ES2406063T3

ES2406063T3 - Anticuerpos monoclonales humanos contra la proteína Tirosina Quinasa 7(PTK7) y su uso

Info

Publication number: ES2406063T3
Application number: ES06848508T
Authority: ES
Inventors: Li-Sheng Lu; Jonathan Alexander Terrett; Chin Pan
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 2005-12-08
Filing date: 2006-12-08
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2026-12-08
Also published as: CN101360761B; EP1957539B1; US20120207764A1; BRPI0619582A2; RS52804B; PT1957539E; AU2006321841C1; WO2007067730A2; JP5401639B2; AU2006321841B2; CA2632552C; CA2632552A1; US8222375B2; NO20082559L; SG177194A1; IL191788A0; DK1957539T3; SI1957539T1; WO2007067730A3; US9505845B2

Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: (a) se une específicamente a PTK7 humana; y (b) se une a la línea celular tumoral de Wilms que tiene el Núm. de Acc. ATCC CRL-1441 con una CE50 de 4,0 nM o menos, en un análisis que comprende la incubación de 1 x 105 células con el anticuerpo a una concentración de partida de 30 μg/ml y la dilución seriada del anticuerpo a una dilución 1:10, y (c) se une al mismo epítopo en PTK7 humana como un anticuerpo de referencia que comprende: (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y 10 una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7; o (ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8; o (iii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10.

Description

Anticuerpos monoclonales humanos contra la proteína tirosina quinasa 7 (PTK7) y su uso.

Antecedentes de la invención

Las tirosina quinasas receptoras (RTK) son proteínas de señalización transmembrana que transmiten señales biológicas desde el entorno extracelular al interior de la célula. La regulación de las señales de RTK es importante para la regulación del crecimiento celular, la diferenciación, el crecimiento axonal, el crecimiento epitelial, el desarrollo, la adhesión, la migración, y la apoptosis (Prenzel et al. (2001) Endocr. Relat. Cancer 8:11-31; Hubbard y Till (2000) Annu. Rev. Biochem. 69:373-98). Se sabe que las RTK están implicadas en el desarrollo y la progresión de varias formas de cáncer. En la mayoría de los cánceres relacionados con RTK, ha habido una amplificación de la proteína receptora en lugar de una mutación del gen (Kobus y Fleming (2005) Biochemistry 44:1464-70).

La proteína tirosina quinasa 7 (PTK7), un miembro de la familia de proteínas tirosina quinasa receptoras, se aisló en primer lugar de los melanocitos humanos normales y se clonó mediante RT-PCR (Lee et al., (1993) Oncogene 8:3403-10; Park et al., (1996) J. Biochem 119:235-9). Por separado, el gen se clonó a partir de líneas celulares derivadas de carcinoma de colon humano y se denominó quinasa 4 de carcinoma de colon (CCK4) (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). La PTK7 pertenece a un subconjunto de las RTK que carecen de actividad tirosina quinasa catalítica detectable pero retienen la actividad de transducción de señales y se cree que posiblemente funcionar como una molécula de adherencia celular.

Se encontró que el ARNm para PTK7 se expresaba en forma variable líneas celulares derivadas de carcinoma de colon pero no se encontró que se expresara en los tejidos de colon humanos adultos (Mossie et al., supra). También se observó expresión de PTK7 en algunas líneas celulares de melanoma y biopsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Se ha encontrado una forma de empalme alternativa que se expresa en hepatomas y células de cáncer de colon (Jung et al. (2002) Biochim Biophys Acta 1579: 153-63). Además, se encontró que PTK7 estaba altamente expresada en exceso en muestras de leucemia mieloide aguda (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9). Mediante inmunohistoquímica, se observó tinción específica de tumor de PTK7 en los cánceres de mama, de colon, de pulmón, de páncreas, de riñón y de vejiga, como se describe en la Publicación PCT WO 04/17992. El documento WO 2004/017992 describe PTK7, agentes que interaccionan con o modulan la expresión o actividad de PTK7, y su uso en el tratamiento del carcinoma. Kyriakos et al. (Cancer Research 52, Febrero de 1992, Núm. 4, páginas 835-842) describen el destino de anticuerpos unidos a la superficie de las células tumorales in vitro.

Por lo tanto, se desean agentes que reconozcan PTK7, y métodos de uso de tales agentes.

Compendio de la invención

La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a PTK7 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen una alta afinidad de unión a PTK7 humana y unión a las células del tumor de Wilms. También se proporcionan los anticuerpos y composiciones de la invención para su uso en métodos para el tratamiento de una variedad de enfermedades mediadas por PTK7.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo:

1.: (a) se une específicamente a PTK7 humana; y

2.: (b) se une a la línea celular tumoral de Wilms que tiene el Núm. de Acc. ATCC CRL-1441 con una CE50 de 4,0 nM o menos, en un análisis que comprende la incubación de 1 x 105 células con el anticuerpo a una concentración de partida de 30 μg/ml y la dilución seriada del anticuerpo a una dilución 1:10, y

3.: (c) se une al mismo epítopo en PTK7 humana como un anticuerpo de referencia que comprende:

1.: (i) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7; o

2.: (ii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8; o

3.: (iii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:

10.

Un anticuerpo preferido o porción de unión a antígeno del mismo comprende:

1.: (a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 12;

2.: (b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 16;

3.: (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 20;

4.: (d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 25;

5.: (e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 31; y

6.: (f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 37;

o

1.: (a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 14;

2.: (b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 18;

3.: (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 22;

4.: (d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 28;

5.: (e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 34; y

6.: (f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 40.

o

1.: (a) una región variable de la cadena pesada CDR1que comprende el SEQ ID NO: 13;

2.: (b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 17;

3.: (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 21;

4.: (d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 26;

5.: (e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 32; y

6.: (f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 38.

Otros anticuerpos preferidos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden:

1.: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2; y

2.: (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7;

o

1.: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4; y

2.: (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10;

o

1.: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3; y

2.: (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.

Los anticuerpos de la invención pueden ser, por ejemplo, anticuerpos completos, por ejemplo de un isotipo IgG1 o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpos, tales como fragmentos Fab o Fab'2,

o anticuerpos de la cadena sencilla.

La invención también proporciona un producto inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o porción de unión a antígeno del mismo, conectado a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo.

También se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo,

o producto inmunoconjugado de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También están abarcados por la invención moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de las mismas de la invención, así como vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos y células anfitrionas que comprenden tales vectores de expresión.

También se proporciona un método in vitro para preparar un anticuerpo de la invención, que comprende expresar el anticuerpo en una célula anfitriona de la invención y aislar el anticuerpo de la célula anfitriona.

Por otra parte, en la presente memoria se describe un ratón transgénico que comprende transgenes de la cadena pesada y ligera de inmunoglobulina humana, en donde el ratón expresa un anticuerpo de la invención, así como hibridomas preparados a partir de tal ratón, en donde el hibridoma produce el anticuerpo de la invención.

En otro aspecto más, la invención proporciona un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la invención para su uso en un método de tratamiento o prevención de un cáncer caracterizado por crecimiento de células tumorales que expresan PTK7. El cáncer puede ser cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), leucemia mieloide aguda, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de ovario o cáncer de próstata. Los ejemplos de otros tipos de cáncer incluyen cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias crónicas o agudas incluyendo leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de células T adultas (LLCTA), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primario del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma anaplásico de células grandes (LACG), linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células hendidas pequeñas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfoma de células T (LLCT), cánceres por linfomas foliculares centroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas difusos de células B grandes, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (LCTLA) y linfomas en cavidades corporales asociados al VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p. ej., Tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por el amianto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Breve Descripción de los Dibujos

La Figura 1A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 41) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales humanos 3G8 y 3G8a. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 11), CDR2 (SEQ ID NO: 15) y CDR3 (SEC ID NO: 19) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J. La Figura 1B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 45) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3G8. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 23), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEC ID NO: 35) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 1C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 46) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3G8a. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 24), CDR2 (SEQ ID NO: 30) y CDR3 (SEC ID NO: 36) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 42) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 4D5. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 12), CDR2 (SEQ ID NO: 16) y CDR3 (SEC ID NO: 20) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 47) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 4D5. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 25), CDR2 (SEQ ID NO: 31) y CDR3 (SEC ID NO: 37) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 43) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la región variable de la cadena pesada de los anticuerpos monoclonales humanos 12C6. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 13), CDR2 (SEQ ID NO: 17) y CDR3 (SEC ID NO: 21) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 48) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 12C6. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 26), CDR2 (SEQ ID NO: 32) y CDR3 (SEC ID NO: 38) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 3C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 49) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 12C6a. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 27), CDR2 (SEQ ID NO: 33) y CDR3 (SEC ID NO: 39) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 44) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 7C8. Se delimitan las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 14), CDR2 (SEQ ID NO: 18) y CDR3 (SEC ID NO: 22) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V, D y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 50) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 7C8. Se delimitan las regiones

CDR1 (SEQ ID NO: 28), CDR2 (SEQ ID NO: 34) y CDR3 (SEC ID NO: 40) y se indican las derivaciones de las líneas germinales V y J. La Figura 5 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 3G8 (SEQ ID NO: 1) y 3G8a (SEC ID NO: 1) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH3-30.3, (SEQ ID NO: 51) (la línea germinal JH4b se describe como SEC ID NO: 59). La Figura 6 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 4D5 (SEC ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos línea germinal humana VH3-30.3 (SEQ ID NO: 51) (la línea germinal JH4b se describe como SEC ID NO: 60). La Figura 7 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada de 12C6 (SEQ ID NO: 3) y 12C6a (SEC ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VHDP44 (SEQ ID NO: 52) (las líneas germinales 3-7, 3-23, y JH4b se describen como SEQ ID NO: 6163, respectivamente). La Figura 8 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 7C8 (SEQ ID NO: 4) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH3-33 (SEQ ID NO: 53) (la línea germinal 3H6b se describe como SEQ ID NO: 64). La Figura 9 muestra el alineamiento de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera de 3G8 (SEQ ID NO: 5) y 3G8a (SEC ID NO: 6) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VkL15 (SEQ ID NO: 54) (la línea germinal JK1 se describe como SEQ ID NO: 65). La Figura 10 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 4D5 (SEC ID NO: 7) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VkA10 (SEQ ID NO: 55) (la línea germinal JK5 se describe como SEQ ID NO: 66). La Figura 11 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 12C6 (SEQ ID NO: 8) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VkA27 (SEQ ID NO: 56) (la línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 67). La Figura 12 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 12C6a (SEQ ID NO: 9) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VkL15 (SEQ ID NO: 54) (la línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 68). La Figura 13 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de 7C8 (SEQ ID NO: 10) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VkL6 (SEQ ID NO: 57) (la línea germinal JK3 se describe como SEQ ID NO: 69). La Figura 14 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que el anticuerpo monoclonal 7C8 humano, dirigido contra PTK7 humana se une a la superficie celular de células HEK3 transfectadas con PTK7 humana completa. La Figura 15 muestra los resultados de los experimentos de ELISA que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 humana se unen específicamente a PTK7. La Figura 16 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana se unen a la superficie celular de las células del tumor de Wilms. La Figura 17 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana se unen a la superficie celular de una variedad de líneas celulares de cáncer. La Figura 18 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana se unen a la superficie celular de las células dendríticas. La Figura 19 muestra los resultados de los experimentos de citometría de flujo que demuestran que los anticuerpos dirigidos contra PTK7 humana se unen a los linfocitos T CD8+ y CD4+, pero no a los linfocitos B. La Figura 20 muestra los resultados de experimentos de internalización Hum-Zap que demuestran que los anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 humana se pueden internalizar en células PTK7+. (A) Internalización de los anticuerpos humanos 3G8, 4D5 y 7C8 en las células del tumor de Wilms. (B) Internalización del anticuerpo 12C6 humano en células de tumor de Wilms. (C) Internalización de los anticuerpos 7C8 y 12C6 humanos en las células tumorales A-431. (D) Internalización de los anticuerpos humanos 7C8 y 12C6 en células tumorales PC3. La Figura 21 muestra los resultados de un análisis de proliferación celular que demuestra que los anticuerpos anti- PTK7 monoclonales humanos conjugados con toxina destruyen líneas celulares de cáncer de riñón humano. La Figura 22 muestra los resultados de un análisis de proliferación celular que demuestra que los anticuerpos anti- PTK7 monoclonales humanos conjugados con toxina destruyen líneas celulares que expresan de bajos a altos niveles de expresión de PTK7. La Figura 23 muestra los resultados de un análisis de invasión que demuestra que los anticuerpos anti-PTK7 inhiben la movilidad de invasión de células que expresan PTK7 en la superficie celular. La Figura 24 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de tumor in vivo que demuestra que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con una toxina retardaron la progresión del crecimiento tumoral en el cáncer de páncreas. La Figura 25 muestra los resultados de un estudio de xenoinjerto de tumor in vivo que demuestra que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con una toxina retardaron la progresión del crecimiento tumoral en el cáncer de mama.

Descripción Detallada de la Invención

En un aspecto, la presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a PTK7. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención exhiben una o más propiedades funcionales deseables, tales como una alta afinidad de unión a PTK7 y/o la capacidad de inhibir el crecimiento de las células tumorales in vitro o in vivo. En ciertas realizaciones, los anticuerpos de la invención derivan de secuencias de la línea germinal de la cadena pesada y ligera concretas y/o comprenden características estructurales concretas tales como regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos concretas. La invención proporciona anticuerpos aislados, los métodos de fabricación de tales anticuerpos, productos inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden dichos anticuerpos y las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, o los productos inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La invención también se refiere a métodos de uso de los anticuerpos, por ejemplo para el tratamiento de enfermedades tales como el cáncer.

