ES2526079T3 - Anticuerpo anti-ILT7 - Google Patents

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ES2526079T3
ES2526079T3 ES12168586.1T ES12168586T ES2526079T3 ES 2526079 T3 ES2526079 T3 ES 2526079T3 ES 12168586 T ES12168586 T ES 12168586T ES 2526079 T3 ES2526079 T3 ES 2526079T3
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Minkwon Cho
Naoko Arai
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Abstract

Anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano, no se une a ninguno de ILT1 humano, ILT2 humano e ILT3 humano, y suprime la producción de interferón-a (IFNa) desde células que expresan ILT7, o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno.

Description

Anticuerpo anti-ILT7
Campo técnico
La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a ILT7 humano.
Antecedentes de la técnica
El interferón α (IFNα: a continuación en el presente documento, “interferón” se abrevia como IFN) y el interferón β (IFNβ) se conocen como IFN tipo 1 que presentan actividad antiviral o actividad antitumoral. Por otro lado, también se ha revelado que IFNα está relacionado con la enfermedad autoinmunitaria. Por ejemplo, se ha notificado la producción anómala de IFNα en pacientes con las siguientes enfermedades autoinmunitarias. También se ha sugerido que los síntomas de las enfermedades autoinmunitarias pueden reducirse mediante la neutralización de IFNα.
Lupus eritematoso sistémico (Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992)
Reumatismo crónico (Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988)
Se notificaron casos en los que los síntomas de las enfermedades autoinmunitarias se habían manifestado o empeorado mediante la administración de IFNα2 o IFN recombinantes (Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995; Perez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995; Wilson LE et al, Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002.).
Además, también se ha revelado que IFNα induce la diferenciación de células dendríticas. La célula dendrítica es también una célula presentadora de antígeno. Por tanto, se considera que la inducción de diferenciación de células dendríticas consiste en un importante mecanismo en enfermedades autoinmunitarias. Se ha sugerido que existe una profunda asociación entre la inducción de diferenciación de células dendríticas de IFNα y la aparición de lupus eritematoso sistémico (Blanco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001). Por tanto, se ha señalado que IFNα está estrechamente relacionado con la actividad antitumoral así como con enfermedades autoinmunitarias. Además, IFNα está profundamente implicado en la aparición de psoriasis (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005).
Se identificaron células productoras de interferón (IPC) como células que producen IFN tipo 1 en grandes cantidades asociadas con infección viral. Se presentan pocas IPC en la sangre. Se considera que los linfocitos de sangre periférica representan el 1% o menos de las IPC. Sin embargo, las IPC tienen una capacidad muy elevada para producir IFN. La capacidad de producción de IFN de las IPC alcanza, por ejemplo, 3000 pg/ml/104 células. Es decir, puede decirse que la mayor parte del IFNα o IFNβ en la sangre, que se produce en la infección viral, resulta de las IPC, aunque haya pocas células.
Por otro lado, las IPC son células dendríticas linfoides no diferenciadas que se consideran como células precursoras de las células dendríticas. Las IPC pueden denominarse células dendríticas plasmocitoides. Las IPC se diferencian en células dendríticas mediante estimulación viral e inducen la producción de IFNy o IL-10 por células T. Las IPC también se diferencian en células dendríticas mediante la estimulación por IL-3. Las células dendríticas diferenciadas mediante la estimulación por IL-3 inducen la producción de citocina Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) por células
T. Por tanto, las IPC tienen propiedades que les permiten diferenciarse en distintas células dendríticas mediante
diferente estimulación. Por consiguiente, las IPC tienen dos perfiles: células productoras de IFN y células precursoras de células dendríticas. Ambas células desempeñan un papel importante en el sistema inmunitario. En otras palabras, IPC es una de las células importantes que soportan el sistema inmunitario en diversos aspectos.
Documento no de patente 1: Shiozawa et al., Arthr. & Rheum. 35, 412, 1992 Documento no de patente 2: Hopkins et al., Clin. Exp. Immunol. 73, 88, 1988 Documento no de patente 3: Wada et al., Am. J. Gastroenterol. 90, 136, 1995 Documento no de patente 4: Parez et al., Am. J. Hematol. 49, 365, 1995 Documento no de patente 5: Bianco et al., Science, 16:294, 1540-1543, 2001 Documento no de patente 6: Ju et al., Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64. Documento no de patente 7: Colonna M et al., Seminars in Immunology 12: 121-127, 2000.
Documento no de patente 8: Nakajima H. et al., J. Immunology 162: 5-8. 1999
Documento no de patente 9: Wilson LE et al., Semin Arthritis. Rheum. 32, 163-173, 2002
Documento no de patente 10: Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005
Documento de patente 1: documento WO03/12061 (solicitud de patente estadounidense publicada n.º 2003-148316)
Descripción de la invención
Problemas que debe resolver la invención
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo que se una al transcrito 7 similar a inmunoglobulina (ILT7), para regular por disminución la actividad de IFN de las IPC.
Medios para resolver los problemas
Para regular la actividad de un factor humoral tal como IFN, la administración de anticuerpos, que reconocen el factor, es eficaz. Por ejemplo, se ha realizado el intento de tratar enfermedades autoinmunitarias mediante anticuerpos contra interleucina (IL)-1 o IL-4 (Guler et al., Arthritis Rheum., 44. S307, 2001). Además, se supone que los anticuerpos neutralizantes pueden servir como agentes terapéuticos de enfermedades autoinmunitarias como con el interferón (Stewart, TA. Cytokine Growth Factor Rev. 14; 139-154, 2003). Puede predecirse que el mismo enfoque que se describió anteriormente es eficaz con el IFN producido por las IPC. Sin embargo, un enfoque se este tipo se basa en la inhibición del efecto del factor humoral tras la producción del factor. Si la producción del factor humoral deseado puede controlarse directamente, pueden lograrse efectos terapéuticos más sustanciales. Se han notificado anticuerpos, que reconocen IPC humanas. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es anticuerpo monoclonal específico de IPC humanas (Dzionek A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000). Se encuentra que anticuerpo monoclonal anti-BDCA-2 es eficaz en la inhibición de la producción de IFN por IPC humanas (J. Exp. Med. 194: 1823-1834, 2001.). Además, también se ha notificado que anticuerpos monoclonales, que reconocen células productoras de interferón en ratones, inhiben la producción de interferón (Blood 1 de junio de 2004; 103/11: 4201-4206. Epub diciembre de 2003). Se notificó que el número reducido de células dendríticas se debía a anticuerpos monoclonales contra células dendríticas plasmocitoides en ratones (J. Immunol. 2003, 171: 6466-6477).
De manera similar, será útil que se proporcionen anticuerpos que reconozcan IPC humanas y que puedan regular la actividad. Por ejemplo, los presentes inventores han mostrado ya que un anticuerpo, que reconoce Ly49Q, se une específicamente a IPC de ratón. Sin embargo, el anticuerpo contra Ly49Q no interfirió en la actividad de IPC de ratón (Blood, 1 de abril de 2005, Vol. 105, N.º 7 y págs. 2787-2792.; documento WO2004/13325). Por otro lado, ILT7 se conoce como molécula cuya expresión específica se observa en células dendríticas plasmocitoides (Ju XS et al.y Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; documento WO03/12061). Sin embargo, no se ha obtenido ningún anticuerpo contra ILT7. Por tanto, también se desconocen los efectos de los anticuerpos sobre las IPC. ILT7 es una proteína de membrana que contiene un motivo similar a inmunoglobulina. Se ha notificado como una de las moléculas expresadas en células del sistema mieloide o el sistema linfático (Colonna M et al., Seminars in Immunology 12:121-127, 2000.). Una pluralidad de moléculas con estructuras análogas a ILT7 se denomina familia de ILT. La familia de ILT también es estructuralmente similar a los receptores inhibidores de células citotóxicas (KIR). ILT7 tiene cuatro dominios similares a inmunoglobulina tipo C como con otras moléculas de la familia de ILT. Se considera que ILT7 envía señales de activación al interior de la célula como con ILT1, proteína similar a ILT1, ILT8 y LIR6a. Se ha confirmado que una molécula perteneciente a la familia de ILT se expresa en células del sistema hemocítico (Young et al., Immunogenetics 53: 270-278, 2001; “The KIR Gene Cluster. “Carrington, Mary y Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (EE.UU.), NCBI; 2003).
Entonces, se detectó una alta expresión de ILT7 en células dendríticas plasmocitoides (PDC) y se detectó una baja expresión de ILT7 en células dendríticas derivadas de monocitos (MDDC) mediante hibridación sustractiva. ILT2 e ILT3 se expresaron no sólo en PDC sino también en DC obtenidas de células positivas para CD34 o MDDC. Sin embargo, puesto que el ARNm en ILT7 se expresó específicamente en PDC, se encontró que el ARNm podría servir como marcador de PDC. Adicionalmente, se encontró que en ese momento, la expresión de ILT7 se reducía por la estimulación de CpG (Ju XS et al. Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.; documento WO03/12061).
Los presentes inventores confirmaron que la expresión específica de ILT7 en IPC estaba facilitada a través del estudio sobre IPC humanas. Entonces, los presentes inventores intentaron producir anticuerpos de ILT7 y dilucidar los efectos. Por ejemplo, moléculas que constituyen familias de ILT tales como ILT2 e ILT3 tienen alta conservación, particularmente en secuencias de aminoácidos de dominios extracelulares (figura 9). Estas familias de ILT presentan perfiles de expresión característicos en diversas células sanguíneas, respectivamente. Por tanto, es un objeto muy importante obtener un anticuerpo que pueda distinguir inmunológicamente entre otras moléculas de la familia de ILT e ILT7. Sin embargo, de hecho, fue difícil producir un anticuerpo que se uniese específicamente a IPC humanas
usando ILT7 como inmunógeno debido a los obstáculos descritos a continuación.
Generalmente, una proteína producida mediante la tecnología de recombinación génica se usa como inmunógeno para obtener un anticuerpo que reconoce una cantidad traza de proteínas derivadas de organismos vivos. Los presentes inventores intentaron expresar ILT7 humano basándose en información de una secuencia de bases de ADNc de ILT7 humano, que ya se había hallado, y la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de bases (n.º de registro GenBank NM012276). Sin embargo, los presentes inventores no pudieron producir ILT7 humano como recombinante en condiciones normales. La secuencia de aminoácidos parcial de la proteína natural se intenta usar a menudo como inmunógeno para obtener un anticuerpo de proteína. Sin embargo, hay pocas secuencias de aminoácidos específicas para ILT7 humano en proteínas puesto que la homología con las secuencias de aminoácidos es extremadamente alta en la familia de ILT. Además, es necesario seleccionar la región constituida por la parte que se reconoce como epítopo por anticuerpos en la superficie de las células con el fin de permitir que anticuerpos reconozcan moléculas en la superficie de las células. Por tanto, se ha considerado que la formación de un anticuerpo que es específico para ILT7 usando una secuencia de aminoácidos fragmento como inmunógeno no es realista.
Los presentes inventores mostraron que podía obtenerse un anticuerpo, que se une a las IPC, usando un inmunógeno especial en tales condiciones. Además, los presentes inventores encontraron que el anticuerpo así obtenido reconocía específicamente IPC humanas y además tenía un efecto de regular la actividad y de ese modo tuvieron éxito en completar la presente invención. Es decir, la presente invención se refiere al siguiente anticuerpo anti-ILT7, al método de producción del mismo y al uso del mismo.
Efectos de la invención
La presente invención proporciona un inmunógeno útil en la producción de un anticuerpo que se une a ILT7 humano, no se une a ninguno de ILT1 humano, ILT2 humano e ILT3 humano, y suprime la producción de interferón-α (IFNα) desde células que expresan ILT-7, o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno. Un método de producción de tal anticuerpo anti-ILT7 humano usando el inmunógeno.
ILT7 es una proteína de membrana perteneciente a la familia de ILT. Particularmente, la secuencia de aminoácidos de la región extracelular está altamente conservada entre las familias de ILT. Por tanto, es extremadamente difícil producir un anticuerpo que distinga entre las familias de ILT mediante métodos de inmunización generales. Los presentes inventores mostraron que el anticuerpo, que reconoce ILT7 humano, puede obtenerse fácilmente usando células animales en las que ILT7 se coexpresa con proteína de membrana celular. El anticuerpo anti-ILT7, que puede obtenerse mediante la presente invención, tiene una alta especificidad que distingue células que expresan otras familias de ILT de las que expresan IPC humanas.
En una realización preferida, el anticuerpo anti-ILT7 humano proporcionado por la presente invención se une a IPC humanas. Además, el anticuerpo de la presente invención reconoce específicamente IPC humanas. Por tanto, es útil en la detección y el aislamiento de IPC. IPC es una célula que produce la mayor parte del interferón tipo 1. Por tanto, la detección y el aislamiento son importantes en el diagnóstico y el estudio de enfermedades que implican IPC tales como enfermedades autoinmunitarias. Particularmente, según los hallazgos de los presentes inventores, la expresión de ILT7 en las IPC no se reduce con la presencia de IFNα. La expresión de IFNα está facilitada a menudo en pacientes con enfermedades autoinmunitarias. Esto significa que el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede usarse para la detección y el aislamiento de las IPC con respecto a los pacientes con enfermedades autoinmunitarias en las que la expresión de IFNα está facilitada.
El anticuerpo anti-ILT7 proporcionado por la presente invención tiene un efecto que regula la actividad de IPC humanas en una realización preferida. Por tanto, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede usarse para inhibir la actividad de las IPC. Tal como se describió previamente, la expresión de ILT7 en las IPC no se reduce con la presencia de IFNα. Por tanto, si se usa la inhibición de la actividad de las IPC por el anticuerpo de la presente invención, puede esperarse un efecto terapéutico sobre los pacientes con enfermedades autoinmunitarias las en que la expresión de IFNα está facilitada.
Escasas IPC producen una gran cantidad de IFN. Son necesarios tantos anticuerpos como moléculas de IFN para la neutralización de IFN. Sin embargo, se inhibe la producción de activación celular directamente en la presente invención. Como resultado, puede esperarse un fuerte efecto inhibidor sobre IFN aunque se use una cantidad menor de anticuerpos en comparación con neutralización por el anticuerpo anti-IFN. Además, en el caso en el que IFN se produce de manera continua, se predice que la neutralización por anticuerpos frente a IFN es una inhibición transitoria. En la presente invención, puesto que se inhibe la actividad de las IPC, puede esperarse el efecto de inhibición de la producción de IFN a lo largo de un periodo de tiempo prolongado.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1a es una fotografía en la que se examina la expresión de ARNm del gen de ILT7 mediante un método de
RT-PCR. Es el resultado de la expresión analizada de ARNm del gen de ILT7 en inmunocitos humanos.
La figura 1b es un diagrama en el que la expresión de ARNm del gen de ILT7 en diversos tejidos y células humanos se compara y examina usando un método de PCR cuantitativa. El eje horizontal muestra los tejidos y células examinados y el eje vertical muestra el nivel de expresión de ILT7, que se normaliza según el nivel de expresión del gen de GAPDH.
La figura 2 es un diagrama que muestra estructuras de proteína ILT7, en el que la figura 2(a) muestra una secuencia de aminoácidos de proteína ILT7 y muestra además la secuencia señal de secreción estimada y el dominio transmembrana en el dibujo, y la figura 2(b) muestra un diagrama esquemático de proteínas ILT7 que están codificadas por vectores de expresión construidos.
La figura 3 es un diagrama que muestra el resultado de que se introdujeran el vector de expresión de ILT7 y el vector de expresión de FcRy en células y se examinó la expresión en la superficie celular de moléculas de ILT7 mediante FCM. El eje horizontal muestra la intensidad de fluorescencia detectada en anticuerpo anti-FLAG, concretamente, la intensidad de la expresión en la superficie celular de moléculas de ILT7 a las que se les unió una etiqueta FLAG y el eje vertical muestra el número de células.
La figura 4 muestra fotografías en las que se analizó la introducción del vector de expresión de ILT7 y el vector de expresión de FcRy en células y la asociación de moléculas mediante inmunoprecipitación e inmunotransferencia de tipo Western. Los diagramas en el lado izquierdo muestran los resultados de que se sometió a inmunotransferencia molécula de ILT7 con anticuerpo anti-FLAG tras la inmunoprecipitación de molécula de FcRy con anticuerpo antimyc (el dibujo superior) y se sometió a inmunotransferencia molécula de FcRy con anticuerpo anti-myc (el dibujo inferior). De manera similar, los diagramas en el lado derecho muestran los resultados de que se sometió a inmunotransferencia molécula de ILT7 con anticuerpo anti-FLAG tras la inmunoprecipitación de molécula de FcRy con anticuerpo anti-FLAG (parte superior) y se sometió a inmunotransferencia molécula de FcRy con anticuerpo antimyc (parte inferior).
La figura 5 es una fotografía en la que se examinó la glicosilación de molécula de ILT7 mediante la introducción de vector de expresión de ILT7 y vector de expresión de FcRy en la célula y tratamiento con N-glicosidasa. El lado izquierdo de la fotografía muestra el tamaño de ILT7 en el caso en el que ILT7 no se trató con N-glicosidasa y el lado derecho de la fotografía muestra el tamaño de ILT7 en el caso en el que se realizó el tratamiento con N-glicosidasa.
La figura 6a es un diagrama en el que se examinó la capacidad de respuesta del anticuerpo monoclonal anti-ILT7 producido mediante análisis de FCM. (a) muestra el resultado de que se analizó la unión del anticuerpo anti-ILT7 a la fracción de IPC de positivas para BDCA-2 usando linfocitos de sangre periférica humanos y doble tinción con el anticuerpo anti-ILT7 y el anticuerpo anti-BDCA-2. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta frente al anticuerpo frente a BDCA-2 y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta frente a cada uno de los anticuerpos anti-ILT7 producidos.
La figura 6b es un diagrama en el que se examinó la capacidad de respuesta de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos mediante análisis de FCM. (b) muestra el resultado en el que se examinó la unión del anticuerpo anti-ILT7 a molécula de ILT7 usando células 293T en las que se habían introducido los vectores de expresión de ILT7 y de FcRy. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta de anticuerpo anti-FLAG, concretamente, la intensidad de expresión de moléculas de ILT7 a las que se les unió una etiqueta FLAG y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de anticuerpos anti-ILT7 respectivos.
La figura 7 es un diagrama en el que entre los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos, se examinó la capacidad de respuesta de dos clones frente a linfocitos de sangre periférica humanos mediante análisis de FCM. Tres gráficos a la izquierda muestran los resultados de #11 y tres gráficos a la derecha muestran los resultados de #17. En los diagramas en el lado izquierdo, cada eje con la marca de ILT7 muestra la capacidad de respuesta de ILT7#11. De manera similar, en los diagramas en el lado derecho, cada eje con la marca de ILT7 muestra la capacidad de respuesta de ILT7#17.
La figura 8 es el resultado en el que se comparó la actividad de unión de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 ILT7#11 e ILT7#17 producidos frente a linfocitos humanos con la del anticuerpo anti-BDCA-2 y se examinó. El eje vertical muestra la capacidad de respuesta del anticuerpo anti-CD123 y el eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de cada anticuerpo. Es decir, cada anticuerpo se une a una parte de célula positiva para CD123. Es un diagrama que muestra los resultados en los que se analizó la capacidad de respuesta cuando se estimularon células linfocíticas mediante dos clases de CpG e IFNα.
La figura 9a es un diagrama que muestra secuencias de aminoácidos de moléculas de la familia con alta homología con moléculas de ILT7. Cada secuencia de aminoácidos de la región extracelular se muestra principalmente como una alineación;
La figura 9b es una continuación de la figura 9a; y la figura 9c es una continuación de la figura 9b.
La figura 10 es el resultado en el que se examinó la capacidad de respuesta de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 ILT7#11 e ILT7#17 producidos frente a moléculas de ILT1, ILT2 e ILT3 usando células en las que se introdujeron sus vectores de expresión. El diagrama superior muestra los resultados en los que se reafirmó la capacidad de respuesta frente a células en las que se habían coexpresado moléculas de ILT7 con una etiqueta FLAG, con FcRγ. El diagrama inferior muestra los resultados en los que la capacidad de respuesta frente a células en las que se introdujeron ILT1, ILT2, ILT3 y FcRy (diagrama izquierdo: ILT7#11, diagrama derecho: ILT7#17). El eje horizontal muestra la capacidad de respuesta de cada anticuerpo anti-ILT7.
La figura 11 es un diagrama que muestra el efecto de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 ILT7#11 e ILT7#17 producidos sobre la capacidad interferogénica de linfocitos humanos. En el diagrama, el eje horizontal muestra la concentración de IFNα en un sobrenadante de cultivo cuando se estimularon linfocitos humanos mediante virus Influenza y el eje vertical muestra los anticuerpos tratados. El término “sin infecciones” indica los resultados de células que no se estimularon mediante virus Influenza.
La figura 12 es un diagrama que muestra la actividad de CDC de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 ILT7#37, ILT7#28 e ILT7#33 producidos. Incluso cuando se usaron los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 obtenidos a partir de cualquier hibridoma, se mostró el 80% o más de la actividad de CDC a la concentración de anticuerpo de 0,1 µg/ml o mayor. En el caso de anticuerpos distintos del anticuerpo monoclonal anti-ILT7, no se observó la actividad de CDC frente a células diana.
