ES2593484T3

ES2593484T3 - Anticuerpos biespecíficos y métodos de producción de los mismos

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Publication number: ES2593484T3
Application number: ES08715601.4T
Authority: ES
Inventors: Janine Schuurman; Tom Vink; Jan Van De Winkel; Aran Frank Labrijn; Rob Aalberse; Marijn Van Der Neut Kolfschoten; Paul Parren
Original assignee: Genmab AS
Current assignee: Genmab AS
Priority date: 2007-03-29
Filing date: 2008-03-28
Publication date: 2016-12-09
Anticipated expiration: 2028-03-28
Also published as: JP2010522701A; IL201082A; US10906991B2; EP2626372A1; WO2008119353A8; MX2009010282A; CA2681974A1; ES2667863T3; EP2139924B1; CA2681974C; CN101802015A; EP2139924A1; US20100105874A1; CN104497143B; US9212230B2; EP2626372B1; US20160159930A1; NZ614857A; WO2008119353A1; AU2008234248A1

Abstract

Un método ex vivo para la generación de un anticuerpo biespecífico, comprendiendo dicho método las etapas de: a) proporcionar un primer anticuerpo que tiene una primera especificidad, donde dicho primer anticuerpo comprende una secuencia CPPC en la región del centro de la bisagra y una región CH3 tipo IgG4 que es la región CH3 de SEQ ID NO: 19, pero donde la región CH3 se ha modificado de manera que la Lys (K) de la posición 292 se ha sustituido por Arg (R) b) proporcionar un segundo anticuerpo que tiene una segunda especificidad que es diferente de la primera especificidad de unión, donde dicho segundo anticuerpo comprende una secuencia CPPC en la región del centro de la bisagra y una región CH3 tipo IgG4 que es la región CH3 de SEQ ID NO: 19, pero donde la región CH3 se ha modificado de manera que la Lys (K) de la posición 292 se ha sustituido por Arg (R ) c) incubar juntos dichos primer y segundo anticuerpos en condiciones reductoras que permitan que las cisteínas del centro de la región bisagra se sometan a isomerización de enlaces disulfuro, d) poner la composición obtenida en la etapa c) en condiciones no reductoras con el fin de detener el intercambio de semi-moléculas, y e) obtener un anticuerpo biespecífico.

Description

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El término “ka” (M-1 x s-1), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constante de la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término “KD” (M) como se utiliza en el presente documento se refiere a la constante de equilibrio de disociación de 5 una interacción anticuerpo-antígeno particular.

El término “KA” (M-1), como se utiliza en el presente documento, se refiere a la constate de equilibrio de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular y se obtiene dividiendo la ka por la kd.

Como se utiliza en el presente documento, “isotipo” se refiere a la clase de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM) que está codificado por genes de región constante de cadena pesada.

El término “epítopo” significa un determinante proteico capaz de unirse específicamente a un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente en agrupamientos de moléculas en la superficie tales como aminoácidos o

15 cadenas laterales de azúcares y habitualmente tienen características tridimensionales específicas, así como características específicas de carga. Los epítopos conformacionales o no conformacionales se distinguen porque la unión del primero se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes pero no la del segundo. El epítopo puede comprender restos de aminoácido implicados directamente en la unión (también llamados componente inmunodominante del epítopo) y otros restos de aminoácidos, que no están directamente implicados en la unión, tal como restos de aminoácidos que se bloquean eficazmente por el péptido de unión al antígeno específicamente (en otras palabras, el resto de aminoácido está en la planta del péptido que se une al antígeno específicamente).

