BRPI0618761A2 - substrato promotor de angiogênese - Google Patents

Abstract

SUBSTRATO PROMOTOR DE ANGIOGêNESE. Para se preparar um substrato promotor de angiogénese, que possa ser preparado de modo simples e com qualidade reproduzível e que permaneça estável, particularmente sob condições fisiológicas, por um espaço de tempo pré-determinado, e que apesar disso seja biocompatível e reabsorvível, aconselha-se que o substrato promotor de angiogénese abranja um corpo moldável poroso consistindo em um material gelatinoso, insolúvel e reabsorvível sob condições fisiológicas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SUBSTRATO PROMOTOR DE ANGIOGÊNESE".

A presente invenção refere-se a um substrato promotor de angi- ogênese.

Em mamíferos vivos, as células endoteliais que revestem os va- sos sangüíneos existentes formam novos capilares também sempre onde são necessários. As células endoteliais possuem a surpreendente capacida- de de ajustar seu número e disposição às exigências locais. Tecidos são dependentes da irrigação sangüínea que ocorre através do sistema de vasos sangüíneos. O sistema vascular por sua vez depende das células endoteli- ais. As células endoteliais viabilizam um sistema de segurança da vida ca- paz de se adaptar, e que se ramifica por quase todas as regiões do corpo.

Enquanto os vasos sangüíneos maiores, as artérias e veias, a- presentam uma parede espessa forte, de tecido conjuntivo e musculatura em parte lisa, e no interior estão revestidos apenas por camadas simples extre- mamente finas de células endoteliais, encontra-se nas ramificações mais finas do sistema vascular, os capilares, paredes que consistem apenas em células endoteliais e uma, assim denominada, lâmina basal. Células endote- liais revestem assim todo o sistema dos vasos sangüíneos, que atinge desde o coração até os menores capilares, e elas controlam a passagem de mate- riais para a corrente sangüínea e originada da corrente sangüínea.

As células nos tecidos liberam, na falta de oxigênio, fatores de angiogênese que estimulam o crescimento de novos capilares. Estímulos (mecânicos) locais e infecções causam, igualmente, a proliferação de novos capilares, a maioria dos quais se retrai e some tão logo desvaneça a infla- mação.

Os vasos sangüíneos recém formados surgem sempre primei- ramente como capilares, que se ramificam a partir de pequenos vasos exis- tentes. Essa etapa é denominada angiogênese.

A disseminação dos capilares continua até que a respectiva ra- mificação encontre um outro capilar e possa se ligar a ele, de modo que o sangue possa circular nele (comparar por exemplo com B. Alberts et al., Bio- logia Molecular das células, VCH Weinheim, 3a edição 1995, páginas 1360 - 1364).

Fatores estimulantes da angiogênese são muitos conhecidos e abrangem por exemplo os fatores HGF, FGF, VEGF e outros mais.

Na literatura (comparar por exemplo com EP 1 415 663 A1 E EP 1 555 030 A1) aconselhou-se aplicar tais fatores estimulantes da angiogêne- se em uma matriz com função de depósito, onde como matriz de depósito foi aconselhado um hidrogel de gelatina de uma gelatina com um peso molecu- lar médio de 100 000 até 200 000 Dáltons (Da). Para tipos diferentes de colágeno são descritos sua adequação como estrutura de suporte na formação de novos vasos, bem como seus efeitos antiangiogenéticos. Como exemplos desta literatura deve ser feita menção a S. M. Sweeney et al., Journal of Biological Chemistry vol. 278, n° 33, páginas 30516 até 30524 (2003) assim como R. Xu et al., em Biochemi- cal and Biophysical Research Communications 289, páginas 264 até 268 (2001).

É tarefa da presente invenção preparar um substrato promotor de angiogênese, que é preparável de modo simples e em qualidade repro- duzível, e que particularmente permanece estável sob condições fisiológicas por um espaço de tempo previamente indicado, e apesar disto é biologica- mente compatível e reabsorvível.

