BRPI0619381A2 - preparações de enzimas que não alteram o paladar - Google Patents

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Abstract

PREPARAçOES DE ENZIMAS QUE NAO ALTERAM O PALADAR A presente invenção descreve uma lactase de produção intracelular, que compreende atividade de menos de 40 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase. A invenção também fornece um processo que compreende o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima, em que a preparação de enzima é substancialmente livre de arilsulfatase.

Description

PREPARAÇÕES DE ENZIMAS QUE NÃO ALTERAM O PALADAR Campo da invenção
A invenção está relacionada a um processo para o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima, para uma nova preparação de enzima e um processo para a produção de uma preparação de enzima. A invenção também está relacionada à lactase. Fundamentos da invenção
O uso de enzimas para aprimorar a natureza química, físico-química ou organoléptica de produtos alimentícios é disseminado. Também no processamento de leite de vaca e outros substratos derivados de animais, o uso de enzimas adiciona um valor significativo ao produto final. Exemplos são incubações com lactase para tornar o leite aceitável para indivíduos com intolerância à lactose, hidrólise proteolítica de caseína e proteínas do soro do leite para reduzir alergenicidades e aprimorar as características da espuma, a modificação de fosfolipídeos dos ovos com o uso de fosfolipase A2 para melhorar o desempenho de cozimento e estabilizar maioneses, o uso de transglutaminase em produtos de carne e peixe para melhorar a consistência e elasticidade, bem como a remoção de oxigênio de produtos de ovos ou queijo ralado pela adição de glicose oxidase. Adicionalmente, tratamentos enzimáticos têm sido usados para melhorar o paladar de vários produtos alimentícios de origem animal. Por exemplo, estão sendo utilizadas proteases para acelerar o desenvolvimento de paladar em extratos de peixe e carne. Além disso, a aceleração do desenvolvimento de paladar no queijo é um objetivo bem conhecido. Embora o EMC (Queijo Modificado por Enzima) seja um produto estabelecido no qual são usadas primariamente várias lipases, a aceleração de alterações sutis do paladar envolvidas na maturação de queijos por adição de pequenas quantidades de exoproteases, lipases ou esterases é um desenvolvimento mais recente.
A invenção também está relacionada à lactase. A lactase, ou β-galactosidase (E.C: 3.2.1.23), é uma enzima, que catalisa a hidrólise de lactose (um dissacarideo) em seus monossacarídeos componentes, glicose e galactose. A lactose está presente em laticínios e, mais especificamente, no leite, no leite desnatado, na nata do leite, e em outros produtos derivados do leite. A degradação de lactose ocorre na parede intestinal do corpo humano (e de outros mamíferos) pela presença natural de lactase.
Os problemas nutricionais e funcionais causados pela lactose na maioria das populações privadas de lactase são bem conhecidos e descritos. Os membros dessas populações não podem hidrolisar a lactose, que, nesses casos, passa para o intestino grosso, onde produz desidratação, deficiência da absorção de cálcio, diarréia, flatulência, eructações e cólicas e, em casos graves, até mesmo uma diarréia aquosa explosiva.
Uma importante aplicação industrial da lactase é na produção de laticínios com lactose hidrolisada para indivíduos com intolerância à lactose. Esses laticínios hidrolisados incluem leite pasteurizado, leite longa vida (UHT-milk = ultra heat treated milk: leite tratado por ultra-aquecimento) e leite reconstituído com todos ou parte de seus constituintes originais, com ou sem etapas intermediárias de processamento, por exemplo, hidrólise de proteínas. O tratamento com lactase pode ser feito antes e depois do tratamento por aquecimento do leite. O btratamento da lactase pode ser feito por adição da enzima ao leite. As propriedades de solubilidade da lactose fazem com que possa haver sua cristalização, levando a uma textura arenosa ou granular. Essa textura indesejada pode ser encontrada em alguns laticínios como, por exemplo, leite condensado, leite evaporado, leite em pó, leite congelado, sorvete e em produtos de confeitaria com um teor elevado de leite. A hidrólise total ou parcial da lactose pela lactase elimina esse problema, fornecendo produtos com uma textura homogênea e, conseqüentemente, uma maior aceitação do consumidor.
Outra aplicação industrial da lactase é para aumentar paladar doce nos produtos que contêm lactose, como o leite ou iogurte. A hidrólise da lactose nesses produtos produz um aumento do paladar doce em conseqüência da produção de glicose. Outra aplicação industrial da lactase é a hidrólise de produtos de lactose que contêm laticínios como componentes, por exemplo, o pão. A lactose é adicionada nesses produtos para aprimorar o sabor, reter a umidade, permitir o douramento e melhorar as propriedades de torrefação. Xaropes de lactose hidrolisada são promissores em termos, por exemplo, de aumento do desenvolvimento da cor da crosta, melhora do sabor e do aroma, modificação da textura, extensão da validade e reforço da estrutura da massa.
A hidrólise da lactose por lactase em laticínios fermentados como, por exemplo, iogurte, aumentará o paladar doce. No entanto, quando a lactase é adicionada antes do início do processo de fermentação, ela pode aumentar a taxa de desenvolvimento de ácido e, dessa forma, reduzir os tempos de processamento. 0 tratamento da lactase de leite ou produtos derivados do leite como, por exemplo, o soro do leite, faz com que esses produtos sejam adequados à aplicação em rações animais e rações para animais de estimação para animais com intolerância à lactose como, por exemplo, gatos. A hidrólise da lactose permite a fabricação de um soro do leite concentrado superior e, ao mesmo tempo, evita problemas intestinais, similares àqueles descritos anteriormente para pacientes deficientes em lactose. 0 soro do leite com lactose hidrolisada é concentrado para produzir um xarope que contém 70-75% de sólidos e é usado como um ingrediente alimentar em sorvetes, produtos de panificação e confeitaria.
As lactases foram descritas e isoladas de uma ampla gama de organismos, incluindo microorganismos. A lactase é freqüentemente um componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces e, especialmente K. fragilis e K. Iactis, e outras leveduras, tais como aquelas dos gêneros Candidal Torula e Torulopsis, são uma fonte comum de enzimas lactases de leveduras, enquanto B. coagulans ou B. circulans são fontes conhecidas de lactases bacterianas. São disponíveis várias preparações comerciais de lactase derivadas desses organismos como, por exemplo, Maxilact® (de K. Iactisl produzido por DSM, Deflt, Holanda) . Todas essas lactases são denominadas lactases neutras, na medida em que possuem pH ótimo entre pH = 6 e pH = 8. Vários organismos, por exemplo, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae, podem produzir lactase extracelular, e a Patente U.S. 5.73 6.3 74 descreve um exemplo dessa lactase, produzida por Aspergillus oryzae. As propriedades enzimáticas de lactases, como o pH e a temperatura ideais, variam entre espécies. Em geral, no entanto, as lactases que são excretadas exibem um pH-ótimo inferior de pH = 3,5 ao pH = 5,0; as lactases intracelulares normalmente apresentam um pH ótimo superior na faixa de pH = 6,0 ao pH = 7,5, mas podem ocorrer exceções a essas regras gerais. A escolha por uma lactase neutral ou ácida depende do perfil de pH na aplicação. Em aplicações com pH neutro, as lactases neutras são normalmente preferidas; essas aplicações incluem leite, sorvete, soro do leite, queijo, iogurte, leite em pó etc.
As lactases ácidas são mais adequadas para aplicações na faixa ácida. A concentração de lactase adequada depende de concentração de lactose inicial, do grau de hidrólise necessário, do pH, da temperatura e do tempo de hidrólise.
Embora se destine a melhorar a funcionalidade e/ou os perfis de paladar do produto alimentício, ocasionalmente um tratamento enzimático pode ter efeitos colaterais inesperados e indesejáveis. Um exemplo de um efeito colateral indesejável é o desenvolvimento de off-flavour (sabor estranho) em conseqüência do tratamento enzimático.
Mettall e cols. , em "The Australian Journal of Dairy Technology", (1991), 46-48, descrevem o problema de desenvolvimento de sabor estranho quando o leite é tratado com lactase. De acordo com essa publicação, níveis elevados de protease produzirão o desenvolvimento rápido de sabor estranho. Portanto, os processos de produção são otimizados para minimizar atividades proteolíticas colaterais a fim de reduzir o risco de formação de sabor estranho. Um exemplo de um processo de purificação para lactase derivada de K. lactis é descrito em WO 02/081673.
Verificou-se que até mesmo preparações de lactase com baixa atividade de protease podem ainda dar origem à formação de sabor estranho. Esse ocorre especialmente em lactases neutras, derivadas do citoplasma de leveduras. A formação de sabor estranho associada ao uso de preparações de lactase é especialmente critico para o leite longa vida com lactose hidrolisada. As lactases usadas nesse caso são lactases neutras, por causa de seu pH ótimo favorável ao leite. O leite longa vida recebeu um tratamento por alto aquecimento para obter uma validade de vários meses em temperatura ambiente. Os longos prazos de estocagem fora do refrigerador tornam esses produtos especialmente inclinados à formação de sabor estranho: até mesmo uma taxa de formação de sabor estranho muito baixa pode dar origem à formação significativa de sabor estranho após vários meses de estocagem, tornando o produto pouco atrativo para o consumo.
Sumário da invenção
Verificou-se agora surpreendentemente que a presença de arilsulfatase como atividade colateral contaminante em preparações de enzimas, mesmo em níveis muito reduzidos, pode levar a um forte desenvolvimento de sabor estranho em um produto, quando um substrato for tratado com a preparação, e que o uso de uma preparação de enzima que não possui ou que possui uma atividade de arilsulfatase reduzida produz uma forte redução do desenvolvimento de sabor estranho.
Conseqüentemente, a invenção fornece um processo, em um aspecto, um processo que compreende o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima, em que a preparação de enzima é substancialmente livre de arilsulfatase.
A invenção também fornece, em aspectos adicionais, preparações de enzimas substancialmente livres de arilsulfatase.
A invenção também fornece, em um aspecto particular, lactase que compreende atividade de menos de 4 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
A preparação de lactase de acordo com a invenção pode ser usada de forma vantajosa em produtos alimentícios e rações para hidrolisar a lactose, sem a formação de compostos com sabor estranho.
Verificamos surpreendentemente que arilsulfatase é uma atividade enzimática crucial responsável pela formação de sabor estranho. Encontramos evidências confirmativas por adição de arilsulfatase ao leite longa vida e que resultou no fato de que essa única enzima é capaz de mimetizar o sabor estranho freqüentemente observado no leite longa vida com tratamento de lactase.
Sem se fixar a nenhuma teoria científica específica, acredita-se que a hidrólise de conjugados metabólicos, em particular alquil fenóis substituídos com um grupo sulfato, por arilsulfatases, é o mecanismo que causa o desenvolvimento de sabor estranho. Conseqüentemente, as preparações de enzimas de acordo com a invenção são particularmente vantajosas para o tratamento de substratos que contêm um alquil fenol substituído com um grupo sulfato.
Descrição detalhada da invenção
Em um aspecto, a invenção fornece uma lactase que compreende atividade de menos de 4 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase. De preferência, a lactase compreende atividade de menos de 3 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase, mais preferivelmente, atividade de menos de 2 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase e, principalmente, atividade de menos de 10 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase. As unidades de arilsulfatase são definidas no Exemplo 2, e são normalizadas para a atividade de lactase expressa em NLU, também definida no Exemplo 2.
A lactase pode ser uma lactase de produção intracelular ou extracelular. Em uma modalidade preferida, a lactase é lactase de produção intracelular.
Em uma modalidade preferida, a lactase é uma lactase neutra. A lactase neutra pode ter um pH ótimo entre pH = 6 e pH = 8 .
Preparações de lactase neutra são normalmente derivadas do citoplasma de microorganismos. Sua produção inclui a fermentação (em larga escala) do microorganismo, seguida por isolamento da lactase. Esse último exige a ruptura da parede celular a fim de liberar a enzima do citoplasma. Podem ser usadas várias técnicas para se obter a Iise da célula, incluindo a permeabilização da parede celular por solventes orgânicos como, por exemplo, octanol, sonificação ou prensa francesa. Outras enzimas, além da lactase, são liberadas ao mesmo tempo do citoplasma, incluindo proteases.
Em uma modalidade preferida, a lactase tem atividade de protease de menos de 0,5 RFU/min por NLU de atividade de lactase.
As lactases intracelulares que podem ser purificadas de acordo com a presente invenção foram descritas e isoladas de vários organismos, incluindo microorganismos. A lactase é freqüentemente um componente intracelular de microorganismos como Kluyveromyces e Bacillus. Kluyveromyces e especialmente K. lactis, K. marxianus e K. fragilis, e outras leveduras, tais como aquelas dos gêneros Candida, Torula e Torulopsis, são uma fonte comum de enzimas lactases de leveduras, enquanto B. coagulans ou B. circulans são fontes conhecidas para lactases bacterianas. São disponíveis várias preparações comerciais de lactase derivadas desses organismos como, por exemplo, MaxiIact® (de K. lactis, produzido por DSM). Todas essas lactases são denominadas lactases neutras, na medida em que possuem um pH ótimo entre pH = 6 e pH = 8.
Foram descritas lactases intracelulares para várias espécies, e para várias delas são conhecidas suas seqüências de aminoácidos e/ou suas seqüências de DNA. As informações de seqüências estão disponíveis publicamente em bases de dados de seqüências, por exemplo, no GenBank (Bethesda, Mariland, EUA), no "European Molecular Biology Laboratory1S European Bioinformatics Institute" (EMBL-Bank em Hinxton, GB) , no "DNA Data Bank of Japan" (Mishima, Japão) e no Swissprot (Suíça). As lactases podem ser identificadas em genomas com base na homologia em seqüências gênicas e/ou de proteínas. Preparações brutas de enzimas intracelulares são caracterizadas pela presença de várias enzimas que só ocorrem no citoplasma da célula, por exemplo, as enzimas envolvidas no metabolismo central da célula, incluindo aquelas envolvidas na glicólise.
Também foram descritas lactases extracelulares. Elas são geralmente reconhecidas como enzimas extracelulares, pois contêm uma seqüência peptidica denominada seqüência- líder. Essa seqüência-lider é reconhecida de alguma forma pela célula que produz as enzimas como um sinal de que a enzima deve ser exportada para fora da célula. Durante a secreção, a seqüência-líder é normalmente removida. Foram descritas lactases extracelulares para várias espécies, por exemplo, Aspergillus oryzae. Preparações brutas de lactases extracelulares são caracterizadas pela ausência de enzimas intracelulares e pela presença de enzimas extracelulares típicas, como proteases. O tipo de enzimas extracelulares encontradas varia com o organismo, e elas são típicas para aquele organismo. Em função da lise da célula durante a fermentação ou processamento, podem ser encontrados níveis baixos de enzimas intracelulares nessas preparações de enzimas extracelulares.
Desse modo, as enzimas lactase podem ser extracelulares ou intracelulares com base na comparação de suas seqüências de aminoácidos com as de outras lactases conhecidas. Em princípio, uma lactase intracelular pode ser fornecida com uma seqüência-líder. Isso poderia resultar na excreção da lactase pela célula para o meio. Preparações brutas dessas enzimas seriam caracterizadas por uma lactase classificada como intracelular com base em sua seqüência de aminoácidos, na presença de enzimas extracelulares típicas e na ausência ou níveis baixos de enzimas intracelulares típicas.
Lactases intracelulares preferidas usadas na presente invenção são: lactase de K. Iactis que possui uma seqüência de aminoácidos descrita em:
http://www.ebi.uniprot.orq/entry/BGAL_KLULA ou uma lactase que possua uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos 90%, pref erivelmente pelo menos 95% idêntica ã seqüência de aminoácidos de K. Iactis. Lactase de K. marxianus que possui uma seqüência de aminoácidos descrita em:
http://www.ebi.uniprot.orq/entry/Q6QTF4_KLUMA ou uma lactase que possua uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos 90%, pref erivelmente pelo menos 95% idêntica à seqüência de aminoácidos de K. Iactis. Lactase de B. circulans que possui uma seqüência de aminoácidos descrita em:
http://www.ebi.uniprot.orq/uniprot- srv/uniProtView.do?proteinId=031341_BACCI&pager.offset=0
http://www.ebi.uniprot.orq/uniprot- srv/uniProtView.do?proteinId=Q45092_BACCI&pager.Offset=O
http : / /www. ebi . uniprot. orq/uniprot - srv/uniProtView. do?prote inId=Q45093_BACCI&pager.Offset=O
ou uma lactase que possua uma seqüência de aminoácidos que seja pelo menos 90%, pref erivelmente pelo menos 95% idêntica à seqüência de aminoácidos de B. circulans.
