BRPI0619582A2

BRPI0619582A2 - anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção de ligação de antigéno do mesmo, composição, imonuconjugado, molécula de ácido nucleico isolada, vetor de expressão, célula hospedeira, e, métodos para preparar um anticorpo anti-ptk7 e para tratar ou prevenir uma doença

Info

Publication number: BRPI0619582A2
Application number: BRPI0619582-2A
Authority: BR
Inventors: Li-Sheng Lu; Jonathan Alexander Terrett; Chin Pan
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2012-12-11
Also published as: CN101360761A; ME02002B; KR101373464B1; CN101360761B; US20120207764A1; EA200801509A1; WO2007067730A3; KR20080082660A; US8222375B2; WO2007067730A2; US20100034826A1; NO20082559L; JP5401639B2; NZ569236A; RS52804B; CA2632552C; ES2406063T3; PT1957539E; AU2006321841A1; US9102738B2

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORçãO DE LIGAçãO DE ANTìGENO DO MESMO, COMPOSIçãO, IMUNOCONJUGADO, MOLéCULA DE áCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSãO, CéLULA HOSPEDEIRA, E, MéTODOS PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-PTK7 E PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DOENçA. A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente a PTK7 com alta afinidade. Proporciona-se moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos da invenção, vetores de expressão, células hospedeiras e métodos para expressar os anticorpos da invenção. Proporciona-se também imunoconjugados, composições farmacêuticas e moléculas biespecíficas compreendendo os anticorpos da invenção. A invenção também proporciona métodos para detectar PTK7, e também métodos para tratar várias doenças, incluido câncer e doenças infecciosas, usando-se anticorpos anti-PTK7.

Description

"ANTICORPO MONOCLONAL HUMANO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, COMPOSIÇÃO, IMUNOCONJUGADO, MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADA, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, E, MÉTODOS PARA PREPARAR UM ANTICORPO ANTI-PTK7 E PARA TRATAR OU

-PREVENIR UMA DOENÇA"-

Pedidos Relacionados Este pedido reivindica prioridade relativamente ao Pedido Provisional dos E.U.A. n° 60/748,373, depositado em 8 de dezembro de 2005, que é incorporado aqui integralmente por referência.

Fundamentos da Invenção Receptores de tirosina quinase (RTKs, Receptor Tyrosine Kinases) são proteínas de sinalização de transmembrana que transmitem sinais biológicos do ambiente extracelular para o interior da célula. A regulação de sinais de RTK é importante para a regulação do crescimento celular, diferenciação, crescimento axonal, crescimento epitelial, desenvolvimento, adesão, migração, e apoptose celular (Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat Câncer 8:11-31; Hubbard e Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98). RTKs são conhecidos por estarem envolvidos no desenvolvimento e na progressão de várias formas de câncer. Na maior parte dos cânceres relacionados com RTK, tem havido uma amplificação da proteína de receptor, ao invés de uma mutação do gene (Kobus e Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70).

Proteína de tirosina quinase 7 (PTK7), um membro da família de receptores de proteínas de tirosina quinases, foi isolada primeiramente de melanócitos humanos normais e clonada por meio de RT-PCR (Lee et ai, (1993) Oncogene 8:3403-10; Park et ai., (1996) J. Biochem 119:235-9). Separadamente, o gene foi clonado de linhas de células derivadas de carcinoma de colo humano e denominado quinase do carcinoma do colo 4 (CCK4, colon carcinoma kinase 4) (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179- 84). PTK7 pertence a um subconjunto de RTKs que não apresentam atividade detectável de tirosina quinase catalítica, mas que conservam atividade de transdução de sinal, e considera-se que funciona possivelmente como uma molécula de adesão celular.

---Verificou-se que o mRNA para PTK7 é expresso de forma

variável em linhas de células derivadas de carcinoma do colo, mas verificou- se que não é expresso em tecidos de colo adulto humano (Mossie et al., supra). A expressão de PTK7 também foi observada em algumas linhas de células de melanoma e biópsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Câncer Jl-1061 -5). Verificou-se que uma recomposição alternativa é expressa em hepatomas e células de câncer de colo (Jung et al (2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63). Adicionalmente, verificou-se que PTK7 é altamente superexpressa em amostras de leucemia mielóide aguda (Muller- Tidow et al, (2004) Clin. Câncer Res. 10:1241-9). Por meio de imuno- histoquímica, observou-se manchamento específico de tumor por parte de PTK7 em cânceres de mama, colo, pulmão, pancreático, rim e bexiga, como descrito na Publicação PCT WO 04/17992.

Assim, deseja-se agentes que reconhecem PTK7, e métodos de uso de referidos agentes.

Sumário da Invenção

A presente invenção proporciona anticorpos monoclonais isolados, em particular anticorpos monoclonais humanos, que se ligam a PTK7 e que apresentam numerosas propriedades desejáveis. Estas propriedades incluem ligação de alta afinidade a PTK7 humana e ligação a células de tumor de Wilms. Proporciona-se também métodos para tratar uma variedade de doenças mediadas com PTK7 usando-se os anticorpos e composições da invenção. Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo: (a) liga-se especificamente a PTK7 humana; e

(b) liga-se à linha de células de tumor de Wilms (n° de acesso ATCC CRL-1441).

De preferência, o anticorpo é um anticorpo humano, embora em concretizações alternativas o anticorpo possa ser um anticorpo murino, um anticorpo quimérico ou anticorpo humanizado.

Em concretizações mais preferidas, o anticorpo liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 4,0 nM ou menos ou liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 3,5 nM ou menos.

Em outra concretização, o anticorpo liga-se a uma linha de células de câncer selecionada do grupo que consiste de linhas de células A- 431 (n° de acesso ATCC CRL-1555), Saos-2 (n° de acesso ATCC HTB-85), SKOV-3 (n° de acesso ATCC HTB-77), PC3 (n° de acesso ATCC CRL- 1435), DMS 114 (n° de acesso ATCC CRL-2066), ACHN (n° de acesso ATCC CRL-1611), LNCaP (n° de acesso ATCC CRL-1740), DU 145 (n° de acesso ATCC HTB-81), LoVo (n° de acesso ATCC CCL-229) e MIA PaCa-2 (n° de acesso ATCC CRL-1420).

Em outra concretização, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo compete de maneira cruzada pela ligação com PTK7 com um anticorpo de referência, sendo que o anticorpo de referência:

(a) liga-se especificamente a PTK7 humana; e

Em várias concretizações, o anticorpo de referência

compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 1; e Ji

Ο

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:5;

ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:l; e

-(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a

seqüência de aminoácidos da SEQID NO:6;

ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID N0:2; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID N0:7;

ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID N0:3; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID N0:8;

ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:3; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:9;

ou o anticorpo de referência compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:4; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10.

Em um aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, V

compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh 3-30.3 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7. A invenção também proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou

-derivado de um gene Vn DP44 humano, sendo que o anticorpo liga-se

especificamente a PTK7. A invenção também proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh 3-33 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7. A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk Ll5 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7. A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk AlO humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7. A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk A27 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7. A invenção proporciona adicionalmente um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk L6 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7.

Uma concretização preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl í

compreendendo SEQID NO: 11;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 15;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:19;

-(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo

SEQ ID NO:23;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:29; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo

SEQ ID NO:35.

Outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO :11;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2

compreendendo SEQID NO: 15;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 19;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo

SEQID NO:24;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID N0:30; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:36.

Outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 12;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 16; (c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID N0:20;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO:25;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:31; e--------

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:37.

Outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO: 13;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:17;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO:21;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:26;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:32; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:38.

Outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO: 13;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO:21;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID ΝΟ:27;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:33;e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:39.

-Outra combinação preferida compreende:--

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 18;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO:22;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:28;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:34; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID N0:40.

Outros anticorpos preferidos da invenção, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos compreendem:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 1; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:5.

Outra combinação preferida compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:l; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:6. Outra combinação preferida compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2; e

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:7.

-Outra combinação preferida compreende:--

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:8.

Outra combinação preferida compreende:

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:9.

Outra combinação preferida compreende:

Os anticorpos da invenção podem ser, por exemplo, anticorpos de comprimento pleno, por exemplo de um isótipo IgGl ou IgG4. Alternativamente, os anticorpos pode ser fragmentos de anticorpos, como fragmentos Fab ou Fab'2, ou anticorpos de cadeia única.

A invenção também proporciona um imunoconjugado compreendendo um anticorpo da invenção, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ligada a um agente terapêutico, como uma citotoxina ou um isótipo radioativo. A invenção também proporciona uma molécula biespecífica compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, da invenção, ligado a uma segunda porção funcional apresentando uma especificidade de ligação diferente do que referido anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo.

Composições compreendendo um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, ou imunoconjugado ou molécula biespecífica ila—invenção—e—um—veículo—farmaceuticamente—aceitável—também—são proporcionadas.

Moléculas de ácido nucleico codificando os anticorpos, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, da invenção também são compreendidas pela invenção, e também vetores de expressão compreendendo referidos ácidos nucleicos e células hospedeiras compreendendo referidos vetores de expressão. Além disso, a invenção proporciona um camundongo transgênico compreendendo transgenes de cadeia leve e pesada de imunoglobulina humana, sendo que o camundongo expressa um anticorpo da invenção, e também hibridomas preparadas de um camundongo do tipo referido, sendo que o hibridoma produz o anticorpo da invenção.

Em outro aspecto adicional, a invenção proporciona um método para tratar ou prevenir uma doença caracterizada pelo crescimento de células de tumor expressando PTK7, compreendendo administrar, ao sujeito, o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, da invenção numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença. A doença pode ser, por exemplo, câncer, p. ex., câncer de colo (incluindo câncer do intestino delgado), câncer do pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, câncer do rim, câncer de bexiga, câncer ovariano e câncer da próstata.

Em uma concretização preferida, a invenção proporciona um método para tratar câncer in vivo usando-se um anticorpo anti-PTK7. O anticorpo anti-PTK7 pode ser um anticorpo murino, quimérico, humanizado β C

ou anticorpo humano. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando-se os métodos da invenção incluem câncer renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores do cérebro, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL, acute lymphocytic leukemia), leucemia de células T adultas (T-ALL, adult T-cell leukemia),

-leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica

crônica, linfomas (p. ex., Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T5 linfoma de Bukitt, linfomas de células grandes anaplásicos (ALCL, anaplastic large-cell lymphomas), linfomas de células T cutâneas, linfomas de células clivadas pequenas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cânceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem B, linfoma de células T similar a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidade corporal associados com HIV), carcinomas embrionários, carcinomas não diferenciados da rino-faringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, câncer de mama, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, câncer dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvice, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, câncer do tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou da uretra, carcinoma da pelvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma da base do cérebro, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cãnceres induzidos ambientalmente incluindo aqueles induzidos por amianto, p. ex., mesotelioma e combinações de referidos cânceres.

Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da descrição detalhada e dos exemplos a seguir que não deveriam ser interpretados como limitantes. Os teores de todas as referências, entradas no Genbank, patentes e pedidos de patentes publicados indicados neste pedido são incorporados expressamente aqui por referência.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura IA mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:41) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:l) da região variável de cadeia pesada dos anticorpos monoclonais humanos 3G8 e 3G8a. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 15) e CDR3 (SEQ ID NO: 19) são delineadas, e as derivações de linha germinal V, D e J são indicadas.

Figura IB mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:45) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:5) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3G8. As regiões CDRl (SEQ ID NO:23), CDR2 (SEQ ID NO:29) e CDR3 (SEQ ID NO:35) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

Figura IC mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:46) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID N0:6) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 3G8a. As regiões CDRl (SEQ ID NO:24), CDR2 (SEQ ID N0:30) e CDR3 (SEQ ID NO:36) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

Figura 2A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:42) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:2) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 4D5. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 16) e CDR3 (SEQ ID N0:20) são delineadas e as linhas derivações de germinais V, D e J são delineadas. Figura 2B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:47) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:7) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 4D5. As regiões CDRl (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:31) e CDR3 (SEQ ID NO:37) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

-Figura 3A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID

NO:43) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:3) da região variável de cadeia pesada dos anticorpos monoclonais humanos 12C6. As regiões CDRl (SEQ ID NO:13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) e CDR3 (SEQ ID NO:21) são delineadas e as linhas derivações de germinais V, D e J são delineadas.

Figura 3B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:48) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:8) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 12C6. As regiões CDRl (SEQ ID NO:26), CDR2 (SEQ ID NO:32) e CDR3 (SEQ ID NO:38) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

Figura 3C mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:49) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:9) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 12C6a. As regiões CDRl (SEQ ID NO:27), CDR2 (SEQ ID NO:33) e CDR3 (SEQ ID NO:39) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

Figura 4A mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID NO:44) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:4) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano 7C8. As regiões CDRl (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) e CDR3 (SEQ ID NO:22) são delineadas e as linhas derivações de germinais V, D e J são delineadas.

Figura 4B mostra a seqüência de nucleotídeos (SEQ ID N0:50) e seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano 7C8. As CDRl (SEQ ID NO:28), CDR2 (SEQ ID NO:34) e CDR3 (SEQ ID N0:40) são delineadas e as derivações germinais VeJ são indicadas.

Figura 5 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada de 3G8 (SEQ ID NO: 1) e 3G8a (SEQ ID NO: 1) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vh 3- 30.3 (SEQ ID NO:51) (linha germinal JH4b divulgada como SEQ ID NO: -59).-------

JU

e

Figura 6 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 4D5 (SEQ ID NO: 2) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vh 3-30.3 (SEQ ID NO:51) (linha germinal JH4b divulgada como SEQ ID NO: 60).

Figura 7 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis de cadeia pesada de 12C6 (SEQ ID NO: 3) e 12C6a (SEQ ID NO: 2) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vh DP44 (SEQ ID NO:52) (3-7, 3-23, e linhas germinais JH4b divulgadas como SEQ ID NOS 61-63, respectivamente).

Figura 8 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7C8 (SEQ ID NO: 4) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vh 3-33 (SEQ ID NO:53) (linha germinal JH6b revelada como SEQ ID NO: 64). Figura 9 mostra o alinhamento das seqüências de aminoácidos

das regiões variáveis de cadeia leve de 3G8 (SEQ ID NO: 5) e 3G8a (SEQ ID NO: 6) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vk Ll5 (SEQ ID NO:54) (linha germinal JKl revelada como SEQ ID NO: 65).

Figura 10 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 4D5 (SEQ ID NO: 7) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vk AlO (SEQ ID NO:55) (linha germinal JK5 revelada como SEQ ID NO: 66).

Figura 11 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6 (SEQ ID NO: 8) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vk A27 seqüência de aminoácidos (SEQID NO:56) (linha germinal JK2 revelada como SEQ ID NO: 67).

Figura 12 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6a (SEQ ID NO: 9) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vk Ll5 seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:54) (JK2 linha germinal revelada como SEQ ID NO: 68).-

C

Figura 13 mostra o alinhamento da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7C8 (SEQ ID NO: 10) com a seqüência de aminoácidos de linha germinal humana Vk L6 seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO:57) (JK3 linha germinal revelada como SEQ ID NO: 69).

Figura 14 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando que o anticorpo monoclonal humano 7C8, dirigido contra PTK7 humana, liga-se à superfície celular de células HEK3 transfectadas com uma PTK7 humana de comprimento pleno. Figura 15 mostra os resultados de experimentos ELISA

demonstrando que anticorpos monoclonais humanos contra PTK7 humana

ligam-se especificamente a PTK7.

Figura 16 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra PTK7 humana ligam- se à superfície celular de células de tumor de Wilms.

Figura 17 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra PTK7 humana ligam- se à superfície celular de uma variedade de linhas de células de câncer.

Figura 18 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra PTK7 humana ligam- se à superfície celular de células dendríticas.

Figura 19 mostra os resultados de experimentos de citometria de fluxo demonstrando que anticorpos dirigidos contra PTK7 humana ligam- se a linfócitos T CD4+ e CD8+, mas não a linfócitos B. Figura 20 mostra os resultados de experimentos de internalização Hum-Zap demonstrando que anticorpos monoclonais humanos contra PTK7 humana podem internalizar em células PTK7+. (A) Internalização dos anticorpos humanos 3G8, 4D5 e 7C8 em células de tumor de Wilms. (B) Internalização do anticorpo humano 12C6 em células de tumor de Wilms. (C) Internalização dos anticorpos humanos 7C8 e 12C6 em células de tumor A-431. (D) Internalização dos anticorpos humanos 7C8 e 12C6 em células de tumor PC3.

Figura 21 mostra os resultados de um ensaio de proliferação de células demonstrando que anticorpo monoclonal humano anti-PTK7s conjugado a toxina mata linhas de células de câncer do rim humano.

Figura 22 mostra os resultados de um ensaio de proliferação de células demonstrando que anticorpo monoclonal humano anti-PTK7s conjugado a toxina mata linhas de células expressando níveis de baixos até altos de expressão de PTK7.

Figura 23 mostra os resultados de um ensaio de invasão demonstrando que anticorpos anti-PTK7 inibem a mobilidade de invasão de células expressando PTK7 na superfície celular.

Figura 24 mostra os resultados de um estudo de enxerto exógeno de tumor in vivo demonstrando que anticorpos anti-PTK7 conjugados a uma progressão de crescimento de tumor desacelerado por toxina no câncer pancreático.

Figura 25 mostra os resultados de um estudo de enxerto exógeno de tumor in vivo demonstrando que anticorpos anti-PTK7 conjugados a um progressão de crescimento de tumor desacelerada por toxina no câncer de mama.

Descrição Detalhada da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos, que se ligam especificamente a PTK7. Em determinadas concretizações, os anticorpos da invenção apresentam uma ou mais propriedades funcionais desejáveis, como ligação de alta afinidade a PTK7 e/ou a capacidade de inibir crescimento de células de tumor in vitro ou in vivo. Em determinadas concretizações, os anticorpos da invenção são derivados de seqüências de linha germinal de cadeia pesada e leve particulares e/ou compreendem

i

características estruturais particulares, como regiões de CDR compreendendo seqüências de aminoácidos particulares. A invenção proporciona anticorpos isolados, métodos de preparar referidos anticorpos, imunoconjugados e moléculas biespecíficas compreendendo referidos anticorpos e composições farmacêuticas contendo os anticorpos, imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. A invenção refere-se também a métodos de uso dos anticorpos, como para tratar doenças, como o câncer.

Para que a presente invenção possa ser compreendida mais facilmente, define-se primeiramente determinados termos. Definições adicionais são apresentadas ao longo da descrição detalhada.

Os termos "PTK7" e "CCK4" são usados intercambiavelmente e incluem variantes, isoformas e homólogos de espécies de PTK7 humana. Assim, em determinados casos, anticorpos humanos da invenção podem reagir de forma cruzada com PTK7 de espécies diferentes da humana. Em determinadas concretizações, os anticorpos podem ser completamente específicos para uma ou mais PTK7 humana e podem não apresentar espécies ou outros tipos de reatividade cruzada não-humana. A seqüência completa de aminoácidos de uma PTK7 humana exemplar tem número de acesso Genbank

NM_002821 (SEQID NO:58).

O termo "resposta imune" refere-se à ação de, por exemplo, linfócitos, células apresentadoras de antígeno, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas, e complemento) o que resulta em «3J5 l

dano seletivo ao corpo humano, destruição do mesmo, ou elminação - do corpo humano - de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, tecidos ou células humanas normais.

Uma "via de transdução de sinal" refere-se à relação

---bioquímica entre uma variedade de moléculas de transdução de sinal que

desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Como usado aqui, a expressão "receptor de superfície celular" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receber um sinal e a transmissão de um sinal do tipo referido através da membrana plasmática de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície celular" da presente invenção é o receptor de PTK7.

O termo "anticorpo" como referido aqui inclui anticorpos inteiros e qualquer fragmento de ligação de antígeno (ie., "porção de ligação de antígeno") ou cadeias simples do mesmo. Um "anticorpo" refere-se a uma glicoproteína compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H, heavy) e duas cadeias leves (L, light) interconectadas por ligações dissulfeto, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo. Cada cadeia pesada é constituída de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada é constituída de três domínios, CHi, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é constituída de uma região variável de cadeia leve (abrevidada aqui como VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é constituída de um domínio, CL. As regiões Vh e Vl podem ser subdivididas adicionalmente em regiões de hipervariabilidade, denominadas CDR região determinadora de complementaridade (CDR, complementarity determining region), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR, framework regions). Cada Vh e Vl é constituído de três CDRs e quatro FRs, dispostas desde a ponta amino até a ponta carbóxi na seguinte ordem: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina com fatores ou tecidos do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imunológico (p. ex., células efetoras) e o primeiro

---componente (Clq) do sistema de complemento clássico.--

O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), como usado aqui, refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que conservam a capacidade de ligar-se especificamente a um antígeno (p. ex., PTK7). Mostrou-se que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por meio de fragmentos de um anticorpo de comprimento pleno. Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos pelo termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste dos domínios VL, VH, Cl e ChI ; (ü) um fragmento F(ab% um fragmento divalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na posição de dobradiça; (iii) um fragmento Fab', que é essencialmente um Fab com parte da região de dobradiça (ver, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3, sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento de Fd que consiste dos domínios VHeCHl; (v) um fragmento Fv que consiste dos domínios Vl e Vh de um braço simples de um anticorpo, (vi) um fragmento dAb (Ward et αϊ, (1989) Nature 341:544-546), que consiste de um domínio VH; (vii) uma região determinadora de complementaridade (CR) isolada; e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um domínio variável simples e dois domínios constantes. Adicionalmente, embora os dois domínios do fragmento Fv, Vl e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser conjugados, usando-se métodos recombinantes, por meio de um ligante sintético que lhes permite serem preparados como uma cadeia de proteína simples em que as regiões Vl e Vh regiões pareiam formando moléculas monovalentes (conhecidas como Fv de cadeia única (scFv, single chain Fv); see p. ex., Bird et ai. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al (1988) Proc. Natl Acad Sei USA 85:5879- 5883^ Referidos anticorpos de cadeia única também se destinam a serem compreendidos pelo termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas por aqueles com prática na arte, e os fragmentos são selecionados quanto à utilidade da mesma maneira que o são anticorpos intactos.

Um "anticorpo isolado", como usado aqui, destina-se a referir- se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos apresentando diferentes especificidades antigênicas (p. ex., um anticorpo isolado que se liga especificamente a PTK7 é substancialmente isento de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos diferentes de PTK7). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a PTK7 pode, contudo, apresentam reatividade cruzada com outros antígenos, como moléculas de PTK7 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outros materiais celulares e/ou químicos.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" como usado aqui referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal apresenta uma especificidade de ligação simples e afinidade por um epítopo particular.

O termo "anticorpo humano", como usado aqui, destina-se a incluir anticorpos apresentando regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura e CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha

germinal humana.

Adicionalmente, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir radicais de aminoácidos não codificados por seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana (p. ex., mutações introduzidas por mutagênese randômica ou específica para sítio in vitro ou por meio de mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como usado aqui, não se destina a incluir anticorpos em que seqüências de CDR derivadas da linha germinal de outras espécies mamíferas, como um camundongo, foram enxertadas em seqüências de estrutura humanas.

O termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se a anticorpos apresentando uma especificidade de ligação simples que apresentam regiões variáveis em que tanto as regiões de estrutura e de CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não-humano transgênico, p. ex., um camundongo transgênico, apresentando um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundido com uma célula imortalizada.

O termo "anticorpo humano recombinante", como usado aqui, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados via meios recombinantes, como (a) anticorpos isolados de um animal (p. ex., um camundongo) que é transgênica ou transcromossômico para genes de imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado dos mesmos (descrito adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, p. ex., de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpos humanos combinatorial, recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados via quaisquer outros meios que envolvem recomposição de seqüências de gene de imunoglobulina humana a outras seqüências de DNA. Referidos anticorpos humanos recombinantes apresentam regiões variáveis em que as regiões de estrutura e CDR são derivadas de seqüências de imunoglobulina de linha germinal humana. Em determinadas concretizações, contudo, referidos anticorpos humanos recombinantes podem ser submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para seqüenciamento de Ig humanas é usado, mutagênese somática in vivo) e, assim, as seqüências de aminoácidos das regiões Vh e Vl dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora derivadas de, e relacionadas com, seqüências Vh e Vl de linha germinal humana, podem não existir naturalmente no repertório de linha germinal de anticorpo humano in vivo.

