ES2349672T3 - Procedimiento para medir la actividad enzimática de enzima alergénica adsorbida. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe en la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

Description

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para medir la actividad enzimática de una o más enzimas alergénicas en una preparación de vacuna y así obtener una indicación de la actividad inmunológica y/o una cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en la preparación de vacuna. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interacción de proteínas con superficies es un fenómeno ampliamente reconocido de importancia tanto fisiológica como tecnológica. Un ejemplo importante es la adsorción de alérgenos de proteína al adyuvante hidróxido de aluminio en vacunas para la alergia. Un adyuvante es un compuesto que actúa potenciando la respuesta inmunitaria tras la vacunación. El efecto del adyuvante de hidróxido de aluminio se ha investigado mucho y se han propuesto numerosas teorías en lo referente al mecanismo.

Las vacunas para la alergia para, por ejemplo, inyección subcutánea pueden prepararse mezclando una disolución acuosa de un alérgeno y un vehículo de fase sólida, por ejemplo, gel de hidróxido de aluminio, para producir una mezcla en la que al menos una parte del alérgeno se adsorbe en la fase sólida y parte de o nada del alérgeno está en la fase líquida. El vehículo de fase sólida pude servir de adyuvante, es decir, potencia la respuesta inmunitaria del alérgeno, aunque el mecanismo de la potenciación no siempre se entiende completamente. Igualmente, el mecanismo y la naturaleza de la adsorción del alérgeno en el vehículo de fase sólida no siempre se entienden completamente y puede depender plenamente del tipo de alérgeno implicado. Teóricamente, sin embargo, la adsorción en los geles de hidróxido de aluminio implica parcialmente fuerzas electrostáticas. Para las proteínas, se cree que los grupos fosfato de proteínas fosforiladas también interactúan con el gel de hidróxido de aluminio y posiblemente sustituye hasta cierto punto los grupos hidróxido en la estructura del gel.

La capacidad de adsorción de proteínas del hidróxido de aluminio se ha estudiado profundamente con las proteínas modelo ovoalbúmina (OA) y albúmina de suero bovino (BSA). Recientemente se han llevado a cabo estudios referentes al impacto estructural de la adsorción de proteína en hidróxido de aluminio. Las mediciones de fluorescencia de emisión junto con calorimetría diferencial de barrido indican que se producen alteraciones estructurales importantes tras la adsorción de OA y BSA en hidróxido de aluminio (Jones y col., Effects of Adsorption to Aluminium Salt Adjuvants on the Structure and Stability of Model Protein Antigens, The Journal of Biological Chemistry, vol. 280, pág. 13406-13414, 2005). Otro estudio indica por el contario que la presencia de hidróxido de aluminio en un experimento de ELISA ayudó a mantener la OA en la conformación nativa (Houen y col., A Non-denaturing Enzyme Linked Immunosorbent Assay With Protein Preadsorbed Onto Aluminium Hydroxide, Journal of Immunological Methods, vol. 200, pág.

99-105, 1997). La OA adsorbida en hidróxido de aluminio antes de la transferencia a la superficie de plástico del pocillo de una placa de microvaloración mantuvo su capacidad para unirse a anticuerpos monoclonales producidos contra la forma nativa de OA. Por el contrario, la OA no se preincubó con hidróxido de aluminio unido a anticuerpos monoclonales producidos contra albúmina desnaturalizada con calor. Sin embargo, estas técnicas no facilitan información sobre proteínas individuales presentes en una mezcla de proteínas.

El efecto del hidróxido de aluminio sobre la estructura y la estabilidad de alérgenos es importante desde varias perspectivas. Los epítopos conformacionales pueden perderse durante la adsorción y la inmunogenicidad puede alterarse como consecuencia del almacenamiento durante un periodo de tiempo más largo.

El grado de adsorción varía con la naturaleza del alérgeno específico en cuestión. En el caso de un alérgeno en forma de un extracto de un material biológico, por ejemplo, un extracto de alérgenos de polen de césped, el extracto contiene varios iones y moléculas diferentes que posiblemente interfieren con la unión de los alérgenos al vehículo de fase sólida.

El ácaro del polvo doméstico (HDM) Dermatophagoides pteronyssinus es una fuente importante de alérgenos inhalados. Los alérgenos de proteína Der p 1 y Der p 2 se consideran los dos alérgenos más potentes de los alérgenos Der p. Se ha caracterizado bien la estructura y la actividad enzimática de Der p 1. Varios estudios in vitro sugieren que la actividad de cisteínaproteasa de Der p 1 intensifica la potencia del alérgeno, por ejemplo, escindiendo proteínas de la zona de oclusión en las células epiteliales del pulmón y escindiendo CD23 (receptor de IgE de baja afinidad) en células B humanas (Jacquet y col., Biochemical and Immunological Characterization of a Recombinant Precursor form of the House Dust Mite Allergen Der p 1 produced by Drosophila cells, Clinical and Experimental Allergy, vol. 30, pág. 784-793, 2000). Las vacunas contra HDM basadas en el adyuvante de hidróxido de aluminio contienen extracto de HDM purificado como principio activo farmacéutico (PAF).

La actividad alergénica y la posibilidad de inducir reacciones alérgicas puede ensayarse, por ejemplo, por inyección intradérmica en animales sensibilizados y por medición del cambio de diversos síntomas (Kildsgaard y col., Assessment of the in vivo allergenic potency of new allergy vaccines by intradermal testing in sensitised mice, Clinical Immunology and Allergy en Medicine, Proceedings of the 21st EAACI Congress 2002, Nápoles, Italia). Sin embargo, tales procedimientos in vivo son laboriosos y requieren tiempo y necesitan el uso de animales de prueba, que no se desea.

Hasta ahora ha sido una práctica común evaluar la actividad inmunológica de una vacuna in vitro basándose en una medición de la actividad inmunológica de la disolución de alérgeno usada para la preparación de la vacuna de vehículo de fase sólida lista para uso.

El documento WO2005/022157 desvela un procedimiento in vitro para evaluar la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de un antígeno molecular y un vehículo, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la que al menos una parte del antígeno está unida, procedimiento que comprende las etapas de i) someter la vacuna a una medición de la actividad inmunológica seleccionada del grupo que está constituido por a) capacidad de unión a anticuerpo usando un inmunoensayo que emplea un anticuerpo específico de antígeno unido a una fase sólida de anticuerpo, b) capacidad para activar células efectoras y c) posibilidad de inducir anafilaxia; y ii) usar los resultados de medición para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna. El documento WO2005/022157 no desvela la medición de la actividad enzimática en un producto que contiene hidróxido de aluminio como adyuvante y no desvela el uso de la actividad enzimática medida para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna.

La naturaleza de la adsorción de alérgenos a adyuvantes de hidróxido de aluminio es muy compleja y ampliamente desconocida y también se espera que varíe entre diferentes alérgenos. El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento in vitro para evaluar y cuantificar la actividad inmunológica de preparaciones de vacunas para la alergia basadas en adyuvantes de hidróxido de aluminio tales como vacunas listas para uso. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según un aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe a la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas para medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

Según otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe a las fases sólidas, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida para cuantificar la cantidad de enzima alergénica. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Fig. 1 muestra un algoritmo diagnóstico de la purificación de Der p 1.

La Fig. 2a muestra la fluorescencia del sustrato sintético Z-FR-AMC y la relación entre la señal de fluorescencia y la concentración de sustrato.

La Fig. 2b muestra curvas patrón de AMC: a) curva patrón de AMC hasta 500 µM y b) intervalo lineal de a).

La Fig. 3 muestra un estudio de la concentración óptima de enzima y de sustrato en la que a) muestra la actividad en función de la concentración de sustrato y b) muestra la actividad en función de la concentración de enzima.

La Fig. 4 muestra A280 de 100 µg/ml de papaína ± 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio y 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio solo.

La Fig. 5 muestra la evolución temporal de la sedimentación de 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio.

La Fig. 6 muestra el efecto del hidróxido de aluminio sobre AMC. Se comparó A350 de una muestra de control con A350 de una muestra de sobrenadante.

La Fig. 7 muestra un estudio del tiempo de AMC en presencia y ausencia de hidróxido de aluminio.

La Fig. 8 muestra los espectros de absorbancia de los sustratos Boc-QAR-AMC y Z-FRAMC.

La Fig. 9 muestra la influencia del hidróxido de aluminio sobre el sustrato Z-FR-AMC medida como a) medición de punto final a A325 y b) medición de la actividad de papaína.

La Fig. 10 muestra la influencia del hidróxido de aluminio sobre el sustrato Boc-QAR-AMC medida como a) medición de punto final a A325 y b) medición de la actividad de papaína.

La Fig. 11 muestra la influencia del hidróxido de aluminio sobre la actividad de papaína con concentración constante del inhibidor E64 específico de la cisteína-proteasa.

La Fig. 12 muestra una visión general de muestras del experimento de adsorción con papaína e hidróxido de aluminio.

La Fig. 13 muestra una visión general de muestras del experimento de adsorción con Der p 1 e hidróxido de aluminio.

La Fig. 14 muestra la actividad de Der p 1 de diferentes muestras en presencia y ausencia de hidróxido de aluminio.

La Fig. 15 muestra una curva de Michaelis-Menten para Der p 1 en presencia de hidróxido

de aluminio.

La Fig. 16 muestra la inhibición de la unión a IgE. Línea discontinua: Der p 1 eluida de hidróxido de aluminio (Elu), línea continua: control Der p 1 en ausencia de hidróxido de aluminio (Con 1). DEFINICIONES

La expresión “procedimiento in vitro” como se usa en este documento significa un procedimiento que puede llevarse a cabo fuera de un organismo vivo.

La expresión “actividad inmunológica” como se usa en este documento significa cualquier respuesta específica de alérgeno del sistema inmunitario que incluye respuestas inmunitarias mediadas por inmunoglobulina.

Las expresiones “fase sólida” y “fase líquida” de una preparación de vacuna como se usa en este documento significa las fases resultantes de un procedimiento de separación de una suspensión de hidróxido de aluminio en un disolvente líquido, por ejemplo, agua en una fase sólida y una fase líquida, siendo el procedimiento de separación, por ejemplo, centrifugación, extracción o sedimentación simple.

La expresión “adsorbido” como se usa en este documento significa cualquier unión no covalente, acoplamiento, adherencia o unión que incluye adsorción por fuerzas electrostáticas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para medir la actividad enzimática de una enzima alergénica y así obtener una indicación de la actividad inmunológica y/o una cuantificación de la cantidad de una enzima alergénica en una preparación de vacuna.

En un aspecto de la invención, el término “al menos una parte de” se refiere a que al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70 %, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85% o al menos el 90% de las enzimas alergénicas se adsorben a la fase sólida.

En un aspecto de la invención, la actividad inmunológica es la capacidad de la preparación de vacuna para provocar una respuesta inmunitaria mediada por una inmunoglobulina específica de alérgeno que incluye cualquier clase, subclase o combinación de las mismas que incluye IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, en particular IgG y/o IgE.

Aunque el hidróxido de aluminio es el adyuvante más comúnmente usado en vacunas, lo que le ocurre a los alérgenos cuando se adsorben a la superficie del mismo nunca se ha caracterizado completamente. Un entendimiento de cómo la adsorción a hidróxido de aluminio afecta la estructura y la actividad de alérgenos es esencial para su uso en vacunas, además de para el entendimiento del mecanismo de estimulación inmunitaria con adyuvante.

La actividad enzimática está en general directamente relacionada con la estructura de la enzima. Si se altera la estructura, por ejemplo, por exposición a calor o a condiciones ácidas, probablemente se afectará la actividad. Una población de proteínas homogéneas puede describirse por el siguiente equilibrio de dos estados simplificado:

imagen1

en la que N es la proteína en la forma nativa, D es la forma desnaturalizada, ku y kf son las constantes de velocidad de la cinética de desplegamiento y replegamiento, respectivamente. Entre la forma nativa y la desnaturalizada pueden producirse varios estados de transición intermedios. A partir de este simple modelo, la definición de desnaturalización puede establecerse como: cualquier cambio temporal o permanente en la estructura tridimensional de una proteína. Por tanto, cuando se cambian las propiedades fisicoquímicas del entorno circundante, un cambio del paisaje de energía libre que representa el espacio de configuración disponible para la proteína podría producirse en función de cómo de persistente es el cambio.

