BRPI0620141B1 - Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, inibidor para a atividade de uma célula produtora de interferon, reagente para detecção de célula produtora de interferon, método de detecção de célula produtora de interferon, método in vitro de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon, hibridoma, método de produção de um anticorpo monoclonal, polinucleotídeo isolado e vetor - Google Patents

Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, inibidor para a atividade de uma célula produtora de interferon, reagente para detecção de célula produtora de interferon, método de detecção de célula produtora de interferon, método in vitro de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon, hibridoma, método de produção de um anticorpo monoclonal, polinucleotídeo isolado e vetor Download PDF

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BRPI0620141B1
BRPI0620141B1 BRPI0620141-5A BRPI0620141A BRPI0620141B1 BR PI0620141 B1 BRPI0620141 B1 BR PI0620141B1 BR PI0620141 A BRPI0620141 A BR PI0620141A BR PI0620141 B1 BRPI0620141 B1 BR PI0620141B1
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Yumiko Kamogawa
Minkwon Cho
Naoko Arai
Koji Ishida
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Abstract

anticorpo anti-ilt7. um anticorpo que se liga a ipc foi obtido, utilizando-se uma célula animal na qual uma proteína de membrana celular, associável a ilt7, foi co-expressa como imunogene. anticorpo da invenção possui alta especificidade que possibilita distinção imunológica entre outras moléculas da família ilt e ilt7. anticorpo anti-ilt7 da invenção ligou-se a ipc e inibiu a atividade da mesma. com o anticorpo anti-ilt7 da invenção, é possível inibir a atividade da ipc e uma doença relacionada com interferon pode ser tratada ou prevenida. a expressão de ilt7 é mantida, mesmo em ipc, na presença de lfn-?. por conseguinte, pode-se prever inibição da atividade de ipc, pelo anticorpo anti-ilt7, mesmo em paciente portador de doença autoimune com produção aumentada de lfn-?.

Description

Estado da Técnica
[0001] A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga ao ILT7 humano.
Antecedentes da Técnica
[0002] O Interferon-α (IFN-a: a seguir, "interferon" é abreviado como IFN) e o interferon-β (IFN-β) são conhecidos como IFNs tipo 1 e possuem atividade antiviral ou atividade antitumoral. Por outro lado, foi exposto também que o IFN-a está relacionado com doença auto-imune. Por exemplo, produção anormal de IFN-a foi relatada em pacientes com as doenças auto-imunes abaixo. Foi sugerido também que a neutralização do IFN-a pode reduzir os sintomas das doenças auto- imunes.
[0003] Lupus eritematoso sistêmico (Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992);
[0004] Reumatismo crônico (Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988)
[0005] Casos em que sintomas das doenças auto-imunes manifes taram-se ou pioraram por administração de IFN-a2 ou IFN recombinante foram relatados (Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, l995; Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002).
[0006] Ademais, foi exposto ainda que IFN-a induz diferenciação de células dendríticas. A célula dendrítica é também uma célula apresentadora de antígenos. Por conseguinte, a indução da diferenciação de células dendríticas é considerada um importante mecanismo em doenças auto- imunes. Foi sugerido haver uma associação profunda entre a indução de diferenciação de células dendríticas, produtoras de IFN-a, e o aparecimento de lupus eritematoso sistêmico (Blanco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001). Dessa forma, foi indicado que o IFN-a está estreitamente relacionado com atividade antitumoral, bem como com doenças auto-imunes. Ademais, o IFN-a está profundamente envolvido no aparecimento de psoríase (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135143, 2005).
[0007] Células Produtoras de Interferon (IPCs) foram identificadas como células que produzem IFN tipo 1 em grandes quantidades associadas com infecção viral. Há poucas IPCs presentes no sangue. Considera-se que linfócitos do sangue periférico sejam responsáveis por 1% ou menos das IPCs. No entanto, IPCs possuem uma capacidade muito grande para produzir IFN. A capacidade de produção de IFN das IPCs atinge, por exemplo, 3000 pg/ml/104 células. Ou seja, pode-se dizer que a maior parte do IFN-a ou IFN-β presente no sangue é produzido em infecção viral resulta de IPCs, embora exista apenas um número pequeno de células.
[0008] Por outro lado, IPCs são células dendríticas linfóides não diferenciadas, consideradas células precursoras de células dendríticas, podendo ser referidas como células dendríticas Plasmocitóides. IPCs diferenciam-se em células dendríticas por estimulação de vírus e induzem a produção de IFN-y ou IL-10 pelas células T. Elas diferenciam- se também em células dendríticas por estimulação de IL-3. As células dendríticas diferenciadas, por estimulação de IL-3, induzem a produção de Th2 citoquina (IL-4, IL-5 e IL-10) pelas células T. Dessa forma, as IPCs possuem propriedades que lhes permitem diferenciar-se em células dendríticas distintas quando estimuladas diferentemente.
[0009] De acordo com o mesmo, as IPCs possuem dois perfis: células produtoras de IFN e células precursoras de células dendríticas. Ambas as células desempenham importante papel no sistema imunológico. Em outras palavras, a IPC é uma das células importantes que dão sustentação ao sistema imunológico em vários aspectos.
[00010] Documento 1 não de patente: Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, l992
[00011] Documento 2 não de patente: Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988
[00012] Documento 3 não de patente: Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995
[00013] Documento 4 não de patente: Parez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995
[00014] Documento 5 não de patente: Bianco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001
[00015] Documento 6 não de patente: Ju et al., Gene. 28 de abril de 2004 28; 331: 159-64.
[00016] Documento 7 não de patente: Colonna M et al., Seminars in Immunology 12: 121-127, 2000.
[00017] Documento 8 não de patente: Nakajima H. et al., J. Immunology 162: 5-8. 1999
[00018] Documento 9 não de patente: Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002
[00019] Documento 10 não de patente: Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005
[00020] Documento 1 de patente: WO03/12061 (Pedido de Patente Publicado U.S. N° 2003-148316)
Descrição da Invenção
[00021] Questões a serem resolvidas pela Invenção
[00022] Um objetivo da invenção é prover um anticorpo que se ligue ao transcrito 7 semelhante à imunoglobulina (ILT7) e detectar, identificar ou isolar IPCs. Outro objetivo da presente invenção é regular a atividade de IPCs.
Meios para resolução das questões
[00023] A fim de regular a atividade de um fator humoral como o IFN, a administração de anticorpos que reconheçam o fator é efetiva. Por exemplo, foram efetuadas tentativas para tratamento de doenças auto- imunes por administração de anticorpos contra interleucina (IL)-1 ou IL- 4 (Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 2001). E mais, supõe-se que anticorpos neutralizantes possam servir como agentes terapêuticos de doenças auto-imunes, conforme por meio de interferon (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Pode-se prever que algum tipo de abordagem, conforme descrito acima, tenha efeito sobre o IFN produzido pelas IPCs. No entanto, este tipo de abordagem baseia- se na inibição do efeito do fator humoral após a produção deste fator. Se a produção do fator humoral desejado puder ser controlada diretamente, efeitos terapêuticos mais substanciais podem ser atingidos.
[00024] Foram relatados anticorpos que reconhecem IPC humana. Por exemplo, o anticorpo monoclonal anti-BDCA-2 é o anticorpo monoclonal específico contra IPC humana (Dzionek A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000). Foi descoberto que o anticorpo monoclonal anti- BDCA-2 inibe efetivamente a produção de IFN pelas IPCs humanas (J. Exp. Med. 194: 1823-1834, 2001). Ademais, foi relatado também que anticorpos monoclonais que reconhecem células produtoras de interferon em camundongos, inibem a produção de interferon (Blood 2004 Jun 1; 103/11: 4201-4206.Epub 2003 Dec). Foi relatado que a redução do número de células dendríticas foi decorrente de anticorpos monoclonais contra células dendríticas plasmocitóides em camundongos (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).
[00025] Semelhantemente, será útil prover anticorpos que reconheçam IPCs humanas e que possam regular a sua atividade. Por exemplo, os presentes inventores já demonstraram que um anticorpo que reconhece Ly49Q, liga-se especificamente a IPCs de camundongos. No entanto, o anticorpo contra Ly49Q não interferiu com a atividade de IPCs de camundongos (Blood, 1° de abril de 2005, Vol. 105, N° 7, e pág. 2787-2792.; WO2004/13325). Por outro lado, ILT7 é conhecido como uma molécula cuja expressão específica é observada em células dendríticas Plasmocitóides (Ju XS et al. e Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; WO03/12061). Contudo, não foram obtidos anticorpos contra ILT7. Por conseguinte, os efeitos de anticorpos sobre IPCs são também desconhecidos.
[00026] ILT7 é uma proteína da membrana contendo motivo semelhante ao da imunoglobulina. Foi relatado que este seria uma das moléculas expressadas em células do sistema mielóide ou sistema linfático (Colonna M et al., Seminars in Immunology 12:121-127, 2000). Uma pluralidade de moléculas com estruturas análogas a de ILT7 é referida como família ILT. A família ILT é também estruturalmente semelhante a receptores inibidores de células assassinas (KIR). ILT7 possui quatro domínios tipo C semelhante aos da imunoglobulina, conforme ocorre com outras moléculas da família ILT. De acordo com o considerado, o ILT7 envie sinais de ativação celular conforme observado com ILT1, proteína semelhante a ILT1, ILT8 e LIR6a. Foi confirmado que moléculas pertencentes à família ILT são expressas em células do sistema hemócito (Young et al., Imunogeneetics 53: 270-278, 2001; "The KIR Gene Cluster" Carrington, Mary e Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2003).
[00027] De acordo com o mesmo, foram detectadas expressão alta de ILT7 em células dendríticas Plasmocitóides (PDC) e expressão baixa de ILT7 em células dendríticas derivadas de monócitos (MDDC), por hibridização subtrativa. ILT2 e ILT3 são expressos não só em PDC, mas também em DC, obtida de MDDC ou células CD34 positivas. No entanto, como o mRNA, no ILT7, foi expresso especificamente em PDC, foi constatado que o mRNA poderia servir como marcador de PDC. Adicionalmente, foi constatado que, nessa ocasião, a expressão de ILT7 foi reduzida por estimulação de CpG (Ju XS et al. Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; WO03/12061).
[00028] Os presentes inventores confirmaram que a expressão específica de ILT7 em IPC foi facilitada por meio do estudo em IPC humana. Em seguida, os presentes inventores tentaram produzir anticorpos contra ILT7 e elucidar os seus efeitos. Por exemplo, moléculas que fazem parte de famílias ILT, como ILT2 e ILT3, possuem alto nível de conservação, especialmente em relação a seqüências de aminoácidos de domínios extracelulares (Figura 9). Estas famílias ILT exibem, respectivamente, perfis de expressão característicos em várias células sangüíneas. Por conseguinte, é muito importante obter um anticorpo possa fazer a distinção, em termos imunológicos, entre moléculas de outras famílias ILT e a de ILT7. Contudo, de fato, foi difícil produzir um anticorpo que se ligue especificamente a IPCs humanas, empregando ILT7 como imunogene em virtude de os obstáculos descritos abaixo.
[00029] Em geral, uma proteína obtida por tecnologia de recombinação gênica é produzida sob a forma de imunogene para que possa ser obtido um anticorpo que reconheça traços de proteínas derivadas de organismos vivos. Os presentes inventores tentaram expressar ILT7 humano, com base em informação de uma seqüência de bases de cDNA de ILT7 humano, a qual já tinha sido descoberta, e na seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de bases (N° de acesso do GenBank NM_012276). No entanto, os presentes inventores não conseguiram produzir ILT7 humano recombinante, sob condições normais.
[00030] Freqüentemente, usa-se a seqüência parcial de aminoácidos da proteína natural como imunogene para se tentar obter um anticorpo contra a proteína. No entanto, existem poucas seqüências de aminoácidos em proteínas, específicas para ILT7 humano, uma vez que a homologia em relação a seqüências de aminoácidos é extremamente alta entre a família ILT. Ademais, é necessário selecionar a região que constitui a parte reconhecida como epítopo por anticorpos na superfície de células, de forma a possibilitar que os anticorpos reconheçam as moléculas que se encontram na superfície celular. Por conseguinte, foi considerado que a formação de um anticorpo específico contra ILT7, utilizando-se um fragmento de seqüência de aminoácidos como imunogene, não é uma opção realista.
[00031] Os presentes inventores demonstraram que um anticorpo que se liga a IPCs poderia ser obtido empregando um imunogene especial, sob estas condições. Ademais, os presentes inventores constataram que o anticorpo assim obtido reconheceu especificamente IPCs humanas e que apresentava ainda efeito de regular a atividade, obtendo, pelo menos, êxito em concluir a presente invenção. Ou seja, a presente invenção refere-se ao anticorpo anti-ILT7 seguinte e a métodos de produção e uso deste anticorpo.
Efeitos da invenção
[00032] A presente invenção provê um imunogene que pode ser utilizado na produção de um anticorpo que reconhece ILT7 humano e um método de produção de anticorpo anti-ILT7 humano, empregando o imunogene. ILT7 é uma proteína da membrana que pertence à família ILT. Particularmente, a seqüência de aminoácidos da região extracelular é altamente conservada entre famílias ILT. Por conseguinte, é extremamente difícil produzir um anticorpo que faça a distinção entre famílias ILT por métodos gerais de imunização. Os presentes inventores demonstraram que o anticorpo que reconhece ILT7 humano pode ser facilmente obtido, utilizando-se células animais nas quais o ILT7 é co- expresso com proteína da membrana celular. Este anticorpo anti-ILT7, obtido pela presente invenção, possui alta especificidade possibilitando a distinção entre células que expressam outras famílias ILT e aquelas que expressam IPCs humanas.
[00033] Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-ILT7 humano, provido pela presente invenção, liga-se a IPCs humanas. Ademais, o anticorpo da presente invenção reconhece especificamente IPCs humanas. Por conseguinte, ele é útil na detecção e isolamento de IPCs. IPC é uma célula que produz a maior parte do interferon tipo 1. Por conseguinte, a detecção e isolamento são importantes no diagnóstico e estudo de doenças que envolvem IPCs, como as doenças auto-imunes. Particularmente, de acordo com os achados da presente invenção, a expressão de ILT7 em IPCs não é reduzida sob a presença de IFN-α. A expressão do IFN-α é freqüentemente facilitada em pacientes com doenças auto-imunes. Isso significa que o anticorpo anti- ILT7 da presente invenção pode ser utilizado na detecção e isolamento de IPCs, em pacientes com doenças auto-imunes, nos quais a expressão do IFN-α é facilitada.
[00034] Em uma concretização preferida, o anticorpo anti-ILT7 provido pela invenção exerce efeito de regulação da atividade de IPCs humanas. Por conseguinte, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção pode ser utilizado para inibir a atividade de IPCs. Conforme foi descrito previamente, a expressão de ILT7 em IPCs não é reduzida sob a presença de IFN-α. Por conseguinte, se a inibição da atividade de IPCs pelo anticorpo da presente invenção for utilizada, pode-se esperar um efeito terapêutico sobre pacientes com doenças auto-imunes nos quais a expressão de IFNα encontra-se facilitada.
[00035] Poucas IPCs produzem grande quantidade de IFN. Para neutralização do IFN é necessário o mesmo número de moléculas de anticorpo e de IFN. No entanto, a ativação da produção de células é diretamente inibida na presente invenção. Em resultado, um forte efeito inibidor sobre IFN pode ser previsto mesmo se uma quantidade menor de anticorpos for utilizada, em comparação com a neutralização pelo anticorpo anti-IFN. Ademais, quando IFN é continuamente produzido, prevê-se que a neutralização por anticorpos contra IFN ocorra sob a forma de inibição transitória. Na presente invenção, como a atividade de IPCs é inibida, pode-se prever que ocorrerá um efeito inibidor sobre a produção de IFN por um período prolongado de tempo.
Breve Descrição resumida dos Desenhos
[00036] A Figura 1a exibe uma fotografia da expressão de mRNA do gene de ILT7, examinada pelo método de RT-PCR. Ela reproduz o resultado da expressão de mRNA do gene de ILT7, analisada em imunocitos humanos.
[00037] A Figura 1b é um diagrama no qual a expressão de mRNA do gene de ILT7, em vários tecidos e células humanas, é comparada e examinada utilizando o método de PCR quantitativa. O eixo horizontal exibe os tecidos e células que foram examinados e o vertical, o nível de expressão de ILT7, padronizado de acordo com o nível de expressão do gene de GAPDH.
[00038] A Figura 2 é um diagrama exibindo estruturas da proteína ILT7, em que a Figura 2(a) exibe uma seqüência de aminoácidos da proteína ILT7 e exibe ainda a seqüência estimada de sinalização de secreção e domínio transmembrana no desenho, e a Figura 2(b) exibe um diagrama esquemático de proteínas ILT7, codificadas por vetores construídos de expressão.
[00039] A Figura 3 é um diagrama resultante da introdução do vetor de expressão de ILT7 e do vetor de expressão de FcRy em células, no qual a expressão de moléculas de ILT7 na superfície celular foi examinada por FCM. O eixo horizontal exibe a intensidade de fluorescência detectada no anticorpo anti-FLAG, a saber, a intensidade, na superfície celular, da expressão de moléculas de ILT7, às quais uma etiqueta (tag) FLAG foi anexada, e o eixo vertical exibe o número de células.
[00040] A Figura 4 exibe fotografias nas quais o vetor de expressão de ILT7 e o vetor de expressão de FcRy foram introduzidos nas células e a associação de moléculas foi analisada por imunoprecipitação e pela técnica Western blotting. Os diagramas do lado esquerdo exibem resultados nos quais a molécula de ILT7 foi detectada com anticorpo anti-FLAG, após imunoprecipitação da molécula de FcRy com o anticorpo anti-myc (o desenho acima), e a molécula de FcRy foi detectada com anticorpo anti-myc (o desenho abaixo). Semelhantemente, os diagramas do lado direito exibem resultados nos quais a molécula de ILT7 foi detectada com anticorpo anti-FLAG após imunoprecipitação da molécula de FcRy com o anticorpo anti-FLAG (acima), e a molécula de FcRy foi detectada com anticorpo anti-myc (abaixo).
[00041] A Figura 5 é uma fotografia na qual foi examinada glicosilação da molécula de ILT7 pela introdução do vetor de expressão de ILT7 e do vetor de expressão de FcRy na célula e tratamento com N- glicosidase. O lado esquerdo da fotografia exibe o tamanho de ILT7, quando este não foi tratado com N-glicosidase, e o lado direito da fotografia exibe o tamanho do ILT7 quando efetuado tratamento com N- glicosidase.
[00042] A Figura 6a é um diagrama no qual a responsividade do anticorpo monoclonal anti-ILT7 produzido foi examinada por análise de FCM.(a) exibe um resultado no qual a ligação do anticorpo anti-ILT7 à fração da IPC de BDCA-2 positivo foi analisada empregando linfócitos humanos do sangue periférico e dupla coloração com o anticorpo anti- ILT7 e anticorpo anti-BDCA-2. O eixo vertical exibe a responsividade ao anticorpo anti-BDCA-2, e o eixo horizontal, a responsividade a cada um dos anticorpos anti-ILT7 produzidos.
[00043] A Figura 6b é um diagrama no qual a responsividade dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos foi examinada por análise de FCM. (b) exibe um resultado no qual a ligação do anticorpo anti-ILT7 à molécula de ILT7 foi examinada, utilizando-se células 293T, nas quais vetores de expressão de ILT7 e de FcRy foram introduzidos. O eixo vertical exibe a responsividade do anticorpo anti-FLAG, a saber, a intensidade de expressão de moléculas de ILT7, às quais uma etiqueta FLAG foi anexada, e o eixo horizontal, a responsividade dos respectivos anticorpos anti-ILT7.
[00044] A Figura 7 é um diagrama no qual a responsividade de dois clones a linfócitos humanos de sangue periférico, entre os anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, foi examinada por análise de FCM. Três gráficos na esquerda exibem os resultados do n° 11 e três gráficos na direita, os resultados do n° 17. Nos diagramas do lado esquerdo, cada eixo com a marca de ILT7 exibe a responsividade do ILT7 n° 11. Semelhantemente, nos diagramas do lado direito, cada eixo com a marca de ILT7 exibe a responsividade do ILT7 n° 17.