La figura 13 es un diagrama que muestra la internalización frente a células diana de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 ILT7#17, ILT7#26, ILT7#37, ILT7#28 e ILT7#33 producidos.
La intensidad de fluorescencia de APC es un indicador de la cantidad del complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 que estaba presente en la superficie de las células antes de la incubación y se detecta independientemente de si el complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 está presente en la superficie de la célula diana o se incorpora en la célula tras la incubación. Por otro lado, la intensidad de fluorescencia de FITC es un indicador de la cantidad del complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 que permanece en la superficie de las células tras la incubación. Es decir, la intensidad de fluorescencia de FITC disminuye mediante internalización.
Se ha notificado que ILT7 (transcrito 7 similar a inmunoglobulina) humano es una molécula que se expresa específicamente en células dendríticas plasmocitoides (Gene. 28 de abril de 2004; 331:1 59-64.; documento WO03/12061). Alternativamente, también se sabe que ILT7 humano puede usarse como indicador predictivo para el pronóstico de linfoma (documento WO2005/24043). Sin embargo, no se ha establecido un método para producir un anticuerpo que pueda reconocer ILT7 humano.
ILT7 humano consiste en 499 residuos de aminoácido tal como se muestra en SEQ ID NO: 2 y es una proteína transmembrana tipo 1 que comprende cuatro dominios similares a inmunoglobulina en la estructura y una región transmembrana (445-466; desde 429 hasta 450 en SEQ ID NO: 2). Entre los 444 residuos de aminoácido incluyendo el extremo N-terminal, 16 residuos de aminoácido (desde -15 hasta -1, en SEQ ID NO: 2) son secuencias señal y 17 a 444 residuos de aminoácido (desde 1 hasta 428, en SEQ ID NO: 2) constituyen un dominio extracelular. Por otro lado, la región C-terminal es un dominio intracelular. La mayor parte de las partes del ILT7 humano son dominios extracelulares y 33 residuos de aminoácido constituyen un dominio intracelular (desde 467 hasta 499; desde 451 hasta 483, en SEQ ID NO: 2). No se predice que un motivo, que está implicado en la señalización, esté presente en un dominio intracelular. Una secuencia de aminoácidos de longitud completa de ILT7 humano se muestra en SEQ ID NO: 2 y una secuencia de bases de ADNc que codifica para la secuencia de aminoácidos se muestra en SEQ ID NO: 1. En este caso, las regiones codificantes del péptido maduro (72)..(1520), mostradas en SEQ ID NO: 1, no comprenden los codones de terminación e iniciación. Es decir, las secuencias codificantes de proteína que comprenden los codones de terminación e iniciación en SEQ ID NO: 1 son desde 24 hasta 1523.
Se considera que la señal de ligando se transmite a las células mediante la asociación de ILT7 humano con una molécula de transducción de señales. Por ejemplo, la mayor parte de las cadenas γ del receptor de Fc están presentes en células. Además, el dominio intracelular contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (ITAM) que está implicado en la señalización. ITAM es una parte de secuencia de aminoácidos, que se observa comúnmente en moléculas adaptadoras que están asociadas con inmunorreceptores tales como receptores de Fc. Un motivo tal como YxxL (SEQ ID NO: 76), que es una diana de la fosforilación de tirosinas, está comprendido en ITAM y se transmite la señal mediante la fosforilación. Los ejemplos conocidos de la molécula de transducción de señales, que comprende ITAM en un dominio intracelular, incluyen CD3ζ y DAP12 además de la cadena γ del receptor de Fc. Entre estas moléculas de transducción de señales, se predice que la molécula asociada con ILT7 humano es la cadena γ del receptor de Fc. Actualmente, no se ha encontrado un ligando, que se una a ILT7 humano.
Los presentes inventores confirmaron que ILT7 se expresaba específicamente en IPC humanas mediante análisis de la expresión génica. Los presentes inventores consideraron que sería útil en el estudio de las IPC que pudiera
obtenerse un anticuerpo que pueda distinguir ILT7 humano de otras moléculas de manera inmunológica. Sin embargo, existen muchas moléculas con estructuras similares en la familia de ILT incluyendo ILT7. Moléculas tales como ILT1, ILT2, ILT3, ILT4, ILT5, ILT6, o LIR-8 comprenden secuencias de aminoácidos altamente homólogas, particularmente en sus dominios extracelulares. Por tanto, los presentes inventores consideraron que era difícil obtener un anticuerpo que pueda distinguir entre estas moléculas usando un péptido de dominio que comprende una secuencia de aminoácidos parcial que constituye un dominio extracelular como inmunógeno. Entonces, los presentes inventores han intentado producir un anticuerpo contra ILT7 humano usando las células que expresan ILT7 humano como inmunógenos.
Sin embargo, el uso de vectores de expresión generales no provocó la expresión de ADNc de ILT7 humano en células animales. Se ha notificado que la molécula de ILT1 que tiene una estructura muy similar a ILT7 se asocia con la cadena γ del receptor de Fc. Es decir, cuando se usaron células en las que se expresó la cadena γ del receptor de Fc tales como células RBL (leucemia basófila de rata) y células P815 (mastocitoma de ratón) como células huésped, se observó la expresión de ILT1 en la superficie celular. Sin embargo, si se forzaba que se expresase ILT1 en células 293 en las que no se expresaba originariamente la cadena del receptor de Fc, no se observaba la expresión en la superficie celular. Por otro lado, se mostró que la expresión en la superficie celular de ILT1 pudo confirmarse cuando se coexpresó ILT1 con la cadena del receptor de Fc (Nakajima H. et al., J. Immunology 162:5-8,1999). Sin embargo, no existe información sobre un inmunógeno para producir anticuerpos frente a ILT7.
Por ejemplo, en el informe, se usan células RBL en las que se introduce el gen de ILT1 como inmunógenos para producir anticuerpos frente a ILT1. Los presentes inventores intentaron producir anticuerpos frente a ILT1 usando la combinación de células RBL con el gen de ILT7 de la misma manera que se ha descrito. Sin embargo, aunque se forzase que se expresara ILT7 en células RBL (P815), no se observó expresión en la superficie celular de ILT7, y por tanto no pudo usarse como inmunógeno.
Los presentes inventores han realizado una investigación dedicada para obtener el anticuerpo que pueda reconocer ILT7 humano. Como resultado, los presentes inventores encontraron que podía producirse el anticuerpo deseado usando una célula transformada específica como inmunógeno y completaron la presente invención. Es decir, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une a un anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano, no se une a ninguno de ILT1 humano, ILT2 humano e ILT3 humano, y suprime la producción de interferónα (IFNα) desde células que expresan ILT-7, o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno.
En la presente invención, ILT7 humano puede definirse como una molécula natural que se expresa en IPC humanas
o una molécula que es inmunológicamente equivalente a ILT7 que se expresa en IPC humanas. En la presente invención, la unión de anticuerpos a ILT7 humano puede confirmarse, por ejemplo, tal como sigue.
Confirmación basándose en la capacidad de respuesta frente a células humanas:
Según los hallazgos de los presentes inventores, la expresión específica de ILT7 humano se observó en IPC humanas. Originariamente, se aisló ILT7 humano como un gen cuya expresión se observa en células dendríticas plasmocitoides (Blood. 2002 100; 3295-3303, Gene. 28 de abril de 2004; 331:159-64.). Además, también se sabe que puede usarse como marcador de células dendríticas plasmocitoides (documento WO03/12061). Se supone que las células dendríticas plasmocitoides y las IPC son en su mayor parte poblaciones celulares idénticas o grandes partes de las mismas son comunes. Por tanto, no existe contradicción entre estos informes y los hallazgos de los presentes inventores.
Considerando tal perfil de expresión de ILT7 humano, en primer lugar, la actividad de unión de IPC o células dendríticas plasmocitoides a al menos un determinado subconjunto es una de las características importantes del anticuerpo que se une a ILT humano en la presente invención. Pueden usarse marcadores de superficie celular específicos para poblaciones celulares respectivas para determinar si una determinada célula es IPC o célula dendrítica plasmocitoide. Por ejemplo, la unión a las células deseadas puede confirmarse mediante tinción doble con el anticuerpo que se une a marcadores de superficie celular y el anticuerpo cuya actividad de unión debe comprobarse. Es decir, las IPC en la presente invención comprenden, por ejemplo, células que expresan BDCA2.
Confirmación basándose en la capacidad de respuesta frente a células transformadas que expresan el gen de ILT7 humano:
Los presentes inventores encontraron que se reconstruía una característica inmunológica de ILT7 expresado en IPC humanas cuando se llevaba a cabo la expresión del gen de ILT7 humano en una condición específica. Por tanto, la capacidad de respuesta frente a ILT7 humano también puede confirmarse basándose en la capacidad de respuesta de anticuerpos frente a células en las que se introduce de manera artificial un gen que codifica para ILT7. Concretamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende la secuencia de aminoácidos que constituye un dominio extracelular como el dominio extracelular y se une a una molécula coexpresada con la molécula de transducción de señales o se refiere a un fragmento que comprende su región de unión a antígeno. En este caso, el dominio extracelular se compone de una secuencia de aminoácidos que
corresponde a la posición 17ª a 444ª de la secuencia de aminoácidos N-terminal mostrada en SEQ ID NO: 2 (desde 1 hasta 428 en SEQ ID NO: 2).
Por ejemplo, la característica inmunológica de ILT7 expresada en IPC humanas se mantiene en células cotransfectadas con un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para ILT7 humano y un vector de expresión que comprende un ADN que codifica para la molécula de transducción de señales. Por tanto, una célula transformada, que coexpresa ILT7 humano y la molécula de transducción de señales, es preferible para confirmar la afinidad de unión de anticuerpos al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención. En la presente invención, es deseable usar una célula, que no está transformada como controles cuando la capacidad de respuesta de anticuerpos, se confirma usando la célula transformada. Además, también es importante confirmar que la unión de anticuerpos no se detecta usando la misma célula huésped que expresa sólo la molécula de transducción de señales como control.
En la presente invención, una molécula, que induce la expresión de ILT7 humano en la superficie celular, puede usarse como la molécula de transducción de señales para la coexpresión. La molécula de transducción de señales en la presente invención también puede definirse como una molécula que puede conferir la característica inmunológica de ILT7 humano natural a al menos el dominio extracelular de la molécula de ILT7 en una célula que expresa ILT7. Tal como se usa en el presente documento, el término “característica inmunológica” de ILT7 humano natural significa el reconocimiento por un anticuerpo que se une a IPC humanas.
Específicamente, es preferible usar la cadena γ del receptor de Fc o DAP12 como molécula de transducción de señales. En la presente invención, la cadena γ del receptor de Fc es particularmente preferible como la molécula de transducción de señales. La cadena γ del receptor de Fc es una molécula que consiste en las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 16. La molécula de transducción de señales puede ser un fragmento siempre que el ILT7 humano que va a coexpresarse se localice en la superficie celular. Siempre que el ILT7 humano que va a coexpresarse se localice en la superficie celular, se permite la mutación o adición de la secuencia de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 16. Es decir, la presente invención proporciona métodos para producir células que producen un anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano, no se une a ninguno de ILT1 humano, ILT2 humano e ILT3 humano, y suprime la producción de interferón-α (IFNα) desde células que expresan ILT-7, o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno, que comprende las siguientes etapas de:
(1)
administrar a un animal no humano una célula que conserva los siguientes puntos (a) y (b) de manera expresable:
a.
un polinucleótido exógeno que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano; y
b.
un polinucleótido exógeno que codifica para la cadena γ del receptor de Fc (FcRγ); y
(2)
producir y seleccionar una célula productora de anticuerpos que produce el anticuerpo que se une a ILT7 humano de células productoras de anticuerpos del animal no humano; y
(3)
cultivar la célula así seleccionada y recuperar un anticuerpo monoclonal del cultivo.
Posteriormente, como el anticuerpo que se une a ILT7 humano en la presente invención, es preferible usar un anticuerpo en el que no se observa cruzamiento con poblaciones celulares que se sabe que expresan las familias de ILT distintas de ILT7. Específicamente, como el anticuerpo que se une a ILT7 humano en la presente invención, es preferible usar un anticuerpo en el que no puede observarse la unión a las poblaciones celulares que se sabe que expresan las familias de ILT distintas de ILT7, en la misma condición que la condición en la que se confirmó la unión a las IPC. Tal como se describió ya, por ejemplo, ILT2 e ILT3 se expresan no sólo en PDC sino también en DC obtenidas de células positivas para CD34 o MDDC (Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.). Por otro lado, la expresión de ILT7 no puede detectarse debido a la diferenciación de las IPC en células dendríticas. Por tanto, el anticuerpo no puede detectar la unión a DC obtenidas de células positivas para CD34 o MDDC en la condición en la que puede confirmarse que la unión a las IPC está comprendida en el anticuerpo que se une a ILT7 humano en la presente invención.
Se han notificado los siguientes patrones de expresión en cuanto a otras moléculas de la familia de ILT (“The KIR Gene Cluster” Carrington, Mary y Norman, Paul. Bethesda (MD): National Library of Medicine (EE.UU.), NCBI; 2003, Gene. 28 de abril de 2004; 331: 159-64.). Por tanto, un anticuerpo que se une a IPC humanas o PDC y cuya unión a las siguientes células no puede confirmarse se incluye en un anticuerpo que tiene especificidad para ILT7:
ILT1; células del linaje mieloide (monocitos, DC derivadas de monocitos, macrófagos);
ILT2; PDC, células B, células positivas para CD34, DC derivadas de células positivas para CD34 y DC derivadas de
monocitos;
ILT3; PDC y DC;
ILT5; monocitos, DC derivadas de células positivas para CD34 y DC derivadas de monocitos; e
ILT8; células del linaje de monocitos.
Es decir, el anticuerpo monoclonal, que se une al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención preferiblemente, comprende un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes características inmunológicas:
a) el anticuerpo monoclonal se une a IPC humanas; y
b) la unión del anticuerpo monoclonal a una o más células seleccionadas del grupo que consiste en monocitos, macrófagos, células B, células positivas para CD34 y células dendríticas derivadas de estas células no puede confirmarse en la condición para la unión a IPC humanas.
Como el anticuerpo monoclonal de la presente invención, es preferible usar un anticuerpo en el que la unión a monocitos, macrófagos, células B, células positivas para CD34 y células dendríticas derivadas de estas células no puede confirmarse en la condición para la unión, particularmente a IPC humanas.
Alternativamente, el anticuerpo monoclonal, que se une al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención, comprende preferiblemente un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes características inmunológicas:
c) el anticuerpo monoclonal se une a la célula transformada que se cotransfecta con un vector de expresión que porta de manera expresiva el ADN que codifica para ILT7 humano y un vector de expresión que porta de manera expresiva el ADN que codifica para la molécula de transducción de señales;
d) la unión a la célula huésped antes de la transformación no puede confirmarse en la condición para la unión a las células cotransfectadas tal como se describe en c); o
el anticuerpo monoclonal de la presente invención comprende un anticuerpo monoclonal que tiene las siguientes características inmunológicas:
e) la unión a la célula huésped que expresa sólo la molécula de transducción de señales no puede confirmarse en la condición para la unión a las células contransfectadas tal como se describe en c).
En la presente invención, el hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 no se cruce con la familia de ILT de otras moléculas puede confirmarse usando células en las que se forzó que se expresase cada familia de ILT. Es decir, para la expresión forzada, se introduce ADNc que codifica para cada familia de ILT de secuencias de aminoácidos en una célula huésped apropiada. El anticuerpo monoclonal anti-ILT7 cuyo cruzamiento debe confirmarse se pone en contacto con la célula transformada obtenida. Entonces, puede confirmarse que si no se observa la unión del anticuerpo a la célula, que expresa moléculas de la familia de ILT distintas a ILT7, el anticuerpo puede distinguir inmunológicamente entre ILT7 y otras moléculas de la familia de ILT. Por ejemplo, en los ejemplos descritos a continuación, se confirma el hecho de que el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 obtenido mediante la presente invención no se cruza con ILT1, ILT2 e ILT3. Por tanto, un ejemplo preferible del anticuerpo monoclonal en la presente invención es el anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 en el que la unión a ILT1, ILT2 e ILT3 no puede detectarse en la misma condición.
Particularmente, ILT2 e ILT3 son genes cuya expresión en las IPC se ha confirmado (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004). Sin embargo, estas moléculas pueden mostrar perfiles de expresión únicos para cada tipo celular dependiendo de los niveles de diferenciación respectivos en las IPC o condiciones tales como la estimulación con virus u otras citocinas. El uso de un anticuerpo, que puede distinguir inmunológicamente estas moléculas de la familia de ILT de ILT7, permite detectar específicamente cambios en la expresión de ILT7.
La unión de un anticuerpo monoclonal cuya actividad de unión debe confirmarse a diversas clases de células, puede confirmarse basándose en, por ejemplo, el principio de la citometría de flujo. Para confirmar la capacidad de respuesta de anticuerpos basándose en el principio de la citometría de flujo, es ventajoso marcar por adelantado los anticuerpos con una molécula o un grupo atómico que produzca una señal detectable. Generalmente, se usan los marcadores fluorescentes o luminiscentes. Puede usarse un separador de células activado por fluorescencia (FACS) para analizar la unión de los anticuerpos marcados de manera fluorescente a células basándose en el principio de la citometría de flujo. El uso de FACS permite confirmar de manera eficaz la unión de una pluralidad de anticuerpos a una pluralidad de células.
Específicamente, por ejemplo, se hacen reaccionar el anticuerpo A que se ha encontrado previamente que puede
identificar las IPC y el anticuerpo B cuyas características de unión a IPC deben analizarse, con poblaciones celulares que comprenden las IPC al mismo tiempo. El anticuerpo A y el anticuerpo B se marcan por adelantado con una señal de fluorescencia que se distingue mutuamente por estos anticuerpos. En el caso en el que ambas señales se detectan a partir de las mismas poblaciones celulares, puede confirmarse la unión de esos anticuerpos a las mismas poblaciones celulares. En otras palabras, se encuentra que ambos anticuerpos A y B tienen las mismas características de unión. En el caso en el que se unen a diferentes poblaciones celulares, está claro que ambos anticuerpos tienen distintas características de unión.
Un ejemplo preferible del anticuerpo monoclonal en la presente invención puede comprender un anticuerpo monoclonal que se produce por el hibridoma ILT7#11 o ILT7#17. El hibridoma ILT7#11 y el hibridoma ILT7#17 se han depositado ante el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Autoridad Depositaria Internacional de Organismos de Patentes con los n.os de registro FERM BP-10704 y FERM BP-10705 el 21 de octubre de 2005.
El contenido del depositario especificado es tal como sigue:
(a)
Denominación y dirección de la institución depositaria, denominación: Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Autoridad Depositaria Internacional de Organismos de Patentes, dirección: AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1, Higashi, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón (código postal 305-8566)
(b)
Fecha de depósito: 21 de octubre de 2005
(c)
Número de registro: FERM BP-10704 (hibridoma ILT7#11)
(c)
Número de registro: FERM BP-10705 (hibridoma ILT7#17)
El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede ser un fragmento que comprende su región de unión a antígeno. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno que se obtiene mediante digestión enzimática de IgG puede usarse como el anticuerpo en la presente invención. Específicamente, pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo tales como Fab y F(ab’)2 mediante digestión con papaína o pepsina. Se sabe bien que estos fragmentos de anticuerpo pueden usarse como moléculas de anticuerpo que tienen afinidad por los anticuerpos. Alternativamente, también pueden usarse anticuerpos construidos mediante recombinación genética siempre que se mantenga una actividad de unión a antígeno satisfactoria. Los ejemplos de los anticuerpos construidos mediante recombinación genética comprenden anticuerpos quiméricos, anticuerpos trasplantados con CDR, Fv de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos poliespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Es de conocimiento común que estos anticuerpos pueden proporcionarse usando anticuerpos monoclonales o células productoras de anticuerpos que producen los anticuerpos.
El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede obtenerse usando una célula transformada específica como inmunógeno. Es decir, la presente invención se refiere a un método para producir células que producen un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano, que comprende las siguientes etapas de:
(1)
administrar una célula que expresa una proteína exógena que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula exógena que está asociada con ILT7 humano a animales inmunes; y
(2)
seleccionar una célula productora de anticuerpos que produce el anticuerpo que se une a ILT7 humano de células productoras de anticuerpos de los animales inmunes.
Las células productoras de anticuerpos así obtenidas o las células productoras de anticuerpos inmortalizadas se cultivan y los anticuerpos monoclonales deseados pueden recuperarse de los cultivos. Con referencia al método para inmortalizar células productoras de anticuerpos, se conocen diversos métodos.
En el método para producir el anticuerpo monoclonal de la presente invención, los ejemplos que pueden usarse de la molécula, que está asociada con ILT7 humano para producir una célula transformada que va a usarse como inmunógeno, comprenden proteínas de membrana celular. Entre ellas, es preferible usar una molécula de transducción de señales, que se localiza en membranas celulares, como proteína de membrana celular en la presente invención. El término “molécula de transducción de señales” significa una molécula que está asociada con proteínas y células que tienen estructuras receptoras en el dominio extracelular y transmite la estimulación de la unión de ligandos a receptores en células. Los ejemplos de la molécula de transducción de señales comprenden la cadena γ del receptor de Fc, DAP12, o similar. Por ejemplo, es preferible usar la cadena γ del receptor de Fc como proteína de membrana celular en la presente invención. Se conocen de manera pública secuencias de aminoácidos de DAP12 humano y la cadena γ del receptor de Fc así como una secuencia de bases de ADNc, que codifica para las secuencias. Una secuencia de bases de la cadena γ del receptor de Fc humano y una secuencia de aminoácidos que está codificada por la secuencia de bases se muestran en SEQ ID NO: 15 y 16, respectivamente.
