BRPI0618947A2 - antagonistas de ativina-actriia e usos para promover crescimento ósseo - Google Patents

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Abstract

ANTAGONISTAS DE ATIVINA-ACTRIIA E USOS PARA PROMOVER CRESCIMENTO óSSEO Em certos aspectos, a presente invenção fornececomposições e métodos para promover crescimento ásseo e aumentar a densidade óssea.

Description

"ANTAGONISTAS DA ATIVINA-ACTRIIA E USOS PARA PROMOVER CRESCIMENTO ÓSSEO"
PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica o beneficio do Pedido Provi- sório US 60/739.462, depositado em 23 de novembro de 2005, 60/783.322, depositado em 17 de março de 2006 e 60/844.855, depositado em 15 de setembro de 2006, cujos pedidos são aqui incorporados pela referência em suas integras.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Distúrbios ósseos, variando de osteoporose a fratu- ras, representam um conjunto de estados patológicos para os quais há poucos agentes farmacêuticos efetivos. Em vez disto, o tratamento focaliza em intervenções físicas e comportamen- tais, incluindo imobilização, exercícios e mudanças na dieta. Será benéfico ter agentes terapêuticos que promovem o cresci- mento ósseo e aumentam a densidade óssea com o propósito de tratar uma variedade de distúrbios ósseos.
atividades de dois tipos de células, osteoblastos e osteo- blastos, embora condrócitos e células da vasculatura também participem em aspectos críticos destes processos. Do ponto de vista do desenvolvimento, a formação óssea ocorre por meio de dois mecanismos, ossificaçao endocondral e o.ssificação intra- membranosa, com o anterior responsável pela formação óssea longitudinal e o último responsável pela formação de ossos topologicamente chatos, tais como os ossos do crânio. Ossifi- cação endocondral exige a formação e degradação seqüencial de estruturas cartilaginosas nas placas de crescimento que servem
0 crescimento ósseo e a mineralização dependem das como modelos para a formação de osteoblastos, osteoblastos, da vasculatura e da subseqüente mineralização. Durante a os- sificação intramembranosa, o osso é formado diretamente nos tecidos conjuntivos. Ambos os processos exigem a infiltração de osteoblastos e subseqüente deposição da matriz.
Fraturas e outras rupturas estruturais ósseas são cicatrizadas por meio de um processo que, pelo menos superfi- cialmente, remete à seqüência de eventos de desenvolvimento da osteogênese, incluindo a formação de tecido cartilaginoso e subseqüente mineralização. O processo de cicatrização da fratura pode ocorrer de duas maneiras. Cicatrização óssea direta ou primária ocorre sem a formação de calos. A cica- trização óssea indireta ou secundária ocorre com um estágio precursor de calos. A cicatrização primária de fraturas en- volve a reformação de continuidade mecânica através de uma ruptura precisamente localizada. Sob condições adequadas, células reabsorventes ósseas que circundam a ruptura mos- tram uma resposta de reabsorção de tunelamento e estabele- cem rotas para a penetração de vasos sangüíneos e subse- qüente cicatrização. A cicatrização secundária de ossos se- gue um processo de inflamação, suave formação de calos, mi- neralização de calos e remodelagem de calos. No estágio de inflamação, a formação de hematoma e de hemorragia resulta da ruptura de vasos sangüíneos periosteal e endosteal no local da lesão. Células inflamatórias invadem a área. No estágio da suave formação de calos, as células produzem no- vos vasos, fibroblastos, material intracelular e células de suporte, formando tecido de granulação no espaço entre os fragmentos da fratura. A união clinica através da ruptura é estabelecida pelo tecido fibroso ou cartilaginoso (calos suaves). Osteoblastos são formados e medeiam a mineraliza- ção de calos suaves, que, então, são substituídos por ossos lamelares e sujeitos aos processos normais de remodelagem.
Além das fraturas e de outras rupturas físicas da estrutura óssea, a perda de conteúdo mineral ósseo e de massa óssea pode ser ocasionada por uma ampla variedade de condições e pode resultar em significativos problemas médi- cos. Mudanças na massa óssea ocorrem de uma maneira relati- vamente previsível durante a vida de um indivíduo. Até cer- ca de 30 anos, òs ossos tanto de homens quanto de mulheres crescem até sua massa máxima por meio de crescimento linear das placas endocondrais de crescimento e de crescimento ra- dial. Depois de cerca dos 30 anos (para osso trabecular, por exemplo, ossos chatos, tais como a vértebra e pélvis) e dos 40 anos (para osso cortical, por exemplo, ossos longos encontrados nos membros), ocorre lenta perda óssea tanto em homens quanto em mulheres. Em mulheres, uma fase final de perda óssea substancial também ocorre, provavelmente em função de deficiências estrogênio pós-menopausa. Durante esta fase, mulheres podem perder 10 % adicional de massa óssea do osso cortical e 25% do compartimento trabecular. Se a perda óssea progressiva resulta em uma condição pato- lógica, tal como osteoporose, depende enormemente da massa óssea inicial do indivíduo e se há condições exacerbantes.
Algumas vezes, a perda óssea é caracterizada como um desequilíbrio no processo normal de remodelagem óssea. Ossos saudáveis são constantemente sujeitos à remodelagem. A remodelagem começa com a reabsorção de ossos por osteo- blastos. Então, o osso reabsorvido é substituído pelo novo tecido ósseo, que é caracterizado pela formação de coláge- no por osteoblastos, e subseqüente calcificação. Em indiví- duos saudáveis, as taxas de reabsorção e formação são equi- libradas. Osteoporose é uma condição crônica e progressiva marcada por uma mudança na direção da reabsorção, resul- tando em uma diminuição geral da massa óssea e da minera- lização óssea. Em humanos, a osteoporose é precedida por osteopenia clínica "(densidade mineral óssea que é maior do que um desvio padrão, mas menor do que 2,5 desvios padrões abaixo do valor médio para ossos de adultos jovens). Em to- do o mundo, aproximadamente 75 milhões de pessoas estão em risco de osteoporose.
Assim, métodos para controlar o equilíbrio entre a atividade do osteoblasto e do osteoblasto podem ser usa- dos para promover a cicatrização de fraturas e de outros danos aos ossos, bem como o tratamento de distúrbios, tal como osteoporose, associadas com a perda de massa óssea e da mineralização óssea.
Em relação à osteoporose, estrogênio, calcitoni- na, osteocalcina com vitamina K, ou altas doses de cálcio dietético são todos usados como intervenções terapêuticas. Outras abordagens terapêuticas em relação à osteoporose incluem bisfosfonatos, hormônio paratireóide, calcimiméti- cos, estatinas, esteróides anabolizantes, lantânio e sais de estrôncio, e fluoreto de sódio. Entretanto, tais tera- pias são freqüentemente associadas com efeitos colaterais indesej áveis.
Assim, é um objetivo da presente divulgação for- necer composições e métodos para promover o crescimento ósseo e a mineralização.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em porção, a divulgação demonstra que moléculas com atividade de antagonista ativina ou ActRIIa ("antago- nistas' da ativina" e "antagonistas ActRIIa") podem ser u- sadas para aumentar a densidade óssea, promovem o cresci- mento ósseo e/ou aumentam a resistência óssea. Em particu- lar, a divulgação demonstra que uma forma solúvel de Ac- tRIIa age como um inibidor de sinalização ativina-ActRIIa e promove maior densidade óssea, crescimento ósseo e re- sistência óssea in vivo. Embora a maior porção dos agentes farmacêuticos que promovem o crescimento ósseo ou inibem a perda óssea ajam tanto como agentes anticatabólicos (também comumente chamados de "agentes catabólicos") (por exemplo, bisfosfonatos) quanto como agentes anabólicos (por exem- plo, hormônio paratireóide, PTH, quando apropriadamente do- sado), a proteína ActRIIa solúvel apresenta atividade dual, com efeitos tanto catabólicos quanto anabólicos. Assim, a divulgação estabelece que antagonistas da rota de sinaliza- ção ativina-ActRIIa podem ser usados para aumentar a densi- dade óssea e promovem o crescimento ósseo. Embora ActRIIa solúvel possa afetar o osso por meio de um mecanismo dife- rente do antagonismo ativina, contudo, a divulgação demons- tra que agentes terapêuticos desejáveis podem ser selecio- nados na base da atividade de um antagonista ativina- ActRIIa. Portanto, em certas modalidades, a divulgação for- nece métodos para usar antagonistas da ativina-ActRIIa inclu- indo, por exemplo, polipeptideos ActRIIa de ligação de ati- vina, anticorpos anti-ativina, anticorpos anti-ActRIIa, pe- quenas moléculas e aptâmeros alvejados com ativina ou Ac- tRIIa, e ácidos nucléicos que diminuem a expressão de ati- vina e ActRIIa para tratar distúrbios associados com baixa densidade óssea ou Baixa resistência óssea, tal como osteo- porose, ou para promover o crescimento ósseo em pacientes com esta necessidade, tais como em pacientes com uma fratu- ra óssea. Adicionalmente, o polipeptideo ActRIIa solúvel promove o crescimento ósseo sem ocasionar um aumento con- sistentemente mensurável na massa muscular.
Em certos aspectos, a divulgação fornece polipep- tideos compreendendo um polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina solúvel que se liga a ativina. Polipeptideos ActRI- la podem ser formulados como uma preparação farmacêutica que compreende o polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina e um carreador farmaceuticamente aceitável. Preferivelmen- te, o polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina se liga à ativina com um Kd menor do que 1 micromolar ou menor do que 100, 10 ou 1 nanomolar. Opcionalmente, o polipeptideo Ac- tRIIa de ligação de ativina liga seletivamente ativina em funç ão de GDFll e/ou GDF8 e, preferivelmente, com um Kd que é pelo menos 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes menor em rela- ção à ativina do que em relação a GDFll e/ou GDF8. Embora não desejado estar ligado a um mecanismo de ação em parti- cular, espera-se que este grau de seletividade para a ini- bição de ativina durante a inibição de GDF11/GDF8 explique o efeito seletivo no osso sem um efeito consistentemente mensurável no músculo. Em muitas modalidades, um polipeptí- deo ActRIIa será selecionado para ocasionar menos do que 15 %, menos do que 10 % ou menos do que 5 % de aumento no mús- culo em doses que alcançam efeitos desejáveis no osso. Pre- ferivelmente,. a composição é pelo menos 95 % pura em rela- ção a outros componentes do polipeptideo, como avaliado pe- 10 Ia cromatografia de exclusão de tamanho e, mais preferivel- mente, a composição é pelo menos 98 % pura. Um polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina para uso em uma preparação co- mo esta pode ser qualquer um daqueles aqui revelados, tal co- mo um polipeptideo com uma seqüência de aminoácidos selecio- nados de SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ou 12, ou com uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % ou 99 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 ou 13. Um polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina pode incluir um fragmento funcional de um polipeptideo ActRIIa natural, tal como um que compreende pelo menos 10, 20 ou 30 aminoácidos de uma seqüência selecionada de SEQ ID NOs: 1-3 ou uma seqüência de SEQ ID NO: 2, sem os aminoácidos C-terminal 10 a 15 (a "cauda").
Um polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina solú- vel pode incluir uma ou mais alterações na seqüência de ami- noácidos (por exemplo, no domínio de ligação do ligante) em relação a um polipeptideo ActRIIa de ocorrência natural. E- xemplos de polipeptídeos ActRIIa alterados são fornecidos em WO 2006/012627, páginas 59-60, aqui incorporado pela referên- cia. A alteração na seqüência de aminoácidos pode, por exem- plo, alterar a glicosilação do polipeptideo quando produzido em um mamífero, inseto ou outra célula eucariótica ou alterar a clivagem proteolítica do polipeptideo em relação ao poli- peptideo ActRIIa de ocorrência natural.
Um polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina pode ser uma proteína de fusão que tem, como um domínio, um poli- peptideo ActRIIa (por exemplo, uma porção que se liga a Ii- gante de um ActRIIa) e um ou mais domínios adicionais que fornecem uma propriedade desejável, tais como melhor farmaco- cinética, purificação mais fácil, alvejamento a tecidos em particular, etc. Por exemplo, um domínio de uma proteína de fusão pode melhorar uma ou mais da estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção / administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, multimerização da proteína de fusão, e/ou purificação. Uma proteína de fusão ActRIIa de ligação de ativina pode incluir um domínio Fc de imunoglobulina (tipo selvagem ou mutante) ou uma albumina sérica ou outra porção de polipeptideo que for- nece propriedades desejáveis, tais como melhor farmacocinéti- ca, melhor solubilidade ou melhor estabilidade. Em uma moda- lidade preferida, uma fusão ActRIIa-Fc compreende um ligante relativamente não estruturado posicionado entre o domínio Fc e o domínio ActRIIa extracelular. Este ligante não estrutura- do pode corresponder a aproximadamente a região 15 do aminoá- cido não estruturado na extremidade do C-terminal do domínio extracelular de ActRIIa (a "cauda") , ou ele pode ser uma se- qüência artificial de 1, 2, 3, 4 ou 5 aminoácidos ou um com- primento entre 5 e 15, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos que são relativamente sem estrutura secundária, ou uma mistura de ambos. Um ligante pode ser rico em glicina e resíduos de prole e pode, por exemplo, conter uma única seqüência de treonina / serina e glicinas ou seqüências repetidas de treonina / serina e glicinas (por exemplo, singletes ou re- petições de TG4 ou SG4). Uma proteína de fusão pode incluir uma subseqüência de purificação, tais como um epítopo tag, um tag FLAG, uma seqüência de poli-histidina, e uma fusão de GST. Opcionalmente, um polipeptídeo ActRIIa solúvel in- clui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados sele- cionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGui- lado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fra- ção lipídeo, e um aminoácido conjugado a um agente de deri- vatização orgânico. Uma preparação farmacêutica também pode incluir um ou mais compostos adicionais, tal como um .com- posto que é usado para tratar um distúrbio ósseo. Preferi- velmente, uma preparação farmacêutica é substancialmente sem pirogênio. No geral, é preferível que uma Proteína Ac- tRIIa seja expressa em uma linha de célula de mamífero que medeia adequadamente a glicosilação natural da proteína Ac- tRIIa para diminuir a probabilidade de uma imuno resposta desfavorável em um paciente. Linhas de células humanas e CHO foram usadas com sucesso, e espera-se que outros siste- ma comuns de expressão em mamífero sejam usados.
Da maneira descrita, proteínas ActRIIa designadas ActRIIa-Fc (uma forma com um ligante mínimo entre a porção ActRIIa e a porção Fe) têm propriedades desejáveis, inclu- indo ligação seletiva a ativina em relação a GDF8 e/ou GDF11, alta afinidade de ligação a ligante e meia-vida sé- rica maior do que duas semanas em modelos animais. Em cer- tas modalidades, a invenção fornece polipeptídeos ActRIIa- Fc e preparações farmacêuticas compreendendo tais polipep- tídeos e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
Em certos aspectos, a divulgação fornece ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo ActRIIa solúvel de ligação de ativina. Um polinucleotídeo isolado pode compre- ender uma seqüência de codificação para um polipeptídeo Ac- tRIIa solúvel de ligação de ativina, tal como supradescri- to. Por exemplo, um ácido nucléico isolado pode incluir uma codificação de seqüência para um domínio extracelular (por exemplo, domínio de ligação do ligante) de um ActRIIa e uma seqüência que codificará para porção ou todo o domínio transmembrana e/ou o domínio citoplásmico de um ActRIIa, mas para um códon de parada posicionado no domínio trans- membrana ou no domínio citoplásmico, ou posicionado entre o domínio extracelular e o domínio transmembrana ou domí- nio citoplásmico. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado pode compreender seqüência de polinucleotídeo ActRIIa de comprimento integral, tais como SEQ ID NOs: 4 ou 5, ou uma versão parcialmente truncada, o dito polinucleotídeo isola- do compreendendo adicionalmente um códon de terminação de transcrição pelo menos seiscentos nucleotídeos antes do 3'-terminal ou de outra forma posicionado de maneira tal que a tradução do polinucleotideo resulta em um domínio extracelular opcionalmente fundido em uma porção truncada da ActRIIa de comprimento completo. Uma seqüência de ácido nucléico preferida é SEQ ID NO:14. Ácidos nucléicos aqui revelados podem ser ligados operacionalmente a um promotor para expressão, e a divulgação fornece células transforma- das com tais polinucleotídeos recombinantes. Preferivel- mente, a célula é uma célula de mamífero, tal como uma cé- lula de CHO.
Em certos aspectos, a divulgação fornece métodos para preparar um polipeptídeo ActRIIa solúvel de ligação de ativina. Um método como este pode incluir expressar qualquer dos ácidos nucléicos (por exemplo, SEQ ID NOs: 4, 5 ou 14) aqui revelados em uma célula adequada, tal como uma célula de um ovário de hamster chinês (CHO). Um método como este pode compreender: a) fazer cultura de uma célula sob condições adequadas para a expressão do polipeptídeo ActRIIa solúvel, em que a dita célula é transformada com um construção de expressão ActRIIa solúvel; e b) recuperar o polipeptídeo ActRIIa solúvel assim expresso. Polipeptí- deos ActRIIa solúveis podem ser recuperados como frações brutas, parcialmente purificadas ou altamente purificadas. A purificação pode ser alcançada por um série de etapas de purificação, incluindo, por exemplo, um, dois ou três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: cromatografia da proteína A, cromatografia de troca aniônica (por exemplo, sefarose Q) , cromatografia de interação hidrofóbica (por exemplo, fenilsefarose) , cromatografia por exclusão de ta- manho e cromatografia por troca catiônica.
Em certos aspectos, um antagonista ativina- ActRIIa aqui divulgado, tal como um polipeptideo ActRIIa solúvel de ligação de ativina, pode ser usado em um método para promover o crescimento ósseo ou aumentar a densidade óssea em um sujeito. Em certas modalidades, a divulgação fornece métodos para tratar um distúrbio associado com baixa densidade óssea ou para promover o crescimento ósseo em pacientes com estas necessidades. Um método pode com- preender administrar em um sujeito com estas necessidades uma quantidade efetiva de antagonista ativina-ActRIIa. Em certos aspectos, a divulgação fornece usos de antagonista ativina-ActRIIa para preparar um medicamento para o trata- mento de um distúrbio ou condição da maneira descrita.
Em certos aspectos, a divulgação fornece um método para identificar um agente que estimula o crescimento ou a maior mineralização de ossos. O método compreende: a) iden- tificar um agente de teste que se liga a ativina ou a um domínio de ligação a ligante de um polipeptideo ActRIIa; e b) avaliar o efeito do agente no crescimento ou na minera- lização de ossos.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra a purificação de ActRIIa-hFc expressa em células de CHO. A proteína purifica como um ú- nico pico bem definido bem definido.
A Figura 2 mostra a ligação de ActRIIa-hFc em ati- vina e GDF-11, medida pelo Ensaio BiaCore'.
A Figura 3 mostra uma representação esquemática para o Ensaio do gene reportador A-204. A figura mostra o vetor Reportador: pGL3(CAGA)12 (descrito em Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.) 0 tema CAGA 12 está presente nos genes responsivos TGF-Beta (gene PAI-1), então, este vetor é de uso geral para fatores que sinalizam através de Smad 2 e 3.
A Figura 4 mostra os efeitos de ActRIIa-hFc (lo- sangos) e ActRIIa-mFc (quadrados) no GDF-8 que sinaliza no ensaio do gene reportador A-204. Ambas as proteínas exibi- ram inibição substancial de GDF-8 mediado que sinaliza em concentrações picomolares.
A Figura 5 mostra os efeitos de três diferentes preparações de ActRIIa-hFc em GDF-Il que sinaliza no ensaio do gene reportador A-204.
A Figura 6 mostra exemplos de imagens DEXA de ca- mundõngos BALB/c tratados com controle e ActRIIa-mFc, antes (painéis do topo) e depois (painéis da base) do período de tratamento de 12 semanas. Sombreado mais pálido indica mai- or densidade óssea.
A Figura 7 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc na densidade mineral óssea em Camundongos BALB/c durante o período de 12 semanas. Os tratamentos fo- ram controle (losangos), dosagem de 2 mg/kg de ActRIIa-mFc (quadrados), dosagem de 6 mg/kg de ActRIIa-mFc (triângu- los) e dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (círculos).
A Figura 8 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc no conteúdo mineral ósseo em camundongos BALB/c durante o período de 12 semanas. Os tratamentos fo- ram controle (losangos), dosagem de 2 mg/kg de ActRIIa-mFc (quadrados), dosagem de 6 mg/kg de ActRIIa-mFc (triângu- los) e dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (círculos).
A Figura 9 mostra uma quantificação do efeito de ActRIIa-mFc na densidade mineral óssea do osso trabecular em camundongos C57BL6 ovariectomizado (OVX) ou com opera- ção simulada (SHAM) durante um período de 6 semanas. Os tratamentos foram controle (PBS) ou dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (ActRIIa).
A Figura 10 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc no osso trabecular em camundongos C57BL6 o- variectomizados (OVX) durante um período de 12 semanas. Os tratamentos foram de controle (PBS; barras pálidas) ou de do- sagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (ActRIIa; barras escuras).