[00045] A Figura 8 é um resultado no qual a atividade de ligação dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos n° 11 e n° 17 a linfócitos humanos foi comparada e examinada àquela do anticorpo anti-BDCA- 2. O eixo vertical exibe a responsividade do anticorpo anti-CD123 e o eixo horizontal, a responsividade de cada anticorpo. Ou seja, cada anticorpo liga-se a uma parte da célula CD123 positiva. Este é um diagrama exibindo os resultados nos quais a responsividade foi analisada quando células linfócitos foram estimuladas por dois tipos de CpGs e IFN-a.
[00046] A Figura 9a é um diagrama exibindo seqüências de aminoácidos de moléculas de famílias com alta homologia a moléculas de ILT7. Cada seqüência de aminoácidos da região extracelular é apresentada, principalmente, como alinhamento; a Figura 9b é continuação da Figura 9a; e a Figura 9c é continuação da Figura 9b.
[00047] A Figura 10 é um resultado no qual a responsividade dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n° 11 e ILT7 n° 17, as moléculas de ILT1, ILT2 e de ILT3 foi examinada, utilizando-se células nas quais seus vetores de expressão foram introduzidos. O diagrama superior exibe os resultados quando a responsividade a células, nas quais moléculas de ILT7 com etiqueta FLAG foram expressas concomitantemente com FcRy, foi reafirmada. O diagrama inferior exibe os resultados quando a responsividade a células nas quais ILT1, ILT2, ILT3 e FcRy foram introduzidos (diagrama esquerdo: ILT7 n° 11, diagrama direito: ILT7 n° 17). O eixo horizontal exibe a responsividade de cada anticorpo anti-ILT7.
[00048] A Figura 11 é um diagrama exibindo o efeito dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n° 11 e ILT7 n° 17, sobre a capacidade interferogênica de linfócitos humanos. No diagrama, o eixo horizontal exibe a concentração de IFN-a, em sobrenadante de cultura, quando linfócitos humanos foram estimulados por vírus Influenza, e o eixo vertical exibe os anticorpos tratados. O termo "sem infecções" indica os resultados de células que não foram estimuladas pelo vírus Influenza.
[00049] A Figura 12 é um diagrama exibindo o nível de atividade de CDC (citotoxicidade complemento-dependente) dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n° 37, ILT7 n° 28 e ILT7 n° 33. Mesmo quando utilizados anticorpos monoclonais anti-ILT7 obtidos de qualquer hibridoma, foi exibido nível de atividade de CDC de 80% ou mais na concentração de anticorpos de 0,1 μg/ml ou mais alta. Quando foram utilizados anticorpos diferentes do anticorpo monoclonal anti- ILT7, não foi observado nível atividade de CDC contra células-alvo.
[00050] A Figura 13 é um diagrama exibindo internalização em células-alvo dos anticorpos monoclonais anti-ILT7 produzidos, ILT7 n° 17, ILT7 n° 26, ILT7 n° 37, ILT7 n° 28 e ILT7 n° 33.
[00051] A intensidade de fluorescência da APC indica a quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente na superfície de células antes de incubação, e esta é detectada independentemente se o complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 está presente na superfície da célula-alvo ou incorporado na célula após incubação. Por outro lado, a intensidade fluorescente da FITC indica a quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permanece sobre a superfície de células após incubação. Ou seja, a intensidade fluorescente da FITC é reduzida por internalização.
Melhor modo para Conduzir a Invenção
[00052] De acordo com o relatado, ILT7 humano (transcrito 7 semelhante à imunoglobulina) é uma molécula que se expressa especificamente em células dendríticas Plasmocitóides ( Gene. 28 de abril de 2004; 331:1 59-64.; WO03/12061). Alternativamente, é também conhecido que ILT7 humano pode ser utilizado como indicador preditivo para prognóstico de linfoma (WO2005/24043). No entanto, não foi estabelecido um método de produção de anticorpo que seja capaz de reconhecer ILT7 humano.
[00053] ILT7 humano consiste em 499 resíduos de aminoácidos, conforme exibido na SEQ ID NO: 2 e é uma proteína transmembrana tipo 1 compreendendo quatro domínios semelhantes aos da imunoglobulina, na estrutura, e uma região transmembrana (445-466; de 429 a 450 na SEQ ID NO: 2). Entre os 444 resíduos de aminoácidos, incluindo o N-terminal, 16 resíduos de aminoácidos (de -15 a -1, na SEQ ID NO: 2) são seqüências de sinalização, e de 17 a 444 resíduos de aminoácidos (de 1 a 428, na SEQ ID NO: 2) constituem um domínio extracelular. Por outro lado, a região C-terminal é um domínio extracelular. A maior parte do ILT7 humano é constituída por domínios extracelulares e 33 resíduos de aminoácidos constituem um domínio intracelular (de 467 a 499; de 451 a 483, na SEQ ID NO: 2). Não se prevê a presença de motivo envolvido em sinalização em domínio intracelular. Uma seqüência de aminoácidos, em extensão completa, do ILT7 é apresentada na SEQ ID NO: 2, sendo exibida uma seqüência de bases do cDNA codificador da seqüência de aminoácidos, na SEQ ID NO: 1. Aqui, as regiões codificadoras do peptídeo maduro (72)..(1520), exibidas na SEQ ID NO: 1, não compreendem os códons de terminação e de iniciação. Ou seja, as seqüências que codificam a proteína, nas quais os códons de terminação e de iniciação na SEQ ID NO: 1 estão compreendidos, são de 24 a 1523.
[00054] Considera-se que o sinal do ligante é transmitido a células por associação do ILT7 com uma molécula transdutora de sinal. Por exemplo, a maior parte das cadeias y do receptor FC está presente em células. Além disso, o domínio intracelular contém um motivo de ativação de imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM), o qual está envolvido na sinalização. ITAM é uma parte da seqüência de aminoácidos, comumente observado em moléculas adaptadoras, associadas com imunoreceptores, como receptores Fc. Um motivo como YxxL (SEQ ID NO: 76), alvo de tirosina fosforilação, está compreendido no ITAM e o sinal é transmitido pela fosforilação. Exemplos conhecidos da molécula transdutora de sinal que compreenda ITAM em domínio intracelular inclui CD3Z e DAP12, além de cadeia y do receptor Fc. Entre estas moléculas transdutoras de sinais, prevê-se que a molécula associada a ILT7 humano seria a cadeia Y do receptor Fc. Atualmente, não foi encontrado um ligante que se ligue a ILT7 humano.
[00055] Os presentes inventores confirmaram que ILT7 foi especificamente expresso em IPCs humanas por análise de expressão gênica. Os presentes inventores consideraram que seria útil, no estudo de IPCs, se um anticorpo capaz de distinguir ILT7 humano de outras moléculas pudesse ser imunologicamente obtido. No entanto, existem muitas moléculas com estruturas semelhantes na família ILT, incluindo ILT7. Moléculas como ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6 ou LIR-8 compreendem seqüências de aminoácidos altamente homólogas, especialmente em seus domínios extracelulares. Por conseguinte, os presentes inventores consideraram ser difícil obter um anticorpo capaz de efetuar a distinção entre estas moléculas, utilizando um peptídeo de um domínio compreendendo uma seqüência parcial de aminoácidos que constitua um domínio extracelular, como imunogene. Dessa forma, os presentes inventores tentaram produzir um anticorpo contra ILT7 humano utilizando as células que expressam ILT7 como imunogenes.
[00056] No entanto, o uso de vetores gerais de expressão não fez com que ocorresse a expressão do cDNA de ILT7 humano em células animais. Foi relatado que a molécula do ILT1 com estrutura muito semelhante a do ILT7 associa-se com a cadeia Y do receptor Fc. Ou seja, quando células nas quais a cadeia Y do receptor Fc foi expressa, como células RBL (leucemia basofílica de rato) e células P815 (mastocitoma de camundongo), foram utilizadas como células hospedeiras, foi observada a expressão do ILT1 sobre a superfície celular. No entanto, quando foi forçada a expressão de ILT1 em células 293, nas quais a cadeia Y do receptor Fc não era originalmente expressa, a expressão na superfície celular não foi observada. Por outro lado, foi demonstrado que a expressão na superfície celular do ILT1 poderia ser confirmada quando ILT1 era co-expresso com a cadeia Y do receptor Fc (Nakajima H. et al., J. Immunology 162:5-8.1999). No entanto, não há informação sobre um imunogene para produção de anticorpos contra ILT7.
[00057] Por exemplo, de acordo com o relatado, células RBL, nas quais o gene do ILT1 é introduzido, são utilizadas como imunogenes para produzir anticorpos contra ILT1. Os presentes inventores tentaram produzir anticorpos contra ILT7 utilizando a combinação de células RBL com gene de ILT7 na mesma maneira descrita. No entanto, mesmo quando foi forçada a expressão de ILT7 em células RBL (P815), a expressão sobre a superfície celular do ILT7 não foi observada e, portanto, este não poderia ser utilizado como imunogene.
[00058] Os presentes inventores conduziram pesquisa dedicada para obter o anticorpo capaz de reconhecer ILT7 humano. Em resultado, os presentes inventores constataram que o anticorpo desejado poderia ser produzido, utilizando-se uma célula especificamente transformada como imunogene e concluíram a presente invenção. Ou seja, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano e refere-se a um fragmento compreendendo a região de ligação de seu antígeno.
[00059] Na presente invenção, o ILT7 humano pode ser definido como uma molécula natural expressa em IPCs humanas ou uma molécula imunologicamente equivalente ao ILT7 expresso em IPCs humanas. Na presente invenção, a ligação de anticorpos a ILT7 humano pode ser confirmada, por exemplo, da forma como segue.
- Confirmação fundamentada em responsividade a células humanas:
[00060] De acordo com os achados dos presentes inventores, foi observada expressão específica do ILT7 humano em IPCs humanas. Originalmente, o ILT7 humano foi isolado como um gene cuja expressão é observada em células dendríticas Plasmocitóides (Blood. 2002 100; 3295-3303, Gene. 28 de abril de 2004; 331:159-64). Ademais, sabe-se também que ele pode ser utilizado como marcador de células dendríticas Plasmocitóides (WO03/12061). Supõe-se que células dendríticas Plasmocitóides e IPCs sejam populações de células em grande parte idênticas ou que grandes partes destas sejam comuns. Por conseguinte, não há contradição entre esses relatos e os achados dos presentes inventores.
[00061] Considerando esse perfil de expressão do ILT7 humano, inicialmente, a atividade de ligação de IPCs ou de células dendríticas Plasmocitóides, em relação a, pelo menos, um certo subconjunto, é uma das características importantes do anticorpo que se liga a ILT humano na presente invenção. Marcadores de superfície celular, específicos das respectivas populações celulares, podem ser utilizados para determinar se uma certa célula é IPC ou célula dendrítica Plasmocitóide. Por exemplo, a ligação às células desejadas pode ser confirmada por coloração dupla com o anticorpo que se liga a marcadores da superfície celular e o anticorpo cuja atividade de ligação deve ser verificada. Ou seja, IPCs na presente invenção compreendem, por exemplo, células que expressam BDCA2.
- Confirmação fundamentada em responsividade a células transformadas que expressam o gene de ILT7 humano:
[00062] Os presentes inventores constataram que uma característica imunológica do ILT7 expresso em IPCs humanas era reconstruída quando a expressão do gene do ILT7 era conduzida sob uma condição específica. Por conseguinte, a responsividade a ILT7 humano pode ser confirmada também com base na responsividade de anticorpos a células nas quais um gene codificador de ILT7 é artificialmente introduzido. A saber, a presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal compreendendo a seqüência de aminoácidos, que constitui um domínio extracelular, como o domínio extracelular, e que se liga a uma célula co-expressada com a molécula transdutora de sinal, ou refere-se a um fragmento compreendendo a região de ligação de seu antígeno. Nesse caso, o domínio extracelular é composto por uma seqüência de aminoácidos que corresponde da 17a à 44a posição da seqüência N-terminal de aminoácidos exibida na SEQ ID NO: 2 (de 1 a 428, na SEQ ID NO: 2).
[00063] Por exemplo, a característica imunológica do ILT7 expresso em IPCs humanas é mantida em células co-transfectadas com um vetor de expressão, compreendendo um DNA codificador de ILT7 humano e um vetor de expressão compreendendo um DNA codificador da molécula transdutora de sinal. Por conseguinte, uma molécula transformada que co-expresse ILT7 humano e a molécula transdutora de sinal é preferível para confirmar a afinidade de ligação de anticorpos ao domínio extracelular do ILT7 na presente invenção. Na presente invenção, é desejável utilizar uma célula não transformada como controle quando a responsividade de anticorpos é confirmada pelo uso da célula transformada. Além disso, é importante também confirmar que a ligação de anticorpos não é detectada quando se utiliza a mesma célula hospedeira que expressa somente a molécula transdutora de sinal como controle.
[00064] Na presente invenção, pode ser utilizada uma molécula que induza a expressão de ILT7 humano na superfície celular como a molécula transdutora de sinal para a co-expressão. A molécula transdutora de sinal na presente invenção pode ser definida também como uma molécula capaz de transmitir a característica imunológica do ILT7 humano a, pelo menos, o domínio extracelular da molécula do ILT7, em uma célula que expresse ILT7. Conforme utilizado neste pedido, o termo "característica imunológica" de ILT7 humano natural significa reconhecimento por um anticorpo que se liga a IPCs humanas.
[00065] Especificamente, é preferível utilizar cadeia y de receptor Fc ou DAP12 como molécula transdutora de sinal. Na presente invenção, a cadeia y do receptor Fc é especialmente preferida como a molécula transdutora de sinal. A cadeia y do receptor Fc é uma molécula que consiste em seqüências de aminoácidos exibidas na SEQ ID NO: 16. A molécula transdutora de sinal pode ser um fragmento, desde que ILT7 humano a ser co-expressado esteja localizado na superfície celular. Desde que ILT7 humano a ser co-expressado esteja localizado na superfície celular, a mutação ou adição da seqüência de é permitida nas seqüências de aminoácidos exibidas na SEQ ID NO: 16. Ou seja, a presente invenção provê métodos para produção de células que produzem um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, compreendendo as seguintes etapas: (1) administração de uma célula que expresse em meio exógeno uma proteína compreendendo domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula compreendendo seqüências de aminoácidos descritas na SEQ ID NO: 16 a animais imunes; e (2) seleção de um anticorpo produtor de célula que produza o anticorpo que se liga a ILT7 humano entre células produtoras de anticorpo dos animais imunes.
[00066] Subseqüentemente, como o anticorpo liga-se a ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo no qual o cruzamento com populações de células, as quais são conhecidas por expressar outras famílias ILT diferente de ILT7, não é observado. Especificamente, como o anticorpo liga-se a ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo no qual a ligação às populações celulares, as quais sabe-se expressam outras famílias ILT diferentes de ILT7, não pode ser observada sob a mesma condição na qual a ligação a IPCs foi confirmada. Conforme já descrito, por exemplo, ILT2 e ILT3 são expressos não só em PDC, mas também em DC obtidas de MDDC ou de células CD34 positiva (Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64). Por outro lado, a expressão de ILT7 não pode ser detectada em decorrência da diferenciação de IPCs em células dendríticas. Por conseguinte, o anticorpo não pode detectar a ligação a DCs, obtidas de MDDC ou de células CD34 positiva, sob a condição em que a possível confirmação da ligação a IPCs esteja compreendida no anticorpo que se liga a ILT 7 humano na presente invenção.
[00067] Foram relatados os padrões de expressão a seguir, quanto a moléculas de outras famílias ILT ("The KIR Gene Cluster" Carrington, Mary and Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), NCBI; 2003, Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64). Por conseguinte, um anticorpo que se ligue a IPCs ou PDC humanos e cuja ligação às células seguintes não pode ser confirmada é incluído em anticorpos com especificidade para ILT7: ILT1; células de linhagem mielóide (monócitos, DCs derivados de monócitos, macrófagos); ILT2; PDCs, células B, células CD34 positivas, DCs derivadas de células CD34 positivas e DCs derivadas de monócitos; ILT3; PDCs e DCs; ILT5; monócitos, DCs derivadas de células CD34 positivas e DCs derivadas de monócitos; e ILT8; células de linhagem de monócito.
[00068] Ou seja, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular de ILT7 humano na presente invenção compreende, de preferência, um anticorpo monoclonal que possua as seguintes características imunológicas: a) o anticorpo monoclonal liga-se a IPCs humanas; e b) a ligação do anticorpo monoclonal a uma ou mais das células selecionadas do grupo constituído por monócitos, macrófagos, células B, células CD34 positivas e células dendríticas derivadas destas células não pode ser confirmada, sob condições para que ocorra ligação a IPCs humanas.
[00069] Como o anticorpo monoclonal da presente invenção, é preferível utilizar um anticorpo em que a ligação a monócitos, macrófagos, células B, células CD34 positivas e células dendríticas derivadas destas células não possa ser confirmada, sob condições para que ocorra ligação, especialmente a IPCs humanas.
[00070] Alternativamente, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção, compreende, de preferência um anticorpo monoclonal que possua as seguintes características imunológicas: c) o anticorpo monoclonal liga-se à célula transformada que é co-transfectada com um vetor de expressão contendo expressamente o DNA que codifica ILT7 humano e um vetor de expressão contendo expressamente o DNA que codifica a molécula transdutora de sinal; d) a ligação à célula hospedeira, anteriormente a transformação, não pode ser confirmada sob condições para a ligação às células co-transfectadas, conforme descrito em c); ou o anticorpo monoclonal da presente invenção compreende um anticorpo monoclonal com as seguintes características imunológicas: e) a ligação à célula hospedeira que expressa somente a molécula transdutora de sinal não pode ser confirmada, sob condições para a ligação às células co-transfectadas, conforme descrito em c).
[00071] Na presente invenção, o fato de o anticorpo monoclonal anti- ILT7 não se cruzar com a família ILT de outras moléculas pode ser confirmado utilizando células nas quais foi forçada a expressão de cada família ILT. Ou seja, para expressão forçada, o cDNA que codifica seqüências de aminoácidos de cada família ILT é introduzido em uma célula hospedeira apropriada. O anticorpo monoclonal anti-ILT7', cujo cruzamento deve ser confirmado, é posto em contato com a célula transformada obtida. Em seguida, pode ser confirmado que, se a ligação do anticorpo à célula, que expressa moléculas de outra família que não a ILT7, não for observada, o anticorpo é capaz de efetuar a distinção, imunologicamente, entre moléculas de ILT7 e de outras famílias ILT. Por exemplo, em exemplos descritos abaixo, o fato de que não há cruzamento do anticorpo monoclonal anti-ILT7, obtido pela presente invenção, com ILT1, ILT2 e ILT3 é confirmado. Por conseguinte, um exemplo preferível do anticorpo monoclonal na presente invenção é o anticorpo monoclonal que se liga a ILT7, em que a ligação com a ILT1, ILT2 e ILT3 não pode ser detectada sob a mesma condição.
[00072] Particularmente, ILT2 e ILT3 são genes cuja expressão em IPCs foi confirmada (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004). No entanto, estas moléculas podem exibir perfis únicos de expressão para cada tipo de célula, dependendo dos respectivos níveis de diferenciação nas IPCs ou condições como a estimulação com vírus ou outras citoquinas. O uso de um anticorpo, capaz de distinguir imunologicamente estas moléculas da família ILT daquelas de ILT7, permite detecção específicas de alterações na expressão do ILT7.
[00073] A ligação de um anticorpo monoclonal, cuja atividade de ligação deve ser confirmada em relação a vários tipos de células, pode ser confirmada com base em, por exemplo, o princípio da citometria de fluxo. A fim de confirmar a responsividade de anticorpos, com base no princípio da citometria de fluxo, é vantajosa para marcar antecipadamente anticorpos com molécula ou grupo atômico que produza um sinal detectável. Em geral, são utilizadas as marcações fluorescentes ou luminescentes. Um classificador de células fluorescentes ativadas (FACS) pode ser utilizado para analisar a ligação dos anticorpos fluorescentes marcados a células, com base no princípio da citometria de fluxo. O uso de FACS permite a confirmação com eficiência da ligação de uma pluralidade de anticorpos a uma pluralidade de células.
