BRPI0618972A2

BRPI0618972A2 - Métodos de medição da atividade imunológica e para quantificação da quantidade de enzima alergênica em uma preparação de vacina

Info

Publication number: BRPI0618972A2
Application number: BRPI0618972-5A
Authority: BR
Inventors: Maria Mercedes Ferreira Gomez; Morten Jonas Maltesen; Rasmus Linnemann Krogh
Original assignee: Alk Abello As
Priority date: 2005-11-24
Filing date: 2006-11-23
Publication date: 2011-09-20
Also published as: ES2349672T3; CN101351561A; DK1957661T3; CN101351561B; PT1957661E; DE602006016000D1

Abstract

MéTODOS DE MEDIçãO DA ATIVIDADE IMUNOLóGICA E PARA QUANTIFICAçãO DA QUANTIDADE DE ENZIMA ALERGêNICA EM UMA PREPARAçãO DE VACINA. A presente invenção refere-se a um método de medição da atividade imunológica de uma preparação de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergênicas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigénio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, o método compreendendo as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obtida como indicação da atividade imunológica da preparação de vacina, ou usar a mediação obtida para quantificar a quantidade de enzima alergênica.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS DE MEDIÇÃO DA ATIVIDADE IMUNOLÓGICA E PARA QUANTIFICAÇÃO DA QUANTIDADE DE ENZIMA ALERGÊNICA EM UMA PREPARAÇÃO DE VACINA".

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um método in vitro de medição da atividade enzimática de uma ou mais enzimas alergênicas em uma preparação de vacina e, desse modo, obter uma indicação da atividade imunológica e/ou uma quantificação da quantidade da enzima alergênica na preparação de vacina.

ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

A interação de proteínas com superfícies é um fenômeno de sig- nificância tanto fisiológica quanto tecnológica amplamente reconhecido. Um importante exemplo é a adsorção de alérgenos protéicos no adjuvante hidró- xido de alumínio em vacinas contra alergia. Um adjuvante é um composto que atua aumentando a resposta imune a vacinação. O efeito adjuvante de hidróxido de alumínio tem sido intensamente investigado e numerosas teori- as com relação ao mecanismo têm sido propostas.

Vacinas contra alergia, por exemplo injeção subcutânea, pode- rão ser preparadas misturando uma solução aquosa de um alérgeno e um veículo em fase sólida, por exemplo gel de hidróxido de alumínio, para pro- duzir uma mistura, na qual pelo menos uma parte do alérgeno é adsorvida na fase sólida e parte ou nada do alérgeno encontra-se na fase líquida. O veículo em fase sólida poderá funcionar como adjuvante, isto é, ele potencia- liza a resposta imune do alérgeno, embora o mecanismo da potencialização nem sempre seja totalmente entendida. Também, o mecanismo e natureza da adsorção do alérgeno no veículo em fase sólida não são sempre total- mente entendidos e poderão depender fortemente do tipo de alérgeno en- volvido. Teoricamente, entretanto, a adsorção em géis de hidróxido de alu- mínio envolve parcialmente forças eletrostáticas. No caso de proteínas, a - credita-se que os grupos fosfatos de proteínas fosforiladas também intera- gem com o gel de hidróxido de alumínio e possivelmente substitui em certo grau os grupos hidróxidos na estrutura do gel. A capacidade de adsorção de proteína de hidróxido de alumínio tem sido estudada intensivamente com as proteínas-modelo ovoalbumina (OA) e albumina do soro bovino (BSA). Recentemente, foram realizados es- tudos relativos ao impacto estrutural de adsorção de proteína em hidróxido de alumínio. Medições de emissão de fluorescêneia juntamente com calori- metria de varredura diferencial indicam que importantes alterações estrutu- rais ocorrem na adsorção de OA e BSA em hidróxido de alumínio (Jones e outros, Effects of Adsorption to Aluminium Salt Adjuvants on the Structure and Stability of Model Protein Antigens, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 280, pp. 13406-13414, 2005). Outro estudo, ao contrário, indica que a presença de hidróxido de alumínio em um experimento com ELISA ajudou a manter OA na conformação nativa (Houen e outros, A Non-denaturing Enzyme Linked Immunosorbent Assay With Protein Preadsorbed Onto Alu- minium Hydroxide, Journal of Immunological Methods, Vol. 200, pp. 99-105, 1997). OA adsorvido em hidróxido de alumínio antes de transferência à su- perfície plástica da cavidade de uma placa de microtitulação, mantida sua capacidade de ligar-se a anticorpos monoclonais, elevou-se no sentido da forma nativa de OA. Ao contrário, OA não pré-íncubado com hidróxido de alumínio ligado a anticorpos monoclonais elevou-se contra albumina desna- turada termicamente. Contudo, essas técnicas não fornecem qualquer infor- mação sobre proteínas individuais presentes em uma mistura de proteínas.

O efeito de hidróxido de alumínio sobre a estrutura e estabilida- de de alérgenos é importante a partir de diversas perspectivas. Epitopos conformativos poderão perder-se durante adsorção e a imunogenicidade poderá ser alterada como conseqüência de armazenamento por período de tempo mais longo.

O grau de adsorção varia com a natureza do alérgeno específi- co em questão. No caso de um alérgeno na forma de extrato de um material biológico, por exemplo um extrato de alérgenos de pólen de grama, o extrato contém vários íons e moléculas diferentes, o que potencialmente interfere na ligação dos alérgenos com o veículo em fase sólida.

O ácaro do pó doméstico (HDM), Dermatophagoides pteronys- sinus, é uma importante fonte de alérgenos inalados. Os alérgenos protéicos Der ρ 1 e Der ρ 2 são considerados ser os dois mais potentes alérgenos dos alérgenos Der ρ. A estrutura e atividade enzimática de Der ρ 1 encontra-se bem caracterizada. Diversos estudos in vitro sugerem que a atividade de protease de cisteína de Der ρ 1 aumenta a potência do alérgeno, por exem- plo mediante clivagem de proteínas de junção firme no epitélio pulmonar e clivagem de CD23 (receptor de IgE de baixa afinidade) em células B huma- nas (Jacquet e outros, Biochemical and Immunological Charaeterization ofa Reeombinant Precursor from of the House Dust Mite Allergen Der ρ 1 Produ- ced by Drosophila eells, Clinicai and Experimental Allergy, Vol. 30, pp. 784- 793, 2000). Vacinas contra HDM baseadas em adjuvante de hidróxido de alumínio contêm extrato de HDM purificado como ingrediente farmacêutico ativo (API).

A atividade alergênica e o potencial para induzir reações alérgi- cas poderão ser testados, por exemplo, por injeção intradérmica em animais sensibilizados e por medição da alteração de vários sintomas (Kildsgaard e outros, Assessment of the in vivo allergenic potency of new allergy vaccines by intradermal testing in sensitised mice, Clinicai Immunology and Allergy in Medicine Proceedings of the 21st EAACI Congress 2002, Nápoles, Itália). Entretanto, tais métodos in vivo são laboriosos e levam tempo, e eles neces- sitam do uso de animais de teste, o que é indesejável.

Até agora tem sido prática comum avaliar a atividade imunológi- ca de uma vacina in vitro com base em uma medição da atividade imunoló- gica da solução de alérgeno usada para a preparação da vacina em veículo em fase sólida pronta para usar.

W02005/022157 descreve um método in vitro de avaliação da atividade imunológica de uma preparação de vacina na forma de uma mistu- ra de um antígeno molecular e um veículo, no qual a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, à qual pelo menos uma parte do antíge- no acha-se ligada, compreendendo o método as etapas de i) submeter a vacina a uma medição da atividade imunológica selecionada do grupo que consiste em a) capacidade de ligação com anticorpos usando um imunoen- saio que emprega um anticorpo específico a antígenos ligado a uma fase sólida de anticorpos, b) capacidade de ativar células efetuadoras e c) poten- cial para induzir anafilaxia; e ii) usar os resultados da medição para avaliar a atividade imunológica da vacina.

A natureza de adsorção de alérgenos em adjuvantes de sais metálicos que contêm oxigênio é muito complexa e amplamente desconhe- cida, e espera-se também que varie a quantidade de diferentes alérgenos e diferentes sais metálicos que contêm oxigênio. O objetivo da presente inven- ção é proporcionar um novo método in vitro de avaliação e quantificação da atividade imunológica de preparações de vacina contra alergia com base em adjuvantes de sais metálicos que contêm oxigênio, tais como vacinas pron- tas para usar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da invenção, proporciona-se um método de medição da atividade imunológica de uma preparação de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergênicas e um adju- vante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, compreendendo esse método as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obtida como indicação da ativida- de imunológica da preparação de vacina.

De acordo com um aspecto adicional da invenção, proporciona- se um método para quantificação da quantidade de enzima alergênica em uma preparação de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzi- mas alergênicas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, compreendendo esse método as etapas de medir a atividade enzimá- tica da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obti- da para quantificar a quantidade de enzima alergênica.

DESCRIÇÃO CONCISA DAS FIGURAS A figura. 1 mostra um esquema de fluxo da purificação de Der ρ 1.

A figura. 2a mostra fluorescência do substrato sintético Z-FR- AMC e a relação entre sinal de fluorescência e concentração de substrato.

A figura. 2b mostra curvas padrões de AMC: a) curva-padrão de AMC em AMC a 500 μΜ e b) faixa linear de a).

A figura. 3 mostra um estudo da enzima ótima e concentração de substrato em que a) mostra atividade como função da concentração de substrato e b) mostra atividade como função da concentração de enzima.

A figura. 4 mostra A28O de 100 pg/mL de papaína ± 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio e 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio isoladamen- te.

A figura. 5 mostra o curso do tempo de sedimentação de 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio.

A figura. 6 mostra o efeito de hidróxido de alumínio sobre AMC. A350 de uma amostra de controle foi comparado com A350 de uma amostra de sobrenadante.

A figura. 7 mostra um estudo de tempo de AMC na presença e ausência de hidróxido de alumínio.

A figura. 8 mostra espectros de absorbância dos substratos Boc- QAR-AMC e Z-FR-AMC.

A figura. 9 mostra a influência de hidróxido de alumínio sobre o substrato Z-FR-AMC medida como a) medição de ponto final A325 e b) medi- ção de atividade de papaína.

A figura. 10 mostra a influência de hidróxido de alumínio sobre o substrato Boc-QAR-AMC medida como a) medição de ponto final A32S e b) medição de atividade de papaína.

A figura. 11 mostra a influência de hidróxido de alumínio sobre atividade de papaína com concentração constante do inibidor específico de protease de cisteína E64.

A figura. 12 mostra uma revisão geral de amostras do experi- mento de adsorção com papaína e hidróxido de alumínio. A figura. 13 mostra uma revisão geral de amostras do experi- mento de adsorção com Derp 1 e hidróxido de alumínio.

A figura. 14 mostra atividade de Der p1 de diferentes amostras na presença e ausência de hidróxido de alumínio.

A figura. 15 mostra uma curva de Michaelis-Menten para Der p1 na presença de hidróxido de alumínio.

A figura. 16 mostra inibição de ligação de IgE. Linha descontí- nua: Der p1 eluído de hidróxido de alumínio (Elu), linha contínua: Der ρ 1 de controle na ausência de hidróxido de alumínio (Con 1).

DEFINIÇÕES

A expressão "método in vitro", como usado neste relatório des- critivo, significa um método que poderá ser realizado externamente a um organismo vivo.

A expressão "atividade imunológica", como usado neste relató- rio descritivo, significa qualquer resposta do sistema imune específica a a- lérgenos, incluindo respostas imunes mediadas por imunoglobulina.

As expressões "fase sólida" e "fase líquida" de uma preparação de vacina, como usado neste relatório descritivo, significam as fases que resultam de um processo de separação de uma suspensão do adjuvante de sal metálico que contém oxigênio em um solvente líquido, por exemplo água, em uma fase sólida e uma fase líquida, o processo de separação sendo, por exemplo, centrifugação, extração ou sedimentação simples.

A expressão "adsorvido", como usado neste relatório, significa qualquer ligação não-covalente, acoplamento, aderência ou ligação, incluin- do adsorção por forças eletrostáticas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método in vitro de medição da atividade enzimática de uma enzima alergênica e, desse modo, obtenção de uma indicação da atividade imunológica e/ou uma quantificação da quan- tidade de uma enzima alergênica em uma preparação de vacina.

Em um aspecto, a invenção proporciona, assim, um método de medição da atividade imunológica de uma preparação de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergênicas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase lí- quida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é(são) adsorvida(s) na fase sólida, compreendendo esse mé- todo as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obtida como indicação da atividade imunológica da preparação de vacina.

