BRPI0619056A2

BRPI0619056A2 - anticorpo monovalente, método para preparar e produzir um antcorpo monovalente, construção de ácido nucleico, célula hospedeira, imunoconjugado, uso de um anticorpo monovalente, e, composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0619056A2
Application number: BRPI0619056-1A
Authority: BR
Inventors: Paul Parren; Janine Schuurman; Tom Vink; Willem Karem Bleeker; De Winkel Jan G J Van; Berkel Patrick Van; Frank Beurskens
Original assignee: Genmab As
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2006-11-28
Publication date: 2011-09-20
Also published as: JP5525729B2; KR20150041197A; US10155816B2; US20090226421A1; CA2631184A1; KR101866623B1; EA016609B1; EA200801460A1; US20190169298A1; AU2006317242A1; JP2016182138A; JP2014128266A; WO2007059782A1; JP2009517006A; US20220396629A1; KR20080090406A; JP6341954B2; SG10201600950TA; EP1973576A1; EP1973576B1

Abstract

ANTICORPO MONO VALENTE, MéTODO PARA PREPARAR E PRODUZIR UM ANTICORPO MONO VALENTE, CONSTRUçãO DE áCIDO NUCLEICO, CéLULA HOSPEDEIRA, IMUNOCONJUGADO, USO DE UM ANTICORPO MONOVALENTE, E, COMPOSIçãO FARMACêUTICA. A presente invenção provê anticorpos monovalentes com uma meia-vida longa quando administrados in vivo, métodos de fabricar estes anticorpos monovalentes, composições farmacêuticas compreendendo estes anticorpos, e usos dos anticorpos monovalentes.

Description

"ANTICORPO MONOVALENTE, MÉTODO PARA PREPARAR E PRODUZIR UM ANTICORPO MONOVALENTE, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, IMUNOCONJUGADO, USO DE UM ANTICORPO MONOVALENTE, E, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA."

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a anticorpos monovalentes que podem ser usados em aplicações terapêuticas. A invenção também refere-se a métodos para produzir o anticorpo monovalente, composições farmacêuticas compreendendo estes anticorpos monovalentes e uso dos mesmos para diferentes aplicações terapêuticas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Os anticorpos nativos e imunoglobulina são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia leve é composta de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve (abreviada aqui como Cl). Cada cadeia pesada é composta de uma região variável de cadeia pesada (Vh) e uma região constante de cadeia pesada (Ch) consistindo de três domínios, Ch 1, CH2 e Ch3). Ch1 e Ch2 da cadeia pesada são separados um do outro por assim chamada região de gancho. A região de gancho normalmente compreende um ou mais resíduos cisteína, que podem formar pontes dissulfeto com os resíduos de cisteína da região de gancho da outra cadeia pesada na molécula de anticorpo.

Recentemente, anticorpos se tornaram uma área de foco principal para aplicações terapêuticas, e muitos produtos de fármacos de anticorpos foram aprovados ou estão em processo de serem aprovados para uso como fármacos terapêuticos. As características desejadas de anticorpos terapêuticos podem variar de acordo com a condição específica que deve ser tratada. Para algumas indicações, somente a ligação do antígeno é requerida, por exemplo onde o efeito terapêutico do anticorpo é bloquear a interação entre o antígeno e uma ou mais moléculas específicas de outra forma capazes de ligar ao antígeno. Para tais indicações, o uso de fragmentos Fab, dos quais a única função é ligar antígeno, pode ser preferido. Para outras indicações, outros efeitos também podem ser requeridos, como por exemplo a habilidade de induzir ativação do complemento e/ou a habilidade de, por exemplo, ligar os receptores de Fc, proteger do catabolismo, recrutar células imunes, etc. Para tal uso, outras partes da molécula de anticorpo, como a região Fc, podem ser requeridas. Alguns anticorpos de comprimento completo podem demonstrar efeitos agonísticos (que podem ser considerados como sendo indesejáveis) quando da ligação ao antígeno alvo, mesmo se o anticorpo trabalhar como um antagonista quando usado como um fragmento Fab. Em alguns casos, este efeito pode ser atribuído à "reticulação" dos anticorpos bivalentes, que por sua vez, promovem a dimerização do alvo, o que pode levar à ativação, especialmente quando o alvo é um receptor. No caso de antígenos solúveis, a dimerização pode formar complexos imunes indesejáveis.

Em alguns casos, a ligação monovalente a um antígeno, como no caso de FcaRI, pode induzir sinais apoptóticos (Kanamura et al., Blood publicado on Iine em 25 de setembro de 2006)).

Para alguma indicação, os anticorpos monovalentes podem, assim, ser preferíveis. Os fragmentos Fab atualmente disponíveis mostram farmacocinéticas inferiores devido a seu pequeno tamanho resultando em filtração nos rins bem como sua incapacidade de interagir com o receptor FcRn de Brambell (Junghans RP et al., Proc. Natl Acad Sci USA 93 (11), 5512-6 (1996)), sendo assim instável in vivo e tendo depuração muito rápido após administração.

Anticorpos diméricos monovalentes (Fab/c), em que a região Fc compreende dois polipeptídeos Fc, também foram descritos (W0200563816 para Genentech e Parham P, J Immunol. 131 (6), 2895-902 (1983).

Existe, assim, uma necessidade de anticorpos monovalentes estáveis para uso como terapêuticos.

A deleção de um ou mais dos domínios de anticorpos de comprimento completo, cobrindo, por exemplo, regiões compreendendo resíduos de aminoácidos necessários para formar ligações dissulfeto ou provendo contatos de inter-cadeias pesadas não covalentes no anticorpo pode ser um modo de construir anticorpos monovalentes.

Igarashi et al. (Igarashi, TM. et al., Biochemistry 29, 5727 (1990)) descrevem a estrutura de uma molécula de IgG2a de camundongo em que o domínio ChI total foi deletado, mas a região de gancho estava intacta. O anticorpo deletado em ChI é mostrado como existindo como uma estrutura alongada com um ângulo de gancho relativamente pequeno. A molécula, no entanto, reteve a configuração tetramérica regular consistindo de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas esperadas para IgGs, e era assim ainda bivalente, e a deleção de CrI não afetou a afinidade do anticorpo mutante.

Larson et al. (Larson, SB. et al., J. Mol Biol. 348, 1177 (2005)) descrevem a estrutura de um anticorpo IgGl humanizado em que o domínio Ch2 foi deletado. Este anticorpo existe em duas formas moleculares, denominadas forma A e forma Β. A forma A contém duas ligações dissulfeto inter-cadeias na estrutura, enquanto a forma B não contém ligações dissulfeto inter-cadeias. A forma B existe como a molécula de ~ 122 kDa que parece ser mantida junta por interações não covalentes no domínio CH3- O anticorpo exibe rápida depuração no soro por causa de uma incapacidade de ligar e reciclar através dos receptores FcRn.

Meias-moléculas de Ig, que têm configuração dimérica consistindo de somente uma cadeia leve e somente uma cadeia pesada, foram descritas como o resultado de deleções raras em plasmacitomas de humanos e de murinos. Vários pacientes sofrendo de plasmacitoma de tecido mole extramedular, macroglobulinemia de Waldenstrõm, leucemia de células do plasma e mieloma múltiplo, excretaram meias-moléculas de IgG em sua urina. Verificou-se também que meias-moléculas também estão presentes em seu soro. Estudos sobre a natureza bioquímica destas meias-moléculas mostraram que elas consistem de moléculas de IgGl em que as regiões de ChI de cadeia pesada, de gancho e de Ch2 pareceram normais, enquanto deleções foram encontradas na região de CH3. A deleção no domínio constante Ch3 na meia molécula de IgGl analisada por Spiegelberg foi mostrado englobar 5.000-8.000 daltons e a seqüência de peptídeo de gancho foi idêntica a IgGl do tipo selvagem. As mutações pareceram estar localizadas em CH3 e o peptídeo de gancho pareceu normal (Hobbs, JR et al., Clin Exp Immunol 5, 199 (1969); Hobbs, JR, Br Med J 2, 67 (1971); Spiegeberg, HL et al., Blood 45, 305 (1975); Spiegelbert, HL et al., Biochemistry 14, 2157 (1975); Seligmann ME et al., Ann Immunol (Paris) 129C, 855-870 (1978); Gallango, ML et al., Blut 48, 91 (1983)). Também foi mostrado que esta meia molécula de IgGl humana é rapidamente catabolizada (a meia vida no homem foi de 4,3 dias) e, na forma monomérica, é incapaz de ligar os receptores Clq ou Fc em linfócitos, monócitos ou neutrófilos humanos (Spiegelberg, HL. J Clin Invest 56, 588 (1975)). Foi concluído destes estudos que na meia molécula de IgGl faltam interações não covalentes características para a porção de Fc na cadeia pesada de IgG que desestabiliza a molécula, e que o domínio CH3 pode ser particularmente importante para manter as interações entre as cadeia pesadas de IgG.

Meias moléculas de IgA de murino que foram geradas por mutação somática também são descritas (Mushinski, JF, J Immunol 106, 41 (1971); Mushinski, JF et al., J Immunol 117, 1668 (1976); Potter, M et al., J Mol Biol 93, 537 (1964); Robinson, EA et al., J Biol Chem 249, 6605 (1974); Zack, DJ et al., J Exp Med 154, 1554 (1981)). Mostrou-se que estas moléculas contêm, todas, as deleções do domínio Ch3 ou mutações no limite de Ch2- Ch3. As meias-moléculas de IgA humanas também foram detectadas em pacientes com mieloma múltiplo. Verificou-se que estas moléculas têm deleções localizadas nas regiões de Ch3 também (Spiegelberg, HL et al., J Clin Invest 58, 1259 (1976); Kawai, T. et al., Ann Acad Med Singapore 9, 50 (1980); Sakurabayashi, I. et al., Blood 53, 269 (1979); Biewenga, J. et al., Clin Exp Immunol 51, 395 (1983)).

Mutantes de IgGl humanos com deleções no gancho são descritos e cristalizados (Saphire, EO et al., J Mol Biol 319, 95 (2002). Dob e Mog são proteínas de mieloma humano da subclasse de IgGl humano que contêm uma deleção da região de gancho. As moléculas de IgGl deletadas no gancho formam Igs estáveis com uma estrutura consistindo de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves, que é a estrutura heterotetramérica típica de anticorpos que, no entanto, formam ligações dissulfeto inter-cadeias entre as cadeias leves, resultando em moléculas que são fortemente conformacionalmente restritas e que exibem pouca a nenhuma função efetuadora (Burton DR et al., J Mol Biol 319, 9 (2002); Steiner, A. Et al., Biochemistry 18, 4068 (1979); Silverton, EW et al., Proc Natl Acad Sci USA 74, 5140 (1977); Rajan, SS et al., Mol Immunol 20, 787 (1983); Guddat, W et al., Proc Natl Acad Sei USA 90, 4271 (1993); Sarma, R. et al., J. Applied Cryst. 15, 476 (1982); Klein, M. et al., Proe Natl Aead Sei USA 78, 524 (1981)).

Uma molécula de IgG3 em que as regiões de gancho superior e média ou a região de gancho foi deletada, foi projetada (Brekke, OH et al., Nature 363, 628 (1993); Brekke, OH et al., Nature 383, 103 (1996)). A molécula com o gancho total deletado mostrou a presença de meias-moléculas quando da análise em SDS-PAGE sem redução. Uma segunda molécula deletada no gancho, em que os ganchos de IgG3 superior e inferior foram substituídos por uma cisteína única e o gancho de IgG3 inferior continha uma deleção de Ala única, também continha meias-moléculas quando analisado em SDS-PAGE. No entanto, os resultados mostram que em condições fisiológicas, as duas meias-moléculas de cadeia pesada-leve são mantidas juntas por interações não covalentes entre os domínios Cr3 de IgG3; e moléculas de IgG intactas foram, assim, formadas.

Um conjunto correspondido de anticorpos IgGl e IgG4 quiméricos também foi preparado (Horgan, C. et al., J Immunol 150, 5400 (1993)). Para investigar o papel da região de gancho de IgG na ligação de anticorpo a antígeno, mutantes foram preparados de ambos IgGl e IgG4 que faltavam na região de gancho. Os mutantes foram gerados ao nível de DNA deletando o exon da região de gancho dos genes de cadeia pesada de IgGl e IgG4. Foi descrito que ambas as moléculas deletadas no gancho de IgGl e IgG4 eram bivalentes, tendo assim a estrutura heterotetramérica típica. Em apoio a isto, a afinidade funcional de IgG4 deletado no gancho mostrou melhor ligação de antígeno do que IgG4 do tipo selvagem, indicando que a avidez da molécula deletada no gancho não é afetada pela deleção do gancho assim gerado.

Moléculas de IgG4 humanas existem em várias formas moleculares que diferem pela ausência ou presença de ligações dissulfeto de inter-cadeias pesadas localizadas na região de gancho. Assim, as moléculas de IgG4 existem em que duas, uma ou nenhuma ligações dissulfeto de inter- cadeias pesadas são formadas (Schuurman, J. Et al., Mol Immunol 38, 1 (2001)). Em condições fisiológicas, estas formas moleculares de IgG4 podem estar em equilíbrio umas com as outras. IgG4s humanos existem como tetrâmeros em solução consistindo de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves de Ig, como comum para moléculas de imunoglobulina G, independente da ausência ou presença destas ligações dissulfeto inter-cadeias (Schuurman 2001 supra·, Gregory, L. et al., Mol Immunol 24, 821 (1987)). Somente em desnaturação em condições não redutoras, as duas meias-moléculas não covalentemente associadas dissociam-se como demonstrado por análise de determinação de tamanho como SDS-PAGE (Schuurman, J. et al. Mol Immunol 38, 1 (2001); Deng, L et al., Biotechnol Appl Biochem 40, 261 (2004)). Foi mostrado que a mutação dos resíduos da região de gancho que estão envolvidos na formação de ligações dissulfeto inter-cadeias ou deleção da região de gancho leva à criação de uma montagem homogênea de moléculas de IgG4 em solução, cuja montagem consiste de moléculas tetraméricas consistindo de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas (Schuurman, J. et al., Mol Immunol 38, 1 (2001); Horgan, C. et al., J Immunol 150, 5400 (1993)). Os anticorpos mudados e deletados no gancho de IgG4 também demonstraram uma capacidade melhorada de reticulação de antígeno quando comparados a moléculas e IgG4 nativas (Horgan, C. (1993) supra).

Um número de estudos mostra agora que a mutação ou deleção dos domínios ChI e CH2 da região constante de IgG não afeta a combinação de moléculas de IgG em sua configuração heterotetramérica de duas cadeias pesadas e duas cadeias leves natural. Moléculas de anticorpos recombinantes contendo diferentes deleções em suas regiões constantes de cadeia pesada mostram ser afetadas em sua função efetuadora, por exemplo, elas não são capazes de ativar o complemento, no entanto, elas permanecem sua capacidade de reticulação de antígeno. Além disso, foi demonstrado que meias-moléculas de anticorpos contendo uma cadeia pesada e uma cadeia leve não são estáveis in vivo e/ou têm uma meia-vida diminuída in vivo. As deleções em/da região de Ch3 provêm meias-moléculas tendo uma metabolização rápida tornando as mesmas impróprias para a maioria dos fins terapêuticos.

Existe uma necessidade de um procedimento simples para a produção de anticorpo monovalente estável, que pode ser apropriado para aplicações terapêuticas, em que o bloqueio de uma atividade mediada por antígeno requer ligação de anticorpo monovalente (ausência de reticulação).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê um método para produzir um anticorpo monovalente, referido método compreendendo

A)

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando a região Cl constante de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativãmente juntas, e em que, no caso de um subtipo de IgGl, a seqüência nucleotídica codificando a região Cl foi modificada de modo que uma região Cl não contém quaisquer aminoácidos capazes de formar ligações dissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma região Cl na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um animal ou ser humano; ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando uma região constante Ch de uma Ig humana, em que a seqüência nucleotídica codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região CH, como a região Ch3, não compreendem quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes estáveis com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma região Ch da Ig humana na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um animal ou ser humano, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Ch de referida Ig são ligadas operativãmente juntas;

iii) prover um sistema de expressão de células para produzir referido anticorpo monovalente ;

iv) produzir referido anticorpo monovalente por co-expressão das construções de ácido nucleico de (i) e (ii) em células do sistema de expressão de células de (iii).

Em uma forma de realização do método, a Ig humana é um anticorpo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA ou IgD, como um anticorpo de IgGl, IgG2 ou IgG4.

B) Além disso, método é provido, em que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região CH3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q); Asp (D) em posição 239 foi substituído por Glu (E); Lys (K) em posição 292 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 302 foi substituído por Glu (E); e Pro (P) em posição 328 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com B), em que Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q).

Método de acordo com B), em que Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q), e Pro (P) em posição 328 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com B), em que todas as cinco substituições

foram feitas.

C) Método de acordo com A) ou B, em que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve kappa Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 18, em que a região Cl foi modificada de modo que o resíduo de cisteína terminal em posição 106 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou foi deletado.

D) Método de acordo com A) ou B), em que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve lambda Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 17, em que a região Cl foi modificada de modo que resíduo de cisteína em posição 104 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou foi deletado.

F) Método de acordo com A) ou B), C) ou D), em que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região ChI foi modificada de modo que Ser (S) em posição 14 foi substituído por um resíduo cisteína.

G) Método de acordo com A), em que a Ig humana é uma IgG2 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 20, em que a região Ch3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q); Met (M) em posição 276 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 288 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 298 foi substituído por Glu (E); e Pro (P) em posição 324 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com G), em que Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q).

Método de acordo com G), em que Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q); e Pro (P) em posição 324 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com G), em que todas as cinco substituições foram feitas.

H) Método de acordo com A), em que a Ig humana é uma IgG3 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 21, em que a região CH3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q); Ser (S) em posição 314 foi substituído por Asn (N); Asn (N) em posição 322 foi substituído por Lys (K); Met (M) em posição 327 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 339 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 349 foi substituído por Glu (E); Ile (I) em posição 352 foi substituído por Val (V); Arg (R) em posição 365 foi substituído por His (H); Phe (F) em posição 366 foi substituído por Tyr (Y); e Pro (P) em posição 375 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com H), em que Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q).

Método de acordo com H), em que Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q); e Pro (P) em posição 375 foi substituído por Leu (L).

Método de acordo com H), em que todas as dez substituições foram feitas.

A presente invenção também provê um método para produzir um anticorpo monovalente, referido método compreendendo

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e seqüência nucleica codificando a região constante (Cl) de uma Ig5 em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativamente juntas;

ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e ácido nucleico codificando a região Ch de uma IgG4 humana em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho de uma cadeia pesada não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) de IgG4 humana, em que referido ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referido ácido nucleico codificando a região Ch de IgG4 são ligados operativamente juntos;

iii) prover um sistema de expressão de células para produzir referido anticorpo;

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente obtido pelo uso de um método de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente obtenível pelo uso de um método de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que

a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma Ig,

e

b) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vh) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) de IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que nenhum dentre qualquer um dos resíduos de aminoácidos presentes na região correspondendo à região de gancho são capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) de IgG4 humana.

A presente invenção também provê um método de preparação de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção, o método compreendendo as etapas de:

a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando referido anticorpo monovalente ; e

b) recuperar o anticorpo monovalente a partir da cultura de célula hospedeira.

A presente invenção também provê uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma IgG4, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho na referida região Ch não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência de aminoácidos de referida região CH, ou uma seqüencia complementar da mesma.

A presente invenção também provê um método de preparação de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, e, se referida construção de ácido nucleico não codifica a cadeia leve de referido anticorpo, também compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células.

A presente invenção também provê o uso de uma construção de ácido nucleico de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê um método de preparação de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com a invenção, cuja célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células.

A presente invenção também provê o uso de uma célula hospedeira de acordo com a invenção para a produção de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção.

A presente invenção também provê um imunoconjugado compreendendo um anticorpo monovalente de acordo com a invenção conjugado a uma porção terapêutica .

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente de acordo com a invenção para uso como um medicamento. A presente invenção também provê o uso de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção como um medicamento.

A presente invenção também provê o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação, um distúrbio alérgico (asma) e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

A presente invenção também provê o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, em que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento de atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

A presente invenção também provê o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

A presente invenção também provê o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor. A presente invenção também provê um método para inibir um antígeno em um indivíduo sofrendo de uma doença ou distúrbio em que a atividade do antígeno é indesejável, compreendendo a administração a um indivíduo de um anticorpo mono valente de acordo com a invenção, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, de modo que a atividade do antígeno no indivíduo é inibida.

A presente invenção também provê um método de tratamento de uma doença ou distúrbio, em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com a invenção, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com a invenção, pelo que a doença ou distúrbio é tratada.

A presente invenção também provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monovalente de acordo com a invenção, junto com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

A presente invenção também provê um animal transgene compreendendo uma construção de ácido nucleico de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Os anticorpos específicos para CD20- 7D8-IgGl, 7D8-IgG4 e 7D8-HG foram avaliados em SDS-PAGE não redutor. Trilha 1: Marcador SeuBlue plus2 pre-colorido (Invitrogen BV5 Holanda), Trilha 2: controle interno, Trilha 3: 7D8-IgGl, Trilha 4: 7D8- IgG4, e Trilha 5: 7D8-HG. Figura 2: Cromatograma iônico extraído para [M+3H]3+ e [M+2H]2+ íons (m/z 676.4 e 1014.1 respectivamente) eluindo em tempo de 39,3min TIC no digesto reduzido CNBr/tríptico de 7D8-HG.

Figura 3: Os dados brutos obtidos de análise nanospray- MS/MS dos sinais m/z consistentes com um peptídeo cobrindo resíduos de aminoácidos 220 a 238 (220VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238) de um digesto reduzido CNBr/tríptico de 7D8-HG.

Figura 4A e B: Interpretação dos dados brutos obtidos de análise nanospray-MS/MS dos sinais m/z consistentes com um peptídeo cobrindo resíduos de aminoácidos 220 a 238 (220VAPEFLGGPSVFLFPPKPK238) de um digesto reduzido CNBr/tríptico de 7D8-HG.

Figura 5: Os anticorpos específicos de CD20 7D8-IgGl, 7D8- IgG4 e 7D8-HG foram avaliados em sua ligação a células transfectadas CD20.

Figura 6: Os anticorpos específicos de CD20 7D8-IgGl, 7D8- IgG4 e 7D8-HG foram revestidos em uma placa ELISA (faixa de concentração como indicado em eixo χ-). A ligação de Clq (2 μg/ml) foi avaliadas.

Figura 7: A) As células Daudi foram pre-incubadas com uma faixa de concentração dos anticorpos específicos para CD20 durante 10 minutos, antes de NHS ser adicionado. Quarenta e cinco minutos após indução de CDC5 células foram recolocadas em suspensão em solução de PI.

Lise celular (número de células positivas para PI-) foi medido por citometria de fluxo. Dados mostram a intensidade de fluorescência média de células positivas para PI (mortas).

B) Para avaliar o papel de complemento na Iise medida, o soro inativado por calor (soro ΔΤ) foi adicionado a células incubadas com 10 μg antistof. Dados mostram a intensidade de fluorescência media de células positivas para PI (mortas).

Figura 8: O anticorpo IgG4 sem gancho dirigido contra Bet ν 1 (Betvl-HG) foi testado em SDS-PAGE não redutor.

Trilha 1: Marcador SeaBlue plus2 pre-colorido (Invitrogen BV5 Holanda), trilha 2: controle interno, trilha 3: BetVl-HG5 trilha 4: controle de IgGl.

Figura 9: Filtração de gel de Betvl-HG (IgG4 sem gancho anti-Bet ν 1). Meio condicionado de células HEK contendo rIgG4 Betvl-HG sem gancho foi fracionado em uma coluna Superdex200. Um total de 1 μg de Betvl-HG foi aplicado à coluna. Nas frações, IgG específico para Bet ν 1 (·) foi medido por incubação de 10 μΐ de cada fração no teste de ligação de Bet ν 1. Os resultados são expressados com porcentagem de ligação de Bet ν 1 radio-rotulado relativo à quantidade adicionada. A curva tracejada representa a eluição de Betvl-IgG4 purificado (10 μg), que foi deixado no HPLC por medida da absorção a 214 nm (A214nm).

Figura 10: A ligação de Betvl-IgGl, Betvl-IgG4 e Betvl-HG foi examinada em um teste radioimuno. A ligação de Bet vl rotulado com I em diluições em série de anticorpos ligados a Proteína G Sepharose foi examinada.

Figura 11: A capacidade de Betvl-IgGl, Betvl-IgG4 e Betvl- HG de reticular Bet ν 1 ligado a Sepharose a Bet ν 1 radio rotulado foi examinada em um teste radioimuno. A ligação de - Bet vl rotulado com I a diluições em série dos anticorpos ligados a Bet ν 1 Sepharose foi examinada.

Figura 12: Gráfico semilogarítmico de concentrações no plasma de camundongos de 7D8-HG em comparação com fragmentos 7D8- IgG4 normal, 7D8-IgGl intacto, 7D8-IgGl, F(ab')2 e 7D8-IgGl Fab após administração intravenosa de 100 ug por camundongo.

Figura 13: Gráfico logarítmico de uma depuração nas taxas de plasma como dose/área sob a curva calculada das curvas de concentração- tempo (D/AUC). Os dados representam camundongos individuais e são expressados em ml.dia^1.kg"1.

Figura 14: As curves de resposta a dose mostrando a inibição de fosforilação de EGFr induzida EGF por células A431 por mAb 2F8-HG anti-EGFr, comparado com fragmentos 2F8-IgG4 e 2F8-Fab. O painel superior mostra as curvas de inibição em meio privado de soro, os painéis do meio e inferior a inibição quando IVIG foi adicionado ao meio em uma concentração de 100 μg/ml e 1000 μg/ml, respectivamente. O eixo y representa EGFr fosforilado como detectado com um mAb anti-fosfo-tirosina e é expressados em unidades de fluorescência resolvidas com tempo (unidades TRF). No eixo x, a concentração de mAb em μ§/ηι1. Os pontos de dados são médias e SEM de 4 réplicas.

Figura 15: Um gráfico semilogarítmico das concentrações em tempo. As concentrações iniciais no plasma foram todas da ordem de 100 μg/ml, que é consistente com uma distribuição inicial no compartimento do plasma dos camundongos. A depuração da variante de IgG4 sem gancho foi somente levemente mais rápida do que de IgG4 normal. Importantemente, a depuração da variante sem gancho foi bem mais lenta do que a do fragmento F(ab')2 s, que tem um tamanho molecular comparável.

Este experimento indica que a Fc-parte tem um efeito favorável sobre o tempo de residência no plasma em camundongos tendo um sistema imune normal e provê uma indicação de uma interação funcional com o receptor de Fc neonatal (FcRn) também na presença de IgG endógeno.

Figura 16: A ligação de 2F8-HG a uma capa de proteína EGFr foi comparada em um ELISA à de fragmentos 2F8-IgG4, 2F8-IgGl e Fab de 2F8-IgGl, na presença de IgG humana policlonal (IVIG) em uma concentração de 100 μ§/πι1.

Figura 17: A indução de ADCC por 2F8-HG foi comparada à de por 2F8-IgGl e 2F8-IgG4. Células A431 foram usadas como células alvo e células mononucleares de sangue periférico humano como células efetuadoras,

Figura 18: Seqüência de iniciadores usados nos exemplos.

Figura 19: Seqüências de iniciadores usados nos exemplos.

Figura 20: Depuração de variantes de 7D8 em camundongos SCID suplementados com IVIG. A figura mostra no painel superior gráficos semi-logarítmicos das concentrações de variantes de mAb 7D8 em tempo e no painel inferior as concentrações totais de IgG humana.

Figura 21: Depuração com variantes de 7D8 em camundongos FcRn -/- versus camundongos tipo selvagem. A figura mostra um gráfico semi-logarítmico nas concentrações em tempo. As concentrações no plasma iniciais foram todas da ordem de 100 μ§/ιη1, que é consistente com uma distribuição inicial no compartimento de plasma dos camundongos. A variante IgG4 sem gancho (7D8-HG), IgG4 humana normal (7D8-IgG4) e fragmento F(ab')2 de 7D8 IgGl (7D8-Gl-F(ab')2) foram comparados no modelo.

Figura 22: Células DU-145 foram cultivadas e incubadas com uma diluição em série de (A) cMet-Fab, cMet-Fab e IVIG, cMet-Fab e HGF, cMet-Fab e IVIG e HGF (B) cMet-HG, cMet-HG e IVIG, cMet -HG e HGF, cMet -HG e IVIG e HGF. A dispersão foi observada em teste duplo cego (classificado por 14 pessoas) por microscópio após 48 h e o escore tirado em média ± SEM é traçado em gráfico.

Figura 23: Células DU-145 foram cultivadas e incubadas com 10 μg/ml de (A) cMet-Fab, cMet -Fab e IVIG, cMet -Fab e HGF, cMet -Fab e IVIG e HGF (B) cMet -HG, cMet -HG e IVIG, cMet -HG e HGF, cMet -HG e IVIG e HGF. A dispersão foi observada em teste duplo cego (classificado por 14 pessoas) por microscópio após 48 horas.

cMet -Fab com ou sem IVIG e cMet -HG pre-incubados com IVIG significantemente inibiram a dispersão induzida por HGF. Para análise estatística um teste de faixas marcadas de Wilcoxon, de duas caudas, foi feito com um valor mediano hipotético de 3 (dispersão máxima).

Figura 24: Extratos preparados a partir de células A549 incubadas com cMet -HG (trilha 1), cMet -HG e IVIG (trilha 2), cMet -HG e HGF (trilha 3), cMet -HG, IVIG e HGF (trilha 4), cMet-IgGl (trilha 5), cMet- IgGl e IVIG (trilha 6) foram resolvidos por SDS-PAGE em um gel pré- moldado 4-20% Tris-HCl Criterion e Western blotting em uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi incubada durante a noite a 4°C com anti-fosfo- Met(pYpYpY 1230 1234 1235)- IgG de coelho, (Abcam, ab5662). Após lavar com TBST, os anticorpos secundários, HRP anti-coelho de cabra, sinalização de células, 7074 em reagente de bloqueio foram incubados durante 60 min, em temperatura ambiente em um banco giratório. A membrana foi lavada 6 vezes com TBST. Finalmente as bandas foram reveladas com solução de parada de Luminol Echancer e analisadas em um Lumiimager. O Western blot mostra uma banda de 169 Kd indicando fosfo-Met(pYpYpY 1230 1234 1235).

Figura 25: concentração de partida de adição de HuMax-CD4 ou fragmentos Fab de HuMax-CD4 para o teste de neutralização de HIV-I in vitro. Os valores de IC50 de inibição por HuMax-CD4 e fragmentos Fab de HuMax-CD4 são calculados por um ajuste de curva logística de 4 parâmetros e indicado para cada uma das construções de vírus.

Figura 26: As% de células T humanas,% de células de murinos, e% de células CD4 e% CD8, e a relação CD4/CD8 de dos camundongos reconstituídos com PBMC individuais tratados intraperitonealmente com HuMax-CD4, controle de IgG ou não tratados, e infectados com HIV-1.

Figura 27: As curvas de inibição de HuMax-CD4 e os fragmentos Fab de HuMax-CD4 da infecção de várias cepas de HIV-I de células positivas para CD4-CCR5 ou CD4-CXCR4 medidas por atividade de luciferase ( média de medidas em triplicata).

Figura 28: As concentrações de HuMax-CD4 no plasma em tempo dos camundongos reconstituídos com PBMC individuais tratados intraperitonealmente com HuMax-CD4, ou não tratados, e infectados com HIV-1.

Figura 29: As cópias de HIV-I RNA medidas em tempo de camundongos reconstituídos com PBMC individuais tratados intraperitonealmente com HuMax-CD4, de controle de IgG ou não tratados, e infectados com HIV-1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS LISTAGENS DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID No: 1: A seqüência de ácido nucleico de Cl kappa de Ig humana

SEQ ID No: 2: A seqüência de aminoácido da cadeia leve kappa de Ig humana

SEQ ID No: 3: A seqüência de ácido nucleico de Cl lambda de Ig humana

SEQ ID No: 4: A seqüência de aminoácido da cadeia leve lambda de Ig humana

SEQ ID No: 5: A seqüência de ácido nucleico de uma região Vh de HuMab-7D8

SEQ ID No: 6: A seqüência de aminoácido de uma região Vh de HuMab-7D8

SEQ ID No: 7: A seqüência de ácido nucleico de uma região Vh de anti-Betv-1 de camundongo

SEQ ID No: 8: A seqüência de aminoácido para uma região Vh de anti-Betv-1 de camundongo

SEQ ID No: 9: A seqüência de ácido nucleico da região Vl de HuMab-7D8

SEQ ID No: 10: A seqüência de aminoácido da região Vl de HuMab-7D8

SEQ ID No: 11: A seqüência de ácido nucleico de uma região Vl de camundongo anti-Betvl

SEQ ID No: 12: A seqüência de aminoácido da região Vl de camundongo anti-Betvl

SEQ ID No: 13: A seqüência de ácido nucleico da região Ch de tipo selvagem de IgG4 humana

SEQ ID No: 14: A seqüência de aminoácido da região Ch de tipo selvagem de IgG4 humana

SEQ ID No: 15: A seqüência de ácido nucleico de uma região Ch de IgG4 humana (SEQ ID No: 13) mudada em posições 714 e 722

L

SEQ ID No: 16: A seqüência de aminoácido de uma região Ch de uma IgG4 humana gerada por expressão de uma seqüência de ácido nucleico de SEQ ID No: 15

SEQ ID NO: 17: A seqüência de aminoácido da região humana constante de cadeia lambda (número de acesso S25751)

SEQ ID NO: 18: A seqüência de aminoácido da região humana constante de cadeia kappa (número de acesso PO1834)

SEQ ID NO: 19: A seqüência de aminoácido de região constante de IgGl (número de acesso PO1857)

SEQ ID NO: 20: A seqüência de aminoácido da região constante de IgG2 (número de acesso PO1859)

SEQ ID NO: 21: A seqüência de aminoácido da região constante de IgG3 (número de acesso A23511)

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A fim de que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiramente definidos. Outras definições são descritas por toda a descrição detalhada.

O termo "anticorpo" como referido aqui inclui moléculas de anticorpo totais, fragmentos de ligação de antígeno, anticorpos monovalentes, e cadeias únicas dos mesmos. Moléculas de anticorpo pertencem uma família de proteínas do plasma denominadas imunoglobulinas, cujo bloco de reforço básico, a duplicação ou domínio de imunoglobulina, é usado em várias formas em muitas moléculas do sistema imunológico e outros sistemas de reconhecimento biológicos. Anticorpos nativos e imunoglobulinas são geralmente glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) e duas cadeias pesadas (H) idênticas.

Cada cadeia pesada é ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto covalente, enquanto o número de ligações dissulfeto varia entre as cadeias pesadas de diferentes isotipos de imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também pode ter ligações dissulfeto intra-cadeias espaçadas. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve (abreviada aqui como Cl). Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (Vh) e uma região constante de cadeia pesada (Ch) consistindo de três domínios, ChI5 Ch2 e Ch3, e a região de gancho). O domínio constante de cadeia leve é alinhado com o primeiro domínio constante (Cnl) de cadeia pesada, e o domínio variável de cadeia leve é alinhado com o domínio variável de cadeia pesada formando o que é conhecido como o "fragmento Fab". ChI e Ch2 de cadeia pesada são separados um do outro pela assim denominada região de gancho, que permite que "braços" de Fab da molécula de anticorpo oscile em algum grau. A região de gancho normalmente compreende um ou mais resíduos de cisteína, que são capazes de formar ligações dissulfeto com os resíduos de cisteína da região de gancho da outra cadeia pesada na molécula de anticorpo.

As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imunológico (por exemplo, células efetuadoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

Dependendo das seqüências de aminoácidos de domínio constante de suas cadeias pesadas, as imunoglobulinas podem ser designadas a classes diferentes. Existem pelo menos cinco (5) classes maiores de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias destas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4; IgAl e IgA2. Os genes para os domínios constantes de cadeias pesadas que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa (a), delta (δ), epsilon (ε), gama (γ) e mu (μ), respectivamente. As subclasses de imunoglobulinas são codificadas por diferentes genes como γΐ, γ2, γ3 e γ4. Os genes para as cadeias leves de anticorpos são designadas a um ou dois tipos claramente distintos, denominados kappa (K) e lambda (λ), com base nas seqüências de aminoácidos de seu domínio constante. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas. Alótipos distintos de imunoglobulinas existem dentro da população humana como Glm(a), Glm(x), Glm(f) e Glm(z) para a cadeia pesada de IgGl e Km 1, Km 1, 2 e Km3 para a cadeia leve de kappa. Estes alótipos diferem em aminoácidos distintos em sua região codificando as regiões constantes.

O termo anticorpo também engloba "derivados" de anticorpos, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são derivados, por exemplo, por cilação ou glicosilação, sem afetar ou alterar significativamente as características de ligação do anticorpo contendo as seqüências de aminoácidos.

No contexto da presente invenção, um derivado de um anticorpo monovalente pode, por exemplo, ser um anticorpo monovalente, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos são quimicamente modificados (por exemplo, por alquilação, acilação, formação de éster, ou formação de amida) ou associados com um ou mais substituintes orgânicos não aminoácido e/ou atômicos ou moleculares inorgânicos (por exemplo, um grupo polietileno glicol (PEG), um substituinte lipofílico (que, opcionalmente, pode ser ligado à seqüência de aminoácidos do peptídeo por um grupo ou resíduo espaçador como β-alanina, ácido γ-aminobutírico (GABA), ácido L/D-glutâmico, ácido succínico, e outros), um fluoforo, biotina, um radionuclídeo, etc.) e também pode, ou alternativamente compreende, resíduos não essenciais, ocorrendo não naturalmente, e/ou de L- aminoácidos, a menos que indicado ao contrário ou contestado pelo contexto (no entanto, deve novamente ser reconhecido que estes derivados podem, em e sozinhos, ser considerados aspectos independentes da presente invenção e a inclusão destas moléculas dentro do significado de peptídeo é feita no sentido de conveniência na descrição da presente invenção em vez de implicar em qualquer tipo de equivalência entre peptídeos nus e tais derivados). Exemplos não limitativos destes resíduos de aminoácidos incluem, por exemplo, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, β -alanina, ácido β-aminopropiônico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocapróico, ácido 2-amino-heptanóico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2'- diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiônico, N-etilglicina, N- etilasparagina, hidroxilisina, ali-hidroxilisina, 3-hidroxiprolila, 4- hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metilglicina, N- metilisoleucina, 6-N-metil lisina, N-metilvalina, norvalina, norleucina, ornitina e aminoácidos halogenados de estatina.

A meia-vida in vivo de anticorpos pode, por exemplo, ser melhorada modificando o epítopo de receptor de resgate do domínio constante de Ig ou um domínio constante como Ig, de modo que a molécula não compreende um domínio CH2 intacto ou uma região Fc Ig intacto, conforme US 6121022 e US 6194551). A meia-vida in vivo pode, além disso, ser aumentada fazendo mutações na região Fc, por exemplo substituindo treonina por leucina na posição correspondente à posição 252 de uma molécula de anticorpo inteira, treonina para serina na posição correspondente à posição 254 de uma molécula de anticorpo intacta, ou treonina para fenilalanina na posição correspondente à posição 256 de uma molécula de anticorpo intacta, conforme US 6277375.