Con el fin de que la presente invención puede entenderse más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Las definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "PTK7" y "CCK4" se utilizan indistintamente e incluyen variantes, isoformas y homólogos de especie de PTK7 humana. Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la invención pueden, en ciertos casos, presentar una reacción cruzada con PTK7 de especies distintas a la humana. En ciertas realizaciones, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para una o más PTK7 humanas y pueden no exhibir reactividad cruzada no humana de especie o de otros tipos. La secuencia completa de aminoácidos de una PTK7 humana ilustrativa tiene el número de acceso Genbank NM_002821 (SEC ID NO: 58).

El término "respuesta inmunitaria" se refiere a la acción, por ejemplo, de linfocitos, células presentadoras de antígenos, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citoquinas, y complemento) que da como resultado el daño selectivo a, la destrucción de, o la eliminación del cuerpo humano de patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "ruta de transducción de señales" hace referencia a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señales que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. Según se utiliza en la presente memoria, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor PTK7.

El término "anticuerpo" mencionado en la presente memoria incluye anticuerpos completos y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas de los mismos. Un "anticuerpo" hace referencia a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (abreviada en la presente memoria como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de la cadena ligera (abreviada en la presente memoria como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores de anfitrión, incluyendo diversas células del sistema inmunitario (p. ej., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema del complemento clásico.

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), según se utiliza en la presente memoria, hace referencia a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (p. ej., PTK7). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse por fragmentos de un anticuerpo completo. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra, (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región bisagra (véase, Fundamental Immunology (Paul ed, 3. sup.rd ed 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544546), que consiste de un dominio VH; (vii) una región determinante de la complementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, una región variable de la cadena pesada que contiene un único dominio variable y dos dominios constantes. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH están codificados por genes separados, éstos pueden unirse, usando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permite ser elaborados en forma de una sola cadena proteica en la que las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de la cadena sencilla (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que tales anticuerpos de la cadena sencilla también estén abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen usando mecanismos convencionales conocidos por los expertos en la técnica, y los fragmentos se escrutan para determinar la utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Se pretende que un "anticuerpo aislado", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PTK7 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PTK7). Un anticuerpo aislado que se une específicamente PTK7 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, tales como moléculas PTK7 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" según se utiliza en la presente memoria, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad de unión y afinidad para un epítopo particular.

Se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco como CDR deriven de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Por otra parte, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también deriva de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (p. ej., mutaciones introducidas por mutagénesis al azar o específica del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano", según se utiliza en la presente memoria, incluya anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas.

El término "anticuerpo monoclonal humano" hace referencia a anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tienen regiones variables en las que las regiones tanto marco como CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, p. ej., un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de la cadena pesada humana y un transgén de la cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo humano recombinante", según se utiliza en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos humanos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como

(a) anticuerpos aislados de un animal (p. ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para los genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparados de allí (descrito adicionalmente más adelante), (b) anticuerpos aislados a partir de una célula anfitriona transformada para expresar el anticuerpo humano, p. ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca combinatoria de anticuerpos humanos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique corte y empalme de las secuencias de genes de inmunoglobulinas humanas a otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las que las regiones marco y CDR derivan de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En ciertas realizaciones, sin embargo, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y por lo tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas de y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural en el repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Según se utiliza en la presente memoria, "isotipo" hace referencia a la clase de anticuerpo (p. ej., IgM o IgGI) que está codificada por los genes de la región constante de la cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan aquí indistintamente junto con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno."

El término "derivados de anticuerpos humanos" hace referencia a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, p. ej., un producto conjugado de anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

Se pretende que el término "anticuerpo humanizado" haga referencia a anticuerpos en los que se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, en secuencias marco humanas. Otros modificaciones de la región marco podrán realizarse dentro de las secuencias marco humanas.

Se pretende que el término "anticuerpo quimérico" haga referencia a anticuerpos en los que las secuencias de la región variable derivan de una especie y las secuencias de la región constante derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante derivan de un anticuerpo humano.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que un anticuerpo que "se une específicamente a PTK7 humana" haga referencia a un anticuerpo que se une a PTK7 humana con una KD de 1 x 10-7 M o menos, más preferiblemente 5 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 1 x 10-8 M o menos, más preferiblemente 5 x 10-9 M o menos.

El término "no se unen sustancialmente" a una proteína o a las células, según se utiliza en la presente memoria, significa que no se unen o no se unen con una alta afinidad a la proteína o las células, es decir, se une a la proteína

o a las células con una KD de 1 x 10-6 M o más, más preferiblemente 1 x 10-5 M o más, más preferiblemente 1 x 10-4 M o más, más preferiblemente 1 x 10-3 M o más, incluso más preferiblemente 1 x 10-2 M o más.

Se pretende que el término "Kasoc" o " Ka", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la velocidad de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno concreta, mientras que se pretende que el término" Kdis" o "Kd", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la velocidad de disociación de una interacción anticuerpoantígeno particular. Se pretende que el término "KD", según se utiliza en la presente memoria, haga referencia a la constante de disociación, que se obtiene a partir de la razón de Kd con respecto a Ka (es decir, Kd/ Ka) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para los anticuerpos se pueden determinar utilizando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es mediante la utilización de resonancia de plasmón superficial, preferiblemente utilizando un sistema biosensor tal como un sistema Biacore®.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG hace referencia a un anticuerpo que tiene una KD de 10-8 M o menos, más preferiblemente de 10-9 M o menos y aún más preferiblemente de 10-10 M o menos para un antígeno diana. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, "alta afinidad" de unión para un isotipo IgM hace referencia a un anticuerpo que tiene una KD de 10-7 M o menos, más preferiblemente de 10-8 M o menos, incluso más preferiblemente de 10-9 M o menos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-PTK7

Los anticuerpos de la invención se caracterizan por rasgos funcionales o propiedades particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a PTK7. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a PTK7 con alta afinidad, por ejemplo, con una KD de 1 x 10-7 M o menos. Preferiblemente, el anticuerpo se une a PTK7 humana con una KD de 5 x 10-8 M o menos, se une a PTK7 humana con una KD de 1 x 10-8 M o menos, se une a PTK7 humana con una KD de 5 x 10-9 M o menos, o se une a PTK7 humana con una KD de entre 1 x 10-8 M y 1 x 10-10 M o menos. El anticuerpo se une a las células del tumor de Wilms con una CE50 de 4,0 nM o menos, o se une a las células del tumor de Wilms con una CE50 de 3,5 nM o menos. Los análisis convencionales para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos contra PTK7 son conocidos en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISA, transferencias Western y los RIA. Las cinéticas de unión (p. ej., afinidad de unión) de los anticuerpos también se puede evaluar mediante análisis convencionales conocidos en la técnica, tal como mediante ELISA, y el análisis de Scatchard y Biacore. En cuanto a otro ejemplo, los anticuerpos de la presente invención se pueden unir a una línea celular tumoral de carcinoma de riñón, por ejemplo, la línea celular de tumor de Wilms. Los análisis adecuados para la evaluación de cualquiera de las características descritas anteriormente se describen en detalle en los Ejemplos.

Anticuerpos monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 Los anticuerpos de la invención incluyen los anticuerpos monoclonales humanos 4D5, 12C6 y 7C8. Otros anticuerpos descritos en la presente memoria incluyen 3G8, 3G8a y 12C6. Todos los anticuerpos se aislaron y se caracterizaron estructuralmente como se describe en los Ejemplos 1 y 2. Los expertos en la técnica deberán apreciar que los anticuerpos 3G8 y 3G8a, así como los anticuerpos 12C6 y 12C6a tienen la misma secuencia de la cadena pesada, mientras que difieren en sus secuencias de la cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 1 (3G8 y 3G8a), 2 (4D5), 3 (12C6 y 12C6a) y 4 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de VL de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a, y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente.

Teniendo en cuenta que cada uno de estos anticuerpos se pueden unir a PTK7, las secuencias de VH y VL se pueden "mezclar y emparejar" para crear otras moléculas de unión anti-PTK7. La unión a PTK7 de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede someter a ensayo utilizando los análisis de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA). Preferiblemente, cuando se mezclan y emparejan las cadenas VH y VL, una secuencia VH de un determinado emparejamiento VH/VL se sustituye por una secuencia VH estructuralmente similar. Del mismo modo, preferiblemente una secuencia VL de un determinado emparejamiento VH/VL se sustituye por una secuencia VL estructuralmente similar.

Por lo tanto, en un aspecto, se describe en la presente memoria un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo que comprende:

1.: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 1, 2, 3 y 4; y

2.: (b) una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 y 10;

en donde el anticuerpo se une específicamente PTK7, preferiblemente PTK7 humana.

El anticuerpo, o la proteína de unión a anticuerpo del mismo, de la invención pueden comprender:

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de el SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7; o

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10; o

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.

Otras combinaciones de cadenas pesadas y ligeras descritas incluyen:

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 5; o

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 6, o

(a): una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9.

En otro aspecto, en la presente memoria se describen anticuerpos que comprenden los CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada y la cadena ligera de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8, o combinaciones de los mismos. Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 11 (3G8 y 3G8a), 12 (4D5), 13 (12C6 y 12C6a) y 14 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 15 (3G8 y 3G8a), 16 (4D5), 17 (12C6 y 12C6a) y 18 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de VH de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 19 (3G8 y 3G8a), 20 (4D5), 21 (12C6 y 12C6a) y 22 (7C8). Las secuencias de aminoácidos de las CDR1 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 y 28, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3 de Vk de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 y 40, respectivamente. Las regiones CDR se delimitan mediante el sistema de Kabat (Kabat, EA, et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publicación NIH Núm. 91-3242).

Teniendo en cuenta que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a PTK7 y que la especificidad de unión al antígeno es proporcionada principalmente por las regiones CDR1, CDR2, y CDR3, las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1, CDR2, y CDR3 de Vk se pueden "mezclar y emparejar" (es decir, las CDR de anticuerpos diferentes se pueden mezclar y emparejar, aunque cada anticuerpo deba contener una CDR1, CDR2, y CDR3 de VH y una CDR1, CDR2, y CDR3 de Vk) para crear otras moléculas de unión anti-PTK7 de la invención. La unión a PTK7 de tales anticuerpos "mezclados y emparejados" se puede someter a ensayo utilizando los análisis de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (p. ej., ELISA, análisis Biacore). Preferiblemente, cuando las secuencias de CDR de VH se mezclan y emparejan, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH concreta se remplaza por una o varias secuencias de CDR estructuralmente similares. Del mismo modo, cuando se mezclan y emparejan secuencias de CDR de Vk, la secuencia de CDR1, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia Vk concreta se sustituye preferiblemente por una o varias secuencias de CDR estructuralmente similares. Será fácilmente evidente para el experto normal en la técnica que se puedan crear secuencias de VH y VL mediante la sustitución de una o más secuencias de la región CDR de VH y/o VL por secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas en la presente memoria para los anticuerpos monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8.

Por lo tanto, en otro aspecto, en la presente memoria se describe un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo que comprende:

(a): una CDR1 de la región de variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 11, 12, 13 y 14;

(b): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO: 15, 16, 17 y 18;

(c): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO: 19, 20, 21 y 22;

(d): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO: 23, 24, 25, 26, 27 y 28;

(e): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en los SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34; y

(F): una CDR3 región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de los SEQ ID NO: 35, 36, 37, 38, 39 y 40; en donde el anticuerpo se une específicamente a PTK7, preferiblemente PTK7 humana.

El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo de la invención pueden comprender:

(A): una CDR1 de la región variable de la cadena pesada de que comprende el SEQ ID NO: 12;

(B): una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de la que comprende el SEQ ID NO: 16;

(C): una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 20;

(D): una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 25;

(E): una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 31; y

(F) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 37; o

1.: (a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 14;

2.: (b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 18;

3.: (c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 22;

4.: (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 28;

5.: (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 34; y

6.: (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 40;

o

1.: (a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 13;

2.: (b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 17;

3.: (c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 21;

4.: (d) una CDR1 de la región variable de cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 26;

5.: (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 32; y

6.: (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 38.

También se describen en la presente memoria anticuerpos que comprenden:

1.: (a) una CDR1 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 11;

2.: (b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de la que comprende el SEQ ID NO: 15;

3.: (c) una CDR3 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 19;

4.: (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 23;

5.: (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 29; y

6.: (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 35;

o

2.: (b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada que comprende el SEQ ID NO: 15;

4.: (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 24;

5.: (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 30; y

6.: (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 36;

o

2.: (b) una CDR2 de la región variable de la cadena pesada de la que comprende el SEQ ID NO: 17;

4.: (d) una CDR1 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 27;

5.: (e) una CDR2 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 33; y

6.: (f) una CDR3 de la región variable de la cadena ligera que comprende el SEQ ID NO: 39.