Em um aspecto da invenção, o termo "pelo menos uma parte de" refere-se ao fato de que pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 1 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85% ou pelo menos 90%, das enzimas alergênicas são adsorvidos na fase sólida.

Em um aspecto da invenção, a atividade imunológica é a capa- cidade de a preparação de vacina dar origem a uma resposta imune media- da por uma imunoglobulina específica a alérgenos, incluindo qualquer clas- se, subclasse ou combinação destas, incluindo IgA, lgA1, lgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, em particular IgG e/ou IgE.

Embora hidróxido de alumínio seja o adjuvante mais comumente usado em vacinas, o que acontece com os alérgenos quando adsorvidos em sua superfície nunca foi totalmente caracterizado. Uma compreensão de como adsorção em hidróxido de alumínio afeta a estrutura e atividade de alérgenos é essencial a seu uso em vacinas, bem como à compreensão do mecanismo de estimulação imune por adjuvante.

Atividade enzimática é em geral diretamente relacionada com a estrutura da enzima. Se a estrutura é alterada, por exemplo por exposição a calor ou condições ácidas, a atividade será provavelmente afetada. Uma população de proteínas homogêneas pode ser descrita pelo seguinte equilí- brio de dois estados simplificado(s): <formula>formula see original document page 9</formula>

em que Né a proteína na forma nativa, Dê a forma desnatura- da, ku e kf são as constantes de velocidade da cinética de desenovelamento e reenovelamento, respectivamente. Entre a forma nativa e a forma desnatu- rada poderão ocorrer vários estados de transição intermediários. A partir desse modelo simples, a definição de desnaturação pode ser estabelecida como: qualquer alteração temporária ou permanente na estrutura tridimensi- onal de uma proteína. Assim, quando mudam as propriedades físico- químicas do ambiente circundante, uma alteração do panorama de energia livre que representa o espaço de configuração disponível na proteína pode ocorrer dependendo de quão persistente é a alteração.

Atração eletrostática em qualquer superfície de uma fase sólida pode levar a uma adsorção da proteína. A adsorção de uma proteína em uma superfície poderá induzir alterações conformativas na proteína, deslo- cando desse modo o mínimo de energia global da proteína. No caso de uma enzima, isso poderia resultar em uma alteração de sua atividade enzimática. Assim, uma mudança na atividade enzimática poderia ser uma medida sen- sível de alterações estruturais resultantes de adsorção em uma fase sólida.

O sistema proteína-hidróxido de alumínio foi totalmente investi- gado devido ao efeito adjuvante do hidróxido de alumínio. A literatura mostra que proteínas de pl ácido ligam-se a hidróxido de alumínio, mas o efeito da ligação sobre atividade enzimática estão os presentes inventores cientes de que nunca foi até agora investigado.

A presente invenção baseia-se na verificação de que é possível realizar medições de atividade enzimática em uma preparação de vacina que compreende enzima(s) alergênica(s) e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio.

A presente invenção baseia-se adicionalmente no reconheci- mento de que essas medições de atividade enzimática da preparação de vacina podem ser usadas como uma indicação da atividade imunológica da preparação de vacina, uma vez que uma alteração na atividade enzimática pode estar ligada a uma mudança na conformação da molécula de enzima conforme presente na preparação de vacina, o que novamente está ligado à atividade imunológica da preparação de vacina.

A capacidade de realizar essas medições torna possível avaliar o impacto da adsorção do alérgeno no adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, por meio de medição da atividade enzimática antes e após adsor- ção no veículo em fase sólida e, desse modo, obtenção de uma medição da atividade imunológica após adsorção, uma vez que, conforme explicado a- cima, espera-se que uma alteração na atividade enzimática venha a ter um impacto na atividade imunológica.

O método de acordo com a invenção pode também ser usado para quantificar a quantidade de enzima(s) alergênica(s) em uma prepara- ção de vacina.

Um aspecto adicional da invenção proporciona, assim, um mé- todo para quantificação da quantidade de enzima alergênica em uma prepa- ração de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergêni- cas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, compreen- dendo esse método as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obtida para quantifi- car a quantidade de enzima alergênica.

Em um aspecto da invenção, a quantificação da enzima alergê- nica é realizada comparando a atividade enzimática medida com um padrão bem caracterizado. Em um aspecto adicional da invenção, a quantificação do alérgeno enzimático é realizada por titulação de sítios ativos. Titulação de sítios ativos exige o uso de um inibidor dessa atividade enzimática particular o qual se liga à enzima irreversivelmente ou pelo menos com uma afinidade muito alta.

PREPARAÇÃO DE VACINA

A preparação de vacina submetida ao método da presente in- venção poderá ser qualquer preparação pronta para uso na forma de uma mistura que compreende uma ou mais enzimas alergênicas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, à qual pelo menos uma parte da enzima aler- gênica é adsorvida, ou qualquer preparação de vacina tal como esta para preparar uma formulação pronta para usar. A preparação de vacina poderá adicionalmente compreender um ou mais alérgenos que não apresentam uma atividade enzimática.

A preparação pronta para usar poderá destinar-se a administra- ção parenteral ou a administração via mucosa.

Administração parenteral inclui administração intravenosa, in- tramuscular, intra-articular, subcutânea, intradérmica, epicutâ- nea/transdérmica e intraperitoneal. Vacinas para administração via injeção poderão ser formuladas de modo a serem adequadas para injeção por agu- lha ou para injeção sem agulha.

Administração via mucosa inclui administração oral, nasal, vagi- nal, sublingual, ocular, retal, urinária, intramamária, pulmonar, otolar (isto é, via ouvido) ou bucal.

A vacina poderá ser na forma de um spray, um aerossol, uma mistura, uma suspensão, uma dispersão, uma emulsão, um gel, uma pasta, um xarope, um creme, uma pomada, implantes (ouvido, olho, pele, nariz, reto e vagina), preparações intramamárias, vagitórios, supositórios ou uteri- tórios.

ENZIMA ALERGÊNICA

No presente contexto, o termo "enzima alergênica" é qualquer proteína que induz reação alérgica, isto é, reações mediadas por IgE após sua exposição repetida a um indivíduo e que apresenta uma atividade enzi- mática, isto é, sendo capaz de catalisar ou acelerar uma reação química.

Como todos os catalisadores, enzimas funcionam baixando a energia de ativação de uma reação, permitindo assim que a reação prossiga muito mais rápido. Enzimas poderão acelerar reações por um fator de muitos milhares. Uma enzima, como qualquer catalisador, permanece inalterada pela reação completa e pode, portanto, continuar a funcionar. Porque enzi- mas, como todos os catalisadores, não afetam a energia relativa entre os produtos e reagentes, elas não afetam o equilíbrio de uma reação. Contudo, a vantagem de enzimas, em comparação com a maioria de outros catalisa- dores, é sua estereo, regio e quimiosseletividade e especificidade.

Exemplos de alérgenos que ocorrem naturalmente incluem alér- genos de pólen (alérgenos de pólen de árvore, erva, erva daninha e grama), alérgenos de inseto (alérgenos inalantes, de saliva e de veneno, por exem- plo alérgenos de ácaros, barata e maruins, alérgenos de veneno de hime- nópteros), alérgenos de pêlo de animal e de caspa (de, por exemplo, cão, gato, cavalo, rato, camundongo etc.), e alérgenos de alimentos. Alérgenos importantes de pólen de árvores, gramas e ervas originam-se tanto das or- dens taxonômicas Fagales, Oleales e Pinales quanto das platanáceas, inclu- indo, entre outras, bétula (Betula), amieiro (Alnus), aveleira (Corylus), carpa (Carpinus) e oliveira (Olea), cedro (Cryptomeria e Juniperus), plátano (Plata- nus), a ordem das Poales, incluindo, entre outras, gramas dos gêneros Loli- um, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale e Sorghum, as ordens das Asterales e Urticales, incluindo, entre outras, ervas dos gêne- ros Ambrosia, Artemisia e Parietaria. Outros importantes alérgenos de inala- ção são aqueles provenientes de ácaros do pó doméstico (HDM) dos gêne- ros Dermatophagoides e Euroglyphus, ácaros do armazenamento, por e- xemplo Lepidoglyphys, Glycyphagus e Tyrophagus, aqueles provenientes das baratas, maruins e pulgas, por exemplo Blatella, Periplaneta, Chirono- mus e Ctenocepphalides, e aqueles provenientes de mamíferos tais como gato, cão e cavalo, alérgenos de venenos, incluindo aqueles que se originam de insetos que ferroam ou picam tais como aqueles da ordem taxonômica Hymenoptera, incluindo abelhas (superfamília Apidae), vespas (superfamília Vespidea) e formigas (superfamília Formicoidae). Alérgenos de inalação im- portantes de fungos são, entre outros, aqueles que se originam dos gêneros Alternaria e Cladosporium.

Em um aspecto da invenção, a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) selecionada(s) do grupo que consiste em alérgenos de pólens de árvo- res, alérgenos de pólens de gramas, alérgenos de pólens de ervas, alérge- nos de ácaros, alérgenos de venenos, pêlos de animais e alérgenos de cas- pas, e alérgenos de alimentos. Em um aspecto adicional da invenção, a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) alérgeno(s) de ácaros do pó doméstico.

Uma lista não exaustiva de enzimas alergênicas é mostrada na tabela 1.

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Uma das principais fontes de alérgenos são HDMs. Em 2000 um total de 13 diferentes espécies de HDMs foram identificadas em todos os continentes, exceto a Antártica. HDMs pertencem ao filo Arthropoda, como se dá, por exemplo, com aranhas e escorpiões. Três espécies constituem 90% da fauna de HDMs, a saber Dermatophagoides pteronyssinus, Derma- tophagoldes farinae e Euroglyphus maynei.

Para D. pteronyssinus, os alérgenos que mediam a resposta alérgica são encontrados nas fezes e dos restos fisicamente dessecados do D. pteronyssinus. Quatorze diferentes grupos de alérgenos de D. pteronyssi- nus são identificados (Tabela 2). Embora nem todos sejam completamente caracterizados, tamanho e função da maioria encontram-se estabelecidos e ensaios imunológicos determinaram a reatividade de IgE in vitro.

Como é evidente da tabela 2, diversos HDMs são enzimas aler- gênicas tais como, por exemplo, Der ρ 1, Der ρ 3, Der ρ 6 e Der ρ 9. TABELA 2. GRUPOS DE ALÉRGENOS DE DERMATOPHAGOIDES PTE- RONYSSINUS- PESO MOLECULAR E FUNÇÃO. _

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A definição formal de um alérgeno importante é qualquer antí- geno que se liga a soro humano com IgE em mais de 50% dos pacientes em um grupo clinicamente sensível. Os alérgenos de HDM Der p i e Der ρ 2 são ambos alérgenos importantes e são considerados os mais potentes dos alérgenos de HDM.

Vários experimentos in vitro indicam que a atividade proteolítica de Der ρ 1 poderia desempenhar um papel essencial no desenvolvimento da reação alérgica a HDM. Acredita-se que Der ρ 1 rompa as firmes junções entre as células epiteliais mediante oclusão por clivagem e eleve a permea- bilidade da mucosa bronquial por meio de degradação de α-antitripsina. Isso poderia facilitar um aumento de acesso ao antígeno subepitelial que se a- presenta nas células, o que poderia levar a um aumento de resposta alérgi- ca. Adicionalmente, Der ρ 1 cliva CD23 (o receptor de IgE de baixa afinidade que regula a produção de IgE) e CD25 (o receptor de IL-2) na superfície de células B e T. Isso orienta a resposta de células T a uma resposta de Th2 e finalmente a níveis elevados de IgE e uma resposta alérgica mais grave.

Enzimas proteolíticas, referidas como proteases ou sinonima- mente peptidases, mediam o desdobramento de proteínas. Isso é feito por proteólise limitada em que um número limitado de ligações peptídicas é cli- vado ou por proteólise ilimitada em que proteínas são degradadas em seus constituintes de aminoácidos. Enzimas proteolíticas, como a maior parte de todas as outras enzimas, são classificadas pelo sistema de numeração da Comissão de Enzimas (EC) com um número que indica função e especifici- dade a substratos. As enzimas proteolíticas são divididas, de acordo com o sistema de numeração da EC, em duas subclasses, a saber exopeptidases e endopeptidades. Estas últimas são também referidas como proteinases.

