RS58231B1 - Antagonisti aktivin-actriia i primene za stimulaciju rasta kostiju - Google Patents

Antagonisti aktivin-actriia i primene za stimulaciju rasta kostiju

Info

Publication number
RS58231B1
RS58231B1 RS20080336A RSP20080336A RS58231B1 RS 58231 B1 RS58231 B1 RS 58231B1 RS 20080336 A RS20080336 A RS 20080336A RS P20080336 A RSP20080336 A RS P20080336A RS 58231 B1 RS58231 B1 RS 58231B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
actriia
bone
activin
cell
Prior art date
Application number
RS20080336A
Other languages
English (en)
Inventor
John Knope
Jasbir Seehra
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Publication of RS20080336A publication Critical patent/RS20080336A/sr
Publication of RS58231B1 publication Critical patent/RS58231B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

OPIS PRONALASKA
OSNOVA PRONALASKA
Poremećaji kosti, u opsegu od osteoporoze do preloma, predstavljaju grupu patoloških stanja za koja postoji nekoliko efikasnih farmaceutskih sredstava. Umesto toga, tretman se fokusira na fizičke i bihejvioralne intervencije, uključujući imobilizaciju, vežbe i promene u ishrani. Bilo bi korisno imati terapeutska sredstva koja stimulišu rast kosti i povećavaju gustinu kosti u svrhu lečenja različitih poremećaja kosti.
Rast i mineralizacija kosti zavise od aktivnosti dva tipa ćelija, osteoklasta i osteoblasta, iako hondrociti i ćelije vaskulature takođe učestvuju u kritičnim aspektima ovih procesa. Tokom razvića formiranje kosti se odigrava preko dva mehanizma, endohondralna osifikacija i intramembranozna osifikacija, pri čemu je prvi od njih odgovoran za uzdužno formiranje kosti, a drugi je odgovoran za formiranje topološki ravnih kosti, kao što su kosti lobanje. Endohondralna osifikacija zahteva sekvencijalno formiranje i razgradnju hrskavičavih struktura u zone rasta koje služe kao kalupi za formiranje osteoblasta, osteoklasta, krvnih sudova i kasniju mineralizaciju. U toku intramembranozne osifikacije, kost je formirana direktno u vezivnim tkivima. Oba procesa zahtevaju infiltraciju osteoblasta i zatim akumulaciju matriksa.
Prelomi i drugi strukturni poremećaji kosti, zaceljuju se preko procesa koji je u najmanjem slučaju površinski, sličan redosledu razvojnih događaja osteogeneze, uključujući formiranje vezivnog tkiva i zatim mineralizaciju. Proces zaceljivanja preloma može se javiti na dva načina. Direktno ili primarno zaceljivanje kosti javlja se bez formiranja kalusa. Indirektno ili sekundarno zaceljivanje kosti javlja se preko prekursorskog kalusnog stadijuma. Primarno zaceljivanje preloma obuhvata novo stvaranje mehaničkog kontinuiteta preko manjih pukotina. Pod pogodnim uslovima, ćelije koje resorbuju kost koje se nalaze u blizini prekida započinju resorpciju i uspostavljaju puteve za prodiranje krvnih sudova i zatim isceljivanje. Sekundarno isceljivanje kosti slede proces inflamacije, formiranja mekanog kalusa, mineralizacija kalusa i remodelovanje kalusa. U stadijumu inflamacije, formiranje hematoma i krvarenje nastaju kao rezultat prekida periostealnih i endostealnih krvnih sudova na mestu povrede. Inflamatorne ćelije ulaze u ovu oblast. U stadijumu formiranja mekanog
kalusa, ćelije proizvode nove sudove, fibroblaste, unutarćelijski materijal i potporne ćelije, koji formiraju granulaciono tkivo u prostoru između polomljenih delova. Kliničko srastanje duž pukotina uspostavljeno je fibroznim ili hrskavičavim tkivom (mekani kalus). Osteoblasti su formirani i posreduju u mineralizaciji mekanog kalusa, koji je zatim zamenjen lamelarnom kosti i podvrgnut normalnim procesima remodelovanja.
Pored preloma i drugi fizički prekidi stukture kosti, gubitak mineralnog sadržaja kosti i koštane mase mogu biti izazvani nizom različitih stanja i mogu imati za rezultat značajne medicinske probleme. Promene koštane mase se javljaju na relativno predvidiv način u toku života osobe. Do starosti od 30 godina, kosti i muškaraca i žena rastu do maksimalne mase linearnim rastom endohondralnih zona rasta i radijalnim rastom. Posle 30 godine starosti (za trabekularnu kost, npr., ravne kosti kao što su kičmeni pršljen i karlica) i 40 godine starosti (za kortikalnu kost, npr., dugačke kosti koje se nalaze u udovima), javlja se spori gubitak koštane mase i kod mušakaraca i kod žena. Kod žena, krajnja faza značajnog gubitka koštane mase takođe se javlja, verovatno kao posledica postmenopauzalnog nedostatka estrogena. U toku ove faze, žene mogu izgubiti dodatnih 10% koštane mase iz kortikalne kosti i 25% iz trabekularnog dela. Da li će progresivni gubitak koštane mase imati za rezultat patološko stanje kao što je osteoporoza većinom zavisi od početne koštane mase individue i od toga da li postoje pogoršavajući uslovi.
Gubitak koštane mase je ponekad naznačen kao neuravnoteženost u normalnom procesu remodeliranja kosti. Zdrava kost je neprekidno podvrgnuta remodeliranju. Remodeliranje počinje resorpcijom kosti od strane osteoklasta. Resorbovana kost je zatim zamenjena novim koštanim tkivom, koja je naznačena time što kolagen formiraju osteoblasti, i kasnijom kalcifikacijom. Kod zdravih individua stope resorpcije i formiranja su uravnotežene. Osteoporoza je hronično, progresivno stanje, naznačeno promenom prema resorpciji, što ima za rezultat ukupno smanjenje koštane mase i koštane mineralizacije. Osteoporozi kod ljudi prethodi klinička osteopenija (koštana mineralna gustina koja je veća od jedne standardne devijacije ali je manja od 2.5 standardne devijacije ispod srednje vrednosti za kost mlade odrasle osobe). Širom sveta, kod približno 75 miliona ljudi postoji rizik od osteoporoze. Tako, postupci za kontrolu ravnoteže između aktivnosti osteoklasta i osteoblasta mogu biti korisni za stimulaciju zaceljenja preloma i drugog oštećenja kosti kao i lečenja poremećaja, kao što je osteoporoza, povezano sa gubitkom koštane mase i koštane mineralizacije.
S obzirom na osteoporozu, estrogen, kalcitonin, osteokalcin sa vitaminom K, ili visoke doze kalcijuma putem ishrane svi se koriste kao terapeutske intervencije. Drugi terapeutski
pristupi osteoporozi obuhvataju bifosfonate, paratiroidni hormon, kalcimimetike, statine, anaboličke steroide, soli lantana i stroncijuma, i natrijum fluorid. Takvi terapeutici, međutim, često su povezani sa neželjenim sporednim efektima. Tako, predmet predstavljenog otkrića je obezbediti kompozicije i postupke za stimulaciju rasta kosti i mineralizacije.
REZIME PRONALASKA
Delimično, otkriće pokazuje da molekuli koji imaju aktivnost antagonista aktivina ili ActRIIa ("antagonisti aktivina" i "antagonisti ActRIIa") mogu biti korišćeni za povećanje gustine kosti, stimulaciju rasta kosti i/ili povećanje čvrstine kosti. Naročito, pronalazak pokazuje da rastvorljivi oblik ActRIIa deluje kao inhibitor aktivin-ActRIIa prenosa signala i sitmuliše povećanu gustinu kosti, rast kosti, i čvrstinu kosti in vivo. Dok većina farmaceutskih sredstava koja stimulišu rast kosti ili inhibiraju gubitak kosti deluju bilo kao anti-katabolička sredstva (takođe zajednički označena kao "katabolička sredstva") (npr., bisfosfonati) ili anabolička sredstva (npr., paratiroidni hormon, PTH, kada se odgovarajuće dozira), rastvorljivi ActRIIa protein pokazuje dvostruku aktivnost, imajući kako kataboličke tako i anaboličke efekte. Tako, pronalazak utvrđuje da se antagonisti aktivin-ActRIIa puta prenosa signala mogu koristiti za povećanje gustine kosti i stimulaciju rasta kosti. Dok rastvorljivi ActRIIa može da deluje na kost preko mehanizma koji nije antagonizam aktivina, pronalazak pored toga pokazuje da željena terapeutska sredstva mogu biti izabrana na osnovu antagonističke aktivnosti u odnosu na aktivin-ActRIIa. Prema tome, u izvesnim varijantama, pronalazak obezbeđuje postupke za primenu antagonista aktivin-ActRIIa, uključujući, na primer, aktivin-vezujuće ActRIIa polipeptide, anti-aktivin antitela, anti-ActRIIa antitela, aktivinili ActRIIa-ciljane male molekule i aptamere, i nukleinske kiseline koje smanjuju ekspresiju aktivina i ActRIIa, za lečenje poremećaja povezanih sa niskom gustinom kosti ili niskom čvrstinom kosti, kao što je osteoporoza, ili za stimulaciju rasta kosti kod pacijenata kod kojih postoji potreba za tim, kao kod pacijenata koji imaju prelom kosti. Pored toga, rastvorljivi ActRIIa polipeptid stimuliše rast kosti bez izazivanja posledičnog merljivog povećanja mišićne mase.
U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje polipeptide koji sadrže rastvorljivi, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid koji se vezuje za aktivin. ActRIIa polipeptidi mogu biti formulisani kao farmaceutski preparati koji sadrže aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid i farmaceutski prihvatljiv nosač. Poželjno, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid se vezuje za aktivin sa KDmanjim od 1 mikromola ili manje od 100, 10 ili 1 nanomola. Izborno, aktivin- vezujući ActRIIa polipeptid selektivno vezuje aktivin prema GDFl1 i/ili GDF8, i poželjno sa
KDkoji je najmanje 10-puta, 20-puta ili 50-puta niži s obzirom na aktivin nego s obzirom na GDFl1 i/ili GDF8. Bez želje da se vežemo za određeni mehanizam delovanja, očekuje se da je ovaj stepen selektivnosti za inhibiciju aktivina u odnosu na inhibiciju GDFU/GDF8 odgovoran za selektivni efekat na kost bez posledičnog merljivog efekta na mišić. U mnogim varijantama, ActRIIa polipeptid biće izabran za izazivanje manje od 15%, manje od 10% ili manje od 5% povećanja u mišiću u dozama koje postižu željene efekte na kost. Poželjno, kompozicija je najmanje 95% čista, s obzirom na druge polipeptidne komponente, kao što je procenjeno pomoću hromatografije na osnovu veličine čestica, i poželjnije, kompozicija je najmanje 98% čista. Aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid za primenu takvom preparatu može biti bilo koji od ovde navedenih, kao što je polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 2, 3, 7 ili 12, ili koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% identična aminokiselinskoj sekvenci koja je izabrana od SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 ili 13. Aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid može da obuhvata funkcionalni fragment prirodnog ActRIIa polipeptida, kao što je onaj koji sadrži najmanje 10, 20 ili 30 aminokiselina sekvence izabrane od SEQ ID NOs: 1-3 ili sekvence SEQ ID NO: 2, kojima nedostaje C-terminalnih 10 do 15 aminokiselina ("rep").
Rastvorljivi, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid može da obuhvata jednu ili više promena u aminokiselinskoj sekvenci (npr., u domenu koji vezuje ligand) u odnosu na prirodni ActRIIa polipeptid. Primeri promenjenih ActRIIa polipeptida su obezbeđeni u WO 2006/012627, pp. 59-60, koji je ovde obuhvaćen. Promena u aminokiselinskoj sekvenci može, na primer, da promeni glikozilaciju polipeptida kada se on proizvodi u sisaru, insektu ili drugoj eukariotskoj ćeliji ili da promeni proteolitičko cepanje polipeptida u odnosu na prirodni ActRIIa polipeptid.
Aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid može biti fuzioni protein koji ima, kao jedan domen, ActRIIa polipeptid (npr., deo ActRIIa koji vezuje ligand) i jedan ili više dodatnih domena koji obezbeđuju željeno svojstvo, kao što je poboljšana farmakokinetika, lakše prečišćavanje, ciljno delovanje na određena tkiva, itd. Na primer, domen fuzionog proteina može povećati jedan ili više od sledećih: in vivo stabilnost, in vivo poluživot, unos/primena, tkivna lokalizacija ili distribucija, formiranje proteinskih kompleksa, multimerizacija fuzionog proteina, i/ili prečišćavanje. Aktivinvezujući ActRIIa fuzioni protein može da obuhvata Fc domen imunoglobulina (divlji tip ili mutant) ili serum albumin ili drugi deo polipeptida koji obezbeđuje željena svojstva kao što su poboljšana farmakokinetika, poboljšana rastvorljivost ili poboljšana stabilnost. U poželjnoj varijanti, ActRIIa-Fc fuzija sadrži relativno bez određene strukture linker postavljen između Fc domena i vanćelijskog ActRIIa domena. Ovaj linker bez određene strukture može da odgovara približno 15 aminokiselinskom regionu bez određene strukture na C-terminalnom kraju vanćelijskog domena ActRIIa ("rep"), ili to može biti veštačka sekvenca od 1, 2, 3, 4 ili 5 aminokiselina ili dužine između 5 i 15, 20, 30, 50 ili više aminokiselina koje su relativno bez sekundarne strukture, ili smeša oba. Linker može biti bogat glicinskim i prolinskim ostacima i može, na primer, da sadrži jednu sekvencu treonin/serin i glicina ili ponavljajućih sekvenci treonin/serin i glicina (npr., TG<4>ili SG<4>singleti ili ponovci). Fuzioni protein može da obuhvata prečišćavajuću sekvencu, kao što je epitop marker, FLAG marker, polihistidinska sekvenca i GST fuzija. Izborno, rastvorljivi ActRIIa polipeptid obuhvata jedan ili više modifikovanih aminokiselinskih ostataka izabranih od: glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilovane aminokiseline, aminokiseline konjugovane za lipidnu grupu i aminokiseline konjugovane za organsko derivatizujuće sredstvo. Farmaceutski preparat može takođe da obuhvata jedno ili više dodatnih jedinjenja kao što su jedinjenje koje se koristi za lečenje poremećaja kosti. Poželjno, farmaceutski preparat je značajno bez pirogena. Uopšteno, poželjno je da se ActRIIa protein eksprimira u sisarskoj ćelijskoj liniji koja pogodno posreduje prirodnu glikozilaciju ActRIIa proteina tako da se smanjuje verovatnoća nepovoljnog imunog odgovora kod pacijenta. Humane i CHO ćelijske linije su uspešno korišćene, i očekuje se da drugi uobičajeni sisarski ekspresioni sistemi budu korisni.
Kao što je ovde opisano, ActRIIa proteini označeni kao ActRIIa-Fc (oblik sa minimalnim linkerom između ActRIIa dela i Fc dela) imaju poželjna svojstva, uključujući selektivno vezivanje za aktivin u odnosu na GDF8 i/ili GDFl 1, vezivanje liganda sa visokim afmitetom i poluživot u serumu veći od dve nedelje u životinjskim modelima. U određenim varijantama pronalazak obezbeđuje ActRIIa-Fc polipeptide i farmaceutske preparate koji sadrže takve polipeptide i farmaceutski prihvatljiv inertni punilac.
U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju rastvorljivi aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid. Izolovani polinukleotid može da sadrži kodirajuću sekvencu za rastvorljivi, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid, kao što je opisano u prethodnom tekstu. Na primer, izolovana nukleinska kiselina može da obuhvata sekvencu koja kodira vanćelijski domen (npr., ligand-vezujući domen) ActRIIa i sekvencu koja bi kodirala deo ili ceo transmembranski domen i/ili citoplazmatični domen ActRIIa, ali za stop kodon postavljen unutar transmembranskog domena ili citoplazmatičnog domena, ili postavljen između vanćelijskog domena i transmembranskog domena ili citoplazmatičnog domena. Na primer, izolovani polinukleotid može da sadrži celu dužinu ActRIIa polinukleotidne sekvence kao što je SEQ ID NO: 4 ili 5, ili delimično skraćenu verziju, pri čemu navedeni izolovani polinukleotid dalje sadrži kodon za završetak transkripcije na najmanje šest stotina nukleotida pre 3'-kraja ili na drugi način postavljenog tako da se translacijom polinukleotida dobija vanćelijski domen izborno fuzionisan za skraćeni deo celog ActRIIa. Poželjna nukleinsko kiselinska sekvenca je SEQ ID NO: 14. Nukleinske kiseline ovde opisane mogu biti funkcionalno povezane za promotor za ekspresiju, i pronalazak obezbeđuje ćelije transformisane sa takvim rekombinantnim polinukleotidima. Poželjno, ćelija je sisarska ćelija kao što je CHO ćelija.
U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje postupke za pripremu rastvorljivog, aktivin-vezujućeg ActRIIa polipeptida. Takav postupak može da obuhvata ekspresiju bilo koje od nukleinskih kiselina (npr., SEQ ID NO: 4, 5 ili 14) opisanih ovde u pogodnoj ćeliji, kao što je ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO). Takav postupak može da sadrži: a) gajenje u kulturi ćelije pod uslovima pogodnim za ekspresiju rastvorljivog ActRIIa polipeptida. pri čemu je navedena ćelija transformisana sa rastvorljivim ActRIIa ekspresionim konstruktom; i b) rekuperovanje rastvorljivog ActRIIa polipeptida koji je tako eksprimiran. Rastvorljivi ActRIIa polipeptidi mogu biti dobijeni kao sirove, delimično prečišćene ili visoko prečišćene frakcije. Prečišćavanje se može postići pomoću serije koraka prečišćavanja, uključujući, na primer, jedan, dva ili tri ili više od sledećih, po bilo kom redosledu: protein A hromatografija, anjonsko izmenjivačka hromatografija (npr., Q sefaroza), hromatografija putem hidrofobne interakcije (npr., fenilsefaroza), hromatografija na osnovu veličine čestica i katjonsko izmenjivačka hromatografija.
U određenim aspektima, antagonist aktivin-ActRIIa koji je ovde opisan, kao što je rastvorljivi, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid. može biti korišćen u postupku za stimulaciju rasta kosti ili povećanje gustine kosti kod subjekta. U određenim varijantama, pronalazak obezbeđuje postupke za lečenje poremećaja koji je povezan sa niskom gustinom kosti, ili za stimulaciju rasta kosti, kod pacijenata kod kojih postoji potreba za tim. Postupak može da sadrži primenu na subjekta, kod koga postoji potreba za tim, efikasne količine antagonista aktivin-ActRIIa. U određenim aspektima, pronalazak obezbeđuje primene antagonista aktivin-ActRIIa za pripremu leka za lečenje poremećaja ili stanja kao što je ovde opisano.
KRATAK OPIS CRTEŽA
Slika 1 prikazuje prečišćavanje ActRIIa-hFc eksprimiranog u CHO ćelijama. Protein se prečišćava kao jedan, dobro definisani maksimum.
Slika 2 prikazuje vezivanje ActRIIa-hFc za aktivin i GDF-11, mereno pomoću BiaCore™ testa. Slika 3 predstavlja šematski prikaz testa A-204 reporter gena. Slika prikazuje Reporter vektor: pGL3 (CAGA) 12 (opisan u Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091-3100.) CAGA12 motiv je prisutan u genu (PAI-1 gen) osetljivom na TGF-Beta, tako da je ovaj vektor ima opštu upotrebu za faktore koji vrše prenos signala preko Smad 2 i 3.
Slika 4 prikazuje efekte ActRIIa-hFc (rombovi) i ActRIIa-mFc (kvadrati) na GDF-8 prenos signala u A-204 testu reporter gena. Oba proteina su pokazala značajnu inhibiciju GDF-8 posredovanog prenosa signala u pikomolarnim koncentracijama.
Slika 5 prikazuje efekte tri različita preparata ActRIIa-hFc na GDF-11 prenos signala u testu A-204 reporter gena.
Slika 6 prikazuje primere DEXA slika kontrolom- i ActRIIa-mFc- tretiranih BALB/c miševa, pre (gornje slike) i posle (donje slike) 12-nedeljnog perioda tretmana. Svetlije osenčeni regioni ukazuju na povećanu gustinu kosti.
Slika 7 prikazuje kvantitativno određivanje efekata ActRIIa-mFc na mineralnu gustinu kosti kod BALB/c miševa u toku 12-nedeljnog perioda. Tretmani su bili kontrola (rombovi), 2 mg/kg doza ActRIIa-mFc (kvadrati), 6 mg/kg doza ActRIIa- mFc (trouglovi) i 10 mg/kg doza ActRIIamFc (krugovi).
