BRPI0619728A2

BRPI0619728A2 - método de preparação de um concentrado de fator h e utilização deste concentrado de fator h a tìtulo de medicamento

Info

Publication number: BRPI0619728A2
Application number: BRPI0619728-0A
Authority: BR
Inventors: Sami Chtourou; Claudine Mazurier; Michel Poulle; Bernadette Cauvin; Frederic Dhainault
Original assignee: Fractionnement Et Des Biot Echnologies Lab Franc
Priority date: 2005-12-07
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2011-10-11
Also published as: AU2006323849B2; FR2894145B1; AU2006323849A1; KR20080091441A; FR2894145A1; JP2009518368A; CN102988958A; CA2633102A1; IL191931A0; WO2007066017A3; EP1962885A2; CN101336111A; US20080318841A1; JP2012211189A; WO2007066017A2

Abstract

MéTODO DE PREPARAçãO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H E UTILIZAçãO DESTE CONCENTRADO DE FATOR H A TìTULO DE MEDICAMENTO. A invenção trata da utilização do fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU), um procedimento de purificação do Fator H a partir de plasma fresco congelado e o concentrado de fator H obtido por este concentrado.

Description

MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H E UTILIZAÇÃO DESTE CONCENTRADO DE FATOR H A TÍTULO DE

MEDICAMENTO

A invenção trata da utilização de Fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU)1 um procedimento de purificação do fator H a partir de plasma fresco congelado e o fator H obtido por este procedimento.

ATRIBUIÇÃO DA INVENÇÃO

A síndrome hemolítico-urêmica (SHU) é definida pela associação de uma anemia hemolítica microangiopática, de uma trombopenia e de uma crise real. Ela é a principal causa das insuficiências renais agudas na criança com menos de três anos. Há duas formas de SHU.

Em sua forma típica, a SHU surge durante o período de verão após um episódio de diarréia, freqüentemente sangrenta. A SHU típica é secundária a uma infecção, na maioria dos casos uma infecção com Escherichia coli enteropatogênica, particularmente o sorotipo 0157:H7, produtor de verotoxinas.

Ao lado da forma típica, certos pacientes têm uma apresentação diferente. As formas atípicas de SHU se apresentam sem pródromos e têm uma evolução mais crônica acabando, freqüentemente, em uma insuficiência renal crônica. A SHU atípica pode surgir a qualquer idade. Ela representa somente 5% dos casos de SHU na criança. Os sinais clínicos da síndrome são devidos ao desenvolvimento de micropedras ricas em plaquetas nos pequenos vasos. Esta afeta, particularmente, os glomérulos do rim causando uma crise renal aguda. A SHU atípica poder ser esporádica, mas é, freqüentemente, familiar. Nestas duas situações, a doença apresenta geralmente um desenvolvimento recorrente pela eliminação. Seu prognóstico é fácil. Além disso, há um risco elevado de reincidência da doença após uma transplantação renal, levando à rejeição do transplante na maioria dos casos. A SHU pode ser associada a uma hipocomplementemia. O complemento faz o papel essencial na defesa do organismo contra agentes infecciosos e no processo inflamatório.

Ele compreende, às vezes, proteínas plasmáticas, numerosos receptores celulares de superfície diferentes, alguns presentes nas células inflamatórias e outros nas células do sistema imunitário, assim como proteínas membranáceas de regulagem que protegem as células hospedeiras de um auto-ataque. As proteínas plasmáticas do complemento são cerca de 20 e funcionam tanto como enzimas, como proteínas de ligação quanto reguladores (inibidores ou ativadores). O complemento pode ser ativado por duas vias diferentes: a via clássica e a via alternativa.

via clássica

<formula>formula see original document page 3</formula>

<table>table see original document page 3</column></row><table> A via clássica é ativada pela ligação dos anticorpos a partícula estranha. Portanto, ela é dependente dos anticorpos.

A via alternativa é ativada pela invasão de micro-organismos, da qual ela é independente dos anticorpos e extremamente importante na defesa da hospedagem contra infecções bacterianas.

O fator H é uma proteína de 155 kDa encontrada no plasma com uma concentração de 110-615 Mg/ml. Ele é sintetizado no fígado, os macrófagos, os fibroblastos, as células endoteliais e as plaquetas. A forma segregada da proteína é composta de 20 unidades repetitivas de 60 aminoácidos. O fator H é o regulador central da via alternativa do complemento. Ele participa da regulagem da taxa de complexos imunes no sangue e, por conseqüência, ao equilíbrio entre os processos resultando em suas gerações ou em suas degradações.