As exopeptidases, por exemplo amino e caboxipeptidases, cli- vam aminoácidos simples do término N ou C da proteína, considerando que endopeptidases clivam ligações na proteína. Para endopeptidases, a ligação particular clivada é dependente da especificidade ou da preferência por ami- noácidos distintos no substrato proteína. Assim, uma endopeptidase poderia apresentar uma preferência em clivar ligações peptídicas vizinhas a um resí- duo hidrofóbico volumoso, considerando que outras preferem resíduos lon- gos carregados ou mesmo dois ou mais resíduos química ou estruturalmente relacionados. A estrutura efetiva em torno do sítio ativo da protease dita a especificidade ou preferência. Os resíduos em torno do sítio de clivagem do substrato são denotados por -P3-P2-P1-P1'-P2-P3'-, a extensão -P1-P1' sendo o sítio de clivagem. Similarmente, os resíduos da protease alinhados com o substrato são denotados por -S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-.

Quatro diferentes tipos de endopeptidases são descritas. Estas são as proteases de serina, proteases de cisteína, aspartil proteases e meta- loproteases. Em cada caso as proteases geram um nucleófilo que ataca o peptídeo carbonila do substrato protéico.

As proteases de cisteína, que são hidrolases ativas em relação a ligações peptídicas por meio de um resíduo de cisteína, pertencem à sub- classe 3.4.22 no sistema de numeração da EC. Quarenta proteases de ciste- ína são correntemente classificadas nesse sistema, cobrindo enzimas como caspase-1, separase, algumas catepsinas e papaína (Car ρ 1). Várias outras proteases de cisteína foram identificadas e caracterizadas, mas não foram ainda classificadas no sistema de numeração da EC.

Além do sistema de numeração da EC1 proteases são também classificadas em clãs e famílias com base na relação filogenética. Isto é, sua estrutura molecular e homologia de seqüências. Presentemente, o banco de dados MEROPS contém informação detalhada sobre 1.816 diferentes prote- ases. Nesse sistema, proteases são anotadas por uma letra que indica o tipo catalítico (S, C, T, A, G, M ou U, para serina, cisteína, treonina, protease as- pártica, protease glutâmica, metaloprotease ou protease desconhecida, res- pectivamente) seguida de um número arbitrário. As proteases de cisteína são divididas em cinco clãs. Pelo sistema, Car ρ 1 pertence ao clã CA1 famí- lia C1 e recebe o nome C.01.001, em contraste com 3.4.22.2 no sistema de numeração da EC.

Os resíduos catalíticos responsáveis pela atividade de protea- ses de cisteína são bem conservados: uma cisteína (Cis), uma histidina (His) e uma asparagina (Asn) constituem a chamada tríade catalítica. Esses três resíduos geram um ânion tiolato nucleofílico de Cis. Um par de íons tiolato- imidazólio é gerado a partir de His e Cis, o qual ataca a carbonila peptídica do substrato. Asn ajuda a orientar o íon ímidazólio de His em posições favo- ráveis pelas várias etapas do mecanismo catalítico. A catálise acontece de uma maneira seqüencial. Primeiro, a enzima é temporariamente acilada pelo substrato protéico por meio do ânion tiolato. Segundo, uma parte do substra- to protéico é clivada seguida de desacilação e da adição de água. Finalmen- te, os resíduos do sítio ativo da protease de cisteína são reconstituídos em sua forma original.

Além dos resíduos catalíticos, vários outros resíduos desempe- nham papéis importantes. Uma glutamina (GIn) constitui parte do que é chamado buraco de oxiânions. Essa estrutura ajuda a estabilizar o estado intermediário de transição do substrato durante catálise. Vários resíduos hi- drofóbicos mantêm um ambiente não-polar em torno de Asn, protegendo-o de solvente externo. Estes são dois triptofanos (Trp), duas valinas (Val) e uma fenilalanina (Fe), todos resíduos conservados.

A catálise realizada por proteases de cisteína é fortemente de- pendente de um ambiente redutor, uma vez que a cisteína reativa é propen- sa a oxidação. Por essa razão, ensaios enzimáticos com proteases de ciste- ína poderão ser conduzidos com um agente redutor, por exemplo ditiotreitol (DTT), cisteína livre ou β-mercaptoetanol.

A protease de cisteína Car ρ 1 da planta Carica papaya é a pro- tease de cisteína mais estudada e bem entendida. Car ρ 1 é um membro da família C1 de proteases de cisteína que usualmente são secretadas e pro- duzidas como pró-formas inativas. Car ρ 1 consiste em uma única cadeia de polipeptídeos de 212 aminoácidos com três pontes de dissulfeto. A cadeia de polipeptídeos é dobrada para formar uma proteína globular constituída de dois domínios interativos que delimitam uma fenda entre eles. Os resíduos de sítios ativos Cys25 e His159 localizam-se nessa fenda em domínios o- postos. O domínio que abriga Cys25 é dominado por motivos estruturais a- helicoidais, considerando que o domínio que abriga His159 é dominado por motivos estruturais β-foliares. O terceiro resíduo catalítico Asn175 é residen- te em estreita proximidade com His159 em seqüência e estrutura terciária.

À parte Cys25 que coordena a carbonila do substrato, Asn175 e Gln19 ajudam a manter o substrato no devido lugar para catálise por ligação de hidrogênios e constituem o núcleo do buraco de oxiânions mencionado. O pH ótimo da atividade proteolítica de Car ρ 1 é de 6,0 - 7,0.

Der ρ 1, um importante alérgeno de HDM que se origina de suas fezes, é também um membro da família C1 de proteases de cisteína. Embo- ra não ocupe um lugar no sistema de numeração da EC, ele é classificado no banco de dados de peptidases MEROPS com o número C.01.073. Der ρ 1 é excretado como uma pró-enzima no trato gastrointestinal de HDMs e é ativado por meio de remoção proteolítica do pró-peptídeo que forma a enzi- ma madura que consiste em 222 aminoácidos com três pontes de dissulfeto. O quadro de leitura aberta codifica um peptídeo de sinal de 18 aminoácidos além de um pró-peptídeo de SO aminoácidos. Der p 1 é estruturalmente mui- to similar a Car ρ 1 e eles apresentam uma homologia estrutural de 80%, apesar de uma homologia de seqüências de 26%. O pH ótimo da atividade proteoiítica de Der ρ 1 é de 7,0 - 8,0.

Em um aspecto da invenção, a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em Der ρ 1, Der ρ 3, Der ρ 6 e Der ρ 9.

Em outro aspecto da invenção, pelo menos uma das enzimas alergênicas é uma protease de cisteína tal como Der ρ 1.

Em outro aspecto ainda da invenção, pelo menos uma das en- zimas alergênicas é uma protease de cisteína tal como uma ou mais sele- cionadas do grupo que consiste em Der ρ 3, Der ρ 6 ou Der ρ 9.

Em outro aspecto ainda da invenção, a preparação de vacina compreende pelo menos duas espécies diferentes de alérgenos, quer se originem da mesma fonte alérgica, quer se originem de diferentes fontes a- lergênicas, por exemplo alérgenos do grupo 1 e do grupo 3 de diferentes ácaros.

A enzima alergênica incorporada na preparação de vacina pode- rá ser na forma de um extrato, um alérgeno purificado, um alérgeno modifi- cado, um alérgeno recombinante ou um mutante de um alégeno recombi- nante. Um extrato alergênico poderá além dos alérgenos conter vários ou- tros íons e moléculas. Um extrato alergênico poderá naturalmente conter uma ou mais isoformas do mesmo alérgeno, considerando que um alérgeno recombinante tipicamente representa somente uma isoforma de um alérge- no. A preparação de vacina poderá adicionalmente compreender um ou mais alérgenos que não apresentam uma atividade enzimática e/ou uma ou mais enzimas que não apresentam atividade alergênica.

Em um aspecto da invenção, a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) na forma de um extrato. Em outro aspecto da invenção, é medida a atividade enzimática de um importante alérgeno do extrato.

Em um aspecto ainda adicional da invenção, poderá ser medida a atividade enzimática de uma ou mais enzimas alergênicas em um extrato total. Em outro aspecto da invenção, o alérgeno é um alérgeno re- combinante. Em um aspecto adicional da invenção, o alérgeno é um mutante de baixa ligação com IgE que ocorre naturalmente ou um mutante recombi- nante de baixa ligação com IgE

Em um aspecto adicional da invenção, o alérgeno de baixa liga- ção com IgE é um alérgeno de acordo com WO 99/47680, WO 02/40676 ou WO 03/096869. INIBIDORES DE ENZIMAS

A atividade enzimática pode ser afetada por outras moléculas tais como inibidores que são moléculas que diminuem ou abolem atividade enzimática.

Um grande número de inibidores de proteases, tanto naturais quanto sintéticos, é descrito. Inibidores inativam a enzima por meio de dife- rentes mecanismos, por exemplo modificação covalente direta dos resíduos catalíticos ou por proteção do sítio ativo para entrada de substrato. O primei- ro tipo de mecanismo é freqüentemente representado por pequenas molécu- las com um grupo reativo a resíduos catalíticos, bloqueado desse modo, ir- reversivelmente, a atividade. Um exemplo de tal inibidor é o inibidor específi- co de protease de cisteína E-64, que se liga covalentemente à cisteína cata- lítica por meio de um grupo epóxido reativo. Esse último tipo de inibidor é freqüentemente uma estrutura macromolecular que se associa à enzima por interações não-covalentes múltiplas. Um exemplo de tal inibidor é o inibidor de tripsina de soja (SBTI), específico a proteases de serina. SBTI é uma pro- teína de 190 aminoácidos que ocorre naturalmente, que cobre a fenda do sítio ativo e, desse modo, os resíduos catalíticos, por ligação de hidrogênios, interações eletrostáticas e interações hidrofóbicas com a superfície da enzi- ma.

Em um aspecto da invenção, a preparação da vacina compre- ende diversas enzimas alergênicas. A fim de medir apenas a atividade de uma das enzimas alergênicas, poderia ser necessário usar inibidores cor- respondentes, dependendo do tipo de atividade enzimática que se deseja inibir. Em um aspecto adicional da invenção, é usado um inibidor para inibir uma ou mais das enzimas alergênicas na preparação da vacina.

O uso de inibidores específicos em relação à enzima alergênica em questão é útil para obter uma caracterização melhor e identificação da atividade enzimática, bem como para a quantificação da quantidade de en- zima ativa presente na preparação (por exemplo, titulação de sítios ativos). Em um aspecto da invenção, o inibidor de protease de cisteína utilizado é selecionado do grupo que consiste em E64 (L-trans-epoxissuccinil-L- leucilamino(4-guanidino)butano) e outros epóxidos. Em um aspecto adicional da invenção, o inibidor é E64.

SUBSTRATOS

A fim de ser capaz de medir a atividade enzimática de uma en- zima alergênica adsorvida na fase sólida em um ensaio de atividade enzimá- tica, deve ser identificado um substrato e, se necessário, um inibidor especí- fico à enzima alergênica em questão.

Em um aspecto da invenção, o substrato no ensaio de atividade enzimática é específico à enzima em questão, o que significa que nenhuma outra enzima na mesma fonte alergênica é capaz de converter esse substra- to em produto. Como exemplo, o substrato Z-Leu-Leu-GIu-MCA é específico a proteases de cisteína, por exemplo Der ρ 1, e não é clivado pelas outras proteases sabidas estar presentes nessa fonte alergênica (extratos de HDM), tais como as proteases de serina Der ρ 3, Der ρ 6 ou Der ρ 9. Em um aspecto da invenção, um substrato específico a uma enzima alergênica é usado para medir a atividade enzimática da enzima alergênica. Em um as- pecto adicional da invenção, o substrato usado é Z-LeuLeuGlu-MCA.

ADJUVANTE DE SAL METÁLICO QUE CONTÉM OXIGÊNIO

Um adjuvante é um composto que atua para intesificar a respos- ta imune sobre vacinação.

O sal metálico que contém oxigênio a ser utilizado de acordo com a invenção poderá ser qualquer sal metálico que contém oxigênio que proporcione o efeito desejado quando formulado em um sistema de transfe- rência. Exemplos de tais substâncias que contêm oxigênio são hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, sulfato de potássio- alumínio, fosfato de cálcio, Maalox (mistura de hidróxido de alumínio e hidró- xido de magnésio), hidróxido de berílio, hidróxido de zinco, carbonato de zin- co, cioreto de zinco e sulfato de bário.

Exemplos de sais metálicos adequados que contêm oxigênio são, por exemplo, aqueles em que o cátion é selecionado de Al, K, Ca, Mg, Zn, Ba, Na, Li, B, Be, Fe, Si, Co, Cu, Ni, Ag, Au e Cr.