Como se utiliza en el presente documento un anticuerpo humano se “deriva de” una secuencia de línea germinal particular si el anticuerpo se obtiene de un sistema que utiliza secuencias de inmunoglobulina humana, por ejemplo,

25 inmunizando un ratón transgénico que alberga genes de inmunoglobulina humana o explorando una biblioteca genética de inmunoglobulinas humanas, y donde el anticuerpo humano seleccionado es al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, por ejemplo al menos un 96 %, tal como al menos un 97 %, por ejemplo al menos un 98 %, o tal como al menos un 99 % idéntico en su secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal. Típicamente, aparte de la CDR3 de cadena pesada, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de la línea germinal humana particular presentará no más de 20 aminoácidos de diferencia, por ejemplo, no más de 10 aminoácidos de diferencia, tal como no más de 5, por ejemplo no más de 4, 3, 2, o 1 aminoácido de diferencia respecto a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de la línea germinal.

35 La expresión “anticuerpo biespecífico” pretende que incluya cualquier anticuerpo, que tiene dos especificidades de unión diferentes, es decir, el anticuerpo se une a dos epítopos diferentes, que se pueden localizar en el mismo antígeno diana o, más comúnmente, en diferentes antígenos diana.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión “célula efectora” se refiere a una célula inmunitaria que está implicada en la fase efectora de una respuesta inmunitaria, en oposición a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias ejemplares incluyen una célula de origen mieloide o linfoide, por ejemplo linfocitos (tales como células B y células T que incluyen las células T citolíticas (CTL), células citolíticas, células citolíticas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tales como neutrófilos, granulocitos, mastocitos, y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fc específicos y llevan a cabo

45 funciones inmunitarias específicas. En algunas realizaciones, una célula efectora es capaz de inducir una citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC), tal como una célula citolítica natural, capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrófagos, que expresan FcR están implicados en la destrucción específica de células diana y presentan antígenos a otros componentes del sistema inmunitario, o se unen a células que presentan antígenos. En algunas realizaciones, una célula efectora puede fagocitar un antígeno diana o una célula diana. La expresión de un FcR particular en una célula efectora se puede regular por factores humorales tales como citocinas. Por ejemplo, se ha descubierto que la expresión de FcγRI está regulada positivamente por el interferón γ (IFN-γ) y/o G-CSF. Este aumento de la expresión aumenta la actividad citotóxica de las células que albergan FcγRI contra las dianas. Una célula efectora puede fagocitar o lisar un antígeno diana o célula diana.

55 “Tratamiento” se refiere a la administración de una cantidad eficaz de un compuesto terapéuticamente activo de la presente invención con el fin de aliviar, mejorar, detener o erradicar (curar) los síntomas o estados de enfermedad.

Una “cantidad eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y por periodos de tiempo necesarios, para conseguir un resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéutica eficaz de un anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para desencadenar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una donde los efectos perjudiciales del anticuerpo o la parte de anticuerpo son superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos.

65 La expresión “región central de la bisagra tipo IgG4” se refiere a una región central de la bisagra donde los restos de cisteína son significativamente más susceptibles a la reducción y/o la isomerización de enlaces disulfuro que otras

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CH3 se ha modificado de forma que la Lys (K) en la posición 292 se ha sustituido por Arg (R), c) incubar juntos dichos primer y segundo anticuerpos en condiciones reductoras que permitan que las cisteínas de la región central de la bisagra se sometan a isomerización de puentes disulfuro, d) poner la composición obtenida en la etapa c) en condiciones no reductoras con el fin de detener más

5 intercambios de semi-moléculas, y e) obtener un anticuerpo biespecífico.

En una realización preferida, el primer y segundo anticuerpos que se utilizan en los métodos de la invención son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir, por ejemplo, por el método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. (14), o se puede producir por métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales se pueden aislar también a partir de bibliotecas de anticuerpos fagos utilizando las técnicas descritas, por ejemplo en Clackson et al. (15) y Marks et al. (16). Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de cualquier fuente adecuada. Por lo tanto, por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden obtener a partir de hibridomas preparados a partir de células B esplénicas murinas que se obtienen de ratones 15 inmunizados con un antígeno de interés por ejemplo en forma de células que expresan un antígeno en la superficie,

o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés. Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener también de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de seres humanos inmunizados o mamíferos no humanos tales como ratas, perros, primates, etc.