En la presente invención, una célula transformada que va a usarse como inmunógeno puede obtenerse mediante la
preparación, por ejemplo, de una célula que porta de manera expresiva los siguientes puntos (a) y (b):
(a)
un polinucleótido exógeno que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano; y
(b)
un polinucleótido exógeno que codifica para la cadena γ del receptor de Fc.
En la presente invención, un polinucleótido exógeno significa un polinucleótido que se introduce de manera artificial en una célula huésped. Cuando se usan células humanas como células, se introducen genes humanos en células humanas. En una combinación de este tipo, un polinucleótido introducido de manera artificial significa el polinucleótido exógeno. Por tanto, la expresión ectópica de ILT7 humano o la cadena γ del receptor de Fc humano está comprendida en la expresión del polinucleótido exógeno.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio extracelular de ILT7 humano” significa la secuencia de aminoácidos desde la posición 17ª hasta la 444ª de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 2 que corresponde al dominio extracelular de la secuencia de aminoácidos (desde 1 hasta 428 en SEQ ID NO: 2). Como secuencia de aminoácidos que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención, es preferible usar la secuencia de aminoácidos que comprende cada región, por ejemplo, partiendo desde el extremo N-terminal, en el orden siguiente:
[Secuencia señal + dominio extracelular + dominio transmembrana + región intracelular]
Alternativamente, una secuencia de aminoácidos, que carece parcialmente de una región intracelular tal como se describe a continuación, está incluida en la secuencia de aminoácidos que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención.
[Secuencia señal + dominio extracelular + dominio transmembrana + una parte de la región intracelular]
Además, una estructura, que carece de una región intracelular tal como se menciona a continuación, está incluida en la secuencia de aminoácidos que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención.
[Secuencia señal + dominio extracelular + dominio transmembrana]
En la estructura, las regiones distintas al dominio extracelular pueden ser secuencias de aminoácidos que se seleccionan de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, o pueden combinarse con otras secuencias de aminoácidos que tienen homología con las regiones. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que constituye una secuencia señal, un dominio transmembrana y una región intracelular puede ser una secuencia de aminoácidos de moléculas de la familia de ILT distintas de ILT7. O bien, puede combinarse con la secuencia de aminoácidos de la familia de ILT en especies distintas al ser humano. Además, la secuencia de aminoácidos, que constituye regiones distintas del dominio extracelular, puede comprender una mutación en el intervalo que puede mantener la función de cada región. Alternativamente, otras regiones pueden ser intermedias entre cada región. Por ejemplo, una etiqueta de epítopo tal como FLAG también puede insertarse entre la secuencia señal y el dominio extracelular. Particularmente, la secuencia señal se elimina por el procesamiento durante su transferencia a la superficie de la membrana celular tras traducirse para dar una proteína. Por tanto, puede usarse una secuencia de aminoácidos arbitraria, que induce el tránsito de la proteína traducida a la membrana celular, como la secuencia señal. Más específicamente, es preferible usar la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de ILT7 humano como la secuencia de aminoácidos que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano.
Por tanto, en la presente invención, puede usarse una secuencia de bases arbitraria que codifica para la secuencia de aminoácidos que constituye la estructura mencionada anteriormente [secuencia señal + dominio extracelular + dominio transmembrana + región intracelular] como el polinucleótido que constituye el polinucleótido exógeno descrito en (a). Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 está codificada por la secuencia de bases descrita en SEQ ID NO: 1.
En la presente invención, un vector de expresión que porta de manera expresiva los polinucleótidos (a) y (b) mencionados anteriormente puede introducirse en una célula huésped apropiada para obtener una célula transformada que va a usarse como inmunógeno. Los polinucleótidos (a) y (b) pueden portarse en un vector o diferentes vectores. Cuando cada polinucleótido se porta en diferentes vectores, las células huésped se cotransfectan con dos clases de vectores.
Los ejemplos preferibles de la célula huésped en la presente invención comprenden células de mamífero. Los ejemplos específicos de la célula huésped comprenden células derivadas de seres humanos, monos, ratones o ratas. Particularmente, las células derivadas de seres humanos son preferibles como células huésped. Por ejemplo, es preferible usar células 293T derivadas de ser humano como la célula huésped en la presente invención. Pueden obtenerse células 293T como ATCC CRL-11268. Además, también pueden usarse células derivadas de animales inmunes como células huésped. Cuando se usan células derivadas de animales inmunes como inmunógenos, se
proporciona una pequeña respuesta inmunológica frente a células huésped. Por ese motivo, puede obtenerse de manera eficaz un anticuerpo contra el dominio extracelular de ILT7 expresado de manera endógena. Por tanto, por ejemplo, cuando se usan ratones como animales inmunes, también pueden usarse células derivadas de ratones como células huésped.
Los polinucleótidos mencionados anteriormente pueden transformarse en células portándolos en un vector que puede inducir expresión en células huésped. Pueden usarse vectores disponibles comercialmente, que pueden inducir la expresión en células de mamífero. Pueden usarse vectores de expresión tales como el vector pCMV-Script (R), el vector PSG5 (fabricado por Stratagene), pADNc3.1 (fabricado por Invitrogen) para la presente invención.
Las células transformadas así obtenidas se administran a animales inmunes junto con componentes adicionales tales como adyuvantes, si es necesario. Los ejemplos del adyuvante que pueden usarse incluyen adyuvante completo de Freund, y similares. En caso de usar ratones como animales inmunes, las células transformadas
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pueden administrarse en el intervalo de 10a 10células, más específicamente de 10a 10células. Generalmente, se administran múltiples dosis de inmunógeno a intervalos regulares hasta que se eleva el título de anticuerpos. Por ejemplo, en el caso de una inmunización a corto plazo, las células transformadas se administran a intervalos de 2 a 4 días, más específicamente a intervalos de 3 días. Tras administrarse dos o tres veces, las células productoras de anticuerpos pueden recuperarse. Alternativamente, se administran una vez a la semana y las células productoras de anticuerpos también pueden recuperarse tras administrarse cinco o seis veces.
En la presente invención, las células productoras de anticuerpos recuperadas se clonan para proporcionar anticuerpos monoclonales. Es preferible que las células productoras de anticuerpos se inmortalicen para la clonación. Por ejemplo, puede usarse el método de fusión celular tal como se tipifica mediante el método del hibridoma o transformación mediante virus de Epstein-Barr (VEB) como el método de inmortalización de células productoras de anticuerpos.
En cuanto a las células productoras de anticuerpos, una célula produce una clase de anticuerpo. Por tanto, el establecimiento de poblaciones celulares derivadas de una célula (es decir, la clonación) permite producir anticuerpos monoclonales. El método del hibridoma implica el proceso en el que se fusionan células productoras de anticuerpos con una línea celular apropiada, que se inmortaliza y luego se somete a clonación. Las células productoras de anticuerpos inmortalizadas pueden clonarse mediante una técnica tal como el método de dilución limitante. Se sabe que existen muchas líneas celulares útiles para el método del hibridoma. Estas líneas celulares son excelentes en la eficacia de inmortalización de células linfocíticas y tienen diversos marcadores genéticos que son necesarios para seleccionar las células fusionadas de manera satisfactoria. Además, cuando se pretende la producción de células productoras de anticuerpos, puede usarse una línea celular que carece de la capacidad para producir anticuerpos también.
Por ejemplo, se usan ampliamente los mielomas de ratón P3x63Ag8.653 (ATCC CRL-1580) y P3x63Ag8U.1 (ATCCCRL-1597) como líneas celulares útiles para el método de fusión celular para ratones o ratas. En general, un hibridoma se produce mediante la fusión de células homogéneas, mientras que un anticuerpo monoclonal también puede obtenerse a partir del heterohibridoma de una especie diferente entre especies estrechamente relacionadas.
Se conocen de manera pública protocolos específicos de fusión celular. Es decir, se mezclan células productoras de anticuerpos de animales inmunes con parejas de fusión apropiadas para realizar la fusión celular. Los ejemplos que pueden usarse de la célula productora de anticuerpos incluyen células esplénicas, células linfocíticas recogidas del ganglio linfático y células B de sangre periférica. Como parejas de fusión, pueden usarse diversas líneas celulares descritas previamente. Pueden usarse el método del polietilenglicol y el método de fusión eléctrica para la fusión celular.
A continuación, basándose en marcadores selectivos de células fusionadas, se seleccionan las células fusionadas de manera satisfactoria. Por ejemplo, cuando se usa la línea celular sensible a HAT para la fusión celular, las células fusionadas de manera satisfactoria se seleccionan mediante la selección de células que crecen en medio HAT. Además, se confirma que los anticuerpos producidos por las células seleccionadas tienen la capacidad de respuesta deseada.
Se examina cada hibridoma basándose en la capacidad de respuesta de anticuerpos. Es decir, se selecciona el hibridoma que produce anticuerpos que se unen a ILT7 humano mediante el método tal como se describió previamente. Preferiblemente, cuando el hibridoma seleccionado se subclona y entonces se confirma finalmente la producción del anticuerpo deseado, se selecciona el anticuerpo confirmado como hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal de la presente invención:
Específicamente, el hibridoma deseado puede seleccionarse basándose en la capacidad de respuesta frente a células humanas o la capacidad de respuesta frente a la célula transformada que expresa el gen de ILT7 humano. Los anticuerpos, que se unen a células, pueden detectarse basándose en el principio de inmunoensayo. Por ejemplo, ELISA, que usa células como antígenos, puede utilizarse para la detección del anticuerpo deseado. Específicamente, se pone en contacto un sobrenadante de cultivo del hibridoma con un soporte sobre el que se usa
la IPC humana o la célula transformada como inmunógeno. En el caso en el que el sobrenadante de cultivo comprende el anticuerpo deseado, el anticuerpo se atrapa en la célula inmovilizada sobre el soporte. Entonces, se separa la fase sólida del sobrenadante de cultivo, que se lava, si es necesario. Después de eso, puede detectarse el anticuerpo atrapado en la fase sólida. Un anticuerpo, que reconoce un anticuerpo, puede usarse para la detección de anticuerpos. Por ejemplo, un anticuerpo de ratón puede detectarse mediante un anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón. La detección es fácil si se marca el anticuerpo, que reconoce un anticuerpo. Los ejemplos que pueden usarse del marcador incluyen enzimas, colorantes fluorescentes, colorantes luminiscentes, y similares.
Por otro lado, pueden usarse partículas y una pared interna de una placa de microtitulación como el soporte sobre el que se inmovilizan las células. Las células pueden inmovilizarse sobre partículas compuestas por plástico o la superficie de un recipiente mediante adsorción física. Los ejemplos que pueden usarse del soporte para inmovilizar células incluyen perlas compuestas por poliestireno y recipientes de reacción.
En la selección de los hibridomas, puede predecirse la producción del anticuerpo que no es contra ILT7 sino la célula huésped de la célula transformada usada como inmunógeno. Por ejemplo, tal como se ilustra en los ejemplos, en el caso en el que se usa una célula humana como inmunógeno y se usa un ratón como animal inmune, la célula humana se reconoce como sustancia foránea. Por tanto, se predice la producción de un anticuerpo, que se une a la sustancia foránea. En la presente invención, se pretende obtener un anticuerpo que pueda reconocer ILT7 humano. Por tanto, no es necesario obtener un anticuerpo que reconoce antígenos de células humanas distintos de ILT7 humano. Para eliminar los hibridomas, que producen un anticuerpo de este tipo en el examen, los anticuerpos no deseados pueden adsorberse antes de la confirmación de la capacidad de respuesta del anticuerpo.
Los anticuerpos no deseados pueden adsorberse por un antígeno al que se une un anticuerpo que se supone que existe. Específicamente, por ejemplo, un anticuerpo contra antígenos de células humanas distintos de ILT7 humano puede adsorberse por una célula que no puede detectar la expresión de ILT7 humano. En la presente invención, es preferible usar la célula huésped usada para el inmunógeno como antígeno para absorber los anticuerpos no deseados. Alternativamente, una célula huésped que no expresa el dominio extracelular de ILT7 humano, pero que expresa una molécula que se asocia con ILT7 puede usarse como el antígeno para absorber los anticuerpos.
En cuanto al anticuerpo monoclonal cuya actividad de unión a antígeno se confirma, su efecto real sobre la actividad de IPC se confirma, si es necesario. El efecto sobre IPC puede confirmarse mediante métodos tales como los métodos descritos a continuación.
En cuanto al anticuerpo monoclonal de la presente invención, se cultiva un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal y se recupera el anticuerpo monoclonal de la presente invención del cultivo resultante. El hibridoma puede cultivarse in vitro o in vivo. En el caso in vitro, el hibridoma puede cultivarse usando un medio de cultivo conocido tal como RPMI1640. La inmunoglobulina secretada por el hibridoma se acumula en el sobrenadante de cultivo. Por tanto, el anticuerpo monoclonal de la presente invención puede obtenerse recogiendo el sobrenadante de cultivo y purificándolo, si es necesario. Es más fácil purificar la inmunoglobulina cuando no se añade suero al medio de cultivo. Sin embargo, con el fin de una proliferación más rápida del hibridoma y la facilitación de la producción de anticuerpos, también puede añadirse suero bovino fetal al 10% al medio de cultivo.
El hibridoma también puede cultivarse in vivo. Específicamente, puede realizarse el cultivo intraperitoneal del hibridoma mediante la inoculación del hibridoma en la cavidad abdominal de ratones desnudos. Se acumulan anticuerpos monoclonales en la ascitis. Por tanto, si se obtiene la ascitis y se purifica según sea necesario, puede producirse el anticuerpo monoclonal requerido. Los anticuerpos monoclonales obtenidos pueden modificarse o procesarse apropiadamente según el uso pretendido.
El anticuerpo monoclonal de la presente invención puede expresarse mediante la obtención de ADNc que codifica para la región de unión a antígeno del anticuerpo procedente del hibridoma y la inserción en un vector de expresión apropiado. Se conoce la técnica en la que se obtiene ADNc que codifica para una región variable de anticuerpo y entonces se expresa en una célula huésped apropiada. Además, también se conoce el método en el que se prepara un anticuerpo quimérico mediante ligamiento de una región variable que comprende la región de unión a antígeno en una región constante.
Los ejemplos preferibles del anticuerpo monoclonal en la presente invención comprenden anticuerpos monoclonales producidos por el hibridoma #11 (número de registro: FERM BP-10704), el hibridoma #17 (número de registro: FERM BP-10705) o el hibridoma #37. Se describen a continuación secuencias de aminoácidos que constituyen regiones variables de estos anticuerpos monoclonales así como secuencias de bases de ADNc que codifican para las mismas. Por tanto, por ejemplo, los anticuerpos quiméricos que van a obtenerse mediante conjugación de estas regiones variables con regiones constantes de otras inmunoglobulinas son preferibles en la presente invención. En secuencias de aminoácidos descritas en la lista de secuencias, la secuencia de aminoácidos desde 1 hasta el extremo C-terminal constituye una proteína madura. Es decir, la secuencia de aminoácidos consecutiva desde 1 hasta el extremo C-terminal para cada secuencia de aminoácidos es una secuencia madura de cada secuencia de aminoácidos. Por otro lado, la secuencia de aminoácidos representada por un valor numérico desde el extremo Nterminal hasta -1 es una secuencia señal.
Región variable de cadena pesada Región variable de cadena ligera #11 SEQ ID NO: 38 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 40 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 39 (secuencia de aminoácidos) SEQ ID NO: 41 (secuencia de aminoácidos) #17 SEQ ID NO: 42 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 44 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 43 (secuencia de aminoácidos) SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoácidos #37 SEQ ID NO: 46 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 48 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 47 secuencia señal SEQ ID NO: 49 (secuencia de aminoácidos)
Por ejemplo, puede prepararse un anticuerpo quimérico de ratón (región variable)-ser humano (región constante) mediante ligamiento de estos genes de región variable en una región constante de cadena pesada de IgG1 humana y un gen que codifica para la región constante de cadena ligera de IgG1 humana , respectivamente. A continuación se describen respectivamente secuencias de aminoácidos de un anticuerpo quimérico de este tipo y secuencias de bases que codifican para las mismas. Los anticuerpos quiméricos especificados por estas secuencias muestran la construcción de una realización preferida del anticuerpo monoclonal anti-ILT7 en la presente invención. En las siguientes secuencias de aminoácidos de anticuerpos quiméricos, la secuencia de aminoácidos desde el extremo Nterminal hasta -1 corresponde a la secuencia señal y la secuencia de aminoácidos desde 1 hasta el extremo Cterminal corresponde a la proteína madura. Es decir, un anticuerpo quimérico compuesto por cadenas pesada y ligera, que consisten en la secuencia de aminoácidos desde 1 hasta el extremo C-terminal para cada secuencia de aminoácidos, es preferible en la presente invención.
Cadena pesada Cadena ligera #11 SEQ ID NO: 50 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 52 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 51 (secuencia de aminoácidos) SEQ ID NO: 53 (secuencia de aminoácidos) #17 SEQ ID NO: 51 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 56 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 55 (secuencia de aminoácidos) SEQ ID NO: 57 (secuencia de aminoácidos
Además, la actividad de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal también puede injertarse a otras inmunoglobulinas. La región variable de inmunoglobulina se compone de una región determinante de complementariedad (CDR) y una región de entramado. La propiedad de unión a antígeno de cada inmunoglobulina se determina mediante CDR y la región de entramado mantiene la estructura de región de unión a antígeno. La secuencia de aminoácidos de CDR es de una diversidad extremadamente grande, mientras que la secuencia de aminoácidos de la parte de la región de entramado está altamente conservada. Se sabe que la secuencia de aminoácidos que constituye la CDR se incorpora en la región de entramado de otras moléculas de inmunoglobulina, lo que permite el injerto de la actividad de unión a antígeno. Se ha establecido el método en el que la propiedad de unión a antígeno de diferentes inmunoglobulinas se injerta a inmunoglobulina humana usando este proceso. Tal como se usa en el presente documento, el término “región de unión a antígeno” puede comprender la CDR que se injerta a la región de entramado. Por tanto, el término “fragmento que comprende la región de unión a antígeno” de un determinado anticuerpo monoclonal” comprende un fragmento de inmunoglobulina humana que comprende la región variable en la que se injerta la CDR del anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, cada una de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables mencionadas anteriormente comprende las siguientes secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO) como CDR.
CDR1.
CDR2 CDR3
cadena pesada de #11
SDYAWN (58) YISYSGSTSYNPSLKSR (59) SPPYYAMDY (60)
cadena ligera de #11
KASQDVGTAVA (61) WASTRHT (62) QQYSSYPLT (63)
cadena pesada de #17
SYWIH (64) RIYPGTGSTYYNEKFKG (65) YPTYDWYFDV (66)
cadena ligera de #17
RASQSISNILH (67) YASQSIS (68) QQSNSWPLT (69)
cadena pesada de #37
SDYAWN (70) YISYSGSTSYNPSLKSR (71) ALPLPWFAY (72)
cadena ligera de #37
KASQDVGTAVA (73) WASTRHT (74) QQYSSYPYT (75)
Basándose en la información de la secuencia de bases que codifica para las secuencias de aminoácidos mencionadas anteriormente y la información de la secuencia de bases que codifica para la región de entramado (FR) de inmunoglobulina humana, puede diseñarse un cebador y puede amplificarse un ADNc que tiene una secuencia de bases obtenida mediante conjugación de ambas secuencias de bases. Se repite la operación para cada región de entramado y puede construirse una región variable en la que CDR1, CDR2 y CDR3 de ratones se conectan mediante FR humana. Además, cuando la secuencia de bases, que codifica para una región constante de inmunoglobulina humana, se conjuga según sea necesario, puede obtenerse un anticuerpo humanizado con la región constante.
Como el anticuerpo quimérico que comprende las regiones variables mencionadas anteriormente o un anticuerpo humanizado en el que se injerta una CDR que constituye una región variable, un anticuerpo con una región constante derivada de IgG o IgM está comprendido en un anticuerpo preferible en la presente invención. Los presentes inventores confirmaron que el anticuerpo monoclonal contra ILT7 mostró acción de CDC sobre células que expresan ILT7. Por tanto, el anticuerpo que tiene una región constante derivada de IgG o IgM presenta citotoxicidad contra células que expresan ILT7 debido al efecto de CDC. Tales anticuerpos son útiles en la inhibición
del número de células que expresan ILT7 tales como las IPC.