[00074] Especificamente, por exemplo, o anticorpo A, previamente constatado como capaz de identificar IPCs, e o anticorpo B, cujas características de ligação a IPCS devem ser analisadas, reagem com populações celulares, compreendendo IPCs, ao mesmo tempo. O anticorpo A e o anticorpo B são marcados com sinal fluorescente que é mutuamente distinguido por estes anticorpos com antecedência. No caso em que for constatada a detecção de ambos sinais provenientes das mesmas populações de células, a ligação destes anticorpos às mesmas populações de células pode ser confirmada. Em outras palavras, é constatado que ambos anticorpos, A e B, possuem as mesmas características de ligação. No caso em que eles ligam-se a populações de células diferentes, fica claro que ambos anticorpos possuem características de ligação distintas.
[00075] Um exemplo preferível do anticorpo monoclonal na presente invenção pode compreender um anticorpo monoclonal produzido pelo hibridoma ILT7 n° 11 ou ILT7 n° 17. O hibridoma ILT7 n° 11 e o hibridoma ILT7 n° 17 foram depositados junto ao National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Internacional Depositário de Patentes, sob os Nos. de Acesso: FERM BP-10704 e FERM BP-10705, em 21 de outubro de 2005.
[00076] O conteúdo do depósito especificado é conforme segue: (a) Nome e endereço da instituição depositária
[00077] Nome: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Organismo Internacional Depositário de Patentes Endereço: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japão (código postal 305-8566) (b) Data do depósito: 21 de outubro de 2005 (c) Número de Acesso: FERM BP-10704 (hibridoma ILT7 n° 11) (d) Número de Acesso: FERM BP-10705 (hibridoma ILT7 n° 17)
[00078] O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser um fragmento compreendendo a sua região de ligação a antígeno. Por exemplo, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno, obtido por digestão enzimática de IgG, pode ser utilizado como o anticorpo na presente invenção. Especificamente, fragmentos de anticorpos como Fab e F(ab’)2 podem ser obtidos por digestão com papaína ou pepsina. É fato bem conhecido que estes fragmentos de anticorpos podem ser utilizados como moléculas de anticorpos que possuem afinidade por anticorpos. Alternativamente, anticorpos construídos por recombinação genética podem ser utilizados também desde que uma atividade ligação satisfatória a antígeno seja mantida. Exemplos dos anticorpos construídos por recombinação genética compreendem anticorpos quiméricos, anticorpos transplantados com CDR, Fvs de cadeia simples, diabodies, anticorpos lineares e anticorpos poliespecíficos, formados por fragmentos de anticorpos. É de conhecimento comum que estes anticorpos podem resultar de anticorpos monoclonais ou anticorpos que produzem células que produzem os anticorpos.
[00079] O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido, utilizando-se uma célula transformada específica como um imunogene. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método para produção de células que produzem um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, compreendendo as seguintes etapas: (1) administração de uma célula que expressa uma proteína exógena, compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula exógena associada a ILT7 humano a animais imunes; e (2) seleção de um anticorpo que produza a célula que produz o anticorpo que se liga ao ILT7 humano, proveniente de anticorpo que produza células dos animais imunes.
[00080] O anticorpo produtor de células assim obtido ou as células produzidas pelo anticorpo imortalizado são cultivados e os anticorpos monoclonais desejados podem ser recuperados das culturas. Com referência ao método de células produzidas por anticorpo imortalizado, vários métodos são conhecidos.
[00081] No método de produção do anticorpo monoclonal da presente invenção, exemplos utilizáveis da molécula, associada ao ILT7 humano para produção de célula transformada a ser utilizada como imunogene, compreende proteínas da membrana celular. Entre elas, é preferível utilizar uma molécula transdutora de sinal, localizada em membranas celulares, como a proteína da membrana celular. O termo "molécula transdutora de sinal" significa uma molécula associada a proteínas e células com estruturas de receptor no domínio extracelular que transmite a estimulação de ligantes a receptores em células. Exemplos da molécula transdutora de sinal compreendem cadeia y do receptor Fc, DAP12 ou assemelhados. Por exemplo, é preferível utilizar cadeia y do receptor Fc como a proteína da membrana celular na presente invenção. Seqüências de aminoácidos de DAP12 e cadeia y do receptor Fc humanos, bem como seqüência de bases de cDNA que codifica as seqüências, são conhecidas publicamente. Uma seqüência de bases da cadeia y do receptor Fc humano e uma seqüência de aminoácidos que é codificada pela seqüência de bases são apresentadas nas SEQ ID NOs: 15 e 16, respectivamente.
[00082] Na presente invenção, uma célula transformada a ser utilizada como imunogene pode ser obtida pelo preparo, por exemplo, de uma célula que carrega expressivamente (a) e (b) seguintes: (a) um polinucleotídeo exógeno que codifica uma seqüência de aminoácidos compreendendo um domínio extracelular do ILT7 humano; e (b) um polinucleotídeo exógeno que codifica a cadeia y do receptor Fc.
[00083] Na presente invenção, polinucleotídeo exógeno significa um polinucleotídeo que é introduzido artificialmente em uma célula hospedeira. Quando células humanas são utilizadas como as células, genes humanos são introduzidos em células humanas. Em combinação desse tipo, um polinucleotídeo introduzido artificialmente significa o polinucleotídeo exógeno. Por conseguinte, a expressão ectópica do ILT7 humano ou da cadeia y do receptor Fc humano está compreendida na expressão do polinucleotídeo exógeno.
[00084] Conforme utilizado neste pedido, o termo "domínio extracelular do ILT7 humano" significa a seqüência de aminoácidos, da 17a a 444a posição da seqüência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 2, que corresponde ao domínio extracelular da seqüência de aminoácidos (de 1 a 428 na SEQ ID NO: 2). Como seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção, é preferível utilizar a seqüência de aminoácidos que compreende cada região, por exemplo, iniciando-se do N terminal, na seguinte ordem: [Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana + região intracelular]
[00085] Alternativamente, uma seqüência de aminoácidos, desprovida parcialmente de uma região intracelular conforme descrita abaixo, é incluída na seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção. [Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana + uma parte da região intracelular]
[00086] Ademais, uma estrutura desprovida de região intracelular conforme mencionada abaixo, é incluída na seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção. [Seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana]
[00087] Na estrutura, outras regiões diferentes do domínio extracelular podem ser seqüências de aminoácidos, selecionadas da seqüência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 2, ou podem ser combinadas a outras seqüências de aminoácidos com homologia às regiões. Por exemplo, a seqüência de aminoácidos constituindo por seqüência do sinal, domínio transmembrana e região intracelular pode ser uma outra seqüência de aminoácidos de moléculas da família ILT diferente daquela do ILT7. Ou, pode estar combinada à seqüência de aminoácidos da família ILT em outras espécies diferentes da humana. Ademais, a seqüência de aminoácidos que constitui outras regiões diferentes do domínio extracelular, pode compreender uma mutação incluída entre aquelas capazes de manter a função de cada região. Alternativamente, outras regiões podem intervir entre cada região. Por exemplo, uma etiqueta (tag) de epítopo, como FLAG, pode ser inserida também entre a seqüência do sinal e o domínio extracelular. Especialmente, a seqüência do sinal é removida por processamento durante a sua transferência para superfície da membrana celular, após ter sido traduzida em proteína. Por conseguinte, seqüência arbitrária de aminoá- cidos que induza passagem da proteína traduzida para a membrana celular, pode ser utilizada como a seqüência do sinal. Mais especialmente, é preferível utilizar a seqüência de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do ILT7 humano como a seqüência de aminoácidos compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano.
[00088] Portanto, na presente invenção, uma seqüência arbitrária de bases que codifica a seqüência de aminoácidos constituindo a estrutura supramencionada [seqüência do sinal + domínio extracelular + domínio transmembrana + região intracelular] pode ser utilizada como o polinucleotídeo que constitui o polinucleotídeo exógeno descrito em (a). Por exemplo, a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 é codificada pela seqüência de bases descrita em SEQ ID NO: 1.
[00089] Na presente invenção, um vetor de expressão que carregue expressamente os polinucleotídeos (a) e (b) supramencionados pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropriada a fim de ser obtida uma célula transformada a ser utilizada como imunogene. Os polinucleotídeos (a) e (b) podem ser carregados em um vetor ou em vetores diferentes. Quando cada polinucleotídeo é carregado em vetores diferentes, a células hospedeiras são co-transfectadas com dois tipos de vetores.
[00090] Exemplos preferíveis da célula hospedeira na presente invenção compreendem células de mamíferos. Exemplos específicos da célula hospedeira compreendem células derivadas de seres humanos, macacos, camundongos ou ratos. As células derivadas de seres humanos são especialmente preferíveis como células hospedeiras. Por exemplo, é preferível utilizar células 293T derivadas de seres humanos como a célula hospedeira na presente invenção. Células 293T podem ser obtidas como a ATCC CRL-11268. Além disso, células derivadas de animais imunes podem ser utilizadas também como células hospedeiras. Quando células derivadas de animais imunes são utilizadas como imunogenes, é conferida pouca resposta imunológica às células hospedeiras. Por esse motivo, um anticorpo contra o domínio extracelular de ILT7 expresso em meio exógeno pode ser obtido eficientemente. Por conseguinte, por exemplo, quando camundongos são utilizados como animais imunes, células derivadas de camundongos podem ser utilizadas também como células hospedeiras.
[00091] Os polinucleotídeos supramencionados podem ser transformados em células, fazendo com que estes sejam carregados em um vetor capaz de induzir expressão em células hospedeiras. Podem ser utilizados vetores à disposição no mercado que possam induzir a expressão em células de mamíferos. Na presente invenção podem ser utilizados vetores de expressão como o Vetor pCMV-Script(R), Vetor PSG5 (produzido pela Stratagene) e o pcDNA3.1 (produzido pela Invitrogen).
[00092] As células transformadas assim obtidas são administradas a animais imunes juntamente com componentes adicionais como adjuvantes, se necessário. Exemplos úteis do adjuvante incluem o adjuvante completo de Freund e similares. No caso de serem utilizados camundongos como animais imunes, as células transformadas podem ser administradas em um intervalo que varia de 104 a 109 células, mais especificamente de 104 a 106 células. Em geral, doses múltiplas do imunogene são fornecidas em intervalos regulares até que o título do anticorpo esteja elevado. Por exemplo, no caso de imunização de curto prazo, as células transformadas são administradas em intervalos de 2 a 4 dias, mais especificamente, em intervalos de 3 dias. Após duas ou três administrações, é possível recuperar células que produzem anticorpos. Alternativamente, é efetuada a administração uma vez por semana e as células que produzem anticorpos podem ser recuperadas também após cinco ou seis administrações.
[00093] Na presente invenção, as células produtoras de anticorpos recuperadas são clonadas para darem origem a anticorpos monoclo- nais. É preferível que as células produtoras de anticorpos sejam imortalizadas para clonagem. Por exemplo, o método de fusão celular, conforme tipificado pelo método de hibridoma, ou transformação pelo vírus Epstein-Barr (EBV) podem ser utilizados como o método de imortalização de células produtoras de anticorpos.
[00094] Em relação às células produtoras de anticorpos, uma célula produz um tipo de anticorpo. Por conseguinte, o estabelecimento de populações celulares derivadas de uma única célula (ou seja, clonagem) possibilita a produção de anticorpos monoclonais. O método de hibridoma envolve o processo no qual células produtoras de anticorpos são fundidas a uma linhagem celular apropriada, a qual é imortalizada e submetida, em seguida, à clonagem. As células produtoras de anticorpos imortalizadas podem ser clonadas por técnica como o método de diluição limitada. É sabido que existem muitas linhagens celulares úteis para o método de hibridoma. Estas linhagens celulares são excelentes, em termos de eficiência, na imortalização de células linfocíticas e possuem vários marcadores genéticos, necessários para selecionar células que possam ser fundidas com êxito. Ademais, quando a produção de células produtoras de anticorpos é pretendida, é possível utilizar também linhagem celular desprovida da capacidade de produzir anticorpos.
[00095] Por exemplo, células P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) e P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597), de mielomas de camundongos, são amplamente utilizadas como linhagens celulares úteis para o método de fusão celular de camundongos ou ratos. Em geral, é produzido um hibridoma pela fusão de células homogêneas, enquanto que é possível obter-se também anticorpo monoclonal proveniente de hetero-hibrido- ma de espécies diferentes entre espécies estreitamente relacionadas.
[00096] Protocolos específicos da fusão celular foram publicamente expostos. Ou seja, células produtoras de anticorpos de animais imunes são misturadas a parceiros apropriados de fusão para que possa ser conduzida a fusão celular. Exemplos úteis da célula produtora de anticorpos incluem células esplênicas, células de linfócitos recolhidas do linfonodo e células B de sangue periférico. Como parceiras da fusão, várias linhagens celulares, previamente descritas, podem ser utilizadas. O método de polietilenoglicol e o de fusão elétrica podem ser utilizados para a fusão celular.
[00097] Em seguida, com base em marcadores seletivos de células fundidas, as células fundidas com êxito são selecionadas. Por exemplo, quando a linhagem celular sensível a HAT é utilizada para fusão celular, as células fundidas com êxito são selecionadas por seleção de células que crescem meio com HAT. Além disso, é efetuada a confirmação de que os anticorpos produzidos pelas células selecionadas possuem a responsividade desejada.
[00098] Cada hibridoma é selecionado com base na responsividade de anticorpos. Ou seja, o hibridoma que produz anticorpos que se ligam ao ILT7 humano é selecionado pelo método descrito previamente. De preferência, quando o hibridoma selecionado é subclonado e, em seguida, a produção do anticorpo desejado é finalmente confirmada, o anticorpo confirmado é selecionado como um hibridoma que produz anticorpo monoclonal da presente invenção.
[00099] Especificamente, o hibridoma selecionado pode ser selecionado com base na responsividade a células humanas ou a responsi- vidade à célula transformada que expressa gene de ILT7 humano. Os anticorpos que se ligam a células podem ser detectados com base no princípio empregado em imunoensaio. Por exemplo, a técnica ELISA, que usa células como antígenos, pode ser utilizada para detecção do anticorpo desejado. Especificamente, sobrenadante de cultura de hibridoma é posto em contato com um suporte sobre o qual encontra-se IPC humana ou a célula transformada utilizada como imunogene. Quando o sobrenadante da cultura contiver o anticorpo desejado, o anticorpo é capturado na célula imobilizada sobre o suporte. Em seguida, a fase sólida é separada do sobrenadante da cultura, o qual é lavado se necessário. Posteriormente, é possível detectar o anticorpo capturado na fase sólida. Um anticorpo que reconheça anticorpo pode ser utilizado para a detecção de anticorpos. Por exemplo, um anticorpo de camundongo pode ser detectado por um anticorpo antiimuno- globulina de camundongo. A detecção é fácil se o anticorpo, que reconhece um anticorpo, estiver marcado. Exemplos úteis da marcação incluem enzimas, corantes luminescentes similares.
[000100] Por outro lado, partículas e uma parede interna de uma placa de microtitulação podem ser utilizadas como o suporte sobre o qual as células são imobilizadas. As células podem ser imobilizadas sobre partículas feitas em plástico ou a superfície de um recipiente por adsorção física. Exemplos úteis do suporte para imobilização de células incluem contas feitas em poliestireno e recipientes de reação.
[000101] Na seleção de hibridomas, é possível prever a produção do anticorpo contra não só ILT7, mas também a célula hospedeira da célula transformada utilizada como imunogene. Por exemplo, conforme ilustrado nos Exemplos, quando uma célula humana for utilizada como imunogene e camundongo, como animal imune, a célula humana é reconhecida como substância estranha. Dessa forma, é predita a produção de um anticorpo que se liga à substância estranha. Na presente invenção, pretende-se obter um anticorpo capaz de reconhecer ILT7 humano. Por conseguinte, não é necessário obter um anticorpo que reconheça outros antígenos de células humanas a não ser ILT7 humano. A fim de remover hibridomas que produzam anticorpo desse tipo na seleção, anticorpos não desejados podem ser absorvidos antes de ser confirmada a responsividade do anticorpo.
[000102] Anticorpos não desejados podem ser absorvidos por um antígeno ao qual um anticorpo supostamente existente liga-se. Especificamente, por exemplo, um anticorpo contra outros antígenos, presentes em célula humana, diferentes de ILT7 humano, podem ser absorvidos por uma célula que não consegue detectar a expressão do ILT7 humano. Na presente invenção, é preferível empregar a célula hospedeira utilizada para o imunogene, como antígeno para absorção dos anticorpos não desejados. Alternativamente, a célula hospedeira que não expressa o domínio extracelular do ILT7 humano, porém que expressa a molécula associada ao ILT7, pode ser utilizada como o antígeno para absorção dos anticorpos.
[000103] Quanto ao anticorpo monoclonal cuja atividade de ligação ao antígeno é confirmada, o seu efeito real sobre a atividade da IPC é confirmado, se necessário. O efeito sobre IPC pode ser confirmado por método conforme aqueles descritos abaixo.
[000104] Quanto ao anticorpo monoclonal da presente invenção, um hibridoma produtor do anticorpo monoclonal é cultivado e o anticorpo monoclonal da presente invenção é recuperado da cultura resultante. O hibridoma pode ser cultivado in vitro ou in vivo. Se in vitro, o hibridoma pode ser cultivado em meio de cultura conhecido como o RPMI1640. A imunoglobulina secretada pelo hibridoma acumula-se no sobrenadante da cultura. Por conseguinte, o anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser obtido pela coleta do sobrenadante da cultura e sua purificação, se necessário. É mais fácil purificar a imunoglobulina quando soro não é acrescentado ao meio de cultura. No entanto, para que ocorra proliferação mais rápida do hibridoma e facilitar a produção de anticorpo, soro bovino fetal a 10% pode ser também acrescentado ao meio de cultura.
[000105] O hibridoma pode ser cultivado também in vivo. Especificamente, a cultura intraperitoneal do hibridoma pode ser realizada pela inoculação do hibridoma na cavidade abdominal de camundongos sem pêlos. Anticorpos monoclonais acumulam-se no líquido ascítico. Por conseguinte, se o líquido ascítico é obtido e purificado, conforme necessário, é possível produzir o anticorpo monoclonal requerido. Os anticorpos monoclonais obtidos podem ser apropriadamente modificados ou processados de acordo com o uso pretendido.
[000106] O anticorpo monoclonal da presente invenção pode ser expresso, obtendo-se cDNA que codifica a região de ligação ao antíge- no do anticorpo, proveniente do hibridoma, e inserção em vetor de expressão apropriado. A técnica pela qual é obtido cDNA que codifica uma região variável de anticorpo e, em seguida, expressado em célula hospedeira apropriada é conhecida. Ademais, o método pela qual é produzido um anticorpo quimérico por ligação de uma região variável, compreendendo a região de ligação a antígeno em uma região constante, é também conhecido.
[000107] Exemplos preferíveis do anticorpo monoclonal na presente invenção compreendem anticorpos monoclonais produzidos pelo hibridoma n° 11 (Número de acesso: FERM BP-10704), hibridoma n° 17 (Número de acesso: FERM BP-10705) ou pelo hibridoma n° 37. Seqüências de aminoácidos que constituem regiões variáveis destes anticorpos monoclonais, bem como seqüências de bases de cDNA que codifica os mesmos, são descritas abaixo. Por conseguinte, anticorpos quiméricos a serem obtidos pela conjugação destas regiões variáveis a regiões constantes de outras imunoglobulinas são preferíveis na presente invenção. Em seqüências de aminoácidos descritas na Listagem de seqüências, a seqüência de aminoácidos de 1 ao C terminal constitui uma proteína madura. Ou seja, a seqüência de aminoácidos consecutivos de 1 ao C terminal, de cada seqüência de aminoácidos, é uma seqüência madura de cada seqüência de aminoácidos. Por outro lado, a seqüência de aminoácidos representada por valor numérico de N terminal até -1 é uma seqüência do sinal.