Com o fator I, o fator H inativa as moléculas de C3b livres ou ligadas à superfície das células. Assim, os conjuntos imunes compostos de um complexo antígeno- anticorpos junto ao composto do complemento C3b não podem mais ativar a série subseqüente do complemento (compostos C5-C9). A função do Fator H pode se decompor em três atividades principais:

1) o Fator H comporta-se, primeiramente, como um co-fator do fator I. Assim, o Fator Heo Fator I procedem à transformação da proteína C3b do complemento em C3b, (molécula inativa) por uma divisão da cadeia da proteína C3b. A proteína C3b, assim inativada, não pode mais, então, cumprir seu papel no funcionamento do complemento, e não participa mais na formação da C3 convertase;

2) o Fator H é implicado nos mecanismos de fixação às células endoteliais e às plaquetas sangüíneas;

3) o Fator H é, enfim, implicado na dissociação da C3 convertase pré-formada (C3bBb), na via alternativa da ativação do complemento. Este última atividade depende diretamente da integridade molecular do Fator H1 e revela-se particularmente mais dependente da presença de uma ligação asn323-asn324 intacta no Fator H.

O déficit ou a ausência do Fator H, responsáveis por numerosos casos de SHU atípica, conduzem consequentemente a uma hiper-ativação do complemento, traduzindo-se, em alguns pacientes, por uma observação de depósitos de proteínas C3 na ocasião de biópsias renais, e por uma diminuição da taxa de proteínas C3 presente na circulação.

Em alguns pacientes atingidos por SHU atípica, a baixa taxa de C3 é observada somente durante a fase aguda da doença. Fortes argumentos defendem favoravelmente o papel de um déficit qualitativo e quantitativo no Fator H freqüentemente associado a uma baixa da taxa de C3, na patogenia de algumas SHU atípicas (Rougier N, Kazatchkine MD, et al., Human complement factor H deficiency associated with hemolytic uremic syndrome, J. Am. Soe. Nephrol. 1998; 9:2318-2326).

O déficit no Fator H é responsável por uma ativação permanente da via alternada do complemento responsável de uma taxa baixa de C3.

Uma ligação entre a SHU atípica e uma região codificando para as proteínas reguladoras do complemento, em particular o fator H, situada no cromossomo 1, foi demonstrada (Noris et al., Hypocomplementemia discloses genetic predisposition to haemolytic uraemic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura: role of factor H abnormalities, J. Am. Soc Nephrol. 1999; 10:281-293); (Warwicker et ali., Genetic studies into haemolytic uraemic syndrome, Kidney Int, 1998; 53:836-844; (Warwicker et ali., Familial relapsing haemolytic uraemic syndrome and complement factor H deficiency, Nephrol Dial Transplant 1999; 14:1229-1233). Mutações do gene do fator H foram em seguida identificadas nas formas familiares de SHU com uma transmissão autossômica recessiva ou dominante (Buddles et al.; Complement factor H gene mutatíon associated with autosomal recessive atypical haemolytic uraemic syndrome, Am J Hum Genet, 2000; 66:1721-1722); (Caprioli et ali., The molecular basis of familial haemolytic uraemic syndrome: mutation analysis of factor H gene reveals a hot spot in short consensus repeat 20, J Am Soc Nephrol 2001; 12:297-307); (Ohali et ali., Hypocomplementemic autosomal recessive haemolytic uraemic syndrome with de creased factor H, Pediatric Nephrol 1998; 12:619-624); (Ying et al., Complement factor H gene mutation associated with autosomal recessive atypical haemolytic uremic syndrome, AM J Hum Genet 1999; 65:1538-1546).

A reincidência após a transplantação nos pacientes apresentando uma forma atípica de SHU é observada em cerca de 25% dos casos. O prognóstico no caso de reincidência é ruim; a perda do transplante em relação à reincidência é a regra.