El anticuerpo quimérico que puede reconocer ILT7 o anticuerpo humanizado, que se proporciona por la presente invención, puede producirse mediante ingeniería genética usando polinucleótidos que codifican para estos anticuerpos. Por ejemplo, un polinucleótido que es la secuencia de bases descrita en las siguientes SEQ ID NO y codifica para la secuencia de aminoácidos que constituye una proteína madura para cada secuencia de aminoácidos, puede usarse como polinucleótido que codifica para la región variable de #11 o #17. La secuencia de aminoácidos consecutiva desde 1 hasta el extremo C-terminal para cada secuencia de aminoácidos corresponde a una proteína madura. En el caso en el que cada proteína madura se expresa como una proteína independiente, es preferible colocar la señal de secreción en el extremo N-terminal de cada secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, en las secuencias de aminoácidos mostradas en estas SEQ ID NO, la secuencia de aminoácidos desde el extremo N-terminal hasta -1 puede usarse como secuencia señal cuando tales proteínas se expresan en células animales. Alternativamente, estas regiones variables pueden secretarse como proteínas maduras usando una secuencia señal arbitraria que permite la secreción de inmunoglobulina.
#11 SEQ ID NO: 50 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 52 (secuencia de bases) #17 SEQ ID NO: 54 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 56 (secuencia de bases)
De la misma manera tal como se describió anteriormente, en cuanto al polinucleótido que codifica para el anticuerpo humanizado, puede prepararse un polinucleótido que expresa el anticuerpo humanizado usando la secuencia de bases que codifica para una proteína que tiene la secuencia señal que va a añadirse al extremo N-terminal. Cuando se portan las cadenas pesada y ligera en vectores independientes, ambos vectores se cotransfectan en la misma célula huésped. Las cadenas pesada y ligera expresadas desde cada vector se usan para construir una molécula de inmunoglobulina con ambas cadenas. O bien, también puede portarse un polinucleótido que codifica para una cadena pesada y un polinucleótido que codifica para una cadena ligera en el mismo vector. La célula huésped en la que se cotransfecta un vector que porta ambos polinucleótidos expresa las cadenas pesada y ligera y produce una inmunoglobulina que tiene ambas cadenas.
Estos polinucleótidos pueden expresarse como anticuerpos usando un sistema huésped-vector que puede expresar un gen de anticuerpo. Además, en el caso en el que se expresan como una única molécula de proteína mediante la conexión de una región variable de cadena pesada con una región variable de cadena ligera, puede colocarse una secuencia señal en el extremo N-terminal de la molécula de proteína. Un ejemplo conocido de una molécula de anticuerpo de este tipo incluye molécula de scFv en la que una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera se conectan mediante un ligador.
Cada uno de los anticuerpos monoclonales así producidos está comprendido en el anticuerpo monoclonal de la presente invención. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal que consiste en una inmunoglobulina que comprende la región de unión a antígeno codificada por un polinucleótido derivado de ADNc que codifica para la región de unión a antígeno de los anticuerpos monoclonales mencionados anteriormente está comprendido en el anticuerpo monoclonal en la presente invención.
Tal como se describió previamente, podrían usarse células RBL en las que se forzó que se expresase el gen de ILT1 como inmunógeno para obtener anticuerpos frente a ILT1. Sin embargo, la expresión de ILT7 en la superficie de células RBL (P815) no pudo confirmarse y por tanto no pudo usarse como el inmunógeno. Los presentes inventores descubrieron que la expresión de ILT7 humano en la superficie celular podía inducirse mediante la coexpresión de ILT7 humano y otras proteínas de membrana celular que se asocian con ILT7 humano. Entonces, los presentes inventores encontraron que el anticuerpo, que se une a IPC humanas, puede obtenerse usando la célula transformada cuya expresión se induce así como inmunógeno y completarse la presente invención.
Es decir, la presente invención proporciona el inmunógeno para producir el anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7 humano, y comprende células animales en las que se mantienen (a) un polinucleótido que codifica para la secuencia de aminoácidos que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano; y (b) un polinucleótido que codifica para la cadena del receptor de Fc de modo que se expresen de manera exógena o fracciones de membrana celular de los mismos.
Han pasado ya seis años o más desde que la estructura de ILT7 humano se halló en 1998. Sin embargo, el anticuerpo que puede reconocer específicamente ILT7 no se ha obtenido todavía. Se proporcionó por primera vez el anticuerpo que puede reconocer ILT7 humano usando el inmunógeno de la presente invención. Es decir, la presente invención proporcionó el anticuerpo que puede reconocer ILT7 humano que puede obtenerse mediante las siguientes etapas de:
(1)
administrar una célula que expresa de manera exógena una proteína que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula que está asociada con ILT7 humano a animales inmunes;
(2)
seleccionar una célula productora de anticuerpos que produce el anticuerpo que se une a ILT7 humano de células productoras de anticuerpos de los animales inmunes; y
(3) cultivar las células productoras de anticuerpos seleccionadas mediante la etapa (2) y recuperar un anticuerpo que puede reconocer ILT7 humano de los cultivos.
Se encuentra que ILT7 humano se expresa específicamente en IPC humanas. En el análisis de la expresión génica mediante SAGE que se realizó por los presentes inventores, también se confirmó la expresión específica de ILT7 humano en IPC humanas. Sin embargo, en los anteriores informes, se analizaron los niveles de expresión de ILT7 de ambos casos basándose en ARNm. Puesto que no se proporcionó el anticuerpo que puede detectar ILT7 humano, no se analizó el estado de expresión de la proteína de manera convencional. El análisis de la proteína de ILT7 humano se realizó mediante la provisión del anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7 humano en la presente invención.
Los presentes inventores confirmaron realmente que el anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano basándose en la presente invención detectaba específicamente IPC humanas. Es decir, la presente invención se refiere a un método para detectar células productoras de interferón, que comprende las etapas de: poner en contacto un anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano o un fragmento que comprende la región de unión a antígeno con una célula de prueba; y detectar el anticuerpo monoclonal que se une a células o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno.
La detección de ILT7 humano basándose en la presente invención permite determinar si una determinada célula es IPC. Es decir, la presente invención proporciona un método para identificar las IPC usando ILT7 humano como indicador. O bien, pueden separarse IPC humanas separando las células en las que se detectó ILT7 humano basándose en la presente invención. Es decir, la presente invención proporciona un método para separar las IPC usando ILT7 humano como indicador.
Basándose en el análisis mediante anticuerpo frente a ILT7 humano, se confirmó que se reducía el nivel de expresión de ILT7 en las IPC cuya diferenciación se indujo mediante CpG, y similares. Es decir, las IPC antes de que se induzca su diferenciación pueden detectarse específicamente usando ILT7 como indicador. En otras palabras, el anticuerpo monoclonal de la presente invención es útil, particularmente en la detección de las IPC antes de su diferenciación en células dendríticas. Tal como se usa en el presente documento, el término “IPC antes de su diferenciación” puede definirse como poblaciones celulares que mantienen la capacidad para producir interferón.
En la presente invención, el anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano o el fragmento que comprende su región de unión a antígeno puede marcarse por adelantado. Por ejemplo, pueden detectarse fácilmente anticuerpos mediante marcaje con colorantes luminiscentes o colorantes fluorescentes. Más específicamente, el anticuerpo marcado con colorante fluorescente se pone en contacto con una población celular que puede comprender las IPC y entonces pueden detectarse células a las que se unió el anticuerpo de la presente invención usando el colorante fluorescente como indicador. Además, las IPC pueden separarse separando las células en las que el colorante fluorescente se detecta. Puede realizarse fácilmente una serie de las etapas basándose en el principio de FACS. Alternativamente, el anticuerpo de la presente invención puede unirse por adelantado a un soporte de fase sólida tal como partículas magnéticas. El anticuerpo unido al soporte en fase sólida reconoce ILT7 humano y entonces las IPC se atrapan en el soporte en fase sólida. Como resultado, las IPC pueden detectarse o separarse.
El anticuerpo necesario para el método para detectar las IPC basándose en la presente invención puede proporcionarse como reactivo para detectar las IPC. Es decir, la presente invención proporciona un reactivo para detectar células productoras de interferón, que comprende el anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano o el fragmento que comprende su región de unión a antígeno. El reactivo para detectar las IPC de la presente invención puede usarse en combinación con un control positivo o un control negativo además de anticuerpos. Por ejemplo, las células transformadas que expresan el dominio extracelular de ILT7 humano y se usan para el inmunógeno así como las IPC obtenidas de ser humano pueden usarse como los controles positivos. Habitualmente, sólo pueden obtenerse unas pocas IPC humanas a partir de la sangre periférica. Por tanto, es preferible usar, particularmente una célula transformada como el control positivo en el reactivo de la presente invención. Por otro lado, una célula arbitraria, que no expresa ILT7 humano, puede usarse como el control negativo.
Es decir, la presente invención proporciona un kit para detectar IPC humanas que comprende:
(a)
el anticuerpo monoclonal que se une al dominio extracelular de ILT7 humano o el fragmento que comprende su región de unión a antígeno; y
(b)
la célula que expresa una proteína exógena que comprende el dominio extracelular de ILT7 humano y una molécula exógena que está asociada con ILT7 humano.
Los presentes inventores analizaron el efecto del anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7 humano sobre las IPC. Como resultado, se confirma que el anticuerpo, que se une al dominio extracelular de ILT7 humano, inhibe la actividad de las IPC. Es decir, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de
células productoras de interferón, que comprende una etapa de poner en contacto cualquiera de los siguientes componentes con células productoras de interferón:
(a)
un anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano e inhibe la actividad de células productoras de interferón o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno; y
(b)
una inmunoglobulina en la que se injerta una región determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal descrito en (a) o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno.
O bien, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de células productoras de interferón en organismos vivos, que comprende una etapa de administrar cualquiera de los siguientes componentes a los organismos vivos:
(a)
el anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano e inhibe la actividad de células productoras de interferón o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno;
(b)
un fragmento que comprende la inmunoglobulina en la que se injerta una región determinante de complementariedad del anticuerpo monoclonal descrito en (a) o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno; y
(c)
un polinucleótido que codifica para los componentes descritos en (a) o (b).
Tal como se usa en el presente documento, el término “células productoras de interferón (IPC)” significa células que tienen la capacidad para producir IFN y expresar ILT7 en la superficie celular. A continuación en el presente documento, a menos que se indique de otro modo, el término “IPC” engloba no sólo células que son células precursoras de células dendríticas sino también las células que tienen la capacidad para producir IFN y expresar ILT7 en la superficie celular. Se conocen comúnmente métodos para identificar tales IPC. Las IPC pueden distinguirse de otras células sanguíneas usando algunos marcadores de superficie celular como indicadores. Específicamente, se describe a continuación un perfil de marcadores de superficie celular de IPC humanas (Shortman, K. y Liu, YJ. Nature Reviews 2: 151-161, 2002). En los últimos años, un determinado informe también ha sugerido que célula positiva para BDCA-2 se define como IPC (Dzionek, A. et al. J. Immunol. 165: 6037-6046, 2000.). [Profile of cell surface antigens of human IPCs] positiva para CD4, positiva para CD123, negativa para linaje (CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56) y negativa para CD11c.
Por tanto, también puede decirse que las IPC son células que tienen el perfil de expresión de estos marcadores conocidos y tienen la capacidad para producir IFN. Además, están comprendidas en las IPC células en organismos vivos con la capacidad para producir IFN, aunque las células sean una población celular con perfiles diferentes del patrón de expresión del perfil de expresión de estos marcadores.
Además, ejemplos de las características, que se observan comúnmente en IPC humanas, son tal como sigue:
[Característica morfológica de las células]
-
Similares a células plasmáticas
-
Células redondas con una superficie celular lisa
-
El núcleo es relativamente grande
[Característica funcional de las células]
-
Durante la infección viral, se produce una gran cantidad de interferones tipo 1 en un corto periodo de tiempo.
-
Se diferencian en células dendríticas tras la infección viral.
Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibición de la actividad de IPC” significa la inhibición de al menos una de las funciones de las IPC. Los ejemplos de la función de las IPC incluyen la producción de IFN y la supervivencia celular. La supervivencia celular también puede traducirse en el número de células. Por tanto, en el caso de inhibir ambas o cualquiera de estas funciones, se dice que se inhibe la actividad de las IPC. Se encuentra que el IFN tipo 1 producido por las IPC conduce a diversas enfermedades. Por tanto, la inhibición del número de las IPC y la producción de IFN es útil para una estrategia de tratamiento médico de esas enfermedades.
Por ejemplo, se ha señalado la relación entre el estado patológico de enfermedades autoinmunitarias e IFNα. La mayor parte del IFNα se produce por las IPC. Por tanto, pueden aliviarse estados patológicos provocados por IFNα mediante la inhibición de la producción de IFNα. Tal como se usa en el presente documento, el término “inhibición de la producción de IFN por IPC” significa la inhibición de la producción de al menos uno de los IFN producidos por
las IPC. Preferiblemente, IFN en la presente invención es el IFN tipo 1. Entre ellos, IFNα es importante.
Es decir, la presente invención se refiere a un inhibidor de la producción de IFN que comprende un anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7 como componente activo. O bien, la presente invención proporciona un método para inhibir la producción de IFN que comprende una etapa de administrar el anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7. Además, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo que se une al dominio extracelular de ILT7 en la producción de una composición medicinal para inhibir la producción de IFN.
Las células en las que se produce una gran cantidad de IFN por un pequeño número de células están incluidas en las IPC. Por ejemplo, células precursoras de células dendríticas estimuladas por virus y similares producen la mayor parte del IFN producido por el organismo vivo. La inhibición del número de las IPC que producen gran cantidad de IFN da como resultado la supresión de la producción de IFN. Por tanto, pueden reducirse estados patológicos provocados por IFNα mediante la inhibición del número de las IPC. Se confirmó que anticuerpo monoclonal anti-ILT7 se unía a células que expresan ILT7 y entonces se proporcionaba el efecto de citotoxicidad mediante citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) en una realización preferible de la presente invención. El efecto de CDC es uno de los mecanismos importantes del fármaco anticuerpo. El anticuerpo monoclonal anti-ILT7 de la presente invención también tiene potente citotoxicidad contra células que expresan ILT7 tales como las IPC debido al efecto de CDC de las mismas. Es decir, en cuanto al anticuerpo monoclonal anti-ILT7, puede esperarse el efecto de inhibición de la producción de IFN mediante citotoxicidad contra las IPC, además del mecanismo de inhibición de la producción de IFN en una realización preferible.
El anticuerpo, que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano que va a usarse para la presente invención, puede obtenerse basándose en el método descrito previamente. El anticuerpo en la presente invención puede ser de cualquier clase. Las especies de organismo de las que se deriva el anticuerpo no están limitadas tampoco. Además, puede usarse como anticuerpo un fragmento que comprende la región de unión a antígeno del anticuerpo. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno que se obtiene mediante digestión enzimática de IgG puede usarse como el anticuerpo en la presente invención. Específicamente, fragmentos de anticuerpo tales como Fab y F(ab’)2 pueden obtenerse mediante digestión con papaína o pepsina. Se sabe bien que estos fragmentos de anticuerpo pueden usarse como moléculas de anticuerpo que tienen afinidad por anticuerpos. Alternativamente, también pueden usarse anticuerpos construidos mediante recombinación genética siempre que se mantenga una actividad de unión a antígeno satisfactoria. Los ejemplos de los anticuerpos construidos mediante recombinación genética incluyen anticuerpos quiméricos, anticuerpos trasplantados con CDR, Fv de cadena sencilla, diacuerpos, anticuerpos lineales y anticuerpos poliespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Es de conocimiento común que estos anticuerpos pueden proporcionarse usando anticuerpos monoclonales.
En la presente invención, pueden modificarse anticuerpos, si es necesario. Según la presente invención, el anticuerpo, que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, tiene un efecto inhibidor sobre la actividad de las IPC. Es decir, se contempla que el propio anticuerpo tenga citotoxicidad contra las IPC. Se conocen subclases de anticuerpos que presentan una potente actividad efectora. Alternativamente, el efecto inhibidor sobre la actividad de IPC puede potenciarse además modificando anticuerpos con un agente citotóxico. A continuación se describen ejemplos del agente citotóxico.
Toxinas: entotoxina de Pseudomonas (PE), toxina diftérica, ricina
99m8913190
Radioisótopos: Tc, Sr, I, Y
Agentes anticancerígenos: calicheamicina, mitomicina, paclitaxel
Pueden conjugarse toxinas que consisten en proteínas con anticuerpos o sus fragmentos con un reactivo bifuncional. Alternativamente, un gen que codifica para una toxina se conecta a un gen que codifica para un anticuerpo y también pueden obtenerse proteínas de fusión de ambos genes. También se conoce el método para conjugar anticuerpos con radioisótopos. Por ejemplo, se conoce el método para marcar anticuerpos con radioisótopos usando un agente quelante. Además, los agentes anticancerígenos pueden conjugarse con anticuerpos usando cadenas de azúcar o el reactivo bifuncional.
Los presentes inventores han confirmado un fenómeno en el que un anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 expresado en una membrana celular se incorpora en células tras su unión (internalización). Por tanto, los agentes citotóxicos pueden suministrarse a células mediante la puesta en contacto de anticuerpos conjugados con estos agentes citotóxicos de la presente invención con células que expresan ILT7. Es decir, la presente invención proporciona un inhibidor activo de células que expresan ILT7 que comprende el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 con el que se conjuga el agente citotóxico como componente activo. O bien, la presente invención se refiere al uso del anticuerpo monoclonal anti-ILT7 con el que se conjuga el agente citotóxico en la producción del inhibidor activo de células que expresan ILT7. Además, la presente invención proporciona un método para inhibir la actividad de células que expresan ILT7 que comprende una etapa de administrar el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 con el que se conjuga el agente citotóxico.
En la presente invención, un anticuerpo cuya estructura se modifica de manera artificial también puede usarse como componente activo. Por ejemplo, se conocen diversos métodos de modificación para mejorar la citotoxicidad y estabilidad de anticuerpos. Específicamente, se conoce una inmunoglobulina en la que se modifican cadenas de azúcar de cadenas pesadas (Shinkawa, T. et al. J. Biol. Chem. 278:3466-3473. 2003.). Se potenció la actividad de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) de la inmunoglobulina mediante la modificación de cadenas de azúcar. O bien, también se conoce una inmunoglobulina en la que se modifica la secuencia de aminoácidos de la región Fc. Es decir, se potenció la actividad de ADCC aumentando de manera artificial la actividad de unión de inmunoglobulina al receptor de Fc (Shield, RL. et al. J. Biol. Chem. 276; 6591-6604, 2001.).
IgG, que se une al receptor de Fc, se incorpora en células una vez. Entonces, IgG se une al receptor de Fc que se expresa en endosoma y se libera en la sangre de nuevo. Este fenómeno se ha revelado. IgG con una alta actividad de unión con el receptor de Fc tiene una mayor probabilidad de liberarse en la sangre de nuevo tras su incorporación en las células. Como resultado, se amplía el tiempo de retención de IgG en sangre (Hinton, PR. et al. J Biol Chem.
279: 6213-6216. 2004). Además de esto, se dice que la modificación de la secuencia de aminoácidos de la región Fc provoca un cambio de la actividad de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Estos anticuerpos modificados pueden usarse como el anticuerpo en la presente invención.
Cuando el anticuerpo, que se une al dominio extracelular de ILT7 humano, se pone en contacto con las IPC, se inhibe la actividad de las IPC. Por tanto, estos anticuerpos pueden usarse para un inhibidor o método para inhibir la actividad de las IPC. Es decir, la presente invención proporciona un inhibidor activo de las IPC que comprende al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes puntos (a) a (c) como componente activo. O bien, la presente invención se refiere a un método para inhibir la actividad de las IPC que comprende una etapa de administrar al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes puntos (a) a (c). Además, la presente invención se refiere al uso de al menos un componente seleccionado del grupo que consiste en los siguientes puntos (a) a (c) en la producción del inhibidor activo de las IPC:
(a)
el anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno;
(b)
la inmunoglobulina en la que se injerta una región determinante de complementariedad del anticuerpo descrito en
(a)
o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno; y
(c)
un polinucleótido que codifica para componentes descritos en (a) o (b). En la presente invención, el anticuerpo monoclonal, que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, puede usarse como el anticuerpo monoclonal, que inhibe la actividad de las IPC. En la presente invención, pueden usarse uno o más anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, uno o más anticuerpos monoclonales, que reconocen el dominio extracelular de ILT7 humano, se combinan para usarse en la presente invención.
Puede confirmarse que los anticuerpos tienen un efecto inhibidor sobre la producción de IFN por IPC de la manera tal como se describe a continuación. Las IPC producen una gran cantidad de IFN debido a estimulación viral. Se administran anticuerpos a las IPC antes de, después de, o al mismo tiempo que la estimulación de las IPC con virus. La capacidad para producir cada IFN para las IPC resultantes se compara con la de cada control al que no se administran anticuerpos. La capacidad para producir IFN puede evaluarse midiendo el IFNα o IFNβ contenido en el sobrenadante de cultivo de las IPC. Como resultado de la comparación, puede confirmarse que los anticuerpos sometidos a prueba son eficaces en la inhibición de la capacidad para producir IFN cuando la cantidad de IFN en el sobrenadante se disminuye significativamente mediante la adición de anticuerpos. Se conocen estos métodos para medir IFN. Las IPC producen la mayor parte del IFN en el organismo vivo. Por tanto, puede regularse un estado que produce IFN en el organismo vivo mediante la inhibición de la capacidad para producir IFN de las IPC.