Como usado aqui, "isótipo" refere-se à classe de anticorpo (p. ex., IgM ou IgGl) que é codificada pelos genes de região constante de cadeia pesada.

As expressões "um anticorpo que reconhece um antígeno" e "um anticorpo específica para um antígeno" são usadas intercambiavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".

O termo "derivados de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, p. ex., um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

O termo "anticorpo humanizado" destina-se a referir a anticorpos em que seqüências de CDR derivadas da linha germinal de outras espécies mamíferas, como um camundongo, foram enxertadas sobre seqüências de estrutura humanas. É possível realizar modificações adicionais de região de estrutura nas seqüências de estrutura humanas.

O termo "anticorpo quimérico" destina-se a referir a anticorpos em que as seqüências de região variável são derivadas de uma espécie e as seqüências de região constante são derivadas de outra espécie, como um anticorpo em que as seqüências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as seqüências de região constante são derivadas de um anticorpo humano. Como usado aqui, um anticorpo que "se liga especificamente a PTK7 humana" destina-se a referir a um anticorpo que se liga a PTK7 humana com uma K0 de 1 χ IO"7 M ou menos, mais

g

preferivelmente 5 χ IO"8 M ou menos, mais preferivelmente 1 χ 10" M ou

menos, mais preferivelmente 5 χ IO"9 M ou menos.

O termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou células, como usado aqui, significa que não se liga ou que não se liga com uma alta afinidade à proteína ou células, i.e. liga-se à proteína ou células com uma Kd de 1 χ IO"6 M ou mais, mais preferivelmente 1 χ IO"5 M ou mais, mais preferivelmente 1 χ IO"4 M ou mais, mais preferivelmente 1x10" M ou mais,

ainda mais preferivelmente 1 χ IO"2 M ou mais.

O termo "Kassoc" ou "Ka", como usado aqui, destina-se a

referir à taxa de associação de uma interação de antígeno-anticorpo particular,

enquanto que o termo wKdis" ou "Kd," como usado aqui, destina-se a referir à

taxa de dissociação de uma interação de antígeno-anticorpo particular. O

termo "KD", como usado aqui, destina-se a referir à constantes de dissociação,

que é obtida da relação de Kd para Ka (i.e,. Kd/Ka) e é expressa como uma

concentração molar (M). Valores de Kd para anticorpos podem ser

determinados usando-se métodos poço estabelecidos na arte. Um método

preferido para determinara Kd de um anticorpo é por meio do uso de

ressonância de plasmônio de superfície, de preferência, usando um sistema

biossensor, como um sistema Biacore®.

Como usado aqui, o termo "alta afinidade" por um anticorpo

8 *

IgG refere-se a um anticorpo apresentando uma Kd de 10" M ou menos, mais preferivelmente IO"9 M ou menos e ainda mais preferivelmente IO'10 M ou menos para um antígeno-alvo. No entanto, ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isótipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" para um isótipo de IgM refere-se a um anticorpo apresentando uma Kd of IO"7 M ou menos, mais preferivelmente IO"8 M ou menos, ainda mais

preferivelmente IO"9 M ou menos.

Como usado aqui, o termo "sujeito" inclui qualquer humano ou animal não-humano. O termo "animal não-humano" inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não-mamíferos, como primatas não- humanos, ovelhas, cães, gatos, cavalos, vacas, frangos, anfíbios, répteis, etc.

Vários aspectos da invenção encontram-se descritos com maior detalhe nas subseções a seguir.

Anticorposantb^PTK/-

Os anticorpos da invenção são caracterizados por propriedades ou características funcionais particulares dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos ligam-se especificamente a PTK7. De preferência, um anticorpo da invenção liga-se a PTK7 com alta afinidade, por exemplo com uma Kd de 1 χ IO"7 M ou menos. Os anticorpos anti-PTK7 da invenção apresentam, de preferência, uma ou mais das características a seguir:

(a) liga-se especificamente a PTK7 humana; ou

De preferência, o anticorpo liga-se à PTK7 humana com uma

ç 8

Kd de 5 χ 10 M ou menos, liga-se à PTK7 humana com uma Kd de 1 χ 10" M ou menos, liga-se à PTK7 humana com uma Kd de 5 χ IO"9 M ou menos, ou liga-se à PTK7 humana com uma Kd entre IxlO-8Melx IO"10 M ou menos. De preferência, o anticorpo liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 4,0 nM ou menos, ou liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 3,5 nM ou menos. Ensaios convencionais para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos no sentido de PTK7 são conhecidos na arte, incluindo, por exemplo, ELISAs, Western blots e RIAs. As cinéticas de ligação (p. ex., afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avaliadas por meio de ensaios convencionais conhecidos na arte, como por meio de ELISA, análise Scatchard e Biacore. Como outro exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ligar-se a uma linhas de células de tumor de carcinoma de rim, por exemplo,< a linhas de células de tumor de ί

Wilms. Ensaios vantajosos para avaliar qualquer uma das características descritas acima encontram-se descritos detalhadamente nos Exemplos. Anticorpos monoclonais 3G8.3G8a. 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8

Anticorpos preferidos da invenção são os anticorpos monoclonais humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8, isolados e

-caracterizados estruturalmente como descrito nos Exemplos 1 e 2. Aqueles

com prática ordinária na arte haverão de perceber que os anticorpos 3G8 e 3G8a, e também os anticorpos 12C6 e 12C6a apresentam a mesma seqüência de cadeia pesada, embora difiram quanto às seqüências de cadeia leve. As seqüências de aminoácidos Vh de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 1 (3G8 e 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 e 12C6a) e 4 (7C8). As seqüências de aminoácidos Vl de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a, e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 e IO5 respectivamente.

Dados que cada um destes compostos pode ligar-se a PTK7, as seqüências Vh e Vl podem ser "misturadas e pareadas" para criar outras moléculas de ligação anti-PTK7 da invenção. A ligação de PTK7 de referidos anticorpos "misturados e pareados" pode ser testada usando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (p. ex., ELISAs). De preferência, quando cadeias Vh e Vl são misturadas e pareadas, uma seqüência Vh de um pareamento VH/VL particular é substituído por uma seqüência Vh estruturalmente similar. De maneira análoga, de preferência, uma seqüência Vl de um pareamento VH/VL particular é substituída por uma seqüência Vl estruturalmente similar.

Assim, em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreendendo:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1, 2, 3 e 4; e J3 i

(b) uma região variável de cadeia leve compreendendo uma

seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste das SEQ ID

NOs:5,6, 7, 8, 9 e 10;

sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de

preferência, PTK7 humana. ---Combinações de cadeia pesada e de cadeia íeve preferidas

incluem:

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:l; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:5; ou

(a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:l; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:7; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:8; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a

seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:9; ou (a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:4; e (b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID N0:10.

Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos que compreendem as CDRl s, CDR2s e CDR3s de cadeia pesada de cadeia leve de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8, ou combinações dos mesmos. As seqüências de aminoácidos das CDRls Vh de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e

e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 11 (3G8 e 3G8a), 12 (4D5), 13 (12C6 e 12C6a) e 14 (7C8). As seqüências de aminoácidos das CDR2s Vh de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 15 (3G8 e 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 e 12C6a) e 18 (7C8). As seqüências de aminoácidos das CDR3s Vh de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são

--mostradas nas SEQ ID NOs: 19 (3G8 e 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 e 12C6a)

e 22 (7C8). As seqüências de aminoácidos das CDRls Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR2s Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, respectivamente. As seqüências de aminoácidos das CDR3s Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente. As regiões CDR são delineadas usando-se o sistema Kabat (Kabat, Ε. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242).

Dado que cada um destes anticorpos pode ligar-se a PTK7 e que a especificidade de ligação de antígeno é proporcionada primariamente pelas regiões CDRl, CDR2, e CDR3, as seqüências CDRl, CDR2, e CDR3 Vh e seqüências CDRl, CDR2, e CDR3 Vk podem ser "misturadas e pareadas" (i.e., CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e pareadas, embora cada anticorpo precise conter uma CDRl, CDR2, e CDR3 Vh e uma CDRl, CDR2, e CDR3 Vk) para criar outras moléculas de ligação anti-PTK7 da invenção. A ligação de PTK7 de referidos anticorpos "misturados e pareados" podem ser testados empregando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (p. ex., ELISAs, análise Biacore). De preferência, quando seqüências CDR Vh são misturadas e pareadas, a seqüência de CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vh particular é substituída por seqüência(s) CDR estruturalmente similar(es). De maneira análoga, quando seqüências CDR Vji são misturadas e pareadas, a seqüência CDRl, CDR2 e/ou CDR3 de uma seqüência Vk particular é substituída, de preferência, por seqüência(s) CDR estruturalmente similar(es). A pessoa ordinariamente versada na arte perceberá facilmente que é possível criar seqüências Vh e Vl inéditas por meio de substituição de uma ou mais seqüências de região CDR Vh e/ou Vi. por seqüências estruturalmente similares das seqüências de CDR divulgadas aqui para anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8.

Assim, em outro aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo compreendendo:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQID NOs: 15, 16, 17 e 18;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQID NOs: 19, 20, 21 e 22;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40; í

sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana.

Em uma concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 11;

--(b)—uma—região—variável—de—cadeia—pesada—CDR2

compreendendo SEQ ID NO: 15;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO: 19; (d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo

SEQ ID NO:23;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:29; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:35.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO:l 1;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 15;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO: 19;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO:24;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo

SEQ ID N0:30; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:36.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende: ί

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 12;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 16;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 ----compreendendo SEQ ID N0:20;----------------

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:25;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:31; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:37.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 13;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:21;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo

SEQID NO:26;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:32; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:38.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 13;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 2ft

compreendendo SEQID NO: 17;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:21;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:27;

----(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo

SEQ ID NO:33; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:39.

Em outra concretização preferida, o anticorpo compreende:

(a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 14;

(b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 18;

(c) uma região variável de cadeia pesada CDR3

compreendendo SEQID NO:22;

(d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO:28;

(e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo

SEQID NO:34; e

(f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID N0:40.

É de conhecimento geral na arte que o domínio de CDR3, independentemente do(s) domínio(s) de CDRl e/ou CDR2, pode determinar

sozinho a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que múltiplos anticorpos podem ser gerados de forma predizível apresentando a mesma especificidade de ligação baseada numa seqüência de CDR3 comum. Ver, por exemplo, Klimka et αί, British J. of Câncer 83(2):252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 20 ί

humanizado empregando-se apenas o domínio variável de cadeia pesada CDR3 de anticorpo anti-CD30 murino Ki-4); Beiboer et al., J. Mol Biol 296:833-849 (2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína epitelial recombinante 2 (EGP-2, recombinant epithelial glycoprotein-2) usando apenas a seqüência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo anti-EGP-2 de

--MOG-31murinO^arentai);Rader^UvS^h

95:8910-8915 (1998) (descrevendo um grupo de anticorpos ανβ3 anti- integrina humanizados usando-se um domínio de CDR3 variável de cadeia pesada e leve de um anticorpo ανβ3 anti-integrina murino LM609 em que cada anticorpo do membro compreende uma seqüência distinta fora do domínio de CDR3 e capaz de ligar o mesmo epítopo que o anticorpo murino com afinidades tão altas ou mais altas que o anticorpo murino parental); Barbas et al, J. Am. Chem. Soe. .116:2161-2162 (1994) (revelando que o domínio de CDR3 proporciona a contribuição mais significativa para ligação de antígeno); Barbas et al, Proc. Natl Aead. Scl U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de seqüências de CDR3 de cadeia pesada dos três Fabs (SI-1, SI-40, e SI-32) contra DNA placentar humano sobre a cadeia pesada de um Fab toxóide anti-tétano, substituindo com isso a CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio de CDR3 conferiu sozinho especificidade de ligação); e Ditzel et al, J. Immunol 157:739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxerto em que a transferência de apenas a CDR3 de cadeia pesada de um Fab poliespecífico parental LNA3 para uma cadeia pesada de um anticorpo p313 de Fab de ligação de toxóide do tétano de IgG monoespecífico foi suficiente para retardar a especificidade de ligação do Fab parental). Cada uma destas referências é incorporada aqui integralmente por referência.

Assim, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo derivado de um humano ou de um animal não-humano, sendo que o anticorpo monoclonal é capaz de ligar especificamente a PTK7. Em determinados aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo não-humano, como um anticorpo de camundongo ou rato, sendo que o anticorpo monoclonal é capaz de ligar-se especificamente a PTK7. Em algumas concretizações, referidos anticorpos inventivos compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo não- humano (a) são capazes de competir pela ligação com; (b) conservam as características funcionais; (c) ligam-se ao mesmo epítopo; e/ou (d) apresentam uma afinidade de ligação similar ao anticorpo não-humano

parental correspondente.

Em outros aspectos, a presente invenção proporciona

anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um anticorpo humano, como, por exemplo, a anticorpos humano obtido de um animal não-humano, sendo que o anticorpo humano é capaz de ligar-se especificamente a PTK7. Em outros aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia leve de um primeiro anticorpo humano, como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não-humano, sendo que o primeiro anticorpo humano é capaz de ligar-se especificamente a PTK7 e sendo que o domínio de CDR3 do primeiro anticorpo humano substitui um domínio de CDR3 em um anticorpo humano que não apresenta especificidade ligação por PTK7 para gerar um segundo anticorpo humano que é capaz de ligar-se especificamente a PTK7. Em algumas concretizações, referidos anticorpos inventivos compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou de cadeia leve do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de competir pela ligação com; (b) conservam as características funcionais; (c) ligam-se ao ι

mesmo epítopo; e/ou (d) apresentam uma afinidade de ligação similar ao primeiro anticorpo humano parental correspondente. Em concretizações preferidas, o primeiro anticorpo humano é 3G8, #g8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8.

Anticorpos apresentando seqüências de linha germinal particulares

-----Em determinadas concretizações, um anticorpo da invenção

compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linha germinal particular e/ou uma região variável de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linha germinal particular.

Por exemplo, em uma concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh 3-30.3 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh DP44 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh 3-33 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk Ll5 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra

concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk AlO humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção

--proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de

antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk A27 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk L6 humano, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7, de preferência, PTK7 humana. Em outra concretização preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, sendo que o anticorpo:

(a) compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene Vh 3-30.3 humano, DP44 ou gene 3-33 (sendo que referido gene codifica a seqüência de aminoácidos apresentada nas

SEQ ID NOs: 51, 52 ou 53, respectivamente);

(b) compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene Vk Ll 5, A10, A27 ou L6 humano (sendo que referido gene codifica a seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:54, 55, 56 ou 57, respectivamente); e

(c) especificamente liga-se a PTK7.

Exemplos de anticorpos apresentando Vh e Vk de Vh 3-30.3 e Vk Ll5, respectivamente, são 3G8 e 3G8a. Um exemplo de um anticorpo apresentando Vh e Vk de Vh 3-30.3 e Vk A10, respectivamente é 4D5. Um exemplo de um anticorpo apresentando Vh e Vk de Vh DP44 e Vk A27, respectivamente é 12C6. Um exemplo de um anticorpo apresentando Vh e Vk de Vh DP44 e Vk L15, respectivamente é 12C6a. Um exemplo de um anticorpo apresentando Vh e Vk de Vh 3-33 e Vk L6, respectivamente é 7C8.

Como usado aqui, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de linha germinal particular se as regiões variáveis do anticorpo forem obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linha germinal humana. Referidos sistemas incluem imunização de um camundongo transgênico portando genes de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse, ou seleção de uma biblioteca de genes de imunoglobulina humana apresentada em fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana pode ser identificado como tal comparando-se a seqüência de aminoácidos do anticorpo humano com as seqüências de aminoácidos de imunoglobulinas de linha germinal humana e selecionando-se a seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana que é a mais próxima no que se refere à seqüência (i.e.9 maior % de identidade) com a seqüência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma seqüência de imunoglobulina de linha germinal humana particular pode conter diferenças de aminoácidos em comparação com a seqüência de linha germinal, devido a, por exemplo, mutações somáticas naturalmente ocorrentes ou introdução intencional de mutação dirigida para sítio. No entanto, um anticorpo humano selecionado é tipicamente pelo menos 90 % idêntico no que se refere à seqüência de aminoácidos a uma seqüência de aminoácidos codificada por um gene de imunoglobulina de linha germinal humana e contém radicais de aminoácidos que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado com as seqüências de aminoácidos de imunoglobulina de linha germinal de outras espécies (p. ex., seqüências de linha germinal murinas). Em determinados casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou mesmo pelo menos 96 %, 97 %, 98 %, ou 99 % idêntico quanto à seqüência de aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma seqüência de linha germinal humana particular não apresentará mais do que 10 diferenças dc aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal humana. Em determinados casos, o anticorpo humano pode apresentar não mais do que 5, ou mesmo não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácidos com relação à seqüência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina de linha germinal. Anticorpos homólogos

Em outra concretização adicional, um anticorpo da invenção compreende regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreendendo seqüências de aminoácidos que são homólogas às seqüências de aminoácidos dos anticorpos preferidos aqui descritos, e sendo que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-PTK7 da invenção.

Por exemplo, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, sendo que:

(a) a região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga a uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQID NOs: 1, 2, 3 e 4;

(b) a região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80 % homóloga a uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9 e 10; e

o anticorpo apresenta uma ou mais das seguintes propriedades:

(c) o anticorpo liga-se à PTK7 humana com uma Kd de 1 χ 10"

7 M ou menos;

(d) o anticorpo liga-se à linha de células de tumor de Willms.

---Em outras concretizações, as seqüências de aminoácidos Vh

e/ou Vl pode ser 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % ou 99 % homólogas às seqüências apresentadas acima. Um anticorpo apresentando regiões Vh e Vl apresentando alta homologia (i.e., 80 % ou maior) com as regiões Vh e Vl das seqüências apresentadas acima, podem ser obtidas por meio de mutagênese (p. ex., mutagênese dirigida para sítio ou mediada com PCR) de moléculas de ácido nucleico codificando SEQ ID NOs: 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 e 50, seguido de testes do anticorpo alterado codificado para determinação da função conservada (i.e., as funções apresentadas em (c) e (d) acima) usando- se o ensaio funcional aqui descrito.

Como usado aqui, o percentual de homologia entre duas seqüências de aminoácidos é equivalente ao percentual de identidade entre as duas seqüências. O percentual de identidade entre as duas seqüências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências (i.e., % de homologia = n° de posições idênticas/n0 total de posições χ 100), considerando o número de intervalos, e o comprimento de cada intervalo, que precisam ser introduzidos para alinhamento ótimo das duas seqüências. A comparação de seqüências e a determinação do percentual de identidade entre duas seqüências pode ser realizada usando-se um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não-limitantes abaixo.

O percentual de identidade entre as seqüências de aminoácidos pode ser determinado usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (iComput. Appl Biosci4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de radicais em peso PAM120, uma penalidade para comprimento de espaço of 12 e a penalidade para espaços de 4, Adicionalmente, o percentual de identidade entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol Biol 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa GAP no pacote de programas GCG (obtenível em www.gcg.com), usando-se uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um escore de espaço de

kQ

t

16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um escore de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

Adicionalmente ou alternativamente, as seqüências de proteína da presente invenção podem ser usadas adicionalmente como uma "seqüência de pesquisa" para realizar uma pesquisa contra bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar seqüências relacionadas. Referidas pesquisas podem ser realizadas empregando-se o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al (1990) J. Mol Biol 215:403-10. É possível realizar pesquisas de proteína BLAST com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento da palavra = 3 para se obter seqüências de aminoácidos homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para se obter alinhamentos intervalados [gapped] para fins de comparação, é possível usar Gapped BLAST como descrito em Altschul et al, (1997) Nucleico Aeids Res. 25(17):3389-3402. Quando se usa programas BLAST e Gapped BLAST, é possível usar os parâmetros default dos respectivos programas (p. ex., XBLAST e NBLAST). (ver www.ncbi.nlm.nih.gov). Anticorpos com modificações conservativas

Em determinadas concretizações, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências de CDR1, CDR2 e CDR3, sendo que uma ou mais destas seqüências de CDR compreendem seqüências de aminoácidos especificadas baseadas nos anticorpos preferidos aqui descritos (p. ex., 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8), ou modificações conservativas dos mesmos, e sendo que os anticorpos conservam as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-PTK7 da invenção. Assim, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências de CDRl, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências de CDRl, CDR2, e CDR3, sendo que:

(a) a seqüência de CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22, e modificações conservativas das mesmas;

(b) a seqüência de CDR3 de região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüência de aminoácidos das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40, e modificações conservativas das mesmas; e

o anticorpo apresenta uma ou mais das seguintes propriedades:

(c) liga-se especificamente a PTK7 humana; e

(d) liga-se à linha de células de tumor de Wilms (n° de acesso ATCC CRL-1441).

Em uma concretização preferida, a seqüência de CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18, e modificações conservativas das mesmas; e a seqüência de CDR2 de região variável de cadeia leve CDR2 compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, e modificações conservativas das mesmas. Em outra concretização preferida, a seqüência de CDRl de região variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüências de aminoácidos í

das SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14, e modificações conservativas das mesmas; e a seqüência de CDRl de região variável de cadeia leve compreende uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste de seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, e modificações conservativas das mesmas.

-----Como usado aqui, o termo "modificações de seqüências

conservativas" destina-se a referir a modificações de aminoácidos que não afetam ou alteram significamente as características de ligação do anticorpo contendo a seqüência de aminoácidos. Referidas modificações conservativas incluem substituições, adições e deleções de aminoácidos. E possível introduzir modificações em um anticorpo da invenção por meio de técnicas convencionais conhecidas na arte, como mutagênese dirigida para sítio e mutagênese mediada com PCR. Substituições de aminoácidos conservativas são aquelas em que o radical de aminoácido é substituído por um radical de aminoácido apresentando uma cadeia lateral similar. Famílias de radicais de aminoácidos apresentando cadeias laterais similares foram definidas na arte. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (p. ex., lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (p. ex., ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (p. ex., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (p. ex., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas em beta (p. ex., treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (p. ex., tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais radicais de aminoácidos nas regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos por outros radicais de aminoácidos da mesma família de cadeias laterais, e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função conservada (i.e., as funções apresentadas em (c) e (d) acima) usando-se os ensaios funcionais descritos aqui. Anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que anticorpos anti-PTK7 da invenção

Em outra concretização, a invenção proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo na PTK7 humana que qualquer um dos anticorpos monoclonais de PTK7 da invenção (/.£?., anticorpos que apresentam a capacidade de competir de maneira cruzada pela ligação a PTK7 com qualquer um dos anticorpos monoclonais da invenção). Em concretizações preferidas, o anticorpo de referência para estudos de competição cruzada pode ser o anticorpo monoclonal 3G8 (apresentando seqüências Vh e Yl como mostrado nas SEQ ID NOs: 1 e 5, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 3G8a (apresentando seqüências Yh e Yl como mostrado nas SEQ ID NOs: 1 e 6, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 4D5 (apresentando seqüências Vh e Vl como mostrado nas SEQ ID NOs: 2 e 7, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 12C6 (apresentando seqüências Yh e Yl como mostrado nas SEQ ID NOs: 3 e 8, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 12C6a (apresentando seqüências Yh e Yl como mostrado nas SEQ ID NOs: 3 e 9, respectivamente), ou o anticorpo monoclonal 7C8 (apresentando seqüências Vh e Vl como mostrado nas SEQ ID NOs: 4 e 10, respectivamente). Referidos anticorpos de competição cruzada podem ser identificados com base em sua capacidade de competir de maneira cruzada com 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8 em ensaios de ligação de PTK7 convencionais. Por exemplo, é possível usar análise BIAcore, ensaios ELISA ou citometria de fluxo para demonstrar competição cruzada com os anticorpos da presente invenção. A capacidade de um anticorpo de teste de inibir a ligação de, por exemplo, 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8, a PTK7 humana demonstra que o anticorpo de teste pode competir com 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8 pela ligação a PTK7 humana e, assim, liga-se ao mesmo epítopo na PTK7 humana que 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8. Em uma concretização preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítopo em PTK7 humana que 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8 é um anticorpo monoclonal humano. Referidos anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados como descrito nos Exemplos.