O ânion do composto que contém oxigênio poderá ser um ânion orgânico ou inorgânico, ou uma combinação de ânions orgânicos e inorgâni- cos. Exemplos de sais metálicos adequados que contêm oxigênio são, por exemplo, aqueles em que o ânion é selecionado de sulfatos, hidróxidos, fos- fatos, nitratos, iodatos, bromatos, carbonatos, hidratos, acetatos, citratos, oxalatos e tartratos, bem como formas mistas destes. Os sais metálicos que contêm oxigênio compreendem adicionalmente complexos de coordenação. Uma definição de complexos de coordenação é dada em, por exemplo, The Handbook of Chemistry and Physics (Manual de Química e Física), 56 Ed., Seção B, Capííuio 7 (1975-76).

No presente contexto, a expressão "formas mistas" pretende incluir combinações de vários ânions, bem como combinações com, por e- xemplo, cloretos e sulfetos.

Embora o sistema de transferência compreenda um sal metálico que contém oxigênio, considera-se que o oxigênio poderia ser substituído por outro átomo do Grupo VIA tal como S, Se ou TE.

Sais metálicos que contêm oxigênio podem ser caracterizados por meio de uma variedade de parâmetros físico-químicos tais como propri- edades de adsorção, solubilidade e dissolução, carga iônica medida como ponto isoelétrico pl (pH em que a carga líquida da substância é zero para um composto passível de dissociação), constantes de dissociação, coordenação complexa, configurações eletrônicas, valência, orbitais de ligação e orbitais antiligação, propriedades de depósito, propriedades de adesão, característi- cas superficiais, características das partículas e adjuvanticidade.

Acredita-se que a substância biologicamente ativa seja adsorvi- da (ou acoplada) no sal metálico que contém oxigênio e que essa adsorção contribua para a eficácia da vacina. Diversos fatores poderão ser importan- tes ou influenciar a adsorção entre a substância ativa e o sal metálico que contém oxigênio (vide, por exemplo, P.M. Callahan e outros, Pharmaceutical Research, Vol. 8, No. 7.851.858 (1991), e Vaccine Design. The Subunitand Adjuvant Approaeh). Esses fatores incluem pH, a extensão de tempo em que a reação de adsorção é realizada em relação a condições de mistura, con- centrações dos vários componentes nas vacinas, recipientes, temperatura, armazenamento, tampão e excipientes. Verificou-se adicionalmente que a adsorção da substância ativa poderá ser influenciada pela carga líquida/total do sal metálico e a carga da substância ativa, ambas as quais são depen- dentes do pH. Uma característica adicional que se acredita ser de importân- cia é a solubilidade dos sais metálicos que contêm oxigênio.

O sal metálico que contém oxigênio poderá adicionalmente a- presentar um efeito de depósito. Um efeito de depósito significa que a subs- tância ativa será liberada gradualmente da vacina. A substância ativa será, assim, retida com o(s) sai (sais) meiáiico(s) que contém (contêm) oxigênio e gradualmente liberada dele(s). Acredita-se que isso apresente vários efeitos benéficos, por exemplo estimulação prolongada, liberação benéfica de fár- maco e proteção das substâncias biológicas interativas contra condições ambientais. Acredita-se adicionalmente que o sal metálico que contém oxi- gênio possa possuir certas propriedades de captura, retendo desse modo a substância ativa a ser liberada.

Uma outra característica de sais que contêm oxigênio é a prote- ção da substância ativa, seja mantendo o pH ideal para a substância ativa no microambiente, evitando assim degradação ácida, ou pela proteção da substância ativa contra degradação enzimática, permitindo desse modo que a substância seja liberada.

Adicionalmente, alguns dos sais metálicos que contêm oxigênio apresentam uma capacidade de tamponamento. Essa capacidade poderá resultar em um microambiente in vivo na formulação de vacina, o qual prote- ge a substância ativa do ambiente degradável. Isso poderá, por exemplo, ser uma vantagem para o estômago ou intestino, onde há um risco de degrada- ções ácida e enzimática, respectivamente.

Alguns sais metálicos que contêm oxigênio, por exemplo hidró- xido de alumínio, apresentam a forma de um gel suspenso em um solvente, tipicamente água. Quando se agita o gel, isto é, a fase sólida, ocorrerá uma distribuição uniforme em todo o volume da suspensão, encerrando, portanto, toda a água, isto é, a fase líquida, presente. Quando deixado em repouso ou quando submetido a um processo de separação, tal como centrifugação, uma parte da água será separada do gel. A quantidade de água separada dependerá do processo de separação usado, bem como do tipo e concen- tração do sal metálico que contém oxigênio utilizado.

Em um aspecto da invenção, o sal metálico que contém oxigê- nio é selecionado do grupo que consiste em hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio e fosfato de cálcio.

Em um aspecto da invenção, o sal metálico que contém oxigê- nio é hidróxido de alumínio. A fórmula molecular do hidróxido de alumínio é AI(OH)3. Isso, contudo, subestima a verdadeira complexidade do composto. A composição estrutural molecular é um octaedro. Alumínio está no centro do plano de simetria da bipirâmide, hidróxidos nas interseções conectivas e moléculas de água em todo o resto. O octaedro individual combina estrutu- ras macromoleculares de octaedros frouxas. À medida que mais octaedros se combinam, a razão de alumínio para oxigênio aproxima-se assintotica- mente de 1:3, à medida que mais hidrogênio da água é deslocado.

A aparência física do hidróxido de alumínio é uma suspensão em gel com fluidez decrescente de acordo com teor crescente de alumínio. O gel agrega-se e, portanto, sedimenta-se quando armazenado devido à sua alta densidade, deixando uma fase aquosa acima dele. O tamanho típico das partículas de um agregado de hidróxido de alumínio situa-se na área de dois para três pm. Hidróxido de alumínio apresenta um ponto de carga zero (PZC) de 9,1. O PZC é equivalente ao pl em proteína, que é o valor de pH em que a molécula apresenta uma carga líquida total de zero. Os pis de Car ρ 1 são 8,75 e para Der ρ 1, 4,6-6,6 (dependendo dos diferentes isômeros de Der ρ 1). Adicionalmente, mostra-se que o microambiente que circunda o adjuvante de hidróxido de alumínio apresenta um pH diferente daquele da solução em massa, isso se deve à atração de ânions, incluindo hidroxilas, que formam uma camada dupla que envolve as partículas de adjuvante.

A base da adsorção de proteínas em hidróxido de alumínio é principalmente mediada por sua diferença de cargas. Uma diferença subs- tancial no PZC para pl sob pH constante é necessária a fim de estabelecer as interações eletrostáticas exigidas para a adsorção. Isso é sustentado pelo potencial de Nernst ou pelo potencial superficial para hidróxido de alumínio dado por

Potencial superficial = 59 mV. (PZC - pH)

Proteínas com um pl menor que PZC serão capazes de ligar-se a hidróxido de alumínio. Quanto maior a diferença entre PZC e pH, maior é o potencial do adjuvante de hidróxido de alumínio e mais intensa a interação eletrostática entre hidróxido de alumínio e proteína, uma vez que o pl da pro- teína é menor que o PZC do hidróxido de alumínio.

Outras interações incluem ligações hidrofóbicas, forças de van der Waals e ligações de hidrogênio, mas não são elas mesmas suficientes para orientar a adsorção se nenhuma diferença significativa de cargas existe entre as moléculas. Assim, em teoria, Car ρ 1 não deverá, ou pelo menos em baixo grau, adsorver-se em hidróxido de alumínio, considerando que Der ρ 1 deverá ser adsorvido devido a grande diferença de cargas em compara- ção com hidróxido de alumínio. ENSAIO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

A finalidade do ensaio de atividade enzimática é obter uma cur- va de progresso de uma reação catalisada por enzima. A velocidade inicial é estimada como a taxa inicial de formação de produto ou a diminuição inicial na concentração de substrato. Isso pode ser obtido de diferentes maneiras, dependendo da reação enzimática, as mais populares sendo absorbância, fluorescência ou alteração de pH. Uma curva de progresso de enzima é a concentração de produto como função do tempo. No presente contexto, o termo "ensaio de atividade enzimática" refere-se a qualquer ensaio apropria- do, dependendo da enzima alergênica a ser medida. Pelo método escolhido, deverá ser possível seguir e quantificar o consumo de substrato e/ou a gera- ção de produto, por métodos que sejam compatíveis e não alterados pela presença do veículo em fase sólida, por exemplo por métodos espectroscó- picos tais como absorbância, fluorescência, FTIR (Espectrometria de Infra- vermelho por Transformadas de Fourier), por métodos imunológicos, por exemplo ELISA, e similares. Antes de decidir sobre um ensaio, é prática pa- drão para aquele versado na técnica verificar se a presença da fase sólida não interfere na catálise enzimática, com as condições de ensaio (por exem- pio, ligando o substrato e/ou o produto, alterando as condições de pH, etc.), ou com o próprio método de medição, de uma maneira que afete os resulta- dos medidos, como, por exemplo, exemplificado nos exemplos dados neste relatório.

Em um aspecto da invenção, o ensaio é um ensaio de fluores- cência no qual a formação de produto é medida em função do tempo. O substrato pode ser feito de um peptídeo sintético ligado a um grupo fluores- cente que é extinto pelo peptídeo e apresenta intensidade de fluorescência relativamente baixa enquanto ligado ao peptídeo, tais como os substratos de protease de cisteína Boc-GIn-AIa-Arg-MCA, Z-Leu-Leu-Glu-MCA ou Z-Fe- Arg-MCA, nos quais MCA é o grupo fluorescente. Quando uma enzima cliva a ligação entre o grupo fluorescente e a seqüência de peptídeos, a fluores- cência aumenta dramaticamente. O peptídeo pode ser projetado para satis- fazer as exigências de especificidade da enzima.

Quando a enzima alergênica, em um aspecto da invenção, é uma protease de cisteína, o resíduo ativo de cisteína precisa estar em sua forma reduzida a fim de que a protease seja enzimaticamente ativa. Nesse aspecto da invenção, a enzima alergênica é incubada com um agente redu- tor para ativar a enzima alergênica. É importante que o agente redutor esteja presente em uma concentração suficiente de modo a reduzir totalmente o resíduo de cisteína em sítios ativos, mas não em um excesso de concentra- ção tal que reduza as pontes de dissulfeto da enzima.

Em um aspecto da invenção, é medida a atividade enzimática da mistura de fase líquida e fase sólida da preparação de vacina. Em um aspecto adicional da invenção, a preparação de vacina é submetida a um processo de separação para separar a fase líquida e a fase sólida a fim de tornar possível medir a atividade enzimática da fase sólida e da fase líquida separadamente. A separação pode ser realizada por meio de qualquer mé- todo apropriado. Em um aspecto da invenção, o processo de separação é realizado por centrifugação, extração ou sedimentação simples. Dependen- do do ensaio enzimático específico usado e da qualidade da amostra da fase sólida, pode ser necessário usar, por exemplo, soluções tampões a fim de obter uma amostra apropriada antes de medir a atividade enzimática da(s) enzima(s) alergência(s).

Em um aspecto da invenção, a preparação de vacina é subme- tida somente a uma medição da atividade enzimática de enzima alergênica na mistura da fase líquida e da fase sólida (medição 1).

Em um aspecto adicional da invenção, a preparação de vacina é submetida somente a uma medição da atividade enzimática de enzima aler- gênica na fase líquida após uma separação da fase líquida da fase sólida (medição 2).

Em um aspecto adicional da invenção, a preparação de vacina é submetida somente a uma medição da atividade enzimática de enzima aler- gênica na fase sólida após uma separação da fase líquida da fase sólida (medição 3).

Em um aspecto ainda adicional da invenção, a preparação de vacina é submetida tanto a uma medição da atividade enzimática da mistura da fase líquida e da fase sólida (medição 1), e a uma medição de atividade enzimática de enzima alergênica na fase líquida (medição 2).

Em um aspecto ainda adicional da invenção, a preparação de vacina é submetida tanto a uma medição da atividade enzimática de enzima alergênica na fase líquida (medição 2), e a uma medição da atividade enzi- mática de enzima alergênica na fase sólida (medição 3).

A distribuição das enzimas alergênicas entre a fase líquida e a fase sólida é um parâmetro que é característico para cada enzima alergênica e, portanto, poderá servir para caracterizar o estado e a ativida- de imunológica de uma preparação de vacina. Conseqüentemente, a finali- dade dos aspectos acima da invenção que envolvem medições da atividade enzimática de várias combinações de diferentes fases da preparação de va- cina e/ou de toda a preparação de vacina é fornecer informação adicional sobre a atividade imunológica da preparação de vacina.

