BRPI0618771A2 - produtos controladores de patógenos - Google Patents

Abstract

PRODUTOS CONTROLADORES DE PATóGENOS. Formulação antibacteriana que compreende: (a) pelo menos um composto de cobre solúvel em água capaz de formar íons de cobre em dissolução em um meio aquoso; (b) pelo menos um agente de amónio solúvel em água capaz de formar íons de amónio em dissolução em um meio aquoso; (c) pelo menos um ácido solúvel em água; e (d) um meio aquoso no qual os componentes (a), (b) e (c) são dissolvidos; a dita formulação tendo (e) um pH ácido e (f) um potencial eletrolítico em excesso de 50 milivolts.

Description

"PRODUTOS CONTROLADORES DE PATOGENOS"

Esta invenção diz respeito a formulações e outros produtos usados no controle de doença patogênica e no comba- te da presença de espécie patogênica provável ou responsável por causar infecção. Bactérias, fungo e virus são classifi- cados neste grupo de organismos patogênicos. É desejável continuar a busca para agentes e desinfetantes antiinfeccio- sos capazes de controlar organismos patogênicos no estado livre (isto é, pode estar presente no ambiente ou redonde- zas) e no estado infeccioso onde o organismo patogênico in- vadiu o corpo do hospedeiro, resultando em sintomas de doen- ça associados com o organismo particular.

Convencionalmente, muitos estados doente atribuí- dos aos organismos patogênicos são tratados com antibióti- cos, tipicamente medicamentos que foram revelados e comerci- alizados para o uso em tratar tal infecção. Na repartição hospitalar, ou ambiente clínico, sala operatória, cirúrgica, ou similares, desinfetantes comercialmente disponíveis são usados como uma medida preventiva para controlar e, em par- ticular, matar ou de outra forma tornar inofensivos patóge- nos tais como bactérias que podem estar presentes nas super- fícies tais como pisos, paredes, depressões, portas simila- res. Existem muitos desinfetantes como estes amplamente dis- poníveis que tendem ser baseados em hidrocarboneto halogena- do/aromático. Outros tipos de substâncias químicas são tam- bém conhecidos.

Desinfetantes comercialmente disponíveis são tam- bém usados em ambientes domésticos e de escritório, por e- xemplo, em casas e/ou escritórios de funcionários da área de saúde. É desejável fornecer um sistema de controle de infec- ção para ambientes hospitalares ou associados.

Entretanto, existem atualmente preocupações com a emergência de cepas patogênicas resistentes a antibiótico, por exemplo: MRSA (Staphylococcus aureus resistente a meti- cilina); VRE (Enferococcus resistente a vancomicina) ; Heli- eobaeter pylori resistente a claritromcina, metronidazol pa- ra identificar apenas alguns. Bactérias resistentes a anti- biótico são problemáticas para tratar com antibióticos con- vencionais em função de tal resistência adquirida. Conse- qüentemente, é desejável fornecer regimes de tratamento e prevenção alternativos sem ser baseados em medicamentos an- tibióticos existentes ou a ser ainda descobertos.

Existem também preocupações com a saúde associadas com desinfetantes halogenados aromáticos, e é similarmente desejável desenvolver agentes desinfetantes e antiinfeccio- sos alternativos não baseados em componentes aromáticos ha- logenados .

Sugeriu-se em nosso pedido publicado anteriormente WO 0//15554 que uma ampla faixa de ions de metais contendo as composições pode ser benéfica no tratamento de organismos patogênicos. Observou-se agora surpreendentemente que uma seleção de composições reveladas no nosso dito pedido ante- rior é usada no combate de organismos patogênicos específi- cos que são resistentes a antibiótico ou de outra forma di- ficultam o tratamento ou controle, e/ou que podem estar pre- sentes em ambientes hospitalares, cirúrgicos, clínicos e em salas operatórias, casas e no ambiente em um regime de tra- tamento sem efeito prejudicial ou deletério significativo em células humanas vivas. Também, observou-se também efeitos benéficos em composições que são similares, mas no entanto diferentes daquelas reveladas em nosso dito pedido anterior. Observou-se também surpreendentemente que um substrato pode ser impregnado com composições aqui descritas, para conferir surpreendentemente propriedades antibacterianas efetivas e de longa duração. Por exemplo, observou-se que um pano de mi- crofibra e/ou ultramicro hoje comercialmente disponível para limpeza de superfícies hospitalares pode ser impregnado com composições aqui descritas e usado como um auxiliar de de- sinfecção de espectro amplo poderoso antibacteriano e/ou an- tifúngico. Também, observou-se que tal pano de microfibra pode ser lavado, ré-impregnado e usado novamente muitas, ve- zes, fornecendo benefícios econômicos significativos.

Inesperadamente, observou-se também que composi- ções contendo cobre ionicamente modificadas aqui descritas podem ser efetivas simultaneamente contra diferentes patóge- nos múltipos, e podem fornecer proteção contra infecção e ré-infecção com tais diferentes organismos patogênicos múl- tiplos .

As composições aqui descritas podem ser aplicadas topicamente a um paciente que sofre de uma infecção, por e- xemplo, aplicação tópica na pele de um paciente para prevenir ou tratar MRSA e/ou VRE.

Desenvolveu-se adicionalmente um sistema de con- trole de infecção baseado na detecção da presença em uma su- perfície ou no ambiente atmosférico de pelo menos um orga- nismo patogênico, preferivelmente, por microensaio fluidico, exibição ou outra apresentação do resultado de detecção, tratamento de espécie patogênica detectada, aplicando à su- perficie ou ao ambiente atmosférico uma ou mais composições do tipo aqui descrito, repetição da etapa de detecção e re- petição da etapa de exibição. Um processo de etapas como es- se pode levar a um sistema sólido de controle de infecção.

As composições podem ser usadas ou aplicadas em uma névoa de aspersão, névoa fina ou 'neblina' para combater espécie patogênica. Em tal pedido, a composição que age como um reagente desinfetante é dissipada em goticulas de água que são em seguida aplicadas como uma aspersão fina ou névoa para cobrir superfícies expostas e/ou encobertas, e entrar nas fendas e rachaduras nos interiores do edifício. Uma vez na superfície, as propriedades desinfetantes do íon de cobre complexado são efetivas e podem permanecer efetivas por um tempo considerável. Vários arranjos de aspersão podem ser usados, e o tamanho das goticulas de água e a concentração da composição aplicada variam. Agentes tensoativos podem ser incluídos nestas composições com tal propósito.

A invenção também diz respeito a composições de detergente que incorporam a presente composição contendo co- bre. Em particular, tais detergentes se tornarão desinfetan- tes e capazes de controlar espécie patogênica tais como bac- térias e bactérias resistentes a medicamento quando usadas para lavar vestimentas usadas pelos funcionários da área de saúde ou outra pessoa em contacto com pacientes que sofrem de uma infecção. Similarmente, tais detergentes desinfetan- tes podem ser usados para lavar vestimenta e roupa de cama de pacientes que sofrem de uma infecção.

As composições descritas a seguir são conveniente- mente preparadas de acordo com o procedimento geral esboçado em nosso pedido de patente referido anteriormente, exceto que a adição de ácido pode em alguns casos ser limitada a obter potencial eletrolitico, começando em uma faixa mais baixa, por exemplo, pelo menos no máximo 150 mVolts, mas al- gumas modalidades sendo menor que 350 mV. Quando ingredien- tes adicionais estão presentes, por exemplo, agentes tensoa- tivos, para ajudar na limpeza de produtos antiinfecciosos, isto está indicado na tabela.

Tabela 1

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Em outras modalidades, uma baixa concentração de cobre é desejável, por exemplo, 80 a 140 g, tal como 90 a 130 g, ou na ordem de 100 a 120 g de sulfato de cobre, dado para as mesmas quantidades para outros componentes. Isto pode ser usado para aplicação tópica e contra infecção H. pylori.

Na tabela anterior, as composições presentes como soluções aquosas contendo cobre nas quais o cobre está pre- sente como ion de metal dissolvido, na presença e potencial- mente combinado com ions de amônio aquoso do agente de amô- nio dissolvido e as composições apresentando potenciais ele- troliticos demonstráveis de pelo menos 150 mV, embora, em al- gumas modalidades preferidas, maior que 300 mV, tal como pe- lo menos 350 mV. Observou-se surpreendentemente que as com- posições supramencionadas podem ser altamente efetivas con- tra dificuldade para tratar cepas bacterianas tais como de cepas persistentes de E. coli com falta simultânea de citoto- xicidade para pelo menos duas diferentes culturas celulares humanas, por exemplo, células humanas HT-29 e U-937, quando aplicadas a uma concentração menor que 100 ppm, por exemplo, 50 ppm, para culturas destas células E. coli. Entretanto, altas concentrações de até 1.000 ppm de cobre equivalente são contempladas em algumas modalidades. Prefere-se que a concentração equivalente de cobre nas composições seja na ordem de 10 a 50 g/litro, preferi- velmente 20 a 40 g/litro, mais pref erivelmente 25 a 35 g/litro, a fase solvente sendo água destilada (e não deioni- zada) ;

Prefere-se que os organismos patogênicos alvos se- jam tratados com composição contendo na faixa de 0,01 a 100 ppm de cobre equivalente, à temperatura ambiente e por uma duração de 1 minuto a 12 horas, ou 1 minuto a 6 horas, ou 0, 25 até 3,0 horas. Entretanto, no caso de tratamentos por aspersão/névoa, o tempo de aplicação pode ser muito pequeno, já que aspersões podem ser em pequenas rajadas.

As presentes composições de cobre podem ser usa- das, por exemplo, em 0,5 a 500 ppm de cobre equivalente, contra Helicobacter pylori (H. pylori) e especialmente con- tra Helicobacter pylori resistentes a medicamento, ambos os quais são a principal causa de úlceras gástrica/péptica. As cepas resistentes especialmente tratáveis pelas presentes composições de cobre são resistentes a claritromcina H. p- ylori, H. pylori resistente a metronidazol e (embora raro) H. pylori resistente a amoxicilina.

As presentes composições de cobre podem ser formu- ladas em formulações tópicas, tais como soluções em cremes, géis, e aspersão que podem ser para aplicação nas superfí- cies da pele e mucosa, curativos impregnados e soluções de irrigação.

As presentes composições de cobre podem ser usadas para impregnar um substrato absorvente usado para limpar su- perficies, de maneira a desinfetar tais superfícies. O subs- trato preferido é chamado pano de microfibra e/ou fibra ul- tramicro (UMF) disponível pela Johnson Diversity, inc. Con- forme prenunciado anteriormente, tais panos de microfibra im- pregnados podem ser lavados e usados novamente muitas vezes. Impregnados, tais panos fornecem um meio fácil de controlar o crescimento e/ou desenvolvimento bacteriano, por exemplo, i- nibindo o crescimento e/ou desenvolvimento bacteriano, por exemplo, inibindo o crescimento e/ou replicação bacteriana, ou pelo menos inibindo a atividade bacteriana de tais bacté- rias. Embora a presente invenção em seu escopo total seja am- pla o bastante para abranger a combinação do substrato de mi- crofibra impregnado com qualquer agente antimicrobiano, a in- venção também inclui a modalidade específica de tal substrato de microfibra impregnado com uma composição de cobre derivada da tabela anterior, ou de outra forma de acordo com composi- ções contendo cobre que se enquadram no escopo desta inven- ção.

Uma vantagem de incorporar os presentes biocidas de íon de metal baseado em cobre no substrato tal como o pano de microfibra ou ultramicrofibra é que eles podem prevenir con- taminação cruzada de superfícies, que é um perigo real sem eles.

Em particular, tal pano de microfibra impregnado pode ser usado para desinfetar superfícies (por exemplo, como em hospitais, ambientes cirúrgicos, clínicas, salas operató- rias) contra a dificuldade para tratar infecções hospitalares nosocomiais MRSA (cepa silvestre), ACCB (cepa silvestre), VRE (cepa silvestre), C. diff (suspensão de esporo), LPn (Legio- nela) da maneira subseqüentemente aqui definida e Salmonela.