La atracción electrostática a cualquier superficie de una fase sólida puede conducir a una adsorción de la proteína. La adsorción de una proteína a una superficie puede inducir cambios conformacionales en la proteína, desplazando así el mínimo de energía global de la proteína. En el caso de una enzima, esto puede dar como resultado un cambio de su actividad enzimática. Por tanto, un cambio en la actividad enzimática podría ser una medida sensible de cambios estructurales resultantes de la adsorción a una fase sólida.

El sistema de proteína-hidróxido de aluminio se ha investigado exhaustivamente debido al efecto adyuvante del hidróxido de aluminio. La bibliografía muestra que las proteínas pl ácidas se unen a hidróxido de aluminio, pero el efecto de la unión sobre la actividad enzimática nunca ha sido investigado, en la medida en que son conscientes los presentes inventores.

La presente invención se basa en el hallazgo de que es posible realizar mediciones de la actividad enzimática en una preparación de vacuna que comprende enzima(s) alergénica(s) e hidróxido de aluminio.

La presente invención se basa adicionalmente en el reconocimiento de que dicha medición de la actividad enzimática de la preparación de vacuna puede usarse como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna, ya que un cambio en la actividad enzimática puede ligarse a un cambio en la conformación de la molécula enzimática como está presente en la preparación de vacuna, que de nuevo está ligado a la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

La capacidad para realizar esta medición hace posible evaluar el impacto de la adsorción del alérgeno a hidróxido de aluminio midiendo la actividad enzimática antes y después de la adsorción al vehículo de fase sólida y así obtener una medición de la actividad inmunológica después de la adsorción ya que como se explica anteriormente se espera que un cambio en la actividad enzimática tenga un impacto en la actividad inmunológica.

El procedimiento según la invención también puede usarse para cuantificar la cantidad de enzima(s) alergénica(s) en una preparación de vacuna.

En un aspecto de la invención, la cuantificación de la enzima alergénica se realiza comparando la actividad enzimática medida con un patrón bien caracterizado. En otro aspecto de la invención, la cuantificación del alérgeno enzimático se realiza por valoración de sitios activos. La valoración de sitios activos requiere el uso de un inhibidor de esa actividad enzimática particular que se une a la enzima irreversiblemente o al menos con una afinidad muy alta. Preparación de vacuna

La preparación de vacuna sometida al procedimiento de la presente invención puede ser cualquier preparación lista para uso en forma de una mezcla que comprende una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en la que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la que se adsorbe al menos una parte de la enzima alergénica, o cualquier preparación de vacuna tal para preparar una formulación lista para uso. La preparación de vacuna puede comprender adicionalmente uno o más alérgenos que no tienen una actividad enzimática.

La preparación lista para uso puede ser para administración parenteral o para administración mucosa.

La administración parenteral incluye administración intravenosa, intramuscular, intraarticular, subcutánea, intradérmica, epicutánea/transdérmica e intraperitoneal. Las vacunas para administración mediante una inyección pueden formularse de forma que sean adecuadas para inyección mediante aguja o para inyección sin aguja.

La administración en la mucosa incluye administración oral, nasal, vaginal, sublingual, ocular, rectal, urinal, intramamaria, pulmonar, ótica (es decir, por el oído) o por vía oral.

La vacuna puede estar en forma de un spray, un aerosol, una mezcla, una suspensión, una dispersión, una emulsión, un gel, una pasta, un jarabe, una crema, una pomada, implantes (oído, ojo, piel, nariz, rectal y vaginal), preparaciones intramamarias, vagitorios, supositorios o uteritorios. Enzima alergénica

En el presente contexto, el término “enzima alergénica” es cualquier proteína que induce reacciones alérgicas, es decir, mediadas por IgE tras su exposición repetida a un individuo y tiene una actividad enzimática, es decir, que puede catalizar o acelerar una reacción química.

Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energía de activación de una reacción, permitiendo así que la reacción avance mucho más rápido. Las enzimas pueden acelerar reacciones por un factor de muchos miles. Una enzima, como cualquier catalizador, permanece inalterada por la reacción completada y, por tanto, puede continuar funcionando. Debido a que las enzimas, como todos los catalizadores, no afectan la energía relativa entre los productos y reactivos, no afectan el equilibrio de una reacción. Sin embargo, la ventaja de las enzimas en comparación con la mayoría de los otros catalizadores es su estéreo, regio y quimioselectividad y especificidad.

Ejemplos de alérgenos que se producen naturalmente incluyen alérgenos del polen (alérgenos del polen de árboles, hierbas, malas hierbas y césped), alérgenos de insectos (alérgenos inhalantes, de saliva y de veneno, por ejemplo, alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y de mosquitos, alérgenos de veneno de himenópteros), alérgenos de pelo de animal y de caspa (de, por ejemplo, perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.) y alérgenos alimentarios. Alérgenos del polen importantes de árboles, céspedes y hierbas son aquellos que se originan a partir de los órdenes taxonómicos de Fagales, Oleales, Pinales y platanaceae que incluyen, entre otros, abedul (Betula), aliso (Alnus), avellano (Corilus), carpe (Carpinus) y olivo (Olea), cedro (Cryptomeria y Junipers), plátano (Platanus), el orden de Poales que incluye, entre otros, céspedes de los géneros Lolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactilis, Holcus, Phalaris, Secale y Sorghum, los órdenes de Asterales y Urticales que incluyen, entre otros, hierbas de los géneros Ambrosia, Artemisia y Parietaria. Otros alérgenos de inhalación importantes son aquellos de ácaros del polvo doméstico (HDM) del género Dermatophagoides y Euroglyphus, ácaros del almacenamiento, por ejemplo, Lepidoglyphus, Glycyphagus y Tyrophagus, aquellos de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo, Blatella, Periplaneta, Chironomus y Ctenocephalides, y aquellos de mamíferos tales como gato, perro y caballo, alérgenos de veneno que incluyen aquellos que se originan a partir de insectos picadores o mordedores tales como aquellos del orden taxonómico de los himenópteros que incluye abejas (superfamilia Apidae), avispas (superfamilia Vespidea) y hormigas (superfamilia Formicoidae). Alérgenos de inhalación importantes de hongos son, entre otros, aquellos que se originan de los géneros Alternaria y Cladosporium.

En un aspecto de la invención, la(s) enzima(s) alergénica(s) se selecciona(n) del grupo constituido por alérgenos del polen de árboles, alérgenos del polen de césped, alérgenos del polen de hierbas, alérgenos de ácaros, alérgenos de veneno, alérgenos de pelo de animal y de caspa y alérgenos alimentarios. En otro aspecto de la invención, la(s) enzima(s) alergénica(s) es (son) alérgeno(s) de ácaros del polvo doméstico.

Una lista no exhaustiva de enzimas alergénicas se muestra en la Tabla 1.

Actividad enzimática Alérgeno Organismo

Cisteína-proteasas

Der p 1 Dermatophagoides pteronyssinus HDM

Der f 1 Blo t 1

Dermatophagoides farinae Blomia tropicalis HDM Ácaro

Act c 1

Actinidia chinensis Kiwi

Car p 1

Carica papaya Papaya

Serina-proteasas

Der p 3 Dermatophagoides pteronyssinus HDM

Der p 6

Dermatophagoides pteronyssinus HDM

Der p 9

Dermatophagoides pteronyssinus HDM

Cla h 9 Blo t 6

Cladosporium herbarum Blomia tropicalis Hongo Ácaro

Asp fl 13

Aspergillus flavus Hongo

Asp f 13

Aspergillus fumigatus Hongo

Asp p 18

Aspergillus fumigatus Hongo

Tri r 4

Trichophyton tonsurans Hongo

Rho m 2

Rhodotorula mucilaginosa Hongo

Epi p 1

Epicoccum purpurascens Hongo

Api m 7

Apis mellifera Abeja de miel

Pol d 4

Polistes dominulus Avispa

Cuc m 1

Cucumis melo Melón

Metaloproteasas

Asp f 5 Aspergillus fumigatus Hongo

Proteasas aspárticas Asp f 10 Aspergillus fumigatus Hongo Bla g 2 Blattella germanica Cucaracha alemana

Enolasas Cyn d 22w Alt a 6 Cla h 6 Asp f 22w Pen c 22w Rho m 1

Cynodon dactylon Alternaria alternata Cladosporium herbarum Aspergillus fumigatus Penicillium citrinum Rhodotorula mucilaginosa

Césped de Bermuda Césped Césped Hongo Hongo Hongo

Amilasas

Der p 4 Dermatophagoides pteronyssinus HDM

Blo t 4

Blomia tropicalis Ácaro

Hor v 16

Hordeum vulgare Cebada

Hor v 17

Hordeum vulgare Cebada

Actividad enzimática Alérgeno Organismo

Glutatión transferasas

Der p 8 Bla g 5 Dermatophagoides pteronyssinus Blatella germanica HDM Cucaracha alemana

Arginina cinasas

Der p 20 Pen m 2 Dermatophagoides pteronyssinus Penaeus monodon HDM Camarón tigre negro

Fosfolipasas

Api m 1 Bom p 1 Dol m 1 Pol a 1 Apis mellifera Bombus pennsylvanicus Dolichovespula maculata Polistes annularis Abeja de miel Abejorro Avispón de cara blanca

Vesp c 1 Ves m 1 Ves v 1

Vespa crabro Vespula maculifrons Vespula vulgaris Avispa Avispón europeo Avispa de chaqueta amarilla

Avispa de chaqueta amarilla

Deshidrogenasas

Alt a 8 Alt a 10 Hala f 4 Alternaria alternata Alternaria alternata Malassezia furfur Hongo Hongo Hongo

Una de las fuentes principales de alérgenos es HDM. En el 2000 se identificaron un total de 13 especies diferentes de HDM en todos los continentes, excepto en la Antártida. Los HDM pertenecen al filo Arthropoda como, por ejemplo, arañas y escorpiones. Tres especies constituyen el 90% de la fauna de HDM, concretamente Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides

5 farinae y Euroglyphus maynei.

Para D. pteronyssinus, los alérgenos que median en la respuesta alérgica se encuentran en las heces y de los restos corporales desecados de D. pteronyssinus. Se identifican 14 grupos diferentes de alérgenos de D. pteronyssinus (Tabla 2). Aunque no todos están completamente caracterizados, el tamaño y la función de la mayoría está establecido y los ensayos inmunológicos

10 han determinado la reactividad de IgE in vitro. Como se desprende de la Tabla 2, varios de los HDM son enzimas alergénicas tales como, por ejemplo, Der p 1, Der p 3, Der p 6 y Der p 9.

5

10

15

11 Tabla 2. Grupos de alérgenos de Dermatophagoides pteronyssinus -peso molecular y función.

Alérgeno Pm (kDa) Función

Grupo 1

25 Cisteína proteasa

Grupo 2

14 Secreción epitelial

Grupo 3

25 Tripsina

Grupo 4

57 Amilasa

Grupo 5

15 ND

Grupo 6

25 Quimotripsina

Grupo 7

31 ND

Grupo 8

26 Glutatión-S-transferasa

Grupo 9

30 Serina proteasa colagenolítica

Grupo 10

37 Tropomiosina

Grupo 11

92 Paramiosina

Grupo 12

14 ND

Grupo 13

15 Proteína de unión a ácido graso

Grupo 14

189 Apolipoforina

ND: No disponible

La definición formal de un alérgeno principal es cualquier antígeno que se une a sueros de IgE humanos en más del 50% de los pacientes en un grupo clínicamente sensible. Los alérgenos de HDM Der p 1 y Der p 2 son los principales alérgenos y se consideran los más potentes de los alérgenos de HDM.

Varios experimentos in vitro indican que la actividad proteolítica de Der p 1 podría desempeñar una función esencial en el desarrollo de la reacción alérgica hacia HDM. Se cree que Der p 1 rompe las zonas de oclusión entre las células epiteliales mediante escisión que ocluye y aumenta la permeabilidad de la mucosa bronquial degradando α-antitripsina. Esto podría facilitar un aumento del acceso a las células presentadoras de antígeno subepitelial, que podría conducir a un aumento de la respuesta alérgica. Además, Der p 1 escinde CD23 (el receptor de IgE de baja afinidad que regula la producción de IgE) y CD25 (el receptor de IL-2) sobre la superficie de células B y T. Esto dirige la respuesta de células T hacia una respuesta de Th2 y finalmente a niveles elevados de IgE y una respuesta alérgica más grave.