[000108] Por exemplo, é possível (seqüência de aminoácidos) produzir um anticorpo quimérico constituído por (região variável) de camundongo-(região constante) de ser humano pela ligação dos genes destas regiões variáveis em uma região constante da cadeia pesada de uma IgG1 humana e um gene que codifica a região constante da cadeia leve da Igkapa humana, respectivamente. Seqüências de aminoácidos de anticorpos quiméricos desse tipo e seqüências de bases que as codificam são descritas abaixo, respectivamente. Anticorpos quiméricos especificados por estas seqüências exibem a construção de uma concretização preferida de anticorpo monoclonal anti-ILT7 na presente invenção. Nas seqüências de aminoácidos seguintes de anticorpos quiméricos, a seqüência de aminoácidos de N terminal a -1 corresponde à seqüência do sinal, e a seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal madura. Ou seja, na presente invenção, é preferível um anticorpo quimérico composto por cadeia pesada e leve, constituídas pela seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal de cada seqüência de aminoácidos.
[000109] Além disso, a atividade de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal pode ser enxertada também em outras imunoglobulinas. A região variável da imunoglobulina é composta por uma região determinante de complementaridade (CDR) e uma região estrutural. A propriedade de ligação a antígeno de cada imunoglobulina é determinada pela CDR e a estrutural mantém a estrutura da região de ligação ao antígeno. A seqüência de aminoácidos da CDR é extremamente diversificada, enquanto que a seqüência de aminoácidos da porção estrutural é altamente conservada. Sabe-se que a seqüência de aminoácidos, que constitui a CDR, está incorporada na região estrutural de outras moléculas de imunoglobulina, possibilitando que a atividade de ligação a antígeno seja enxertada. O método em que a propriedade de ligação a antígeno de imunoglobulinas diferentes é enxertada na imunoglobulina, empregando esse foi processo, foi estabelecido. Conforme utilizado neste pedido, o termo "região de ligação a antígeno" pode compreender a CDR que é enxertada na estrutura. Por conseguinte, o termo "fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno" de um determinado anticorpo monoclonal compreende um fragmento de imunoglobulina humana, incluindo a região variável à qual a CDR do anticorpo monoclonal é enxertada. Por exemplo, cada uma das seqüências de aminoácidos das regiões variáveis mencionadas acima compreende as seguintes seqüências de aminoácidos (SEQ ID NOs) como CDRs.
[000110] Com base na informação da seqüência de bases que codifica as seqüências de aminoácidos acima mencionadas e a informação da seqüência de bases que codifica a estrutura (FR) da imunoglobulina humana, pode-se criar um iniciador e o cDNA com uma seqüência de bases obtida pela conjugação de ambas as seqüências de bases, pode ser amplificado. A operação é repetida para cada estrutura e uma região variável, em que CDR1, CDR2 e CDR3 de camundongos são unidas por FR humana, pode ser construída. Ademais, quando a seqüência de bases, que codifica uma região constante da imunoglobulina humana, é conjugada conforme necessário, é possível obter um anticorpo humanizado com a região constante.
[000111] Como o anticorpo quimérico compreendendo as regiões variáveis acima ou um anticorpo humanizado ao qual CDR constituindo uma região constante é enxertada, um tipo preferível de anticorpo, na presente invenção, inclui aqueles contendo região constante derivada de IgG ou IgM. Os presentes inventores confirmaram que o anticorpo monoclonal contra ILT7 exibiu nível de atividade de CDC sobre células que expressam ILT7. Por conseguinte, o anticorpo contendo região constante derivada de IgG ou IgM exibe citotoxicidade contra células que expressam ILT7, em decorrência do efeito de CDC. Estes anticorpos são úteis para inibir o número de células que expressam ILT7, como as IPCs.
[000112] O anticorpo quimérico capaz de reconhecer ILT7 ou anticorpo humanizado, provido pela presente invenção, pode ser produzido por engenharia genética empregando polinucleotídeos que codificam estes anticorpos. Por exemplo, um polinucleotídeo representado pela seqüência de bases descritas nas SEQ ID NOs seguintes e que codifica a seqüência de aminoácidos que constitui uma proteína matura para cada seqüência de aminoácidos pode ser utilizado como polinucleotídeo codificador da região variável n°11 ou n° 17. A seqüência de aminoácidos consecutivos de 1 a C terminal, de cada seqüência de aminoácidos, corresponde a uma proteína madura. Quando cada proteína madura é expressa como uma proteína separada, é preferível posicionar o sinal de secreção no N terminal de cada seqüência de aminoácidos. Por exemplo, nas seqüências de aminoácidos apresentadas nestas SEQ ID NOs, a seqüência de aminoácidos de N terminal a -1 pode ser utilizada como seqüência do sinal quando estas proteínas são expressas em células de animais. Alternativamente, estas regiões variáveis podem ser secretadas como proteínas maduras, empregando uma seqüência arbitrária do sinal que possibilita a secreção de imunoglobulina.
[000113] Da mesma maneira conforme descrito acima, quanto ao polinucleotídeo codificador do anticorpo humanizado, é possível produzir um polinucleotídeo que expresse o anticorpo humanizado empregando a seqüência de bases que codifica uma proteína com a seqüência do sinal a ser acrescentada ao N terminal. Quando a cadeia pesada e a leve são carregadas em vetores separados, os dois vetores são transfectados na mesma célula hospedeira. As cadeias, pesada e leve, expressadas de cada vetor são utilizadas para construir uma molécula de imunoglobulina contendo as duas cadeias. Ou, um polinucleotídeo, codificador de cadeia pesada, e um polinucleotídeo, codificador de cadeia leve, podem ser carregados também no mesmo vetor. A célula hospedeira, na qual é co-transfectado um vetor carregan-do os dois polinucleotídeos, expressa a cadeia pesada e a leve e produz uma imunoglobulina com as duas cadeias.
[000114] Estes polinucleotídeos podem ser expressos como anticorpos, empregando um sistema hospedeiro-vetor capaz de expressar um gene de anticorpo. Ademais, quando são expressos sob a forma de molécula protéica simples, pela união da região variável de uma cadeia pesada com a região variável de uma cadeia leve, é possível posicionar uma seqüência do sinal no N terminal da molécula da proteína. Um exemplo conhecido deste tipo de molécula de anticorpo inclui a molécula scFv, na qual a região variável de uma cadeia pesada e a região variável de uma cadeia leve é unida por um ligante.
[000115] Cada anticorpo monoclonal assim produzido está incluído no anticorpo monoclonal da presente invenção. Em outras palavras, anticorpos monoclonais que consistem em imunoglobulina compreen-dendo a região de ligação a antígeno, codificada por polinucleotídeo derivado de cDNA codificador da região de ligação a antígeno dos anticorpos monoclonais mencionados acima, estão incluídos no anticorpo monoclonal na presente invenção.
[000116] Conforme foi descrito previamente, células RBL, nas quais foi forçada a expressão do gene de ILT1, poderiam ser utilizadas como imunogene para se obter anticorpos contra ILT1. No entanto, a expressão do ILT7 sobre a superfície das células RBL (P815) não pode ser confirmada e, dessa forma, estas não puderam ser utilizadas como o imunogene. Os presentes inventores constataram que a expressão do ILT7 humano sobre a superfície celular poderia ser induzida pela co- expressão do ILT7 humano e de outras proteínas da membrana celular que se associam ao ILT7 humano. Em seguida, os presentes inventores constataram que o anticorpo, que se liga a IPCs humanas, pode ser obtido empregando a célula transformada cuja expressão é assim induzida como imunogene, e concluíram a presente invenção.
[000117] Ou seja, a presente invenção provê o imunogene para produção do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, e compreende células de animal, nas quais (a) um polinucle- otídeo que codifica a seqüência de aminoácidos, contendo o domínio extracelular do ILT7 humano; e (b) um polinucleotídeo que codifica a cadeia y do receptor Fc, são conservados de forma a serem expressos em meio exógeno ou frações da membrana celular das mesmas.
[000118] Seis anos ou mais já transcorreram desde que a estrutura do ILT7 humano foi descoberta em 1998. No entanto, o anticorpo capaz de reconhecer especificadamente o ILT7 ainda não foi obtido. O anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 humano foi provido, empregando o imunogene da presente invenção pela primeira vez. Ou seja, a presente invenção proveu o anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 humano, o qual pode ser obtido, seguindo-se as seguintes etapas: (1) administração de uma célula que expressa em meio exógeno uma proteína, compreendendo o domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula que se associa ao ILT7 humano para animais imunes; (2) seleção de um anticorpo produtor de células que produz- zem o anticorpo que se liga ao ILT7 humano, provenientes de células produtoras de anticorpos dos animais imunes; e (3) cultura das células produtoras de anticorpos, selecio-nados na etapa (2), e recuperação de um anticorpo capaz de reconhecer o ILT7 humano das culturas.
[000119] Foi descoberto que o ILT7 humano é expresso especificamente em IPC humana. Na análise de expressão gênica por SAGE, executada pelos presentes inventores, a expressão específica do ILT7 humano em IPC humana foi confirmada também. No entanto, nos relatos anteriores, os níveis de expressão do ILT7 de ambos os casos foram analisados com base em mRNA. Como não havia sido provido o anticorpo capaz de detectar ILT7 humano, o estado da expressão protéica não foi analisada por meios convencionais. A análise protéica do ILT7 humano foi efetuada ao ser provido o anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano na presente invenção.
[000120] Os presentes inventores confirmaram efetivamente que o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, com base na the presente invenção, foi especificamente detectado em IPCs humanas. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método de detecção de células que produzem células produtoras de interferon, o qual compreende as etapas de: o contato de um anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, ou a um fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno, com uma célula em teste; e a detecção do anticorpo monoclonal ligado a células ou a um fragmento contendo a sua região de ligação a antígeno.
[000121] A detecção do ILT7 humano, de acordo com a presente invenção, possibilita a determinação se uma determinada célula é IPC. Ou seja, a presente invenção provê um método de identificação de IPCs, empregando ILT7 humano como indicador. Ou, IPCs humanas que possam ser separadas pela separação das células nas quais ILT7 humano foi detectado, com base na presente invenção. Ou seja, a presente invenção provê um método para separação de IPCs, empregando ILT7 humano como indicador.
[000122] Com base na análise por anticorpo contra ILT7 humano, foi confirmado que o nível de expressão do ILT7, em IPCs cuja diferenciação foi induzida por CpG e similares, foi reduzido. Ou seja, as IPCs antes de sua diferenciação ser induzida, podem ser especificada- mente detectadas, empregando ILT7 como indicador. Em outras palavras, o anticorpo monoclonal da presente invenção é útil, especial-mente na detecção de IPCs antes de sua diferenciação em células dendríticas. Conforme utilizado neste pedido, o termo "IPCs antes de sua diferenciação" pode ser definido como populações de células que mantêm a capacidade de produzir interferon.
[000123] Na presente invenção, o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno pode ser marcado antecipadamente. Por exemplo, anticorpos podem ser facilmente detectados com marcação com corantes luminescentes ou corantes fluorescentes. Mais especificamente, o anticorpo marcado com corante fluorescente é posto em contato com uma população de células que pode compreender IPCs e, em seguida, células às quais o anticorpo da presente invenção ligou- se podem ser detectadas utilizando o corante fluorescente como indicador. Além disso, as IPCs podem ser separadas, separando-se as células nas quais o corante fluorescente for detectado. Uma série das etapas pode ser facilmente executada de acordo com o princípio da técnica FACS.
[000124] Alternativamente, o anticorpo da presente invenção pode ligar-se a um suporte de fase sólida, como partículas magnetizadas antecipadamente. O anticorpo ligado ao suporte de fase sólida reconhece o ILT7 humano e, em seguida, as IPCs são capturadas no suporte de fase sólida, resultando na detecção ou separação das IPCs.
[000125] O anticorpo necessário para o método de detecção de IPCs, baseado na presente invenção, pode ser provido como reagente para detecção de IPCs. Ou seja, a presente invenção provê um reagente para detecção de células produtoras de interferon, compreendendo o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento compreendendo a sua região de ligação a antígeno. O reagente para detecção de IPCs da presente invenção pode ser utilizado em combinação com um controle positivo ou controle negativo além de anticorpos. Por exemplo, as células transformadas que expressam o domínio extracelular do ILT7 humano e são utilizada para o imunogene, bem como as IPCs obtidas de seres humanos, podem ser utilizadas como os controles positivos. Geralmente, somente poucas IPCs humanas podem ser obtidas do sangue periférico. Por conseguinte, é preferível utilizar, em especial uma célula transformada como o controle positivo no reagente da presente invenção. Por outro lado, uma célula arbitrária que não expressa ILT7 humano pode ser utilizada como o controle negativo.
[000126] Ou seja, a presente invenção provê um kit para detecção de IPCs humanas que compreende: (a) o anticorpo monoclonal que se liga ao domínio extrace- lular do ILT7 humano ou o fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (b) a célula que expressa uma proteína exógena, compreen-dendo o domínio extracelular do ILT7 humano e uma molécula exógena que é associada ao ILT7 humano.
[000127] Os presentes inventores analisaram o efeito do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano sobre IPCs. Em resultado, foi confirmado que o anticorpo, que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano, inibe a atividade de IPCs. Ou seja, a presente invenção refere-se a um método de inibição da atividade de células produtoras de interferon, compreendendo uma etapa em que é posto em contato qualquer um dos seguintes componentes com células produtoras de interferon: (a) um anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de células produtoras de interferon ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (b) uma imunoglobulina à qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno.
[000128] Ou, a presente invenção refere-se a um método de inibição da atividade de células produtoras de interferon em organismos vivos, compreendendo uma etapa de administração de qualquer um dos componentes seguintes aos organismos vivos: (a) o anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de células produtoras de interferon ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; (b) um fragmento compreendendo a imunoglobulina à qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo monoclonal descrito em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (c) um polinucleotídeo que codifica os componentes descritos em (a) ou (b).
[000129] Conforme utilizado neste pedido, o termo "células produtoras de interferon (IPCs)" significa células que possuem a capacidade de produzir IFN e expressar ILT7 na superfície celular. A seguir, a não se que observado de outra forma, o termo "IPCs" engloba não só células que são células precursoras de células dendríticas, mas também as células que possuem a capacidade de produzir IFN e expressar ILT7 sobre a superfície celular. Métodos de identificação destas IPCs são de conhecimento comum. IPCs podem ser distinguidas de outras células do sangue, utilizando alguns marcadores de superfície celular como indicadores. Especificamente, um perfil de marcadores de superfície celular de IPCs humanas é descrito abaixo (Shortman, K. e Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002). Nos últimos anos, um determinado relatório sugeriu também que célula BDCA-2 positiva é também definida como IPC (Dzionek, A. et a1. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000). Perfil de antígenos de superfície celular de IPCs humanas CD4 positivo, CD123 positivo, Linhagem (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) negativa e CD11c negativa.
[000130] Portanto, pode ser dito também que IPCs são células que possuem o perfil de expressão destes marcadores conhecidos e com a capacidade de produzir IFN. Além disso, IPCs incluem células em organismos vivos com a capacidade de produzir IFN, mesmo se as células pertencerem a uma população celular com perfis diferentes do padrão de expressão do perfil de expressão destes marcadores. Ademais, exemplos das características comumente observadas em IPCs humanas, são conforme seguem: Característica morfológica das células - Semelhante a células plasmáticas - Células arrendodadas com superfície celular lisa - Núcleo relativamente grande [Característica funcional das células] - Durante infecção viral, uma grande quantidade de interferons Tipo 1 é produzida em um curto período de tempo. - Diferenciam-se em células dendríticas após infecção viral.
[000131] Conforme utilizado neste pedido, o termo "inibição da atividade de IPCs" significa a inibição de, pelo menos, uma das funções das IPCs. Exemplos da função de IPCs incluem a produção de IFN e a sobrevida celular. A sobrevida celular pode ser traduzida também no número de células. Portanto, no caso de inibição de ambas ou de qualquer uma destas funções, diz-se que a atividade das IPCs está inibida. Foi descoberto que IFN tipo 1, produzido por IPCs, leva a várias doenças. Por conseguinte, a inibição do número de IPCs e da produção de IFN é útil para uma abordagem de tratamento médico destas doenças.
[000132] Por exemplo, foi ressaltada a relação entre a condição patológica de doenças auto-imunes e IFN-α. A maior parte do IFN-α é produzida por IPCs. Portanto, condições patológicas causadas por IFN- α podem ser atenuadas por inibição da produção de IF-Nα. Conforme utilizado neste pedido, o termo "inibição de produção de IFN por IPCs" significa a inibição da produção de, pelo menos, um tipo do IFN produzido pelas IPCs. O IFN preferível na presente invenção é o IFN tipo 1. Entre eles, é importante o IFN-α.
[000133] Ou seja, a presente invenção refere-se a um inibidor da produção de IFN que compreende um anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção provê um método de inibição da produção de IFN, compreendendo uma etapa de administração do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso do anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 na produção de uma composição farmacêutica para inibição da produção de IFN.
[000134] IPCs incluem células em que uma grande quantidade de IFN é produzida por um número pequeno de células. Por exemplo, células precursoras de células dendríticas, estimuladas por vírus e asseme-lhadas produzem a maior parte do IFN produzida pelo organismo vivo. A inibição do número de IPCs que produzem muito IFN resulta na supressão da produção de IFN. Portanto, condições patológicas causadas por IFN-α podem ser reduzidas por inibição do número de IPCs. Foi confirmado que anticorpo monoclonal anti-ILT7, ligado a células que expressam ILT7, e o efeito seguinte de citotoxicidade, foi conferido por Citotoxicidade Complemento-Dependente (CDC) em uma concretização preferida da presente invenção. O efeito de CDC é um dos importantes mecanismos do fármaco contendo o anticorpo. O anticorpo monoclonal anti-ILT7 da presente invenção possui também citotoxicidade potente contra células que expressam ILT7, como IPCs, decorrente do efeito de CDC do mesmo. Ou seja, quanto ao anticorpo monoclonal anti-ILT7, o efeito de inibir a produção de IFN pode ser previsto pela citotoxicidade contra IPCs, adicionalmente ao mecanismo de inibição da produção de IFN em uma concretização preferida.
[000135] O anticorpo, que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano a ser utilizado para a presente invenção, pode ser obtido de acordo com o método descrito previamente. O anticorpo na presente invenção pode ser de qualquer classe. Espécies de organismos dos quais o anticorpo deriva-se não são limitados também. Além disso, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno pode ser utilizado como anticorpo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo compreendendo a região de ligação a antígeno, obtido por digestão enzimática de IgG, pode ser utilizado como o anticorpo na presente invenção. Especificamente, fragmentos de anticorpo como Fab e F(ab’)2 podem ser obtidos por digestão com papaína ou pepsina. É bem conhecido que estes fragmentos de anticorpo podem ser utilizados como moléculas de anticorpo com afinidade de anticorpos. Alternativamente, anticorpos construídos por recombinação genética podem ser utilizados também, desde que seja mantida atividade satisfatória de ligação a antígeno. Exemplos dos anticorpos construídos por recombinação genética incluem anticorpos quiméricos, anticorpos com transplante de CDR, Fvs de cadeia simples, diabodies, anticorpos lineares e anticorpos poliespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. É de conhecimento comum que estes anticorpos podem ser formados empregando anticorpos monoclonais.
[000136] Na presente invenção, anticorpos podem ser modificados, se necessário. De acordo com a presente invenção, o anticorpo que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano possui efeito de inibição sobre a atividade de IPCs. Ou seja, é contemplado que o próprio anticorpo possua citotoxicidade contra IPCs. São conhecidas subclasses de anticorpos que exibem efeito potente sobre atividade. Alternativamente, o efeito inibidor sobre a atividade de IPC pode ser intensificado ainda, modificando-se os anticorpos com um agente citotóxico. Exemplos do agente citotóxico são descritos abaixo. Toxinas: Endotoxina de pseudomonas (PE), toxina diftérica, ricina Radioisótopos: Tc99m, Sr89, I131, Y90 Agentes anticâncer: caliquemicina, mitomicina, paclitaxel
[000137] Proteínas constituídas por toxinas podem ser conjugadas a anticorpos ou a seus fragmentos com um agente bifuncional. Alternativamente, um gene codificador de toxina é unido a um gene codificador de anticorpo e as proteínas de fusão de ambos os genes podem ser obtidas também. Também é conhecido o método de conjugação de anticorpos a radioisótopos. Por exemplo, o método de marcação de anticorpos com radioisótopos, em que é empregado agente de quelação, é conhecido. Ademais, os agentes anticâncer podem ser conjugados a anticorpos usando cadeias de açúcares ou o reagente bifuncional.