As presentes composições e substratos impregnados com este podem fornecer uma inibição de atividade bacteriana muito substancial e significativa, isto é, são capazes de in- terferir e assim controlar o crescimento, desenvolvimento e/ou replicação de tais bactérias patogênicas nosocomiais, até então difíceis de tratar com antibiótico convencional e/ou regimes desinfetantes convencionais. Tal inibição de a- tividade patogênica bacteriana pode ser surpreendentemente efetuada sem citotoxicidade concomitante significativa para células humanas vizinhas prevalescentes.

A invenção está aqui definida nas reivindicações anexas.

A fim de que a invenção possa ser ilustrada, mais facilmente percebida e prontamente realizada pelos versados na tecnologia, modalidades desta serão agora apresentadas a- penas a título de exemplo não limitante, e descritas com re- ferência aos desenhos anexos, em que

A figura 1 é uma curva morte em função do tempo de MRSA a um cobre equivalente de 20 ppm para as composições, o sal de cobre sozinho e os demais componentes da composição (coloquialmente referido aqui como o 'ligante') para compa- ração;

A figura 2 é uma curva morte em função do tempo de MRSA similar à figura 1, mas a 150 ppm de cobre equivalente;

A figura 3 é uma curva morte em função do tempo ACCB similar à figura 1, de 40 ppm; A figura 4 é uma curva morte em função do tempo ACCB similar à figura 3, de 150 ppm;

A figura 5 demonstra os efeitos antibacterianos do meio aquoso X-gel formulado contendo CuAL42 [A] e Purelltm [gl géis para mãos na sobrevivência de bactérias MRSA usando o protocolo EN 12054 padrão;

A figura 6 é um vista similar à a figura 5, mas que demonstra efeitos usando as mesmas formulações mediante a so- brevivência de ACCB;

A figura 7 é um vista similar às figures 5 e 6, mas que demonstra efeitos usando as mesmas formulações medi- ante a sobrevivência de C. diff (esporos);

As figuras 8 A a 8 D são gráficos que representam os efeitos citotóxicos das três formulações de cobre e sul- fato de cobre sozinho [□] mediante células HT - 29 epiteli- ais do intestino humano;

As figuras 9A a 9D são gráficos similares aos das figuras 8A a 8D, mas que mostram os efeitos citotóxicos das três formulações de cobre comparados com sulfato de cobre sozinho [□] mediante células U937 de linfoma monocitico hu- mano;

As figuras 10 a 14 são gráficos que demonstram os efeitos das formulações de cobre exemplificadas relevantes ao exemplo 12 H. pylori, em que AL é usado como uma abrevia- ção para CuAL42, PC para CuPC33, e as concentrações sendo dadas em ppm, onde 0 representa um controle;

A figura 15 mostra as zonas de inibição obtidas com as formulações de cobre exemplificadas codificadas CuAL42 e oito microorganismos bacterianos associados com úlceras de pé diabético;

A figura 16 mostra zonas de inibição similares co- mo na figura 15, mas usando a composição antibacteriana de cobre codificada CuWB50;

As figuras 17 a 19 são representações gráficas que representam curvas de morte em função do tempo das três com- posições de cobre em baixa dosagem (1 ppm) contra uma varie- dade de dificuldade para tratar e/ou bactérias resistente a antibiótico;

A figura 20 mostra a atividade anti - MRSA de re- síduos de gel para mãos, relevantes ao exemplo 13, onde um gel tipo meio aquoso de acordo com a invenção (X-gel) é com- parado com um produto comercialmente disponível;

A figura 21 mostra a desinfecção de panos UMF con- taminados com MRSA (ultra microfibra) relevantes ao exemplo

14, por impregnação com as três composições antibacterianas de cobre formuladas; e

A figura 22 é uma comparação de citotoxicidade de gel para mãos com a linha celular de pele humana A43, com outros produtos relevantes da maneira explicada em exemplo 15.

EXEMPLO 1

Introdução: Três formulações de íon de metal de co- bre codificadas CuAL42, CuPC33 e CuWB50 obtidas de acordo com modalidades 1 a 8 da tabela 1 foram aqui testadas com relação à atividade contra os seguintes organismos alvos: Staphylo- coccus aureus resistente a meticilina (MRSA), Acinetobacter calcoaceticus- baumaníi (ACCB); Enterococcus sp. (VRE resis- tente a vancomicina), esporos de Clostridium difficile, Le- gionella pneumophila.

A concentração de cobre elementar equivalente em cada uma das três soluções estoque de formulação de ion de metal foi 30,43 gramas/litro, antes da diluição com água des- tilada. Cada uma das três soluções estoque de formulações de cobre foi substancialmente diluída com água deionizada e em seguida testada em concentrações finais pós-diluição de 0,25, 0,5 e 1,0 parte por milhão (ppm) de cobre elementar equiva- lente contra microorganismos em crescimento de fase logarit- mica. As mesmas composições foram também testadas a 1 ppm contra microorganismos de fase estacionária.

Abreviações: ACCB, Acinetobacter caleoacetieus- baumaníi, MRSA, Staphylococcus aureus resistente a meticili- na, PBS, solução salina tamponada de fosfato, VRE, Enterocoe- eus sp. (resistente a vancomicina).

Materiais e Métodos: Ágar sangue, caldo nutriente e meio BYCE foram adquiridos da Oxoid Ltd (UK). MRSA, ACCB, e VRE cresceram em cultura pura em ágar sangue e uma colônia única transferida para o caldo nutriente e incubada com agi- tação por seis horas a 37°C. As culturas de caldo das seis horas (células da fase logarítmica) foram em seguida centri- fugadas para depositar as células, o caldo descartado e as células bacterianas lavadas e centrifugadas três vezes usando solução salina tamponada com fosfato a pH 7,2 (PBS). A sus- pensão final foi feita em PBS e a contagem de célula viável ajustada ao inóculo exigido para os experimentos (1,5 x 106). Estas células foram em seguida expostas às formulações de co- bre atualmente exemplificadas em concentrações finais de 0,25, 0,5 e 1,0 ppm.

Amostras destas culturas foram retiradas a 15, 30, 60 e 120 minutos e a contagem viável determinada pela técnica Miles e Misra. Uma cultura de controle de amostras PBS a 15 e 120 minutos foi realizada para assegurar viabilidade e esta- bilidade do inóculo.

Os exemplos anteriores foram repetidos a 1,0 ppm usando células de fase estacionária, tomando células culturas de placa ágar de 24 horas e suspendendo-as diretamente em PBS após uma lavagem de PBS inicial e um inóculo ajustado a 1,5 χ 10^8 células/mL.

Suspensões de esporo de Clostridium difficile fo- ram feitas suspendendo uma cultura do dia cinco do organismo em ágar sangue incubado anaerobicamente em 50:50 álcool- salina. Uma contagem Miles e Misra foi em seguida realizada nesta suspensão para determinar a concentração final de es- poros viáveis e o inóculo finalmente ajustado a 5 χ 406 es- poros/mL para os testes.

Suspensões de Legionella pneumophila foram feitas a partir da cultura do dia cinco em meio BCYE em PBS e a contagem viável usada para ajustar a suspensão a 5 χ 10^6 cé- lulas/mL.

Todas as três formulações de cobre foram testadas com relação a MRSA, ACCB e VRE usando culturas das 6 horas em caldo nutriente como o desafio pela inoculação.

Resultados: Todas as três formulações de cobre Cu- AL42 (Tabela A), CuPC33 (Tabela 2) e CuWB50 (Tabela 3) redu- zem os números bacterianos de um modo dependente da dose. Em uma concentração de 4 ppm, todas as três formulações de co- bre atingiram uma inibição logaritmica em torno de três de MRSA, ACCB e VRE. CuAL42 e CuPC33 deu um inibição logaritmi- ca de dois de esporos Cenoesfera difficile, enquanto CuWB50 deu uma inibição logaritmica de três de esporos C. diffici- le.

CuAL42 e CuWB50 deu uma inibição logaritmica de dois de Legionella pneumophila e CuPC33 deu inibição loga- ritmica em torno de três.

Da maneira mostrada na Tabela 4, o efeito inibitó- rio das três formulações de cobre é similar tanto para a cé- lulas de fase Iog quanto para fase estacionária quando usan- do MRSA, ACCB e VRE.

Nos outros experimentos, as bactérias cresceram em PBS e efeitos bactericidas significativos foram observados. Da maneira mostrada na Tabela 5, MRSA, ACCB e VRE foram me- nos sensíveis aos efeitos bactericidas quando crescem em caldo nutriente, sugerindo que a proteína ou outros compo- nentes estão inibindo a atividade das formulações de cobre. C. difficile e Legionella pneumophila não foram testadas em caldo nutriente devido a dificuldades técnicas de se obter o crescimento bacteriano.

Discussão: os resultados apresentados mostram aqui que todas as três formulações de cobre são altamente bacte- ricidas para bactérias patogênicas a concentrações até 1 ppm. Entretanto, esta atividade é de certa forma neutraliza- da quando as bactérias crescem em caldo nutriente, sugerindo que proteínas ou outros componentes do caldo estão reduzindo a eficácia das formulações de cobre.

De forma interessante, as formulações de cobre fo- ram altamente ativas contra bactérias em crescimento e bacté- rias em fase estacionária, sugerindo um efeito citotóxico nas células bacterianas, em vez de simplesmente um efeito estático.

Mostrou-se que MRSA que cresceu na presença de 0,1 ppm de CuAL42 por 10 dias mata 100 % mediante exposição a 1 ppm de CuAL42.

Tabela A. Curvas de morte em função do tempo com CuAL42 (sulfato de cobre/amônio sulfato/ácido sulfúrico) (a) MRSA (cepa silvestre)

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(b) Acinobacter (cepa silvestre)

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(c) Suspensão de esporo Clostridium difficile <table>table see original document page 17</column></row><table>

(d) cepa silvestre resistente a Vancomicina

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(e) Legionella pneumophila NCTC

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Tabela 2. Curvas de morte em função do tempo com CuWB60 (sulfato de cobre/amônio cloreto/ácido clorídrico)

a) MRSA (cepa silvestre)

<table>table see original document page 17</column></row><table> <table>table see original document page 18</column></row><table>

(b) Acinetobacter (cepa silvestre)

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(c) Suspensão de esporo Clostridium difficile

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(d) Enterococcus (cepa silvestre resistente a Van-comicina)

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(e) Legionella pneumophila NCTC

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Tabela 3. Curvas de morte em função do tempo com CuPC33 (cobre sulfato/ fosfato de amônio/ácido fosfórico)

(a) MRSA (cepa silvestre)

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(b) Acinetobacter (cepa silvestre)

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c) Suspensão de esporo Clostridium difficile

<table>table see original document page 19</column></row><table> d) Enterococcus (cepa silvestre resistente a Van- comicina)

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(e) Legionella pneumophila NCTC

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Tabela 4. Efeito de três formulações de cobre (1 ppm) nas bactérias de fase estacionária.

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Tabela 5. Efeito de três formulações de cobre (1 Dpm) na bactéria que cresceu no caldo nutriente. <table>table see original document page 21</column></row><table>

Inóculo inicial=108 CFU/mL

EXEMPLO 2

Introdução: As mesmas três formulações de ion de metal (cobre) codificadas CuAL42, CuPC33 e CuWB50 obtidas de acordo com modalidades 1 a 8 da tabela 1 foram investigadas com relação a suas propriedades bactericidas quando absorvi- das em um pano ultramicrofibra (UMF) e em seguida usadas pa- ra remover inóculo de alto nivel de bactérias viável (MRSA, ACCB ou C diff) de um superfície hospitalar ambiental comum (superfície plana laminada).

Abreviações: ACCB, Acinetobacter calcoaceticus- baumanii; C diff, Clostridium difficile (esporos) ; MRSA, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina; PBS, solução salina tamponada com fosfato; ppm, partes por milhão; UMF, pano ultramicrofibra.

Materiais e Métodos; Os organismos MRSA, ACCB e C diff (esporos) usados no- estudo foram isolados clínicos.

As superfícies laminadas foram inoculadas com 100 μΙ- de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 2 χ IO6 unidades de formação de colônia (cfu) de MRSA ou ACCB ou 3 χ IO5 esporos/mL de C diff espalhado com um espalhador plano estéril sob uma área de 100 cm2 e secas naturalmente.

Após secagem, a área foi laqueada por contato para assegurar a viabilidade do inóculo.