Las enzimas proteolíticas, denominadas en lo sucesivo proteasas o sinónimamente peptidasas, median en la descomposición de proteínas. Esto se hace o bien por proteolisis limitada en la que un número limitado de enlaces peptídicos se escinden o bien por proteolisis no limitada en la que las proteínas se degradan en sus constituyentes de aminoácidos. Las enzimas proteolíticas, como la mayoría de las otras enzimas, se clasifican por el sistema de numeración de la Comisión de Enzimas (CE) con un número que indica la función y la especificidad del sustrato. Las enzimas proteolíticas se dividen, según el sistema de numeración de la CE, en dos subsubclases, concretamente exopeptidasas y endopeptidasas. Estas últimas también se denominan en lo sucesivo proteinasas.

Las exopeptidasas, por ejemplo, amino y carboxipeptidasa, escinden aminoácidos individuales de tanto el extremo N como C de la proteína, mientras que las endopeptidasas escinden enlaces dentro de la proteína. Para las endopeptidasas, el enlace particular escindido depende de la especificidad o la preferencia hacia distintos aminoácidos en el sustrato de proteínas. Por tanto, una endopeptidasa puede tener una preferencia hacia la escisión de enlaces peptídicos vecinos que están cerca de un residuo hidrófobo voluminoso, mientras que otras prefieren residuos cargados largos o incluso dos o más residuos químicamente o estructuralmente relacionados. La estructura real alrededor del sitio activo de la proteasa dicta la especificidad o preferencia. Los residuos alrededor del sitio de escisión del sustrato se denotan -P3-P2-P1-P1'-P2'P3'-, siendo el tramo P1-P1' el sitio de escisión. Similarmente, los residuos de la proteasa alineada al sustrato se denotan -S3-S2-S1-S1'-S2'-S3'-.

Se han descrito cuatro tipos diferentes de endopeptidasas. Éstas son las serina proteasas, cisteína proteasa, aspartil proteasas y metaloproteasas. En cada caso, las proteasas generan un nucleófilo que ataca el carbonilo del péptido del sustrato de proteína.

Las cisteína proteasas son hidrolasas activas para enlaces peptídicos mediante un resto de cisteína, pertenecen a la subsubclase 3.4.22 en el sistema de numeración de la CE. Actualmente, están clasificadas 40 cisteína proteasas en este sistema, cubriendo enzimas como caspasa 1, separasa, algunas catepsinas y papaína (Car p 1). Se han identificado y caracterizado varias otras cisteína proteasas, pero todavía no se han clasificado en el sistema de numeración de la CE.

Además del sistema de numeración de la CE, las proteasas también se clasifican en clanes y familias basándose en la relación filogenética, es decir, su estructura molecular y homología de secuencias. En este momento, la base de datos MEROPS contiene información detallada de 1816 proteasas diferentes. En este sistema, las proteasas se anotan por una letra que indica el tipo catalítico (S, C, T, A, G, M o U para serina, cisteína, treonina, aspártico, glutámico, metaloproteasa o proteasa conocida, respectivamente) seguido de un número arbitrario. Las cisteína proteasas se dividen en cinco clanes. Por este sistema, Car p 1 pertenece al clan CA, familia C1, y se le da el nombre C.01.001, a diferencia de 3.4.22.2 en el sistema de numeración de la CE.

Los restos catalíticos responsables de la actividad de las cisteína proteasas están muy conservados: una cisteína (Cys), una histidina (His) y una asparagina (Asn) constituyen la llamada tríada catalítica. Estos tres restos generan un anión tiolato nucleófilo a partir de Cys. Se genera un par de iones tiolato-imidazolio a partir de la His y la Cys, que ataca el carbonilo del péptido del sustrato. La Asn ayuda a orientar el ión imidazolio de la His en posiciones favorables para las diversas etapas del mecanismo catalítico. La catálisis se produce de una forma secuencial. Primero, la enzima es temporalmente acilada por el sustrato de proteína mediante el anión tiolato. Segundo, una parte del sustrato de proteína se escinde seguido por desacilación y adición de agua. Finalmente, los residuos de sitios activos de la cisteína-proteasa se reconstituyen en su forma original.

Además de los restos catalíticos, varios otros restos desempeñan funciones importantes. Una glutamina (Gln) constituye parte de lo que se conoce como el agujero de oxoanión. Esta estructura ayuda a estabilizar el estado de transición intermedio del sustrato durante la catálisis. Varios restos hidrófobos establecen un entorno no polar alrededor de Asn, protegiendo del disolvente externo. Éstos son dos triptófanos (Trp), dos valinas (Val) y una fenilalanina (Phe), todos residuos conservados.

La catálisis realizada por cisteína proteasas depende fuertemente de un entorno reductor ya que la cisteína reactiva tiene tendencia a la oxidación. Por este motivo, los ensayos enzimáticos con cisteína proteasas pueden realizarse con un agente reductor, por ejemplo, ditiotreitol (DTT), cisteína libre o β-mercaptoetanol.

La cisteína-proteasa Car p 1 de la planta Carica papaya es la cisteína-proteasa más estudiada y bien entendida. Car p 1 es un miembro de la familia C1 de cisteína proteasas que normalmente son secretadas y se producen como proformas inactivas. Car p 1 está constituida por una única cadena de polipéptidos de 212 aminoácidos con tres puentes disulfuro. La cadena de polipéptidos está plegada para formar una proteína globular constituida por dos dominios de interacción que delimitan una hendidura entre ellos. Los residuos de sitios activos Cys25 y His159 se localizan en esta hendidura en dominios opuestos. El dominio que alberga Cys25 está dominado por motivos estructurales de hélice α mientras que el dominio que alberga His159 está dominado por motivos estructurales de hoja β. El tercer residuo catalítico Asn175 está residiendo en estrecha proximidad a His159 en secuencia y estructura terciaria. Aparte de la Cys25 que coordina con el carbonilo del sustrato, Asn175 y Gln19 ayudan a mantener el sustrato en su sitio para la catálisis mediante enlaces de hidrógeno y constituye el núcleo del agujero de oxoanión mencionado. El pH óptimo de la actividad proteolítica de Car p 1 es 6,0 -7,0.

Der p 1, un importante alérgeno de HDM que se origina a partir de sus heces, también es un miembro de la familia C1 de cisteína proteasas. Aunque no se le concede un sitio en el sistema de numeración de la CE, se ha clasificado en la base de datos de peptidasas MEROPS con el número C.01.073. Der p 1 es secretado como una proenzima en el tacto gastrointestinal de HDM y se activa por la eliminación proteolítica del pro-péptido que forma la enzima madura que está constituida por 222 aminoácidos con tres puentes disulfuro. El marco de lectura abierto codifica un péptido señal de 18 aminoácidos, además de un pro-péptido de 80 aminoácidos. Der p 1 es estructuralmente muy similar a Car p 1 y muestran una homología estructural del 80%, a pesar de una homología de secuencias del 26%. El pH óptimo de la actividad proteolítica de Der p 1 es 7,0 -8,0.

En un aspecto de la invención, la(s) enzima(s) alergénica(s) es (son) una o más seleccionadas del grupo que está constituido por Der p 1, Der p 3, Der p 6 y Der p 9.

En otro aspecto de la invención, al menos una de la(s) enzima(s) alergénica(s) es una cisteína-proteasa tal como Der p 1.

En otro aspecto adicional de la invención, al menos una de la(s) enzima(s) alergénica(s) es una serina-proteasa tal como una o más seleccionadas del grupo que está constituido por Der p3, Der p 6 o Der p 9.

En otro aspecto adicional de la invención, la preparación de vacuna comprende al menos dos especies diferentes de alérgenos que se originan tanto a partir de la misma fuente alergénica como que se originan a partir de fuentes alergénicas diferentes, por ejemplo, alérgenos de ácaros del grupo 1 y grupo 3 de diferentes ácaros.

La enzima alergénica incorporada en la preparación de vacuna puede estar en forma de un extracto, un alérgeno purificado, un alérgeno modificado, un alérgeno recombinante o un mutante de un alérgeno recombinante. Un extracto alergénico puede contener, además de los alérgenos, varios otros iones y moléculas. Un extracto alergénico puede contener naturalmente una o más isoformas del mismo alérgeno, mientras que un alérgeno recombinante normalmente sólo representa una isoforma de un alérgeno. La preparación de vacuna puede comprender adicionalmente uno o más alérgenos que no tienen una actividad enzimática y/o una o más enzimas que no tienen actividad alergénica.

En un aspecto de la invención, la(s) enzima(s) alergénicas(s) está(n) en forma de un extracto. En otro aspecto de la invención se mide la actividad enzimática de un alérgeno importante del extracto.

En otro aspecto adicional de la invención, la actividad enzimática de una o más enzimas alergénicas puede medirse en un extracto completo.

En otro aspecto de la invención, el alérgeno es un alérgeno recombinante. En otro aspecto de la invención, el alérgeno es un mutante de baja unión a IgE que se produce naturalmente o un mutante de baja unión a IgE recombinante.

En otro aspecto de la invención, el alérgeno de baja unión a IgE es un alérgeno según los

documentos WO 99/47680, WO 02/40676 o WO 03/096869.

Inhibidores enzimáticos

La actividad enzimática puede afectarse por otras moléculas tales como inhibidores que son moléculas que disminuyen o suprimen la actividad enzimática.

Se ha descrito un gran número de inhibidores de proteasas, tanto naturales como sintéticos. Los inhibidores inactivan la enzima por diferentes mecanismos, por ejemplo, modificación covalente directa de los restos catalíticos o protegiendo el sitio activo para la entada de sustrato. El primer tipo de mecanismo se representa frecuentemente por moléculas pequeñas con un grupo reactivo hacia restos catalíticos, bloqueando así irreversiblemente la actividad. Un ejemplo de un inhibidor tal es el inhibidor de cisteína proteasas específico E-64 que se une covalentemente a la cisteína catalítica mediante un grupo epóxido reactivo. El último tipo de inhibidor es frecuentemente una estructura macromolecular que se asocia a la enzima por múltiples interacciones no covalentes. Un ejemplo de un inhibidor tal es el inhibidor de la tripsina de soja (SBTI) específico para serina-proteasas. El SBTI es una proteína de 190 aminoácidos que se produce naturalmente, que cubre la hendidura del sitio activo y, por tanto, los restos catalíticos por enlaces de hidrógeno, interacciones electrostáticas e hidrófobas con la superficie de la enzima.

En un aspecto de la invención, la preparación de vacuna comprende varias enzimas alergénicas. Con el fin de medir sólo la actividad de una de las enzimas alergénicas puede ser necesario usar inhibidores relevantes dependiendo del tipo de actividad enzimática que se desee inhibir. En otro aspecto de la invención se usa un inhibidor para inhibir una o más de la(s) enzima(s) alergénicas(s) en la preparación de vacuna.

El uso de inhibidores específicos para la enzima alergénica en cuestión es útil para obtener una mejor caracterización e identificación de la actividad enzimática, además de para la cuantificación de la cantidad de enzima activa presente en la preparación (mediante, por ejemplo, valoración de sitios activos). En un aspecto de la invención, el inhibidor de cisteína proteasas usado se selecciona del grupo que está constituido por E64 (L-trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano) y otros epóxidos. En otro aspecto de la invención, el inhibidor es E64. Sustratos

Con el fin de poder medir la actividad enzimática de una enzima alergénica adsorbida a la fase sólida en un ensayo de actividad enzimática deberá identificarse un sustrato y, si se necesita, un inhibidor específico para la enzima alergénica en cuestión.

En un aspecto de la invención, el sustrato en el ensayo de actividad enzimática es específico para la enzima en cuestión, que significa que ninguna otra enzima en la misma fuente alergénico puede convertir este sustrato en producto. Como ejemplo, el sustrato Z-Leu-Leu-Glu-MCA es específico para cisteína proteasas, por ejemplo Der p 1, y no es escindido por otras proteasas que se sabe están presentes en esa fuente alergénica (extractos de HDM) tales como las serina-proteasas Der p 3, Der p 6 o Der p 9. En un aspecto de la invención se usa un sustrato específico para una enzima alergénica para medir la actividad enzimática de la enzima alergénica. En otro aspecto de la invención, el sustrato usado es Z-LeuLeuGlu-MCA. Adyuvante de hidróxido de aluminio

Un adyuvante es un compuesto que actúa potenciando la respuesta inmunitaria tras la vacunación.