Os termos "homologia" ou "percentual de identidade" são aqui usados de forma intercambiável. Define-se aqui que, para determinar o percentual de identidade de duas seqüências de aminoácidos ou de duas seqüências de ácidos nucléicos, as seqüências são alinhadas visando a uma comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidas lacunas (gaps) na seqüência de uma primeira seqüência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos para um alinhamento ótimo com uma segunda seqüência de aminoácidos ou de ácidos nucléicos). Os resíduos de aminoácidos ou os nucleotídeos nas posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira seqüência for ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda seqüência, as moléculas serão idênticas naquela posição. 0 percentual de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (ou seja, % de identidade = número de posições idênticas/número total de posições (ou seja, posições que se superpõem) χ 100). De preferência, as duas seqüências são do mesmo comprimento. Aqueles habilitados na técnica terão ciência do fato de que estão disponíveis vários programas de computador para determinar a homologia entre duas seqüências. Por exemplo, uma comparação de seqüências e a determinação do percentual de identidade entre duas seqüências podem ser feitas com o uso de um algoritmo matemático. Em uma modalidade preferida, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidos é determinado com a utilização do algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) que foi incorporado no programa "GAP" na suíte de aplicativos "GCG" (disponível em http://www.qcq.com), com o uso de uma matriz Blossom 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Aqueles habilitados na técnica irão observar que todos esses diferentes parâmetros darão origem a resultados ligeiramente diferentes, mas que a percentagem de identidade global de duas seqüências não é alterada significativamente quando se utilizam diferentes algoritmos.
A preparação de lactases intracelulares exige a ruptura das células para liberação da enzima lactase. Ao mesmo tempo, são liberadas outras enzimas citoplasmáticas.
A qualidade de uma preparação industrial de lactase é determinada pela proporção de atividades colaterais em relação à atividade de lactase. Especialmente, as proteases são enzimas colaterais cruciais, uma vez que são conhecidas por levarem a efeitos colaterais indesejados em algumas aplicações, por exemplo, coagulação do leite ou formação de sabor estranho no leite. A formação de sabor estranho é especialmente critica em produtos com validade longa e que são estocados em temperaturas ambientes. Um produto desse tipo é o leite longa vida, e a formação de sabor estranho é um problema conhecido para o leite longa vida com lactose hidrolisada. O leite longa vida é muito sensível à formação de sabor estranho; quando uma preparação de lactase não gerar sabor estranho no leite longa vida, ela normalmente também não irá gerar sabor estranho em outras aplicações.
Compostos associados à formação de sabor estranho no leite, e especialmente no leite longa vida, estão relacionados tanto à proteólise quanto às reações de Maillard (Valero e cols. (2001) Food Chem. 72, 51-58). Qualquer protease presente como atividades colaterais em preparações de lactase potencialmente aumentam a formação de sabor estranho; não estão claros quais os níveis de proteases necessários, mas com tempos de estocagem de vários meses, até mesmo uma atividade proteolítica muito baixa seria importante. O leite longa vida é muito sensível à formação de sabor estranho; quando uma preparação de lactase não gera sabor estranho no leite longa vida, outros sabor estranhos, além do sabor estranho descrito (como, por exemplo, descritos em Valero e cols: (2001) Food Chem. 72, 51-58) também são normalmente gerados em outras aplicações.
A aplicação no leite longa vida é, portanto, um bom método para avaliar a qualidade de preparações de lactase em relação ao seu potencial para sabor estranho. Na medida em que as proteases são consideradas pelo menos parcialmente responsáveis pela formação de sabor estranho, concentraram- se esforços na redução dos níveis de protease de produtos de lactase. Verificamos, no entanto, que uma redução dos níveis de protease não leva a uma remoção completa da formação de sabor estranho no leite longa vida. Verificamos surpreendentemente que arilsulfatase é uma atividade enzimática crucial responsável pela formação de sabor estranho. Encontramos evidências confirmativas por adição de arilsulfatase ao leite longa vida e que resultaram no fato de que essa única enzima é capaz de mimetizar o sabor estranho freqüentemente observado no leite longa vida com tratamento de lactase.
De acordo com a presente invenção, é revelado um processo cromatográfico para remover a arilsulfatase da enzima lactase, que é preferivelmente derivada de K. lactis.
Realizamos uma análise sensorial detalhada de várias amostras de leite longa vida que não continham sabor estranho ou continham níveis significativos de sabor estranho (exemplo 1). Essas análises sensoriais foram combinadas com uma análise detalhada da composição química das amostras. Foram identificados vários compostos considerados cruciais para o aroma, e a maioria deles foi descrita previamente como associada ao leite longa vida. Surpreendentemente, p-cresol também foi identificado como um composto crucial com sabor estranho. Esses compostos não foram descritos previamente dentre os compostos com sabor estranho no leite longa vida (Valero e cols. (2001) Food Chem. 72, 51-58) . Ele pode ser gerado por arilsulfatase a partir de seu conjugado de sulfato que está presente em quantidades muito pequenas (níveis de ppb) no leite (V. Lopez7 R. C. Lindsay J. Agric. Food Chem. (1993), 41, 446- 454; M. Killic & R. C. Lindsay, J. Dairy Sei. (2005) 88, 7- 12; M. Kilic & R. C. Lindsay J. Agric. Food Chem. (2005) 53, 1.707-1.712). Verificamos surpreendentemente que arilsulfatase é uma enzimática ativa em preparações de lactase, e responsável pela formação de sabor estranho. Confirmamos esse fato com a adição de arilsulf atase ao leite longa vida, e verificamos que essa única enzima é, na verdade, capaz de mimetizar o sabor estranho observado freqüentemente no leite longa vida com tratamento de lactase. A seguir, desenvolvemos um processo cromatográfico para remover a arilsulfatase da enzima lactase, que é derivada de K. Iactis. Verificamos que a remoção de arilsulfatase também causa a remoção da formação de sabor estranho no leite longa vida, como foi concluído por experimentos com painéis de paladar. Os níveis de arilsulfatase no produto de lactase final são de <20 unidades de arilsulfatase, preferivelmente <10 unidades de arilsulfatase, ainda mais preferivelmente, <8 unidades de arilsulfatase e, principalmente, 0 unidade de arilsulfatase. As unidades de arilsulfatase serão definidas no Exemplo 2, e são normalizadas para a atividade de lactase expressa em NLU, que também será definida no Exemplo 2. Foram descritas várias vias de purificações para lactases (por exemplo, em WO 02/081673), mas esses processos de purificação não se dirigiam à remoção da arilsulfatase. Os presentes resultados mostram que a arilsulfatase e a lactase, ambas derivadas de K. Iactisl possuem um comportamento de eluição muito similar na cromatografia por troca iônica (Q-sefarose) e por interação hidrofóbica (butil-sefarose). Portanto, espera-se que as vias descritas na técnica estabelecida não produzam preparações de lactase livres de atividade de arilsulfatase.
Além da redução dos níveis de arilsulfatase em preparações de lactase por cromatografia, há outras formas de reduzir ou eliminar a atividade de arilsulfatase da preparação de lactase, as quais compreendem: 1) a adição de sulfato ao meio de crescimento. 0 sulfato é conhecido por reprimir a expressão de arilsulfatase (Beil e cols. (1995) Eur. J. Biochem. 229, 385-394), e espera-se, portanto, que a adição de sulfato ao meio diminua os níveis de arilsulfatase; 2) eliminação ou ruptura do gene para arilsulfatase do genoma do organismo por técnicas de mutagênese aleatória ou por uma abordagem direta usando, por exemplo, tecnologias de biologia molecular conhecidas por aqueles habilitados na técnica, 3) rastreamento e seleção de uma cepa que seja um baixo produtor natural ou não produtor de atividade de arilsulfatase; 4) adição de um inibidor da enzima. Sabe-se, por exemplo, que certas classes de arilsulfatases são inibidas por íons fosfato.
Conjugados metabólicos, tais como sulfatos, glicuronídeos e fosfatos, estão presentes no leite de várias espécies, incluindo o leite de váca (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem. 41, 446-454; Killic e cols. (2005) J. Dairy Sei. 88, 7-12). A conjugação metabólica é um meio universalmente aceito de detoxificação e aumento da solubilidade aquosa de substâncias estranhas em mamíferos.
Conjugados são formados mais eficazmente pelo fígado e pelo rim, e circulam na corrente sangüínea antes de serem eliminados principalmente na urina e bile. Foram encontrados conjugados de alquilfenóis e diversos outros compostos no leite, por exemplo, de vaca, cabra e ovelha (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem. 41, 446-454) . A natureza e a diversidade de conjugados metabólicos são amplas, e incluem conjugados de tiofenõis, fenóis, o-cresol e p-cresol. A conjugação pode causar a adesão de grupos sulfato, fosfato ou glicuronídeo. Esses grupos podem ser liberados do conjugado por enzimas como arilsulfatases, fosfatos e glucoronidases, resultando na liberação do composto tóxico. A presença de vários tipos de conjugados foi demonstrada no leite de vaca, ovelha e cabra; a abundância relativa dos conjugados varia entre preparações, e é pelo menos parcialmente relacionada à espécie (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem. 41, 446-454). No leite de vaca, demonstrou-se que conjugados de sulfato são os conjugados mais abundantes, mas no leite de ovelha, conjugados de fosfato são mais abundantes do que sulfatos (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem. 41, 446-454) .
No presente pedido, demonstrou-se que os conjugados presentes no leite formam o substrato para atividades colaterais em preparações de lactase neutra. Sabe-se que os níveis de concentração desses conjugados podem variar para uma espécie ao longo do tempo (Kilic e cols., (2005) J. Dairy Sei. 88, 7-12) e entre espécies (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem 41, 446-454) . Antecipa-se que isso possa afetar os requisitos para a preparação de lactase. Por exemplo, antecipa-se que, para o leite de ovelha, no qual conjugados de fosfato são muito abundantes, a tolerância para níveis de fosfatase em preparações de lactase é bem menor, em comparação com a situação em que a mesma preparação de lactase é usada no leite de vaca, que possui níveis muitos baixos de conjugados de fosfato. A esse respeito, não há diferenças entre uma preparação de lactase intracelular ou preparações de lactase extracelular.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece um processo para o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima. A preparação de enzima é, de preferência, substancialmente livre de arilsulfatase.
Como aqui usada, uma preparação de enzima substancialmente livre de arilsulfatase pode englobar qualquer preparação de enzima na qual a atividade de arilsulfatase não esteja presente ou esteja presente em um nível suficientemente baixo em que, com uma dosagem eficaz da atividade enzimática desejada no processo de produção relevante, não ocorra decomposição observável de alquilfenóis sulfatados com os efeitos organolépticos negativos associados descritos acima no referido processo de produção.
Como aqui usada, uma preparação de enzima substancialmente livre de arilsulfatase pode englobar uma preparação de enzima em que a proporção da atividade de arilsulfatase dividida pela atividade da enzima de interesse esteja abaixo de um valor especificado. As proporções preferidas podem variar, dependendo da enzima e da aplicação usada.
O termo "atividade de arilsulfatase" significa a atividade de éster sulfúrico hidrolase capaz de quebrar um sulfato fenólico nas porções fenol e sulfato, como descrito para EC 3.1.6.1. Uma definição para a unidade de arilsulfatase é fornecida na seção "Materiais e métodos" (e no Exemplo 2) do presente pedido. Definições para as atividades das outras enzimas também podem ser encontradas na seção "Materiais e métodos" do presente pedido.
Em um aspecto adicional da invenção, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma carboxipeptidase, em que a preparação de enzima compreende menos de 10.000 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por unidade de carboxipeptidase (CPG). De preferência, a preparação de enzima compreende menos de 5.000 unidades, mais preferivelmente, menos de 1.000 unidades, mais preferivelmente, menos de 500 unidades, mais preferivelmente, menos de 100 unidades, mais preferivelmente, menos de 50 unidades, mais
3 0 preferivelmente, menos de 10 unidades de atividade de arilsulfatase por unidade de carboxipeptidase (CPG).
Em ura aspecto adicional, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma protease específica para prolina, em que a preparação de enzima compreende menos de 300*10E3 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por unidade de protease de prolina (PPU). De preferência, a preparação de enzima compreende menos de 100*10E3 unidades, preferivelmente menos de 50*10E3 unidades, preferivelmente menos de 10*0E3 unidades, preferivelmente menos de 5.000 unidades de arilsulfatase por unidade de protease (PPU).
Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma lactase (neutra) , em que a preparação de enzima compreende atividade de menos de 4 0 unidades (ASU) de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase. De preferência, a preparação de enzima compreende atividade de menos de 3 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase, mais preferivelmente, atividade de menos de 2 0 unidades de arilsulf atase por NLU de atividade de lactase e, principalmente, atividade de menos de 10 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma lactase (ácida), em que a preparação de enzima compreende menos de 4 00 unidades (ASU) de atividade de arilsulf atase por ALU de atividade de lactase. De preferência, a preparação de enzima compreende menos de 100 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase, preferivelmente atividade de 3 0 unidades de arilsulfatase por ALU de atividade de lactase, mais pref erivelmente, atividade de menos de 20 unidades de arilsulfatase por ALU de atividade de lactase e, principalmente, atividade de menos de 10 unidades de arilsulfatase por ALU de atividade de lactase.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma aminopeptidase, em que a preparação de enzima compreende menos de 1.00 0 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por APU, preferivelmente menos de 3 00 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por APU, preferivelmente menos de 100 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por APU, preferivelmente menos de 3 0 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por APU, preferivelmente menos de 10 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por APU.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma preparação de enzima que compreende uma esterase e/ou uma lipase, em que a preparação de enzima compreende menos de 10*10E6 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por BGE, preferivelmente menos de 3*10E6 unidades (ASU) de
O atividade de arilsulfatase por BGE, preferivelmente menos de 1*10E6 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por BGE, preferivelmente menos de 3 00*10E3 unidades (ASU) de atividade de arilsulfatase por BGE.
O tratamento de um substrato com uma preparação de enzima substancialmente livre de arilsulfatase também pode englobar o tratamento de um substrato, em que o nível de arilsulfatase no substrato durante o referido tratamento está abaixo de um valor especificado.
Em um aspecto adicional, a invenção fornece um processo para o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima, em que o nível de arilsulfatase no substrato durante o referido tratamento é de, no máximo, 500*10E3 unidades de arilsulfatase por litro de substrato, preferivelmente no máximo 250*10E3, preferivelmente no máximo 100*10E3, preferivelmente no máximo 50*10E3, preferivelmente no máximo 25*10E3 unidades de arilsulfatase por litro de substrato. Verificou-se que a manutenção do nível de arilsulfatase abaixo dos valores mencionados anteriormente é particular vantajoso quando o substrato for leite, preferivelmente leite de vaca.
Uma preparação de enzima substancialmente livre de arilsulfatase também pode englobar qualquer preparação de enzima obtida por purificação de uma preparação de enzima bruta que contenha uma enzima de interesse e arilsulfatase, em que a arilsulfatase é separada da enzima de interesse.
Conseqüentemente, a invenção também fornece um processo para a produção de uma preparação de enzima, em que o processo compreende a purificação de uma preparação de enzima bruta que contém uma enzima de interesse e arilsulfatase, em que a arilsulfatase é separada da enzima de interesse. O processo pode vantajosamente compreender o tratamento de um substrato com a preparação de enzima purificada.