Slika 8 prikazuje kvantitativno određivanje efekta ActRIIa-mFc na mineralni sadržaj kosti kod BALB/c miševa u toku 12-nedeljnog perioda. Tretmani su bili kontrola (rombovi), 2 mg/kg doza ActRIIa-mFc (kvadrati), 6 mg/kg doza ActRIIa- mFc (trouglovi) i 10 mg/kg doza ActRIIamFc (krugovi).
Slika 9 prikazuju kvantitativno određivanje efekata ActRIIa-mFc na mineralnu gustinu trabekularne kosti kod C57BL6 miševa sa ovarijektomijom (OVX) ili lažno operisanih (SHAM) tokom 6-nedeljnog perioda. Tretmani su bili kontrola (PBS) ili 10 mg/kg doza ActRIIa-mFc (ActRIIa).
Slika 10 prikazuje kvantitativno određivanje efekata ActRIIa-mFc na trabekularnu kost kod C57BL6 miševa sa ovarijektomijom (OVX) u toku 12-nedeljnog perioda. Tretmani su bili kontrola (PBS; svetli stubići) ili 10 mg/kg doza ActRIIa-mFc (ActRIIa; tamni stubići).
Slika 11 prikazuje kvantitativno određivanje efekata ActRIIa-mFc na trabelukarnu kost kod lažno operisanih C57BL6 miševa posle 6 ili 12 nedelja tretmana. Tretmani su bili kontrola (PBS; svetli stubići) ili 10 mg/kg doza ActRIIa- mFc (ActRIIa; tamni stubići).
Slika 12 prikazuje rezultate pQCT analize gustine kosti kod miševa sa overijektomijom u toku 12 nedeljnog tretmana. Tretmani su bili kontrola (PBS; svetli stubovi) ili ActRIIa-mFc (tamni stubovi), y-osa: mg/ccm
Slika 13 prikazuje rezultate pQCT analize gustine kosti kod lažno operisanih miševa u toku 12 nedeljnog tretmana. Tretmani su bili kontrola (PBS; svetli stubovi) ili ActRIIa-mFc (tamni stubovi), y-osa; mg/ccm.
Slike 14A i 14B prikazuju DEXA analizu celog tela posle 12 nedelja tretmana (A) i ex vivo analizu butnih kosti (B). Svetle površine prikazuju oblasti sa visokom gustinom kosti.
Slika 15 prikazuje ex vivo pQCT analizu medularne šupljine butne kosti posle dvanaest nedelja tretmana. Tretmani su bili kontrola u obliku nosača (PBS, tamni stubovi) i ActRIIa- mFc (svetli stubovi). Cetiri stuba sa leve strane prikazuju ukupnu gustinu kosti dok četiri stuba sa desne strane prikazuju kortikalnu gustinu kosti. Prvi par stubova u svakoj grupi od četiri stuba predstavljaju rezultate miševa sa ovarijektomijom dok drugi par stubova predstavlja rezultate lažno operisanih miševa.
Slika 16 prikazuje ex vivo pQCT analizu i diafiznog sadržaja medularne šupljine butne kosti posle dvanaest nedelja tretmana. Tretmani su bili kontrola u obliku nosača (PBS, tamni stubovi) ili ActRIIa-mFc (svetli stubovi). Četiri stuba sa leve strane pokazuju ukupni sadržaj kosti dok četiri stuba sa leve strane pokazuju kortikalni sadržaj kosti. Prvi par stubova u svakoj grupi od četiri stuba predstavljaju rezultate miševa sa ovarijektomijom dok drugi par stubova predstavlja rezultate lažno operisanih miševa.
Slika 17 prikazuje ex vivo pQCT analizu medularne šupljine butne kosti i kortikalne debljine butne kosti. Tretmani su bili kontrola (PBS, tamni stubovi) i ActRIIa-mFc (svetli stubovi). Četiri stuba sa leve strane pokazuju endostealni obim, dok četiri stuba na desnoj strani pokazuju periostealni obim. Prvi par stubova u svakoj grupi od četiri stuba predstavljaju rezultate miševa sa ovarijektomijom dok drugi par stubova predstavlja rezultate lažno operisanih miševa.
Slika 18 prikazuje rezultate mehaničkog testiranja butnih kosti posle dvanaest nedelja tretmana. Tretmani su bili kontrola (PBS, tamni stubovi) i ActRIIa-mFc (svetli stubovi). Dva stuba sa leve strane predstavljaju rezultate miševa sa ovarijektomijom dok poslednja dva stuba predstavljaju rezultate lažno operisanih miševa.
Slika 19 prikazuje efekte Actrlla-mFc na zapreminu trabekularne kosti.
Slika 20 prikazuje efekte Actrlla-mFc na trabekularnu građu u distalnom delu butne kosti.
Slika 21 prikazuje efekte Actrlla-mFc na kortikalnu kost.
Slika 22 prikazuje efekte Actrlla-mFc na mehaničku čvrstinu kosti.
Slika 23 prikazuje efekte različitih doza ActRIIa-mFc na karakteristike kosti u tri različite doze. Slika 24 prikazuje histomorfometriju kosti koja ukazuje na to da ActRIIa-mFc ima dvostruko anaboličko i anti-resorptivno delovanje.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
1. Pregled
Superfamilija transformišućeg faktora rasta beta (TGF-beta) sadrži različite faktore rasta koji dele zajedničke elemente sekvence i strukturne motive. Za ove proteine je poznato da pokazuju biološke efekte na veliki broj različitih ćelijskih tipova kako kod kičmenjaka tako i kod beskičmenjaka. Članovi superfamilije ispunjavaju značajne funkcije u toku embrionalnog razvića u formiranju obrazaca aktivnosti i tkivnoj specifičnosti i mogu da utiču na različite procese diferencijacije, uključujući adipogenezu, miogenezu, hondrogenezu, kardiogenezu, hematopoezu, neurogenezu i diferencijaciju epitelijalnih ćelija. Familija je podeljena u dve glavne grane: BMP/GDF i TGF-beta/aktivin/BMPl0 grane, čiji članovi imaju različite, često komplementarne efekte. Manipulacijom aktivnosti člana TGF-beta familije, često je moguće izazvati značajne fiziološke promene u organizmu. Na primer, Piedmontese i Belgian Blue sojevi stoke nose mutaciju gubitakfunkcije u GDF8 (takođe nazvan miostatin) genu koji izaziva primetno povećanje u mišićnoj masi. Grobet et al., Nat Genet. 1997, 17(l):71-4. Pored toga, kod ljudi, neaktivni aleli GDF8 su povezani sa povećanom mišićnom masom i, navodno, izuzetnom snagom. Schuelke et al., N Engl J Med 2004, 350:2682-8. Aktivini su dimerni polipeptidni faktori rasta koji pripadaju TGF-beta superfamiliji. Postoje tri glavna oblika aktivina (A, B i AB) koji su homo/heterodimeri dve blisko srodne β podjedinice (P<A>P<A>, P<B>P<B>i P<A>P<B>)- Humani genom takođe kodira aktivin C i aktivin E, koji se primarno eksprimiraju u jetri. U TGF-beta superfamiliji, aktivini su jedinstveni i multifunkcionalni faktori koji mogu da stimulišu proizvodnju hormona u ćelijama jajnika i posteljice, pomažu preživljavanje nervnih ćelija, utiču na napredovanje ćelijskog ciklusa pozitivno ili negativno u zavisnosti od ćelijskog tipa, i indukuju mezodermalnu diferencijaciju najmanje u embrionima vodozemaca (DePaolo et al., 1991, Proc Soc Ep Biol Med.198:500- 512; Dyson et al., 1997, Curr Biol.7:81-84; Woodruff, 1998, Biochem Pharmacol.55:953- 963). Pored toga, nađeno je da je eritroidni diferencijacioni faktor (EDF) izolovan iz
stimulisanih humanih leukemičnih monocita identičan aktivinu A (Murata et al., 1988, PNAS, 85:2434). Sugerisano je da aktivin A deluje kao prirodni, pozitivni regulator eritropoeze u koštanoj srži. U nekoliko tkiva, prenos signala preko aktivina je antagonizovan njegovim srodnim heterodimerom, inhibinom. Na primer, u toku oslobađanja folikulo-stimulirajućeg hormona (FSH) iz hipofize, aktivin stimuliše izlučivanje i sintezu FSH, dok inhibin sprečava izlučivanje i sintezu FSH. Drugi proteini koji mogu da regulišu bioaktivnost aktivina i/ili da se vežu za aktivin obuhvataju folistatin (FS), folistatin- srodni protein (FSRP), α2- makroglobulin, Cerberus i endoglin.
TGF-β signali su posredovani heteromernim kompleksima tipa I i tipa II serin/ treonin kinaza receptora, koji fosforilišu i aktiviraju nishodno Smad proteine usled stimulacije liganda (Massague, 2000, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 : 169-178). Ovi, tip I i tip II receptori su transmembranski proteini, sastavljeni od vanćelijskog domena koji vezuje ligand sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatičnog domena sa predviđenom serin/treonin specifičnošću. Tip I receptori su bitni za prenos signala; i tip II receptori su potrebni za vezivanje liganada i za ekspresiju tip I receptora. Tip I i II receptora za aktivin formiraju stabilan kompleks posle vezivanja liganda, što ima za rezultat fosforilaciju receptora tipa I receptorima tipa II.
Dva srodna tip II receptora, ActRIIa i ActRIIb, identifikovani su kao tip II receptori za aktivine (Mathews and Vale, 1991, Cell 65 : 973 -982; Attisano et al., 1992, Cell 68: 97-108). Pored aktivina, ActRIIa i ActRIIb mogu biohemijski da interaguju sa nekoliko drugih proteina TGF-P familije, uključujući BMP7, Nodal, GDF8 i GDFl 1 (Yamashita et al., 1995, J. Cell Biol.
130:217-226; Lee and McPherron, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. 98:9306-9311; Yeo and Whitman, 2001, Mol. Cell 7: 949-957; Oh et al„ 2002, Genes Dev. 16:2749-54). ALK4 je primarni receptor tip I za aktivine, naročito za aktivin A, i ALK-7 može da služi kao receptor za aktivine takođe, naročito za aktivin B.
Kao što je pokazano ovde, rastvorljivi ActRIIa polipeptid (sActRIIa), koji pokazuje značajnu prednost u vezivanju za aktivin A što je suprotno drugim članovima TGF-beta familije, kao što je GDF8 ili GDFl 1, je efikasan u stimulaciji rasta kosti i povećanju gustine kosti in vivo. Bez želje da se vežemo za bilo koji poseban mehanizam, očekuje se da je efekat sActRIIa izazvan primarno aktivin antagonističkim efektom, dajući veoma snažno vezivanje aktivina (pikomolarna konstanta disocijacije) koju pokazuje određeni sActRIIa konstrukt korišćen u ovim studijama. Bez obzira na mehanizam, očigledno je iz rezultata koji su ovde prikazani da antagonisti ActRIIaaktivina povećavaju gustinu kosti kod normalnih miševa i u modelima miševa za osteoporozu. Potrebno je naglasiti da je kost dinamičko tkivo, sa rastom
ili smanjenjem i povećanom ili smanjenom gustinom u zavisnosti od ravnoteže faktora koji proizvode kost i stimulišu mineralizaciju (pre svega osteoblasti) i faktora koji uništavaju i demineralizuju kost (pre svega osteoklasti). Rast i mineralizacija kosti mogu biti povećani povećanjem produktivnih faktora, smanjenjem destruktivnih faktora, ili oba. Termini "stimulišu rast kosti" i "povećavaju mineralizaciju kosti" odnose se na primetne fiziološke promene u kostima i određeni su da budu neutralni prema mehanizmu pomoću koga se javljaju promene u kostima. Modeli na miševima za osteoporozu i rast/gustinu kosti koji su korišćeni u ovde opisanim studijama smatraju se visoko predvidivim za efikasnost na ljudima, i prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje postupke za primenu ActRIIa polipeptida i drugih antagonista aktivin-ActRIIa za stimulaciju rasta kosti i povećanje gustine kosti kod ljudi. Antagonisti aktivin-ActRIIa obuhvataju, na primer, aktivin-vezujuće rastvorljive ActRIIa polipeptide, antitela koja se vezuju za aktivin (naročito podjedinice aktivina A ili B, takođe označene kao βA ili βB) i prekidaju ActRIIa vezivanje, antitela koja se vezuju za ActRIIa i prekidaju vezivanje aktivina, ne-antitelo proteini izabrani za vezivanje aktivina ili ActRIIa (videti npr., WO/2002/088171,WO/2006/055689, WO/2002/032925, WO/2005/037989, US 2003/0133939 i US 2005/0238646 za primere takvih proteina i postupaka za konstruisanje i izbor istih), peptidi izabrani po slučajnom izboru za vezivanje aktivina ili ActRIIa, često pričvršćeni za Fc domen. Dva različita proteina (ili druge grupe) sa aktivnošću vezivanja aktivina ili ActRIIa, naročito oni koji vezuju aktivin i koji blokiraju tip I (npr., rastvorljivi tip I receptora za aktivin) i tip II (npr., rastvorljivi tip II receptora za aktivin) vezujuća mesta, redom, mogu biti povezani međusobno tako da stvaraju bifunkcionalni vezujući molekul. Aptameri nukleinske kiseline, mali molekuli i druga sredstva koja inhibiraju aktivin-ActRIIa osu prenosa signala. Različiti proteini imaju aktivin-ActRIIa antagonističku aktivnost, uključujući inhibin (tj., inhibin alfa podjedinica), iako inhibin univerzalno ne antagonizuje aktivin u svim tkivima, folistatin (npr., folistatin-288 i folistatin-315), Cerberus, FSRP, endoglin, aktivin C, alfa(2)-makroglobulin, i M108 A (metionin u alanin promena na položaju 108) mutantni aktivin A. Generalno, alternativni oblici aktivina, naročito oni sa promenama u domenu koji se vezuje za receptor tip I mogu da se vezuju za receptore tip II i ne mogu da formiraju aktivni trostruki kompleks, na taj način delujući kao antagonisti. Pored toga, nukleinske kiseline, kao što su antisens molekuli, iRNK ili ribozomi koj inhibiraju aktivin A, B, C ili E, ili, naročito, ekspresiju ActRIIa, mogu se koristiti kao antagonisti aktivin-ActRIIa. Poželjno, antagonist aktivin-ActRIIa koji će se koristiti pokazaće selektivnost za inhibiciju aktivinom posredovanog prenosa signala u odnosu na druge članove
TGF-beta familije, i naročito u odnosu na GDF8 i G D F l l . Rastvorljivi ActRIIb proteini se vezuju za aktivin, međutim, protein divljeg tipa ne pokazuje značajnu selektivnost u vezivanju za aktivin u odnosu na GDF8/11, i preliminarnii eksperimenti sugerišu da ovaj protein ne obezbeđuje željene efekte na kost, dok takođe izaziva značajni rast mišića. Međutim, identifikovani su promenjeni oblici ActRIIb sa različitim svojstvima vezivanja (videti, npr., WO 2006/012627, pp. 55-59, koji je ovde obuhvaćen) i ovi proteini mogu da postignu željene efekte na kost. Prirodni ili promenjeni ActRIIb može biti obezbeđen uz dodatu specifičnost za aktivin spajanjem sa drugim, aktivinselektivnim vezujućim sredstvom. Termini korišćeni u ovoj specifikaciji generalno imaju svoja uobičajena značenja u tehnici, unutar konteksta ovog pronalaska i u posebnom kontekstu gde se koristi svaki termin. Izvesni termini su razmatrani u daljem tekstu ili na drugom mestu u specifikaciji, da bi se obezbedilo dodatno uputstvo za praktičara u opisivanju kompozicija i postupaka prema pronalasku i kako ih napraviti i koristiti. Obim ili značenje svake upotrebe termina biće očigledno iz specifičnog konteksta u kome se termin koristi.
"Oko" i "približno" generalno će označavati prihvatljivi stepen greške za veličinu merenu za datu prirodu ili preciznost merenja. Tipično, primeri stepeni greške su unutar 20 procenata (%), poželjno unutar 10%, i poželjnije unutar 5% date vrednosti ili opsega vrednosti.
Alternativno, i naročito u biološkim sistemima, termini "oko" i "približno" mogu da označavaju vrednosti koje su unutar reda veličine, poželjno unutar 5-puta i poželjnije unutar 2-puta date vrednosti. Numeričke veličine koje su ovde date su približne osim ukoliko nije naznačeno drugačije, što znači da termin "oko" ili "približno" može biti pretpostavljen kada nije izričito naveden.
Postupci prema pronalasku mogu da obuhvataju korake međusobnog poređenja sekvenci, uključujući sekvencu divljeg tipa sa jednim ili više mutanata (varijante sekvence). Takva poređenja tipično sadrže poravnavanje polimernih sekvenci, npr., primenom programa za poravnavanje sekvenci i/ili algoritama koji su dobro poznati u tehnici (na primer, BLAST, FASTA i MEGALIGN, da navedemo neke od njih). Iskusan stručnjak lako će shvatiti da, u takvim poravnavanjima, gde mutacija sadrži inserciju ili deleciju ostatka, poravnavanje sekvence će uvesti "prazninu" (džep) (tipično predstavljena cr ticom ili "A") u polimernoj sekveci koja ne sadrži inserirani ili deletirani ostatak. "Homologan," u svim njegovim gramatičkim oblicima i pravopisnim varijacijama, označava vezu između dva proteina koji poseduju "zajedničko evoluciono poreklo," uključujući proteine iz superfamilija u istoj vrsti organizma, kao i homologe proteine iz različitih vrste organizama. Takvi proteini (i njihove kodirajuće nukleinske kiseline) imaju homologiju sekvenci, kao što se može videti preko sličnosti njihovih sekvenci, bilo prema procentu identičnosti ili prema prisustvu specifičnih ostataka ili motiva i konzervativih položaja.
Termin "sličnost sekvenci," u svim njegovim gramatičkim oblicima, označava stepen identičnosti ili sličnosti između nukleinsko kiselinskih ili aminokiselinskih sekvenci koji mogu i ne moraju da dele zajedničko evoluciono poreklo.
Međutim, u uobičajenoj upotrebi i u ovoj prijavi, termin "homologan," kada je modifikovan sa prilogom "visoko," može da označava sličnost sekvenci i može ili ne mora da se odnosi na zajedničko evoluciono poreklo.
2. ActRIIa polipeptidi
U određenim aspektima, predstavljeni pronalazak se odnosi na ActRIIa polipeptide. Kao što je ovde korišćen, termin "ActRIIa" označava familiju proteina aktivin receptora tipa IIa (ActRIIa) iz bilo koje vrste i varijante izvedene od takvih ActRIIa proteina mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ActRIIa ovde označava pozivanje na bilo koji od trenutno identifikovanih oblika. Članovi ActRIIa familije su generalno transmembranski proteini, sastavljeni od vanćelijskog domena koji vezuje ligand sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena i citoplazmatičnog domena sa predviđenom aktivnošću serin/treonin kinaze. Termin "ActRIIa polipeptid" obuhvata polipeptide koji sadrže bilo koji prirodni polipeptid člana ActRIIa familije kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzione i peptidomimetičke oblike) koji zadržavaju korisnu aktivnost. Na primer, ActRIIa polipeptidi obuhvataju polipeptide izvedene od sekvence bilo kog poznatog ActRIIa koji ima sekvencu najmanje oko 80% identičnu sekvenci ActRIIa polipeptida, i poželjno najmanje 85%, 90%, 95%, 97%, 99% ili veću identičnost. Na primer, ActRIIa polipeptid prema pronalasku može da se veže za i inhibira funkciju ActRIIa proteina i/ili aktivina. Poželjno, ActRIIa polipeptid stimuliše rast kosti i mineralizaciju kosti. Primeri ActRIIa polipeptida obuhvataju humani ActRIIa prekursorski polipeptid (SEQ ID NO: 1) i rastvorljive humane ActRIIa polipeptide (npr., SEQ ID NOs: 2, 3, 7 i 12).
Sekvenca humanog ActRIIa prekursorskog proteina je kao što sledi:
U specifičnoj varijanti, pronalazak se odnosi na rastvorljive ActRIIa polipeptide. Kao što je ovde opisano, termin "rastvorljivi ActRIIa polipeptid" se generalno odnosi na polipeptide koji sadrže vanćelijski domen ActRIIa proteina. Termin "rastvorljivi ActRIIa polipeptid," kao što je ovde korišćen, obuhvata bilo koji prirodni vanćelijski domen ActRIIa proteina kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente i peptidomimetičke oblike). Aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid je onaj koji zadržava sposobnost da se veže za aktivin, naročito aktivin AA, AB ili BB. Poželjno, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid će se vezati za aktivin AA sa konstantnom disocijacije od 1 nM ili manje. Aminokiselinske sekvence humanog ActRIIa prekursorskog proteina date su u daljem tekstu. Vanćelijski domen ActRIIa proteina se vezuje za aktivin i generalno je rastvorljiv, i na taj način se može odrediti terminom rastvorljiv, aktivin-vezujući ActRIIa polipeptid. Primeri rastvorljivih, aktivin-vezujućih ActRIIa polipeptida obuhvataju rastvorljivi polipeptid ilustrovan u SEQ ID NOs: 2, 3, 7, 12 i 13. SEQ ID NO:7 je označena kao ActRIIa-hFc, i dodatno je opisana u Primerima. Drugi primeri rastvorljivih, aktivin-vezujućih ActRIIa polipeptida sadrže signalnu sekvencu pored vanćelijskog domena ActRIIa proteina, na primer, lider sekvenca melitina medonosne pčele (SEQ ID NO: 8), aktivator tkivnog plazminogena (TPA) lider sekvenca (SEQ ID NO: 9) ili nativni ActRIIa leader (SEQ ID NO: 10). ActRIIa-hFc polipeptid ilustrovan u SEQ ID NO: 13 koristi TPA lider sekvencu.