ARTE ANTERIOR

O tratamento de primeira intenção, consistindo em duas perfusões de plasma fresco congelado com ou sem trocas plasmáticas, foi empreendido empiricamente nos anos 70, muito antes que se conhecesse o papel do complemento numa SHU. Hoje, as perfusões de plasma fresco congelado com ou sem trocas plasmáticas servem de base à terapia da SHU. No entanto, as qualidades e a freqüência das perfusões de plasma fresco congelado são ainda determinadas de maneira empírica. Estas perfusões devem ser repetidas com intervalos regulares de duas vezes por semana e duas vezes ao mês, cada perfusão leva de 2 a 3 horas. Este tratamento é, portanto, longo e repetitivo para o paciente. As qualidades de plasma fresco congelado transfundido são importantes, o que aumenta os riscos clássicos de uma perfusão de plasma fresco congelado. Primeiramente, a plasma fresco congelado (PFC) contém hemolisinas anti-A ou anti- B e deve ser reservado aos doentes do mesmo grupo ABO, ou ao menos, aos doentes desprovidos de antígenos A ou B correspondendo às hemolisinas (regra de compatibilidade inversa daquela dos glóbulos vermelhos). O não respeito destas regras expõe o recebedor a uma hemolisina pós-transfusicional dos glóbulos vermelhos por incompatibilidade ABO).

Por outro lado, com o objetivo de evitar todo o risco de aloimunização diante do antígeno D do sistema rhesus, é necessário, sobretudo nas doenças de risco (garotas mulheres em idade de procriação, multitransfusionadas), realizar perfusões em que doentes e doadores possuem as mesmas características no nível deste antígeno.

Depois, o PFC pode conduzir uma hiperfosfatomia nos pacientes com SHU porque a concentração em fosfato no PFC1 particularmente o plasma vírus atenuado (PVA)1 é muito elevado (9 a 12 mmol/L) e o paciente com SHU sofre de uma insuficiência renal. A concentração elevada de fosfato do PVA é suscetível para conduzir nos pacientes transfusionados com PVA uma hiperfosfatomia, mais importantes que:

- os volumes de PVA transfusionados são importantes;

- são repetidos de maneira jornaleira;

- pré-existe no paciente uma insuficiência renal;

- pré-existe no paciente uma hiperfosfatomia.

Em seguida, as quantidades de PFC perfuradas podem conduzir a uma sobrecarga protéica e/ou a uma sobrecarga em citrato que reduz a concentração de cálcio circulante. Enfim, o PFC conduz a um risco de alergias, assim como de transmissão de agentes infecciosos. De fato, os métodos de detecção e inativação atuais não apresentam sempre uma sensibilidade e uma capacidade suficientes para permitir a detecção e a eliminação dos agentes infecciosos potencialmente presentes no plasma fresco congelado.

A associação de trocas plasmáticas nas perfusões de plasma fresco congelado impõe-se quando os volumes perfurados são muito importantes para serem eliminados pela diurese e para manter uma pressão arterial normal. Esta associação apresenta riscos suplementares significativos, para a maioria, devidos ao acesso vascular (necessidade de uma via central), na sobrecarga volúmica, na reação anafilática, nos problemas de coagulação e na transmissão de doenças virais. Além disso, as trocas plasmáticas são difíceis de realizar em crianças. Outro tratamento consiste em uma transplantação renal. No entanto, o risco de reincidência após esta é muito elevado. Além do mais, o diagnóstico depois da transplantação renal nos pacientes SHUa (SHUa atípica) poder ser difícil. É difícil de fazer a diferença entre uma reincidência e uma rejeição vascular aguda ou uma rejeição crônica em uma biópsia do transplantado.

O tratamento da reincidência consiste em perfusões de plasma fresco congelado, em trocas plasmáticas com ou sem perfusão de plasma com resultados muito inconstantes. Estes resultados inconstantes podem ser explicados pelo número e o volume de perfusões da PFC, cada perfusão representando um pool de doações de vários doadores e não um lote homogêneo.

Como o Fator H é sintetizado no fígado, parece lógico propor uma transplantação hepática, até mesmo uma transplantação combinada fígado-rim. Esta transplantação é sempre uma escolha difícil para os médicos e os pacientes e apresenta os riscos operatórios e de rejeição de toda transplantação hepática.

RESUMO DA INVENÇÃO

Para amenizar estes inconvenientes da arte anterior, o requerente observou de maneira surpreendente que é possível utilizar o Fato H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da SHU.

O fator H1 por exemplo, sob a forma de um concentrado de fator H a partir de plasma fresco congelado, permite restaurar a deficiência em fator H nos pacientes atingidos pela SHU diminuindo os volumes injetados e os tempos de injeção com um produto eficaz, estável e seguro.