Essa tarefa é solucionada por um substrato promotor de angio- gênese, que abrange um corpo moldável poroso, que é formado por um ma- terial reabsorvível contendo gelatina, insolúvel sob condições fisiológicas.

Surpreendentemente verificou-se que corpos moldáveis poro- sos, que são preparados a partir de material reabsorvível contendo gelatina, insolúvel sob condições fisiológicas, apresentam na forma (GestaIt) um efei- to promotor de angiogênese muito disseminado, que atua a uma densidade elevada na angiogênese, particularmente na formação de vasos sangüíneos dentro do corpo moldado poroso, de modo que objetivamente a angiogênese é possível por introdução do corpo moldado poroso nos locais desejados do corpo do paciente ou animal a ser tratado. É particularmente surpreendente, que o material contendo gela- tina preparado como corpo moldado poroso surge como promotor tal angio- gênese no surgimento, sem que ele requisitasse, como antes descrito na literatura, fatores promotores da angiogênese como, por exemplo, os fatores previamente mencionados VEGF, FGF, HGF e outros.

De preferência o material contendo gelatina é um material à ba- se de gelatina e consiste em modo preponderante de frações de gelatina. Isto significa que a gelatina representa a maior parte dos outros componen- tes do material eventualmente empregados.

É empregado ainda, de preferência, um material à base de gela- tina, que consiste essencialmente totalmente em gelatina.

Tipos de gelatina particularmente apropriados são gelatinas de toucinho de suínos, que de preferência tem um elevado peso molecular e apresenta um valor de Bloom de cerca de 160 até cerca de 300 g.

Em um âmbito altamente reduzido observa-se um efeito estimu- Iador da angiogênese em gelatinas de baixo peso molecular, solúveis em água com um valor molecular médio menor do que 6 kDa, entretanto um tal efeito é comparativamente não específico se comparado com outros agentes estimuladores igualmente em âmbito reduzido.

A gelatina empregada tem portanto de preferência um peso mo- lecular médio maior do que 6 kDa.

Para assegurar uma ótima biocompatibilidade do substrato de acordo com a invenção no emprego medicinal, é empregada, de preferência, como material de partida, uma gelatina com um teor particularmente peque- no de endotoxinas. Endotoxinas tratam-se de produtos do metabolismo ou fragmentos de microorganismos, que ocorrem na matéria-prima animal bru- ta. O teor de endotoxinas de gelatina é indicado em unidades internacionais por grama (I.E./g) e determinado de acordo com o teste LAL, cuja realização é descrita na quarta edição do livro de medicina europeu "Europãischen Arz- neibuches" (PH. Eur. 4).

Para manter o teor de endotoxinas o mais baixo possível é van- tajoso matar os microorganismos o mais cedo possível no decorrer da pre- paração da gelatina. Além disso, os respectivos padrões de higiene devem ser mantidos no processo de preparação.

Assim o teor de endotoxinas da gelatina pode ser drasticamente reduzido por determinadas medidas, no processo de preparação. Dentre essas medidas estão em primeiro lugar o emprego de matérias-primas bru- tas frescas (por exemplo, toucinho de porco) evitando tempos de armaze- namento, a cuidadosa limpeza de todos os dispositivos de produção imedia- tamente antes do início da preparação da gelatina, assim como opcional- mente a troca dos trocadores de íons e sistemas de filtragem nos equipa- mentos de produção.

A gelatina empregada no quadro da presente invenção apresen- ta de preferência um teor de endotoxina de 1200 I.E./g ou menor, ainda mais preferido de 200 I.E./g ou menos. Otimamente, o teor de endotoxinas situa- se a 50 I. E. / g ou menos, respectivamente de acordo com o teste LAL. Em comparação com isto, muitas gelatinas comercialmente usuais apresentam teores de endotoxinas acima de 20 000 I. E./g.