El hidróxido de aluminio puede caracterizarse por una variedad de parámetros fisicoquímicos como propiedades de adsorción, solubilidad y de disolución, carga iónica medida como el punto isoeléctrico pI (pH al que la carga neta de la sustancia es cero para un compuesto disociable), constantes de disociación, coordinación de complejos, configuraciones electrónicas, valencia, orbitales de unión y orbitales de antiunión, propiedades de liberación prolongada, propiedades de adhesión, características superficiales, características de partículas y adyuvanticidad.

Se cree que la sustancia biológicamente activa se adsorbe (o se acopla) a hidróxido de aluminio y esta adsorción contribuye a la eficacia de la vacuna. Varios factores pueden ser importantes o influir en la adsorción entre la sustancia activa y el hidróxido de aluminio (véanse, por ejemplo P. M. Callahan y col., Pharmaceutical Research vol. 8, No. 7,851-858 (1991), y Vaccine Design. The Subunit and Adjuvant Approach). Estos factores incluyen pH, la duración de tiempo durante la que se lleva a cabo la reacción de adsorción, condiciones de mezclado, concentraciones de los diversos componentes en las vacunas, recipientes, temperatura, almacenamiento, tampón y excipientes. Se ha encontrado adicionalmente que la adsorción de la sustancia activa puede influirse por la carga neta/global de la sal metálica y la carga de la sustancia activa, ambas dependientes del pH. Otra característica que se cree que es de importancia es la solubilidad de hidróxido de aluminio.

El hidróxido de aluminio puede tener adicionalmente un efecto de liberación prolongada. Un efecto de liberación prolongada significa que la sustancia activa se liberará gradualmente de la vacuna. Por tanto, la sustancia activa será retenida por hidróxido de aluminio y se liberará gradualmente del mismo. Se cree que esto tiene varios efectos beneficiosos, por ejemplo, estimulación prolongada, liberación beneficiosa del fármaco y protección de las sustancias interactivas biológicas contra condiciones medioambientales. Además, se cree que el hidróxido de aluminio puede poseer ciertas propiedades de atrapamiento, reteniendo así la sustancia activa que va a administrarse.

Otra característica del hidróxido de aluminio es la protección de la sustancia activa tanto manteniendo el pH ideal para la sustancia activa en el microentorno, previniéndose así la degradación del ácido, como protegiendo la sustancia activa de la degradación enzimática, permitiendo así que se administre la sustancia.

Además, el hidróxido de aluminio puede tener una capacidad de tampón. Esto puede dar como resultado un microentorno in vivo dentro de la formulación de vacuna que protege la sustancia activa del entorno degradable. Esto puede ser una ventaja, por ejemplo, en el estómago

o el intestino en los que hay riesgo de degradación ácida y enzimática, respectivamente.

El hidróxido de aluminio puede tener la forma de un gel suspendido en un disolvente, normalmente agua. Cuando se agita el gel, es decir, la fase sólida, se distribuirá uniformemente por todo el volumen de la suspensión, de ahí que encierre toda el agua, es decir, la fase líquida, presente. Si se deja reposar o se somete a un procedimiento de separación tal como centrifugación, una parte del agua se separará del gel. La cantidad de agua separada dependerá del procedimiento de separación usado, además del tipo y la concentración de hidróxido de aluminio usado.

La fórmula molecular del hidróxido de aluminio es Al(OH)3. Sin embargo, ésta subestima la verdadera complejidad del compuesto. La composición estructural molecular es un octaedro. El aluminio está en el centro del plano de simetría de la bipirámide, los hidróxidos en las intersecciones de conexión y las moléculas de agua en todas las otras. El octaedro individual se combina para dar estructuras macromoleculares de octaedros. Cuantos más octaedros se combinen, la relación de aluminio con respecto a oxígeno se aproxima asintóticamente a 1:3 cuanto más hidrógeno sea desplazado por el agua.

El aspecto físico del hidróxido de aluminio es una suspensión de gel con fluidez decreciente a medida que aumenta el contenido de aluminio. El gel se agrega y, por tanto, sedimenta cuando se almacena debido a su alta densidad, dejando una fase acuosa sobre él. El tamaño de partícula típico de un agregado de hidróxido de aluminio está en el intervalo de dos a tres µm. El hidróxido de aluminio tiene un punto de carga cero (PZC) de 9,1. El PZC es equivalente al pI en proteínas, que es el valor de pH al que la molécula tiene una carga neta global de cero. El pI de Car p 1 es 8,75 y para Der p 1 4,6-6,6 (dependiendo de las diferentes isoformas de Der p 1).

Además, se ha mostrado que el microentorno que rodea al adyuvante de hidróxido de aluminio tiene un pH diferente del de la disolución en masa. Esto es debido a la atracción de aniones que incluyen hidroxilos que forman una capa doble que rodea las partículas de adyuvante.

La base de la adsorción de proteínas a hidróxido de aluminio está principalmente mediada por su diferencia de carga. Se necesita una diferencia sustancial en el PZC con respecto al pI a pH constante con el fin de establecer las interacciones electrostáticas requeridas para la adsorción. Esto está soportado por el potencial de Nernst o el potencial superficial del hidróxido de aluminio dado por

Potencial superficial = 59 mV · (PZC – pH)

Las proteínas con un pI inferior al PZC podrán unirse a hidróxido de aluminio. Cuanto mayor sea la diferencia entre PZC y pH, mayor será el potencial del adyuvante de hidróxido de aluminio y más fuerte será la interacción electrostática entre hidróxido de aluminio y proteína dado que el pI de la proteína es inferior al PZC del hidróxido de aluminio.

Otras interacciones incluyen hidrófobas, de van der Waals y enlaces de hidrógeno, pero por sí mismas no son suficientes para impulsar la adsorción si no existe una diferencia significativa de carga entre las moléculas. Por tanto, en teoría, Car p 1 no debería adsorberse, o al menos a un bajo grado, al hidróxido de aluminio, mientras que Der p 1 debería adsorberse debido a la gran diferencia de carga en comparación con el hidróxido de aluminio. Ensayo de la actividad enzimática

El fin del ensayo de actividad enzimática es obtener una curva de progreso de una reacción catalizada por enzimas. La velocidad inicial se estima como la tasa inicial de la formación de producto o la disminución inicial en la concentración de sustrato. Esto puede obtenerse de diferentes formas dependiendo de la reacción enzimática, siendo la más popular la absorbancia, la fluorescencia o el cambio de pH. Una curva de progreso de enzimas es la concentración de producto en función del tiempo. En el presente contexto, el término “ensayo de actividad enzimática” se refiere a cualquier ensayo apropiado que depende de la enzima alergénica que va a medirse. Mediante el procedimiento elegido debe ser posible seguir y cuantificar el consumo de sustrato y/o la generación de producto mediante procedimientos que son compatibles y que no se alteran por la presencia del vehículo de fase sólida, por ejemplo, por procedimientos espectroscópicos como absorbancia, fluorescencia, FTIR (espectrometría de infrarrojos por transformada de Fourier), por procedimientos inmunológicos, por ejemplo ELISA, y similares. Antes de decidirse por un ensayo es práctica habitual para un experto dentro del campo verificar que la presencia de la fase sólida no interfiere con la catálisis enzimática, con las condiciones de ensayo (por ejemplo, uniendo el sustrato y/o el producto, alterando las condiciones de pH, etc.) o con el propio procedimiento de medición en una forma tal que se afecten los resultados medidos como se ejemplifican, por ejemplo, en los ejemplos en este documento.

En un aspecto de la invención, el ensayo es un ensayo de fluorescencia en el que se mide la formación de producto con el tiempo. El sustrato puede estar hecho de un péptido sintético ligado a un grupo fluorescente que se inactiva por el péptido y tiene intensidad de fluorescencia relativamente baja mientras está unido al péptido, tal como los sustratos de cisteína-proteasa Boc-Gln-Ala-Arg-MCA, Z-Leu-Leu-Glu-MCA o Z-Phe-Arg-MCA, en las que MAC es el grupo fluorescente. Si una enzima escinde el enlace entre el grupo fluorescente y la secuencia de péptidos, la fluorescencia aumenta espectacularmente. El péptido puede diseñarse para cumplir los requisitos de especificidad de la enzima.

Si en un aspecto de la invención la enzima alergénica es una cisteína-proteasa, el resto de cisteína activo necesita estar en su forma reducida con el fin de que la proteasa sea enzimáticamente activa. En este aspecto de la invención, la enzima alergénica se incuba con un agente reductor para activar la enzima alergénica. Es importante que el agente reductor esté presente en una concentración suficiente de manera que se reduzca completamente el resto de cisteína del sitio activo, pero no en una concentración en exceso tal que se reduzcan puentes disulfuro de la enzima.

En un aspecto de la invención se mide la actividad enzimática de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida de la preparación de vacuna. En otro aspecto de la invención, la preparación de vacuna se somete a un procedimiento de separación para separar la fase líquida y la fase sólida con el fin de hacer posible la medición de la actividad enzimática de la fase sólida y la fase líquida por separado. La separación puede realizarse mediante cualquier procedimiento apropiado. En un aspecto de la invención, el procedimiento de separación se realiza por centrifugación, extracción o una simple sedimentación. Dependiendo del ensayo enzimático específico usado y la calidad de la muestra de la fase sólida puede ser necesario usar, por ejemplo, disoluciones tampón con el fin de obtener una muestra apropiada antes de medir la actividad enzimática de la(s) enzima(s) alergénicas(s).

En un aspecto de la invención, la preparación de vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1).

En otro aspecto de la invención, la preparación de vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida (medición 2).

En otro aspecto de la invención, la preparación de vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida (medición 3).

En otro aspecto adicional de la invención, la preparación de vacuna se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1) como a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2).

En otro aspecto adicional de la invención, la preparación de vacuna se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2) como a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida (medición 3).

La distribución de las enzimas alergénicas entre la fase líquida y la fase sólida es un parámetro que es característico para cada enzima alergénica, y de ahí que pueda servir para caracterizar el estado y la actividad inmunológica de una preparación de vacuna. Por consiguiente, el fin de los aspectos de la invención anteriores que implican mediciones de la actividad enzimática de diversas combinaciones de diferentes fases de la preparación de vacuna y/o la preparación de vacuna completa es facilitar información adicional sobre la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

En otro aspecto de la invención se mide la actividad enzimática de una disolución de enzima alergénica usada para preparar la preparación de vacuna con adyuvante, y la medición de dicha disolución se compara con la medición obtenida de la preparación de vacuna con adyuvante con el fin de evaluar el efecto sobre la actividad inmunológica de la preparación de la preparación de vacuna con adyuvante.

En otro aspecto adicional de la invención, la preparación de vacuna se somete a la medición de actividad enzimática inmediatamente después de la preparación y después de uno o más periodos de almacenamiento, y la indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna se basa en una comparación de las mediciones anteriores y posteriores.