A etapa de purificação tem o efeito de que a atividade de arilsulfatase em relação ã atividade de enzima de interesse é reduzida. De preferência, a purificação resulta em uma redução da atividade de arilsulfatase de pelo menos 50%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 90%, mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 99%. Aqueles habilitados na técnica irão observar que isso significa que preferivelmente (aAS,pur/aenz,pur) / (aAS,bruto/aenz, bruto) < 0,5, preferivelmente < 0,2, preferivelmente < 0,1, preferivelmente < 0,05, preferivelmente <0,01, em que:
aAS,pur = atividade de arilsulfatase na preparação de enzima purificada (unidade/ml)
aenz,pur = atividade de enzima de interesse na preparação de enzima purificada (unidade/ml)
aAS,bruto = atividade de arilsulfatase na preparação de enzima bruta (unidade/ml)
aenz,bruto = atividade da enzima de interesse na preparação de enzima bruta (unidade/ml)
A purificação pode ser efetuada por qualquer forma adequada. Em uma modalidade preferida, a purificação é por cromatografia. Processos para a purificação de preparações de enzimas com o uso de cromatograf ia são conhecidos per se. A seleção dos métodos de separação cromatográfica apropriados depende das características moleculares tanto da enzima relevante quanto da atividade de arilsulfatase relevante presentes. Características moleculares relevantes são o ponto isoelétrico, hidrofobicidade, a distribuição de cargas na superfície molecular, o peso molecular da enzima relevante e a atividade colateral, além de várias outras propriedades químicas da proteína. Um fundamento prático sobre o uso dessas características na seleção do processo de separação cromatográfica apropriado pode ser encontrado no "Protein Purification Handbook" (emitido por Amersham Pharmacia Biotech, atualmente GE Healthcare Bio-Sciences, Diegem, Bélgica). Métodos de separação cromatográfica adequados compreendem cromatografia por troca iônica, cromatografia por afinidade, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia por interação hidrofóbica e outros. Para a presente invenção, a cromatografia por troca iônica ou a cromatografia por interação hidrofóbica são preferidas.
Em uma modalidade preferida, a purificação é realizada em uma etapa única de separação cromatográfica. 0 fato de que a atividade enzimática pode ser separada eficientemente da atividade de arilsulfatase contaminante em uma etapa cromatográfica única, é particularmente vantajoso para a aplicabilidade industrial do processo de acordo com a invenção.
A preparação de enzima pode compreender qualquer enzima adequada. Em uma modalidade preferida, a enzima, daqui a diante denominada enzima de interesse, é uma lactase, uma protease, uma lipase ou uma esterase. Enzimas que podem ser usadas de acordo com a invenção serão reveladas posteriormente.
Os esquemas internacionalmente reconhecidos para a classificação e nomenclatura de todas as enzimas são fornecidos por IUMB. Um texto atualizado da IUMB para números EC pode ser encontrado na página da internet: http://www.chem.gmw/ac.uk/iubmb/enzima/EC3/4/ll/. Nesse sistema, as enzimas são definidas pelo fato de que elas catalisam uma única reação. Isso implica em que várias proteínas diferentes são descritas como a mesma enzima, e uma proteína que catalisa mais de uma reação é tratada como mais de uma enzima.
De acordo com o sistema, as proteases podem ser subdivididas em endo- e exoproteases. Além disso, existem as denominadas di- e tripeptidil peptidases. As endoproteases são aquelas enzimas que hidrolisam ligações peptídicas internas, as exoproteases hidrolisam ligações peptídicas adjacentes a um grupo α-amino terminal ("aminopeptidases"), ou uma ligação peptídica entre o grupo carboxil terminal e o penúltimo aminoácido ("carboxipeptidases")· As endoproteases são divididas em sub-subclasses com base no mecanismo catalitico. Há sub- subclasses de serina endoproteases (EC 3.4.21), cisteína endoproteases (EC 3.4.22), endoproteases aspárticas (EC 3.4.23), metaloendoproteases (EC 3.4.24) e treonina endoproteases (EC 3.4.25). As proteases tipicamente coagulam o leite para a produção de queijo como, por exemplo, quimosina (EC 3.4.23.4) ou mucorpepsina (EC 3.4.23.23), todas pertencentes à classe das endoproteases aspárticas.
Dentre as exoproteases, as denominadas aminopeptidases (EC 3.4.11) podem remover seqüencialmente aminoácidos únicos do terminal amino de substratos protéicos e peptídicos. Dentre as exoproteases, as carboxipeptidases (EC 3.4.16, 3.4.17 e 3.4.18) podem remover seqüencialmente aminoácidos únicos do terminal carbóxi de substratos protéicos e peptídicos. Di- e tripeptidil peptidases (EC 3.4.13, 3.4.14 e 3.4.15) podem quebrar dipeptídeos ou tripeptideos do lado do terminal amino ou carbóxi de peptídeos ou proteínas.
Em uma modalidade da invenção, a enzima é uma protease com a exclusão de uma endoprotease aspártica (EC 3.4.23).
Outras enzimas que atuam sobre proteínas ou peptídeos e especialmente importantes dentro do escopo do presente pedido são as Omega peptidases (EC 3.4.19) e enzimas capazes de transformar grupos laterais de aminoácidos. Os substratos para essas reações de transformação podem ser aminoácidos livres ou aminoácidos ligados a proteínas ou peptídeos. Exemplos desse último grupo de enzimas são enzimas que podem hidrolisar seletivamente grupos gama amida de glutaminas ligadas à proteína, ou seja, as peptídeo-glutaminases (EC 3.5.1.43 e 3.5.1.44).
Além disso, enzimas capazes de entrecruzar proteínas ou peptídeos como, por exemplo, transglutaminase (EC 2.3.2.13) e proteína-lisina 6-oxidase (EC 1.4.3.13), representam exemplos típicos.
A lactase (EC 3.2.1.23), uma beta-galactosidase microbiana capaz de decompor a lactose, é especialmente importante dentro do escopo do presente pedido.
Lipases e esterases são especialmente importantes dentro do escopo do presente pedido, pois essas enzimas são usadas comumente na produção de EMCs (Queijos Modificados por Enzima) e apresentam um interesse crescente para aceleração da maturação de queijos. Portanto, lipases e esterases são os candidatos principais a serem purificados de acordo com o processo da presente invenção. De acordo com o sistema de IUMB, lipases e esterases pertencem às éster carboxílico hidrolases (EC 3.1.1). Enquanto as esterases podem atuar em uma ampla gama de substratos, as lipases (EC 3.1.1.3) só degradam triacilgliceróis. Lipases capazes de remover formato, acetato, propionato ou butirato de triacilgliceróis são algumas vezes denominadas "esterases". No presente pedido, o termo "esterase" refere- se às enzimas que podem remover eficientemente esses ácidos carboxílicos de cadeia curta de triacilgliceróis. A recuperação de enzimas anfifílicas como, por exemplo, lipases ou esterases, é opcionalmente aprimorada pelo uso de ácidos biliares ou outro emulsificante de grau alimentício. Métodos para a determinação da atividade de lipases e esterases são fornecidos na seção "Materiais e métodos".
Preparações de enzimas de grau alimentício industrialmente disponíveis são obtidas tipicamente de tecido de mamífero, por exemplo, a tripsina do pâncreas, ou de material de plantas, por exemplo, papaína do mamão. Em uma modalidade preferida, a enzima é obtida de uma cepa microbiana, por exemplo, bactérias, por exemplo, espécies de Bacillus, ou de leveduras, por exemplo, Saccharomycesl Kluyveromyces ou Piehia, ou fungos filamentosos. Fungos filamentosos conhecidos pela produção de preparações de enzimas de grau alimentício são, por exemplo, Aspergillus, Rhizomueor, Rhizopus, Triehoderma e Talaromyees. Em uma modalidade da invenção, a preparação de enzima é produzida por ou derivada de um fungo fi lamentoso, por exemplo, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Como aqui usadas, essas preparações de enzimas também englobam preparações de enzimas autoclonadas produzidas por A. niger ou por A. oryzae.
A enzima de interesse pode ser produzida por processos de fermentação microbiana com a utilização de fungos que produzem e, preferivelmente, secretam a protease de interesse no caldo de fermentação. Na técnica, esses processos de fermentação são conhecidos; veja, por exemplo, WO 02/45524. Nos processos da técnica estabelecida, a enzima pode ser recuperada do caldo de fermentação por técnicas também conhecidas na técnica. Como uma primeira etapa, as células do organismo produtor podem ser separadas do caldo por centrifugação ou filtração. O caldo sem células pode ser concentrado, por exemplo, por ultrafiltração, e subseqüentemente purificado cromatograficamente. Cepas fúngicas tipicamente produzem mais de uma atividade de arilsulfatase, de forma que a separação cromatográfica da enzima relevante dessas atividades de arilsulfatase em uma etapa única não é trivial. Uma complicação adicional é que as diferentes atividades enzimáticas secretadas por um microorganismo específico, ou seja, a atividade enzimática buscada entre as várias atividades de arilsulfatase, possuem pontos isoelétricos muito próximos. Com a separação cromatográfica da atividade enzimática desejada e das atividades de arilsulfatase contaminantes, a preparação de enzima purificada assim obtida pode ser estabilizada.
No caso de a enzima não ser secretada pelo microorganismo, mas sim permanecer intracelular, o organismo produtor pode ser recuperado por filtração ou centrifugação, e após essa etapa as células retidas podem ser lisadas para liberar a atividade enzimática relevante. Após outra etapa de filtração ou centrifugação para remoção dos restos celulares, a fração líquida pode ser concentrada e estabilizada como descrito acima para a enzima secretada.
As preparações de enzimas purificadas e líquidas podem ser concentradas e misturadas com estabilizantes conhecidos como, por exemplo, glicerol ou outros polióis.
Alternativamente, podem ser obtidas preparações sólidas a partir de soluções concentradas de enzima por etapas conhecidas de precipitação e/ou evaporação, seguidas por técnicas de secagem bem conhecidas (spray).
De acordo com a invenção, um substrato pode ser tratado com a preparação de enzima. O substrato pode ser qualquer substrato adequado. De preferência, o substrato é um substrato proteináceo. O substrato proteináceo pode ser qualquer substrato que compreenda proteína. Em uma modalidade preferida, o substrato contém proteína do leite, por exemplo, caseína e/ou proteína do soro do leite. Exemplos de substratos preferidos são leite, produtos derivados do leite, laticínios fermentados (por exemplo, iogurte), soro do leite e/ou hidrolisados. O substrato também pode compreender carne.
Como hidrolisado, pode ser usado qualquer produto que seja formado pela hidrólise enzimática da proteína de um substrato proteináceo, de preferência, uma proteína de um substrato derivado de animal. Hidrolisados de proteínas do soro do leite, hidrolisados de caseína e hidrolisados de leite desnatado são preferidos.
Em uma modalidade preferida, o substrato contém um alquil fenol substituído com um grupo sulfato. O termo "alquilfenol" significa um grupo fenol do qual pelo menos um próton aromático foi substituído por um grupo alquil. O comprimento do grupo alquil pode variar, e pode ser ramificado ou substituído. Alquilfenóis preferidos são metil e etil fenóis.
O termo "alquilfenol sulfatado" significa um alquilfenol que está conjugado no grupo hidroxil por sulfatação. Arilsulfatase (EC 3.1.6.1) é uma éster sulfúrico hidrolase capaz de clivar um sulfato alquil fenólico nas porções alquil fenol e sulfato.
O tratamento do substrato pode envolver qualquer processo no qual um substrato seja colocado em contato com a preparação de enzima. O tratamento pode envolver qualquer processo no qual o substrato seja incubado na presença da preparação de enzima. A preparação de enzima pode ser adicionada ao substrato por qualquer forma adequada.
O processo pode ser qualquer processo em que seja produzido um produto, por exemplo, um produto nutritivo, preferivelmente um laticínio. Como aqui usado, um laticínio engloba qualquer composição que contenha proteína do leite, por exemplo, caseína e/ou proteína do soro do leite.
Exemplos são leite, produtos derivados do leite, laticínios fermentados (por exemplo, iogurte), leite condensado, leite evaporado, leite em pó, leite congelado, sorvete, soro do leite; e/ou queijo. O produto também pode ser um hidrolisado.
A preparação de enzima pode ser usada para a preparação de qualquer produto adequado, por exemplo, um produto nutritivo, preferivelmente um laticínio.
A invenção também está relacionada ao uso da preparação de enzima de acordo com a invenção para evitar ou reduzir o desenvolvimento de sabor estranho.
Em um aspecto, a invenção fornece um processo para a produção de uma célula hospedeira que seja uma cepa deficiente em arilsulfatase, que compreende o desenvolvimento de uma cultura que produz arilsulfatase sob condições em que parte da cultura seja modificada para formar a célula hospedeira deficiente em arilsulfatase e isolamento da célula hospedeira.
Em uma modalidade preferida, são usadas condições de mutagênese, preferivelmente condições de mutagênese aleatória como, por exemplo, mutagênese física ou química.
Em uma modalidade preferida, são usadas técnicas recombinantes de manipulação genética, preferivelmente ruptura gênica em uma etapa, inserção de marcador, mutagênese sítio-dirigida, eliminação, interferência de RNA, RNA anti-senso.
A invenção ainda fornece um processo para a produção de um polipeptídeo por um método que compreende:
(a) o cultivo de uma célula hospedeira deficiente em arilsulfatase em um meio nutriente, sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo,
(b) a expressão do polipeptídeo na referida célula hospedeira, e
(c) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
A invenção ainda fornece um processo para a produção de um polipeptídeo por um método que compreende:
(a) a transformação de uma célula hospedeira deficiente em arilsulfatase com um vetor de expressão, em que o vetor expressa o polipeptídeo,
(b) o cultivo da célula hospedeira em um meio nutriente, sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo,
(c) a expressão do polipeptídeo na célula hospedeira, e
(d) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
A invenção ainda fornece um processo para a produção de um polipeptídeo por um método que compreende:
(a) o cultivo de uma célula hospedeira em um meio nutriente que impede a produção de arilsulfatase e sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo,
(b) a expressão do polipeptídeo na referida célula hospedeira, e
(c) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
A invenção ainda fornece um processo para a produção de um polipeptídeo por um método que compreende:
(a) a transformação de uma célula hospedeira com um vetor de expressão, em que o vetor expressa o polipeptídeo,
(b) o cultivo da célula hospedeira em um meio nutriente que impede a produção de arilsulfatase e sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo,
(c) a expressão do polipeptídeo na célula hospedeira, e
(d) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
Em uma modalidade preferida, o polipeptídeo é uma enzima. Em uma modalidade preferida, é fornecido um processo para a produção de uma preparação de enzima, o referido processo compreendendo o preparo de uma enzima por um processo aqui revelado, e recuperação de uma preparação de enzima do meio nutriente ou da célula hospedeira. Maiores especificações serão fornecidas abaixo.
Repressão fermentativa
Em uma modalidade preferida, a preparação de enzima pode ser produzida com o uso de uma cepa hospedeira industrial que é cultivada em um meio de crescimento que limita ou impede a produção de arilsulfatases. Para Pseudomonas aeruginosa, foi descrito que, após cultivo em um meio que contenha excesso de sulfato como a fonte única de enxofre, não se detectava nenhum nível de arilsulfatase, enquanto o uso de etanossulfonato como a fonte única de enxofre leva à produção de quantidades significativas de atividade de arilsulfatase (Beil e cols. (1995) Eur. J.
Biochem. 229, 385-3 94). Portanto, é concebível que o uso de um excesso de sulfato no meio de fermentação também tem um efeito repressor sobre a produção de atividade de arilsulfatase em microorganismos industrialmente mais importantes. Portanto, o crescimento do organismo produtor de enzima em um meio que contenha um excesso de sulfato como fonte de enxofre talvez leve à produção de produtos de enzima preferíveis com uma quantidade reduzida de atividade de arilsulfatase. "Com um excesso de sulfato no meio" significa aqui que ainda resta uma quantidade significativa de sulfato livre no caldo após crescimento do microorganismo ter terminado. Não é necessário para essa invenção que sulfato seja a fonte única de enxofre no meio de crescimento, desde que a quantidade molar de sulfato no meio de crescimento seja maior do que a quantidade molar de qualquer outra substância que contenha enxofre durante o período completo de crescimento. Adicionalmente, também podem ser usados cisteína ou tiocianato em vez de sulfato como fonte preferida de enxofre na repressão da atividade de arilsulfatase. Adicionalmente, também é relevante ter uma quantidade significativa de sulfato, ou de outra fonte repressora de enxofre, em todas as soluções durante a lavagem, estocagem e outras etapas posteriores do processamento, para evitar a desrepressão da atividade de arilsulfatase no caldo, mesmo após o final da fermentação.
Aprimoramento clássico da cepa
Uma cepa deficiente em arilsulfatase pode ser obtida por engenharia genética com o uso de técnicas recombinantes de manipulação genética, submetendo-se o hospedeiro à mutagênese, ou ambos. A modificação ou inativação dos genes que codificam arilsulfatase da presente invenção pode resultar da submissão da célula-mãe à mutagênese e da seleção de células mutantes nas quais a habilidade para expressar arilsulfatases foi reduzida por comparação com a célula-mãe. A mutagênese, que pode ser especifica ou aleatória, pode ser realizada, por exemplo, pelo uso de um agente mutagênico fisico ou químico adequado, pelo uso de um oligonucleotideo adequado ou submetendo-se a seqüência de DNA à mutagênese gerada por PCR. Além disso, a mutagênese pode ser realizada pelo uso de qualquer combinação desses agentes mutagênicos.
