BRPI0619932A2 - moléculas de oligonucleotìdeo-oligocátion, método para a obtenção das mesmas, reagentes de fosforamidita, método para uso em biologia e diagnóstico, e, composições farmacêuticas - Google Patents
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Abstract
MOLéCULAS DE OLIGONUCLEOTìDEO-OLIGOCáTION, MéTODO PARA A OBTENçãO DAS MESMAS, REAGENTES DE FOSFORAMIDITA, MéTODO PARA USO EM BIOLOGIA E DIAGNóSTICO, E, COMPOSIçõES FARMACêUTICAS. A invenção diz respeito a moléculas de oligonucleotídeo- oligocátion A~ i~B~ j~ H que podem ser sintetizadas por intermédio da química da fosforamidita automatizada tendo porções de oligonucleotídeos Ai e porções de oligocátions Bj, em que A~ i~ é um resíduo de oligonucleotídeo i-mero, com i = 5 a 50, onde o nucleotídeo A é um oligómero com nucleobases que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente e/ou grupos pentafuranosil e/ou ligações de fosfodiéster nativas, por exemplo selecionados do grupo que compreende desoxirribo, ribo, (LNA) nucleotídeos bloqueados assim como suas modificações ou substituições químicas tais como fosforotioato, 2'- fluoro, 2'-O-alquila, ou um grupo marcador tal como um agente fluorescente, Bj é uma porção de oligocátion orgânico j-mero, com j =1 a 50, onde B é selecionado do grupo que compreende <sym> -HPO~ 3~-R^ 1^-(X-R^ 2^~ n~)~ n1~-X-R^ 3^-O-, onde R^ 1^, R^ 2^ ~ m~ , e R^ 3^ idêntico ou diferente, são alquileno inferior, X é NH ou NC(NH~ 2~)~ 2~, n varia de 1 a 5 e nl =2 a 20,<sym> -HIPO~ 3~-R^ 4^-CH(R^ 5^X^ 1^)-R^ 6^-O-, onde R^ 4^ é alquileno inferior, R^ 5^ e R^ 6^, idênticos ou diferentes, são alquileno inferior e X^ 1^ é resíduo de putrescina, espermidina ou espermina, <sym> -HPO~ 3~-R^ 7^-(aa)~n2~-2-R^ 8^ -O-, onde R^ 7^ é alquileno inferior e R^ 8^ é alquileno inferior, serina, um aminoálcool natural, (aa)~ n2~ é um peptídeo contendo aminoácidos naturais com cadeias laterais catiónicas, tais como Arginina, Lisina, Omitina, Histidina, Acido diaminopropiónico e n2 =2 a 20.
Description
'MOLÉCULAS DE OLIGONUCLEOTÍDEO-OLIGOCÁTION, MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DAS MESMAS, REAGENTES DE FOSFORAMIDITA, MÉTODO PARA USO EM BIOLOGIA E DIAGNÓSTICO, E, COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS"
A invenção diz respeito a oligonucleotídeos catiônicos, isto é, moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion, também chamadas de oligonucleotídeos catiônicos na descrição (independente da sua carga global) que podem ser sintetizadas gradativamente em um sintetizador de oligonucleotídeo. Esta também diz respeito ao seu uso, na biologia molecular, aplicações em diagnósticos e terapêuticas.
Os oligonucleotídeos encontram um número extremamente grande de aplicações na biologia molecular e diagnósticos, e podem vir a ser uma classe muito seletiva de medicamentos para o tratamento de uma vasta gama de doenças.
Os oligonucleotídeos são poliânions que exercem a sua atividade específica a seguir da hibridização a uma seqüência complementar transportada por um outro ácido nucléico polianiônico.
Como candidatos a medicamento, estes também devem ser capazes de cruzar a membrana celular aniônica.
Considerações eletrostáticas simples implicam que a energia de hibridização e a ligação celular poderiam se beneficiar da adição de grupos catiônicos à estrutura de oligonucleotídeo.
Para esta meta, muitos métodos sintéticos para introduzir resíduos de amônio ou guanidínio em oligonucleotídeos foram explorados: substituição de cadeia principal de fosfato, modificação de ribose ou base nucléica, e conjugação final de um policátion. Entretanto, a especificidade de hibridização, a atividade de enzima no processamento de ácido nucléico assim como problemas de toxicidade de metabólito todas apontam para o método de bloco, onde o policátion é anexado a um oligonucleotídeo de outro modo natural, como a melhor solução. Infelizmente, a síntese gradativamente automatizada de conjugados de oligonucleotídeo-peptídeo catiônico ainda não é rotina. Por outro lado, a química da conjugação entre blocos grandes pré formados não é direta, especialmente em água, onde «super» zwitteríons incitam problemas de solubilidade, purificação e caracterização intratáveis. Além disso, aplicações na biologia molecular e em diagnósticos requerem a síntese rápida e direta de qualquer seqüência base dada ligada a qualquer comprimento de cátion orgânico.
Os inventores descobriram que uma síntese em tempo real, conduzida em computador, de moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion foi possível tampando-se frascos contendo derivados de oligocatiônico apropriadamente ativados e protegidos a um sintetizador de oligonucleotídeo além daqueles das quatro bases naturais.
Um objetivo da invenção é assim fornecer novos oligonucleotídeos catiônicos.
Um outro objetivo da invenção é fornecer uma síntese de alto rendimento, automatizada dos ditos oligonucleotídeos catiônicos.
Em um outro objetivo, a invenção diz respeito às aplicações dos ditos oligonucleotídeos catiônicos, particularmente em biologia molecular, diagnósticos e produtos terapêuticos.
A invenção assim diz respeito a moléculas de oligonucleotídeo oligocátion mistas que podem ser sintetizadas por intermédio da química da fosforamidita automatizada, isto é, polifosfodiésteres.
Mais particularmente, os oligonucleotídeos catiônicos AiBjH da invenção têm porções de oligonucleotídeos Ai e porções de oligocátions Bj, em que
. Ai é um resíduo de oligonucleotídeo i-mero, com i = 5 a 50, com nucleobases que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente e/ou grupos pentafuranosil e/ou ligações de fosfodiéster nativas, . Bj é um porção de oligocátion orgânico j-mero, com j = 1 a 50, onde B é selecionado do grupo que compreende
• -HPO3-R1-(X-R2n)nI-X-R3-O-, onde R1, R2n e R3, idênticos ou diferentes, são alquileno inferior, X é NH ou NC(NH2)2, η varia de 1 a 5 e nl = 2 a 20,
• -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, onde R4 é alquileno inferior, R5 e R6, idênticos ou diferentes, são alquileno inferior e X1 é um resíduo de putrescina, espermidina ou espermina,
• -HPO3-R -(aa)n2-R -O-, onde R é alquileno inferior e R é alquileno inferior, serina, um aminoálcool obtido pela redução de um aminoácido natural, (aa)n2 é um peptídeo contendo aminoácidos naturais com cadeias laterais catiônicas, tais como Arginina, Lisina, Ornitina, Histidina,
Acido diaminopropiônico e n2 = 2 a 20.
"Alquila inferior" e "alquileno inferior", como usados na descrição e nas reivindicações, preferivelmente designam um radical de alquila ou alquileno opcionalmente substituídos C1-C5 lineares ou ramificados, respectivamente.