En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que albergan más partes del sistema inmunitario humano que del sistema del ratón. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen los ratones a los que se hace referencia en el presente documento como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y a los que se hace referencia colectivamente en el presente documento como “ratones

25 transgénicos”.

El ratón HuMAb contiene miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias no reordenadas de cadena pesada humana (µ y γ) y ligera κ de inmunoglobulina, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de cadenas µ y κ endógenas (17). En consecuencia, los ratones presentan una reducción de la expresión de IgM o κ y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humanos que se introducen, se someten a cambio de clase y mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG, κ humanos de alta afinidad (1720). La preparación de ratones HuMAb se describe en detalle en las ref. 21-25. Véase también los documentos US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO

35 92/03918 y WO 01/09187.

Los ratones HCo7 tienen una alteración JKD en sus genes de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen et al. (26)), una alteración de CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén KCo5 de cadena ligera kappa humana (como se describe en Fishwild et al. (25)), y un transgén HCo7 humano de cadena pesada (como se describe en el documento US 5.770.429).

El ratón HCo12 tiene una alteración JKD en sus genes endógenos de cadena ligera (kappa) (como se describe en Chen et al. (26)), una alteración de CMD en sus genes endógenos de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén KCo5 de cadena ligera kappa humana (como se describe en

45 Fishwild et al. (25)), y un transgén HCo12 humano de cadena pesada (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424).

En la estirpe de ratón KM, el gen endógeno de cadena ligera kappa del ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en Chen et al. (26) y el gen endógeno de cadena pesada del ratón se ha alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta estirpe de ratón alberga un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al. (25). Esta estirpe de ratón también alberga un transcromosoma de cadena pesada humana compuesto por el fragmento del cromosoma 14 hCF (SC20) como se describe en el documento WO 02/43478.

55 Los esplenocitos de estos ratones transgénicos se pueden utilizar para generar hibridomas que segreguen anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas. Dichos animales transgénicos no humanos, animales no humanos que comprenden una secuencia de ácido nucleico operativa que codifica la expresión del anticuerpo utilizando en la invención, animales no humanos transfectados establemente con una o más secuencias de ácido nucleico que codifican dianas, y similares, son características adicionales de la presente invención.

Los anticuerpos humanos monoclonales o policlonales que se van a utilizar en la presente invención, o los anticuerpos utilizados en la presente invención que se originan de otras especies también se pueden generar transgénicamente por medio de la generación de otros mamíferos no humanos o plantas que sean transgénicos 65 para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de los mismos. En conexión con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos se

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pueden producir y recuperar de, la leche de cabras, vacas u otros animales. Véase por ejemplo los documentos US 5.827.690, US 5.756.687, US 5.750.172 y US 5.741.957.

Además, los anticuerpos humanos u otros que se van a usar en la presente invención se pueden generar por medio

5 de tecnologías de tipo presentación, que incluyen sin limitación, fago de presentación, presentación retrovírica, presentación ribosómica, y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en la técnica y las moléculas resultantes se pueden someter a una maduración adicional, tal como maduración por afinidad, ya que dichas técnicas son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo, las ref. 27, 28, y 30 (fago de presentación), 29 (presentación ribosómica), 31-35 y el documento US 5.733.743). Si se utilizan tecnologías de presentación para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos pueden estar humanizados.

También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o el segundo anticuerpo es un anticuerpo IgG4. Sin embargo, el anticuerpo puede en principio ser de cualquier isotipo, siempre que las secuencias de la región CH3 permitan el intercambio de semi-moléculas. Por ejemplo, los anticuerpos que se utilizan o se

15 obtienen en el método de la invención pueden comprender cualquiera de las secuencias de la región constante que se muestran en SEQ ID NO: 19-22 (aparte de cualquiera de las posiciones mutadas).