A Figura 11 mostra uma quantificação dos efeitos de ActRIIa-mFc no osso trabecular camundongos C57BL6 com operação simulada depois do período de 6 ou 12 semanas de tratamento. Os tratamentos foram de controle (PBS; barras desbotadas) ou de dosagem de 10 mg/kg de ActRIIa-mFc (Ac- tRIIa; barras escuras).
A Figura 12 mostra os resultados da análise pQCT de densidade óssea em camundongos ovariectomizados durante 12 semanas de tratamento. Os tratamentos foram de controle (PBS; barras pálidas) ou de ActRIIa-mFc (barras escuras). Eixo geométrico y: mg/ccm.
A Figura 13 representa os resultados da análise pQCT da densidade óssea em camundongos com operação simula- da durante 12 semanas de tratamento. Os tratamentos foram de controle (PBS; barras pálidas) ou de ActRIIa-mFc (barras escuras). Eixo geométrico y; mg/ccm.
As Figuras 14A e 14B mostram a análise DEXA de todo o corpo depois de 12 semanas de tratamento (A) e aná- lise ex vivo de fêmures (B) . As áreas claras representam áreas de alta densidade óssea.
A Figura 15 mostra análise pQCT ex vivo do eixo médio femoral depois de doze semanas de tratamento. Os tratamentos foram veiculo controle (PBS, barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As quatro barras à esquerda mostram a densidade óssea total enquanto que as quatro barras da direita mostram a densidade óssea cortical. 0 primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representa dados dos camundongos ovariectomizados enquanto que o segundo par de barras representa dados dos camundon- gos com operação simulada.
A Figura 16 mostra a análise pQCT ex vivo e con- teúdo ósseo diafiseal do eixo médio femoral depois de doze semanas de tratamento. Os tratamentos foram veiculo con- trole (PBS, barras escuras) ou ActRIIa-mFc (barras páli- das). As quatro barras- da esquerda mostram o conteúdo ós- seo total enquanto que as quatro barras da direita mostram o conteúdo ósseo cortical. 0 primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representa dados dos camundongos ovariectomizados enquanto que o segundo par de barras re- presenta dados dos camundongos com operação simulada.
A Figura 17 mostra análise pQCT ex vivo do eixo médio femoral e dá espessura cortical femoral. Os trata- mentos foram controle (PBS, barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As quatro barras da esquerda mostram a circunferência endosteal enquanto que as quatro barras da direita mostram' a circunferência periosteal. 0 primeiro par de barras em cada conjunto de quatro barras representa dados dos camundongos ovariectomizados enquanto que o se- gundo par de barras representa dados dos camundongos com operação simulada.
A Figura 18 representa os resultados de testes mecânicos dos fêmures depois de doze semanas de tratamen- to. Os tratamentos foram controle (PBS, .barras escuras) e ActRIIa-mFc (barras pálidas). As duas barras da esquerda representam dados dos camundongos ovariectomizados enquanto que as duas últimas barras representam dados dos camundon- gos com operação simulada.
A Figura 19 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc no volume do osso trabecular.
A Figura 20 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc na arquitetura trabecular do fêmur distai.
A Figura 21 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc no osso cortical.
A Figura - 22 mostra os efeitos de ActRIIa-mFc na resistência -mecânica do osso.
A Figura 23 mostra os efeitos de diferentes doses de ActRIIa-mFc nas características ósseas em três diferen- tes dosagens.
A Figura 24 mostra histomorfometria óssea que in- dica que ActRIIa-mFc tem atividade dual anabólica e anti- reabsorvente. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
1. Visão Geral
A superfamília do fator de crescimento de trans- formação beta (TGF-beta) contém uma variedade de fatores de crescimento que compartilham membros de seqüência comuns e temas estruturais. Estas proteínas são conhecidas - por. e- xercer efeitos biológicos em uma grande variedade de tipos de células tanto em vertebrados quanto em invertebrados. Membros da superfamília realizam importantes funções du- rante desenvolvimento embriônico na formação de padrão e na especificação de tecido, e podem influenciar uma varie- dade de processos de diferenciação incluindo adipogênese, miogênese, condrogênese, cardiogênese, hematopoiese, neuro- gênese e diferenciação de célula epitelial. A família é dividida em duas ramificações gerais: a ramificação BMP/GDF e a ramificação TGF-beta/Ativina/ΒΜΡΙΟ, cujos mem- bros têm efeitos diversos, freqüentemente complementares. Pela manipulação da atividade de um elemento da família TGF-beta, freqüentemente, é possível ocasionar signifiça- tivas mudanças psicológicas em um organismo. Por exemplo, as raças bovinas Piedmontese e Belga Azul portam uma muta- ção de perda de função no gene GDF8 (também chamada mios- tatina) que ocasiona um aumento marcado na massa muscular. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(l):71-4. Além do mais, em humanos, alelos inativos de GDF8 são associados com maior massa muscular e, reportadamente, excepcional resis- tência. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8.
Ativinas são fatores de crescimento de polipeptí- deo dimérico que pertencem à superfamília TGF-beta. Há três formas principais de ativina (A, B, e AB) que' são ho- mo/heterodimeros de duas subunidades β intimamente rela- cionadas (βAβΑ, βBβB e βΑβΒ) · O genoma humano também codifi- ca uma ativina C e uma ativina E, que são expressadas pri- mariamente no figado. Na superfamília TGF-beta, ativinas são fatores exclusivos e multifuncionais que podem estimu- lar . a produção hormonal em células ovarianas e placentá- rias, suportar a sobrevivência de célula neuronal, influ- enciar o progresso do ciclo da célula de forma positiva ou negativa dependendo do tipo da célula, e induzir diferen- ciação mesodérmica pelo menos em embriões de anfíbios (De- Paolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med. 198:500-512; Dy- son et al., 1997, Curr Biol. 7:81-84; Woodruff, 1998, Bio- chem Pharmacol. 55:953-963). Além do mais, descobriu-se que o fator de diferenciação de eritróide (EDP) isolado das células 'leucêmicas monocíticas humanas estimuladas é idêntico à ativina A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Sugeriu-se que ativina A age como um regulador natural e positivo de eritropoiese na medula óssea. Em diversos teci- dos, a sinalização de ativina é antagonizada pelo seu hete- rodímero relacionado, inibina. Por exemplo, durante a libe- ração de hormônio estimulante de folículo (FSH) da pituitá- ria, a ativina promove secreção e síntese de FSH, embora a inibina impeça a secreção e síntese de FSH. Outras proteí- nas que podem regular a bioatividade de ativina e/ou se li- gar em ativina incluem folistatina (FS), proteína relacio- nada a folistatina (FSRP) , α-macroglobulina, Cerberus e endoglina.
Sinais TGF-β são mediados por complexos heteromé- ricos de receptores de serina/treonina quinase tipo I e ti- po II, que fosforilam e ativam à jusante proteínas Smad me- diante o estímulo do ligante (Massagué, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178). Estes receptores tipo I e tipo II são proteínas transmembrana compostas por um domínio ex- tracelular de ligação a ligante com região rica em cister- na, um domínio transmembrana e um domínio citoplásmico com especificidade serina / treonina previsível. Receptores ti- po I são essenciais para sinalização e receptores tipo II são exigidos para ligar ligantes e para expressão de recep- tores tipo I. Receptores de ativina tipo I e II formam um complexo estável depois da ligação do ligante, resultando em fosforilação de receptores tipo I pelos receptores tipo II.
Dois receptores tipo II relacionados, ActRIIa e ActRIIb, foram identificados como os receptores tipo II pa- ra ativinas (Mathews and Vale, 1991, Cell 65:973-982; Atti- sano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Além das ativinas, Ac- tRIIa e ActRIIb podem interagir bioquimicamente com diversas outras proteínas da família TGF-β, incluindo BMP7, Nodal, GDF8 e GDFll (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol. 130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7:949- 957; Oh et al., 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 é o re- ceptor tipo I primário para ativinas, particularmente para ativina A, e ALK-7 também pode servir como um receptor para ativinas, particularmente, para a ativina B. Como foi aqui demonstrado, um polipeptideo ActRI- Ia solúvel (sActRIIa), que mostra substancial preferência na ligação em ativina A em oposição a outros membros da fa- mília TGF-beta, tal como GDF8 ou GDF11, é efetivo para pro- mover o crescimento ósseo e aumenta a densidade óssea in vivo. Embora não desejando ficar ligado a nenhum mecanismo em particular, espera-se que o efeito de sActRIIa seja oca- sionado, primariamente, pelo efeito de antagonista de ati- vina, dada a ligação de ativina muito forte (constante de dissociação picomolar) exibida pela construção sActRIIa em particular usada nestes estudos. Independente do mecanismo fica aparente pelos dados aqui apresentados que antagonis- tas da ativina ActRIIa aumenta densidade óssea em camundon- gos normais e em modelos de camundongos para osteoporose. Deve-se notar que osso é um tecido dinâmico, com crescimen- to ou contração e aumenta ou diminui densidade dependendo de um equilíbrio de fatores que produzem osso e estimulam mineralização (primariamente osteoblastos) e fatores que destroem e desmineralizam o osso (primariamente osteoblas- tos). Crescimento e mineralização óssea podem ser aumenta- dos, aumentando-se os fatores produtivos, diminuindo os fa- tores destrutivos, ou ambos. Os termos "promovem crescimen- to ósseo" e "aumenta mineralização óssea" referem-se às mu- danças físicas observáveis no osso e devem ser neutras como para o mecanismo pelo qual ocorrem mudanças no osso.
Os modelos de camundongos para osteoporose e crescimento/densidade óssea que foram usados nos estudos aqui descritos devem ser altamente previsíveis de eficácia em humanos e, portanto, esta divulgação fornece métodos pa- ra usar polipeptideos ActRIIa e outra antagonistas de ati- vina ActRIIa para promover crescimento ósseo e aumenta den- sidade óssea em humanos. Antagonistas da ativina-ActRIIa incluem, por exemplo, polipeptideos ActRIIa solúveis em li- gação de ativina, anticorpos que ligam a ativina (particu- larmente as subunidades ativina A ou B, também referida co- mo OA ou OB) e interrompem ligação de ActRIIa, anticorpos que ligam a ActRIIa e interrompem ligação de ativina, pro- teinas não anticorpo selecionadas para ligação de ativina ou ActRIIa (ver por exemplo, W0/2002/088171, WO/2006/055689, W0/2002/032925, W012005/037989, US 2003/0133939, e US 2005/0238646 para exemplos de tais pro- teínas e métodos para projeto e seleção do mesmo), peptí- deos randomizados selecionados para ligação de ativina ou ActRIIa, freqüentemente afixados a um domínio Fe. Duas di- ferente proteínas (ou outras frações) com atividade de li- gação de ativina ou ActRIIa, especialmente ligantes de ati- vina que bloqueiam o tipo I (por exemplo, um solúvel tipo I receptor de ativina) e tipo II (por exemplo, um receptor de ativina tipo II solúvel) sítios de ligação, respectivamen- te, podem ser ligados juntos para criar uma molécula de li- gação bifuncional. Aptâmeros de ácido nucléico, pequenas moléculas e outros agentes que inibem o eixo de sinalização de ativina-ActRIIa. Várias proteínas têm atividade do anta- gonista de ativina ActRIIa, incluindo inibina (isto é, su- bunidade alfa inibina), embora inibina não antagonize uni- versalmente ativina em todos os tecidos, folistatina (por exemplo, folistatina-288 e folistatina-315), Cerberus, FSRP, endoglina, ativina C, alfa(2)-macroglobulina, e um mutante ativina A M108A (metionina para alanina muda na po- sição 108). Geralmente, formas alternativas de ativina, particularmente aquelas com alterações no domínio de liga- ção do receptor tipo I podem se ligar aos receptores tipo II e falta formar um complexo ternário ativo, agindo .assim como antagonistas. Adicionalmente, ácidos nucléicos, tais como moléculas anti-sentido, siRNAs ou ribozima que inibem ativina A, B, C ou E, ou, particularmente, expressão ActRI- Ia, podem ser usados como antagonistas da ativina-ActRIIa.
Preferivelmente, o antagonista ativina-ActRIIa a ser usado apresentará seletividade para inibir sinalização mediada por ativina em função de outros membros da família TGF-beta, e particularmente com relação a GDF8 e GDFl I. Proteínas Ac- tRIIb solúveis ligam a ativina, entretanto, o proteína tipo selvagem não apresenta seletividade significativa na liga- ção com ativina em função de GDF8/11, e preliminarmente ex- perimentos sugerem que esta proteína não fornece os efeitos desejados no osso, ao passo que também causam crescimento muscular substancial. Entretanto, formas alteradas de Ac- tRIIb com propriedades de ligação diferentes foram identi- ficadas (ver, por exemplo, WO 2006/012627, pp. 55-59, aqui incorporado pela referência) e estas proteínas podem atin- gir os efeitos desejados no osso. ActRIIb nativo ou altera- do pode-ser dado, especificidade adicional para ativina a- coplando com um segundo agente de ligação seletiva de ativina. Os termos usados nesta especificação geralmente têm seu significado ordinário na tecnologia, no contexto desta invenção e no contexto especifico onde cada termo é usado. Certos termos são discutidos a seguir ou em outro lugar na especificação, para fornecer diretriz adicional ao técnico habilitado na descrição de composições e métodos da invenção e como fazê-las e usá-las. 0 escopo ou significado de qualquer uso de um termo ficará aparente a partir do contexto especifico no qual o termo é usado.
"A cerca de" e "aproximadamente" geralmente sig- nificará um grau de erro aceitável para a quantidade medida dado a natureza ou precisão das medições. Tipicamente, graus exemplares de erro estão em 20 porcento (%), preferi- velmente em 10 %, e mais preferivelmente em 5 % de um dado valor ou faixa de valores.
Alternativamente, e de modo particular em siste- mas biológicos, os termos "a cerca de" e "aproximadamente" podem significar valores que são em uma ordem de magnitude, preferivelmente em 5-vezes e mais pref erivelmente em 2- vezes de um dado valor. Quantidades numéricas dadas aqui são aproximadas a menos que de outra forma declarado, sig- nifica que o termo "a cerca de" ou "aproximadamente" pode ser inferido quando não expressamente declarado.
Os métodos da invenção podem incluir etapas de comparar seqüências entre si, incluindo seqüência tipo sel- vagem com um ou mais mutantes (variantes da seqüência). Tais comparações tipicamente compreendem alinhamentos de seqüências de polímero, por exemplo, usando programas de alinhamento de seqüência e/ou algoritimos que são bem co- nhecidos na tecnologia (por exemplo, BLAST, FASTA e MEGALIGN, para citar alguns). Os versados na tecnologia po- dem perceber facilmente que, em tais alinhamentos, onde uma mutação contém uma inserção ou deleção de resíduo, o ali- nhamento da seqüência introduzirá um "gap" (tipicamente re- presentado por um traço, ou "A") na seqüência de polímero não contendo o resíduo inserido ou deletado.
"Homólogo," em todas as suas formas gramaticais e variações ortográficas, refere-se ao relacionamento entre duas proteínas que possuem uma "origem evolucionária co- mum, " incluindo as proteínas das superfamílias na mesma espécie de organismo, bem como proteínas homólogas a par- tir de diferente espécie de organismo. Tais proteínas (e seus ácidos nucléicos de codificação) têm homologia de se- qüência, como refletido por sua similaridade de seqüência, quer em termos de percentual de identidade ou pela presen- ça de resíduos específicos ou motivos e posições conserva- das .
O termo "similaridade de seqüência," em todas su- as formas gramaticais, refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre seqüências de ácido nucléico ou ami- noácido que podem ou não compartilhar, uma origem evolucio- nária comum.
Entretanto, no uso comum e no presente pedido, o termo "homólogo," quando modificado com um advérbio tal como "altamente," pode. referir-se a similaridade de se- qüência e pode ou não relacionar-se a uma origem evolucio- nária comum.
2. Polipeptídeos ActRIIa
Em certos aspectos, a presente invenção diz res- peito a polipeptídeos ActRIIa. Da maneira aqui usada, o termo "ActRIIa" refere-se a um família de proteínas do re- ceptor de ativina tipo IIa (ActRIIa) a partir de qualquer espécie e variantes derivados de tal proteínas ActRIIa por mutagênese ou outra modificação. Entende-se aqui, que re- ferência a ActRIIa pode ser uma referência a qualquer uma das formas atualmente identificadas. Membros da família ActRIIa são geralmente proteínas transmembrana, compostas de um domínio extracelular de ligação ao ligante com uma região rica em cisteína, um domínio transmembrana, e um domínio citoplásmico com atividade prevista seri- na/treonina quinase.
O termo "polipeptídeo ActRIIa" inclui polipeptí- deos compreendendo qualquer polipeptídeo de ocorrência na- tural de um membro da família ActRIIa bem como qualquer va- riantes destes (incluindo mutantes, fragmentos, fusões, e formas peptidomiméticas) que retêm uma atividade usada. Por exemplo, polipeptídeos ActRIIa incluem polipeptídeos derivados da seqüência de qualquer ActRIIa conhecido tendo uma seqüência pelo menos cerca de 80 % idêntica à seqüên- cia de um polipeptídeo ActRIIa, e preferivelmente pelo me- nos 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % ou maior identidade. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa da invenção pode ligar e inibir a função de uma proteína ActRIIa e/ou ativina. Pre- ferivelmente, um polipeptídeo ActRIIa promove o crescimen- to ósseo e mineralização óssea. Exemplos de polipeptideos ActRIIa incluem polipeptideo precursor de ActRIIa humano (SEQ ID NO: 1) e polipeptideos de ActRIIa humano solúvel (por exemplo, SEQ ID NOs: 2, 3, 7 e 12).
A seqüência de proteína precursora de ActRIIa hu- mano é da maneira a seguir:
MGAAAKLAFAVFLISCSS GAILGRSETQECLFFNANWEKDRTN QTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCY DRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNP
VTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVL VPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEY VAVKIF PIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIG AEKRGT S VD VDLWLITAFHEKGSLS DFLKAN VVSWNELCHIAE TMARGLA YLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLA LKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDM. Y AMGL VL WELAS RCT AADG PVD EYML PFEEEIGQHPSLE DMQE W VHKKKR P VL RDY WQKHAGMAML CETIEECWDH DAEARL SAG CVGERITQMQRLTNIITTEDIVT WTMVTN VDFPPKESSL (SEQ ID NO: 1)
0 peptídeo de sinal é sublinhado uma vez; o domí- nio extraeelular está em negrito e os sítios de glicosila- ção N-Iigados potencial são sublinhados duas vezes.
A seqüência de polipeptideo AetRIIa humano solú- vel (extraeelular), processada é da maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT WKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE GNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP (SEQ ID NO: 2)
A "Calda C-terminal" do domínio extraeelular é sublinhada. A seqüência com a "calda" deletada (uma se- qüência Δ15) é da maneira a seguir:
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFAT WKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCE GNMCNEKFSYFPEM (SEQ ID NO:3)
A seqüência de ácido nucléico que codifica prote- ína precursora de ActRIIa humano é da maneira a seguir (nu- cleotídeos 164-1705 de Genbank entry NM 001616):
ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCT.CCTGTTCTT CAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGC TAATTGGGAAAAAGACAGAACCmATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGT GACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTT CCATTGAAATAGTGAMCAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGA CAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGC TGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAG TCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCCTATTACAACAT CCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGT GCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTC CAACTCAAGACCCÀGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACC ACTGCAGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAA GCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACA AACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCA TGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGAT GTGGATCTTTGGCTGATCACAGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACT TTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAAC CATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGAT ' GGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGT
TGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATT
TGAGGCTGGCAAGTCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGG
TACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCAT
TTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTC
TCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATÁCATGTTGCCATTTGAG
GAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAÃGTTGTTGTGC '
ATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAAT
GGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGAAGCC
AGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAA
CAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGAGAAA·
TGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA (SEQ ED NO: 4)
A seqüência de ácido nucléico que codifica um po- lipeptideo ActRIIa humano solúvel (extracelular) é da ma- neira a seguir: ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGG AAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGA TAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAA ATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTG ATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGG CAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAG CCCACTTCAAATCCAGTTACACCTAAGCCACCC (SEQ ID NO: 5)
Em uma modalidade específica, a invenção diz res- peito a polipeptídeos ActRIIa solúveis. Da maneira descri- ta, o termo "Polipeptídeo ActRIIa solúvel" geralmente re- fere-se a polipeptídeos compreendendo um domínio extracelu- Iar de uma proteína ActRIIa. 0 termo "polipeptídeo ActRIIa solúvel", da maneira aqui usada, inclui qualquer domínio extracelular de ocorrência natural, de uma proteína ActRI- Ia bem como qualquer variantes destes (incluindo mutantes, fragmentos e formas peptidomimétieas). Um polipeptídeo Ac- tRIIa de ligação de ativina é um que retém a capacidade de ligar a ativina, particularmente ativina AA, AB ou BB. Preferivelmente, um polipeptídeo ActRIIa de ligação de a- tivina ligará a ativina AA com uma constante de dissocia- ção de 1 nM ou menos. Seqüências de aminoácido de proteína precursora de ActRIIa humano é fornecida a seguir. 0 domí- nio extracelular de uma proteína ActRIIa se liga a ativina e é geralmente solúvel, e pode assim ser denominada um po- lipeptídeo ActRIIa solúvel de ligação de ativina. Exemplos de polipeptídeos ActRIIa de ligação de ativina solúvel, incluem o polipeptídeo solúvel ilustrado em SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 e 13. SEQ ID NO:7 é referido como ActRIIa-hFc, e é descrito adicionalmente nos Exemplos. Outros exemplos de po- lipeptídeos ActRIIa solúvel de ligação de ativina compreen- dem uma seqüência de sinal além do domínio extracelular de uma proteína ActRIIa, por exemplo, a seqüência líder de meli- tina abelha (SEQ ID NO: 8), o líder ativador plasminogênio de tecido (TPA) (SEQ ID NO: 9) ou o líder ActRIIa nativo (SEQ ID NO: 10). O polipeptídeo ActRIIa-hFc ilustrado em SEQ ID NO:13 usa um líder TPA.