Particularmente, a administração do fator H no período imediato pós-transplantação hepática permite amenizar a produção fraca de fator H pelo fígado transplantado, e assim à recaída imediata e à rejeição do transplante.

A presente invenção trata igualmente de um procedimento de purificação do fator H que compreende as seguintes etapas:

1) preparar o sobrenadante de um crioprecipitado do plasma;

2) submeter este sobrenadante a uma cromatografia em gel/resina de tipo aquecedor de ânions;

3) submeter a fração não retida a uma cromatografia em um (a) gel/resina comportando um Iigante transplantado de tipo heparina;

4) ajustar o ph da fabricação não retida após a cromatografia da etapa 3 para permitir a ligação do Fator H a um(a) gel/resina de suporte cromatográfico comportando um Iigante transplantado de tipo heparina;

5) eluir o fator H por um tampão de força iônica superior àquela do tampão de equilibro do gel/da resina; 6) diluir a fração eluída, depois submetê-la a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte;

7) eluir o fator H por um tampão de força iônica superior àquela do tampão de equilíbrio do gel/da resina;

8) diluir a fração eluída, depois submetê-la a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de ânions de tipo ácido forte;

9) lavar o gel/a resina e eluir o fator H;

10) preparar um concentrado de fator H. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Figuras:

Figura 1: esquema do procedimento de purificação do fator H. Figura 2: dissociação da C3 convertase pelo fator H.

O objeto principal da presente invenção é a utilização do fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU)1 em particular, de sua forma típica ou atípica.

Uma forma preferida da invenção é a utilização do Fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica, o Fator H é purificado a partir de plasma fresco humano ou de frações plasmáticas vindas de uma purificação por procedimentos clássicos bem conhecidos pelo profissional da área.

Esta purificação é bem conhecida pelo profissional da área. Ele pode se dar por cromatografia utilizando uma coluna de lisina-sefarose, QAE-sefadex, DEAE- Toyopearl, Sephacryl S-300 e hidroxiapatite.

Esta é detalhada nos seguintes documentos: Fearon, J Immunol1 119, 1248-1252 (1977); Crossley et ali.; Biochem J, 191, 173-182 (1980), Nagasawa et ali.; J Immunol, 125, 578-582, (1980); Weiler et ali.; Ρ. Ν. A. S., 73, 3268-3272, (1976) e Whaleyetali.; J Exp Med, 144, 1147-1163 (1976).

O fato H resultante de uma purificação a partir de plasma fresco congelado encontra-se, por exemplo, sob a forma de um concentrado de fator H. Outro modo de realização da invenção é a utilização do Fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica, o Fator H sendo obtido por gênio genético, pela expressão de seu gene numa célula escolhida em um grupo composto de bactérias, leveduras, fungos ou de células de mamíferos.

Um modo de realização particular da invenção consiste na utilização do Fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico- Urêmica, o medicamento assim obtido sob forma liofilizada.

Um modo suplementar de realização da invenção consiste na utilização do Fator H para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica, o medicamento assim tendo sofrido, ao menos, um método de eliminação ou de inativação de ao menos um agente infeccioso.

Entre os agentes infecciosos, podemos citar os vírus e os ATNC (agentes transmissíveis não convencionais) como a proteína príon.

O medicamento pode ser particularmente inativado de maneira viral.

Entende-se por "inativado de maneira viral" que o medicamento sofreu, ao menos, um método de inativação viral conhecido pelo profissional da área por tratamento com produtos químicos, por exemplo, solvente/detergente, e/ou o calor, por exemplo, por aquecimento a seco ou pasteurização, e/ou pela nanofiltração.

Os vírus suscetíveis de serem inativados por um destes métodos compreendem: os vírus da síndrome de imunodeficiência adquirida (HIV), o vírus da hepatite A (VHA), o vírus da hepatite B (VBH)1 o parvovírus B19, o citomegalovírus (CMV), o porcine parvovírus, o poliovírus, o vírus da diarréia viral bovina (BVDV)1 etc.

Outro objeto da invenção é uma composição farmacêutica Iiofilizada e inativada de maneira viral, por exemplo, como descrito acima, e que compreende o fator H e seus excipientes e ou veículos farmacêuticos aceitáveis.