Por lo tanto, en una realización del método de la invención, el primer y/o segundo anticuerpo comprende una secuencia CPPC en la región central de la bisagra. También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o el segundo anticuerpo comprende una región central de la bisagra tipo IgG4. Por ejemplo, también se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o el segundo anticuerpo es un anticuerpo que comprende una secuencia CX1X2C en la región central de la bisagra, donde X1 y X2 puede ser cualquier aminoácido siempre que X1 y X2 no sean ambos prolina. También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o segundo anticuerpo es un anticuerpo que comprende una secuencia CX3PC o CPX3C en la región central

25 de la bisagra, donde X3 puede ser cualquier aminoácido excepto prolina. También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o segundo anticuerpo es un anticuerpo que comprende una secuencia CSPC, CPSC, CRPC, CPRC, CGHC o CPHC en la región central de la bisagra. Las mutaciones descritas anteriormente pueden introducirse, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio bien conocida en la técnica.

La elección del isotipo estará guiada típicamente por las funciones efectoras deseadas, tales como inducción de CDC, o la actividad en cuanto a ADCC. Los isotipos ejemplares son IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 (véase por ejemplo, SEQ ID NO: 19-22). Se pueden utilizar regiones constantes de cadena ligera humanas, kappa o lambda. Si se desea, la clase de un anticuerpo para su uso en la presente invención se puede cambiar por métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo que se va a utilizar en la presente invención que era originalmente una IgM, IgG1 o IgG2

35 se puede cambiar de clase en un anticuerpo IgG4 de la presente invención. Por lo tanto, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención se puede cambiar mediante un cambio de isotipo en, por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, o IgM para distintos usos terapéuticos.

En una realización, el primer y/o segundo anticuerpo que se utiliza en la invención es un anticuerpo de longitud completa. En otra realización, el primer y/o segundo anticuerpo que se utiliza es un fragmento de anticuerpo.

También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o el segundo anticuerpo comprende una región CH3 de IgG4, tal como la región CH3 de IgG4 que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 22).

45 También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o segundo anticuerpo comprende una región CH3 de un isotipo no IgG4, donde la secuencia CH3 es tal, o se ha modificado de tal manera, que no comprende ningún resto de aminoácido que participe en la formación de enlaces disulfuro o enlaces estables covalentes o no covalentes entre las cadenas pesadas con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica a la región CH3.

También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o segundo anticuerpo comprende una región CH3 que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 19), donde la región CH3 se ha modificado de manera que se han hecho una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: la Arg (R) en la

55 posición 238 se ha sustituido por Gln (Q); Asp (D) en la posición 239 se ha sustituido por Glu (E); Lys (K) en la posición 292 se ha sustituido por Arg (R); Gln (Q) en la posición 302 se ha sustituido por Glu (E); y Pro (P) en la posición 328 se ha sustituido por Leu (L).

De acuerdo con el método de la presente invención, el primer y/o segundo anticuerpo comprende una región CH3 que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 19), donde la Lys (K) de la posición 292 se ha sustituido por Arg (R).

También se desvelan en el presente documento métodos en los que el primer y/o segundo anticuerpo comprende una región CH3 que tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 19), pero donde la Lys (K) de la

65 posición 292 se ha sustituido por Tyr (W) o Phe (F).

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En una realización adicional, la concentración de dicho agente reductor es tal que el potencial redox de la solución generado en la etapa c) es

- igual o más reductor que el potencial redox generado por 1 microM de glutatión en las condiciones descritas en

5 el Ejemplo 31, tal como igual o más reductora que el potencial redox generado por 10 microM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 50 microM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 0,1 mM de glutatión, en las condiciones descritas en el Ejemplo 31, y

-es igual a o menos reductor que el potencial redox generado por 1 M de glutatión en las condiciones descritas en el Ejemplo 31, tal como igual o menos reductor que el potencial redox generado por 100 mM de glutatión, igual o menos reductor que el potencial redox generado por 15 mM de glutatión.