A área foi em seguida limpa com um UMF umedecido no limite recomendado de umidade com água estéril (controle) ou com a respectiva formulação de cobre a uma concentração final de 75 ppm.

A área foi em seguida novamente laqueada por con- tato para avaliar a remoção do inóculo pelo UMF. 0 UMF foi em seguida ensacolado em um saco com minialça e deixado a temperatura ambiente por 16 horas para simular deslocamento até a lavanderia ou armazenamento estático na ala hospita- lar. Após 16 horas o UMF foi colocado em 100 mL de PBS e a- gitado em um Stomacher (Seward Ltd, UK) por 3 minutos a 250 rpm.

Contagens viáveis foram realizadas no eluente e 10 mL de eluente centrifugado a 3.500 rpm por 10 minutos e o depósito cultivado em ágar sangue.

A contagem de fundo das placas e as contagens de PBS foram testadas com relação a qualquer contaminação ambi- ental. Os resultados mostrados são a média de três corridas separadas.

Resultados: Da maneira mostrada na Tabela 6, a a- plicação de placas de contacto revelou um inóculo pesado vi- ável que foi removido de maneira bastante efetiva pelo UMF. Entretanto, na ausência de formulações de cobre, as bacté- rias permanecem viáveis nos panos UMF. Todas as três formu- lações de cobre mataram 100 % de Acinetobacter e esporos C. difficile e uma produziu uma morte Iog quatro de MRSA. Não houve Acinetobacter recuperável ou bactéria C. difficile dos eluentes Stomacher dos panos impregnados da formulação UMF- Cu.

Discussão: Estes estudos investigaram a capacidade de panos ultramicrofibra limpar superfícies contaminadas com e sem formulações antibacterianas baseadas em cobre. Embora os panos UMF mostrassem ser altamente efetivos na remoção de bactérias das superfícies, a bactérias permanecem viáveis nos panos por pelo menos 16 horas. Quando os panos UMF são pré-tratados com qualquer das três formulações baseadas em cobre, a eficácia da limpeza mudou, mas a sobrevivência bac- teriana nos panos foi completamente prevenida para esporos ACCB e C diff e foi reduzida por log 4 com MRSA. Estes re- sultados mostram que panos UMF são altamente eficazes para limpar superfícies contaminadas, mas o pré-tratamento dos panos com formulações antibacterianas baseadas em cobre, de acordo com exemplos da presente invenção, reduz grandemente sobrevivência destas bactérias patogênicas nos panos, que pode ser de imenso benefício em hospitais e casas.

Tabela 6. Limpeza de superfícies contaminadas com panos UMF com e sem formulações antibacterianas baseadas em cobre.

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* controles para contaminantes ambientais.** con- trole de esterilidade de PBS.

EXEMPLO 3

Introdução: A presença em hospitais de bactérias resistente ao antibiótico tal como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) e Enterococcl resistente a vancomicina, e esporos de Clostridium diff icile que são muito difíceis de destruir é cada vez mais um sério proble- ma. Estes organismos podem também se colonizar em uniformes de enfermeira e isto representa um método pelo qual a bac- térias pode ser espalhada em hospitais e no ambiente geral.

Então, o presente exemplo foi realizado para de- terminar se a formulação de íon de metal baseada em cobre denominada CuWB50 (da maneira aqui definida) já mostrada aqui como ativa contra MRSA, Acinetobacter sp. , E. coli e Clostridium difficile in vitro tem atividade em um sistema de lavagem modelo com e sem detergente biológico Ariel™.

Abreviações: C diff, Clostridium difficile; MRSA, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina; ppm, partes por milhão;

Material e Métodos: Os organismos MRSA e C diff (esporos) usados no estudo foram isolados clínicos. 0 Stoma- cher® 400 Circulator foi adquirido da Seward Ltd (UK).

1. Protocolo de lavagem usando detergente Ariel com ou sem a modalidade de formulação de cobre referido aqui como CuWB50. Retalhos de panos de material para uniforme de enfermagem (100 cm2) foram contaminados com esporos MRSA ou C diff e secos naturalmente a temperatura ambiente por 3 ho- ras. Cada retalho de pano foi adicionado a um saco plástico contendo 20 mL de água com detergente Ariel adicionado à concentração recomendada pelos fabricantes com ou sem 200 ppm de CuWB50. Cada retalho de pano foi processado em um Stomacher circulante por 15 minutos a 240 rpm a temperatura ambiente para simular um ciclo de lavagem de baixa tempera- tura. Após a lavagem, 2 mL do eluente foram misturados com 2 mL de solução de Ringer rico em cálcio para neutralizar qualquer sobra de CuWB50. 0 eluente neutralizado (0,1 mL) foi em seguida espalhado em placas de ágar sangue e incubado por toda a noite a 37 0C no ar (MRSA) ou anaerobicamente (es- poros C diff) quando as colônias foram contadas nas placas duplicadas. 2. O protocolo de lavagem com CuWB50 adicionado ao ciclo de enxágüe. Retalhos de panos de material para unifor- me de enfermagem (100 cm2) foram contaminados com esporos MRSA ou C diff e secos naturalmente a temperatura ambiente por 3 horas. Cada retalho de pano foi adicionado a um saco plástico contendo 20 mL de água e foi em seguida processado em um Stomacher circulante por 15 minutos a 240 rpm a tempe- ratura ambiente para simular um ciclo de lavagem de baixa temperatura. Após o ciclo de lavagem somente de água, a água foi substituída com 20 mL de água contendo 200 ppm de CuWB50 e em seguida processada novamente no Stomacher por 5 minutos para simular um ciclo de enxágüe. 2 mL do eluente foram mis- turados com 2 mL de solução de Ringer rica em cálcio para neutralizar qualquer sobra de CuWB50. O eluente neutralizado (0,1 mL) foi em seguida espalhado nas placas de ágar sangue e incubado por toda a noite a 37°C no ar (MRSA) ou anaero- bicamente (esporos C diff) quando as colônias foram contadas nas placas duplicadas.

Resultados: Da maneira mostrada na Tabela 7, recu- peração após a lavagem de MRSA e C. diff foi reduzida por logs 2-3 em relação aos níveis de inóculo original quando os retalhos de panos de material para uniforme de enfermagem fo- ram lavados apenas com detergente Ariel. Ao contrário, houve uma completa morte log 6 quando a lavagem continha Ariel com 200 ppm de CuWB50.

Quando os retalhos de panos de material para uni- forme de enfermagem foram lavados apenas em água, a recupe- ração após a lavagem de MRSA e C diff foi apenas levemente reduzida para menos que Iog 1 em cada caso da maneira mos- trada na Tabela 8 . Entretanto, após um enxágüe de 5 minutos em água contendo 200 ppm de CuWB50, todos os organismos res- tantes morreram, e nenhuma colônia foi observada.

Discussão: Usou-se um sistema de lavagem modelo com retalhos de panos de material para uniforme de enfermagem contaminados com Staphylococcus aureus resistentes a metici- lina (MRSA) ou esporos Clostridium difficile (C diff) para avaliar os efeitos antimicrobianos de lavagem com detergente biológico Ariel com e sem CuWB50 ou adicionando CuWB50 a um ciclo de enxágüe.

Os resultados mostram que, ao passo que Ariel reduz contaminação bacteriana por Iogs 2-3, CuWB50 é 100 % efetivo em remover/matar bactérias quando adicionado tanto nos ciclos de lavagem quanto de enxágüe.

A adição das formulações de ion de metal baseadas em cobre de acordo com a presente invenção para lavanderia hospitalar e doméstica pode ser um meio econômico e efetivo para esterilizar vestimentas.

Tabela 7. Protocolo de lavagem usando detergente Ariel com ou sem CuWB50.

<table>table see original document page 28</column></row><table> Tabela 8. Protocolo de lavagem com CuWB50 adicio- nado ao ciclo de enxágüe.

<table>table see original document page 29</column></row><table>

EXEMPLO 4

Introdução: úlceras diabéticas representam uma condição médica séria que é difícil de tratar, particular- mente quando infectado com bactérias anaeróbicas ou resis- tentes a antibiótico. Úlceras de pé diabético são freqüente- mente incapacitantes e podem levar a amputação de dedos, pés e até das pernas.

Infecção de úlceras diabéticas ocorre de um modo comum com um ou mais dos seguintes organismos: Staphylococ- cus aureus (MRSA), Pseudomonas aeruginosa, A calcoaceticus- baumanii, Klebsiella pneumonia, Bacteroides fragills, Porph- yromonas asaccharolytica, Finegoldia magna, Peptostreptococ- eus anaerobius [1-3] resistentes a meticilina.

O objetivo do presente exemplo foi determinar se três formulações de íon de metal baseadas em cobre aqui de- finidas denominadas CuAL42, CuPC33 e CuWB50 que mostraram ser ativas contra MRSA, Acinetobacter sp., E. eoli e Clos- tridium difficile terão também atividade contra o organismos relacionados a úlcera diabética listados anteriormente.

Materiais e Métodos: Os organismos usados no estu- do foram isolados clínicos. Os nomes das cepas e os nomes abreviados usados na Tabela 1 são da maneira a seguir: Sta- phylococcus aureus (MRSA), A calcoaceticus-baumanii (ACCB), Pseudomonas aeruginosa (P aerug), Klebsiella pneumoniae,(K pneum), Bacteroides fragilis (B fragills), Porphyromonas a- saccharolytica (P asacch), Finegoldia magna (F magna), Pep- tostreptococcus anaeroblus (P anaerob) resistentes a metici- lina.

Uma suspensão padrão de 0,5 mL MacFarland foi fei- ta de cada um destes organismos em salina isotônica tampona- da. Um esfregão foi mergulhado na suspensão bacteriana e em seguida plaqueada em ágar sangue usando um plaqueador rota- tativo a fim de desenvolver um campo de bactérias nas placas ágar.

Discos de papel contendo várias concentrações de CuAL42, CuPC33 e CuWB50 (calculado como pg de cobre elemen- tar por disco) foram colocados na superfície ágar e as pla- cas incubadas anaerobicamente em um Don Whitley Anaerobic Workstation a 37 0C por 24 horas (bactérias anaeróbicas) ou a 37 0C no ar por 24 horas (bactérias aeróbicas).

Zonas de inibição foram medidas usando calibradores eletrônicos e registradas. Os resultados mostrados na Tabela 9 são de testes feitos em duplicata.

Resultados: Da maneira mostrada na Tabela 9 e nas figuras 15 e 16, todas as três formulações de cobre foram de modo consistente altamente ativas contra todos os 8 microor- ganismos testados nas concentrações acima de 100 pg de cobre elementar. Alguma variabilidade leve foi vista na sensibilida- de de certas bactérias para as 3 diferentes formulações, por exemplo, A ceicoaceticus-baumanii foi mais sensível a CuAL42 e CuPC33 do que CuWB50 a 50 pg, e K pneumoniae foi sensível apenas a CuAL42 a 50 pg.

MRSA, B fragilis e P asaccharolytica foram sensí- veis a todas as três formulações de cobre a 10 pg, a mais baixa concentração testada.

Discussão: Fica claro que concentrações de todas as três formulações de cobre acima de 100 pg de cobre elementar nos discos produziram zonas de inibição significativas para todos os 8 organismos. Estes resultados são consistentes com estudos usando testes de diluição em tubo onde pelo menos 75 pg das formulações de cobre foram exigidas para inibir bacté- rias na presença de caldo nutriente, e também estudos com pa- nos de microfibra onde 7 5 pg de cobre matam completamente bactérias nos panos armazenados. Bactérias tanto aeróbicas quanto anaeróbicas de um modo comum encontradas nas úlceras infectadas em pacientes diabéticos são suscetíveis aos níveis de "100 pg ou mais de cobre, como revelado por amplas zonas de inibição nestes testes de disco. Existem algumas diferenças na atividade com diferentes formulações de cobre e certos or- ganismos, mas estas foram modestas.