Es bien sabido en la técnica que el dominio CDR3, independientemente del dominio CDR1 y/o CDR2, por sí solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo a un antígeno cognado y que previsiblemente se pueden generar múltiples anticuerpos que tienen la misma especificidad unión basada en una secuencia de CDR3 común. Véase, por ejemplo, Klimka et al., British J. of Cáncer 83(2):252-260 (2000) (que describen la producción de un anticuerpo anti-CD30 humanizado utilizando solo la CDR3 del dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo Ki-4 murino anti-CD30); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (que describen anticuerpos recombinantes contra la glicoproteína epitelial 2 (EGP-2) utilizando solo la secuencia de CDR3 de la cadena pesada del anticuerpo anti-EGP-2 murino parental MOC-31); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915 (1998) (que describen un panel de anticuerpos anti-integrina αvβ3 humanizados utilizando un dominio CDR3 variable de la cadena ligera y pesada de un anticuerpo LM609 murino anti-integrina αvβ3 en el que cada miembro del anticuerpo comprende una secuencia distinta fuera del dominio CDR3 y capaz de unirse al mismo epítopo que el anticuerpo murino parental con afinidades tan altos o más que el anticuerpo murino parental); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que describen que el dominio CDR3 proporciona la contribución más significativa a la unión al antígeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2529-2533 (1995) (que describen el injerto de secuencias de CDR3 de la cadena pesada de tres Fab (SI-1, SI-40, y SI-32) contra el ADN de placenta humana en la cadena pesada de un anticuerpo Fab sustituyendo así la CDR3 de la cadena pesada existente y demostrando que el dominio CDR3 solo confiere especificidad de unión); y Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que describen estudios de injertos en los que la transferencia de solo la CDR3 de la cadena pesada de un Fab poliespecífico parental LNA3 a una cadena pesada de un anticuerpo Fab p313 de unión al toxoide de tétanos monoespecífico de IgG era suficiente para retener la especificidad de unión de los Fab parentales).

Por lo tanto, en la presente memoria se describen anticuerpos monoclonales que comprende uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un ser humano o animal no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a PTK7. También se describen en la presente memoria anticuerpos monoclonales que comprende uno o más dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a PTK7. Tales anticuerpos que comprenden uno o más dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no-humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo, y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del anticuerpo no humano parental correspondiente.

También se describen en la presente memoria anticuerpos monoclonales que comprende uno o más dominio CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a PTK7. También se describen en la presente memoria anticuerpos monoclonales que comprende uno o más dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a PTK7 y en donde el dominio de CDR3 del primer anticuerpo humano sustituye un dominio CDR3 de un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión para PTK7 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse específicamente a PTK7. Tales anticuerpos que comprenden uno o más dominios CDR3 de la cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) conservan las características funcionales; (c) se unen al mismo epítopo, y/o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del primer anticuerpo humano parental correspondiente. El primer anticuerpo humano puede ser 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8.

Anticuerpos que se Unen al Mismo Epítopo que los Anticuerpos Anti-PTK7 de la Invención La invención proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítopo en PTK7 humana como cualquiera de los anticuerpos monoclonales PTK7 de la invención (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad de competir de manera cruzada por la unión a PTK7 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención). El anticuerpo de referencia para los estudios competición cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 4D5 (que tiene las secuencias VH y VL mostradas en los SEQ ID NO: 2 y 7, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 12C6 (que tiene las secuencias VH y VL mostradas en los SEQ ID NO: 3 y 8, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 7C8 (que tiene las secuencias VH y VL mostradas en los SEQ ID NO: 4 y 10, respectivamente). Tales anticuerpos de competición cruzada se pueden identificar basándose en su capacidad para competir de manera cruzada con 4D5, 7C8 o 12C6 en análisis de unión a PTK7 convencionales. Por ejemplo, se pueden utilizar el análisis BIAcore, ensayos de ELISA o citometría de flujo para demostrar la competición cruzada con los anticuerpos de la presente invención. La capacidad de un anticuerpo de ensayo para inhibir la unión de, por ejemplo, 4D5, 7C8 o 12C6, a PTK7 humana demuestra que el anticuerpo de ensayo puede competir con 4D5, 7C8-12C6 o por la unión a PTK7 humana y por lo tanto se une al mismo epítopo en PTK7 humana como 4D5, 7C8 o 12C6. El anticuerpo que se une al mismo epítopo en PTK7 humana como 4D5, 7C8 o 12C6 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en los Ejemplos.

Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican Anticuerpos de la Invención

Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un producto lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se deja sustancialmente puro" cuando se purifica aparte de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante mecanismos convencionales, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de bandas con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., Ed. (1987), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, Nueva York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede contener o no secuencias intrónicas. En una realización preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos se pueden obtener utilizando técnicas convencionales de biología molecular. Para los anticuerpos expresados por los hibridomas (por ejemplo, hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos que portan genes de inmunoglobulina humana como se describe adicionalmente más adelante), los ADNc que codifican las cadenas ligera y pesada del anticuerpo elaborado por el hibridoma se pueden obtener mediante amplificación por PCR convencional o técnicas de clonación de ADNc. Para los anticuerpos obtenidos a partir de una biblioteca de genes de inmunoglobulina (por ejemplo, utilizando técnicas de presentación en fagos), el ácido nucleico que codifica el anticuerpo se puede recuperar de la biblioteca.

Las moléculas de ácido nucleico preferidas son aquellas que codifican las secuencias de VH y VL de los anticuerpos monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a o 7C8. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VH de 3G8, 3G8a, 4D5,12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 41 (3G8 y 3G8a), 42 (4D5), 43 (12C6 y 12C6a) y 44 (7C8). Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VL de 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se muestran en los SEQ ID NO: 45, 46, 47, 48, 49 y 50, respectivamente.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican los segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas de ADN recombinante convencionales, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de las cadenas de anticuerpo completos, en genes de fragmentos Fab o en un gen de scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se conecta operativamente a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un conector flexible. Se pretende que el término "conectado operativamente", según se utiliza en este contexto, signifique que los dos fragmentos de ADN se unen de tal forma que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en marco.

El ADN aislado que codifica la región VH puede convertirse en un gen de la cadena pesada completo uniendo operativamente el ADN que codifica VH con otra molécula de ADN que codifica las regiones constantes de la cadena pesada (CH1, CH2 y CH3). Las secuencias de los genes de la región constante de la cadena pesada humana se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publication NIH Núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena pesada puede ser una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferiblemente es una región constante de IgG1 o IgG4. Para obtener un gen de la cadena pesada de un fragmento Fab, el ADN que codifica VH se puede conectar operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo la región constante CH1 de la cadena pesada.

El ADN aislado que codifica la región VL puede convertirse en un gen de la cadena ligera completo (así como un gen de la cadena ligera de Fab) conectando operativamente el ADN que codifica VL a otra molécula de ADN que codifica la región constante de la cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante la cadena ligera humana son conocidas en la técnica (véase p. ej. Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los Estados Unidos, Publication NIH Núm. 91-3242) y los fragmentos de ADN que incluyen estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR convencional. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa

o lambda, pero más preferiblemente es una región constante kappa.

Para crear un gen de scFv, los fragmentos de ADN que codifican VH y VL están conectados operativamente a otro fragmento que codifica un conector flexible, p. ej., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que la secuencias de VH y VL se pueden expresar en forma de una proteína de la cadena sencilla contigua, con las regiones VL y VH unidas por el enlazador flexible (véase p. ej., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-554).

Producción de Anticuerpos Monoclonales de la Invención

Los anticuerpos monoclonales (mAb) pueden ser producidos mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología de anticuerpos monoclonales convencional, p. ej., la técnica de hibridación de células somáticas convencional de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren los procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, se pueden emplear otras técnicas para la producción de anticuerpos monoclonales

p. ej., transformación viral u oncogénica de linfocitos B.

El sistema animal preferidos para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y las técnicas para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión se conocen en la técnica. También se conocen compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y procedimientos de fusión.

Los anticuerpos quiméricos o humanizados se pueden preparar basándose en la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se ha descrito anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera se pueden obtener a partir del hibridoma murino de interés y diseñar para contener secuencias de inmunoglobulina no murinas (por ejemplo, humanas) usando técnicas convencionales de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas se pueden conectar a las regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (véase p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas se pueden insertar en un marco humano usando métodos conocidos en la técnica (véase p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.225.539 de Winter, y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.530.,101; 5.,585.,089;

5.693.762 y 6.180.370 de Queen et al.).

Los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra PTK7 se pueden generar utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente memoria como ratones HuMAb y ratones KM™, respectivamente, y se denominan colectivamente en la presente memoria como "ratones de Ig humana".

El ratón HuMAb ® (Medarex, Inc.) contiene miniloci de genes de inmunoglobulina humana que codifican secuencias de inmunoglobulina de la cadena pesada (μ y γ) y ligera κ humanas no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de la cadena μ y κ endógenos (véase p. ej., Lonberg, et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). Por lo tanto, los ratones muestran una expresión reducida de IgM o κ de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de la cadena pesada y ligera humanas introducidos experimentan cambio de clase y mutación somática para generar un anticuerpo monoclonal IgGκ humana de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), más arriba, Revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764:536-546). La preparación y el uso de los ratones HuMab, y las modificaciones genómicas realizadas por tales ratones, son descritas con más detalle por Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; y Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851. Véanse adicionalmente, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; y 5.770.429; todas de Lonberg y Kay; la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.545.807 de Surani et al.; Publicación PCT Núms. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas de Lonberg y Kay; y Publicación PCT Núm. WO 01/14424 de Korman et al.

En otra realización, se pueden originar anticuerpos humanos de la invención usando un ratón que porta secuencias de inmunoglobulina humana en los transgenes y transcromosomas, tal como un ratón que porta un transgén de la cadena pesada humana y un transcromosoma de la cadena ligera humana. Tales ratones, referidos en la presente memoria como "ratones KM™", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Otros sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por ejemplo, se puede utilizar un sistema transgénico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 y

6.162.963 de Kucherlapati et al.

Por otra parte, están disponibles en la técnica sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana y se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-PTK7 de la invención. Por ejemplo, se pueden utilizar ratones que portan tanto un transcromosoma de cadena pesada humana y un transcromosoma de cadena ligera humana, denominados "ratones TC"; tales ratones son descritos por Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, se han descrito en la técnica vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanas (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y se pueden utilizar para originar anticuerpos anti-PTK7 de la invención.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar utilizando métodos de presentación en fagos para el escrutinio de bibliotecas de genes de inmunoglobulina humanos. Tales métodos de presentación en fagos para aislar anticuerpos humanos están establecidos en la técnica. Véanse, por ejemplo: las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.223.409; 5.403.484; y 5.571.698 de Ladner et al.; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.427.908 y 5.580.717 de Dower et al.; las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.969.108 y 6.172.197 de McCafferty et al.; y las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 y 6.593.081 de Griffiths et al.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando ratones SCID en los que se han reconstituido células inmunitaria humanas de manera que se pueda generar una respuesta de anticuerpo humano después de la inmunización. Tales ratones se describen, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.476.996 y 5.698.767 de Wilson et al.

Inmunización de Ratones de Ig Humana

Cuando se utilizan ratones de Ig humana para producir anticuerpos humanos de la invención, dichos ratones pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno PTK7 y/o PTK7 recombinante, o una proteína de fusión de PTK7, como describen Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; y Publicación PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferiblemente, los ratones tendrán 6-16 semanas de edad tras la primera infusión. Por ejemplo, se puede utilizar una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) de antígeno PTK7 para inmunizar a los ratones de Ig humana por vía intraperitoneal.

Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para PTK7 se describen en el Ejemplo 1 a continuación. La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en coadyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones IP cada otros semanas (hasta un total de 6) con antígeno en coadyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, también se ha encontrado que son eficaces otros coadyuvantes de Freund. Además, se ha encontrado que las células completas en ausencia de coadyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmunitaria puede verificarse durante el transcurso del protocolo de inmunización con muestras de plasma que se obtienen mediante sangrías retroorbitales. El plasma puede escrutarse mediante ELISA (como se describe a continuación), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PTK7 se puede utilizar para las fusiones. Los ratones se pueden reforzar intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo. Se espera que se pueda necesitar realizar 2-3 fusiones para cada inmunización. Se inmunizan típicamente entre 6 y 24 ratones para cada antígeno. Por lo general, se utilizan ambas cepas HCo7 y HCo12. Además, se pueden producir juntos ambos transgenes HCo7 y HCo12 en un único ratón que tenga dos transgenes de la cadena pesada humana diferentes (HCo7/HCo12). Alternativamente o adicionalmente, se puede utilizar la cepa de ratón KM™ , como se describe en el Ejemplo 1.

Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos de la invención

Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos de la invención, los esplenocitos y/o células de nódulos linfáticos de ratones inmunizados se puede aislar y fusionado a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes se pueden escrutar para determinar la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, las suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se pueden fusionar a un sexto del número de células P3X63-Ag8.653 de mieloma de ratón no secretoras (ATCC, CRL 1580) con 50% de PEG. Las células cultivan en placa a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene Clone Serum fetal al 20%,medio acondicionado "653" al 18%,origen al 5% (IGEN), L-glutamina 4 mM, piruvato sódico 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y 1X HAT (Sigma, el HAT se añade 24 horas después de la fusión). Después de aproximadamente dos semanas, las células se pueden cultivar en un medio en el que el HAT se reemplaza por HT. Los pocillos individuales se pueden escrutar a continuación mediante ELISA para determinar anticuerpos monoclonales humanos IgM e IgG. Una vez que se produce el crecimiento extensivo del hibridoma, medio se puede observar por lo general al cabo de 10-14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se pueden replantar, examinar de nuevo, y si todavía fueran positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales se pueden subclonar al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se pueden cultivar a continuación in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización.

Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces de agitación de dos litros para la purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución tampón puede ser intercambiado por PBS, y la concentración se puede determinar mediante la DO280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.

Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales de la Invención

Los anticuerpos de la invención también se pueden producir en un transfectoma de célula anfitriona usando, por ejemplo, una combinación de mecanismos de ADN recombinante y métodos de transfección de genes como es bien conocido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de los mismos, los ADN que codifican las cadenas de pesadas y ligeras parciales o completas, se pueden obtener mediante técnicas de biología molecular convencionales (p. ej., amplificación mediante PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN se pueden insertar en vectores de expresión de manera que los genes se conecten operativamente a secuencias de control de la transcripción y la traducción. En este contexto, se pretende que el término "conectado operativamente" signifique que un gen de anticuerpo se ligue en un vector de manera que las secuencias de control de la transcripción y la traducción dentro del vector sirvan para su función pretendida de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula anfitriona de expresión utilizada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores separados o, más típicamente, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos convencionales (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento génico del anticuerpo y el vector, o ligación de extremos romos si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente memoria pueden usarse para crear genes de anticuerpos completos de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya codifican las regiones constante de la cadena pesada y constante de la cadena ligera del isotipo deseado de tal manera que el segmento VH se una operativamente al segmento o los segmentos CH dentro del vector y el segmento VK se una operativamente al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula anfitriona. El gen de la cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de tal manera que el péptido señal se conecte en marco al extremo amino del gen de la cadena de anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de las cadenas de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas de anticuerpo en una célula anfitriona. Se pretende que el término "secuencia reguladora" incluya promotores, intensificadores y otros elementos de control de expresión (p. ej., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o la traducción de los genes de las cadenas de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, por Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula anfitriona que se vaya a transformar, el nivel de expresión de proteínas deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células anfitrionas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de la proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus de simio 40 (SV40), adenovirus, (p. ej., el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, se pueden utilizar secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de la ubicuitina o el promotor de la β-globina. Adicionalmente, otros elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema de promotor SRα, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición terminal larga del virus de la leucemia humana de células T tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de las cadenas de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en células anfitrionas (p. ej., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células anfitrionas en las que se ha introducido el vector (véanse,

p. ej., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.399.216, 4.634.665 y 5.179.017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, típicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula anfitriona en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células anfitrionas dhfr- con selección/amplificación con metotrexato) y el gen neo (para selección con G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el vector o los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan a una célula anfitriona mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula anfitriona procariótica o eucariótica, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células anfitrionas procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y lo más preferiblemente en células anfitrionas de mamífero, es la más preferida porque es más probable que tales células eucarióticas, y, en particular, las células de mamífero ensamblen y secreten un anticuerpo correctamente plegado e inmunológicamente activo que las células procarióticas. Se ha informado de que la expresión procariótica de genes de anticuerpos no es eficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13).

Las células anfitrionas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células CHO dhfr-, descritas por Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad, Sci. USA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador seleccionable de DHFR, p. ej., como describen R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol.. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión de gen GS descrito en los documentos WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338.841. Cuando se introducen en células anfitrionas de mamífero vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos, los anticuerpos se producen cultivando las células anfitrionas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células anfitrionas o, más preferiblemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células anfitrionas. Los anticuerpos se pueden recuperar del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas. Caracterización de la Unión del Anticuerpo al Antígeno Los anticuerpos de la invención pueden ser sometidos a ensayo para determinar la unión a PTK7, por ejemplo, mediante un ELISA convencional. Brevemente, las placas de microtitulación se recubren con PTK7 purificado a 0,25 µg/ml en PBS, y a continuación se bloquean con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Se añaden a cada pocillo diluciones de anticuerpo (p. ej., diluciones de plasma de ratones inmunizados con PTK7) y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y a continuación se incuban con reactivo secundario (p. ej., para los anticuerpos humanos, un reactivo policlonal de cabra anti-IgG humana específico de Fc) conjugado con fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después del lavado, las placas se revelaron con sustrato pNPP (1 mg/ml), y se analizaron a una DO de 405 a 650. Preferiblemente, los ratones que desarrollan los títulos más altos se utilizarán para las fusiones.

También se puede utilizar un análisis ELISA como se ha descrito anteriormente para el escrutinio de hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunógeno PTK7. Los hibridomas que se unen con alta avidez a PTK7 se subclonan y se caracterizan adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células parentales (mediante ELISA), puede elegirse para elaborar un banco de células de 5-10 viales almacenado a -140°C, y para la purificación de los anticuerpos.

Para purificar anticuerpos anti-PTK7, los hibridomas seleccionados se pueden cultivar en matraces de agitación de dos litros para la purificación de anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes se pueden filtrar y concentrar antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ). La IgG eluida se puede comprobar mediante electroforesis en gel y cromatografía líquida de alto rendimiento para garantizar la pureza. La solución tampón se puede intercambiar a PBS, y la concentración se puede determinar mediante la DO280 utilizando un coeficiente de extinción de 1,43. Los anticuerpos monoclonales se pueden dividir en alícuotas y almacenar a -80°C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 seleccionados se unen a epítopos únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse usando reactivos disponibles comercialmente (Pierce, Rockford, IL). Se pueden llevar a cabo estudios de competición utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando placas de ELISA recubiertas con PTK7 como se ha descrito anteriormente. La unión del mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de Estreptavidina- fosfatasa alcalina.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISA de isotipo utilizando reactivos específicos para los anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pocillos de placas de microtitulación puede ser recubierta con 1 mg / ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4 ° C. Después de bloquear con BSA al 1%, las placas se hacen reaccionar con 1 g / ml o menos de anticuerpos monoclonales purificados de prueba o controles de isotipo, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pozos a continuación, se pueden hacer reaccionar con cualquiera de IgG1 humana o sondas alcalinos específicos IgM humanos conjugados con fosfatasa. Las placas se desarrollaron y se analizaron como se ha descrito anteriormente.

Las IgG humanas anti-PTK7 se pueden someter a ensayo adicionalmente para determinar la reactividad con el antígeno PTK7 mediante transferencia Western. Brevemente, PTK7 se puede preparar y someter a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas con suero de ternera fetal al 10%, y se sondaron con los anticuerpos monoclonales que se iban a someter a ensayo. La unión de IgG humana puede detectarse utilizando fosfatasa alcalina anti-IgG humana y se reveló con pastillas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO).

Productos Inmunoconjugados

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un anticuerpo anti-PTK7, o un fragmento del mismo, conjugado con un radical terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco (por ejemplo, un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales productos conjugados se denominan en este documento "productos inmunoconjugados". Los productos inmunoconjugados que incluyen uno o más citotoxinas se conocen como "inmunotoxinas." Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para (por ejemplo, destruye) las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracinodiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo descarbazina), agentes alquilantes (p. ej. mecloretamina, tioepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (p. ej. daunorubicina (antes daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej. dactinomicina (antes actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (p. ej. vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden conjugarse con un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, calicheamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un producto conjugado de anticuerpo calicheamicina está disponible comercialmente (Mylotarg™; Wyeth-Ayerst). Los ejemplos de citotoxinas terapéuticas se pueden encontrar, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms: 6548530 y 6281354 y en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núms: US 2003/0064984, US 2003/0073852 y US 2003/0050331.

Las citotoxinas se pueden conjugar a los anticuerpos de la invención utilizando la tecnología de conectores disponible en la técnica. Ejemplos de los tipos de conectores que se han utilizados para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y conectores que contienen péptidos. Se puede elegir un conector que es, por ejemplo, susceptible de escisión por bajo pH dentro del compartimento lisosomal o es susceptible de escisión por proteasas, tales como proteasas expresadas preferentemente en el tejido tumoral, tales como las catepsinas (p. ej. catepsinas B, C, D).

Para una discusión adicional de los tipos de citotoxinas, conectores y métodos para conjugar los agentes terapéuticos a los anticuerpos, véase también Saito, G. et. al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev 55:99-215; Trail, P. A. et al. (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne; (2003) Cancer. Cell 3:207-212; Allen, T. M. (2002) Nat. Rev. Cancer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter, P. D. y Springer, C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también se pueden conjugar con un isótopo radioactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también referidos como productos radioinmunoconjugados. Los ejemplos de los isótopos radiactivos que se pueden conjugar con anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, Indio111, Itrio90 y lutecio177. El método para la preparación de productos radioinmunconjugados está establecido en la técnica. Los ejemplos de productos radioinmunoconjugados están disponibles comercialmente, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y se pueden utilizar métodos similares para preparar productos radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención.

Los productos conjugados de anticuerpos de la invención se pueden utilizar para modificar una respuesta biológica dada, y no se debe considerar que el radical de fármaco está limitado a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, el radical de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento activo de la misma, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina de la difteria; una proteína tal como el factor de necrosis tumoral o interferón-γ; o, modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 ("IL-1"), interleuquina-2 ("IL-2"), interleuquina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos, ("GM-CSF "), factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar tales radicales terapéuticos con anticuerpos son bien conocidas, véase, p. ej., Arnón et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62:119-58 (1982).

Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, p. ej. una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o una o varias porciones de unión a antígenos de los mismos, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación (p. ej. dos o más diferentes) de anticuerpos o productos inmunoconjugados de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o productos inmunoconjugados) que se unen a diferentes epítopos en el antígeno diana o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también se pueden administrar en terapia combinada, es decir, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia combinada puede incluir un anticuerpo anti-PTK7 de la presente invención combinado con al menos otro agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Los ejemplos de los agentes terapéuticos que se pueden utilizar en la terapia combinada se describen con mayor detalle más adelante en la sección sobre los usos de los anticuerpos de la invención.

Según se utiliza en la presente memoria, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares que sean fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (p. ej., mediante inyección o infusión). Dependiendo de la ruta de administración, el compuesto activo, es decir, el anticuerpo, producto inmunoconjugado, o molécula biespecífica, se pueden revestir con un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" hace referencia a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto parental y no confiere efectos toxicológicos no deseados (véase p. ej. Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Los ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de álcali. Las sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición de álcali incluyen las derivadas de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como N,N'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina , etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares;

(2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado ( BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol, y similares, y (3) agentes quelantes de metales, tales como ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, y similares.

Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de tensioactivos.

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede asegurar tanto mediante procedimientos de esterilización, más arriba, y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser ocasionada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la invención. También se pueden incorporar a las composiciones compuestos activos complementarios.

Las composiciones terapéuticas deben ser típicamente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse en forma de una solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como cloruro de manitol, sorbitol, o sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede provocarse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión alcalino y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo .

La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación unitaria variará dependiendo del sujeto que está siendo tratado, y el modo particular de administración. La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con un material portador para producir una forma de dosificación unitaria será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, exceptuando el cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0,01 por ciento a aproximadamente el noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferiblemente de alrededor de 0,1 por ciento a aproximadamente 70 por ciento, más preferiblemente de aproximadamente 1 por ciento a alrededor de 30 por ciento de ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (p. ej. una respuesta terapéutica). Por ejemplo, se puede administrar una única embolada, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente según se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitarias para facilitar la administración y la uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria tal como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos que se van a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención está dictada por y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico concreto que se va a conseguir, y (b) las limitaciones inherentes a la técnica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos.

Para la administración del anticuerpo, la dosificación oscila de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg, y más habitualmente de 0,01 a 5 mg/kg, de peso corporal del anfitrión. Por ejemplo las dosificaciones pueden ser de 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg . Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada tres a 6 meses. Los regímenes de dosificación preferidos para un anticuerpo anti-PTK7 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de la administración intravenosa, administrándose el anticuerpo mediante la utilización de uno de los siguientes regímenes de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, y luego cada tres meses, (ii) cada tres semanas, (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido de 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosificación de cada anticuerpo administrado está dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis individuales pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como se indica mediante la medición de los niveles sanguíneos de anticuerpo para el antígeno diana en el paciente. En algunos métodos, la dosificación se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos aproximadamente 25-300 µg/ml.

Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y la frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido de los anticuerpos humanizados, los anticuerpos quiméricos, y los anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosificación relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento durante el resto de sus vidas. En las aplicaciones terapéuticas, a veces es necesaria una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que se reduce o termina la progresión de la enfermedad, y preferiblemente hasta que el paciente muestra una mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. A partir de entonces, se puede administrar al paciente un régimen profiláctico.

Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar con el fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración concretos, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones concretas de la presente invención empleadas, o su éster, sal o amida, la ruta de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción de la compuesto concreto que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados combinados con las composiciones concretas empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general e historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Una "dosis terapéuticamente eficaz" de un anticuerpo anti-PTK7 de la invención da como resultado preferiblemente una disminución de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de enfermedad, o una prevención del deterioro o discapacidad debidos al padecimiento de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores, una "dosis terapéuticamente eficaz" preferiblemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento tumoral en al menos aproximadamente 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente 40%, aún más preferiblemente en al menos aproximadamente 60%, y todavía más preferiblemente en al menos aproximadamente 80% con respecto a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento del tumor puede ser evaluada en un sistema modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir, tal inhibición in vitro mediante análisis conocidos por el experto en la técnica. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o mejorar de otra manera los síntomas en un sujeto. Un experto normal en la técnica sería capaz de determinar tales cantidades basándose en factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición o ruta de administración concretas seleccionadas.

Una composición de la presente invención se puede administrar a través de una o más rutas de administración utilizando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como apreciará el experto en la técnica, la ruta y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados. Las rutas de administración preferidas para los anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal o por otras rutas de administración parenterales, por ejemplo por inyección o infusión. La frase "administración parenteral" según se utiliza en la presente memoria significa modos de administración distintos de la administración enteral y tópica, normalmente mediante inyección, e incluye, sin limitación, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, inyección intraespinal, epidural e intraesternal e infusión.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar a través de una ruta no parenteral, tal como una ruta de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente.

Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de liberación microencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etileno y acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y poli(ácido láctico). Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones están patentados o son conocidos generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una realización preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; o 4.596.556. Los ejemplos de los implantes y módulos bien conocidos útiles en la presente invención incluyen: la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.487.603, que describe una bomba de micro-infusión implantable para dispensar medicación a una velocidad controlada; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.486.194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicación a través de la piel; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.447.233, que describe una bomba de infusión de medicación para la liberación de medicación a una velocidad de infusión precisa; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.447.224, que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para la liberación continua de fármaco; la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.439.196, que describe un sistema de liberación de fármaco osmótico que tiene compartimientos multicámara; y la Patente de los Estados Unidos Núm. 4.475.196, que describe un sistema de liberación de fármaco osmótico. Muchos otros implantes, sistemas de entrega y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar una distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BHE) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención cruzan la BHE (si se desea), éstos pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, Las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.522.811; 5.374.548; y 5.399.331. Los liposomas pueden comprender uno o más radicales que se transportan selectivamente a células u órganos específicos, por lo tanto mejoran la liberación de fármacos (véase, p. ej., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los radicales de redireccionamiento ilustrativos incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm.

5.416.016 de Low et al.); manósidos; (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (PG Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteína A tensioactiva (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol.. Chem.. 269:9090), véanse también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y Métodos de la Invención

Los anticuerpos, las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo que implican el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados por PTK7. Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Por ejemplo, estas moléculas se pueden administrar a células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "sujeto" incluya animales humanos y no humanos. Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, p. ej., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen los pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad PTK7. Los métodos son particularmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresión aberrante PTK7. Cuando los anticuerpos a PTK7 se administran junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente.

Teniendo en cuenta la unión específica de los anticuerpos de la invención a PTK7, los anticuerpos de la invención se pueden utilizar para detectar específicamente la expresión de PTK7 en la superficie de las células y, por otra parte, se puede utilizar para purificar PTK7 a través de purificación por inmunoafinidad.

La invención proporciona adicionalmente métodos para detectar la presencia de antígeno PTK7 humano en una muestra, o medir la cantidad de antígeno PTK7 humano, que comprende poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a PTK7 humana, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo

o porción del mismo y PTK7 humana. A continuación, se detecta la formación de un complejo, en donde una formación de complejos diferente entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia de antígeno PTK7 humano en la muestra.

PTK7 se expresa en líneas celulares derivadas de carcinoma de colon, pero no se encontró que se expresara en los tejidos de colon humanos adultos (Mossie et al. (1995) Oncogene 11:2179-84). La expresión PTK7 también se observó en algunas líneas celulares de melanoma y biopsias de melanoma (Easty, et al. (1997) Int. J. Cancer 71:1061-5). Además, se encontró que PTK7 estaba altamente expresada en exceso en muestras de leucemia mieloide aguda (Muller-Tidow et al., (2004) Clin. Cancer Res. 10:1241-9). Un anticuerpo anti-PTK7 se puede utilizar solo para inhibir el crecimiento de tumores cancerosos. Alternativamente, un anticuerpo anti-PTK7 se puede utilizar junto con otros agentes inmunogénicos, tratamientos convencionales contra el cáncer u otros anticuerpos, tal como se describe a continuación.

Los cánceres preferidos cuyo crecimiento se puede inhibir utilizando los anticuerpos de la invención incluyen típicamente cánceres que responden a la inmunoterapia. Los ejemplos no limitantes de los cánceres preferidos para su tratamiento incluyen el cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), leucemia mieloide aguda, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Los ejemplos de otros tipos de cáncer que se pueden tratar utilizando los métodos de la invención incluyen cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias agudas o crónicas como leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de células T adultas (LLCTA), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primario del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma anaplásico de células grandes (LACG), linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células hendidas pequeñas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfoma de células T (LLCT), cánceres por linfomas foliculares centroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas difusos de células B grandes, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (LCTLA) y linfomas en cavidades corporales asociados al VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p. ej., Tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por el amianto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Además, dada la expresión de PTK7 en varias células tumorales, los anticuerpos humanos, las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención se puede utilizar para tratar a un sujeto con un trastorno tumorigénico, p. ej., un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan PTK7 incluyendo, por ejemplo, cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), melanoma (p. ej., melanoma maligno metastásico), leucemia mieloide aguda, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario y cáncer de próstata. Los ejemplos de otros sujetos con un trastorno tumorigénico incluyen sujetos con cáncer renal (p. ej., carcinoma de células renales), glioblastoma, tumores cerebrales, leucemias agudas o crónicas incluyendo la leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia de células T adultas (LLCTA), leucemia mieloide crónica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, linfomas (p. ej., linfoma de Hodgkin y no Hodgkin, linfoma linfocítico, linfoma primario del SNC, linfoma de células T, linfoma de Burkitt, linfoma anaplásico de células grandes (LACG), linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células hendidas pequeñas, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, leucemia/linfoma de células T (LLCT), cánceres por linfomas foliculares centroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas difusos de células B grandes, linfoma de células T de tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (LCTLA) y linfomas en cavidades corporales asociados al VIH), carcinomas embrionarios, carcinomas indiferenciados de la rinofaringe (p. ej., Tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B, carcinomas nasofaríngeos, cáncer de hueso, cáncer de piel, cáncer de cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo

o intraocular, cáncer de útero, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de útero, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinoma del cuello uterino, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, cáncer de esófago, cáncer de intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula suprarrenal, sarcoma de tejidos blandos, cáncer de la uretra, cáncer de pene, tumores sólidos de la infancia, cáncer de la vejiga, cáncer del riñón o uréter, carcinoma de la pelvis renal, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tronco encefálico, adenoma de la pituitaria, cáncer epidermoide, cáncer de células escamosas, cánceres inducidos ambientalmente incluyendo los inducidos por el amianto, por ejemplo, mesotelioma y combinaciones de dichos cánceres.

Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona un anticuerpo o porción de unión al antígeno de la invención para uso en un método de inhibir el crecimiento de células tumorales en un sujeto, comprendiendo dicho método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho anticuerpo o porción de unión al antígeno.

Los anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos y composiciones) de la invención se pueden utilizar para detectar los niveles de PTK7 o niveles de células que contienen PTK7 en su superficie de la membrana, cuyos niveles pueden ser relacionados a continuación con ciertos síntomas de la enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos se pueden utilizar para inhibir o bloquear la función de PTK7 que, a su vez, se puede relacionar con la prevención o mejora de ciertos síntomas de la enfermedad, implicando de ese modo a PTK7 como un mediador de la enfermedad. Esto se puede lograr poniendo en contacto una muestra experimental y una muestra de control con el anticuerpo anti-PTK7 en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y PTK7. Los complejos formados entre el anticuerpo y PTK7 se detectan y se comparan en la muestra experimental y el control.

Los anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanos y composiciones) de la invención se pueden someter a ensayo inicialmente para determinar la actividad de unión asociada con el uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención se pueden someter a ensayo usando los ensayos de citometría de flujo descritos en los Ejemplos de más abajo.

Los anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanos, productos inmunoconjugados y composiciones) de la invención pueden tener utilidad adicional en la terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con PTK7. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos y los producto inmunoconjugados se pueden utilizar para provocar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento de y/o destruir una célula que expresa PTK7; mediar la fagocitosis o la ADCC de una célula que expresa PTK7 en la presencia de células efectoras humanas, o bloquear la unión del ligando de PTK7 a PTK7.

Los anticuerpos (p. ej., anticuerpos humanos y composiciones) se pueden utilizar in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con PTK7. Los ejemplos de las enfermedades relacionadas con PTK7 incluyen, entre otras, cáncer de colon (incluyendo cáncer del intestino delgado), melanoma

(p. ej., melanoma maligno metastásico), leucemia mieloide aguda, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de ovario y cáncer de próstata.

Las rutas de administración adecuadas de las composiciones de anticuerpos (p. ej., anticuerpos monoclonales humanos y productos inmunoconjugados) de la invención in vivo e en vitro son bien conocidos en la técnica y pueden ser seleccionados por los expertos normales en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos se pueden administrar mediante inyección (p. ej., Intravenosa o subcutánea). Las dosificaciones adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y de la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo.

Como se ha descrito anteriormente, los anticuerpos anti-PTK7 humana de la invención se pueden administrar simultáneamente con uno o más de otros agentes terapéuticos, p. ej., un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor. El anticuerpo se puede unir al agente (en forma de un inmunocomplejo) o se puede administrar por separado a partir del agente. En este último caso (administración separada), el anticuerpo se puede administrar antes, después o simultáneamente al agente o se puede administrar simultáneamente a otras terapias conocidas, p. ej., una terapia contra el cáncer, p. ej., radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina), cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida e hidroxiurea que, por sí mismos, solo son eficaces a niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa a una dosis de 100 mg/ una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra por vía intravenosa a una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La administración simultánea de los anticuerpos anti-PTK7 humanas o fragmentos de unión al antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anti-cancerosos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Tal administración simultánea puede resolver los problemas debidos al desarrollo de resistencia a los medicamentos o cambios en la antigenicidad de las células tumorales que las hacen no reactivas con el anticuerpo.

En una realización, los productos inmunoconjugados de la invención se pueden utilizar para compuestos diana (por ejemplo, agentes terapéuticos, marcas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) contra las células que tienen receptores de PTK7 en la superficie celular mediante la unión de tales compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PTK7 se puede conjugar con cualquiera de los compuestos toxina descritos en la Patente de los Estados Unidos Núms. 6.281.354 y 6.548.530, la Publicación de Patente de los Estados Unidos Núms. 20030050331, 20030064984, 20030073852 y 20040087497 o publicados en el documento WO 03/022806. Por lo tanto, la invención también proporciona métodos para localizar ex vivo o in vivo células que expresan PTK7 (p. ej., con una marca detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático). Como alternativa, los productos inmunoconjugados se pueden utilizar para destruir las células que tienen receptores de PTK7 de superficie celular dirigiendo citotoxinas o radiotoxinas a PTK7.

Las células efectoras específicas de la diana, p. ej., células efectoras unidas a composiciones (p. ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden usar como agentes terapéuticos. Las células efectoras de redireccionamiento pueden ser leucocitos humanos, tales como los macrófagos, los neutrófilos o los monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células que portan receptores de IgG o IgA. Si se desea, las células efectoras se pueden obtener del sujeto que se vaya tratar. Las células efectoras específicas de la diana se pueden administrar en forma de una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108109 pero puede variar en función de la finalidad terapéutica. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula diana, p. ej., una célula de tumor que expresa PTK7 y para efectuar la destrucción celular, p. ej., mediante fagocitosis. Las rutas de administración también pueden variar.

La terapia con células efectoras específicas de la diana se puede llevar a cabo conjuntamente con otras técnicas para la eliminación de células diana. Por ejemplo, la terapia anti-tumoral usando las composiciones (p. ej., anticuerpos humanos) de la invención y/o las células efectoras armadas con estas composiciones se pueden utilizar conjuntamente con quimioterapia. Además, la inmunoterapia combinada se puede utilizar para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PTK7 unidos a RI anti-Fc-gamma o anti-CD3 se pueden utilizar conjuntamente con agentes de unión específicos de receptores de IgG o IgA.

Las composiciones (p. ej., anticuerpos humanos y productos inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión al complemento, tales como porciones de IgG1, -2 o -3 o IgM que se unen al complemento, también se pueden utilizar en presencia de complemento. En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células diana con un agente de unión de la invención y las células efectoras apropiadas se puede complementar mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de las células diana recubiertas con un agente de unión de la invención se puede mejorar mediante la unión de proteínas del complemento. En otra realización las células diana revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos) de la invención también pueden ser lisadas por el complemento. En otra realización más, las composiciones de la invención no activan el complemento.

Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos y productos inmunoconjugados) de la invención también se pueden administrar junto con el complemento. Por lo tanto, dentro del alcance de la invención se encuentran las composiciones que comprenden anticuerpos humanos y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas debido a que el complemento se encuentra en estrecha proximidad a los anticuerpos humanos. Alternativamente, los anticuerpos humanos de la invención y el complemento o suero se pueden administrar por separado.

Por consiguiente, a los pacientes tratados con composiciones de anticuerpos de la invención se les puede administrar adicionalmente (antes de, simultáneamente a o después de la administración de un anticuerpo humano de la invención) otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, lo que mejora o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos.

En otras realizaciones, el sujeto se puede tratar adicionalmente con un agente que modula, p. ej., mejora o inhibe, la expresión o la actividad de Fcγ o de los receptores de Fcγ, por ejemplo, tratando al sujeto con una citoquina. Las citoquinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), el interferón-γ (IFN-γ) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Las composiciones (p. ej., anticuerpos humanos) de la invención también se pueden utilizar para localizar células expresan FcγR o PTK7, por ejemplo para marcar tales células. Para tal uso, el agente de unión se puede conectar a una molécula que puede ser detectada. Por lo tanto, la invención proporciona métodos para localizar ex vivo o in vitro células que expresan receptores de Fc, tales como FcγR o PTK7. El marcador detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático.

También se encuentran dentro del alcance de la presente invención los kits que comprenden composiciones de anticuerpos de la invención (p. ej., anticuerpos humanos o productos inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit puede contener adicionalmente uno más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (p. ej., un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítopo en el antígeno PTK7 distinto del primer anticuerpo humano). Los kits incluyen típicamente una etiqueta que indica el uso deseado de los contenidos del kit. El término etiqueta incluye cualquier escritura, o material escrito suministrado en o con el kit, o que acompaña de otra manera el kit.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben considerar una limitación adicional.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7

Antígeno

Los protocolos de inmunización utilizaron como antígeno (i) una proteína de fusión recombinante que comprende la porción extracelular de PTK7 con una etiqueta myc e His y (ii) PTK7 completa unida a la membrana. Ambos antígenos se generaron mediante métodos de transfección recombinante en una línea celular CHO.