Exemplos de um agente mutagênico físico ou químico adequado para essa finalidade incluem radiação gama ou ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N- nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso, etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeos. Quando esses agentes são usados, a mutagênese é realizada tipicamente por incubação da célula-mãe que sofrerá mutagênese na presença do agente mutagênico de escolha sob condições adequadas, e a seleção das células mutantes que exibem expressão reduzida do gene. Alternativamente, essas cepas podem ser isoladas com o uso de técnicas genéticas, tais como hibridização ou pareamento, e fusão de protoplastos ou qualquer outra técnica genética clássica para induzir diversidade genética. A cepa deficiente em arilsulfatase obtida pode ser subseqüentemente selecionada por monitoramento do nível de expressão da arilsulfatase. Opcionalmente, a cepa deficiente em arilsulfatase é subseqüentemente selecionada medindo-se o nível de expressão de certo gene de interesse a ser expresso na célula hospedeira. A seleção de cepas que possuem atividade de arilsulfatase reduzida pode ser feita medindo-se diretamente a atividade de arilsulfatase no caldo de cultura, no sobrenadante da cultura, em células permeabilizadas ou em lisados de células. Para a medida da atividade de arilsulfatase, é possível opcionalmente permeabilizar as células da cepa de produção industrial, incubá-las com um substrato fluorescente (por exemplo, 4- metilumbeliferona-sulfato (MUS)), até que o substrato tenha sido captado pelas células, e rastrear as células com menor atividade de arilsulfatase medindo-se a diminuição da fluorescência. Essa medida pode ser feita diretamente com o uso de um fluorímetro convencional em culturas individuais ou, de preferência, ser feita por citometria de fluxo, de tal forma que as células com baixa fluorescência possam ser separadas e usadas para cultivo posterior. As células usadas nesse procedimento podem ou não sofrer mutagênese antes da incubação com substrato fluorescente.
Alternativamente, cepas que possuem atividade de arilsulfatase reduzida podem ser isoladas por seleção de cepas que não são capazes de crescer em ésteres de sulfato de alquilésteres (por exemplo, cresil sulfato ou etanossulfonato) como fonte única de enxofre no meio de crescimento.
O isolamento de cepas adequadas de acordo com a invenção pode exigir que sejam aplicadas várias rodadas de técnicas genéticas clássicas, especialmente em cepas de produção industrial que não sejam haplóides, mas sim diplóides, aneuplóides ou que possuam uma ploidia diferente, o que ocorre com muitas cepas de leveduras industriais, ou caso a cepa de produção industrial contenha vários genes que codificam arilsulfatase, o que ocorre com fungos.
Técnicas de DNA recombinante
Alternativamente, cepas de produção industrial que possuem uma quantidade reduzida de atividade de arilsulfatase podem ser construídas com o uso de tecnologia de DNA recombinante. Várias técnicas para inativação gênica ou ruptura gênica são descritas na técnica como, por exemplo, ruptura gênica em uma etapa, inserção de marcador, mutagênese sítio-dirigida, eliminação, interferência de RNA, RNA anti-senso, e outras, e podem ser usadas para reduzir, inibir ou alterar a síntese da atividade de arilsulfatase a fim de obter uma cepa de produção industrial com atividade de arilsulfatase diminuída. Além disso, a inativação de arilsulfatase por alteração da(s) seqüência(s) de controle que dirige a expressão do gene de arilsulfatase faz parte da presente invenção. Um exemplo desta é a redução da atividade promotora por ruptura gênica. Utilizando-se técnicas modernas de modificação genética, pode-se obter uma cepa recombinante deficiente em arilsulfatase, preferivelmente por alteração de um gene que codifica atividade de arilsulfatase, mais preferivelmente, por inserção de um gene marcador em um gene que codifica atividade de arilsulfatase, principalmente, por remoção de parte ou de toda a região codificadora de arilsulf atase do genoma. Foram descritos métodos para efetuar essas inativações gênicas para muitos microorganismos diferentes, e eles são conhecidos por aqueles habilitados na técnica (veja, por exemplo, EP357127) e também são descritos no Exemplo 8. A expressão de arilsulfatases na célula mutante pode, dessa forma, ser reduzida ou eliminada. Dependendo da cepa hospedeira que é modificada com o uso dessas técnicas, o procedimento deve ser repetido várias vezes para a remoção de todas ou da maioria das seqüências codificadoras de arilsulfatase.
A modificação ou inativação de um gene do hospedeiro, por exemplo, arilsulfatase, pode ser realizada por técnicas anti-senso estabelecidas com o uso de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos do gene. Mais especificamente, a expressão do gene pode ser reduzida ou eliminada por introdução de uma seqüência de nucleotídeos complementar à seqüência de nucleotídeos, que pode ser transcrita na célula e é capaz de hibridizar para o mRNA produzido na célula. Sob condições que permitem que a seqüência de nucleotídeos anti-senso complementar hibridize para o mRNA, a quantidade de proteína traduzida é, dessa forma, reduzida ou eliminada. Exemplos de expressão de um RNA anti-senso são fornecidos por Ngiam e cols. (Appl. Environ. Microbiol. 66: 775-782, 2000) e Zrenner e cols. (Planta 190: 247-252, 1993).
A modificação, infra-regulação ou inativação de um gene do hospedeiro pode ser obtida através de técnicas de interferência de RNA (RNAi) (FEMS Microb. Lett. 237: 317- 324, 2004). Mais especificamente, a expressão do gene por uma célula fúngica filamentosa pode ser reduzida ou eliminada por clonagem de porções senso e anti-senso idênticas da seqüência de nucleotídeos cuja expressão será afetada, com um espaçador nucleotídico entre eles atrás de cada um, inserindo-os em um vetor de expressão e introduzindo-se o vetor de expressão na célula, onde o RNA de fita dupla (dsRNA) pode ser transcrito e depois processado até um siRNA mais curto que seja capaz de hibridizar para o mRNA-alvo. Após o dsRNA ser transcrito, a formação de pequenos fragmentos nucleotídicos (21-23) de siRNA produzirá uma degradação direcionada do mRNA que se deseja alterar. A eliminação do mRNA específico pode ocorrer em diferentes extensões. As técnicas de interferência de RNA descritas em WO 2005/05672 e WO 2005/026356 podem ser usadas para modificação, infra- regulação ou inativação do gene do hospedeiro.
A cepa deficiente em arilsulfatase, que foi modificada ou inativada por qualquer um dos métodos descritos acima e que produz atividade de arilsulfatase menor do que a célula-mãe quando cultivada sob condições idênticas, medida com a utilização dos mesmos ensaios definidos anteriormente, pode abrigar outra seqüência de nucleotídeos.
Essas cepas de produção industrial com atividade de arilsulfatase diminuída, isoladas ou construídas por técnicas genéticas clássicas ou por tecnologia de DNA recombinante podem ser usadas para processos industriais relevantes que exigem que o produto final não possua sabor estranho. De preferência, essas cepas são usadas para a produção de enzimas industrialmente relevantes. Mais preferivelmente, essas cepas são usadas para a produção de enzimas que são usadas na indústria alimentícia e, ainda mais preferivelmente, essas enzimas são usadas no processamento de laticínios. Principalmente, essas cepas de produção industrial com atividade de arilsulfatase diminuída são usadas para a produção de lactase. Cepas hospedeiras
Cepas hospedeiras industriais adequadas são preferivelmente microorganismos procarióticos, por exemplo, bactérias, ou, mais preferivelmente, organismos eucarióticos, por exemplo, fungos, por exemplo, leveduras ou fungos filamentosos, ou células de plantas. Bactérias do gênero Bacillus são muito adequadas como hospedeiros, por causa de sua capacidade para secretar proteínas no meio de cultura. Outras bactérias adequadas como hospedeiros são aquelas dos gêneros Streptomyces e Pseudomonas. Uma célula hospedeira de levedura preferida para a expressão de uma seqüência de DNA que codifica a enzima de interesse é aquela do gênero Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenulal Piehia, Yarrowia ou Sehizosaeeharomyces. Mais preferivelmente, uma célula hospedeira de levedura é selecionada do grupo que consiste nas espécies Saccharomyees eerevisiae, Kluyveromyces laetis (também conhecido como Kluyveromyces marxianus var. laetis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Yarrowia lipolytica e Schizosaccharomyces pombe.
No entanto, para a expressão de uma enzima, preferem- se principalmente células fúngicas filamentosas hospedeiras. Células fúngicas filamentosas hospedeiras preferidas são selecionadas do grupo que consiste nos gêneros Aspergillus, Triehoderma, Fusarium, Disporotrichum, Penieillium, Aeremonium, Neurospora, Thermoaseus, Myeeliophtora, Sporotriehum, Thielavia e Talaromyees. Mais preferivelmente, uma célula fúngica filamentosa hospedeira é das espécies Aspergillus oyzae, Aspergillus sojae ou Aspergillus nidulans ou é de uma espécie do Grupo Aspergillus niger (como definido por Raper e Fennell, "The Genus Aspergillus", The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp 293-344, 1965). Essas incluem, sem limitação, Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Aspergillus tubigensis, Aspergillus aeuleatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus nidulans, Aspergillus japonieus, Aspergillus oryzae e Aspergillus fieuum, e também aquelas das espécies Triehoderma reesei, Fusarium graminearum, Penieillium ehrysogenum, Aeremonium alabamense, Neurospora crassa, Myeeliophtora thermophilum, Sporotriehum eellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum e Thielavia terrestris.
Exemplos de cepas de produção industrial preferidas dentro do escopo da presente invenção são fungos, por exemplo, espécies de Aspergillus (em particular aquelas descritas em EP-A-184.438 e EP-A-284.603) e espécies de Triehoderma; bactérias, por exemplo, espécies de Baeillus (em particular aquelas descritas em EP-A-134.048 e EP-A- 253.455), especialmente Baeillus subtilis, Baeillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaeiens, espécies de Pseudomonas; e leveduras, por exemplo, espécies de Kluyveromyces (em particular aquelas descritas em EP-A- 096.430, por exemplo, Kluyveromyces lactis, e em EP-A- 301,670), espécies de Saccharomycesl por exemplo, Saccharomyees eerevisiae ou Piehia pastoris, Hansenula polymorpha, Candida utilis ou Yarrowia lipolytiea. A presente invenção está relacionada, principalmente, à produção de lactase desprovida de atividade de arilsulfatase por Kluyveromyces lactis.
Foram isoladas cepas deficientes em arilsulfatase adequadas para a produção de certo polipeptídeo ou enzima em um contexto industrial, em que, surpreendentemente, a cepa deficiente em arilsulfatase produz pelo menos a mesma quantidade de polipeptídeo ou enzima que a cepa do tipo selvagem da qual se origina, sob as mesmas condições de cultura.
De preferência, as cepas deficientes em arilsulfatase da invenção são cepas que possuem menos de 50% da atividade de arilsulfatase intracelular ou extracelular detectável, detectada em uma reação-modelo (veja informações experimentais no Exemplo 2) . Mais preferivelmente, as cepas deficientes em arilsulfatase da invenção são cepas que possuem menos de 50% da atividade de arilsulfatase intracelular. Mais preferivelmente, as cepas deficientes em arilsulfatase da invenção são cepas que possuem uma atividade de arilsulfatase intracelular, que é menos de 25% da atividade de arilsulfatase intracelular da cepa do tipo selvagem da qual se origina, como detectada em uma reação- modelo, preferivelmente menos de 10%, mais preferivelmente, menos de 5%, mais pref erivelmente, menos de 1% e, principalmente, a atividade de arilsulfatase é indetectável nas cepas deficientes em arilsulfatase.
Neste pedido, a cepa CBS 2359 de K. Iactis é tomada como referência dos níveis de arilsulfatase do tipo selvagem que podem ser obtidos em uma cultura de K. lactis, como referência do nível do polipeptídeo do tipo selvagem que pode ser obtido em uma cultura de K. lactis e como referência da atividade de arilsulfatase intracelular que pode ser obtida em uma cultura de K. lactis. Cepas de K. lactis deficientes em arilsulfatase são definidas como cepas que produzem menos atividade de arilsulfatase do que a cepa CBS 2359 de K. lactis sob as mesmas condições de cultura. De preferência, a cepa deficiente em arilsulfatase são cepas de K. lactis que possuem menos de 50% da atividade de arilsulfatase intracelular da cepa CBS 2359 de K. lactis, como detectada em uma reação-modelo. Mais preferivelmente, as cepas de K. lactis deficientes em arilsulfatase da invenção são cepas que possuem uma atividade de arilsulfatase intracelular que é menos de 25% da atividade de arilsulfatase intracelular da cepa CBS 2359 de K. lactis da qual se originam, como detectada em uma reação-modelo, preferivelmente menos de 10%, mais preferivelmente, menos de 5%, mais preferivelmente, menos de 1% e, principalmente, a atividade de arilsulfatase é indetectável nas cepas de K. lactis deficientes em arilsulfatase. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, a cepa de K. lactis deficiente em arilsulfatase usada foi obtida pela aplicação do método definido posteriormente neste pedido. São conhecidos por aqueles habilitados na técnica diversos sistemas para a detecção de polipeptídeos. Os sistemas de detecção incluem qualquer ensaio possível para a detecção de polipeptídeos ou da atividade enzimática.
Como exemplo, esses sistemas de teste incluem, sem limitação, testes baseados em ensaios colorimétricos, fotométricos, fluorométricôs, turbidimétricos,
viscosimétricos, imunológicos, biológicos, cromatográficos, e outros ensaios disponíveis.
De preferência, caso o polipeptídeo produzido seja uma enzima, a quantidade de enzima ativa produzida é determinada medindo-se sua atividade em uma reação-modelo (veja o Exemplo 2).
De acordo com uma modalidade preferida adicional, a cepa deficiente em arilsulfatase da invenção é caracterizada pelo fato de que, quando essa cepa foi transformada com uma construção de expressão que compreende um gene que codifica um polipeptídeo, a referida cepa produz pelo menos a mesma quantidade do polipeptídeo que seria produzida pela cepa do tipo selvagem da qual se origina, sob as mesmas condições de cultura, quando a cepa do tipo selvagem também foi transformada com a mesma construção de expressão que a cepa deficiente em arilsulfatase. De preferência, as cepas deficientes em arilsulfatase da invenção são cepas que produzem a mesma quantidade ou mais de certo polipeptídeo do que a cepa do tipo selvagem da qual se origina, sob as mesmas condições de cultura. Mais preferivelmente, a cepa deficiente em arilsulfatase produz mais de certo polipeptídeo do que a cepa do tipo selvagem da qual se origina, sob as mesmas condições de cultura.
Produção de outros polipeptídeos nativos ou heterólogos e de outras seqüências
De acordo ainda com outra modalidade, a presente invenção está relacionada aos métodos de transcrição de uma seqüência de nucleotídeos em uma célula hospedeira, em que a seqüência transcrita codifica um polipeptideo desejado ou é uma molécula de ácido nucléico funcional, que compreende:
(a) o cultivo, em um meio nutriente, de uma célula hospedeira que compreende (i) um promotor, (iv) uma seqüência de nucleotídeos abaixo que codifica um polipeptideo, (iii) um sinal de parada de tradução e (iv) um sinal de parada de transcrição,
(b) a expressão do polipeptideo na célula hospedeira, e
(c) opcionalmente, a recuperação do polipeptideo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
O polipeptideo produzido pode ser sensível à degradação por protease. Nesse caso, será usada uma célula hospedeira mutante que é deficiente em protease. A cepa deficiente em arilsulfatase é produzida preferivelmente de acordo com o método da presente invenção. A cepa deficiente em arilsulf atase pode crescer ou ser mantida em um meio nutriente adequado à produção do polipeptideo desejado com a utilização de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, as células podem ser plaqueadas em um substrato sólido, agitadas em um frasco, cultivadas em fermentação em pequena ou larga escala (incluindo fermentação contínua, em batelada, em batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais em um meio adequado e sob condições que permitam que o polipeptídeo seja expresso e/ou isolado. 0 cultivo ocorre em um meio nutriente adequado que compreende fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, com o uso de procedimentos conhecidos na técnica (veja, por exemplo, Bennett & LaSure, eds. , "More Gene Manipulations in Fungi", Academic Press, CA, 1991). Meios adequados são disponíveis por fornecedores comerciais ou podem ser preparados com a utilização de composições publicadas (por exemplo, nos catálogos da "American Type Culture Collection")· Caso o polipeptídeo seja secretado no meio nutriente, o polipeptídeo poderá ser recuperado diretamente do meio. Caso o polipeptídeo não seja secretado, ele poderá ser recuperado de lisados de células.