Fragmentos funcionalmente ativos de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidos selecionando polipeptídeos produzi- dos recombinantemente a partir do fragmento correspondente do ácido nucléico que codifica um polipeptídeo ActRIIa. Além disso, fragmentos podem ser quimicamente sintetizados usando técnicas conhecidas na tecnologia tal como química f-Moo ou t-Boc de fase sólida Merrifield convencional. Os fragmentos podem ser produzidos (recombinantemente ou por síntese quími- ca) e testados para identificar os fragmentos peptidila que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActRIIa ou sinalização mediada por ativina.
Variantes funcionalmente ativas de polipeptídeos ActRIIa podem ser obtidos selecionando bibliotecas de poli- peptídeos recombinantemente modificados produzido partir dos ácidos nucléicos mutagenizados correspondentes que codificam um polipeptídeo ActRIIa. As variantes podem ser produzidas e testadas para identificar aquelas que podem funcionar como antagonistas (inibidores) de proteína ActRIIa ou sinalização mediada por ativina. Em certas modalidades, uma variante fun- cional do polipeptídeos ActRIIa compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 75 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3. Em certos ca- sos, a variante funcional tem uma seqüência de aminoácidos pelo menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % ou 100 % idêntica a uma seqüência de aminoácidos selecionada de SEQ ID NOs: 2 ou 3.
Variante funcionais podem ser geradas modificando a estrutura de um polipeptideo ActRIIa com tal propósito como maior eficácia terapêutica, ou estabilidade (por exemplo, vi- da em prateleira ex vivo e resistência a degradação proteolí- tica in vivo). Tais polipeptideos ActRIIa modificado quando selecionado para reter ligação de ativina, são considerados equivalentes funcionais do polipeptideos ActRIIa de ocorrên- cia natural. Polipeptideos ActRIIa modificados podem também ser produzidos, por exemplo, por substituição, deleção, ou adição de aminoácido. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com um isoleucina ou valina, um aspartato com um glutamato, um treonina com uma serina, ou uma substituição similar de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado (por exemplo, muta- ções conservadoras) não terão um maior efeito na atividade biológica da molécula resultante. Substituições conserva- doras são aquelas que ocorrem em uma família de aminoáci- dos que são relacionados em suas cadeias laterais. Pode ser facilmente determinado se uma mudança na seqüência de aminoácidos de um polipeptideo ActRIIa resulta em um homó- logo funcional, avaliando a capacidade da variante de po- lipeptideo ActRIIa de produzir uma resposta em células de um modo similar ao polipeptideo ActRIIa tipo selvagem.
Em certas modalidades, a presente invenção con- templa mutações especificas dos polipeptideos ActRIIa de maneira a alterar a glicosilação do polipeptideo. Tais mu- tações podem ser selecionadas de maneira a introduzir ou eliminar um ou mais sítios de glicosilação, tais como sí- tios de glicosilação O-Iigados ou N-Iigados. Sítios de re- conhecimento de glicosilação ligados a asparagina geral- mente compreendem uma seqüência tripeptídeo, asparagina-X- treonina (ou asparaginas-X-serina) (onde "X" é qualquer aminoácido) que é especificamente reconhecido por enzimas de glicosilação celular apropriadas. A alteração também pode ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina com a seqüência do po- lipeptideo ActRIIa tipo selvagem (para sítios de glicosi- lação 0-ligados). Uma variedade de substituições ou dele- ções de aminoácido em uma ou ambas das primeiras ou ter- ceiras posições de aminoácido de um sítio de reconhecimen- to de glicosilação (e/ou deleção de aminoácido na segunda posição) resulta em não glicosilação na seqüência tripeptí- deo modificada. Um outro meio de aumentar o número de fra- ções de carboidrato em um polipeptideo ActRIIa é por aco- plamento químico ou enzimático de glicosídeos com o poli- peptideo ActRIIa. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(s) pode(m) ser anexado(s) a (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxila livres; (c) grupos sulfi- drila livres tal como os de cisteína; (d) grupos hidroxila livres tais como os de serina, treonina, ou hidroxiproli- na; (e) resíduos aromáticos tais como os de f enilalanina, tirosina, ou triptofano; ou (f} o grupo amida de glutami- na. Estes métodos são descritos em WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, incorporado aqui pe- la referência. Remoção de uma ou mais frações de carboi- drato presentes em um polipeptideo ActRIIa pode ser reali- zado quimicamente e/ou enzimaticamente. Desglicosilação quí- mica pode envolver, por exemplo, exposição do polipeptideo ActRIIa ao composto ácido trifluormetanossulfônico, ou um composto equivalente. Este tratamento resulta na clivagem da maioria ou todos os açúcares exceto o açúcar ligante (N- acetilglicosamina ou N-acetilgalactosamina), enquanto deixa a seqüência de aminoácidos intacta. Desglicosilação química é adicionalmente descrita por Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge at al. (1981) Anal. Bio- chem. 118:131. Clivagem enzimática de frações de carboidrato nos polipeptídeos ActRIIa pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases da maneira descrita por Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. A seqüência de um polipeptideo ActRIIa pode ser ajustada, da maneira a- propriada, dependendo do tipo de sistema de expressão usado, como células mamíferas, de leveduras, de inseto e planta po- dem todas introduzir padrões de glicosilação diferenciados que podem ser afetados pela seqüência de aminoácidos do peptí- deo. No geral, proteínas ActRIIa para uso em humanos serão expressas em uma linha celular de mamífero que fornece glico- silação própria, tais como linhas celulares HEK293 ou de CHO, embora espere-se que outras linhas celulares de expressão ma- mífera, linhas celulares de levedura com enzimas de glicosi- lação produzidos por engenharia e células de inseto sejam i- gualmente usadas.
Esta divulgação adicional contempla um método de gerar mutantes, particularmente conjuntos de mutantes combi- natórias de um polipeptideo ActRIIa, bem como mutantes de truncação; agrupamentos de mutantes combinatórias são especi- almente usados para identificar seqüências de variante fun- cional. O propósito de selecionar tais bibliotecas combinató- rias pode ser para gerar, por exemplo, variantes de polipep- tideo ActRIIa que podem agir tanto como agonistas quanto an- tagonista, ou alternativamente, que possuem todas as ativida- des inéditas juntas. Uma variedade de selecionar ensaios é fornecida a seguir, e tais ensaios podem ser usados para ava- liar variantes. Por exemplo, uma variante de polipeptideo Ac- tRIIa pode ser selecionada pela capacidade de ligar um ligan- te ActRIIa, para prevenir ligação de um ligante ActRIIa a um polipeptideo ActRIIa ou para interferir com sinalização oca- sionada por um ligante ActRIIa.
A atividade de um polipeptideo ActRIIa ou suas va- riantes também podem ser testados em um ensaio baseado em cé- lula ou in vivo. Por exemplo, o efeito de uma variante de po- lipeptideo ActRIIa na expressão de genes envolvida em produ- ção óssea ou destruição óssea pode ser avaliado. Isto pode, da maneira necessária, ser realizado na presença de uma ou mais proteínas ligantes de ActRIIa recombinante (por exemplo, ativina), e células podem ser transfectadas de maneira a produzir um polipeptideo ActRIIa e/ou variantes deste, e opcionalmente, um ligante ActRIIa. Da mesma forma, um poli- peptídeo ActRIIa pode ser administrado a um camundongo ou outro animal, e uma ou mais propriedades ósseas, tais como densidade ou volume podem ser avaliadas. A taxa de cicatri- zação para fraturas ósseas também pode ser avaliada. Absor- timetria por dupla emissão de raios-X DEXA) é uma técnica quantitativa bem estabelecida, não invasiva, para avaliar densidade óssea em um animal. Em sistemas DEXA central hu- mano pode ser usado para avaliar densidade óssea na espinha dorsal e pélvis. Estes são os melhores predictores de den- sidade óssea geral. Sistemas DEXA periféricos podem ser u- sados para avaliar densidade óssea em ossos periféricos, incluindo, por exemplo, os ossos da mão, pulso, tornozelo e pé. Sistemas de imagens de raios-X tradicionais, incluindo varreduras CAT, podem ser usados para avaliar crescimento ósseo e tratamento da fratura. A resistência mecânica do osso também pode ser avaliada.
Variantes combinatoriamente derivadas que têm uma potência seletiva ou geralmente maior com relação a um po- lipeptideo ActRIIa de ocorrência natural, podem ser gera- das. Da mesma forma, mutagênese pode dar origem a variantes que têm meias vidas intracelulares dramaticamente diferen- tes do que um polipeptideo ActRIIa tipo selvagem correspon- dente. Por exemplo, a proteína alterada pode tornar-se tan- to mais estável quanto menos estável para degradação prote- olitica ou outros processos celulares que resultam em des- truição de, ou de outra forma inativação de um polipeptideo ActRIIa nativo. Tais variantes, e os genes que os codifica, podem ser utilizados para alterar níveis de polipeptideo ActRIIa modulando a meia vida do polipeptideos ActRIIa. Por exemplo, uma meia vida curta pode dar origem a efeitos bio- lógicos mais transitórios e pode permitir controle mais ri- goroso de níveis de polipeptídeo ActRIIa recombinante no paciente. Em uma proteína de fusão Fc, mutações podem ser feitas no ligante (talvez nenhum) e/ou a porção Fc para al- terar a meia vida da proteína.
Uma biblioteca combinatória pode ser produzida por meio de um biblioteca degenerada de genes que codificam uma biblioteca de polipept ídeos na qual cada inclui pelo menos uma porção de seqüências de polipeptídeo ActRIIa po- tencial. Por exemplo, uma mistura de oligonucleotídeos sin- téticos pode ser enzimaticamente ligada nas seqüências do gene de maneira que o conjunto degenerado de seqüências de nucleotídeo de polipeptídeo ActRIIa potencial são expres- sões como polipeptídeos individuais, ou alternativamente, como um conjunto de maior proteínas de fusão (por exemplo, para apresentação de fago).
Existem muitos meios pelos quais a biblioteca de homólogos potenciais pode ser gerada de uma seqüência de oligonucleotídeo degenerada. Síntese química de uma se- qüência de gene degenerada pode ser realizada em um sinte- tizador de DNA automático, e os genes sintéticos em segui- da podem ser ligados em um vetor apropriado para expres- são. A síntese de oligonucleotídeos degenerada é bem conhe- cida na tecnologia (ver, por exemplo, Narang, SA (1983) Te- trahedron 39:3; Itakura at al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev, Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et at., (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Tais técnicas foram empregadas na evolução direcionada de outras proteínas (ver, por exemplo, Scott at al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwixla at al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; bem como U.S. Patent Nos: 5,223,409, 5,198,346, e 5,096,815).
Alternativamente, outras formas de mutagênese po- dem ser utilizadas para gerar uma biblioteca combinatória. Por exemplo, variantes de polipeptídeo ActRIIa podem ser geradas e isoladas de uma biblioteca selecionando usando, por exemplo, mutagênese de varredura de alanina e simila- res (Rufet at., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint at al., (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima at al., (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), por mutagênese de varredura ligante (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et at., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight at al., (1982) Science 232:316); por mutagênese de saturação (Me- yers et al., (1986) Science 232:613); por mutagênese de PCR (Leung et al., (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); ou por mutagênese aleatória, incluindo mutagênese química, etc. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genet- ics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Mutagênese de varredura ligante, particularmente em um ajuste combinató- ria, é um método atrativo para identificar formas de poli- peptideos ActRIIa truncados (bioativo).
Uma ampla faixa de técnicas são conhecidas para selecionar produtos genéticos de bibliotecas combinatórias feitos por mutações e truncações de ponto, e, dentro desse assunto, para selecionar bibliotecas cDNA para produtos ge- néticos tendo uma certa propriedade. Tais técnicas serão geralmente adaptáveis para seleção rápida das bibliotecas genéticas geradas pelo mutagênese combinatória dos polipep- tideos ActRIIa. As técnicas mais amplamente usadas para se- lecionar bibliotecas genéticas grandes tipicamente compre- ende clonar a biblioteca genética em vetores de expressão replicáveis, transformar células apropriadas com o biblio- teca resultante de vetores, e expressar os genes combinató- rias em condições nas quais a detecção de uma atividade de- sejada. facilita relativamente isolação fácil do vetor que codifica o gene cujo produto foi detectado. Ensaios prefe- ridos incluem ensaios de ligação de ativina e ensaios de sinalização celular mediados por ativina.
Em certas modalidades, os polipeptideos ActRIIa da invenção podem compreender adicionalmente modificações pós translacionais além de qualquer que estejam naturalmen- te presentes nos polipeptideos ActRIIa. Tais modificações incluem, mas sem limitações, acetilação, carboxilação, gli- cosilação, fosforilação, lipidação, e acilação. Como um re- sultado, os polipeptideos ActRIIa modificados podem conter elementos não aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipideos, poli- ou mono-sacarídeo, e fosfatos. Efeitos de tais elementos não aminoácidos na funcionalidade de um po- lipeptideo ActRIIa podem ser testados da maneira descrita para outras variantes de polipeptideo ActRIIa. Quando um polipeptideo ActRIIa é produzido em células clivando uma forma nascente do Polipeptideo ActRIIa, processamento pós translacional também pode ser importante para dobras corre- tas e/ou função da proteína. Células diferentes (tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NTH-3T3 ou HEK293) têm maquiná- rio celular específico e mecanismos característicos para tais atividades pós translacionais e pode ser escolhidas para assegurar a modificação e processamento corretos dos polipeptideos ActRIIa.
Em certos aspectos, variante funcionais ou formas modificadas dos polipeptideos ActRIIa incluem, proteínas de fusão tendo pelo menos uma porção do polipeptideos ActRIIa e um ou mais domínios de fusão. Exemplos bem conhecidos de tais domínios de fusão incluem, mas sem limitações, poli- histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tiore- doxina, proteína A, proteína G, uma região constante ca- deia pesada de imunoglobulina (Fe), proteína de ligação de maltose (MBP) , ou albumina sérica humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a conferir uma pro- priedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente usados para isolação das proteínas de fusão por cromatografia de afinidade. Com o propósito de purificação da afinidade, são usadas matrizes relevantes para cromatografia de afinidade, tais como resinas de glu- tationa, amilase, e níquel ou cobalto conjugados. Muitas das tais matrizes estão disponíveis em forma de "estojo", tais como o sistema de purificação de Pharmacia GST e o sistema QIAexpress™ (Qiagen) usados com (parceiros fusão HISs). Como um outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de maneira a facilitar a detecção dos polipep- tídeos ActRIIa. Exemplos de tais domínios de detecção in- cluem as várias proteínas fluorescentes (por exemplo, GFP) bem como "epítopo de tags," que são normalmente seqüências de peptídeo curtas para as quais um anticorpo específico está disponível. Epítopo de tags bem conhecidos nos quais anticorpos monoclonais específicos estão facilmente dispo- níveis incluem FLAG, hemaglutinina do vírus influenza (HA), e tags c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão - têm um sítio de clivagem de protease, tal como para Fator Xa ou Trombina, que permite a protease relevante a digerir parcialmente as proteínas de fusão e liberar assim as pro- teínas recombinantes dela. As proteínas liberadas podem sem seguida ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subseqüente. Em certas modalidade preferi- das, um polipeptídeo ActRIIa é fundido com um domínio que estabiliza o polipeptídeo ActRIIa in vivo (um domínio "es- tabilizador"). "Estabilizar" significa qualquer coisa que aumenta a meia-vida sérica, independente se isto é em vir- tude de maior destruição, menor liberação pelo rim, ou ou- tro efeito farmacocinético. Fusões com a porção Fc de uma imunoglobulina são conhecidas para conferir propriedades farmacocinéticas desejáveis em uma ampla faixa de proteí- nas. Da mesma forma, fusões com albumina sérica humana po- dem conferir propriedades desejáveis. Outros tipos de do- mínios de fusão que podem ser selecionados incluem domínios de multimerização (por exemplo, dimerização, tetrameriza- ção) e domínios funcionais (que conferem uma função bioló- gica adicional, tais como mais estímulo de crescimento ós- seo ou crescimento muscular, da maneira desejada).
As um exemplo específico, a presente in- venção fornece uma proteína de fusão compreendendo um domí- nio extracelular solúvel de ActRÍIa fundido com um domínio Fc (por exemplo, SEQ ID NO: 6),
THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVD (A) VSHEDPEVKF NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK (A) VSNKAL PVPXEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN (A) HYT QKSLSLSPGK*
Opcionalmente, o domínio Fc tem uma ou mais muta- ções nos resíduos tais como Asp-265, Lisina 322, e Asn-434. Em certos casos, o domínio Fc mutante tendo uma ou mais dessas mutações (por exemplo, mutação Asp-265) tem capaci- dade de ligação reduzida com o receptor Fcy com relação a um domínio Fc tipo selvagem. Em outros casos, o domínio Fc mutante tendo uma ou mais dessas mutações (por exemplo, mu- tação Asn-434) tem maior capacidade de ligação com o recep- tor Fc relacionado com MHC classe 1 (FcRN) com relação a um domínio Fc tipo selvagem.
Entende-se que elementos diferentes das proteínas de fusão podem ser arranjadas de qualquer maneira que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptideo ActRIIa pode ser C-terminal colocado em um do- mínio heterólogo, ou, alternativamente, um domínio heteró- logo pode ser C-terminal colocado em um polipeptideo ActRI- la. O domínio de polipeptideo ActRIIa e o domínio heterólo- go não precisam ser adjacentes em uma proteína de fusão, e domínios adicionais ou seqüências de aminoácido podem ser terminal C- ou N- incluídos tanto para domínio quanto entre os domínios.
Em certas modalidades, os polipeptídeos ActRIIa da presente invenção contêm uma ou mais modificações que são capazes de estabilizar os polipeptídeos ActRIIa. Por exemplo, tais modificações melhoram a meia-vida in vitro dos polipeptídeos ActRIIa, melhoram a meia-vida circulató- ria dos polipeptídeos ActRIIa ou reduzem a degradação pro- teolítica dos polipeptídeos ActRIIa. Tais modificações es- tabilizantes incluem, mas sem limitações, proteínas de fu- são (incluindo, por exemplo, proteínas de fusão compreen- dendo um polipeptideo ActRIIa e um domínio estabilizador), modificações de um sítio de glicosilação (incluindo, por exemplo, adição de um sítio de glicosilação a um polipep- tideo ActRIIa), e modificações de fração de carboidrato (incluindo, por exemplo, remoção de frações de carboidrato de um polipeptideo ActRIIa) . No caso de proteínas de fu- são, um polipeptideo ActRIIa é fundido com um domínio es- tabilizador tal como uma molécula IgG (por exemplo, um do- mínio Fc). Da maneira aqui usada, o termo "domínio estabi- lizador" não refere-se apenas a um domínio de fusão (por exemplo, Fc) como no caso de proteínas de fusão, mas tam- bém inclui modificações não proteináceas tal como uma fra- ção de carboidrato, ou polímero não proteináceo, tal como polietileno glicol.
Em certas modalidades, a presente invenção torna disponível formas isoladas e/ou purificadas dos polipeptí- deos ActRIIa, que são isolados de, ou de outra forma subs- tancialmente livre de, outras proteínas. Polipeptideos Ac- tRIIa serão geralmente produzido por expressão a partir de ácidos nucléicos recombinantes.
3. Ácidos nucléicos que codificam Polipeptideos ActRIIa
Em certos aspectos, a invenção fornece isolado e/ou ácidos nucléicos recombinantes que codificam qualquer dos polipeptídeos ActRIIa (por exemplo, polipeptídeos Ac- tRIIa solúveis), incluindo fragmentos, variante funcionais e proteínas de fusão aqui revelados. Por exemplo, SEQ ID NO: 4 codifica o polipeptídeo precursor de ActRIIa humano de ocorrência natural, ao passo que SEQ ID NO: 5 codifica o domínio extracelular de ActRIIa processado. Os ácidos nucléicos em questão podem ser de fita única ou fita du- pla. Tais ácidos nucléicos podem ser moléculas de DNA ou RNA. Estes ácidos nucléicos podem ser usados, por exemplo, em métodos para fazer polipeptídeos ActRIIa ou como agentes terapêuticos diretos (por exemplo, em uma abordagem de te- rapia genética).