Anticorpos engenheirados e modificados

Um anticorpo da invenção pode ser preparado adicionalmente usando^se^mantico^oapresentandoumaoumaisdasseqü aqui divulgadas como material de partida para manipular um anticorpo modificado, sendo que referido anticorpo modificado pode apresentar propriedades alteradas com relação ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser engenheirado modificando-se um ou mais radicais em uma ou ambas as regiões variáveis (ie., Vh e/ou VL), por exemplo em uma ou mais regiões CDR e/ou em uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser engenheirado modificando-se radicais nas região constante ou nas regiões constantes, por exemplo, para alterar a função efetora ou as funções efetoras do anticorpo.

Um tipo de manipulação de região variável que pode ser realizada é enxerto de CDR. Anticorpos interagem com antígenos-alvo predominantemente através de radicais de aminoácidos que se localizam nas seis regiões determinadoras de complementaridade (CDRs, complementarity determining regions). Por esta razão, as seqüências de aminoácidos em CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que seqüências fora de CDRs. Como seqüências de CDR são responsáveis pela maior parte das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que emulam as propriedades de anticorpos específicos naturalmente ocorrentes mediante construção de vetores de expressão que incluem seqüências de CDR do anticorpo específico naturalmente ocorrente enxertado sobre seqüências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (Ver, p. ex., Riechmann, L. et al (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al (1989) Proc. NatL Aead See. U.S.A. 86:10029-10033; Patente U.S. 5.225.539 para Winter5 e Patentes U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et ai.)

Assimi outra concretização da invenção refere-se a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno do mesmo, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo seqüências de CDRl, CDR2, e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14, SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18 e SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo seqüências de CDRl, CDR2, e CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34 e SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40, respectivamente. Assim, referidos anticorpos contêm as seqüências de CDR Vh e Vl de anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8 ainda podem conter seqüências de estrutura diferentes destes anticorpos.

Referidas seqüências de estrutura podem ser obtidas de bancos de dados de DNA públicos ou de referências publicadas que incluem seqüências de gene de anticorpo de linha germinal. Por exemplo, seqüências de DNA de linha germinal para genes de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser encontradas no banco de dados de seqüências de linha germinal humana "VBase" (obtenível na internet em www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), e também em Kabat, Ε. A., et ai. (1991) Sequences of Proteins of Immunologieal Interest [Seqüências de proteínas de interesse imunológico], quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline Vh Sequences Reveals about Fifty Groups of Vh Segments with Different Hypervariable Loops" J. MoL BioL 227:776-798; e Cox, J. Ρ. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-Iine Vh Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. ImmunoL 24:827-836; sendo que os teores de cada um destes documentos é incorporado aqui expressamente por referência.

Como outro exemplo, as seqüências de DNA de linha germinal

------para genes de região variável de cadeia pesada e de cadeia leve humanos

podem ser encontradas no banco de dados Genbank. Por exemplo, as seqüências de linha germinal de cadeia pesada a seguir que são encontradas no camundongo HCo7 HuMAb encontram-se disponíveis nos números de acesso Genbank anexos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seqüências de linha germinal de cadeia pesada a seguir encontradas no camundongo HCo 12 HuMAb encontram-se disponíveis nos números de acesso Genbank anexos: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (?) e 3-23 (AJ406678).

Seqüências de proteínas de anticorpos são comparadas contra um banco de dados de seqüências de proteína compiladas usando-se um dos métodos de busca de similaridade de seqüências denominado Gapped BLAST (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que é bem conhecido por aqueles com prática na arte. BLAST é um algoritmo heurístico pelo fato de que um alinhamento estatisticamente significativo entre a seqüência de anticorpos e a seqüência do banco de dados provavelmente conterá pares de segmentos de escore elevado (HSP, high-scoring segment pairs) de palavras alinhadas. Pares de segmentos cujos escores não podem ser melhorados por extensão ou aparamento é denominado um hit. Resumidamente, as seqüências de nucleotídeos de origem YBASE (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbasel/list2.php) são traduzidas e a região entre, e incluindo a região de estrutura de FRl até FR3 é conservada. As

i seqüências de banco de dados apresentam um comprimento médio de 98 radicais. Seqüências duplicatas que são paramentos exatos ao longo de todo o comprimento da proteína são removidas. Uma busca BLAST por proteínas usando o programa blastp com parâmetros default, padrão, exceto o filtro de baixa complexidade, que é desligado, e a matriz de substituição de BLOSUM62,—filtros—para—5—melhores—acertos—(ίkits)—proporcionando pareamentos de seqüências. As seqüências de nucleotídeos são traduzidas em todas as seis matrizes, e a matriz sem códon de interrupção no segmento de pareamento da seqüência do banco de dados é considerada o acerto (hit) potencial. Isto confirma-se, por sua vez, com o emprego do programa BLAST tblastx, que traduz a seqüência de anticorpos em todas as seis matrizes e compara aquelas traduções com as seqüências de nucleotídeos VBASE traduzidas dinamicamente em todas as seis matrizes.

As identidades são pareamentos exatos de aminoácidos entre a seqüência de anticorpo e o banco de dados de proteínas ao longo de todo o comprimento da seqüência. As positivas (identidades + pareamento de substituição) não são idênticas, mas substituições de aminoácidos guiadas pela matriz de substituição BLOSUM62. Se a seqüência de anticorpo se equiparar a duas das seqüências de banco de dados com a mesma identidade, o acerto com a maior parte dos positivos poderia ser decidido como sendo acerto de seqüência de pareamento.

Seqüências de estrutura preferidas para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às seqüências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, p. ex., similares às seqüências de estrutura de Vh 3-30.3 (SEQ ID NO:51) e/ou às seqüências de estrutura de Vh DP44 seqüências de estrutura (SEQ ID NO:52) e/ou às seqüências de estrutura de 3-33 Vh (SEQ ID NO:53) e/ou às seqüências de estrutura de Ll5 Vk (SEQ ID NO:54) e/ou às seqüências de estrutura de AlO Vk (SEQ ID NO:55) e/ou às seqüências de estrutura de L15 Vk (SEQ ID NO:54) e/ou às seqüências de estrutura de A27 Vk (SEQ ID NO:56) e/ou às seqüências de estrutura de L15 Vk (SEQ ID NO:54) e/ou às seqüências de estrutura de L6 Vk (SEQ ID NO:57) usadas por anticorpos monoclonais preferidos da invenção. As seqüências de estrutura das seqüências de CDRl, CDR2, e CDR3 VH, e as seqüências CDRli CDR2, e CDR3 VK, podem ser enxertadas em regiões de estrutura que apresentam a seqüência idêntica àquela encontrada no gene de imunoglobulina de linha germinal do qual a seqüência de estrutura se deriva, ou as seqüências de CDR podem ser enxertadas em regiões de estrutura que contêm uma ou mais mutações em comparação com as seqüências de linha germinal. Por exemplo, em determinados casos verificou-se que é benéfico mutar radicais nas regiões de estrutura para manter ou incrementar a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo (ver p. ex., Patentes U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et αΐ).

Outro tipo de modificação de região variável consiste em mutar radicais de aminoácidos nas regiões CDR1, CDR2 e/ou CDR3 Vh e/ou Vk para melhorar, com isso, uma ou mais propriedades de ligação (p. ex., afinidade) do anticorpo de interesse. E possível realizar mutagênese dirigida para sítio ou mutagênese mediada com PCR para introduzir a mutação/as mutações e o efeito sobre a ligação de anticorpo, ou outra propriedade funcional de interesse, pode ser avaliado em ensaios in vitro ou in vivo como descrito aqui e proporcionado nos Exemplos. De preferência, introduz-se modificações conservativas (como discutido acima). As mutações podem ser substituições, adições ou deleções de aminoácidos, mas, de preferência, substituições. Além disso, altera-se tipicamente não mais de um, dois, três, quatro ou cinco radicais em uma região CDR.

Assim, em outra concretização, a invenção proporciona anticorpos monoclonais anti-PTK7 isolados, ou porções de ligação de antígeno dos mesmos, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região de CDRl Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14; (b) uma região CDR2 Vh

-------compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que

consiste das SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18; (c) uma região CDR3 Vh compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22; (d) uma região CDRl Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28; (e) uma região CDR2 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34; e (f) uma região CDR3 Vk compreendendo uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40, ou uma seqüência de aminoácidos apresentando uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, deleções ou adições de aminoácidos em comparação com as SEQ ID NOs: 35, 36,37,38, 39 e 40.

Anticorpos engenheirados da invenção incluem aqueles em

l que se realizou modificações em radicais de estrutura em Vh e/ou VKj p. ex. para melhorar as propriedades do anticorpo. Tipicamente, realiza-se referidas modificações de estrutura para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma abordagem consiste em "backmutate" [retro-mutar] um ou mais radicais de estrutura à seqüência de linha germinal correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que sofreu mutação somática pode conter radicais de estrutura que diferem da seqüência de linha germinal da qual o anticorpo se deriva.

Referidos radicais podem ser identificados comparando-se as seqüências de estrutura do anticorpo com as seqüências de linha germinal de que o anticorpo se deriva.

Por exemplo, para 3G8 (e 3G8a), radical de aminoácido n° 28 (em FRl) de Vh é uma isoleucina, enquanto que este radical na seqüência de linha germinal Vh 3-30.3 correspondente é uma treonina. Para retornar as seqüências de região de estrutura a sua configuração de linha germinal, as mutações somáticas podem ser "backmutated" [retro-mutadas] à seqüência de linha germinal, por exemplo, por meio de mutagênese dirigida para sítio ou mutagênese mediada com PCR (p. ex., radical n° 28 de FRl da Vh de 3G8 (e 3G8a) pode ser "backmutated" [retro-mutada] de isoleucina a treonina).

Como outro exemplo, para 12C6 (e 12C6a), radical de aminoácido n° 44 (entre FR2) de Vh é uma treonina, enquanto que este radical na seqüência de linha germinal Vh DP44 correspondente é uma glicina. Para retornar as seqüências de região de estrutura à sua configuração de linha germinal, por exemplo, radical n° 44 (radical n° 9 de FR2) da Vh de 12C6 (e 12C6a) pode ser "backmutated" [retro-mutado] de treonina a glicina. Referidos anticorpos "backmutated" [retro-mutados] também devem ser compreendidos pela invenção.

Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutar um ou mais radicais na região de estrutura, ou mesmo em uma ou mais regiões CDR, para remover epítopos de células T para, com isso, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta abordagem também é referida como "desimunização" e é descrita mais detalhadamente na Publicação de Patente dos E.U.A. n° 20030153043 por Carr et al

Adicionalmente ou alternativamente a modificações realizadas nã estrutura õü regiões GDR, anticorpos da invenção podem ser engenheirados para incluírem modificações na região Fc, tipicamente alterando uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, como meia-vida no soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Adicionalmente, um anticorpo da invenção pode ser modificado quimicamente (p. ex., uma ou mais porções químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou pode ser modificado de forma a alterar sua glicosilação, novamente de forma a alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas concretizações é descrita de forma mais detalhada abaixo. A numeração dos radicais na região Fc é aquela do índice EU do Kabat.

Em uma concretização, a região de dobradiça de CHl é modificada de tal forma que o número de radicais cisteína na região de dobradiça é alterado, p. ex., incrementado ou diminuído. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Patente U.S. 5.677.425 por Bodmer et al O número de radicais cisteína na região de dobradiça de CHl é alterado, por exemplo, para facilitar a montagem das cadeias leve e pesada ou para incrementar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

Em outra concretização, a região de dobradiça de Fc de um anticorpo é mutada de forma a incrementar a meia-vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácidos são introduzidas na região de interface de domínio de CH2-CH3 do fragmento de dobradiça - Fc, de tal forma que o anticorpo apresenta ligação prejudicada de proteína A de Staphylococcyl (SpA) relativamente à ligação de SpA do 15

20

25

domínio de ,Obradiirfc nalivo. Es„ „bordagen] 4 detalhada na Patente U.S. 6.165.745 por Ward etal.

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desço» de Porma mais de,a,hadanas Patentts U.S. 6.m.5il por Idusogie „ Em outro exemplo, um ou mais radicais de aminoácidos nas posições de aminoácidos 231 e 239 são alterados para, com isso, alterar a capacidade do anticorpo em fixar complemento. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al

Em outro exemplo adicional, a região Fc é modificada de forma a alterar a capacidade do anticorpo em mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity) e/ou de forma a incrementar a afinidade do anticorpo por um receptor Fcy por meio de modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta abordagem é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os sítios de ligação em IgGl humana para FcyRl, FcyRII, FcyRIII e FcRn foram mapeados, e descreveu-se variantes com ligação aperfeiçoada (ver Shields, R.L. et al (2001) J. BioL Chem. 276:6591-6604). Mostrou-se que mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 incrementam a ligação a FcyRIIL Adicionalmente, mostrou-se que os mutantes de combinação a seguir incrementam a ligação de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

Em outra concretização adicional, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, é possível preparar um anticorpo aglicosilado (i.e., o anticorpo não apresenta glicosilação). Glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, incrementar a afinidade do anticorpo pelo antígeno. Referidas modificações de cloridrato de podem ser realizadas, por exemplo, alterando-se um ou mais sítios de glicosilação na seqüência de anticorpo. Por exemplo, é possível realizar uma ou mais substituições de aminoácidos que resultam na eliminação de um ou mais sítios de glicosilação de estrutura de região variável de forma a, com isso, eliminar a glicosilação naquele sítio. Referida aglicosilação pode incrementar a afinidade do anticorpo por antígeno. Uma abordagem do tipo referido é descrita mais detalhadamente nas Patentes U.S. 5.714.350 e 6.350.861 por Co et al -AdTciOnalmenteou^ltematw^

anticorpo que apresenta um tipo alterado de glicosilação, como um anticorpo hipofucosilado apresentando quantidades reduzidas de radicais fucosila ou um anticorpo apresentando estruturas GlcNac bisseccionantes incrementadas. Referidos padrões de glicosilação alterados demonstraram incrementar a capacidade de ADCC de anticorpos. Referidas modificações de carboidratos podem ser realizadas, por exemplo, por meio de expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. Células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na arte e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais expressar anticorpos recombinantes da invenção para, com isso, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhas de células Ms704, Ms705, e Ms709 não apresentam o gene da fucosiltransferase, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferase), de tal forma que anticorpos expressos nas linhas de células Ms704, Ms705, e Ms709 não apresentam fucose em seus carboidratos. As linhas de células Ms704, Ms705, e Ms709 FUT8_/" foram criadas pela disrupção objetivada do gene FUT8 em células CHO/DG44 usando dois vetores de complemento (ver Publicação de Patente dos E.U.A. n° 20040110704 por Yamane et al e Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como outro exemplo, a EP 1.176.195 por Hanai et al descreve uma linha de células com um gene FUT8 disrompido funcionalmente que codifica uma fucosil transferase, de tal forma que anticorpos expressos em uma linha de células do tipo referido apresentam hipofucosilação mediante redução ou eliminação da enzima relacionada com ligação alfa 1,6. Hanai et al. também descrevem linhas de células que apresentam uma baixa atividade enzimática para adicionar de fucose à N- acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não apresenta a atividade enzimática, por exemplo, a linhas de células de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhas de células CHO variante, células Lec 13, com reduzida capacidade de ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), resultando também em hipofucosilação de anticorpos expressa naquela célula hospedeira (ver também Shields, R.L. et al (2002) J. Biol Chem. 277:26733-26740). Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et ai. descreve linhas de células engenheiradas de forma a expressarem glicosil transferases modificadoras de glicoproteína (p. ex., beta(l,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) de tal forma que anticorpos expressos nas linhas de células engenheiradas apresentam estruturas GlcNac bisseccionantes incrementadas, o que resulta em atividade ADCC incrementada dos anticorpos (ver também Umana et ai. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os radicais fucose do anticorpo podem ser removidos por clivagem usando-se uma enzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove radicais fucosila dos anticorpos (Tarentino, A.L. et ai. (1975) Biochem. 14:5516-23).

Outra modificação dos anticorpos que é considerada pela invenção é a PEGuilação. Um anticorpo pode ser PEGuilado para, por exemplo, incrementar a meia-vida biológica (p. ex., soro) do anticorpo. Para PEGuilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, é reagido tipicamente com polietileno glicol (PEG), como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, em condições em que um ou mais grupos PEG se tornam ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. De preferência, a PEGuilação é realizada via uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como usado aqui, o termo "polietileno glicol" deve compreender qualquer uma das formas de PEG que foram usadas para derivar outras proteínas, como mono (Cl-ClO) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol- maleimida. Em determinadas concretizações, o anticorpo a ser PEGuilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para PEGuilar proteínas são conhecidos na arte e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Ver, por exemplo,

EPO 154 316 por Nishimura et aí. e EP 0 401 384 por Isliikawa et al-

Propriedades físicas de anticorpos

Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados adicionalmente pelas diversas propriedades físicas dos anticorpos anti-PTK7. É possível usar vários ensaios para detectar e/ou diferenciar classes diferentes de anticorpos com base nestas propriedades físicas.

Em algumas concretizações, anticorpos da presente invenção podem conter um ou mais sítios de glicosilação, seja na região variável de cadeia leve ou na região variável de cadeia pesada. A presença de um ou mais sítios de glicosilação na região variável pode resultar em imunogenicidade incrementada do anticorpo ou numa alteração do pK do anticorpo devido à ligação de antígeno alterada (Marshall et aí (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA e Morrison SL (2004) JImmunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al (2000) Mol Immunol 37:697-706). Sabe-se que a glicosilação ocorre em unidades repetitivas contendo uma seqüência N-X-S/T. A glicosilação de região variável pode ser testada empregando-se um ensaio Glycoblot, que cliva o anticorpo para produzir um Fab, e então testa-se a glicosilação usando-se um ensaio que mede a oxidação de periodato e a formação de base de Schiff. Alternativamente, a glicosilação de região variável pode ser testada empregando-se cromatografia de luz Dionex (Dionex-LC), que cliva sacarídeos de um Fab em monossacarídeos e analisa o teor individual de sacarídeo. Em alguns casos, prefere-se ter um anticorpo anti-PTK7 que não C3 c

contém glicosilação de região variável. Isto pode ser obtido, seja por meio de seleção de anticorpos que não contêm a unidade repetitiva de glicosilação na região variável, ou por meio de mutação de radicais na unidade repetitiva de glicosilação usando-se técnicas convencionais bem conhecidas na arte.

Em uma concretização preferida, os anticorpos da presente

---------invenção não contêm sítios de isomerismo de asparagina. Um efeito de

desamidação ou de ácido isoaspártico pode ocorrer em seqüências N-G ou D- G, respectivamente. A desamidação ou efeito de ácido isoaspártico resulta na criação de ácido isoaspártico, o que diminui a estabilidade de um anticorpo por meio de criação de uma estrutura dobrada fora de uma ponta carbóxi de cadeia lateral, ao invés de na cadeia principal. A criação de ácido isoaspártico pode ser medida usando-se um ensaio iso-quant, que usa uma HPLC de fase invertida para testar ácido isoaspártico.

Cada anticorpo apresentará um ponto isoelétrico único (pi), mas, geralmente, anticorpos se enquadrarão na faixa de pH entre 6 e 9,5. O pi para um anticorpo IgGl enquadra-se tipicamente na faixa de pH de 7-9,5, e o pi para um anticorpo IgG4 enquadra-se tipicamente na faixa de pH de 6-8. Anticorpos podem apresentar um pi que se encontra fora desta faixa. Embora os efeitos sejam geralmente conhecidos, especula-se que anticorpos com um pi fora da faixa normal podem apresentar alguma desdobragem e instabilidade em condições in vivo. O ponto isoelétrico pode ser testado usando-se um ensaio de foco isoelétrico capilar, que cria um gradiente de pH e pode empregar foco a laser para maior precisão (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). Em alguns casos, prefere-se ter um anticorpo anti-PTK7 que contém um valor de pi que se enquadra na faixa normal. Isto pode ser obtido, seja selecionando-se anticorpos com um pi na faixa normal, ou mutando-se radicais de superfície carregada empregando-se técnicas convencionais bem conhecidas na arte. Cada anticorpo apresentará uma temperatura de fusão que é indicativa de estabilidade térmica (Krishnamurthy R e Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidade térmica maior indica maior estabilidade global do anticorpo in vivo. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido empregando-se técnicas, como calorimetria de varredura diferencial (Chen et al (2003) Phann Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TM] indica a temperatura da desdobragem inicial do anticorpo. TM2 indica a temperatura de desdobragem completa of the anticorpo. De uma maneira geral, prefere-se que a TMi de um anticorpo da presente invenção seja maior do que 60°C, de preferência, maior do que 65°C, ainda mais preferivelmente maior do que 70°C. Alternativamente, a estabilidade térmica de um anticorpo pode ser medida usando-se dicroísmo circular (Murray et al (2002)J. Chromatogr Sb/40:343-9).

Em uma concretização preferida, seleciona-se anticorpos que não se degradam rapidamente. A fragmentação de um anticorpo anti-PTK7 pode ser medida usando-se eletroforese capilar (CE, capülary eleetrophoresis) e MALDI-MS, como bem se compreende na arte (Alexander AJ e Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

Em outra concretização preferida, seleciona-se anticorpos que apresentam mínimos efeitos de agregação. A agregação pode levar ao disparo de uma resposta imune indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. De uma maneira geral, são anticorpos aceitáveis com uma agregação de 25 % ou menos, de preferência, 20 % ou menos, ainda mais preferivelmente 15 % ou menos, ainda mais preferivelmente 10 % ou menos e ainda mais preferivelmente 5 % ou menos. A agregação pode ser medida por meio de diversas técnicas conhecidas na arte, incluindo coluna de exclusão de tamanho (SEC, size-exclusion column), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC, high performance liquid chromatography\ e difração de luz para identificar monômeros, dímeros, trimeros ou multímeros. Métodos de manipular anticorpos

Como discutido acima, os anticorpos anti-PTK7 apresentando seqüências Vh e Vk divulgadas aqui podem ser usados para criar novos anticorpos anti-PTK7 mediante modificação das seqüências Vh e/ou VK, ou a(s) região/regiões constante(s) ligadas aos mesmos. Assims em outro aspecto da invenção. As características adicionais de um anticorpo anti-PTK7 da invenção, p. ex. 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8, são usadas para criar anticorpos anti-PTK7 relacionados estruturalmente que conservam pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, como ligação à PTK7 humana. Por exemplo, um ou mais regiões CDR de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8, ou mutações das mesmas, podem ser combinadas recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-PKT7 adicionais, engenheirados recombinantemente, da invenção, como discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aqueles descritos na seção precedente. O material de partida para o método de manipulação consiste de uma ou mais das seqüências Vh e/ou Vk aqui proporcionadas, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Para criar o anticorpo engenheirado, não é necessário preparar eficazmente (i.e., expressar como uma proteína) um anticorpo apresentando um ou mais das seqüências Vh e/ou Yk aqui proporcionadas, ou uma ou mais regiões CDR das mesmas. Ao invés, a informação contida na(s) seqüência(s) é usada como o material de partida para criar uma seqüência(s) de "segundo geração" derivada(s) da seqüência(s) original/originais e, então, a(s) seqüência(s) de "segunda geração" é/são preparada(s) e expressa(s) como uma proteína.

Assim, em outra concretização, a invenção proporciona um método para preparar um anticorpo anti-PTK7 compreendendo:

(a) proporcionar: (i) uma região variável de cadeia pesada anticorpo seqüência compreendendo uma seqüência de CDRl selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 11, 12, 13 e 14, uma seqüência de CDR2 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 15, 16, 17 e 18, e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 19, 20, 21 e 22; e/ou (ii) uma seqüência de região variável de cadeia leve anticorpo compreendendo uma seqüência de CDRl selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27 e 28, uma seqüência de CDR2 selecionada do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 29, 30, 31, 32, 33 e 34, e/ou uma seqüência de CDR3 selecionada do grupo que consiste das SEQID NOs: 35, 36, 37, 38, 39 e 40;

(b) alterar pelo menos um radical de aminoácido na região variável de cadeia pesada anticorpo seqüência e/ou na região variável de cadeia leve anticorpo seqüência para criar pelo menos uma seqüência de anticorpo alterada; e

(c) expressar a seqüência de anticorpo alterada como uma

proteína.