Já que a gelatina - nas condições fisiológicas às quais o substra- to é submetido no seu emprego promotor da angiogênese- é rapidamente dissolvida, e com isso o corpo moldado poroso perde rapidamente sua inte- gridade estrutural, o material contendo a gelatina é empregado de preferên- cia com um grau de reticulação predeterminado.

Com relação a uma outra forma de execução da presente inven- ção, pode-se reagir contra isto empregando-se a gelatina juntamente com outro componente que se dissolve mais lentamente (Exemplos de tais biopo- límeros reabsorvíveis são, quitosana e ácido hialurônico). Tais componentes podem ser empregados com o propósito de uma imobilização parcial da fra- ção de gelatina.

Escolhendo-se a reticulação para estabilização do material, a fração de gelatina do material contendo gelatina pode ser particularmente reticulada, sendo que por um lado pode-se recorrer a uma reticulação quími- ca, mas também a uma reticulação enzimática.

Agentes de reticulação química preferidos são aldeídos, dialdeí- dos, isocianatos, carbodiimidas e dihalogenetos de alquila. Particularmente preferido é assim formaldeído, que concomitantemente efetua uma esterili- zação do corpo moldado.

Como agente de reticulação enzimático é empregada, de prefe- rência, a enzima transglutaminase, que efetua uma ligação da cadeia lateral de glutamina e lisina, particularmente também de gelatinas.

A estabilidade perante a reabsorção, sob as condições fisiológi- cas anteriormente mencionadas, às quais o material é submetido no seu emprego, pode ser ajustada in vitro, sob as respectivas condições fisiológi- cas padrão. Aqui é empregada uma solução tampão PBS (pH 7,2) a 37°C e sob essas condições os substratos são testados e comparados quanto ao seu comportamento de estabilidade dependente do tempo.

O corpo moldado poroso é estabilizado, de preferência por meio de um reticulador, em duas etapas, quanto à sua estrutura, sendo que na primeira etapa o material contendo a gelatina em solução é submetido a uma primeira reação. O material depois é espumado e depois um corpo moldado poroso obtido é posteriormente reticulado em uma segunda etapa de reticulação.

Enquanto na primeira etapa de reticulação a reticulação ocorre em solução para a segunda etapa de reticulação se destacam dois proces- sos de reticulação diferentes.

Por um lado o corpo moldado poroso pode ser colocado em con- tato com uma solução de reticulação, e assim o grau de reticulação é au- mentado ainda mais, ou então, particularmente quando a própria gelatina é reticulada, o corpo moldado poroso pode ser submetido a um vapor de fo- maldeído, para que a fração de formaldeído que penetra no corpo moldado poroso na fase gasosa leve a uma outra reticulação.

A reticulação em duas etapas tem a particular vantagem, de que no total é atingível um grau de reticulação mais elevado que então, além dis- so, ainda pode ser realizado também homogeneamente, essencialmente através de todo o corte transversal do corpo moldado poroso. Isto tem, como conseqüência, que as propriedades de decomposição do corpo moldado poroso na reabsorção são homogêneas, de modo que essas, para o espaço de tempo previsto, dependentes do grau de reticulação, mantêm essencial- mente sua integridade estrutural e então são reabsorvidas totalmente com perda da integridade estrutural.

Tendo em vista o efeito mostrado no início da concentração da angiogênese no âmbito em que o corpo moldado poroso assume, ele tem a grande vantagem de que a angiogênese é muito bem conduzível e pode ser focada no local desejado pelo médico clínico.

A estabilidade de reabsorção do corpo moldado pode ser nova- mente ajustada sobre a variação do grau de reticulação dependente do caso de emprego, assim como do momento no qual o corpo moldado poroso per- de sua integridade estrutural.

Para muitos casos de emprego o grau de reticulação deveria ser escolhido de tal modo que durante 7 dias até 20% em peso ou menos do material contendo gelatina é decomposto sob as supracitadas condições fisiológicas padrão.

O corpo moldado poroso pode ser realizado em muitas dissemi- nações diferentes, sobre o que nada foi até agora falado.