Ratones transgénicos HuMab y KM™

Se prepararon anticuerpos monoclonales completamente humanos contra PTK7 utilizando las cepas HCo7 y HCo12 de ratones transgénicos HuMab y la cepa KM de ratones transcromosómicos transgénicos, cada una de las cuales expresa genes de anticuerpos humanos. En cada una de estas cepas de ratón, el gen endógeno de la cadena ligera kappa de ratón ha sido alterado homocigóticamente como describen Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen endógeno de la cadena pesada de ratón ha sido alterado homocigóticamente como se describe en el Ejemplo 1 de Publicación PCT WO 01/09187. Cada una de estas cepas de ratón porta un transgén de la cadena ligera kappa humana, KCo5, como describen Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. La cepa HCo7 porta el transgén de la cadena pesada humana HCo7 como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.770.429; 5.545.806; 5.625.825; y 5.545.807. La cepa HCo72 lleva el transgen de la cadena pesada humana HCo12 como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/09187 o el ejemplo 2 del documento WO 01/14424. La cepa KM contiene el transcromosoma SC20 como se describe en la Publicación PCT WO 02/43478.

Inmunizaciones HuMab y KM:

Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos contra PTK7, se inmunizaron ratones HuMab y ratones KM™ con la proteína fusión PTK7 recombinante purificada y las células CHO transfectadas con PTK7 como antígeno. Los esquemas de inmunización general para los ratones HuMab son descritos por Lonberg, N. et al (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y la Publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad tras la primera infusión de antígeno. Se utilizaron una preparación purificada recombinante (5-50 µg) de antígeno de proteína de fusión PTK7 y 5 - 10x106 células para inmunizar los ratones HuMab y los ratones KM™ por vía intraperitoneal, por vía subcutánea (Sc) o por medio de inyección en la almohadilla de la pata.

Los ratones transgénicos se inmunizaron dos veces con antígeno en coadyuvante completo de Freund o coadyuvante de Ribi IP, seguido de 3-21 días IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en coadyuvante incompleto de Freund o coadyuvante de Ribi. La respuesta inmunitaria se controló mediante sangrías retroorbitales. El plasma se escrutó mediante ELISA (como se describe a continuación), y los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PTK7 se utilizaron para las fusiones. Los ratones se reforzaron intravenosamente con antígeno 3 días antes del sacrificio y la extirpación del bazo. Típicamente, se realizaron 10-35 fusiones para cada antígeno. Se inmunizaron varias docenas de ratones para cada antígeno.

Selección de ratones HuMab o KM™ que producen anticuerpos anti-PTK7:

Para seleccionar los ratones HuMab o KM™ que producen anticuerpos que se unen a PTK7, los sueros de ratones inmunizados se sometieron a ensayo mediante ELISA como describen Fishwild, D. et al. (1996). En resumen, se recubrieron placas de microtitulación con proteína de fusión PTK7 recombinante purificada a partir de células CHO transfectadas a 1-2 µg/ml en PBS, se incubaron a 4°C durante la noche 100 µl/pocillo, después se bloquearon con 200 µl/pocillo de suero bovino fetal al 5% en PBS/Tween (0,05%). Las diluciones de los sueros de los ratones inmunizados con PTK7 se añadieron a cada pocillo y se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y se incubaron a continuación con un anticuerpo policlonal anti- IgG humana de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se revelaron con sustrato ABTS (Sigma, A-1888, 0,22 mg/ml) y se analizaron mediante espectrofotometría a una DO de 415-495. Los ratones que desarrollaron los títulos más altos de anticuerpos anti-PTK7 se utilizaron para las fusiones. Las fusiones se realizaron como se describe a continuación y sobrenadantes de hibridoma se sometieron a ensayo para determinar la actividad anti-PTK7 mediante ELISA.

Generación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7:

Los esplenocitos de ratón, aislados de los ratones HuMab, se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón basándose en protocolos convencionales. Los hibridomas resultantes se escrutaron a continuación para determinar la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Las suspensiones de células individuales de esplenocitos de ratones inmunizados se fusionaron a una cuarta parte del número de células de mieloma de ratón no secretoras SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50% (Sigma). Las células se cultivaron en placas a aproximadamente 1x105/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de incubación durante aproximadamente dos semanas en medio selectivo que contenía suero bovino fetal al 10%, medio acondicionado P388D1 al 10% (ATCC, CRL TIB-63), Origen al 3-5% (IGEN) en DMEM (Mediatech, CRL 10013, con alto contenido de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio) más HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0,055 mM, 50 mg/ml de gentamicina y 1x HAT (Sigma, P CRL-7185). Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en un medio en el que HAT se reemplazó por HT. Los pocillos individuales se escrutaron después mediante ELISA (descrito anteriormente) para determinar los anticuerpos IgG monoclonales anti-PTK7 humana. Una vez que se produjo un amplio crecimiento del hibridoma, el medio se controló usualmente al cabo de 10-14 días. Los hibridomas que secretaban anticuerpos se volvieron a sembrar, se escrutaron de nuevo y, si todavía eran positivos para IgG humana, los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 se subclonaron al menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables se cultivaron a continuación in vitro para generar pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para una caracterización adicional.

Los clones de hibridoma 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se seleccionaron para su posterior análisis.

Ejemplo 2: Caracterización estructural de anticuerpos monoclonales humanos 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8

Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8 se obtuvieron a partir de los hibridomas 3G8, 3G8a, 4D5, 12C6, 12C6a y 7C8, respectivamente, utilizando técnicas de PCR convencionales y se secuenciaron utilizando técnicas de secuenciación de ADN convencionales.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 3G8 se muestran en la Figura 1A y en los SEC ID NO: 41 y 1, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3G8 se muestran en la Figura 1B y en los SEC ID NO: 45 y 5, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 3G8 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 3G8 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 3-30.3, un segmento D indeterminado, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. El alineamiento de la secuencia de VH de 3G8 con la secuencia de la línea germinal de VH de 3-30.3 se muestra en la Figura 5. Un análisis adicional más detallado de la secuencia de VH de 3G8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 1A y 5, y en los SEQ ID NO: 11, 15 y 19, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 3G8 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 3G8 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana de VK L15 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 1. El alineamiento de la secuencia de VL de 3G8 con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura

9. Un análisis más detallado de la secuencia de VL de 3G8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 1B y 9, y en los SEQ ID NO: 23, 29 y 35, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 3G8a se muestran en la Figura 1A y en los SEC ID NO: 41 y 1, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3G8a se muestran en la Figura 1C y en los SEC ID NO: 46 y 6, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 3G8a con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena pesada de 3G8a utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 3-30.3, un segmento D indeterminado, y un segmento de JH de la línea germinal humana JH 4b. El alineamiento de la secuencia de VH de 3G8a con la secuencia de la línea germinal de VH 3-30.3 se muestra en la Figura 5. Un análisis más detallado de la secuencia de VH de 3G8a utilizando el sistema de Kabat de determinación la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 1A y 5, y en los SEQ ID NO: 11, 15 y 19, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 3G8a con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 3G8a utiliza un segmento VL de la línea germinal humana de VK L15 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 3. El alineamiento de la secuencia de VL de 3G8a con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 9. Un análisis más detallado de la secuencia de VL de 3G8a utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 1C y 9, y en los SEQ ID NO: 24, 30 y 36, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 4D5 se muestran en la Figura 2A y en los SEQ ID NO: 42 y 2, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 4D5 se muestran en la Figura 2B y en los SEC ID NO: 47 y 7, respectivamente.

La comparación de la secuencia de la cadena pesada de inmunoglobulina de 4D5 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 4D5 utiliza un segmento VH de la línea germinal de VH humana 3-30.3, un segmento D indeterminado, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. El alineamiento de la secuencia de VH de 4D5 con la secuencia de la línea germinal VH 3-30.3 se muestra en la Figura 6. Un análisis más detallado de la secuencia de VH de 4D5 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 2A y 6, y en los SEQ ID NO: 12, 16 y 20, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 4D5 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 4D5 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana VK A10 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 5. El alineamiento de la secuencia de VL 4D5 con la secuencia de VK A10 de la línea germinal se muestra en la Figura

10. Un análisis más detallado de la secuencia de VL 4D5 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 2B y 10, y en los SEQ ID NO: 25, 31 y 37, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 12C6 se muestran en la Figura 3A y en los SEQ ID NO: 43 y 3, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6 se muestran en la Figura 3B y en los SEC ID NO: 48 y 8, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 12C6 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 12C6 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH DP44, un segmento indeterminado D, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. El alineamiento de la secuencia de VH de 12C6 con la secuencia VH DP44 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. Un análisis más detallado de la secuencia de VH de 12C6 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 3A y 7, y en los SEQ ID NO: 13, 17 y 21, respectivamente .

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 12C6 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 12C6 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana VK A27 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 2. El alineamiento de la secuencia de VL de 12C6 con la secuencia de VK A27 de la línea germinal se muestra en la Figura 11. Un análisis más detallado de la secuencia de VL de 12C6 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR llevó a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 3B y 11, y en los SEQ ID NO: 26, 32 y 38, respectivamente .

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 12C6a se muestran en la Figura 3A y en los SEQ ID NO: 43 y 3, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 12C6a se muestran en la figura 3C y en los SEC ID NO: 49 y 9, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 12C6a con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 12C6a utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH DP44, un segmento indeterminado D, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. El alineamiento de la secuencia de VH de 12C6a con la secuencia de VH DP44 de la línea germinal se muestra en la Figura 7. Un análisis más detallado de la secuencia de VH de 12C6a utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 3A y 7, y en los SEQ ID NO: 13, 17 y 21, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 12C6a con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 12C6a utiliza un segmento VL de la línea germinal humana VK L15 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 2. El alineamiento de la secuencia de VL de 12C6 con la secuencia de VK L15 de la línea germinal se muestra en la Figura 12. Un análisis más detallado de la secuencia de VL de 12C6a utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 3C y 12, y en los SEQ ID NO: 27, 33 y 39, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de 7C8 se muestran en la Figura 4A y en los SEC ID NO: 44 y 4, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 7C8 se muestran en la figura 4B y en los SEQ ID NO: 50 y 10, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena pesada de 7C8 con las secuencias de la cadena pesada de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostraron que la cadena pesada de 7C8 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 3-33, un segmento D de la línea germinal humana 3-10, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. El alineamiento de la secuencia de VH de 7C8 con la secuencia de la línea germinal VH 3-33 se muestra en la Figura 8. Un análisis más detallado de la secuencia de VH de 7C8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena pesada como se muestra en las Figuras 4A y 8, y en los SEQ ID NO: 14, 18 y 22, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de la cadena ligera de 7C8 con las secuencias de la cadena ligera de inmunoglobulina de la línea germinal humana conocidas demostró que la cadena ligera de 7C8 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana VK L6 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 3. El alineamiento de la secuencia de VL de 7C8 con la secuencia de VK L6 de la línea germinal se muestra en la Figura

13. Un análisis más detallado de la secuencia de VL de 7C8 utilizando el sistema de Kabat de determinación de la región CDR condujo a la delimitación de las regiones CDR1, CDR2 y CD3 de la cadena ligera como se muestra en las Figuras 4B y 13, y en los SEQ ID NO: 28, 34 y 40, respectivamente.

Ejemplo 3: Mutación del mAb 12C6 y uso alternativo de la línea germinal

Como se comentó en el Ejemplo 2 anterior, los anticuerpos monoclonales 12C6 y 12C6a utilizan una región variable de la cadena pesada derivada de una secuencia de la línea germinal DP-44 humana presente en el transgén HCo7 de la cepa HuMab Mouse®. Puesto que DP-44 no es una secuencia de la línea germinal que se utiliza en el repertorio de inmunoglobulina humana nativa, puede ser ventajoso mutar la secuencia de VH de 12C6 y 12C6a para reducir la inmunogenicidad potencial. Preferiblemente, se mutan uno o más residuos del marco de la secuencia de VH de 12C6 o 12C6a a uno o varios residuos presentes en el marco de una secuencia de la línea germinal de VH estructuralmente relacionados que se utiliza en el repertorio de inmunoglobulina humana nativa. Por ejemplo, la Figura 7 muestra el alineamiento de la secuencia de VH de 12C6 y 12C6a con la secuencia de la línea germinal DP44 y también con dos secuencias de la línea germinal humana estructuralmente relacionadas, VH 3-23 y VH 3-7. Teniendo en cuenta la relación de estas secuencias, se puede predecir que se puede seleccionar un anticuerpo humano que se une específicamente a PTK7 humana y que utiliza una región VH derivada de una secuencia de la línea germinal VH 3-23 o VH 3-7. Por otra parte, se pueden mutar uno o más residuos dentro de la secuencia de VH de 12C6 o 12C6a que difieren del residuo o los residuos en la posición comparable en la secuencia VH 3-23 o VH 37 con respecto al residuo o los residuos que están presentes en VH 3-23 o VH 3-7, o con respecto a una sustitución de aminoácidos conservativa de la misma.

Ejemplo 4: Caracterización de la especificidad de unión y de la cinética de unión de anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7

En este ejemplo, afinidad de unión y la cinética de unión de anticuerpos anti-PTK7 se examinaron mediante análisis de Biacore. La especificidad de unión, y la competición cruzada se analizaron mediante citometría de flujo.

Especificidad de unión mediante citometría de flujo Se desarrollaron líneas celulares HEK3 que expresan PTK7 humana recombinante en la superficie celular y se utilizaron para determinar la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos contra PTK7 mediante citometría de flujo. Las células HEK3 se transfectaron con plásmidos de expresión que contenían ADNc completo que codificaba formas transmembrana de PTK7. La unión del anticuerpo monoclonal anti-PTK7 humana 7C8 se evaluó mediante la incubación de las células transfectadas con el anticuerpo monoclonal anti-PTK7 humana a una concentración de 10 g/ml. Las células se lavaron y la unión se detectó con un Ab anti-IgG humana marcado con FITC. Los análisis de citometría de flujo se realizaron utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se representan en las Figuras 14. El anticuerpo monoclonal anti-PTK7 humana 7C8 se unió a las células HEK3 transfectadas con PTK7 pero no a las células HEK3 que no se transfectaron con PTK7 humana. Estos datos demuestran la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 para PTK7.