E possível usar técnicas convencionais da biologia molecular para preparar e expressar a seqüência de anticorpo alterada.

De preferência, o anticorpo codificado pela(s) seqüência(s) de anticorpo alterada(s) é uma que conserva uma, algumas ou todas as propriedades funcionais propriedades funcionais dos anticorpos anti-PTK7 aqui descritos, sendo que as referidas propriedades funcionais incluem, embora sem limitação:

(a) o anticorpo liga-se à PTK7 humana com uma Kd de 1 χ 10"

M ou menos;

(b) o anticorpo liga-se à linhas de células de tumor de Wilms.

As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser

avaliadas usando-se ensaios convencionais disponíveis na arte e/ou descritos aqui, como aqueles apresentados nos Exemplos (p. ex., citometria de fluxo, ensaios de ligação). ί

Em determinadas concretizações dos métodos de manipulação de anticorpos da invenção, é possível introduzir mutações randomicamente ou seletivamente ao longo de toda uma seqüência codificante de anticorpo anti- PTK7, e os anticorpos anti-PKT7 modificados resultantes podem ser selecionados quanto à atividade de ligação e/ou outras propriedades --------fancronais^comodescrítoaquh-

Métodos mutacionais foram descritos na arte. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criar e selecionar mutações de anticorpos usando mutagênese de saturação, montagem de ligação sintética, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar et ai. descreve métodos de uso de métodos de seleção computacional para otimizar propriedades físico-químicas dos anticorpos. Moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos da invenção Outro aspecto da invenção refere-se a moléculas de ácido

nucleico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em uma lisados de células, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado de outros componentes celulares ou de outros contaminantes, p. ex., outras proteínas ou ácidos nucleicos celulares, por meio de técnicas convencionais, incluindo tratamento alcalino/SDS, formação de bandas de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na arte. Ver, F. Ausubel, et ai., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing e Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA e pode ou não conter seqüências intrônicas. Em uma concretização preferida, o ácido nucleico é uma molécula de cDNA.

r

Ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando-se técnicas convencionais da biologia molecular. No caso de anticorpos expressos por hibridomas (p. ex., hibridomas preparados de camundongos transgênicos portando genes de imunoglobulina humana como descrito adicionalmente abaixo), cDNAs codificando as cadeias leve e pesada do anticorpo preparadas pelo hibridoma podem ser obtidos por meio de técnicas convencionais de amplificação de PCR ou de clonagem de cDNA. No caso de anticorpos obtidos de uma biblioteca de genes de imunoglobulina (p. ex., usando técnicas de apresentação de fago), ácido nucleico codificando o anticorpo pode ser recuperado da biblioteca.

Moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam as seqüências VH e VL dos anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a ou 7C8. Seqüências de DNA codificando as seqüências VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 41 (3G8 e 3G8a), 42 (4D5), 43 (12C6 e 12C6a) e 44 (7C8). Seqüências de DNA codificando as seqüências VL de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 são mostradas nas SEQ ID NOs: 45, 46, 47, 48, 49 e 50, respectivamente.

Uma vez que fragmentos de DNA que codificam segmentos de VH e VL são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser engenheirados adicionalmente por meio de técnicas convencionais de DNA recombinante, por exemplo, para converter os genes de região variável a genes de cadeia de anticorpo de comprimento pleno, a genes de fragmento Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA codificando VL ou VH é ligado operacionalmente a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, como uma região constante de anticorpo ou um ligante flexível. O termo "ligado operacionalmente", como usado neste contexto, deve significar que os fragmentos de DNA são conjugados de tal forma que as seqüências de aminoácidos codificadas pelos dois fragmentos de DNA permaneçam na- matriz. O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido a um gene de cadeia pesada de comprimento pleno mediante ligação operacional do DNA codificando VH a outra molécula de DNA codificando regiões constantes de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). As seqüências de genes de região constante de cadeia pesada humanos são conhecidos na arte (verp. ex., Kabat, Ε, A., et ai. (1991) Seqüências de proteínas de interesse imunológico, quinta edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n° 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo estas regiões podem ser obtidas por meio de amplificação de PCR convencional. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, porém, da forma mais preferível, é uma região constante de IgGl ou IgG4. No caso de um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA codificando VH pode ser ligado operacionalmente a outra molécula de DNA codificando apenas a região constante CHl de cadeia pesada.

O DNA isolado que codifica a região VL pode ser convertido a gene de cadeia leve de comprimento pleno (e também a um gene de cadeia leve de Fab) mediante ligação operacional do DNA codificando VL a outra molécula de DNA codificando a região constante de cadeia leve, CL. As seqüências de genes de região constante de cadeia leve humanos são conhecidos na arte (ver p. ex., Kabat, Ε. A., et al (1991) "Seqüências de proteínas de interesse imunológico", 5a edição, U.S. Department of Health and Human Services, Publicação NIH n° 91-3242) e fragmentos de DNA compreendendo estas regiões podem ser obtidas por meio de amplificação de PCR convencional. A região constante de cadeia leve pode ser uma região constante kapa ou lambda, mas, da forma mais preferível, é uma região constante kapa.

Para criar um gene de anticorpo de cadeia única (scFv), os fragmentos de DNA codificando VH e VL são ligados operacionalmente a outro fragmento codificando um ligante flexível, p. ex., codificando a seqüência de aminoácidos (GIy4 -Ser)3, de tal forma que as seqüências VH e VL podem ser expressas como uma proteína de cloreto de sódio contígua, com as regiões VL e VH conjugadas pelo ligante flexível (ver p. ex., Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al (1988) Proc. Natl Acad. ScL

-^4-85^879=5883;HVÍceafferty-^^ ----

Produção de anticorpos monoclonais da invenção

Anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos por meio de uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, p. ex., a técnica convencional de hibridação de células somáticas de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora se prefira procedimentos de hibridação de células somáticas, em princípio é possível empregar outras técnicas para produzir anticorpo monoclonal, p. ex., transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

O sistema animal preferido para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são bem conhecidos na arte. Parceiros de fusão (p. ex., células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos.

Anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados com base na seqüência de um anticorpo monoclonal murino preparado como descrito acima. DNA codificando as imunoglobulinas de cadeia pesada e de cadeia leve pode ser obtido do hibridoma murino de interesse e engenheirado para conter seqüências de imunoglobulina não- murina (p. ex., humana) usando-se técnicas convencionais da biologia molecular. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, as regiões variáveis murinas podem ser ligadas a regiões constantes humanas usando-se métodos conhecidos na arte (ver p. ex., Patente U.S. 4.816.567 para Cabilly et Ή

e

β/.). Para criar um anticorpo humanizado, as regiões CDR murinas podem ser inseridas em uma estrutura humana com o uso de métodos conhecidos na arte (ver p. ex., Patente U.S. 5.225.539 para Winter, e Patentes U.S. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et ai).

Em uma concretização preferida, os anticorpos da invenção

---são anticorpos monoclonais humanos. Referidos anticorpos monoclonais

humanos dirigidos contra PTK7 podem ser gerados usando-se partes portadoras de camundongos transgênicos ou transcromossômicos do sistema imune humano, ao invés de no sistema de camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos HuMAb e KM mice™, respectivamente, e são referidos aqui coletivamente como "camundongos de Ig humana".

O camundongo HuMAb mouse® (Medarex, Inc.) contém miniloci de genes de imunoglobulina humana que codificam seqüências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e λ) e de cadeia leve κ não-rearranjadas, juntamente com mutações objetivadas que inativam os Ioci de cadeias μ e κ endógenas (ver p. ex., Lonberg, et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Assim, os camundongos apresentam expressão reduzida de IgM de camundongo ou κ, e, em resposta à imunização, os transgenes de cadeia pesada e de cadeia leve humanos introduzidos sofrem troca de classe e mutação somática para gerar IgG κ monoclonal humana de alta afinidade (Lonberg, N. et al (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. ImmunoL 13: 65-93, e Harding, F. e Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad Sei. 764:536-546). A preparação e o uso de camundongos HuMab, e as modificações genômicas realizadas por referidos camundongos, é descrita adicionalmente em Taylor, L. et al (1992) Nucleic Aeids Research 20:6287- 6295; Chen, J. et al (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al (1993) Proe. Natl Aead Sei USA 90:3720-3724; Choi et al (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al (1994) J ImmunoL 152:2912-2920; Taylor, L. eí al (1994) International Immunology 6: 579-591; e Fishwild, D. et al (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, cujo teores são incorporados aqui especificamente e integralmente por referência. Ver adicionalmente, Patentes U.S. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.7 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente U.S. 5.545.807 para Surani et al.; Publicações PCT nums. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT n° WO 01/14424 para Korman et al.

Em outra concretização, anticorpos humanos da invenção pode ser desenvolvidos usando-se um camundongo que porta seqüências de imunoglobulina humana em transgenes e transcromossomas, como um camundongo que porta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossoma de cadeia leve humano. Referidos camundongos, referidos aqui como "KM mice™", são descritos detalhadamente na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al

Adicionalmente, sistemas animais transgênicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana são disponíveis na arte e podem ser usados para desenvolver anticorpos anti-PTK7 da invenção. Por exemplo, é possível usar um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomouse (Abgenix, Inc.); referidos camundongos encontram-se descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al

Além disso, sistemas animais transcromossômicos alternativos expressando genes de imunoglobulina humana encontram-se disponíveis na arte e podem ser usados para desenvolver anticorpos anti-PTK7 da invenção. Por exemplo, usar camundongos que portam tanto um transcromossomo de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano, referidos como "camundongos TC"; referidos camundongos encontram-se descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl Acad Sei. USA 97:722-727. Adicionalmente, vacas portando transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foram descritas na arte (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e podem ser usadas para desenvolver anticorpos anti-PTK7 da invenção.

Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados empregando-se métodos de apresentação de fago para selecionar bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Referidos métodos de apresentação de fago para isolar anticorpos humanos são estabelecidos na arte. Ver, por exemplo: Patentes U.S. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et ai; Patentes U.S. 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et ai; Patentes U.S. 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al\ e Patentes U.S. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths etal

Anticorpos monoclonais humanos da invenção também podem ser preparados empregando-se camundongos SCID em que células imunes humans foram reconstituídas de tal forma que é possível gerar uma resposta de anticorpo humano à imunização. Referidos camundongos encontram-se descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson et ai.

Imunização de camundongos com Ig humana

Quando se usa camundongos com Ig humana para desenvolver anticorpos humanos da invenção, referidos camundongos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno de PTK7 e/ou PTK7 recombinante, ou uma proteína de fusão de PTK7, como descrito por Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicação PCT WO L

98/24884 e WO 01/14424. De preferência, os camundongos terão de 6 a 16 semanas de vida quando da primeira infusão. Por exemplo, é possível usar uma preparação purificada ou recombinante (de 5 a 50 μg) de antígeno PTK7 para imunizar os camundongos com Ig humana intraperitonealmente.

Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais

----totalmente humanos para PTK7 encontram-se descritos no Exemplo 1 abaixo.

Experiência cumulativa com vários antígenos mostrou que os camundongos transgênicos respondem quando imunizados inicialmente por via intraperítoneal (IP) com antígeno em adjuvante de Freund completo, seguido, em semanas alternadas, de imunizações IP (até um total de 6) com antígeno em adjuvante de Freund incompleto. No entanto, verificou-se que adjuvantes diferentes dos de Freund também são efetivos. Adicionalmente, verificou-se que células inteiras, na ausência de adjuvante, são altamente imunogênicas. A

»

resposta imune pode ser monitorada ao longo do curso do protocolo de imunização, obtendo-se amostras de plasma por meio de sangramentos retroorbitais. O plasma pode ser selecionado por meio de ELISA (como descrito abaixo), e é possível usar camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-PTK7 para fusões. Camundongos podem receber reforços por via intravenosa com antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Espera-se que não seja necessário realizar de 2 a 3 fusões para cada imunização. Entre 6 e 24 camundongos são imunizados tipicamente para cada antígeno. Usualmente emprega-se tanto cepas HCo7 e cepas HCol2. Adicionalmente, ambos os transgenes HCo7 e HCol2 podem ser desenvolvidos em conjunto em um único camundongo apresentando dois transgenes de cadeia pesada humanos diferentes (HCo7/HCol2). Alternativamente ou adicionalmente, é possível usar a cepa de camundongo KM mouse™, como descrito em Exemplo 1.

Geração de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais humanos da invenção í

Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais humanos da invenção, é possível isolar esplenócitos e/ou células de nódulos linfáticos de camundongos imunizados, e fundidos a uma linha de células imortalizada apropriada, como uma linha de células de mieloma de

camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser selecionados quanto à

de células simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a um sexto do número de células de mieloma de mouse não-secretoras P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50 % de PEG. Células são plaqueadas a aproximadamente 2 χ IO5 em placa de microtitulação de fundo plano, seguido de uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20 % de soro fetal Clone, 18 % de meio condicionado "653", 5 % de origen (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e IX HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Após aproximadamente dois semanas, células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é substituído por HT. Em seguida, poços individuais podem ser selecionados por meio de ELISA para anticorpos IgM e IgG monoclonais humanos. Uma vez que ocorre crescimento extensivo de hibridoma, meio pode ser observado usualmente após de 10 a 14 dias. Os hibridomas secretadores de anticorpos podem ser replaqueados, novamente selecionados, e, se ainda positivos pra IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes limitando-se a diluição. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

Para purificar anticorpos monoclonais humanos, é possível desenvolver hibridomas selecionados em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Sobrenadantes podem ser £

filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A- sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ.). IgG eluída pode ser verificada por meio de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBSi e é possível determinar a concentração por meio de OD2So usando-se coeficiente de

---extinção—de—1^4-3—Os--anticorpos—monoclonais—podem—ser—repartidos—σ

armazenados a -80° C.

Geração de transfectomas produzindo anticorpos monoclonais da invenção

Anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene como é de conhecimento geral na arte (p. ex., Morrisoni S. (1985) Science 229:1202). Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpos dos mesmos, é possível obter DNAs codificando cadeias pesadas e leves de comprimento parcial ou pleno por meio de técnicas convencionais da biologia molecular (p. ex., amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão de tal forma que os genes são ligados operacionalmente a seqüências de controle transcricional e de tradução. Neste contexto, o termo "ligado operacionalmente" deve significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor de tal forma que as seqüências de controle transcricional e de tradução no vetor serem a sua função intencionada de regular a transcrição e tradução do gene de anticorpo. As seqüências de vetor de expressão e de controle de expressão são selecionadas de forma a serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de cadeia leve de anticorpo e o gene de cadeia pesada de anticorpo pode ser inserido em vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes podem ser inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por meio de métodos convencionais (p. ex., ligação de sítios de

restrição complementares no vetor e fragmento de gene de anticorpo, ou ligação de ponta cega caso não estejam presentes sítios de restrição). As regiões variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada dos anticorpos aqui descritas podem ser usadas para criar genes de anticorpo de comprimento pleno de qualquer isótipo de anticorpo mediante inserção dos mesmos em

-vetores dc expressão já codificando regiões constantes de cadeia pesada e

regiões constantes de cadeia leve do isótipo desejado, de tal forma que o segmento Vh é ligado operacionalmente ao(s) segmento(s) Ch no vetor e o segmento Vk é ligado operacionalmente ao segmento Cl no vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo-sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor de tal forma que o peptídeo-sinal é ligado na-matriz à ponta amino do gene de cadeia do anticorpo. O peptídeo-sinal pode ser um peptídeo-sinal de imunoglobulina ou um peptídeo-sinal heterólogo (i.e., um peptídeo-sinal de uma proteína não-imunoglobulina).

Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção portam seqüências reguladoras que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência reguladora" deve incluir promotores, acentuadores e outros elementos de controle de expressão (p. ex., sinais de poliadenilação) que controla a transcrição ou tradução dos genes de cadeia de anticorpo. Referidas seqüências reguladoras encontram-se descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology [Tecnologia de Expressão de Genes]. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Aqueles versados na arte perceberão que os projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Seqüências reguladoras preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que dirigem altos níveis de expressão de proteína em células mamíferas, como promotores e/ou acentuadores derivados de citomegalovírus (CMV), vírus símio 40 (SV40), adenovírus, (p. ex., o promotor tardio maior do adenovírus (AdMLP, adenovírus major late promoter) e polioma. Alternativamente, é possível usar seqüências reguladoras não virais, como o promotor de ubiquitina ou promotor de β-globina. Adicionalmente, elementos reguladores constituídos de seqüências de diferentes fontes, como o sistema promotor SRa, que contém seqüências do promotor precoce do SV40 e a longa repetição terminal do vírus da leucemia de células T humana de tipo 1 (Takebe, Y. et al (1988) Mol Cell Biol 8:466-472).

Adicionalmente aos genes de cadeia de anticorpo e seqüências reguladoras, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem portar seqüências adicionais, como seqüências que regulam a replicação do vetor em células hospedeiras (p. ex., origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor foi introduzido (ver, p. ex., Patentes U.S. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas para Axel et al). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a drogas, como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que o vetor foi introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene de diidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras de dhfr com amplificação/seleção de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor(es) de expressão codificando as cadeias pesada e leve são transferidos para uma célula hospedeira por meio de técnicas convecionais. As diversas formas do termo "transfecção" devem compreender uma ampla variedade de técnicas comumente conhecidas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, p. ex., electroporação, precipitação de 1<Ò í

fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextrano e análogos. Embora seja possível teoricamente expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e, da forma mais preferível, células hospedeiras mamíferas, é a mais preferida porque referidas células eucarióticas, e, em

-particular,—células—mamíferas,—agrupam-se—e—secretam,—com—maior

probabilidade do que células procarióticas, um anticorpo adequadamente dobrado e imunologicamente ativo. A expressão procariótica de genes de anticorpo foi reportada como sendo ineficaz para a produção de altos níveis de anticorpo ativo (Boss, M. A. e Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

Células hospedeiras mamíferas preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hâmster Chinês (células CHO) (incluindo células CHO-dhfr, descrito em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl Âcad. Sei. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, p. ex., como descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) Mol Biol 159:601-621), células de mieloma de NSO, células COS e células SP2. Em particular, para uso com células de mieloma de NSO, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de genes GS revelado no WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338.841. Quando vetores de expressão recombinantes codificando genes de anticorpo são introduzidos em células hospedeiras mamíferas, os anticorpos são produzidos cultivando-se as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são desenvolvidas. Anticorpos podem ser recuperados do meio de cultura usando- se métodos convencionais de purificação de proteína. Caracterização da ligação de anticorpo a antígeno

Anticorpos da invenção podem ser testados quanto à ligação a ΡΤΚ7 por meio de, por exemplo, ELISA convencional. Em resumo, placas de microtitulação são revestidas com PTK7 purificada a 0,25 μ^ιηΐ em PBS, e então bloqueadas com 5 % de albumina de soro bovino em PBS. Diluições de anticorpo (p. ex., diluições de plasma de camundongos imunizados com PTK7) são adicionadas em cada poço e incubadas durante de 1 a 2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e então incubadas com reagente secundário (p. ex., para anticorpos humanos, um reagente policlonal específico para Fc de IgG anti-humana de cabra) conjugado com fosfatase alcalina durante 1 hora a 37°C. Após a lavagem, as placas são revelado com substrato de pNPP (1 mg/ml), e analisadas a OD de 405-650. De preferência, usa-se para as fusões camundongos que desenvolvem as maiores titulações.

Também é possível usar um ensaio ELISA para selecionar hibridomas que apresentam reatividade positiva com imunógeno de PTK7. Hibridomas que se ligam com alta avidez a PTK7 são subclonados e caracterizados adicionalmente. Um clone de cada hibridoma, que conserva a reatividade das células parentais (por meio de ELISA), pode ser selecionado para a preparação de um banco de células de 5 a 10 frascos armazenado a - 140°C, e para purificação de anticorpo.

Para purificar anticorpos anti-PTK7, é possível desenvolver hibridomas selecionados em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). IgG eluída pode ser verificada por meio de eletroforese em gel e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar a pureza. A solução tampão pode ser trocada por PBS, e a concentração pode ser determinada com OD280 usando-se coeficiente de extinção 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser repartidos e armazenados a -80°C.

Para determinar se os anticorpos monoclonais anti-PKT7 selecionados se ligam a epítopos únicos, cada anticorpo pode ser biotinilado usando-se reagentes comercialmente obteníveis (Pierce, Rockford, IL). Estudos de competição usando anticorpos monoclonais não-marcados e anticorpos monoclonais biotinilados podem ser realizados usando-se placas ELISA revestidas com PTK7 como descrito acima. A ligação de mAb biotinilado pode ser detectada com uma sonda de estreptavidina-fosfatase alcalina.

Para determinar o isótipo de anticorpos purificados, é possível realizar ELISAs de isótipo empregando-se reagentes específicos para anticorpos de um tipo particular. Por exemplo, para determinar o isótipo de um anticorpo monoclonal humano, poços de placas de microtitulação podem ser revestidos com 1 μ g/ml de imunoglobulina anti-humana de um dia para o outro a 4°C. Após bloqueio com 1 % de BSA, as placas são reagidas com 1 μg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste ou controles de isótipo purificados, à temperatura ambiente, durante uma a duas horas. Os poços podem então ser reagidos com sondas conjugadas com IgGl humana ou fosfatase alcalina específica para IgM humana. Placas são desenvolvidas e analisadas como descrito acima.

IgGs humanas anti-PTK7 podem ser testadas adicionalmente quanto à reatividade com antígeno de PTK7 por meio de manchamento Western. Em resumo, PTK7 pode ser preparado e submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sódio. Após eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 10 % de soro de bezerro fetal, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada usando-se fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com tabletes de substrato de BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.). Imunoconi ugados

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um anticorpo anti-PTK7, ou um fragmento do mesmo, conjugado a uma porção terapêutica, como uma citotoxina, uma droga (p. ex., um imunossupressor) ou uma radiotoxina. Referidos conjugados são referidos aqui como "imunoconjugados". Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imunotoxinas." Uma citotoxina ou agente citotóxico i-ncl-ui-qualquer—ag (p. cx., que as-mata)r

Exemplos incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, diidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina Ds 1 -desidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Agentes terapêuticos como incluem, por exemplo, antimetabólitos (p. ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6- tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquiladores (p. ex., mecloretamina, tioepa clorambucila, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU)j ciclotosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina), antraciclinas (p. ex., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina), antibióticos (p. ex., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (p. ex., vincristina e vinblastina).

Outros exemplos preferidos de citotoxinas terapêuticas que podem ser conjugadas com um anticorpo da invenção incluem duocarmicinas, caliqueamicina, maitansinas e auristatinas, e seus derivados. Um exemplo de um conjugado de caliqueamicina - anticorpo é comercialmente obtenível (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Exemplos de citotoxinas terapêuticas podem ser encontrados, por exemplo, nas Patentes U.S.: 6548530 e 6281354 e Pedidos de Patentes dos E.U.A. nums.: US 2003/0064984, US 2003/0073852 e US 2003/0050331. Citotoxinas podem ser conjugado a anticorpos da invenção usando-se tecnologia de ligante disponível na arte. Exemplos de tipos de ligantes que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, embora sem limitação, hidrazonas, tioéteres, ésteres, dissulfetos e ligantes contendo peptídeo. Um ligante pode ser selecionado, ou seja, por exemplo, suscetível a clivagem com baixo pH no compartimento lisosômico ou suscetível a clivagem por meio de proteases, como proteases expressas preferivelmente em tecido de tumor, como catepsinas (p. ex., catepsinas B, C, D).