O polipeptídeo resultante pode ser isolado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser isolado do meio nutriente por procedimentos convencionais que incluem, sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem por vaporização, evaporação ou precipitação. O polipeptídeo isolado pode então ser adicionalmente purificado por vários procedimentos conhecidos na técnica incluindo, sem limitação, cromatografia (por exemplo, por troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocusing ou exclusão de tamanho), eletroforese (por exemplo, concentração isoelétrica preparatória), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com acetona ou sulfato de amônio) ou extração (por exemplo, caotrópica, sal, ou pH). Veja, por exemplo, Janson & Ryden, eds., "Protein Purification", VCH Publishers, Nova York, 198 9. O polipeptídeo pode ser detectado com a utilização de métodos conhecidos na técnica que sejam específicos para o polipeptídeo. Esses métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, a formação de um produto de enzima, desaparecimento de um substrato de enzima ou SDS- PAGE. Por exemplo, pode ser usado um ensaio enzimático para determinar a atividade do polipeptídeo. Procedimentos para a determinação da atividade enzimática são conhecidos na técnica para muitas enzimas.
0 polipeptídeo pode ser qualquer polipeptídeo, seja ele nativo ou heterólogo para a cepa deficiente em arilsulfatase. O termo "polipeptídeo heterólogo" é aqui definido como um polipeptídeo que não é produzido por uma cepa do tipo selvagem. 0 termo "polipeptídeo" não visa, aqui, a se referir a um comprimento específico do produto codificado e, portanto, engloba peptídeos, oligopeptídeos e proteínas. A seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo heterólogo pode ser obtida de uma fonte procariótica, eucariótica ou de outra fonte, e pode ser um gene sintético. O termo "obtido de", como aqui usado em relação a certa fonte, visa a significar que o polipeptídeo é produzido pela fonte ou por uma célula na qual um gene da fonte foi inserido.
0 polipeptídeo desejado pode ser um anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste, antígeno, fator da coagulação, enzima, hormônio peptídico ou variante deste, receptor ou porção de ligação de ligante deste, proteína reguladora, proteína estrutural, repórter, proteína de transporte, proteína intracelular, proteína envolvida em um processo secretor, proteína envolvida em um processo de dobradura, chaperona, transportador peptídico de aminoácido, fator de glicosilação ou fator de transcrição.
O polipeptídeo pode ser secretado extracelularmente no meio de cultura.
Não há limitação quanto a uma enzima especifica.
Enzimas preferidas são reveladas no restante da especificação e nos exemplos.
Alternativamente, o polipeptídeo pode ser uma proteína ou enzima intracelular como, por exemplo, uma chaperona, protease ou fator de transcrição. Um exemplo disso é descrito por Punt e cols. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 447-454, 1998). Isso pode ser usado, por exemplo, para aumentar a eficiência de uma célula hospedeira como produtora de proteína caso esse polipeptídeo, por exemplo, uma chaperona, protease ou fator de transcrição, seja sabidamente um fator limitante na produção de proteínas.
Nos métodos da presente invenção, a cepa deficiente em arilsulfatase também pode ser usada para a produção de polipeptídeos recombinantes que sejam nativos para a célula. Os polipeptídeos nativos podem ser produzidos de forma recombinante, por exemplo, colocando-se um gene que codifica o polipeptídeo sob o controle de um promotor diferente para aumentar a expressão do polipeptídeo, para acelerar a exportação de um polipeptídeo nativo de interesse para fora da célula pelo uso de uma seqüência sinalizadora, e para aumentar o número de cópias de um gene que codifica o polipeptídeo normalmente produzido pela célula. A presente invenção também engloba, dentro do escopo do termo "polipeptídeo heterólogo", essa produção recombinante de polipeptídeos nativos para a célula, na medida em que essa expressão envolva o uso de elementos genéticos que não são endógenos à célula, ou o uso de elementos de seqüência endógenos que tenham sido manipulados para funcionar de uma forma que não ocorra normalmente na célula fúngica filamentosa. As tecnologias usadas para isolar ou clonar uma seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptideo heterólogo são conhecidas na técnica, e incluem o isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação destes.
Nos métodos da presente invenção, os polipeptideos heterólogos também podem incluir um polipeptideo fundido ou híbrido no qual outro polipeptideo está fundido no terminal N ou no terminal C do polipeptideo ou fragmento deste. Um polipeptideo fundido é produzido por fusão de uma seqüência de nucleotídeos (ou uma porção desta) que codifica um polipeptideo com uma seqüência de nucleotídeos (ou uma porção desta) que codifica outro polipeptideo.
Tecnologias para a produção de polipeptideos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem a ligação das seqüências codificadoras que codificam os polipeptideos, de forma que eles fiquem in frame e que a expressão do polipeptideo fundido esteja sob o controle do mesmo promotor e finalizador. Os polipeptideos híbridos podem compreender uma combinação de seqüências polipeptídicas parciais ou completas obtidas de pelo menos dois polipeptideos diferentes, em que um ou mais podem ser heterólogos para a célula fúngica mutante. Uma seqüência de nucleotídeos isolada que codifica um polipeptideo heterólogo de interesse pode ser manipulada de diversas formas para permitir a expressão do polipeptideo. Entende- se que o termo "expressão" inclui qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, transcrição, modificação põs-transcrição, tradução, modificação pós-tradução e secreção. A manipulação da seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária, dependendo do vetor de expressão. As tecnologias para a modificação de seqüências de nucleotídeos que utilizam métodos de clonagem são bem conhecidas na técnica.
A seqüência de DNA que codifica o polipeptídeo a ser produzido pode ser ligada operacionalmente às regiões reguladoras do DNA adequadas para assegurar um nível elevado de expressão da referida seqüência de DNA e, preferivelmente, um nível de secreção elevado do referido polipeptídeo. Caso o polipeptídeo a ser produzido seja nativo para a cepa deficiente em arilsulfatase, será usado preferivelmente seu sinal de secreção nativo. Alternativamente, caso o polipeptídeo a ser produzido não seja nativo para a cepa deficiente em arilsulf atase, será feita preferivelmente uma construção de fusão que compreende, por exemplo, o gene de glicoamilase de Aspergillus niger fundido ao gene heterólogo a ser produzido. De acordo com uma modalidade preferida da invenção, são usadas as regiões reguladoras do gene de alfa amilase de Aspergillus oryzae. De acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, são usadas as regiões reguladoras do gene de glicoamilase de' A. niger. De acordo com uma modalidade mais preferida da invenção, são usadas as regiões reguladoras do gene de lactase de K. Iactis. A construção de DNA também pode compreender um marcador selecionável. Alternativamente, o marcador selecionável pode estar presente em uma segunda construção de DNA. Como exemplo, esses marcadores incluem, sem limitação, amdS (genes de acetamidase), genes marcadores auxotróficos, por exemplo, argB trpC, ou pyrG, e genes de resistência antibiótica que fornecem resistência contra, por exemplo, bleomicina, higromicina B ou G418. De preferência, o gene marcador é o gene de acetamidase de Aspergillus nidulans.
Mais preferivelmente, o gene de acetamidase de Aspergillus nidulans é fundido ao promotor gpdA. Mais preferivelmente, o gene de acetamidase de Aspergillus nidulans é fundido ao promotor ADHl de Saccharomyces cerevisiae.
Foi desenvolvido um método para a obtenção de uma cepa deficiente em arilsulfatase que seja adequada à produção de rendimentos elevados de um polipeptídeo e que possa ser usado como produtoras de polipeptídeo em um contexto industrial. O polipeptídeo pode ser homólogo ou heterólogo para a referida cepa deficiente em arilsulfatase. No caso de um polipeptídeo ou uma enzima heteróloga, a cepa do tipo selvagem na qual o método da invenção é aplicado pode ter sido transformada anteriormente para expressar um gene que codifica esse polipeptídeo ou enzima, da forma descrita anteriormente na descrição. Tais cepas deficientes em arilsulfatase produzem pelo menos a quantidade de polipeptídeo que as cepas do tipo selvagem da qual se originam produzem, sob as mesmas condições de cultura. Alternativamente, a construção da cepa deficiente em arilsulfatase pode ser realizada antes da transformação com um gene que codifica esse polipeptídeo ou enzima, da forma descrita anteriormente na descrição.
De acordo com uma modalidade da invenção, os polipeptídeos são conseqüentemente produzidos em uma célula hospedeira da presente invenção com um fenótipo de arilsulfatase reduzida, e essa célula é um mutante de uma célula-mãe útil para a produção de enzimas úteis na indústria alimentícia, em que a célula-mãe compreende uma ou mais seqüências de nucleotídeos que codificam arilsulfatases, e a célula mutante produz menos atividade de arilsulfatase do que a célula-mãe, quando cultivada sob as mesmas condições.
As características preferidas reveladas para um aspecto da invenção também são aplicáveis a outros aspectos da invenção.
A invenção será agora elucidada com referência aos exemplos a seguir, sem, no entanto, ser por eles limitada. Legenda das figuras
Figura 1: Clonagem 5' do gene de arilsulf atase de K. Iactis no vetor TOPO.
Figura 2: Clonagem do f lanço 3' do gene de arilsulfatase de K. Iactis no vetor TOPO.
Figura 3: Clonagem do f lanço 3' do gene de arilsulfatase de K. Iactis, desprovido do sítio SacII, no vetor TOPO.
Figura 4: Combinação do flanco 5' e do cassete de seleção amdS em um plasmídeo.
Figura 5: Combinação do flanco 51 , do flanco 3 1 e do cassete de seleção amdS em um plasmídeo.
Figura 6: Construção final da construção knockout para arilsulfatase. Figura 7: mostra o perfil de endoprotease usando Dabcyl-Edans como substrato. Materiais e métodos
Ensaio da atividade de arilsulfatase: a atividade de arilsulf atase foi determinada com o uso de p- nitrofenilsulfato (obtido de Sigma) como substrato. Para medidas da atividade, 0,5 ml de solução de substrato (20 mM de p-nitrofenilsulfato em 100 mM de tampão NaPi pH 6,5) foi misturado com 0,5 ml de solução de amostra que contém a atividade de arilsulfatase. A solução foi incubada a 37°C por 3 horas. A seguir, a reação foi interrompida por adição de 1,5 ml de 0,5 M NaOH. A OD a 410 nm foi determinada (caminho óptico de 1 cm) contra um experimento em branco em que foi adicionada água em vez da solução de amostra. Como referência, foi preparada uma solução na qual a enzima foi adicionada após a reação ter sido interrompida com NaOH. A OD410 dessa solução de referência foi subtraída da OD410 determinada para a solução na qual a enzima foi ativa por três horas. Uma unidade de arilsulfatase (ASU) é expressa como a mudança da OD410 *10E6/hora. Para produtos líquidos, a atividade de arilsulfatase pode ser expressa como a mudança da OD410 *10E6/hora por ml de produto. Para produtos sólidos, a atividade de arilsulfatase pode ser expressa como a mudança da OD410 *10E6/hora por g de produto. Quando a atividade da enzima de interesse for desconhecida, a atividade de arilsulfatase também poderá ser expressa como a mudança da OD410 *10E6/hora por unidade de atividade de enzima de interesse.
Ensaio da atividade da lactase ácida: a lactase ácida é incubada durante 15 minutos com o-nitrofenil-beta-D- galactopiranosídeo (Fluka 73660) em pH 4,5 e 37°C para gerar o-nitrofenol. A incubação é interrompida por adição de carbonato de sódio 10%. A extinção do o-nitrofenol gerado é medida em um comprimento de onda de 42 0 nm e quantifica a atividade da lactase ácida. Uma unidade de lactase ácida (ALU) é a quantidade de enzima que, sob as condições de teste, gera 1 micromol de o-nitrofenol por minuto.
Ensaio da atividade de endoproteases específicas para prolina: a superprodução e a purificação cromatográfica da endoprotease específica para prolina por Aspergillus niger foram obtidas como descrito em WO 02/45524. A atividade de endoprotease específica para prolina de A. niger foi testada com o uso de CBZ-Gly-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Suíça) como substrato a 37 0C em um tampão de citrato/fosfato dissódico em pH 4,6. Os produtos da reação foram monitorados por espectrofotometria a 405 nM. 0 aumento da absorvência a 4 05 nm no tempo é uma medida da atividade enzimática.
A atividade de endoproteases específicas para prolina com pH ótimo quase neutro é estabelecida exatamente sob as mesmas condições, mas, nesse caso, a reação da enzima é feita em pH 7,0.
A atividade de dipeptidil peptidases específicas para prolina, por exemplo, DPP IV, é estabelecida sob as condições especificadas para endoproteases específicas para prolina com pH ótimo quase neutro, mas, nesse caso, é usado Gly-Pro-pNA como substrato.
Uma unidade de prolina protease (PPU) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de p-nitroanilida por minuto sob as condições especificadas, e era uma concentração de substrato de 0,3 7 mM.
Ensaio da atividade de carboxipeptidases: a atividade da carboxipeptidase derivada de A. niger PepG ("CPG"; Dal Degan e cols., Appl. Env. Microbiol. 58 (1992) 2.144-2.152) foi estabelecida com o uso do substrato sintético FA-Phe- Ala (Bachem, Bubendorf, Suíça) como substrato. A hidrólise enzimática desse substrato (1,5 mM de FA-Phe-Ala em pH 4,5 e 37°C) produz uma diminuição da absorvência, a qual é monitorada em um comprimento de onda de 34 0 nra. Uma unidade (CPGU) é a quantidade de enzima necessária para diminuir a densidade óptica a 34 0 nm por uma unidade absorvência por minuto sob as condições de teste.
Ensaio da atividade de amino peptidases.
A atividade de aminopeptidases é estabelecida com o uso do substrato sintético X-pNA, no qual pNA representa p- nitroanilida e "X" um resíduo de arainoácido. Pelo fato de que as diferentes aminopeptidases podem ter diferentes seletividades, a natureza do resíduo de aminoácido "X" depende da preferência de clivagem da atividade de aminopeptidase testada. Dessa forma, "X" representa o resíduo para o qual a aminopeptidase específica tem a maior preferência. Como muitas aminopeptidases exibem a maior reatividade para Phe, Phe-pNA representa um substrato preferido. Vários substratos X-pNA podem ser obtidos por Bachem (Bubendorf, Suíça). A hidrólise enzimática desse substrato (1,5 mM em pH 6,5 e 37°C) produz um desenvolvimento de cor que é monitorado em um comprimento de onda de 410 nm. Uma unidade (APU) é a quantidade de enzima necessária para aumentar a densidade óptica a 410 nm por uma unidade de absorvência por minuto sob as condições de teste.
Ensaio da atividade de esterases/lipases: esterases e lipases catalisam a liberação de ácidos graxos livres de trigliceróis. No presente ensaio, é usado tributirato de glicerol como substrato. Para estabelecer a atividade de esterase/lipase, o ácido butírico liberado pelo tributirato é titulado com hidróxido de sódio em um pH constante de 7,5. Portanto, a quantidade de hidróxido de sódio dosada por unidade de tempo a fim de manter o pH constante é diretamente proporcional à atividade de esterase da amostra de enzima
A medida é realizada com o uso de uma unidade de radiômetro pH-stat, e os seguintes reagentes:
- solução de goma arábica: dissolver consecutivamente, agitando-se suavemente, 100 g de goma arábica (Sigma) e 500 mg de Thyrool (ICN) em aproximadamente 8 00 ml de água desmineralizada em um frasco volumétrico de 1 litro. Completar até um litro com água e misturar. Centrifugar a solução por 15 minutos a 4.000 rpm. A solução de goma arábica resultante pode ser mantida no refrigerador por 2 meses, mas deve ser preparada pelo menos um dia antes do uso.
hidróxido de sódio 0,02 mol/1: transferir quantitativamente o conteúdo de uma ampola contendo 0,01 mol/1 de NaOH em um frasco volumétrico de 500 ml com água. Completar o volume com água e misturar.
solução de SDS/BSA: dissolver, agitando-se suavemente, 1 g de SDS (Merck) e 1 g de BSA (fração V, Sigma) em aproximadamente 40 ml de água. Evitar a formação de espuma. Completar o volume até 1 litro com água após a dissolução completa do SDS e BSA. Usar somente uma solução recém-preparada.