En otro aspecto de la invención, la indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna se basa en una comparación de la medición obtenida para preparación de vacuna con adyuvante y mediciones correspondientes anteriores del mismo tipo de preparación de vacuna con adyuvante o de otro tipo de preparación de vacuna. PROCEDIMIENTOS Y MATERIALES Preparación de vacunas de alérgeno con adyuvante de gel de aluminio

Se disuelve alérgeno liofilizado en un tampón acuoso y se diluye a una concentración deseada. Se añade “Alhydrogel” (1,3%) a la disolución de alérgeno obtenida mientras se agita y luego se añade agua estéril. La disolución resultante se deja reposar hasta el día siguiente y entonces se añade lentamente tampón mientras se agita para producir el gel de hidróxido de aluminio de alérgeno final. Inmunoelectroforesis en cohete Objetivo

Este procedimiento se usó para cuantificar una proteína dada midiendo la propagación del complejo de proteína-anticuerpo después de electroforesis en un gel de agarosa que contenía anticuerpos dirigidos contra la proteína en investigación. Teoría

Este procedimiento se basa en la movilidad del complejo de proteína-anticuerpo sobre un

gel de agarosa durante la electroforesis. Los anticuerpos se incorporan en el gel de agarosa durante la polimerización y la proteína de muestra se aplica luego a los pocillos. Las proteínas se mueven según su movilidad electroforética encontrándose con los anticuerpos en el gel y formando complejos. Estos complejos crecen en tamaño a medida que el antígeno encuentra cada vez más anticuerpos, limitándose así la migración por los poros del gel hasta que no se produzca más migración. Los complejos se visualizan tiñendo el gel. El área delimitada por los complejos es proporcional a la cantidad de proteína aplicada al pocillo. La cuantificación se realiza con respecto a una preparación de patrón interno aplicada en una serie de dilución sobre el mismo gel. Aparatos:

Baño de agua calentado controlado por termostato 56 -60ºC

Aparato de electroforesis (2 recipientes de tampón, 2 electrodos, superficie enfriada y

cámara)

Fuente de alimentación, Immuno Power 320, Kebo Lab A/S

Ventilador de aire caliente, Team International HL2 Materiales y reactivos:

Placa de vidrio: 7 x 10cm

Mechas de papel: papel de filtro, tamaño estándar: 21 x 10cm, Watman Tampón para los recipientes de electrodos y el gel de agarosa:

Ácido 5,5-dietilbarbitúrtico 0,1 M, Veronal, Tris 0,40 M, Sigma,

Lactato de calcio 2 mM, Purum Gel de agarosa que contiene anticuerpos:

1% (p/v) de agarosa, tipo HAS, Litex

Anticuerpo: Rb-a-Derp1, ALK-Abelló A/S Disolución de tinción:

Azul brillante de Coomasie 6 mM R-250, Pierce, 10% de ácido acético, Bie & Berntsen en

43,2% de etanol Disolución de decoloración:

10% de ácido acético, Bie & Berntsen en 43,2% de etanol Procedimiento experimental

Se colocó una placa de vidrio sobre una superficie nivelada y se limpió con etanol. Se pipetearon 11 ml de agarosa en un tubo de ensayo en un baño de agua a 56ºC, se añadieron 15 µl de anticuerpo y la disolución se mezcló cuidadosamente mediante inversión. La agarosa se vertió cuidadosamente sobre la placa de vidrio evitando la formación de burbujas de aire. Después de la gelificación, una serie de pocillos se perforaron a 1,5 cm del borde inferior de la placa. La placa se colocó sobre la superficie enfriada del aparato de electroforesis. Se establecieron puentes de conexión de 5 capas de papel de filtro y el voltaje a través del gel se ajustó a 2 V/cm. Se aplicaron 10 µl de muestra a los pocillos. Otra placa de vidrio se colocó sobre la parte superior de los puentes de conexión del papel de filtro para evitar la condensación de agua sobre el gel y la electroforesis continuó durante la noche.

Tras realizarse la electroforesis, la placa de vidrio se colocó sobre papel de filtro y los pocillos se llenaron con agua destilada. Entonces, el gel se cubrió con papel de filtro húmedo y se presionó bajo varias capas de papel de filtro seco, una placa de vidrio gruesa y una carga de 3-4 kg. Después de diez minutos se repitió el procedimiento. Entonces, la placa se colocó en un recipiente con NaCl 0,1 M durante 15-30 minutos seguido por compresión como se describe anteriormente. Después de esto, la placa se secó en una corriente de aire caliente y las placas se tiñeron durante 5 min en disolución de tinción de Coomassie. La placa se sumergió en agua destilada durante algunos segundos con el fin de eliminar la disolución de tinción en exceso. Finalmente, la placa se decoloró durante 2 minutos en baños sucesivos hasta que se alcanzó la decoloración deseada. La placa se secó con aire caliente y la digitalización del gel se hizo por el software Gel-Pro Analyzer 3.1. Purificación de Der p 1 Objetivo

El fin es la purificación de Der p 1 a partir de extracto de D. pteronyssinus. Teoría

La purificación de Der p 1 implica varias etapas. La aplicación de dos tipos de etapas de cromatografía de afinidad conduce a la Der p 1 purificada. La primera cromatografía se realizó en una columna de SBTI-agarosa. El fin de esta etapa es la eliminación de serina-proteasas contaminantes presentes en el extracto, haciendo que el extracto sea más estable.

La segunda etapa en la purificación se realiza en una columna de 4C1B8-Sepharose. 4C1B8 es un anticuerpo monoclonal de ratón específico para Der p 1 (de Martin Chapman). Der p 1 se eluye aplicando un gradiente de pH.

El algoritmo diagnóstico de la purificación se muestra en la Figura 1.

Se realiza una purificación adicional sobre una columna de SBTI con el fin de eliminar completamente trazas de la serina-proteasa Der p 3 que se copurifica con Der p 1 en la etapa previa. Las fracciones que contienen Der p 1 se recogieron y se concentraron por ultrafiltración. Aparatos:

Sistema ÄKTA explorer FPLC, Amersham Biosciences

Centrífuga Sorval RC 3B Plus, Du Pont Materiales y reactivos:

Purificación por afinidad: Columnas: columna para Der p 1 SBTI-agarosa (SBTI-agarosa), volumen de columna (VC) 1 ml Columna para Der p 1 de CNBr-Sepharose-Acm 4C1B8 (4C1B8-Sepharose), VC 5 ml Extracto de ácaro del polvo doméstico de D. pteronyssinus Tampones para la purificación cromatográfica:

A11: Solución salina tamponada con fosfato (PBS), Bie & Berntsen A2: PBS, NaCl 0,5 M, Merck B1: Glicina 0,1 M, pH 11, Sigma, NaCl 0,5 M, Merck

Concentración de proteína: Dispositivos de filtración centrífuga de 15 ml Amicon Ultra-15, Millipore. Intercambio de tampón:

Columna de desalinización PD 10, Amersham Biosciences Procedimiento experimental Preparación de muestras

Se disolvieron 120 mg de extracto Der p en 10 ml de tampón A11. La muestra se filtró con un filtro de baja unión a proteína de 0,22 µm. Con el fin de reducir la posible proteolisis de Der p 1, todas las operaciones se llevaron a cabo a 5ºC. Todos los tampones usados también se enfriaron hasta 5ºC. Cromatografía de afinidad en columna de SBTI-agarosa

La columna de SBTI-agarosa se equilibró con tampón A11 y 5 ml de la muestra preparada se inyectaron en la columna. Se tomaron muestras de 50 µl de fracciones para la posterior investigación y se congelaron por separado. Las fracciones del flujo continuo que contenían Der p 1 se reunieron para la posterior purificación. Cromatografía de afinidad en columna de 4C1B8-Sepharose

La columna se equilibró con tampón A11 y 5 ml de la muestra (combinación purificada en SBTI-agarosa) se inyectaron en la columna. El material no específicamente unido se eluyó con tampón A2. Después se eluyó Der p 1 con un gradiente respecto al tampón B1. Se pipeteó tampón fosfato 800 mM, pH 7, en los tubos de recogida (200 µl/ml de fracción) destinados para la recogida de Der p 1 con el fin de neutralizar el eluato alcalino. Se tomaron muestras de 50 µl de fracciones y se congelaron por separado para la posterior investigación. Las fracciones del pico de elución se reunieron y se congelaron. Las fracciones que contenían Der p 1 se reunieron y se sometieron a una segunda cromatografía en SBTI-agarosa bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Procedimientos pospurificación

La combinación, de aproximadamente 140 ml, de la purificación de la segunda columna de SBTI se concentró por ultrafiltración usando filtros de centrífuga de 15 ml Amicon Altra-15. Los filtros se lavaron con tampón PBS y la Der p 1 reunida se centrifugó a 3.500 rpm durante 15 minutos reduciéndose el volumen a 5 ml.

El tampón se cambió a Tris 50 mM, pH 7, usando la columna de desalinización PD-10 rellena de Sephadex G-25 diseñada para separar sustancias de alto (MW > 5000) a bajo peso molecular (MW < 1000). Absorbancia Objetivos

Este procedimiento se usa para evaluar la concentración de proteína total. Teoría

Los aminoácidos aromáticos triptófano, tirosina y fenilalanina absorben luz ultravioleta. Sin embargo, sólo el triptófano y la tirosina absorben a 280 nm, y el triptófano absorbe 5 veces más luz que la tirosina. Esto es debido a la transición n→ n* en el anillo de indol del triptófano en el que la fenilalanina y la tirosina contienen un grupo fenilo. La absorbancia de una proteína guarda una correlación lineal con la cantidad de triptófano y tirosina en la proteína, la longitud de la trayectoria de la luz y la concentración de proteína. Esta relación se llama la ley de Lambert-Beer y viene dada por:

A= imagen2 ·l·c

en la que la A es la absorbancia, ε es el coeficiente de absorción molar de la proteína (determinado por la cantidad de triptófano y tirosina en la proteína), I es la longitud de la trayectoria de la luz y c es la concentración de proteína. Por tanto, a partir de una medición de absorbancia puede estimarse la concentración de proteína si se conoce el coeficiente de absortividad molar. Aparatos

Espectrómetro Lambda 800 UV/VIS, PerkinElmer™

100-QS, cubeta de cuarzo, longitud de la trayectoria 1 cm, Hellma® Materiales y reactivos

Bis-Tris 50 mM, pH 6,5, Sigma

Tris 50 mM, pH 7,0, Sigma

Tampón fosfato 50 mM, pH 7,0, Merck

Disolución de Helmanex al 2%, Hellma Procedimiento experimental

El espectrofotómetro se encendió 30 min antes de uso para un periodo de calentamiento. La longitud de onda del espectrofotómetro se ajustó a 280 nm y el instrumento se puso a cero para una muestra de blanco que contenía la matriz de la muestra verdadera. La cubeta de cuarzo se lavó primero con una disolución de Helmanex al 2% y luego 4 veces con agua MQ y después se secó con aire a alta presión. Después del secado con aire, el exterior de la cubera se frotó con tejido para limpieza de lentes. Este procedimiento se realizó entre cada medición de muestras. Después de limpiar la cubeta, 200 µl de muestra se transfirieron a la cubeta y se midió la absorbancia.

Ensayos de actividad enzimática (ensayo de fluorescencia)

Aparatos

Molecular Devices Spectra MAX GeminlXS

Placa de poliestireno negro de no unión de 96 pocillos Corning

Centrífuga Heraeus Sepatech

Mezcladora, Janke & Kunkel Materiales y reactivos

Der p 1 purificada

Papaína (Car p1) purificada, Sigma

Boc-QAR-AMC 10 mM, Bachem

Z-FR-AMC 10 mM, Bachem

E-64 0,70 mM en DMF, Merck

DTT 1 M, Sigma

EDTA 100 mM, Bie & Berntsen

Tampón Tris 50 mM, pH 7,0, Sigma

Tampón Bis-Tris 50 mM, pH 6,5, Sigma

Tampón fosfato, 50 mM, Merck

6,686 mg/ml de hidróxido de aluminio, Brenntag Biosector Procedimiento experimental

Se prepararon disoluciones madre de DTT 1 M y EDTA 100 mM al principio del periodo experimental, se congelaron a -20ºC y se usaron durante todo el periodo del proyecto. Cada día se preparó un tampón nuevo que contenía el agente reductor DTT y EDTA a partir de las disoluciones madre. Para una descripción de las condiciones de ensayo véase la Tabla 4. El DTT es continuamente oxidado por el oxígeno en el aire y, por tanto, cada día debe prepararse un tampón nuevo. Para beneficiarse de las mediciones de alto rendimiento se usó una placa de microvaloración de 96 pocillos y cada pocillo tuvo un volumen de ensayo de 200 µl. La placa de microvaloración era opaca para evitar la contaminación cruzada de la fluorescencia emitida entre pocillos. El sustrato se diluyó a la concentración final en el tampón nuevamente preparado que contenía DTT y EDTA y se transfirió a la placa de microvaloración. La enzima se diluyó en el

5

10

15

20

26

mismo tampón y se incubó 10 min en el caso de papaína y 20 min en el caso de Der p 1 para su activación. El mezclado, la transferencia y la incubación se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Después de la incubación, la disolución de enzima se transfirió a la placa de microvaloración y se iniciaron las mediciones. Las mediciones se llevaron a cabo durante 10 min con un total de 36 mediciones para cada pocillo y mezcla automática entre cada medición.

Tabla 4. Condiciones del ensayo con enzimas.

Variables

Papaína Der p 1

Sustrato

Z-FR-AMC Boc-QAR-AMC

Inhibidor

E-64 E-64

DTT

1-5 mM 5 mM

EDTA

1-5 mM 1 mM

Tampón

Bis-Tris 50 mM Tris 50 mM

Temperatura

37ºC 37ºC

pH

6,5 7,0

Tiempo de incubación, activación

10 min 20 min

El volumen de ensayo no se dividió equitativamente para cada experimento. Por tanto, los volúmenes específicos para enzima, sustrato, tampón e inhibidor fueron diferentes de experimento a experimento dependiendo del fin del experimento (Tabla 5).