En una realización, donde el primer anticuerpo tiene una secuencia CPPC en la región central de la bisagra y/o el segundo anticuerpo tiene una secuencia CPPC en la región central de la bisagra, se prefiere que el potencial redox

15 de la solución generada en la etapa c) sea igual o más reductor que el potencial redox generado por 1 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 2 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 4 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 6 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 8 mM de glutatión, por ejemplo igual o más redox que el potencial reductor generado por 10 mM de glutatión, en las condiciones descritas en el Ejemplo 35.

25 -igual o más reductor que el potencial redox generado por 1 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 2 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 4 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 6 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 8 mM de glutatión, por ejemplo igual

o más reductor que el potencial redox generado por 10 mM de glutatión, en las condiciones descritas en el Ejemplo 35, y

- es igual a o menos reductor que el potencial redox generado por 1 M de glutatión, tal como igual o menos reductor que el potencial redox generado por 100 mM de glutatión, igual o menos reductor que el potencial redox generado por 15 mM de glutatión.

35 En una realización del método de la invención, la etapa c) comprende la incubación de dichos anticuerpos en presencia de glutatión reducido durante al menos 1 hora, tal como durante al menos 2 horas, por ejemplo, durante al menos 5 horas, tal como al menos 10 horas a una temperatura de 20 ºC o más, tal como 37 ºC.

En una realización adicional del método de la invención, las condiciones escogidas en la etapa c) son tales que menos del 10 %, tal como menos del 5 %, por ejemplo, menos del 2 %, tal como menos del 1 % de moléculas de anticuerpo en la composición resultante están en estado agregado, como se determina por cromatografía de exclusión por tamaño como se describe en el presente documento (donde un pico que se eluye antes de los anticuerpos del material de partida es indicativo de la formación de agregados).

45 en una realización del método ex vivo de la invención, el método comprende la adición de una proteína que tenga actividad proteína disulfuro isomerasa, tal como PDI. En otra realización del método ex vivo de la invención el método no comprende la adición de una proteína que tenga actividad proteína disulfuro isomerasa, tal como PDI.

En una realización del método ex vivo de la invención, el método no comprende la adición de células vivas o extractos celulares.

Como se ha explicado anteriormente, el primer y segundo anticuerpos que se utilizan en el método de la invención se diferencian en la especificidad de unión, es decir, se unen a diferentes epítopos. En principio, se puede utilizar cualquier combinación de especificidades como material de partida en el método de la invención. El método de la

55 invención tampoco se limita a que tenga dos diferentes anticuerpos como material de partida. Por lo tanto, el método de la invención se puede llevar a cabo también con tres o más anticuerpos como material de partida. En dicha realización, la composición que se obtiene en la etapa d) del método de la invención contendrá una pluralidad de anticuerpos biespecíficos.

En una realización del método de la invención, el primer anticuerpo tiene una especificidad por una célula tumoral o proteína celular tumoral, tal como erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4, CD38 o CXCR5, y el segundo anticuerpo tiene una especificidad de unión para una proteína celular tumoral, tal como erbB1, erbB2, erbB3, erbB4, MUC-1, CD19, CD20, CD4 o CXCR5.

65 En una realización adicional, el primer anticuerpo tiene una especificidad de unión para erbB1 y el segundo anticuerpo tiene una especificidad de unión para erbB2.

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En una realización adicional más del método de la invención, el método comprende la etapa adicional de formular los anticuerpos biespecíficos resultantes para su uso terapéutico. Esto comprende la formulación de una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo biespecífico en una solución acuosa que sea adecuada para uso humano, en particular adecuada para la administración parenteral, tal como la intravenosa.