Especificidad de unión mediante ELISA

La unión de los anticuerpos anti-PTK7 también se evaluó mediante un ELISA convencional para examinar la especificidad de la unión para PTK7.

Se sometió a ensayo el dominio extracelular recombinante de PTK7 para determinar la unión contra los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 12C6a a diferentes concentraciones. Se llevaron a cabo los procedimientos de ELISA convencionales. Los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 se añadieron a una concentración de partida de 10 µg/ml y se diluyeron seriadamente a una dilución 1:2. Se utilizó anticuerpo policlonal anti-IgG humana (específico de cadena kappa) de cabra conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) como anticuerpo secundario. Los resultados se muestran en la Figura 15. Cada uno de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 12C6a se unieron a PTK7. Estos datos demuestran la especificidad de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 para PTK7.

Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-PTK7

Se utilizó citometría de flujo para determinar el agrupamiento de epítopos de HuMAbs anti-PTK7. Se transfectaron células del tumor de Wilms G-401 (Núm. Acc ATCC CRL-1441) con plásmidos de expresión que contenían ADNc completo que codificaba formas transmembrana de PTK7. La unión al epítopo de cada anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 se evaluó mediante la incubación de 1x105 células transfectadas con 10 µg/ml de anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 frío, se lavaron, seguido de la adición de 10 µg/ml de un anticuerpo monoclonal humano de anti-PTK7 conjugado con un compuesto fluorescente. La unión se detectó con un Ab anti-IgG humana marcado con FITC. El análisis de citometría de flujo se realizó utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Tras el análisis de los datos, los anticuerpos anti-PTK7 se han clasificado en 3 grupos de epítopos – el grupo A, que incluye 7D11, el grupo B, que incluye 3G8 y 3G8a y el grupo C, que incluye 7C8, 12C6 y 12C6a.

Ejemplo 5: Caracterización de la unión de anticuerpo anti-PTK7 a PTK7 expresado en la superficie de células cancerosas humanas

La línea celular G-401 de nefroblastoma o tumor de Wilms (Núm. Acc ATCC CRL-1441) se sometió a ensayó para determinar la unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 HuMAb 12C6 y 7C8 a diferentes concentraciones. La unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 se evaluó mediante la incubación de 1x105 células con anticuerpo a una concentración de partida de 30 µg/ml y diluyendo seriadamente el anticuerpo a una dilución 1:10. Las células se lavaron y la unión se detectó con un Ab anti-IgG humana marcado con PE. Se realizaron análisis de citometría de flujo utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la Figura 16. Los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 12C6 y 7C8 se unieron a la línea celular de nefroblastoma o tumor de Wilms de una manera dependiente de la concentración, medida por la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la tinción. Los valores de CE50 de los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 12C6 y 7C8 fue de 4,035 nM y 3,428 nM, respectivamente.

Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PTK7 se unen a líneas celulares de cáncer de riñón.

Ejemplo 6: Unión del anticuerpo anti-PTK7 humana a las líneas celulares de cáncer

Los anticuerpos anti-PTK7 se sometieron a ensayo para determinar la unión a una variedad de líneas celulares de cáncer mediante citometría de flujo.

La unión de los anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 y 12C6 a un panel de líneas celulares de cáncer se evaluó mediante la incubación de las líneas celulares de cáncer con anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 a una concentración de 10 µg/ml. Las líneas celulares de cáncer que se sometieron a ensayo fueron A-431 (Núm. Acc ATCC CRL-1555), células del tumor de Wilms G-401 (Núm. Acc ATCC CRL-1441), Saos-2 (Núm. Acc ATCC HTB-85), SKOV-3 (Núm. Acc ATCC HTB-77), PC3 (Núm. Acc ATCC CRL1435), DMS 114 (Núm. Acc ATCC CRL-2066), ACHN (Acc ATCC Núm. CRL-1611), LNCaP (Núm. Acc ATCC CRL1740), DU 145 (Núm. Acc ATCC HTB-81), LoVo (Núm. Acc ATCC CCL-229) y MIA PaCa-2 (Núm. Acc ATCC CRL1420). Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Las células se lavaron y la unión se detectó con un Ab anti-IgG humana marcado con FITC. Se realizaron análisis de citometría de flujo utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en la Figuras 17. Los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 3G8, 12C6a, 4D5 y 12C6 se unieron a las líneas celulares de cáncer A-431, células del tumor de Wilms G-401, Saos-2, SKOV-3, PC3, DMS 114, ACHN, LNCaP, DU 145, LoVo y MIA PaCa-2, según se midió mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la tinción. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PTK7 se unen a una amplia gama de células cancerosas que expresan PTK7 en la superficie de la célula.

Ejemplo 7: Unión de anti-PTK7 a células T, B y dendríticas humanas

Los anticuerpos anti-PTK7 se sometieron a ensayo para determinar la unión a células T CD4+, CD8+, células B CD19+ y células dendríticas mieloides sanguíneas humanas que expresan PTK7 en su superficie celular mediante citometría de flujo.

Las células T humanas se activaron con anticuerpo anti-CD3 para inducir la expresión de PTK7 en células T antes de la unión con un anticuerpo monoclonal anti-PTK7 humano. La unión del anticuerpo monoclonal humano anti-PTK7 7C8 se evaluó mediante la incubación de las células con anticuerpos monoclonales humanos anti-PTK7 a una concentración de 10 µg/ml. En algunos experimentos, se utilizó un anticuerpo conocido que se une a un marcador específico de células T y B como control positivo. Las células se lavaron y la unión se detectó con un Ab anti-IgG humana marcado con FITC. Se realizaron análisis de citometría de flujo utilizando una citometría de flujo FACScan (Becton Dickinson, San José, CA). Los resultados se muestran en las Figuras 18 (células T y células B humanas activadas) y 19 (células dendríticas). El anticuerpo monoclonal anti-PTK7 7C8 se unió a células T CD4+ y CD8+ humanas activadas y a células dendríticas, pero no a células B, según se midió mediante la intensidad media de fluorescencia (IMF) de la tinción. Estos datos demuestran que los HuMAbs anti-PTK7 se unen a las células T y a las células dendríticas humanas.

Ejemplo 8: Internalización del anticuerpo monoclonal anti-PTK7

Los HuMAbs anti-PTK7 se sometieron a ensayo para determinar la capacidad de internalizarse en líneas celulares que expresan PTK7 utilizando un ensayo de internalización Hum-Zap. El análisis Hum-Zap somete a ensayo la internalización de un anticuerpo humano primario a través de la unión de un anticuerpo secundario con afinidad por IgG humana conjugada a la toxina saporina.

Las líneas celulares de cáncer que expresan PTK7 de tumor de Wilms G-401 (Núm. Acc ATCC CRL-1441), A-431 (Núm. Acc ATCC CRL-1555) y PC3 (Núm. Acc ATCC CRL-1435) se sembraron a 1x104 células/pocillo en pocillos de 100 µl directamente. Los anticuerpos HuMAb anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 o 7C8 se añadieron a los pocillos a una concentración de partida de 30 nM y se titularon de forma descendente en diluciones seriadas 1:3. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo que es no específico para PTK7 como control negativo. El Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, San Diego, CA, IT-22-25) se añadió a una concentración 11 nM y las placas se dejaron incubando durante 72 horas. Las placas se sometieron a pulsos de 1,0 µCi de 3H-timidina durante 24 horas, se recogieron y se leyeron en un contador de centelleo Top Count (Packard Instruments, Meriden, CT). Los resultados se muestran en las Figuras 20A-D. Los anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 mostraron una disminución dependiente de la concentración de anticuerpo den la incorporación de 3H-timidina en las líneas celulares cancerosas de Tumor de Wilms que expresan PTK7. Los anticuerpos anti-PTK7 12C6 y 7C8 mostraron una disminución dependiente de la concentración de anticuerpo de la incorporación de 3H-timidina en las líneas celulares cancerosas que expresan PTK7 A-431 y PC3. El valor de CE50 para los anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 en las células del tumor de Wilms fue 0,6437 nM, 0,2516 nM, 0,2053 nM y 0,1788 nM, respectivamente. El valor de CE50 para los anticuerpos anti-PTK7 12C6 y 7C8 en células A-431 fue 0,1657 nM y 0,1826 nM, respectivamente. El valor de CE50 para los anticuerpos anti-PTK7 12C6 y 7C8 en células tumorales PC3 fue 0,3175 nM y 0,2648 nM, respectivamente. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 3G8, 4D5, 12C6 y 7C8 se internalizan en las células cancerosas.

Ejemplo 9: Evaluación de la destrucción celular de un anticuerpo anti-PTK7 conjugado con una toxina en líneas celulares de cáncer humano

En este ejemplo, se sometieron a ensayo anticuerpos monoclonales anti-PTK7 conjugados con una toxina para determinar la capacidad de destruir líneas celulares cancerosas humanas PTK7+ en un análisis de proliferación celular.

El anticuerpo HuMAb anti-PTK7 12C6a se conjugó con una toxina a través de un conector, tal como un conector de peptidilo, hidrazona o disulfuro. Los ejemplos de los compuestos de toxina que se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente invención se describen en el documento WO 2007/038658. La línea celular de cáncer renal humano de tumor de Wilms que expresa PTK7 G-401 (Núm. Acc. ATCC CRL-1441) se sembró a 104 células/pocillo en pocillos de 100 µl durante 3 horas. Se añadió un producto conjugado de anticuerpo anti-PTK7toxina a los pocillos a una concentración de partida 100 nM y se titulo de manera descendente a diluciones seriadas

1:03. Las placas se dejaron incubando durante 48 horas. Las placas se sometieron a pulsos de 1 µCi de 3H-timidina durante 24 horas antes de terminar el cultivo, se recogieron y se leyeron en un Contador de Centelleo Top Count (Packard Instruments). La Figura 21 muestra los efectos del producto conjugado 12C6a sobre las células de tumor de Wilms. El anticuerpo anti-PTK7 12C6a mostró una disminución dependiente de la concentración de anticuerpotoxina de la incorporación de 3H-timidina en la línea celular de cáncer renal humano de tumor de Wilms que expresa PTK7.

Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con una toxina muestran citotoxicidad específica para las células de cáncer renal humano.

Ejemplo 10: Evaluación de la destrucción celular de un anticuerpo anti-PTK7 conjugado con toxina en líneas celulares tumorales humanas

En este ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 conjugados a una toxina se sometieron a ensayo para determinar la capacidad de destruir líneas celulares tumorales humanas PTK7+ que tienen una expresión de PTK7 en la superficie celular baja, intermedia o alta en un análisis de proliferación celular.

Los anticuerpos HuMAb anti-PTK7 12C6a se conjugó con una toxina a través de un conector, tal como un conector peptidilo, hidrazona o disulfuro. Los ejemplos de compuestos de toxina que se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente invención se describen en el documento WO 2007/038658. Las líneas celulares tumorales cancerosas humanas que expresan PTK7 A-431, SKOV3 y LoVo se sembraron a 104 células/pocillo en pocillos de 100 μl. Las líneas celulares se analizaron previamente para determinar la expresión en la superficie celular de PTK7 en un análisis FACS convencional. La línea celular A-431 expresó el más alto nivel de expresión en la superficie celular de PTK7 y la línea celular LoVo expresó el nivel más bajo de expresión en la superficie celular de PTK7. Se añadió un anticuerpo anti-PTK7 conjugado con toxina a los pocillos a una concentración de partida 20 nM y se tituló de manera descendente en diluciones seriadas 1:2. Se utilizó un anticuerpo control de isotipo como control negativo. Las placas se dejaron incubando durante 3 horas y los productos conjugados de anticuerpo-toxina no unidos (libres) se eliminaron mediante lavado. Las placas se continuaron incubando durante 96 horas y se midió la actividad de destrucción (UF, unidad de fluorescencia) mediante la viabilidad celular en un análisis CellTiter-Glo® Luminiscent de acuerdo con el protocolo (Promega, WI, USA, Technical Bulletin Núm. 288) utilizando un lector BIO-TEK (Bio-Tek Instruments, Inc, VT, USA). Los resultados se muestran en la Figura 22. El producto conjugado anti-PTK7-toxina mostró una disminución dependiente de la concentración de anticuerpo-toxina en el análisis de proliferación en A431alto, SKOV3inter, y LoVobajo que expresan PTK7.

Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina muestran citotoxicidad específica para diversas células cancerosas humanas.

Ejemplo 11: Inmunohistoquímica con 3G8, 12C6a, 2E11

La capacidad de los HuMAbs anti-PTK7 3G8, 12C6a, y 2E11 para reconocer PTK7 mediante inmunohistoquímica se examinó utilizando biopsias clínicas de cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer de intestino delgado y cáncer de próstata.