A é por exemplo selecionado do grupo que compreende desoxirribo, ribo, (LNA) nucleotídeos bloqueados assim como suas modificações ou substituições químicas tais como fosforotioato (também designado tiofosfato), 2'-fluoro, 2'-0-alquila ou um grupo marcador tal como um agente fluorescente.
As moléculas mistas de oligonucleotídeo-oligocátion da invenção têm a seqüência3 A5 -B.
Outras moléculas da invenção têm a seqüência B - 3 A5.
Ainda outras moléculas da invenção têm as seqüências B-3 A5 - B ou3 A5 -B-3 A5.
Uma tal seqüência é ilustrada nos exemplos por uma molécula de oligonucleotídeo-espermina tendo a seguinte estrutura: (3'A5')i-[P03-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-0]jH
em que A, i e j são como acima definidos.
As moléculas com A sendo um nucleotídeo de fosforotioato são particularmente vantajosas em vista das suas aplicações biológicas, visto que os oligonucleotídeos de fosforotioato não são hidrolisados em fluidos biológicos.
Os oligonucleotídeos catiônicos definidos acima formam complexos rápidos e estáveis com a sua seqüência complementar em um contexto de substituição de filamento e mesmo em um contexto de invasão de filamento plasmídico, como ilustrado pelos exemplos.
Devido à conjugação final, a seletividade de seqüência permanece tão alto como para nucleotídeos naturais.
Conseqüentemente, os oligonucleotídeos catiônicos da invenção são de enorme interesse para a biologia molecular, reagentes de pesquisa e aplicações em diagnósticos, tais como PCR, PCR em tempo real, genotipagem, hibridização in situ e chips de DNA.
Tais aplicações são depois também abrangidas pela invenção e compreendem o uso de moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion tais como definidas acima.
Ao contrário dos oligonucleotídeos aniônicos, os oligonucleotídeos catiônicos da invenção são mostrados nos exemplos entrarem espontaneamente no citoplasma e núcleos de células vivas.
Em vista da sua hibridização realçada e propriedades de permeação de célula, estes também são úteis para métodos terapêuticos, tais como aqueles mediados pela degradação de anti-sentido e siRNA de RNA mensageiro, pelo pulo de exon durante a maturação do RNA mensageiro, pela formação de hélice tripla com cromatina, pela invasão de filamento de cromatina (correção de gene). A invenção assim também diz respeito a composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade eficaz de moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion tais como definidas acima, em associação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
A invenção também diz respeito a um método de tratamento que compreende usar uma quantidade eficaz de moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion tais como definidas acima, em associação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
As moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion mistas definidas acima são de modo vantajoso gradativamente sintetizadas em um sintetizador de oligonucleotídeo, por intermédio da via da fosforamidita, de acordo com um método que compreende
- tampar frascos contendo oligocátions B ativados e protegidos a um sintetizador de oligonucleotídeo, além dos frascos de oligonucleotídeos
A tais como definidos acima, ou o reverso,
- interromper a síntese, quando o comprimento desejado é obtido,
- clivar os oligômeros do suporte sólido, e
- remover os grupos de proteção.
A invenção está intimamente relacionada com os reagentes de fosforamidita usados na síntese automatizada para a construção de blocos B repetidos de oligocátion. Os seguintes reagentes de fosforamidita podem ser usados para este propósito
• P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)-X-R3-O-Prot, onde R1, R2, R3, e n1 são como definidos acima, X é NH ou NC(NH2)2 adequadamente protegido, R9 é -CH2CH2CN, ou alquila inferior, R10 é alquila inferior, ou - N(R10)2 é grupo pirrolidino, piperidino ou morfolino, e Prot é um grupo de proteção usado na síntese de oligonucleotídeo, tal como DMT, MMT;
• P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot, onde R4, R5, R6 são alquileno inferior, X é putrescina, espermidina ou espermina adequadamente protegidos, R9 e R10 são como definidos acima;
• P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R8-O-Prot, onde R7, R85R9, R10, n2, e Prot são como definidos acima, (aa)n2 é um peptídeo contendo aminoácidos naturais com cadeias laterais catiônicas adequadamente protegidas, tais como Arginina, Lisina, Ornitina, Histidina, Acido diaminopropiônico e n2 = 2 a 20.
NH ou NC(NH2)2 adequadamente protegido significa que os grupos de proteção estão presentes no resíduo de amino ou guanidina, respectivamente, para tornar a sua funcionalidade inerte para as condições de reação química às quais o reagente é exposto.
Tais grupos de proteção são por exemplo grupos ftalimida (ΡΗΤΗ), trifluoroacetato, aliloxicarbonil (Alloc), benziloxicarbonila (CBZ), clorobenziloxicarbonila, t-butiloxicarbonila (Boc), fluorenil-metóxi-carbonila (Fmoc) e isonicotinilóxi (i-Noc).
De acordo com uma forma de realização da invenção, a síntese gradativa da seqüência de oligonucleotídeo é seguida pela síntese gradativa da porção de oligocátion para obter compostos tendo a seqüência (3 A5 - B).
De acordo com uma outra forma de realização, as etapas reversas são realizadas, a síntese gradativa da porção de oligocátion sendo seguida pela síntese gradativa da seqüência de oligonucleotídeo para obter os compostos da seqüência (B - 3 A5 ).
De acordo ainda com uma outra forma de realização, as seqüências mistas são sintetizadas.
Em particular, as seqüências de oligonucleotídeo capeadas em ambas as extremidades (B- A -B) podem resistir às exonucleases em fluidos biológicos, e seqüências ( A -B- A ) interrompida por cátion permitem o alvejamento de seqüências de ácido nucléico vicinais.
Usando-se as aminas que ocorrem naturalmente como a espermina, ou peptídeos tais como oligoargininas, a toxicidade potencial de metabólitos é evitada. A espermina está de fato presente na concentração milimolar em células e a sua alquilação na extremidade é nociva. Além disso, as seqüências de peptídeo básico estão presentes em muitas proteínas nucleares.
Os oligocátions B ativados e protegidos são vantajosamente obtidos pela proteção dos grupos amino de uma poliamina, seguido por α, ω- bis hidroxilalquilação, levando aos dióis compatíveis com a síntese de oligonucleotídeo.
A química de DMT e alongamento ue fosforamidita clássica é vantajosamente implementada junto com grupos de proteção TFA instável em base.
Os dióis quimicamente protegidos são novos produtos e entram no escopo da invenção.