Funkcionalno aktivni fragmenti ActRIIa polipeptida mogu se dobiti skriningom polipeptida koji su rekombinantno proizvedeni od odgovarajućeg fragmenta nukleinske kiseline koja kodira ActRIIa polipeptid. Pored toga, fragmenti mogu biti hemijski sintetisani korišćenjem tehnika poznatih u tehnici kao što je uobičajena Merrifield čvrsta faza f-Moc ili t- Boc hemija. Fragmenti mogu biti proizvedeni (rekombinantno ili hemijskom sintezom) i testirani u pogledu identifikacije onih peptidil fragmenata koji mogu da funkcionišu kao antagonisti (inhibitori) ActRIIa proteina ili prenosa signala posredovanog aktivinom. Funkcionalno aktivne varijante ActRIIa polipeptida mogu biti dobijene skriningom biblioteka modifikovanih polipeptida rekombinantno proizvedenih od odgovarajuće mutagenizovanih
1
nukleinskih kiselina koje kodiraju ActRIIa polipeptid. Varijante mogu biti proizvedene i testirane za identifikaciju onih koje mogu da funkcionišu kao antagonisti (inhibitori) ActRIIa proteina ili prenosa signala posredovanog aktivinom. U određenim varijantama pronalaska, funkcionalna varijanta ActRIIa polipeptida sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 75% identična aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NOs: 2 ili 3. U određenim slučajevima, funkcionalna varijanta ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičnu aminokiselinskoj sekvenci izabranoj od SEQ ID NOs: 2 ili 3.
Funkcionalne varijante mogu biti stvorene modifikacijom strukture ActRIIa polipeptida za takve svrhe kao što su povećanje terapeutske efikasnosti, ili stabilnosti (npr., ex vivo rok trajanja i otpornost na proteolitičku razgradnju in vivo). Takvi modifikovani ActRIIa polipeptidi kada su izabrani tako da zadrže vezivanje aktivina, smatraju se funkcionalnim ekvivalentima prirodnih ActRIIa polipeptida. Modifikovani ActRIIa polipeptidi takođe mogu biti proizvedeni, na primer, supstitucijom, delecijom ili adicijom aminokiseline. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena aminokiseline sa strukturno srodnom aminokiselinom (npr., konzervativne mutacije) neće imati veći efekat na biološku aktivnost dobijenog molekula. Konzervativne zamene su one koje se odigravaju unutar familije aminokiselina koje su srodne prema njihovim bočnim lancima. Da li će promena u aminokiselinskoj sekvenci ActRIIa polipeptida imati za rezultat funkcionalni homolog može biti lako određena procenom sposobnosti varijante ActRIIa polipeptida da proizvodi odgovor u ćelijama na način koji je sličan divljem tipu ActRIIa polipeptida.
U određenim varijantama, predstavljeni pronalazak razmatra specifične mutacije ActRIIa polipeptida tako da se menja glikozilacija polipeptida. Takve mutacije mogu biti izabrane tako da uvode ili eliminišu jedno ili više glikozilacionih mesta, kao što su O-vezana ili N-vezana glikozilaciona mesta. Asparagin-vezana mesta prepoznavanja glikozilacije generalno sadrže tripeptidnu sekvencu, asparagin-X-treonin (ili asparagin-X-serin) (gde je "X" bilo koja aminokiselina) koju specifično prepoznaju odgovarajući ćelijski glikozilacioni enzimi. Promena takođe može biti napravljena dodavanjem, ili supstitucijom, jednog ili više serinskih ili treoninskih ostataka sekvenci divljeg tipa ActRIIa polipeptida (za O-vezana glikozilaciona mesta). Različite aminokiselinske supstitucije ili delecije na jednom ili oba od prvog ili trećeg aminokiselinskog položaja mesta prepoznavanja glikozilacije (i/ili aminokiselinska delecija na drugom položaju) imaju za rezultat ne-glikozilaciju na modifikovanoj tripeptidnoj sekvenci. Druga sredstva za povećanje broja ugljenohidratnih
grupa na ActRIIa polipeptidu je hemijskim ili enzimatskim spajanjem glikozida za ActRIIa polipeptid. U zavisnosti od korišćenog načina spajanja, šećer (šećeri) mogu biti vezani za (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksil grupe; (c) slobodne sulfhidril grupe kao što su one iz cisteina; (d) slobodne hidroksil grupe kao što su one iz serina, treonina ili hidroksiprolina; (e) aromatični ostaci kao što su oni iz fenilalanina, tirozina ili triptofana; ili (f) amidna grupa iz glutamina. Ovi postupci su opisani u WO 87/05330 objavljenom 11.09.1987., i u Aplin and Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, koji su ovde obuhvaćeni. Uklanjanje jedne ili više ugljenohidratnih grupa prisutnih na ActRIIa polipeptidu može se postići hemijski i/ili enzimatski. Hemijska deglikozilacija može da obuhvata, na primer, izlaganje ActRIIa polipeptida jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman ima za rezultat cepanje većine ili svih šećera osim vezujućeg šećera (N- acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), ostavljajući aminokiselinsku sekvencu intaktnom. Hemijska deglikozilacija je dalje opisana od strane Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys.259:52 i od strane Edge et al. (1981) Anal. Biochem.118:131. Enzimatsko cepanje ugljenohidratnih grupa na ActRIIa polipeptidima može se postići primenom različitih endoi egzo-glikozidaza kao što su opisali Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Sekvenca ActRIIa polipeptida može biti podešena, na odgovarajući način, u zavisnosti od korišćenog tipa ekspresionog sistema, budući da ćelije sisara, kvasca, insekata i biljaka, mogu da uvedu različite glikozilacione obrasce na koju može uticati aminokiselinska sekvenca peptida. Uopšteno, ActRIIa proteini za primenu kod ljudi biće eksprimirani u sisarskoj ćelijskoj liniji koja obezbeđuje pravilnu glikozilaciju, kao što su HEK293 ili CHO ćelijske linije, iako se očekuje da su takođe korisne i druge sisarske ekspresione ćelijske linije, ćelijske linije kvasca sa glikozilacionim enzimima dobijenim gentičkim inženjeringom i ćelije insekata.
Ovaj pronalazak dalje razmatra postupak za stvaranje mutanata, naročito grupa kombinatornih mutanata ActRIIa polipeptida, kao i odsecanje mutanata; fondovi kombinatornih mutanata su naročito korisni za identifikaciju sekvenci funkcionalnih varijanti. Svrha skrininga takvih kombinatornih biblioteka može biti stvaranje, na primer, ActRIIa polipeptidnih varijanti koje mogu da deluju bilo kao agonisti ili antagonisti, ili alternativno, koje poseduju nove aktivnosti. U daljem tekstu su dati različiti skrining testovi, i takvi testovi se mogu koristiti za procenu varijanti. Na primer, ActRIIa polipeptidna varijanta može biti ispitivana u pogledu sposobnosti da se veže za ActRIIa ligand, da spreči vezivanje ActRIIa liganda za ActRIIa polipeptid ili da ometa prenos signala izazvan ActRIIa ligandom.
Aktivnost ActRIIa polipeptida ili njegovih varijanti takođe može biti testirana u testu na bazi ćelije ili u in vivo testu. Na primer, može se proceniti efekat ActRIIa polipeptidne varijante na ekspresiju gena uključenih u proizvodnju kosti ili razaranje kosti. Ovo se može, prema potrebi, izvesti u prisustvu jednog ili više rekombinantnih ActRIIa ligand proteina (npr., aktivin), i ćelije mogu biti transficirane tako da proizvode ActRIIa polipeptid i/ili njegove varijante, i izborno, ActRIIa ligand. Slično tome, ActRIIa polipeptid može biti primenjen na miša ili drugu životinju, i moguće je proceniti jednu ili više osobina kosti, kao što je gustina ili zapremina. Stopa zaceljivanja za prelome kosti takođe se može proceniti. Dvoenergetska rendgenska apsorpciometrija (DEXA) je dobro utemeljena, neinvazivna, kvantitativna tehnika za procenu gustine kosti kod sisara. Kod ljudi centralni DEXA sistemi se mogu koristiti za procenu gustine kosti u kičmi i karlici. Ovo su najbolji pokazatelji u smislu predviđanja ukupne gustine kosti. Periferni DEXA sistemi se mogu koristiti za procenu gustine kosti u perifernim kostima, uključujući, na primer, kosti ruke, ručnog zgloba, gležnja i stopala. Klasični sistemi rendgenskih snimaka, uključujući CAT skeniranje, mogu se koristiti za procenu rasta kosti i zarastanje preloma. Mehanička čvrstina kosti takođe se može proceniti.
Mogu se stvoriti kombinatorno-izvedene varijante koje imaju selektivnu ili generalno povećanu potenciju u odnosu na prirodni ActRIIa polipeptid. Slično tome, mutageneza može dati varijante koje imaju unutarćelijski polu-život izrazito različit od odgovarajućeg divljeg tipa ActRIIa polipeptida. Na primer, promenjeni protein može biti napravljen bilo stabilnijim ili manje stabilnim na proteolitičko razlaganje ili druge ćelijske procese koji imaju za rezultat razlaganje, ili drugačiju inaktivaciju prirodnog ActRIIa polipeptida. Takve varijante, i geni koji ih kodiraju, mogu biti korišćeni za promenu nivoa ActRIIa polipeptida modulacijom poluživota ActRIIa polipeptida. Na primer, kratak poluživot može dati više prolaznih bioloških efekata i može obezbediti veću kontrolu nivoa rekombinantnog ActRIIa polipeptida unutar pacijenta. U Fc fuzionom proteinu, mutacije mogu biti napravljene u linkeru (ako postoji) i/ili Fc delu da bi se promenio poluživot proteina.
Kombinatorna biblioteka može biti proizvedena pomoću izrođene biblioteke gena koji kodiraju biblioteku polipeptida, pri čemu svaki od njih obuhvata najmanje deo potencijalnih ActRIIa polipeptidnih sekvenci. Na primer, smeša sintetičkih oligonukleotida može biti enzimatski vezana u genske sekvence tako da izrođena grupa potencijalnih nukleotidnih sekvenci ActRIIa polipeptida može biti eksprimirana kao pojedinačni polipeptidi, ili alternativno, kao grupa većih fuzionih proteina (npr., za fagni prikaz).
2
Postoji mnogo načina pomoću kojih se može napraviti biblioteka potencijalnih homologa od izrođene oligonukleotidne sekvence. Hemijska sinteza izrođene genske sekvence može se izvesti u automatskom uređaju za sintezu DNK, i sintetički geni zatim mogu biti vezani u odgovarajući vektor za ekpresiju. Sinteza izrođenog oligonukleotida je dobro poznata u tehnici (videti na primer, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al., (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al., (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al„ (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Takve tehnike su korišćene u usmerenoj evoluciji drugih proteina (videti, na primer, Scott et al„ (1990) Science 249:386-390; Roberts et al„ (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al„ (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al„ (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; kao i U.S. Patent Nos: 5,223,409, 5,198,346, i 5,096,815).
Alternativno, drugi oblici mutageneze mogu biti korišćeni za stvaranje kombinatorne biblioteke. Na primer, ActRIIa polipeptidne varijante mogu biti napravljene i izolovane iz biblioteke skriningom primenom, na primer, alanin skenirajuće mutageneze i slično (Ruf et al„ (1994) Biochemistry 33: 1565-1572; Wang et al„ (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al„ (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al„ (1993) Eur. J. Biochem. 218:597- 601; Nagashima et al„ (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; and Cunningham et al., (1989) Science 244:1081-1085), putem linker skenirajuće mutageneze (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al., (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); saturacione mutageneze (Meyers et al., (1986) Science 232:613); pomoću PCR mutgeneze (Leung et al„ (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); ili pomoću slučajne mutageneze, uključujući hemijsku mutagenezu, itd. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; and Greener et al., (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34). Linker skenirajuća mutageneza, naročito u kombinatornoj postavci, je privlačan postupak za identifikaciju odsečenih (bioaktivnih) oblika ActRIIa polipeptida.
Siroki opseg tehnika je poznat u tehnici za skrining genskih proizvoda kombinatornih biblioteka napravljenih tačkastim mutacijama i odsecanjima, i, što se toga tiče, za skrining cDNK biblioteka za genske proizvode koji imaju određeno svojstvo. Takve tehnike biće generalno prihvatljive za brzi skrining genskih biblioteka stvorenih kombintornom mutagenezom ActRIIa polipeptida. Najšire korišćene tehnike za skrining velikih genskih biblioteka tipično sadrže kloniranje genske biblioteke u ekspresione vektore koji se mogu replicirati, transformaciju odgovarajućih ćelija sa nastalom bibliotekom vektora, i
2
eksprimiranje kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti olakšava relativno laku izolaciju vektora sa kodirajućim genom čiji je proizvod detektovan. Poželjno testovi obuhvataju testove vezivanja aktivina i testove aktivinom-posredovanog ćelijskog prenosa signala.
U određenim varijantama, ActRIIa polipeptidi prema pronalasku mogu dalje da sadrže posttranslacione modifikacije pored svih koje su prirodno prisutne u ActRIIa polipeptidima. Takve modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na, acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju i acilaciju. Kao rezultat, modifikovani ActRIIa polipeptidi mogu da sadrže ne-aminokiselinske elemente, kao što su polietilen glikoli, lipidi, poli- ili mono-saharid i fosfate. Efekti takvih ne-aminokiselinskih elemenata na funkcionalnost ActRIIa polipeptida može biti testirana kao što je ovde opisano za druge ActRIIa polipeptidne varijante. Kada je ActRIIa polipeptid proizveden u ćelijama cepanjem nascentnog oblika ActRIIa polipeptida, post-translaciona obrada može takođe biti značajna za ispravno pakovanje i/ili funkciju proteina. Različite ćelije (kao što su CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ili HEK293) imaju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za takve post-translacione aktivnosti i mogu biti izabrane tako da osiguraju ispravnu modifikaciju i obradu ActRIIa polipeptida.
U određenim aspektima, funkcionalne varijante ili modifikovani oblici ActRIIa polipeptida obuhvataju fuzione proteine koji imaju najmanje deo ActRIIa polipeptida i jedan ili više fuzionih domena. Dobro poznati primeri takvih fuzionih domena obuhvataju, ali nisu ograničeni na, polihistidin, Glu-Glu, glutation S transferazu (GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region (Fc) teškog lanca imunoglobulina, protein koji vezuje maltozu (MBP) ili humani serum albumin. Fuzioni domen može biti izabran tako da obezbedi željeno svojstvo. Na primer, neki fuzioni domeni su naročito korisni za izolaciju fuzionih proteina hromatografijom na osnovu afiniteta. Za prečišćavanje na osnovu afiniteta koriste se relevantne matrice za hromatografiju na osnovu afiniteta, kao što su glutation-, amilaza- i nikl- ili kobalt- konjugovane smole. Mnoge od takvih matrica su dostupne u obliku "kompleta", kao što su Pharmacia GST sistem za prečišćavanje i QIAexpress™ sistem (Qiagen) koristan za (HISg) fuzione partnere. Kao sledeći primer, fuzioni domen može biti izabran tako olakša detekciju ActRIIa polipeptida. Primeri takvih detekcionih domena obuhvataju različite fluorescentne proteine (npr., GFP) kao i "epitop markere," koji su obično kratke peptidne sekvence za koje je dostupno specifično antitelo. Dobro poznati epitop markeri za koje su lako dostupna specifična monoklonalna antitela obuhvataju FLAG, hemaglutininin virusa gripa (HA) i c-myc marker. U nekim slučajevima, fuzioni domeni
2
imaju mesto cepanja proteaze, kao što je za faktor Xa ili trombin, koje omogućava relevatnoj proteazi da delimično razloži fuzione proteine i tako iz njega oslobodi rekombinantne proteine. Oslobođeni proteini zatim mogu biti izolovani iz fuzionog domena kasnijim hromatografskim odvajanjem. U određenim poželjnim varijantama. ActRIIa polipeptid je fuzionisan sa domenom koji stabilizuje ActRIIa polipeptid in vivo ("stabilizator" domen). Pod "stabilizacijom" se podrazumeva bilo šta što povećava poluživot u serumu, bez obzira da li je to zbog smanjenog razlaganja, smanjenog oslobađanja (klirensa) preko bubrega, ili drugog farmakokinetičkog efekta. Poznato je da fuzije sa Fc delom imunoglobulina obezbeđuju željena farmakokinetička svojstva na širokom opsegu proteina. Slično tome, fuzije sa humanim serum albuminom mogu da obezbede željena svojstva. Drugi tipovi fuzionih domena koji mogu biti izabrani obuhvataju multimerizaciju (npr., dimerizaciju, tetramerizaciju) domena i funkcionalnih domena (koja obezbeđuje dodatnu biološku funkciju, kao što su dodatna stimulacija rasta kosti ili rasta mišića, prema potrebi).
Izborno, Fc domen ima jednu ili više mutacija na ostacima kao što su Asp-265, lizin 322 i Asn-434. U određenim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr., Asp-265 mutaciju) ima smanjenu sposobnost vezivanja za Fcγ receptor u odnosu na divlji tip Fc domena. U drugim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr., Asn-434 mutaciju) ima povećanu sposobnost vezivanja za MHC klase I-srodni Fc-receptor (FcRN) u odnosu na divlji tip Fc domena.
Razume se da različiti elementi fuzionih proteina mogu biti raspoređeni na bilo koji način koji je u skladu sa željenom funkcionalnošću. Na primer, ActRIIa polipeptid može biti postavljen C-terminalno za heterologni domen, ili, alternativno, heterologni domen može biti postavljen C-terminalno za ActRIIa polipeptid. ActRIIa polipeptidni domen i heterologni domen ne moraju biti jedan pored drugog u fuzionom proteinu, i dodatni domeni ili aminokiselinske sekvence mogu biti uključene C- ili N-terminalno u bilo koji domen ili između domena.
2
U određenim varijantama, ActRIIa polipeptidi prema predstavljenom pronalasku sadrže jednu ili više modifikacija koje mogu da stabilizuju ActRIIa polipeptide. Na primer, takve modifikacije povećavaju in vitro polu-život ActRIIa polipeptida, povećavaju polu-život ActRIIa polipeptida u cirkulaciji ili smanjuju proteolitičku razgradnju ActRIIa polipeptida. Takve stabilizujuće modifikacije obuhvataju, ali nisu ograničene na, fuzione proteine (uključujući, na primer, fuzione proteine koji sadrže ActRIIa polipeptid i stabilizatorski domen), modifikacije glikozilacionog mesta (uključujući, na primer, adiciju glikozilacionog mesta ActRIIa polipeptidu), i modifikacije ugljenohidratne grupe (uključujući, na primer, uklanjanje ugljenohidratnih grupa iz ActRIIa polipeptida). U slučaju fuzionih proteina, ActRIIa polipeptid je fuzionisan za stabilizatorski domen kao što je IgG molekul (npr., Fc domen). Kao što je ovde korišćen, termin "stabilizatorski domen" se ne odnosi samo na fuzioni domen (npr., Fc) kao u slučaju fuzionih proteina, već takođe obuhvata ne-proteinske modifikacije kao što je ugljenohidratna grupa, ili ne-proteinski polimer, kao što je polietilen glikol.
U određenim varijantama, predstavljeni pronalazak čini dostupnim izolovane i/ili prečišćene oblike ActRIIa polipeptida, koji su izolovani iz, ili na drugi način značajno bez, drugih proteina. ActRIIa polipeptidi će generalno biti proizvedeni ekspresijom iz rekombinantnih nukleinskih kiselina.
3. Nukleinske kiseline koje kodiraju ActRIIa polipeptide
U određenim aspektima, pronalazak daje izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od ActRIIa polipeptida (npr., rastvorljive ActRIIa polipeptide), uključujući fragmente, funkcionalne varijante i fuzione proteine koji su ovde opisani. Na primer, SEQ ID NO: 4 kodira prirodni humani ActRIIa prekursorski polipeptid, dok SEQ ID NO: 5 kodira obrađeni vanćelijski domen ActRIIa. Predmetne nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane. Takve nukleinske kiseline mogu biti molekuli DNK ili RNK. Ove nukleinske kiseline mogu biti korišćene, na primer, u postupcima za pripremu ActRIIa polipeptida ili kao direktna terapeutska sredstva (npr., u pristupu genske terapije).