Além disso, os anticorpos e particularmente Fab ou outros fragmentos, podem ser peguilados para aumentar a meia-vida. Isto pode ser realizado por reações de peguilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, em Focus on Growth Factors, 3, 4-10 (1992), EP 154 316 e EP 401 384.

Mutações também podem ser introduzidas aleatoriamente junto com toda ou parte de uma seqüência de codificação de anticorpo, como por mutagênese de saturação, e os anticorpos modificados resultantes podem ser triados para atividade de ligação e/ou outras características.

O termo "derivados de anticorpo" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo, por exemplo um conjugado do anticorpo e um outro agente ou anticorpo.

O termo "porção de ligação de antígeno" ou "domínio de ligação de antígeno" de um anticorpo, como um anticorpo monovalente, como usado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno. E mostrado na técnica que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem:

(i)um fragmento Fab ou Fab', um fragmento monovalente consistindo dos domínios VL, Vh, CL e Ch1; (ii)fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab' ligados por uma ligação dissulfeto na região de gancho;

(iii)um fragmento Fd consistindo essencialmente dos domínios Vh e ChI ;

(iv)um fragmento Fv consistindo essencialmente dos domínios VL e Vh de um braço único de um anticorpo;

(v)um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente de um domínio VH;

(vi)uma região determinante de complementaridade isolada (CDR, e

(vii)uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem opcionalmente ser unidas por um ligador sintético.

Além disso, apesar dos dois domínios do fragmento Fv, Vl e VH, serem codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligador sintético que possibilita aos mesmos serem produzidos como uma cadeia de proteína única em que as regiões de VL e Vh juntam-se para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia única (scFv), ver, por exemplo, Bird et al., Science 242, 423- 426 (1988) e Huston et al., PNAS US 85, 5879- 5883 (1988)). Os anticorpos de cadeia única estão englobados dentro do termo anticorpo a menos que indicado ao contrário ou claramente indicado pelo contexto.

Um outro exemplo são proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação de antígeno compreendendo um polipeptídeo de domínio de ligação de antígeno que é fundido em

(i)um polipeptídeo da região de gancho de imunoglobulina,

(ii)uma região constante de CH2 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região de gancho, e

(iii)uma região constante de CH3 de cadeia pesada de imunoglobulina fundida à região constante de Ch2.

O polipeptídeo de domínio de ligação de antígeno pode ser uma região variável de cadeia pesada ou uma região variável de cadeia leve, um scFv ou qualquer outro polipeptídeo capaz de ligar-se especificamente ao antígeno. As proteínas de fusão de imunoglobulina de domínio de ligação são ainda descritas em US 2003/0118592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas dos versados na técnica, e os fragmentos são triados para utilidade do mesmo modo como são os anticorpos intactos.

O termo "meia-molécula de anticorpo" é usado aqui para significar uma molécula de anticorpo como descrito acima, mas compreendendo não mais do que uma cadeia leve e não mais do que uma cadeia pesada, e que existe em soluções de água como um heterodímero de referida cadeia leve única e cadeia pesada única. O anticorpo é por natureza monovalente uma vez que somente uma porção de ligação de antígeno está presente.

O termo "modificações de seqüência conservativas" no contexto de seqüências de nucleotídeo ou de aminoácidos são modificações de nucleotídeo(s) e aminoácido(s), respectivamente, que não afetam ou alteram significativamente as características de ligação do anticorpo codificado pela seqüência de nucleotídeos ou contendo a seqüência de aminoácidos. As modificações de seqüência conservativas incluem substituições, adições ou deleções de nucleotídeos e de aminoácidos. As modificações podem ser introduzidas nas seqüências por técnicas padrão conhecidas na técnica, como mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácidos conservativas incluem as em que o resíduo de aminoácidos é substituído com um resíduo de aminoácidos tendo uma cadeia lateral similar. As famílias de resíduos de aminoácidos tendo cadeias laterais similares são definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparafina, glutamina, seria, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeia laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais β- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um resíduo de aminoácidos não essencial previsto em um anticorpo humano específico para um certo antígeno pode ser substituído com um outro resíduo de aminoácido da mesma família de cadeia lateral.

Como usado aqui, um anticorpo humano é "derivado de" uma seqüência de célula embrionária particular se o anticorpo é obtido de um sistema usando seqüências de imunoglobulina humanas, por exemplo, imunizando camundongo transgênico possuindo genes de imunoglobulina humanos ou triando uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana, e em que a região codificada por gene variável (não incluindo a CDR3 de cadeia pesada ou leve) ou o anticorpo humano selecionado é pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, ainda mais preferivelmente pelo menos 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico na seqüência de ácido nucleico ao gene de imunoglobulina de célula embrionária. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de célula embrionária humana exibirá não mais do que 10 diferenças em aminoácidos, mais preferivelmente não mais do que 5, ou ainda mais preferivelmente não mais do que 4, 3, 2 ou 1 diferença em aminoácidos da seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de célula embrionária.

O termo "epítopo" significa uma proteína determinante capaz de ligação específica a um anticorpo. Os epítopos consistem geralmente de grupamentos de superfícies quimicamente ativas de moléculas como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e, geralmente, têm características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específicas. Epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos, em que a ligação aos primeiros, mas não ao último é perdida na presença de solventes desnaturantes.

O termo "epítopo descontínuo", como usado aqui, significa um epítopo conformacional em um antígeno de proteína que é formado de pelo menos duas regiões separadas na seqüência primária da proteína.

Para seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos, o termo "homologia" indica o grau de identidade entre duas seqüências de ácido nucleico ou aminoácidos quando otimamente alinhadas e comparadas com inserções ou deleções apropriadas. Além disso, homologia substancial existe quando os segmentos de DNA hibridizarão em condições de hibridização seletivas, no complemento do filamento.

A identidade percentual entre duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (isto é,% de homologia = # de posições idênticas/ # total de posições χ 100), levando em conta o número de espaços e comprimento de cada espaço, que precisam ser introduzidas para alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação das seqüências e determinação da identidade percentual entre duas seqüências podem ser obtidas usando um algoritmo matemático, por exemplo, como descrito a seguir.

A identidade percentual entre duas seqüências de nucleotídeos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso de espaço de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1,2, 3, 4, 5, ou 6. A identidade percentual entre duas seqüências de nucleotídeos ou de aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci. 4, 11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAMl 20, uma penalidade de comprimento de espaço de 12 e uma penalidade de espaço de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Boi. 48, 444-453 (1970)) que foi incorporada no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando tanto uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de espaço de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

O termo "célula hospedeira" (ou "célula hospedeira recombinante"), como usado aqui, pretende referir-se a uma célula em que um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Deve ser compreendido que estes termos são pretendidos para referir-se não somente à célula como um objeto particular mas também à progênie desta célula. Porque certas modificações podem ocorrer nas gerações sucessivas devido tanto a mutação como influências ambientais, a progênie não pode, de fato, ser idêntica à célula parental, mas estão ainda incluídas dentro do escopo do termo "célula hospedeira" como usado aqui. Células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, como células CHO transfectadas, células NS/0 e células linfocíticas. O termo "célula hospedeira" de forma singular também pode significar uma cultura de um tipo específico de célula hospedeira.

O termo "anticorpo humano", como usado aqui, é pretendido para incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de célula embrionária humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas seqüências de imunoglobulina de célula embrionária humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, não é pretendido para incluir anticorpos em que seqüências de CDRl ou CDR2 derivadas da célula embrionária de outras espécies de mamífero, como um camundongo, ou a região de CDR3 derivada de um anticorpo de outra espécie, como camundongo, são enxertadas em seqüências de armação humanas.

O termo "KD" (M)5 como usado aqui, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", como usados aqui, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade de ligação única e afinidade para um epítopo particular. Conseqüentemente, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos exibindo uma especificidade de ligação única que tem regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de célula embrionária humana.

O termo "anticorpo monovalente" significa no contexto atual que uma molécula de anticorpo é capaz de ligar uma molécula única do antígeno, e, assim, não é capaz de reticulação de antígeno.

O termo "ácido nucleico", "construção de ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico", como usado aqui, é pretendido para incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de DNA pode ser de filamento único ou de filamento duplo.

O termo "ácido nucleico isolado", "construção de ácido nucleico isolado" ou molécula de ácido nucleico isolado", como usado aqui em referência a anticorpos codificando ácidos nucleicos, ou fragmentos mesmos se destina a fazer referência a uma molécula de ácido nucleico em que as seqüências de nucleotídeos codificando o anticorpo intacto, ou fragmento do mesmo, são isentas de outras seqüências de nucleotídeos. Um ácido nucleico pode ser isolado ou tornado substancialmente puro, quando purificado longe de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, formação de bandas de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese de gel agarose e outras bem conhecidas na técnica. Ver, F. Ausubel et al., ed. Current protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).

Um ácido nucleico é "operavelmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com uma outra seqüência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor ou melhorador é operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se ele afeta a transcrição da seqüência. Para seqüências de comutação, operavelmente ligado indica que as seqüências são capazes de efetuar recombinação de comutação.

Quando referência é feita a "condição fisiológica", significa uma condição que existe in vivo, dentro do organismo, ou uma condição in vivo, que é re-criada imitando totalmente ou parcialmente referida condição in vivo, por exemplo uma solução de água com um valor osmótico equivalente como o sangue.

O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, como, por exemplo, (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo um camundongo) que é transgênico ou transcromossômico pra genes de imunoglobulina humanos ou um hibridoma preparado dos mesmos, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humana recombinante, combinatorial, e (d) anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem a emenda de seqüências de genes de imunoglobulina humanos a outras seqüências de DNA. Estes anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de célula embrionária humana. Os anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as seqüências de aminoácidos das regiões de Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, apesar de derivadas de e relacionadas a seqüências de Vh e Vl de célula embrionária humana, não podem existir naturalmente dentro do repertório de célula embrionária humana in vivo.

Como usado aqui, "ligação específica" refere-se à ligação de um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, em um antígeno predeterminado. Tipicamente, o anticorpo liga-se com uma afinidade correspondente a um Kd de cerca de IO"7 M ou menos, como cerca de IO"8 M ou menos, como cerca de IO"9 M ou menos, cerca de IO"10 ou menos, ou cerca de IO"11 M ou até menos, quando medido por exemplo usando ressonância de sulfon plasmon em BIAcore ou como afinidades aparentes baseadas em valores IC50 em FACS ou ELISA, e liga-se ao antígeno predeterminado com uma afinidade correspondente a Kd que é pelo menos dez vezes mais baixa, como pelo menos 100 vezes mais baixa, por exemplo pelo menos 1000 vezes mais baixa, como pelo menos 10.000 vezes mais baixa, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes mais baixa do que sua afinidade para ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno predeterminado ou um antígeno intimamente relacionado. A quantidade com que a afinidade é mais baixa depende do Kd do peptídeo de ligação de antígeno, de modo que quando o Kd do peptídeo de ligação de antígeno é muito baixo (isto é, o peptídeo de ligação de antígeno é altamente específico), então a quantidade com que a afinidade para o antígeno é mais baixa do que a afinidade para um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes.

Como usado aqui, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, como primatas não humanos, ovelha, cabra, cachorro, vaca, camundongo, rato, coelho, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

Quando se faz referência a uma dosagem "terapeuticamente" efetiva ou "quantidade terapeuticamente efetiva", deve ser tomado para significar uma dosagem ou quantidade efetiva para obter um resultado terapêutico desejado durante um certo período de tempo. Uma dosagem terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção variará naturalmente com o alvo do anticorpo e pode também variar de acordo com fatores como estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade do anticorpo monovalente elicitar uma resposta desejada no indivíduo. A dosagem ou quantidade terapeuticamente efetiva também pode ser uma em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudicial do anticorpo monovalente são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

O termo "animal não humano, transgênico" refere-se a um animal não humano tendo um genoma compreendendo um ou mais transcromossomas ou transgenes de cadeia leve e/ou pesada humanos (tanto integrados como não integrados no DNA genômico natural do animal) e que é capaz de expressar anticorpos humanos. Por exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene de cadeia leve humano ou transcromossoma de cadeia pesada humano, de modo que o camundongo produz anticorpos humanos quando imunizado com um antígeno e/ou células expressando um antígeno. O transgene de cadeia pesada humano pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso para camundongos HuMAb transgênicos, como camundongos Hco7 ou Hco 12, ou o transgene de cadeia pesada humano pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para camundongos KM transcromossômico como descrito em WO 02/43478. Os camundongos transgênicos e transcromossômicos são capazes de produzir classes múltiplas e isotipos de anticorpos monovalentes em um dado antígeno (por exemplo, IgM5 IgG5 IgA e/ou IgE) passando por recombinação de V-D-J e comutação de isotipo.

O termo "transfectoma", como usado aqui, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes expressando o anticorpo, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células NS/0, células HEK293, células de planta, ou fungos, incluindo células de levedura.

O termo "tratamento" ou "tratando" ou "tratar" significa facilitar, melhorar ou erradicar (curar) sintomas ou estados de doença.

O termo "valência de um anticorpo" significa o número máximo de determinados antigênicos com os quais o anticorpo pode reagir. Por exemplo, os anticorpos IgG contêm duas regiões de Fab e podem ligar duas moléculas de antígeno ou dois sítios idênticos na mesma partícula, e, assim, têm uma valência de dois.

O termo "vetor", como usado aqui, é pretendido par referir-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar e induzir replicação de outro ácido nucleico ao qual ele estava ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que refere-se a um laço de DNA de filamento duplo circular em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA e RNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira em que eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de replicação e vetores de mamíferos epissomais). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira quando da introdução na célula hospedeira, e, assim, são replicados juntos com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de dirigir a expressão de genes aos quais eles são operativamente ligados. Estes vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinantes estão freqüentemente na forma de plasmídeos. No presente relatório, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. No entanto, a invenção é pretendida para incluir outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituosos de replicação, adenovírus e adenovírus associados), que servem funções equivalentes.

Um número de referências é feito aqui a uma solução de água ou condições fisiológicas. Quando se faz referência a "solução de água", significa solução de qualquer matéria química em água, por exemplo, uma solução salina, como solução salina tamponada com fosfato (PBS). Uma solução de água pode ser projetada para a finalidade e contém um número de diferentes matérias químicas, ou pode ser um fluido do corpo natural, por exemplo, o sangue.

Existem cinco classes diferentes de imunoglobulinas, isto é, IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, e estas classes podem ser distinguidas por suas regiões C.

Na classe IgG de anticorpos existem várias subclasses, isto é, em IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanos (Jefferis, R. 1990, Molecular structure of human IgG subclasses, in The Human IgG subclasses. F. Shakib, ed. Pergamon Press, Oxford, p. 15). Cada cadeia pesada de IgG é composta de seqüências de peptídeo estruturalmente relacionadas (isto é, domínios de regiões variáveis e constantes) que são codificadas por segmentos de genes distintos ou exons. A ligação da região de gancho ao domínio CHl e CH2 é codificada por um exon separado. Cada uma das quatro cadeias pesadas da subclasse IgG pode ser expressada em combinação tanto com cadeias leves de kappa como de lambda para dar uma molécula essencialmente simétrica composta de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves de kappa e lambda idênticas. A comparação na cadeia pesada define as regiões de homologia de CHI, CH2 e CH3. Comparações entre regiões de homologia semelhantes de cada uma das quatro subclasses revelam >95% de identidade de seqüência (Jefferis, R. 1990, F. Shakib, ed. Pergamon Press Oxford, p. 15). A seqüência entre os domínios CHl e CH2 é referida como a região de gancho porque ela permite flexibilidade molecular. Os domínios CH3 são dispostos em pares e as interações não covalentes são suficientes pra a molécula de IgG manter sua integridade estrutural após redução das ligações dissulfeto inter-cadeias pesadas em condições brandas. A formação de pares do domínio CH3 é compacta e similar a formação de pares no Fab, com uma díade quase exata entre os dois domínios (Saphire, et al., 2002, J. Mol. BioL 319:9). Isto está em contraste com os domínios CH2, que não associam-se intimamente e seu contato é primeira mediado por duas cadeias de carboidratos fixadas aos resíduos Asn297 (Saphire, et al., 2002, J. Mol. Biol. 319:9).

A estrutura característica de IgG em que dois heterodímeros de cadeia pesada-leve são ligados é assim mantida por ligações dissulfeto de inter-cadeias pesadas da região de gancho e as interações não covalentes dos domínios CH3.

A interação na região de CH3 mostra ser importante em IgGl. Meias-moléculas de Ig, que têm uma configuração dimérica consistindo de somente uma cadeia leve e somente uma cadeia pesada, é descrita como o resultado de deleções raras em plasmacitomas humanos e de murino. Vários pacientes sofrendo de plasmacitoma de tecido mole extramedular, macroglobulinemia de Waldenstrõm, leucemia de células do plasma e mieloma múltiplo, excretaram meias-moléculas de IgG em sua urina. Verificou-se também que as meias-moléculas estão presentes em seu soro. Estudos de natureza bioquímica destas meias-moléculas mostraram que elas consistem de moléculas de IgG em que as regiões de ChI de cadeia pesada, de gancho e de Ch2 pareceram normais, enquanto deleções foram encontradas na região de Ch3 (já no pedido de patente, página 3).

Os requerentes mostram neste relatório que a remoção da região de gancho em IgG4 resulta na formação de anticorpos monovalentes, em que a ligação entre os dois heterodímeros de cadeia pesada-leve é perdida ou diminuída. Conseqüentemente, trocas nas ligações dissulfeto da região de gancho de outras subclasses de IgG sozinhas ou em combinação com mutações nas interações do domínio Ch3 podem resultar na formação de anticorpos monovalentes para estas outras subclasses também. Está bem dentro da capacidade dos versados na técnica usar o conhecimento íntimo da estrutura das subclasses de Ig, e o conhecimento dado na presente invenção, para selecionar e para modificar aminoácidos selecionados para prevenir interações de cadeia leve.

Conseqüentemente, em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que

a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma Ig, e

b) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vh) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) de Ig humana, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que nenhum dentre qualquer um dos resíduos de aminoácidos presentes na região correspondendo à região de gancho são capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) de Ig humana

c) referida cadeia pesada ou leve, dependendo do isotipo de Ig é modificada por mutação por pontos ou deleção a fim de remover ou mudar quaisquer aminoácidos isto é cisteínas, capazes de causar a ligação do anticorpo, ou modificação em forma de mutação por pontos ou deleção a fim de tornar a região constante de cadeia pesada similar à de IgG4 com relação à capacidade de formar ligações dissulfeto ou covalentemente ligar a molécula com sua contraparte formando um dímero.

A seqüência de aminoácido de uma cadeia leve de um anticorpo monovalente da invenção compreende a região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos de uma região constante (Cl) de uma imunoglobulina.

De acordo com a invenção, a seqüência de aminoácidos da região Vl do anticorpo monovalente não contribui para as propriedades moleculares de referida molécula de anticorpo que são de interesse da invenção, em particular a incapacidade do anticorpo monovalente de formar heterotetrâmeros (anticorpos"normais"), e assim a invenção não é limitada a qualquer particular seqüência de aminoácidos da região VL. A seqüência de aminoácido da região Vl pode ser derivada de uma seqüência de aminoácidos de qualquer anticorpo específico de antígeno gerado em qualquer um de muitos modos conhecidos do versado na técnica.

De acordo com a invenção, a seqüência de aminoácidos de uma região Vh do anticorpo monovalente não contribui para as propriedades moleculares de referida molécula de anticorpo que são de interesse da invenção, em particular a incapacidade do anticorpo monovalente para formar heterotetrâmeros anticorpos("normais"), e assim a invenção não é limitada a qualquer particular seqüência de aminoácidos de uma região VH. A seqüência de aminoácido de uma região Vh pode ser derivada de uma seqüência de aminoácidos de qualquer anticorpo específico de antígeno gerado em qualquer um de muitos modos conhecidos do versado na técnica.

Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção não liga ao antígeno sintético (Tyr, Glu), Ala, Lys (Pincus et ai. 1985, Molecular Imunolog, vol 22, 4; pp. 455-461)

Em outra forma de realização, o anticorpo da invenção é um anticorpo humano.

Em outra forma de realização, o anticorpo da invenção é baseado em um anticorpo humano.

Em uma forma de realização, a presente invenção refere-se a um anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que

A seqüência de aminoácido de uma cadeia leve de um anticorpo monovalente da invenção compreende a região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma imunoglobulina.

De acordo com a invenção, a seqüência de aminoácidos da região Vl do anticorpo monovalente não contribui para as propriedades moleculares de referida molécula de anticorpo que são de interesse da invenção, em particular a incapacidade do anticorpo monovalente para formar heterotetrâmeros anticorpos("normais"), e assim a invenção não é limitada a qualquer particular seqüência de aminoácidos da região Vl- A seqüência de aminoácido da região Vl pode ser derivada de uma seqüência de aminoácidos de qualquer anticorpo específico de antígeno gerado em qualquer um de muitos modos conhecidos do versado na técnica.

De acordo com a invenção, a seqüência de aminoácidos de uma região Vh do anticorpo monovalente não contribui para as propriedades moleculares de referida molécula de anticorpo que são de interesse da invenção, em particular a incapacidade do anticorpo monovalente para formar heterotetrâmeros anticorpos("normais"), e assim a invenção não é limitada a qualquer seqüência de aminoácidos particular de uma região VH. A seqüência de aminoácido de uma região Vh pode ser derivada de uma seqüência de aminoácidos de qualquer anticorpo específico de antígeno gerado em qualquer um de muitos modos conhecidos do versado na técnica.

A invenção provê um exemplo de 1) um anticorpo monovalente compreendendo uma região Vh compreendendo a seqüência de aminoácidos de uma região Vh de HuMab-7D8 identificada como SEQ ID No: 6 e a seqüência de aminoácidos codificando Ch sem gancho de IgG4 identificada como SEQ ID No: 16, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas, e 2) um anticorpo monovalente compreendendo uma região Vh compreendendo a seqüência de aminoácidos de uma região Vh de anti-Betv-1 de camundongo identificada como SEQ ID No: 8 e a seqüência de aminoácidos codificando Ch sem gancho de IgG4 identificada como SEQ ID No: 16, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas.

Em uma forma de realização, as regiões Vh e Vl de uma molécula de anticorpo da invenção são derivadas do mesmo anticorpo específico de antígeno.

De acordo com a invenção, a seqüência de uma região Cl de uma cadeia leve da molécula de anticorpo pode ser derivada da seqüência de região Cl de uma imunoglobulina. Em uma forma de realização, a região Cl é uma região constante da cadeia leve kappa de IgG humana. Em uma forma de realização, a região Cl compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 2. Em uma forma de realização, a região Cl é a região constante da cadeia leve lambda de IgG humana. Em uma forma de realização, a região Cl compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 4.

Em uma forma de realização, a cadeia leve e a cadeia pesada do anticorpo monovalente da invenção são conectadas uma na outra via uma ou mais ligações dissulfeto. E evidente que para tais ligações dissulfeto, nenhum dos parceiros de ligação na ligação dissulfeto está presente na região correspondendo à região de gancho.

Em uma forma de realização, a cadeia leve e a cadeia pesada são conectadas uma na outra via uma ligação amida, por exemplo como é visto Fv's de cadeia única.

A região de gancho é uma região de um anticorpo situada entre as regiões CrI e CH2 do domínio constante de uma cadeia pesada. A extensão da região de gancho é determinada pelo exon separado, que codifica a região de gancho. A região de gancho está normalmente envolvida em participar para assegurar a montagem correta das quatro cadeias de peptídeo de um anticorpo na forma tetramérica tradicional via a formação de ligações dissulfeto, ou pontes, entre um ou mais resíduos de cisteína em uma região de gancho de uma dentre uma cadeia pesada e um ou mais resíduos de cisteína em uma região de gancho da outra cadeia pesada. A modificação da região de gancho de modo que um dos resíduos de aminoácidos em uma região de gancho são capazes de participar na formação de ligações dissulfeto pode assim por exemplo compreender a deleção e/ou substituição dos resíduos de cisteína presentes em região de gancho não modificada. Uma região correspondendo à região de gancho deve ser para os fins deste relatório construída para significar a região entre a região ChI e Ch2 de uma cadeia pesada de um anticorpo. No contexto da presente invenção, esta tal região pode também não compreender resíduos de aminoácidos de todo, correspondendo a uma deleção da região de gancho, resultando nas regiões Ch1 e Ch2 sendo conectadas uma na outra sem quaisquer resíduos de aminoácidos intervenientes. Esta tal região pode também compreender somente um ou poucos resíduos de aminoácidos, cujos resíduos não precisam ser os resíduos de aminoácidos presentes no N- ou C-terminal da região de gancho original.

Ligações dissulfeto é um aspecto bem conhecido de algumas proteínas, por exemplo anticorpos, onde um resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfeto com outro resíduo de cisteína da mesma cadeia (ligações dissulfeto intra-cadeia) ou outras cadeias (ligações dissulfeto inter-cadeias) da proteína. Pode-se ter várias destas ligações dissulfeto dentro de uma dada proteína. Para anticorpos, as formações de ligações dissulfeto, tanto intra- cadeia como inter-cadeia, é uma parte integrante da montagem correta do anticorpo de tipo selvagem completamente amadurecido, e as ligações dissulfeto são normalmente pelo menos parcialmente responsáveis pela aparência altamente ordenada e regular de anticorpos, assim como para a estabilidade do anticorpo. Nos anticorpos monovalentes da invenção, nenhum dos aminoácidos da região de gancho são capazes de participar na formação de tais ligações dissulfeto.

A modificação de uma seqüência de aminoácidos da região de gancho pode ser realizada em nível de DNA por uso de técnicas recombinantes permitindo a deleção e/ou substituição de aminoácidos na proteína expressada para a deleção e/ou substituição de ácidos nucleicos como é bem conhecido na técnica e é descrito em outras partes aqui e exemplificado nos exemplos.

A modificação pode também ser realizada em um anticorpo expressado de um ácido nucleico não modificado, por exemplo por derivação dos resíduos de aminoácidos na região de gancho, cujos resíduos de aminoácidos são capazes de formar ligações dissulfeto. Esta derivação dos resíduos de cisteína bloqueando os mesmos de formar ligações dissulfeto com outros resíduos de cisteína pode ser realizada como é conhecido na técnica.

A modificação pode também ser realizada por preparação das cadeias dos anticorpos sinteticamente usando resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína, por exemplo aminoácidos de ocorrência natural ou aminoácidos não de ocorrência natural, como por exemplo cisteínas derivadas, em vez dos resíduos de cisteína.

Um anticorpo monovalente de IgG4 da presente invenção pode também ser uma variante de IgG4. Este anticorpo de variante é um anticorpo que difere de um anticorpo de IgG4 por uma ou mais alterações de resíduo de aminoácido apropriadas, isto é substituições, deleções, inserções, ou adições de seqüência terminal, por exemplo em regiões de domínio constante, e/ou variável (ou qualquer um ou mais dos CDRs do mesmo) em um anticorpo variante único. Tipicamente, as alterações de seqüências de aminoácido, como variações de substituição conservativas, desejavelmente mas não substancialmente mudam as características estruturais da seqüência parental (por exemplo, um aminoácido de substituição não deve tender a romper a estrutura secundária que caracteriza a função da seqüência parental), mas que pode ser associada com propriedades vantajosas, como mudança das propriedades funcionais ou farmacocinéticas dos anticorpos, por exemplo aumentando a meia-vida, alterando a imunogenicidade, provendo um sítio para ligação covalente ou não covalente para outra molécula, reduzindo a susceptibilidade à proteólise, reduzindo a susceptibilidade a oxidação, ou alterando o padrão de glicosilação. Estas variantes de seqüência de aminoácido de um anticorpo podem ser obtidas como descrito acima para as modificações na região correspondendo à região de gancho. Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos de cisteína.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos de cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos. A região de gancho de anticorpos da invenção pode ser assim modificada em outras posições do que as posições, em que quaisquer resíduos de cisteína estão normalmente presentes, como também descrito acima para anticorpos de IgG4 variantes da invenção. Estas modificações podem ser realizadas como descrito acima ou por qualquer outro meio conhecido na técnica.

No contexto da presente invenção, os resíduos de cisteína da região correspondendo à região de gancho podem ser substituídos por quaisquer resíduos de aminoácidos de ocorrência natural, ou não de ocorrência natural, e/ou não L-aminoácido, diferentes de cisteína ou com derivados destes resíduos de aminoácidos incluindo derivados de resíduos de cisteína, cujos resíduos de cisteína derivados são incapazes de participar na formação de ligações dissulfeto.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que os aminoácidos correspondendo a aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados. SEQ ID No: 14 mostra uma seqüência de aminoácidos da região Ch de tipo selvagem de IgG4 humana e posições 106 e 109 são as posições dos dois resíduos de cisteína.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Em uma forma de realização, a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 16. SEQ ID No: 16 é uma seqüência de aminoácidos de uma região CH de uma IgG4 humana gerada por expressão do ácido nucleico compreendendo a seqüência de SEQ ID No: 15, que é uma seqüência de ácido nucleico codificando a região CH de IgG4 humana (SEQ ID No: 13) transportando mutações de substituição em posições 714 e 722. Estas substituições no sítio doador de emenda de uma seqüência de ácido nucleico tem o efeito de que a emenda envolvendo o exon codificando a região de gancho não será realizada corretamente resultando em uma cadeia pesada sem os resíduos de aminoácidos codificados pelo exon.

Em uma forma de realização, a região de gancho completa de uma região CH foi deletada. Este é o caso em que nenhum aminoácido codificado pelo exon codificando a região de gancho de uma região CH está presente na cadeia pesada. Para o IgG4 mostrado em SEQ ID No: 14, isto irá corresponder a uma região CH tendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 16.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

Em uma forma de realização, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que um dos resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de cisteína e o outro dos resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foi deletado. Em uma outra forma de realização, é o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106, que foram substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de cisteína, e o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 109, que foi deletado. Em uma outra forma de realização, é o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106, que foi deletado, e o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 109, que foi substituído com um resíduo de aminoácido diferente de cisteína.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é obtenível por um método compreendendo expressão recombinante do anticorpo em um sistema de expressão de células in vitro como descrito em algum ponto aqui.

Em uma forma de realização, este método compreende

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando a região Cl de IgG;

ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de IgG4 humana, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto;

iv) produzir referido anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve codificada por uma construção de ácido nucleico de (i) e uma cadeia pesada codificada por uma construção de ácido nucleico de (ii) por co- expressão de referidas construções de ácido nucleico em células do sistema de expressão de células de (iii).

Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção tem uma concentração no plasma acima 10 μg/ml durante mais do que 7 dias quando administrado in vivo em uma dose de 4 mg por kg, como medido em um estudo farmacocinético em camundongos SCID (por exemplo como mostrado em exemplo 32). A taxa de depuração de um anticorpo monovalente da invenção pode ser medida por uso de métodos farmacocinéticos como é conhecido na técnica. O anticorpo pode por exemplo ser injetado intravenosamente (outras vias como i.p. ou i.m. também podem ser usadas) em um humano ou animal após o que as amostras de sangue são retiradas por venipunção em vários pontos no tempo, por exemplo 1 hora, 4 horas, 24 horas, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após injeção inicial). A concentração de anticorpo no soro é determinada por um teste apropriado como ELISA. A análise farmacocinética é realizada como conhecido na técnica e descrita em exemplo 32. Anticorpos monovalentes da invenção podem ter um tempo de residência no plasma, que é tão elevado como 100 vezes mais longo do que o tempo de residência no plasma, de por exemplo fragmentos Fab que são usados com freqüência como anticorpos monovalentes.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção tem uma depuração no plasma, que é mais de 10 vezes mais lenta do que a depuração no plasma de um fragmento F(ab')2, que tem um tamanho molecular comparável. Isto pode ser uma indicação da capacidade dos anticorpos da invenção de se ligarem a FcRn. FcRn é um receptor relacionado com a classe I de complexo de histocompatibilidade, e desempenha um papel na liberação passiva de imunoglobulina (Ig)Gs de mãe para o jovem e na regulação dos níveis de IgG do soro por proteção de IgG de degradação intracelular (Ghetie V et al., Annu Rev Imuno 1.18, 739-66 (2000)). Em uma forma de realização, o fragmento F(ab')2 é dirigido ao mesmo antígeno que o anticorpo monovalente da invenção. Em uma forma de realização, o fragmento F(ab')2 é dirigido ao mesmo epítopo que o anticorpo monovalente da invenção. Em uma forma de realização, a região Vh e a região Vl do fragmento F(ab')2 são idênticas a uma região Vh e a região Vl do anticorpo monovalente da invenção.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias quando administrado in vivo. A meia- vida de um anticorpo monovalente da invenção pode ser medida por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo como descrito acima.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias e até 14 dias, quando administrado in vivo.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias e até 21 dias, quando administrado in vivo.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é capaz de se ligar a FcRn. Esta ligação pode ser determinada por uso de métodos para a determinação da ligação, como é conhecido na técnica, por exemplo por uso de testes ELISA. A ligação de um anticorpo monovalente da invenção a FcRn pode por exemplo ser comparada a uma ligação do fragmento F(ab')2, cujo fragmento F(ab')2 tem uma região Vh e uma região Vl região, que são idênticas a uma região Vh e a região Vl do anticorpo monovalente da invenção, a FcRn no mesmo teste. Em uma forma de realização, a ligação de um anticorpo monovalente da invenção a FcRn é mais do que 10 vezes mais forte do que uma ligação do fragmento F(ab')2 a FcRn.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção se liga especificamente a um antígeno de tumor. Sem serem limitados a antígenos de tumor específicos, exemplos destes antígenos de tumor podem ser cMet e VEGF-R.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção especificamente liga um receptor de superfície de célula que é ativado quando da dimerização do receptor. Anticorpos monovalentes, como os anticorpos monovalentes da invenção, podem com freqüência ser utilizáveis no tratamento de doenças ou distúrbios, onde a ativação do receptor é indesejável, porque as moléculas de anticorpos da invenção devido à sua natureza monovalente são incapazes de induzir esta dimerização e assim esta ativação. Sem ser limitados a receptores específicos, os exemplos destes receptores podem ser erb-Bl, erb-B2, erb-B3, erb-B4 e membros de efrinas e receptores de efrinas como efrina Al a A6, ephAl a A8, efrina Bl a B3 e eph- Bl a eph-B6.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção, quando ligado a uma molécula alvo, inibe a multimerização da molécula alvo (como dimerização). Novamente, anticorpos monovalentes, como os anticorpos monovalentes da invenção, podem com freqüência ser utilizáveis no tratamento de doenças ou distúrbios, onde a multimerização do antígeno alvo é indesejável, porque as moléculas de anticorpos da invenção devido à sua natureza monovalente são incapazes de induzir esta multimerização. No caso de antígenos solúveis, multimerização pode formar complexos imunes indesejáveis. Sem serem limitados a alvos específicos, exemplos destes alvos podem ser os receptores de tipo Toll, como TLR-3 e TLR-9, ou angiopoietina-1, ou angiopoietina-2, ou membros da família de receptor de TNF como CD30, CD40 e CD95.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é um inibidor de TNF-alfa. Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo monovalente da invenção é uma forma monovalente de adalimumab, etanercept, ou infliximab.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é incapaz de ligação do efetuador. A expressão "incapaz de ligação do efetuador" ou "incapacidade de ligação do efetuador" no presente contexto significa que um anticorpo monovalente de IgG4 da invenção é incapaz de se ligar ao componente Clq do primeiro componente de complemento (Cl) e assim é incapaz de ativar a via clássica de citotoxicidade mediada por complemento. Além disso, os anticorpos monovalentes da invenção são incapazes de interagir com receptores de Fc e podem assim ser incapazes de disparar as funções de efetuador mediadas por receptor de Fc, como fagocitose, ativação celular, indução de liberação de citocinas

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é produzido por uso de tecnologias de DNA recombinante. Anticorpos podem ser produzidos usando células hospedeiras eucarióticas recombinantes, como células de ovário de hamster chinês (CHO), células NS/0, células HEK293, células de insetos, células de plantas, ou fungos, incluindo células de levedura. Ambos os sistemas estáveis assim como transientes podem ser usados para este fim. A técnica pode ser feita usando vetores de expressão de plasmídeos por vários métodos estabelecidos, como eletroporação, lipofeção ou nucleofeção. Alternativamente, infecção pode ser usada para expressar proteínas codificadas por vírus recombinantes como adeno, vacínia ou baculovírus. Outro método pode ser usar animais transgênicos para a produção de anticorpos.

Uma seqüência de DNA codificando o anticorpo pode ser preparada sinteticamente por métodos padrões estabelecidos, por exemplo o método fosfoamidina descrito por Beaucage et al.„ Tetrahedron Lett. 22, 1859-1869 (1981), ou o método descrito por Matthes et al., EMBO J. 3, 801- 805 (1984). De acordo com o método fosfoamidina, oligonucleotídeos são sintetizados, por exemplo em um sintetizador automático de DNA, purificados, anelados, ligados e clonados em vetores apropriados.

Uma seqüência de DNA codificando pode também ser de origem genômica ou cDNA, por exemplo obtida por preparação de uma bibliotecas genômica ou cDNA e triando as seqüências de DNA codificando para todo ou parte do anticorpo por hibridização usando sondas de oligonucleotídeo sintéticas de acordo com técnicas padrões (confere Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor, 1989). A seqüência de DNA também pode ser preparada por reação de cadeia polimerase usando iniciadores específicos, por exemplo como descrito em US 4683202 ou Saiki et al. Science 239, 487-491 (1988).

A seqüência de DNA pode então ser inserida em um vetor de expressão recombinante, que pode ser qualquer vetor, que pode convenientemente ser submetido a procedimentos de DNA recombinantes. A escolha do vetor com freqüência irá depender da célula hospedeira em que deve ser introduzido. Assim, o vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo um plasmídeo. Alternativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido em uma célula hospedeira, é integrado no genoma da célula hospedeira e replicado junto com o cromossomo(s) em que ele foi integrado.

No vetor, a seqüência de DNA codificando o anticorpo deve ser ligada operativamente a uma seqüência de promotores apropriada. O promotor pode ser qualquer seqüência de DNA, que mostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha e pode ser derivado de genes codificando proteínas ou homólogas ou heterólogas para a célula hospedeira.

Os exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição da seqüência de DNA de codificação em células de mamíferos são o promotor CMV, o promotor SV40, o promotor MT-I (gene metalotioneina ) ou o promotor tardio principal de adenovírus 2 Outros promotores apropriados são conhecidos na técnica. Um promotor apropriado para uso em células de insetos é por exemplo o promotor de polihedrina. Os promotores apropriados para uso em células hospedeiras de levedura incluem promotores de gene glicolíticos de levedura ou genes álcool desidrogenases, ou os promotores TPIl ou ADH2-4c. Os promotores apropriados para uso em células hospedeiras de fungo filamentoso são,, por exemplo, o promotor ADH3 ou o promotor tpiA.