Outro objeto da presente invenção trata de um procedimento de purificação do Fator H que compreende as etapas que consistem em:

1) preparar o sobrenadante de um crioprecipitado do plasma;

5) eluir o fator H por um tampão de força iônica superior àquela do tampão de equilibro do gel/da resina;

6) diluir a fração eluída, depois submetê-la a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte;

9) lavar o gel/a resina e eluir o fator H; 10) preparar um concentrado de fator H. Em um modo de realização particular da invenção, o suporte cromatográfico sobre o qual é transplantado um Iigante Heparina da etapa 3) é um (a) gel/resina Heparina Sefarose.

Em um modo de realização particular da invenção, o suporte cromatográfico sobre o qual é transplantado um Iigante Heparina da etapa 4) é um (a) gel/resina Heparina Sefarose.

Em um modo de realização particular da invenção, a cromatografia em gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte da etapa 6) é uma cromatografia de tipo SP Sefarose.

Em um modo de realização particular da invenção, a cromatografia em gel/resina de tipo aquecedor de ânions de tipo ácido forte da etapa 8) é uma cromatografia de tipo Q Sefarose FF ou equivalente.

Vantajosamente, o ph da fabricação não retido da etapa 4) é ajustado para ser incluído na série que vai de ph 5,5 a ph 6,5 e, de preferência, para ser igual a ph 6,0. Vantajosamente, o ph da fração diluída na etapa 8) é ajustado para ser incluído na série que vai de ph 6,5 a 7,5.

O procedimento de purificação da invenção é o único procedimento conhecido de purificação de um fator H vindo do plasma que se revela industrializável, e que permite obter um concentrado de fator H purificado na ausência de inibidores de protéases químicas ou sintéticas, não deixando, portanto, subsistir nenhum traço destes inibidores no produto final.

De fato, os procedimentos de purificação do fator H a partir de plasma humano conhecidos do estado da técnica são postos em prática numa ótica de pesquisa fundamental, utilizando, às vezes, técnicas de purificação por precipitação (exemplo PEG, sulfato de amônia) dificilmente industrializáveis, e inibidores de protéases. Estes inibidores de protéases impedem a ação das proteínas de tipo tripsina, presentes no soro e no plasma, que são responsáveis pela divisão da ligação protéica alcançando os aminoácidos asn323 e asn324 da molécula do Fator H. Consequentemente, o acréscimo de inibidores de protéases contribui à diminuição da proteólise deste fator e melhora, desta maneira, sua estabilidade. No entanto, os inibidores de protéases são freqüentemente compostos altamente tóxicos, o que os torna inadaptáveis a um procedimento industrial de produção de um fator H destinado a uma utilização terapêutica.

Por outro lado, o procedimento da invenção apresenta uma vantagem significativa porque ele permite obter um concentrado de fator H no qual os 3 tipos de atividades principais são conservadas, o que nenhum dos fatores H descritos no estado da técnica possui. O fator H obtido pelo procedimento da invenção pode, portanto, preencher sua' atividade de regulador central da via alternativa do complemento, uma atividade que se revela deficiente nos pacientes atingidos pela SHU, e notavelmente pela SHU atípica. Particularmente, o fator H produzido pelo procedimento da invenção conserva sua atividade de dissociação da C3 convertase pré-formada na via alternativa do complemento e se revela suscetível de ser utilizado no tratamento da SHU graças à sua atividade funcional completa. O concentrado de Fator H obtido pelo procedimento da invenção possui, além disso, uma atividade específica próxima de 1 (AS=0.8 a 0.9), o que o torna mais eficaz do que uma solução de plasma fresco congelado (AS=0.008) que, mesmo que terapeuticamente eficaz, comporta numerosas desvantagens, assim como foi descrito na introdução do presente pedido.

Entre estas desvantagens, a administração de plasma introduz no organismo proteínas suplementares inúteis para o tratamento da SHU (albumina, fibrinogênio...) que podem, no caso contrário, desencadear reações indesejáveis ligadas a uma sobrecarga protéica ou provocar reações alérgicas, conhecidas com o nome de "doença sérica".

Enfim, a inativação de vírus transmissíveis presentes no plasma se revela geralmente mais difícil e com menos performance que àquela posta para inativar os vírus presentes nos derivados sangüíneos. O concentrado de Fator H obtido pelo procedimento da invenção pode, portanto, beneficiar tratamentos reconhecidos e aprovados trazendo segurança viral documentada.

Exemplos

Exemplo 1: procedimento de purificação do Fator H

O procedimento realizado para purificar o Fator H é representado sob a forma de esquema na figura 1.