5 En un aspecto adicional, la invención se refiere a un método ex vivo para la generación de un anticuerpo biespecífico, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) proporcionar un primer anticuerpo que tiene una primera especificidad de unión, donde dicho primer anticuerpo comprende la secuencia CPPC en la región central de la bisagra y una región CH3 de IgG4, b) proporcionar un segundo anticuerpos que tiene una segunda especificidad de unión, donde dicho segundo anticuerpo comprende una secuencia CPPC en la región central de la bisagra y una región CH3 de IgG4, e c) incubar juntos dichos primer y segundo anticuerpos en condiciones reductoras que permitan que las cisteínas de la región central de la bisagra se sometan a isomerización de los enlaces disulfuro, y

15 d) obtener un anticuerpo biespecífico.

Preferentemente, en la etapa c) se ha añadido un agente reductor donde la concentración de dicho agente es tal que el potencial redox de la solución generada en la etapa c) es igual, o más reductora que el potencial redox generado por 1 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 2 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 4 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 6 mM de glutatión, tal como igual o más reductor que el potencial redox generado por 8 mM de glutatión, por ejemplo igual o más reductor que el potencial redox generado por 10 mM de glutatión, en las condiciones descritas en el Ejemplo 35.

25 En un aspecto adicional, la invención se refiere a una composición que comprende anticuerpos biespecíficos que se obtienen o se pueden obtener por cualquiera de los métodos de la invención como se describe en el presente documento.

En un aspecto principal adicional, la invención se refiere a un anticuerpo biespecífico aislado comprende dos regiones CH3 tipo IgG4.

En una realización, dicho anticuerpo comprende una o dos secuencias CPPC en la región central de la bisagra.

También se desvelan en el presente documento anticuerpos que comprenden una o dos secuencias CX1X2C en la

35 región central de la bisagra, donde X1 y X2 puede ser cualquier aminoácido, siempre que X1 y X2 no son ambos prolina.

También se desvelan en el presente documento anticuerpos que comprenden una o dos secuencias CX3PC o CPX3C en la región central de la bisagra, donde X3 puede ser cualquier aminoácido excepto prolina.

También se desvelan en el presente documento anticuerpos que comprenden una o dos secuencias CSPC, CPSC, CRPC o CPRC en la región central de la bisagra.

En algunas realizaciones del anticuerpo biespecífico aislado, la primera o segunda región CH3 es de un isotipo no

45 IgG4, donde la secuencia de CH3 es tal, o se ha modificado de tal manera, que no comprende ningún resto de aminoácidos que participe en la formación de enlaces disulfuro o enlaces estables covalentes o no covalentes entre las cadenas pesadas con otros péptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos idéntica a la región CH3.

En una realización de la misma, la primera y/o segunda región CH3 tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 19), donde la región CH3 se ha modificado de forma que la Lys (K) en la posición 292 se ha sustituido por Arg (R).

También se desvelan en el presente documento anticuerpos en los que dicha primera y/o segunda región CH3 tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 19), donde la región CH3 se ha modificado de forma que

55 se han hecho una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Arg (R) de la posición 238 se ha sustituido por Gln (Q); Asp (D) de la posición 239 se ha sustituido por Glu (E); Lys (K) de la posición 292 se ha sustituido por Arg (R); Gln (Q) de la posición 302 se ha sustituido por Glu (E); y Pro (P) de la posición 328 se ha sustituido por Leu (L).

También se desvelan en el presente documento anticuerpos en los que la primera y/o segunda región CH3 tiene la secuencia que se muestra en la Figura 18 (SEQ ID NO: 20), donde la región CH3 se ha modificado de manera que se han hecho una o más de las siguientes sustituciones de aminoácidos: Arg (R) de la posición 234 se ha sustituido por Gln (Q); Met (M) de la posición 276 se ha sustituido por Val (V); Lys (K) de la posición 288 se ha sustituido por Arg (R); Gln (Q) de la posición 298 se ha sustituido por Glu (E); y Pro (P) de la posición 324 se ha sustituido por Leu

65 (L).