Em uma forma preferida de execução da invenção, o corpo mol- dado do substrato apresenta uma estrutura de fibras. Essa estrutura de fi- bras pode por um lado apresentar uma estrutura em tecido ou tricô, alterna- tivamente também interessa uma estrutura de fibras na forma de um velo.

Uma estrutura totalmente diferente do corpo moldado do subs- trato de acordo com a invenção apresenta-se na estrutura da esponja, que de preferência abrange uma fração de poros abertos. Ainda é preferida uma estrutura de esponja com uma estrutura de poros essencialmente abertos.

Conjuntamente em todas as disseminações de corpos moldados porosos, que são dadas pela porosidade das células endoteliais, é apresen- tada uma possibilidade de andar pelo substrato e penetrar no mesmo. I- gualmente o corpo moldado já oferece também, devido a sua porosidade, as células endoteliais a possibilidade de formar vasos capilares no substrato.

No caso da escolha da estrutura da esponja para o corpo mol- dado poroso, é vantajoso quando esse apresenta uma diversidade de poros com um tamanho de poros médio na faixa de cerca de 50 até 500 \im.

A porosidade dos outros corpos moldados porosos deveria ser escolhida de tal forma que lá existam estruturas de poros semelhantes, já que esses são otimamente apropriados para receber as células endoteliais e permitir um crescimento do substrato com vasos capilares.

Os corpos moldados porosos dos substratos promotores de an- giogênese de acordo com a invenção têm, além disso, a vantagem de que nos poros do corpo moldável uma ou mais substâncias ativas farmacêuticas não à base de gelatina são armazenadas.

Além disso, os poros do corpo moldado já podem ser coloniza- dos com células, antes que o substrato seja levado ao local do corpo huma- no ou do animal a ser tratado.

A forma geométrica do substrato não foi até agora esclarecida em detalhes, entretanto compreende-se que o substrato em suas dimensões externas pode ser escolhido de diversas formas. Assim é empregado vanta- josamente um substrato plano como um implante para estimular a formação do vaso sangüíneo. Além disso, o substrato também pode estar presente na forma de pequenas partículas, particularmente na forma de pó, sendo que as partículas do pó de preferência são preparadas a partir de uma estrutura em esponja, um velo, um tecido ou um tricô, particularmente por meio de tritura- ção.

Essas e outras vantagens da invenção são a seguir ainda mais esclarecidas por meio de desenhos, bem como de exemplos. Eles mostram em detalhes:

Figura 1: o comportamento da decomposição de diversos subs- tratos promotores da angiogênese de acordo com a invenção;

Figuras 2a e b: uma representação esquemática da disposição dos ensaios para verificação da angiogênese por meio de uma membrana de alantocórion (CAM);

Figura 3: a angiogênese disparada por um substrato promotor da angiogênese de acordo com a invenção em uma CAM após 3, 5 e 7 dias; Figura 4: um diagrama para ilustração da formação de vasos sangüíneos em torno do substrato promotor da angiogênese;

Figura 5: um diagrama para ilustração do desenvolvimento de vasos sangüíneos no próprio substrato promotor de angiogênese;

Figura 6: três fotografias com microscópio eletrônico de uma es- ponja de colágeno consistindo em substratos de referência de 2, 5 e 7 dias; e

Figura 7a e 7b: quatro fotografias com microscópio eletrônico de um substrato promotor de angiogênese de acordo com a invenção após 3, 5, 7e8dias.

Exemplo 1:

Preparação e Propriedades de corpos moldados com estrutura celular à base de gelatinas reticuladas

Cinco preparações de uma solução a 12% em peso de gelatinas de toucinho de porco (goma Bloom 300 g, peso molecular médio 140 kDa) em água, foram preparadas por dissolução da gelatina a 60°C, desgaseifica- das por meio de ultra-som, e respectivamente reagidas com a respectiva quantidade de uma solução de formaldeído aquosa (1,0 % em peso, tempe- ratura ambiente), de modo que 1500 ppm de formaldeído (relativo à gelatina) estavam presentes. Em um sexto preparado não ocorreu nenhuma adição de formaldeído.