Em outro aspecto da invenção, é medida a atividade enzimática de uma solução de enzimas alergênicas usada para preparar a preparação de vacina com adjuvante, e a medição dessa solução é comparada com a medição obtida para a preparação de vacina com adjuvante a fim de avaliar o efeito sobre a atividade enzimática da preparação de vacina com adjuvan- te.

Em outro aspecto ainda da invenção, a preparação de vacina é submetida à medição de atividade enzimática imediatamente após prepara- ção e após um ou mais períodos de armazenamento, e a indicação da ativi- dade imunológica da preparação de vacina baseia-se em uma comparação daquelas e dessas últimas medições.

Em outro aspecto da invenção, a indicação da atividade imuno- lógica da preparação de vacina baseia-se em uma comparação da medição obtida para a preparação de vacina com adjuvante e de medições corres- pondentes anteriores do mesmo tipo de preparação de vacina com adjuvan- te ou de outro tipo de preparação de vacina.

MÉTODOS E MATERIAIS

PREPARAÇÃO DE VACINAS COM ADJUVANTE DE GEL DE ALUMÍNIO COM ALÉRG ENOS

Alérgeno Iiofilizado é dissolvido em tampão aquoso e diluído até uma concentração desejada. "Alidrogel" (1,3%) é adicionado à solução de alérgeno obtida enquanto sob agitação e, em seguida, água estéril é adicio- nada. A solução resultante é deixada permanecer em repouso até o dia se- guinte e, em seguida, tampão é adicionado lentamente enquanto sob agita- ção para produzir o gel final de hidróxido de alumínio com alérgeno.

IMUNELETROFORESE ROCKET OBJETIVO

Esse método foi usado para quantificar uma dada proteína me- diante medição da propagação de complexo proteína-anticorpos após eletro- forese em um gel de agarose contendo anticorpos orientados contra a prote- ína sob investigação.

TEORIA

Esse método baseia-se na mobilidade de complexo proteína- anticorpos em um gel de agarose durante eletroforese. Os anticorpos são incorporados no gel de agarose durante polimerização e a proteína de amos- tra é então aplicada aos poços. As proteínas deslocam-se de acordo com sua mobilidade eletroforética encontrando os anticorpos no gel e formando complexos. Esses complexos desenvolvem-se em tamanho à medida que os antígenos encontram cada vez mais antígenos, limitando desse modo a mi- gração através dos poros do gel até nenhuma migração adicional ocorrer. Os complexos são visualizados corando o gel. A área delimitada pelos com- plexos é proporcional à quantidade de proteína aplicada ao poço. A quantifi- cação é realizada em relação a uma preparação padrão interna aplicada em uma série de diluições no mesmo gel.

APARELHOS:

Banho-maria controlado por termostato aquecido a 56-60°C Aparelho de eletroforese (2 recipientes com tampões, 2 eletro- dos, superfície resfriada e câmara)

Alimentação de energia, Immuno Power 320, Kebo Lab A/S Insuflados de ar quente, Team International HL2

MATERIAIS E REAGENTES:

Placa de vidro: 7 χ 10 cm Wicks de papel: papel de filtro, tamanho padrão: 21 χ 10 cm,

Watman

Tampão para recipientes com eletrodos e gel de agarose: Ácido 5,5-dietilbarbitúrico 0,1 M, Veronal, Tris 0,40 M, Sigma, Lactato de a cálcio 2 mM, Purum Gel de agarose contendo anticorpos: Agarose 1% (ρ/ν), tipo HAS, Litex

Anticorpo: Rb-a-Derp1, ALK-Abelló A/S

SOLUÇÃO DE CORAÇÃO:

Azul Brilhante de Coomassie R-250 6 mM, Pierce, ácido acético a 10%, Bie & Berntsen, em etanol a 43,2%

SOLUÇÃO DE DESCORACÃO:

Ácido acético a 10%, Bie & Berntsen, em etanol a 43,2%

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Uma placa de vidro foi colocada sobre uma superfície nivelada e limpa com etanol. 11 mL de agarose foram pipetados em um tubo de ensaio em um banho de água a 56°C, 15 pL de anticorpos foram adicionados e a solução foi misturada com moderação por inversão. A agarose foi derramada sobre a placa de vidro cuidadosamente evitando formação de bolhas de ar. Após gelação, uma série de poços foi perfurada a 1,5 cm da borda inferior da placa. A placa foi colocada sobre a superfície resfriada do aparelho de eletroforese. Pontes de ligação de 5 camadas de papel de filtro foram esta- belecidas e a tensão através do gel ajustada em 2 V/cm. 10 pL de amostra foram aplicados aos poços. Uma outra placa de vidro foi colocada no alto das pontes de ligação de papel de filtro para evitar condensação de água no gel e eletroforese foi continuada da noite para o dia.

Após a eletroforese ser conduzida, a placa de vidro foi colocada sobre papel de vidro e os poços cheios de água destilada. Em seguida, o gel foi coberto com papel de filtro úmido e prensado sob diversas camadas de papel de filtro seco, uma placa de vidro espessa e uma carga de 3-4 kg. A- pós dez minutos o procedimento foi repetido. A placa foi então colocada em um recipiente com NaCI 0,1 M por 15-30 minutos seguido de prensagem conforme descrito acima. Após esse procedimento, a placa foi secada em uma corrente de ar quente e as placas coradas por 5 min em solução de co- ração de Coomassie. A placa foi imersa em água destilada por alguns se- gundos a fim de remover excesso de solução de coração. Finalmente a pla- ca foi descorada por 2 minutos em banhos sucessivos até a descoração de- sejada ser atingida. A placa foi secada com ar quente e digitalização do gel foi efetuada pelo software Gel-Pro Analyzer 3.1.

PURIFICAÇÃO DE DERP 1

OBJETIVO

A finalidade é a purificação de Der ρ 1 a partir de extrato de D. pteronyssinus. TEORIA

A purificação de Der ρ 1 envolve diversas etapas. Aplicação de dois tipos de etapas cromatográficas por afinidade conduz ao Der ρ 1 purifi- cado. A primeira cromatografia foi realizada em uma coluna de SBTI- agarose. A finalidade dessa etapa é a remoção de proteases de serina con- taminantes presentes no extrato, proporcionando um extrato mais estável.

A segunda etapa da purificação é realizada em uma coluna de sefarose 4C1B8. 4C1B8 é um anticorpo monoclonal de camundongo especí- fico a Der ρ 1 (de Martin Chapmari). O Der ρ 1 é eluído mediante aplicação de um gradiente de pH.

Fluxograma da purificação é mostrado na figura 1.

Uma purificação adicional em uma coluna de SBTI é realizada a fim de remover completamente traços da protease de serina de Der ρ 3 que se co-purifica na etapa anterior. As frações que contêm Der ρ 1 foram cole- tadas e concentradas por ultrafütração.

APARELHOS:

Sistema explorador FPLC ÂKTA, Amersham Biosciences

Centrífuga Sorval RC 3B Plus, Du Pont

MATERIAIS E REAGENTES:

Purificação por afinidade:

Colunas: coluna de SBTI-agarose para Der ρ 1 (SBTI-agarose), volume da coluna (VC), 1 ml_.

Coluna de CNBr-sefarose 4C1B8 mAb para Der ρ 1 (4C1B8- sefarose), VC1 5 mL.

Extrato de ácaros do pó doméstico de D. pteronyssinusTampões para purificação cromatográfica:

A11: Solução salina tamponada com fosfato (PBS), Bie & Bernt- 32

sen

A2: PBS1 NaCI 0,5 M1 Merck Β1: Glicina 0,1 Μ, pH 11, Sigma, NaCI 0,5 Μ, Merck

CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNA:

Dispositivos de filtro para centrífuga, Amicon Ultra-15 15 mL, Millipore.

TROCA DE TAMPÃO:

Coluna de dessalgação PD 10, Amersham Bioscienees Procedimento Experimental

PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

120 mg de extrato de Der ρ foram dissolvidos em 10 mL de tam- pão A11. A amostra foi filtrada com um filtro de baixa ligação de proteína de 0,22 μιτι. A fim de reduzir possível proteólise de Der ρ 1, todas as operações foram realizadas a 5°C. Todos os tampões usados foram resfriados a 5°C também.

CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE EM COLUNA DE SBTI-AGAROSE

A coluna de SBTI-agarose foi equilibrada com tampão A11 e 5 mL da amostra preparada foram injetados na coluna. Amostras de 50 pL de frações foram tomadas para investigação posterior e congeladas separada- mente. As frações da vazão contendo Der ρ 1 foram reunidas para purifica- ção posterior.

CROMATOGRAFIA POR AFINIDADE EM COLUNA DE 4C1B8-SEFAROSE A coluna foi equilibrada com tampão A11 e 5 mL de amostra (pool purificado por SBTI-agarose) foram injetados na coluna. O material não-esoecificamente ligado foi eluído com tampão A2. Em seguida, Der p 1 foi eluído com um gradiente de tampão B1. Tampão de Fosfato 800 mM, pH 7, foi pipetado nos tubos de coleta (200 pL/mL de fração) destinados à cole- ta de Der ρ 1 a fim de neutralizar o eluato alcalino. Amostras de 50 pL de frações foram removidas e congeladas separadamente para investigação posterior. Frações do pico de eluição foram reunidas e congeladas.

As frações contendo Der ρ 1 foram reunidas e submetidas a uma segunda cromatografia em SBTI-agarose, sob as mesmas condições descritas anteriormente.

PROCESSOS DE PÓS-PURIFICACÃO

O pool, em torno de 140 mL, da segunda purificação em coluna de SBTI foi concentrado por ultrafiltração, usando filtros para centrífuga Ami- con Ultra-15 15 mL. Os filtros foram lavados com tampão de PBS e o Der ρ 1 reunido centrifugado a 3.500 rpm por 15 minutos reduzindo o volume para 5 mL.

O tampão foi mudado para Tris 50 mM, pH 7, usando a coluna de dessalgação PD-10 recheada com Sephadex G-25 para separar altos pesos moleculares (PM > 5.000) de substâncias com baixos pesos molecu- lares (PM < 1.000).

ABSORBÂNCIA

OBJETIVOS

Esse método é utilizado para avaliar concentração total de pro- teínas

TEORIA

Os aminoácidos aromáticos triptofano, tirosina e fenilalanina absorvem luz ultravioleta. Entretanto, somente triptofano e tirosina absorvem a 280 nm, e triptofano absorve 5 vezes mais luz que tirosina. Isso é devido à transição η —> η* no anel indol do triptofano, no qual fenilalanina e tirosina contêm um grupo fenila. A absorbância de uma proteína correlaciona-se li- nearmente com a quantidade de triptofano e tirosina na proteína, com o comprimento do caminho da luz e com a concentração de proteína. Essa relação é chamada lei de Lambert-Beer e é dada por:

A= ε.l.c

Em que A é a absorbância, ε é o coeficiente de absorção molar da proteína (determinado pela quantidade de triptofano e tirosina na proteí- na), I é o comprimento do caminho da luz e c é a concentração de proteína. Assim, a partir de uma medição de absorbância pode-se estimar a concen- tração de proteína se o coeficiente de absortividade molar é conhecido.

APARELHOS

Espectrômeto Lambda 800 UV/VIS, Perkin-Elmer® 10O-OS1 cadinhode quartzo, comprimento do caminho, 1 cm,

Hellma®

MATERIAIS E REAGENTES

Bis-Tris a 50 mM, pH 6,5, Sigma

Tris a 50 mM, pH 7,0, Sigma

Tampão de fosfato a 50 mM, pH 7,0, Merck

Solução Helmanex a 2%, Hellma

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

O espectrofotômetro foi ligado 30 min antes de usar para um período de aquecimento. O comprimento de onda do espectrofotômetro foi ajustado a 280 nm e o instrumento zerado sob uma amostra em branco con- tendo a matriz da amostra verdadeira. O cadinho de quartzo foi lavado pri- meiro com uma solução Helmanex a 2% e, em seguida, 4 vezes com água MQ, e, depois, secado com ar a alta pressão. Após secagem com ar, o exte- rior do cadinho foi limpo com lenço de limpar lentes. Esse procedimento foi realizado entre cada medição de amostra. Após limpeza do cadinho, 200 μΙ_ de amostra foram transferidos para o cadinho e a absorbância medida.