A seqüência de DNA de codificação também pode ser ligada operativamente a um terminador apropriado, como o terminador de hormônio de crescimento humano (ou hospedeiros fungicos) os terminadores TPIl ou ADH3. Outros terminadores apropriados são conhecidos na técnica. O vetor pode ainda compreender elementos como sinais de poliadenilação (por exemplo de SV40 ou a região de adenovírus 5 Elb), seqüências de melhorador transcripcional (por exemplo o melhorador de SV40) e seqüências de melhorador translacional (por exemplo as codificando RNAs de adenovírus VA). Outros sinais e melhoradores são conhecidos na técnica.

O vetor de expressão pode ainda compreender a seqüência de DNA permitindo ao vetor replicar na célula hospedeira em questão. Um estrutura de tal seqüência (quando a célula hospedeira é uma célula de mamífero) é a origem de replicação de SV40. Outras origens de replicações são conhecidas na técnica. O vetor pode também compreender um marcador selecionável, por exemplo um gene cujo produto complementa um defeito na célula hospedeira, como o gene codificando for dihidrofolato reductase (DHFR), glutamina sintetase (GS) ou um que confere resistência a fármaco, por exemplo neomicina, hidromicina ou metotrexato. Outros marcadores selecionáveis são conhecidos na técnica.

Os procedimentos usados para ligar as seqüências de DNA codificando os peptídeos ou proteínas de comprimento completo, o promotor e o terminador, respectivamente, e para inserir os mesmos em vetores apropriados contendo a informação necessária para a replicação, são bem conhecidos dos versados (confere, por exemplo, Sambrook et al., op.cit.).

Para obter anticorpos monovalentes recombinantes da invenção, as seqüências de DNA codificando partes diferentes da(s) cadeia(s) de polipeptídeo do anticorpo podem ser individualmente expressados na célula hospedeira, ou pode ser fusionadas, dando uma construção de DNA codificando o polipeptídeo de fusão, como um polipeptídeo compreendendo ambas as cadeias pesadas e leves, inseridas em um vetor de expressão recombinante, e expressadas em células hospedeiras.

A célula hospedeira em que o vetor de expressão pode ser introduzido, pode ser qualquer célula que é capaz de expressão de proteínas de comprimento completo, e pode ser por exemplo uma célula eucariótica, como células de invertebrados (insetos) ou células de vertebrados, por exemplo oócitos de Xenopus laevis ou células de mamíferos, como células de insetos e de mamíferos. Exemplos de linhagens de células de células de mamíferos são as linhagens de células HEK293 (ATCC CRL-15 73), COS (ATCC CRL-1650), BHK (ATCC CRL-1632, ATCC CCL-10), NS/0 (ECACC 85110503) ou CHO (ATCC CCL-61). Outras linhagens de células apropriadas conhecidas na técnica. Em uma forma de realização, o sistema de expressão é um sistema de expressão de mamíferos, como um sistema de expressão de células de mamíferos compreendendo diversas variações clonais de células HEK293.

Os métodos de transfecção de células de mamíferos e expressando seqüências de DNA introduzidas nas células são descritos por exemplo em Kaufinan et al.„ J. Mol. Biol. 159, 601-621 (1982); Southern et al., J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341 (1982); Loyter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 422-426 (1982); Wigler et al., Cell 14, 725 (1978); Corsaro et al., Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981); Graham et al., Virol. 52, 456 (1973); e Neumann et al., EMBO J. 1, 841-845 (1982). Para obter um anticorpo monovalente da invenção, células hospedeiras do sistema de expressão podem, em uma forma de realização, ser cotransfectadas com dois vetores de expressão simultaneamente, em que o primeiro dos referidos dois vetores de expressão compreende a seqüência de DNA codificando a cadeia pesada do anticorpo, e o segundo dos referidos dois vetores de expressão compreende a seqüência dê DNA codificando a cadeia leve do anticorpo. As duas seqüências também podem estar presentes no mesmo vetor de expressão, ou elas podem estar fusionadas dando uma construção de DNA codificando o polipeptídeo de fusão, como um polipeptídeo compreendendo tanto cadeias leves como pesadas.

Em uma forma de realização, células fungicas (incluindo células de levedura) podem ser usadas como células hospedeiras. Exemplos de células de leveduras apropriadas incluem células de Saccharomyces spp. ou Schizosaccharomyces spp., em particular cepas de Saccharomyces cerevisiae. Exemplos de outras células fungicas são células de fungos filamentosos, por exemplo Aspergillus spp. ou Neurospora spp., em particular cepas de Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger. O uso de Aspergillus spp. Para a expressão de proteínas é descrito em, por exemplo EP 238 023.

O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional apropriado para o cultivo de células de mamíferos, como um meio contendo soro ou um meio sem soro contendo suplementos apropriados, ou um meio apropriado para o cultivo de células de insetos, levedura ou fungo. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com as formulações publicadas (por exemplo em catálogos do American Type Culture Collection).

O anticorpo monovalente produzido de modo recombinante pode então ser recuperado do meio de cultura por procedimentos convencionais, incluindo separação das células hospedeiras do meio por centrifugação ou filtração, precipitação dos componentes proteináceos do sobrenadante ou filtrado por meio de sal, por exemplo sulfato de amônio, purificação por vários procedimentos cromatográficos, por exemplo HPLC, cromatografia de troca iônica, cromatografia por afinidade, cromatografia de proteína A, cromatografia de proteína G, ou outros.

A presente invenção também refere-se a um método de preparação de um anticorpo monovalente da invenção, em que referido método compreende as etapas de:

(a)cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando referido anticorpo monovalente ; e

(b)recuperar o anticorpo monovalente a partir da cultura de célula hospedeira.

Em uma forma de realização, referida célula hospedeira é uma célula hospedeira procariótica. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em uma forma de realização, as células de E. coli são de uma cepa deficiente em atividades de protease endógenas.

Em uma forma de realização, referida célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula HEK-293F. Em outra forma de realização, a célula hospedeira é uma célula CHO.

Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura. Em outra forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células.

Os anticorpos da presente invenção têm a vantagem de terem uma meia-vida longa in vivo, levando a uma janela terapêutica mais lona, como comparado com, por exemplo, um fragmento FAB do mesmo anticorpo que tem uma meia vida in vivo consideravelmente mais curta.

Além disso, devido à meia-vida longa e ao tamanho pequeno, os e anticorpos monovalentes da invenção terão um potencial tendo uma melhor distribuição in vivo, em exemplo por serem capazes de penetrar em tumores sólidos. Isto leva a um grande uso em potencial dos anticorpos monovalentes da invenção, por exemplo para tratamento de câncer, porque os anticorpos da invenção podem ser usados ou para inibir a molécula alvo, ou como um mecanismo de liberação específico do alvo para outros fármacos que devem tratar a doença.

Devido à ausência de ativação do sistema imune para os anticorpos monovalentes da invenção, os anticorpos da invenção são inibidores da célula alvo, mas não matam a célula alvo. Isto pode ser uma vantagem quando contemplando o tratamento de uma variedade de doenças onde a inibição do mecanismo é desejada sem o desejo de que a célula seja morta.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente anti- VEGF é usado para tratamento de AMD (degeneração macular aguda), e outras doenças.

Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente anti- VEGF usados é uma forma monovalente de Bevacizumab (Avastin).

Anticorpos da presente invenção são monovalentes, são estáveis sob condições fisiológicas, são incapazes de ativar complemento, e são assim apropriados para uso no tratamento de distúrbios e doenças, em que o uso de anticorpos polivalentes, como anticorpos divalentes, são desnecessários e desvantajoso, ou em que a ativação de complemento é desnecessária ou desvantajosa. Anticorpo monovalente da invenção pode ser representado em soluções de água por um heterodímero consistindo de uma cadeia leve e uma cadeia pesada.

A expressão "estável sob condições fisiológicas" ou "estabilidade sob condições fisiológicas" no presente contexto significa que o anticorpo monovalente retém suas características estruturais e funcionais inalteradas e está presente em uma concentração terapeuticamente significante por mais do que uma semana após referida molécula ser administrada a um indivíduo in vivo em uma dose de 1 a 10 mg por kg. Uma concentração no plasma de 5 μg/ml é considerada como sendo significante para a maior parte dos anticorpos terapêuticos, porque os anticorpos podem mostrar saturação da ligação alvo neste nível. Um intervalo de tempo de 7 dias é considerado neste contexto como sendo relativamente longo.

Tanto em camundongos imuno-deficientes como imuno- competentes, a depuração da variante sem gancho é bem mais lenta do que a dos fragmentos F(ab')2, que tem um tamanho molecular comparável. Isto indica que a parte Fc tem um efeito favorável sobre o tempo de residência no plasma e provê indicação de uma interação funcional com o receptor Fc neonatal (FcRn) que protege IgG endocitosado de degradação intracelular. A taxa de depuração da variante sem gancho foi cerca de 300 vezes menor do que a dos fragmentos Fab, indicando que pode ser dada em uma dosagem 300 vezes menor para obter concentrações no plasma sustentadas equivalentes.

A invenção também refere-se a um imunoconjugado do anticorpo monovalente da invenção. A presente invenção refere-se em particular a um anticorpo monovalente da invenção conjugado a uma porção terapêutica, como uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo. Estes conjugados são referidos aqui como "imuno conjugados". Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial (por exemplo mata) as células. Exemplos incluem taxol, citochalasina B, gramicidina D, brometo de etídeo, emetina, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos e homólogos dos mesmos.

Os agentes quimioterapêuticos apropriados para a formação de imuno conjugados da invenção incluem, mas não são limitados a, antimetabólitos (por exemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracil, decarbazina, hidroxiuréia, azatiprina, gemcitabina e cladribina), agentes alquilantes (por exemplo mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomannitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (por exemplo daunorubicina (antigamente daunomicina) e doxorubicina), antibióticos (por exemplo dactinomicina (antigamente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (por exemplo vincristina, vinblastina, docetaxel, paclitaxel e vinorelbina).

Os radioisótopos apropriados são por exemplo iodo-131, ítrio- 90 ou índio-111.

Outros exemplos de porções terapêuticas podem ser uma proteína ou polipeptídeo possuindo uma atividade biológica desejada. Estas proteínas pode incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo da mesma, como abrina, ricina A, exotoxina pseudomonas, ou toxina de difteria; um proteína como fator de necrose de tumor ou interferon-γ; ou modificadores de resposta biológica, como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulante de colônia de granulócitos macrófagos, (GM-CSF), fator estimulante de colônia de granulócitos (G-CSF), ou outros fatores de crescimento.

Em uma forma de realização, a porção terapêutica é doxorubicina, cisplatina, bleomicina, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida ou ricina A.

Técnicas para conjugar esta porção terapêutica a anticorpos são bem conhecidas, ver, por exemplo Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Imuno targeting of Drugs in Câncer Therapy", Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies for Drugs Delivery", Controlled Drug Delivery (2a. ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Cytotoxic Agents em Câncer Therapy: A Review", Monoclonal Antibodies 1984: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective of The Therapeutic Use of Radiolabelled Antibody in Câncer Therapy", Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The Preparação And Cytotoxic Properties of antibody-Toxin Conjugates " Imuno 1. Rev., 62:119-58 (1982).

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção são fixados a um ligador- quelador, por exemplo tiuxetano, que permite que o anticorpo seja conjugado a um radioisótopo.

Em uma forma de realização, a presente invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monovalente da presente invenção. As composições farmacêuticas pode ser formuladas com veículos farmaceuticamente aceitáveis ou diluentes assim como outros adjuvantes e excipientes bem conhecidos de acordo com técnicas convencionais como as descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Ed., Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.

A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via e modo apropriado. Como será notado pelo versado, a via e/ou modo administração irá variar dependendo dos resultados desejados.

As composições farmacêuticas da presente invenção incluem as apropriadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral.

Formulações da presente invenção que são apropriadas para administração vaginal incluem pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas, ou formulações de pulverização, como veículos que são bem conhecidos na técnica como apropriados. A formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições desta invenção incluem pós, pulverizações, ungüentos, pastas, cremes, loções, géis, soluções, curativos e inalantes.

Em uma forma de realização, a composição farmacêutica é apropriado para administração parenteral.

As expressões "administração parenteral" e "administrada parenteralmente" como usadas aqui significam modos de administração diferentes de administração enteral e tópica, geralmente por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intra- peritoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intrasternal.

Em uma forma de realização a composição farmacêutica é administrada por injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção são administrados em forma cristalina por injeção subcutânea, confere Yang et al. PNAS, 100(12), 6934-6939 (2003).

Sem levar em conta a via de administração selecionadas, os anticorpos monovalentes da presente invenção, que podem ser usados na forma de um sal farmaceuticamente aceitável ou em uma forma hidratada apropriada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais bem conhecidos do versado na técnica.

Como usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes anti-bacterianos e anti-fungos, agentes de isotonicidade, antioxidantes, e agentes de retardo da absorção, e outros, que são fisiologicamente compatíveis.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. O uso destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido η técnica. Exceto pelo fato de que o meio ou agente convencional é incompatível com o anticorpo monovalente, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado.

Em uma forma de realização, o veículo é apropriado para administração parenteral por exemplo injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.

As composições farmacêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada apropriada para uma concentração elevada do fármaco. Os exemplos de veículos aquosos e não aquosos apropriados que podem ser empregados em composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e outros) e misturas apropriadas dos mesmos, óleos vegetais, como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, por uso de materiais de revestimento, como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de tensoativos.

As composições farmacêuticas também podem conter adjuvantes como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização e pela inclusão de vários agentes anti-bacterianos e anti-fungicos por exemplo parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, e outros, também pode ser desejável incluir agentes de isotonicidade, como açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol, glicerol e cloreto de sódio nas composições. Os antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis também podem ser incluídos, por exemplo (1) antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, e outros, (2) antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e outros, e (3) agentes quelantes de metal, como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e outros.

A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocasionada por inclusão de agentes que retardam a absorção, por exemplo sais de monoestearato e gelatina.

As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação de anticorpo monovalente na quantidade requeridas em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes por exemplo como enumerado acima, como requerido, seguido por microfiltração com esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação do anticorpo monovalente em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os requeridos outros ingredientes, por exemplo, dentre os enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos para a preparação são secagem a vácuo e secagem por congelamento (liofilização) que dão um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução previamente filtrada de modo estéril do mesmo.

Se apropriado, o anticorpo monovalente pode ser usado em uma forma hidratada apropriada, ou na forma de um sal farmaceuticamente aceitável. Um "sal farmaceuticamente aceitável' refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver por exemplo Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácido e sais de adição de base. Os sais de adição de ácido incluem os derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfórico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e outros, assim como ácidos orgânicos não tóxicos, como ácidos mono- e dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidroxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, e outros. Os sais de adição d base incluem os derivados de metais alcalino-terrosos, como sódio, potássio, magnésio, cálcio e outros, assim como aminas orgânicas não tóxicas, como N-N'- benziletileno diamina, N-metil-glucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e outros.

Dependendo da via de administração, o anticorpo monovalente pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado por exemplo, lipossomas. Os lipossomas incluem emulsões água- em-óleo CGF assim como lipossomas convencionais (Strejan et al., J. Neuroimuno 1. 7, 27 (1984)).

O anticorpo monovalente pode ser preparado com veículos que irão proteger o anticorpo monovalente contra a liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, curativos transdérmicos, e sistemas de liberação microencapsulados. Os polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, podem ser usados, como acetato de etileno vinila, polianidridos, ácidos poliglicólicos, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Os métodos para a preparação destas formulações são geralmente bem conhecidos do versado, ver, por exemplo Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

As composições farmacêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Em uma forma de realização, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, como os dispositivos descritos em US 5399163; US 5383851; US 5312335; US 5064413; US 4941880; US 4790824; ou US 4596556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos utilizáveis na presente invenção incluem: US 4487603, que descreve uma bomba de micro-infusão implantável para a distribuição do medicamento em uma taxa controlada; US 4486194, que descreve um dispositivo terapêutico para a administração de medicamentos através da pele;US 4447233, que descreve uma bomba de infusão de medicação para liberar a medicação em uma taxa de infusão precisa; US 4447224, que descreve um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para a liberação contínua de fármacos; US 4439196, que descreve um sistema de liberação de fármacos osmótico tendo compartimentos de múltiplas câmaras, e US 4475196, que descreve um sistema de liberação osmótico de fármacos. Muitos outros de tais implantes, sistemas de liberação e módulos são bem conhecidos na técnica.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção podem ser formulados para assegurar uma distribuição apropriada in vivo por exemplo por uso de lipossomas. Para métodos de fabricação de lipossomas, ver por exemplo US 4522811; US 5374548; e US 5399331. Os lipossomas podem compreender uma ou mais por substituído que são seletivamente transportadas em células ou órgãos específicos, assim melhoram a liberação marcada do fármaco (ver, por exemplo V.V. Ranade, J. Clin. Pharmacol. 29, 685 (1989)). As porções marcadas exemplares incluem folato ou biotina (ver, por exemplo US 5416016); manosídeos (Umezawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 153, 1038 (1988)); outros anticorpos (Bloeman et al., FEBS Lett. 357, 140 (1995); Owais et al., Antimicrob. Agents Chemother. 39, 180 (1995)); receptor de proteína A de anticorpo (Briscoe et al., Am. J. Physiol. 1233, 134 (1995)), espécies diferentes que podem compreender as formulações da invenção, assim como componentes das moléculas inventadas; ρ 120 (Schreier et al., J. Biol. Chem. 269, 9090 (1994)); ver também Keinanen et al., FEBS Lett. 346, 123 (1994); Killion et al., ImunoMethods 4, 273 (1994). A composição pode ser fluida na extensão de que existe uma fácil aplicação por seringa. Ela deve ser estável sob as condições de fabricação e armazenamento e deve ser evitada contra a ação contaminante de microorganismos como bactérias e fungos.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção podem ser formulados para evitar ou reduzir seu transporte através da placenta. Isto pode ser feito por métodos bem conhecidos, por exemplo por PEGuilação dos anticorpos monovalentes. Outras referências podem ser feitas a Cunningham-Rundles et al., J Imuno 1 Methds. 152, 177-190 (1992); e a Landor et al.,Ann. Allergy Asthma Imuno 1. 74, 279-283 (1995).

Os regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo uma resposta terapêutica), por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas, com o tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicada pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. A forma de unidade de dosagem como usada aqui refere-se a unidades fisicamente discretas apropriadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados, cada unidade contém uma quantidade predeterminada de anticorpo mono valente calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de unidade de dosagem da invenção são ditadas por e diretamente dependentes em (a) as características singulares do anticorpo monovalente e o efeito terapêutico particular a ser obtidos, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição como um anticorpo monovalente para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Os níveis de dosagem reais dos anticorpos monovalentes nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade de ingrediente ativo que é efetiva para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição, e modo de administração. O nível de dosagem selecionado irá depender de vários fatores farmacocinéticos incluindo a atividade dos anticorpos monovalentes particulares da presente invenção empregados, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do anticorpo monovalente particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado, e fatores semelhantes bem conhecidos nas técnicas médicas.

Um médico ou veterinário tendo o conhecimento da técnica pode prontamente determinar e prescrever a quantidade efetiva da composição farmacêutica requerida. Por exemplo,1 o médico ou veterinário pode iniciar com doses dos compostos da invenção empregados na composição farmacêutica em níveis menores do que os requeridos a fim de obter o efeito terapêutico desejado e gradualmente aumentar a dosagem até o efeito desejado ser obtido. Em geral, uma dose apropriada de uma composição farmacêutica da invenção será a quantidade de anticorpo monovalente que é a menor dose efetiva para produzir um efeito terapêutico. Esta dose efetiva irá geralmente depender de fatores descritos acima. Como outro exemplo, o médico ou veterinário irá iniciar com uma dose de carga alta seguido por administração repetida de doses menores para construir rapidamente uma dose terapeuticamente efetiva e manter a mesma durante períodos de tempo mais longos.

Uma composição farmacêutica da invenção pode conter uma ou uma combinação de diferentes anticorpos monovalentes da invenção. Assim, em uma outra forma de realização, as composições farmacêuticas incluem uma combinação de anticorpos monovalentes múltiplos (por exemplo dois ou mais) da invenção que atuam por diferentes mecanismos. Os anticorpos monovalentes podem também ser assim combinados com anticorpos divalentes.

A presente invenção também refere-se a uma construção de ácido nucleico codificando a seqüência de aminoácidos de uma região Ch de uma cadeia pesada de um anticorpo monovalente da invenção.

Em uma forma de realização, a invenção provê uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma IgG4, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho na referida região Ch não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência de aminoácidos de referida região Ch, ou uma seqüência complementar da mesma.

Uma construção de ácido nucleico codificando a região Ch de um anticorpo monovalente da invenção pode ser derivada de ácidos nucleicos codificando a região Ch de IgG4. A construção de ácido nucleico codificando a seqüência de comprimento completo de aminoácidos de uma região Ch de IgG4 pode ser preparada por qualquer um dos métodos discutidos aqui, por exemplo nos exemplos, ou em outros modos conhecidos na técnica. Os métodos de manipulação com seqüências de DNA recombinantes são bem conhecidos na técnica, e podem por exemplo ser feitos usando mutagênese sítio-dirigida, como descrito no presente relatório. No entanto, mutagênese sítio-dirigida é apenas um dos exemplos de tecnologias não limitativos que podem ser aplicados.

A modificação de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch pode ser realizada como descrito acima para a construção dos anticorpos monovalentes da invenção.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos cisteína.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que os aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQID No: 14 foram deletados.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região de gancho completa foi deletada.

Em uma forma de realização, mutação (substituição) de nucleotídeos correspondendo ao sítio doador de emenda da região de gancho na seqüência codificando a região Ch de IgG4, identificada aqui como SEQ ID No: 13, leva à expressão do polipeptídeo compreendendo a região Ch sem gancho de IgG4.

Assim, em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico da invenção foi modificada de modo que pelo menos um nucleotídeo do sítio doador de emenda de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho foi substituído com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo originalmente presente nesta posição.

Em uma forma de realização, os nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos em posição 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma construção de ácido nucleico da invenção compreende uma seqüência de SEQ ID No: 13, em que nucleotídeos 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma construção de ácido nucleico da invenção compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 15.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma construção de ácido nucleico da invenção foi modificada de modo que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

Em uma forma de realização, os nucleotídeos substituídos de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma construção de ácido nucleico da invenção são substituídos por uso de mutagênese sítio- dirigida.

Em uma forma de realização, uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma IgG4, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto, é fusionada com um ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh do anticorpo monovalente da invenção.

Assim, em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo específico para antígeno, ou uma seqüência complementar da mesma.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh da construção de ácido nucleico é operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch? ou uma seqüência complementar da mesma.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico compreende uma seqüência nucleotídica codificando a cadeia pesada de um anticorpo monovalente da invenção.

Isto pode ser obtido usando tecnologias bem conhecidas para obter uma construção de ácido nucleico em que duas seqüências de codificação diferentes são ligadas operativamente juntas. A seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo monovalente da invenção pode ser derivada de ácidos nucleicos codificando a região Vh de qualquer anticorpo específico de antígeno. Em uma forma de realização, a região Vh é derivada do mesmo anticorpo do qual a região Vl do anticorpo monovalente é derivada. A invenção provê exemplos de como fazer as construções de ácido nucleico compreendendo

1) a seqüência de ácido nucleico codificando o Vh de HuMab- 7D8 identificada como SEQ ID No: 5 e a seqüência de ácido nucleico codificando Ch sem gancho de IgG4 identificada como SEQ ID No: 15, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas, e

2) a seqüência de ácido nucleico codificando o Vh de anti- Betv-I de camundongo identificada como SEQ ID No: 7 e a seqüência de ácido nucleico codificando Ch sem gancho de IgG4 identificada como SEQ ID No: 15, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas.

Várias diferentes construções de ácido nucleico codificando anticorpos monovalentes capazes de ligar antígenos específicos diferentes podem ser geradas usando o método da invenção descrito acima e assim exemplos de anticorpos monovalentes específicos não são limitados aos exemplos de anticorpos descritos aqui.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico da invenção também compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de um anticorpo monovalente da invenção.

Em uma forma de realização, uma construção de ácido nucleico da invenção compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vl de um anticorpo monovalente da invenção.

Em uma forma de realização, uma construção de ácido nucleico da invenção compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Cl de um anticorpo monovalente da invenção. Em uma forma de realização, a região Cl é a região Cl de Ig cadeia leve kappa. Em uma forma de realização, a região Cl tem a seqüência de SEQ ID No: 1. em outra forma de realização, a região Cl é uma região Cl de Ig de cadeia leve kappa. Em uma forma de realização, a região Cl tem a seqüência de SEQ ID No: 3.

Esta construção de ácido nucleico pode ser preparada por qualquer tecnologia recombinante conhecida discutida aqui, ou preparada de acordo com os procedimentos descritos no presente pedido nos exemplos apresentados.

A seqüência de ácido nucleico codificando a região Vl do anticorpo monovalente da invenção pode ser derivada de ácidos nucleicos codificando a região Vh de qualquer anticorpo específico de antígeno. Em uma forma de realização, a região Vl é derivada do mesmo anticorpo do qual a região Vh do anticorpo monovalente é derivada de. A invenção provê exemplos de como fazer

1) uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência de ácido nucleico codificando o Vl de HuMab-7D8 identificada como SEQ ID No: 9 e a seqüência de ácido nucleico codificando um Cl kappa de uma Ig identificada como SEQ ID No: 1, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas, e

2) uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência de ácido nucleico codificando o Vl de anti-Betv-1 de camundongo identificada como SEQ ID No: 11 e a seqüência de ácido nucleico codificando um Cl kappa de uma Ig identificada como SEQ ID No: 1, em que referidas seqüências são ligadas operativamente juntas.

Os ácidos nucleicos pode estar presentes em células completas, em um lisado de células, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura.

As construções de ácido nucleico da presente invenção, apesar de com freqüência em uma seqüência nativa (exceto por sítios de restrição modificados e outros), ou de cDNA, genômico ou misturas dos mesmos, pode ser mudada de acordo com técnicas padrões para prover seqüências de genes. Para seqüências de codificação, estas mutações, podem afetar a seqüência de aminoácidos como desejado. Em particular, as seqüências de DNA substancialmente homólogas a ou derivadas de variantes nativas V, D, J, constantes, de troca, e outras tais seqüências descritas aqui são contempladas (onde "derivado" indica que a seqüência é idêntica ou modificada de outra seqüência).

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico é uma construção de DNA. Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico é a construção de DNA de filamento duplo.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico é uma construção de RNA.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção são preparados deixando-se uma construção de ácido nucleico como descrito acima ser expressada em uma célula.

Assim, a invenção refere-se a uma construção de ácido nucleico como descrito acima, que é um vetor de expressão. Em uma forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão procariótico. Em uma forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão eucariótico. Em uma forma de realização, o vetor de expressão é um vetor de expressão de mamífero. Exemplos de vetores de expressão diferentes, que podem ser usados para os fins da invenção, são discutidos em outras partes do documento e os exemplos particulares são descritos na seção de Exemplos.

A invenção provê um método de preparação de um anticorpo monovalente da invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucleico da invenção, e, se referida construção de ácido nucleico não codifica a cadeia leve de referido anticorpo, também compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células. Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células. Em outra forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura de células.

A invenção também provê o uso de uma construção de ácido nucleico da invenção para a produção de um anticorpo monovalente da invenção. Em uma forma de realização, referida produção inclui o uso de um método como descrito em outros detalhes abaixo.

Um anticorpo monovalente da invenção pode assim por exemplo ser preparado por expressão de um vetor de expressão compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve do anticorpo da invenção e um vetor de expressão compreendendo uma seqüência nucleica codificando a cadeia pesada do anticorpo da invenção, ou um vetor de expressão compreendendo ambas, em células hospedeiras. As células hospedeiras podem r selecionados dentre qualquer uma das células apropriadas para expressão de proteínas estranhas, por exemplo células de mamíferos, como descrito em algum ponto aqui. A invenção refere-se a ambas as expressões in vivo e in vitro.

Para a expressão in vitro transiente, células HEK293 de mamíferos podem ser usadas. Neste caso, as células em cultura devem ser transfectadas com os vetores de expressão de acima de qualquer um dos métodos apropriados para a transfecção de células que são bem conhecidas na técnica, por exemplo um kit de tranfecção de células apropriado pode ser adquirido de um fabricante comercial, por exemplo Stratagene ou Invitrogene. Para a expressão in vivo, o vetor de expressão é administrado in vivo por qualquer modo apropriado de administração desenvolvido para este fim. Os métodos para administração dos vetores de expressão in vivo são também bem conhecidos na técnica.

Conseqüentemente, a invenção provê uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucleico como descrito acima. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula procariótica. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula de E. coli. Em outra forma de realização, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula de mamíferos. Em uma forma de realização, a célula hospedeira é uma célula CHO. Em outra forma de realização, a célula hospedeira é uma célula HEK-293F.

A invenção provê um método de preparação de um anticorpo monovalente da invenção compreendendo cultivar uma célula hospedeira da invenção, cuja célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo e uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células. A invenção também provê o uso de uma célula hospedeira da invenção para a produção de um anticorpo monovalente da invenção. Em uma forma de realização, referida produção inclui o uso de um método como descrito em maiores detalhes abaixo. A seqüência de ácido nucleico pode estar presente na mesma construção de ácido nucleico que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada ou presente em uma construção de ácido nucleico separada. Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células. Em outra forma de realização, o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura de células.

A invenção também provê um animal transgene compreendendo uma construção de ácido nucleico como descrito acima.

A invenção provê um método para a produção recombinante de um anticorpo monovalente, referido método compreendendo

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região VL de um anticorpo específico do antígeno selecionado e seqüência nucleica codificando a região (CL) constante de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região VL de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleica codificando a região CL de uma Ig são ligadas operativamente juntas;

iii) prover um sistema de expressão de células para a produção de referido anticorpo; iv) produzir referido anticorpo monovalente por co-expressão das construções de ácido nucleico de (i) e (ii) em células do sistema de expressão de células de (iii).

Após a etapa (iv) o anticorpo monovalente pode ser purificado e formulado como desejado. Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho de uma cadeia pesada não compreende quaisquer resíduos de cisteína como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que os aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região de gancho completa foi deletada como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana, em que pelo menos um nucleotídeo do sítio doador de emenda de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho foi substituído com outro nucleotídeo como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana, em que os nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos em posição 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13 como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana compreendendo uma seqüência de SEQ ID No: 13, em que nucleotídeos 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13 como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 15 como descrito acima.

Em uma forma de realização, a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína como descrito acima.

Em uma forma de realização, os nucleotídeos substituídos de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho de uma região Ch são substituídos por uso de mutagênese sítio-dirigida como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região Cl da cadeia kappa de IgG humana como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 1 como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região Cl da cadeia lambda de IgG humana como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 3 como descrito acima.

Em uma forma de realização, as construções de ácido nucleico são construções de DNA como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico de (i), (ii), (iii) e/ou (iv) é um vetor de expressão procariótico como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células procarióticas como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o sistema de expressão procariótico de células compreende células de E. coli como descrito acima. Em uma outra forma de realização, as células de E. coli são de uma cepa deficiente em atividades de protease endógenas como descrito acima.

Em uma forma de realização, a construção de ácido nucleico de (i), (ii), (iii) e/ou (iv) é um vetor de expressão eucariótico como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células eucarióticas como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células de mamíferos como descrito acima. Em uma outra forma de realização, o sistema de expressão de células de mamíferos compreende células CHO como descrito acima. Em ainda outra forma de realização, o sistema de expressão de células de mamíferos compreende células HEK-293F como descrito acima.

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente obtenível pelo uso de um método da invenção.

A presente invenção também provê um anticorpo monovalente obtido pelo uso de um método da invenção.

De acordo com a invenção, qualquer anticorpo específico de antígeno monovalente da invenção pode ser feito usando um método como descrito acima.

O anticorpo monovalente da presente invenção tem numerosas utilidades terapêuticas e diagnosticas in vitro e in vivo envolvendo o diagnóstico e o tratamento de distúrbios envolvendo células expressando o antígeno que o anticorpo pode reconhecer e se ligar. A invenção não se refere a anticorpos monovalentes dirigidos a qualquer antígeno específico, como de acordo com a invenção, o anticorpo monovalente descrito no presente relatório pode ser feito contra qualquer antígeno específico. A invenção descreve dois anticorpos monovalentes diferentes, 7D8-HG (HuMab 7D8, ou simplesmente 7D8, é um anticorpo anti-CD20 descrito em W004/035607, e HuMab 7D8-HG, ou simplesmente 7D8-HG, é o mesmo anticorpo tendo uma cadeia pesada de IgG4 compreendendo uma região Ch consistindo de uma seqüência de aminoácidos com SEQ ID No: 16) e anti-Betvl-HG (anti-Betvl é um anticorpo de camundongo expressado por clone 2H8 da referência (Akkerdaas JH et al., Allergy 50(3), 215-20 (1995)) e anti-Betvl-HG é o mesmo anticorpo tendo uma cadeia pesada de IgG4 compreendendo uma região Ch consistindo de uma seqüência de aminoácidos com SEQ ID No: 16), preparados pelo método descrito no presente pedido, no entanto a invenção não é limitada a estes dois anticorpos monovalentes. Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes CD20 de acordo com a invenção são anticorpos monovalentes dos anticorpos descritos em W02005/103081.

Em algumas condições patológicas, é necessário e/ou desejável utilizar anticorpos monovalentes. Também, em alguns casos, prefere-se que um anticorpo terapêutico efetue sua ação terapêutica sem envolver atividades mediadas por sistema imune como as funções de efetuador, ADCC, fagocitose e CDC. Em tais situações, é desejável gerar formas de anticorpos em que estas atividades são substancialmente reduzidas ou eliminadas. Também é vantajoso se o anticorpo for de uma forma que possa ser feita de modo eficiente e com alto rendimento. A presente invenção provê estes anticorpos, que podem ser usados para vários fins, por exemplo, como terapêuticos, profiláticos e diagnósticos.

A utilidade específica de um anticorpo monovalente da invenção é naturalmente dependente do alvo específico do anticorpo. A seleção de alvos para os quais o anticorpo monovalente da invenção é um anticorpo utilizável para terapêutica, profilaxia, e diagnóstico pode ser baseada no valor terapêutico da administração de um anticorpo específico para o alvo, ou específica para um dado epítopo no alvo (esta informação é abundante na técnica com relação a um hospedeiro de diferentes alvos) e as vantagens de usar um anticorpo monovalente estável para o alvo específico. Estas considerações são bem conhecidas dos versados na técnica.

Um anticorpo monovalente da invenção pode ser usado como um antagonista para bloquear parcial ou totalmente a atividade do antígeno específico in vitro, ex vivo e/ou in vivo. Além disso, um anticorpo monovalente da invenção pode neutralizar a atividade do antígeno de outras espécies devido à ligação cruzada causada pelo compartilhamento de antígeno diferente dos mesmos epítopos. Assim, os anticorpos monovalentes da invenção podem ser usados para inibir uma atividade de antígeno específica, por exemplo em uma cultura de células contendo o antígeno, em indivíduos humanos ou em outros indivíduos mamíferos tendo o antígeno com o qual um anticorpo da invenção reage cruzado (por exemplo chimpanzé, babuíno, sagüi, macaco cinomolgo e rhesus, porco ou camundongo). Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção pode ser usado para inibir as atividades do antígeno ao contatar o anticorpo com o antígeno de modo que a atividade do antígeno é inibida. Em uma forma de realização, o antígeno é uma molécula de proteína humana.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é específico para um antígeno de ligando, e inibe a atividade do antígeno por bloqueio ou interferência com a interação ligando- receptor envolvendo o antígeno do ligando, assim inibindo a via de sinal correspondente e outros eventos moleculares e celulares.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é específico para um antígeno de receptor, que pode ser ativado por contato com um ligando e inibe a atividade do antígeno por bloqueio ou interferência com a interação ligando- receptor, assim inibindo a via de sinal correspondente e outros eventos moleculares e celulares.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD74 e inibe a sinalização induzida por MIF, mas afeta as funções de efetuador mediadas por Fc.

A invenção também refere-se a anticorpos monovalentes específicos do receptor que não necessariamente evitam a ligação do ligando mas interferem com a ativação do receptor, assim inibindo quaisquer respostas que seriam normalmente iniciadas pela ligação do ligando. A invenção também engloba anticorpos monovalentes que ou preferivelmente ou exclusivamente ligam a complexos ligando- receptor.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção pode atuar como um agonista de um receptor de antígeno particular, assim potenciando, melhorando ou ativando ou todas as atividades ou atividades parciais da ativação do receptor mediada por ligando.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção pode evitar a ligação de um vírus ou outro patógeno a seu receptor, como inibição de ligação de HIV a CD4 ou co-receptor, como CCR5 ou CXCR4.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção pode ser usado para tratar, inibir, retardar a progressão de, evitar / retardar a recorrência de, melhorar, ou evitar doenças, distúrbios, ou condições associadas com a expressão anormal e/ou atividade de uma ou mais moléculas de antígenos, como incluindo mas não limitado a tumores malignos e benignos, malignidades não leucemias e linfóides, distúrbios neuronais, gliais, astrocitais, hipotalâmicos e outros glandulares, macrofagais, epiteliais, estromais e blastocélicos, e distúrbios inflamatórios, angiogênicos e imunológicos.

Em uma forma de realização, um anticorpo monovalente da invenção pode ser usado para tratar, como inibir, retardar a progressão de, evitar / retardar a recorrência de, ou melhorar, ou evitar doenças, distúrbios ou condições como um câncer, um distúrbio proliferativo celular, distúrbio (auto-) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese. Isto irá depender do anticorpo monovalente sendo capaz de, através de uma especificidade de antígeno, interferir com a proliferação celular, crescimento celular, viabilidade celular, apoptose, necrose, interação célula-célula, interação célula-matriz, sinalização celular, expressão de molécula na superfície da célula, interações de molécula na superfície da célula, interações ligando- receptor.

A presente invenção provê um anticorpo monovalente da invenção para uso como um medicamento.

A presente invenção provê um anticorpo monovalente da invenção para uso como um medicamento for tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto-) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

A presente invenção provê um anticorpo monovalente da invenção para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização (como dimerização) de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno..

A presente invenção provê um anticorpo monovalente da invenção para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

A presente invenção provê um anticorpo monovalente da invenção para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção como um medicamento.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção como um medicamento for tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto-) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização (como dimerização) de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica for tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto-) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença. A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização (como dimerização) de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

A presente invenção provê o uso de um anticorpo monovalente da invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

A invenção provê um método de tratamento de uma doença ou distúrbio, em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de um anticorpo monovalente da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção, pelo que a doença ou distúrbio é tratada.

A invenção provê um método para inibir um antígeno em um indivíduo sofrendo de uma doença ou distúrbio em que a atividade do antígeno é indesejável, compreendendo administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção, de modo que a atividade do antígeno no indivíduo é inibida.

A presente invenção provê um método de tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção, e em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização (como dimerização) de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, compreendendo administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção dirigido ao referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção.

Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, compreendendo administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção.

Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio é uma doença ou distúrbio tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, compreendendo administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente da invenção, cujo anticorpo especificamente liga referido receptor, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico da invenção.