En la presente invención, la actividad de las IPC engloba el mantenimiento del número de IPC. Por tanto, la inhibición de la actividad de las IPC en la presente invención comprende la inhibición del número de IPC. Cuando se confirma que el número de IPC se inhibe con la presencia de anticuerpos, puede encontrarse que los anticuerpos están inhibiendo la actividad de las IPC. Como con la producción de IFN, una inmunoglobulina inerte derivada de la misma especie animal que el anticuerpo cuya actividad debe confirmarse, puede usarse como control comparativo. El número de IPC puede compararse cuantitativamente mediante recuento de las células. El número de células puede contarse con FACS o un microscopio.
Además, se dice que las IPC se diferencian en células que inducen Th2 denominadas células dendríticas 2 (DC2) como resultado de la infección con virus o similar. Si puede inhibirse la producción de IFN de las IPC mediante estimulación viral, también puede inhibirse su diferenciación en Th2. Por tanto, puede esperarse que el anticuerpo monoclonal de la presente invención, que inhibe la producción de IFN, también pueda tener un efecto terapéutico sobre diversas enfermedades alérgicas. Cuando el anticuerpo, que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano, se administra a un huésped diferente de la especie de organismo de la que se deriva el anticuerpo, es deseable procesar el anticuerpo en una forma que sea difícil de reconocer como sustancia foránea por el huésped.
Por ejemplo, la inmunoglobulina no puede reconocerse fácilmente como sustancia foránea mediante el procesamiento del anticuerpo en las siguientes moléculas. Se conoce la técnica para procesar moléculas de inmunoglobulina tal como se describe a continuación. Fragmento que comprende la región de unión a antígeno que carece de una región constante (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Academic Press Limited. 1995; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)
Anticuerpo quimérico que se compone de la región de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal y la región constante de inmunoglobulina del huésped (“Gene Expression Experiment Manual”, Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994)
Anticuerpo sustituido con CDR en el que la región determinante de complementariedad (CDR) de la inmunoglobulina del huésped se sustituye por CDR de anticuerpo monoclonal (“Gene Expression Experiment Manual”, Isao Ishida, Tamie Ando, eds., Kodansha, 1994)
Alternativamente, puede obtenerse un anticuerpo humano usando animales no humanos en los que se incorpora un gen de anticuerpo humano como animales inmunes, mientras que se usan los animales no humanos. Por ejemplo, se han puesto en uso práctico ratones transgénicos con genes de anticuerpos humanos para producir anticuerpos humanos como animales inmunes (Ishida et al., Cloning and Stem Cells, 4: 85-95, 2002). El uso de tales animales permite obtener el anticuerpo humano que reconoce ILT7 usando inmunógenos tal como se describió previamente. Es preferible administrar anticuerpo humano a seres humanos.
Alternativamente, también puede obtenerse un gen de región variable de inmunoglobulina humana mediante un método de presentación en fago (McCafferty J. et al., Nature 348:552-554, 1990; Kretzschmar T et. al., Curr Opin Biotechnol., diciembre de 2002; 13(6): 598-602.). En el método de presentación en fago, un gen que codifica para región variable de inmunoglobulina humana se incorpora en un gen de fago. También puede producirse una biblioteca de fagos usando diversos genes de inmunoglobulina como fuentes. Un fago expresa una región variable como proteína de fusión de la proteína compuesta por el fago. La región variable expresada por el fago en la superficie del fago mantiene la actividad de unión con un antígeno. Por tanto, se seleccionan de la biblioteca de fagos, fagos que se unen a antígenos o células en las que se expresan antígenos, permitiendo de ese modo examinar un fago en el que se expresa una región variable que tiene la actividad de unión deseada. Además, un gen que codifica para una región variable, que tiene la actividad de unión deseada, se conserva en las partículas de fago así seleccionadas. Es decir, en el método de presentación en fago, puede obtenerse un gen que codifica para una región variable con la actividad de unión deseada usando la actividad de unión de la región variable como indicador.
En el inhibidor activo de las IPC o el método para inhibir la actividad de las IPC en la presente invención, el anticuerpo que reconoce el dominio extracelular de ILT7 humano o el fragmento de anticuerpo que comprende al menos la región de unión a antígeno del anticuerpo pueden administrarse como proteína o polinucleótido que codifica para la proteína. En la administración de polinucleótidos, es deseable usar un vector en el que un polinucleótido que codifica para la proteína deseada se pone bajo el control de un promotor apropiado de modo que se exprese la proteína deseada. También puede colocarse en el vector un potenciador y un terminador. Se conoce un vector que porta un gen de las cadenas pesada y ligera que constituye una inmunoglobulina y que puede expresar una molécula de inmunoglobulina.
El vector que puede expresar la inmunoglobulina puede administrarse mediante su introducción en células. En la administración a organismos vivos, puede administrarse directamente un vector, que puede infectarse con células mediante la administración a los organismos vivos. Una vez que se separan los linfocitos de los organismos vivos, entonces se introduce el vector en los linfocitos, que pueden devolverse a los organismos vivos de nuevo (ex vivo).
En el inhibidor activo de las IPC o el método para inhibir la actividad de las IPC basándose en la presente invención, en cuanto a la cantidad de anticuerpo monoclonal que debe administrarse a los organismos vivos, habitualmente se administra inmunoglobulina en el intervalo de 0,5 mg a 100 mg, por ejemplo, de 1 mg a 50 mg, preferiblemente de 2 mg a 10 mg por kg de peso corporal. Pueden ajustarse apropiadamente los intervalos de administración del anticuerpo a organismos vivos de modo que se mantenga una concentración eficaz de inmunoglobulina en los organismos vivos durante el periodo de tratamiento. Específicamente, por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse a intervalos de 1 a 2 semanas. La vía de administración es opcional. Los expertos en la técnica pueden seleccionar apropiadamente una vía de administración eficaz en tratamientos. Los ejemplos específicos de la misma incluyen administración oral o parenteral. Los anticuerpos se administran de manera sistémica o tópica, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, o similar. Los ejemplos de una formulación apropiada para administración parenteral en la presente invención incluyen disoluciones inyectables, supositorios y pulverizaciones. Cuando el anticuerpo se administra a células, se añade inmunoglobulina al medio de cultivo habitualmente en el intervalo de 1 µg/ml, preferiblemente 10 µg/ml, más preferiblemente 50 µg/ml, todavía más preferiblemente 0,5 mg/ml. En el inhibidor activo de las IPC o método para inhibir la actividad de las IPC de la presente invención, el anticuerpo monoclonal puede administrarse a organismos vivos mediante métodos opcionales. Habitualmente, el anticuerpo monoclonal se combina con un soporte farmacéuticamente aceptable. Si es necesario, el anticuerpo monoclonal puede combinarse con agentes aditivos tales como espesantes, estabilizantes, conservantes y solubilizantes. Los ejemplos de un soporte o agente aditivo
de este tipo incluyen lactosa, ácido cítrico, ácido esteárico, estearato de magnesio, sacarosa, almidón, talco, gelatina, agar, aceite vegetal y etilenglicol. El término “farmacéuticamente aceptable” significa aprobado por una agencia reguladora en cada gobierno o enumerado en la Farmacopea en cada país u otra farmacopea reconocida generalmente para uso en animales, en mamíferos, y más particularmente, en seres humanos. El inhibidor activo de las IPC de la presente invención también puede proporcionarse en forma de dosis únicas o múltiples de polvos liofilizados o comprimidos. Además, los polvos liofilizados o comprimidos pueden usarse en combinación con agua esterilizada para inyección, solución salina fisiológica o disolución tampón para disolver las composiciones de modo que sea de una concentración deseada antes de la administración.
Además, cuando el anticuerpo monoclonal se administra como vector, que expresa inmunoglobulina, las cadenas pesada y ligera se cotransfectan con otro plásmido y cada plásmido puede administrarse en el intervalo de 0,1 a 10 mg, por ejemplo, de 1 a 5 mg por kg de peso corporal. Para introducir los plásmidos en células in vitro, el contenido de los vectores para su uso es de 1 a 5 µg/106 células. A continuación en el presente documento, la presente invención se describirá específicamente con referencia a los ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
A. Análisis de la expresión de ILT7
A-1) Análisis usando biblioteca de SAGE
Se comparó la expresión de genes en monocitos humanos, las IPC y las IPC tratadas con VHS y se analizó mediante el método de análisis en serie de la expresión génica (Serial Analysis of Gene Expression) (nombre comercial; SAGE). El método de análisis es tal como sigue. Se separaron monocitos como células positivas para BDCA-4 y se separaron las IPC como células positivas para CD14 a partir de sangre periférica humana usando un clasificador celular. Además, se cultivaron las IPC durante 12 horas con la presencia de virus del herpes simple (VHS) y entonces se prepararon las IPC diferenciadas. Se obtuvieron los ARN de las respectivas células, seguido por la producción de una biblioteca de SAGE usando el kit I-SAGE (nombre comercial) (fabricado por Invitrogen). Se analizaron los datos sobre las secuencias de bases obtenidas de aproximadamente 100.000 etiquetas usando el software de análisis de SAGE (fabricado por Invitrogen). Como resultado, se encontró un gen cuyo valor de puntuación de monocito/IPC/IPC+VHS es de 0/16/0, concretamente, ILT7 (n.º de registro de Gen Bank NM_012276) conocido como gen, que muestra expresión específica de IPC. ILT7 es una proteína de membrana con dominios similares a inmunoglobulina codificados por una secuencia de bases mostrada en SEQ ID NO: 1 (figura 2(a)). Se ha notificado que el ARNm de ILT7 se expresa en las IPC (Blood 100, 3295-3303 (2002)).
A-2) RT-PCR
Se examinó la expresión de ILT7 en células hemocíticas con más detalle. Se aisló cada célula de manera preparativa a partir de sangre periférica humana mediante el clasificador de células. Se extrajeron los ARN de cada una de las poblaciones celulares aisladas, a partir de los que se sintetizó ADNc. Se realizó PCR cuantitativa según un método habitual usando como molde el ADNc resultante y se analizó el nivel de expresión de ARNm de ILT7. Las condiciones usadas para las secuencias de bases de cebadores y PCR son tal como sigue:
Cebador directo: 5’ CTC CAA CCC CTA CCT GCT GTC 3’ (SEQ ID NO: 3) Cebador inverso: 5’ TTC CCA AGG CTC CAC CAC TCT 3’ (SEQ ID NO: 4)
1 ciclo de PCR (a 94ºC durante 3 minutos)
25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 30 segundos, a 58ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 1 minuto]
1 ciclo de PCR (a 72ºC durante 6 minutos). Cuando se examinaron las IPC estimuladas por monocitos, las IPC, los VHS y células positivas para CD19 (es decir, células B), células positivas para CD3 (es decir, células T), células T estimuladas por PMA y células positivas para CD56 (es decir, linfocitos citolíticos), se encontró que ILT7 se expresaba específicamente en las IPC (figura 1 (a)).
A-3) RT-PCR cuantitativa
Además, se examinó la expresión en otros órganos y tejidos mediante PCR cuantitativa usando el instrumento ABI PRISM 7000 (fabricado por Applied Biosystem). Como panel de ADNc, se usaron panel de ADNc de múltiples tejidos MTC BD (nombre comercial) (Human I; n.º de cat. 636742, Human immune; n.º de cat. 636748, Human blood fractions; n.º de cat. 636750; todos ellos fabricados por Becton Dickinson) y el mismo ADNc derivado de células hemocíticas tal como se describe en el punto 2).
Las secuencias de bases usadas de cebadores son tal como sigue:
Cebador directo para ILT7: 5’ CCT CAA TCC AGC ACA AAA GAA GT 3’ (SEQ ID NO: 5)
Cebador inverso para ILT7: 5’ CGG ATG AGA TTC TCC ACT GTG TAA 3’ (SEQ ID NO: 6)
Cebador directo para GAPDH: 5’ CCA CCC ATG GCA AAT TCC 3’ (SEQ ID NO: 7)
Cebador inverso para GAPDH: 5’ TGG GAT TTC CAT TGA TGA CAA G 3’ (SEQ ID NO: 8)
Se realizó la PCR usando un instrumento ABI PRISM 7000 (fabricado por Applied Biosystem) y el kit de mezcla maestra de PCR SYBR green (fabricado por la misma compañía). Se usó el software Sequence Detection System (fabricado por la misma compañía) para el análisis.
Las condiciones de reacción son tal como sigue:
Etapa 1: 1 ciclo de PCR (a 50ºC durante 2 minutos)
Etapa 2: 1 ciclo de PCR (a 95ºC durante 10 minutos)
Etapa 3: 40 ciclos de PCR (a 95ºC durante 15 segundos, a 60ºC durante 1 minuto). Se comparó la expresión del gen de ILT7 entre cada tejido mediante normalización al nivel de expresión del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), que se sabe que se expresa de manera constitutiva. Como resultado, se observó que ILT7 no se expresaba en ningún órgano distinto de tejidos linfoides y se expresaba específicamente en las IPC.
B. Producción de vectores de expresión de ILT7 y FcRγ
Posteriormente, se llevó a cabo la clonación de genes y la producción de vectores de expresión para expresar proteínas ILT7.
B-1) Clonación de genes de ILT7
Se extrajo ARN de poli (A)+ separado de sangre periférica humana de las IPC, a partir del que se sintetizó ADNc usando cebador de oligo dT y el sistema Super Script Choice para el kit de síntesis de ADNc. Se ligó un adaptador de EcoRI en el ADNc sintetizado, que se ligó en el vector pME18S escindido por EcoRl, dando como resultado la producción de una biblioteca de ADNc de IPC humanas. Se amplificó el gen de ILT7 mediante un método de PCR usando como molde la biblioteca de ADNc producida así como usando cebadores con las siguientes secuencias de bases. Se usó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para la reacción PCR. Se fijaron las condiciones de reacción a 25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 2 minutos] tras 1 ciclo de PCR a 94ºC durante 2 minutos. Cebador directo: 5’ CAG GGC CAG GAG GAG GAG ATG 3’ (SEQ ID NO: 9) Cebador inverso: 5’ TCA GCA GAC ACT TCC CCA ACT 3’ (SEQ ID NO: 10)
Se separó el fragmento de ADNc de ILT7 de 2 kb y se recuperó mediante electroforesis usando gel de agarosa al 1%, que se clonó en el vector de plásmido pCR4 Blunt-TOPO (fabricado por Invitrogen) usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (fabricado por Invitrogen). Se analizaron las secuencias de bases de los genes obtenidos, y se encontró que se obtuvo el gen de ILT7 deseado mostrado en SEQ ID NO: 1.
B-2) Producción de vectores de expresión de ILT7 etiquetados con FLAG
Se construyó un plásmido que expresa una proteína en la que se fusionaron etiquetas FLAG a los extremos N-y Cterminales de ILT7, respectivamente. Se fusionó ILT7 con una etiqueta, que permitía la confirmación de la expresión de la proteína ILT7 mediante detección de la etiqueta. Se amplificó la secuencia deseada mediante un método de PCR usando como molde el gen de ILT7 producido tal como se describe en el punto 1) así como usando cebadores con las siguientes secuencias de bases. Se usó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para la reacción PCR. Se fijaron las condiciones de reacción a 25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 2 minutos] tras 1 ciclo de PCR a 94ºC durante 2 minutos.
Para N-FLAG ILT7
Cebador directo (SEQ ID NO: 11): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC CTG CTC TTC TTT GGG CTG AGC CTG GGC [GAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG] CCC AGG ACC CGG GTG CAG GCA GAA 3’
Cebador inverso (SEQ ID NO: 12): 5’ C TAG act agt TCA GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3’
Para C-FLAG ILT7
Cebador directo (SEQ ID NO: 13): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CTC ATT CTC ACA AGC 3’
Cebador inverso (SEQ ID NO: 14): 5’ C TAG act agt TCA [CTT ATC GTC GTC ATC CTT GTA ATC] GAT CTG TTC CCA AGG CTC 3’
En las secuencias de bases mencionadas anteriormente, cada parte destacada entre paréntesis muestra una secuencia de bases que codifica para la etiqueta FLAG unida y cada letra minúscula muestra el sitio de escisión para la enzima de restricción Xhol o Spel. Se escindieron por Xhol y Spel los fragmentos de ADN amplificados por PCR, que entonces se separaron mediante electroforesis en gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de 2 kb, que se ligaron en el vector pME18X escindido por Xhol y Spel de la misma manera que se describió anteriormente. Entonces, se construyeron dos tipos de plásmido que pueden expresar la proteína de fusión deseada, es decir pME18XN-FLAG ILT7 y pME18X-C-FLAG ILT7, respectivamente.
B-3) Clonación de genes de FcRγ
Se consideró la proteína FcRγ como una proteína que puede asociarse con la proteína ILT7. La presente molécula es un gen con secuencias de bases y secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y 16 (n.º de registro de Genbank NM_0041 06, J. Biol. Chem. 265, 6448-6452 (1990)). La molécula es una molécula (cadena γ) que constituye FcεRI, es decir un receptor de IgE de alta afinidad. Aunque también se denomina FcεRly, se denominará FcRγ a continuación en el presente documento. A este respecto, la presente molécula también se conoce como componente de FcRγ o FcαR. Se clonó el presente gen mediante un método de PCR tal como se muestra a continuación para producir vectores de expresión. Se amplificó el gen de FcRγ mediante un método de PCR usando como molde la biblioteca de ADNc de IPC humanas tal como se describe en el punto 1) así como usando cebadores con las siguientes base secuencias. Se usó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para la reacción PCR. Se fijaron las condiciones de reacción a 25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 1 minuto] tras 1 ciclo de PCR a 94ºC durante 2 minutos.
Cebador directo: 5’ CCC AAG ATG ATT CCA GCA GTG 3’ (SEQ ID NO: 17)
Cebador inverso: 5’ GGA AGA ACC AGA AGC CAA AGA 3’ (SEQ ID NO: 18)
Se separó el fragmento de ADNc de FcRγ de 0,3 kb y se recuperó mediante electroforesis usando gel de agarosa al 2%, que se clonó en el vector de plásmido pCR4 Blunt TOPO (fabricado por Invitrogen) usando el kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO (fabricado por Invitrogen). Se analizaron las secuencias de bases de los genes obtenidos, y se confirmó que se clonó el gen de FcRγ deseado mostrado en SEQ ID NO: 15.
B-4) Producción de vectores de expresión de FcRγ etiquetados con Myc
Se construyó un plásmido que expresa una proteína en la que se unió la etiqueta Myc al extremo C-terminal de modo que pudo confirmarse la expresión de la proteína FcRγ. Se amplificó la secuencia deseada mediante un método de PCR usando como molde el gen de FcRγ producido tal como se describe en el punto 3) así como usando cebadores con las siguientes secuencias de bases. Se usó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para la reacción PCR. Se fijaron las condiciones a 25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 1 minuto] tras 1 ciclo de PCR a 94ºC durante 2 minutos.
Cebador directo (SEQ ID NO: 19): 5’ CCG ctc gag ATG ATT CCA GCA GTG GTC TTG 3’
Cebador inverso (SEQ ID NO: 20): 5’ CTA Gac tag tCT A[CA GAT CCT CTT CAG AGA TGA GTT TCT GCT C] CT GTG GTG GTT TCT CAT G 3’
De las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente, la parte destacada entre paréntesis muestra una secuencia de bases que codifica para la etiqueta Myc unida y cada letra minúscula muestra el sitio de escisión para la enzima de restricción Xhol o Spel. Se escindieron por Xhol y Spel los fragmentos de ADN amplificados por PCR, que entonces se separaron mediante electroforesis en gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de aproximadamente 0,3 kb, que se ligaron en el vector pME18X escindido por Xhol y Spel de la misma manera que se describió anteriormente. Entonces, se construyó un plásmido que puede expresar la proteína de fusión deseada, es decir pME18X-Myc-FcRγ.
C. Expresión de ILT7 en células animales
Se examinó la expresión de ILT7 en células animales usando vectores de expresión producidos tal como se describió anteriormente.
C-1) Expresión en células 293T
Se introdujeron ADN que consisten en las siguientes cinco combinaciones en células 293T (7x105 células) usando el
kit de transfección Effectene (fabricado por Qiagen). Dos días tras la introducción, se llevó a cabo el análisis de citometría de flujo (análisis de FCM).
(1)
2 g de pME18X-N-FLAG ILT7
(2)
2 g de pME18X-C-FLAG ILT7
(3)
1 g de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 g de pME18X-Myc-FcRγ
(4)
1 g de pME18X-C-FLAG ILT7 + 1 g de pME18X-Myc-FcRγ
(5)
2 g de pME18X-Myc-FcRγ Se realizó el método de análisis de FCM de la misma manera que se describe en el punto A-4 del siguiente ejemplo
2. Se usó anticuerpo anti-FLAG conjugado con Cy3 (fabricado por Sigma) para la reacción y se usó un instrumento FACScan (fabricado por Becton Dickinson) para el análisis. Como resultado, se encontró que sólo se expresaba una pequeña cantidad de ILT7 en la superficie celular cuando se hizo reaccionar solo, mientras que se expresaba ILT7 de manera extracelular y robusta cuando coexistía con FcRγ (figura 3). Se sabe que FcRγ de ratón tiene alta homología con FcRγ humano. Sin embargo, cuando se usaron células p815 (mastocitoma de ratón) que expresan FcRγ de ratón como huéspedes, no pudo observarse la expresión de ILT7.