Tabla 5. Volúmenes del ensayo con enzimas.

Variables

Actividad Cinética Valoración de sitios activos

Enzima

50 µl 50 µl 50 µl

Sustrato

100 µl 100 µl 100 µl

Inhibidor

- - 50 µl

Tampón

50 µl 50 µl -

Total

200 µl 200 µl 200 µl

Después de medir la actividad enzimática, la pendiente máxima de la curva de progreso se estimó usando el software SoftMax® PRO Life Sciences Edition, Molecular Devices, 2001. Después de estimar la velocidad inicial de los experimentos se transfirieron a Prism y se analizaron. Ensayo de unión a IgE

Ensayo de inhibición de IgE para alérgeno en disolución y para alérgeno adsorbido y después eluido de un gel de adyuvante de hidróxido de aluminio.

Este ensayo evalúa la capacidad que tiene un alérgeno de unirse a IgE de sueros de pacientes alérgicos a esa fuente de alérgenos. En este contexto, este ensayo se usó para evaluar la influencia de la unión de un alérgeno a hidróxido de aluminio en su capacidad de unirse a IgE, y por tanto, en su actividad alergénica. Procedimiento

Los experimentos de inhibición de IgE se realizaron en un instrumento ADVIA centaur. Las diluciones seriadas (realizadas con TECAN (P-05-07F294)) del inhibidor (antígeno en disolución o vacuna en adyuvante de gel de antígeno) se mezclaron con una cantidad fijada de antígeno biotinilado y se incubaron adicionalmente con una IgE absorbida en la fase sólida. La cantidad de alérgeno biotinilado unido a la fase sólida se estimó como la luz emitida después de la incubación con estreptavidina marcada con éster de acridinio. Los datos sin procesar se procesaron en Excel y se transfirieron a GraphPad Prism v. 4.0 para el análisis final (ajuste a curva, representación y comparaciones estadísticas). Los datos se ajustaron a una función logística de cuatro parámetros:

imagen1

y las curvas ajustadas se consideraron paralelas entre sí cuando la pendiente (HS) de los ajustes individuales no se diferenciaban significativamente. Procedimiento experimental

Debido a la naturaleza del hidróxido de aluminio no es posible evaluar la unión a IgE en presencia de hidróxido de aluminio. Por tanto, el efecto de la adsorción de Der p 1 a hidróxido de aluminio sobre Der p 1 se evaluó después de la elución de la Der p 1. Una muestra de 500 µl de Der p 1 165 µg/ml se incubó con 100 µl de hidróxido de aluminio 6,868 mg/ml durante 1 hora a 4ºC. Después de la adsorción, la disolución se centrifugó durante 5 minutos a 13.000 rpm. El sedimento se resuspendió en 300 µl de tampón fosfato 50 mM y se incubó durante 2 horas con el fin de eluir la Der p 1 adsorbida del hidróxido de aluminio. De la misma forma se trataron 300 µl de control de Der p 1 165 µg/ml sin hidróxido de aluminio. Una muestra de extracto de Der p se preparó para la incubación con IgE de suero reunido. EJEMPLO 1 Optimización de sustrato y enzima

1.1 Fluorescencia del sustrato

Aunque la fluorescencia de AMC se extingue mientras que está unida al péptido, todavía puede medirse algo de fluorescencia. La influencia de la fluorescencia del sustrato sobre el ensayo se evaluó realizando mediciones de fluorescencia del sustrato a diferentes concentraciones. Se usaron concentraciones de sustrato de 0 µM a 200 µM y se midió la fluorescencia del punto final (Figura 2a).

La regresión lineal que describe la relación entre la concentración de sustrato y la fluorescencia tiene una pendiente de:

imagen1

Esto indica que la fluorescencia disminuye 39,07 URF cada vez que se escinde un µM de sustrato. Como un µM de sustrato produce un µM de AMC, el aumento en la fluorescencia a partir del AMC producido es 4106 URF, que significa que el aumento neto en la fluorescencia cuando el

imagen3

Todas las mediciones de fluorescencia se convirtieron en una concentración de AMC producido según la curva patrón presentada en la Figura 2b.

1.2 Concentraciones de enzima y sustrato

Se realizaron estudios preliminares de concentración óptima de enzima y de sustrato para el ensayo de actividad enzimática. Todos los experimentos se llevaron a cabo con DTT 1 mM y EDTA 5 mM en concentraciones de ensayo. De la bibliografía, la papaína debería estar presente en el intervalo de nM y el sustrato en el intervalo de µM, dependiendo del sustrato (Schulz y col.; A Sensitive Fluorescent Assay for Measuring the Cysteine Protease Activity of Der p 1, a Major Allergen From the House Dust Mite Dermatophagoides pteronyssinus, Journal of Clinical Pathology: Molecular Pathology, vol. 51, pág. 222-224, 1998; John y col.; Functional Effects of the Inhibition of the Cysteine Protease Activity of the Major House Dust Mite Allergen Der p 1 by a Novel Peptide-based Inhibitor, Clinical and Experimental Allergy, vol. 30, pág. 784-793, 2000; Szabelski y col; Influence of Me2SO and Incubation Time on Papain Activity Studied Using Fluorogenic Substrates, Acta Biochimica Polonica, vol. 48:4, pág. 995-1002; 2001). Para optimizar las condiciones exactas se usó un diseño experimental de 3 x 3 (Figura 3).

Para la concentración de enzima 1 nM, la señal medida en URF/s era aproximadamente igual al LOQ para el ensayo (LOQ = 2,44 URF/s). Esto hace muy poco fidedignas las mediciones con enzima 1 nM. Para la disolución de papaína 2,5 nM, las mediciones fueron al menos 2,3 veces el LOQ y para la disolución de papaína 10 nM fue 10,6 veces. Estos resultados refuerzan una correlación lineal entre las mediciones de la actividad y la concentración de papaína (véase la Figura 3(b)). La curva de progreso de la disolución de papaína 10 nM con sustrato 200 µM (que dio la mayor actividad) mostró que las URF no superaron 15000 hasta 4 min. Esto era un intervalo razonable para las URF ya que la velocidad inicial se mide durante los dos primeros minutos y la correlación entre URF y la concentración de AMC todavía es lineal. Al mismo tiempo, la correlación entre la concentración de sustrato y la actividad enzimática medida no era lineal, que indica que las concentraciones de sustrato usadas en este experimento fueron superiores a la KM. De estos resultados se eligieron concentraciones de sustrato inferiores a 200 µM y concentraciones de papaína de nM, ya que la actividad medida era al menos un orden de magnitud superior al del LOQ.

5

10

15

20

25

30

29

EJEMPLO 2 Experimentos preliminares sobre la adsorción de hidróxido de aluminio

2.1 Cuantificación de proteína en presencia de hidróxido de aluminio

Para establecer si era posible determinar la concentración de proteína mediante espectroscopía de absorción en una muestra que contenía hidróxido de aluminio se llevaron a cabo mediciones de absorción de papaína en presencia y en ausencia de hidróxido de aluminio.

La absorbancia de las muestras que contenían hidróxido de aluminio mostró un alto nivel de dispersión de la luz, que era de esperar dada la turbidez de la disolución (Figura 4). Como la dilución de la muestra da como resultado concentraciones de proteína inferiores al límite de cuantificación, este procedimiento no es válido para la estimación de proteína bajo las condiciones dadas. Por tanto, la concentración de proteína en una muestra que contenía hidróxido de aluminio se determinó indirectamente restando la cantidad de proteína no unida a hidróxido de aluminio (en la fase líquida) de la cantidad de proteína en la preparación de control (en ausencia de hidróxido de aluminio).

2.2 Sedimentación de hidróxido de aluminio

Para investigar si el hidróxido de aluminio sedimenta durante el periodo de tiempo del ensayo enzimático, la sedimentación se midió como A400 con el tiempo. El perfil de sedimentación gravitacional mostró un umbral de sedimentación a 40 min (Figura 5). Como el ensayo enzimático se completa en 10 min, la sedimentación no se produce en el ensayo. EJEMPLO 3 Componentes de ensayo

Con el fin de verificar si los componentes de ensayo se adsorbieron a hidróxido de aluminio, afectando así el resultado del ensayo enzimático, se llevaron a cabo los siguientes experimentos de unión (Tabla 6).

Tabla 6. Visión general de procedimientos usados para evaluar la influencia de hidróxido de

aluminio sobre los componentes de ensayo. *E-64 no mostró ninguna absorción de luz diferente

entre 200 nm y 900 nm.

Medición

AMC Z-FR-AMC Boc-QAR-AMC E-64*

Punto final

X X X

Actividad

X X X

Todos los ensayos enzimáticos que describen posibles interacciones con hidróxido de aluminio se llevaron a cabo con papaína a una concentración final de 5 nM. Se añadió EDTA a 1 mM y DTT a concentraciones finales de 5 mM. La concentración de hidróxido de aluminio fue 1,14 mg/ml. Como la medición de absorción de 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio muestra un alto nivel de dispersión de la luz, las mediciones de punto final sólo se llevaron a cabo en muestras sin hidróxido de aluminio. Para todos los experimentos referentes a la influencia de hidróxido de aluminio sobre los componentes de ensayo, la adsorción a hidróxido de aluminio se llevó a cabo durante 15 min, 30 min y 60 min.

3.1 AMC

Se evaluó si el AMC, el producto de ensayo, se adsorbe a hidróxido de aluminio con el tiempo. Se llevaron a cabo mediciones a A350 por triplicado de AMC en un control sin hidróxido de aluminio y en una muestra de sobrenadante, o fase líquida (Figura 6) con el tiempo. El sobrenadante se obtiene a partir de un experimento de adsorción en el que se mezclaron juntos AMC 2 µM en 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio, y luego la fracción de fase sólida se separó de la fase líquida por centrifugación durante 5 minutos a 13.000 rpm. Una ANOVA bilateral de los resultados mostró que los dos factores, absorbancia y tiempo (valor de p = 0,40 y valor de p = 0,066, respectivamente) no tenían efecto significativo sobre los resultados. El término de interacción entre factores (valor de p = 0,70) no mostró efecto significativo. Por tanto, el AMC no se adsorbió significativamente a hidróxido de aluminio bajo las condiciones dadas durante un periodo de tiempo de hasta una hora.

Para tratar si la presencia de hidróxido de aluminio extinguió la fluorescencia de AMC se realizó un experimento en el que se midió la fluorescencia de AMC 1 µM con y sin hidróxido de aluminio con el tiempo. Éste indicó que no se produjo extinción durante el tiempo del ensayo (Figura 7). Esta concentración de AMC es equivalente a la concentración de AMC del ensayo enzimático generada por papaína y Der p 1.

3.2 Sustratos

Se examinó si los sustratos usados, Z-FR-AMC y Boc-QAR-AMC, se adsorbieron a hidróxido de aluminio. Para tal fin, los sustratos se mezclaron con 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio. La fase líquida (sobrenadante) se separó de la fase sólida por centrifugación. La concentración de sustrato en el sobrenadante se comparó con la concentración de sustrato en una preparación sin hidróxido de aluminio (control) con el tiempo de dos formas:

a) Comparando la absorción a 325 nm (para ambos sustratos, la absorción máxima

producida a 325 nm (Figura 8)) en ambas preparaciones. Las determinaciones se

realizaron por triplicado usando un concentración de sustrato de 40 µM (Figuras 9a y 10a)

b) Midiendo la actividad enzimática de papaína cuando se mezcla con el control en

ausencia de hidróxido de aluminio, el sustrato en presencia de hidróxido de aluminio

(mezcla) y en el sobrenadante de la mezcla. Las determinaciones se realizaron por

triplicado usando concentraciones de sustrato de 30 µM (Figuras 9b y 10b)

Un ANOVA bilateral de los resultados de absorbancia de Z-FR-AMC indicó que el valor de absorbancia (valor de p = 0,88) no tenía efecto significativo (Figura 9a). Por otra parte, el factor tiempo (valor de p < 0,0001) tuvo un efecto significativo sobre el resultado. Sin embargo, la inspección del diagrama de barras muestra una gran variación en el momento 60 min. Cuando sólo se analizaron puntos de datos durante 15 min y 30 min, el factor tiempo no llega a ser significativo (valor de p = 0,95). Esto es un análisis razonable y confirma la validez del sistema de ensayo.