As misturas homogeneizadas foram temperadas a 45°C, e após um tempo de reação de 10 minutos, foram mecanicamente espumadas com ar. O procedimento de espumamento de cerca de 30 minutos foi realizado para as seis preparações, com proporções diferente de ar para solução de gelatina, com o que foram obtidas estruturas celulares com diferentes densi- dades em condições de umidade e tamanhos de poros de acordo com a ta- bela 1.

As soluções de gelatina esponjadas, que apresentaram uma temperatura de 26,5°C, foram entornados em formas com uma medida de 40 χ 20 χ 6 cm durante cerca de quatro dias a 26°C e foram secadas a uma u- midade relativa do ar de 10%. Os corpos moldados a seco de todas as seis preparações apre- sentam uma estrutura celular em esponja (a seguir denominado de espon- jas). Elas foram cortadas com 2 mm de espessura e submetidas à segunda etapa de reticulação por 17 horas em um exsecador, a uma pressão de va- por homogênea de uma solução de formaldeído a 17 % em peso aquosa à temperatura ambiente. Para a sexta preparação esta apresentou os primei- ros passos de reticulação (e únicos). Para se obter uma desgaseificação homogênea de todo o volume do corpo moldado, o exsecador foi então res- pectivamente duas até três vezes evacuado e novamente arejado.

A estrutura dos poros da esponja foi determinada por microscó- pio eletrônico e pode ser confirmada por microscrópio eletrônico de rastrea- mento com retícula.

Tabela 1

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Para determinar a estabilidade das esponjas, foram pesados pedaços de tamanho 30 χ 30 χ 2 mm, e introduzidos em uma solução tam- pão de 75 ml de PBS e armazenado a 37°C. Após o respectivo tempo de armazenamento, os pedaços foram lavados por 30 minutos em água, seca- dos e pesados.

A Figura 1 mostra o comportamento de dissolução, isto é, o comportamento de reabsorção das esponjas reticuladas em duas etapas 1-1 até 1-5, assim como a esponja reticulada uma única vez 1-6 (a seqüência de barras apresentada é respectivamente: 1-6, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5).

Enquanto a esponja 1-6 após três dias já está completamente dissolvida, todas as esponjas reticuladas em duas etapas permanecem man- tidos acima de 80% também após 14 dias. Mostrou-se uma enorme diferen- ça nos demais comportamentos de decomposição, que são devidos às dife- rentes densidades de esponja dos materiais. Assim a esponja 1-1 é total- mente dissolvida após 21 dias, e a esponja 1-5 também após 28 dias, en- quanto que as esponjas 1-4 e 1-5, mesmo após 35 dias, ainda permanecem mantidas em grande parte. Disto resulta uma outra possibilidade, a de influ- enciar objetivamente o comportamento de decomposição dessas esponjas ou materiais de estrutura celular, independentemente de outros parâmetros.

As propriedades dos materiais de estrutura celular também po- dem ser visivelmente modificadas por uma mudança na concentração da gelatina na solução de partida.

Concentrações mais elevadas de gelatina levam a paredes celu- lares mais largas (espessas) ou a caminhos entre os poros individuais, o que se reflete em uma maior resistência à ruptura das esponjas corresponden- tes.

A resistência à ruptura aumenta com a elevação da concentra- ção de gelatina da solução de partida de 10 até 18 % em peso, sendo que é coberto um maior âmbito de cerca de 500 até quase que 2000 Newton. Ao mesmo tempo a deformação até a ruptura se modifica apenas reduzidamen- te. Surpreendentemente a correlação entre a força de ruptura e a concentra- ção de gelatina é assim amplamente independente do grau de reticulação.

Por meio do grau de reticulação, isto é, pela escolha da concen- tração do agente de reticulação, pode ser contrariamente influenciada a es- tabilidade dos corpos moldados, particularmente tendo em vista a decompo- sição proteolítica.