Os resultados sugerem que banhos, sabões e géis contendo uma ou mais das formulações de cobre exemplificadas podem ser usados no tratamento de úlceras diabéticas em vir- tude de sua capacidade para matar bactérias que são responsá- veis pela manutenção e espalhamento de úlceras diabéticas, e uma capacidade para acelerar o processo de cicatrização pele. TABELA 9

<table>table see original document page 33</column></row><table> EXEMPLO 5

Introdução: Existe uma pequena evidência atual que os relacionamentos tempo/temperatura recomendados para lavanderia como dado em HSG(95)18 são eficazes para orga- nismos que são de uma preocupação particular em infecção nosocomial. Além do mais, existe um pequeno suporte cienti- fico para estas condições de lavanderia. Conseqüentemente, o presente exemplo foi realizado para definir as condições que levam a redução de roupas de cama contaminadas em condições de lavagem a frio.

Um ciclo de lavagem a frio foi considerado o tes- te mais exigente das formulações antimicrobianas de cobre. Além disto, parece provável que custos de energia cada vez mais altos levarão ao uso de temperaturas de lavagem mais baixas, tanto em lavagem industrial quanto doméstica - par- ticularmente se um produto antimicrobiano suficientemente de fácil uso e econômico que é também "confortável" para os panos puder ser desenvolvido.

Este estudo descreve um estudo de descontaminação de lavanderia usando pano que foi contaminado com microor- ganismos marcadores. Os materiais de teste são uma formula- ção de ion de metal (cobre) denominada CuWB50 e dois deter- gentes de lavagem comercialmente disponíveis (designados A e P) em uma máquina de lavar Electrolux usando uma lavagem de baixa temperatura (18 °C).

Abreviações: ACCB, Acinetobacter sp.; BSA, albu- mina sérica bovina; cfu, Unidades de formação de colônia; MRSA, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina; PBS, solução salina tamponada de fosfato;

Materiais e Métodos: Retalhos de panos comercial- mente disponíveis de pano de uniforme de qualidade hospita- lar típico foram supridos pela Carrington Career & Work we- ar Ltd (UK) . A composição dos retalhos de panos é uma com- binação de poliéster 67 %/algodão 33 % com um peso de pano de 195 g/m2.

Uma máquina de lavar comercial, modernizada com o novo sistema de controle Claris, foi adquirida da Electro- lux. 0 sistema de controle Claris fornece ao pesquisador uma completa flexibilidade para controlar tempo e tempera- tura de cada ciclo de lavagem. 0 sistema Claris também for- nece saída de dados eletrônicos que registram as especifi- cações de cada ciclo de lavagem. 0 Stomacher 400 Circulator foi adquirido pela Seward Ltd (UK).

Os detergentes de lavagem AeP foram adquiridos de um supermercado local. Albumina sérica bovina (BSA) foi adquirida da Sigma-Aldrich. Todos os reagentes microbiológi- cos e placas ágar foram adquiridos da Oxoid Ltd (UK). PBS e BSA foram adquiridos da Sigma.

Os retalhos de panos foram cada qual contaminados com um inóculo de 2 χ IO8 bactérias de isolados clínicos de Staphylococcus A resistentes a meticilina (MRSA) Acineto- bacter sp. Ou multi-resistente (ACCB) em um volume de 2 mL de PBS contendo BSA 7 %. Os retalhos de panos foram secos a temperatura ambiente antes do uso nos estudos de lavagem.

Os retalhos de panos foram anexados à roupa de ca- ma de lastro para dar um peso final de 5 kg por lavagem com água fria a fim de simular uma carga de lavagem normal em 15 litros de água com um tempo de lavagem padrão de 15 minutos. Seis condições de lavagem foram avaliadas em ambas cepas bacterianas: 1. Apenas água; 2. Água + Detergente A; 3.

Água + Detergente P; 4, Água + CuWB50; 5. Água + Detergente A + CuWB5 0; 6. Água + Detergente P + CuWB50. A concentração de CuWB50 foi 100 ppm e um único gélule de detergente A (50 mL) ou detergente P (25 g) foi usado, a menos que de outra forma declarado. No final de cada lavagem 1 litro de água da máquina após a lavagem foi coletado e 100 mL foram centrifu- gados e o precipitado bacteriano testado com relação a uni- dades de formação de colônia (cfu).

Retalhos de panos contaminados lavados (n = 3), controle de retalhos de panos não contaminados (limpos) (n = 2; usados para avaliar a transferência de bactérias de reta- lhos de panos contaminados durante a lavagem), e retalhos de panos contaminados não lavados para dar um medida real de contaminação bacteriana como cfu (ao contrário do inóculo original, controlando assim a perda de viabilidade do orga- nismo durante o período de secagem), foram colocados indi- vidualmente em sacos plásticos com 20 mL de PBS e massagea- dos em um Stomacher por 15 minutos a temperatura ambiente.

Diluições decimais das suspensões bacterianas de Stomacher resultantes e também água da máquina após a Iava- gem foram plaqueadas em placas ágar em duplicata e o número de cfu foi contado após um período incubação de 24 horas a 37 °C.

Resultados: Em cada uma das seguintes Tabelas os resultados são apresentados para (i) retalhos de panos con- taminados de controle = inóculo bacteriano inicial em cfu, (ii) retalhos de panos contaminados após a lavagem= cfu bacteriano restante nos retalhos de panos contaminados após a lavagem, (iii) eluente de máquina após a lavagem = cfu de bactérias livre na água da lavagem no final do ciclo de la- vagem de 15 minutos, e (iv) retalhos de panos limpos após a lavagem = cfu bacteriano em retalhos de panos não contamina- dos após a lavagem (indica transferência bacteriana durante a lavagem).

Os resultados na Tabela 10 mostram que lavagem com água fria produziu uma diminuição modesta no número de cfu nos retalhos de panos contaminados - uma redução Iog 2 com ACCB e uma redução Iog 4 com MRSA. 0 cfu de ACCB e MRSA no eluente de máquina após a lavagem foi similar tanto para bactérias quanto para a transferência de cfu bacteriano para os retalhos de panos limpos foi em torno de Iog 2 maior que o nivel de cfu restante nos retalhos de panos contaminados após a lavagem. Estes resultados indicam que o ciclo de Ia- vagem de 15 minutos com apenas água fria pode desalojar al- gumas bactérias dos retalhos de panos contaminados na água e que algumas destas bactérias livres podem se anexar nos retalhos de panos limpos durante o ciclo de lavagem.

Os resultados na Tabela 11 mostram que uma lavagem com água fria com qualquer detergente produz uma diminuição modesta no número de Acinetobacter cfu nos retalhos de panos contaminados - ligeiramente maior que uma redução log 2 com detergente A e ligeiramente menor que uma redução log 2 com detergente Ρ. O cfu de ACCB no eluente de máquina após a la- vagem foi ligeiramente maior para detergente A que para P, embora o inóculo inicial fosse também ligeiramente maior no exemplo com detergente A. A transferência de cfu bacteriano para os retalhos de panos limpos foi em torno de Iog 2 menor que o nivel de cfu restante nos retalhos de panos contamina- dos após a lavagem. Estes resultados indicam que o ciclo de lavagem de 15 minutos com água fria e detergentes pode desa- lojar alguns Acinetobacter dos retalhos de panos contamina- dos na água e que algumas das bactérias livres podem se ane- xar nos retalhos de panos limpos durante o ciclo de lavagem. Entretanto, os resultados não foram muito diferentes daque- les mostrados na Tabela 10 com apenas água indicando que es- tes detergentes têm pequena atividade antibacteriana contra Acinetobacter.

Os resultados na Tabela 12 mostram que uma lavagem com água fria com ambos detergentes produz um aumento subs- tancial de Iog 5 a 6 no número de cfu de MRSA nos retalhos de panos contaminados, sugerindo que ambos detergentes têm um forte efeito antibacteriano contra MRSA. Os níveis de cfu de MRSA no eluente de máquina após a lavagem e transferida para os retalhos de panos limpos foram muito baixos, supor- tando a vista que os detergentes têm um forte efeito anti- bacteriano com MRSA. Estes resultados indicam que ambos de- tergentes têm um forte efeito antibacteriano em MRSA que não foi observado com Aeinetobaeter (Tabela 11).

os resultados na Tabela 13 mostram que uma lavagem com água fria com CuWB50 sozinho é altamente efetiva na re- dução de contaminação bacteriana em uma ampla faixa de con- centração. Acinetobacter é mais sensível a CuWB50 e morre completamente em concentrações de 100 e 15 ppm. Em concen- trações Cu WB50 de 1 a 10 ppm, existe ainda um considerável efeito antibacteriano com uma redução Iog 3 a 5 de Aeineto- bacter cfu. Em quase todas as concentrações de CuWB50, Aei- netobacter não foi viável para sobreviver no eluente de má- quina ou ser transferido para os retalhos de panos limpos. CuWB50 foi também efetivo contra MRSA produzindo uma morte log 4 a 5 em concentrações de 1 a 100 ppm. Como com Acineto- bacter, poucos cfu de MRSA foram detectados no eluente de máquina ou nos retalhos de panos limpos em qualquer concen- tração de CuWB50. Estes resultados mostram que ambas cepas bacterianas são altamente sensíveis a CuWB50 com Acinetobac- ter sendo de certa forma mais sensível do que MRSA.

Os resultados na Tabela 14 mostram claramente que 100 ppm de CuWB50 combinados tanto com detergente A quanto P levam a morte completa tanto de Aeinetobaeter quanto de MRSA sem nenhum cfu detectável em qualquer das amostras após a lavagem. Os resultados na Tabela 11 mostram que qualquer de- tergente sozinho tem pequeno efeito bactericida em Aeineto- baeter (morte Iog 2), ao passo que o resultado na Tabela 13 mostra que 100 ppm de CuWB50 matam completamente Aeinetobae- ter, que explica o resultado anterior.

Os resultados na Tabela 12 mostram que ambos de- tergentes sozinhos foram bastante efetivos contra MRSA, pro- duzindo uma morte Iog 5, e o resultado na Tabela 13 mostra que CuWB50 é também bastante efetivo contra MRSA (morte Iog 5). Então, o resultado anterior sugere um aditivo efeito dos detergentes com CuWB50 levando a morte completa de MRSA.

Os resultados mostrados na Tabela 15 confirmam a- queles na Tabela 14 mostrando que CuWB50 a 100 pm combinado com detergente A mata completamente tanto Acinetobacter quanto MRSA em condições de lavagem a frio. Além do mais, os resultados na Tabela 15 mostram que detergente A e CuWB50 em concentrações baixas de até 5 ppm são altamente efetivos pa- ra matar ambas bactérias. MRSA também morre completamente por detergente A com CuWB50 a 2 ppm, enquanto Acinetobacter foi menos sensíveis a esta concentração com apenas uma morte log 2. Estes resultados mostram que CuWB50 a concentrações de 5 ppm e superiores combinados com detergente A formam uma potente combinação antibacteriana, mesmo usando uma lavagem de baixa temperatura.

Discussão: 0 efeito de um composto biocida de co- bre, CuWB50, em lavagem com água fria de MRSA ou retalhos de panos contaminados com Aeinetobaeter de pano de uniforme de enfermeira com e sem 2 detergentes de lavagem comerciais foi avaliado usando uma máquina de lavar Electrolux industrial. Lavagem apenas com água fria produziu uma redução log 2-3 em cfu de MRSA e ACCB nos retalhos de panos contaminados (Tabe- la 10), mas as bactérias liberadas foram detectadas na má- quina após a lavagem efluente e nos retalhos de panos esté- reis.

Os dois detergentes comerciais usados sozinhos fo- ram mais efetivos na remoção de MRSA (redução log 5-6 em cfu; Tabela 12) do que em ACCB (redução log 1-2 em cfu; Ta- bela 11) a partir dos retalhos de panos contaminados. Em am- bos casos, bactérias vivas foram detectadas na máquina após a lavagem efluente e nos retalhos de panos estéreis, mas os números de bactérias recuperadas foram reduzidos no caso de MRSA, sugerindo um modesto efeito antibacteriano dos deter- gentes nesta cepa bacteriana. Da maneira mostrada na Tabela 13, CuWB50 sozinho matou ACCB completamente a 100 e 15 ppm e reduziu cfu em Logs 3-4 a concentrações baixas até 1 ppm. CuWB50 sozinho reduziu cfu de MRSA em 4-5 Logs a 1-100 ppm. Em ambos casos, o número de bactérias recuperadas na máquina após a lavagem efluente e nos retalhos de panos estéreis foi substancialmente reduzido indicando um efeito antibacteriano de CuWB50 sozinho na lavagem com água fria mesmo em baixas concentrações.