A invenção particularmente diz respeito aos intermediários selecionados do grupo que compreende
P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2n)n1-XR3-O-Prot, onde R1, R2, R3, e nl são como definidos acima, X é NH ou NC(NH2)2 adequadamente protegido, R9 é -CH2CH2CN, ou alquila inferior, R10 é alquila inferior, ou - N(R10)2 é grupo pirrolidino, piperidino ou morfolino, e Prot é um grupo de proteção usado na síntese de oligonucleotídeo tal como DMT, MMT;
• P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot, onde R4, R5, R6 são alquileno inferior, X é putrescina, espermidina ou espermina adequadamente protegidas, R9 e R10 são como definidos acima;
• P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R5-O-Prot, onde R7, R8, R9, R10, n2, e Prot são como definidos acima, (aa)n2 é um peptídeo contendo aminoácidos naturais com cadeias laterais catiônicas adequadamente protegidas, tais como Arginina, Lisina, Ornitina, Histidina, Acido diaminopropiônico e n2 = 2 a 20. Outras características e vantagens da invenção são dadas a seguir. Em particular, a síntese de seqüências oligonucleotídicas decaméricas (A10) com espermina (S), designadas por A10Sn no seguinte será dado por via de ilustração, sem limitar a invenção. Nos exemplos, isto será aludido nas Figuras de 1 a 14, que representam, respectivamente:
- Figura 1, análise de HPLC de oligonucleotídeos catiônicos N10Sn (η = 1 a 2) em uma coluna de fase reversa,
- Figura 2, análise de HPLC de oligonucleotídeos purificados N10Sn (η = 1 a 6) em uma coluna de troca aniônica,
- Figura 3, análise de Ni0Sn (η = 1 a 6) mobilidade eletroforética pela eletroforese em gel de poliacrilamida,
- Figura 4, troca espontânea de N10 com N10-C10 em várias temperaturas,
- Figura 5, troca de filamento entre N10 e N10Sn como revelado pela eletroforese em gel de poliacrilamida
- Figura 6, temperaturas de fusão de Ni0Sn. duplexes C10 (onde C é o nucleotídeo complementar a N),
- Figura 7: resultados comparativos de temperaturas de fusão de duplexes formados por N10Sn (n = 0 a 6) com TGGCATCGC e com 5GTGGCGTCGC3'
- Figura 8, análise ES-MS de N10Sn purificado (η = 1 a 6) oligonucleotídeos,
- Figura 9, traços de HPLC de oligonucleotídeos de fosforotioato Ni2ShF (9A) e N12S2F (9B),
- Figura 10, espectros de MALDI-TOF MS, de N12S2F (10 A) e N12S11F(10B),
- Figura 11, traços de HPLC de NhS4F (1 IA) e N20S5F (11B), respectivamente
- Figura 12, espectros de MALDI-TOF MS de NmS4F (12A) e N20S5F (12Β),
- Figura 13, invasão de filamento de plasmídeos pGL2 e pGL3 pela N14SnF (13A) e N20SnF (13B).
- Figuras 14A e 14B, penetração do oligonucleotídeo catiônico F-SigNi9 em células HeLa.
Exemplo 1: Síntese de synthon de fosforamidita espermina
A fosforamidita presa à espermina 1 foi sintetizada a partir da espermina como mostrado no seguinte Esquema 1:
<formula>formula see original document page 10</formula>
(Mes = 2,4,6-trimetilfenila; TBDMS = t-butildimetilsilila; TFA = CF3CO-; DMT = 4,4' -dimetoxitritila)
A tetracis(mesitilsufonil)espermina 2, preparada a partir de espermina, foi bis-alquilada a 3. Depois da desproteção completa de 3 em condições ácidas, o tetrabromidreto de bis(C4-OH)espermina bruto 4 foi totalmente protegido pelo anidrido trifluoroacético em piridina, depois os dois grupos de éster terminal de 5 foram hidrolisados em condições neutras ao diol 6. A mono tritilação de 5 foi realizada no modo estatístico usando um equivalente molar de reagente de DMTCI para produzir 7 em rendimento de 43 %. O diol não reagido 6 e o composto de bis-tritila 8 foram recuperados e re-equilibrados em condições ácidas brandas (ácido trifluororoacético em diclorometano) para produzir 7. A fosfitilação de 7 deu a fosforamidita desejada 1.
N1,N4,N9,N12 -Tetracis(mesitilsulfonil)espermina (2): Este composto foi preparado de acordo com a referência: Bergeron et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 232-244.
N1,N12-Bis[4-(t-butildimetilsililóxi)butil]-N1,N4,N9,N12- tetracis(mesitilsulfonil)-espermina (3): Hidreto de sódio (60 %, 1,0 g, 25 mmoles) foi adicionado em porções com agitação sob N2 a 0°C a uma solução de 2 (9,31 g, 10,0 mmoles) em DMF (20 ml). Depois da agitação na temperatura ambiente por 30 min, t-butil (4-iodobutóxi)dimetilsilano (7,86 g, 25 mmoles) foi adicionado em uma porção. A mistura foi agitada durante a noite na temperatura ambiente e depois dividida entre H2O-CH2Cl2 (100 ml/100 ml). A fase orgânica foi separada e a fase aquosa foi extraída três vezes com CH2Cl2 (50 ml). As fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução de NaHCO3 (1 M) e depois secadas em MgSO4 Depois da evaporação, o resíduo pastoso foi purificado pela cromatografia cintilante com 1:4 AcOEfccicloexano como eluente. As frações contendo 3 foram evaporadas a um óleo pastoso que foi ainda lavado com pentano frio para eliminar as impurezas que se movem rápido e depois bombeadas a vácuo para produzir 9,97 g (76 %) de 3 como um óleo: TLC (AcOEt/cicloexano 1:4): Rf = 0,28. - 1R (KRS-5): 2937, 1604, 1471, 1320, 1151, 1101, 838, 777, 657, 578 cm-1- 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = -0,01 (s, 12H), 0,85 (s, 18H), 1,20 - 1,45 (m, 12 H), 1,62 (m, 4 H), 2,28 (s, 6 H), 2,29 (s, 6H), 2,53 (s, 12 H), 2,54 (s, 12 H), 2,90 - 3,10 (m, 16H), 3,42 (t, J = 6,1 Hz, 4H), 6,91 (s, 4 H), 6,92 (s, 4 H). - 13C RMN (75 MHz, CDCl3): δ = 4,7, 18,9, 21,6, 23,4, 23,5, 24,1, 24,9, 25,7, 26,6, 30,4, 43,5, 43,6, 45,6, 45,7, 62,9, 132,59, 132,64, 133,8, 140,7, 143,0, 143,1 - MS-ESI (MeOH): m/z = 1325,85 [Μ + Na]+, 1303,83 [Μ + H]+. - C66HiioN4O10S4Si2 (Pm = 1304,03) calculado C 60,79, H 8,50, N 4,30, S 9,84; encontrado C 60,74, H 8,55, N 4,21, S 9,63.
<formula>formula see original document page 12</formula>
Tetrabromidreto de N1, N12 -Bis(4-hidroxibutil)espermina (4): Brometo de hidrogênio em ácido acético (33 % em peso de solução, 80 ml, 1,4 mol) foi adicionado às gotas a uma solução de 3 (9,87 g, 7,57 mmoles) e fenol (29,0 g, 0,31 mol, 40 equiv.) em CH2Cl2 (80 ml). A mistura de reação foi agitada durante a noite na temperatura ambiente. No esfriamento com um banho de gelo, água fria (100 mi) foi adicionada com agitação. A camada orgânica foi separada e extraída três vezes com água (20 ml). As camadas aquosas combinadas foram lavadas cinco vezes com CH2Cl2 (30 ml) e evaporadas à secura. O resíduo sólido úmido resultante foi colocado em suspensão em éter, triturado com espátula e a camada de éter sobrenadante foi descartada. Estas operações foram repetidas (cinco vezes) até que uma suspensão sólida fosse obtida. Depois da evaporação e secagem a vácuo, o composto 4 foi obtido como um sólido (5,32 g). Este material bruto foi usado sem outra purificação: 1H IiMN (300 MHz, D2O): δ = 1,75 - 2,10 (m, 12 H), 2,27 (m, 4 H), 3,15 - 3,35 (m, 16 H), 3,76 (t, J = 12,2 Hz, 4 H). - 13C RMN (75 MHz, D2O): δ = 22,9, 23,2, 23,4, 29,0, 45,0, 45,2, 47,7, 48,3, 61,5. - MS- ESI (MeOH): m/z = 347,39 [M + H]+.