U određenim aspektima, dalje se podrazumeva da predmetne nukleinske kiseline koje kodiraju ActRIIa polipeptide obuhvataju nukelinske kiseline koje su varijante sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5. Varijante nukleotidnih sekvenci obuhvataju sekvence koje se razlikuju po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija, adicija ili delecija, kao što su alelske varijante.
2
U određenim varijantama, pronalazak obezbeđuje izolovane ili rekombinantne nukleinsko kiselinske sekvence koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identične sa SEQ ID NO: 4 ili 5. Stručnjak iz date oblasti tehnike će razumeti da su nukleinsko kiselinske sekvence komplementarne sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 5, i varijante sekvence SEQ ID NO: 4 ili 5 takođe u okviru obima ovog pronalaska. U daljim varijantama, nukleinsko kiselinske sekvence prema pronalasku mogu biti izolovane. rekombinantne i/ili fuzionisane sa heterolognom nukleotidnom sekvencom, ili u DNK biblioteci.
U drugim varijantama, nukleinske kiseline prema pronalasku takođe obuhvataju nukleotidne sekvence koje hibridizuju pod visoko strogim uslovima do nukleotidne sekvence označene u SEQ ID NO: 4 ili 5, komplemetarne sekvence sekvenci SEQ ID NO: 4 ili 5, ili njihovih fargmenata. Kao što je razmatrano u prethodnom tekstu, stmčnjak iz date oblasti tehnike će lako razumeti da odgovarajuća rigoroznost uslova koji stimulišu DNK hibridizaciju mogu biti menjani. Stručnjak iz date oblasti tehnike će lako razumeti da odgovarajuća rigoroznost uslova koji stimulišu DNK hibridizaciju mogu biti menjani. Na primer, moguće je izvesti hibridizaciju na 6.0 x natrijum hlorida /natrijum citrata (SSC) na oko 45°C, nakon čega sledi ispiranje sa 2.0 x SSC na 50°C. Na primer, koncentracija soli u koraku ispiranja može biti izabrana od nisko rigoroznih uslova od oko 2.0 x SSC na 50°C do visoko rigoroznih uslova od oko 0.2 x SSC na 50°C. Pored toga, temperatura u koraku ispiranja može biti povećana od nisko rigoroznih uslova na sobnoj temperaturi, oko 22°C, do visoko rigoroznih uslova na oko 65°C. I temperatura i so se mogu menjati, ili temperatura ili koncentracija soli mogu se održavati konstantnim dok se druga promenljiva menja. U jednoj varijanti, pronalazak obezbeđuje nukleinske kiseline koje hibridizuju pod nisko rigoroznim uslovima od 6 x SSC na sobnoj temperaturi nakon čega sledi ispiranje na 2 x SSC na sobnoj temperaturi.
Izolovane nukleinske kiseline koje se razlikuju od nukleinskih kiselina kao što su navedene u SEQ ID NOs: 4 ili 5 zbog degeneracije u genetičkom kodu su takođe u okviru obima pronalaska. Na primer, određen broj aminokiselina je označen sa više od jednim tripletom. Kodoni koji određuju istu aminokiselinu, ili sinonimi (na primer, CAU i CAC su sinonimi za histidin) mogu imati za rezultat "tihe" mutacije koje ne utiču na aminokiselinsku sekvencu proteina. Međutim, očekuje se da će polimorfizam DNK sekvence koji vodi ka promenama u aminokiselinskim sekvencama predmetnih proteina postojati kod sisarskih ćelija. Stručnjaku iz date oblasti tehnike će biti jasno da ove varijacije u jednom ili više nukleotida (do oko 3-5% nukleotida) nukleinskih kiselina koje kodiraju određeni protein mogu da postoje kod individua date vrste zahvaljujući prirodnoj alelskoj varijaciji. Bilo koja i
2
sve takve nukleotidne varijacije i nastali polimorfizmi aminokiselina su unutar obima ovog pronalaska.
U određenim varijantama, rekombinantne nukleinske kiseline prema pronalasku mogu biti funkcionalno vezane za jednu ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci u ekspresionom konstruktu. Regulatorne nukleotidne sekvence će generalno biti odgovarajuće za ćeliju domaćina upotrebljenu za ekspresiju. Brojni tipovi odgovarajućih ekspresionih vektora i pogodne regulatorne sekvence su poznati u tehnici za različite ćelije domaćine. Tipično, navedene jedna ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci mogu da obuhvataju, ali nisu ograničene na, promotor sekvencu, lider ili signalne sekvence, mesta vezivanja ribozoma, transkripcione početne i završne sekvence, translacione početne i završne sekvence i pojačivač ili aktivator sekvence. Konstitutivni ili inducibilni promotori kao što su poznati u tehnici razmatrani su u ovom pronalasku. Promotori mogu biti bilo prirodni promotori ili hibridni promotori koji kombinuju elemente više od jednog promotora. Ekspresioni konstrukt može biti prisutan u ćeliji na epizomu, kao što je plazmid, ili ekspresioni konstrukt može biti umetnut u hromozomu. U poželjnoj varijanti, ekspresioni vektor sadrži izborni marker gen da bi se omogućio izbor transformisanih ćelija domaćina. Izborni marker geni su dobro poznati u tehnici i variraće sa korišćenom ćelijom domaćinom.
U određenim aspektima pronalaska, predmetna nukleinska kiselina je obezbeđena u ekspresionom vektoru koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira ActRIIa polipeptid i operativno je vezana za najmanje jednu regulatornu sekvencu. Regulatorne sekvence su poznate u tehnici i izabrane su tako da usmeravaju ekspresiju ActRIIa polipeptida. Prema tome, termin regulatorna sekvenca obuhvata promotore, pojačivače i druge elemente za kontrolu ekspresije. Primeri regulatornih sekvenci opisani su u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Na primer, bilo koja od širokog opsega ekspresionih kontrolnih sekvenci koje kontrolišu ekspresiju DNK sekvence kada su operativno vezane za nju mogu se koristiti u ovim vektorima za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju ActRIIa polipeptid. Takve korisne ekspresione kontrolne sekvence, obuhvataju, na primer, rane i kasne promotore SV40, tet promotor, neposredni rani promotor adeno ili citomegalovirusa, RSV promotori, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, T7 promotor čija ekspresija je usmerena pomoću T7 RNK polimeraze, glavni operatorski i promotorski regioni lambda faga, kontrolni regioni za fd protein omotača. promotor za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotori kisele fosfataze, npr., Pho5, promotori ,,α-mating“ faktora kvasca, the polihedron promotor bakulovirus sistema i druge sekvence za koje je poznato da kontrolišu ekspresiju gena prokariotiskih ili
2
eukariotiskih ćelija ili drugih virusa, i njihove različite kombinacije. Potrebno je razumeti da konstrukcija ekspresionog vektora može zavisiti od takvih faktora kao što su izbor ćelije domaćina koja će se transformisati i/ili tipa proteina koji se želi eksprimirati. Pored toga, broj kopija vektora, sposobnost kontrolisanja da broj kopija i ekspresija bilo kog drugog proteina koji je kodiran vektorom, kao što su antibiotski markeri, takođe je potrebno razmatrati.
Rekombinantna nukleinska kiselina prema pronalasku može biti proizvedena vezivanjem kloniranog gena, ili njegovof dela, u vektor koji je sposoban za ekspresiju bilo u prokariotiskim ćelijama, eukariotskim ćelijama (kvasca, ptičjim, insekata ili sisarskim), ili obe. Ekspresioni nosači za proizvodnju rekombinantnog ActRIIa polipeptida obuhvataju plazmide i druge vektore. Na primer, pogodni vektori obuhvataju plazmide sledećih tipova: pBR322-izvedene plazmide, pEMBL-izvedene plazmide, pEX-izvedene plazmide, pBTac- izvedene plazmide i pUC-izvedene plazmide za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, kao što je E. coli.
Neki sisarski ekspresioni vektori sadrže kako prokariotske sekvence za olakšavanje propagacije vektora u bakterijama, i jednu ili više eukariotskih transkripcionih jedinica koje su eksprimirane u eukariotskim ćelijama. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg izvedeni vektori su primeri sisarskih ekspresionih vektora pogodnih za transfekciju eukariotiskih ćelija. Neki od ovih vektora su modifikovani sa sekvencama iz bakterijskih plazmida, kao što je pBR322, da bi se olakšala replikacija i selekcija vezana za otpornost na lek kako kod prokariotskih tako i kod eukariotskih ćelija. Alternativno, derivati virusa kao što su goveđi papilloma virus (BPV- I), ili Epstein-Barr virus (pHEBo, pREP-izveden i p205) mogu se koristiti za prelaznu ekspresiju proteina u eukariotiskim ćelijama. Primeri drugih virusnih (uključujući retrovirusne) ekspresionih sistema mogu se naći u daljem tekstu u opisu sistema za primenu genske terapije. Različiti postupci korišćeni u pripremi plazmida i u transformaciji organizama domaćina dobro su poznati u tehnici. Za druge pogodne ekspresione sisteme kako za prokariotske tako i za eukariotske ćelije, kao i opšte rekombinantne postupke, videti Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). U nekim slučajevima, može biti poželjno eksprimirati rekombinantne polipeptide primenom baculovirus ekspresionog sistema. Primeri takvih baculovirus ekspresionih sistema obuhvataju pVL-izvedene vektore (kao što su pVL1392, pVL1393 i pVL941), pAcUW-izvedene vektore (kao što je pAcUWl), i pBlueBac- izvedene vektore (kao što je β-gal koji sadrži pBIueBac III).
2
U poželjnoj varijanti, vektor će biti konstruisan za proizvodnju predmetnih ActRIIa polipeptida u CHO ćelijama, kao što je Pcmv-Script vektor (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 vektori (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i pCI-neo vektori (Promega, Madison, Wise). Kao što će biti jasno, predmetni genski konstrukti se mogu koristiti za izazivanje ekspresije predmetnih ActRIIa polipeptida u ćelijama razmnožavanim u kulturi, npr., za proizvodnju proteina, uključujući fuzione proteine ili varijante proteina, za prečišćavanje.
Ovaj opis se takođe odnosi na ćeliju domaćina transficiranu sa rekombinantnim genom uključujući kodirajuću sekvencu (npr., SEQ ID NO: 4 ili 5) za jedan ili više predmetnih ActRIIa polipeptida. Ćelija domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, ActRIIa polipeptid prema pronalasku može biti eksprimiran u bakterijskim ćelijama kao što je E. coli, ćelije insekata (npr., primenom baculovirus ekspresionog sistema), ćelija kvasca ili sisarske ćelije. Druge pogodne ćelije domaćini su poznate stručnjacima iz ove oblasti tehnike.
Prema tome, predstavljeni pronalazak se dalje odnosi na postupke za proizvodnju predmetnih ActRIIa polipeptida. Na primer, ćelija domaćin transficirana sa ekspresionim vektorom koji kodira ActRIIa polipeptid može biti gajena u kulturi pod odgovarajućim uslovima da bi se omogućila ekspresija ActRIIa polipeptida. ActRIIa polipeptid može biti izlučen i izolovan iz smeše ćelija i podloge koja sadrži ActRIIa polipeptid. Alternativno, ActRIIa polipeptid može biti sačuvan citoplazmatski ili u frakciji membrane i ćelije mogu biti sakupljene, lizirane i protein izolovan. Ćelijska kultura obuhvata ćelije domaćine, podlogu i druge sporedne proizvode. Pogodne podloge za ćelijsku kulturu su dobro poznate u tehnici. Predmetni ActRIIa polipeptidi mogu biti izolovani iz podloge za ćelijsku kulturu, ćelija domaćina, ili oba, primenom tehnika koje su poznate u tehnici za prečišćavanje proteina, uključujući jonoizmenjivačku hromatografiju, gel filtracionu hromatografiju, ultrafiltraciju, elektroforezu, imunoafinitetno prečišćavanje sa antitelima specifičnim za određene epitiope ActRIIa polipeptida i afinitentno prečišćavanje sa sredstvom koje se vezuje za domen fuzionisan za ActRIIa polipeptid (npr., kolona proteina A može biti korišćena za prečišćavanje ActRIIa-Fc fuzije). U poželjnoj varijanti, ActRIIa polipeptid je fuzioni protein koji sadrži domen koji olakšava njegovo prečišćavanje. U poželjnoj varijanti, prečišćavanje je postignuto pomoću serije koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, po bilo kom redosledu: protein A hromatografija, Q sefaroza hromatografija, fenilsefaroza hromatografija, hromatografija na osnovu veličine i katjonsko izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje bi se moglo završiti sa virusnom filtracijom i puferskom izmenom. Kao što je pokazano ovde, ActRIIa-hFc protein je prečišćen do čistoće od >98%
kao što je određeno pomoću hromatografije na osnovu veličine i >95% kao što je određeno pomoću SDS PAGE. Ovaj nivo čistoće je bio dovoljan da se postignu poželjni efekti na kost kod miševa i prihvatljiv profil bezbednosti kod miševa, pacova i nehumanih primata.
U drugoj varijanti, fuzioni gen koji kodira lider sekvencu za prečišćavanje, kao što je sekvenca mesta cepanja poli-(His)/enterokinaze na N-terminusu željenog dela rekombinantnog ActRIIa polipeptida, može omogućiti prečišćavanje eksprimiranog fuzionog proteina hromatografijom na osnovu afiniteta primenom Ni<2+>metal smole. Lider sekvenca za prečišćavanje može kasnije biti uklonjena tretmanom sa enterokinazom da bi se obezbedio prečišćeni ActRIIa polipeptid (npr., videti Hochuli et al., (1987) J Chromatography 411:177; and Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
Tehnike za stvaranje fuzionih gena su dobro poznate. U suštini, spajanje različitih DNK fragmenata koji kodiraju različite polipeptidne sekvence izvedeno je u skladu sa uobičajenim tehnikama, primenom terminusa sa tupim ili nazubljenim krajevima za ligaciju, razlaganje restrikcionim enzimima da bi se obezbedili odgovarajući terminusi, punjenje kohezivnih krajeva kako je prikladno, tretmanom alkalnom fosfatazom da bi se izbeglo neželjeno spajanje, i enzimatsko vezivanje. U sledećoj varijanti, fuzioni gen može biti sintetisan uobičajenim tehnikama uključujući automatizovan uređaj za sintezu DNK. Altemativno, PCR amplifikacija genskih fragmenata se može izvesti primenom sidrenih prajmera koji daju komplementame ispuste između dva uzastopna genska fragmenta koji mogu biti kasnije spojeni tako da stvore himernu gensku sekvencu (videti, na primer, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
4. Primeri terapeutske primene
U određenim varijantama, antagonisti aktivin-ActRIIa (npr., ActRIIa polipeptidi) prema predstavljenom pronalasku mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja koje je povezano sa oštećenjem kosti, bilo preko, npr., preloma, gubitka ili demineralizacije. U određenim varijantama, predstavljeni pronalazak daje postupke za lečenje ili prevenciju oštećenja kosti kod individue kod koje postoji potreba za tim preko primene na individuu terapeutski efikasne količine antagonista aktivin-ActRIIa, naročito ActRIIa polipeptida. U određenim varijantama, predstavljeni pronalazak daje postupke za stimulaciju rasta ili mineralizacije kosti kod individue kod koje postoji potreba za tim preko primene na individuu terapeutski efikasne količine antagonista aktivin-ActRIIa, naročito ActRIIa polipeptida. Ovi postupci su poželjno usmereni na terapeutske i profilaktičke tretmane životinja, i poželjnije, ljudi. U određenim varijantama, pronalazak obezbeđuje za primenu antagonist aktivin-
ActRIIa (naročito rastvorljive ActRIIa polipeptide i neutralizujuća antitela koja ciljno deluju na aktivin ili ActRIIa) za lečenje poremećaja povezanih sa niskom gustinom kosti ili smanjenom čvrstinom kosti.
Kao što je ovde korišćen, lek koji "sprečava" poremećaj ili stanje odnosi se na jedinjenje koje, u statističkom uzorku, smanjuje pojavu poremećaja ili stanja u tretiranom uzorku u odnosu na netretirani kontrolni uzorak, ili odlaže početak ili smanjuje jačinu jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja u odnosu na netretirani kontrolni uzorak. Termin "tretman/lečenje" kao što je korišćen ovde obuhvata profilaksu navedenog stanja ili poboljšanje ili eliminaciju stanja pošto je ono utvrđeno. U svakom slučaju, prevencija ili lečenje mogu se razlikovati u dijagnozi obezbeđenoj od strane lekara i nameravanom rezultatu primene terapeutskog sredstva.
Pronalazak obezbeđuje postupke za indukciju formiranja kosti i/ili hrskavice, prevenciju gubitka kosti, povećanje mineralizacije kosti ili prevenciju demineralizacije kosti. Na primer, predmetni antagonisti aktivin-ActRIIa imaju primenu u lečenju osteoporoze i zaceljivanju preloma kosti i oštećenja hrskavice kod ljudi i životinja. ActRIIa ili aktivin polipeptidi mogu biti korisni kod pacijenata kojima je postavljena dijagnoza subkliničke niske gustine kosti, kao zaštitna mera protiv razvoja osteoporoze.
U jednoj specifičnoj varijanti, postupci i kompozicije prema predstavljenom pronalasku mogu naći medicinsku korist u zaceljivanju peloma kosti i oštećenja hrskavice kod ljudi i životinja. Predmetni postupci i kompozicije takođe mogu imati profilaktičku primenu u smanjenju zatvorenog kao i otvorenog preloma i takođe u poboljšanom fiksiranju veštačkih zglobova. Formiranje kosti de novo indukovano osteogenim sredstvom doprinosi obnovi kongenitalnih, indukovanih povredom, ili indukovanih onkološkom resekcijom kraniofacijalnih defekata, i takođe je korisno u kozmetičkoj plastičnoj hirurgiji. U određenim slučajevima, predmetni antagonisti aktivin-ActRIIa mogu da obezbede sredinu koja će privući ćelije koje formiraju kost, stimuliše rast ćelija koje formiraju kost ili indukuje diferencijaciju progenitore ćelija koje formiraju kost. Antagonisti aktivin-ActRIIa prema pronalasku takođe mogu biti korisni u lečenju osteoporoze. Postupci i kompozicije prema pronalasku mogu biti primenjeni na stanja koja su okarakterisana ili koja izazivaju gubitak kosti, kao što je osteoporoza (uključujući sekundarnu osteoporozu), hiperparatiroidizam, Cushing-ova bolest, Paget-ova bolest, tirotoksikoza, hronična dijareja ili poremećena apsorpcija, renalna tubulama acidoza ili anorexia nervosa. Osteoporoza može biti izazvana, ili povezana sa, različitim faktorima. Osobe ženskog pola, naročito žene posle menopauze, koje imaju nisku telesnu težinu, i vode sedentarni način života imaju faktore rizika za osteoporozu (gubitak mineralne
3
gustine kosti, što vodi ka riziku od preloma). Osobe koje imaju bilo koji od sledećih profila mogu biti kandidati za lečenje sa antagonistom ActRIIa: žene posle menopauze i koje ne uzimaju estrogen ili drugu terapiju zamene hormona; osoba sa ličnom ili po majčinoj liniji istorijom preloma kuka ili pušenje; žena posle menopauze koja je visoka (preko 5 stopa i 7 inča) ili mršava (manje od 125 funti); muškarac sa kliničkim stanjima povezanim sa gubitkom kosti; osoba koja koristi lekove za koje je poznato da izazivaju gubitak kosti, uključujući kortikosteroide kao što je Prednisone™, različiti lekovi protiv napada kao što je Dilantin™ i određeni barbiturati, ili visoka doza lekova zamene za tiroidni hormon; osoba koja ima dijabetes tipa 1, bolest jetre, bolest bubrega ili porodičnu istoriju osteoporoze; osoba koja ima visoki metabolizam kosti (npr., višak kolagena u uzorcima urina); osoba sa tiroidnim stanjem, kao što je hipertiroidizam; osoba koja je imala prelom posle samo blage povrede; osoba koja imala rendgenski dokaz kičmenog preloma ili druge znake osteoporoze.