Em certos aspectos, os ácidos nucléicos submeti- dos que codificam polipeptideos ActRIIa são adicionalmente para incluir ácidos nucléicos que são variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5. Seqüências de nucleotideo variante incluem se- qüências que diferem de uma ou mais substituições de nu- cleotideo, adições ou deleções, tais como variantes alélicas.
Em certas modalidades, a invenção fornece seqüên- cias de ácido nucléico isolado ou recombinante que são pe- lo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% idênticas à SEQ ID NO: 4 ou 5. Versados na tecnologia re- conhecerão que seqüências de ácido nucléico complementares a SEQ ID NO: 4 ou 5, e variantes de SEQ ID NO: 4 ou 5 estão também dentro do escopo desta invenção. Em modalidades adi- cionais, as seqüências de ácido nucléico da invenção podem ser isoladas, recombinantes, e/ou fundidas com uma seqüên- cia de nucleotideo heterólogo, ou em uma biblioteca de DNA.
Em outras modalidades, ácidos nucléicos da inven- ção também incluem seqüências de nucleotideo que hibridizam em condições altamente rigorosas com a seqüência de nucle- otideo designada em SEQ ID NO: 4 ou 5, seqüência de comple- mento de SEQ ID NO: 4 ou 5, ou fragmentos destes. Da ma- neira discutida anteriormente, versados na tecnologia en- tendem facilmente que condições de rigor apropriadas que promovem Hibridização de DNA podem ser variadas. Versados na tecnologia entendem facilmente que condições de rigor apropriadas que promovem hibridização de DNA pode variar. Por exemplo, uma hibridização poderia se realizar a 6,0 χ cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguido por uma lavagem de 2,0 x SSC a 50 °C. Por exemplo, a concentração de sal na etapa da lavagem pode ser selecio- nada de um baixo rigor de cerca de 2,0 x SSC a 50 ºC até um alto rigor de cerca de 0,2 χ SSC a 50 °C. Além disso, a temperatura na etapa da lavagem pode ser aumentada de con- dições de baixo rigor a temperatura ambiente, a cerca de 22 ºC, até condições de alto rigor a cerca de 65 °C. Tanto a temperatura quanto o sal podem variar, ou temperatura ou concentração de sal podem ser mantidas constantes ao passo que a outra variável muda. Em uma modalidade, a invenção fornece ácidos nucléicos que hibridizam em condições de baixo rigor de 6 χ SSC a temperatura ambiente seguido por uma lavagem a 2 χ SSC a temperatura ambiente.
Ácidos nucléicos isolados que diferem dos ácidos nucléicos como apresentado em SEQ ID NOs: 4 ou 5 em função da degeneração no código genético estão também dentro do escopo da invenção. Por exemplo, diversos aminoácidos são designados por mais do que um triplete. Códons que especi- ficam o mesmo aminoácido, ou sinônimos (por exemplo, CAU e CAC são sinônimos para histidina) podem resultar em muta- ções "silenciosas" que não afetam a seqüência de aminoáci- dos da proteína.- Entretanto, espera-se que polimorfismo da seqüência de DNA que leva a mudanças nas seqüências de ami- noácido das proteínas em questão existe entre célula de mamíferos. Versados na tecnologia percebem que estas vari- ações em um ou mais nucleotídeos (até cerca de 3-5 % dos nucleotídeos) dos ácidos nucléicos que codificam uma pro- teína particular pode existir entre indivíduos de uma dada espécie em função de variação alélica natural. Todas e quaisquer variações de nucleotideo e polimorfismo do amino- ácido resultante estão no escopo desta invenção.
Em certas modalidades, os ácidos nucléicos recom- binantes da invenção podem ser ligados operacionalmente a uma ou mais seqüências de nucleotideo regulatórias em uma construção de expressão. Seqüências de nucleotideo regula- tórias serão geralmente apropriadas para as célula hospe- deira usadas para expressão. Inúmeros tipos de vetores de expressão apropriados e seqüências regulatórias adequadas são conhecidos na tecnologia por uma variedade de células hospedeiras. Tipicamente, as ditas uma ou mais seqüências de nucleotideo regulatórias podem incluir, mas sem limita- ções, seqüência promotoras, seqüência líder ou de sinais, sítios de ligação ribossômica, seqüências de início e fi- nalização transcripcional, seqüências de início e finali- zação translacional, e seqüências melhoradoras ou ativado- ras. Promotores constitutivos ou indutíveis conhecidos na tecnologia são contemplados pela invenção. Os promotores podem ser tento promotores de ocorrência natural, quanto promotores híbridos que combinam elementos de mais que um promotor. Uma construção de expressão pode estar presente em uma célula em um epissoma, tal como um plasmídeo, ou a construção de expressão pode ser inserida em um cromossomo. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão contém um gene marcador selecionável para permitir a seleção de células hospedeiras transformadas. Genes marcadores sele- cionáveis são bem conhecidos na tecnologia e variarão com a célula hospedeira usada.
Em certos aspectos da invenção, o ácido nucléico em questão é fornecido em um vetor de expressão compreen- dendo uma seqüência de nucleotideo que codifica um poli- peptideo ActRIIa e ligado operacionalmente a pelo menos uma seqüência regulatória. Seqüências regulatórias são re- conhecidas na tecnologia e são selecionadas para direcio- nar a expressão do polipeptideo ActRIIa. Consequentemente, o termo seqüência regulatória inclui promotores, melhora- dores, e outros elementos de controle de expressão. Seqüên- cias regulatórias exemplares são descritas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Por exemplo, qualquer de uma ampla variedade de seqüências de controle de expressão que controla a expressão de uma seqüência de DNA quando ligada operacionalmente a ela pode ser usada nestes vetores para expressar seqüências de DNA que codificam um polipeptideo ActRIIa. Tais seqüências de controle de expressão usadas incluem, por exemplo, os promotores anteriores e posterio- res de SV40, promotor tet, adenovirus ou citomegalovirus promotor anterior imediato, promotores RSV, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, T7 promotor cuja ex- pressão é dirigida por polimerase T7 RNA, as principais re- giões operadoras e promotoras de fago lambda, as regiões de controle para proteína de revestimento fd, o promotor para 3 -fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores de ácido fosfatase, por exemplo, PhoS, os promotores dos fatores α de acasalamento de levedura, o pro- motor poliedron do sistema baculovírus e outras seqüências conhecidas para controlar a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus virus, e várias com- binações destas. Deve-se entender que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira pode ser transformada e/ou o tipo de pro- teína desejada pode ser expressa. Além do mais, o número de copia dos vetores, a capacidade para controlar esse número de cópia e a expressão de qualquer outra proteína codifica- da pelo vetor, tal como marcadores de antibiótico, devem também ser considerados.
Um ácido nucléico recombinante da invenção pode ser produzido ligando o gene clonado, ou uma porção deste, em um vetor adequado para expressão tanto em células proca- rióticas, células eucarióticas (levedura, ave, inseto ou mamífero), quanto em ambas. Veículos de expressão para pro- dução de um polipeptídeo ActRIIa recombinante incluem plas- mídeos e outros vetores. Por exemplo, vetores adequados in- cluem plasmídeos dos tipos: plasmídeos derivados de pBR322, plasmídeos derivados de pBMBL, plasmídeos derivados de pEX, plasmídeos derivados de pBTac e plasmídeos derivados de pUC para expressão em células procarióticas, tais como E. coli.
Alguns vetores de expressão de mamífero contêm ambas seqüências procarióticas para facilitar a propagação do vetor em bactéria, e uma ou mais unidades de transcrição eucarióticas que são expressas em célula eucarióticas. Os vetores derivados pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo e pHyg são exemplos de vetores de expressão de mamífero ade- quados para transfecção de células eucarióticas. Alguns desses vetores são modificados com seqüências de plasmídeos bacterianos, tal como pBR322, para facilitar a replicação e seleção de resistência a medicamento em tanto em células procarióticas quanto eucarióticas. Alternativamente, deri- vados de vírus tais como o vírus papiloma bovino (BPV-I), ou vírus Epstein-Barr (derivados de pHEBo, pREP e p205) podem ser usados para expressão transiente de proteínas em célu- las eucarióticas. Exemplos de outros sistemas de expressão viral (incluindo retroviral) podem ser encontrados a seguir na descrição dos sistemas de distribuição de terapia gené- tica. Os vários métodos empregados na preparação dos plas- mídeos e na transformação de organismos hospedeiros são bem conhecidos na tecnologia. Para outros sistemas de expressão adequados tanto para células procarióticas quanto eucarió- ticas, bem como procedimentos recombinantes gerais, ver Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Labora- tory Press, 2001). Em alguns casos, pode-se desejar ex- pressar o polipeptídeos recombinante pelo uso de um siste- ma de expressão baculovírus. Exemplos de Tais sistemas de expressão baculovírus incluem vetores derivados de pVL (tais como pVL1392, pVL1393 e pVL941), vetores derivados de pAcUW (tal como pAcUWl), e vetores derivados de pBlue- Bac (tal como o pBlueBac III contendo β-gal).
Em uma modalidade preferida, um vetor será proje- tado para produção dos polipeptídeos ActRIIa em questão em células de CHO, tais como um vetor Pcmv-Script (Stratage- ne, La Jolla, Calif.)/ vetores pcDNA4 (Invitrogen, Carls- bad, Calif.) e vetores pCI-neo (Promega, Madison, Wisc.). Conforme fica aparente, as construções genéticas em ques- tão podem ser usadas para fazer com que a expressão do po- lipeptideos ActRIIa em questão em células se propagem em cultura, por exemplo, para produzir proteínas, incluindo proteínas de fusão ou proteínas variantes, para purificação.
Esta divulgação também pertence a uma célula hos- pedeira transfectada com um gene recombinante incluindo uma seqüência de codificação (por exemplo, SEQ ID NO: 4 ou 5) para um ou mais dos polipeptídeos ActRIIa em questão. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eucariótica. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa da in- venção pode ser expresso em células bacterianas tais como E. coli, células de inseto (por exemplo, usando um sistema de expressão baculovírus) , levedura, ou célula de mamífe- ros. Outras células hospedeiras adequadas são conhecidas pelos versados na tecnologia.
Consequentemente, a presente invenção pertence adicionalmente aos métodos de produzir os polipeptídeos ActRIIa em questão. Por exemplo, uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão que codifica um po- lipeptídeo ActRIIa pode ser cultivada em condições apro- priadas para permitir que a expressão do polipeptídeo Ac- tRIIa ocorra. 0 polipeptídeo ActRIIa pode ser secretado e isolado a partir de uma mistura de células e meio contendo o polipeptídeo ActRIIa. Alternativamente, o polipeptídeo ActRIIa pode ser retido citoplasmicamente ou em uma fração de membrana e as células colhidas, lisadas e a proteína iso- lada. Uma cultura celular inclui células hospedeiras, meio e outros subprodutos. Meios adequados para cultura celular são bem conhecidos na tecnologia. Os polipeptideos ActRIIa em questão podem ser isolados a partir do meio de cultura celular, células hospedeiras, ou ambos, usando técnicas co- nhecidas na tecnologia par purificar proteínas, incluindo cromatografia de troca iônica, cromatografia de filtração de gel, ultrafiltração, eletroforese, purificação de imuno- afinidade com anticorpos específicos para particular epíto- pos dos polipeptídeos ActRIIa e purificação da afinidade com um agente que se liga a um domínio fundido ao polipep- tídeo ActRIIa (por exemplo, uma coluna A da proteína pode ser usada para purificar uma fusão ActRIIa-Fc). Em uma mo- dalidade preferida, o polipeptídeo ActRIIa é uma proteína de fusão contendo um domínio que facilita sua purificação. Em uma modalidade preferida, purificação é alcançada por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais dos seguintes, em qualquer ordem: cromatografia de proteína A, cromatografia de Q sefarose, cromatografia de fenilsefarose, cromatografia de exclusão de tamanho, e cromatografia por troca catiônica. A purifi- cação pode ser completa com filtração viral e troca de tam- pão. Da maneira aqui demonstrada, proteína ActRIIa-hFc foi purificada até uma pureza de >9.8 % determinado por cromato- grafia de exclusão de tamanho e >95 % determinado por SDS PAGE. Este nível de pureza foi suficiente para alcançar e- feitos desejáveis no osso em camundongos e um perfil de se- gurança aceitável em camundongos, ratos e primatas não hu- manos .
Em uma outra modalidade, um gene de fusão que co- difica para uma seqüência líder de purificação, tais como uma seqüência de sítio de clivagem poli-(His)/enteroquinase no N-término da porção desejada do polipeptídeo ActRIIa re- combinante, pode permitir purificação da proteína de fusão expressa pela cromatografia de afinidade usando um resina metálica Ni2+. A seqüência líder de purificação pode em se- guida ser subseqüentemente removidas por tratamento com en- teroquinase para fornecer o polipeptídeo ActRIIa purificado (por exemplo, ver Hochuli et al., (1987) J. Chromatography 411:177; and Janknecht et al. , PNAS USA 88:8972).
Técnicas para preparar genes de fusão são bem co- nhecidas. Essencialmente, a união de vários fragmentos de DNA que codificam para diferentes seqüências de polipeptí- deo é realizada de acordo com técnicas convencionais, em- pregando terminal de ponta romba ou ponta deslocada para ligação, digestão de enzima restrição para permitir termi- nal apropriado, enchendo-o de extremidades coesivas da ma- neira apropriada, tratamento fosfatase alcalina para evitar união indesejável, e ligação enzimática. Em uma outra mo- dalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técni- cas convencionais incluindo sintetizadores de DNA automa- tizados. Alternativamente, amplificação do PCR de fragmen- tos do gene pode ser realizada usando iniciadores âncora que dão origem a saliências complementares entre dois fragmentos do gene consecutivos que podem subseqüentemente ser anelados para gerar uma seqüência quimérica do gene (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992) .
4. Ativina alternativa e antagonistas ActRIIa Os dados aqui apresentados demonstram que antago- nistas de sinalização de ActRIIa de ativina pode ser usada para promover o crescimento ósseo e mineralização óssea. Embora polipeptideos ActRIIa solúveis, e particularmente ActrIIa-Fc, sejam antagonistas preferidos, e embora tais antagonistas possam afetar o osso através de um mecanismo sem ser antagonismo de ativina (por exemplo, inibição de ativina pode ser um indicativo da tendência de um agente para inibir as atividades de um espectro de moléculas, in- cluindo, talvez, outros elementos da superfamilia TGF- beta, e tal inibição coletiva pode levar ao efeito deseja- do no osso), espera-se que outros tipos de antagonistas da ativina-ActRIIa sejam usados, incluindo anticorpos anti- ativina (por exemplo, A, B, C ou Ε) , anticorpos anti- ActRIIa, anti-sentido, RNAi ou ácidos nucléicos ribozima que inibem a produção de ActRIIa e outros inibidores de ativina ou ActRIIa, particularmente os que interrompem li- gação de ativina-ActRIIa.
Um anticorpo que é especificamente reativo com um polipeptideo ActRIIa (por exemplo, um polipeptideo ActRIIa solúvel) e que tanto se liga competitivamente ao ligante com o polipeptideo ActRIIa quanto de outra forma inibe si- nalização mediada por ActRIIa por pode ser usada como um antagonista de atividades de polipeptideo ActRIIa. Da mes- ma forma, um anticorpo que é especificamente reativo com uma ativina A polipeptideo e que interrompe a ligação de ActRIIa pode ser usado como um antagonista.
Usando imunógenos derivados de um polipeptideo ActRIIa ou uma ativina polipeptideo, anti-proteína/anti- peptideo antisera ou anticorpos monoclonais podem ser fei- tos por protocolos padrões (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratory Manual ed. By Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Um mamífero, tais como um camundongo, um hamster ou coelho pode ser imunizado com um forma imuno- gênica do polipeptideo ActRIIa, um fragmento antigênico que é capazes de elicitar uma resposta ao anticorpo, ou uma proteína de fusão. Técnicas para conferir imunogenicidade em uma proteína ou peptídeo incluem conjugação com carrea- dores ou outras técnicas bem conhecidas na tecnologia. Uma porção imunogênica de um polipeptideo ActRIIa ou ativina pode ser administrada na presença de adjuvante. O progresso de imunização pode ser monitorado pela detecção de titula- dores de anticorpo em plasma ou soro. ELISA ou outros imu- noensaios padrões podem ser usados com o imunógeno como antí- geno para avaliar os níveis de anticorpos.
Após a imunização de um animal com um preparação antigênica de um polipeptideo ActRIIa, antisera pode ser obtida e, se desejado, anticorpos policlonais podem ser i- solados do soro. Para produzir anticorpos monoclonais, cé- lulas de produção de anticorpo (linfócitos) podem ser co- lhidas de um animal imunizado e fundidas por procedimentos fusão de célula somática padrão com células imortalizadas tais como células de mieloma para produzir células de hi- bridoma. Tais técnicas são bem conhecidas na tecnologia, e incluem, por exemplo, a técnica de hibridoma (originalmente desenvolvida por Kohler and Milstein, (1975) Nature, 256: 495-497), a técnica de hibridoma célula B humana (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72), e a técnica de hibri- doma EBV para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., (1985) Antibodies Monoclonal and Câncer Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96) . Células de hibridoma podem ser selecionadas imunoquimicamente para produção de anti- corpos especificamente reativos com um polipeptideo ActRIIa e anticorpos monoclonais isolados de uma cultura compreen- déndo tais células de hibridoma.
O termo "anticorpo" da maneira aqui usada deve incluir fragmentos deste que são também especificamente re- ativos com um polipeptideo em questão. Anticorpos podem ser fragmentados usando técnicas convencionais e os fragmentos selecionados para utilidade da mesma maneira supradescrita para aqueles anticorpos. Por exemplo, fragmentos F(ab)2 po- dem ser gerados tratando anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab)2 resultante pode ser tratado para reduzir ligações de dissulfeto para produzir fragmentos Fab. O anticorpo da presente invenção deve incluir adicionalmente moléculas bi- oespecificas, cadeia única, quimérica, humanizada e total- mente humano tendo afinidade com um polipeptideo ActRIIa ou ativina conferido por pelo menos uma região CDR do anti- corpo. Um anticorpo pode compreender adicionalmente um marcador anexado a ele e capaz de ser detectado (por exem- plo, o marcador pode ser um radioisótopo, composto fluo- rescente, enzima ou co-fator de enzima).
Em certas modalidades, o anticorpo é um anticorpo recombinante, cujo termo engloba qualquer anticorpo gerado em parte por técnicas de biologia molecular, incluindo an- ticorpos enxertados com CDR ou quiméricos, anticorpos huma- nos ou outros montados de domínios de anticorpo seleciona- do de biblioteca, anticorpos de cadeia única e anticorpos de domínio único (por exemplo, proteínas Vh humana ou pro- teínas VHh camelídeo)·. Em certas modalidades, um anticorpo da invenção é um anticorpo monoclonal, e em certas modali- dades, a invenção torna disponíveis métodos para gerar an- ticorpos inéditos. Por exemplo, um método para gerar um an- ticorpo monoclonal que se liga especificamente a um poli- peptídeo ActRIIa ou polipeptídeo ativina pode compreender administrar a um camundongo uma quantidade de uma composi- ção imunogênica compreendendo o polipeptídeo de antígeno efetivo para estimular um detectável resposta imune, ob- tendo células de produção de anticorpo (por exemplo, célu- las do baço) do camundongo e fundindo as células de produ- ção de anticorpo com células de mieloma para obter hibri- domas de produção de anticorpo, e testar o hibridomas de produção de anticorpo para identificar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno. Uma vez obtido, um hibridoma pode ser propa- gado em uma cultura celular, opcionalmente em condições de cultura onde as células derivadas de hibridoma produzam o anticorpo monoclonal que se ligam especificamente ao antí- geno. 0 anticorpo monoclonal pode ser purificado a partir da cultura celular.
O adjetivo "especificamente reativo com" da ma- neira usada em referência a um anticorpo deve significar, da maneira geralmente entendida na tecnologia, que o anti- corpo é suficientemente seletivo entre o antigeno de inte- resse (por exemplo, um polipeptideo ActRIIa) e outros an- tigenos que não são de interesse que o anticorpo é usado para, no mínimo, detectar a presença do antigeno de inte- resse em um tipo particular de amostra biológica. Em cer- tos métodos, empregar o anticorpo, tal como aplicações te- rapêuticas, um maior grau de especificidade em ligação po- de ser desejável. Anticorpos monoclonais geralmente têm uma grande tendência (comparado com anticorpos policlo- nais) a discriminar efetivamente entre os antígenos deseja- dos e polipeptídeos de reação cruzada. Uma característica que influencia a especificidade de um interação anticor- po:antigeno é a afinidade do anticorpo com o antigeno. Em- bora a especificidade desejada possa ser alcançada com uma faixa de afinidades diferentes, geralmente anticorpos pre- feridos terão uma afinidade (uma constante de dissociação) de cerca de 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 ou menos. Dado a ligação extraordinariamente estreita entre ativina e ActRIIa, espe- ra-se que um anticorpo anti-ativina ou anti-ActRIIa neutra- lizante teria geralmente uma constante de dissociação de 10-10 ou menos. Além disso, as técnicas usadas para selecionar anticorpos a fim de identificar um anticorpo desejável po- dem influenciar as propriedades do anticorpo obtido. Por exemplo, se um anticorpo pode ser usado para ligação de um antigeno em solução, pode-se desejar testar a ligação da solução. Uma variedade de diferentes técnicas estão dispo- níveis" para testar interação entre anticorpos e antígenos para identificar particularmente anticorpos desejáveis. Tais técnicas incluem ELISAs, ensaios de ligação de resso- nância plásmon de superfície (por exemplo, o ensaio de li- gação Biacore™, Biacore AB, Uppsala, Sweden), ensaios san- duíche (por exemplo, o sistema contas paramagnéticas de IGEN International, Inc., Gaithersburg, Maryland) , western blots, ensaios de imunoprecipitação, e imunoistoquímico.