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21.: Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992)

22.: Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993)

23.: Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994)

24.: Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994) 15 25. Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)

26.: Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)

27.: Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991)

28.: Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996)

29.: Hanes y Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997)

30.: Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988)

31.: Scott TIBS 17, 241-245 (1992)

32.: Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990)

33.: Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993),

34.: Hoogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992) 25 35. Chiswell y McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992)

36.: Merchant et al. (1998) Nature Biotech 16:677-681

37.: Sambrook, Russell et al. 2000 Molecular cloning. A laboratory manual (tercera edición), Cold Spring Harbor Laboratory Press

38.: Akkerdaas, van Ree et al. 1995 Allergy 50(3), 215-220

39.: de Groot et al. 1988 J. Allergy Clin. Immunol. 82, 778

La presente invención se ilustra adicionalmente por los siguientes ejemplos que no se deberían considerar como limitantes.

35 Ejemplos

Ejemplo 1: Cebadores oligonucleótidos y amplificación por PCR

Los cebadores oligonucleótidos se sintetizaron y cuantificaron por Isogen Bioscience (Maarsen, Holanda). Se disolvieron los cebadores en H2O hasta 100 pmol/ml y se almacenaron a -20 ºC. Se hace un resumen de toda la PCR y secuenciación de los cebadores posteriormente. Para la PCR se utilizó ADN polimerasa PfuTurbo® Hotstart (Stratagene, Amsterdam, Holanda) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cada mezcla de reacción contenía 200 µM de dNTPs mezclados (Roche Diagnostics, Almere, Holanda), 6,7 pmol de ambos cebadores directo e inverso, 100 ng de ADN genómico o 1 ng de plásmido ADN y una unidad de ADN polimerasa PfuTurbo® Hotstart

45 en tampón de reacción PCR (suministrado con polimerasa) en un volumen total de 20 µl. Las reacciones PCR se llevaron a cabo con un TGradient Thermocycler 96 (Whatman Biometra, Goettingen, Alemania) utilizando un programa de 32 ciclos: desnaturalización a 95 ºC durante 2 min; 30 ciclos de 95 ºC durante 30 s, un gradiente de 6070 ºC (u otra temperatura de hibridación específica) durante 30 s, y 72 ºC durante 3 min; extensión final a 72 ºC durante 10 min. Si fuera apropiado, las mezclas de PCR se almacenaban a 4 ºC hasta su análisis o procesamiento posterior.

Ejemplo 2: Electroforesis en gel de agarosa

Se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa de acuerdo con Sambrook (37) utilizando geles de 50 ml, en 1 x

55 tampón de Acetato Tris EDTA. Se visualizó el ADN por inclusión de bromuro de etidio en el gel y la observación bajo luz UV. Las imágenes del gel se registraron con una cámara CCD y un sistema de análisis de imagen (GeneGnome; Syngene, via Westburg B.V., Leusden, Holanda).

Ejemplo 3: Análisis y purificación de los productos PCR y digestión enzimática

Se llevó a cabo la purificación de los fragmentos PCR deseados utilizando el kit de purificación MinElute PCR (Qiagen, via Westburg, Leusden, Holanda; producto nº 28006), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN aislado se cuantificó por espectroscopia UV y se evaluó la calidad por electroforesis en gel de agarosa.

65 De manera alternativa, los productos de la PCR o la digestión se separaron por electroforesis en gel de agarosa (por ejemplo, cuando había presentes múltiples fragmentos) utilizando gel de agarosa con un 1 % de Acetato Tris EDTA.

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El fragmento deseado se escindió del gel y se recuperó utilizando el kit de extracción de gel QIAEX II (Qiagen; producto nº 20051), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 4: Cuantificación de ADN por espectroscopia UV

5 La densidad óptica de los ácidos nucleicos se determinó utilizando un Espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Isogen Life Science, Maarssen, Holanda) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La concentración de ADN se midió por análisis de la densidad óptica (DO) a 260 nm (una unidad DO260 nm = 50 mg/ml). Para todas las muestras, el tampón donde se disolvieron los ácidos nucleicos se utilizó como referencia.