Para discussão adicional relativa a tipos de citotoxinas, ligantes e métodos para conjugar agentes terapêuticos com anticorpos, ver também Saito, G. et al. (2003) Adv. DrugDeliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et ai. (2003) Câncer Immunol Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Câncer Cell 3:207-212; Allen, T.M. (2002) Nat Rev. Câncer 2:750-763; Pastan, I. e Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P.D. e Springer, C.J. (2001) Adv. DrugDeliv. Rev. 53:247-264.

Anticorpos da presente invenção também podem ser conjugados a um isótipo radioativo para gerar rádio-farmacêuticos citotóxicos, também referidos como rádio-imunoconjugados. Exemplos de isótipos radioativos que podem ser conjugados com anticorpos para uso diagnóstico ou terapêutico incluem, embora sem limitação, iodo131, índio111,

' * 90 177

ítrio e lutécio . Métodos para preparar rádio-imunoconjugados são estabelecidos na arte. Exemplos de rádio-imunoconjugados são comercialmente obteníveis, incluindo Zevalina™ (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), e é possível usar métodos similares para preparar rádio-imunoconjugados usando-se os anticorpos da invenção.

Os conjugados de anticorpos da invenção podem ser usados para modificar uma dada resposta biológica, e a porção de droga não deve ser interpretada como limitada a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por ί

exemplo, a porção de droga pode ser uma proteína ou polipeptídeo apresentando uma atividade biológica desejável. Referidas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa, ou fragmento ativo das mesmas, como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína, como fator de necrose de tumor ou interferon-γ; ou,

---modifícadores—de—resposta—biológica^—como,—per—exemplo^—Hnfoeinas^

interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-ó"), fator estimulador de colônias de granulócitos macrófagos ("GM-CSF, granulocyte macrophage colony stimulating factor"), fator estimulador de colônias de granulócitos ("G-CSF, granulocyte colony stimulating factor"), ou outros fatores de crescimento.

Técnicas para conjugar referida porção terapêutica com anticorpos são bem conhecidas. Ver, p. ex., Arnon et ai., "Anticorpos monoclonais para imuno-objetivar drogas na terapia do câncer", em Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Reisfeld et ai. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al (eds.), pp. 623-53 (Mareei Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Portadores de anticorpos de agentes citotóxicos na terapia do câncer: uma revisão", em Monoclonal antibodies '84: Biological and Clinicai Applicationsi Pinchera et al (eds.)? pp. 475-506 (1985); "Análise, resultados, e perspectiva futura do uso terapêutico de anticorpo rádio-marcado na terapia do câncer", Baldwin et al (eds.), pp. 303- 16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al, "A preparação e propriedades citotóxicas de conjugados de anticorpo-toxina", Immunol Rev., 62:119-58 (1982).

Moléculas biespecíficas

Em outro aspecto, a presente invenção apresenta moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-PTK7, ou um fragmento dos mesmos, de acordo com a invenção. Um anticorpo da invenção, ou porções de ligação de antígeno do mesmo, pode ser derivado ou ligado a outra molécula funcional, p. ex., outra proteína ou peptídeo (p. ex., outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação diferentes ou moléculas-alvo. O anticorpo da invenção pode eficazmente ser derivado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar sítios diferentes e/ou moléculas-alvo; referidas moléculas multiespecíficas também devem ser compreendidas pelo termo "molécula biespecífica" como usado aqui. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser ligado funcionalmente (p. ex., por meio de acoplamento químico, fusão genética, associação não-covalente ou, de outra forma) a uma ou mais outras moléculas de ligação, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de tal forma que resulta uma molécula biespecífica.

Assim, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para PTK7 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epitopo- alvo. Em uma concretização particular da invenção, o segundo epitopo-alvo é um receptor de Fc, p. ex., FcyRI humano (CD64) ou um receptor de Fca humano (CD89). Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de ligar ambos, FcyR ou FcaR, expressando células efetoras (p. ex., monócitos, macrófagos ou células polimorfonucleares (PMNs)), e para objetivar células expressando PTK7. Estas moléculas biespecíficas objetivam células expressando PTK7 para célula efetora e dispara atividades de células efetoras mediadas com receptor de Fc, como fagocitose de uma célula expressando PTK7, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity), liberação de citocina, ou geração de ânion superóxido.

Em uma concretização da invenção em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode incluir adicionalmente uma ί terceira atividade de ligação, adicionalmente a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-PTK7. Em uma concretização, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator anti-incremento (EF), p. ex., uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, com isso, aumenta a resposta imune contra a célula-

-alvo. A "porção de fator anti-incremento" pode ser um anticorpo, fragmento

funcional do mesmo ou um ligante que se liga a uma dada molécula, p. ex., um antígeno ou um receptor, e, com isso, resulta em um incremento do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou antígeno de célula-alvo. A "porção de fator anti-incremento" pode ligar um receptor de Fc ou um antígeno de célula-alvo. Alternativamente, a porção de fator anti-incremento pode ligar-se a uma entidade que é diferente da entidade à qual as primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator anti-incremento pode ligar-se a uma célula T citotóxica (p. ex. via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-I ou outra célula imune que resulta em uma resposta imune incrementada contra a célula-alvo).

Em uma concretização, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem, como uma especificidade de ligação, pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo do mesmo, incluindo, p. ex., um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ou um Fv de cadeia única. O anticorpo também pode ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo do mesmo, como um Fv ou uma construção de cadeia única como descrito em Ladner et ai. Patente U.S. 4.946.778, cujo teor é incorporado expressamente por referência. Em uma concretização, a especificidade de ligação para um

receptor de Fcy é proporcionada por um anticorpo monoclonal, sendo que sua ligação não é bloqueada pela imunoglobulina humana G (IgG). Como usado aqui, o termo "receptor de IgG" refere-se a qualquer um dos oito genes de cadeia γ localizados no cromossomo 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de transmembrana ou de receptor solúvel que são agrupadas em três classes de receptor de Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), e FcyRIII (CD16). Em uma concretização preferida, o receptor de Fcy [apresenta] um Fc yRI de alta afinidade humano. O FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que apresenta uma alta afinidade por IgG monomérica (108 - 109 M-I).

-A produção e caracterização de determinados anticorpos

monoclonais anti—Fcy preferidos são descritos por Fanger et ai. na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente U.S. 4.954.617, cujos ensinamentos são incorporados aqui integralmente por referência. Estes anticorpos ligam-se a um epítopo de FcyRIs FcyRII ou FcyRIII em um sítio que é distinto do sítio de ligação de Fcy do receptor e, assim, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O hibridoma que produz mAb 32 é obtenível junto à American Type Culture Collection, N0 de acesso ATCC HB9469. Em outras concretizações, o anticorpo de receptor anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 é descrita por Graziano, R.F. et ai. (1995; J,. Immunol 155 (10): 4996- 5002 e Publicação PCT WO 94/10332. A linhas de células produtora do anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a denominação HA022CL1 e tem o n° de acesso CRL 11177.

Em outras concretizações preferidas adicionais, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é proporcionada por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, p. ex., um receptor de Fc- alfa (FcaRI (CD89)), sendo que a sua ligação, de preferência, não é bloqueada pela imunoglobulina A (IgA) humana. O termo "receptor de IgAn deve incluir o produto gênico de um gene α (FcaRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido por codificar diversas isoformas de transmembrana recompostas alternativamente com de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é expresso constitutivamente em monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de células não-efetoras. FcaRI tem afinidade com o meio («5 χ 107 M-1) tanto com IgAl e com Ig A2, que é incrementada mediante exposição com citocinas, como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Criticai Reviews in Immunology 16:423-440).—Quatro—anticorpos—monoclonais—específicos—para—FeaRIy identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a FcaRI fora do domínio de ligação de ligante de IgAs foram descritos (Monteiro, R.C. et al (1992) J. Immunol 148:1764).

FcaRI e FcyRI são receptores de disparo preferidos para uso nas moléculas biespecíficas da invenção porque eles são (1) expressos primariamente em células efetoras imunes, p. ex., monócitos, PMNss macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em altos níveis (p. ex., 5.000- 100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (p. ex., ADCC, fagocitose); (4) mediam apresentação de antígeno incrementada de antígenos, incluindo auto-antígenos, objetivados para os mesmos.

Embora se prefira anticorpos monoclonais humanos, é possível empregar outros anticorpos nas moléculas biespecíficas da invenção [que são] anticorpos monoclonais murinos, quiméricos e humanizados.

As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas conjugando-se as especificidades de ligação de constituinte, p. ex., as especificidades de ligação anti-FcR e anti-PTK7, usando-se métodos conhecidos na arte. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, então, conjugada uma com a outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, é possível usar uma variedade de agentes de acoplamento ou de reticulação para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'- ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N- succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP)i e sulfosuccinimidila 4-(N- maleimidometil) cicloexano-1 -carboxilato (sulfo-SMCC) (ver p. ex., Karpovsky et al (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al (1985) Proc. Natl Acad ScL USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brerman et al (1985)

Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos obteníveis junto à Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Quando as especificidades de ligação são anticorpos, elas podem ser conjugadas via ligação de sulfidrila das regiões de dobradiça C- terminais das duas cadeias pesadas. Em uma concretização particularmente preferida, a região de dobradiça é modificada de forma a conter um número ímpar de radicais sulfidrila, de preferência, um, antes da conjugação.

Alternativamente, ambas as especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e agrupadas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um mAb χ mAb, mAb χ Fab, Fab χ F(ab')2 ou proteína de fusão ligante χ Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia única compreendendo um anticorpo de cadeia única e um determinante de ligação, ou uma molécula de cadeia única biespecífica compreendendo dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas biespecíficas encontram-se descritos, por exemplo, na Patentes U. S. 5.260.203; Patentes U.S. 5.455.030; Patentes U.S. 4.881.175; Patentes U.S. 5.132.405; Patentes U.S. 5.091.513; Patentes U.S. 5.476.786; Patentes U.S. 5.013.653; Patentes U.S. 5.258.498; e Patentes U.S. 5.482.858.

A ligação das moléculas biespecíficas com seus alvos específicos pode ser confirmada, por exemplo, por meio de ensaio imunoenzimático (ELISA), ensaio rádio-imunológico (RIA), análise FACS, 30

e

bioensaio (ρ. ex., inibição de crescimento), ou ensaio de manchamento Western Blot. Cada um destes ensaios detecta geralmente a presença de complexos proteína-anticorpo de interesse particular empregando-se um reagente marcado (p. ex., um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos FcR-anticorpo podem ser detectados

-usando-sc, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo ligado a

enzima que reconhece e se liga especificamente aos complexos anticorpo- FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando-se qualquer um de uma variedade de outros ensaios imunológicos. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioativamente e usado em um ensaio rádio- imunológico (RIA) (Ver, por exemplo, Weintraub, B., Princípios de ensaios rádio-imunológicos, Sétimo Curso de Treinamento de Técnicas de Ensaio de Rádio-ligante, The Endocrine Soeiety, março de 1986, que é incorporado aqui por referência). O isótipo radioativo pode ser detectado com meios como o uso de um contador γ ou de um contador de cintilação ou por meio de auto- radiografia.

Composições farmacêuticas

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição, p. ex., uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porção de ligação de antígeno(s) dos mesmos, da presente invenção, formulado em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Referidas composições podem incluir um ou uma combinação de anticorpos (p. ex., dois ou mais diferentes), ou imunoconjugados ou moléculas biespecíflcas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a diferentes epítopos no antígeno-alvo, ou que apresentam atividades complementares.

Composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, i.e.9 combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-PTK7 da presente invenção combinado com pelo menos um outro agentes antiinflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos de forma mais detalhada abaixo na seção sobre usos dos anticorpos da invenção.

-Como usado aqui,—"veículo farmaceuticamente aceitável"

inclui qualquer solvente e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção, e análogos que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é vantajoso para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (p. ex., por meio de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, i.e.9 anticorpo, imunoconjugado, ou molécula biespecífica, pode ser revestido com um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que conserva a atividade biológica desejada do composto parental e não confere quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (ver p. ex., Berge, S.M., et ai (1977) J. Pharm. Sei. 66:1-19). Exemplos de referidos sais incluem Sais de adição de ácido e sais de adição de base. Sais de adição de ácido incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não- tóxicos, como ácido clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfurico, bromídrico, iodídrico, fosforoso e análogos, e também de ácidos orgânicos não-tóxicos, como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, ácidos alcanóicos substituídos por fenila, ácidos hidróxi alcanóicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e análogos. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, como sódio, potássio, magnésio, cálcio e análogos, e também de aminas orgânicas não-tóxicas, como N5N- dibenziletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e análogos.

Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um anti-oxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e análogos; (2) antioxidantes solúveis em óleo, como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, gaiato de propila, alfa-tocoferol, e análogos; e (3) agentes queladores de metal, como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e análogos.

Exemplos de veículos aquosos e não-aquosos vantajosos que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e análogos), e misturas vantajosas dos mesmos, óleos vegetais, como óleo de

r

oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, como oleato de etila. E possível manter a fluidez apropriada, por exemplo, com o uso de materiais de revestimento, como lecitina, por meio da manutenção do tamanho de partícula desejado, no caso de dispersões, e por meio do uso de tensoativos.

Estas composições também podem conter adjuvantes, como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada tanto por meio de procedimentos de esterilização, acima, como por meio de inclusão de diversos agentes antibacterianos e antifüngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico, e análogos. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio, e análogos nas composições. Adicionalmente, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser proporcionada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, como monoestearato de alumínio e gelatina.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem dispersões ou soluções aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de referidos meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na arte. Na medida em

-que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o composto

ativo, considera-se o seu uso nas composições farmacêuticas da invenção. Compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

Tipicamente, composições terapêuticas precisam ser estéreis e

estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, liposoma, ou outra estrutura vantajosa para elevada concentração de droga. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e análogos), e misturas vantajosas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, com o uso de um revestimento, como lecitina, por meio da conservação do tamanho de partículas necessário, no caso de dispersão, e com o uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis, como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser proporcionada incluindo-se na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas

incorporando-se o composto ativo na quantidade necessária em um solvente apropriado com um, ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido de esterilização e microfiltração. De uma maneira geral, dispersões são preparadas incorporando-se o composto ativo C

em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários dentre aqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem com vácuo e secagem com congelamento (liofilização) que proporcionam um pó do ingrediente ativo acrescido de

-quaktuer^ngredienteadie^^

filtrada de forma estéril do mesmo.

A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de veículo produzindo uma forma de dosagem simples variará dependendo do sujeito que está sendo tratado, e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material de veículo para produzir uma forma de dosagem simples será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. De uma maneira geral, de um total de cem porcento, esta quantidade compreenderá de cerca de O5Ol porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, de preferência, de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, da forma mais preferível, de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável. Regimes de dosagem são ajustados dando a resposta desejada

ótima (p. ex., uma resposta terapêutica). Por exemplo, é possível administrar um bolo simples, podendo-se administrar diversas doses divididas ao longo do tempo, ou a dose pode ser reduzida ou incrementada proporcionalmente

r

como indicado pelas exigências da situação terapêutica. E particularmente vantajoso formular composições parenterais em forma de unidade de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de unidade de dosagem, como usado aqui, refere-se a unidades fisicamente distintas apropriadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto 9S

e

ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. As especificações para as formas de dosagem unitária da invenção são determinadas por, e diretamente dependentes de, (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser obtido, e (b) as limitações inerentes encontradas na

-arte da compostação de um composto ativo do tipo referido para o tratamento

de sensibilidade em indivíduos.

Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais comumente, de 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, dosagens podem ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou na faixa de 1 a 10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar carreia a administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada de três a seis meses. Regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-PTK7 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal via administração intravenosa, sendo que o anticorpo é dado usando- se um dos programas de dosagem a seguir: (i) a cada quatro semanas durante seis dosagens, depois a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.

Em alguns métodos, duas ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, sendo que neste caso a dosagem de cada anticorpo administrado enquadra-se nas faixas indicadas. O anticorpo é administrado usualmente em múltiplas ocasiões. Intervalos entre dosagens simples pode ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos também podem ser irregulares como indicado medindo-se os níveis QG

e

sangüíneos de anticorpo com relação ao antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada de forma a se obter uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 μ^πιΐ e em alguns métodos cerca de 25-300 μg /ml.

Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como

-uma formulação de liberação sustentada, sendo que neste caso exige-se

administração menos freqüente. A dosagem e a freqüência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. De uma forma geral, anticorpos humanos apresentam a meia-vida mais longa, seguido de anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, e anticorpos não-humanos. A dosagem e freqüência de administração pode variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, um regime de dosagem relativamente baixo é administrado em intervalos relativamente pouco freqüentes ao longo de um determinado período. Alguns pacientes continuam a receber tratamento durante o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, algumas vezes exige-se uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e, de preferência, até que o paciente apresente melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Em seguida, o paciente pode receber a administração de um regime profilático.

Níveis de dosagem efetivos dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de forma a se obter uma quantidade do ingrediente ativo que é eficaz para se obter a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado depende de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica prévia do paciente que está sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas artes médicas.

Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo anti- PTK7 da invenção resulta, de preferência, em um decréscimo da gravidade dos sintomas de doença, um incremento da freqüência e duração de períodos livres de sintomas de doença, ou na prevenção de prejuízo ou incapacidade devida ao sofrimento da doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores, uma "dosagem terapeuticamente eficaz" inibe, de preferência, crescimento celular ou crescimento tumoral em pelo menos cerca de 20 %, mais preferivelmente em pelo menos cerca de 40 %, ainda mais preferivelmente em pelo menos cerca de 60 %, e ainda mais preferivelmente em pelo menos cerca de 80 % relativamente a sujeitos não tratados. A capacidade de um composto inibir crescimento tumoral pode ser avaliada em um sistema de modelo animal preditivo da eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando-sé a capacidade do composto em inibir, como inibiçao in vitro por meio de ensaios conhecidos pelo praticante versado na arte. Uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou, de outra forma, melhorar sintomas em um sujeito. Alguém com prática na arte poderia ser capaz de determinar referidas quantidades com base em fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou a via de administração selecionada.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada por meio de uma ou mais vias de administração usando-se um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na arte. Como o perceberá a pessoa versada na arte, a via e/ou o modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Vias de administração preferidas para anticorpos da invenção incluem administração intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenterais, por exemplo por meio de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" como usado aqui significa modos de administração diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por meio de injeção, _e_inclul·,—sem—limitação,—injeção—e—infusão^ntraven&sa—intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, epidural e intraesternal.

Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por uma via não-parenteral, como uma via de administração tópica, epidérmica ou mucosal, por exemplo, por via intranasal, oral, vaginal, retal, por via sublingual ou topicamente.

Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra a liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de fornecimento microencapsulados. É possível usar polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como acetato de vinil etileno, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação de referidas formulações são patenteados ou são geralmente conhecidos por aqueles versados na arte. Ver, p. exv Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systemsi J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na arte. Por exemplo, em uma concretização preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, como os dispositivos divulgados nas Patentes U.S. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de módulos e implantes bem ι

conhecidos úteis na presente invenção incluem: Patente U.S. 4.487.603, que divulga uma bomba de micro-infusão implantável para fornecer medicação a uma taxa controlada; Patente U.S. 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente U.S.

4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para

-fornecimento de medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente U.S.

4.447.224, que divulga uma dispositivo de infusão implantável de fluxo variável para fornecimento contínuo de droga; Patente U.S. 4.439.196, que divulga um sistema de fornecimento osmótico de droga apresentando compartimentos de câmaras múltiplas; e Patente U.S. 4.475.196, que divulga um sistema de fornecimento osmótico de droga. Estas patentes são incorporadas aqui por referência. A pessoa versada na arte está familiarizada com muitos outros implantes, sistemas de fornecimento, e módulos do tipo referido.

Em determinadas concretizações, os anticorpos monoclonais

humanos da invenção podem ser formulados de forma a assegurar distribuição adequada in vivo. Por exemplo, a barreira hematencefálica (barreira sangue- cérebro) ou BBB [blood-brain barrier] exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção atravessem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em liposomas. para métodos de fabricação de liposomas, ver, p. ex., Patentes U.S. 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os liposomas podem compreender uma ou mais porções que são transportadas seletivamente em células ou órgãos específicos, incrementando assim o fornecimento objetivado de droga (ver, p. ex., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol 29:685). Porções de objetivação exemplares incluem folato ou biotina (ver, p. ex., Patente U.S. 5.416.016 para Low et ai); manosídeos (Umezawa et aí(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman et al (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensoativo (Briscoe et ai. (1995) Am. J. PhysioL 1233:134); pl20 (Schreier et ai. (1994) J. Biol Chem. 269:9090); ver também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunométodos 4:273. Usos e métodos da invenção

----Os anticorpos, composições de anticorpos e métodos da

presente invenção apresentam numerosas utilidades diagnosticas e terapêuticas in vitro e in vivo, envolvendo o diagnóstico e tratamento de distúrbios mediados com PTK7. Em uma concretização preferida, os anticorpos da presente invenção são anticorpos humanos. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a sujeitos humanos, p. ex., in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Como usado aqui, o termo "sujeito" deve incluir humanos e animais não humanos. Animais não-humanos inclui todos os vertebrados, p. ex., mamíferos e não-mamíferos, como primatas não- humanos, ovelha, cães, gatos, vacas, cavalos, frangos, anfíbios, e répteis. Sujeitos preferidos incluem pacientes humanos apresentando distúrbios mediados com atividade de PTK7. Os métodos são particularmente vantajosos para tratar pacientes humanos apresentando um distúrbio associado com expressão aberrante de PTK7. Quando anticorpos para PTK7 são administrados juntamente com outro agente, os dois podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente.

Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção para PTK7, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar especificamente a expressão de PTK7 sobre a superfície de células e, adicionalmente, podem ser usados para purificar PTK7 via purificação de imunoafmidade.

A invenção proporciona adicionalmente métodos para detectar a presença de antígeno de PTK7 humana em uma amostra, ou medir a iOf

quantidade de antígeno de PTK7 humana, compreendendo contactar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, que se liga especificamente a PTK7 humana, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo ou porção do mesmo e PTK7 humana. A formação de um

-complexo é detectada então, sendo que a diferença de formação de complexo

entre a amostra, comparada com a amostra de controle, é indicativa da presença de antígeno de PTK7 humana na amostra.

PTK7 é expressa em linhas de células derivadas de carcinoma do colo, mas não é encontrada expressa em tecidos do colon adultos humanos (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). A expressão de PTK7 também foi observada em algumas linhas de células de melanoma e biópsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Câncer 71:1061-5). Adicionalmente, verificou-se que a PTK7 foi altamente superexpressada em amostras de leucemia mielóide aguda (Muller-Tidow et ai., (2004) Clin. Câncer Res. 10:1241-9). Usou-se um anticorpo anti-PTK7 sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerosos. Alternativamente, é possível usar um anticorpo anti-PTK7 em conjunto com outros agentes imunogênicos, tratamentos convencionais de câncer ou outros anticorpos, como descrito abaixo.

Cânceres preferidos, cujo crescimento pode ser inibido usando-se os anticorpos da invenção incluem cânceres que são tipicamente responsivos a imunoterapia. Exemplos não-limitantes de cânceres preferidos para tratamento incluem câncer de colo (incluindo câncer do intestino delgado), câncer do pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, câncer do rim, câncer de bexiga, câncer ovariano e câncer da próstata. Exemplos de outros cânceres que podem ser tratados usando-se os métodos da invenção incluem câncer renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores do cérebro, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL, acute lymphocytic leukemia), leucemia de células T adultas (T-ALL5 adult T-cell leukemialeucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfomas (p. ex., Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T, linfoma de Bukitt, linfomas de células grandes anaplásicas (ALCL, Anaplastic Large Cell Lymphoma), linfomas de células T cutâneas, linfomas de células clivadas pequenas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cânceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem B, linfoma de células T similar a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidade corporal associados com HIV), carcinomas embrionários, carcinomas não diferenciados da rino-faringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, câncer de mama, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, câncer dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvice, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, câncer do tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou da uretra, carcinoma da pelvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma da base do cérebro, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos ambientalmente incluindo aqueles induzidos por amianto, ρ. ex., mesotelioma e combinações de referidos cânceres.