N1, N12 -Bis(4-(trifluoroacetóxi)butil)-N1, N4, N912- tetracis(trifluoroacetil) espermina (5) (a partir de 4 com TFA20/NEt3): A uma suspensão de 4 (5,3 g, 7,6 mmoles) em CH2Cl2 (50 ml), trietilamina (11,5 g, 114 mmoles, 15 equiv.) foi adicionado em uma porção. A mistura foi esfriada em um banho de gelo e anidrido trifluoroacético (19,1 g, 90,9 mmoles, 12 equiv.) foi adicionado às gotas com agitação sob N2. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 3,5 h. Depois de esfriar em um banho de gelo, a solução resultante foi lavada três vezes com água fria (20 ml), secada em MgSO4, e depois evaporado para produzir um resíduo oleoso (11,7 g) que contém como produto secundário desta reação, (TFA)2C=CH-NEt2 (ref Schreber, S. L., Tetrahedron Lett. 1980, 21, 1027). Isto foi eliminado pelas duas cromatografias cintilantes sucessivas (eluente 1:1 — 60:40 AcOEtxicloexano e depois 5 a 10 % de Et2(VCH2Cl2) para produzir 5 (5,59 g, 81 %) como um óleo: TLC (AcOEt/cicloexano 1:1): Rf= 0,25. - IR (KRS-5): 2955, 1789, 1690, 1467, 1352, 1197, 1147, 759, 731, 692 cm-1. - 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,52 - 2,06 (m, 16 H), 3,33 - 3,49 (m, 16 H), 3,38 (m, 4 H). - 13C RMN (75 MHz, CDCl3): Este espectro é complicado pelo isomerismo rotacional de quatro grupos amida. Apenas sinais de ressonância de alta intensidade são descritos como segue: δ = 23,3, 23,9, 24,1, 24,8, 25,3, 25,6, 26,0, 26,55, 26,61, 44,4, 44,8, 45,7, 46,1, 46,4, 47,3, 48,0, 56,6, 67,3, 67,5, 116,6 (q, J = 288 Hz), 156,9, 157,4, 157,8, 158,6.
N1,N12-Bis(4-hidroxibutil)-N1,N4,N9,N12-tetracis(trifluoro- acetil)espermina (6): A uma solução de 5 (5,39 g, 5,84 mmoles) em MeOH (50 ml), NaHCO3 (0,1 g, sólido) foi adicionado em uma porção e a suspensão resultante foi agitada por 2 h na temperatura ambiente. Depois da evaporação, o resíduo oleoso foi dissolvido em CH2Cl2 (produzindo uma suspensão de algum NaHCO3 fibroso) e purificado pela cromatografia cintilante eluindo com 5 a 10 % de MeOH/CH2Cl2 para produzir 3,61 g (85 %) de 6 como um óleo: TLC (MeOH 5 %/CH2Cl2): Rf= 0,14. (MeOH 10 %/CH2Cl2): Rf = 0,45. - 1HRMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,51 - 2,02 (m, 18 H), 3,33 - 3,51 (m, 16 H), 3,68 (m, 4 H). - MS-ESI (MeOH): m/z = 753,33 [M + Na]+. - C26H38F12N4O6-H2O (Pm = 748,60) calculado C 41,72, H 5,39, N 7,48, F 30,45; encontrado C 41,97, H 5,26, N 7,37, F 30,14.
Preparação de 6 a partir de 4 (com TFA20/piridina, depois NaHCO3): A uma suspensão de 4 (15,3 g, 22,8 mmoles) em CH2Cl2 (100 ml) e piridina (44 ml, 0,54 mol), anidrido trifluoroacético (46 ml, 0,33 mol) foi adicionado às gotas com esfriamento em um banho de gelo e com agitação sob N2. A mistura foi agitada na temperatura ambiente por 3 horas. O excesso de anidrido trifluoroacético foi decomposto pela adição de água fria (100 ml) com esfriamento em um banho de gelo, depois a solução resultante foi extraída com CH2Cl2 (quatro vezes 100 ml + 50 ml + 25 ml χ 2). Os extratos combinados foram lavados com água fria (50 ml χ 3), secado em MgSÜ4 e depois evaporados para produzir 5 bruto (19,4 g, 92 %) como óleo. Este óleo foi dissolvido em MeOH (100 ml). NaHCO3 (sólido, 0,1 g) foi adicionado e a suspensão foi agitada durante a noite. Depois da evaporação do solvente, o resíduo foi purificado pela cromatografia cintilante com 5 a 7 % de MeOH: CH2Cl2 como eluente para produzir 10,1 g (61 %) de 6 como um óleo.
N1-[4-(Dimetoxitritilóxi)butil]-N12-(4-hidroxibutil)- -tetracis(trifluoroacetil)espermina (7): A uma solução de 6 (1,46 g, 2,00 mmoles) em piridina (3 ml), DMTCl (757 mg, 2,23 mmoles) foi adicionado usando 1 ml de piridina para enxaguar. A mistura de reação foi agitada por 4 h na temperatura ambiente sob N2 e depois piridina foi repetidamente removido pela co-evaporação com tolueno. O resíduo foi purificado pelas duas cromatografias cintilantes sucessiva (eluente 2 a 5 % de MeOHZCH2Cl2 e depois 10 a 15 % de acetona/CH2Cl2) para produzir 7 (879 mg, 43 %) como espuma e derivado de bis-DMT 8 (648 mg, 24 %). O diol de partida 6 também foi recuperado (350 mg, 24 %). Dados de 7: TLC (acetona/CH2Cl2 1:9): Rf= 0,20. - 1H RMN (300 MHz, CDCl3): δ = 1,51 - 2,03 (m, 17 H), 3,11 (m, 2 H), 3,32 - 3,51 (m, 16 H), 3,71 (m, 2 H), 3,81 (s, 6H), 6,84 (m, 4 H), 7,19 - 7,46 (m, 9 H). - MS-ESI (MeOH): m/z = 1055,52 [M + Na]+. - C47H56Fi2N4O8 (Pm = 1032,95) calculado C 54,65, H 5,46, N 5,42, F 22,07; encontrado C 54,46, H 5,58, N 5,37, F 21,63.
O composto (7) a partir de diol (6) e derivado de bis-DMT (8): A uma solução de 6 (1,4 g, 1,9 mmol) e 8 (2,5 g, 1,9 mmol) em CH2Cl2, ácido trifluoroacético (50 μΐ, 0,6 mmol) foram adicionados e agitados na temperatura ambiente por 30 min. A solução foi lavada três vezes com solução 1 M de Na2COs, secado em MgSC>4 e evaporado. O resíduo foi separado pela cromatografia cintilante (diâmetro da coluna: 50 mm, SiO2 altura: 15 cm) usando sucessivamente 5 % de AcOEt/CH2Cl2 (750 ml), 33 % de AcOEt/CH2Cl2 (500 ml), 7 % de MeOH/CH2Cl2 (500 ml) e 10 % de 5 MeOH/CH2Cl2 (500 ml) para produzir 8 (1,1 g), 7 (1,2 g) e 6 (1,3 g).