Kao što je navedeno u prethodnom tekstu, osteoporoza takođe može nastati kao stanje povezano sa drugim poremećajem ili od upotrebe određenih lekova. Osteoporoza koja nastaje kao rezultat upotrebe lekova ili kao posledica drugih medicinskih stanja poznata je kao sekundarna osteoporoza. U stanju poznatom kao Cushing-ova bolest, prekomema količina kortizola proizvedenog u telu ima za rezultat osteoporozu i prelome. Najčešći lekovi povezani sa sekundarnom osteoporozom su kortikosteroidi, klasa lekova koji deluju kao kortizol, hormon koji prirodno proizvode nadbubrežne žlezde. Iako su dovoljni nivoi tiroidnih hormona (koje proizvodi tiroidna žlezda) potrebni za razvoj skeleta, višak tiroidnog hormona može smanjiti koštanu masu u toku vremena. Antacidi koji sadrže aluminijum mogu dovesti do gubitka kosti kada ih uzimaju u visokim dozama ljudi koji imaju probleme sa bubrezima, naročito oni koji koji su na dijalizi. Drugi lekovi koji mogu da izazovu sekundarnu osteoporozu obuhvataju fenitoin (Dilantin) i barbiturate koji se koriste za sprečavanje napada; metotreksat (reumatreks, imuneks, foleks PFS), lek za neke oblike artritisa, kancer, i imune poremećeje; ciklosporin (sandimun, neoral), lek koji se koristi za lečenje nekih autoimunih bolesti i suprimiranje imunog sistema kod pacijenata sa transplantiranim organom; agonist hormona koji oslobađa luteinizirajući hormon (lupron, zoladeks), koji se koristi za lečenje kancera prostate i endometrioze; heparin (kalciparin, likvaemin), lek protiv zgmšavanja krvi; i holestiramin (kvestran) i kolestipol (kolestid), koji se koriste za lečenje visokog nivoa holesterola. Gubitak kosti koji je rezultat terapije kancera široko je prepoznatljiv i označen je terminom gubitak kosti indukovan terapijom kancera (CTIBL). Metastaze na kostima mogu da stvore šupljine u kosti koje mogu biti ispravljene tretmanom sa antagonistima aktivina- ActRIIa.
3
U poželjnoj varijanti, antagonisti aktivin-ActRIIa, naročito rastvorljivi ActRIIa, koji su ovde opisani, mogu se koristiti kod pacijenata koji boluju od kancera. Pacijenti koji imaju određene tumore (npr. prostate, dojke, multipli mijelom ili bilo koji tumor koji izaziva hiperparatiroidizam) su pod visokim rizikom od gubitka kosti zbog gubitka kosti koji je indukovan tumorom kao i metastazama na kostima i terapeutskim sredstvima. Takvi pacijenti mogu biti lečeni sa antagonistima aktivin-ActRIIa čak i u odsustvu dokaza gubitka kosti ili metastaze na kostima. Pacijenti se takođe mogu pratiti u pogledu dokaza o gubitku kosti ili metastaze na kostima, i mogu biti lečeni sa antagonistima aktivin-ActRIIa u slučaju da indikatori sugerišu povećani rizik. Uopšteno, DEXA sken se koristi za procenu promena u gustini kosti, dok se indikatori remodelacije kosti mogu koristiti za procenu verovatnoće metastaza na kostima. Serum markeri se mogu pratiti. Alkalna fosfataza specifična za kosti (BSAP) je enzim koji je prisutan u osteoblastima. Nivoi BSAP u krvi su povećani kod pacijenata sa metastazama na kostima i drugim stanjima koja imaju za rezultat povećanu remodelaciju kosti. Osteokalcin i prokolagen peptidi su takođe povezani sa formiranjem kosti i metastazom na kostima. Povećanja u BSAP su detektovana kod pacijenata sa metastazom na kostima izazvanom kancerom prostate, i u manjem stepenu, metastazama na kostima od kancera dojke. Nivoi morfogenetičkog proteina-7 kosti (BMP-7) su visoki kod kancera prostate koji je metastazirao na kost, ali ne i kod metastaza na kostima koje su posledica kancera bešike, kože, jetre ili pluća. Tip I karboksi-terminalni telopeptid (ICTP) je unakrsna veza nađena u kolagenu koja je formirana u toku resorpcije kosti. S obzirom da se kost stalno razlaže i obnavlja (remodeluje), ICTP će se naći svuda u telu. Međutim, na mestu metastaze na kostima, nivo će biti značajno viši nego u oblasti normalne kosti. ICTP je nađen u visokim nivoima kod metastaze kosti koja je rezultat kancera prostate, pluća i dojke. Sledeća unakrsna veza kolagena, tip I N-terminalni telopeptid (NTx), se proizvodi zajedno sa ICTP u toku metabolizma kosti. Količina NTx je povećana kod metastaze kosti izazvane velikim brojem različitih tipova kancera uključujući kancer pluća, prostate i dojke. Takođe, nivoi NTx se povećavaju sa napredovanjem metastaze kosti. Prema tome, ovaj marker se može koristiti kako za detekciju metastaze tako i za merenje stepena bolesti. Drugi markeri resorpcije obuhvataju piridinolin i deoksipiridinolin. Svako povećanje u resorpcionim markerima ili markerima metastaze kosti ukazuju na potrebu za terapijom antagonistom aktivin-ActRIIa kod pacijenta.
Antagonisti aktivin-ActRIIa mogu biti zajedno primenjeni sa drugim farmaceutskim sredstvima. Zajednička primena se može postići primenom jedne koformulacije, istovremenom primenom ili primenom u različita vremena. Antagonisti aktivin-ActRIIa mogu
3
biti naročito korisni ako se primenjuju sa drugim sredstvima koja deluju na kost. Pacijent može imati korist od zajedničkog primanja antagonista aktivin-ActRIIa i uzimanja kalcijumskih dodataka, vitamina D, odgovarajućeg vežbanja i/ili, u nekim slučajevima, drugog leka. Primeri drugih lekova obuhvataju, bisfosfonate (alendronat, ibandronat i risedronat), kalcitonin, estrogene, paratiroid hormon i raloksifen. Bisfosfonati (alendronat, ibandronat i risedronat), kalcitonin, estrogeni i raloksifen utiču na ciklus remodeliranja kosti i klasifikovani su kao anti-resorptivni lekovi. Remodelovanje kosti se sastoji od dva posebna stadijuma: resorpcija kosti i formiranje kosti. Anti-resorptivni lekovi usporavaju ili zaustavljaju resorpciju kosti koja je deo u ciklusu remodelovanja kosti, ali ne usporavaju deo ciklusa koji je predstavljen formiranjem kosti. Kao rezultat, novo formiranje se nastavlja sa većom stopom od resorpcije kosti, i gustina kosti se može povećati u toku vremena. Teriparatid, oblik paratiroidnog hormona, povećava stopu formiranja kosti u ciklusu remodelovanja kosti. Alendronat je odobren kako za prevenciju (5 mg na dan ili 35 mg jednom nedeljno) i lečenje (10 mg na dan ili 70 mg jednom nedeljno) postmenopauzalne osteoporoze. Alendronat smanjuje gubitak kosti, povećava gustinu kosti i smanjuje rizik od preloma kičme, ručnog zgloba i kuka. Alendronat je takođe odobren za lečenje glukokortikoidomindukovane osteoporoze kod mušakaraca i žena kao rezultat dugotrajne upotrebe ovih lekova (tj., prednizona i kortizona) i za lečenje osteoporoze kod muškaraca. Alendronat plus vitamin D je odobren za lečenje osteoporoze kod postmenopauzalnih žena (70 mg jednom nedeljno plus vitamin D), i za lečenje za poboljšanje koštane mase kod muškaraca sa osteoporozom. Ibandronat je odobren za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. Kada se uzima kao pilula jednom mesečno (150 mg), ibandronat bi trebalo uzimati istog dana svaki mesec. Ibandronat smanjuje gubitak kosti, povećava gustinu kosti i smanjuje rizik od preloma kičme. Risedronat je odobren za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. Kada se uzima dnevno (5 mg doza) ili nedeljno (35 mg doza ili 35 mg doza sa kalcijumom), risedronat usporava gubitak kosti, povećava gustinu kosti i smanjuje rizik od kičmenih i ne-kičmenih preloma. Risedronat je takođe odobren za primenu kod muškaraca i žena za prevenciju i/ili lečenje glukokortikoidom-indukovane osteoporoze koja je rezultat dugotrajne primene ovih lekova (tj., prednizon ili kortizon). Kalcitonin je prirodni hormon uključen u regulaciju kalcijuma i metabolizam kosti. Kod žena kod kojih je proteklo više od 5 godina od menopauze, kalcitonin usporava gubitak kosti, povećava gustinu kičmene kosti, i može da olakša bol povezan sa prelomom kosti. Kalcitonin smanjuje rizik od preloma kičme. Kalcitonin je dostupan kao injekcija (50-100 IU dnevno) ili nazalni sprej (200 IU dnevno). Terapija estrogenom (ET)/hormonska terapija (HT) je odobrena za prevenciju
3
osteoporoze. Pokazano je da ET smanjuje gubitak kosti, povećava gustinu kosti u kičmi i kuku, i smanjuje rizik od preloma kuka i kičme kod žena u postmenopauzi. ET se primenjuje najčešće u obliku pilule ili kožnih flastera koji oslobađaju nisku dozu od približno 0.3 mg dnevno ili standardnu dozu od približno 0.625 mg dnevno i efikasnaje čak i kada je započeta posle starosti od 70 godina. Kada se estrogen uzima sam, on može da poveća rizik kod žena od razvoja kancera endometrijuma. Da bi se eliminisao taj rizik, zdravstveni radnici prepisuju hormon progestin u kombinaciji sa estrogenom (terapija zamene hormona ili HT) za one žene koje imaju intaktnu matericu. ET/HT olakšava simptome menopauze i pokazano je da imaju koristan efekat na zdravlje kosti. Sporedni efekti mogu da obuhvataju vaginalno krvarenje, osetljivost u dojkama, poremećaje raspoloženja i bolest žučnog mehura. Raloksifen, 60 mg na dan, je odobren za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. On je iz klase lekova pod nazivom selektivni modulatori receptora za estrogen (SERMs) koji su razvijeni da bi obezbedili korisne efekte estrogena bez njihovih potencijalnih nedostataka. Raloksifen povećava koštanu masu i smanjuje rizik od preloma kičme. Rezultati nisu još uvek dostupni da bi se pokazalo da raloksifen može da smanji rizik od preloma kuka i drugih preloma koji ne uključuju kičmu. Teriparatid, oblik paratiroidnog hormona, je odobren za lečenje osteoporoze kod postmenopauzalnih žena i muškaraca kod kojih postoji rizik od preloma. Ovaj lek stimuliše formiranje nove kosti i značajno povećava mineralnu gustinu kosti. Kod postmenopauzalnih žena, smanjenje preloma je zabeleženo u kičmi, kuku, stopalu, rebrima i ručnom zglobu. Kod muškaraca, smanjenje preloma je zabeleženo u kičmi, ali nije bilo dovoljno podataka da bi se proceniolo smanjenje preloma na drugim mestima. Teriparatid se samoprimenjuje kao dnevna injekcija do 24 meseca.
5. Farmaceutske kompoziciie
U određenim varijantama, antagonisti aktivin-ActRIIa (npr., ActRIIa polipeptidi) prema predstavljenom pronalasku su formulisani sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Na primer, ActRIIa polipeptid se može primenjivati sam ili kao komponenta farmaceutske formulacije (terapeutska kompozicija). Predmetna jedinjenja mogu biti formulisana za primenu na bilo koji pogodan način za primenu kod ljudi ili u veterinarskoj medicini.
U određenim varijantama, terapeutski postupak prema pronalasku obuhvata primenu kompozicije sistemski, ili lokalno kao implant ili uređaj. Kada se primenjuje, terapeutska kompozicija za primenu u ovom pronalasku je, naravno, u fiziološki prihvatljivom obliku bez pirogena. Terapeutski korisna sredstva osim antagonista ActRIIa koja takođe mogu izboUQo
3
biti uključena u kompoziciju kao što je opisana u prethodnom tekstu, mogu biti primenjena istovremeno ili uzastopno sa predmetnim jedinjenjima (npr., ActRIIa polipeptidi) u postupcima prema pronalasku. Tipično, antagonisti ActRIIa biće primenjeni parenteralno.
Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu mogu da sadrže jedan ili više ActRIIa polipeptida u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivim sterilinim izotoničnim vodenim ili nevodenim rastvorima, disperzijama, suspenzijama ili emulzijama, ili sterilnih praškova koji mogu biti rekonstituisani u sterilne injektabilne rastvore ili disperzije neposredno pre primene, koji mogu da sadrže antioksidante, pufere, bakteriostate, rastvorljiva sredstva koja daju formulciji izotoničnost sa krvlju nameravanog recipijenta ili suspendujućih sredstava ili sredstava za zgušnjavanje. Primeri pogodnih vodenih ili nevodenih nosača koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama prema pronalasku obuhvataju vodu, etanol, poliole (kao što su glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što su maslinovo ulje, i injektabilni organski estri, kao što je etil oleat. Pogodna fluidnost se može održavati, na primer, primenom oblagajućih materijala, kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom površinski aktivnih sredstava. Pored toga, kompozicija može biti inkapsulirana ili injektirana u obliku za primenu na mesto ciljnog tkiva (npr., kost). U određenim varijantama, kompozicije prema predstavljenom pronalasku mogu da obuhvataju matriks koji je sposoban da oslobađa jedno ili više terapeutskih jedinjenja (npr., ActRIIa polipeptida) na mesto ciljnog tkiva (npr., kost), obezbeđujući strukturu za razvoj tkiva i optimalno je sposoban da bude resorbovan u telu. Na primer, matriks može da obezbedi sporo oslobađanje ActRIIa polipeptida. Takvi matriksi mogu biti formirani od materijala koji se sada koriste za druge implantirane medicinske primene.
Izbor matriksnog materijala je zasnovan na biokompatibilnosti, biorazgradljivosti, mehaničkim osobinama, kozmetičkom izgledu i karakteristikama interfejsa. Određena primena predmetnih kompozicija definisaće odgovarajuću formulaciju. Potencijalni matriksi za kompozicije mogu biti biorazgradivi i hemijski definisani kalcijum sulfat, trikalcijumfosfat, hidroksiapatit, polilaktid i polianhidridi. Drugi potencijalni materijali su biorazgradivi i biološki dobro definisani, kao što su kolagen kosti ili kože. Dodatni matriksi su sastavljeni od čistih proteina ili komponenanta vanćelijskog matriksa. Drugi potencijalni matriksi su ne-biorazgradivi i hemijski određeni, kao što su sinterovani hidroksiapatit, biostaklo, aluminati ili druga keramika. Matriksi mogu biti sastavljeni od kombinacija bilo kog od prethodno navedenih tipova materijala, kao što su polilaktid i hidroksiapatit ili kolagen i trikalcijumfosfat. Biokeramika može biti promenjena u kompoziciji, kao što je u kalcijum-
3
aluminat-fosfatu i obrađena da bi se promenila veličina pora. veličina čestica, oblik čestica i biorazgradivost.
U određenim varijantama, postupci prema pronalasku mogu biti primenjeni za oralne, npr., u obliku kapsula, tableta sa žigom, pilula, tableta, lozengi (primenom aromatizovane osnove, obično saharoze i akacije ili tragantove gume), praškova, granula ili kao rastvor ili suspenzija u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, ili kao ulje-u-vodi ili voda-u-ulju tečne emulzije, ili kao eliksir ili sirup, ili kao pastile (primenom inertne baze. kao što su želatin i glicerin, ili saharoza i akacija) i/ili kao tečnosti za ispiranje usta i slično, pri čemu svaki od njih sadrži unapred određenu količinu sredstva kao aktivnog sastojka. Sredstvo se takođe može primeniti kao bolus, elektuarijum ili pasta.
U čvrstim oblicima doze za oralnu primenu (kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, granule i slično), jedno ili više terapeutskih jedinjenja prema predstavljenom pronalasku može biti pomešano sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, kao što je natrijum citrat ili dikalcijum fosfat, i/ili bilo koji od sledećih: (1) sredstva za punjenje ili produžavanje, kao što su skrobovi, laktoza, saharoza, glukoza, manitol i/ili kremena kiselina; (2) vezujuća sredstva, kao što su, na primer, karboksimetilceluloza, alginati, želatin, polivinil pirolidon, saharoza i/ili akacija; (3) ovlaživači, kao što je glicerol; (4) sredstva za raspadanje, kao što su agar- agar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapioka skrob, alginska kiselina, određeni silikati i natrijum karbonat; (5) agensi za usporavanje rastvaranja, kao što je parafin; (6) sredstva za ubrzavanje apsorpcije, kao što su kvaternarna amonijum jedinjenja; (7) sredstva za vlaženje, kao što su, na primer, cetil alkohol i gliceril monostearat; (8) absorbensi, kao što su kaolin i bentonit glina; (9) lubrikanti, kao što su talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat i njihove smeše; i (10) sredstva za bojenje. U slučaju kapsula, tableta i pilula, farmaceutske kompozicije mogu takođe da sadrže puferujuća sredstva. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se takođe koristiti kao sredstva za punjenje u mekanim i tvrdim punjenim želatinoznim kapsulama primenom takvih inertnih punilaca kao što su laktoza ili mlečni šećeri, kao i polietilenglikoli sa visokom molekulskom masom i slično. Tečni oblici doze za oralnu primenu obuhvataju farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe i eliksire. Pored aktivnog sastojka, tečni oblici doze mogu da sadrže inertne razblaživače koji se obično koriste u tehnici, kao što su voda ili drugi rastvarači, solubilizujuća sredstva i emulgatori, kao što su etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, ulja (naročito, pamučnog semena, Apios americana, kukuruzno, iz semena žitarica, maslinovo, ricinusovo i sezamovo ulje), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikoli i
3
srobitan estri masnih kiselina i njihove smeše. Pored inertnih razblaživača, oralne kompozicije mogu takođe da obuhvataju adjuvante kao što su sredstva za vlaženje, emulgujuća i suspendujuća sredstva, zaslađivače, aromate, boje, mirisna sredstva i konzervanse.
Suspenzije, pored aktivnih jedinjenja mogu da sadrže suspendujuća sredstva kao što su etoksilovani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan estri, mikrokristalna celuloza, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar i tragantova guma, i njihove smeše.
Kompozicije prema pronalasku mogu takođe da sadrže adjuvante, kao što su konzervansi, sredstva za vlaženje, emulgatori i dispergujuća sredstva. Prevencija delovanja mikroorganizama može se osigurati uključivanjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava, na primer, paraben, hlorobutanol, fenol sorbinska kiselina, i slično. Takože može biti poželjno uključiti izotonična sredstva, kao što su šećeri, natrijum hlorid i slično u kompozicije. Pored toga, produženo apsorbovanje injektabilnog farmaceutskog oblika može biti ostvareno uključivanjem sredstava koja odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin. Razume se da će režim doziranja biti određen od strane lekara koji će razmotriti različite faktore koji modifikuju delovanje predmetnih jedinjenja prema pronalasku (npr., ActRIIa polipeptidi). Različiti faktori obuhvataju, ali nisu ograničeni na, količinu koštane mase koju želimo da formiramo, stepen gubitka gustine kosti, veličina oštećenja kosti, stanje oštećene kosti, starost, pol i ishrana pacijenta, težina bilo koje bolesti koja može da doprinese gubitku kosti, vreme primene i drugi klinički faktori.
Izborno, doza može da varira sa tipom matriksa koji se koristi u rekonstituciji i tipova jedinjenja u kompoziciji. Dodavanje drugih poznatih faktora krajnjoj kompoziciji, takođe može imati uticaja na dozu. Napredovanje se može pratiti periodičnim procenjivanjem rasta kosti i/ili obnove, na primer, rendgenski (uključujući DEXA), histomorfometrijskim određivanjem i obeležavanjem tetraciklinom.
Eksperimenti sa miševima su pokazali da su efekti ActRIIa-Fc na kost detektabilni kada se jedinjenje dozira u intervalima i količinama koji su dovoljni da se postignu koncentracije u serumu od 0.2 pg/kg ili više, i nivoi u serumu od 1 pg/kg ili 2 pg/kg ili više su poželjni za postizanje značajnih efekata na gustinu i čvrstinu kosti. Iako ne postoji indikacija da su više doze ActRIIa-Fc nepoželjne zbog sporednih efekata, režimi doziranja mogu biti konstruisani tako da se dostignu koncentracije u serumu od između 0.2 i 15 pg/kg, i izbomo između 1 i 5 pg/kg. Kod ljudi, nivoi u serumu od 0.2 pg/kg mogu se postići sa jednom dozom od 0.1 mg/kg ili više i nivoi u serumu od 1 μg/kg mogu se postići sa jednom dozom od 0.3 mg/kg ili više. Zabeleženi polu-život molekula u serumu je između oko 20 i 30 dana, značajno duže od većine Fc fuzionih proteina, i na taj način produženi efikasan nivo u serumu može se
postići, na primer, doziranjem sa 0.2-0.4 mg/kg jednom ili dva puta nedeljno, ili više doze se mogu koristiti sa dužim intervalima između doziranja. Na primer, doze od 1-3 mg/kg mogu se koristiti na jednom ili dva puta mesečno, i efekat na kost može biti dovoljno trajan da je doziranje neophodno samo jednom u svakih 3,4, 5, 6, 9, 12 ili više meseci.
U određenim varijantama, predstavljeni pronalazak takođe daje gensku terapiju za in vivo proizvodnju ActRIIa polipeptida. Takvom terapijom bi se postigao njen terapeutski efekat uvođenjem ActRIIa polinukleotidnih sekvenci u ćelije ili tkiva koji imaju poremećaje kao što su navedeni u prethodnom tekstu. Primena ActRIIa polinukleotidnih sekvenci se može postići primenom rekombinantnog ekspresionog vektora kao što je himerni virusni ili koloidni disperzioni sistem. Poželjno za terapeutsku primenu ActRIIa polinukleotidnih sekvenci je primena ciljanih lipozoma.