CuWB50 a 100 ppm combinado com qualquer detergente resultou em uma morte 100 % de ambos ACCB e MRSA nos reta- lhos de panos contaminados, na máquina após a lavagem eflu- ente e nos retalhos de panos estéreis (Tabela 14) . Uma vez que 100 ppm de CuWB50 não foram completamente efetivos sozi- nhos contra MRSA (Tabela 13) e ambos detergentes mostraram alguma variabilidade em sua capacidade de matar MRSA (Tabela 12), existe claramente um efeito aditivo levando a desconta- minação completa com os dois produtos juntos. ACCB foi rela- tivamente resistentes a ambos detergentes sozinhos (Tabela 11), mas foi muito sensível a CuWB50 (Tabela 13), e a combi- nação de CuWB50 com qualquer detergente resultou na morte completa de ACCB.

De fato, a combinação de CuWB50 e detergente A foi muito efetiva em todas as concentrações de CuWB50 (2-100 ppm) contra MRSA e 5-100 ppm de CuWB50 contra ACCB. Em todos

*

os casos, nenhuma bactéria viva foi recuperada na máquina após a lavagem efluente ou nos retalhos de panos estéreis.

Conclusivamente, estes resultados sugerem que a lavagem com água fria de uniformes de enfermeira com deter- gentes sozinho provavelmente é inefetiva na remoção de toda contaminação bacteriana. Uma peguena adição tal como 5-10 ppm de CuWB50 com qualquer detergente usando uma lavagem com água fria resultou em desinfecção completa dos retalhos de panos contaminados de MRSA e ACC e da máquina após a lavagem efluente e dos retalhos de panos estéreis. Uma vez que uma concentração de CuWB50 de 10 ppm foi obtida adicionando ape- nas 5 mL da solução de estoque da composição formulada em uma lavagem de 15 litros e considerando os altos níveis de contaminação bacteriana nos retalhos de panos usados nestes experimentos (em torno de IO8 cfu), os resultados sugerem que adição de CuWB50 nas lavagens de máquina com quantidades normais de detergentes de lavagem comerciais pode reduzir significativamente a contaminação bacteriana em toda lavan- deria hospitalar. Embora esporos C. difficile não fossem testados, seu resultado sugere aqui que esporos C. diffici- le podem também ser efetivamente descontaminados por uma combinação de detergente de CuWB501. Tabela 10. O efeito de lavagem com água fria ape- nas na remoção de Acinetobacter (ACCB) e MRSA dos retalhos de panos contaminados.

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NT = não testado

Tabela 11. O efeito de lavagem com água fria com detergentes A ou P na remoção de Acinetobacter de retalhos de panos contaminados.

<table>table see original document page 44</column></row><table> Tabela 12. O efeito de lavagem com água fria com detergentes A ou P na remoção de MRSA de retalhos de panos contaminados

<table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table>

Tabela 13. O efeito de lavagem com água fria com o formulação antibacteriana de cobre CuWB50 na remoção de Aci- netobacter (ACCB) e MRSA de retalhos de panos contaminados.

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*Todos os resultados são a média de cada set de experimentos (número de de experimentos = n) . Tabela 14. O efeito de lavagem com água fria com CuWB50 (100 ppm) e 2 detergentes (A e P) na remoção de Acine- tobacter (ACCB) e MRSA de retalhos de panos contaminados.

<table>table see original document page 47</column></row><table>

*os resultados mostrados são média de cfu para ex- perimentos em duplicata.

Tabela 15. O efeito de lavagem com água fria com várias concentrações de CuWB50 e detergente A on o remoção de Acinetobacter (ACCB) e MRSA de retalhos de panos conta- minados.

<table>table see original document page 47</column></row><table> <table>table see original document page 48</column></row><table> 0

EXEMPLO 7

Introdução; Uma consideração importante em higie- ne hospitalar é limpeza das mãos. Purell™ (Gojo Industries Inc, USA) , é um gel para mãos baseado em álcool que é nos dias de hoje amplamente usado pelo corpo técnico de enfer- magem em hospitais no UK. A composição de ion de cobre de metal CuAL42 mostrou aqui ter potente atividade biocida contra cinco cepas bacterianas patogênicas comuns. Conse- qüentemente, um gel para mãos sem álcool baseado em Aloe vera e contendo 314 ppm de CuAL42 denominada Xgel foi for- mulado e comparado ao Purell deste exemplo. 0 protocolo u- sado foi baseado em EN (European Norm) 12054 (1997), um procedimento padronizado onde o produto em teste pode pro- duzir uma morte Iog 4 em 60 segundos a fim de obter o pa- drão exigido. Abreviações: ACCB, Acinetobacter sp.; BSA, albu- mina sérica bovina; cfu, Unidades de formação de colônia; MRSA, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina; PBS, solução salina tamponada de fosfato;

Resultados: Da maneira mostrada nas Figuras 5 a 7, no caso de MRSA e ACCB respectivamente, tanto Purell™ quanto Xgel ambos atingiram a morte log 4 exigida em 60 se- gundos. Entretanto, em ambos os casos, Xgel foi considera- velmente mais efetivo do que Purell, em que Xgel matou 100 % de ambas cepas de bactérias. No caso de esporos C. diffi- cile, Purell não foi efetivo, ao passo que Xgel praticamen- te atingiu a morte Iog 4 exigida (3.000 vezes mais morte) em 60 segundos.

Materiais e Métodos: 0 protocolo padrão EN 12054 (1997) foi seguido. Resumidamente, 9 mL do teste de gel pa- ra mãos foi inoculado com 1 mL de suspensão bacteriana e misturado. Alíquotas de mL foram em seguida tomadas a 30 e 60 segundos e misturadas com 9 mL de solução de Ringer por 5 minutos, Uma alíquota foi em seguida tomada e espalhada em um placa de ágar e incubada por toda a noite quando CFUs fo- ram contados.

Discussão: Limpeza das mãos é de maior importância em higiene hospitalar uma vez que bactérias ou seus esporos podem facilmente ser espalhados em torno de hospitais pelo contacto das mãos. Purell™ é um gel para mãos baseado em álcool que é nos dias de hoje amplamente usado pelos funcio- nários da saúde em hospitais UK.

Os resultados dos presentes estudos mostram clara- mente que Xgel, um gel para mãos baseado em Aloe vera que contém 314 ppm CuAL42, é consideravelmente mais efetivo con- tra 3 importantes bactérias patogênicas - MRSA, Aeinetobae- ter sp. e esporos C. difficile - do que Purell™. Com rela- ção a isto, é importante notar que C. difficile tem se tor- nado uma grande ameaça à saúde do paciente do que MRSA e mais pacientes são agora mortos por infecções C.difficile do que MRSA.

Purell™, como todos géis para mãos baseados em ál- cool, é conhecido em uso repetido, prolongado por causar se- cura e rachadura na pele. Ao contrário, Xgel sendo sem álco- ol e tendo uma base de Aloe vera é muito bom para as mãos. Além do mais, estudos preliminares indicam que o residuo de Purell™ deixado para trás quando o álcool foi evaporado po- de ainda suportar crescimento de MRSA e Acinetobacter sp. por pelo menos 3 horas, enquanto residuo de Xgel não permite a sobrevivência de bactérias no todo.

EXEMPLO 8

Registro das Curvas de morte em função do tempo (TK) para MRSA e Acinetobacter sp (ACCB) contra composições de cobre codificadas CuAL42, CuPC33 e CuWB50, seus ligantes de componente e solução de sulfato de cobre

Introdução:

Mostrou-se (ver figuras 17 a 19) que baixas con- centrações destas composições de cobre (CuAL42, CuPC33 e CuWB50) a um ppm atingiram uma morte log três a quatro em um período de duas horas. Realizou-se uma faixa de experimentos morte tempo na concentração bactericida mínima (MSC), deter- minado por métodos de tubo MIC/MBC usando meio RPMI-1460 e também a 150 ppm (como foi usado em uma situação de limpeza ambiental experimental).

Determinações de MIC/MBC

O MIC/MBC para cada composto, ligante relevante e sulfato de cobre foi determinado fazendo concentrações fi- nais de cada variação de 100 ppm até 1 ppm em meio RPMI-1460 (Sigma) e em seguida observado com um inóculo de 2 x 10'5 bactérias por tubo. Todos os tubos foram incubados por toda a noite a 37 °C e o MIC tomado como o primeiro tubo para re- velar nenhuma leitura de crescimento de 1 ppm acima). O MBC foi determinado subcultivando todos os tubos não mostrando crescimento de ágar sangue, incubando por toda a noite a 37 °C e leitura para qualquer crescimento de sobrevivência das colônias. O MBC é tomado como o primeiro tubo a não mostrar crescimento nas placas ágar (leitura da menor concentração para cima).

Curvas de morte em função do tempo

Curvas de morte em função do tempo foram realizadas usando meio RPMI-1460 (Sigma).

MRSA foi testado a 20 ppm e a 150 ppm de cada com- posição, ligante e sulfato de cobre, (referência às figuras 1 e 2) ACCB foi testado a 40 ppm e 150 ppm de cada composição, ligante e sulfato de cobre (referência às figuras 3 e 4). Um crescimento controle para cada experimento consistiu de RPMI- 1460 e apenas o organismo teste.

Cada tubo de reação consistiu de 10 mL de RPMI-1460 contendo a concentração de composição exigida, ligante ou sulfato de cobre e foi semeada com 2 χ 106 organismos e ime- diatamente incubada a 37 C. Alíquotas foram tomadas nos pon- tos 0, 15, 30, 60, 120, 360 e 960 minutos e contagens viáveis realizadas em triplicata usando solução de Ringer em um quar- to de concentração como diluente e neutralizador semeado em ágar sangue incubado por toda a noite a 37°C. Colônias foram contadas e a contagem de sobreviventes expressa como unidades de formação de colônia. Log das contagens de colônias foram colocados em gráfico contra cada ponto do tempo para produzir uma curva TK for cada organismo em cada concentração para ca- da composto, ligante e sulfato de cobre. Uma curva para os controles de crescimento foi colocada em gráfico em cada sé- rie de curvas para comparação de taxa de crescimento. O termo ligante é usado coloquialmente aqui para abranger os compo- nentes presentes nas composições de cobre sem considerar o composto de cobre por si próprio.

Sumário dos resultados

Resultados de determinações de MIC/MBC para MRSA foram 10/20 ppm.

Resultados de determinações MIC/MBC para ACCB foram 20/40 ppm.

Curvas morte tempo

Contra MRSA: A 20 ppm, CuAL42 e CuWB50 atingiram uma morte Iog 4 em 6 horas e uma morte Iog 6 ao mesmo tempo entre 6 e 16 horas. A morte Iog por CuPC33 foi Iog 3 e Iog 6 respectivamente. A 150 ppm, CuAL42 e CuWB50 atingiram uma morte Iog 6 após 60 minutos, CuPC33 após 120 minutos. Todos os ligantes e sulfato de cobre tiveram alguma atividade, mas as bactérias recuperaram.

Contra ACCB: A 40 ppm, todas três composições a- tingiram um 4 morte Iog após 6 horas e um morte Iog 6 entre 6 e 16 horas. A 150 ppm, todas as três composições atingi- ram um morte Iog 6 após 60 minutos. Todos os ligantes e sulfato de cobre tiveram pequena atividade inicial, mas as bactérias recuperaram.

As figuras 1 a 4 anexas mostraram as curvas de crescimento para cada combinação registrada para 0, 15, 30, 60, 120 e 360 minutos e, finalmente, após 960 minutos (26 horas de incubação) .