Adicionalmente, dada a expressão de PTK7 em várias células de tumor, é possível usar os anticorpos humanos, anticorpo composições e métodos da presente invenção para tratar um sujeito com um distúrbio tumorigênico, p. ex., um distúrbio caracterizado pela presença de células de tumor expressando PTK7 incluindo, por exemplo, câncer de colo (incluindo câncer do intestino delgado), melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ovariano e câncer da próstata. Exemplos de outros sujeitos com um distúrbio tumorigênico incluem sujeitos apresentando câncer renal (p. ex., carcinoma de células renais), glioblastoma, tumores do cérebro, leucemias crônicas ou agudas incluindo leucemia linfocítica aguda (ALL, acute lymphocytic leukemia), leucemia de células T adultas (T-ALL, adult T~eell leukemia), leucemia mielóide crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, linfomas (p. ex., Iinfoma de Hodgkin e não-Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma do SNC primário, linfoma de células T, linfoma de Bukitts linfoma de células grandes anaplásicas (,Anaplastie Large Cell Lymphoma), linfomas de células T cutâneas, linfomas de células clivadas pequenas nodulares, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas imunoblásticos, linfomas/leucemia de células T (ATLL), cânceres de linfomas foliculares entroblásticos/centrocíticos (cb/cc), linfomas de células grandes difusas de linhagem B, linfoma de células T similar a linfoadenopatia angioimunoblástica (AILD) e linfomas baseados em cavidade corporal associados com HIV), carcinomas embrionários, carcinomas não diferenciados da rino-faringe (p. ex., tumor de Schmincke), doença de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom e outros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, câncer de mama, câncer de pele, câncer da cabeça ou pescoço, melanoma maligno cutâneo ou intraocular, câncer uterino, câncer retal, câncer da região anal, câncer do estômago, câncer testicular, câncer uterino, câncer dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma do cérvice, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula tireóide, câncer da glândula paratireóide, câncer da glândula adrenal, câncer do tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da bexiga, câncer do rim ou da uretra, carcinoma da pelvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma da base do cérebro, adenoma pituitário, câncer epidermóide, câncer de células escamosas, cânceres induzidos ambientalmente incluindo aqueles induzidos por amianto, p. ex., mesotelioma e combinações de referidos cânceres.

Assim, em uma concretização, a invenção proporciona um método de inibir o crescimento de células de tumor em um sujeito, compreendendo administrar ao sujeito uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo anti-PTK7 ou porção de ligação de antígeno do mesmo. De preferência, o anticorpo é um anticorpo anti-PTK7 humano (como qualquer um dos anticorpos humanos de PTK7 anti-humana aqui descritos). Adicionalmente ou alternativamente, o anticorpo pode ser um anticorpo anti- PTK7 quimérico ou humanizado.

Em uma concretização, os anticorpos (p. ex., anticorpos monoclonais humanos, composições e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem ser usados para detectar níveis de PTK7 ou níveis de células que contêm PTK7 na superfície de sua membrana, sendo que referidos níveis podem ser ligados a determinados sintomas de doença. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para inibir ou bloquear a função de PTK7 que, por sua vez, podem ser ligados à prevenção ou melhoramento de determinados sintomas de doença, implicando com isso a PTK7 como um mediador da doença. Isto pode ser obtido contactando-se uma amostra experimental e uma amostra de controle com o anticorpo anti-PTK7 em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e PTK7. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e PTK7 são detectados e comparados na amostra experimental e o controle.

Em outra concretização, os anticorpos (p. ex., anticorpos humanos, composições e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem ser testados inicialmente quanto à atividade de ligação associada com uso terapêutico ou diagnóstico in vitro. Por exemplo, composições da invenção podem ser testadas usando-se ensaios citométricos descritos nos Exemplos abaixo.

Os anticorpos (p. ex., anticorpos humanos, multiespecíficos e moléculas biespecíficas, imunoconjugados e composições) da invenção apresentam utilidade adicional na terapia e no diagnóstico de doenças relacionadas com PTK7. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, as moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugados podem ser usados para elicitar in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou matar uma célula expressando PTK7; mediar fagocitose ou ADCC de uma célula expressando PTK7 na presença de células efetoras humanas; ou bloquear a ligação de ligante de PTK7 a PTK7.

Em uma concretização particular, os anticorpos (p. ex., anticorpos humanos, composições e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) são usados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com PTK7. Exemplos de doenças relacionadas com PTK7 incluem, entre outros, câncer de colo (incluindo câncer do intestino delgado), melanoma (p. ex., melanoma maligno metastático), leucemia mielóide aguda, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer ovariano e câncer da próstata.

Vias de administração vantajosas para as composições de M ί

anticorpo (ρ. ex., anticorpos monoclonais humanos, imunoconjugados e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na arte e podem ser selecionadas por aqueles com prática ordinária. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por meio de injeção (p. ex., intravenosa ou subcutânea). Dosagens vantajosas

--das moléculas usadas dependerão da idade e do peso do sujeito e da

concentração e/ou formulação da composição de anticorpo.

Como descrito previamente, anticorpos anti-PTK7 humanos da invenção podem ser co-administrados com um ou mais outros agentes terapêuticos, p. ex., um agente citotóxico, um agente radiotóxico ou um agente imunossupressivo. O anticorpo pode ser ligado ao agente (como um imunocomplexo) ou pode ser administrado separadamente do agente. Neste último caso (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes, após ou concorrentemente com o agente ou pode ser co-administrado com outras terapias conhecidas, p. ex., uma terapia anti-câncer, p. ex., radiação. Referidos agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti- neoplásicos, como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucila e ciclofosfamida hidroxiuréia que, por si só, são efetivos apenas em níveis que são tóxicos ou subtóxicos para um paciente. A cisplatina é administrada intravenosamente a 100 mg/dose uma vez a cada quatro semanas, e adriamicina é administrada intravenosamente como uma dose de 60-75 mg/ml de uma vez a cada 21 dias. A co- administração dos anticorpos anti-PTK7 humanos, ou seus fragmentos de ligação de antígeno, da presente invenção com agentes quimioterápicos proporciona dois agentes anti-câncer que operam via mecanismos diferentes que proporcionam um efeito citotóxico a células de tumor humanas. Referida co-administração pode resolver problemas devidos ao desenvolvimento de resistência a drogas ou uma alteração na antigenicidade das células de tumor que poderia torná-las não-reativas com o anticorpo. W ί

Em uma concretização, imunoconjugados da invenção podem ser usados para objetivar compostos (p. ex., agentes terapêuticos, marcadores, citotoxinas, rádio-toxinas imunos supres sores, etc.) para células que apresentam receptores de superfície celular de PTK7 por meio de ligação de referidos compostos ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo anti-PTK7 pode

-ser conjugado a qualquer um dos compostos dc toxina descritos nas Patentes

U.S. 6.281.354 e 6.548.530, Publicações de Patentes dos E.U.A. números 20030050331, 20030064984, 20030073852 e 20040087497 ou publicados no WO 03/022806, que são incorporados aqui integralmente por referência. Assim, a invenção também proporciona métodos para localizar, ex vivo ou in vivo, células expressando PTK7 (p. ex., com um marcador detectável, como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser usadas para matar células que apresentam receptores de superfície celular de PTK7 mediante objetivação de citotoxinas ou radiotoxinas para PTK7.

Células efetoras específicas para alvo, p. ex.s células efetoras ligadas a composições (p. ex., anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas como agentes terapêuticos. Células efetoras para objetivação podem ser leucócitos humanos, como macrófagos, neutrófllos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células assassinas naturais e outras células portando receptor de IgG ou IgA. Se desejado, células efetoras podem ser obtidas dos sujeitos sendo tratados. As células efetoras específicas para alvo podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode ser da ordem de IO8-IO9, mas variará dependendo da finalidade terapêutica. De uma forma geral, a quantidade será suficiente para se obter a localização na célula- alvo, p. ex., uma célula de tumor expressando PTK7, e efetuar a morte de células por meio de, p. ex., fagocitose. Vias de administração também podem variar.

Terapia com células efetoras específicas para alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção de células objetivadas. Por exemplo, terapia anti-tumor usando-se as composições (p. ex., anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção e/ou células efetoras armadas com estas composições pode ser usada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, é possível usar imunoterapia de combinação para dirigir duas populações efetoras citotóxicas distintas no sentido da rejeição de células de tumor. Por exemplo, é possível usar anticorpos anti-PTK7 ligados a anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 em conjunto com Agente de ligação específica a receptor de IgG ou IgA.

Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção também podem ser usadas para modular níveis de FcyR ou FcyR em células efetoras, como por meio de terminação e eliminação de receptores na superfície da célula. Misturas de receptores anti-Fc também podem ser usadas para esta finalidade.

As composições (p. ex., anticorpos humanos, imunoconjugados e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção que apresentam sítios de ligação de complemento, como porções de IgGl, -2 ou -3 ou IgM que ligam complemento, também podem ser usadas na presença de complemento. Em uma concretização, tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células-alvo com um agente de ligação da invenção e células efetoras apropriadas pode ser suplementado com a adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células-alvo revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser aperfeiçoada por meio de ligação de proteínas de complemento. Em outra concretização, células-alvo revestidas com as composições (p. ex., anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser lisadas por complemento. Em outra concretização adicional, as composições da invenção não ativam complemento.

As composições (p. ex.s anticorpos humanos, imunoconjugados e moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser administradas em conjunto com complemento. Assim, o escopo da invenção compreende composições compreendendo anticorpos humanos,—moléculas—multiespecíficas—ou—biespecíficas—e—soro—ou complemento. Estas composições são vantajosas pelo fato de que o complemento é localizado em proximidade estreita com os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas. Alternativamente, o anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento ou soro pode ser administrado separadamente.

Assim, pacientes tratados com composições de anticorpo da invenção podem receber administração adicional (antes de, simultaneamente com ou após administração de um anticorpo humano da invenção) com outro agente terapêutico, como um agente citotóxico ou radiotóxico, que acentua ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.

Em outras concretizações, o sujeito pode ser tratado adicionalmente com um agente que modula, p. ex., acentua ou inibe, a expressão ou atividade de receptores de Fcy ou Fcy por meio de, por exemplo, tratamento do sujeito com uma citocina. Citocinas preferidas para administração durante o tratamento com a multiespecífica incluem fator co- estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF, granulocyte colony- stimulating factor), fator estimulador de colônias de macrófagos-granulócitos (GM-CSF, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), interferon-y (IFN-γ) e fator de necrose de tumor (TNF).

As composições (p. ex., anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção também podem ser usadas para objetivar células FcyR ou PTK7, por exemplo para marcação de referidas células. Para referido uso, o agente de ligação pode ser ligada a uma molécula que pode ser detectada. Assim, a invenção proporciona métodos para localizar, ex vivo ou in vitro, células expressando receptores de Fc5 como FcyR ou PTK7. O marcador detectável pode ser, p. ex., um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima ou um co-fator de enzima.

Também se encontram no escopo da presente invenção kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (p. ex., anticorpos humanos, moléculas biespecíficas ou multiespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode conter adicionalmente um ou mais reagentes adicionais, como um reagente imunossupressivo, um agente citotóxico ou um agente radiotóxico ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (p. ex., um anticorpo humano apresentando uma atividade complementar que se liga a um epítopo no antígeno de PTK7 distinto do primeiro anticorpo humano). Kits incluem tipicamente um rótulo indicando o uso intencionado para o conteúdo do kit. O termo rótulo inclui qualquer indicação escrita, ou material gravado fornecido no ou com o kit, ou que, de outra forma, acompanha o kit.

A presente invenção é ilustrada adicionalmente com os exemplos a seguir, que não deveriam ser interpretados como limitantes. O teor de todas as figuras e de todas as referências, patentes e pedidos de patentes publicados citados em todo este pedido são incorporado aqui expressamente por referência. Exemplos

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais humanos contra PTK7 Antígeno

Protocolos de imunização usaram como antígeno tanto (i) uma proteína de fusão recombinante compreendendo a porção extracelular de PTK7 com ambos, um marcador myc e his, e (ii) PTK7 de comprimento pleno ligada a membrana. Ambos os antígenos foram gerados por meio de métodos de transfecção recombinante em uma linhas de células CHO. Camundongos KM mice™ e HuMab transgênicos

Anticorpos monoclonais totalmente humanos para PTK7 foram preparados usando-se as cepas HCo7 e HCo 12 de camundongos HuMab transgênicos e a cepa KM de camundongos transcromossômicos transgênicos, sendo que cada um expressa genes de anticorpo humano. Em cada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve capa de

camundongo endógeno foi disrompido homozigoticamente como descrito em Chen et al (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi disrompido homozigoticamente como descrito em Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Cada uma destas cepas de camundongo porta um transgene de cadeia leve capa humano, KCo5, como descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851.

A cepa HCo7 porta o transgene de cadeia pesada humana HCo7 como descrito nas Patentes U.S. 5.770.429; 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. A cepa HCol2 porta o transgene de cadeia pesada humana HCol2 como descrito no Exemplo 2 do WO 01/09187 ou exemplo 2 do WO 01/14424. A cepa BCM contém o transcromossoma SC20 como descrito em Publicação PCT WO 02/43478. Imunizações de HuMab e KM: Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para

PTK7, camundongos HuMab e KM mice™ foram imunizados com proteína de fusão de PTK7 recombinante purificada e células CHO transfectadas com PTK7 como antígeno. Esquemas de imunização gerais para camundongos HuMab são descritos por Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856- 859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham de 6 a 16 semanas de vida quando da primeira infusão de antígeno. Usou-se uma preparação recombinante purificada (de 5 a 50 μg) de antígeno de proteína de fusão de PTK7 e 5-10xl06 células para imunizar os camundongos HuMab e KM mice™ intraperitonealmente, subcutaneamente (Sc) ou via injeção na planta do pé.

Camundongos transgênicos foram imunizados duas vezes com antígeno em adjuvante de Freund completo ou adjuvante Ribi IP, seguido de 3 a 21 dias IP (até um total de 11 imunizações) com o antígeno em adjuvante Ribi ou de Freund incompleto. A resposta imune foi monitorada por meio de sangramentos retroorbitais. O plasma foi selecionado por meio de ELISA (como descrito abaixo), e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-PTK7 foram usados para fusões. Camundongos receberam reforços intravenosamente com antígeno 3 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, realizou-se de 10 a 35 fusões para cada antígeno. Várias dúzias de camundongos foram imunizados para cada antígeno.

Seleção de camundongos HuMab ou KM Mice™ produzindo anticorpos anti- PTK7:

Para selecionar camundongos HuMab ou KM mice™ produzindo anticorpos que ligaram PTK7, testou-se soros de camundongos imunizados por meio de ELISA como descrito por Fishwild, D. et ai. (1996). Em resumo, placas de microtitulação foram revestidas com proteína de fusão de PTK7 recombinante purificada de células CHO transfectadas a 1-2 μg/ml em PBS, 100 μΐ/poços incubados a 4°C de um dia para o outro, depois bloqueadas com 200 μΐ/poço de 5 % de soro bovino fetal em PBS/Tween (0,05 %). Diluições de soros de camundongos imunizados com PTK7 foram adicionadas em cada poço e incubadas durante de 1-2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e então incubadas com um anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato de ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) e analisadas com espectrofotômetro a OD 415-495. Camundongos j<(3 e

que desenvolveram as maiores titulações de anticorpos anti-PTK7 foram usados para fusões. Fusões foram realizadas como descrito abaixo e hibridomas sobrenadantes foram testados quanto à atividade anti-PTK7 por meio de ELISA.

Geração de hibridomas produzindo anticorpos monoclonais humanos para

-PTK7:-----------------------------

Os esplenócitos de Camundongoi isolados dos camundongos HuMab, foram fundidos com PEG a uma linhas de células de mieloma de camundongo com base em protocolos convencionais. Os hibridomas resultantes foram então selecionados quanto à produção de anticorpos específicos para antígeno. Suspensões de células simples de esplenócitos de camundongos imunizados foram fundidas com uma quarta parte do número de células de mieloma de camundongo não-secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) com 50 % de PEG (Sigma). Células foram plaqueadas a aproximadamente lxl05/poço em

placa de microtitulação com fundo plano, seguido de incubação durante cerca de dois semanas em meio seletivo contendo 10 % de soro bovino fetal, 10 % de meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5 % de origen (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alta glucose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e Ix HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, células foram cultivadas em meio em que o HAT foi substituído por HT. Poços individuais foram então selecionados por meio de ELISA (descrito acima) quanto a anticorpos IgG monoclonais anti-PKT7 humanos. Uma vez que tenha ocorrido crescimento extensivo de hibridoma, meio foi monitorado usualmente após de 10 a 14 dias. Os hibridomas secretadores de anticorpo foram substituídos, novamente selecionados e, se ainda forem positivos para IgG humana, anticorpos monoclonais anti-PKT7 foram subclonados pelo menos duas vezes com diluição limitante. Em seguida, os subclones estáveis foram cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização adicional.

Clones de hibridoma 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 foram selecionados para análise posterior.

Exemplo 2: Caracterização estrutural de anticorpos monoclonais humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8-------------------

í

As seqüências de cDNA codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve dos anticorpos monoclonais 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8 foram obtidas dos hibridomas 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a e 7C8, respectivamente, usando-se técnicas de PCR convencionais e foram seqüenciados usando-se técnicas convencionais de sequenciamento de DNA.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 3G8 são mostradas na Figura IA e na SEQ ID NO:41 e 1, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 3G8 são mostradas na Figura IB e na SEQ ID NO:45 e 5, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 3G8 com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia pesada 3G8 utiliza um segmento VH da linha germinal humana VH 3-30.3, um segmento D não-determinado, e um segmento JH de linha germinal humana JH 4b. O alinhamento da seqüência 3G8 VH com a seqüência de linha germinal VH 3-30.3 é mostrada na Figura 5. Análise adicional da seqüência 3G8 VH usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 como mostrado nas Figuras IA e 5, e nas SEQ IDNOs: 11, 15 e 19, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 3G8 com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve 3G8 usa um segmento VL de linha germinal humana VK Ll5 e um segmento JK de linha germinal humana JK 1. O alinhamento da seqüência 3G8 VL com a seqüência de linha germinal VK Ll5 é mostrado na Figura 9. Análise adicional da seqüência 3G8 VL usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl5 CDR2 e CD3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras IB e 9, e nas SEQ ID NOs: 23, 29 e 35, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 3G8a são mostradas na Figura IA e na SEQ ID NO:41 e 1, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 3G8a são mostradas na Figura IC e na SEQ ID NO:46 e 6, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 3G8a com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 3G8a usa um segmento VH da linha germinal humana VH 3-30.3, um segmento D não-determinado, e um segmento JH da linha germinal humana JH 4b. O alinhamento da seqüência 3G8a VH com a seqüência de linha germinal VH 3-30.3 é mostrada na Figura 5. Análise adicional da seqüência 3G8a VH usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 como mostrado nas Figuras IA e 5, e nas SEQ ID NOs: 11, 15 e 19, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 3G8a com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve 3G8a usa um segmento VL da linha germinal humana VK L15 e um segmento JK da linha germinal humana JK 3. O alinhamento da seqüência 3G8a VL com a seqüência de linha germinal VK Ll5 é mostrado na Figura 9. Análise adicional da seqüência 3G8a VL usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras IC e 9, e nas SEQ ID NOs: 24, 30 e 36, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 4D5 são mostradas na Figura 2A e na SEQ ID NO:42 e 2, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 4D5 são mostradas na Figura 2B e na SEQ ID NO:47 e 7, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 4D5 com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 4D5 usa um segmento VH da linha germinal humana VH 3-30.3, um segmento D não determinado, e um segmento JH da linha germinal humana JH 4b.

O alinhamento da seqüência 4D5 VH com a seqüência de linha germinal VH 3-30.3 é mostrado na Figura 6. Análise adicional da seqüência de 4D5 VH usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões de cadeia pesada CDRl, CDR2 e CD3 como mostrado nas Figuras 2A e 6, e nas SEQ ID NOs: 12, 16 e 20, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 4D5 com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia leve 4D5 usa um segmento VL da linha germinal humana VK AlO e um segmento JK da linha germinal humana JK 5. O alinhamento da seqüência 4D5 VL com a seqüência de linha germinal VK AlO é mostrado na Figura 10. Análise adicional da seqüência 4D5 VL usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras 2B e 10, e nas SEQ ID NOs: 25, 31 e 37, respectivamente. £

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 12C6 são mostradas na Figura 3 A e na SEQ ID NO:43 e 3, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6 são mostradas na Figura 3B e na SEQ ID NO:48 e 8, respectivamente.-

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 12C6 com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada 12C6 usa um segmento VH da linha germinal humana VH DP44, um segmento D não determinado, e um segmento JH da linha germinal humana JH 4b. O alinhamento da seqüência 12C6 VH com a seqüência de linha germinal VH DP44 é mostrado na Figura 7. Análise adicional da seqüência 12C6 VH usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 cadeia pesada como mostrado nas Figuras 3 A e 7, e nas SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 12C6 com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve 12C6 usa um segmento VL de linha germinal humana VK A27 e um segmento JK da linha germinal humana JK 2. O alinhamento da seqüência 12C6 VL com a seqüência de linha germinal VK A27 é mostrado na Figura 11. Análise adicional da seqüência de 12C6 VL usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras 3B e 11, e nas SEQID NOs: 26, 32 e 38, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 12C6a são mostradas na Figura 3 A e na SEQ ID NO:43 e 3, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 12C6a são mostradas na Figura 3C e na SEQ ID NO:49 e 9, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 12C6a com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de 12C6a usa um segmento VI I de linha germinal humana VH DP44, um segmento D não determinado, e um segmento JH da linha germinal JH 4b. O alinhamento da seqüência 12C6a VH com a seqüência de linha germinal VH DP44 é mostrado na Figura 7. Análise adicional da seqüência 12C6a VH usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CD3 de cadeia pesada como mostrado nas Figuras 3A e 7, e nas SEQ ID NOs: 13, 17 e 21, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve 12C6a com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 12C6a usa um segmento VL da linha germinal humana VK Ll5 e um segmento JK da linha germinal humana JK 2. O alinhamento da seqüência 12C6a VL com a seqüência de linha germinal VK L15 é mostrado na Figura 12. Análise adicional da seqüência 12C6a VL usando o sistema Kabat de região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras 3C e 12, e nas SEQ ID NOs: 27, 33 e 39, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia pesada de 7C8 são mostradas na Figura 4A e na SEQ ID NO:44 e 4, respectivamente.

As seqüências de nucleotídeos e aminoácidos da região variável de cadeia leve de 7C8 são mostradas na Figura 4B e na SEQ ID N0:50 e 10, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia pesada 7C8 com as seqüências de cadeia pesada de imunoglobulina de linha germinal humana demonstrou que a cadeia pesada de 7C8 usa um segmento VH da linha germinal humana VH 3-33, um segmento D da linha germinal humana 3-10, e um segmento JH da linha germinal humana JH 6b. O alinhamento da seqüência 7C8 VH com a seqüência de linha germinal VH 3-33 é mostrado na Figura 8. Análise adicional da seqüência 7C8 VH usando o sistema Kabat de região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRls CDR2 e CD3 de cadeia pesada como mostrado nas Figuras 4A e 8, e nas SEQ ID NOs: 14, 18 e 22, respectivamente.

Comparação da seqüência de imunoglobulina de cadeia leve de 7C8 com as seqüências de cadeia leve de imunoglobulina de linha germinal humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve de 7C8 usa um segmento VL de linha germinal humana VK L6 e um segmento JK da linha germinal humana de JK 3. O alinhamento da seqüência de 7C8 VL com a seqüência de linha germinal VK L6 é mostrada na Figura 13. Análise adicional da seqüência 7C8 VL usando o sistema Kabat da região de determinação CDR levou à delineação das regiões CDRl, CDR2 e CDR3 de cadeia leve como mostrado nas Figuras 4B e 13, e nas SEQ ID NOs: 28, 34 e 40, respectivamente.