A literatura científica é abundante em exemplos de alvos, onde a ligação de anticorpos contra referido alvo, ou epítopos específicos de referido alvo, é mostrada como tendo, ou esperada como tendo, um efeito terapêutico. Dado os ensinamentos deste relatório e como descrito em outras partes aqui, está dentro do conhecimento do versado na técnica determinar se o uso de um anticorpo monovalente, com um anticorpo monovalente da presente invenção, contra estes alvos deve ser esperado como produzindo o efeito terapêutico. A seguir, vários exemplos destes alvos são dados; no entanto, estes exemplos não significam ser construídos como limitados pelo escopo da invenção.

Um anticorpo monovalente da invenção, cujo anticorpo especificamente liga um antígeno solúvel, em que a multimerização (como dimerização) de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis por exemplo resultando em agregação, por exemplo onde o antígeno solúvel consiste de subunidades idênticas múltiplas.

Um anticorpo mono valente da invenção, cujo anticorpo especificamente liga um receptor, que pode ser ativado por dimerização de referido receptor, pode por exemplo ser dirigido a receptor cmet, FcsRI, receptor de acetil colina, fas ou fasL, TRAIL, ou VEGF.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratada é tratável por interferência com a ativação da célula através de FcaRI, por interferência com função de FcaRI, por inibição de respostas mediadas por IgE ativadas por FcaRI ou por ligação de FcaRI solúvel. Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo monovalente é dirigido contra FcaRI e induz apoptose de células expressando FcaRI. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo asma alérgica, ou outras doenças alérgicas, como rinite alérgica, alergias de estação/ perenes, febre de feno, alergias nasais, dermatite atópica, eczema, urticária crônica, urticária, alergias de contato, conjuntivite alérgica, alergias oculares, alergias a alimentos e fármacos, alergias a látex, ou alergias a insetos, ou nefropatia IgA, como IgA pênfigo. Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a FcaRI. Estes anticorpos monovalentes podem também ser usados para a triagem ín vitro ou in vivo para FcaRI em amostra ou em paciente ou em uma abordagem de imunotoxina ou radio-rótulo para tratar estas doenças e distúrbios.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por regulação de modo negativo de sinalização mediada por cadeia γ de receptor de Fc através dos receptores FceRl ou Fcy. A ligação monomérica de anticorpo a FcaRI é conhecida para efetuar estas inibição. Anticorpos monovalentes podem assim ser usados para inibir a ativação imune através de uma faixa de receptores de Fc incluindo receptores Fcy, Fca e Fce.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por inibição, morte e/ou atividade de modulação 6 crescimento (por exemplo proliferação) de células expressando CD25, através do bloqueio direto ou indireto e células T ativadas ou células expressando CD25. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo ser:

Rejeição a transplantes, incluindo rejeição a aloenxerto e xenoenxerto, em pacientes sofrendo ou que sofreram transplante de órgão ou tecido, como coração, pulmão, coração- pulmão combinado, traquéia, rim, fígado, pâncreas, esôfago, intestino, pele, membros, cordão umbilical, célula- tronco, transplante de ilhotas, etc, em que um anticorpo monovalente da invenção pode ser usado como profilático em rejeição a aloenxerto e xenoenxerto, ou ser usado para reverter, tratar ou de outra forma melhorar os episódios de rejeição a aloenxerto e xenoenxerto agudos,

Doença de enxerto-versus-hospedeiro, por exemplo doença de enxerto-versus hospedeiro de transfusão de sangue e doença de enxerto- versus-hospedeiro de medula óssea,

Doenças inflamatórias, imunes ou autoimunes, como artrite reumatóide, espondilite anquilosante, artrite psoriática, diabete tipo 1, diabete tipo 2 requerendo insulina, esclerose múltipla, lupus eritematoso sistêmico, miastenia grave, doença de intestino inflamatório, doença de Crohn, colite ulcerativa, dermato-polimiosite, síndrome de Sjogrens, artrite, incluindo artrite de célula gigante, anemia aplásica, asma, escleroderma, e uveíte,

Distúrbios de pele inflamatórios ou hiperproliferativos, por exemplo psoríase, incluindo psoríase de placa, pustulose palmatoplantaris (PP), líquen plano erosivo, pênfigo bulosa, epidermólise bulosa, dermatite de contato e dermatite atópica,

Neoplasmas linfóides, por exemplo leucemia de célula T, doença de Hodgkin, leucemia de célula cabeluda, ou linfoma de células T cutâneas, incluindo micoses fungóides, e síndrome de Sezary, Malignidades, por exemplo câncer gástrico, câncer esofagiano, melanoma maligno, câncer coloretal, câncer do pâncreas, câncer da mama, câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão não de célula pequena, câncer cervical, câncer ovariano, e carcinoma de célula renal,

Distúrbios hematológicos, com leucemia/ linfoma de células T adultas, linfoma de célula grande anaplásica, leucemia linfocítica crônica (CLL)/ linfoma linfocítico pequeno (SLL), linfoma de células T periféricas, e amiloidose secundária,

Distúrbios da pele, como pioderma gangrenoso, granuloma anular, dermatite de contato alérgico, penfigóide cicatricial, e herpes - gestacional,

Distúrbios hepato-gastrointestinais, como colite de colágeno, colangite esclerosante, hepatite ativa crônica, hepatite lupóide, hepatite autoimune, hepatite alcoólica, pancreatite crônica e pancreatite aguda, Distúrbios cardíacos, como miocardite e pericardite,

Distúrbios vasculares, como arteriosclerose, artrite de célula gigante/ polimialgia reumática, artrite de Takayasu, poliartrite nodosa, síndrome de Kawasaki, granulomatose de Wegener, poliangiite microscópica, síndrome de Churg-Strauss, angiite leucocitoclástica, e vasculite leucocistoclástica secundária,

Distúrbios renais, como glomerulonifrite aguda, glomerulonifrite crônica, nefrite de mudança mínima, e síndrome de Goodpasture,

Distúrbios pulmonares, como alveolite, bronquiolite obliterans, silicose, e beriliose,

Distúrbios neurológicos, como esclerose múltipla, mal de Alzheimer, miastenia grave, polineuropatia desmielinante crônica, e poliradiculite incluindo síndrome de Guillain-Barré,

Distúrbios de tecido conectivo, como policondrite de relapso, sarcoidose, lupus eritematoso sistêmico, lupus do sistema nervoso central, lupus discóide, lupus nefrite, síndrome de fadiga crônica, e fibromialgia,

Distúrbios endocrinológicos, como doença de Graves, tiroidite de Hashimoto, e tiroidite subaguda, ou

Infecções virais, como HIV-I/AIDS e paraparese espástica tropical.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD25. Estes anticorpos monovalentes também podem ser usados para triagem in vitro ou in vivo para CD25 em amostra ou paciente ou em uma imunotoxina ou abordagem de rádio-rótulo para o tratamento destas doenças e distúrbios.

Em uma forma de realização, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por antagonização e/ou inibição de funções de IL-15 ou de receptor de IL-15. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode ser por exemplo distúrbios de artrite, gota, conectivo, neurológico, gastrointestinal, hepático, alérgico, hematológico, pele, pulmonar, maligno, endocrinológico, vascular, infeccioso, rim, cardíaco, circulatório, metabólico, osso e músculo. Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a IL-15. Estes anticorpos monovalentes podem ser também usados para a triagem in vitro ou in vivo para IL-15 em uma amostra ou paciente ou em uma imunotoxina ou abordagem de rádio-rótulo para o tratamento destas doenças e distúrbios

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por prevenção da ligação de IL-8 a seu receptor, ou por bloqueio da função de IL-8. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo ser

Pustulose palmoplantar (PPP), psoriase, ou outras doenças da pele,

Distúrbios inflamatórios, autoimunes e imunes, como artrite psoriática, escleroderma sistêmico e esclerose, doença de intestino inflamatório (IBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, dano agudo do pulmão, como síndrome de falta de ar aguda, ou síndrome de falta de ar no adulto, meningite, encefalite, uveíte, mieloma múltiplo, glomerulonefrite, nefrite, asma, aterosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogern, diabete de início juvenil, doença de Reiter, Doença Behcet, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenias mediadas imunes, como púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, lupus nefrite, lupus eritematoso, artrite reumatóide (RA), espondilite anquilosante, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hasmimoto, vasculitídeos de vaso pequeno, como granulomatose de Wegener, síndrome de Omen, falha renal crônica, doença de tiróide autoimune, mononucleose infecciosa aguda, HTV, doenças associadas com vírus da herpes, infecções virais humanas, como resfriado comum como causadas por rhinovírus humano, coronavírus, outros enterovírus, vírus da herpes, vírus da influenza, vírus da parainfluenza, vírus sincicial respiratório, ou infecção por adenovírus, pneumonia bacteriana, feridas, sépses, derrame cerebral / edema cerebral, dano de reperfusão -isquemia, e hepatite C, Hepatite alcoólica e pancreatite aguda,

Doenças envolvendo angiogênese mediada por IL-8, como tumores e cânceres, por exemplo melanoma, carcinoma da tiróide, carcinoma de célula transcional, triquilemona, carcinoma de célula escamosa, e câncer da mama.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a IL-8. Estes anticorpos monovalentes também podem ser usados para triagem in vitro ou in vivo para IL-8 em amostra ou paciente ou em uma imunotoxina ou abordagem de rádio-rótulo para o tratamento destas doenças e distúrbios.

Em uma forma de realização, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por interferência com a atividade de cD40, por depleção de células B, interferência com crescimento de células B, e/ou proliferação através de por exemplo uma imunotoxina ou abordagem de radio-rótulo. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode ser por exemplo uma artrite reumatóide, distúrbios (auto) imunes e inflamatórios (como descrito acima para doenças ou distúrbios relacionados com IL-8), linfoma não de Hodgkin, BG-CLL, neoplasmas linfóides, malignidades e distúrbios hematológicos, doenças infecciosas e conectivas, neurológicas, gastrointestinais, hepáticas, alérgicas, hematológicas, pele, pulmonar, malignas, endocrinológicas, vascular, infecciosa, rim, cardíaca, circulatória, metabólica, distúrbios dos ossos e músculo, e citopenia mediada imune.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD20. Estes anticorpos monovalentes também podem ser usados para a triagem in vitro ou in vivo para CD20 em uma amostra ou paciente.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por interferência da atividade de cD38, por depleção de células expressando CD38, interferência com o crescimento de células CD38+ e/ou proliferação através de por exemplo uma abordagem de radio-rótulo ou imunotoxina. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode ser por exemplo,

Distúrbios tumorigênicos, como linfoma de células B, malignidades de células do plasma, linfoma de células T/NK, e malignidades mielóides,

Distúrbios imunes em que CD38 expressando células B, células plasma, monócitos e células T estão envolvidos, como distúrbios autoimunes, como psoríase, artrite psoriática, dermatite, escleroderma sistêmico, e esclerose, doença de intestino inflamatório (IBD), doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome de falta de ar, meningite, encefalite, uveíte, glomerulonefrite, eczema, asma, aterosclerose, deficiência de adesão de leucócitos, esclerose múltipla, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, diabete de início juvenil, doença de Reiter, doença de Behcet, nefrite de complexo imune, nefropatia de IgA, polineuropatias de IgM, trombocitopenias mediadas imunes, como púrpura trombocitopênica idiopática aguda, púrpura trombocitopênica idiopática crônica, anemia hemolítica, miastenia grave, lupus nefrite, lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide (RA), dermatite atópica, pênfigo, doença de Graves, tiroidite de Hasmimoto, granulomatose de Wegener, síndrome de Omen, falha renal crônica, mononucleose infecciosa aguda, HIV, e doenças associadas com vírus da herpes,,

Síndrome de falta de ar aguda e coreorenite,

Doenças e distúrbios como os causados por ou mediados por infecção de células B com vírus, como vírus Epstein-Barr (EBV), Artrite reumatóide,

Distúrbios inflamatórios, imunes e/ou auto-imunes em que auto- anticorpos 6t atividade de linfócitos BeT excessiva são proeminentes, como vasculitíte, e outros distúrbios dos vasos, como poliangite microscópica, síndrome de Churg-Strauss, e outras vasculites associadas com ANCA, poliarterite nodosa, vasculite crioglobulinêmica essencial, angiite leucocitoclástica cutânea, doença de Kawasaki, artrite de Takayasu, artrite de célula gigante, púrpura de Henoch-Schoniein, angiite cerebral primária ou isolada, eritema nodoso, trombangiite obliterans, púrpura trombocitopênica trombótica, (incluindo síndrome urêmica hemolítica), e vasculite secundária, incluindo vasculite leucocitoclástica cutânea, (por exemplo secundária a hepatite B, hepatite C, macroglobulinemia de Waldenstrom, neoplasias de células B, artrite reumatóide, síndrome de Sjogren, ou lupus eritematoso sistêmico); outros exemplos são eritema nodoso, vasculite alérgica, paniculite, doença de Weber- Christian, púrpura hiperglobulinêmica, e doença de Buerger.

Distúrbios da pele, como dermatite de contato, dermatose de IgA linear, vitiligo, pioderma gangrenoso, epidermólise bulosa acquisita, pênfigo vulgar (incluindo penfigóide cicatricial e penfigóide buloso), alopécia areata, (incluindo alopécia universal e alopécia total), dermatite herpetiformis, eritema multiforme, e urticária autoimune crônica (incluindo edema angioneurótico e vasculite urticária),

Citopenias mediadas imunes, como neutropenia autoimune, e apalsia de células vermelhas puras,

Distúrbios do tecido conectivo como lupus do sistema nervoso central, lupus eritematoso discóide, síndrome de Crest, doença de tecido conectivo misto, polimiosite/ dermatomiosite, miosite de corpo de inclusão, amiloidose secundária, crioglobulinemia tipo I e tipo II, fibromialgia, síndrome de anticorpo fosfolipídeo, hemofilia secundária, policondrite de relapso, sarcoidose, síndrome de homem rígido, e febre reumática; um outro exemplo é fasciite de eosinófilos,

Artrites, como espondilite anquilosante, atrite crônica juvenil, doença de Still adulto, e síndrome de SAPHO, outros exemplos são sacroileite, artrite reativa, doença de Still5 e gota.

Distúrbios hematológicos, como anemia aplástica, anemia hemolítica primária (incluindo síndrome de aglutinina fria), anemia hemolítica secundária a CLL ou lupus eritematoso sistêmico, síndrome de POEMS, anemia perniciosa, e púrpura hiperglobulinêmica de Waldemstrom, outros exemplos são agranulocitose, neutropenia autoimune, doença de Franklin, doença de Selignmann, doença de cadeia, síndrome de paraneoplasia secundária a timoma e linfomas, e formação de inibidor de fator VIII, Endocrinopatias, como poliendocrinopatia, e doença de Addison, outros exemplos são hipoglicemia autoimune, hipotiroidismo autoimune, síndrome de insulina autoimune, tiroidite de Quervain, e resistência a insulina mediada por anticorpo receptor de insulina;

Distúrbios hepato-gastrointestinais, como doença celíaca, doença de Whipple, cirrose biliar primária, hepatite ativa crônica, e colangiite esclerosante primária, um outro exemplo é gastrite autoimune,

Nefropatias, como glomerulonefrite progressiva rápida, nefrite pós-estreptococos, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite mebranoso, e nefrite crioglobulinêmica, um outro exemplo é doença de mudança mínima,

Distúrbios neurológicos, como neuropatias autoimunes, mononeurite multiplex, síndrome miastênica de Lambert- Eaton, coréia de Sydenham, tabels dorsalis, e síndrome de Guillain- Barré; outros exemplos são paraparese espástica tropical / mielopatia, miastenia grave, polineuropatias desmielinantes inflamatórias agudas, e polineuropatias desmielinantes inflamatórias crônicas, esclerose múltipla, demência induzida por HIV.

Distúrbios cardíacos e pulmonares, como COPD, alveolite fibrosante, bronquiolite obliterans, aspergilose alérgica, fibrose cística, síndrome de Loffler, miiocardite, e pericardite, outros exemplos são pneumonite de hipersensibilidade, e síndrome paraneoplásica secundária a câncer de pulmão,

Distúrbios alérgicos, como asma bronquial, e síndrome de hiper-IgE, um outro exemplo é amaurosis fugax,

Distúrbios oftalmológicos, como corioretinite idiopática, Doenças infecciosas, como infecção por parvovírus B (incluindo síndrome de exantema em luvas e meias),

Distúrbios ginecológicos - obstétricos, como aborto recorrente, perda fetal recorrente, e retardo de crescimento intrauterina, um outro exemplo é síndrome paraneoplásica secundária a neoplasmas ginecológicos,

Distúrbios de reprodução masculinos, como síndrome paraneoplásica secundária a neoplasmas testiculares, e

Distúrbios derivados de transplantes, como rejeição de aloenxertos e xenoenxertos, e doença de enxerto-versus-hospedeiro.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD38. Estes anticorpos mono valentes podem ser usados para triagem in vitro ou in vivo para CD38 em uma amostra ou paciente.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratada é tratável por bloqueio da interação ligando - EGFr, bloqueio da função de EGFr, depleção de células expressando EGFr / interferência com crescimento de células EGFr+ e/ou proliferação através de, por exemplo, uma imunotoxina ou abordagem de rádio-rótulo. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode ser por exemplo:

Cânceres (super) expressando EGFr, como câncer de bexiga, mama, cólon, rim, ovário, próstata, célula renal, célula escamosa, pulmão (célula não pequena), e cabeça e pescoço, e glioma,

Outras doenças relacionadas com EGFr, como doenças autoimunes, psoríase, artrite inflamatória.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a EGFr. Estes anticorpos monovalentes podem ser usados para triagem in vitro ou in vivo para EGFr em uma amostra ou paciente.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por interferência com função de CD4, depleção de células expressando CD4 /interferência com crescimento de células CD4+ e/ou proliferação através de por exemplo um imunotoxina ou abordagem de rádio-rótulo. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo, artrite reumatóide, distúrbios (auto) imunes e inflamatórios, (como descrito acima para doenças ou distúrbios relacionados com IL_8), linfomas de células T cutâneas, linfomas de células T não cutâneas, neoplasmas de linfóides, malignidades e distúrbios hematológicos, doenças infecciosas, e distúrbios conectivos, neurológicos, gastrointestinais, hepáticos, alérgicos, hematológicos, pele, pulmonar, malignos, endocrinológicos, vascular, infeccioso, rim, cardíaco, circulatório, metabólico, osso, e músculo, e citopenia mediada imune.

Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD4. Estes anticorpos monovalentes também ser usados para triagem in vitro ou in vivo para CD4 em uma amostra ou paciente.

Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo monovalente dirigido a CD4 é usado para tratamento de infecção HIV, ou para o tratamento de AIDS.

Em uma forma de realização da invenção, os anticorpos monovalentes da invenção são anticorpos monovalentes de anticorpos CD4 descritos em W097/13852.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por antagonização e/ou inibição de funções de CD28, como evitando sinais co-estimulatórios necessários em ativação celular T. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo ser um distúrbio inflamatório, autoimune e imune como indicado acima. Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a CD28.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratada é tratável por alteração das funções do fator de tecido, como alteração de coagulação ou inibição de sinalização do fator de tecido. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo doenças vasculares, como doença vascular do miocárdio, doença vascular cerebral, retinopatia e degeneração macular, e distúrbios inflamatórios como indicado acima. Em uma forma de realização da invenção, os anticorpos monovalentes são dirigidos ao fator de tecido, ou a um complexo de Fator VII e Fator de Tecido.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por interferência com infecção por vírus de Hepatite C (HCV). Em uma tal forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é dirigido a HCV ou um receptor de HCV como CD81.

Em uma forma de realização da invenção, o anticorpo monovalente é um anticorpo monovalente de acordo com a invenção de um anticorpo como descrito em W02000/05266.

Em uma forma de realização da invenção, a doença ou distúrbio a ser tratado é tratável por prevenção de ligação de alergênio para IgE-sensibilizado em células -tronco. Em uma forma de realização, esta doença ou distúrbio pode por exemplo, imunoterapia de alergênicos de doenças alérgicas, como asma, rinite alérgica, alergias de estação/ perenes, febre de feno, alergias nasais, dermatite atópica, eczema, urticária crônica, urticária, alergias de contato, conjuntivite alérgica, alergias oculares, alergias a alimentos e fármacos, alergias a látex, e alergias a insetos.

Em uma tal forma de realização, o (s) anticorpo (s) monovalente (s) da invenção são anticorpos de IgG4 sem ganchos dirigidos para alergênio(s).

Em algumas formas de realização, um imunoconjugado compreendendo um anticorpo monovalente conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Em algumas formas de realização, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qual ele é ligado é/ são internalizados pela célula, resultando em aumentada eficácia terapêutica do imunoconjugado em matar a célula alvo à qual ele se liga. Em uma forma de realização, o agente citotóxico marca ou interfere com ácido nucleico na célula alvo.

Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem qualquer um dentre os agentes quimioterapêuticos notados aqui, (como um maitansinóide ou caliqueamicina), um isótopo radioativo, ou uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease.

Em uma forma de realização, o antígeno é uma molécula de proteína humana e o indivíduo é um indivíduo humano. Em uma forma de realização, o indivíduo pode ser um mamífero não humano expressando o antígeno com que um anticorpo da invenção se liga. Em uma forma de realização, o indivíduo pode ser um mamífero em que o antígeno foi introduzido (por exemplo por administração do antígeno ou por expressão de um transgene de antígeno). Além disso, um anticorpo monovalente da invenção pode ser administrado a um mamífero não humano expressando um antígeno com que a imuno globulina reage cruzado (por exemplo um primata, suíno ou camundongo) para fins veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Com relação ao último, estes modelos animais podem ser utilizáveis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (por exemplo teste de dosagens e cursos de tempo de administração).

Anticorpos monovalentes da invenção podem ser usados ou sozinhos em combinação com outras composições em uma terapia. Por exemplo, um anticorpo monovalente da invenção pode ser co-administrado com um ou mais de outros anticorpos, como anticorpos monovalentes da presente invenção, um ou mais agente(s) quimioterapêutico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterapêuticos), um ou mais de outros agente(s) citotóxicos, um ou mais agente(s)anti-angiogênicos, uma ou mais citocinas, um ou mais agente(s) inibidores do crescimento, um ou mais agente(s) anti- inflamatórios, um ou mais fármaco(s) antirreumáticos modificadores da doença (DMARD), ou um ou mais agente(s) imuno supressivos, dependendo da doença ou condição a ser tratada. Onde um anticorpo monovalente da invenção inibe o crescimento de tumor, pode ser particularmente desejável combinar o mesmo com um ou mais de outros agente(s) terapêuticos que também inibem o crescimento do tumor. Por exemplo, anticorpos anti-VEGF bloqueando as atividades de VEGF podem ser combinados com anticorpos anti-ErbB (por exemplo Trastuzumab (Herceptina), um anticorpo anti-HER2) em um tratamento de câncer da mama metastático. Alternativamente, ou adicionalmente, o paciente pode receber terapia de radiação combinada (por exemplo irradiação de feixes externa ou terapia com um agente rotulado radioativo, como um anticorpo). Estas terapias combinadas notadas acima incluem administração combinada (onde dois ou mais agentes são incluídos nas mesmas ou formulações separadas), e administração separada, neste caso, administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes, e/ou após a administração da terapia ou terapias adjuntas.

Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente da invenção é uma forma monovalente de Trastuzumab, para tratamento de câncer positivo para Her2.

A composição de anticorpo monovalente da invenção pode ser formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular sendo tratado, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o sítio de distribuição do agente, o método de administração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos dos médicos. Em uma forma de realização, o anticorpo monovalente pode ser formulado com um ou mais agentes correntemente usados para evitar ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade efetiva destes outros agentes depende da quantidade de anticorpos monovalentes da invenção presentes na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores discutidos acima.

O anticorpo monovalente da invenção (e agente terapêutico adjunto) pode ser administrado por qualquer meio apropriado, incluindo parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamento local, administração intralesional. As infusões parenterais incluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o anticorpo monovalente pode ser administrado de modo apropriado por infusão de pulso, particularmente com doses declinantes do anticorpo monovalente. A dosagem pode ser por qualquer via apropriada, por exemplo por injeções, como injeções intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte de se a administração é breve ou crônica.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo monovalente da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com outros agentes como agentes quimioterapêuticos) irá depender do tipo de doença a ser tratado, o tipo de anticorpo, a severidade e curso da doença, se o anticorpo monovalente é administrado para fins preventivos, terapêutico ou diagnósticos, terapia anterior, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e as diretrizes do médico atendente. O anticorpo monovalente pode ser administrado de modo apropriado ao paciente de uma vez ou em uma série de tratamentos.

Estas dosagens podem ser administradas intermitentemente, por exemplo a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo de modo que o paciente recebe de cerca de duas a cerca de vinte, por exemplo cerca de seis doses do anticorpo monovalente ). Uma dose de carga maior inicial, seguido por uma ou mais doses menores pode ser administrada. Um regime de dosagem exemplar compreende a administração de uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo monovalente. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser utilizáveis. Em uma forma de realização, os anticorpos mono valentes da invenção são administrados em uma dosagem semanal de 50 mg a 4000 mg, por exemplo de 250 mg a 2000 mg, como por exemplo 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1000 mg, 1500 mg ou 2000 mg, por até 8 vezes, como de 4 a 6 vezes. A dosagem semanal pode ser dividida em duas ou três subdosagens e administrada durante mais do que um dia. Por exemplo, uma dosagem de 300 mg pode ser administrada durante 2 dias com 100 mg no dia um (1), e 200 mg no dia dois (2). A dosagem de 500 mg pode ser administrada durante 3 dias com 100 mg no dia um (1), 200 mg no dia dois (2), e 200 mg no dia três (3), e uma dosagem de 700 mg pode ser administrada durante 3 dias com 100 mg no dia 1 (um), 300 mg no dia 2 (dois), e 300 mg no dia 3 (três). O regime pode ser repetido uma ou mais vezes como necessário,, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses.

A dosagem pode ser determinada ou ajustada por medida da quantidade de anticorpos monovalentes circulantes da invenção quando administração em uma amostra biológica, por exemplo por uso de anticorpos anti-idiotípicos que marcam os referidos anticorpos monovalentes.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção podem ser administrados por terapia de manutenção, como, por exemplo uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.

Em uma forma de realização, os anticorpos monovalentes da invenção podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão de um anticorpo monovalente da invenção seguido por uma infusão do mesmo anticorpo monovalente conjugado a um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo 7 a 9 dias depois.

O progresso desta terapia pode ser monitorado por testes e técnicas convencionais.

A invenção provê um artigo de fabricação contendo materiais utilizáveis para o tratamento, prevenção e/ou diagnostico dos distúrbios descritos acima. Um artigo de fabricação da presente invenção compreende um recipiente e um rótulo ou inserto de embalagem ou associado com o recipiente. Os recipientes apropriados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de vários materiais como vidro ou plástico. O recipiente mantém uma composição que é sozinha ou quando combinada com outras composições efetiva para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter uma abertura de acesso estéril (por exemplo o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou um frasquinho tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo monovalente da invenção. O rótulo ou inserto de embalagem indica que a composição é usada para o tratamento da condição de escolha, por exemplo câncer. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo monovalente da invenção, e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um outro agente citotóxico. O artigo de fabricação nesta forma de realização da invenção pode ainda compreender um inserto de embalagem indicando que a primeira e a segunda composições podem ser usados para tratar uma condição em particular, por exemplo câncer. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Também estão dentro do escopo da presente invenção kits compreendendo composições farmacêuticas da invenção compreendendo um ou mais anticorpos monovalentes da invenção e instruções para uso. O kit pode ainda compreender um ou mais agentes adicionais, como um reagente imunossupressivo, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico, dependendo da doença ou distúrbio a ser tratado, ou um ou mais anticorpos monovalentes adicionais da invenção (por exemplo um anticorpo monovalente tendo uma atividade complementar).

Em uma forma de realização, a invenção provê métodos para detectar a presença do antígeno específico ao qual o anticorpo monovalente se liga, em uma amostra ou medindo a quantidade de referido antígeno específico, compreendendo contatar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monovalente, que especificamente liga ao referido antígeno, sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e referido antígeno. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada à amostra de controle é indicativo da presença de referido antígeno na amostra.

Em uma forma de realização, anticorpos monovalentes da invenção podem ser usados para detectar níveis de circulação de antígeno específico ao qual o anticorpo monovalente liga, ou níveis de células que contém referido antígeno específico, em sua superfície de membrana, cujos níveis podem ser então ligados a alguns sintomas de doença. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para depletar ou interagir com a função de células expressando o referido antígeno, assim implicando estas células como mediadores importantes da doença. Isto pode ser obtido por contato de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo monovalente sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e referido antígeno específico. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e referido antígeno são detectados e comparados na amostra e o controle.

Em uma forma de realização, a invenção provê um método para detectar a presença ou quantificar, in vivo ou in vitro, a quantidade de células expressando o antígeno específico ao qual o anticorpo monovalente se liga. O método compreende (i) administração a um indivíduo de um anticorpo monovalente da invenção conjugado a um marcador detectável; (ii) exposição do indivíduo a um meio para detectar referido marcador detectável para identificar áreas contendo células expressando o referido antígeno.

Em uma forma de realização, anticorpos monovalentes da invenção podem ser usados para marcar compostos (por exemplo agentes terapêuticos, rótulos, citotoxinas, imunossupressores de radiotoxinas, etc.) a células que tem o antígeno específico ao qual o anticorpo monovalente se liga, expressado em sua superfície por ligação destes compostos ao anticorpo monovalente. Assim, a invenção também provê métodos para localizar células ex vivo ou in vitro expressando referido antígeno, como células Reed- Sternberg (por exemplo com um rótulo detectável, como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima).

O seguinte é uma lista de formas de realização selecionadas da presente invenção.

Forma de realização 1: Um método para produzir um anticorpo monovalente, referido método compreendendo

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Yl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e seqüência nucleotídica codificando a região Cl constante de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativamente juntas, e em que, no caso de um subtipo de IgGl, a seqüência nucleotídica codificando a região Cl foi modificada de modo que uma região Cl não contém quaisquer aminoácidos capazes de formar ligações dissulfeto ou covalentemente liga com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma região CL;

ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando uma região constante Ch de uma Ig humana em que a seqüência nucleotídica codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região Ch, como a região Ch3, não compreendem quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma região Ch da Ig humana, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Ch de referida Ig são ligadas operativãmente juntas;

Forma de realização 2: Um método de acordo com forma de realização 1, em que a Ig humana é uma IgGl5 IgG2, IgG3, IgG4 ou IgA ou IgD anticorpo, como um anticorpo de IgGl, IgG2 ou IgG4.

Forma de realização 3: Um método de acordo com forma de realização 1, em que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região CH3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q); Asp (D) em posição 239 foi substituído por Glu (E); Lys (K) em posição 292 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 302 foi substituído por Glu (E); e Pro (P) em posição 328 foi substituído por Leu (L). Forma de realização 4: Um método de acordo com forma de realização 3, em que Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q).

Forma de realização 5: Um método de acordo com forma de realização 3, em que Arg (R) em posição 238 foi substituído por Gln (Q), e Pro (P) em posição 328 foi substituído por Leu (L).

Forma de realização 6: Um método de acordo com forma de realização 3, em que todas as cinco substituições foram feitas.

Forma de realização 7: Um método de acordo com forma de realização 1 ou 3, em que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve kappa Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 18, em que a região Cl foi modificada de modo que o resíduo de cisteína terminal em posição 106 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou deletado. Em uma forma de realização, ele foi deletado.

Forma de realização 8: Um método de acordo com forma de realização 1 ou 3, em que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve lambda Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 17, em que a região Cl foi modificada de modo que resíduo de cisteína em posição 104 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou deletado. Em uma forma de realização, ele foi deletado.

Forma de realização 9: Um método de acordo com forma de realização 1, 3, 7 ou 8, em que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região ChI foi modificada de modo que Ser (S) em posição 14 foi substituído por um resíduo cisteína.

Forma de realização 10: Um método de acordo com forma de realização 1, em que a Ig humana é uma IgG2 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 20, em que a região Ch3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q); Met (M) em posição 276 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 288 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 298 foi substituído por Glu (E); e Pro (P) em posição 324 foi substituído por Leu (L).

Forma de realização 11: Um método de acordo com forma de realização 10, em que Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q).

Forma de realização 12: Um método de acordo com forma de realização 10, em que Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q); e Pro (P) em posição 324 foi substituído por Leu (L).

Forma de realização 13: Um método de acordo com forma de realização 10, em que todas as cinco substituições foram feitas.

Forma de realização 14: Um método de acordo com forma de realização 1, em que a Ig humana é uma IgG3 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 21, em que a região Ch3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q); Ser (S) em posição 314 foi substituído por Asn (N); Asn (N) em posição 322 foi substituído por Lys (K); Met (M) em posição 327 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 339 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 349 foi substituído por Glu (E); Ile (I) em posição 352 foi substituído por Val (V); Arg (R) em posição 365 foi substituído por His (H); Phe (F) em posição 366 foi substituído por Tyr (Y); e Pro (P) em posição 375 foi substituído por Leu (L).

Forma de realização 15: Um método de acordo com forma de realização 14, em que Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q).

Forma de realização 16: Um método de acordo com forma de realização 14, em que Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q); e Pro (P) em posição 375 foi substituído por Leu (L).

Forma de realização 17: Um método de acordo com forma de realização 14, em que todas as dez substituições foram feitas. Forma de realização 18: Um método para produzir um anticorpo monovalente, referido método compreendendo:

i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e seqüência nucleica codificando a região constante (Cl) de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativamente juntas;

Forma de realização 19: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 18, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho de uma cadeia pesada não compreende quaisquer resíduos cisteína.

Forma de realização 20: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 19, em que o anticorpo monovalente produzido é um anticorpo humano.

Forma de realização 21: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 20, em que o anticorpo monovalente produzido não liga ao antígeno sintético (Tir, Glu)-Ala-Lys.

Forma de realização 22: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 21, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos.

Forma de realização 23: Um método de acordo com forma de realização 22, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que os resíduos de cisteína da região de gancho foram substituídos com resíduos de aminoácidos que tem uma cadeia lateral polar não carregada, ou uma cadeia lateral não polar.

Forma de realização 24: Um método de acordo com forma de realização 22 ou 23, em que os aminoácidos com cadeia lateral polar não carregada são independentemente selecionados dentre glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, triptofano, e o aminoácido com a cadeia lateral não polar são independentemente selecionados dentre alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina.

Forma de realização 25: Um método de acordo com forma de realização 22, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch de IgG4, em que os aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 26: Um método de acordo com forma de realização 22 ou forma de realização 25, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende a região Ch de IgG4, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 27: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 22 a 26, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 28: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 22 a 27, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região de gancho completa foi deletada.

Forma de realização 29: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 28, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana, em que pelo menos um nucleotídeo do sítio doador de emenda de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho foi substituído com outro nucleotídeo.

Forma de realização 30: Um método de acordo com forma de realização 29, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana, em que os nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos em posição 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Forma de realização 31: Um método de acordo com forma de realização 30, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência nucleotídica codificando a região Ch de uma IgG4 humana compreendendo uma seqüência de SEQ ID No: 13, em que nucleotídeos 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Forma de realização 32: Um método de acordo com forma de realização 31, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 15.

Forma de realização 33: Um método de acordo com forma de realização 22, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

Forma de realização 34: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 29 a 33, em que os nucleotídeos substituídos de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho de uma região Ch são substituídos por uso de mutagênese sítio-dirigida.

Forma de realização 35: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 34, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região Cl da cadeia kappa de IgG humana. Forma de realização 36: Um método de acordo com forma de realização 35, em que a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 1.

Forma de realização 37: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 34, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região CL da cadeia lambda de IgG humana.

Forma de realização 38: Um método de acordo com forma de realização 37, em que a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 3.

Forma de realização 39: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 38, em que as construções de ácido nucleico são construções de DNA.

Forma de realização 40: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 39, em que a construção de ácido nucleico de (i), (ii), (iii) e/ou (iv) é um vetor de expressão procariótico.

Forma de realização 41: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 40, em que o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células procarióticas.

Forma de realização 42: Um método de acordo com forma de realização 41, em que o sistema de expressão procariótico de células compreende células de E. coli.

Forma de realização 43: Um método de acordo com forma de realização 42, em que as células de E. coli são de uma cepa deficiente em atividades de protease endógenas.

Forma de realização 44: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 39, em que a construção de ácido nucleico de (i), (ii), (iii) e/ou (iv) é um vetor de expressão eucariótico.

Forma de realização 45: Um método de acordo com forma de realização 44, em que o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células eucarióticas.

Forma de realização 46: Um método de acordo com forma de realização 45, em que o sistema de expressão de células é um sistema de expressão de células de mamíferos.

Forma de realização 47: Um método de acordo com forma de realização 46, em que o sistema de expressão de células de mamíferos compreende células CHO.

Forma de realização 48: Um método de acordo com forma de realização 46, em que o sistema de expressão de células de mamíferos compreende células HEK-293F.

Forma de realização 49: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 39, em que I e II do sistema de expressão compreende construções de DNA apropriadas para terapia de genes.

Forma de realização 50: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-39, em que I e II do sistema de expressão são construções virais apropriadas para terapia de genes.

Forma de realização 51: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-39, em que III do sistema de expressão de células de mamíferos são células humanas compreendendo I e II, e que são apropriadas para implante em um paciente em necessidade de terapia com o anticorpo monovalente produzido.

Forma de realização 52: Um método de acordo com qualquer uma forma de realização 51, em que as células humanas são derivadas do paciente.

Forma de realização 53: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 51, em que o anticorpo monovalente produzido é para uso farmacêutico.

Forma de realização 53a: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-53, em que as construções de ácido nucleico de i) e ii) estão no mesmo plasmídeo.

Forma de realização 53b: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1-53, em que o anticorpo é produzido em duas linhagens de células diferentes, e o anticorpo é montado após expressão irt vitro.

Forma de realização 54: Um anticorpo monovalente obtido pelo uso de um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 50 e 53.

Forma de realização 55: Um anticorpo monovalente obtenível pelo uso de um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 50 e 53.

Forma de realização 56: Um anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que

a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma Ig, e em que, no caso de um subtipo de IgGl, a seqüência amino da região constante (Cl) foi modificada de modo que ela não contém quaisquer aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Cl) de Ig, e

b) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vh) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) de Ig humana, em que a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) foi modificada de modo que região de gancho e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região Ch, como a região Ch3, não contém quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) da Ig humana.

Forma de realização 57: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 56, em que a Ig humana é uma IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgGA anticorpo, como um anticorpo de IgGl, IgG2 ou IgG4.

Forma de realização 58: Um anticorpo monovalente compreendendo uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que

Forma de realização 59: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 54 a 58, em que a região Cl é a região constante da cadeia leve kappa de IgG humana.

Forma de realização 60: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 59, em que a região Cl compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

Forma de realização 61: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 54 a 58, em que a região Cl é a região constante da cadeia leve lambda de IgG humana.

Forma de realização 62: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 61, em que a região Cl compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 4.

Forma de realização 63: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 62, em que a cadeia leve e a cadeia pesada são conectadas uma na outra via uma ou mais ligação dissulfeto.