C-2) Análisis mediante inmunoprecipitación y método de inmunotransferencia de tipo Western
Se expresó ILT7 con FcRγ acompañante en la superficie celular, que se confirmó tal como sigue. Tras la inmunoprecipitación, se analizaron diversos anticuerpos para cada célula 293T que se coexpresaba con ambos genes en las respectivas combinaciones descritas en los puntos (1) a (5). Se introdujeron los ADN en células 293T (7x105 células), a partir de lo cual se recuperaron células 293T dos días tras la introducción de la misma manera que se describe en el punto 1). Se disolvieron fraccionamientos celulares en tampón de lisis (Triton al 0,5%, NaCl 150 mM), que se dejó sobre hielo durante 20 minutos. Después de eso, se repitió la aspiración usando una aguja (27G) varias veces, seguido por centrifugación a 15 Krpm durante 20 minutos. Se añadió un anticuerpo anti-myc (2 g, fabricado por Santa Cruz Biotechnology) o anticuerpo anti-FLAG (2 g, fabricado por Sigma) a 200 g de lisado de los productos resultantes, que se agitaron adicionalmente mediante rotación a 4ºC durante 4 horas. Entonces, se añadió a lo mismo mezcla de proteína A/G Sepharose 4 Fast Flow (fabricada por Amersham Bioscience), que se agitó mediante rotación a 4ºC durante 1 hora. Entonces, se lavaron las fracciones precipitadas resultantes con tampón de lisis con la siguiente composición 3 veces. Tampón de lisis:
TritonX-100 al 0,5%,
HEPES 50 mM (pH 7,6),
NaCl 150 mM,
EDTA 1 mM,
glicerol al 10%,
DTT 1 mM,
PMSF 2 mM,
aprotinina 1 g/ml,
leupeptina 1 g/ml,
pepstatina A 1 g/ml,
quimostatina 0,1 g/ml,
Na3VO4 1 mM,
glicerofosfato 0,1 mM.
Se añadió un tampón de muestra para SDS-PAGE a los precipitados lavados, que se sometió a ebullición durante 5 minutos y se centrifugó, seguido por la realización de la electroforesis con gel de SDS al 10%. Se transfirieron las muestras desde los geles tras la electroforesis a una membrana de PVDF (membrana de transferencia Immobilon-p:
fabricada por Millipore) según un método habitual. Se realizó la inmunotransferencia con anticuerpo anti-FLAG y anticuerpo anti-myc. Se confirmó que la ILT7 asociada con FcRγ estaba presente en células 293T porque se observó su presencia en cada precipitado inmunitario (figura 4).
5 C-3) Análisis de la cadena de azúcar
Puesto que se observaron varias bandas de ILT7 en el análisis de tipo Western, se examinó la posibilidad de que ILT7 estuviese glicosilada. Se sometieron a inmunoprecipitación 200 g de lisado de células 293T que expresan N-FLAG ILT7 y Myc-FcRγ con anticuerpo anti-FLAG de la manera descrita en los puntos 1) y 2). Después de eso, se
10 suspendieron las fracciones precipitadas en 60 l de tampón de N-glicosidasa con la siguiente composición y se tomaron alícuotas de 30 µl de cada disolución resultante en dos tubos. Tampón de N-glicosidasa:
EDTA 10 mM,
15 SDS al 0,2%,
TritonX100 al 0,5%,
2-mercaptoetanol al 1% en PBS (tampón fosfato).
20 Entonces, se añadieron 3 unidades de 3 µl de N-glicosidasa (n.º 1365177, fabricada por Roche) a un tubo, que se hizo reaccionar a 37ºC durante 15 horas. Además, se añadieron al mismo 7 µl de tampón de muestra, que se calentó a 100ºC durante 5 minutos, seguido por la realización de la electroforesis con gel de SDS al 10%. Tras la electroforesis, se transfirió el gel a una membrana de PVDF, a la que se le añadió 1 µg de anticuerpo policlonal anti
25 ILT7 tal como se describe en el punto 4) y se hizo reaccionar a 4ºC durante la noche. Se lavó el producto resultante con tampón TBS-T y se hizo reaccionar con anticuerpo anti-conejo marcado con HRP diluido 100.000 veces (fabricado por Jackson) a temperatura ambiente. Entonces, se coloreó con el sistema de detección de inmunotransferencia de tipo Western de ECL (fabricado por Amersham Bioscience). Como resultado, disminuyó el peso molecular aparente al realizar el tratamiento con N-glicosidasa. Por tanto, se esperaba que se añadieran
30 cadenas de azúcar a ILT7 (figura 5).
C-4) Producción de anticuerpo policlonal anti-ILT7
Se produjo el anticuerpo policlonal anti-ILT7 usado tal como se describe en el punto 3) tal como sigue. Se sintetizó
35 químicamente un péptido de 23 aminoácidos correspondiente al extremo C-terminal de ILT7 (CSQEANSRKDNAPFRWEPWEQI; SEQ ID NO: 21) y se unió a proteína KLH que es un portador, y se usó el producto resultante como inmunógeno. Se inmunizaron por vía intradérmica conejos con inmunógeno mezclado con adyuvante completo de Freund. Tras seis inmunizaciones en total (una vez a la semana), se confirmó el aumento del título de anticuerpos en suero y entonces se recogió sangre completa. Entonces, se purificó por afinidad cierta
40 cantidad de suero usando una columna de péptido de la misma secuencia. Se determinó el producto resultante como anticuerpo policlonal anti-ILT7.
Ejemplo 2
45 A. Producción del anticuerpo monoclonal anti-ILT7
A-1) Producción de inmunógenos
Se prepararon células que iban a usarse como inmunógenos introduciendo genes en células 293T tal como se
50 describe a continuación. Se añadieron 46,4 µg de transgén (23,2 µg de pME18X-C-FLAG ILT7 y 23,2 g de pME18XMyc-FcRy) al fondo de una placa recubierta con colágeno de 100 mm (IWAKI) recubierta con 3 ml de opti-MEM (GIBCO) y se mezclaron. Posteriormente, aparte de la disolución de transgén, se diluyeron 58 l de Lipofectamine (nombre comercial) 2000 (Invitrogen) con 3 ml de opti-MEM, que se dejaron en reposo a temperatura ambiente durante 5 minutos y se preparó una disolución de Lipofectamine. Después de eso, se añadió suavemente la
55 disolución de Lipofectamine a la placa que contenía la disolución de transgén y se mezclaron. Tras estar en reposo a temperatura ambiente durante 20 minutos, se añadieron suavemente a la placa 10 ml de células 293T, diluidas hasta 1x106 células/ml usando medio de cultivo DMEM (SIGMA) que contenía FBS (suero bovino fetal) al 10%. Se sometió el medio resultante a cultivo estático en un incubador a 37ºC bajo CO2 durante 48 horas, del que se recuperaron células mediante pipeteo. Se usaron las células obtenidas como transfectantes para inmunógenos.
A-2) Producción de hibridomas
El día antes de que se inmunizaran con las células, se inyectaron 50 l de emulsión obtenida mezclando 200 l de PBS con 200 l de complete adyuvante (FREUND) (M606-1, fabricado por Mitsubishi Kagaku latron, Inc.) en las superficies 65 plantares de ambas patas de cuatro ratones hembra Balb/c (de cuatro semanas de edad) para la inmunización. Al
día siguiente, se realizó la inmunización con 50 l de 2 x107 células suspendidas en 400 l de PBS. Se realizaron las inmunizaciones segunda y tercera cada cuatro días. Tres días tras la tercera inmunización, se realizó la fusión celular tal como sigue. Se recogieron células de ganglios linfáticos de patas de ratones inmunizados. Se mezclaron células de mieloma de ratón P3-X63-Ag8-U1 cultivadas en medio de cultivo RPM11640 (SIGMA) que contenía FBS al 10% con las células derivadas de ganglios linfáticos y mieloma de modo que la razón de las células de mieloma de ratón con respecto a las células derivadas de ganglios linfáticos y mieloma debe ser de 2:1 a 10:1, a partir de lo cual se recuperaron células mediante centrifugación. Se añadió PEG4000 (MERCK) diluido de manera equivalente con medio de cultivo RPMI 1640 a las fracciones celulares obtenidas, que se sometieron a fusión celular. Tras lavar las células, se suspendió el producto resultante en 160 ml de medio HAT con FBS al 15% que contenía un complemente y entonces se inocularon en dieciséis placas de 96 pocillos a 200 l/pocillo. Se intercambió el medio de cultivo tras tres días. De una a dos semanas tras la observación de la formación de colonias, se realizó la selección primaria.
A-3) Selección de hibridoma mediante el método de ELISA celular
Se seleccionó un hibridoma, que produce anticuerpo diana, mediante el siguiente ELISA celular. Se usaron las células producidas tal como se describe en el punto 1) a 1x107 células por placa de 96 pocillos, que se suspendieron en BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS y entonces se tomaron alícuotas en una placa para el ELISA celular (NUNC 249570 96V NW PS) a 100 l/pocillo. Se llevó a cabo la centrifugación a 2.000 rpm a 4ºC y entonces se desechó el sobrenadante. Se añadió sobrenadante de cultivo muestreado a 50 µl/pocillo, que se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se llevó a cabo dos veces una operación de lavado que implica añadir BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS a cada pocillo, centrifugación a 2.000 rpm a 4ºC durante 2 minutos y luego desechar el sobrenadante. Se añadieron 50 µl/pocillo de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa diluido
10.000 veces (IM0819; Beckman Coulter) a cada pocillo tras el lavado, lo que se hizo reaccionar durante 30 minutos. Se llevó a cabo dos veces la operación de lavado usando BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS, seguido por la adición de una disolución colorante. Se sustituyó la disolución de anticuerpo preparada por PBS (-) mediante una membrana de diálisis (cortes de 10.000 fabricada por PIERCE) para dar anticuerpos quiméricos anti-ILT7 purificados.
A-4) Examen de la capacidad de respuesta de anticuerpo mediante análisis de citometría de flujo (FCM)
Se analizó el sobrenadante de cultivo de hibridomas mediante análisis de citometría de flujo (FCM). Se suspendieron las células producidas tal como se describe en el punto 1) en BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS, que se transfirió a un tubo de centrífuga a 1 x 105 por una muestra, seguido por la adición de 40 l de cada cultivo y reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se llevó a cabo dos veces la operación de lavado que implica añadir 1 ml de BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS a cada tubo, centrifugar a 1200 rpm a 4ºC durante 3 minutos y desechar el sobrenadante. Se añadieron 40 l de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón marcado con FITC diluido 100 veces (IM0819; Beckman Coulter) a cada pocillo tras lavar, lo que se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se llevó a cabo dos veces la operación de lavado usando BSA al 0,5%/EDTA 2 mM/PBS, seguido por análisis usando citometría de flujo FC500 (Beckman Coulter). Se seleccionó un hibridoma que producía un anticuerpo que no respondía sólo a la célula huésped y respondía específicamente en la que se había introducido el gen. Se clonó el hibridoma seleccionado mediante el método de dilución limitante y se obtuvieron los hibridomas #11 y #17 que producen anticuerpos monoclonales.
B. Examen de la capacidad de respuesta de anticuerpo anti-ILT7
Se coexpresó ILT7 en el que se unió la etiqueta FLAG al extremo N-terminal, con la molécula FcRγ en células 293T de la misma manera que se describe en el punto C-1) del ejemplo 1. Entonces, se confirmó la capacidad de respuesta del anticuerpo obtenido en el ejemplo 2 mediante análisis de FCM usando FACScan (Becton Dickinson). Como resultado, se confirmó que todos los anticuerpos producidos por los hibridomas #11 y #17 que se obtuvieron tal como se describe en el punto A respondían a las células en las que se introdujo el gen de ILT7 y que expresaban ILT7 (figura 6 (b)). Además, se separaron linfocitos de sangre periférica humana usando Ficoll y entonces se realizó doble tinción con el anticuerpo anti-ILT7 producido y el anticuerpo anti-BDCA-2 marcado con PE (Miltenyi). Entonces, se examinó la capacidad de respuesta frente a los linfocitos. Como resultado, se detectó la unión del anticuerpo monoclonal producido por los hibridomas #11 y #17 a células positivas para BDCA-2. Es decir, se confirmó que ambos anticuerpos monoclonales reconocían moléculas de ILT7 expresadas en IPC humanas (figura 6 (a)). Estos anticuerpos monoclonales se designaron como anticuerpo anti-ILT7 #11 y anticuerpo anti-ILT7 #17, respectivamente. Se realizó un análisis más detallado.
Se llevó a cabo análisis de tinción múltiple para linfocitos de sangre periférica humanos usando el anticuerpo anti-ILT7 producido, anticuerpo anti-linaje 1 (anticuerpos anti-CD3, CD14, CD16, CD19, CD56; Becton Dickinson), el anticuerpo anti-CD123 (Becton Dickinson) y el anticuerpo anti-BDCA-2 (Miltenyi). Como para las fracciones positivas para anticuerpo frente a ILT7, el marcador de linaje era negativo, CD123 era positivo y BDCA-2 era positivo. A partir de los resultados, se confirmó que las IPC se tiñeron sólo por ILT7 #11 e ILT7 #17 (figura 7).
Además, se examinó la expresión de diversas moléculas mediante análisis de FCM cuando se estimularon linfocitos
de sangre periférica humanos mediante CpG o IFNα durante 24 horas. Se usó CpGODN2216 como CpGA, que induce la producción de IFN a partir de las IPC y se usó CpGODN2006 como CpGB que facilita la maduración de células dendríticas (Moseman et al. J. Immunology. 173, 4433-4442, 2004). Se fijó una compuerta para la fracción negativa para el marcador de linaje. Cuando se analizó la capacidad de respuesta del anticuerpo anti-BDCA-2 y el 5 anticuerpo anti-ILT7 a la población de células positivas para CD123, la mayor parte de las fracciones positivas para ILT7 desaparecieron incluso tras 24 horas de estimulación con CpG. Por otro lado, algunas células de BDCA-2 mostraron ser positivas tras 24 horas de estimulación con CpG (figura 8). Se ha considerado que las IPC se diferencian en diferentes células inmediatamente tras la estimulación con CpG. Se indicó que el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención era útil como anticuerpo específico de fase frente a las IPC. Además, se confirmó que las
10 IPC en los linfocitos de sangre periférica no se diferenciaban con la presencia de IFNα, en este caso cuando la razón de supervivencia era alta, se mantuvo la expresión de ILT7 en las IPC, además estaba presente ILT7 de manera estable en las IPC en enfermedades autoinmunitarias con la posibilidad de que IFN en suero estuviese a un alto nivel.
15 C. Examen de la especificidad de anticuerpo anti-lLT7
ILT7 pertenece a la familia de ILT/LIR y existe una pluralidad de moléculas con alta homología, particularmente con alta homología en la región extracelular (figura 9). Se ha notificado que los ARNm de moléculas, especialmente tales como ILT2 e ILT3 se expresan en las IPC (Ju et al. Gene 331, 159-164, 2004). Por tanto, se confirmó la capacidad
20 de respuesta de estas moléculas usando células transgénicas.
C-1) Clonación de la molécula de ILT1 y producción de vectores de expresión
Se sintetizó ADNc a partir de ARN derivado de amígdala humana usando cebador de oligo dT y el sistema
25 SuperScript Choice para el kit de síntesis de ADNc. A continuación, se ligó un adaptador de Notl en el vector pME18S escindido por Notl; dando como resultado la producción de una biblioteca de ADNc de amígdala humana.
Se amplificó el gen de ILT1 con una etiqueta FLAG en el extremo C-terminal mediante el método de PCR usando como molde la biblioteca de ADNc producida así como usando cebadores con las siguientes secuencias de bases.
30 Se usó 1 unidad de ADN polimerasa KOD Plus (fabricada por TOYOBO CO., LTD.) para la reacción PCR. Se fijaron las condiciones de reacción a 25 ciclos de PCR [a 94ºC durante 15 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 68ºC durante 2 minutos] tras 1 ciclo de PCR a 94ºC durante 2 minutos.
Cebador directo (SEQ ID NO: 22): 5’ CCG ctc gag ATG ACC CCC ATC CTC ACG GTC C 3’
35 Cebador inverso (SEQ ID NO: 23): 5’ CTA Gac tag tTC A[CT TAT CGT CGT CAT CCT TGT AAT C]CC TCC CGG CTG CAT CTT G 3’
En las secuencias de cebadores mencionadas anteriormente, la parte destacada entre paréntesis muestra una
40 secuencia de bases que codifica para la etiqueta FLAG unida y cada letra minúscula muestra el sitio de escisión para la enzima de restricción Xhol o Spel. Se escindieron por Xhol y Spel los fragmentos de ADN amplificados mediante PCR, que entonces se separaron mediante electroforesis en gel. Se recuperaron fragmentos de ADN de aproximadamente 2 kb, que se ligaron en el vector pME18X escindido por Xhol y Spel de la misma manera que se describió anteriormente. Entonces, se construyó un plásmido que puede expresar la proteína de fusión deseada, es
45 decir pME18X-C-FLAGILT1. La secuencia de bases y la secuencia de aminoácidos se muestran en SEQ ID NO: 24 y 25.
C-2) Producción de células que expresan y examen de la capacidad de respuesta de anticuerpo
50 Como para ILT2 (SEQ ID NO: 26) e ILT3 (SEQ ID NO: 28), se usaron vectores de expresión en los que se clonaron genes respectivos en sitios Xbal o Xhol de pDNAc4.1 (fabricado por Invitrogen). Se introdujeron los ADN de las siguientes combinaciones en células 293T (7 x 105 células) de la misma manera que se describe en el punto C-1). Dos días tras la introducción, se llevó a cabo el análisis de FCM y entonces se analizó el anticuerpo anti-ILT7.
55 (1) 1 µg de pME18X-N-FLAG ILT7 + 1 µg de pME18X-Myc-FcRy
(2) 0,5 µg de pME18X-C-FLAG ILT1 + 0,5 µg de pME18X-Myc-FcRγ + 0,5 µg de pDNAc4.1-ILT2 + 0,5 µg de pDNAc4.1-ILT3
60 Como resultado, ningún anticuerpo respondió a las células en las que se expresó ILT1. Por este motivo, se sugirió que estas anticuerpos anti-ILT7 reconocían específicamente moléculas de ILT7 en las IPC (figura 10).
Ejemplo 3
65 Efecto del anticuerpo anti-ILT7 sobre la capacidad para producir IFN humano
Se inocularon linfocitos de sangre periférica humanos en una placa de 96 pocillos a 2 x105 células/pocillo, que se hicieron reaccionar con 5 µg/ml de diversos anticuerpos a 37ºC. Tras 1 hora de cultivo, se añadieron a los mismos virus Influenza PR8. Tras 24 horas de cultivo, se midió IFNα en el sobrenadante de cultivo mediante el kit de ELISA (Bender Med System). Como resultado, se inhibió la producción de IFN mediante la adición de anticuerpo anti-ILT7
5 (figura 11). Concretamente, se encontró que la producción de IFN por las IPC se vio afectada por el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención.
Ejemplo 4
10 Actividad de CDC de anticuerpo anti-ILT7
A. Producción del anticuerpo monoclonal anti-ILT7
Se obtuvo un clon que produce un anticuerpo monoclonal de la misma manera que se describe en los puntos A-1) a
15 A-4) del ejemplo 2. Se examinó la capacidad de respuesta de la misma manera que se describe en el punto B del ejemplo 2 y se examinó la especificidad de la misma manera que se describe en el punto C del ejemplo 2. Como resultado, se obtuvieron los hibridomas #37, #28 y #33, que producían anticuerpos monoclonales anti-ILT7 con buena capacidad de respuesta y especificidad. Se midió la actividad de CDC tal como se describe a continuación usando el anticuerpo monoclonal anti-ILT7 en el que se produjeron tres clases de estos hibridomas.
B. Determinación de la actividad de CDC
B-1) El día previo de la producción de la diana
25 Producción de la línea celular diana (línea celular ILT7-CHO), se introdujo el siguiente ADN en células CHO-k1, que se inocularon para que fuesen 6 x 105 células por placa (6 cm de ϕ) usando reactivo de transfección Effectene (fabricado por QLAGEN) y entonces se seleccionaron cepas resistentes usando 800 Lg/ml de Zeocin (fabricado por Invitrogen). ADN introducido: 1 µg de pDNAc3.1-C-FLAG ILT7 + 2 µg de pME18X-Myc FcRγ
30 Después de eso, se obtuvo una línea celular, que expresaba altamente ILT7, usando el clasificador de células (BD FACSAria, fabricado por Becton Dickinson). Se confirmó que la línea celular seleccionada expresaba altamente ILT7 mediante análisis de FCM. Se llevó a cabo la operación de análisis de FCM según el método tal como se describe en el punto A-4) del ejemplo 2 excepto porque se usó el instrumento BD FACSCaliber (fabricado por BD) para FCM. Se usaron los siguientes anticuerpos para un anticuerpo primario y un anticuerpo secundario, respectivamente.