- emulsão de substrato: pesar 50 g de tributirato de glicerol em uma proveta de vidro de 600 ml e adicionar 3 00 ml de solução de goma arábica. Preparar uma emulsão por agitação por 5 minutos em velocidade máxima com o Ultra Turrax. Ajustar o pH até 7,5 com 0,5 mol/1 de NaOH.
Para testar a atividade de esterase/lipase de uma amostra de enzima em particular, pesar aproximadamente 1 g de amostra de enzima e dissolver na solução de SDS/BSA. Essa solução de amostra deve ter um teor final de enzima equivalente a aproximadamente 0,2 a 0,8 NBGE/ml (veja a seguir) . Manter a solução de amostra no gelo até o início da medida.
Realizar a medida transferindo-se subseqüentemente as soluções seguintes nos vasos de reação aquecidos: 20 ml de emulsão de substrato, 5,0 ml de água (pré-aquecida a 40°C) e deixar pré-aquecer por 15 minutos, e depois iniciar a medida por adição de 5,0 ml de amostra de controle ou da solução de amostra, e começar o programa de esterase VIT 90 da unidade de radiômetro pH-stat.
A unidade de esterase/lipase (NBGE) é definida como a quantidade de enzima que libera 1 μmol de ácido graxo livre do tributirato de glicerol por minuto, em uma temperatura de 40°C e pH 7,5 no procedimento seguinte.
EXEMPLOS
Exemplo 1
Identificação de compostos com sabor estranho no leite longa vida Maxilact LG5000 (DSM, Holanda) foi adicionado sob condições estéreis ao leite longa vida semidesnatado (Friesche Vlag, Holanda) a níveis de 10.000 e 40.000 NLU por litro, e incubado por 4 dias em temperatura ambiente. No experimento de referência, não foi adicionado Maxilact. Antes da avaliação das amostras por avaliadores de paladar, uma amostra fresca de leite com lactase hidrolisada foi preparada por adição de 40.000 NLU por litro de leite semidesnatado, e incubada por 18 horas em temperatura ambiente. A análise da amostra foi realizada no "NIZO Food Research" (Holanda) usando o procedimento de SOIR, que é um procedimento comum no "NIZO Food Research" e que inclui uma análise sensorial e química. A análise sensorial foi realizada diretamente nas amostras preparadas, e foram congeladas a -25°C alíquotas de cada amostra de leite em pequenas porções para análise química posterior.
A análise sensorial foi realizada por uma equipe de avaliação treinada com 9 componentes. A amostra de referência foi descrita como cozida, as outras amostras foram classificadas como leites longa vida não padronizadas. Os atributos principais que descreveram o sabor estranho foram substância química, medicinal, urina/sujeira e estábulo/estrume. Foram isolados compostos voláteis com uma destilação simultânea de alto vácuo próxima à temperatura ambiente, criando um extrato aquoso da amostra. Os compostos voláteis foram subseqüentemente isolados do extrato aquoso com a utilização de um headspace dinâmico, e coletados em um absorvente. Os compostos isolados foram injetados em um cromatógrafo a gás utilizando-se dessorção térmica e separados em uma coluna GC. O efluente de GC foi avaliado por dois assessores treinados (GC-sniff) e descrito em termos de odores (olfactometria). Foram feitas análises GC-sniff duplicadas com alta e baixa concentração por utilização de dois tempos de expurgo diferentes (30 minutos e 24 horas) durante amostragem de headspace dinâmico. Subseqüentemente, os picos (compostos) indicados durante a análise olfatométrica como correspondendo às características de sabor estranho das amostras de leite longa vida com tratamento de lactase foram identificados por espectrometria de massa. Os compostos de interesse que podem explicar a causa do sabor estranho foram identificados como: 1) ésteres (butanoato de etila); 2) compostos de enxofre (sulfeto de dimetila, trissulfeto de dimetila e benzotiazol); 3) ésteres de enxofre (tioacetato de metila, metiltiobutirato); 4) 1- octen-3-ol; 5) 2-nonenal; 6) 8-damascenona; 7) borneol e 8) p-cresol. O p-cresol poderia se originar de conjugados no leite. 0 único composto que estava associado ao atributo sensorial mais ofensivo, "medicinal", foi p-cresol. A concentração de p-cresol nas amostras foi determinada com o uso de análise GC adicionando-se quantidades padronizadas de p-cresol às amostras. A concentração de p-cresol na incubação de 4 dias da amostra de leite longa vida foi estimada em 12 μg por litro. Esse valor está claramente acima do limiar de sabor de 1 ppb e 2 ppb para o ar e a água, respectivamente (Ha e cols. , (1991) J. Dairy Sei. 74, 3.267-3.274). Ele também está na faixa de concentrações de p-cresol comumente encontradas no leite de vaca. Os resultados foram confirmados por experimentos de recombinação no leite, confirmando que o p-cresol é responsável pelo sabor estranho medicinal no leite longa vida com tratamento de lactase.
Exemplo 2
Determinação da atividade de arilsulfatase e β- galactosidase.
A atividade de arilsulfatase foi determinada com o uso de p-nitrofenilsulfato (obtido de Sigma) como substrato. Para as medidas da atividade, 0,5 ml de solução de substrato (20 mM p-nitrof enilsulfato em 100 mM de tampão NaP1 pH 6,5) foi misturado com 0,5 ml de solução de amostra contendo a atividade de arilsulfatase. A solução foi incubada a 37 °C por 3 horas. A seguir, a reação foi interrompida por adição de 1,5 ml de 0,5 M de NaOH. A OD a 410 nm foi determinada (caminho óptico de 1 cm) contra um experimento em branco em que foi adicionada água em vez da solução de amostra. Como referência, foi preparada uma solução na qual a enzima foi adicionada após a reação ter sido interrompida com NaOH. A OD410 dessa solução de referência foi subtraída da OD410 determinada para a solução na qual a enzima foi ativa por três horas. A atividade de sulfatase é expressa como a mudança na OD410 *10E6/hora e por NLU. A atividade de lactase (NLU) para a solução de amostra foi determinada da forma apresentada abaixo.
A atividade de lactase foi determinada como unidades de lactase neutra (NLU) usando o-nitrofenil-β-Ο- galactopiranosídeo (ONPG) como substrato, de acordo com o procedimento descrito em FCC (quarta edição, julho de 1996, páginas 801-802: "Lactase (neutral) β-galactosidase activity"). Exemplo 3
Adição de arilsulfatase ao leite longa vida
O teste de sabor estranho no leite foi realizado com arilsulfatase disponível comercialmente (Sigma, Aerobacter aerogenes, tipo VI; 4,9 mg de proteína/ml; 3,9 unidades de arilsulfatase como definido por Sigma/mg de proteína). No experimento, 50 ml de leite longa vida (Campina, Holanda) foram incubados com 1 ml de solução de enzima a 30°C. 0 desenvolvimento de sabor estranho foi acompanhado por sniffing da amostra. 0 cheiro típico do sabor estranho que também foi descrito no Exemplo 1 para o leite longa vida incubado com lactase era nitidamente perceptível após 2 horas de incubação. 0 cheiro era mais intenso após 17 horas de incubação. Aparentemente, a arilsulfatase gerou um sabor estranho similar ao da lactase. Com base nos achados descritos no Exemplo 1, isso pode ser explicado por uma liberação de p-cresol pelo p-cresilsulfato conjugado no leite. Também foram feitos experimentos nos quais foram adicionadas fosfatase ácida (germe de trigo, Sigma, 6 unidades de fosfatase como definida por Sigma em 4 0 ml de leite) ou glucuronidase (de E. coli, Sigma, 6350 unidades de glucuronidase como definida por Sigma por 4 0 ml de leite) em vez de arilsulfatase. Nessas incubações, não se desenvolveu o sabor estranho típico. Isso sugere que os conjugados de sulfato são os conjugados mais importantes para a formação de sabor estranho no leite de vaca. Isso é consistente com os achados da literatura (Lopez e cols. (1993) J. Agric. Food Chem. 41, 446-454) . Os resultados não excluem completamente a presença de outros compostos com sabor estranho, que poderiam ser gerados por glucuronidase ou fosfatase ácida, mas aparentemente esses compostos não alcançam níveis que sejam maiores do que os limiares de sabor. Exemplo 4
Teste de sabor estranho no leite longa vida: procedimento
Leite longa vida semidesnatado (Campina, Holanda) foi incubado com 20.000 NLU/1 de leite durante 4 8 horas a 30°C. A lactase foi adicionada através de um filtro estéril sob condições estéreis para evitar infecção bacteriana. 0 leite foi provado após 4 8 horas por avaliadores de paladar treinados, e comparado com uma solução de leite que havia sido incubada sob condições idênticas, mas sem a adição de lactase. Foi preparada uma solução de referência, imediatamente antes da prova do sabor, por adição de 5.000 NLU/1 de leite e incubação por 2 horas a 30°C. Esse leite adocicado foi usado como a solução de referência pela equipe de avaliação do paladar. O sabor estranho é classificado pelos avaliadores da seguinte forma: o leite puro foi classificado como "-". Produtos com sabor estranho reduzido que contêm um sabor estranho perceptível, mas leve, recebem "+" , enquanto os produtos que contêm quantidades maiores de sabor estranho são expressos como "++" ou "+++" . A indicação "+++" indica um nível elevado de sabor estranho, percebido como muito desagradável. Os termos usados para caracterizar o sabor estranho foram os iguais aos descritos no Exemplo 1. Exemplo 5
Purificação de lactase de K. Iactis: remoção da atividade de arilsulfatase.
Maxilact LX5000 (DSM, Holanda), uma lactase de K. lactis disponível comercialmente, foi diluído 10 vezes com água, e aplicado a uma coluna Q-Sefarose (Amersham Biosciences), equilibrada em 55 mM de KPi (pH 7,0) . A carga prosseguia até que a atividade de lactase fosse detectada na passagem da coluna. A coluna foi subseqüentemente lavada com 4 volumes de coluna de 55 mM de KPi (pH 7,0) , seguida por eluição de lactase com 65 mM de KPi (pH 7,0) contendo 0,16 M de NaCl. Foram coletadas frações que foram testadas quanto à atividade de lactase. As frações que contêm lactase foram reunidas em pool e carregadas em uma coluna de butil Sefarose (Amersham Biosciences) equilibrada em 55 mM de KPi (pH 7,0) contendo 1 M de NaS04. A lactase foi aplicada à coluna na presença de 1 M de NaS04 (pH 7,0), até que a lactase fosse detectada na passagem da coluna. A coluna foi lavada com 4 volumes de coluna de 55 mM de KPi (pH 7,0) contendo 1 M de NaS04. A lactase foi eluída usando um gradiente linear de 15 volumes de coluna de 55 mM de KPi (pH 7,0) contendo 1 M de NaS04 até 55 mM de KPi (pH 7,0). 0 perfil de eluição foi monitorado por detecção UV (280 nm) . Foram coletadas frações que foram testadas quanto à atividade de lactase. As frações que contêm lactase foram reunidas em pool, com omissão das frações que eram coletadas após o pico de lactase (OD 280 nm) ter diminuído até 50% do valor máximo do pico. A omissão dessas frações é crucial para evitar contaminação da preparação de lactase com arilsulfatase. A eluição de lactase se sobrepõe parcialmente com a eluição de arilsulfatase. 0 produto foi concentrado e dessalinizado por ultrafiltração em um filtro de 10 quilodáltons, e preservado por adição de glicerol a 50% p/p. Exemplo 6
Níveis de protease na lactase purificada
A atividade de protease foi determinada com o uso de uma série de substratos com a fórmula geral Glu(EDANS)-Ala- Ala-Xxx-Ala-Ala-Lys(DABCYL) (Xxx: qualquer um dos 20 aminoácidos naturais). Os substratos foram obtidos de PEPSCAN (Lelystad, Holanda), e são substratos fluorescentes extintos internamente. Quando esses substratos peptídicos são clivados, é produzido um sinal fluorescente. O surgimento de fluorescência, portanto, sinaliza a presença de atividade de endoprotease. A atividade de endoprotease foi determinada em placas de microtitulação de 96 poços por adição de 50 μl de solução de enzima a 200 μl de solução contendo 50 μΜ do substrato em 100 mM de Tris-Bis (pH 6,7).
A mistura de reação foi incubada por 10 minutos a 40°C em uma leitora de placas de microtitulação TECAN Genius, usando o programa de computador Magellan4. Foi acompanhado o desenvolvimento de fluorescência ao longo do tempo (filtro de excitação: 340 nm, filtro de emissão: 492 nm). A atividade de protease foi quantificada como o declive da linha de fluorescência, expressa como RFU/minuto/NLU (RFU: unidades fluorescentes relativas, geradas pelo equipamento Genius). As unidades NLU da amostra de enzima são determinadas da forma apresentada no Exemplo 2. A Figura 7 mostra a grande redução da atividade de protease quando LX5000 é purificado na coluna Q-Sefarose. As frações reunidas em pool após Q-sefarose (exemplo 4) possuem um fator de atividade de protease pelo menos 5-10 menor, em comparação com o material de partida (LX5000). As amostras de lactase nas quais a RFU/min/NLU é < 0,5 para cada um dos substratos usados (veja a figura 1) são definidas como preparações que possuem níveis baixos de atividade de protease.
Exemplo 7
Comparação de lactase não purificada e purificada
Várias preparações de lactase foram submetidas ao teste de sabor estranho descrito no Exemplo 4 . As preparações de lactase difiram no teor de arilsulfatase. Para cada preparação, foram usadas pelo menos duas amostras; as amostras individuais variavam na atividade de arilsulfatase, e as faixas de atividade estão indicadas na coluna da direita da Tabela 1. Os resultados do teste de sabor estranho são apresentados na Tabela 1. Nitidamente, os níveis de atividade de arilsulfatase estão correlacionados com a formação de sabor estranho. Níveis baixos de arilsulfatase (19 ou menos, veja a Tabela 1) não causam a formação de sabor estranho, enquanto níveis crescentes levam â formação aumentada de sabor estranho. Também está claro que a preparação de lactase após Q- Sefarose ainda exibe desenvolvimento de sabor estranho, embora os níveis de protease sejam baixos (veja o Exemplo 5).
Tabela 1: Desenvolvimento de sabor estranho para várias preparações de lactase. 1: Fração com atividade elevada de arilsulfatase, selecionada das frações de eluição em Q- Sefarose descritas no Exemplo 4. 2: o nível de 8 unidades de arilsulfatase (como definidas no Exemplo 2) é o limite de detecção do ensaio. <8 significa que não foi observada atividade de arilsulfatase.
Preparação de Nível de Atividade de V) aril <table>table see original document page 66</column></row><table>
Exemplo 8
Diferentes preparações comerciais de enzimas contêm atividade de arilsulfatase
Vários produtos de enzima produzidos por diferentes fontes e recuperados por diferentes vias de processamento foram coletados e analisados quanto à atividade de arilsulf atase com o uso do ensaio especificado na seção "Materiais e métodos". A partir dos resultados obtidos (veja a Tabela 2), fica claro que as preparações de enzimas obtidas a partir de diversos microorganismos como, por exemplo, Aspergillus oryzae, Kluyveromyces lactis, Rhizomucor miehei, Talaromyces emersonii e Trichoderma harzianum, podem ser seriamente contaminadas com atividade de arilsulfatase.
Essas preparações de enzimas podem ser vantajosamente purificadas pelo processo de acordo com a invenção. Tabela 2: Atividade de aril sulfatase em várias preparações comerciais de enzimas
<table>table see original document page 67</column></row><table> <table>table see original document page 68</column></row><table>
Exemplo 9
Remoção cromatográfica da atividade de arilsulfatase da protease específica para prolina de Aspergillus niger com a utilização de cromatografia por troca iônica
A fim de remover as atividades colaterais de arilsulfatase da endoprotease específica para prolina secretada por A. niger (WO 02/046381), foram rastreadas diversas resinas cromatográficas. Como os pontos isoelétricos da protease e as principais atividades secretadas da arilsulfatase secretada por A. niger tinham uma diferença de pH de aproximadamente 0,5 unidade, a identificação de uma separação cromatográfica que permita uma separação aceitável das duas atividades, mesmo em larga escala, em condições industriais, é muito trabalhosa.
Finalmente, a Sefarose 6FF de troca catiônica SP e a resina de interação hidrofóbica (HIC) butil Sefarose 6FF (Amersham Biosciences Europe) foram selecionadas para testes adicionais. Ambas as resinas foram testadas em colunas Tricorn 5/100 (CV =2,2 ml) usando um AKTA Explorer 100 controlado por UNICORN 3.20, e um Purificador AKTA controlado por UNICORN 3.21, em combinação com um coletor de frações FRAC-950. Após eluição, todas as frações geradas foram testadas quanto à atividade de endoprotease especifica para prolina e atividade de arilsulfatase com a utilização de métodos especificados na seção "Materiais e métodos".