Mediante inmunohistoquímica, se utilizaron secciones congeladas de 5 µm (Ardais Inc, USA). Después de secar durante 30 minutos, las secciones se fijaron con acetona (a temperatura ambiente durante 10 minutos) y se secaron al aire durante 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron en PBS y a continuación se pre-incubaron con suero normal de cabra al 10% en PBS durante 20 min y con posterioridad se incubaron con 10 µg/ml de anticuerpo tratado con fitc en PBS con suero normal de cabra al 10% durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, los portaobjetos se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 30 min con el anti-FITC (10 μg/ml DAKO) de ratón a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron de nuevo con PBS y se incubaron con producto conjugado con HRP de Cabra anti-ratón (DAKO) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron de nuevo 3 veces con PBS. Se utilizó diaminobencidina (Sigma) como sustrato, lo que dio como resultado una tinción de color pardo. Después de lavar con agua destilada, los portaobjetos se contra-tiñeron con hematoxilina durante 1 min. Posteriormente, los portaobjetos se lavaron durante 10 segundos con agua corriente destilada y se montaron en Glycergel (DAKO). La tinción inmunohistoquímica de la biopsia clínica presentó una tinción positiva en secciones de cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de vejiga, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer de ovario, cáncer del intestino delgado y de cáncer de próstata. El tejido normal fue siempre negativo en la tinción para PTK7 mientras que dentro del tejido maligno, se observó que tanto los fibroblastos activados por el tumor y las células epiteliales cancerosas eran positivos para la tinción de PTK7. La identidad de los fibroblastos activados por el tumor se confirmó en secciones de cáncer de vejiga y de cáncer de mama mediante la tinción con un anticuerpo Fibroblast Activation Protein (FAP, Alexis Biochemicals, San Diego, USA). El FAP es un marcador conocido de fibroblastos activados por el tumor (Hofheinz y col. (2003) Oncologie 26:44-48).

Ejemplo 12: Análisis de invasión

En este ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra PTK7 se sometieron a ensayo para determinar la capacidad de afectar a la invasión celular en una línea de células CHO transfectadas con PTK7. El análisis se realizó utilizando un HTS 96-Multiwell Insert System (Núm. de Cat. 351162, BD Biosciences, CA) de acuerdo con el protocolo. Se mezclaron una línea celular parental CHO, células CHO transfectadas con PTK7 completa o una línea celular HEK293 de control con una reserva de HuMAbs anti-PTK7 o con un anticuerpo de control de isotipo antes de la adición de las células a los insertos. La mezcla (células + reserva Ab) se añadió a un pocillo de inserto en la placa de invasión. Después de la incubación a 37°C con CO2 al 5% durante 24 horas, las células se marcaron con un colorante fluorescente y las células que invadieron a la parte inferior de la membrana se cuantificaron utilizando un lector de placas de fluorescencia. Los resultados se muestran en la Figura 23. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti-PTK7 inhiben la movilidad de invasión de las células que expresan PTK7 en la superficie celular.

Ejemplo 13: Tratamiento del modelo de xenoinjertos de células de cáncer de páncreas in vivo utilizando anticuerpos anti-PTK7 desnudos y conjugados con citotoxina

Este Ejemplo describe el tratamiento in vivo de los ratones a los que se habían implantado un tumor de carcinoma de células de páncreas con anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos sobre el crecimiento del tumor.

Se expandieron in vitro HPAC (adenocarcinoma de páncreas humano, Número de Acceso ATCC CRL-2119) u otras células de cáncer de páncreas adecuadas utilizando procedimientos convencionales de laboratorio. A ratones Ncr macho atímicos carentes de sistema inmunitario (Taconic, Hudson, NY) de entre 6-8 semanas de edad se les implantaron subcutáneamente en el flanco derecho 2,5 x106 células HPAC en 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratón. Los ratones se pesaron y se midieron los tumores tridimensionalmente utilizando un calibre electrónico dos veces por semana después de la implantación. Los volúmenes de los tumores se calcularon como la altura x anchura x longitud/2. Los ratones con tumores HPAC con un promedio de 90 mm3 se asignaron al azar a grupos de tratamiento. A los ratones se les administró una dosis única intravenosa de vehículo PBS, anticuerpo anti-PTK7 desnudo o HuMab anti-PTK7 conjugado con toxina el Día 0 a la dosis indicada (µmol/kg). Los ejemplos de los compuestos de toxina que se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente invención se describieron en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2006/0024317 A1. Se controló el crecimiento del tumor en los ratones durante 61 días después de la dosificación. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores alcanzaron el punto final del tumor (2.000 mm3) o se ulceraron. Los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con una toxina ralentizaron la progresión del crecimiento tumoral. Los resultados se muestran en la Figura 24. El efecto antitumoral del producto conjugado de anti-PTK7-toxina era dependiente de la dosis, observándose el mayor efecto a una dosis de 0,3 µmol/kg. El tratamiento con producto conjugado de anti-PTK7-toxina fue bien tolerado, sin experimentar los sujetos una pérdida de peso corporal mayor del 5% de la media (datos no mostrados). Por lo tanto, el tratamiento con un producto conjugado de anticuerpo anti-PTK7-toxina tiene un efecto inhibidor in vivo directo sobre el crecimiento del tumor de cáncer de páncreas.

Ejemplo 14: Tratamiento del modelo de xenoinjerto de células de cáncer de mama in vivo utilizando anticuerpos anti-PTK7 desnudos y conjugados con citotoxina

Este Ejemplo describe el tratamiento in vivo de ratones a los que se había implantado un tumor de carcinoma de mama con resistencia a adriamicina con anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos sobre el crecimiento del tumor.

Se expandieron in vitro MCF7-adr (línea de células de cáncer de mama humana resistente a adriamicina) utilizando procedimientos de laboratorio convencionales. A ratones CB.17SCID hembra (Taconic, Hudson, NY) de entre 6 y 8 semanas de edad se les implantaron subcutáneamente gránulos de estrógeno de liberación en 90 días de 1,7 mg, de 3,0 mm de tamaño (Innovative Research of America, Sarasota, FL) en la región del cuello un día antes de implantarles subcutáneamente en el flanco derecho 10 x 106 células MCF7-Adr en 0,2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratón. Se midieron y se pesaron los tumores de los ratones tridimensionalmente utilizando un calibre electrónico dos veces a la semana después del implante. Los volúmenes de los tumores se calcularon como la altura x anchura x longitud/2. Los ratones con tumores MCF7-adr con un promedio de 160 mm3 se asignaron al azar a grupos de tratamiento. A los ratones se les administró una dosis única intravenosa de 0,1 µmol/kg de vehículo PBS, anticuerpo anti-PTK7 desnudo o HuMab anti-PTK7 conjugado con toxina el Día 0. Los ejemplos de los compuestos de toxina que se pueden conjugar con los anticuerpos de la presente invención se describieron en la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. 2006/0024317 A1. Se controló el crecimiento del tumor en los ratones durante 63 días después de la dosificación. Los ratones se sacrificaron cuando los tumores se ulceraron.

Los resultados se muestran en la Figura 25. Los anticuerpos anti-PTK7 conjugados con toxina ralentizaron la progresión del crecimiento tumoral. De este modo, el tratamiento con un producto conjugado de anticuerpo antiPTK7-toxina tuvo un efecto inhibidor in vivo directo sobre el crecimiento tumoral del cáncer de mama.

SEQ ID NO:: SECUENCIA SEQ ID NO: SECUENCIA

1: a.a. VH 3G8, 3G8a 23 a.a. CDR1 VK 3G8

2: a.a. VH 4D5 24 a.a. CDR1 VK 3G8a

3: a.a. VH 12C6, 12C6a 25 a.a. CDR1 VK 4D5

4: a.a. VH 7C8 26 a.a. CDR1 VK 12C6

27: a.a. CDR1 VK 12C6a

5: a.a. VK 3G8 28 a.a. CDR1 VK 7C8

6: a.a. VK 3G8a

7: a.a. VK 4D5 29 a.a. CDR2 VK 3G8

8: a.a. VK 12C6 30 a.a. CDR2 VK 3G8a

9: a.a. VK 12C6a 31 a.a. CDR2 VK 4D5

10: a.a. VK 7C8 32 a.a. CDR2 VK 12C6

33: a.a. CDR2 VK 12C6a

11: a.a. CDR1 VH 3G8 34 a.a. CDR2 VK 7C8

12: a.a. CDR1 VH 4D5

13: a.a. CDR1 VH 12C6 35 a.a. CDR3 VK 3G8

14: a.a. CDR1 VH 7C8 36 a.a. CDR3 VK 3G8a

37: a.a. CDR3 VK 4D5

15: a.a. CDR2 VH 3G8 38 a.a. CDR3 VK 12C6

16: a.a. CDR2 VH 4D5 39 a.a. CDR3 VK 12C6a

17: a.a. CDR2 VH 12C6 40 a.a. CDR3 VK 7C8

18: a.a. CDR2 VH 7C8

41: n.t. VH 3G8, 3G8a

19: a.a. CDR3 VH 3G8 42 n.t. VH 4D5

20: a.a. CDR3 VH 4D5 43 n.t. VH 12C6, 12C6a

21: a.a. CDR3 VH 12C6 44 n.t. VH 7C8

22: a.a. CDR3 VH 7C8

45: n.t. VK 3G8 51 a.a. de la línea germinal 3-30.3 VH

46: n.t. VK 3G8a 52 a.a. de la línea germinal DP44 VH

47: n.t. VK 4D5 53 a.a. de la línea germinal 3-33 VH

48: n.t. VK 12C6

49: n.t. VK 12C6a 54 a.a. de la línea germinal L15 VK

50: n.t. VK 7C8 55 a.a. de la línea germinal A10 VK

56: a.a. de la línea germinal A27 VK

57: a.a. de la línea germinal L6 VK

SEQ ID NO:: SECUENCIA SEQ ID NO: SECUENCIA

58: a.a. PTK7

59: a.a. de la línea germinal JH4b

60: a.a. de la línea germinal JH4b

61: a.a. de la línea germinal 3-7

62: a.a. de la línea germinal 3-23

63: a.a. de la línea germinal JH4b

64: a.a. de la línea germinal JH6b

65: a.a. de la línea germinal JK1

66: a.a. de la línea germinal JK5

67: a.a. de la línea germinal JK2

68: a.a. de la línea germinal JK2

69: a.a. de la línea germinal JK3

LISTA DE SECUENCIA

<110> MEDAREX, INC.

5 <120> ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS CONTRA LA PROTEÍNA TIROSINA QUINASA 7 (PTK7) Y MÉTODOS PARA LA UTILIZACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ANTI-PTK7

<130> MXI-345PC

<140>

<141> 10 <150> 60/748,373

<151> 2005-12-08

<160> 69

<170> PatentIn Ver. 3.3

<210> 1 15 <211> 116

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 3

<211> 112

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4 10 <211> 126

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 107

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<213> Homo sapiens

<400> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

<210> 13

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 13

<210> 14

<211> 5

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 16

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 6

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 17

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 35 <210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 10

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 348

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(348)

<400> 41

<210> 42

<211> 345

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(345)

<400> 42

<210> 43

<213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (1)..(336)

<400> 43

<210> 44

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(378) 15 <400> 44

<210> 45

<211> 321

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 45

<210> 46

<211> 321

<212> ADN

<213> Homo sapiens 10 <220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 46

<210> 47

<211> 321

<212> ADN 20 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321)

<400> 47

<210> 48

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(327) 10 <400> 48

<210> 49

<211> 321

<212> ADN 15 <213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(321).

<400> 49 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(324)

<400> 50

15 <210> 51

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 51

<210> 52

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 52

10 <210> 53

<211> 98

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 53

<210> 54

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 54

<210> 55

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 55

10 <210> 56

<211> 96

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 56

<210> 57

<211> 95

<212> PRT

<213> Homo sapiens 20 <400> 57

<210> 58

<211> 1070

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 58

<210> 59

<211> 13

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 59

10 <210> 60

<211> 15

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 60

<210> 61

<211> 97

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 61

<210> 62

<211> 97

<212> PRT 10 <213> Homo sapiens

<400> 62

<210> 63

<213> Homo sapiens

<400> 63

<210> 64 20 <211> 18

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 64

25 <210> 65

<211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 65

<210> 66

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 66

<210> 67

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 67

<210> 68

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 68

<210> 69

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 69

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado, o una porción de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo:

(a)

se une específicamente a PTK7 humana; y

(b)

se une a la línea celular tumoral de Wilms que tiene el Núm. de Acc. ATCC CRL-1441 con una CE50 de 4,0 nM o menos, en un análisis que comprende la incubación de 1 x 105 células con el anticuerpo a una concentración de partida de 30 μg/ml y la dilución seriada del anticuerpo a una dilución 1:10, y

(c)

se une al mismo epítopo en PTK7 humana como un anticuerpo de referencia que comprende:

(i)

una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 7; o

(ii)

una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8; o

(iii) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10.
2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es:

(a)

un anticuerpo completo de un isotipo IgG1 o IgG4; o

(b)

un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo de cadena sencilla.
3.

El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo se une a células de tumor de Wilms con una CE50 de 3,5 nM o menos.
4.

El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a)

una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 12; una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 16; una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 20; una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 25; una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 31; y una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 37; o

(b)

una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 14; una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 18; una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 22; una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 28; una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 34; y una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 40; o

(c)

una región variable de la cadena pesada CDR1que comprende el SEQ ID NO: 13; una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 17; una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 21; una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende el SEQ ID NO: 26; una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende el SEQ ID NO: 32; y una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende el SEQ ID NO: 38.
5.

El anticuerpo, o porción de unión al antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende:

(a)

una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:7; o

(b)

una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:4 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10; o

(c)

una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 3 y una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8.
6.

Un producto inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, conectados a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo.
7.

Una composición que comprende el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o el producto inmunoconjugado de la reivindicación 6 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8.

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8. 5
10.

Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.
11.

Un método in vitro para la preparación de un anticuerpo anti-PTK7 que comprende expresar el anticuerpo en la

célula anfitriona de la reivindicación 10 y aislar el anticuerpo de la célula anfitriona. 10
12. El anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para uso en un método de tratamiento o prevención de un cáncer caracterizado por el crecimiento de células tumorales que expresan PTK7.

15 13. El anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 12, en el que el cáncer se selecciona entre cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, melanoma, leucemia mieloide aguda, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de ovario y cáncer de próstata.