[000138] Os presentes inventores confirmaram um fenômeno no qual um anticorpo monoclonal, ligado a ILT7 expresso em membrana celular, é incorporado em células após a ligação (internalização). Por conseguinte, os agentes citotóxicos podem ser liberados para células pelo contato de anticorpos conjugados a estes agentes citotóxicos da presente invenção com células que expressam ILT7. Ou seja, a presente invenção provê um inibidor ativo de células que expressam ILT7, o qual compreende o anticorpo monoclonal anti-ILT7, ao qual o agente citotóxico é conjugado, como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção refere-se ao uso de anticorpo anti-ILT7, ao qual o agente citotóxico é conjugado, na produção do inibidor ativo de células que expressam ILT7. Além disso, a presente invenção provê um método de inibição da atividade de células que expressam ILT7, compreendendo a etapa de administração do anticorpo anti-ILT7 ao qual o agente citotóxico é conjugado.
[000139] Na presente invenção, um anticorpo cuja estrutura é artificialmente modificada pode ser utilizado também como ingrediente ativo. Por exemplo, vários métodos de modificação são conhecidos para melhorar a citotoxidade e estabilidade de anticorpos. Especificamente, é conhecido um método em que cadeias de açúcar de cadeias pesadas de uma imunoglobulina são modificadas (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278:3466-3473. 2003). A atividade de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) da imunoglobulina foi intensificada pela modificação de cadeias de açúcar. Ou, uma imunoglobulina em que a seqüência de aminoácidos da região Fc é modificada é um método conhecido também. Ou seja, a atividade de ADCC foi intensificada, aumentando-se artificialmente a atividade de ligação da imunoglobulina ao receptor Fc (Shield, RL. et al. J. Biol. Chem. 276; 6591-6604, 2001).
[000140] IgG, ligada ao receptor Fc, é incorporada em células uma vez. Em seguida, a IgG liga-se ao receptor Fc, expresso no endossoma, e é liberada no sangue mais vez. Esse fenômeno foi descrito. IgG com alta afinidade de ligação a receptor Fc apresenta uma chance melhor de ser liberada no sangue de novo após a sua incorporação em células. Em resultado, o tempo de permanência da IgG no sangue é ampliado (Hinton, PR. et al. J Biol Chem. 279: 6213-6216. 2004). Além disso, diz- se que a modificação da seqüência de aminoácidos da região Fc faz que ocorra uma alteração na atividade de citotoxicidade complemento- dependente (CDC). Estes anticorpos modificados podem ser utilizados como o anticorpo na presente invenção.
[000141] Quando o anticorpo que se liga ao domínio extracelular do ILT7 humano é posto em contato com IPCs, a atividade das IPCs é inibida. Por conseguinte, estes anticorpos podem ser utilizados para um inibidor ou método de inibição da atividade de IPCs. Ou seja, a presente invenção provê um inibidor ativo de IPCs, o qual compreende, pelo menos, um componente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes como ingrediente ativo. Ou, a presente invenção refere-se a um método de inibição da atividade de IPCs, compreendendo uma etapa de administração de, pelo menos, um componente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de, pelo menos, um componente selecionado do grupo constituído por (a) a (c) seguintes, na produção de inibidor ativo de IPCs: (a) o anticorpo monoclonal que se liga ao ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; (b) a imunoglobulina a qual uma região determinante de complementaridade do anticorpo descrito em (a) é enxertada ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno; e (c) um polinucleotídeo que codifica os componentes descritos em (a) ou (b).
[000142] Na presente invenção, o anticorpo monoclonal que pode reconhecer o domínio extracelular do ILT7 humano pode ser utilizado como o anticorpo monoclonal que inibe a atividade de IPCs. Na presente invenção, um ou mais anticorpos monoclonais podem ser utilizados. Por exemplo, um ou mais anticorpos monoclonais que reconhecem o domínio extracelular do ILT7 humano são misturados para uso na presente invenção.
[000143] Pode ser confirmado que anticorpos possuem efeito inibidor sobre produção de IFN por IPCs da maneira descrita abaixo. IPCs produzem uma grande quantidade de IFN, decorrente de estimulação viral. São fornecidos anticorpos contra IPCs antes, após ou ao mesmo tempo da estimulação, de IPCs, com vírus. A capacidade de produzir IFN, individualmente para as IPCs resultantes, é comparada àquela de cada controle para o qual anticorpos não foram fornecidos. A capacidade de produzir IFN pode ser avaliada pela medição de IFN-a ou IFN-β, contido no sobrenadante da cultura de IPCs. Em resultado da comparação, pode ser confirmado que os anticorpos testados são eficazes na inibição da capacidade de produzir IFN quando a quantidade de IFN, no sobrenadante, é diminuída significativamente pela adição de anticorpos. Estes métodos de medição de IFN são conhecidos. IPCs produzem a maior parte do IFN presente no organismo vivo. Por conseguinte, o nível de produção de IFN, no organismo vivo, pode ser regulado pela inibição da capacidade de produzir IFN de IPCs.
[000144] Na presente invenção, a atividade de IPCs abrange a manutenção do número de IPCs. Por conseguinte, a inibição da atividade de IPCs na presente invenção compreende a inibição do número de IPCs. Quando é confirmado que o número de IPCs é diminuído, sob a presença de anticorpos, pode ser constatado que os anticorpos estão inibindo a atividade de IPCs. Conforme com a produção de IFN, uma imunoglobulina inerte, derivada da mesma espécie animal, como o anticorpo cuja atividade deva ser confirmada, pode ser utilizada como controle comparativo. O número de IPCs pode ser quantitativamente comparado pela contagem de células. O número de células pode ser contato com FACS ou um microscópio.
[000145] Além disso, diz-se que IPCs são diferenciadas em células que induzem Th2, referidas como célula dendrítica 2 (DC2), em resultado de infecção com vírus ou similares. Se a produção de IFN de IPCs por estimulação viral pode ser inibida, a sua diferenciação em Th2 pode ser inibida também. Por conseguinte, pode ser previsto que o anticorpo monoclonal da presente invenção, inibidor da produção de IFN, pode ter também um efeito terapêutico sobre várias doenças alérgicas.
[000146] Quando o anticorpo que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano é administrado a um hospedeiro de espécie diferente daquela do organismo do qual o anticorpo é derivado, pode ser desejado que o anticorpo seja processado de forma a dificultar que o hospedeiro o reconheça como substância estranha. Por exemplo, a imunoglobulina não é facilmente reconhecida como substância estranha se o anticorpo for processado de forma a resultar as moléculas abaixo. A técnica de processamento de moléculas de imunoglobulina, conforme descrita abaixo, é conhecida. Fragmento compreendendo a região de ligação a antígeno desprovida de região constante (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, terceira edição, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996) - Anticorpo quimérico composto pela região de ligação a antígeno do anticorpo monoclonal e a região constante da imunoglobulina do hospedeiro ("Gene Expression Experiment Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994) - Anticorpo com CDR substituída, no qual a região determinante de complementaridade (CDR) da imunoglobulina do hospedeiro é substituída pela CDR do anticorpo monoclonal ("Gene Expression Experiment Manual", Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994)
[000147] Alternativamente, é possível obter um anticorpo humano, empregando-se animais não humanos, no qual um gene de anticorpo humano é incorporado, como animais imunes, embora os animais não humanos tenham sido utilizados. Por exemplo, o uso de camundongos transgênicos com genes de anticorpo humanos, como animais imunes, foi posto em prática para produção de anticorpos humanos (Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4:85-95, 2002). O uso destes animais possibilita obter o anticorpo humano que reconhece ILT7, empregando imunogenes conforme descrito anteriormente. É preferível administrar anticorpo humano a seres humanos.
[000148] Alternativamente, um gene de região variável de imunoglobulina humana pode ser obtido também pelo método de exibição em fago (MacCafferty J. et al., Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. al., Curr Opin Biotechnol. Dez. de 2002; 13(6): 598602). No método de exibição em fago, um gene que codifica a região variável de uma imunoglobulina humana é incorporado em um gene de fago. É possível também produzir uma biblioteca em fago, utilizando-se vários genes de imunoglobulina como fonte. Um fago expressa uma região variável sob a forma de proteína de fusão da proteína composta pelo fago. A região variável expressa pelo fago, em sua superfície, mantém a atividade de ligação a antígeno. Por conseguinte, são selecionados fagos que se ligam a antígenos ou células nas quais antígenos são expressos e, pelo menos, possibilitando a triagem de um fago no qual uma região variável com a atividade de ligação desejada esteja conservada nas partículas do fago assim selecionado. Ou seja, no método de exibição em fago, um gene que codifica uma região variável com a atividade de ligação desejada pode ser obtido, empregando-se a atividade de ligação como indicador.
[000149] No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs na presente invenção, o anticorpo que reconhece o domínio extracelular do ILT7 humano ou o fragmento de anticorpo que compreende, pelo menos, a região de ligação a antígeno do anticorpo pode ser administrado, sob a forma de proteína ou de polinucleotídeo que codifica a proteína. Na administração de polinucleotídeos, é conveniente utilizar um vetor, no qual um polinucleotídeo que codifica a proteína desejada esteja sob controle de um promotor apropriado para que ocorra a expressão da proteína desejada. Um intensificador e terminador podem ser também colocados no vetor. Vetores que carregam gene da cadeia pesada e da leve que constituem uma imunoglobulina e que são capazes de expressar uma molécula de uma imunoglobulina são conhecidos.
[000150] O vetor capaz de expressar a imunoglobulina pode ser administrado por sua introdução em células. Na administração a organismos vivos, um vetor que pode ser infectado com células pela administração aos organismos vivos pode ser administrado diretamente. Uma vez separados os linfócitos dos organismos vivos, o vetor é então introduzido nos linfócitos, os quais podem ser, mais uma vez, devolvidos aos organismos vivos (ex vivo).
[000151] No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs, de acordo com a presente invenção, em relação à quantidade de anticorpo monoclonal a ser administrada aos organismos vivos, a administração da imunoglobulina varia geralmente de 0,5 mg a 100 mg, por exemplo, 1 mg a 50 mg, de preferência de 2 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Intervalos de administração do anticorpo a organismos vivos podem ser adequadamente ajustados de forma a ser mantida uma concentração eficaz da imunoglobulina nos organismos vivos durante o período de tratamento. Especificamente, por exemplo, o anticorpo pode ser administrado de 1 a 2 semanas. A via de administração é opcional. Especialistas na técnica podem selecionar adequadamente uma via de administração efetiva em tratamentos. Exemplos específicos da mesma incluem administração oral ou parenteral. Os anticorpos são administrados por via sistêmica ou tópica, por exemplo, por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção subcutânea ou similares. Exemplos de formulação apropriada para administração parenteral na presente invenção incluem soluções injetáveis, supositórios e aerossóis. Quando o anticorpo é fornecido às células, a imunoglobulina é acrescentada ao meio de cultura, em geral, em torno de 1 μg/ml, preferencialmente 10 μg/ml, mais preferencialmente 50 μg/ml e ainda mais preferencialmente, 0,5 mg/ml.
[000152] No inibidor ativo de IPCs ou o método de inibição da atividade de IPCs da presente invenção, o anticorpo monoclonal pode ser administrado a organismos vivos por métodos opcionais. Geralmente, o anticorpo monoclonal é misturado a um adjuvante farmacêuticamente aceitável. Se necessário, o anticorpo monoclonal pode ser misturado a agentes adicionais, como espessantes, estabilizantes, conservantes e solubilizantes. Exemplos deste adjuvante ou agente adicional incluem lactose, ácido cítrico, ácido esteárico, estearato de magnésio, sacarose, amido, talco, gelatina, ágar, óleo vegetal e etilenoglicol. O termo "farma- ceuticamente aceitável" significa aprovado por agência reguladora em cada governo ou listado na Farmacopéia em cada país ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, em mamíferos e, mais especialmente, em seres humanos. O inibidor ativo de IPCs da presente invenção pode ser provido também sob a forma de pó liofilizado ou comprimidos em doses únicas ou múltiplas. Além disso, os pós liofilizados ou comprimidos podem ser utilizados em combinação com água para injetáveis esterilizada, solução de sal fisiológico ou solução para dissolução das composições para que atinjam a concentração desejada antes de serem administrados.
[000153] Além disso, quando o anticorpo monoclonal é administrado sob a forma de vetor que expressa imunoglobulina, a cadeia pesada e a leve são co-transfectadas em outro plasmídeo, e cada plasmídeo pode ser administrado, variando de 0,1 a 10 mg, por exemplo, 1 a 5 mg por kg de peso corporal. A fim de introduzir os plasmídeos nas células in vitro, o teor dos vetores a ser utilizado é de 1 a 5 μg/106 células. Abaixo, a presente invenção será especificamente descrita em referência a Exemplos.
[000154] Todos os documentos da técnica anterior, mencionados no presente, são aqui incorporados em sua totalidade por referência neste pedido.
EXEMPLOS Exemplo 1 A. Análise de expressão do ILT7 A-1) Análise utilizando biblioteca de SAGE
[000155] A expressão gênica em monócitos humanos, IPCs e em IPCs, tratadas com HSV, é comparada e analisada pelo método de Análise Serial de Expressão Gênica (Nome comercial; SAGE). O método da análise é executado de acordo com o seguinte. Os monócitos e IPCs, provenientes de sangue periféricos, foram separados em células BDCA-4 positivas e células CD14 positivas, respectivamente, empregando um classificador de células. Além disso, as IPCs foram permaneceram em cultura por 12 horas sob a presença do Vírus Herpes Simplex (HSV) e, em seguida, as IPCs diferenciadas foram preparadas. Foi obtido o RNA das respectivas células, seguido pela produção de biblioteca de SAGE, utilizando-se kit de I-SAGE (Nome comercial) (produzido por Invitrogen). Os dados sobre as seqüências de bases obtidas de aproximadamente 100.000 etiquetas (tags) foram analisados com o Software de Análise de SAGE (produzido por Invitrogen). Em resultado, foi descoberto um gene cujo valor de pontuação de monócito/IPC/IPC+HSV é 0/16/0, a saber, ILT7 (Gen Bank Acc#NM_012276), conhecido como um gene que exibe expressão específica de IPC. ILT7 é uma proteína de membrana com domínios semelhantes aos de imunoglobulina, codificado por uma seqüência de bases apresentada na SEQ ID NO: 1 (Figura 2 (a)). Foi relatado que o mRNA do ILT7 é expresso em IPCs (Blood 100, 3295-3303 (2002)).
A-2) RT-PCR
[000156] A expressão do ILT7 em células do sistema hemócito foi examinada mais detalhadamente. Cada célula foi isolada, de modo preparatório, de sangue periférico humano pelo classificador de células. Foram extraídos RNAs de cada população de célula isolada, das quais cDNA foi sintetizado. PCR quantitativa foi conduzida, de acordo com um método convencional, utilizado o cDNA resultante como modelo, e o nível de expressão do mRNA de ILT7 foi analisado. As condições usadas para as seqüências de bases de iniciadores e PCR são as que se seguem: Dianteiro primer: 5’ CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3’ (SEQ ID NO: 3) Reverso primer: 5’ TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3’ (SEQ ID NO: 4) 1 ciclo de PCR (a 94 °C por 3 minutos) 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 30 segundos, a 58 °C por 30 segundos e a 72 °C por 1 minuto] 1 ciclo de PCR (a 72 °C por 6 minutos)
[000157] Quando IPCs estimuladas por monócitos, IPCs, HSVs e células CD19 positivas (ou seja, células B), células CD3 positivas (ou seja, células T), células T estimuladas por PMAs e células CD56 positivas (ou seja, células NK) foram examinadas, foi constatado que ILT7 foi expresso especificamente em IPCs (Figura 1 (a)).
A-3) RT-PCR quantitativa
[000158] Além disso, a expressão em outros órgãos e tecidos foi examinada por PCR quantitativa, utilizando ABI PRISM 7000 (produzido por Applied Biosystem). Foram utilizados como painel de cDNA , o Painel de cDNA de múltiplos tecidos MTC BD (Nome comercial) (Humano I; Cat. N°: 636742, Imuno Humano; Cat. N°: 636748, Frações de sangue humano; Cat. N°: 636750; todos eles fabricados por Becton Dickinson) e o mesmo cDNA derivado de células do sistema hemócito, conforme descrito em (2).
[000159] As seqüências de bases utilizadas de iniciadores são as seguintes: Dianteiro primer do ILT7: 5’ CCT CAA TCC AGC ACA AAA GAA GT 3’ (SEQ ID NO: 5) Reverso primer do ILT7: 5’ CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3’ (SEQ ID NO: 6) Dianteiro primer do GAPDH: 5’ CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3’ (SEQ ID NO: 7) Reverso primer do GAPDH: 5’ TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3’ (SEQ ID NO: 8)
[000160] A PCR foi realizada, utilizando o ABI PRISM 7000 (produzido por Applied Biosystem) e o kit de mistura máster verde de PCR, SYBR (produzido pela mesma companhia). O Software do Sistema de Detecção de Seqüência (produzido pela mesma companhia) foi utilizado para análise.
[000161] As condições da reação foram as seguintes: Etapa 1: 1 ciclo de PCR (a 50 °C por 2 minutos) Etapa 2: 1 ciclo de PCR (a 95 °C por 10 minutos) Etapa 3: 40 ciclos de PCR (a 95 °C por 15 segundos, a 60°C por 1 minuto)
[000162] A expressão do gene de ILT7 foi comparada entre cada tecido por padronização com o nível de expressão do gene de gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), o qual é conhecido a ser expresso constitutivamente. Em resultado, foi observado que o ILT7 não foi expresso em quaisquer órgãos a não ser em tecidos linfóides e, especificamente, em IPCs.
B. Produção de vetores de expressão de ILT7 e FcRy
[000163] Subseqüentemente, foi conduzida a clonagem de genes e produção de vetores de expressão, a fim de serem expressas proteínas do ILT7.
B-1) Clonagem de genes de ILT7
[000164] Poli(A)+RNA separado de sangue periférico humano foi extraído de IPCs, do qual cDNA foi sintetizado, utilizando-se primer oligo dT e o Sistema de Escolha Super Script do kit de Síntese de cDNA. Um adaptador EcoRI foi unido ao cDNA sintetizado, o qual foi unido no vetor, clivado pelo EcoRI, resultando em produção de biblioteca de cDNA de IPC humana. O gene de ILT7 foi amplificado pelo método de PCR, utilizado a biblioteca de cDNA produzida como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 2 minutos], após 1 ciclo def PCR a 94 °C por 2 minutos. Dianteiro primer: 5’ CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3’ (SEQ ID NO: 9) Reverso primer: 5’ TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3’ (SEQ ID NO: 10)
[000165] O fragmento cDNA de ILT7 de 2 kb amplificado foi separado e recuperado por eletroforese, empregando gel de agarose a 1%, o qual foi clonado no vetor de plasmídeo pCR4 Blunt-TOPO (produzido por Invitrogen), utilizando o kit de Clonagem por PCR, Zero Blunt TOPO (produzido por Invitrogen). As seqüências de bases dos genes obtidos foram analisadas e foi constatado ter sido obtido o gene desejado de ILT7, apresentado na SEQ ID NO: 1.
B-2) Produção de vetores de expressão de ILT7 com etiqueta (tag) FLAG
[000166] Foi construído um plasmídeo, expressando uma proteína na qual etiquetas FLAG foram fundidas ao N e C terminais do ILT7, respectivamente. O ILT7 foi fundido com uma etiqueta, possibilitando a confirmação da expressão da proteína de ILT7, por detecção da etiqueta. A seqüência desejada foi amplificada pelo método de PCR, utilizando o gene de ILT7 produzido conforme descrito em (1) como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 2 minutos], após 1 ciclo de PCR a 94 °C por 2 minutos. Para ILT7 com N-FLAG Dianteiro primer (SEQ ID NO: 11): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC [GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG] CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3’ Reverso primer (SEQ ID NO: 12): 5’ C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3’ Para ILT7 com C-FLAG Dianteiro primer (SEQ ID NO: 13): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC 3’ Reverso primer (SEQ ID NO: 14): 5’ C TAG act agt TCA [CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC] GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3’
[000167] Nas seqüências de bases mencionadas acima, cada parte sublinhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta FLAG anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da enzima de restrição XhoI ou SpeI. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram clivados por XhoI e SpeI, os quais foram, então, separados por eletroforese em gel. Foram recuperados fragmentos de DNA de 2 kb, os quais foram ligados no vetor pME18X, clivado por XhoI e SpeI, na mesma maneira conforme descrita acima. Em seguida, foram construídos dois tipos de plasmídeos capazes de expressarem a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-N-FLAG ILT7 e pME18 X-C-FLAG ILT7, respectivamente.