Exemplo 3: Mutação de mAb 12C6 e uso alternativo de linha germinal

Como discutido no Exemplo 2 acima, anticorpos monoclonais 12C6 e 12C6a usam uma região variável de cadeia pesada derivada de uma seqüência de linha germinal humana DP-44 presente no transgene HCo7 da cepa de camundongo HuMab Mouse®. Como DP-44 não é uma seqüência de linha germinal que é usada no repertório de imunoglobulina humana nativa, pode ser vantajoso mutar a seqüência VH de 12C6 e 12C6a para reduzir a imunogenicidade potencial. De preferência, um ou mais radicais de estrutura da seqüência 12C6 ou 12C6a VH é mutada a um resíduo(s) presente na estrutura de uma seqüência de linha germinal VH relacionada estruturalmente que é usada no repertório de imunoglobulina humana nativa. Por exemplo, a Figura 7 mostra o alinhamento da seqüência VH de 12C6 e 12C6a com a seqüência de linha germinal DP44 e também com duas seqüências de linha germinal humana relacionadas estruturalmente, VH 3-23 e VH 3-7. Dada a relação entre estas seqüências, pode-se predizer que é possível selecionar um anticorpo humano que se liga especificamente à PTK7 humana e que usa uma região VH derivada de uma sendo que de linha germinal VH 3-23 ou VH 3-7. Além disso, é possível mutar um ou mais radicais na seqüência 12C6 ou 12C6a VH que diferem do(s) radical/radicais na posição comparável na seqüência VH 3-23 ou VH 3-7 com o radical/radicais que está/estão presente(s) em VH 3-23 ou VH 3-7, ou com uma substituição de aminoácido conservativa dos mesmos.

Exemplo 4: Caracterização da especificidade de ligação e cinética de ligação de anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7

Neste exemplo, examinou-se via análise Biacore a afinidade de ligação e a cinética de ligação de anticorpos anti-PTK7. Especificidade de ligação, e competição cruzada foram examinadas por meio de citometria de fluxo.

Especificidade de ligação por meio de citometria de fluxo

Linhas de células HEK3 que expressam PTK7 humana recombinante na superfície celular foram desenvolvidas e usadas para se determinar a especificidade de anticorpos monoclonais humanos de PTK7 por meio de citometria de fluxo. Células HEK3 foram transfectadas com plasmídios de expressão contendo cDNA de comprimento pleno codificando formas de transmembrana de PTK7. A ligação do anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 7C8 foi avaliada incubando-se as células transfectadas com o anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 a uma concentração de 10 Mg/ml. As células foram lavadas e detectou-se a ligação com um Ab IgG anti- humano marcado com FITC. Realizou-se análises citométricas de fluxo usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os resultados são ilustrados nas Figuras 14. O anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 7C8 ligou-se às células HEK3 transfectadas com PTK7, mas não a células HEK3 que não foram transfectadas com PTK7 humana. Estes dados demonstram a especificidade de anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7

--para PTK7.--

Especificidade de ligação por meio de ELISA

A ligação de anticorpos anti-PTK7 também foi avaliada por meio de ELISA convencional para examinar a especificidade de ligação para PTK7.

Domínio extracelular recombinante de PTK7 foi testado quanto à ligação contra os anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 12C6a em diferentes concentrações. Realizou-se procedimentos ELISA convencionais. Os anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 foram adicionados a uma concentração de partida de 10 μg/ml e diluídos serialmente a uma diluição de 1:2. Usou-se anticorpo policlonal IgG anti-humano de cabra (específico para capa) conjugado com peroxidase de rabanete (HRP) como anticorpo secundário. Os resultados são mostrados na Figura 15. Cada um dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 12C6a ligou- se a PTK7. Estes dados demonstram a especificidade de anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 para PTK7. Mapeamento de epítopo de anticorpos anti-PTK7

Usou-se citometria de fluxo para determinar o grupamento de epítopos de HuMAbs anti-PTK7. Células de tumor de Wilms G-401 (n° de acesso ATCC CRL-1441) foram transfectadas com plasmídios de expressão contendo cDNA de comprimento pleno codificando formas de transmembrana de PTK7. A ligação de epítopo de cada anticorpo monoclonal humano anti- PTK7 foi avaliada incubando-se IxlO5 células transfectadas com 10 μg/ml de anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 frio, lavadas, e seguido de adição de 10 μg/ml de um anticorpo monoclonal humano anti-PTK7 conjugado com fluorescência. A ligação foi detectada com um Ab IgG anti-humano marcado com FITC. Realizou-se análises citométricas de fluxo usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Após análise dos dados, os anticorpos anti-PTK7 foram categorizados em 3 grupos de epítopos —grupo A, que inclui 7D11, grapo B, que inclui 3G8 e 3G8a e grupo C, que inclui 7C8, 12C6 e 12C6a.

Exemplo 5: Caracterização da ligação de anticorpo anti-PTK7 com PTK7 expressa na superfície de células de câncer humanas

A linha de células de nefroblastoma tumor de Wilms G-401 (n° de acesso ATCC CRL-1441) foi testada quanto à ligação dos Anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 HuMAb 12C6 e 7C8 em diferentes concentrações. A ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 foi avaliado por meio de incubação de IxlO5 células com anticorpo a uma concentração de partida de 30 μg/ml e diluindo-se serialmente o anticorpo a uma diluição de 1:10. As células foram lavadas e a ligação foi detectada com um Ab IgG anti-humano marcado com PE. Realizou-se análises citométricas de fluxo usando-se uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinson, San Jose, CA). Os resultados são mostrados na Figura 16. Os anticorpos monoclonais anti-PTK7 12C6 e 7C8 ligados à linha de células de nefroblastoma tumor de Wilms de uma maneira dependente da concentração, como medido com a intensidade fluorescente média (MFI, mean fluorescent intensity) de manchamento. Os valores EC50 para os anticorpos monoclonais anti-PTK7 12C6 e 7C8 foram de 4,035 nM e 3,428 nM, respectivamente.

Estes dados demonstram que os HuMAbs anti-PTK7 se ligam a linhas de células de câncer do rim.

Exemplo 6: Ligação de anticorpo humano anti-PTK7 a linhas de células de câncer

Anticorpos anti-PTK7 foram testados quanto à ligação com J23 ί

uma variedade de linhas de células de câncer por meio de citometria de fluxo.

Ligação dos anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 e 12C6 com um grupo de linhas de células de câncer foi avaliada por meio de incubação de linhas de células de câncer com anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 a uma concentração de 10 μ^ιηΐ. As linhas

-de células de câncer que foram testadas foram A-431 (n° de acesso ATCC

CRL-1555), células de tumor de Wilms G-401 (n° de acesso ATCC CRL- 1441), Saos-2 (n° de acesso ATCC HTB-85), SKOV-3 (n° de acesso ATCC HTB-77), PC3 (n° de acesso ATCC CRL-1435), DMS 114 (n° de acesso ATCC CRL-2066), ACHN (n° de acesso ATCC CRL-1611), LNCaP (n° de acesso ATCC CRL-1740), DU 145 (n° de acesso ATCC HTB-81), LoVo (n° de acesso ATCC CCL-229) e MIA PaCa-2 (n° de acesso ATCC CRL-1420). Usou-se um anticorpo de controle de isótipo como um controle negativo. As células foram lavadas e detectou-se a ligação com um Ab IgG anti-humano marcado com FITC. Realizou-se análises citométricas de fluxo usando uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinsoni San Jose, CA). Os resultados são mostrados nas Figuras 17. Os anticorpos monoclonais anti- PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 e 12C6 ligaram-se às linhas de células de câncer A- 431, células de tumor de Wilms G-401, Saos-2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo e MIA PaCa-2, como medido com a intensidade fluorescente média (MFI) de manchamento. Estes dados demonstram que os HuMAbs anti-PTK7 ligam-se a uma faixa de células de câncer que expressam PTK7 de superfície celular. Exemplo 7: Ligação de anti-PTK7 a células dendríticas, BeT humanas Anticorpos anti-PTK7 foram testados quanto à ligação com

células T CD4+, CD8+, células B CDl 9+ e células dendríticas mielóides do sangue humano expressando PTK7 em sua superfície celular por meio de citometria de fluxo.

Células T humanas foram ativadas por meio de anticorpo anti- CD3 para induzir expressão de PTK7 em células T antes da ligação com um anticorpo monoclonal anti-PTK7 humano. A ligação do anticorpo monoclonal anti-PKT-7 7c8 foi avaliada incubando-se as células com anticorpos monoclonais humanos anti-PTK7 a uma concentração de 10 μ^ιηΐ. Em alguns experimentos, usou-se um anticorpo conhecido que se liga a um marcador específico para células TeB como um controle positivo. As células foram lavadas e detectou-se a ligação com um Ab IgG anti-humano marcado com FITC. Análises citométricas de fluxo foram realizadas usando-se uma citometria de fluxo FACScan (Becton Dickinsoni San Josej CA). Os resultados são mostrados nas Figuras 18 (células B e células T humanas ativadas) e 19 (células dendríticas). O anticorpo monoclonal anti-PTK7 7C8 ligou-se a células dendríticas e células T CD4+ e CD8+ humanas ativadas, mas não a células Bj como medido por meio de intensidade fluorescente média (MFI) de manchamento. Estes dados demonstram que os HuMAbs anti-PTK7 se ligam a células dendríticas e células T humanas. Exemplo 8: Internalização de anticorpo monoclonal anti-PTK7

HuMAbs anti-PTK7 foram testados quanto à capacidade de internalizar em linhas de células expressando PTK7 usando-se um ensaio de internalização Hum-Zap. O ensaio Hum-Zap testa a internalização de um anticorpo humano primário por meio da ligação de um anticorpo secundário com afinidade para IgG humana conjugada com a toxina saporina.

As linhas de células de câncer de tumor de Wilms expressando PTK7 G-401 (n° de acesso ATCC CRL-1441), A-431 (n° de acesso ATCC CRL-1555) e PC3 (n° de acesso ATCC CRL-1435) foram semeadas, a IxlO4 células/poço, diretamente em poços de 100 μΐ. Os anticorpos HuMAb anti- PTK7 3G8, 4D5, 12C6 ou 7C8 foram adicionados nos poços a uma concentração de partida de 30 nM e titulados a diluições seriais a 1:3. Um anticorpo de controle de isótipo que não é específico para PTK7 foi usado como um controle negativo. O Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) foi adicionado a uma concentração de 11 nM e deixou- se as placas incubarem durante 72 horas. As placas foram então pulsadas com 1,0 μϋϊ de 3H-timidina durante 24 horas, colhidas e lidas em um contador de cintilação Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT). Os resultados são mostrados nas Figuras 20A-D. Os anticorpos anti- PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 7C8 apresentaram uma diminuição da incorporação de H-timidina - dependente da concentração de anticorpos - nas linhas de células de tumor de Wilms expressando PTK7. Os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 apresentaram uma diminuição da incorporação de 3H-timidina - dependente da concentração de anticorpos - nas linhas de células de câncer expressando PTK7 A-431 e PC3. O valor de EC50 para os anticorpos anti- PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 7C8 em células de tumor de Wilms foi de 0,6437 nM, 0,2516 nM, 0,2053 nM e 0,1788 nM, respectivamente. O valor de EC50 para os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 em células A-431 foi de 0,1657 nM e 0,1826 nM, respectivamente. O valor de EC50 para os anticorpos anti-PTK7 12C6 e 7C8 em células de tumor PC3 foi de 0,3175 nM e 0,2648 nM, respectivamente. Estes dados demonstram que os anticorpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 e 7C8 internalizam em células de câncer.

Exemplo 9: Avaliação da morte celular com um anticorpo anti-PTK7 conjugado a toxina em linhas de células de câncer humanas

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PTK7 conjugados com a toxina foram testados quanto à capacidade de matar linhas de células de câncer humanas PTK7+ em um ensaio de proliferação de células.

O anticorpo HuMAb anti-PTK7 12C6a foi conjugado com uma toxina via um ligante, como um ligante de peptidila, hidrazona ou dissulfeto. Exemplos de compostos de toxina que podem ser conjugados aos anticorpos da presente invenção são descritos no pedido depositado com número do arquivo do procurador 04280/100M629US3, depositado em 26 de setembro de 2005. A linha de células de câncer de rim humano tumor de Wilms expressando PTK7 G-401 (n° de acesso ATCC CRL-1441) foi semeada a 104 células/poço em poços de 100 μΐ durante 3 horas. Adicionou-se um conjugado de anticorpo anti-PTK7-toxina a uma concentração de partida de 100 nM e isto foi titulado em diluições seriais a 1:3. Placas foram deixadas incubar durante 48 horas. As placas foram então pulsadas com 1 μα de 3H- timidina durante 24 horas antes da terminação da cultura, colhidas e lidas em um contador de cintilação Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments). Figura 21 mostra os efeitos do conjugado de 12C6a sobre as células de tumor de Wilms. O anticorpo anti-PTK7 12C6a apresentou uma

λ

diminuição da incorporação de H-timidina - dependente da concentração de anticorpo-toxina - na linha de células de câncer do rim humano tumor de Wilms expressando PTK7.

Estes dados demonstram que anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina apresentam citotoxicidade específica para células de câncer do rim humano.

Exemplo 10: Avaliação de morte celular de um anticorpo anti-PTK7 conjugado com toxina em linha de células de tumor humano

Neste exemplo, anticorpos monoclonais anti-PTK7 conjugados com uma toxina foram testados quanto à capacidade de matar linhas de células de tumor humano PTK7+ apresentando expressão baixa, intermediária ou alta, de PTK7 na superfície celular em um ensaio de proliferação celular.

O anticorpo HuMab anti-PTK7 12C6a foi conjugado a uma toxina via um ligante, como um ligante de peptidila, hidrazona ou dissulfeto. Exemplos de compostos de toxina que podem ser conjugados aos anticorpos da invenção corrente são descritos no pedido depositado com Número do arquivo do procurador 04280/100M629US3, depositado em 26 de setembro de 2005. As linhas de células de câncer de tumor humano expressando PTK7 A-431, SKOV3, e LoVo foram semeadas a IO4 células/poço em poços de 100 μΐ. As linhas de células foram testadas previamente quanto à expressão de superfície celular de PTK7 em um ensaio FACS padrão. A linha de células A- 431 expressaram o maior nível de expressão de superfície celular de PTK7 e a linha de células LoVo expressa o nível mais baixo de expressão de superfície celular de PTK7. Um conjugado de anticorpo anti-PTK7-toxina foi adicionado nos poços a uma concentração de partida de 20 nM e titulado a diluições seriais de 1:2. Usou-se um anticorpo de controle de isótipo como um controle negativo. Placas foram deixadas incubar durante 3 horas e os conjugados anticorpo-toxina não-ligados (livres) foram removidos por lavagem. Continuou-se incubando as placas durante 96 h e mediu-se a atividade de eliminação (FU,fluorescent unit [unidade de fluorescência]) por meio de viabilidade de células em ensaio luminescente CellTiter-Glo® de acordo com o protocolo (Promegaj WI, USA5 boletim técnico n° 288) usando- se uma leitora BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT5 E.U.A.). Os resultados são mostrados na Figura 22. O conjugado anti-PTK7-toxina apresentou, no ensaio de proliferação, uma diminuição de A43 Ihigh, SKOV3lnter, e LoVol0w expressando PTK7 que é dependente da concentração de anticorpo-toxina. Estes dados demonstram que anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina apresentam especificidade específica para várias células de câncer humano.

Exemplo 11: Imuno-histoquímica com 3G8, 12C6a, 2E11

A capacidade dos HuMAbs anti-PTK7 3G8, 12C6a, e 2E11 de reconhecer PTK7 por meio de imuno-histoquímica foi examinada usando-se biópsias clínicas de câncer do pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer do colo, câncer ovariano, câncer do intestino delgado & câncer da próstata.

Para a imuno-histoquímica, usou-se seções congeladas de 5 μιη (Ardais Inc, E.U.A.). Após secagem durante 30 minutos, seções foram fixadas com acetona (à temperatura ambiente durante 10 minutos) e secadas ao ar durante 5 minutos. Lâminas foram enxaguadas em PBS e então pré- incubadas com 10 % de soro de cabra normal em PBS durante 20 min e, subseqüentemente, incubadas com 10 μ^ηιΐ de anticorpo fit-cilado em PBS com 10 % de soro de cabra normal durante 30 min à temperatura ambiente. Em seguida, lâminas foram lavadas três vezes com PBS e incubadas durante min com anti-FITC de camundongo (10 μ^πιΐ DAKO) à temperatura ambiente. Lâminas foram lavada novamente com PBS e incubadas com _ conjugado HRP anti-moouse de cabra (DAKO) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Lâminas foram lavadas novamente 3x com PBS. Usou- se diaminobenzidina (Sigma) como substrato, resultando em manchamento castanho. Após lavagem com água destilada, lâminas foram contra- manchadas com hematoxilina durante 1 min. Subseqüentemente, lâminas foram lavadas durante 10 s em água destilada corrente e montadas em glicergel (DAKO). Manchamento imuno-histoquímico de biópsia clínica apresentou manchamento positivo nas seções de câncer do pulmão, câncer de mama, câncer de bexiga, câncer pancreático, câncer do colo, câncer ovariano, câncer do intestino delgado & câncer da próstata. Tecido normal foi sempre negativo para manchamento de PTK7, enquanto que no tecido maligno, observou-se que tanto fibroblastos ativados com câncer e células epiteliais cancerosas são positivos para manchamento de PTK7. A identidade dos fibroblastos ativados com câncer foi confirmada em seções de câncer de bexiga e câncer de mama por meio de manchamento com um anticorpo de proteína de ativação de fibroblasto (FAP [Fibroblast Activation Protein], Alexis Biochemicals, San Diego, USA ). FAP é um marcador conhecido de fibroblastos ativados com câncer (Hofheinz et ai (2003) Oncologie 26:44- 48).

Exemplo 12: Ensaio de invasão

Neste exemplo, anticorpos dirigidos contra PTK7 foram testados quanto à capacidade de afetar a invasão celular em uma linha de células de CHO transfectadas com PTK7. O ensaio foi realizado usando-se um sistema de inserção HTS 96-Multiwell Insert System (n° de catálogo 351162, BD Biosciences, CA) de acordo com o protocolo. Uma linha de células parental CHO, células CHO transfectadas com PTK7 de comprimento pleno, ou uma linha de células HEK293 de controle, foram misturadas com um combinado de HuMabs antiPTK7 ou um anticorpo de controle de isótipo antes da adição das células

J*9

í

nos insertos. A mistura (combinado de células + Ab) foi adicionada em um poço de inserto na placa de invasão. Após incubação a 37°C com 5 % de CO2 durante 24 horas, as células foram marcadas com um corante fluorescente e células que invadiram o fundo da membrana foram quantificadas usando uma leitora de placa de fluorescência. Os resultados são mostrados na Figura 23. Estes dados demonstram que anticorpos anti-PTK7 inibem a mobilidade de invasão de células expressando PTK7 na superfície da célula. Exemplo 13: Tratamento de modelo de enxerto exógeno de células de câncer pancreático in vivo usando anticorpos anti-PTK7 nucleotídeospuros e

conjugados com citotoxina

Este Exemplo divulga o tratamento in vivo de camundongos

implantados com um tumor de carcinoma de células pancreáticas com

anticorpos anti-PTK7 conjugados com toxina para examinar o efeito in vivo

dos anticorpos sobre crescimento de tumor.

HPAC (adenocarcinoma pancreático humano, número de

acesso ATCC CRL-2119) ou outras células vantajosas de câncer pancreático

foram expandidas in vitro usando-se procedimentos de laboratório

convencionais. Camundongos atímicos Ncr machos (Taconic, Hudson, NY)

com entre 6 e δ semanas de vida receberam implantes subcutâneos no flanco

direito de 2,5 xlO6 células HPAC em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por

camundongo. Camundongos foram pesados e seus tumores medidos

tridimensionalmente usando-se um paquímetro eletrônico duas vezes por

semana após a implantação. Volumes de tumor foram calculados como altura X largura χ comprimento / 2. Camundongos com tumores HPAC com médias de 90 mm3 foram randomizados em grupos de tratamento. Os camundongos receberam administração de uma única dose intravenosa com veículo de PBSs anticorpo anti-PTK7 puro ou HuMab anti-PTK7 conjugado com toxina no dia O na dosagem indicada (μιηοΐ/kg). Exemplos de compostos de toxina que

-podem ser conjugados aos anticorpos da presente invenção foram descritos no

Pedido de Patente dos E.U.A. pendente com número de série 11/134.826 e no Pedido de Patente U.S. pendente designado MEDX-0034US4. Camundongos foram monitorados quanto ao crescimento de tumor durante 61 dias após a dosagem. Camundongos foram eutanizados quando os tumores atingiram o ponto de viragem do tumor (2000 mm3) ou ulceraram. Anticorpos anti-PTK7 conjugados com uma toxina diminuíram a progressão do crescimento de tumor. Os resultados são mostrados na Figura 24. O efeito anti-tumor do conjugado de anti-PTK7 toxina foi dependente da dose, sendo que se observou o maior efeito a uma dose de 0,3 μηιοΐ/kg. Tratamento com conjugado anti-PTK7 toxina foi bem tolerado, sendo que sujeitos nunca experimentaram mais do que 5 % de perda de peso corporal média (dados não mostrados). Assim, tratamento com um conjugado de anticorpo anti-PTK7- toxina tem um efeito inibidor direto in vivo sobre o crescimento do tumor de

câncer pancreático.

Exemplo 14: Tratamento de modelo de enxerto exógeno de células de câncer de mama in vivo usando-se anticorpos anti-PTK7 puros e conjugados com citotoxina

Este Exemplo divulga o tratamento in vivo de camundongos que receberam implantes com um tumor de carcinoma de mama resistente a adriamicina com anticorpos anti-PTK7 conjugados toxina para se examinar o efeito in vivo dos anticorpos sobre o crescimento do tumor.