Exemplo 2:

A partir de corpos moldados análogos ao exemplo 1, duas vezes reticulados (densidade de secagem 22 mg/ml, tamanho médio dos poros cerca de 250 pm) foram preparadas amostras com as medidas 15x15x2 mm, a seguir denominadas implantes.

As propriedades promotoras da angiogênese desses implantes foram verificadas por meio de um ensaio em ovos de galinha fecundados, o que é esquematicamente apresentado na figura 2.

A figura 2a mostra esquematicamente a decomposição de um ovo de galinha em corte transversal. Abaixo da casca de cálcio 10 encontra- se a membrana de corioalantóide 12 (a seguir brevemente denominada CAM). Partindo do embrião 16 que se encontra na borda da gema de ovo 14 ocorre uma formação de vasos sangüíneos 18 extra-embrionais, que se dis- seminam ao longo da CAM. Caso, por meio de uma cânula, uma parte da clara seja retirada, em seguida uma janela 20 pode ser cortada na casca 10 de cálcio, sem machucar a CAM 12 (como apresentado na Figura 2b). Então um implante 22 pode ser disposto na CAM 12 e pode-se verificar sua eficá- cia na formação de vasos sangüíneos (comparar, por exemplo, com J. Bor- ges et al. (2004) Der Chirurg 75, 284-290).

A Figura 3 mostra a reorientação e nova formação de vasos sangüíneos em fotografias com microscópio eletrônico após 3, 5 e 7 dias.

Como exemplos de referência foram testados, além do substrato de acordo com a invenção, materiais de colágeno esponjoso comparáveis (colágeno renaturado, bovino, densidade 5,6 mg/cm3, obtenível na Firma Innocoll) e poli-DL-lactídeos (fabricante ITV Denkendorf).

Todos os implantes foram introduzidos em uma CAM e após 3, 4, 5, 6 e 7 dias determinou-se o número dos vasos sangüíneos, que se de- senvolveram nas cercanias diretas do implante. Como pode ser observado na Figura 3, os vasos sangüíneos orientam-se dentro de poucos dias, muito visivelmente, no substrato promotor da angiogênese ou amostras de refe- rência de colágeno e poli-DL-lactídeo esponjoso.

Na Figura 4 é apresentada a avaliação do número de vasos sangüíneos por imagem em corte em torno do substrato e mostra-se, que em todas as três amostras perante o valor zero (CAM sem implante coloca- do) um número visivelmente elevado de vasos sangüíneos está presente, sendo que em todas as três amostras foram obtidos efeitos semelhantes, particularmente perante o valor zero.

Isto é, todos os materiais testados quanto a sua eficácia angio- genética situam-se, em sua vizinhança, mais ou menos no mesmo nível ele- vado. O efeito observado é causado sobre uma certa distância e refere-se, supostamente, a fatores denominados difundíveis. A CAM trata-se de um tecido que representa a superfície limite entre ar e líquido amniótico. Possivelmente, somente pela excitação mecâni- ca através da colocação do substrato na CAM tem-se uma ativação dos re- ceptores, o que poderia levar a uma redução de fatores pró-angiogenéticos como, por exemplo, VEGF das células. Com isso, as células endoteliais po- deriam ser atraídas e isto levaria, então, a uma formação de vasos sangüí- neos dirigidos ao implante.

Uma outra possibilidade de esclarecimento consiste no fato de que, devido à colocação do implante, a entrada de oxigênio do ar é impedida pelo tecido epitelial. Assim, na região do implante origina-se uma denomina- da anoxia, já que no tecido epitelial menos oxigênio está presente. As célu- las reagem a uma anoxia tipicamente com um esvaziamento de VEGF, o que induz a uma reorganização ou nova formação de vasos sangüíneos. Isto significa que a parte das células subabastecida organiza novos condutos de abastecimento. Esse fenômeno biológico ocorre aparentemente acima de uma superfície de tecido criticamente subabastecida (deformada).