Espermina presa a fosforamidita (1): A uma solução de 7 (844 mg, 817 μηιοί) e trietilamina (230 μΐ, 1,65 mmol, 2 equiv.) em CH2Cl2 (4 ml), 2-cianoetil-(N,N-diisopropilamino)clorofosfito (205 μΐ, 0,92 mmol, 1,1 equiv.) foi adicionado e a mistura foi agitada sob N2 na temperatura ambiente por 40 min. A mistura de reação foi passada através de coluna de SiO2 (diâmetro: 20 mm, altura: 15 cm) saturado com NEt3 (NEt3 1 % em CH2Cl2 :cicloexano 1:2; 400 ml) usando NEt3 1 % em CH2Cl2xicloexano 1:2 (125 ml) e depois NEt3 1 % em CH2Cl2xicloexano 1:1 100 ml para dar 1 (735 mg, 73 %) como um óleo: 1H RMN (200 MHz, CDCl3): δ = 1,13 - 1,35 (m, 12 H), 1,51 - 2,06 (m, 16 H), 2,66 (t, J = 6,4 Hz, 2 H), 3,11 (m, 2 H), 3,32 - 3,98 (m, 20 H), 3,81 (s, 6H), 6,84 (m, 4 H), 7,15 - 7,51 (m, 9 H). - 31PRMN (81 MHz, CDCi3): 148,06, 148,13, 148,19, 148,3 (separação devido ao isomerismo rotacional da amida).
Exemplo 2: Síntese, purificação e caracterização de oligonucleotídeos decaméricas tendo a fórmula
<formula>formula see original document page 15</formula>
Os ditos oligonucleotídeos serão a seguir designados pelo Ni0Sn (Νιο = uma porção de oligonucleotídeo; S = um resíduo de espermina e η = 1 a 6).
Síntese Automatizada: Uma série de oligonucleotídeos decaméncos de seqüências idênticas N]0 = CACCGTAGCG anexadas com números crescentes de resíduos de espermina S foi sintetizada usando a química da cianoetila fosforamidita de fase sólida padrão em um sintetizador de DNA Expedite, de acordo com o seguinte esquema:
<formula>formula see original document page 16</formula>
a última porção N sendo um nucleosídeo de acordo com a síntese de oligonucleotídeo clássica.
Os reagentes usados para a síntese de DNA automatizada foram adquiridos da Glen Research (Eurogentec).
Durante a síntese automatizada, o ciclo de ligação de l μmol padrão foi usado, exceto para a ligação da espermina fosforamidita 1 que foi feita com tempo de ligação prolongada (15 min) e usando uma solução de fosforamidita levemente mais concentrada (90 mg de amidita em 1 ml de acetonitrila).
As frações de tritila foram coletadas, diluídas e analisadas em um espectrofotômetro para determinar os rendimentos da ligação gradativa.
Os rendimentos de ligação dos quatro nucleotídeos naturais excederam 97 %, enquanto que os rendimentos da ligação de espermina fosforamidita foram entre 90 e 96 % nas condições de ligação acima.
Em todos os casos, o modo de DMT-ON (ON = oligonucleotídeo) foi usado, mantendo o grupo do DMT da extremidade 5' não clivado nos oligômeros para propósitos de purificação-identificação.
Tratamento pós sintético: Depois da síntese automatizada, a clivagem do suporte sólido e a desproteção completa de oligômeros foram feitos usando condições padrão (tratamento com amônia aquosa concentrada por 90 min na temperatura ambiente para a clivagem e depois durante a noite a 55° C para a desproteção).
Purificação: Os primeiros dois oligonucleotídeos aniônicos N10S1 e N10S2 foram inicialmente purificados no estado DMT-on pelo procedimento de HPLC padrão em uma coluna nucleosil C-18 de fase reversa (Macherey-Nagel 10 χ 250 mm) com um gradiente linear de acetonitrila (5 a 35 % em 20 min) em solução de acetato de amônio 20 mM (pH 7). Os oligonucleotídeos purificados foram depois destritilados pelo tratamento com AcOH/H20 = 4/1 (500 ml) na temperatura ambiente por 20 min. Depois da diluição com água (5 ml), DMT-OH foi eliminado pela extração em éter (3 χ 2 ml) e a fase aquosa foi concentrada para produzir os oligômeros.
A análise de HPLC de oligonucleotídeos N10S1 e N10S2 é dada na Figura 1 uma coluna C-18 de nucleosila de fase reversa (Macherey-Nagel 4,6 χ 250 mm) com um gradiente linear de acetonitrila (5 a 35 % em 20 min) em solução 20 mM de acetato de amônio (pH 7): a) N10S1, bruto, DMT-ON; b) N10S1, purificado c) N10S2, bruto, DMT-ON; d) N10S2, purificado. *Benzamida; **Seqüências Truncadas.
O oligômero neutro N10S3 e os oligômeros catiônicos N10S4, N10S5 e N10S6 (com ou sem grupo DMT) foram purificados usando colunas Poli-Pak II® (Glen Research/Eurogentec) de acordo com a instrução dada pelo fabricante exceto para a eluição de oligonucleotídeo final que foi feita com acetonitrila/amônia aquosa concentrada/água (20:4:80). As frações contendo o oligonucleotídeo puderam ser reveladas usando uma placa de TLC. Depois da coleta das frações, os solventes foram removidos pela liofilização. Os oligômeros assim obtidos foram no geral contaminadas pela benzamida. Esta foi eliminada pela extração com éter (três vezes) depois da dissolução em solução de amônia aquosa diluída (50 mM). Os oligonucleotídeos purificados foram dissolvidos em solução de amônia aquosa diluída (50 mM), e a sua concentração foi determinada usando o seguinte coeficiente de extinção (260 nm, mol-1 dm3 cm-1 ):
ε = (15,4 NA+ 11,5 NG + 7,4 Nc + 8,7 ΝT) x 0,9 x 103. A análise de HPLC de oligonucleotídeos purificados é dada na Figura 2: coluna de troca aniônica (Dionex PA-100 9 x' 250 mm) com um gradiente linear de NaCl (100 a 350 mM em 10 min)/NaOH 25 mM (pH 12,4): a) N10Si, b) N10S 2, c) N10S3, d) N10S4, e) N10S5, f) N10S6.
Devido à química de conjugação utilizada, cada poliamina veio com um grupo fosfato, contribuindo por esta razão para uma carga catiônica adicional líquida. Sete oligonucleotídeos, (N10Sn)311"9 η = 0...6, com cargas globais -9, -6, -3, 0, +3, +6, +9 quando completamente ionizados, onde assim disponível em quantidades variando de 80 a 250 nanomoles. Mobilidade eletroforética:
A sua migração em um campo elétrico no pH7 foi estudada pela eletroforese em gel de poliacrilamida e revelada pelo manchamento de espelho de prata. Compostos (0,5 nmol) em 10 μΐ de tampão de carga (10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, glicerol) foram carregados em um gel de poliacrilamida não desnaturante (15 % em TAE pH 7). Eletroforese foi conduzido em 5 V/cm por 17 horas a 4o C. O manchamento com prata foi realizado de acordo com Rabilloud et al, Electrophoresis, 1987, 9, 288-291. Os resultados são dados na Figura 3. O oligonucleotídeo N10 (linha 1) sem espermina moveu-se rápido na direção do ânodo e mostrou apenas manchamento de prata débil em condições onde os oligonucleotídeos contendo poliamina foram revelados.