ENSAIOS DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA (ENSAIO DE FLUORESCÊNCIA) APARELHOS

Spectra MAX GeminiXS, Molecular Devices

Placa de poliestireno negra não-aderente de 96 poços, Corning

Centrífuga Sepatech, Heraeus

Misturador, Janke & Kunkel

MATERIAIS E REAGENTES

Der ρ 1 purificado

Papaína purificada (Car ρ 1), Sigma

Boc-QAR-AMC a 10 mM, Bachem

Z-FR-AMC a 10 mM, Bachem

E-64 0,70 a mM em DMF, Merck

DTT a 1 M, Sigma

EDTA a 100 mM, Bie & Berntsen

Tampão Tris a 50 mM, pH 7,0, Sigma Tampão Bis-Tris a 50 mM, pH 6,5, Sigma

Tampão de fosfato a 50 mM, Merck

6,686 mg/mL de hidróxido de alumínio, Brenntag Biosector

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Soluções de estoque de DTT IaMe EDTA 100 a mM foram produzidas no começo do período experimental, congeladas a -20°C e usa- das por todo o período do projeto. A cada dia um novo tampão foi produzido contendo o agente redutor DTT e EDTA das soluções de estoque. Para uma descrição de condições de ensaio, vide tabela 4. DTT é continuamente oxi- dado pelo oxigênio no ar e, portanto, um novo tampão tem de ser produzido a cada dia. Para se beneficiar de medições de altas vazões, uma placa de microtitulação de 96 poços foi utilizada e cada poço tinha um volume de en- saio de 200 pL. A placa de microtitulação era opaca para evitar contamina- ção cruzada de fluorescência emitida entre poços. O substrato foi diluído até a concentração final no tampão produzido de novo contendo DTT e EDTA e transferido para a placa de microtitulação. A enzima foi diluída no mesmo tampão e incubada por 10 min no caso de papaína e 20 min no caso de Der ρ 1, para sua ativação. Mistura, transferência e incubação foram realizada a temperatura ambiente. Após incubação, a solução de enzima foi transferida para a placa de microtitulação e as medições foram iniciadas. As medições foram realizadas por 10 min com um total de 36 medições para cada poço e mistura automática entre cada medição.

TABELA 4. CONDIÇÕES PARA ENSAIO ENZIMÁTICO

<table>table see original document page 36</column></row><table> O volume de ensaio não foi dividido igualmente para cada expe- rimento. Assim, os volumes específicos para enzima, substrato, tampão e inibidor foram diferentes de experimento para experimento, dependendo da finalidade do experimento (Tabela 5).

TABELA 5. VOLUMES DE ENSAIO ENZIMÁTICO

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Após medição da atividade enzimática, a inclinação máxima da curva de progresso foi estimada usando o software SoftMax® PRO Life Sci- ences Edition, Molecular Devices, 2001. Após estimar a velocidade inicial dos experimentos, eles foram transferidos para Prism e analizados.

ENSAIO DE LIGAÇÃO DEIGE

Ensaio de inibição de IgE para alérgeno em solução e para alér- geno adsorvido e depois eluído de um adjuvante de gel de hidróxido de alu- mínio.

Esse ensaio avalia a capacidade que um aiérgeno tem de ligar- se a IgE de soros de pacientes alérgicos nessa fonte de alérgenos. Nesse contexto, esse ensaio foi usado para avaliar a influência da ligação de um alérgeno a hidróxido de alumínio sob sua capacidade de ligar-se a IgE e, portanto, sob sua atividade alergênica.

MÉTODO

Experimentos de inibição de IgE foram realizados em um ins- trumento centauro ADVIA. Diluições em série (realizadas com TECAN (P-05- 07F294)) do inibidor (antígeno em solução ou vacina com adjuvante em gel de antígenos) foram misturadas com uma quantidade fixa de antígeno bioti- nado e adicionalmente incubadas com IgE absorvido em uma fase sólida. A quantidade de alérgeno biotinado ligado à fase sólida foi estimada como a luz emitida após incubação com estreptavidina marcada com éster acridíni- co. Os dados brutos foram processados em Excel e transferidos para Gra- phPad Prism v. 4.0 para análise final (ajuste de curva, traçado de gráfico e comparações estatísticas). Os dados foram ajustados sob uma função logís- tica de quatro parâmetros:

<formula>formula see original document page 38</formula>

e curvas ajustadas foram consideradas paralelas se a Inclinação de Hill (HS) dos ajustes individuais não diferiam significativamente.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Devido à natureza do hidróxido de alumínio, não é possível avaliar ligação de IgE na presença de hidróxido de alumínio. Portanto, o efeito de adsorção de Der ρ 1 em hidróxido de alumínio sobre Der ρ 1 foi avaliado após eluição do Der ρ 1. Uma amostra de 500 uL de 165 ug/mL de Der ρ 1 foi incubada com 100 pL de 6,868 mg/mL de hidróxido de alumínio por 1 ho- ra a 4°C. Após a adsorção, a solução foi centrifugada por 5 minutos a 13.000 rpm. O pélete foi ressuspenso em 300 uL de tampão de fosfato 50 a mM e incubado por 2 horas a fim de eluir de hidróxido de alumínio o Der ρ 1 adsor- vido. Um controle de 300 uL de 165 ug/mL de Der ρ 1 sem hidróxido de alu- mínio foi tratado da mesma maneira. Uma amostra de extraio de Der ρ foi preparada para incubação com IgE sérico pooled.

EXEMPLO 1

OTIMIZAÇÃO DO SUBSTRATO E ENZIMA

1.1 FLUORESCÊNCIA DO SUBSTRATO

Embora a fluorescência de AMC extinga-se enquanto ligado ao peptídeo, alguma fluorescência pode ainda ser medida. A influência de fluo- rescência do substrato no ensaio foi avaliada mediante realização de medi- ções de fluorescência do substrato sob diferentes concentrações. Concen- trações de 0 uM a 200 uM do substrato foram usadas e fluorescência de ponto final foi medida (figura 2a).

A regressão linear que descreve a relação entre concentração e fluorescência do substrato apresenta a inclinação de: <formula>formula see original document page 39</formula>

Isso indica que a fluorescência decresce 39,07 RFU toda vez que 1 μΜ de substrato é clivado. Uma vez que 1 μΜ de substrato produz 1 μΜ de AMC, o aumento de fluorescência de AMC produzido é de 4106 RFU, o que significa que o aumento líquido de fluorescência, quando o substrato é hidrolisado produzindo AMC, é:

<formula>formula see original document page 39</formula>

Todas as medições de fluorescência foram convertidas em uma concentração de AMC produzido, após a curva-padrão apresentada na figu- ra 2b.

1.2 CONCENTRAÇÕES DE ENZIMA E SUBSTRATO

Estudos preliminares de enzima otimizada e concentração de substrato para o ensaio de atividade enzimática foram realizados. Todos os experimentos foram realizados com DTT 1 a mM e EDTA 5 a mM em con- centrações de ensaio. Da literatura, papaína deverá estar presente em faixa de nM e o substrato em faixa de μΜ, dependendo do substrato (Schulz e outros; A Sensitive Fluorescent Assay for Measuring the Cysteine Protease Activity of Der ρ 1, a Major Allergen from the House Dust Mite Dermatopha- goides pteronyssinus, Journal of Clinicai Pathology: Molecular Pathology, Vol. 51, pp. 222-224, 1998; John e outros, Functional Effects of the Inhibition of the Cysteine Protease Activity of the Major House Dust Mite Allergen Der ρ 1 by a Novel Peptide-based, Clinicai and Experimental AIIergy, Vol. 30, pp. 784-793, 2000; Szabelski e outros, Influence of Me2SO and Ineubation Time on Papain Activity Studied Using Fluorogenie Substrates, Acta Bioehemica Polonica, Vol. 48:4, pp. 995-1002, 2001). Para otimizar as condições exatas, foi utilizado um projeto experimental 3x3 (figura 3).

Para a concentração de enzima a 1 nM, o sinal medido em RFUs foi aproximadamente igual ao LOQ do ensaio (LOQ = 2,44 RFU s). Isso torna as medições com enzima 1 a nM muito não confiável. Para a so- lução de papaína 2,5 nM, as medições foram pelo menos 2,3 vezes o LOQ, e para a solução de papaína a 10 nM, foram 10,6 vezes. Esses resultados sustentam uma correlação linear entre as medições de atividade e a concen- tração de papaína (vide figura 3(b)). A curva de progresso da solução de papaína a 10 nM com substrato a 200 μΜ (que forneceu a mais alta ativida- de) mostrou que o RFU não excedeu 15.000 até 4 min. Essa foi uma faixa razoável para o RFU, uma vez a velocidade inicial é medida nos primeiros dois minutos e a correlação entre RFU e concentração de AMC é ainda line- ar. Ao mesmo tempo, a correlação entre a concentração de substrato e a atividade enzimática medida foi não linear, indicando que as concentrações de substrato usadas neste experimento foram maiores que Km- A partir des- ses resultados, foram escolhidas concentrações de substrato abaixo de 200 μΜ e concentrações de papaína a 10 nM, uma vez que a atividade medida foi pelo menos uma ordem de magnitude maior que o LOQ.

EXEMPLO 2

EXPERIMENTOS PRELIMINARES SOBRE APSORCÃO DE HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO

2.1 QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNA NA PRESENÇA DE HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO

Para estabelecer se foi possível determinar a concentração de proteína por espectroscopia de absorção em uma amostra contendo hidróxi- do de alumínio, foram realizadas medições de absorção de papaína na pre- sença e ausência de hidróxido de alumínio.

A absorbância das amostras contendo hidróxido de alumínio apresentou um alto nível de espalhamento de luz, que era esperado dada a turbidez da solução (figura 4). Uma vez que diluição da amostra resulta em concentrações de proteína menores que o limite de quantificação, esse mé- todo não é válido para estimativa de proteína sob as condições dadas. Por- tanto, concentração de proteína em uma amostra contendo hidróxido de a- lumínio foi determinada indiretamente, subtraindo a quantidade de proteína não ligada a hidróxido de alumínio (na fase líquida) da quantidade de proteí- na na preparação de controle (na ausência de hidróxido de alumínio). 2.2 SEDIMENTAÇÃO DE HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO

Para investigar se o hidróxido de alumínio sedimenta durante o intervalo de tempo do ensaio enzimático, sedimentação foi medida como A400 em função do tempo. O perfil de sedimentação gravitacional mostrou um limite de sedimentação em 40 min. (figura 5). Uma vez que o ensaio en- zimático completa-se em 10 min, sedimentação não ocorre no ensaio.

EXEMPLO 3

COMPONENTES DO ENSAIO

A fim de verificar se componentes do ensaio adsorvem em hi- dróxido de alumínio, afetando desse modo o resultado do ensaio enzimático, os experimentos de ligação seguintes foram realizados (Tabela 6)._

<table>table see original document page 41</column></row><table>

Tabela 6. Visão geral de métodos utilizados para avaliar a influ- ência de hidróxido de alumínio sobre os componentes do ensaio. *E-64 não mostrou qualquer absorção distinta de luz entre 200 nm e 900 nm.

Todos os ensaios enzimáticos que descrevem possíveis intera- ções com hidróxido de alumínio foram realizados com papaína, sob uma concentração final a 5 nM. EDTA foi adicionado sob 1 mM e DTT sob con- centrações finais a 5 mM. A concentração de hidróxido de alumínio foi de 1,14 mg/mL. Uma vez que a medição de absorção de 1,14 mg/mL de hidró- xido de alumínio apresenta um alto nível de espalhamento de luz, medições de pontos finais são realizadas apenas em amostras sem hidróxido de alu- mínio. Para todos os experimentos relativos a influência de hidróxido de a- lumínio sobre componentes do ensaio, adsorção de hidróxido de alumínio foi realizada por 15 min, 30 min e 60 min. 3.1 AMC

Avaliou-se se AMC, o produto do ensaio, adsorve em hidróxido de alumínio em função do tempo. Medições de AMC em triplicata sob A350 foram realizadas em um controle sem hidróxido de alumínio e em uma a- mostra de sobrenadante, ou fase líquida (figura 6), em função do tempo. O sobrenadante é obtido de um experimento de adsorção se 2 μΜ de AMC em 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio foram misturados, e, em seguida, a fração de fase sólida foi separada da fase líquida por centrifugação por 5 minutos a 13.000 rpm. Uma ANOVA de duas vias dos resultados mostrou que os dois fatores, absorbância e tempo (valor de ρ = 0,40 e valor de ρ = 0,066, respectivamente), não apresentaram efeito significativo sobre os re- sultados. O termo de interação entre fatores (valor de ρ = 0,70) não mostrou efeito significativo. Assim, AMC não adsorveu significativamente em hidróxi- do de alumínio sob as condições dadas por um período de tempo até uma hora.