O plasma humano fresco congelado é descongelado em uma temperatura entre 1o C e 6° C, e o sobrenadante plasmático do crioprecipitado é separado da fração insolúvel do crioprecipitado por centrifugação.

O sobrenadante plasmático do crioprecipitado obtido, do qual concentração em fator H é incluída na série que vai de 400 a, aproximadamente, 550 mg de Fator H/litro, é submetido a uma cromatografia em resina/gel de tipo aquecedor de ânions (por exemplo, um(a) gel/resina de tipo DEAE sefadex), a fim de separar os fatores dependentes da vitamina K do sobrenadante plasmático por retenção destes Fatores na resina/no gel.

A fração de sobrenadante plasmático não retida (fração A), em que a concentração em fator H é incluída em uma série que vai de 400 a, aproximadamente, 500 mg de fator H/litro é a seguir submetida a uma cromatrografia de afinidade em um (a) gel/resina de tipo Heparina Sefarose FF, afim de separar a antitrombina Ill desta fração A, por retenção da antitrombina Ill na resina/no gel.

O ph da fração A não retida (fração B), em que a concentração e fator H é incluída numa série que vai de 300 a, aproximadamente, 400 mg de Fator H/litro, é ajustado para ser incluído numa série que vai de ph 5,5 a ph 6,5, e, de preferência, para ser igual a ph 6,0.

A fração B, em que o ph foi ajustado, é submetida a uma cromatografia em um segundo gel/resina de tipo Heparina Sefarose FF ou em outro suporte cromatográfico que comporta Iigantes transplantados de tipo Heparina. A maior parte das proteínas contidas na fração plasmática B são então eluídas com o filtrado de cromctografia. As proteínas levemente adsorvidas no gel/resina são eliminadas por uma série de lavagens e por pré-separação. O fator H retido no gel/resina é em seguida separado utilizando um tampão apresentando uma força iônica superior àquela do tampão utilizado para equilibrar o gel/a resina.

A fração eluída contendo o Fator H (Fração C) é diluída, depois submetida a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte, por exemplo, um(a) gel/resina de tipo SP Sefarose FF ou equivalente. As proteínas levemente adsorvidas no gel/resina são eliminadas por uma série de lavagens e de pré-separações.

O fato H retido no gel/resina é em seguida separado utilizando um tampão apresentando uma força iônica superior àquela do tampão utilizado para equilibrar o gel/a resina.

A fração eluída contendo o Fator H (Fração D) é então submetida a uma etapa de inativação viral através do tratamento por um solvente de tipo detergente, por exemplo, o polisorbato 80 e o TnBP. Este tratamento permite ativar de maneira eficaz os vírus, e particularmente, os vírus de tipo vírus envelopados. A Fração D é, em seguida, diluída, e o ph desta fração é ajustado para ser incluído numa.série que vai de ph 6,5 a PH 7,5. A fração D é, em seguida, submetida a uma cromatografia em um(a) gel/resina de tipo aquecedor de ânions de tipo ácido forte, por exemplo um(a) gel/resina de tipo Q Sefarose FF ou um equivalente. Após uma série de lavagens, o Fator H retido no gel/resina é separado utilizando um tampão representando uma força iônica superior àquela do tampão utilizado para equilibrar o gel/a resina.

Os agentes precedentemente introduzidos para realizar a inativação viral através do tratamento por solvente de tipo detergente são eliminados no curso desta etapa cromatográfica, e o grau de pureza do Fator H é aumentado.

A fração purificada que contém o Fator H (Fração E) é, em seguida, submetida a uma etapa de eliminação viral por nanofiltração em um filtro tendo uma porosidade de, aproximadamente, 15 nm. Este tratamento de eliminação viral permite eliminar de maneira eficaz os vírus, e particularmente, os vírus não-envelopados de pequeno porte.

A solução resultante (fração F) é, enfim, concentrada e ajustada por ultrafiltração, depois filtrada em um filtro 0,22 pm.

O rendimento do procedimento de purificação acima descrito e a atividade específica do Fator H purificado por este procedimento foram medidos em dois lotes distintos.

Os resultados correspondentes são apresentados no Quadro 1. A atividade específica (A.S.) é expressa em mg de antígeno de tipo Fator H/mg proteína.