35 Anticuerpo primario: anticuerpo de ratón anti-ILT7 5 µg/ml (#37), anticuerpo secundario: anticuerpo policlonal de cabra específico anti-inmunoglobulina de ratón conjugado con R-ficoeritrina (R-PE) (BD)
B-2) Respuesta de células diana a anticuerpos anti-ILT7
40 Se recuperaron las células diana obtenidas tal como se describe en el punto B-1) (células ILT7-CHO) usando disolución de EDTA 5 mM/PBS, que se suspendieron en medio de CDC con la siguiente composición para que fuese una concentración de 4 x 105 células/ml. Se tomaron alícuotas de la suspensión en cada placa de 96 pocillos a 50 µl/pocillo.
45 Medio de CDC: RPMI1640
BSA al 0,1%
Penicilina 100 unidades/ml
Estreptomicina 100 µg/ml
Hepes 10 mM (pH 7,6)
55 L-glutamina 2 mM
Se añadieron 50 µl de disolución de anticuerpo anti-ILT7 preparada mediante medio de CDC a cada pocillo y se mezclaron de modo que la concentración final de anticuerpos debe ser de 0,1 µg/ml, 0,5 µg/ml, 1 µg/mly 5 µg/ml. Además, se añadieron a lo mismo 50 µl de medio de CDC que contenía un complemento con la siguiente
60 composición y se mezclaron de modo que la concentración de complemento final debe ser del 6%, seguido por cultivo a 37ºC durante 2 horas. Medio de CDC que contenía un complemento:
1 ml de medio de CDC (véase anteriormente) con complemento de conejo juvenil (n.º de catálogo: CL3441, fabricado por CEDARLANE).
Entonces, se centrifugó la suspensión (condición de centrífuga: a 250 G durante 4 minutos) y se recuperó el sobrenadante mientras que se prestaba atención para no contaminarlo con células. Se midió la LDH en el sobrenadante mediante un método habitual, que se determinó como “la cantidad de LDH que se escapaba de la célula diana por la actividad del complemento” (muestra experimental).
También se prepararon los siguientes parámetros con el fin de determinar la actividad de CDC.
Liberación de LDH espontánea de la célula diana: sólo se cultivaron células diana en el mismo volumen que la muestra y se prepararon.
10 Liberación de LDH máxima de la célula diana: sólo se cultivaron células diana en el mismo volumen que la muestra, y entonces se añadió a la misma la disolución de TritonX-100 incluida con el kit 60 minutos antes de la recuperación del sobrenadante de modo que la concentración final debe ser del 0,8% y se prepararon.
15 Control de corrección de volumen: se añadió la misma cantidad de TritonX-100 que la añadida cuando se preparó la liberación de LDH máxima de la célula diana, al medio de cultivo del mismo volumen que la muestra y se preparó.
Fondo de medio de cultivo: se prepararon el medio de cultivo del mismo volumen que la muestra y la disolución a la que se añadió medio de CDC que contenía complemento de modo que fuese el mismo volumen que la muestra.
20 Se restó el mismo volumen de medio de cultivo que la muestra de la absorbancia de la diana máxima y la diana espontánea. Se restó la disolución a la que se añadió medio de CDC que contenía complemento al medio de cultivo de modo que fuese el mismo volumen que la muestra, de la absorbancia de la muestra experimental y se corrigió. Se calculó la actividad de CDC mediante la siguiente ecuación. Se muestran los resultados en la tabla 1 y la figura
25 12. Incluso en el caso en el que se usaron anticuerpos monoclonales anti-ILT7 obtenidos de cualquier hibridoma, se presentaba el 80% o más de la actividad de CDC cuando la concentración de anticuerpo era de 0,5 µg/ml o más.
61 muestra experimental − diana espontánea
Actividad de CDC (%) = x 100
diana máxima − control de volumen − diana espontánea
30 Tabla 1
Concentración de anticuerpo
Citotoxicidad (prom.) Citotoxicidad (STD)
#37
0,1 14,78 3,16
0,5
85,50 0,60
1
86,13 2,93
5
90,26 1,87
#28
0,1 18,52 0,60
0,5
80,97 1,62
1
83,64 1,99
5
88,17 3,32
#33
0,1 4,42 1,58
0,5
82,16 3,35
1
85,39 2,78
5
86,18 1,71
IgG2a de ratón
0,1 1,53 0,60
0,5
1,47 2,50
1
3,68 2,90
5
3,06 1,72
Sin Ac
0 2,10 0,49
Ejemplo comparativo 1
35 Se realizó exactamente la misma operación de la misma manera que se describe en los puntos B y C del ejemplo 4 excepto porque se usó IgG2a de ratón en lugar de anticuerpo anti-ILT7. Se muestran los resultados en el ejemplo 4 así como la tabla 5 y la figura. No se observó actividad de CDC para las células diana en anticuerpos distintos del anticuerpo monoclonal anti-ILT7.
40 Ejemplos 5
Internalización de anticuerpo anti-ILT7 en células diana
A. Anticuerpo monoclonal anti-ILT7
Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-ILT7. Anticuerpos monoclonales anti-ILT7: #17, #26, #37, #28 y #33
B. Observación de internalización
B-1) Producción de línea celular diana (línea celular ILT7-CHO)
Se produjo la línea celular diana (línea celular ILT7-CHO) de la misma manera que se describe en el punto B-1 del ejemplo 4.
B-2) Respuesta de células diana a anticuerpo anti-ILT7
Se suspendieron las células ILT7-CHO recuperadas en tampón (T(-) + FBS al 10%) enfriado con hielo con la siguiente composición a 1 x 106 células/ml usando 5 mM de disolución de EDTA/PBS.
Medio T (-):
RPMI1640
Penicilina 100 unidades/ml
Estreptomicina 100 mg/ml
Hepes 10 mM (pH 7,6)
L-Glutamina 2 mM
Piruvato de sodio 1 mM
2-Mercaptoetanol 50 M
Suero bovino fetal inactivado por calor al 10%
Se colocó 1 ml de suspensión tal como se describió anteriormente en un tubo de centrífuga de 15 ml, que se centrifugó (condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos) y entonces se desechó el sobrenadante. Se añadieron 200 µl de suspensión de anticuerpo monoclonal anti-ILT7 (10 µg/ml) a los sedimentos celulares, que se mezclaron e incubaron a 4ºC durante 30 minutos, seguido por lavado con medio T (-) enfriado con hielo dos veces (la cantidad del medio usada: 10 ml por lavado, condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos).
B-3) Modificación del complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 presente en la superficie de células diana
Posteriormente, se modificó el complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 presente en la superficie de las células con un anticuerpo secundario, que estaba marcado con fluorescencia para su detección. Se describe a continuación el método específico. Se añadió anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de ratón marcado con APC (número de catálogo: 550826BD, fabricado por Biosciences) que contenía medio T (-) enfriado con hielo a los sedimentos celulares obtenidos tal como se describe en el punto B-2), que se incubaron con sombreado a 4ºC durante 20 minutos, seguido por lavado con medio T (-)enfriado con hielo dos veces (la cantidad del medio usada: 10 ml por lavado, condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos). Entonces, se añadió a lo mismo medio T (-) enfriado con hielo, que se usó como 1 x 106 células/ml de suspensión.
B-4) Inducción de internalización mediante incubación a 37ºC
Se dividió por igual la suspensión obtenida tal como se describe en el punto B-3 en dos tubos (es decir, tubos (a) y (b)). Se incubaron los tubos (a) y (b) a 37ºC y 4ºC, respectivamente, en condición de sombreado durante 60 minutos. Tras la incubación, se añadió a lo mismo FBS al 1%/PBS (enfriado con hielo) para detener la internalización. Se centrifugó la disolución resultante (condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos) y entonces se desechó el sobrenadante, seguido por lavado con el 1% de FBS/PBS (enfriado con hielo) dos veces (la cantidad de la disolución: 10 ml por lavado, condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos).
B-6) Modificación del complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 que permanece en la superficie de células diana tras la incubación
Se modificó el complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 que permaneció en la superficie celular tras la incubación con un anticuerpo terciario para la detección mediante fluorescencia. Se describe a continuación el método específico. Se añadieron 20 µl de suspensión que contenía anticuerpos terciarios (anticuerpo de asno anti
IgG de cabra marcado con FITC (número de catálogo: sc-2024, fabricado por Santa Cruz Biotechnology)) a los sedimentos celulares obtenidos tal como se describe en el punto B-4), que se mezclaron y se dejaron en reposo a 4ºC durante 15 minutos en condición de sombreado. Se lavó la disolución resultante con (la cantidad de la disolución: 10 ml por lavado, condición de centrífuga: a 1200 rpm, a 4ºC, durante 5 minutos).
B-5) Análisis del anticuerpo anti-ILT7 presente en células diana
Posteriormente, se añadieron 150 µl de FBS al 1%/PBS a los sedimentos celulares obtenidos tal como se describe en el punto B-5), que se suspendieron y recogieron en un tubo de microtitulación de 1,2 ml, seguido por la
10 realización del análisis de FCM. En el análisis, se analizó por separado la intensidad de fluorescencia media (MPI) de cada célula en FITC y APC. Además, se calculó la razón de intensidad de fluorescencia (%) mediante la siguiente ecuación.
Intensidad de fluorescencia media de células incubadas a 37º C durante 60 minutos
Razón de intensidad de fluorescencia (%) = x 100
Intensidad de fluorescencia media de células incubadas a 4º C durante 6 minutos
Los resultados se muestran en la tabla 2, la tabla 3 y la figura 13.
Tabla 2
FITC
APC
Intensidad de fluorescencia media
Razón de intensidad de fluorescencia (%) Intensidad de fluorescencia media Razón de intensidad de fluorescencia (%)
Temperatura de incubación (ºC)
Temperatura de incubación (ºC)
4
37
4
4
#17
35,7 15,9 44,5 1384 1320 95,4
#26
29,8 16,5 55,4 844 816 96,7
#37
51,0 28,5 55,9 2194 2155 98,2
#28
40,6 19,3 47,5 1746 1709 97,9
#33
47,7 22,6 47,4 1882 1845 98,0
IgG2a
3,7 4,2 116,2 3 3,64 121,3
Especie de anticuerpos primarios
Razón de intensidad de fluorescencia (%)
APC
FITC
Ejemplo 5
Anticuerpo anti-ILT7 #17 95,4 44,5
Anticuerpo anti-ILT7 #26
96,7 55,4
Anticuerpo anti-ILT7 #37
98,2 55,9
Anticuerpo anti-ILT7 #28
97,9 47,5
Anticuerpo anti-ILT7 #33
98,0 47,4
Ejemplo comparativo 2
IgG2a de ratón 121,3 116,2
La intensidad de fluorescencia de FITC es un indicador de la cantidad del complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 que permanece en la superficie celular tras la incubación. La fluorescencia media, la intensidad de FITC en
25 cuanto a las células incubadas a 37ºC durante 60 minutos disminuyó en aproximadamente el 50% en comparación con las células incubadas a 4ºC.
Por otro lado, la intensidad de fluorescencia de APC es un indicador de la cantidad del complejo inmunitario ILT7anticuerpo anti-ILT7 presentado en la superficie celular antes de la incubación. El complejo inmunitario ILT730 anticuerpo anti-ILT7 se detecta independientemente de si está presente en la superficie celular o se incorpora en las células tras la incubación. En el ejemplo 5, la intensidad de fluorescencia de APC tras la incubación en el caso de incubación a 37ºC era equivalente a la de en el caso de incubación a 4ºC. Se muestra que el complejo inmunitario ILT7-anticuerpo anti-ILT7 puede estar presente en cualquier sitio de las células diana incluso cuando la incubación se realiza a cualquier temperatura. Tal como se mencionó anteriormente, se encontró que el anticuerpo monoclonal
35 anti-ILT7 provocaba la internalización de ILT7 mediante la incubación a 37ºC.
Ejemplo comparativo 2
Se realizó exactamente la misma operación de la misma manera que se describe en el ejemplo 5 excepto porque se
40 usó IgG2a de ratón en lugar de anticuerpo anti-ILT7. Los resultados se muestran en el ejemplo 5 así como la tabla 2, la tabla 3 y la figura 13. En el caso en el que se usó la IgG2a de ratón, no se observó ningún cambio en la intensidad de fluorescencia de FITC y APC, por tanto se encontró que la IgG2a de ratón no provocaba la internalización de ILT7.
Ejemplo 6 Acerca de la estructura del anticuerpo monoclonal de ratón anti-ILT7 humano [Secuencias de regiones variables]
A. Clonación de ADNc que codifica para la región variable de anticuerpo de ratón anti-ILT7 A-1) Acerca de hibridomas que producen anticuerpos de ratón anti-ILT7
10 Se usaron los siguientes hibridomas como hibridomas que producen anticuerpos de ratón anti-ILT7. Hibridoma #11 (número de registro: FERM BP-1 0704) Hibridoma #17 (número de registro: FERM BP-10705)
A-2) Aislamiento de los ARN totales
Se aislaron los ARN totales de los hibridomas descritos en el punto A-1) usando el kit disponible comercialmente “RNeasy Mini Kit” (número de catálogo: 74106, fabricado por Qiagen) según las instrucciones adjuntas al kit. En 20 ambos casos, se obtuvieron aproximadamente 200 µg de los ARN totales a partir de 1 x 107 hibridomas.
A-3) Amplificación y fragmentación de ADNc que codifica para una región variable de cadena pesada de ratón
Se amplificó ADNc que codifica para una región variable de cadena pesada de ratón mediante el método de 5’
25 RACE usando 5 µg de los ARN totales aislados tal como se describe en el punto A-2. Como para la amplificación, se usó el kit disponible comercialmente “5’ RACE System for Rapid Amplification of cDNA ENDs, versión 2.0” (número de catálogo: 18374-058, fabricado por Invitrogen). Se describirá específicamente tal como sigue. En primer lugar, se sintetizó ADNc de primera hebra a partir de los ARN totales tal como se describe en el punto A-2) mediante transcriptasa inversa. Las secuencias de bases de cebadores antisentido (GSP1) usados en ese momento se
30 muestran en la tabla 4.
Cebadores usados para la amplificación de un gen que codifica para una región variable de cadena pesada de ratón
Hibridomas usados
Nombres de cebadores SEQ ID NO: Secuencia
#11
Mu IgG3VH5RACE-GSP1 30 5’ CCA TAG TTC CAT TTT ACA GTT ACC 3’ (24 meros)
Mu IgG3VH5RACE-GSP2
31 5’ GGG ACC AAG GGA TAG ACA GA 3’ (20 meros)
#17
Mu IgG2aVH5RACE-GSP1 32 5’ TCC AGA GTT CCA GGT CAA GGT CAC 3’ (24 meros)
Mu IgG2aVH5RACE-GSP2
33 5’ GCC AGT GGA TAG ACC GAT GG 3’ (20 meros)
35 Posteriormente, se degradaron los ARN totales mediante ARNasaH y se purificó el ADNc de primera hebra que permanecía como una única hebra mediante un método de agarosa de bajo punto de fusión (al 1,5%). Además, se unió dC (es decir, homopolímero de nucleótido) al extremo 3’-terminal del ADNc de primera cadena usando desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Se amplificó el ADNc mediante un método de PCR usando cebadores de anclaje (SEQ ID NO: 34) que tienen un polímero de nucleótidos complementario a dC (secuencia de anclaje) en
40 el extremo 3’-terminal y cebadores antisentido (GSP2) mostrados en la tabla 4. Además, se usaron como moldes los productos de PCR obtenidos. Se amplificó el ADNc mediante un método de PCR anidada usando el cebador AUAP (SEQ ID NO: 35) y los cebadores antisentido (GSP2) mostrados en la tabla 4. Además, se purificaron los productos de PCR mediante un método de agarosa de bajo punto de fusión (1,5%).
45 Cebador de anclaje para 5’RACE (SEQ ID NO: 34)
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT ACG GGI IGG GII GGG IIG-3’ (36 meros)
Cebador AUAP para 5’RACE (SEQ ID NO: 35)
5’-GGC CAC GCG TCG ACT AGT AC-3’ (20 meros)
A-4) Amplificación y fragmentación de ADNc que codifica para región variable de cadena ligera de ratón
55 Se amplificó ADNc que codifica para una región variable de cadena ligera de ratón a partir de los ARN totales aislados tal como se describe en el punto A-2) de la misma manera que se describe en el punto A-3). Las
secuencias de bases de cebadores usados en ese momento se muestran en la tabla 5. Se purificaron los productos de PCR obtenidos mediante un método de agarosa de bajo punto de fusión (1,5, tabla 5).
Cebadores usados para la amplificación de un gen que codifica para una región variable de cadena ligera de ratón
Hibridomas usados
Nombres de cebadores SEQ ID No: Secuencia
#11, #17
Mu IgVL5RACE-GSP1 36 5’ TTC ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT 3’ (24 meros)
Mu IgVL5RACE-GSP2
37 5’ GAT GGA TAC AGT TGG TGC AGC 3’ (21 meros)
A-5) Confirmación de la secuencia de bases de ADNc y determinación de la región CDR
Se clonaron una región variable de cadena pesada obtenida tal como se describe en el punto A-3) y un fragmento de
10 ADNc de región variable de cadena ligera obtenido tal como se describe en el punto A-4) en el vector pCR4 Blunt-TOPO usando el kit disponible comercialmente “kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO” (número de catálogo: 1325137, fabricado por Invitrogen) según las instrucciones adjuntas al kit, que entonces se introdujo en células competentes de Escherichia coli para dar transformante de Escherichia coli. Se obtuvo el plásmido mencionado anteriormente a partir del transformante, entonces se confirmó la secuencia de bases de ADNc en el plásmido
15 usando el secuenciador automático de ADN “analizador genético ABI PRISM 3100 basado en PCR” (fabricado por Applied Biosystems). Se extrajeron las secuencias corregidas excluyendo transcritos obtenidos a partir de un ARN inactivo debido a mutaciones del marco de lectura y sin sentido alrededor de la región determinante de complementariedad (denominada a continuación en el presente documento “región CDR”). Además, se comparó la homología de la secuencia de bases de ADNc comprendida en el plásmido con la base de datos Kabat y se
20 determinaron las secuencias de la región CDR y la región variable en las respectivas regiones variables. También, como para el hibridoma #37 producido en el ejemplo 4, se determinaron las secuencias de la región CDR y la región variable en regiones variables en el mismo procedimiento descrito en los puntos A-1) a A-5) del ejemplo 6 usando el hibridoma #17. Las secuencias de bases de ADNc de las regiones variables de cadena pesada y regiones variables de cadena ligera de los anticuerpos monoclonales anti-ILT7 producidos por cada hibridoma y las secuencias de
25 aminoácidos codificadas por las secuencias se muestran en las siguientes SEQ ID NO.
Región variable de cadena pesada
Región variable de cadena ligera
#11
SEQ ID NO: 38 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 40 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 39 (secuencia de aminoácidos)
SEQ ID NO: 41 (secuencia de aminoácidos)
#17
SEQ ID NO: 42 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 44 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 43 (secuencia de aminoácidos)
SEQ ID NO: 45 (secuencia de aminoácidos)
#37
SEQ ID NO: 46 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 48 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 47 (secuencia de aminoácidos)
SEQ ID NO: 49 (secuencia de aminoácidos)
[Confirmación del isotipo de la región constante]
30 Como para el sobrenadante de cultivo de hibridomas, se confirmó el isotipo de la región constante del anticuerpo monoclonal producido usando un kit de isotipado de anticuerpo monoclonal de ratón disponible comercialmente (número de catálogo: MMT1, fabricado por Serotec Product). La región constante de cadena pesada de anticuerpo de ratón anti-ILT7 humano #11 era Ig 3 y la región constante de cadena ligera era Igk. Además, cada una de las regiones constantes de cadena pesada del anticuerpo de ratón anti-ILT7 humano #17 y anticuerpo de ratón anti-ILT7
35 humano #37 era Ig 2a y cada una de la región constante de cadena ligera era Igk.
Ejemplo 7
Producción de anticuerpos quiméricos
A. Clonación de ADNc que codifica para la región constante de IgG humana
Se seleccionaron la región constante de cadena pesada de IgG1 humana y la región constante de cadena ligera kappa de Ig humana a partir de una biblioteca de ADNc de IPC humanas. Entonces, se clonaron las regiones 45 seleccionadas en el vector pCR4 Blunt-TOPO usando el kit disponible comercialmente “kit de clonación de PCR Zero Blunt TOPO” (número de catálogo: 1325137, fabricado por Invitrogen) según las instrucciones adjuntas al kit, que entonces se introdujo en células competentes de Escherichia coli para dar transformante de Escherichia coli. Se obtuvo el plásmido mencionado anteriormente a partir del transformante, entonces se confirmó la secuencia de bases de ADNc en el plásmido usando el secuenciador automático de ADN “analizador genético ABI PRISM 3100
50 basado en PCR” (fabricado por Applied Biosystems).
B. Ligamiento de región variable con región constante y clonación
Se usó el ADNc que codifica para la región constante de cadena pesada obtenido tal como se describe en el punto A y el ADNc que codifica para la región variable de cadena pesada obtenido tal como se describe en el punto A-5 del ejemplo 6, respectivamente. Ambos ADN tienen una región en la que se solapa una secuencia de bases de ADN.
5 Entonces, se obtuvo ADN bicatenario mediante el método de extensión del solapamiento usando la región. El procedimiento específico es tal como sigue.