Različiti virusni vektori koji se mogu koristiti za gensku terapiju kao što je ovde navedeno obuhvataju adenovirus, herpes virus, vakcinija ili, poželjno, RNK virus kao što je retrovirus. Poželjno, retrovirusni vektor je derivat mišjeg ili ptičjeg retrovirusa. Primeri retrovirusnih vektora u koje može biti inseriran jedan strani gen obuhvataju, ali nisu ograničeni na: Moloney virus mišje leukemije (MoMuLV), Harvey virus mišjeg sarkoma (HaMuSV), mišji virus tumora mlečne žlezde (MuMTV) i Rous virus sarkoma (RSV). Određen broj dodatnih retrovirusnih vektora može da ugradi višestruke gene. Svi ovi vektori mogu da prenose ili ugrade gen za izbomi marker tako da ćelije dobijene transdukcijom mogu biti identifikovane i stvorene. Retrovimsni vektori mogu biti napravljeni ciljno-specifični vezivanjem, na primer, šećera, glikolipida ili proteina. Poželjno ciljno delovanje je postignuto primenom antitela. Stručnjacima iz date oblasti tehnike biće jasno da specifične polinukleotidne sekvence mogu biti inserirane u retrovirusi genom ili vezane za virusni omotač da bi se omogućila ciljno specifična primena retrovirusnog vektora koji sadrži ActRIIa polinukleotid. U poželjnoj varijanti, vektor se ciljno primenjuje na kost ili hrskavicu.
Altemativno, ćelije kulture tkiva mogu biti direktno transficirane sa plazmidima koji kodiraju retrovirusne struktume gene gag, pol i env, uobičajenom transfekcijom kalcijum fosfatom. Ove ćelije su zatim transficirane sa plazmidnim vektorom koji sadrži gene od interesa. Dobijene ćelije oslobađaju retrovimsni vektor u podlugu za kulturu.
Drugi sistem za ciljanu primenu ActRIIa polinukleotida je sistem koloidne disperzije. Sistemi koloidne disperzije obuhvataju makromolekulske komplekse, nanokapsule, mikrosfere, kuglice i sisteme na bazi lipida uključujući ulje-u-vodi emulzije, micele, smeše micela i lipozome. Poželjan koloidni sistem ovog pronalaska je lipozom. Lipozomi su vezikule veštačke membrane koje su korisne kao vezikule za oslobađanje (primenu) in vitro i
in vivo. RNK, DNK i intaktni virioni mogu biti inkapsulirani unutar vodene unutrašnjosti i mogu biti primenjeni na ćelije u biološki aktivnom obliku (videti npr., Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77, 1981). Postupci za efikasan trasnfer gena primenom lipozomskog nosača, poznati su u tehnici, videti npr., Mannino, et al., Biotechniques, 6:682, 1988. Kompozicija lipozoma je obično kombinacija fosfolipida, obično u kombinaciji sa steroidima, naročito holesterolom. Drugi fosfolipidi ili drugi lipidi takođe se mogu koristiti. Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH vrednosti, jonske jačine i prisustva dvovalentnih katjona.
Primeri lipida koji su korisni u proizvodnji lipida obuhvataju fosfatidil jedinjenja, kao šo su fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipidi, cerebrozidi i gangliozidi. Ilustrativni fosfolipidi obuhvataju fosfatidilholin iz jajeta, dipalmitoilfosfatidilholin i distearoilfosfatidilholin. Ciljno delovanje lipozoma je takođe moguće na osnovu, na primer, specifičnosti za organ, ćelijske specifičnosti i specifičnosti za organelu i poznato je u tehnici.
PRIMERI
Pronalazak je sada uopšteno opisan i lakše će se razumeti u vezi sa sledećim primerima, koji su obuhvaćeni samo radi ilustrovanja određenih varijanti i varijanti predstavljenog pronalaska, i nije bila namera da ograniče pronalazak.
Primer 1: ActRIla-Fc fuzioni proteini
Prijavioci su konstruisali rastvorljivi ActRIIa fuzioni protein koji ima vanćelijski domen humanog ActRIIa fuzionisan za humani ili mišji Fc domen sa minimalnim linkerom između. Konstrukti su označeni kao ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc, redom.
Oba ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc su značajno podložni rekombinantnoj ekspresiji. Kao što je prikazano na Slici 1, protein je prečišćen kao jedan, dobro definisani maksimum proteina. N-terminalno sekvenciranje je otkrilo jednu sekvencu - ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11). Prečišćavanje bi se moglo postići pomoću serije koraka hromatograflje na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećih, po bilo kom redosledu: protein A hromatografiju, Q sefaroza hromatografiju, fenilsefaroza hromatografiju, hromatografiju na osnovu veličine i katjonsko izmenjivačku hromatografiju. Prečišćavanje se može završiti sa virusnim filtriranjem i puferskom izmenom. ActRIIa-hFc protein je prečišćen do čistoće od >98% kao što je određeno pomoću hromatografije na osnovu veličine i >95% kao što je određeno pomoću SDS PAGE.
ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc su pokazali visok afinitet za ligande, naročito aktivin A. GDF-11 ili aktivin A ("ActA") su imobilizovani na Biacore CM5 čipu primenom standardnog postupka kuplovanja amina. Sistem je napunjen proteinima ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc, i mereno je vezivanje. ActRIIa-hFc se vezao za aktivin sa konstantnom disocijacije (K<D>) od 5xl0<~12>, i protein se vezao za GDFll sa KDod 9.96xl0<-9>. Videti Sliku 2. ActRIIa-mFc se ponašao na sličan način.
Test A-204 reporter gena je upotrebljen za procenu efekata ActRIIa- hFc proteina na prenos signala preko GDF-11 i aktivina A. Ćelijska linija: humani rabdomiosarkom (izveden iz mišića). Reporter vektor: pGL3(CAGA)12 (Opisan u Dennler et al, 1998, EMBO 17: 3091 -3100.) Videti Sliku 3. CAGA12 motiv je prisutan u genu (PAI-I gen) osetljivom na TGF-
41
Beta, tako da je ovaj vektor od opšte upotrebe za faktore koji prenose signale preko Smad2 i 3.
Dan 1: Podeliti A-204 ćelije u 48-komornu ploču.
Dan 2: A-204 ćelije transficirane sa 10 μg pGL3(CAGA)12 ili pGL3(CAGA)12 (10 pg)+ pRLCMV (1 μg) i Fugen.
Dan 3: Dodati faktore (razblaženi u podlozi 0.1 % BSA). Inhibitori moraju biti prethodno inkubirani sa faktorima 1 čas pre dodavanja u ćelije. Šest časova kasnije, ćelije su isprane sa PBS i ćelije su lizirane.
Nakon ovoga je izvršen test luciferaze. Tipično u ovom testu, u odsustvu inhibitora, aktivin A pokazuje približno 10-struku stimulaciju ekspresije reporter gena i ED50 ~ 2 ng/ml. GDF-11: 16-struku stimulacija, ED50: ~ 1.5 ng/ml. GDF-8 pokazuje efekat sličan sa GDF-11.
Kao što je prikazano na Slici 4, ActRIIa-hFc i ActRIIa-mFc inhibiraju GDF-8 posredovani prenos signala u pikomolamim koncentracijama. Kao što je prikazano na Slici 5, tri različita preparata ActRIIa-hFc inhibirala su GDF-11 prenos signala sa IC 50 od približno 200 pM.
ActRIIa-hFc je bio veoma stabilan u farmakokinetičkim ispitivanjima. Pacovi su dozirani sa 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg ActRIIa-hFc proteina i nivoi proteina u plazmi su mereni na 24, 48, 72, 144 i 168 časova. U posebnoj studiji, pacovi su dozirani sa 1 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg. Kod pacova, ActRIIa-hFc je imao polu-život u serumu od 11- 14 dana i nivoi leka u cirkulaciji su bili prilično visoki posle dve nedelje (11 pg/ml, 110 μg/ml ili 304 μg/ml za početne primene od 1 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg, redom.) Kod makaka majmuna, polu-život u plazmi je bio značajno veći od 14 dana i nivoi leka u cirkulaciji bili su 25 μg/ml, 304 μg/ml ili 1440 μg/ml za početne primene od 1 mg/kg, 10 mg/kg ili 30 mg/kg, redom. Preliminami rezultati kod ljudi sugerišu da je polu-život u serumu između oko 20 i 30 dana.
Primer 2: ActRIIa-mFc stimuliše rast kosti In Vivo
Normalne ženke miševa (BALB/c) dozirane su sa ActRIIa-mFc u nivou od 1 mg/kg/dozi, 3 mg/kg/dozi ili 10 mg/kg/dozi, sa dozama koje se daju dva puta nedeljno. Mineralna gustina kosti i mineralni sadžaj kosti određeni su pomoću DEXA, videti Sliku 6.
Kod BALB/c ženki miševa, DEXA skenovi su pokazali značajno povećanje (>20%) u mineralnoj gustini i sadržaju kosti kao rezultat ActRIIa-mFc tretmana. Videti Slike 7 i 8.
Prema tome, antagonizam ActRIIa je izazvao povećanu gustinu i sadržaj kosti kod normalnih ženki miševa. Kao sledeći korak, testiran je efekat ActRIIa-mFc na kost u mišjem modelu za osteoporozu.
Andersson et al. (2001), su utvrdili da su miševi sa ovarijektomijom patili od značajnog gubitka kosti (približno 50% gubitka trabekularne kosti šest nedelja posle operacije), i da gubitak kosti kod ovih miševa može biti ispravljen sa kandidatima za terapeutska sredstva, kao što je paratiroidni hormon.
Prijavioci su koristili C57BL6 ženke miševa sa ovarijektomijom (OVX) ili koje su lažno operisane na 4-5 nedelja starosti. Osam nedelja posle operacije, započet je tretman sa ActRIIa-mFc (10 mg/kg, dva puta nedeljno) ili kontrolom (PBS). Gustina kosti je merena pomoću CT skenera. Kao što je prikazano na Slici 9, netretirani, miševi sa ovarijektomijom su pokazali značajan gubitak gustine trabekularne kosti u odnosu na lažno operisane kontrole posle šest nedelja. ActRIIa-mFc tretman je obnovio gustinu kosti do nivoa lažno operisanih miševa. Na 6 i 12 nedelja tretmana, ActRIIa-mFc je izazvao značajno povećanje trabekularne kosti OVX miševa. Videti Sliku 10. Posle 6 nedelja tretmana, gustina kosti je povećana za 24% u odnosu na PBS kontrole. Posle 12 nedelja, povećanje je bilo 27%.
Kod lažno operisanih miševa, ActRIIa-mFc je takođe izazvao značajno povećanje trabekularne kosti. Videti Sliku 11. Posle 6 i 12 nedelja, tretman je proizveo 35% povećanje u odnosu na kontrole.
U dodatnoj grupi eksperimenata, miševi sa ovarijektomijom (OVX) ili lažno operisani miševi kao što je opisano u prethodnom tekstu tretirani su sa ActRIIa-mFc (10 mg/kg, dva puta nedeljno) ili kontrolom (PBS) u toku dvanaest nedelja. Slično rezultatima opisanim u prethodnom tekstu za ActRIIa-mFc, OVX miševi koji su primali ActRIIa-mFc pokazali su povećanje gustine trabekularne kosti od 15% već od četvrte nedelje i 25% posle 12 nedelja tretmana (Slika 12). Lažno operisani miševi koji su primali ActRIIa-mFc slično su pokazali povećanje gustine trabekularne kosti od 22% već od četvrte nedelje i od 32% posle 12 nedelja tretmana (Slika 13).
Posle dvanaest nedelja tretmana sa ActRIIa-mFc, DEXA analiza celog tela i ex vivo butne kosti pokazala je da tretman indukuje povećanje gustine kosti kako kod miševa sa ovarijektomijom tako i kod lažno operisanih miševa (Slike 14A i 14B, redom). Ovi rezultati su takođe podržani sa ex vivo pQCT analizom medularne šupljine butne kosti koja pokazuje značajno povećanje kako u ukupnoj tako i u kortikalnoj gustini kosti posle dvanaest nedelja od tretmana sa ActRIIa-mFc. Nosačem tretirani kontrolni miševi sa ovarijektomijom su pokazali gustine kostiju koje su mogle da se uporede sa istim kod nosačem tretiranih
43
kontrolnih lažno operisanih miševa (Slika 15). Pored gustine kosti, sadržaj kosti se povećao posle tretmana sa ActRIIa-mFC. Ex vivo pQCT analiza medularne šupljine butne kosti pokazala je značajno povećanje kako kod ukupnog tako i kod kortikalnog sadržaja kosti posle dvanaest nedelja tretmana sa ActRIIa-mFc, dok su i miševi sa ovarijektomijom i lažno operisani miševi tretirani kontrolom pokazali uporedivi (sličan) sadržaj kosti (Slika 16). Ex vivo pQCT analiza medularne šupljine butne kosti takođe je pokazala da ActRIIa-mFc tretirani miševi nisu pokazali promenu u periostealnom obimu; međutim ActRIIa-mFc tretman je imao za rezultat smanjenje endostealnog obima što ukazuje na povećanje kortikalne debljine zahvaljujući rastu sa unutrašnje površine butne kosti (Slika 17).
Mehaničkim testiranjem butnih kosti određeno je da je ActRIIa-mFc mogao da poveća karakteristike spoljašnje strane kosti (maksimalno opterećenje, čvrstoću i silu potrebnu da se ost polomi) koje su doprinele značajnom povećanju osobina unutrašnjeg dela kosti (maksimalna snaga). Miševi sa ovarijektomijom tretirani sa ActRIIa-mFc pokazali su povećanje čvrstine kosti do nivoa iznad istih kod lažno operisanih, nosačem tretiranih kontrola, što ukazuje na potpuno izlečenje osteoporotičnog fenotipa (Slika 18).
Ovi rezultati pokazuju da antagonist aktivin-ActRIIa može povećati gustinu kosti kod normalnih ženki miševa i, pored toga, ispraviti defekte u koštanoj gustini kosti, sadržaju kosti, i konačno čvrstini kosti, u mišjem modelu osteoporoze.
U dodatnoj grupi eksperimenata, miševima je izvršena ovarijektomija ili su lažno operisani na 4 nedelje, i sa početkom od 12 nedelje primali su ili placebo ili ActRIIa-mFc (2 puta/nedeljno, 10 mg/kg) (takođe označen kao RAP-11 na Slikama 19-24), za dodatni period od 12 nedelja. Procenjivani su različiti parametri kosti. Kao što je prikazano na Slici 19, ActRIIa-mFc je povećao zapreminu vertebralne trabekularne kosti do ukupnih zapreminskih odnosa (BV/TV) kako kod OVX tako i kod SHAM operisanih miševa. ActRIIa-mFc je takođe poboljšao trabekularnu građu (Slika 20), povećao je kortikalnu debljinu (Slika 21) i poboljšao je čvrstinu kosti (Slika 22). Kao što je prikazano na Slici 23, ActRIIa-mFc je proizveo željene efekte u opsegu doza od 1 mg/kg do 10 mg/kg.
Histomorfometrija kosti je izvedena na 2 nedeljnoj vremenskoj tački kod lažno operisanih miševa. Ovi rezultati, prikazani na Slici 24, pokazuju da ActRIIa-mFc ima dvostruki efekat, inhibira resorpciju kosti i stimuliše rast kosti. Tako, ActRIIa-mFc stimuliše rast kosti (anabolički efekat) i inhibira resorpciju kosti (anti-katabolički efekat).
Primer 4: Alternativni ActRIIa-Fc proteini
44

Claims (23)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Polipeptid naznačen time što ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sa SEQ ID NO: 7, pri čemu, N-terminus je ILGRSETQE (SEQ ID NO: 11).
2. Polipeptid prema patentnom zahtevu 1, naznačen time što polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 7.
3. Polipeptid prema patentnom zahtevu 2, naznačen time što polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7.
4. Polipeptid prema patentnom zahtevu 3, naznačen time što se polipeptid sastoji od aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 7.
5. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što je polipeptid najmanje 95% čist, u vezi sa proteinskim zagađenjima, kao što je određeno preko hromatografije na osnovu veličine.
6. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što se polipeptid vezuje za aktivin.
7. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što polipeptid sadrži jedan ili više modifikovanih aminokiselinskih ostatka izabranih od: glikozilovane aminokiseline, PEGilovane aminokiseline, farnezilovane aminokiseline, acetilovane aminokiseline, biotinilovane aminokiseline, karboksilovane aminokiseline, fosforilovane aminokiseline, acilovane aminokiseline, aminokiseline konjugovane sa organskim derivatizujućim sredstvom i aminokiseline konjugovane za lipidnu grupu.
8. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7, naznačen time što polipeptid je glikozilovan i ima sisarski glikozilacioni obrazac.
9. Polipeptid prema patentnom zahtevu 8, naznačen time što polipeptid ima glikozilacioni obrazac koji se može dobiti ekspresijom u CHO ćeliji.
46
10. Farmaceutski preparat naznačen time što sadrži polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4 i farmaceutski prihvatljiv inertni punilac.
11. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 10, naznačen time što je navedeni preparat značajno bez pirogena.
12. Izolovani polinukleotid naznačen time što sadrži kodirajuću sekvencu za polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4.
13. Izolovani polinukleotid prema patentnom zahtevu 12, naznačen time što izolovani polinukleotid sadrži sekvencu SEQ ID NO: 14.
14. Rekombinantni polinukleotid naznačen time što sadrži promotor sekvencu operativno povezanu za polinukleotid prema patentnim zahtevima 12 ili 13.
15. Ćelija koja je transformisana sa rekombinantnim polinukleotidom prema bilo kom od patentnih zahteva 12-14, pri čemu humana ćelija nije humana embrionalna matična ćelija ili humana germinativna ćelija.
16. Ćelija prema patentnom zahtevu 15, naznačena time što je ćelija sisarska ćelija.
17. Ćelija prema patentnom zahtevu 16, naznačena time što je ćelija CHO ćelija ili humana ćelija.
18. Postupak za pripremu polipeptida, naznačen time što sadrži: a) gajenje u kulturi ćelije pod uslovima pogodnim za ekspresiju rastvorljivog polipeptida, gde je navedena ćelija transformisana sa rekombinantnim polinukleotidom prema bilo kom od patentnih zahteva 12- 14; i b) izolaciju polipeptida koji je tako eksprimiran.
19. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što polipeptid sadrži poli-saharid.
20. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što polipeptid sadrži mono-saharid.
21. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što se polipeptid vezuje za aktivin A.