Forma de realização 64: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 63, em que a cadeia leve e a cadeia pesada são conectadas uma na outra via uma ligação amida.

Forma de realização 65: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 64, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos cisteína.

Forma de realização 66: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 65, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos.

Forma de realização 67: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 66, em que os resíduos de cisteína da região de gancho são substituídos com resíduos de aminoácidos que tem uma cadeia lateral polar não carregada, ou uma cadeia lateral não polar.

Forma de realização 68: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 67, em que os aminoácidos com cadeia lateral polar não carregada são independentemente selecionados dentre glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, triptofano, e os aminoácidos com a cadeia lateral não polar são independentemente selecionados dentre alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina.

Forma de realização 69: Um anticorpo mono valente de acordo com forma de realização 68, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que os aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 70: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 66 ou forma de realização 69, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende a região Ch de IgG4, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 71: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 66 a 70, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende a IgG4 região Ch, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 72: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 66 a 71, em que a região completa de gancho foi deletada.

Forma de realização 73: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 66 a 72, em que a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 16.

Forma de realização 74: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 66, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende a IgG4 região CH, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

Forma de realização 75: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 66, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região CH, em que um dos resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foi substituído com um resíduo de aminoácido diferente de cisteína, como um resíduo de aminoácido descritos em forma de realização 67 ou 68, e o outro dos resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foi deletado.

Forma de realização 76: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 75, em que o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 foi substituído com um resíduo de aminoácido que é diferente de cisteína, como um resíduo de aminoácido descritos em forma de realização 67 ou 68, e em que o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 109 foi deletado.

Forma de realização 77: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 75, em que o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 foi deletado, e o resíduo de aminoácido correspondendo aos resíduos de aminoácidos 109 foi substituído com um resíduo de aminoácido diferente de cisteína, como um resíduo de aminoácido descrito em forma de realização 67 ou 68.

Forma de realização 78: Um anticorpo monovalente de qualquer uma das formas de realização 54 a 77, em que referido anticorpo é obtenível por um método compreendendo expressão recombinante do anticorpo em um sistema de expressão de células in vitro. Forma de realização 79: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 78, em que o método compreende

Forma de realização 80: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 79, em que a Ig humana é uma IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 ou IgGA anticorpo, como uma IgGl, IgG2, IgG4 anticorpo.

Forma de realização 81: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 78, em que o método compreende

Forma de realização 82: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 81, cujo anticorpo monovalente tem uma concentração no plasma acima 10 μg/ml durante mais do que 7 dias quando administrado in vivo em uma dose de 4 mg por kg.

Forma de realização 83: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 82, em que o anticorpo monovalente tem uma concentração no plasma acima 10 μg/ml durante mais do que 7 dias quando administrado in vivo em camundongos SCID em uma dose de 4 mg por kg.

Forma de realização 84: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 83, cujo anticorpo monovalente tem uma depuração no plasma, que é mais de 10 vezes mais lenta do que a depuração no plasma de um fragmento F(ab')2.

Forma de realização 85: Um anticorpo mono valente de acordo com forma de realização 84, em que a seqüência do fragmento F(ab')2 é idêntica à seqüência da região correspondente do anticorpo monovalente.

Forma de realização 86: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 84, em que a depuração no plasma é medida usando camundongos SCID.

Forma de realização 87: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 86, em que a região Vh e a região Vl do fragmento F(ab')2 são idênticas a uma região Vh e a região Vl do anticorpo monovalente

Forma de realização 88: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 87, em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias quando administrado in vivo.

Forma de realização 89: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 87, em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 5 e até 21 dias quando administrado in vivo.

Forma de realização 90: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 87, em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 5 e até 14 dias quando administrado in vivo

Forma de realização 91: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 87, em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 14 dias.

Forma de realização 92: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 87, em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 21 dias. Forma de realização 93: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 88, em que em que referido anticorpo monovalente tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias quando administrado in vivo em camundongos SCID.

Forma de realização 94: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 93, em que referido anticorpo é capaz de se ligar a FcRn.

Forma de realização 95: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 94, que se liga especificamente a um antígeno de tumor.

Forma de realização 96: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 95, que especificamente liga um receptor de superfície de célula que é ativado quando da dimerização do receptor.

Forma de realização 97: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 96, em que o anticorpo monovalente quando ligado a uma molécula alvo inibe a multimerização e/ou agregação da molécula alvo.

Forma de realização 98: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 97, em que o anticorpo monovalente se liga a um alvo selecionado dentre VEGF, cMet, CD20, CD38, IL-8, CD25, FcalphaRI, FcepsilonRI, receptor de acetil colina, fas, fasL, TRAIL, vírus da hepatite, vírus da hepatite C, fator de tecido, um complexo de fator de tecido e Fator VII, EGFr, CD4, e CD28.

Forma de realização 99: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 97, em que o anticorpo monovalente especificamente se liga a um alvo selecionado dentre VEGF, cMet, CD20, CD38, IL-8, CD25, FcalphaRI, FcepsilonRI, receptor de acetil colina, fas, fasL, TRAIL, vírus da hepatite, vírus da hepatite C, fator de tecido, um complexo de fator de tecido e Fator VII, EGFr5 CD4, e CD28.

Forma de realização 100: Anticorpo anti-cMet de IgG4 mono valente de acordo com qualquer uma das formas de realização 56 a 97.

Forma de realização 101: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 100, que está em uma forma monovalente na presença de IgG humana policlonal.

Forma de realização 102: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 100, que está em uma forma monovalente quando administrado a um ser humano.

Forma de realização 103: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 100, que dissocia em uma forma monovalente na presença de IgG humana policlonal.

Forma de realização 104: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 100, que dissocia em uma forma monovalente quando administrado a um ser humano.

Forma de realização 105: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 56 a 104, em que referido anticorpo é incapaz de ligação do efetuador.

Forma de realização 106: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 104, em que o anticorpo é fabricado para uso farmacêutico.

Forma de realização 107: Um método de preparação de um anticorpo monovalente de qualquer uma das formas de realização 54 a 104, o método compreendendo as etapas de:

b) recuperar o anticorpo monovalente a partir da cultura de célula hospedeira.

Forma de realização 108: Um método de acordo com forma de realização 107, em que referida célula hospedeira é procariótica.

Forma de realização 109: Um método de acordo com forma de realização 108, em que a célula hospedeira é célula de E. coli.

Forma de realização 110: Um método de acordo com forma de realização 109, em que as células de E. coli são de uma cepa deficiente em atividades de protease endógenas.

Forma de realização 111: Um método de acordo com forma de realização 107, em que referida célula hospedeira é eucariótica.

Forma de realização 112: Um método de acordo com forma de realização 111, em que a célula hospedeira é célula HEK-293F.

Forma de realização 113: Um método de acordo com forma de realização 111, em que a célula hospedeira é célula CHO.

Forma de realização 114: Um método de acordo com forma de realização 111, em que a célula hospedeira é uma célula humana.

Forma de realização 115: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 107 a 114, em que o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura.

Forma de realização 116: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 107 a 114, em que o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células.

Forma de realização 117: Construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch de uma IgG4, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho na referida região Ch não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos idêntica a uma seqüência de aminoácidos de referida região CH, ou uma seqüência complementar da mesma. Forma de realização 118: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 117, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de gancho não compreende quaisquer resíduos de cisteína.

Forma de realização 119: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 117 ou forma de realização 118, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de gancho, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos.

Forma de realização 120: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 119, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que os aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

Forma de realização 121: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 119 ou forma de realização 120, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foi deletado.

Forma de realização 122: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 119 a 121, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQ ID No: 14 foi deletado.

Forma de realização 123: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 119 a 122, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região de gancho completa foi deletada. Forma de realização 124: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 123, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que pelo menos um nucleotídeo do sítio doador de emenda de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região de gancho foi substituído com outro nucleotídeo.

Forma de realização 125: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 124, em que os nucleotídeos correspondendo aos nucleotídeos em posição 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Forma de realização 126: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 125, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch compreende uma seqüência de SEQ ID No: 13, em que nucleotídeos 714 e 722 da seqüência de SEQ ID No: 13 foram substituídos com um nucleotídeo diferente do nucleotídeo presente nesta posição em SEQ ID No: 13.

Forma de realização 127: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 126, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 15.

Forma de realização 128: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 119, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

Forma de realização 129: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 124 a 128, em que os nucleotídeos substituídos de uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch são substituídos por uso de mutagênese sítio-dirigida.

Forma de realização 130: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 129, em que referida construção compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo específico para antígeno, ou uma seqüência complementar da mesma.

Forma de realização 131: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 130, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh é operativamente ligada a uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch, ou uma seqüência complementar da mesma.

Forma de realização 132: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 131, em que referida construção compreende uma seqüência nucleotídica codificando a cadeia pesada de um anticorpo mono valente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106.

Forma de realização 133: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 132, em que referida construção compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vl de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106.

Forma de realização 134: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 133, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região Cl da cadeia kappa de IgG humana.

Forma de realização 135: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 134, em que a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 1

Forma de realização 136: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 133, em que a construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente compreende uma seqüência codificando a região Cl da cadeia lambda de IgG humana.

Forma de realização 137: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 136, em que a construção de ácido nucleico compreende a seqüência nucleotídica de SEQ ID No: 3.

Forma de realização 138: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 137, em que a construção de ácido nucleico é uma construção de DNA.

Forma de realização 139: Construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 138, em que referida construção de ácido nucleico é um vetor de expressão,

Forma de realização 140: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 139, em que referido vetor de expressão é um vetor de expressão procariótico.

Forma de realização 141: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 139, em que referido vetor de expressão é um vetor de expressão eucariótico.

Forma de realização 142: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 141, em que referido vetor de expressão é um vetor de expressão de mamífero.

Forma de realização 143: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 142, em que referido vetor de expressão é apropriado para terapia de genes em um humano.

Forma de realização 144: Construção de ácido nucleico de acordo com forma de realização 139, em que referido vetor de expressão é um vetor viral apropriado para terapia de genes em um humano.

Forma de realização 145: Um método de preparação de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 compreendendo cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144, e, se referida construção de ácido nucleico não codifica a cadeia leve de referido anticorpo, também compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células.

Forma de realização 146: Um método de acordo com forma de realização 145, em que o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células.

Forma de realização 147: Um método de acordo com forma de realização 145, em que o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura de células.

Forma de realização 148: Uso de uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144 para a produção de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106.

Forma de realização 149: Uso de acordo com forma de realização 148 ou 170, em que a produção de um anticorpo monovalente inclui o uso de um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 53.

Forma de realização 150: Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144.

Forma de realização 151: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 150, que célula hospedeira é uma célula procariótica.

Forma de realização 152: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 151, que célula hospedeira é uma célula de E. coli.

Forma de realização 153: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 150, cuja célula hospedeira é uma célula eucariótica.

Forma de realização 154: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 153, cuja célula hospedeira é uma célula de mamífero.

Forma de realização 155: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 154, cuja célula hospedeira é uma célula CHO.

Forma de realização 156: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 154, cuja célula hospedeira é uma célula HEK-293F.

Forma de realização 157: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 154, cuja célula hospedeira é uma célula humana.

Forma de realização 158: Célula hospedeira de acordo com i forma de realização 154, cuja célula hospedeira é uma célula humana derivada de um paciente.

Forma de realização 159: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 154, cuja célula hospedeira é uma célula humana em um paciente.

Forma de realização 160: Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 132 a 144.

Forma de realização 161: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 160, cuja célula hospedeira é uma célula procariótica.

Forma de realização 162: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 161, cuja célula hospedeira é uma célula de E. coli.

Forma de realização 163: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 162, cuja célula hospedeira é uma célula eucariótica.

Forma de realização 164: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 163, cuja célula hospedeira é uma célula de mamífero.

Forma de realização 165: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 164, cuja célula hospedeira é uma célula CHO.

Forma de realização 166: Célula hospedeira de acordo com forma de realização 164, que célula hospedeira é um célula HEK-293F.

Forma de realização 167: Um método de preparação de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das formas de realização 160 a 166, cuja célula hospedeira compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperação do anticorpo monovalente da cultura de células.

Forma de realização 168: Um método de acordo com forma de realização 167, em que o anticorpo monovalente é recuperado do lisado de células.

Forma de realização 169: Um método de acordo com forma de realização 167, em que o anticorpo monovalente é recuperado do meio de cultura de células.

Forma de realização 170: Uso de uma célula hospedeira de acordo com qualquer uma das formas de realização 150 a 159 para a produção de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106.

Forma de realização 171: Uso de acordo com forma de realização 170, em que a produção de um anticorpo monovalente inclui o uso de um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 1 a 53.

Forma de realização 172: Imunoconjugado compreendendo um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 conjugado a uma porção terapêutica.

Forma de realização 173: Imunoconjugado de forma de realização 172, em que a porção terapêutica é uma citotoxina, um fármaco quimioterapêutico, um imunossupressor ou um radioisótopo.

Forma de realização 174: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 para uso como um medicamento.

Forma de realização 175: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 174 para uso como um medicamento para o tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

Forma de realização 176: Um anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 174 ou forma de realização 175 para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 177: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 174 a 176 para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 178: Um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 174 a 176 para uso como um medicamento para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

Forma de realização 179: Uso de um anticorpo mono valente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 como um medicamento.

Forma de realização 180: Uso de acordo com forma de realização 179, em que o medicamento é utilizável para tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

Forma de realização 181: Uso de acordo com forma de realização 179 ou forma de realização 180, em que o medicamento é utilizável para tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 182: Uso de acordo com qualquer uma das formas de realização 179 a 181, em que o medicamento é utilizável para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 183: Uso de acordo com qualquer uma das formas de realização 179 a 181, em que o medicamento é utilizável para tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

Forma de realização 184: Uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

Forma de realização 185: Uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 ou forma de realização 184 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, que a doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 186: Uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 ou forma de realização 184 ou forma de realização 185 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido anticorpo especificamente liga referido antígeno.

Forma de realização 187: Uso de um anticorpo de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 ou forma de realização 184 ou forma de realização 185 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença ou distúrbio, cuja doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor.

Forma de realização 188: Um método para inibir um antígeno em um indivíduo sofrendo de uma doença ou distúrbio em que a atividade do antígeno é indesejável, compreendendo administração a um indivíduo de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117a 144, de modo que a atividade do antígeno no indivíduo é inibida .

Forma de realização 189: Um método de tratamento de uma doença ou distúrbio, em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144, pelo que a doença ou distúrbio é tratada.

Forma de realização 190: Um método de acordo com forma de realização 189, em que referida doença ou distúrbio é câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, e em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144, e em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é efetiva no tratamento da referida doença.

Forma de realização 191: Um método de acordo com forma de realização 189 ou forma de realização 190, em que referida doença ou distúrbio é tratável por administração de um anticorpo contra um determinado alvo, em que o envolvimento das atividades mediadas pelo sistema imune não é necessário ou é indesejável para obter os efeitos da administração do anticorpo, e em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144.

Forma de realização 192: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 189 a 191, em que referida doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um antígeno solúvel, em que multimerização de referido antígeno pode formar complexos imunes indesejáveis, e em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, cujo anticorpo especificamente liga referido antígeno, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117a 144. Forma de realização 193: Um método de acordo com qualquer uma das formas de realização 189 a 191, em que referida doença ou distúrbio é tratável por bloqueio ou inibição de um receptor ligado à membrana da célula, em que referido receptor pode ser ativado por dimerização de referido receptor, e em que referido método compreende administração a um indivíduo em necessidade de tratamento de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, em que referido anticorpo especificamente liga referido receptor, uma composição farmacêutica compreendendo referido anticorpo, imunoconjugado compreendendo referido anticorpo, ou uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144.

Forma de realização 194: Um método de qualquer uma das formas de realização 189 a 193, compreendendo administração de um ou mais de outros agentes terapêuticos ao indivíduo.

Forma de realização 195: Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106, junto com um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Forma de realização 196: Um animal transgene compreendendo uma construção de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das formas de realização 117 a 144.

Forma de realização 197: Uso de um anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das formas de realização 54 a 106 como um agente diagnóstico.

Forma de realização 198: Um método de identificação de um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente com uma meia-vida longa, em que o anticorpo monovalente ou fragmento de anticorpo é testado para proteção por FcRn contra depuração. Forma de realização 199: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente que é protegido da depuração por FcRn.

Forma de realização 200: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias quando administrado in vivo.

Forma de realização 201: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento tem uma meia-vida de pelo menos 5 e até 21 dias quando administrado in vivo.

Forma de realização 202: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento ίφ'πι uma meia-vida de pelo menos 5 e até 14 dias quando administrado in vivo.

Forma de realização 203: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento tem uma meia-vida de pelo menos 14 dias.

Forma de realização 204: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento tem uma meia-vida de pelo menos 21 dias.

Forma de realização 205: Um anticorpo monovalente ou um fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento tem uma meia-vida de pelo menos 5 dias quando administrado in vivo em camundongos SCID. Forma de realização 206: Um anticorpo monovalente ou fragmento de anticorpo monovalente de acordo com forma de realização 199, em que referido anticorpo monovalente ou anticorpo monovalente fragmento é capaz de se ligar a FcRn.

A presente invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como ainda limitativos.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Iniciadores de oligonucleotídeos e amplificação PCR

Os iniciadores de oligonucleotídeos foram sintetizados quantificados por Isogen Bioscience (Maarssen, Holanda). Iniciadores foram dissolvidos em H2O a 100 pmol/μΐ e armazenados a -20°C. Um resumo de todos os iniciadores de PCR e seqüenciamento é tabulado (Figura 1). Para PCR, DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart (Stratagene, Amsterdam, Holanda) foi usada de acordo com as instruções dos fabricantes. Cada mistura de reação continha 200 μΜ dNTPs mistos (Roche Diagnostics, Almere5 Holanda), 6,7 pmol de ambos o iniciador dianteiro e reverso, 100 ng de DNA genômico ou 1 ng de plasmídeo DNA e 1 unidade de DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart em tampão de reação PCR (suprido com polimerase) em um volume total de 20 μΐ. As reações PCR foram realizadas com um Termociclador 96 TGradient (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha) usando um programa de 32-ciclos: desnaturação a 95°C durante 2 min; 30 ciclos de 950C durante 3 0 segundos, a 60-70°C gradiente (ou outra temperatura de anelamento específica) durante 30 segundos, e 72°C durante 3 min; extensão final a 12°C durante 10 min. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até outra análise ou processamento.

Exemplo 2

Eletroforese de gel agarose

A eletroforese de gel agarose foi realizada de acordo com Sambrook (Sambrook J. e Russel, D.V. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed.., Cold Spring Harbor, 2000) usando géis de 50 ml, em 1 χ Tris tampão Acetato EDTA. DNA foi visualizado pela inclusão de brometo de etídio em gel e observação sob luz UV. As imagens do gel foram registradas por uma câmera CCD e um sistema de análise de imagem (GeneGnome; Syngene, via Westburg B.V., Leusden, Holanda). Exemplo 3

Análise e purificação de produtos PCR e produtos de digestão enzimática.

Purificação de fragmentos PCR desejados foi realizada usando um kit de purificação MinElute PCR (Qiagen, via Westburg, Leusden, Holanda; produto # 28006), de acordo com as instruções dos fabricantes. DNA isolado foi quantificado por espectroscopia de UV e a qualidade foi avaliada por eletroforese de gel agarose.

Alternativamente, PCR ou produtos de digestão foram separados por eletroforese de gel agarose (por exemplo quando fragmentos múltiplos estavam presentes) usando a 1% Tris Acetato EDTA gel agarose. O fragmento desejado foi excisado do gel e recuperado usando o kit de Extração de gel QIAEX II (Qiagen; produto# 20051), de acordo com as instruções dos fabricantes.

Exemplo 4

Quantificação de DNA por espectroscopia de UV

A densidade óptica de ácidos nucleicos foi determinada usando um Espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, Maarssen, Holanda) de acordo com as instruções dos fabricantes. A concentração de DNA foi medida por análise da densidade óptica (OD) a 260 nm (uma unidade OD260nm = 50 μg/ml). |Para todas as amostras, o tampão em que os ácidos nucleicos foram dissolvidos foi usado como uma referência.

Exemplo 5:

Digestões das enzimas de restrição As enzimas de restrição e suplementos foram obtidos de New England Biolabs (Beverly, MA, USA) ou Fermetas (Vilnius, Lituânia) e usados de acordo com as instruções dos fabricantes.

DNA (100 ng) foi digerido com 5 unidades de enzima(s) no tampão apropriado em um volume final de 10 μΐ (volumes de reação foram escalonados como apropriado). As digestões foram incubadas a temperatura recomendada por um mínimo de 60 min. Para fragmentos requerendo digestões duplas com enzimas de restrição que envolvem tampões incompatíveis ou exigências de temperatura, digestões foram realizadas seqüencialmente. Se necessário, os produtos de digestão foram purificados por eletroforese de gel agarose e extração de gel.

Exemplo 6

Ligação de fragmentos de DNA

Ligações de fragmentos de DNA foram realizadas com o kit de ligação Quick (New England Biolabs) de acordo com as instruções dos fabricantes. Para cada ligação, DNA do vetor foi misturado com aproximadamente excesso molar de três vezes do DNA do inserto.

Exemplo 7

Transformação de E. coli

DNA Plasmídeo (1-5 μΐ de solução de DNA, tipicamente 2 μΐ de mistura de ligação de DNA ) foi transformado em células competentes One Shot DH5a-TlR ou MACH-I TIr de E. coli (Invitrogen, Breda, Holanda; produto# 12297-016) usando o método de choque térmico, de acordo com as instruções dos fabricantes.Depois, células foram colocadas em placas de agar Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/ml ampicilina. As placas foram incubadas durante 16-18 horas a 37°C até as colônias bacterianas se tornarem evidentes.

Exemplo 8

Triagem de colônias bacterianas por PCR

As colônias bacterianas foram triadas pela presença de vetores contendo as seqüências desejadas via PCR de colônia usando o kit HotStarTaq Master Mix (Qiagen; produto# 203445) e o iniciador dianteiro e reverso apropriados. As colônias selecionadas foram levemente tocadas em uma ponta de pipeta de 20 μΐ e tocadas brevemente em 2 ml LB para uma cultura em escala pequena, e então recolocadas em suspensão na mistura PCR. PCR foi realizado com um termociclador TGradient 96 usando um programa de 35-ciclos: desnaturação a 95°C durante 15 min; 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 min; seguido por uma etapa de extensão final de 10 min a 72°C. Se apropriado, as misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até 1 análise por eletroforese de gel agarose.

Exemplo 9

Isolamento de DNA Plasmídeo de cultura de E. coli

DNA Plasmídeo foi isolado de culturas de E. coli usando os seguintes kits de Qiagen (via Westburg, Leusden, Holanda), de acordo com as instruções dos fabricantes. Para a preparação de plasmídeo em bruto (cultura de 50-150 ml), ou um kit HiSpeed Plasmid Maxi (produto# 12663) ou um kit HiSpeed Plasmid Midi (produto# 12643) foi usado. Para a preparação de plasmídeo em escala pequena (cultura ± 2 ml) um kit Qiaprep Spin Miniprep (produto# 27106) foi usado e DNA foi eluído em tampão de eluição de 50 μΐ (suprido com kit).

Exemplo 10

Mutagênese sítio-dirigida

A mutagênese sítio-dirigida foi realizada usando o kit de Mutagênese Sitio-Dirigida QuickChange II XL (Stratagene, Amsterdam, Holanda) de acordo com as instruções dos fabricantes. Este método incluía a introdução de um sítio extra Xmal silente para triar para uma mutagênese de sucesso. Brevemente, 5 μΐ IOx tampão de reação, 1 μΐ oligonucleotídeo IgG4S228Pf (PI6) (100 pmol/ μΐ), 1 μΐ oligonucleotídeo IgG4S228Pr (Ρ17)(100 pmol/μl), 1 μΐ mistura dNTP, 3 μΐ Quicksolution, 1 μl plasmídeo pTomG4Tom7D8 (ver exemplo 16) (50 ng/μl) e 1 μl PfuUltra HF DNA polimerase foram misturados em um volume total de 50 μl e amplificados com a termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemanha; produto# 050-801) usando um programa de 18-ciclos: desnaturação a 95°C durante 1 min; 18 ciclos de 95°C durante 50 segundos, 60°C durante 50 segundos, e 68°C durante 10 min. As misturas de PCR foram armazenadas a 4°C até outro processamento. A seguir, misturas de PCR foram incubadas com 1 μl Dpnl durante 60 min a 37°C para digerir o vetor pTomG47D8 e armazenadas a 4°C até outro processamento. A mistura de reação foi precipitada com 5 μl sM NaAc e 125 μl Etanol, incubada durante 20 minutos a -20°C e girada durante 20 minutos a 4°C a 14000xg. A pelota de DNA foi lavada com 70% etanol, secada e dissolvida em 4 μl de água. O volume de reação total de 4 μl foi transformado em células competentes One Shot Top 10 de E. coli (Invitrogen, Breda, Holanda) de acordo com as instruções dos fabricantes(Invitrogen). A seguir, células foram colocadas em placas de agar Luria-Bertani (LB) contendo 50 μg/ml ampicilina. As placas foram incubadas durante 16-18 horas a 37°C até as colônias bacterianas se tornarem evidentes. Exemplo 11

Seqüenciamento de DNA

As amostras de DNA Plasmídeo foram enviadas para AGOWA (Berlin, Alemanha) para análise da seqüência. Seqüências foram analisadas usando software avançado Vector NTI (Informax, Oxford, UK). Exemplo 12

Expressão transiente em células HEK-293F

Células Freestyle™ 293-F (um subclone HEK-293 adaptado para um meio de crescimento em suspensão e quimicamente definido Freestyle, por exemplo HEK-293F) foram obtidas de Invitrogen e 1 transfectadas de acordo com o protocolo do fabricante usando 293fectin (Invitrogen).

Exemplo 13

Construção de pConGlfA77: Um vetor para a produção de uma cadeia pesada de A77-IgGl

A região codificando Vh do anticorpo anti-FcaRI A77 de camundongo foi amplificada de um vetor de fago scFv, contendo as regiões de codificação Vh e VL deste anticorpo, por um PCR de extensão de sobreposição dupla. Para isto foi usado incorporar um peptídeo de sinal de mamífero, uma seqüência ideal de Kozak e sítios de restrição apropriados para a clonagem em pConGlf. O primeiro PCR foi feito usando iniciadores A77VHforl e A77VHrev com o vetor de fago scFv como gabarito. Parte deste primeiro PCR foi usada em um segundo PCR usando iniciadores A77VHfor2 e A77VHrev. O fragmento Vh foi purificado por gel e clonado em pConGlf0.4. Para isto, o vetor pConGlfO.4 e o fragmento Vh foram digeridos com HindIII e ApaI e purificados. O fragmento Vh e o vetor digerido pConGlfü.4HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR. Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada e foi chamada pConGlfA77.

Exemplo 14

Construção de pConKA77: um vetor para a produção de uma cadeia leve de anticorpos A77

A região codificando Vl de anticorpo anti- FcaRI A77 de camundongo foi amplificada de uma vetor de fago scFv, contendo Vh e VL deste anticorpo, por um PCR de extensão de sobreposição dupla.. Este foi usado para incorporar um peptídeo de sinal de mamífero, uma seqüência ideal de Kozak e sítios de restrição apropriados para clonagem em pConKappa0.4.

O primeiro PCR foi feito usando iniciadores A77VLforl e A77VLrev com vetor de fago scFv como gabarito. Parte deste primeiro PCR foi usada em um segundo PCR usando iniciadores A77VLfor2 e A77VLrev.O produto PCR e o vetor pConKappa0.4 foram digeridos com HindIII e Pfl23II e purificados. O fragmento de Vl e o vetor digerido pConKappa0.4HindIII-Pfl23II foram ligados e transformados em células competentes DH5a TIr de E. coli.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pConKA77.

Exemplo 15

Construção de pTomG4A77: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de A77-IgG4

Para construir um vetor para expressão de A77-IgG4, a região Vh de A77 foi clonada em pTomG4.

Para isto, pTomG4 e pConGlfA77 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento A77 de Vh e o vetor digerido pTomG4HindIII- ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG4A77.

Exemplo 16

Construção de pTomG4A77HG: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de A77-HG

Para fazer uma construção para expressão de A77-HG, a região Vh de A77 foi clonada em pTomG47D8HG, substituindo a região Vh 7D8.

Para isto, pTomG47D8HG e pConGlfA77 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento A77 de Vh e o fragmento de vetor digerido pTomG47D8HGHindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR. Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG4A77HG.

Exemplo 17

Construção de pEE6.4A77Fab: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de A77-Fab

Para fazer uma construção para expressão de A77-Fab, a região Vh de A77 foi clonada em pEE6.42F8Fab, substituindo a região Vh 2F8.

Para isto, pEE6.42F8Fab e pConGlfA77 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento A77 de Vh e o fragmento de vetor digerido pEE6.42F8Fab HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-T1R.

Um clone foi selecionado contendo o inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pEE6.4A77Fab.

Exemplo 18

Clonagem de regiões variáveis de anticorpo anti-cMet humano

RNA Total foi preparado de IxlO6 células de hibridoma de camundongo com o kit RNeasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Holanda) de acordo com o protocolo do fabricante.

DNA 5'-RACE-Complementar (cDNA) de RNA foi preparado de 60 ng total RNA5 usando o kit de amplificação de cDNA SMART RACE k (BD Biosciences Clontech, Mountain View, CA, USA), seguindo o protocolo do fabricante.

As regiões VL e Vh de anticorpo cMet foram amplificadas por PCR. Para isto, DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart (Stratagene) foi usado de acordo com as instruções dos fabricantes. Cada mistura de reação continha 5 μΐ IOx BD tampão Advantage 2 PCR (Clontech), 200 μΜ dNTPs misturados (Roche Diagnostics), 12 pmol de iniciador reverso (RACEG1A1 para uma região Vh e RACEKA1 para uma região Vl), 7.2 pmol UPM-Mix (UPM-Mix: 2μΜ ShortUPMH3 e 0,4 μΜ oligonucleotídeo LongUPMH3), Ιμΐ de cDNA gabarito 5'RACE como descrito acima, e 1 μΐ mistura de polimerase 50X BD Advantage 2 (Clontech) em um volume total de 50 μΐ.

As reações PCR foram realizadas com um termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra) usando um programa de 35-ciclos: desnaturação a 95°C durante 1 min; 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 68°C durante 60 segundos.

Os produtos de reação foram separados por eletroforese de gel agarose em um gel agarose a 1% TAE e coloridos com brometo de etídio. bandas do tamanho correto foram cortadas dos géis e DNA foi isolado de agarose usando o kit Qiagen Minelute Reaction Cleanup (QIAGEN).

Os fragmentos de PCR isolados do gel foram clonados em vetor pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen) usando o kit Zero Blunt® TOPO® PCRCloning para seqüenciamento (Invitrogen), seguindo o protocolo do fabricante. 5 μΐ da mistura de ligação foram transformados em E.Coli competente OneShot DH5aTlR (Invitrogen) e colocados em placas de LB/Ampicilina.

De seis clones contendo insertos, as seqüências Vl foram determinadas e de cinco clones, contendo insertos, as seqüências Vh foram determinadas. Exemplo 19

Construção de pConGlfcMet: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de cMet-IgGl

A região codificando Vh de anticorpo anti-cMet humano foi cortada de um plasmídeo contendo esta região usando HindIII e ApaI. O fragmento Vh foi purificado com gel e clonado em pConGlf0.4. Para isto, vetor pConGlfO.4 foram digerido com HindIII e ApaI e purificado. O fragmento de Vh e o vetor digerido pConGlf0.4HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto isolado e foi chamado pConGlfcMet.

Exemplo 20

Construção de pConKcMet: um vetor para a produção de uma cadeia leve de anticorpos cMet

A região codificando Vl de anticorpo anti-cMet humano foi amplificada de um plasmídeo contendo esta região usando os iniciadores shortUPMH3 e RACEVLBsiWI, introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem em pConK0.4.

O produto PCR e o vetor pConKappa0.4 foram digeridos com HindIII e Pfl23II e purificados. O fragmento de Vl e o vetor digerido pConKappa0.4HindIII-Pfl23II foram ligados e transformados em E. coli competente DH5a T1R.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pConKcMet.

Exemplo 21

Construção de pTomG4cMet: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de cMet-IgG4

Para construir um vetor para expressão de cMet-IgG4, a região Vh de cMet foi clonada em pTomG4.

Para isto, pTomG42F8 e pConGIfcMet foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento cMet de Vh e o vetor digerido pTomG42F8HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG4cMet. Exemplo 22

Construção de pTomG4cMetHG: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de cMet-HG

Para fazer uma construção para expressão de cMet-HG, a região Vh de cMet foi clonada em pTomG42F8HG, substituindo a região Vh de 2F8.

Para isto, pTomG42F8HG e pConGIfcMet foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento cMet de Vh e o fragmento de vetor digerido pTomG42F8HGHindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG4cMetHG.

Exemplo 23

Construção de pEE6.4cMetFab: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de cMet-Fab

Para fazer uma construção para expressão de cMet-Fab, a região Vh de cMet foi clonada em pEE6.42F8Fab, substituindo a região Vh de 2F8.

Para isto, pEE6.42F8Fab e pConGlfcMet foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento cMet de Vh e o fragmento de vetor digerido pEE6.42F8Fab HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pEE6.4cMetFab.

Exemplo 24

Construção de pConG 1Í2F8: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 2F8-IgGl A região codificando Vh de 2F8 (WO 2002/100348) foi amplificada por PCR a partir de pIESRa2F8 (Medarex) usando os iniciadores 2f8HCexfor e 2f8HCexrev e subclonados em PCRscriptCam(Stratagene). O fragmento de Vh foi subseqüentemente clonado em pCONglfO.4.

Para isto, pConGlf0.4 e os vetores pCRScriptCAMVH2F8 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram purificados .

O fragmento de fragmento e o vetor digerido pConGl ft).4HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR. Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto, a seqüência foi confirmada e o vetor foi chamado pConGl f2F 8.

Exemplo 25

Construção de pConK2F8: um vetor para a produção de uma cadeia leve de anticorpos 2F8

IESRa2F8 foi digerido com HindIII e BsiWI e a região codificando Vl de 2F8 (anti-EGFr) foi isolada do gel. O vetor pConKappa0.4 vetor foi digerido com HindIII e BsiWI e purificado. O fragmento de Vl e o vetor digerido pConKappa0.4HindIII-BsiWI vetor digerido foram ligados e transformados em E. coli competente DH5a T1R.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pConK2F8.

Exemplo 26

Construção de pTomG42F8: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 2F8-IgG4

Para construir um vetor para expressão de 2F8-IgG4, a região Vh de 2F8 foi clonada em pTomG4.

Para isto, pTomG4 e pConGlf2F8 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados. O fragmento 2F8 de Vh e o vetor digerido pTomG4HindIII- ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG42F8. Exemplo 27

Construção de pTomG42F8HG: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 2F8-HG

Para fazer uma construção para expressão de 2F8-HG, a região Vh de 2F8 foi clonada em pTomG47D8HG, substituindo a região Vh de 7D8.

Para isto, pTomG47D8HG e pConGlf2F8 foram digeridos com HindIII e ApaI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento 2F8 de Vh e fragmento de vetor digerido pTomG47D8HGHindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto. Este plasmídeo foi chamado pTomG42F8HG. Exemplo 28

Construção de pEE6.42F8Fab: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 2F8-Fab

A região codificando Fab foi amplificada do vetor pConGlf2F8 por PCR com iniciadores pConGlseql e 2F8fabrev2, introduzindo um sítio de restrição de clonagem apropriado e uma seqüência codificando etiqueta his C-terminal. O fragmento de PCR foi purificado e clonado em PEE6.4.

Para isto, pEE6.4 e o fragmento de PCR foram digeridos com HindIII e EcoRI e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento 2F8 de Fab e o fragmento de vetor digerido pEE6.4HindIII-EcoRI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR. Um clone foi selecionado contendo o inserto correto e a seqüência foi confirmada por seqüenciamento de DNA. Este plasmídeo foi chamado pEE6.42F8Fab.

Exemplo 29

Construção de pConGlf7D8: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 7D8-IgGl

A região codificando Vh de HuMab-7D8 específico de CD20 (WO 04/035607) foi amplificada por PCR de um vetor pGemT (Promega, Madison, USA) contendo esta região usando os iniciadores 7D8VHexfor (P8) e 2F8HCexrev (PI3) (Figura 14), introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem em pConGlf0.4(Lonza Biologics, Slough, UK), um vetor de expressão de mamífero contendo a região constante genômica (alotipo f) de IgGl humana, e uma seqüência Kozak ideal (GCCGCCACC, (Kozak M et al., Gene 234(2), 187-208 (1999)). O fragmento de PCR foi clonado em pPCR-Script CAM (Stratagene, Amsterdam, Holanda) usando um kit de clonagem PCR-Script® Cam (Stratagene), de acordo com as instruções dos fabricantes. Vários clones foram seqüenciados e um clone contendo a seqüência prevista foi selecionado para outro uso.

O fragmento de Vh foi purificado com gel e clonado em pConGlf0.4. Para isto, o fragmento de Vh foi isolado do vetor pPCR-Script CAM após digestão com HindIII e ApaI e purificação com gel.

O vetor pConGlf0.4 foi digerido com HinálII e ApaI e o fragmento do vetor foi isolado do gel, seguido por desfosforilação com fosfatase alcalina de camarão (New England Biolabs) O fragmento de Vh e o fragmento desfosforilado ^pConGIiQ AHinálII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR (Invitrogen). Oito colônias foram verificadas por PCR de colônia (usando iniciadores pConGlseql (PIO) e HCseq5 (Pll) (Figura 14) e todas as colônias foram verificadas como contendo o inserto de tamanho correto. Um clone foi escolhido para outro estudo e chamado pConGlf7D8.

Exemplo 30

Construção de pConK7D8: um vetor para a produção de uma cadeia leve de 7D8-IgGl, 7D8-IgG4 e 7D8-HG

A região codificando Vl de HuMab-7D8 específico de CD20 (WO 04/035607) foi amplificada de uma plasmídeo contendo esta região usando os iniciadores 7D8VLexfor (P7) e 7D8VLexrev (P6) (Figura 14), introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem em pConKappa0.4 (Lonza Biologics), um vetor de expressão de mamífero contendo a região leve de cadeia kappa constante (alotipo km3) de IgG humana, e uma seqüência Kozak ideal.

O produto PCR e o vetor pConKappa0.4 foram digeridos com Hindlll e BsiWl. O vetor e fragmento de Vl foram purificados e o vetor foi desfosforilado com fosfatase alcalina de camarão. O fragmento de Vl e o vetor digerido pConKappaO Âffindlll-BsiWl foram ligados e transformados em E. coli competente DH5a T1R. Dez colônias foram verificadas por PCR de colônia (usando iniciadores pConKseql (P9) e LCseq3 (P5) (Figura 14) e 9 colônias foram verificadas como contendo o tamanho de inserto correto.