Isto esclareceria porque em testes, nos quais ocorre apenas a colocação de pequenos anéis de borracha na CAM, não pode ser verificado nenhum efeito pró-angiogenético.

Na Figura 5, é retratada a superfície dos vasos sangüíneos (em μm2) dentro do substrato ou implante dos materiais comparativos e o subs- trato promotor da angiogênese da presente invenção após 3, 5 e 7 dias. Na ordem de apresentação das colunas, é valida a seqüência: amostra de gela- tina, amostra de colágeno, amostras de poli-DL-lactídeo.

Como é observável da Figura 5, após 3 dias mostra-se apenas no substrato promotor de angiogênese de acordo com a invenção uma fra- ção mensurável de vasos sangüíneos no próprio implante, enquanto na es- ponja de colágeno e na esponja de poli-DL-lactídeo não estão presentes ne- nhuma fração mensurável de vasos sangüíneos.

Os vasos sangüíneos mensuráveis após 5 dias mostram um ex- tremo aumento nos substratos promotores da angiogênese de acordo com a invenção, enquanto para a amostra de poli-DL-lactídeo e para a esponja de colágeno ainda não se observa nenhum efeito.

Após 7 dias a fração de vasos sangüíneos se reduz visivelmente no implante no substrato promotor de angiogênese de acordo com a inven- ção, o efeito é entretanto ainda cerca do dobro do que após 3 dias. Neste momento observa-se na esponja de colágeno ainda nenhum êxito mensurá- vel, enquanto na esponja de poli-DL-lactídeo então inicia-se um efeito como ele já foi observado após 3 dias na amostra de implante de esponja de gela- tina de acordo com a invenção.

Para avaliação das amostras e determinação do número dos vasos sangüíneos no implante foram preparados, das respectivas amostras, cortes congelados e tingidos com DAPI , para analisar a superfície dos va- sos sangüíneos dentro do implante. Além disso, foram tiradas fotografias da região média do corte, que em seguida foram avaliadas quantitativamente pelo processo de processamento de fotos. Nas esponjas de colágeno não se observou nenhuma formação de vasos sangüíneos na região média. Nas esponjas de poli_DL-lactídeo verificou-se angiogênese apenas após 7 dias, ligado a uma progressiva infestação de células de tecido conjuntivo. No total a infestação de células nesta amostra comparativa também progrediu visi- velmente mais lentamente do que nos implantes de acordo com a invenção.

A regeneração dos vasos sangüíneos do implante de acordo com a invenção após 7 dias expressa-se em uma redução da superfície me- dida. Isto poderia se basear em uma rede de vasos sangüíneos, que é no- vamente tão reduzida quanto de fato é necessário para o âmbito do implante porque, por exemplo, ainda são deslocados alguns tipos de outras células que precisam ser abastecidas. Isto corresponde a uma etapa, que também é encontrada em infecções, onde uma rede de vasos sangüíneos é regenera- da tão logo a inflamação retroceda.

Uma comparação dos dados que foram obtidos com os substra- tos promotores da angiogênese de acordo com a invenção, evidencia que o emprego de um corpo moldado poroso de um material contendo gelatina reabsorvido sob condições fisiológicas insolúveis, tem um grande significa- do. Exemplo 3:

Para esclarecimento do efeito de acordo com a invenção nas fi- guras 6 e 7 é apresentado o desenvolvimento da angiogênese em esponja de colágeno e esponja de gelatina em fotografias de microscópio eletrônico.

Enquanto na esponja de colágeno ocorre apenas uma angiogê- nese em torno da amostra e na própria amostra, até que nenhum vaso capi- lar seja observado mesmo após 7 dias (Figura 6), ao contrário aqui na amos- tra da esponja de gelatina verifica-se um crescimento total do substrato com um crescente tempo de teste (figuras 7a e b). Também essas fotografias feitas por microscópio eletrônico justificam por sua vez o significado da exis- tência da gelatina no corpo moldado poroso.

