauteados (3 meses de idade) por cepa e genótipo foram dissecadas e imediatamente congeladas em ni- trogênio líquido. Para o experimento de microarranjo de lesões, cinco fê- meas de camundongo (6-7 semanas de idade) de cada genótipo e cepa so- freram uma lesão da medula espinhal com o auxílio de tesouras para iridec- tomia finas para produzir uma lesão bilateral dos funículos dorsais e dorsola- terais e do chifre dorsal. Seis dias após a lesão, uma análise comportamen- tal de Basso Mouse Scale em relação à locomoção em campo aberto foi rea- lizada e quatro dos cinco camundongos por categoria com o escore mais similar foram selecionados para a análise de microarranjo. Uma semana a- pós a lesão, 1 cm da medula espinhal foi dissecado com o local da lesão no centro e imediatamente congelado em nitrogênio líquido. Para a preparação da sonda, foram seguidos os procedimentos descritos no manual de Affyme- trix (Santa Clara, CA) GeneChip Analysis. O cDNA biotinilado foi hibridizado sobre os arranjos Affymetrix Mouse Genome 430 2.0, que representam >45.000 conjuntos de sondas, na Affymetrix fluidics station 450 e os chips foram então verificados com o Affymetrix Scanner 3000. Cada chip foi utili- zado para a hibridização com o cRNA isolado de uma amostra de medula espinhal proveniente de um único animal em um número total de 28 amos- tras. Os resultados foram subseqüentemente analisados utilizando o Affyme- trix Microarray Suite 5, seguido pelo Genespring 7.2 (Silicon Genetics, Red- wood City, CA). Para a identificação dos genes que são diferencialmente expressos nas medulas espinhais de camundongos Sv129 e BL76 de medu- las espinhais "naíve" e nocauteadas de animais com lesão e sem lesão 1 semana após a lesãò da medula espinhal, um filtro estatístico (ANOVA ρ < 0,05) e limites de alteração de vezes (>1,2/<0,66 ou >2/<0,5) foram aplica- dos após uma pré-filtração em relação a ocorrências presentes.

As vias e os grupos de genes comumente afetados uma semana após a lesão da medula espinhal em camundongos Sv129 e em camundon- gos BL/6 nocauteados e no modelo SCI de rato foram identificados através da comparação dos genes expressos de forma diferencial identificados em comparações de duas vias entre os animais nocauteados e "naíve" e no mo- delo SCI de rato, entre os animais tratados com o controle (IgG) e os trata- dos com o anticorpo anti-Nogo A 11C7.

113 grupos de genes comumente afetados foram identificados. Estes estão listados na Tabela 24. TABELA 24

<table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table> <table>table see original document page 124</column></row><table> <table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table> <table>table see original document page 129</column></row><table> <table>table see original document page 130</column></row><table> <table>table see original document page 131</column></row><table> <table>table see original document page 132</column></row><table> <table>table see original document page 133</column></row><table> <table>table see original document page 134</column></row><table> <table>table see original document page 135</column></row><table> <table>table see original document page 136</column></row><table> <table>table see original document page 137</column></row><table>

CONSOLIDAÇÃO DOS DADOS

Os dados acima foram adicionalmente confirmados através de géis em 2D e/ou marcação por afinidade codificada por isótopos (ICAT).

Uma lista dos genes regulados de forma diferencial após a inibi- ção ou a regulação para menos de Nogo-A considerados como sendo os mais relevantes é fornecida na Tabela 25.

TABELA 25. Lista dos genes mais relevantes

<table>table see original document page 138</column></row><table> <table>table see original document page 139</column></row><table>

EQUIVALENTES

A presente invenção não é limitada em termos das modalidades particulares descritas neste pedido de patente, que são pretendidas como ilustrações isoladas de aspectos individuais da invenção. Muitas modifica- ções e variações desta invenção podem ser feitas sem sair de seu espírito e âmbito, como será evidente para os versados na ténica. Os métodos e os aparelhos funcionalmente equivalentes dentro do âmbito da invenção, em adição aos enumerados aqui, serão evidentes aos versados na ténica par- tindo das descrições anteriores. É pretendido que tais modificações e varia- ções se encaixem dentro do âmbito das reivindicações em anexo. A presen- te invenção deve ser limitada apenas pelos termos das reivindicações em anexo junto com o âmbito completo de equivalentes ao qual tais reivindica- ções são designadas.