De 4 clones o DNA plasmídeo foi isolado e a região Vl foi seqüenciada. 3 clones continham a seqüência prevista e um clone foi selecionado para uso posterior e chamado pConK7D8. Exemplo 31

Construção de pTomG4: um vetor para a expressão de regiões de cadeia pesada variáveis de IgG Humana com a região constante de IgG4 humana

DNA genômico foi isolado de uma amostra de sangue de um voluntário e usado como um gabarito em um PCR com iniciadores IgG4gene2f (PI5) e IgG4gene2r (PI4) (Figura 14), amplificando a região constante genômica completa de uma cadeia pesada de IgG4 e introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem no vetor de expressão de mamífero pEE6.4 (Lonza Biologics). O fragmento de PCR foi purificado e clonado em pEE6.4. Para isto, o produto PCR foi digerido com Hínàlll e EcoRI, seguido por inativação com calor das enzimas de restrição. O vetor pEE6.4 foi digerido com HindUl e EcoRI, seguido por inativação por calor das enzimas de restrição e desfosforilação do fragmento do vetor com fosfatase alcalina de camarão, seguido por inativação com calor da fosfatase. O fragmento de IgG4 e o vetor desfosforilado τρΈΈβ AHindlllJEcoRl foram ligados e transformados em células competentes MACHI-TIr (Invitrogen). Três clones foram cultivados em LB e DNA plasmídeo foi isolado de uma cultura pequena (1,5 ml). A digestão de restrição revelou um padrão consistente com a clonagem do fragmento de IgG4 no vetor pEE6.4. DNA Plasmídeo de dois clones foi transformado em E.coli DH5a-TlR e DNA plasmídeo foi isolado e as construções foram verificadas por análise de seqüência do inserto e um clone foi verificado como sendo idêntico a um clone IgG4 genômico da base de dados do Genbank, além de algumas diferenças pequenas em introns. SEQ ID No: 13 mostra a seqüência da região de IgG4 em pTomG4. Estas diferenças são provavelmente ou polimorfismos ou falhas na seqüência do Genbank. O plasmídeo foi chamado pTomG4.

Exemplo 32

Construção de pTomG47D8: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de 7D8-IgG4

DNA plasmídeo de pConGlf7D8 foi digerido com Hindlll e Apal e o fragmento de Vh foi purificado com gel. O vetor pTomG4 foi digerido com HindlU e Apal e o fragmento do vetor foi isolado do gel. O fragmento de Vh e o fragmento pTomG4HindIII-ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR. Quatro colônias foram verificadas por PCR de colônia (usando iniciadores pConKseql (P9) e HCseql 1 (PI2)) e dias foram verificadas como contendo o tamanho de inserto correto e a presença da estrutura dorsal de pTomG4 foi confirmada por digestão com Mspl no fragmento de PCR de colônia. Um dos clones foi selecionado para uso posterior. Este plasmídeo foi chamado pTomG47D8.

Exemplo 33

Construção de pTomG47D8HG; um vetor para a expressão de uma cadeia pesada de 7D8-HG

A mutagênese sítio-dirigida foi usada para destruir o sítio do doador de emenda do exon de gancho de IgG4 no plasmídeo pTomG47D8. Uma reação de mutagênese sítio-dirigida foi feita de acordo com o método de mutagênese sítio-dirigida QuickChange XL usando iniciadores IgG4S228Pf (P16) e IgG4S228Pr (PI7). 24 colônias foram tríadas por PCR de colônia e digestão de Xmal (um sítio extra Xmal foi introduzido durante a mutagênese ) e todas as colônias pareceram conter as mudanças de nucleotídeos corretas. Duas colônias positivas foram cultivadas durante a noite, DNA plasmídeo foi isolado e seqüenciado para confirmar que a mutação correta foi introduzida. Ambas de fato continham a seqüência correta e uma foi selecionada para outra propagação e chamada pTomG47D8HG. Para excluir a introdução de mutações adicionais durante o processo de mutagênese, a região codificando todo o IgG4 de pTomG47D8HG foi reseqüenciada e não foram encontradas mutações adicionais O vetor final foi chamado pTomG47D8HG.

Exemplo 34

Clonagem de regiões variáveis do anticorpo anti-Betvl de camundongo

RNA Total foi preparado de 0,3x105 células de hibridoma de camundongo (Clone 2H8 de referência (Akkerdaas JH et al., Allergy 50(3), 215-20 (1995)) com o kit RNeasy (Qiagen, Westburg, Leusden, Holanda) de acordo com o protocolo do fabricante.

DNA 5'-RACE-Complementar (cDNA) de RNA foi preparado de 112 ng RNA total, usando o kit de Amplificação de cDNA SMART RACE (BD Biosciences Clontech, Mountain View, CA, USA), seguindo o protocolo do fabricante.

As regiões Vl e Vh de anticorpo Betvl foram amplificadas por PCR. Para isto, DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart (Stratagene) foi usada de acordo com as instruções dos fabricantes. Cada mistura de reação continha 200 μΜ dNTPs misto (Roche Diagnostics), 12 pmol de iniciador reverso (RACEGlmml (PI9) para uma região Vh e RACEKmml (PI8) para uma região VL), 7,2 pmol UPM-Mix (UPM=Mix: 2 μΜ ShortUPMH3 (P20) e 0,4 μΜ oligonucleotídeo LongUPMH3 (P21) (Figura 14)), 0,6 μΐ de cDNA gabarito 5'RACE como descrito acima, e 1,5 unidade de DNA polimerase PfuTurbo® Hotstart em tampão de reação PCR (suprido com polimerase) em um volume total de 30 μΐ.

As reações PCR foram realizadas com um termociclador TGradient 96 (Whatman Biometra) usando um programa de 35-ciclos: desnaturação a 950C durante 2 min; 35 ciclos de 950C durante 30 segundos, a 55°C durante 3 0 segundos, e 72°C durante 1,5 min; extensão final a 72°C durante 10 min.

Os produtos da reação foram separados por eletroforese de gel agarose em um gel agarose a 1% TAE e coloridos com brometo de etídio. Bandas do tamanho correto foram cortadas dos géis e o DNA foi isolado da agarose usando o kit de extração de gel QiaexII (Qiagen).

Fragmentos isolados do gel de PCR foram de cauda A por uma incubação a Il0C de 10 minutos com 200 μΜ dATP e 2, 5 unidades Amplitaq (Perkin Elmer) e purificados usando colunas minielute (Qiagen). fragmentos A-tailed de PCR foram clonados no vetor pGEMTeasy (Promega) usando o kit pGEMT easy vector system II (Promega), seguindo o protocolo do fabricante. 2 μΐ da mistura de ligação foram transformados em E.Coli competente OneShot DH5aTlR (Invitrogen) e colocados em placas on LB/ Amp/ IPTG/ Xgal.

Colônias brancas contendo quatro insertos, cada para as seqüências de Vh e Vl foram tomadas e os insertos foram seqüenciados. As seqüências de aminoácidos deduzidas dos Vh e Vl de Betvl são mostradas como SEQ ID No: 8 e SEQ ID No: 12, respectivamente.

Exemplo 35

Construção de pConGlfBetVl: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de Betvl-IgGl

A região codificando Vh de anticorpo anti-BetVl de camundongo foi amplificada por PCR de um plasmídeo contendo esta região (exemplo 18) usando iniciadores VHexbetvlfor (P4) e Vnexbetvlrev (P3), introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem em pConGlf0.4 e uma seqüência Kozak ideal.

Os fragmentos de Vh foram purificados com gel e clonados em pConGlfO.4. Para isto, o produto PCR e o vetor pConKappa0.4 foram digeridos com Hinálll e Apal e purificados .

O fragmento de Vh e o vetor ipConG\fQÁHinàlll-Apal digerido foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência correta foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pConGlfBetvl.

Exemplo 36

Construção de pConKBetvl: um vetor para a produção de uma cadeia leve de Betvl

A região codificando Vl de anticorpo anti-BetVl de camundongo foi amplificada de uma plasmídeo contendo esta região (exemplo 18) usando iniciadores VLexbetvlfor (P2) e VLexbetvlrev (PI), introduzindo sítios de restrição apropriados para clonagem em pConK0.4 e uma seqüência Kozak ideal.

O produto PCR e o vetor pConKappa0.4 foram digeridos com Hindlll e BsiWl e purificados O fragmento de Vl e o vetor digerido pConKappa0.4//z'«dIII-ÃS7WI foram ligados e transformados em E. coli competente DH5a T1R.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pConKBetvl.

Exemplo 37

Construção de pTomG4Betvl: um vetor para a produção de uma cadeia pesada de Betvl-IgG4

Para construir um vetor para expressão de Betvl-IgG4, a região Vh de BetVl foi clonada em pTomG4.

Para isto, pTomG4 e pConGlfBetvl foram digeridos com Hinálll e Apal e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento Vh de Betvl e o vetor digerido pTomG4//mdIII- ApaI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pTomG4Betvl.

Exemplo 38

Construção de pTomG4BetvlHG; um vetor para a produção de uma cadeia pesada de Betvl-HG

Para fazer uma construção para expressão de Betvl-HG, a região Vh de Betvl foi clonada em pTomG47D8HG, substituindo a região de Vh 7D8.

Para isto, pTomG47D8HG e pConGIfBetvl foram digeridos com Hinálll e Apal e os fragmentos relevantes foram isolados.

O fragmento Vh de Betvl fragmento e o fragmento de vetor digerido pTomG47D8HG//mdIII-,4/?aI foram ligados e transformados em células competentes DH5a-TlR.

Um clone foi selecionado contendo o tamanho de inserto correto e a seqüência foi confirmada. Este plasmídeo foi chamado pTomG4Betv 1HG.

Exemplo 39

Produção de 7D8-IgGl, 7D8-IgG4, 7D8-HG, Betvl-IgGl, Betvl-IgG4, Betvl-HG, 2F8-IgGl, 2F8-IgG4, 2F8-HG, 2F8-Fab, A77-IgGl, A77-IgG4, A77-HG, A77-Fab. cMet-IgGl, cMet-IgG4, cMet-HG, e cMet-Fab por expressão transiente em células Hek-293F

Anticorpos foram produzidos a partir de todas as construções por cotransfecção de vetores de cadeia pesada e leve relevantes em células HEK-293F usando 293fectin de acordo com as instruções dos fabricantes. Para 7D8-IgGl, pConGlf7D8 e pConK7D8 foram coexpressados. Para 7D8- IgG4, pTomG47D8 e pConK7D8 foram coexpressados. Para 7D8-HG, pTomG47D8HG e pConK7D8 foram coexpressados. Para Betvl-IgGl, pConGIBetvl e pConKBetvl foram coexpressados. Para Betvl-IgG4, pTomG4Betvl e pConKBetvl foram coexpressados. Para Betvl-HG, pTomG4BetvlHG e pConKBetvl foram coexpressados.

Para 2F8-IgGl, pConGlf2F8 e pConK2F8 foram coexpressados. Para 2F8-IgG4, pTomG42F8 e pConK2F8 foram coexpressados. Para 2F8-HG, pTomG42F8HG e pConK2F8 foram coexpressados. Para 2F8-Fab, pEE6.42F8-Fab e pConK2F8 foram coexpressados.

Para cMet-IgGl, pConG IfcMet e pConKcMet foram coexpressados. Para cMet-IgG4, pTomG4cMet e pConKcMet foram coexpressados. Para cMet-HG, pTomG4cMetHG e pConKcMet foram coexpressados. Para cMet-Fab, pEE6.4cMet-Fab e pConKcMet foram coexpressados.

Para A77-IgGl, pConGlfA77 e pConKA77 foram coexpressados. Para A77-IgG4, pTomG4A77 e pConKA77 foram coexpressados. Para A77-HG, pTomG4A77HG e pConKA77 foram coexpressados. Para A77-Fab, pEE6.4A77-Fab e pConKA77 foram coexpressados.

Exemplo 40

Purificação de anticorpos de IgGl, IgG4 e IgG4- sem ganchos

Todos os anticorpos de IgGl5 IgG4 e sem ganchos foram purificados. Primeiro, os sobrenadantes foram filtrados sobre 0,20 μΜ filtro de ponta morta. Então.o sobrenadante foi carregado em uma coluna de 5 ml de Proteína A (rProtein A FF, Amersham Bioscience) e eluídos com 0,1 M ácido cítrico-NaOH, pH 3. O eluado foi imediatamente neutralizado com 2 M Tris-HCl, pH 9 e dialisado durante a noite a 12,6 mM fosfato de sódio, 140 mM NaCl, pH 7.4 (B. Braun, Oss, Holanda). Após as diálise, as amostras foram filtradas de modo estéril sobre um filtro de ponta morta sobre 0,20 μΜ.

Anticorpos foram deglicosilados pela incubação durante a noite a 37°C com 1 unidade PNgase F (Roche) / μg anticorpo, seguido por purificação em proteína A.

Amostras foram analisadas para concentração de IgG por nefelometria e absorbância a 280 nm.

Exemplo 41

Purificação de anticorpos Fab recombinantes por cromatografia de afinidade de metal

As contas de Talon (Clontech) foram usadas para purificação de anticorpos A77-Fab, 2F8-Fab e cMet-Fab.

Antes do uso, as contas foram equilibradas com Ix tampão de equilíbrio/lavagem pH 7,0 (50 mM fosfato de sódio e 300 mM NaCl) seguido por incubação com sobrenadante de cultura contendo o anticorpo Fab. As contras foram lavadas com Ix tampão equilíbrio/lavagem para remover proteínas ligadas não específicas e a proteína de etiqueta His foi eluída com Ix tampão de eluição (50 mM fosfato de sódio, 300 mM NaCl e 150 mM Imidazol) a pH 5,0. Incubação foi feita em batelada, enquanto a lavagem e a eluição foram feitas em colunas recheadas usando centrifugação (2 minutos a 700 g). A proteína eluída foi dessalificada em uma coluna PD-10 por mudança para PBS. O rendimento de proteína purificada foi determinado por medida da absorbância a 280 nm usando o coeficiente de absorbância teórico como calculado e uma seqüência de aminoácidos. As proteínas purificadas foram analisadas por SDS-PAGE, a proteína migrou como uma banda no tamanho esperado.

Exemplo 42

Análise SDS-PAGE não reduzido de anticorpos 7D8-IgG4 e 7D8-HG

Após a purificação, os anticorpos específico para CD207 D8- IgGl (IgGl anti-CD20) 7D8-IgG4 (IgG4 anti-CD20) e 7D8-HG (IgG4 anti- CD20sem gancho) foram analisadas em SDS-PAGE não redutor.

Os métodos de eletroforese Bis-Tris usados incluem a modificação do método Laemmli (Laemmli UK, Nature 227, 6801 (1970)), onde as amostras foram cicladas em pH neutro. Os géis SDS-PAGE foram coloridos com Coomassie e formados em imagem digital usando GeneGenius (Synoptics, Camponte, UK).

Como pode ser visto em Figura 1, 7D8-IgGl mostrou 1 banda principal representando a molécula tetramérica de comprimento completo (2 cadeias pesadas e duas cadeias leves) 7D8 IgGl. 7D8-IgG4 mostram ter além da banda principal representando a molécula de IgG4 tetramérica, uma quantidade substancial de meias moléculas (isto é uma banda pesada e uma cadeia leve) como descrito em literatura ( Schuurman J et. al., Mol Imuno 1 38, 1 (2001); Angal S et al., Mol Imuno 1 30, 105 (1993); Colcher D et al., Câncer Res 49, 1738 (1989); King DJ et al., Biochem J 281( Pt 2), 317 (1992); Petersen J G et al., J Biol Chem 249, 5633 (1974)). A molécula de IgG4sem gancho 7D8-HG é mostrada como sendo somente meias-moléculas.

Exemplo 43

Espectrometria de massa de 7D8-HG Para espectrometria de massa por técnica Nanospray as amostras foram concentradas e tampão foi trocado a 20 mM fosfato de sódio, pH 7.2 usando concentradores Millipore Microcon YM-30. Subseqüentemente, aproximadamente 100 IgG foram digeridos durante 16 horas a 37°C com 1 U N-glicosidase F (Roche, cat. no. 1365177) para liberar os glicanos N-ligados.

Amostras foram dessalinizadas fora de linha usando um cartucho C4 micro-trap e eluídas em 30% propanol/5% ácido acético. A análise de peso molecular foi realizada usando nanospray Electrospray-MS usando Q-TOF (Waters, Almere, Holanda). O instrumento foi calibrado usando glu-fibrinopeptídeo. O software Masslynx 4.0 foi usado para desconvolutar os dados carregados de modo multiply obtidos.

Uma outra alíquota da amostra foi reduzida usando ditiotreitol. Os produtos de redução foram dessalinizados fora de linha usando um coletor C4 microtrap e analisadas como descrito acima. A análise MS de 7D8-HG sob condições redutoras mostrou uma massa de cadeia leve de 23440 dalton que é consistente com a massa de cadeia leve prevista de 23440 dalton. Não foi detectada massa de uma cadeia pesada, provavelmente devido à precipitação da cadeia pesada.

A análise de MS sob condições não reduzidas mostrou uma massa predominante de 71520 dalton, que se correlaciona bem com a massa prevista (71522 dalton) da meia-molécula (combinando uma cadeia pesada e uma cadeia leve) faltando o gancho. Uma quantidade fina do produto com uma massa de 143041 dalton foi observada, provavelmente representando uma molécula tetramérica com uma cadeia pesada sem gancho.

Exemplo 44

Espectrometria de massa - mapeamento de peptídeo de 7D8-HG

Uma alíquota (25 μg) de 7D8-HG foi digerida com CNBr durante 5 horas em temperatura ambiente. A amostra digerida com CNBr foi secada por congelamento e então redissolvida em tampão 50 mM bicarbonato de amônio ajustado a pH 8.4 com 10% amônia aq. e digeridos com tripsina tratada com TPCK durante 5 horas a 37°C. Os produtos de digestão foram liofilizados e a redução foi realizada na amostra digerida liofilizada usando um excesso molar de 20 vezes de ditiotreitol (DTT) em tampão Tris-acetato a pH 8,5. Os produtos da reação foram analisados por LC/ES-MS on Iine usando uma coluna C18. Eluição foi realizada usando ácido fórmico aquoso e um gradiente de acetonitrila. Detecção de massas ocorreu em um espectrômetro de massa de Electrospray LCT Premier, calibrado em uma faixa de m/z 250 a 3000.

Um peptídeo tríptico com uma massa de 2026.2 Da correspondendo à massa teórica do peptídeo específico sem gancho 220 VAPEFLGGPSVFLFPPKPK 238 foi detectado (Figura 2). A identidade deste peptídeo foi confirmada por nanospray MS e MS/MS (Figuras 3 e 4).

Este resultado mostra que o anticorpo 7D8-HG não contém uma região de gancho.

Exemplo 45

Distribuição de massa molecular da velocidade de sedimentação por experimentos de ultra centrifuga analíticos (AUC) de 7D8-HG.

Uma amostra de 1 mg/ ml de 7D8-HG em PBS foi enviada para Nanolytics (Dalgow, Alemanha) para análise AUC. Uma população dominante de sedimentos de 7D8-HG com uma velocidade e 6,7 S (95%) foi identificada. Um agregado distinto foi encontrado a 11,5 S (2%). O resto do material foi encontrado em agregados maiores.

O coeficiente de sedimentação da fração principal indica que 7D8-HG em PBS predominantemente ocorre como um dímero com uma relação de atrito de 1.4.

Aparentemente 7D8-HG forma um dímero por interações não covalentes de baixa afinidade, provavelmente na região Ch3 (Saphire, Stanfield et al. 2002). Este processo de dimerização pode ser inibido usando moléculas de HG na presença de um excesso de anticorpos irrelevantes (ver exemplo 54)

Saphire, E.O., R.L. Stanfield, et al (2002). "Contrasting IgG structures reveal extrem asymmetry and flexibility." J. Mol. Biol 319 (1): 9-18.

Exemplo 46

Análise funcional de anticorpos 7D8-IgGl, 7D8-IgG4 e 7D8-HG

A ligação do antígeno CD20 destes anticorpos específicos para CD20 foi examinada por citometria de fluxo. As células transfectadas com NSO/CD20 (50 000 células/50 μΐ) foram lavadas em tampão FACS (FB: PBS, 0,05% BSA, 0,02% NaN3) e incubadas em placas de 96 cavidades de fundo em V com os anticorpos de teste (50 μΐ a 4°C durante 3 0 min). Após lavar, F(ab)2 de IgG-kappa anti-humano de cabra rotulado com PE (Southern Biotechnology, cat No: 2062-09, www.southernbiotech.com) foi adicionado às células. As células foram lavadas em FB e células foram coletadas em tubos de FACS em um volume total de 150 μl. Amostras foram medidas e analisadas por uso de FACScalibur™ (Becton Dickinson, San Diego, CA, USA).

Como pode ser visto em Figura 5, todos os três anticorpos foram específicos para antígeno e mostraram uma boa ligação para CD20.

A fim de determinar a ligação de Clq (o primeiro componente de cascata clássica de complemento) para 7D1-IgGl, 7D8-IgG4 e 7D8-HG, um ELISA foi realizado. Em resumo, placas ELISA de microtitulação (Greiner, Alemanha) foram revestidas durante a noite a RT com anticorpos de teste diluídos em série de 10 μ§/ml a 0,06 μg/ml em PBS. Placas foram esvaziadas e cavidades foram bloqueadas com 200 μl ELISA-diluente por cavidade (0,1 M NaPO4, 0,1 M NaCl, 0,1% gelatina e 0m05% Tween-20), a RT durante 3 0 minutos. Subseqüentemente, placas foram esvaziadas e cavidades foram incubadas com 2 μg/ml Clq humano (Quidel, lote #900848) em tampão Clq (PBS suplementado com 0,1% w/v gelatina e 0,05% v/v Tween-20, 100 μl/cavidade, 37°C, 1 hora). Placas foram lavadas três vezes com PBST e cavidades foram incubadas com Clq anti-humano de coelho (DAKO, AO136), diluído em tampão Clq (100 μl/cavidade, RT, 1 h). Após lavar as placas (3x) com PBST, cavidades foram incubadas com IgG-Fc anti- coelho de suíno conjugado a HRP (DAKO, P0300, lote #069) diluído em diluente ELISA (1:2500, 100 μl/cavidade, RT, 1 hora). A seguir, placas foram lavadas três vezes e testes foram desenvolvidos com 1 mg/ml solução ABTS recentemente preparada (ABTS: ácido 2,2'-azino-bis[3-etil benztiazolina-6- sulfônico); 2 comprimidos de 5 mg em 10 ml tampão ABTS, Boehringer Mannheim, Ingelheim, Alemanha) a RT no escuro durante 30 minutos. Absorbância foi medida a 405 nm em uma leitora de placa ELISA (Biotek Instruments Inc., Winooski, USA).

Como pode ser visto em Figura 6, Clq não liga a ambos 7D8- IgG4 e 7D8-HG. Como um controle, a ligação de Clq a 7D8-IgGl foi avaliada a qual mostrou ligação dependente de concentração de Clq. Para ainda investigar as propriedades do complemento de anticorpos específicos para CD20, a toxicidade celular dependente do complemento foi examinada. Após coleta, as células Daudi ATCC, www.ATCC.org) foram lavadas três vezes em PBS e recolocadas em suspensão a 2 x IO6 células/ml em RPMI 1640, suplementado com 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA; Roche, Basel, Suíça). Então, células foram colocadas em uma placa de fundo redondo de 96 cavidades a 1,0 x IO5 células/cavidade em um volume de 50 μl. O mesmo volume de anticorpo (maior concentração 10 μg/ml, diluído em RPMI 1640 e 1% BSA) foi adicionado às cavidades e incubado durante 15 minutos em temperatura ambiente (RT). Então 25 μl soro humano normal (NHS) foi adicionado e as células foram incubadas a 37°C durante 45 minutos. O soro inativado por calor (soro ΔΤ) é NHS que foi incubado durante 10 minutos a 56°C. Após a incubação durante 45 minutos, células foram recolocadas em suspensão e transferidas para tubos FACS (Greiner). Então, 10 μΐ iodeto de propídio (PI; Sigma- Dendrich Chemie B.V.) foram adicionados (10 μ§/πι1 solução) a esta suspensão. A Iise foi detectada por citometria de fluxo (FACScaliburTM, Becton Dickinson, San Diego, CA, USA) por medida do número de células mortas (células positivas para PI).

Como pode ser visto em Figura 7A, 7D8-IgGl mostrou uma boa lise das células daudi, enquanto ambos 7D8-IgG4 e 7D8-HG mostraram uma Iise diminuída de células Daudi.

Para avaliar o papel de soro, soro inativado por calor (soro ΔΤ) foi adicionado a células incubadas com 10 μg antistof. Figura 7B mostrou que a indução de Iise foi dependente em soro ativo no complemento, a adição de soro inactivado por calor resultou em falta de lise.

Exemplo 47

Análise SDS-PAGE não reduzido de anticorpo Betvl-HG

Após purificação, o Betvl-HG (IgG4 anti-Bet vl sem gancho) foi analisado em SDS-PAGE não redutor. O método usado Bis-Tris eletroforese é uma modificação de método Laemmli, cujas amostras foram cicladas em pH neutro. Os géis SDS-PAGE foram coloridos com Coomassie e digitalmente formados em imagem usando GeneGenius (Synoptics, Camponte, UK).

Como pode ser visto em Figura 8, Betvl-HG mostrou 1 ligação principal representando uma meia-molécula (isto é uma cadeia pesada e uma leve).

Exemplo 48

Filtração em gel de anticorpo Betvl-HG

Betvl-HG foi submetido à filtração em gel para investigar se este mutante pode eluir como uma meia molécula ou dímero intacto. Amostras (100 μl) foram aplicadas a uma coluna Superdex 200 HR 10/30 (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia), que foi conectada a um sistema HPLC (ÀKTA explorer) de Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia. A coluna foi primeiro equilibrada em PBS. Frações de 250 μl foram coletadas, em que IgG específico de Bet ν 1 foi medido usando o teste de ligação de antígeno. As amostras também foram seguidas por medida da absorção a 214 nm.

Para testar a ligação do antígeno de anticorpos específicos para Bet ν 1, a amostra de anticorpo diluído foi incubada durante a noite em temperatura ambiente com 0,75 mg Proteína-G sepharose (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) em 750 μl PBS/AT (PBS suplementado com 0,3% BSA, 0,1% Tween-20, 0,05% NaN3) junto com 50 μl Bet ν 1 125I- rotulado diluído ou Fel d 1 125I-rotulado. Bet ν 1 foi iodado pelo método de cloramina-T com veículo sem 125I (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) como descrito em Aalberse et al. (Serological aspects of IgG4 antibodies. 1983. 130:722-726). Após lavar a suspensão de Sepharose com PBS-T (PBS suplementado com 0,1% Tween-20), a radioatividade ligada foi medida. Os resultados foram expressados como a quantidade de radioatividade relativa à quantidade adicionada.

A atividade de ligação de Bet ν 1 de Betvl-HG sem gancho eluído em um pico, que foi mais retida do que o pico de eluição de Betvl- IgG4 purificado (IgG4 anti Bet ν 1) contendo um ganho intacto (Figura 9). Calibração desta coluna usando proteínas globulares mostrou que Betvl-HG eluído em frações correspondendo às proteínas com um tamanho molecular de -70 kD (dados não mostrado)s. Os dados sustentam as observações dos requerentes de que IgG4 sem gancho existe como meias-moléculas e, em contraste ao registrado, as moléculas de IgGl e IgG4 sem gancho (Silverton EW et al., Proc Natl Acad Sci USA 74, 5140 (1977); Rajan SS et al., Mol Imuno 1 20, 787 (1983); Horgan C et al., J Imuno 1 150, 5400 (1993)), não associam via interações não covalentes em moléculas tetraméricas.

Exemplo 49

Caracterização funcional de anticorpos Betvl-IgG4 e Betvl-HG

Foi previamente mostrado que, em contraste com IgG4 específico de antígeno derivado soro, anticorpos monoclonais de IgG4 produzidos in vitro são capazes de reticular os anticorpos IgGl de tipo antígeno e são assim anticorpos bivalentes (Schuurman J et al., Immunology 97, 693 (1999); Aalberse R C et al., Immunology 105, 9 (2002)). A habilidade para reticular antígeno de Betvl-IgGl, Betvl-IgG4 e Betvl-HG foi determinada por um teste radio Imuno usando Bet ν 1 ligado a Sepharose e antígeno rotulado I. Assim, Sepharose de pólen de bétula foi preparado. Brevemente, extrato de pólen de bétula (Allergon, Àngelholm, Suécia) foi acoplado Sepharose 4B ativado com CNBr- (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) de acordo com as instruções do fabricante.

Subseqüentemente, Sepharose foi recolocada em suspensão em PBS suplementado com 0,3% BSA, 0,1% Tween-20, 0,05% NaN3.

Para examinar a habilidade do anticorpo de reticular o antígeno ligado a Sepharose a antígeno rotulado com 1 25I, 50 μl de anticorpos diluídos foram incubados durante a noite em temperatura ambiente com 750 μl Sepharose em PBS/AT. A seguir, a suspensão de Sepharose foi lavada com PBS-T, após que a suspensão foi incubada durante a noite em temperatura ambiente com 50 μl de Bet vl diluído rotulado com 125I em um volume total de 750 μl PBS/AT. Finalmente, Sepharose foi lavada com PBS-T e radioatividade ligada foi medida. Os resultados foram expressados como a quantidade de radioatividade ligada relativa à quantidade de rádio-rótulo adicionado.

Como pode ser visto em Figura 10, todos os três anticorpos foram específicos de antígeno e mostraram uma boa ligação a Betvl radio-rotulado. Na Figura 11 é mostrado que Betvl-IgGl e Betvl-IgG4 são capazes de reticular Bet ν 1 ligado a Sepharose a Bet ν lradio-rotulado. Os anticorpos IgGl e IgG4 se comportam como anticorpos bivalentes. O anticorpo Betvl-HG não foi capaz de reticular o antígeno Betvl e assim demonstrou ligação monovalente.

Exemplo 50

Avaliação farmacocinética de um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho, comparado a fragmentos normais de IgGl, IgG4 e IgGl

Vinte e cinco camundongos SCID (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River) com pesos corporais entre 24 e 27 g foram usados para o experimento. Os camundongos foram alojados em uma unidade de barreira do Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Holanda) e mantidos em gaiolas de topo de filtro com água e ração providos ad libitum. Todas os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Etica Animal da Utrecht University.

Anticorpos monoclonais foram administrados intravenosamente via a veia do rabo. As amostras de sangue de 50μ1 foram coletadas da veia safena a 1 hora, 4 horas, 24 horas, 3 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após administração. Sangue foi coletado em frasquinhos contendo heparina e centrifugado durante 5 minutos a 10.000 g. Plasma foi armazenado a - 20°C para determinação de concentrações de mAb.

Neste experimento, a depuração de variante IgG4 sem gancho (7D8-HG, lote 5 70-003-EP) foi comparada com a de IgG4 humana normal (7D8-IgG4, lote 570-002-EP), uma variante de IgGl (7D8-IgGl, lote 793- 25 001-EP), fragmentos F(ab')2 (7D8-Gl-F(ab')2, lote 815-004-XX) e Fab (7D8- Gl-Fab, 815-003-X) do ultimo mAb. Cada anticorpo foi administrado a 5 camundongos, em uma dose de 0,1 mg em 200 μΐ por camundongo.

As concentrações de IgG Humana foram determinadas usando um ELISA sandwich. Clone MH19-1 anti-IgG mAb humano-kappa de camundongo (#Μ1272, CLB Sanquin, Holanda), revestido em placas ELISA de 96 cavidades de Microlon (Greiner, Alemanha) em uma concentração de 1OO ng/cavidade foi usado anticorpo de captura. Após o bloqueio, placas com PBS suplementado com 2% soro de galinha, amostras foram adicionadas, diluídas em série em tampão ELISA (PBS suplementado com 0,05% Tween 20 e 2% soro de galinha), e incubadas em um agitador de placa durante 1 h em temperatura ambiente (RT). Placas foram subseqüentemente incubadas com fragmentos F(ab')2 rotulados com peroxidase de imunoglobulina IgG anti-humana de cabra (#109-035-097, Jackson, West Grace, PA) e reveladas com ácido 2,2'-azino-bis (3-etil benztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

Camundongos SCID foram selecionados porque eles tem concentrações de IgG no plasma baixas e assim, uma depuração de IgG relativamente lenta. Isto provê um modelo de PK que é muito sensível para detector a Depuração acelerada devido à ligação diminuída de Fcy-parte para o receptor Fc neonatal (FcRn).

A análise farmacocinética foi feito por determinação da área sob a curva (AUC) das curves de concentração — tempo, com correção da cauda. A taxa de depuração no plasma foi calculada como dose / AUC (ml/dia). Os testes estatísticos foram realizados usando GraphPad PRISM vs. 4 (Graphpad Software).

Figura 12 mostra um gráfico semilogarítmico das concentrações em tempo. As concentrações no plasma iniciais foram da mesma ordem para todos os mAbs intactos, 85 - 105 ug/ml, incluindo a variante sem gancho. Estas concentrações iniciais correspondem a um volume de distribuição central de cerca de 1 ml, que é consistente com distribuição no compartimento de plasma do camundongo. Para os fragmentos F(ab')2 e Fab menores concentrações iniciais foram observadas, 75 e 4 ug/ml, respectivamente. Para os fragmentos Fab, isto é provavelmente devido a uma rápida distribuição extravascular dentro da primeira hora após a administração.

Figura 13 mostra as taxas de depuração calculadas para os camundongo individuais. A taxa de depuração da variante sem gancho foi 3 a 4 vezes maior do que a IgGl e IgG4 normais. No entanto, ela foi mais do que 10 vezes mais lenta do que a dos fragmentos F(ab')2 e mais de 200 vezes mais lenta do que a depuração de fragmentos Fab.

Exemplo 51

Avaliação farmacocinética de um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho comparado a fragmentos de IgG4 e IgGl F(ab)2 normais em camundongos imuno-competentes.

Vinte camundongos BAlb/c de 8 semanas de idade (Balb/ CAnNCrl5 Charles-River) foram usados para o experimento. Os camundongos foram alojados em uma unidade de barreira do Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Holanda) e mantidos em gaiolas de topo de filtro com água e ração providos ad libitum. Todas os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Utrecht University.

Neste experimento, a depuração de variante IgG4 sem gancho (7D8-HG, lote 570-003-EP) foi comparada com a de IgG4 humana normal (7D8-IgG4, lote 570-002-EP), fragmentos F(ab')2 de 7D8 (7D8-Gl-F(ab')2, lote 815-004-XX). Cada anticorpo foi administrado a 4 camundongos, em uma dose de 0,1 mg em 200 μl por camundongo, correspondendo a uma dose de 4 mg por kg de peso corporal.

As concentrações de IgG humana no plasma foram determinadas usando um ELISA sandwich. Clone MH19-1 anti-IgG mAb humano-kappa de camundongo (#M1272, CLB Sanquin, Holanda), revestido em placas ELISA de 96 cavidades de Microlon (Greiner, Alemanha) em uma concentração de 100 ng/cavidade foi usado como o anticorpo de captura.

Após o bloqueio, placas com PBS suplementado com 2% soro de galinha, amostras foram adicionadas, diluídas em série em tampão ELISA (PBS suplementado com 0,05% Tween 20 e 2% soro de galinha), e incubadas em um agitador de placa durante 1 h em temperatura ambiente (RT). Após a lavagem, as placas foram subseqüentemente incubadas com fragmentos F(ab')2 rotulados com peroxidase de imunoglobulina IgG anti-humana de cabra (#109-035-097, Jackson, West Grace, PA) e reveladas com ácido 2,2'- azino-bis (3-etil benztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm.

Camundongos Balb/c foram selecionados porque eles tem uma produção normal de IgG e assim uma depuração de IgG mais rápida do que os camundongos SCID. Isto provê um modelo de camundongo em que os anticorpos administrados precisam competir com o IgG de camundongo endógeno para a ligação do receptor de Fc neonatal (FcRn).

Figura 15 mostra um gráfico semilogarítmico das concentrações em tempo. As concentrações no plasma iniciais foram da mesma ordem de 100 ug/ml, que é consistente com uma distribuição inicial no compartimento de plasma do camundongo. A depuração da variante de IgG4 sem gancho foi somente levemente mais rápida do que a de IgG4 normal. Como importante, a depuração da variante sem gancho foi bem mais lenta do que a dos fragmentos F(ab')2, que tem um peso molecular comparável. Esta experiência indica que Fc-parte tem um efeito favorável sobre o tempo de residência no plasma em camundongos tendo um sistema imune normal e provê uma indicação de uma interação funcional com o receptor Fc neonatal (FcRn) também na presença de IgG endógeno.

Exemplo 52

Avaliação farmacocinética de um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho em camundongos SCID suplementados com IgG humana.

Dezesseis camundongos SCID (C.B-17/IcrCrl-scid-BR, Charles-River) com pesos corporais entre 18 e 22 g foram usados para o experimento. Os camundongos foram alojados em uma unidade de barreira do Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Holanda) e mantidos em gaiolas de topo de filtro com água e ração providos ad libitum. Todas os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Utrecht University.

Os camundongos SCID imuno deficientes foram selecionados para estudar a farmacocinética da variante de IgG4 sem gancho, porque estes camundongos não desenvolvem respostas de anticorpo a proteínas humanas que podem afetar os estudos de depuração com durações de mais do que uma semana. Estes camundongos deficientes em IgG- foram suplementados com uma dose elevada de imunoglobulina intravenosa (IgG policlonal multidoador humano) para estudar a depuração de mutante IgG4 sem gancho na presença de IgG humana em concentrações fisiologicamente relevantes. Isto provê um modelo de camundongo que melhor representa as condições em humanos, porque 1) associação de IgG4 sem gancho em uma forma bivalente é evitada pela presença de IVIG, e 2) IgG4 sem gancho precisa competir com outro IgG para ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn)1. A ligação a FcRn protege IgG de degradação intracelular após endocitose e é responsável por sua meia-vida no plasma longa.

Neste modelo a depuração no plasma foi estudada de variantes do clone 7D8 de mAb humano específico de CD20 humano. A taxa de depuração de variante de IgG4 sem gancho (7D8-HG, lote 992-001-EP) foi comparada com a de IgG4 humana normal (7D8-IgG4, lote 992-002-EP), de fragmentos F(ab')2 s de 7D8 IgGl (7D8-F(ab')2, lote 892-020-XX). Além disso, a preparação de variante sem gancho testada que foi enzimaticamente desglicosilada (TH3001-7D8-HG deglyc, lote 991-004-EP). Cada anticorpo foi administrado a 4 camundongos via a veia da cauda, em uma dose de 0,1 mg em 200 μΐ, correspondendo a uma dose de cerca de 5 mg por kg de peso corporal. Os anticorpos monoclonais foram administrados em uma mistura 1:1 com imunoglobulina intravenosa (60 mg/ml, Sanquin, Holanda, JFKl08ST, carga # 04H04H443A). O volume injetado total foi 400 μΐ/camundongo, dando uma dose de IVIGIG de 12,5 mg por camundongo.