Exemplos de categorias de compostos de ácido nu- cléico que são antagonistas ativina ou ActRIIa incluem áci- dos nucléicos anti-sentidos, construções RNAi e construções de ácido nucléico catalíticas. Um composto de ácido nucléi- co pode ser de fita única ou dupla. Um composto de fita du- pia também pode incluir regiões de saliência ou não comple- mentariedade, onde uma ou outra das fitas é fita única. Um composto de fita única pode incluir regiões de auto comple- mentaridade, significa que o composto forma uma estrutura assim denominada "tipo grampo" ou "semi circular", com uma região de estrutura helicoidal dupla. Um composto de ácido nucléico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a um região consistindo de não mais que 1.000, não mais que 500, não mais que 250, não mais que 100 ou não mais que 50, 35, 30, 25, 22, 20 ou 18 nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico de ActRIIa comprimento total ou seqüência de ácido nucléico de ativina βΑ ou ativina βΒ.
A região, de complementariedade será preferivelmente pelo menos 8 nucleotídeos, e opcionalmente pelo menos 10 ou pelo menos 15 nucleotídeos, e opcionalmente entre 15 e 25 nucle- otídeos. Uma região de complementariedade pode cair em um íntron, uma seqüência de codificação ou uma seqüência de não codificação da transcrição do alvo, tal como a porção de seqüência de codificação. Geralmente, um composto de á- cido nucléico terá uma comprimento de cerca de 8 a cerca de 500 nucleotídeos ou pares de base em comprimento, e op- cionalmente o comprimento será cerca de 14 a cerca de 50 nucleotídeos. Um ácido nucléico pode ter um DNA (particu- larmente para uso como um anti-sentido) , RNA ou RNA:DNA híbrido. Qualquer um fita pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facil- mente classificadas tanto como DNA quanto como RNA. Da mes- ma forma, um composto de fita dupla pode ser DNA:DNA, DNA:DNA ou RNA:RNA, e qualquer um fita também pode incluir uma mistura de DNA e RNA, bem como formas modificadas que não podem ser facilmente classificadas tanto como DNA quanto como RNA. Um composto de ácido nucléico pode incluir qualquer de uma variedade de modificações, incluindo uma ou mais modificações da espinha dorsal (a porção açúcar- fosfato em um ácido nucléico natural, incluindo ligações internucleotídeo) ou a porção base (a porção purina ou pi- rimidina de um ácido nucléico natural). Um composto de á- cido nucléico anti-sentido terá preferivelmente um compri- mento de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos e conterá freqüentemente uma ou mais modificações para melhorar as características tal como estabilidade no soro, em uma célu- la ou em um local onde o composto é provavelmente para ser distribuído, tal como o estômago no caso de compostos dis- tribuídos oralmente e o pulmão para compostos inalados. No caso de uma construção de RNAi, a fita complementar para a transcrição do alvo será geralmente RNA ou modificações destes. A outra fita pode ser RNA, DNA ou qualquer outra variação. A porção duplex de fita dupla ou fita única construção de RNAi "tipo grampo" terá preferivelmente um comprimento de 18 a 40 nucleotídeos em comprimento e opcio- nalmente cerca de 21 a 23 nucleotídeos em comprimento, des- de que ela serva como um substrato Dicer. Ácidos nucléicos catalíticos ou enzimáticos podem ser ribozima ou enzimas de DNA e também podem conter formas modificadas. Compostos de ácido nucléico podem inibir expressão do alvo por cerca de 50%, 75%, 90% ou mais quando colocados em contato com células em condições fisiológicas e em uma concentra- ção onde um controle não sentido ou sentido tem pouco ou nenhum efeito. Concentrações preferidas para testar o efei- to de compostos de ácido nucléico são 1, 5 e 10 micromolar. Compostos de ácido nucléico também podem ser testados para efeitos, por exemplo, em crescimento ósseo e mineralização.
5. Ensaios de seleção
Em certos aspectos, a presente invenção diz res- peito ao uso de polipeptídeos ActRIIa (por exemplo, poli- peptideos ActRIIa solúveis) e polipeptideos de ativina para identificar compostos (agentes) que são agonista ou antago- nistas da rota de sinalização de ativina-ActRII. Compostos identificados através desta seleção podem ser testados para avaliar sua capacidade de modular o crescimento ósseo ou mineralização in vitro. Opcionalmente, estes compostos po- dem ser adicionalmente testados em modelos animais para a- valiar sua capacidade de modular crescimento do tecido in vivo.
.Existem inúmeras abordagens para selecionar agen- tes terapêuticos para modular crescimento do tecido alve- jando polipeptideos ativina e ActRIIa. Em certas modalida- des, seleção de alta produção de compostos pode ser reali- zada para identificar agentes que perturbam os efeitos me- diados por ativina ou ActRIIa no osso. Em certas modalida- des, o ensaio é realizado para selecionar e identificar compostos que especificamente inibem ou reduzem ligação de um polipeptideo ActRIIa com ativina. Alternativamente, o ensaio pode ser usado para identificar compostos que melho- ram a ligação de um polipeptideo ActRIIa com ativina. Em uma modalidade adicional, os compostos podem ser identifi- cados por sua capacidade de interagir com uma polipeptideo ativina ou ActRIIa.
Uma variedade de formatos de ensaio bastará e, sob a luz da presente revelação, aqueles não expressamente aqui descritos, no entanto serão contemplados pelos versa- dos na tecnologia. Da maneira descrita, os compostos testes (agentes) da invenção podem ser criados por qualquer método químico combinatória. Alternativamente, os compostos em questão podem ser biomoléculas de ocorrência natural sinte- tizadas in vivo ou in vitro. Compostos (agentes) podem ser testados por sua capacidade de agir como moduladores de crescimento do tecido podem ser produzidos, por exemplo, por bactéria, levedura, plantas ou outros organismos (por exemplo, produtos naturais), produzidos quimicamente (por exemplo, moléculas pequenas, incluindo peptidomiméticas), ou produzidos recombinantemente. Compostos testes contem- piados pela presente invenção incluem moléculas orgânicas não peptidila, peptídeos, polipeptideos, peptidomiméticos, açúcares, hormônios, e moléculas de ácido nucléico. Em uma modalidade específica, o agente de teste é uma pequena mo- lécula orgânica tendo um peso molecular menor do que cerca de 2.000 daltons.
Os compostos testes da invenção podem ser forne- cidos como únicos, entidades discretas, ou fornecido em bi- bliotecas de maior complexidade, tal como feito por produ- to químico combinatória. Estas bibliotecas podem compreen- der, por exemplo, álcoois, haletos de alquila, aminas, a- midas, ésteres, aldeídos, éteres e outras classes de com- postos orgânicos. A apresentação de compostos testes para o sistema de teste pode ser tanto em uma forma isolado quanto como misturas de compostos, especialmente em etapas de seleção iniciais. Opcionalmente, os compostos podem ser opcionalmente derivatizados com outros compostos e têm gru- pos de derivatização que facilitam a isolação dos compos- tos. Exemplos não limitantes de grupos de derivatização incluem biotina, fluoresceína, digoxigenina, proteína flu- orescente verde, isótopos, poli-histidina, gotas magnéti- cas, glutationa S transferase (GST), reticuladores fotoati- váveis ou qualquer combinação destes.
Em muitos programas de seleção de medicamento em cujas bibliotecas de teste de compostos e extratos natu- rais, ensaios de alta produção são desejáveis a fim de ma- ximizar o número de compostos avaliados em um dado período de tempo. Ensaios que são realizados em sistemas sem célu- la como esse, podem ser derivados com proteínas purifica- das ou semi purificadas, são freqüentemente preferidos co- mo seleções "primárias" em que elas podem ser geradas para permitir desenvolvimento rápido e detecção relativamente fácil de uma alteração em um alvo molecular que é mediado por um composto teste. Além do mais, os efeitos de toxici- dade celular ou biodisponibilidade do composto teste podem ser geralmente ignorados no sistema in vitro, o ensaio em vez de ser focado primariamente no efeito do medicamento no alvo molecular como pode ser manifestado em uma altera- ção de afinidade de ligação entre um polipeptídeo ActRIIa e ativina.
Apenas para ilustrar, em um ensaio de seleção e- xemplar do presente invenção, o composto de interesse é co- locado em contato com um polipeptídeo ActRIIa isolado e pu- rifiçado que é ordinariamente capaz de ligar a ativina. Para a mistura do composto e polipeptídeo ActRIIa é em se- guida adicionado uma composição contendo um ligante ActRI- la. Detecção e quantificação de complexos ActRIIa/ativina fornece um meio para determinar a eficácia do composto em inibir (ou potenciação) formação do complexo entre o poli- peptideo ActRIIa e ativina. A eficácia do composto pode ser avaliada gerando curvas de resposta de dose dos dados ob- tidos usando várias concentrações do composto teste. Além do mais, um ensaio do controle pode também ser realizado para fornecer uma linha de base para comparação. Por exem- plo, em um ensaio do controle, ativina isolada e purificada é adicionada a uma composição contendo o polipeptideo Ac- tRIIa, e a formação do complexo ActRIIa/ativina é. quantifi- cado na ausência do composto teste. Deve-se entender que, no geral, a ordem na qual os reagentes podem ser misturados pode variar, e podem ser misturados simultaneamente. Além do mais, no local de proteínas purificadas, extratos celu- lares e lisatos podem ser usados para render um sistema de ensaio sem célula adequada.
Formação do complexo entre o polipeptideo ActRIIa e ativina pode ser detectado por uma variedade de técnicas. Por exemplo, modulação da formação de complexos pode ser quantificada usando, por exemplo, proteínas marcadas detec- tável tais como polipeptideo ActRIIa ou ativina radiomarca- das (por exemplo, 32P, 35S, 14C ou 3H) , marcadas fluorescen- temente (por exemplo, FITC), ou marcadas enzimaticamente, por imunoensaio, ou por detecção cromatográfica.
Em certas modalidades, a presente invenção con- templa o uso de ensaios de polarização de fluorescência e ensaios de transferência de energia de ressonância de fluo- rescência (FRET) em medições, tanto diretamente quanto in- diretamente, o grau de interação entre um polipeptideo Ac- tRIIa e sua proteína de ligação. Adicionalmente, outros mo- dos de detecção, tal como aqueles baseados em guias de on- das óticas CT Publicação WO 96/26432 e U.S. Pat. No.
5.677.196), ressonância de plásmon de superfície (SPR), sensores carga superficiais, e sensores de força superfici- ais, são compatíveis com muitas modalidades da invenção.
Além do mais, a presente invenção contempla o uso de uma interação de ensaio de armadilha, também conhecida como os "dois ensaios híbridos", para identificar agentes que interrompem ou potenciam a interação entre um polipep- tideo ActRIIa e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, U.S. Pat. No. 5, 283, 317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223- 232; Madura et al. (1993) Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; and Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). Em uma modalidade específica, a presente invenção contempla o uso de dois sistemas híbri- dos reversos para identificar compostos (por exemplo, pe- quenas moléculas ou peptídeos) que dissociam interações en- tre um polipeptideo ActRIIa e sua proteína de ligação. Ver por exemplo, Vidal and Legraina, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legraina, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; and U.S. Pat. Nos. 5,525,490; 5,955,280; and 5,965,368.
Em certas modalidades, os compostos em questão são identificados por sua capacidade de interagir com um polipeptideo ActRIIa ou ativina da invenção. A interação entre o composto e o polipeptideo ActRIIa ou ativina pode ser covalente ou não covalente. Por exemplo, tal interação pode ser identificada no nivel de proteína usando métodos bioquímicos in vitro, incluindo foto-reticulação, ligação de ligante radiomarcada, e cromatografia de afinidade (Ja- koby WB et al., 1974, Methods in Enzymology 46: 1) . Em cer- tos casos, os compostos podem ser selecionados em um meca- nismo com base no ensaio, tal como um ensaio para detectar compostos que se ligam a um polipeptídeo ativina ou ActRI- Ia. Isto pode incluir uma fase sólida ou evento de ligação de fase de fluido. Alternativamente, o gene que codifica um polipeptídeo ativina ou ActRIIa pode ser transfectado com um sistema reportador (por exemplo, β-galactosidase, luciferase, ou proteína fluorescente verde) em uma célula e selecionada contra a biblioteca preferivelmente por uma se- leção de alta produção ou com elementos individuais da bi- blioteca. Outro mecanismo com base em ensaio de ligações pode ser usado, por exemplo, ensaios de ligação que detec- tam mudanças em energia livre. Ensaios de ligação podem ser realizados com o alvo fixado em um poço, conta ou chip ou capturados por um anticorpo imobilizado ou resolvido por eletroforese capilar. Os compostos ligados podem ser detectados normalmente usando colorimetria ou fluorescên- cia ou ressonância de plásmon de superfície.
Em certos aspectos, a presente invenção fornece métodos e agentes para modular (estimular ou inibidor) for- mação óssea e aumentar a massa óssea. Portanto, qualquer composto identificado pode ser testado em todas as células ou tecidos, in vitro ou in vivo, para confirmar sua capa- cidade de modular o crescimento ósseo ou mineralização. Vários métodos conhecidos na tecnologia podem ser utiliza- dos com este propósito.
Por exemplo, o efeito do polipeptideo ActRIIa ou ativinas ou compostos testes no crescimento do osso ou cartilagem pode ser determinado medindo indução de Msx2 ou diferenciação de células osteoprogenitoras em osteoblastos em ensaios baseados em célula (ver, por exemplo, Daluiski et al., Nat Genet. 2001, 27(1) : 84-8; Hino et al., Front Biosci. 2004, 9:1520-9). Um outro exemplo de ensaios basea- dos em célula inclui analisar a atividade osteogênica do polipeptideo ou ativinas ActRIIa em questão e compostos testes em progenitor mesenquimais e células osteoblásti- cas. Para ilustrar, adenovirus recombinante que expressam um polipeptideo ativina ou ActRIIa pode ser construído pa- ra infectar células progenitoras mesenquimais pluripotente C3H10T1/2, células C2C12 pré-osteoblásticas, e células TE- 85 osteoblásticas. Atividade osteogênica é em seguida de- terminada por medições a indução de fosfatase alcalina, os- teocalcina, e mineralização da matriz (ver, por exemplo, Chengetal., JBone Joint SurgAm. 2003, 85-Um(8):1544-52).
A presente invenção também contempla ensaios in vivo para medir o crescimento do osso ou cartilagem. Por exemplo, Namkung-Matthai et al., Bone, 28:80-86 (2001) re- vela um modelo osteoporótico de rato no qual o reparo ósseo durante o período inicial depois que a fratura é estudada. Kubo et al., Steroid Biochemistry & Molecular Biology, 68:197-202 (1999) também revela um modelo osteoporótico de rato no qual o reparo ósseo durante o período posterior de- pois que fratura é estudada. Andersson et al., J. Endocri- nol. 170:529-537 descreve um modelo de osteoporose de ca- mundongos nos quais os camundongos são ovariectomizados, que leva os camundongos a perda substancial do conteúdo mi- neral ósseo e densidade mineral óssea, com o osso trabecu- lar perdendo aproximadamente 50 % de densidade mineral ós- sea. Densidade óssea pode ser maior nos camundongos ovari- ectomizados por administração de fatores tais como hormônio da paratireóide. Em certos aspectos, a presente invenção faz uso de ensaios de tratamento da fratura que são conhe- cidos na tecnologia. Estes ensaios incluem técnica de fra- tura, análise histológica, e análise biomecânica, que são descritos, por exemplo, em U.S. Pat. No. 6.521.750, que es- tá incorporado pela referência na sua íntegra para sua di- vulgação de protocolos experimentais para causar bem como medir a extensão de fraturas, e o processo de reparo.
6. Usos terapêuticos exemplares
Em certas modalidades, antagonistas ativina- ActRIIa (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa) da presente invenção podem ser usados para tratar ou prevenir um doença ou condição que é associada com o dano ósseo, quer, por e- xemplo, através de fratura, perda ou desmineralização. Em certas modalidades, a presente invenção fornece métodos de tratar ou prevenir dano ósseo em um indivíduo que necessita deste, administrando direto ao indivíduo uma quantidade te- rapeuticamente efetiva de um antagonista ativina-ActRRIIa, particularmente um polipeptídeo ActRIIa. Em certas modali- dades, a presente invenção fornece métodos de promover o crescimento ósseo ou mineralização em um indivíduo que ne- cessita deste, administrando direto ao indivíduo uma quan- tidade terapeuticamente efetiva de um antagonista ativina- ActRIIa, particularmente um polipeptídeo ActRIIa. Estes métodos são preferivelmente visados em tratamentos tera- pêuticos e profiláticos de animais, e mais preferivelmente, humanos. Em certas modalidades, a divulgação permite o uso de antagonistas ativina-ActRIIa (particularmente polipeptí- deos ActRIIa solúveis e anticorpos neutralizantes visados por ativina ou ActRIIa) para o tratamento de distúrbios associados com baixa densidade óssea ou menor resistência óssea.
Da maneira aqui usada, uma terapêutica que "pre- vine" um distúrbio ou condição refere-se a um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do distúr- bio ou condição na amostra tratada com relação a uma amos- tra de controle não tratada, ou atrasa o início de ação ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou condição com relação à amostra de controle não tratada. 0 termo "tratar" da maneira aqui usada inclui profilaxia da condição nomeada ou melhora ou eliminação da condição uma vez ela foi estabelecida. De qualquer maneira, de preven- ção ou tratamento pode ser discernido no diagnóstico for- necido por um médico e o resultado pretendido de adminis- tração do agente terapêutico.
A divulgação fornece métodos de indução do osso e/ou formação de cartilagem, prevenção de perda óssea, au- mento de mineralização óssea ou prevenção da desminerali- zação óssea. Por exemplo, os antagonistas da ativina- ActRIIa em questão têm aplicação em tratar osteoporose e a cicatrização de fraturas ósseas e defeitos de cartilagem em humanos e outro animais. Polipeptideo ActRIIa ou ativi- nas pode ser usado em pacientes que são diagnosticados com baixa densidade óssea sub clinica, como uma medida prote- tora contra o desenvolvimento de osteoporose.
Em uma modalidade especifica, métodos e composi- ções da presente invenção podem encontrar utilidade médica na cicatrização de fraturas ósseas e defeitos de cartila- gem em humanos e outro animais. Os métodos e composições em questão também podem ter uso profilático na redução de fra- tura fechada bem aberta e também na melhor fixação de arti- culações artificiais. A formação óssea de nova induzida por um agente osteogênico contribui para o reparo de de- feitos congênitos, induzido por trauma, ou craniofacial induzido por resseção oncológica, e também é usada em plástica cirurgia cosmética. Em certos casos, os antago- nistas ativina-ActRIIa em questão podem fornecer um ambi- ente para atrair células de formação óssea, estimular o crescimento de células de formação óssea ou induzir dife- renciação de progenitores de células de formação óssea. An- tagonistas da ativina-ActRIIa da invenção também pode ser usados no tratamento de osteoporose.
Métodos e composições da invenção podem ser apli- cados em condições caracterizadas por, ou que causam perda óssea, tais como osteoporose (incluindo osteoporose secun- dária), hiperparatireoidismo, doença de Cushing, doença de Paget, tirotoxicose, estado de diarréia crônica ou má ab- sorção, acidez tubular renal, ou anorexia nervosa.
Osteoporose pode ser ocasionada por, ou associado a vários fatores. Sendo fêmea, particularmente uma fêmea em pós menopausa, tendo um baixo peso corpóreo, e lavando uma estilo de vida sedentário são todos os fatores de risco pa- ra osteoporose (perda de densidade mineral óssea, levando a risco de fratura). Pessoas tendo qualquer dos seguintes perfis podem ser candidatos ao tratamento com um antagonis- ta ActRIIa: um mulher em pós menopausa e não tomando estro- gênio ou outro terapia de substituição hormonal; uma pessoa com um história materna ou paterna de fratura do quadril ou fumo; uma mulher em pós menopausa que é alta (acima 5 pés 7 polegadas (acima de 1,70 m) ) ou magra (menor do que 125 li- bras (56,7 quilos)); um homem com condições clinicas asso- ciadas com perda óssea; um pessoa usando medicamentos que são conhecidos por causar perda óssea, incluindo corticos- teróides tal como Prednisona™, vários medicamentos anticon- vulsivos tal como Dilantina™ e certos barbiturados, ou alta dose e medicamentos de substituição de tireóide; uma pessoa tendo diabetes tipo 1, doença do fígado, doença do rim ou uma história de osteoporose familiar; uma pessoa tendo alta renovação óssea (por exemplo, colágeno excessivo nas amos- tras de urina); uma pessoa com uma condição de tireóide, tal como hipertireoidismo; um pessoa que tenha experimenta- do trauma apenas brando depois de uma fratura; um pessoa que tenha tido evidência em raios-X de fratura vertebral ou outros sinais de osteoporose.