Troca espontânea de Njo com NioeCio
O oligonucleotídeo Ci0 (onde C é o nucleotídeo complementar a N) (50 pmol ou 500 pmol) foi adicionado à solução de duplex NioeCio* fluorescente (50 pmol em HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mm). As misturas foram incubadas 4 h a 37° C, 20° C ou 10° C e carregada em um gel de poliacrilamida não desnaturante (15 % em TAE pH 7). A eletroforese foi realizada a 4o C por 17 h a 5 V/cm. A fluorescência Cio* foi detectada pela varredura em gel usando um Typhoon 8600 Imager. Como mostrado pelos resultados dados na Figura 4, a troca espontânea de Ni0 com Ni0-Ci0 não é significante a 10° C.
Troca de filamento entre Ni0 e Ni0 Sn
A capacidade de substituição de filamento de NjoSn com respeito ao duplex Ni0eCi0 natural foi testada em condições salinas fisiológicas.
Os conjugados de espermina Ni0Sn (50 ou 500 pmol) foram adicionados a uma solução do duplex Ni0-Ci0* fluorescente (50 pmol em 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl). As misturas foram incubadas 4 horas a 10° C e carregadas em um gel de poliacrilamida não desnaturante (15 % em TAE pH 7). A eletroforese foi realizada a 4o C por 17 h a 5 V/cm. A fluorescência foi detectada varrendo-se o gel usando um Typhoon 8600 Imager.
A conjugação de espermina teve um efeito profundo na reação de troca de filamento como mostrado na Figura 5. A faixa que corresponde a N10-C10* tornou-se mais fraca conforme o número de resíduos de espermina do N1i0Sn de competição aumentou, em favor de um movimento mais lento, menos complexo Ni0Sn"Ci0* aniônico. Este efeito foi especialmente pronunciado para Ni0S3, isto é, para conjugados que não mais carregam uma carga negativa formal. De fato, a espermina é juntada a estruturas de DNA duplex pela formação de uma rede interfilamento de ligações de hidrogênio bidentadas de NH2+ na ranhura menor, por este motivo favorecerão a ligação de N10Sn em Ni0. Já um fator cinético favorável adicional pode operar quando a troca de filamento ocorre em um complexo eletrostático de (N10Sn)3n- 9/(N10'C10)18- realizado, que pode ser o caso para η > 3.
Temperaturas de fusão de duplexes Al10Sn C10
As estabilidades de ácidos nucléicos de filamento duplo foram comparadas medindo-se as suas temperaturas de fusão, isto é, a temperatura onde os filamentos complementares cooperativamente desintegram-se. A densidade óptica (O.D.) foi daí registrada a 260 nm de soluções de N10Sn•C10 vs. a temperatura T.
As temperaturas de fusão Tm foram medidas em HEPES 10 mM pH 7,4 (linha preta, rombos) e em HEPES 10 mM pH 7,4 + 150 mM de NaCl (linha cinza, círculos). Os perfis de fusão de todos os duplexes (3,75 nmoles em 1 ml de tampão) foram obtidos usando um Espectrofotômetro CARY 4000 equipado com uma unidade de controle de temperatura pelo aquecimento gradual das amostras (Io C/min) enquanto se registra a sua absorbância a 260 nm. A fusão de duplex resulta em uma mudança hipercrômica e Tm é a temperatura onde a primeira curva derivada dO.D./dT = f(T) atinge a sua máxima. Os resultados são dados na Figura 5.
O duplex natural fundido na Tm = 30° C em 10 mM de HEPES pH 7,4 (Figura 5). A conjugação de números crescentes de esperminas leva a aumentos na Tm acentuáveis. N10Se-C10 fundido na Tm = 75,2° C, alguns 45° C mais altos do que o duplex natural. A curva Tm = f(n) mostrou uma forma sigmoidal com uma inflexão para o oligonucleotídeo N10Ss neutro.
As temperaturas de fusão também foram registradas em condições salinas fisiológicas. A curva Tm = f(n) pareceu muito moderada e, acentuadamente, cruzou a curva anterior para N10Ss- Assim para η < 3, tanto o oligonucleotídeo N10Sn quanto C10 são aniônicos e repelem-se entre si no duplex; aumentando a concentração salina da solução protege as forças repulsivas conseqüentemente a Tm aumenta. Para η > 3 NioSn torna-se catiônico e atrai C10; aqui a proteção eletrostática induzida por sal diminui a estabilidade.
Para a estabilidade de duplex de N10S3 neutro é independente da concentração salina. A comparação de temperaturas de fusão de duplexes formados por Ni0Sn (n = 0 a 6) com 5 GTGGCATCGC3 e com 5GTGGCGTCGC3'
Uma discriminação de desemparelhamento de par de base único dos conjugados de oligonucleotídeo-espermina foi testada. Dentro do contexto de seqüência de C10 = GTGGCATCGC , os dados de literatura recomendaram uma conversão de A para G centralmente localizada como sendo o teste mais severo.
As temperaturas de fusão Tm foram medidas em HEPES 10 mm pH 7,4 + NaCl 150 mm. Os perfis de fusão de todos os duplexes (3,75 nmoles em 1 ml de tampão) foram obtidos usando um Espectrofotômetro CARY 4000 equipado com uma unidade de controle de temperatura pelo aquecimento gradual das amostras (Io C/min) enquanto se registra a sua absorbância a 260 nm. A Tm é a temperatura onde a primeira curva derivada dO.D./dT = f(T) atinge o seu máximo. Os resultados são dados na Figura 7 (rombos correspondem a GTGGCATCGC e os triângulos a frGTGGCGTCGC3').
A temperatura de transição do duplex Ni0Ci0 natural em 150 mM de NaCl caiu de 50,6° C a 42,9° C, isto é, DTm = 7,7° C quando o desemparelhamento foi presente. Em princípio, a estabilidade aumentada devido às forças eletrostáticas não específicas, conjugadas na extremidade não deve comunicar especificidade de par de base, que é expressada como AAG. Isto é de fato o que foi observado, conforme o oligonucleotídeo alvo complementar e desemparelhado mostrou Tm quase-paralela = curvas f(n) com ΔTm = 7,9° C.
Análise ES-MS de oligonucleotídeos Ni0Sn purificados.
Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em 50 % de acetonitrila aquosa (v/v) contendo 1 % de trietilamina em uma concentração final de 5 χ 10-5 M. alíquotas de 100 ml foram introduzidas na fonte de íon de um espectrômetro de massa Applied Biosystems Mariner 5155 a uma razão de fluxo de 5 ml/min. Os resultados são dados na Figura 8 (influxos: espectros desconvolutos): a) N10S1, b) N10S2, c) N10S3, d) N10S4, e) N10S5, f) N10S6. A ionização dos oligômeros neutros e catiônicos N10S3^ tornou-se mais difícil e foi necessário acumular vários espectros para se obter relação de sinal para ruído aceitável.
Exemplo 3: Síntese, purificação e caracterização de oligonucleotídeos de tiofosfato de 12-mero tendo a fórmula
<formula>formula see original document page 22</formula>
Os ditos oligonucleotídeos serão a seguir designados por N12SnF (N = uma porção de oligonucleotídeo tiofosfato de 12-mero; S = um resíduo de espermina e n = 2 ou 11; F = fluoresceína conjugada à timina).