Para el ensayo de actividad, el análisis estadístico del factor hidróxido de aluminio se llevó a cabo como una ANOVA unilateral (Figura 9b). El motivo para excluir el factor tiempo es que se usaron preparaciones de enzima independientes para cada momento de tiempo, confundiéndose así el tiempo y la concentración de enzima. La ANOVA unilateral mostró que no había diferencia significativa entre las medias de todos los resultados de actividad (p = 0,11). Esto corrobora adicionalmente las mediciones de absorbancia que no indican adsorción de Z-FR-AMC a hidróxido de aluminio.

Una ANOVA bilateral de los resultados de absorbancia de Boc-QAR-AMC indicó que ni el factor absorbancia (valor de p = 0,72), ni el tiempo factor (valor de p = 0,24) ni el factor interacción tenían efecto significativo sobre el resultado (Figura 10a).

Para el ensayo de actividad, la investigación estadística se llevó a cabo de la misma forma que para Z-FR-AMC mediante un ANOVA unilateral referente a la respuesta de actividad sola (Figura 10b). La ANOVA unilateral mostró que no había diferencia significativa entre las medias de todos los resultados de actividad (p = 0,98). Esto corrobora las mediciones de absorbancia que no indican adsorción de Boc-QAR-AMC a hidróxido de aluminio.

3.3 E-64

Para determinar si el inhibidor de cisteína-proteasa E-64 se adsorbió a hidróxido de aluminio se realizaron ensayos enzimáticos en un control de E-64 12,5 nM sin hidróxido de aluminio, una mezcla de E-64 e hidróxido de aluminio, y un sobrenadante de la mezcla, después de haberse separado de la fase sólida por centrifugación. Esta concentración de E-64 no inhibe completamente la actividad enzimática. Por tanto, es posible evaluar la unión de E-64 a hidróxido de aluminio mediante actividad enzimática.

Se realizó un ANOVA unilateral que no indicó diferencia significativa entre las medias (valor de p = 0,79), de ahí que no tenga lugar adsorción (Figura 11). Los momentos de tiempo se confunden con concentración de enzima debido a la preparación separada de enzima.

3.4 Resumen de la influencia de hidróxido de aluminio sobre los componentes del ensayo enzimático

Como conclusión a los experimentos referentes a la influencia del hidróxido de aluminio sobre los componentes del ensayo enzimático se encontró que el hidróxido de aluminio no influye en ninguno de los componentes de ensayo, AMC, Z-FR-AMC, Boc-QAR-AMC y E-64, tanto en mediciones de punto final como en mediciones de la actividad enzimática.

EJEMPLO 4

4.1 Adsorción de papaína a hidróxido de aluminio

Después de la validación del ensayo enzimático con y sin la presencia de hidróxido de aluminio se hizo un diseño experimental para investigar los parámetros cinéticos de papaína y una posible influencia del hidróxido de aluminio sobre ellos. Como se esperaba que la papaína sólo se adsorbiera en un menor grado a hidróxido de aluminio (pI aproximadamente al PZC de hidróxido de aluminio), se eligió como control negativo. Reflejará el posible efecto de la presencia de hidróxido de aluminio en el medio de ensayo sobre los resultados cinéticos cuando la mayor proporción de las moléculas de enzima no esté unida al adyuvante. Una visión general de la preparación de muestras se facilita en la Figura 12.

Se preparó una disolución de 3 ml con 100 µg/ml de papaína y 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio. Esta disolución se colocó durante 1 h a 4ºC para permitir la adsorción de papaína a hidróxido de aluminio. Después de la adsorción se tomaron 500 µl para el posterior análisis y el resto de la mezcla se centrifugó durante 10 min a 4000 rpm. El resto de las muestras analizadas siguen el algoritmo diagnóstico en la Figura 12. Además, se preparó un control (Con) que contenía papaína en tampón Bis-Tris en ausencia de hidróxido de aluminio. El control se incubó como la mezcla de hidróxido de aluminio durante 1 h a 4ºC y después se analizó.

Las muestras se analizaron con los siguientes procedimientos:

•

Determinación de la concentración de proteína (enzima) (A280nm y valoración de sitios activos)

•

Mediciones de la actividad enzimática

4.2 Determinación de la concentración de papaína

La concentración de proteína de las diferentes muestras se evaluó de dos formas:

4.2.1 A280

Estas mediciones se convirtieron en concentración de proteína por la ley de Lambert-Beer usando un coeficiente de absorción molar para papaína de 2,46 mg/ml. Como no es técnicamente posible determinar la concentración de proteína a partir de A280 en presencia de hidróxido de aluminio, la concentración de papaína en la Mezcla 1 y la Mezcla 2 se estimaron indirectamente. La concentración de proteína en la Mezcla 1 era la misma que en Con, y la concentración de proteína en la Mezcla 2 era la diferencia entre Con y Sob 1. Un ANOVA de los resultados no mostró diferencia entre Con y Sob 1 (valor de p = 0,615) que indica que la papaína no se adsorbe significativamente a hidróxido de aluminio. Las concentraciones de papaína estimadas en el control y la cantidad adsorbida a hidróxido de aluminio se muestran en la Tabla 7.

Las mediciones de proteína no representan los 100 µg/ml que era la concentración

estimada en el Con. La pérdida de proteína puede ser debida a la estimación errónea de la concentración de papaína original en la disolución madre. Esta concentración fue medida por el fabricante y, por tanto, no en el mismo instrumento que el resto de las muestras.

Tabla 7. Determinación de los parámetros cinéticos Vmáx, KM y kcat (Vmáx/concentración de 5 proteína), además de la concentración de proteína para papaína. aConcentración de proteína

determinada a A280. bConcentración de proteína determinada por valoración de sitios activos. *Las concentraciones de proteína obtenidas se determinan indirectamente (véase el texto). El control representa una preparación de papaína en ausencia de hidróxido de aluminio. Adsorbida se refiere a una preparación de papaína adsorbida a hidróxido de aluminio (Mezcla 2).

10

Preparación

KM (µM) Vmáx (ng/ml·s) Concentración de proteínaa kcat a (1/s) Concentración de proteínab kcat b (1/s)

Control

22 373,9 70,8 ng/ml 5,13 33,7 ng/ml 11,41

Adsorbida

21 44,1 3,0 ng/ml* 14,58 3,4 ng/ml 12,18

4.2.2 Valoración de sitios activos

Se usó la valoración de sitios activos para estimar la cantidad de enzima activa en las

diferentes muestras. Esto es una diferencia de la concentración de proteína estimada a partir de

A280 que representa el contenido de proteína total de la muestra. Las condiciones de ensayo

15 usadas se indican en la Tabla 8 más adelante. Estos resultados muestran que aproximadamente el 7% (Mezcla 3) de la papaína activa se adsorbió a hidróxido de aluminio, mientras que el 91% (Sob 1 + Sob 2) estaba en disolución. Esto está de acuerdo con los resultados obtenidos en la evaluación de la actividad enzimática en las muestras, véase la Sección 4.3.1.

20 4.3 Actividad enzimática Se realizaron dos tipos de ensayos enzimáticos: (i) mediciones de la actividad usando una concentración fijada de sustrato para evaluar la actividad enzimática y (ii) cinética de Michaelis-Menten para estimar los parámetros cinéticos Vmáx y KM. Todos los ensayos de actividad se realizaron con tampón Bis-Tris, pH 6,5, DTT 5 mM,

25 EDTA 1 mM y Z-FR-AMC como sustrato. Una visión general de los diferentes ensayos enzimáticos realizados se facilita en la Tabla 8. Tabla 8. Especificaciones de ensayos con enzimas para el experimento de adsorción de papaína. Las mediciones de la actividad son combinaciones individuales de enzima y sustrato con el fin de evaluar el nivel de actividad en muestras. Las mediciones cinéticas de Michaelis-Menten de la

30 actividad enzimática con diferentes concentraciones de sustrato se usan para estimar Vmáx y KM.

Todas las mediciones fueron por triplicado.

Parámetro de análisis

Actividad Cinética de Michelis-Menten Valoración de sitios activos

Dilución (Con, Mezcla 1, Sob 1)

2048, 1024, 512, 256 1024 1024

Dilución (Mezcla 2, Sob 2, Mezcla 3)

2048,1024, 512, 256 128 128

Concentración de sustrato

30 µM 12,5 µM, 25 µM, 37,5 µM, 50 µM, 75 µM, 100 µM, 125 µM, 150 µM 30 µM

Concentración de inhibidor

0,0 nM, 0,25 nM, 0,50 nM, 1,0 nM, 1,5 nm, 2,0 nM, 3,0 nM, 4,0 nM

Tiempo de incubación con DTT

10 min 10 min 60 min*

*Incubación tanto con DTT como con E-64.

4.3.1 Evaluación de la actividad enzimática

Las mediciones de la actividad se usaron para analizar cuantitativamente la cantidad de papaína adsorbida a hidróxido de aluminio y la cantidad libremente distribuida en la disolución. El 96% de la actividad en la Mezcla 1 se encontró en disolución (Sob 1 + Sob 2), mientras que el 8%

5 de la actividad de papaína se adsorbió a hidróxido de aluminio (Mezcla 3). La actividad del control es un 17% inferior a la actividad de la Mezcla 1. Esto podría ser debido a una pérdida de actividad de la proteína en el control durante el periodo de tiempo del experimento. Esta pérdida se evitó por la presencia de hidróxido de aluminio.

Con el fin de evaluar adicionalmente esta observación se realizaron nuevos experimentos

10 en los que la actividad de la papaína se siguió con el tiempo en ausencia de hidróxido de aluminio. La papaína se mezcló con tampón Bis-Tris 50 mM a una concentración final de 10 µg/ml en un volumen total de 500 µl. La mezcla se incubó a 4ºC y las muestras se tomaron a 0, 30 y 60 min. Las muestras se diluyeron y se incubaron durante 10 min en tampón que contenía DTT y posteriormente se midió la actividad después de la adición de sustrato. Los resultados analizados

15 con ANOVA unilateral mostraron que había una diferencia significativa entre los 3 momentos de tiempo (valor de p = 0,015) y por la prueba de comparación de Newman-Keuis se encontró que se diferenciaban 60 min de los otros dos puntos de tiempo, y era un 7% inferior. Estos resultados sugieren que durante los 60 min de incubación entre papaína e hidróxido de aluminio, la papaína en la muestra de control ha perdido el 7% de su actividad. Se produce una pérdida adicional hasta el inicio del ensayo enzimático.

4.3.2 Parámetros cinéticos de Michaelis-Menten

Los parámetros de Michaelis-Menten KM y Vmáx se evaluaron en las diferentes muestras.

Los valores estimados de KM y Vmáx de las diferentes muestras se muestran en la Tabla 7 anterior. La prueba de Bartlett no indicó diferencia significativa entre las varianzas de muestras de KM (valor de p = 0,758) y se usó un ANOVA unilateral para comparar medias. La prueba de ANOVA unilateral no mostró diferencia significativa entre cálculos aproximados de KM (valor de p = 0,999), que indica que la afinidad hacia el sustrato no cambia cuando la papaína está en presencia y en ausencia de hidróxido de aluminio.

La Vmáx en disolución (Sob 1 + Sob 2) es el 97% de la de en la Mezcla 1, mientras que la Vmáx en la Mezcla 3 se corresponde con el 7%.

La Vmáx es específica para una enzima definida y depende linealmente de la concentración de enzima en el ensayo. La normalización de Vmáx por la concentración de enzima da el parámetro kcat, que sólo depende de las características de la actividad enzimática. La Tabla 7 anterior muestra los valores estimados de kcat para las diferentes muestras calculados a partir de los valores de concentración de enzima obtenidos a partir de la valoración de sitios activos y A280.

Los valores de kcat obtenidos a partir de la determinación de A280 de la concentración de proteína fueron aproximadamente la mitad de los obtenidos con la valoración de sitios activos en el control, que indica que la mitad de la proteína en las muestras era inactiva. Los valores de kcat de Con, Mezcla 1, Sob 1, Mezcla 2 y Mezcla 3 son comparables cuando la concentración de enzima se calculó por valoración de sitios activos, sugiriendo que la presencia de hidróxido de aluminio no afecta las propiedades cinéticas de la papaína. Los valores de kcat de Con, Mezcla 1, Sob 1 y Sob 2 también son comparables cuando la concentración de enzima se calcula a partir de A280. Sin embargo, la determinación indirecta de la concentración de proteína en la Mezcla 2 hace que el valor de kcat sea más impreciso.