EXEMPLO 9

Eficácia de descontaminação de um gel para mãos não alcoólico contendo biocida baseada em cobre

Descontaminação da mão por aplicação géis para mãos feitos de propósito é essencial para controle de in- fecção. A maioria dos géis para mãos nos dias de hoje con- tém álcool isopropilico, que confere propriedades biocidas e secagem rápida para o gel. Álcool não é amigo das mãos nem do ambiente, e é absorvido na corrente sangüínea. Fo- ram formulados quatro géis aloe vera não alcoólicos para mãos, três incluindo uma das três biocidas inorgânicas (CuWB50, CuAL42, e CuPC33) contendo em torno de 300 ppm tal como 314 ppm de cobre efetivo, e investigou-se se estas po- dem descontaminar as mãos tão efetivamente como uma prepa- ração comercial. 106 CFU ou MRSA, ou E coli, foram aplica- dos às mãos de voluntários, e impressões de palma/dedo fei- tas imediatamente depois. Um dos quatro géis para mãos foi em seguida esfregado nas mãos, e impressões subseqüentes foram feitas em intervalos marcados. Ao contrário do con- trole de Aloe vera, nenhum MRSA pode ser recuperado tanto do CuAL42 quanto do CuWB50 contendo géis imediatamente após a aplicação, e em todo o tempo depois. MRSA pode ser recu- perado de mãos tratadas com CuPC33 por 15 minutos. Ao con- trário o controle, E coli não pode ser recuperado em qual- quer ponto de tempo das mãos tratadas com CuAL42-contendo gel; desaparecimento completo do organismo foi apenas seme- ado nos últimos pontos de tempo para os outros dois géis. Concluiu-se que CuAL42 contendo gel rapidamente e de manei- ra efetiva erradica organismos viáveis das mãos, e pode o- ferecer uma alternativa mais pessoalmente e ecologicamente aceitável para géis contendo álcool. Resultados são mostra- dos nas figuras 5, 6 e 7.

EXEMPLO 10

Segurança de CuAL42, CuPC33 e CuWB50: estudos dos efeitos citotóxicos nas células humanas vivas em cultura de pano

Fundamentos, alvos e objetivos

Outros exemplos aqui estabeleceram que estas com- posições têm atividade antibacteriana notável, inesperada- mente superior aos componentes individuais. 0 presente e- xemplo exposto para investigar se as propriedades antibac- terianas e tóxicas de CuWB50, CuPC33, e CuAL42 no sentido de patógenos bacterianos estendem-se até as células mamífe- ras (humanas).

Materiais e Métodos As três soluções contendo cobre antimicrobiano CuPC33, CuAL42 e CuWB50 - foram fornecidas e cada uma con- tinha 30,43 g/L de ion de cobre. Uma solução de controle de sulfato de cobre foi feita na mesma concentração em água destilada. Duas linhas celulares humanas foram usadas para este exemplo: HT 29, uma linha celular epitelial intesti- nal, e U937, um linfoma monocitico. Amostras das soluções antibióticas contendo cobre ou sulfato de cobre em várias concentrações no meio completo apropriado foram adicionadas às culturas celulares e as células cultivadas estabelecidas por mais 24 ou 48 horas. Após exame por microscópio, as cé- lulas foram em seguida fixadas e manchadas para determinar quantitativamente citotoxicidade usando um ensaio de citoto- xicidade de sulforodamina (SRB) , desenvolvido e validado pe- lo National Câncer Institute.

A porcentagem de citotoxicidade de CuPC33 (B) , CuAL 4 2 (A), CuWB5 0 (▼) e sulfato de cobre (♦) foi avali- ada usando células HT-29 em pontos de tempo de 24 e 48 ho- ras e em meio contendo 5 % ou 25 % de soro fetal de bezerro (FCS). Todas as culturas de teste foram em triplicata. Re- sultados são mostrados na Figura 8.

A porcentagem de citotoxicidade de CuPC33 (a) , CuAL42 (A), CuWB50 (T) e sulfato de cobre (♦) foi avaliada usando células U937 em pontos de tempo de 24 e 48 horas e em meio contendo 5 % ou 25 % de soro fetal de bezerro (FCS) . Todas as culturas de teste foram em triplo. Os re- sultado estão mostrados na Figura 9.

Resultados Exame por microscópio não revelou nenhum efeito tóxico óbvio das soluções antibacterianas contendo ion de metal de cobre ou sulfato de cobre em concentrações de 1-100 ppm em qualquer linha celular com FCS 5 % ou 25 %. Entre- tanto, a 1.000 ppm, as soluções antibióticas contendo cobre e sulfato de cobre causaram arredondamento de até células HT-29 em meio com FCS 25 %, ao passo que células HT-29 em meio com FCS 5 % mostraram sinais claros de morte celular (arredondamento para cima com citoplasma granular e perda de refratividade). Estes efeitos foram similares em cultu- ras de 24 e 48 horas. HT-29 cresceram igualmente bem em meio com 5 % ou FCS 25 % (ver valores de densidade de con- trole na legenda da Figura 8 e aumentar os resultados de concentração do soro em alguma proteção contra o(s) efei- to(s) citotóxico(s) das soluções antibióticas contendo co- bre. Células U937 cresceram mais bem em meio com FCS 25 % do que em meio com FCS 5 % (ver densidades óticas de con- trole na legenda da Figura 9), mas mostraram padrões simi- lares de citotoxicidade com as soluções antibióticas con- tendo cobre e sulfato de cobre como HT-29.

Os resultados do ensaio SRB confirmam que não houve nenhuma citotoxicidade significativa tanto para célu- las HT 29 (Figura 8) quanto para células U937 (Figura 9) por qualquer das três soluções antibacterianas contendo ion de metal de cobre ou por sulfato de cobre em concentrações de até 100 ppm. Com 1.000 ppm houve de um modo geral cito- toxicidade de 80-100 % por todas as 3 soluções antibacteria- nas contendo cobre tanto em 24 quanto em 48 horas de cultura com ambas linhas celulares. 0 efeito protetor modesto de concentração do soro maior não pode ser distinguido pelo en- saio SRB e enfatiza o valor de avaliação microscópica das células. Sulfato de cobre foi consideravelmente menos tóxico tanto para HT-29 quanto para células U937 em meio contendo FCS 25 % (Figuras 8 e 9, painéis CeD).

Conclusões

As três soluções antibióticas contendo cobre CuPC33, CuAL42 e CuWB50 e sulfato de cobre não foram signi- ficativamente citotóxicos para as 2 diferentes linhas celu- lares humanas em concentrações de 1-100 ppm. Em uma concen- tração de 1.000 ppm todas as 3 soluções antibióticas conten- do cobre foram muito citotóxicas (80-100 %) para ambas li- nhas celulares humanas e este efeito foi apenas modestamente reduzido por maiores níveis de FCS no meio. A 1.000 ppm, sulfato de cobre foi também muito tóxico para ambas linhas celulares embora isto seja substancialmente reduzido pelo aumento da concentração do soro e possa ser visualizado pelo ensaio SRS.

Os resultados sugerem que uma janela de segurança biológica muito grande de toxicidade de todas as três compo- sições de cobre existe no que diz respeito a seu efeito em células bacterianas, em vez de mamíferas (humanas). Esta conclusão é baseada nos efeitos antimicrobianos claros das composições em faixas de concentração de 1 a 100 ppm, em cu- jas concentrações nenhuma citotoxicidade no sentido de li- nhas celulares humanas pode ser detectada.

EXEMPLO 11 A capacidade de CuAL42, CuWB50, e CuPC33 de redu- zir ou eliminar o material biológico bacteriano presente nos panos de limpeza contaminados

Fundamentos, alvos e objetivos

Bactérias são mais freqüentemente removidas das superfícies usando tanto tecnologias baseadas em pano com ondulações molhado proprietário, quanto os mais modernos (e efetivos) panos baseados em microfibra. Panos baseados em ultramicrobfibra (UMF) são particularmente efetivos na remo- ção de bactérias das superfícies duras. Estes panos funcio- nam de forma ideal com água não contendo nenhum detergente. Após o uso no ambiente hospitalar, tais panos representam um perigo biológico, já eles contêm milhões, se não bilhões, de organismos viáveis, pelo menos algumas das quais são conhe- cidas como responsáveis por infecção hospitalar. Uma vez que estes panos f.uncionam de forma ideal quando umedecidos com água, investigou-se se a adição de CuWB50, CuAL42, e CuPC33 à água reduziu ou eliminou a viabilidade destes organismos captados pelos panos.

Materiais e métodos

Superfícies laminadas foram inoculadas com salina tamponada contendo concentrações apropriadas de MRSA, Aci- netobacter, ou esporos Clostridium difficile, espalhadas com um espalhador plano estéril em uma área de 100 centíme- tros quadrados e secas naturalmente. A área foi laqueada por contacto para assegurar deposição satisfatória de orga- nismos patogênicos viáveis vivos. A área foi em seguida limpa com panos ultramicrofibra (UMF), umedecida no limite de umidade recomendado com a respectiva composição de cobre a uma concentração final de 75 ppm. A área foi em seguida laqueada por contacto novamente para avaliar a remoção do inóculo pelo UMF. 0 UMF foi em seguida ensacolado em um sa- co com minialça e deixado a temperatura ambiente por 16 ho- ras para simular deslocamento até a lavanderia. Após 16 ho- ras o UMF foi colocado em 100 mL de tampão de fosfato e agi- tado no Stomacher (um dispositivo projetado para liberar or- ganismos viáveis dos panos e gêneros alimentícios) por 3 minutos a 250 rpm. Contagens bacterianas viáveis foram rea- lizadas no eluente e 10 mL de eluente centrifugado at 3500 rpm por 10 minutos e o depósito cultivado em ágar sangue. A contagem de fundo das placas e as contagens de PBS foram testadas para qualquer contaminação ambiental. Os resulta- dos são apresentados na Tabela 16 a seguir.

Tabela 16

<table>table see original document page 59</column></row><table> <table>table see original document page 60</column></row><table>

Conclusões

Plaqueamento de contacto mostrou um inóculo viá-

vel que foi efetivamente removido pelo UMF. Morte completa foi obtida por todas as três composições de cobre no perio- do de tempo de 16 horas contra Acinetobacter e esporos C. difficile e um quatro de morte Iog (99,99 %) contra MRSA. Bactérias não puderam ser recuperáveis do depósito centri- fugado do eluente dos panos de Acinetobacter ou C. diffici- le UMF-Cu. Este exemplo sugere que todas as três composi- ções de cobre presentes a 75 partes por milhão, são agentes biocida altamente efetivos quando usados em conjunto com tecnologia de limpeza de pano nos dias de hoje sendo avali- ados e implementados através do NHS. Embora outros biocidas (tais como compostos de amônio quaternário, haletos, etc.) sejam igualmente efetivos neste contexto, é provável que o impulso atual no sentido de sua eliminação com relação a razões ambientais criará a necessidade de alternativas mais seguras. Os dados apresentados aqui suportam a premissa de que estas composições de ion de cobre de metal podem ofere- cer uma alternativa como essa.

EXEMPLO 12

Eficácia de cobre antimicrobianos CuAL42 e CuPC33 contra H. pylori

Neste exemplo métodos NCCLS padrões são usados para testar, usando cepas NCTC CagA positivas, NCTC CagA negativa, e ACTC J5 (seqüência de genoma conhecida) . Os i- solados clínicos foram resistentes a metronidazol UKl e re- sistentes claritromcina BI. Um inóculo final de Iog 7 CFU/mL (unidades de formação de colônia per mililitro) foi usado.

No método, uma curva de morte padrão a concentra- ções de 0,5, 1,0, 5,0 e 12 ppm de cada um destes produtos antimicrobianos foi derivada a partir de amostragem a 15, 30, 60 e 120 minutos.

O neutralizador usado foi lactato de Ringer V4. como para quantificação, diluições decimais foram prepara- das e plaqueadas a 100 microlitros. As placas foram incuba- das por 5 dias a 37 0C em uma atmosfera gerada pela Campy- Gen.

Resultados:

Conforme representado nas figuras 10 a 14 do de- senho anexo, o CuAL42 foi mais ativo do que CuPC33. CuAL42 a 5 ppm reduziu a contagem viável por Iogs 5 a 6 por 120 minutos. CuAL42 a 12 ppm reduziu a contagem viável por Iog 5 a 6 em 30 minutos e resultou em nenhum crescimento em 60 a 120 minutos. Nem o estado de cagA nem a resistência a me- tronidazol ou claritromcina pareceu ter qualquer efeito na eficácia das duas composições de ion de cobre de metal.