22. Polipeptid prema patentnom zahtevu 6 ili 21, naznačen time što se polipeptid vezuje za aktivin B.
23. Polipeptid prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, naznačen time što se polipeptid vezuje za GDFl1.
RS20080336A 2005-11-23 2006-11-22 Antagonisti aktivin-actriia i primene za stimulaciju rasta kostiju RS58231B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US73946205P 2005-11-23 2005-11-23
US78332206P 2006-03-17 2006-03-17
US84485506P 2006-09-15 2006-09-15
PCT/US2006/045322 WO2007062188A2 (en) 2005-11-23 2006-11-22 Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RS20080336A RS20080336A (en) 2009-07-15
RS58231B1 true RS58231B1 (sr) 2019-03-29

Family

ID=38067939

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20080336A RS58231B1 (sr) 2005-11-23 2006-11-22 Antagonisti aktivin-actriia i primene za stimulaciju rasta kostiju

Country Status (24)

Country Link
US (9) US7612041B2 (sr)
EP (5) EP2781222B1 (sr)
JP (9) JP5261187B2 (sr)
KR (8) KR20150115961A (sr)
CN (4) CN104844713B (sr)
AU (1) AU2006318449B2 (sr)
BR (1) BRPI0618947B1 (sr)
CA (2) CA2631013C (sr)
CR (1) CR10008A (sr)
DK (1) DK1973559T3 (sr)
EA (4) EA018450B1 (sr)
EC (1) ECSP088463A (sr)
ES (3) ES2649983T3 (sr)
HR (1) HRP20080377B1 (sr)
IL (5) IL191596A (sr)
IN (1) IN2015DN02553A (sr)
ME (1) ME00380B (sr)
MX (1) MX2008006626A (sr)
NZ (1) NZ568369A (sr)
PL (1) PL1973559T3 (sr)
PT (1) PT1973559E (sr)
RS (1) RS58231B1 (sr)
SG (1) SG10201509620SA (sr)
WO (1) WO2007062188A2 (sr)

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3489257A1 (en) 2004-07-23 2019-05-29 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
EP2781222B1 (en) 2005-11-23 2017-08-02 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
JP5537946B2 (ja) 2006-11-22 2014-07-02 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｉｇｆ−ｉｒを含むチロシンキナーゼ受容体に対する改変タンパク質に基づく標的治療薬
US20100028332A1 (en) * 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
AU2016250354B2 (en) * 2006-12-18 2019-01-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
WO2008076437A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels
AU2013221910B2 (en) * 2006-12-18 2016-11-17 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRII antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US8895016B2 (en) * 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
CA2677007A1 (en) * 2007-02-01 2008-08-07 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
AU2016202691B2 (en) * 2007-02-09 2018-03-15 Acceleron Pharma Inc. Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
AU2013204959B2 (en) * 2007-02-09 2016-05-19 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
EP2481415B1 (en) * 2007-02-09 2019-09-11 Acceleron Pharma Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists
EP2574671B1 (en) * 2007-03-19 2016-02-03 National Research Council Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
JP2010539236A (ja) 2007-09-18 2010-12-16 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬およびＦＳＨ分泌を低減または阻害するための使用
JP2011517314A (ja) 2008-02-14 2011-06-02 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｅｇｆｒに結合する操作されたタンパク質に基づく標的化された治療薬
WO2009137075A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
RU2519645C2 (ru) * 2008-05-14 2014-06-20 Эгрикалчер Виктория Сервисиз Пти Лтд Применение ангиогенина или агонистов ангиогенина для лечения заболеваний и нарушений
PE20091931A1 (es) 2008-05-22 2009-12-31 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de dominio de armazon basadas en fibronectina multivalentes
KR20110031951A (ko) * 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
CN102131822A (zh) 2008-06-26 2011-07-20 阿塞勒隆制药公司 进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药和监测受治疗患者的方法
TWI626945B (zh) 2008-08-14 2018-06-21 艾瑟勒朗法瑪公司 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI496582B (zh) 2008-11-24 2015-08-21 必治妥美雅史谷比公司 雙重專一性之ｅｇｆｒ／ｉｇｆｉｒ結合分子
AU2010204985A1 (en) 2009-01-13 2011-08-04 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
EP3058986B1 (en) * 2009-03-30 2018-05-09 Acceleron Pharma Inc. Bmp-alk3 antagonists and uses for promoting bone growth
JP5912078B2 (ja) 2009-06-08 2016-04-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
EP3290439B1 (en) 2009-06-12 2020-09-02 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
JP6211767B2 (ja) * 2009-09-09 2017-10-11 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニストならびにその投薬および使用
WO2011056896A1 (en) * 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP3332796A1 (en) 2009-11-17 2018-06-13 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
TW201138808A (en) 2010-05-03 2011-11-16 Bristol Myers Squibb Co Serum albumin binding molecules
US9562089B2 (en) 2010-05-26 2017-02-07 Bristol-Myers Squibb Company Fibronectin based scaffold proteins having improved stability
WO2012027065A2 (en) * 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
KR20130132824A (ko) 2010-11-08 2013-12-05 악셀레론 파마 인코포레이티드 Actriia 결합제 및 이의 용도
US10400029B2 (en) 2011-06-28 2019-09-03 Inhibrx, Lp Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
SG10201601621PA (en) 2011-06-28 2016-04-28 Inhibrx Llc Serpin fusion polypeptides and methods of use thereof
US9809636B2 (en) 2012-04-06 2017-11-07 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing red blood cell levels comprising administering BMP9
AU2013204740C1 (en) 2012-05-10 2015-10-01 Agriculture Victoria Services Pty Ltd Methods of treating cancer using angiogenin or an angiogenin agonist
US20140120149A1 (en) * 2012-10-30 2014-05-01 The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University Calcium sulphate based composite
US10195249B2 (en) * 2012-11-02 2019-02-05 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating bone and other disorders
EP3129401B1 (en) 2014-03-20 2019-06-12 Bristol-Myers Squibb Company Serum albumin-binding fibronectin type iii domains
BR112016024319B1 (pt) 2014-04-18 2024-01-23 Acceleron Pharma Inc USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM ANTAGONISTA DE ActRII PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAR OU PREVINIR UMA COMPLICAÇÃO DE ANEMIA FALCIFORME
MA40008A (fr) 2014-06-13 2021-05-05 Acceleron Pharma Inc Antagoniste actrii pour le traitement et la prevention d'un ulcere cutane chez un sujet ayant l'anemie
MA41052A (fr) * 2014-10-09 2017-08-15 Celgene Corp Traitement d'une maladie cardiovasculaire à l'aide de pièges de ligands d'actrii
MA41119A (fr) 2014-12-03 2017-10-10 Acceleron Pharma Inc Méthodes de traitement de syndromes myélodysplasiques et d'anémie sidéroblastique
TWI730949B (zh) 2014-12-03 2021-06-21 美商西建公司 活化素-ａｃｔｒｉｉ拮抗劑及治療貧血之用途
BR112017021510A2 (pt) 2015-04-06 2018-07-03 Acceleron Pharma Inc heteromultímeros do receptor tipo i e tipo ii da superfamília tgf-beta e sua utilização
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
KR20170141215A (ko) 2015-04-06 2017-12-22 악셀레론 파마 인코포레이티드 싱글-암 유형 i과 유형 ii 수용체 융합 단백질들 및 이들의 용도
EP3298034A4 (en) 2015-05-20 2019-02-13 Celgene Corporation IN VITRO CELL CULTURE PROCEDURE FOR BETA THALASSEMIA BY MEANS OF ACTIVIN TYPE II RECEPTOR LIGANDS
ES2781207T3 (es) 2015-09-23 2020-08-31 Bristol Myers Squibb Co Dominios de fibronectina de tipo iii de unión a seroalbúmina con velocidad de disociación rápida
EP3370754B1 (en) 2015-11-04 2026-04-29 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating ineffective erythropoiesis
CA3005975A1 (en) 2015-11-23 2017-06-01 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating eye disorders
EP3439741B1 (en) 2016-04-06 2026-05-20 Acceleron Pharma Inc ACTRIIB:ALK7 HETEROMULTIMERS FOR THERAPEUTIC BODY WEIGHT REDUCTION
CN116531490A (zh) 2016-07-15 2023-08-04 阿塞勒隆制药公司 用于治疗肺高血压的组合物和方法
HUE067225T2 (hu) 2016-07-27 2024-10-28 Acceleron Pharma Inc Mielofibrózis kezelésére szolgáló készítmények
CA3039074A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Compositions and method for treating kidney disease
WO2018067879A1 (en) 2016-10-05 2018-04-12 Acceleron Pharma Inc. Alk4:actriib heteromultimers and uses thereof
CN119241685A (zh) 2016-11-10 2025-01-03 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法
SI3600415T1 (sl) 2017-03-24 2026-01-30 Novartis Ag Protitelo proti aktivinskemu receptorju tipa ii za uporabo pri zdravljenju srčnega popuščanja
CN111801112A (zh) * 2017-11-09 2020-10-20 科乐斯疗法公司 激活素受体iia型变体及其使用方法
KR20200109330A (ko) 2018-01-12 2020-09-22 케로스 테라퓨틱스, 인크. 액티빈 수용체 유형 iib 변이체 및 그의 사용 방법
WO2019217715A1 (en) 2018-05-09 2019-11-14 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
CN109320597B (zh) * 2018-10-26 2021-10-26 中国农业科学院特产研究所 狐亚科激活素a蛋白及其制备与应用
JP2022549506A (ja) 2019-09-27 2022-11-25 ディスク・メディシン・インコーポレイテッド 骨髄線維症および関連状態を処置するための方法
EP4121088A4 (en) 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
CA3176735A1 (en) 2020-03-20 2021-09-23 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type ii chimeras and methods of use thereof
EP4142769A4 (en) 2020-04-28 2024-05-15 Acceleron Pharma Inc. ACTRII PROTEINS AND USE IN THE TREATMENT OF POSTCAPILLARY PULMONARY HYPERTENSION
KR20230012539A (ko) 2020-05-13 2023-01-26 디스크 메디슨, 인크. 골수섬유증을 치료하기 위한 항-헤모주벨린 (hjv) 항체
US12186370B1 (en) 2020-11-05 2025-01-07 Celgene Corporation ACTRIIB ligand trap compositions and uses thereof
CN114594170B (zh) * 2020-12-03 2024-05-17 复旦大学 一种磁固相萃取结合快速原位衍生化的体内药物分析方法
EP4351723A4 (en) * 2021-06-11 2025-04-16 Acceleron Pharma, Inc. ACTRII PROTEINS AND THEIR USES
WO2023141724A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 35Pharma Inc. Activin receptor type iib variants and uses thereof
CR20250375A (es) * 2023-03-09 2025-10-07 Merck Sharp & Dohme Llc Formulaciones que comprenden variantes de la proteína actriia
EP4676515A1 (en) * 2023-03-09 2026-01-14 Merck Sharp & Dohme LLC Formulations comprising actriia polypeptide variants
US20260092096A1 (en) 2024-05-14 2026-04-02 35Pharma Inc. Activin receptor type iib variants and uses thereof

Family Cites Families (217)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0637520B2 (ja) 1985-07-03 1994-05-18 味の素株式会社 ポリペプチド
WO1987005330A1 (en) 1986-03-07 1987-09-11 Michel Louis Eugene Bergh Method for enhancing glycoprotein stability
US4973577A (en) * 1986-04-04 1990-11-27 The Salk Institute For Biological Studies FSH-releasing peptides
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
EP0548276A4 (en) 1990-09-13 1993-12-29 Children's Hospital Medical Center Of Northern California Method for increasing red blood cell production by treatment with activin or activin-related peptides
US5118667A (en) * 1991-05-03 1992-06-02 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Bone growth factors and inhibitors of bone resorption for promoting bone formation
US6162896A (en) * 1991-05-10 2000-12-19 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant vertebrate activin receptors
CA2086327A1 (en) 1991-05-10 1992-11-11 Lawrence S. Mathews Cloning and recombinant production of receptor(s) of the activin/tgf- .beta. superfamily
US5885794A (en) * 1991-05-10 1999-03-23 The Salk Institute For Biological Studies Recombinant production of vertebrate activin receptor polypeptides and identification of receptor DNAs in the activin/TGF-β superfamily
US20050186593A1 (en) 1991-05-10 2005-08-25 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
US6287816B1 (en) 1991-06-25 2001-09-11 Genetics Institute, Inc. BMP-9 compositions
KR100255415B1 (ko) 1991-06-25 2000-05-01 브루스 엠. 에이센 비엠피-9 조성물
AU3968793A (en) * 1992-04-02 1993-11-08 United States Of America, As Represented By The Secretary Of Health And Human Services Use of restriction endonucleases against viruses, including HIV
US6692925B1 (en) 1992-11-17 2004-02-17 Ludwig Institute For Cancer Research Proteins having serine/threonine kinase domains, corresponding nucleic acid molecules, and their use
EP1475440A3 (en) 1993-01-12 2004-11-17 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-3
DE69433742T2 (de) 1993-05-12 2005-07-07 Genetics Institute, LLC, Cambridge Bmp-10 zusammensetzungen
US5637480A (en) 1993-05-12 1997-06-10 Genetics Institute, Inc. DNA molecules encoding bone morphogenetic protein-10
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5831050A (en) * 1993-06-07 1998-11-03 Creative Biomolecules, Inc. Morphogen cell surface receptor
AU701623B2 (en) 1993-10-14 1999-02-04 President And Fellows Of Harvard College Method of inducing and maintaining neuronal cells
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5658876A (en) 1994-04-28 1997-08-19 The General Hospital Corporation Activin antagonists as novel contraceptives
ATE378407T1 (de) * 1994-04-29 2007-11-15 Curis Inc Morphogene protein-spezifische zelloberflächenrezeptoren und ihre verwendungen
IL114397A0 (en) * 1994-07-01 1995-10-31 Bioph Biotech Entw Pharm Gmbh Growth/differentiation factor of the TGF-beta-family
US5760010A (en) 1995-01-01 1998-06-02 Klein; Ira Method of treating liver disorders with a macrolide antibiotic
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
NZ502795A (en) 1995-04-11 2001-09-28 Gen Hospital Corp Method of identifying molecular interactions employing counterselection and at least two hybrid molecules or two hybrid systems
EP0771873A3 (en) * 1995-10-27 1998-03-04 Takeda Chemical Industries, Ltd. Neuronal cell-specific receptor protein
GB9526131D0 (en) 1995-12-21 1996-02-21 Celltech Therapeutics Ltd Recombinant chimeric receptors
US6004780A (en) 1996-03-26 1999-12-21 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
US20050244867A1 (en) 1996-03-26 2005-11-03 Human Genome Sciences, Inc. Growth factor HTTER36
PL189756B1 (pl) 1996-10-25 2005-09-30 Searle & Co Polipeptyd ludzkiego agonisty receptora erytropoetyny (EPO), sposób jego wytwarzania i zastosowanie, cząsteczka kwasu nukleinowego, kompozycja, sposób selektywnego namnażania ex vivo erytroidalnych komórek progenitorowych
US6605699B1 (en) * 1997-01-21 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Galectin-11 polypeptides
US6034062A (en) 1997-03-13 2000-03-07 Genetics Institute, Inc. Bone morphogenetic protein (BMP)-9 compositions and their uses
US6231880B1 (en) 1997-05-30 2001-05-15 Susan P. Perrine Compositions and administration of compositions for the treatment of blood disorders
ES2320603T3 (es) 1997-07-30 2009-05-25 Emory University Sistemas de expresion, vectores, adn, proteinas de mineralizacion osea novedosos.
AU8666398A (en) 1997-08-01 1999-02-22 Johns Hopkins University School Of Medicine, The Methods to identify growth differentiation factor (gdf) receptors
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6696260B1 (en) 1997-08-01 2004-02-24 The Johns Hopkins University School Of Medicine Methods to identify growth differentiation factor (GDF) binding proteins
US6953662B2 (en) 1997-08-29 2005-10-11 Human Genome Sciences, Inc. Follistatin-3
JP2001513982A (ja) 1997-08-29 2001-09-11 ヒューマン ジノーム サイエンシーズ， インコーポレイテッド フォリスタチン−３
CA2305712A1 (en) 1997-10-03 1999-04-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Natural humanized antibody
US6696411B1 (en) 1998-04-22 2004-02-24 Cornell Research Foundation, Inc. Canine erythropoietin gene and recombinant protein
AU4572899A (en) 1998-06-16 2000-01-05 Biogen, Inc. Variant type ii tgf-beta receptor fusion proteins and methods
BR9913857A (pt) * 1998-09-17 2001-06-12 Lilly Co Eli Formulações de proteìna
WO2000017350A1 (fr) 1998-09-22 2000-03-30 Long Yu Sequence codante pour un nouveau facteur de differenciation de la croissance d'origine humaine et polypeptide code par cette sequence d'adn, et methode de production correspondante
US6472179B2 (en) * 1998-09-25 2002-10-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Receptor based antagonists and methods of making and using
US6548634B1 (en) 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6238860B1 (en) 1998-11-05 2001-05-29 Dyax Corp. Binding moieties for human parvovirus B19
US6777205B1 (en) 1998-11-06 2004-08-17 Sterrenbeld Biotechnologie North America, Inc. Host cells expressing recombinant human erythropoietin
US20040009535A1 (en) 1998-11-27 2004-01-15 Celltech R&D, Inc. Compositions and methods for increasing bone mineralization
JP4813660B2 (ja) * 1998-11-27 2011-11-09 ダーウィン ディスカバリー リミテッド 骨鉱化作用を増加するための組成物および方法
NZ513642A (en) 1999-01-21 2004-02-27 Metamorphix Inc Growth differentiation factor inhibitors and uses therefor
US6914128B1 (en) 1999-03-25 2005-07-05 Abbott Gmbh & Co. Kg Human antibodies that bind human IL-12 and methods for producing
AU777783B2 (en) 1999-04-19 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. Proliferation inhibitor for androgen-independent tumor
US6468543B1 (en) 1999-05-03 2002-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods for promoting growth of bone using ZVEGF4
SK8292002A3 (en) 1999-11-12 2002-12-03 Maxygen Holdings Ltd A conjugate exhibiting interferon gamma activity, nucleotide sequence encoding for a polypeptide fraction of conjugate, an expression vector and a host cell containing nucleotide sequence, pharmaceutical composition comprising the same and use thereof
NZ519546A (en) 1999-12-15 2005-07-29 Res Dev Foundation Betaglycan as an inhibin receptor and uses thereof
US20030224501A1 (en) 2000-03-17 2003-12-04 Young Paul E. Bone morphogenic protein polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP4487376B2 (ja) 2000-03-31 2010-06-23 味の素株式会社 腎疾患治療剤
JP3967594B2 (ja) 2000-05-15 2007-08-29 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 新しい薬剤組成物
US6627424B1 (en) 2000-05-26 2003-09-30 Mj Bioworks, Inc. Nucleic acid modifying enzymes
AU2001269709A1 (en) 2000-07-19 2002-02-05 Eli Lilly And Company Nucleic acids, vectors, host cells, polypeptides, and uses thereof
US6632180B1 (en) 2000-09-07 2003-10-14 John H. Laragh Method for evaluating and treating hypertension
DE10045591A1 (de) 2000-09-15 2002-04-04 Klaus Pfizenmaier Ortsspezifische, antikörpervermittelte Aktivierung proapoptotischer Zytokine - AMAIZe (Antibody-Mediated Apoptosis Inducing Zytokine)
EP2141243A3 (en) 2000-10-16 2010-01-27 Brystol-Myers Squibb Company Protein scaffolds for antibody mimics and other binding proteins
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
WO2002040501A2 (en) 2000-11-20 2002-05-23 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Membrane scaffold proteins
WO2002043759A2 (en) 2000-12-01 2002-06-06 Wyeth Method and composition for modulating bone growth
US20030082233A1 (en) 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
TWI329129B (en) * 2001-02-08 2010-08-21 Wyeth Corp Modified and stabilized gdf propeptides and uses thereof
US20040132971A1 (en) * 2001-02-09 2004-07-08 Haaning Jesper Mortensen Rank ligand-binding polypeptides
US20040132675A1 (en) 2002-02-08 2004-07-08 Calvin Kuo Method for treating cancer and increasing hematocrit levels
US7294472B2 (en) * 2001-03-14 2007-11-13 Caden Biosciences Method for identifying modulators of G protein coupled receptor signaling
WO2002074340A1 (fr) 2001-03-16 2002-09-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. Procede de fabrication d'une preparation a liberation continue
JP4369662B2 (ja) 2001-04-26 2009-11-25 アビディア インコーポレイテッド 単量体ドメインのコンビナトリアルライブラリー
EA010594B1 (ru) 2001-05-24 2008-10-30 Займодженетикс, Инк. Слитые белки taci-иммуноглобулина
AU2001286171B2 (en) 2001-05-25 2008-01-10 Serono Genetics Institute S.A. Human CDNAs and proteins and uses thereof
AUPR638101A0 (en) 2001-07-13 2001-08-09 Bioa Pty Limited Composition and method for treatment of disease
JP3888998B2 (ja) 2001-07-17 2007-03-07 帝人株式会社 ＰＰＡＲδ活性化作用を測定することを特徴とする物質の選択方法及び薬剤
US6855344B2 (en) 2001-07-17 2005-02-15 Integrated Chinese Medicine Holdings, Ltd. Compositions and methods for prostate and kidney health and disorders, an herbal preparation
KR100453877B1 (ko) 2001-07-26 2004-10-20 메덱스젠 주식회사 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 ＴＮＦＲ/Ｆｃ 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 ＤＮＡ, 상기 ＤＮＡ를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체
US7320789B2 (en) 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
US6784154B2 (en) 2001-11-01 2004-08-31 University Of Utah Research Foundation Method of use of erythropoietin to treat ischemic acute renal failure
CN102526045A (zh) 2001-12-06 2012-07-04 法布罗根股份有限公司 提高内源性红细胞生成素(epo)的方法
US20030144203A1 (en) 2001-12-19 2003-07-31 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for slowing senescence and treating and preventing diseases associated with senescence
US20060234918A1 (en) 2001-12-19 2006-10-19 Voyager Pharmaceutical Corporation Methods for treating and preventing cancers that express the hypothalamic-pituitary-gonadal axis of hormones and receptors
US6998118B2 (en) 2001-12-21 2006-02-14 The Salk Institute For Biological Studies Targeted retrograde gene delivery for neuronal protection
WO2003068801A2 (en) 2002-02-11 2003-08-21 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
BR0307907A2 (pt) 2002-02-21 2011-07-05 Wyeth Corp gasp1: proteìna contendo domìnio de folistatina
US20030219846A1 (en) 2002-02-28 2003-11-27 Pfizer Inc. Assay for activity of the ActRIIB kinase
AU2003232485A1 (en) * 2002-04-18 2003-10-27 Mtm Laboratories Ag Neopeptides and methods useful for detection and treatment of cancer
DE10234192B4 (de) 2002-07-26 2009-11-26 Epoplus Gmbh Co.Kg Verwendung von Erythropoetin
US20050271637A1 (en) 2002-08-16 2005-12-08 Bodine Peter Van N BMP-2 estrogen responsive element and methods of using the same
US7261893B2 (en) * 2002-10-22 2007-08-28 Wyeth Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
AU2002953327A0 (en) 2002-12-12 2003-01-09 Monash University Methods of diagnosing prognosing and treating activin associated diseases and conditions
EP1592416B1 (en) 2003-02-07 2009-01-07 ProMetic BioSciences Inc. Medium-chain length fatty acids, glycerides and analogues as stimulators of erythropoiesis
WO2004086953A2 (en) 2003-03-26 2004-10-14 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Method for diagnosis and treatment of bone turnover
US20070184052A1 (en) 2003-05-09 2007-08-09 Lin Herbert Y Soluble tgf-b type III receptor fusion proteins
JP5110877B2 (ja) 2003-06-02 2012-12-26 ワイス・エルエルシー 神経筋障害を処置するための、コルチコステロイドと組み合わせたミオスタチン（ｇｄｆ８）インヒビターの使用
US7381409B2 (en) 2003-06-16 2008-06-03 Celltech R&D, Inc. Antibodies specific for sclerostin and methods of screening and use therefor
WO2005009460A2 (en) 2003-07-25 2005-02-03 Medexis, S.A. Pharmaceutical composition comprising activin a, alk-4 or derivatives thereof for the treatment of ophthalmic disorders or cancer
US8895540B2 (en) 2003-11-26 2014-11-25 DePuy Synthes Products, LLC Local intraosseous administration of bone forming agents and anti-resorptive agents, and devices therefor
AU2005206277B2 (en) * 2004-01-22 2011-06-23 Merck Patent Gmbh Anti-cancer antibodies with reduced complement fixation
US20050197292A1 (en) * 2004-01-30 2005-09-08 Glennda Smithson Compositions and methods for treating T-cell mediated pathological conditions
JP2007530055A (ja) * 2004-03-26 2007-11-01 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド Ｂｍｐ−３プロペプチドおよび関連する方法
WO2005097825A2 (en) 2004-03-31 2005-10-20 Xencor, Inc. Bmp-7 variants with improved properties
WO2005113590A2 (en) 2004-05-12 2005-12-01 Acceleron Pharma Inc. Bmp10 propeptides and related methods
EP1771557B1 (en) 2004-06-24 2014-12-31 Acceleron Pharma Inc. GDF3 Propeptides and Related Methods
EP3489257A1 (en) 2004-07-23 2019-05-29 Acceleron Pharma Inc. Actrii receptor polypeptides, methods and compositions
JP2008508878A (ja) 2004-08-05 2008-03-27 ザ・レジェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア 細胞の発生および機能に対する効果を有する分子
MX2007000976A (es) 2004-08-12 2007-04-10 Wyeth Corp Tratamiento combinado para diabetes, obesidad y enfermedades cardiovasculares utilizando inhibidores del factor 8 de crecimiento y diferenciacion.