Ejemplo 5: Digestiones con enzimas de restricción

Se obtuvieron las enzimas de restricción y los suplementos en New England Biolabs (Beverly, MA, USA) o Fermetas (Vilnius, Lithuania) y se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

15 Se digirió el ADN (100 ng) con 5 unidades de enzima(s) en el tampón apropiado en un volumen final de 10 µl (los volúmenes de reacción se escalaron según era apropiado). Las digestiones se incubaron a la temperatura recomendada durante un mínimo de 60 min. Para los fragmentos que necesitaban digestiones dobles con enzimas de restricción que implicaban tampones o necesidades de temperatura incompatibles, las digestiones se llevaron a cabo secuencialmente. Si era necesario, los productos de la digestión se purificaron por electroforesis en gel de agarosa y extracción en gel.

Ejemplo 6: Ligadura de fragmentos de ADN

25 Se llevaron a cabo las ligaduras de fragmentos de ADN con el kit de ligadura Quick (New England Biolabs) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada ligadura, se mezcló el vector de ADN con aproximadamente un exceso molar de tres veces la inserción de ADN.

Ejemplo 7: Transformación de E. coli

El plásmido de ADN (1-5 µl de solución de ADN, típicamente 2 µl de mezcla de ligadura de ADN) se transformó en células de E. coli competentes One Shot DH5α-T1R o MACH-1 T1R (Invitrogen, Breda, Holanda; producto nº 12297016) utilizando el método de choque térmico, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego se colocaron en placas las células en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían 50 µg/ml de ampicilina. Se incubaron las

35 placas durante 16-18 h a 37 ºC hasta que las colonias bacterianas se volvieron evidentes.

Ejemplo 8: Exploración de las colonias bacterianas por PCR

Las colonias bacterianas se exploraron en cuanto a la presencia de vectores que contenían las secuencias deseadas por medio de PCR de colonias utilizando el kit HotStarTaq Master Mix (Qiagen; producto nº 203445) y los cebadores directo e inverso apropiados (Apéndice 1). Las colonias seleccionadas se rozaron con una punta de pipeta de 20 µl y se tocaron brevemente en 2 ml de LB para cultivarlas a pequeña escala, y luego se resuspendieron en la mezcla PCR. Se llevó a cabo la PCR con un TGradient Thermocycler 96 utilizando un programa de 35 ciclos: desnaturalización a 95 ºC durante 15 min; 35 ciclos de 94 ºC durante 20 s, 55 ºC durante 30 s y 72 ºC durante 2 min;

45 seguido por una etapa final de extensión de 10 min a 72 ºC. Si era apropiado, las mezclas de PCR se almacenaron a 4 ºC hasta el análisis de electroforesis en gel de agarosa.

Ejemplo 9: Aislamiento del plásmido de ADN del cultivo de E. coli

Se aisló el plásmido de ADN de los cultivos de E. coli utilizando los siguientes kits de Qiagen (via Westburg, Leusden, Holanda), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la preparación en masa de plásmidos (50150 ml de cultivo), se utilizó un Kit HiSpeed Plasmid Maxi (producto nº 12663) o un Kit HiSpeed Plasmid Midi (producto nº 12643). Para la preparación de plásmido a pequeña escala (± 2 ml de cultivo) se utilizó un Kit Qiaprep Spin Miniprep (producto nº 27106) y el ADN se eluyó en 50 µl de tampón de elución (suministrado con el kit).

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Ejemplo 10: Secuenciación de ADN

Se secuenció el plásmido de ADN utilizando procedimientos convencionales conocidos en la técnica. Las secuencias se analizaron utilizando el software Vector NTI (Informax, Oxford, RU).

Ejemplo 11: Expresión transitoria en células HEK-293F

Se obtuvieron células Freestyle™ 293-F (un subclon de HEK-293 adaptado al cultivo en un medio Freestyle en suspensión y químicamente definido, por ejemplo, HEK-293F) en Invitrogen y se transfectaron de acuerdo con el

65 protocolo del fabricante utilizando 293fectina (Invitrogen).

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