Para verificar se a presença de hidróxido de alumínio extinguiu a fluorescência de AMC, foi conduzido um experimento em que a fluorescên- cia de AMC a 1 μΜ foi medida com e sem hidróxido de alumínio, em função do tempo. Isso indicou que nenhuma extinção ocorreu durante o tempo do ensaio (figura 7). Essa concentração de AMC é equivalente à concentração de AMC no ensaio enzimático gerada por papaína e Der ρ 1.

3.2 SUBSTRATOS

Examinou-se se os substratos usados, Z-FR-AMC e Boc-QAR- AMC, adsorveram-se em hidróxido de alumínio. Com essa finalidade, os substratos foram misturados com 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio. A fase líquida (sobrenadante) foi separada da fase sólida por centrifugação. A concentração de substrato no sobrenadante foi comparada com a concen- tração de substrato em uma preparação sem hidróxido de alumínio (controle) em função do tempo, de duas maneiras:

a) Comparando a absorção sob 325 nm (para ambos os substratos, a absorção máxima ocorreu em 325 nm (figura 8)) em ambas as preparações. Determinações foram realizadas em triplicata, utilizando uma concentração de substrato a 40 μΜ (figuras 9a e 10a).

b) Medindo a atividade enzimática de papaína quando misturada com o controle na ausência de hidróxido de alumínio, do substrato na presença de hidróxido de alumínio (mistura) e no sobrenadante da mistu- ra. Determinações foram realizadas em triplicata, utilizando uma concentra- ção de substrato a 30 μΜ (figuras 9b e 10b).

Uma ANOVA de duas vias dos resultados de absorbância de Z- FR-AMC indicou que o fator de absorbância (vaior de ρ = 0,88) não apresen- tou efeito significativo (figura 9a). O fator de tempo (valor de ρ < 0,0001), por outro lado, apresentou um efeito significativo sobre o resultado. Inspeção do diagrama de barras, entretanto, mostra maior variação no ponto de tempo de 60 min. Quando analisado somente para pontos de tempo de 15 min e 30 min, o fator de tempo, na verdade, torna-se não-significativo (valor de ρ = 0,95). Essa é uma análise razoável e confirma a validade da configuração do ensaio.

Para o ensaio de atividade, foi realizada a análise estatística do fator de hidróxido de alumínio como uma ANOVA de uma via (figura 9b). A razão para excluir o fator de tempo é que preparações de enzima indepen- dentes foram usadas para cada ponto de tempo, confundindo, desse modo, tempo e concentração enzimática. A ANOVA de uma via mostrou que não houve diferença significativa entre as médias de todos os resultados de ati- vidade (p = 0,11). Isso sustenta adicionalmente que as medições de absor- bância indicam não adsorção de Z-FR-AMC em hidróxido de alumínio.

Uma ANOVA de duas vias dos resultados de absorbância de Boc-QAR-AMC indicou que nem o fator de absorbância (valor de ρ = 0,72), nem o fator de tempo (valor de ρ = 0,24) ou o fator de interação apresenta- ram qualquer efeito significativo sobre o resultado (figura 10a).

Para o ensaio de atividade, a investigação estatística foi realiza- da da mesma maneira que para Z-FR-AMC por uma ANOVA de uma via, com relação à resposta de atividade apenas (figura 10b). A ANOVA de uma via mostrou que mostrou que não houve diferença significativa entre as mé- dias de todos os resultados de atividade (p = 0,98). Isso sustenta que as medições de absorbância indicam não adsorção de Boc-QAR-AMC em hi- dróxido de alumínio.

3.3 E-64

Para verificar se o inibidor de protease de cisteína E-64 adsor- veu em hidróxido de alumínio, ensaios enzimáticos foram realizados sobre um controle de E-64 a 12,5 nM sem hidróxido de alumínio, uma mistura de E-64 e hidróxido de alumínio, e um sobrenadante da mistura, após ter sido separado da fase sólida por centrifugação. Essa concentração de E-64 não inibiu completamente a atividade enzimática. É possível, portanto, avaliar a ligação de E-64 com hidróxido de alumínio por atividade enzimática.

Foi realizada uma ANOVA de uma via que não indicou nenhuma diferença significativa entre as médias (valor de ρ = 0,79), portanto nenhuma adsorção ocorreu (figura 11). Pontos de tempo confundem-se com concen- tração de enzima devido à preparação de enzima separada.

3.4 SUMÁRIO DA INFLUÊNCIA DE HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO SOBRE COMPONENTES DO ENSAIO ENZIMÁTICO

Em conclusão aos experimentos relativos à influência de hidró- xido de alumínio sobre componentes do ensaio enzimático, verificou-se que hidróxido de alumínio não influencia quaisquer dos componentes do ensaio, AMC, Z-FR-AMC, Boc-QAR-AMC e E-64, seja em medições de pontos fi- nais, seja em medições de atividade enzimática.

EXEMPLO 4

4.1 ADSORCÂO DE PAPAÍNA EM HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO

Após validação do ensaio enzimático com e sem a presença de hidróxido de alumínio, um projeto experimental foi produzido para investigar os parâmetros cinéticos de papaína e uma possível influência de hidróxido de alumínio sobre eles. Uma vez que se esperava que papaína adsorvesse somente em pequeno grau em de hidróxido de alumínio (pl em torno do PZC de hidróxido de alumínio), ela foi escolhida como controle negativo. Isso re- fletirá o possível efeito da presença de hidróxido de alumínio no meio de en- saio sobre os resultados cinéticos, quando a maior proporção das moléculas de enzima não está ligada ao adjuvante. Uma visão geral da preparação de amostra é dada na figura 12.

Uma solução de 3 mL com 100 pg/mL de papaína e 1,14 mg/mL de hidróxido de alumínio foi preparada. Essa solução foi colocada por 1 h a 4°C para permitir adsorção de papaína em hidróxido de alumínio. Após ad- sorção, 500 pL foram tomados para análise adicional e o resto da mistura foi centrifugado por 10 min a 4.000 rpm. O restante das amostras analisadas seguiu o esquema de fluxo na figura 12. Adicionalmente, foi preparado um controle (Con) contendo papaína em tampão Bis-Tris na ausência de hidró- xido de alumínio. O controle foi o mesmo da mistura de hidróxido de alumí- nio incubada por 1 h a 4°C e analisado depois.

Amostras foram analisadas com os seguintes métodos:

- Determinação de concentração de proteína (enzima) (A280nm e titulação de sítios ativos)

- Medições de atividade enzimática

4.2 DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PAPAÍNA

A concentração de proteína das diferentes amostras foi avaliada de duas maneiras: 4.2.1 A9ftn

Essas medições foram convertidas em concentração de proteí- na pela lei de Lambert-Beer usando um coeficiente de absorção molar para papaína de 2,46 mg/mL. Uma vez que não é tecnicamente possível determi- nar concentração de proteína a partir de A2eo na presença de hidróxido de alumínio, a concentração de papaína em Mixl e Mix2 foi estimada indireta- mente. A concentração de proteína em Mixl foi a mesma que em Con e a concentração de proteína em Mix2 foi a diferença entre Con e Supl. Uma ANOVA dos resultados não mostrou diferença entre Con e Supl (valor de ρ = 0,615), indicando que papaína não adsorve significativamente em hidróxi- do de alumínio. As concentrações estimadas de papaína no controle e a quantidade adsorvida em hidróxido de alumínio são mostradas na Tabela 7.

As medições de proteína não respondem por todos os 100 pg/mL que foram a concentração estimada no Con. A perda de proteína po- deria ser devido à estimativa errônea da concentração original de papaína na solução de estoque. Essa concentração foi medida pelo fabricante e, as- sim, não no mesmo instrumento do resto das amostras. <table>table see original document page 46</column></row><table>

Tabela 7. Determinação dos parâmetros cinéticos Vmáx., Km e kcat. (Vmáx/Concentração de proteína), bem como concentração de proteína para papaína. aConcentração de proteína determinada por Α280. b Concentração de proteína determinada por titulação de sítios ativos. * Concentrações de proteína obtidas são determinadas indiretamente (vide texto). Controle re- presenta uma preparação de papaína na ausência de hidróxido de alumínio. Adsorvido refere-se a uma preparação de papaína adsorvida em hidróxido de alumínio (mistura 2).

4.2.2 TITULAÇÃO DE SÍTIOS ATIVOS

A titulação de sítios ativos foi usada para estimar a quantidade de enzima ativa nas diferentes amostras. Essa quantidade está em contraste com a concentração de proteína estimada a partir de Α280, a qual representa o teor de proteína total da amostra. As condições de ensaio usadas são indi- cadas na Tabela 8 abaixo.

Esses resultados mostram que aproximadamente 7% (Mix3) da papaína ativa foram adsorvidos em hidróxido de alumínio, enquanto 91% (Sup1 + Sup2) estavam em solução. Isso está em acordo com os resultados obtidos na avaliação de atividade de enzima nas amostras; vide seção 4.3.1.

4.3 ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Dois tipos de ensaios enzimáticos foram realizados: (i) medições de atividade usando uma concentração fixa de substrato para avaliar ativi- dade enzimática e (ii) cinética de Michaelis-Menten para estimar os parâme- tros cinéticos Vmáx. e KM.

Todos os ensaios de atividade foram conduzidos com tampão Bis-Tris, pH 6,5, DTT a 5 mM, EDTA 1 a mM e Z-FR-AMC como substrato. Uma visão geral dos diferentes ensaios enzimáticos realizados é dada na Tabela 8.

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 8. Especificações de ensaios de enzima para experimento de adsor- ção de papaína. Medições de atividade são combinações simples de enzima e substrato a fim de avaliar o nível de atividade em amostras. Medições da cinética de Michaelis-Menten de atividade enzimática com diferentes con- centrações de substrato são usadas para estimar VmáX. e KM. Todas as medi- ções foram efetuadas em triplicata.

* Incubação tanto com DTT quanto com E-64.

4.3.1 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

As medições de atividade foram usadas para analisar quantitati- vamente a quantidade de papaína adsorvida em hidróxido de alumínio e a quantidade distribuída livremente na solução. 96% de atividade em Mixl fo- ram verificados em solução (Sup1 + Sup2), enquanto 8% da atividade de papaína foram adsorvidos em hidróxido de alumínio (Mix3). A atividade do controle é 17% menor que a atividade de Mixl. Isso poderia ser devido a uma perda de atividade da proteína no controle durante o intervalo de tempo do experimento. Essa perda foi evitada pela presença de hidróxido de alu- mínio.

A fim de avaliar adicionalmente essa observação, novos expe- rimentos foram conduzidos nos quais a atividade de papaína foi acompa- nhada em função do tempo na ausência de hidróxido de alumínio. Papaína foi misturada com tampão Bis-Tris a 50 mM até uma concentração final de 10 pg/mL em um volume total de 500 pL. A mistura foi incubada a 4°C e a- mostras foram tomadas a 0,30 e 60 min. As amostras foram diluídas e incu- 1 badas por 10 min em tampão contendo DTT e subseqüentemente atividade foi medida após adição de substrato. Os resultados analisados com ANOVA de uma via mostraram que houve uma significativa diferença entre os 3 pon- tos de tempo (valor de ρ = 0,015) e por meio de teste de comparação de Newman-Keuls, verificou-se que 60 min diferem dos outros dois pontos de tempo e foram menores que 7%. Esses resultados sugerem que durante os 60 min de incubação entre papaína e hidróxido de alumínio papaína na a- mostra de controle perdeu 7% de sua atividade. Perda adicional ocorre até o início do ensaio enzimático.

4.3.2 PARÂMETROS CINÉTICOS DE MICHAELIS-MENTEN

Os parâmetros de Michaelis-Menten Km e Vmáx. foram avaliados nas diferentes amostras.

Os valores estimados de Km e Vmáx. das diferentes amostras são mostrados na Tabela 7 acima. Teste de Bartlett não indicou diferença signifi- cativa entre variâncias de Km (valor de ρ = 0,758) nas amostras e uma A- NOVA de uma via foi usada para comparar médias. O teste com ANOVA de uma via não mostrou diferença significativa entre estimativas de Km (valor de ρ = 0,999), indicando que a afinidade com o substrato não se altera quando papaína está na presença e ausência de hidróxido de alumínio.

Vmáx. em solução (Sup1 + Sup2) é 97% daquele em Mixl, en- quanto Vmáx. em Mix3 corresponde a um de 7%. Vmáx- é específico para uma enzima definida e é linearmente dependente da concentração de enzima no ensaio. A normalização de Vmáx, pela concentração de enzima fornece o parâmetro kcat., que é apenas de- pendente das características da atividade da enzima. A Tabela 7 acima mos- tra os valores estimados decat para as diferentes amostras, calculado a par- tir dos valores de concentração de enzima obtidos de titulação de sítios ati- vos e A280.