CA2581896C (en) 2004-09-29 2015-11-10 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Fsh and fsh receptor modulator compositions and methods for inhibiting osteoclastic bone resorption and bone loss in osteoporosis
EP1824796A4 (en) 2004-11-16 2010-02-17 Avidia Res Inst PROTEIN SKELETONS AND USES THEREOF
NL1027887C2 (nl) 2004-12-24 2006-06-27 Bosch Gmbh Robert Transmissie met gebombeerde poelieschijven en een drijfriem.
NZ538097A (en) 2005-02-07 2006-07-28 Ovita Ltd Method and compositions for improving wound healing
US7968091B2 (en) 2005-02-16 2011-06-28 The General Hospital Corporation Methods and compositions to regulate iron metabolism
EP1877075A4 (en) 2005-04-25 2008-07-30 Pfizer ANTIBODY TO MYOSTATIN
KR20080003929A (ko) 2005-04-26 2008-01-08 아지노모토 가부시키가이샤 골수 적혈구 전구 세포 분화 촉진제
JP2007099764A (ja) 2005-09-09 2007-04-19 Ajinomoto Co Inc 血糖低下剤
EP1931697B1 (en) 2005-09-28 2010-09-15 ZymoGenetics, Inc. Il-17a and il-17f antagonists and methods of using the same
US8067562B2 (en) 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
EP2781222B1 (en) * 2005-11-23 2017-08-02 Acceleron Pharma, Inc. Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
US8128933B2 (en) 2005-11-23 2012-03-06 Acceleron Pharma, Inc. Method of promoting bone growth by an anti-activin B antibody
EP1968621A2 (en) 2005-12-06 2008-09-17 Amgen Inc. Uses of myostatin antagonists
WO2007071023A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Merck Frosst Canada Ltd. Heteroaromatic compounds as inhibitors of stearoyl-coenzyme a delta-9 desaturase
CA2634940A1 (en) 2005-12-21 2007-07-05 Schering Corporation Treatment of nonalcoholic fatty liver disease using cholesterol lowering agents and h3 receptor antagonist/inverse agonist
EP1973909A2 (en) 2005-12-22 2008-10-01 Biogen Idec MA Inc. Transforming growth factor modulators
US7361512B2 (en) 2006-01-20 2008-04-22 Beckman Coulter, Inc. Low hemoglobin concentration cell percentage and method of use in detection of iron deficiency
WO2007087505A2 (en) 2006-01-25 2007-08-02 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
US20100227901A1 (en) 2006-02-28 2010-09-09 Wellstat Therapeutics Corporation Compounds for the treatment of metabolic disorders
AU2007238705A1 (en) 2006-04-14 2007-10-25 Amgen Inc. Agonist erythropoietin receptor antibodies
WO2007123391A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 Academisch Ziekenhuis Leiden Therapeutic intervention in a genetic disease in an individual by modifying expression of an aberrantly expressed gene.
AU2007249827A1 (en) 2006-05-09 2007-11-22 Colorado State University Research Foundation Methods for treating blood disorders
TW200803123A (en) * 2006-06-02 2008-01-01 Delta Electronics Inc Power converter and magnetic structure thereof
AU2007275606B9 (en) 2006-07-21 2013-09-26 Lyne Laboratories, Inc. Liquid compositions of calcium acetate
GB0615129D0 (en) 2006-07-29 2006-09-06 Univ Cardiff Anti-cancer activity of BMP-9 and BMP-10 and their use in cancer therapies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US7547781B2 (en) 2006-09-11 2009-06-16 Curis, Inc. Quinazoline based EGFR inhibitors containing a zinc binding moiety
WO2008060139A1 (en) 2006-11-17 2008-05-22 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for controlling mineralization of extracellular matrix, therapeutic methods based thereon and medicaments for use therein
WO2008073292A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Caritas St. Elizabeth's Medical Center Of Boston, Inc. Method for protecting renal tubular epithelial cells from radiocontrast nephro parhy (rcn)
CA2672581A1 (en) 2006-12-14 2008-06-19 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-claudin 3 monoclonal antibody and treatment and diagnosis of cancer using the same
US8895016B2 (en) 2006-12-18 2014-11-25 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of activin-actriia and uses for increasing red blood cell levels
WO2008076437A2 (en) * 2006-12-18 2008-06-26 Acceleron Pharma Inc. Activin-actrii antagonists and uses for increasing red blood cell levels
US20100028332A1 (en) 2006-12-18 2010-02-04 Acceleron Pharma Inc. Antagonists of actriib and uses for increasing red blood cell levels
CA2677007A1 (en) 2007-02-01 2008-08-07 Acceleron Pharma Inc. Activin-actriia antagonists and uses for treating or preventing breast cancer
TW201803890A (zh) 2007-02-02 2018-02-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
EP2481415B1 (en) 2007-02-09 2019-09-11 Acceleron Pharma Inc. Pharmaceutical compositions comprising Activin-ActRIIA antagonists
US8501678B2 (en) 2007-03-06 2013-08-06 Atara Biotherapeutics, Inc. Variant activin receptor polypeptides and uses thereof
US7947646B2 (en) 2007-03-06 2011-05-24 Amgen Inc. Variant activin receptor polypeptides
US20090017019A1 (en) 2007-06-01 2009-01-15 Wyeth Methods and compositions for modulating bmp-10 activity
WO2009009059A1 (en) 2007-07-09 2009-01-15 Biogen Idec Ma Inc. Spiro compounds as antagonists of tgf-beta
US20090025308A1 (en) * 2007-07-26 2009-01-29 Deans Brian W Seismic support and reinforcement systems
TW200911237A (en) 2007-08-03 2009-03-16 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
GB0715087D0 (en) 2007-08-03 2007-09-12 Summit Corp Plc Drug combinations for the treatment of duchenne muscular dystrophy
GB0715938D0 (en) 2007-08-15 2007-09-26 Vastox Plc Method of treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2009025651A1 (en) 2007-08-17 2009-02-26 University Of Maine System Board Of Trustees Biologically active peptide and method of using the same
WO2009035629A1 (en) 2007-09-13 2009-03-19 Ludwig Institute Of Cancer Research Method for modifying cellular immune response by modulating activin activity
JP2010539236A (ja) 2007-09-18 2010-12-16 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド アクチビン−ＡｃｔＲＩＩａ拮抗薬およびＦＳＨ分泌を低減または阻害するための使用
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
WO2009070243A2 (en) 2007-11-21 2009-06-04 Amgen Inc. Wise binding agents and epitopes
EP2265603B1 (en) 2008-03-13 2014-05-07 The General Hospital Corporation Inhibitors of the bmp signaling pathway
AU2009244308A1 (en) 2008-05-06 2009-11-12 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods and compositions for inducing brown adipogenesis
WO2009137075A1 (en) * 2008-05-06 2009-11-12 Acceleron Pharma Inc. Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
CN102131822A (zh) 2008-06-26 2011-07-20 阿塞勒隆制药公司 进行激活素-ActRIIa拮抗剂给药和监测受治疗患者的方法
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
TWI626945B (zh) 2008-08-14 2018-06-21 艾瑟勒朗法瑪公司 使用ｇｄｆ阱以增加紅血球水平
WO2010059861A1 (en) 2008-11-20 2010-05-27 University Of Southern California Compositions and methods to modulate hair growth
NZ627111A (en) 2008-11-26 2015-10-30 Amgen Inc Variants of activin iib receptor polypeptides and uses thereof
AU2010204985A1 (en) 2009-01-13 2011-08-04 Acceleron Pharma Inc. Methods for increasing adiponectin
US8110355B2 (en) 2009-02-20 2012-02-07 GenRemedy, LLC Methods for identifying agents that inhibit cell migration, promote cell adhesion and prevent metastasis
CA2993053A1 (en) 2009-04-27 2010-11-04 Novartis Ag Antagonistic activin receptor iib (actriib) antibodies for increasing muscle growth
JP5912078B2 (ja) 2009-06-08 2016-04-27 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド 熱発生性脂肪細胞を増加させるための方法
EP3290439B1 (en) 2009-06-12 2020-09-02 Acceleron Pharma Inc. Truncated actriib-fc fusion proteins
CN102655872B (zh) 2009-08-13 2016-01-20 阿塞勒隆制药公司 Gdf捕获物和促红细胞生成素受体激活剂联合应用以增加红细胞水平
JP6211767B2 (ja) 2009-09-09 2017-10-11 アクセルロン ファーマ， インコーポレイテッド ＡｃｔＲＩＩｂアンタゴニストならびにその投薬および使用
WO2011056896A1 (en) 2009-11-03 2011-05-12 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
EP3332796A1 (en) 2009-11-17 2018-06-13 Acceleron Pharma Inc. Actriib proteins and variants and uses therefore relating to utrophin induction for muscular dystrophy therapy
WO2012027065A2 (en) 2010-08-27 2012-03-01 Celgene Corporation Combination therapy for treatment of disease
US8580922B2 (en) 2011-03-04 2013-11-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Peptide linkers for polypeptide compositions and methods for using same
DK2726099T3 (en) 2011-07-01 2018-11-05 Novartis Ag Method of treating metabolic disorders
KR20140084211A (ko) 2011-10-17 2014-07-04 악셀레론 파마 인코포레이티드 효과가 없는 적혈구생성 치료를 위한 방법 및 조성물
US8765385B2 (en) 2011-10-27 2014-07-01 Ravindra Kumar Method of detection of neutralizing anti-actriib antibodies
WO2013063536A1 (en) 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
EP2771017A4 (en) 2011-10-28 2015-04-01 Paranta Biosciences Ltd METHOD FOR THE TREATMENT OF SLIP SEED SECRETION
BR112014015003A2 (pt) 2011-12-19 2019-09-24 Amgen Inc composição farmacêutica, método para tratar um cancer e método para reduzir o tamanho de uma massa tumoral
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
EP3521310A1 (en) 2012-06-14 2019-08-07 The Medical Research, Infrastructure, And Health Services Fund Of The Tel Aviv Medical Center Use of blocking agents of bone morphogenic protein (bmp) signaling for the treatment of neuroinflammatory and neurodegenerative diseases
CN104411720B (zh) 2012-07-02 2018-05-11 协和发酵麒麟株式会社 以抗bmp9抗体作为有效成分的、对肾性贫血、癌性贫血等贫血的治疗剂
EP2912462B1 (en) 2012-10-24 2019-08-07 Celgene Corporation Biomarker for use in treating anemia
CA2889286A1 (en) 2012-10-24 2014-05-01 Celgene Corporation Methods for treating anemia
WO2014064292A1 (en) 2012-10-26 2014-05-01 Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6) A method for preventing or treating atrial fibrillation
US10195249B2 (en) 2012-11-02 2019-02-05 Celgene Corporation Activin-ActRII antagonists and uses for treating bone and other disorders
KR102467714B1 (ko) 2012-11-08 2022-11-16 클리어사이드 바이오메디컬, 인코포레이드 인간 대상체에서 안구 질병을 치료하기 위한 방법 및 장치
WO2014093531A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Modulation of myofiber repair by anti-myostatin in strategies with stem cells
US20140220033A1 (en) 2013-02-01 2014-08-07 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Administration of an Anti-Activin-A Compound to a Subject
EP2970940B1 (en) 2013-03-14 2018-07-25 Translate Bio, Inc. Mrna therapeutic compositions and use to treat diseases and disorders
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
CA2918300A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Methods of treating sporadic inclusion body myositis
JP2017505428A (ja) 2013-12-16 2017-02-16 パランタ バイオサイエンス リミテッド 診断及び治療の方法
US20160333418A1 (en) 2014-01-14 2016-11-17 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Activin Inhibitor Response Prediction and Uses for Treatment
JP2017510622A (ja) 2014-01-27 2017-04-13 ノバルティス アーゲー 筋萎縮を予測するバイオマーカー、方法および使用
US10260068B2 (en) 2014-03-31 2019-04-16 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Prophylactic agent and therapeutic agent for fibrodysplasia ossificans progressiva
BR112016024319B1 (pt) 2014-04-18 2024-01-23 Acceleron Pharma Inc USO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM ANTAGONISTA DE ActRII PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO PARA TRATAR OU PREVINIR UMA COMPLICAÇÃO DE ANEMIA FALCIFORME
TW201622746A (zh) 2014-04-24 2016-07-01 諾華公司 改善或加速髖部骨折術後身體復原之方法
KR102132144B1 (ko) 2014-06-04 2020-07-09 악셀레론 파마 인코포레이티드 폴리스타틴 폴리펩티드를 이용한 장애의 치료방법 및 치료를 위한 조성물
PE20170471A1 (es) 2014-06-13 2017-05-14 Santa Maria Biotherapeutics Inc Polipeptidos receptores formulados y metodos relacionados
JP6976859B2 (ja) 2015-05-13 2021-12-08 セルジーン コーポレイション ＡｃｔＲＩＩリガンドトラップを用いたβ−サラセミアの治療

Also Published As

Publication number Publication date
JP5261187B2 (ja) 2013-08-14
CR10008A (es) 2008-10-03
CN103479994B (zh) 2019-08-30
US7612041B2 (en) 2009-11-03
HK1123215A1 (en) 2009-06-12
EP2329837B1 (en) 2014-04-30
IL191596A (en) 2014-02-27
ES2649983T3 (es) 2018-01-16
EP2781222B1 (en) 2017-08-02
US20240358793A1 (en) 2024-10-31
US20070249022A1 (en) 2007-10-25
IL259893A (en) 2018-07-31
CN103479994A (zh) 2014-01-01
DK1973559T3 (da) 2013-03-25
JP2009517051A (ja) 2009-04-30
PT1973559E (pt) 2013-02-19
JP2019156848A (ja) 2019-09-19
IL230646A0 (en) 2014-03-31
HRP20080377B1 (hr) 2015-03-27
EP1973559B1 (en) 2013-01-09
JP2021151266A (ja) 2021-09-30
EA026874B1 (ru) 2017-05-31
KR20190006086A (ko) 2019-01-16
EP2329837A1 (en) 2011-06-08
RS20080336A (en) 2009-07-15
JP6195885B2 (ja) 2017-09-13
US20160120939A1 (en) 2016-05-05
CN104844713B (zh) 2021-05-14
CA2631013C (en) 2019-06-11
IL230645A (en) 2015-10-29
ES2401805T3 (es) 2013-04-24
US11129873B2 (en) 2021-09-28
KR101557375B1 (ko) 2015-10-08
MX2008006626A (es) 2008-09-24
CN103432568A (zh) 2013-12-11
CN105001320A (zh) 2015-10-28
EP3811965A1 (en) 2021-04-28
US20220211806A1 (en) 2022-07-07
EP2781222A1 (en) 2014-09-24
IL259893B (en) 2021-03-25
JP2016041733A (ja) 2016-03-31
KR101585623B1 (ko) 2016-01-19
KR20200041386A (ko) 2020-04-21
KR20130120557A (ko) 2013-11-04
US20120058115A1 (en) 2012-03-08
NZ568369A (en) 2011-10-28
IL230646B (en) 2019-10-31
ME00380B (me) 2011-10-10
EA201692543A1 (ru) 2017-08-31
KR20160137665A (ko) 2016-11-30
SG10201509620SA (en) 2015-12-30
ES2839549T3 (es) 2021-07-05
IL280877A (en) 2021-04-29
EA018450B1 (ru) 2013-08-30
EA200801406A1 (ru) 2009-12-30
AU2006318449B2 (en) 2012-07-05
JP2013153765A (ja) 2013-08-15
EA015105B1 (ru) 2011-06-30
US10071135B2 (en) 2018-09-11
US8067360B2 (en) 2011-11-29
WO2007062188A2 (en) 2007-05-31
EA201300330A1 (ru) 2013-11-29
EP3269381B1 (en) 2020-10-07
HRP20080377A2 (en) 2008-11-30
CA3045808A1 (en) 2007-05-31
ECSP088463A (es) 2008-07-30
AU2006318449A1 (en) 2007-05-31
HK1248598A1 (en) 2018-10-19
US20140079700A1 (en) 2014-03-20
CA2631013A1 (en) 2007-05-31
JP2010094129A (ja) 2010-04-30
US20090099086A1 (en) 2009-04-16
BRPI0618947B1 (pt) 2022-07-19
JP2012125259A (ja) 2012-07-05
PL1973559T3 (pl) 2013-06-28
BRPI0618947A2 (pt) 2011-09-13
MEP59208A (en) 2011-05-10
JP2018000205A (ja) 2018-01-11
IN2015DN02553A (sr) 2015-09-11
US9163075B2 (en) 2015-10-20
IL191596A0 (en) 2008-12-29
KR20190097310A (ko) 2019-08-20
EP3269381A1 (en) 2018-01-17
KR20080087092A (ko) 2008-09-30
US20190192625A1 (en) 2019-06-27
IL230645A0 (en) 2014-03-31
CN104844713A (zh) 2015-08-19
KR20150115961A (ko) 2015-10-14
EP1973559A2 (en) 2008-10-01
US20090098113A1 (en) 2009-04-16
US7951771B2 (en) 2011-05-31
JP5785129B2 (ja) 2015-09-24
CA3045808C (en) 2022-08-16
US8629109B2 (en) 2014-01-14
WO2007062188A3 (en) 2007-09-13
HK1158548A1 (en) 2012-07-20
KR20180030264A (ko) 2018-03-21
EA201100158A1 (ru) 2011-08-30
JP2016026212A (ja) 2016-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1973559B1 (en) Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
US20210261682A1 (en) Activin-actriia antagonists and uses for treating multiple myeloma
WO2009137075A1 (en) Anti-activin antibodies and uses for promoting bone growth
AU2019222887B2 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth
HK40050689A (en) Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
HK1123215B (en) Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth
HK1248598B (en) Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
AU2017203993A1 (en) Activin-ActRIIa antagonists and uses for promoting bone growth
HK1158548B (en) Anti-activin a or b antibodies and use thereof for promoting bone growth
HK1202245A1 (en) Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
HK1202245B (en) Activin-actriia antagonists in use for promoting bone growth
HK1137366B (en) Pharmaceutical compositions comprising activin-actriia antagonists and use thereof in preventing or treating multiple myeloma
HK1173982A (en) Pharmaceutical compositions comprising activin-actriia antagonists
HK1174273A (en) Activin-actriia antagonists and uses for promoting bone growth in cancer patients
HK1173982B (en) Pharmaceutical compositions comprising activin-actriia antagonists