Cinqüenta amostras de sangue de 50 μΐ foram coletadas da veia safena a 15 minutos, 5 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 7 dias, e 10 dias após administração. Sangue foi coletado em frasquinhos contendo heparina e centrifugado durante 10 minutos a 14.000 g. Plasma foi armazenando a - 20 0C para determinação das concentrações de mAb. As concentrações de plasma da variantes de 7D8 foram determinadas usando Elisa sandwich. Um anticorpo anti-7D8-idiotipo de mAb de camundongo (clone 2F2 SAB 1.1 (LD2), lote 0347-028-EP) foi usado como um anticorpo de captura. Após bloquear as placas com PBS suplementado com 0,05% Tween e 2% soro de galinha, amostras foram adicionadas, diluídas em série em tampão ELISA (PBS suplementado com 0,05% Tween 20 e 2% soro de galinha), e incubadas em um agitador de placa durante 2 h em temperatura ambiente (RT). Os anticorpos infundidos foram usados como a referência. Após lavar, as placas foram subseqüentemente incubadas com F(ab')2 específico anti-humano de cabra, rotulado com peroxidase (109-035-097, Jackson Immunoresearch, West Grace, PA) e revelados com ácido 2,2'-azino-bis (3-etil benztiazolina-6- sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm. As concentrações totais de IgG humana no plasma foram determinadas usando um ELISA similar. Clone MH16 anti-IgG humana-kappa de mAb de camundongo (#M1268, CLB Sanquin, Holanda) foi usado anticorpo de captura. A imunoglobulina humana anti-IgG de cabra rotulada com peroxidase (#109-035-098, Jackson, West Grace, PA) foi usada para a detecção.

A análise farmacocinética foi feita por determinação da área sob a curva (AUC) das curvas de concentração - tempo, com correção da cauda. A taxa de depuração no plasma foi calculada como Dose / AUC (ml/dia). O teste estatístico foi realizado usando GraphPad PRISM vs. 4 (Graphpad Software).

Figura 20 mostra no painel superior, gráficos semi- logarítmicos das concentrações de variantes de mAb 7D8 em tempo e no painel inferior as concentrações totais de IgG humana. As concentrações totais iniciais de IgG humana foram em média de 2,3 mg/ml e declinaram a 0,47 mg/ml após 10 dias. As concentrações iniciais no plasma de variantes 7D8 IgG4 e IgG4 HG estavam na faixa de 94 a 180 μg/ml, que é consistente com uma distribuição inicial no compartimento de plasma do camundongo. Para os fragmentos F(ab')2 as concentrações iniciais foram um pouco menores, em média 62 μg/ml. O painel superior torna claro que a depuração da variante sem gancho, incluindo a preparação desglicosilada, é um pouco mais rápida do que de IgG4 intacto, mas um pouco mais lenta do que o dos fragmentos F (ab')2. A tabela abaixo mostra as taxas de depuração calculadas das curvas de concentração tempo. A taxa de depuração da variante sem gancho foi 2 a 3 vezes maior do que a de IgG4 normal. No entanto, ela foi quase 10 vezes mais lenta do que a dos fragmentos F(ab')2. Como importante, a desglicosilação não teve um efeito significante sobre a taxa de depuração da

variante de IgG4 sem gancho.

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Assim, também na presença de IgG humana em concentrações fisiologicamente importantes, a Depuração da variante sem gancho é bem mais lenta do que a dos fragmentos F(ab')2, que tem um tamanho molecular comparável. O experimento demonstra que, também na presença de IgG humana competindo,as concentrações fisiologicamente relevantes, a variante de IgG4 sem gancho é capaz de interação funcional com o receptor de Fc neonatal(FcRn). Além disso, este experimento indica que a glicosilação da variante de IgG4 sem gancho IgG4 não afeta a depuração no plasma e que IgG4 sem gancho não

Glicosilado tem uma meia-vida similar in vivo como a forma totalmente glicosilada.

Exemplo 53

Avaliação farmacocinética de um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho comparado a fragmentos de FCab)? normais de IgG4 e IgGl em camundongos FcRn -/-.

Este experimento foi realizado para investigar se o mutante de IgG4 sem gancho é capaz de interagir com o receptor de Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela meia-vida longa no plasma de IgG por proteção de IgG da degradação intracelular após endocitose. Os camundongos de nocaute B2M foram usados neste experimento porque eles não expressam FcRn.

Doze camundongos fêmeas de nocaute C57B1/6 B2M (Taconic modelo B2MN12-M, referidos como camundongos FcRn-/-), e doze camundongos fêmeas de controle de tipo selvagem 57B1/6 (Taconic, modelo nr. Β6, referidos como camundongos WT) foram usados para o experimento. Os camundongos foram alojados em uma unidade de barreira do Central Laboratory Animal Facility (Utrecht, Holanda) e mantidos em gaiolas de topo de filtro com água e ração providos ad libitum. Todas os experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Utrecht University.

A depuração no plasma foi estudada de variantes de clone 7D8 de mAb humano específico de CD20 humano. A taxa de depuração de variante de IgG4 sem gancho (7D8-HG, lote 992-001-EP) foi comparada com que a de IgG4 humana normal (7D8-IgG4, lote 992-002-EP), fragmentos F(ab')2 de 7D8-IgGl (7D8-Gl-F(ab')2, lote 892-020-XX).

Os anticorpos monoclonais foram administrados intravenosamente via a veia da cauda. Cada anticorpo foi administrado a 4 camundongos em uma dose de 0, 1 mg em 200 μl por camundongo, correspondendo a uma dose de 5 mg por kg de peso corporal. 50 μl de amostras de sangue foram coletados da veia da safena a 10 minutos, 5 horas, 24 horas, 2 dias, 3 dias, 7 dias, e 10 dias após administração. Sangue foi coletado em frascos contendo heparina e centrifugado durante 10 minutos a 14,000 g. Plasma foi armazenado a -20°C para determinação de concentrações de mAb. As concentrações no plasma de IgG Humana foram determinadas usando um ELISA sandwich em que clone MHl 9-1 anti-IgG humana-kappa de mAb de camundongo (#M1272, CLB Sanquin, Holanda), foi revestido em placas ELISA Microlon de 96 cavidades (Greiner, Alemanha) a 100 ng/cavidade foi usado como um anticorpo de captura. Após bloquear as placas com tampão ELISA (PBS suplementado com 0,05% Tween e 2% soro de galinha), amostras foram adicionadas, diluídas em série em tampão ELISA. Diluição em séries das preparações de anticorpo infundido correspondentes foi usado como uma referência. Após a incubação e lavagem, as placas foram incubadas com IgG anti-humano de cabra, AffiniPure, rotulado com peroxidase, fragmento F(ab')2 específico (#109- 035-097, Jackson Immunoresearch, West Graee, PA) e revelados com ácido 2,2'-azino-bis (3-etil benztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a 405 nm. A análise farmacocinética foi feita por determinação da área sob a curva (AUC) das curvas de concentração - tempo, com correção da causa. A taxa de depuração no plasma foi calculada como Dose / AUC (ml/dia). A análise estatística foi realizada usando GraphPad PRISM vs. 4 (Graphpad Software).

Figura 21 mostra um gráfico semi-logarítmico das concentrações em tempo. As concentrações no plasma iniciais foram todas da ordem de 100 μg/ml, que é consistente com uma distribuição inicial no compartimento de plasma dos camundongos. A tabela abaixo mostra a depuração nas taxas de plasma calculadas a partir das curvas de concentração- tempo dos camundongos individuais.

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Para os fragmentos F(ab')2 s não foram observadas significantes diferenças entre os camundongo de tipo selvagem (WT) e nocaute. (FcRn-/-). Em contraste, para IgG4 e a variante IgG4 sem gancho, as taxas de depuração foram 3 a 5 vezes mais lentas nos camundongos WT comparadas às de camundongos FcRn -/-. Este experimento mostra que a presença de FcRn tem um efeito favorável sobre o tempo de residência no plasma de IgG4sem gancho. Assim, provê evidencia de que IgG4 sem gancho é capaz de ter uma interação funcional com FcRn in vivo, o que explica sua meia-vida no plasma favorável.

Exemplo 54

Análise funcional de mAb anti-EGFr 2F8-HG MAb 2F8 é um anticorpo monoclonal de IgGl humana (mAb) contra receptor de fator de crescimento epidérmico humano (EGFr) que é capaz de inibir a sinalização de EGFr por bloqueio da ligação de ligandos. A partir deste mAb, uma variante de IgG4, 2F8-IgG4, foi feita e também uma variante sem gancho, 2F8-HG.

No presente exemplo, os requerentes compararam a potência de 2F8-HG com a de fragmentos 2F8-IgGl e 2F8-Fab para inibir a fosforilação de EGFr induzida por ligando em células in vitro. Este foi feito tanto com como sem imunoglobulina intravenosa (IVIG), uma preparação policlonal humana de IgG, contendo todas as subclasses de IgG.

A inibição da fosforilação de EGFr foi medida em um teste em duas etapas usando as linhagens de células epidermóides, A431 (ATCC, American Type Cultura Collection, Manassas, USA). As células foram cultivadas durante a noite em placas de 96-cavidades em meio isento de soro, contendo 0,5% albumina humana (albumina humana a 20%,Sanquin, Holanda). A seguir, mAb foi adicionado em diluição em série, com ou sem IVIG (Imunoglobulina I.V., Sanquin) em uma concentração fixa final de ou 100 ou 1000 μg/ml. Após 60 minutos de incubação a 37° C, 50 ng/ml EGF humano recombinante (Biosource) foram adicionados para induzir a ativação de EGFr não bloqueado. Após um adicional de 30 minutos de incubação, células foram solubilizadas com tampão de Iise (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), e os lisados foram transferidos para placas ELISA revestidas com 1 μg/ml de anticorpos anti-EGF-R de camundongo (mAb EGFRl, BD Pharmingen, San Diego, CA). Após 2 horas de incubação a RT, as placas foram lavadas e a ligação de EGF-R fosforilado foi detectada usando um mAb de camundongo rotulado com európio, específico para tirosinas fosforiladas (mAb Eu-Nl P-Tir-100, PerkinElmer). Finalmente, a solução de melhora DELFIA foi adicionada, e a fluorescência resolvida no tempo foi medida por excitação a 315 nm e medida da emissão a 615 nm em uma leitora de placa EnVision (PerkinElmer). Curvas sigmoidais dose-resposta foram calculadas usando regressão não linear (GraphPad Prism 4).

Como pode ser visto em painel superior da figura 14, 2F8-HG foi igualmente efetivo como 2F8-IgGl em inibição de fosforilação quando meio de cultura foi usados sem IVIG. Ambos mAbs foram mais potentes do que os fragmentos 2F8-Fab, que ligam monovalentemente a EgFr. Os painéis do meio e inferior da figura 14 mostram que a adição de IVIG tem um efeito negligenciável sobre 2F8-IgG4 e 2F8- Fab. No entanto, ele marcadamente deslocou à direita a curva de dose-resposta de 2F8-HG, indicando uma mudança nas características de ligação, o que é consistente com a idéia de que, sob algumas condições, 2F8-HG pode se comportar como um anticorpo bivalente, mas dissocia em uma forma monovalente na presença de IgG humano policlonal.

Exemplo 55

Prova de princípio: IgG4 sem gancho contra CD89 (CD89-HG) inibe a asma mediada por IgE em um modelo de camundongo

Pasquier et al. (Pasquier, B et al., Immunity 22, 31 (2005)) mostraram que FcaRI (CD89 (Monteiro RC et al., Annu Rev Imuno 1 2J_, 177 (2003)) tem um papel tanto anti- como proinflamatório. Agregação de FcaRI leva à ativação de células por recrutamento de Syk e abortando a ligação de SHP-1. Uma interação monomérica com FcaRI inibe a resposta de ativação :SHP-1 está sendo recrutado e ocorre um prejuízo da fosforilação de Syk, LAT e ERK.

Os fragmentos Fab de um anticorpo anti-CD89 (clone A77) podem inibir a fagocitose mediada por IgG usando monócitos humanos. Além disso, as respostas medidas por IgE in vitro usando células RBL-2H3 transfectadas com FcaRI e in vivo em um modelo de asma mediado por IgE foram inibidas por fragmentos Fab deste anticorpo anti-CD89. neste modelo de animal, camundongos transgênicos FcaRI (Launay P et al., J Exp Med 191, 1999 (2000)) foram sensibilizados com TNP-OVA. Os camundongos desafiados intranasalmente com complexos imunes IgE-TNP-OVA na presença de fragmentos A77 Fab- mostraram uma reatividade reduzida bronquial para metacolina enquanto que o fragmento Fab irrelevante pode reduzir a hiper reatividade bronquial.

A prova em princípio in vitro de um anticorpo não ativante, monovalente, não de reticulação, específico de antígeno, é obtida no seguinte experimento. PBMC aderentes são incubados com 10 μg/ml A77-HG (IgG4 sem gancho) pre-incubados 24 h com ou sem IgG4 irrelevante (Genmab BV) ou incubados com anticorpo HG irrelevante durante 3 0 min a 37°C, lavados, e incubados a 37°C durante 30 min com E. coli conjugado a vermelhoTexas (50 bactérias/célula) (Molecular Probes, Eugene, OR) opsonizado ou não com policlonal anticorpos IgG anti-E. coli de coelho, de acordo com as instruções dos fabricantes. Lâminas são montadas e examinadas com um microscópio confocal a laser. O PBMC recebendo E. coli opsonizado e A77-HG (pre- incubados com IgG4 irrelevante) mostram fagocitose reduzida de E. coli quando comparados a PMBC recebendo E. coli opsonizado e anticorpo de controle HG.

Os camundongos transgênicos FcaRI são sensibilizados com TNP-OVA como descrito (Pasquier B et al., Immunity 22, 31 (2005)); ou alternativamente com OVA como descrito por Deurloo et al. (Deurloo D T et al., Clin Exp Allergy 33, 1297 (2003)). Os camundongos transgênicos com FcaRI humano e controles de ninhadas são imunizados duas vezes no dia 0 e dia 7 intraperitonealmente com TNP-OVA ou OVA (Sigma) em hidróxido de alumínio. Os camundongos são desafiados intranasalmente por alguns dias consecutivos com ou TNP-OVA complexado com 20 μg anti-DNP-IgE (Zuberi, R I et al., J Imuno 1164, 2667 (2000)) ou aerossol OVA (Deurloo D T et al., Clin Exp Allergy 33, 1297 (2003)) na presença de A77-HG (IgG4 sem ganho) ou um anticorpo sem gancho irrelevante (HG de controle).

Os camundongos recebem 50 μg A77-HG ou HG de controle intraperitonealmente duas vezes, uma vez durante o período de desafio e uma vez com o último desafio intranasal. Doze horas após o desafio intranasal final, os camundongos são colocados em uma câmara tipo plethysmograph de corpo completo (BUXCO Electronics, Sharon CT5 USA), e 300 mM metacolina liberados. A resistência das vias aéreas é medida após exposição a metacolina A avaliação imunohistológica é realizada em seções do pulmão após eutanásia dos camundongos.

Os camundongos recebendo A77-HG mostram uma hiper- reatividade reduzida quando comparados aos e camundongos recebendo o anticorpo HG de controle.

Isto indica que uma molécula de IgG4 sem gancho, é não reticulante, monovalente e não ativante e, assim, utilizável para fins terapêuticos onde este anticorpo inerte pode ser favorável como na inibição de reações inflamatórias através de FcaRL Exemplo 56

Prova do estudo de conceito com IgG4 cMet (cMet-HG) sem gancho

O receptor tirosina quinase c-Met é proeminentemente expressado em uma ampla variedade de células epiteliais. Durante a embriogênese, fator de crescimento / fator de dispersão de cMet e hepatóticos (HGF/SF) estão envolvidos em diferenciação específica de tecido, levando a uma organização apropriada de células epiteliais, endotélio muscular, e os sistemas nervosos e hematopoiéticos. A sinalização anormal de cMet foi implicada em tumorogênese, particularmente em desenvolvimento de tumores invasivos e metastáticos. Como uma conseqüência de atividade de cMet melhorada, células de tumor podem aumentar sua taxa de crescimento e se tornarem resistantes a apoptose, resultando em uma vantagem de crescimento e/ou sobrevivência. Além disso, a ativação de cMet pode levar a uma reorganização citoesqueletal e ativação de integrina, assim como à ativação de sistemas proteolíticos envolvidos em degradação de matriz extracelular, resultando em uma capacidade invasiva e metastática aumentada. A inibição da sinalização de HGF/SF-cMet, assim, representa um caminho terapêutico importante o tratamento de tumores malignos.

Kong-Beltran et ai. em Câncer Cell (2004 volume 6, pags. 75- 84) criaram um anticorpo (5D5) para o domínio extracelular de cMet e inibiram a ligação de HGF. O fragmento Fab de anti-Met 5D5 foi mostrado como inibindo a fosforilação de cMet dirigida por HGF, motilidade das células, migração e crescimento do tumor. Estes especularam que anti-cMet- 5D5-Fab bloqueia a dimerização de receptor por impedimento estereo- químico.

MAb C6 é um anticorpo monoclonal de IgGl humana (mAb) contra cMet human que é capaz de ligar com alta afinidade para células H441, ativar a fosforilação de cMet, induzir a dispersão de DU-145 e bloquear a ligação de HGF para cMet em ELISA. A partir deste mAb, um fragmento Fab (cMet-Fab), uma variante de IgG4 (cMet-IgG4), e também uma variante sem gancho foram feitas (cMet-HG).

Em um estudo de prova de conceito, um IgG4 sem gancho contra cMet (cMet-HG) este anticorpo monovalente inibiu a ligação de HGF, dimerização/ativação de receptor, dispersão das célula, e sinalização a jusante.

Este experimento foi realizado tanto como sem a adição de imunoglobulina intravenosa (IVIG), uma preparação de IgG humana policlonal, contendo todas as subclasses de IgG e com e sem rHGF.

Teste de dispersão de DJJ-145

As células DU-145 ( linhagem de células de carcinoma de próstata, ATCC HTB-81) foram cultivadas em DMEM+ (contendo 500 ml MEM Dulbecco (DMEM-Meio, glucose 4,5 g/ml com NaHC03, sem glutamina, Sigma, D-6546), 50 ml soro de bezerro Cosmic (Hyclone SH30087.03), 5 ml de 200mM/L L-glutamina (Bio Whittatker, BE17-605F), 5 ml piruvato de sódio (Bio Whittaker BE13-115E), 5 ml penicilina/estreptamicina (Bio Whittaker, DE17-603E)) e eram células agrupadas aderentes em crescimento. Quando da adição de rhHGF (Sigma, H- 1404), migração das células foi induzida, que leva a células singularizadas. Este processo foi chamado de dispersão. Indução ou inibição de dispersão foi observada por microscopia.

Dia 1: cMet, cMet-HG, cMet-Fab, cMet-IgG4 (30 / 3,0 / 0,3 / 0,03 μg/ml), foram incubados durante a noite com e sem adição de IVIG, 6 mg/ml. Células DU145 foram semeadas (células aderentes fora do frasco de cultura de T75-) o sobrenadante de cultura de células foi removido e células foram lavadas 1 vez com 10 ml PBS 2 ml Tripsina/EDTA foi adicionado (37°C) e células foram incubadas a 37°C durante 1-2 min. As células foram removidas da superfície do frasco de cultura por batidas, e a reação de Tripsina/EDTA foi parada com o sobrenadante de cultura armazenados. As células foram contadas e a suspensão foi preparada de 1 * 104 células/ml em meio de cultura novo e 50 μΐ/cavidade foram colocados em placas de 96 cavidades (placa de fundo plano estéril, Costar, 3596) (densidade final 1000 células/cavidade ). Células foram cultivadas durante 15-24 h a 37°C e 5% CO2 em um incubador.

Dia 2: Meio foi substituído por meio novo, 40 μΐ/cavidade. 40 ul de anticorpos preincubados foram adicionados às células e as células foram incubadas a 37°C em incubador durante 60 min, após o que 40 μΐ/cavidade de meio ou 60 ng/ml rh-HGF foram adicionados. (As concentrações finais foram : 10 / 1,0 / 0,1 / 0,01 μg/ml Ab, 2 mg/ml IVIG, 20 ng/ml HGF). Células foram incubados durante pelo menos 24 h.

Dia 3 e 4: A dispersão foi observada por teste duplo -cego por microscópio após 24 h ou após 48 h. As características morfológicas de dispersão: as células destacam da superfície, mostram formas conformadas em pino (migram) e a maior parte foram de células únicas não em agrupamentos. A faixa de inibição de dispersão induzida por rh-HGF por anticorpos:

3 células tiveram uma dispersão máxima

2 inibição pequena da dispersão

1 inibição da dispersão

0 sem dispersão

Neste experimento C6-HG pre-incubado com IVIG significantemente bloqueou a dispersão induzida por HGF. Fosforilação de receptor cMet

Células A549 foram cultivadas em meio de Ham F12 e cMet não foi fosforilado sob condições de cultura normais. Quando da ativação por HGF, o receptor cMet se torna fosforilado, por aplicação de cMet bloqueando cMet-Fab ou cMet-HG com pre-incubação de IVIG. A fosforilação mediada por HGF do receptor foi inibida.

Dia 1: cMet-IgGl, cMet-HG (12,5 μ^πύ), foram incubados durante a noite com e sem IVIG, 2,5 mg/ml. células A549 (1*106 /cavidade ) foram cultivadas em uma placa de 6 cavidades.

Dia 2: O meio de cultura, (contendo 500 ml Ham's F12 (Bio Whittaker BE12-615F 50 ml soro de bezerro Cosmic (Hyclone SH30087.03), 5 ml de 200mM/L L-glutamina (Bio Whittatker, BE17-605F), 5 ml penicilina/estreptamicina (Bio Whittaker, DE17-603E)) foi removido e 800 μΐ de anticorpos preincubados foram adicionados às células e células foram incubadas com o mesmo a 370C em uma incubadora durante 15 min, após o que 200 μΐ/cavidade de meio ou 80 ng/ml rh-HGF foram adicionados, (concentrações finais foram 10 μg/ml Ab, 2 mg/ml IVIG, 16 ng/ml HGF).

Após incubação por mais 15 min, o meio de incubação foi removido e as células foram lavadas duas vezes com PBS resfriado em gelo, e 250 μΐ de tampão de Iise RIPA (contendo 50 mM Tris, pH 7,5, 0,5% Na deoxicolato e 0,1% Nonidet P40, 150mM NaCl, 0,1% SDS, 2 mM vanadato e Complete (inibidor de protease, Roche 1836170) foi adicionado, e a placa foi suavemente girada durante 10 min. a 4°C. Os lisados foram transferidos em tubos pré-resfriados (Eppendorf) e centrifugados em uma maior velocidade durante 30 min. a 4°C. DNA foi removido e o lisado foi congelado de modo instantâneo em N2 após o que uma fração foi usada para medir a análise do teor de proteína BCA (Pierce). Lisados foram armazenados a -80°C até análise por Western-blot. Amostras reduzidas de 10 μg sofreram eletroforese em 4-20% gel Tris-HCl Criterion Precast (Biorad 345-0033) e Western blotting em uma membrana nitrocelulose (Biorad 162-0114) de acordo com procedimentos padrões. A membrana foi bloqueada com solução de bloqueio (contendo 5% BSA (Roche, 10735086) em TBST (Tris-HCL 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% Tween 20) durante 1,5 horas em temperatura ambiente em um banco giratório. A membrana foi incubada durante a noite a 4°C com diluição 1:1000 de anti-fosfo-Met(pYpYpY 1230 1234 1235)- IgG de coelho, (Abcam, ab5662). Após lavar 6 vezes com TBST, os anticorpos secundários, cabra-anti-coelho-HRP, Cell Signalling, 7074 (1:2000) em reagente de bloqueio foram incubados durante 60 min, em temperatura ambiente em uma banca giratória. A membrana foi lavada 6 vezes com TBST. Finalmente as bandas foram reveladas com Luminol Echancer stopsolution (Pierce 1856145) e analisadas em um dispositivo Lumiimager. cMet-HG pre-incubado com IVIG inibe a fosforilação mediada por HGF do receptor.

Figura 22

Células DU-145 foram cultivadas e incubadas com uma diluição em série de (A) cMet-Fab, cMet-Fab e IVIG, cMet -Fab e HGF, cMet -Fab e IVIG e HGF (B) cMet -HG, cMet -HG e IVIG, cMet -HG e HGF, cMet -HG e IVIG e HGF. A dispersão foi observada em teste duplo-cego (classificado por 14 pessoas) por microscópio após 48 h e o escore médio ± SEM é traçado em gráfico.

cMet -Fab com ou sem IVIG (A) e cMet -HG pre-incubados com IVIG (B) significantemente bloquearam a dose de dispersão induzida por HGF de modo dependente. Figura 23

Células DU-145 foram cultivadas e incubadas com 10 μ§/ηι1 de (A) cMet -Fab, cMet -Fab e IVIG, cMet -Fab e HGF5 cMet -Fab e IVIG e HGF (B) cMet -HG5 cMet -HG e IVIG, cMet -HG e HGF, cMet -HG e IVIG e HGF. A dispersão foi observada em teste duplo-cego (classificado por 14 pessoas) por microscópio após 48 horas. cMet -Fab com ou sem IVIG e cMet -HG pre-incubados com IVIG significantemente inibiram a dispersão induzida por HGF. Para análise estatística, um teste de classificação designada Wilcoxon de duas caudas foi feito com um valor mediano hipotético de 3 (dispersão máxima) Figura 24

Extratos preparados de células A549 incubadas com cMet -HG (trilha 1), cMet -HG e IVIG (trilha 2), cMet -HG e HGF (trilha 3), cMet -HG, IVIG e HGF (trilha 4), cMet-IgGl (trilha 5), cMet-IgGl e IVIG (trilha 6) foram resolvidos por SDS-PAGE em um gel pré-moldado 4-20% Tris-HCl Criterion e Western blotting em uma membrana nitrocelulose. A membrana foi incubada durante a noite a 4°C com anti-fosfo-Met(pYpYpY 1230 1234 1235)- IgG de coelho (Abcam, ab5662). Após lavar com TBST, os anticorpos secundários, HRP -anti-coelho de cabra, Cell Signalling, 7074 em reagente de bloqueio foram incubados durante 60 min, em temperatura ambiente em um banco giratório. A membrana foi lavada 6 vezes com TBST. Finalmente, as bandas foram reveladas com solução de parada Luminol Echancer e analisadas em um Lumiimager. O Western blot mostra a banda de 169 Kd indicando fosfo-Met(pYpYpY 1230 1234 1235).

Exemplo 57

Avaliação In vitro de um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho marcando o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFr): Avidez de ligação e indução de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC)

Neste experimento um anticorpo mutante de IgG4 sem gancho marcando o receptor de fator de crescimento epidérmico (EGFr)5 mAb 2F8- HG foi comparado a uma versão de IgG4, uma versão de IgGl e fragmentos Fab, referidos como 2F8-IgG4, 2F8-IgGl e 2F8-Fab, respectivamente. A avaliação in vitro compreendia a avidez de ligação a EGFr em ELISA e a indução de ADCC.

ELISA. As afinidades de ligação foram determinadas usando um ELISA em que EGF-R purificado (Sigma, St Louis, MO) foi revestido em placas Elisa Microlon de 96 cavidades (Greiner, Alemanha), 50 ng/cavidade. Placas foram bloqueadas com PBS suplementado com 0,05% Tween 20 e 2% soro de galinha. Subseqüentemente, amostras, diluídos em série em um tampão contendo 100 μg/ml IgG humana policlonal (Imunoglobulina intravenosa, IVIG, Sanquin Holanda) foram adicionados e incubados durante 1 h em temperatura ambiente (RT). Placas foram subseqüentemente incubadas com cadeia leve anti-humana kappa de coelho conjugada a peroxidase (DAKO, Glostrup, Dinamarca) como anticorpo de detecção e reveladas com ácido 2,2'-azino-bis (3-etil benztiazolina-6-sulfônico) (ABTS; Roche, Mannheim, Alemanha). Absorbância foi medida em uma leitora de microplaca (Biotek, Winooski, VT) a c405 nm.

Figura 16 mostra que as curvas de ligação de 2F8-HG e 2F8- Fab são superpostas e claramente deslocadas à direita com relação às curvas de ligação de IgGl e IgG4. Este diferença na avidez para o revestimento de EGFr é consistente com a idéia de que, na presença de IVIG, 2F8-HG liga monovalentemente, do mesmo modo que os fragmentos Fab.

Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). A capacidade para induzir a Iise dependente de célula de efetuador foi avaliada em teste de liberação de cromo 51 (51Cr). As células A431 alvo (2-5x106 células) foram rotuladas com 100 μΏ Na251CrC^ (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia) sob condições de agitação a 37°C durante 1 h. As células foram lavadas três vezes com PBS e foram re-colocadas em suspensão em meio de cultura IxlO5 células/ml. As células rotuladas foram distribuídas em placas de 96 cavidades (5x10^3, em 50 μl/cavidade ) e pre- incubadas (RT, 30 minutos) com 50 μl de diluição em série de 10 vezes de mAb em meio de cultura, na faixa de 20 μg/ml a 0,02 ng/ml (concentrações finais). O meio de cultura foi adicionado em vez de anticorpo para determinar a liberação espontânea de 51Cr release, tritonXIOO (1% concentração final) foi adicionado para determinar a liberação máxima de 51Cr. A seguir, PBMC foi adicionado às cavidades (5xl05/cavidade ) e células foram incubadas a 37°C durante a noite. No próximo dia, sobrenadantes foram coletados para medida da liberação de 51Cr por determinação das contagens por minuto (cpm) em um contador gama. A porcentagem de citotoxicidade celular foi calculada usando a seguinte fórmula:

% lise específica = (liberação experimental (cpm) - liberação espontânea (cpm))/(liberação máxima (cpm) - liberação espontânea (cpm)) χ 100

onde liberação máxima 51Cr determinada por adição de triton X-100 a células alvo e a liberação espontânea foi medida na ausência de anticorpos sensibilizantes e células efetuadoras.

Figura 17 mostra que 2F8-HG não induz ADCC, como 2F8- IgG4, enquanto 2F8-IgGl é muito potente neste aspecto.

Exemplo 58

Plataforma AlgoNomics' Epibase® foi aplicada a anticorpo mono valente de IgG4 constante sem gancho. Em resumo, a plataforma analisa as especificidades de ligação de HLA de todos os possíveis peptídeos de 10 meros derivados de uma seqüência alvo (Desmet et al. 1992, 1997, 2002, 2005). O perfil é feito no nível de alotipo para receptores de classe II, 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 14 DQ e 7 DP, isto é 48 HLA em total. Epibase® calcula uma estimativa quantitativa de energia livre de ligação de AGliga da peptídeo para cada um dos receptores de classe II 48 HLA. Estes dados são então ainda processados como a seguir: peptídeos são classificados como ligadores fortes (S), médios (M), fracos e não ligadores (N).

Nenhum epítopo de ligação forte e somente 1 médio foram encontrados dentro da região constante de anticorpo monovalente IgG4 sem gancho. Este neo- epítopo único criou um ligante médio DRB 1*0407. DRB 1*0407 é um alotipo menor, presente em menos de 2% da população caucasiana. Além disso, um epítopo único de resistência média é insignificante na contagem de epítopo total de mesmo o anticorpo menos imunogênico.

Em conclusão, o anticorpo monovalente de IgG4 sem gancho é previsto como sendo muito improvável de ser imunogênico.

Exemplo 59

Antecedentes do estudo e materiais usados em exemplos 59 e 60 apresentados por Unibody- CD4

As experiências in vitro e in vivo foram realizadas para se dirigir à capacidade de um anticorpo monoclonal humano contra CD4 ( HuMax-CD4) para inibir a infecção por HIV-1. O anticorpo é dirigido contra domínio 1 de CD4 e se sobrepõe com o sítio de ligação de HTV-I gpl20 em CD4.

O presente exemplo (59) mostra que fragmentos Fab de anticorpos anti-CD4 inibem a infecção de células CD4-CCR5 ou células CD4-CXCR4 por isolados primários diferentes e vírus de HIV adaptados na linhagem de células T. Os valores de IC50 de inibição estão na faixa dos valores de EC50 de HuMax-CD4 ligando a sCD4 e ligado a célula CD4 (dados não mostrados), implicando na inibição de ligação de envelope de HIV-I a CD4 como um mecanismo de inibição. Geralmente, os fragmentos Fab de HuMax-CD4 inibem com uma eficiência 10 vezes menor do que o anticorpo completo o que é como esperado da diferença em avidez entre o anticorpo completo.

Exemplo 60 mostra que em camundongos tratados com HuMax-CD4 um menor declínio na relação de CD4/CD8 comparada é observada do que em grupos de tratamento de controle de IgG, indicando que HuMax-CD4 protege contra depleção de células positivas para CD4 por HIV- 1. Além disso, o tratamento com HuMax-CD4 leva a uma diminuição na quantidade de cópias de RNA de HIV-I no sangue como tempo, enquanto o tratamento de controle com IgG não induz esta diminuição. Os dados in vitro indicam que anticorpos anti-CD4 podem proteger contra depleção de CD4 induzida por HIV-I e diminuir a grande da infecção por HIV e a carga viral.

Norris et al publicaram sobre o tratamento de indivíduos infectados com HIV -1 com um anticorpo anti-CD4 completo (domínio 2) da subclasse de IgG4.

• Os resultados de eficácia demonstraram uma atividade antiviral significante em um ponto final primário (semana 24).

• A resposta durável sugerida pelos resultados de semana 48 em pacientes recebendo TNX-355.

TNX-355 10 mg/kg + OBR demonstraram uma redução de

0,96 IoglO em HIV-RNA a partir da linha de base em semana 48 versus uma diminuição de 0,14 IoglO para placebo + OBR (p<0,001).

• TNX-355 15 mg/kg + OBR demonstraram uma redução de 0,71 IoglO em HIV-RNA da linha de base em semana 48 versus 0,14 IoglO para placebo + OBR (p=0,009).

• Tratamento com TNX-355 + OBR foi associado com aumentos estatisticamente significante e clinicamente significativos em células CD4+ na semana 48 em tanto o braços de 10 mg/kg (+ 48 células, p= 0,031) e 15 mg/kg (+51 células, p=0,016) versus o aumento do placebo (+1 célula).

Literatura

Zwick M.B., Wang M., Poignard P., Stiegler G., Katinger H., Burton D.R., e Parren P.W.H.I. 2001. Neutralization synergy of humum imunodeficiency virus type 1 primary isolates for cocktails of broadly neutralizing antibodies. J Vir 75:12198.

Poignard P., Sabbe R., Picchio G.R., Wang M., Gulizia R.J., Katinger H., Parren P.W.H.I., Mosier D.E., e Burton D.R. 1999. Neutralizing antibodies have limitated effects on the control of established HTV-1 infection in vivo. Immunity 10:431.

Norris D., Moralis J., Gathe J., Godafsky E., Gareias F., Hardwiek R., e Lewis S. 2006. Phase 2 efficacy and safety of the novel viral- entry inhibitor, TNX-355, in combination with optimized background regimen (OBR). XVI International AIDS Conference, Toronto, Canada.

Neutralização de HIV-I In vitro por anticorpo completo HuMax-CD4 e fragmentos Fab do anticorpo HuMax-CD4

O método é descrito em detalhes em Zwick et al 2001. em resumo o grau da neutralização viral por anticorpo foi medido por atividade luciferase. os vírus competentes para um ciclo único de replicação foram produzidos por cotransfecção das construções de vírus apropriadas em um vetor modificado psviiienv (por exemplo isolados primários: JR-CSF, JR-FL, SF162, ADA5 YU2, 89.6, US143 e vírus adaptado da linhagens de células T: IIIB) E PNL4-3.lec.R-E-. Os vírus foram pre-incubados com várias quantidades de anticorpo (antes da adição determinada para dar uma contagem de cerca de 100 000) para células U87.CD4.CCR5 (isolados primários ) ou células CD4-CXCR4 (para IIIB), e cultivados durante 3 dias. as cavidades foram lavadas, incubadas com reagente de Iise de cultura de células luciferase, e lisados foram transferidos para placa de teste opaca para medir a atividade de luciferase em um luminômetro usando reagente de teste luciferase. para neutralização HuMax-CD4 e fragmentos Fab de HuMax-cd4 foram testados.

De acordo com o método descrito, as construções de vírus YU2, IIIB, ADA5 89.6, US143, JR-FL, JR-CSF, e SF 162 foram usadas no teste de neutralização in vitro usando o sistema de expressão de teste luciferase. HIV-I IIIB é uma linhagem de células T adaptada, todos os outros vírus são isolados primários de HTV-1. O anticorpo HuMax-CD4 e fragmentos Fab de HuMax-CD4 foram adicionadas em uma resposta de diluição de 1:2 partindo nas concentrações indicadas em Figura 25. Na Figura 27, as curvas configuradas por uma análise logística de 4 parâmetros são dadas para HuMax-CD4 e os fragmentos Fab de HuMax-CD4 e em Figura 25, o IC50 calculado a partir destas configurações é indicado. Os dados mostram que o anticorpo HuMax-CD4 inibiu a infecção de todos os vírus testados, e em geral fez isto com uma eficiência 10 vezes maior do que os fragmentos Fab (exceções são YU2 e JR-CSF). O EC50 para ligação de HuMax-CD4 a sCD4 foi determinado como sendo de cerca de 0,3-1 nM. Os valores de IC50 de inibição estão na faixa destes valores de EC50, indicando que a ocupação do receptor por HuMax-CD4 refere-se ao grau de inibição de infecção.

As experiências dos requerentes fornecem uma prova de princípio para uma inibição efetiva de infecção por HIV-I de ambas as células expressando co-receptor de HIV-I CXCR4 e CCR5 HTV-I por ligação monovalente de um anticorpo anti-CD4, (isto é fragmento Fab). Isto prove evidência de que uma inibição similar pode ser obtida por um anticorpo anti- CD4 de HG.

Exemplo 60

Proteção de depleção de células T CD4+ em modelo de camundongo hu- PBMC-SCID in vivo de infecção de HIV

O procedimento experimental é descrito em detalhes em Poignard et al 1999. Em resumo, camundongos SCID CB-17 foram reconstituídos com cerca de 25x106 PBMC humano normal (células mononucleares de sangue periférico). Cerca duas semanas depois, os animais foram infectados com HTV-I (HIV-1jr_csf)· Três dias depois, os animais são tratados com 1 mg/ml HuMax-CD4, ou um anticorpo de controle de isotipo de IgG humana, ou nenhum tratamento foi dado intraperitonealmente. As amostras de sangue foram tomadas em lhora, 6 horas, dia 1, 2, 3, 6, 9, 13, e 15 após injeção, e duas semanas depois os animais foram submetidos a eutanásia e a análise FACS realizada para determinar a% de células humanas (usando H2Kd-PE e CD3-APC humano) e a relação CD4/CD8 (usando coloração dupla CD4-PE e CD8-APC). Além disso, a carga viral no plasma foi medida por medida dos níveis de RNA em HIV-I pelo teste quantitativo Roche RT PCR. Além disso, com um ELISA de ligação direta de sCD4 (revestimento de sCD4 sobre a placa e detecção por anticorpo policlonal anti- Fc) as concentrações de HuMax-CD4 em plasma foram determinadas.

Na Figura 28, os níveis de plasma dos animais são dados.