El hecho de que los parámetros cinéticos evaluados en presencia y en ausencia de hidróxido de aluminio no sean significativamente diferentes indica que la presencia de hidróxido de aluminio no afectó la reacción enzimática. Como conclusión, estos resultados muestran que es posible medir las propiedades enzimáticas de una enzima en presencia de hidróxido de aluminio cuando la mayor parte de la enzima (93%) no está unida al adyuvante.

EJEMPLO 5

5.1 Adsorción de Der p 1 a hidróxido de aluminio

Según la teoría de adsorción de proteínas a hidróxido de aluminio, se esperaba que Der p 1 se adsorbiera (pI inferior al PZC del hidróxido de aluminio). Se examinó el efecto de esta adsorción sobre la actividad y la estructura de Der p 1.

Una visión general de la preparación de muestras se facilita en la Figura 13. Se preparó una disolución de 3 ml con 100 µg/ml de Der p 1 y 1,14 mg/ml de hidróxido de aluminio. Esta disolución se colocó durante 1 h a 4ºC para permitir la adsorción de Der p 1 a hidróxido de aluminio. Después de la adsorción se tomaron 500 µl para el análisis adicional y el resto de la mezcla se centrifugó durante 10 min a 4000 rpm. Se realizó una etapa de elución durante 1 h a 4ºC en la que el sedimento de la Mezcla 2 se resuspendió en tampón fosfato. Además, se prepararon dos controles (Con 1 y Con 2) que contenían Der p 1 en tampón Tris en ausencia de hidróxido de aluminio. Con 1 se analizó al principio del experimento y Con 2 se analizó al final del experimento de 2 horas.

Las muestras se analizaron con los siguientes procedimientos:

•

Determinación de la concentración de proteína (A280 nm y RIE)

•

Mediciones de la actividad enzimática

•

Unión a IgE

5.2 Determinación de la concentración de Der p 1

La determinación de la concentración de Der p 1 en las diferentes muestras se evaluó por A280 y RIE.

5.2.1 A280

Con el fin de cuantificar el contenido de proteína, la absorbancia a 280 nm se midió en muestras sin hidróxido de aluminio (Con 1, Con 2, Sob y Elu). Las mediciones de absorbancia se convirtieron en la concentración de proteína por la ley de Lambert-Beer usando un coeficiente de absorción molar para Der p 1 de 1,72 mg/ml como se muestra en la Tabla 8a.

Tabla 8a. Determinación de los parámetros cinéticos Vmáx, Km y kcat (Vmáx/concentración de

proteína), además de concentración de proteína para Der p1. aConcentración de proteína

determinada a A280. Concentración de proteína determinada por RIE. *Las concentraciones de

proteína obtenidas se determinan indirectamente (véase el texto). El control representa una

preparación de Der p 1 en ausencia de hidróxido de aluminio. Adsorbida se refiere a una

preparación de Der p 1 adsorbida a hidróxido de aluminio (Mezcla 2).

Preparación

KM (µM) Vmáx (ng/ml·s) Concentración de proteínaa kcat a (1/s) Concentración de proteínac kcat c (1/s)

Control

47 0,25 10,4 0,024 13,9 0,018

Adsorbida

56 0,15 7,1* 0,022 7,8 0,019

Eluida

51 0,11 4,0 0,025 7,6 0,014

La concentración de proteína en la Mezcla 1 y la Mezcla 2 se estimó indirectamente. La concentración de proteína en la Mezcla 1 se consideró la misma que en Con 1 y la concentración de proteína en la Mezcla 2 era la diferencia entre Con 1 y Sob. Una prueba de la t no mostró

5 diferencia significativa entre la concentración de proteína en Con 1 y Con 2 (valor de p = 0,092). El 32% del contenido de proteína en Con 1 se encontró en Sob, que indica un grado de adsorción de aproximadamente el 70%. De la proteína adsorbida, el 56% se eluyó de hidróxido de aluminio usando tampón fosfato.

5.2.2 RIE

10 Otro procedimiento aplicado para cuantificar el contenido de proteína era RIE. Las muestras Con 1, Con 2, Sob y Elu se evaluaron juntas con tres patrones de Der p 1 (125 ng, 250 ng y 500 ng). En la Tabla 8a se muestran las concentraciones de Der p 1 estimadas de Der p 1 en el control, la cantidad adsorbida a hidróxido de aluminio, además de la cantidad eluida. Los valores estimados se generaron a partir de la curva patrón de regresión lineal de los

15 tres patrones (concentración en función del área de precipitado). El 44% del contenido de proteína en Con 1 se encontró en Sob que indica indirectamente un grado de adsorción de aproximadamente el 56%. De la proteína adsorbida, el 98% se eluyó de hidróxido de aluminio usando tampón fosfato. La concentración de Con 1 y Con 2 estaba fuera del área de predicción de la curva patrón y, por tanto, es probable que la concentración de Der p 1 esté subestimada. Esto

20 puede explicar el alto grado de elución de Der p 1 de hidróxido de aluminio ya que la concentración de Der p 1 adsorbida se estima como la diferencia entre Con 1 y Sob.

5.3 Actividad enzimática

Se realizaron diferentes tipos de ensayos enzimáticos: (i) mediciones de la actividad usando una concentración fijada de sustrato para evaluar la actividad enzimática, y (ii) cinética de 25 Michaelis-Menten para estimar los parámetros cinéticos Vmáx y KM.

Todos los ensayos de actividad se realizaron con tampón Tris, pH 7,0, DTT 5 mM, EDTA 1 mM y Boc-QAR-AMC como sustrato. Una visión general de los diferentes ensayos enzimáticos realizados se facilita en la Tabla 9. Tabla 9. Especificaciones de ensayos con enzimas para el experimento de adsorción de Der p 1.

30 Las mediciones de la actividad son combinaciones individuales de enzima y sustrato con el fin de

evaluar el nivel de actividad en muestras. Las mediciones cinéticas de Michaelis-Menten de la actividad enzimática con diferentes concentraciones de sustrato se usan para estimar Vmáx y KM. Todas las mediciones fueron por triplicado.

Parámetro de análisis

Medición de la actividad Cinética de Michelis-Menten

Dilución (Con 1, Mezcla 1, Sob, Mezcla 2, Elu, Con 2)

4 y 8 8

Concentración de sustrato

100 µM 25 µM, 50 µM, 75 µM, 100 µM, 150 µM, 200 µM

Concentración de inhibidor

Tiempo de incubación

20 min 20 min

* Incubación tanto con DTT como con E-64.

5.3.1 Evaluación de la actividad enzimática

5 Las mediciones de la actividad de Der p 1 en ausencia y en presencia de hidróxido de aluminio se usaron para cuantificar la cantidad de Der p 1 adsorbida a hidróxido de aluminio y la cantidad libremente distribuida en la disolución. Los resultados de las mediciones de la actividad se resumen en la Figura 14.

La actividad de la Der p 1 no adsorbida en Sob se corresponde con el 33% de la actividad

10 en la Mezcla 1. El 66% de la actividad de Der p 1 se adsorbió a hidróxido de aluminio y el 67% de esta actividad se desorbió después de la elución de la Mezcla 2 con tampón fosfato. Con el fin de monitorizar la estabilidad de Der p 1 durante el periodo de experimento, la actividad de Con 1 se midió al principio del experimento y Con 2 al final. La realización de una ANOVA unilateral en Con 1, Con 2 y Mezcla 1 no mostró diferencia significativa entre las medias (valor de p = 0,76). Esto

15 indica que ni el tiempo ni la presencia de hidróxido de aluminio influyen en la actividad de Der p 1 bajo estas condiciones.

5.3.2 Parámetros cinéticos de Michaelis-Menten

Los parámetros de Michaelis-Menten KM y Vmáx se evaluaron en las diferentes muestras. La Figura 15 muestra una curva típica de Michaelis-Menten para Der p 1 en presencia de

20 hidróxido de aluminio. Los valores de KM y Vmáx se muestran en la Tabla 8a. La prueba de Bartlett no indicó diferencia significativa entre las varianzas de KM (valor de p = 0,11) y una ANOVA unilateral no mostró diferencia significativa entre las medias de las muestras (valor de p = 0,62). Esto indica que la afinidad de Der p 1 hacia Boc-QAR-AMC no cambia en presencia de hidróxido de aluminio.

25 La Vmáx de Con 2 es un 14% inferior a Vmáx en Con 1 (prueba de la t, valor de p = 0,0024) que indica que Der p 1 ha perdido actividad durante el periodo de tiempo del experimento. Una prueba de comparación múltiple de Newman-Keuls no mostró diferencia significativa entre Vmáx de Con 1 y la Mezcla 1 (p > 0,05), sugiriendo que el hidróxido de aluminio no tuvo influencia en la actividad de Der p 1. Además, parece que el hidróxido de aluminio ha evitado la pérdida de actividad en el tiempo observado de Con 1 a Con 2. La Vmáx en Sob y la Mezcla 2 es el 30% y el 62% de Vmáx en la Mezcla 1, respectivamente. El 68% de la actividad en la Mezcla 2 se encontró en Elu.

Los valores de kcat de Der p 1 se estimaron a partir de los valores de Vmáx obtenidos y las concentraciones de proteína obtenidas de los diferentes procedimientos (A280 y RIE) como se muestra en la Tabla 8a. Los valores de kcat de las diferentes muestras son comparables cuando la concentración de proteína se estimó por A280 y RIE.

Como conclusión, los valores de KM y kcat obtenidos para Der p 1 no fueron significativamente diferentes en ausencia de hidróxido de aluminio ni cuando la mayor parte de las moléculas de Der p 1 (60-70%) se adsorben al hidróxido de aluminio. Estos datos corroboran que es posible medir la actividad enzimática de una enzima adsorbida a hidróxido de aluminio haciendo una evaluación del impacto que tiene la adsorción de una enzima a hidróxido de aluminio sobre la actividad/estructura de la enzima posible.

5.4 Unión a IgE

Se evaluó la influencia del hidróxido de aluminio sobre la capacidad de Der p 1 en ausencia de hidróxido de aluminio (Con 1) y de Der p 1 unida y eluida de hidróxido de aluminio (Elu) para unirse a IgE de sueros de pacientes alérgicos a HDM.

La inhibición de la señal de Der p 1 patrón marcada con biotina usando concentraciones crecientes de Der p 1 en Con 1 y Elu bajo evaluación siguió una curva descendente sigmoide (Figura 16).

Comparando la curva de Con 1 con Elu es evidente que los niveles de fondo son idénticos, por tanto es posible la inhibición completa en cualquier caso. Esto indica que todos los epítopos de IgE en Con 1 todavía estaban presentes en Elu. Una prueba de la t de una muestra que compara las pendientes de Con 1 y Elu mostró que las medias no eran significativamente diferentes (p = 0,83), que indica que la afinidad de IgE hacia epítopos en Der p 1 se conservó tras la unión a hidróxido de aluminio

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1.-Un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe en la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.
2. 2.-Un procedimiento para la cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase sólida y una fase líquida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe a la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida para cuantificar la cantidad de enzima alergénica.
3. 3.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que se usa un sustrato específico para una enzima alergénica para medir la actividad enzimática de la enzima alergénica.
4. 4.-El procedimiento según la reivindicación 3, en el que se usa un inhibidor para inhibir una o más de la(s) enzima(s) alergénica(s) en la preparación de vacuna.
5. 5.-El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que la(s) enzima(s) alergénica(s) está(n) en forma de un extracto.
6. 6.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos una de las enzimas alergénicas es una cisteína-proteasa.
7. 7.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos una de las enzimas alergénicas es una serina-proteasa.
8. 8.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la(s) enzima(s) alergénica(s) es (son) una o más seleccionadas del grupo que está constituido por Der p 1, Der p 3, Der p 6 y Der p 9.
9. 9.-El procedimiento según la reivindicación 8, en el que la enzima alergénica es Der p 1.
10. 10.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-9, en el que el sustrato usado es Z-LeuLeuGlu-MCA. 11.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el ensayo de actividad enzimática es un ensayo de absorbancia, ensayo de fluorescencia, FTIR o un 5 procedimiento inmunológico. 12.-El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la ensayo de actividad enzimática es un ELISA. 13.-El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la ensayo de actividad enzimática es un ensayo de fluorescencia.

    10 14.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la preparación de vacuna se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1) como a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2), o se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2) como a una medición

    15 de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida (medición 3). 15.-El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la preparación de vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida (medición 3).

    20