B-3) Clonagem de genes de FcRy
[000168] A proteína FcRy foi considerada como aquela capaz de se associar à proteína do ILT7. Esta molécula é um gene com seqüências de bases e seqüências de aminoácidos das SEQ ID NO: 15 e 16 (Genbank Acc#NM_004106, J. Biol. Chem. 265, 6448-6452 (1990)). Esta é uma molécula (cadeia y) que constitui Fc ε RI, ou seja, um receptor de IgE de alta afinidade. Embora seja também denominada Fc ε RI y, ela será referida como FcRy a seguir. A esse respeito, esta molécula tem sido conhecida também como um componente do FcyR ou FcaR. O presente gene foi clonado pelo método de PCR, conforme apresentado abaixo, para produção de vetores de expressão. O gene de FcRy foi amplificado pelo método de PCR, utilizando a biblioteca de cDNA de IPC humana, produzida conforme descrito em (1), como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 1 minuto], após 1 ciclo de PCR a 94 °C por 2 minutos. Dianteiro primer: 5’ CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3’ (SEQ ID NO: 17) Reverso primer: 5’ GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3’ (SEQ ID NO: 18)
[000169] O fragmento amplificado de FcRycDNA de 0,3 kb foi separado e recuperado por eletroforese em gel, utilizando gel de agarose a 2%, o qual foi clonado para o vetor do plasmídeo pCR4 Blunt- TOPO (produzido por Invitrogen), utilizando o kit de Clonagem em PCR, Zero Blunt TOPO (produzido por Invitrogen). As seqüências de bases dos genes obtidos foram analisadas e foi confirmado que o gene de FcRy desejado, apresentado na SEQ ID NO: 15, foi clonado.
B-4) Produção de vetores de expressão de FcRy com etiqueta Myc
[000170] Foi construído um plasmídeo que expressa uma proteína na qual a etiqueta Myc foi anexada ao C-terminal, de forma que a expressão da proteína do FcRy pudesse ser confirmada. A seqüência desejada foi amplificada pelo método de PCR, utilizando o gene de FcRy, produzido conforme descrito em (3), como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 1 minuto], após 1 ciclo de PCR a 94 °C por 2 minutos. Dianteiro primer (SEQ ID NO: 19): 5’ CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTG GTC TTG 3’ Reverso primer(SEQ ID NO: 20): 5’ CTA Gac tag tCT A[CA GAT CCT CTT CAG AGA TGA GTT TCT GCT C]CT GTG GTG GTT TCT CAT G 3’
[000171] Nas seqüências de bases mencionadas acima, cada parte sublinhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta Myc anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da enzima de XhoI ou SpeI. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram clivados por XhoI e SpeI, os quais foram então separados por eletroforese em gel. Fragmentos de DNA de aproximadamente 0,3 kb foram recuperados, os quais foram unidos no vetor pME18X, clivado por XhoI e SpeI, na mesma maneira descrita acima. Em seguida, foi construído um plasmídeo capaz de expressar a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-Myc-FcRy.
C. Expressão de ILT7 em células de animais
[000172] A expressão de ILT7 em células de animais foi examinada, utilizando-se vetores de expressão, produzidos conforme descrito acima.
C-1) Expressão em células 293T
[000173] DNAs constituídos pelas cinco combinações seguintes foram introduzidos em células 293T (7 x 105 células), utilizando o kit de transfecção effectene (produzido por Qiagen). Dois dias depois da introdução, foi conduzida análise por citometria de fluxo (análise por FCM). (1) 2 μg de pME18X-N-FLAG ILT7 (2) 2 μg de pME18X-C-FLAG ILT7 (3) 1 μg de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 μg de pME18X-Myc-FcRy (4) 1 μg de pME18X-C-FLAG ILT7 + 1 μg de pME18X-Myc-FcRy (5) 2 μg de pME18X-Myc-FcRy
[000174] O método da análise por FCM foi conduzido da mesma maneira descrita em A-4 do Exemplo 2 seguinte. O anticorpo anti-Flag conjugado a Cy3 (produzido por Sigma) foi utilizado para a reação e o FACScan (fabricado por Becton Dickinson) foi utilizado para a análise. Em resultado, foi constatado que uma quantidade pequena de ILT7 foi expressa na superfície celular quando reagido isoladamente, enquanto que ILT7 foi expresso em meio extracelular e de maneira robusta quando presente também com FcRy (Figura 3). Sabe-se que FcRy de camundongo possui alta homologia com FcRy humano. No entanto, quando células p815 (mastocitoma de camundongo), que expressam FcRy de camundongo, foram utilizadas como hospedeiras, a expressão de ILT7 não pode ser observada.
C-2) Análise pelo método de imunoprecipitação e western blotting
[000175] ILT7 foi expresso juntamente com FcRy sobre a superfície celular, o que foi confirmado da seguinte maneira. Após imunoprecipitação, foram analisados vários anticorpos para cada célula 293T, co-expressos com ambos os genes, em combinações correspondentes, descritas em (1) a (5). Os DNAs foram introduzidos em células 293T (7 x 105 células), de cujas células 293T foram recuperados dois após a introdução, na mesma maneira conforme descrita em (1). Frações de células foram dissolvidas em tampão de lise (Triton a 0,5%, NaCl a 150 mM), sendo então deixadas sobre gelo por 20 minutos. Posteriormente, foram repetidas várias vezes aspirações por agulha (27 G), seguidas por centrifugação a 15 Krpm por 20 minutos. Anticorpo anti-myc (2 μg, produzido por tecnologia da Santa Cruz) ou anticorpo anti-Flag (2 μg, produzido por Sigma) foi acrescentado a 200 μg do lisado dos produtos resultantes, os quais foram agitados posteriormente por rotação a 4 °C por 4 horas. Em seguida, a mistura Protein A/G Sepharose 4 Fast Flow (produzida por Amersham bioscience) foi acrescentada aos mesmos, os quais foram agitados por rotação a 4 °C por 1 hora. Em seguida, as frações precipitadas resultantes foram lavadas, 3 vezes, com tampão de lise com a seguinte composição. Tampão de lise: TritonX-100 a 0,5%, HEPES a 50 mM (pH 7,6), NaCl a 150 mM, EDTA a 1 mM, glicerol a 10%, DTT a 1 mM, PMSF a 2 mM, 1 μg/ml de Aprotinina, 1 μg/ml de Leupeptina, 1 μg/ml de Pepstatina A, 0,1 μg/ml de Quimostatina, Na3VO4 a 1mM β-glicerofosfato a 0,1 mM.
[000176] Um tampão de amostra para SDS-PAGE foi acrescentado aos precipitados lavados, os quais foram fervidos por 5 minutos e centrifugados, seguido por eletroforese em gel com SDS a 10%. Amostras foram transferidas de géis, após eletroforese, para membrana de PVDF (Membrana de transferência Immobilon-p: produzida por Millipore), de acordo com um método convencional. A detecção foi efetuada com anticorpo anti-Flag anticorpo e anticorpo anti-myc. Foi confirmada a presença do ILT7 associado a FcRy em células 293T células, visto este estar presente em cada imunoprecipitado (Figura 4).
C-3) Análise de cadeia de açúcar
[000177] Como várias faixas de ILT7 foram observadas na análise por Western Blotting, foi examinada a possibilidade de ILT7 ter sido glicosilado. 200 μg do lisado de células 293T que expressam ILT7 N- FLAG e Myc-FcRy foram imunoprecipitados com anticorpo anti-Flag, na maneira descrita em (1) e (2). Posteriormente, as frações precipitadas foram suspensas em 60 μl de tampão de N-glicosidase, com a composi-ção a seguir, e 30 μl de cada solução resultante foram repartidas em alíquotas em dois tubos. Tampão de N-glicosidase: EDTA a 10 mM, SDS a 0,2%, TritonX100 a 0,5%, 2-mercaptoetanol a 1% em PBS (tampão fosfato)
[000178] Em seguida, 3 unidades de 3 μl de N-glicosidase (#1365177, produzido pela Roche) foram acrescentadas a um tubo, sendo permitido que ocorresse a reação a 37 °C por 15 horas. Além disso, 7 μl de tampão de amostra foram acrescentados ao tubo, sendo este aquecido a 100 °C por 5 minutos, seguidos por eletroforese em gel com SDS a 10%. Após a eletroforese, o gel foi transferido para uma membrana de PVDF, à qual foi acrescentado 1 μg de anticorpo policlonal anti-ILT7, conforme descrito em (4), tendo sido permitido que ocorresse a reação a 4 °C durante a noite. O produto resultante foi lavado com tampão TBS-T e reagiu com anticorpo anti-HRP marcado de coelho (produzido por Jackson), diluído 100.000 vezes em temperatura ambiente. A seguir, o produto foi corado com o Sistema de Detecção ECL de Western Blotting (produzido por Amersham bioscience). Em resultado, o peso molecular aparente foi diminuído pelo tratamento com N-glicosidase. Dessa forma, previu-se que cadeias de açúcar tinham sido acrescentadas ao ILT7 (Figura 5).
C-4) Produção de anticorpo policlonal anti-ILT7
[000179] O anticorpo policlonal anti-ILT7 utilizado, conforme descrito em (3) foi produzido da seguinte maneira. Um peptídeo de 23 aminoácidos, correspondentes ao C-terminal do ILT7 (CSQEANSRKD- NAPFRVVEPWEQI; SEQ ID NO: 21) foi sintetizado quimicamente e ligado à proteína KLH, que é veículo, e o produto resultante foi utilizado como imunogene. Coelhos foram imunizados por via intradérmica com o imunogene misturado ao adjuvante completo de Freund. Depois de, no total, seis imunizações (uma vez por semana) o título aumentado do anticorpo foi confirmado e, em seguida, foi coletado sangue total. A seguir, algum soro foi purificado por afinidade, empregando coluna de peptídeo da mesma seqüência. O produto resultante foi determinado como o anticorpo policlonal anti-ILT7.
Exemplo 2 A. Produção de anticorpo monoclonal anti-ILT7 A-1) Produção de imunogene
[000180] Células a serem utilizadas como imunogenes foram preparadas pela introdução de genes em células 293T, conforme descrito abaixo. 46,4 μg de transgene (23.2 μg de pME18 X-C-FLAG ILT7 e 23.2 μg de pME18X-Myc-FcRy) foram acrescentados ao fundo de um Prato de Revestimento em Colágeno de 100 mm (IWAKI), revestido com 3 ml de opti-MEM (GIBCO), e misturados. Subseqüente- mente, à parte da solução do transgene, 58 μl de Lipofectamina (Nome comercial) 2000 (Invitrogen) foram diluídos com 3 ml de opti-MEM e deixados em repouso por 5 minutos em temperatura ambiente, e a solução de Lipofectamina foi preparada. Posteriormente, a solução de Lipofectamina foi cuidadosamente acrescentada ao prato contendo a solução do transgene e misturada. Após permanecer em temperatura ambiente por 20 minutos, 10 ml de células 293T-células, diluídas para 1 x 106 células/Ml, empregando meio de cultura DMEM (SIGMA), contendo FBS a 10% (soro fetal bovino), foram cuidadosamente acrescentados ao prato. O meio resultante foi submetido à cultura estática em incubadora a 37 °C sob CO2 por 48 horas, do qual as células foram recuperadas por pipetas. As células obtidas foram utilizadas como transfectantes de imunogenes.
A-2) Produção de hibridomas
[000181] No dia anterior à imunização das células, 50 μl de emulsão, obtida pela mistura de 200 μl de PBS com 200 μl de adjuvante completo (FREUND) (RM606-1, produzido por Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.), foram injetados na parte inferior de ambas as patas de quatro camundongos Balb/c do sexo feminino (quatro semanas de vida) para imunização. No dia seguinte, foi efetuada a imunização em 50 μl contendo 2 x 107 células, suspensas em 400 μl de PBS. As segunda e terceira imunizações foram realizadas a cada quatro dias. Três dias depois da terceira imunização, foi conduzida a fusão celular conforme segue. As células foram coletadas de linfonodos da pata de camundongos imunizados. Células P3-X63-Ag8-U1 de mieloma de camundongo, cultivadas em meio de cultura RPMI1640 (SIGMA) contendo FBS a 10%, foram misturadas às células derivadas dos linfonodos e mieloma, de forma que a relação das células de mieloma para as células derivadas de linfonodos e mieloma fosse de 2:1 a 10:1, sendo as células recuperadas da mistura por centrifugação. PEG4000 (MERCK) diluído equivalentemente com meio de cultura RPMI1640 foi acrescentado às frações celulares obtidas, as quais foram submetidas à fusão celular. Depois de lavagem das células, o produto resultante foi suspenso em 160 ml de meio FBS-HAT a 15%, contendo um complemento e, em seguida, inoculado em dezesseis placas de 96 cavidades, em 200 μl/cavidade. O meio de cultura foi trocado depois de três dias. Uma a duas semanas após observação da formação de colônias, foi realizada uma varredura primária.
A-3) Varredura de hibridoma pelo método de ELISA celular
[000182] O hibridoma que produz o anticorpo alvo foi investigado pelo seguinte método de ELISA celular. As células produzidas, conforme descrito em (1) foram utilizadas em concentração de 1 x 107 células por placa de 96 cavidades, as quais foram suspensas em BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS e, em seguida, transferidas em alíquotas para uma placa para condução do método de ELISA Celular (NUNC 249570 96V NW PS), em concentração de 100 μl/cavidade. Foi efetuada centrifugação a 2.000 rpm a 4 °C e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. Amostras de 50 μl/cavidade do sobrenadante da cultura foram acrescentadas e deixadas reagir em temperatura ambiente por 30 minutos. Foi efetuada, por duas vezes, a operação de lavagem, envolvendo adição de BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM e PBS a cada cavidade, centrifugação a 2.000 rpm a 4 °C por 2 minutos e, em seguida, descarte do sobrenadante. 50 μl/cavidade de anticorpo de cabra anti- IgG de camundongo marcado ligado à peroxidase (IM0819; Beckman Coulter), diluído 10.000 vezes, foram acrescentados a cada cavidade após lavagem, sendo permitida a reação por 30 minutos. A operação de lavagem com BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS foi conduzida por duas vezes, seguida pela adição de uma solução corante. A solução preparada de anticorpos foi substituída por PBS (-), por membrana de diálise (10.000 cortes, fabricada por PIERCE), para fornecer anticorpos quiméricos anti-ILT7.
A-4) Exame de responsividade de anticorpo por análise por citometria de fluxo (FCM)
[000183] O sobrenadante da cultura de hibridomas foi analisado por citometria de fluxo (FCM). As células produzidas, conforme descrito em (1), foram suspensas em BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS, sendo 1 x 105 por amostra destas transferidas para um tubo de centrífuga, seguido pela adição de 40 μl de cada cultura e reação em temperatura ambiente por 30 minutos. Foi efetuada, por duas vezes, a operação de lavagem, envolvendo adição de 1 ml BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS a cada tubo, centrifugação a 1200 rpm a 4 °C por 3 minutos e, em seguida, descarte do sobrenadante. 40 μL μl/cavidade de anticorpo de cabra anti-IgG de camundongo marcado ligado à peroxidase (IM0819; Beckman Coulter), diluído 10.000 vezes, foram acrescentados a cada cavidade após lavagem, sendo permitida a reação em temperatura ambiente por 30 minutos. A operação de lavagem com BSA a 0,5%/EDTA a 2 mM/PBS foi conduzida por duas vezes, seguida de análise por citometria de fluxo com FC500 (Beckman Coulter). Foi selecionado um hibridoma produtor de anticorpo que não respondeu somente à célula hospedeira e que respondeu especificamente à célula na qual o gene foi introduzido. O hibridoma selecionado foi clonado pelo método de diluição limitante, tendo sido obtidos os hibridomas n° 11 e n° 17 que produzem anticorpos monoclonais.
B. Exame de responsividade do anticorpo anti-ILT7
[000184] O ILT7 com etiqueta FLAG anexada a N-terminal foi co- expressado com a molécula de FcRy em células 293T, da mesma maneira conforme descrito em C-1) do Exemplo 1. Em seguida, a responsividade do anticorpo, obtido no Exemplo 2, foi confirmada por análise de FCM com o FACScan (Becton Dickinson). Em resultado, foi confirmado que todos os anticorpos produzidos pelos hibridomas n° 11 e n° 17, obtidos conforme descrito em A, responderam às células nas quais o gene do ILT7 foi introduzido e que expressaram ILT7 (Figura 6 (b)). Além disso, foram separados linfócitos de sangue periférico humano com Ficoll e, em seguida, foi efetuada a dupla coloração com o anticorpo anti-ILT7 produzido e anticorpo PE-marcado anti-BDCA-2 (Miltenyi). A seguir, foi examinada a responsividade aos linfócitos. Em resultado, a ligação do anticorpo monoclonal produzido pelos hibridomas n° 11 e n° 17 a célula BDCA-2 positiva foi detectada. Ou seja, foi confirmado que ambos os anticorpos monoclonais reconheceram moléculas de ILT7, expressas em IPCs humanas IPCs (Figura 6 (a)). Estes anticorpos monoclonais foram designados anticorpo anti- ILT7 n° 11 e anticorpo anti-ILT7 n° 17, respectivamente. Foram conduzidas análises mais detalhadas.
[000185] Foi conduzida análise de coloração múltipla de linfócitos de sangue periférico humano, utilizando-se o anticorpo anti-ILT7 produzido, anticorpo anti-Linhagem-1 (anticorpos anti-CD3, CD14, CD16, CD19, CD56; Becton Dickinson), anticorpo anti-CD123 (Becton Dickinson) e anticorpo anti-BDCA-2 (Miltenyi). Quanto às frações positivas de anticorpo contra ILT7, o Marcador de Linhagem foi negativo, CD123 foi positiva e BDCA-2 foi positiva. A partir dos resultados, foi confirmado que IPCs eram coradas somente por ILT7 n° 11 e ILT7 n° 17 (Figura 7).
[000186] Além disso, a expressão de várias moléculas foi examinada por análise de FCM, quando linfócitos do sangue periférico humano foram estimulados por CpG ou IFN-a por 24 horas. CpGODN2216 foi utilizado como CpGA, o qual induz a produção de IFN, proveniente de IPCs, e CpGODN2006, foi utilizado como CpGB que facilita a maturação de células dendríticas (Moseman et al. J. Immunology. 173, 4433-4442, 2004). Uma saída foi definida para fração negativa de Marcador de Linhagem. Quando a responsividade do anticorpo anti-BDCA-2 e do anticorpo anti-ILT7 à população de célula CD123 positiva foi analisada, a maioria das frações ILT7 positivas desapareceram mesmo depois de estimulação por CpG de 24 horas. Por outro lado, algumas células de BDCA-2 foram positivas após estimulação por CpG de 24 horas (Figura 8). Foi considerado que IPCs diferenciaram-se em células diferentes imediatamente depois da estimulação por CpG. Foi indicado que o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção era útil como anticorpo em estágio específico para IPCs. Ademais, foi confirmado que IPCs, em linfócitos de sangue periférico não se diferenciaram sob a presença de IFN-α, neste caso em que o índice de sobrevida era alto, a expressão do ILT7 foi mantida em IPCs, além de ILT7 estar presente estavelmente em IPCs, em doenças auto-imunes, sendo possível que o nível de IFN no soro estivesse alto.
C. Exame de especificidade do anticorpo anti-ILT7
[000187] ILT7 pertence à família ILT/LIR, havendo uma pluralidade de moléculas com grande homologia, especialmente com alta homologia na região extracelular (Figura 9). Foi relatado que mRNAs de moléculas, especialmente, ILT2 e ILT3, são expressas em IPCs (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004). Por conseguinte, a responsividade destas moléculas foi confirmada, utilizando-se células transgênicas.