MCF7-adr (linha de células de câncer de mama humano resistentes a adriamicina) foram expandidas in vitro com o uso de procedimentos de laboratório convencionais. Camundongos CB17.SCID fêmeas (Taconic, Hudson, NY) com entre 6 e 8 semanas de vida receberam implantes subcutâneos com 1,7 mg de grânulos de estrogênio de liberação ao longo de 90 dias, com tamanho de 3,0 mm (Innovative Research of America, Sarasota, FL) na região da nuca, um dia antes de receberem implantes subcutâneos no flanco direito com 10 xlO6 células MCF7-Adr em 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por camundongo. Camundongos foram pesados e medidos tridimensionalmente quanto a tumores usando-se um paquímetro eletrônico duas vezes por semana após o implante. Volumes de tumor foram calculados como altura χ largura χ comprimento/2. Camundongos com tumores MCF7-adr medindo em média 160 mm3 foram randomizados em grupos de tratamento. Os camundongos receberam administração de uma única dose intravenosa a 0,1 μπιοΐ/kg com veículo de PBS, anticorpo anti- PTK7 puro ou HuMab anti-PTK7 conjugado com toxina no dia 0. Exemplos de compostos de toxina que podem ser conjugados com os anticorpos da presente invenção foram descritos no Pedido de Patente U.S. pendente com número de série 11/134.826 e o Pedido de Patente U.S. pendente denominado MEDX-003 4US4. Camundongos foram monitorados quanto ao crescimento do tumor durante 63 dias após a dosagem. Camundongos foram eutanizados quando os tumores ulceraram. Os resultados são mostrados na Figura 25. Conjugados de anticorpo anti-PTK7 toxina diminuíram a progressão do crescimento do tumor. Assim, tratamento com um conjugado anticorpo anti- PTK7-toxina tem um efeito inibidor direto in vivo sobre o crescimento de tumor de câncer de mama. _

SEQ ID NO: SEQÜÊNCIA SEQ ID NO: SEQÜÊNCIA 1 VH a.a. 3G8, 3G8a 23 VKCDRl a.a. 3G8 2 VH a.a. 4D5 24 VK CDRl a.a. 3G8a 3 VH a.a. 12C6, 12C6a 25 VKCDRl a.a. 4D5 4 VH a.a. 7C8 26 VKCDRl a.a. 12C6 27 VKCDRl a.a. 12C6a VK a.a. 3G8 28 VK CDRl a.a. 7C8 6 VK a.a. 3G8a __ e

7 VK a.a. 4D5 29 VK CDR2 a.a. 3G8 8 VK a. a. 12C6 30 VK CDR2 a.a. 3G8a 9 VK a.a. 12C6a 31 VK CDR2 a.a. 4D5 VK a.a. 7C8 32 VKCDR2 a. a. 12C6 33 VK CDR2 a.a. 12C6a 11 VH CDRl a.a. 3G8 34 VK CDR2 a.a. 7C8 12 VH CDRl a.a. 4D5 13 VH CDRl a.a. 12C6 35 VK CDR3 a.a. 3G8 14 VH CDRl a.a. 7C8 36 VK CDR3 a.a. 3G8a 37 VK CDR3 a.a. 4D5 VH CDR2 a.a. 3G8 38 VK CDR3 a.a. 12C6 16 VH CDR2 a.a. 4D5 39 VKCDR3 a.a. 12C6a 17 VH CDR2 a.a. 12C6 40 VK CDR3 a.a. 7C8 18 VH CDR2 a.a. 7C8 41 VH n.t. 3G8,3G8a 19 VH CDR3 a.a. 3G8 42 VH n.t. 4D5 VH CDR3 a.a. 4D5 43 VH n.t. 12C6, 12C6a 21 VH CDR3 a.a. 12C6 44 VH n.t. 7C8 22 VH CDR3 a.a. 7C8 45 VK n.t. 3G8 51 VH 3-30.3 linha germinal a.a. 46 VK n.t. 3G8a 52 VH DP44 linha germinal a.a. 47 VK n.t. 4D5 53 VH 3-33 linha germinal a.a. 48 VK n.t 12C6 49 VK n.t. 12C6a 54 VK Ll5 linha germinal a.a. 50 VK n.t. 7C8 55 VK AlO linha germinal a.a. 56 VK A27 linha germinal a.a. 57 VK L6 linha germinal a.a. 58 PTK7 a.a. 59 JH4b linha germinal a.a 60 JH4b linha germinal a.a. 61 3-7 linha germinal a.a. 62 3-23 linha germinal a.a. 63 JH4b linha germinal a.a 64 JH6b linha germinal a.a. 65 JKl linha germinal a.a. 66 JK5 linha germinal a.a. 67 JK2 linha germinal a.a. 68 JK2 linha germinal a,a. 69 JK3 linha germinal a.a. T JSTAGEM DE seqüências

<110> MEDAREX, INC.

<120> ANTICORPOS MONOCLONAIS HUMANOS PARA PROTEÍNA DE TIROSINA QUINASE (PTK7) E MÉTODOS PARA USO DE ANTICORPOS ANTI-PTK7

<130> MXI-345PC

<140> <141>

<150> 60/748,373 <151> 08.12.2005

<160> 69

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1

<211> 116

<212> PRT

<213> Horao sapiens

Gingai Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 13

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Val Trp Ser Ile Asp Asn Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 HO

Thr Val Ser Ser 115

<210> 2 <211> 115 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 30 Ma Phe His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser He Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50

55

60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 7b

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85

90

Ala Arg

Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100

105

Val Ser Ser 115

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

G4Iu0Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly χ 5 10 13

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 25

Leu Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 40

Ser Ala Ile Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala AsP Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu 65 70

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90

Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser y 105 il(J

100

<210> 4 <211> 126 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

1 5

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 20

Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

40 4b

35

Ala Val Ile TrP Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 ^O ^

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Phe Asn Ser Tyr Tyr Gly 100 105

Thr Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 5 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Asp0Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 1°

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg 85 90 ^

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

<210> 6 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens

A4Sp0Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly l 5 IO

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly He Ser Ser Trp 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50

55

60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 VO 75

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe 85 90

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105

<210> 7 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Glu0Il7e Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys 1 5 10 13

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser 25

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65

70 7^

Glu Asp Ala Ala Ala Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Ile 85 90

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 8 <211> 109 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 10

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 25

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser

50

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 Met Tvr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 9 <211> 107 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Asp^Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 ^

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ue Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 10 <211> 108 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Glu0íle°Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 1°

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ue Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65

70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 1°5

<210> 11 <211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

Asn Tyr Ala Met His 1 5

<210> 12 <211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens <4 00> 12

Ser Tyr Ala Phe His 1 5

<210> 13 <211> 5 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 13

Thr Tyr Leu Met Tyr 1 5

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Horno sapiens

<4 00> 14

Ser Tyr Gly Met His 1 5

<210> 15 <211> 17 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 15

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

10 15

Gly

<210> 16 <211> 17 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 16

Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 10 15

Gly <210> 17 <211> 16 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Ala0Ile7Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15

<210> 18 <211> 1"/ <212> PRT

<213> Homo sapiens

vli°ile8Trp Asp Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys 1 5 10 lb

Gly

<210> 19 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 19

Glu Val Trp Ser Ile Asp Asn 1 5

<210> 20 <211> 6 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 20

Thr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5

<210> 21 <211> 4 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21 Gly Leu Gly Tyr 1

<210> 22 <211> 17 <212> PRT

<213> Homo sapiens Val

<210> 23 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 24 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 24

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 25 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 25

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser Leu His 1 5 10

<210> 26 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 26

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10

<210> 27 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 27

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 28 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 28

Arq Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 29 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 30 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 31 <211> 7 <212> PRT

<213> Horno sapiens <400> 31

Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser 1 5

<210> 32 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 32

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5

<210> 33 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 33

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 34 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 34

Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5

<210> 35 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 35

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Arg Thr 1 5

<210> 36 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 36

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 37

His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Ile Thr 1 5

<210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 38

Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Met Tyr Thr χ 5 10

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5

<210> 40 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 40

Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr 1 5 10

<210> 41

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1).·(348

<4O0> 41

cia ata cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg Gln Sal G^n Leu Va! Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10

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40 45

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65 70

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85 90

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100 110

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96

240

288

336

34:

<210> 42

<211> 345

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)·.(345)

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25 JU

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45

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55 60

96

144

192

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288

336

345

<210> 43

<211> 336

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1) - - (336)

<400> 43

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ctt atg tac tgg gtt cgc cag gct cca gga aaa act ctg gag tgg gtc Leu Met Tyr Irp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Thr Leu Glu Trp Val 40 45

tca gct att ggt tet ggt ggt gat aca tac tat gea gac tcc gtg aag Ser Ala Ue Gly Ser Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60

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aga gga ctg ggc tac tgg ggc eag gga acc ctg gtc acc gtc tcc tca Arg Gly Leu Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

100 105 HO

48

96

144

192

240

288

336

<210> 44

<211> 378

<212> DNA

<213> Homo sapiens <220> <221> CDS

<222> (1)..(378)

<400> 44 _________ ^ _ . ___ 48

cag gtg caa ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cot ggg agg η Val Gln Leu Val 1 5

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25 30

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50 55 60

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"7 π "75

65

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96

144

192

240

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336

378

<210> 45

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).-(321)

gac°atc5cag atg acc cag tct cca tcc tca ctg tct gca tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10

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tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tcc ctg ate Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40

96

144 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50

55 60

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70 75

65

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aeg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa ate aaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

240

288

321

<210> 46

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220> <221> CDS

<222> (1). - (321)

aac°atc6caq atg acc cag tet cca tcc tca ctg tet gca tet gta gga Isp fie Gln Me^ Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10

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25 30

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tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc age ggc Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

- - 60

96

144

192

50

55

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70 7 5

65

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321

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<210> 47

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (321:

<400> 47

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Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

10 15

1

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25 30

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50 55 60

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85 90 95

acc ttc ggc caa ggg aca cga ctg gag att aaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 100 105

96

144

192

240

288

321

<210> 48

<211> 327

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220> <221> CDS

<222> (1)..(327)

<400> 48

gaa att gtg ttg acg cag tct cca ggc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 10 15

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

25 30

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40 45

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50 55 60

96

144

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65

70 75 80

240

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<210> 49

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).-(321)

ga^atfcag atg acc cag tct cca tec tca ctg tet gea tct gta gga 48 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

gac aga gtc acc ate act tgt cgg gcg agt cag ggt att age age tgg 96 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

tta gcc tgg tat cag cag aaa cca gag aaa gcc cct aag tec ctg ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

tat gct gea tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc age ggc 192 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tet ggg aca gat ttc aet ctc acc ate age age ctg cag cet 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 ^O 75 SO

aaa gat ttt gea act tat tac tgc caa cag tat aat agt tac ccg tac 288 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95

321

act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag ate aaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

<210> 50

<211> 324

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(324) gaa att gtg ttg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg Glu He Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gtt age ate tac Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Tyr 25 30

tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 40 45

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50 55 60

aat aaa tct ggg aca gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 BU

gaa gat ttt gea gtt tat tac tgt cag cag cgt age aac tgg cct cca Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro

90 95

85

ttc act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat ate aaa Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105

<210> 51 <211> 98 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Gln0Val1Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 7O 75

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg

96

144

192

240

288

324

<210> 52 <211> 97 <212> PRT <213> Homo sapiens

Glu0Val2Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val His Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ala Ile Gly Thr Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60

Glv Ara Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg

<210> 53 <211> 98 <212> PRT

<213> Homo sapiens

Gln0Val3Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Glv Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 7 5 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg

<210> 54

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 54 owi η 1

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10 I5

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95

<210> 55 <211> 95 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 55

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Phe Gln Ser Val Thr Pro Lys

10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Ser

25 30

Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 40 45

Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Phe Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Ser Ser Ser Leu Pro 85 90 95

<210> 56 <211> 96 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 56

Glu Ile Val Leu Thr 1 5

Glu Arg Ala Thr Leu 20

Tyr Leu Ala Trp Tyr 35

Ile Tyr Gly Ala Ser

50

Gly Ser Gly Ser Gly

65

Pro Glu Asp Phe Ala 85

Gln Ser Pro Gly Thr Leu

10

Ser Cys Arg Ala Ser Gln 25

Gln Gln Lys Pro Gly Gln 40

Ser Arg Ala Thr Gly Ile

55

Thr Asp Phe Thr Leu Thr

70 75

Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 90

Ser Leu Ser Pro Gly

15

Ser Val Ser Ser Ser

30

Ala Pro Arg Leu Leu

45

Pro Asp Arg Phe Ser

60

Ile Ser Arg Leu Glu

80

Tyr Gly Ser Ser Pro 95 <210> 57 <211> 95 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 57

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro 85 90 95

<210> 58

<211> 1070

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

Met Gly Ala Ala Arg Gly Ser Pro Ala Arg Pro Arg Arg Leu Pro Leu 10 15

Leu Ser Val Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Gly Thr Gln Thr Ala Ile 25 30

Val Phe Ile Lys Gln Pro Ser Ser Gln Asp Ala Leu Gln Gly Arg Arg 40 45

Ala Leu Leu Arg Cys Glu Val Glu Ala Pro Gly Pro Val His Val Tyr

50 55 60

Trp Leu Leu Asp Gly Ala Pro Val Gln Asp Thr Glu Arg Arg Phe Ala

65 70 75 80

Gln Gly Ser Ser Leu Ser Phe Ala Ala Val Asp Arg Leu Gln Asp Ser 85 90 95

Gly Thr Phe Gln Cys Val Ala Arg Asp Asp Val Thr Gly Glu Glu Ala

100 105 110

Arg Ser Ala Asn Ala Ser Phe Asn Ile Lys Trp Ile Glu Ala Gly Pro 115 120 125

Val Val Leu Lys His Pro Ala Ser Glu Ala Glu Ile Gln Pro Gln Thr 130 135 140 Gln Val Thr Leu Arg Cys His Ile Asp Gly His Pro Arg Pro Thr Tyr 145 150 155 160

Gln Trp Phe Arg Asp Gly Thr Pro Leu Ser Asp Gly Gln Ser Asn His

165 170 175

Thr Val Ser Ser Lys Glu Arg Asn Leu Thr Leu Arg Pro Ala Gly Pro

180 185 190

Glu His Ser Gly Leu Tyr Ser Cys Cys Ala His Ser Ala Phe Gly Gln

195 200 205

Ala Cys Ser Ser Gln Asn Phe Thr Leu Ser Ile Ala Asp Glu Sex Phe

210 215 220

Ala Arg Val Val Leu Ala Pro Gln Asp Val Val Val Ala Arg Tyr Glu

225 230 235 240

Glu Ala Met Phe His Cys Gln Phe Ser Ala Gln Pro Pro Pro Ser Leu 245 250 255

Gln Trp Leu Phe Glu Asp Glu Thr Pro Ile Thr Asn Arg Ser Arg Pro 260 265 270

Pro His Leu Arg Arg Ala Thr Val Phe Ala Asn Gly Ser Leu Leu Leu

275 280 285

Thr Gln Val Arg Pro Arg Asn Ala Gly Ile Tyr Arg Cys Ile Gly Gln

290 295 300

Gly Gln Arg Gly Pro Pro Ile Ile Leu Glu Ala Thr Leu His Leu Ala

305 310 315 320

Glu Ile Glu Asp Met Pro Leu Phe Glu Pro Arg Val Phe Thr Ala Gly

325 330 335

Ser Glu Glu Arg Val Thr Cys Leu Pro Pro Lys Gly Leu Pro Glu Pro 340 345 350

Ser Val Trp Trp Glu His Ala Gly Val Arg Leu Pro Thr His Gly Arg 355 360 365

Val Tyr Gln Lys Gly His Glu Leu Val Leu Ala Asn Ile Ala Glu Ser

370 375 380

Asp Ala Gly Val Tyr Thr Cys His Ala Ala Asn Leu Ala Gly Gln Arg

385 390 395 400

Arg Gln Asp Val Asn Ile Thr Val Ala Thr Val Pro Ser Trp Leu Lys 405 410 415

Lys Pro Gln Asp Ser Gln Leu Glu Glu Gly Lys Pro Gly Tyr Leu Asp 420 425 430

Cys Leu Thr Gln Ala Thr Pro Lys Pro Thr Val Val Trp Tyr Arg Asn 435 440 445

Gln Met Leu Ile Ser Glu Asp Ser Arg Phe Glu Val Phe Lys Asn Gly 450 455 460

Thr Leu Arg Ile Asn Ser Val Glu Val Tyr Asp Gly Thr Trp Tyr Arg 465 470 475 480 Cvs Met Ser Ser Thr Pro Ala Gly Ser Ile Glu Ala Gln Ala Arg Val 485 4 90 495

Gln Val Leu Glu Lys Leu Lys Phe Thr Pro Pro Pro Gln Pro Gln Gln 500 505 510

Cys Met Glu Phe Asp Lys Glu Ala Thr Val Pro Cys Ser Ala Thr Gly 515 520 525

Arq Glu Lys Pro Thr Ile Lys Trp Glu Arg Ala Asp Gly Ser Ser Leu 530 535 540

Pro Glu Trp Val Thr Asp Asn Ala Gly Thr Leu His Phe Ala Arg Val 545 550 555 560

Thr Arg Asp Asp Ala Gly Asn Tyr Thr Cys Ue Ala Ser Asn Gly Pro 565 570 575

Gln Gly Gln Ile Arg Ala His Val Gln Leu Thr Val Ala Val Phe Ile 580 585 590

Thr Phe Lys Val Glu Pro Glu Arg Thr Thr Val Tyr Gln Gly His Thr 595 600 605

Ala Leu Leu Gln Cys Glu Ala Gln Gly Asp Pro Lys Pro Leu Ile Gln 610 615 620

Trp Lys Gly Lys Asp Arg Ile Leu Asp Pro Thr Lys Leu Gly Pro Arg 625 630 635 640

Met His Ile Phe Gln Asn Gly Ser Leu Val Ile His Asp Val Ala Pro 645 650 655

Glu Asp Ser Gly Arg Tyr Thr Cys Ile Ala Gly Asn Ser Cys Asn Ile 660 665 670

Lys His Thr Glu Ala Pro Leu Tyr Val Val Asp Lys Pro Val Pro Glu 675 680 685

Glu Ser Glu Gly Pro Gly Ser Pro Pro Pro Tyr Lys Met Ile Gln Thr 690 695 7OO

Ile Gly Leu Ser Val Gly Ala Ala Val Ala Tyr Ile Ile Ala Val Leu 705 710 715 720

Gly Leu Met Phe Tyr Cys Lys Lys Arg Cys Lys Ala Lys Arg Leu Gln 725 730 735

Lys Gln Pro Glu Gly Glu Glu Pro Glu Met Glu Cys Leu Asn Gly Gly 740 745 750

Pro Leu Gln Asn Gly Gln Pro Ser Ala Glu Ile Gln Glu Glu Val Ala 755 760 765

Leu Thr Ser Leu Gly Ser Gly Pro Ala Ala Thr Asn Lys Arg His Ser 770 775 780

Thr Ser Asp Lys Met His Phe Pro Arg Ser Ser Leu Gln Pro Ile Thr 785 790 795 800

Thr Leu Gly Lys Ser Glu Phe Gly Glu Val Phe Leu Ala Lys Ala Gln 805 810 815 Gly Leu Glu Glu Gly Val Ala Glu Thr Leu Val Leu Val Lys Ser Leu 820 825 830

Gln Ser Lys Asp Glu Gln Gln Gln Leu Asp Phe Arg Arg Glu Leu Glu 835 840 845

Met Phe Gly Lys Leu Asn His Ala Asn Val Val Arg Leu Leu Gly Leu 850 855 860

Cys Arg Glu Ala Glu Pro His Tyr Met Val Leu Glu Tyr Val Asp Leu

865 870 875 880

Gly Asp Leu Lys Gln Phe Leu Arg Ile Ser Lys Ser Lys Asp Glu Lys 885 890 895

Leu Lys Ser Gln Pro Leu Ser Thr

900

Gln Val Ala Leu Gly Met Glu His 915 920

Lys Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys 930 935

Lys Val Ser Ala Leu Gly Leu Ser 945 950

Tyr His Phe Arg Gln Ala Trp Val 965

Lys Gln Lys Val Ala Leu Cys Thr 905 910

Leu Ser Asn Asn Arg Phe Val His

925

Leu Val Ser Ala Gln Arg Gln Val

940

Lys Asp Val Tyr Asn Ser Glu Tyr 955 960

Pro Leu Arg Trp Met Ser Pro Glu 970 975

Ala Ile Leu Glu Gly Asp Phe Ser Thr Lys Ser Asp Val Trp Ala Phe

980 985 990

Gly Val Leu Met Trp Glu Val Phe Thr His Gly Glu Met Pro His Gly

995 1000 1005

Gly Gln Ala Asp Asp Glu Val Leu Ala Asp Leu Gln Ala Gly Lys Ala

1010 1015 1020

Arg Leu Pro Gln Pro Glu Gly Cys Pro Ser Lys Leu Tyr Arg Leu Met 1025 1030 1035 1040

Gln Arg Cys Trp Ala Leu Ser Pro Lys Asp Arg Pro Ser Phe Ser Glu 1045 1050 1055

Ile Ala Ser Ala Leu Gly Asp Ser Thr Val Asp Ser Lys Pro 1060 1065 1070

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 10

<210> 60 <211> 15 <212> PRT <213> Homo

sapiens <400> 60

Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 10 15

<210> 61 <2U> 97 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ala 40 45

Asn Ala Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg

<210> 62 <211> 97 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 62

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 40 45

Ser Ala Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Lys

<210> 63 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 63

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10

<210> 64 <211> 18 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64 ,,,,ι

Tvr Tvr Tvr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

1 5 10 15

Ser Ser

<210> 65 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 66 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 66

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 67 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 67

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 1 5 10

<210> 68 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 68

Tvr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210> 69 <211> 12 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

Claims

1. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo: a) liga-se especificamente a PTK7 humana; e b) liga-se à linha de células de tumor de Wilms (n° de acesso ATCC CRL-1441).

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é um anticorpo de comprimento pleno de um isótipo IgGl ou IgG4.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo fato de que é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia única.

4. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 4,0 nM ou menos.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo liga-se a células de tumor de Wilms com uma EC50 de 3,5 nM ou menos.

6. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido anticorpo liga-se adicionalmente a uma linha de células de câncer selecionada do grupo que consiste de linhas de células A- 431 (n° de acesso ATCC CRL-1555), Saos-2 (n° de acesso ATCC HTB-85), SKOV-3 (n° de acesso ATCC HTB-77), PC3 (n° de acesso ATCC CRL- 1435), DMS 114 (n° de acesso ATCC CRL-2066), ACHN (n° de acesso ATCC CRL-1611), LNCaP (n° de acesso ATCC CRL-1740), DU 145 (n° de acesso ATCC HTB-81), LoVo (n° de acesso ATCC CCL-229) e MIA PaCa-2 (n° de acesso ATCC CRL-1420).

7. Anticorpo monoclonal humano isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compete de maneira cruzada pela ligação com PTK7 com um anticorpo de referência compreendendo: a) uma região variável de cadeia pesada humana compreende uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 1,2,3, e 4; e b) uma região variável de cadeia leve humana compreende uma seqüência de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste das SEQ ID NOs: 5, 6, 7, 8, 9,el0.

8. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos de SEQID NO: 1, e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:5.

9. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:l, e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

10. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:7.

11. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:3, e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:8.

12. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:3 e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:9.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a região variável de cadeia pesada humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:4 e a região variável de cadeia leve humana compreende a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 10.

14. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivado de, um gene Vh 3-30.3 humano, gene Vh DP44 ou gene Vh 3-33, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7.

15. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de, ou derivado de, um gene Vk Ll 5 humano, gene Vk A10, gene Vk A27 ou gene Vk L6, sendo que o anticorpo liga-se especificamente a PTK7.

16. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 18 caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região variável de cadeia pesada que é o produto de, ou derivado de, um gene Vh 3-30.3 humano, gene Vh DP44 ou um gene Vh 3-33 humano.

17. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO: 11; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 15; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO: 19; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:23; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo 4 SEQID NO:29;e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO:35.

18. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 11; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO:15; ^ q c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO:19; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO:24; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID N0:30; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:36.

19. Anticorpo de acordo com a reivindicação I5 caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO: 12; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 16; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID N0:20; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:25; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:31;e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:37.

20. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO:13; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 17; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:21; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQ ID NO:26; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:32; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQID NO:38.

21. Anticorpo de acordo com a reivindicação I5 caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQID NO: 13; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 17; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQID NO:21; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:27; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:33; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo 6 SEQID ΝΟ:39,

22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada CDRl compreendendo SEQ ID NO: 14; b) uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQID NO: 18; c) uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:22; d) uma região variável de cadeia leve CDRl compreendendo SEQID NO:28; e) uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQID NO:34; e f) uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID N0:40.

23. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:l; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:5.

24. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a 25 seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 1; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

25. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:2; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:7.

26. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:3; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:8.

27. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:3; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO:9.

28. Anticorpo monoclonal isolado ou porção de ligação de antígeno do mesmo caracterizado pelo fato de que compreende: a) uma região variável de cadeia pesada compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:4; e b) uma região variável de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoácidos da SEQID NO: 10.

29. Composição caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

30. Imunoconjugado caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1, ligado a um agente terapêutico.

31. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado como definido na reivindicação 30 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

32. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é uma citotoxina.

33. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado como definido na reivindicação 32 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

34. Imunoconjugado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um isótipo radioativo.

35. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o imunoconjugado como definido na reivindicação 34 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

36. Molécula de ácido nucleico isolada caracterizada pelo fato de que codifica o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1.

37. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico como definida na reivindicação 36.

38. Célula hospedeira caracterizada pelo fato de que compreende o vetor de expressão como definido na reivindicação 37.

39. Método para preparar um anticorpo anti-PTK7 caracterizado pelo fato de que compreende expressar o anticorpo na célula hospedeira como definida na reivindicação 38 e isolar o anticorpo da célula hospedeira.

40. Método para tratar ou prevenir uma doença distinguida pelo crescimento de células de tumor expressando PTK7, caracterizado pelo fato de que compreende administrar a um sujeito o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo, como definido na reivindicação 1 numa quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste de câncer do colo, câncer do pulmão, câncer de mama, câncer pancreático, melanoma, leucemia mielóide aguda, câncer do rim, câncer de bexiga, câncer ovariano e câncer da próstata.

43. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer pancreático.

44. Método de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.