Claims (13)

1. Método para prever a resposta de um indivíduo a um medi- camento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A, em que a expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 é avaliada antes e depois da adminis- tração do dito medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A e em que dita expressão do dito pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do dito medicamento que compreende um anticorpo anti- Nogo-A é comparada com a expressão do dito gene antes da dita adminis- tração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que uma desre- gulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A quando comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é indicativa de uma resposta positiva (indivíduo que respem que) à dita administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a ausência de uma desregulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti- Nogo-A quando comparada com a expressão do dito gene antes da administra- ção do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é indicativa de uma ausência de resposta (indivíduo que não respem que) à dita administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A.

4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, em que a dita desregulação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é uma alteração na expressão que é maior ou igual a 1,2 vez e estatistica- mente significativa (p<0,05, teste t de Student) quando comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que com- preende um anticorpo anti-Nogo-A.

5. Método de acordo com as reivindicações 1 a 4, em que a ex- pressão de pelo menos um gene do qual os grupos de genes de adesão, genes de citoesqueleto e genes de sinalização são avaliados, em que o dito grupo de genes de adesão consiste em caderina 11, caderina 2, caderina 8, caderina 22, receptor de Eph A3, receptor de Eph A4, Efrina A3, Efrina B2, receptor de Eph B2, semaforina 4A, semaforina 4D, semaforina 4F, semafo- rina 6A, semaforina 6B, proteína 3 associada com o domínio citoplasmático de semaF e plexina B2, em que o dito grupo dos genes de citoesqueleto consiste em proteína de adição de cap (filamento de actina) similar à gelsolina, caseína quinase 1 delta, centractina, gelsolina, proteína associada a microtúbulo tau e neurofilamento 68 e em que o dito grupo de genes de sinalização consiste em inibi- dor de dissociação de Rho-GDP 1, proteína relacionada à dihidropirimidina- se 2, proteína relacionada à dihidropirimidinase 1, proteína relacionada à dihidropirimidinase 5.

6. Método de acordo com as reivindicações 1 a 5, em que a ex- pressão de todos os genes da Tabela 25 é avaliada.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a desregu- lação da dita expressão de pelo menos um gene da Tabela 25 após a admi- nistração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A quan- do comparada com a expressão do dito gene antes da administração do medicamento que compreende um anticorpo anti-Nogo-A é indicativa da re- generação do sistema nervoso central.

8. Método de acordo com as reivindicações 1 a 7, em que é rea- lizado in vitro.

9. Uso de um anticorpo anti-Nogo-A na produção de um medi- camento para o tratamento de danos ao sistema nervoso central em uma população de pacientes, em que a população de pacientes é selecionada pelo método como definido nas reivindicações 1 a 8.

10. Uso de acordo com a reivindicação 9, em que o anticorpo anti- Nogo-A é um anticorpo monoclonal humano completo (lgG4/K) que se liga ao epitopo do fragmento de Nogo-A humano partindo dos aminoácidos 342-357.

11. Método para o tratamento de danos ao sistema nervoso cen- trai em um indivíduo, que compreende as etapas de: (a) administração de um anticorpo anti-Nogo-A a um indivíduo com danos no sistema nervoso central; (b) determinação do padrão de expressão gênica do indivíduo de acordo com o método de acordo com as reivindicações 1 a 8; e (c) qualquer um de: (i) continuação com a terapia com o anticorpo anti-Nogo-A se a expressão gênica de biomarcadores indicar regeneração do sistema nervoso central ou (ii) interrupção ou redução da terapia com o anticorpo anti-Nogo- A se a expressão gênica dos biomarcadores não indicar regeneração do sis- tema nervoso central.

12. Método para o diagnóstico da regeneração do sistema ner- voso central em um indivíduo, que compreende as etapas de: (a) administração de um anticorpo anti-Nogo-A ao indivíduo; (b) determinação do padrão de expressão gênica do indivíduo de acordo com o método de acordo com as reivindicações 1 a 8; e (c) determinação do fato da expressão gênica de biomarcadores indicar regeneração do sistema nervoso central.

13. Kit para a realização dos métodos como definidos nas reivin- dicações 1 a 12, que compreende pelo menos duas sondas, cada sonda sendo capaz de detectar especificamente a expressão de um gene da Tabe- la 25, em que as ditas pelo menos duas sondas não detectam a expressão do mesmo gene.