Tabela 3: Condições sob as quais foi realizada a cromatografia SP-Sefarose-6FF.
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Após criar um pool das frações que exibem atividade específica para prolina em direção ao peptídeo cromogênico Z-Gly-Pro-pNA (Bachem, Bubendorf, Suiça), foram comparadas as atividades de arilsulfatase das preparações de enzimas brutas e purificadas cromatograficamente. Constatou-se que, em preparações que exibem exatamente a mesma atividade específica para prolina (9 PPU/ml), a atividade de arilsulfatase foi diminuída de 3800*10E3 unidades/ml na preparação bruta para menos de 30*10E3 unidades/ml na preparação purificada cromatograficamente.
Exemplo 10
Remoção cromatografica da atividade de arilsulfatase da protease específica para prolina de Aspergillus niger com o uso de cromatografia por interação hidrofóbica
A cromatografia por HIC foi realizada sob as seguintes condições: foi usado como material de partida um diafiltrado da endoprotease específica para prolina derivada de A. niger que possui uma atividade de 10 PPU/ml. Esse diafiltrado foi diluído duas vezes com 20 mM de tampão de citrato contendo 2 M de Na2S04 (pH 4,2, G = 121 mS/cm) e foi subseqüentemente esterilizado por filtração (0,2 μm) , antes da carga na coluna.
Tabela 4: Condições sob as quais foi realizada a purificação do Exemplo 10.
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Em conseqüência de uma formação considerável de resíduos após carga da enzima na coluna, foi necessário um longo procedimento de lavagem para obter a separação basal. Finalmente, a endoprotease específica para prolina pode ser eluída da coluna com tampão B. As frações que contêm a atividade específica para prolina proteolítica foram reunidas em um pool. Embora diluído, esse material purificado mostrou atividade de arilsulfatase significativamente diminuída se recalculado em relação à atividade proteolítica original, demonstrando que a atividade endoproteolítica específica para prolina e a atividade de arilsulfatase foram separadas eficazmente com o uso desse protocolo de cromatografia por interação hidrofóbica. Além disso, constatou-se que, em preparações que exibem exatamente a mesma atividade específica para prolina (9 PPU/ml), a atividade de arilsulfatase foi reduzida de 3800*10E3 unidades/ml na preparação bruta para menos de 3 0*10E3 unidades/ml na preparação purificada cromatograficamente.
Exemplo 11
A endoprotease específica para prolina de A. niger purificada gera hidrolisados de caseína sem odores estranhos Para testar o desempenho da endoprotease específica para prolina purificada cromatograficamente, foram preparados dois hidrolisados de caseína utilizando-se uma endoprotease específica para prolina purificada cromatograficamente e uma purificada não cromatograficamente exatamente nos mesmos protocolos.
A uma solução contendo 100 g/l de caseinato de sódio (Murray Goldbern, Nova Zelândia) e água, foi adicionada subtilisina (ProtexA L; 25 mililitro/grama de proteína), e ela foi incubada por 4 horas a 60°C em um pH similar. O precipitado formado se dissolveu lentamente durante agitação. AO final, foi obtida uma solução clarificada com um pequeno precipitado. A seguir, o pH da solução foi ajustado até o pH 4,5, e o líquido foi dividido em volumes iguais. A um desses volumes, foi adicionado 1 PPU de uma prolil endopeptidase bruta de A. niger por grama de hidrolisado de caseína; ao outro volume foi acrescentado 1 PPU de uma prolil endopeptidase de A. niger purificada cromatograficamente. A incubação prossegui por 9 horas a 55°C, seguida por uma ultrafiltração de 10 kDa para ambas as soluções. Após uma etapa adicional de inativação por aquecimento (5 segundos a 120°C) e um período de resfriamento, o paladar e o odor dos dois líquidos foram avaliados por uma equipe de 5 avaliadores treinados na detecção e classificação de sabor estranhos e odores diferentes em hidrolisados de leite. A equipe foi unânime em sua conclusão de que o hidrolisado preparado com a endoprotease bruto específica para prolina tinha um odor e sabor característicos "de estábulo", ausentes na preparação produzida com a endoprotease específica para prolina purificada cromatograficamente.
Tabela 5: Visão geral dos resultados dos exemplos 11 e 13
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Exemplo 12
Remoção cromatográfica da atividade de arilsulfatase de uma carboxipeptidase de Aspergillus niger
Como os pontos isoelétricos da carboxipeptidase (ponto isoelétrico de 4,5) e a arilsulfatases secretada principal de A. niger (pontos isoelétricos de 5,0 e 5,4) são próximos, a separação cromatográfica das duas enzimas provou ser bem difícil. No entanto, o procedimento seguinte nos permitiu obter uma carboxipeptidase pura, livre de atividade de arilsulfatase. E o mais importante, o método é relativamente simples e, portanto, ele pode ser realizado em escala industrial.
Novamente, foi usada uma resina de SP-Sefarose FF. A cromatografia foi efetuada sob as seguintes condições: Tabela 6: Condições sob as quais é realizada a cromatografia do Exemplo 12
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Após a enzima bruta ter sido aplicada à coluna, a coluna foi lavada com tampão A para remover contaminações não ligadas/ligeiramente ligadas. Finalmente, a carboxipeptidase é eluída com tampão Β. O pico que contém a atividade em direção à hidrólise do peptídeo cromogênico FA-Phe-Ala-OH (Bachem, Bubendorf, Suíça) foi coletado. Em preparações de carboxipeptidase que contêm atividades de carboxipeptidase comparáveis (2.060 CPG/g; veja a seção "Materiais e métodos" para determinação da atividade), a atividade de arilsulfatase diminui de um valor inicial de 31200*10E3 unidades/ml na enzima bruta para 10*10E3 unidades/ml na preparação purificada.
Exemplo 13
A carboxipeptidase purificada de A. niqer acelera a maturação de queijos Gouda sem a geração de sabor estranhos.
O leite foi não padronizado e coletado do NIZO. O queijo Gouda foi fabricado com o uso do método NIZO. Resumidamente: após adição inicial, agitar por 15-20 minutos. A seguir, adicionar renina, agitar por 3 minutos e deixar em repouso (aproximadamente 45-50 minutos). Cortar o coágulo usando o disco de aumento gradual. Isso levará 10 minutos, e tem uma velocidade final de 8,5. Girar as lâminas e agitar por mais 10 minutos na velocidade 11. Drenar até que permaneça 120 1 no tanque. Adicionar 36 1 (30% do volume restante) de água a 55°C para obter uma temperatura final no tanque de 35,5-35,7°C, agitando em na velocidade 16. Agitar por 60 minutos na velocidade 16. Coletar a coalhada e deixar em repouso por 15 minutos. Dividir a coalhada sobre os moldes (pesar), e deixar era repouso os moldes preenchidos por 3 0 minutos. Comprimir por 30 minutos a 0,7 bar (adicionar o código do queijo após a primeira compressão), 30 minutos a 1,2 bar e, a seguir, mais 30 minutos a 1,7 bar. Virar a coalhada depois de cada compressão. Após a compressão, a pressão é removida e os queijos repousam nos moldes (de um dia para o outro na sala onde é salgado a 13°C) . Os queijos são removidos dos moldes e entram na salmoura por 3 0 horas e são virados duas vezes para assegurar que sejam salgados uniformemente. Maturação a 13°C, com 88% de umidade. 0 método é padronizado com uma proporção de gordura para proteína de 1,05 (equivalente a cerca de 0,85 de gordura para caseína) . Após a pasteurização, o leite era bombeado era tanques de queijo de 200 litros. Delvo®-TEC UX21A (1,5 U; DSM Food Specialities, Delft, Holanda) foi usada como cultura de partida, e Maxiren® 600 (55 IMCU/1 de leite; DSM Food Specialities, Delft, Holanda) como renina. Os queijos eram salgados por 26 horas e maturados a 13 °C, 88% de umidade relativa. PepG purificado e não purificado foi adicionado com a renina em um nível de 200 CPGU/litro de leite.
Após 6 e 24 semanas de maturação, amostras representativas de um queijo de cada tanque de queijo foram classificadas usando uma equipe de avaliação interna. Essas sessões ocorreram de ura modo round-the-place, o que significa que os avaliadores eram informados dos detalhes do experimento e posteriormente discutiam seus achados, os quais eram então resumidos.
Tabela 7: Resultados do Exemplo 13: 6 semanas (n=7)
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Verificou-se um efeito nítido em conseqüência da adição de PepG, tanto purificado quanto não purificado. O toque amargo e os desequilíbrios relatados para os queijos nos quais se utilizou PepG não purificado levam ã conclusão de que o PepG deve ser purificado.
EXEMPLOS 14-15
Nos exemplos descritos a seguir, foram realizadas técnicas padronizadas de clonagem molecular, por exemplo, isolamento e purificação de ácidos nucléicos, eletroforese de ácidos nucléicos, modificação enzimática, clivagem e/ou amplificação de ácidos nucléicos, transformação de E. coli etc., como descrito na literatura (Sambrook e cols. (2000) "Molecular Cloning: a laboratory manual", terceira edição, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, Nova York, e Innis e cols. (eds.) (1990) "PCR protocols, a guide to methods and applications" Academic Press, San Diego).
Exemplo 14
Construção de uma cepa knockout para arilsulfatase de Kluyveromyces Iactis Isolamento de DNA cromossômico de Kluyveromyces lactis:
Um frasco agitado de 100 ml de YEPD (1% de extrato de levedura; 1% de Bacto-peptona; 2% de glicose) foi inoculado com uma colônia única de K. lactis CBS 2359, e cultivado por 24 horas a 30°C com agitação a 28 0 rpm. A quantidade de células foi contada com a utilização de uma câmara de contagem, e foi usada uma quantidade de cultura que corresponde a 4,1*108 células. A extração de DNA cromossômico foi realizada com o uso do Kit Fast DNA Spin fornecido por Q-BlOgene (Cat. # 6540600). O protocolo de levedura foi utilizado: a etapa de homogeneização utilizando o homogeneizador Fastprep FP120 (B10101 Savant) de 40 segundos, com a velocidade de ajustada em 6,0. Subseqüentemente, a amostra foi resfriada no gelo e subseqüentemente homogeneizada novamente com o uso das mesmas condições.
A pureza e o rendimento do DNA genômico extraído foram determinados com o uso do espectrofotômetro Nanodrop ND1000. Constatou-se que a concentração do extrato era de 114 nanogramas/microlitro. Verificou-se que as proporções A260/280 e A260/230 eram de 1,57 e 0,77, respectivamente.
Amplificação por PCR dos f lanços 5' e 3' de arilsulfatase:
Iniciadores do flanço 5' de arilsulfatase: DFS-15289 (5' —>3 ' ) : TCG CCG CGG TTG TCA ACT ATA TTA
ACT ATG
DFS-15290 (5' —>3') : GAT AGA TCA TAG AGT AAC AAT TGG
Flanco 3' de arilsulfatase:
DFS-15291 (5' —>3' ) : GCA ACT GAA GGT GGT ATC AAT TG
DFS-15292 (5' —>3' ) : CAC CCG CGG CAC CAG ATA ATG GAG GTA G
Flanco 3' de SacII- arilsulfatase:
DFS-15291 (5' —> 3') : GCA ACT GAA GGT GGT ATC AAT TG DFS-15340 (5' —> 3') : CGG CAC CAG ATA ATG GAG GT
Os flancos de arilsulfatase foram amplificados com o uso de "Phusion High-Fidelity DNA Polymerase" (Finnzymes, Espoo, Finlândia). 0 DNA genômico de K. Iactis CBS 2359 foi diluído 100 vezes com água Milli-Q e, foram utilizados 5 μl como modelo em uma mistura de PCR de 50 μl, de acordo com as instruções do fornecedor. Um bloco de PCR Hybaid MBS 0.2G utilizou os seguintes programas:
Programa de PCR para o flanço 5' de arilsulfatase:
Estágio 1 (1 ciclo) 98°C 30 s
Estágio 2 (30 ciclos) 98°C 10 s
60°C 30 s
72°C 30 s
Estágio 3 (1 ciclo) 72°C 10 min
4°C Manter
Programa de PCR para o flanço 3
Estágio 1 (1 ciclo) 98°C 30
Estágio 2 (30 ciclos) 98°C 10
72°C 30 s
72°C 30 s
Estágio 3 (1 ciclo) 72°C 10
4°C Manter
Programa de PCR para o f lanço 3' SacIII- de arilsulfatase:
Estágio 1 (1 ciclo) 98°C 30 s
Estágio 2 (30 ciclos) 98°C 10 s
65°C 30 s 72 °C 30 s
Estágio 3 (1 ciclo) 72°C 10 min
4ºC Manter
Construção de um vetor knockout para arilsulfatase:
Os fragmentos de PCR dos flanços 5', 3' e 3' SaeII- arilsulfatase obtidos foram clonados no vetor pCR-Blunt II- TOPO usando o Kit de Clonagem por PCR Zero Blunt TOPO (Invitrogen; código do produto: 45-0245) , de acordo com as instruções do fornecedor. As reações de clonagem TOPO foram transformadas em E. coli guimicamente competente "One Shot TOP10" (Invitrogen; código do produto: 440301) de acordo com as instruções do fornecedor. Foram selecionados os clones corretos com base na análise do padrão de restrição com o uso de MunI SacII, XcmI e DraI; Muni, SacII, EcoRl e ScoRV; Muni, EcoRl, EcoRV e SacII para, respectivamente, 5' TOPO, 3* TOPO e 3* SacII-TOPO.
O cassete amdS foi isolado do vetor pKLACl (New England Biolabs). O plasmideo pKLACl foi transformado em células de E. coli dam-Idcm- quimicamente competentes (New England Biolabs; N0 de Catálogo: C2925H), e foi isolado o plasmideo não metilado.
Foram isolados grandes lotes de DNA de plasmideo do vetor 5' TOPO, 3' TOPO, 3' SacII- TOPO e pKLACl de culturas em LBC de um dia para o outro contendo 50 pg/ml de canamicina usando o Kit "GeneElute Plasmid MidiPrep"
(Sigma; N0 de Catálogo: NA0200).
O vetor pKLACl foi digerido com Sall e Xball e o vetor 51 TOPO foi digerido com Xbal e Xhol. Os produtos digeridos foram purificados com o uso do Kit "Nucleospin ExtractII" (Machery Nagel) de acordo com as instruções do fornecedor. O cassete amdS digerido com Sall/Xbal foi ligado no vetor 51 TOPO digerido com Xbal/XhoI utilizando o kit de ligação "Quick" (New England Biolabs; N° de Catálogo: M2200S) de acordo com as instruções do fornecedor. A mistura de ligação foi transformada em E. coli quimicamente competente "One Shot TOPIO" (Invitrogen; código do produto: 44-0301) de acordo com as instruções do fornecedor. Foi selecionado um clone correto com base na análise do padrão de restrição usando Muni, EcoRI e Saci. Isso produziu o seguinte vetor: vetor 5'amdS TOPO (Figura 1).
Foi isolado um grande lote do plasmideo 5'amdS TOPO de culturas em LBC de um dia para o outro contendo 50 pg/ml de canamicina usando o Kit "GeneElute Plasmid MidiPrep" (Sigma; N° de Catálogo: NA0200) de acordo com as instruções do fornecedor. O vetor 5' amdS TOPO foi digerido com MunI e AscIl e o vetor 3' SacII- TOPO foi digerido com MunI e EcoRI.
O fragmento Munl/EcoRI 3' SacII- TOPO foi isolado e purificado através de extração em gel. Foi realizada uma eletroforese em agarose 1% em tampão TAE contendo corante de DNA "SYBR Safe" (Invitrogen; N° de Catálogo: S33102), de acordo com as instruções do fornecedor. O fragmento foi visualizado com a utilização de um transiluminador de leitura no escuro (Clare Chemical Research; N° de Catálogo: 25 DR-45M), retirado do gel e extraído da agarose com o uso do kit "the Nucleospin ExtractII" (Machery Nagel; N° de Catálogo: 740 609.250) de acordo com protocolo de extração em gel do fornecedor.
O vetor 5' amdS TOPO foi digerido com MunI e AscI e purificado com a utilização do Kit "Nucleospin ExtractII" (Machery Nagel) de acordo com o protocolo de purificação por PCR do fornecedor. Subseqüentemente, o vetor 5'amdS TOPO digerido com Muni/Asei foi desfosforilado usando fosfatase alcalina de camarão (Roche; N0 de Catálogo: 1 758 250) de acordo com as instruções do fornecedor.