C-1) Preparación de ADNc que codifica para la cadena pesada de anticuerpo quimérico frente a ILT7
10 Se digirió el “plásmido con ADNc que codifica para las regiones variables de cadena pesada de #11 y #17” que se obtuvo tal como se describe en el punto A-5) con las enzimas de restricción Notl y Xbal, que se purificó mediante el método de gel de agarosa (al 1,5%). Se disolvieron los productos resultantes en cada tampón TE con la siguiente composición para que fuese de 100 pmol/l para preparar una disolución del fragmento de ADNc que codifica para la región variable de cadena pesada.
Tampón TE:
Tris-HCl 10 mM
20 EDTA 1 mM
pH de 7,5 a8,0
Además, se trató el “plásmido con ADNc que codifica para la región constante de cadena pesada” obtenido tal como
25 se describe en el punto B de la misma manera que se describió anteriormente para preparar 100 pmol/l de disolución. Posteriormente, se mezclaron ambas disoluciones y entonces se hibridaron ambas regiones de solapamiento manteniéndolas en primer lugar a 70ºC durante 10 minutos y a continuación manteniéndolas a 37ºC durante 5 minutos. Después de eso, se amplificó el ADNc mediante un método de PCR y se digirió el ADNc obtenido con las enzimas restricción Notl y Xbal, que se purificó mediante un método de gel de agarosa de bajo punto de
30 fusión (al 1,5%).
C-2) Preparación de ADNc que codifica para la cadena ligera de anticuerpo quimérico frente a ILT7
Se usó el ADNc que codifica para la región constante de cadena ligera obtenido tal como se describe en el punto A y
35 el ADNc que codifica para la región variable de cadena ligera obtenido tal como se describe en el punto A-5 del ejemplo 6, respectivamente se obtuvo ADNc que codifica para la cadena libera de anticuerpo quimérico frente a ILT7 de la misma manera que se describe en el punto C-1) usando estos ADNc.
C-3) Clonación
40 Se clonó el ADNc obtenido tal como se describe en el punto C-1) en el vector de plásmido pDNAc3.1-Zeocin (fabricado por Invitrogen) usando Notl y Xbal como sitios de clonación para producir un vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo frente ILT7 quimérico. Además, se clonó el ADNc obtenido tal como se describe en el punto C-2) en el vector de plásmido pDNAc3.1-hygromycin (fabricado por Invitrogen) usando Notl y Xbal como sitios
45 de clonación para producir un vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico frente a ILT7. Los nombres de cada vector se muestran en la tabla 6.
Nombres de vectores de plásmido
Cadena pesada de anticuerpo frente a ILT7 para la expresión
Cadena ligera de anticuerpo frente a ILT7 para la expresión
#11
pcDNA-#11VH pcDNA-#11VL
#17
pcDNA-#17VH pcDNA-#17VL
D. Expresión de anticuerpo quimérico frente a ILT7
D-1) Transformación transitoria
Se cotransfectaron 1 µg de vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo quimérico frente a ILT7 y 1 µg de vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico frente a ILT7, que se obtuvieron tal como se describe
55 en el punto C-3), en células 293T usando el kit de transfección Effectine (número de catálogo: 301427, fabricado por Qiagen). Después de eso, se cultivaron los productos resultantes a 37ºC usando medio de cultivo DMEM con FBS de bajo contenido en IgG al 2% añadido con la siguiente composición.
Medio de cultivo DMEM con FBS de bajo contenido en IgG al 2% añadido:
Medio de cultivo DMEM (número de catálogo: D5796, fabricado por Sigma) FBS con bajo contenido en IgG al 2% (número de catálogo: SH30151.03, fabricado por HyClone) L-Glutamina 2 mM Penicilina 100 U/ml Estreptomicina 100 mg/ml pH 7,2 apH 7,4 Tras la introducción de los vectores, se cultivó el medio resultante durante 96 horas y se recogió el sobrenadante de
cultivo. Entonces, se eliminaron los fragmentos celulares mediante centrifugación para dar una disolución de anticuerpo en bruto.
D-2) Transformación de homeostasis Se cotransfectaron 1 µg de vector de expresión de cadena pesada de anticuerpo quimérico frente a ILT7 y 1 g de vector de expresión de cadena ligera de anticuerpo quimérico frente a ILT7, que se obtuvieron tal como se describe en el punto C-3), en células YB 2/0 (células derivadas de mieloma de rata, n.º de la ATCC CRL-1622) usando el kit de transfección Effectine (número de catálogo: 301427, fabricado por Qiagen). Entre los vectores de plásmido usados, el vector para la expresión de la cadena pesada es un marcador para resistencia a Zeocin y el vector para la expresión de la cadena ligera es un marcador para resistencia a higromicina. Por tanto, pueden hacerse crecer células en las que se introdujeron ambos vectores en un medio de cultivo al que se añaden al mismo tiempo Zeocin e higromicina. Entonces, se cultivaron las células en medio de cultivo RPMI al que se añadieron Zeocin e higromicina y se seleccionó una cepa resistente.
Medio de cultivo RPMI con Zeocin-higromicina añadidas: Medio de cultivo RPMI1640 (número de catálogo: R8758, fabricado por Sigma) FBS al 10% HEPES 0,01 M (ácido N-2-hidroxietilpiperazin-N’-2-etanosulfónico) Piruvato de sodio 1 mM L-Glutamina 2 mM Penicilina 100 U/ml Estreptomicina 100 µg/ml 2-Mercaptoetanol 55 µM Zeocin 0,5 mg/ml Higromicina 0,5 mg/ml pH 7,2 apH 7,4 Tres días después de eso, se determinó la cantidad de producción de anticuerpo en el sobrenadante de cultivo
mediante el método de ELISA. Se seleccionó una línea celular que producía anticuerpo quimérico frente a ILT7 con un alto nivel de expresión y células suficientemente aumentadas. Además, se realizó una única clonación de las líneas celulares seleccionadas mediante el método de clasificador de células método para obtener las siguientes líneas celulares.
#11 línea celular que produce anticuerpo quimérico frente a ILT7: línea celular #11-5 y línea celular #11-16 línea celular #17 línea celular que produce anticuerpo quimérico frente a ILT7 #17: línea celular #17-24
Se cultivaron respectivamente las líneas celulares mencionadas anteriormente (línea celular #11-5, línea celular #1116 y línea celular #17-24) en medio de cultivo RPMI con FBS al 5% añadido con la siguiente composición. La temperatura de incubación y el tiempo de incubación se fijaron a 37ºC y 96 horas, respectivamente.
Medio de cultivo RPMI con FBS al 5% añadido: Medio de cultivo RPMI1640 (número de catálogo: R8758S, fabricado por Sigma)
10 FBS al 5% HEPES 0,01 M Piruvato de sodio 1 mM
L-Glutamina 2 mM Penicilina 100 U/ml
20 Estreptomicina 100 g/ml 2-Mercaptoetanol 55 M pH 7,2 apH 7,4
Se recogió el sobrenadante de cultivo y entonces se eliminaron los fragmentos celulares mediante centrifugación para dar una disolución de anticuerpo en bruto.
E. Purificación de anticuerpos
Se purificó cada una de las disoluciones de anticuerpos en bruto obtenidas tal como se describe en los puntos D-1 y D-2 mediante columna de afinidad de proteína A (rProtein A Sepharose FF, número de catálogo: 17-1279-01, fabricada por Amershram Pharmacia). Las condiciones de purificación son tal como sigue. Se llevó a cabo una purificación por afinidad usando tampón PBS (-) con la siguiente composición como tampón de adsorción y tampón 35 citrato de sodio 0,1 M (pH 3) como tampón de elución según el manual de instrucciones adjunto. Se añadió Tris-HCl 1 M (pH 8,0) a las fracciones eluídas para ajustar el pH a alrededor de 7,2. Se midieron las DO a de 450 a 620 nm y entonces se seleccionaron los pocillos que muestran reacción positiva. Con referencia a la concentración de anticuerpos purificados, se determinó la absorbancia a 280 nm y se calculó basándose en 1,38 DO/mg/ml. Las relaciones entre los anticuerpos quiméricos frente a ILT7 obtenidos, los hibridomas a partir de los que se derivó el
40 gen de la región variable y las células huésped se resumen en la tabla 7.
Tampón PBS (-):
Dihidrogenofosfato de monopotasio 0,2 g/l
Cloruro de potasio 0,2 g/l Cloruro de sodio 8 g/l
50 Monohidrogenofosfato de disodio 1,15 g/l Tabla 7 Anticuerpos quiméricos producidos
Nombres de los anticuerpos quiméricos producidos
Hibridomas usados Forma de transformación Células en las que se introducen
anticuerpo quimérico frente a ILT7 #11
#11 De manera transitoria 293T
anticuerpo quimérico frente a ILT7 #17
#17
anticuerpo quimérico frente a ILT7 #11-5
#11 Homeostasis YB 2/0
anticuerpo quimérico frente a ILT7 #11-16
#11
anticuerpo quimérico frente a ILT7 #17-24
#17
Se muestran a continuación, respectivamente, secuencias de bases de ADNc y secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos quiméricos producidos. En cada secuencia de aminoácidos, la
secuencia de aminoácidos desde el extremo N-terminal hasta -1 es una secuencia señal y la secuencia de aminoácidos desde 1 hasta el extremo C-terminal es una secuencia de aminoácidos de una proteína madura. Es decir, las cadenas pesada y ligera, que constituyen estos anticuerpos quiméricos, consisten en la secuencia de aminoácidos desde 1 hasta el extremo C-terminal de cada una de las siguientes secuencias de aminoácidos.
Cadena pesada
Cadena ligera
#11
SEQ ID NO: 50 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 52 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 51 (secuencia de aminoácidos)
SEQ ID NO: 53 (secuencia de aminoácidos)
#17
SEQ ID NO: 54 (secuencia de bases) SEQ ID NO: 56 (secuencia de bases)
SEQ ID NO: 55 (secuencia de aminoácidos)
SEQ ID NO: 57 (secuencia de aminoácidos)
Aplicabilidad industrial
La presente invención proporcionó el inmunógeno útil en la producción del anticuerpo que reconoce específicamente ILT7 humano y el método para producir el anticuerpo anti-ILT7 usando el inmunógeno. El anticuerpo que reconoce específicamente ILT7 humano de la presente invención reconoce específicamente ILT7 con la presencia de la familia de ILT. Por tanto, el anticuerpo de la presente invención puede usarse para la detección y el aislamiento de ILT7 humano. Por ejemplo, la localización de ILT7 también puede analizarse usando el anticuerpo de la presente invención. Se considera que ILT7 es una molécula estrechamente relacionada con la diferenciación y función de las IPC o células dendríticas. Por tanto, el anticuerpo, que reconoce ILT7 con alta especificidad, es útil para el análisis de función de las IPC o células dendríticas. Se conocen células cancerígenas similares a IPC (que tienen la característica en la que se expresa BDCA-2) (Chaper de L et al. Eur. J. Immunol. 34; 418-426, 2004, Maeda T et al., Int. J. Hematol. 81; 148-154, 2005). La confirmación de la expresión de ILT7 en estas células puede permitir el diagnóstico de cáncer y un agente terapéutico.
En el caso de enfermedades autoinmunitarias, por ejemplo, se señala la profunda relación entre IFNα producido por las IPC y el desarrollo de psoriasis, que es una enfermedad de la piel (Nestle FO et al., J. Exp. Med. 202, 135-143, 2005). Por tanto, puede examinarse la gravedad de psoriasis mediante la identificación de IPC en el tejido cutáneo de pacientes con psoriasis, es decir en muestras de biopsia usando el anticuerpo anti-ILT7.
Se sabe que el desarrollo de SIDA en pacientes infectados por el VIH está correlacionado con el número de IPC. Concretamente, se ha observado gran cantidad de las IPC en pacientes que no muestran síntomas y se ha observado la reducción en las IPC en la aparición (Soumells V. et al., Blood 98; 906-912, 2001). Por tanto, es eficaz en la predicción del pronóstico de infección viral, tal como por VIH.
Por ejemplo, ILT7 es una molécula que se expresa específicamente en IPC humanas. Por tanto, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención puede usarse para detectar, identificar o aislar las IPC. Las IPC son células que producen la mayor parte del interferón tipo 1. Por tanto, la detección, identificación o el aislamiento es un importante objetivo en el diagnóstico y el estudio de enfermedades que implican interferón tipo 1. Como tales enfermedades, pueden ilustrarse diversas enfermedades autoinmunitarias e infecciones en las que está implicado el interferón en la formación del estado patológico.
Adicionalmente, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención tiene el efecto inhibidor sobre la actividad de las IPC. Por tanto, la actividad de las IPC puede inhibirse usando el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención. Además, las enfermedades que implican interferón tipo 1 pueden tratarse mediante la inhibición de la actividad de las IPC. Específicamente, el anticuerpo anti-ILT7 de la presente invención es útil para diversas enfermedades autoinmunitarias e infecciones en las que está implicado el interferón en la formación del estado patológico. Particularmente, puesto que el anticuerpo anti-ILT7 tiene una alta especificidad, puede eliminar las IPC de manera eficaz.
Lista de secuencias
<110> GINKGO BIOMEDICAL RESEARCH INSTITUTE CO., LTD.
<120> Anticuerpo anti-ILT7
<130> G2-A0501P
<150> Documento JP 2005-366465
<151>
<160> 76
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 1577
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (24)..(1520)
10 <220>
<221> sig_peptide
<222> (24)..(71)
<220> 15 <221> mat_peptide
<222> (72)..(1520)
<400> 1
<210> 2
<211> 499
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 21 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 3 ctccaacccc tacctgctgt c 21
<210> 4 15 <211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 4 ttcccaaggc tccaccactc t 21
25 <210> 5
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
30 <220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 5 cctcaatcca gcacaaaaga agt 23
<210> 6
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 6 cggatgagat tctccactgt gtaa 24
<210> 7
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 7 ccacccatgg caaattcc 18
<210> 8
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 8 tgggatttcc attgatgaca ag 22
<210> 9
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 9 cagggccagg aggaggagat g 21
<210> 10
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 10 tcagcagaca cttccccaac t 21
<210> 11
<211> 105
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 11
<210> 12
<211> 31
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 12 ctagactagt tcagatctgt tcccaaggct c 31
<210> 13 10 <211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 15 <223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 13 ccgctcgaga tgaccctcat tctcacaagc 30
20 <210> 14
<211> 55
<212> ADN
<213> Artificial
25 <220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 14 ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatcgat ctgttcccaa ggctc 55
<210> 15
<211> 313
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS
<222> (7)..(267)
40 <400> 15
<210> 16
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 21 10 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 17 cccaagatga ttccagcagt g 21
<210> 18 20 <211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 25 <223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 18 ggaagaacca gaagccaaag a 21
30 <210> 19
<211> 30
<212> ADN
<213> Artificial
35 <220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 19 ccgctcgaga tgattccagc agtggtcttg 30
<210> 20
<211> 61
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<210> 21
<211> 23
<212> PRT 10 <213> Artificial
<220>
<223> una secuencia peptídica sintetizada de manera artificial
15 <400> 21
<210> 22
<211> 31 20 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 22 ccgctcgaga tgacccccat cctcacggtc c 31
<210> 23 30 <211> 55
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 35 <223> una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 23 ctagactagt tcacttatcg tcgtcatcct tgtaatccct cccggctgca tcttg 55
40 <210> 24
<211> 1425
<212> ADN
<213> Homo sapiens
45 <220>
<221> CDS
<222> (1)..(1425)
<400> 24
<210> 25
<211> 474
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 1953 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1953)
<400> 26
<210> 27
<211> 650
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 1347 5 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(1347)
<400> 28
<210> 29
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 24 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 30 ccatagttcc attttacagt tacc 24
<210> 31 15 <211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220> 20 <223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 31 gggaccaagg gatagacaga 20
25 <210> 32
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
30 <220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 32 tccagagttc caggtcaagg tcac 24
<210> 33
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 33 gccagtggat agaccgatgg 20
<210> 34
<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<220>
<221> modified_base
<222> (24)..(25)
<223> I
<220>
<221> modified_base
<222> (29)..(30)
<223> I
<220>
<221> modified_base
<222> (34)..(35)
<223> I
<400> 34 ggccacgcgt cgactagtac gggnngggnn gggnng 36
<210> 35
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 35 ggccacgcgt cgactagtac 20
<210> 36
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 36 ttcactgcca tcaatcttcc actt 24
<210> 37
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de cebador sintetizada de manera artificial
<400> 37 gatggataca gttggtgcag c 21
<210> 38
<211> 408
<212> ADN
<213> Mus musculus
<220> 5 <221> CDS
<222> (1)..(408)
<220>
<221> si_peptide 10 <222> (1)..(54)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(408)
<400> 38
<210> 39 20 <211> 136
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 39 <210> 40
<211> 381 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
20 <400> 40
<210> 41
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 41
10
<210> 42
<211> 414
<212> ADN
<213> Mus musculus
15
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(414)
20
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(57)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(414)
<400> 42
10
<210> 43
<211> 138
<212> PRT
<213> Mus musculus
15
<400> 43
<210> 44
<211> 381 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
20 <400> 44
<210> 45
<211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 45
10 15
<210> 46 <211> 408 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(408)
20
<220> <221> sig_peptide <222> (1)..(54)
25
<220> <221> mat_peptide <222> (55)..(408)
<400> 46
<210> 47
<211> 136
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 47
<210> 48
<211> 381 5 <212> ADN
<213> Mus musculus
<220>
<221> CDS 10 <222> (1)..(381)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(381)
20 <400> 48
<210> 49 25 <211> 127
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 49 <210> 50
<211> 1401 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de nucleótidos sintetizada de manera artificial
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1398)
15 <220>
<221> si_peptide
<222> (1)..(54)
<220> 20 <221> mat_peptide
<222> (55)..(1398)
<400> 50
<210> 51
<211> 466 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 51
<210> 52
<211> 705 5 <212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de nucleótidos sintetizada de manera artificial
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
15 <220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220> 20 <221> mat_peptide
<222> (61)..(702)
<400> 52 <210> 53
<211> 234 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 53
<210> 54
<211> 1407
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de nucleótidos sintetizada de manera artificial
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1404)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(57)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (55)..(1404)
<400> 54
<210> 55
<211> 468 5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Constructo sintético
<400> 55
<210> 56
<211> 705
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia de nucleótidos sintetizada de manera artificial
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(702)
<220>
<221> sig_peptide
<222> (1)..(60)
<220>
<221> mat_peptide
<222> (61)..(702)
<400> 56 <220>
5
<210> 57
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial
10
<223> Constructo sintético
<210> 58
<211> 6
<212> PRT 10 <213> Mus musculus <220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> CDR
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
<400> 59
<210> 60
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 60
<210> 61
<211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 63
15
<210> 64
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> CDR
25
<400> 64
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<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220> 35 <221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
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<211> 10
<212> PRT 45 <213> Mus musculus
<220>
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<222> (1)..(10)
<223> CDR
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55 <210> 67
<211> 11
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(11)
<223> CDR
<400> 67
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 68
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 69
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<211> 6
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(6)
<223> CDR
<400> 70
<210> 71
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(17)
<223> CDR
<400> 71 <210> 72
<211> 9
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
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<211> 11
<212> PRT
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<220>
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<222> (1)..(11)
<223> CDR
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR
<400> 74
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<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR
<400> 75
<210> 76
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Una secuencia peptídica sintetizada de manera artificial
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(3)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se produce de manera natural
<400> 76

Claims (9)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Anticuerpo monoclonal que se une a ILT7 humano, no se une a ninguno de ILT1 humano, ILT2 humano e ILT3 humano, y suprime la producción de interferón-α (IFNα) desde células que expresan ILT7, o un fragmento que comprende su región de unión a antígeno.
  2. 2.
    Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que la célula que expresa ILT-7 es una célula productora de interferón (IPC).
  3. 3.
    Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 ó 2, en el que la célula es positiva para CD123 o positiva para BDCA-2.
  4. 4.
    Anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula es negativa para CD3, negativa para CD14, negativa para CD16, negativa para CD19, negativa para CD20 y negativa para CD56.
  5. 5.
    Anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el anticuerpo monoclonal se produce mediante un método que comprende las siguientes etapas de:
    (1)
    administrar a un animal no humano una célula que conserva los siguientes puntos (a) y (b) de manera expresable:
    (a)
    un polinucleótido exógeno que codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende un dominio extracelular de ILT7 humano; y
    (b)
    un polinucleótido exógeno que codifica para la cadena γ del receptor de Fc (FcRγ);
    (2)
    producir y seleccionar una célula productora de anticuerpos que produce un anticuerpo que se une a ILT7 humano desde la célula productora de anticuerpos del animal no humano; y
    (3)
    cultivar la célula así seleccionada y recuperar un anticuerpo monoclonal del cultivo.
  6. 6.
    Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 5, en el que la célula es una célula animal; y opcionalmente en el que la célula es una célula derivada de ser humano; y además opcionalmente en la que la célula derivada de ser humano es una célula 293T.
  7. 7.
    Anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el fragmento que comprende su región de unión a antígeno es Fab, F(ab’)2, Fv de cadena sencilla o diacuerpo.
  8. 8.
    Método para detectar una célula productora de interferón, que comprende las etapas de:
    poner en contacto el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 con una célula de prueba; y
    detectar el anticuerpo monoclonal o el fragmento que comprende su región de unión a antígeno que se une a la célula.
  9. 9. Agente de supresión de interferón a (IFNα) que comprende el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 como componente activo.
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