Síntese automatizada: oligonucleotídeos de tiofosfato de doze- mero de seqüência N12 = 3' GCGACTCATGAA 5' anexada com dois ou 11 resíduos de espermina S foram sintetizados usando a química da cianoetil fosforamidita de fase sólida em um sintetizador de DNA Expedite. Fosforamiditas Ultramild CE e suportes ultramild (Glen Research/Eurogentec) foram usados de modo a evitar a clivagem de oligômero durante o trabalho. Um reagente de sulfurização padrão (Glen Research/Eurogentec) foi usado para gerar as ligações de fosforotioato na porção de oligonucleotídeo de 12-mero. A Fluoresceína-dT fosforamidita (Glen Research/Eurogentec) foi usado para a rotulação da extremidade 5'. A ligação da espermina fosforamidita foi realizada usando o protocolo de ligação descrito no Exemplo 2.
As frações de Tritila foram coletadas, diluídas e analisadas em um espectrofotômetro para determinar os rendimentos de ligação gradativa.
Em todos os casos, o modo DMT-ON foi usado, mantendo o grupo DMT da extremidade 5' não clivado nos oligômeros com propósitos de purificação-identificação.
Tratamento pós sintético: Depois da síntese automatizada, a clivagem do suporte sólido e a desproteção completa de oligômeros foram realizadas pelo tratamento com amônia aquosa concentrada durante a noite na temperatura ambiente.
Purificação: Os compostos DMT-ON N12S2F e N12S11F foram purificados usando colunas Poli-Pak II® (Glen Research/ Eurogentec) de acordo com as instruções dadas pelo fabricante.
Os oligonucleotídeos purificados N12SnF (n = 2, 11) foram analisados em uma coluna de troca aniônica (SAX1000-8) em condições básicas aquosas (100 mM de amônia, pH 11) usando um gradiente de NaCl (0,75 a 2,5 M em 20 min), os traços de HPLC são mostrados na Figura 9 (A: N1211F,B: N12S2F).
A análise MALDI-TOF MS de oligonucleotídeos purificados.
Os oligonucleotídeos foram dissolvidos em 500 μl de água deionizada. A amostra e a matriz HPA foram misturadas entre si na placa. Uma vez cristalizada, a amostra foi analisada com um aparelho BRUKER Ultraflex MS. Os resultados são dados na Figura 10 A: N12S2F calc 5460, encontrado 5459 (superior) e Figura 10 B: N12S11F calc: 9135 encontrado: 9125 (inferior). Exemplo 4: Invasão de filamento de DNA plasmídico com oligonucleotídeos fluorescentes de 14-mero e 20-mero
<formula>formula see original document page 24</formula>
Os compostos mostrados acima serão em seguida designados por N14SnF (N = uma porção de oligonucleotídeo; S = um resíduo de espermina com η = 2 a 4; F = um resíduo de fluoresceína) e por N2oSnF( N = uma porção de oligonucleotídeo; S = um resíduo de espermina com η = 3 a 5; F = um resíduo de fluoresceína).
Estes oligonucleotídeos fluorescentes foram sintetizados seguindo o procedimento descrito no exemplo 2. 5 -Fluoresceína fosforamidita (Glen Research/Eurogentec) foi usado para rotular a extremidade 5'. Os traços de HPLC analítica e os espectros de MALDI-TOF MS para a maioria dos compostos de N14S4F e N20S5F substituídos são mostrados nas figuras 11 e 12 como provas de pureza e estrutura (Ni4S4F calc 6470, encontrado 6478; N2OS5Fcalc 8813, encontrado 8815), respectivamente.
As seqüências de oligonucleotídeo de N14SnF e N20SnF foram escolhidas dentro da seqüência de gene da Luciferase do plasmídeo de controle pGL3 (Promega). Para avaliar a especificidade de seqüência da invasão de filamento, o plasmídeo de controle pGL2 (Promega) foi usado. A seqüência da GL2 Luciferase é 95 % idêntica a GL3, e as seqüências alvejadas por N14SnF e N20SnF contêm respectivamente um e dois desemparelhamentos.
A capacidade de N14SnF e N20SnF para invadir o filamento o plasmídeo pGL3 e não pGL2 foi testado em sal fisiológico e condições de temperatura.
Os conjugados fluorescentes N14S^nF e N20S^nF (8,65 pmol) foram adicionados a uma solução de plasmídeo (1,5 μg, 0,43 pmol em 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl). As misturas foram incubadas 24 horas a 37° C e carregada em um gel de agarose (1,3 % em TAE pH 7,4). A eletroforese foi realizada na temperatura ambiente por 45 min depois do que a emissão de fluoresceína verde foi detectada pela varredura do gel usando um Typhoon 8600 Imager. Um quadro de fluorescência vermelha do gel foi absorvida em um transiluminador UV a seguir de uma incubação de 15 min em solução de brometo de etídio. Os resultados são dados na Figura 13.
As fluorescências vermelha e verde são evidência de DNA plasmídico de filamento duplo e oligonucleotídeo fluorescente, respectivamente. A sua colocalização com pGL3 e não com pGL2 é assim evidência para a invasão de filamento. Os compostos N14S3F e N2oSnF mostrou uma faixa fluorescente verde débil associada com o plasmídeo quando incubado com pGL3 e não com pGL2.
Exemplo 5: Penetração de oligonucleotídeos catiônicos em células.
As células Hela, cultivadas em soro de bezerro fetal a 10 % (v/v) contendo meio MEM, foram plaqueados a 50-60 χ 10^3 células/ reservatório em placas de Lab-Tek de borossilicato de câmara de 4 reservatório um dia antes do experimento. O meio completo foi substituído por 0,5 ml de meio MEM isento de soro. Uma formulação de oligonucleotídeo conjugado com fluoresceína 5'-catiônico F-S18N19 (onde N19 é TCGAAGTACTCAGCGTAAG) foi preparada em PBS estéril. Esta foi adicionada às células a uma concentração final de 2 μΜ. Quatro horas mais tarde, o meio foi substituído por 1 ml de meio contendo soro fresco. Um primeiro quadro foi tirado com um microscópio de fluorescência Zeiss axiovert 25, equipado com um filtro FITC (Figura 14 A, esquerda). Todas as células tornaram-se fluorescentes, com alguma fluorescência localizada em vacúolos intracelulares e, mais importantemente, também espalhado por todo o citoplasma e núcleo. Depois de 24 horas, o meio foi substituído com 1 ml de meio MEM isento de vermelho de fenol. Iodeto de propídio (1 mM em água) foi adicionado a uma concentração final de 10 μΜ. Dez minutos mais tarde, um segundo quadro foi tirado mostrando uma maioria de células saudáveis isentas de propídio que ainda foram fluorescentes (Figura 14 B, direita). As células de controle que foram incubadas em condições similares com oligonucleotídeo F-Nl 9 não mostraram nenhuma fluorescência.