QUADRO 1

ETAPAS LOTE 1 LOTE 2

<table>table see original document page 17</column></row><table> <table>table see original document page 18</column></row><table>

Exemplo 2: Método de dosagem da atividade do Fator H

Os poços de uma placa ELISA (de tipo 96 poços) são recobertos por uma solução de proteína C3b purificada, tendo uma concentração de 2,5 · g/ml (Calbiochem: ref: 341274) em tampão de carbonato de sódio 0.2 M. Para se fazer, 100 μΙ de solução são introduzidos nos poços e as placas são colocadas para incubar durante 1 hora a 37° e 1 noite a 4°C.

Três lavagens de 300 μl/poços são efetuadas com uma solução de tampão com fosfato de sódio 10 mM, NaCI 25 mM, Tween 20 0.1%, ph 7.2. Os sítios não específicos são em seguida saturados por uma incubação de uma hora a 37°C com 300 μl/poços de uma solução de tampão de fosfato de sódio de 10 mM, NaCI 25 mM, ph 7.2, Tween 20 0.05%, e contendo 1% de BSA. Depois uma lavagem de poços é realizada com a solução de lavagem descrita precedentemente. 100 μl de uma solução contendo:

- 75 μl de uma solução-mão de NiCl2 20 mM (concentração final 1.5 mM);

- 4 μl de Fator B (Calbiochem ref: 341262) a uma concentração de 1 mg/ml; - 3 μl de Fator D (Calbiochem ref: 341273) a uma concentração de 1 mg/ml; e

- 918 μl de tampão de fosfato de sódio 10 mM, NaCl 25 nM, ph 7.2 e 4% de BSA; São depositados em cada poço antes de proceder a uma incubação de 2 horas a 37°C.

Três lavagens sucessivas de 300 μl/poço são em seguida realizadas com uma solução de tampão de fosfato de sódio de 10mM, NaCI 25 mM, Tween 20 0,1%, ph 7.2.

Uma série de soluções de fator H tendo concentrações respectivas em Fator H de 20 μg/ml, 10 μg/ml, 1 μg/ml, 0.25 μg/ml, 0.0625 μg/ml, 0.015625 μg/ml, 0.00390625 μg/ml e 0,001 μg/ml é preparada.

100 μl de cada solução são depositados em um poço diferente e uma incubação de 30 mn a 37° é realizada.

Três lavagens sucessivas de 300 μΙ/poços são em seguida realizadas com uma solução de tampão de fosfato de sódio de 10mM, NaCI 25 mM, Tween 20 0,1%, ph 7.2.

Uma solução de anticorpos de cabra anti-fator B humano (Calbiochem ref: 341272 é diluída em 1/2000 num tampão PBS (Sigma P-3813), ph 7.4, contendo 0,1 % de BSA, depois 100μl da solução diluída são depositados nos poços e uma incubação é realizada durante 1 hora a 37° C.

Três lavagens sucessivas de 300 μΙ/poço são em seguida realizadas com uma solução de PBS, Tween 20 0,1%, ph 7.2. Depois 100 μl de uma solução contendo um anticorpo de coelho anti-cabra marcado na peroxídase (Calbiochem ref: 401515 1 mg/ml), e diluído em 1/1000 no PBS contendo 0,1% de BSA, são depositados nos poços antes de proceder a uma incubação de 20 a 25 minutos em temperatura ambiente. Três lavagens sucessivas de 300 μΙ/poço são em seguida realizadas com uma solução de PBS, Tween 20 0,1%, ph 7.2.

O substrato da peroxídase OPC (Sigma), a uma concentração de 5mg/10ml na solução de citrato de sódio, é acrescentado aos poços, assim como 10 μΙ de H202 a proporção de 100 μΙ/poço no final. A mistura da reação é deixada em contato com os poços durante, aproximadamente, 10 minutos antes de proceder à parada da reação pelo acréscimo de 50 μL de H2S04 4N por poço.

A absorvência da solução contida nos poços é então medida em um comprimento de onda de 492 nm. Os resultados correspondentes estão presentes na Figura 2. As representações gráficas que se apresentam na figura 2 dão o valor da absorvência medida em função da concentração em Fator H ou em função da concentração em proteína (SAH).

Um método de dosagem da atividade do fator H semelhante é descrito no documento McRae et ali.; The joumal of immunology, 2005, 174: 6250-6256.

Claims

1. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", caracterizado por ser destinado ao tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU).

2. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme a reivindicação 1, caracterizada pelo medicamento ser destinado ao tratamento da forma típica da SHU.

3. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme a reivindicação 1, caracterizada pelo medicamento ser destinado: ao tratamento da forma atípica da SHU.

4. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo medicamento Fator H ser purificado a partir de plasma fresco humano ou de uma fração plasmática.

5. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo dito fator H ser produzido por gênio genético pela expressão do gene do fator H numa célula escolhida num grupo composto de bactérias, leveduras, fungos ou células de mamíferos.

6. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo dito medicamento ser preparado sob a forma liofilizada.

7. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo dito medicamento sofrer, ao menos, um método de eliminação ou inativação de ao menos um agente infeccioso.

8. "UTILIZAÇÃO DO FATOR H PARA A FABRICAÇÃO DE UM MEDICAMENTO", conforme qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo dito medicamento sofrer, ao menos, um método de inativação viral.

9. "COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA LIOFILIZADA, INATIVADA DE MANEIRA VIRAL", caracterizado por compreender o fator H e seus excipientes e/ou veículos farmacêuticos aceitáveis.

10. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", caracterizado por compreendendo as etapas que consistem em: 1) preparar o sobrenadante de um crioprecipitado do plasma; 2) submeter este sobrenadante a uma cromatografia em gel/resina de tipo aquecedor de ânions; 3) submeter a fração não retida a uma cromatografia em um(a) gel/resina comportando um Iigante transplantado de tipo heparina; 4) ajustar o ph da fabricação não retida após a cromatografia da etapa 3 para permitir a ligação do fator H a um(a) gel/resina de suporte cromatográfico comportando um Iigante transplantado de tipo heparina; 5) eluir o fator H por um tampão de força iônica superior àquela do tampão de equilibro do gel/da resina; 6) diluir a fração purificada, depois submetê-la a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte; 7) eluir o fator H por um tampão de força iônica superior àquela de equilíbrio do gel/da resina; 8) diluir a fração eluída, depois submetê-la a uma cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de ânions de tipo ácido forte; 9) lavar o gel/a resina e eluir o fator H; 10) preparar um concentrado de fator H.

11. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", conforme a reivindicação -10, caracterizado pelo suporte cromatográfico comportando um Iigante transplantado de tipo Heparina da etapa 3) é um (a) gel/resina Heparina Sefarose.

12. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", conforme um das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo suporte cromatográfico comportando um Iigante transplantado de tipo Heparina da etapa 4 é um (a) gel/resina Heparina;

13. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H",conforme umas das reivindicações 11 a 12, caracterizado pela cromatografia no gel/resina de tipo aquecedor de cátions de tipo ácido forte da etapa 6) é uma cromatografia de tipo SP Sefarose.

14. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", conforme uma das reivindicações 10 a 13, caracterizado pela cromatografia em um(a) gel/resina de tipo aquecedor de ânions de tipo ácido forte da etapa 8) é uma cromatografia de tipo Q Sefarose FF ou equivalente.

15. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", conforme uma das reivindicações 10 a 14, caracterizado pelo ph da fração não retida da etapa 4) é ajustado para ser incluído na série que vai de 5,5 a ph 6,5 e, preferentemente, para ser igual a ph 6,0.

16. "PROCEDIMENTO DE PURIFICAÇÃO DO FATOR H", conforme um das reivindicações 10 a 15, caracterizado pelo ph da primeira fração diluída na etapa 8) é ajustado para ser incluído na série que vai de 6,5 a ph 7,5.

17. "CONCENTRADO DE FATOR H", caracterizado por ser obtido através do procedimento de acordo com uma das reivindicações 10 a 16.

18. "CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela utilização no tratamento de doenças resultantes de um controle deficiente da ativação do complemento.

19. "CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme com uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela utilização no tratamento da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU).

20. "CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela utilização no tratamento da forma atípica da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHAa).

21. "UTILIZAÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme com uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado por controlar a ativação do complemento in vitro ou ex vitro.

22. "UTILIZAÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela obtenção de um medicamento destinado ao tratamento terapêutico ou profilático de doenças resultantes de um controle deficiente da ativação do complemento.

23. "UTILIZAÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela obtenção de um medicamento destinado ao tratamento terapêutico ou profilático da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHU).

24. "UTILIZAÇÃO DE UM CONCENTRADO DE FATOR H", obtido pelo procedimento conforme uma das reivindicações 10 a 16, caracterizado pela obtenção de um medicamento destinado ao tratamento terapêutico ou profilático da forma atípica da Síndrome Hemolítico-Urêmica (SHUa).