Também são colocadas soluções que contêm fatores angioge- néticos, no corpo moldado poroso e assim, pelo menos na fase inicial, ainda reforçam o efeito pró-angiogenético.

Além disso, parece possível co-utilizar o corpo moldado poroso como carreador para substâncias farmacêuticas ativas, sem que seu efeito promotor de angiogênese seja com isso impedido.

Claims (28)

1. Substrato promotor de angiogênese, abrangendo um corpo moldado poroso de um material contendo gelatina reabsorvível insolúvel sob condições fisiológicas.

2. Substrato de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material contendo gelatina é um material à base de gelatina e consiste principalmente em frações de gelatina.

3. Substrato de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o material à base de gelatina consiste essencialmente totalmente em gelatina.

4. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 3, caracterizado pelo fato de que a gelatina abrange gelatina de alto peso mo- lecular, particularmente gelatina de toucinho de porco.

5. Substrato de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a gelatina de alto peso molecular apresenta um valor Bloom na faixa de cerca de 160 até cerca de 300 g.

6. Substrato de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracteriza- do pelo fato de que a gelatina apresenta um peso molecular médio maior do que 6 kDa.

7. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 4 até 6, caracterizado pelo fato de que a gelatina apresenta um teor de endotoxina determinado de acordo com o teste LAL1 de 1200 I.E./g ou menos, particu- larmente de 200 I. E./ g ou menos.

8. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 7, caracterizado pelo fato de que o material contendo gelatina apresenta um grau de reticulação predeterminado.

9. Substrato de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a fração de gelatina do material contendo gelatina é reticulado.

10. Substrato de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracteri- zado pelo fato de que o grau de reticulação é de tal forma escolhido, que o material contendo gelatina é decomposto sob condições fisiológicas padrão durante 7 dias até 20 % em peso ou menos.

11. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 8 até -10, caracterizado pelo fato de que o material contendo gelatina é reticulado sob emprego de formaldeído.

12. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 8 até -10, caracterizado pelo fato de que o material contendo gelatina é enzimati- camente reticulado.

13. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até -12, caracterizado pelo fato de que o corpo moldado apresenta uma estrutura de fibra.

14. Substrato de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a estrutura em fibra abrange um tecido ou tricô.

15. Substrato de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a estrutura em fibra abrange um velo.

16. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até -12, caracterizado pelo fato de que o corpo moldado apresenta uma estrutura em esponja.

17. Substrato de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a estrutura em esponja apresenta uma fração de poros a - bertos.

18. Substrato de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a estrutura em esponja é uma estrutura essencialmente de poros abertos.

19. Substrato de acordo com uma das reivindicações 16 até 18, caracterizado pelo fato de que a estrutura em esponja apresenta uma diver- sidade de poros com um tamanho médio de poros de cerca de 50 até 500 μm.

20. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até -19, caracterizado pelo fato de que nos poros do corpo moldado está arma- zenada uma gelatina angiogeneticamente eficaz.

21. Substrato de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a gelatina angiogeneticamente eficaz liberada retardada- mente é armazenada nos corpos moldados.

22. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 21, caracterizado pelo fato de que nos poros do corpo moldado estão arma- zenadas uma ou mais substâncias farmacêuticamente ativas não baseadas em gelatina.

23. Substrato de acordo com uma ou mais das reivindicações de 1 até 22, caracterizado pelo fato de que os poros do corpo moldado são in- festados de células.

24. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 23, caracterizado pelo fato de que o corpo moldado é um material tensoativo.

25. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 23, caracterizado pelo fato de que o corpo moldado apresenta-se como par- tícula na forma de pó.

26. Substrato de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que as partículas na forma de pó são preparadas por trituração de um material esponjoso poroso ou de fibra, particularmente um material de velo ou tecido.

27. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 26, caracterizado pelo fato de que ele é um substrato para a medicina humana.

28. Substrato de acordo com uma das reivindicações de 1 até 26, caracterizado pelo fato de que ele é um substrato para a medicina veterinária.