EXEMPLO 13

Atividade anti MRSA de resíduos de gel para mãos

Métodos: Os géis para mãos foram espalhados nas placas com superfície laminada a 1 mL por 10 cm2 e secos na- turalmente por toda a noite a temperatura ambiente. 0,1 mL de uma suspensão de MRSA em PBS (IO6 CFU/mL) foi cuidadosa- mente espalhada em cada 10 cm2 de área marcada (um quadrado para cada ponto de tempo para cada resíduo de gel para mãos) e seca naturalmente por 10 minutos. Os quadrados ti- veram imediatamente os contactos plaqueados (t = 0 hora) e em seguida em vários pontos de tempo de até 24 horas. As placas de contacto foram incubadas por 24 horas e as unida- des de formação de colônia contadas (CFUs).

Resultados: Da maneira mostrada na figura 20, não houve CFUs em qualquer ponto de tempo no resíduo de Xgel, presumivelmente devido à presença de CuAL42 no resíduo. Ao contrário, CFUs foram detectados em todos os pontos de tem- po de até 3 horas no resíduo de Purell, embora estes dimi- nuam em um modo dependente do tempo, sugerindo que um con- servante ou alguns outros componentes no resíduo tenham uma atividade antibacteriana modesta. Isto não pode ser atribu- ído à presença de álcool no resíduo de Purell, como isto pode ter evaporado durante o período de secagem por toda a noite.

Conclusão: O resíduo de Xgel preveniu sobrevivên- cia e crescimento de MRSA em todos os pontos de tempo, ao passo que o resíduo de Purell suportou a sobrevivência de MRSA por pelo menos 3 horas. Estima-se pelo NHS que 1 litro de Purell sejaé usado por leito por mês. Uma vez que 1 li- tro de Purell contém 70 % de álcool, em seguida em torno de 300 mL de resíduo será depositado em torno de cada leito por mês, e isto pode potencialmente suportar a sobrevivên- cia de MRSA (e resultados preliminares mostraram resultados similares a uma cepa Acinetobacter resistentes a antibióti- co). Ao contrário, resíduo de Xgel não suporta a sobrevi- vência de MRSA (ou resultados preliminares de Aeinetobae- ter) e pode então ajudar a prevenir o crescimento bacteriano e sobrevivência em ambientes da área de saúde.

EXEMPLO 14

Desinfecção de Panos UMF contaminados por MRSA pelas três composições de cobre a 75 ppm

Métodos: MRSA (2 χ 106) em PBS foi espalhado nas placas de superfície laminada (50 cm2) e seco naturalmente por 10 minutos. Um quadrado foi imediatamente limpo com um pano ultramicrofibra (UMF), digerido, plaqueado e as unida- des de formação de colônia (CFUs) foram contadas 24 horas após confirmar que o inóculo foi corrigido e foi totalmente captado pelo pano UMF. As outras placas foram limpas tanto com um UMF de controle umedecido com água quanto com UMFs umedecidos com água contendo 75 ppm das 3 composições de cobre. Estes UMFs contaminados foram colocados em sacos plásticos por 16 horas, em seguida digeridos, plaqueados e CFUs foram contados 24 horas depois.

Resultados: Da maneira mostrada na Figura 21, o controle de inóculo conteve 2 χ IO6 CFUs indicando que os panos UMF captam todas as bactérias MRSA. O pano UMF de controle umedecido apenas com água e armazenado por 16 ho- ras conteve 1 χ 10^6 MRSA, enquanto os panos UMF umedecidos com os três compostos de cobre não contiveram nenhuma bac- téria viva após armazenamento por 16 horas.

Conclusão: Estes resultados demonstram claramente que panos UMF são muito efetivos na remoção de MRSA das su- perfícies laminadas, tal como aqueles usados em hospitais. Entretanto, a sobrevivência das bactérias nos panos UMF é muito boa e a disposição ou lavagem destes panos apresenta uma série de riscos de transmissão de bactérias vivas em qualquer outro lugar. Então, o fato de que os panos UMF u- medecidos com os compostos de cobre não apresentaram nenhu- ma sobrevivência de MRSA após 16 horas é muito importante. Esta descontaminação 100 % efetiva vista com as três compo- sições de cobre pode ser de grande valor em hospitais e ou- tros locais onde bactérias potencialmente perigosas preci- sam ser removidas das superfícies.

EXEMPLO 15

citotoxicidade de gel para mãos para linha celu- lar de pele humana A43

Métodos: A linha celular epitelial escamosa huma- na A431 foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementada com FCS 10 %, bicarbonato de sódio 2 g/L e L-glutamina 2 mM (meio completo), em frascos de cultura de pano de 75 cm2 em um incubador umidificado a 37°C com um C02 5 % na atmosfe- ra do ar. Para os experimentos de citotoxicidade, células A431 foram plaqueadas nos poços de base plana de placas de 96 poços em células 5 χ 10^4 por poço em 200 μL de meio com- pleto e cresceu naturalmente até a confluência. No dia do experimento, o meio de cultura esgotado foi aspirado e substituído com 100 μL de meio completo fresco. Amostras dos géis para mãos foram diluídas em meio completo par do- brar as concentrações mostradas na Figura e 100 μL de cada amostra foram adicionados às células que foram em seguida cultivadas por mais 24 horas. Após exame microscópico, as células foram fixadas e manchadas para determinar quantita- tivamente citotoxicidade d maneira descrita a seguir. 0 en- saio de citotoxicidade de sulforodamina B (SRB) foi desen- volvido e validado pelo National Câncer Institute. Resumi- damente, as células foram lavadas duas vezes com meio RPMI (nenhum FCS) e em seguida fixadas com ácido tricloroacético 10% por 1 hora a 4°C. Após a lavagem duas vezes com água de torneira o células foram manchadas com SRB (0,4% w/v SRB em ácido acético 1%) por 30 minutos a temperatura am- biente. Após lavagem duas vezes com água de torneira a man- cha restante foi dissolvida em base Tris 10 mM e a densida- de ótica (O.D.) dos poços foi medida em um leitor Dynatech Multiplate ELISA a 540 nm. A porcentagem de sobrevivência celular foi calculada dividindo o teste O.C. pelo controle O.D. e multiplicando por 100.

Resultados: Da maneira mostrada na figura 22 ane- xa, base Xgel (gel Aloe vera com goma xantana e ácido cí- trico como agentes espessantes) não tem nenhum efeito sig- nificativo na sobrevivência da célula A431 em qualguer con- centração testada. Xgel é um gel para mãos não alcoólico que consiste em base Xgel com 314 ppm de CuAL42, um biocida ba- seado em cobre; este produto reduziu a sobrevivência celu- lar em torno de 25 % a concentrações mais altas, mas não tem nenhum efeito em baixas concentrações. Etanol 10 % re- duziu sobrevivência de células A431 em torno de 50 %, mas tem um pequeno efeito em concentrações mais baixas. Purell é um gel para mãos baseado em álcool que nos dias de hoje é usado em hospitais para desinfecção das mãos. Purell contém álcool desnaturado 62 % mais miristato de isopropila, propi- Ieno glicol, acetato de tocoferila, amonometil propanol, e eles mataram mais que 95 % das células A431 em uma concen- tração de 10 %, mas têm um pequeno efeito em concentrações mais baixas. Spirigel e Softalind são também géis para mãos contendo álcool, mas enquanto Spirigel tem um perfil simi- lar a Purell, Softalind matam em torno de 50 % das células A431 em uma concentração de apenas 1 %. Entretanto, Softa- Iind contém uma mistura de álcool e propanol desnaturado bem como glicerideos PEG-6 caprilico/cáprico e adipato de diisopropila, que conta presumidamente por seu efeito tóxi- co mais significativamente nas células A431. Nexan é um gel para mãos que contém detergente triclosano plus 0,2 % e ele foi extremamente citotóxico, matando as células A431 em to- das as concentrações testadas. Em altas concentrações '(I) Nexan atualmente dissolvido nas células A431 (observação mi- croscópica), um efeito mais provável por causa do detergen- te. Finalmente, os 2 produtos de limpeza CBC e Activ8 que contêm compostos de amônio quaternário foram também muito citotóxicos para células A431. Em maiores concentrações (*) estes produtos grudaram as células A431 mostras nas placas plásticas (observação microscópica) dando a falsa impressão de que a sobrevivência celular foi melhorada.

Conclusões: Os resultados mostram que os géis pa- ra mãos contendo álcool têm um modesto efeito citotóxico para células A431 epiteliais da pele em cultura. Entretan- to, estes efeitos citotóxicos foram vistos a décimos ou me- nos da concentração na qual estes produtos são usados nas mãos pelo corpo técnico da área de saúde, e é bem documen- tado que Purell, por exemplo, causa secura e rachadura na pele com freqüente uso diário.

Xgel também apresentou citotoxicidade muito modes- ta em concentração normal de décimos, aproximadamente o mesmo efeito como Purell em concentração normal de 1/33, um efeito presumivelmente por causa da presença do biocida Cu- AL42, uma vez que base Xgel não tem nenhum efeito signifi- cativo nas células A431 em qualquer concentração. Estes re- sultados sugerem que Xgel seria melhor para a pele do que Purell; além do mais, outros estudos mostraram que Xgel é consideravelmente mais efetivo para matar MRSA, Acinetobac- ter e esporos Clostridium difficile resistentes a antibió- tico do que Purell. De fato, Purell foi completamente ine- fetivo contra esporos C. difficile e uma vez que esta bac- téria que pode causar diarréia fatal é agora uma maior cau- sa de morte em hospitais do que MRSA, o uso de Xgel em vez de Purell parecerá ser uma escolha lógica.

Nexan contém triclosano 0,2 % e detergente e ele matou células A431 completamente em todas as concentrações testadas. Espantosamente, Nexan é usado como um gel para mãos padrão pelo corpo técnico da área de saúde nos hospi- tais da Itália. Os dois produtos de limpeza CBC e Activ8, que contêm compostos de amônio quaternário como seu ingre- diente ativo, foram também muito citotóxicos para células A431, mas, uma vez que estes produtos são presumivelmente usados por pessoa usando luvas de borracha, eles não causa- riam problemas na pele.

EXEMPLO 16

DETERMINAÇÃO DA SUSCETIBILIDADE DAS TRÊS COMPOSI- ÇÕES DE COBRE

PARA DIFERENTES ESPÉCIES BACTERIANAS ISOLADAS DAS ERUPÇÕES HOSPITALARES.

Alvo: Para determinar a atividade das três composi- ções de cobre em uma faixa de bactérias, tais como Entero- bacteriaceae, Pseudomonads, Staphylococci e Enterococci.

Sumário

Um total de 170 diferentes isolados bacterianos (22 Acinetobacter, 18 Enterobacter, 27 Klebsiella, 26 Ente- rococci, 10 Pseudomonas, 37 Serratia e 45 Staphylococci) fo- ram testados para suscetibilidade das três composições de co- bre usando determinações MIC. Tamanhos da zona variaram de 11-31 mm, não mostrando nenhum padrão de resistência.

Materiais 1) Composições de cobre usadas, da maneira aqui definida e codificadas : CuAL42, CuWB5Ò e CuPC33 derivadas das modalidades 1 a 8 na Tabela 1

2) ágar Isosensitest (ISO Ágar)

5 3) caldo Isosensitest (ISO caldo)

4) Discos de Teste de Suscetibilidade Antimicrobi- ano (OXOID CT0998B)

5) Esfregões estéreis obtidos de lojas

6) Crescimento por toda a noite de culturas bacte- rianas

Método

Discos de teste de suscetibilidade antimicrobiana (OXOID CT0998B) foram saturados com 20 W de cada uma das composições de cobre, secos separadamente em um forno de ar quente por duas horas e armazenados a 4°C.

Culturas bacterianas foram inoculadas no meio a- propriado (ágar nutriente ou MacConkey) e incubadas por toda a noite. 5 colônias isoladas do poço foram tocadas com um laço e inoculadas em 5 mL de caldo Isosensitest. (caldo ISO) . Os caldos foram incubados por toda a noite aerobica- mente a 36 0C -/ + 20 °C. 0 inóculo foi preparado vortexando o caldo por toda a noite e pipetando gotas "x" da cultura por toda a noite a partir de um pipeta Pasteur longa de plástico em caldo ISO 5 mL da maneira a seguir:

Enterobacteriaceael gota

Pseudomonasl gota

Enterococci5 gotas

Staphylococci2 gotas Um esfregão estéril foi mergulhado na suspensão de inóculo vortexada, prensado contra a parede do tubo e rodado para remover excesso de fluido. As placas foram inoculadas usando um plaqueador rotativo. Usando fórceps estéril, os discos foram colocados na placa de modo que eles ficassem em completo contacto com o ágar. Uma vez aplicado, o disco não foi removido.