A invenção assim fornece uma síntese automática versátil de oligonucleotídeos catiônicos que formam complexos rápidos e estáveis com a sua seqüência complementar mesmo em um contexto de invasão de filamento. Devido à conjugação final, a seletividade de seqüência permanece tão alta como para os oligonucleotídeos naturais. Além disso, graças à sua natureza catiônica, a liberação intracelular não requer a formação de complexo com moléculas carreadoras catiônicas. Quando juntas, estas propriedades tornam os conjugados de oligonucleotídeo-oligocátion alternativas atraentes para os oligonucleotídeos para a biologia molecular, diagnósticos assim como aplicações terapêuticas. LISTAGEM DE SEQÜENCIA
<110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)
<120> OLIGONUCLEOTÍDEOS CATIÔNICOS, MÉTODOS AUTOMATIZADOS PARA PREPARAR OS MESMOS E SEUS USOS
<130> CP/BB 61802-2665
<150> US 60/750 346 <151> 2005-12-15
<160> 7
<170> Patentln version 3.3
<210> 1 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 1
gtggcatcgc 10
<210> 2 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 2
gtggcgtcgc 10
<210> 3 <211> 10 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 3
caccgtagcg 10
<210> 4 <211> 12 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 4
gcgactcatg aa 12
<210> 5 <211> 14 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 5
tcgccaaggt agaa
<210> 6 <211> 20 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 6
aggtcgccaa ggtagaaggt
<210> 7 <211> 19 <212> DNA
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> oligonucleotideo <400> 7
tcgaagtact cagcgtaag
Claims (19)
1. Moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion AiBjH5 caracterizadas pelo fato de que podem ser sintetizadas por intermédio da química da fosforamidita automatizada tendo porções de oligonucleotídeos Ai e porções de oligocátions Bj, em que . Ai é um resíduo de oligonucleotídeo i-mero, com i = 5 a 50, com nucleobases que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente e/ou grupos pentafuranosil e/ou ligações de fosfodiéster nativas, por exemplo selecionado do grupo que compreende desoxirribo, ribo, (LNA) nucleotídeos bloqueados assim como suas modificações ou substituições químicas, . Bj é uma porção de oligocátion orgânico j-mero, com j = Ia -50, onde B é selecionados do grupo que compreende • -HPO3-R1-(X-R2n)nI-X-R3-O-, onde R1, R2n e R3, idênticos ou diferentes, são alquileno inferior, X é NH ou NC(NH2)2, e nl = 2 a 20, • -HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-, onde R4 é alquileno inferior, R5 e R6, idênticos ou diferentes, são alquileno inferior e X1 é um resíduo de putrescina, espermidina ou espermina, • -HPO3-R -(aa)n2-R -O-, onde R é alquileno inferior e R é alquileno inferior, serina, um aminoálcool obtido pela redução de um aminoácido natural, (aa)^ é um peptídeo contendo aminoácidos naturais com cadeias laterais catiônicas, e n2 = 2 a 20.
2. Moléculas de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que o oligonucleotídeos é selecionado no grupo compreendendo desoxirribo, ribo, (LNA) nucleotídeos bloqueados assim como suas modificações ou substituições químicas.
3. Moléculas de acordo com a reivindicação 2, caracterizadas pelo fato de que as modificações ou substituições químicas são fosforotioato, 2'-fluoro, 2 -O-alquila.
4. Moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 3, caracterizadas pelo fato de que o grupo marcador é um agente fluorescente.
5. Moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 4, caracterizadas pelo fato de que os aminoácidos são Arginina, Lisina, Ornitina, Histidina, Acido diaminopropiônico.
6. Moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 5, caracterizadas pelo fato de que têm a seqüência
7. Moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 5, caracterizadas pelo fato de que têm a seqüência B-3" A5".
8. Moléculas de acordo com qualquer uma das reivindicações -1 a 5, caracterizadas pelo fato de que têm as seqüências B-3A5 -B ou 3 A5 -B- -3A5' assim como combinações dos mesmos.
9. Método para a obtenção de moléculas de oligonucleotídeo- oligocátion como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser pelo uso de uma síntese gradativa em um sintetizador de oligonucleotídeo, por intermédio da via da fosforamidita, compreendendo: - tampar frascos contendo oligocátions B ativados e protegidos a um sintetizador de oligonucleotídeo, além dos frascos de oligonucleotídeos A, ou o reverso, - interromper a síntese, quando o comprimento desejado é obtido, - clivar os oligômeros do suporte sólido, e - remover os grupos de proteção.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que os reagentes de fosforamidita são selecionados do grupo que compreende: • P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)-X-R3-O-Prot, onde R1, R2, R3, n e n1 são como definidos acima, X é NH ou NC(NH2)2 adequadamente protegido, R9 é -CH2CH2CN, ou alquila inferior, R10 é alquila inferior, ou - N(R10)2 é grupo pirrolidino, piperidino ou morfolino, e Prot é um grupo de proteção usado na síntese de oligonucleotídeo, tal como DMT, MMT; • P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot, onde R4, R5, R6 são alquileno inferior, X é putrescina, espermidina ou espermina adequadamente protegidos, R9 e R10 são como definidos acima; • P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R8-O-Prot, onde R7, R85R9, R10, n2, (aa)n2 e Prot são como definidos acima.
11. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a síntese gradativa da seqüência de oligonucleotídeo é seguida pela síntese gradativa da porção de oligocátion para se obter compostos tendo a seqüência (A3' - B5').
12. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que a síntese gradativa da porção de oligocátion é seguida pela síntese gradativa da seqüência de oligonucleotídeo para se obter os compostos da seqüência (B3' - A5').
13. Método de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que compreende a síntese de seqüências mistas.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que compreende a síntese de seqüências de oligonucleotídeo capeadas em ambas as extremidades (B-3' A5' -B) ou seqüências de oligonucleotídeo das seqüências interrompidas por cátion ( 3'A5' -B-3' A5' ).
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de -9 a 14, caracterizado pelo fato de que os oligocátions B ativados e protegidos são obtidos pela proteção dos grupos amino de uma poliamina, seguido por a, ω-bis hidroxilalquilação, levando aos dióis compatíveis com a síntese de oligonucleotídeo.
16. Reagentes de fosforamidita como compostos intermediários, caracterizado pelo fato de que são da fórmula: • P(OR9)(N(R10)2)-O-R1-(X-R2)-X-R3-O-Prot, onde R1, R2, R3, e nl são como definidos acima, X é NH ou NC(NH2)2 adequadamente protegido, R9 é -CH2CH2CN, ou alquila inferior, R10 é alquila inferior, ou - N(R10)2 é grupo pirrolidino, piperidino ou morfolino, e Prot é um grupo de proteção usado na síntese de oligonucleotídeo, tal como DMT, MMT; • P(OR9)(N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot, onde R4, R5, R6 são alquileno inferior, X é putrescina, espermidina ou espermina adequadamente protegidos, R9 e R10 são como definidos acima; • P(OR9)(N(R10)2)-O-R7-(aa)n2-R8-O-Prot, onde R7, R8, R9, R10, n2, e Prot são como definidos acima.
17. Método para uso em biologia e diagnóstico, caracterizado pelo fato de compreender uso de moléculas de oligonucleotídeo-oligocátion como definidas em qualquer uma das reivindicações 1 a 8.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de ser para uso em PCR, PCR em tempo real, genotipagem, hibridização in situ e na manufatura de chips de DNA.
19. Composições farmacêuticas, caracterizadas pelo fato de que compreendem uma quantidade eficaz de moléculas de oligonucleotídeo- oligocátion como definidas em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, em associação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
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| US8583380B2 (en) | 2008-09-05 | 2013-11-12 | Aueon, Inc. | Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options |
| WO2011034605A2 (en) | 2009-09-16 | 2011-03-24 | Genentech, Inc. | Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof |
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| DK2711370T3 (en) | 2011-05-17 | 2018-02-26 | Ajinomoto Kk | PROCEDURE FOR THE PREPARATION OF OLIGONUCLEOTIDES |
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| MX2014009565A (es) | 2012-02-10 | 2014-11-10 | Genentech Inc | Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros. |
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| WO2014072357A1 (en) | 2012-11-06 | 2014-05-15 | Interna Technologies B.V. | Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated b-raf pathway |
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