Os valores de kcat obtidos de determinação de concentração de proteína sob A280 foram aproximadamente metade daqueles obtidos com titulação de sítios ativos no controle, indicando que metade da proteína nas amostras era inativa. Os valores de kcat. de Con, Mixl, Sup1, Mix2 e Mix3 são comparáveis quando a concentração de enzima foi calculada por titula- ção de sítios ativos, sugerindo que a presença de hidróxido de alumínio não afeta as propriedades cinéticas da papaína. Os valores de Kcat de Con, Mixl, Supl e Sup2 são também comparáveis quando a concentração de enzima é calculada a partir de Α280. No entanto, a determinação indireta de concentra- ção de proteína em Mix2 produz o valor de kcat. mais impreciso.

O fato de que os parâmetros cinéticos avaliados na presença e ausência de hidróxido de alumínio não são significativamente diferentes indi- ca que a presença de hidróxido de alumínio não afetou a reação enzimática. Em conclusão, esses resultados mostram que é possível medir as proprie- dades enzimáticas de uma enzima na presença de hidróxido de alumínio, quando a maior parte da enzima (93%) não se ligou ao adjuvante.

EXEMPLO 5

5.1 ADSORÇÃO DE DER P 1 EM HIDRÓXIDO DE ALUMÍNIO

De acordo com a teoria de adsorção de proteínas em hidróxido de alumínio, esperava-se que Der ρ 1 fosse adsorvido (pl abaixo do PZC do hidróxido de alumínio). O efeito dessa adsorção na atividade e estrutura de Der ρ 1 foi examinado.

Uma visão geral da preparação de amostra é fornecida na figura 13. Uma solução de 3 mL com 100 ug/mL de Der ρ 1 e 1,14 mg/mL de hi- dróxido de alumínio foi preparada. Essa solução foi colocada por 1 h a 4°C para permitir adsorção de Der ρ 1 em hidróxido de alumínio. Após adsorção, 500 μL foram tomados para análise adicional e o resto da mistura foi centri- fugado por 10 min a 4.000 rpm. Uma etapa de eluição foi realizada por 1 h a 4°C, na qual o pélete de Mix2 foi ressuspenso em tampão de fosfato. Adicio- nalmente, dois controles (Con1 e Con2) contendo Der ρ 1 em tampão de Tris na ausência de hidróxido de alumínio foram preparados. Conl foi analisado no começo do experimento e Con2 no fim das 2 horas de experimento.

As amostras foram analisadas com os seguintes métodos:

- Determinação de concentração de proteína (A280nm e RIE)

- Medições de atividade enzimática

- Ligação de IgE

5.2 DETERMINAÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE DER P 1

A determinação de concentração de Der ρ 1 nas diferentes a- mostras foi avaliada por A2eoe RIE.

5.2.1 Apfln

A fim de quantificar teor protéico, absorbância a 280 nm foi me- dida em amostras sem hidróxido de alumínio (Con1, Con2, Sup e Elu). As medições de absorbância foram convertidas em concentração de proteína pela lei de Lambert-Beer usando um coeficiente de absorção molar para Der

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Tabela 8a. Determinação dos parâmetros cinéticos VmáX., Km e kcat. (Vmáx./Concentração de proteína), bem como concentração de proteína para Der ρ 1. a Concentração de proteína determinada por Α2βο· 0Concentra- ção de proteína determinada por RIE. * Concentrações de proteína obtidas são determinadas indiretamente (vide texto). Controle representa uma pre- paração de Der ρ 1 na ausência de hidróxido de alumínio. Adsorvido refere- se a uma preparação de Der ρ 1 adsorvida em hidróxido de alumínio (mistu- ra 2).

Concentração de proteína em Mixl e Mix2 foi estimada indire- tamente. A concentração de proteína em Mixl foi considerada a mesma que em Con 1 e a concentração de proteína em Mix2 foi a diferença entre Con 1 e Sup. Um teste t não mostrou diferença significativa entre as concentrações de proteína em Conl e Con2 (valor de ρ = 0,092). 32% do teor de proteína em Conl foram verificados em Sup1 indicando um grau de adsorção de a- proximadamente de 70%. Da proteína adsorvida, 56% foram eluídos de hi- dróxido de alumínio usando tampão de fosfato.

5.2.2 RIE

Outro método aplicado para quantificar teor de proteína foi RIE. As amostras Conl, Con2, Sup e Elu foram avaliadas juntamente com três padrões de Der ρ 1 (125 ng, 250 ng e 500 ng). As concentrações de Der ρ 1 estimadas no controle, a quantidade adsorvida em hidróxido de alumínio, bem como a quantidade eluída, são mostradas na Tabela 8a.

Os valores estimados foram gerados a partir da curva-padrão de regressão linear dos três padrões (concentração como função de área de precipitado). 44% do teor de proteína em Conl foram verificados em Sup, indicando indiretamente um grau de adsorção de aproximadamente 56%. Da proteína adsorvida, 98% foram eluídos de hidróxido de alumínio usando tampão de fosfato. A concentração de Conl e Con2 foi externa à área de previsão da curva-padrão, e é, portanto, provavelmente aquela em que a concentração de Der ρ 1 é subestimada. Isso pode explicar o alto grau de eluição de Der ρ 1 a partir de hidróxido de alumínio, uma vez que a concen- tração de Der ρ 1 adsorvido é estimada como a diferença entre Conl e Sup.

5.3 ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Diferentes tipos de ensaios enzimáticos foram realizados: (i) medições de atividade usando uma concentração fixa de substrato para ava- liar atividade enzimática e (ii) cinética de Michaelis-Menten para estimar os parâmetros cinéticos Vmáx. e KM.

Todos os ensaios de atividade foram conduzidos com tampão Tris, pH 7,0, DTT 5 mM, EDTA 1 mM e Boc-QAR-AMC como substrato. Uma visão geral dos diferentes ensaios enzimáticos realizados é dada na Tabela 9.

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Tabela 9. Especificações de ensaios de enzima para experimen- to de adsorção de Der ρ 1. Medições de atividade são combinações simples de enzima e substrato a fim de avaliar o nível de atividade em amostras. Medições da cinética de Michaelis-Menten de atividade enzimática com dife- rentes concentrações de substrato são usadas para estimar VmáX. e KM. To- das as medições foram efetuadas em triplicata.

* Incubação tanto com DTT quanto com E-64.

5.3.1 AVALIAÇÃO DE ATIVIDADE ENZIMÁTICA

As medições de atividade de Der ρ 1 na ausência e presença de hidróxido de alumínio foram usadas para quantificar a quantidade de Der ρ 1 adsorvida em hidróxido de alumínio e a quantidade distribuída livremente na solução. Os resultados das medições de atividade são resumidas na figura 14.

A atividade de Der ρ 1 não-adsorvido em Sup a 33% da ativida- de em Mixl. 66% da atividade de Der ρ 1 foram adsorvidos em hidróxido de alumínio e 67% dessa atividade foram dessorvidos após eluição a partir de Mix2 com tampão de fosfato.

A fim de monitorar a estabilidade de Der ρ 1 durante o período de experimento, a atividade de Con 1 foi medida no início do experimento e a de Con2 no fim. Eficácia de uma ANOVA de uma via sobre Con1, Con2 e Mixl não mostrou diferença significativa entre as médias (valor de ρ = 0,76). Isso indica que nem tempo nem presença de hidróxido de alumínio influencia a atividade de Der ρ 1 sob essas condições.

5.3.2 PARÂMETROS CINÉTICOS DE MICHAELIS-MENTEN Os parâmetros de Michaelis-Menten Km e Vmax. foram avaliados nas diferentes amostras.

A figura 15 mostra uma curva típica de Michaelis-Menten para Der ρ 1 na presença de hidróxido de alumínio. Os valores de Km e Vmáx. são mostrados na Tabela 8a. Teste de Bartlett não indicou diferença significativa entre variâncias de Km (valor de ρ = 0,11) e uma ANOVA de uma via não mostrou diferença significativa entre as médias das amostras (valor de ρ = 0,62). Isso indica que a afinidade de Der ρ 1 com Boc-QAR-AMC não se al- tera na presença de hidróxido de alumínio.

Vmáx. de Con2 é 14% menor que Vmáx, em Conl (teste t, valor de ρ = 0,0024), indicando que Der ρ 1 havia perdido atividade durante o período de tempo do experimento. Teste de comparações múltiplas de New- man.Keuls não mostrou diferença significativa entre Vmáx. de Conl e Mixl (p > 0,05), sugerindo que hidróxido de alumínio não teve influência na atividade de Der ρ 1. Adicionalmente, parece que hidróxido de alumínio impediu a perda de atividade no tempo observado de Conl a Con2. Vmáx. em Sup e Mix2 é de 30% e 62% de Vmáx. em Mixl, respectivamente. 68% da atividade em Mix2 foram verificados em Elu.

Os valores de kcat. de Der ρ 1 foram estimados a partir dos valo- res obtidos de Vmàx. e as concentrações de proteína obtidas dos diferentes métodos (A28o e RIE) conforme mostrado na Tabela 8a; valores de kcat. das diferentes amostras são comparáveis quando a concentração de proteína foi estimada por A280 e RIE.

Em conclusão, os valores de Km e kcat. obtidos para Der ρ 1 não foram significativamente diferentes na ausência de hidróxido de alumínio e quando a maior parte das moléculas de Der ρ 1 (60-70%) é adsorvida no hidróxido de alumínio. Esses dados sustentam que é possível medir a ativi- dade enzimática de uma enzima adsorvida em hidróxido de alumínio fazen- do uma avaliação do impacto que a adsorção de uma enzima em hidróxido de alumínio tem sobre a atividade/estrutura da enzima possível. 5.4 LIGAÇÃO DE IGE

Avaliou-se a influência de hidróxido de alumínio na capacidade de Der ρ 1 na ausência de hidróxido de alumínio (ConI) e de Der ρ 1 ligado e eluído a partir de hidróxido de alumínio (EIu) ligar-se a IgE de soros de pa- cientes alérgicos a HDM.

A inibição do sinal de Der ρ 1 padrão, marcado com biotina, me- diante uso de concentrações crescentes de Der ρ 1 em Conl e Elu sob ava- liação seguiu uma curva descendente sigmoidal (figura 16).

Comparando a curva de Con 1 com Elu, é evidente que os níveis inferiores são idênticos, portanto inibição completa é possível em ambos os casos. Isso indica que todos os epitopos de IgE em Conl estavam ainda presentes em Elu. Um teste t de uma amostra comparando as inclinações de Hill de Con 1 e Elu mostrou que as médias não foram significativamente dife- rentes (p = 0,83), o que indica que a afinidade de IgE por epitopos sobre Der ρ 1 foi conservada após ligação com hidróxido de alumínio.

Claims

1. Método de medição da atividade imunológica de uma prepa- ração de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergêni- cas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, sendo o refe- rido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de atividade enzimática e usar a medição obtida como indicação da atividade imunológica da prepara- ção de vacina.

2. Método para quantificação da quantidade de enzima alergêni- ca em uma preparação de vacina na forma de uma mistura de uma ou mais enzimas alergênicas e um adjuvante de sal metálico que contém oxigênio, em que a mistura compreende uma fase líquida e uma fase sólida, e em que pelo menos uma parte da(s) enzima(s) alergênica(s) é adsorvida na fase sólida, sendo o referido método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de medir a atividade enzimática da mistura em um ensaio de ativi- dade enzimática e usar a medição obtida para quantificar a quantidade de enzima alergênica.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -2, caracterizado pelo fato de que um substrato específico para uma enzima alergênica é usado para medir a atividade enzimática da enzima alergênica.

4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que um inibidor é usado para inibir uma ou mais das enzimas alergê- nicas na preparação de vacina.

5. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 2 e 4, caracterizado pelo fato de que a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) na forma de um extrato.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas alergênicas é uma protease de cisteína.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -5, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma das enzimas alergênicas é uma protease de serina.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, caracterizado pelo fato de que a(s) enzima(s) alergênica(s) é (são) uma ou mais selecionadas do grupo que consiste em Der ρ 1, Der ρ 3, Der ρ 6 e Der ρ 9.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a enzima alergênica é Der ρ 1.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6 e 8-9, caracterizado pelo fato de que o substrato usado é Z-LeuLeuGIu- MCA.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -10, caracterizado pelo fato de que o sal metálico que contém oxigênio é hi- dróxido de alumínio.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -11, caracterizado pelo fato de que a preparação de vacina é submetida a uma medição da atividade enzimática de enzima alergênica na fase líquida (medição 2) e/ou a uma medição da atividade enzimática de enzima alergê- nica na fase sólida (medição 3).