LEITURA

A zona de inibição foi medida onde o crescimento foi inibido pela composição.

Resultados foram registrados.

A = CuAL42

B = CuWB50

C = CuPC33

Tamanhos da zona dados em mm

Resultados.

Staphylococcus aureus

A B C EMRSA-15 H040220409 E15 Bl 26 22 23 H040220408 E15 B3 27 22 22 H040340351 E15 B3 26 26 26 H061500550 E15 B5 27 25 27 H061500522 E15 B7 31 25 27 H061440332 E15 B1 30 27 27 H061520148 E15 B17 22 22 19 H061520592 E15 B8 24 25 25 Η061780511 E15 B1 20 17 18 Η061780562 E15 B2 30 27 25 Η061880414 E15 B3 20 19 19 Η062040630 E15 B3 24 20 21 EMRSA-16 Η045180281 E16A1 30 28 25 Η04022045 E16 A16 25 22 21 Η053000200 E16 A14 25 22 21 Η055140586 E16A12 23 21 20 HO 60 62 O 616 E16 A16 24 22 20 Η060620609 E16 A2 22 22 23 Η060780341 E16 A11 22 22 19 Η061620087 E16 A7 24 22 20 Η061700478 E16 A29 27 22 19 Η060780344 E16A1 21 21 21 Η060440423 E16A14 23 22 20 Η060200417 E16 A16 20 19 18 EMRSA-I Η043980582 GOS 26 26 26 EMRSA-17 H041940150 S'hampton 26 26 26 H053100245 S'hampton 26 26 25 Irish-I H042280049 Belfast 25 25 25 Η054360295

Irish-2 H052080391

CA-MRSA

H043880199

H060180184

H0452 60142

H044300316

H060640427

H060660187

H054 96027 0

H052320141

MSSAs 55/3488 H051680084 H051760098

H051660517

H051260160

H051640376 H0522 60557 H060940449

Craigavon 25 24 22

Craigavon 27 26 24

STl PVL- 25 24 22

ST5 PVL+ 25 25 25

ST8 PVL+ 27 24 22

ST22 PVL+ 22 19 17

ST30 PVL+ 27 25 24

ST59 PVL+ 24 23 22

ST80 PVL+ 25 25 25

ST88 PVL+ 25 25 25

8 0/81;PVL+ 27 27 26

Distinto 26 25 22

Grupo II 24 24 23 MSSA

Grupo II 24 24 24 MSSA

Grupo II 27 24 25 MSSA

WSS-96 27 27 26

Dis PVL+ 27 25 24

NT PVL+ 26 22 12 Esterococcus faeeium VRE VSE A B C Η062940352 POS NEG 29 28 31 Η062940351 POS NEG 25 22 21 Η0627 60230 POS NEG 32 28 30 Η062920531 POS NEG 27 26 25 Η062940372 POS NEG 26 24 25 Η063000437 NEG POS 27 27 28 Η063000438 NEG POS 27 24 29 Η062740365 30 26 25 Η062980090 31 27 33 Η062940548 32 29 31 Η062940550 28 24 27 Η062940547 29 24 26 HO6294059 28 24 26 Η062940322 30 25 29 Η062980250 30 27 28 Enterococcus faeealis Η0630004390 NEG POS 27 27 28 Η062980583 POS NEG 29 27 29 Η062380292 NEG POS 24 23 26 Η062 960351 30 27 30 Η062 960251 30 28 32 Enterococcus gallinarum Η062980247 29 31 29 Eterobaeter eloaeae Ά B C Η062680089 17 16 20 Η062760216 19 18 19 <table>table see original document page 74</column></row><table> Η061480383 18 17 17

Η061480364 18 18 18

Η061120437 17 15 22

Η061120438 16 15 23

Η061120439 15 16 22 Cepas de rotina

H062840595 12 12 15

H062840614 15 13 17

H062840675 12 13 17

H062860495 14 13 16

H062880408 12 12 17

H062880414 14 13 17

H062880489 12 12 15

H062900312 14 12 11

H062920527 11 13 16

H062920528 11 12 16

H062920529 13 15 17

H062920530 13 14 15

H062920245 15 14 14

H062920257 12 14 14

Pseudomonas aeruginosa cepas fragmentadas HPA86 St Georges Hospital

ABC

H062880427 20 17 25

H062880428 17 17 23

H062680429 17 17 23

H061820407 20 18 24

H061420408 18 16 21 H062500552 21 18 24 H062500553 19 17 23 H053940608 20 17 24 H053940608 20 17 24 H053940609 18 17 23

Serratia marcesens cepas fragmentadas St, Mary's Neonatal Unit

A B C HO 62 8 8 0311 19 17 24 HO 62 8 8 0312 18 18 20 HO 62 8 8 0313 . 20 18 20 H06288 0314 20 18 23 HO 62 8 8 0315 19 18 20 HO 62 8 8 0316 20 18 20 HO 62 8 8 0317 20 22 20 Acinetobacter baumannii A B C A/3009 SE clone 22 20 23 H043260547 SE clone 22 20 22 H061340585 SE clone 18 18 21 A/3214 OXA-23 clone 20 16 22 H044640092 OXA-23 clone 20 20 23 H060800607 OXA-23 clone 19 18 20 H044220140 Cepa NW 21 21 27 H034940173 Cepa T 22 19 20 H052600376 Cepa T 20 19 22 H060560322 Cepa T 21 18 25 3/A/3311 Esporádico 1 17 14 19 <table>table see original document page 77</column></row><table>

CONCLUSÃO

Um total de 170 cepas, 22 Acinetobacters, 18 En terobacters, 27 Klebsiellas, 26 Enterococci, 10 Pseudomo nas, 37 Serratias, e 45 Staphylococci, foi testado contra a três composições de cobre. Não houve nenhuma resistência Os tamanhos da zona variaram de 11-31 mm.

Claims (38)

1. Formulação antibacteriana, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) pelo menos um composto de cobre solúvel em á- gua capaz de formar íons de cobre em dissolução em um meio aquoso; (b) pelo menos um agente de amônio solúvel em água capaz de formar ions de amônio em dissolução em um meio a- quoso; (c) pelo menos um ácido solúvel em água; e (d) um meio aquoso no qual os componentes (a) , (b) e (c) são dissolvidos; a dita formulação tendo (e) um pH ácido e (f) um potencial eletrolitico em excesso de 50 milivolts.

2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que (a) compreende um ou mais sais inorgânicos de cobre, tais como, por exemplo, sulfato de cobre, cloreto de cobre e nitrato de cobre.

3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1 ou -2, CARACTERIZADA pelo fato de que (b) compreende pelo menos um hidróxido ou sal de amônio inorgânico.

4. Formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que (c) com- preende um ou mais ácidos inorgânicos, tais como, por exem- plo, um dentre ácidos clorídrico, sulfúrico, nítrico e fos- fórico.

5. Formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações I a 3, CARACTERIZADA pelo fato de que (c) com- preende um ou mais ácidos selecionados do grupo consistindo em ácido nitrico, ácido maléico, ácido tartárico, ácido acé- tico e ácido lático.

6. Formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, CARACTERIZADA pelo fato de que o meio a- quoso compreende ou consiste essencialmente em água destila- da pura.

7. Formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o valor do pH (e) é menor que 5, preferivelmente menor que 4, mais pre- ferivelmente menor que 3, mais preferivelmente menor que 2,5.

8. Formulação, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o valor de pH (e) é 2 ou me- nos .

9. Formulação, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o va- lor (f) de potencial eletrolítico é de mais de 100 mili- volts, pref erivelmente de mais do que 150 milivolts, mais pref erivelmente de mais do que 200 milivolts, ainda mais pref erivelmente de mais do que 300 milivolts, tal como na faixa de 300 a 400 milivolts.

10. Formulação antibacteriana, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o meio aquoso compreende uma base gel.

11. Formulação, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que a base gel base compreende Aloe vera e um ou mais espessantes.

12. Formulação, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o espessante compreende pelo menos uma goma xantana.

13. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que com- posto de cobre (a) é um sal orgânico e está presente em uma concentração de 25 a 500 ppm, preferivelmente 50 a 400 ppm, mais preferivelmente 100 a 350 ppm.

14. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que essencialmente consiste nos componentes estabelecidos na mesma.

15. Formulação, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que essencialmente consiste nos componentes estabelecidos na mesma separados da possibili- dade de possível presença de quaisquer impurezas indese- jáveis.

16. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de que o composto de cobre (a) é sulfato de cobre cristalino hidrata- do, e o ácido selecionado do grupo consistindo em: ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico, e o agente de amônio (b) compreende um composto de amônio selecionado do grupo consistindo em: sulfato de amônio, cloreto de amônio, e fosfato de amônio.

17. Formulação antibacteriana, de acordo com qual- quer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de ser para uso no controle do crescimento e/ou repro- dução de bactéria.

18. Formulação, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADA pelo fato de que as bactérias são difíceis de tratar ou, de outra maneira, bactérias persistentes.

19. Formulação, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADA pelo fato de que as bactérias são bactérias nosocomiais ou, de outra maneira, bactérias resistentes à droga.

20. Formulação, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADA pelo fato de ser para o uso na preparação de um medicamento para o uso no tratamento de bactéria ou de infecção bacteriana.

21. Formulação, de acordo com a reivindicação 20, CARACTERIZADA pelo fato de que as bactérias são difíceis de tratar ou são bactérias persistentes tais como bactérias no- socomiais ou, de outra maneira, bactérias resistentes à droga.

22. Uso de ma formulação conforme definida em qualquer uma das reivindicações precedentes, CARACTERIZADO pelo fato de ser como uma preparação antibacteriana.

23. Método de tratamento de uma superfície ou de um material compreendendo bactéria, tal como nosocomial ou, de outra maneira, bactéria resistente à droga, CARACTERIZADO pelo fato de compreender a aplicação à referida superfície ou material, uma formulação conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

24. Formulação antibacteriana, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADA pelo fato de estar em combinação com pelo menos um detergente.

25. Composição de detergente, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um ou mais detergentes em conjunção com uma formulação antibacteriana conforme definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 21.

26. Substrato de material, CARACTERIZADO pelo fato de que foi impregnado com pelo menos uma formulação antibac- teriana conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21.

27. Substrato, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ser um material de tecido.

28. Substrato, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ser um material têxtil ou de tecido.

29. Substrato, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ser um material de roupa.

30. Substrato, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ser um material de roupa com mi- crofibra.

31. Substrato, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de ser um material de roupa com mi- crofibra ultra.

32. Formulação antibacteriana, CARACTERIZADA pelo fato de compreender a formulação conforme definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 21 juntamente com um veicu- lo, diluente ou excipiente aceitável seu.

33. Método de desinfecção de uma superfície, CARACTERIZADO pelo fato de compreender aplicar na superfície um substrato de material conforme definido em qualquer uma das reivindicações 23 a 31.

34. Método de lavar um material compreendendo bac- téria, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende sujeitar o material à lavagem usando uma formulação conforme definida na reivindicação 24 ou uma composição de detergente conforme definida na reivindicação 25.

35. Formulação antibacteriana, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 1 a 21, CARACTERIZADO pelo fato de estar na forma de creme, sabão, lavagem, solução spray, solução de curativo, solução de irrigação ou formulação de spray mist.

36. Método de desinfecção de uma superfície, CARACTERIZADO pelo fato de sujeitar a superfície a um spray mist ou fog de uma composição antibacteriana conforme defi- nida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 35.

37. Sistema de controle de infecção bacteriana, CARACTERIZADO pelo fato de que envolve (i) detecção da bac- téria, (ii) apresentação dos resultados detectados, (iii) tratamento da bactéria detectada pela aplicação ou pulveri- zação na superfície de uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 21 ou 35, (iv) repetição da etapa de detecção, e repetição da etapa de apresentação.

38. Sistema de controle de infecção bacteriana, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato d a etapa de detecção (i) ser realizada pelo ensaio micro fluí- dico.