Da maneira notada anteriormente, osteoporose pode também resultar em uma condição associada com um outro dis- túrbio ou do uso de certos medicamentos. Osteoporose resul- tante de medicamentos ou uma outra condição médica é conhe- cida como osteoporose secundária. Em uma condição conhecida como doença de Cushing, a quantidade em excesso de cortisol produzido pelos resultados corpóreos em osteoporose e fra- turas. A maioria de medicamentos comuns associados com os- teoporose secundária são os corticosteróides, uma classe de medicamentos que age como cortisol, um hormônio produzido naturalmente pelas glândulas supra-renais. Embora níveis adequados de hormônios da tireóide (que são produzidos pela glândula tireóide) sejam necessários para o desenvolvimento do esqueleto, hormônio da tireóide em excesso pode diminu- ir a massa óssea por um tempo. Antiácidos que contêm alu- mínio can levar a perda óssea quando tomas em altas doses por pessoas com problemas renais, particularmente aquelas passando por diálise. Outros medicamentos que podem causar osteoporose secundária incluem fenitoína (Dilantina) e bar- biturados que são usados para prevenir convulsões; meto- trexato (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), um medicamento para as mesmas formas de artrite, câncer, e distúrbios i- munes; ciclosporina (Sandimune, Neoral), um medicamento usado para tratar algumas doenças autoimunes e para suprir o sistema imune em pacientes com transplante de órgãos; agonistas do hormônio de liberação do hormônio luteinizante (Lupron, Zoladex), usado para tratar câncer de próstata e endometriose; heparina (Calciparina, Liquaemina), uma me- dicação anticoagulante; e colestiramina (Questran) e co- lestipol (Colestid), usado para tratar colesterol alto. Perda óssea resultante de terapia de câncer é amplamente reconhecida e denominada terapia de câncer induzida por perda óssea (CTIBL). Metástase óssea pode criar cavidades no osso que podem ser corrigidas por tratamento com anta- gonistas da ativina-ActRIIa.
Em uma modalidade preferida, antagonistas ativi- na-ActRTIIa, particularmente um ActRIIa solúvel, aqui di- vulgado pode ser usado em pacientes com câncer. Pacientes tendo certos tumores (por exemplo, próstata, mama, mieloma múltipla ou qualquer tumor causando hiperparatireoidismo) estão em alto risco para perda óssea em função de perda ós- sea induzida por tumor bem como metástase óssea e agentes terapêuticos. Tais pacientes podem ser tratados com anta- gonistas da ativina-ActRIIa mesmo na ausência de evidência de perda óssea ou metástase óssea. Pacientes também podem ser monitorados para evidência de perda óssea ou metástase óssea, e podem ser tratados com antagonistas de ativina- ActRIIa no evento que indicadores sugerem um maior risco. Geralmente, varreduras DEXA são empregadas para avaliar mu- danças na densidade óssea, ao passo que indicadores de re- modelagem óssea pode ser usado para avaliar a probabilidade de metástase óssea. Marcadores de soro podem ser monitora- dos. Osso especifico fosfatase alcalina (BSAP) é uma enzi- ma que está presente em osteoblastos. Niveis sangüíneos de BSAP são maiores em pacientes com metástase óssea e outras condições que resultam em maior remodelagem óssea. Osteo- calcina e peptideos procolágeno são também associados com formação óssea e metástase óssea. Aumentos em BSAF foram detectados em pacientes com metástase óssea ocasionado por câncer de próstata, e para um menor grau, em metástase óssea de câncer de mama. Niveis de Proteína Morfomagnética Óssea-7 (BMP-7) são altos em câncer de próstata que metastatizou o osso, mas não em metástase óssea em função câncer de bexiga, pele, fígado, ou pulmão. Telopeptídeo terminal carbóxi tipo I (ICTP) é uma reticulação encontrada em colágeno que é formada durante a reabsorção óssea. Uma vez que o osso está constantemente sendo quebrado e reformado, ICTP será encon- trado por todo o corpo. Entretanto, no sítio de metástase óssea, o nível será significativamente maior que em uma á- rea de osso normal. ICTP foi encontrado em altos níveis em metástase óssea em função de câncer de próstata, pulmão, e de mama. Uma outra reticulação de colágeno, telopeptídeo N- terminal Tipo I (NTx), é produzido junto com ICTP durante a renovação do osso. A quantidade de NTx é maior em metástase óssea ocasionado por muitos diferentes tipos de câncer in- cluindo câncer de pulmão, próstata, e mama. Também, os ní- veis de NTx aumentam com a progressão da metástase óssea. Portanto, este marcador pode ser usado tanto para detectar metástase bem como para medir a extensão da doença. Outros marcadores de reabsorção incluem piridinolina e deoxipiri- dinolina. Qualquer aumento nos marcadores reabsorção ou marcadores de metástase óssea indica a necessidade de tera- pia de antagonista ativina-ActRIIa em um paciente. Antagonistas da ativina-ActRIIa pode ser conjun- tamente administrada com outros agentes farmacêuticos. Ad- ministração conjunta pode ser realizada por administração de uma coformulação única, por administração simultânea ou por administração em tempos separados. Antagonistas ativi- na-ActRIIa podem ser de uma maneira particular vantajosa- mente se administrados com outro agente ativos ósseos. Um paciente pode beneficiar conjuntamente recebendo antagonis- ta ativina-ActRIIa e tomando suplementos de cálcio, vitami- na D, exercícios apropriados e/ou, em alguns casos, outra medicação. Exemplos de outros medicamentos incluem, bisfos- fonatos (alendronato, ibandronato e risedronato), calcito- nina, estrogênios, hormônio de paratireóide e raloxifeno. Os bisfosfonatos (alendronato, ibandronato e risedronato), calcitonina, estrogênios e raloxifeno afetam o ciclo de re- modelagem óssea e são classificados como medicamentos anti- ressortivos. Remodelagem óssea consiste de dois estágios distintos: ressorção óssea e formação óssea. Medicamentos anti-ressortivos diminuem ou interrompem a porção de resor- ção óssea do ciclo de remodelagem óssea, mas não reduzem a porção de formação óssea do ciclo. Como um resultado, nova formação continua em uma taxa maior do que ressorção óssea e densidade óssea pode aumentar várias vezes. Teriparati- deo, um forma de hormônio da paratireóide, aumenta a taxa de formação óssea no ciclo de remodelagem óssea. Alendro- nato é aprovado tanto para a prevenção (5 mg por dia ou 35 mg uma vez uma semana) quanto para tratamento (10 mg por dia ou 70 mg uma vez uma semana) de osteoporose pós- menopausa. Alendronato reduz a perda óssea, aumenta a den- sidade óssea e reduz o risco de spina, pulso e fratura dos quadris. Alendronato também é aprovado para tratamento de osteoporose induzido por glucocorticóide em homens e mu- lheres com um resultado de uso de longa data destes medi- camentos (isto é, prednisona e cortisona) e para o trata- mento de osteoporose em homens. Alendronato mais vitamina D é aprovado para o tratamento de osteoporose em mulheres em pós-menopausa (70 mg uma vez uma semana mais vitamina D) , e para tratamento para melhorar a massa óssea em ho- mens com osteoporose. Ibandronato é aprovado para a pre- venção e tratamento de osteoporose de pós-menopausa. Toma- do na forma de pílula um uma vez ao mês (150 mg), ibandro- nato deve ser tomado no mesmo dia cada mês. Ibandronato reduz a perda óssea, aumenta a densidade óssea e reduz o risco de fraturas na espinha dorsal. Risedronato é aprova- do para a prevenção e tratamento de osteoporose pós- menopausa. Tomado diariamente (5 mg dose) ou semanalmente (35 mg dose ou 35 mg dose com cálcio), risedronato diminui a perda óssea, aumenta a densidade óssea e reduz o risco de fraturas da espinha dorsal e não espinha dorsal. Risedrona- to também é aprovado para uso por homens e mulheres para prevenir e/ou tratar osteoporose induzida por glucocorti- cóide que resulta do uso a longo prazo destes medicamentos (isto é, prednisona ou cortisona). Calcitonina é um hormô- nio de ocorrência natural envolvida em regulação de cálcio e metabolismo ósseo. Em mulheres que estão com mais que 5 anos além da menopausa, calcitonina diminui a perda óssea, aumenta a densidade óssea da espinha, e pode aliviar a dor associada com fraturas ósseas. Calcitonina reduz o risco de fraturas da espinha. Calcitonina é disponível como uma injeção (50-100 IU diariamente) ou aspersão nasal (200 IU diariamente). Terapia de estrógeno (ET)/ terapia Hormonal (HT) é aprovada para a prevenção de osteoporose. ET foi apresentado para reduzir perda óssea, aumentar a densidade óssea tanto na espinha dorsal quanto quadril, e reduzir o risco de fraturas do quadril e espinha em mulheres em pós- menopausa. ET é administrada mais comumente na forma de uma pílula ou adesivo dérmico que distribui uma baixa dose de aproximadamente 0,3 mg diariamente ou uma dose padrão de aproximadamente 0,625 mg diariamente e é efetivo mesmo quando iniciado depois de 70 anos de idade. Quando estrogê- nio é tomado sozinho, ele pode aumentar um risco da mulher desenvolver câncer do revestimento uterino (câncer endome- trial). Para eliminar este risco, provedores da área de sa- úde o hormônio prescrevem progestina em combinação com es- trogênio (terapia de substituição hormonal ou HT) para es- sas mulheres que têm um útero intacto. ET/HT aliviou os sintomas da menopausa e mostrou ter um efeito benéfico na saúde óssea. Efeitos colaterais podem incluir hemorragia vaginal, mama ternura, distúrbios do humor e doença da ve- sícula biliar. Raloxifeno, 60 mg ao dia, é aprovado para a prevenção e tratamento de osteoporose pós-menopausa. Ele é proveniente de uma classe de medicamentos denominada Modu- ladores do Receptor de Estrógeno Seletivo (SERMs) que foi desenvolvida para fornecer os efeitos benéficos de estrogê- nios sem suas desvantagens potenciais. Raloxifeno aumenta a massa óssea e reduz o risco de fraturas da espinha dorsal. Dados não estão ainda disponíveis para demonstrar que ralo- xifeno pode reduzir o risco de fraturas de quadril e outra não espinha dorsal. Teriparatídeo, uma forma de hormônio da paratireóide, é aprovado para o tratamento de osteoporose em mulheres em pós-menopausa e homens que estão em alto risco de uma fratura. Esta medicação estimula nova formação óssea e aumenta significativamente a densidade mineral ós- sea. Em mulheres em pós-menopausa, redução da fratura foi notada na espinha, quadril, pés, costelas e pulso. Em ho- mens, redução da fratura foi notada na espinha, mas dados foram insuficientes para avaliar a redução da fratura em outros locais. Teriparatídeo é auto administrada como uma injeção diariamente por até 24 meses.
7. Composições farmacêuticas
Em certas modalidades, antagonistas da ativina- ActRIIa (por exemplo, polipeptídeos ActRIIa) da presente invenção são formulados com um carreador farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, um polipeptídeo ActRIIa pode ser administrado sozinho ou como um componente de uma formula- ção farmacêutica (composição terapêutica), os compostos em questão pode ser formulados para administração em qualquer meio conveniente para uso na medicina humana ou veteriná- ria.
Em certas modalidades, o método terapêutico da invenção inclui administrar a composição sistemicamente, ou localmente como um implante ou dispositivo. Quando adminis- trada, a composição terapêutica para uso nesta invenção é claro, em uma forma fisiologicamente aceitável sem pirogê- nio. Agentes terapeuticamente usados sem ser os antagonis- tas ActRIIa que também podem opcionalmente ser incluídos na composição da maneira supradescrita, pode ser administrada simultaneamente ou seqüencialmente com os compostos em questão (por exemplo, polipeptideos ActRIIa) nos métodos da invenção.
Tipicamente, antagonistas de ActRIIa serão admi- nistrados parentalmente. Composições farmacêuticas adequa- das para administração parenteral pode compreender um ou mais polipeptídeos ActRIIa em combinação com uma ou mais soluções aquosas ou não aquosas isotônicas estéreis farma- ceuticamente aceitáveis, dispersões, suspensões ou emul- sões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em solu- ções injetáveis estéreis ou dispersões apenas antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, bacteriostatos, solutos que render a formulação isotônica com o sangue do recipiente pretendido ou agentes de suspensão ou espessan- te. Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e mis- turas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dis- persões, e pelo uso de agentes tensoativos.
Adicionalmente, a composição pode ser encapsulada ou injetada em uma forma para distribuído a um local do te- cido alvo (por exemplo, osso). Em certas modalidades, com- posições da presente invenção podem incluir uma matriz ca- paz de distribuir um ou mais compostos terapêuticos (por exemplo, polipeptideos ActRIIa) para um local do tecido al- vo (por exemplo, osso), fornecendo uma estrutura para o de- senvolvimento do tecido e da melhor forma capaz de ser re- absorvido no corpo. Por exemplo, a matriz pode fornecer li- beração lenta dos polipeptideos ActRIIa. Tais matrizes po- dem ser formadas de materiais atualmente em uso para outras aplicações médicas implantadas.
A escolha do material da matriz é baseada em bio- compatibilidade, biodegradabilidade, propriedades mecâni- cas, aparência cosmética e propriedades interface. A apli- cação particular das composições em questão definirá a for- mulação apropriada. Matrizes potenciais para as composições podem ser biodegradáveis e sulfato de cálcio quimicamente definido, tricalciofosfato, hidroxiapatita, ácido poliláti- co e polianidridos. Outros materiais potenciais são biode- gradáveis e biologicamente bem definidos, tais como osso ou colágeno dérmico. Matrizes adicionais são compreendidas de proteínas puras ou componentes de matriz extracelulares.
Outras matrizes potenciais são não biodegradáveis e quimi- camente definidas, tais como hidroxiapatita sinterizada, biovidro, aluminatos, ou outras cerâmicas. Matrizes podem ser compreendidas de combinações de qualquer dos tipos men- cionados anteriormente de material, tais como ácido poli- láctico e hidroxiapatita ou colágeno e tricalciofosfato. Os biocerâmicos podem ser alterados na composição, tal como em aluminato-fosfato de cálcio e processamento para alterar o tamanho de poro, tamanho de partícula, forma de partícula, e biodegradabilidade.
Em certas modalidades, métodos da invenção podem ser administrados oralmente, por exemplo, na forma de cáp- sulas, sachês, pílulas, comprimidos, pastilhas (usando uma base flavorizada, normalmente sacarose e acácia ou traga- canto), pós, grãnulos, ou como uma solução ou uma suspensão em um líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão lí- quida óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tais co- mo gelatina e glicerina, ou sacarose e acácia) e/ou como enxaguantes bucais e similares, cada contendo uma quantida- de predeterminada de um agente como um ingrediente ativo. Um agente também pode ser administrado como um bolo, elec- tuário ou pasta.
Em formas de dosagem sólidas para administração oral (cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grãnu- los, e similares), um ou mais compostos terapêuticos da presente invenção podem ser misturados com um ou mais car- readores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato de dicálcio, e/ou qualquer dos seguintes: (1) enchimentos e extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) ligan- tes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, algina- tos, gelatina, polivinil pirrolidona, sacarose, e/ou acá- cia; (3) umectantes, tal como glicerol; (4) agentes de de- sintegração, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, ba- tata ou amido de tapioca, ácido alginico, certos silicatos, e carbonato de sódio; (5) agentes de retardamento de solu- ção, tal como parafina; (6) aceleradores de absorção, tal como compostos de amônio quaternário; (7) agentes umectan- tes, tais como, por exemplo, álcool cetilico e monostearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulim e terra de bentonita; (9) lubrificantes, tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio, e misturas destes; e (10) agentes de coloração. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as composições farmacêuticas também podem compreender os agentes de tamponamento. Composições sólidas de um tipo si- milar também podem ser empregadas como enchimentos em gela- tina cápsulas de enchimento macio e duro usando tais exci- pientes como lactose ou açúcares de leite, bem como polie- tileno de glicóis alto peso molecular e similares.
Formas de dosagem líquidas para administração o- ral incluem emulsões farmaceuticamente aceitável, microe- mulsões, soluções, suspensões, xaropes, e elixires. Além do ingrediente ativo, as formas líquidas de dosagem podem con- ter diluentes inertes comumente usados na tecnologia, tais como água ou outros solventes, agentes solubilizantes e e- mulsificadores, tais como álcool etílico, álcool isopropí- lico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzíli- co, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno gi- col, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, a- mendoim, milho, germe, oliva, castor, e sésamo), glicerol, álcool tetraidrofurilico, polietileno glicóis e ésteres de ácido graxo de sorbitano, e misturas destes. Baseado em di- luentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes umectantes, emulsificantes e agentes de suspensão, edulcorantes, flavorizantes, coloran- tes, perfumantes, e agentes conservantes.
Suspensões, além dos compostos ativos, podem con- ter agentes de suspensão tais como álcoois isostearilicos etoxilados, polioxietileno sorbitol, e ésteres do sorbita- no, celulose microcristalina, metaidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e tragacanto, e misturas destes.
As composições da invenção também podem conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, a- gentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção da ação de microorganismos pode ser assegurada pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exem- plo, parabeno, clorobutanol, ácido sórbico fenol, e simila- res. Pose-se também desejar incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas com- posições. Além disso, absorção prolongada da forma farma- cêutica injetável pode ser realizada pela inclusão de agen- tes que atrasam absorção, tais como monostearato de alumí- nio e gelatina.
Entende-se que o regime de dosagem será determi- nado pelo médico atendente considerando vários fatores que modificam a ação dos compostos da invenção em questão (por exemplo, polipeptideos ActRIIa). Os vários fatores incluem, mas sem limitações, quantidade de peso ósseo desejado pode ser formado, o grau de densidade de perda óssea, o local do dano ósseo, a condição do dano ósseo, a idade do paciente, sexo, e dieta, a gravidade de qualquer doença que pode con- tribuir para a perda óssea, tempo de administração, e ou- tros fatores clínicos. Opcionalmente, os meios de dosagem variam com o tipo de matriz usado na reconstituição e os tipos de compostos na composição. A adição de outros fato- res de crescimento conhecidos até a composição final, tam- bém pode afetar a dosagem. Progresso pode ser monitorado por avaliação periódica de crescimento ósseo e/ou reparo, por exemplo, raios-X (incluindo DEXA), determinações histo- morfométricas, e marcação de tetraciclina.
Experimentos com camundongos têm demonstrado que efeitos de ActRIIa-Fc no osso são detectáveis quando o com- posto é dosado em intervalos e quantidades suficientes para alcançar a concentração sérica de 0,2 pg/kg ou mais, e ní- veis de soro de 1 pg/kg ou 2 pg/kg ou mais são desejáveis para obter efeitos significativos na densidade e resistên- cia óssea. Embora não haja nenhuma indicação de que maiores doses de ActRIIa-Fc sejam indesejáveis em função de efeitos colaterais, regimes de dosagem podem ser designados para alcançar concentrações séricas entre 0,2 e 15 pg/kg, e op- cionalmente entre 1 e 5 pg/kg. Em humanos, níveis de soro de 0,2 pg/kg podem ser alcançados com uma dose única de 0,1 mg/kg ou mais e níveis de soro de 1 pg/kg podem ser alcan- çados com uma dose única de 0,3 mg/kg ou mais. A meia-vida sérica observada da molécula é entre cerca de 20 e 30 dias, substancialmente maior do que a maioria das proteínas de fusão Fe, e assim um nível de soro efetivo sustentado pode ser alcançado, por exemplo, dosando com 0,2-0,4 mg/kg em uma base semanalmente ou bisemanalmente, ou doses maiores pode ser usadas com maiores intervalos entre as dosagens. Por exemplo, doses de 1-3 mg/kg podem ser usadas em um base mensalmente ou bimensalmente, e o efeito no osso pode ser suficientemente durável que dosagem é necessário apenas uma vez a cada 3, 4, 5, 6, 9, 12 ou mais meses.
Em certas modalidades, a presente invenção também fornece terapia genética para o produção de polipeptídeos ActRIIa in vivo. Tal terapia obterá seu efeito terapêutico por introdução da seqüência de polinucleotídeos ActRIIa nas células ou tecidos tendo os distúrbios da maneira listada anteriormente. Distribuição de seqüências de polinucleotí- deo ActRIIa pode ser alcançada usando um vetor de expressão recombinante tais como um vírus quimérico ou um sistema de dispersão coloidal. O uso de lipossomos visados é preferido para distribuição terapêutica de seqüências de polinucleo- tídeo de ActRIIa.