C-1) Clonagem de molécula de ILT1 e produção de vetores de expressão
[000188] cDNA foi sintetizado a partir de RNA derivado de amídala humana, empregando primer oligo dT e o Sistema de Escolha Super Script do kit de Síntese de cDNA. Em seguida um adaptador NotI foi unido em vetor pME18S, clivado por NotI, resultando em produção de biblioteca de cDNA de amídala humana.
[000189] O gene de ILT1 com etiqueta FLAG no C terminal foi amplificado pelo método de PCR, utilizando a biblioteca de cDNA produzida como modelo, bem como com iniciadores com as seguintes seqüências de bases. 1 unidade de KOD Plus DNA polimerase (produzido por TOYOBO CO., LTD.) foi utilizada para reação de PCR. As condições da reação foram estabelecidas em 25 ciclos de PCR [a 94 °C por 15 segundos, a 55 °C por 30 segundos e a 68 °C por 2 minutos], após 1 ciclo de PCR a 94 °C por 2 minutos. Dianteiro primer (SEQ ID NO: 22): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC C 3’ Reverso primer (SEQ ID NO: 23): 5’ CTA Gac tag tTC A[CT TAT CGT CGT CAT CCT TGT AAT C]CC TCC CGG CTG CAT CTT G 3’
[000190] Nas seqüências de iniciadores mencionadas acima, cada parte sublinhada em parênteses exibe uma seqüência de bases que codifica a etiqueta FLAG anexada, e as letras em minúsculo exibem o sítio de clivagem da enzima de restrição XhoI ou SpeI. Fragmentos de DNA, amplificados por PCR, foram clivados por XhoI e SpeI, os quais foram, então, separados por eletroforese em gel. Fragmentos de DNA de aproximadamente 2 kb foram recuperados, os quais foram ligados no vetor pME18X, clivado por XhoI e SpeI, na mesma maneira conforme descrita acima. Em seguida, foi construído um plasmídeo capaz de expressar a proteína de fusão desejada, ou seja, pME18X-C-FLAGILT1. A seqüência de bases e a seqüência de aminoácidos são apresentadas nas SEQ ID NO: 24 e 25.
C-2) Produção de células que expressam e exame de responsividade de anticorpo
[000191] Quanto ao ILT2 (SEQ ID NO: 26) e ILT3 (SEQ ID NO: 28), foram utilizados vetores de expressão nos quais os respectivos genes foram clonados para sítios de XbaI ou XhoI de pcDNA4.1 (produzidos por Invitrogen). DNAs das combinações abaixo foram introduzidos em células 293T (7 x 105 células), da mesma maneira descrita em C-1). Dois depois da introdução, foi conduzida análise por FCM e o anticorpo anti-ILT7 foi então analisado. (1) 1 μg de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 μg de pME18X-Myc-FcRy (2) 0,5 μg de pME18X-C-FLAG ILT1 + 0,5 μg de pME18X-Myc-FcRy + 0,5 μg de pcDNA4.1-ILT2 + 0,5 μg de pcDNA4.1-ILT3
[000192] Em resultado, nenhum anticorpo respondeu às células nas quais ILT1 foi expresso. Por esse motivo, foi sugerido que estes anticorpos anti-ILT7 reconheceram especificamente moléculas de ILT7 em IPCs (Figura 10).
Exemplo 3 Efeito do anticorpo anti-ILT7 sobre a capacidade de produzir IFN humano
[000193] Linfócitos de sangue periférico humano foram inoculados em placa de 96 cavidades, 2 x 105 células/cavidade, os quais reagiram com 5 μg/ml de vários anticorpos a 37 °C. Depois de cultura por 1 hora, foi acrescentado aos mesmos o vírus Influenza PR8. Após 24 horas de cultura, IFN-α, no sobrenadante da cultura, foi medido por kit do método ELISA (Bender Med System). Em resultado, a produção de IFN foi inibida pela adição do anticorpo anti-ILT7 (Figura 11). A saber, foi constatado que a produção de IFN por IPCs foi afetada pelo anticorpo anti-ILT7 da presente invenção.
Exemplo 4 Atividade de CDC do anticorpo anti-ILT7 A. Produção do anticorpo monoclonal anti-ILT7
[000194] Foi obtido um clone que produz um anticorpo monoclonal, da mesma maneira conforme descrito em A-1) a A-4) do Exemplo 2. A responsividade foi examinada da mesma maneira, conforme descrita em B do Exemplo 2 e a especificidade, na mesma maneira descrita em C do Exemplo 2. Em resultado, foram obtidos os hibridomas n° 37, n° 28 e n° 33 que produziram anticorpos monoclonais anti-ILT7 com boa responsividade e especificidade. A atividade de CDC foi medida, conforme descrito abaixo, empregando anticorpo monoclonal anti-ILT7, em que três tipos destes hibridomas foram produzidos. B. Determinação de atividade de CDC B-1) No dia anterior ao da Produção alvo de uma linhagem celular alvo (linhagem de células ILT7-CHO), foi introduzido o DNA abaixo em células CHO-k1 células, as quais foram inoculadas de forma a haver 6 x 105 células por prato (6 cmΦ), utilizando o Reagente de Transfecção Effectene (produzido por QLAGEN), e, em seguida, cepas resistentes foram selecionadas com 800 μg/ml de Zeocina (produzida por Invitrogen). DNA introduzido: 1 μg de pcDNA3.1-C-FLAG ILT7 + 2 μg de pME18X- Myc FcRy
[000195] Posteriormente, uma linhagem celular, com nível de expressão alto de ILT7, foi obtida com o classificador de células (BD FACSAria, fabricado por Becton Dickinson). Foi confirmado, por análise de FCM, que a linhagem celular selecionada apresentou nível alto de expressão de ILT7. A operação da análise de FCM foi conduzida de acordo com o método descrito em A-4) do Exemplo 2, exceto que o BD FACSCaliber (fabricado por BD) foi utilizado para FCM. Os anticorpos seguintes foram utilizados para anticorpo primário e anticorpo secundário, respectivamente. Anticorpo primário: 5 μg/ml de anticorpo anti-ILT7 de camundongo (n° 37), Anticorpo secundário: anticorpo policlonal específico de imunoglobulina de cabra de anti-R-ficoeritrina (R-PE) conjugado de camundongo (BD) B-2) Resposta de células-alvo a anticorpos anti-ILT7
[000196] As células-alvo obtidas, conforme descrito em B-1) (célula ILT7-CHO) foram recuperadas com solução de EDTA a EDTA/PBS, as quais foram suspensas em meio CDC com a composição seguinte, de forma a apresentar concentração de 4 x 105 células/ml. A suspensão foi dividida em alíquotas de 50 μl/cavidade em placa de 96 cavidades. Meio CDC: RPMI1640 BSA a 0,1% 100 unidades/ml de Penicilina 100 μg/ml de estreptomicina Hepes a 10 mM (pH 7,6) L-Glutamina a 2 mM
[000197] 50 μl de solução de anticorpo anti-ILT7, preparada por meio CDC, foram adicionados a cada cavidade e misturados de forma que a concentração final de anticorpos fosse de 0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 1 μg/ml e 5 μg/ml. Além disso, 50 μl de meio CDC, contendo um complemento com a composição abaixo, foram acrescentados à mesma e misturados de forma que a concentração final do complemento seja 6%, seguido por cultura a 37 °C por 2 horas. Meio CDC contendo complemento: 1 ml de complemento de coelho jovem (N° de catálogo.: CL3441, produzido por CEDARLANE) Meio CDC (vide acima)
[000198] Em seguida, a suspensão foi centrifugada (condição da centrifugação: a 250 G por 4 minutos) e o sobrenadante foi recuperado, tomando-se cuidado para não haver contaminação com células. LDH no sobrenadante foi medido por método convencional, o qual foi determinado como "a quantidade de LDH extravasada da célula-alvo por atividade do complemento" (Amostra Experimental).
[000199] Os parâmetros seguintes foram preparados também para determinar a atividade de CDC. - Liberação Espontânea de LDH de Célula-Alvo: somente células-alvo foram cultivadas no mesmo volume, conforme a amostra, e preparada. - Liberação Máxima de LDH de Célula-Alvo: somente células-alvo foram cultivadas no mesmo volume, conforme a amostra e, em seguida uma solução de TritonX-100, incluída com o kit, foi acrescentada, 60 minutos antes de recuperação do sobrenadante, de forma que a concentração final seja 0,8% e preparada. - Controle de Correção de Volume: a mesma quantidade de TritonX-100, conforme aquela acrescentada quando a Liberação Máxima de LDH de Célula-Alvo foi preparada, foi acrescentada ao meio de cultura do mesmo volume da amostra e preparada. - Formação do Meio de Cultura: o meio de cultura do mesmo volume conforme a amostra e a solução à qual o meio de cultura CDC contendo o complemento foi acrescentado ao meio de cultura, de forma a ter o mesmo volume conforme a amostra, foram preparados.
[000200] O mesmo volume de meio de cultura, conforme a amostra, foi subtraído da absorvência de Máxima de Alvo e Espontânea de Alvo. A solução à qual o meio CDC contendo complemento foi acrescentado ao meio de cultura de forma a ter o mesmo volume conforme a amostra, foi subtraída da absorvência da Amostra Experimental e corrigido. A atividade de CDC foi calculada pela equação seguinte. Os resultados são apresentados na Tabela 1 e Figura 12. Mesmo o caso em que anticorpos monoclonais anti-ILT7, obtidos de qualquer hibridoma, foram utilizados, foi exibido 80% ou mais de atividade de CDC em concentração do anticorpo de 0,5 μg/ml ou mais alta. [Tabela 1]
Exemplo comparativo 1
[000201] A mesma operação foi conduzida exatamente da mesma maneira, conforme descrita em B e C do Exemplo 4, exceto que IgG2a de camundongo foi utilizado em vez de anticorpo anti-ILT7. Os resultados são mostrados no Exemplo 4, bem como na Tabela 5 e Figura A atividade de CDC contra as células-alvo não foi observada em outros anticorpos a não ser o anticorpo monoclonal anti-ILT7.
Exemplo 5 Internalização de anticorpo anti-ILT7 em células-alvo A. Anticorpo monoclonal anti-ILT7
[000202] Foram utilizados os seguintes anticorpos monoclonais anti- ILT7. Anticorpos monoclonais anti-ILT7: n° 17, n° 26, n° 37, n° 28 e n° 33. B. Observação de internalização
B-1) Produção de linhagem celular alvo (linhagem celular ILT7-CHO)
[000203] A linhagem celular alvo (linhagem celular ILT7-CHO) foi produzida da mesma maneira descrita em B-1 do Exemplo 4.
B-2) Resposta de células alvo a anticorpo anti-ILT7
[000204] As células ILT7-CHO recuperadas foram suspensas em tampão gelado (T(-) + FBS a 10%) com a seguinte composição, em 1 x 106 células/ml, utilizando 5 mM de solução de EDTA/PBS. Meio T (-): RPMI1640 100 unidades/ml de Penicilina 100 μg/ml de estreptomicina Hepes a 10 mM (pH 7,6) L-Glutamina a 2 mM Piruvato de sódio a 1 mM 2-mercaptoetanol a 50 μM Soro Fetal Bovino a 10% inativado por calor
[000205] 1 ml da suspensão conforme descrita acima foi colocado em um tubo de centrífuga de 15 ml, o qual foi centrifugado (condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos) e, em seguida, o sobrenadante foi descartado. 200 μl de suspensão de anticorpo anti-ILT7 de 10 μg/ml foram acrescentados a células em péletess que foram misturadas e incubadas a 4 °C por 30 minutos, seguido por duas lavagens com meio T (-) gelado (Quantidade do meio utilizada: 10 ml por lavagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos).
B-3) Modificação do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente sobre a superfície de células-alvo
[000206] Subseqüentemente, o complexo imune ILT7-anticorpo anti- ILT7, presente sobre a superfície de células foi modificado por um anticorpo secundário, o qual foi marcado com fluorescência para detecção. O método específico é descrito abaixo. Meio T (-) gelado, contendo anticorpo policlonal marcado de IgG de cabra anti-APC de camundongo (N° do catálogo: 550826BD, produzido por Biosciences), foi acrescentado a células em péletess, obtidas conforme descrito em B-2), sendo incubado sob sombra a 4 °C por 20 minutos, seguido por duas lavagens com meio T (-) gelado (quantidade do meio utilizada: 10 ml por lavagem; condição de centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos). Em seguida, meio T (-) gelado foi acrescentado ao mesmo, que foi utilizado como suspensão de 1 x 106 células/ml.
B-4) Indução de internalização por incubação a 37 °C
[000207] A suspensão obtida, conforme descrito em B-3 foi dividida igualmente em dois tubos (ou seja, tubos (a) e (b)). Os tubos (a) e (b) foram incubados a 37 e 4 °C, respectivamente, sob condições de sombra por 60 minutos. Após a incubação, FBS/PBS a 1% (gelado) foi acrescentado à mesma para interromper a internalização. A solução resultante foi centrifugada (condições da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos) e, em seguida, o sobrenadante foi descartada, seguido por 2 lavagens com FBS/PBS a 1% of FBS/PBS (gelado) (quantidade da solução: 10 ml por lavagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4°C por 5 minutos).
B-5)Modificação do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permaneceu na superfície de células-alvo após incubação
[000208] O complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permaneceu sobre a superfície celular após a incubação foi modificação com um anticorpo terciário para ser detectado por fluorescência. O método específico é descrito abaixo. 20 μl de suspensão contendo anticorpos terciários (anticorpo de burro anti-IgG de cabra com FITC-marcado (Número do catálogo: sc-2024, produzido por Santa cruz biotechnology)) foram acrescentados a células em péletess, obtidas conforme descrito em B-4), os quais foram misturados e deixados em repouso a 4 °C por 15 minutos à sombra. A solução resultante foi lavada (quantidade da solução: 10 ml por lavagem; condição da centrifugação: 1200 rpm, a 4 °C por 5 minutos).
B-6) Análise de anticorpo anti-ILT7, presente em células-alvo
[000209] Subseqüentemente, 150 μl de FBS/PBS a 1% foram acrescentados a células em péletess, obtidas conforme descrito em B- 5), as quais foram suspensas e coletadas em tubo de microtitulação de 1,2 ml, seguido por análise por FCM. Na análise, a intensidade média de fluorescência (MPI) de cada células foi analisada separadamente em FITC e APC. Além disso, foi calculada a relação entre intensidade de fluorescência (%) pela equação seguinte.
[000210] Os resultados são apresentados na Tabela 2, Tabela 3 e Figura 13. [Tabela 2] [Tabela 3]
[000211] A intensidade de fluorescência de FITC é indicadora da quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 que permaneceu na superfície celular após incubação. A intensidade média de fluorescência de FITC, em relação às células incubadas a 37 °C por 60 minutos, decresceu em aproximadamente 50%, em comparação às células incubadas a 4 °C.
[000212] Por outro lado, a intensidade de fluorescência de APC é indicadora da quantidade do complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7, presente na superfície celular antes de incubação. O complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 é detectado independentemente se presente na superfície celular ou se incorporado nas células após incubação. No Exemplo 5, a intensidade de fluorescência de APC, após incubação a 37 °C, foi equivalente àquela na incubação a 4 °C. Isso demonstra que o complexo imune ILT7-anticorpo anti-ILT7 pode estar presente em qualquer sítio das células-alvo, mesmo quando a incubação é realizada em quaisquer destas temperaturas. Conforme mencionado acima, foi constatado que o anticorpo monoclonal anti-ILT7 promoveu a internalização do ILT7 pela incubação a 37°C.
Exemplo comparativo 2
[000213] A mesma operação foi conduzida exatamente da mesma maneira, conforme descrita no Exemplo 5, exceto que IgG2a de camundongo foi utilizado em vez de anticorpo anti-ILT7. Os resultados são mostrados no Exemplo 5, bem como na Tabela 2, Tabela 3 e Figura 13. No caso em que o IgG2a de camundongo foi utilizado, não foram observadas alterações na intensidade de fluorescência de FITC e APC e, dessa forma, foi constatado que o IgG2a de camundongo não promoveu a internalização do ILT7.
Exemplo 6 Referente à estrutura do anticorpo monoclonal de camundongo anti- ILT7 humano [Seqüências de regiões variáveis] A. Clonagem de cDNA codificador de região variável de anticorpo de camundongo anti-ILT7 A-1) Referente a hibridomas que produzem anticorpos de camundongo anti-ILT7
[000214] Foram utilizados os seguintes hibridomas como hibridomas que produzem anticorpos de camundongo anti-ILT7. -Hibridoma n° 11 (Número de acesso: FERM BP-10704) -Hibridoma n° 17 (Número de acesso: FERM BP-10705)
A-2) Isolamento de RNAs totais
[000215] Os RNAs totais foram isolados dos hibridomas descritos em A-1), utilizando um kit à disposição no mercado, "RNeasy Mini Kit" (Número de catálogo: 74106, produzido por Qiagen), de acordo com a instrução anexada ao kit. Em ambos os casos, foram obtidos aproximadamente 200 μg dos RNAs totais de 1 x 107 hibridomas.
A-3) Amplificação e fragmentação de cDNA codificador de região variável de cadeia pesada de camundongo
[000216] O cDNA codificador de região variável de cadeia pesada de camundongo foi amplificado pelo método 5’RACE, utilizando 5 μg dos RNAs totais, isolados conforme descrito em A-2. Quanto à amplificação, foi utilizado o kit à disposição no mercado, "5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, Kit Versão 2.0" (Número de catálogo: 18374-058, produzido por Invitrogen). Ele será especificamente descrito a seguir. Inicialmente, foi sintetizado um primeiro cDNA em fita, a partir dos RNAs totais, obtidos conforme descritos em A-2), pela transcriptase reversa. As seqüências de bases de iniciadores antisentido (GSP1), então utilizadas, são apresentadas na Tabela 4. [Tabela 4] Iniciadores utilizados para amplificação de um gene codificador de região variável de cadeia pesada de camundongo
[000217] Subseqüentemente, os RNAs totais foram degradados pela RNaseH e o primeiro cDNA em fita restante como fita simples foi purificado pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). Ademais, dC (ou seja, homopolímero de nucleotídeo) foi unido a 3’- terminal do primeiro cDNA em cadeia, empregando desoxinucleotidil terminal transferase (TdT). O cDNA foi amplificado pelo método de PCR, utilizando iniciadores âncora (SEQ ID NO: 34) com complementaridade de polímero nucleotídeo a dC (seqüência âncora) em 3’-terminal e iniciadores anti-sentido (GSP2), apresentados na Tabela 4. Além disso, os produtos obtidos por PCR foram utilizados como modelos. O cDNA foi amplificado pelo método de PCR aninhada (nested), empregando o primer AUAP (SEQ ID NO: 35) e iniciadores anti-sentido (GSP2), apresentados na Tabela 4. Além disso, os produtos da PCR foram purificados pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). Primer âncora para 5’RACE (SEQ ID NO: 34) 5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’ (36- mero) Primer AUAP primer para 5’RACE (SEQ ID NO: 35) 5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’ (20-mero)
A-4) Amplificação e fragmentação de cDNA codificador de região variável de cadeia leve de camundongo
[000218] O cDNA codificador de região variável de cadeia leve foi amplificado a partir dos RNAs isolados, conforme descrito em A-2), da mesma maneira conforme descrita em A-3). As seqüências de bases de iniciadores então utilizados são apresentadas na Tabela 5. Os produtos obtidos por PCR foram purificados pelo método de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%). [Tabela 5]
A-5) Confirmação de seqüência de bases de cDNA e determinação da região CDR
[000219] Uma região variável de cadeia pesada, obtida conforme descrito em A-3) e um fragmento de cDNA da região variável de cadeia leve, obtido conforme descrito em A-4) foram clonados no vetor pCR4 Blunt-TOPO, utilizando um kit à disposição no mercado "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Número de catálogo: 1325137, produzido por Invitrogen), de acordo com a instrução anexada ao kit, o qual foi, então, introduzido em células competentes de Escherichia coli para fornecer Escherichia coli transformante. O plasmídeo mencionado acima foi obtido a partir do transformante e, em seguida, a seqüência de bases do cDNA no plasmídeo foi confirmada usando um seqüenciador automático de DNA, "Analisador Genético ABI PRISM 3100, baseado em PCR" (fabricado por Applied Biosystems). Seqüências corretas foram extraídas por exclusão de transcritos obtidos de RNA inativo, decorrente de deslocamento de estrutura e mutações sem sentido em torno da região determinante de complementaridade (a seguir referida como "região CDR"). Além disso, a homologia da seqüência de bases do cDNA seqüência de bases, contido no plasmídeo, foi comparada ao banco de dados Kabat, e seqüências da região CDR e a região variável, nas respectivas regiões variáveis, foram determinadas. Ademais, quanto ao hibridoma n° 37 produzido no Exemplo 4, seqüências da região CDR e da região variável em regiões variáveis foram determinadas no mesmo procedimento, conforme descrito em A-1) a A- 5) do Exemplo 6, usando o hibridoma n° 17. Seqüências de bases do cDNA das regiões variáveis da cadeia pesada e regiões variáveis da cadeia leve dos anticorpos monoclonais anti-ILT7, produzidas por cada hibridoma, e seqüências de aminoácidos codificadas pelas seqüências são apresentadas nas seguintes SEQ ID NOs. Confirmação de isotipo de região constante
[000220] Quanto ao sobrenadante da cultura do hibridoma, o isotipo da região constante do anticorpo monoclonal produzido foi confirmado com um kit de isotipagem à disposição no mercado de anticorpo monoclonal de camundongo (Número de catálogo: MMT1, produzido por Serotec Product). A região constante da cadeia pesada do anticorpo de camundongo anti-ILT7 humano n° 11 foi Igy3 e a região constante da cadeia leve foi IgK. Além disso, cada região constante da cadeia pesada anticorpo de camundongo anti-ILT7 humano n° 17 e anticorpo de camundongo anti-ILT7 humano n° 37 foi Igy2a e cada região constante da cadeia leve foi IgK.
Exemplo 7 Produção de anticorpos quiméricos A. Clonagem de cDNA codificador de região constante de IgG humana
[000221] A região constante da cadeia pesada da IgG1 humana e a região constante da cadeia leve da Ig kapa humana foram selecionadas da biblioteca de cDNA de IPCs humanas. Em seguida, as regiões selecionadas foram clonadas no vetor pCR4 Blunt-TOPO com um kit à disposição no mercado "Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit" (Número de catálogo: 1325137, produzido por Invitrogen), de acordo com a instrução anexada ao kit, o qual foi, então, introduzido em células competentes de Escherichia coli para fornecer Escherichia coli transformante. O plasmídeo mencionado acima foi obtido a partir do transformante e, em seguida, a seqüência de bases do cDNA no plasmídeo foi confirmada um seqüenciador automático de DNA, "Analisador Genético ABI PRISM 3100, baseado em PCR" (fabricado por Applied Biosystems).
B. Ligação de região variável com região constante e clonagem
[000222] O cDNA codificador da região constante de cadeia pesada obtido conforme descrito em A, e o cDNA codificador da região variável da cadeia pesada obtido conforme descrito em A-5 do Exemplo 6, foram utilizados respectivamente. Os dois DNAs contêm uma região na qual uma seqüência de bases de DNA é sobreposta. Em seguida, DNA de fita dupla foi obtido pelo método de extensão de sobreposição, utilizando a região. O processo específico é descrito abaixo.
C-1) Preparo de cDNA codificador de cadeia pesada de anticorpo quimérico contra ILT7
[000223] O "plasmídeo com cDNA codificador de regiões variáveis da cadeia pesada de n° 11 e n° 17", obtido conforme descrito em A-5), foi digerido com as enzimas de restrição NotI e XbaI e purificado pelo método de gel de agarose (1,5%). Os produtos resultantes foram dissolvidos em cada tampão TE com a seguinte composição, de forma a ser preparada uma solução de 100 pmols/μl do fragmento de cDNA que codifica a região variável da cadeia pesada. Tampão TE: Tris-HCl a 10 mM EDTA a 1 mM pH 7,5 a 8,0
[000224] Além disso, o "plasmídeo com cDNA codificador da região constante da cadeia pesada", obtido conforme descrito em B, foi tratado da mesma maneira conforme descrito acima para preparar 100 pmol/μl de solução. Subseqüentemente, ambas as soluções são misturadas e, em seguida, as duas regiões de sobreposição foram hibridizadas, inicialmente mantendo-as a 70 °C por 10 minutos e, em seguida, a 37 °C por 5 minutos. Posteriormente, o cDNA foi amplificado pelo método de PCR e o cDNA, digerido com as enzimas de restrição NotI e XbaI e purificado pelo método de gel de agarose de baixo ponto de fusão (1,5%).
C-2) Preparo de cDNA codificador de cadeia leve de anticorpo quimérico contra ILT7
[000225] O cDNA codificador da região constante da cadeia leve, obtido conforme descrito em A, e o cDNA codificador da região variável da cadeia leve, obtido conforme descrito em A-5 do Exemplo 6, foram utilizados respectivamente. O cDNA que codifica a cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7 foi obtido da mesma maneira conforme descrito em C-1), empregando estes cDNAs.
C-3) Clonagem
[000226] O cDNA obtido conforme descrito em C-1) foi clonado no vetor de plasmídeo pcDNA3.1-Zeocina (produzido por Invitrogen), empregando NotI e XbaI como sítios de clonagem, de forma a produzir um vetor de expressão de cadeia pesada do anticorpo quimérico contra ILT7. Além disso, o cDNA obtido conforme descrito em C-2) foi clonado no vetor de plasmídeo pcDNA3.1 -higromicina (produzido por Invitrogen), empregando NotI e XbaI como sítios de clonagem a fim de ser produzido vetor de expressão de cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7. Os nomes de cada vetor são apresentados na Tabela 6. [Tabela 6] Nomes de vetores de plasmídeos
D. Expressão do anticorpo quimérico contra ILT7 D-1) Transformação transitória
[000227] 1 μg do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo quimérico contra ILT7 e 1 μg do vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7, obtidos conforme descrito em C-3), foram co-transfectados em células 293T, utilizando o kit de transfecção effectine (Número de catálogo: 301427, produzido por Qiagen). Posteriormente, os produtos resultantes foram cultivados a 37 °C com meio de cultura DMEM suplementado com 2% de FBS com baixa concentração de IgG, contendo a composição seguinte. Meio de cultura DMEM suplementado com 2% de FBS com baixa concentração de IgG: Meio de cultura DMEM (Número de catálogo: D5796, produzido por Sigma) FBS a 2% com baixa concentração de IgG (Número de catálogo: SH30151.03, produzido por HyClone) L-Glutamina a 2 mM 100 U/ml de Penicilina 100 μg/ml de Estreptomicina pH 7,2 a pH 7,4
[000228] Após introdução de vetores, o meio resultante foi cultivado por 96 horas e o sobrenadante da cultura foi coletado. Em seguida, os fragmentos de células foram retirados por centrifugação, fornecendo uma solução não purificada de anticorpos.
D-2) Transformação por homeostase
[000229] 1 μg do vetor de expressão da cadeia pesada do anticorpo quimérico contra ILT7 e 1 μg of do vetor de expressão da cadeia leve do anticorpo quimérico contra ILT7, obtidos conforme descrito em C-3), foram co-transfectados em células YB 2/0 (células derivadas de mieloma de rato, ATCC#CRL-1622) utilizando o kit de transfecção effectine (Número de catálogo: 301427, produzido por Qiagen). Entre os vetores de plasmídeos utilizados, o vetor para a expressão da cadeia pesada é um marcador para resistência à Zeocina, e o vetor para a expressão da cadeia leve é um marcador para resistência à higromicina. Por conseguinte, células nas quais ambos os vetores foram introduzidos podem ser cultivadas em meio de cultura ao qual Zeocina e higromicina são acrescentadas ao mesmo tempo. Em seguida, as células foram cultivadas em meio de cultura RPMI, ao qual Zeocina e higromicina foram acrescentadas e uma cepa resistente foi selecionada. Meio de cultura RPMI suplementado com Zeocina e higromicina: Meio de cultura RPMI1640 (Número de catálogo: R8758, produzido por Sigma) FBS a 10% HEPES a 0,01 M (ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanossulfônico) Piruvato de sódio a 1 mM L-Glutamina a 2 mM 100 U/ml de Penicilina 100 μg/ml de Estreptomicina 2-mercaptoetanol a 55 μM 0,5 mg/ml de Zeocina 0,5 mg/ml de Higromicina pH 7,2 a pH 7,4
[000230] Três dias depois, a quantidade de anticorpo produzido no sobrenadante da cultura foi determinada pelo método ELISA. A linhagem celular produtora de anticorpo quimérico contra ILT7, em nível alto de expressão, e células que aumentaram suficientemente foram selecionadas. Ademais, uma única clonagem das linhagens celulares selecionadas foi conduzida, pelo método com classificador de células, para serem obtidas as seguintes linhagens celulares. Linhagem de célula produtora de anticorpo quimérico contra ILT7 n° 11: Linhagem celular n° 11-5 e linhagem celular n° 11-16 Linhagem de célula produtora de anticorpo quimérico contra ILT7 n° 17: Linhagem celular n° 17-24
[000231] As linhagens celulares mencionadas acima (linhagem celular n° 11-5, linhagem celular n° 11-16 e linhagem celular n° 17-24) foram cultivadas, respectivamente, em meio de cultura RPMI suplementado com 5% de FBS com a composição seguinte. A temperatura de incubação e o tempo de incubação foram estabelecidos para 37 °C e 96 horas, respectivamente. Meio de cultura RPMI suplementado com FBS a 5%: Meio de cultura RPMI1640 (Número de catálogo: R8758S, produzido por Sigma) FBS a 5% HEPES a 0,01 M Piruvato de sódio a 1 mM L-Glutamina a 2 mM 100 U/ml de Penicilina 100 μg/ml de Estreptomicina 2-mercaptoetanol a 55 μM pH 7,2 a pH 7.4
[000232] O sobrenadante da cultura foi coletado e, em seguida, fragmentos de células foram retirados por centrifugação, fornecendo uma solução não purificada de anticorpos.
E. Purificação de anticorpos
[000233] Cada solução não purificada de anticorpos, obtidas conforme descrito em D-1 e D-2 foram purificadas por coluna de afinidade por proteína A (rProtein A Sefarose FF, Número de catálogo: 17-1279-01, fabricada por Amershram Pharmacia). As condições da purificação são indicadas abaixo. A purificação por afinidade foi conduzida, utilizando tampão PBS (-) com a composição seguinte, como tampão de adsorção, e tampão citrato de sódio a 0,1 M, como tampão de eluição, de acordo com o manual de instrução anexado. Tris-HCl a 1 M (pH 8,0) foi acrescentado às frações eluídas para ajustar o pH em torno de 7,2. As ODs, em comprimento de onda de 450 a 620 nm, foram medidas e, em seguida, cavidades exibindo reação positiva foram selecionadas. Com referência à concentração de anticorpos purificados, a absorvência a 280 nm foi determinada e calculada com base em 1,38 OD/mg/ml. Na Tabela 7, foram resumidas as relações entre anticorpos quiméricos contra ILT7 obtidos, os hibridomas dos quais o gene da região variável foi derivado e as células hospedeiras. Tampão PBS (-): 0,2 g/l de fosfato dihidrogênio monopotássico 0,2 g/l de cloreto de potássio 8 g/l de cloreto de sódio 1,15g/l de fosfato monohidrogênio sódico anidro [Tabela 7] Anticorpos quiméricos produzidos
[000234] Seqüências de bases de cDNA e seqüências de aminoácidos da cadeia pesada e da leve dos anticorpos quiméricos produzidos são apresentadas abaixo, respectivamente. Em cada seqüência de aminoácidos, a seqüência de aminoácidos do N-terminal a -1 é uma seqüência do sinal e a seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal é uma seqüência de aminoácidos de proteína madura. Ou seja, a cadeia pesada e a leve que constituem estes anticorpos quiméricos consistem na seqüência de aminoácidos de 1 a C terminal de cada uma das seguintes seqüências de aminoácidos.
Aplicabilidade Industrial
[000235] A presente invenção forneceu o imunogene útil na produção do anticorpo que reconhece especificamente ILT7 humano e o método para produção do anticorpo anti-ILT7, empregando o imunogene. O anticorpo que reconhece especificamente ILT7 humano da presente invenção reconhece especificamente ILT7 na presença da família ILT. Por conseguinte, o anticorpo da presente invenção pode ser utilizado para detecção e isolamento do ILT7 humano. Por exemplo, a localização do ILT7 pode ser analisada também, utilizando-se o anticorpo da presente invenção. O ILT7 é considerado uma molécula estreitamente relacionada com a diferenciação e função de IPCs ou células dendríticas. Por conseguinte, o anticorpo que reconhece ILT7 com alta especificidade é útil para a análise da função de IPCs ou células dendríticas. São conhecidas células de câncer semelhantes a IPC (com a característica de que BDCA-2 é expressa) (Chaper of L et al. Eur. J. Immunol. 34; 418-426, 2004, Maeda T et al., Int. J. Hematol. 81; 148-154, 2005). A confirmação da expressão do ILT7 nestas células pode permitir o diagnóstico de câncer e um agente terapêutico.
[000236] No caso de doenças auto-imunes, por exemplo, é ressaltada a relação profunda entre IFN-α, produzido por IPCs, e o desenvolvimento de psoríase, uma doença de pele (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Por conseguinte, a gravidade da psoríase pode ser examinada pela identificação de IPCs no tecido cutâneo de pacientes portadores de psoríase, ou seja, o uso do anticorpo anti-ILT7 em amostras de biópsia.
[000237] Sabe-se que o desenvolvimento de AIDS em pacientes infectados por HIV está correlacionado com o número de IPCs. A saber, um número alto de IPCs foi observado em pacientes que não exibem sintomas e a redução em IPCs foi observada no aparecimento (Soumells V. et al., Blood 98; 906-912, 2001). Por conseguinte, ele é eficaz para predizer o prognóstico de infecção viral, como por HIV.
[000238] Por exemplo, o ILT7 é uma molécula expressa especialmente em IPCs humanas. Portanto, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção pode ser utilizado para detectar, identificar ou isolar IPCs. IPCs são células que produzem a maior parte do interferon tipo 1. Portanto, a detecção, identificação ou isolamento é um objetivo importante no diagnóstico e estudo de doenças que envolvem interferon tipo 1. Conforme com estas doenças, várias doenças auto-imunes e infecções, nas quais o interferon está envolvido na criação da condição patológica, podem ser ilustradas.
[000239] Adicionalmente, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção possui efeito inibidor sobre a atividade de IPCs. Por conseguinte, a atividade de IPCs pode ser inibida com o uso do anticorpo anti-ILT7 da presente invenção. Ademais, as doenças que envolvem interferon tipo 1 podem ser tratadas por inibição da atividade de IPCs. Especificamente, o anticorpo anti-ILT7 da presente invenção é útil para várias doenças auto-imunes e infecções nas quais interferon está envolvido na criação da condição patológica. Especialmente, como o anticorpo anti- ILT7 possui alta especificidade, ele pode remover IPCs eficientemente.

Claims (17)

1. Anticorpo monoclonal isolado ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano, em que o anticorpo monoclonal ou fragmento do anticorpo compreende sequências de aminoácidos, de acordo com qualquer um dos seguintes de i) a iii), como CDR1, CDR2 e CDR3, na região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve: i) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: 58); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 59); e CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: SPPYYAMDY (SEQ ID NO: 60); CDR1 de região variável de cadeia leve: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 61); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: WASTRIAT (SEQ ID NO: 62); e CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQYSSYPLT (SEQ ID NO: 63); ii) CDR1 de região variável de cadeia pesada: SYWIH (SEQ ID NO: 64); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: RIYPGTGSTYNNEKFKG (SEQ ID NO: 65); e CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: YPTYDWYFDV (SEQ ID NO: 66); CDR1 de uma região variável de cadeia leve: RASQSISNYLH (SEQ ID NO: 67); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: YASQSIS (SEQ ID NO: 68); CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQSNSWPLT (SEQ ID NO: 69); iii) CDR1 de uma região variável de cadeia pesada: SDYAWN (SEQ ID NO: 70); CDR2 de uma região variável de cadeia pesada: YISYSGSTSYNPSLKSR (SEQ ID NO: 71); CDR3 de uma região variável de cadeia pesada: ALPLPWFAY (SEQ ID NO: 72); CDR1 de uma região variável de cadeia leve: KASQDVGTAVA (SEQ ID NO: 73); CDR2 de uma região variável de cadeia leve: WASTRHT (SEQ ID NO: 74); e CDR3 de uma região variável de cadeia leve: QQYSSYPYT (SEQ ID NO: 75).
2. Anticorpo monoclonal ou o fragmento do anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento do anticorpo liga-se a uma célula humana produtora de interferon.
3. Anticorpo monoclonal ou o fragmento de anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo compreende uma sequência madura das sequência de aminoácidos selecionadas entre qualquer uma das seguintes combinações (a) a (c) como a região variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve: a) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 39 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 41; b) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 43 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 45; e c) uma região variável da cadeia pesada da SEQ ID NO: 47 e uma região variável da cadeia leve da SEQ ID NO: 49.
4. Inibidor para a atividade de uma célula produtora de inter-feron, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, como definido na reivindicação 1, que se liga ao ILT7 humano e inibe a atividade de uma célula produtora de interferon.
5. Inibidor para a atividade de uma célula produtora de interferon, de acordo coma reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a atividade da célula produtora de interferon é decorrente de a atividade produtora de interferon ou a sobrevida da célula produtora de interferon, ou ambas.
6. Reagente para detecção de célula produtora de interferon, caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo monoclonal ou um fragemento de anticorpo, como definido na reivindicação 1, que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano.
7. Método de detecção de célula produtora de interferon, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: por em contato uma célula teste com um anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, como definido na reivindicação 1; e detecção do anticorpo monoclonal ou o fragmento de anticorpo que está ligado à célula.
8. Método in vitro de inibição da atividade de uma célula produtora de interferon caracterizado pelo fato de compreender uma etapa de por em contato uma célula produtora de interferon com o anticorpo monoclonal ou fragmento de anticorpo, como definido na reivindicação 1.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a célula está compreendida em linfócitos do sangue periférico humano.
10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 ou 9, caracterizado pelo fato de que a atividade da célula produtora de interferon é decorrente de a atividade produtora de interferon ou a sobrevida da célula produtora de interferon, ou ambas.
11. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de ser pro-duzido por hibridoma ILT7 n° 11, depositado no Organismo Internacional Depositário de Patentes sob número de Acesso FERM BP-10704 ou hibridoma ILT7 n°17 depositado no Organismo Internacional Depositário de Patentes sob número de Acesso FERM BP-10705, ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno.
12. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser ILT7 n° 11, depositado no Organismo Internacional Depositário de Patentes sob o número de Acesso FERM BP-10704 ou hibridoma ILT7 n° 17 depositado no Organismo Internacional Depositário de Patentes sob o número de Acesso FERM BP-10705.
13. Método de produção de um anticorpo monoclonal, carac-terizado pelo fato de compreender as etapas de: cultura do hibridoma como definido na reivindicação 12; e coleta do anticorpo monoclonal da cultura.
14. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano ou um fragmento compreendendo sua região de ligação a antígeno em que a região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal é selecionada de qualquer uma das combinações (a) a (c): a) SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, respectivamente; b) SEQ ID NO: 42 e SEQ ID NO: 44, respectivamente; e c) SEQ ID NO: 46 e SEQ ID NO: 48, respectivamente.
15. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reidicação 14, caracterizado pelo fato de que a região variável da cadeia pesada e região variável da cadeia leve do anticorpo monoclonal compreende SEQ ID NO: 38 e SEQ ID NO: 40, respectivamente.
16. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende um polinucleotídeo como definido na reivindicação 14 ou 15.
17. Método de produção de um anticorpo monoclonal que se liga a um domínio extracelular do ILT7 humano conforme definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: cultura de uma célula produtora de anticorpo; e recuperação do anticorpo monoclonal da cultura.
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