Conclui-se que a injeção de HuMax-CD4 leva a concentrações elevadas no plasma de HuMax-CD4 que ainda estavam acima de 100 μg/ml no dia 15. Os camundongos não tratado não deram valores mensuráveis acima dos antecedentes.

Na Figura 26, os números de células coletadas dos camundongos no final da experiência são dados. Os dados indicam que a infecção por HIV-I levou a uma diminuição extensiva em células T positivas para CD4 como indicado pela queda na relação CD4/ CD8. Isto mostra que as células T positivas para CD4 são rapidamente depletadas do sangue por HIV- 1 em contraste com os níveis constantes em camundongos não infectados. Os camundongos tratados ip com HuMax-CD4 tinha um declínio bem menor em relação CD4/CD8, o que mostra que HuMax-CD4 provê proteção contra depleção de células positivas para CD4 por HIV-1. Na figura 29, as cópias de RNA de HIV-I por ml de sangue foram dadas em tempo, e estes dados indicam que o tratamento com HuMax- CD4 levou a uma diminuição na quantidade de copias de RNA de HIV-I no sangue com tempo, enquanto o anticorpo de controle de isotipo não levou a uma diminuição.

A experiência dos requerentes provê uma prova de princípio para a proteção contra depleção de células CD4 em infecção por HIV-I in vivo. A proteção contra depleção é observada mesmo se o anticorpo anti-CD4 completo tiver propriedades de depleção de CD4 sozinho. Isto indica que uma proteção mais forte contra depleção de células T induzida por HIV-I pode ser (obtida por tratamento com um anticorpo monovalente anti-CD4 não de depleção, como um anticorpo anti-CD4 HG. A prova de princípio para a neutralização de HTV-I por anti-CD4 HG e proteção contra a depleção de CD4 pode ser obtida em uma configuração de experiência similar. Isto provê uma evidência de que HUMax-CD4 HG mostrando uma meia-vida in vivo longa, pode inibir a infecção por HIV e a carga viral de HtV-1 e proteger da depleção de células positivas para CD4. Sumário dos resultados

Os dados apresentados nos exemplos mostram que a expressão de um anticorpo de IgG4 sem ganho por destruição do sítio de doador de emenda do exon de gancho resulta em meias-moléculas de IgG4 sem ganho (uma cadeia pesada e uma cadeia leve combinadas). A presença de meias- moléculas sem gancho de IgG4 é confirmada por SDS-PAGE sob condições de não redução, espectrometria de massa, cromatografia de exclusão de tamanho e teste radio-imuno da ausência de capacidades de reticulação. Os anticorpos sem gancho retém a mesma especificidade de ligação do antígeno como IgGl de formato natural e moléculas de anticorpo de IgG4. Isto é mostrado para dois anticorpos sem ganho com especificidade diferente, 7D8- HG (específico para o antígeno de célula B CD20), e Betvl-HG (específico para o antígeno de pólen de bétula Bet vl). A ligação de Clq de 7D8-HG está ausente e somente toxicidade celular dependente de complemento menor (ADCC) é observada (comparável ao anticorpo 7D8-IgG4 de formato natural). A monovalência da meia-molécula sem gancho é mostrada na experiência de reticulação usando Betvl-HG. Apesar de tanto IgGl como IgG4 mostrarem a reticulação de Bet ν 1 ligado a Sepharose para Bet ν 1 radio-rotulado, a molécula sem gancho Betvl-HG é incapaz de reticular.

A meia-vida de 7D8-HG é avaliada in vivo em uma experiência de farmacocinética de camundongo (PACIENTES) e comparada com 7D8-IgG4. Apesar de 7D8-HG ter uma depuração 2 a 3 vezes mais rápida do que IgG4 normal neste modelo, a meia-vida de 6 dias é contada como favorável para a meia-vida de menos de um dia registrada para fragmentos F(ab')2 de IgG. Os requerentes concluíram que o perfil de PK favorável irá tornar os anticorpos sem gancho- IgG4 valiosos para aplicações terapêuticas quando um anticorpo não reticulante, monovalente e não ativador de complemento é necessário. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

SEQ ID No: 1: A seqüência de ácido nucleico de Cl kappa de IgG humana 1 CGTACGGTGG CTGCACCATC TGTCTTCATC TTCCCGCCAT CTGATGAGCA 51 GTTGAAATCT GGAACTGCCT CTGTTGTGTG CCTGCTGAAT AACTTCTATC 101 CCAGAGAGGC CAAAGTACAG TGGAAGGTGG ATAACGCCCT CCAATCGGGT 151 AACTCCCAGG AGAGTGTCAC AGAGCAGGAC AGCAAGGACA GCACCTACAG 201 CCTCAGCAGC ACCCTGACGC TGAGCAAAGC AGACTACGAG AAACACAAAG 251 TCTACGCCTG CGAAGTCACC CATCAGGGCC TGAGCTCGCC CGTCACAAAG 301 AGCTTCAACA GGGGAGAGTG T

SEQ ID No: 2: A seqüência de aminoácido de Cl kappa de IgG humana 1 RTVAAPSVFIFPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG 51 NSQESVTEQD SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK 101 SFNRGEC

SEQ ID No: 3: A seqüência de ácido nucleico de Cl lambda de IgG humana 1 ACCGTCCTAG GTCAGCCCAA GGCTGCCCCC TCGGTCACTC TGTTCCCGCC 51 CTCCTCTGAG GAGCTTCAAG CCAACAAGGC CACACTGGTG TGTCTCATAA 101 GTGACTTCTA CCCGGGAGCC GTGACAGTGG CCTGGAAGGC AGATAGCAGC 151 CCCGTCAAGG CGGGAGTGGA GACCACCACA CCCTCCAAAC AAAGCAACAA 201 CAAGTACGCG GCCAGCAGCT ACCTGAGCCT GACGCCTGAG CAGTGGAAGT 251 CCCACAGAAG CTACAGCTGC CAGGTCACGC ATGAAGGGAG CACCGTGGAG 301 AAGACAGTGG CCCCTACAGA ATGTTCA

SEQ ID No: 4: A seqüência de aminoácido de Cl lambda de IgG humana 1 TVLGQPKAAP SVTLFPPSSE ELQANKATLV CLISDFYPGA VTVAWKADSS 51 PVKAGVETTT PSKQSNNKYA ASSYLSLTPE QWKSHRSYSC QVTHEGSTVE 101 KTV APTECS

SEQ ID No: 5: A seqüência de ácido nucleico para o Vh de HuMab-7D8 1 GAAGTGCAGC TGGTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGACAGGTC 51 CCTGAGACTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTTCAT GATTATGCCA 101 TGCACTGGGT CCGGCAAGCT CCAGGGAAGG GCCTGGAGTG GGTCTCAACT 151 ATTAGTTGGA ATAGTGGTAC CATAGGCTAT GCGGACTCTG TGAAGGGCCG 201 ATTCACCATC TCCAGAGACA ACGCCAAGAA CTCCCTGTAT CTGCAAATGA 251 ACAGTCTGAG AGCTGAGGAC ACGGCCTTGT ATTACTGTGC AAAAGATATA 301 CAGTACGGCA ACTACTACTA CGGTATGGAC GTCTGGGGCC AAGGGACCAC 351 GGTCACCGTC TCCTCA SEQID No: 6: A seqüência de aminoácido para o Vh de HuMab-7D8 1 EVQLVESGGG LVQPDRSLRL SCAASGFTFH DYAMHWVRQA PGKGLEWVST 51ISWNSGTIGY ADSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TALYYCAKDI 101 QYGNYYYGMD VWGQGTTVTV SS

SEQ ID No: 7: A seqüência de ácido nucleico para o Vh de anti-Betv-1 de camundongo

1 GAGGTTCAGC TGCAGCAGTC TGGGGCAGAG CTTGTGAAAC CAGGGGCCTC 51 AGTCAAGTTG TCCTGCACAG CTTCTGGCTT CAACATTAAA GACACCTATA 101 TCCACTGGGT GAAGCAGAGG CCTGAACAGG GCCTGGAGTG GGTTGGAAGG 151 ATTGATCCTG CGACTGGCAA TACTAGATAT GACCCGAAGT TCCAGGGCAA 201 GGCCACTATA ACAGCTGACA CATCCTCCAA CACAGCCTAC CTGCAACTCA 251 GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC ACTGCCGTCT ATTACTGTGC TAGTTTTAGG 301 CCGGGGTATG CTCTGGACTA CTGGGGTCAA GGAACCTCAG TCACCGTCTC 351 CTCA

SEQ ID No: 8: A seqüência de aminoácido para o Vh de anti-Betv-1 de camundongo

1 EVQLQQSGAE LVKPGASVKL SCTASGFNIK DTYIHWVKQR PEQGLEWVGR 51 IDPATGNTRY DPKFQGKATI TADTSSNTAY LQLSSLTSED TAVYYCASFR 101 PGYALDYWGQ GTSVTVSS

SEQ ID No: 9: A seqüência de ácido nucleico para o Vl de HuMab-7D8

1 GAAATTGTGT TGACACAGTC TCCAGCCACC CTGTCTTTGT CTCCAGGGGA 51 AAGAGCCACC CTCTCCTGCA GGGCCAGTCA GAGTGTTAGC AGCTACTTAG 101 CCTGGTACCA ACAGAAACCT GGCCAGGCTC CCAGGCTCCT CATCTATGAT 151 GCATCCAACA GGGCCACTGG CATCCCAGCC AGGTTCAGTG GCAGTGGGTC 201 TGGGACAGAC TTCACTCTCA CCATCAGCAG CCTAGAGCCT GAAGATTTTG 251 CAGTTTATTA CTGTCAGCAG CGTAGCAACT GGCCGATCAC CTTCGGCCAA 301 GGGACACGAC TGGAGATTAA A

SEQ ID No: 10: A seqüência de aminoácido para o Vl de HuMab-7D8

1 EIVLTQSPAT LSLSPGERAT LSCRASQSVS SYLAWYQQKP GQAPRLLIYD 51 ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSNWPITFGQ 101 GTRLEIK

SEQID No: 11: A seqüência de ácido nucleico para o Vl de anti-Betv-1 de camundongo

1 GACATTGTGA TGACCCAGTC TCACAAATTC ATGTCCACAT CAGTTGGAGA 51 CAGGGTCAGC TTCACCTGCA AGGCCAGTCA GGATGTGTTT ACTGCTGTAG 101 CCTGGTATCA ACAAAAACCA GGGCAATCTC CTAAACTACT GATTTACTGG 151 GCATCCACCC GGCGCACTGG AGTCCCTGAT CGCTTCACAG GCAGTGGATC 201 TGGGACAGAT TATACTCTCA CCATCAGCAG TGTGCAGGCT GAAGACCTGG 251 CACTTTATTA CTGTCAGCAA CATTTTAGCA CTCCTCCGAC GTTCGGTGGA 301 GGCACCAAGC TGGAAATCAA A

SEQ ID No: 12: A seqüência de aminoácido para o Vl de anti-Betv-1 de camundongo

1 DIVMTQSHKF MSTSVGDRVS FTCKASQDVF TAVAWYQQKP GQSPKLLIYW 51 ASTRRTGVPD RFTGSGSGTD YTLTISSVQA EDLALYYCQQ HFSTPPTFGG 101 GTKLEIK

SEQID No: 13: A seqüência de ácido nucleico de Ch de região tipo selvagem de IgG4 humana

1 GCTAGCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG 51 CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC 101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG 151 CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACGAAGACC TACACCTGCA 251 ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAG AGTTGGTGAG 301 AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG CTCAGCCCTC 351 CTGCCTGGAC GCACCCCGGC TGTGCAGCCC CAGCCCAGGG CAGCAAGGCA 401 TGCCCCATCT GTCTCCTCAC CCGGAGGCCT CTGACCACCC CACTCATGCT 451 CAGGGAGAGG GTCTTCTGGA TTTTTCCACC AGGCTCCGGG CAGCCACAGG 501 CTGGATGCCC CTACCCCAGG CCCTGCGCAT ACAGGGGCAG GTGCTGCGCT 551 CAGACCTGCC AAGAGCCATA TCCGGGAGGA CCCTGCCCCT GACCTAAGCC 601 CACCCCAAAG GCCAAACTCT CCACTCCCTC AGCTCAGACA CCTTCTCTCC 651 TCCCAGATCT GAGTAACTCC CAATCTTCTC TCTGCAGAGT CCAAATATGG 701 TCCCCCATGC CCATCATGCC CAGGTAAGCC AACCCAGGCC TCGCCCTCCA 751 GCTCAAGGCG GGACAGGTGC CCTAGAGTAG CCTGCATCCA GGGACAGGCC 801 CCAGCCGGGT GCTGACGCAT CCACCTCCAT CTCTTCCTCA GCACCTGAGT 851 TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACT 901 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 951 CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT GGCGTGGAGG 1001 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTAC 1051 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 1101 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC TCCATCGAGA 1151 AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGTGGGACCC ACGGGGTGCG AGGGCCACAT 1201 GGACAGAGGT CAGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGGGAGTG ACCGCTGTGC 1251 CAACCTCTGT CCCTACAGGG CAGCCCCGAG AGCCACAGGT GTACACCCTG 1301 CCCCCATCCC AGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT 1351 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG 1401 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC 1451 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAGGCTAACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA 1501 GGAGGGGAAT GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC 1551 ACTACACACA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC TGGGTAAA

SEQ ID No: 14: A seqüência de aminoácido de Ch região de tipo selvagem de IgG4 humana

1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES 101 KYGPPCPSCP APEFLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED 151 PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQFNSTY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK 201 CKVSNKGLPS SDEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK 251 GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG 301 NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSLGK

SEQ ID No: 15: A seqüência de ácido nucleico codificando a região CH de IgG4 humana (SEQ ID No: 13) mudada em posições 714 e 722

1 GCTAGCACCA AGGGCCCATC CGTCTTCCCC CTGGCGCCCT GCTCCAGGAG 51 CACCTCCGAG AGCACAGCCG CCCTGGGCTG CCTGGTCAAG GACTACTTCC 101 CCGAACCGGT GACGGTGTCG TGGAACTCAG GCGCCCTGAC CAGCGGCGTG 151 CACACCTTCC CGGCTGTCCT ACAGTCCTCA GGACTCTACT CCCTCAGCAG 201 CGTGGTGACC GTGCCCTCCA GCAGCTTGGG CACGAAGACC TACACCTGCA 251 ACGTAGATCA CAAGCCCAGC AACACCAAGG TGGACAAGAG AGTTGGTGAG 301 AGGCCAGCAC AGGGAGGGAG GGTGTCTGCT GGAAGCCAGG CTCAGCCCTC 351 CTGCCTGGAC GCACCCCGGC TGTGCAGCCC CAGCCCAGGG CAGCAAGGCA 401 TGCCCCATCT GTCTCCTCAC CCGGAGGÇCT CTGACCACCC CACTCATGCT 451 CAGGGAGAGG GTCTTCTGGA TTTTTCCACC AGGCTCCGGG CAGCCACAGG 501 CTGGATGCCC CTACCCCAGG CCCTGCGCAT ACAGGGGCAG GTGCTGCGCT 551 CAGACCTGCC AAGAGCCATA TCCGGGAGGA CCCTGCCCCT GACCTAAGCC 601 CACCCCAAAG GCCAAACTCT CCACTCCCTC AGCTCAGACA CCTTCTCTCC 651 TCCCAGATCT GAGTAACTCC CAATCTTCTC TCTGCAGAGT CCAAATATGG 701 TCCCCCATGC CCACCATGCC CGGGTAAGCC AACCCAGGCC TCGCCCTCCA 751 GCTCAAGGCG GGACAGGTGC CCTAGAGTAG CCTGCATCCA GGGACAGGCC 801 CCAGCCGGGT GCTGACGCAT CCACCTCCAT CTCTTCCTCA GCACCTGAGT 851 TCCTGGGGGG ACCATCAGTC TTCCTGTTCC CCCCAAAACC CAAGGACACT 901 CTCATGATCT CCCGGACCCC TGAGGTCACG TGCGTGGTGG TGGACGTGAG 951 CCAGGAAGAC CCCGAGGTCC AGTTCAACTG GTACGTGGAT GGCGTGGAGG 1001 TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG AGCAGTTCAA CAGCACGTAC 1051 CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC CAGGACTGGC TGAACGGCAA 1101 GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGG CCTCCCGTCC TCCATCGAGA 1151 AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGTGGGACCC ACGGGGTGCG AGGGCCACAT 1201 GGACAGAGGT CAGCTCGGCC CACCCTCTGC CCTGGGAGTG ACCGCTGTGC 1251 CAACCTCTGT CCCTACAGGG CAGCCCCGAG AGCCACAGGT GTACACCCTG 1301 CCCCCATCCC AGGAGGAGAT GACCAAGAAC CAGGTCAGCC TGACCTGCCT 1351 GGTCAAAGGC TTCTACCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG GAGAGCAATG 1401 GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC 1451 GGCTCCTTCT TCCTCTACAG CAGGCTAACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA 1501 GGAGGGGAAT GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC 1551 ACTACACACA GAAGAGCCTC TCCCTGTCTC TGGGTAAA

SEQ Ε) No: 16: A seqüência de aminoácido de Ch de região sem gancho de uma IgG4 humana.

1 ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV 51 HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVAP

101 EFLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCV WDVSQEDPE VQFNWYVDGV

151 EVhNAKTKPR EEQFNSTIRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI

201 EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE

251 SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL

301 HNHYTQKSLS LSLGK

SEQ ID NO: 17: A seqüência de aminoácido da região humana constante de cadeia lambda (número de acesso S25751) 1 qpkaapsvtl fppsseelqa nkatlvclis dfypgavtva wkadsspvka 51 gvetttpskq snnkyaassy lsltpeqwks hrsyscqvth egstvektva 101 pteCs

SEQ ID NO: 18: A seqüência de aminoácido da região humana constante de cadeia kappa (número de acesso P01834) 1 tvaapsvfif ppsdeqlksg taswcllnn fypreakvqw kvdnalqsgn 51 sqesvteqds kdstyslsst ltlskadyek hkvyacevth qglsspvtks 101 forgeC

SEQ ID NO: 19: A seqüência de aminoácido de região constante de IgGl (número de acesso P01857)

1 astkgpsvfp IapSskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslsswt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkkvep 101 kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvwdvs 151 hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn stirwsvlt vlhqdwlngk 201 eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsRDe mtknqvsltc 251 lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly sKltvdksrw 301 qQgnvfscsv mhealhnhyt qkslslsPgk

1 astkgpsvfp lapcsrstse staalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslsswt vpssnfgtqt ytcnvdhkps ntkvdktver 101 kccvecppcp appvagpsvf lfjppkpkdtl misrtpevtc wvdvshedp 151 evqfhwyvdg vevhnaktkp reeqfnstfr wsvltwhq dwlngkeykc 201 kvsnkglpap iektisktkg qprepqvytl ppsReemtkn qvsltclvkg 251 fypsdiavew esngqpenny kttppMldsd gsfflysKlt vdksrwqQgn 301 vfscsvmhea lhnhytqksl slsPgk

1 astkgpsvfp lapcsrstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv 51 htfpavlqss glyslsswt vpssslgtqt ytcnvnhkps ntkvdkrvel 101 ktplgdttht cprcpepksc dtpppcprcp epkscdtppp cprcpepksc 151 dtpppcprcp apellggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvwdvshed 201 pevqfkwyvd gvevhnaktk preeqynstf rwsvltvlh qdwlngkeyk 251 ckvsnkalpa piektisktk gqprepqvyt IppsReemtk nqvsltclvk 301 gfypsdiave wesSgqpenn yNttppMlds dgsfflysKl tvdksrwqQg 351 nlfscsvmhe alhnRFtqks IslsPgk LISTAGEM DE SEOUENCIAS

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<213> Homo sapiens

<400> 1

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aãcttctatc"ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t 321

<210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 1 5 10 15 Gln Leu Lys 20 Ser Gly Thr Ala Ser 25 Val Val Cys Leu Leu 30 Asn Asn Phe Tyr Pro 35 Arg Glu Ala Lys Val 40 Gln Trp Lys Val Asp 45 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 50 55 60 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 65 70 75 80 Lys His Lys Val 85 Tyr Ala Cys Glu Val 90 Thr His Gln Gly Leu 95 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 3

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<4 00> 3

accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc tcggtcactc tgttcccgcc ctcctctgag 60

gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc 120

gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca 180

ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg gccagcagct acctgagcct gacgcctgag 240

cagtggaagt cccacagaag ctacagctgc caggtcacgc atgaagggag caccgtggag 300

aagacagtgg cccctacaga atgttca 327

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro 1 5 10 15

Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu

20 25 30

Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp

35 40 45

Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln 50 55 60 Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu 65 70 75

Gln Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln

85 90

Ser Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu 100 105

<210> 5

<211> 366

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc

tcctgtgcag cctctggatt cacctttcat gattatgcca

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaact attagttgga

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt

cagtacggca actactacta cggtatggac gtctggggcc

tcctca

<210> 6

<211> 122

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

20 25

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

35 40

Ser Thr Ile Ser Trp Asn Ser Gly Thr Ile Gly 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

85 90

Ala Lys Asp Ile Gln Tyr Gly Asn Tyr Tyr Tyr

100 105

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 7 <211> 354 <212> DNA <213> Mus <400> 7

gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag cttgtgaaac tcctgcacag cttctggctt caacattaaa gacacctata cctgaacagg gcctggagtg ggttggaagg attgatcctg gacccgaagt tccagggcaa ggccactata acagctgaca ctgcaactca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct ccggggtatg ctctggacta ctggggtcaa ggaacctcag <210> 8 <211> 118 <212> PRT <213> mus <400> 8

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 1 5 10

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe

20 25

Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln

35 40

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Thr Gly Asn Thr Arg 50 55 60

Ser Leu Thr Pro Glu 80

Val Thr His Glu Gly 95

Cys Ser

ctgacaggtc tgcactgggt atagtggtac acgccaagaa attactgtgc aagggaccac

cctgagactc ccggcaagct cataggctat ctccctgtat aaaagatata ggtcaccgtc

Val Gln Pro Asp Arg 15

Thr Phe His Asp Tyr 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Tyr Ala Asp Ser Val

Lys Asn Ser Leu Tyr 80

Ala Leu Tyr Tyr Cys 95

Gly Met Asp Val Trp 110

caggggcctc tccactgggt cgactggcaa catcctccaa attactgtgc tcaccgtctc

Val Lys Pro Gly Ala 15

Asn Ile Lys Asp Thr 30

Gly Leu Glu Trp Val 45

Tyr Asp Pro Lys Phe

60 120 180 240 300 360 366

agtcaagttg gaagcagagg tactagatat cacagcctac tagttttagg ctca

60 120 180 240 300 354 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser 65 70 75

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr 85

90

Ser Asn Thr Ala Tyr 80

Ala Val Tyr Tyr Cys 95

Trp Gly Gln Gly Thr 110

ctccagggga cctggtacca gggccactgg ccatcagcag ggccgatcac

aagagccacc acagaaacct catcccagcc cctagagcct cttcggccaa

Ala Ser Phe Arg Pro Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr 100 105

Ser Val Thr Val Ser Ser 115

<210> 9 <211> 321 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9

gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact gggacacgac tggagattaa a <210> 10 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu 15 10

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

20 25

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg 85 90

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 11 <211> 321 <212> DNA <213> mus <400> 11

gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat ttcacctgca aggccagtca ggatgtgttt actgctgtag gggcaatctc ctaaactact gatttactgg gcatccaccc cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat tatactctca gaagacctgg cactttatta ctgtcagcaa cattttagca ggcaccaagc tggaaatcaa a <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> mus <400> 12

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met 15 10

Asp Arg Val Ser Phe Thr Cys Lys Ala Ser Gln 20 25

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40

Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Arg Thr Gly Val Pro 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

60 120 180 240 300 321

Ser Leu Ser Pro Gly 15

Ser Val Ser Ser Tyr 30

Pro Arg Leu Leu Ile 45

Ala Arg Phe Ser Gly

Ser Ser Leu Glu Pro 80

Ser Asn Trp Pro Ile 95

cagttggaga cctggtatca ggcgcactgg ccatcagcag ctcctccgac

cagggtcagc acaaaaacca agtccctgat tgtgcaggct gttcggtgga

60 120 180 240 300 321

Ser Thr Ser Val Gly 15

Asp Val Phe Thr Ala 30

Pro Lys Leu Leu Ile 45

Asp Arg Phe Thr Gly 65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Phe Ser Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13 <211> 1588 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct

agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca

tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg

aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg

gcaccccggc tgtgcagccc cagcccaggg cagcaaggca

ccggaggcct ctgaccaccc cactcatgct cagggagagg

aggctccggg cagccacagg ctggatgccc ctaccccagg

gtgctgcgct cagacctgcc aagagccata tccgggagga

caccccaaag gccaaactct ccactccctc agctcagaca

gagtaactcc caatcttctc tctgcagagt ccaaatatgg

caggtaagcc aacccaggcc tcgccctcca gctcaaggcg

cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt gctgacgcat

gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg

cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg

ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct

tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc

ggacagaggt cagctcggcc caccctctgc cctgggagtg

ccctacaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg

gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc

cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc

ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaa <210> 14 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 14

gctccaggag ccgaaccggt cggctgtcct gcagcttggg tggacaagag ctcagccctc tgccccatct gtcttctgga ccctgcgcat ccctgcccct ccttctctcc tcccccatgc ggacaggtgc ccacctccat ccccaaaacc tggacgtgag tgcataatgc gcgtcctcac ccaacaaagg acggggtgcg accgctgtgc cccccatccc ttctacccca aagaccacgc gtggacaaga ctgcacaacc

cacctccgag gacggtgtcg acagtcctca cacgaagacc agttggtgag ctgcctggac gtctcctcac tttttccacc acaggggcag gacctaagcc tcccagatct ccatcatgcc cctagagtag ctcttcctca caaggacact ccaggaagac caagacaaag cgtcctgcac cctcccgtcc agggccacat caacctctgt aggaggagat gcgacatcgc ctcccgtgct gcaggtggca actacacaca

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser 20 Glu Ser Thr Ala Ala 25 Leu Gly Cys Leu Val 30 Lys Asp Tyr Phe Pro 35 Glu Pro Val Thr Val 40 Ser Trp Asn Ser Gly 45 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn 85 Val Asp His Lys Pro 90 Ser Asn Thr Lys Val 95 Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1588 165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325

<210> 15 <211> 1588 <212> DNA <213> Homo sapiens <4 00> 15

gctagcacca agggcccatc cgtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacgaagacc tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttggtgag aggccagcac agggagggag ggtgtctgct ggaagccagg ctcagccctc ctgcctggac gcaccccggc tgtgcagccc cagcccaggg cagcaaggca tgccccatct gtctcctcac ccggaggcct ctgaccaccc cactcatgct cagggagagg gtcttctgga tttttccacc aggctccggg cagccacagg ctggatgccc ctaccccagg ccctgcgcat acaggggcag gtgctgcgct cagacctgcc aagagccata tccgggagga ccctgcccct gacctaagcc caccccaaag gccaaactct ccactccctc agctcagaca ccttctctcc tcccagatct gagtaactcc caatcttctc tctgcagagt ccaaatatgg tcccccatgc ccaccatgcc cgggtaagcc aacccaggcc tcgccctcca gctcaaggcg ggacaggtgc cctagagtag cctgcatcca gggacaggcc ccagccgggt gctgacgcat ccacctccat ctcttcctca gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa ggtgggaccc acggggtgcg agggccacat ggacagaggt cagctcggcc caccctctgc cctgggagtg accgctgtgc caacctctgt ccctacaggg cagccccgag agccacaggt gtacaccctg cccccatccc aggaggagat gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caggctaacc gtggacaaga gcaggtggca ggaggggaat gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacaca gaagagcctc tccctgtctc tgggtaaa <210> 16 <211> 315 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1588 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

100 105 110

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

115 120 125

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

130 135 140

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 145 150 155 160

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

165 170 175

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

180 185 190

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

195 200 205

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

210 215 220

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe 225 230 235 240

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

245 250 255

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

260 265 270

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

275 280 285

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

290 295 300

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 305 310 315

<210> 17 <211> 105 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 1 5 . 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser 65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 15 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 35 40 45 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80 His Lys Val Tyr 85 Ala Cys Glu Val Thr 90 His Gln Gly Leu Ser 95 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 19 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 19 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser 20 Gly Gly Thr Ala Ala 25 Leu Gly Cys Leu Val 30 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn 85 Val Asn His Lys Pro 90 Ser Asn Thr Lys Val 95 Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330

<210> 20

<211> 326

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser 20 Glu Ser Thr Ala Ala 25 Leu Gly Cys Leu Val 30 Lys Asp Tyr Phe Pro 35 Glu Pro Val Thr Val 40 Ser Trp Asn Ser Gly 45 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn 85 Val Asp His Lys Pro 90 Ser Asn Thr Lys Val 95 Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 <210> 21 <211> 377 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser 20 Gly Gly Thr Ala Ala 25 Leu Gly Cys Leu Val 30 Lys Asp Tyr Phe Pro 35 Glu Pro Val Thr Val 40 Ser Trp Asn Ser Gly 45 Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn 85 Val Asn His Lys Pro 90 Ser Asn Thr Lys Val 95 Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro 100 105 110 Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg 115 120 125 Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys 130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 145 150 155 160 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 165 170 175 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 180 185 190 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr 195 200 205 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 210 215 220 Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 225 230 235 240 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 245 250 255 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 260 265 270 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 275 280 285 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 290 295 300 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn 305 310 315 320 Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 325 330 335 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile 340 345 350 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln 355 360 365 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

Claims

1. Anticorpo monovalente, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma Ig, e em que, no caso de um subtipo de IgGl, a seqüência amino da região constante (Cl) foi modificada de modo que ela não contém quaisquer aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Cl) da Ig, na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano e b) referida cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vh) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) de Ig humana, em que a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) foi modificada de modo que região de articulação e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região CH, como a região CH3, não contém quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes estáveis com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) da Ig humana, na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano.

2. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é um anticorpo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA ou IgD5 como um anticorpo de IgGl, IgG2 ou IgG4.

3. Anticorpo monovalente, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve e uma cadeia pesada , em que a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (VL) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (CL) de uma Ig, e b) referida cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (VH) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (CH) de IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que nenhum de quaisquer resíduos de aminoácidos presentes na região correspondendo à região de articulação são capazes de participar na formação de ligações dissulfeto estáveis com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (CH) de IgG4 humana, na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano.

4. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região Cl é a região constante da cadeia leve kappa de IgG humana.

5. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região Cl é uma região constante da cadeia leve lambda de IgG humana.

6. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a cadeia leve e a cadeia pesada são conectadas uma na outra via uma ou mais ligações dissulfeto ou via uma ligação amida.

7. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação não compreende quaisquer resíduos cisteína.

8. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que pelo menos um dos resíduos de aminoácidos da região correspondendo à região de articulação, incluindo quaisquer resíduos cisteína, foi deletado e/ou substituído com outros resíduos de aminoácidos.

9. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada é uma cadeia pesada de uma IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 a 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram deletados.

10. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada é uma cadeia pesada de uma IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que pelo menos os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 99 a 110 da seqüência de SEQID No: 14 foram deletados.

11. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de que toda a região de articulação foi deletada.

12. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos de SEQ ID No: 16.

13. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a cadeia pesada é uma cadeia pesada de uma IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos de uma cadeia pesada foi modificada de modo que a cadeia pesada compreende uma região Ch, em que os resíduos de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 106 e 109 da seqüência de SEQ ID No: 14 foram substituídos com resíduos de aminoácidos diferentes de cisteína.

14. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monovalente se liga a um alvo selecionado dentre VEGF, cMet, CD20, CD38, IL-8, CD25, CD74, FcalphaRI, FcepsilonRI, receptor de acetil colina, fas, fasL, TRAIL, vírus da hepatite, vírus da hepatite C, envelope E2 de vírus da hepatite C, fator de Tecido, um complexo de fator de Tecido e Fator VII, EGFr, CD4, e CD28.

15. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de estar em uma forma monovalente na presença de IgG humana policlonal.

16. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de estar em uma forma monovalente quando administrado a um ser humano.

17. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região Ch3 foi modificada de modo que as seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Lys (K) na posição 292 foi substituído por Arg (R).

18. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve kappa Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 18, em que a região Cl foi modificada de modo que o resíduo cisteína terminal em posição 106 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou foi deletado.

19. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgGl, e a região Cl é uma cadeia leve lambda Cl tendo a seqüência de aminoácidos como especificada em SEQ ID NO: 17, em que a região Cl foi modificada de modo que resíduo cisteína em posição 104 foi substituído com outro resíduo de aminoácido ou foi deletado.

20. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgGl tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 19, em que a região Ch1 foi modificada de modo que Ser (S) em posição 14 foi substituído por um resíduo cisteína

21. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgG2 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 20, em que a região Ch3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 234 foi substituído por Gln (Q); Met (M) em posição 276 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 288 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 298 foi substituído por Glu (E); e Pro (P) em posição 324 foi substituído por Leu (L).

22. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Ig humana é uma IgG3 tendo a região Ch de aminoácido como especificada em SEQ ID NO: 21, em que a região Ch3 foi modificada de modo que uma ou mais das seguintes substituições de aminoácidos foi feita: Arg (R) em posição 285 foi substituído por Gln (Q); Ser (S) em posição 314 foi substituído por Asn (N); Asn (N) em posição 322 foi substituído por Lys (K); Met (M) em posição 327 foi substituído por Val (V); Lys (K) em posição 339 foi substituído por Arg (R); Gln (Q) em posição 349 foi substituído por Glu (E); Ile (I) em posição 352 foi substituído por Val (V); Arg (R) em posição 365 foi substituído por His (H); Phe (F) em posição 366 foi substituído por Tyr (Y); e Pro (P) em posição 375 foi substituído por Leu (L).

23. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não liga especificamente ao antígeno sintético de peptídeo (Tyr, Glu)-Ala-Lys.

24. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monovalente produzido é um anticorpo humano.

25. Método para preparar um anticorpo monovalente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico codificando referido anticorpo monovalente; e b) recuperar o anticorpo monovalente a partir da cultura de célula hospedeira.

26. Método para produzir um anticorpo monovalente, o dito método caracterizado pelo fato de compreender: i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando a região Cl constante de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativamente juntas, e em que, no caso de um subtipo de IgGl, a seqüência nucleotídica codificando a região Cl foi modificada de modo que uma região Cl não contém quaisquer aminoácidos capazes de formar ligações dissulfeto ou ligações covalentes com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região Cl na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano; ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleotídica codificando uma região Ch constante de uma Ig humana, em que a seqüência nucleotídica codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região Ch, como a região Ch3, não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes estáveis com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região Ch da Ig humana na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleotídica codificando a região Ch de referida Ig são ligadas operativamente juntas; iii) prover um sistema de expressão de células para produzir referido anticorpo monovalente; iv) produzir referido anticorpo monovalente por co-expressão das construções de ácido nucleico de (i) e (ii) em células do sistema de expressão de células de (iii).

27. Método para produzir um anticorpo monovalente, caracterizado pelo fato de compreender: i) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e uma seqüência nucleica codificando a região constante (Cl) de uma Ig, em que referida seqüência nucleotídica codificando a região Vl de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referida seqüência nucleica codificando a região Cl de uma Ig são ligadas operativamente juntas; ii) prover uma construção de ácido nucleico codificando a cadeia pesada de referido anticorpo monovalente, referida construção compreendendo uma seqüência nucleotídica codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e ácido nucleico codificando uma região Ch de uma IgG4 humana, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia pesada foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação de uma cadeia pesada não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) de IgG4 humana na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano, em que referido ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo específico do antígeno selecionado e referido ácido nucleico codificando a região Ch de IgG4 são ligadas operativamente juntas; iii) prover um sistema de expressão de células para a produção de referido anticorpo monovalente; iv) produzir referido anticorpo monovalente por co-expressão das construções de ácido nucleico de (i) e (ii) em células do sistema de expressão de células de (iii).

28. Construção de ácido nucleico para expressão de um anticorpo monovalente para uso farmacêutico, caracterizada pelo fato de compreender i) uma seqüência de ácido nucleico codificando uma região Ch de uma IgG4, em que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação na referida região Ch não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos capazes de participar na formação de ligações dissulfeto estáveis com peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácidos idêntica à seqüência de aminoácidos de referida região Ch, na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano ou (ii) uma seqüência nucleotídica codificando uma região constante Ch de uma Ig humana, em que a seqüência nucleotídica codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação e, como requerido pelo subtipo de Ig, outras regiões da região CH, como a região CH3, não compreende quaisquer resíduos de aminoácidos que participam na formação de ligações dissulfeto ou ligações de cadeia inter-pesada covalentes ou não covalentes estáveis com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica a uma região Ch da Ig humana, na presença de IgG humana policlonal ou quando administrada a um ser humano ou (iii) uma seqüência complementar da mesma.

29. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Ch foi modificada de modo que a região correspondendo à região de articulação não compreende quaisquer resíduos cisteína.

30. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizada pelo fato de que referida construção compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh de um anticorpo específico para antígeno, ou uma seqüência complementar da mesma.

31. Construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a seqüência de ácido nucleico codificando a região Vh é ligada operativamente à seqüência de ácido nucleico codificando a região CH, ou uma seqüência complementar da mesma.

32. Método para preparar um anticorpo monovalente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de compreender cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucleico como definida em qualquer uma das reivindicações 28 a 31, e, se referida construção de ácido nucleico não codificar uma cadeia leve de referido anticorpo, também compreendendo uma construção de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando a cadeia leve de referido anticorpo, de modo que polipeptídeos são expressados, e recuperar o anticorpo da cultura de células.

33. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de compreender uma construção de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 28 a 31.

34. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo monovalente como definido em qualquer urna das reivindicações 1 a 24 conjugado a uma porção terapêutica.

35. Anticorpo monovalente para o uso como um medicamento, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia leve e uma cadeia pesada, em que: a) referida cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vl) de um anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Cl) de uma Ig, e b) referida cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos da região variável (Vh) de referido anticorpo específico do antígeno selecionado e a seqüência de aminoácidos da região constante (Ch) de IgG4 humana, em que a seqüência de aminoácidos da cadeia pesada foi modificada de modo que nenhum de quaisquer resíduos de aminoácidos presentes na região correspondendo à região de articulação são capazes de participar na formação de ligações dissulfeto com outros peptídeos compreendendo uma seqüência de aminoácido idêntica à região constante (Ch) de IgG4 humana.

36. Anticorpo monovalente de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.

37. Anticorpo monovalente de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento para o tratamento de câncer, um distúrbio proliferativo celular, um distúrbio (auto) imune, um distúrbio de inflamação e/ou um distúrbio de angiogênese, em que o anticorpo especificamente liga a um dado alvo ou epítopo alvo, em que a ligação de um anticorpo ao referido alvo ou epítopo alvo é eficaz no tratamento da referida doença.

38. Uso de um anticorpo monovalente como definido em qualquer uma das reivindicações I a 24; caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica.

39. Uso de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica é preparada para o tratamento de câncer ou de uma condição inflamatória.

40. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender um anticorpo monovalente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 24 e um ou mais excipientes, diluentes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

41. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação -40, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreende um ou mais outros agentes terapêuticos.