Vários vetores viral que podem ser utilizados pa- ra terapia genética da maneira aqui preceituada, incluem adenovírus, vírus da herpes, varíola, ou, preferivelmente, um vírus do RNA tal como um retrovírus. Preferivelmente, o vetor retroviral é um derivado de um retrovírus de murina ou ave. Exemplos de vetores retrovirais nos quais um gene estranho único pode ser inserido incluem, mas sem limita- ções: vírus da leucemia murina Moloney (MoMuLV), vírus do sarcoma murina Harvey (HaMuSV), vírus de tumor mamário mu- rina (MTV), e Vírus do Sarcoma Rous (RSV) . Diversos ve- tores retrovirais adicionais podem incorporar genes múlti- pios. Todos desses vetores podem transferir ou incorporar um gene para um marcador selecionável de maneira que célu- las transduzidas possam ser identificadas e geradas. Veto- res retrovirais podem ser feitos alvo-específico anexando, por exemplo, um açúcar, um gicolipídeo, ou uma proteína. Alvejamento preferido é realizado usando um anticorpo. Versados na tecnologia reconhecem que seqüências de polinu- cleotídeo específicas podem ser inseridas no genoma retro- viral ou anexadas a um envelope viral para permitir dis- tribuição do.alvo específico do vetor retroviral contendo o polinucleotídeo ActRIIa. Em uma modalidade preferida, o ve- tor é visado para osso ou cartilagem.
Alternativamente, células de cultura de tecido podem ser diretamente transfectadas com plasmídeos que co- dificam os genes estruturais retrovirais gag, pol e env, por transfecção de fosfato de cálcio convencional. Estas células são em seguida transfectadas com o plasmídeo do vetor contendo os genes de interesse. -As das células resul- tantes liberam o vetor retroviral no meio de cultura.
Um outro sistema de distribuição visado para po- linucleotídeos ActRIIa é um sistema de dispersão coloidal. Sistemas de dispersão coloidal incluem complexos de macro- molécula, nanocápsulas, microesferas, gotas, e sistemas baseado em lipídeo incluindo emulsões de óleo-em-água, mi- celas, micelas misturadas, e lipossomos. O sistema coloidal preferido desta invenção é um lipossomo. Lipossomos são vesiculas da membrana artificial que são usadas como veí- culos de distribuição in vitro e in vivo. RNA, DNA e ví- rions intactos podem ser encapsulados no interior aquoso e ser distribuído às células em uma forma biologicamente a- tivo (ver, por exemplo, Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Métodos para transferência genética e- ficiente usando um veículo lipossomo, são conhecidos na tecnologia, ver, por exemplo, Mannino, et al., Biotechni- que, 6:682, 1988. A composição do lipossomo é normalmente uma combinação de fosfolipídeos, normalmente em combinação com esteróides, especialmente colesterol. Outros fosfolipí- deos ou outros lipídeos também podem ser usados. As carac- terísticas físicas de lipossomos depende do pH, intensidade iônica, e a presença de cátions divalentes.
Exemplos de lipídeos usados na produção de lipos- somo incluem compostos de fosfatidila, tais como fosfatidi- laglicerol, fosfatidilacolina, fosfatidilaserina, fosfati- dilaetanolamina, esfingolipídeos, cerebrosídeos, e ganglio- sídeos. Fosfolipídeos ilustrativos incluem egg fosfatidila- colina, dipalmitoilfosfatidilacolina, e distearoilfosfati- dilacolina. O alvejamento de lipossomos é também possível baseado, por exemplo, na especificidade o órgão, especifi- cidade celular, e especificidade de organela e é conhecido na tecnologia.
EXEMPLIFICAÇÃO
A invenção agora sendo descrita geralmente, será mais facilmente entendida pela referência aos exemplos se- guintes, que são incluídos apenas com propósito de ilustra- ção de certas modalidades e modalidades da presente inven- ção, e não são para limitar a invenção.
Exemplo 1: Proteínas de fusão ActRIIa-Fc
Requerentes construíram uma proteína de fusão Ac- tRIIa solúvel que tem o domínio extracelular de ActRIIa hu- mano fundido com um domínio Fc humano ou de eamundongos com um ligante mínimo em entre. As construções são referidas como ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc, respectivamente.
ActRIIa-hFc é mostrado a seguir como purificado a
partir de linhas celulares CHO (SEQ ID NO: 7):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSI
EIVKQGCWLDDINGYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEV
TOPTSNPYTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSWLFPPKPKDTLMISRTPEV
TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVL
HODWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTK
NOVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTV DKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
As proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram ex- pressas em linhas celulares CHO. Três diferentes seqüências líderes foram consideradas:
(i) Abelha melitina (HBML): MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO: 8)
(ii) Ativador Plasminogênio de Tecido (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 9)
(iii) Nativo: MGAAAKLAFAVFLISCSSGA (SEQ ID NO: 10) .
A forma selecionada emprega o líder TPA e tem a seguinte seqüência de aminoácido não processada: MDAMKRGLCCYLLLCGAWVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQT GVEPCYGDKDKI^CFATWKOTSGSffilVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKD SPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALP VPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTÇLVKGFYPSDIAVE WESNG QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK (SEQID N0:13)
Este polipeptideo é codificado pela seguinte se- qüência de ácido nucléico:
ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAG
CAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAG
GAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAAC
TGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTG
CTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTT
GGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAA
AGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGGTGTGAGGGCAATATGTGTAATG
AAAAGTTTTGTTATlTrCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAAT
CCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAAGTCACACATGCCCAC
CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC
CCAAAACCCAAGGACAÇCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT
GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG
GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCGAAGACAAAGCCGCGGGA
GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA
AAGCCCTCCCAGTCGCCATCGAGAAAACCATGTCCAAAGCCAAAGGGCA
GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCÇCCATCCCGGGAGGAGATG
ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA
GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT
ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAT
AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT
CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCAGTACACGCAGAAGAG
CCTCTCCCTGTCTCGGGGTAAATGAGAATTC (SEQ ID NO: 14)
Tanto ActRIIa-hFc quanto ActRIIa-mFc foram nota- velmente receptivos à expressão recombinante. Da maneira mostrada na figura 1, a proteína foi purificada como um único pico bem definido de proteína. Seqüenciamento N- terminal revelou uma única seqüência de-ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11). A purificação pode ser alcançada por uma série de etapas de cromatografia de coluna, incluindo, por exemplo, três ou mais das seguintes, em qualquer ordem: cromatogra- fia de proteína A, cromatografia de Q sefarose, cromato- grafia de fenilsefarose, cromatografia de exclusão de ta- manho, e cromatografia por troca catiônica. A purificação pode ser completa com filtração viral e troca de tampão. A proteína ActRIIa-hFc foi purificada com uma pureza de >98 % determinado por cromatografia de exclusão de tamanho e >95 % determinado por SDS PAGE.
ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc mostraram uma alta afi- nidade com ligantes, particularmente ativina A. GDP-Il ou Ativina A (wActA") foram imobilizados em um chip Biacore CM 5 usando procedimento de acoplamento de amina padrão. Proteínas ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc foram carregadas no sistema, e a ligação foi medida. ActRIIa-hFc liga a ativi- na com uma constante de dissociação (Kd) de 5 χ IO12, e a proteína liga a GDFll com um Kd de 9,9 6 χ IO"9. Ver figura 2. ActRIIa-mFc comportou similarmente.
Um Ensaio Genético Reportador A-2 04 foi usado pa- ra avaliar os efeitos de proteínas ActRIIa-hFc na sinaliza- ção por GDF-Il e Ativina A. Linha celular: Rabdomiosarcoma Humano (derivados de músculo). Vetor Reportador: p- GL3(CAGA)12 (Descritos em Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.) Ver Figura 3. 0 motivo de CAGAI2 estar presen- te em genes responsivos TGF-Beta (PM-1 gene), assim, este vetor é de uso geral para fatores de sinalização através de Smad2 e 3.
Dia 1: células A-204 divididas em placa de 48 po- ços .
Dia 2: células A-204 transf ectadas com 10 pg p-
GL3(CAGA)12 ou pGL3(CAGA)12 (10 pg)+pRLCMV (1 pg) e Fugeno.
Dia 3: Adicionar fatores (diluídos no meio + BSA 0,1 %) . Inibidores necessários podem ser pré incubados com Fatores por 1 hora antes de adicionar às células. 6 horas depois, células rinsadas com PBS, e as células lisadas.
Isto é seguido por um ensaio Luciferase. Tipica- mente neste ensaio, na ausência de qualquer inibidores, A- tivina A mostra aproximadamente 10 vezes mais estímulo de expressão do gene reportador e um ED50 = 2 ng/mL. GDF-11: 16 vezes mais estímulo, ED50: = 1,5 ng/mL. GDF-8 mostra um efeito similar a GDF-11.
Da maneira mostrada na figura 4, ActRIIa-hFc e ActRIIa-mFc inibem sinalização mediada por GDF -8 em con- centrações picomolares. Da maneira mostrada na figura 5, três diferentes preparações de ActRIIa-hFc inibem sinali- zação de GDP-Il com um IC50 de aproximadamente 200 pM.
O ActRIIa-hPc foi muito estável em estudos farma- cocinéticos. Ratos foram dosados com 1 mg/kg, 3 mg/kg ou 10 mg/kg de proteína ActRIIa-hFc e níveis plasmáticos da pro- teína foram medidos em 24, 48, 72, 144 e 168 horas. Em um estudo separado, ratos foram dosados em 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg. Em ratos, ActRIIa-hFc tem uma meia-vida sérica nos dias 11-14 e níveis de circulação do medicamento foram bastante altos depois de duas semanas (11 pg/mL, 110 pg/mL ou 304 pg/mL para administração inicial de 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg, respectivamente.) Em macacos cynomolgus, a meia-vida plasmática foi substancialmente maior do que 14 dias e niveis de circulação do medicamento foram 25 pg/mL, 304 pg/mL ou 1440 pg/mL para administração inicial de 1 mg/kg, 10 mg/kg ou 30 mg/kg, respectivamente. Resultados preliminares em humanos sugerem que a meia-vida sérica se- ja entre cerca de 20 e 30 dias.
Exemplo 2: ActRIIa-mFc promove o crescimento ósseo In Vivo
Camundongos fêmeas normais (BALB/c) foram dosados com ActRIIa-mFc em um nivel de 1 mg/kg/dose, 3 mg/kg/dose ou 10 mg/kg/dose, com doses dadas duas vezes semanalmente. Densidade mineral óssea e conteúdo mineral ósseo foram de- terminados por DEXA, ver figura 6.
Em camundongos fêmeas BALB/c, varreduras DEXA mostraram um aumento significativo (>20 %) na densidade mi- neral óssea e conteúdo como um resultado de tratamento Ac- tRIIa-mFc. Ver figuras 7 e 8.
Assim, antagonismo de ActRIIa ocasionou maior densidade óssea e conteúdo em camundongos fêmeas normais.
Como uma etapa seguinte, o efeito de ActRIIa-mFc no osso em um camundongos modelo para osteoporose foi testado.
Andersson et al. (2001), estabeleceu que camun- dongos ovariectomizados sofreram perda óssea substancial (aproximadamente 50 % de perda do osso trabecular seis se- manas após a operação) , e que perda óssea nesses camundon- gos pode ser corrigida com agentes terapêuticos candida- tos, tal como hormônio da paratireóide.
Requerentes usaram camundongos fêmeas C57BL6 que foram ovariectomizados (OVX) ou operados simulados com 4-5 semanas de idade. Oito semanas depois da cirurgia, trata- mento com ActRIIa-mFc (10 mg/kg, duas vezes semanalmente) ou controle (PBS) foi iniciado. A densidade óssea foi me- dida por digitalizador CT.
Da maneira mostrada na figura 9, camundongos ova- riectomizados não tratados apresentaram perda de densidade óssea trabecular substanciais com relação ao controles si- mulados depois de seis semanas. 0 tratamento ActRIIa-mFc restaurou a densidade óssea para o nivel dos camundongos com operação simulada. Em 6 e 12 semanas do tratamento, ActRIIa-mFc ocasionou aumento substancial no osso trabecu- lar de camundongos OVX. Ver figura 10. Depois 6 semanas de tratamento, densidade óssea aumentou por 24% com relação a controles PBS. Depois de 12 semanas, o aumento foi de 27%.
Nos camundongos com operação simulada, ActRIIa- mFc também ocasionou um aumento substancial no osso trabe- cular. Ver figura 11. Depois de 6 e 12 semanas, o trata- mento produziu um aumento de 35% de com relação aos con- troles.
Em um conjunto adicional de experimentos, camun- dongos ovariectomizado (OVX) ou com operação simulada da maneira supradescrita foram tratados com ActRIIa-mFc (10 mg/kg, duas vezes semanalmente) ou controle (PBS) durante doze semanas. Similar aos resultados supradescritos para ActRIIa-mFc, camundongos OVX recebendo ActRIIa-mFc apresen- taram um aumento na densidade óssea trabecular de 15 % em apenas quatro semanas e 25 % depois de 12 semanas de tra- tamento (Figura 12). Camundongos com operação simulada re- cebendo ActRIIa-mFc mostraram similarmente um aumento na densidade óssea trabecular de 22 % em apenas quatro sema- nas e de 32 % depois de 12 semanas de tratamento (Figura 13).
Depois de doze semanas de tratamento com ActRIIa- mFc, análise DEXA em fêmur ex vivo e todo o corpo mostrou que o tratamento induz um aumenta na densidade óssea tanto em camundongos ovariectomizado quanto com os operados simu- lados (Figuras 14A e 14B, respectivamente). Estes resulta- dos são também suportados por análise pQCT ex vivo do eixo médio femoral que demonstram um aumenta significativo tan- to em densidade óssea total quanto cortical depois de doze semanas de tratamento com ActRIIa-mFc. Camundongos ovari- ectomizados de controle tratados com veiculo apresentaram densidades ósseas que foram comparáveis aos camundongos com operação simulada de controle tratados com veiculo (Figura 15). Além da densidade óssea, conteúdo ósseo au- menta depois do tratamento com ActRIIa-mFC. Análise pQCT Ex vivo do eixo médio femoral demonstrou um aumento significa- tivo tanto no conteúdo ósseo total quanto cortical depois de doze semanas de tratamento com ActRIIa-mFc ao passo que tanto camundongos tratado com veiculo controle ovariecto- mizado quanto os operados simulados apresentaram conteúdo ósseo comparável (Figura 16). Análise pQCT ex vivo do eixo médio femoral também mostrou que camundongos tratados com ActRIIa-mFc não apresentam um mudança na circunferência periosteal; entretanto tratamento com ActRIia-mFc resultou em uma menor em circunferência endosteal indicando um au- mento na espessura cortical em função de crescimento na su- perfície interna do fêmur (Figura 17).
Testes mecânicos de fêmures determinou que ActRI- Ia-mFc foi capaz de aumentar as características extrínsecas do osso (carga máxima, rigidez e energia para ruptura) que contribui para um aumento significativo nas propriedades intrínsecas (resistência máxima) do ossos. Camundongos o- variectomizados tratados com ActRIIa-mFc apresentaram mai- or resistência óssea para níveis além de operados simula- dos, controles tratados com veículo, indicando uma comple- ta reversão do fenótipo osteoporótico (Figura 18).
Estes dados demonstram que um antagonista ativina- ActRIIa pode aumentar a densidade óssea nos camundongos fê- meas normais e, além disso, corrigir defeitos na densidade óssea, conteúdo ósseo, e finalmente resistência óssea, em um camundongos modelo de osteoporose.
Em um conjunto adicional de experimentos, camun- dongos foram ovariectomizados ou operados simulados em 4 semanas, e começando nas 12 semanas recebendo tanto placebo quanto ActRIIa-mFc (2 vezes/semana, 10 mg/kg) (também refe- rido como RAP-Il nas Figuras 19-24), por um período adicio- nal de 12 semanas. Uma variedade de parâmetros ósseos foi avaliada. Da maneira mostrada na figura 19, ActRIIa-mFc au- menta volume ósseo trabecular vertebral para o razões de vo- lume total (BV/TV) tanto no OVX quanto Camundongos com ope- ração simulada. ActRIIa-mFc também melhora a arquitetura trabecular (Figura 20), aumenta a espessura cortical (Figu- ra 21) e melhora a resistência óssea (Figura 22). Da manei- ra mostrada na figura 23, ActRIIa-mFc produziu efeitos de- sejáveis em uma faixa de doses de 1 mg/kg a 10 mg/kg.
Histomorfometria óssea foi conduzida em um ponto de tempo de 2 semanas em camundongos com operação simulada. Estes dados, apresentados na figura 24, demonstram que Ac- tRIIa-mFc tem um efeito duplo, tanto inibindo ressorção ós- sea quanto promovendo o crescimento ósseo. Assim, ActRIIa- mFc estimula o crescimento ósseo (efeito anabólico) e inibe a ressorção óssea (efeito anti-catabólico) .
Exemplo 4: Proteínas ActRIIa-Fc alternativas
Uma construção alternativa pode ter uma deleção da calda do C-terminal (os 15 aminoácidos finais do domínio ex- tracelular de ActRIIa. A seqüência para uma construção como essa é apresentada a seguir (sublinhado por porção Fe) (SEQ ID NO: 12):
ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSI
EIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTG
GGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVYDYSHEDPEV
KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVYSVLTVLHODWLNGICE YICCK
VSNKALPWIÉKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNYFSCS
VMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
INCORPORAÇÃO PELA REFERÊNCIA
Todos os pedidos e patentes aqui mencionados são por meio deste incorporados pela referência na sua íntegra como se cada pedido ou patente individual fosse especifica- mente e individualmente indicado para ser incorporado pela referência.