O fragmento Munl/EcóRI 3' SacII-TOPO foi ligado no vetor 5' amdS TOPO desf osf orilado digerido com Muni/Asei utilizando o kit de ligação "Quick" (New England Biolabs; N0 de Catálogo: M2200S) de acordo com as instruções do fornecedor. A mistura de ligação foi transformada em células de E. coli dam-I dcm- quimicamente competentes, (New England Biolabs; N° de Catálogo: C2925H) de acordo com as instruções do fornecedor. Foi selecionado um clone correto com base na análise do padrão de restrição com a utilização de EcoRI e EcoRV. Isso produziu o seguinte vetor: vetor 5' amdS 31 SacII-TOPO.
Foi isolado um grande lote do vetor 5'amdS 3' SacII- TOPO de culturas em LBC de um dia para o outro contendo 50 pg/ml de canamicina usando o Kit "GeneElute Plasmid MidiPrep" (Sigma; N0 de Catálogo: NA0200) de acordo com as instruções do fornecedor.
O vetor 5'amdS 3'SacII foi digerido com Xbal. 0 vetor 3' TOPO foi digerido com XbaI e SpeI. Os produtos digeridos foram purificados com o uso do Kit "Nucleospin ExtractII" (Machery Nagel) de acordo com as instruções do fornecedor. 0 fragmento XbaI/SpeI 3' TOPO foi isolado através de extração em gel, como descrito acima. 0 vetor 5'amdS 3'SacII- digerido com XbaI foi desfosforilado usando fosfatase alcalina de camarão, Roche (N° de Catálogo: 1 758 250) , de acordo com as instruções do fornecedor. 0 fragmento XbaI/SpeI 3' foi ligado no vetor 51amdS 3' SacII- desfosforilado digerido com XfoaI utilizando o kit de ligação "Quick" (New England Biolabs; N° de Catálogo: M2200S) de acordo com as instruções do fornecedor. A mistura de ligação foi transformada em E. coli quimicamente competente "One Shot TOPIO" (Invitrogen; código do produto: 44-03 01). Foi selecionado um clone correto com base na análise do padrão de restrição usando MfeI, KpnIl EcoRll SacII, ScaI. Isso produziu o vetor knockout para arilsulfatase de K. Iactis final (figura 3).
Foi isolado um grande lote do vetor knockout para arilsulf atase de culturas em LBC de um dia para o outro contendo 50 pg/ml de canamicina usando o Kit "GeneElute Plasmid MidiPrep" (Sigma; N0 de Catálogo: NA0200) de acordo com as instruções do fornecedor. 0 vetor knockout para arilsulfatase de K. Iactis foi digerido com SacII e, dessa forma, seria obtido o cassete linear knockout, desprovido da parte do vetor TOPO. 0 produto digerido foi purificado com a utilização do Kit "Nucleospin ExtractII" (Machery Nagel) de acordo com as instruções do fornecedor.
Transformação de K. Iactis CBS 2359 com vetor knockout para arilsulfatase
Uma cultura em 100 ml de YEPD de K. Iactis CBS2359 foi incubada a 30°C, com agitação a 28 0 rpm por 24 horas. Essa cultura foi usada para inocular uma cultura com 100 ml de YEPD que havia crescido sob as mesmas condições até que fosse alcançada uma OD6IO entre 0,5 e 0,8.
As células foram coletadas através de centrifugação por 5 minutos a 1.559 g e 4°C. 0 pélete de células é lavado com 50 ml de tampão de eletroporação (EB) estéril: 10 mM de Tris pH 7,5, 9,2% (p/v) Sacarose, 1 mM de MgCl2 a 4 °C. O pélete de células foi re-suspenso em 50 ml de YEPD contendo 2 5 mM de DTT e 20 mM de tampão HEPES pH 8,0 em temperatura ambiente. As células foram incubadas por 30 minutos a 30°C, sem agitação. As células foram coletadas através de centrifugação por 5 minutos a 1.559 g e 4°C, e lavadas com 10 ml de EB gelado. As células foram novamente peletizadas através de centrifugação por 5 minutos a 1.559 g e 4°C, e re-suspensas em 0,1 ml de EB gelado. A suspensão de células foi distribuída em alíquotas de 40 microlitros em 1,5 ml de tubos de Eppendorf. A uma alíquota de células, foi adicionado 0,2-1,0 micrograma (1-5 microlitros) da construção linear knockout, misturado por pipetagem e incubado no gelo por 15 minutos. A mistura de células-DNA foi adicionada a um cadinho de eletroporação resfriado com um tamanho de lacuna de 2 mm (BTX; código do produto 45- 0125) . A eletroporação foi realizada em um aparelho de eletroporação BioRad, composto de um "Gene Pulser" (BioRad, Modelo N0 1652077) e um "Pulse Controler" (BioRad, Modelo N° 1652098) usando os seguintes ajustes: 1.000 V, 400 Ohm e 25 μF. Imediatamente após a eletroporação, 1 ml de YEPD foi adicionado, e as células foram transferidas a um tubo estéril de 12 ml, e incubadas durante 2 horas em uma incubadora com agitação a 30°C. As células foram peletizadas por 5 minutos a 1.559 g, e lavadas em soro fisiológico (cloreto de sódio 0,85% (p/v)). As células foram novamente peletizadas e re-suspensas em 1 ml de soro fisiológico. Várias alíquotas de 25 μΐ, 50 μΐ e 100 μl foram plaqueadas em placas de ágar seletivas para amdS: ágar 1,25% (p/v), Base de Carbono de Levedura 1,17% (p/v), 30 mM de tampão fosfato pH 6,8, e 5 mM de acetamida. As placas foram incubadas por 2 dias a 30°C, seguido por incubação por 2 dias em temperatura ambiente.
As colônias foram selecionadas e purificadas espalhando-as em placas de ágar YEPD, e, dessa forma, surgiram colônias únicas que foram incubadas a 30°C por 24 horas. Essas colônias únicas foram testadas quanto à integração visada da construção knockout usando um PCR de colônias com oligonucleotídeos dirigidos contra o cassete amdS e abaixo da construção knockout integrada. 0 material da colônia foi suspenso em 20 mM de NaOH, 0,2% (p/v), e incubado por 5' a 98°C. A suspensão de células foi diluída 2 vezes com água, e 2,5 microlitros foram usados diretamente como modelo em uma reação de PCR de 25 microlitros com a utilização de "Phusion High-Fidelity DNA Polymerase" (Finnzymes; Espoo Finlândia; Código do Produto F-5305) de acordo com as instruções do fornecedor.
Fw 3 * amdS: GAC AAT TGA TAC CAC CTT CAG TTG Rv abaixo: CTG GGA AAT GTG GTG ACT CCA TA
Programa de PCR direcionada:
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A PCR foi analisada em géis de agarose 1% e os transformantes-alvo que exibem uma banda amplificada nítida foram selecionados. As cepas knockout para arilsulfatase foram denominadas 23 5AARY1-10, e estocadas até serem usadas posteriormente. Exemplo 15
Detecção da atividade de arilsulfatase em 235ÁARY1
A cepa-mãe CBS 2359 e a cepa 235ÀARY1 foram cultivadas em um frasco em agitação em 100 ml de YEP + galactose 2% por 3 dias a 30°C. A biomassa foi coletada por centrifugação por 5 minutos a 1.55 9 g e 4 °C. A biomassa foi lavada duas vezes com água gelada para remover os componentes do meio. A biomassa de levedura foi tratada com reagente de Extração de Proteína de Levedura (Y-PER) de acordo com as instruções do fabricante (Pierce), para extrair enzimas intracelulares como, por exemplo, arilsulfatase. Ficará evidente para aqueles habilitados na técnica que poderiam ser utilizados outros protocolos de Iise de leveduras para extrair a atividade de arilsulfatase como, por exemplo, cisalhamento mecânico com glóbulos de vidro, ou tratamento enzimático para dissolver a parede celular com, por exemplo, Zymolyase (veja, por exemplo, Glover e Hames, "DNA cloning 2 — a practical approach", IRL Press 1995) .
A arilsulf atase foi medida no extrato com o uso do método descrito no Exemplo 2. A partir desse experimento, tornou-se claro que, embora a cepa-mãe contivesse uma quantidade apreciável de atividade de arilsulfatase, essa atividade não poderia ser detectada na cepa 2359ÁARY. Quando a atividade de β-galactosidase (lactase) foi medida nesse extrato de acordo com o Exemplo 2, não pôde ser detectada diferença na atividade de lactase entre a cepa do tipo selvagem CBS 2359 e a cepa mutante 2359ÀARY, mostrando que a cepa mutante é alterada especificamente na atividade de arilsulfatase.
A cepa mutante pode ser usada para se produzir uma preparação de lactase em escala industrial, praticamente desprovida de atividade de arilsulfatase.

Claims (45)

1. Lactase caracterizada por compreender atividade de menos de 40 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
2. Lactase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender atividade de menos de 30 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase, mais preferivelmente, atividade de menos de 20 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase e, principalmente, atividade de menos de 10 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
3. Lactase, de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizada por ser uma lactase de produção intracelular.
4. Lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizada por ser uma lactase neutra, preferivelmente uma lactase de K. Iactis.
5. Lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizada por ter um pH ótimo entre pH = 6 e pH = 8.
6. Lactase, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4 ou 5, caracterizada por ter menos de 0,5 de RFU/min de atividade de protease por NLU de atividade de lactase.
7. Composição caracterizada por compreender lactase de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
8. Laticínio caracterizado por compreender lactase de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, ou 6, ou uma composição de acordo com a reivindicação 7.
9. Processo para a produção de um laticínio, caracterizado por compreender a adição de uma lactase de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, ou de uma composição de acordo com a reivindicação 7 a um laticínio que compreende lactose.
10. Processo para a produção de um laticínio caracterizado por ser livre de sabor estranhos produzidos por arilsulfatase que compreende a utilização de uma lactase de qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou -6 ou de uma composição de acordo com a reivindicação 7.
11. Processo para purificar uma preparação de enzima que contém lactase, caracterizado por compreender a separação de arilsulf atase de lactase com o uso de cromatografia.
12. Processo caracterizado por compreender o tratamento de um substrato com uma preparação de enzima, em que a preparação de enzima é substancialmente livre de arilsulfatase.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a preparação de enzima é uma preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43.
14. Processo, de acordo com a reivindicação 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que o processo compreende a obtenção da preparação de enzima por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25 ou a reivindicação 34 ou 35.
15. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o referido substrato é um substrato proteináceo.
16. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o referido substrato contém um alquil fenol substituído com um grupo sulfato.
17. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o substrato contém proteína do leite, por exemplo, caseína e/ou proteína do soro do leite.
18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o substrato é leite, um laticínio fermentado, por exemplo, iogurte, soro do leite, um hidrolisado e/ou carne.
19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18, caracterizado pelo fato de que o nível de arilsulfatase no substrato durante o referido tratamento é de, no máximo, 500*10E3 unidades de arilsulfatase por litro de substrato, preferivelmente no máximo 250*10E3, preferivelmente no máximo 100*10E3, preferivelmente no máximo 50*10E3, preferivelmente no máximo 25*10E3 unidades de arilsulfatase por litro de substrato.
20. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ou 19, caracterizado pelo fato de que a preparação de enzima compreende uma lactase, uma protease, uma lipase ou uma esterase.
21. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou -20, caracterizado por ser um processo para a preparação de um produto nutritivo (por exemplo, um laticínio).
22. Produto caracterizado pelo fato de que pode ser obtido pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21.
23. Processo para a produção de uma preparação de enzima, o referido processo caracterizado por compreender a purificação de uma preparação de enzima bruta que contém uma enzima de interesse e arilsulfatase, em que a arilsulfatase é separada da enzima de interesse.
24. Processo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a referida purificação resulta em uma redução de atividade de arilsulfatase de pelo menos 50%, pref erivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, mais preferivelmente pelo menos 95%, mais preferivelmente pelo menos 99%.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 23 ou 24, caracterizado pelo fato de que a referida purificação é feita por cromatografia, preferivelmente em uma etapa única de separação cromatografica.
26. Processo para a produção de uma célula hospedeira caracterizada por ser uma cepa deficiente em arilsulfatase, que compreende o desenvolvimento de uma cultura que produz arilsulfatase sob condições em que parte da cultura seja modificada para formar a célula hospedeira deficiente em arilsulfatase, e o isolamento da célula hospedeira.
27. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que são usadas condições de mutagênese, preferivelmente condições de mutagênese aleatória como, por exemplo, mutagênese física ou química.
28. Processo, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que são usadas técnicas recombinantes de manipulação genética, preferivelmente ruptura gênica em uma etapa, inserção de marcador, mutagênese sítio-dirigida, eliminação, interferência de RNA, RNA anti-senso.
29. Processo para a produção de um polipeptídeo por um método caracterizado por compreender: (a) o cultivo de uma célula hospedeira deficiente em arilsulfatase em um meio nutriente, sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo, (b) a expressão do polipeptídeo na referida célula hospedeira, e (c) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
30. Processo para a produção de um polipeptídeo por um método caracterizado por compreender: (a) a transformação de uma célula hospedeira deficiente em arilsulfatase com um vetor de expressão, em que o vetor expressa o polipeptídeo, (b) o cultivo da célula hospedeira em um meio nutriente, sob condições que conduzem ã expressão do polipeptídeo, (c) a expressão do polipeptídeo na célula hospedeira, e (d) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
31. Processo para a produção de um polipeptídeo por um método caracterizado por compreender: (a) o cultivo de uma célula hospedeira em um meio nutriente que impede a produção de arilsulfatase, e sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo, (b) a expressão do polipeptídeo na referida célula hospedeira, e (c) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
32. Processo para a produção de um polipeptídeo por um método caracterizado por compreender: (a) a transformação de uma célula hospedeira com um vetor de expressão, em que o vetor expressa o polipeptídeo, (b) o cultivo da célula hospedeira em um meio nutriente que impede a produção de arilsulfatase, e sob condições que conduzem à expressão do polipeptídeo, (c) a expressão do polipeptídeo na célula hospedeira, e (d) opcionalmente, a recuperação do polipeptídeo do meio nutriente ou da célula hospedeira.
33. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 29, 30, 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é uma enzima.
34. Processo para a produção de uma preparação de enzima, o referido processo caracterizado por compreender o preparo de uma enzima por um processo de acordo com a reivindicação 33, e recuperação de uma preparação de enzima do meio nutriente ou da célula hospedeira.
35. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25 ou com a reivindicação 33 ou -34, caracterizado pelo fato de que a enzima é uma lactase, uma protease, uma lipase ou uma esterase.
36. Preparação de enzima caracterizada pelo fato de que pode ser obtida pelo processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 ou 25 ou com a reivindicação -35.
37. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, -22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 ,32, 33, 34, 35 ou -36, caracterizada pelo fato de que a preparação de enzima compreende uma lactase, uma protease, uma lipase e/ou uma esterase.
38. Preparação de enzima caracterizada por compreender uma carboxipeptidase, preparação essa que compreende menos de 10.000 unidades de atividade de arilsulfatase por CPG.
39. Preparação de enzima de acordo com a reivindicação -38, caracterizada por compreender menos de 1.000 unidades, preferivelmente menos de 100 unidades, preferivelmente menos de 50, pref erivelmente menos de 10 unidades de atividade de arilsulfatase por CPG.
40. Preparação de enzima caracterizada por compreender uma protease específica para prolina, preparação essa que compreende menos de 300*10E3 unidades de atividade de arilsulfatase por PPU.
41. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada por compreender menos de -100*10E3 unidades de arilsulfatase por PPU.
42. Preparação de enzima caracterizada por compreender uma lactase, preparação essa que compreende atividade de menos de 4 0 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
43. Preparação de enzima, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada por compreender atividade de menos de 3 0 unidades de arilsulf atase por NLU de atividade de lactase, mais preferivelmente, atividade de menos de 2 0 unidades de arilsulf atase por NLU de atividade de lactase e, principalmente, atividade de menos de 10 unidades de arilsulfatase por NLU de atividade de lactase.
44. Preparação de enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43, caracterizada por ser usada para o preparo de um laticínio.
45. Preparação de enzima de acordo com qualquer uma das reivindicações 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42 ou 43, caracterizada por ser usada para evitar ou reduzir o desenvolvimento de sabor estranho.
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