Embora modalidades especificas da matéria em questão tenham sido discutidas, a especificação apresentada é ilustrativa, e não restritiva. Muitas variações ficarão aparentes aos versados na tecnologia mediante revisão desta especificação e das reivindicações a seguir. 0 escopo total da invenção pode ser determinado pela referência às rei- vindicações, junto com seu escopo total de equivalentes, e a especificação, junto com tais variações. PHPH--PWO-019_Substitute_Sequence_Li sting. txt SEQUENCE LISTING
<110> Acceleron Pharma Inc. Knopf, John Seehra, Jasbir
<120> ANTAGONISTAS DA ATIVINA-ACTRIIA E USOS PARA PROMOVER CRESCIMENTO ÓSSEO
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<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala vai Phe Leu Ile Ser Cys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Ala Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe 20 25 30 Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly vai Glu 35 40 45 Pro Cys Tyr Gly Asp Lys ASD Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp 50 55' 60 Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile vai Lys Gln Gly Cys Trp Leu 65 70 75 80 Asp Asp Ile Asn Cys 85 Tyr ASp Arg Thr Asp 90 Cys Val Glu Lys Lys 95 Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu IOO 105 110 Lys Phe ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu vai Thr Gln Pro Thr Ser Asn 115 120 125 Pro vai Thr Pro Lys Pro Pro Tyr Tyr Asn Ile Leu Leu Tyr Ser Leu 130 135 140 Val Pro Leu Met Leu Ile Ala Gly Ile vai Ile Cys Ala Phe Trp vai 145 150 155 160 Tyr Arg Hi s Hi S Lys Met Ala Tyr Pro Pro vai Leu Val Pro Thr Gln 165 170 175 Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190 Gln Leu Leu Glu Val Lys Ala Arg Gly Arg Phe Gly Cys vai Trp Lys 195 200 205 Ala Gln Leu Leu Asn GlU Tyr vai Ala vai Lys Ile Phe Pro Ile Gln 210 215 220 Asp Lys Gln Ser Trp Gln Asn Glu Tyr Glu Val Tyr Ser Leu Pro Gly 225 230 235 240 Met Lys Hi s Glu Asn Ile Leu Gln Phe Ile Gly Ala Glu Lys Arg Gly 245 250 255 Thr Ser vai ASp vai ASp Leu Trp Leu Ile Thr Ala Phe His Glu Lys PHPH-PWO-019_Substitute_Sequence_l _i sting. Cxt 260 265 270 Gly Ser Leu Ser Asp Phe Leu Lys Ala Asn vai vai Ser Trp Asn Glu 275 280 285 Leu Cys His Ile Ala Glu Thr Met Ala Arg Gly Leu Ala Tyr L„eu Hi S 290 295 300 Glu Asp Ile Pro Gly Leu Lys Asp Gly His Lys Pro Ala Ile Ser Hi s 305 310 315 320 Arg Asp Ile Lys Ser Lys as η vai Leu Leu Lys Asn Asn Leu Thr Ala 325 330 335 Cys Ile Ala ASP Phe Gly Leu Ala Leu Lys Phe Glu Ala Gly Lys Ser 340 345 350 Ala Gly Asp Thr His Gly Gln vai Gly Thr Arg Arg Tyr Met Ala Pro 355 360 365 Glu vai Leu Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gln Arg Asp Ala Phe Leu Arg 370 375 380 Ile Asp Met Tyr Ala Met Gly Leu vai Leu Trp Glu Leu Ala Ser Arg 385 390 395 400 Cys Thr Ala Ala asp Gly Pro vai ASp Glu Tyr Met Leu Pro Phe Glu 405 410 415 Glu Glu Ile Gly Gln His Pro ser Leu Glu Asp Met Gln Glu vai vai 420 425 430 Val His Lys Lys Lys Arg Pro vai Leu Arg AS ρ Tyr Trp Gln Lys Hl s 435 440 445 Ala Gly Met Ala Met Leu Cys Glu Thr Ile Glu Glu Cys Trp Asp His 450 455 460 Asp Ala Glu Ala Arg Leu Ser Ala Gly Cys vai Gly Glu Arg Ile Thr 465 470 475 480 Gln Met Gln Arg Leu Thr Asn Ile Ile Thr Thr Glu Asp lie vai Thr 485 490 495 Val vai Thr Met vai Thr Asn vai ASp Phe Pro Pro Lys Glu Ser Ser 500 505 510 Leu <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Homo : sapiens <400> 2 lie Leu Gly Arq Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys ASp Lys Arg Arg Hi S Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly ser Ile Glu Ile Val Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn 50 55 60 Cys Tvr ASp Arg Thr Asp Cys vai Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu vai 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cvs Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn GlU Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu vai Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro vai Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro 115 <21Q> 3 <211> 100 <212> PRT <2'13> Homo : sapiens <400> 3 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys ASp Arg Thr asn Gln Thr Gly vai Glu Pro Cys Tyr Gly Página 2 PHPH-PWO-019_Substitute_Sequence_Listing.txt
20 25 30 ASp Lys Asp 35 Lys Arg Arg His Cys 40 Phe Ala Thr Trp Lys 45 Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile vai Lys Gln Gly Cys Trp Leu ASp Asp lie Asn 50 55 60 Cys Tyr ASp Arg Thr ASp Cys Val Glu Lys Lys ASp ser Pro Glu vai 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn GlU Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met 100
<210> 4 <211> 1542 <212> DNA <213> Homo sapiens
<400> 4
atgggagctg ctgcaaagtt ggcgtttgcc gtctttctta tctcctgttc ttcaggtgct 60
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 120
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 180
tttgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 240
gatgatatca ãctgctatga caggàctgat tgtgtagaaà aaaaagacag ccctgaagta 300
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccagagatg 360
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccctatta caacatcctg 420
ctctattcct tggtgccact tatgttaatt gcggggattg tcatttgtgc attttgggtg 480
tacaggcatc acaagatggc ctaccctcct gtacttgttc caactcaaga cccaggaccã 540
cccccacctt ctccattact agggttgaaa ccactgcagt tattagaagt gaaagcaagg 600
ggaagatttg gttgtgtctg gaaagcccag ttgcttaacg aatatgtggc tgtcaaaata 660
tttccaatac aggacaaaca gtcatggcaa aatgaatacg aagtctacag tttgcctgga 720
atgaagcatg agaacatatt acagttcatt ggtgcagaaa aacgaggcac cagtgttgat 780
gtggatcttt ggctgatcac agcatttcat gaaaagggtt cactatcaga ctttcttaag 840
gctaatgtgg tctcttggaa tgaactgtgt catattgcag aaaccatggc tagaggattg 900
gcatatttac atgaggatat acctggccta aaagatggcc acaaacctgc catatctcac 960
agggacatca aaagtaaaaa tgtgctgttg aaaaacaacc tgacagcttg cattgctgac 1020
tttgggttgg ccttaaaatt tgaggctggc aagtctgcag gcgataccca tggacaggtt 1080
ggtacccgga ggtacatggc tccagaggta ttagagggtg ctataaactt ccaaagggat 1140
gcatttttga ggatagatat gtatgccatg ggattagtcc tatgggaact ggcttctcgc 1200
tgtactgctg cagatggacc tgtagatgaa tacatgttgc catttgagga ggaaattggc 1260
cagcatccat ctcttgaaga catgcaggaa gttgttgtgc ataaaaaaaa gaggcctgtt 1320
ttaagagatt attggcagaa acatgctgga atggcaatgc tctgtgaaac cattgaagaa 1380
tgttgggatc acgacgcaga agccaggtta tcagctggat gtgtaggtga aagaattacc 1440
cagatgcaga gactaacaaa tattattacc excagaggaca ttgtaacagt ggtcacaatg 1500
gtgacaaatg ttgactttcc tcccaaagaa tctagtctat ga 1542
<210> 5
<211> 345
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atacttggta gatcagaaac tcaggagtgt cttttcttta atgctaattg ggaaaaagac 60
agaaccaatc aaactggtgt tgaaccgtgt tatggtgaca aagataaacg gcggcattgt 120
trgctacct ggaagaatat ttctggttcc attgaaatag tgaaacaagg ttgttggctg 180
gatgatatca actgctatga caggactgat tgtgtagaaa aaaaagacag ccctgaagta 240
tatttttgtt gctgtgaggg caatatgtgt aatgaaaagt tttcttattt tccagagatg 300
gaagtcacac agcccacttc aaatccagtt acacctaagc caccc 345
<210> 6
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> VARIANTE
<222> 43
<223> POSIÇÃO 43 TAMBÉM PODE SER Ala
Pági na 3 PHPH-PWO~019„Substi tute_.Sequence_Li sti ng. txt
<220>
<22] > VARIANTE
<222> 100
<223> POSIÇÃO 100 TAMBÉM PODE SER Ala <220>
<221> VARIANTE
<222> 212
<223> POSIÇÃO 212 TAMBÉM PODE SER Ala
<400> 6 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 1 5 10 15 Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser 20 25 30 Arg Thr Pro Glu Val Thr cys vai vai vai Asp vai Ser Hi S Glu Asp 35 40 45 Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly vai Glu Val Hi s Asn 50 55 60 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai 65 70 75 80 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 85 90 95 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Val Pro lie Glu L.ys 100 105 110 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr 115 120 125 Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr 130 .135 140 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala vai Glu Trp Glu 145 150 155 160 ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 165 170 175 Asp ser Asp Gly Pro Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys 180 185 190 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe Ser Cys Ser vai Met Hi S Glu 195 200 205 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215 220 Lys 225 <210> 7 <211> 344 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ile Leu Gly Arq Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys ASp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile vai Lys Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp lie Asn 50 55 60 Cys Tyr ASp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys ASp Ser Pro Glu vai 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Glu vai Thr Gln Pro Thr Ser Asn Pro vai Thr Pro 100 105 110 Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 115 120 125 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 130 135 140 Pági na 4 PHPH-I PWO-I 319_: Substi tute_Sequence„Li st i ng. txt Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr cys vai vai 145 150 155 160 Val Asp Val Ser Hi S Glu ASp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr vai 165 170 175 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 180 185 190 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai vai Ser vai Leu Thr vai Leu His Gln 195 200 205 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Ala 210 215 220 Leu Pro vai Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 225 230 235 240 Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 245 250 255 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 260 265 270 Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Glv Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 275 280 285 Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu ASp ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 290 295 300 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe 305 310 315 320 Ser Cys Ser vai Met Hi S Glu Ala Leu Hi S Asn Hi S Tyr Thr Gln Lys 325 330 335 Ser Leu Ser Leu ser Pro Gly Lys
340
<210> 8
<211> 21 <212> PRT
<213> Apis mel li fera
<400> 8
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Tyr Ala
20
<210> 9
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
15 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro
20
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Gly Ala Ala Ala Lys Leu Ala Phe Ala Val Phe Leu Ile Ser Cys
1 5 10 15
ser Ser Gly Ala 20
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens PHPH~PWO-019„Substi tute_Sequence„Listing.txt
<400> 11
rle Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu 1 5
<210> 12 <21i> 329 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 12 Ile Leu Gly Arg Ser Glu Thr Gln Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn 1 5 10 15 Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn Gln Thr Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly 20 25 30 Asp Lys Asp Lys Arg Arg His cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Glu Ile vai Lys Gln Gly cys Trp Leu Asp ASp Ile Asn 50 55 60 Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Glu Lys Lys Asp ser Pro Glu Val 65 70 75 80 Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr 85 90 95 Phe Pro Glu Met Thr Gly Gly Gly Thr Hi S Thr Cys Pro Pro Cys Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys 115 120 125 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr cys vai 130 135 140 vai vai ASP vai Ser Hi S Glu Asp Pro Glu vai Lys Phe Asn Trp Tyr 145 150 155 160 vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 165 170 175 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s 180 185 190 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys cys Lys vai ser Asn Lys 195 200 205 Ala Leu Pro vai Pro lie Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 210 215 220 Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 225 230 235 240 Thr Lys Asn Gln vai Ser Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro 245 250 255 Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 260 265 270 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 275 280 285 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai 290 295 300 Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 305 310 315 320 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
<210> 13
<211> 369
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Asp Ala Met Lys Ara Gly Leu Cys Cys vai Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala vai Phe vai Ser Pro Gly Ala Ala Tle Leu Gly Arg Ser Glu Thr
20 25 30
Glrt Glu Cys Leu Phe Phe Asn Ala Asn Trp Glu Lys Asp Arg Thr Asn 35 40 45
Página 6 Gln Thr PHPH-I PWO-< 319_: Substi tute_Sequence_Li sti ng. txt Gly Val Glu Pro Cys Tyr Gly Asp Lys ASp Lys Arg Arg HiS SO 55 60 Cys Phe Ala Thr Trp Lys Asn Ile Ser Gly Ser Ile Glu Ile Val Lys 65 70 75 80 Gln Gly Cys Trp Leu Asp Asp Ile Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys vai 85 90 95 Glu Lys Lys Asp Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys cys cys Glu Gly 100 105 110 Asn Met Cys Asn Glu Lys Phe Ser Tyr Phe Pro Glu Met Glu vai Thr Gln 115 120 125 Pro Thr Ser Asn Pro vai Thr Pro Lys Pro Pro Thr Gly Gly Gly 130 135 140 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 145 150 155 160 Ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys ASp Thr Leu Met Ile Ser 165 170 175 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys vai Val vai ASP vai Ser Hi S Glu Asp 180 185 190 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr vai ASp Gly vai Glu vai Hi S Asn Ala 195 200 205 Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 210 215 220 vai Ser Val Leu Thr Val Leu Hi s Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 225 230 235 240 Tyr Lys Cys Lys vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro vai Pro Ile Glu Lys 245 250 255 Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln vai Tyr Thr 260 265 270 Leu Pro ΡΓΟ Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 275 280 285 cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser ASp Ile Ala Val Glu Trp Glu 290 295 300 ser Asn Glv Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro vai Leu 305 310 315 320 Asp Ser ASp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai ASp Lys 325 330 335 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn vai Phe ser Cys Ser vai Met His Glu 340 345 350 Ala Leu His Asn Hi s Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 355 360 365 Lys
<210> 14 <211> 1114 <212> DNA
<213> Homo sapiens <400> 14
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt tcgcccggcg ccgctatact tggtagatca attgggaaaa agacagaacc aatcaaactg aacggcggca ttgttttgct acctggaaga aggttgttgg ctggatgata tcaactgcta cagccctgaa gtatatttct gttgctgtga ttttccggag atggaagtca cacagcccac cSQtggtgga actcacacat gcccaccgtg agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa ggggãacgtc ttctcatgct ccgtgatgca
gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60 gaaactcagg agtgtctttt tttaatgcta 120 gtgttgaacc gtgttatggt gacaaagata 180 atatttctgg ttccattgaa tagtgaaaca 240 tgacaggact gattgtgtag aaaaaaaaga 300 gggcaatatg tgtaatgaaa agttttctta 360 ttcaaatcca gttacaccta agccacccac 420 cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc 480 caccctcatg atctcccgga cccctgaggt 540 aaaccctgag gtcaagttca actggtacgt 600 aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac 660 gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta 720 agtccccatc gagaaaacca tctccaaagc 780 caccctgccc ccatcccggg aggagatgac 840 caaaggcttc tatcccaacg acatcgccgt 900 caactacaag accacgcctc ccgtgctgga 960 gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca 1020 tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa 1080 Página 7 PHPH-PWO-019_Substitute_Sequence_Listing.txt gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgaga attc 1114

Claims (78)

1. Polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos que consiste na seqüência de aminoácidos SEQ ID NO: 7.
2. Polipeptídeo ActRIIa de ligação de ativina, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo é pelo menos 95% puro, com relação a contaminantes de proteína, como determinado por cromatografia por exclusão de tamanho.
3. Polipeptídeo ActRIIa de ligação de ativina, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo apresenta seletividade pelo menos 10 vezes superior na constante de dissociação para ativina versus GDF-Il.
4. Preparação farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo ActRIIa de ligação de ativina, conforme definido em qualquer uma das reivindica- ções 1-3, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente a- ceitável.
5. Preparação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADA pelo fato de que a dita preparação é substancialmente livre de pirogênio.
6. Polinucleotídeo isolado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma seqüência de codificação para o polipeptídeo ActRIIa de ligação de ativina, conforme defi- nido em qualquer uma das reivindicações 1-3.
7. Polinucleotídeo isolado, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o polinucleotídeo isolado compreende uma seqüência SEQ ID NO:14.
8. Polinucleotídeo recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de compreender uma seqüência promotora ligada operacionalmente a um polinucleotídeo, conforme definido nas reivindicações 6 ou 7.
9. Célula, CARACTERIZADA pelo fato de ser transformada com um polinucleotídeo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6-8.
10. Célula, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero.
11. Célula, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é uma célula CHO ou uma célula humana.
12. Processo para preparar um polipeptídeo ActRI- Ia de ligação de ativina, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) cultivar uma célula em condições adequadas pa- ra expressão do polipeptídeo ActRIIa solúvel, em que a dita célula é transformada com um polinucleotídeo recombinante, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6-8; e b) recuperar o polipeptídeo ActRIIa de ligação de ativina assim expresso.
13. Método para promover crescimento ósseo, aumentar a densidade óssea ou aumentar a resistência óssea, o método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um sujeito uma quantidade efetiva de um polipeptideo selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2; b) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3; e c) um polipeptideo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados da SEQ ID NO:2.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo tem uma ou mais das características seguintes: i) se liga a um ligante ActRIIa com um K0 de pelo menos 10-7M; e ii) inibe sinalização de ActRIIa em uma célula.
15. Método, de acordo com as reivindicações 13 ou 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptideo é uma proteína de fusão incluindo, além de um domínio de polipeptideo ActRIIa, uma ou mais porções de polipeptideo que melhoram uma ou mais de: estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, e/ou purificação.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão inclui uma porção de polipeptideo selecionada do grupo que consiste em: um domínio Fc de imunoglobulina e uma albumina sérica.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-16, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptideo inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração lipidica, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
18. Método para tratar uma doença relacionada aos ossos, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende administrar a um sujeito necessitado deste uma quantidade efetiva de uma ativina ou antagonista de ActRIIa.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a ativina ou antagonista de ActRIIa é um polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIa.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIa é selecionado do grupo que consiste em: a) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a SEQ ID NO: 2; b) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3; e c) um polipeptideo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados da SEQ ID NO: 2.
21. Método, de acordo com as reivindicações 19 ou CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIa tem uma ou mais das características seguintes: i) se liga a um ligante de ActRIIa com um K0 de pelo menos 10-7M; e ii) inibe sinalização de ActRIIa em uma célula.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-21 , CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIa é uma proteína de fusão incluindo, além de um domínio de polipeptideo ActRIIa, uma ou mais porções de polipeptideo que melhoram uma ou mais de: estabilidade in vivo, meia-vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição de tecido, formação de complexos de proteína, e/ou purificação.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita proteína de fusão inclui uma porção de polipeptideo selecionada do grupo que consiste em: um domínio Fc de imunoglobulina e uma albumina sérica.
24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19-23, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIa inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados de: um aminoácido glicosilado, um aminoácido PEGuilado, um aminoácido farnesilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, um aminoácido conjugado a uma fração lipídica, e um aminoácido conjugado a um agente de derivatização orgânico.
25. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-24, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença relacionada aos ossos é selecionada do grupo que consiste em: osteoporose primária e osteoporose secundária.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-24, CARACTERIZADO pelo fato de que a doença relacionada aos ossos é selecionada do grupo que consiste em: osteoporose pós-menopausa, perda óssea hipogonadal, perda óssea induzida por tumor, perda óssea induzida por terapia de câncer, metástases ósseas, mieloma múltiplo e doença de Paget.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18-26, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende adicionalmente administrar um segundo agente de atividade óssea.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que o agente de atividade óssea é selecionado do grupo que consiste em: um bisfosfonato, um estrogênio, um modulador seletivo do receptor de estrogênio, um hormônio paratiróide, uma calcitonina, um suplemento de cálcio e um suplemento de vitamina D.
29. Preparação farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende: (a) uma ativina ou antagonista de ActRIIa; e (b) um segundo agente de atividade óssea.
30. Método para identificação de um agente que promove crescimento ósseo ou aumenta a densidade óssea, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: a) identificar um agente de teste que se liga a um domínio de ligação do ligante de um polipeptídeo ActRIIa competitivamente com um polipeptídeo ativina ou antagonista de ActRIIa; e b) avaliar o efeito do agente no crescimento do tecido.
31. Uso de um polipeptídeo ativina ou antagonista de ActRIIa, CARACTERIZADO pelo fato de ser para preparar um medicamento para o tratamento de uma doença relacionada aos ossos.
32. Método para prevenir uma doença relacionada aos ossos, CARACTERIZADO pelo fato de o método compreende administrar a um sujeito necessitado deste uma quantidade efetiva de uma ativina ou antagonista de ActRIIa.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem um câncer que é associado com metástase óssea.
34. Método, de acordo com as reivindicações 32-33, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é positivo para um indicador de perda de densidade óssea, ressorção óssea, ou metástase óssea.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-34, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito é o recebedor de regime de tratamento de câncer que é associado com perda óssea.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-34, CARACTERIZADO pelo fato de que o sujeito tem um câncer associado com perda óssea.
37. Polipeptideo ActRIIa de ligação de ativina, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1-3, a preparação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-5 ou 29, ou o método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13-28, CARACTERIZADOS pelo fato de que o polipeptideo é glicosilado.
38. Método para promover crescimento ósseo e inibir ressorção óssea em um paciente, o método sendo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade efetiva de um proteína de fusão ActRIIa-Fc, em que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:3.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:3.
40. Método, de acordo com as reivindicações 38 ou 39, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende a seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:3.
41. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-40, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc compreende o seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:2.
42. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-41, CARACTERIZADO pelo fato de que o método provoca menos que 10% de aumento na massa músculo-esquelética do paciente.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-41, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada de maneira a atingir uma concentração sérica no paciente de pelo menos 0,2 ug/kg.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-43, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem uma seqüência de aminoácidos SEQ ID NO:7.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-44, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc tem uma meia-vida sérica entre -15 e 30 dias.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-45, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada ao paciente com uma freqüência não superior a uma vez por semana.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38-46, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína de fusão ActRIIa-Fc é administrada ao paciente com uma freqüência não superior a uma vez por mês.
48. Uso de um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO:2; (b) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3; e (c) um polipeptídeo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados da SEQ ID NO: 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para promover crescimento ósseo, aumentar a densidade óssea ou aumentar a resistência óssea.
49. Uso de um polipeptídeo ativina ou antagonista de ActRIIa, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenir uma doença relacionada aos ossos.
50. Uso de uma proteína de fusão ActRIIa-Fc compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos -90% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para promover crescimento ósseo e inibir ressorção óssea.
51. Polipeptideo selecionado do grupo que consiste em: (a) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptideo compreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à SEQ ID NO: 3; e (c) um polipeptideo compreendendo pelo menos 50 aminoácidos consecutivos selecionados da SEQ ID NO: 2, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso para promover o crescimento ósseo, aumentar a densidade óssea ou aumentar a resistência óssea.
52. Polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIaf CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso no tratamento de uma doença relacionada aos ossos.
53. Polipeptideo ativina ou antagonista de ActRIIaf CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso para prevenir uma doença relacionada aos ossos.
54. Proteína de fusão ActRIIa-Fc compreendendo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3f CARACTERIZADA pelo fato de que é para uso para promover o crescimento ósseo e inibir ressorção óssea.
55. Polipeptideo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a SEQ ID NO:7.
56. Polipeptideo solúvel, CARACTERIZADO pelo fato de que é conforme definido na reivindicação 55.
57. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 56, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à ativina.
58. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 57, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à ativina com um Kd menor que cerca de 1 micromolar.
59. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 58, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à ativina com um K0 menor que cerca de 100 nanomolar.
60. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 59, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à ativina com um K0 menor que cerca de 10 nanomolar.
61. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 60, CARACTERIZADO pelo fato de que se liga à ativina com um Kd menor que cerca de 1 nanomolar.
62. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é pelo menos cerca de 95% puro.
63. Polipeptideo, de acordo com a reivindicação 62, CARACTERIZADO pelo fato de que é pelo menos cerca de 98% puro.
64. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é acetilado.
65. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é carboxilado.
66. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é glicosilado.
67. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é fosforilado.
68. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é lipideoado.
69. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é acilado.
70. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende polietileno glicol.
71. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um lipideo.
72. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um fosfato.
73. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um polissacarideo.
74. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um monossacarideo.
75. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é PEGuilado.
76. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é farnesilado.
77. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é biotinilado.
78. Polipeptideo, conforme definido na reivindicação 55, CARACTERIZADO pelo fato de que é conjugado a um agente de derivatização orgânico.
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Owner name: ACCELERON PHARMA INC. (US)

Free format text: ENDERECOS ALTERADOS CONFORME SOLICITADO NA PETICAO NO 020090100105/RJ DE 23/10/2009.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
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Free format text: NOTIFICACAO DE ANUENCIA RELACIONADA COM O ART 229 DA LPI

B06T Formal requirements before examination [chapter 6.20 patent gazette]
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 22/11/2006, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO.