BRPI0620178B1 - Composições compreendendo moléculas de ctla4-ig - Google Patents

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Eugene J. Schaefer
Ronald Bates
Elizabeth A. Bramhall
David M. Didio
Robert Donaldson
Alan R. Flesher
Helen G. Haggerty
David H. Kirkley
John M. Tabor
Lee K. Tay
Pallaiah Thammana
Ajoy Velayudhan
David E. Smolin
Reb J. Russell
Thomas Vanden Boom
Joyce Whitehead
Dean Brownell
Jeffrey Schrimsher
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Bristol-Myers Squibb Company
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Abstract

A presente invenção proporciona células de mamífero capazes de produzir CTLA4-Ig recombinante e variantes da mesma. A invenção também proporciona composições compreendendo CTLA4-lg e formulações da mesma. A invenção ainda proporciona métodos para produção em massa de CTLA4-lg a partir de células de mamífero capazes de produzir essa proteína recombinante e purificação da CTLA4-lg.

Description

[0001] O presente pedido de patente reivindica prioridade do N° de Série U.S. 60/752.267, depositado em 20 de Dezembro de 2005, N° de Série U.S. 60/849.543, depositado em 5 de Outubro de 2006 e N° de Série U.S. 60/752.150, depositado em 20 de Dezembro de 2005, todos os quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades. O presente pedido também incorpora, por referência e em sua totalidade, o pedido de patente intitulado "Stable Protein Formulations" com o Número de Documento do Procurador 10739 PCT depositado em 19 de Dezembro de 2006.
[0002] Todas as patentes, pedidos de patente e publicações mencionados aqui, são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
[0003] A presente descrição contém material que está sujeito à proteção de copyright. O proprietário de copyright não tem objeção à reprodução por fac-símile por qualquer um do documento de patente ou descrição de patente uma vez que ele aparece no arquivo ou registro de patentes do U.S. Patent and Trademark Office mas, de outro modo, se reserva a qualquer e todos os direitos de copyright.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[0004] Antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4), um membro da superfamília de imunoglobulina, é uma molécula expressa por células T ativadas. O CTLA4 é similar à molécula coestimulatória de células T CD28 e ambas as moléculas se ligam B7-1 (CD80) e B7-2 (CD86) sobre células que apresentam antígeno (APCs). Contudo, o CTLA4 transmite um sinal inibitório à células T, enquanto que CD28 transmite um sinal estimulatório.
[0005] Moléculas de CTLA4-Ig são proteínas de fusão do domínio de ligação a ligante do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina (Ig). Essa molécula solúvel exerce seus efeitos fisiológicos através de ligação a antígenos B7 (CD80 e CD86) sobre a superfície de várias células apresentando antígeno (APC), assim, bloqueando a interação funcional de B7-1 e B7-2 com CD28 sobre a superfície de células T. Esse bloqueio resulta na supressão de ativação e, consequentemente, na supressão da resposta imune. Moléculas de CTLA4-Ig podem, portanto, proporcionar um método para inibição de rejeições a transplante de órgão sólido e/ou tecidual, bem como um uso terapêutico para doenças ou distúrbios que se relacionam à respostas imunes desreguladas em geral, incluindo autoimunidade. Por exemplo, moléculas de CTLA4- Ig podem suprimir a produção de anticorpos anti-dsDNA e diminuir a nefrite em camundongos propensos a lúpus; pode reduzir a proteinúria e prolongar a sobrevivência em camundongos com nefrite avançada e podem melhorar os resultados clínicos para psoríase e artrite reuma- toide.
[0006] Para melhorar a utilidade terapêutica de moléculas de CTLA4-Ig, é importante determinar alterações moleculares que podem ser feitas para intensificar a eficácia das moléculas como um inibidor de estimulação de células T, por exemplo, através de aumento da avidez e potência da molécula por antígenos B7. Um aumento na avidez e potência de moléculas de CTLA4-Ig pode permitir a administração de uma quantidade diminuída de moléculas de CTLA4-Ig a um paciente para obter um efeito terapêutico desejado (isto é, administração de uma menor dose). Um aumento na avidez e potência de moléculas de CTLA4-Ig também pode diminuir o número de doses ou a frequência de doses que são administradas a um paciente para obter um efeito terapêutico desejado.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0007] A presente invenção refere-se à composições e métodos para a produção de composições de CTLA4-Ig. A invenção é dirigida à moléculas de CTLA4-Ig, composições aperfeiçoadas compreendendo moléculas de CTLA4-Ig e métodos aperfeiçoados para a produção (incluindo produção em massa) de moléculas de CTLA4-Ig e outras proteínas recombinantes.
[0008] A invenção inclui quaisquer permutações e/ou combinações de qualquer um dos elementos e características descritos aqui, quer descritos unicamente ou em determinadas combinações ou permutações.
[0009] Células: A invenção proporciona um população de células de Ovário de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-Ig, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig. A invenção também proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-Ig, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula. A invenção proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês clonais capaz de produzir CTLA4-Ig, em que um cassete de expressão de CTLA4-Ig é estável durante cerca de 105 passagens. Em uma modalidade, a CTLA4-Ig é codificada por um cassete de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico descrita por Koduri R., e outros (Gene, 2001, 280: 87-95) e Patentes U.S. N°s 6.800.457 e 6.521.419, os quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Em outra modalidade, a CTLA4-Ig é codificada por um cassete de expressão integrado em um genoma celular da população de células em um locus específico descrito por Koduri R., e outros (Gene, 2001,280: 87-95) nas Patentes U.S. N°s 6.800.457 e 6.521.419, os quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades. Em uma modalidade, a população compreende uma sub- população de células compreendendo 33 ou mais cópias do cassete de expressão de CTLA4-Ig, em que as peptídeo de objetivação ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula da subpopulação.
[00010] A invenção proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês clonal capaz de produzir CTLA4-Ig em que pelo menos 75% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 75% da população. A invenção proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês clonal capaz de produzir CTLA4-Ig em que pelo menos 85% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 85% da população. A invenção proporciona uma população de células de Ovário de Hamster Chinês clonal capaz de produzir CTLA4-Ig em que pelo menos 95% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 95% da população. Em uma modalidade, a população de célula é capaz de produzir mais de 0,5 ou mais gramas de proteína CTLA4-Ig por litro de cultura líquida e em que a CTLA4-Ig exibe características de carboidrato aceitáveis, onde a proporção molar de ácido siálico para CTLA4- Ig é de cerca de 6 a cerca de 14 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, a população de células foi adaptada a um meio isento de soro quimicamente definido. Em outra modalidade, CTLA4-Ig produzida a partir da cultura da população de células tem uma coeficiente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1. Em outra modalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, é capaz de produzir polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a lisina no resíduo número 383, (d) cerca de 96% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382; e, opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25.
[00011] A invenção proporciona uma célula de prole da célula clonal, em que a célula de prole produz CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura da célula precursora clonal durante pelo menos 5 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 10 gerações, durante pelo menos 20 gerações, durante pelo menos 40 gerações, durante pelo menos 50 gerações, durante pelo menos 75 gerações ou durante pelo menos 100 gerações. A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida a partir da célula clonal. Em uma modalidade, a linhagem de célula é clonal. A invenção proporciona uma linhagem de célula capaz de produzir: (a) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de ami- noácido 382; figuras 1A e 1B); (b) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383; figuras 1A e 1B); (c) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (alanina na posição de ami- noácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382; figuras 1A e 1B); (d) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 6 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoácido 383; figuras 1A e 1B); (e) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido 382; figuras 1A e 1B); ou (f) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (me- tionina na posição de aminoácido 25 e lisina na posição de aminoácido 383; figuras 1A e 1B). Em outra modalidade, a linhagem de célula é capaz de produzir proteínas de fusão de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a lisina no resíduo número 383, (d) cerca de 96% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25.
[00012] Em uma modalidade, as proteínas de fusão de CTLA4-Ig, as quais são produzidas a partir de cultura a linhagem de célula, têm um coeficiente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1. A invenção proporciona uma população de célula derivada da linhagem de célula clonal. Em uma modalidade, a população de célula consiste em pelo menos uma alteração genética adicional quando comparado com a linhagem de célula clonal original e em que a população de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a população de célula consiste em pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 10, pelo menos 15 ou pelo menos 20 alterações genéticas adicionais quando comparado com a célula precursora e em que a população de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação não conservativa no genoma celular ou no cassete de expressão re- combinante que codifica CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a alteração genética compreende pelo menos um ácido nucleico recombinante adicional dentro da célula. Em uma outra modalidade, a alteração compreende uma mutação do genoma celular. Em outra modalidade, a alteração compreende a adição de um ácido nucleico ao genoma celular ou como um ácido transnucleico, o qual codifica um polipeptídeo antiapoptótico. Em outra modalidade, o polipeptídeo antiapoptótico se refere à glicosilação. Em outra modalidade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação do genoma celular ou do cassete de expressão recombinante que codifica CTLA4-Ig.
[00013] Composições: A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 12 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 13 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 14 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siáli- co para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 17. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 16. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que mais de 95% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de 98% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, mais de 99% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, mais de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig e cerca de 0,5% a cerca de 5% das moléculas são tetrâmeros de CTLA4-Ig ou espécies de elevado peso molecular. Em outra modalidade, cerca de 98,6% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig e cerca de 1,2% das moléculas são tetrâmeros de CTLA4-Ig ou espécies de elevado peso molecular e cerca de menos do que 0,7 % das moléculas são monômeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população consistindo em dímeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de monômero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de tetrâmero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de monômeros de moléculas de CTLA4-Ig substancialmente isenta de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem pelo menos 3 grupos ácido siálico. Em outra modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelo menos 8 grupos ácido siálico. A invenção proporciona uma população purificada de tetrâmeros de moléculas de CTLA4-Ig, a população sendo substancialmente isenta de dímero de CTLA4-Ig e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. A invenção proporciona uma população purificada de tetrâmeros de moléculas de CTLA4- Ig, a população sendo substancialmente isenta de monômero de CTLA4-Ig e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica compreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma sequência de aminoáci- do selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5-10 e em que cada membro do par de polipeptídeos é covalentemente ligado ao outro membro e em que os dois pares de polipeptídeos são não- covalentemente associados um ao outro. Em outra modalidade, cada molécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. Em uma outra modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezes maior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com um dímero de molécula de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com um dí- mero de molécula de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de foca- lização isoelétrica de CTLA4-Ig o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menos de ou igual a 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma compo- sição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de foca- lização isoelétrica de CTLA4-Ig o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menos de ou igual a 5,8 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, o pI aumenta após tratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétri- ca de CTLA4-Ig o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menos de ou igual a 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6 ou 4,5 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em outra modalidade, pelo menos 40% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelé- trico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em outra modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de me-nos do que ou igual a cerca de 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em outra modalidade, pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 2,5 conforme determinado através de focalização isoelétrica. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7 ± 0,2. A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, a composição compreendendo uma molécula de CTLA4-Ig com um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição de uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig à eletroforese em gel de focalização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de moléculas de CTLA4-Ig com um pI em particular e (b) isolamento da população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2 de modo a preparar a composição.
[00014] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc por mol de díme- ro de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dí- mero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12.
[00015] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4- Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de díme- ro de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de Glc- NAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de Glc- NAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f) uma proporção molar média de ácido siá- lico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição exibe um pico por cromatograma de NGNA de cerca de 9,589+/-0,3 e um pico por cromatograma de NANA de cerca de 10,543+/-0,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA-Ig exibem um perfil de carboidrato conforme mostrado na figura 68. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - V (por exemplo, I-IV), em que o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio II compreende picos os quais representam oligossacarídeos monossialilados, o Domínio III compreende picos os quais representam oligossacarídeos dissialilados e o Domínio IV compreende picos os quais representam oligossacarí- deos trissialilados. O Domínio V compreende picos que representam oligossacarídeo tetrassialilados. Em uma modalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-ligados entre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio II é de cerca de 22 a cerca de 28 minutos. A invenção proporciona uma composição compreendendo dímeros de moléculas de CTLA4-Ig, em que pelo menos 0,5 % dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados. Em uma modalidade, pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de espec- trometria de massa conforme mostrado nas figuras 8 e 10. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de eletroforese capilar conforme mostrado nas figuras 20 e 21. A invenção proporciona uma composição de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição de CTLA4-Ig obtida através de qualquer um dos métodos descritos aqui. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas são glico- siladas em um resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2 ou um resíduo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2.
[00016] A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) menos de 3,0 % de tetrâmero (por exemplo, 2,5% de espécies de elevado peso molecular ou tetrâmero, 2,0% de espécies de elevado peso molecular ou tetrâmero; (j) menos de 0,5% de monômero; (k) polipeptídeos de CTLA4-Ig da população tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 2-8; (l) em que moléculas de CTLA4-Ig dentro da população são capazes de ligação a CD80 e CD86.
[00017] Composições: A invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz das moléculas de CTLA4-Ig da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona uma composição compreendendo excipientes conforme descrito no Pedido U.S. No. 60/752,150, depositado em 20 de Dezembro de 2005. Em uma modalidade, a composição inclui CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a composição ainda compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a composição ainda compreende maltose, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril. Em outra modalidade, a composição compreende sacarose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, fosfato de sódio anídri- co dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril.
[00018] Formulações e Kits: A invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos 95% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 5% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 98% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 2% de espécies de elevado peso molecular ou tetrâmero de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a mistura compreende pelo menos 99% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 1% de espécies de elevado peso molecular ou tetrâmero de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a mistura compreende pelo menos 8,0 mols de ácido siálico por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a mistura compreende cerca de 15,7 a cerca de 31 mols de GlcNAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a mistura compreende cerca de 1,6 a cerca de 3,2 mols de GalNAc por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a mistura compreende cerca de 9,3 a cerca de 15,5 mols de galactose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 3,6 a cerca de 7,9 mols de fucose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 9,7 mols de manose por mol de dímero ou molécula de CTLA4-Ig. A invenção também proporciona um kit farmacêutico compreendendo: (a) um recipiente contendo uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig da invenção; e (b) instruções para reconstituição da mistura liofilizada de CTLA4-Ig em solução para injeção.
[00019] Métodos ilustrativos de Tratamento: A invenção proporciona um método para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de inflamação em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de artrite reumatoide compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de psoríase em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4- Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de uma alergia em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de doença enxerto vs hospedeiro em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejeição de um órgão transplantado em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo, o método compre- endendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de Doença de Crohn em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de diabetes do tipo I em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de doença inflamatória do intestino em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ooforite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de glomerulonefrite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de encefalomielite alérgica em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de miastenia gravis em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção.
[00020] A invenção proporciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de um distúrbio imune. A invenção proporciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero ou molécula de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um agente antiartrite reumatoide em uma embalagem junto com instruções para seu uso no tratamento de artrite reumatoide.
[00021] Terapias combinadas ilustrativas: A invenção proporciona um método para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção em combinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção em combinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de CTLA4-Ig da invenção em combinação com metotrexato.
[00022] Métodos para produção de CTLA4-Ig: A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secre- tam uma proteína recombinante, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida, em que a concentração de proteína recombinante é de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida. A cultura líquida pode ser de pelo menos 1.000 L, pelo menos 5.000 L, pelo menos 10.000 L, pelo menos 15.000 L, pelo menos 20.000 L, pelo menos 25.000 L, pelo menos 30.000 L, pelo menos 40.000 L. Em uma modalidade, a expansão da etapa (a) compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL, em que cada estágio de semente começa em cerca de 2 x 105 por mL e vai até 1-2 mil células por mL; (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir, a partir da cultura, pelo menos cerca de 0,5 g / L. Em uma modalidade, a proteína é uma glicoproteína. Em uma modalidade, a proteína é uma proteína de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, as células de mamífero são a prole de uma linhagem de célula clonal CHO capaz de produzir proteínas de fusão de CTLA4-Ig, em que as células de CHO têm, estavelmente integradas em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 40%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 60%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou 95%.
[00023] Em uma outra modalidade, as pelo menos quatro passagens compreendem: (i) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 50 mL até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 mil células por mL ser atingida, (ii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 10 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida; (iii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 100 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida; e (iv) crescimento das células em um volume de cultura de 200 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida. Em uma modalidade, galactose é adicionada ao meio isento de soro quimicamente definido. Em uma modalidade, a manutenção de compreende (i) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C para 34±2°C; e (ii) diminuição da temperatura da cultura de 34±2°C para 32±2°C. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 5 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 6 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 7 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 8 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 9 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 10 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 11 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 12 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 13 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 14 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 15 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 16 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 17 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 18 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante até 18 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C até a densidade celular da cultura ser de cerca de 30 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL de cultura líquida.
[00024] A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína recombinante seja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre apenas quando a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de proteína ou dímero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína re- combinante de uma cultura originária para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre apenas quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recom- binante de uma cultura originária para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína recombinante seja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 30% ou cerca de 38%. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína re- combinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre apenas quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método com-preendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a bioburden é menos de 1 unidade de formação de colônia por mL de cultura líquida. A cultura líquida da invenção pode ser de um volume de pelo menos 5.000 L, pelo menos 10.000 L, pelo menos 15.000 L, pelo menos 20.000 L, pelo menos 25.000 L, pelo menos 30.000 L, pelo menos 40.000 L, pelo menos 50.000 L, pelo menos 60.000 L.
[00025] A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida, de modo que a concentração de proteína recombinante seja de pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida, em que o isolamento ocorre apenas se pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL, (iii) a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 38% ou (iv) a quantidade de CTLA4-Ig na cultura é mais de 0,5 g / L. Em uma modalidade, o isolamento compreende: (i) obtenção de um sobrenadante de cultura de célula; (ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca de ânions para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de interação hi- drofóbica, de modo a obter um produto de proteína enriquecido; (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (v) sujeição do produto de proteína enriquecido eluído de (iv) à cromatografia de troca de ânions. Em outra modalidade, o produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iii) é caracterizado pelo fato de que um percentual de qualquer contaminante de elevado peso molecular é menos de 25% em peso. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCl a cerca de 360 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando um tampão de elui- ção compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 325 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em outra modalidade, a cromato- grafia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo Glicina a cerca de 100 mM e tendo um pH de cerca de 3,5. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl de cerca de 120 mM a NaCl a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em outra modalidade, a resina tem um grupo funcional amina quaternária. Em outra modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcó- xi, butila ou isoamila. Em outra modalidade, o grupo funcional é um grupo funcional fenila. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando uma coluna contendo Proteína A.
[00026] A invenção proporciona um método para preparo de CTLA4-Ig, o método compreendendo purificação de CTLA4-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que a CTLA4-Ig purificada (a) tem cerca de 38 ng de MCP-1 por mg de dímero de CTLA4-Ig e (b) compreende menos do que 2,5% de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig (por exemplo, tetrâmero) em peso. A invenção proporciona um método para produção de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de prole ou células de CHO que são capazes de produzir CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a concen-tração de CTLA4-Ig é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a cromatografia é sobre uma coluna com resina de interação hidrofóbica com pelo menos um grupo funcional fenila, em que o isolamento compreende uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica realizada usando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0.
[00027] Moléculas de CTLA4-Ig incluem moléculas de beta polipep- tídeo. CTLA4A29YL104E-Ig é uma molécula de beta polipeptídeo. A presente invenção se refere a métodos para produção de (incluindo produção em massa) composições de beta polipeptídeo ou composições de molécula de beta polipeptídeo e composições aperfeiçoadas. A invenção é dirigida à moléculas de beta polipeptídeo, composições aperfeiçoadas compreendendo moléculas de beta polipeptídeo e métodos aperfeiçoados para produção de (incluindo produção em massa) moléculas de beta polipeptídeo e outras glicoproteínas recombinantes.
[00028] Métodos para produção de beta polipeptídeos e outras glicoproteínas: A invenção proporciona um método para produção de uma glicoproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma glicoproteína re- combinante, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante é pelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida, em que a expansão de compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL, em que cada estágio de semente começa em cerca de 2 x 105 por mL e vai até cerca de 1-2 milhão células por mL, em que a cultura compreende: (1) cultura das células em um meio de inóculo isento de soro quimicamente definido durante de cerca de 15 dias a cerca de 25 dias; então, (2) cultura das células em um meio basal isento de soro quimicamente definido até uma densidade celular de cerca de pelo menos 4 milhão células por mL ser atingida; e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir a proteína recombinante da cultura de pelo menos cerca de 0,5 g/L; e (b) isolamento da proteína recombinan- te da cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L.
[00029] A invenção proporciona um método para produção de uma glicoproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma glicoproteína recombinante, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante é pelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida, em que a expansão de compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL, em que cada estágio de semente começa em cerca de 2 x 105 por mL e vai até cerca de 1-2 milhão células por mL; e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir a proteína recombinante da cultura de pelo menos cerca de 0,5 g/L, em que a manutenção de compreende: (1) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C para 34±2°C; e (2) adição de um composto polianiônico à cultura; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L.
[00030] A invenção proporciona um método para produção de uma glicoproteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma glicoproteína recombinante, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante é pelo menos cerca de 0,5 g/L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura líquida de pelo menos cerca de 10.000 L, em que o isolamento compreende: (i) obtenção de uma fração solúvel da cultura da etapa (a); (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia de interação hidrofóbica para obter um produto de proteína enriquecido.
[00031] Em uma modalidade da invenção, a proteína compreende uma CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a proteína compreende um beta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptídeo. Em outra modalidade, a proteína compreende beta polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
[00032] Em uma modalidade da invenção, as pelo menos quatro passagens compreendem: (i) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 50 mL até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mL ser atingida; (ii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 10 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mL ser atingida; (iii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 100 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mL ser atingida; e (iv) crescimento das células em um volume de cultura de 200 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão células por mL ser atingida.
[00033] Em uma modalidade da invenção, o isolamento compreende: (i) obtenção de uma fração solúvel da cultura da etapa (a); (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia de interação hidrofóbica para obter um produto de proteína enriquecido.
[00034] Em uma modalidade, o produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iv) é caracterizado pelo fato de que um percentual de qualquer multímero de elevado peso molecular é menos de 25% em peso. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando um tampão de eluição com-preendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 a cerca de 1,2 M e tendo um pH de cerca de 7. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 150 mM e tendo um pH de cerca de 7,5. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo Glicina a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 3. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em outra modalidade, a resina tem um grupo funcional amina quaternária. Em outra modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em outra modalidade, o grupo funcional é um grupo funcional fenila. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando uma coluna contendo Proteína A.
[00035] Em outra modalidade, a expansão de compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL, em que cada estágio de semente começa em cerca de 2 x 105 por mL e vai até cerca de 1-2 milhão células por mL; e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir a proteína recombinan- te da cultura de pelo menos cerca de 0,5 g/L. Em outra modalidade, a cultura compreende: (i) cultura das células em um meio de inóculo isento de soro quimicamente definido durante de cerca de 15 dias a cerca de 25 dias; então, (ii) cultura das células em um meio basal isen-to de soro quimicamente definido até uma densidade celular de cerca de pelo menos 4 milhão células por mL ser atingida.
[00036] Em outra modalidade, a manutenção de compreende (i) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C para 34±2°C; e (ii) adição de um composto polianiônico à cultura. Em uma modalidade, o composto polianiônico é sulfato de dextrano e em que o sulfato de dextrana é adicionado à cultura em uma concentração final de cerca de 50 mg/ml. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 5 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 6 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 7 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 8 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 9 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 10 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 11 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 12 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 13 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 14 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 15 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 16 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 17 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 18 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 19 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 20 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 21 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 22 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 23 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 24 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 25 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 26 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 27 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante pelo menos 28 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C durante até 28 dias. Em outra modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 34±2°C até a densidade celular da cultura ser de cerca de 30 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL de cultura líquida.
[00037] Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 40%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 60%. Em outra modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou 95%.
[00038] Em uma modalidade, galactose é adicionada ao meio isento de soro quimicamente definido. Em outra modalidade, isolamento ocorre quando a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6 mols de ácido siálico por mol de proteína. Em outra modalidade, isolamento ocorre quando a cultura líquida contém de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 mols de ácido siálico por mol de proteína. Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL. Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 37%. Em outra moda-lidade, o isolamento ocorre quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 4,8 EU por mL de cultura líquida. Em outra modalidade, o isolamento ocorre quando a bioburden é menos de cerca de 1 unidade de formação de colônia por mL (cfu/ml) de cultura líquida. Em outra modalidade, o isolamento ocorre se pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6 mols de ácido siálico por mol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL, (iii) a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 37% ou (iv) a quantidade de glicoproteína na cultura é de cerca de 0,46 g/L a cerca de 0,71 g/L.
[00039] Em uma modalidade, as células de mamífero são a prole de uma linhagem de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz qualquer combinação de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que as células de Ovário de Hamster Chinês têm, cada uma, estavelmente integradas em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um cassete de expressão compreendendo SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a cultura líquida compreende uma célula de ou uma célula de prole de uma célula de uma linhagem de célula de produção da invenção.
[00040] A invenção proporciona um beta polipeptídeo compreendendo SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 obtido através de um método proporcionado pela invenção. A invenção proporciona uma composição compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta poli- peptídeo, em que cada polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 obtido através de um método proporcionado pela invenção. A invenção proporciona um beta polipeptídeo obtido através de um método proporcionado pela invenção.
[00041] Células: A invenção proporciona uma célula clonal de Ovário de Hamster Chinês compreendendo um ácido nucleico que codifica um beta polipeptídeo ou uma molécula de beta polipeptídeo. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptí- deo. Em uma modalidade, o beta polipeptídeo compreende SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A invenção proporciona uma célula clonal de Ovário de Hamster Chinês compreendendo um ácido nucleico compreendendo um cassete de expressão que codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma modali- dade, o cassete de expressão compreende SEQ ID NO: 3. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep- tídeo, em que o beta polipeptídeo é expresso a partir de uma sequência de nucleotídeo derivada de um plasmídeo tendo No. de Acesso ATCC PTA-2104 depositado sob as condições do Tratado de Budapeste em 19 de Junho de 2000 com a American Type Cultura Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110.
[00042] A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptídeo, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou moléculas de beta poli- peptídeo, cada célula compreendendo 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo ou moléculas de beta poli- peptídeo, em que um cassete de expressão de beta polipeptídeo é estável durante cerca de 105 passagens. Em uma modalidade, o beta polipeptídeo é codificado por um cassete de expressão integrado em um genoma de célula.
[00043] A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos 75% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 75% da população. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos 85% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 85% da população. A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês que produz um beta polipeptídeo, em que pelo menos 95% da população de células tem 30 ou mais cópias de um cassete de expressão de beta polipeptídeo por célula, em que as 30 ou mais cópias são integradas em um único sítio no genoma de cada célula dos 95% da população. Em uma modalidade, o cassete de expressão é derivado de um plasmídeo depositado como No. de Acesso ATCC PTA-2104. Em outra modalidade, o cassete de expressão compreende um ácido nuclei- co tendo a sequência de SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade, a população de célula produz pelo menos cerca de 0,5 grama do beta poli- peptídeo por litro de cultura líquida e em que o beta polipeptídeo tem uma proporção molar de ácido siálico para dímero de beta polipeptí- deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, a população de célula produz pelo menos 5, pelo menos 10 ou pelo menos 20 gramas do beta polipeptídeo por litro de cultura líquida. Em outra modalidade, o beta polipeptídeo tem uma proporção molar de ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep- tídeo de cerca de 5 a cerca de 10 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em outra modalidade, a população de célula foi adaptada a um meio isento de soro quimicamente definido. Em outra modalidade, um beta polipeptídeo produzido a partir da cultura da população de célula tem um coeficiente de extinção de 1,0 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1' Em outra modalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, produz beta polipeptídeos, em que: (a) cerca de 90% ou cerca de 80% dos beta polipeptídeos compreendem uma sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% ou cerca de 20% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) de cerca de 4% a cerca de 8% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a lisina no resíduo número 383; (d) de cerca de 92% a cerca de 96% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina no resíduo número 25.
[00044] A invenção proporciona uma célula de prole de uma população de célula da invenção, em que a célula de prole produz um beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 5, pelo menos 10, pelo menos 20, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 75 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante 27 gerações.
[00045] A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida a partir de qualquer célula proporcionada pela invenção. Em uma modalidade, a linhagem de célula é clonal. Em uma modalidade, a linhagem de célula produz: (a) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (metionina na posição de aminoáci- do 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (d) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (e) um beta polipeptí- deo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (metioni- na na posição de aminoácido 25 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (f) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (metionina na posição de aminoáci- do 25 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); ou (g) qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a linhagem de célula produz beta polipeptídeos ou moléculas de beta poli- peptídeo, em que: (a) cerca de 90% ou cerca de 80% dos beta poli- peptídeos compreendem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% ou cerca de 20% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) de cerca de 4% a cerca de 8% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a lisina no resíduo número 383; (d) de cerca de 92% a cerca de 96% dos beta polipeptídeos compreendem a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 4 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos beta poli- peptídeos compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25, Em uma modalidade, em que os beta polipeptídeos, os quais são produzidos a partir de cultura a linhagem de célula, têm um coeficiente de extinção de 1,0 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1.
[00046] A invenção proporciona uma população de célula derivada de uma célula da invenção. Em uma modalidade, as células da população contêm pelo menos uma alteração genética adicional quando comparado com a célula da invenção da qual a população foi derivada e em que as células produzem um beta polipeptídeo. Em outra moda- lidade, as células da população contêm pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10 ou pelo menos 20 alterações genéticas adicionais quando comparado com a célula da invenção da qual a população foi derivada e em que as células produzem um beta poli- peptídeo. Em uma modalidade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação não conservativa no genoma celular ou no cassete de expressão que codifica o beta polipeptídeo. Em outra modalidade, a alteração genética compreende pelo menos um ácido nucleico recombinante adicional dentro da célula. Em outra modalidade, a alte-ração genética compreende uma mutação do genoma celular. Em outra modalidade, a alteração genética compreende adição de um ácido nucleico a um genoma de célula ou como um ácido transnucleico e em que o ácido nucleico codifica um polipeptídeo antiapoptótico. Em outra modalidade, o polipeptídeo antiapoptótico se refere à glicosilação. Em outra modalidade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação do genoma celular ou do cassete de expressão que codifica um beta polipeptídeo. Em outra modalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, produz: (a) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoá- cido 382 de SEQ ID NO: 4); (d) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 (alanina na posição de ami- noácido 26 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (e) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 (metionina na posição de aminoácido 25 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (f) um beta polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); ou (g) qualquer combinação dos mesmos.
[00047] Composições: A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma proporção molar média de grupos ácido siáli- co para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5 a cerca de 10. Em uma modalidade, a proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo é de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. Em uma modalidade, a proporção molar média de grupos ácido siálico para dí- mero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo é de cerca de 5,2 a cerca de 7,6. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos, em que cada poli- peptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que mais de 95% dos polipeptídeos são transformados em dímeros. Em uma modalidade, mais de 98%, mais de 99% ou mais de 99,5% dos polipeptídeos são transformados em dímeros. Em outra modalidade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% dos polipeptídeos são transformados em dímeros e cerca de 0,5% a cerca de 5% dos poli- peptídeos são transformados em tetrâmeros ou espécies de elevado peso molecular. Em outra modalidade, cerca de 98,6% dos polipeptí- deos são transformados em dímeros e cerca de 1,2% dos polipeptí- deos são transformados em tetrâmeros ou espécies de elevado peso molecular e cerca de menos do que 0,7 % dos polipeptídeos são mo- nômeros. Em outra modalidade, cerca de 95% dos polipeptídeos são transformados em dímeros e cerca de 4% dos polipeptídeos são trans-formados em tetrâmeros ou espécies de elevado peso molecular e cerca de 1% dos polipeptídeos são a população isolada de dímeros de beta polipeptídeo, em que cada monômero de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma modalidade, a população é substancialmente isenta de monômero de beta polipeptídeo. Em outra modalidade, a população é substancialmente isenta de tetrâmero de beta polipeptídeo. A invenção proporciona uma população isolada de monômeros de beta polipeptídeos substancialmente isenta de dímero de tetrâmero de beta polipeptídeos. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de beta polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e tem pelo menos 2,5 grupos ácido siálico.
[00048] A invenção proporciona uma população isolada de beta po- lipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma potência de cerca de 70% a cerca de 130% em um ensaio de ligação a B7, comparado com um padrão de CTLA4-Ig, em que o ensaio compreende medição através de ressonância de plasmônio em superfície. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos, em que cada poli- peptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma potência de cerca de 50% a cerca de 150% em um ensaio de inibição de IL-2 em célula humana, comparado com um padrão. A invenção proporciona uma população purificada de tetrâmeros de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular, em que cada monômero de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, a população sendo substancialmente isenta de dímeros de beta polipeptídeo e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. A invenção proporciona uma população purificada de tetrâme- ros de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular, em que cada monômero de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, a população sendo substancialmente isenta de monômero de beta polipeptídeo e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica compreende dois pares de beta polipeptídeos, em que cada monômero de polipep- tídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que cada membro do par de polipeptídeos é covalentemente ligado ao outro membro e em que os dois pares de polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezes maior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com um dímero de beta polipeptídeo, em que cada monômero de polipeptídeo do dímero compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em outra modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezes maior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com a tetrâmero de molécula de CTLA4-Ig compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, cada molécula te- tramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com um dímero de beta polipeptídeo, em que cada monômero de polipeptídeo do dímero compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em outra modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com a tetrâmero de molécula de CTLA4-Ig compreenden- do a sequência de SEQ ID NO: 2.
[00049] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menos de ou igual a 5,5 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, o pI aumenta após tratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% dos beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipep- tídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 70% dos beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 90% dos beta polipeptí- deos ou moléculas de beta polipeptídeo exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 conforme determinado através de focalização isoelétrica. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pI de cerca de 4,5 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pI de cerca de 4,7 ± 0,2 a cerca de 5,1 ± 0,2. A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, a composição compreendendo beta polipeptí- deos ou moléculas de beta polipeptídeo com um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, o método compreen- dendo: (a) sujeição de uma mistura de beta polipeptídeos à eletroforese em gel de focalização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo com um pI em particular e (b) isolamento da população de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo tendo um pl de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2 de modo a preparar a composição.
[00050] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta po- lipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipep- tídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta poli- peptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0. A invenção proporciona uma composição isola da compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por uma proporção molar média de manose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 14 a cerca de 16. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada com-preendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5 a cerca de 10. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta polipep- tídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada com-preendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptí- deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí- deo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptí- deos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dí- mero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptí- deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí- deo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 14 a cerca de 16; e (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (c) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli- peptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptí- deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; (c) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 8; e (d) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeo de menos do que cerca de 5%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (c) um teor de tetrâmero de beta poli- peptídeo de menos do que cerca de 5%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que polipeptídeos são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta poli- peptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (b) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreen- de a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptí- deos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que polipeptídeos são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; e (b) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular de menos do que cerca de 5%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos são caracterizados por: (a) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta poli- peptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) um teor de tetrâmero de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular de menos do que cerca de 5%.
[00051] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos exibem um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 8. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta poli- peptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que os polipeptídeos exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, em que o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio II compreende picos os quais representam oligossacarídeos monossialilados, o Domínio III compreende picos os quais representam oligossacarídeos dissialilados e Domínio IV compreende picos os quais representam oligossacarídeos trissialilados. Em uma modalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-ligados entre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio II é de cerca de 11 a cerca de 13 minutos. Em uma modalidade, a soma dos Domínios III e IV compreende cerca de 25% a cerca de 36% do perfil total de carboidrato.
[00052] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo dímeros de beta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptí- deo, em que cada monômero de polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que pelo menos cerca de 0,5 % das moléculas são cisteinilados. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos, em que cada polipeptí- deo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população exibe um perfil de espectrometria de massa conforme mostrado na figura 11. A invenção proporciona uma população isolada de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5, em que o dímero de beta polipeptídeo ou moléculas de beta polipeptídeo são produzidas a partir de células de uma linhagem de célula de produção. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que os polipeptídeos são glicosilados em um resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 4. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo beta polipeptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas são caracterizadas por: (a) uma proporção molar média de Glc- NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta poli- peptídeo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de beta polipeptí- deo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 14 a cerca de 16; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dí- mero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) menos de 5% de tetrâmero ou espécies de elevado peso molecular; (j) menos de beta polipeptídeo 1% de monômero; e (k) beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo da população tendo uma sequência de aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que os beta polipeptídeos dentro da população são capazes de ligação a CD80 e CD86. A invenção proporciona uma população isolada de beta poli- peptídeos, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptí- deo de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 14 a cerca de 16; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dí- mero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) menos de 5% de tetrâmero de beta polipeptídeo ou espécies de elevado peso molecular; (j) menos de 1% de monôme- ro; e (k) beta polipeptídeos da população tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, em que moléculas de beta polipeptídeo dentro da popu-lação são capazes de ligação a CD80 e CD86; ou equivalentes farmacêuticos dos mesmos.
[00053] A invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz do beta polipeptídeo da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona uma composição compreendendo excipientes conforme descrito no Pedido U.S. No. 60/752.150; depositado em 20 de Dezembro de 2005. Em uma modalidade, a composição inclui moléculas de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a composição ainda compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a com- posição ainda compreende sacarose, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio, ácido clorídrico e água estéril. Em outra modalidade, a composição compreende sacarose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, fosfato de sódio anídrico dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril. Em uma modalidade, a composição é liofilizada. A invenção proporciona uma composição liofilizada compreendendo uma quantidade eficaz dos beta polipeptídeos da invenção, sacarose, mono- hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e ácido clorídrico.
[00054] Formulações e kits: A invenção proporciona uma mistura liofilizada de beta polipeptídeo, em que cada polipeptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16, compreendendo pelo menos 95% de dímero de beta polipeptídeo e não mais do que 5% de tetrâmero de beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 98% de dímero de beta polipeptídeo e não mais do que 2% de tetrâmero de beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 99% de dímero de beta polipeptídeo e não mais do que 1% de tetrâmero de beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 5 mols de ácido siálico por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 24 a cerca de 28 mols de Glc- NAc por mol de dímero de beta polipeptídeo (espécies de elevado peso molecular). Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 2,7 a cerca de 3,6 mols de GalNAc por mol de dímero de beta polipep- tídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 11 a cerca de 13 mols de galactose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 6,4 a cerca de 7,0 mols de fucose por mol de dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 14 a cerca de 16 mols de manose por mol de dímero de beta poli- peptídeo ou molécula de beta polipeptídeo. A invenção também proporciona um kit farmacêutico compreendendo: (a) um recipiente contendo a mistura liofilizada de beta polipeptídeo da invenção e (b) instruções para reconstituição da mistura liofilizada de beta polipeptídeo em solução para injeção.
[00055] Métodos ilustrativos de tratamento: um método para inibição de proliferação de células T, ativação ou ambos, o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de um distúrbio imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de inflamação em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de artrite reumatoide compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantida- de eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de psoríase em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de lúpus em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de uma alergia em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de doença enxerto versus hospedeiro em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejeição de um órgão transplantado em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta poli- peptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejeição a tecido transplantado em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de a composição uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ou prevenção de rejeição de uma célula transplantada em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. Em uma modalidade, a célula transplantada é uma célula de medula óssea. Em outra modalidade, a célula transplantada é uma célula de ilhota. Em outra modalidade, a célula transplantada é uma célula pancreática que produz insulina. A invenção proporciona um método para tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de Doença de Crohn em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de diabetes do tipo I em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta poli- peptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de doença inflamatória do intestino em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de ooforite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de glomerulonefrite em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de encefalomielite alérgica em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção. A invenção proporciona um método para tratamento de mi- astenia gravis em um indivíduo, o método compreendendo administra- ção, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção.
[00056] A invenção proporciona o uso de uma população de beta polipeptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada poli- peptídeo compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população tem uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5 a cerca de 10 na fabricação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de um distúrbio imune. A invenção proporciona o uso de uma população de beta poli- peptídeos ou moléculas de beta polipeptídeo, em que cada polipeptí- deo compreende a sequência de SEQ ID NO11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que a população tem uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipep- tídeo de cerca de 5 a cerca de 10 na fabricação de um agente antiartrite reumatoide em uma embalagem junto com instruções para seu uso no tratamento de artrite reumatoide. Em uma modalidade, a população tem uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de beta polipeptídeo ou molécula de beta polipeptídeo de cerca de 5,5 a cerca de 8,5.
[00057] Terapias combinadas ilustrativas: A invenção proporciona um método para inibição de proliferação de células T, ativação ou ambos, o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção em combinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção em combinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz de uma composição de beta polipeptídeo da invenção em combinação com metotrexato.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00058] As figuras 1A-1B apresentam a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 1) de uma porção de um cassete de expressão para a molécula de CTLA4-Ig. Também mostrada é a sequência de aminoá- cido (SEQ ID NO: 2) codificada pelo ácido nucleico. Moléculas de CTLA4-Ig que podem ser produzidas a partir desse cassete de expressão incluem moléculas tendo a sequência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2, O cassete de expressão compreende as seguintes regiões: (a) uma sequência sinalizadora de Oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 126 de SEQ ID NO: 2); (b) um domínio extracelular de Humano CTLA4 (nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 2); (c) uma porção modificada de região constante de IgG1 humana (nucleotídeos 464-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152383 de SEQ ID NO: 2), incluindo uma região de dobradiça modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2), um domínio CH2 de IgG1 humana (nucleotídeos 509838 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 167-276 de SEQ ID NO: 2) e um domínio CH3 de IgG1 humana (nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).
[00059] A figura 2 apresenta as sequências de ácido nucleico (fileira superior) e aminoácido (fileira inferior) correspondendo a CTLA4A29YL104E-Ig. A sequência de aminoácido contém uma alteração de aminoácido da sequência mostrada na figura 1, em que as alterações estão na posição 29 (A a Y) e na posição 104 (L a E) comparado com aquela de SEQ ID NO: 2, em que a numeração dos resíduos de aminoácido começa na Metionina (M) marcada por "+1". A sequência de nucleotídeo de CTLA4A29YL104E-Ig é mostrada nessa figura começando de A na posição 79 (isto é, a posição marcada pelo "+1" abaixo de M) a A na posição de nucleotídeo 1149 (SEQ ID NO: 3). Em particular, a sequência de nucleotídeo que codifica CTLA4A29YL104E-Ig é do nucleotídeo na posição 79 ao nucleotídeo na posição 1149, designada SEQ ID NO: 3. A sequência de nucleotídeo completa mostrada na figura 2 é designada SEQ ID NO: 23 e inclui a sequência de ácido nuclei- co que codifica o peptídeo sinalizador Oncostatina M.
[00060] A figura 3 apresenta a sequência de aminoácido (SEQ ID NO: 4) da molécula de CTLA4A29YL104E-Ig, incluindo uma pró-sequência de Oncostatina M (vide itálico em negrito). Polipeptídeos que podem ser produzidos que são moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig incluem moléculas tendo a sequência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.
[00061] A figura 4 é um modelo de uma CTLA4A29YL104E-Ig mostrada com os sítios de glicosilação N-ligados (N76, N108 e N207), a ligação de dissulfeto C120-C120 e as duas substituições de aminoácido feitas no domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y).
[00062] A figura 5 representa a sequência de aminoácido cDNA- derivada teórica de uma CTLA4A29YL104E-Ig (SEQ ID NO: 4). Duas substituições de aminoácido foram feitas no domínio extracelular de CTLA- 4 (L104E e A29Y) para gerar CTLA4A29YL104E-Ig. A sequência identifica o peptídeo sinalizador (pró-sequência) de oncostatina M junto com os sítios de glicosilação N-ligados.
[00063] A figura 6 é um gráfico representando a ligação de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig a um anticorpo de Fc anti-IgG humana de bezerro. A ligação de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig foi detectada através de medição da resposta obtida sobre essa superfície, comparado com uma superfície de chip sensor não modificada. Os vários lotes representam três amostras de CTLA4A29YL104E-Ig diferentes.
[00064] A figura 7 é um gráfico que mostra os pesos moleculares evidentes os quais correspondem às frações de multímero, tetrâmero e dímero de um pico de clarificação por HIC de CTLA4-Ig, conforme determinado através de uma sobreposição de SEC com duas colunas com detecção por dispersão dinâmica de luz (DSL) e tempo de retenção sobre SEC.
[00065] As figura 8A (superior) e 8B (inferior) mostram géis de IEF representativos de frações de moléculas de CTLA4-Ig glicosiladas (compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2) isoladas e purificadas de um pico de clarificação por HIC. A ordem de carregamento para o gel superior é: fileira 1, marcadores de pI (Amersham); fileira 2, padrão de dímero de CLTA4-Ig; fileira 3, eluato de Proteína A; fileira 4, Multí- mero; fileira 5, tetrâmero; fileira 6, dímero. A ordem de carregamento para o gel inferior é: fileira 1, marcador de pI (Amersham); fileira 2, padrão de dímero de CLTA4-Ig; fileira 3, tetrâmero; fileira 4, tetrâmero dissociado. Os painéis mostram que o tetrâmero é menos sialilado do que o dímero.
[00066] A figura 9 mostra as estruturas de carboidrato predominantes e quantidades relativas de carboidratos observadas sobre um dí- mero de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. A numeração de resíduo de aminoácido na figura não é consistente com SEQ ID NO: 2. Para que a numeração de resíduo de aminoácido na figura seja consistente com SEQ ID NO: 2, a numeração precisa aumentar em 26, isto é, N76 é N102.
[00067] A figura 10 INTENCIONALMENTE DEIXADA EM BRANCO.
[00068] A figura 11 mostra um gel de IEF representativo (pH de 4,0 a 6,5) de um dímero de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. As fileiras 1 e 5 mostram um padrão de calibração, a fileiras 2, 3, 4 mostram, cada uma, 20 μg/μl de dímero de CLTA4-Ig.
[00069] A figura 12 mostra um gel de IEF representativo (pH de 4,0 a 6,5) de um dímero de CTLA4A29YL104E-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 4. As fileiras 1 e 8 mostram um padrão de calibração, as fileira 2-7 mostram, cada uma, 10 μg/μl de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig.
[00070] A figura 13 mostra o perfil de carboidrato N-ligado de uma população de moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. Os carboidratos foram coletados de glicopeptídeos e separados usando a técnica de oligossacarídeo N-ligado PGC por LC/MS. Os cromatogramas proporcionam o perfil de população para cada sítio de fixação de N-ligação. A) Os carboidratos Asn76 (Asn102 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T5 e B) os carboidratos Asn108 (Asn134 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T7 mostram ambos distribuições dentre espécies mono- e multissialiladas. C) Os carboidratos Asn207 (Asn 233 de SEQ ID NO: 2) do peptídeo T14 consistem predominantemente em espécies asialiladas. D) A distribuição de carboidratos N-ligados para moléculas de CTLA4-Ig é mostrada. E) Um espectro primário selecionado do peptídeo T5 mostra um pico principal correspondendo à estru-tura monossialilada biantenária representada. F) Um espectro primário selecionado do T14 mostra um pico principal correspondendo à estrutura asialo biantenária. G) Um espectro primário selecionado de uma espécie menor a qual coelui com o pico a 64,23 minutos, o qual corresponde à estrutura dissialilada tri-antenária. H) Um espectro primário selecionado revela a espécie principal no pico a 64,23 minutos, o qual corresponde à estrutura dissialilada biantenária.
[00071] As figuras 14A-B mostram um traço por UV e TIC de um perfil de oligossacarídeo N-ligado de um monômero de SEQ ID NO: 2 de CTLA4-Ig a partir de cromatografia PGC sob condições de eluição ácida (TFA a 0,05%). O traço da figura 14A mostra a contagem total de íons negativos (TIC) para o cromatograma PGC sob condições de eluição ácida (TFA a 0,05%). O traço da figura 14B mostra o traço por UV a 206 nm para cromatograma PGC sob condições de eluição ácida (TFA a 0,05%).
[00072] As figuras 15A-B mostram um traço por UV e TIC de um perfil de oligossacarídeo N-ligado de um monômero de SEQ ID NO: 2 de CTLA4-Ig a partir de cromatografia PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a 0,4%). O traço da figura 15A mostra a contagem total de íons negativos (TIC) para cromatograma PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a 0,4%). O traço da figura 15B mostra o traço por UV a 206 nm para cromatograma PGC sob condições de eluição básica (NH4OH a 0,4%).
[00073] A figura 16 representa os perfis de carboidrato e oligossa- carídeo N-ligado para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreendendo SEQ ID NO: 4. Quatro domínios de oligossacarídeo são observados: o Domínio I contém espécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios II, III e IV contêm espécies monossialiladas, dissialiladas e trissialila- das, respectivamente. Isolamento dos oligossacarídeos cromatografi- camente e análise dos mesmos através de espectroscopia de massa determinaram os domínios.
[00074] A figura 17 mostra um perfil por HPAEC-PAD de oligossa- carídeos N-ligados de moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monô- meros de SEQ ID NO: 2. Os domínios são mostrados na ordem crescente de teor de ácido siálico para os oligossacarídeos. Os Domínios I, II, III e IV contêm estruturas de oligossacarídeo tendo 0, 1, 2 e 3 ácidos siálicos, respectivamente. Os rótulos de pico representam estruturas de oligossacarídeo atribuídas através de determinação de perfil por HPAEC-PAD de picos coletados a partir de determinação de perfil por PGC. A identificação estrutural da estrutura de carboidrato é consistente com determinações anteriores.
[00075] As figuras 18A-B mostram um perfil por PGC de moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. O perfil é obtido a partir de injeção direta de mistura de digestão de carboidrato preparada conforme descrito no Exemplo 3. Injeção direta resulta em detecção da estrutura P4144 eluindo a 130 minutos. A estrutura te- trassialilada P4144 não é observada em perfis de oligossacarídeos os quais são isolados antes de injeção.
[00076] A figura 19 apresenta um espectro por eletropulverização positiva de desconvolução por LC/MS para o fragmento T9 de um mo- nômero de SEQ ID NO: 2. O espectro ilustra três principais estruturas O-ligadas. O espectro ilustra o peptídeo de base com ladder de açúcar consistente com a estrutura O-ligada (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)1. A porção em negrito do espectro foi intensificada 10 vezes com relação à porção não em negrito do espectro e ilustra duas estruturas O-ligadas adicionais com (GalNAc)1(Gal)1(NeuAc)2 e (Gal-NAc)1(GlcNAc)1(Gal)2(NeuAc)2.
[00077] A figura 20 mostra os pontos de fixação e populações relativas de estruturas de carboidrato O-ligado de uma cadeia simples de CTLA4-Ig tendo a sequência monomérica SEQ ID NO: 2. As quantidades relativas em cada local mostram dados gerados através de duas ou mais técnicas ortogonais e estão sujeitas à variabilidade. A localização da cisteinilação covalente também é representada.
[00078] A figura 21 representa um mapa do plasmídeo intermediário piLN-huCTLA4-Ig. Esse plasmídeo compreende uma sequência que pode codificar uma molécula de CTLA4-Ig humana (huCTLA4-Ig) (isto é, SEQ ID NO: 1) flanqueada pelos sítios de enzima de restrição HindIII e XbaI.
[00079] A figura 22 representa um mapa do plasmídeo pD16LEA29Y. Esse plasmídeo compreende uma sequência que pode codificar uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig humana (isto é, SEQ ID NO: 4).
[00080] A figura 23 é uma fotografia de uma Southern blot de DNA extraído de células de CHO expressando o cassete de expressão de CTLA4-Ig derivado de 1D5-100A1 (por exemplo, clone 17). As fileiras para o gel da esquerda para a direita são: fileira M, marcador de peso molecular de DNA; fileira N, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI (5 mg); fileira 1, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 1 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; fileira 2, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 0,5 ng de pcSDhuCTLA4- Ig; fileira 3, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 0,25 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; fileira 4, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 0,125 ng de pcS-DhuCTLA4-Ig; fileira 5, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 0,0625 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; fileira 6, DNA de CHO digerido com EcoRI/XbaI não transfectado (2,5 μg) + 0,03125 ng de pcSDhuCTLA4-Ig; fileira 7, DNA digerido com EcoRI/XbaI: MCB (5,0 μg); fileira 8, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030618A-01 (5,0 μg); fileira 9, DNA digerido com Eco-RI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030712A-01 (5,0 μg); fileira 10, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030801A- 01 (5,0 μg); fileira 11, DNA digerido com EcoRI/XbaI: MCB (2,5 μg); fileira 12, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030618A-01 (2,5 μg); fileira 13, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030712A-01 (2,5 μg); fileira 14, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030801A-01 (2,5 μg); fileira 15, DNA digerido com EcoRI/XbaI: MCB (1,25 μg); fileira 16, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030618A-01 (1,25 μg); fileira 17, DNA digerido com EcoRI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030712A-01 (1,25 μg); fileira18, DNA digerido com Eco-RI/XbaI: Número de Lote EPCB C20030801A-01 (1,25 μg).
[00081] A figura 24 representa um fluxograma de um processo de cultura em escala de produção. Esse processo permite a produção em massa de proteínas recombinantes em um biorreator de produção de 25.000 L.
[00082] A figura 25 mostra um cromatograma representativo do padrão de adequabilidade de sistema de NGNA e NANA. O pico a ~9,7 min é NGNA e o pico a ~10,7 min é NANA.
[00083] A figura 26 mostra um cromatograma representativo de moléculas de CTLA4-Ig hidrolisadas compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2. O pico a ~8,4 min é o pico de solvente. O pico a ~9,6 min é NGNA. O pico a ~10,5min é NANA. O pico a ~11,3 min é NANA degradado, resultante das condições de hidrólise. As contagens de área são combinadas para cálculos da proporção molar de NANA.
[00084] As figuras 27A, 27B e 27C mostram os espectros por MALDI de peptídeos cisteinilados de CTLA4-Ig. Os espectros por MALDI foram obtidos para fragmentos de tripsina/quimiotripsina de CTLA4-Ig contendo Cys146 de SEQ ID NO: 2. A figura 27A mostra o espectro de peptídeo com cadeia simples ilustrando a modificação por cisteinilação. A figura 27B mostra o espectro do peptídeo com cadeia simples após redução e demonstra que a modificação ocorre em Cys146. A figura 27C mostra a alquilação do peptídeo com cadeia simples reduzido, o qual demonstra que a cisteinilação ocorre em Cys146.
[00085] A figura 28 apresenta um esquema de clonagem útil para a geração do vetor pcSD. pcDNA3 foi digerido com a enzima de restrição NaeI de forma a isolar um fragmento de 3,821 Kb que contém o promotor de CMV, um gene de resistência à ampicilina e uma origem de replicação para E. coli. pSV2-dhfr foi digerido com as enzimas de restrição PvuII e BamHI de forma a isolar um fragmento de 1,93 Kb, o qual contém o promotor SV40 e o gene dhfr e teve a extremidade sub-sequentemente cega. Para gerar o pcSD, ambos os fragmentos foram ligados. O mapa do plasmídeo pcSD é mostrado no fundo da figura.
[00086] A figura 29 apresenta um esquema de clonagem útil para geração do vetor de expressão pcSDhuCTLA4-Ig. pcSD foi digerido com as enzimas de restrição EcoRV e XbaI. piLN-huCTLA4-Ig foi digerido com a enzima de restrição HindIII, teve a extremidade cega e, então, digerido com a enzima de restrição XbaI de forma a isolar o fragmento huCTLA4-Ig de 1,2 Kb. Para gerar o pcSDhuCTLA4-Ig, o fragmento de CTLA4-Ig foi ligado ao vetor pcSD digerido. O mapa do plasmídeo pcSDhuCTLA4-Ig é mostrado no inferior da figura. Esse plasmídeo foi linearizado e transfectado em células de CHO que não têm um gene dhfr funcional. Uma vez que o plasmídeo contém um gene dhfr funcional, transfectantes estáveis podem ser selecionados com base na sobrevivência celular. O pcSDhuCTLA4-Ig no cassete de expressão compreendendo o promotor de CMV, uma sequência que codifica uma molécula de CTLA4-Ig humana (huCTLA4-Ig) (isto é, SEQ ID NO: 1) e uma sequência de cauda poli(A) de BGH.
[00087] A figura 30 mostra um eletroferograma de amino monossa- carídeos da adequabilidade do sistema representado como unidades de fluorescência relativa (RFU) versus tempo (min).
[00088] A figura 31 mostra um eletroferograma de monossacarí- deos neutros da adequabilidade de sistema representada como unidades de fluorescência relativa (RFU) versus tempo (min).
[00089] A figura 32 representa um mapa do peptídeo trípitico de CTLA4A29YL104E-Ig com peptídeos rotulados. A Tabela 23 corresponde aos peptídeos rotulados.
[00090] A figura 33 mostra uma análise por hibridização de Northern da CTLA4A29YL104E-Ig. O Painel A representa um gel de ágarose corado com brometo de etídio em que a Fileira M é marcador de RNA; a Fileira 1 é RNA total de CHO; a Fileira 2 é RNA total de MCB; e a Fileira 3 é RNA total de EPCB. O Painel B é o autorradiograma correspondente, em que a Fileira M é marcador de RNA; a Fileira 1 é RNA total de CHO; a Fileira 2 é RNA total de MCB; e a Fileira 3 é RNA total de EPCB.
[00091] A figura 34A-C representa cromatogramas por exclusão de tamanho, os quais distinguem dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig de espécies de alto e baixo peso molecular.
[00092] A figura 35 mostra uma análise por SDS-PAGE (Reduzida e Não-Reduzida) de CTLA4A29YL104E-Ig corada com Coomassie Blue. A Fileira 1 é carregada com marcadores de peso molecular; as Fileiras 2, 7 e 12 são placebo; as Fileiras 3-6 são amostras de CTLA4A29YL104E-Ig (reduzida); as Fileiras 8-11 são amostras de CTLA4A29YL104E-Ig (não- reduzida).
[00093] A figura 36 mostra uma análise por SDS-PAGE (Reduzida e Não-Reduzida) de CTLA4A29YL104E-Ig submetida à coloração com prata. A Fileira 1 é carregada com marcadores de peso molecular; as Fileiras 2, 7 e 12 são placebo; as Fileiras 3-6 são amostras de CTLA4A29YL104E- Ig (reduzida); as Fileiras 8-11 são amostras de CTLA4A29YL104E-Ig (não- reduzida).
[00094] A figura 37 representa um mapa peptídico de CTLA4A29YL104E-Ig não reduzida usando uma combinação de digestão com tripsina e quimiotripsina.
[00095] A figura 38 representa um mapa peptídico de CTLA4A29YL104E-Ig não-reduzida usando uma combinação de digestão com tripsina e elastase.
[00096] A figura 39 é um diagrama que representa pacientes com respostas anti-CTLA4-Ig ou anti-CTLA-4. A resposta de anticorpo à molécula de CTLA4-Ig inteira (CTLA-4 e porção de Ig) e à porção de CTLA-4 apenas foi determinada usando os Ensaios A e B, conforme esboçado no Exemplo 32.
[00097] A figura 40 é um esquema mostrando a distribuição de eliminação e o volume de compartimento central através do estado de imunogenicidade.
[00098] A figura 41 é um gráfico demonstrando perfis de concentrações médias de CTLA4-Ig no soro (SD) com o tempo em macacos administrados 10 mg/kg de substância de fármaco produzida através de um processo da invenção.
[00099] A figura 42 é um gráfico de um cromatograma por cromato- grafia de exclusão de tamanho (SEC) de Proteína A (MAbSelect) purificada do controle e material de CTLA4-Ig desagregado.
[000100] A figura 43 é um gráfico de uma análise de N-glicana comparando o Material Processado de Desagregação (ii) com o Controle (i).
[000101] A figura 44 é um gráfico representando as concentrações médias de CTLA4-Ig no soro [μg/ml] versus o tempo (mais de 71 dias).
[000102] A figura 45 mostra um eletroferograma de monossacarí- deos neutros representado como unidades de fluorescência relativa (RFU) versus o tempo (min).
[000103] A figura 46 mostra um eletroferograma de amino monossa- carídeos representado como unidades de fluorescência relativa (RFU) versus o tempo (min).
[000104] A figura 47 representa os perfis de carboidrato de oligossa- carídeo N-ligado para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreendendo SEQ ID NO: 4. Quatro domínios de oligossacarídeo são observados, em que o Domínio I contém espécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios II, III e IV contêm espécies monossialiladas, dissialiladas e trissialiladas, respectivamente.
[000105] A figura 48 é um gráfico de uma separação por eletroforese capilar de CTLA4-Ig que foi misturada a 1:1 com CTLA4A29YL104E-Ig. Os tempos de migração do pico principal são de aproximadamente 0,8 minuto de intervalo.
[000106] A figura 49 é um cromatograma de material CTLA4A29YL104E- Ig hidrolisado, em que um pico de NANA é observado a 3,4 minutos.
[000107] A figura 50 representa várias das estruturas de carboidrato N-ligadas encontradas em proteínas de mamífero. Todas as cadeias compartilham uma estrutura central em comum contendo dois resíduos de GlcNAc e três de manose.
[000108] A figura 51 é um gráfico representando a exposição de CTLA4-Ig (AUC) como uma função de sialilação da glicoproteína (proporção de NANA).
[000109] A figura 52 é um gráfico representando a exposição de CTLA4-Ig (AUC) como uma função do perfil de carboidrato de CTLA4- Ig. Um grande número de picos foi gerado através de HPLC de troca de ânions, os quais foram decompostos em quatro ou cinco domínios. Os domínios 1 e 2 são estruturas grandemente asialiladas e monossia- liladas, enquanto que os domínios 3 e 4 são estruturas grandemente di- e trissialiladas.
[000110] A figura 53 representa um mapa de peptídeo tríptico de CTLA4A29YL104E-Ig com peptídeos rotulados. A Tabela 56 corresponde aos peptídeos rotulados.
[000111] A figura 54 representa os perfis de carboidrato N-ligado comparativos para moléculas de CTLA4-Ig compreendendo SEQ ID NO: 2. Quatro domínios de oligossacarídeo são observados, em que o Domínio I contém espécies não-sialiladas, enquanto que os Domínios II, III e IV contêm espécies monossialiladas, dissialiladas e trissialila- das, respectivamente.
[000112] As figuras 55A-D são um gráfico que representa os perfis de oligossacarídeo de CTLA4-Ig e Peptídeos T5, T7 e T14 através de HPAEC-PAD.
[000113] A figura 56 é um gráfico representando o perfil de oligossa- carídeo rotulado de CTLA4-Ig obtida de uma coluna de PGC (Hypercarb).
[000114] A figura 57 representa um gráfico dos dados de farmacoci- nética mostrando AUC de macaco sobre o eixo Y e o percentual de glicosilação N-ligada, conforme mostrado nos Domínios I e II a partir de um perfil de carboidrato sobre o eixo X. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. À medida que o percentual dos Domínios I e II aumenta (e o percentual dos Domínios III, IV e V diminui), a eliminação aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-Ig com baixo teor de ácido siá- lico, é eliminado muito rapidamente. Note que a variante de CTLA4-Ig, LEA (CTLA4-IgA29YL104E-Ig), é incluída nesse gráfico.
[000115] As figura 58 A e 58 B representam um traço de um croma- tograma de carboidrato N-ligado dos carboidratos N-ligados liberados de CTA4-Ig (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44, 22 e 37). O traço na figura 58A é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura sem galactose extra adicionado à cultura. O traço na figura 58 B tem galactose adicionada à cultura. Os percentuais de carboidratos N-ligados em cada domínios são mostrados na tabela em anexo.
[000116] A figura 59 representa um traço de um cromatograma de carboidrato N-ligado dos carboidratos N-ligados liberados de CTA4-Ig (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44, 22 e 37). Esse é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura com galactose adicionada à cultura no dia 8. Esse traço é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura sem galactose extra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-ligados em cada domínio são mostrados na tabela em anexo.
[000117] A figura 60 representa um traço de um cromatograma de carboidrato N-ligado dos carboidratos N-ligados liberados de CTA4-Ig (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44, 22 e 37). Esse é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura com galactose adicionada à cultura no dia 14. Esse traço é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura sem galactose extra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-ligados em cada domínios são mostrados na tabela em anexo.
[000118] As figuras 61A e 61B representa um traço de um cromato- grama de carboidrato N-ligado dos carboidratos N-ligados liberados de CTA4-Ig (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44, 22 e 37). A figura 61A é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura sem galactose adicionada e a figura 61B é de uma análise onde galactose foi adicionada à cultura no dia 14. Esse traço é de uma análise de CTLA4-Ig produzida em um método de cultura sem galactose extra adicionado à cultura. Os percentuais de carboidratos N-ligados em cada domínios são mostrados na tabela em anexo.
[000119] A figura 62 representa um traço de um cromatograma de carboidrato N-ligado dos carboidratos N-ligados liberados de CTA4-Ig (conforme obtida a partir de métodos tais como aqueles descritos nos Exemplos 3, 44, 22 e 37). Esse traço foi obtido de material CTLA4-Ig que foi recuperado da etapa de lavagem da coluna de QFF, produzindo uma fração de material de CTLA4-Ig com baixo teor de ácido siáli- co. A quantidade relativa de Domínios I e II é aumentada e os Domínios III e Iv são diminuídos, comparado com os traços mostrados nas figuras 61, 60 e 59. Os percentuais de carboidratos N-ligados em cada domínio são mostrados na tabela em anexo.
[000120] A figura 63 mostra o mapa de peptídeo tríptico de CTLA4- Ig, indicando que T8 elui ao final do fronte de solvente e T9 elui na extremidade ("shoulder") de T27.
[000121] A figura 64 é um gráfico que representa o espectro todo de massa correspondendo ao glicopeptídeo T8 de CTLA4-Ig.
[000122] A figura 65 é um gráfico que representa o espectro todo de massa correspondendo ao glicopeptídeo T9 de CTLA4-Ig.
[000123] A figura 66 é um gráfico que representa os dados de MAL- DI-TOF para o fragmento de peptídeo T9 de CTLA4-Ig.
[000124] A figura 67A-B representa cromatogramas de íons e espectros de massa de peptídeos trípticos nativos e oxidados de CTLA4- Ig.
[000125] A figura 68 representa um perfil de oligossacarídeo N- ligado típico (Domínios I, II, III, IV e V e Picos 1A e 1B dentro de 5% das médias dos lotes). Os picos 1A, 1B e 1C representam as estruturas de asialo oligossacarídeo N-ligados de G0, G1 e G2. Os dados pa-ra o perfil estão na tabela diretamente abaixo. Veja Exemplo 44.
Figure img0001
[000126] A figura 69 representa um gel de focalização isoelétrica de CTLA4-Ig. As bandas são caracterizadas por:
Figure img0002
[000127] A figura 70 representa um relatório de análise quantitative em gel de focalização isoelétrica representativo de CTLA4-Ig. A quanti-ficação do gel foi realizada e os dados são como segue:
Figure img0003
Relativa da amostra (%) = Amostra % Internsidade da banda/Ref. % Internsidade da banda NOTA: Para a faixa de pI de 4,3 a 5,3
[000128] A figura 71 A representa uma injeção de 20 μL típica do padrão de adequabilidade de sistema sobre uma coluna TOSO HAAS 3000 SWXL equipada com uma coluna de proteção. A figura 71B representa uma injeção de 20 μL de material de referência CTLA4-Ig sobre a coluna TOSO HAAS 3000 SWXL equipada com uma coluna de proteção.
[000129] Fig. 72 - Exemplo de imagem digitalmente adquirida de análise por SDS-PAGE de CTLA4-Ig através de eletroforese em gel de poliacrilamida corado com Coomassie Blue (4-20).
Figure img0004
[000130] A figura 73 representa um exemplo de um rela tório de aná-lise quantitativa para SDS-PAGE corado com Coomassie Blue.
[000131] A figura 74 mostra uma tabela apresentando a análise quantitativa do gel de SDS-PAGE corado na figura 73.
[000132] A figura 75 representa um exemplo de uma imagem intensificada de análise por SDS-PAGE de um gel corado com Coomassie Blue de CTLA4-Ig para ilustração das posições de migração das bandas principais e menores esperadas com relação aos marcadores de peso molecular.
[000133] A figura 76 é uma representação de um perfil de carboidrato N-ligado de material padrão/referência de CTLA4-Ig. Esse é um perfil de carboidrato representativo da operação sobre o sistema Waters. Os tempos de retenção são dependentes do sistema.
[000134] A figura 77 é uma representação de um cromatograma de adequabilidade de sistema por estaquiose representativo.
[000135] A figura 78 é um traço de um cromatograma representativo de material CTLA4-Ig hidrolisado.
[000136] A figura 79 representa uma imagem em gel de análise por SDS-PAGE de CTLA4A29YL104E-Ig em eletroforese em gel de poliacrila- mida corado com Coomassie Blue (4-20%).
Figure img0005
[000137] A figura 80 representa um fluxograma das etapas de coleta. Veja Exemplo 28.
[000138] A figura 81 representa um eletroferograma da adequabili-dade de sistema de amino monossacarídeos. Veja Exemplo 16.
[000139] A figura 82 representa um gráfico de dados farmacocinéti- cos mostrando a AUC de macaco sobre o eixo Y e o percentual de gli- cosilação N-ligada, conforme mostrado no Domínios I e II de um perfil de carboidrato sobre o eixo X. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. À medida que o percentual dos Domínios I e II aumenta (e o percentual dos Domínios III, IV e V diminui), a AUC aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-Ig com baixo teor de ácido siálico, é eliminado muito rapidamente. Note que a molécula mutante de CTLA4-Ig, CTLA4- IgA29YL104E-Ig (designada LEA), é incluída nesse gráfico.
[000140] A figura 83 representa um gráfico de dados farmacocinéti- cos mostrando a AUC sobre o eixo Y e o percentual de glicosilação N- ligada, conforme mostrado no Domínios III e IV (conforme determinado a partir de um perfil de carboidrato N-ligado) sobre o eixo X. À medida que o percentual dos Domínios III e IV aumenta, a AUC aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4-Ig com baixo teor de ácido siálico, é eliminado muito rapidamente. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. Note que a molécula mutante de CTLA4-Ig, CTLA4-IgA29YL104E-Ig (designada LEA), é incluída nesse gráfico.
[000141] A figura 84 representa outro gráfico de dados farmacociné- ticos mostrando a AUC sobre o eixo Y e o percentual de glicosilação N-ligada, conforme mostrado no Domínios III e IV de um perfil de carboidrato sobre o eixo X. À medida que o percentual dos Domínios III e IV aumenta, a AUC aumenta. Note que o controle negativo, a CTLA4- Ig com baixo teor de ácido siálico, é eliminado muito rapidamente. Veja métodos de determinação do perfil de carboidrato N-ligado, por exemplo, nos Exemplos 3, 44, 22 e 37. Note que a molécula mutante de CTLA4-Ig, CTLA4-IgA29YL104E-Ig (designada LEA), é incluída nesse gráfico.
[000142] A figura 85 representa um Mapeamento Tríptico de padrão de CTLA4-Ig (veja Tabela no final do Exemplo 65) para atribuições de pico. Um pequeno pico rotulado T1+A é o peptídeo tríptico T1 estendido por um resíduo de alanina N-terminal. O pequeno pico rotulado T31+K é o peptídeo tríptico T31 estendido por um resíduo de lisina C- terminal.
[000143] A figura 86 representa uma sobreposição de dados a 280 nm para um Mapeamento Tríptico de padrão de CTLA4-Ig mais Same Spiked com 5% em mols de Peptídeo Indicador T6ox, Met(O) 85 (8493). Veja Exemplo 65.
[000144] A figura 87 representa uma vista expandida de dados a 215 nm para um Mapeamento Tríptico de padrão de CTLA4-Ig mais o mesmo reforço com 5% em mols de Peptídeo Indicador T26deaml, isoAsp294(281-302). Veja Exemplo 65.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[000145] Moléculas de CTLA4-Ig podem ser usadas para tratar uma variedade de distúrbios, incluindo distúrbios relacionados a fenômenos imunoproliferativos e imunorreativos anormais, tais como autoimunida- de e alergia. A invenção proporciona composições de CTLA4-Ig que compreendem, por exemplo, populações de moléculas de CTLA4-Ig tendo particulares modificações de glicosilação, em particular, tendo perfis ou características de carboidrato em particular, tendo estruturas multiméricas em particular e/ou tendo resistências de avidez em particular. Documentos que são aqui incorporados por referência em sua totalidade que também descrevem moléculas de CTLA4-Ig, usos e métodos das mesmas, incluem Patente U.S. No. 5.434.131; 5.851.795; 5.885.796; 5.885.579; e 7.094.874.
[000146] A invenção também proporciona linhagens de células que são capazes de produzir grandes quantidades de moléculas de CTLA4-Ig via os métodos de produção em massa e cultura proporcionados aqui. Uma linhagem de célula em particular da invenção é uma linhagem de célula clonal que pode ser usada para produzir em massa moléculas de CTLA4-Ig, de modo que elas tenham um perfil de carboidrato e glicosilação em particular. Quando comparado com a população de célula heterogênea e não-clonal tendo No. de Acesso ATCC 68629 (veja Patente U.S. No. 5.434.131, a qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade), as linhagens de células clonais da in-venção podem secretar uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um perfil de glicosilação ou carboidrato mais consistente ou mais uniforme. Ainda, quando comparado com a população de células heterogênea e não-clonal tendo No. de Acesso ATCC 68629, as linhagens de células clonais da invenção podem secretar uma maior quan- tidade de moléculas de CTLA4-Ig, em parte porque as presentes linhagens de célula clonal são selecionadas para ter um maior número de cópias de cassetes de expressão de CTLA4-Ig integrados em um único sítio no genoma da célula.
[000147] A invenção proporciona a descoberta de que a avidez e potência de CTLA4-Ig (SEQ ID NO: 2) pode ser aumentada fazendo duas substituições de aminoácido na região de ligação B7 do domínio de ligação de CTLA-4: (i) alanina na posição 29 de SEQ ID NO: 2 é substituída por tirosina (A29Y) e (ii) lisina na posição 104 de SEQ ID NO: 2 é substituída por glutamato (L104E). A invenção proporciona um sub- gênero de moléculas de CTLA4-Ig, denominado "moléculas de beta polipeptídeo," as quais compreendem beta polipeptídeos os quais têm atividade de ligação a B7 e podem compreender a sequência de ami- noácido em SEQ ID NO: 24 ( domínio extracelular de CTLA4 com mu-tações A29Y e L104E), ligados a uma região constante de imunoglo- bulina ou porção da mesma. SEQ ID NO: 24 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD SEQ ID NO: 18 - Um domínio extracelular CTLA4 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
Termos
[000148] Conforme usado aqui, o termo "clonal" se refere a uma população de célula que é expandida a partir de uma única célula. Com relação a uma linhagem de célula clonal ou população de célula clonal capaz de expressar a molécula de CTLA4-Ig, a linhagem ou população de célula clonal é expandida a partir de uma única célula que foi isola- da de uma população de células que foram transfectadas com um vetor de expressão que codifica a molécula de CTLA4-Ig. A população transfectada de células pode ser uma população heterogênea. Uma linhagem ou população de célula clonal pode ser considerada como sendo homogênea no sentido de que todas as células na população se originam de um único transfectante.
[000149] Conforme usado aqui, o termo "B7-1" se refere a CD80; o termo "B7-2" se refere a CD86; e o termo "B7" se refere a um ou ambos de B7-1 e B7-2 (CD80 e CD86). O termo "B7-1-Ig" ou "B7-1Ig" se refere a CD80-Ig; o termo "B7-2-Ig" ou "B7-2Ig" se refere a CD86-Ig.
[000150] Conforme usado aqui, os termos "CTLA4-Ig" ou "molécula de CTLA4-Ig" ou "molécula de CTLA4Ig" ou "proteína CTLA4-Ig" ou "Proteína de CTLA4Ig" são usados permutavelmente e se referem a uma molécula de proteína que compreende pelo menos um polipeptí- deo de CTLA4-Ig tendo um domínio extracelular de CTLA4 e uma região constante de imunoglobulina ou porção da mesma. Em algumas modalidades, por exemplo, um polipeptídeo de CTLA4-Ig compreende pelo menos a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em determinadas modalidades, o domínio extracelular de CTLA4 e a região constante de imunoglobulina ou porção da mesma pode ser do tipo silvestre ou mutante ou modificada. Um polipeptídeo de CTLA4-Ig mutante é um polipeptídeo de CTLA4-Ig compreendendo um domínio ex- tracelular de CTLA4 mutante. Uma molécula mutante de CTLA4Ig compreende pelo menos um polipeptídeo de CTLA4-Ig mutante. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de CTLA4 e a região constante de imunoglobulina ou porção da mesma pode ser de mamífero, incluindo de ser humano ou camundongo. Em algumas modalidades, um domínio extracelular de CTLA4 mutante pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica ao domínio extracelular de CTLA4 mostrado na figura 1 ou SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, uma região constante de imunoglobulina mutante ou porção da mesma pode ter uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à região constante de imunoglobulina (g) conforme mostrado na figura 1. O polipeptídeo pode ainda compreender domínios de proteína adicionais. A molécula de CTLA4-Ig pode se referir a um monômero do polipeptídeo de CTLA4-Ig e também pode se referir a formas multiméricas do polipep- tídeo, tais como dímeros, tetrâmeros e hexâmeros, etc. (ou outras espécies de elevado peso molecular). Moléculas de CTLA4-Ig são também capazes de ligação a CD80 e/ou CD86, moléculas de CTLA4-Ig incluem moléculas mutantes de CTLAIg, tais como "moléculas de beta polipeptídeos," por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig. Por exemplo, CTLA4- Ig compreende moléculas de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig compreende moléculas de beta polipeptídeos (um exemplo de moléculas mutan- tes de CTLA4-Ig).
[000151] Conforme usado aqui, o termo "domínio extracelular de CTLA4" se refere a um domínio de proteína compreendendo toda ou uma porção da sequência de aminoácido mostrada em SEQ ID NO: 18, que se liga a B7-1 (CD80) e/ou B7-2 (CD86). Em algumas modalidades, um domínio extracelular de CTLA4 pode compreender um poli- peptídeo tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos aminoáci- dos 27-150 de SEQ ID NO: 2, os quais são os mesmos aminoácidos mostrados em SEQ ID NO: 18. O aminoácido 151 de SEQ ID NO: 2 é um aminoácido de junção.
[000152] Conforme usado aqui, o termo "beta polipeptídeo" se refere a um polipeptídeo de CTLA4-Ig mutante que (1) compreende sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18 em que o aminoácido na posição 29 sofreu mutação para tirosina e o aminoácido na posição 104 sofreu mutação para glutamato, opcionalmente com várias mutações adicionais e uma região constante de imunoglobulina ou uma porção da mesma; e (2) é capaz de ligação a CD80 e/ou CD86. Em algumas modalidades, por exemplo, um beta polipeptídeo compreende pelo menos a sequência de aminoácido do domínio extracelular de CTLA4A29YL104E- Ig (conforme mostrado em SEQ ID NO: 24). Exemplos não-limitativos de beta polipeptídeos incluem belatacept e SEQ ID NOS: 4 e 11-16. Em determinadas modalidades, a região constante de imunoglobulina ou porção da mesma pode ser do tipo silvestre ou mutante ou modificada. Em determinadas modalidades, a região constante de imunoglo- bulina ou porção da mesma pode ser de mamífero, incluindo de ser humano ou camundongo. Exemplos não-limitativos adicionais de beta polipeptídeos incluem um beta polipeptídeo compreendendo uma ou mais mutações de aminoácido na região constante de imunoglobulina ou porção da mesma (por exemplo, substituição de cisteína 120 de SEQ ID NO: 4) e um beta polipeptídeo compreendendo outras mutações em uma ou mais das posições de aminoácido 25, 30, 93, 96, 103 ou 105 de SEQ ID NO: 18. Uma molécula de beta polipeptídeo compreende um beta polipeptídeo. Uma molécula de beta polipeptídeo pode se referir a um monômero do beta polipeptídeo e formas multiméri- cas do beta polipeptídeo, tais como dímeros, tetrâmeros e hexâmeros, etc. Por exemplo, belatacept compreende moléculas de beta polipeptí- deo. Moléculas de beta polipeptídeo são ainda descritas no Pedido Provisório U.S. No. 60/849.543 depositado em 5 de Outubro de 2006, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[000153] Conforme usado aqui, os termos "glutamato" e "ácido glu- tâmico" são usados permutavelmente.
[000154] Conforme usado aqui, o termo "dímero" se refere a uma proteína de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig composta de dois po- lipeptídeos de CTLA4-Ig ou monômeros ligados ou unidos juntos. A ligação entre monômeros de um dímero pode ser uma ligação ou interação não covalente, uma ligação ou interação covalente ou ambos. Um exemplo de um dímero de CTLA4-Ig é mostrado na figura 4. Uma proteína de CTLA4-Ig ou molécula de CTLA4-Ig composta de dois mo- nômeros idênticos é um homodímero. Um homodímero de CTLA4-Ig também abrange uma molécula compreendendo dois monômeros que podem diferir ligeiramente quanto à sequência. Um homodímero abrange um dímero onde os monômeros unidos juntos têm substancialmente a mesma sequência. Os monômeros compreendendo um ho- modímero compartilham homologia estrutural considerável. Por exemplo, as diferenças na sequência podem ser em virtude de modificações de processamento N-terminais do monômero.
[000155] Conforme usado aqui, "mutação conservativa" se refere a uma alteração em uma sequência de ácido nucleico que substitui um aminoácido por outro da mesma classe (por exemplo, substituição de um aminoácido não polar por outro, tais como isoleucina, valina, leuci- na ou metionina; ou substituição de um aminoácido polar por outro, tais como substituição de arginina por lisina, ácido glutâmico por ácido aspártico ou glutamina por asparagina).
[000156] Conforme usado aqui, "mutação não conservativa" se refere a uma alteração em uma sequência de ácido nucleico que substitui um aminoácido por outro de uma classe diferente (por exemplo, substituição de um aminoácido básico, tal como lisina, arginina ou histidina, por um aminoácido ácido, tal como ácido aspártico ou ácido glutâmi- co). Por exemplo, um aminoácido pode ser bioquimicamente dissimilar de outro aminoácido baseado no tamanho, carga, polaridade, reativi- dade ou outras de tais características dos aminoácidos.
[000157] Conforme usado aqui, "isolado" se refere a uma molécula que é tirada de seu ambiente nativo e está em um ambiente diferente daquele no qual a molécula ocorre naturalmente ou uma substância (por exemplo, uma proteína) que é parcial ou completamente recuperada ou separada de outros componentes de seu ambiente, de modo que a substância (por exemplo, proteína) é a espécie predominante (por exemplo, espécie de proteína) presente na composição, mistura ou coleção de componentes resultantes (por exemplo, em uma base molar, ela é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Por exemplo, um preparado pode consistir em mais de cerca de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 ou 95% de CTLA4-Ig isolada. "Isolada" não exclui misturas de moléculas de CTLA4-Ig com outras moléculas de CTLA4-Ig do ambiente no qual a molécula ocorre naturalmente. "Isolada" não exclui excipientes farmaceuticamente aceitáveis combinados com CTLA4-Ig, em que a CTLA4-Ig foi recuperada de seu ambiente, tal como uma cultura de célula, uma cultura em batelada ou um biorreator, etc. Conforme usado aqui, "isolamento" se refere à realização de um processo ou método para obter uma molécula de CTLA4-Ig isolada.
[000158] Conforme usado aqui, o termo "CTLA4 solúvel" significa uma molécula que pode circular in vivo ou CTLA4 a qual não é ligada a uma membrana celular. Por exemplo, a CTLA4 solúvel pode incluir CTLA4-Ig a qual inclui a região extracelular de CTLA4 ligada a uma Ig.
[000159] Conforme usado aqui, o termo "fração solúvel de uma cultura de célula" se refere à porção líquida de uma outra cultura de célula que não ou a qual é substancialmente isenta de componentes insolúveis, em partículas ou sólidos da cultura de célula, tais como células, membranas celulares e núcleos. A fração solúvel pode ser, por exemplo, o sobrenadante resultante após centrifugação da cultura de célula ou o filtrado resultante após filtração da cultura de célula.
[000160] Conforme usado aqui, o termo "cassete de expressão" se refere a um ácido nucleico tendo pelo menos a região regulatória 5‘ (por exemplo, promotor) operavelmente ligada a uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo e opcionalmente uma região de término não traduzida 3‘ (por exemplo, códon terminal e sequência de poliadenilação). Sob condições apropriadas, um polipeptídeo codificado por um cassete de expressão é produzido pelo cassete de expressão. Um cassete de expressão pode também ter uma ou mais sequências de nucleotídeo que objetivam a integração do cassete de expressão em um sítio específico no genoma de uma célula hospedeira (por exemplo, veja Koduri e outros, (2001) Gene 280: 87-95). Por exemplo, um cassete de expressão de polipeptídeo de CTLA4A29YL104E- Ig derivado de um plasmídeo depositado como No. de Acesso ATCC PTA-2104, é um exemplo de um cassete de expressão que codifica uma CTLA4A29YL104E-Ig.
[000161] Conforme usado aqui, o termo "substancialmente purificada" se refere a uma composição compreendendo a molécula de CTLA4-Ig ou uma população selecionada de moléculas de CTLA4-Ig que é removida de seu ambiente natural (por exemplo, é isolada) e é pelo menos 90% isenta, 91% isenta, 92% isenta, 93% isenta, 94% isenta, 95% isenta, 96% isenta, 97% isenta, 98% isenta, 99% isenta, 99,5% isenta ou 99,9% isenta de outros componentes, tais como material celular ou meio de cultura, com o qual ela está naturalmente associada. Por exemplo, com relação a uma molécula de proteína de CTLA4-Ig recombinantemente produzida, o termo "substancialmente purificada" pode também se referir a uma composição compreendendo uma proteína de molécula de CTLA4-Ig que é removida do ambiente de produção, de modo que a molécula de proteína é pelo menos 90% isenta, 91% isenta, 92% isenta, 93% isenta, 94% isenta, 95% isenta, 96% isenta, 97% isenta, 98% isenta, 99% isenta, 99,5% isenta ou 99,9% isenta de moléculas de proteína as quais não são polipeptídeos de SEQ ID NO: 2 ou polipeptídeos mutantes de SEQ ID NO: 2 os quais são de interesse. "Substancialmente purificada" não exclui misturas de moléculas de CTLA4-Ig (tais como dímeros) com outras moléculas de CTLA4-Ig (tais como tetrâmeros). "Substancialmente purificada" não exclui excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis combinados com moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig foram tiradas de seu ambiente nativo.
[000162] Conforme usado aqui, o termo "processo em larga escala" é usado permutavelmente com o termo "processo em escala industrial". O termo "vaso de cultura de semeadura" é usado permutavelmente com "biorreator", "reator" e "tanque".
[000163] Uma "cultura líquida" se refere a células (por exemplo, células de bactérias, planta, inseto, levedo ou animal) desenvolvidas sobre suportes ou desenvolvidas em suspensão em um meio nutriente líquido.
[000164] Uma "cultura de semeadura" se refere a uma cultura de célula desenvolvida de forma a ser usada para inocular volumes maiores de meio de cultura. A cultura de semeadura pode ser usada para inocular volumes maiores de meios de forma a expandir o número de células em crescimento na cultura (por exemplo, células desenvolvida em suspensão).
[000165] Conforme usado aqui, "cultura" se refere ao crescimento de uma ou mais células in vitro sob condições definidas ou controladas. Exemplos de condições de cultura as quais podem ser definidas incluem temperatura, mistura de gás, tempo e formulação de meio.
[000166] Conforme usado aqui, "expansão" se refere à cultura de uma ou mais células in vitro para fins de obtenção de um número maior de células na cultura.
[000167] Conforme usado aqui, "população" se refere a um grupo de duas ou mais moléculas ("população de moléculas") ou células ("população de células") que são caracterizadas pela presença ou ausência de uma ou mais propriedades mensuráveis ou detectáveis. Em uma população homogênea, as moléculas ou células na população são caracterizadas pela mesma ou substancialmente as mesmas propriedades (por exemplo, as células de uma linhagem de célula clonal). Em uma população heterogênea, as moléculas ou células na população são caracterizadas por pelo menos uma propriedade que é a mesma, onde as células ou moléculas podem também exibir propriedades que não são as mesmas (por exemplo, uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um teor médio de ácido siálico substancialmente similar, mas tendo um teor de manose não similar).
[000168] Conforme usado aqui, "agregado de espécies de elevado peso molecular" é usado permutavelmente com "espécies de elevado peso molecular" para se referir a uma molécula de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos três monômeros de CTLA4-Ig. Por exemplo, um agregado de espécies de elevado peso molecular pode ser um tetrâ- mero, um pentâmero ou um hexâmero.
[000169] "Rendimento percentual (%)" se refere ao rendimento real dividido pelo rendimento teórico e esse valor multiplicado por 100. O rendimento real pode ser fornecido como o peso em grama ou em molécula (por exemplo, um rendimento molar). O rendimento teórico pode ser fornecido como o rendimento ideal ou matematicamente calculado.
[000170] Conforme usado aqui uma quantidade de MCP-1" se refere a (1) uma quantidade de MCP-1 (Proteína-1 quimiotática de monócito, especialmente MCP-1 de hamster) sozinha ou (2) uma quantidade de proteína "semelhante a MCP-1", fragmentos de MCP-1, e/ou fragmentos de proteínas homólogas a MCP-1 (por exemplo, em cada um dos casos antes mencionados, conforme pode ser de reação cruzada com um ensaio de anticorpo (por exemplo ELISA policlonal para a detecção de MCP-1). A ausência de MCP-1 (e/ou proteínas homólogas a MCP- 1, fragmentos de MCP-1 e/ou fragmentos de proteínas homólogas a MCP-1) é considerada onde nenhum limite mínimo é proporcionado com relação a uma faixa de quantidades de MCP-1.
[000171] Conforme usado aqui, "teor de glicosilação" se refere a uma quantidade de resíduos de açúcar N-ligados ou O-ligados covalente- mente presos a uma molécula de proteína, tal como uma glicoproteína, tal como uma molécula de CTLA4-Ig.
[000172] Conforme usado aqui, o termo "proporção molar de ácido siálico para proteína" é calculado e fornecido como o número de mols de moléculas de ácido siálico por mols de proteína (moléculas ou dí- mero de CTLA4-Ig).
[000173] Conforme usado aqui, o termo "glicoproteína" se refere a uma proteína que é modificada através da adição de um ou mais carboidratos, incluindo a adição de um ou mais resíduos de açúcar.
[000174] Conforme usado aqui, o termo "sialilação" se refere à adição de um resíduo de ácido siálico a uma proteína, incluindo uma gli- coproteína.
[000175] Conforme usado aqui, o termo "isoforma de glicoproteína" se refere a uma molécula caracterizada por seu teor de carboidrato e ácido siálico, conforme determinado através de eletroforese em gel de focalização isoelétrica (IEF) ou outros métodos adequados para distinguir diferentes proteínas em uma mistura por seu peso molecular, carga e/ou outras características. Por exemplo, cada banda distinta observada sobre um gel de IEF representa moléculas que têm um ponto isoelétrico (pI) em particular e, assim, a mesma carga global líquida. Uma isoforma de glicoproteína pode ser uma banda distinta observada sobre um gel de IEF, onde cada banda pode ser uma população de moléculas que tem um pI em particular.
[000176] "Tolerância imune" se refere a um estado de não responsi- vidade a um antígeno ou grupo de antígenos específico ao qual uma pessoa é normalmente responsiva (por exemplo, um estado no qual uma célula T não pode mais responder ao antígeno).
[000177] "Potência" se refere a uma medida da resposta como uma função da concentração de ligante. Por exemplo, potência agonista é quantificada como a concentração de ligante que produz metade do efeito máximo (EC50). Uma definição farmacológica não limitativa de potência inclui componentes de afinidade e eficácia, onde eficácia é capacidade de um fármaco de estimular uma resposta uma vez ligado. Potência está relacionada à afinidade, mas a potência e a afinidade são diferentes medidas de ação de fármaco.
[000178] Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um veículo para um agente farmacologicamente ativo. O veículo facilita a distribuição do agente ativo ao local alvo sem terminar a função do agente. Exemplos não-limitativos de formas adequadas do veículo incluem soluções, cremes, géis, emulsões de gel, geleias, pastas, loções, unguentos, sprays, pomadas, pós, misturas sólidas, aerossóis, emulsões (por exemplo, água em óleo ou óleo em água), soluções aquosas de gel, soluções aquosas, suspensões, linimentos, tinturas e emplastros adequados para administração tópica.
[000179] Conforme usado aqui, a frase "composição farmaceutica- mente aceitável" (ou "composição farmacêutica") se refere a uma composição que é aceitável para administração farmacêutica, tal como a um ser humano. Tal composição pode incluir substâncias que são impuras em um nível não excedendo a um nível aceitável para administração farmacêutica, tal nível incluindo uma ausência de tais impurezas) e pode incluir excipientes, veículos, carreadores e outros ingredientes inativos farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, para formular tal composição para facilidade de administração, além de qualquer (quaisquer) agente(s) ativo(s). Por exemplo, uma composição de CTLA4-Ig farmaceuticamente aceitável pode incluir MCP-1 ou DNA, desde que essas substâncias estejam em um nível aceitável para ad-ministração a seres humanos.
[000180] "Substância de fármaco" é o ingrediente farmacêutico ativo contido em uma composição farmacêutica. O termo "substância de fármaco" inclui um ingrediente farmacêutico ativo em solução e/ou na forma tamponada. "Produto de fármaco" é uma composição farmacêutica contendo substância de fármaco formulada para administração farmacêutica. Para fins dos ensaios contidos nos Exemplo e em qualquer parte aqui, a qual possa se referir a uma substância de fármaco e/ou produto de fármaco, substâncias de fármaco e produtos de fár- maco exemplificativos que podem ser ensaiados são como segue.
[000181] Uma substância de fármaco exemplificativa para moléculas de CTLA4-Ig compreendendo SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18, é proteína de CTLA4-Ig em uma concentração de 50 mg/mL, em uma solução aquosa tamponada (fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,5).
[000182] Um produto de fármaco exemplificativo para moléculas de CTLA4-Ig compreendendo SEQ ID NOs: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 é 250 mg de proteína de CTLA4-Ig liofilizada, 500 mg de maltose, 17,2 mg de fosfato de sódio monobásico e 14,6 mg de cloreto de sódio, pH de 7,0 - 8,0; ou Composição de produto de fármaco de proteína de CTLA4-Ig liofi- lizada (250 mg / frasco)
Figure img0006
[000183] Uma substância de fármaco exemplificativa para moléculas de CTLA4-Ig compreendendo SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24 é proteína de CTLA4-Ig em uma concentração de 25 mg/ml, em uma solução aquosa tamponada (fosfato de sódio a 25 mM, cloreto de sódio a 10 mM, pH de 7,5).
[000184] Um produto de fármaco exemplificativo para moléculas de CTLA4-Ig compreendendo SEQ ID NOs: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24: Composição de produto de fármaco de CLTA4A29YL104E-Ig liofilizada - 100 mg / frasco
Figure img0007
[000185] Conforme usado aqui, os termos "meio de cultura" e "meio de cultura de célula" e "meio de alimentação" e "meio de fermentação" se referem à soluções nutrientes usadas para desenvolvimento ou manutenção de células, especialmente células de mamífero. Sem limitação, essas soluções proporcionam, comumente, pelo menos um componente de uma ou mais das seguintes categorias: (1) uma fonte de energia, usualmente na forma de um carboidrato, tal como glicose; (2) todos os aminoácidos essenciais e usualmente o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; (3) vitaminas e/ou outros compostos orgânicos requeridos em baixas concentrações; (4) ácidos graxos livres ou lipídios, por exemplo, ácido linoleico; e (5) elementos vestigi- ais, onde elementos vestigiais são definidos como compostos inorgânicos ou elementos que ocorrem naturalmente que são, tipicamente, requeridos em concentrações muito baixas, usualmente na faixa de micromolar. A solução nutriente pode ser suplementada eletivamente com um ou mais componentes de qualquer uma das seguintes categorias: (1) hormônios e outros fatores de crescimento, tais como soro, insulina, transferrina e fator de crescimento epidérmico; (2) sais, por exemplo, magnésio, cálcio e fosfato (3) tampões, tal como HEPES; (4) nucleosídeos e bases, tais como adenosina, timidina e hipoxantina; (5) proteína e hidrolisatos teciduais, por exemplo, peptona ou misturas de peptona as quais podem ser obtidas de gelatina purificada, material vegetal ou subprodutos animais; (6) antibióticos, tais como gentamici- na; (7) agentes protetores de células, por exemplo, poliol pluronic; e (8) galactose.
[000186] O termo "inoculação", conforme usado aqui, se refere à adição de células a um meio de cultura no início de cultura.
[000187] O termo "fase de crescimento" de uma cultura de célula, conforme usado aqui, se refere ao período de crescimento celular exponencial (por exemplo, a fase log), onde as células estão primariamente em divisão rapidamente. Durante essa fase, a taxa de aumento na densidade de células viáveis é maior do que em qualquer outro ponto de tempo.
[000188] Conforme usado aqui, o termo "fase de produção" de uma cultura de célula se refere ao período de tempo durante o qual o crescimento celular está estacionário ou é mantido em ou próximo de um nível constante. A densidade de células viáveis permanece aproximadamente durante um determinado período de tempo. O crescimento de célula logarítmico terminou e a produção de proteína é a atividade primária durante a fase de produção. O meio, nesse momento, geralmente é suplementado para suportar produção contínua de proteína e obter o produto de glicoproteína desejado.
[000189] Conforme usado aqui, os termos "expressão" ou "expressa" são usados para se referir à transcrição e tradução que ocorrem dentro de uma célula. O nível de expressão de um produto genético em uma célula hospedeira pode ser determinado com base na quantidade de mRNA correspondente que está presente na célula ou na quantidade de uma proteína codificada pelo produto genético que é produzido por uma célula ou ambos. Conforme usado aqui, "glicosilação" se refere à adição de estruturas de oligossacarídeos complexos em uma pro- teína em sítios específicos dentro da cadeia polipeptídica. Glicosilação de proteínas e o subsequente processamento dos carboidratos adicionados pode afetar a estrutura e duplicação da proteína, a estabilidade da proteína, incluindo meia-vida da proteína e propriedades funcionais de uma proteína. Glicosilação de proteína pode ser dividida em duas classes em virtude do contexto de sequência onde a modificação ocorre: glicosilação N-ligada e glicosilação O-ligada. Polissacarídeos O- ligados são ligados a um grupo hidroxila, usualmente ao grupo hidroxi- la de um resíduo de serina ou treonina. O-glicanas não são adicionadas a cada resíduo de serina e treonina. Oligossacarídeos O-ligados são usualmente mono ou biantenários, isto é, eles compreendem uma ou no máximo duas ramificações (antenas) e compreendem de um a quatro tipos diferentes de resíduos de açúcar, os quais são adicionados um por um. Polissacarídeos N-ligados são presos ao nitrogênio da amida de uma asparagina. Apenas asparaginas que são partes de uma de duas sequências tripeptídicas, quer asparagina-X - serina ou asparagina - X - treonina (onde X é qualquer aminoácido exceto prolina), são alvos para glicosilação. Oligossacarídeos N-ligados podem ter de uma a quatro ramificações referidas como mono -, bi-, tri- e tetra- antenárias. As estruturas de resíduos de açúcar encontradas em oli- gossacarídeos O- e N-ligados são diferentes. A despeito dessa diferença, o resíduo terminal sobre cada ramificação de um polissacarídeo O- e N-ligado pode ser modificado através de uma molécula de ácido siálico, uma modificação referida como revestimento de ácido siálico. O ácido siálico é um nome comum para uma família de monossacarí- deos com nove carbonos únicos, os quais podem ser ligados a outros oligossacarídeos. Dois membros na família são ácido N-acetil neura- mínico, abreviado como Neu5Ac ou NANA e ácido N-glicolil neuramí- nico, abreviado como Neu5Gc ou NGNA. A forma mais comum de ácido siálico em seres humanos é NANA. Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálico primária presente em moléculas de CTLA4-Ig. Contudo, deve ser notado que níveis mínimos, mas de- tectáveis de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) também estão presentes em moléculas de CTLA4-Ig. Além disso, o método descrito aqui pode ser usado para determinar o número de mols de ácido siálico para NANA e NGNA e, portanto, os níveis de NANA e NGNA são determinados e reportados para moléculas de CTLA4-Ig. Oligossacarídeos O- e N-ligados têm diferentes números de ramificações, as quais proporcionam diferentes números de posições às quais moléculas de ácido siálico podem ser presas. Oligossacarídeos N-ligados podem proporcionar até quatro posições de fixação para ácidos siálicos, enquanto que oligossacarídeos O-ligados podem proporcionar 2 sítios para fixação de ácido siálico.
[000190] Conforme usado aqui, o termo "processo em larga escala" pode ser usado permutavelmente com o termo "processo em escala industrial". Além disso, o termo "vaso de cultura de semeadura" pode ser usado permutavelmente com "biorreator", "reator" e "tanque".
[000191] Conforme usado aqui, a frase "solução(ões) de trabalho" se refere a soluções que são usadas em um método. Exemplos não- limitativos de soluções de trabalho incluem tampões.
[000192] Conforme usado aqui, "material de referência" se refere a um material que é usado como um padrão em um método. Por exemplo, um material de referência pode ser usado como um padrão com o qual amostras experimentais são comparadas.
[000193] A ausência de uma substância é considerada onde nenhum limite mínimo é proporcionado com relação a uma faixa de quantidades de tal substância.
[000194] Conforme usado aqui, as temperaturas mencionadas em referência à cultura de células se referem ao ajuste de temperatura sobre o instrumento que regula a temperatura do biorreator. Natural- mente, a temperatura da cultura líquida em si adotará o ajuste de temperatura sobre o instrumento que regula a temperatura para o biorrea- tor. Onde a temperatura se refere a uma cultura de células que é mantida sobre uma prateleira em uma incubadora, a temperatura, então, se refere à temperatura da prateleira da incubadora.
Modalidades não limitativas da invenção:
[000195] A invenção proporciona composições de moléculas de CTLA4-Ig e composições de moléculas mutantes de CTLA4-Ig, tais como CTLA4A29YL104E-Ig. A invenção proporciona composições com determinadas características, tais como determinadas quantidades de endotoxina bacteriana, bioburden, um pI dentro de uma faixa determinada (ou determinadas bandas de IEF dentro de uma faixa determinada de pI), uma determinada quantidade de monômero (cadeia simples), dímero ou espécies de elevado peso molecular (tal como tetrâ- mero), um determinado padrão de peptídeo tríptico, um determinado conjunto de bandas principais sobre SDS-PAGE, um determinado teor de DNA, uma quantidade de MCP-1 não excedendo um determinado máximo, uma quantidade de proteína celular não excedendo a um determinado máximo, uma quantidade de Triton X-100 não excedendo a um determinado máximo, uma quantidade de Proteína A não excedendo a um determinado máximo, um determinado perfil de carboidratos N-ligados, uma determinada composição de amino monossacarí- deos (GlcNac, GalNAc), uma determinada composição de monossaca- rídeos neutros (galactose, fucose, manose), uma determinada quantidade de ligação a B7, uma determinada quantidade de atividade em um ensaio celular de inibição de IL-2 e /ou uma determinada composição de ácido siálico (NANA, NGNA), em cada caso onde as referidas determinadas quantidades podem ser uma faixa ou faixas. A invenção proporciona composições com qualquer uma das características antes mencionadas ou mais de uma das características antes mencionadas, até e incluindo todas as características antes mencionadas em qualquer e todas as possíveis permutações ou combinações. A invenção inclui todas as composições da invenção na forma isolada ou substancialmente purificada ou não na forma isolada ou substancialmente purificada. A invenção proporciona composições as quais são composições farmacêuticas.
[000196] Em um aspecto, a invenção é dirigida a um método para obtenção de uma composição compreendendo uma população isolada de moléculas de CTLA4-Ig de um meio de cultura líquida, o meio compreendendo uma população inicial de moléculas de CTLA4-Ig, em que (1) moléculas de CTLA4-Ig da população inicial têm um ou mais resíduos de ácido siálico, (2) o número de resíduos de ácido siálico por molécula de CTLA4-Ig varia dentro da população inicial e (3) a população inicial compreende dímero de CTLA4-Ig e agregado de espécies de elevado peso molecular e o método compreende (a) coleta, do meio de cultura líquida, de uma cultura de células de mamífero ex-pressando moléculas de CTLA4-Ig; (b) separação das moléculas de CTLA4-Ig dos componentes celulares; (c) separação de dímeros de CTLA4-Ig de agregados moleculares de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig; e (d) separação das moléculas de CTLA4-Ig em duas ou mais frações, em que pelo menos uma fração tem uma maior proporção molar de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig comparado com pelo menos uma outra fração e em que as etapas (b), (c) e (d) são realizadas simultaneamente ou em qualquer ordem, de modo a obter a referida composição.
[000197] Em uma modalidade do método da invenção, a coleta na etapa (a) compreende obtenção de uma fração solúvel da cultura líquida. Em outra modalidade, as etapas (c) e (d) do método compreendem o uso de cromatografia em coluna de modo a obter frações de moléculas de CTLA4-Ig tendo diferentes teores de ácido siálico. Em ainda outra modalidade, o método ainda compreende uso de cromato- grafia em coluna para reduzir o teor de MCP-1 na composição.
[000198] Em algumas modalidades do método da invenção, as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em outras modalidades, as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
[000199] Em algumas modalidades do método da invenção, a fração em (d) tendo a maior proporção molar de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig exibe uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 14. Em modalidades específicas, a proporção molar média é de cerca de 8 a cerca de 11, de cerca de 8 a cerca de 10 ou de cerca de 8 a cerca de 9.
[000200] A invenção proporciona um método para isolamento de moléculas de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions para obter uma composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da composição da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iv) sujeição da composi-ção de (iii) à cromatografia por afinidade para obter uma composição adicionalmente enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (v) sujeição da composição de (iv) à cromatografia de troca de ânions. Em uma modalidade, a composição obtida na etapa (ii) é caracterizada por: (a) uma média de 6,0-10,1 mols de NANA por mol de molécula de CTLA4Ig; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,57 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em outra modalidade, a composição obtida na etapa (iii) é caracterizada por: (a) uma média de 6,8-11,4 mols de NANA por mol de molécula de CTLA4Ig; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma outra modalidade, a composição obtida na etapa (iv) é caracterizada por: (a) uma média de 8,0-11,0 mols de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a composição obtida na etapa (v) é caracterizada por: (a) uma média de 8,011,9 mols de NANA por mol de molécula de CTLA4-Ig; e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento sendo espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de croma- tografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica (SPD). Em uma modalidade, um exemplo de SPD pode ser a 280 nm.
[000201] A presente invenção também proporciona um método para isolamento de uma composição de moléculas de CTLA4-Ig compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4- Ig e, em qualquer ordem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iv) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (v) sujeição da fração solúvel à cromato- grafia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig. Em outro aspec- to, a presente invenção proporciona um método para isolamento de uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-Ig; (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions para obter uma composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição de um produto de proteína da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iv) sujeição de um produto de proteína de (iii) à cromatografia por afinidade para obter uma composição adicionalmente enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (v) sujeição de um produto de proteína de (iv) à cromatografia de troca de ânions, de modo a isolar uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig.
[000202] Em uma modalidade, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig obtida na etapa (ii) do método é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4Ig de 6,0 a 10,1 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em outra modalidade, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig obtida na etapa (iii) do método é caracterizada pelo fato de que (a) a área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig é menos de cerca de 2,5% conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec- trofotométrica, (b) proteína celular é menos de cerca de 95 ng/ml e (c) MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm. Em uma modalidade adicional, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig obtida na etapa (iii) do método é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de 6,8 a 11,4 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma outra modalidade, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig obtida na etapa (iv) do método é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de 8,0 a 11,0 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec- trofotométrica. Em ainda outra modalidade, a composição obtida na etapa (iii) da invenção é caracterizado pelo fato de que a área percentual de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig é menos de 2,5% conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em ainda outra modalidade, a proteína composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig na etapa (v) do método é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de 8,0 a 11,9 e (b) uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de croma- tografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.
[000203] A invenção também proporciona, em outro aspecto, um método para isolamento de uma composição de moléculas de CTLA4-Ig, compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-Ig e, em qualquer ordem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iv) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (v) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição obtida na etapa (iii) é caracterizada pelo fato de que o percentual da área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig é menos de cerca de 2,5%, proteína celular é menos de 95 ng/ml e MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm.
[000204] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para isolamento de uma composição de moléculas de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-Ig e, em qualquer ordem, (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iv) sujeição da fração solúvel à cromato- grafia por afinidade de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (v) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição enriquecida e eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição obtida na etapa (iii) é caracterizado pelo fato de que o percentual da área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig é menos de cerca de 2,5%, proteína celular é menos de 95 ng/ml, MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm e a proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 8,0 a cerca de 12.
[000205] Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) do método é realizada usando um tampão de lavagem com- preendendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCl a cerca de 360 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) da invenção é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma modalidade adicional, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) do método é realizada usando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em ainda outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando um tampão de eluição compreendendo glicina a cerca de 100 mM e tendo um pH de cerca de 3,5. Em ainda outra modalidade, a cromato- grafia de troca de ânions da etapa (v) do método é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl de cerca de 120 mM a NaCl a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em ainda outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) do método é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em ainda outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) do método é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions compreen-dendo um grupo funcional amina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em uma modalidade específica, a resina compreende um grupo funcional amina quaternária. Em ainda outra modalidade, a cro- matografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) do método é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica compreendendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma modalidade específica, o grupo funcional compreende um grupo funcional fenila. Em ainda outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando uma resina de cro- matografia por afinidade compreendendo Proteína A.
[000206] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para preparo de uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, compreendendo purificação de moléculas de CTLA4-Ig de uma cultura de célula líquida, em que uma composição purificada de CTLA4-Ig compreende (a) uma quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1 por mg de moléculas de CTLA4-Ig e (b) uma área de menos do que 2,5% de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, a quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1 compreende cerca de 40 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a quantidade farmaceuticamente aceitável de MCP-1 compreende cerca de 35 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. Em uma modalidade adicional, a quantidade farmaceutica- mente aceitável de MCP-1 compreende cerca de 10 a cerca de 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. Em uma outra modalidade, a cro- matografia por afinidade da etapa (iv) do método é realizada usando uma coluna compreendendo uma resina capaz de reduzir a MCP-1 no produto de proteína eluído. Em ainda outra modalidade, a cromatogra- fia de interação hidrofóbica da etapa (iii) do método é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica, em que a resina é capaz de (a) separação de dímeros de CTLA4-Ig de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig; (b) aumento do teor de ácido siálico das moléculas eluídas de CTLA4-Ig; ou (c) ambos (a) e (b). Em ainda outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) ou etapa (iv) ou ambas, é realizada usando uma resina de troca de ânions, em que a resina é capaz de (a) diminuir o teor de agregados de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig da composição eluída; (b) aumentar o teor de ácido siálico da composição eluída; ou (c) ambos (a) e (b).
[000207] Em outro aspecto, a invenção proporciona um método para isolamento de uma composição compreendendo moléculas de CTLA4- Ig, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel de uma cultura líquida compreendendo células de mamífero que produzem moléculas de CTLA4-Ig e, em qualquer ordem; (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade de modo a obter uma composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da fração solúvel à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição eluída e enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (iv) sujeição da fração solúvel à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter uma composição eluída e enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade etapa é realizada primeiro. Em outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) do método é realizada usando uma resina compreendendo Proteína A. Em uma modalidade adicional, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo guanidina. Em uma outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo ureia. Em ainda outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) resulta em um aumento em dímeros de CTLA4-Ig na composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig.
[000208] Em ainda outro aspecto, a invenção proporciona um método para isolamento de composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig de líquido coletado de uma cultura de células de mamífero, em que as células produzem moléculas de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (i) obtenção de uma fração solúvel do líquido coletado; (ii) sujeição da fração solúvel à cromatografia por afinidade para obter uma composição eluída compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; (iii) sujeição da composição da etapa (ii) à cromatografia de troca de ânions de modo a obter uma composição eluída e enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig; e (iv) sujeição da composição da etapa (iii) à cromatografia de interação hidrofóbica para obter uma composição adicionalmente enriquecida compreendendo moléculas de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a composição obtida na etapa (iv) do método é caracterizada pelo fato de que o percentual de espécies de elevado peso molecular é uma área de menos do que cerca de 2,5% conforme determinado através de cromatografia por exclusão de ta-manho e detecção espectrofotométrica e o percentual de proteína celular é menos de cerca de 95 ng/ml e o percentual de MCP-1 é menos de cerca de 5 ppm. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em uma modalidade adicional, a cromato- grafia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7. Em uma modalidade específica, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica compreendendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma outra modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 a cerca de 1,2 M e tendo um pH de cerca de 7. Em ainda outra modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 150 mM e tendo um pH de cerca de 7,5. Em ainda outra modalidade, a cromatografia por afini- dade da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo glicina a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 3. Em outra modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions compreendendo um grupo funcional amina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em uma modalidade específica, a resina compreende um grupo funcional amina quaternária.
[000209] Em uma modalidade, a cromatografia de interação hidrofó- bica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofó- bica compreendendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma modalidade, o grupo funcional compreende um grupo funcional fenila. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (ii) é realizada usando uma resina compreendendo Proteína A. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig obtida através de qualquer um dos métodos da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A invenção proporciona um plasmídeo de expressão de CTLA4-Ig tendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 17. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5.
[000210] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as molé-culas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5 a cerca de 10. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 18.
[000211] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 11. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 7 a cerca de 12.
[000212] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 7 a cerca de 11. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 12 a cerca de 18,
[000213] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 13 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 14 a cerca de 18. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 17.
[000214] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 16. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 10. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6. Em uma modalidade, o ácido siálico é ácido N-acetil neuramínico (NANA). A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para moléculas de CTLA4-Ig de menos do que ou igual a cerca de 1,5.
[000215] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 0,5 a cerca de 1,5. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,0 a cerca de 1,5. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18.
[000216] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12.
[000217] A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada poli- peptídeo da molécula compreende sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. Em uma modalidade, a proporção molar de ácido siálico por mol de moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de hidrólise ácida e HPLC. Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um ou mais po- lipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[000218] Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A invenção proporciona uma composição substancialmente purificada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que mais de ou igual a 95% das moléculas de CTLA4-Ig são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de ou igual a 98% das moléculas de CTLA4-Ig são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de ou igual a 99% das moléculas de CTLA4-Ig são dímeros de CTLA4-Ig.
[000219] Em uma modalidade, mais de ou igual a 99,5% das moléculas de CTLA4-Ig são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% das moléculas de CTLA4-Ig são díme- ros de CTLA4-Ig e uma área de cerca de 0,5 por cento a uma área de cerca de 5 por cento das moléculas são espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, cerca de 98,6% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig e uma área de cerca de 1,2 por cento das moléculas são espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig e uma área de menos do que cerca de 0,7 por cento das moléculas são monômeros de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, cerca de menos do que 0,3% das moléculas são multímeros compreendendo cinco ou mais monômeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição consistindo essencialmente em dímeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição consistindo essencialmente em moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de monômeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição consistindo essencialmente em moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição consistindo essencialmente em monômeros de CTLA4-Ig substancialmente isenta de dímeros e espécies de elevado peso molecular de CTLA4- Ig. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem pelo menos 3 grupos ácido siálico. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem pelo menos 2,5 grupos ácido siálico. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelo menos 8 grupos ácido siálico.
[000220] Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem de pelo menos 2,5 grupos ácido siálico a pelo menos 5 grupos ácido siálico. Em uma modalidade, cada dímero compreende dois polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5-16. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais polipeptídeos tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo tetrâmeros de CTLA4-Ig, a qual é substancialmente isenta de dímeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo tetrâmeros de CTLA4-Ig a qual é substancialmente isenta de monômeros de CTLA4- Ig. Em uma modalidade, a composição existe como uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada tetrâ- mero compreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 5-10. Em uma modalidade, cada tetrâmero compreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 11-16. Em uma modalidade, cada tetrâmero é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. A invenção proporciona uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição é substancialmente isenta de MCP-1. A invenção proporciona uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende não mais do que cerca de 25 ppm de MCP-1. Em uma modalidade, a composição compreende não mais do que 10 ppm de MCP-1. Em uma modalidade, a composição compreende cerca de 0,2 ng/ml de MCP-1 a cerca de 10 ng / ml de MCP- 1. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição far- maceuticamente aceitável compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende (a) de cerca de 0,2 ng/ml de MCP- 1 a cerca de 10 ng/ml de MCP-1 e (b) não mais do que 25 ng/ml de proteína de CHO ou não mais do que 10 ng/ml de proteína de CHO. Em uma modalidade, a composição compreende não mais do que cerca de 20 pg/ml de DNA.
[000221] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig em que, quando administrada a um indivíduo em uma dose intravenosa de cerca de 10 mg/kg, as moléculas de CTLA4-Ig são capazes de exibir: uma área sob a curva (AUC) de cerca de 44400 μg.h/ml; um volume de distribuição de cerca de 0,09 L/kg; uma concentração de pico (Cmax) de cerca de 292 μg/ml; e uma taxa de eliminação de cerca de 0,23 ml/h/kg. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4- Ig, em que a composição compreende isoformas dominantes de moléculas de CTLA4-Ig visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétri- ca o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menor do que ou igual a 5,1 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, o pI médio da composição aumenta após tratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoe- létrica. Em uma modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoe- létrica. Em uma modalidade, pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoe- létrica. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2.
[000222] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7 ± 0,2. Em uma modalidade, a composição é substancialmente purificada. A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, a composição compreendendo uma molécula de CTLA4-Ig com um pI de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição de uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig à eletroforese em gel de focalização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de moléculas de CTLA4-Ig com um pI em particular e (b) isolamento da população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica o qual tem um ponto isoelétri- co, pI, menor do que ou igual a 5,5 ± 0,2 conforme determinado atra- vés de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, o pI médio da composição aumenta após tratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 ± 0,2 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelé- trico de menos do que ou igual a cerca de 5,3 ± 0,2 conforme determi-nado através de focalização isoelétrica. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2.
[000223] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,5 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,7 ± 0,2 a cerca de 5,1 ± 0,2. Em uma modalidade, a composição é substancialmente purificada.
[000224] A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig com um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição de uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig à eletroforese em gel de focalização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de moléculas de CTLA4-Ig com um pI em particular e (b) isolamento da população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,0 ± 0,2 a cerca de 5,2 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 17 a cerca de 28. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4- Ig de cerca de 17 a cerca de 25. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35.
[000225] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporcio-na uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6.
[000226] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de galactose para molé- culas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3.
[000227] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6,4 a cerca de 7,0. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 7,7 a cerca de 22. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo da molécula compreende a sequência de SEQ ID NO: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 e em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 14 a cerca de 16.
[000228] Em uma modalidade, a proporção molar de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, a proporção molar de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, a proporção molar de galactose para moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de eletroforese capilar.
[000229] Em uma modalidade, a proporção molar de fucose para moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, a proporção molar de manose para moléculas de CTLA4-Ig é determinada através de eletroforese capilar. Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-Ig são obtidas através de fixação enzimática de um ou mais carboidratos à molécula. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas compreendem resíduos de carboidrato presos às moléculas enzimaticamente in vitro. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4- Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma composição compreenden- do moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6,4 a cerca de 7,0; (e) uma proporção molar média de manose para proteína de CTLA4-Ig de cerca de 14 a cerca de 16; e (f) uma proporção molar média de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5.
[000230] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são glico- siladas em um resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2 ou 4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2 ou 4, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 2 ou 4, um resíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2 ou 4 ou um resíduo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2 ou 4. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são glicosiladas e em que pelo menos cerca de 2 % da massa total de glicosilação é glicosilação O-ligada.
[000231] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição exibe um pico por cro- matograma de NGNA de cerca de 9,6 ± 0,3 e um pico por cromato- grama de NANA de cerca de 10,5 ± 0,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig exibem um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme na figura 68. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA-Ig exibem um perfil de carboidrato conforme mostrado na figura 68. A invenção proporciona uma composição consistindo essen-cialmente em moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, em que o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio II compreende picos os quais representam oli- gossacarídeos monossialilados, o Domínio III compreende picos os quais representam oligossacarídeos dissialilados, o Domínio IV compreende picos os quais representam oligossacarídeos trissialilados e Domínio V compreende picos os quais representam oligossacarídeos tetrassialilados e em que o perfil é um cromatograma de oligossacarí- deos liberados de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-ligados entre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio II é de cerca de 10 a cerca de 12 minutos. Em uma modalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N-ligados entre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio II é de cerca de 11 a cerca de 13 minutos. Em uma modalidade, glicosilação dos Domínios III e IV compreende cerca de 25% a cerca de 36% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosila- ção do Domínio I compreende cerca de 24,5% a cerca de 35,2% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Domínio II compreende cerca de 26,3% a cerca de 34,1% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Domínio III compreende cerca de 21,9% a cerca de 31,5% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, glicosilação do Domínio IV e Domínio V compreende cerca de 7,9% a cerca de 18,6% de glicosilação N-ligada conforme medido através de HPAEC.
[000232] Em uma modalidade: (a) o Domínio I exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 31; (b) o Domínio II exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 33; (c) o Domínio III exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 24; (iv) o Domínio IV exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 9,4, (v) o Domínio V exibe uma área percentual de pelo menos cerca de 67; ou em que a área é medida a partir de um cromatograma de oligossacarídeos liberados de CTLA4-Ig.
[000233] Em uma modalidade: (a) o Domínio I exibe pelo menos cerca de 5 picos; (b) o Domínio II exibe pelo menos cerca de 5 picos; (c) o Domínio III exibe pelo menos cerca de 5 picos; (d) o Domínio IV exibe pelo menos cerca de 6 picos ou (e) o Domínio V exibe pelo menos cerca de 6 picos e em que os picos são exibidos sobre um cromato- grama. A composição em que o Domínio I exibe pelo menos dois picos, em que um primeiro pico tem uma área mínima de cerca de 4,5% e uma área máxima de cerca de 11,2% e em que um segundo pico tem uma área mínima de cerca de 8,7% e um máximo de cerca de 11,8%.
[000234] Em uma modalidade, os Domínios III e IV exibem uma área percentual de cerca de 25% a cerca de 36% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, o Domínio I exibe uma área percentual de cerca de 24,5% a cerca de 35,2% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, o Domínio II exibe uma área percentual de cerca de 26,3% a cerca de 34,1% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, o Domínio III exibe uma área percentual de cerca de 21,9% a cerca de 31,5% conforme medido através de HPAEC. Em uma modalidade, o Domínio IV exibe uma área percentual de cerca de 7,9% a cerca de 18,6% conforme medido através de HPAEC.
[000235] A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80% dos polipeptí- deos têm glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14% dos poli- peptídeos têm glicosilação N-ligada tri-antenária; e (c) cerca de 6% dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária. Em uma modalidade, a glicosilação N-ligada é determinada através de croma- tografia de troca de ânions em pH elevado com detecção amperomé- trica pulsada (HPEAC-PAD). A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; e (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; e (c) uma área percentual de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 3% conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; e (c) uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-Ig de menos do que ou igual a cerca de 1,5.
[000236] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (c) uma área de teor de agregados de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 3 por cento conforme determinado através de croma- tografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; e (d) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme aquele da figura 68. A invenção proporciona a composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (c) uma área de teor de agregados de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 3 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométri- ca; e (d) um teor de glicosilação no Domínios III, IV e V de pelo menos cerca de 29,8% a cerca de 50,1% de glicosilação N-ligada conforme determinado através de HPAEC. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (b) uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; e (c) uma área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 3 por cento conforme determinado através de croma- tografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, as moléculas são ainda caracterizadas por uma pro- porção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 12.
[000237] Em uma modalidade, as moléculas são ainda caracterizadas por: (a) cerca de 80% de glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14% glicosilação N-ligada tri-antenária; e (c) cerca de 6% de gli- cosilação N-ligada tetra-antenária. Em uma modalidade, as moléculas ainda compreendem qualquer combinação de um ou mais de: (a) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (b) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (c) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); e (d) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoáci- do 383 de SEQ ID NO: 2). Em uma modalidade, (a) cerca de 90% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a lisina no resíduo número 383; e (d) cerca de 96% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80 % dos polipeptídeos têm glicosila- ção N-ligada biantenária; (b) cerca de 14 % dos polipeptídeos têm gli- cosilação N-ligada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-Ig de menos do que ou igual a 1,5. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80 % dos polipeptí- deos têm glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14 % dos poli- peptídeos têm glicosilação N-ligada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80% dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14% dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tri-antenária; (c) cerca de 6% dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5.
[000238] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5; e (c) uma área de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 5 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cer- ca de 5,5 a cerca de 9,5; (c) uma área de teor de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 5 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; e (d) um perfil de carboidrato substancialmente o mesmo conforme aquele da figura 68. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de 5,5 a cerca de 9,5; (c) uma área de teor de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 5 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; e (d) um teor de glicosilação no Domínios III, IV e V de pelo menos cerca de 29,8% a cerca de 50,1% de glicosi- lação N-ligada conforme determinado através de HPAEC.
[000239] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 13; (b) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 9,5; e (c) um teor de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig de menos do que cerca de 5 por cento conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em uma modalidade, as moléculas são ainda caracterizadas por: (a) cerca de 80% de glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14% de glicosilação N-ligada tri-antenária; e (c) cerca de 6% de glicosilação N-ligada tetra- antenária, em outra modalidade, as moléculas ainda compreendem qualquer combinação de um ou mais de: (a) a sequência de aminoáci- do de SEQ ID NO: 16 (metionina na posição de aminoácido 27 e glici- na na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); (b) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 (metionina na posição de aminoáci- do 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4); (c) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 4); e (d) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 4), em outra modalidade, (a) cerca de 90% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% das mo-léculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a lisina no resíduo número 383; e (d) cerca de 96% das moléculas compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 terminando com a glicina no resíduo número 382. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80 % dos polipeptídeos têm glicosila- ção N-ligada biantenária; (b) cerca de 14 % dos polipeptídeos têm gli- cosilação N-ligada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de proteína de CTLA4-Ig de cerca de 24 a cerca de 28. A invenção proporciona uma composição compreendendo polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 80 % dos polipep- tídeos têm glicosilação N-ligada biantenária; (b) cerca de 14 % dos po- lipeptídeos têm glicosilação N-ligada tri-antenária; (c) cerca de 6 % dos polipeptídeos têm glicosilação N-ligada tetra-antenária; e (d) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 2,7 a cerca de 3,6, em outra modalidade, a composição é uma composição substancialmente purificada. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que menos de ou igual a cerca de 2,5 % das moléculas de CTLA4-Ig são oxidadas. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que menos de ou igual a cerca de 2,0 % das moléculas de CTLA4-Ig são desamidadas. A invenção proporciona uma composição compreendendo dímeros de moléculas de CTLA4-Ig, em que pelo menos 0,5 % dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados. Em uma modalidade, pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de espectrometria de massa substancialmente o mesmo conforme na figura 64, 65 ou 67. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de eletroforese capilar substancialmente o mesmo conforme na figura 48.
[000240] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de Gal- NAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 3 ppm; (i) uma área de menos do que 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; (j) uma área de menos do que 0,5 por cento de monômero conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométri- ca; (k) polipeptídeos de CTLA4-Ig tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 5-10; (l) moléculas de CTLA4-Ig capaz de ligação a CD80 e CD86. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelé- trica, em uma faixa de cerca de 3,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) uma área de menos do que 2,5 por cento de espécies de elevado peso molecular conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; (j) uma área de menos do que 0,5 por cento de monômero conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; (k) polipeptí- deos de CTLA4-Ig tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 5-10; (l) moléculas de CTLA4-Ig capaz de ligação a CD80 e CD86; ou equivalentes farmacêuticos dos mesmos.
[000241] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig tendo uma incidência de imunogeni- cidade de menos do que ou igual a 7,4%. Em uma modalidade, a incidência de imunogenicidade é de cerca de 2,1% a cerca de 7,4%. Em uma modalidade, a incidência de imunogenicidade é menos de ou igual a 3,7%. Em uma modalidade, a incidência de imunogenicidade é menos de ou igual a 3,0%. Em uma modalidade, a incidência de imu- nogenicidade é de cerca de 2,8% a cerca de 3,0%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4- Ig em que, após administração da composição a seres humanos, a produção de anticorpos que se ligam às moléculas de CTLA4-Ig ocorre em uma incidência, em seres humanos, de menos do que ou igual a 7,4%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 2,1% a cerca de 7,4%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 3,7%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 3,0%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 2,8% a cerca de 3,0%. A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig em que, após administração da composição a seres humanos, a produção de anticorpos que se ligam às porções de CTLA4 das moléculas de CTLA4-Ig ocorre, em seres humanos, em uma incidência de menos do que ou igual a 4,9%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 0,5% a cerca de 4,9%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 1,2%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 1,0%. Em uma modalidade, a incidência é de cerca de 0,9% a cerca de 1,0%. Em uma modalidade, a incidência é medida em um ensaio imunoabsorvente enzi- ma-ligado (ELISA). Em uma modalidade, em que a incidência é medida em um ensaio de eletroquimioluminescência (ECL).
[000242] A invenção proporciona uma composição isolada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que, após administração da composição a seres humanos, a produção de anticorpos que neutralizam as moléculas de CTLA4-Ig ocorre em uma incidência de menos do que ou igual a 75% dos seres humanos tendo anticorpos que se ligam à porção de CTLA4 da molécula de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a incidência é 40-75%. Em uma modalidade, a incidência é menos de ou igual a 40%. Em uma modalidade, a incidência é medida em um ensaio repórter de luciferase baseado em célula.
[000243] A invenção proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a cultura líquida exibe mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. O método também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a cultura líquida exibe de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 mols de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. O método também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4- Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 células viáveis por mL de cultura líquida a cerca de 79 x 105 células por mL de cultura líquida. A invenção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 38%. A invenção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 37%. O método também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isola-mento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. O método também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 4,8 EU por mL de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. A invenção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a bioburden é menos de 1 unidade de formação de colônia por mL de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. A invenção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um rendimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig; (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 células viáveis por mL de cultura líquida a cerca de 79 x 105 células viáveis por mL de cultura líquida; (iii) a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 38%; ou (iv) o rendimento de proteína de CTLA4-Ig é mais de cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, em que a concentração de NANA em (i) e o rendimento em (iv) são determinados através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. A invenção também proporciona um método para produção de proteína de CTLA4-Ig, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que produzem proteína de CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L até a proteína de CTLA4-Ig ser produzida em um ren- dimento de pelo menos cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, conforme determinado através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida; e (b) isolamento da proteína de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i) a cultura líquida contém de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 mols de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig; (ii) a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 37%; ou (iii) o rendimento de proteína de CTLA4-Ig é mais de cerca de 0,5 grama de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida, em que o teor de ácido siálico em (i) e o rendimento em (iii) são determinados através de ensaio de uma alíquota da cultura líquida. Sequências: SEQ ID NO: 1 - Sequência de nucleotídeo de CTLA4-Ig, veja figura 1 SEQ ID NO: 2 - Sequência de aminoácido de CTLA4-Ig, veja figura 1 SEQ ID NO: 3 - Sequência de nucleotídeo de CTLA4A29YL104E-Ig compreende nucleotídeos 79 a 1149 da sequência de ácido nucleico mostrado em figura 2 SEQ ID NO: 23 é a sequência de nucleotídeo de comprimento total mostrada em figura 2. Essa sequência de nucleotídeo inclui a sequência de codificação para a pró-sequência. SEQ ID NO: 4 - Sequência de aminoácido CTLA4A29YL104E-Ig, figura 3, sem a pró-sequência SEQ ID NO: 5 - aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 2 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 6 - aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 7 - aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 8 - aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 2 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 9 - aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 10 - aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 11 - aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 4 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 12 - aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 4 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 13 - aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 4 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 14 - aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 4 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 15 - aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 4 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 16 - aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 4 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 18 - domínio extracelular da sequência de CTLA4 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD SEQ ID NO: 19 5’-AGAAAAGGGGCTGGAGAGATGGCTCAGTGGTTAAGAGCA-3’ SEQ ID NOS: 20-22 SEQ ID NO: 20 -- 5’-GTACTCAGG SEQ ID NO: 21 -- AGTCAGAGAC SEQ ID NO: 22 -- CGGCAGATCTCTGTGAGTTTGAGGCCAGCCTGG TCTACAAAGCAAGTT-3’
Monômeros e Multímeros de CTLA4-Ig
[000244] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona linhagens de células tendo um cassete de expressão que compreende SEQ ID NO: 1 (FIG. 1A). Tal cassete de expressão, quando expresso em células de mamífero, incluindo células de CHO, pode resultar na produção de variantes N- e C- terminais, de modo que as proteínas produzidas a partir do cassete de expressão podem ter a sequência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2 (FIG. 1A). Essas proteínas podem ser referidas aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 2" ou monômeros "tendo a sequência SEQ ID NO: 2." Esses monômeros de SEQ ID NO: 2 podem dimerizar, de modo que combinações de dímero possam incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímero podem também se associar umas com as outras para formar moléculas de CTLA4-Ig tetraméricas. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outros multímeros podem ser referidos aqui como "proteínas de SEQ ID NO: 2" ou proteínas "tendo a sequência SEQ ID NO: 2". Embora a linhagem de células possa produzir essas variantes imediatamente quando de tradução, as variantes podem, mais tipicamente, ser um produto de ações pós-traducionais nas células. A linhagem de célula também secreta moléculas de CTLA4-Ig. Abatacept se refere a proteínas de SEQ ID NO: 2.
[000245] Moléculas de CTLA4-Ig podem incluir, por exemplo, proteínas de CTLA4-Ig nas formas de monômero, dímero, trímero, tetrâme- ro, pentâmero, hexâmero ou outras multiméricas. Moléculas de CTLA4-Ig podem compreender uma fusão de proteína com pelo menos um domínio extracelular de CTLA4 e uma região constante de imunoglobulina. Moléculas de CTLA4-Ig podem ter sequências do tipo silvestre ou mutantes, por exemplo, com relação ao domínio extracelu- lar de CTLA4 e sequências de região constante de imunoglobulina. Monômeros de CTLA4-Ig, sozinhos ou na forma de dímero, tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.
[000246] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm pelo menos um determinado percentual de dímero ou outras moléculas multiméricas. Por exemplo, a invenção proporciona populações de moléculas de CTLA4- Ig que são mais de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dí- meros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que compreende cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímero de CTLA4-Ig e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-Ig compreende cerca de 98 % de díme- ro de CTLA4-Ig, cerca de 1,5% de tetrâmero de CTLA4-Ig e cerca de 0,5% de monômero de CTLA4-Ig.
[000247] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig em que a população é substancialmente isenta de monômeros de moléculas de CTLA4-Ig. Substancialmente isenta de monômeros de moléculas de CTLA4-Ig pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.
[000248] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de multímeros de CTLA4-Ig que são maiores do que dí- meros, tais como tetrâmeros, hexâmeros, etc. (por exemplo, espécies de elevado peso molecular). Substancialmente isenta de moléculas multiméricas de CTLA4-Ig maiores do que dímeros pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de multímeros de CTLA4-Ig (por exemplo, espécies de elevado peso molecular) maiores do que a forma dimérica.
[000249] Um monômero de molécula de CTLA4-Ig pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2 ou (iv) 27382 de SEQ ID NO: 2 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Quando um cassete de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 é expresso em células de CHO, a forma monomérica predominante expressa tem o resíduo de aminoácido metionina no N-término (resíduo 27 de SEQ ID NO: 2), o qual corresponde ao resíduo de aminoácido no N-término da Humano CTLA4 do tipo silvestre. Contudo, em virtude do fato de SEQ ID NO: 1 também incluir a sequência de codificação para uma sequência sinalizadora de oncostatina M (nucleotídeos 1188 de SEQ ID NO: 1), a proteína expressa de SEQ ID NO: 1 contém uma sequência sinalizadora de oncostatina M. A sequência sinalizadora é clivada da proteína expressa durante o processo de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula. Mas clivagem pode resultar em variantes N-terminais, tal como clivagem entre resíduos de aminoácido 25 e 26 de SEQ ID NO. 2 (resultando em um N-término de resíduo 26, isto é, a "variante Ala") ou entre resíduos de aminoácido 24 e 25 de SEQ ID NO. 2 (resultando em um N-término de resíduo 25, isto é, a "variante Met-Ala"), em oposição à clivagem entre resíduos de aminoácido 26 e 27 de SEQ ID NO. 2 (resultando em um N-término de resíduo 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig em cerca de 1% e a variante Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig em cerca de 8-10%. Além disso, a proteína expressa de SEQ ID NO: 1 pode ter variantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-término predominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 2. Em uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig, monômeros tendo lisina no C-término (resíduo 383 de SEQ ID NO: 2) podem estar presentes, por exemplo, em cerca de 4-5%.
[000250] Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 2):SEQ ID NO: 5 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000251] Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 2): SEQ ID NO: 6 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000252] Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 27-383 de SEQ ID NO: 2): SEQ ID NO: 7 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000253] Em outra modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 2): SEQ ID NO: 8 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG;
[000254] Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 2): SEQ ID NO: 9 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
[000255] Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 2): SEQ ID NO: 10 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
[000256] Um monômero de molécula de CTLA4-Ig pode compreen- der um domínio extracelular de Humano CTLA4. Em uma modalidade, o domínio extracelular pode compreender a sequência de nucleotídeo dos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1 que codifica os aminoáci- dos 27-151 de SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, o domínio extra- celular pode compreender sequências de Humano CTLA4 mutante. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender alterações de nucleotídeo para os nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1, de modo que alterações conservativas de aminoácido sejam feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 1.
[000257] Um monômero de molécula de CTLA4-Ig pode compreender uma região constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constante pode ser uma porção de uma região constante; essa região constante pode ter uma sequência do tipo silvestre ou mutante. A região constante pode ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD ou IgE humana. A região constante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imunoglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG, IgD ou IgA. A região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3. Onde a região constante é de IgM ou IgE, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4. Em uma modalidade, a região constante pode compreender um ou mais domínios de domínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE.
[000258] Em uma modalidade, dímeros de CTLA4-Ig são compreendidos de dois monômeros, em que cada monômero pode ter a mesma ou uma sequência de aminoácido diferente e onde a sequência pode ser a sequência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26- 382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Tais monômeros de CTLA4-Ig podem dimerizar através do domínio extracelular da Humano CTLA4 via um resíduo de aminoácido de cisteína na posição 146 de SEQ ID NO: 2.
[000259] A molécula de CTLA4-Ig pode multimerizar através da interação dos domínios de região constante de IgM ou IgA com uma proteína de cadeia J. IgM e IgA são usualmente produzidas como multíme- ros em associação com uma cadeia polipeptídica adicional, a cadeia J. Em IgM pentamérica, os monômeros são ligados cruzadamente através de ligações de dissulfeto uns aos outros no domínio CH3 e à cadeia J através do domínio CH4. IgM pode também formar hexâmeros que carecem de uma cadeia J, onde multimerização é obtida através de ligações de dissulfeto uns aos outros. Em IgA dimérica, os monô- meros têm ligações de dissulfeto a uma cadeia J via seu domínio CH3 e não uns aos outros. Assim, em uma modalidade, a invenção proporciona multímeros de CTLA4-Ig, incluindo dímeros, pentâmeros e he- xâmeros, em que a porção de Ig compreende uma região constante de IgM ou porção da mesma ou uma região constante de IgA ou porção da mesma. Tais multímeros de CTLA4-Ig baseados em IgM ou IgA podem incluir a cadeia J.
[000260] Em uma modalidade, um monômero de molécula de CTLA4-Ig (No. de Acesso da CTLA4 ao GenBank I13253) compreende uma região de dobradiça de IgG1 humana modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ ID NO: 1; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 2) em que as serinas nos resíduos de aminoácido 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 2 foram manipuladas das cisteínas presentes na sequência do tipo silvestre.
[000261] Em uma modalidade, um monômero de molécula de CTLA4-Ig compreende uma região CH2 de IgG1 humana modificada e uma região CH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de IgG1 humana modificado tendo os nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoáci- dos 167-276 de SEQ ID NO: 2; o domínio CH3 de IgG1 tendo os nu- cleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 277-383 de SEQ ID NO: 2).
[000262] Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4-Ig compreende monômeros tendo uma sequência mostrado em qualquer uma ou mais das figuras 7, 8 ou 9 do pedido de Patente U.S. publicado como Publicação No. US 2002/0182211 A1 e nos pedidos de Patente U.S. publicados como Publicações N°s US20030083246 e US20040022787, cada um dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[000263] Em uma modalidade, um tetrâmero de molécula de CTLA4- Ig compreende dois pares ou dois dímeros de polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma das seguintes sequências de aminoácido: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Cada membro do par de polipeptídeos ou dímero é covalentemente ligado ao outro membro e os dois pares de polipeptídeos são não-covalentemente associados um ao outro, desse modo, formando um tetrâmero. Tais moléculas tetraméricas são capazes de ligação ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem se ligar ao CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes mais a avidez de ligação de um dímero de CTLA4-Ig (cujos monômeros têm uma das sequências de aminoácido acima) ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem se ligar ao CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes mais a afinidade ou avidez de ligação da CTLA4 do tipo silvestre ao CD80 ou CD86. Essa maior avidez pode contribuir para maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e outras doenças conforme descrito abaixo, bem como em inibição rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido. Além disso, avidez maior ou aperfeiçoada pode produzir o resultado de maior potência de um fármaco. Por exemplo, uma composição terapêutica compreendendo tetrâmero de CTLA4-Ig teria uma maior avidez e, portanto, maior potência do que a mesma quantidade de uma composição terapêutica tendo monômero de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com um dímero de CTLA4-Ig (cujos monômeros têm uma das sequências de aminoácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com uma molécula de CTLA4 do tipo silvestre.
Monômeros, Dímeros e Multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig
[000264] CTLA4A29YL104E-Ig são formas modificadas de CTLA4-Ig (FIG. 1A; SEQ ID NOS: 1-2). A modificação consiste em mutações de ponto que resultam em duas substituições de aminoácido (L104E e A29Y) conforme mostrado na figura 2 (correspondendo às posições de aminoácido 55 e 130 na figura 3; SEQ ID NO: 4). Com relação a CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig (por exemplo, SEQ ID NOS: 5-10) se liga ao CD80 (B7-1) com avidez aproximadamente 2 vezes aumentada e se liga CD86 (B7-2) com avidez aproximadamente 4 vezes aumentada. CTLA4A29YL104E-Ig são aproximadamente 10 vezes mais eficaz do que a CTLA4-Ig na inibição de proliferação de células T, produção de citocina e morte CD28-dependente de células alvo por células assassinas naturais. CTLA4A29YL104E-Ig causa inibição modesta de proliferação de células T B7-1-mediada, mas é acentuadamente mais potente do que CTLA4-Ig no bloqueio de proliferação de células T B7-2- mediada. A potência aumentada é comparável, quer através de blo- queio de B7-2 apenas ou bloqueio de B7-1 e B7-2, sugerindo que a atividade imunomodulatória intensificada de CTLA4A29YL104E-Ig pode mais provavelmente ser à potência intensificada para bloqueio de B7- 2.
[000265] CTLA4A29YL104E-Ig é uma proteína de fusão geneticamente modificada, a qual consiste no domínio de ligação funcional da CTLA-4 humana modificada e o domínio Fc da imunoglobulina humana da classe IgG1 (FIG. 3A-B). Duas substituições de aminoácido foram feitas na região de ligação a B7 do domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) para gerar uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig. Um dímero de CTLA4A29YL104E-Ig é compreendido de duas cadeias de CTLA4A29YL104E- Ig glicosiladas. Ela existe como um dímero covalente ligado através de uma ligação de dissulfeto intercadeia. Um modelo molecular de uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig é mostrado na figura 4. Uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tem uma massa média de aproximadamente 91.800 Da, conforme determinado através de espectrometria de massa por desabsorção-ionização a laser matriz-assistida time-of-flight (MALDI-TOF).
[000266] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma linhagem de células tendo um cassete de expressão que compreende SEQ ID NO: 3. Tal cassete de expressão, quando expresso em células de mamífero, por exemplo, células de CHO, pode resultar na produção de Variantes N- e C-terminais, de modo que os polipeptí- deos produzidos a partir do cassete de expressão podem ter a sequência de aminoácido de resíduos: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Esses polipeptídeos podem ser referidos aqui como "monômeros de SEQ ID NO: 4" ou monômeros "tendo a sequência SEQ ID NO: 4".
[000267] Esses monômeros de SEQ ID NO: 4 podem dimerizar, de modo que combinações de dímero possam incluir, por exemplo: (i) e (i); (i) e (ii); (i) e (iii); (i) e (iv); (i) e (v); (i) e (vi); (ii) e (ii); (ii) e (iii); (ii) e (iv); (ii) e (v); (ii) e (vi); (iii) e (iii); (iii) e (iv); (iii) e (v); (iii) e (vi); (iv) e (iv); (iv) e (v); (iv) e (vi); (v) e (v); (v) e (vi); e (vi) e (vi). Essas diferentes combinações de dímero podem também se associar umas com as outras para formar moléculas tetraméricas de CTLA4A29YL104E-Ig. Esses monômeros, dímeros, tetrâmeros e outros multímeros podem ser referidos aqui como "polipeptídeos de SEQ ID NO: 4" ou polipeptídeos "tendo a sequência SEQ ID NO: 4". Embora a linhagem de células possa produzir essas variantes imediatamente quando de tradução, as variantes podem, mais tipicamente, ser um produto de ações pós- traducionais nas células. Dímeros pode ser covalentemente unidos juntos, não-covalentemente unidos juntos ou ambos. A invenção proporciona composições que consistem essencialmente de dímeros que são covalentemente ligados juntos. Por exemplo, a invenção proporciona composições onde pelo menos 50% dos dímeros de CTLA4-Ig são compostos de monômeros covalentemente unidos. A invenção também proporciona composições onde pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos dímeros de CTLA4-Ig são compostos de monômeros covalentemente unidos. A invenção também proporciona composições de moléculas de CTLA4- Ig, em que as moléculas estão predominantemente na forma de díme- ro e os dímeros são predominantemente formados através de ligações covalentes. Por exemplo, a invenção proporciona uma composição em que a maioria dos dímeros de CTLA4-Ig é covalentemente unida. É possível que alguma fração dos dímeros de CTLA4-Ig na composição seja unida não-covalentemente.
[000268] Moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig podem incluir, por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig nas formas de monômero, dímero, trímero, tetrâme- ro, pentâmero, hexâmero ou outras multiméricas. Moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig podem compreender uma fusão de proteína com pelo menos um domínio extracelular de CTLA4 modificado (SEQ ID NO: 18) e uma região constante de imunoglobulina. Moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig podem ter sequências mutantes, por exemplo, com relação ao domínio extracelular de CTLA4 modificado e sequências de região constante de imunoglobulina. Monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig, sozinhos ou na forma de dímero, tetrâmero ou outro multímero, podem ser glicosilados.
[000269] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm pelo menos um determinado percentual de dímero ou outras moléculas multiméricas. Por exemplo, a invenção proporciona populações de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que são mais de 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E- Ig que compreende cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTLA4A29YL104E-Ig. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que compreende cerca de 95% a cerca de 99,5% de dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig, de cerca de 0,5% a cerca de 2,5% de monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig e de cerca de 0,5% a cerca de 5% de tetrâmeros de CTLA4A29YL104E-Ig. Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreende cerca de 96% de dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig, cerca de 2,5% de tetrâmeros de CTLA4A29YL104E-Ig e cerca de 0,5% de monôme- ros de CTLA4A29YL104E-Ig.
[000270] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig em que a população é substancialmente isenta de monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig. Substancial- mente isenta de monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm menos de 1%, 0,5% ou 0,1% de monômeros.
[000271] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig em que a população é substancialmente isenta de multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig que são maiores do que dímeros, tais como tetrâmeros, hexâmeros, etc. Substancialmente isenta de multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig maiores do que dímeros pode se referir a uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm menos de 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig maiores do que dímeros.
[000272] Um monômero de CTLA4A29YL104E-Ig pode ter, por exemplo, a sequência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4 (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4 ou (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4 ou opcionalmente (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4, Quando um cassete de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 3 ou 23 é expresso em células de CHO, a forma monomérica predominante expressa tem o resíduo de aminoácido metionina no N-término (resíduo 27 de SEQ ID NO: 4), o qual corresponde ao resíduo de aminoácido no N-término de Humano CTLA4. Contudo, em virtude do fato de que SEQ ID NO: 23 também inclui a sequência de codificação para uma sequência sinalizadora de oncostatina M (nucleotídeos 11-88 de SEQ ID NO: 23), a proteína expressa de SEQ ID NO: 23 contém uma sequência sinaliza-dora de oncostatina M.
[000273] A sequência sinalizadora é clivada da proteína expressa durante o processo de exportação de proteína do citoplasma ou secreção da célula, mas clivagem pode resultar em variantes N-terminais, tais como clivagem entre resíduos de aminoácido 25 e 26 de SEQ ID NO: 4 (resultando em um N-término de resíduo 26, isto é, a "variante Ala") ou entre resíduos de aminoácido 24 e 25 SEQ ID NO: 4 (resultando em um N-término de resíduo 25, isto é, a "variante Met-Ala"), em oposição à clivagem entre resíduos de aminoácido 26 e 27 SEQ ID NO: 4 (resultando em um N-término começando com o resíduo de Met na posição de aminoácido 27). Por exemplo, a variante Met-Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig em cerca de 1% e a variante Ala pode estar presente em uma mistura de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig em cerca de 10-20%.
[000274] Além disso, a proteína expressa a partir de um ácido nu- cleico compreendendo SEQ ID NO: 3 pode ter variantes C-terminais em virtude de processamento incompleto. O C-término predominante é a glicina no resíduo 382 de SEQ ID NO: 4. Em uma mistura de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, monômeros tendo lisina no C-término (resíduo 383 de SEQ ID NO: 4) podem estar presente, por exemplo, em cerca de 4-8%.
[000275] Em uma modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 25-383 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 11 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000276] Em outra modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 26-383 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 12 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000277] Em uma outra modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 27383 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 13 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
[000278] Em outra modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 25-382 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 14 MAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
[000279] Em uma modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 26-382 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 15 AMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLR- QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGL- RAMDTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD- QEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMIS- RTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
[000280] Em uma outra modalidade, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16 como segue (a qual é a mesma conforme os aminoácidos 27-382 de SEQ ID NO: 4): SEQ ID NO: 16 MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKYTEVRVTVLRQADSQVTE- VCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAM- DTGLYICKVELMYPPPYYEGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPKSSD- KTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV- DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS- TYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA- KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN- GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN- VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG.
[000281] Um monômero de CTLA4A29YL104E-Ig compreende um domínio extracelular de Humano CTLA4, em que duas substituições de aminoácido foram feitas no domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) (FIG. 5). Em uma modalidade, o domínio extracelular pode compreender a sequência de nucleotídeo dos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23 que codificam os aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender sequências de Humano CTLA4 mutante (tais como mutantes em um único, em dois e três sítios nos aminoácidos 27-151 de SEQ ID NO: 4). Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender alterações de nucleo- tídeo para os nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23, de modo que alterações conservativas de aminoácido sejam feitas. Em uma outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender alterações de nucleotídeo para os nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23, de modo que alterações não conservativas de aminoácido sejam feitas. Em outra modalidade, o domínio extracelular pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica aos nucleotídeos 89-463 de SEQ ID NO: 23.
[000282] Um monômero de CTLA4A29YL104E-Ig pode compreender uma região constante de uma imunoglobulina humana. Essa região constante pode ser uma porção de uma região constante. Essa região constante também pode ter uma sequência do tipo silvestre ou mutante. A região constante pode ser de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD ou IgE humana. A região constante pode ser de uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de uma imunoglobulina. Onde a região constante é de uma molécula de IgG, IgD ou IgA, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, dobradiça, CH2 ou CH3, Onde a região constante é de IgM ou IgE, a região constante pode compreender um ou mais dos seguintes domínios de região constante: CL, CH1, CH2, CH3 ou CH4. Em uma modalidade, a região constante pode compreender um ou mais domínios de região constante de IgG, IgD, IgA, IgM ou IgE.
[000283] Em uma modalidade, dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig são compreendidos de dois monômeros, em que cada monômero pode ter a mesma ou uma sequência de aminoácido diferente e onde a sequência pode ser a sequência de aminoácido de: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Tais monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig podem dimerizar através do domínio extracelular da sequência de Humano CTLA4 via um resíduo de aminoácido de cisteína na posição 146 de SEQ ID NO: 4 (ou resíduo de aminoácido de cisteína na posição 120 da figura 5).
[000284] Uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig pode multimerizar através da interação de domínios de região constante de IgM ou IgA com uma proteína de cadeia J. IgM e IgA são usualmente produzidas como multímeros em associação com uma cadeia polipeptídica adicional, a cadeia J. Em IgM pentamérica, os monômeros são ligados cruzadamente através de ligações de dissulfeto uns aos outros no domínio CH3 e a uma cadeia J através do domínio CH4. IgM também pode formar hexâmeros que carecem de uma cadeia J, onde multimerização é obtida através de ligações de dissulfeto uns aos outros. Em IgA dimé- rica, os monômeros têm ligações de dissulfeto à cadeia J via seu domínio CH3 e não uns aos outros. Assim, em uma modalidade, a invenção proporciona multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig, incluindo dímeros, pentâmeros e hexâmeros, em que a porção de Ig compreende uma região constante de IgM ou porção da mesma ou uma região constante de IgA ou porção da mesma. Tais multímeros de CTLA4A29YL104E-Ig baseados em IgM ou IgA podem incluir a cadeia J.
[000285] Em uma modalidade, um monômero de CTLA4A29YL104E-Ig compreende uma região de dobradiça de IgG1 humana modificada (nucleotídeos 464-508 de SEQ ID NO: 23; aminoácidos 152-166 de SEQ ID NO: 4) em que os resíduos de serina nas posições 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 4 foram manipulados com relação aos resíduos de cisteína presentes na sequência do tipo silvestre.
[000286] Em uma modalidade, um monômero de CTLA4A29YL104E-Ig compreende uma região CH2 de IgG1 humana modificada e uma região CH3 do tipo silvestre (o domínio CH2 de IgG1 humana modificado tendo os nucleotídeos 509-838 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 167276 de SEQ ID NO: 2; o domínio CH3 de IgG1 humana modificado tendo os nucleotídeos 839-1159 de SEQ ID NO: 1 e aminoácidos 277383 de SEQ ID NO: 2).
[000287] Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreende monômeros tendo uma sequência mostrada nas Publicações de Pedido de Patente U.S. N°s U.S. 2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S.2005/0019859 e U.S. 2005/0084933 e Patente U.S. N°. 7.094.874, cada uma das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.
[000288] Em uma modalidade, um tetrâmero de CTLA4A29YL104E-Ig compreende dois pares ou dois dímeros de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma das seguintes sequências de aminoácido: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Cada membro do par de polipeptídeos ou dímero é covalentemente ligado ao outro membro e os dois pares de polipeptídeos são não- covalentemente associados um ao outro desse modo formando um tetrâmero. Tais moléculas tetraméricas são capazes de ligação ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem se ligar ao CD80 ou CD86 com uma avidez que é pelo menos 2 vezes maior do que a avidez de ligação de um dímero de CTLA4A29YL104E-Ig (cujos monômeros têm uma das sequências de ami- noácido acima) ao CD80 ou CD86.
[000289] Essa maior avidez pode contribuir para maior eficácia no tratamento de distúrbios imunes e outras doenças conforme descrito abaixo, bem como em inibição de rejeições a transplante de tecido e/ou órgão sólido. Além disso, avidez maior ou aperfeiçoada pode produzir o resultado de maior potência de um fármaco. Por exemplo, uma composição terapêutica compreendendo tetrâmero de CTLA4A29YL104E- Ig teria uma maior avidez e, portanto, maior potência do que a mesma quantidade de uma composição terapêutica tendo monômero de CTLA4A29YL104E-Ig. Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas podem ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com um dímero de CTLA4A29YL104E-Ig (cujos monômeros têm uma das sequências de aminoácido acima). Em outra modalidade, tais moléculas tetraméricas pode ter pelo menos uma inibição 2 vezes maior sobre a proliferação de células T quando comparado com um tetrâmero de molécula de CTLA4-Ig.
Caracterização de moléculas de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig
[000290] A proliferação de células T pode ser medida usando ensaios-padrão conhecidos na técnica. Por exemplo, uma das formas mais comuns para avaliar a proliferação de células T é estimular células T via um antígeno ou anticorpos agonísticos ao TCR e medir, por exemplo, a incorporação de timidina tritiada (3H-TdR) em células T em proliferação ou a quantidade de citocinas liberadas por células T em proliferação em cultura. O efeito inibitório de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig sobre a ativação ou proliferação de células T pode, desse modo, ser medido.
[000291] A afinidade da molécula de CTLA4-Ig é a resistência de ligação da molécula a um único ligante, incluindo CD80, CD86 ou proteínas de fusão de CD80Ig ou CD86Ig. A afinidade de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig a ligantes pode ser medida, por exemplo, usando análise de interação de ligação (BIA) baseada na técnica de plasmônio em superfície. Além de medição da resistência de ligação, ela permite determinação em tempo real da cinética de ligação, tal como constantes de associação e dissociação. Um chip sensor, consistindo em uma lâmina de vidro revestida com um filme fino de metal, ao qual uma matriz de superfície está covalentemente presa, é revestido com um dos agentes de interação, isto é, CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig ou um dos ligantes. Uma solução contendo o outro agente de interação é deixada fluir sobre sua superfície. Um feixe de luz contínuo é dirigido contra o outro lado da superfície e seu ângulo de reflexão é medido. Quando de ligação de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig ao ligante, o ângulo de ressonância do feixe de luz muda (uma vez que ele depende do índice refrativo do meio próximo ao lado reativo do sensor o qual, por sua vez, está diretamente correlacionado à concentração do material dissolvido no meio). Ela é subsequentemente analisada com o auxilio de um computador.
[000292] Em uma modalidade, experimentos de ligação de CTLA4-Ig podem ser realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) sobre um instrumento BYAcore (BIAcore AG, Uppsala, Suécia). CTLA4-Ig pode ser covalentemente acoplada, através de gru- pos amina primária, a uma matriz de dextrana carboximetilada sobre um chip sensor BIAcore, desse modo, imobilizando o CTLA4-Ig ao chip sensor. Alternativamente, um anticorpo antirregião constante pode ser usado para imobilizar CTLA4-Ig indiretamente à superfície do sensor via o fragmento de Ig. Após o que, os ligantes são adicionados ao chip para medir a ligação de CTLA4-Ig aos ligantes. Medições de afinidade podem ser realizadas, por exemplo, conforme descrito em van der Merwe, P. e outros, J. Exp. Med. (1997) 185 (3): 393-404, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em outra modalidade, experimentos de ligação de CTLA4A29YL104E-Ig podem ser realizados usando a tecnologia de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) conforme descrito acima (FIG. 6; veja Exemplo 21).
[000293] A avidez de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig pode também ser medida. A avidez pode ser definida como a soma total da resistência de ligação de duas moléculas ou células umas às outras em múltiplos sítios. A avidez é distinta de afinidade, a qual é a resistência de ligação de um sítio sobre uma molécula a seu ligante. Sem estar preso pela teoria, maior avidez de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig pode levar à potência aumentada de inibição por moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4 A29YL104E-Ig sobre a proliferação e ativação de células T. A avidez pode ser medida, por exemplo, através de duas categorias de ensaios em fase sólida: a) ensaios de inibição competitiva e b) ensaios de eluição, em ambos os quais o ligante é preso a um suporte sólido. No ensaio de ligação competitiva, moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig são, então, adicionadas em so-lução em uma concentração fixa, junto com ligante livre, em diferentes concentrações e a quantidade de ligante a qual inibe a ligação em fase sólida em 50%, é determinada. Quanto menos ligante necessário, mais forte a avidez. Em ensaios de eluição, o ligante é adicionado em solução. Após obtenção de um estado de equilíbrio, um caotropo ou agente desnaturante (por exemplo isotiocianato, ureia ou dietilamina) é adicionado em diferentes concentrações para romper interações CTLA4-Ig/ligante ou interações CTLA4A29YL104E-Ig /ligante. A quantidade de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig que resiste à eluição é determinada, depois disso, com um ELISA. Quanto maior a avidez, mais agente caotrópico é necessário para eluir uma determinada quantidade de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig. A avidez relativa de uma mistura heterogênea de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig pode ser expressa como o índice de avidez (AI), igual à concentração de agente de eluição necessário para eluir 50% das moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig ligadas. Análise refinada de dados pode ser realizada através de determinação dos percentuais de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig eluída em diferentes concentrações do agente de eluição.
[000294] Um processo de cromatografia em coluna de Fluxo Rápida em fenil Sefarose 4, Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), pode ser usado para reduzir a quantidade de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig eluídas em uma etapa de purificação por HIC (veja Exemplo 15). Portanto, o pico de clarificação da coluna de HIC é enriquecido em espécies de CTLA4-Ig de HMW. Por exemplo, SEC HPLC em coluna preparativa única ou aleatória pode ser empregada para purificar as subpopulações de dímero, tetrâmero e multímero do material de pico de clarificação por HIC. Em uma modalidade, os componentes purificados são dímeros, tetrâmeros e hexâmeros de CTLA4- Ig. Caracterização de componentes de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig presentes em um pico de clarificação por HIC pode ser feita através de técnicas de dispersão estática e dinâmica de luz. Amostras tomadas em uma etapa de processo de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) revelaram a presença de dímeros, te- trâmeros e multímeros em vários pontos de amostragem. Espécies de hexâmero podem ser detectadas apenas em amostras correspondendo ao "início do pico de clarificação" e "OD máxima de pico de clarificação". Espécies decaméricas foram detectadas na "OD máxima de pico de clarificação. A massa molar e formação de raio dinâmico podem ser determinadas através de fracionamento via cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) empregando dispersão de luz em múltiplos ângulos (MALS) acoplada com detecção por dispersão de luz quasi elástica (QELS).
[000295] Com relação a moléculas de CTLA4-Ig produzidas a partir de uma linhagem de célula, SEC mostra um eluato de proteína A que é uma mistura de componentes de multímero, tetrâmero e dímero. Fracionamento dessa mistura sobre uma coluna de SEC aleatória preparativa permite isolamento de quantidades de espécies multiméricas, tetraméricas e diméricas. A recuperação de área percentual para cada componente em análise por SEC das frações isoladas resulta em 9398% de homogeneidade para cada fração. Em um aspecto, purificação dos componentes individuais permite comparação das propriedades físico-químicas de componentes de material de CTLA4-Ig de HMW daqueles de dímeros de CTLA4-Ig. A figura 7 mostra os pesos molecu-lares evidentes, os quais correspondem às frações de multímero, te- trâmero e dímero do pico de clarificação de CTLA4-Ig por HIC, conforme determinado através de SEC com detecção por dispersão dinâmica de luz (DSL) e tempo de retenção sobre SEC. Em uma modalidade, a atividade de ligação bioespecífica de componentes purificados do pico de clarificação por HIC é comparável à atividade de ligação determinada através de um ensaio de ligação de B7-Ig imobilizado baseado em BIAcore. Em outro aspecto, a proporção molar de ácido siá- lico para componentes isolados do pico de clarificação por HIC está na faixa de 4,9 a 7,6, enquanto que a proporção molar de ácido siálico de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig (não no pico de clarificação por HIC) está na faixa de 8- 10. Análise em um gel de IEF indica mobilidade reduzida de isoformas de CTLA4-Ig purificadas de um pico de clarificação por HIC comparado com a migração de dímeros de CTLA4-Ig. Isso é consistente com menores proporções de ácido siálico observadas para as frações de pico de clarificação por HIC de CTLA4-Ig (FIG. 8).
[000296] A escolha das condições de cultura de células pode influenciar a formação de espécies com cadeia simples (isto é, monôme- ros) e de elevado peso molecular (isto é, dímeros, tetrâmeros, etc.) de um produto de proteína recombinante. Condições de crescimento também incluindo, mas não limitado a, composição do meio, são fatores que podem afetar a formação de cadeia simples e o nível de cisteinila- ção. Isso é, provavelmente, o resultado da presença de agentes que levam à redução da ligação de dissulfeto. A suplementação de cisteína diretamente ou meio contendo cisteína a células que secretam CTLA4- Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig pode resultar em uma rápida formação de espécies de cadeia simples e de elevado peso molecular. A taxa é proporcional à quantidade de cisteína adicionada. Em outra modalidade, a suplementação de iodoacetamida, um composto que reage com as sulfidrilas livres, bloqueia a formação de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig que são dependentes de ligações de dissulfeto.
[000297] Por exemplo, a via de espécies de elevado peso molecular sensíveis e não-sensíveis à iodoacetamida destaca dois mecanismos principais e distintamente diferentes pelos quais espécies de elevado peso molecular podem se formar em CTLA4-Ig. A suplementação de altas concentrações de sal (0,5M) a soluções de CTLA4-Ig resulta em uma taxa rápida, sustentada de formação de espécies de elevado peso molecular. EDTA, ConAcidSol II e isolados de levedo aumentam a formação de cadeia simples (veja Exemplo 5).
[000298] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona métodos para a geração de populações de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig, em que misturas contendo predominantemente monômeros ou dímeros de CTLA4-Ig são suplementadas com alta concentração de sal, de modo que a mistura tenha uma concentração de sal de mais de cerca de 0,3, 0,4, 0,45, 0,5 ou 0,6M. Em uma modalidade, tais métodos geram uma mistura compreendendo uma população de CTLA4-Ig que tem pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig.
[000299] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma popula-ção de espécies de CTLA4-Ig com cadeia simples contendo uma modificação sobre a Cys146, de modo que ela seja cisteinilada (veja Exemplo 4). Cisteinilação é uma modificação pós-traducional em que a cisteína dentro de uma cadeia polipeptídica é modificada através da fixação de outra cisteína via uma ligação de dissulfeto. Cisteinilação de proteínas implica em modificação de bioatividade da proteína, incluindo imunogenicidade e antigenicidade de determinantes virais restritas à Classe I do MHC. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição que compreende pelo menos 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 90 ou 95% de moléculas de CTLA4-Ig cisteiniladas com cadeia simples. Em outra modalidade da invenção, uma população de CTLA4-Ig tem não mais do que cerca de 1% de monômeros de moléculas de CTLA4-Ig ou, em outra modalidade, menos de 0,6% de monômeros de CTLA4-Ig.
[000300] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5 a cerca de 18. Em algumas modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig está entre cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 17 e Y é cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18. Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 ou 6,0 e Y é cerca de 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siáli- co para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 ou 9,0 e Y é cerca de 11,0, 11,5, 12,0, 12,5 ou 13,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 6 a cerca de 14, de cerca de 7 a cerca de 13, de cerca de 8 a cerca de 12 ou de cerca de 9 a cerca de 11. Em outras modali-dades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 5 a cerca de 9, de cerca de 5,5 a cerca de 9,5, de cerca de 6 a cerca de 9, de cerca de 6 a cerca de 10 ou de cerca de 7 a cerca de 10. Em outras modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig é mais de ou igual a 5 ou mais de ou igual a 8. Em determinadas modalidades, o ácido siálico é ácido N-acetil neuramínico (NANA).
[000301] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para moléculas de CTLA4-Ig de menos do que ou igual a 2,5, menos de ou igual a 2,0, menos de ou igual a 1,5, menos de ou igual a 1,0 ou menos de ou igual a 0,5.
[000302] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são mais de ou igual a uma área de 93,0 por cento, mais de ou igual a uma área de 93,5 por cento, mais de ou igual a uma área de 94,0 por cento, mais de ou igual a uma área de 94,5 por cento, mais de ou igual a uma área de 95,0 por cento, mais de ou igual a uma área de 95,5 por cento, mais de ou igual a uma área de 96,0 por cento, mais de ou igual a uma área de 96,5 por cento ou mais de ou igual a uma área de 97,0 por cento de dímeros de CTLA4-Ig, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofo- tométrica. Em algumas modalidades, a composição compreende moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são mais de ou igual a uma área de 95,0 por cento de dímeros de CTLA4-Ig e menos de ou igual a uma área de 4,0 por cento de espécies de elevado peso molecular, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em algumas modalidades, a composição compreende moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são mais de ou igual a uma área de 95,0 por cento de dímeros de CTLA4-Ig e menos de ou igual a uma área de 5,0 por cento de espécies de elevado peso molecular, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.
[000303] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são de uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento para monômeros de CTLA4-Ig (isto é, cadeia simples), conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.
[000304] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são uma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig (por exemplo, tetrâmero), conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica. Em algumas modalidades, especialmente aquelas envolvendo composições concentradas compreendendo moléculas de CTLA4-Ig (tais como, por exemplo, aquelas para administração subcutânea), as moléculas de CTLA4-Ig são de uma área de menos do que ou igual a 10 por cento, uma área de menos do que ou igual a 9 por cento, uma área de menos do que ou igual a 8 por cento, uma área de menos do que ou igual a 7 por cento, uma área de menos do que ou igual a 6 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig, conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica.
[000305] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende uma quantidade de MCP-1 ou material semelhante a MCP-1 de menos do que ou igual a 50 ppm, menos de ou igual a 40 ppm, menos de ou igual a 38 ppm, menos de ou igual a 30 ppm menos de ou igual a 20 ppm, menos de ou igual a 10 ppm, 5 ppm, menos de ou igual a 4 ppm, menos de ou igual a menos de ou igual a 3 ppm, menos de ou igual a 2 ppm ou menos de ou igual a 1 ppm. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende MCP-1 ou material semelhante a MCP-1 em menos de ou igual a 50 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 40 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 38 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 30 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 20 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 10 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 5 ng/mg, menos de ou igual a 4 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 2 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 1 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig e uma quantidade de MCP-1 (incluindo a ausência de MCP-1) em que a referida composição é uma composição farmaceuti- camente aceitável.
[000306] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 19. Em algumas modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de X a cerca de Y, onde X é cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou 18 e Y é cerca de 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 19. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10,0 e Y é cerca de 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5 ou 16,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, em que X é cerca de 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 ou 8,0 e Y é cerca de 15,0, 15,5, 16,0, 16,5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5 ou 19,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de cerca de 7 a cerca de 15, de cerca de 8 a cerca de 14, de cerca de 9 a cerca de 13, de cerca de 10 a cerca de 12. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 7 a cerca de 18, de cerca de 8 a cerca de 17, de cerca de 9 a cerca de 17, de cerca de 9 a cerca de 16 ou de cerca de 10 a cerca de 15. Em outras modalidades, a proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig é mais de ou igual a 8.
[000307] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4- Ig de cerca de 0,5 a cerca de 12. Em algumas modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ou 4,5 e Y é cerca de 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 ou 10,5. Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 2,9, 3,1, 3,3, 3,5, 3,7, 3,9 ou 4,1 e Y é cerca de 7,9, 8,1, 8,3, 8,5, 8,7, 8,9 ou 9,1. Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, em que X é cerca de 1,0, 1,5, 1,7, 1,9, 2,1, 2,3 ou 2,5 e Y é cerca de 8,7, 8,9, 9,1, 9,3, 9,6, 9,9, 10,1, 10,3 ou 10,5. Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de cerca de 3,3 a cerca de 8,5, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3, de cerca de 3,7 a cerca de 8,1, de cerca de 3,9 a cerca de 7,9. Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 1,5 a cerca de 9,5, de cerca de 1,7 a cerca de 9,3, de cerca de 1,9 a cerca de 9,1 ou de cerca de 2,1 a cerca de 8,9. Em outras modalidades, a proporção molar média de fucose para mo-léculas de CTLA4-Ig é mais de ou igual a 1,7.
[000308] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 5 a cerca de 25. Em algumas modalidades, a proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 e Y é cerca de 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24. Em outras modalidades, a proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 6,5, 7,0, 7,5, 7,7, 7,9, 8,1, 8,3, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5 ou 12,0 e Y é cerca de 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5, 20,0, 20,5, 21,0, 21,5, 22,0, 22,5, 23, 23,5 ou 24,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 8, 8,5, 9,0, 9,5 10,0 ou 11,0 e Y é cerca de 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 ou 20,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de cerca de 6 a cerca de 23, de cerca de 7 a cerca de 22, de cerca de 7,7 a cerca de 22, de cerca de 8 a cerca de 21, de cerca de 9 a cerca de 20, de cerca de 10 a cerca de 19, de cerca de 11 a cerca de 19 e de cerca de 11 a cerca de 17. Em outras modalidades, a pro-porção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 8 a cerca de 19, de cerca de 9 a cerca de 18, de cerca de 10 a cerca de 17 ou de cerca de 11 a cerca de 16. Em outras modalidades, a proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig é mais de ou igual a 7.
[000309] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são de uma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento de espécies oxidadas. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são de uma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 4,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 3,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 2,0 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,5 por cento, uma área de menos do que ou igual a 1,0 por cento ou uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento de espécies desamida- das. Em algumas modalidades, a composição compreende moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são de uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento de espécies oxidadas e uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento de espécies desamida- das.
[000310] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende endotoxina bacterianas LAL em menos de ou igual a 0,7 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,6 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,5 EU/mg de moléculas de CTLA4- Ig, menos de ou igual a 0,42 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,4 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,35 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,3 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,25 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,20 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 0,15 EU/mg de molé- culas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 0,05 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig.
[000311] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende uma bioburden em menos de ou igual a 2 CFU/10 mL, menos de ou igual a 1,5 CFU/10 mL, menos de ou igual a 1 CFU/10 mL ou menos de ou igual a 0,5 CFU/10 mL.
[000312] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende DNA em menos de ou igual a 25 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 20 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 15 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 10 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 5,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 4,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 2,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,0 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 0,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 0,20 pg/ml moléculas de CTLA4-Ig.
[000313] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende proteína celular (por exemplo, proteína de CHO ou CHOP) em menos de ou igual a 200 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 150 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 125 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 100 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 90 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 80 ng/mg de moléculas de CTLA4- Ig, 70 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 60 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 50 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 40 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 30 ng/mg de moléculas de CTLA4- Ig, menos de ou igual a 25 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 20 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 15 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 10 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende proteína celular em menos de ou igual a 200 ppm, menos de ou igual a 150 ppm, menos de ou igual a 125 ppm, menos de ou igual a 100 ppm, menos de ou igual a 90 ppm, menos de ou igual a 80 ppm, 70 ppm, menos de ou igual a 60 ppm, menos de ou igual a 50 ppm, menos de ou igual a 40 ppm, menos de ou igual a 30 ppm, menos de ou igual a 25 ppm, menos de ou igual a 20 ppm, menos de ou igual a 15 ppm, menos de ou igual a 10 ppm ou menos de ou igual a 5 ppm.
[000314] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende Triton-X (por exemplo, Triton X-100) em menos de ou igual a 4,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 2,5 ng/mg de moléculas de CTLA4- Ig, menos de ou igual a 2,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende Triton-X em menos de ou igual a 4,0 ppm, menos de ou igual a 3,5 ppm, menos de ou igual a 3,0 ppm, menos de ou igual a 2,5 ppm, menos de ou igual a 2,0 ppm, menos de ou igual a 1,5 ppm, menos de ou igual a 1,0 ppm ou menos de ou igual a 0,5 ppm.
[000315] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende Proteína A em menos de ou igual a 8,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 7,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig,menos de ou igual a 7,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 6,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 6,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 5,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 5,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 4,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 4,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 3,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 2,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 2,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig, menos de ou igual a 1,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou menos de ou igual a 0,5 ng/mg de moléculas de CTLA4- Ig. A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende Proteína A em menos de ou igual a 8,0 ppm, menos de ou igual a 7,5 ppm, menos de ou igual a 7,0 ppm, menos de ou igual a 6,5 ppm, menos de ou igual a 6,0 ppm, menos de ou igual a 5,5 ppm, menos de ou igual a 5,0 ppm, menos de ou igual a 4,5 ppm, menos de ou igual a 4,0 ppm, menos de ou igual a 3,5 ppm, menos de ou igual a 3,0 ppm, menos de ou igual a 2,5 ppm, menos de ou igual a 2,0 ppm, menos de ou igual a 1,5 ppm, menos de ou igual a 1,0 ppm ou menos de ou igual a 0,5 ppm.
[000316] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 10 a cerca de 40. Em algumas modalidades, a proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é qualquer número inteiro entre 10 e 39 e Y é qualquer número inteiro entre 11 e 40. Em outras modalidades, a proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 12, 14, 14, 15, 16 ou 17 e Y é cerca de 32, 33, 34, 35, 36 ou 37. Em outras modalidades, a proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 12 a cerca de 35, de cerca de 13 a cerca de 35, de cerca de 14 a cerca de 35, de cerca de 15 a cerca de 35.
[000317] A presente invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig de cerca de 0,5 a cerca de 7,0. Em algumas modalidades, a proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X a cerca de Y, inclusive de X e Y, onde X é 0,5, 0,6,0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 ou 2,0 e Y é 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5,4,6, 4,7, 4,8, 4,9, 5,0, 6,0, 7,0 ou 8,0. Em outras modalidades, a proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig está entre de cerca de X para Y, inclusive de X e Y, onde X é cerca de 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 ou 1,0 e Y é cerca de 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1 ou 4,2. Em outras modalidades, a proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 0,7 a cerca de 4,1, de cerca de 0,8 a cerca de 4,0, de cerca de 0,9 a cerca de 3,9 ou cerca de 1,0 a cerca de 3,8 ou cerca de 1,1 a cerca de 3,7. Em outras modalidades, a proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig é de cerca de 1,6 a cerca de 3,7, de cerca de 1,7 a cerca de 3,6, de cerca de 1,8 a cerca de 3,5 ou cerca de 1,9 a cerca de 3,4. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição de CTLA4-Ig exibe bandas em faixas de pI conforme determinado sobre um gel de focalização isoelé- trica (gel IEF) como segue : de cerca de 10 a cerca de 22 bandas na faixa de pI de cerca de 4,3 a cerca de 5,6; intensidade de banda cumulativa de cerca de 90% a cerca de 110% em uma faixa de pI de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 e cerca de 3m, bandas principais em uma faixa de pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,2. Em uma modalidade, as bandas na faixa de cerca de 4,3 a cerca de 5,6 são de cerca de 5 a cerca de 30, de cerca de 6 a cerca de 29, de cerca de 7 a cerca de 28, de cerca de 8 a cerca de 27, de cerca de 9 a cerca de 26, de cerca de 10 a cerca de 25, de cerca de 11 a cerca de 24, de cerca de 12 a cerca de 23, de cerca de 13 a cerca de 22, de cerca de 14 a cerca de 21, de cerca de 15 a cerca de 20, de cerca de 16 a cerca de 19, de cerca de 17 a cerca de 20, de cerca de 18 a cerca de 19.
Moléculas de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig Glicosiladas e Populações das Mesmas
[000318] Sem limitação, glicosilação pode se referir à adição de estruturas de oligossacarídeo complexas a uma proteína em sítios específicos dentro da cadeia polipeptídica. Glicosilação de proteínas e o subsequente processamento de carboidratos adicionados pode afetar a duplicação e estrutura de proteína, estabilidade de proteína, incluindo meia-vida da proteína e propriedades funcionais de uma proteína. A glicosilação de proteína pode ser dividida em duas classes em virtude do contexto de sequência onde a modificação ocorre, glicosilação O- ligada e glicosilação N-ligada. Polissacarídeos O-ligados são ligados a um grupo hidroxila, usualmente ao grupo hidroxila de um resíduo de serina ou treonina. O-glicanas não são adicionadas a cada resíduo de serina e treonina. Oligossacarídeos O-ligados são usualmente mono ou biantenários, isto é, eles compreendem uma ou no máximo duas ramificações (antenas) e compreendem de um a quatro tipos diferentes de resíduos de açúcar, os quais são adicionados um a um.Polissacarídeos N-ligados são presos ao nitrogênio da amida de uma asparagina. Apenas asparaginas que são parte de uma de duas sequências tripeptídicas, quer asparagina-X-serina ou asparagina-X- treonina (onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina), são alvos para glicosilação. Oligossacarídeos N-ligados podem ter de uma a quatro ramificações referidas como mono-, bi-, tri- e tetra-antenárias. As estruturas de resíduos de açúcar encontrados em oligossacarídeos N- e O-ligados são diferentes. A despeito dessa diferença, o resíduo terminal sobre cada ramificação de polissacarídeos N- e O-ligados pode ser modificado através de uma molécula de ácido siálico, uma modificação referida como revestimento de ácido siálico. O ácido siálico é um nome comum para uma família de monossacarídeos com nove carbonos únicos, os quais podem ser ligados a outros oligossacarídeos. Dois membros na família são ácido N-acetil neuramínico, abreviado como Neu5Ac ou NANA e ácido N-glicolil neuramínico, abreviado como Neu5Gc ou NGNA.
[000319] A forma mais comum de ácido siálico em seres humanos é NANA. Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálico primária presente em moléculas de CTLA4-Ig. Contudo, deve ser notado que níveis mínimos, mas detectáveis, de ácido N-glicolil neuramí- nico (NGNA) também estão presentes em moléculas de CTLA4-Ig. Além disso, o método descrito aqui pode ser usado para determinar o número de mols de ácido siálico para NANA e NGNA e, portanto, os níveis de NANA e NGNA são determinados e reportados para moléculas de CTLA4-Ig. Oligossacarídeos N- e O-ligados têm diferentes números de ramificações, as quais proporcionam diferentes números de posições às quais moléculas de ácido siálico podem ser presas. Oli- gossacarídeos N-ligados podem proporcionar até quatro posições de fixação para ácidos siálicos, enquanto que oligossacarídeos O-ligados podem proporcionar dois sítios para fixação de ácido siálico.
[000320] Proteínas glicosiladas (glicoproteínas), muitas das quais foram produzidas através de métodos de tecnologia de DNA recombi- nante, são de grande interesse como agentes diagnósticos e terapêuticos. Muitas proteínas transmembrana eucariotas destinadas a uma superfície celular e proteínas secretadas são pós-traducionalmente modificadas para incorporar grupos carboidrato N-ligado e O-ligado. Oligossacarídeos N-ligados são presos a resíduos de asparagina quando eles são parte do motivo peptídico Asn-X-Ser/Thr, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto prolina. Oligossacarídeos O- ligados são presos a resíduos de serina ou treonina. As estruturas de oligossacarídeos N-ligados e O-ligados, bem como os resíduos de açúcar encontrados em cada um podem ser diferentes. Um tipo de açúcar que é comumente encontrado em ambos é ácido N-acetil neu- ramínico (NANA; aqui depois referido como ácido siálico). Usualmente, ácido siálico é o resíduo terminal de oligossacarídeos N-ligados e O- ligados. A glicoproteína, em virtude de sua carga negativa, pode exibir propriedades ácidas.
[000321] Supõe-se que proteínas glicosiladas exercem papéis em duplicação aumentada de proteína, regulação de seleção e tráfego celular, prevenção de agregação de proteína, mediação de adesão célula-célula e aumento de resistência à proteólise. Em organismos euca- riotas, a natureza e extensão de glicosilação pode ter um impacto profundo sobre a meia-vida em circulação e bioatividade de produtos terapêuticos de glicoproteína através de processos os quais envolvem endocitose mediada por receptor e depuração. Acredita-se que sistemas receptor-mediados exerçam um papel principal na eliminação de glicoproteínas no soro através de reconhecimento de vários componentes de anticorpo do oligossacarídeo. O grupo ácido siálico terminal de uma glicoproteína pode afetar a absorção, meia-vida e clearance no soro. Assim, estratégias de produção de glicoproteína, as quais mantêm o componente ácido siálico terminal da proteína glicosilada, podem aumentar a biodisponibilidade e meia-vida no soro de uma proteína. Vários parâmetros de processo de produção foram investigados referentes à síntese de glicoproteína, especialmente o efeito da composição do meio e desvios de temperatura em várias estratégias de produção.
[000322] Dímeros de CTLA4-Ig composta de monômeros tendo a sequência de aminoácido de resíduos (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2 podem ter um MW teórico previsto de cerca de 78.000 a cerca de 79.000 Dáltons. Contudo, o MW para tais dímeros obtidos através de MALDI-TOF é de aproximadamente 91.000 Dáltons. Essa diferença no MW de aproximadamente 13.000-14.000 Dáltons é em virtude, pelo menos em parte, de glicosilação a qual, em uma modalidade, responde por aproximadamente 15% da massa desse monômero de molécula de CTLA4-Ig em particular. Os monômeros especificados acima têm três sítios de glicosilação N-ligada que foram confirmados, através de mapeamento peptídico, como ocorrendo em asparaginas nos resíduos 102, 134 e 233 de SEQ ID NO: 2. Moléculas de carboidrato que são ligadas através de asparagina pode ser clivadas seletivamente usando a enzima Glicosidase F de Peptídeo-N (PNGase F). Em um caso, tratamento do monômero tendo a sequência 27-383 de SEQ ID NO: 2 com PNGase F resultou em uma espécie com um MW de aproximadamente 80.200 Dáltons e, em virtude do fato de o MW teórico desse monômero ser cerca de 80.200, o tratamento sugeriu que os 1.400 Dáltons não contados (80.200 - 78.800 = 1.400) podem ser em virtude de glicosilação O-ligada. Embora existam i números resíduos de serina e treonina que têm o potencial de ser sítios de glicosilação, apenas dois sítios O-ligados foram identificados: Ser155 e Ser165 de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, a glicana predominante presa nesses dois sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.
[000323] Por exemplo, a figura 9 apresenta uma visão geral das estruturas de carboidrato N-ligadas e O-ligadas sobre moléculas de CTLA4-Ig compreendidas de monômeros tendo uma sequência de SEQ ID NO: 2 (isto é, um monômero tendo uma das seguintes sequências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2), (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2 em que, em uma modalidade, tais moléculas com as características de carboidrato mostradas são produzidas através de uma linhagem de célula da invenção ou prole da mesma de acordo com o método de produção descrito nos Exemplos 14-15 e também mostrada na figura 10. As principais estruturas listadas para cada sítio são baseadas em técnicas ortogonais (veja aqui). Para cada estrutura, é estimado um percentual dessa estrutura observada durante esses experimentos. Esses percentuais representam as melhores estimativas a partir de técnicas ortogonais.
[000324] Dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig compostos de monômeros tendo a sequência de aminoácido de resíduos (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4 podem ter um MW teórico previsto de cerca de 78,000 a cerca de 79.000 Dáltons. Contudo, o MW para tais dímeros obtidos através de MALDI-TOF é de aproximadamente 91.500 Dál- tons. Essa diferença no MW de aproximadamente 12.000-13.000 Dál- tons é em virtude, pelo menos em parte, de glicosilação. Os monôme- ros especificados acima têm três sítios de glicosilação N-ligada que foram confirmados através de mapeamento por peptídeo como ocor- rendo nas asparaginas nos resíduos 102, 134 e 233 de SEQ ID NO: 4 (N76, N108 e N207 da figura 4). Moléculas de carboidrato que são ligadas através de asparagina podem ser clivadas seletivamente usando a enzima Glicosidase F de Peptídeo-N (PNGase F). Embora existam i números resíduos de serina e treonina que têm o potencial de ser sítios de glicosilação, apenas três sítios O-ligados foram identificados: Ser149, Ser155 e Ser165 de SEQ ID NO: 4 (veja Tabela 25 no EXEMPLO 22). Em uma modalidade, a glicana predominante presa a esses sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.
[000325] Em determinadas modalidades, moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig são glicoproteínas que podem ser produzidas através dos métodos de cultura da invenção. Em uma modalidade, glico- proteínas de CTLA4-Ig são modificadas com oligossacarídeos que representam aproximadamente 15% (peso/peso) da molécula. Esses oligossacarídeos podem exercer um papel importante nos parâmetros farmacocinéticos (PK) de uma glicoproteína de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig. Além disso, diferentes perfis de oligossacarídeo podem influenciar a estabilidade e degradação de proteínas. Por exemplo, oligossacarídeos O-ligados podem intensificar a estabilidade de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig impedindo a autolise na região de dobradiça da região constante de imunoglobulina.
[000326] A distribuição de oligossacarídeo sobre uma população de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig pode ser de natureza heterogênea em virtude da complexidade da cultura de célula e processos. A heterogeneidade pode estar presente em virtude de sítios de glicosilação sendo completamente ocupados e não ocupados e pelo fato de que qualquer sítio específico pode ser habitado com muitas estruturas de oligossacarídeo diferentes, as quais podem ainda mostrar variação no padrão de modificação de ácido siálico.
[000327] Em uma modalidade, a porção ácido siálico primária sobre moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig é ácido N-acetil neuramí- nico (NeuAc, NANA) e a porção ácido siálico secundária é ácido N- glicolil neuramínico (NGNA). A natureza carregada do ácido siálico e as estruturas complexas contendo ácido siálico podem resultar em múltiplas isoformas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig, respectivamente, onde tais isoformas podem ser evidentes em um perfil de focaliza- ção isoelétrica (IEF). Por exemplo, veja figura 11 e Exemplo 3 para perfil de IEF de CTLA4-Ig. Adicionalmente, veja figura 12 e EXEMPLO 22 para perfil de IEF de CTLA4A29YL104E-Ig.
[000328] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm uma isoforma de CTLA4-Ig dominante tendo um ponto isoelétrico (pI) que é menos de ou igual a 5,1 ou 5,0, o qual pode ser determinado, por exemplo, através de IEF. Em outra modalidade, é proporcionada uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig é que tem isoformas de CTLA4A29YL104E-Ig dominantes tendo um ponto isoelétrico (pI) que é menos de ou igual a 5,5, o qual pode ser determinado, por exemplo, através de IEF (FIG. 12).
[000329] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm um pI de cerca de 4,2 a cerca de 5,7, de cerca de 4,25 a cerca de 5,5, de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 ou de cerca de 4,5 a cerca de 5,2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm um pI de cerca de 4,45 a cerca de 5,30. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm um pI de cerca de 4,3 a cerca de 5,1. Em uma modalidade em particular, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm um pI de cerca de 4,45 a cerca de 5,0. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1, 3,0, 2,9, 2,8, 2,7, 2,6, 2,5, 2,4, 2,3, 2,2, 2,1 ou 2,1 conforme determinado através de IEF (esses valores podem ter um desvio-padrão de ± 0,2). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para preparo de uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,45 a cerca de 5,30 ou de cerca de 4,45 a cerca de 5,1 ou de cerca de 4,45 a cerca de 5,0, em que o métodos envolve sujeição de uma população de moléculas de CTLA4-Ig à eletroforese em gel de IEF, em que uma única banda sobre o gel representa a subpopulação de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI em particular e isolamento da subpopulação de moléculas de CTLA4-Ig tendo o pI em particular através de excisão da banda do gel e subsequente purificação das proteínas da banda de gel excisada.
[000330] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm um pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,2. Em outras modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm um pI de cerca de 4,7 a cerca de 5,1. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que têm um pI de cerca de 2,0 a cerca de 5,2. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 ou 3,0 conforme determinado através de IEF (esses valores podem ter um desvio-padrão de ± 0,2). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para preparo de uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo um pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,2; de cerca de 4,7 a cerca de 5,1; de cerca de 2,0 a cerca de 5,2, em que o método envolve sujeição de uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig à eletroforese em gel de IEF, em que uma única banda sobre o gel representa uma subpopulação de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo um pI em particular e isolamento da subpopulação de moléculas de CTLA4A29YL104E- Ig tendo o pI em particular através de excisão da banda do gel e subsequente purificação das proteínas da banda de gel excisada.
[000331] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de mols de grupos ácido siálico para mols de moléculas de CTLA4-Ig de: cerca de 6 a cerca de 32, cerca de 8 a cerca de 32, cerca de 11 a cerca de 30, cerca de 12 a cerca de 20, cerca de 13 a cerca de 19, cerca de 14 a cerca de 18, cerca de 15 a cerca de 17, cerca de 6 a cerca de 16, cerca de 8 a cerca de 16, cerca de 8 a cerca de 14, cerca de 8 a cerca de 12.
[000332] Em algumas modalidades, um máximo permissível de proteína de célula hospedeira de CHO de < 25 ppm a < 10 ng/mg caracteriza a composição de moléculas de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por DNA de célula hospedeira em um nível de <2,5 pg/mg a <1,0 pg/mg. Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por Triton X-100 em um nível de <1,0 ng/mg ou <1,0 ppm. A concentração de Triton X-100 pode ser determinada através de extração do Triton X-100 usando extração em fase sólida sobre Waters OASIS- HLB, seguido por lavagem com água para remover a proteína residual. O Triton X-100 ligado é removido através de eluição com acetonitrila. O eluato de acetonitrila é analisado através de cromatografia de fase reversa usando uma coluna SAS Hypersil de 5 μm e uma fase móvel consistindo em acetonitrila: água (80: 20). Detecção é através de ab- sorbância de UV a 225 nm. Em uma modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por deamidação uma área de oxidação <2,5% e uma área de <2,0%. Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por uma área de oxidação <3,0% e uma área de deamidação <2,5%. O método de mapeamento com peptídeo tríptico foi usado para quantificação de oxidação e deamidação. Os dados de oxidação percentual foram determinados através do uso de um ensaio de mapeamento tríptico por RP- HPLC que quantifica a área de oxidação percentual de Met85 na proteína de CTLA4-Ig em sulfóxido de metionina. A oxidação percentual no método é obtida através de medição por UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP-HPLC para o peptídeo tríptico T6, compreendido dos resíduos 84-93 contendo Met85 e o peptídeo tríptico oxidado correspondente T6ox, contendo Met(O)85. A área de oxidação percentual de Met85 em Met(O)85 é proporcional à área percentual do pico de T6ox: Oxidação percentual = 100 * AT6ox/ (AT6ox + AT6), onde, AT6 = área de pico para peptídeo tríptico T6, (84-93). AT6ox = área de pico para peptídeo tríptico T6ox, Met(O)85(84-93). Os dados de deamidação percentual, adquiridos através de uso de um ensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxidação e deamidação percentual, é obtida através de medição por UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP-HPLC para o peptídeo tríptico T26, compreendido dos resíduos 281-302 contendo Asn294 e o peptídeo tríptico desamidado correspondente T26deam1, contendo isoAsp294. A área percentual deamidação de Asn294 em isoAsp294, então, é proporcional à área percentual do pico de T26deam1: onde, AT26 = área de pico para T26, (281-302), AT26deam1 = área de pico para T26deam1, isoAsp294(281-302). AT26deam2 = área de pico para T26deam2, Asp299(281-302). AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302). AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302).
[000333] Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por N-Acetil glicosamina (GlcNAc) de 15 a 35 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig ou N-Acetil galactosamina (GalNAc) de 1,7 a 3,6 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig. Os amino monossacarídeos são quantificados através de eletroforese capilar (CE) após liberação da proteína através de hidrólise ácida. Os amino monossacarídeos liberados são re-acetilados e fluorescentemente rotulados com ácido aminopireno trissulfônico (APTS) para facilitar sua detecção e quantificação. N-Acetil manosamina é adicionada à amostra e padrões de amino monossacarídeo para servir como um padrão interno. As áreas de pico dos amino monossacarídeos nas amostras são normalizados usando o padrão interno e quantificados através de comparação com sua respectiva área de pico de amino monossacarí- deos normalizada no padrão. A proporção molar de cada monossaca- rídeo com relação à molécula de CTLA4-Ig é então, calculada.
[000334] Em uma modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada pelas seguintes especificações de perfil de oligossacarídeo N-ligado:Especificações de perfil de Oligossacarídeo N-ligado
Figure img0008
[000335] Em uma modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é caracterizada por monossacarídeos neutros onde a composição tem proporções de cerca de: Galactose: 8,0 a 17 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig Fucose: 3,5 a 8,3 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig Manose: 7,7 a 22 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig ou Galactose: 9,0 a 17 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig Manose: 11 a 19 Mols: Mol de proteína de CTLA4-Ig. Composição ilustrativa de Monossacarídeo neutro: Mols: Mol de Proteína de Galactose, Fucose e Manose
Figure img0009
[000336] Em outra modalidade, a faixa de proporção molar de mo-nossacarídeo para uma composição de CTLA4A29YL104E-Ig é como segue : manose de cerca de 10 - 20 mols/mol de proteína; fucose de cerca de 4,2 -7,0 mols/mol de proteína; e galactose de cerca de 9,2 - 17 mols/mol de proteína. Em outra modalidade, a composição de CTLA4A29YL104E-Ig é caracterizada por uma proporção molar de NANA de cerca de 5,0 - 10,0 mol de NANA/mol de proteína. Em outra modalidade, a composição de CTLA4A29YL104E-Ig é caracterizada por uma proporção molar de NGNA de < 1,5 mol NGNA/mol de proteína. Em algumas modalidades, o desvio % da proporção molar para ácido siáli- co é < 15% ou < 20% ou < 30%.
[000337] Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4-Ig pode compreender monômeros de CTLA4-Ig que cada um tem pelo menos 3 grupos ácido siálico. Em outra modalidade, uma população de moléculas de CTLA4-Ig compreende monômeros de CTLA4-Ig que cada um tem de 3 a 8 grupos ácido siálico.
[000338] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,7, 5,6, 5,5, 5,4, 5,3, 5,2, 5,1, 5,0, 4,9, 4,8, 4,7, 4,6, 4,5, 4,4, 4,3, 4,2, 4,1, 4,0, 3,9, 3,8, 3,7, 3,6, 3,5, 3,4, 3,3, 3,2, 3,1 ou 3,0.
[000339] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de mols de NANA para mols de moléculas de CTLA4-Ig ou dímero de: cerca de 6 a cerca de 16, cerca de 6 a cerca de 14, cerca de 6 a cerca de 12, cerca de 8 a cerca de 12, cerca de 8 a cerca de 14, cerca de 8 a cerca de 16.
[000340] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de mols de NGNA para mols de moléculas de CTLA4-Ig ou dímero de menos do que ou igual a cerca de 2, 1,8, 1,6, 1,5, 1,4, 1,0, 0,8 ou 0,5.
[000341] Em modalidades particulares, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo uma proporção molar média de mols de grupos ácido siálico para mols de moléculas ou dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig de cerca de 5,5 a cerca de 8,5. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo uma proporção molar média de mols de grupos ácido siálico para mols de moléculas ou dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig de cerca de 5 a cerca de 10.
[000342] Em uma modalidade, uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pode compreender monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig que têm, cada um, pelo menos 2,5 grupos ácido siálico. Em outra modalidade, uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreende monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig que têm, cada um, de 2,5 a 5 grupos ácido siálico.
[000343] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que se distinguem por uma proporção molar média da população de mols de amino monossacarídeos e/ou monossacarídeos neutros e/ou ácido siálicos para mols de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig. Em modalidades particulares, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que se distinguem por uma proporção molar média da população de mols de amino monossacarídeos e/ou monossacarídeos neutros e/ou ácido siálicos para mols de moléculas ou dímeros de CTLA4A29YL104E- Ig. Amino monossacarídeos incluem N-acetil galactosamina (GalNAc) e N-acetil glicosamina (GlcNAc). Monossacarídeos neutros incluem manose, fucose e galactose. Ácidos siálicos incluem ácido N-acetil neuramínico (NANA) e ácido N-glicolil neuramínico (NGNA).
[000344] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é de cerca de 10 a cerca de 40, de cerca de 15 a cerca de 35, de cerca de 15 a cerca de 25 ou de cerca de 15 a cerca de 20. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 40, 38, 35, 30, 25, 20, 18 ou 15.
[000345] Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de GalNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é de cerca de 1,5 a cerca de 8,5, de cerca de 1,7 a cerca de 3,0, de cerca de 1,7 a cerca de 4,0, de cerca de 1,7 a cerca de 5,0, de cerca de 1,7 a cerca de 6,0, de cerca de 1,7 a cerca de 7,0, de cerca de 1,7 a cerca de 8,0 ou de cerca de 1,7 a cerca de 8,3. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 8,5, 8, 7,5, 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5, 4,0, 3,8, 3,6, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,7 ou 1,5.
[000346] Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é de cerca de 7,5 a cerca de 20,0, de cerca de 8,0 a cerca de 19,0, de cerca de 8 a cerca de 18,0, de cerca de 8,0 a cerca de 17,0, de cerca de 8,5 a cerca de 17,0 ou de cerca de 9,0 a cerca de 17,0. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 20,0, 19,0, 18,0, 17,0, 16,0, 15,0, 14,0, 13,0, 12,0, 11,0, 10,0, 9,0, 8,5, 8,0 ou 7,5.
[000347] Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é de cerca de 3 a cerca de 8,5, de cerca de 3,5 a cerca de 8,5, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3, de cerca de 3,5 a cerca de 8,0, de cerca de 3,5 a cerca de 7,5 ou de cerca de 3,5 a cerca de 7,0. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 8,5, 8,3, 8,0, 7,5, 7,0, 6,5, 6,0, 5,5, 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,2 ou 3,0.
[000348] Em uma outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é de cerca de 7 a cerca de 23, de cerca de 7,5 a cerca de 23, de cerca de 7,7 a cerca de 23, de cerca de 7,7 a cerca de 22,5, de cerca de 7,7 a cerca de 22, de cerca de 7,7 a cerca de 20, de cerca de 7,7 a cerca de 18, de cerca de 7,7 a cerca de 16, de cerca de 8,0 a cerca de 16,0, de cerca de 9,0 a cerca de 17,0, de cerca de 10 a cerca de 19,0 ou de cerca de 11 a cerca de 19,0. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig onde pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% das moléculas na população são caracterizadas por uma proporção molar média de mols de manose por mol de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig que é menos de ou igual a cerca de 23, 22,5, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9,5, 9, 8,5, 8, 7,7, 7,5, 7,3 ou 7.
[000349] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população glicosilada de CTLA4-Ig que exibe valores de PK aumentados, tal como exposição aumentada conforme medido através da área sob a curva (AUC), tal como resultante de ou conforme demonstrado pela clearance diminuída do soro, ao mesmo tempo em que retém a bioati- vidade. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de CTLA4A29YL104E-Ig glicosilada que exibe valores de farmacocinética (PK) aumentados conforme demonstrado através da clearance diminuída do soro, ao mesmo tempo em que retém a bioatividade.
[000350] Em algumas modalidades, a invenção proporciona análogos de moléculas solúveis de CTLA4-Ig, as quais têm sítios de glicosi- lação adicionais. Em outras modalidades, a invenção proporciona análogos de moléculas solúveis de CTLA4A29YL104E-Ig, as quais têm sítios de glicosilação adicionais. Sítios de glicosilação adicionais proporcionam pontos de fixação para estruturas de carboidrato adicionais que podem ser sialiladas. Teor aumentado de ácido siálico pode levar a valores de PK aumentados e/ou estabilidade aumentada da glicoprote- ína. Maior teor de ácido siálico é benéfico. Métodos de pós-purificação in vitro que usam enzimas para adicionar mais ácidos siálicos podem ser realizados para produzir outras modalidades das moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig da invenção.
[000351] As modalidades da invenção incluem qualquer uma das faixas descritas aqui em combinação com qualquer uma ou mais faixas descritas aqui. As modalidades da invenção incluem qualquer característica ou propriedade de CTLA4-Ig descritas aqui em combinação com qualquer uma ou mais características ou propriedades de CTLA4-Ig descritas aqui.
[000352] Métodos para análise e Isolamento de glicoproteínas de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig
[000353] Os métodos descritos aqui a seguir podem ser usados para distinguir, identificar ou isolar populações de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig em particular com base em vários perfis de açúcar incluindo, mas não limitado a, uma proporção molar média da população de mols de amino monossacarídeos e/ou monossacarídeos neutros e/ou ácidos siálicos por mol moléculas ou dímeros de CTLA4- Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig.
[000354] Uma glicoproteína que é secretada de células cultivadas pode ser isolada do meio de cultura ou sobrenadante. A glicoproteína produzida pelas células é coletada, recuperada, isolada e/ou purificada ou substancialmente purificada, conforme desejado, ao final do período de cultura de célula total usando métodos de isolamento e purificação conforme conhecido e praticado na técnica ou conforme descrito aqui. Em uma modalidade, uma glicoproteína da invenção, a qual é expressa pela célula mas não secretada pela célula, ainda pode ser recuperada das células, por exemplo, fazendo lisatos de célula e isolando a glicoproteína e/ou usando métodos que são conhecidos e pra- ticados na técnica e conforme ainda descritas abaixo.
[000355] A glicoproteína produzida através de um processo de cultura de célula da presente invenção compreende carboidratos complexos que podem ser analisados através de várias técnicas de análise de carboidrato. Por exemplo, técnicas tais como blotting de lectina, bem-conhecidos na técnica, revelam proporções de manose terminal ou outros açúcares, tais como galactose. Término de oligossacarídeos mono-, bi-, tri- ou tetra-antenários por ácidos siálicos pode ser confirmado através de liberação de açúcares da proteína usando hidrazina anídrica ou métodos enzimáticos e fracionamento de oligossacarídeos através de cromatografia de troca de íons, cromatografia por exclusão de tamanho ou outros métodos que são conhecidos na técnica.
[000356] Existem dois tipos principais de ligações glicosídicas encontradas em glicoproteínas, N- e O-ligação. N-glicosilações são criadas através da ligação covalente da glicana ao nitrogênio da amida de um resíduo de asparagina. Ligações O-glicosídicas são criadas através da ligação covalente do grupo hidroxila de serina, treonina, hidroxilisina ou hidroxiprolina à glicana. As porções de carboidrato de glicoproteí- nas estão envolvidas em numerosos fenômenos de reconhecimento molecular, incluindo interações hospedeiro-patógeno, clearance do soro e direcionamento de diferentes tecidos. Com relação à moléculas de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig, porções de carboidrato podem afetar pelo menos a ligação entre moléculas de CTLA4-Ig e CD80 ou CD86 ou entre moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig e CD80 ou CD86.
[000357] Estruturas de carboidrato ocorrem, tipicamente, sobre uma proteína expressa como carboidratos N-ligados ou O-ligados. Os carboidratos N-ligados e O-ligados diferem primariamente quanto às suas estruturas centrais. glicosilação N-ligada se refere à fixação da porção de carboidrato, via GlcNAc, a um resíduo de asparagina na cadeia peptídica. Em uma modalidade, os carboidratos N-ligados contêm to- dos uma estrutura central de Man1-6(Man1-3)Manp1-4Glc- NAcpl- 4GlcNAcp-R em comum, onde R nessa estrutura central representa um resíduo de asparagina. A sequência peptídica da proteína produzida conterá uma asparagina-X-serina, asparagina-X-treonina e asparagi- na-X-cisteína, em que X é qualquer aminoácido, exceto prolina.
[000358] Em contraste, carboidratos O-ligados são caracterizados por uma estrutura central em comum, a qual contém GalNAc presa ao grupo hidroxila da treonina ou serina. Dos carboidratos N-ligados e O- ligados, os mais importantes são os carboidratos N- e O-ligados complexos. Tais carboidratos complexos contêm várias estruturas antená- rias. As estruturas mono-, bi-, tri, - e tetra-antenárias são importantes para a adição de ácidos siálicos terminais. Tais estruturas de cadeia externa proporcionam sítios adicionais para os açúcares específicos e ligações que compreendem os carboidratos dos produtos de proteínas.
[000359] Glicoproteínas terapêuticas são frequentemente produzidas usando técnicas de cultura de células de DNA recombinante. A distribuição de glicosilação de proteína em cultura de células pode ser afetada por variações no pH, densidade celular, concentrações de nutriente e concentrações de metabólito. A sensibilidade de distribuições de glicana a efeitos ambientais torna necessário monitorar cuidadosamente a distribuição de glicana durante desenvolvimento e produção de produto de forma a assegurar que um produto reproduzível seja fabricado.
[000360] O desenvolvimento de glicoproteínas recombinantes - derivadas para uso terapêutico levou a uma demanda crescente por métodos para caracterizar e obter um perfil de suas estruturas de carboidrato. Mapeamento de oligossacarídeos foi usado para caracterização inicial de proteínas recombinantes para comparação com a proteína nativa, para identificar estruturas de oligossacarídeos presentes, para monitorar a consistência da composição de oligossacarídeo, para ava- liar alterações que podem resultar de uma mudança na cultura de células ou processo de produção e identificar alterações na glicosilação que ocorrem como um resultado de expressão em diferentes linhagens de células.
[000361] Uma variedade de técnicas está disponível para avaliar distribuições estruturais de carboidrato. Essas incluem filtração em gel, técnicas de separação cromatográficas e eletroforéticas acopladas com uma ampla faixa de técnicas de detecção. Se as quantidades de amostra são limitadas, as glicoproteínas são, frequentemente, derivati- zadas com reagentes fluorescentes, tais como ácido 2-aminobenzóico e 2-aminopiridina de forma a melhorar a detecção. Contudo, derivati- zação e purificação dos derivados pode consumir tempo. Quando o tamanho de amostra não é um problema, avaliação direta de distribuições estruturais de carboidrato é possível.
[000362] Análise do teor de oligossacarídeo de uma glicoproteí- na
[000363] Uma glicoproteína em particular pode mostrar heterogeneidade de carboidratos. A heterogeneidade pode ser observada em vários níveis: sítios de glicosilação podem variarde completamente ocupados a desocupados e qualquer sítio específico pode ter uma população de muitas estruturas de oligossacarídeo diferentes, em que cada estrutura pode ser modificada por moléculas de ácido siálico, tais como NANA ou NGNA.
[000364] O teor de carboidrato da proteína da presente invenção pode ser analisado através de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos descritos nos Exemplos aqui. Vários métodos são conhecidos na técnica para análise de glicosilação e são úteis no contexto da presente invenção. Esses métodos proporcionam informação com relação à identidade e a composição do oligossacarídeo preso ao peptídeo produzido. Métodos para análise de carboidrato úteis com relação à presente invenção incluem, mas não estão limitados a, cromatografia de lecitina, cromatografia de troca de íons de elevado desempenho combinada com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD), a qual usa cromatografia de troca de ânions em pH elevado para separar oligossacarídeos baseado na carga; RMN; Espectrometria de Massa; HPLC; cromatografia em carbono grafítico poroso (GPC).
[000365] Métodos para liberação de oligossacarídeo são conhecidos. Esses métodos incluem 1) métodos enzimáticos, os quais são comu- mente realizados usando N-glicosidase F/ endo-a-galactosidase; 2) métodos de p-eliminação, usando o ambiente rigoroso alcalino para liberar principalmente estruturas O-ligadas; e 3) métodos químicos usando hidrazina anídrica para liberar oligossacarídeos O-ligados e N- ligados. Métodos para análise podem compreender as seguintes etapas: 1. diálise da amostra contra água desionizada para remover todos os sais de tampão, seguido por liofilização. 2. Liberação de cadeias de oligossacarídeos intactas com hidrazina anídrica. 3. tratamento das cadeias de oligossacarídeos intactas com HCl anídrico metanólico para liberar monossacarídeos individuais como derivados de O-metila. 4. N- acetilação de quaisquer grupos amino primários. 5. Derivatização para proporcionar glicosídeos de per-O-trimetil-silil metila. 6. Separação des-ses derivados através de cromatografia gasosa - líquido capilar (GLC) sobre uma coluna de CP-SIL8. 7. Identificação de derivados de glicosí- deo individuais através do tempo de retenção a partir de GLC e espec- trometria de massa, comparado com padrões conhecidos. 8. Quantificação de derivados individuais através de FID com um padrão interno (triase -O- metil- D- glicose).
[000366] A presença de açúcares neutros e amino açúcares pode ser determinada usando cromatografia de troca de ânions de elevado desempenho combinada com detecção amperométrica pulsada (HPA- EC-PAD Carbohydrate System; Dionex Corp.). Por exemplo, açúcares podem ser liberados através de hidrólise em ácido trifluoroacético a 20% (v/v) a 100°C durante 6 horas. Os hidrolisatos são, então, secos através de liofilização ou com um Speed-Vac (Savant Instruments). Resíduos são, então, dissolvidos em solução de tri-hidrato de acetato de sódio a 1% e analisados sobre uma coluna de HPLC-AS6 (conforme descrito por Anumula e outros, 1991, Anal. Biochem., 195: 269280).
[000367] Alternativamente, análise de carboidrato por imunoblot pode ser realizada. Neste procedimento, os carboidratos proteína-ligados são detectados usando um sistema de detecção de glicana comercial (Boehringer), o qual é baseado no procedimento de imunoblot oxidati- vo descrito por Haselbeck e outros (1993, Glycoconjugate J., 7: 63). O protocolo de coloração recomendado pelo fabricante é seguido, exceto que a proteína é transferida para uma membrana de difluoreto de poli- vinilideno ao invés de uma membrana de nitrocelulose e os tampões de bloqueio contêm albumina de soro bovino a 5% em tampão de Tris a 10 mM, pH de 7,4 com cloreto de sódio a 0,9%. Detecção é realizada com anticorpos antidigoxigenina ligados com um conjugado de fos- fatase alcalina (Boehringer), diluição a 1: 1000 em solução salina tam- ponada com Tris usando os substratos de fosfato, cloreto de 4- nitroblue tetrazólio, 0,03% (p/v) e 5-bromo-4 cloro-3-indolil-fosfato0,03% (p/v) em tampão de TRIS a 100 mM, pH de 9,5, contendo cloreto de sódio a 100 mM e cloreto de magnésio a 50 mM. As bandas de proteína contendo carboidrato são, usualmente, visualizadas em cerca de 10 a 15 minutos.
[000368] Carboidratos associados à proteína também podem ser clivados através de digestão com peptídeo-N-glicosidase F. De acordo com esse procedimento, o resíduo é suspenso em 14 μL de um tampão contendo SDS a 0,18%, beta-mercaptoetanol a 18 mM, fosfato a 90 mM, EDTA a 3,6 mM, em um pH de 8,6 e aquecido a 100°C duran- te 3 minutos. Após esfriar até a temperatura ambiente, a mistura de reação é dividida em duas partes aproximadamente iguais. Uma parte, a qual ainda não foi tratada, serve como um controle. A outra parte é ajustada com detergente NP-40 a cerca de 1%, seguido pela adição de 0,2 unidade de peptídeo-N-glicosidase F (Boehringer). Ambas as partes são aquecidas a 37°C durante 2 horas e, então, analisadas através de eletroforese em gel de poliacrilamida - SDS.
[000369] Mapeamento de glicana de glicoproteínas tem se tornado crescentemente aceito. A metodologia descrita permite a rápida carac-terização de oligossacarídeos em termos de tipo de glicana, extensão de sialilação e número de ramificações sobre a extremidade de não redução dos carboidratos. Assim, em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma população de CTLA4-Ig caracterizada por perfis de oligossacarídeo em particular. Definição de perfil de oligossa- carídeo é, tipicamente, feita através de separação cromatográfica dos oligossacarídeos, seguido por detecção e quantificação relativa. Uma alternativa à definição de perfil cromatográfica é a análise direta de oligossacarídeos através de infusão por ESI após dessalinização online.
[000370] Definição de perfil de oligossacarídeos através de PGC pode ser usada para caracterizar os oligossacarídeos N-ligados a partir de moléculas de CTLA4-Ig. Existem 31 classes estruturais de oligos- sacarídeos identificados a partir de moléculas de CTLA4-Ig (SEQ ID NO: 2) , incluindo uma classe estrutural contendo grupos ácido siálico O-acetilados. Verificação da classe estrutural é obtida através do uso de MS/MS e MS no modo de íons positivo. Quantificação relativa de classes estruturais é possível através da integração do traço de UV a 206 nM. Comparação dos perfis de subpopulação a partir de sítios de N-ligação individuais é conhecida, revelando diferenças significativas de populações entre sítios de N-ligação. Definição de perfil de oligos- sacarídeo usando PGC proporciona uma alternativa rica em informação conveniente aos métodos de definição de perfil mais tradicionais, tal como HPAEC.
[000371] Estruturas N-ligadas em moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2
[000372] Existem três sítios de glicosilação N-ligada por cadeia (isto é, por monômero) sobre um multímero ou dímero de CTLA4-Ig, em que o monômero tem uma sequência de SEQ ID NO: 2, por exemplo: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 ou (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2). As variações na glicosilação por sítio são analisadas através de isolamento de fragmentos peptídi- cos contendo glicanas N-ligadas a partir de uma digestão tríptica da proteína. Os sítios de glicosilação N-ligada sobre uma proteína estão localizados em Asn102, Asn134 e Asn233, contidos nos fragmentos trípti-cos 5, 7 e 14, respectivamente. Liberação enzimática de oligossacarí- deos N-ligados a partir dos fragmentos peptídicos isolados, seguido por definição de perfil por PGC dos oligossacarídeos liberados, resulta nos perfis mostrados na figura 13. Está claro a partir do perfil das gli- canas liberadas de Asn233 (fragmento tríptico 14, T14) que a população de oligossacarídeo é enriquecida nas estruturas de asialo (estruturas que não têm ácidos siálicos). Os perfis de oligossacarídeos das glica- nas presas em Asn102 e Asn134 (T5 e T7) contêm a parte principal das estruturas sialiladas.
[000373] Oligossacarídeos isolados liberados da glicoproteína são diretamente injetados no sistema de LC/UV/MS de carbono grafítico poroso. As figuras 14 e 15 mostram os cromatogramas por TIC e UV de um perfil por PGC típico gerado através de gradientes de acetonitri- la contendo aditivos ácidos e básicos. Na maioria dos casos, os espectros de massa de um único pico cromatográfico contêm picos de mas- sa para um único oligossacarídeo. Trinta classes estruturais de oligos- sacarídeos são identificadas a partir do perfil de eluição contendo TFA. Apenas dezesseis classes estruturais de oligossacarídeos são identificadas a partir do perfil de eluição contendo NH4OH. Dentro de cada classe estrutural existem estruturas variantes contendo substituição de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) em lugar de ácido N-acetil neu- ramínico (NANA) bem como diferentes graus de acetilação de ácido siálico. Embora somente informação quantitativa possa ser obtida a partir de comparação das contagens de íons para as classes de oli- gossacarídeos, é evidente que as principais classes estruturais dentro de cada um dos quatro domínios são P2100, P2111, P2122 e P3133. Isso é consistente com os valores de integração obtidos a partir do traço de UV a 206 nm. Verificação estrutural adicional pode ser obtida a partir do espectrograma de massa de íons positivos. A ionização no modo de íons positivo promove uma fragmentação em fonte de oligos- sacarídeo, principalmente nas ligações glicosídicas. Em virtude do fato de haver boa separação de oligossacarídeos, conforme determinado através dos espectros de massa de íons negativos, os espectros fragmentados do modo de íons positivo imitam os espectros de MS/MS de íons positivos. O Domínio III (estruturas dissialiladas) contém uma quantidade significativa de P2122-Ac O-acetilada. Dados de m/s de íons positivos sustentam a O-acetilação de um dos ácidos siálicos sobre a estrutura. O sítio de O-acetilação mais comum de resíduos de ácido siálico está nas posições C-7 e C-9 (Shi WX, Chammas R., Varki A., J. Biol. Chem. 271 (1996) 15130-15188). Em um pH extracelular fisiológico, O-acetil ésteres em C-7 migram espontaneamente para C9. O sítio de O-acetilação mais provável é, portanto, C-9.
[000374] Análise do teor de oligossacarídeos N-ligados: As técnicas analíticas podem compreender clivagem e isolamento de oligossa- carídeos N-ligados através de cromatografia em coluna a qual, em uma modalidade não limitativa, usa uma coluna Hypercarb. Glicanas submetidas à cromatografia em Hypercarb são isoladas e podem ser analisadas através de HPAEC-PAD, cuja análise determina os tipos de carboidratos que modificam uma glicoproteína em particular. Caracterização analítica dos oligossacarídeos N-ligados pode também ser obtida através de Cromatografia de Líquido/Espectrometria de Massa (LC/MS ) usando um Carbono Grafítico Poroso (PGC). Análise de carboidrato pode também incluir mapeamento peptídico com tripsina, Asp-N e Tripsina/Quimiotripsina para determinar os peptídeos os quais compreendem estruturas de carboidrato.
[000375] Estruturas de oligossacarídeo N-ligado podem ser analisadas usando uma série de técnicas de espectrometria de massa ortogonal e HPAEC-PAD (veja Exemplos). Essas técnicas incluem várias clivagens com endopeptidase, seguido por análise através de LC/MS/MS. Com relação a monômeros de CTLA4-Ig tendo uma sequência de SEQ ID NO: 2, os três principais sítios de glicosilação N- ligada foram caracterizados usando LC/MS e ionização por eletropul- verização LC/MS/MS e as principais estruturas em cada sítio de N- ligação foram determinadas. Esses dados são resumidos na figura 9. Existem pelo menos três pontos principais de fixação para oligossaca- rídeos N-ligados em Asn102, Asn134 e Asn233. Além disso, descobriu-se que Asn233 contém uma população de estruturas N-ligadas que não contêm grupos ácido siálico que ocorrem cerca de 80% das vezes.
[000376] Estruturas de oligossacarídeo N-ligado de CTLA4-Ig de-terminadas através de LC/MS dos glicopeptídeos, LC/MS dos oli- gossacarídeos e HPAEC-PAD: Os carboidratos N-ligados estão associados a um motivo de sequência de consenso de Asn - X - Ser/Thr. Essa sequência aparece três vezes sobre cadeias monoméricas de CTLA4-Ig tendo uma das seguintes sequências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. O motivo de sequência de consenso aparece em SEQ ID NO: 2 em: Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135 Thr136; e Asn233 Ser234 Thr235. Baseado na sequência de consenso, existem seis sítios de carboidrato N-ligado por molécula dimérica que são formados de qualquer uma ou duas das seguintes sequências monoméricas: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2.
[000377] Carboidratos N-ligados podem ser de três variedades gerais: com alto teor de manose, híbridos e/ou complexos. Uma técnica de LC/MS para a análise de glicopeptídeo foi desenvolvida. Clivagem de monômeros endoproteolítica com tripsina (tendo uma das sequências (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2) resulta em três peptí- deos que contêm glicosilação N-ligada. Todos os três sítios de N- ligação têm uma população de estruturas de carboidrato. O fragmento tríptico T5, correspondendo aos aminoácidos 65-109 de SEQ ID NO: 2, contém uma glicosilação sobre Asn102. O fragmento tríptico T7, cor-respondendo aos aminoácidos 120-154 de SEQ ID NO: 2, contém uma glicosilação sobre Asn134. O fragmento tríptico T14, correspondendo aos aminoácidos 229-237 de SEQ ID NO: 2, contém uma glicosilação sobre Asn233.
[000378] De forma a determinar os tipos específicos de glicosilação sobre cada sítio, carboidratos foram obtidos de cada sítio específico através de aumento da escala de digestão e separação de proteína, seguido por coleta dos peptídeos T5, T7 e T14. Os picos de peptídeo tríptico de interesse foram tratados com PNGase F e processados para análise através de LC/MS sobre uma coluna Hypercarb. Os resulta- dos mostraram uma população heterogênea de estruturas bi-, tri- e tetra-antenárias complexas em cada sítio. Essas podem ser observadas na figura 13, onde a cromatografia separa os açúcares em cinco domínios: estruturas asialo, monossialo, dissialo, trissialo e tetrassialo (referidos como Domínios I, II, III, IV e V, respectivamente). Um croma- tograma (FIG. 13, painel A) para os carboidratos Asn102 (T5) ilustra uma série de estruturas mono- e dissialo no sítio. Um cromatograma (FIG. 13, painel B) para Asn134 (T7) ilustra duas estruturas dissialo principais com uma população de estruturas monossialo. Um cromato- grama (FIG. 13, painel C) para Asn233 (T14) ilustra pouca sialilação. Para cada um dos sítios de carboidrato N-ligado, um espectro por MS e estrutura correspondente são mostrados para o pico principal em cada cromatograma (veja figura 13, painéis E, F, H). Na figura 13, painel D, o perfil de carboidratos N-ligados totais de CTLA4-Ig é mostrado no cromatograma. A massa e estruturas de picos selecionados são listadas na Tabela 1. Os dados de LC/MS para oligossacarídeo foram sustentados através de análise em profundidade do mapeamento pep- tídico. Asn102 (peptídeo T5) tem o maior grau de heterogeneidade de carboidrato oscilando de estruturas biantenárias, não-sialiladas a estruturas tetra-antenárias, tetrassialiladas. Asn134 (peptídeo T7) contém primariamente estruturas biantenárias. Esse sítio contém muito menos heterogeneidade do que o sítio Asn102. O sítio Asn233 (peptídeo T14) contém pouca sialilação. Uma terceira técnica analítica, HPAEC-PAD, foi também empregada para sustentar duas descobertas por LC/MS ortogonal.Tabela 1: As principais estruturas N-ligadas e estruturas complexas menores selecionadas observadas usando métodos de LC/MS
Figure img0010
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[000379] A população de carboidratos N-ligados totais foi analisada usando HPAEC-PAD. Os dados obtidos através desse método são listados nas Tabelas 2 e 3. Na Tabela 2, os percentuais de área relativa de domínios asialo a trissialo são listados dentro de cada sítio (Asn102, Asn134 e Asn233 de SEQ ID NO: 2). Na Tabela 3, os percentuais de área de domínio de oligossacarídeo são listados como uma fração da população total de oligossacarídeos.Tabela 2: Os percentuais de área para cada domínio observado através de HPAEC-PAD
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Tabela 3: Os percentuais de área para cada domínio expressos como a média calculada ponderada sobre o conjunto de dados na Tabela 2
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[000380] Estruturas de oligossacarídeo N-ligado de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig determinadas através de LC/MS dos glicopeptí- deos, LC/MS dos oligossacarídeos e HPAEC-PAD: Os carboidratos N-ligados estão associados a um motivo de sequência de consenso de Asn - X - Ser/Thr. Essa sequência aparece três vezes sobre cadeias monoméricas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo uma das seguintes sequên- cias: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. O motivo de sequência de consenso aparece em SEQ ID NO: 4 em: Asn102 Leu103 Thr104; Asn134 Gly135 Thr136; e Asn233 Ser234 Thr235. Baseado na sequência de consenso, existem seis sítios de carboidrato N-ligado por molécula di- mérica que são formados de qualquer uma ou duas das seguintes sequências monoméricas: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4.
[000381] Carboidratos N-ligados podem ser de três variedades gerais: com alto teor de manose, híbridos e/ou complexos. Uma técnica de LC/MS para a análise de glicopeptídeo foi desenvolvida. Clivagem endoproteolítica com tripsina de monômeros (tendo uma das sequências (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4) resultou em três peptí- deos que contêm glicosilação N-ligada (veja Tabela 25 no Exemplo 22). Todos os três sítios N-ligados têm populações de estruturas de carboidrato. O fragmento tríptico T5, correspondendo aos aminoácidos 65-109 de SEQ ID NO: 4, contém uma glicosilação sobre Asn102. O fragmento tríptico T7, correspondendo aos aminoácidos 120-154 de SEQ ID NO: 4, contém uma glicosilação sobre Asn134. O fragmento tríptico T14, correspondendo aos aminoácidos 229-237 de SEQ ID NO: 4, contém uma glicosilação sobre Asn233 (veja Tabela 25 no Exemplo 22).
[000382] De forma a determinar os tipos específicos de glicosilação sobre cada sítio, carboidratos foram obtidos de cada sítio específico através de aumento da escala de digestão e separação de proteína, seguido por coleta dos peptídeos T5, T7 e T14. Os picos de peptídeo tríptico de interesse foram tratados com PNGase F e processados para análise através de LC/MS sobre uma coluna Hypercarb. Os resultados mostraram uma população heterogênea de estruturas bi-, tri- e tetra-antenárias complexas em cada sítio. Essas podem ser observadas na figura 16, onde a cromatografia separa os açúcares em quatro domínios: estruturas asialo, monossialo, dissialo e trissialo (referidos como Domínios I, II, III e IV, respectivamente). As características de um perfil de carboidrato que podem ser analisadas e comparadas entre moléculas ou populações glicosiladas ou composições compreendendo moléculas glicosiladas incluem área de pico percentual, área de domínio percentual, distância vale a vale ou distância pico a pico.
Caracterização por LC/MS de oligossacarídeos N-ligados de CTLA4-Ig
[000383] Cromatografia em carbono grafítico poroso (PGC) por LC/MS é um método para definição de perfil de oligossacarídeos N- ligados que pode proporcionar vantagens com relação à cromatografia de troca de ânions em pH elevado (HPAEC). Algumas dessas vantagens incluem: obtenção direta de perfil a partir de misturas de digestão, o que minimiza a degradação de amostra; a interface de MS direta proporciona um método para caracterização e análise rápida de oli- gossacarídeos; resolução aumentada através de cromatografia por PGC permite comparações interdomínio, bem como análise intradomí- nio mais sutil.
[000384] O método de PGC por LC/MS permite a obtenção rápida de perfil e caracterização de oligossacarídeos em termos de tipo de glica- na e determinação da extensão de sialilação e ramificação sobre a extremidade de não-redução dos carboidratos. Assim, os espectros de MS no modo de íons negativo produzem dados que são simples de interpretar, com fragmentação mínima dos oligossacarídeos, enquanto que ionização no modo positivo permite verificação da classe estrutu- ral. O método descrito aqui pode ser aplicado a misturas inteiras de digestão de glicoproteínas, bem como a amostras de oligossacarídeo previamente isoladas sem a necessidade de derivatização. As fases móveis cromatográficas usadas permitem coleta de picos dos perfis e concentração até secagem, sem manipulação adicional para caracterização mais detalhada. Em uma modalidade, o método é usado para caracterizar oligossacarídeos N-ligados de CTLA4-Ig. Usando o método de PGC por LC/MS, trinta e uma classes distintas de oligossacarí- deos podem ser identificadas sobre moléculas de CTLA4-Ig compreendidas de monômeros tendo sequências de SEQ ID NO: 2, por exemplo, SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
[000385] Cromatografia de troca de ânions em pH elevado (HPAEC) foi usada extensivamente para obter um perfil de oligossacarídeos liberados de glicoproteínas sem a necessidade de derivatização. A alta resolução de HPAEC e o fato de que a separação é influenciada pelo tipo de resíduo de açúcar presente, tipo de ligação e o tamanho da gli- cana são razões para o uso difundido da técnica. O fator dominante na separação é a carga, oligossacarídeos altamente carregados eluindo depois das glicanas menos carregadas. Os perfis cromatográficos são frequentemente divididos em domínios definidos pelo número de espécies carregadas, tipicamente resíduos de ácido siálico, sobre as gli- canas (FIG. 17).
[000386] Para obter mais informação sobre a estrutura dos oligossa- carídeos desconhecidos, os picos de HPAEC podem ser coletados, dessalinizados e caracterizados por MS e/ou RMN. Uma consideração sobre a definição de perfil por HPAEC-PAD de distribuições de oligos- sacarídeo é a variabilidade inerente do modo de detecção. Envelhecimento de célula eletroquímica e incrustação da superfície de eletrofo- se resultam em variabilidade do perfil. Foi também reportado que estruturas de oligossacarídeo e o grau de sialilação podem causar varia- bilidade entre células de detecção quando usando HPAEC com detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD). Essa variabilidade pode afetar os resultados relativamente quantitativos usados para avaliar o efeito de alterações de processo ou determinar a consistência lote a lote. Em virtude de sua velocidade e especificidade, espectrometria de massa (MS) tem obtido popularidade como uma técnica para avaliação de perfis de oligossacarídeo de glicoproteínas. Embora os perfis por MS não possam ser usados diretamente para determinar a configuração anomérica ou padrões de ramificação, os dados de MS podem ser usados para identificar classes estruturais e detectar alterações qualitativas nas distribuições de glicoforma.
[000387] O método de definição de perfil por cromatografia em carbono grafítico poroso (PGC) para oligossacarídeos N-ligados enzimati- camente liberados usa detecção por ultravioleta (UV) e por espectro- metria de massa (MS) para obter o perfil e caracterizar oligossacarí- deos N-ligados, diretamente a partir de misturas de digestão enzimáti- ca ou de oligossacarídeos isolados. Esse método pode ser usado para obter um perfil e caracterizar oligossacarídeos liberados de glicoprote- ínas de CTLA4-Ig. O método de PGC por LC/MS pode avaliar a consistência das distribuições de oligossacarídeo resultantes do processo de produção, bem como quaisquer alterações nas distribuições de oli- gossacarídeo resultantes de modificações do processo. Em uma mi- croanálise cromatográfica de oligossacarídeos N-ligados de moléculas de CTLA4-Ig, oligossacarídeos N-ligados enzimaticamente liberados podem ser prontamente separados através da coluna de PGC de forma a aumentar a sialilação e aumentar o tamanho. A faixa de estruturas presentes e as quantidades relativas de cada classe de estrutura são determinadas através da combinação de análise por MS e UV (Exemplo 3).
[000388] Para otimizar o método de PGC por LC/MS, otimização das condições espectrais de massa pode ser útil. Otimização pode incluir uma série de experimentos de mapeamento de superfície de forma a avaliar os efeitos da composição de solvente e parâmetros de ionização por MS quando de detecção de oligossacarídeo. Parâmetros da composição de solvente para avaliação compreendem percentual de acetonitrila (em volume) e aditivos eluentes (ácido trifluoroacético e hidróxido de amônio). Os parâmetros de ionização por MS considerados para avaliação incluem os ajustes de temperatura de dessolvata- ção, tensão de capilar e tensão de cone para a fonte de eletropulveri- zação.
[000389] Os parâmetros de ionização podem exercer um papel significativo na resposta de sinal. O modelo resultante da determinação por mapeamento de superfície foi usado para ajustar os parâmetros de ionização durante a determinação cromatográfica. Maiores valores para a temperatura de dessolvatação e tensão de cone resultam em maior resposta. A tensão ótima do capilar varia, dependendo do aditivo eluente, o sistema de solvente contendo TFA tendo uma tensão ótima de capilar ligeiramente maior. O fator com o maior efeito é o volume percentual de acetonitrila, um maior teor de acetonitrila resultando em maiores respostas.
Cromatografia em Carbono Grafítico Poroso
[000390] Carbono Grafítico Poroso (PGC) foi usado para dessalini- zação por extração em fase sólida de oligossacarídeos. PGC também é conhecida como um meio cromatográfico eficaz para separação de oligossacarídeo sob condições de eluição ácidas e básicas. Condições cromatográficas para definição de perfil ácido e básico de oligossaca- rídeos enzimaticamente liberados de moléculas de CTLA4-Ig tendo sequências monoméricas de SEQ ID NO: 2 foram desenvolvidas. Cada condição é compatível com detecção por UV e MS. Conforme foi observado nos experimentos de infusão, as condições de eluição áci- da resultam em sensibilidade do MS maior do que as condições básicas. A resposta do MS para oligossacarídeos neutros eluídos sob condições ácidas, detectados como adutos de TFA, são cinco a nove vezes a intensidade do pico correspondente eluído sob condições básicas. A diferença na resposta de sinal é menos dramática para os oli- gossacarídeos ácidos, em média três vezes a resposta de sinal para glicanas monossialiladas e uma resposta de sinal igual para glicanas dissialiladas. O número aumentado de picos no cromatograma eluído com TFA (FIGS. 14A-B) comparado com o cromatograma eluído com NH4OH (FIG. 15A-B) é um resultado de separação de formas anomé- ricas de oligossacarídeos. Coleta e concentração de picos individuais eluídos do gradiente com TFA resultam em divisão do pico único em dois picos de massa idêntica quando de reinjeção. Eluição básica dos oligossacarídeos da coluna de PGC resulta em um perfil mais simples (FIG. 15A-B). As condições de eluição básica não resultam em separação anomérica completa, contudo, ampliação de pico significativa é observada. A resolução de pico pode ser aumentada através de aumento da temperatura da coluna, o que irá acelerar a intertroca de formas anoméricas (Itoh S. e outros, J. Chromatogr. A. 2002 968(1 -2), 89-100). Contudo, a sensibilidade (contagem de íons) para os oligos- sacarídeos detectados permanece reduzida, comparado com as condições de eluição ácida. Foi reportado que a adição de sais, tal como acetato de amônio, aumenta a sensibilidade (Churms SC, J. Chromatogr. A. 500 (1990) 555-583).
[000391] A adição de acetato de amônio, trifluoroacetato de amônio ou formiato de amônio resulta em resposta aumentada, mas também resulta em ampliação assimétrica de pico. A ampliação de pico e interferência potencial do sal adicionado com a detecção por UV resultantes tornaram a adição de sal uma opção não atraente. Um meio alternativo de eliminação de separação anomérica é reduzir os oligossaca-rídeos aos alditóis correspondentes.
[000392] Maior sensibilidade e resolução cromatográfica tornam as condições de eluição ácida úteis para definição de perfil de oligossaca- rídeo. Um sistema de definição de perfil em particular consiste em uma coluna Luna C18 acoplada através de duas válvulas de admissão com seis orifícios de posições duplas à coluna Hypercarb de 5 μM (100 x 4,6 mm). A coluna Hypercarb é acoplada a um detector de UV (Waters 2996 PDA) em série com um Q-ToF Micro (Micromass) com uma sonda de ESI padrão. Através de controle de comutação apropriado, a definição de perfil de amostras de CTLA4-Ig pré-purificadas pode ser realizada usando somente a coluna Hypercarb ou o perfil de misturas de digestão pode ser obtido através de injeção direta da mistura de digestão sobre a Luna C18 em série com a coluna Hypercarb. Tipicamente, os perfis são obtidos dos oligossacarídeos N-ligados liberados de 10 a 20 nmols de proteína.
[000393] Em determinadas modalidades, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que têm um cromatograma de acordo com qualquer um ou mais dos cromatogramas tendo picos representativos. Cromatogramas de perfil de oligossacarídeo representativos de moléculas de CTLA4-Ig tendo monômeros com sequências de SEQ ID NO: 2 são mostrados na figura 13, figuras 14A-B, figuras 15A-B (PGC), figura 17 (HPAEC/PAD) e figuras 18A-B. Ambos esses perfis cromatográficos podem ser decompostos em quatro domínios distintos contendo estruturas de oligossacarídeo com graus crescentes de sialilação nos últimos domínios de eluição. O sistema cro- matográfico de PGC permite a interface direta com um detector de massa. A resolução de massa e proporções de sinal para interferência são aceitáveis para oligossacarídeos os quais estão presentes em baixos percentuais. Resolução cromatográfica de estruturas de oligossa- carídeos individuais parece maior na separação cromatográfica por PGC quando comparado com a HPAEC.
[000394] Coleta de picos do método de HPAEC requer dessaliniza- ção e o elevado pH empregado introduz a possibilidade de reações de descamação que poderiam interferir com a identificação estrutural precisa de picos. Em virtude do fato de as condições cromatográficas usadas com cromatografia por PGC serem isentas de sais, os picos de oligossacarídeo eluídos podem ser coletados e concentrados com manipulação mínima. Isso permite a coleta e concentração de picos eluí- dos, seguido por injeção dos oligossacarídeos coletados sobre o sistema de HPAEC. Reinjeção dos oligossacarídeos coletados sobre um sistema de HPAEC-PAD permite a atribuição estrutural de alguns dos picos presentes no perfil por HPAEC (FIG. 17). Em virtude de resolução de pico incompleta sobre a coluna de troca de ânions, nem todos os picos isolados puderam ser mapeados ao perfil por HPAEC.
[000395] Os perfis resultantes de injeção direta de misturas de digestão e aqueles para oligossacarídeos isolados da mesma amostra de proteína não são idênticos. Os perfis resultantes de injeção direta (FIGS. 18A-B) têm diferentes proporções de anômero, sugerindo que a concentração de oligossacarídeos coletados é resultante de anome- rização aumentada. De modo mais importante, o perfil resultante de injeção direta contém um pico, o qual corresponde a uma estrutura te- trassialilada. Essa estrutura não é identificada no perfil de oligossaca- rídeos coletados e isolados. Além de menor tempo de ensaio, definição de perfil diretamente das misturas de digestão pode resultar em uma representação mais precisa da distribuição de oligossacarídeo, evitando degradação de glicana durante coleta e concentração.
Quantificação Relativa
[000396] O mapeamento de superfície realizado sobre amostras de infusão indica que o volume percentual de acetonitrila tem um efeito significativo sobre a eficiência de ionização dos oligossacarídeos em eluição. A dependência da intensidade de sinal sobre o teor de aceto- nitrila na fase móvel torna a quantificação relativa de oligossacarídeos através de MS dependente do tempo de retenção do pico de eluição. Variações na condição da coluna podem afetar os tempos sobre colunas de PGC. Por essa razão, seria difícil obter quantificação relativa consistente a partir do perfil de eluição no cromatograma de íons. O traço de UV a 206 nm não deverá ser afetado pela composição de solvente até o mesmo ponto em que o traço de íons. A quantificação relativa foi realizada usando o traço de UV, o traço de íons foi usado para caracterização e comparações qualitativas apenas. Injeção repetida para os oligossacarídeos isolados de um único lote de glicoproteína resultou em percentuais de desvio-padrão relativo (% de RSD) de menos do que 4% para cada um dos quatro domínios de oligossacarídeo quantificados.
Estruturas O-ligadas em moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2
[000397] Além dos carboidratos N-ligados, moléculas de CTLA4-Ig podem conter carboidratos O-ligados. As estruturas de oligossacarídeo O-ligado podem ser analisadas usando uma série de técnicas de es- pectrometria de massa ortogonal. Essas técnicas incluem várias clivagens com endopeptidase, seguido por análise através de LC/MS/MS.
[000398] Com relação a moléculas de CTLA4-Ig formadas de monô- meros tendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, os dois principais sítios de glicosilação O-ligada foram caracterizados usando ionização por eletropulverização de massa exata e as principais estruturas em cada sítio de O-ligação foram determinadas. Esses dados são resumidos na figura 9. Os dados são consistentes com a existência de três principais estruturas O-ligadas: (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1; (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2; (GalNAc)1 (GlcNac)1 (Gal)2 (NeuAc)2. Cada estrutura é observada em diferentes quantidades sobre cada sítio. Es- sas quantidades são relativamente quantitativas e representam dados obtidos de múltiplas análises. Os oligossacarídeos O-ligados contribuem para uma quantidade substancial de ácido siálico para CTLA4-Ig. Existem dois pontos de fixação principais de oligossacarídeo O-ligado por cadeia. O sítio primário de ocorrência para oligossacarídeos O- ligados é Ser165, o qual é ocupado em cerca de 95% das vezes. O sítio secundário de ocorrência para oligossacarídeos O-ligados é Ser155/156, o qual é ocupado = 25% das vezes. Os dados ortogonais apresentados aqui proporcionam uma visão geral das estruturas de carboidrato predominantes presentes sobre tais moléculas de CTLA4-Ig e são resumidos na figura 9.
[000399] Em geral, os carboidratos O-ligados têm heterogeneidade de estrutura muito maior do que está presente em carboidratos N- ligados. Além disso, não há sequência de consenso para fixação de O- ligação. Assim, uma série de técnicas ortogonais foi desenvolvida para uso na caracterização estrutural dos oligossacarídeos O-ligados: análise intacta por LC/MS e análise de glicopeptídeo por LC/MS.
[000400] Baseado na degradação de Edman e MALDI, um sítio de O-ligação foi reportado como sendo Ser165 (com relação à SEQ ID NO: 2). Para obter dados diretos com relação à presença de glicosilação Ser165, sequenciamento por MS/MS usando a série de íons b' e y" sobre o peptídeo T9 (veja Tabela 4 e Tabela 5) foi realizado. A Tabela 4 lista a série de íons para o peptídeo T9 em quatro estados diferentes de glicosilação. Em todos os quatro estados, a série de íons b', íons b1... b6, está em concordância. Contudo, a série de íons b', b7... bmax, varia através dos diferentes estados de glicosilação em b7 (Ser165). Como uma confirmação, a série de íons y" correspondente é reportada. Em todas as quatro séries de ions y", os íons y1....y19 estão em completa concordância. Contudo, a série de íons y", y20...ymax, varia através dos diferentes estados de glicosilação em y20 (Ser139). A série de íons b' e y", tomados juntos, sustenta a implicação do sequencia- mento de Edman de que Ser139 é o sítio de glicosilação O-ligada primário sobre o peptídeo T9. T9 é um peptídeo que contém vários resíduos de serina e treonina.
[000401] A Tabela 4 apresenta íons b' e y' de LC/MS/MS para o pep- tídeo T9 com e sem o ladder O-ligado de (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. A série de íons b’ é idêntica para todos os espectros até b7, onde o espectro, então, difere pela estrutura de carboidrato O-ligado listada acima de cada série. A série de íons y’ é idêntica para todos os espectros até y19, onde o espectro, então, difere pela estrutura de carboidrato O- ligado listada acima de cada série. Tabela 4: Íons b' e y' de LC/MS/MS para o peptídeo T9
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Tabela 5: Fragmentos de glicopeptídeo O-ligado com os números de sequência correspondentes, sequências de aminoácido e massas teóricas
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[000402] As estruturas O-ligadas de carboidrato em Ser165 representam uma população heterogênea de três espécies principais. Na figura 19, o glicopeptídeo T9 é observado no espectro com desconvolução. Há um pico de base a 2689,2 amu, o qual está em concordância com a massa teórica para esse peptídeo, 2689,11 amu. O espectro ilustra três principais estruturas O-ligadas. O espectro ilustra o peptídeo de base com um ladder de açúcar consistente com a estrutura O-ligada (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. A porção ampliada em negrito do espectro foi intensificada 10 vezes e identifica duas estruturas O-ligadas adicionais consistentes com (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 e (GalNAc)1 (Glc- NAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2.
[000403] Espectrometria de massa foi usada para avaliar a abundância relativa de cada espécie O-ligada. Na figura 19, a glicana (Gal- NAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 é observada em uma proporção de 10:1 com a glicana (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 e em uma proporção de 30:1 com a glicana (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2. Em uma modalidade, portanto, a invenção proporciona uma população compreendendo moléculas de CTLA4-Ig que têm uma proporção de 10:1 de glicana (Gal- NAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 para glicana (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população compreendendo moléculas de CTLA4-Ig que têm uma proporção de 30:1 de gli- cana (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 para glicana (GalNAc)1 (GlcNAc)1 (Gal)2 (NeuAc)2. A glicana (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 é observada em uma proporção de 20:1 com a glicana (HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população compreendendo moléculas de CTLA4-Ig que têm uma proporção de 20:1 da gli- cana (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)2 para glicana (HexNAc)2 (Gal)2 (Neu- Ac)2. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig que compreendem todas as referidas proporções nesse parágrafo. Além disso, um espectro por eletropulverização de íons negativa confirma essas três estruturas predominantes; a abundância relativa de cada uma é mostrada na figura 9.
[000404] Com relação a moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2, além do sítio Ser165, um segundo sítio de O-ligação é observado em Ser155 ou Ser156. Esse sítio é referido como Ser155/156. O peptídeo D8 contendo Ser155/156 foi gerado a partir de uma digestão com AspN e corresponde aos aminoácidos 150-156 de SEQ ID NO: 2. O peptídeo é separado e detectado através de LC/MS. O espectro (não mostrado aqui) para o glicopeptídeo O-ligado D8 mostra um pico de base de 790,2 amu que está em concordância com a massa teórica de 790,8 amu. O espectro ilustra o íon de peptí- deo e uma série de íons os quais são consistentes com a estrutura (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. O peptídeo é predominantemente não- glicosilado; a espécie glicosilada (GalNAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1 constitui aproximadamente 22% da área de pico.
[000405] As estruturas de oligossacarídeo O-ligado da CTLA4-Ig com cadeia simples foram caracterizadas usando uma série de técnicas de espectrometria de massa ortogonal. Essas técnicas incluem clivagens com endopeptidase com análise por LC/MS dos dois sítios de glicosilação O-ligada predominantes com o uso de ionização por eletropulverização para determinar as estruturas predominantes em cada sítio de O-ligação. Esses dados são resumidos na figura 20. Podem existir quatro estruturas O-ligadas predominantes: (Gal- NAc)1(Gal)1(NeuAc)1; (GalNAc)1(Gal)1 (NeuAc)2; (Hex- NAc)2(Gal)2(NeuAc)2; (HexNAc)2(Gal)2,(NeuAc)3. Essas estruturas são detectadas em diferentes quantidades sobre cada sítio. Mais de 95% da CTLA4-Ig com cadeia simples têm pelo menos (HexNAc)2 (Gal)2 (NeuAc)2.
[000406] Outro ensaio foi desenvolvido para confirmar os carboidratos O-ligados e buscar estruturas menos prevalentes. Essa técnica utilizou codigestão com tripsina e quimiotripsina para produzir um peptí- deo confirmado através de MS/MS como sendo THTSPPSPAPELL (aminoácidos 159-171 de SEQ ID NO: 2). Esse peptídeo permitiu a identificação de uma espécie O-ligada monossialilada, duas dissialila- das e uma trissialilada. Uma estrutura definitiva não foi elucidada para as espécies trissialiladas, contudo, duas possibilidades são propostas: um peptídeo contendo uma estrutura com 2 núcleos com 3 ácidos siá- licos ou duas estruturas com 1 núcleo presentes sobre dois resíduos de aminoácido diferentes.
[000407] Uma técnica complementar, análise intacta através de MS, foi usada para confirmar a presença de glicosilações O-ligadas hetero-gêneas de moléculas de CTLA4-Ig. Dímeros de CTLA4-Ig e CTLA4-Ig de cadeia simples foram tratados com PNGase F para remover os oli- gossacarídeos N-ligados. A molécula foi, então, detectada através do espectrômetro de massa e os íons correspondentes foram submetidos à desconvolução no espectro. No material com cadeia simples, a com-posição de glicana predominante é (HexNAc)2(Hex)2(NeuAc)2, enquanto que a referência é predominantemente (Hex- NAc)1(Hex)1(NeuAc)1. As composições de glicosilação estão em concordância com aquelas observadas durante a análise de peptídeo por LC/MS. Além de uma alteração na glicosilação O-ligada sobre o padrão, uma segunda modificação principal foi observada. Um desvio de massa de 113 ± 4 u é observado entre as espécies não-reduzidas com cadeia simples e o padrão de CTLA4Ig reduzido. O desvio de massa de 113 ± 4 u desapareceu quando de redução com DTT. No material dimérico, o envoltório de íons resultante foi submetido à desconvolu- ção em um espectro (não mostrado aqui) com um pico principal a 79944 amu, o qual corresponde à presença de duas estruturas (Gal- NAc)1 (Gal)1 (NeuAc)1. O próximo maior pico, a 80600 amu, corresponde a três estruturas O-ligadas ou uma combinação de no máximo uma estrutura O-ligada ramificada. O terceiro maior pico corresponde à quatro estruturas O-ligadas ou uma combinação contendo no máximo duas estruturas O-ligadas ramificadas.
Determinação do teor de ácido siálico
[000408] Outro aspecto de caracterização de glicoproteína é deter-minação de ácido siálico. O teor de ácido siálico pode ser uma assinatura característica da glicoproteína. O teor de ácido siálico de uma gli- coproteína da presente invenção pode ser avaliado através de métodos convencionais. Por exemplo, ácido siálico pode ser separadamente determinado através de um método colorimétrico direto (Yao e outros, 1989, Anal. Biochem., 179: 332-335), usando pelo menos amostras em triplicata. Outro método de determinação de ácido siálico envolve o uso de ácido tiobarbatúrico (TBA), conforme descrito por Warren e outros, 1959, J. Biol. Chem., 234: 1971-1975. Ainda outro método envolve cromatografia de elevado desempenho, conforme descrito por H. K. Ogawa e outros, 1993, J. Chromatography, 612: 145-149.
[000409] Em uma modalidade, um método para determinar a quantidade de ácido N-Acetil Neuramínico (NANA) e ácido N-Glicolil Neura- mínico (NGNA) é através de tratamento por hidrólise ácida da glicopro- teína de interesse (por exemplo, veja Exemplo 3). Nesse método, NANA e NGNA são clivados da proteína através de hidrólise ácida. Em uma modalidade , a glicoproteína é substancialmente purificada através de métodos adequados para sua purificação. O NANA e NGNA liberados são separados através de HPLC sobre uma coluna Rezex Monosacharide RHM e detectados através de absorbância de UV (206 nm). NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatores de resposta de padrões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Os resultados podem ser reportados como proporções molares (MR) de NANA e NGNA respectivamente, para proteína.
[000410] A finalidade do método de medição do teor de ácido siálico por hidrólise ácida é medir a quantidade total de ácido siálico (NANA e NGNA) para proteína em amostras de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig (proporções molares). É importante notar, contudo, que essas propor-ções molares de ácido siálico incluem NANA e NGNA livre e ligado. Os resultados da proporção molar são obtidos baseado na comparação da área de pico de NANA e NGNA de amostras de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig hidrolisadas versus padrões de NANA e NGNA. Pa-drões de NANA e NGNA hidrolisados também podem ser usados.
[000411] Por exemplo, proporções molares foram obtidas para moléculas de CTLA4-Ig tendo a sequência de aminoácido SEQ ID NO: 2. Sem hidrólise, o pico de interesse em cromatogramas de padrões de NANA e NGNA aparece como um único pico. Quando o padrão de NANA e amostras de CTLA4-Ig são hidrolisados, os cromatogramas resultantes mostram NANA como um pico principal, seguido intimamente por um pequeno pico extra (<10% da principal área de pico; referido como "NANA degradado"); a mesma concentração de padrões de NANA com e sem hidrólise resultou em áreas de pico muito próximas, incluindo o degradante. Nenhum pico é claramente observado nos cromatogramas para as espécies de NGNA degradadas, enquanto que as contagens de área do pico de NGNA em um padrão de NGNA hidrolisado foram observadas como diminuindo aproximadamente 8 - 9%. Experimentos de espectrometria de massa (MS) demonstraram que o "degradante NANA" em um padrão de NANA hidrolisado e nas amostras de CTLA4-Ig hidrolisadas resultam de perda de 18 Dáltons (água) do NANA. Portanto, o método inclui, apropriadamente, o pequeno pico extra na integração do pico de NANA em CTLA4-Ig hidroli- sada. Foi também demonstrado, através de experimentos de MS, que o NGNA degrada quando de hidrólise, com uma perda de 18 Dáltons. O degradante NGNA eluído entre NANA e o degradante NANA, de modo que UV não pode detectá-lo. No material de CTLA4-Ig, o teor de NGNA é de aproximadamente 5% do teor de NANA e, como um resultado, coeluição do degradante NGNA causa menos de 0,5% de alteração na área de pico de NANA, o que está dentro da faixa de variabilidade da área de pico de NANA. O método não pode incluir a área do NGNA degradado no resultado de NGNA; portanto, o resultado de NGNA pode ser baixo em < 10%, também dentro da variabilidade do método.
[000412] Em virtude de se acreditar que o NGNA é mais imunogêni- co do que o NANA, há uma preferência clínica por um produto terapêutico recombinante que contém uma baixa proporção molar de NGNA. Em uma modalidade da invenção, a preponderância de ácido siálico em uma população de moléculas de CTLA4-Ig é NANA e não NGNA em que, nessa população, a proporção molar de mols de ácido siálico por mol de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig é de cerca de 5 a cerca de 18. Em outra modalidade, a preponderância de ácido siálico em uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig é NANA e não NGNA em que, nessa população, a proporção molar de mols de ácido siálico por mol de moléculas ou dímeros de CTLA4A29YL104E-Ig é de cerca de 5,5 a cerca de 8,5.
Cassetes de expressão de CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig
[000413] A invenção proporciona um ácido nucleico que codifica uma molécula de CTLA4-Ig, o qual é um cassete de expressão em uma modalidade. A invenção também proporciona um ácido nucleico que codifica uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica a molécula de CTLA4-Ig está contido dentro de um cassete de expressão. Em outra modalidade, o ácido nuclei- co que codifica a molécula de CTLA4-Ig está contido dentro de um cassete de expressão derivado de um plasmídeo tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. Em uma outra modalidades, o ácido nucleico que codifica a molécula de CTLA4A29YL104E-Ig está contido dentro de um cassete de expressão. Em determinadas modalidades, o ácido nucleico que codifica a molécula de CTLA4A29YL104E-Ig está contido dentro de um cassete de expressão derivado de um plasmídeo depositado como No. de Acesso ATCC PTA-2104.
[000414] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser uma molécula de ácido nucleico de CDNA, cDNA-semelhante, DNA ou RNA de interesse em um formato passível de expressão, tal como um cassete de expressão, o qual pode ser expresso a partir do promotor natural ou derivado do mesmo ou um promotor totalmente heterólogo. Alternati-vamente, o ácido nucleico de interesse pode codificar um RNA antis- senso. O ácido nucleico de interesse pode codificar uma proteína (por exemplo, uma glicoproteína, tal como uma glicoproteína de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) e pode ou não incluir íntrons.
[000415] Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica um pep- tídeo tendo atividade de CTLA4 pode ser obtido de DNA genômico de células T ou de mRNA presente em linfócitos T ativados. Em outra modalidade, o ácido nucleico que codifica um CTLA4A29YL104E-Ig também pode ser obtido de DNA genômico de células T ou de mRNA presente em linfócitos T ativados. Em outra modalidade da invenção, o gene que codifica uma proteína de interesse, por exemplo CTLA4 ou CTLA4A29YL104E-Ig, pode ser clonado de uma biblioteca genômica ou ao cDNA de acordo com protocolos-padrão que versados na técnica pra-ticam. Um cDNA, por exemplo, que codifica CTLA4 ou CTLA4A29YL104E- Ig, pode ser obtido através de isolamento de mRNA total de uma li- nhagem de célula adequada. Usando métodos conhecidos na técnica, cDNAs de fita dupla podem ser preparados a partir de mRNA total e subsequentemente podem ser inseridos em um vetor de bacteriófago ou plasmídeo adequado. Genes podem também ser clonados usando métodos de PCR bem-estabelecidos na técnica. Em uma modalidade, um gene que codifica CTLA4 ou CTLA4A29YL104E-Ig pode ser clonado via PCR de acordo com a informação de sequência de nucleotídeo proporcionada pela presente invenção.
[000416] Em outra modalidade, um vetor de DNA contendo o cDNA de CTLA4 ou CTLA4A29YL104E-Ig pode atuar como um modelo em reações de PCR em que iniciadores de oligonucleotídeo projetados para amplificar uma região de interesse podem ser usados para obter um fragmento de DNA isolado abrangendo essa região. Em uma modalidade particular da invenção, a região de interesse direcionada no cDNA de CTLA4 pode ser o domínio extracelular de CTLA4, incluindo o domínio extracelular de Humano CTLA4. Em determinadas modalidades, a região de interesse direcionada em um cDNA de CTLA4A29YL104E-Ig pode ser o domínio extracelular de CTLA4 com alterações de aminoácido nas posições de aminoácido 55 e 130 de SEQ ID NO: 2 (por exemplo, veja SEQ ID NO: 18), incluindo o domínio ex- tracelular de Humano CTLA4 abrigando as alterações de aminoácido descritas acima.
[000417] Para expressar uma proteína de fusão no contexto da presente invenção, a fusão de gene quimérico em uma modalidade (por exemplo, um gene que codifica uma proteína de fusão de CTLA4- imunoglobulina (CTLA4-Ig) ou proteína de fusão CTLA4A29YL104E-Ig) inclui uma sequência de nucleotídeo, a qual codifica a sequência sinalizadora pelo que, quando de transcrição e tradução do gene quimérico, direciona a proteína de fusão recentemente sintetizada para secreção. Em uma modalidade, uma sequência sinalizadora de CTLA4 nati- va (por exemplo, a sequência sinalizadora de Humano CTLA4 descrita em Harper, K. e outros (1991, J. Immunol. 147,1037-1044) pode ser usada. Em uma modalidade alternativa da invenção, uma sequência sinalizadora heteróloga pode ser usada para dirigir a secreção de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig (por exemplo, a sequência sinalizadora de oncostatina-M (Malik N., e outros, 1989, Mol Cell Biol 9(7), 28472853) ou uma sequência sinalizadora de imunoglobulina). Versados na técnica compreenderão que a sequência de nucleotídeo correspondendo à sequência sinalizadora pode ser inserida na fusão de gene quimérico através de técnicas padrão de DNA recombinante, tais como realizando uma ligação em-rede da sequência sinalizadora na extremidade 5' de uma sequência de ácido nucleico que codifica CTLA4.
[000418] Sob as condições do Tratado de Budapeste, DNA que codifica a sequência de aminoácido correspondendo a uma proteína de fusão de CTLA4-Ig foi depositado na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110, em 31 de Maio de 1991. A ele foi atribuído No. de Acesso ATCC 68629. Adicionalmente, um plasmídeo de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica a sequência de aminoácido correspondendo a uma CTLA4A29YL104E-Ig foi depositado sob as condições do Tratado de Budapeste em 19 de Junho de 2000 na ATCC. Ao plasmí- deo depositado foi atribuído o No. de Acesso ATCC PTA-2104. O plasmídeo depositado é também referido como pD16 LEA29Y e pD16 L104EA29Y. CTLA4A29YL104E-Igs são ainda descritas na Patente U.S. No. 7.094.874 e Pedidos de Patente U.S. copendentes N°s 09/579.927, 60/287.576 e 60/214.065 e Na Publicação de Patente Internacional No. WO 01/923337 A2, todos os quais são incorporados por referência ao presente pedido em suas totalidades.
[000419] Um vetor de expressão da invenção pode ser usado para transfectar células, eucariotas (por exemplo, células de levedo, de mamífero ou inseto) ou procariotas, de forma a produzir proteínas (por exemplo, proteínas de fusão, tais como moléculas de CTLA4-Ig, CTLA4A29YL104E-Ig e semelhantes) codificadas por sequências de nu- cleotídeo do vetor. Versados na técnica compreenderão que a expressão de produtos de proteína desejados em procariotas é mais frequentemente realizada em E. coli com vetores que contêm promotores constitutivos ou induzíveis. Alguns vetores de expressão de E. coli (também conhecidos na técnica como vetores de fusão) são projetados para adicionar uma série de resíduos de aminoácido, usualmente ao N-término da proteína recombinante expressa. Os referidos vetores de fusão podem servir a três funções: 1) aumentar a solubilidade da proteína recombinante desejada; 2) aumentar a expressão da proteína recombinante de interesse; e 3) auxiliar na purificação da proteína re- combinante atuando como um ligante em purificação por afinidade. Alguns exemplos de vetores de expressão de fusão incluem, mas não estão limitados a: a) pGEX (Amrad Corp., Melbourne, Austrália), o qual funde glutationa S-transferase à proteína desejada; b) pcD- NA™3,1/V5-His A B & C (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA), o qual funde 6x-His a uma proteína recombinante de interesse; e c) pMAL (New England Biolabs, Beverly, Mass.), o qual funde proteína de ligação à maltose E à proteína recombinante alvo.
[000420] As células adequadas para cultura de acordo com os processos e métodos da presente invenção podem abrigar vetores de expressão introduzidos (estruturas), tais como plasmídeos e semelhantes. As estruturas de vetor de expressão podem ser introduzidas via transfecção, lipofecção, transformação, injeção, eletroporação ou infecção. Os vetores de expressão podem conter sequências de codificação ou porções das mesmas, que codificam as proteínas para expressão e produção em um processo de cultura. Tais vetores de expressão podem incluir os componentes requeridos para a transcrição e tradução da sequência de codificação inserida. Vetores de expressão contendo sequências que codificam as proteínas e polipeptídeos pro-duzidos, bem como os elementos de controle de transcrição e tradução apropriados, podem ser gerados usando métodos bem- conhecidos e praticados por versados na técnica. Esses métodos incluem técnicas de DNA recombinante in vitro, técnicas sintéticas e re- combinação genética in vivo, os quais são descritos em J. Sambrook e outros, 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. e em F. M. Ausubel e outros, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.
[000421] Um marcador selecionável pode ser usado em um vetor de expressão recombinante (por exemplo, um plasmídeo), em que o vetor é estavelmente integrado no genoma da célula, para conferir resistência a células abrigando o vetor. Isso permite sua seleção em um meio de seleção apropriado. Vários sistemas de seleção podem ser usados incluindo, mas não limitado a, os genes de hipoxantina-guanina fosfo- ribosil transferase (HGPRT), a timidina quinase do Vírus do Herpes Simplex (HSV TK) (Wigler e outros, 1977, Cell, 11: 223), (Szybalska e Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 202) e adenina fosfo- ribosil transferase (APRT) (Lowy e outros, 1980, Cell, 22: 817), os quais podem ser empregados em células hgprt-, tk- ou aprt-, respectivamente.
[000422] Os seguintes Exemplos não-limitativos de genes marcadores, os quais podem estar contidos dentro de um vetor de expressão, podem também ser usados como a base de seleção para resistência antimetabólito: gpt, o qual confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072); dhfr, o qual confere resistência ao metotrexato (Wigler e outros, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 357; e O'Hare e outros, 1981, Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 78: 1527); hygro, o qual confere resistência à higromi- cina (Santerre e outros, 1984, Gene, 30: 147); e neo, o qual confere resistência ao aminoglicosídeo G418 (Clinical Pharmacy, 12: 488-505; Wu e Wu, 1991, Biotherapy, 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science, 260: 926932; Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem., 62: 191-21; Maio de 1993, TIB Tech, 11 (5): 155-215). Técnicas de DNA recombinante comumen- te conhecidas na técnica podem ser rotineiramente aplicadas para escolher os clones de célula recombinante desejados. Tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel e outros (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, 1990, Gene Transfection and Expression. A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli e outros (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colber- re-Garapin e outros, 1981, J. Mol. Biol., 150: 1, os quais são incorporados por referência aqui em suas totalidades.
[000423] Os níveis de expressão de uma molécula de proteína expressa podem ser aumentados via amplificação do vetor de expressão (para uma revisão, veja Bebbington e Hentschel, "The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning", Vol. 3, Academic Press, New York, 1987). Um aumento no nível de um inibidor presente na meio de cultura de uma célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador quando um marcador no sistema de vetor de expressão expressando uma proteína de interesse é amplificável. Uma vez que a região amplificada está associada a um gene que codifica proteína, produção de proteína aumentará concomitantemente (Crousar e outros, 1983, Mol. Cell. Biol., 3: 257). Vetores que abrigam as sequências de ácido nucleico que codificam os marcadores selecionáveis glutami- na sintase de (GS) ou di-hidrofolato reductase (DHFR) podem ser am- plificados na presença dos fármacos metionina sulfoximina ou meto- trexato, respectivamente. Uma vantagem de tais vetores é a disponibi-lidade de linhagens de células, por exemplo, a linhagem de células de mieloma de murino, a linhagem de células NSO e de Ovário de Hamster Chinês, CHO, DG44, as quais são negativas para glutamina sintase e negativas para di-hidrofolato reductase, respectivamente.
[000424] Em uma modalidade da presente invenção, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CTLA4 solúvel ou molécula de proteína de fusão CTLA4A29YL104E-Ig pode ser inserida em um vetor de expressão projetado para expressão de sequências estranhas em um hospedeiro eucariota. Os componentes regulatórios do vetor podem variar de acordo com o hospedeiro eucariota escolhido para uso. Vetores usados para expressar CTLA4 solúvel ou CTLA4A29YL104E-Ig em células hospedeiras eucariotas podem incluir sequências intensificadoras para otimização de expressão de proteína.
[000425] Células de mamífero (tais como células de BHK, células de VERO, células de CHO e semelhantes) podem abrigar um vetor de expressão (por exemplo, um que contém um gene que codifica as pro-teínas de fusão de CTLA4-Ig ou a proteína de fusão CTLA4A29YL104E-Ig) via introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira apro-priada. Consequentemente, a invenção abrange vetores de expressão contendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma CTLA4-Ig ou proteína de fusão CTLA4A29YL104E-Ig e abrange células hospedeiras nas quais tais vetores de expressão podem ser introduzidos via métodos conhecidos na técnica. Conforme descrito aqui, um vetor de expressão da invenção pode incluir sequências de nucleotídeo que codificam uma CTLA4-Ig ou proteína de fusão CTLA4A29YL104E-Ig ligada a pelo menos uma sequência regulatória de uma maneira que permita a expressão da sequência de nucleotídeo em uma célula hospedeira. Para versados na técnica, sequências regulatórias são bem- conhecidas e podem ser selecionadas para dirigir a expressão de uma proteína de interesse em uma célula hospedeira apropriada, conforme descrito em Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Sequências regulatórias podem compreender o seguinte: intensificadores, promotores, sinais de poliadenilação e outros elementos de controle de expressão. Os praticantes na técnica compreenderão que o design de um vetor de expressão pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transfectada e/ou o tipo e/ou a quantidade desejada de proteína a ser expressa.
[000426] Plasmídeos de clonagem e expressão (por exemplo, pcSD e piLN) são construídos conforme descrito no Exemplo 11. Em uma modalidade da presente invenção, um fragmento de DNA isolado do plasmídeo pSV2dhfr- é ligado à parte principal do vetor pcDNA3, gerando o vetor de expressão pcSD. O vetor pcSD é compreendido das seguintes características: um promotor de citomegalovírus (CMV), seguido por um sítio de clonagem múltipla (MCS); um sinal de poliadeni- lação de hormônio de crescimento bovino (BGH) e uma sequência de término de transcrição; uma sequência de cDNA de dhfr de camundongo para seleção e amplificação; um gene de resistência à ampicili- na; e uma origem de replicação pUC para seleção e manutenção em Escherichia coli. O vetor piLN é construído contendo cDNAs que codificam porções da sequência de aminoácido correspondendo a um fragmento do domínio extracelular do receptor de Humano CTLA4, Exemplo 11, onde o cDNA que codifica uma primeira sequência de aminoácido é unido ao DNA que codifica uma segunda sequência de aminoácido, a qual corresponde a uma região de IgC que permite a expressão do gene do receptor de CTLA4 através de alteração da solubilidade da proteína de CTLA4 expressa (veja figura 1 e breve descrição para figura 1 para resíduos correspondendo à porção extracelu- lar de CTLA4 e região constante de IgG1). Em uma modalidade, uma sequência de peptídeo sinalizador de oncostatina M pode ser fundida a uma sequência de aminoácido correspondendo ao domínio extrace- lular de CTLA4, o qual é subsequentemente fundido a uma segunda sequência de aminoácido correspondendo a um domínio de Ig (por exemplo, o domínio IgCYi humano) conforme previamente descrito na figura 1. A sequência sinalizadora de oncostatina M permite que formas solúveis do gene de produto de proteína de CTLA4 (por exemplo CTLA4-Ig) sejam geradas.
[000427] Para construir um vetor de expressão pcSD contendo um gene que codifica a proteína de fusão de CTLA4-imunoglobulina, métodos conhecidos na técnica (por exemplo, subclonagem em sítio de restrição) podem ser usados. O material de iniciação para uma modalidade da invenção pode ser um fragmento de DNA digerido e excisa- do do vetor de clonagem piLN descrito no Exemplo 11. Em outra modalidade, o fragmento de DNA excisado do referido vetor contém a sequência de aminoácido da sequência sinalizadora de oncostatina M e a proteína de fusão de CTLA4, em que o referido fragmento de DNA é ligado ao vetor pcSD digerido. O fragmento de DNA de oncostatina M- CTLA4-Ig pode ser inserido entre o promotor de CMV e um cassete contendo o sinal de poliadenilação de BGH e uma sequência de término de transcrição. Isso colocaria um produto genético de CTLA4 sob o controle do promotor de CMV no plasmídeo designado pcSDhuCTLA4- Ig (FIG. 21; SEQ ID NO: 17).
[000428] Adicionalmente, plasmídeos de expressão e clonagem (por exemplo, pD16LEA29Y) podem ser derivados do plasmídeo pcDNA3 da Invitrogen. O vetor pD16LEA29Y (FIG. 22) compreende as seguintes características: o gene de resistência à neomicina do pcDNA3 foi substituído pelo gene de di-hidrofolato reductase de murino (DHFR) sob o controle do promotor SV40 sem intensificador (enfraquecido); o gene que codifica uma CTLA4A29YL104E-Ig =é expresso a partir do pro-motor de CMV e o sinal de poliadenilação é do gene do hormônio de crescimento bovino; o cassete de expressão para o gene de interesse é flanqueado por sequências de término de transcrição, isto é, 5' ao promotor e 3' ao sítio poli A; os vetores contêm dois poliligantes de sítio de restrição distintos, um 3' ao promotor para clonagem do gene de interesse e um 5' ao promotor para linearização do vetor antes de transfecção; o vetor contém um gene de resistência à ampicilina e a origem de replicação ColE1 para propagação de plasmídeo em E. coli; a sequência de CTLA4A29YL104E-Ig (SEQ ID NO: 3) é precedida pelo peptídeo sinalizador de oncostatina M e montado no vetor de expressão conhecido como vetor pD16LEA29Y.
[000429] O vetor é construído contendo cDNAs que codificam porções da sequência de aminoácido correspondendo a um fragmento do domínio extracelular do receptor de CTLA4 humano (SEQ ID NO: 2), em que o aminoácido Ala na posição 55 é substituído pelo aminoácido Tyr e o aminoácido Leu na posição 130 é substituído pelo aminoácido Glu (FIG. 3). Essas alterações de aminoácido são representadas na sequência de aminoácido CTLA4A29YL104E-Ig tendo SEQ ID NO: 4. O cDNA que codifica uma primeira sequência de aminoácido (por exemplo, a sequência que codifica a CTLA4A29YL104E-Ig) é unido ao DNA que codifica uma segunda sequência de aminoácido, a qual corresponde a uma região de IgC que permite a expressão do gene do receptor de CTLA4A29YL104E-Ig alterando a solubilidade da proteína de CTLA4A29YL104E-Ig expressa (veja figura 3 e a breve descrição para a figura 3 para resíduos correspondendo à porção extracelular de CTLA4 modificada e a região constante de IgG1) tendo SEQ ID NO: 3.
[000430] Em uma modalidade, uma sequência de peptídeo sinalizador de oncostatina M pode ser fundida a uma sequência de aminoáci- do correspondendo ao domínio extracelular de CTLA4 o qual, subse- quentemente, é fundido a uma segunda sequência de aminoácido cor-respondendo a um domínio de ingrediente (por exemplo, o domínio IgCYi humano) conforme previamente descrito na figura 3. A sequência sinalizadora de oncostatina M permite que formas solúveis do produto de proteína do gene de CTLA4 (por exemplo, uma CTLA4A29YL104E-Ig) sejam geradas.
Transfecção Estável para Gerar Linhagem de Célula
[000431] Vetores que contêm DNA que codifica uma proteína de in-teresse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) podem ser transformados em células hospedeiras adequadas (por exemplo, células bacterianas) de forma a produzir grandes quantidades de DNA clonado. Alguns exemplos não-limitativos de células bac- terianas para transformação incluem a linhagem de célula bacteriana das cepas DH5α ou MC1061/p3 de E. coli (Invitrogen Corp., San Diego, Calif.), a qual pode ser transformada usando procedimentos- padrão praticados na técnica e colônias podem, então, ser selecionadas para a expressão em plasmídeo apropriada.
[000432] Vetores de expressão para células eucariotas, tais como células de mamífero, podem incluir promotores e sequências de controle compatíveis com células de mamífero. Em uma modalidade da invenção, esses elementos regulatórios podem ser, por exemplo, um promotor de CMV encontrado no vetor pcSD ou pD16LEA29Y ou o vírus sarcoma de aves (ASV) localizado no vetor piLN. Outros promotores precoces e tardios comumente usados incluem, mas não estão limitados a, aqueles do Simian Virus 40 (SV 40) (Fiers, e outros, 1973, Nature 273: 113) ou outros promotores virais, tais como aqueles derivados de papiloma bovina, polioma e Adenovírus 2. O promotor regulado hMTII (Karin, e outros, 1982, Nature 299: 797-802) pode também ser usado, além de outros conhecidos na técnica. Para expressão de proteína recombinante, em células de inseto cultivadas (por exemplo, células SF 9), alguns vetores de baculovírus disponíveis incluem a série pVL (Lucklow, V. A. e Summers, M. D., 1989, Virology 170: 31-39) e a série pAc (Smith e outros, 1983, Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165). Versados na técnica também compreenderão que regiões intensificadoras (aquelas sequências encontradas a montante ou a jusante da região promotora em regiões de DNA de não-codificação) são também importantes para otimizar a expressão. Origens de replicação podem ser empregadas, se necessário, a partir de fontes virais, por exemplo, por exemplo, se utilizando um hospedeiro procariota para introdução do DNA de plasmídeo. Contudo, integração cromossômica é um mecanismo comum para replicação de DNA em organismos eucariotas.
[000433] Embora, em uma modalidade da presente invenção, células hospedeiras de mamífero (tais como células de CHO) sejam empregadas para expressão da proteína desejada (por exemplo, proteínas de fusão, glicoproteína e semelhantes), outros organismos eucariotas também podem ser usados como hospedeiros. Cepas de laboratório do levedo de germinação Saccharomyces cerevisiae (também conhecido como levedo de padaria ou levedo de pão) podem ser usadas, bem como outras cepas de levedo, tais como o levedo de fissão Schi- zosaccharomyces pombe. Vetores de levedo abrigando DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, gli- coproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) podem utilizar a origem de replicação 2μ de Broach, Meth. Enz. 101: 307 (1983) ou outras origens de replicação compatíveis com levedo (por exemplo, Stinchcomb e outros, 1979, Nature 282: 39; Tschempe e outros, 1980, Gene 10: 157; e Clarke e outros, 1983, Meth. Enz. 101: 300). Um elemento regulatório contido dentro de vetores de levedo pode ser um promotor para síntese de enzimas glicolíticas (Hess e outros, 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland e outros, 1978, Biochemistry 17: 4900).
[000434] Aqueles versados na técnica podem também utilizar outros promotores em que as condições de crescimento podem regular a transcrição do referido gene regulável e podem incluir os seguintes exemplos não-limitativos: Isocitocroma C, desidrogenase 2 de álcool, enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose, fosfa- tase ácida e enzimas degradativas associadas ao metabolismo de nitrogênio. Similar aos sistemas de expressão de mamífero, sequências terminadoras em vetores de expressão de levedo também são desejáveis na extremidade 3' das sequências de codificação e são encontradas na região não traduzida 3' após a rede de leitura aberta em genes derivados de levedo. Alguns exemplos não-limitativos de vetores de levedo adequados para expressão de proteína recombinante em levedo (por exemplo, em S. cerevisiae) incluem pMFa (Kurjan e Hers- kowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz e outros, 1987, Gene 54: 113-123), pYepSec1 (Baldari, e outros, 1987, Embo J. 6: 229234), pYES2 (Invitrogen Corporação, San Diego, Calif.), bem como aqueles pertencendo à família pRS de vetores de levedo.
[000435] Clones, por exemplo, clones bacterianos, os quais contêm DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) obtidos conforme descrito acima podem, então, ser transfectados em células hospedeiras adequadas, tais como células de mamífero, para expressão do produto desejado. Técnicas de transfecção são realizadas usando técnicas- padrão estabelecidas na técnica apropriadas para as referidas células hospedeiras, em que a técnica de transfecção depende da célula hos-pedeira usada. Por exemplo, transfecção de célula de mamífero pode ser realizada usando lipofecção, fusão de protoplasto, transfecção mediada por DEAE- dextrana, coprecipitação com CaPO4, eletropora- ção, microinjeção direta, bem como outros métodos conhecidos na técnica, os quais podem compreender: raspagem, captação direta, choque osmótico ou com sacarose, fusão de lisozima ou fusão de eri- trócito, microinjeção indireta, tal como via técnicas eritrócito-mediadas e/ou submetendo as células hospedeiras a correntes elétricas. Como outras técnicas para a introdução de informação genética em células hospedeiras serão desenvolvidas, a lista acima mencionada de métodos de transfecção não é considerada como sendo exaustiva.
[000436] Expressão de DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) em células hospedeiras eucariotas derivadas de organismos multicelulares (por exemplo, originárias de mamífero) é particularmente utilizada no contexto da presente invenção (Tissue Cultures, Academic Press, Cruz e Patterson, Eds. (1973)). Células hospedeiras derivadas de organismos multicelulares têm a capacidade de realizar combinação de íntrons e, assim, podem ser usadas diretamente para expressar fragmentos de DNA genômico. Conforme estabelecido anteriormente, linhagens de células hospedeiras úteis incluem, mas não estão limitadas a, Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de BHK, rim de macaco (COS), células de VERO e HeLa. Na presente invenção, linhagens de células expressando estavelmente uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes) são usadas. Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal como uma linhagem de célula de CHO) é transfectada (por exemplo, através de eletroporação) com um vetor de expressão (por exemplo, pcSDhuCTLA4-Ig, pD16LEA29Y e semelhantes) contendo a Sequência de DNA que codifica uma glicoproteína de interesse. Em uma modalidade, a glicoproteína de interesse pode ser uma proteína de CTLA4-Ig, incluindo a proteína de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido contida em SEQ ID NO: 2, codificada por uma porção da sequência de nucleotídeo em SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, a glicoproteína de interesse pode ser a CTLA4A29YL104E-Ig, incluindo a CTLA4A29YL104E-Ig tendo uma sequência de aminoácido contida em SEQ ID NO: 4, codificada por uma porção da sequência de nucleotí- deo em SEQ ID NO: 23.
[000437] Uma proteína recombinante, tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig, pode ser expressa em células hospedeiras eucario- tas, tais como células de mamífero (por exemplo, células de CHO, BHK, VERO ou NS0), células de inseto (por exemplo, usando um vetor de baculovírus) ou células de levedo. Versados na técnica podem usar outras células hospedeiras adequadas, tais como aquelas descritas anteriormente, no contexto da presente invenção. Em uma modalidade, expressão eucariota, ao invés de procariota, de uma proteína de fusão recombinante (tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) é empregada. Expressão de proteínas recombinantes eucariotas, tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig humana, em células eucariotas, tais como células de CHO, pode levar à glicosilação parcial e/ou completa, bem como à formação de ligações de dissulfeto intra- ou intercadeia. Para amplificação transitória e expressão de uma proteína desejada, um vetor abrigando DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) é distribuída em células eucariotas através de um método de transfecção conhecido na técnica, mas não integrado no genoma da célula. Expressão de genes transfectados pode ser medida dentro de 16-96 horas. Células de mamífero (tais como células de COS) podem ser usadas em conjunto com vetores, tais como pCDM8, para expressar transitoriamente uma proteína desejada (Gluzman, Y., 1981, Cell 23: 175-182; Seed, B., 1987, Nature 329: 840).
[000438] É compreendido na técnica que, para transfecção estável de células de mamífero, uma pequena fração de células pode integrar o DNA em seus genomas e integração com sucesso pode depender do vetor de expressão e do método de transfecção utilizado. Para am-plificação e expressão estável de uma proteína desejada, um vetor abrigando DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4- Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) é estavelmente integrado no genoma de células eucariotas (tais como células de mamífero), resultando na expressão estável de genes transfectados. De forma a identificar e selecionar clones expressando estavelmente um gene que codifica uma proteína de interesse, um gene que codifica um marcador selecionável (por exemplo, resistência a antibióticos) pode ser introduzido nas células hospedeiras junto com o gene de interesse. Marcadores selecionáveis usados por versados na técnica podem ser aqueles que conferem resistência a fármacos, tais como G418 e higromicina. O gene que codifica um marcador selecionável pode ser introduzido em uma célula hospedeira em um plasmídeo distinto ou pode ser introduzido sobre o mesmo plasmídeo que o gene de interesse. Células contendo o gene de interesse podem ser identificadas através de seleção com fármaco, em que células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão na presença do referido fármaco, enquanto que células que não incorporaram o gene marcador selecionável morrerão. As células que sobrevivem podem, então, ser selecionadas para a produção da proteína desejada (por exemplo, uma proteína de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig).
[000439] Conforme descrito anteriormente, células de CHO deficientes quanto à expressão do gene de di-hidrofolato reductase (dhfr) podem sobreviver apenas com a adição de nucleosídeos. Quando as referidas células são estavelmente transfectadas com um vetor de DNA abrigando o gene dhfr, as células são, então, capazes de produzir os nucleosídeos desejados. Usando o dhfr como o marcador selecioná- vel, versados na técnica compreenderão que, na presença do antime- tabólito, metotrexato, amplificação de gene dhfr, bem como o gene de interesse transfectado (por exemplo, CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) ocorre prontamente. Em uma modalidade da presente invenção, células de mamífero, tais como células de CHO dhfr-, são transfectadas com um vetor de expressão, tal como pcSDhuCTLA4-Ig (Exemplos 1113) ou pD16LEA29Y, para gerar uma população de células que podem ser estavelmente amplificadas e que podem expressar estavelmente um produto de proteína desejado, (tal como beta polipeptídeos de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig, respectivamente). Em outra modalidade, a linhagem de célula dhfr- negativa DG44 (Invitrogen Corp. Carlsbad, CA) pode ser empregada para a transfecção estável. Em outra modalidade da presente invenção, transfecção pode ocorrer via eletro- poração.
[000440] Conforme é prontamente praticado na técnica, células de mamífero transfectadas (por exemplo, células de CHO dhfr- negativas) são mantidas em meio não seletivo contendo soro durante 1-2 dias pós transfecção. As células são, então, tratadas com tripsina e recolocadas em meio contendo soro, na presença de uma pressão seletiva (por exemplo, um fármaco tal como metotrexato). As células são cultivadas em meio contendo soro seletivo durante 2-3 semanas, com trocas frequentes de meio de forma a eliminar resíduos e células mortas, até que colônias distintas possam ser visualizadas. Colônias individuais podem, então, ser tripsinizadas e colocadas em lâminas com múltiplas cavidades para propagação adicional e amplificação na presença de meio seletivo de forma a identificar produtores que expressam um alto nível da proteína desejada (por exemplo, construtos de fusão, gli- coproteínas e semelhantes) via métodos estabelecidos na técnica, tais como ELISAs ou imunoprecipitação. Em uma modalidade da presente invenção, o método descrito acima foi realizado para transfecção de células de CHO dhfr- negativas (por exemplo, células DG44) de forma a estabelecer uma linhagem de célula estável expressando uma proteína recombinante de interesse (por exemplo, uma proteína de CTLA4- Ig) (veja, por exemplo, Exemplos 12-13). Em outra modalidade, uma linhagem de célula estável expressando uma CTLA4A29YL104E-Ig foi es-tabelecida (veja Exemplo 23).
[000441] Uma linhagem de célula de CHO estável da invenção expressa estavelmente moléculas de proteína de CTLA4-Ig como mo- nômeros de CTLA4-Ig tendo a sequência (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Essa linhagem de célula pode secretar uma população de moléculas de CTLA4-Ig que podem existir como formas multiméricas (tais como, dímeros, tetrâmeros e semelhantes), em que a forma mul- timérica pode ter diferentes sequências monoméricas de SEQ ID NO: 2. O cassete de expressão integrado nessa linhagem de célula compreende SEQ ID NO: 1 e está contido dentro do pcSDhuCTLA4-Ig.
[000442] A invenção também proporciona uma linhagem de célula de CHO estável, a qual expressa estavelmente uma CTLA4A29YL104E-Ig. Em uma modalidade, a linhagem de célula expressa monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig tendo a sequência (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, a linhagem de célula pode secretar uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig que podem existir como formas multiméricas (tais como dímeros, tetrâmeros e semelhantes), em que a forma multimérica pode ter diferentes sequências monoméri- cas de SEQ ID NO: 4. O cassete de expressão integrado nessa linhagem de célula compreende SEQ ID NO: 3 e está contido dentro do pD16LEA29Y.
Subclonagem para Gerar uma População de Clonal Células
[000443] Células identificadas como sendo produtoras de uma proteína desejada (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e se-melhantes) são isoladas de cultura de células e subsequentemente amplificadas sob condições de produção equivalentes, em que o meio de cultura pode conter soro, métodos de subclonagem conhecidos na técnica tais como, mas não limitado a, clonagem em ágar macio, podem ser empregados. Os clones de célula recombinantes estáveis obtidos podem, então, ser ainda multiplicados sob condições isentas de soro e produto animal. De acordo com a presente invenção, um clone de célula estável expressando o produto de proteína desejado (por exemplo, CTLA4-Ig, a CTLA4A29YL104E-Ig e semelhantes) é obtido via obtenção de um clone de célula recombinante de uma cultura de célula que é obtida após cultura de um clone de célula original recombi- nante em meio contendo soro e readaptação das células a um meio isento de soro e produto animal. Em uma modalidade, os clones de célula expressando CTLA4-Ig podem continuar a ser cultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo menos 50 gerações. Em outra modalidade da invenção, os clones de célula expressando CTLA4-Ig podem continuar a ser cultivados conforme descrito acima através de pelo menos 75 gerações. De acordo com a invenção, os clones de célula também podem continuar a ser cultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo menos 100 gerações.
[000444] Em uma outra modalidade, clones de célula expressando a CTLA4A29YL104E-Ig podem continuar a ser cultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo menos 27 gerações. Em outra modalidade os clones de célula podem continuar a ser cultivados como descrito acima através de pelo menos 75 gerações. Adicionalmente, os clones de célula podem ser cultivados em meio isento de soro e produto animal através de pelo menos 100 gerações.
[000445] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma linhagem de célula que produz moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monô- meros de SEQ ID NO: 2, em que a linhagem de célula é estável durante mais de 100 gerações e em que a estabilidade da linhagem de célula compreende: (1) tempo de duplicação na geração 100 é menor do que cerca de 24,5 ± 2,6 horas; (2) a viabilidade celular na geração 100 é maior do que 95%, (3) titulação de produto para CTLA4-Ig em bior- reatores de 5-L é maior do que 1,69 mg/mL na geração 100; (4) pro-porção molar de ácido siálico para proteína é cerca de 9,3 a cerca de 11,0 na geração 105.
[000446] O clone de célula recombinante estável da presente invenção está presente em uma forma isolada, em que isolamento ocorre de acordo com métodos praticados na técnica (por exemplo, clonagem em ágar macio ou clonagem por diluição limitada ou semelhante). Na presente invenção, o clone de célula recombinante estável é derivado de uma célula recombinante de mamífero (por exemplo, uma célula de CHO) que contém sequências de DNA que codificam uma proteína recombinante de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicopro- teínas e semelhantes, tais como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig), a qual pode crescer em suspensão ou aderentemente. Uma proteína recombinante expressa pela linhagem de célula da presente invenção pode ser uma glicoproteína terapêutica, tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig. De acordo com a presente invenção, clones de célula recombinante estáveis derivados de células eucariotas (tais como de células de mamífero, células de CHO, células de DG44 ou células de CHO dhfr- negativas), as quais contêm a sequência de DNA que codifica uma glicoproteína recombinante, tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig e as quais são capazes de expressar estavelmente a glicoproteína recombinante durante várias gerações são úteis.
[000447] Em uma modalidade da invenção, uma população de células hospedeiras de mamífero expressando estavelmente uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e seme-lhantes, tais como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) é obtida sob condi-ções isentas de soro e produto animal via amplificação das células es- tavelmente transfectadas. De acordo com a invenção, um clone de célula recombinante pode, então, ser caracterizado pelo fato de que ele é estável em meio de cultura isento de soro e produto animal através de pelo menos 105 gerações, por exemplo.
[000448] Em uma modalidade da invenção, a população de células clonais produz moléculas de CTLA4-Ig. Algumas das características específicas dessa população de moléculas de CTLA4-Ig são listadas abaixo na Tabela 6. Uma população de moléculas de CTLA4-Ig pode pelo menos incluir dímeros de moléculas de CTLA4-Ig que compreendem duas moléculas monoméricas que, cada uma, pode ter uma das seguinte sequências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 2, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2. Assim, a população de moléculas de CTLA4-Ig pode incluir predominantemente homodímeros ou heterodímeros. A população pode incluir homodíme- ros e heterodímeros. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo as características mostradas na Tabela 6 ou um equivalente farmacêutico das mesmas. Conforme usado aqui, um equivalente farmacêutico é onde uma população de moléculas tem um perfil seguro e eficaz equivalente à população original (população padrão) para tratamento de um paciente, conforme seria compreendido por uma agência governamental, tal como o FDA. Por exemplo, a população de CTLA4-Ig da presente invenção pode ter as características mostradas na Tabela 6. Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4-Ig da invenção pode ter as características mostradas na Tabela 6 ou equivalentes das mesmas unicamente em qualquer combinação ou permutação das mesmas.
[000449] Em outra modalidade, o clone de interesse pode também ser caracterizado de acordo com o produto recombinante expresso e suas características bioquímicas (por exemplo, CTLA4-Ig tendo um valor de coeficiente de extinção em particular). Um valor de coeficiente de extinção (também referido como um valor de capacidade de absorção (as)) pode ser derivado teórica ou experimentalmente. A 280 nm, o valor da capacidade de absorção (as) de CTLA4-Ig foi determinado como sendo de 1,01 mL mg-1 cm-1 usando o método de Mach e outros (Analytical Biochemistry, Vol. 200, páginas 74-80, 1992) conforme detalhado abaixo.
[000450] A Equação 1 foi usada para determinar a capacidade de absorção molar (ε).Equação 1: ε = [(Número de ligações de dissulfeto x 134) + (Número de resíduos de Triptofano x 5,540) + (Número de resíduos de Tirosina x 1,480)]
[000451] CTLA4-Ig tem 9 ligações de dissulfeto, 8 resíduos de tripto- fano e 32 resíduos de tirosina a fim de proporcionar uma capacidade de absorção molar (ε) de 92,886 M-1cm-1, conforme mostrado em Equação 2.Equação 2: ε = (9 x 134) + (8 x 5,540) + (32 x 1,480)] = 92,886 M-1cm- 1
[000452] A constante da capacidade de absorção (as) foi calculada dividindo a capacidade de absorção molar (ε) pelo peso molecular, onde o peso molecular foi determinado através de MALDI-TOF, conforme mostrado na Equação 3.Equação 3: as =ε/Peso molecular = 92,886 M-1cm-1 / 92,278 Da = 1,01 mL mg-1 cm-1
[000453] Uma comparação do valor de capacidade de absorção teo-ricamente derivado com os valores de capacidade de absorção experi- mentalmente determinados sobre dois lotes de material de CTLA4-Ig (compreendendo SEQ ID NO: 2) foi realizada usando análise de amino- ácido. A constante de capacidade de absorção média calculada experi-mentalmente determinada é de 1,00 ± 0,05 mL mg-1 cm-1. O valor expe-rimental confirma o valor teórico de 1,01 mL mg-1 cm-1 dentro do erro da determinação experimental. Assim, em uma modalidade, a invenção proporciona uma linhagem de célula que produz moléculas de CTLA4-Ig que têm uma valor de capacidade de absorção ou coeficiente de extinção de cerca de 1,00 ± 0,05 mL mg-1 cm-1.
[000454] De acordo com a presente invenção, o clone recombinante de interesse pode também ser caracterizado de acordo com o número de sítios na sequência de DNA que codifica uma proteína de interesse (por exemplo, construtos de fusão, glicoproteínas e semelhantes, tais como CTLA4-Ig) que são integrados no genoma da célula hospedeira. Versados na técnica compreenderão que técnicas-padrão de hibridiza- ção de Southern permitirão tal análise. Em uma modalidade da invenção, um único fragmento de hibridização de aproximadamente 1,2 kb foi detectado em cada uma das digestões com EcoRI e XbaI do DNA genômico preparado a partir do clone de célula recombinante da in-venção, consistente com o tamanho esperado do gene de CTLA4-Ig (híbrido de Southern; figura 23). A representação na figura é consistente com um único sítio de integração do plasmídeo, bem como não havendo inserções ou deleções no gene de CTLA4-Ig sendo detectá- veis através de análise por hibridização de Southern.
[000455] Em uma modalidade, a invenção proporciona populações de célula de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4-Ig, em que cada célula da população compreende pelo menos 30 cópias de um ácido nucleico que codifica uma proteína de CTLA4-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas aleatoriamente em um único sítio no genoma da célula e em que a população de células é clonal. Em ou- tras modalidades, as populações de célula de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4-Ig compreendem uma população em que pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% das células nas populações compreendem pelo menos 30 cópias de um ácido nucleico que codifica uma proteína de CTLA4-Ig.
[000456] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma linhagem de célula que, quando cultivada em condições de acordo com figura 10 ou Exemplo 14, produz moléculas de CTLA4-Ig compreendidas de SEQ ID NO: 2 em uma quantidade que é pelo menos 1,0, 1,3, 1,6, 1,8, 2,0 ou 2,5 gramas de moléculas de CTLA4-Ig por litro de cultura de células no estágio de produção.
[000457] De acordo com a invenção, a linhagem de célula de mamífero (por exemplo, uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) é gerada, a qual expressa uma proteína desejada (por exemplo, uma proteína de CTLA4-Ig) que, quando desenvolvida em uma cultura suspensa, pode produzir uma população de moléculas que é secretada no sobrenadante de cultura. Essa população de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas as seguintes características listadas na Tabela 6.Tabela 6. Características Ilustrativas de CTLA4-Ig
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[000458] De acordo com a Tabela 6, o percentual de dímero de CTLA4-Ig, percentual de espécies de HMW (por exemplo, multímeros de CTLA4-Ig, tal como um tetrâmero) e percentual de espécies de LMW (por exemplo, monômero de CTLA4-Ig) são com relação a uma população de moléculas de CTLA4-Ig. Os mols de açúcares e os mols de ácido siálico descritos na Tabela 6 são com relação ao mol de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig. O percentual de ligação a B7 encontrado na Tabela 6 é em referência a experimentos de ligação a CTLA4- Ig realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) sobre um instrumento BIAcore descrito anteriormente, em que o percentual é uma comparação da ligação a B7 com um controle de CTLA4-Ig.
[000459] Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal como uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) gera uma população de moléculas de CTLA4-Ig mostrando atributos característicos números 1-5 da Tabela 6. Em outra modalidade da invenção, a linhagem de célula de mamífero gera uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo atributos característicos números 1-10 da Tabela 6. Em outras modalidades, a linhagem de célula de mamífero gera uma população de moléculas de CTLA4-Ig mostrando atributos característicos números 1-15 da Tabela 6. Em uma outra modalidade, a quantidade de grupos sulfidrila livres sobre a CTLA4-Ig é cerca de < 0,20 tiol livre por molécula.
[000460] Quando de purificação do sobrenadante de cultura de célu- la que contém a proteína desejada (por exemplo uma proteína de CTLA4-Ig) secretada por uma população de células de mamífero transfectadas (por exemplo, uma célula de CHO dhfr negativa), a população de moléculas pode ter outras características. Além daquelas características listadas na Tabela 6, essa população de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas as seguintes características: uma faixa de pH de cerca de 7,0 - 8,0; capacidade de inibir a atividade de IL-2 em células humanas em 50 - 150%; proteína quimiotáti- ca de monócito (MCP-1) presente no produto purificado final a < 5 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig ou moléculas de CTLA4-Ig; concentração de DNA presente no produto purificado final a < 2,5 pg/mg de dí- mero de CTLA4-Ig; proteína de célula hospedeira CHO presente no produto purificado final a < 50 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig; concentração de Triton X-100 no produto purificado final a < 1,0 ppm; quantidade de Proteína A a < 5 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig; quantidade de endotoxinas bacterianas no produto purificado final a < 0,3 EU/mg de dímero de CTLA4-Ig; quantidade de Bioburden no produto purificado final a < 3,0 CFU/10 mL.
[000461] Em uma modalidade, proteína quimiotática de monócito (MCP-1) está presente no produto purificado final a < 3 ng/mg de dí- mero de CTLA4-Ig ou moléculas de CTLA4-Ig; a concentração de DNA presente no produto purificado final a <1,0 pg/mg de dímero de CTLA4-Ig; proteína de célula hospedeira CHO presente no produto purificado final a < 10 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig; quantidade de Proteína A a < 1ng/mg de dímero de CTLA4-Ig; quantidade de endoto- xinas bacterianas no produto purificado final a < 0,15 EU/mg de dímero de CTLA4-Ig; e quantidade de Bioburden no produto purificado final a <1,0 CFU/10 mL; uma faixa de pH de cerca de 7,2 - 7,8. Em uma modalidade particular, proteína quimiotática de monócito (MCP-1) está presente no produto purificado final a < 1 ng/mg de dímero de CTLA4- Ig ou moléculas de CTLA4-Ig, em uma outra modalidade, moléculas de CTLA4-Ig inibem a atividade de IL-2 em células humanas em 60 - 140%.
[000462] Em outra modalidade da invenção, a população de células clonais produz moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig. Algumas das caracte-rísticas específicas dessa população de moléculas de CTLA4A29YL104E- Ig são listadas na Tabela 7. Uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pode pelo menos incluir moléculas diméricas de CTLA4A29YL104E-Ig que compreendem duas moléculas monoméricas que, podem ter, cada uma, uma das seguintes sequências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 4, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 4, (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 4, (iv) 27-382 de SEQ ID NO: 4, (v) 25-382 de SEQ ID NO: 4 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 4. Assim, a população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pode incluir predominantemente homodímeros ou heterodímeros ou qualquer mistura dos mesmos. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo as características mostradas na Tabela 7 ou um equivalente farmacêutico das mesmas. Conforme usado aqui, um equivalente farmacêutico é onde uma população de moléculas tem um perfil de segurança e eficácia à população original (população padrão) para tratamento de um paciente, conforme seria compreendido por uma agência governamental, tal como o FDA. Por exemplo, a população de CTLA4A29YL104E-Ig da presente invenção pode as características mostradas na Tabela 7. Em outra modalidade, a população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig da invenção pode ter as características mostradas na Tabela 7 ou equivalentes das mesmas unicamente ou em qualquer combinação ou permuta dos mesmos.
[000463] Em uma modalidade, a invenção proporciona populações de células de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4A29YL104E- Ig, em que cada célula da população compreende pelo menos 30 có- pias de um ácido nucleico que codifica uma proteína de CTLA4A29YL104E-Ig, em que as 30 ou mais cópias são integradas aleatoriamente em um único sítio no genoma da célula e em que a população de células é clonal. Em outras modalidades, as populações de células de CHO capazes de produzir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreendem uma população em que pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% das células nas populações compreendem pelo menos 30 cópias de um ácido nucleico que codifica a CTLA4A29YL104E- Ig.
[000464] Em outras modalidades, a invenção proporciona uma linhagem de células que, quando cultivada em condições de acordo com figura 24 ou Exemplos 19-20, produz moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreendidas de SEQ ID NO: 4 em uma quantidade que é pelo menos 22, 22,5, 23, 27,5 ou 28 gramas de moléculas de CTLA4A29YL104E- Ig por litro cultura de células no estágio de produção.
[000465] De acordo com a invenção, uma linhagem de célula de mamífero (por exemplo, uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) é gerada, a qual expressa uma proteína desejada (por exemplo, a CTLA4A29YL104E-Ig) que, quando desenvolvida em uma cultura suspensa, pode produzir uma população de moléculas que é secretada no sobrenadante de cultura. Essa população de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas as seguintes características listadas na Tabela 7.Tabela 7. Características ilustrativas da CTLA4A29YL104E-Ig
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[000466] De acordo com a Tabela 7, o percentual de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig, percentual de espécies de HMW (por exemplo, mul- tímeros de CTLA4A29YL104E-Ig, tal como um tetrâmero) e percentual de espécies de LMW (por exemplo, monômeros de CTLA4A29YL104E-Ig) são com relação a uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig. Os mols de açúcares e os mols de ácido siálico descritos na Tabela 7 são com relação ao mol de moléculas ou dímero de CTLA4A29YL104E-Ig. O percentual de ligação a B7 encontrado na Tabela 7 é em referência aos experimentos de ligação de CTLA4A29YL104E-Ig realizados através de ressonância de plasmônio em superfície (SPR) sobre um instrumento BIAcore descrito anteriormente, em que o percentual é uma comparação com a ligação a B7 com um controle de CTLA4A29YL104E- Ig.
[000467] Em uma modalidade, a linhagem de célula de mamífero (tal como uma linhagem de célula de CHO dhfr negativa) gera uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig mostrando atributos característicos números 1-5 da Tabela 7. Em outra modalidade da invenção, a linhagem de célula de mamífero gera uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig tendo atributos característicos números 1-10 da Tabela 7. Em outras modalidades, a linhagem de célula de mamífero gera uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig mostrando atributos característicos números 1-13 da Tabela 7.
[000468] Quando de purificação de um sobrenadante de cultura de célula que contém a proteína desejada (por exemplo, a CTLA4A29YL104E-Ig) secretada por uma população de células de mamífero transfectadas (por exemplo, uma célula de CHO dhfr negativa), a população de moléculas pode ter outras características. Além daquelas características listadas na Tabela 7, essa população de moléculas pode ter, por exemplo, uma ou mais ou todas as seguintes características: Proteína quimiotática de monócito (MCP-1) presente no produto purifi-cado final a < 5 ng/mg de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig; concentração de DNA presente no produto purificado final a < 2,5 pg/mg de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig; e proteína de célula hospedeira CHO presente no produto purificado final a < 50 ng/mg de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig.
Cultura geral de linhagens de células
[000469] De acordo com presente invenção, células de mamífero são cultivadas para produzir uma proteína desejada, incluindo uma glico- proteína, conforme convencionalmente conhecidos por versados na técnica. As células de mamífero expressando uma glicoproteína de interesse expressam ou seriam manipuladas para expressar as enzimas apropriadas de modo que, sob condições satisfatórias, modificações pós-traducionais mais pertinentes à glicosilação ocorrem in vivo. As enzimas incluem aquelas necessárias para a adição e término de carboidratos N- e O-ligados, tais como aqueles descritos em Hubbard e Ivatt, Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583(1981) para oligossacarídeos N-ligados. As enzimas incluem, opcionalmente, oligossacariltransfera- se, alfa-glicosidase I, alfa-glicosidase II, alfa(1,2)manosidase de ER, alfa-manosidase I de Golgi, N-acetili glicosaminil transferase I, alfa- manosidase II de Golgi, N-acetilglicosaminiltransferase II, al- fa(1,6)fucosiltransferase, beta (1,4)galactosiltransferase e uma sialil- transferase apropriada.
[000470] Um retardo na apoptose (morte celular programada) pode ter um efeito de aumentar a viabilidade celular durante processos de cultura de células. Uma diminuição na apoptose e, por sua vez, um aumento na vida útil de uma célula em particular pode aumentar a produção de proteína a partir de uma cultura de célula. Eventos apop- tóticos podem ser inibidos em uma célula através de introdução, na célula (tal como uma célula de mamífero, uma célula de inseto ou uma célula de levedo), de uma ou mais proteínas antiapoptóticas, as quais inibem a apoptose em células em pontos precisos ao longo da via apoptótica. Outro método para inibir a apoptose é inibir a liberação de moléculas pró-apoptóticas das mitocôndrias na célula. Variantes de proteínas pró-apoptóticas conhecidas na técnica, tais como uma forma dominante-negativa de caspase-9, podem ser usadas como um inibidor de apoptose em uma célula. Tal proteína variante pode ser introduzida em uma célula a fim de impedir a morte célula programada. Inibição de apoptose de uma célula, por sua vez, prolonga o tempo durante o qual uma célula em particular produz proteína, resultando em um aumento global na produção de uma proteína desejada por uma célula em particular. Vários genes que codificam inibidores de caspase (tais como o inibidor de apoptose X-ligado (XIAP) ou variantes do mesmo) ou genes antiapoptóticos (por exemplo, Bcl-2 e Bcl-xL ou variantes dos mesmos) podem ser transfectados em células de mamífero geneticamente manipuladas (tais como células de CHO, células de- VERO, células de BHK e semelhantes) (Sauerwald, T. e outros, 2003, Biotechnol Bioeng. 81: 329-340; Sauerwald, T. e outros, 2002, Bio- technol Bioeng. 77: 704-716; Mastrangelo, A., e outros, 2000, Biotechnol Bioeng. 67: 544-564; Kim, N., e outros, 2002, J Biotechnol. 95: 237-248; Figueroa, B., e outros, 2001, Biotechnol Bioeng. 73: 211222).
[000471] Em uma modalidade, células de mamífero as quais produzem uma proteína recombinante podem ser transfectadas com um vetor contendo um gene antiapoptótico (tal como bcl-2). Em outra modalidade, células de mamífero recombinantes podem ser transfectadas com um plasmídeo que contém um gene que codifica um inibidor de caspase ou um gene que codifica uma variante de uma molécula pró- apoptótica, conforme descrito acima, um gene que codifica uma proteína que é conhecida por versados na técnica por possuir atividade an- tiapoptótica ou qualquer combinação dos mesmos.
[000472] Em outra modalidade, qualidade global de produto (por exemplo, glicosilação intensificada) de uma proteína recombinante desejada (tal como uma proteína terapêutica) pode ser intensificada. Para aumentar a glicosilação de uma proteína recombinante, células de mamífero (por exemplo, células de CHO, células de VERO, células de BHK e semelhantes) pode ser transfectada com ácidos nucleicos que codificam uma ou mais enzimas que estão envolvidas em glicosilação (tais como α2,3-sialiltransferase, β1,4-galactosiltransferase e semelhantes) de proteínas (Weikert e outros, 1999, Nature Biotechnol 17: 1116-21). Em uma modalidade, um plasmídeo que codifica β1,4- galactosiltransferase pode ser introduzido em células de mamífero expressando uma proteína de interesse. Em outra modalidade, um plas- mídeo que codifica α2,3-sialiltransferase pode ser introduzido em células de mamífero expressando uma proteína de interesse.
[000473] Vários parâmetros de cultura podem ser usados com relação à célula hospedeira que está sendo cultivada. Condições de cultura apropriadas para células de mamífero são bem-conhecidas na técnica (Cleveland e outros, J. Immunol. Methodos, 56: 221-234 (1983)) ou podem ser determinadas por aqueles versados na técnica (veja, por exemplo, Animal Cell Culture: A Practical Approach, 2ad Ed., Rickwo- od, D. e Hames, B. D., eds. (Oxford University Press: New York, 1992)) e variam de acordo com a célula hospedeira selecionada em particular.
[000474] Sem limitação, meio de cultura de células (tais como meio de inóculo, meio de alimentação, meio basal e semelhantes) pode se referir a uma solução nutriente usada para crescimento de e ou manu-tenção de células, especialmente células de mamífero. Essas soluções comumente proporcionam pelo menos um componente de uma ou mais das seguintes categorias: (1) uma fonte de energia, usualmente na forma de um carboidrato, tal como glicose; (2) todos os aminoáci- dos essenciais e usualmente o conjunto básico de vinte aminoácidos mais cisteína; (3) vitaminas e/ou outros compostos orgânicos requeridos em baixas concentrações; (4) ácidos graxos livres ou lipídios, por exemplo, ácido linoleico; e (5) elementos vestigiais, onde elementos vestigiais são definidos como compostos inorgânicos ou elementos que ocorrem naturalmente que são, tipicamente, requeridos em concentrações muito baixas, usualmente na faixa micromolar. A solução nutriente pode ser suplementada eletivamente com um ou mais componentes de qualquer uma das seguintes categorias: (1) hormônios e outros fatores de crescimento, tais como soro, insulina, transferrina e fator de crescimento epidérmico; (2) sais, por exemplo, magnésio, cálcio e fosfato; (3) tampões, tais como HEPES; (4) nucleosídeos e bases, tais como adenosina, timidina e hipoxantina; (5) proteína e hidroli- satos teciduais, por exemplo, peptona ou misturas de peptona as quais podem ser obtidas de gelatina purificada, material vegetal ou subprodutos animais; (6) antibióticos, tais como gentamicina; (7) agentes protetores de célula, por exemplo, poliol Pluronic; e (8) galactose. Um exemplo de meio basal pode ser Meio Basal de Crescimento Celular. Um exemplo de meio de inóculo pode ser Meio Basal de Crescimento de Células de Inóculo. Um exemplo de meio de alimentação pode ser Meio de alimentação para Produção em Biorreator.
[000475] Meios comercialmente disponíveis podem ser utilizados e incluem, por exemplo, Meio Mínimo Essencial (MEM, Sigma, St. Louis, Mo.); Meio de Eagles Modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma); Meio F10 de Ham (Sigma); meio de cultura de células HyClone (HyClone, Logan, Utah); Meio RPMI-1640 (Sigma); e meio quimicamente definido (CD), os quais são formulados para tipos de célula particulares, por exemplo, Meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif.). Qualquer um desses meios pode ser suplementado conforme necessário com os componentes ou ingredientes suplementares previamente definidos, incluindo componentes opcionais, em concentrações ou quantidades apropriadas, conforme necessário ou desejado. A cultura de células de mamífero que pode ser usada com a presente invenção é preparada em um meio adequado para a célula que está sendo cultivada em particular. Em uma modalidade, um meio de cultura de célula pode ser um daqueles antes mencionados que geralmente é isento de soro de qualquer fonte de mamífero (por exemplo, soro fetal bovino (FBS)). Em outra modalidade da presente invenção, a cultura de células de mamífero pode ser desenvolvida no meio (CD)-CHO quimicamente definido comercialmente disponível, suplementado com componentes adicionais especificados na Tabela 15. Em uma outra modalidade, a cultura de células de mamífero pode ser desenvolvida em Meio CD-CHO, suplementado com componentes adicionais especificados na Tabela 20 ou 21.
[000476] Os métodos da presente invenção incluem a cultura de inúmeros tipos de célula. Em uma modalidade da invenção, as células são de animal ou de mamífero. Em outra modalidade, as células podem expressar e secretar grandes quantidades de uma proteína desejada. Em outra modalidade da invenção, células podem expressar e secretar grandes quantidades de uma glicoproteína de interesse no meio de cultura. As células de animal ou mamífero podem também ser molecularmente modificadas para expressar e secretar uma proteína de interesse. A proteína produzida pela célula hospedeira pode ser endógena ou homóloga à célula hospedeira. A proteína também pode ser heteróloga (por exemplo, estranha) à célula hospedeira, pelo que a informação genética que codifica a proteína de interesse é introduzida na célula hospedeira via métodos-padrão na técnica (por exemplo, através de eletroporação, transfecção e semelhantes). Em uma modalidade, a glicoproteína de mamífero pode ser produzida e secretada por uma célula hospedeira de Ovário de Hamster Chinês (CHO) no meio de cultura.
[000477] Em algumas modalidades, a invenção proporciona uma po-pulação de moléculas de CTLA4-Ig produzida através dos métodos de produção discutidos aqui, incluindo o método de produção em massa que é descrito no Exemplo 14 e mostrado na figura 10. O processo pode resultar na produção de espécies de elevado peso molecular (HMW) de moléculas de CTLA4-Ig (por exemplo, veja Exemplos 14 e 15). Em outra modalidade, populações de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig são proporcionadas que são produzidas através dos métodos de produção discutidos acima, tais como o método de produção em massa que é descrito nos Exemplos 19 e 20 e mostrado na figura 24. O processo pode resultar na produção de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de elevado peso molecular (HMW) (por exemplo, veja Exemplos 19 e 20). Em algumas modalidades, as espécies de HMW podem ser cerca de 15-25% das moléculas ou dímeros produzidos através de um método para produção, incluindo um processo de fermentação de (CD)-CHO1 quimicamente modificado. Em outras modalidades, a presente invenção proporciona métodos para isolamento, purificação e caracterização de componentes de HMW de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig produzidos através do processo de fermentação de CD-CHO1. Componentes de HMW de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E- Ig são multímeros (isto é, tetrâmeros, hexâmeros, etc.), os quais têm um peso molecular maior do que dímeros de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig.
[000478] Células hospedeiras de animal ou de mamífero capazes de abrigar, expressar e secretar grandes quantidades de uma glicoproteí- na de interesse no meio de cultura para subsequente isolamento e/ou purificação incluem, mas não estão limitadas a, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), tais como CHO-K1 (ATCC CCL-61), DG44 (Chasin e outros, 1986, Som. Cell Molec. Genet, 12: 555-556; Kolkekar e outros, 1997, Biochemistry, 36: 10901-10909; e WO 01/92337 A2), células de CHO negativas para di-hidrofolato reductase (CHO/dhfr-, Urlaub e Chasin, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4216) e células de CHO.dp12 (Patente U.S. N°. 5.721.121); células CV1 de rim de macaco transformadas através do SV40 (células de COS, COS-7, ATCC CRL-1651); células de rim embriônico humano (por exemplo, células 293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham e outros, 1977, J. Gen. Virol., 36: 59); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL-10); células de rim de macaco (CV1, ATCC CCL-70); células de rim de macaco African green (VERO- 76, ATCC CRL-1587; VERO, ATCC CCL-81); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod., 23: 243-251); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL-2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL-34); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL-75); células de hepatoma humano (HEP-G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL- 51); células de fígado de rato (BRL 3A, ATCC CRL-1442); células TRI (Mather, 1982, Annals NY Acad. Sci., 383: 44-68); células MCR 5; células FS4. Em um aspecto da presente invenção, células de CHO são utilizadas, particularmente células de CHO/dhfr- e células DG44.
[000479] Exemplos de glicoproteínas de mamífero que podem ser produzidas através dos métodos da presente invenção incluem, sem limitação, citocinas, receptores de citocina, fatores de crescimento (por exemplo, EGF, HER-2, FGF-α, FGF-β, TGF- α, TGF-β, PDGF, IGF-1, IGF-2, NGF, NGF- β); receptores de fator de crescimento, incluindo proteínas de fusão ou quiméricas. Outros exemplos incluem, mas não estão limitados a, hormônios de crescimento (por exemplo, hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento bovino); insulina (por exemplo, cadeia A de insulina e cadeia B de insulina), pró- insulina; eritropoietina (EPO); fatores de estimulação de colônia (por exemplo, G-CSF, GM-CSF, M-CSF); interleucinas (por exemplo, IL-1 a IL-12); fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e seu receptor (VEGF-R); interferons (por exemplo, IFN-α, β ou y); fator de necrose de tumor (por exemplo, TNF-α e TNF-β) e seus receptores, TNFR-1 e TNFR-2; trombopoietina (TPO); trombina; peptídeo natriurético cerebral (BNP); fatores de coagulação (por exemplo, Fator VIII, Fator IX, fator de von Willebrands e semelhantes); fatores anticoagulação; ati- vador de plasminogênio tecidual (TPA), por exemplo, uroquinase ou urina humana ou TPA do tipo tecidual; hormônio de estimulação de folículo (FSH); hormônio de luteinização (LH); calcitonina; proteínas de CD (por exemplo, CD3, CD4, CD8, CD28, CD19, etc.); proteínas de CTLA (por exemplo, CTLA4); proteínas do receptor de células T e células B; proteínas morfogênicas ósseas (BNPs, por exemplo, BMP-1, BMP-2, BMP-3, etc.); fatores neurotróficos, por exemplo, fator neuro- trófico derivado de osso (BDNF); neurotrofinas, por exemplo, 3-6; renina; fator reumatoide; RANTES; albumina; relaxina; proteína inibitória de macrófago (por exemplo, MIP-1, MIP-2); proteínas ou antígenos virais; proteínas na membrana de superfície; proteínas do canal de íons; enzimas; proteínas regulatórias; anticorpos; proteínas imunomo- dulatórias (por exemplo, HLA, MHC, a família B7); receptor residente ("homing receptor"); proteínas de transporte; dismutase de superóxido (SOD); proteínas de receptor acopladas à proteína G (GPCRs); proteínas neuromodulatórias; proteínas e peptídeos associados ao mal de Alzheimer (por exemplo, A-beta), bem como outros conhecidos na técnica. Proteínas, polipeptídeos e peptídeos adequados que podem ser produzidos através dos métodos da presente invenção incluem, mas não estão limitados a, proteínas de fusão, polipeptídeos, proteínas quiméricas, bem como fragmentos ou porções ou mutantes, variantes ou análogos de qualquer uma das proteínas e polipeptídeos antes mencionados.
[000480] Os métodos da invenção podem também ser usados para produzir moléculas de CTLA4-Ig as quais são variantes de SEQ ID NO: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-Ig pode compreender um monômero tendo uma ou mais alterações nos resíduos 55 (A55Y) e 130 (L130E) (os resíduos mencionados são de SEQ ID NO: 2). Veja as descrições de variantes e mutantes de CTLA4-Ig descritas na Publicação U.S. No. 2002/0182211 A1, a qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade. Em outra modalidade, uma variante de CTLA4-Ig pode compreender a molécula de CTLA4-Ig tendo uma mutação dentro da região de CTLA-4 ou uma mutação na região de Ig ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade, uma molécula variante de CTLA4-Ig compreende a molécula de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% idêntica à SEQ ID NOS: 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Em uma modalidade, a molécula variante de CTLA4-Ig é capaz de ligação ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, a variante é capaz de formar um dímero. Em uma outra modalidade, a variante exibe um perfil de carboidrato similar àquele exibido por uma população de moléculas de CTLA4-Ig sem mutação. Em uma modalidade, as moléculas variantes de CTLA4-Ig têm os mesmos sítios potenciais de glicosilação N-ligada e O-ligada presentes em SEQ ID NO: 2. Em outra modalidade, uma molécula variante de CTLA4-Ig tem os mesmos sítios de glicosilação N-ligada e O-ligada presentes em SEQ ID NO: 2 e tem sítios de glicosilação adicionais. As mutações podem incluir, mas não estão limitadas a, deleções, inserções, adições de nucleotídeo; deleções, substituições, adições de aminoácido; desvios de rede de ácido nucleico; as substituições podendo ser não con- servativas (por exemplo, a glicina substituída por um triptofano) ou substituições conservativas (por exemplo, uma leucina substituída por uma isoleucina).
[000481] Moléculas variantes de CTLA4-Ig incluem, mas não estão limitadas a, CTLA4-L104EA29YIg (usando o sistema de numeração de resíduo de acordo com SEQ ID NO: 2, CTLA4-L104EA29YIg aqui é referida como CTLA4-L130EA55YIg), bem como aquelas moléculas variantes de CTLA4-Ig conforme descrito nos Pedidos de Patente U.S. N°s de Série 09/865.321 (Pub. U.S. No. US2002/0182211), 60/214.065 e 60/287,576; no WO 01/92337 A2; nas Patentes U.S. N°s 6.090.914, 5.844.095 e 5.773.253; e conforme descrito em R. J. Peach e outros, 1994, J Exp Med, 180: 2049-2058. Em uma modalidade, moléculas variantes de CTLA4-Ig produzidas nos presentes métodos podem ser secretadas de uma célula que compreende um vetor de expressão que codifica uma proteína variante de CTLA4-Ig.
[000482] Uma variante de CTLA4-Ig, L130EA55Y-Ig, é uma proteína de fusão geneticamente modificada similar, quanto à estrutura, à molécula de CTAL4-Ig. L130EA55Y-Ig tem o domínio de ligação extrace- lular funcional da CTLA-4 humana modificada e o domínio Fc da imu- noglobulina humana da classe IgG1. Duas modificações de aminoáci- do, leucina para ácido glutâmico na posição 104 (L104E) de uma variante L104EA29Y, a qual corresponde à posição 130 de SEQ ID NO: 2 e alanina para tirosina na posição 29 (A29Y) de uma variante L104EA29Y, a qual corresponde à posição 55 de SEQ ID NO: 2, foram feitas na região de ligação a B7 do domínio de CTLA-4 para gerar a L130EA55Y. L130EA55Y-Ig pode compreender duas cadeias polipep- tídicas glicosiladas homólogas de aproximadamente 45.700 Dáltons cada, as quais são mantidas juntas por uma ligação de dissulfeto in- tercadeia e interações não covalentes. DNA que codifica L130EA55Y- Ig foi depositado como DNA que codifica L104EA29Y-Ig em 20 de Junho de 2000 na American Type Culture Collection (ATCC) sob as condições do Tratado de Budapeste. A ele foi atribuído número de acesso a ATCC PTA-2104. L104EA29Y-Ig (correspondendo a L130EA55Y-Ig no presente pedido) é ainda descrita nos pedidos de patente copen- dentes U.S. N°s de Série 09/579.927, 60/287.576 e 60/214.065 e 09/865.321 e no WO/01/923337 A2, todos os quais são incorporados por referência no presente pedido em suas totalidades.
[000483] Uma vez que a proteína recombinante L130EA55Y-Ig é diferente por apenas 2 aminoácidos (Tyr na posição de aminoácido 55 e Glu na posição de aminoácido 130) comparado com monômeros de CTLA4-Ig tendo uma Ala na posição de aminoácido 55 e Leu na posição de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 2 e em virtude do fato de essas 2 mutações não afetarem a glicosilação N- ou O-ligada, populações de moléculas variantes de CTLA4-Ig compreendendo L130EA55Y-Ig podem ter o mesmo perfil ou um perfil de glicosilação muito similar àquele de populações compreendendo CTLA4-Ig do tipo silvestre. Ainda, em virtude do fato de que a proteína recombinante L130EA55Y-Ig é diferente por apenas 2 aminoácidos (Tyr na posição de aminoácido 55 e Glu na posição de aminoácido 130) comparado com monômeros de CTLA4-Ig tendo uma Ala na posição de aminoáci- do 55 e Leu na posição de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 2, os presentes métodos da presente invenção deverão ser capazes de produzir L130EA55Y-Ig com atributos característicos similares conforme descrito na Tabela 6.
[000484] Os métodos da invenção podem também ser usados para produzir moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig as quais são variantes de SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma modalidade, a CTLA4A29YL104E-Ig pode compreender um monômero tendo uma ou mais alterações em SEQ ID NO: 3. Por exemplo, descrições de outras moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig são descritas nas Publicações de Pedido de Patente U.S. N°s U.S. 2002/0039577, U.S. 2003/0007968, U.S. 2004/0022787, U.S. 2005/0019859 e U.S. 2005/0084933 e Patente U.S. No. 7.094.8874, as quais são aqui incorporadas por referência em sua totalidade.
[000485] Em uma modalidade, CTLA4A29YL104E-Ig compreende uma ou mais mutações dentro da região de CTLA-4 (SEQ ID NO: 18) ou uma mutação na região de Ig ou qualquer combinação dos mesmos. Em outras modalidades, a molécula de CTLA4A29YL104E-Ig compreende a CTLA4A29YL104E-Ig tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% idêntica à SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Em uma outra modalidade, a molécula de CTLA4A29YL104E-Ig conforme descrito acima é capaz de ligação ao CD80 ou CD86. Em outra modalidade, a CTLA4A29YL104E-Ig é capaz de formar um dímero. Em uma outra modalidade, a CTLA4A29YL104E-Ig exibe um perfil de carboidrato similar àquele exibido por uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig sem mutação. Em ainda outras modalidades, as moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig têm os mesmos sítios potenciais de glicosilação N-ligada e O-ligada presentes em SEQ ID NO: 4. Em outra modalidade, a CTLA4A29YL104E-Ig tem os mesmos sítios de glicosilação N-ligada e O-ligada presentes em SEQ ID NO: 4 e tem sítios de glicosilação adicionais. A mutações podem incluir, mas não estão limitadas a, deleções, inserções, adições de nucleotídeo; deleções, substituições, adições de aminoácido; desvios de rede de ácido nucleico; as substituições podendo ser não conservativas (por exemplo, a glicina substituída por um triptofano) ou substituições con- servativas (por exemplo, uma leucina substituída por uma isoleucina).
[000486] Em uma modalidade da invenção, uma população de moléculas variantes de CTLA4-Ig pode ser produzida por células de mamífero (por exemplo, células de CHO dhfr negativas), as quais expressam um gene que codifica a proteína desejada (por exemplo, uma proteína L130EA55Y-Ig ou semelhante), desenvolvida em suspensão de acordo com o método de produção em massa da presente invenção. De acordo com presente invenção, uma proteína variante de CTLA4-Ig recombinante produzida por células de mamífero pode ser recuperada de acordo com os parâmetros de coleta descritos aqui. Em outras modalidades, uma proteína variante de CTLA4-Ig recombinante produzida por células de mamífero pode ser purificada de acordo com o esquema de purificação descrito na presente invenção (Exemplo 15).
[000487] Em uma modalidade da invenção, uma população de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig pode ser produzida por células de mamífero (por exemplo, células de CHO dhfr negativas), as quais expressam um gene que codifica a proteína desejada (por exemplo, a CTLA4A29YL104E- Ig), desenvolvidas em suspensão de acordo com o método de produção em massa da presente invenção. De acordo com presente invenção, uma CTLA4A29YL104E-Ig recombinante produzida por células de mamífero pode ser recuperada de acordo com os parâmetros de coleta descritos aqui. Em outras modalidades, uma CTLA4A29YL104E-Ig re- combinante produzida por células de mamífero pode ser purificada de acordo com o esquema de purificação descrito na presente invenção (EXEMPLOS 19-20).
Tipos de processos de cultura de células e cultura geral
[000488] Uma proteína de interesse, por exemplo, uma glicoproteína, uma proteína de fusão e semelhantes, pode ser produzida através de desenvolvimento de células expressando o produto de proteína desejado sob uma variedade de condições de cultura de células. Versados na técnica compreenderão que a cultura de células e operações de cultura para produção de proteína podem incluir, mas não estão limitados a, três tipos gerais: cultura contínua, cultura em batelada e cultura com alimentação em batelada. Em um processo de cultura contínuo, um meio de suplemento de cultura fresco (por exemplo, meio de alimentação) é fornecido às células durante um período de cultura enquanto o meio de cultura velho é removido. O produto produzido durante a cultura contínua pode também ser coletado, por exemplo, em uma base diária ou continuamente. Na medida em que as células permaneçam vivas e as condições ambientais e de cultura sejam mantidas, as células podem permanecer em cultura durante tanto tempo quanto desejado em um processo de cultura contínuo.
[000489] Em um processo de cultura em batelada, as células são inicialmente cultivadas em meio e esse meio de cultura não é substituído, nem removido, nem suplementado. As células não são "alimentadas" com novo meio durante ou antes do final da operação de cultura, assim, a cultura continua até que os nutrientes tenham se esgotado. Um produto de proteína é coletado ao final de uma operação de cultura.
[000490] Para processos de cultura com alimentação em batelada, um tempo de operação de cultura pode ser aumentado suplementando o meio de cultura uma ou mais vezes ao dia (ou continuamente) com meio fresco durante a operação. Nesse processo, as células são fornecidas com meio fresco, um "meio de alimentação", durante um período de cultura. Culturas com alimentação em batelada podem incluir os vários esquemas de alimentação descritos previamente, por exemplo, diariamente, a cada dois dias, dia sim dia não, etc.; mais de uma vez por dia ou menos de uma vez por dia e assim por diante. Culturas com alimentação em batelada podem também ser alimentadas continuamente com meio de alimentação. Ao final de uma operação de cul- tura/produção, um produto de proteína de interesse é, então, coletado.
[000491] Sistemas de cultura de células para a produção em pequena ou larga escala de proteínas, incluindo glicoproteínas, produzidas por células hospedeiras de mamífero são úteis dentro do contexto da presente invenção. Versados na técnica compreenderão que discos de cultura tecidual, frascos para centrífuga e T-frascos são, tipicamente, usados para métodos de cultura em uma escala de laboratório. Os processos que podem ser usados para cultura em uma escala maior (por exemplo, 500 L, 5000 L, 10.000 L, 20.000 L e semelhantes) incluem, mas não estão limitados a, biorreator com fibra oca, um biorreator com leito fluidizado, um sistema de biorreator com tanque agitado ou uma garrafa de cultura giratória. Os dois últimos processos podem ser utilizados com ou sem microveículos.
[000492] Os sistemas podem ser operados em um modo em batelada, com alimentação em batelada ou contínuo. Para cultura em larga escala, o biorreator com tanque agitado é o sistema de escolha em virtude de sua flexibilidade. Esses reatores podem manter as células em suspensão por meio de agitação através de agitação mecânica com purgação de bolhas de gás ou um propulsor. Os biorreatores com tanque agitado podem ser escalonados para volumes de produção em larga escala (por exemplo, 20.000 litros) e podem ser operados em diferentes modos de alimentação. Esses sistemas proporcionam uma área de superfície grande para crescimento celular e a transferência eficiente de resíduos metabólicos, oxigênio e nutrientes, bem como manter um ambiente homogêneo por todo o reator impedindo as células de assentar no fundo via agitação ou mistura contínua dos componentes dentro dos reatores. Para a produção da glicoproteína desejada, a presente invenção concretiza cultura de células em larga escala com alimentação em batelada mantida em um biorreator com tanque agitado, alimentando diariamente com meio de alimentação contendo D-galactose. Em outra modalidade, cultura de células com alimentação em batelada pode também ser mantida em um biorreator com tanque agitado, alimentado diariamente com meio de cultura que contém con-centrações adequadas dos nutrientes limitativos para a cultura de células importantes para glicosilação de proteína, tais como glicose e glu- tamina (Chee e outros, 2005, Biotechnol. Bioeng. 89: 164-177).
[000493] As células em cultura que produzem uma proteína de interesse podem ser propagadas de acordo com qualquer esquema ou rotina que se mostra adequada para a célula hospedeira de mamífero em particular e o plano de produção considerado em particular. Condições de cultura de células podem ser desenvolvidas para intensificar a expansão ou crescimento de uma população de células hospedeiras de mamífero na fase de crescimento da cultura de célula durante um período de tempo que é maximizado para tal expansão e crescimento. A fase de crescimento da cultura de célula compreende o período de crescimento exponencial de células (por exemplo, a fase log) onde as células estão primariamente se dividindo rapidamente. Durante essa fase, a taxa de aumento na densidade de células viáveis é maior do que em qualquer outro ponto de tempo.
[000494] Também, condições de cultura de células podem ser de-senvolvidas para intensificar a produção de proteína durante a fase de produção da cultura de células durante um período de tempo. A fase de produção da cultura de células compreende o período de tempo durante o qual crescimento celular é estacionário ou é mantido em um nível quase constante. A densidade de células viáveis permanece aproximadamente constante durante um determinado período de tempo. Crescimento celular logarítmico terminou e a produção de proteína é a atividade primária durante a fase de produção. O meio, nesse momento, geralmente é suplementado para sustentar produção contínua de proteína e obter o produto de glicoproteína desejado.
[000495] Condições de cultura, tais como temperatura, pH, oxigênio dissolvido (DO2) e semelhantes, são aquelas usadas em cultura de células hospedeiras de mamífero que são compreendidas por versados na técnica. Uma faixa de temperatura apropriada para cultura de células hospedeiras de mamífero, tais como células de CHO, está entre 30 a 40°C e, em uma modalidade, cerca de 37°C. O pH geralmente é ajustado para um nível entre cerca de 6,5 e 7,5 usando um ácido ou base. Um DO2 adequado está entre 5-90% de saturação de ar. Essas condições de cultura podem ser usadas para facilitar a cultura de células de mamífero que produzem um produto de proteína ou glicoproteí- na desejado.
[000496] A população de células hospedeiras de mamífero pode ser expandida e desenvolvida na fase de crescimento da cultura, em que as células, possivelmente removidas de armazenamento, são inoculadas em um meio de cultura aceitável para promover crescimento e alta viabilidade. As células podem, então, ser mantidas em uma fase de produção durante um período de tempo adequado através da adição de meio de cultura fresco à cultura de células hospedeiras. Durante a fase de produção, as células podem ser submetidas a vários desvios na temperatura para intensificar a produção de proteína. Processos de cultura com múltiplos desvios de temperatura são descritos nos pedidos de patente U.S. N° de Série 10/742.564, depositado em 18 de Dezembro de 2003 e U.S. N° de Série 10/740.645, depositado em 18 de Dezembro de 2003. Os conteúdos desses pedidos são incorporados por referência aqui em sua totalidade. Na presente invenção, o processo de cultura de células compreendendo os dois ou mais desvios de temperatura pode resultar em um número aumentado de células viáveis que sobrevivem na cultura até o final do processo ou operação de produção. Durante a fase de produção da cultura, o maior número de células que sobrevivem pode resultar em uma maior quantidade de produto de proteína ou glicoproteína produzido, aumentando a quanti- dade de produto de proteína no final do processo.
[000497] Um aspecto particular da presente invenção concretiza cultura de células de mamíferos em larga escala de alimentação em batelada (por exemplo, 500 L, 5000 L, 10000 L e semelhantes), que é alimentada diariamente ou com alimentação de meio descrita nas Tabelas 14, 15, compreendendo D-galactose de forma que células produzam uma glicoproteína de interesse. Para aumentar a qualidade da proteína produzida nessa modalidade, dois ou mais desvios de temperatura podem ser empregados durante o período de cultura para prolongar a fase de produção de proteína para além daquela que ocorre quando nenhum desvio de temperatura é usado ou quando apenas um desvio de temperatura é usado. Em outra modalidade, a invenção requer cultura de células de mamífero em larga escala de alimentação em batelada (por exemplo, 500 L, 5000 L, 10000 L e semelhantes), que é alimentada 1 ou mais vezes ao dia com meio de alimentação descrito na Tabela 22 o qual compreende D-galactose, de modo que as células produzam uma glicoproteína de interesse (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig). Um ou mais desvios de temperatura também podem ser empregados durante o período de cultura para prolongar a fase de produção de proteína para além daquela que ocorre quando nenhum desvio de temperatura é usado de forma a aumentar a qualidade da glicoproteína. Alternativamente, sulfato de dextrana pode ser adicionado à cultura com um concomitante desvio de temperatura.
Produção em massa de proteína recombinante em biorreatores
[000498] A presente invenção proporciona métodos para cultura convencional em um biorreator com tanque agitado de células eucario- tas (por exemplo, um volume de cultura de células de 20000 L), parti-cularmente para produzir quantidades em larga escala ou industriais de produtos de proteína desejados que são expressos por tais células. O processo de cultura é um processo de cultura de alimentação em batelada de células desenvolvidas em suspensão, com coleta do so- brenadante de cultura, em que células eucariotas, por exemplo, células de mamífero, expressando uma proteína de interesse, secretam um produto de proteína desejado no meio de cultura.
[000499] Métodos para cultura em larga escala de células de mamífero, particularmente para produzir grandes quantidades de produtos de proteína desejados que são expressos por tais células, são concre-tizados na presente invenção. Os métodos podem ser realizados através de etapas compreendendo:
[000500] (i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro e propagação da cultura de semeadura (por exemplo, uma cultura inicial que é usada para inocular um volume maior) pelo menos até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada mínima, pelo que a densidade é um valor predeterminado necessário para propagação suficiente de células no volume de cultura subsequente;
[000501] (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ou sacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal de forma a expandir a cultura;
[000502] (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isento de soro para propágar adicionalmente a cultura de célula; e
[000503] (iv) manutenção da cultura em larga escala em meio carecendo de componentes derivados de animal, pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo ou mostrem uma característica bioquímica específica.
[000504] Em algumas modalidades, o método pode compreender a etapa de (iv) coleta do meio de cultura e substituição desse meio por meio fresco.
[000505] Em outras modalidades, métodos para a cultura em larga escala de células de mamífero podem ser realizados através de etapas compreendendo:
[000506] (i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio de inóculo) e propagação da cultura de semeadura (por exemplo, uma cultura inicial que é usada para inocular um volume maior), pelo menos até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada mínima que é um valor predeterminado necessário para propagação suficiente de células no volume de cultura subsequente;
[000507] (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ou sacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal (por exemplo, meio de inóculo) de forma a expandir a cultura;
[000508] (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala (tal como biorreato- res de 1000-L) contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio basal) para propágar adicionalmente a cultura de células; e
[000509] (iv) manutenção da cultura em larga escala em meio carecendo de componentes derivados de animal (por exemplo, meio de alimentação), pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo ou mostrem uma característica bioquímica específica.
[000510] Em algumas modalidades da invenção, o método pode compreender a etapa de:
[000511] (v) coleta do meio de cultura e substituição do meio consumido por meio fresco.
[000512] A presente invenção é aplicável a qualquer tipo de célula em qualquer formulação de meio carecendo de componentes derivados de animal de forma a produzir quantidades em larga escala de produtos de proteína desejados e pode utilizar um dos dois processos a seguir ou variações dos mesmos: a) processos com microveículo ou b) processos de células em suspensão. Cultura de células, por exemplo, células de mamífero, pode utilizar um processo operado em duas fases distintas, uma fase de crescimento e uma fase de produção. Em outra modalidade da invenção, qualquer formulação de meio a qual contém componentes derivados de animal (alguns exemplos não- limitativos sendo Albumina de Soro Bovino (BSA) ou FBS) pode ser empregada também para a produção de quantidades de proteína em larga escala, conforme descrito acima.
[000513] Aqueles versados na técnica compreenderão que um processo com microveículo, não limitado a um processo com microveículo padrão ou um processo de perfusão de microveículo, pode ser usado para a cultura de células em que as células são presas a e/ou imobilizadas em um veículo macroporoso. Em um processo com microveícu- lo padrão, as células são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura contendo meio de cultura isento de soro e propagadas até as células atingirem uma densidade de cultura mínima. Subsequentemente, a cultura de semeadura propagada é transferida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isento de soro e microveículos. Nessa fase de crescimento, as células são desenvolvidas sobre microveículos até que os veículos estejam totalmente colonizados, por exemplo, através de migração das células para os veículos no caso de um processo usando veículos macroporosos.
[000514] Troca de meio pode ocorrer quando microveículos assentam no fundo do vaso de cultura de semeadura, após o que um percentual predeterminado de volume do tanque é removido e um percentual correspondente do volume do tanque de meio fresco é adicionado ao vaso. Microveículos são, então, ressuspensos no meio de cultura. Versados na técnica entendem que o processo de remoção e substituição de meio pode ser repetido em um intervalo predeterminado, por exemplo, a cada 24 horas, pelo que a quantidade de meio substituído é dependente da densidade celular e pode, tipicamente, ser de 25% a 80% do volume do tanque. 60-95% do meio no tanque podem ser trocados a cada 24 horas, quando a densidade celular atinge um valor predeterminado adequado para expressão de proteína. Versados na técnica frequentemente usam o valor % de troca de meio antes mencionado por toda a fase de produção também.
[000515] Durante a fase de produção, meio de cultura pode ser trocado para permitir que os microveículos assentem no fundo do tanque, após o que o volume % selecionado do tanque é removido e um volume % do tanque correspondente, por exemplo, 60-95% conforme descrito anteriormente, de meio de cultura fresco é adicionado ao vaso. Microveículos são, então, ressuspensos no meio de cultura e o processo de substituição e remoção do meio pode ser repetido diariamente.
[000516] O processo de perfusão de microveículo se assemelha ao processo com microveículo padrão e também é operado nas fases de crescimento/expansão e produção. A principal diferença entre os dois processos é o método empregado para trocar o meio de cultura. Uma quantidade definida de volume do tanque, por exemplo, 60-95% do volume total do tanque, é trocada toda de uma vez no processo com microveículo padrão enquanto que, no processo de perfusão, o meio é adicionado continuamente. Essencialmente, um volume % do tanque de meio é trocado gradualmente durante um período de tempo prede-terminado, enquanto os microveículos são mantidos no vaso através de uso de um dispositivo de separação (ou dispositivo de perfusão) que permite que o meio saia do vaso, mas retém os microveículos dentro do tanque. A fase de crescimento nesse processo é conforme descrito para um processo com microveículo padrão, exceto quanto à troca gradual de meio.
[000517] Duas opções não limitativas para um processo de células em suspensão incluem um processo de perfusão de células em suspensão e um processo em batelada de células em suspensão. No processo de perfusão, células em um meio de cultura são livremente suspensas sem serem imobilizadas em veículos e, tais processos com microveículo, podem ser operados em duas fases distintas (por exemplo, uma fase de crescimento e uma fase de produção). Durante a fase de crescimento de um processo de perfusão de células em suspensão, as células são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura contendo meio de cultura isento de soro e propagadas até as células atingirem uma densidade de semeadura cruzada alvo. A cultura de semeadura propagada pode, então, ser transferida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala, o qual contém meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal e propagadas até um valor de densidade celular predeterminado adequado para expressão da proteína ser obtida. A perfusão contínua do vaso de cultura de semeadura com meio de cultura fresco é realizada para executar o processo de troca de meio.
[000518] No processo de suspensão de célula em batelada, cultura de células pode ser realizada via os seguintes formatos não-limitativos: a) processo em batelada simples ou b) processo de alimentação em batelada. Células são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal em um processo em batelada simples e propagadas até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada. Subsequentemente, a cultura de semeadura propagada é transferida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isento de soro e o vaso de cultura de semeadura é operado até que os nutrientes no meio de cultura tenham sido esgotados. Em um processo de alimentação em batelada, alimentação de uma solução concentrada de nutrientes (por exemplo, um meio de alimentação) ao tanque pode estender o suprimento de nutrientes no meio desse processo de cultura, assim, aumentando o tempo de processo e, por fim, levando a um aumento na produção da proteína desejada dentro do vaso de cultura de semeadura. O método de adição do meio de alimentação pode variar. Ele pode ser adicionado como um único bolo pulsado (uma vez, duas vezes, três vezes etc., um dia) ou pode ser alimentado gradualmente no decorrer de um período de 24 horas. Essa alimentação permite que as células sejam propagadas em um vaso de cultura de semeadura de larga escala e o meio, o qual pode conter o produto de proteína secretado de interesse, a ser coletado ao final da operação antes que qualquer um dos nutrientes sejam esgotados. Ao invés de remoção de todos os conteúdos do vaso, aqueles versados na técnica removerão apenas uma porção do volume do tanque (pode ser cerca de 80%).
[000519] Um aspecto opcional do processo de alimentação em batelada é o uso de desvios de temperatura. Nesse processo, as temperaturas empregadas como as temperaturas de operação durante a fase de produção são menores do que a temperatura usada durante a fase de crescimento. As referidas faixas de temperatura para um processo de alimentação em batelada, por exemplo, o processo usado na presente invenção, poderia consistir de uma fase de crescimento inicial em uma temperatura adequada para crescimento da linhagem de célula em particular em uso, seguido por uma diminuição na temperatura de operação em uma densidade celular predeterminada.
[000520] Em uma modalidade, um processo para um processo de cultura com alimentação em batelada em larga escala compreende o seguinte: (i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro e propagação da cultura de semeadura pelo menos até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada em uma temperatura adequada para crescimento; (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ou sacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal de forma a expandir a cultura em uma temperatura adequada; (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala contendo meio de cultura isento de soro para propágar adicionalmente para a cultura de célula em uma temperatura adequada; e (iv) manutenção da cultura em larga escala em uma temperatura diminuída adequada para expressão de proteína, em meio carecendo de componentes derivados de animal, com reposições diárias através de meio de alimentação fresco, pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo ou extensão de tempo crítica.
[000521] A etapa de reposição de meio de alimentação fresco em (iv) pode requerer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80%, do volume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume de meio de alimentação fresco.
[000522] Em uma outra modalidade, um processo para um processo de cultura com alimentação em batelada em larga escala compreende o seguinte: (i) inoculação de células em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro e propagação da cultura de semeadura pelo menos até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada em uma temperatura adequada para crescimento; (ii) transferência da cultura de semeadura propagada para um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, garrafas giratórias ou sacos de células) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal de forma a expandir a cultura em uma temperatura adequada; (iii) transferência da cultura de semeadura expandida para um vaso de cultura de semeadura de larga escala (por exemplo, um biorreator de 1000-L) contendo meio de cultura isento de soro para propágar adicionalmente para a cultura de célula em uma temperatura adequada; e (iv) manutenção da cultura em larga escala em uma temperatura diminuída adequada para expressão de proteína, em meio carecendo de componentes derivados de animal, com reposições diárias através de meio de alimentação fresco, pelo menos até que as referidas células atinjam uma densidade-alvo ou extensão de tempo crítica.
[000523] A etapa de reposição de meio de alimentação fresco em (iv) pode requerer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, cerca de 80% do volume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume de meio de alimentação fresco.
[000524] Em uma modalidade da presente invenção, as células cultivadas em um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína desejado. Células de mamífero são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO (Exemplo 13) e propagadas em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de 35-39°C, durante 3-4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo > 6,0x106 células viáveis ou em que a viabilidade de cultura final > 80%). A cultura de semeadura propagada é, então, transferida para um grande vaso de cultura de semeadura (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (por exemplo, em cerca de 35-39°C) durante aproximadamente 3-4 dias. A cultura de célula é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L e semelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO, em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de 35-39°C, durante 3-4 dias até as células atingirem uma densidade de semeadura alvo (por exemplo, tendo > 1-2 x106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade de cultura final > 80%). Em uma modalidade, a expansão de inóculo envolve um mínimo de 4 passagens. Em outra modalidade da invenção, expansão de inóculo requer não mais do que 20 passagens.
[000525] A cultura de semeadura expandida pode, então, ser usada para inocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, a 1000L, um biorreator de 4000L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio CD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura de célula em uma temperatura adequada, por exemplo, em cerca de 35-39°C, durante 3-6 dias, até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1-2 x 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade final da cultura de células > 80%). Uma cultura em larga escala (por exemplo, uma cultura de 10.000L, 15.000L, 20.000L em um biorreator e semelhantes) é subsequentemente mantida em meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF, Exemplo 14), em uma temperatura menor do que a temperatura de crescimento (por exemplo, em ou cerca de 33-35°C durante 3-4 dias e em ou cerca de 31-33°C durante 6-8 dias), adequada para expressão de proteína e produção do produto de proteína secretado. O meio de alimentação é substituído diariamente por meio de alimentação fresco, pelo que a reposição do tanque com meio de alimentação fresco requer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80% do volume do tan- que e reposição do tanque com o mesmo volume de meio de alimentação fresco. A escala comercial de cultura é mantida até que as referidas células atinjam um valor-alvo de parâmetros de produção que podem ser, mas não estão limitados a, uma extensão de tempo, uma densidade celular alvo ou característica bioquímica de proteína (tal como uma proporção molar de NANA conforme previamente descrito) em que a densidade celular viável pode ser 3,0-8,0 x 106 células/ml; a proporção molar de NANA pode ser > 6,0; a viabilidade final de cultura de células pode ser > 30%; e a titulação final de produto de proteína pode ser > 0,5 g/L).
[000526] Em uma modalidade particular da presente invenção, as células cultivadas em um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína desejado (por exemplo, a molécula de CTLA4-Ig). células de CHO são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO e propagadas em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de 37°C, durante 3-4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo > 10,0x106 células viáveis ou em que a viabilidade de cultura final > 84%). A cultura de semeadura propagada é, então, transferida para um grande vaso de cultura de semeadura (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (aproximadamente 37°C) durante cerca de 4 dias. A cultura de célula é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L e semelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO, durante 4 dias em uma temperatura adequada para crescimento (por exemplo, em cerca de 37°C) até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1-2 x 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade de cultura final > 91%). A expansão de inóculo pode envolver um mínimo de 7 passagens.
[000527] A cultura de semeadura expandida é, então, usada para inocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um bior- reator de 4000L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio CD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura de célula em uma temperatura adequada, por exemplo, em cerca de 37°C, durante 5-6 dias, até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1-2 x 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade final da cultura de células > 86%). Uma cultura em escala comercial (por exemplo, uma cultura de 20.000 L em um biorreator) é subsequentemente mantida em meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF), em uma temperatura menor do que a temperatura de crescimento, a qual é adequada para expressão de proteína e produção do produto de proteína secretado (por exemplo, CTLA4-Ig). A cultura em escala comercial é primeiro diminuída de cerca de 37°C para cerca de 34°C durante 4 dias e, então, submetida a um segundo desvio de temperatura através de diminuição da temperatura de cerca de 34°C para cerca de 32°C durante 8 dias. O meio de alimentação é substituído diariamente por meio de alimentação fresco, pelo que reposição do meio de alimentação no tanque do biorreator requer remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80% do volume do tanque e reposição do mesmo pelo mesmo volume de meio de alimentação fresco. A escala comercial é mantida até que as referidas células de CHO e/ou produto de proteína secretado atinja um valor-alvo dos seguintes parâmetros de produção não-limitativos: uma densidade celular viável de 4,0-7,0 x 106 células/ml; uma proporção molar de NANA >8,0; uma vi- abilidade final de cultura de células > 38%; e uma titulação final de produto de proteína de > 0,6 g/L.
[000528] Em outra modalidade da presente invenção, as células cul-tivadas em um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína desejado. Células de mamífero são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO (EXEMPLO 19) e propagadas em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C, durante cerca de 3-4 dias; ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C, durante cerca de até cerca de 4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo uma densidade celular de mais de ou igual a 1,5 x 106 ou em que a viabilidade de cultura final é mais de ou igual a cerca de 80%). A cultura de semeadura propagada é, então, transferida para um grande vaso de cultura de semeadura (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (por exemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C) durante cerca de 3-4 dias ou até cerca de 4 dias. A cultura de célula é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura maior (por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L e semelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO, em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C, durante cerca de 3-4 dias ou até cerca de 4 dias até as células atingirem uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo pelo menos cerca de 1,5 x 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade de cultura final é mais de ou igual a 80%). Em uma modalidade, a expansão de inóculo envolve um mínimo de 4 passagens. Em outra modalidade da invenção, expansão de inó- culo requer não mais do que 20 passagens. Em algumas modalidades, o meio CD-CHO é o meio de inóculo CD-CHO.
[000529] A cultura de semeadura estendida pode, então, ser usada para inocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um biorreator de 1000L, 4000L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio CD-CHO, tais como meio de inóculo CD-CHO e/ou meio basal CD-CHO) para propágar adicionalmente a cultura de células em uma temperatura adequada, por exemplo, de cerca de 35°C a cerca de 39°C ou de cerca de 36°C a cerca de 38°C durante de cerca de 3 a cerca de 6 dias ou durante de cerca de 4 a cerca de 5 dias ou durante cerca de 4,7 dias ou durante menos de ou igual a cerca de 113 horas, até que as células atinjam uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo cerca de 2,3 x 106 células viá- veis/ml ou em que a viabilidade final da cultura de células seja de pelo menos cerca de 88%).
[000530] Uma cultura em escala comercial (por exemplo uma cultura de 10.000L, 15.000L, 20.000L, 30.000L em um biorreator e semelhantes) é subsequentemente mantida em meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF, EXEMPLO 19), em uma temperatura de cerca de 35°C a cerca de 39°C durante de cerca de 3 a cerca de 6 dias ou de cerca de 4 a cerca de 5 dias, adequado para expressão de proteína e produção do produto de proteína secretado. Alternativamente, um composto polianiônico (por exemplo, tal como sulfato de dextrana) pode ser adicionado à cultura mantida em meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meio de alimentação (por exemplo, meio eRDF, EXEMPLO 19) conforme descrito abaixo e na Publicação de Pedido de Patente U.S. N° 2005/0019859, a qual é incorporada aqui por referência em sua totalidade. A cultura pode ser concomitantemente submetida a uma única etapa de diminuição de temperatura (por exemplo, em ou cerca de 32°C a em ou cerca de 36°C durante de cerca de 3 a cerca de 14 dias ou durante de cerca de 10 a cerca de 13 dias ou durante de cerca de 234 a cerca de 304 horas).
[000531] Em uma modalidade da invenção, a cultura pode também ser concomitantemente submetida a uma diminuição de temperatura em múltiplas etapas (por exemplo, em ou cerca de 33°C a em ou cerca de 35°C durante cerca de 3-6 dias e em ou cerca de 31°C a em ou cerca de 33°C durante cerca de 6-8 dias). O processo acima descrito é adequado para expressão e produção de proteína do produto de proteína secretado.
[000532] O meio de alimentação nos casos descritos acima pode ser substituído diariamente (1, 2, 3, etc. vezes ao dia) ou a cada uns poucos dias por meio de alimentação fresco. A reposição do tanque com meio de alimentação fresco requer a remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80% do volume do tanque e reposição do tanque com o mesmo volume de meio de alimentação fresco. A cultura em escala comercial é mantida até que as células atinjam um valor- alvo de parâmetros de produção que podem ser, mas não estão limitados a, a extensão de tempo, uma densidade celular alvo ou característica bioquímica de proteína (tal como uma proporção molar de NANA conforme previamente descrito), em que a densidade celular viável pode ser de 3,0-8,0 x 106 células/ml; a proporção molar de NANA pode ser > 5,0 ou cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; a viabilidade celular final de cultura pode ser maior do que ou igual a cerca de 30% ou maior do que ou igual a cerca de 37%; e uma titulação final de produto de proteína que pode ser de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 g/L, mais de ou igual a 0,5 g/L ou mais de ou igual a 20 g/L.
[000533] De acordo com a presente invenção, um processo de cultura de célula envolvendo a adição retardada de composto polianiônico é proporcionado. O processo compreende adição de composto polianiô- nico a uma cultura de célula em um momento após inoculação (por exemplo, durante a fase de crescimento ou durante a fase de produção de um processo de cultura). A adição retardada de composto poli- aniônico obtém viabilidade celular aumentada. Em uma modalidade, a invenção é dirigida a um processo de cultura de célula que compreende cultura de células hospedeiras as quais expressam uma proteína de interesse e adição de composto polianiônico à cultura de célula em um momento após inoculação.
[000534] Composto polianiônicos incluem, mas não estão limitados a, sulfato de dextrana (disponível da Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo.), heparina (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de heparana (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de manana, sulfato de condroitina (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de dermatana (disponível da Sigma- Aldrich), sulfato de queratana (disponível da Sigma-Aldrich), hialurona- to (disponível da Sigma-Aldrich), sulfato de (poli)vinila (disponível da Sigma-Aldrich), kappa-carragena (disponível da Sigma-Aldrich) e su- ramina (disponível da Sigma-Aldrich). Os compostos estão prontamente disponíveis das fontes listadas ou prontamente obteníveis através de meios conhecidos por versados na técnica. Esses compostos estão frequentemente disponíveis na forma de um sal incluindo, mas não limitado a, um sal de sódio, mas também podem ser usados nas formas de não-sal. um composto polianiônico inclui todas as formas do mesmo incluindo, mas não limitado a, formas de sal, tais como sais de sódio.
[000535] Exemplos particularmente úteis não-limitativos de compostos polianiônicos da invenção incluem compostos polissulfatados: sulfato de dextrana, heparina, sulfato de heparana, sulfato de manana, sulfato de condroitina, sulfato de dermatana, sulfato de queratana, sulfato de (poli)vinila, capa-carragena e suramina. Em uma modalidade, o composto polianiônico é sulfato de dextrana. Sulfato de dextrana pode ter um peso molecular médio calculado de 5.000 a 500.000 Da. Em outra modalidade da invenção, sulfato de dextrana tendo um peso molecular de 5.000 Da é usado.
[000536] De acordo com os métodos da invenção, o composto polia- niônico pode ser adicionado à cultura de células uma vez, duas vezes, três vezes ou qualquer número de vezes durante o período de cultura de células especificado (por exemplo, em um momento após inoculação, tal como durante a fase de crescimento ou a fase de produção). Um ou mais compostos polianiônicos podem ser usados em conjunto. Por exemplo, qualquer dada única adição de um composto polianiôni- co pode incluir a adição de um ou mais de outros compostos polianiô- nicos. Similarmente, se há mais de uma adição de um composto polia- niônico, diferentes compostos polianiônicos podem ser adicionados em diferentes adições. Compostos e substâncias adicionais, incluindo compostos polianiônicos, podem ser adicionados à cultura antes, com ou após a adição de composto polianiônico, durante ou não durante o período de tempo especificado. Em a particular modalidade, há uma única, por exemplo, uma vez, adição de composto polianiônico. Em outra modalidade, um composto polianiônico é adicionado.
[000537] O composto polianiônico pode ser adicionado à cultura de célula através de qualquer meio. Meios para a adição de composto polianiônico incluem, mas não estão limitados a, dissolução em água, dissolução em meio de cultura, dissolução em meio de alimentação, dissolução em um meio adequado e em uma forma na qual ele é obtido. Em particular, o composto polianiônico é adicionado dissolvido em água. De acordo com a invenção, o composto polianiônico é adicionado para levar a concentração na cultura para um nível apropriado. Como exemplos não-limitativos, o composto polianiônico é adicionado a uma concentração de 1-1000 mg/L, 1-200 mg/L, 1-100 mg/L ou 25-75 mg/L. Concentrações particularmente úteis de composto polianiônico adicionado à cultura de célula incluem, mas não estão limitadas a, cerca de 25-200 mg/L; cerca de 25-100 mg/L; e cerca de 50-100 mg/L. Em uma modalidade da invenção, a concentração de composto polianiôni- co adicionado à cultura é cerca de 50 mg/L. Em outra modalidade, a concentração de composto polianiônico adicionado à cultura é cerca de 100 mg/L.
[000538] Métodos da invenção proporcionam que a cultura pode ser operada durante qualquer extensão de tempo após a adição de composto polianiônico. O tempo de operação de cultura pode ser determinado por versados na técnica, baseado em fatores relevantes, tais como a quantidade e qualidade de proteína recuperável e o nível de espécies celulares contaminantes (por exemplo, proteínas e DNA) no sobrenadante resultante de lise celular, o que complicará a recuperação da proteína de interesse. Em algumas modalidades do processo de cultura de célula, o composto polianiônico é adicionado em um momento após inoculação (por exemplo, durante a fase de crescimento do processo de cultura de célula ou durante a fase de produção do processo de cultura de célula). Composto polianiônico é adicionado em um momento após inoculação que é durante ou em torno do final da fase de crescimento. Em particular, o composto polianiônico é adicionado em um momento após inoculação que é durante a fase de produção, por exemplo, no início da fase de produção.
[000539] Em uma modalidade particular da presente invenção, as células cultivadas em um processo de alimentação em batelada são células de mamífero, por exemplo, células de CHO, as quais expressam um produto de proteína desejado (por exemplo, uma molécula de CTLA4A29YL104E-Ig). Células de CHO são inoculadas em um vaso de cultura de semeadura de (por exemplo, um frasco T-175) contendo meio de cultura isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO (tal como meio de inóculo CD-CHO) e propagadas em uma temperatura adequada para crescimento, por exemplo, em cerca de 37°C, durante cerca de 3-4 dias, até que as células atinjam uma densidade de cultura cruzada predeterminada (por exemplo, tendo > 1,5 x 106 células viáveis ou em que a viabilidade final de cultura > 80%). A cultura de semeadura propagada é, então, transferida para um vaso de cultura de semeadura grande (por exemplo, garrafas giratórias) contendo meio de cultura carecendo de componentes derivados de animal para expansão em uma temperatura adequada (em torno de 37°C) durante cerca de 4 dias. A cultura de células é ainda expandida em um vaso de cultura de semeadura grande (por exemplo, um saco de células de 20 L, um saco de células de 100 L e semelhantes) contendo meio isento de soro, por exemplo, meio CD-CHO (tal como meio de inóculo CD-CHO), durante cerca de 4 dias em uma temperatura adequada para crescimento (por exemplo, em cerca de 37°C) até que as células atinjam uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo > 1,5 x 106 células viáveis ou em que a viabilidade final de cultura > 80%). A expansão de inóculo pode envolver um mínimo de 7 passagens.
[000540] A cultura de semeadura expandida é, então, usada para inocular um tanque de cultura em larga escala (por exemplo, um bior- reator de 1000-L, 4000-L e semelhantes), contendo meio de cultura isento de soro (por exemplo, meio CD-CHO, tal como meio basal CD- CHO) para propágar adicionalmente a cultura de célula em uma temperatura adequada, por exemplo, em cerca de 37°C, durante cerca de 5-6 dias, até que as células atinjam uma densidade de cultura-alvo (por exemplo, tendo cerca de 2,3 x 106 células viáveis/ml ou em que a viabilidade final das culturas de célula > 88%). A cultura em escala comercial (por exemplo, uma cultura de 10.000L, 15.0000L ou 20.000 L e semelhantes em um biorreator) é subsequentemente mantida em um meio de cultura isento de soro, em que o meio é um meio de ali- mentação (por exemplo, meio eRDF), em uma temperatura menor do que a temperatura de crescimento, a qual é adequada para expressão de proteína e produção do produto de proteína secretado (por exemplo, a CTLA4A29YL104E-Ig).
[000541] A cultura em escala comercial é diminuída, por exemplo, de cerca de 37°C para cerca de 34°C durante cerca de 4 dias. O composto polianiônico pode ser adicionado concomitantemente à cultura quando a temperatura é diminuída. Alternativamente, a cultura em escala comercial é diminuída de cerca de 35°C-37°C para cerca de 32°C-36°C durante cerca de 12 dias e o composto polianiônico é concomitantemente adicionado à medida que a temperatura é diminuída.
[000542] O meio de alimentação nos casos descritos acima pode ser substituído diariamente (1, 2, 3, etc. vezes ao dia) ou a cada alguns dias por meio de alimentação fresco. A reposição do tanque com meio de alimentação fresco requer a remoção de um volume predeterminado, por exemplo, 80% do volume do tanque e reposição do tanque com o mesmo volume de meio de alimentação fresco. Em uma modalidade, o meio de alimentação é adicionado diariamente cerca de 2 a 3 dias até, por exemplo, a concentração de glicose cair para 1 g/L. Em outra modalidade, o meio de alimentação é adicionado a cada 8 horas, por exemplo, uma vez que a concentração de glicose tenha atingido 1 g/L. A escala comercial é mantida até que as referidas células de CHO e/ou produto de proteína secretado atinja um valor-alvo dos seguintes parâmetros de produção não-limitativos: uma proporção molar de NANA de cerca de 6,0 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; uma viabilidade final de cultura de células > 37%; e uma titulação final de produto de proteína de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 g/L.
[000543] Em uma modalidade da presente invenção, as células que estão sendo cultivadas podem ser células de mamífero ou uma linhagem de células de mamífero estabelecida incluindo, sem limitação, CHO (por exemplo, ATCC CCL 61), HEK293 (por exemplo, ATCC CRL 1573; Graham e outros, J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), COS-1 (por exemplo, ATCC CRL 1650), DG44 (linhagem de célula de CHO) (Cell, 33: 405, 1983 e Somatic Cell and Molecular Genetics 12: 555, 1986) e linhagens de células de rim de hamster bebê (BHK). Outros exemplos não-limitativos úteis são mielomas, células 3T3, células Namala e fusões de mielomas com outras células. Em algumas modalidades, as células podem ser células mutantes ou recombinantes tais como, por exemplo, células que expressam um espectro diferente de enzimas que catalisam a modificação pós-traducional de proteínas (por exemplo, enzimas de processamento, tais como pró-peptídeos ou enzimas de glicosilação, tais como glicosil transferases e/ou glicosidases) do que um tipo de célula do qual elas foram derivadas. Em um aspecto particular da presente invenção, células de CHO/dhfr- são particularmente utilizadas.
[000544] Os vasos de cultura de semeadura usados para expansão da cultura de célula pode ser, mas não estão limitado a, frascos de Er- lenmyer, frascos T-175, garrafas giratórias e sacos de células. Os vasos de cultura em grande escala podem ser, por exemplo, reatores aéreos onde agitação é obtida por meio de introdução de ar do fundo do vaso ou reatores com tanque agitado convencionais (CSTR), onde agitação é obtida por meio de propulsores do tipo convencional. Dentre os parâmetros controlados dentro de limites especificados estão temperatura, pH e tensão de oxigênio dissolvido (DOT). O meio de controle de temperatura nesse sistema é água e pode ser aquecido ou resfriado, conforme necessário. A água pode ser passada através de uma tubulação em espiral imersa em um meio de cultura de células ou através de uma camisa circundando o vaso. O pH, por exemplo, pode ser regulado através da adição de base a um meio de cultura de células quando requerido ou variando a concentração de CO2 do gás no headspace. DOT pode ser mantido através de purgação com oxigênio puro ou ar ou misturas dos mesmos.
[000545] A invenção, portanto, proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo pelo menos duas etapas: (a) expansão de células de mamífero que secre- tam uma proteína recombinante (isto é, uma proteína que as células de mamífero normalmente não expressam ou superexpressam, onde a proteína recombinante é expressa nas células via um vetor ou estrutura de expressão que tenha sido transfectada nas células ou os precursores das células) de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000L e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L. Em uma modalidade, esse método pode ser usado de modo que a proteína recombinante seja produzida em uma concentração de pelo menos 0,5 grama por litro de cultura líquida antes de purificação da proteína da cultura líquida. Em outra modalidade, o método de acordo com a invenção pode ser usado para produzir uma proteína recombinante em uma concentração de pelo menos de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 grama por litro de cultura líquida antes de purificação da proteína da cultura líquida.
[000546] Em uma modalidade, a etapa de expansão pode envolver (i) cultura das células em um meio isento de soro com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir pelo menos cerca de 0,5 da proteína recombinante. Em uma modalidade, o número de passagens não excede a 36 passagens. Em outra modalidade, o número de passagens pode exceder a 36 passagens, onde as células são estáveis durante gerações com relação ao número de cópia do ácido nucleico que codifica uma proteína recombinante, viabilidade celular e tempo de duplicação.
[000547] O tempo suficiente para produzir pelo menos cerca de 0,5 a cerca de 1,3 g/L da proteína recombinante pode ser qualquer quantidade de tempo, na medida em que a viabilidade celular não cai abaixo de 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e/ou na medida em que o número de gerações de célula não excede a 50, 75, 100, 105 ou 125 gerações. A etapa de manutenção pode também compreender etapas de desvio de temperatura, tais como diminuição da temperatura da cultura primeiro de 37 ± 2°C para 34 ± 2°C e, em um momento posterior, de 34 ± 2°C para 32 ± 2°C. A temperatura de 32 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 ou 100 dias. A temperatura de 32 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 20, 50, 75 ou 100 gerações de células. A temperatura de 32 ± 2°C pode ser mantida até que a densidade celular da cultura seja de cerca de 30 a cerca de 100 x 105 células por mL de cultura líquida.
[000548] Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo pelo menos as etapas de: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama/L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L quando a cultura líquida: (i) contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de proteína (glicoproteína nesse caso); (ii) tem uma densidade celular de cerca de 33 a cerca de 79 x 105 células por mL; (iii) a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 38% ou é mais de ou igual a cerca de 38%; (iv) a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida; e/ou (v) a bioburden é menos de 1 unidade formação de colônia por mL de cultura líquida.
[000549] Em uma outra modalidade, a etapa de expansão pode envolver (i) cultura das células em um meio isento de soro com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 106 células viáveis por mL e (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir pelo menos de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 grama da proteína recombinante por litro de cultura líquida. Em uma modalidade, o número de passagens não excede a 36 passagens. Em outra modalidade, o número de passagens pode exceder 36 passagens, onde as células são estáveis durante gerações com relação ao número de cópias obtido do ácido nucleico que codifica a proteína recombinante, viabilidade celular e tempo de duplicação.
[000550] O tempo suficiente para produzir de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 g/L da proteína recombinante pode ser qualquer quantidade de tempo, na medida em que a viabilidade celular não caia abaixo de 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% e/ou na medida em que o número de gerações de células não exceda a 27, 50, 75, 100, 105 ou 125 gerações. A etapa de manutenção pode também compreender etapas de desvio de temperatura, tal como diminuição da temperatura da cultura primeiro de 37 ± 2°C para 34 ± 2°C. A temperatura de 34 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 ou 100 dias. Alternativamente, a etapa de manutenção pode ser uma etapa de desvio de temperatura, tal como diminuição da temperatura da cultura de 37 ± 2°C para 34 ± 2°C.
[000551] Composto polianiônico pode ser adicionado às culturas à medida que a diminuição de temperatura começa. A concentração de compostos polianiônico adicionado à cultura pode ser cerca de 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 12,5 mg/L, 15 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 75 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 250 mg/L, 500 mg/L, 750 mg/L ou 1000 mg/L. A tem- peratura de 32 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 30, 50 ou 100 dias. A temperatura de 34 ± 2°C pode ser mantida durante pelo menos 20, 27, 50, 75 ou 100 gerações de célula.
[000552] Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para a produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo pelo menos as etapas de: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos de cerca de 0,46 a cerca de 0,71 grama por litro de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante da cultura de pelo menos 10.000 L de cultura líquida quando a cultura líquida: (i) contém cerca de 6 mols de NANA por mol de proteína (glicoproteína nesse caso); (ii) a viabilidade celular na cultura líquida não é menos de cerca de 37%; (iii) a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 4,8 EU por mL de cultura líquida; e/ou (iv) a bioburden é menos de 1 unidade em formação de colônia por mL de cultura líquida.
[000553] A proteína recombinante produzida através desses métodos da invenção pode ser uma proteína secretada, uma glicoproteína, uma citocina, um hormônio, uma proteína de CTLA4-Ig ou uma proteína de CTLA4A29YL104E-Ig. Em uma modalidade, as células de mamífero são uma prole ou subclones de células proporcionadas pela invenção. Em outra modalidade, as células de mamífero são a prole ou subclones de células derivadas da linhagem de células da invenção. Em uma outra modalidade, as células de mamífero são uma população clonal de células transfectadas com um cassete de expressão compreendendo SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade particular, as células de mamífero são uma população clonal de células transfectadas com um cassete de expressão compreendendo SEQ ID NO: 3.
Técnicas gerais para a purificação de Proteína recombinante de Cultura
[000554] Após uma fase de produção de proteína em um processo de cultura de célula, a proteína de interesse, por exemplo uma glico- proteína, é recuperada do meio de cultura de célula usando técnicas compreendidas por versados na técnica. Em particular, a proteína de interesse é recuperada do meio de cultura como um polipeptídeo se- cretado, embora ela também possa ser recuperada dos lisatos de célula hospedeira. O meio de cultura ou lisato é inicialmente centrifugado para remover resíduos e partículas de células. A proteína desejada é subsequentemente purificada do DNA contaminante, proteínas e poli- peptídeos solúveis, com os seguintes procedimentos de purificação bem estabelecidos na técnica: SDS-PAGE; precipitação com sulfato de amônio; precipitação com etanol; fracionamento sobre colunas de imunoafinidade ou troca de íons; HPLC de fase reversa; cromatografia sobre sílica ou uma resina de troca de ânions, tal como QAE ou DEAE; cromatofocalização; filtração em gel usando, por exemplo, uma coluna Sephadex G-75®; e colunas de proteína A Sefarose® para remover contaminantes, tal como IgG. A adição de um inibidor de protease, tal como fluoreto de fenil metil sulfonila (PMSF) ou uma mistura de coquetel de inibidor de protease também pode ser útil para inibir a degradação proteolítica durante purificação. Versados na técnica reconhecerão que métodos de purificação adequados para uma proteína de interesse, por exemplo, uma glicoproteína, podem requerer alterações para levar em conta mudanças no caráter da proteína quando de expressão em uma cultura de células recombinante.
[000555] Técnicas de purificação e métodos que selecionam os grupos carboidrato da glicoproteína são também de utilidade dentro do contexto da presente invenção. Por exemplo, tais técnicas incluem HPLC ou cromatografia de troca de íons usando resinas de troca de cátions ou de troca de ânions, em que a fração mais básica ou mais ácida é coletada, dependendo de qual carboidrato está sendo selecio-nado. O uso de tais técnicas também pode resultar na remoção con-comitante de contaminantes.
[000556] Na presente invenção, células de CHO capazes de produzir proteínas de fusão de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig são desenvolvidas como uma suspensão em um meio CHO-específico até uma densidade celular predeterminada. Células de CHO desenvolvidas em suspensão no meio de expressão sem soro subsequentemente produzem moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig, as quais são secre- tadas pelas células de CHO no meio de cultura. A suspensão de células pode ser clivada via centrifugação e moléculas de CTLA4-Ig podem, então, ser separadas do sobrenadante de cultura clarificado de técnicas-padrão de purificação. Exemplos não-limitativos de procedimentos de purificação adequados para obtenção de maior pureza e homogeneidade de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig, individualmente ou em combinação, são: cromatografia por afinidade sobre sefarose; fracionamento sobre colunas de troca de ânions (AEC); e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).
[000557] Em algumas modalidades, isolamento de moléculas de CTLA4-Ig ou outras proteínas (incluindo glicoproteínas) dos métodos de produção descritos aqui podem pelo menos incluir as etapas seguintes: (i) obtenção de uma cultura de célula sobrenadante; (ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca de ânions para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína elu- ído da etapa (ii) à cromatografia de interação hidrofóbica, de modo a obter um produto de proteína enriquecido; (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (v) sujeição do produto de proteína enriquecido eluído de (iv) à cromatografia de troca de ânions. O produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iii) pode ser caracte-rizado, por exemplo, em que seu percentual de qualquer proteína de HMW ou contaminante é menos de 5, 10, 15 ou 25%. A cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem compreendendo HEPES cerca de 25-100 mM e a NaCl cerca de 300-900 mM e tendo um pH de cerca de 7,0-8,0. A cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um único tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 7,0 e compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM; ou um tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 8,0 e compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCl e cerca de 250 mM. A cromatografia por afinidade da etapa (iv) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de eluição tendo um pH de cerca de 3,5 e compreendendo Glicina a cerca de 100 mM. A cromatografia por afinidade da etapa (v) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 8,0 e compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl da cerca de 120 mM a NaCl a cerca de 130 mM ou um tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 8,0 e compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 200 mM. A cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) pode ser realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. A coluna de interação hidrofóbica da etapa (iii) pode ser realizada usando uma resina de interação hidrofó- bica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila.
[000558] Em outras modalidades, isolamento de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig ou outras proteínas (incluindo glicoproteínas) dos métodos de produção descritos aqui pode pelo menos incluir as etapas seguintes: (i) obtenção de uma cultura de célula sobrenadante; (ii) su-jeição do sobrenadante à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cromatografia de troca de ânions de modo a obter um produto de proteína enriquecido; e (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia de interação hidrofóbica para obter um produto de proteína enriquecido eluído com complexos de espécies de elevado peso molecular (HMW)/proteína reduzidos. O produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iv) pode ser caracterizado, por exemplo, em que seu percentual de qualquer proteína de HMW ou contaminante é menos de 5, 10, 15 ou 25%. A cromatografia por afinidade da etapa (ii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de eluição tendo um pH de cerca de 3,0 e compreendendo Glicina a cerca de 250 mM. A cromatografia por afinidade da etapa (ii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 7,5 e compreendendo NaH2PO4 a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 150 mM. A cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 135 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. A cro- matografia de troca de ânions da etapa (iii) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 7,0, A cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iv) pode ser realizada, por exemplo, através de uso de um tampão de lavagem tendo um pH de cerca de 7,0 e compreendendo HEPES a cerca de 50 mM e (NH4)2SO4 a cerca de 1,2 M A cromatografia de troca de ânions da etapa (iii) pode ser realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. A coluna de interação hidrofóbica da etapa (iv) pode ser realizada usando uma resina de interação hidrofó- bica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila.
[000559] Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para purificação de moléculas de CTLA4-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que uma CTLA4-Ig purificada é substancialmente isenta de Proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1). Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição farmaceuticamente aceitável de moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende não mais do que 0,5 ppm de MCP-1, 1 ppm de MCP-1, 2 ppm de MCP-1, 3 ppm de MCP-1, 4 ppm de MCP-1, 5 ppm de MCP-1, 6 ppm de MCP-1, 7 ppm de MCP-1, 8 ppm de MCP-1, 9 ppm de MCP-1 ou 10 ppm de MCP-1 Em outra modalidade, na composição, a quantidade MCP-1 não pode exceder a 1%, 0,5% ou 0,1% do peso de CTLA4-Ig purificada. Em outra modalidade, a composição de moléculas de CTLA4-Ig é substancialmente isenta de MCP-1 onde há menos de 50, 45, 40, 38, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 ng/mL de MCP-1 no eluato líquido de QFF. Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para purificação de moléculas de CTLA4-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que uma CTLA4-Ig purificada é substancialmente isenta de MCP-1 e compreende menos do que 2,5% de tetrâmero de CTLA4-Ig.
[000560] A quantidade de proteína 1 quimiotática de monócito (MCP- 1) na composição pode ser quantificada usando um método ELISA. O anticorpo de revestimento é um anticorpo de IgG anti-MCP-1 de ca-mundongo de bezerro. O anticorpo secundário é um anticorpo de IgG anti-MCP-1 de rato de coelho. Detecção é realizada usando anticorpo anti-coelho de cabra conjugado à morseradish peroxidase e o substrato TMB. O reagente peroxidase de rábano-silvestre produz uma reação colorimétrica que se desenvolve em proporção à quantidade de proteína capturada. O ELISA quantifica o nível de MCP-1 com relação à Curva-padrão de Material. Em uma modalidade, MCP-1 foi quantificada na composição e os níveis de MCP-1 estavam em faixas de 00,097 ng/mg e 0,014-0,154 ng/mg.
[000561] Em outra modalidade, a invenção proporciona um método para a purificação de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que a CTLA4A29YL104E-Ig purificada é substancialmente isenta de Proteína-1 quimiotática de monócitos (MCP-1). Em uma modalidade, a quantidade MCP-1 não pode exceder a 1%, 0,5% ou 0,1% do peso da CTLA4A29YL104E-Ig purificada. Em outra modalidade, CTLA4A29YL104E-Ig é substancialmente isenta de MCP-1, onde há menos de 50, 45, 40, 38, 35 ou 30 ng/mL de MCP-1 no eluato líquido de HIC. Em uma outra modalidade, a invenção proporciona um método para purificação de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que a CTLA4A29YL104E-Ig purificada seja substancialmente isenta de MCP-1 e compreende menos do que 2,5% de CTLA4A29YL104E-Ig.
Recuperação de Glicoproteína de uma cultura de célula e Purificação
[000562] A presente invenção descreve uma série da etapas para a separação de uma glicoproteína (por exemplo, CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) de um sobrenadante de cultura de células impuro, empoçamento da proteína contém a glicoproteína de interesse (tal como CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) e contaminantes indesejados. O sobrenadante de cultura de células impuro pode ser usado como o material de iniciação para a purificação da glicoproteína de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig.
[000563] Em uma modalidade da presente invenção, o sobrenadante de cultura de célula que contém glicoproteína de CTLA4-Ig e contami- nantes indesejáveis é aplicado a um meio de troca de ânions. A glico- proteína de CTLA4-Ig presente no sobrenadante de cultura de célula se liga ao meio de troca de ânions. O meio de troca de ânions é, então, lavado para remover qualquer material não ligado do meio de troca de ânions. A glicoproteína de CTLA4-Ig é eluída após o material não ligado ser removido e o eluato é coletado.
[000564] Em uma modalidade da presente invenção, o sobrenadante de cultura de célula impuro que contém glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig e contaminantes indesejáveis é aplicado a um meio de cromatografia por afinidade. A glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig presente no sobrenadante de cultura de célula impuro se liga a um meio de cromatografia por afinidade. O meio de cromatografia por afinidade é, então, lavado para remover qualquer material não ligado do meio de troca de ânions. A glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig é eluída após o material não ligado ser removido e o eluato é coletado.
[000565] Em uma modalidade particular da presente invenção, uma cromatografia de troca de íons em Q-Sefarose (AEC), por exemplo, usando uma coluna Q-Sefarose XL (GE Healthcare), é empregada para separar glicoproteína de CTLA4-Ig do material coletado, bem como para diminuir contaminantes. Essa coluna pode ser usada como uma etapa inicial na purificação de glicoproteína de CTLA4-Ig de uma cultura de células de mamífero, para fracionamento do meio de cultura de células coletado. Em outra modalidade, uma cromatografia de troca de íons Q-Sefarose, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), pode ser usada após uma etapa de purificação através de croma- tografia por afinidade. A propriedade de fluxo muito alta das colunas de troca de ânions permite que o grande volume de glicoproteína de CTLA4-Ig ou meio de cultura de células coletado seja prontamente concentrado antes de subsequentes etapas de cromatografia, tais como SP-Sefarose ou HIC, através de ajuste das condições de modo que a glicoproteína de CTLA4-Ig se liga à coluna. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, em particular cerca de 8, concen- trações de HEPES a 75 mM e NaCl a 360 mM são úteis. Tipicamente, para um tampão de eluição com pH de cerca de 5 a 8, em particular cerca de 7, concentrações de HEPES a 25 mM e NaCl a 325 mM são úteis.
[000566] Resinas adequadas para separação de glicoproteína de CTLA4-Ig do meio de cultura coletado foram aquelas tendo grupos funcionais amina imobilizados. Mais úteis são as resinas com um grupo funcional de amina quaternária, por exemplo, aquelas sobre as resinas Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um ligante de amônio quaternário é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticulada. Também úteis são as resinas com um grupo funcional amina primária, secundária e terciária, por exemplo, aquelas nas resinas DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um ligante de dietilaminoetila terciária é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticulada.
[000567] Em outra modalidade da presente invenção, o eluato contendo glicoproteína de CTLA4-Ig do meio de troca de ânions é coletado e, então, contatado com uma resina de interação hidrofóbica. Conforme descrito abaixo, o volume contendo glicoproteína de CTLA4-Ig passa através da coluna de HIC e o reservatório coletado, o qual pode ser ainda purificado é, então, ligado a uma resina de troca de ânions.
[000568] HIC é útil para a separação de dímeros de glicoproteína de CTLA4-Ig desejados de material de espécies de elevado peso molecular e outras impurezas de proteína da cultura de células de mamífero. Por exemplo, cultura de células de CHO expressando CTLA4-Ig contém agregados de espécies de elevado peso molecular de glicoproteí- na de CTLA4-Ig. Também encontradas no meio de cultura de células de mamífero são impurezas de proteína de células de CHO. Esses produtos indesejáveis poderiam gerar uma resposta antigênica indese- jada em um paciente e contribuir para a pobre qualidade de produto ou atividade. HIC separa eficazmente variantes hidrofóbicas, dímeros de glicoproteína de CTLA4-Ig de complexos de HWM de glicoproteína de CTLA4-Ig e impurezas de proteína de CHO via ligação dos últimos produtos à resina de HIC e passagem dos dímeros de glicoproteína de CTLA4-Ig através da coluna. Assim, uma glicoproteína de CTLA4-Ig empoçada poderia ser obtida que é substancialmente isenta dessas espécies e que é particularmente adequada para outra etapa cromato- gráfica, tal como uma cromatografia de troca de íons. Uma fonte de misturas de glicoproteína de CTLA4-Ig para uso com HIC é cultura de células de mamífero, por exemplo, uma cultura de células de CHO. Em particular, a cultura pode ser submetida a pelo menos uma etapa de purificação anterior, conforme discutido previamente.
[000569] Em outra modalidade da presente invenção, o método de HIC pode ser modificado para coletar e empoçar de outras glicoproteí- nas (por exemplo, complexos de HMW de CTLA4-Ig). Agregados de HMW podem se ligar à resina de HIC (por exemplo, compreendendo tetrâmero de CTLA4-Ig e semelhantes). Esses complexos de HMW têm uma maior avidez e se ligam mais eficazmente in vivo do que o dímero de CTLA4-Ig apenas. Assim, versados na técnica podem obter e empoçar agregados de HMW de CTLA4-Ig através de eluição da CTLA4-Ig empoçada da HIC.
[000570] As resinas de HIC mais úteis para separação de formas de glicoproteína de CTLA4-Ig são aquelas tendo grupos funcionais fenila imobilizados. Das resinas de fenill-HIC, fenill Sepharose Fast Flow High Sub (alta substituição) pela GE Healthcare é mais útil. Meio Fenil Toyopearl pela TosoHaas e TSK Phenyl 5PW são exemplos não- limitativos de outras resinas de fenill-HIC que podem ser usadas. Outros grupos funcionais em HIC incluem, mas não são limitados a, as porções propila, octila, alcoxila, butila e isoamila.
[000571] Por exemplo, um processo de cromatografia em coluna de Phenyl Sepharose Fast Flow, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), pode ser usado para reduzir a quantidade de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig eluídas em uma etapa de purificação por HIC (veja Exemplo 15 e Exemplo 20). Portanto, o pico de eliminação da coluna de HIC é enriquecido em espécies de HMW de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig.
[000572] A fração não ligada contendo glicoproteína de CTLA4-Ig da etapa de purificação de HIC pode ser submetida a um método de puri-ficação adicional, tal como cromatografia por afinidade e o eluato re-sultante pode, então, ser aplicado a um meio de troca de ânions. A gli- coproteína de CTLA4-Ig se liga à resina de troca de ânions, a qual pode ser subsequentemente lavada para remover proteínas não ligadas. Após as proteínas não ligadas serem removidas, glicoproteína de CTLA4-Ig é eluída em uma resina de troca de ânions. O eluato é coletado e pode ser ainda concentrado.
[000573] Em outra modalidade da presente invenção, cromatografia por afinidade, por exemplo rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), é empregada para enriquecer adicionalmente glicoproteína de CTLA4-Ig, a qual pode ser ainda seguido por uma etapa de cromato- grafia de troca de íons, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). A etapa de cromatografia por afinidade pode também reduzir os níveis de impurezas de proteína de CHO e Proteína Quimiotá- tica de Monócito (MCP-1, uma quimiocina). Cromatografia por afinidade envolve separação por adsorção, onde a molécula de interesse a ser purificada, por exemplo, glicoproteína CTLA4A29YL104E-Ig, se liga específica e reversivelmente a um ligante imobilizado sobre alguma matriz ou resina. Alguns exemplos não-limitativos de colunas de purificação por afinidade incluem lectina; expressão de afinidade (por exemplo, uma coluna GST ou coluna 6X-His); Estreptavidina; hepari- na; ou anticorpo (por exemplo, uma coluna de proteína A ou uma colu na de proteína G). Em particular, a presente invenção utiliza uma resina de proteína A para ligação da glicoproteína CTLA4A29YL104E-Ig. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, mais preferivelmente de cerca de 7,5, concentrações de Tris a 25 mM, NaH2PO4 a 25 mM e NaCl a 250 mM são úteis. Para um tampão de eluição com pH de cerca de 2 a 5, mais preferivelmente de cerca de 3,5, uma concentração de glicina de 100-300 mM é útil. O eluato da cromatografia por afinidade pode, então, ser neutralizado e carregado sobre uma coluna de cromatografia de troca de ânions, Q-Sepharose Fast Flow sendo mais útil.
[000574] Para reduzir adicionalmente os níveis de proteína A, DNA e espécies de glicoproteína de CTLA4-Ig indesejados no produto após as etapas de recuperação/purificação inicial precedentes, outra etapa de troca de íons pode ser incorporada no procedimento de purificação. A presente invenção pode empregar colunas de troca de íons comer-cialmente disponíveis, tais como uma coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare ou uma coluna DEAE Sepharose Fast Flow, também da GE Healthcare. Conforme determinado aqui, as resinas mais adequadas para separação de glicoproteína de CTLA4-Ig do meio de cultura coletada foram aquelas tendo grupos funcionais amina imobilizados. Outros grupos úteis são as resinas com grupo funcional de amina quaternária, por exemplo, aquelas em uma coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um ligante de amônio quaternário é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticulada. Também úteis são as resinas com grupo funcional de amina primária, secundária e terciária, por exemplo, aquelas em uma coluna DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um ligante de dietilaminoetila terciária é ligado a uma ágarose de alta pureza reticulada. Em uma modalidade particular da invenção, uma coluna que utiliza um permutador de íons forte, tal como uma coluna Q-Sepharose Fast Flow, é utilizado.
[000575] Em uma modalidade da invenção, um eluato de glicoproteí- na de CTLA4-Ig é carregado sobre uma coluna de troca de ânions, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow. A coluna é lavada e glicoproteína de CTLA4-Ig é subsequentemente eluída da coluna de troca de ânions. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, em uma modalidade um pH de 8, concentrações de HEPES a 25 mM e NaCl a 100-140 mM são úteis. Para um tampão de eluição com pH de cerca de 5 a 9 ou, em outra modalidade, um pH de 8, concentrações de HEPES a 25 mM e NaCl a 200 mM são úteis. A glicoproteína de CTLA4-Ig eluída do meio de troca de íons é recuperada, concentrada e lavada, através de diafiltração ou outro método adequado conhecido por versados na técnica, para proporcionar um produto final de glico- proteína de CTLA4-Ig purificado. O produto de glicoproteína de CTLA4-Ig preparado de acordo com o processo da presente invenção é de alta pureza, por exemplo, contendo > 95% do dímero de CTLA4 - Ig, contendo < 5% do produto de HMW de CTLA4-Ig e contendo < 1% de monômero de CTLA4-Ig.
[000576] O método de purificação pode ainda compreender etapas adicionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estar potencialmente presentes em um meio de cultura de células de linhagens de células de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viral estão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com caotropos, tais como ureia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais de diafiltração/ultrafiltração, separação convencional, tais como cromatografia de troca de íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases, solventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos
[000577] Em outra modalidade da presente invenção, cromatografia por afinidade, por exemplo resina MabSelect Protein A Sepharose (GE Healthcare), é empregada para capturar glicoproteína CTLA4A29YL104E- Ig, a qual pode ser ainda seguido por uma etapa de cromatografia de troca de íons, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow (GE Healthcare). A etapa de cromatografia por afinidade pode também reduzir os níveis de impurezas de proteínas CHO e Proteína Quimiotática de Monócito (MCP-1, uma quimiocina). Cromatografia por afinidade envolve separação por adsorção, onde a molécula de interesse a ser purificada, por exemplo, glicoproteína CTLA4A29YL104E-Ig, se liga específica e reversi- velmente a um ligante imobilizado sobre alguma matriz ou resina. Alguns exemplos não-limitativos de colunas de purificação por afinidade incluem lectina; tag de afinidade (por exemplo, uma coluna GST ou coluna 6X-His); Estreptavidina; heparina; ou anticorpo (por exemplo, uma coluna de proteína A ou uma coluna de proteína G). Em particular, a presente invenção utiliza uma resina de proteína A para ligação da glicoproteína CTLA4A29YL104E-Ig. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, mais preferivelmente de cerca de 7,5, concentrações de Tris a 25 mM, NaH2PO4 a 25 mM e NaCl a 250 mM são úteis. Para um tampão de eluição com pH de cerca de 2 a 5, mais preferivelmente de cerca de 3,5, uma concentração de glicina de 100-300 mM é útil. O eluato da cromatografia por afinidade pode, então, ser neutralizado e carregado sobre uma coluna de cromatografia de troca de ânions, Q-Sepharose Fast Flow sendo mais útil.
[000578] Para reduzir adicionalmente os níveis de proteína A, DNA e espécies de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig não desejadas no produto após as etapas precedentes de recuperação/purificação inicial, uma etapa de troca de íons pode ser incorporada no procedimento de purificação. A presente invenção pode empregar colunas de troca de íons comercialmente disponíveis, tais como a coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, coluna Q-Sefarose XL (GE Healthcare) ou a coluna DEAE Sepharose Fast Flow, também da GE Healthcare. As resinas mais adequadas para separação de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig são aquelas tendo grupos amina funcionais imobili-zados. Outros grupos úteis são as resinas com grupo funcional amina quaternária, por exemplo, aquelas na coluna Q-Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde um ligante de amônio quaternário é ligado a uma ágarose de alta porosidade reticulada. Também úteis são as resinas com grupo funcional amina primária, secundária e terciária, por exemplo, aquelas na coluna DEAE Sepharose Fast Flow da GE Healthcare, onde uma dietilaminoetila terciária está ligada a uma ágarose de alta porosidade reticular. Em uma modalidade particular da invenção, uma coluna que utiliza um permutador de íons forte, tal como uma coluna Q-Sepharose Fast Flow, é utilizada.
[000579] Em uma modalidade da invenção, uma glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig eluída e carregada sobre uma coluna de troca de ânions, por exemplo, Q-Sepharose Fast Flow. A coluna é lavada e gli- coproteína de CTLA4A29YL104E-Ig é subsequentemente eluída da coluna de troca de ânions. Para um tampão de lavagem com pH de cerca de 5 a 9, em uma modalidade, pH de 7, concentrações de HEPES a 2555 mM e NaCl a 100-140 mM são úteis. Para um tampão de eluição com pH de cerca de 5 a 9 ou, em outra modalidade, pH de 7, concentrações de HEPES a 25-50 mM e NaCl a 200 mM são úteis.
[000580] Em outra modalidade da presente invenção, o eluato contendo glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig do meio de troca de ânions é coletado e, então, contatado com uma resina de interação hidrofóbica. HIC é útil para a separação de dímeros de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig desejados de material de espécie de elevado peso molecular e outras impurezas de proteína da cultura de células de mamífero. Por exemplo, cultura de células de CHO expressando CTLA4A29YL104E-Ig contêm agregados moleculares de espécies de elevado peso molecular de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig. Também encontradas no meio de cultura de células de mamífero são impurezas de proteína de CHO. Esses produtos indesejáveis poderiam gerar uma resposta antigênica indesejada em um paciente e contribuir para pobre qualidade de produto ou atividade.
[000581] HIC separa eficazmente variantes hidrofóbicas, dímeros de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig de complexos de HMW de glicopro- teína de CTLA4A29YL104E-Ig e impurezas de proteína de CHO via ligação dos últimos produtos à resina de HIC e passagem dos dímeros de gli- coproteína de CTLA4A29YL104E-Ig através da coluna. Assim, uma glico- proteína de CTLA4A29YL104E-Ig empoçada é obtida que é substancialmente isenta dessas espécies. Uma fonte de misturas de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig para uso com HIC é cultura de células de mamífero, por exemplo, uma cultura de células de CHO. Em particular, a cultura pode ser submetida a pelo menos uma etapa de purificação, conforme discutido previamente.
[000582] Em outra modalidade da presente invenção, o método de HIC pode ser modificado para coletar e empoçar outras glicoproteínas (por exemplo, complexos de HMW de CTLA4A29YL104E-Ig). Agregados de HMW podem se ligar à resina de HIC (por exemplo, compreendendo tetrâmero de CTLA4A29YL104E-Ig e semelhantes). Esses complexos de HMW têm uma maior avidez e se ligam mais eficazmente in vivo do que o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig apenas. Assim, versados na técnica podem obter e empoçar agregados de HMW de CTLA4A29YL104E-Ig através de eluição da CTLA4A29YL104E-Ig empoçada da HIC.
[000583] Glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig eluída do meio de HIC é recuperada, concentrada e lavada através de diafiltração ou outro método adequado conhecido por versados na técnica, para proporcionar um produto final de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig purificada. O produto de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig preparado de acordo com o processo da presente invenção é de alta pureza, por exemplo, contendo > 95% do dímero de CTLA4A29YL104E-Ig, contendo < 5% do produto de HMW de CTLA4A29YL104E-Ig e contendo < 1% de monômero de CTLA4A29YL104E-Ig.
[000584] As resinas de HIC mais úteis para separação de formas de glicoproteína de CTLA4A29YL104E-Ig são aquelas tendo grupos fenila funcionais imobilizados. Das resinas de phenyl-HIC, Phenyl Sepharose Fast Flow High Sub (alta substituição) pela GE Healthcare é mais útil. Meio Phenyl Toyopearl pela TosoHaas e TSK Phenyl 5PW são exemplos não-limitativos de outras resinas de phenyl-HIC que podem ser usadas. Outros grupos funcionais em HIC incluem, mas não estão limitados a, as porções propila, octila, alcoxila, butila e isoamila.
[000585] O método de purificação pode ainda compreender etapas adicionais que inativam e/ou removem vírus e/ou retrovírus que poderiam estar potencialmente presentes em um meio de cultura de células de linhagens de células de mamífero. Um número significativo de etapas de eliminação viral estão disponíveis incluindo, mas não limitado a, tratamento com caotropos, tais como ureia ou guanidina, detergentes, etapas adicionais de diafiltração/ultrafiltração, separação convencional, tais como cromatografia de troca de íons ou por exclusão de tamanho, extremos de pH, calor, proteases, solventes orgânicos ou qualquer combinação dos mesmos.
[000586] Em um aspecto, moléculas purificadas de CTLA4-Ig as quais foram concentradas e submetidas a uma etapa de diafiltração podem ser enchidas em garrafas Biotainer® de 2 L, saco de biopro- cesso de 50 L ou qualquer outro vaso adequado. Moléculas de CTLA4-Ig em tais vasos podem ser armazenadas durante cerca de 60 dias a 2°C a 8°C antes de congelamento. Armazenamento prolongado de CTLA4-Ig purificada a 2°C a 8°C pode levar a um aumento na proporção de CTLA4-Ig tetramérico. Portanto, para armazenamento a longo prazo, moléculas de CTLA4-Ig podem ser congeladas a cerca de -70°C antes de armazenamento e armazenadas em uma temperatura de cerca de -40°C. A temperatura de congelamento pode variar de cerca de -50°C a cerca de -90°C. O tempo de congelamento pode variar e depende grandemente do volume do vaso que contém moléculas de CTLA4-Ig e do número de vasos que são carregados no congelador. Por exemplo, em uma modalidade, moléculas de CTLA4-Ig estão em garrafas Biotainer® de 2 L. Carregamento de menos do que quatro garrafas Biotainer® de 2 L no congelador podem requerer um tempo de congelamento de cerca de 14 a pelo menos cerca de 18 horas. Vasos com moléculas de CTLA4-Ig congeladas são armazenados em uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -55°C.
[000587] O tempo de armazenamento em uma temperatura de cerca de -35°C a cerca de -55°C pode variar e pode ser tão curto quanto 18 horas. As moléculas de CTLA4-Ig congeladas podem ser descongeladas de uma maneira controlada. Descongelamento das moléculas de CTLA4-Ig congeladas é controlado e pode ser feito em uma incubadora em uma temperatura de cerca de 20°C a cerca de 24°C. A duração das etapas de descongelamento depende da carga da incubadora, em que carregamento de menos do que quatro garrafas Biotainer® de 2L pode requerer um tempo de congelamento de menos do que cerca de 24 horas. Carregamento de quatro garrafas Biotainer® de 2 L pode requerer cerca de 18 horas. Solução descongelada compreendendo moléculas de CTLA4-Ig pode ser misturada para evitar gradientes potenciais de concentração. Portanto, descongelamento pode ser feito em uma incubadora com temperatura controlada, a qual também permite a agitação dos vasos os quais contêm CTLA4-Ig. a velocidade de agitação pode ser cerca de 40 a cerca de 80 rpm. Moléculas descongeladas de CTLA4-Ig podem ser ainda misturadas durante mais 5-10 min em uma taxa rotacional de cerca de 3 rpm. Moléculas descongeladas de CTLA4-Ig podem ser armazenadas a 2°C a 8°C, transformadas em alíquotas e liofilizadas durante a produção de composições farmacêuticas compreendendo CTLA4-Ig.
[000588] A presente invenção pode ser ainda aplicada à purificação de outros Exemplos não-limitativos de glicoproteínas terapêuticas pro-duzidas em larga escala. O processo da presente invenção pode ser aplicável à produção de outras glicoproteínas tendo mais de uma variante glicosilada em cultura de células de mamífero. Versados na técnica compreenderão uma modificação que poderia se tornar necessária no curso da adaptação do método de produção exemplificado de diferentes glicoproteínas.
Formulações & Kits
[000589] A invenção também proporciona qualquer uma das moléculas de CTLA4-Ig descritas como uma mistura liofilizada. Formulações compreendendo CTLA4-Ig a ser liofilizada podem ainda compreender três componentes básicos: (1) um ingrediente ativo adicional incluindo outras proteínas recombinantes ou pequenas moléculas (tais como imunossupressores), (2) um excipiente(s) e (3) um solvente(s). Excipi- entes incluem reagentes farmaceuticamente aceitáveis que proporcionam boas propriedades de liofilização ao bolo (agentes de composição de volume), bem como proporcionam lioproteção e/ou crioproteção de proteínas ("estabilizante"), manutenção de pH (agentes de tampona- mento) e conformação apropriada da proteína durante armazenamento, de modo que retenção substancial de atividade biológica (incluindo estabilidade do ingrediente ativo, tal como estabilidade de proteína) seja mantida. Com relação a excipientes, um exemplo de formulação pode incluir um ou mais de um agente(s) de tamponamento, um agente de composição de volume, um estabilizante de proteína e um anti- microbiano. Açúcares ou polióis podem ser usados como estabilizan- tes de proteína não específicos em solução e durante liofilização e secagem-pulverização. Polímeros podem ser usados para estabilizar proteínas em solução e durante liofilização e secagem-pulverização. Um polímero popular é albumina de soro, a qual foi usada como um crioprotetor e lioprotetor. Em uma modalidade, a invenção proporciona formulações que são isentas de albumina. Vários sais podem ser usados como agentes de composição de volume. Agentes de composição de volume salinos ilustrativos incluem, por exemplo, NaCl, MgCl2 e CaCl2. Determinados aminoácidos podem ser usados como crioprote- tores e/ou lioprotetores e/ou agentes de volume. Aminoácidos que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, glicina, prolina, 4- hidroxiprolina, L-serina, glutamato de sódio, alanina, arginina e clori- drato de lisina. Muitos agentes de tamponamento que abrangem uma faixa ampla de pH estão disponíveis para seleção em formulações. Agentes de tamponamento incluem, por exemplo, acetato, citrato, gli- cina, histidina, fosfato (sódio ou potássio), dietanolamina e Tris. Agentes de tamponamento abrangem aqueles agentes os quais mantêm um pH em solução em uma faixa aceitável antes de liofilização. Formulações foram previamente descritas no Pedido de Patente U.S. No. 60/752.150, depositado em 20 de dezembro de 2005, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade.
[000590] Em uma modalidade, a invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos 90%, 95%, 99% ou 99,5% de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos 90%, 95%, 99% ou 99,5% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4- Ig compreendendo pelo menos 90%, 95%, 99% ou 99,5% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% de tetrâmero de CTLA4-Ig e não mais do que 2%, 1,5%, 1,0%, 0,8%, 0,5% ou 0,3% monômero de CTLA4-Ig. Em uma outra modalidade, a invenção pro-porciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos 8,0 mols de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo: de cerca de 15 a cerca de 35 mols de GlcNac por mol de CTLAIg moléculas ou dímero; de cerca de 1 a cerca de 5 mols de GalNac por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig; de cerca de 5 mols a cerca de 20 mols de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig; de cerca de 2 a cerca de 10 mols de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig; e/ou de cerca de 5-15 mols de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig ou para molécula de CTLA4-Ig.
[000591] A substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig está disponível como uma solução aquosa em uma concentração de aproximadamente 25 mg/mL (22,5-27,5 mg/mL) em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloreto de sódio a 10 mM em um pH de ~ 7,5. ACTLA4A29YL104E-Ig tem uma tendência a formar espécies de elevado peso molecular em solução aquosa. Portanto, um produto liofilizado foi desenvolvido de forma a minimizar os níveis de espécies de elevado peso molecular que podem se formar no produto de fármaco. Vários excipientes, tais como maltose, sacarose e aminoácidos, tal como clo- ridrato de L-arginina, foram selecionados como lioprotetores potenciais durante liofilização de CTLA4A29YL104E-Ig. Descobriu-se que sacarose é o lioprotetor mais eficaz. Foi ainda observado que aumento da proporção de sacarose para proteína melhorou a estabilidade da proteína. uma proporção de sacarose:proteína de 2:1 (peso:peso) foi escolhida para uma solução de proteína a ser liofilizada. O produto de fármaco liofilizado tem estabilidade adequada e comportamento de constituição satisfatório.
Métodos de Tratamento
[000592] De acordo com presente invenção, uma doença mediada através de interações de células T com células B7 positivas pode ser tratada recebendo uma formulação farmaceuticamente aceitável de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig. As moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig secretadas por uma linhagem de célula de mamífero manipulada (por exemplo, uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês dhfr- negativa que abriga DNA que codifica CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig) pode ser uma população de moléculas tendo um perfil de glicosilação em particular. Conforme estabelecido aqui, um perfil de glicosilação particular pode afetar a ligação de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig ao CD80 e/ou CD86, de modo que moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig podem proporcionar uma maior inibição de ativação e/ou proliferação de células T. Conforme estabelecido aqui, um perfil de glicosilação particular pode ser afetado pela linhagem de célula e o método de produção. Assim, em determinadas modalidades da invenção, a invenção proporciona moléculas de CTLA4- Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig produzidas por uma linhagem de célula nos métodos de produção descritos aqui de forma a tratar doenças ou distúrbios relacionados a células T que incluem, mas não estão limitados a, geralmente qualquer distúrbio ou doença linfoproliferativa dependente de células T e qualquer doença ou distúrbio autoimune dependente de células T e, mais especificamente: linfoma de células T, leucemia linfoblástica aguda de células T, linfoma de células T angiocên- trico testicular, angiíte linfocítica benigna, doença de enxerto versus hospedeiro (GVHD), distúrbios imunes associados à rejeição a trans-plante de enxerto, psoríase, inflamação, alergia, ooforite, doença in-flamatória do intestino, glomerulonefrite, encefalomielite, tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, doença de Crohn, síndrome de Sjogren, lúpus eritematoso, mixedema primário, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, artrite reumatoide, diabetes mellitus dependente de insulina, síndrome de Good Pasture, miastenia gravis, pênfigo, esclerose múltipla, oftalmia simpatética, uveíte autoi- mune, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite de ação crônica, colite ulcerativa, escleroderma, polimiosite e doença mista do tecido conectivo.
[000593] A invenção proporciona o uso de qualquer uma das moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig descritas em métodos para a inibição de proliferação ou ativação de células T, inibição de uma resposta imune em um indivíduo ou para o tratamento in vitro de um distúrbio imune em um indivíduo ou indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo. Tolerância imune é um tipo de resposta imunológica na qual é desenvolvida uma não-reatividade específica dos tecidos linfoides a um antígeno específico onde, na ausência de tolerância, o antígeno é capaz de induzir a uma resposta imune. Em uma modalidade, as moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig e composições da invenção podem ser usadas para tratar um indivíduo que recebeu um transplante de forma a induzir a tolerância e reduzir a possibilidade de rejeição. Em outra modalidade, o transplante é um transplante de órgão, um transplante de tecido ou um transplante de células. Em outra modalidade, o transplante de célula compreende células de medula óssea ou células de ilhota.
[000594] A invenção proporciona o uso de qualquer uma das moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig descritas na fabricação de um medicamento para tratamento de qualquer uma das doenças ou dis-túrbios acima estabelecidos. A invenção também proporciona o uso de qualquer uma das moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig descritas em uma co-administração com outro agente para o tratamento das doenças ou distúrbios acima mencionados. As moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig da invenção podem ser administradas a um indivíduo, por exemplo, intravenosamente, subcutaneamente e/ou através de inalação. Formulações de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig aplicáveis para administração intravenosa ou subcutânea são descritas no Pedido de Patente N° de Série U.S. 60/752.150, depositado em 20 de dezembro de 2005, o qual é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Formulações de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig também podem incluir formulações baseadas em lipossoma em que os lipossomas podem distribuir moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig à células ou tecidos-alvo. Moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig podem também ser distribuídas à células ou tecidos alvo através de adminis-tração de um vetor viral que compreende um cassete de expressão de gene de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig. A administração e dosagens de uma população de moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig são descritas nos pedidos de Patente U.S. publicados como US20030083246 e US20040022787, bem como no pedido de Patente U.S. número de série 60/668.774, depositado em 6 de abril de 2005, todos os quais são aqui incorporados por referência em suas totalidades.
[000595] As moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig conforme descrito aqui, podem estar em uma variedade de formas de dosagens as quais incluem, mas não estão limitadas a, soluções ou suspensões líquidas, comprimidos, pílulas, pós, supositórios, microcápsulas ou mi- crovesículas poliméricas, lipossomas e soluções injetáveis ou passíveis de infusão. A forma depende do modo de administração e da aplicação terapêutica. Um modo de administração e regime de dosagem eficazes para as moléculas da presente invenção depende da gravidade e curso da doença, a saúde do indivíduo e resposta ao tratamento e o julgamento do médico que faz o tratamento. Consequentemente, as dosagens das moléculas deverão ser tituladas aos indivíduos. A inter-relação de dosagens para animais de vários tamanhos e espécie e seres humanos baseada em mg/m2 de área de superfície é descrita por Freireich, E. J. e outros (Quantitative Comparison of Toxicity of An ticancer Agents in Mouse, Rat, Hamster, Dog, Monkey and Man. Cancer Chemother, Rep., 50, No. 4, 219-244, Maio de 1966). Ajustes no regime de dosagem podem ser feitos para otimizar a inibição da resposta de crescimento.
[000596] Doses podem ser divididas e administradas em uma base diária ou a dose pode ser reduzida proporcionalmente, dependendo da situação. Por exemplo, várias doses divididas podem ser administradas diária ou mensalmente ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida, conforme indicado pela situação terapêutica específica. Em uma modalidade, a administração é mensal, trimestral, diária, duas vezes ao dia, cerca de cada 10 horas, cerca de cada 6 horas, cerca de cada 4 horas, cerca de cada 2 horas, cerca de uma vez a uma hora. De acordo com a prática da invenção, uma quantidade eficaz para tratamento de um indivíduo pode estar entre cerca de 0,1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. também, a quantidade eficaz pode ser uma quantidade entre cerca de 1 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal do indivíduo. As moléculas de CTLA4-Ig ou CTLA4A29YL104E-Ig da invenção também têm aplicação clínica in vivo. Elas podem ser usadas para a enumeração de células B7 positivas no diagnóstico ou prognóstico de algumas condições de imunodeficiência, na fenotipifi- cação de leucemias e linfomas e no monitoramento de alteração imu- nológica após transplante de órgão.
[000597] A distribuição das composições descritas aqui pode ser obtida via injeção, distribuição oral, inalação de uma pulverização ou outra dispersão particular, injeção subcutânea, distribuição intravenosa, distribuição tópica, supositório, distribuição ocular, distribuição nasal ou oral. A composição pode ser distribuída via encapsulação em um lipossoma ou outro veículo de distribuição semelhante à membrana. A composição pode ser distribuída via o sangue ou outros fluidos que são previamente tratados com a composição e, então, subsequente- mente transfundidas em um indivíduo.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[000598] SEQ ID NO: 17 é a sequência de nucleotídeo que codifica pcSDhuCTLA4Ig: GATCTCCCGA TCCCCTATGG TCGACTCTCA GTACAATCTG CTCTGATGCC GCATAGTTAA GCCAGTATCT GCTCCCTGCT TGTGTGTTGG AGGTCGCTGA GTAGTGCGCG AGCAAAATTT AAGCTACAAC AAGGCAAGGC TTGACCGACA ATTGCATGAA GAATCTGCTT AGGGTTAGGC GTTTTGCGCT GCTTCGCGAT GTACGGGCCA GATATACGCG TTGACATTGA TTATTGACTA GTTATTAATA GTAATCAATT ACGGGGTCAT TAGTTCATAG CCCATATATG GAGTTCCGCG TTACATAACT TACGGTAAAT GGCCCGCCTG GCTGACCGCC CAACGACCCC CGCCCATTGA CGTCAATAAT GACGTATGTT CCCATAGTAA CGCCAATAGG GACTTTCCAT TGACGTCAAT GGGTGGACTA TTTACGGTAA ACTGCCCACT TGGCAGTACA TCAAGTGTAT CATATGCCAA GTACGCCCCC TATTGACGTC AATGACGGTA AATGGCCCGC CTGGCATTAT GCCCAGTACA TGACCTTATG GGACTTTCCT ACTTGGCAGT ACATCTACGT ATTAGTCATC GCTATTACCA TGGTGATGCG GTTTTGGCAG TACATCAATG GGCGTGGATA GCGGTTTGAC TCACGGGGAT TTCCAAGTCT CCACCCCATT GACGTCAATG GGAGTTTGTT TTGGCACCAA AATCAACGGG ACTTTCCAAA ATGTCGTAAC AACTCCGCCC CATTGACGCA AATGGGCGGT AGGCGTGTAC GGTGGGAGGT CTATATAAGC AGAGCTCTCT GGCTAACTAG AGAAC-CCACT GCTTACTGGC TTATCGAAAT TAATACGACT CACTATAGGG AGACCCAAGC TTGGTACCGA GCTCGGATCC ACTAGTAACG GCCGCCAGTG TGCTGGAATT CTGCAGATAG CTTCACCAAT GGGTGTACTG CTCACACAGA GGACGCTGCT CAGTCTGGTC CTTGCACTCC TGTTTCCAAG CATGGCGAGC ATGGCAATGC ACGTGGCCCA GCCTGCTGTG GTACTGGCCA GCAGCCGAGG CATCGCCAGC TTTGTGTGTG AGTATGCATC TCCAGGCAAA GCCACTGAGG TCCGGGTGAC AGTGCTTCGG CAGGCTGACA GCCAGGTGAC TGAAGTCTGT GCGGCAACCT ACATGATGGG GAATGAGTTG ACCTTCCTAG ATGATTCCAT CTGCACGGGC ACCTCCAGTG GAAATCAAGT GAACCTCACT ATCCAAGGAC TGAGGGCCAT GGACACGGGA CTCTACATCT GCAAGGTGGA GCTCATGTAC CCACCGCCAT ACTACCTGGG CATAGGCAAC GGAACCCAGA TTTATGTAAT TGATCCAGAA CCGTGCCCAG ATTCTGATCA GGAGCCCAAA TCTTCTGACA AAACTCACAC ATCCCCACCG TCCCCAGCAC CTGAACTCCT GGGGGGATCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACATGCG TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCTG AGGTCAAGTT CAACTGGTAC GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCGC GGGAGGAGCA GTACAACAGC ACGTACCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTC CTGCACCAGG ACTGGCTGAA TGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGCCCTC CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA GCCAAAGGGC AGCCCCGAGA ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGATGAGCTG ACCAAGAACC AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTATCCCAG CGACATCGCC GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACGCC TCCCGTGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC GGGTAAATGA GTGCGACGGC CGGCAAGCCC CCGCTCCCCG GGCTCTCGCG GTCGCACGAG GATGCTTCTA GAGGGCCCTA TTCTATAGTG TCACCTAAAT GCTAGAGCTC GCTGATCAGC CTCGACTGTG CCTTCTAGTT GCCAGCCATC TGTTGTTTGC CCCTCCCCCG TGCCTTCCTT GACCCTGGAA GGTGCCACTC CCACTGTCCT TTCCTAATAA AATGAGGAAA TTGCATCGCA TTGTCTGAGT AGGTGTCATT CTATTCTGGG GGGTGGGGTG GGGCAGGACA GCAAGGGGGA GGATTGGGAA GACAATAGCA GGCATGCTGG GGATGCGGTG GGCTCTATGG CTTCTGAGGC GGAAAGAACC AGCTGGGGCT CTAGGGGGTA TCCCCACGCG CCCTGTAGCG GCGCATTAAG CGCGGCGGGT GTGGTGGTTA CGCGCAGCGT GACCGCTACA CTTGCCAGCG CCCTAGCGCC CGCTCCTTTC GCTTTCTTCC CTTCCTTTCT CGCCACGTTC GCCCTGTGGA ATGTGTGTCA GTTAGGGTGT GGAAAGTCCC CAGGCTCCCC AGCAGGCAGA AGTATGCAAA GCATG-CATCT CAATTAGTCA GCAACCAGGT GTGGAAAGTC CCCAGGCTCC CCAGCAGGCA GAAGTATGCA AAGCATGCAT CTCAATTAGT CAGCAACCAT AGTCCCGCCC CTAACTCCGC CCATCCCGCC CCTAACTCCG CCCAGTTCCG CCCATTCTCC GCCCCATGGC TGACTAATTT TTTTTATTTA TGCAGAGGCC GAGGCCGCCT CGGCCTCTGA GCTATTCCAG AAGTAGTGAG GAGGCTTTTT TGGAGGCCTA GGCTTTTGCA AAAAGCTTGG ACAGCTGAGG GCTGCGATTT CGCGCCAAAC TTGACGGCAA TCCTAGCGTG AAGGCTGGTA GGATTTTATC CCCGCTGCCA TCATGGTTCG ACCATTGAAC TGCATCGTCG CCGTGTCCCA AGATATGGGG ATTGGCAAGA ACGGAGACCT ACCCTGGCCT CCGCTCAGGA ACGAGTTCAA GTACTTCCAA AGAATGACCA CAACCTCTTC AGTGGAAGGT AAACAGAATC TGGTGATTAT GGGTAGGAAA ACCTGGTTCT CCATTCCTGA GAAGAATCGA CCTTTAAAGG ACAGAATTAA TATAGTTCTC AGTAGAGAAC TCAAAGAACC ACCACGAGGA GCTCATTTTC TTGCCAAAAG TTTGGATGAT GCCTTAAGAC TTATTGAACA ACCGGAATTG GCAAGTAAAG TAGACATGGT TTGGATAGTC GGAGGCAGTT CTGTTTACCA GGAAGCCATG AATCAACCAG GCCACCTCAG ACTCTTTGTG ACAAGGATCA TGCAGGAATT TGAAAGTGAC ACGTTTTTCC CAGAAATTGA TTTGGGGAAA TATAAACTTC TCCCAGAATA CCCAGGCGTC CTCTCTGAGG TCCAGGAGGA AAAAGGCATC AAGTATAAGT TTGAAGTCTA CGAGAAGAAA GACTAACAGG AAGATGCTTT CAAGTTCTCT GCTCCCCTCC TAAAGCTATG CATTTTTATA AGACCATGGG ACTTTTGCTG GCTTTAGATC TTTGTGAAGG AACCTTACTT CTGTGGTGTG ACATAATTGG ACAAACTACC TACAGAGATT TAAAGCTCTA AGGTAAATAT AAAATTTTTA AGTGTATAAT GTGTTAAACT ACTGATTCTA ATTGTTTGTG TATTTTAGAT TCCAACCTAT GGAACTGATG AATGGGAGCA GTGGTGGAAT GCCTTTAATG AGGAAAACCT GTTTTGCTCA GAAGAAATGC CATCTAGTGA TGATGAGGCT ACTGCTGACT CTCAACATTC TACTCCTCCA AAAAAGAAGA GAAAGGTAGA AGACCCCAAG GACTTTCCTT CAGAATTGCT AAGTTTTTTG AGTCATGCTG TGTTTAGTAA TAGAACTCTT GCTTGCTTTG CTATTTACAC CACAAAGGAA AAAGCTGCAC TGCTATACAA GAAAATTATG GAAAAATATT CTGTAACCTT TATAAGTAGG CATAACAGTT ATAATCATAA CATACTGTTT TTTCTTACTC CACACAGGCA TAGAGTGTCT GCTATTAATA ACTATGCTCA AAAATTGTGT ACCTTTAGCT TTTTAATTTG TAAAGGGGTT AATAAGGAAT ATTTGATGTA TAGTGCCTTG ACTAGAGATC ATAATCAGCC ATACCACATT TGTAGAGGTT TTACTTGCTT TAAAAAACCT CCCACACCTC CCCCTGAACC TGAAACATAA AATGAATGCA ATTGTTGTTG TTAACTTGTT TATTGCAGCT TATAATGGTT ACAAATAAAG CAATAGCATC ACAAATTTCA CAAATAAAGC ATTTTTTTCA CTGCATTCTA GTTGTGGTTT GTCCAAACTC ATCAATGTAT CTTATCATGT CTGGATCGGC TGGA-TGATCC TCCAGCGCGG GGATCTCATG CTGGAGTTCT TCGCCCACCC CAACTTGTTT ATTGCAGCTT ATAATGGTTA CAAATAAAGC AATAGCATCA CAAATTTCAC AAATAAAGCA TTTTTTTCAC TGCATTCTAG TTGTGGTTTG TCCAAACTCA TCAATGTATC TTATCATGTC TGTATACCGT CGACCTCTAG CTAGAGCTTG GCGTAATCAT GGTCATAGCT GTTTCCTGTG TGAAATTGTT ATCCGCTCAC AATTCCACAC AACATACGAG CCGGAAGCAT AAAGTGTAAA GCCTGGGGTG CCTAATGAGT GAGCTAACTC ACATTAATTG CGTTGCGCTC ACTGCCCGCT TTCCAGTCGG GAAACCTGTC GTGCCAGCTG CATTAATGAA TCGGCCAACG CGCGGGGAGA GGCGGTTTGC GTATTGGGCG CTCTTCCGCT TCCTCGCTCA CTGACTCGCT GCGCTCGGTC GTTCGGCTGC GGCGAGCGGT ATCAGCTCAC TCAAAGGCGG TAATACGGTT ATCCACAGAA TCAGGGGATA ACGCAGGAAA GAACATGTGA GCAAAAGGCC AGCAAAAGGC CAGGAACCGT AAAAAGGCCG CGTTGCTGGC GTTTTTCCAT AGGCTCCGCC CCCCTGACGA GCATCACAAA AATCGACGCT CAAGTCAGAG GTGGCGAAAC CCGACAGGAC TATAAAGATA CCAGGCGTTT CCCCCTGGAA GCTCCCTCGT GCGCTCTCCT GTTCCGACCC TGCCGCTTAC CGGATACCTG TCCGCCTTTC TCCCTTCGGG AAGCGTGGCG CTTTCTCAAT GCTCACGCTG TAGGTATCTC AGTTCGGTGT AGGTCGTTCG CTCCAAGCTG GGCTGTGTGC ACGAACCCCC CGTTCAGCCC GACCGCTGCG CCTTATCCGG TAACTATCGT CTTGAGTCCA ACCCGGTAAG ACACGACTTA TCGCCACTGG CAGCAGCCAC TGGTAACAGG ATTAGCAGAG CGAGGTATGT AGGCGGTGCT ACAGAGTTCT TGAAGTGGTG GCCTAACTAC GGCTACACTA GAAGGACAGT ATTTGGTATC TGCGCTCTGC TGAAGCCAGT TACCTTCGGA AAAAGAGTTG GTAGCTCTTG ATCCGGCAAA CAAACCACCG CTGGTAGCGG TGGTTTTTTT GTTTGCAAGC AGCAGATTAC GCGCAGAAAA AAAGGATCTC AAGAAGATCC TTTGATCTTT TCTACGGGGT CTGACGCTCA GTGGAACGAA AACTCACGTT AAGGGATTTT GGTCATGAGA TTATCAAAAA GGATCTTCAC CTAGATCCTT TTAAATTAAA AATGAAGTTT TAAATCAATC TAAAGTATAT ATGAGTAAAC TTGGTCTGAC AGTTACCAAT GCTTAATCAG TGAGGCACCT ATCTCAGCGA TCTGTCTATT TCGTTCATCC ATAGTTGCCT GACTCCCCGT CGTGTAGATA ACTACGATAC GGGAGGGCTT ACCATCTGGC CCCAGTGCTG CAATGATACC GCGAGACCCA CGCTCACCGG CTCCAGATTT ATCAGCAATA AACCAGCCAG CCGGAAGGGC CGAGCGCAGA AGTGGTCCTG CAACTTTATC CGCCTCCATC CAGTCTATTA ATTGTTGCCG GGAAGCTAGA GTAAGTAGTT CGCCAGTTAA TAGTTTGCGC AACGTTGTTG CCATTGCTAC AGGCATCGTG GTGTCACGCT CGTCGTTTGG TATGGCTTCA TTCAGCTCCG GTTCCCAACG TCAAGGCGA GTTACATGAT CCCCCATGTT GTGCAAAAAA GCGGTTAGCT CCTTCGGTCC CCGATCGTT GTCAGAAGTA AGTTGGCCGC AGTGTTATCA CTCATGGTTA TGGCAGCACT CATAATTCT CTTACTGTCA TGCCATCCGT AAGATGCTTT TCTGTGACTG GTGAGTACTC AACCAAGTCA TTCTGAGAAT AGTGTATGCG GCGACCGAGT TGCTCTTGCC CGGCGTCAAT ACGGGATAAT ACCGCGCCAC ATAGCAGAAC TTTAAAAGTG CTCATCATTG GAAAACGTTC TTCGGGGCGA AAACTCTCAA GGATCTTACC GCTGTTGAGA TCCAGTTCGA TGTAACCCAC TCGTGCACCC AACTGATCTT CAGCATCTTT TACTTTCACC AGCGTTTCTG GGTGAGCAAA AACAGGAAGG CAAAATGCCG CAAAAAAGGG AATAAGGGCG ACACGGAAAT GTTGAATACT CATACTCTTC CTTTTTCAAT ATTATTGAAG CATTTATCAG GGTTATTGTC TCATGAGCGG ATACATATTT GAATGTATTT AGAAAAATAA ACAAATAGGG GTTCCGCGCA CATTTCCCCGA AAAGTGCCA CCTGACGTCG ACGGATCGGG A SEQ ID NO: 18 é a sequência de aminoácido do domínio extracelular de Humano CTLA4: MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSD
Outras modalidades não limitativas:
[000599] A invenção proporciona uma população de célula clonal de Ovário de Hamster Chinês capaz de produzir CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a população de célula é capaz de produzir mais de 0,5 ou mais gramas de proteína de CTLA4-Ig por litro de cultura líquida e em que a CTLA4-Ig exibe uma proporção molar de ácido siálico para dí- mero de CTLA4-Ig é de cerca de 6 a cerca de 14 em uma escala de cultura de 1.000 L ou mais. Em uma modalidade, a população de célula foi adaptada a um meio isento de soro quimicamente definido. Em outra modalidade, CTLA4-Ig produzida a partir de cultura da população de célula tem um coeficiente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1. Em uma outra modalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, é capaz de produzir polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a lisina no resíduo número 383; (d) cerca de 96% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25.
[000600] A invenção proporciona uma célula de prole das células descritas acima, em que a célula de prole produz CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 5 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 10 gerações. Em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 20 gerações. Em outra modali- dade,a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula duran- te pelo menos 40 gerações, em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 50 gerações, em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 75 gerações, em outra modalidade, a célula de prole é obtida a partir de cultura de uma célula durante pelo menos 100 gerações.A invenção proporciona uma linhagem de célula produzida a partir de qualquer das células descritas acima. Em uma modalidade, a linhagem de célula é clonal. Em outra modalidade, a linhagem de célula é capaz de produzir: (a) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (b) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (c) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (d) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoáci- do 383 de SEQ ID NO: 2); (e) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (metionina na posição de aminoácido 25 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); ou (f) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2).
[000601] Em outra modalidade, a linhagem de célula é capaz de produzir proteínas de fusão de CTLA4-Ig, em que: (a) cerca de 90% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem uma sequência de aminoá- cido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo 27; (b) cerca de 10% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a alanina no resíduo número 26; (c) cerca de 4% dos polipeptídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a lisina no resíduo número 383; (d) cerca de 96% dos polipep- tídeos de CTLA4-Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 terminando com a glicina no resíduo número 382; e opcionalmente, (e) cerca de menos do que 1% dos polipeptídeos de CTLA4- Ig compreendem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 2 começando com a metionina no resíduo número 25,
[000602] Em uma modalidade, as proteínas de fusão de CTLA4-Ig, as quais são produzidas a partir de cultura a linhagem de célula, têm um coeficiente de extinção de 1,00 ± 0,05 AU mL cm-1 mg-1. Em uma modalidade, a invenção proporciona uma população de célula derivada de uma célula da invenção. Em uma modalidade, a população de célula consiste em pelo menos uma alteração genética adicional quando comparado com a célula originalmente transfectada e em que a população de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-Ig. Em outras modalidades, a população de célula consiste em pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 alterações genéticas adicionais quando comparado com a célula originalmente transfectada e em que a população de célula derivada é capaz de produzir CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a alteração genética compreende pelo menos uma mutação não-conservativa no ge- noma celular ou no cassete de expressão recombinante que codifica a CTLA4-Ig.
[000603] Em uma modalidade, a alteração genética compreende pelo menos um ácido nucleico recombinante adicional dentro da célula. Em uma modalidade, a alteração compreende uma mutação do geno-ma celular. Em uma modalidade, a alteração compreende a adição de um ácido nucleico ao genoma celular ou como um ácido transnucleico, o qual codifica um polipeptídeo antiapoptótico. Em uma modalidade, o polipeptídeo antiapoptótico se refere à glicosilação.
[000604] Em uma modalidade, alteração genética compreende pelo menos uma mutação do genoma celular ou do cassete de expressão recombinante que codifica a CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a população de célula, quando desenvolvida em cultura, é capaz de produzir: (a) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 8 (metionina na posição de aminoácido 27 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2); (b) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 (metionina na posição de aminoácido 27 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (c) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 (alanina na posição de aminoácido 26 e glicina na posição de aminoá- cido 382 de SEQ ID NO: 2); (d) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (alanina na posição de aminoácido 26 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); (e) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 4 (metionina na posição de aminoá- cido 25 e lisina na posição de aminoácido 383 de SEQ ID NO: 2); ou (f) uma proteína de fusão de CTLA4-Ig tendo uma sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 6 (metionina na posição de aminoácido 25 e glicina na posição de aminoácido 382 de SEQ ID NO: 2).
[000605] A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4- Ig de cerca de 8 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 11 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 12 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4- Ig de cerca de 13 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 14 a cerca de 18. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 17. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4- Ig de cerca de 16.
[000606] A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que mais de 95% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de 98% das moléculas são dí- meros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de 99% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, mais de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, de cerca de 95% a cerca de 99,5% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig e cerca de 0,5% a cerca de 5% das moléculas são tetrâmeros de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, cerca de 98,6% das moléculas são dímeros de CTLA4-Ig e cerca de 1,2% das moléculas são tetrâmeros de CTLA4-Ig e cerca de menos do que 0,7 % das moléculas são mo- nômeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população consistindo em dímeros de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma popula- ção de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de monômero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população é substancialmente isenta de tetrâmero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona uma população de monômeros de moléculas de CTLA4-Ig substancialmente isenta de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem pelo menos 3 grupos ácido siálico.
[000607] Em uma modalidade, cada monômero de cada dímero de CTLA4-Ig tem de pelo menos 3 grupos ácido siálico a pelo menos 8 grupos ácido siálico. A invenção proporciona uma população purificada de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig, a população sendo substancialmente isenta de dímero de CTLA4-Ig e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. A invenção proporciona uma população purificada de moléculas tetraméricas de CTLA4-Ig, a população sendo substancialmente isenta de monômero de CTLA4-Ig e opcionalmente em que a população compreende uma quantidade que é mais de cerca de 100 gramas. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica compreende dois pares de polipeptídeos de CTLA4-Ig, em que cada polipeptídeo tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOS: 3-8 e em que cada membro do par de polipeptídeos é cova- lentemente ligado ao outro membro e em que os dois pares de poli- peptídeos são não-covalentemente associados um ao outro. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica é capaz de ligação a um CD80 ou CD86. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma avidez 2 vezes maior pelo CD80 ou CD86 quando comparado com um dímero de molécula de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, cada molécula tetramérica tem pelo menos uma inibição 2 vezes maior de proliferação ou ativação de células T quando comparado com um dímero de molécula de CTLA4-Ig.
[000608] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição compreende isoformas dominantes visualizáveis sobre um gel de focalização isoelétrica de CTLA4-Ig o qual tem um ponto isoelétrico, pI, menos de ou igual a 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma mo-dalidade, o pI aumenta após tratamento com neuraminidase. Em uma modalidade, pelo menos 40% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 70% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelé- trico de menos do que ou igual a cerca de 5,1 conforme determinado através de focalização isoelétrica. Em uma modalidade, pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um ponto isoelétrico de menos do que ou igual a cerca de 2,5 conforme determinado através de focalização isoelétrica. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 4,3 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 3,3 ± 0,2 a cerca de 4,7 ± 0,2. A invenção proporciona um método para preparo de uma composição, a composição compreendendo a molécula de CTLA4-Ig com um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2, o método compreendendo: (a) sujeição de uma mistura de moléculas de CTLA4-Ig à eletroforese em gel de foca- lização isoelétrica, em que uma única banda sobre o gel representa uma população de moléculas de CTLA4-Ig com um pI em particular e (b) isolamento da população de moléculas de CTLA4-Ig tendo um pI de cerca de 2,0 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2 de modo a preparar uma composição. A invenção proporciona uma composição compreenden- do moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são ca-racterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 17 a cerca de 25. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig são caracterizadas por uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; e (b) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; e (c) uma proporção molar média de ácido siáli- co por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de Glc- NAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; e (d) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; e (e) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig caracterizada por: (a) uma proporção molar média de Glc- NAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4- Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; e (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12,
[000609] A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição exibe um pico por cro- matograma de NGNA de cerca de 9,589+/-0,3 e um pico por cromato- grama de NANA de cerca de 10,543+/-0,3. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA-Ig exibem um perfil de carboidrato conforme mostrado na figura 7. A invenção proporciona uma composição compreendendo moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig exibem um perfil de carboidrato dos Domínios I - IV, em que o Domínio I compreende picos os quais representam oligossacarídeos a-sialilados, o Domínio II compreende picos os quais representam oligossacarídeos monossialilados, o Domínio III compreende picos os quais representam oligossacarídeos dissialilados e o Domínio IV compreende picos os quais representam oligossacarídeos trissialilados. Em uma modalidade, a diferença nos tempos de retenção de oligossacarídeos N- ligados entre um primeiro pico no Domínio I e um pico principal no Domínio II é de cerca de 22 a cerca de 28 minutos. A invenção proporciona uma composição compreendendo dímeros de moléculas de CTLA4-Ig, em que pelo menos 0,5 % dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados, em outra modalidade, pelo menos 1,0% dos dímeros de moléculas de CTLA4-Ig são cisteinilados. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de espectrometria de massa conforme mostrado nas figuras 8 e 10. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população exibe um perfil de eletroforese capilar conforme mostrado nas figuras 20 e 21. A invenção proporciona uma composição de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma pro- porção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18, em que o dímero de CTLA4-Ig é produzido a partir de células de uma linhagem de célula comercial. A invenção proporciona uma composição de CTLA4-Ig obtida através de qualquer método da invenção. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas são glicosiladas em um resíduo de aminoácido asparagina na posição 102 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 134 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido asparagina na posição 233 de SEQ ID NO: 2, um resíduo de aminoácido serina na posição 155 de SEQ ID NO: 2 ou um resíduo de aminoácido serina na posição 165 de SEQ ID NO: 2. A invenção proporciona uma população de moléculas de CTLA4-Ig, em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm;(i) menos de 2,5 % de tetrâmero; (j) menos de 0,5% de monôme- ro; (k) polipeptídeos de CTLA4-Ig da população tendo um aminoácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 2-8;(l) em que moléculas de CTLA4-Ig dentro da população é capaz de ligação ao CD80 e CD86. A invenção proporciona uma população de molécu- las de CTLA4-Ig, em que a população de moléculas é caracterizada por: (a) uma proporção molar média de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 15 a cerca de 35; (b) uma proporção molar média de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; (c) uma proporção molar média de galactose por mol de díme- ro de CTLA4-Ig de cerca de 8 a cerca de 17; (d) uma proporção molar média de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; (e) uma proporção molar média de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 7,2 a cerca de 22; (f) uma proporção molar média de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 12; (g) um pI, conforme determinado a partir de visualização sobre um gel de focalização isoelétrica, em uma faixa de cerca de 2,4 ± 0,2 a cerca de 5,0 ± 0,2; (h) MCP-1 de menos do que ou igual a 5 ppm; (i) menos de 2,5 % de tetrâmero; (j) menos de 0,5% de mo- nômero; (k) polipeptídeos de CTLA4-Ig da população tendo um amino- ácido pelo menos 95% idêntica a qualquer uma de SEQ ID NOS: 2-8; (l) em que moléculas de CTLA4-Ig dentro da população é capaz de ligação ao CD80 e CD86; ou equivalentes farmacêuticos dos mesmos. A invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz das moléculas de CTLA4-Ig e um veículo farmaceutica- mente aceitável. A invenção proporciona uma composição compreendendo uma quantidade eficaz das moléculas de CTLA4-Ig, em que a composição ainda compreende uma quantidade de mono-hidrato de maltose. Em uma modalidade, a composição ainda compreende um diluente, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição ainda compreende maltose, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril. Em uma modalidade, a composição ainda compreende sacarose, poloxâmero, mono-hidrato monobásico de fosfato de sódio, fosfato de sódio anídrico dibásico, cloreto de sódio, hidróxido de sódio e água estéril.
[000610] A invenção proporciona uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig compreendendo pelo menos 95% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 5% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 98% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 2% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 99% de dímero de CTLA4-Ig e não mais do que 1% de tetrâmero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende pelo menos 8,0 mols de ácido siálico por mol de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 15,7 a cerca de 31 mols de GlcNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 1,6 a cerca de 3,2 mols de GalNAc por mol de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 9,3 a cerca de 15,5 mols de galactose por mol de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 3,6 a cerca de 7,9 mols de fucose por mol de dímero de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, a mistura compreende cerca de 9,7 mols de manose por mol de dímero de CTLA4-Ig. A invenção proporciona um kit farmacêutico compreendendo: (a) um recipiente contendo uma mistura liofilizada de CTLA4-Ig da reivindicação 1; e (b) instruções para reconstituição da mistura liofilizada de CTLA4-Ig em solução para injeção.
[000611] A invenção proporciona um método para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz de a composição de CTLA4- Ig. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz da composição. A invenção proporciona métodos para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, tratamento de inflama- ção em um indivíduo, tratamento de artrite reumatoide, tratamento de psoríase em um indivíduo, tratamento de lúpus em um indivíduo, tra-tamento de ou prevenção de uma alergia em um indivíduo, tratamento de ou prevenção de doença enxerto vs hospedeiro em um indivíduo, tratamento de ou prevenção de rejeição de um órgão transplantado em um indivíduo, tratamento de esclerose múltipla em um indivíduo, tratamento de diabetes do tipo I em um indivíduo, tratamento de doença inflamatória do intestino em um indivíduo, tratamento de ooforite em um indivíduo, tratamento de glomerulonefrite em um indivíduo, tratamento de encefalomielite alérgica em um indivíduo ou tratamento de miastenia gravis em um indivíduo através de administração de uma composição da invenção em uma quantidade a um indivíduo para tratar a doença ou distúrbio. A composição pode ser combinada com um veículo farmaceuticamente aceitável. A invenção proporciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4-Ig de cerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de um distúrbio imune. A invenção proporciona o uso de uma população de moléculas de CTLA4-Ig tendo uma proporção molar média de grupos ácido siálico para dímero de CTLA4- Ig de cerca de 6 a cerca de 18 na fabricação de um agente antiartrite reumatoide em uma embalagem junto com instruções para seu uso no tratamento de artrite reumatoide. A invenção proporciona um método para inibição de proliferação de células T (ou ativação), o método compreendendo contato de uma célula T com uma quantidade eficaz da composição da invenção em combinação com metotrexato. A invenção proporciona um método para inibição de uma resposta imune em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz da composição da invenção em combinação com metotrexato. A invenção propor- ciona um método para indução de tolerância imune a um antígeno em um indivíduo, o método compreendendo administração, a um indivíduo que precisa do mesmo, de uma quantidade eficaz da composição de qualquer uma das reivindicações 1-64 em combinação com metotrexa- to. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L. Em uma modalidade, a expansão da etapa (a) compreende: (i) cultura das células em um meio isento de soro quimicamente definido com pelo menos quatro passagens, de modo a obter uma densidade celular de pelo menos cerca de 1,0 x 105 células viáveis por mL, em que cada estágio de semente começa em cerca de 2 x 105 por mL e vai até 1-2 mil células por mL; (ii) manutenção das células em cultura durante um tempo suficiente para produzir, a partir da cultura, pelo menos cerca de 0,5 g / L. Em uma modalidade, a proteína é uma glicoproteína. Em uma modalidade, a proteína é uma proteína de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, as células de mamífero são a prole células. Em uma modalidade, as células de mamífero são a prole de uma linhagem de célula clonal CHO capaz de produzir Proteínas de fusão de CTLA4-Ig, em que as células de CHO têm, estavelmente integradas em seu genoma, pelo menos 30 cópias de um cassete de expressão de CTLA4-Ig. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 30%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 40%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 50%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 60%. Em uma modalidade, o tempo suficiente é um tempo pelo qual a viabilidade das células não cai abaixo de 70% ou 80% ou 90% ou 95%. Em uma modalidade, as pelo menos quatro passagens compreendem: (i) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 50 mL até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 mil células por mL ser atingida, (ii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 10 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhões de células por mL ser atingida; (iii) crescimento das células em um volume de cultura de pelo menos 100 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida; e (iv) crescimento das células em um volume de cultura de 200 L até uma densidade celular de cerca de 1 milhão a cerca de 2,5 milhão de células por mL ser atingida. Em uma modalidade, galactose é adicionada ao meio isento de soro quimicamente definido. Em uma modalidade, a manutenção de compreende (i) diminuição da temperatura da cultura de 37±2°C a 34±2°C; e (ii) diminuição da temperatura da cultura de 34±2°C a 32±2°C. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 5 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 6 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 7 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 8 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 9 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 10 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 11 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 12 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 13 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 14 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 15 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 16 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 17 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante pelo menos 18 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C durante até 18 dias. Em uma modalidade, a temperatura é mantida dentro da faixa de 32±2°C até a densidade celular da cultura ser de cerca de 30 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL de cultura líquida. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de proteína. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL.
[000612] A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre quando a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 30% ou cerca de 38%. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombi- nante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a endotoxina é menos de ou igual a cerca de 76,8 EU por mL de cultura líquida. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombi- nante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas quando a bioburden é menos de 1 unidade formação de colônia por mL de cultura líquida. A invenção proporciona um método para produção de uma proteína recombinante, o método compreendendo: (a) expansão de células de mamífero que secretam uma proteína recombinante de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, de modo que a concentração de proteína recombinante é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento da proteína recombinante de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que o isolamento ocorre apenas se pelo menos duas das seguintes condições são reunidas: (i) a cultura líquida contém mais de ou igual a cerca de 6,0 mols de NANA por mol de proteína, (ii) a cultura líquida tem uma densidade celular de cerca de 33 x 105 a cerca de 79 x 105 células por mL, (iii) a viabilidade celular na cultura líquida não caiu para abaixo de cerca de 20% ou cerca de 38% ou (iv) a quantidade CTLA4-Ig na cultura é mais de 0,5 g / L. Em uma modalidade, o isolamento compreende: (i) obtenção de um sobrenadante de cultura de célula; (ii) sujeição do sobrenadante à cromatografia de troca de ânions para obter um produto de proteína eluído; (iii) sujeição do produto de proteína eluído da etapa (ii) à cro- matografia de interação hidrofóbica, de modo a obter um produto de proteína enriquecido; (iv) sujeição do produto de proteína enriquecido à cromatografia por afinidade para obter um produto de proteína enriquecido eluído; e (v) sujeição do produto de proteína enriquecido eluí- do de (iv) à cromatografia de troca de ânions.
[000613] Em uma modalidade, o produto de proteína enriquecido obtido na etapa (iii) é caracterizado pelo fato de que o percentual de qualquer multímero de elevado peso molecular é menos de 25% em peso. Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 75 mM e NaCl a cerca de 360 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 325 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando um único tam-pão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo Tris a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 250 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo Glicina a cerca de 100 mM e tendo um pH de cerca de 3,5. Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando um tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 120 mM a NaCl a cerca de 130 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (v) é realizada usando um tampão de eluição compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 200 mM e tendo um pH de cerca de 8,0. Em uma modalidade, a cromatografia de troca de ânions da etapa (ii) é realizada usando uma coluna tendo uma resina de troca de ânions tendo um grupo amina primária, secundária, terciária ou quaternária. Em uma modalidade, a resina tem um grupo funcional amina quaternária. Em uma modalidade, a cromatografia de interação hidrofóbica da etapa (iii) é realizada usando uma resina de interação hidrofóbica tendo um grupo funcional fenila, octila, propila, alcóxi, butila ou isoamila. Em uma modalidade, o grupo funcional é um grupo funcional fenila. Em uma modalidade, a cromatografia por afinidade da etapa (iv) é realizada usando uma coluna contendo Proteína A. Em uma modalidade, método para o preparo de CTLA4-Ig, o método compreendendo purificação de CTLA4-Ig de uma cultura de célula líquida, de modo que uma CTLA4-Ig purificada (a) tem cerca de 38 ng de MCP-1 por mg de dímero de CTLA4-Ig e (b) compreende menos do que 2,5% de tetrâ- mero de CTLA4-Ig em peso.
[000614] Em uma modalidade, a cultura líquida de células compre- ende uma célula ou uma célula de prole da invenção. A invenção pro-porciona um método para produção de CTLA4-Ig, o método compre-endendo: (a) expansão de células de prole de qualquer de linhagem de células de CHO comercial que são capazes de produzir CTLA4-Ig, em que a expansão é de uma cultura originária para uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a concentração de CTLA4-Ig é pelo menos 0,5 grama / L de cultura líquida; e (b) isolamento de CTLA4-Ig de uma cultura líquida de pelo menos 10.000 L, em que a cromatografia é sobre uma coluna com resina de interação hidrofóbica com pelo menos um grupo funcional fenila, em que o isolamento compreende uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica realizada usando um único tampão de lavagem compreendendo HEPES a cerca de 25 mM e NaCl a cerca de 850 mM e tendo um pH de cerca de 7,0.
EXEMPLOS DA INVENÇÃO
[000615] Uma série de Exemplos são proporcionados abaixo para facilitar uma compreensão mais completa da presente invenção. Os exemplos a seguir ilustram os modos exemplificativos e prática da presente invenção. Contudo, o escopo da invenção não está limitado às modalidades específicas descritas nesses Exemplos, as quais são para fins de ilustração apenas, uma vez que métodos alternativos podem ser utilizados para obter resultados similares.
[000616] Os Exemplos a seguir se referem a moléculas de CTLA4-Ig que compreendem sequências de uma ou mais de SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Esses Exemplos não se destinam a ser limitativos e versados na técnica compreenderão que os exemplos podem ser expandidos e adaptados, por exemplo, à outras moléculas de CTLA4-Ig, outras glicoproteínas e outras proteínas relacionadas a ou compreendendo porções de uma proteína da superfamí- lia Ig.
[000617] A tabela a seguir apresenta exemplos que se relacionam à CTLA4-Ig e à CTLA4A29YL104E-Ig.
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Abreviações: 15N 15 Nanômetro A280 Absorbância a 280 nm CTLA4-Ig Antígeno 4 de Linfócito T Citotóxico/Imunoglobulina; CTLA-4 Ig API Ingrediente farmacêutico ativo AU Unidades de absorbância B7 Ligante do receptor de CTLA-4 cfu Unidade de formação de colônia CHO Ovário de Hamster Chinês CHOP Proteína de Ovário de Hamster Chinês em células hospedeiras CV Volume de Coluna ELISA EU Fc GalNAc GlcNAc HEPES HIC Ensaio Imunoabsorvente enzima-ligado Unidades de endotoxina A região constante de anticorpos N-Acetil-galactosamina N-Acetil-glicosamina Ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etano-sulfônico Cromatografia de interação hidrofóbica; Phenyl Sepharose® Fast Flow HMW HPLC IgG1 IPC LAL MBR(s) MCP-1 MTX MW N/A NANA NMWC OD PAR Planova PP(s) PQ psi psid psig QFF QXL rPA SA SDS-PAGE SOP Tris Triton X-100 Espécies de elevado peso molecular Cromatografia de líquido de elevado desempenho Imunoglobulina da Classe G1 Controle em-processo Lisato de amebócito Limulus Registro(s) de lote mestre Proteína 1 quimiotática de monócito Metotrexato Peso molecular Não aplicável ácido N-acetilneuramínico; ácido siálico; SA Corte Nominal de Peso molecular Densidade óptica Faixa aceitável provada Filtros de remoção viral, tamanho de poro de 15 nm Parâmetro(s) de processo Qualificação de desempenho Libras por polegada quadrada Libras por Polegada quadrada, diferencial Libras por Polegada quadrada; Calibre Q Sepharose® Fast Flow Carga extrema de Q Sefarose Proteína recombinante A Sepharose Fast Flow Ácido siálico; ácido N-acetilneuramínico; NANA Eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil sulfato de sódio Procedimento de operação padrão Tris (Hidroximetil) Aminometano t-Octilfenoxipolietóxietanol; terc-octilfenil éter de polietileno glicol UF UV v/v VF VI Ultrafiltração Ultravioleta Volume por Volume Filtração viral; filtração em nanômetro Inativação viral Enchimento de Subs- Concentração de Substância de Fármaco/Etapa de Diafiltra- tância de Fármaco ção e Enchimento
Exemplo 1: Confirmação da sequência de codificação de CTLA4-Ig no plasmídeo pcSDhuCTLA4-Ig
[000618] A sequência de ácido nucleico anotada do gene de CTLA4-Ig presente em pcSDhuCTLA4-Ig e a sequência de aminoácido dedu-zida correspondente de CTLA4-Ig são mostradas na figura 1. O ácido nucleico de pcSDhuCTLA4-Ig foi transfectado em células de CHO de forma a gerar transfectantes estáveis que pudessem expressar moléculas de CTLA4-Ig (veja Exemplo 12). Os transfectantes foram selecionados e determinados transfectantes foram subclonados ou expandidos para gerar linhagens de células clonais.
[000619] Análise dos dados de sequência de DNA confirmaram que as junções criadas durante a construção do plasmídeo eram conforme projetado e que os iniciadores de oligonucleotídeo sintéticos usados na reação em cadeia de polimerase geraram a sequência sinalizadora de oncostatina M correta a montante da sequência de CTLA4-Ig. As alterações desejadas de cisteína para serina (nas posições 156, 162 e 165 de SEQ ID NO: 2) na região de dobradiça da proteína de fusão foram confirmadas. Esses resíduos de aminoácido são designados em negrito com um asterisco na figura 1. Uma alteração de aminoácido adicional de prolina para serina na posição 174 de SEQ ID NO: 2 foi também detectada. Essa alteração foi introduzida durante a síntese de cDNA de IgG1 através da reação em cadeia de polimerase. Esse resíduo de aminoácido é também designado em negrito com um asterisco na figura 1.
[000620] A análise dos dados de sequência de DNA identificou uma diferença adicional quando comparado com as sequências de nucleo- tídeo publicadas da região constante de IgG1 humana e Humano CTLA4. O códon no aminoácido 110 da região de codificação de CTLA4 foi identificado como ACC (treonina) ao invés de GCC (alani- na).
Exemplo 2: Formulação de CTLA4-Ig
[000621] A composição de CTLA4-Ig para injeção, 250 mg/frasco, é um liofilizado estéril, não-pirogênico para administração intravenosa (IV). Uma população de moléculas de CTLA4-Ig é embalada em fras- cos de vidro com tubulação de sílex do Tipo I de 15 cc. Cada frasco é tampado com uma rolha revestida com fluoro-resina de butila cinza Daikyo D-21-7-S/B2-TR de 20 mm e vedado com uma vedação flip-off branca de alumínio de 20 mm.
[000622] Cada frasco de uso único contém 250 mg de composição de CTLA4-Ig a qual é constituída com Água estéril para injeção, USP e ainda diluída com Cloreto de sódio para Injeção a 0,9%, USP, no momento de uso. A composição de CTLA4-Ig para injeção, 250 mg/frasco e a função de cada componente é listada na tabela abaixo.Tabela 8: Composição de CTLA4-Ig
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[000623] A composição de CTLA4-Ig contém aproximadamente 50 mg/mL de CTLA4-Ig em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloreto de sódio a 50 mM em um pH de 7,5. Durante desenvolvimento anterior, esse sistema tampão foi selecionado baseado na avaliação da estabilidade física e química de CTLA4-Ig como uma função do pH, tipo de tampão, concentração de tampão e concentração de cloreto de sódio. A estabilidade de soluções de CTLA4-Ig foi investigada na faixa de pH de 5 a 9. Os resultados indicaram que a formação de espécies de elevado peso molecular era pH-dependente e a faixa de pH de estabilidade máxima estava entre 7 e 8. Em uma determinação distinta, o efeito do tipo e concentração de tampão foi avaliado, onde descobriu- se que a composição de CTLA4-Ig era igualmente estável no tampão de fosfato de sódio ou tampão de tris em um pH de 8. Adicionalmente, as concentrações de tampão entre 10 a 100 mM não têm qualquer im- pacto sobre a estabilidade da composição de CTLA4-Ig a 2°-8°C. Simi-larmente, a presença de cloreto de sódio em uma concentração entre 30 a 500 mM não teve efeito sobre a estabilidade do estado em solução da composição de CTLA4-Ig armazenada a 2°-8°C.
[000624] Baseado nesses resultados, a composição de CTLA4-Ig a 10 mg/mL em tampão de fosfato de sódio a 25 mM e cloreto de sódio a 50 mM em um pH de 7,5 foi selecionada para formulação com uma resistência de 50 mg/frasco. A concentração de CTLA4-Ig foi depois alterada para 50 mg/mL na mesma composição de tampão para permitir o desenvolvimento das composições de CTLA4-Ig com resistências de 200 e 250 mg/frasco.
[000625] CTLA4-Ig para injeção é formulada com maltose além de tampão de fosfato de sódio e cloreto de sódio. A função dos excipien- tes usados nesse produto é listada na tabela acima.
[000626] A presença de sais inorgânicos, tais como os componentes de tampão cloreto de sódio e fosfato de sódio, reduz a temperatura de transição do vidro (Tg’) do sistema congelado. Além disso, fosfato de sódio dibásico, o qual é formado in situ em um pH de 7,5, sofre crista-lização preferencial durante congelamento, o que reduz o pH do micro- ambiente da solução congelada. Baseado nessas razões, as quantidades mínimas de tampão de cloreto de sódio e fosfato de sódio foram selecionadas para minimizar seu impacto sobre o processo de liofiliza- ção. Maltose é adicionada como um estabilizante o qual atua como um crio- e lio-protetor durante liofilização e quando de subsequente arma-zenamento do produto de fármaco, respectivamente. A composição de CTLA4-Ig para injeção, 250 mg/frasco, é um frasco estéril para único uso sem conservantes antimicrobianos.
Exemplo 3: Análise do teor de carboidrato de uma composição de CTLA4-Ig
[000627] A finalidade do método é proporcionar perfis cromatográfi- cos de oligossacarídeos de CTLA4-Ig N-ligados. Esse procedimento pode ser usado para obter a proporção molar de ácido N-acetil neura- mínico (NANA) e ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para proteína em amostras de CTLA4-Ig (ligação total mais livre). NANA e NGNA são duas formas de ácido siálico. A glicosilação sobre a proteína de CTLA4-Ig contém oligossacarídeos N-ligados. Por exemplo, esses oli- gossacarídeos podem ser liberados através de hidrólise enzimática com PNGase F durante o curso de 22 horas. O perfil de oligossacarí- deos livres é obtido usando cromatografia de troca de ânions em pH elevado empregando detecção eletroquímica. Perfis de carboidrato para os oligossacarídeos N-ligados foram avaliados usando Cromato- grafia de troca de ânions em pH elevado com Detecção amperométri- ca pulsada (HPAEC-PAD). Esses perfis foram confirmados e informação estrutural foi obtida usando cromatografia em carbono grafitado poroso (PGC) acoplada com MS. Ambas as técnicas e os resultados são descritos nessa seção. Esse procedimento é exemplificativo para CTLA4-Ig de SEQ ID NO:
[000628] Isolamento de oligossacarídeo N-ligado: Clivagem de oligossacarídeos asparagina-ligados (N-ligados) de CTLA4-Ig foi realizado através de hidrólise enzimática usando PNGase F. Para realizar a desglicosilação, CTLA4-Ig foi primeiro reduzida e desnaturada: 1-2 mg de CTLA4-Ig em 176 μL de tampão de fosfato de sódio a 5 mM contendo SDS a 0,5% e 1% de beta-mercaptoetanol foram aquecidos a 100°C durante 2 minutos, então, deixados resfriar para a temperatura ambiente. À mistura esfriada, 16 μL de NP-40 a 10% foram adicionados. A amostra foi bem misturada e 40 μL de PNGase F (50.000 U/mL, em tampão de fosfato de sódio a 50 mM) foram adicionados. A amostra foi bem misturada e incubada a 38° C durante 24 horas. Os oligossacarídeos enzimaticamente liberados (glicanas) foram purificados através de cromatografia de líquido de alto desempenho em fase reversa (HPLC) usando uma coluna Phenomenex Luna C18 (4,6 x 150 mm; 5 μL) acoplada a uma coluna Thermo HyperCarb (4,6 x 100 mm; 5 μL,) em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/minuto; o cromatágrafo usado para o isolamento foi um Waters Alliance 2695 equipado com um detector Waters 2996. As colunas foram primeiro equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA). Após injeção da amostra, um gradiente de acetonitrila foi iniciado, terminando a 15 minutos com uma composição de solvente de TFA a 0,05% em acetonitrila a 12%. As glicanas foram, então, eluídas da coluna HyperCarb com um gradiente de etapa para TFA a 0,05% em acetonitrila a 60%. As glicanas foram coletadas enquanto se monitorava através de absorbância de UV a 206 nm e foram concentradas até secagem sob vácuo. Antes de subsequentes injeções, a coluna Luna C18 foi limpa com TFA a 0,05% em acetonitri- la a 40%, isopropanol a 40%, 20% de água.
[000629] Preparo de Solução de estoque de NANA (ácido N-acetil neuramínico) (1 mg/mL). Importante: Antes de pesagem, deixar que o padrão de NANA aqueça para a temperatura ambiente. Falha em assim fazer resultará em condensação de água no padrão. Abrir apenas o suficiente para obter a quantidade desejada, então, revedar a garrafa hermeticamente e retornar para o congelador, armazenando com dessecante. Pesar precisamente entre 3 e 10 mg do ácido N- acetil neuramínico. Registrar para aproximadamente 0,1 mg. Transferir para um recipiente de tamanho apropriado se pesagem é feita usando papel/bote de pesagem. Adicionar uma quantidade suficiente de água com grau para HPLC para proporcionar uma concentração de 1 mg/mL de solução. Misturar com uma barra de agitação ou através de turbilhonamento até dissolvida. Armazenar entre 2 e 8°C durante até 3 meses em um tubo de polipropileno.
[000630] Preparo de Solução de estoque de NGNA (ácido N- glicolil neuramínico) (1 mg/mL) Importante: Antes de pesagem, dei- xar o padrão de NGNA aquecer para a temperatura ambiente. Falha em assim fazer resultará em condensação de água no estoque. Abrir apenas o suficiente para obter a quantidade desejada, então, revedar a garrafa hermeticamente e retornar para o congelador, armazenando com dessecante. Pesar precisamente entre 3 e 10 mg (registrar para aproximadamente 0,1 mg de ácido N-glicolil neuramínico. Registrar para aproximadamente 0,1 mg. Transferir para um recipiente de tamanho apropriado se pesagem é feita usando papel/bote de pesagem. Adicionar um volume apropriado de água com grau para HPLC para proporcionar uma concentração-alvo de 1 mg/mL de solução. Misturar com uma barra de agitação ou através de turbilhonamento até dissolvida. Armazenar entre 2 e 8°C durante até 3 meses em um tubo de polipropileno.
[000631] Solução de adequabilidade de sistema. Adicionar 0,050 mL de cada de soluções de estoque de NANA e NGNA a 1 mg/mL a 0,900 mL de água com grau para HPLC em um recipiente apropriado. Misturar através de turbilhonamento. Armazenar entre 2 e 8°C durante até 3 meses.
[000632] Solução de trabalho de ácido N-acetil neuramínico (0,050 mg/mL). Medir precisamente 0,050 mL de solução de estoque de NANA a 1 mg/mL e adicionar a 0,950 mL de água com grau para HPLC. Misturar através de turbilhonamento. Preparar em duplicata no momento de uso.
[000633] Solução de trabalho de ácido N-glicolil neuramínico (0,050 mg/mL). Medir precisamente 0,050 mL de solução de estoque de NGNA a 1 mg/mL e adicionar a 0,950 mL de água com grau para HPLC. Misturar através de turbilhonamento. Preparar em duplicata no momento de uso.
[000634] Preparo de Amostras e branco de hidrólise. Obter a concentração de proteína para material de CTLA4-Ig do Certificado de Análise (COA). Preparar uma única amostra de branco de hidrólise através da adição de 0,190 mL de água com grau para HPLC a um tubo para microcentrífuga de 1,5 mL. Preparar duas soluções de amostra a 1 mg/mL e material de referência de CTLA4-Ig usando água com grau para HPLC. Misturar através de turbilhonamento.
[000635] Hidrólise de Amostras, material de referência de CTLA4- Ig e branco de hidrólise. Realizar a hidrólise sobre preparados em duplicada de material de referência e amostras em tubos para microcentrí- fuga de 1,5 mL. Nota: É importante usar tubos para microcentrífuga os quais se encaixarão completamente no bloco de aquecimento. Adicionar 0,010 mL de H2SO4 a 1 M a 0,190 mL de diluições de amostra a 1 mg/mL e material de referência de CTLA4-Ig e branco de hidrólise. Misturar através de turbilhonamento e prender a tampa com uma trava para tampa ou fita. Colocar os tubos para microcentrífuga em um bloco de aquecimento a 80°C ± 2°C durante 1 hora ± 2 min. Após incubação, remover os tubos do bloco de aquecimento, colocar os tubos na micro- centrífuga e centrifugar para forçar a amostra para o fundo do tubo. Transformar em alíquotas soluções hidrolisadas em frascos para amos- trador automático e colocar em um amostrador automático para injeção.
[000636] Condições do instrumento. Preparar o sistema de croma- tografia de líquido de elevado desempenho (HPLC). Ajustar as condições a seguir. Equilibrar a coluna durante pelo menos uma hora em uma taxa de fluxo de 0,6 mL/min e uma temperatura de 40°C.
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[000637] Adequabilidade de sistema. Começar análise com uma injeção de fase móvel como o Placebo do Instrumento para avaliar a linha de base do sistema, a qual deverá ser uniforme e estável. Se a linha de base não é uniforme e estável, injeções de placebo adicionais deverão ser feitas. Nota: Um desvio da linha de base não deverá exceder a 0,25 AU. Realizar seis injeções repetidas de Solução de ade- quabilidade de sistema. Calcular a Resolução (R) e placas teóricas (N).
[000638] Usando a primeira injeção de adequabilidade de sistema, calcular o número de placas teóricas (N) usando a seguinte equação:
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onde: N = contagem de placa teórica T = tempo de retenção de pico de NANA, em minutos W = largura de pico de NANA na linha de base, em minutos Calcular os mols de NANA e NGNA no material de referência de CTLA4-Ig e amostras. Padrões de NANA e NGNA são injetados no início e no final de cada operação. Calcular a média das contagens de área para as injeções repetidas de NANA e NGNA. Usar essa área na seguinte equação: mols de NANA ou NGNA no material de referência Abatacept ou amostra = (X) (Y) (Z) X = mols de NANA ou NGNA em soluções de trabalho calculados na Seção 7.3.1 Y = contagens de área de NANA ou NGNA no material de referência abatacept para amostra para cada preparado (Nota: veja Seção 7.2 e figura 3 para picos para integrar NANA) Z = área média de NANA ou NGNA repetidos em soluções de trabalho
[000639] Em uma modalidade, a resolução entre os picos de NGNA e NANA deve ser >1,3. A contagem de placa teórica deve ser > ou = a 4000. A reprodutibilidade de injeção de adequabilidade de sistema avaliada como % de RSD das contagens de área de pico de NANA deve ser <3%. A contagem de placa teórica deve ser >4000. A repro- dutibilidade de injeção de adequabilidade de sistema avaliada como % de RSD das contagens de área de pico de NANA deve ser <3%.
[000640] Definição de perfil de oligossacarídeo N-ligado através de Cromatografia de troca de ânions em pH elevado com Detecção amperométrica pulsada (HPAEC-PAD): HPAEC de oligossaca- rídeos isolados foi realizada sobre um sistema de cromatografia consistindo em um Waters Alliance equipado com um Detector eletroquí- mico Waters 464 utilizando uma coluna de troca de ânions Dionex CarboPack PA1 (4 x 250 mm) e uma coluna de proteção Dionex CarboPack. As amostras de oligossacarídeo foram eluídas usando um gradiente de acetato de sódio em hidróxido de sódio a 200 mM (aumentando a concentração de acetato de sódio de 0 mM no momento de injeção para 225 mM a 60 minutos). O detector eletroquímico foi operado sob o modo de pulso com potenciais de pulso E1 = 0,05V (t1 = 0,4 s), S = 0,75V (t2 = 0,2 s), E3 = -0,15V (t3 = 0,4 s). A célula de detecção era composta de um eletrodo de trabalho de ouro, um contra eletrodo de aço inoxidável e um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata.
[000641] Esse método descreve o procedimento para determinar o perfil por HPAEC (Cromatografia de troca de ânions em pH elevado) de oligossacarídeos N-ligados liberados de proteína em amostras de CTLA4-Ig. A finalidade do método é proporcionar perfis cromatográfi- cos de CTLA4-Ig, tais como oligossacarídeos N-ligados em Substância de Fármaco de CTLA4-Ig a qual pode ser usada para análise comparativa entre diferentes composições de moléculas de CTLA4-Ig. A gli- cosilação sobre a proteína de CTLA4-Ig contém oligossacarídeos N- ligados. Esses oligossacarídeos são liberados através de hidrólise en- zimática com PNGase F (Peptídeo: N-Glicosidase F) durante o curso de 22 horas. O perfil de oligossacarídeos livres é obtido usando cro- matografia de troca de ânions em pH elevado empregando detecção eletroquímica.
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[000642] Perfis de oligossacarídeo de Substância de Fármaco são avaliados contra amostras de material de referência concorrentemente operadas. Os resultados são reportados como desvio percentual de domínios e picos selecionados dos mesmos picos nos padrões de re-ferência.
[000643] Condições de cromatografia para perfil de oligossacarídeo através de Uma cromatografia de troca de íons
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NOTA: Equilibrar a coluna e detector com a fase móvel inicial na taxa de fluxo de análise durante aproximadamente 2 horas ou até a linha de base estar estável antes de fazer as injeções.
Figure img0028
Preparo de Fases móveis para definição de perfil de carboidrato de oligossacarídeo por HPAEC
[000644] Eluente 1 de HPAEC: acetato de sódio a 500 mM (NaO- Ac). Pesar 20,51 ± 0,05 g de Acetato de sódio (anídrico) em um cilindro graduado de 500 mL contendo 400 mL de água com grau para HPLC. Levar o volume para 500 mL com água com grau para HPLC e agitar durante 5 minutos usando uma pipeta sorológica de plástico até completamente misturado. Filtrar a solução através de um filtro de náilon de 0,2 μm. Transferir para uma garrafa de eluente de 1 L. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[000645] Eluente 2 de HPAEC: hidróxido de sódio a 400 mM (Na- OH). Usando um cilindro graduado de 1 L, medir 960 mL de água com grau para HPLC e transferir para uma garrafa de eluente de 1 L limpa. Usando uma pipeta sorológica de plástico, adicionar 40,0 mL de NaOH a 10 N diretamente na garrafa de eluente e misturar o eluente através de turbilhonamento. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[000646] Eluente 3 de HPAEC: água com grau para HPLC. Encher uma garrafa de eluente de 1 L com aproximadamente 1 L de água com grau para HPLC. Colocar a garrafa de eluente sobre o sistema, tampar frouxamente e purgar durante aproximadamente 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[000647] Tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5, NaH2PO4 • H2O6,9 g Na N30,2 g H2Ovolume final de 1,0 litro
[000648] Pesar 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 • H2O e 0,2 g NaN3 e dissolver em 800 mL de H2O com grau para HPLC em uma garrafa de reagente usando mistura contínua com uma barra de agitação. Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para 7,5 usando NaOH a 10 M. Levar o volume final para 1,0 litro usando um cilindro graduado de 1 L. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até seis meses.
[000649] Solução de trabalho de enzima PNGase F em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5.
[000650] Tampão de fosfato de sódio a 50 mM
[000651] azida de sódio a 0,02%, pH = 7,51,8 mL
[000652] PNGase F do Kit, Catálogo No. P0704L0,2 mL
[000653] Pipetear 1,8 mL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH de 7,5 em um frasco criogênico de 1,8 mL. Adicionar 0,2 mL de PNGase F do kit e misturar totalmente. Armazenar a solução a -20°C ou pelo menos durante até seis meses. A solução pode ser transformada em alíquotas antes de congelamento.
[000654] Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo. Solução de estoque de estaquiose (1,25 mg/mL). Pesar 0,125 g de Estaquiose sobre um papel de pesagem. Usar uma balança analítica e transferir para um frasco volumétrico de 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturar totalmente. Transformar em alíquotas em porções de 2 mL em criofrascos Nalgene. Armazenar a solução a - 20°C ou pelo menos durante até seis meses.
[000655] Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose (12,5 μg/mL). Pipetear 1 mL do estoque a 1,25 mg/mL em um frasco volumétrico de 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturar totalmente. Transformar em alíquotas em porções de 200 μL em tubos para microcentrífuga de 0,65 mL. Colocar os tubos em uma caixa de armazenamento apropriadamente rotulada. Armaze- nar a Solução de Adequabilidade de Sistema a -20°C ou pelo menos durante até seis meses.
PREPARO DE PADRÃO E AMOSTRA
[000656] Preparo de Material de Referência. A um frasco contendo 1 mg de RapiGest SF liofilizado, adicionar 625 μL de tampão de fosfato de Na a 50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pH de 7,5. A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adicionar 120 μL do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 μL de Material de Referência (~ 50 mg/mL). A concentração final de RapiGest SF deverá ser 0,12% em peso/v. Adicionar 40 μL da solução de trabalho de PNGase F, misturar totalmente, centrifugar a amostra e colocar a 38 ± 2°C durante 22 ± 2 horas (banho de água ou o compartimento do amostrador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífuga Microcon YM- 100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200 μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado a turbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10 segundos. Usando a pipetear transferir a solução resultante (~ 380 μL) para um frasco para amostrador automático de HPLC de recuperação total (item 1.15).
[000657] Preparo de amostra. A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adicionar 120 μL do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 μL de amostra de proteína ( esse volume deverá ser igual a entre 1 e 2 mg de CTLA4-Ig). A concentração final de RapiGest SF deverá ser 0,12% em peso/v. Adicionar 40 μL da solução de trabalho de PNGase F e misturar totalmente através de turbilhonamento durante 10 segundos. Centrifugar a amostra e colocar a 38 ± 2°C durante 22 ± 2 horas (banho de água ou o compartimento do amostrador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífuga Microcon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200 μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado a turbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10 segundos. Transferir a solução resultante (~ 380 uL) para um frasco para amostrador automático de HPLC de recuperação total (item 1.15).
ADEQUABILIDADE DE SISTEMA
[000658] Estabilização da célula do detector eletroquímico. Injetar 30 μL do Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo de Esta- quiose (12,5 μg/mL). Assegurar que a altura de pico para estaquiose é > 800 nA. Assegurar que não há interferência elétrica excessiva da célula e que a linha de base é uniforme. Um cromatograma de ade- quabilidade de sistema representativo é mostrado na figura 2. Se a sensibilidade à estaquiose ou a linha de base é inaceitável, verificar a composição de tampão, limpar o eletrodo ou substituir o eletrodo. Se interferência excessiva está presente, verificar a célula para assegurar remoção de todas as bolhas de ar. Re-estabilizar a célula e reinjetar padrão de estaquiose.
[000659] Placas teóricas (N). Determinar o número de placas teóricas (N) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feito manualmente.N = 16 (t / W)2
[000660] onde:
[000661] t:tempo de retenção medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição de pico na altura máxima
[000662] W:largura de pico aravés de extrapolação dos lados para a linha de base.
[000663] N deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menos de 6000, ajustar o gradiente de operação ou substituir a coluna.
[000664] Fator de configuração (T). Determinar o fator de configu ração de coluna (T) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feito manualmente.T = (W0,05/ 2f)
[000665] onde:
[000666] W0,05:largura de pico a 5% de altura (0,05h).
[000667] f:a medida (largura) a borda frontal de pico a W0,05 para o ápice do pico.
[000668] T deve ser < 1,2. Se o fator de configuração é mais de 1,2, verificar a composição de tampão, substituir a coluna ou limpar a coluna conforme indicado e reinjetar Padrão de Adequabilidade de Sistema.
[000669] Verificação do Tempo de Retenção do Padrão de Ade- quabilidade de Sistema de Estaquiose. O tempo de retenção é de-pendente do sistema. O Padrão de Adequabilidade de Sistema de Es- taquiose deverá exibir um tempo de retenção de 18,5 ± 2,0 minutos. Material Padrão de CTLA4-Ig. Observar o perfil de carboidrato do Material de Referência entre as primeiras faixas injetado antes de injeção de amostras. O perfil de carboidrato deverá ser similar àquele mostrado na figura 1. Os tempos de retenção absolutos são dependentes do sistema. Assegurar que a diferença nos tempos de retenção entre os primeiros picos no Domínio I (Pico 1A) e o principal pico no Domínio III (Pico 3) está entre 22 minutos e 28 minutos. Se delineamento dos picos não se assemelha àquele obtido na figura 1, tomar as ações apropriadas (por exemplo, verificar a função do instrumento, limpar a coluna, verificar/substituir tampões, substituir a coluna) e reavaliar. O pro-cedimento a seguir pode ser usado para limpar a coluna: desligar a célula célula e limpar a coluna com Eluente 1 a 80%, Eluente 2 a 20% durante 5 minutos, seguido por Eluente 1 a 50%, Eluente 2 a 50% durante 10 minutos. Re-equilibrar a coluna e célula (com a célula ligada) em condições iniciais e re-avaliar.
SEQUÊNCIA DE INJEÇÃO
[000670] Ajustar a sequência de injeção de oligossacarídeos isolados como segue :
[000671] Padrão de estaquiose (30 μL)
[000672] Material de Referência (60 μL)
[000673] Amostra(s) (60 μL)
[000674] Material de Referência (60 μL)
[000675] É recomendado que < cinco amostras sejam operadas entre injeções de Material de Referência entre as faixas.
ANÁLISE DE DADOS
[000676] Processamento de cromatogramas. Processar os croma- togramas para o Material de Referência e amostras no Empower. Ajustar parâmetros de integração de modo que o delineamento de pico e a linha de base sejam similares àqueles mostrados na figura 76. Pode ser preciso colocar as linhas de integração manualmente. Realizar cálculos para áreas de Domínio relativas e áreas de pico relativas, conforme mostrado. Determinar os valores médios para esses parâmetros para o material de CTLA4-Ig e para cada amostra se injeções repetidas foram feitas. Para o Material de Referência, determinar o desvio relativo para os Domínios I, II, III, Picos 1A e 1B para cada réplica com relação à média de todas as réplicas.
Comparação de Perfis de Amostra com perfis de Material de Refe-rência
[000677] Comparação Visual. Determinar se as amostras e Material de Referência têm o mesmo número de Domínios e picos primários. Picos primários são aqueles picos rotulados na figura 76 (Picos 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 e 4).
[000678] Comparação de Quantificação Relativa. Comparar as áreas relativas de amostras (Domínios I, II e III e Picos 1A e 1B; se injeções repetidas de amostras foram feitas, usar seus valores médios) com as áreas relativas médias das injeções de CTLA4-Ig entre as faixas. Determinar a diferença relativa dessas áreas a partir dos valores médios de Material de CTLA4-Ig.
Cálculos:
[000679] Área de Domínio % (Área de Domínio relativa). Calcular a área de Domínio % para os Domínios dos perfis para o Material de Referência e amostras. Refira-se à figura 76 para padrão de áreas de Domínio. Seguindo o exemplo na figura 76, calcular as proporções percentuais de domínio usando a informação e fórmula a seguir (tempos de retenção são dependentes do sistema e refletem os resultados na figura 76): Domínio I: Soma das áreas de pico em tempos de retenção aproximados de 18-24 minutos (Picos 1A-1E) Domínio II: Soma dos picos de 26-38 minutos Domínio III: Soma dos picos de 39-50 minutos Domínio IV: Soma dos picos de 51-64 minutos Domínio V: Soma dos picos de 65-75 minutos NOTA: Janelas de tempo de retenção para os domínios desviar-se-ão de acordo com variações no desempenho cromatográfico diário. Ajustar os tempos consequentemente.
Figure img0029
[000680] Para os Domínios I-III, calcular também os valores médios nas injeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras, se injeções repetidas foram feitas.
[000681] Área de pico % (Área de pico relativa). Calcular a Área de pico % para os Picos 1A, 1B, 1C e 3 dos perfis para o Material de Referência e amostras. Refira-se à figura 1 para padrão de áreas de pico; tempos de retenção são dependentes do sistema. Calcular as proporções percentuais de pico usando a informação e fórmula a seguir:
Figure img0030
[000682] Para cada um dos Picos 1A e 1B, calcular também os valores médios nas injeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras, se injeções repetidas foram feitas.
[000683] Cálculo da diferença percentual dos valores médios de Material de Referência. Usar a seguinte fórmula para calcular diferenças percentuais nas áreas relativas médias dos Domínios I-III, Picos 1A e 1B de amostras comparado com Material de Referência:Dif % = |RM - S| / RM x 100
[000684] onde:
[000685] RM = valor de área relativa média de interesse para Material de Referência
[000686] S = valor de área relativa média de interesse para a amostra
[000687] | | = valor absoluto
[000688] Valores exemplificativos. Para que uma operação seja aceitável, os valores exemplificativos devem ser reunidos e todas as injeções relevantes para a amostra devem ter ocorrido com sucesso. Adicionalmente, para cada uma das injeções de Material de Referência entre as faixas, as áreas de Domínio % para os Domínios I, II e III e áreas de pico % para os Picos 1A e 1B devem estar dentro de 15% de seus valores médios.
[000689] Análise através de HPAEC-PAD: Oligossacarídeos N- ligados foram clivados de moléculas de CTLA4-Ig e analisados através de HPAEC-PAD. Oligossacarídeos eluem em quatro domínios basea- do na quantidade de ácido siálico presente. Domínios foram estabelecidos baseado na migração de padrões de oligossacarídeo e foram confirmados através de MS. O Domínio I representa espécies asialila- das. Os Domínios II, III e IV representam espécies mono-, di- e trissia- liladas, respectivamente. De forma a caracterizar a estrutura dos oli- gossacarídeos nos três sítios N-ligados, peptídeos T5, T7 e T14 foram individualmente isolados (refira-se à Tabela 59 para identidade desses peptídeos). Isso foi realizado usando digestão tríptica de CTLA4-Ig e coleta manual de picos correspondendo a esses três peptídeos.
[000690] Os peptídeos isolados foram tratados com PNGase F para liberar os oligossacarídeos, os quais foram subsequentemente purificados e analisados através de HPAEC-PAD. Peptídeo T5 não produz um bom perfil, uma vez que ele é difícil de purificar em virtude sua extrema hidrofobicidade. As quantidades de oligossacarídeos clivados são baixas em virtude da baixa recuperação desse peptídeo por meio de uma etapa de cromatografia de fase reversa após digestão tríptica.
Figure img0031
Figure img0032
ND, Não detectado NE, não esperado a partir de digestão tríptica (essas massas não foram esperadas a partir da digestão, clivagem não- específica) aPeptídeos trípticos T5, T7 e T14 têm glicosilação N-ligada. A massa listada é aquela do peptídeo sem glicosilação. bPeptídeos trípticos T8 e T9 têm glicosilação O-ligada. A massa listada é aquela do peptídeo sem glicosilação. cVárias massas diferentes correspondendo à diferentes gli- coformas de peptídeos glicosilados foram observadas.
[000691] Os perfis por HPAEC-PAD para todos os carboidratos N- ligados de CTLA4-Ig e os três peptídeos são mostrados na figuras 55A-D. O painel A mostra o perfil de oligossacarídeo N-ligado da molécula de CTLA4-Ig, enquanto que os painéis B, C e D mostram os perfis para T5, T7 e T14, respectivamente. A quantidados oligossaca- rídeos injetados para cada um dos peptídeos é diferente em virtude dos processos de preparo. A maioria dos oligossacarídeos detectados sobre o peptídeo T5 consistem dos oligossacarídeos mono- e dissiali- lados. O perfil de T7 contém primariamente espécies de glicanas mono-, di- e algumas trissialiladas. Apenas uma pequena quantidade das estruturas trissialiladas pode ser detectada sobre T5. O Peptídeo T14 consiste predominantemente de oligossacarídeos asialilados e uma pequena quantidade de oligossacarídeos mono- e dissialilados.
[000692] Os resultados obtidos através de HPAEC-PAD proporcionam informação sobre glicosilação N-ligada sítio-específica. Oligossa- carídeos N-ligados da região de CTLA4 de CTLA4-Ig contêm uma maior proporção de espécies sialiladas do que aqueles da região Fc de CTLA4-Ig.
[000693] Mapeamento peptídico com tripsina, Asp-N e tripsi- na/quimiotripsina de CTLA4-Ig: CTLA4-Ig foi desnaturada e reduzida em tampão de Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo guanidina a 6 M e ditiotreitol a 5 mM (DTT). Após uma incubação de 20 minutos a 50°C, iodoacetamida (IAA) foi adicionada para uma concentração final de 10 mM para alquilar tióis livres e a incubação foi continuada durante mais 20 minutos a 50°C no escuro. A mistura alquilada e reduzida foi carregada sobre uma coluna de dessalinização (Amersham NAP-5), então, eluída no volume de vazio com Tris a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 8,0 ou tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5. Após dessali- nização, CTLA4-Ig reduzida/alquilada foi digerida usando duas diferentes proteases: tripsina ou Asp-N. Para digestão com tripsina mais cquimiotripsina, CTLA4-Ig é não é reduzida nem alquilada.
[000694] Para digestão com tripsina, tripsina com grau para sequen- ciamento (Roche, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37°C. Para digestão com Asp-N, Asp-N com grau para sequenciamento (Roche, 4%, peso/peso, enzima/ proteína) foi adicionada e incubada durante 16 horas a 37°C. Para a digestão com tripsina/quimiotripsina, tripsina com grau para sequencia- mento (Promega, 4%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37°C, então, a-quimiotripsina foi adicionada (Sigma, 4%, peso/peso, enzima/proteína) e incubada durante 16 horas a 37° C. Todas as amostras foram colocadas em um congelador após a digestão.
[000695] As misturas peptídicas resultantes foram separadas através de eluição em gradiente a partir de uma coluna Waters Atlantis® dC18 (2,1 x 250 mm) sobre uma Workstation de HPLC Waters Alliance a 0,120 mL/minuto. A coluna foi diretamente conectada ao Espectrôme- tro de massa Waters Micromass Q-Tof Micro® equipado com uma fonte de pulverização de íons para coleta dos espectros de massa. Misturas peptídicas foram também separadas sobre uma coluna Varian Polaris C18 (4,6 x 250 mm) a 0,7 mL/minuto usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foram equilibradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos foram eluídos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a 0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para dirigir 15% do fluxo para a workstation Q-Tof, a qual foi operada no modo de TOF positivo (m/z 100-2000). A tensão de pulverização de íons típica usada foi de 3000 V.
[000696] Análise de CTLA4-Ig através de MS: CTLA4-Ig foi diluída com TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 0,7 mg/mL. PNGase F (New England Biolabs) foi diluída 30 vezes com TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 17 U/μL. Volumes iguais (60 μL cada) de amostra de fermentação purificada diluída e solução de glicosidase diluída foram misturados e incubados a 37° C durante 4 horas.
[000697] A CTLA4-Ig desglicosilada resultante (2 μg) foi carregada sobre uma coluna de extração com cartucho em fase reversa baseada em polímero (copolímero de poliestireno e poli N-vinil-2-pirrolidinona) Waters Oasis® (2,1 x 20 mm). A coluna carregada foi lavada com 5% de solvente B (solvente A: ácido fórmico a 1% em água, solvente B: ácido fórmico a 1% em acetonitrila) em uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto durante cinco minutos para dessalinizar, com o eluente desviado para descarte. Ao final de 5 minutos, um gradiente rápido (5% de solvente B a 95% de solvente B em 10 minutos) começou a eluição de CTLA4-Ig da coluna; aqui, o eluente foi dirigido para o es- pectrômetro de massa (Waters Micromass Q-Tof micro®) a 45 μL/min após divisão de fluxo (sistema de cromatografia usado foi um Waters Alliance 2695 equipado com um detector Waters 2996).
[000698] A tensão de capilar para o Q-Tof micro® foi ajustada a 3kV e a tensão de cone de amostra a 40 V. A média para explorações a cada 0,9 segundos foi calculada em uma exploração; o tempo interex- ploração foi de 0,1 segundo. O Analisador Q-Tof explora de m/z 800 a 2500. Espectros correspondendo à porção maior do que metade da altura de pico máxima (no cromatograma por TIC) são combinadas usando O software Waters MassLynx®. Os espectros combinados foram submetidos à deconvolução no Waters MaxEnt1. A resolução foi ajustada a 1 Da/Canal e o modelo de dano Gaussiano uniforme foi selecionado com largura no ajuste de metade da altura entre 0,5-1 Da. Proporções de intensidade mínima para o pico à esquerda e o pico à direita foram ambas ajustadas a 50%.
[000699] Análise de Oligossacarídeo N-ligado através de Croma- tografia de líquido/Espectrometria de massa (LC/MS ) Usando um carbono grafitado poroso (PGC): Oligossacarídeos isolados foram separados sobre uma coluna grafitada porosa (Thermo Hypercarb; 4,6 x 100 mm) usando um Sistema Waters Alliance 2695 HPLC equipado com um detector com conjunto de fotodiodo Waters 2996. Separação de oligossacarídeo foi obtida usando um gradiente em dois estágios de proporções crescentes de acetonitrila em TFA a 0,05%. Nos primeiros estágios do gradiente, o percentual de acetonitrila oscilava de 9,6% no momento de injeção para 24% a 80 minutos, no segundo estágio do gradiente, o percentual de acetonitrila oscilava de 24% a 80 minutos a 60% a 110 minutos. Uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto foi usada sempre. A corrente de eluição foi monitorada através de detecção por UV a 206 nm e analisada através de espectrometria de massa usando um Waters MicroMass Q-Tof micro® para identificação de massa.
[000700] Análise de carboidrato através do método de LC/MS PGC: Isolamento de oligossacarídeo através de desglicosilação da proteína foi realizado através de hidrólise enzimática usando PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA). Para a desglicosilação, entre 1 e 2 mg de glicoproteína em 160 μL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM contendo 0,15% (peso/v) de Rapigest SF (Waters Corporation) foram desnaturados aquecendo a 100°C durante 2 minutos. A solução resfriada foi misturada e 40 μL de PNGase F (50.000 U/mL, em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5) foram adicionados. A amostra foi submetida a turbilhonamento, seguido por incubação a 38° C durante 24 horas. Os oligossacarídeos enzimaticamente liberados foram purificados através de cromatografia líquida de alto desempenho. Cromatografia de líquido em fase reversa foi realizada sobre uma coluna Phenomenex Luna 5 μL C18 (4,6 x 150 mm, Phenomenex, Torrance, CA) acoplada a um Thermo HyperCarb 5 μL (4,6 x 100 mm, Phenomenex, Torrance, CA) em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. As colunas foram equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA) antes de injeção. Após injeção de amostra (150 μL da mistura digerida), um gradiente de acetonitrila foi iniciado terminando a 15 minutos e uma composição de solvente de TFA a 0,05% em acetonitrila a 12%. As glicanas foram, então, eluídas da coluna HyperCarb através de lavagem com TFA a 0,05% em acetonitrila a 60%. As glicanas foram detectadas através de absorbância de UV a 206 nm. Picos eluídos de lavagem da coluna Hypercarb foram coletados e concentrados até secagem sob vácuo. Antes de subsequentes injeções, a coluna Luna C18 foi limpa com TFA a 0,05% em acetonitrila a 40%, isopropanol a 40%, 20% de água.
Definição de perfil dos oligossacarídeos isolados com PGC
[000701] O sistema usado para cromatografia PGC dos oligossacarí- deos isolados consistia de um Waters Alliance equipado com um detector com conjunto de fotodiodo Waters 2996 utilizando uma coluna Hypercarb (2,1 x 100 mm). As amostras de oligossacarídeo foram elu- ídas usando um gradiente de acetonitrila.
[000702] Eluição em fase móvel ácida: Gradiente de acetonitrila em ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA). Um gradiente em dois estágios de acetonitrila crescente foi usado para a separação cromato- gráfica dos oligossacarídeos. O gradiente linear inicial de volume percentual crescente de acetonitrila de 9,6% no momento de injeção para 24% a 80 minutos é seguido por um segundo gradiente de volume percentual crescente de acetonitrila de 24% a 80 minutos para acetoni- trila a 60% a 110 minutos. Uma taxa de fluxo de 0,15 ml/min foi usada por todo o gradiente. A corrente de eluição foi monitorada a 206 nm com um detector de UV Waters, seguido por um Micromass Q-Tof Micro para identificação de massa. Os parâmetros de ionização para a sonda de ESI foram ajustados como segue : Tensão de capilar = 3 kV, Tensão de cone = 45 V, Temperatura da fonte de 80° C e Temperatura de dessolvatação de 175° C.
[000703] Eluição em fase móvel básica: Um gradiente de acetoni- trila em hidróxido de amônio a 0,4% (NH4OH) foi usado para a separação cromatográfica dos oligossacarídeos. Um gradiente linear de volume percentual crescente de acetonitrila de 10,4% no momento de injeção para 28% a 150 minutos em uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min foi usado para produzir o perfil. A corrente de eluição foi monitorada a 206 nm com um detector de UV Waters, seguido por um Micromass Q- Tof Micro para identificação de massa. Os parâmetros de ionização para a sonda de ESI foram ajustados como segue : Tensão de capilar = 3 kV, Tensão de cone = 45 V, Temperatura da fonte de 80° C e Temperatura de dessolvatação de 175° C.
[000704] Obtenção direta de perfil de misturas de oligossacarí- deo digeridas com PGC: O sistema usado para cromatografia PGC de misturas de oligossacarídeo digeridas consistia de um Waters Alliance adaptado com uma coluna grafitada porosa Luna C18 e Hypercarb (4,6 x 100 mm, Thermo). O sistema tinha uma interface com um detector com conjunto de fotodiodo Waters 2996 e um Q-ToF Micro (Micromass). Desglicosilação de proteína foi realizada através de hidrólise enzimática usando PNGase F. Para a desglicosilação, entre 1 e 2 mg de glicoproteína em 160 μL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM contendo 0,15% em peso de Rapigest SF (Waters Corporation), foram desnaturados aquecendo a 100° C durante 2 minutos. A solução resfriada foi bem misturada e 40 μL de PNGase F (50.000 U/mL, em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5) foram adicionados. A amostra foi misturada e, então, incubada a 38° C durante 24 horas. O perfil de oligossacarídeos enzimaticamente liberados foi obtido através de cromatografia de líquido de elevado desempenho. Cromatografia de líquido em fase reversa foi realizada sobre uma coluna Phenome- nex Luna 5 μl C18 (4,6 x 150 mm) acoplada a uma coluna Thermo HyperCarb 5 μL (4,6 x 100 mm) em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. As colunas foram equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA). Após injeção de amostra (150 μL de mistura digerida) um gradiente de acetonitrila foi iniciado, terminando a 11 minutos e uma composição de solvente de TFA a 0,05% em 9% acetonitrila. Uma troca de coluna foi usada para isolar a coluna Hypercarb e as glicanas são, então, eluídas da coluna HyperCarb com um gradiente linear de percentual crescente de acetonitrila. Um gradiente inicial de percentual crescente de acetonitrila de 9% no momento de injeção para 36% a 160 minutos foi usado. O segundo gradiente envolveu um volume percen- tual crescente de acetonitrila de 36% a 160 minutos para acetonitrila a 60% a 170 minutos. Uma taxa de fluxo de 0,15 mL/min foi usada por todos os gradientes de eluição. As glicanas foram detectadas através de absorbância de UV a 206 nm e através de Exploração por MS da faixa de massa de 400 - 3000 m/z. Os parâmetros de MS foram ajustados para os seguintes valores: Capilar 3 kV, Cone 45 V. Antes de subsequentes injeções, a coluna Luna C18 foi limpa com TFA a 0,05% em acetonitrila a 40%, isopropanol a 40%, 20% de água.
[000705] Análise através de Cromatografia em carbono grafitado poroso: A estruturas dos oligossacarídeos dos Domínios I-IV foram investigadas usando Cromatografia em carbono grafitado poroso (PGC) acoplada a MS. Oligossacarídeos N-ligados foram isolados de CTLA4-Ig e purificados conforme descrito na seção HPAEC-PAD anterior. Os oligossacarídeos foram analisados usando uma Hypercarb (PGC) com um detector de UV, seguido por Q-TOF ESI/MS. O perfil por PGC para os oligossacarídeos N-ligados liberados de CTLA4-Ig através de digestão com PNGase F é mostrado na figura 56, com os domínios anotados. A ordem de eluição é a mesma conforme aquela observada em HPAEC-PAD. A estruturas obtidas são mostradas na Tabela 60.
[000706] A nomenclatura para denominação dos oligossacarídeos mostrados na Tabela 60 é mostrado abaixo:
Figure img0033
[000707] A área sombreada de cinza mostra a estrutura central do oligossacarídeo N-ligado, onde P significa digestão com PNGase F e os dígi-tos subsequentes descrevem o número de resíduos de Manose (círculo), Fucose (triângulos apontando para cima), Galactose (triângulo apontando para a direita) e resíduos de ácido siálico (estrela), respectivamente. N-acetil glicosamina (GlcNAc) é representada por um quadrado.Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T02: Estruturas e massas de Oligossacarídeos N ligados detectados em Abatecept
Figure img0034
Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T02: Estruturas e massas de Oligossacarídeos N ligados detectados em Abatecept
Figure img0035
[000708] No Domínio I, seis picos foram identificados, correspondendo aos três oligossacarídeos asialilados (estruturas P2100, P2110,P2120). A diferença de massa de 113 Dáltons entre a estrutura prevista e a massa observada é em virtude de detecção de um aduto de tri- fluoroácido acético (TFA). Diferentes picos com a mesma massa de 1,463 correspondendo aP2100, indica que, provavelmente, eles são diferentes anômeros.
[000709] No Domínio II, seis picos foram identificados, correspondendo aos três oligossacarídeos biantenários e triantenários (estruturas P2111, P2121 e P3131, respectivamente), cada um contendo um resíduo de ácido siálico (ácido N-acetil neuramínico, NANA).
[000710] No Domínio III, seis picos foram identificados, correspondendo aos três oligossacarídeos biantenários, triantenários e tetra- antenários (estruturas P2122, P3132 e P4142, respectivamente), cada um contendo dois resíduos de ácido siálico (NANA).
[000711] No Domínio IV, dois picos foram identificados, correspondendo a dois oligossacarídeos triantenários e tetra-antenários (estruturas P3133 e P4133), cada um contendo três resíduos de ácido siálico (NANA).
[000712] Medição de proporção molar de mols de ácido siálico para mols de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig através de tratamento por hidrólise ácida de moléculas de CTLA4-Ig (veja figuras 25 e 26): Nesse método, NANA e NGNA são clivados da proteína através de hidrólise ácida. Os NANA e NGNA liberados são separados através de HPLC sobre uma coluna Rezex Monosaccharide RHM e detectados através de absorbância de UV (206 nm). NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatores de resposta de padões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Os resultados do teste são reportados como proporções molares (MR) de NANA e NGNA, respectivamente, para proteína. Esse ensaio determina o número total de mols, ligados e não-ligados, de ácido siálico.
[000713] Reagente, instrumentação e condições cromatográficas usadas no ensaio: Tampão de operação de fase móvel de ácido sul- fúrico a H2SO4 a 1M (estoque) e H2SO4 a 5 mM; solução-padrão de NANA a 1 mg/ml; padrão solução de NGNA a 1 mg/ml. Módulo Alliance Chromatographic System -Waters Corporation 2695 Separations com amostrador automático integrado; coluna Rezex Monosaccharide RHM-8 micrômetros, 7,8 x 300 mm, Phenomenex, equipada com coluna de proteção de 7,8 x 50 mm, Phenomenex; Detector-- Detector com conjunto de fotodiodo Waters Corporation 996 ou detector de absor- bância com comprimento de onda duplo Waters Corporation 2487.
[000714] Parâmetro cromatográficos: Fluxo -- 0,600mL/min; Fase móvel -- H2SO4 a 5 mM; Volume de injeção -- 5 microL; Concentração- alvo -- 1 mg/ml; Tempo de operação -- 25min; Temperatura da coluna - - 40°C; Temperatura do amostrador automático -- 4°C; Comprimento de onda - 206 nm; Tempo de retenção de NANA (dependente do sistema) - 10,8 min (+ ou - 1 min), Tempo de retenção de NGNA (dependente do sistema) - 9,8 min (+ ou - 1 min.).
[000715] Padrão de Adequabilidade de Sistema: Adicionar 50 μL de cada de NANA e NGNA a 1 mg/mL a 900 μL de H2O em um recipiente apropriado. Armazenar a 4°C durante até 3 meses; solução de trabalho de ácido N-acetil neuramínico (0,05 mg/mL); solução de trabalho de ácido N-glicolil neuramínico (0,05 mg/mL).
[000716] Hidrólise de Amostras e padrão de material de CTLA4- Ig: Amostras e padrão de material de CTLA4-Ig são diluídos para 1 mg/mL em H2O para hidrólise. Amostras de CTLA4-Ig e padrão de material de CTLA4-Ig são hidrolisados através da adição de 10 μL de H2SO4 a 1 M a 190 μL de amostras diluídas e CTLA4-Ig a 1 mg/mL. Hidrólise é realizada em duplicata em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL. As tampas são presas com uma trava para tampa ou fita. Os tubos são misturados através de turbilhonamento e colocados em um bloco de aquecimento a 80°C durante 1 h. Após incubação, os tubos são removidos do bloco de aquecimento, esfriados para a temperatura ambiente durante 3 min e colocados na centrífuga para uma rápida centrifugação para coletar a amostra do fundo do tubo. Dos tubos, 50 μL são transformados em alíquota da solução hidrolisada em frasco de amostra, a qual é colocada em um amostrador automático resfriado para injeção. O branco de hidrólise é feito como um preparado único através da adição de 10 μL de H2SO4 a 1 M a 190 μL água em tubos para microcentrífuga de 1,5 mL. O placebo é processado conforme as amostras.
[000717] Adequabilidade de sistema: Para verificar a Adequabili- dade de sistema, seis injeções repetidas do Padrão de Adequabilidade de Sistema (5 μL cada) foram injetadas, seguido por uma injeção do branco de hidrólise (5 μL). Usando a última injeção de Padrão de Ade- quabilidade de Sistema, a Resolução (R), valores aceitáveis são maiores do que 1,3 e placas teóricas (N), a contagem de placa teórica aceitável deve ser pelo menos 4000, foram calculadas, respectivamente. Usando as últimas cinco réplicas de adequabilidade de sistema, a re- produtibilidade de contagens de NANA foi calculada e o branco de hidrólise foi avaliado.
[000718] Resolução: Usando a última injeção de Padrão de Ade- quabilidade de Sistema, a resolução de pico foi calculada usando a seguinte equação: R = 2(T2-T1)/(W2+W1), onde R é a resolução, T2 é o tempo de retenção do pico de NANA (pico 2), T1 é o tempo de retenção do pico de NGNA (pico 1), W2 é a largura na linha de base de linhas traçadas da tangente para os lados de pico 2, W1 é a largura na linha de base de linhas traçadas da tangente para os lados de pico 1. A figura 25 representa uma injeção de Adequabilidade de sistema típica.
[000719] Placas teóricas (N): Usando a última injeção de Padrão de Adequabilidade de Sistema, a contagem de placa teórica (N) foi calculada usando a seguinte equação: N = 16(RT2/W), onde N é a contagem de placa teórica, RT é o tempo de retenção do pico de NANA em minutos, W é a largura na linha de base de linhas traçadas da tangente para os lados do pico de NANA. As últimas cinco injeções do Pa- drão de Adequabilidade de Sistema foram usadas para calcular as contagens de área média e seu desvio-padrão para NANA. O desvio- padrão relativo era igual ou menos de 3%. O branco de hidrólise estava isento de quaisquer picos significativos com o tempo de retenção de NANA e NGNA.
[000720] Sequência de injeção: Uma injeção de cada um dos padrões de trabalho de NANA e NGNA foi injetada, seguido pelo material de amostra de CTLA4-Ig hidrolisado (amostras em duplicata), seguido pelo material de CTLA4-Ig hidrolisado. Após as operações com CTLA4-Ig terem terminado, uma injeção de cada um dos padrões de trabalho de NANA e NGNA foi injetada.
[000721] Para determinar os mols de NANA ou NGNA injetados no padrão de trabalho, a seguinte equação é usada: mol de NANA ou NGNA = (C)(P)(I)/MW, onde C é a concentração de NANA e NGNA no padrão de trabalho, P é a pureza do padrão, I é o volume de injeção, MW é o peso molecular (309,2 g/mol para NANA e 325,3 g/mol para NGNA).
[000722] Para determinar os mols de NANA e NGNA nas amostras de CTLA4-Ig, a seguinte equação é usada: mols de NANA ou NGNA na amostra = (X)(Y)/Z, onde X é o número de mols no padrão de trabalho de NANA e NGNA, Y é as contagens médias de NANA e NGNA na amostra de CTLA4-Ig, Z é a área média de NANA e NGNA em duplicata nos Padrões de Trabalho. A partir das injeções em duplicata dos padrões, as contagens de área do padrão de NANA e NGNA devem ter um RSD de menos do que 10%.
[000723] Para determinar a quantidade injetada em cada amostra, a seguinte equação é usada: mols de proteína = (C)(D)(I)/MW, onde C é a concentração de dímero de CTLA4-Ig em g/ml (obtida a partir de análise por UV), D é a diluição para hidrólise (0,95), I é o volume de injeção (0,005 ml) e MW é o peso molecular de dímero de CTLA4-Ig, conforme determinado a partir de espectrometria de massa (92,439g/mol).
[000724] A proporção molar (MR) de NANA ou NGNA para proteína de CTLA4-Ig é calculada através da seguinte equação: MR = A/B, onde A é o número de mols de NANA ou NGNA e B é o número de mols de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig.
[000725] A proporção molar (MR) de ácido siálico, NANA e NGNA para proteína de CTLA4-Ig é calculada através da seguinte equação: MR = (A+B)/C, onde A é o número de mols de NANA, B é o número de mols de NGNA e C é o número de mols de moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig. Duplicatas de amostras de CTLA4-Ig e padrão de material de CTLA4-Ig devem ter um RSD de menos do que 10% em proporções molares para NANA.
[000726] Linearidade de respostas determinada através de método de hidrólise de medição do teor de ácido siálico: Respostas de NANA foram demonstradas como sendo lineares com relação às concentrações de padrão de NANA na faixa de 0,5 μg/mL (padrão nominal de NANA de ~0,1% = NANA~QL) a 98,7 μg /mL (padrão nominal de NANA de ~200%). Respostas de NGNA foram demonstradas como sendo lineares a concentrações de padrão de NGNA na faixa de 5,0 μg/mL (padrão nominal de NGNA de ~10%) a 82,0 μg /mL (-160% padrão nominal de NGNA).
[000727] Respostas de NANA de material de CTLA4-Ig hidrolisado são lineares com relação a concentrações de proteína na faixa de 0,25 mg/mL (carga nominal de CTLA4-Ig de 25%) a 2,0 mg/mL de CTLA4- Ig (carga nominal de CTLA4-Ig de 200%). Respostas de NGNA de material de CTLA4-Ig hidrolisado são lineares à concentrações de proteína na faixa de 0,25 mg/mL (carga nominal de CTLA4-Ig de 25%) a 2,0 mg/mL de CTLA4-Ig (carga nominal de CTLA4-Ig de 200%).
Precisão do método de hidrólise de medição do teor de ácido siá- lico: Precisão foi demonstrada para material de CTLA4-Ig (1 mg/mL) reforçado com padrões de NANA ou NGNA.
[000728] Precisão do método de hidrólise de medição do teor de ácido siálico: Experimentos de validação demonstraram a precisão do instrumento (RSD % < 3%), capacidade de repetição para o preparo de amostras (RSD % < 4%) e reprodutibilidade através de diferentes preparados de amostra, diferentes dias, diferentes instrumentos e dife-rentes análises (RSD % < 6% para NANA, % RSD < 12% para NGNA). Proporções molares de NANA e NGNA foram consideradas como sendo precisas dentro de uma faixa de 10% e 20%, respectivamente, dos resultados reportados.
[000729] Faixa do método de hidrólise de medição do teor de ácido siálico: A faixa de trabalho para esse ensaio foi mostrada como sendo de 0,49 mg/mL a 3,87 mg/mL de material de CTLA4-Ig.
[000730] Limite de detecção (DL) do método de hidrólise de medição do teor de ácido siálico: Os valores de DL individuais para Padrões de NANA e NGNA usando um detector com conjunto de fotodio- do (PDA; Sistema de HPLC 1) foram de 0,464 μg/mL e 0,402 μg/mL, respectivamente; os valores de DL individuais para NANA e NGNA usando detector com comprimento de onda duplo (Sistema de HPLC 2) foram de 0,131 μg/mL e 0,111 μg/mL, respectivamente. O DL do método, para ambas as espécies de ácido siálico e baseado no uso do detector mais sensível, foi de 0,5 μg/mL para NANA e NGNA.
[000731] Limite de Quantificação (QL) do método de hidrólise de medição do teor de ácido siálico: Os valores de QL individuais para Padrões de NANA e NGNA usando um detector com conjunto de foto- diodo (PDA; Sistema de HPLC 1) foram de 1,68 μg/mL e 1,52 μg /mL, respectivamente; os valores de QL para NANA e NGNA usando um detector com comprimento de onda duplo (Sistema de HPLC 2) foram de 0,48 μg/mL e 0,41 μg/mL, respectivamente. O QL do método, para ambas as espécies de ácido siálico e baseado no uso do detector mais sensível, foi de 1,7 μg/mL para NANA e NGNA.
[000732] Resistência/Robustez: O método foi demonstrado como sendo robusto com relação à estabilidade de solução de amostra refrigerada 48 horas, o uso de diferentes colunas, o uso de diferentes lotes de NANA e NGNA e o uso de fases móveis com alteração da concentração de ± 5 %.
[000733] Eletroforese em gel de IEF: O pI da glicoproteína pode também ser medido, antes e após tratamento com neuraminidase, para remover ácidos siálicos. Um aumento no pI após tratamento com neuraminidase indica a presença de ácidos siálicos sobre a glicoprote- ína. Um gel de IEF pode ser usado para determinar o ponto isoelétrico, o número de isoformas de CTLA4-Ig. Um sistema adequado para operação do gel de IEF é o Multiphore II Electrophoresis System e um gel de IEF com pH de 4,0 a 6,5 (Amersham Biosciences). O tampão de anodo tem a seguinte composição: Ácido glutâmico a 0,1 M em ácido fosfórico a 0,5 M. O tampão de catodo tem a seguinte composição: beta-alanina a 0,1 M. O gel de IEF foi pré-focalizado sob energia (25 watts) e corrente (25 mAmps) constantes até a tensão atingir > 300V. Padrões de calibração de IEF e amostras da concentração apropriada foram carregados e o gel foi operado sob energia (25 watts) e corrente (25 mAmps) constantes com um máximo de 2000V durante 2,5 horas. Após fixação e coloração com azul Coomassie do gel de IEF, bandas de proteína são visualizadas através de um densitômetro. Um gel de IEF típico de preparado de dímero de CTLA4-Ig é mostrado na figura 11.
Exemplo 4: Isolamento e Caracterização de Cadeia simples (Mo- nômero) de CTLA4-Ig
[000734] Preparo de CTLA4-Ig de cadeia simples nativa: Amostras de proteína recombinante de CTLA4-Ig preparadas através dos métodos da invenção foram separadas através de SEC de não- desnaturação usando um 2695 Alliance HPLC (Waters, Milford, MA) sobre duas colunas preparativas 21,5 x 300 mm TSK Gel® G3000SWXL (Tosoh Bioscience, Montgomery, PA) aleatoriamente. Trinta injeções (1,0 mL de cada) da amostra a ~50 mg/mL foram separadas sob condições isocráticas usando uma fase móvel consistindo em NaH2PO4 a 0,2 M, NaCl a 0,9%, pH de 7,0, em uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. Amostras foram monitoradas em uma absorbância de 280 nm usando um detector Waters 2996 PDA. Análise foi realizada usando os softwares Waters Millennium 4,0® e Empower Pro©. Frações foram coletadas (1,0 mL de cada) sobre um coletor de frações automático Foxy 200 de 90 a 150 minutos. Frações 16 a 39 (começando a 105 mL e terminando a 129 mL) foram empoçadas e concentradas usando concentradores Centricon com um corte de 3500 MW.
[000735] A amostra (2,0 mL a ~4 mg/mL) foi ainda cromatografada sob condições de desnaturação usando uma coluna de grau prep Hi- Load 26/60 Superdex 200 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) em uma taxa de fluxo isocrática de 2,0 mL/min usando NaH2PO4 a 200 mM, cloridrato de guanidina a 6,0 M em um pH de 6,0 como a fase móvel sobre um ÃKTAexplorer® (Amersham Biosciences). Frações 12-16 foram coletadas, empoçadas, o tampao trocado para NaH2PO4 a 200 mM, pH de 6,0 usando uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 (Amersham Biosciences) e, finalmente, concentradas.
[000736] Preparo de CTLA4-Ig de cadeia simples induzida: CTLA4-Ig de cadeia simples induzida foi preparadas através de desnaturação, redução e alquilação de proteína recombinante de CTLA4-Ig preparada através dos métodos da invenção. Cloridrato de guanidina (0,684 g) foi pesado em um tubo de Eppendorf para centrífuga de 1,5 mL e 512 μL de NaH2PO4 a 200 mM, pH de 6,0 foram adicionados e submetidos a turbilhonamento até que o cloridrato de guanidina esti- vesse completamente dissolvido. Proteína recombinante de CTLA4-Ig foi desnaturada através da adição de 238 μL de material de CTLA4-Ig (concentração: 50 mg/mL) nos tubos acima e submetido a turbilhona- mento, resultando em uma concentração final de CTLA4-Ig de ~10,0 mg/mL em cloridrato de guanidina a 6,0 M. A proteína desnaturada foi reduzida através da adição de 2,6 μL de DTT a 1,0 M e incubação a 37°C durante 90 minutos. A proteína reduzida foi, então, alquilada através da adição de 0,047 g de iodoacetamida sólida na mistura de amostra, seguido por turbilhonamento e incubação a 37°C durante 60 minutos no escuro. A amostra (2,0 mL a ~4,0 mg/mL para cada injeção) foi cromatografada sob condições de desnaturação usando uma coluna de grau prep HiLoad 26/60 Superdex 200 em uma taxa de fluxo isocrática de 2,0 mL/min usando NaH2PO4 a 200 mM, cloridrato de guanidina a 6,0 M em um pH de 6,0 sobre um AKTAexplorer®. As frações de cadeia simples resultantes (9-12) foram coletadas, empoçadas, o tampão trocado para NaH2PO4 a 200 mM, pH de 6,0 sobre uma coluna de dessalinização HiPrep 26/10 e concentradas.
[000737] Análise por espectrometria de massa MALDI-TOF de CTLA4-Ig nativa e de cadeia simples induzida: As amostras de cadeia simples (20 μL) foram dessalinizadas e concentradas com C4 ZipTips (Millipore, Billerica, MA), então, eluídas com 20 μL de acetoni- trila a 80% com TFA a 0,1% saturado com ácido sinapínico. A mistura (1,0 μL) foi colocada sobre a cavidade da lâmina de amostra para MALDI e deixada secar ao ar antes de ser colocada no espectrômetro de massa. Os espectros de MALDI-MS foram adquiridos sobre um es- pectrômetro de massa OmniFlex (Bruker Daltonics, MA) usando um laser de nitrogênio (337 nm). As amostras foram analisadas no modo de íons positivo reflexivo através de extração retardada usando uma tensão de aceleração de 20 kV e um tempo de retardo de 200 ns. Um total de 250 espectros em um único ponto foi somado para cada amos- tra. Calibração externa foi obtida usando uma mistura de Tripsinogênio (23982 m/z), Proteína A (44613 m/z) e Albumina Bovina (66431 m/z).
[000738] Análise de cadeia simples usando cromatografia por exclusão de tamanho desnaturativa (Guanidina HCl): Sobrenadan- te de CTLA4-Ig de culturas de célula desenvolvidas coletada em diferentes pontos durante o curso de tempo são preparadas para análise por HPLC. As amostras são preparadas através de pesagem de 0,114 g de cloridrato de guanidina (Mallinckrodt Baker Inc.) em um tubo de Eppendorf para centrífuga de 0,65 mL; adição de 125 uL de amostra de CTLA4-Ig no curso de tempo e turbilhonamento para dissolver completamente o HCl de guanidina. Então, imediatamente, adicionar 1,8 uL de iodoacetamida a 250 mM e misturar e incubar a 37°C durante 30 minutos.
[000739] Uma coluna de exclusão por tamanho TSK- GEL®G3000SWXL aleatória (DI de 7,8 mm x 30 cm) com uma coluna de proteção TSK (SWXL, DI DE 6,0 mm x 4,0 cm) é usada para a análise por SEC de cadeia simples realizada sobre o módulo de separação Waters 2695 com um detector 2996 com conjunto de fotodiodo. 25 μL de cada amostra são injetados sobre a coluna equilibrada com fosfato de sódio a 200 mM, cloridrato de guanidina a 6,0 M, pH de 6,0 como a fase móvel. As proteínas são separadas sobre a coluna com uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min e o cromatograma resultante é coletado durante uma janela de 60 minutos. A integração e quantificação de picos individuais (monômero, cadeia simples, etc.) são realizadas usando o software Empower Pro. Para assegurar que o sistema de HPLC está funcionando apropriadamente, injeções são também feitas sobre a fase móvel, o tampão de amostra de proteína, o Padrão de Adequabili- dade de Sistema e o material de CTLA4-Ig presente antes e após injeções de amostra. A resolução de pico e contagem de placa sobre o cromatograma de Padrão de Adequabilidade de Sistema são calcula- das.
[000740] Análise de cisteinilação de CTLA4-Ig de cadeia simples através de análise por LC/MS de peptídeo: CTLA4-Ig foi desnaturada e reduzida em tampão de Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo gua- nidina a 6 M e ditiotreitol a 5 mM (DTT). Após uma incubação de 20 minutos a 50 °C, iodoacetamida (IAM) foi adicionada para uma concentração final de 10 mM para alquilar os tióis livres e a incubação foi continuada durante mais 20 minutos a 50 °C no escuro. A mistura alquilada e reduzida foi carregada sobre uma coluna de dessalinização (Amersham, NAP-5), então, eluída no volume de vazio com Tris a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 8,0 ou tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5. Após dessalinização, CTLA4-Ig reduzida/alquilada foi digerida usando duas diferentes proteases: tripsina ou Asp-N. Material de CTLA4-Ig foi também submetido à digestão com tripsina/qui- miotripsina sem redução e alquilação.
[000741] Para digestão com tripsina, tripsina com grau para sequen- ciamento (Promega, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e a mistura foi incubada durante 4 horas a 37°C. Para digestão com Asp-N, Asp-N com grau para sequenciamento (Roche, 2%, peso/peso, enzima/proteína) foi adicionada e a mistura foi incubadas durante 16 horas a 37 °C. Para a digestão com tripsina/quimiotripsina, tripsina com grau para sequenciamento (Promega, 4%, peso/peso, enzi- ma/proteína) foi adicionada e a mistura foi incubada durante 4 horas a 37 °C, então, a-cquimiotripsina foi adicionada (Sigma, 4%, peso/peso, enzima/proteína) e a mistura foi incubadas durante 16 horas a 37 °C. Todas as amostras foram congeladas (-20 °C) após a digestão.
[000742] As misturas peptídicas resultantes foram separadas através de eluição em gradiente a partir de uma coluna Waters Atlantis® dC18 (2,1 x 250 mm) sobre uma Workstation de HPLC Waters Alliance a 0,12 mL/minuto. A coluna foi diretamente conectada ao Espectrômetro de massa Waters Micromass Q-Tof Micro® equipado com uma fonte de pulverização de íons para coleta dos espectros de massa. Misturas peptídicas foram também separadas sobre uma coluna Varian Polaris C18 (4,6 x 250 mm) a 0,70 mL/minuto usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foram equilibradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos foram eluídos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a 0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para dirigir 15% do fluxo para a workstation Q-Tof, a qual foi operada no modo de TOF positivo tempo de passagem(time of flight) (m/z 100-2000). A tensão de pulverização de íons típica usada foi de 3000 V.
[000743] A perda de 113 ± 4 u quando de redução sugeriu que há uma modificação de dissulfeto covalente na proteína. O desvio previsto para cisteinilação é de 119,14 u. Contudo, uma perda de massa real de 111,14 u é esperada quando de redução das espécies com cadeia simples. Perda de 119,14 u resultou da remoção da cisteína e um ganho de 8 u resultou da adição de 8 prótons quando de redução das oito cisteínas intra-cadeia (Cys 47, 74, 92, 118, 197, 157, 303, 361 de SEQ ID NO: 2). Assim, mais 113 ± 4 u sobre a massa intacta correspondem à cisteinilação com um aminoácido cisteína. A cisteína mais provável de ser modificada é Cys146, uma vez que a ligação de dissulfeto interca- deia está ausente nas espécies com cadeia simples baseado nos dados de MALDI. Usando análise de peptídeo por LC/MS para examinar os peptídeos os quais contêm Cys146, descobriu-se que material reduzido e não-reduzido mostram tempos de retenção e massas diferentes do material com cadeia simples. Para confirmar a cisteinilação, o pep- tídeo com cadeia simples contendo Cys146 foi coletado e analisado usando MALDI.
[000744] O pico coletado contendo Cys146 tem uma massa de 1787,48 u, em concordância com a massa prevista de 1787,51 u para o peptídeo com a cisteinilação de Cys146 (FIG. 27, painel A). Esse pep- tídeo, após ser submetido à redução, perde 119,11 u, em concordância com uma perda prevista de 119,14 u; a perda de cisteína (FIG. 27, painel B). O material é, então, ainda manipulado com iodoacetamida produzindo um desvio de 56,99 u, em concordância com um ganho de massa previsto de 57,03 u (FIG. 27, painel C).
Exemplo 5: Manipulação de formação de Monômero ou Multímero de CTLA4-Ig
[000745] Efeitos agonísticos do meio e componentes do meio sobre a formação de cadeia simples: Os efeitos agonísticos de diferentes meios e componentes de meio são determinados para a formação de cadeia simples. Moléculas de CTLA4-Ig podem ser incubadas a 37°C com vários meios e constituintes de meio individuais durante um período de 60 horas e analisados com relação à formação de cadeia simples através de desnaturação em coluna aleatória. Uma resposta agonista devastadora para formação de cadeia simples é encontrada quando da adição de cisteína a 10 mM ao tampão de formulação. Há uma rápida elevação na formação de cadeia simples a qual tem um pico em torno de seis horas após a adição de cisteína. Essa resposta diminui gradualmente durante as 56 horas restantes.Além disso, a alimentação de +30% gal realizou um aumento mais gradual, mas ainda relativamente rápido na formação de cadeia simples. A alimentação de +30% gal é uma composição de galactose e 117E. Essa mistura é adicionada todo dia para alimentar as células. Embora, nesse experimento, cisteína tivesse sido introduzida em quantidades artificialmente grandes independentes de 117E, há a necessidade de determinar qual dos componentes de 117E pode estar envolvido na formação de cadeia simples.
[000746] Componentes específicos de 117E e outros meios são incubados com CTLA4 Ig durante um período de 60 horas e analisados com relação à formação de cadeia simples através de seg. desnaturação em coluna aleatória. Investigação nesse meio se concentra em torno de possíveis componentes de redução e/ou inibidores de dissul- feto, os quais afetarão a formação de cadeia simples baseado em experimentos anteriores, mostrando que o dissulfeto intercadeia não está presente. Constituintes de 117E os quais são conhecidos por terem algum efeito de redução sobre dissulfetos foram testados; ácido lipói- co, cisteína, metionina e glutationa. Novamente, uma resposta agonis- ta devastadora para formação de cadeia simples é encontrada quando de adição de cisteína ao tampão de formulação. Há uma rápida resposta na formação de cadeia simples, a qual tem um pico em torno de seis horas, após a adição de cisteína. Essa resposta diminui gradualmente ao longo das 56 horas restantes. A principal formação de cadeia simples ocorre com meio contendo cisteína: cisteína, isolados de levedo e meio de fermentação. Os outros componentes contendo enxofre, tais como metionina e glutationa, não têm um efeito ou um efeito muito pequeno sobre a formação de cadeia simples. Não há efeitos observados pelo cloreto de amônio.
[000747] A presente invenção, portanto, abrange um método para fornecimento de uma proporção de formas de cadeia simples:dímero de uma proteína, tal proteína capaz de existir na forma de dímero, bem como de cadeia simples, compreendendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de (tal como durante a etapa (2)) um meio de cultura de célula líquido para a cultura de células expressando a referida proteína, no qual a concentração de um agente capaz de reduzir ou inibir a formação de dímero (tal como cisteína) é selecionada para proporcionar a referida proporção e (2) cultura das referidas células para expressar a referida proteína. Adição de e/ou aumento da concentração de tal agente (por exemplo, cisteína) em um meio de cultura de célula líquido proporciona uma maior proporção de formas de ca- deia simples:dímero de tal proteína, enquanto que remoção, diminuição ou eliminação da concentração de tal agente (por exemplo, cisteí- na) em um meio de cultura de célula líquido diminui a proporção de formas de cadeia simples: dímero da referida proteína.
[000748] Uma modalidade particular desse método é onde a referida proteína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formação da ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.
[000749] Efeitos agonísticos de elevado teor de sal sobre a formação de espécies de elevado peso molecular: Durante o processo de purificação, CTLA4-Ig é exposta a altas concentrações de sal durante períodos variados de tempo. Os efeitos de altas concentrações de sal são determinados sobre a formação de espécies de elevado peso molecular. CTLA4-Ig (a ~ 50 mg/mL) é incubada na presença de fosfato de sódio a 500 mM, pH = 6,0, 37°C. Há um efeito agonístico em altas concentrações de fosfato de sódio; um aumento rápido, sustentado nas formas de espécies de elevado peso molecular, principalmente tetrâmero, é observada durante um período de 100 horas.
[000750] A presente invenção, portanto, abrange um método para redução da proporção de forma dimérica:agregado de uma proteína, tal proteína capaz de existir nas formas de dímero, bem como agregada, durante processamento (tal como durante purificação) de tal proteína, compreendendo o uso de um ou mais líquidos os quais são soluções salinas de não-agregação. Uma "solução salina de não- agregação" se refere a um líquido contendo uma concentração de sal dissolvido no mesmo o qual é, com relação ao mesmo líquido contendo uma concentração maior de tal sal, menos agonística quanto à formação de agregado.
[000751] Uma modalidade particular desse método é onde a referida proteína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formação de uma ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.
[000752] Efeitos antagonísticos sobre a formação de cadeia simples: Os experimentos de modelamento anteriores demonstraram um efeito grande e rápido sobre a formação de cadeia simples através da adição de componentes contendo cisteína. Cisteína é um aminoá- cido o qual contém uma sulfidrila livre. Se a sulfidrila está envolvida na formação de cadeia simples, ela deverá ser bloqueada através do uso de compostos antagonísticos. Um de tais compostos é iodoacetamida. Iodoacetamida é um composto solúvel em água que reage de modo rápido com qualquer sulfidrila livre para formar uma ligação de tioéter irreversível. CTLA4-Ig é incubada a 37°C com vários meios, cisteína e iodoacetamida durante um período de 60 horas e analisada com relação à formação de cadeia simples através de SEC desnaturante em coluna aleatória e HMW através de seg. não desnaturante em coluna aleatória. Iodoacetamida não apenas bloqueia a formação de cadeia simples, mas também bloqueia a formação de agregado em uma composição de CTLA4-Ig e alto teor de sal. Iodoacetamida não bloqueia a formação de agregado em baixo teor de monômero de ácido siálico. Contudo, a quantidade de agregado formado no material com baixo teor de ácido siálico é comparável com a quantidade formada na composição de CTLA4-Ig.
[000753] O modelo proporciona um "insight" sobre um mecanismo que não era anteriormente bem compreendido. Parece que existem pelo menos duas vias principais de formação de agregado no processo com CTLA4-Ig que foram identificadas. A primeira via, a qual produz a grande quantidade de agregado, sulfidril cisteína livre, atua como um agonista para a formação de espécies de cadeia simples. O efeito agonístico da cisteína pode ser bloqueado através da adição de iodoacetamida. Surpreendentemente, a iodoacetamida não é apenas um antagonista para a formação de cadeia simples, mas também para a formação de espécies de elevado peso. Deverá ser notado que o processo é projetado para produzir uma composição que contém uma quantidade aumentada de ácido siálico quando comparado com a fermentação durante a purificação a jusante. Na segunda via, a qual produz muito menos agregado, uma subespécie a qual contém baixas quantidades de ácido siálico, não é afetada pela iodoacetamida para a formação de cadeia simples ou agregado.
[000754] A presente invenção, portanto, abrange um método para diminuir a proporção de formas de cadeia simples:dímero de uma proteína, tal proteína capaz de existir na forma de dímero, bem como de cadeia simples, compreendendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de (tal como durante a etapa (2)) um meio de cultura de célula líquido para a cultura de células expressando a referida proteína, tal meio contendo um agente antagonístico à formação de cadeia simples (tal como iodoacetamida) e (2) cultura das referidas células para expressar a referida proteína.
[000755] A presente invenção também abrange um método para diminuição da proporção de formas de agregado:dímero de uma proteína, tal proteína capaz de existir na forma de agregado, bem como de dímero, compreendendo as etapas de (1) fornecimento e/ou manutenção de (tal como durante a etapa (2)) de um meio de cultura de célula líquido para a cultura de células expressando a referida proteína, tal meio contendo um agente antagonístico à formação de agregado e/ou antagonístico à formação de cadeia simples (tal como iodoacetamida) e (2) cultura das referidas células para expressar a referida proteína.
[000756] Uma modalidade particular desse método é onde a referida proteína é uma glicoproteína capaz de formação de dímero através da formação de uma ligação de dissulfeto intercadeia, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.
[000757] Baseado nesses dados, não é difícil imaginar que pelo menos duas vias para a formação de agregado são induzidas em CTLA4- Ig, na principal via, cadeia simples está envolvida na formação de agregado, embora esse ainda não seja um mecanismo completamente claro. A segunda via menor, a qual é independente da formação de cadeia simples, está envolvida na formação de agregado. Essas vias podem ajudar a explicar porque existem pelo menos três formas de espécies de elevado peso molecular que podem ser cromatografica- mente separadas. Esses são modelos e devem ser testados durante o processo de fermentação real de forma a determinar os efeitos reais, se houver, e a magnitude dos efeitos. Baseado nesses dados, consideração deverá ser dada à testagem não apenas do processo de fermentação atual, mas também à fermentação desprovida de cisteína.
Exemplo 6: CTLA4-Ig Dímero e Tetrâmero Ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig a B7-1 Ig
[000758] A invenção proporciona métodos para avaliação de ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig a B7-1Ig. Características físicas (por exemplo, coeficiente de difusão, peso molecular, valência de ligação) e parâmetros operacionais do instrumento (por exemplo, taxa de fluxo, densidade de chip) podem influenciar os resultados do ensaio Biacore. Sob limitação de transferência de massa; a taxa de ligação de tetrâmero é aproximadamente 20% menor do que o dímero para a mesma concentração molar. Em uma taxa de fluxo especificada, é possível que moléculas tetraméricas penetrem na matriz menos eficientemente comparado com o dímero. Sob um chip imobilizado de B7- 1Ig de alta densidade, ligação competitiva de tetrâmero e dímero exibe curvas de inibição comparável. Isso indica que a valência teórica de tetrâmero (quatro) versus dímero (dois) não tem influência sobre a ligação a B7-1Ig. Concentrações molares de tetrâmero podem ser calculadas baseado em uma Curva-padrão de dímero. Usando essa abordagem, descobriu-se que a ligação de tetrâmero a B7-1Ig tem resposta dose-dependente comparado com dímero.
[000759] Comparação da potência de ligação de um tetrâmero e um dímero é influenciada pela unidade de medição usada para o preparo de padrões e amostras. Amostras de tetrâmero e dímero podem ser comparadas com uma concentração de 2000 ng/mL. Em uma base em massa (ng/mL), cada espécie mostra uma potência de ligação de aproximadamente 100% usando uma curva-padrão da mesma espécie. Contudo, a potência de ligação de tetrâmero era a metade quando determinada sobre uma Curva-padrão de dímero e a potência de ligação de um dímero foi mais do que duplicada quando determinada sobre uma Curva-padrão de tetrâmero. Uma vez que o instrumento Bia- core detecta interações moleculares baseado na massa, as unidades de ressonância de sinal (RU) a partir de concentrações idênticas (ng/mL) de tetrâmero e dímero deverão ser as mesmas. Embora o sistema de detecção seja uma função da massa, a interação entre moléculas ocorre em uma base molar. Portanto, as concentrações molares de dímero de CTLA4-Ig e tetrâmero de CTLA4-Ig são de 21,6 nM e 10,8 nM, respectivamente, a 2000 ng/mL. Usando a concentração molar, as amostras de dímero de CTLA4-Ig e tetrâmero de CTLA4-Ig mostram potência de ligação comparável sobre uma Curva-padrão de dímero. Usando a mesma abordagem de concentração molar sobre uma curva de padrão de tetrâmero de CTLA4-Ig, a amostra de dímero de CTLA4-Ig mostra um aumento extra de 30% na potência de ligação comparado com a amostra de tetrâmero. Essa observação é em virtude de uma diminuição no declínio da Curva-padrão de tetrâmero em altas concentrações, resultando em uma maior concentração calculada para uma determinada taxa de ligação inicial. Uma explicação para essa observação é o efeito da transferência de massa.
[000760] Experimento com limitação de transferência de massa indi- ca que a taxa de ligação inicial do tetrâmero de CTLA4-Ig é aproxima-damente 20% menor do que aquela do dímero de CTLA4-Ig para o mesmo número de moléculas (isto é, a taxa de ligação do tetrâmero difere do dímero por um fator de 0,8). Essa diferença observada é em virtude do peso molecular das duas espécies e seu efeito sobre a difusão das moléculas para a superfície do chip. O coeficiente de difusão da molécula é inversamente proporcional à raiz cúbica do peso molecular. Um menor coeficiente de difusão indicaria menor movimento das moléculas. Baseado nos respectivos pesos moleculares, o coeficiente de difusão calculado de tetrâmero de CTLA4-Ig é 0,8 vezes aquele do dímero de CTLA4-Ig ou, inversamente, aquele do dímero é 1,25 vezes aquele do tetrâmero. Dados experimental são consistentes com essa observação, onde o dímero de CTLA4-Ig mostra uma potência de 133%, conforme calculado a partir de uma curva-padrão de tetrâmero de CTLA4-Ig usando concentrações molares. Limitações de transferência de massa sobre chips de alta densidade são mais pronunciadas em menores taxas de fluxo e menores concentrações de analito. À medida que a taxa de fluxo aumenta, o dímero mostra taxas de ligação iniciais mais rápidas comparado com o tetrâmero. Portanto, o peso molecular aumentado e menor coeficiente de difusão do tetrâmero contribuem para as diferenças na taxa de ligação inicial comparado com o dímero.
[000761] Ligação competitiva de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig a B71Ig indica que o tetrâmero e dímero mostram Valencia de ligação similar sob condições limitadas de transferência de massa. Os efeitos de tetrâmero adicional sobre um chip de B7-1Ig inicialmente ligado com dímero ou tetrâmero indicam baixo potencial de ligação. Essa observação não é em virtude de disponibilidade limitada do sítio de ligação, porque o dímero adicional poderia se ligar a chips de B7-1Ig inicialmente ligado com dímero de CTLA4-Ig ou CTLA4-Ig tetrâmero. Pe- netração limitada na matriz pode explicar a diminuição observada na ligação de tetrâmero.
[000762] A natureza pela qual moléculas se ligam sobre o Biacore afeta a interpretação dos resultados. As moléculas de tetrâmero e dí- mero se difundem em diferentes taxas em virtude de suas diferenças no tamanho molecular sob a condição de limitação de transferência de massa. Além disso, impedimento estérico sobre a superfície de um chip de alta densidade afeta a penetração de subsequentes moléculas na matriz.
[000763] Características físicas, tais como o peso molecular, coeficiente de difusão e ligação de cada espécie precisa ser considerada quando de realização de análises de concentração sobre o Biacore. Padrões usados para comparação do analito de interesse deverão ser do mesmo material. Contudo, tetrâmero ainda pode ser analisado contra padrões de dímero se os padrões e amostras são expressos em uma base molar onde o tamanho molecular é levado em consideração. Os dados apresentados indicam que a ligação de dímero de CTLA4-Ig e tetrâmero de CTLA4-Ig a B7-1Ig é comparável.
[000764] Dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig mostram taxas de associação (kon) similares. Contudo, o tetrâmero mostra uma menor taxa de dissociação (koff), a qual é atribuída à avidez em virtude de aumento no número de sítios de ligação.
[000765] Análise de cinética de ligação entre duas proteínas, tais como um ligante e um receptor, pode ser realizada sobre o Biacore usando um chip imobilizado com uma baixa densidade de ligante de aproximadamente 600-800 RUs, de modo que a capacidade de ligação máxima (Rmax) está na faixa de 50-150 RU. A finalidade de um chip de baixa densidade é minimizar os efeitos da avidez e transporte de massa. A avidez é observada quando analitos multivalentes permanecem ligados à superfície do chip em virtude proximidade íntima de ligantes disponível à medida que dissociação de sítios de ligação individuais ocorre. Transporte de massa é observado quando há uma diferença significativa na concentrações de analito entre a superfície do chip e a solução bruta.
[000766] Em uma modalidade, a molécula de CTLA4-Ig é um dímero consistindo em duas moléculas com cadeia simples ligadas através de uma única ligação de dissulfeto intercadeia e contém dois sítios de ligação para moléculas de B7. Em outra modalidade, formação de te- trâmero de CTLA4-Ig, conforme confirmado através de dispersão de luz, SEC e SDS-PAGE, resulta em uma molécula com potencialmente quatro sítios de ligação. A cinética de ligação de monômeros e díme- ros purificados é estaticamente comparada com material de dímero de CTLA4-Ig. Não existem diferenças significativas nas taxas kon (p valores > 0,05). A taxa koff de tetrâmero é significativamente diferente da taxa koff do dímero. A taxa koff do dímero purificado do pico de clarificação por HIC não é significativamente diferente da taxa koff do material de dímero de CTLA4-Ig. Portanto, o tetrâmero dissocia mais lentamente do que o dímero, indicando um efeito de avidez em virtude do número aumentado de sítios de ligação pela molécula.
[000767] Tetrâmero pode ser separado e dissociado do dímero através de tratamento com guanidina. Esse dímero de CTLA4-Ig tratado com guanidina foi analisado e os resultado indicam que suas características de ligação cinética eram similares àquelas do dímero de CTLA4-Ig formado sob condições fisiológicas. Essa observação sustenta a hipótese de que a diferença observada na taxa koff entre díme- ro e tetrâmero está relacionada à valência de ligação das moléculas e à natureza inerente do método Biacore, onde a avidez exerce um papel na cinética de ligação.
Purificação por afinidade de material de CTLA4-Ig do pico de clari-ficação por HIC:
[000768] Cromatografia por afinidade em Proteína A-Sefarose: 500 mL de pico de clarificação por HIC foram filtrados através de um sistema com filtro de 0,22 mícron de 1 L (Corning, Corning, NY, Parte no. 430517) e carregada sobre a coluna de rProteína A-Sefarose (5 cm x 15 cm), a qual foi pré-equilibrada com solução salina tamponada com fosfato (Sigma, St. Louis, MO, P-4417) em um pH de 7,4. A coluna foi lavada com 700 mL de PBS, pH de 7,4 e eluída com glicina a 100 mM, pH de 3,5. Frações de 50 mL de cada foram neutralizadas para coleta através da adição de 0,5 mL de Tris a 2,0 M, pH de 10 em tubos de coleta. Frações foram ensaiadas em uma absorbância de 280 nm, empoçadas e concentradas usando um cartucho Centriprep YM-3 (Millipore Corporation, Bedford, MA, Parte no. 4203). A solução de proteína purificada foi armazenada a -70° C.
[000769] Cromatografia por afinidade PROSEP- rA (proteína re- combinante A): 500 mL de pico de clarificação por HIC foram filtrados através de um sistema com filtro de 0,22 mícron de 1 L (Corning, Corning, NY, Parte no. 430517) e carregados em uma taxa de fluxo de 25 mL/minuto sobre uma coluna PROSEP-rA High Capacity (Millipore Corporation, Bedford, MA) (25 mm x 28 cm), a qual foi pré-equilibrada com Tris a 25 mM, pH de 8,0 contendo cloreto de sódio 250 mM. O sistema Waters PrepLC equipado com Waters 2767 Sample Manager e um detector com conjunto de fotodiodo Waters 2996 foi usado para essa cromatografia. A coluna foi lavada com tampão de equilíbrio a 25 mM durante 30 minutos em uma taxa de fluxo de 25 mL/minuto e eluí- da com acetato a 100 mM, pH de 3,0 em uma taxa de fluxo de 25 mL/minuto durante 30 minutos. Frações de 10 mL de cada foram neutralizadas para eluição através de coleta sobre 50 ul de Tris a 2,0 M, pH de 10, o foi previamente adicionado aos tubos. Frações tendo alta absorbância a 280 nm foram empoçadas e concentradas usando um cartucho Centriprep YM-3 (Millopore Corporation, Bedford, MA, Parte No. 4203). A solução de proteína purificada foi armazenada a -70°C.
[000770] Cromatografia por exclusão de tamanho: cromatografia foi exclusão de tamanho foi realizada sobre um módulo de separação Waters Alliance 2695 equipado com um detector com conjunto de fo- todiodo Waters 2996 (Milford, MA) e um coletor de frações Foxy 200 controlado por um software Millennium32 versão 3.20 ou Empower. Colunas TOSOH BIOSCIENCE aleatória (Montgomery, PA) TSK G3000 SW (21,5 mm x 300 mm) e TSK G3000 SWxL aleatória (7,8 mm x 300 mm) foram usadas para SEC preparativa a analítica, respectivamente. As proteínas eluídas foram monitoradas através de absorbância de UV a 280 nm.
[000771] Isolamento preparativo de dímero, tetrâmero e multímero foi obtido através de SEC do material de pico de clarificação por HIC em Proteína A purificada. Trinta amostras (~10 mg cada) de eluato de Pro-teína A foram injetados sobre uma coluna de SEC preparativa aleatória usando uma fase móvel de tampão de fosfato de sódio monobásico a 100 mM, pH de 7,0 contendo cloreto de sódio a 0,9% em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. Frações foram coletadas a cada minuto de 90160 minutos para cada uma das trinta injeções. O tempo de operação para uma única injeção foi de 180 minutos.
[000772] Cada fração foi examinada através de HPLC por exclusão de tamanho analítica em coluna aleatória. Frações 13-15 (contendo multímero), frações 22 e 23 (contendo tetrâmero) e frações 43-49 (contendo dímero) foram empoçadas. Frações purificadas multímero, tetrâmero e dímero foram examinadas sobre duas colunas de SEC analíticas com detecção por dispersão de luz dinâmica (DSL).
[000773] Análise de ligação bioespecífica de componente de CTLA4-Ig do pico de clarificação por HIC e componentes purificados a B7-1 Ig imobilizada: A ligação bioespecífica de CTLA4-Ig a B7- 1Ig imobilizada (sobre um chip CM5) foi medida usando um biosensor BIAcore C SPR-baseado (BIAcore, AB, Piscataway NJ). Material de CTLA4-Ig foi usado para gerar a Curva-padrão. B7-1Ig foi imobilizado em uma densidade de 5000 a 10.000 unidades de ressonância (RU's) sobre um chio sensor CM5 ativado. Padrões de referência de CTLA4- Ig, controles de qualidade e amostras foram injetados em uma taxa de fluxo de 20 μL/min. sobre a superfície do chip sensor B7-1 Ig para gerar sensorgramas. A taxa de ligação inicial (RU/s) de CTLA4-Ig sobre B7- 1Ig imobilizada foi medida sob condições de difusão limitada sobre uma superfície de B7-1Ig de alta densidade e isso se correlaciona diretamente com a concentração ativa de CTLA4-Ig nas amostras. Amos- tras-padrão, controle de qualidade e concentrações de amostra desconhecidas foram interpoladas a partir da Curva-padrão gerada através de plotagem das RU's versus concentrações de CTLA4-Ig na faixa nominal de 125-8000 ng/mL. Os resultados finais foram expressos como ligação percentuais (Concentração Média Desconhecida / amostra / 2000) x 100.
[000774] Determinação de massa molar e raio hidrodinâmico: A separação por SEC foi realizada com uma coluna TSK3000 SWXL e uma coluna de proteção correspondente. A fase móvel consistia em HEPES a 25 mM, NaCl a 850 mM, pH de 7,0, usando condições iso- cráticas para eluição a 0,8 mL/min. Análises por HPLC foram realizadas em temperatura ambiente e as amostras mantidas a 4°C durante análise. A determinação de massa molar incorporou o Wyatt Dawn EOS utilizando 15 ângulos de dispersão distintos para medir a variação angular dispersão de luz para cada espécie. Um formalismo de plotagem Zimm foi usado para determinação de massa molar, onde a média de seções para cada espécie foi calculada para a massa molar. O valor de incremento de índice refrativo específico (dn/dc) usado para calcular a massa molar absoluta foi de 0,189 obtido usando a) e um Interferômetro Optilab DSP (RI. Determinação de raio hidrodinâmico (Rh) foi realizada in-Line com um detector Photon Correlator QELS posicionado em um ângulo de aproximadamente 90° para a célula de fluxo. A constante de difusão translacional é medida a partir desse sinal e o Rh é calculado usando a relação de Einstein-Stokes. Análise de dados foi realizada usando o software Astra versão 4.90 da Wyatt Technology.
[000775] Descobriu-se que os valores de peso molecular e raio hi-drodinâmico para espécies diméricas e tetraméricas eram de 86 - 91 kDa e 172 - 199 kDa, respectivamente. Foi observado que as amostra de pico de clarificação continham espécies de HMW adicionais, correspondendo a hexâmero e decâmero através do peso molecular. A faixa dos raios hidrodinâmicos para as espécies diméricas é de 3,8 - 4,7 nm. As faixas dos raios hidrodinâmicos das espécies tetraméricas heterogêneas foram de 5,7 nm a 6,2 - 6,3 nm.
Ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig a B7-1Ig usando res-sonância de plasmônio em superfície:
[000776] Análises de concentração: Análises de concentração das várias espécies de CTLA4-Ig a B7-1Ig foram realizadas sobre um instrumento Biacore 3000 (Biacore, Piscataway, NJ) de acordo com Método 7441-42 com modificações mínimas. Modificações incluem o seguinte: Biacore 3000 foi usado ao invés do Biacore C. A taxa de fluxo foi de 10 μL/min ao invés de 20 μL/min. A amostra foi injetada durante 60 segundos em oposição a 15 segundos. A superfície do chip sensor foi re-gerada a 30 μL/min através de três pulsos curtos de 30 segundos (15 μL)de citrato de sódio a 10 mM, pH de 4,0, contendo NaCl a 100 mM (tampão de regeneração), seguido por um pulso de 30 segundos de água.
[000777] Um chip sensor CM5 foi imobilizado com B7-1Ig em uma concentração de 20 μg/mL em tampão de acetato, pH de 5,0, objetivando uma densidade-alvo de 6000-12000 unidades de ressonância (RU). Padrões foram preparados através de diluição serial de material de CTLA4-Ig para concentrações de 62,5-8000 ng/mL (0,675-86,3 nM) e dímero para concentrações de 125-16000 ng/mL (0,675-86,3 nM) em tampão de HBS-EP. Amostras de teste, consistindo em monômero ou dímero, foram diluídas para uma concentração-alvo de ~2000 ng/mL e analisadas sobre o Biacore. Concentrações foram determinadas através do software BIAavaliation (versão 4.0.1) usando Curvas Padrões de material de CTLA4-Ig (> 98% de monômero) ou dímero purificado. A potência de ligação é calculada como a concentração percentual determinada sobre o Biacore dividido pela concentração determinada a A280 nm.
[000778] A taxa de ligação da molécula à superfície fornecida é uma função da concentração, o que permite a determinação de concentrações desconhecidas. Dímero de CTLA4-Ig exibe uma maior taxa de ligação como uma função da concentração (ng/mL) quando comparado com tetrâmero de CTLA4-Ig.
[000779] As potências de ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig são resumidas na Tabela 7. Baseado em ng/mL, a potência de ligação de uma amostra de dímero é calculada a partir da Curva-padrão de dímero e descobriu-se que era de 99,5%; enquanto que uma concentração equivalente de uma amostra de tetrâmero é 47,2%. Inversamente, a potência de ligação da amostra de dímero é calculada a partir de uma Curva-padrão de tetrâmero e descobriu-se que era de 266%; enquanto uma concentração equivalente de uma amostra de tetrâmero é de 103%. Contudo, quando dímero e tetrâmero são expressos como concentrações molares (nM), as potências de ligação de ambas as espécies são comparáveis. A potência de ligação de amostras de dímero e tetrâmero calculada a partir de uma Curva-padrão de dímero são de 99,4% e 94,3%, respectivamente. Sobre uma Curva-padrão de tetrâ- mero, ela é de 133% e 103%, respectivamente. Curvas Padrões de dímero e tetrâmero são comparáveis baseado nas concentrações molares.Tabela 9: Potência de ligação de dímero e tetrâmero de CTLA4-Ig
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[000780] Valência de ligação: Dímero de CTLA4-Ig (25-1600 nM) ou tetrâmero (25-400 nM) foi pré-misturado em várias proporções molares com B7-1Ig durante três minutos antes de 30 μL da mistura serem inje-tados em uma taxa de fluxo de 10 μL/min sobre um chip B7-1Ig imobilizado com uma densidade de 9392 RU. O chip foi re-gerado após cada injeção através de três pulsos de 30 segundos de tampão de regeneração, seguido por um pulso de 30 segundo de água. As RU's obtidas ao final de cada injeção foram comparadas.
[000781] Teoricamente, a valência de ligação da molécula de dímero é de dois; cada cadeia simples consiste em um sítio de ligação. A molécula tetramérica consiste em duas moléculas de dímero e, assim, tem uma valência de ligação de quatro. Para determinar a valência de ligação aparente de dímero e tetrâmero, um ensaio competitivo foi projetado e conduzido sobre o Biacore 3000. No experimento, analitos foram pré-misturados com B7-1Ig em várias proporções molares durante três minutos antes da mistura ser injetada sobre um chip B7-1Ig (9392 RU) em uma taxa de fluxo de 10 μL/min durante um minuto. A Tabela 10 mostra o percentual de dímero ou tetrâmero que foi competitivamente inibido com quantidades molares crescentes de B7-1Ig. Em uma proporção molar de 1,25 (B7-1Ig) para 1 (dímero ou tetrâmero), uma diferença significativa foi observada na inibição competitiva com monômero a 96,1% e dímero a 84,9%. Contudo, dímero e tetrâmero exibem curvas de inibição similares; isso sugere que as valências são aproximadamente iguais. Além disso, dímero e tetrâmero também mostraram perfis de inibição similares usando chips de menor densidade.Tabela 10: Inibição de Dímero e Tetrâmero com B7-1Ig.
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[000782] Saturação de Chip de B7-1Ig: Dímero ou tetrâmero deCTLA4-Ig (200, 1000 ou 8000 ng/mL) foi inicialmente injetado a 10 μL/min durante um minuto sobre um chip B7-1Ig de alta densidade (6738 RU) seguido por uma série de sete injeções de 1 minuto com monômero ou dímero (200, 1000 ou 8000 ng/mL). O chip foi re-gerado após cada condição através de quatro injeções de 25 μL de tampão de regeneração, seguido por uma injeção de 25 μL de água. As RU's obtidas ao final de cada injeção foram comparadas.
[000783] Dímero ou tetrâmero foi repetidamente injetado sobre uma superfície B7-1Ig pré-revestida com dímero ou tetrâmero sem regeneração de superfície. Ligação inicial com tetrâmero não impede subsequentes injeções de dímero de se ligar, contudo, injeções adicionais de tetrâmero resultam em uma taxa de ligação significativamente diminuída quando comparado com injeção dímero. Ligação inicial com dí- mero seguido por subsequentes injeções de dímero resulta em uma ligação aumentada tendendo à saturação. Subsequente injeção de te- trâmero ao chip pré-revestido com dímero mostra uma diminuição gra- dual na ligação, indicando uma dissociação de moléculas do chip e uma falta de penetração de tetrâmero na matriz. Resultados similar são observados com injeção inicial de 200 ng/mL ou 8000 ng/mL de moléculas de CTLA4-Ig.
[000784] Tetrâmero de CTLA4-Ig tem maior avidez ao receptor de B7-1Ig: Espécies de CTLA4-Ig, incluindo as porções descartadas de colunas de purificação, tal como os picos de clarificação de colunas de HIC e QFF foram purificados e sua cinética de ligação foi analisada sobre o Biacore.
[000785] Espécies de CTLA4-Ig do pico de clarificação por HIC: A coluna de HIC é usada no processo com CTLA4-Ig para remover espécies de elevado peso molecular, tal como DNA. Espécies de CTLA4- Ig do pico de clarificação da coluna de HIC podem ser usadas para subsequente purificação e análise cinética. O pico de clarificação por HIC foi passado através de uma coluna de Proteína A para capturar todas as espécies CTLA4-Ig e remover outras impurezas que possam estar presentes. O eluato da coluna de proteína A, o qual consistia em uma mistura de todas as espécies de CTLA4-Ig (isto é, dímero, tetrâ- mero, hexâmero multímero), mostrou taxas de kon e koff aparentes as quais eram comparáveis com o padrão de dímero de CTLA4-Ig. Separação do eluato de Proteína A através de 2 coluna de SEC resultou em três espécies de CTLA4-Ig: dímero, tetrâmero e hexâmero /multímero, com taxas de kon e koff conforme resumido na Tabela 11. O teor de ácido siálico do dímero purificado do pico de clarificação por HIC era baixo comparado com dímero de CTLA4-Ig.
[000786] Na Tabela 11, concentrações de amostra de 75-200 nM foram testadas sobre o chip B7-1Ig (694 RU). Espécies de CTLA4-Ig purificadas do pico de clarificação por HIC mostraram menor ligação comparado com a referência de CTLA4-Ig. Tetrâmero, o qual foi desagregado, proporcionou taxas de kon e kof comparáveis com a referência de CTLA4-Ig.Tabela 11: Análise cinética de espécies de CTLA4-Ig a partir do pico de clarificação por HIC
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[000787] Análise estatística dos dados foi realizada usando o T-teste de Student baseado em 7 observações do padrão de dímero de CTLA4-Ig e 14 observações de dímero e tetrâmero purificados. Não houve diferença na comparação das taxas de kon do padrão de dímero de CTLA4-Ig com dímero ou tetrâmero purificado. Contudo, a taxa de koff e a KD foram estatisticamente significativa quando a referência foi comparado com tetrâmero purificado (Tabela 12). Comparando o te- trâmero purificado com dímero purificado, as taxas de kon e koff, bem como a KD foram estatisticamente diferente. Deverá ser destacado que, embora os dados tenham sido agrupados em dímero e tetrâmero, classificações individuais de amostras (isto é, frontal, lateral, etc.) pode ter características ligeiramente diferentes que podem afetar sua cinética de ligação. Para o dímero, a média das taxas de kon e koff era de 3,3 ± 1,0 x 105M-1s-1 e 8,8 ± 3,5 x 10-3s-1, respectivamente. As taxas de kon e koff do tetrâmero foram de 2,6 ± 0,8 x 105M-1s-1 e 3,1 ± 1,4 x 10- 3s-1, respectivamente.
[000788] Na Tabela 12, Dímero (n = 14) e tetrâmero (n = 14) e padrão de dímero de CTLA4-Ig (n = 7) foram analisados.Tabela 12: Análise estatística de espécies de CLTA4-Ig
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[000789] Espécies de CTLA4-Ig do pico de clarificação de QFF: A coluna de QFF é a última coluna de purificação usada para limpar im-purezas residuais do produto. Espécies de CTLA4-Ig foram isoladas do pico de clarificação da coluna de QFF usando o método com 2 colunas SEC e analisadas sobre o Biacore 3000. Os dados mostraram que a cinética de ligação dessa amostra de "pico de clarificação de QFF" foi similar ao padrão de dímero CTLA4-Ig. Além disso, dímero e tetrâmero purificados do pico de clarificação de QFF proporcionaram cinética de ligação similar comparado com aqueles purificados da composição. Além disso, o teor de ácido siálico das frações de monô- mero purificadas era maior do que aquele do padrão de dímero de CTLA4-Ig.
[000790] Tratamento com guanidina (dimerização do tetrâmero): O tetrâmero pode ser convertido ao dímero através de tratamento com guanidina, seguido por diálise em tampão de fosfato e confirmou que existia como um dímero através de seg. analítico. Análise cinética do tetrâmero "dimerizado" do pico de clarificação de HIC mostrou que suas taxas de kon e koff eram similares àquelas do dímero de CTLA4-Ig.
Exemplo 7: Análise intacta através de ionização por eletropulveri- zação (ESI)-MS
[000791] CTLA4-Ig foi diluída com TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 0,7 mg/mL. PNGase F (New England Biolabs) foi diluída 30 vezes com TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8 para uma concentração final de 17 unidades/μL. Volumes iguais (60 μL cada) de amostra diluída e solução de glicosidase diluída foram misturados e incubados a 37°C durante 4 horas.
[000792] A CTLA4-Ig desglicosilada resultante (2 μL) foi carregada sobre uma coluna com cartucho de extração em fase reversa Waters Oasis® (2,1 x 20 mm). A coluna carregada foi lavada com 5% de solvente B (solvente A: ácido fórmico a 1% em água, solvente B: ácido fórmico a 1% em acetonitrila) em uma taxa de fluxo de 0,2 mL/minuto durante cinco minutos para dessalinizar, com o eluente desviado para descarte. Ao final de 5 minutos, um gradiente rápido (5% de solvente B a 95% de solvente B em 10 minutos) começou a eluição de CTLA4-Ig da coluna; aqui, o eluente foi dirigido para o espectrômetro de massa (Waters Micromass Q-Tof micro®) a 45 μL/min após divisão de fluxo (sistema de cromatografia usado foi um Waters Alliance 2695 equipado com um detector Waters 2996).
[000793] A tensão de capilar para o Q-Tof microTM foi ajustada a 3kV e a tensão de cone de amostra a 40 V. A média das explorações (cada 0,9 segundo) foi calculada em uma exploração; o tempo inter- exploração foi de 0,1 segundo. O Analisador Q-Tof explora de m/z 800 a 2500. Espectros correspondendo à porção maior do que metade da altura de pico máxima (no cromatograma por TIC) foram combinados usando o software Waters MassLynx®. Os espectros combinados foram submetidos a uma deconvolução Waters MaxEnt1. A resolução foi ajustada a 1 Da/Canal e o modelo de dano Gaussiano uniforme foi selecionado com largura no ajuste de metade da altura entre 0,5-1 Da. Proporções de intensidade mínima para o pico à esquerda e o pico à direita foram ambas ajustadas a 50%.
Exemplo 8: Ionização por desabsorção a laser matriz-assistida - Time of Flight (MALDI-TOF)
[000794] Os espectros de MALDI-MS foram adquiridos sobre um OmniFlex® (Bruker Daltonics, MA) usando um laser de nitrogênio (337 nm). Amostras de proteínas foram usadas sem dessalinização ou des- salinizadas usando extração em fase sólida na forma de ponteiras de pipeta C4 ZipTip® (Millipore, Bedford MA). As ponteiras de pipeta foram umedecidas com acetonitrila-água (1: 1 v/v) e equilibradas com ácido trifluoroacético a 0,1% (TFA) antes de uso. As ponteiras de pipeta foram, então, carregas através de extração e expelindo 10 μL de amostra da pipeta três vezes. A amostra carregada foi lavada três vezes com 10 μL de TFA a 0,1%. Amostras de proteína dessalinizadas foram eluídas da pipeta com 10 μL de acetonitrila para água (1: 1 v/v). As amostras foram colocadas através de mistura de 1 μL de amostra ( dessalinizada ou contendo tampão) com 1 μL de solução de matriz e colocando 1 μL da mistura sobre o alvo de aço inoxidável. A solução de matriz era uma solução saturada de ácido sinápico água para ace- tonitrila a 1:1 (v/v) contendo TFA a 0,1%. A mistura foi colocada sobre a lâmina de amostra para MALDI e deixada secar ao ar antes de ser colocada no espectrômetro de massa. Todas as amostra de proteínas foram analisadas no modo de íons linear positivo através de extração retardada usando uma tensão de aceleração de 20 kV e um tempo de retardo de 200 nano-segundos. Um total de 400 espectros pulso único ("single-shot") foi acumulado de cada amostra. Calibração externa foi obtida usando uma mistura de proteínas padrões contendo tripsinogê- nio (23982 m/z), Proteína A (44613 m/z) e albumina bovina (66431 m/z).
MALDI -TOF MS Análise de Peptídeos por MALDI-TOF/MS
[000795] A mistura de peptídeo foi separada através de cromatogra- fia de fase reversa e frações dos picos cromatográficos foram coletadas e evaporadas até secagem. A amostra foi reconstituída em 50 μL de tampão de fosfato a 25 mM, pH de 7,5. DTT foi adicionado para uma concentração final de 5 mM e as frações foram incubadas a 50°C durante 20 minutos. Após redução, IAM foi adicionada para uma concentração final de 10 mM e incubada no escuro a 50°C durante mais 20 minutos.
[000796] Os espectros de MALDI-MS foram adquiridos sobre um OmniFlex (Bruker Daltonics, MA) usando um laser de nitrogênio (337 nm). As amostras foram preparadas através de mistura de 1 μL de amostra com 1 μL de solução de matriz. A solução de matriz era uma solução saturada de ácido a-ciano-4-hidróxicinâmico em água: aceto- nitrila a 1:1 com TFA a 0,1%. A mistura foi colocada sobre a cavidade da lâmina para amostra de MALDI e deixada secar ao ar antes de ser colocada no espectrômetro de massa. Todos os peptídeos foram ana-lisados no modo de íons positivo refletivo através de extração retardada usando uma tensão de aceleração de 20 kV e um tempo de retardo de 200 nano-segundos. Um total de 100 espectros pulso único foi acumulado de cada amostra. Calibração externa foi obtida usando uma mistura de peptídeos padrões contendo angiotensina II (1046,54 m/z), angiotensina I (1296,68 m/z), substância P (1347,74 m/z), bombe- sina (1619,82 m/z), ACTH clip 1-17 (2093,09 m/z), ACTH clip 18-39 (2465,20 m/z) e somatostatina (3147,47 m/z).
Exemplo 9: Análise dos efeitos de meios e constituintes de meio sobre espécies de CTLA4-Ig com cadeia simples e multiméricas
[000797] Dímero de CTLA4-Ig, uma subfração com baixo teor de ácido siálico, uma subfração com alto teor de ácido siálico, espécies de monômero frontal e monômero de CTLA4-Ig são preparadas e purificadas. Essas amostras são usadas em uma série de experimentos de modelamento projetados para determinar os efeitos dos meios e constituintes de meio sobre a formação de espécies com cadeia simples e espécies de elevado peso molecular durante tempos entre zero a pelo menos 60 horas. Os efeitos do tampão de formulação, iodoace- tamida, fosfato de sódio, cloreto de amônio, meio basal, caldo de fermentação, meio 177e, meio com solução I ácida concentrada, meio com solução II ácida concentrada, insulina, EDTA, cisteína, ácido lipói- co, glutationa, metionina e isolados de levedo sozinhos e em combinações são testados.
Exemplo 10: Análise de moléculas de CTLA4-Ig através do tamanho
[000798] Um método de cromatografia por exclusão de tamanho (SEG) o qual usa condições de desnaturação pode ser empregado para a quantificação de espécies de proteína de diferentes tamanhos. Em uma modalidade, o método de SEC aleatória usando condições de desnaturação pode ser empregado para a quantificação de espécies de CTLA4-Ig com cadeia simples. CTLA4-Ig com cadeia simples podem ser uma espécie carecendo da ligação em ponte de dissulfeto in- tercadeia. Espécies de CTLA4-Ig com cadeia simples isoladas durante o processo de purificação são referidas comos CTLA4-Ig de cadeia simples nativa. A cadeia simples purificada produzida através de redução e alquilação de dímero de CTLA4-Ig é referida como cadeia simples induzida. CTLA4-Ig de cadeia simples nativa e induzida têm as mesmas características. Materiais: Fosfato de potássio monobásico (KH2PO4), grau ACS Solução de hidróxido de potássio (KOH) a 45% peso/peso, grau ACS Cloreto de sódio (NaCl), grau ACS Pipeteador simples ajustável calibrado, 100 L Rainina, (Catálogo No. P-100) Água (H2O), grau para HPLC Frascos criogênicos de 2,0 mL Nalgene, (Catálogo No. 5000-0020) Ácido clorídrico concentrado (HCl) Fisher (Catálogo No. A144-212) Solução de hidróxido de sódio a 10N, (NaOH) J.T.Baker, (Catálogo No. 5674-02) 1000 mL de Unidade de filtro de 0,22 mm Corning, (Catálogo No.430517) Tubos de ensaio de polipropileno de 15 mL Falcon, (Catálogo No. 352097) Azida de sódio (NaN3), grau ACS Monoidrato de fosfato de sódio, monobásico (NaH2PO4^H2O) Péletes de hidróxido de potássio (KOH) Instrumentação e Condições Módulo de separação HPLC System Waters 2695 Coluna Toso Haas 5 μTSK 3000 SWXL, D.I. de 300 mm x 7,8 mm (Parte No. 08541) Coluna de proteção Toso Haas 5 μTSK 3000 SWXL, D.I. 40 mm x 6,0 mm I.D. (Parte No. 08543) Detector Waters 2487 Detector com comprimento de onda duplo Comprimento de onda 280 nm Taxa de fluxo 1 mL/min Sistema de integração Empower Volume de injeção 20 μL Conc. de ensaio Alvo. 10 mg/mL Fase móvel de KH2PO4 a 0,2M, NaCl a 0,9%, pH de 6,8 com KOH Tempo de operação do ensaio de 20 min Coluna em temperatura ambiente Temperatura da amostra 4°C Tempo de retenção de monômero 8,7 min ± 1,0 min, espécies de HMW a 7,5 min ± 1,0 min. Se presente, espécies de MW elui- rão após o pico monomérico.
Reagentes
[000799] Hidróxido de potássio a 4N (KOH a 4N) (100 mL)
[000800] Usar um dos seguintes preparados conforme descrito:
[000801] Adicionar 40 mL de água com grau para HPLC e 11,6 mL de solução a 45% peso/peso de KOH a um frasco volumétrico de 100 mL. Levar o volume para 100 mL com água com grau para HPLC.
[000802] Em um frasco volumétrico de 100 mL, adicionar 80 mL de água com grau para HPLC, pesar 22,4 gramas de péletes de KOH e agitar magneticamente até completamente dissolvida. Compor o volume de 100 mL com água com grau para HPLC.
[000803] Transferir a solução para uma garrafa de reagente de vidro de 250 mL. Misturar bem através de inversão. Armazenar em temperatura ambiente durante até 1 ano.
Fase móvel (KH2PO4 a 0,2 M, NaCl a 0,9%, pH 6,8)
[000804] Pesar 27,2 gramas de KH2PO4 e 9,0 gramas de NaCl em um béquer de 1000 mL. Dissolver os sólidos em 800 mL de água com grau para HPLC usando mistura contínua com uma barra de agitação.
[000805] Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para 6,8 usando solução de KOH a 4N. Se o pH excede 6,8, ajustar com HCl concentrado.
[000806] Levar o volume final para 1 litro usando um cilindro graduado de 1000 mL. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μm.
[000807] Transferir para uma garrafa de reagente de vidro de 1000 mL e submeter a ultra-som enquanto desfasseifica a vácuo durante 5 +/- 1 minuto. Desgasseificar antes de cada uso.
[000808] Armazenar em temperatura ambiente durante até 1 mês.
Hidróxido de sódio a 2N (NaOH a 2N)
[000809] Transferir 20 mL de NaOH a 10N para um cilindro de vidro graduado de 100 mL.
[000810] Levar o volume para 100 mL com água para HPLC.
[000811] Transferir a solução para uma garrafa de reagente de vidro de 250 mL. Misturar bem através de inversão. Armazenar em temperatura ambiente durante até 1 ano.
[000812] Pesar 3,45 gramas de NaH2PO^H2O e 2,92 gramas de NaCl e dissolver com mistura com uma barra de agitação em 900 mL de água com grau para HPLC. Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para 7,4 com NaOH a 2N. Se o pH excede a 7,4, ajustar com HCl concentrado.
[000813] Levar o volume final para 1 litro usando um cilindro graduado de 1000 mL. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μm.
[000814] Armazenar a 2°C - 8°C durante até 6 meses.
Tampão de armazenamento de coluna (NaN3 a 0,05% peso/v em Água)
[000815] Pesar 50 ± 5 mg de azida de sódio e adicionar a mesma a um béquer de 1000 mL com uma barra de agitação magnética.
[000816] Adicionar 500 mL de água com grau para HPLC ao béquer e agitar até completamente dissolvida.
[000817] Levar o volume para 1 L com água. Filtrar a solução através de uma unidade com filtro de 0,22 μm e entornar em uma garrafa de reagente de HPLC de 1000 mL.
[000818] Armazenar em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Preparo de Espécies de elevado peso molecular e Padrão de Adequabilidade de Sistema
[000819] Isso proporcionará uma diluição a três de Material de Referência de CTLA4-Ig aquecido a não aquecido e uma quantidade de espécies de elevado peso molecular com uma área percentual de 15% - 30%. Em um tubo de ensaio Falcon de 15 mL, preparar aproximadamente 3 mL de Material de Referência a 10,0 ± 1,0 mg/mL usando tampão de diluição de CTLA4-Ig. A concentração inicial de CTLA4-Ig é do COA. Fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir desse valor. Transferir 1,0 mL do Material de Referência diluído, feito em um frasco criogênico, para um criofrasco de 2,0 mL usando uma pipeta de 1 mL e aquecer em um banho de água a 67°C ± 2°C durante 45 ± 2 minu- tos. Transferir o Material de Referência aquecido feito antes para o tubo de ensaio de 15 mL usando uma pipeta de 1 mL. Gentilmente pipetear para cima e para baixo um volume de 1 mL dos conteúdos do tubo de ensaio para um total de 10 vezes. Esse é o Padrão de Adequa- bilidade de Sistema.
[000820] Condições de armazenamento: Preparar alíquotas de 150 μL do Padrão de Adequabilidade de Sistema em criofrascos de 2,0 mL para armazenamento a -80 ± 5°C durante até 1 ano. Obter a concentração inicial de Material de Referência e fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir desse valor. Usar um mínimo de 100 μl de Material de Referência e uma quantidade apropriada do tampão de diluição para obter a concentração final de 10,0 ± 1,0 mg/mL. Referi-se à seguinte equação para diluições:
Figure img0040
[000821] Para Substância de Fármaco de CTLA4-Ig, fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir da concentração de proteína usando um mínimo de 100 μL. Transformar em alíquotas de amostra e uma quantidade apropriada do tampão de diluição para obter uma concentração final de 10,0 ±1,0 mg/mL. Refira-se à seguinte equação para diluições:(0,1 mL x 50 mg/mL) - 0,1 mL = 0,4 mL de tampão de diluição 10 mg/mL
[000822] Uma vez diluída para 10,0 ± 1,0 mg/mL, as amostras podem ser armazenadas a 2°C - 8°C durante até 24 horas. Para Produto de fármaco de CTLA4-Ig, fazer a diluição a 10,0 ± 1,0 mg/mL a partir da concentração de proteína usando um mínimo de 200 μL. Transformar em alíquotas de amostra e uma quantidade apropriada do tampão de diluição para obter a concentração final de 10,0 ± 1,0 mg/mL. Refi- ra-se à seguinte equação para diluições: (0,2 mL x 25 mg/mL) - 0,2 mL = 0,3 mL de tampão de diluição 10 mg/mL
[000823] Colocar a fase móvel em um reservatório de solvente e água com grau para HPLC em outro. Submeter a ultra-som e desgas- seificar a vácuo antes de operação. Ligar o detector e permitir 15 minutos para aquecer antes da operação. Antes que uma nova coluna ou a atual seja usada para análise, submeter a coluna a fluxo com água com grau para HPLC durante pelo menos 20 minutos, seguido por equilíbrio com tampão de fase móvel durante pelo menos 20 minutos. Usar uma taxa de fluxo de 1,0 mL/min. Descongelar a 150 μL. Transformar em alíquotas de Padrão de Adequabilidade de Sistema, adicionar ao frasco para o amostrador automático e colocar o frasco no amostrador automático. Injetar 20 μL do padrão sob as condições.
[000824] Determinar o percentual de Espécies de elevado peso molecular que elui a aproximadamente 7,5 minutos de acordo com a seguinte fórmula: (na fórmula abaixo, Monômero, na verdade, se refere a dímero.)
Figure img0041
[000825] onde:
[000826] A = área de pico de espécies de elevado peso molecular
[000827] B = área de pico de monômero
[000828] A área percentual de Espécies de elevado peso molecular não deverá ser de menos do que 15%. Se ela é menor do que 15%, adicionar espécies de elevado peso molecular concentradas extra ao Padrão de Adequabilidade de Sistema acima.
[000829] Resolução (R). Determinação e avaliação de tempo de retenção. Injetar 20 μL de Padrão de Adequabilidade de Sistema. Cal- cular a resolução entre as espécies de elevado peso molecular (tempo de retenção de aproximadamente 7,5 minutos) e o pico de monômero (tempo de retenção de aproximadamente 8,7 minutos) usando a seguinte equação: (na fórmula abaixo, "monômero", na verdade, se refere a dímero).
Figure img0042
[000830] onde:
[000831] t1 = tempo de retenção das espécies de elevado peso molecular
[000832] t2 = tempo de retenção de monômero
[000833] W1 = largura de pico de espécies de elevado peso molecular
[000834] W2 = largura de pico de monômero
[000835] A largura de pico é medida em minutos na base do pico após extrapolação dos lados relativamente retos do pico para a linha de base. O tempo de retenção e largura de pico são medidos nas mesmas unidades. Em uma modalidade, (R) deve ser > 1,2 e o tempo de retenção para o pico deverá ser 8,7 ± 1,0 minutos.
Determinação do número de placas teóricas (N)
[000836] A partir do cromatograma de Padrão de Adequabilidade de Sistema, determinar a eficiência da coluna calculando o número de placas teóricas (N) de acordo com a seguinte equação:
Figure img0043
[000837] onde:
[000838] t = é o tempo de retenção de monômero (em minutos)
[000839] w = é a largura (em minutos) na linha de base do monôme- ro obtido através de extrapolação dos lados do pico para a linha de base
[000840] Um total de seis (6) injeções de material de CTLA4-Ig será feito. Transformar em alíquotas de 200 μL de de material de Referência a 10 mg/mL em um frasco para amostrador automático e colocar o frasco no amostrador automático e injetar seis vezes. Processar os cromatogramas e calcular a área de pico de dímero para cada croma- tógrafo. Somar as áreas de pico de dímero dos seis cromatógrafos e calcular a média, desvio-padrão e RSD % de acordo com as seguintes equações:
Figure img0044
[000841] onde:
[000842] Xi,2, 3 = um valor específico em um conjunto de dados
[000843] nx = um conjunto de valores (x)
[000844] 5.4.4.2 Calcular o desvio-padrão como segue:
Figure img0045
[000845] onde:
[000846] n = número de valores (x) em um conjunto de dados
[000847] x = um valor em um conjunto de dados
[000848] 5.4.4.3 Calcular o desvio-padrão relativo % (RSD) como segue:
Figure img0046
Exemplo de uma sequência de injeção:
Figure img0047
Figure img0048
Integração de Picos
[000849] Integrar todas as áreas de pico no cromatograma de 5,5 a 11,8 minutos. Ampliar a linha de base do cromatograma para assegurar que a área total de todas as espécies LMW e HMW são incluídas na integração. Desconsiderar picos na amostra que correspondem aos picos no controle. O pico de volume de inclusão (11,8-13,5 minutos) e picos posteriores não são considerados nesse cálculo. Contudo, se a área no volume de inclusão é 0,1% ou maior do que a área total, ela deverá ser anotada. O pico de dímero elui a 8,7 ± 1,0 minutos, o pico de espécies de elevado peso molecular elui a 7,5 ± 1,0 minutos e as espécies de baixo peso molecular (por exemplo, monômero, se presentes) eluirão após o pico de dímero. Qualquer outro pico que não as espécies de elevado peso molecular, dímero ou espécies de baixo peso molecular que tem absorbância a 280 nm acima de 0,1% de área da área total de pico deverá ser anotado. Calcular a área percentual como segue:
[000850] (A referência ao "monômero de Abatacept" nesse Exemplo se refere a dímero de CTLA4-Ig).
Figure img0049
[000851] onde:
[000852] A = área de pico de monômero de abatacept
[000853] B = área total de todos os picos com tempos de retenção menores do que o monômero de abatacept
[000854] C = área total de todos os picos com tempos de retenção maiores do que o pico de monômero de abatacept (excluindo volume de inclusão)
[000855] Amostras foram separadas através de cromatografia por exclusão de tamanho usando um Water's Alliance® 2695 (Milford, MA) sobre duas colunas 7,8 x 300 mm TSK Gel G3000SWXL® (Tosoh Biosep, Montgomery, PA) colocadas em série empregando uma coluna de proteção de 6,0 x 40 mm. 25 microlitros de cada amostra purificada foi injetados e separados sob condições isocráticas usando Na2HPO4 0,1M , Na2SO4 a 0,1M, pH de 6,8 a 1,0 mL/min. Amostras foram detectadas a 280 nm usando um detector 996 PDA (conjunto de fotodiodo) (Waters, Milford, MA) e analisadas usando um software de cromato- grafia Millennium 4.0® (Waters, Milford, MA).
[000856] Os cromatogramas sobrepostos de material com cadeia simples nativo e induzido da cromatografia por exclusão de tamanho aleatória analítica desnaturante mostram um tempo de retenção médio (6 réplicas) de 27,96 ± 0,02 e 27,99 ± 0,02, respectivamente. Descobriu-se que a área média de pico para cadeia simples nativa era de 495525,0 ± 9589,6 e, para cadeia simples induzida, era de 463311,8 ± 7997,2 (Tabela 13). Os espectros sobrepostos de MALDI-TOF de material de cadeia simples nativo e induzido têm picos que são muito amplos, com uma largura na linha de base cerca de 15000 unidades de massa. Isso é esperado em virtude da heterogeneidade da glicosilação em ambas as amostras. O ponto de ápice do pico de cadeia simples em cada espectro de massa foi usado para calcular a massa média. As massas médias para CTLA4-Ig com cadeia simples nativa e induzi- da são de 45694,426 ± 297,735 e 45333,086 ± 264,778 unidades de massa, respectivamente, baseado na análise de seis réplicas (Tabela 14). Espera-se que a massa da cadeia simples nativa seja maior do que aquela da cadeia simples induzida, porque sobre a cadeia simples nativa há uma cisteína extra (massa do resíduo de 103 Dáltons) sobre Cys146 de SEQ ID NO: 2, enquanto que a cadeia simples induzida é um resultado de redução seletiva de uma única ligação em ponte de dis- sulfeto intercadeia, seguido por alquilação, que adiciona um grupo acetila (massa de 58 Dáltons).
[000857] Esses dados mostram que os materiais nativos e induzidos produzem resultados equivalentes através de cromatografia SEC des- naturante aleatória e análise por MALDI-TOF. Esses resultados de-monstram a comparabilidade entre os materiais de CTLA4-Ig com cadeia simples nativos e induzidos. Tabela 13: Dados de HPLC SEC de cadeia simples nativa e induzida
Figure img0050
Tabela 14: Dados de Espectrometria de massa MALDI-TO F de cadeia simples nativa e induzida
Figure img0051
Figure img0052
[000858] A presença de cisteínas dentro de uma cadeia polipeptídica permite a formação de ligações de dissulfeto, as quais podem ser in- tramoleculares ou intermoleculares, levando à formação de complexos de proteínas diméricas ou multiméricas. A CTLA4-Ig existe como um dímero (em que o dímero é composto de dois monômeros tendo qualquer uma das seguintes sequências: (i) 26-383 de SEQ ID NO: 2, (ii) 26-382 de SEQ ID NO: 2; (iii) 27-383 de SEQ ID NO: 2, (iv) 26-382 de SEQ ID NO: 2), (v) 25-382 de SEQ ID NO: 2 e (vi) 25-383 de SEQ ID NO: 2) mantidas juntas através de uma ligação de dissulfeto entre C146 sobre cada cadeia. A redução dessa ligação de dissulfeto pode resultar na formação de duas cadeias de proteína equivalentes mantidas juntas através de forças eletrostáticas não covalentes. Quando submetida a condições de desnaturação que sobrepujam ou superam as forças eletrostáticas de atração, tal CTLA4-Ig pode dissociar completamente, resultando em duas estruturas de proteína idênticas de aproximadamente 46 kDa. A estrutura resultante é referida como cadeia simples ou monômero. A presença da cadeia simples pode ser monitorada através de cromatografia por exclusão de tamanho em coluna aleatória operando sob condições de desnaturação.
[000859] Uma subpopulação de moléculas de CTLA4-Ig contém uma modificação sobre Cys146: a ligação de dissulfeto presente na maioria da população é trocada para um aminoácido de cisteína livre (referido como cisteinilação). O dímero de CTLA4-Ig é predominantemente uma proteína com um peso molecular de aproximadamente 92.000. Ele é compreendido de duas cadeias polipeptídicas glicosiladas as quais são mantidas juntas através de uma ligação de dissulfeto intercadeia em Cys146 e interações não covalentes (também referida como "díme- ro" de CTLA4-Ig). A proteína purificada existe como uma população heterogênea e contém modificações, tais como glicosilações e varia- ções nos N- e C-términos.
[000860] Uma população distinta de moléculas de CTLA4-Ig existe, a qual carece da ligação de dissulfeto intercadeia. Essa população não- covalentemente ligada existe dentro do pico de dímero frontal gerado através de cromatografia por exclusão de tamanho. Descobriu-se que o dímero frontal carece da ligação de dissulfeto intercadeia. As espécies de CTLA4-Ig as quais carecem da ligação de dissulfeto interca- deia são modificadas através de cisteinilação em Cys146, modificação a qual ocorre sobre >99% das espécies com cadeia simples, baseado em dados por ESI-MS intacta. Cisteinilação em Cys146 e o enriquecimento de carboidratos O-ligados são as duas principais modificações sobre as espécies de CTLA4-Ig com cadeia simples. O dímero frontal é submetido a uma cromatografia por exclusão de tamanho desnatu- rante, resultando em isolamento do pico de CTLA4-Ig com cadeia simples. O material monomérico frontal purificado foi comparado com CTLA4-Ig com e sem extração em fase sólida (SPE) e analisado sobre MALDI. O monômero frontal purificado contém duas espécies dominantes: uma espécie principal a 47005 u para SPE-tratado ou 46897 u para não-tratado; uma espécie menor a 95070 u para SPE-tratado ou 96172 u para não-tratado. O material de CTLA4-Ig também contém duas espécies dominantes: uma espécie principal a 91518 u para SPE-tratado ou 91143 u para não-tratado; uma espécie menor a 45660 u para SPE-tratado ou 46014 u para não-tratado.
Figure img0053
[000861] A composição de CTLA4-Ig, em uma modalidade, tem as seguintes características quando de análise por Homogeneidade de Tamanho (HPLC) de dímero, espécies de elevado MW e espécies de baixo MW (monômero, cadeia simples): • ≥97,0% de Dímero • ≤2,0% de espécies de HMW • ≤ 0,5% de espécies de LMW (por exemplo, monômero, cadeia simples)
[000862] Em outra modalidade, a composição de CTLA4-Ig tem as seguintes quantidades características de cada espécie: • ≥95,5% de dímero • ≤3,0% de espécies de HMW • ≤ 0,5% de espécies de LMW (por exemplo, monômero, cadeia simples) Sumário de análise por SE-HPLC de Processo com lotes de CD-CHO1
Figure img0054
[000863] O percentual de monômero oscilava de 98,4 a 99,8%, com um valor médio de 99,4% para Substância de Fármaco fabricada usando o Processo com CD-CHO1. O percentual de espécies de HMW variava de 0,2 a 1,6%. O valor médio foi de 0,6%, com um CV de 45,7%. O intervalo de tolerância de 95% foi >98,7% para o dímero e <1,3% para as espécies de HMW. O percentual de espécies de HMW dos lotes variava de um valor mínimo de 0,4% para um valor máximo de 2,1%. O percentual médio de espécies de HMW foi de 0,8%, com um CV % de 40%. Em todos os casos, as espécies ou mo- nômeros de LMW estavam abaixo do limite de detecção (DL = 0,1%). O intervalo de tolerância de 95% (proporciona cobertura para 99% da área da população) para CTLA4-Ig fabricada do processo com CD- CHO1 foi <1,3 e <1,8%, respectivamente, para as espécies de HMW. Os intervalos de tolerância de 95% para o dímero na Substância de Fármaco do Processo com CD-CHO1 foram de 98,7% e 96,5%, res-pectivamente. Sumário de dados combinados para CTLA4-Ig
Figure img0055
[000864] A Tabela acima mostra que o percentual de espécies de HMW oscilava de 0,2 a 2,1%, com uma média de 0,6%. O dímero oscilava de 94,8% a 99,8%, com um valor médio de 99,3% e uma precisão de 0,3%. A variação entre-sítio, dentro do-sítio e variação de sítio total para o dímero estava dentro de 0,3 a 0,5%. A variação entre sítio para a HMW foi de 26,4%. A variação dentro do-sítio e sítio-total para as espécies de HMW foram de 44,2 e 51,4%, respectivamente. O intervalo de tolerância de 95% para o dímero (97,3%) e as espécies de HMW (1,8%) estavam dentro da especificação.
EXEMPLO 11: Construção de Vetor
[000865] Construção do vetor de expressão pcSD: O vetor de ex-pressão, pcSD, foi construído a partir do vetor pcDNA3 comercialmente disponível (Invitrogen, Carlsbad, CA) conforme mostrado na figura 28. O cassete do gene de resistência à neomicina foi removido do plasmídeo pcDNA3 através de digestão com a endonuclease de restrição Nae I. A endonuclease de restrição Nae I cria extremidades cegas. Os fragmentos de DNA foram separados através de eletroforese em gel de ágarose e a parte principal do vetor pcDNA3 de 3,821 kb foi purificada do gel. O fragmento de DNA contendo o gene que codifica reductase de di-hidrofolato de camundongo (dhfr) e um promotor de SV40 foram isolados do plasmídeo pSV2-dhfr através de digestão do plasmídeo com as endonucleases de restrição Pvu II e BamH I. O fra-gmento de 1,93 kb correspondendo ao cassete do gene dhfr foi separado e purificado através de eletroforese em gel de ágarose. As extremidades cortadas 3' geradas através de digestão com BamH I foram enchidas usando o fragmento Klenow de DNA polimerase I para gerar extremidades cegas. Esse fragmento isolado foi ligado na parte principal do vetor pcDNA3 de 3,8 kb com extremidade cega para criar o vetor de expressão pcSD. Esse vetor de expressão tem as seguintes características: um promotor de citomegalovírus (CMV), seguido por um sítio de clonagem múltipla, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BGH) e uma sequência de término de transcrição, uma sequência de cDNA de dhfr de camundongo para seleção e amplificação e um gene de resistência à ampicilina e a origem de replica- ção pUC para seleção e manutenção em Escherichia coli.
[000866] Construção do vetor de expressão pcSDhuCTLA4-Ig: Um fragmento de DNA de 1,2 quilobase (kb) contendo uma sequência que codifica uma proteína de CTLA4-Ig foi isolado do plasmídeo pCDM8-CTLA4-Ig através de digestão com as enzimas de restrição Hind III e Xba I. O fragmento de 1,2 kb Hind III/Xba I foi ligado no vetor piLN previamente digerido com as enzimas de restrição Hind III e Xba I. A estrutura de plasmídeo resultante, designada piLN-huCTLA4- Ig, é mostrada na figura 21. O plasmídeo piLN-huCTLA4-Ig foi usado como a fonte da sequência de codificação de CTLA4-Ig usada na construção do vetor de expressão final pcSDhuCTLA4-Ig.
[000867] O vetor final para expressão do gene de CTLA4-Ig foi construído conforme mostrado na figura 29. Um fragmento de DNA de 1,2 kb contendo o gene de CTLA4-Ig foi isolado do plasmídeo piLN- huCTLA4-Ig através de um procedimento de digestão por restrição com duas etapas. O plasmídeo piLN-huCTLA4-Ig foi primeiro digerido com a enzima de restrição Hind III. As extremidades cortadas 3-prime resultantes foram enchidas através de tratamento com o fragmento Klenow de DNA polimerase I. O plasmídeo foi, então, digerido com a enzima de restrição Xba I para liberar o fragmento de 1,2 kb contendo o gene de CTLA4-Ig. Esse fragmento foi purificado e ligado aos fragmentos EcoR V e Xba I isolados da digestão por restrição de pcSD. Os sítios de restrição EcoR V e Xba I estão localizados no sítio de clonagem múltipla do pcSD entre o promotor de CMV e um cassete contendo o sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino e sequência de término de transcrição. Isso colocou o fragmento do gene de CTLA4-Ig sob o controle do promotor de CMV. Esse plasmídeo é designado pcSDhuCTLA4-Ig e compreende SEQ ID NO: 1.
Exemplo 12: Transfecção de vetor de expressão de CTLA4-Ig para obter Linhagens de células estáveis
[000868] Esse Exemplo e o Exemplo 13 descrevem uma população recentemente transfectada de células da qual clones individuais foram selecionados e expandidos e, assim, os clones expandidos são diferentes das células depositadas na ATCC como N°. de Acesso CRL- 10762. A linhagem de células de CHO anterior trazendo um vetor de expressão contendo DNA que codifica a sequência de aminoácido correspondendo à CTLA4-Ig (DNA tendo Número de Acesso à ATCC 68629) é descrita na Patente U.S. N° 5.434.131. Resumidamente, um plasmídeo de expressão (por exemplo, pCDM8) contendo cDNA que foi depositado sob No. de Acesso ATCC 68629, foi transfectado através de lipofecção usando procedimentos-padrão em células de CHO dhfr negativas para obter linhagens de células que expressam esta- velmente CTLA4-Ig. Seleção de linhagens de células de CHO B7 positivas com relação à atividade de ligação a B7 no meio usando imu- nocoloração resultou em um transfectante estável que expressa CTLA4-Ig. Essa população heterogênea de células transfectadas foi designada a linhagem de células de Ovário, CTLA4-Ig-24, e foi deposita na ATCC sob o Tratado de Budapeste em 31 de Maio de 1991 tendo Número de Acesso à ATCC CRL-10762.
[000869] A linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês, DG44, contém uma deleção do gene que codifica a enzima reductase de di- hidrofolato. O plasmídeo de expressão pcSDhuCTLA4-Ig contém uma cópia do gene de reductase de di-hidrofolato (dhfr). Inserção do plas- mídeo pcSDhuCTLA4-Ig no genoma de DG44 resulta em complemen- tação funcional da deleção do dhfr. Essa complementação funcional pode ser usada para a seleção de transfectantes na presença de me- totrexato (MTX) e amplificação de dhfr e genes adjacentes.
[000870] A linhagem de células 1D5 que secreta CTLA4-Ig humana foi construída através de transfecção da linhagem de células DG44 com o plasmídeo de expressão pcSDhuCTLA4-Ig, conforme mostrado na figura 29. O DNA de plasmídeo foi introduzido em células DG44 através de eletroporação usando procedimentos-padrão conhecidos na técnica. Transfectantes foram selecionados usando um meio mínimo essencial (MEM; JRH Biosciences, Inc., Kansas) suplementado com Soro Bovino Fetal a 5% (v/v) submetido à diálise. Sobrenadantes de cultura dos transfectantes foram selecionados com relação à produção de IgG humana usando um método ELISA em sanduíche. Um anticorpo anti-IgG humana de bezerro Fc-específico foi usado como o anticorpo de captura. Anticorpo anti-IgG humana de bezerro conjugado à peroxidase de rábano-silvestre foi usado para detectar a IgG humana. Transfectantes expressando altos níveis do gene de CTLA4-Ig humana foram selecionados para amplificação adicional.
[000871] Amplificação de gene dos transfectantes selecionados foi realizada através da adição de MTX ao meio de cultura em uma con-centração final de 100 nM. MTX é um análogo de ácido fólico que atua vez um inibidor competitivo de reductase de di-hidrofolato. Adição de MTX ao meio permitiu seleção de transfectantes contendo múltiplas cópias do gene dhfr e níveis elevados de reductase de di-hidrofolato. Transfectantes também contendo múltiplas cópias de do gene de CTLA4-Ig adjacente foram identificados usando o método ELISA específico para IgG humana. Um clone que produz CTLA4-Ig, designado 1D5, foi selecionado para desenvolvimento adicional, em parte descrito no Exemplo 13.
Exemplo 13: Subclonagem de Células Transfectadas estáveis
[000872] A linhagem de células 1D5 foi submetida à clonagem em ágar macio. Subclones derivados da clonagem em ágar macio foram analisados com relação à produção de IgG humana usando o método ELISA. Subclones selecionados foram avaliados quanto à produção de CTLA4-Ig e propriedades de crescimento. O subclone protótipo, designado 1D5-100A1, foi selecionado.
[000873] A linhagem de célula 1D5-100A1 foi adaptada a partir de meio DE (JRH Biosciences, Inc., Kansas, o qual contém matérias primas originárias de animal, para um meio quimicamente definido designado CD-CHO (Tabela 15). Meio CD-CHO é um meio isento de componente animal patenteado fabricado pela Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA. Tabela 15:Composição de Meio Y de Processo
Figure img0056
[000874] A linhagem de célula 1D5-100A1 foi cultivada e passada em meio DE de acordo com um protocolo padrão de cultura tecidual. As células foram, então, transferidas para um meio composto de 50% de meio DE e 50% de meio CD-CHO. Após várias passagens nesse meio, as células foram transferidas para T-frascos contendo 100% de meio CD-CHO. As células foram desenvolvidas em 100% de meio CD- CHO durante várias passagens. As células adaptadas foram, então, submetidas à clonagem através de diluição limitativa.
[000875] Células da linhagem de célula 1D5-100A1 CD-CHO- adaptada foram clonadas através de diluição limitativa usando meio isento de soro. As células 1D5-100A1 foram cultivadas em um alvo de 1 célula/cavidade em lâminas de microtitulação com 96 cavidades contendo meio MCDB suplementado. MCDB é uma formulação de meio quimicamente definida distribuída pela Sigma-Aldrich, St. Louis, MO. O meio MCDB foi suplementado com glutamina a 4 mM, 500 μg/mL de insulina humana recombinante, MTX a 100 nM e meio condicionado a 10%. O meio condicionado era um sobrenadante esterilizado em filtro de uma cultura da linhagem de célula 1D5-100A1 CD-CHO adaptada desenvolvida em meio MCDB.
[000876] Cavidades contendo uma única colônia foram identificadas e os clones avaliados quanto à produção de CTLA4-Ig usando o método ELISA. Clones selecionados foram expandidos de lâminas de mi- crotitulação com 96 cavidades para lâminas de cultura de células com 6 cavidades. As culturas foram ainda expandidas em T-frascos de 25 cm2 e, então, em garrafas giratórias.
[000877] As culturas na garrafa giratória foram avaliadas quanto à titulação de CTLA4-Ig, teor de ácido siálico em CTLA4-Ig e crescimento. Três clones foram selecionados para avaliação adicional em Bior- reatores e caracterização adicional. Estoque de pesquisa do frasco congelado da linhagem de célula clonal 1D5-100A1,17 armazenado a - 80°C foi usado para gerar um banco de célula.
Exemplo 14: Produção de CTLA4-Ig em Biorreatores via um processo com alimentação em batelada
[000878] Cultura em escala comercial de Células de mamífero em suspensão Expressando CTLA4-Ig: Esse Exemplo descreve a produção de moléculas de CTLA4-Ig compreendendo monômeros de SEQ ID NO: 2, a partir de células de CHO dhfr-negativas cultivadas em suspensão. Os métodos descritos nesse Exemplo podem ser adaptados e estendidos para a produção de outras proteínas recombi- nantes incluindo, mas não limitado a, proteínas secretadas tais como citocinas e outros hormônios, proteínas secretadas que são membros da superfamília Ig ou compreendem uma porção de uma proteína da superfamília Ig e geralmente qualquer proteína expressa em células de CHO. Um fluxograma de processo para as etapas de cultura de CTLA4-Ig é mostrado na figura 10.
[000879] Os frascos de cultura (por exemplo, T-175 e Frascos de Er- lenmyer), garrafas giratórias e sacos para célula foram usados para as etapas de expansão de inóculo do processo de cultura de CTLA4-Ig para propágar serialmente células de um frasco congelado para proporcionar um número suficiente de células viáveis para inocular um biorreator de 20.000 L.
[000880] Um único frasco de células é removido da fase vapor de um congelador de armazenamento de nitrogênio líquido e descongelado em um banho de água a 37°C. Os conteúdos todos do frasco são as- septicamente transferidos para um tubo para centrífuga cônico de 15 mL estéril. Meio CD-CHO é adicionado para levar o volume final para 10 mL. A célula suspensa é centrifugada, o sobrenadante descartado e o pélete de célula ressuspenso em 10 mL de Meio de cultura de células CD-CHO. As células ressuspensas são transferidas para um frasco T-175 contendo 10 mL de Meio CD-CHO. A densidade de células viáveis e a viabilidade percentual da cultura no frasco T-175 são determinadas. Um critério para a viabilidade percentual nessa etapa de > 84% foi estabelecido. Meio CD-CHO é adicionado ao frasco T- 175 para obter uma densidade-alvo de células viáveis de 1,7-2,6 x 105 células/mL.
[000881] O frasco T-175 é incubado a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo de quatro dias para obter um número de células final alvo de > 6 x 106 células viáveis. Após a etapa com frasco T-175, a cultura é expandida usando uma série de fracos para agitador, garrafas giratórias de 1 L e 2 L, conforme mostrado na figura 10. Em cada passagem, as células são cultivadas em uma densidade-alvo de 2,0 x 105 células viáveis/mL, em que as culturas são direcionadas para ter uma viabilidade celular de cultura final >80%. As culturas são incubadas em Meio CD-CHO a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo de quatro dias.
[000882] Expansão da cultura ocorre em uma série de sacos para célula (20 L, 100 L e 200 L) de forma a inocular adicionalmente um biorreator de 1000 L. Material de cultura de célula da etapa de expansão de inóculo em garrafas giratórios de 2 L é empoçado para inocular um saco de célula de 20 L em uma densidade de cultura-alvo de 2,0 x 105 células viáveis/mL. Uma condição para a densidade final de células viáveis na etapa de expansão de inóculo em garrafa giratória de 2 L de 1,0 a 2,0 x 106 células/mL e uma viabilidade celular percentual mínima de > 80% foi estabelecida. Quando de inoculação, a cultura em saco de célula de 20 L é incubada em Meio CD-CHO a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo de quatro dias. Para cada subsequente passagem (sacos para célula de 100 L e 200 L), as células são cultivadas em uma densidade-alvo de 2,0 x 105 células viáveis/mL, em que as culturas são direcionadas para ter uma viabilidade celular de cultura final >80%. As culturas são incubadas em Meio CD-CHO a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo de quatro dias. Valores exemplificati- vos para a densidade final de células viáveis expansão etapa de inócu- lo em saco de célula de 20 L, 100 L e 200 L de 1,0 a 2,0 x 106 célu- las/mL e uma viabilidade celular percentual mínima de > 80% foram estabelecidos. Esses valores exemplificativos asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado para inocular o biorreator de 1000 L.
[000883] O objetivo das etapas de expansão de inóculo em biorrea- tor de cultura de 1000 L e 4000 L do processo com CTLA4-Ig é proporcionar um número suficiente de células viáveis para inocular o bior- reator de produção de 20.000 L.
[000884] Os biorreatores de cultura são operados no modo em batelada usando Meio de cultura de células CD-CHO. A temperatura, pH, oxigênio dissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo de gás para ar, oxigênio e dióxido de carbono são controladas através de um sistema de controle distribuído (DCS) e proporcionam condições para crescimento ótimo da cultura nos biorreatores de cultura. Os biorreatores de cultura são operados a 37°C. Amostras de cultura são removidas dos biorreatores de cultura para a determinação de densidade de células viáveis, viabilidade percentual e concentrações de metabólito.
[000885] O biorreator de cultura de 1000 L é inoculado com inóculo da etapa de expansão em saco de célula de 200 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 1,0 a 3,0x105 células viáveis/mL. a cultura é incubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 5 dias. Valores exemplificativos para a densidade final de células viáveis etapa de expansão de inóculo no biorreator de cultura de 1000 L é de 1,0 a 2,0 x 106 células/mL e a viabilidade celular percentual mínima é > 80%.
[000886] O biorreator de cultura de 4000 L é inoculado com inóculo da etapa de expansão no biorreator de cultura de 1000 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 1,0 a 3,0x105 células viá- veis/mL. A cultura é incubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 6 dias. Valores exemplificativos para a densidade final de células viáveis na etapa de expansão de inóculo no biorreator de cultura de 4000 L é de 1,0 a 2,0 x 106 células/mL e a viabilidade celular percentual mínima é > 80%. Esses valores exemplificativos asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado para inocular o biorreator de produção de 20.000 L.
[000887] O biorreator de cultura de 20.000 L é inoculado com inóculo da etapa de expansão no biorreator de cultura de 4000 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 1,0 a 1,8 x105 células viá- veis/mL. A cultura é incubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 6 dias. Valores exemplificativos para a densidade final de células viáveis na etapa de expansão no biorreator de cultura de 20.000 L é de 1,0 a 2,0 x 106 células/mL e a viabilidade celular percentual mínima é > 80%. Esses valores exemplificativos asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado antes de iniciar a fase de produção no biorreator de produção de 20.000 L.
[000888] Produção em escala comercial de CTLA4-Ig: A fase de produção da presente invenção que ocorre em um biorreator de produção de 20.000 L produz proteína de CTLA4-Ig em alta quantidade e alta qualidade, o que envolve operações de cultura tendo um desvio de temperatura em duas etapas. A cultura de 20.000L que é incubada em Meio CD-CHO a 37°C durante um máximo de 6 dias (conforme descrito acima) é submetida a um desvio de temperatura (T-desvio) de 37°C para 34°C no dia 6 (o final da fase de crescimento logarítmico). Doze horas após o desvio de temperatura de 37°C para 34°C, Meio CD-CHO é suplementado com um meio de alimentação eRDF modificado (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA; Tabelas 16, 17) e essa alimentação é fornecida diariamente ao reator de produção como um bolo (1% peso/peso). Tabela 16: Composição do meio de alimentação eRDF
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Tabela 17: Composição do meio eRDF-1
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[000889] A cultura de 20.000L é incubada em Meio CD-CHO suplementado diariamente com meio de alimentação eRDF a 34°C durante um máximo de 4 dias. No dia 10, a cultura de 20.000 L é submetida a um segundo desvio-T de 34°C para 32°C. A cultura de produção de 20.000 L no biorreator de produção foi mantida a 32°C durante um máximo de 8 dias. No dia 18, a amostra de cultura foi analisada com relação aos seguintes valores exemplificativos: densidade de células viáveis na etapa de produção no biorreator de cultura de 20.000 L é de 3,0 a 8,0 x 106 células/mL; viabilidade celular percentual mínima é > 38%; proporção molar final de ácido siálico (descrita em alguma parte aqui) é > 6; e titulação final de produto de proteína de CTLA4-Ig é de 0,5 a 1,3 g/L. Esses valores exemplificativos asseguram que um produto de proteína de qualidade e quantidade suficientes está sendo produzido pela linhagem de células de CHO recombinante e que a cultura de células de mamífero de 20.000 L está pronta para ser coletada. À cultura no biorreator durante a fase de produção, é fornecida uma alimentação em bolo diária usando meio eRDF modificado (Tabela 16, 17), como segue : começando 12 horas após o desvio de temperatura inicial (37°C para 34°C), um mínimo de 1% de volume de cultura foi adicionado como meio de alimentação; se o nível de glicose cai para abaixo de 3 g/L, um volume calculado é adicionado para levar o nível de glicose de volta para 3 g/L.
[000890] A fase de produção teve uma duração de 18 dias na escala de 20.000 L. Amostras foram tomadas em uma base diária do biorrea- tor de produção para análise. Por exemplo, a amostra usada para contagem de células foi corada com azul de tripano (Sigma, St. Louis, Mo.). A contagem de células e determinação de viabilidade celular foram realizadas usando um hemocitômetro para conter células viáveis coradas sob o microscópio. Para análise de metabólitos, uma amostra adicional transformada em alíquotas foi centrifugada durante 20 minutos a 2000 rpm (4°C) para peletizar as células. O sobrenadante foi analisado com relação à titulação de proteína, ácido siálico, glicose, lactato, glutamina, glutamato, pH, pO2, pCO2, amônia e LDH, usando técnicas e protocolos convencionalmente praticados na técnica.
Exemplo 15: Purificação de CTLA4-Ig recombinante
[000891] Cromatografia de troca de ânions QXL para purificação de CTLA4-Ig: A etapa de cromatografia de troca de ânions no processo com CTLA4-Ig usa uma resina de troca de ânions Q Sefarose Extreme Load (QXL). Essa resina é fornecida pela GE Healthcare, Waukesha, WI (formalmente Amersham Biosciences). A etapa de cromato- grafia QXL é para capturar e concentrar o dímero de CTLA4-Ig do material em-processo das etapas de operação de coleta para processamento adicional a jusante.
[000892] Uma coluna com diâmetro interno de 1,0-2,0 m é empacotada com resina QXL em uma altura de 17 a 30 cm, representando um volume de cerca de 643 L a 1018 L. A coluna é qualificada para uso determinando a altura equivalente a uma lâmina teórica (HETP) e assimetria (As) da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna QXL.
[000893] A operação da coluna QXL é realizada em temperatura ambiente. O caldo de cultura de células clarificado é carregado sobre uma coluna QXL equilibrada. A etapa de cromatografia QXL é realizada usando uma taxa de fluxo máxima de 99,4 L/min. A pressão de entrada da coluna é mantida abaixo de 35 psig. A carga máxima de proteína de CTLA4-Ig para a coluna QXL é de 28 gramas de CTLA4-Ig por litro de resina.
[000894] A coluna de cromatografia QXL é primeiro sanitarizada com uma solução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitarização é realizada usando 2 a 4 volumes de coluna (CV) da solução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitarização está completa quando a condutividade do efluente da coluna é igual a 169 ± 33 mS/cm e a coluna é mantida durante 60 a 120 minutos.
[000895] Após etapa de sanitarização, a coluna é equilibrada com um tampão de HEPES a 75 mM, cloreto de sódio a 360 mM, pH de 8,0. O equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio foi passado através da coluna e o pH do efluente é de 8,0 ± 0,2 e a condutividade do efluente é de 13,4 ± 1,0 mS/cm.
[000896] O material em-processo da etapa de operação de coleta é carregado sobre a coluna de QXL. A coluna é lavada com um mínimo de 10 CV de tampão de Lavagem (HEPES a 75 mM, NaCl a 360 mM, pH de 8,0) e a absorbância a 280 nm (A280) do efluente da coluna é medida ao final da etapa de lavagem. CTLA4-Ig é, então, eluída da coluna com um tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 325 mM ou NaCl a 850 mM, pH de 7,0. O eluato é desviado para um vaso de coleta quando a A280 aumenta para > 0,02 unidades de absorbância (AU) acima do valor de AU ao final da etapa de lavagem. O eluato é coletado até que a A280 da borda guia do pico de eluição diminua para um valor de < 1,0 AU.
[000897] Um dímero de produto de CTLA4-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols proteína de CTLA4-Ig que é > 8 é coletado e um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig está presente a < 25,7%. O material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig, o qual inclui tetrâme- ros, pode, então, ser ainda purificado para uso como uma substância distinta para os métodos de tratamento descritos aqui.
[000898] HIC em Phenyl Sefarose FF para purificação de CTLA4- Ig: A etapa de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usa resina Phenyl Sepharose Fast Flow (GE Healthcare, Waukesha, WI (formalmente Amersham Biosciences)). A etapa de HIC reduz o nível de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig presente no reservatório de produto de QXL. O dímero de CTLA4-Ig não se liga à resina de HIC sob as condições de carregamento usadas para a etapa de HIC.
[000899] Uma coluna com diâmetro interno de 1,0 a 2,0 m é empacotada com resina Phenyl Sepharose Fast Flow para uma altura de 18 a 22 cm, representando um volume de cerca de 680 a 852 L. A coluna é qualificada para uso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna de HIC.
[000900] A operação da coluna de HIC é realizada em temperatura ambiente. O reservatório de eluato da etapa na coluna QXL é carregada sem outro tratamento à coluna de HIC equilibrada. A etapa de HIC é operada em uma taxa de fluxo máxima de 65,4 L/min e em uma pressão de operação de < 13 psig. A carga máxima de proteína de CTLA4-Ig aplicada à coluna de HIC é de 10,0 g de proteína de CTLA4- Ig por litro de resina. Múltiplos ciclos da etapa de HIC podem ser empregados baseado na quantidade proteína de CTLA4-Ig presente no reservatório de eluato de QXL.
[000901] A coluna de HIC é primeiro sanitarizada com uma solução de hidróxido de sódio a 1 N. A sanitarização está completa quando 2 a 4 CV da solução de hidróxido de sódio a 1N passaram através da coluna. A coluna é, então, mantida durante 60 a 120 minutos para assegurar essa sanitarização.
[000902] Após a etapa de sanitarização, a coluna é equilibradas com um tampão de HEPES a 75 mM, cloreto de sódio a 2,55 M, pH de 7,0. O equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e o pH do efluente é de 7,0 ± 0,3 e a condutividade é de 71,5 a 75,5 mS/cm.
[000903] O eluato da etapa QXL é aplicado à coluna de HIC equilibrada. A coluna é, então, lavada com o tampão de equilíbrio até que a A280 do efluente diminua para entre 0,8 e 1,0 AU. O efluente contendo proteína de CTLA4-Ig de cada ciclo da etapa de HIC é filtrado através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm em um vaso de coleta de aço inoxidável comum. Esse reservatório de produto de HIC é mantido no vaso de coleta a 2° a 8°C. O tempo máximo de contenção no vaso de coleta é de 3 dias.
[000904] Um dímero de produto de CTLA4-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols proteína de CTLA4-Ig que é >8 é coletado e um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig está presente a < 2,5%.
[000905] Cromatografia por afinidade em proteína A recombinan- te para purificação de CTLA4-Ig: A resina de afinidade por proteína A recombinante Sepharose Fast Flow (rPA) usada no processo de produção de CTLA4-Ig a jusante é obtida da GE Healthcare (Waukesha, WI (formalmente Amersham Biosciences)). A coluna da etapa de cromatografia rPA ainda purifica a proteína de CTLA4-Ig. Essa etapa remove DNA e proteína de células hospedeiras, incluindo proteína 1 quimiotática de monócito (MCP-1).
[000906] Uma coluna com diâmetro interno de 80 a 140 cm é empacotada com resina rPA para uma altura de 18 a 25 cm, representando um volume de cerca de 339 a 372 L. A coluna é qualificada para uso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna. O número máximo de uso para a resina rPA estabelecido em um estudo de vida útil da resina é 60.
[000907] A operação na coluna de rPA é realizada em temperatura ambiente. O reservatório de produto da inativação viral é carregado sobre a coluna de rPA equilibrada. A etapa de rPA é operada em uma taxa de fluxo máxima de 26,7 L/min e uma pressão de operação de < 13 psig. A carga máxima de proteína de CTLA4-Ig aplicada à coluna de rPA é de 25 g de proteína de CTLA4-Ig por litro de resina.
[000908] A coluna de rPA é equilibrada com um tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, pH de 8,0. Equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e os valores de pH e condutividade dos efluentes estão entre 7,8 a 8,2 e 23,0 a 27,0 mS/cm, respectivamente.
[000909] O reservatório de produto da etapa de inativação viral é aplicado à coluna de rPA equilibrada. A etapa de cromatografia rPA inclui duas etapas de lavagem. A primeira etapa de lavagem é realizada usando um mínimo de 5 CV de um tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, Triton X-100 a 0,5%, pH de 8,0 para remover material fracamente ligado da coluna de rPA. A segunda etapa de lavagem é realizada usando um tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, pH de 8,0. A segunda etapa de lavagem usa um mínimo de 5 CV para remover o Triton X-100 residual da coluna de rPA.
[000910] A proteína de CTLA4-Ig é eluída da coluna de cromatogra- fia rPA com um tampão de glicina a 100 mM, pH de 3,5. O eluato é desviado para um vaso de coleta quando a A280 aumenta para >0,2 AU acima da linha de base. O efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm em um vaso de coleta equipado com um agitador. O eluato é coletado até que a A280 da borda guia do pico de eluição diminua para um valor de □ 0,2 AU. O pH do eluato empoçado é ajustado para um pH de 7,5 ± 0,2 com um tampão de HEPES a 2 M, pH de 8,0. O reservatório de produto da etapa de cro- matografia rPA é mantido a 2 a 8°C durante um máximo de 3 dias.
[000911] Um dímero de produto de CTLA4-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols proteína de CTLA4-Ig que é >8 é coletado; um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig está presente a <2,5%; e um reservatório de MCP-1 < 38 ng/mL está presente.
[000912] Cromatografia de troca de ânions QFF para purificação de CTLA4-Ig: A etapa de cromatografia de troca de ânions no processo de produção de CTLA4-Ig produção a jusante usa uma resina de cromatografia de troca de ânions Q Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare (Waukesha, WI (formalmente Amersham Biosciences). O objetivo da etapa de cromatografia QFF é reduzir os níveis residuais de proteína A e proporcionar redução adicional de DNA de célula hospedeira do reservatório de produto da etapa de filtração viral. A etapa em coluna QFF é também usada para controlar a proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig do reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF e proporcionar controle adicional de níveis de materiais de HMW de CTLA4-Ig em-processo. O ponto de controle primário em-processo para a redução de Material de HMW de CTLA4-Ig é a etapa de HIC.
[000913] Uma coluna com diâmetro interno de 60 a 140 cm é empacotada com resina QFF para uma altura de 28 a 35 cm, representando um volume de cerca de 536 a 667 L. A coluna é qualificada para uso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma
[000914] As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da colu na.
[000915] A operação na coluna QFF é realizada em temperatura ambiente. O reservatório de produto da etapa de filtração viral é carregado sobre a coluna QFF equilibrada. A etapa QFF é operada em uma taxa de fluxo máxima de 38,7 L/min e uma pressão de operação de < 0,2413 MPa manométrico (35 psig). A carga máxima de proteína de CTLA4-Ig aplicada à coluna QFF é de 25 g de proteína de CTLA4-Ig por litro de resina.
[000916] A coluna de cromatografia QFF é primeiro sanitarizada com uma solução de hidróxido de sódio a 1 N. A sanitarização é realizada usando 2 a 4 CV da solução de hidróxido de sódio a 1N. A sanitariza- ção está completa quando a condutividade do efluente da coluna é igual a 136 a 202 mS/cm e a coluna é mantida durante 60 a 120 minutos.
[000917] Após a etapa de sanitarização, a coluna é equilibrada com um tampão de HEPES a 25 mM, cloreto de sódio a 100 mM, pH de 8,0. O equilíbrio está completo quando um mínimo de 4 CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e o pH do efluente é de 7,7 a 8,3 e a condutividade é de 10,5 a 12,9 mS/cm.
[000918] O reservatório de produto da etapa de filtração viral contido em sacos de bioprocesso é transferido para um vaso de coleta de aço inoxidável estéril.
[000919] O reservatório de produto da etapa de filtração viral é aplicado à coluna QFF equilibrada. A etapa de cromatografia QFF inclui duas etapas de lavagem. A primeira etapa de lavagem é realizada usando um mínimo de 5,0 CV de um tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 120 mM, pH de 8,0. A segunda etapa de lavagem é realizada usando um mínimo 5,0 CV de um tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 130 mM, pH de 8,0.
[000920] O dímero de CTLA4-Ig é eluído da coluna de cromatografia QFF usando um tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 200 mM, pH de 8,0. A coleta de eluato é iniciada quando a A280 do efluente começa a aumentar. Durante eluição, o efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm no vaso de coleta de aço inoxidável. O eluato é coletado até que a absorbância da borda guia do pico de eluição diminua para <0,2 AU acima da linha de base. O vaso de coleta é, então, esfriado para 2 a 8°C. O tempo de contenção máximo para que o produto da etapa de cromatografia QFF empoce a 2 a 8°C é 3 dias.
[000921] Um dímero de produto de CTLA4-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols proteína de CTLA4-Ig que é >8 é coletado; um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig está presente a <2,5%; um reservatório de material de baixo peso molecular de CTLA4-Ig (por exemplo, monôme- ro de CTLA4-Ig) está presente a <0,5%; e um reservatório de MCP-1 < 9,5 ng/mL está presente.
[000922] O sistema Pall Filtron TFF é usado na etapa de concentração e diafiltração do processo de produção de CTLA4-Ig a jusante. O objetivo dessa etapa é concentrar o produto da etapa de cromatografia QFF. Empoçar para 45 a 55 g/L e trocar o tampão de eluição usado na etapa de cromatografia QFF pelo tampão final usado para Composições de CTLA4-Ig. O produto de proteína de CTLA4-Ig concentrado empoçado é transferido através de um filtro de fluoreto de polivinilide- no de 0,2 μm e para um saco de bioprocesso de 50 L.
Exemplo 16: CTLA4-Ig-Proporção molar Determinação de Amino monossacarídeos
[000923] Esse Exemplo proporciona métodos para obter proporções molares de amino monossacarídeos (N-acetil galactosamina, N-acetil glicosamina) para proteína em amostras de CTLA4-Ig.
[000924] Instrumentação: Sistema de eletroforese em capilar Beckman P/ACE MDQ CE System; sistema de detecção com Detector Beckman Laser-Induced-Fluorescence (LIF) (acoplado com P/ACE MDQ);Capilar não revestido (d.i. de 25 μm; d.e. de 360 μm), comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ ou 5510 PolyMicro Technologies, Cat. No. TSP025375; Misturador Maxi-Mix Thermolyne, (VWR Catálogo No. 58810-185)
Reagentes: Solução de hidrólise (solução aquosa de HCl a 4 N)
[000925] Adicionar 160 mL de HCl a 6 N e 80 mL de água com grau para HPLC a uma garrafa de vidro de 250 mL.
[000926] Agitar para misturar bem.
[000927] Armazenar a 2-8°C durante até 6 meses.
Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0,1 M)
[000928] Adicionar 192 μL de água com grau para HPLC a 10 mg de pó de APTS em um frasco de vidro.
[000929] Submeter o frasco a turbilhonamento 5-10 segundos para dissolver completamente o APTS.
[000930] Armazenar a -20°C durante até um ano.
Solução de Derivatização II (ácido acético a 1 M e NaBH3CN a 0,25 M)
[000931] Diluir 20 μL ácido acético com 320 μL água com grau para HPLC (diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazer uma solução de ácido acético a 1 M.
[000932] Pesar 2,0 ± 0,5 mg de NaBHsCN em um frasco criogênico.
[000933] Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropriado da solução de ácido acético a 1 M para fazer 0,25 M NaBH3CN a 0,25 M. Volume (μL) = 103 x (peso de NaBHsCN em mg)/(62,84 g/mol x 0,25 mol/L) • Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) deverá ser arma-zenado no escuro em um secador. • Sub-divisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0 mL para armazenamento é recomendada para evitar abertura repetida da garrafa de reagente original como segue: • Pesar 1,0 g ± 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um criofrasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianoborohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira. • Tampar hermeticamente e rotular os criofrascos sequen-cialmente (1,2,3, etc.) junto com o nome do reagente, número de lote e uma data de expiração de 6 meses. • Os frascos deverão ser vedados com parafilme para evitar umidade. • Pesar cianoborohidreto de sódio para a Solução de Deri- vatização II não mais do que três vezes a partir do mesmo criofrasco. Anotar isso e do número de sequência do criofrasco na folha de dados do laboratório. • Um pico de reagente observado no perfil de CE ou pobre rotulação pode ocorrer após abertura repetida do criofrasco ou com esse lote de cianoborohidreto de sódio em particular. Se isso afeta os resultados, descartar o criofrasco que está sendo usado e pesar reagente de um criofrasco com o próximo número de sequência ou de um novo lote de cianoborohidreto de sódio.
Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM, pH de 9,5)
[000934] Pesar 0,210 ± 0,02 g de bicarbonato de sódio em um bé- quer de vidro limpo de 100 mL.
[000935] Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos.
[000936] Ajustar o pH para 9,5 ± 0,1 com NaOH a 10 N.
[000937] Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume final para 100 mL. Filtrar (etapa1.26) a solução e armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses.
Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de 925)
[000938] Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em um béquer de vidro limpo de 100 mL.
[000939] Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos.
[000940] Ajustar o pH para 9,25 ± 0,10 com NaOH a 10 N.
[000941] Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume final para 100 mL para uma concentração final de 60 ± 5 mM.
[000942] Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetra- borato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titula ção.
[000943] Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02) de tetra- borato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titula ção.
[000944] Armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico é obtida (valor R <1,0).
[000945] Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (Micro- Solv) através da adição de 120 mL de água ultra pura a 80 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5 mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1).
[000946] Para uma solução de tetraborato a 55 mM, diluir 66 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 114 mL de água ultra pura. Titular conforme acima.
[000947] Para uma solução de tetraborato a 65 mM, diluir 78 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 102 mL de água ultra pura. Titular conforme acima.
[000948] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante um máximo de 3 meses.
[000949] Preparar tampão fresco se a resolução de pico é obtida (valor R < 1,0).
Soluções de enxágue capilar Solução de NaOH a 10 N
[000950] Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 10 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 9 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[000951] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Solução de HCl a 6N:
[000952] Adicionar 1 mL de solução de HCl a 6 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL
[000953] contendo 5 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[000954] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
3.6.3 Solução de metanol a 80%:
[000955] Adicionar 8 mL de metanol com grau para HPLC em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 2 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[000956] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo N-Acetil Glicosamina (GalNAc)
[000957] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GalNAc em um frasco cri- ogênico de 2,0 mL.
[000958] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissolvida.
[000959] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
N-Acetil Galactosamina (GlcNAc)
[000960] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GlcNAc em um frasco cri- ogênico de 2,0 mL.
[000961] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissolvida.
[000962] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
N-Acetil Manosamina (ManNAc)
[000963] Pesar precisamente 5 ±1 mg de ManNAc em um frasco criogênico de 2,0 mL.
[000964] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissolvida.
[000965] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
[000966] Armazenar Soluções de estoque de Padrão de Monossaca- rídeo a -20°C durante até 1 ano.
Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno
[000967] Diluir a solução de estoque de ManNAc 100 vezes com água com grau para HPLC através da adição de 20 μL de solução de estoque de ManNAc em um frasco criogênico de 2 mL o qual já contém 1980 μL de água com grau para HPLC. Submeter a turbilhona- mento aproximadamente 5 a 10 segundos.
[000968] Armazenar a solução de trabalho de padrão interno a 2-8 oC durante até 6 meses.
[000969] Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino
[000970] Em um frasco criogênico de 2,0 mL contendo 1960 μL de água com grau para HPLC, adicionar 20 μL de soluções de estoque de GalNAc e GlcNAc, respectivamente. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5 a 10 segundos.
[000971] Armazenar a solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino a 2-8°C durante até 6 meses.
Soluções de amostra e Material de Referência.
[000972] Descongelar as amostras de proteína a 2-8°C e misturar ligeiramente através de inversão.
[000973] Diluir as amostras e Material de Referência com água com grau para HPLC para cerca de 1,0 mg/mL. Anotar a concentração para três situações representativas.
Condições de operação CE
[000974] Tampão de Operação (etapa 2.5) tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25
[000975] Temperatura de cartucho do capilar 25°C
[000976] Tensão de 25-30 kV, modo positivo
[000977] Condição do detector: Detector LIF, Excitação: 488 nm, Emissão: 520 nm.
[000978] Injeção de amostra Modo de injeção sob pressão, 20 s a 0,5 PSI
[000979] Tempo de operação 10 minutos
[000980] Armazenamento de amostra 10°C
Procedimento
[000981] Nota: Usar uma pipeta de 10 μL e microponteiras para transferir volumes de amostra de 10 μL e pipetas de tamanho apropriado para transferir outros reagentes (veja faixas na etapas 2.10 a 2.14).
Hidrólise
[000982] Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μL de Solução de Hidrólise a 4 N (etapa 3,1). Isso serve como uma corrente de sistema.
[000983] Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução Padrão de Mistura Amino (etapa 3,9). Adicionar ainda 200 μL de Solução de Hidrólise a 4N. Isso serve como padrão de monossacarídeo para quantificação e Adequabilidade de sistema. Preparar em duplicata.
[000984] Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de solução de Material de Re-ferência de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/mL).
[000985] Adicionar ainda 200 μL de solução de HCl a 4N. Preparar em duplicata.
[000986] Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de solução de amostra (apro-ximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μL de solução de HCl a 4N. Preparar em duplicata.
[000987] Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproxi-madamente 10 segundos e centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos. Colocar as amostras em uma prateleira para frasco com 96 posições e incubar em um forno a 95°C durante 6 horas.
[000988] Após hidrólise, colocar as amostras hidrolisadas a -20°C durante 10 minutos para esfriar.
[000989] Centrifugar rapidamente as amostras hidrolisadas até que qualquer condensado seja forçado para o fundo do tubo (5-10 segundos em alta velocidade). Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evaporação em "Baixa".
[000990] Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau para HPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evaporação em "Baixa".
Reacetilação
[000991] Reconstituir cada amostra com 10 μL de tampão de reaceti- lação M6 e submeter a turbilhonamento 5-10 seg. para misturar bem. Adicionar 4 μL de reagente de reacetilação M3 a cada tubo. Submeter a turbilhonamento durante aproximadamente 5-10 segundos. Incubar sobre gelo durante 30 minutos. Nota: O tampão de reacetilação (M6) e reagente (M3) podem ser substituídos, respectivamente, por NaHCO3 a 25 mM (adicionar 20 μL) preparado no local e anidrido acético (adicionar 4 μL).
[000992] Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evaporação em "Baixa".
[000993] Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau para HPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Nota: Desligar o calor do SpeedVac e ajustar a taxa de evaporação em "Baixa".
Derivatização
[000994] Colocar a micro centrífuga no forno para equilibrar para a temperatura do forno de 55°C.
[000995] Reconstituir cada amostra com 10 μL de Solução de Deri- vatização I (solução de APTS a 0,1 M, etapa 3,2). Submeter a turbi- lhonamento aproximadamente 5-10 segundos.
[000996] Adicionar 5 μL da Solução de Derivatização II (HAc a 1M e NaBH3CN a 0,25 M, etapa 3.3). Submeter a turbilhonamento aproxi-madamente 5-10 segundos e centrifugar.
[000997] Carregar rapidamente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a centrífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3 horas enquanto centrifuga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de solvente sobre a superfície do frasco.
Preparo de instrumentação
[000998] Instalar um novo capilar, enxaguar no modo de alta pressão (80 PSI) usando as seguintes etapas:
[000999] NaOH a 1 N durante 20 minutos.
[0001000] água com grau para HPLC durante 10 minutos.
[0001001] tampão de tetraborato de sódio a 60 mM durante 10 minutos.
Operação
[0001002] Antes cada operação, operar as sequências de lava- gem/enxágue para enxaguar o capilar.
[0001003] Então, operar o Padrão de Adequabilidade de Sistema (padrão de monossacarídeo) para assegurar que o sistema é adequado.
[0001004] Uso de NaOH a 1N pode causticar o interior de capilares de diferentes vendedores e causa um desvio nos tempos de migração por toda a operação. Se isso faz com que o tempo de migração do último pico (GlcNAc) seja maior do que 10,0 minutos, pode ser necessário substituir NaOH a 1N por NaOH a 0,1N ou água com grau para HPLC para o enxágue da etapa 2.
[0001005] Quando uso de um capilar equivalente e do procedimento de lavagem acima não é adequado, uso de metanol a 80% e/ou HCl a 1N pode ser necessário para que o último pico (G1cNAc) esteja dentro dos valores exemplificativos de 10,0 minutos.
Preparo de injeção
[0001006] Após derivatização, deixar as amostras esfriar para a tem-peratura ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente, até o condensado ser forçado para o fundo do tubo.
[0001007] Adicionar 85 μL de água com grau para HPLC a cada tubo para levar o volume final de cada amostra para 100 μL. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos.
[0001008] Transferir 10 μL de amostra de cada tubo para um micro- frasco para CE e adicionar 190 μL de água com grau para HPLC a cada tubo. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos. Etapas de enxágue e sequência de injeção: Nota: Para cada quatro injeções, trocar o Tampão de Operação de CE por Tampão de Operação de CE recentemente preparado (em virtude do efeito de depleção iônica). Realizar enxágue do capilar a 0,2757 MPa (40 psi).
Figure img0060
Figure img0061
Adequabilidade de sistema Nota: Valores de Adequabilidade de sistema são determinados usando as primeiras injeções de padrão de adequabilidade de sistema, a menos que de outro modo especificado.
[0001009] O eletroferograma do primeiro padrão de adequabilidade de sistema deverá ser similar àquele mostrado na figura 81, onde o pico 1 é GalNAc; o pico 2 é ManNAc; o pico 3 é GlcNAc. Nota: Quando outros instrumentos de CE que não Beckman PACE MDO têm de ser usados, o comprimento do capilar poderia ser diferente daquele especificado nesse método em virtude de várias configurações de cartuchos contendo o capilar de separação. Isso causaria variações no tempo de migração de analito, bem como intensidade de pico.
[0001010] A resolução entre dois picos vizinhos é calculada para os primeiros padrões de Adequabilidade de Sistema pelo instrumento de acordo com a seguinte equação:
Figure img0062
[0001011] onde:
[0001012] R = resolução
[0001013] t2, t1 = tempos de migração dos dois picos vizinhos, respec-tivamente
[0001014] W1, W2 = larguras de pico na linha de base dos dois picos vizinhos, respectivamente
[0001015] O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar com as sequências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar. Para a última injeção de Adequabili- dade de sistema, o último pico (GlcNAc) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula: T = W0,85/2f
[0001016] onde:
[0001017] T = fator de configuração
[0001018] W0,85 = largura de pico a 5% da altura
[0001019] f = largura do pico frontal no pico máximo
[0001020] Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as sequências de lava- gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substituir o capilar.
[0001021] As injeções repetidas mostram aos seguintes valores exemplificativos: • Proporção de área de pico de GlcNAc vs. MaNAc: RSD □ 10% (calculada na etapa 7,1) • Tempo de migração de GlcNAc deverá ser < 10,0 minutos • Perfil deverá ser equivalente à figura 81, onde os três picos são observados e o padrão interno (ManNAc) é o pico de número 2.
[0001022] Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não é atingido antes de testagem das amostras, primeiro aumentar a tensão se o tempo de migração de GlcNAc é maior do que 10,0 minutos. Em seguida, se a proporção de área de pico é > 10%, preparar tampão de CE fresco tendo certeza de seu pH ou substituir o capilar. Após ajuste do instrumento, repetir injeções de Adequabilidade de Sistema. Quando de análise do perfil de pico, se uma diminuição significativa na altura de pico de ManNac ocorre, verificar se determinados cabos de fibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados.
[0001023] Determinar o RSD percentual para o padrão monossacarí- dico através de comparação da proporção de áreas de pico dos componentes do padrão interno e padrão de monossacarídeo. Dividir a área de pico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção de padrão de monossacarídeo. Calcular o RSD percentual para GalNAc e GlcNAc para os dois padrões entre as faixas. O RSD deverá ser < 10%. Se esse valor médio exemplificativo não é obtido, então, o capilar deverá ser enxaguado ou substituído conforme acima.
Cálculos
[0001024] Calcular a Proporção de área de pico de GalNAc e GlcNAc com relação ao padrão interno (ManNAc). Usado sobre injeções repetidas dos primeiros quatro Padrões de Adequabilidade de sistema de modo a ir ao encontro dos valores exemplificativos acima e realizar os mesmos cálculos sobre todos os Padrões de Adequabilidade de sistema injetados antes e após amostra(s) entre faixas.
[0001025] Proporção de área de pico = Dividir a área de pico para cada componente de monossacarídeo (GlcNAc, GalNAc) pela área de pico do padrão interno (ManNAc) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade de Sistema.
Figure img0063
[0001026] Calcular uma média das proporções de área de pico para- GlcNAc e GalNAc nos Padrões de Adequabilidade de sistema. Calcular também um desvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (RSD %)
[0001027] Valores exemplificativos: RSD para a área de pico
[0001028] Proporção de GlcNAc < 10%.
[0001029] Dois Padrões de Adequabilidade de sistema entre as faixas injetados antes e após
[0001030] amostra(s): RSD percentual para a proporção de área de pico de GlcNAc e GalNAc < 10%.
[0001031] Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%), então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxágue e aquelas amostras e padrões de monossacarídeo entre as faixas precisam ser operadas novamente. Se o valor exemplifi- cativo médio ainda não é obtido, substituir o capilar e enxágue. Operar as amostras e padrões de monossacarídeo entre as faixas novamente.
Figure img0064
onde: n = número de medições na amostra x = medições individuais
Figure img0065
Cálculo da proporção molar de GalNAc/Proteína:
Figure img0066
[0001032] onde:
[0001033] RGalNAc = proporção molar de GalNAc vs. proteína
[0001034] AGalNAc = área de pico (μV.seg) de GalNAc na amostra
[0001035] AManNAc = área de pico (μV.seg) de ManNAc na amostra
[0001036] AManNAc0 = área de pico (μV.seg) média de ManNAc em padrão de monossacarídeo
[0001037] AGalNAc0 = área de pico (μV.seg) média de GalNAc em padrão de monossacarídeo
[0001038] VGalNAc0 = volume de GalNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001039] Vp = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001040] Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001041] MWabatacept = Peso molecular de Material de Referência Abatacept conforme o Certificado de Análise (COA)
[0001042] MWGlcNAc = Peso molecular de GalNAc (221,2 dáltons)
Padrões entre faixas
[0001043] Quando de cálculo das proporções molares de material de CTLA4-Ig e amostras, usar todos os oito Padrões de Adequabilidade de sistema entre as faixas. Calcular as médias das áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras três amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar a área média de pico dos próximos quatro padrões de monossacarídeo entre as faixas e os quatro padrões anteriores de monossacarídeo entre as faixas para cálculos da proporção molar. Cálculo da proporção molar de GIcNAc/Proteína
Figure img0067
[0001044] onde:
[0001045] RGlcNAc= proporção molar de GlcNAc vs. proteína
[0001046] AGlcNAc = área de pico (μV.seg) de GlcNAc na amostra
[0001047] AManNAc = área de pico (μV.seg) de ManNAc na amostra
[0001048] AManNAco = área de pico (μV.seg) média de ManNAc em padrão de monossacarídeo
[0001049] AGlcNAc0 = área de pico (μV.seg) média de GlcNAc em padrão de monossacarídeo
[0001050] VGlcNAc0 = volume de GlcNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001051] CGlnNAc0 = concentração de GlcNAc contido em em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001052] Vp = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001053] Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001054] MWCTLA4-Ig = Peso molecular de Material de Referência de CTLA4-Ig
[0001055] MWGlcNAc = Peso molecular de GlcNAc (221,2 dáltons)
[0001056] Valores exemplificativos. O RSD percentual para as duas proporções de área de pico para Padrão de Adequabilidade de Sistema amino entre as faixas não deverá exceder a 10%. A proporção molar média para amino monossacarídeos no Material de Referência deverá ser dentro da faixas especificadas na tabela diretamente abaixo. Para cada componente, o RSD % para os quatro resultados (injeção em duplicata de preparados em duplicada) deve ser </ = 25%. Tabela - Faixa de proporção molar de Material de Referência de CTLA4-Ig
Figure img0068
Exemplo 17: Determinação de proporção molar de aminomonos- sacarídeos (GalNAc e GlcNAc) através de eletroforese capilar (CE)
[0001057] Em uma modalidade, a composição de CTLA4-Ig tem a ca- racterística de ter de cerca de 15-35 mols de GlcNAc / mol de proteína e de cerca de 1,7-3,6 mols de GalNAc / mole proteína. O exemplo a seguir descreve um método de determinação dessas proporções molares.
[0001058] Reagentes: Solução de hidrólise (HCl a 4N); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1M, sal de trissó- dio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização II (NaBH3CN a 0,25 M em ácido acético a 1M); Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM, pH9,5); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de 9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCl a 1N; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de GalNAc, GlcNAc e ManNAc em uma concentração de 5 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é uma diluição a 100 vezes de solução de estoque de ManNAc; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino, uma diluição a 100 vezes de soluções de estoque de GalNAc e GlcNAc.
[0001059] Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CE System; Detector: sistema de detecção induzido a laser Beckman (LIF) acoplado com P/ACE MDQ); capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360 μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.
[0001060] Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura de cartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição do detector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção de amostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5PSI; Tempo de operação: 10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.
[0001061] Hidrólise: 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μL de HCl a 4N foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução-Padrão de Mistura Amino foram misturados com 200 μL de HCl a 4N para fazer o Padrão de monossacarídeo. 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de dímero de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de HCl a 4N para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a turbilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostras foram colocadas a - 20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.
[0001062] Reacetilação: Amostras hidrolisadas e secas foram recons-tituídas com 100 μL de água com grau para HPLC. As amostras re-constituídas foram re-acetiladas através da adição de 10 μL de tampão de re-N-acetilação M6 (Glyko) e 4 μL de reagente de reacetilação M3 (Glyko), seguido por mistura e com incubação sobre gelo (30 min). As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.
[0001063] Derivatização: Amostras reconstituídas (100 μL de água com grau para HPLC) foram equilibradas 55°C, seguido pela adição de 10 μL de Solução de Derivatização I, uma rápida mistura e adição de 5 μL de Solução de Derivatização II. As amostras foram carregadas em uma centrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifugava a 2000 rpm.
[0001064] Injeção de CE: O volume final das amostras após derivati- zação foi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10 μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190 μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho de CE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempo de operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampão de Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrões de monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho de CE (tempo de operação de 10 min). Após a operação de injeção de cada padrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado com água com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 30.
[0001065] Cálculos:
[0001066] Calcular a proporção de área de pico de GalNAc e GLCNAc com relação ao padrão interno ManNAc.
[0001067] Proporção de área de pico = área de pico de monossacarí- deo (GalNAc ou GlcNAc)/área de pico de ManNAc
[0001068] em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico é igual ou menor do que 10%.
[0001069] Calcular a proporção monossacarídeo (por exemplo, Gal- NAc) para proteína de CTLA4-Ig:
[0001070] ProporçãoGalNAc = (AGalNAc x AManNAcO x VGalNAcO x CGalNAcO x MW dímero de CTLA4-Ig) / (AManNAc x AGalNAcO x Vp x Cp x MWGalNAc)
[0001071] ProporçãoGalNAc = proporção molar de GalNAc versus proteína
[0001072] AGaiNAc = área de pico (μV.seg) de GalNAc na amostra
[0001073] AManNAc = área de pico (μV.seg) de ManNAc na amostra
[0001074] AManNAcO = área média de pico (μV.seg) de ManNAc no padrão de monossacarídeo
[0001075] AGalNAcO = área média de pico (μV.seg) de GalNAc no padrão de monossacarídeo
[0001076] VGalNAcO = volume de GalNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001077] CGalNAcO = concentração de GalNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/ml)
[0001078] Vp = volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001079] Cp = concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/ml)
[0001080] MW CTLA4-Ig = Peso molecular de dímero de CTLA4-Ig
[0001081] MWGalNAc = 221,2 dáltons. Tabela 18: Proporção molar média de Monossacarídeo para moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig
Figure img0069
Exemplo 18: Determinação de proporção molar de monossacarí- deos neutros (manose, fucose e galactose) através de eletroforese capilar (CE)
[0001082] Reagentes: Solução de hidrólise (ácido trifluoroacético a 2M (TFA)); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6- trissulfônico a 0,1M, sal de trissódio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização II (NaBH3CN a 0,25M em ácido acético a 1M); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCl a 1N; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de manose (Man), fucose (Fuc), galactose (Gal) e xilose (Xyl) em uma concentração de 5 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes diluição de solução de estoque de Xyl; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de trabalho padrão de mistura neutra, 100 vezes diluição de soluções de estoque de Man, Fuc e Gal.
[0001083] Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CE System; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) acoplado com P/ACE MDQ); Capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360 μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.
[0001084] Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura de cartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição do detector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção de amostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5 PSI; Tempo de operação: 10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.
[0001085] Hidrólise: 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 200 μL de TFA a 2M foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de Solução-padrão de mistura neutra foram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer o Padrão de monossacarídeo. 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de dímero de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a turbilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostras foram colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.
[0001086] Derivatização: Amostras foram reconstituídas com 100 μL de água com grau para HPLC e foram equilibradas 55°C, seguido pela adição de 10 μL de Solução de Derivatização I, uma rápida mistura e adição de 5 μL de Solução de Derivatização II. As amostras foram carregadas em uma centrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifugava a 2000 rpm.
[0001087] Injeção de CE: O volume final das amostras após derivati- zação foi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10 μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190 μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho de CE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempo de operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampão de Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrões de monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho de CE (15 min tempo de operação). Após a operação de injeção de cada padrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado com água com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 31.
Cálculos:
[0001088] Calcular a proporção de área de pico de Man, Gal e Fuc com relação ao padrão interno Xilose.
[0001089] Proporção de área de pico = área de pico de monossacarí- deo (Gal, Fuc ou Man)/Área de pico de xilose
[0001090] em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico é igual a ou menor do que 10%.
[0001091] Calcular a proporção de monossacarídeo (por exemplo, Man) para proteína de CTLA4-Ig: ProporçãoMan = (AMan x AXylO x VManO x CManO x MW dímero de CTLA4-Ig) / (AXyl x AManO x Vp x Cp x MWMan) ProporçãoMan= proporção molar de Man versus proteína AMan= área de pico (μV.seg) de Man na amostra AXyl= área de pico (μV.seg) de Xyl na amostra AXylO= área de pico (μV.seg) média de Xyl no padrão de monossacarí- deo AManO= área de pico (μV.seg) média de Man no padrão de monossaca- rídeo VManO= volume de Manose contido em solução de trabalho de monos- sacarídeo usada para hidrólise (em μL) CManO= concentração de Manose contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/ml) Vp= volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL) Cp= concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/ml) MW CTLA4-Ig= Peso molecular de dímero de CTLA4-Ig MWMan= 180,2 dáltons. Tabela 19: Proporção molar média de Monossacarídeo para moléculas ou dímeros de CTLA4-Ig
Figure img0070
EXEMPLO 19: PRODUÇÃO DE CTLA4A29YL104E-Ig
[0001092] CTLA4A29YL104E-Ig é uma proteína de fusão geneticamente modificada, a qual consiste no domínio de ligação funcional da CTLA-4 humana modificada e do domínio Fc da imunoglobulina humana da classe IgG1. Duas substituições de aminoácido foram feitas na região de ligação a B7 do domínio de CTLA-4 (L104E e A29Y) para gerar essa molécula. Ela é compreendida de duas cadeias polipeptídicas glico- siladas de 357 aminoácidos cada. Ela existe como um dímero covalente ligado através de uma ligação de dissulfeto intercadeia. A CTLA4A29YL104E-Ig tem uma massa média de aproximadamente 91.800 Da, conforme determinado por meio de espectrometria de massa através de ionização por deabsorção a laser matriz-assistida time-of-flight (MALDI-TOF).
[0001093] CTLA4A29YL104E-Ig é uma forma modificada de CTLA4-Ig. A modificação consiste em mutações de ponto que resultam em duas substituições de aminoácido (L104E e A29Y). Com relação à CTLA4- Ig, a CTLA4A29YL104E-Ig se liga CD80 (B7-1) com avidez ~2 vezes aumentada e se liga a CD86 (B7-2) com avidez ~4 vezes aumentada. A CTLA4A29YL104E-Ig é aproximadamente 10 vezes mais eficaz do que o abatacept na inibição de proliferação de células T, produção de citoci- na e morte CD28-dependente de células alvo por células assassinas naturais. A CTLA4A29YL104E-Ig causa inibição modesta de proliferação de células T B7-1-mediada, mas é acentuadamente mais potente no bloqueio proliferação de células T B7-2-mediada. Esse Exemplo descreve a produção de moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig compreendendo SEQ ID NO: 4. Os métodos descritos nesse Exemplo podem ser adaptados e estendidos para a produção de outras proteínas recombinan- tes incluindo, mas não limitado a, proteínas secretadas tais como cito- cinas e outros hormônios, proteínas secretadas que são membros da superfamília Ig ou compreendem uma porção de uma proteína da su- perfamília Ig e geralmente qualquer proteína expressa em células de CHO.
[0001094] Um fluxograma de processo para as etapas de cultura de CTLA4A29YL104E-Ig é mostrado na figura 24. CTLA4A29YL104E-Ig é produzida em biorreatores de produção de 5000 L com um volume de trabalho aproximado de 4000 L. Uma batelada de Substância de Fármaco é produzido a partir de um único biorreator de produção derivado de um único frasco de um banco de célula. O processo de produção envolve três estágios consistindo em expansão de inóculo, cultura de células de produção e purificação a jusante. O estágio de expansão de inóculo é conduzido usando meio isento de componente animal. O estágio de cultura de células de produção é também realizado em meio isento de componente animal, com exceção do uso de D-galactose.
[0001095] Meios de cultura de célula. Todos os meios são preparados em vasos de meio limpos do tamanho apropriado e esterilizados através de filtração. A composição do meio utilizado para expansão de inóculo é apresentada na tabela abaixo.
Figure img0071
Expansão de inóculo
[0001096] Um frasco congelado do banco de células é descongelado em uma temperatura controlada e centrifugado para remover o meio crioprotetor. As células são ressuspensas em meio de inóculo e recuperadas em um T-frasco. Uma viabilidade celular mínima após descongelamento de 80% é um valor exemplificativo. A temperatura e dióxido de carbono são controlados durante a incubação etapa no T- frasco. O T-frasco é incubado até que um número de células viáveis de 1,0 x 107 células seja obtido e os conteúdos são transferidos para um frasco de agitação. A cultura é expandida através de uma série de frascos de agitação para obter o volume de inóculo requerido. A faixa de densidade de cultura para as passagens no frasco de agitação é de 1,0 a 3,0 x 105 células viáveis/mL. A temperatura, dióxido de carbono e velocidades do agitador são controlados durante a etapa de incubação em frasco de agitação. As culturas no frasco de agitação são empoçadas em um vaso de transferência de inóculo estéril quando se atinge uma densidade de células viáveis faixa de 1,5 a 3,0 x 106 células/mL. Aproximadamente 20 litros da etapa de expansão de inóculo em frasco de agitação final são transferidos para o biorreator de cultura de 140 L para obter uma faixa inicial de densidade celular de 0,2 a 1,0 x 106 células viáveis/mL.
Operação do biorreator de cultura
[0001097] um biorreator de cultura de 140 L com um volume de trabalho de aproximadamente 90 litros é operado no modo em batelada. A temperatura, pH, pressão e concentração de oxigênio dissolvido no biorreator de cultura de 140 L são monitorados e controlados usando um sistema de controle distribuído (DCS). As amostras são obtidas diariamente do biorreator de cultura de 140 L para monitorar o crescimento celular. A faixa de densidade de cultura do biorreator de cultura de 140 L é de 0,2 a 1,0 x 106 células viáveis/mL. O biorreator de cultura de 140 L é usado para inocular um biorreator de cultura de 1100 L quando uma densidade de células viáveis de >1,5 x 106 células/mL é obtida. A duração da etapa no biorreator de cultura de 140 L é de aproximadamente 3 dias. A densidade-alvo inicial de células viáveis no biorreator de cultura de 1100 L é de 0,4 a 1,5 x 106 células viáveis/mL.
[0001098] O biorreator de produção de 1100 L contém um volume de cultura inicial de 260 litros. O biorreator de produção de 1100 L é operado no modo em batelada. A temperatura, pH, pressão e concentração de oxigênio dissolvido no biorreator de cultura de 1100 L são monitorados e controlados usando um DCS. O volume da cultura é aumentado para 900 litros com meio basal quando a densidade de células viáveis atingiu >1,5 x 106 células/mL. As amostras são obtidas dia- riamente do biorreator de cultura de 1100 L para monitorar o crescimento celular. O biorreator de produção de 1100 L é usado para inocular um biorreator de produção de 5000 L quando uma densidade de células viáveis de >2,0 x 106 células/mL é obtida. A duração da etapa no biorreator de cultura de 1100 L é de aproximadamente 4 dias. A densidade-alvo inicial de células viáveis no biorreator de produção de 5000 L é de 0,4 a 1,5 x 106 células viáveis/mL.
Operação do biorreator de produção
[0001099] O biorreator de produção de 5000 L contém um volume de cultura inicial de 3000 litros. O biorreator de produção de 5000 L é operado em um modo de alimentação em batelada com temperatura, pH, pressão e concentração de oxigênio dissolvido monitorados e controlados usando um DCS. Um bolo de sulfato de dextrano é adicionado à cultura a aproximadamente 72 horas. Durante a operação de um biorreator de produção, o ponto de ajuste da temperatura de cultura é desviado de 37° para 34°C a 144 ± 8 horas. O desvio de temperatura e a adição de sulfato de dextrana são realizados para prolongar a duração de alta viabilidade celular na etapa com o biorreator de produção de 5000 L. As amostras são obtidas do biorreator para monitorar o crescimento e biabilidade celular, concentração de glicose, lactato e amônia. As amostras são também testadas com relação à concentração de CTLA4A29YL104E-Ig e proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4A29YL104E-Ig. o meio de alimentação é adicionado ao biorreator para manter uma concentração de glicose desejada. O critério de coleta primário para um biorreator de produção é a proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4A29YL104E-Ig. um biorrea- tor de produção é coletado em uma proporção molar alvo de ácido siá- lico para proteína de CTLA4A29YL104E-Ig de D6. a duração da etapa com o biorreator de produção de 5000 L é de aproximadamente 14 dias. O volume de coleta do biorreator de produção de 5000 L é de aproxima- damente 4000 litros.
Remoção de célula e Concentração de produto
[0001100] As células são removidas do caldo de cultura através de microfiltração em fluxo tangencial usando membranas de 0,65 μm. o permeado da microfiltração é concentrado através de ultrafiltração em fluxo tangencial usando membranas com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa (NMWCO). a pressão transmembrana e taxas de fluxo são controladas durante as etapas de microfiltração e ultrafiltra- ção. o concentrado é, então, passado através de uma série de filtros de membrana, com uma filtração final através de um filtro de uso único de 0,2 μm. O pH do concentrado é ajustado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M. os filtros de microfiltração e ultrafiltra- ção são de uso múltiplo. Os filtros de microfiltração são limpos com hipoclorito de sódio e Triton X-100 e armazenados em ácido fosfórico. os filtros de ultrafiltração são limpos com hipoclorito de sódio e hidróxido de sódio e, então, armazenados em hidróxido de sódio. EXEMPLO 20: PURIFICAÇÃO DE CTLA4A29YL104E-Ig RECOMBINAN- TE Exemplo 20-A: Um exemplo de um processo de purificação de CTLA4A29YL104E-Ig é mostrado no fluxograma a seguir e a descrição de um processo de purificação é proporcionada através desse Exemplo.
Figure img0072
Inativação viral
[0001101] O pH do material coletado concentrado clarificado é ajustado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M. Agentes virais adventícios potenciais são inativados através da adição de Triton X-100 a 20% para uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução de proteína tratada com Triton X-100 é misturada durante > 2 horas.
Cromatografia por afinidade
[0001102] Cromatografia por afinidade usando uma resina para coluna MabSelect Protein A (GE Healthcare, formalmente conhecida como Amersham Biosciences) é usada para capturar a proteína de CTLA4A29YL104E-Ig do material em-processo da etapa de inativação viral e separar a proteína de belatacept da maioria das impurezas.
[0001103] A coluna MabSelect Protein A é equilibradas com um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,5. A capacidade de ligação dinâmica da resina de afinidade é 25 g de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig por litro de resina em uma velocidade linear de 350 cm/hora. O leito da coluna de 157 L é capaz de ligação de aproximadamente 3,9 kg de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig.
[0001104] O material em-processo tratado com Triton X-100 é aplicado à coluna MabSelect Protein A e a coluna é lavada com um mínimo de 3 volumes de coluna (CV) de tampão de equilíbrio para remover impurezas fracamente retidas. Essas impurezas incluem a proteína 1 quimiotática de monócito de citocina (MCP-1) e Triton X-100. A proteína de CTLA4A29YL104E-Ig é, então, eluída da coluna com um tampão de glicina a 250 mM, pH de 3,0. A proteína de CTLA4A29YL104E-Ig elui como um pico estreito em aproximadamente 2 a 3 CV de tampão de eluição e é coletada em um tanque contendo tampão de HEPES a 2 M, pH de 7,5 de forma a aumentar o pH rapidamente e, desse modo, minimizar a formação de espécies de elevado peso molecular de belatacept (HMW).
Cromatografia de troca de ânions
[0001105] Cromatografia de troca de ânions usando resina Q- Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) é usada primariamente para enriquecer a quantidade de espécies mais altamente sialiladas da proteína de CTLA4A29YL104E-Ig. O reservatório do produto belatacept pH-ajustado da coluna MabSelect Protein A é diluída aproximadamente duas vezes com água para injeção (WFI) antes de aplicação à coluna QFF.
[0001106] A coluna de QFF é equilibrada com um tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 50 mM, pH de 7,0. O reservatório de produto da etapa em MabSelect Protein A com condutividade ajustada é aplicado à coluna QFF e a coluna é lavada com um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio para remover impurezas fracamente ligadas. A coluna é, então, lavada com tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 140 mM, pH de 7,0, para remover espécies de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig com baixo teor de ácido siálico. As espécies mais altamente sialiladas da proteína de CTLA4A29YL104E-Ig são subsequentemente eluídas da coluna usando < 5 CV de tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 200 mM, pH de 7,0.
Cromatografia de interação hidrofóbica
[0001107] Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando resina Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Biosciences) é usada primariamente para reduzir a quantidade espécies de HMW de CTLA4A29YL104E-Ig no reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF. Antes de apli-cação à coluna de HIC, o reservatório de produto da etapa de croma- tografia QFF é diluído usando tampão de HEPES a 50 mM, pH de 7,0 e tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 3,6 M, pH de 7,0 para obter uma condutividade de aproximadamente 135 mS/cm e a concentração de CTLA4A29YL104E-Ig de < 1 g/L no reservatório de produto de QFF.
[0001108] A coluna de HIC é equilibrada com um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0. O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig com concentração e condutividade ajustadas da etapa de cromatografia QFF é aplicada à coluna. A coluna é, então, lavada com um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0 para remover impurezas fracamente ligadas. A proteína de CTLA4A29YL104E-Ig é eluídas da coluna de HIC usando um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 0,55 M, pH de 7,0.
Filtração viral
[0001109] Concentração e diafiltração do reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig da etapa de HIC são obtidas através de ultrafiltração (UF). A etapa de UF utiliza uma membrana com NMWCO de 30 kDa e um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 10 mM, pH de 7,5. A etapa de UF é seguida por uma etapa de filtração viral usando uma membrana Planova de 15 nm (Asahi Kasei). O reservatório de produto de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig é, então, ajustado para uma concentração de proteína de 25 g/L através de UF usando uma membrana com NMWCO de 30 kDa.
Sanitarização e armazenamento de coluna
[0001110] A coluna de cromatografia MabSelect Protein A é sanitari- zada usando solução tampão de NaOH a 0,1 N, lavada com NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,5 para diminuir o pH e, então, armazenada em etanol a 20% a 2 a 8°C. A coluna de cromatografia QFF é sanitarizada com Solução de NaOH a 1 N e armazenada em solução de NaOH a 0,1 N em temperatura ambiente. A coluna de HIC é sanita- rizada com solução de NaOH a 0,1 N, lavada com etanol a 20% e armazenada em etanol a 20% em temperatura ambiente.
Exemplo 20-B: Um outro exemplo de tal método de purificação segue:
[0001111] Inativação viral: O pH do material coletado concentrado clarificado é ajustado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 0,5 M. Agentes virais adventícios potenciais são inativados através da adição de Triton X-100 a 20% para uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução de proteína tratada com Triton X-100 é misturada durante > 2 horas.
[0001112] Cromatografia por afinidade em proteína A para purificação de CTLA4A29YL104E-Ig: Cromatografia por afinidade usando uma coluna com resina MabSelect Protein A (GE Healthcare, formalmente conhecida como Amersham Biosciences) é usada para capturar CTLA4A29YL104E-Ig do material em-processo da etapa de inativação viral e separar CTLA4A29YL104E-Ig da maioria das impurezas.
[0001113] Uma coluna com diâmetro interno de 140 cm é empacotada com resina MabSelect PrA para uma altura de 18 a 25 cm, representando um volume de cerca de 339 a 372 L. A coluna é qualificada para uso determinando HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna.
[0001114] A operação na coluna MabSelect PrA é realizada em tem-peratura ambiente. O reservatório de produto da inativação viral é car-regado sobre a coluna MabSelect PrA equilibrada. A etapa em MabSe- lect PrA é operada em uma taxa de fluxo máxima de 26,7 L/min e uma pressão de operação de > 0,0896 MPa manométrico (13 psig). A carga máxima de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig aplicada à coluna MabSelect PrA é de 25 g de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig por litro de resina em uma velocidade linear de 350 cm/hora. O leito da coluna é capaz de ligação de aproximadamente 3,9 kg de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig.
[0001115] A coluna MabSelect PrA é equilibrada com um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,5. Equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e os valores de pH e condutividade dos efluentes estão entre 7,3 a 7,7 e 14,5 a 17,5 mS/cm, respectivamente.
[0001116] O material em processo tratado com Triton X-100 é aplicado à coluna MabSelect PrA equilibrada. A coluna é lavada com um mínimo de 3 CV de um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 150 mM, Triton X-100 a 0,5%, pH de 7,5 para remover impurezas fracamente retidas da coluna MabSelect PrA. Essas impurezas incluem a proteína 1 quimiotática de monócito de citocina (MCP-1) e Triton X-100. Etapas subsequentes de lavagem são realizadas usando um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 150 mM, pH de 7,5 para remover o Triton X-100 residual da coluna MabSelect PrA.
[0001117] A CTLA4A29YL104E-Ig é eluída da coluna de cromatografia MabSelect PrA com um tampão de glicina a 250 mM, pH de 3,0. O eluato é desviado para um vaso de coleta quando a A280 aumenta para > 0,2 AU acima da linha de base. O efluente da coluna é filtrado através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm em um vaso de coleta equipado com um agitador. O eluato é coletado até que a A280 da borda guia do pico de eluição diminua para um valor de < 0,2 AU. A CTLA4A29YL104E-Ig elui como um pico estreito em aproximadamente 2 a 3 CV de tampão de eluição. O pH do eluato empoçado é ajustado para um pH de 7,5 □ 0,2 com um tampão de HEPES a 2 M, pH de 7,5 de forma a aumentar o pH rapidamente e, desse modo, minimizar a formação de espécies de elevado peso molecular de CTLA4A29YL104E-Ig (HMW). O reservatório de produto da etapa de cromatografia MabSe- lect PrA é mantido em temperatura ambiente durante um máximo de 5 dias. O reservatório de produto pode ser esfriado para armazenamento; o perfil de estabilidade da CTLA4A29YL104E-Ig era o mesmo a 5°C e 22°C. O produto pode ser armazenado durante até 5 dias.
[0001118] O produto de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig que é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6, é coletado.
[0001119] Cromatografia de troca de ânions QFF para purificação de CTLA4A29YL104E-Ig: Cromatografia de troca de ânions usando resina Q-Sepharose Fast Flow (QFF) (GE Healthcare) é usada primariamente para enriquecer a quantidade de espécies mais altamente sialiladas de CTLA4A29YL104E-Ig, bem como reduzir os níveis residuais de proteína A. O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig com pH ajustado da coluna MabSelect Protein A é diluído aproximadamente duas vezes com água para injeção (WFI) antes de aplicação à coluna de QFF.
[0001120] Uma coluna com diâmetro interno de 80 cm é empacotada com resina QFF para uma altura de 27 a 35 cm, representando um volume de cerca de 136 a 176 L. A coluna é qualificada para uso de-terminando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma assimetria (As) de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna.
[0001121] A operação na coluna de QFF é realizada em temperatura ambiente. A coluna de QFF é equilibrada com um tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 50 mM, pH de 7,0. O reservatório de produto da etapa em MabSelect Protein A com pH e condutividade ajustados é aplicado à coluna de QFF. A etapa QFF é operada em uma taxa de fluxo máxima de 16,4 L/min (196 cm/h) e uma pressão máxima de operação de 0,2413 MPa (35 psi).
[0001122] A coluna é sanitarizada antes e após uso com uma solução de NaOH a 1 N. Um mínimo de 2 volumes de coluna da solução de hidróxido de sódio é passado sobre a coluna. A coluna é, então, mantida estática durante 60 a 120 minutos. A faixa de condutividade aceitável para a solução e o efluente da coluna é de 136 a 202 mS/cm.
[0001123] A coluna é equilibrada com um mínimo de 5 volumes de coluna de um tampão de HEPES a 50 mM, cloreto de sódio a 50 mM, pH de 7,0. As faixas de pH e condutividade para esse tampão são 6,8 a 7,2 e 5,0 a 7,0 mS/cm, respectivamente. Essas faixas são também usadas para determinar se a coluna está equilibrada.
[0001124] O reservatório de produto da etapa em MabSelect Protein A produto empoçar com pH e condutividade ajustados é aplicado à coluna de QFF e a coluna é lavada com um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio para remover impurezas fracamente ligadas. A coluna é, então, lavada com tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 135 mM, pH de 7,0, para remover espécies de CTLA4A29YL104E-Ig com baixo teor de ácido siálico.
[0001125] As espécies mais altamente sialiladas da CTLA4A29YL104E-Ig são eluídas da coluna de cromatografia QFF usando um tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 200 mM, pH de 7,0. A coleta de eluato é iniciada quando o tampão de eluição é primeiro aplicado à coluna. Durante eluição, o efluente da coluna é filtrado através de um filtro de 0,2 μm no vaso de coleta. O eluato é coletado até que a absorbância da borda guia do pico de eluição diminua para < 0,2 AU acima da linha de base. A CTLA4A29YL104E-Ig elui da coluna usando < 5 CV de um tampão de HEPES a 50 mM, NaCl a 200 mM, pH de 7,0. O vaso de coleta é, então, esfriado para 2 a 8°C. O tempo máximo de contenção para o reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF a 2 a 8°C é 3 dias.
[0001126] Um produto de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig que é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6 é coletado.
[0001127] HIC em Phenyl Sefarose FF para purificação de CTLA4A29YL104E-Ig: Cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) usando resina Toyopearl Phenyl 650M (Tosoh Biosciences) é usada primariamente para reduzir a quantidade espécies de HMW de CTLA4A29YL104E-Ig no reservatório de produto da etapa de cromatogra- fia QFF.
[0001128] Uma coluna com diâmetro interno de 100 cm é empacotada com resina Phenyl Sefarose Phenyl 650M para uma altura de 18 a 22 cm, representando um volume de cerca de 141 a 173 L. A coluna é qualificada para uso determinando a HETP e As da coluna empacotada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são empregadas para qualificação da coluna de HIC.
[0001129] A operação da coluna de HIC é realizada em temperatura ambiente. Antes de aplicação à coluna de HIC, o reservatório de produto da etapa de cromatografia QFF é diluído usando um tampão de HEPES a 50 mM, pH de 7,0 e HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 3,6 M, pH de 7,0 para obter uma condutividade de aproximadamente 135 mS/cm e uma concentração de CTLA4A29YL104E-Ig de < 1 g/L no reservatório de produto de QFF. A etapa de HIC é operada em uma taxa de fluxo máxima de 22,7 L/min (173 cm/h) e em uma pressão máxima de operação de 45 psi. Múltiplos ciclos da etapa de HIC podem ser empregados baseado na quantidade de CTLA4A29YL104E-Ig presente no reservatório de eluato de QXL.
[0001130] A coluna de HIC é primeiro sanitarizada com uma solução de hidróxido de sódio a 1 N. A sanitarização está completa quando 2 a 4 CV da solução de hidróxido de sódio a 1N passaram através da coluna. A coluna é, então, mantida durante 60 a 120 minutos para assegurar essa sanitarização.
[0001131] Após a etapa de sanitarização, a coluna de HIC é equilibrada com um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0. O equilíbrio está completo quando um mínimo de 3 CV de tampão de equilíbrio passou através da coluna e o pH do efluente é 7,0 ± 0,3 e uma condutividade de aproximadamente 135 mS/cm.
[0001132] O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig com con-centração e condutividade ajustadas da etapa de cromatografia QFF é aplicado à coluna. A coluna é, então, lavada com um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 1,2 M, pH de 7,0 para remover impurezas fracamente ligadas. A CTLA4A29YL104E-Ig é eluída da coluna de HIC usando um tampão de HEPES a 50 mM, sulfato de amônio a 0,55 M, pH de 7,0. Esse reservatório de produto de HIC é mantido no vaso de coleta a 2 a 8°C. O tempo máximo de contenção no vaso de coleta é 3 dias.
[0001133] Um produto de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig com uma proporção molar de mols de ácido siálico para mols de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig que é cerca de 6 ou de cerca de 5,2 a cerca de 7,6; um reservatório de material de espécies de elevado peso molecular de CTLA4A29YL104E-Ig está presente a <2,5%; um reservatório de material de espécies de baixo peso molecular de CTLA4A29YL104E-Ig (por exemplo, monômero de CTLA4A29YL104E-Ig) está presente a <0,5%; e um reservatório de MCP-1 < 9,5 ng/mL está presente.
[0001134] Filtração viral. Concentração e diafiltração do reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig da etapa de HIC é obtida através de ultrafiltração (UF). A etapa de UF utiliza uma membrana com NMWCO de 30 kDa e um tampão de NaH2PO4 a 25 mM, NaCl a 10 mM, pH de 7,5. A etapa de UF é seguida por uma etapa de filtração viral usando uma membrana Planova de 15 nm (Asahi Kasei). O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig é, então, ajustado para uma concentração de proteína de 25 g/L através de UF usando uma membrana com NMWCO de 30 kDa.
[0001135] O sistema Pall Filtron TFF é usado em uma etapa de con-centração e diafiltração do processo de produção de CTLA4A29YL104E-Ig a jusante. O objetivo dessa etapa é concentrar o reservatório de produto da etapa de cromatografia HIC para 45 a 55 g/L e trocar o tampão de eluição usado na etapa de cromatografia HIC com o tampão final usado para composições de CTLA4A29YL104E-Ig. O reservatório de produto de CTLA4A29YL104E-Ig concentrado é transferido através de um filtro de fluoreto de polivinilideno de 0,2 μm e para um saco de biopro- cesso de 50 L.
EXEMPLO 21: ATIVIDADE BIOLÓGICA - DETERMINAÇÃO DE LI-GAÇÃO BIO-ESPECÍFICA DE CTLA4A29YL104E-Ig AO CO-RECEPTOR B-7IG ATRAVÉS DE RESSONÂNCIA DE PLASMÔNIO EM SUPERFÍCIE Ressonância de plasmônio em superfície (ligação a B7)
[0001136] Esse método mede a ligação de CTLA4A29YL104E-Ig a um co-receptor de B7 representativo através de ressonância de plasmônio em superfície. B7Ig é imobilizado em alta densidade via grupos amino primário à superfície de um sensorchip CM5 ativado. Material de CTLA4A29YL104E-Ig, Controles de qualidade e amostras são diluídos para concentrações entre 0,125 e 8 ng/mL e injetados sobre a superfície de B7Ig para gerar sensorgramas de ligação. A taxa inicial (declínio) de ligação de CTLA4A29YL104E-Ig ao B7Ig imobilizado é medida sob condições de transferência de massa limitada (difusão) sobre essa superfície de B7Ig. A taxa de ligação inicial em unidades de ressonância por segundo (RU/s) se correlaciona diretamente com a concentração ativa. As taxas de ligação de amostras são convertidas em uma concentração ativa usando a curva de Padrão de Referência, onde a taxa de ligação de material de CTLA4A29YL104E-Ig é plotada contra a concentração de teste. Os resultados finais são expressos como ligação percentual de amostra com relação ao material de CTLA4A29YL104E-Ig.
[0001137] A presença da região Fc de IgG1 humana em CTLA4A29YL104E-Ig foi detectada usando ressonância de plasmônio em superfície (SPR). SPR permite a medição de interações bio- específicas em tempo real. Um fragmento de anticorpo específico para a região Fc de IgG humana (anti-Fc de IgG humana de F(ab’)2 de cabra) foi covalentemente imobilizado sobre a superfície de um sensorchip. Ligação de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig foi detectada através de medição da resposta obtida sobre sua superfície, comparado com a superfície de um sensorchip não modificado.Os resultados, em unidades de ressonância ligadas para o processo B, Processo C e a co- mistura são comparáveis, conforme mostrado na figura 6 e Tabela 23. Tabela 23. Detecção de Fc de IgG Humana em lotes de substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig Usando SPR
Figure img0073
Ensaio de inibição de IL-2 em células humanas
[0001138] O método é baseado na inibição de produção de IL-2 a par- tir de células T através de CTLA4A29YL104E-Ig quando estimuladas com anti-CD3 e células B. Células T Jurkat, transfectadas com o gene de luciferase sob o controle do promotor de IL-2, são coestimuladas com células Daudi B e anti-CD3 na presença de várias concentrações de CTLA4A29YL104E-Ig. A coestimulação ativa o promotor de IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de luciferase. O sinal luminescente resultante é medido usando um sistema de ensaio de luciferase. Nesse sistema, CTLA4A29YL104E-Ig produz uma diminuição dose-dependente na atividade de luciferase.
[0001139] Os resultados para o processo B Lote 000929-278, Processo C Lote 224818-2004-007 e a co-mistura Lote 55128-162 são comparáveis, conforme mostrado na Tabela 24. Os valores de EC50, fatores de declínio e assíntotas máximo e mínimo são similares para todas as três amostras, dentro de um desvio-padrão. Isso indica que CTLA4A29YL104E-Ig do processo C e do processo B se comportam com- paravelmente no ensaio de potência in vitro. Tabela 24. Comparação de atividade de luciferase mediada pelo promotor de IL-2 Humana no bioensaio de potência in vitro. Parâmetros de curva de dose-resposta para Processos da invenção
Figure img0074
Materiais: - Sensor Chip CM5, grau certificado Biacore (Catálogo No. BR-1000-13) - Tampão de HBS-EP BIA Certified, HEPES a 10 mM, pH de 7,4, NaCl a 150 mM, EDTA a 3,4 mM, 0,005% v/v - Surfactant P20 Biacore (Catálogo No. BR-1001-88) - Amine Coupling Kit BIA Certified, 115 mg de N-hidróxi- succinimida (NHS), 750 mg de cloridrato de 1-etil-3-(3 dimetilamino- propil) carbodiimida (EDC), 10,5 mL de HCl de etanolamina Biacore (Catálogo No. BR-1000-50) - Instrumento Biacore C com um computador PC compatível Biacore, (Catálogo No. BR-1100-51) - Biacore C Control Software, conforme fornecido com o ins-trumento Biacore C, versão 1.0.1
[0001140] Amine Coupling Kit BIA Certified: O kit contém um frasco de cada: 115 mg de NHS, 750 mg de EDC e 10,5 mL de etanolamina. Preparar cada frasco de acordo com as orientações dos fabricantes. Transformar em alíquotas volumes de 200 μL de soluções de NHS e EDC em frascos de plástico/vidro individuais de tamanho apropriado e tampar. Essas soluções são estáveis durante 2 meses quando armazenadas a -20°C. Transformar em alíquotas 200 μL de Etanolamina em frascos de plástico/vidro individuais de tamanho apropriado e tampar. Essa solução é armazenada a 2-8°C e é estável de acordo as orientações do fabricante.
[0001141] Para assegurar boa ligação à célula de fluxo, uma célula de fluxo será usada durante uma semana ou 286 injeções, a qual sempre vai primeiro. Uma nova célula de fluxo será imobilizada no início de cada semana. Imobilização de B7.1 Ig em Preparado para Testagem de amostra NOTA: transformar em alíquotas 200 μL de todas as soluções em tubos Biacore de 7 mm para análise.
[0001142] Descongelar um frasco contendo B7.1 Ig em temperatura ambiente. Diluir B7.1 Ig usando tampão de acetato a 10 mM, pH de 5,0 (1.7) para obter uma massa de superfície de entre 3000-9000 Unidades de ressonância (RU). Descongelar um frasco (200 μL) cada um de EDC e NHS para a temperatura ambiente. Remover HCl de etanola- mina do refrigerador e deixar aquecer para a temperatura ambiente. Do software Biacore: Abrir o projeto publicado "B7 Ig Immobilization" selecionado do "Immobilization Wizard". Abrir o arquivo publicado "B7 Immob.blw". Navegar através do wizard e confirmar ou alterar a sele- ção clicando em "Next". Sob "User Information" selecionar célula de fluxo e fornecer informação experimental na aba "Notebook". Colocar reagente e frascos de ligante no rack de amostra conforme esboçado. Revisar instruções. Salvar o arquivo modelo como: B7 Immob BIOQC # Date Inicials Chip # Flow cell # .blw. Começar a imobilização clicando em "Start". Salvar o arquivo resultante como: B7 Immob BIOQC # Date Inicial chip # flow cell #.blr. Quando o ensaio está terminado, imprimir os resultados do Wizard e sensorgrama.
EXEMPLO 22: ANÁLISE DO TEOR CARBOIDRATO DE UMA COM-POSIÇÃO DE CTLA4A29YL104E-Ig, MAPEAMENTO PEPTÍDICO TRÍPTICO E IEF Mapeamento peptídico por digestão tríptica
[0001143] Nesse método de digestão tríptica, amostras de CTLA4A29YL104E-Ig são desnaturadas usando guanidina-HCl e reduzidas e alquiladas usando DTT e IAA. As amostras são dessalinizadas usando uma NAP-5 coluna e digerida com tripsina. A mistura de digestão é separada através de cromatografia de fase reversa (C18) e os picos são detectados através de absorbância de UV a 215 nm.
[0001144] REAGENTES: solução de fase móvel A (ácido trifluoroacé- tico (TFA) em Água (v/v)); solução de Fase móvel B (TFA a 0,02% em ACN a 95% (Acetonitrila) e 5 % de água (v/v)); agente de alquilação (iodoacetamida a 200 mM (IAA)); Tampão de diluição (TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8,0); Tampão de desnaturação (guanidina a 8 M, TRIS a 50 mM, pH de 8,0); Tampão de Digestão (TRIS a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 8,0); Agente de Redução (DTT a 100 mM).
[0001145] INSTRUMENTAÇÃO: (instrumentação equivalente pode ser usada) colunas NAP-5 (Amersham, cat. N° 17-0853-02); aquecedor de coluna para HPLC; Sistema Waters Alliance HPLC com aquecedor de coluna e detector de UV. Visão de Procedimento
Figure img0075
[0001146] Redução e Alquilação: Amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) foram diluídas para 10 mg/ml através da adição de água para um volume final de 100 μL (1 mg). 560 μl de tampão de desnaturação e 35 μL de Agente de Redução (DTT a 100 mM) foram adicionados a 100 μl amostras, foram misturados e centrifugados em uma microcentrífuga durante 3 segundos. As amostras foram, então, incubadas a 50°C durante 20 minutos ± 2 minutos. 35 μL de agente de alquilação (IAA a 200 mM) foram, então, adicionados a cada amostra e novamente foram misturados e centrifugados em uma mi- crocentrífuga durante 3 segundos. As amostras foram, então, cobertas com folha de alumínio e incubadas a 50°C durante 20 min. ± 2 minutos. Após as colunas NAP-5 terem sido equilibradas entornando 3 volumes de coluna (cerca de 7-8 mL) de Tampão de Digestão, 500 μl das misturas reduzidas e alquiladas foram entornadas sobre as colunas NAP-5, permitindo que o líquido drene através da coluna. As amostras foram, então, coletadas das colunas NAP-5 via eluição de amostra da coluna com 1 mL de Tampão de Digestão.
[0001147] Digestão: Amostras foram digeridas com 20 μL de tripsina (0,5 μg/μL) em um banho de água a 38°C durante 4 horas (± 0,5 horas). Quando de término de digestão, as amostras foram acidificada com 2,5 μL de TFA. As amostras foram, então, colocadas em frascos para amostrador automático para subsequente análise. Método do Instrumento: O método de instrumento é mostrado abaixo:
Figure img0076
[0001148] A coluna foi equilibrada com 100% de tampão de fase móvel A durante 25 minutos antes das primeiras injeções. A absorbância de UV foi monitorada a 215 nm enquanto a temperatura da coluna era mantida a 37°C e a temperatura do amostrador automático a 4°C. Um placebo de tampão de fase móvel A foi operado antes do primeiro Padrão de Adequabilidade de Sistema, após o que, uma única injeção de 50 μL de cada amostra. A injeção de Material de Referência deverá abranger faixas a cada seis injeções de amostra.
[0001149] Número de placas teóricas: Eficiência de coluna, avaliada como o número de placas teóricas, pode ser medida quantitativamente usando o equação:
Figure img0077
[0001150] onde:
[0001151] "w" é a largura de pico na linha de base medida através de extrapolação dos lados relativamente retos para a linha de base,
[0001152] "t" é o tempo de retenção do pico medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição do pico máximo.
[0001153] Se N <50000, re-equilibrar a coluna.
[0001154] Resolução: Determinar a resolução (R) entre 2 picos, por exemplo, pico T2 e pico T12 conforme indicado na figura 32; pode ser determinada usando a seguinte equação:
Figure img0078
[0001155] onde:
[0001156] t1, t2=tempos de retenção de picos de fragmentos T2 e T12, respectivamente
[0001157] w1, w2=largura de pico tangente-definida na linha de base dos picos com tempos de retenção t1 e t2, respectivamente.
[0001158] Se R < 1,5, a coluna deverá ser re-equilibrada e se o problema persiste, a coluna deverá ser substituída.
[0001159] A figura 32 e Tabela 25 mostram os fragmentos peptídicos obtidos a partir de uma digestão com tripsina de CTLA4A29YL104E-Ig. A região mostrando os peptídeos T7 e T9 a ~50 minutos algumas vezes refletem digestão incompleta de amostra e picos podem mostrar diferentes qualidades de dia para dia; contudo, dentro de uma operação, todas as amostras mostram comparabilidade. Tabela 25: Fragmentos de peptídeo tríptico de CTLA4A29YL104E-Ig
Figure img0079
Figure img0080
aPeptídeos com carboidrato N-Ligado bPeptídeos com carboidrato O-Ligado c Massas para T5, T7, T9 e T14 são massas sem as porções de car-boidrato d Um número de massa correspondendo aos peptídeos glicosilados foi observado
Focalização isoelétrica
[0001160] Focalização isoelétrica (IEF) é usada para avaliar os pontos isoelétricos (pI) das várias isoformas de CTLA4A29YL104E-Ig em Substância de Fármaco e produto de fármaco. Esse método usa Pharmacia Biotech Ampholine® PAG Plate em um pH com gradiente de 4,0-6,5 e um sistema de eletroforese com leito plano Multiphore II. As amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) são diluídas em água Milli-Q e carregadas diretamente sobre o gel usando tiras de aplicação de amostra. O gel é focalizado durante 2,5 horas sob tensão crescente usando tiras de catodo embebidas em β-alanina a 100 mM e uma tira de anodo embebida em ácido glutâmico a 100 mM / ácido fosfórico a 500 mM. Após focalização, o gel é fixado usando ácido sulfo- salicílico/ácido tricloroacético e, então, corado usando um sistema de coloração com azul Coomassie. Após coloração, o gel úmido é explorado em um arquivo de imagem digital usando um densitômetro baseado a laser em uma resolução espacial de 50 ou 100 μm com até 4096 níveis de resolução de densidade óptica. CTLA4A29YL104E-Ig focaliza em 10 a 15 bandas, oscilando de um pI de 4,5 a 5,5.
[0001161] Focalização isoelétrica de CTLA4A29YL104E-Ig nativa sobre um gel (pH de 4,0-6,5) gera um padrão de formação de banda similar na faixa de pI de 4,6-5,5 para o processo C Lote 224818-2004-007, Processo B Lote 000929-287 e Co-mistura Lote 55128-162, conforme mostrado na figura 12. Esse procedimento mostra que os materiais dos Processos B e C são comparáveis quando analisados sobre o mesmo gel de IEF.
[0001162] Padrões de focalização isoelétrica deverão ser facilmente distinguidos da base (veja figura 12) Padrão de proteínapI Lectina de lentilha8,65 8,45 Mioglobina de cavalo7,35 6,85 Conalbumina5,90 Lactoglobulina5,20 Inibidor de tripsina de soja4,55 Amiloglicosidase3,50
[0001163] CTLA4A29YL104E-Ig é identificada como múltiplas bandas (>10) que têm uma faixa de pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,5 (FIG. 32).
[0001164] CTLA4A29YL104E-Ig é uma glicoproteína de fusão de CTLA4- Ig de segunda geração a qual consiste do domínio de ligação a ligante modificado do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e da região constante da cadeia pesada de IgG1 humana. Essa nova molécula tem aplicação terapêutica como um imunossupressor. CTLA4A29YL104E-Ig contém múltiplas isoformas carregadas as quais podem ser decompostas através de focalização isoelétrica (IEF). Um método de IEF para a análise de substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig e produto de fármaco foi desenvolvido. Esse método é usado para examinar CTLA4A29YL104E-Ig em um sistema de eletroforese com leito plano Ampholine® PAG Plate, pH de 4,0-6,5, Multiphore II. Substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig, produto de fármaco e Material de Referência são diluídos em água Milli-Q e carregados diretamente sobre o gel. O gel é focalizado durante 2,5 horas sob tensão crescente usando uma tira de catodo embebida em β-alanina a 100 mM e uma tira de anodo embebida em ácido glutâmico a 100 mM / ácido fosfórico a 500 mM. Após focalização, o gel e fixado e corado com azul Coomas- sie. O gel corado é explorado através de densitometria a laser e análise semiquantitativa de bandas de gel é realizada sobre o arquivo de imagem digital. Materiais: Ampholine PAG Plate Gel, pH de 4,0-6,5 GE Healthcare (Cat No. 80-1124-81) Tiras de eletrodo para IEF de 6 x 280 mm GE Healthcare (Cat No. 80-1004-40) Peças de aplicação de amostra GE Healthcare (Cat No. 80-1129-46) Equipamento: _Sistema de eletroforese Multiphor II GE Healthcare (Cat No. 18-1018-06) Placa de resfriamento de 125 x 260 mm GE Healthcare (Cat No. 80-1106-54) Suprimento de energia NOVEX (Modelo Básico 3540) BioRad ( Modelo PAC3000) Circulador termostático VWR (Modelo 13271-074/ 1160S 1160A) Agitador orbital IKA (Modelo KS250/260) Densitômetro Personal SI GE Healthcare (Model 375) Software ImageQuantTL GE Healthcare
Preparo de reagentes
[0001165] Solução tampão de anodo (100 mL): Ácido glutâmico a 0,1 M em ácido fosfórico a 0,5 M; 3,4 mL de ácido fosfórico a 85%; 1,47 ± 0,02 g de Ácido glutâmico; água Milli-Q. Adicionar Ácido glutâ- mico a 50 mL de água Milli-Q. Adicionar ácido fosfórico a 85% e Q.S. para 100 mL, agitar para misturar. Atribuir uma data de expiração de 6 meses e armazenar a 4°C.
[0001166] Solução tampão de catodo (100 mL): β-Alanina a 0,1 M, 0,9 ± 0,02 g de β-Alanina, água Milli-Q. Q.S. reagente para 100 mL com água Milli-Q, agitar para misturar. Atribuir uma data de expiração date de 6 meses e armazenar a 4°C.
[0001167] Solução de fixação (2000 mL): ácido 5-sulfo-salicílico a 3,5% em ácido tricloroacético a 12%, 240 ±5,0 g de Ácido tricloroacéti- co, 70 ± 2,0 g de ácido 5-sulfo-salicílico, água Milli-Q. Combinar os reagentes e Q.S. para 2000 mL com água Milli-Q. Atribuir uma data de expiração de 3 meses e armazenar em temperatura ambiente.
[0001168] Aparelho e Preparo de gel. Conectar a plataforma de res-friamento da unidade de eletroforese Multiphore II ao circulador ter-mostático Multi-Temp e ajustar a temperatura para 10°C. Deixar que o circulador atinja 10 ± 2°C. Remover o gel do refrigerador. Usando te-souras, cortar cuidadosamente ao longo de todos os quatro lados do envelope, certificando-se de não cortar o gel/suporte de gel. Adicionar aproximadamente 1,0 mL de água Milli-Q a uma borda da plataforma de resfriamento. Colocar uma borda do gel/suporte de gel na água, de modo que a água se mova através de toda a borda do gel. Aplicar cui-dadosamente o gel através da plataforma de resfriamento, evitando a formação de bolhas de ar. Remover o filme transparente da superfície do gel. Embeber cada tira de eletrodo com aproximadamente 3,0 mL da solução de eletrodo apropriada (Tabela diretamente abaixo). Aplicar as tiras de eletrodo aproximadamente 10 mm das bordas superior e inferior do gel. Colocar a tira de catodo mais próxima das marcas (-) e a tira de anodo mais próxima das marcas (+) sobre a plataforma de resfriamento. Após as tiras de eletrodo terem sido aplicadas, cortar as tiras para adaptar ao gel, evitando contato com o suporte de gel. Soluções de eletrodo e ajustes de parâmetro de eletroforese
Figure img0081
[0001169] Aplicar as peças de aplicação de amostra aproximadamente 10 mm acima da tira de catodo. Usando os parâmetros de eletroforese definidos na tabela diretamente acima, pré-focalizar o gel até que a tensão atinja 300 V.
[0001170] Preparo de marcador de pI para IEF e Controle de coloração. Reconstituir o marcador de pl para IEF com 100 μL de água Milli-Q. Reconstituir o controle de coloração de Anidrase carbônica II com 1000 μL de água Milli-Q para fazer uma solução de estoque a 1,0 mg/mL. Adicionar 10 μL de solução de estoque (1,0 mg/mL) a 90 μL de água Milli-Q para uma concentração final de carregamento de 0,10 mg/mL.
[0001171] Preparo de amostra. Diluir o Material de Referência de CTLA4A29YL104E-Ig e amostras para uma concentração de 2 mg/mL.
[0001172] Exemplo: Se a amostra de CTLA4A29YL104E-Ig tem uma con-centração de 25 mg/mL, usar a seguinte diluição para preparar a con-centração de carregamento final de 2 mg/mL: 10 μL (de 25 mg/mL) + 115 μL de água Milli-Q = 2 mg/mL NOTA: se a concentração de amostra é < 2,0 mg/mL, então, load a amostra without diluição.
[0001173] Carregamento de gel. Carregar os géis para facilitar identi-ficação de amostra baseado no padrão de operação. Não carregar o gel simetricamente. Carregar o marcador de pI para IEF, controle de coloração, Material de Referência de CTLA4A29YL104E-Ig e amostras de CTLA4A29YL104E-Ig, conforme esboçado na tabela diretamente abaixo. Carregar todas as amostras sobre uma peça de aplicação de amostra. Padrão de carregamento de gel
Figure img0082
* Carga de marcador de pI para IEF na Fileira 1 é necessária para definir a orientação do gel. Começar o padrão de carregamento dentro da fileira 2 e repetir o padrão de carregamento para amostras adi-cionais. O marcador de pI para IEF deve ser carregado pelo menos a cada dez fileiras (Exemplo: MRS1S2S3S4S5S6RM; M - marcador; R - Material de Referência, Sx - amostra).
[0001174] Processamento de gel. Colocar o contentor de eletrodo sobre a unidade Multiphor IIt e alinhar os eletrodos com o centro das tiras de eletrodo sobre o gel. Conectar os dois eletrodos do contentor de eletrodo à unidade de base e colocar a tampa de segurança em posição. Usando uma fita adesiva, cobrir os orifícios na tampa de segurança para impedir que o gel seque. Conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Operar a eletroforese na tensão, corrente e energia apropriadas. Quando eletroforese está completa, desligar o supri- mento de energia e remover a tampa de segurança e contentor de ele-trodo. Remover cuidadosamente as tiras de eletrodo e as peças de aplicação de amostra do gel. Remover todos o gel e suporte de gel da placa de resfriamento e colocar em um disco Pyrex™ de 280 x 180 x 40 mm contendo 200 mL de solução de fixação. Cobrir o disco com um envoltório plástico e colocar sobre um agitador orbital em temperatura ambiente durante um mínimo de 20 minutos.
[0001175] NOTA: O gel deverá ser fixado durante um máximo de 1 hora.
[0001176] Quando fixação está completa, lavar o gel 3 vezes durante 5 minutos cada com aproximadamente 200 mL de água Milli-Q. Misturar a solução de reagente de coloração GelCode Blue através de inversão da garrafa várias vezes. É importante misturar o reagente de coloração antes de distribuição para assegurar que uma amostra homogênea do reagente é usada. Adicionar aproximadamente 200 mL do reagente de coloração ao disco. Cobrir o disco com um envoltório plástico e colocar sobre o agitador orbital em temperatura ambiente durante 18 a 20 horas para obter desenvolvimento ótimo de banda. Quando coloração está completa, lavar o gel substituindo o reagente de coloração por aproximadamente 200 mL de água Milli-Q. Realizar um mínimo de 3 trocas de água durante um período de 1-2 horas para resultados ótimos.
[0001177] Exploração e análise de gel. Explorar o gel usando os pa-râmetros de exploração definidos na tabela diretamente acima. Análise do gel é realizada sobre o arquivo da imagem explorada. Exploração de gel e Parâmetros de análise
Figure img0083
Figure img0084
[0001178] NOTA: A Tabela 3 esboça diretrizes gerais para a análise das imagens de gel. Refira-se ao manual do ImageQuant TL (v2003.03) e instruções na tela para informação detalhada sobre o ajuste apropriado de cada parâmetro de detecção de banda.
[0001179] Abrir um arquivo de imagem de gel (dados brutos explorados) da <1D Gel Analysis> no ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra de ferramentas e diminuir o parâmetro <Image Histogram> até que todas as bandas sejam claramente visíveis. Selecionar <Lane Creation> e escolher <Manual> para ajustar <Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane % Width> para 100% para cobrir as fileiras de gel. Alinhar apropriadamente fileiras únicas se necessário. Usar o método <Rolling Ball> para subtrair a base. Isso não é crítico para análise de imagem do gel de IEF. Detectar bandas usando os ajustes iniciais de <Minimum Slope>, <Noise Reduction> e <%Maximum Peak> listados na Tabela 3. O ajuste desses valores é necessário para identificar precisamente as bandas. Corrigir manualmente quaisquer bandas que faltam e bandas mal identicadas. Computar valor de pI através de uso do marcador de pI padrão dos marcadores rotulados listados na seção Adequabilidade de sistema para o gel com pH/pI de 4,0-6,5. Não realizar as etapas de calibração e normalização. Exportar os dados contidos dentro da janela de medição em uma planilha do Excel para cálculo adicional e reportar. Importar os dados do Excel para uma planilha validada para realizar análise quantitativa para reportagem de resultados.
[0001180] ADEQUABILIDADE DE SISTEMA. Padrões de focalização isoelétrica (marcadores de pI) devem ser prontamente distinguidos da base e mostrar distorção limitada através de inspeção visual da imagem de gel explorada (veja Tabela diretamente abaixo para os marcadores de pI listados). Padrões de focalização isoelétrica
Figure img0085
[0001181] NOTA: Nem todos os padrões de focalização isoelétrica aparecerão sobre o gel porque o pH/faixa de pI do gel é de 4,0-6,5. Os marcadores de pI a 3,50, 4,55, 5,20 e 5,85 têm de ser identificados e rotulados sobre o gel.
[0001182] O padrão de formação de banda de Material de Referência de CTLA4A29YL104E-Ig e artigos de teste deverá mostrar distorção limitada através de inspeção visual da imagem de gel explorada. Um controle de coloração de anidrase carbônica II (pI de 5,4) em um baixo nível de carga de proteína (1,0 μg) é usado para demonstrar coloração de gel consistente. A banda deve ser facilmente distinguida da base através de inspeção visual da imagem de gel explorada. Material de Referência de CTLA4A29YL104E-Ig deve conter 8 a 15 bandas com intensidade de banda >1,0% dentro da faixa de pI de 4,5 a 5,6. Material de Referência de CTLA4A29YL104E-Ig com bandas dentro da faixa de pI de 4,5 a 5,6 deve ter uma intensidade cumulativa percentual de >95%.
[0001183] CÁLCULO DE DADOS. A seguinte equação é utilizada para o cálculo da intensidade cumulativa percentual de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig com relação ao Material de Referência:
Figure img0086
[0001184] Exemplo: Se a amostra tem uma intensidade de banda % (pI 4,5-5,6) de 95% e o Material de Referência tem uma intensidade de banda % (pI 4,5-5,6) de 100%, a intensidade % cumulativa será 95%.
[0001185] O material de CTLA4A29YL104E-Ig em uma modalidade terá bandas com uma intensidade de banda relativa > 1,0% dentro da faixa de pI de 4,5 - 5,6. O material de CTLA4A29YL104E-Ig tem uma intensidade cumulativa percentual com relação àquela do material de referência de CTLA4A29YL104E-Ig dentro da faixa de pI de 4,5 - 5,6.
EXEMPLO 23: TRANSFECÇÃO E GERAÇÃO DE LINHAGENS DE CÉLULAS
[0001186] Antes de eletroporação, o vetor de expressão pD16LEA29Y foi linearizado com enzima BstBI para produzir saliências de 4 bp compatíveis. O vetor linearizado e DNA veículo de esperma de salmão cisalhado (como veículo) foram co-precipitados com etanol e assepti- camente ressuspensos em meio PF CHO (JRH Biosciences) para ele- troporação em células DG44.
[0001187] Após eletroporação, as células foram deixadas se recuperar em meio não seletivo. As células foram, então, cultivadas em lâminas com 96 cavidades em meio seletivo de PF CHO contendo 500 ng/mL de recombulina (Gibco), L-glutamina a 4 mM (Gibco) e metotrexato (ICN).
[0001188] Linhagens de células de produção de CTLA4A29YL104E-Ig dessa lâmina foram escolhidas para amplificação de expressão usando a seguinte progressão de concentrações de metotrexato (MTX) adicionadas ao meio: MTX a 20 nM ^ 50 nM ^ 100 nM ^ 250nM ^ 500nM ^ 1 μM MTX
[0001189] Plasmídeo de expressão de CTLA4A29YL104E-Ig inteiro é integrado no genoma de uma célula.
Seleção de linhagem de célula de produção
[0001190] A linhagem de células de produção final GF1.1.9 foi isolada após dois ciclos de clonagem por diluição limitativa das melhores li- nhagens de células na cavidade mestre amplificada. Seleção de linhagem de células GF1.1.9 foi baseada no padrão de crescimento, titulação e produto contendo uma quantidade reduzida de componentes de espécies de elevado peso molecular e um maior teor de ácido siálico com relação ao material produzido de outros clones.
EXEMPLO 24: CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DA CTLA4A29YL104E- Ig Estudos de estabilidade genômica
[0001191] DNA e RNA isolado de células derivadas de um banco de célula foram usados para análise de hibridização de Southern e Northern e sequenciamento do cDNA para uma sequência de codificação de CTLA4A29YL104E-Ig. Os resultados foram comparados com os resultados obtidos de CTLA4A29YL104E-Ig.
[0001192] Os resultados para a análise de hibridização de Northern e estimativa de sequenciamento de cDNA são apresentados abaixo.
Análise de hibridização de Northern
[0001193] A cultura inoculada com células do banco de células foi ex-pandida e usada para isolar RNA para a análise de hibridização de Northern. A cultura preparada representa células de aproximadamente 27 gerações além da idade de célula in vitro usada no processo de produção de CTLA4A29YL104E-Ig. RNA total foi extraído de células derivadas do banco de células de CTLA4A29YL104E-Ig e de células de CTLA4A29YL104E-Ig expandida. Um controle utilizando RNA total da linhagem de células de CHO precursora foi também usada nesses experimentos. Aproximadamente 5 μg de RNA total foram submetidos à eletroforese em gel de ágarose sob condições de desnaturação. O RNA no gel foi blotted sobre uma membrana de náilon e hibridizado com um fragmento de DNA HindIII/XbaI de 1,2 kb 32P-rotulado contendo o gene de CTLA4A29YL104E-Ig. O fragmento de DNA HindIII/XbaI de 1,2 kb usado para a sonda foi isolado do plasmídeo pD16LEA29Y.
[0001194] Uma espécie de mRNA de aproximadamente 1,7 quiloba- ses que se hibridizava à sonda de gene CTLA4A29YL104E-Ig foi detectada na amostra de RNA total do banco de células conforme mostrado na figura 33. O painel A e O painel B mostrados na figura 33 representam o gel de ágarose corado com brometo de etídio e o autorradio- grama correspondente, respectivamente.
[0001195] Esses resultados indicam que apenas um transcrito que codifica CTLA4A29YL104E-Ig é expresso em culturas derivadas do banco de células de CTLA4A29YL104E-Ig expandidas. Além disso, nenhuma alteração detectável no transcrito de mRNA de CTLA4A29YL104E-Ig foi observada nessas amostras quando comparado com os resultados obtidos usando um banco de células.
EXEMPLO 25: CROMATOGRAFIA POR EXCLUSÃO DE TAMANHO
[0001196] Um método de exclusão tamanho foi desenvolvido para analisar composições de CTLA4A29YL104E-Ig usando uma coluna Toso- Haas TSK-3000 SWXL de 7,8 mm x 300 mm equipada com uma coluna de proteção com detecção a 280 nm. CTLA4A29YL104E-Ig é avaliada com relação à homogeneidade de produto, incluindo monômero (cadeia simples), dímero ou espécies de elevado peso molecular (por exemplo, tetrâmero). O método mostra boa precisão (<2%) em uma concentração nominal de ~10 mg/mL e é linear de ~0,5-15 mg/mL (r2 = 0,999). O DL (Limite de detecção) é ~2,26 μg/mL e o QL (Limite de Quantificação) é ~7,53 μg/mL. Essas moléculas solúveis de CTLA4-Ig são proteínas de fusão consistindo do domínio de ligação a ligante do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e da região constante de cadeia pesada de IgG1 humana com aplicação terapêutica potencial como imunossupressores. Esses compostos exercem seus efeitos fisiológicos através de ligação a antígenos B7 (CD80 e CD86) sobre a superfície de várias células apresentando antígeno (APC), assim, bloqueando a interação funcional de B7.1 e B7.2 com CD28 sobre a su- perfície de células T. Esse bloqueio resulta na supressão de ativação de células T, consequentemente, da resposta imune. Embora LEA29Y venha a diferir da CTLA4Ig apenas em dois resíduos de aminoácido, Leu104 - glu e Ala29 - Try, as moléculas têm avidez significativamente diferente pelos antígenos B7.1 e B7.2. LEA29Y mostra uma avidez 5 a 10 vezes maior pela forma humana de B7.2 (CD86) e avidez similar pela B7.1 humana (CD80), comparado com a CTLA4Ig precursora.
[0001197] Cromatografia de exclusão de tamanho com uma coluna TSK-3000 SWXL (7,8 mm x 300 mm) equipada com uma coluna de proteção e detecção a 280 nm é usada para analisar substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig com relação à homogeneidade. Dímero, espécies de elevado peso molecular (HMW) e espécies de baixo peso molecular (LMW) de CTLA4A29YL104E-Ig são diferenciados.
[0001198] Cromatografia de exclusão de tamanho (SEG) é usada para avaliar CTLA4A29YL104E-Ig com relação à homogeneidade de produto. As figuras 34A-C mostram o cromatograma de SEC de CTLA4A29YL104E-Ig para o Processo B, Processo C e um lote de co- mistura. SEC de CTLA4A29YL104E-Ig indica que o material de processo C tem uma área de dímero de 99,8 por cento, uma área de espécies de HMW de 0,2 pode cento e nenhuma espécie de LMW detectável. Esses resultados são comparáveis com o material de processo B (área de dímero de 97,4 por cento, área de HMW de 2,6 por cento e LMW <DL).
[0001199] Reagentes: KOH a 4N (100 mL); Padrão de Adequabilida- de de Sistema (marcadores de peso molecular dissolvidos em água com grau para HPLC); tampão de operação de Fase móvel (KH2PO4 a 0,2 M, NaCl a 0,9%, pH de 6,8); NaOH a 4N; Tampão de diluição (NaH2PO4 a 25 mM -H2O, NaCl a 10 mM, pH de 7,5) INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES - instrumentação equivalente pode ser substituída:
Figure img0087
[0001200] Padrões e amostras (10 mg/ml) foram preparados como volumes de 50 ml em frascos para amostrador automático rotulados. As amostras foram preparadas em duplicata.
CÁLCULOS
[0001201] Determinação de Resolução (R) e avaliação de tempo de retenção: 20 mL de Padrões de Adequabilidade de sistema são injetados para calcular a resolução entre 2 picos de um cromatograma gerado usando tais padrões (por exemplo, um pico, Pico 1, tendo um tempo de retenção ~ 8,5 minutos e um segundo pico, Pico 2, tendo um tempo de retenção ~ 10 minutos) usando a seguinte equação:
Figure img0088
[0001202] onde:
[0001203] t1=Tempo de retenção do Pico 1
[0001204] t2=Tempo de retenção do Pico 2
[0001205] W1=Largura de pico do Pico 1
[0001206] W2=Largura de pico do Pico 2
Figure img0089
[0001207] = 2,12 □3 1,3
[0001208] A largura de pico é igual a largura (em minutos) na base do pico após extrapolação dos lados relativamente retos do pico para a linha de base. Tempo de retenção e larguras de pico são medidos nas mesmas unidades.
[0001209] R deve ser 3□ 1,3 e o tempo de retenção para o pico deverá ser ~ 8,5 V□ 0,5 minutos. Determinação do Número de placas teóricas: A partir do cromato- grama do Padrão de Adequabilidade de Sistema, a eficiência da coluna pode ser determinada calculando o número de placas teóricas de acordo com a seguinte equação:
Figure img0090
[0001210] onde:
[0001211] (t)= é o Tempo de retenção do Pico 2 (em minutos)
[0001212] (w) = é uma largura (em minutos) na linha de base de Pico 2 obtida através de extrapolação dos lados do pico para a linha de base, conforme observado na figura 1.
[0001213] N deverá ser □3 2500.
[0001214] Integração de Picos: As áreas de pico no cromatograma foram integradas (por exemplo, figuras 34A-C). O pico de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig está a ~ 8,5 minutos e o pico de espécies de elevado peso molecular está a ~ 7,4 minutos.
[0001215] As áreas percentuais podem ser calculadas de acordo com as fórmulas abaixo:
[0001216] Área % de monômero = 100 - (área % de espécies de ele- vado peso molecular + área % de espécies de baixo peso molecular)
Figure img0091
[0001217] onde:
[0001218] A=área de pico de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig
[0001219] B =área total de todos os picos com tempos de retenção menores do que o dímero de CTLA4A29YL104E-Ig
[0001220] C =área total de todos os picos com tempos de retenção maiores do que o pico de dímero de CTLA4A29YL104E-Ig (excluindo volume de inclusão).
[0001221] O RSD % das contagens de área total (excluindo o volume de inclusão) é determinado. O RSD % das contagens de área total deve ser 2% ou menos. Se a área é < 2707 contagens de área, reportar os resultados como □ DL, (Limite de detecção) (~ 2,26 μg/mL). Se as contagens de área estão entre 2707-9014, reportar os resultados como □ QL (Limite de Quantificação) (~ 7,53 μg/mL). Se as contagens de área são □ 9014, reportar os resultados para mais próximo de um décimo de um por cento.
EXEMPLO 26: SDS-PAGE E LIGAÇÕES DE DISSULFETO Eletroforese em gel de poliacrilamida/dodecil sulfato de sódio
[0001222] Um procedimento de eletroforese em gel de poliacrilami- da/dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) para a análise de CTLA4A29YL104E-Ig é usada como um teste de pureza. As amostras são preparadas em um tampão de amostra de Tris-HCl (pH de 6,8), SDS, sacarose e azul de bromofenol na presença (reduzida) ou ausência (não-reduzida) de ditiotreitol (DTT). As amostras são colocadas em um banho de água a 80°C durante dois minutos e submetidas à eletroforese em geis de SDS-poliacrilamida com gradiente (4-20%) pré- fundidos usando um tampão de operação de SDS de Tris-glicina. Após eletroforese, os géis são fixados e corados usando um sistema de coloração com azul Coomassie ou prata. CTLA4A29YL104E-Ig não-reduzida é observada como uma grande banda, com um peso molecular evidente aproximado de ~104 kD. CTLA4A29YL104E-Ig é observada como uma banda principal com um peso molecular evidente aproximado de ~53 kD.
[0001223] Amostras de Processo B Lote 000929-278, Processo C Lote 224818-2004-007 e uma co-mistura Lote 551218-162 foram ele- troforeticamente decompostos usando géis de SDS-PAGE com gradiente de 4-20% sob condições de redução e não-redução. Géis foram separadamente corados com corante Coomassie ou prata, conforme mostrado na figura 35 e figura 36. SDS-PAGE de CTLA4A29YL104E-Ig não-reduzida mostrou uma banda principal a aproximadamente 104 kDa, representando o monômero intacto. Três bandas menores, não facilmente observadas sobre reproduções eletrônicas, foram também observadas a ~200, 65 e 53 kDa. Amostras de CTLA4A29YL104E-Ig reduzida mostram uma banda principal a aproximadamente 53 kDa, representando a forma com cadeia simples e uma banda menor a ~150 kDa. Essa comparação mostra que os três materiais testados são comparáveis quando analisados sobre o mesmo gel.
Ligações de dissulfeto
[0001224] Ligações de dissulfeto foram caracterizadas para a Substância de Fármaco do Processo C usando Lote 224818-2004-007. Cada cadeia de CTLA4A29YL104E-Ig contém nove cisteínas. Essas são Cys21, Cys48, Cys66, Cys92, Cys120, Cys171, Cys231, Cys277 e Cys335. Mapeamento peptídico com LC/MS/MS on line de CTLA4A29YL104E-Ig reduzida e não-reduzida foi usado para identificar os sítios de ligações intra- e intermolecular em CTLA4A29YL104E-Ig. Uma lista dos peptídeos obtidos a partir de mapeamento peptídico de CTLA4A29YL104E-Ig não reduzida junto com o MW esperado e observado são mostrados na Tabela 27.
[0001225] O desaparecimento de determinados picos no mapeamento peptídico não-reduzido e o aparecimento de novos picos no mapeamento peptídico reduzido proporcionada evidência de três peptídeos dissulfeto-ligados: T2-T6, T11-T17 e T25-T30, os quais correspondem às ligações de dissulfeto de Cys21-Cys92, Cys171-Cys231 e Cys277- Cys335. Os peptídeos T5 e T7 têm espécies de elevado peso molecular e contêm carboidratos N-ligados, o que torna difícil localizar ligações de dissulfeto. Para gerar peptídeos mais curtos e isentos de carboidrato, CTLA4A29YL104E-Ig foi digerida com uma mistura de tripsina e quimiotripsina. Como um resultado de clivagem adicional com quimio- tripsina T7 foi encurtado de um peptídeo com 35 aminoácidos para um peptídeo com 15 aminoácidos, designado T7’-T7’, no qual o carboidrato N-ligado é removido. O peptídeo T7’-T7’ dissulfeto-ligado aparece no mapa não-reduzido (veja figura 37). MS/MS sobre T7’-T7’ confirmou sua sequência e ligação de dissulfeto intercadeia em Cys120- Cys120. Tabela 27. Sequência de peptídeo e MW de peptídeos dissulfeto-ligados a partir de Digestão com tripsina de CTLA4A29YL104E-Ig sob condições de não-redução
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a.Peptídeos T5 e T7-T7 dão origem à várias massas em virtude de heterogeneidade de glicosilação N- ligada, tornando difícil localizar ligações de dissulfeto.
[0001226] Tratamento com uma mistura de tripsina e quimiotripsina também resultou na formação de fragmentos, os quais correspondem à versões mais curtas de outros peptídeos dissulfeto-ligados que foram observado quando de hidrólise de CTLA4A29YL104E-Ig através de tripsina apenas. Esses são mostrados na Tabela 28. Tabela 28. Sequência de peptídeo e MW de Peptídeos dissulfeto-ligados de CTLA4A29YL104E-Ig com digestão (Tripsina e Quimiotripsina)
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[0001227] A digestão de CTLA4A29YL104E-Ig com uma mistura de tripsi- na e quimiotripsina estabeleceu o emparelhamento de dissulfeto em T7-T7 e confirmou as ligações de dissulfeto observadas com digestão através de tripsina apenas. Contudo, essa mistura de enzima não tem qualquer efeito sobre o peptídeo T5, o qual é também um glicopeptí- deo. De forma a remover os carboidratos N-ligados de T5, CTLA4A29YL104E-Ig foi digerida com uma mistura de tripsina e elastase conforme mostrado na figura 38. Essa mistura de enzimas hidrolisou T5 em quatro diferente sítios, gerando um peptídeo mais curto designado (T5’-T5’’) conforme mostrado na Tabela 29. Esse peptídeo gerado tinha a massa esperada de 1259 Da e continha a ligação de dissul- feto correspondendo a Cys46-Cys66. O perfil por mapeamento peptí- dico obtido a partir de hidrólise de CTLA4A29YL104E-Ig não-reduzida através de uma mistura de tripsina e elastase, é mostrado na figura 38 e a sequência de peptídeo T5’-T5’’ está na Tabela 29. Tabela 29: Sequência de peptídeo e MW de Peptídeos T5’-T5’’ Obtidos através de Digestão de CTLA4A29YL104E-Ig com uma Mistura de Tripsina e Elastase
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[0001228] Os resultados indicam que CTLA4A29YL104E-Ig tem quatro ligações de dissulfeto intra-moleculares nas posições Cys21-Cys92 (T2-T6), Cys48-Cys66 (correspondendo a um único peptídeo T5), Cys171-Cys231 (T11-T17) e Cys277-Cys335 (T25-T30) e uma ligação de dissulfeto intercadeia nas posições Cys120-Cys120 (T7-T7). Os dados somaram todos os dezoito resíduos de cisteína. Nenhum empa- relhamento errôneo foi observado.
EXEMPLO 27: FORMULAÇÃO DE CTLA4A29YL104E-Ig
[0001229] CTLA4A29YL104E-Ig para injeção, 100 mg/frasco, é um liofili- zado estéril não-pirogênico. A composição de produto de fármaco é fornecida na Tabela 30. Ela é um bolo branco a acinzentado, íntegro ou fragmentado fornecido em frascos de vidro do Tipo I tampados com rolhas de butila cinza e vedados com vedações de alumínio. Esse produto inclui um excesso de 10% para levar em conta perdas pelo frasco, agulha e seringa.
[0001230] Antes de administração, CTLA4A29YL104E-Ig para injeção, 100 mg/frasco, é constituída com 4,2 mL de Água estéril para injeção, USP, para proporcionar uma concentração de 25 mg/mL. Ela pode ser ainda diluída para uma concentração tão baixa quanto 1 mg/mL com dextrose para injeção a 5%, USP ou Cloreto de sódio para injeção a 0,9%, USP. Soluções constituídas e diluídas são claras, incolores e essencialmente isentas de matéria em partículas quando de inspeção visual. Tabela 30.Composição de CTLA4A29YL104E-Ig para injeção, 100 mg/frasco
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a Cada frasco contém um excesso de 10% para considerer perdas pelofrasco, agulha e seringa da solução reconstituída. b Removido durante liofilização
[0001231] A temperatura de transição do vidro da solução congelada a ser liofilizada foi determinada como sendo -28,9 °C. Estudos de liofi- lização foram conduzidos em várias auto-temperaturas de forma para determinar a maior auto-temperatura possível permissível durante secagem primária, sem comprometer a qualidade do produto. Baseado nesses estudos, uma auto-temperatura de -20 °C foi selecionada para a etapa de secagem primária durante a liofilização de CTLA4A29YL104E- Ig. Ao final do ciclo de liofilização, os frascos são tampados sob pressão reduzida.
[0001232] O processo de produção envolve congelamento de frascos contendo solução bruta para liofilização (com excipientes apropriados) em uma câmara de liofilização, seguido por sublimação de água congelada sob temperatura e pressão controladas. As condições de temperatura e pressão na câmara são otimizadas de forma ter sublimação eficiente sem comprometer a qualidade do produto.
[0001233] A compatibilidade da solução com várias superfícies de contato com o produto e componentes de embalagem foi estudada. Descobriu-se que a solução é compatível com uma tubulação de silicone, aço inoxidável 316L, Acrodisc®, HT Tuffryn (poli-sulfona), membranas de filtração de PVDF Millipore (fluoreto de polivinilideno) e o sistema de vedação de recipiente selecionado.
[0001234] CTLA4A29YL104E-Ig para injeção, 100 mg/frasco, é embalada em frascos de vidro com tubulação de sílex do Tipo I de 5 cc e tampada com uma rolha revestida com fluoro-resina Daikyo de 20 mm de butila cinza D-21-7-S/B2-TR 2 e vedada com uma vedação flip-off de alumínio de 20 mm.
[0001235] Seleção de frasco para CTLA4A29YL104E-Ig para injeção foi baseada no volume de enchimento de 5,5 mL para assegurar liofiliza- ção eficiente e seleção de rolha revestida com fluoro-resina Daikyo de 20 mm de butila cinza D-21-7-S/B2-TR foi baseada nos dados de compatibilidade.
[0001236] Estudos de compatibilidade com tempo de uso extensivo foram conduzidos. 100 mg/mL de CTLA4A29YL104E-Ig para injeção, quando constituída para 25 mg/mL com água estéril para injeção, pode ser armazenada em temperaturas ambientes de 15°-25°C (59°-77°F) e luz ambiente durante 24 horas. Solução constituída, quando ainda diluída para 1 mg/ml ou 10 mg/mL com Cloreto de sódio a 0,9% para Injeção (solução salina normal/NS) ou com dextrose para injeção a 5% (D5W) e armazenada em um saco de PVC ou Intra Via de não-PVC em temperaturas ambientes de 15°-25°C (59°-77°F) e luz ambiente, não mostrou perda de potência ou aumento nas espécies de elevado peso molecular durante um período de 24 horas. A solução diluída deve ser filtrada através de um filtro de acetato/celulose misto de 0,2 μm ou 1,2 μm antes de administração. A solução diluída é compatível com filtros de celulose/acetato mistos de 0,2 μm e 1,2 μm.
[0001237] O produto é incompatível com silicone. Ele interage com silicone para formar partículas visíveis. Portanto, contato com superfícies tratadas com silicone, tais como seringas siliconizadas, deverá ser evitado.
EXEMPLO 28: PROCESSO DE PRODUÇÃO DE CTLA4-IG
[0001238] CTLA4-Ig é produzida como uma proteína secretada em cultura de célula em larga escala usando uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO). O processo de produção de CTLA4- Ig é iniciado usando uma série de etapas de expansão de inóculo em frasco e biorreator de cultura. Os conteúdos de um biorreator de cultura final são usados para inocular um biorreator de produção de 5000 L. A cultura de célula coletada do biorreator de produção de 5000 L é clarificada e concentrada através de microfiltração e ultrafiltração. O material coletado isento de célula é ajustado com relação ao pH e condu- tividade no preparado para processamento a jusante. CTLA4-Ig é purificada usando uma série de etapas cromatográficas e de filtração. O processo de produção de CTLA4-Ig a jusante inclui duas etapas de cromatografia de troca de ânions, uma etapa de cromatografia de interação hidrofóbica e uma etapa de cromatografia por afinidade. A finalidade dessas etapas é purificar a proteína de CTLA4-Ig, remover espécies de elevado peso molecular material de CTLA4-Ig e controlar o teor de ácido siálico da Substância de Fármaco de CTLA4-Ig. As etapas de processamento a jusante também incluem a etapa de inativação viral e uma etapa de filtração viral para eliminar agentes virais adventícios potenciais. Substância de Fármaco de CTLA4-Ig purificada é enchida em garrafas de policarbonato de 2 L e congelada em uma temperatura-alvo de -70°C antes de armazenamento em uma temperatura alvo de -40°C. A Substância de Fármaco congelada é descongelada.
[0001239] Ácido N-acetil neuramínico (NANA) é a espécie de ácido siálico primária presente em Substância de Fármaco de CTLA4-Ig. Referências a ácido siálico por toda essa seção se refere especificamente a essa especíe. Níveis mínimos de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) também estão presentes em Substância de Fármaco de CTLA4-Ig. Os níveis de NANA e NGNA são determinados para a Substância de Fármaco de CTLA4-Ig final. Um fluxograma de proces- so para o processo de produção de CTLA4-Ig é mostrado abaixo.
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[0001240] CTLA4-Ig é produzida em biorreatores de produção de 5000 L com um volume de trabalho aproximado de 4300 L. Uma bate lada de Substância de Fármaco de CTLA4-Ig é feita em um único bior- reator de produção derivado de um único frasco do banco de células. O processo de produção de cultura de célula a montante é iniciado usando um único frasco de células de um banco de célula. O frasco é descongelado e os conteúdos todos usados para cultivar um T-frasco contendo meio de crescimento de cultura de célula. As células são, então, expandidas em uma série de frascos para centrífuga. Frascos da etapa final de expansão de inóculo em frasco para centrífuga são usados para inocular o biorreator de cultura de 140 L. O biorreator de cultura de 140 L tem um volume de trabalho de aproximadamente 100 L. Os conteúdos do biorreator de cultura de 140 L são usados para inocular o biorreator de cultura de 1100 L. O biorreator de produção de 1100 L tem um volume de trabalho de aproximadamente 600 L. Os conteúdos do biorreator de cultura de 1100 L são usados para cultivar o biorreator de produção de 5000 L. As células são cultivadas no bior- reator de produção de 5000 L durante aproximadamente 14 dias. Após a etapa no biorreator de produção, o caldo de cultura de célula de um único biorreator é transferido para um vaso de coleta para processamento adicional. A unidade de microfiltração em fluxo tangencial (MF) é usada para separar a proteína de CTLA4-Ig secretada de células hospedeiras e resíduos de célula. O permeado de MF contendo proteína de CTLA4-Ig é, então, concentrado através de ultrafiltração (UF) e ajustado com relação ao pH e condutividade no preparado para a primeira etapa de cromatografia.
[0001241] As etapas de purificação e processamento a jusante para Substância de Fármaco de CTLA4-Ig consistem em cromatografia de troca de ânions, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), inativa- ção viral, cromatografia por afinidade, concentração por UF com fluxo tangencial e diafiltração, filtração viral, uma segunda cromatografia de troca de ânions e concentração por UF e diafiltração. A etapa de HIC utiliza múltiplos ciclos por lote de CTLA4-Ig, dependendo da quantidade de CTLA4-Ig a ser processada. Material em-processo de múltiplos ciclos de etapa de HIC é empoçados para a subsequente etapa de ina- tivação viral. Material em-processo de diferente lotes não é empoçado. Múltiplos filtros virais podem ser usados em paralelo ao processo de um único lote de CTLA4-Ig. Após filtração viral, os filtrados são empo- çadas para processamento adicional.
[0001242] Cada Lote de CTLA4-Ig é filtrado através de um filtro de 0,2 μm em garrafas de policarbonato (PC) de 2 L e temporariamente armazenado a 2°C a 8°C. As garrafas de PC de 2 L de CTLA4-Ig são congeladas em uma temperatura alvo de -70°C e, então, armazenadas em uma temperatura alvo de -40°C. Garrafas de Substância de Fár- maco são descongeladas em uma incubadora a 22°C a 24°C e esfriadas para 2°C a 8°C antes de embarque.
Produção
[0001243] CTLA4-Ig é produzida em cultura de célula em larga escala usando uma linhagem de célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO). O processo de produção de CTLA4-Ig a montante é iniciado com o descongelamento de um frasco congelado de um banco de célula. A cultura é propagada em um T-frasco, seguido por uma série de culturas em frasco para centrífuga. Essas culturas são transferidas para um biorreator de cultura de 140 L. A cultura do biorreator de cultura de 140 L é transferida para um biorreator de cultura de 1100 L. A cultura do biorreator de cultura de 1100 L é usada para inocular um biorreator de produção de 5000 L. Um biorreator de produção é coletado primariamente baseado em uma proporção molar alvo de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig. A cultura de célula coletada é clarificada e concentrada usando uma combinação de microfiltração (MF) e ultrafiltra- ção (UF). Finalmente, o material coletado isento de célula concentrado é ajustado para obter uma condutividade e pH específicos no preparo para processamento a jusante.
Cultura de células e Preparo de meio de alimentação
[0001244] Componentes sólidos e líquidos do meio são pesados e medidos. Dois meios para cultura de células são usados no processo. Meio 127-G é usado nas etapas no T-frasco, frasco para centrífuga, biorreator de cultura e biorreator de produção. Meio 117-E é usado como um meio de alimentação na etapa no biorreator de produção. A composição de meio 127-G é mostrada na tabela diretamente abaixo.
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[0001245] A composição de meio 117-E é mostrada abaixo.
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[0001246] A composição de meio e-RDF-1 está abaixo:
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[0001247] A tabela é continuada abaixo:
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[0001248] O meio de cultura 127-G usado no T-frasco e frascos de centrifugação no processo é preparado em vasos para meio equipados com um agitador para mistura e um cilindro de vidro graduado para determinação de volume. O tamanho de batelada de meio 127-G usada para as etapas de expansão de inóculo no T-frasco e frasco para centrífuga é de 75 L. Meio 127-G é preparado usando Água Para injeção (WFI). Componentes sólidos e líquidos do meio são adicionados à WFI. O meio é misturado durante o período de tempo requerido após a adição de cada componente. WFI é adicionada para levar o meio ao volume final de batelada de 75 L. A amostra é removida do preparado de meio final e a concentração de glicose, pH e osmolaridade da amostra são medidos para assegurar que o meio vai ao encontro dos critérios de aceitação definidos. O meio é filtrado através de um filtro de 0,2 μm e distribuído em garrafas estéreis de tereftalato de polietile- no glicol (PETG). O meio 127-G preparado para a etapa de expansão de inóculo em T-frasco e frasco para centrífuga é armazenado a 2°C a 8°C durante um máximo de 42 dias. Meio 127-G para as etapas no biorreator de cultura de 140 L e 1100 L é preparado em vasos equipados com um agitador para mistura. O tamanho da batelada de meio 127-G usada na etapa no biorreator de cultura de 140 L é de 120 L. O vaso usado para preparar o meio para o biorreator de cultura de 140 L é equipado com um vidro com visor graduado para determinação de volume. O tamanho de lote de meio 127-G usado na etapa no biorrea- tor de cultura de 1100 L é de 600 kg. O vaso usado para preparar o meio para o biorreator de cultura de 1100 L é equipado com um transmissor de pressão diferencial para determinação de peso.
[0001249] Os volumes requeridos de meio 127-G são transferidos para os biorreatores de cultura de 140 L e 1100 L através de filtros de 0,2 μm e 0,1 μm consecutivos. O meio 127-G preparado para as etapas nos biorreatores de 140 L e 1100 L pode ser mantido a 37°C durante um máximo de 48 horas. O meio pode ser mantido a 4°C durante mais 84 horas.
Preparo de meios de cultura de célula 127-G e 117-E C usados em uma etapa no biorreator de produção de 5000 L
[0001250] Meio 127-G para a etapa com o biorreator de produção de 5000 L é preparado em um vaso de preparo de meio equipado com um agitador e transmissor de pressão diferencial para determinação de peso. O tamanho de lote de meio 127-G usado na etapa com o biorreator de produção de 5000 L é de 2900 kg. O volume requerido de meio 127-G é transferido para o biorreator de produção de 5000 L através de filtros consecutivos de 0,2 «m e 0,1 μm. O meio 127-G preparado para a etapa com o biorreator de produção de 5000 L pode ser mantido a 37°C durante um máximo de 48 horas. O meio pode ser mantido a 4°C durante mais 84 horas.
[0001251] Meio de alimentação 117-E é preparado em um vaso de preparo de meio equipado com um agitador para mistura e um transmissor de pressão diferencial para determinação de peso. O tamanho de batelada de meio 117-E usado na etapa com o biorreator de produção de 5000 L é de 1800 kg. Os componentes do meio 117-E são adicionados a um peso especificado de WFI no vaso de preparo de meio. O meio é misturado durante o período de tempo requerido após a adição de cada componente. WFI é adicionada para levar o meio ao peso final especificado. A amostra é removida do preparado de meio final e a concentração de glicose, pH e osmolaridade da amostra medidos de forma para assegurar que o meio vai ao encontro dos critérios de aceitação definidos. O volume requerido de meio 117-E é transferido para um tanque de contenção de meio de alimentação através de filtros consecutivos de 0,2 μm e 0,1 μm. O meio 117-E preparado para a etapa com o biorreator de produção de 5000 L pode ser mantido a 37°C durante um máximo de 2 dias. O meio pode ser mantido a 4°C durante mais 4 dias.
Etapas de expansão de inóculo em T-frasco e Frasco para centrífuga
[0001252] O objetivo das etapas de expansão de inóculo em T-frasco e frasco para centrífuga do processo de produção de CTLA4-Ig é pro- págar serialmente células do frasco com banco de células para proporcionar um número suficiente de células viáveis para inocular o bior- reator de cultura de 140 L. Um único frasco do banco de células é removido da fase vapor de um congelador de armazenamento de nitrogênio líquido e descongelado em um banho de água a 37°C. Os conteúdos todos do frasco são assepticamente transferidos para um tubo para centrífuga cônico de 15 mL estéril. Meio 127-G é adicionado para levar o volume final para 10 mL. A suspensão de célula é centrifugada, o sobrenadante descartado e o pélete de célula ressuspenso em 10 mL de meio de cultura de célula 127-G. As células ressuspensas são transferidas para um frasco T-175 contendo 10 mL de meio 127-G. A densidade de células viáveis e a viabilidade percentual da cultura no frasco T-175 são determinadas. Uma viabilidade percentual nessa etapa de >84% foi estabelecida. Meio 127-G é adicionado ao frasco T- 175 para obter uma densidade-alvo de células viáveis de 2,1 x 105 cé- lulas/mL.
[0001253] O frasco T-175 é incubado a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6% durante um máximo de quatro dias para obter um número de células final-alvo de 1,80 x 107 células viáveis. Após a etapa com frasco T-175, a cultura é expandida usando uma série de etapas frascos para centrífuga de 0,25 L, 1 L e 3 L. Em cada passagem, as células são cultivadas em uma densidade-alvo de 2,0 x 105 células viáveis/mL. As culturas em frasco para centrífuga são incubadas a 37°C em uma atmosfera de dióxido de carbono a 6%.
[0001254] Material de cultura de célula da etapa final de expansão de inóculo em frasco para centrífuga de 3 L é empoçado em um vaso de transferência de inóculo esterilizado de 20 L. Uma densidade final de células viáveis na etapa de expansão de inóculo no frasco para centrífuga de 3 L de 1,0 a 2,0 x 106 células/mL e uma viabilidade celular percentual mínima de > 80% foram estabelecidas. Esses valores exempli- ficativos asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado para inocular o biorreator de cultura de 140 L. Um volume total de 12 L a 18 L da cultura de célula empoçada da etapa de expansão de inóculo final no frasco para centrífuga de 3 L é usado para inocular o biorreator de cultura de 140 L.
Etapas de expansão de inóculo em biorreator de cultura de 140 L e1100 L
[0001255] O objetivo das etapas de expansão de inóculo em biorrea- tor de cultura de 140 L e 1100 L do processo de produção de CTLA4- Ig é proporcionar um número suficiente de células viáveis para inocular o biorreator de produção de 5000 L. Os biorreatores de cultura são operados no modo em batelada usando meio de cultura de célula 127- G. A temperatura, pH, oxigênio dissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo de gás para ar, oxigênio e dióxido de carbono são controlados através de um sistema de controle distribuído (DCS) e proporcionam condições para crescimento ótimo da cultura nos biorreatores de cultura. Os biorreatores de cultura são operados a 37°C. As amostras de cultura são removidas dos biorreatores de cultura para a determinação de densidade de células viáveis, viabilidade percentual e concentrações de metabólito.
[0001256] O biorreator de cultura de 140 L é inoculado com inóculo empoçado da etapa de expansão de inóculo em frasco para centrífuga de 3 L para uma densidade-alvo inicial de células viáveis de 2,0 x 105 células/mL. Uma densidade final de células viáveis na etapa de expansão de inóculo no biorreator de cultura de 1100 L de 1,0 a 2,5 x 106 células/mL e uma viabilidade celular percentual mínima de > 80% foram estabelecidas. Esses critérios de aceitação asseguram que um número suficiente de células viáveis é usado para inocular o biorreator de produção de 5000 L. A cultura de célula do biorreator de cultura de 1100 L é transferida para o biorreator de produção de 5000 L para obter uma densidade inicial de células viáveis-alvo de 1,5 x 105 célu- las/mL.
Etapa no biorreator de produção
[0001257] O objetivo da etapa com o biorreator de produção de 5000 L é expandir o número de células viáveis e produzir a proteína de CTLA4-Ig. A duração em um biorreator de produção etapa é de aproximadamente 14 dias. Inóculo do biorreator de cultura de 1100 L é cultivado em um biorreator de produção de 5000 L contendo meio de cultura de célula 127-G. Um biorreator de produção é operado em um modo de alimentação em batelada. A temperatura, pH, oxigênio dissolvido, pressão, agitação e taxas de fluxo de gás para ar, oxigênio e dióxido de carbono são controlados através de DCS e proporcionam condições para crescimento ótimo da cultura e produção da proteína de CTLA4-Ig no biorreator de produção.
[0001258] Uma estratégia de controle de temperatura em três estágios é usada durante a etapa com o biorreator de produção de 5000 L para otimizar o crescimento celular e produção de CTLA4-Ig. A temperatura de incubação inicial de um biorreator de produção é controlada a 37°C para obter crescimento celular ótimo. A temperatura é diminuída para 34°C quando uma densidade de células viáveis de 4,0 x 106 célu- las/mL é obtida no biorreator de produção ou a 144 horas a partir do momento de inoculação, o que ocorrer primeiro. A temperatura é diminuída para 32°C a 240 horas e mantida a 32°C até coleta. Amostras diárias são obtidas do biorreator de produção de 5000 L para monitorar o crescimento celular, viabilidade celular, concentrações de meta- bólito, titulação de CTLA4-Ig e a proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig.
[0001259] Alimentação de meio 117-E ao biorreator de produção é iniciada entre 12 a 24 horas a partir do momento de inoculação. Meio 117-E é adicionado diariamente para obter um alvo de 1% (v/v) de meio de alimentação ao volume de cultura ou um volume suficiente do meio de alimentação 117-E para levar a concentração de glicose para 3 g/L. Essa estratégia de alimentação proporciona níveis suficientes de glicose e outros nutrientes à cultura para sustentar a produção de proteína de CTLA4-Ig durante a etapa em um biorreator de produção.
[0001260] Meio 117-E é suplementado com D-galactose para promover glicosilação aumentada de proteína de CTLA4-Ig. Suplementação com galactose resulta em um aumento no teor final de ácido siálico da proteína de CTLA4-Ig. A proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig é um critério de coleta importante no processo de produção de CTLA4-Ig.
[0001261] Uma estratégia com três estágios é também usada para controlar o oxigênio dissolvido e taxa de agitação no biorreator de pro-dução. A taxa de agitação inicial de 30 rpm assegurar uniformidade de condições físicas e impede assentamento das células dentro do bior- reator de produção de 5000 L. O ponto de ajuste de oxigênio dissolvido inicial de 40% assegurar disponibilidade de níveis suficientes de oxigênio dissolvido para sustentar o crescimento da cultura no biorrea- tor de produção. Os pontos de ajuste para oxigênio dissolvido e taxa de agitação são aumentados a 96 horas a partir do momento de inoculação para 50% e 40 rpm, respectivamente. A 120 horas a partir do momento de inoculação, os pontos de ajuste para oxigênio dissolvido e taxa de agitação são ainda aumentados para 60% e 50 rpm, respectivamente. Essa estratégia assegurar níveis suficientes de oxigênio dissolvido para manter a cultura de célula durante a etapa no biorrea- tor de produção. A titulação de proteína de CTLA4-Ig aumenta durante o curso da etapa em um biorreator de produçã. A viabilidade da cultura é monitorada durante o curso dessa etapa. A proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig é monitorada duas vezes diariamente a partir de 6 dias do momento de inoculação até o momento de coleta. A proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig tem um pico a aproximadamente 10 em torno do dia 8 a partir do momento de inoculação e, então, diminui gradualmente durante o restante da etapa no biorreator de produção. O critério de coleta primário para um biorreator de produção é a proporção molar de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig. Um biorreator de produção é coletado em um proporção molar alvo de ácido siálico para proteína de CTLA4-Ig de 8,0.
[0001262] Um valor de viabilidade celular mínima de 38% foi também estabelecido para coleta da cultura. Esses critérios de coleta asseguram a consistência do material coletado em-processo para processamento a jusante à Substância de Fármaco de CTLA4-Ig. O número total de gerações de célula do início da expansão de inóculo até a coleta de um biorreator de produção no processo de produção de CTLA4-Ig a montante é de aproximadamente 38 gerações. Foi demonstrado que a linhagem de célula usada no processo é estável durante 105 gerações em um estudo de estabilidade de linhagem de célula.
Etapas de operação de coleta
[0001263] O objetivo das etapas de operação de coleta é remover células e resíduos de célula do material coletado e concentrar a corrente em-processo contendo proteína de CTLA4-Ig para processamento adicional a jusante. Os sistemas de MF e UF são sanitarizados antes de processamento do material coletado. Os sistemas de MF e UF são submetidos a fluxo com uma solução de ácido peracético. Os sistemas de MF e UF são, então, tratados com uma solução de alvejamento e uma solução de hidróxido de sódio, respectivamente. Finalmente, os sistemas de MF e UF são submetidos a fluxo com WFI até uma condu- tividade de < 3 μS/cm no retentado e permeado é obtida. O caldo de cultura de célula do biorreator de produção de 5000 L é transferido para um vaso de coleta. MF em fluxo tangencial com membranas de fluo- reto de polivinilideno de 0,65 μm é usada para a remoção de células e resíduos de célula do material coletado em-processo contendo proteína de CTLA4-Ig. O permeado de MF isento de células é coletado em vaso de permeado. O permeado de MF isento de células é simultaneamente concentrado através de UF em fluxo tangencial usando membranas de poliéter-sulfona com um corte de peso molecular nominal de 30 quilodáltons (kDa). O permeado de UF é usado como o meio de diafiltração para a etapa de processo de MF. Uma solução de ácido fosfórico a 0,1 N é usada para armazenamento do sistema de MF. Uma solução de hidróxido de sódio a 0,1 N é usada para armazena-mento do sistema de UF. A temperatura, taxas de fluxo de permeado e retentado e pressões transmembrana são monitoradas e controladas durante a operação de MF e UF. As taxas de fluxo são medidas através de fluxômetros in line presentes sobre as rampas de filtração. Sensores são usados para medir a pressão e temperatura. Uma taxa de fluxo de retentado de MF de 163 a 235 L/min e uma pressão trans- membrana de MF de < 0,0262 MPa manométrico (3,8 psig) foram estabelecidas. Esses valores asseguram consistência no desempenho das etapas de operação de coleta.
[0001264] A etapa final na operação de coleta é um ajuste do pH e condutividade do material coletado em-processo clarificado e concentrado. O pH e condutividade do material coletado em-processo concentrado são ajustados para captura da proteína de CTLA4-Ig durante a primeira etapa de processamento cromatográfico a jusante. O pH é ajustado para 8,0 através da adição de uma solução de Tris a 2 M e a condutividade do permeado concentrado é reduzida para 10 mS/cm através da adição de WFI. O material coletado em-processo concentrado e ajustado é, então, filtrado através de três alojamentos de filtro paralelos e um consecutivo contendo filtros descartáveis de 0,2 μm e transferido para um tanque na área de purificação a jusante. Tabela 31:Composição de Meio CD-CHO
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Tabela 32: Composição de meio de alimentação eRDF
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Tabela 33: Composição Modificada de Meio CD-CHO a 50%
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EXEMPLO 29 - Processo de purificação de CTLA4-Ig
[0001265] O material ajustado com pH e condutividade final da etapa de operação de coleta descrita no Exemplo 28 é primeiro processado usando uma etapa de cromatografia de troca de ânions. A reunião ("pool") de produto dessa primeira etapa de cromatografia de troca de ânions é, então, processada usando uma etapa de cromatografia por interação hidrofóbica. O material contendo CTLA4-Ig é, então, tratado com Triton X-100 para inativar agentes virais adventícios potenciais. O material tratado com Triton X-100 é processado usando uma etapa de cromatografia por afinidade por proteína A recombinante. A reunião de produto da etapa de cromatografia em proteína A recombinante é concentrada e diafiltrada. Uma etapa de filtração viral para a remoção de agentes virais adventícios potenciais é, então, realizada. O filtrado é ainda purificado usando uma segunda etapa de cromatografia por troca de ânions. Finalmente, a proteína CTLA4-Ig purificada é concentrada e diafiltrada no tampão de substância de fármaco final.
[0001266] CTLA4-Ig é uma proteína de fusão geneticamente manipulada a qual consiste no domínio de ligação funcional do Antígeno 4 de Linfócito T Citotóxico humano e o domínio Fc de imunoglobulina monoclonal humana da classe IgG1. O dímero CTLA4-Ig é compreendido de duas cadeias polipeptídicas glicosiladas homólogas de aproximadamente 45 kDa cada, as quais são covalentemente ligadas através de uma única ligação de dissulfeto. Um fluxograma de processo para as etapas a jusante do processo de produção de CTLA4-Ig é mostrado. CTLA4-Ig é produzida em biorreatores de produção de 5000 L usando uma linhagem de células de ovário de hamster Chinês (CHO). Etapas cromatográficas e de filtração no processo de produção de CTLA4-Ig a jusante são realizadas em temperatura ambiente. O material em-processo é armazenado a 2 a 8°C entre as etapas de processamento. O processo a jusante é iniciado com o recebimento do material coletado em-processo das etapas de operação de coleta. Esse material é primeiro processado através de uma coluna de cromatografia de troca de ânions usando resina Q Sepharose® Extreme Load (QXL). A coluna QXL funciona para capturar a proteína CTLA4-Ig do material coletado. A etapa de captura em coluna QXL também obtém uma redução de volume para processamento a jusante adicional.
[0001267] A reunião de produto de QXL é passada através de uma coluna de cromatografia por interação hidrofóbica (HIC) utilizando uma resina Phenyl Sepharose Fast Flow. Durante essa etapa, material de CTLA4-Ig de alto peso molecular (HMW) e proteínas de célula hospedeira de ovário de hamster Chinês (CHOP) são ligados à coluna. A proteína dimérica CTLA4-Ig não se liga à resina de HIC e passa através da coluna. Após a etapa de HIC, uma inativação viral (VI) usando detergente Triton® X-100 é realizada para inativar agentes virais adventícios potenciais. A próxima etapa utiliza uma coluna de afinidade por proteína A recombinante de resina Sepharose Fast Flow (rPA). Nessa etapa de cromatografia, os níveis de CHOP e proteína 1 qui- miotática de monócito (MCP-1) são reduzidos. A etapa de rPA é definida como uma etapa de eliminação viral. Após a etapa de cromato- grafia por afinidade, a proteína CTLA4-Ig é concentrada e submetida à diálise usando membranas de ultrafiltração (UF) de 30 kDa e processada através de filtros Planova® de 15 nm para remover agentes adventícios potenciais. Quando de término da etapa de filtração viral (VF), a proteína CTLA4-Ig é processada sobre uma segunda coluna de troca de ânions usando resina Q Sepharose Fast Flow (QFF). A etapa de cromatografia QFF reduz os níveis de DNA e proteína A recombi- nante residuais. A etapa de QFF é definida como uma etapa de eliminação viral. Finalmente, a proteína CTLA4-Ig é concentrada e diafiltra- da usando uma membrana de UF de 30 kDa contra uma solução de fosfato de sódio a 25 mM, NaCl a 50 mM, pH de 7,5. A substância de fármaco CTLA4-Ig é, então, filtrada através de um filtro de 0,2 μm antes da etapa de enchimento final.
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[0001268] A impurezas relacionadas ao processo CHOP, MCP-1, proteína A recombinante residual, DNA e Triton X-100 são reduzidos em etapas de processamento a jusante específicas do processo de produção de CTLA4-Ig. PPs com limites de ação são estabelecidos no ponto de controle em-processo principal para cada impureza. CHOP e MCP- 1 na reunião de produto são identificados como PPs para a etapa de cromatografia rPA. Ligante proteína A recombinante residual, DNA e Triton X-100 na reunião de produto são identificados como PPs para a etapa de cromatografia QFF. Baseado na estrutura conhecida e retenção cromatográfica da insulina, as etapas de HIC, rPA e QFF proporcionariam eliminação significativa de insulina baseado em modos ortogonais de interação. Além disso, insulina com um peso molecular de 5,8 kDa seria eliminada através de três etapas de concentra- ção/diafiltração a 30 kDa no processo de coleta e a jusante. A etapa de rPA proporciona uma eliminação de > 3,0 log10 de metotrexato (MTX). Além disso, MTX com um peso molecular de 0,455 kDa seria eliminado através das três etapas de concentração/diafiltração a 30 kDa no processo de coleta e a jusante. Insulina e MTX são adicionados ao meio de fermentação em quantidades fixas e são consumidos como uma função do metabolismo celular durante o processo de fermentação de 5000-L antes de processamento a jusante. Insulina e MTX são medidos em múltiplos pontos no processo a jusante. Os níveis de insulina e MTX em cada um desses pontos estavam abaixo do nível de quantificação para operações anteriores completas.
[0001269] Tampões: O objetivo de preparo do tampão é produzir tampões de processamento a jusante que vão de encontro a valores, limites de ação e limites de alerta exemplificativos. Qualidade consistente do tampão é essencial para assegurar desempenho cromatográfico reproduzível. As etapas a jusante do processo CD-CHO1 de CTLA4-Ig requerem 17 tampões e soluções. Tampões e soluções são preparados e usados para etapas de processamento específicas dentro de um lote. Tampões que têm contato com o material em-processo CTLA4-Ig são considerados como sendo tampões de processo significativos. Os tampões de contato com produto incluem tampões de equilíbrio, lavagem, eluição e ajuste de reunião de produto. Os tampões e soluções usados em etapas de limpeza e sanitarização e testagem funcional dos detectores de ultravioleta (UV) nas plataformas de cromatografia têm amplas faixas de especificação. Em virtude das amplas faixas de especificação para esses tampões e soluções e da ausência de contato com produto, nenhum PPs é designado para esses tampões e soluções. Os PPs definidos para os dez tampões de contato com produto e valores exemplificativos correspondentes são resumidos. O limite de tempo de manutenção máximo para esses tampões é de três dias e é derivado de estudos de manutenção em vaso de tampão9 e suportados por estudos de estabilidade de tampão. Os tampões de contato com produto também têm PPs designados com limites de alerta correspondentes. Os PPs e limites de alerta correspondentes para esses tampões são apresentados. Tampões e soluções que não entram em contato com material CTLA4-Ig em-processo têm PPs designados com limites de alerta ou ação e são apresentados. Tampões e soluções que não contatam o produto não são testados com relação à endotoxi- na porque eles são soluções de sanitarização ou tampões ou soluções de limpeza de resina de cromatografia que são seguidas por etapas de sanitarização de coluna.
Etapa de cromatografia de troca de ânions Q Sepharose Extreme Load
[0001270] Cromatografia de troca de ânions é realizada usando resina QXL da GE Healthcare (formalmente Amersham Biosciences). Uma coluna de 1,0 m de diâmetro interno é acondicionada com resina QXL para uma altura de 17 a 24 cm, representando um volume de 133 a 188 L. A coluna é qualificada para uso determinando a altura equivalente a um platô teórico (HETP) e a assimetria (As) da coluna acondicionada. Uma HETP de 0,02 a 0,08 cm e uma As de 0,8 a 1,2 são requeridas para qualificação da coluna QXL. A coluna QXL funciona para capturar a proteína CTLA4-Ig do material coletado em-processo. A etapa de captura por QXL também obtém uma redução de volume para processamento a jusante adicional. A operação na coluna QXL é realizada em temperatura ambiente. O caldo de cultura celular clarificado é carregado sobre uma coluna QXL equilibrada. A etapa de cro- matografia QXL é realizada usando uma taxa de fluxo máxima de 28 L/min. A pressão de entrada da coluna é mantida abaixo de 0,2413 MPa manométrico (35 psig). A carga máxima de proteína abatacept para a coluna QXL é de 28 gramas de abatacept por litro de resina. A coluna é preparada através de equilíbrio com tampão de HEPES a 25 μM, NaCl a 100 mM, pH de 8,0. Após equilíbrio da coluna, o material coletado é carregado sobre a coluna com monitoramento contínuo da absorção de UV do efluente a 280 nm. Após aplicação da carga, a coluna é lavada com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 120 mM, pH de 8,0. A proteína CTLA4-Ig é eluída da coluna com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 850 mM, pH de 7,0. A tabela diretamente abaixo mostra os parâmetros de processo para a etapa de cromato- grafia Q Sepharose Extreme Load.
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[0001271] O tempo de manutenção de coleta assegura consistência de processo com limites de alerta estabelecidos. Ao parâmetro de bio- carga de reunião de produto pré-filtração é atribuído um alerta ínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente. Os seis PPs de QXL definidos pelos limites de ação são altura da coluna, taxa de fluxo, condutividade do tampão de lavagem, pico de eluição e densidade óptica (OD), rendimento da etapa e biocarga. A faixa de altura da coluna foi estabelecida para proporcionar volume suficiente para que a resina capture produto do material coletado. Os limites de ação para esse parâmetro foram estabelecidos a partir dos dados. A taxa de fluxo é um fator importante para assegurar consistência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela é definida para a etapa QXL como um PP com um limite de ação máximo. A condutividade do tampão de lavagem é estabelecida para remover impurezas fracamente ligadas da resina QXL. Estudos de classificação por escalonamento determinaram que esse parâmetro é um fator importante na manutenção da consistência da etapa QXL. O pico de eluição e a OD são definidos para minimizar o nível de material CTLA4-Ig de HMW na reunião de produto. O material CTLA4-Ig de HMW elui ao final do pico de elui- ção. Limites de ação de rendimento da etapa asseguram consistência de processo para a etapa de QXL. Os limites de ação para taxa de fluxo, pico de eluição e OD e PPs de rendimento da etapa foram estabelecidos. À biocarga é atribuído um limite de ação de < 1 cfu/mL. Doze dos PPs de QXL são definidos pelos limites de alerta, conforme apresentado.
[0001272] Os valores de pH e condutividade do tampão no processo são monitorados. Tampões que não vão de encontro aos valores exemplificativos de pH e condutividade no momento de preparo são rejeitados e o lote de tampão descartado. Para a etapa de QXL, a condutividade e pH do tampão de equilíbrio, pH do tampão de lavagem e condutividade e pH do tampão de eluição são definidos. A pressão de entrada da coluna assegura consistência durante a etapa de cro- matografia de ligação-e-eluato. A etapa QXL é realizada em um limite máximo de pressão de 0,2413 MPa manométrico (35 psig). O limite de pressão de 0,2413 MPa manométrico (35 psig) é empregado para prevenir compressão da resina QXL de acordo com a especificação do fabricante. A condutividade da reunião de produto é um PP com um limite de alerta. À condutividade da reunião de produto é atribuído um limite de alerta para assegurar que o material CTLA4-Ig de HMW e CHOP na reunião de produto de QXL se ligam eficazmente à subsequente coluna de HIC. Os limites de alerta de 58,5 a 69,1 mS/cm foram estabelecidos. À titulação de reunião de produto, proporção molar de ácido siálico (SA) para ácido N-acetilneuramínico (NANA), material CTLA4-Ig de HMW e CHOP são atribuídos limites de alerta de forma a assegurar consistência de processo. A titulação de reunião de produto e limites de alerta de SA foram estabelecidos.
[0001273] O material em-processo da etapa de operação de coleta é carregado sobre a coluna de QXL. A coluna é lavada com um mínimo de 10 CV de tampão de lavagem (HEPES a 25 mM, NaCl a 120 mM, pH de 8,0) e a absorbância a 280 nm (A280) do efluente da coluna é medida ao final da etapa de lavagem. O abatacept é, então, eluído da coluna com um tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 850 mM, pH de 7,0. O eluato é desviado para um vaso de coleta quando a A280 aumenta para > 0,02 unidades de absorbância (AU) acima do valor de AU ao final da etapa de lavagem. O eluato é coletado até que a A280 da borda de fuga do pico de eluição diminua para um valor de <1,0 AU. Tampão de eluição é adicionado diretamente ao vaso de coleta de eluato para obter um peso alvo de 600 ± 10 kg do eluato. Uma taxa de agitação de 30 ± 5 rpm no vaso de coleta de eluato é usada para assegurar que os conteúdos sejam bem misturados. Após um período de mistura de > 5 minutos, os conteúdos do vaso de coleta são filtrados através de um filtro de acetato de celulose de 0,2 μm diretamente em um vaso de contenção. Mais 50 kg de tampão de eluição são adicionados ao vaso de coleta e, então, filtrados através do filtro de acetato de celulose de 0,2 μm no mesmo vaso de contenção. Os conteúdos do vaso de contenção são armazenados a 2° a 8 °C durante até 72 horas. Tabela 5. Parâmetros de Processo para a etapa de cromatografia Q Sepharose Extreme Load
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Cromatografia por interação hidrofóbica Phenyl Sepharose Fast Flow
[0001274] O objetivo primário da etapa de HIC é reduzir o nível de es-pécies de CTLA4-Ig de alto peso molecular (por exemplo, tetrâmero) presentes na reunião de produto de QXL. O tetrâmero de CTLA4-Ig não se liga à resina de HIC sob as condições de carregamento usadas para a etapa de HIC.
[0001275] A etapa de HIC é realizada usando uma resina Phenyl Sepharose Fast Flow da GE Healthcare. A coluna de HIC se liga ao material CTLA4-Ig de HMW e CHOP, desse modo, reduzindo suas concentrações na corrente de proteína CTLA4-Ig. A coluna de HIC é preparada através de equilíbrio com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 850 mM, pH de 7,0. A reunião de produto de CTLA4-Ig da etapa de QXL é aplicada à coluna equilibrada. Após aplicação da carga, tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 850 mM, pH de 7,0 é aplicado à coluna. CTLA4-Ig é coletada da coluna no escoamento e frações de chase da coluna. A coluna de HIC é operada em múltiplos ciclos para processar um único lote de CTLA4-Ig, dependendo da massa total de CTLA4-Ig na reunião de produto de QXL. A coluna é limpa e sanitari- zada entre os ciclos e lotes.
[0001276] O PP carga bioburden de HIC é definido por limites de alerta e ação. Ao PP biocarga de HIC é atribuído um alerta de ínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente. Os cincos valores de HIC definidos para a coluna são altura da coluna, taxa de fluxo, OD final de chase, rendimento da etapa e tempo de manutenção da carga. A altura da coluna foi determinada para proporcionar volume de resina suficiente para processar a reunião de eluição da coluna QXL em um, dois ou três ciclos por lote. Os limites de ação para esse parâmetro foram estabelecidos a partir dos dados. A taxa de fluxo é um fator importante para assegurar a consistência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela é definida para a etapa de HIC como um parâmetro de processo com um limite de ação máximo. A OD final de chase é definida para minimizar o nível de material CTLA4-Ig de HMW na reunião de produto. Material CTLA4-Ig de HMW elui ao final do pico de produto. O rendimento da etapa de processo assegura consistência de processo para a etapa de HIC. Os limites de ação para os PPs taxa de fluxo, OD final de chase e rendimento de etapa foram estabelecidos. Limites de ação para tempo de contenção de carga asseguram consistência de processo. O limite de ação para o PP tempo de contenção de carga de < 5 dias é su-portado por estudos de tempo de contenção em vaso de produto e o estudo de estabilidade bioquímica. Nove PPs de HIC são definidos pe- los limites de alerta, conforme apresentado. Os parâmetros de pH e condutividade do tampão no processo a jusante são identificados como PPs com limites de alerta. Tampões que não vão de encontro a valores exemplificativos de pH e condutividade no momento de preparo são rejeitados e o lote de tampão descartado. Para a etapa de HIC, a condutividade e pH do tampão de equilíbrio/chase são definidos como PPs com limites de alerta.
[0001277] A pressão de entrada da coluna assegura consistência durante a etapa de cromatografia. A etapa de HIC é realizada em um limite de pressão máximo de 0,0896 MPa manométrico (13 psig). O limite de pressão de 0,0896 MPa manométrico (13 psig) é empregado para prevenir compressão da resina de HIC de acordo com a especificação do fabricante. A titulação de reunião de produto e limites de alerta de SA asseguram consistência de processo e foram estabelecidos nos relatos de PAR. Ao DNA, CHOP e MCP-1 na reunião de produto são atribuídos limites de alerta nessa etapa de forma a facilitar a quantificação de sua remoção na subsequente etapa de rPA. Tabela 7. Parâmetros de Processo para a etapa de cromatografia por interação hidrofóbica Phenyl Sepharose Fast Flow
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aInformação foi obtida da Tabela 2 no Relato Final PAR: Purificação12.
[0001278] Etapa de inativação viral: Inativação de agentes virais ad-ventícios potenciais na reunião de produto de da etapa de HIC é obtida através da adição de Triton X-100 a 20% até uma concentração final de 0,5% (v/v). A solução tratada com detergente é misturada e mantida a 22 ± 3°C durante uma a quatro horas antes de prosseguir para a próxima etapa. Os cinco PPs definidos para a etapa de IV são apresentados. O limite máximo do parâmetro de adição de Triton X-100 a 20% é de 3,8%. Veja a tabela diretamente abaixo que mostra os pa- râmetros de processo para a etapa de inativação viral.
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Tabela 9. Parâmetros de processo para a etapa de inativação viral
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aInformação foi obtida a partir da Tabela 3 no Relato Final PA R: Purifi- cação12.
Etapa de afinidade Sepharose Fast Flow por proteína A recombi- nante
[0001279] A cromatografia por afinidade é realizada usando uma resina rPA da GE Healthcare. A etapa de cromatografia rPA purifica adici-onalmente a proteína CTLA4-Ig através de redução dos níveis de CHOP, MCP-1 e agentes virais adventícios potenciais. A coluna de cromatografia por afinidade é equilibrada com tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, pH de 8,0. Após equilíbrio da coluna, o material tratado com Triton X-100 da etapa de VI é aplicado à coluna de croma- tografia por afinidade. A coluna é primeiro lavada com tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, Triton X-100 a 0,5%, pH de 8,0, seguido por uma segunda lavagem com tampão de Tris a 25 mM, NaCl a 250 mM, pH de 8,0. A proteína CTLA4-Ig é eluída da coluna com tampão de gli- cina a 100 mM, pH de 3,5. O pH da reunião de produto da coluna de afinidade é ajustado para 7,5 ± 0,2 com tampão de HEPES a 2 M, pH de 8,0. Os quatro PPs definidos para a etapa de rPA são apresentados na Tabela 10. A etapa de cromatografia rPA foi identificada como uma etapa de eliminação viral, assim, a altura do leito da coluna foi estabelecida como um novo PP com valores exemplificativos de 21 a 25 cm. CHOP na reunião de produto e MCP-1 na reunião de produto foram previamente identificados como PPs para a etapa de rPA. Essas impurezas foram redefinidas como PPs com limites de ação. Veja a tabela diretamente abaixo que mostra os parâmetros de processo para a etapa de cromatografia Sepharose Fast Flow proteína A.
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nInformação foi obtida da Tabela 4 no Relato Final PAR: Purificação12.
[0001280] Três PPs para a etapa de rPA são definidos pelos limites de alerta e ação, conforme apresentado. O tempo de contenção de carga assegura consistência de processo com limites de alerta estabelecidos no relato PAR. Limites de ação para tempo de contenção de carga as-seguram consistência de processo. O limite de ação para o PP tempo de contenção de carga de < 48 horas é suportado por estudos de tempo de contenção em vaso de produto e o estudo de estabilidade bioquímica. Estudos de classificação identificaram o pH do tampão de eluição como um fator significativo que afeta o nível de material CTLA4-Ig de HMW na reunião de produto de rPA. Os limites de alerta para o pH do tampão de eluição foram estabelecidos. O limite de ação para o pH do tampão de eluição foi estabelecido a partir do estudo de escalonamento. Ao pp carga bioburden de rPA foi atribuído alerta de ínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 100 cfu/mL, respectivamente.
[0001281] Os sete PPs para rPA definidos pelos limites de ação são pressão de entrada da coluna, taxa de fluxo, rendimento da etapa, pH inicial da reunião de produto, HMW da reunião de produto, CHOP na reunião de produto e MCP-1 na reunião de produto. O limite de pressão de < 0,0896 MPa manométrico (13 psig) é empregado para prevenir compressão da resina rPA de acordo com a especificação do fabricante. A taxa de fluxo é um fator importante para assegurar a consistência e desempenho de uma etapa cromatográfica. Ela é definida para a etapa de rPA como um PP com um limite de ação máximo. Os limites de ação para rendimento da etapa e pH inicial da reunião de produto asseguram consistência de processo para a etapa de rPA. Limites de ação para a taxa de fluxo e pH inicial da reunião de produto foram estabelecidos. A formação potencial de material CTLA4-Ig de HMW durante eluição de pico requer a definição de um limite de ação de < 2,5% para esse parâmetro. A faixa de limite de ação de 66 a 108% foi estabelecida usando os dados de média ± 3 desvios-padrão de um único lote de resina rPA. Essa faixa é consistente com os rendimentos de etapa observados no estudo de vida útil da resina. As impurezas relacionadas ao processo CHOP e MCP-1 foram previamente identificadas como PPs para a etapa de rPA. Nesse relato, essas impurezas foram redefinidas como PPs com limites de ação. CHOP e MCP-1 na reunião de produto são definidos como CQAs com valores exemplificativos para assegurar controle dessas impurezas relacionadas ao processo. Doze dos PPs para rPA são definidos por limites de alerta, conforme apresentado. Os parâmetros de pH e condutividade do tampão no processo a jusante são identificados como PPs com limites de alerta. Tampões que não vão de encontro aos valores exem- plificativos de pH e condutividade no momento de preparo são rejeitados e o lote de tampão descartado. Para a etapa de rPA, a condutivi- dade e pH do tampão de equilíbrio/lavagem 2, pH e condutividade do tampão de lavagem 1 e condutividade do tampão de eluição são definidos como PPs com limites de alerta. Tabela 11. Parâmetros de processo para a etapa de cromatografia Fast Flow proteína A recombinante
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Continuação
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nInformação foi obtida da Tabela 4 no Relato Final PAR: Purificação12.
Etapa de concentração/diafiltração e filtração viral
[0001282] Quando de eluição da coluna de rPA, a reunião de produto é concentrada para obter um volume alvo dentro de um limite de con-centração de CTLA4-Ig. O concentrado é, então, submetido à diafiltra- ção com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 100 mM, pH de 8,0 usando um sistema de membranas de UF com um corte de peso molecular nominal de 30 kDa (NMWC). Após diafiltração, um conjunto de filtro é usado para remover partículas virais adventícias potenciais. O conjunto de filtro consiste em um filtro de 0,2 μm, um filtro de 0,1 μm e filtros de membrana de 15 nm (filtro Planova 15N). Filtros usados na etapa de VF (0,2 μm, 0,1 μm e 15 nm) são filtros de uso único. O limite máximo da faixa para concentração de CTLA4-Ig pós-UF e pressão diferencial Planova foi aumentado baseado na eliminação viral demonstrada usando essas condições. Veja tabela abaixo que mostra os parâmetros de processo para a etapa de filtração viral.
Figure img0117
aInformação foi obtida a partir de estudos de eliminação viral, PQ-58- Viral Clearance-BMS188667-00123, BD-2004-001.023 e BD-2005- 832.026. Tabela 13. Parâmetros de processo para a etapa de filtração viral
Figure img0118
aInformação foi obtida da Tabela 5 no Relato Final PAR: Purificação12. bInformação foi obtida do BD-2005-706.015.
Etapa de cromatografia por troca de ânions Q Sepharose Fast Flow
[0001283] O objetivo da etapa de cromatografia QFF é reduzir os níveis de proteína A residual e proporcionar redução adicional do DNA de célula hospedeira da reunião de produto da etapa de filtração viral. A etapa na coluna QFF é também usada para controlar o ácido siálico nas moléculas de CTLA4-Ig ou a proporção molar de proteína da reunião de produto da etapa de cromatografia QFF e proporcionar controle adicional dos níveis de material de HMW. A etapa de cromatografia de troca de ânions QFF também pode remover a proteína A recombi- nante residual, DNA de célula hospedeira, Triton X-100 e agentes virais adventícios potenciais.
[0001284] A cromatografia por troca de ânions é realizada usando resina QFF da GE Healthcare. A coluna QFF é equilibrada com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 100 mM, pH de 8,0. Após equilíbrio da coluna, o filtrado de Planova é aplicado à coluna QFF. A coluna é primeiro lavada com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 120 mM, pH de 8,0, seguido por uma segunda lavagem com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 130 mM, pH de 8,0. A proteína CTLA4-Ig é eluída da coluna com tampão de HEPES a 25 mM, NaCl a 200 mM, pH de 8,0.
Figure img0119
nInformação foi obtida da Tabela 6 no Relato Final PAR: Purificação12.
[0001285] O valor de carga bioburden QFF é < 10 cfu/mL ou < 100 cfu/mL, respectivamente. Os doze PPs de QFF definidos pelos limites de ação são taxa de fluxo, condutividade do tampão de lavagem 2, condutividade do tampão de eluição, tempo de contenção de carga, rendimento da etapa e os níveis de proteína A, DNA, Triton X-100, SA, HMW, CHOP e MCP-1 residuais na reunião de produto QFF. A taxa de fluxo é um fator a considerar para assegurar consistência e desempe- nho de uma etapa cromatográfica. Ela é definida para a etapa de QFF como um parâmetro de processo com um limite de ação máximo esta-belecido no relato PAR. Os valores de condutividade dos tampões de lavagem 2 e eluição são PPs com limites de ação porque eles são sig-nificativos na determinação de rendimento da etapa e qualidade do produto. Os limites de ação para esses parâmetros foram determinados durante estudos de escalonamento de QFF. Os limites de ação para tempo de contenção de carga asseguram consistência de processo. O limite de ação para o PP tempo de contenção de carga de < 5 dias é suportado por estudos de tempo de contenção em vaso de produto e um estudo de estabilidade bioquímica. O rendimento da etapa assegura consistência de processo para a etapa de QFF. Os parâmetros de qualidade, SA, HMW, CHOP e MCP-1 na reunião de produto devem ser rigorosamente controlados na etapa cromatográfica final. Os limites de ação para o rendimento da etapa e nível de SA, CHOP e MCP-1 na reunião de produto QFF foram estabelecidos. As impurezas relacionadas ao processo proteína A, DNA e Triton X-100 residuais foram previamente identificados como CQAs com valores exemplifica- tivos para assegurar controle dessas impurezas relacionadas ao processo. Nesse exemplo, o limite de ação para HMW na reunião de produto foi revisto de < 2,5 para < 2,0%.
[0001286] Os parâmetros de pH e condutividade do tampão no processo a jusante são identificados como PPs com limites de alerta. Tampões que não vão de encontro aos valores exemplificativos de pH e condutividade no momento de preparo são rejeitados e o lote de tampão descartado. Para a etapa de QFF, a condutividade e pH do tampão de equilíbrio, condutividade e pH do tampão de lavagem 1, pH do tampão de lavagem 2 e pH do tampão de eluição são definidos como PPs com limites de alerta. Esses limites foram estabelecidos. A pressão de entrada da coluna assegura consistência durante a etapa de cromatografia de ligação-e-eluato. A etapa de QFF é realizada em um limite máximo de pressão de 0,2413 MPa manométrico (35 psig) de acordo com a especificação do fabricante. Aos parâmetros de volume de tampão de lavagem 1, volume de tampão de lavagem 2, titulação de reunião de produto e volume de reunião de produto são atribuídos limites de alerta 12 para assegurar consistência de processo. Tabela 15. Parâmetros de processo para a etapa de cromatografia Q Sepharose Fast Flow
Figure img0120
nInformação foi obtida da Tabe a 6 do Relato Final PAR: Purificação12.
Etapas de concentração/diafiltração e enchimento
[0001287] A reunião de produto da etapa de cromatografia de troca de ânions QFF é concentrada e submetida à diafiltração com tampão de fosfato de sódio a 25 mM, NaCl a 50 mM, pH de 7,5 usando um sistema de UF com membranas de NMWC de 30 kDa. O concentrado diafiltrado é filtrado através de um filtro de 0,2 μm em recipientes estéreis e arma-zenado a 2 a 8°C. A substância de fármaco pode ser congelada a -70°C e armazenada a -40°C, se requerido. O único PP definido para a etapa de concentração/diafiltração e enchimento é apresentado. Veja tabela diretamente abaixo que mostra os parâmetros de processo para as etapas de concentração/diafiltração e enchimento de substância de fármaco.
Figure img0121
[0001288] Ao PP biocarga de reunião de produto da UF II é atribuído alerta de ínterim e limites de ação de < 10 cfu/mL e < 50 cfu/mL, res-pectivamente. Os seis PPs definidos pelos limites de ação para a etapa de concentração/diafiltração e enchimento são volumes de diafiltra- ção, condutividade e pH do filtrado, rendimento de etapa, tempo de contenção de carga e rendimento de processo, conforme apresentado. O limite mínimo de volumes de diafiltração foi estabelecido para assegurar troca completa de tampão da proteína CTLA4-Ig pelo tampão de substância de fármaco final antes da etapa de enchimento. A conduti- vidade do filtrado e pH do filtrado ainda asseguram formulação de substância de fármaco consistente. O rendimento da etapa assegura consistência de processo para a etapa de concentração/diafiltração e enchimento. Os limites de ação para volumes de diafiltração, conduti- vidade e pH do filtrado e rendimento da etapa foram estabelecidos. Limites de ação para tempo de contenção de carga asseguram consistência de processo. O tempo de contenção de carga na UF II de < 5 dias é suportado por estudos de tempo de contenção em vaso de produto e o estudo de estabilidade bioquímica. O limite de ação de rendimento de processo de 20 a 62% foi recomendado. Dois PPs são definidos por limites de alerta para assegurar consistência de processo para a etapa, conforme apresentado. Tabela 17. Parâmetros de Processo para as etapas de concentra-ção/diafiltração e enchimento de substância de fármaco
Figure img0122
aInformação foi obtida da Tabela 7 no Relato Final PAR: Purificação12.
EXEMPLO 30: Etapa de enchimento final de substância de fármaco
[0001289] Após término da etapa de concentração de diafiltração II de CTLA4-Ig, a substância de fármaco CTLA4-Ig é enchida do saco de bioprocesso de 300 L em garrafas de PC Biotainer pré-esterilizadas de 2 L e 10 L dentro de um ambiente Classe 100.
[0001290] O exterior de cada garrafa é desinfetado com uma solução de isopropanol a 70%. A vedação em torno da tampa de cada garrafa é removida e a garrafa é tarada antes de enchimento. Um cálculo é registrado no registro de lote para assegurar que o peso do enchimento esteja entre 500 gramas e 1950 gramas para garrafas de 2 L e entre 7500 gramas a 10200 gramas para garrafas de 10 L. A substância de fármaco é distribuída usando uma bomba peristáltica nas garrafas Bio- tainer através de um filtro de 0,45/0,2 μm e funil de enchimento de uso único. As garrafas são tampadas e as tampas presas hermeticamente em um ajuste de torque especificado. A tampa de cada garrafa cheia é vedada com fita e a fita é marcada e datada. Cada garrafa é etiquetada com informação de identificação, bem como a data de enchimento, o número sequencial da garrafa enchida dentro do lote e as iniciais do operador.
[0001291] Durante o processo de enchimento, monitoramento de ar e micróbios na superfície e contagens de partícula são realizados. Amostras de substância de fármaco são obtidas durante a operação de enchimento. Uma amostra é obtida antes de enchimento da primeira garrafa para testagem de endotoxina. Amostras adicionais para testagem de endotoxina são obtidas no meio e no final do processo de enchimento. Durante o processo de enchimento, uma amostra é obtida para testagem de liberação de substância de fármaco.
EXEMPLO 31: ESTUDOS DE IMUNOGENICIDADE
[0001292] CTLA4-Ig é uma proteína de fusão solúvel que consiste do domínio extracelular do antígeno 4 linfócito T citotóxico humano- associado (CTLA-4) ligado à porção Fc modificada (dobradiça, domínios CH2 e CH3) de imunoglobulina (Ig) G1 humana. Ele é o primeiro em uma nova classe de agentes aprovados para o tratamento de artrite reumatoide (RA) que modula seletivamente o sinal coestimulatório CD80/CD86:CD28 empregado para ativação completa de células T. Em RA, foi postulado que um antígeno desconhecido é apresentado via o principal complexo de histocompatibilidade e ativa células T au- torreativas na presença de um sinal coestimulatório. Subsequentemente, células T ativadas recrutam e ativam células imunes a jusante, orquestrando e perpetuando os processos celulares que levam à inflamação e destruição articular (Choy e Panayi (2001) N Engl J Med, 344(12): 907-916).
[0001293] Agentes biológicos recombinantes terapêuticos, tais como CTLA4-Ig, podem ser imunogênicos e, portanto, têm o potencial de estimular uma resposta de anticorpo. A imunogenicidade contra agentes biológicos pode, teoricamente, ter um impacto sobre a segurança, eficácia e farmacocinética. A eliminação anticorpo-mediada de uma terapia biológica pode resultar em uma redução nos níveis de fármaco, resultando em eficácia diminuída. A resposta de anticorpo pode tam- bém impedir o fármaco de se ligar a seu alvo farmacológico, o que também diminui a eficácia. Isso pode levar a uma necessidade de es-calonamento de dose com o tempo - a assim denominada "ascensão de fármaco". A ascensão de fármaco foi reportada com o uso prolongado de anticorpo anti-TNF, infliximab, no tratamento de RA (Anderson (2005) Semin Arthritis Rheum, 34(5 Supl): 19-22) e essa foi recentemente notada como sendo um resultado de anticorpos anti-infliximab que levam a uma redução na eficácia clínica em alguns pacientes (Ha- raoui e colaboradores, (2006) J Rheumatol, 33(1): 31-36).
[0001294] Aqui, a formação de anticorpos anti-CTLA4-Ig e anti-CTLA4 e seu efeito potencial sobre a eficácia e segurança de tratamento com CTLA4-Ig foram examinados. Uma vez que provavelmente a CTLA4-Ig inibe uma resposta imune em si, baseado em sua atividade como um modulador de coestimulação seletivo e respostas observadas em modelos não clínicos. O efeito de 1-2 doses faltantes ou descontinuação de terapia sobre o nível de imunogenicidade também foi examinado. Finalmente, amostras soropositivas foram testadas com relação à atividade de anticorpo de neutralização.
Materiais e Métodos Estudos Avaliados
[0001295] Para determinar se a CTLA4-Ig induz a uma resposta imu- nogênica em pacientes com RA, uma resposta de anticorpo foi avaliada através de múltiplos ensaios clínicos em Fase II e III compreendendo seis períodos de estudo DB e quatro OL em 2.237 pacientes com RA, os quais incluíam pacientes que tinham respostas inadequadas ao metotrexato (MTX) ou terapia anti-TNF. Um estudo (Fase III) também avaliou a reunião de produto para o tratamento de RA como monoterapia (Tabela 40). Amostras foram, em geral, avaliadas pré-estudo, através do tratamento e 56 e/ou 85 dias após a última dose para permitir tempo para eliminação de CTLA4-Ig Tabela 40. Visão geral dos estudos incluídos nessa avaliação
Figure img0123
Continuação
Figure img0124
RA = artrite reumatoide; MTX = metotrexato; DB = duplamente cego; TNF = fator de necrose de tumor; DMARD = fármaco antir- reumático de modificação da doença; ETAN = etanercept; OL = rótulo-aberto; PK = farmacocinética *Indivíduos nos períodos OL, não-controlado são um subconjunto daqueles que completaram os períodos de estudo DB, place- bo-controlado
[0001296] A incidência e tipo de eventos adversos peri-infusionais pré- especificados (AEs), AEs globais e AEs graves (SAEs) e descontinua- ções foram examinados em pacientes que desenvolveram uma resposta de anticorpo positiva contra CTLA4-Ig ou CTLA4. O efeito da imunogenicidade sobre a eficácia foi também examinado avaliando as respostas do American College of Rheumatology (ACR) 20 and Health Assessment Questionnaire em pacientes com uma resposta de anticorpo positiva.
Ensaios de Imunogenicidade
[0001297] Formatos básicos de ensaio: Em virtude da alta reatividade cruzada preexistente dirigida contra a porção Fc de CTLA4-Ig no soro humano, particularmente em populações com RA, dois ensaios imunoabsorventes enzima-ligados (ELISAs) formato-dirigidos foram usados para avaliar a resposta de anticorpo. O ensaio anti-CTLA4-Ig mediu a resposta de anticorpo a todas as porções da molécula, mas tinha menor sensibilidade. O ensaio anti-CTLA4 mediu a resposta de anticorpo na porção CTLA4 apenas, removendo a região Ig e, assim, conferia maior sensibilidade. Ambos os ensaios foram usados em um formato de titulação do ponto final (EPT) (Ensaio A) ou um formato de seleção (Ensaio B).
Formato de Ensaio A: métodos de ensaio de imunogenicidade clínicos, duplamente cego, em fase II
[0001298] O ensaio anti-CTLA4-Ig e o ensaio anti-CTLA4 usados durante os ensaios de RA na Fase II foram coletivamente referidos como Ensaio A. No Ensaio A, CTLA4-Ig ou CTLA4 foi adsorvida sobre lâminas de microtitulação com 96 poços que foram, então, incubadas com soro de teste (diluições seriais de 3 vezes, começando a 1:10). Os anticorpos ligados foram detectados usando um coquetel de anticorpo anti-humano conjugado à fosfatase alcalina (Southern Biotech, Birmingham, EU) e visualizados usando um substrato de Fosfato de p-NitroFenila (PNPP). Uma vez que nenhum anticorpo anti-CTLA4- Ig humano ou soro de controle positivo estava disponível, esses ensaios foram validados usando antissoro CTLA4-Ig-específico gerado em um macaco cynomolgus. Os resultados de cada ensaio foram expressos como valores de EPT. Um paciente era considerado como sendo soro-convertido quando sua EPT aumentava em duas ou mais diluições seriais (> 9 vezes) com relação àquela da EPT pré-dose individual (Dia 1).
Formato de Ensaio B: métodos de ensaio de imunogenicidade clínicos, de rótulo-aberto, em fase III e Fase II
[0001299] Para os ensaios em fase III e períodos OL em Fase II de 2 anos, os ensaios anti-CTLA4-Ig e anti-CTLA4 foram modificados para reduzir a base não-específica, aprimorar a sensibilidade e o método para determinar a positividade foi alterado e foram coletivamente referidos como Ensaio B. Esses ensaios também foram validados usando anticorpos CTLA4-Ig-específicos purificados de antissoro de macaco cynomolgus. Para cada ELISA, lâminas de microtitulação com 96 poços revestidas com CTLA4-Ig (0,25 μg/mL) ou CTLA-4 (0,5 μg/mL) foram incubadas com soro de teste diluído a 1:400 durante 2 horas a 22 ± 5 °C (anti-CTLA4-Ig) ou diluído a 1:25 durante 2 horas a 32-40 °C (anti-CTLA4). Após a incubação primária, anticorpos ligados foram detectados com um coquetel de anticorpo anti-humano conjugado à peroxidase de armorácia (HRP), seguido por substrato de tetra- metil benzidina.
[0001300] Os resultados para o ensaio anti-CTLA4-Ig foram expressos como uma pós-/pré-proporção calculada dividindo-se os valores de OD da amostra pós-dose pelo valor de OD da amostra pré-dose correspondente analisada na mesma lâmina. A positividade foi baseada em valores de corte estabelecidos usando amostras de pacientes com RA placebo-tratados. Se o valor de proporção era menor do que o corte, a amostra era considerada negativa e reportada como um valor de titulação < 400. Qualquer valor que excedia a esse corte era considerado condicionalmente positivo.
[0001301] Os resultados para o ensaio anti-CTLA4 são expressos como um valor de "Proporção 1" calculado dividindo-se a OD média de amostra de soro do paciente pela OD média do controle negativo sobre a mesma lâmina. A positividade foi baseada em valores estabelecidos usando soro empoçado de pacientes com RA placebo-tratados como o controle negativo. Se o valor era menos do que o corte especificado, a amostra era considerada negativa e reportada como um valor de titulação de < 25. Qualquer valor que excedia a esse corte era considerado condicionalmente positivo.
Análises confirmatórias
[0001302] Amostras condicionalmente positivas identificadas em cada ensaio (anti-CTLA4-Ig e anti-CTLA4) e em cada formato de ensaio (Ensaios A e B) foram avaliadas em um ensaio de imunodepleção para determinar a especificidade da resposta. Amostras anti-CTLA4-Ig posi-tivas foram pré-incubadas com aproximadamente 40 μg/mL de CTLA4- Ig (a porção CTLA4 da molécula), outra proteína de fusão de Ig não- relacionada (CD40Ig) ou uma proteína não-relacionada (ovalbumina) para identificar a região da molécula contra a qual a reatividade anti- CTLA4-Ig poderia ser dirigida (CTLA4, Ig ou região de junção). Amostras anti-CTLA4 positivas foram similarmente pré-incubadas com CTLA4-Ig, a porção CTLA4 ou ovalbumina para confirmar a especificidade da reatividade anti-CTLA4. Após pré-incubação, todas as amostras foram reanalisadas no mesmo formato de ensaio original descrito acima. As amostras onde pré-incubação resultou em redução > 30% na OD da amostra pré-incubada comparado com a amostra não tratada foram consideradas confirmadas positivas. Se confirmado, as amostras foram tituladas para identificar a diluição de soro que resulta em um valor de proporção igual ao corte do ensaio em particular e esse valor foi reportado como a EPT.
Avaliações de atividade de anticorpo de neutralização
[0001303] Um bioensaio foi conduzido para avaliar a capacidade de amostras de pacientes com anticorpos fármaco-específicos contra CTLA4 para inibir ou neutralizar a atividade de CTLA4-Ig (inibir a ligação a CD80/86), impedindo o mesmo de se ligar a CD80/86 sobre a superfície de células T. Transfectantes de células T de Jurkat estáveis expressando um gene de luciferase sob o controle do promotor de in- terleucina (IL)-2 foram coestimulados com células B Daudi na presença de anticorpo anti-CD3. Essa coestimulação, mediada através da interação entre CD28 sobre a célula T Jurkat e CD80/86 sobre a célula B Daudi em combinação com anticorpo anti-CD3, ativa o promotor IL- 2, levando à transcrição aumentada do gene de luciferase e, consequentemente, expressão aumentada de proteína luciferase. O sinal luminescente é medido usando um Sistema de Ensaio de Luciferase. Uma vez que a CTLA4-Ig bloqueia a interação CD80/86:CD28, adição de CTLA4-Ig à mistura de célula bloqueia essa ativação do promotor IL-2 e diminui a luminescência, enquanto que pré-incubação com um anticorpo de neutralização restauraria as interações de coestimulação e resulta em um aumento na luminescência.
[0001304] A atividade de anticorpo de neutralização de CTLA4-Ig foi avaliada determinando a resposta de CTLA4-Ig em concentrações de 0,1, 0,25 ou 0,5 μg/mL no bioensaio na presença de soro soropositivo pós-dose a 1:25 e comparação estatística do mesmo com a resposta na presença de sua amostra correspondente no Dia 1. Um anticorpo monoclonal de murino anti-CTLA4 humano (11D4) com atividade de neutralização de CTLA4-Ig no bioensaio foi usado como um controle positivo em cada operação analítica. Em virtude das limitações inerentes no método de teste de bioensaio, após amostras pós-dose com níveis existentes de CTLA4-Ig < 1 μg/mL puderam ser avaliadas, uma vez que níveis maiores de fármaco interferiam com a resposta de neu-tralização e diluição adicional da amostra diminuiria a sensibilidade do ensaio.
Avaliação farmacocinética
[0001305] Análise farmacocinética da população (POPPK) foi realizada sobre dados de amostra de soro de pacientes dos períodos DB dos ensaios na Fase III onde uma resposta imune positiva foi confirmada. O modelo POPPK validado foi aplicado aos dados de concentração de soro de paciente individual e estimativas Bayesianas a posteriori máximas de valores de parâmetro de PK individuais foram obtidas. A distribuição de eliminação, estimativas de volume, valores de área sob a curva em estado uniforme (AUC) e valores de concentração mínima do fármaco no corpo após dosagem (Cmin) para esses pacientes foram comparados com a distribuição desses valores em um conjunto de dados maior de pacientes dos mesmos ensaios que não tinham desenvolvido uma resposta imune.
Resultados Incidência de respostas anti-CTLA4-Ig e anti-CTLA4
[0001306] Um total de 2.237 pacientes tinham amostras de soro pré- e pós-linha de base e foram elegíveis para avaliação. Desses, 62 (2,8%) pacientes tinham evidência de uma resposta anti-CTLA4-Ig ou anti- CTLA4, conforme determinado usando o Ensaio A ou B (FIG. 39). Nenhum paciente demonstrou uma resposta aos domínios Fc e CTLA4 da CTLA4-Ig. Três pacientes tinham uma resposta a região de junção. Quando o Ensaio B mais sensível foi usado, uma resposta de anticorpo a CTLA4-Ig foi detectada em 60 de 1.900 pacientes (3,0%) (FIG. 39).
[0001307] Dos pacientes avaliados nos estudos em Fase III (n = 1.764), 203 descontinuaram a terapia com CTLA4-Ig durante os perío- dos DB ou OL ou não entraram no período de estudo OL subsequente e tiveram soro coletado 56 e/ou 85 dias após descontinuação de terapia. Dos 203 pacientes, 15 (7,4%) tiveram uma resposta imunopositiva a CTLA4-Ig (molécula inteira; n = 5, 2,5%) ou CTLA-4 (n = 10, 4,9%; Tabela 42). Dos 1.561 pacientes com RA restantes que completaram o período DB em Fase III e continuaram no tratamento OL, 40 (2,6%) tiveram uma resposta de anticorpo positiva durante os períodos DB ou OL: 33 (2,1%) a CTLA4-Ig e 7 (0,4%) a CTLA-4. De modo interessante, no estudo em Fase IIa de CTLA4-Ig como monoterapia, nenhum paciente soroconverteu para CTLA4-Ig ou a porção CTLA-4 da molécula; contudo, o formato de Ensaio A menos sensível foi empregado.
[0001308] Um total de 191 pacientes teve um período de mais de 30 dias sem CTLA4-Ig entre sua participação nos períodos DB e OL. Desses, 3 (1,6%) pacientes tiveram uma resposta de anticorpo positiva a CTLA4-Ig e 1 (0,5%) paciente teve uma resposta de anticorpo positiva a CTLA-4 durante o período OL (Tabela 41). Soros também foram analisados de 587 pacientes com RA que faltaram a 1-2 doses da medicação de estudo e re-iniciaram em qualquer ponto durante o estudo. Desses pacientes, 15 (2,6%) demonstraram uma resposta de anticorpo positiva a CTLA4-Ig e sete (1,2%) tiveram uma resposta de anticorpo positiva a CTLA-4 (Tabela 41). Tabela 41. Número (%) de pacientes soropositivos com uso inter-rompido de CTLA4-Ig
Figure img0125
CTLA4 = antígeno-4 linfócito T citotóxico-associado; DB = duplamente cego; OL = rótulo-aberto
Efeito de metotrexato concomitante sobre a imunogenicidade
[0001309] Um total de 2451 pacientes recebeu MTX concomitante e 493 pacientes não. Em geral, o percentual de pacientes com uma resposta de anticorpo positiva a CTLA4-Ig era geralmente similar, quer eles tenham recebido MTX concomitante ou não (2,3% vs 1,4%) (Tabela 42). Tabela 42. Número de pacientes (%) com respostas anti-CTLA4-Ig ou anti-CTLA-4 com ou sem receber metotrexato concomitante
Figure img0126
CTLA-4 = antígeno-4 linfócito-T citotóxico-associado Impacto da imunogenicidade sobre a segurança e eficácia de CTLA4- ig
[0001310] As taxas de AEs, SAEs, AEs peri-infusionais para todos os pacientes positivos foram avaliados e nenhuma relação entre a imuno- genicidade e segurança foram observadas. Similarmente, nenhuma relação entre a imunogenicidade e eficácia foi notada; contudo, a in-terpretação desses dados é restrita em virtude do número limitado de pacientes que soroconverteram.
Atividade de neutralização de anticorpos anti-CTLA4-Ig
[0001311] Vinte e quatro amostras de soro de 20 pacientes foram con-firmadas positivas para reatividade anti-CTLA4-Ig no ensaio de seleção de anticorpo anti-CTLA4. Dessas, 14 amostras (coletadas de 13 pacientes) iam de encontro a valores exemplificativos (< 1 μg/mL de CTLA4-Ig) para avaliação no bioensaio de neutralização. Dessas 13 amostras, 1 foi positiva no Dia 56 e 10 foram positivas no Dia 85 pós- dose. Nove das 14 amostras (tomadas de 8 pacientes) exibiram atividade de anticorpo de neutralização. Com a exceção de septicemia em um paciente, não houve AEs medicamente significativas reportadas nesses pacientes em ou próximo do momento de soroconversão que eram consideradas relacionadas ou possivelmente relacionadas à terapia nesses oito pacientes. Dados de eficácia não foram coletados durante o período após descontinuação do estudo (56 e 85 dias após descontinuação), um período quando o número predominante de amostras era adequado para avaliação de anticorpos de neutralização. Como tal, não foi possível avaliar os efeitos de anticorpos de neutralização sobre a eficácia.
Avaliação farmacocinética
[0001312] Os parâmetros farmacocinéticos foram estimados para 31 dos 32 pacientes que tiveram uma resposta de anticorpo positiva durante o período DB dos ensaios em Fase II/III. Amostras de soro para análise de PK não foram necessariamente coletadas no dia em que uma resposta imune positiva foi documentada. Modelamento de PK da população de dados de pacientes dos períodos de estudo DB sugeriu que os parâmetros de PK previstos nos 31 pacientes imunopositivos eram comparáveis àqueles em uma população maior de pacientes (n = 386) sem uma resposta imune positiva. As concentrações séricas no dia de estudo durante o período DB quando soroconversão foi documentada oscilavam de 1,16-24,21 μg/mL, com a maioria das concentrações no soro entre 5-20 μg/mL. Soroconversão não parece afetar os níveis séricos. A distribuição de eliminação e volume de compartimento central pelo estado de imunogenicidade são mostrados na figura 40.
Ensaio de eletroquimioluminescência MSD
[0001313] Em um esforço para melhorar a sensibilidade do ensaio de imunogenicidade de ligação e a capacidade de detectar anticorpos na presença de fármaco (tolerância a fármaco), uma nova geração de en-saios de imunogenicidade está sendo desenvolvida para monitorar an-ticorpos antifármaco a CTLA4-Ig empregando a tecnologia Meso-Scale Discovery (MSD). Essa nova tecnologia usa um rótulo que emite luz quando de estimulação eletroquímica iniciada na superfície do eletrodo de uma microlâmina. Foi mostrado que o formato MSD tem sensibilidade aprimorada e uma melhor capacidade de detectar anticorpos na presença de fármaco comparado com o formato ELISA. Essa tecnologia de fase em solução permite que o fármaco rotulado venha a competir mais eficientemente com o fármaco no soro e tenha uma maior faixa dinâmica, proporção de sinal para ruído e capacidade de superfície aumentada com relação ao formato ELISA. Diferente dos ELISAs atuais, os quais usam a porção CTLA4 da molécula ou a molécula inteira como o reagente de captura, o novo ensaio é um ensaio de ponte que emprega uma molécula de CTLA4-Ig biotinilada e rutênio-rotulada que é incubada com amostras do paciente antes de ser adicionada a uma lâmina de MSD revestida com avidina. O sinal de eletroquimiolu- minescência emitido pelo rótulo de rutênio é medido usando um instrumento MSD. Amostras positivas, baseado no ponto de corte de ensaio validado, serão ainda avaliadas através de imunodepleção com CTLA4-Ig, CTLA4-T ou CD40Ig no ensaio MSD para confirmar a posi- tividade e demonstrar para qual porção da molécula de CTLA4-Ig a imunogenicidade é dirigida e a titulação ponto final é definida.
EXEMPLO 32: Parâmetros farmacocinéticos em macacos
[0001314] A seis macacos cynomolgus fêmeas por grupo foi administrada uma única dose intravenosa de 10 mg/kg de CTLA4-Ig produzida a partir do processo CD-CHO1. Um grupo de controle de seis macacos fêmeas recebeu solução salina (1 ml/kg). Para avaliar a bioatividade de CTLA4-Ig, todos os macacos foram imunizados intramuscularmente com 10 mg/animal do antígeno células T-dependente hemocianina de caramujo megathura crenulata (KLH) dentro de 30 min antes de dosagem.
[0001315] Os animais foram observados durante 6 semanas após tra-tamento. Amostras de sangue foram obtidas pré-dose: a 3 e 30 min; a 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas; e nos dias 4, 8, 11, 15, 22, 29, 36 e 43 pós- dose para determinar e comparar os perfis farmacocinéticos. No relato farmacocinético, esses dias de estudo correspondem aos dias 0, 1, 2, 3, 7, 10, 14, 21, 28, 35 e 42, respectivamente. Amostras de soro foram analisadas com relação a CTLA4-Ig através de um método ELISA. Uma amostra de sangue comparável foi coletada de animais de controle nos mesmos dias e, quando apropriado, usada para avaliar a resposta de anticorpo anti-KLH. Avaliação da formação de anticorpos CTLA4-Ig-específicos foi realizada sobre soro obtido de animais tratados com CTLA4-Ig pré-estudo e semanalmente depois. A formação de anticorpo KLH-específico foi determinada sobre amostras de soro obtidas de todos os animais antes de imunização e aproximadamente toda semana após isso durante pós-imunização de 4 semanas. Valores exemplificativos adicionais para avaliação incluíam sobrevivência, sinais clínicos, exames físicos (incluindo avaliações neurológicas, taxa respiratória e auscultação), pesos corporais, temperaturas corporais e consumo de alimento.
[0001316] Avaliações clínicas-patológicas foram conduzidas pré- estudo e no dia 45. Todos os animais foram retornados para o grupo após término do estudo. Tabela 43. Parâmetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig produzida a partir de um processo da invenção
Figure img0127
[0001317] Respostas de anticorpo fármaco-específicas ocorrem em ou após o dia 29 em três de seis macacos tratados com o material de processo CD-CHO1 (Tabela 43; figura 41). Aumentos mínimos (20%) no nitrogênio de ureia no sangue (BUN) e diminuições (14%) no potássio no soro em macacos tratados com o material de processo CD- CHO1 não foram fisiológica ou toxicologicamente significativos porque os valores estavam apenas marginalmente fora das faixas de controle históricas e, para BUN, um aumento concomitante na creatinina no soro não estava presente. Nenhuma outra alteração nos parâmetros de patologia clínica foi notada. Supressão acentuada da resposta de anticorpo a KLH (>94% da resposta de controle de pico) foi observada em macacos aos quais foi administrado material de processo CD- CHO1. A imunogenicidade foi acentuadamente retardada até que os níveis de CTLA4-Ig no soro caíssem abaixo dos níveis imunossupres- sivos de aproximadamente 1 μg/mL em ou após o dia 29.
[0001318] Patologia clínica. Amostras de sangue foram coletadas da veia femoral de animais em jejum antes de dosagem (dia 13) e após a última coleta de sangue para avaliação farmacocinética (dia 45). Uriná- lises foram realizadas com a urina coletada durante um período 18 horas pré-estudo (dia -13) e após a última coleta para avaliação farma- cocinética (dia 45). Os seguintes parâmetros analíticos foram determinados: hematologia: hemoglobina, hematócrito, contagem de eritróci- tos, volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média, concentração média de hemoglobina corpuscular, contagem de reticulóci- tos, contagens totais e diferenciais de leucócitos, contagem de plaquetas e avaliação de morfologia celular em esfregaços de sangue periférico foram determinados. Coagulação: tempo de pró-trobina, tempo de tromboplastina parcial ativado e fibrinogênio no plasma foram determinados. Química do soro: nitrogênio de ureia, creatinina, glicose, colesterol total, proteína total, albumina, globulinas, proporção de albumi- na/globulina, aminotransferase de alanina, aminotransferase de aspar- tato, fosfatase alcalina, bilirubina total, triglicerídeos, gama glutamil- transferase, sódio, potássio, cálcio, cloreto e fósforo foram determinados. Urinálise: produção, gravidade específica, pH, cor e aparência e determinações qualitativas de glicose, proteína, cetonas, bilirubina, sangue oculto e urobilinogênio foram determinados. Sedimentos urinários foram examinados microscopicamente.
[0001319] Resposta de anticorpo específica. Respostas de anticorpo fármaco-específicas de magnitude comparável ocorreram em três de seis macacos tratados com o material de processo CD-CHO1 em ou após o dia 29. Conforme esperado, a imunogenicidade com o processo foi acentuadamente retardada até que os níveis de CTLA4-Ig no soro caíssem abaixo dos níveis imunossupressivos de aproximadamente 1 μg/mL em ou após o dia 29. As respostas médias de anticorpo CTLA4-Ig-específicas para macacos aos quais foi fornecido material de processo CD-CHO1 se tornaram positivas no dia 36 e atingiram um pico no dia 43 (o último ponto de tempo avaliado). Titulações de pico de anticorpo em macacos individuais aos quais foram fornecidos materiais de processo CD-CHO1 oscilavam de 23 a 10.448.
EXEMPLO 33: Desagregação sobre a coluna
[0001320] O processo de desagregação através de uma resina de cromatografia por afinidade é útil e tem aplicabilidade à todas as molé-culas recombinantes baseadas em IgG-Fc produzidas em células de mamífero. Caotropos podem ser usados para romper proteína ou material de elevado peso molecular. Essa desagregação pode ser feita sobre a coluna para qualquer uma de tais proteínas. Esse exemplo fornece um método para realização do processo de desagregação sobre um material exemplificativo, isto é, CTLA4-Ig.
[0001321] Material de CTLA4-Ig de elevado peso molecular (HMW) produzido no biorreator de produção pode ser parcialmente convertido no dímero de CTLA4-Ig funcional através do uso de agentes caotropi- cos em solução (modo de batelada) ou em subconjunto com a etapa de cromatografia por afinidade (modo sobre a coluna). Esse processo é referido como "desagregação". Baseado em estudos de caracterização analítica de material CTLA4-Ig desagregado, o material desagregado parece ser bioquimicamente comparável ao material de controle não submetido ao processo de desagregação.
[0001322] Em um processo de fermentação que produz moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção, aproximadamente 20 a 25% da proteína CTLA4-Ig resultante podem estar na forma de material de HMW (isto é, agregado). Recuperação de uma porção desse material como um dímero funcional, portanto, tem o potencial de uma intensificação global do rendimento de processo de > 10%.
Processo de desagregação no modo de batelada
[0001323] A desagregação foi demonstrada no modo de batelada (em solução) através de tratamento com concentrações moderadas de agentes caotrópicos, tais como cloridrato de guanidina ou ureia, seguido por rápida diluição em um tampão de reduplicação com baixo teor de sal para ajudar a molécula a obter sua conformação nativa.
[0001324] CTLA4-Ig purificada usando proteína A (resina usada MAb- Select) foi ajustada para uma concentração final de ~4-5 mg/ml a ser usada como um material de iniciação para esses experimentos em ba-telada. Essa foi, então, contatada em uma proporção em volume de 1:1 com 2x tampões caotrópicos concentrados para obter uma concentração final de caotropo de 1-3 M (para cloridrato de guanidina) e 2-7 M (para ureia). Concentrações de cloridrato de guanidina > 2 M e concentrações de ureia > 4 M foram eficazes para causar desagregação de material CTLA4-Ig de HMW. A fase móvel usada para esses experimentos foi um sistema tamponado com fosfato em uma faixa de pH de 6,5-7,0. A reação de desagregação foi dissipada através de diluição rápida (em uma proporção volumétrica de 1:5) em um tampão de re- duplicação consistindo de Tris a 50 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8,5. Em experimentos de desagregação em batelada, 50 a 60% do material de HMW são convertidos em dímero de CTLA4-Ig com um rendimento de etapa de > 95%. A diminuição no nível de material de HMW observada após a etapa de desagregação é mostrada na figura 42.
Processo de desagregação sobre a coluna
[0001325] Para superar limitações potenciais referentes à mistura e tanque durante escalonamento do processo de desagregação em ba-telada, um processo combinando a etapa de captura por proteína A e a etapa de desagregação foi avaliado. Esse processo envolvia o uso da solução caotrópica como o tampão de eluição para a etapa de proteína A, seguido por coleta da reunião de eluição no tampão de redu- plicação/eluição.
[0001326] Desempenho similar quanto à eficiência de desagregação foi observada usando os processos em batelada e sobre a coluna. O proceso de desagregação sobre a coluna teve uma vantagem distinta de diminuição do número de etapas de processamento. Detalhes ex-perimentais para a etapa de proteína A usando a etapa de desagregação sobre a coluna são resumidos na tabela a seguir. Resina usada: MAbSelect (da GE Healthcare); altura de leito da coluna: 20-25 cm.
Figure img0128
Viabilidade de incorporação no processo a jusante
[0001327] Uma operação de purificação em 3 colunas foi realizada para gerar material de processo final com e sem o uso de uma etapa de desagregação de proteína A sobre a coluna. Os rendimentos da etapa cromatográfica obtidos das duas operações de purificação são fornecidos na Tabela 44. Tabela 44. Rendimentos cromatográficos para o processo em 3 co-lunas com e sem desagregação
Figure img0129
[0001328] A incorporação da etapa de desagregação em um processo em 3 colunas resultou em um aprimoramento de aproximadamente 10% no rendimento de processo. As reuniãos de produto das duas sequências de processo foram analisadas para avaliar a comparabilidade bioquímica do material de CTLA4-Ig resultante.
[0001329] As análises de N-glicana através de MALDI-TOF das duas reuniãos de produto são mostradas na figura 43. Baseado nessas aná-lises, o material parece comparável. Esse resultado por MALDI-TOF foi confirmado usando um método de ensaio de N-glicana baseado em HPLC. As análises de HPLC demonstraram uma diferença de < 1,7% no pico de ácido siálico biantenário entre o material de processo de controle e final desagregado.
[0001330] Mapeamento de peptídeo tríptico também foi realizado sobre as duas reuniões ("pools") de produto para quantificar o percentual de peptídeos deamidados e oxidados presentes no material purificado. Os resultados (resumidos na Tabela 45) demonstraram níveis de de- amidação e oxidação comparáveis para as duas amostras. Tabela 45. Resultados do mapeamento peptídico
Figure img0130
[0001331] Adicionalmente, os resultados do ensaio de ligação-B7 foram de 101% e 98% para o material de controle e desagregado sobre a coluna, respectivamente.
[0001332] Um método para desagregação de moléculas recombinan- tes baseadas em IgG-Fc, tais como aquelas produzidas por células de mamífero, compreendendo a etapa de contato de uma composição compreendendo tais moléculas em uma forma agregada com um agente caotrópico (tal como cloridrato de guanidina ou ureia) em uma quantidade e durante um tempo suficientes para desagregar pelo menos uma porção de tais moléculas agregadas, opcionalmente seguido por contato da referida porção desagregada de moléculas com um agente de reduplicação e/ou dissipação (tal como através de diluição rápida em um tampão de reduplicação com baixo teor de sal para ajudar tais moléculas a obter a conformação nativa). Contato com o agente caotrópico pode, por exemplo, ser realizada no modo de batelada, semibatelada ou contínuo bem como, por exemplo, em solução (tal como no modo em batelada) ou em conjunto com uma etapa cromato- gráfica, tal como durante uma etapa de cromatografia por afinidade (modo sobre a coluna).
[0001333] Um processo combinando uma purificação sobre a coluna, tal como uma etapa de captura com proteína A, com o método de de-sagregação antes mencionado, pode intensificar a eficiência global de processo e é outra modalidade da invenção. Portanto, a presente invenção considera um método para desagregação de moléculas re- combinantes baseadas em IgG-Fc, tais como aquelas produzidas por células de mamífero, compreendendo a etapa de contato de uma composição compreendendo tais moléculas na forma agregada com um agente caotrópico (tal como cloridrato de guanidina ou ureia) em uma quantidade e durante um tempo suficiente para desagregar pelo menos uma porção das referidas moléculas agregadas, em que o referido contato ocorre sobre uma coluna de cromatografia, tal como onde o referido agente caotrópico é empregado em solução para eluição da referida coluna (tal como o tampão de eluição para uma coluna de proteína A), opcionalmente seguido por contato da referida porca desagregada de moléculas com um agente de reduplicação e/ou dissipação (tal como através de diluição rápida em um tampão de reduplicação com baixo teor de sal para ajudar a molécula a obter a conformação nativa).
[0001334] A composição a ser contatada com tal agente caotrópico pode compreender moléculas recombinantes baseadas em IgG-Fc em outras formas que não uma forma agregada (tal como formas com uma única cadeia ou dímeros), além de compreender as referidas moléculas na forma agregada.
[0001335] Moléculas baseadas em IgG-Fc exemplificativas podem incluir glicoproteínas, tais como as moléculas de CTLA4-Ig da presente invenção.
EXEMPLO 34: Farmacocinética
[0001336] Um estudo placebo-controlado, em fase 2B, multi-centro, aleatório, duplamente cego para avaliar a segurança e eficácia clínica de duas doses diferentes de CTLA4-Ig administradas intravenosamente a indivíduos com artrite reumatoide ativa enquanto recebe metotre- xato: Nesse estudo, os indivíduos receberam CTLA4-Ig em 2 doses diferentes (2 e 10 mg/kg) ou placebo em combinação com MTX. CTLA4-Ig foi produzida de acordo com um processo da invenção e fornecida em frascos individuais contendo 200 mg de CTLA4-Ig. CTLA4-Ig foi administrada IV a indivíduos nos dias 1, 15 e 30 e a cada 30 dias depois durante um ano. PK de múltiplas doses foi derivada de dados de concentração no soro vs. tempo obtidos durante o intervalo de do-sagem entre os dias 60 e 90 de indivíduos que foram arrolados em um subestudo de PK local-específico. Para os indivíduos no subestudo de PK, amostras de sangue foram coletadas antes de dosagem no dia 60 e para um perfil de PK começando no dia 60 a 30 minutos (correspondendo ao final da infusão de CTLA4-Ig), a 4 horas após o início de infusão e semanalmente depois, até o dia 90. Um total de 90 indivíduos foram arrolados para participar no subestudo de PK. Contudo, perfis PK completos entre o intervalo de dosagem do dia 60 a 90 foram obtidos de 29 indivíduos (15 indivíduos dosados a 2 mg/kg; 14 indivíduos dosados a 10 mg/kg).
[0001337] Um sumário dos parâmetros de PK é apresentado na Tabela 46. Os resultados do estudo mostraram que a Cmax e AUC(TAU), onde TAU = 30 dias, aumentaram de uma maneira dose-proporcional. Para doses nominais aumentando na proporção de 1:5, as médias geométricas da Cmax aumentaram na proporção de 1:5,2, enquanto que a média geométrica para a AUC(TAU) aumentou na proporção de 1:5,0. Além disso, os valores de T-METADE, CLT e Vss pareciam ser independentes da dose. Nesses indivíduos com RA, os valores médios de T-METADE, CLT e Vss estavam em torno de 13 dias, ~ 0,2 mL/h/kg e ~ 0,07 L/kg, respectivamente. O pequeno Vss indica que CTLA4-Ig está confinada primariamente ao volume de fluido extracelular. Baseado no esquema de dosagem em 2 e 4 semanas após a primeira infusão, então, uma vez por mês após isso, condições em estado uniforme para CTLA4-Ig foram atingidas em torno da terceira dose mensal. Também, como um resultado do esquema de dosagem, as concentrações no soro estavam acima das concentrações séricas em estado uniforme durante os primeiros 2 meses após dosagem mensal. Comparação dos valores séricos (Cmin) nos Dias 60, 90 e 180 indicaram que a CTLA4-Ig não parece se acumular após dosagem mensal. Os valores em estado uniforme de Cmin para todos os indivíduos que re-ceberam doses IV mensais de 2 e 10 mg/kg de CTLA4-Ig oscilavam entre 4,4 a 6,7 μg/mL e 22,0 a 28,7 μg/mL, respectivamente. Tabela 46. Sumário de múltiplos estudos de OK em indivíduos com artrite reumatoide
Figure img0131
[0001338] Em pacientes com Ra, após múltiplas infusões intravenosas, a farmacocinética de CTLA4-Ig mostrou aumentos proporcionais de Cmax e AUC com relação à faixa de dose de 2 mg/kg a 10 mg/kg. A 10 mg/kg, a concentração no soro parecia atingir um estado uniforme em torno do dia 60, com uma concentração sérica média (faixa) de 24 (1-66) mcg/mL. Nenhum acúmulo sistêmico de CTLA4-Ig ocorreu quando de tratamento repetido com 10 mg/kg em intervalos mensais em pacientes com RA.
[0001339] Análises farmacocinéticas da população em pacientes com RA revelaram que havia uma tendência à maior eliminação de CTLA4- Ig com aumento do peso corporal. A idade e o sexo (quando corrigidos para o peso corporal) não afetam a eliminação. Metotrexto (MTX), fár- macos anti-inflamatórios não-esteroidais (NSAIDs), corticosteroides e agentes de bloqueio de TNF concomitantes não influenciam a eliminação de CTLA4-Ig.
EXEMPLO 35: Determinação de proporção molar de manose, fucose e galactose através de CE
[0001340] Um método de eletroforese capilar foi desenvolvido para a análise quantitativa do teor de monossacarídeo neutro em LEA2 CTLA4A29YL104E-Ig. Monossacarídeos neutros, incluindo manose, fucose e galactose, são liberados de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig através de hidrólise ácida em uma condição de temperatura elevada (ácido trifluoroacético a 2M, 6 horas a 95°C). Os monossacarídeos neutros liberados são, então, fluorescentemente rotulados com ácido aminopi- reno trissulfônico (APTS), na presença de ácido acético como um cata-lisador e NaBH3CN como um reagente de redução (APTS a 67mM, HAc a 330mM, NaBH3CN a 83mM, 3 horas a 55°C). Xilose é adicionada a cada amostra e serve como um padrão interno. A proporção de a área de pico de cada monossacarídeo neutro contra aquela do padrão interno é utilizada para quantificação.
[0001341] Reagentes: Solução de hidrólise (ácido trifluoroacético a 2M (TFA)); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6- trissulfônico a 0,1M, sal de trissódio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização II (NaBH3CN a 0,25M em ácido acético a 1M); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCl a 1N; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de manose (Man), fucose (Fuc), galactose (Gal) e xilose (Xyl) em uma concentração de 10 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes diluição de solução de estoque de Xyl; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de trabalho padrão de mistura neutras, 100 vezes diluição de soluções de estoque de Man, Fuc e Gal.
[0001342] Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CE System; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) acoplado com P/ACE MDQ); Capilar não revestido (d.i. de 25 μm, d.e. de 360 μm) comprimento total de 27-31 cm para acomodar P/ACE MDQ.
[0001343] Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura de cartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição do detector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção de amostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5PSI; Tempo de operação: 10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.
[0001344] Hidrólise: 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 200 μL de TFA a 2M foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de Solução-padrão de mistura neutra foram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer o Padrão de monossacarídeo. 10 μL de Solução de trabalho de xilose e 10 μL de amostra (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de TFA a 2M para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a turbilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostras foram colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um Spe- edVac.
[0001345] Derivatização: Amostras foram reconstituídas com 10 μL de Solução de Derivatização I. A amostra foi rapidamente misturada e 5 μL de Solução de Derivatização II foram adicionados. As amostras foram carregadas em uma centrífuga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifugava a 2000 rpm.
[0001346] Injeção de CE: O volume final das amostras após derivati- zação foi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10 μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190 μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho de CE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempo de operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampão de Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrões de monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho de CE (tempo de operação de 15 min). Após a operação de injeção de cada padrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado com água com grau para HPLC e tampão de Operação (Tabela 51). O ele- troferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 45, em que o pico 1 é manose; o pico 2 é xilose; o pico 3 é fucose; e o pico 4 é galactose. Tabela 51. Método do instrument
Figure img0132
ADEQU ABILIDA DE DE SISTEMA:
[0001347] O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar àquele mostrado na figura 45, onde o pico 1 é manose; o pico 2 é xilose; o pico 3 é fucose; e o pico 4 é galactose.
[0001348] Quando outros instrumentos de CE que não o sistema Beckman MDQ são usados, o comprimento do capilar pode ser diferente daquele especificado nesse método. Isso causará variações no tempo de migração de analito, bem como na intensidade de pico. Mas o padrão de pico de analitos de monossacarídeo deverá permanecer o mesmo.
[0001349] A resolução entre dois picos vizinhos para os primeiros Pa-drões de Adequabilidade de sistema pode ser calculada de acordo com a seguinte equação: R =2 (t2-t1) / (W1+W2)
[0001350] onde:
[0001351] R: resolução
[0001352] t2, t1: tempos de migração dos dois picos vizinhos respecti-vamente
[0001353] W1, W2:larguras de pico na linha de base dos dois picos vi-zinhos respectivamente
[0001354] O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar usando as sequências de lavagem/enxágue. Se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente pre-parado ou substituir o capilar.
[0001355] Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o último pico (galactose) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula: T = W0,05/2f
[0001356] onde:
[0001357] T: fator de configuração
[0001358] W0,05: largura de pico a 5% de altura
[0001359] f: largura da fronte de pico em pico máximo
[0001360] Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as sequências de lava- gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar. Proporção de área de pico de galactose e xilose deve ter um RSD de <10%. O tempo de migração de galactose precisa ser >15,0 minutos. O perfil de eletroferograma deverá ser equivalente à figura 45.
[0001361] O RSD percentual para o padrão monossacarídico pode ser determinado através de comparação da proporção de áreas de pico do padrão interno e componentes de padrão de monossacarídeo dividindo a área de pico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção de padrão de monossaca- rídeo. O RSD percentual pode ser calculado para manose, fucose e galactose. O RSD deverá ser <10%.
Determinação das proporções molares de Monossacarídeos neutros para Proteína
[0001362] A proporção de áreas de pico de monossacarídeos neutros (por exemplo, Man, Gal e Fuc) com relação ao padrão interno Xilose pode ser calculada de acordo com as fórmulas proporcionadas abaixo de forma a determinar as proporções molares de cada monossacarí- deo neutro para proteína. Por exemplo, a proporção de área de pico é igual à área de pico de monossacarídeo (Gal, Fuc ou Man) dividido pela Área de pico de xilose, em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico é igual a ou menor do que 10%. As seguintes equações podem ser usadas para calcular o seguinte: Para proporção molar de Manose/Proteína:
Figure img0133
[0001363] onde:
[0001364] Rman: proporção molar de manose vs. proteína
[0001365] Aman: área de pico (μV.seg) de manose na amostra
[0001366] Axyl: área de pico (μV.seg) de xilose na amostra
[0001367] Axyl0: área de pico (μV.seg) média de xilose no padrão de monossacarídeo
[0001368] Aman0: área de pico (μV.seg) média de manose no padrão de monossacarídeo
[0001369] Vman0:volume de manose contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001370] Cman0:concentração de manose contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001371] Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001372] Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001373] MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E- Ig) (91,232 Da)
[0001374] MW de manose: 180,2 dáltons. Para proporção molar de Fucose/Proteína:
Figure img0134
[0001375] onde:
[0001376] Rfc: proporção molar de fucose vs. proteína
[0001377] Afuc: área de pico (μV.seg) de fucose na amostra
[0001378] Axyl: área de pico (μV.seg) de xilose na amostra
[0001379] Axyl0: área de pico (μV.seg) média de xilose no padrão de monossacarídeo
[0001380] Afuc0: área de pico média (μV.seg) de fucose no padrão de monossacarídeo
[0001381] Vfuc0: volume de fucose contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001382] Cfuc0: concentração de fucose contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001383] Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001384] Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001385] MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E-Ig) (91,232 Da)
[0001386] MW de fucose: 164,2 dáltons. Para proporção molar de Galactose/Proteína:
Figure img0135
[0001387] onde:
[0001388] Rgal :proporção molar de galactose vs. proteína
[0001389] Agal:área de pico (μV.seg) de galactose na amostra
[0001390] Axyi: área de pico (μV.seg) de xilose na amostra
[0001391] Axyi0:área de pico (μV.seg) média de xilose no padrão de monossacarídeo
[0001392] Agal0:área de pico (μV.seg) média de galactose no padrão de monossacarídeo
[0001393] Vgal0:volume de galactose contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001394] Cgal0:concentração de galactose contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001395] Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001396] Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001397] MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E-Ig) (91,232 Da)
[0001398] MW galactose: 180,2 dáltons. Tabela 52: Proporção molar média de Monossacarídeo para proteína de CTLA4A29YL104E-Ig
Figure img0136
EXEMPLO 36: Determinação da proporção molar de GalNAc e GlcNAc através de CE
[0001399] Um método de eletroforese em capilar foi desenvolvido para a análise quantitativa do teor de amino monossacarídeo em CTLA4A29YL104E-Ig, uma glicoproteína com 6 sítios de glicosilação N- ligada e pelo menos 1 sítio de glicosilação O-ligada. Amino monossa- carídeos, incluindo N-acetil galactosamina (GalNAc) e N-acetil glico- samina (GlcNAc), são liberados da amostra de CTLA4A29YL104E-Ig através de hidrólise ácida em uma condição de temperatura elevada (HCl a 4N, 6 horas a 95°C). Os amino monossacarídeos liberados vão para a etapa de reacetilação através de incubação com anidrido acético sobre gelo durante meia hora. Eles são, então, fluorescentemente rotulados com ácido aminopireno trissulfônico (APTS), na presença de ácido acético como um catalisador e NaBH3CN como um reagente de redução (APTS a 67 mM, HAc a 330 mM, NaBH3CN a 83 mM, 3 horas a 55°C). N-acetil manosamina é adicionada a cada amostra e serve como um padrão interno. A proporção da área de pico de cada amino monossacarídeo contra aquela do padrão interno é utilizada para quantificação.
[0001400] Reagentes: Solução de hidrólise (HCl a 4N); Solução de Derivatização I (ácido 8-amino-1,3,6-trissulfônico a 0,1M, sal de trissó- dio (APTS) solução aquosa); Solução de Derivatização II (NaBH3CN a 0,25M em ácido acético a 1M); Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM, pH9,5); Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de 9,25); Soluções de enxágue de capilar (NaOH a 1N; HCl a 1N; metanol a 80%); Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo de GalNAc, GlcNAc e ManNAc em uma concentração de 10 mg/ml; Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno é 100 vezes diluição de solução de estoque de ManNAc; Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino, 100 vezes diluição de soluções de estoque de GalNAc e GlcNAc.
[0001401] Instrumentação: O sistema de CE é Beckman P/ACE MDQ CE System; Detector: Sistema de detecção induzida a laser Beckman (LIF) acoplado com P/ACE MDQ).
[0001402] Condições de operação do capilar de eletroforese: Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25); Temperatura de cartucho do capilar: 25°C; Tensão: 25-30 kV, modo positivo; Condição do detector: Detector LIF, excitação a 488 nm, emissão a 520 nm; Injeção de amostra: modo de injeção sob pressão, 20s a 0,5PSI; Tempo de operação: 10 min; Armazenamento de amostra: 10°C.
[0001403] Hidrólise: 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μL de HCl a 4N foram misturados para fazer o sistema de placebo. 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução Padrão de Mistura Amino foram misturados com 200 μL de HCl a 4N para fazer o Padrão de monossacarídeo. 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de amostra (por exemplo, amostra de CTLA4A29YL104E-Ig, etc.; aproximadamente 1 mg/ml) foram misturados com 200 μL de HCl a 4N para fazer a amostra de teste. Todos os tubos foram submetidos a tur- bilhonamento durante 10 seg e centrifugados durante 10 seg, seguido por incubação a 95°C durante 6 horas. Após a etapa de hidrólise, as amostras foram colocadas a -20°C durante 10 min para esfriar. As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac.
[0001404] Reacetilação: Amostras hidrolisadas e secas foram recons-tituídas com 20 μL de tampão de reacetilação e 4 μL de anidrido acético, seguido por mistura e com incubação sobre gelo (30 min). As amostras foram centrifugadas durante 10 seg e evaporadas até secagem em um SpeedVac. As amostras foram, cada uma, reconstituídas com 100 μl de água com grau para HPLC e foram evaporadas até secagem com um SpeedVac.
[0001405] Derivatização: Amostras reconstituídas (10 μL de Solução de Derivatização I HPLC) foram fornecidos 5 μL de Solução de Derivati- zação II. Após mistura, as amostras foram carregadas em uma centrífu-ga pré-aquecida e incubadas durante 3 horas a 55°C enquanto centrifu-gava a 2000 rpm.
[0001406] Injeção de CE: O volume final das amostras após derivati- zação foi levado para 100 μL através da adição de água com grau para HPLC e 10 μL de amostras foram transferidos para um micro frasco para CE com 190 μL água com grau para HPLC. Antes de injeções de amostra, o cartucho de CE foi enxaguado extensivamente com água com grau para HPLC (tempo de operação de 1-3 min), seguido por um enxágue de equilíbrio com tampão de Operação (tempo de operação de 5 min). Após o enxágue inicial, padrões de monossacarídeo e amostras para análise foram injetados no cartucho de CE (tempo de operação de 10 min). Após a operação de injeção de cada padrão ou amostra de teste, o cartucho de CE foi enxaguado e equilibrado com água com grau para HPLC e tampão de Operação. O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar à figura 46, em que o pico 1 é GalNAc; o pico 2 é ManNAc; e o pico 3 é GlcNAc. Tabela 53. Método no Instrumento
Figure img0137
ADEQUABILIDADE DE SISTEMA:
[0001407] O eletroferograma da Adequabilidade de sistema deverá ser similar àquele mostrado na figura 46, onde o pico 1 é GalNAc; o pico 2 é ManNAc; e o pico 3 é GlcNAc
[0001408] Quando outros instrumentos de CE que não o sistema Beckman MDQ são usados, o comprimento do capilar pode ser diferente daquele especificado nesse método. Isso causará variações no tempo de migração de analito, bem como na intensidade de pico. Mas o padrão de pico de analitos de monossacarídeo permanecerá o mesmo.
[0001409] A resolução entre dois picos vizinhos para os primeiros Pa- drões de Adequabilidade de sistema pode ser calculada de acordo com a seguinte equação: R =2 (t2-t1) / (W1+W2)
[0001410] onde:
[0001411] R: resolução
[0001412] t2, t1: tempos de migração dos dois picos vizinhos respecti-vamente
[0001413] W1, W2:larguras de pico na linha de base dos dois picos vi-zinhos respectivamente
[0001414] O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar usando as sequências de lavagem/enxágue. Se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente pre-parado ou substituir o capilar.
[0001415] Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o último pico (GlcNAc) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula: T = W0,05/2f
[0001416] onde:
[0001417] T: fator de configuração
[0001418] W0,05: largura de pico a 5% de altura
[0001419] f: largura da fronte de pico em pico máximo
[0001420] Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as sequências de lava- gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar. A proporção das áreas de pico de GlcNAc e ManNAc deve ter um RSD de <10%. O tempo de migração de GlcNAc deve ser <10,0 minutos. O perfil de eletroferograma deverá ser equivalente à figura 46,
[0001421] O RSD percentual para o padrão monossacarídico pode ser determinado através de comparação da proporção de áreas de pico do padrão interno e componentes do padrão de monossacarídeo dividin- do a área de pico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção de padrão de monossaca- rídeo. O RSD percentual pode ser calculado para GalNAc e GlcNAc. O RSD deverá ser <10%.
Determinação das proporções molares de Amino monossacarí- deos para Proteína
[0001422] A proporção de áreas de pico de Amino monossacarídeos (por exemplo, GalNAc e GlcNAc) com relação ao padrão interno Man- NAc pode ser calculada de acordo com as fórmulas proporcionadas abaixo de forma a determinar as proporções molares de cada amino monossacarídeo para proteína. Por exemplo, a proporção de área de pico é igual à área de pico de monossacarídeo (GalNAc ou GlcNAc) dividido pela área de pico de ManNAc, em que o desvio-padrão relativo (RSD) para a proporção de área de pico é igual a ou menor do que 10%. As seguintes equações podem ser usadas para calcular: Para proporção molar de GalNAc/Proteína:
Figure img0138
[0001423] onde:
[0001424] RGalNAc : proporção molar de GalNAc vs. proteína
[0001425] AGaiNAc:área de pico (μV.seg) de GalNAc na amostra
[0001426] AManNAc: área de pico (μV.seg) de ManNAc na amostra
[0001427] AManNAc0: área de pico (μV.seg) média de ManNAc no padrão de monossacarídeo
[0001428] AGalNAc0: área de pico (μV.seg) média de GalNAc no padrão de monossacarídeo
[0001429] VGalNAc0: volume de GalNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001430] CGalNAc0:concentração de GalNAc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001431] Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001432] Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001433] MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E-Ig) (91,232 Da)
[0001434] MW GalNAc: 221,2 Dáltons. Para proporção molar de GlcNAc/Proteína:
Figure img0139
[0001435] onde;
[0001436] RGlcNAc :proporção molar de GlcNAc vs. proteína
[0001437] AGlcNAc : área de pico (μV.seg) de GlcNAc na amostra
[0001438] AManNAc: área de pico (μV.seg) de ManNAc na amostra
[0001439] AManNAc0: área de pico (μV.seg) média de ManNAc no padrão de monossacarídeo
[0001440] AGlcNAc0: área de pico (μV.seg) média de GlcNAc no padrão de monossacarídeo
[0001441] VGlcNAc0: volume de GlcNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0001442] CGlcNAc0: concentração de GlcNAc contido em solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001443] Vp: volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0001444] Cp: concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0001445] MWLEA29Y: Peso molecular de LEA29Y (ou CTLA4A29YL104E-Ig) (91,232 Da)
[0001446] MW GlcNAc: 221,2 Dáltons Tabela 54: Proporção molar média de mols de Monossacarídeo para mols de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig
Figure img0140
EXEMPLO 37: DEFINIÇÃO DE PERFIL DE CARBOIDRATO N- LIGADO DE OLIGOSSACARÍDEO DE CTLA4A29YL104E-Ig ATRAVÉS DE CROMATOGRAFIA DE TROCA DE ÂNIONS DE ELEVADO DE-SEMPENHO
[0001447] As estruturas de carboidrato presentes sobre glicoproteínas podem afetar sua função e clearance in vivo. Portanto, é importante monitorar a consistência estrutural dos carboidratos de lotes recombi- nantemente produzidos de glicoproteínas. Aqui, carboidratos N-ligados (asparagina-ligados) presentes sobre CTLA4A29YL104E-Ig são monitorados. Nesse método, oligossacarídeos são clivados através de digestão enzimática com PNGase F (Peptídeo: N-Glicosidase F), separados através de cromatografia de troca de ânions de elevado desempenho (HPAEC) e monitorados através de detecção eletroquímica (ampero- metria integrada). O cromatograma gerado é o perfil de carboidrato N- ligado, em que perfis de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig deverão ser similares ao mesmo.
Reagentes para Fases móveis para Isolamento dos oligossacarí- deos através de HPLC em fase reversa e carbono grafitado:
[0001448] Eluente 1 (ácido trifluoroacético a 0,05% (TFA) em água com grau para HPLC); Eluente 2: (TFA a 0,05% em acetonitrila a 60% (ACN), 40% de água para HPLC (60: 40, ACN: H2O); Eluente 3: TFA a 0,05% em acetonitrila a 40%, isopropanol a 40% (IPA), 20% de água para HPLC (40: 40: 20, ACN: IPA: H2O)).
Reagentes para a preparação de Fases móveis para definição de perfil de carboidrato de oligossacarídeo por HPAEC:
[0001449] Eluente 1: acetato de sódio a 500 mM (NaOAc); Eluente 2: hidróxido de sódio a 400 mM (NaOH); água Milli-Q; Hidróxido de sódio a 4M (aproximadamente NaOH a4M); tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5; Solução-estoque de trabalho de enzima PNGase F em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5; Solução-estoque de estaquiose (1,25 mg/mL); Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose (12,5 μg/mL). INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES - (instrumentação equivalente pode ser usada) Instrumentação:
Figure img0141
[0001450] Preparação de amostra: A um tubo de Eppendorf de 1,7 mL, 80 μL de tampão de fosfato de Na a 50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pH de 7 e 80 μL de amostra (~25μg/μL para um total de 2 mg de CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) foram adicionados, seguido por 16 μL de 10X Tampão de desnaturação (SDS a 5%, β-Mercaptoetanol a 10%). As amostras foram misturadas totalmente e subsequentemente levadas à ebulição durante 2 minutos para desnaturar as proteínas. Os frascos foram esfriados para a temperatura ambiente, então, 16 μL de NP40 (10%) e 40 μL da solução de trabalho de PNGase F foram adici-onados e subsequentemente misturados. Após as amostras terem sido incubadas a 37°C durante 24 ± 2 horas, elas foram transferidas para um frasco para amostrador automático de HPLC, pronto para injeção sobre o instrumento de HPLC. Condições de cromatografia para Isolamento de oligossacarídeo:
Figure img0142
Figure img0143
Condições de cromatografia para perfil de Oligo através de cromatografia de troca de íons:
Figure img0144
Figure img0145
[0001451] As amostras de CTLA4A29YL104E-Ig podem ter um perfil de carboidrato representado no cromatograma da figura 47. Os tempos de retenção de cada domínio, conforme identificado na figura 47, deverão ser aproximadamente: Domínio I (Pico 1A, 1B, 1C, 1D e 1E)10-17 min Domínio II:21-29 min Domínio III:33-43 min Domínio IV:48-56 min
[0001452] Tempos de retenção são dependentes do sistema e deverão se desviar similarmente à estaquiose.
Cálculos
[0001453] Placas teóricas (N): O número de placas teóricas (N) pode ser determinado baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Millennium ou pode também ser feito manualmente. N = 16 (t / W)2
[0001454] onde:
[0001455] t: tempo de retenção medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição de pico na altura máxima.
[0001456] W: largura de pico através de extrapolação dos lados para a linha de base.
[0001457] N deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menor do que 6000, a coluna deverá ser substituída.
[0001458] Fator de configuração (T): O fator de configuração da coluna (T) pode ser calculado baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Millennium ou pode também ser feito manualmente. T = (W0,05/ 2f)
[0001459] onde:
[0001460] W0,05: largura de pico a 5% de altura (0,05h).
[0001461] f: a medida (largura) da borda frontal de pico a W0,05 para o meio do pico na altura máxima.
[0001462] T deve ser <1,2. Se o fator de configuração for maior do que 1,2, a composição de tampão deverá ser avaliada, a coluna deverá ser substituída ou limpa.
área de Domínio %:
[0001463] Domínio I: Soma das áreas de pico em tempos de reten ção aproximados de 10 -15 minutos (Picos 1A-1E; por exemplo, figura 47) Domínio II:Soma dos picos de 21 - 27 minutos Domínio III:Soma dos picos de 34 -40 minutos Domínio IV:Área de pico para os Picos a 45 -56 minutos
Figure img0146
[0001464] Área de pico principal percentual: A Área de pico % para cada um dos principais cinco picos pode ser calculada para o seguinte usando a equação abaixo: Picos 1A, 1B, 1C, 2 (duas espécies não- decompostas), 3 (duas espécies não-decompostas) e 4.
Figure img0147
EXEMPLO 38: IDENTIFICAÇÃO ELETROFORÉTICA EM CAPILAR DE CTLA4A29YL104E-Ig EM SUBSTÂNCIA DE FÁRMACO E PRODUTO DE FÁRMACO
[0001465] CTLA4A29YL104E-Ig é uma glicoproteína solúvel em água com atividade imunossupressora. Um método de eletroforese em capilar usando um capilar de sílica não-revestido foi usado para a identificação de CTLA4A29YL104E-Ig. As amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc.) são aquecidas durante 5 minutos a 70°C e, então, analisadas imediatamente através de detecção de UV ajustada a 214 nm para confirmar a identificação.
[0001466] Adicionalmente, uma mistura a 1:1 de CTLA4A29YL104E-Ig e de material de CTLA4-Ig foi misturada e injetada para confirmar que as duas proteínas poderiam ser separadas e diferenciadas. Esse método pode distinguir entre CTLA4A29YL104E-Ig de CTLA4-Ig através de comparação do tempo de migração do material de CTLA4A29YL104E-Ig com a amostra. EQUIPAMENTO (equipamento equivalente pode ser substituído):
Figure img0148
[0001467] REAGENTES E SOLUÇÕES: Tampão de Operação (borato de sódio a 14,4 mM; dodecil sulfato de sódio a 17,3 mM; acetonitrila a 2,0%); tampão de diluição de fosfato (fosfato de sódio a 22,3 mM, dibásico; fosfato de sódio a 4,2 mM, monobásico; cloreto de sódio a 53,4 mM); Tampão de diluição de borato (NaBO2 a 8,5 mM, pH de 9,6); soluções de trabalho de referência ou amostra (10 ±1 mg/mL de amostra em tampão de diluição de fosfato); soluções de injeção de referência ou amostra (10,0 μL de amostra + 50 μL de tampão de diluição de borato); Amostra 1: 1 solução de mistura de CTLA4-Ig- CTLA4A29YL104E-Ig (10,0 μL de amostra de CTLA4-Ig + 10,0 μL de amostra de CTLA4A29YL104E-Ig + 50 μL de tampão de diluição de borato); solução de injeção. CONDIÇÕES DE OPERAÇÃO:
Figure img0149
* Comprimento total: da entrada para a saída do capilar ** Comprimento efetivo: da entrada do capilar para a janela de detecção
[0001468] O tempo de migração de amostra de CTLA4-Ig do pico principal é cerca de 11,0 ± 0,4 minuto. O tempo de migração de amostra de CTLA4A29YL104E-Ig do pico principal é cerca de 12,0 ± 0,4 minuto. Os tempos de migração do pico principal entre cada amostra deverão estar a pelo menos 0,6 minuto de distância (FIG. 48).
EXEMPLO 39: Hidrólise e análise por HPLC para determinação do teor de ácido N-acetil neuramínico e ácido N-glicolil neuramínico em CTLA4A29YL104E-Ig
[0001469] O grau de sialilação em proteínas recombinantes pode afetar a farmacocinética e taxa de clearance. CTLA4A29YL104E-Ig é uma proteína recombinante que possui sítios de carboidrato N- e O-ligado. Os glicanos que ocupam esses sítios possuem graus variáveis de siali- lação. Além de heterogeneidade estrutural de sua sialilação, o teor de ácido siálico individual poderia variar de lote para lote. Uma medição global da proporção de ácido siálico para proteína é, portanto, obtida.
[0001470] O teor de ácido N-Acetil Neuramínico (NANA) e ácido N- glicolil neuramínico (NGNA) presentes em CTLA4A29YL104E-Ig foi examinado. Os ácidos siálicos são liberados da proteína através de hidrólise ácida e, então, fluorescentemente rotulados com DMB. Os ácidos siá- licos rotulados são separados sobre uma coluna RP-HPLC C-18 e quantificados a partir de um fator de resposta de um padrão de ácido siálico concorrentemente operado. Análise de dados e valores reportados (como proporção molar de NANA ou NGNA para proteína) são especificados nesse método exemplificativo. Esse exemplo descreve o método usado para determinar a quantidade de ácido N-Acetil Neura- mínico (NANA) e ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) presente em CTLA4A29YL104E-Ig. Os ácidos siálicos são liberados da proteína através de hidrólise ácida. Os NANA e NGNA liberados são, então, fluorescentemente rotulados com 1, 2,-diamino-4, 5-metilenoxibenzeno (DMB). Os ácidos siálicos rotulados são separados sobre uma coluna RP- HPLC C-18 e detectados através de detecção fluorescente (Ex = 373 nm, Em = 448 nm). NANA e NGNA são quantificados baseado nos fatores de resposta dos padrões de NANA e NGNA concorrentemente operados. Os resultados do teste são reportados como proporção molar (MR) de NANA e NGNA para proteína, respectivamente.
[0001471] Reagentes e Soluções: H2SO4 a 1,0 M; H2SO4 a 50 mM; reagente de rotulação por fluorescência (hidrossulfito de sódio a 18 mM (Na2S2O4), 2-mercaptoetanol a 7%, dicloridrato de 1,2-diamino- 4,5-metileno-dioxibenzeno a 7 mM (DMB)); Tampão de Operação de Fase móvel A (Metanol a 20%); Tampão de Operação de Fase móvel B (Metanol a 70%); solução-padrão de ácido N-acetil neuramínico (1 mg/mL); solução padrão de ácido N-glicolil neuramínico (1 mg/mL); Padrões de Adequabilidade de sistema (50 μL das soluções de NANA ou NGNA em 900 μL de água); Solução de amostras (por exemplo, 2 mg/ml de CTLA4A29YL104E-Ig, etc.); Solução-padrão de estoque de trabalho de NANA (diluir estoque para 50 μg/mL); solução-padrão de Estoque de trabalho de NGNA (diluir estoque para 50 μg/mL).
[0001472] Hidrólise: 20 μL de cada um de padrão de NANA, padrão de NGNA, CTLA4A29YL104E-Ig e solução-padrão de adequabilidade de sistema foram transformados em alíquotas em tubos para centrífuga de 1,5 mL distintos e 200 μL de solução de ácido sulfúrico a 50 mM foram adicionados a cada frasco. Os conteúdos foram misturados ligeiramente e incubados a 80EC durante 1hora V 5 minutos. Quando hidrólise está completa, a amostra é centrifugada rapidamente.
[0001473] Rotulação por fluorescência: reagente de rotulação por fluorescência (200 μL) foi adicionada a cada amostra e misturado to-talmente. As amostras foram, então, incubadas no escuro a 80EC durante 45 V 5 e subsequentemente esfriadas. INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS (instru-mentação equivalente pode ser usada):
Figure img0150
[0001474] Sistema de HPLC: módulo de separação Waters 2690/2695 ou equivalente
[0001475] Detector de fluorescência: detector de fluorescência com comprimento de onda múltiplo Waters 2475 ou equivalente
[0001476] Aquisição de dados: Waters Millennium 32 ou Empower.
[0001477] Coluna: Luna 5 μ, C18, 100 A, 150 x 4,6 mm, Phenomenex, (Catálogo No. 00F-4252-E0)
[0001478] Bloco de aquecimento digital: WVR, (Catálogo No. 13259056) ou equivalente
[0001479] MiniCentrífuga: WVR, (Modelo No. C-1200) ou equivalente
[0001480] Fase móvel A: MeOH a 10% (v/v)/90% de água
[0001481] Fase móvel B: MeOH a 70% (v/v) /30% de água
[0001482] Taxa de fluxo: 1 mL/min
[0001483] Volume de injeção: 10 μL
[0001484] Tempo de operação: 30 min
[0001485] Temperatura da coluna: temperatura ambiente
[0001486] Comprimento de onda de excitação: 373 nm
[0001487] Comprimento de onda de emissão: 448 nm
[0001488] Ganho:1 Gradiente de eluição:
Figure img0151
Preparo de padrões de ácido siálico (~ 5 mM)
[0001489] Padrão de ácido N-acetil neuramínico (NANA, MW = 309,3) (~ 5 mM). Pesar precisamente 154,5 ± 1,0 mg de ácido N-acetil neuramínico em um frasco volumétrico de 100 mL. Dissolver e Q.S. até o volume com água DI, misturar bem. Transformar em alíquotas a solução em frascos criogênicos de 2 mL.
Figure img0152
P = Pureza de NANA - do COA do Vendedor (isto é, 99% = 0,99).
[0001490] Padrão de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA, MW = 325,7) (~ 0,25 mM). Pesar precisamente 8,0 ±1,0 mg de ácido N- glicolil neuramínico em um frasco volumétrico de 100 mL. Dissolver e Q.S. até o volume com água DI, misturar bem. Transformar em alíquotas a solução em um frasco criogênico de 2 mL.
Figure img0153
P = Pureza de NGNA - do COA do Vendedor COA (isto é, 99% = 0,99).
[0001491] Os padrões de ácido siálico transformados em alíquota podem ser armazenados a -20 oC durante até seis meses.
[0001492] Preparação de mistura padrão de ácido siálico. Mistura- padrão de ácido siálico para adequabilidade de sistema e quantificação (NANA a 50 μM, NGNA a 1 μM). Adicionar 1 mL de NANA a 5 mM, 400 μl de NGNA a 0,25 mM em um frasco volumétrico de 100 mL. Q.S. até o volume com água DI e misturar bem. Transformar em alíquotas a mistura padrão de ácido siálico em frascos criogênicos de 2 mL. A mis- tura-padrão de ácido siálico transformada em alíquota pode ser armazenada a -20oC durante até seis meses.
[0001493] Preparação de amostra e Material de Referência. Des-congelar as amostras de proteína a 2-8oC, misturar bem. Diluir as amostras e Material de Referência para aproximadamente 0,5 mg/mL CTLA4A29YL104E-Ig (por exemplo, conc. de proteína = 25,0 mg/ml, adicionar 50,0 μl de proteína em 2450 μl de água). Centrifugar as amostras de teste diluídas e material de referência durante 5 minutos a 10.000 rpm de forma a remover as partículas.
Hidrólise
[0001494] Placebo: A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μL de água DI e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Isso serve como placebo.
[0001495] Padrão de ácido siálico para Adequabilidade de sistema e quantificação. A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μL de mistura de padrão de ácido siálico e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Preparar em duplicata. Denotar como Std1 e Std2.
[0001496] Material de Referência: A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μL de material de referência de CTLA4A29YL104E-Ig diluído (-0,5 mg/mL) e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Preparar em duplicata, denotar como RM1 e RM2.
[0001497] Amostras de teste: A um tubo para centrífuga de 2,0 mL, adicionar 50 μL de substância de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig diluída (- 0,5 mg/mL) e 200 μL de ácido sulfúrico a 50 mM. Preparar em duplicata. Denotar como S1-1, S1-2; S2-1, S2-2; S3-1, S3-2; etc. Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproximadamente 5 segundos e centrifugar durante aproximadamente 5-10 segundos. Colocar as amostras em um bloco de aquecimento e incubar a 80°C ± 5°C durante 1hora ± 5 minutos. Deixar as amostras hidrolisadas esfriar para a temperatura ambiente. Centrifugar as amostras hidrolisadas rapidamente para forçar condensado no tubo (~ 10 segundos em alta velocidade).
[0001498] Derivatização. Pré-aquecer o bloco de aquecimento para 80°C ± 5°C. Adicionar 200 μL de reagente de rotulação por fluorescência a cada amostra hidrolisada. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5 segundos e centrifugar durante ~ 10 segundos. Colocar as amostras em um bloco de aquecimento a 80°C ± 5°C durante 40 ± 5 minutos. Cobrir o bloco de aquecimento com folha de alumínio, uma vez que a solução de rotulação é sensível à luz. Deixar amostras deri- vatizadas esfriar para a temperatura ambiente. Submeter a turbilho- namento e centrifugar as amostras durante aproximadamente 10 segundos para forçar o condensado no tubo.
[0001499] Preparação de injeção. Assegurar que a coluna é equilibrada com fase móvel antes de análise. Transferir amostra suficiente (100 - 200 μL) de cada tubo para centrífuga para um frasco para amostrador automático com inserção limitada. Um carregamento típico para amostrador automático para 10 injeções de amostra é como se- gue:
Figure img0154
[0001500] onde Std1 e Std 2 são as preparações de solução de mistu- ra-padrão de ácido siálico; RM1 e RM2 são os preparados para amostra de controles; e S é a injeção de amostra. As primeiras quatro injeções de padrão de ácido siálico (Amostra N° 2 & 3) (Std1) serão usadas para fins de Adequabilidade de sistema. As quatro injeções de Amostra N° 3 (Std1) e Amostra N° 4 (Std2) serão usadas para cálculo. Para injeções de amostra adicionais, repetir carregamentos 5 a 16 do amostrador automático.
[0001501] ADEQUABILIDADE DE SISTEMA. O perfil de cromato- grama de amostras de Adequabilidade de sistema deverá ser similar ao cromatograma mostrado na figura 49. Para as primeiras injeções de Padrão de Adequabilidade de Sistema (Std1), as resoluções USP (R) para NGNA e NANA devem ser > 1,5. Quatro injeções do Padrão de Adequabilidade de Sistema (Std1) deverão ir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos: O RSD da área de pico para NANA deve ser < 5%. O RSD da área de pico para NGNA deve ser < 10%. O tempo de migração do pico de NGNA deve ser eluído a 11,3 ± 2,0 minutos. O tempo de migração do pico de NANA deve ser eluído a 16,0 ± 2,5 minutos. O RSD da área de pico de quatro injeções de padrão, (Std1, Amostra N° 3) e (Std2, Amostra N° 4) deve ser <10%. O RSD da área de pico de todas as injeções de padrão entre faixas da sequência deve ser <15%.
[0001502] Preparação do sistema de HPLC: Colunas foram equilibradas com 98% de Tampão A e 2% de Tampão B a 1 mL/min durante 15 minutos. 10 μL de solução de adequabilidade de sistema fluores-centemente rotulada foram injetados no sistema. A resolução de pico e o número de placas teóricas podem, então, ser calculados usando as seguintes equações:
Figure img0155
[0001503] onde:R =Resolução
[0001504] T1 =Tempo de retenção (min) de ácido N-glicolil neuramíni- co
[0001505] T2 =Tempo de retenção (min) de ácido N-acetil neuramíni- co
[0001506] W1 =Largura de pico na linha de base de ácido N-glicolil neuramínico (min)
[0001507] W2 =Largura de pico na linha de base de NANA (min)
[0001508] O valor de resolução deve ser 33 1,5.
[0001509] O número de placas teóricas pode ser calculada usando a seguinte equação: N = 16 (T2/W2)2
[0001510] onde:
[0001511] N = Número de placas teóricas
[0001512] T2 = Tempo de retenção (min) de ácido N-acetil neuramíni- co W2 = Largura de pico na linha de base de ácido N-acetil neuramínico (min)
[0001513] O número de placas teóricas deve ser 2000. O cromato- grama de perfil de hidrólise de CTLA4A29YL104E-Ig deverá ser similar à figura 49.
[0001514] Amostras foram analisadas através de HPLC de fase reversa (RP-HPLC) na seguinte ordem: Padrões de NANA e NGNA foram primeiro injetados, seguido por injeção de amostras, em duplicata se necessário (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, etc). Após análise de amostra, a coluna foi lavada com Fase Móvel B durante 20 minutos a 0,5 mL/minuto. Se necessário, a coluna pode ser invertida.
Determinação da proporção molar (MR) de ácido siálico (NANA ou NGNA) para proteína
[0001515] A proporção molar de ácidos siálicos para proteína pode ser calculada através do software Millennium ou Empower.
[0001516] Fator de diluição:
Figure img0156
[0001517] onde
[0001518] V proteína = volume de solução-estoque de proteína adicionado (MI)
[0001519] V água = volume de água adicionado (MI)
[0001520] Concentração de solução de trabalho de proteína (proteína usada para hidrólise) concentração (μM):
Figure img0157
[0001521] onde:
[0001522] Cproteína = Concentração da solução de trabalho de proteína (μM),
[0001523] CA280 = A280 concentração da solução-estoque de proteína (mg/ml),
[0001524] MW CTLA4A29YL104E-Ig = peso molecular de CTLA4A29YL104E- Ig, 91232 Da.
[0001525] Concentração de Ácidos siálicos na solução de trabalho de proteína (μM):
Figure img0158
[0001526] onde:
[0001527] Cdesconhecida =Concentração de ácido siálico (NANA ou NGNA) na amostra desconhecidaa
[0001528] Cstd = Concentração de ácido siálico (NANA ou NGNA) no padrão (μM)
[0001529] A u = área de pico de ácido siálico (NANA ou NGNA) na amostra desconhecida
[0001530] A std = área de pico de ácido siálico (NANA ou NGNA) no padrão
[0001531] Proporção molar (M.R.) de ácido siálico (NANA ou NGNA) para proteína:
Figure img0159
Cálculo da Proporção molar total de ácido siálico para proteína (TSA):
[0001532] TSA = proporção de NANA molar + proporção molar de NGNA
[0001533] O desvio-padrão relativo para as contagens de área de dois padrões de NANA entre faixas deverá ser < 10%. O desvio-padrão relativo para as contagens de área de dois padrões de NGNA entre faixas deverá ser < 10%. O desvio-padrão relativo para as contagens de área de dois hidrolisatos independentes deverá ser < 10%.
[0001534] Em uma modalidade, a proporção molar média para ácidos siálicos na CTLA4A29YL104E-Ig deve estar dentro das faixas especificadas na tabela diretamente abaixo.
[0001535] Faixa de proporção molar de Material de CTLA4A29YL104E-Ig
Figure img0160
[0001536] O desvio % da proporção molar para ácidos siálicos no material de referência e amostras para as duas preparações de amostras deve ser < 15%, < 20%, < 25%, < 30% ou < 35%.
EXEMPLO 40: UM BIOENSAIO BASEADO EM CÉLULA IN-VITRO PARA CTLA4A29YL104E-Ig
[0001537] Células T requerem dois sinais para ativação e subsequente proliferação. O primeiro sinal é proporcionado através da interação de um peptídeo antigênico com o complexo TCR-CD3. O segundo sinal coestimulatório ocorre com a interação dentre CD29 sobre a célula T e a proteína B7 sobre a célula que apresenta antígeno. Quando de recebimento desses dois sinais, células T secretam a citocina Interleu- cina-2 (IL-2). Liberação de IL-2 leva à ativação e proliferação celular. CTLA4A29YL104E-Ig, um composto imunossupressivo solúvel, também se liga à proteína B7 sobre as células apresentando antígeno, assim, blo-queando a interação funcional com CD28 e impedindo o sinal coesti- mulatório que é necessário para a produção de IL-2.
[0001538] Nesse método, células T Jurkat transfectadas com o gene de luciferase, sob o controle de do promotor de IL-2, são coestimula- das com células B de Daudi na presença de anti-CD3. A coestimula- ção ativa o promotor de IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de luciferase. O sinal luminescente resultante é medido usando um Sistema de Ensaio de Luciferase. Nesse sistema, CTLA4A29YL104E-Ig produz uma diminuição dose-dependente na atividade de luciferase.
[0001539] Esse método examina o efeito de CTLA4A29YL104E-Ig sobre o sinal coestimulatório necessário para produção de IL-2. A presença de CTLA4A29YL104E-Ig solúvel impede a sinalização entre a célula T e células apresentando antígeno. Sem esse sinal, IL-2 não é produzida, assim, impedindo a expansão clonal de células T. Um vetor com o gene de luciferase foi criado usando o promotor de IL-2. As células T Jurkat foram, então, transfectadas com esse vetor repórter. Um clone positivo, Jurkat.CA, foi selecionado e usado no método.
[0001540] Esse bioensaio envolve estimulação de células T transfec- tadas (Jurkat.CA) com anti-CD3 e células B (Daudi). Coestimulação proporcionada pelas células B é inibida através da adição de CTLA4A29YL104E-Ig. As células Jurkat.CA e Daudi são cultivadas nas cavidades de uma lâmina com fundo plano, branca, opaca com 96 ca-vidades e estimuladas com anti-CD3 na presença de diferente concen-trações de CTLA4A29YL104E-Ig. Após uma incubação de 16 a 20 horas a 37°C, as cavidades são ensaiadas com relação à atividade de luciferase. Inibição de coestimulação através de CTLA4A29YL104E-Ig é observada como uma diminuição dose-dependente na atividade de luciferase.
[0001541] REAGENTES: Meio de cultura de células Daudi (soro fetal bovino a 10%, MEM piruvato de sódio a 1% em RPMI 1640); Meio de cultura de célula Jurkat.CA (soro de cabra a 10%, MEM piruvato de sódio a 1%, 400 μg/mL de geneticina em RPMI 1640); Meio de bioen- saio (0,2 μg/mL de anticorpo anti-CD3 e solução de penicilina- estreptomicina a 1% em Meio de cultura de células Daudi); solução Bright-Glo Luciferase do sistema de ensaio (Promega, Catálogo N° E2620).
[0001542] INSTRUMENTAÇÃO: Nikon, microscópio invertido Diaphot 200; Luminômetro Packard TopCount NXT; Manipulador de líquido Te- can Genesis; Contador de células Coulter Vi-Cell; Zymark RapidPlate- 96. Procedimento
Figure img0161
Figure img0162
[0001543] Preparação de Soluções de trabalho: 3 mL de soluções de CTLA4A29YL104E-Ig (5000 ng/mL) em meio de bioensaio.
[0001544] Meio de cultura de células Daudi. Adicionar 300 mL de RPMI 1640 a uma unidade de filtro Corning de 1 L. Então, adicionar 100 mL de soro bovino fetal e 10 mL de MEM piruvato de sódio. Adicionar RPMI 1640 o bastante para fazer 1 litro. Filtrar e armazenar a 4°C durante até um mês.
[0001545] Meio de cultura de célula Jurkat.CA. Adicionar 300 mL de RPMI 1640 a uma unidade de filtro Corning de 1 L. Então, adicionar 100 mL de soro de cabra, 10 mL de MEM piruvato de sódio e 8 mL de geneticina a 50 mg/mL (a concentração final é de 400 μg/mL). Adicionar RPMI 1640 o bastante para fazer 1 litro. Filtrar e armazenar a 4°C durante até um mês.
[0001546] Meio de bioensaio. Adicionar 100 mL de Meio de cultura de células Daudi (2,1) a 100 mL de frasco médio. Então, adicionar anticorpo anti-CD3 para uma concentração de 0,2 μg/mL e 1 mL de solução de penicilina-estreptomicina (1.11). Misturar gentilmente através de inversão e armazenar em temperatura ambiente durante não mais do que 8 horas.
[0001547] Solução de luciferase Bright-Glo. Preparar a solução, conforme descrito no sistema (1.21), através da adição de tampão de ensaio ao substrato luciferase e misturar através de inversão. O reagente deverá ser usado dentro de 2 horas ou armazenado a -20°C e protegido da luz durante até 4 semanas.
[0001548] Manutenção de Linhagem de células. Determinar o número de células por mL para as linhagens de célula Jurkat.CA e Daudi através de contagem com um contador de células. As células deverão estar entre 1 x 105 e 1,5 x 106 células/mL. Combinar 12 x 106 Células Jurkat.CA e 12 x 106 células Daudi em um tubo para centrífuga estéril. Centrifugar as células a ~125 x g durante 10 minutos em temperatura ambiente. Ressuspender totalmente as células em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi (2.1) repetidamente pipeteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que nenhum grumo de célula esteja visível, a fim de proporcionar uma concentração de 2,7 x106 célu- las/mL. Verificar a concentração de células através de contagem das células sobre um contador de células. Cultivar as células ressuspen- sas nas cavidades de uma lâmina com 96 cavidades (1.3) a 75 mL por cavidade (200.000 células por cavidade). Incubar a lâmina nos pontos de ajuste da incubadora de 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85% enquanto os padrões, controles de qualidade e amostras são preparados. Preparar concentrações nominais de CTLA4A29YL104E-Ig para os padrões, controles de qualidade e amostras 1 e 2. Preparar 3 mL de solução de trabalho de material de CTLA4A29YL104E-Ig a 5000 ng/mL em meio de bioensaio (2.3) para uso na Curva-padrão. Preparar 3 mL de solução de trabalho de material de CTLA4A29YL104E-Ig a 5000 ng/mL em meio de bioensaio (2.3) para uso na curva de controle de qualidade. Preparar 3 mL de cada uma das duas amostras de solução de trabalho de CTLA4A29YL104E-Ig a 5000 ng/mL em meio de bioensaio (2.3) para uso nas curvas de amostra. (Concentrações aproximadas para amos-tras de CTLA4A29YL104E-Ig podem ser usadas para preparar as curvas com 8 pontos e valores de potência relativa podem ser corrigidos conforme descrito em 5.5 quando a concentração determinada está disponível).
[0001549] Oito curvas de ponto foram preparadas para o padrão, controle de qualidade e amostras nas concentrações de 5000, 200, 100, 50, 25, 10, 5 e 0,1 ng/mL de CTLA4A29YL104E-Ig, conforme mostrado na Tabela 55 abaixo para as concentrações finais no ensaio, após diluição de duas vezes na lâmina, de 2500, 100, 50, 25, 12,5, 5, 2,5 e 0,05 ng/mL. Tabela 55. Diluições usadas para gerar curvas-padrão.
Figure img0163
[0001550] Dois mapas de lâmina podem ser usados. O mapa de lâmina aleatória requer o uso de um manipulador de líquido para ajuste. O mapa de lâmina ordenada tem triplicatas adjacentes e cada ponto de curva para os artigos de teste adicionados em um layout ordenado se- quêncial. Para o mapa de lâmina aleatória, adicionar 75 μL de cada solução (4.8) às cavidades apropriadas de uma lâmina contendo células (4.5) conforme mostrado no mapa de lâmina abaixo. Para o mapa de lâmina ordenada, adicionar 75 μL de cada solução (4.8) às cavidades apropriadas de duas lâminas contendo células (4.5) conforme mostrado no mapa de lâmina abaixo.
[0001551] Vedar a(s) lâmina(s) com TopSeal-A (1,22). Assegurar que a vedação está hermeticamente no lugar. Não deverão existir vãos de ar. Incubar a(s) lâmina(s) nos pontos de ajuste da incubadora de 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85% durante 16 a 20 horas. Equilibrar a(s) lâmina(s) e solução de luciferase Bright-Glo (2.4) para a temperatura do instrumento. Adicionar 150 μL de solução de luciferase Bright-Glo a cada cavidade simultaneamente e misturar. Colocar a lâmina no TopCount NXT imediatamente após mistura para equilibrar no escuro durante 10 minutos. Medir o sinal luminescente no TopCount NXT usando uma integração de 1 segundo por cavidade ou conforme apropriado ao tipo particular de luminômetro usado. O resultado do TopCount NXT é registrado. Quando usando o mapa de lâmina ordenada, duas lâminas serão lidas. A primeira lâmina (de pé) será lida com a cavidade A1 no canto à esquerda superior. A segunda lâmina (invertida) será lida com a cavidade A1 no canto à direita inferior. Ajuste de mapa de lâmina aleatória em Bioensaio:
Figure img0164
Stnd: Padrão d e uma concentração final de 2500 a C ,05 ng/m L mL na cavidade. QC: Controle de Qualidade de uma concentração final de 2500 a 0,05 ng/mL na cavidade. Smp1, Smp2: Amostras 1 a 2 de uma concentração final de 2500 a 0,05 ng/mL na cavidade. Ajuste do mapa de lâmina ordenada em bioensaio:
Figure img0165
Stnd: Padrão de uma concentração final de 2500 a 0,05 ng/mL mL na cavidade. QC: Controle de Qualidade de uma concentração final de 2500 a 0,05 ng/mL na cavidade. Smp1, Smp2: Amostras 1 a 2 de uma concentração final de 2500 a 0,05 ng/mL na cavidade.
[0001552] 200.000 células foram adicionadas por cavidade de uma lâmina com 96 cavidades e foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85%. 12 x 106 Células Jurkat.CA e 12 x 106 células Daudi foram combinadas em um tubo para centrífuga estéril. As células foram centrifugadas a ~125 x g durante 10 minutos em temperatura ambiente e foram totalmente re-suspensas em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi repetidamente pipeteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que mais nenhum grumo de célula fosse visível, a fim de proporcionar uma concentração de 2,7 x106 células/mL. 75 μL de cada solução da Tabela 55 foram adicionados às cavidades apropriadas de uma lâmina contendo células. A(s) lâmina(s) foi(ram), então, vedada(s) com TopSeal-A e incubada(s) a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85% durante 16 a 20 horas. Após as lâminas e solução de luciferase Bright-Glo terem sido equilibradas para a temperatura do instrumento, 150 μL de solução de luciferase Bright-Glo foram adicionados a cada cavidade simultaneamente e foram misturados. A lâmina é, então, colocada no TopCount NXT imediatamente após mistura para equilíbrio no escuro durante 10 minutos. O sinal luminescente foi, então, medido em um TopCount NXT usando uma integração de 1 segundo por cavidade ou conforme apropriado ao tipo particular de lumi- nômetro usado.
[0001553] O resultado do TopCount NXT foi registrado, lido em um programa de análise de padrão e os dados foram transformados tomando seu logaritmo (base 10). Os dados transformados de cada artigo foram adaptados a um modelo logístico com quatro parâmetros, conforme mostrado na equação abaixo: Equação 1:
Figure img0166
[0001554] onde:
[0001555] A é o platô superior da curva, D é o platô inferior da curva, B é o fator de declínio e C é a concentração que produz um efeito igual à média de A e D.
[0001556] Um F-teste R2 estatístico e com falta-de-adaptação pode ser calculado para cada artigo. Uma proporção do mínimo, máximo e declínio dos artigos de teste com relação ao material padrão pode também ser calculada. Além disso, intervalos de confiança para as proporções podem também ser computados.
[0001557] A potência relativa de cada artigo foi determinada através de adaptação de uma única equação aos dados do artigo de interesse combinados com os dados do artigo de referência.
Figure img0167
[0001558] onde:
[0001559] os parâmetros A, B e D são comuns à referência e artigo de teste e CR é o parâmetro referência, CA é o parâmetro artigo de teste e a proporção CR/CA é a potência relativa. O superscrito I é uma variável indicadora. Ele é ajustado em igual a 1 se os dados se originam do artigo de interesse e 0 se os dados se originam do material-padrão.
[0001560] A potência relativa de cada artigo de teste foi traduzida para uma escala percentual e a potência relativa foi fornecida como resultado do programa.
[0001561] Ajuste de valores de potência relativa Obtidos com concentrações aproximadas: Em virtude do "lag" de tempo entre re-cebimento da amostra e obtenção de uma concentração precisa de proteína, a amostra pode ser testada no ensaio em uma concentração aproximada e os resultados ajustados quando a concentração precisa é determinada. Esse ajuste é realizado usando a Equação 2 abaixo, onde a potência relativa determinada no ensaio é multiplicada pela proporção da concentração de CTLA4A29YL104E-Ig usada para ajustar o ensaio para a concentração de amostra de CTLA4A29YL104E-Ig determi-nada. Equação 2:
Figure img0168
Exemplo:
[0001562] Amostra foi testada em uma concentração de proteína de 25 mg/mL no ensaio.
[0001563] Potência relativa determinada foi de 105%.
[0001564] A concentração de CTLA4A29YL104E-Ig determinada foi esta-belecida como sendo de 25,5 mg/mL.
[0001565] Potência relativa reportável = (105 * 25) / 25,5 = 103%.
[0001566] Material-padrão: O valor de EC50 para o padrão do resultado deverá estar entre 5 e 35 ng/mL. A diferença entre as concentrações-padrão de 2500 ng/mL e 0,05 ng/mL (faixa) deverá ser >40.000 contagens por segundo (CPS). O valor de R-quadrado para a referência deverá ser mais de 0,95.
[0001567] Os valores de potência relativa do artigo de teste na Tabela 9 devem estar entre 25 e 175% do padrão de referência, o qual é a faixa do ensaio. Se os valores de potência relativa estão fora dessa faixa, então, a amostra deve ser diluída ou concentrada de forma a cair dentro dessa faixa e a amostra reanalisada.
Linhagem de células B Daudi:
[0001568] Fonte: Células Daudi foram obtidas da ATCC. Um banco mestre foi gerado, compreendido de 64 frascos. Um banco de trabalho foi criado a partir de um frasco de banco mestre após 4 passagens. (NOTA: Passagem 0 é considerada o descongelamento e, então, 3 passagens adicionais foram feitas antes de geração do banco de trabalho).
[0001569] Meios: Células Daudi são desenvolvidas em Meio RPMI 1640 (contendo HEPES e L-glutamina) suplementado com soro fetal bovino a 10% e piruvato de sódio a 1%.
[0001570] Condições da incubadora: Células são mantida em um T- frasco ventilado a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 70-90%.
[0001571] Protocolo de descongelamento: Um frasco de células é removido de um congelador de nitrogênio líquido e descongelado em um banho de água a 37°C. Os conteúdos são misturados com 10 mL de meio de cultura. As células são contadas e, então, coletada através de centrifugação a 125 x g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante é removido e as células são suspensas em meio fresco a 3 x 105 células viáveis/mL. As células são definidas como estando na passagem 0 nesse ponto.
[0001572] Propriedades de crescimento: A linhagem de célula cresce em suspensão.
[0001573] Subcultura: Culturas são mantidas através de passagem duas vezes por semana com não mais do que 5 dias entre passagens. As células são passadas em um T-frasco ventilado com meio fresco entre 0,5 x 105 e 2 x 105 células viáveis/mL. As células não deverão atingir uma densidade de mais de 1,5 x 106 células/mL. As células deverão ser mais de 80% viáveis, conforme avaliado através de coloração com azul de tripano. A data e número de passagens deverão ser rotulados sobre o T-frasco após passagem.
[0001574] Tempos de duplicação: O tempo de duplicação oscila de 18 a 26 horas.
[0001575] Limitações de passagem: As células de um banco de trabalho deverão ser passadas 3 vezes antes de uso no bioensaio, isto é, elas deverão estar na passagem 3 ou maior. As células deverão permanecer em cultura apenas durante 20 passagens. Um novo frasco de trabalho deverá ser descongelado de cada vez.
[0001576] Protocolo de congelamento: Células são congeladas de 5 a 10 x 106 células / mL em um criofrasco. Meio crioprotetor é preparado através de suplementação de meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO. As células são congeladas em uma taxa de 1°C/minuto até que elas atinjam a temperatura do nitrogênio líquido (~190°C).
Linhagem de célula T Jurkat.CA:
[0001577] Fonte: Células T Jurkat foram transfectadas com um plas- mídeo que codifica a molécula de CTLA4-Ig. Um banco de trabalho foi criado a partir de um frasco de banco mestre após 3 passagens. (NOTA: Passagem 0 é considerada o descongelamento e, então, 2 passagens adicionais foram feitas antes de geração do banco de trabalho).
[0001578] Meios: Células Jurkat.CA são desenvolvidas em Meio RPMI 1640 (contendo HEPES e L-glutamina suplementado com soro de cabra a 10% e piruvato de sódio a 1% suplementado com genetici- na (G418 sulfato) em uma concentração final de 400 μg/mL.
[0001579] Condições da incubadora: Células são mantida em um T- frasco ventilado a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 70-90%.
[0001580] Protocolo de descongelamento: A frasco de células é removido de um congelador de nitrogênio líquido e descongelado em um banho de água a 37°C. Os conteúdos são misturados com 10 mL de meio de cultura. As células são contadas e, então, coletadas através de centrifugação a 125 x g durante 10 minutos. Após centrifugação, o sobrenadante é removido e as células são suspensas em meio fresco a 3 x 105 células viáveis/mL. As células são definidas como estando na passagem 0 nesse ponto.
[0001581] Propriedades de crescimento: A linhagem de célula cresce em suspensão.
[0001582] Subcultura: Culturas são mantidas através de passagem duas vezes por semana com não mais do que 5 dias entre passagens. As células são passadas em um T-frasco ventilado com meio fresco entre 0,5 e 2 x 105 células viáveis/mL. As células não deverão atingir uma densidade de mais de 1,5 x 106 células/mL. As células deverão ser mais de 80% viáveis, conforme avaliado através de coloração com azul de tripano. A data e número de passagens deverão ser rotulados sobre o T-frasco após passagem.
[0001583] Tempos de duplicação: O tempo de duplicação oscila de 18 a 26 horas.
[0001584] Limitações de passagem: As células de um banco de trabalho deverão ser passadas 3 vezes antes de uso no bioensaio, isto é, elas deverão estar na passagem 3 ou maior. As células as células deverão permanecer em cultura apenas durante 20 passagens. Um novo frasco de trabalho deverá ser descongelado de cada vez.
[0001585] Protocolo de congelamento: Células são congeladas de 5 a 10 x 106 células/mL em um criofrasco. Meio crioprotetor é preparado através de suplementação de meio de cultura completo com 5% (v/v) de DMSO. As células são congeladas em uma taxa de 1°C/minuto até até que elas atinjam a temperatura do nitrogênio líquido (~190°C).
EXEMPLO 41: Determinação de Ligação bio-específica de CTLA4A29YL104E-Ig ao receptor de B7.1-Ig através de Ressonância de plasmônio em superfície (BIAcore)
[0001586] A ligação relativa de amostras de CTLA4A29YL104E-Ig ao re-ceptor de B7.1Ig foi medida através de ressonância de plasmônio em superfície usando o instrumento BIAcore. Nesse ensaio, CTLA4A29YL104E-Ig se liga a uma proteína de fusão de imunoglobulina B7.1Ig derivada da proteína da membrana celular de APC B7.1. Após imobilização do receptor de B7.1Ig em uma alta densidade sobre a superfície de um chip sensor ativado, material de CTLA4A29YL104E-Ig, con- troles de qualidade e amostras são diluídas para gerar sensorgramas de ligação. A taxa de ligação inicial (declínio)/Unidades de ressonância (RU) ligadas de CTLA4A29YL104E-Ig à superfície de B7.1Ig imobilizada é medida sob as condições de transferência de massa limitativa (difusão) sobre essa superfície de B7.1Ig de alta densidade. A taxa de ligação inicial em unidades de ressonância por segundo (RU’s) se correlaciona diretamente com a concentração bioativa. As taxas de ligação de amostras são calculadas em uma concentração ativa usando a curva- Padrão de Referência, onde a taxa de ligação de um material de CTLA4A29YL104E-Ig é plotada contra a concentração. Os resultados finais são expressos pela ligação percentual de amostra com relação ao material de CTLA4A29YL104E-Ig ou como a concentração.
[0001587] REAGENTES: Amine Coupling Kit BIA Certificado (o kit contém um frasco de cada: 115 mg de N-hidróxi-succinimida (NHS), 750 mg de N-etil-N’-(3-dimetila) (EDC) e etanolamina); Tampão de re-generação (citrato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH 4,0).
[0001588] INSTRUMENTAÇÃO: Instrumento BIAcore C com um computador PC compatível (BIAcore (Catálogo No.BR-1100-51)); sof-tware de controle BIAcore C versão 1.0.2; Software de avaliação BIA- core 1.0; lâmina de microtitulação com 96 cavidades para BIAcore com formato de U (Catálogo No. BR-1005-03); folhas vedantes para lâmina de microtitulação com 96 cavidades BIAcore (Catálogo No. BR-1005- 78). Esboço do Método:
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Figure img0170
Avaliar dados usando o "Wizard Results" do BIAcore C MATERIAIS
Figure img0171
REAGENTES
[0001589] Amine Coupling Kit BIA Certificado. O kit contém um frasco de cada: 115 mg de N-hidróxi-succinimida, 750 mg de N-etil-N’- (3-dimetila) e etanolamina. Transformar em alíquotas cada solução de acordo as orientações do fabricante e armazenar conforme indicado abaixo:
[0001590] Armazenar alíquotas de 11,5 mg/ml de N-hidróxi- succinimida (NHS) a -20°C. Essa alíquota congelada expira 2 meses a partir da data de preparo. Armazenar alíquotas de 75 mg/ml de clori- drato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) a -20°C. Essa alíquota congelada expira 2 meses a partir da data de preparo. Armazenar alíquotas de etanolamina-HCl a 1,0 M, pH de 8,5, a -20°C. Essa alíquota congelada expira 2 meses a partir da data de preparo.
[0001591] Tampão de regeneração (citrato de sódio a 10 mM, NaCl a 100 mM, pH de 4,0). Pesar analiticamente 1,5 ± 0,1 g de Citrato de sódio e 2,9 ± 0,1 g de NaCl. Adicionar 500 mL de água Milli-Q e ajustar o pH para 4,0 com HCl a 1 N. Filtrar a solução com um filtro de 0,22 μm, então, transformar em alíquotas de 500 mL em tubos cônicos de 45 mL/50 mL. A solução expira 6 meses a partir da data de preparo quando armazenada a 2-8°C. INSTRUMENTAÇÃO
Figure img0172
[0001592] PREPARO DE CHIP SENSOR. Inserir um novo Chip sensor CM5 no orifício de cassete sobre a unidade detectora do instrumento. Operar o sistema conforme descrito no Manual do BIAcore C usando Tampão de HBS-EP.
[0001593] OPERAÇÃO DO INSTRUMENTO BIAcore C PARA FUNÇÃO DE MÉTODO. O instrumento BIAcore C é controlado a partir de um computador PC compatível sob o ambiente Microsoft Windows com o software de controle BIAcore C. Refira-se às Instruções de Operação, "Operação do Instrumento BIAcore C" e "Calibração e Manutenção do Instrumento BIAcore C" para uso e manutenção do instrumento BIAcore C.
MÉTODO DE IMOBILIZAÇÃO DE B7.1Ig
[0001594] Preparo de B7.1Ig: Um frasco contendo B7.1Ig foi descon-gelado a 22,5 ± 5°C e diluído para uma concentração que imobiliza 3000-9000 RU, usando tampão de acetato a 10 mM, pH de 5,0 como diluente. Um frasco de EDC, NHS e Etanolamina foram, cada um, descongelados do Amine Coupling Kit conforme descrito. Frascos com reagente e ligante foram, então, colocados no suporte de amostra, conforme orientado pelo programa BIAcore e imobilização foi iniciada de acordo com as orientações do instrumento BIAcore.
PREPARO DE CURVA-PADRÃO DE CTLA4A29YL104E-Ig
[0001595] Padrões e amostras (tal como CTLA4A29YL104E-Ig, etc) foram descongelados em temperatura ambiente. Padrões usados para gerar uma curva-padrão foram diluídos para as concentrações-alvo da curva-padrão (250, 500, 1000, 2000, 4000 e 8000 ng/mL). Para a diluição de uma amostra de padrões (tal como um material de estoque de CTLA4A29YL104E-Ig) e a concentração sendo de 25 mg/mL, pode-se realizar as seguintes diluições: i. Diluir 1/50 (500 μg/mL) através da adição de 20 μL a 980 μL de HBS-EP ii. Diluir para 16 μg/mL através da adição de 30 μL de 500 μg/mL a 908 μL de HBS-EP iii. Diluir serialmente em 1/2 etapas (500 μL da diluição an-terior + 500 μL de HBS-EP) para 250 ng/mL
[0001596] Cada padrão pode ser analisado em injeções em duplicata que resultarão em 2 valores de declínio.
[0001597] AMOSTRAS DE CONTROLE DE QUALIDADE. As amostras de Controle de Qualidade (QC) de CTLA4A29YL104E-Ig são preparadas em Tampão de HBS-EP nos três níveis de concentração-alvo de 750, 2500 e 5000 ng/mL e são congeladas em frascos plásticos de 7 mm como alíquotas de 200 μL a -80°C. As concentrações de CTLA4A29YL104E-Ig nas amostras de QC são determinadas em três ex-perimentos de análise de concentração independentes usando esse método. Em cada experimento, todas as amostras de injeções de QC devem ser aceitáveis, detectando dentro de ± 20% das concentrações nominais. As amostras de QC qualificadas e congeladas expiram 6 meses após preparo. No dia de um experimento, descongelar um frasco de cada uma das três amostras de QC em temperatura ambiente. Colocar as amostras de QC nas posições do suporte de amostra con-forme descrito no wizard do método e analisar cada QC com injeções triplicatas. Alternativamente, QCs podem ser preparadas frescas no dia de análise.
[0001598] AMOSTRAS DE TESTE DE CTLA4A29YL104E-Ig. Amostras de CTLA4A29YL104E-Ig têm de ser diluídas para uma concentração dentro da faixa do ensaio (entre 750 e 5000 ng/mL). Amostras com uma concentração aproximada conhecida de CTLA4A29YL104E-Ig deverão ser diluídas para uma concentração-alvo de 2000 ng/mL. Após desconge-lamento das amostras em temperatura ambiente, elas são diluídas para uma concentração-alvo de 2000 ng/mL usando Tampão de HBS- EP. Diluições de amostra podem ser preparadas para análise em tubos de ensaio de polipropileno certificados para BIAcore ou uma lâmina de microtitulação com 96 cavidades. O seguinte é um exemplo para a diluição de uma amostra de teste de CTLA4A29YL104E-Ig:
[0001599] Após descongelamento das amostras em temperatura am-biente, amostras de CTLA4A29YL104E-Ig foram diluídas para uma con-centração dentro da faixa do ensaio (tal como entre 750 ng/ml e 5000 ng/mL). As amostras com concentração aproximada conhecida de CTLA4A29YL104E-Ig deverão ser diluídas para uma concentração-alvo de 2000 ng/mL usando Tampão de HBS-EP em tubos de ensaio de poli- propileno certificados para BIAcore ou uma lâmina de microtitulação com 96 cavidades.
[0001600] O seguinte é um exemplo para a diluição de uma amostra de CTLA4A29YL104E-Ig (concentração = 25,0 mg/mL): i. Diluir 1/50 (500 μg/mL) através da adição de 20 μL a 980 μL de HBS-EP ii. Diluir 1/25 (20 μg/mL) através da adição de 30 μL de 500 μg/mL a 720 μL de HBS-EP iii. Diluir 1/10 (2 μg/mL) através da adição de 100 μL de 20 μg/mL a 900 μL de HBS-EP
[0001601] Submeter a turbilhonamento em cada diluição na velocidade moderada durante 2-4 segundos. As amostras são preparadas em triplicata (três diluições independentes a partir da solução de amostra de estoque) e cada diluição é analisada com uma injeção. As amostras foram preparadas em triplicata (três diluições independentes a partir da solução de amostra de estoque) e cada diluição foi analisada com uma injeção.
[0001602] COMEÇANDO ANÁLISE USANDO O SOFTWARE BIA- CORE C: Abrir o software de controle BIAcore C e selecionar File- >Project->Published->8164-2 -> Concentration Analysis Wizard. Clicar em "Next" e selecionar um modelo publicado apropriado para a análise a ser realizada, por exemplo, "CTLA4A29YL104E-Ig Sample Concentration Analysis. blw". Inserir o número máximo de amostras para a análise planejada. Esse número de amostras inclui réplicas, então, por exemplo, para analisar 8 amostras em triplicata, o número 24 deverá ser inserido. Selecionar Célula de fluxo (1-4) sobre a qual o ligante B7.1Ig foi imobilizado. Clicar em "Next" e inserir ID da amostra, fatores de diluição e número de réplicas. Clicar em "Next" e verificar posições do frasco. Nesse ponto, as posições dos frascos podem ser movidas para os locais desejados. Clicar em "Next" e confirmar o set-up e escolhas para o ensaio na tela "Preparation for Analysis". Clicar em "Next" sobre a barra de rolagem. Colocar os padrões, QC’s, soluções de regenera- ção e amostras de teste nas posições apropriadas. Clicar em "Start" para começar a análise.
AVALIAÇÃO DE DADOS.
[0001603] Iniciar o software BIAcore C e abrir o arquivo BIAcore***.blr que foi gerado. Então, selecionar "Wizard Results" do menu "View"para avaliar os dados.
Valores exemplificativos para superfície de B7.1Ig
[0001604] A massa de B7.1Ig imobilizada sobre uma célula de fluxo inativada foi expressa como RU’s (unidades de ressonância). A massa de superfície deverá estar entre 3000 a 9000 RU’s para desempenho ótimo do ensaio. Se a massa de superfície não vai de encontro a esse valor exemplificativo, um ajuste do tempo de ativação (injeção de EDC/NHS) ou da concentração de B7.1Ig pode ser feito e outra célula de fluxo pode ser imobilizada. Valores exemplificativos para tendência de linha de base A tendência de linha de base de cada operação foi calculada como a alteração percentual da linha de base ("valores de resposta absolutos") entre cada ciclo com relação à massa de superfície imobilizada do li- gante. A maior alteração percentual entre qualquer dois ciclos da ope-ração deve ser < 5,0%. Por exemplo: se a linha de base no ciclo 20 = 13500 RU, linha de base no ciclo 23 = 13650 RU e densidade de su-perfície de B7.1Ig = 6000 RU, então, a tendência de linha de base = (13650-13500)/6000 x 100 = 2,5%.
Valores exemplificativos para os padrões
[0001605] Valores exemplificativos se aplicam às concentrações de Curva-padrão em ou acima de 500 ng/mL. O coeficiente de variação (CV %) dos valores em cada valor de declínio em cada concentração- padrão usada para determinar a curva-padrão devem estar dentro de ±10%. Os valores médios de concentração (ng/mL) em cada concentração-padrão devem estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal). A diferença entre a concentração calculada e o alvo (concentração nominal ) pode ser dividida pela concentração-alvo (nominal) e multiplicada por 100. Por exemplo, no padrão de 500 ng/mL, a concentração calculada no BIAcore C é de 510 ng/mL. O desvio % será calculado como segue : (510 ng / mL - 500 ng / mL ) / 500 ng/mL x 100% = 2,0%.
[0001606] Valores exemplificativos para amostras de QC: O CV % dos valores médios de concentração em triplicata para cada concentração-alvo de amostra de QC devem estar dentro de ±10%. Os resultados da amostra de QC devem estar dentro de ±15% de seus respectivos valores-alvo durante pelo menos sete das nove determinações de QC. A diferença nos valores de declínio entre a primeira e última injeção de QC ao nível de 2500 ng/mL devem estar dentro de ±5,0%. Por exemplo, o primeiro valor de declínio é de 10.366 RU/s e o último valor de declínio é 10.230 RU/s, a diferença percentual será como segue: (10,366-10,230 ) / 10,366 x 100% = 1,3%
Valores exemplificativos para amostras de teste
[0001607] O CV % das observações em triplicata obtidas para cada concentração-alvo de amostra de teste devem estar dentro de 20%. Os valores de declínio para a amostra devem estar na faixa do método: declínio médio na amostra de controle de qualidade 1 < declínio médio da amostra < declínio médio da amostra de controle de qualidade 3.
CÁLCULOS DE RESULTADOS PARA AMOSTRA
[0001608] Para determinar a ligação percentual da amostra de teste com relação ao material de CTLA4A29YL104E-Ig, um valor de concentração para cada amostra de teste é calculado a partir da Curva-padrão em ng/mL. O "Wizard Results" do instrumento BIAcore calcula a concentração de CTLA4A29YL104E-Ig na amostra não diluída em mg/mL, baseado no fator de diluição inserido para cada amostra.
[0001609] Determinação da ligação percentual: Um valor de con-centração média para cada amostra testada pode ser multiplicado por 100 e dividido pela concentração reportada de proteína da amostra conforme determinado através da absorbância medida a 280 nm (A280). O valor pode, então, ser reportado ao número inteiro mais próximo como ligação percentual com relação à amostras-padrão. Por exemplo, a amostra foi diluída em um fator de diluição de 12.500 (concentração de amostra de proteína de aproximadamente 25 mg/mL). A concentração média de CTLA4A29YL104E-Ig das injeções em triplicata da amostra é de 25,3 mg/mL. A A280 para a amostra é de 24,2 mg/mL. A ligação percentual calculada com relação à amostras-padrão pode ser como segue : 25,3 mg/mL / 24,2 mg/mL x 100% = 104,545 %. Modelo do Wizard de imobilização de CTLA4A29YL104E-Ig Parâmetros de injeção de imobilização
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Pontos reportados de imobilização
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continuação
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Exemplo 42: Corre ações Entre dados analíticos de Carboidrato de CTLA4-Ig e dados farmacocinéticos
[0001610] As estruturas de carboidrato sobre CTLA4-Ig mostram um papel importante na farmacocinética (PK) da composição terapêutica de CTLA4-Ig. Vários métodos analíticos foram desenvolvidos para ca- racterizar essas estruturas de carboidrato. Dois parâmetros analíticos se correlacionam bem com as taxas de clearance: a proporção de ácido siálico (NANA) para proteína de CTLA4-Ig e o percentual de Domínios III e IV do perfil de carboidrato. Um terceiro parâmetro (a proporção de galactose para manose a partir de análise de monossacarídeo) também parece se correlacionar bem. Por exemplo, as especificações para esses parâmetros podem ser: Proporção de NANA:proteína de CTLA4-Ig: > 8,0 Perfil de carboidrato: Domínios III e IV > 25% (Método 1) Proporção de Galactose: Manose > 0,65
[0001611] Uma etapa importante no processo de fermentação de CTLA4-Ig pode ser a seleção de parâmetros de coleta que maximizará o rendimento (titulação) do produto final compreendendo características especificadas aqui (veja Tabela 6). Um dos parâmetros (proporção de NANA: proteína) é suficientemente rápido e preciso para ser usado como um dos parâmetros de coleta. Uma proporção molar-alvo de NANA para proteína de CTLA4-Ig de cerca de 8,0 pode assegurar que a maioria da coleta terá uma proporção de NANA >7,0. Intensificações durante purificação podem, subsequentemente, produzir moléculas de CTLA4-Ig com uma proporção de NANA >9,0.
[0001612] CTLA4-Ig é uma glicoproteína com vários sítios de glicosi- lação N-ligada e O-ligada. As estruturas de carboidrato N-ligadas são, tipicamente, bi- ou triantenárias e, se totalmente sialiladas, terminam com os carboidratos NANA-Gal-GlcNAc. A maioria das moléculas são apenas parcialmente sialiladas e contêm algumas cadeias de carboidrato terminando com Gal ou GlcNAc. A ausência de resíduos de ácido siálico terminais (NANA) é um fator que leva à taxas de exposição aumentadas da corrente sanguínea. Nesse Exemplo, são apresentados dados indicando que a galactose terminal também proporciona alguma proteção contra clearance rápida.
[0001613] Um parâmetro primário usado para avaliar glicosilação é a proporção molar de NANA: proteína de CTLA4-Ig. Estudos de PK de macaco tinham mostrado que clearance aceitável poderia ser obtida usando moléculas de CTLA4-Ig com uma proporção de NANA de 6,9. O primeiro Lote de Material de Processo Y de CTLA4-Ig (composição de CTLA4-Ig obtida do Processo Y) testado em macacos tinha uma proporção de NANA de 7,1. Surpreendentemente, descobriu-se que ele era eliminado duas vezes tão rapidamente quanto o material de CTLA4-Ig com uma proporção de NANA de 6,9. Uma revisão da análise de monossacarídeo das duas amostras indicou que o Material do Processo X tinha significativamente mais galactose do que o Processo com material de CD-CHO. Um processo foi desenvolvido, o qual incluía galactose na alimentação (CD-CHO1). A CTLA4-Ig produzida através desse Processo tinha níveis de galactose e ácido siálico maiores do que o material do Processo Y. Os dados analíticos e de PK para material do Processo com CD-CHO1 são discutidos abaixo e comparados com o material do Processo Y e do Processo X.
Métodos analíticos
[0001614] O ensaio de perfil de carboidrato consiste na remoção en- zimática das estruturas de carboidrato inteiras e sua separação através de cromatografia de troca de ânions. Os picos de carboidrato se decompõem em quatro ou cinco agrupamentos ("domínios") baseado grandemente no número de resíduos de ácido siálico em cada estrutura. O Domínio I é grandemente asialilado, o Domínio II é monossialila- do, o Domínio III é dissialilado, o Domínio IV é trissialilado e o Domínio V é tetrassialilado. A área sob cada pico ou o Domínio pode ser determinado e reportada como um percentual da área total sob todos os picos.
[0001615] A taxa de clearance foi determinada através de injeção em triplicata em macacos de 10 mg/kg de CTLA4-Ig, então, acompanhan- do a diminuição da concentração no soro durante um período de 28 dias. A taxa de clearance está relacionada à "área sob a curva" medida ou AUC. A AUC está relacionada à clearance, uma maior taxa de clearance está relacionada a uma menor AUC e uma menor taxa de clearance a um maior valor de AUC. Valores maiores representam clearance mais lenta de CTLA4-Ig.
[0001616] A figura 50 representa várias das muitas estruturas de car-boidrato N-ligado encontradas em proteínas de mamífero. Todas as cadeias compartilham uma estrutura central em comum contendo dois resíduos de GlcNAc e três de manose. A partir desse núcleo, duas a quatro cadeias se estendem, consistindo em uma de três estruturas: - GlcNAc-Gal-NANA, -GlcNAc-Gal ou -GlcNAc (FIG. 50, estruturas (1), (2) e (3)). Admite-se que o ácido siálico terminal (NANA) é responsável pela redução da clearance da proteína da corrente sanguínea. Foi uma surpresa verificar que a taxa de clearance de CTLA4-Ig duplicou em um estudo de PK de macaco (Tabela 56), mesmo embora a proporção de NANA permanecesse a mesma (Tabela 56 - amostras CTLA4-Ig S1 e CTLA4-Ig (-) Gal, respectivamente, na figuras 51-52). Uma diferença observada entre as amostras, preparadas em diferentes meios, foi a proporção de galactose-para-proteína, a qual era significativamente maior na amostra preparada através do processo X do que através do processo Y (CTLA4-Ig). Isso sugeriu que a taxa de clearance foi prima-riamente determinada pelos resíduos de GlcNAc terminais e que a ga-lactose terminal poderia proporcionar alguma proteção. Para aumentar a galactosilação de CTLA4-Ig, galactose foi adicionada à alimentação para o Processo Y. O novo Processo (CD-CHO1; CTLA4-Ig S2 na FIGS 51-52) aumentou significativamente a galactose e proporções molares de NANA da CTLA4-Ig no biorreatores.
[0001617] Outros estudos de PK de macaco foram realizados. Esses incluíram produto de CTLA4-Ig produzido através dos três diferente processes (Processo X, Processo Y e o Processo com CD-CHO1; CTLA4-Ig S1, CTLA4-Ig (-) Gal e CTLA4-Ig S2, respectivamente na figuras 51-52). Além disso, CTLA4-Ig com uma proporção muito baixa de NANA (recuperada de uma etapa de lavagem no procedimento de purificação; veja figura 62) foi testada. Os dados analíticos e de P de todas as amostras testadas até o momento são compilados na Tabela 56. No estudo de PK mais recente (Tabela 56), CTLA4-Ig produzida a partir de uma operação de fermentação pelo Processo Y prolongado (CTLA4-Ig S3) foi avaliada.
[0001618] A figura 51 mostra a correlação entre a proporção de NANA e os valores de AUC em PK de macaco para todas as amostras nos quatro estudos. As amostras preparadas através do Processo Y (veja CTLA4-Ig (-) Gal na figura 51) e do Processo com CD-CHO1 (CTLA4- Ig S2 na figura 51) mostraram uma forte correlação entre esses parâmetros, indicando que a proporção de NANA tem um impacto significativo sobre ataxa de clearance de CTLA4Ig. Análise da tendência para esses pontos indica que, em NANA = 9, CTLA4-Ig preparada através do Processo Y (CTLA4-Ig (-) Gal) ou CD-CHO1 (CTLA4-Ig S2) será eliminada em cerca da mesma taxa que o material de Processo X CTLA4-Ig S1). Redução da proporção de NANA para 8 reduz a AUC no PK de macaco em de cerca de 25%, enquanto que aumento da proporção para 10 aumenta a AUC em cerca de 25%. Embora haja uma forte correlação entre NANA e AUC dentro do contexto dos Processos Y (CTLA4-Ig (-) Gal) e CD-CHO1 (CTLA4-Ig S2), é importante lembrar que NANA = 7 para material X (CTLA4-Ig S1) com a mesma taxa de clearance que o material CD-CHO1 (CTLA4-Ig S2) com uma proporção de NANA de 9. Portanto, a proporção de NANA não é unicamente responsável pela determinação da taxa de clearance de CTLA4-Ig.
[0001619] Tabela 56. Avaliação de Carboidrato de CTLA4-Ig. M-1 in- dica que o Material de CTLA4-Ig foi analisado usando o Método 1, M-2 indica que o Material de CTLA4-Ig foi analisado usando um método ligeiramente diferente, Método 2, "PA" indica que o material que é uma amostra purificada em proteína A do caldo de fermentação.
Figure img0176
Figure img0177
Figure img0178
[0001620] Outro estudo de PK de macaco (Tabela 56) foi realizado para comparar as taxas de clearance de CTLA4Ig produzida através dos três diferentes processos (Processo X, Processo Y e Processo com CD-CHO1). Além disso, CTLA4Ig com uma proporção muito baixa de NANA (recuperada de uma etapa de lavagem no procedimento de purificação (PA)) foi incluída no estudo. CTLA4Ig preparada através do Processo com CD-CHO em biorreatores de 50L ou 5000L tinha proporções molares de NANA próximas do Material do Processo X e, no estudo de PK, ambos tinham valores de AUC de cerca de metade o valor do processo X. CTLA4Ig produzida através do Processo com CD-CHO1 tinha uma maior proporção de NANA do que o material de Processo X (9,9 vs. 6,9) e um valor de AUC cerca de 30% maior, indicando uma taxa de clearance mais lenta. O material de lavagem pobremente sialilado e galactosilado (NANA = 2,3) foi eliminado extremamente rápido (AUC = 2337 hora-μg/ml vs. 15753 para o material de Processo X).
[0001621] Outro estudo de PK de macaco (Tabela 56) comparou CTLA4Ig preparada através do Processo com CD-CHO1 em biorreato- res de 5.000 L e coletada em diferentes dias. Durante o curso da operação de fermentação, a proporção de NANA, tipicamente, picos em torno do Dia 8, então, declina gradualmente. A partir de duas operações, alíquotas foram removidos nos Dias 12, 14 e 16, então, purificadas. Após purificação, as proporções de NANA oscilavam de 8,8 a 10,0. Nos Dias 12 e 14, amostras (NANA = 9,8 e 10,0 respectivamente) tinham valores de AUC 20-30% maiores do que o material de Processo X. No Dia 16, a amostra (NANA = 8,8) tinha um valor de AUC quase idêntico ao material de Processo X.
[0001622] Outra ferramenta analítica para avaliar a glicosilação de CTLA4-Ig é o perfil de carboidrato. Estruturas de carboidrato N-ligado inteiras são enzimaticamente removidas e separadas através de HPLC de troca de ânions. Um grande número de picos são gerados, os quais se decompõem em quatro ou cinco domínios (veja figuras 58-62). Os Domínios I e II são estruturas grandemente asialiladas e monossialila- das, enquanto que os Domínios III e IV e V são estruturas grandemen- te di- e tri- e tetrassialiladas.
[0001623] Foi empiricamente observado que o percentual do perfil total nos Domínios III e IV se correlacionava bem com a AUC para todas as amostras, incluindo o material de Processo X (FIG. 52). Espera-se que a maioria das estruturas nesses domínios sejam totalmente siali- ladas e galactosiladas. Usando dados do grupo M-1, um percentual de Domínio III e IV de cerca de 29% deverá ter a mesma taxa de clearance conforme o material de Processo X. Os dados dos Domínios III e IV a partir do Método 2 são, tipicamente, cerca de 4% menores (21% vs. 25%) do que os dados gerados através do Método 1.
[0001624] Além disso, também foi observado que o percentual do perfil total no Domínios I e II se correlacionava bem com a AUC para todas as amostras (FIG. 57). Espera-se que a maioria das estruturas nesses domínios sejam estruturas grandemente asialiladas e monos- sialiladas. A figura 57 mostra que a taxa de clearance foi maior nas amostras com um menor percentual dos Domínios I e II versus aquelas amostras com um maior percentual dos Domínios I e II. A glicosila- ção diminuída dos Domínios I e II se correlaciona com a presença presumivelmente aumentada de peptídeos glicosilados no Domínios III e IV.
[0001625] Embora a proporção molar de ácido siálico para proteína tenha sido tradicionalmente usada para prever a taxa de clearance para CTLA4Ig, diferentes meios de fermentação têm produzido moléculas com a mesma proporção de NANA, mas diferentes taxas de clearance em estudos de PK de macaco. Para desenvolver uma melhor forma de prever as taxas de clearance, dois outros conjuntos de dados analíticos (análise de monossacarídeo e perfil de carboidrato) foram avaliados e comparados com dados de PK de macaco. O parâmetro analítico mais previsível foi a extensão de galactosilação de CTLA4Ig. Para reduzir a variabilidade analítica desse ensaio, a proporção molar de galactose foi normalizada para a proporção molar de manose. A proporção de Gal:Man resultante se correlacionava bem com os resultados de AUC do estudo de PK de macaco para todas as amostras, incluindo o material de Processo X. Esse resultado é consistente com um modelo em que a taxa de clearance de CTLA4Ig é primariamente determinada pelo número de resíduos de GlcNAc terminais expostos sobre a molécula. Se esse modelo está correto, a extensão de galac- tosilação poderia prever as taxas de clearance melhor do que a sialila- ção. Para assegurar que comparabilidade farmacocinética (AUC > 75% de material do Processo X), uma especificação para uma proporção de galactose para manose de Gal: Man > 0,65 é recomendada para Substância de Fármaco de CTLA4-Ig bruta purificada (BDS).
[0001626] Quando apenas material preparado através do Processo Y ou Processo com CD-CHO1 é analisado, a proporção molar de NANA para proteína pode prever as taxas de clearance precisamente. Essa relação não se aplica, contudo, ao material preparado através do Processo X. Para ser comparável ao Material do Processo X, CTLA4-Ig preparada através do Processo Y ou do Processo com CD-CHO1 deve ter uma proporção de NANA 2 unidades maior (NANA = 9 para CD- CHO1 é comparável com NANA = 7 para o Material do Processo X). Em virtude do fato de o ensaio de ácido siálico ser preciso e ter um rápido tempo de operação, ele é útil como uma ferramenta analítica em-Processo para monitorar a qualidade da CTLA4Ig durante a operação de fermentação.
[0001627] Para manter farmacocinética comparável (AUC > 75% da referência), uma especificação de NANA > 8 é recomendada para BDS purificada. Esse valor também representa um alvo razoável para coleta das operações de fermentação. Em virtude do fato de o processo de purificação aumentar a proporção de ácido siálico em pelo menos 2 unidades, ajuste do alvo de coleta em NANA = 8 assegurará um valor de coleta real de pelo menos NANA = 7. O processo de purificação aumenta esse valor para pelo menos NANA = 9, o qual é comparável com o material de Processo X e bem acima da especificação mínima recomendada antes mencionada da BDS.
[0001628] O perfil de carboidrato também preveu os resultados de PK de macaco para Material de Processo X e Material de Processo Y quando a área percentual sob os Domínios III e IV foi comparada com a AUC. Os Domínios III e IV consistem grandemente em estruturas de carboidrato totalmente sialiladas e galactosiladas.
[0001629] Os dados na Tabela 56 podem ser ainda apresentados de modo a mostrar uma correlação entre um valor de AUC, o valor de NANA, o valor de Gal e o percentual total da soma da AUC dos Domí- nios II e IV. Veja abaixo:
Figure img0179
[0001630] Essa tabela acima mostra que há uma correlação entre a soma dos Domínios III (e IV) e os resultados de PK da composição. A AUC dos Domínios III e IV e V são diretamente relacionadas à proporção molar de NANA e Gal para mols de proteína de CTLA4-Ig. Portanto, a invenção proporciona composições caracterizadas pelo fato de que seu perfil de carboidrato contém a soma dos Domínios III e IV ou a soma dos Domínios III, IV e V de 18 a cerca de 37 AUC %. Em uma modalidade, a soma dos Domínios II, IV e V é cerca de 19 a cerca de 36, é cerca de 20 a cerca de 35, é cerca de 21 a cerca de 34, é cerca de 22 a cerca de 33, é cerca de 23 a cerca de 32, é cerca de 24 a cerca de 31, é cerca de 25 a cerca de 30, é cerca de 26 a cerca de 29, é cerca de 27 a cerca de 28 AUC %. Em uma modalidade, a invenção proporciona Composições de CTLA4-Ig caracterizadas pelo fato de que o Domínio III tem uma AUC % do total de 19 ± 4; e o Domínio IV tem uma AUC % do total de 7 ± 4.
Exemplo 43: Mapeamento tríptico de peptídeo de CTLA4-Ig
[0001631] CTLA4-Ig derivada de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) transfectadas é uma glicoproteína com uma massa molecular de aproximadamente 92500 Dáltons. Mapeamento peptídico é um método altamente sensível para determinação da identidade da estrutura primária de uma proteína e é útil na detecção de modificações pós- traducionais. A proteína é desnaturada usando guanidina-HCl, reduzida e alquilada usando DTT e IAA. A proteína é dessalinizada usando colunas NAP-5 e a mistura digerida é analisada através de cromato- grafia de fase reversa (C18). Detecção de pico é feita através de ab- sorbância de UV a 215 nm.
[0001632] REAGENTES: Solução de Fase móvel A (ácido trifluoroa- cético a 0,02 % (TFA) em Água (v/v)); solução de Fase móvel B (TFA a 0,02% em ACN a 95% (Acetonitrila) e 5 % de água (v/v)); agente de alquilação (iodoacetamida a 200 mM (IAA)); Tampão de diluição (TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 8,0); Tampão de desnaturação (gua- nidina a 8 M, TRIS a 50 mM, pH de 8,0); Tampão de Digestão (TRIS a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 8,0); Agente de Redução (DTT a 100 mM).
[0001633] INSTRUMENTAÇÃO: (instrumentação equivalente pode ser usada) colunas NAP-5 (Amersham, cat. N° 17-0853-02); Aquecedor para coluna de HPLC; Waters System Alliance HPLC com aquecedor de coluna e detector de UV.
[0001634] Redução e Alquilação: Amostras (por exemplo, CTLA4A29YL104E-Ig, padrões, etc.) foram diluídas para 10 mg/ml através da adição de água para um volume final de 100 μL (1 mg). 560 μl de tampão de desnaturação e 35 μL de Agente de Redução (DTT a 100 mM) foram adicionados à amostras de 100 μl, misturados e centrifugados em uma microcentrífuga durante 3 segundos. As amostras foram, então, incubadas a 50°C durante 20 minutos ± 2 minutos. 35 μL de agente de alquilação (IAA a 200 mM) foram, então, adicionados a cada amostra e novamente as amostras foram misturadas e centrifugadas em uma microcentrífuga durante 3 segundos. As amostras foram subsequentemente incubadas a 50°C durante 20 min. ± 2 minutos, no escuro. Após as colunas NAP-5 terem sido equilibradas entornando 3 volumes de coluna (cerca de 7-8 mL) de Tampão de Digestão, 500 μl das misturas reduzidas e alquiladas foram entornadas sobre as colunas NAP-5, permitindo que o líquido drenasse através da coluna. As amostras foram, então, coletadas das colunas NAP-5 via eluição da amostra da coluna com 1 mL de Tampão de Digestão.
[0001635] Digestão: Amostras foram digeridas com 20 μL de tripsina (0,5 μg/μL) em um banho de água a 38°C durante 4 horas (+ 0,5 hora). Quando de término da digestão, as amostras foram acidificada com 2,5 μL de TFA. As amostras foram, então, colocadas em frascos para amostrador automático para subsequente análise. Método de Instrumento: O método do instrumento é mostrado abaixo:
Figure img0180
[0001636] A coluna foi equilibrada com 100% tampão de fase móvel A durante 25 minutos antes das primeiras injeções. A absorbância de UV foi monitorada a 215 nm enquanto a temperatura da coluna foi mantida a 37°C e a temperatura do amostrador automático a 4°C. Placebo de tampão de fase móvel A foi operado antes do primeiro Padrão de Ade- quabilidade de Sistema, seguido por uma única injeção de 50 μL de cada amostra. Uma injeção de Material de Referência deverá estar entre faixas a cada seis injeções de amostra. O cromatograma por mapeamento peptídico gerado para uma amostra de CTLA4-Ig é representado pela figura 53. As diferenças de tempo de retenção para os picos T2, T3, T15 e T19 (figura 53 e Tabela 57) entre os cromatogra- mas de Material de Referência inicial e entre faixas devem ser ±0,5 min. Tabela 57. Fragmentos teoricamente esperados de CTLA4-Ig Digerida com Tripsina
Figure img0181
Figure img0182
* Contém carboidrato N Ligado ** Contém carboidrato O Ligado
[0001637] Número de placas teóricas: Eficiência de coluna, avaliada como o número de placas teóricas, pode ser medida quantitativamente usando o tempo de retenção e a largura de pico de acordo com a Equação:
Figure img0183
[0001638] onde:
[0001639] "w" é a largura de pico na linha de base medida através de extrapolação dos lados relativamente retos para a linha de base, "t" é o tempo de retenção do pico medida a partir do momento de injeção até o momento de eluição do pico máximo.
[0001640] Se N <50000, re-equilibrar a coluna.
[0001641] Resolução: A resolução (R) entre 2 picos, por exemplo, pico T30 e pico T12 conforme indicado na figura 53, pode ser determinada usando a seguinte equação:
Figure img0184
[0001642] onde:
[0001643] t1, t2=tempos de retenção de pico dos fragmentos T30 e pico T12, respectivamente
[0001644] w1, w2=largura de pico tangente-definida na linha de base dos picos com tempos de retenção t1 e t2, respectivamente.
[0001645] Se R < 1,5, a coluna deverá ser re-equilibrada e se o problema persiste, a coluna deverá ser substituída.
Valores exemplificativos:
[0001646] A diferença entre as áreas de pico relativas para os picos T3, T15 e T19 no artigo de teste e Material de Referência deve ser <10,0%. A Área de pico relativa de um pico é definida como a área de pico expressa como um percentual da área de pico de pico T2. A diferença entre as áreas de pico relativas do artigo de teste e a referência de Adequabilidade de sistema inicial é obtida conforme mostrado abaixo. A Área de pico relativa (RSX) pode ser calculada para cada um dos picos T3, T15 e T19 no cromatograma do artigo de teste usando a fórmula: RSX = (AsX/AS2)*100
[0001647] onde:
[0001648] RSX = Área de pico relativa do pico X no cromatograma
[0001649] ASX = área de pico X na amostra e
[0001650] AS2 = área de pico T2 na amostra.
[0001651] Similarmente, as áreas de pico relativas (RRX) podem ser calculadas para cada um dos picos T3, T15 e T19 no cromatograma- padrão. A diferença entre as áreas de pico relativas na amostra e no padrão (DX) pode subsequentemente calculada usando a fórmula: DX = [(RSX - RRX)/ (RRX)]*100
[0001652] Se um único pico adicional está presente na amostra, a altura de pico relativa para esse pico, quando comparado com pico T11, pode ser determinada através de uso da seguinte fórmula:
[0001653] Altura de pico relativa RT = (HT/H11)*100 onde
[0001654] HT = altura do pico com tempo de retenção t min
[0001655] H11 = altura de pico T11, o pico mais alto no cromatograma.
[0001656] Em uma modalidade, se a altura de pico relativa do novo pico é <5,0%, então, o perfil é considerado como sendo consistente com o perfil de padrão de CTLA4-Ig. Se a altura de pico relativa do novo pico é >5,0%, então, o perfil é considerado como sendo consistente com o perfil do material-padrão de CTAL4-Ig.
[0001657] Os dados de oxidação percentual foram adquiridos usando um ensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxidação percentual de Met85 na proteína para sulfóxido de metio- nina. Oxidação percentual no método é obtida através de medição por UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP-HPLC para o peptídeo tríptico T6, compreendido dos resíduos 84-93 contendo Met85 e o peptídeo tríptico oxidado correspondente, T6ox, contendo Met(O)85. A área de oxidação percentual de Met85 em Met(O)85 é proporcional à área percentual do pico de T6ox: Oxidação percentual = 100 *AT6ox/ (AT6ox + AT6)
[0001658] onde,
[0001659] AT6 = área de pico para peptídeo tríptico T6, (84-93).
[0001660] AT6ox = área de pico para peptídeo tríptico T6ox, Met(O)85(84-93).
[0001661] Os dados de deamidação percentual foi adquiridos usando um ensaio de mapeamento tríptico por RP-HPLC que quantifica a área de oxidação percentual de deamidação no ensaio são obtidos através de medição por UV das áreas de pico no mapeamento tríptico por RP- HPLC para o peptídeo tríptico T26, compreendido dos resíduos 281302 contendo Asn294 e do peptídeo tríptico desamidado correspondente, T26deam1, contendo isoAsp294. A área percentual de deami- dação de Asn294 para isoAsp294, então, é proporcional à área percentual do pico de T26deam1:
Figure img0185
[0001662] onde,
[0001663] AT26 = área de pico para T26, (281-302)
[0001664] AT26deam1 = área de pico para T26deam1, isoAsp294(281- 302).
[0001665] AT26deam2 = área de pico para T26deam2, Asp299(281-302).
[0001666] AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302).
[0001667] AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302).
EXEMPLO 44: Definição de perfil de carboidrato N-ligado de oli- gossacarídeo de CTLA4-Ig através de cromatografia de troca de ânions de elevado desempenho com Detecção eletroquímica
[0001668] As estruturas de carboidrato presentes sobre glicoproteínas podem afetar sua função e clearance in vivo. Portanto, é importante monitorar a consistência estrutural dos carboidratos de bateladas re- combinantemente produzidos de glicoproteínas. CTLA4-Ig é uma proteína recombinante contendo sítios de glicosilação N Ligados e O Ligados (serina Ligados). Aqui, carboidratos N Ligados (asparagina- ligados) presentes sobre CTLA4-Ig são monitorados. Nesse método, oligossacarídeos são clivados através de digestão enzimática com PNGase F (Peptídeo: N-Glicosidase F), então, isolados através de HPLC de fase reversa em um sistema com duas colunas, separados através de cromatografia de troca de ânions de elevado desempenho (HPAEC) e monitorados através de detecção eletroquímica (ampero- metria integrada). O cromatograma gerado é o perfil de carboidrato N Ligado, em que perfis de amostras de CTLA4-Ig deverão ser similar ao mesmo.
[0001669] Esse método descreve o procedimento para determinar o perfil de oligossacarídeo por HPAEC dos oligossacarídeos N Ligados liberados das amostras de CTLA4-Ig. A finalidade do método é proporcionar perfis cromatográficos de oligossacarídeos N Ligados de Substância de Fármaco de CTLA4-Ig, o qual pode ser usado para análise comparativa. A glicosilação sobre a CTLA4-Ig contém oligossacarí- deos N Ligados. Esses oligossacarídeos são liberados através de hidrólise enzimática com PNGase F durante o curso de 22 horas. O perfil dos oligossacarídeos livres é obtido usando cromatografia de troca de ânions em pH elevado empregando detecção eletroquímica. Perfis de oligossacarídeo de Substância de Fármaco são avaliados contra amostras de Material de Referência concorrentemente operadas. Os resultados são reportados como desvio percentual de domínios e picos selecionados dos mesmos picos nos padrões de referência.
Figure img0186
MATERIAIS. Materiais equivalentes podem ser substituídos, a menos que de outro modo especificado.
Figure img0187
INSTRUMENTAÇÃO E CONDIÇÕES. Instrumentação equivalente pode ser usada, a menos que de outro modo especificado. Instrumentação:
Figure img0188
[0001670] Condições de cromatografia para perfil de oligossacarídeo através de cromatografia de troca de íons.
Figure img0189
Figure img0190
NOTA: Equilibrar a coluna e detector com a fase móvel inicial na taxa de fluxo de análise durante aproximadamente 2 horas ou até a linha de base estar estável antes de fazer injeções.
Figure img0191
[0001671] Limpeza de eletrodo (Waters 2465). Seguir as instruções de limpeza no manual do detector. Usar a pasta fluida diamante fornecida no kit da célula de fluxo para polir a superfície do(s) eletrodo(s). Se polimento não proporciona resultados aceitáveis, substituir os eletrodos por um novo kit de célula de fluxo. Remonta a célula de fluxo usando um novo espaçador (50 μm).
REAGENTES
[0001672] NOTA: Rotular e documentar todos os preparados de reagente de acordo com os procedimentos do departamento.
[0001673] Preparo de Fases móveis para definição de perfil de carboidrato de oligossacarídeo por HPAEC.
[0001674] Eluente 1 de HPAEC: acetato de sódio a 500 mM (NaO- Ac). Pesar 20,51 ± 0,05 g de Acetato de sódio (anídrico) em um cilindro graduado de 500 mL contendo 400 mL de água com grau para HPLC. Levar o volume para 500 mL com água com grau para HPLC e agitar durante 5 minutos usando uma pipeta sorológica de plástico até completamente misturado. Filtrar a solução através de a 0,2 μm nylon filtro. Transferir para uma garrafa de eluente de 1 L. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[0001675] Eluente 2 de HPAEC: hidróxido de sódio a 400 mM (Na- OH). Usando um cilindro graduado de 1 L, medir 960 mL de água com grau para HPLC e transferir para uma garrafa de eluente de 1 L limpa. Usando uma pipeta sorológica de plástico, adicionar 40,0 mL de NaOH a 10 N diretamente na garrafa de eluente e misturar o eluente através de turbilhonamento. Tampar a garrafa frouxamente e purgar com hélio durante 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[0001676] Eluente 3 de HPAEC: água com grau para HPLC. Encher uma garrafa de eluente de 1 L com aproximadamente 1 L de água com grau para HPLC. Colocar a garrafa de eluente sobre o sistema, tampar frouxamente e purgar durante aproximadamente 20 minutos. Apertar a tampa e pressurizar a garrafa com hélio. Armazenar a solução em temperatura ambiente sob hélio durante até três semanas.
[0001677] Tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5. Azida de sódio (NaN3) deverá ser manipulada com cuidado para evitar inalação (tóxica) e contato com a pele (irritante). Consultar a folha de MSDS para requisitos adicionais. Após pesagem de NaN3, a área da balança deverá ser totalmente limpa.
[0001678] NaH2PO4 ± H2O6,9 g
[0001679] Na N30,2 g
[0001680] H2Ovolume final de 1,0 litro
[0001681] Pesar 6,9 g ± 0,1 g de NaH2PO4 ± H2Oe0,2 g NaN3 e dissolver em 800 mL de H2O com grau para HPLC em uma garrafa de reagente usando mistura contínua com uma barra de agitação. Usando um medidor de pH, ajustar o pH da solução para 7,5 usando NaOH a 10 M. Levar o volume final para 1,0 litro usando um cilindro graduado de 1 L. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até seis meses. Solução de trabalho de enzima PNGase F em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5.
[0001682] tampão de fosfato de sódio a 50 mM
[0001683] azida de sódio a 0,02%, pH = 7,5, 1,8 mL
[0001684] PNGase F do kit, Catálogo No. P0704L, 0,2 mL
[0001685] Pipetear 1,8 mL de tampão de fosfato de sódio a 50 mM, azida de sódio a 0,02%, pH de 7,5 em um frasco criogênico de 1,8 mL. Adicionar 0,2 mL de PNGase F do kit e misturar totalmente. Armazenar a solução a -20°C ou pelo menos durante até seis meses. A solução pode ser transformada em alíquotas antes do congelamento.
[0001686] Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo. Solução de estoque de estaquiose (1,25 mg/mL): Pesar 0,125 g de Estaquiose sobre um papel de pesagem. Usar uma balança analítica e transferir para um frasco volumétrico de 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturar totalmente. Transformar em alíquotas em porções de 2 mL em criofrascos Nalgene. Armazenar a solução a - 20°C ou pelo menos durante até seis meses.
[0001687] Padrão de Adequabilidade de Sistema de Estaquiose (12,5 μg/mL): Pipetear 1 mL do estoque a 1,25 mg/mL em um frasco volumétrico de 100 mL. Encher até a marca com água com grau para HPLC e misturar totalmente. Transformar em alíquotas porções de 200 μL em tubos para microcentrífuga de 0,65 mL. Colocar os tubos em uma caixa de armazenamento apropriadamente rotulada. Armazenar a Solução de Adequabilidade de Sistema a -20°C ou pelo menos durante até seis meses.
Preparo de padrão e amostra
[0001688] Preparo de Material de Referência. A um frasco contendo 1 mg de RapiGest SF liofilizado, adicionar 625 μL de tampão de fosfato de Na a 50 mM contendo azida de Na a 0,02%, pH de 7,5,
[0001689] NOTA: Um único reservatório de RapiGest SF contendo tampão deverá ser usado para todas as amostras dentro do conjunto de amostra. Vários frascos de RapiGest SF podem ser reconstituídos e combinados para proporcionar um volume adequado.
[0001690] A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adicionar 120 μL do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 μL de Material de Referência (~ 50 mg/mL). A concentração final de RapiGest SF deverá ser de 0,12% peso/v. Adicionar 40 μL da solução de trabalho de PNGase F, misturar totalmente, centrifugar a amostra e colocar a 38 ± 2°C durante 22 ± 2 horas (banho de água ou o compartimento do amostrador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífuga Microcon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200 μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado a turbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10 segundos. Usando uma pipeta, transferir a solução resultante (~ 380 μL) para um frasco para amostrador automático de HPLC de recuperação total.
[0001691] Preparo de amostra: A um tubo de Eppendorf de 0,65 mL, adicionar 120 μL do tampão contendo RapiGest SF. Adicionar 40 μL de amostra de proteína (esse volume deverá ser igual a entre 1 e 2 mg de CTLA4-Ig). A concentração final de RapiGest SF deverá ser de 0,12% peso/v. Adicionar 40 μL da solução de trabalho de PNGase F misturar totalmente através de turbilhonamento durante 10 segundos. Centrifugar a amostra e colocar a 38 ± 2°C durante 22 ± 2 horas (banho de água ou o compartimento do amostrador automático Alliance). Pipetear a amostra em um filtro para centrífuga Microcon YM-100 e centrifugar a 13.000 g durante 30 minutos. Colocar 200 μL de água para HPLC no filtro e enxaguar o filtrado através de centrifugação durante mais 30 minutos a 13.000 g. Submeter o filtrado combinado a turbilhonamento durante 15 segundos e centrifugar a amostra durante 10 segundos. Transferir a solução resultante (~ 380 uL) para um frasco para amostrador automático de HPLC de recuperação total.
[0001692] Estabilização da célula do detector eletroquímico: Injetar 30 μL do Padrão de Adequabilidade de Sistema Externo de Esta- quiose (12,5 μg/mL). Assegurar que a altura de pico para estaquiose é > 800 nA. Assegurar que não há interferência elétrica excessiva da célula e que a linha de base é uniforme. Se a sensibilidade à estaqui- ose ou a linha de base é inaceitável, verificar a composição de tampão, limpar o eletrodo ou substituir o eletrodo. Se interferência excessiva está presente, verificar a célula para assegurar remoção de todas as bolhas de ar. Re-estabilizar a célula e reinjetar padrão de estaqui- ose. Se os problemas persistirem, tomar outras atitudes ou contatar seu supervisor.
[0001693] Placas teóricas (N): Determinar o número de placas teóricas (N) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feito manualmente. N = 16 (t / W)2
[0001694] onde:
[0001695] t:tempo de retenção medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição de pico na altura máxima
[0001696] W:largura de pico através de extrapolação dos lados para a linha de base.
[0001697] N :deve ser > 6000. Se a contagem de placa é menos de 6000, ajustar o gradiente de operação ou substituir a coluna.
[0001698] Fator de configuração (T): Determinar o fator de configuração de coluna (T) baseado no pico de estaquiose usando a fórmula abaixo. Isso é feito através do sistema de análise de dados Empower ou pode também ser feito manualmente. T = (W0,05/ 2f)
[0001699] onde:
[0001700] W0,05: largura de pico a 5% de altura (0,05h).
[0001701] f: a medida (largura) da borda frontal de pico a W0,05 para o ápice do pico.
[0001702] T deve ser < 1,2. Se o fator de configuração é maior do que 1,2, verificar a composição de tampão, substituir a coluna ou limpar a coluna e reinjetar Padrão de Adequabilidade de Sistema.
[0001703] Verificação do Tempo de Retenção do Padrão de Ade- quabilidade de Sistema de Estaquiose: O tempo de retenção é de-pendente do sistema. O Padrão de Adequabilidade de Sistema de Es- taquiose deverá exibir um tempo de retenção de 18,5 ± 2,0 minutos.
[0001704] Material de Referência de CTLA4-Ig. Observar o perfil de carboidrato do Material de Referência entre as primeiras faixas injetadas antes de injeção de amostras. O perfil de carboidrato deverá ser similar àquele mostrado na figura 68. Tempos de retenção absolutos são dependentes do sistema. Assegurar que a diferença nos tempos de retenção entre os primeiros picos no Domínio I (Pico 1A) e o principal pico no Domínio III (Pico 3) está entre 22 minutos e 28 minutos. Se delineamento dos picos não se assemelha àquele obtido na figura 68, tomar as atitudes apropriadas (por exemplo, verificar a função do ins- trumento, limpar a coluna, verificar/substituir tampões, substituir a coluna) e reavaliar. O procedimento a seguir pode ser usado para limpar a coluna: desligar a célula e limpar a coluna com Eluente 1 a 80%, Eluente 2 a 20% durante 5 minutos, seguido por Eluente 1 a 50%, Elu- ente 2 a 50% durante 10 minutos. Reequilibrar a coluna e célula (com a célula ligada) em condições iniciais e reavaliar.
SEQUÊNCIA DE INJEÇÃO:
[0001705] Ajustar a sequência de injeção dos oligossacarídeos isolados como segue : Padrão de estaquiose (30 μL) Material de Referência (60 μL) Amostra(s) (60 μL) Material de Referência (60 μL)
[0001706] É recomendado que < cinco amostras sejam operadas entre injeções de Material de Referência entre as faixas.
ANÁLISE DE DADOS:
[0001707] Processamento de cromatogramas. Processar os croma- togramas para o Material de Referência e amostras no Empower. Ajustar parâmetros de integração de modo que o delineamento de pico e a linha de base sejam similares àqueles mostrados na figura 68. Pode ser preciso colocar as linhas de integração manualmente. Realizar cálculos para áreas de Domínio relativas e com relação áreas de pico (veja tabelas incluídas na Breve Descrição da figura 68 e ao final desse Exemplo). Determinar os valores médios para esses parâmetros para o Material de Referência e para cada amostra se injeções repetidas foram feitas.
[0001708] Para o Material de Referência, determinar o desvio relativo para os Domínios I, II, III, Picos 1A e 1B para cada réplica com relação à média de todas as réplicas.
[0001709] Comparar os Perfis de Amostra com perfis de Material de Referência.
[0001710] Comparação Visual. Determinar se as amostras e Material de Referência têm o mesmo número de Domínios e picos primários. Picos primários são aqueles picos rotulados na descrição da figura 68 (Picos 1A, 1B, 1C, 1D, 2, 3 e 4).
[0001711] Comparação de Quantificação Relativa. Comparar as áreas relativas de amostras (Domínios I, II e III e Picos 1A e 1B; se injeções repetidas de amostras foram feitas, usar seus valores médios) com as áreas relativas médias das injeções de Material de Referência entre as faixas. Determinar a diferença relativa dessas áreas a partir dos valores médios de Material de Referência.
Cálculos
[0001712] Área de Domínio % (Área de Domínio relativa): Calcular a área de Domínio % para os Domínios dos perfis para o Material de Referência e amostras. Refira-se à figura 68 para padrão de Áreas de Domínio. Seguindo o exemplo na figura 68, calcular as proporções percentuais de domínio usando a informação e fórmula a seguir (tempos de retenção são dependentes do sistema e refletem os resultados na figura 68: Domínio I:Soma das áreas de pico em tempos de retenção aproximados de 18-24 minutos (Picos 1A-1E) Domínio II:Soma dos picos de 26-38 minutos Domínio III:Soma dos picos de 39-50 minutos Domínio IV:Soma dos picos de 51-64 minutos Domínio VSoma dos picos de 65-75 minutos NOTA: Janelas de tempo de retenção para os domínios se desviarão de acordo com variações no desempenho cromatográfico diário. Ajustar os tempos consequentemente.
Figure img0192
[0001713] Para o Domínios I-III, calcular também os valores médios nas injeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras, se injeções repetidas foram feitas.
[0001714] % da área de pico (Área de pico relativa). Calcular a % da área de pico para os Picos 1A, 1B, 1C e 3 dos perfis para o Material de Referência e amostras. Refira-se à figura 68 para padrão de áreas de pico; tempos de retenção são dependentes do sistema. Calcular as proporções percentuais de pico usando a informação e fórmula a seguir:
Figure img0193
[0001715] Para cada um dos Picos 1A e 1B, calcular também os valores médios nas injeções de Material de Referência entre as faixas, bem como nas amostras, se injeções repetidas foram feitas.
[0001716] Cálculo da diferença percentual dos valores médios de Material de Referência. Usar a seguinte fórmula para calcular as dife-renças percentuais nas áreas relativas médias dos Domínios I-III, Picos 1A e 1B de amostras comparado com Material de Referência: Dif % = |RM - S| / RM x 100
[0001717] onde:
[0001718] RM = valor de área relativa média de interesse para Material de Referência
[0001719] S = valor de área relativa média de interesse para a amostra
[0001720] | | = valor absoluto
[0001721] Resultados: Resultados que têm de ser reportados são a diferença percentual calculada do Material de Referência para o Domínio I, o Domínio II, o Domínio II, pico 1A e pico 1B. Incluir um croma- tograma representativo integrado para o Material de Referência e a amostra. Incluir as áreas percentuais relativas dos Domínios I-III e Picos 1A e 1B para um décimo de um por cento para amostra e Material de Referência (média de injeções entre faixas). Adicionalmente, para cada uma das injeções de Material de Referência entre as faixas, as áreas de Domínio % para os Domínios I, II e III e áreas de pico % para os Picos 1A e 1B deverão estar dentro de 15% de seus valores médios.
[0001722] As figuras 57-62, 68, 76 e 82-84 mostram dados resultantes dos perfis de oligossacarídeo N-ligado conforme descrito aqui. A figura 68 representa um perfil de oligossacarídeo N Ligado típico (Domínios I, II, III, IV e V e Picos 1A e 1B dentro de 5% das médias de lote). Picos 1A, 1B e 1C representam as estruturas de oligossacarídeo N Ligado de G0, G1 e G2.
Figure img0194
[0001723] A figura 68 mostra um perfil de carboidrato N ligado típico para composição de CTLA4-Ig.
[0001724] A tabela diretamente acima mostra dados tabulados para o perfil de oligossacarídeo N Ligado de CTLA4-Ig.
[0001725] A tabela diretamente abaixo mostra faixas observadas de CTLA4-Ig.
Figure img0195
Figure img0196
EXEMPLO 45: UM BIOENSAIO BASEADO EM CÉLULA IN-VITRO PARA CTLA4-Ig
[0001726] Células T requerem dois sinais ou ativação e subsequente proliferação. O primeiro sinal é proporcionado através da interação de um peptídeo antigênico com o complexo TCR-CD3. O segundo sinal coestimulatório ocorre com a interação entre CD28 sobre a célula T e a proteína B7 sobre células apresentando antígeno. Quando de recebimento desses dois sinais, células T secretam a citocina Interleucina 2 (IL-2). Liberação de IL-2 leva à ativação e proliferação celular, CTLA4-Ig, um composto imunossupressor solúvel, também se liga à proteína B7 sobre células apresentado antígeno, assim, bloqueando a interação funcional com CD28 e prevenção do sinal coestimulatório que é necessário para produção de IL-2.
[0001727] Nesse método, Células T Jurkat transfectadas com o gene de luciferase, sob o controle do promotor de IL-2, são coestimuladas com Células B de Daudi na presença de anti-CD3. A coestimulação ativa o promotor de IL-2 o qual, por sua vez, produz proteína de luciferase. O sinal luminescente resultante é medido usando um Sistema de Ensaio de Luciferase. Nesse sistema, CTLA4-Ig produz uma diminuição dose-dependente na atividade de luciferase.
[0001728] Esse método examina o efeito de CTLA4-Ig sobre o sinal coestimulatório necessário para produção de IL-2. A presença de CTLA4-Ig solúvel impede sinalização entre a célula T e células apresentando antígeno. Sem esse sinal, IL-2 não é produzida, assim, impedindo a expansão clonal de células T. Um vetor com o gene de luciferase foi criado usando o promotor de IL-2. As células T Jurkat foram, então, transfectadas com esse vetor repórter. Um clone positivo, Jur- kat.CA, foi selecionado e usado no método.
[0001729] Esse bioensaio envolve estimulação de células T transfec- tadas (Jurkat.CA) com anti-CD3 e células B (Daudi). Coestimulação proporcionada pelas células B é inibida através da adição de CTLA4- Ig. Jurkat.CA e células Daudi são cultivadas nas cavidades de uma lâmina com fundo plano, branca, opaca com 96 cavidades e estimuladas com anti-CD3 na presença de diferente concentrações de CTLA4- Ig. Após uma incubação de 16 a 20 horas a 37°C, as cavidades são ensaiadas com relação à atividade de luciferase. Inibição de coestimu- lação através de CTLA4-Ig é observada como uma diminuição dose- dependente na atividade de luciferase.
[0001730] REAGENTES: Meio de cultura de células Daudi (soro fetal bovino a 10%, MEM piruvato de sódio a 1% em RPMI 1640); Meio de cultura de célula Jurkat.CA (soro de cabra a 10%, MEM piruvato de sódio a 1%, 400 μg/mL de geneticina em RPMI 1640); Meio de bioen- saio (0,2 μg/mL de anticorpo anti-CD3 e solução de penicilina- estreptomicina a 1% em Meio de cultura de células Daudi); Solução de luciferase Bright-Glo do sistema de ensaio (Promega, Catálogo N° E2620).
[0001731] INSTRUMENTAÇÃO: Nikon, microscópio invertido Diaphot 200; Luminômetro Packard TopCount NXT; Manipulador de líquido Te- can Genesis; Contador de células Coulter Vi-Cell; Zymark RapidPlate- 96. Fluxograma de procedimento
Figure img0197
Figure img0198
[0001732] Preparo de Soluções de trabalho: 3 mL de soluções de CTLA4-Ig (5000 ng/mL) em meio de bioensaio.
[0001733] Oito curvas de ponto foram preparadas para o padrão, controle de qualidade e amostras nas concentrações de 100, 4, 2, 1, 0,5, 0,2, 0,1 e 0,002 μg/mL de CTLA4-Ig conforme mostrado na Tabela 58 abaixo para as concentrações finais no ensaio, após diluição duas vezes na lâmina, de 50, 2, 1,0,5, 0,25, 0,1,0,05 e 0,001 μg/mL. Tabela 58. Diluições usadas para gerar Padrões de curva.
Figure img0199
[0001734] 200.000 células foram adicionadas por cavidade de uma lâmina com 96 cavidades e foram incubadas a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85%. 12 x 106 Células Jurkat.CA e 12 x 106 células Daudi foram combinadas em um tubo para centrífuga estéril. As células foram centrifugadas a ~125 x g durante 10 minutos em temperatura ambiente e foram totalmente re-suspensas em 9 mL de Meio de cultura de células Daudi repetidamente pipeteando gentilmente com uma pipeta sorológica até que mais nenhum grumo de célula fosse visível, a fim de proporcionar uma concentração de 2,7 x106 células/mL. 75 μL de cada solução da Tabela 58 foram adicionados às cavidades apropriadas de uma lâmina contendo células. A(s) lâmina(s) foram, então, vedada(s) com TopSeal-A e incubada(s) a 37°C, 5% de CO2 e umidade de 85% durante 16 a 20 horas. Após as lâminas e solução de luci ferase Bright-Glo terem sido equilibradas para a temperatura do ins-trumento, 150 μL de solução de luciferase Bright-Glo foram adicionados a cada cavidade simultaneamente e foram misturados. A lâmina é, então, colocada no TopCount NXT imediatamente após mistura para equilíbrio no escuro durante 10 minutos. O sinal luminescente foi, então, medido em um TopCount NXT usando uma integração de 1 segundo por cavidade ou conforme apropriado ao tipo particular de lumi- nômetro usado.
[0001735] O resultado do TopCount NXT foi registrado, lido em um programa de análise-padrão e os dados foram transformados tomando seu logaritmo (base 10). Os dados transformados de cada artigo foram adaptados a um modelo logístico com quatro parâmetros, conforme mostrado na equação abaixo: Equação 1:
Figure img0200
[0001736] onde:
[0001737] A é o platô superior da curva, D é o platô inferior da curva, B é o fator de declínio e C é a concentração que produz um efeito igual à média de A e D.
[0001738] Um F-teste R2 estatístico e com falta-de-adaptação pode ser calculado para cada artigo. Uma proporção do mínimo, máximo e declínio dos artigos de teste com relação ao material-padrão pode também ser calculada. Além disso, intervalos de confiança para as proporções podem também ser computados.
[0001739] A potência relativa de cada artigo foi determinada através de adaptação de uma única equação aos dados do artigo de interesse combinados com os dados do artigo de referência. Equação 2:
Figure img0201
[0001740] onde:
[0001741] os parâmetros A, B e D são comuns à referência e artigo de teste e CR é o parâmetro referência, CA é o parâmetro artigo de teste e a proporção CR/CA é a potência relativa. O superscrito I é uma variável indicadora. Ele é ajustado em igual a 1 se os dados se originam do artigo de interesse e 0 se os dados se originam do Material de CTLA4- Ig.
[0001742] A potência relativa de cada artigo de teste foi traduzida para uma escala percentual e a potência relativa foi fornecida como resultado do programa.
[0001743] A média dos oito resultados de potência relativa de cada um dos oito conjuntos de dados analisados pode ser calculada e o desvio-padrão pode ser calculado usando a Equações 3 e 4, respectivamente. O resultado médio é reportado como "potência relativa percentual" arredondado para o número inteiro mais próximo. Equação 3:
Figure img0202
Equação 4:
Figure img0203
[0001744] onde:
[0001745] 8 é o número de medições de potência
[0001746] x = medições individuais
[0001747] Ajuste de Valores de potência relativa Obtidos com concentrações aproximadas: Em virtude do "lag" de tempo entre re-cebimento da amostra e obtenção de uma concentração precisa de proteína, a amostra pode ser testada no ensaio em uma concentração aproximada e os resultados ajustados quando a concentração precisa é determinada. Esse ajuste é realizado usando a Equação 5 abaixo, onde a potência relativa determinada no ensaio é multiplicada pela proporção da concentração de CTLA4-Ig usada para ajustar o ensaio para a concentração determinada de CTLA4-Ig na amostra. Equação 5:
Figure img0204
Exemplo:
[0001748] Amostra foi testada em uma concentração de proteína de 25 mg/mL no ensaio.
[0001749] Potência relativa determinada foi de 105%.
[0001750] Concentração de CTLA4-Ig determinada foi estabelecida como sendo de 25,5 mg/mL
[0001751] Potência relativa reportável = (105 * 25) / 25,5 = 103%.
[0001752] Os valores de potência relativa do artigo de teste devem estar entre 25 e 175% do padrão de referência, o qual é a faixa do ensaio. Se os valores de potência relativa estão fora dessa faixa, então, a amostra deve ser diluída ou concentrada de forma a cair dentro dessa faixa e a amostra re-analisada.
EXEMPLO 46: CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE OLIGOSSA- CARÍDEOS O-LIGADOS
[0001753] A glicosilação O Ligada de CTLA4-Ig foi caracterizada por mapeamento peptídico seguido por ESI-MS/MS e através de MALDI- TOF.
Análise de T8 e T9 através de Mapeamento peptídico com ESI- MS/MS
[0001754] Uma versão manual modificada do método de digestão tríp- tica com ESI-MS/MS in line usando um espectrômetro de massa Finnigan Ion Trap foi realizada de forma a caracterizar glicopeptídeos O- ligados T8 e T9 (refira-se à Tabela 59 para identidade de peptídeo).
[0001755] A figura 63 mostra o mapeamento tríptico de peptídeo de CTLA4-Ig, indicando que T8 elui ao final da frente de solvente e T9 elui em T27.
[0001756] O espectro de massa total do peptídeo T8 é mostrado na figura 64, onde o pico a 436,2 corresponde ao MW esperado do peptí- deo T8 unicamente carregado não modificado e o pico a 1092,2 corresponde ao MW de T8 unicamente carregado glicosilado. A massa correspondendo ao pico principal e sua estrutura (T8-HexNAc-Hex- NeuAc) são mostrados na Tabela 61. Tabela 61 Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T03: Estruturas de oligossacarídeo do peptídeo T8
Figure img0205
[0001757] O espectro de massa total do peptídeo T9 é mostrado na figura 65, onde íons dupla e triplamente carregados dos glicopeptídeos aparecem, correspondendo a uma faixa de glicoformas heterogêneas. O principal pico a 1115,9 corresponde ao MW de T9 triplamente carregado glicosilado com HexNAc-Hex-NeuAc. Os picos a 1213,0 e 1334,8 correspondem aos pesos moleculares do T9 triplamente carregado, glicosilados com HexNAc(NeuAc)-Hex-NeuAc e (HexNAc-Hex- NeuAc)2, respectivamente (Tabela 62). A glicoforma dominante é T9- HexNAc-Hex-NeuAc monossialilado, enquanto que as outras glicofor- mas estão presentes em uma abundância muito menor. Tabela 62 Tabela 3.2.S.3.1.4.1.T04: Estruturas de oligossacarídeo do peptídeo T9
Figure img0206
[0001758] De forma a determinar os sítios de O Ligação, mapeamento peptídico de CTLA4-Ig foi realizados conforme previamente descrito no Exemplo 4 e a fração T8-9 (em virtude de digestão incompleta através de tripsina) foi coletada e submetida a sequenciamento de Edman. Os dados de sequenciamento mostraram que, no 1° ciclo, um pico extra aparece além de Ser. O tempo de retenção do pico extra não está em concordância com aquele de qualquer um dos padrões de aminoáci- dos, sugerindo que Ser na posição 1 em T8 (Ser 129) é modificada e contém glicanas O Ligadas. O aparecimento de Ser e do pico extra indica que Ser é parcialmente modificada. Isso está em concordância com os dados de MS para T8. Os experimentos de sequenciamento também revelam o sítio de O Ligação em T9 como Ser 139. Em conclusão, dois sítios de glicosilação O Ligada foram identificados nos resíduos de aminoácido serina 129 e serina 139. a glicana predominante presa aos dois sítios é HexNAc-Hex-NeuAc.
Análise por MALDI-TOF de peptídeo T9
[0001759] Análise por MALDI-TOF de peptídeo T9 demonstra a presença de várias glicoformas (FIG. 66). O pico com um MW de 2690,8 é consistente com o fragmento T9. O pico com um MW de 2893,7 se refere a T9 mais HexNAc. O pico com um MW de 3055,7 se refere a T9 mais HexNAc-Hex. O pico com um MW de 3345,8 indica T9 mais He- xNAc-Hex-NANA. Galactose e N-Acetil Galactosamina foram detectadas em T9 baseado em análise de monossacarídeo, portanto, é postulado que as principais espécies O Ligadas em T9 são GalNAc-Gal- NANA. Análise por MALDI-TOF de peptídeo T8 não foi realizada em virtude dos baixos rendimentos de recuperação.
EXEMPLO 47: VARIANTES COM OXIDAÇÃO E DEAMIDAÇÃO EM CTLA4-Ig
[0001760] Oxidação e deamidação variantes de produto comuns de peptídeos e proteínas. Elas podem ocorrer durante fermentação, cole- ta/clarificação de célula, purificação, armazenamento de Substância de Fármaco/ produto de fármaco e durante análise da amostra.
[0001761] Oxidação de proteína é, tipicamente, caracterizada pela adição química de um ou mais átomos de oxigênio à proteína. Vários aminoácidos, Met, Cys, Tyr, His e Trp, são mais suscetíveis à oxidação comparado com outros aminoácidos naturais. O aminoácido com o maior grau de suscetibilidade à oxidação é metionina. A maior parte da oxidação de proteína identificada até o momento tem sido a oxidação de metionina à variante de sulfóxido. Oxidação em proteínas pode ser causada por vários mecanismos diferentes. O mecanismo comum de oxidação ocorre a partir de exposição à luz ou catálise com metal de transição.
[0001762] Deamidação é a perda de NH3 de uma proteína, formando um intermediário de succinimida que pode sofrer hidrólise. O intermediário de succinimida resulta em uma diminuição de massa de 17 u do peptídeo precursor. A subsequente hidrólise resulta em um aumento de massa de 18 u. Isolamento do intermediário de succinimida é difícil em virtude da instabilidade sob condições aquosas. Como tal, deami- dação é tipicamente detectável como aumento de massa de 1 u. Dea- midação de uma asparagina resulta em ácido aspártico ou isoaspárti- co. Os parâmetros que afetam a taxa de deamidação incluem pH, temperatura, constante dielétrica do solvente, resistência iônica, sequência primária, conformação de polipeptídeo local e estrutura terciária. Os resíduos de aminoácido adjacentes à Asn na cadeia peptídica afetam as taxas de deamidação. Gly e Ser após uma Asn em sequências de proteína resultam em uma maior suscetibilidade è deamidação.
MATERIAIS e MÉTODOS Amostra: padrão de CTLA4-Ig
[0001763] Mapeamento peptídico com Tripsina/Asp-N/Tripsina e Quimiotripsina de CTLA4-Ig: Proteínas foram desnaturadas e reduzidas em tampão de Tris a 50 mM (pH de 8,0) contendo guanidina a 6 M e ditiotreitol a 5 mM (DTT). Após 20 minutos de incubação a 50 °C, iodoacetamida (IAM) foi adicionada para uma concentração final de 10 mM e a amostra foi incubada no escuro a 50 °C durante mais 20 minutos. A mistura alquilada e reduzida foi carregada sobre a coluna NAP-5 e, então, eluída com Tris a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 8,0. Tripsina com grau para sequenciamento (2% peso/peso, enzima : proteína) foi adicionada e incubada durante 4 horas a 37 °C. No caso de digestão de Asp-N, Asp-N com grau para sequenciamento (4% peso/peso, enzima : proteína) foi adicionada e a amostra foi incubada durante 16 horas a 37 °C.
[0001764] No caso de digestão com tripsina e quimiotripsina, a proteína estava em tampão de fosfato de sódio a 50 mM, pH de 7,5. Tripsina com grau para sequenciamento (4%, peso/peso, enzima: proteína) foi adicionada e a amostra foi incubada durante 4 horas a 37°C. Quimio- tripsina foi adicionada (4%, peso/peso, enzima: proteína) e a amostra incubada durante 16 horas a 37 °C. As amostras foram armazenadas a -20 °C após a digestão.
[0001765] Misturas peptídicas foram separadas através de eluição em gradiente a partir de uma coluna Atlantis C18 (2,1 x 250 mm) sobre uma Workstation de HPLC Waters Alliance (Waters, Milford, MA) a 0,120 mL/min. A coluna foi diretamente conectada ao Q-Tof micro (Waters, Milford, MA) equipado com uma fonte de ionização por ele- tropulverização e os espectros de massa foram coletados. No caso de mapeamento peptídico de Asp-N, misturas peptídicas foram separadas sobre uma coluna Varian C18 (4,6 x 250 mm) a 0,7 mL/min usando a mesma Workstation de HPLC. As colunas foram equilibradas com solvente A (TFA a 0,02% em água) e os peptídeos foram eluídos aumentando a concentração de solvente B (acetonitrila a 95%/TFA a 0,02% em água). Uma válvula de derivação pós-coluna foi usada para direcionar 15% do fluxo para o Q-Tof micro. O instrumento foi operado no modo positivo (m/z 100-2000). A tensão do capilar foi ajustada a 3000 V.
[0001766] Análise de peptídeos por MS/MS: Frações de cromatogra- fia em fase reversa foram coletadas e infundida no Q-Tof micro em uma taxa de fluxo de 20 μL/minuto. Os espectros de MS/MS foram adquiridos usando energia de colisão otimizada para o peptídeo individual (oscilando de 25 a 42 eV).
RESULTADOS
[0001767] Oxidação de CTLA4-Ig: CTLA4-Ig tem sete metioninas por cadeia simples: Met1, Met53, Met54, Met85, Met97, Met162 e Met338. Ma-peamento peptídico foi usado para identificar as variantes de produto oxidativas em cada um desses sítios. Oxidações de Met1, Met85 e Met162 são identificadas usando a técnica de mapeamento tríptico de peptídeo (FIG. 67A-B). Nenhuma oxidação de Met338 é detectada. Os fragmentos trípticos contendo Met53, Met54 ou Met97 são grandes pep- tídeos contendo carboidratos N-ligados heterogêneos. Esses peptí- deos não são passíveis de identificação e quantificação relativa de oxidação. Portanto, proteólise usando múltiplas enzimas, as quais produzem peptídeos não-glicosilados mais curtos, foi realizada. O peptí- deo de Asp-N EVCAATYMMGN (46-56) e peptídeo tríptico / quimiotríp- tico MYPPPY (97-102) são usados para determinar a oxidação de Met53, Met54 e Met97. A quantificação relativa de oxidação de metionina é calculada de acordo com a área de pico percentual dos cromatogra- mas de íons extraídos. As quantidades relativas de peptídeos oxidados são listadas na Tabela 63. Oxidação sobre seis das sete metioni- nas de CTLA4-Ig com cadeia simples é detectada. Os picos A e B são as formas unicamente oxidadas do peptídeo EVCAATYMMGN (46-56) (pico 3). Peptídeos dos picos 2A e 2B são isobáricos e têm um aumento de massa de 16 u quando comparado com a massa do peptídeo não modificado. Cada pico representa a oxidação em diferentes Met. O grau da oxidação é diferente nos dois sítios. Tabela 63. A oxidação de Met em CTLA4-Ig
Figure img0207
*Em virtude da contribuição mínima de oxidação de AT1, o percentual de oxidação em AT1 não é incluído no cálculo da quantidade estimada de oxidação de CTLA4-Ig.
[0001768] A quantidade estimada total de oxidação de metionina em CTLA4-Ig é calculada como sendo de 2,0% para CTLA4-Ig. Isso é cal-culado através da adição do percentual total de oxidação em cada sítio e dividindo pelo número total de metioninas, o qual é sete. Análise por MS/MS foi realizada sobre peptídeos oxidados e nativos listados na Tabela 63.
[0001769] Todos os peptídeos, com exceção de D5, são sequencia- dos usando MS/MS. O aminoácido oxidado é determinado através da diferença de massa dentro da série de íons b e y. Os espectros de MS/MS do peptídeo T1 oxidado e nativo requer os íons precursores duplamente carregados em m/z 741,4 e 733,4. A diferença de massa é de 8 u (para o estado duplamente carregado) que é de 16 u quando corrigida para o estado carregado. O peptídeo tríptico T1 (1-14) contém o resíduo de Met1. O peptídeo nativo e seu derivado oxidado são separados da linha de base através de cromatografia de fase reversa. O cromatograma de íons para íons duplamente carregados de T1 e seus derivados é mostrado na figura 67A-B. A série de íons b e y é os íons predominantes produzidos em dissociação induzida por colisão. Os íons y6-y13 têm as mesmas massas modificada e não modificada. O íon b2 do peptídeo oxidado é 16 u maior do que o íon b2 correspondente do peptídeo nativo. A série de íons b e y, tomada junto com as massas de peptídeo, identificam metionina 1 como o aminoácido modificado no peptídeo T1. Da mesma forma, oxidações de Met nos peptí- deos AT1, T6, T10 e MYPPPY (97-102) são identificadas.
[0001770] Deamidação de CTLA4-Ig: CTLA4-Ig tem 15 asparaginas por cadeia simples. Três asparaginas são conhecidas por estarem presas à estruturas de carboidrato N-ligado. Mapeamento peptídico foi usado para identificar e quantificar relativamente a deamidação que ocorre nos outros 12 resíduos de Asn. Deamidações de Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 e Asn344 são identificadas através do mapeamento tríp- tico de peptídeo por LC/MS (Tabela 64). A quantificação relativa de deamidação de asparagina é calculada de acordo com a área de pico percentual dos cromatogramas de íon extraídos. As quantidades rela-tivas de peptídeos desamidados são listadas na Tabela 64. A quantidade total estimada de deamidação de asparagina em CTLA4-Ig é calculada como sendo de 0,3% para CTLA4-Ig. Isso é calculado através da adição do percentual total de deamidação em cada sítio e dividindo por 15. Análise por MS/MS foi realizada sobre peptídeos desamidados e nativos listados na Tabela 64. Tabela 64. A deamidação de Asn em CTLA4-Ig
Figure img0208
[0001771] O aminoácido desamidado é determinado através da diferença de massa dentro da série de íons b e y. Por exemplo. Se existem dois picos desamidados para o peptídeo T15 - massas de 905,0 u. Pico 1 elui antes do pico nativo; o pico 3 elui após o pico nativo. Peptí- deos trípticos e suas formas amidadas são separados da linha de base sobre a coluna de fase reversa. Análise por MS/MS foi realizada sobre os peptídeos trípticos e peptídeos desamidados são listados na Tabela 64. Os Picos 1-3 contêm os mesmos íons y1 e y2, indicando que os aminoácidos C-terminais são os mesmos para todos os três picos; contudo, os íons y3-y14 dos picos 1 e 3 são 1 u maiores do que os íons correspondentes do pico 2. A diferença de massa entre y2 e y3 é de 114 u para o pico 2; isso corresponde a um resíduo de Asn. A 115 u para os picos 1 e 3 é um aumento de massa de 1 u comparado com a massa do resíduo de Asn; isso corresponde ao ácido aspártico ou isoaspártico. Da mesma forma, deamidações em T12, T25, T26 e T30 foram identificadas e os íons de fragmento identificam sítios de modificação.
[0001772] Deamidações de asparagina e oxidações de metionina são determinados a partir de análises de LC/MS e LC/MS/MS da clivagem com endopeptidase de CTLA4-Ig. As modificações são identificadas através de desvios nas massas entre os peptídeos modificados e não modificados. Os aminoácidos modificados são identificados através de sequenciamento por MS/MS. Seis oxidações de metionina e cinco de- amidações de asparagina por cadeia simples estão presentes no material de CTLA4-Ig em um pequeno percentual. Descobriu-se que Met1, Met53, Met54, Met85, Met97 e Met162 de CTLA4-Ig são todas oxidadas. Verificou-se que essas oxidações determinadas de CTLA4-Ig são menos de 2,5% de todas as metioninas de CTLA4-Ig. Descobriu-se que Asn186, Asn225, Asn271, Asn294 e Asn344 de CTLA4-Ig são todas desami- dadas em baixas quantidades. Verificou-se que essas deamidações determinadas de CTLA4-Ig são menos de 0,5% de todas as asparagi- nas em CTLA4-Ig.
Exemplo 48 - Ensaios de endotoxina bacteriana para CTLA4-Ig e CTLA4A29YL104E-Ig
[0001773] Em uma modalidade, a composição de Substância de Fár- maco de CTLA4-Ig tem menos de ou igual a 0,15 EU/mg de endotoxi- na bacteriana. CTLA4-Ig é ensaiada com relação à presença de en- dotoxinas bacterianas usando a técnica de coagulação em gel Limulus Amebocyte Lysate (LAL) baseada na USP<85>. No preparo para e aplicação do ensaio, observar precauções ao manipular espécimes de forma a evitar contaminação microbiana bruta; tratar quaisquer recipientes ou utensílios empregados para destruir endotoxinas estranhas que possam estar presentes sobre suas superfícies, tal como aquecimento em um forno quente usando um ciclo validado.
[0001774] Reagente LAL: (Associates of Cape Cod, Inc.- ou equi-valente). Limulus liofilizado. Reagente Amebocyte Lysate (LAL), tal como Pyrotell, deverá ser armazenado de acordo com as instruções do fabricante. Reagente LAL reconstituído pode ser mantido congelado durante não mais do que um mês e não deverá ser descongelado ou congelado mais de uma vez.
[0001775] Padrões de endotoxina: (Associates of Cape Cod, Inc.- ou equivalent). O padrão de controle de endotoxina (CSE) usado nos testes deve ser rastreável e padronizado contra Padrão de Referência de Endotoxina (RSE). Armazenar recipientes na reconstituídos de en- dotoxina em um refrigerador; uma vez reconstituído, eles podem ser mantidos a 2°-8°C durante não mais do que 14 dias, a menos que va-lidação durante períodos mais longos mostrem reatividade adequada.
Testagem de lotes de Produção
[0001776] A falta de inibição de produto ou intensificação do procedimento LAL deverá ser validada para cada formulação de fármaco. Tes- tagem dos lotes de produção é realizada usando três unidades individuais representando o início, meio e final de produção. Essas unidades podem ser operadas individualmente ou empoçadas. Um controle de produto positivo representativo da amostra na concentração de teste, inoculado com duas vezes a quantidade de CSE (ou RSE) como a sensibilidade rotulada do ensaio, deve ser incluído para um testa válido. Ajustar o pH de modo que a solução de produto/lisato final esteja na faixa de 6,0 a 8,0 usando tampão de HCl, NaCl estéril isento de en- dotoxina ou outro. Em algumas situações, pode ser útil usar um agente de tamponamento, tal como Pyrosol, como uma alternativa ao ajuste de pH. Refira-se às orientações do fabricante para uso específico.
Uso de agente de tamponamento para reconstituição de lisato
[0001777] Um agente de tamponamento, tal como Pyrosol (Associates of Cape Cod, Inc.) dirigido a reconstituir o lisato usado para testagem e é projetado para amplificar a capacidade de tamponamento do lisato. Lisato reconstituído com Pyrosol pode ser usado para amostras de teste ou diluições de amostra que possam, de outro modo, requerer ajuste de pH com ácido ou base ou as quais se precipitam quando de ajuste do pH. Quando combinado com a amostra de teste, lisato reconstituído com Pyrosol proporciona uma cor rosa para indicar que o pH está na faixa para um teste válido. Se fora dessa faixa, a cor será amarela ou púrpura; nesse caso, a amostra de teste requererá ajuste de pH adicional. Métodos específicos orientarão o uso de Pyrosol para reconstituição de lisato.
Uso de tampão de inibição de glicana para reconstituição de lisa- to
[0001778] Um tampão de inibição de glicana, tal como Glucashield (Associates of Cape Cod, Inc.) é usado para reconstituir o lisato usado para testagem e é projetado para bloquear interferência potencial por glicana. Lisato reconstituído com Glucashield pode ser usado para amostras de teste ou diluições de amostra que possam conter conta-minação por glicana. Interferência proveniente de contaminação por glicana pode dar origem a falsos positivos em determinados materiais de teste, de modo que uso do lisato reconstituído com Glucashield pode bloquear ou reduzir a interferência, permitindo um número reduzido de falsos positivos. Métodos específicos orientarão o uso de Glucashi- eld para reconstituição de lisato.
Diluições de amostra
[0001779] Se necessário para se aproximar do nível de concentração de endotoxina na amostra, preparar uma série apropriada de diluições da amostra em água isenta de endotoxina estéril. Submeter a turbilho- namento e adicionar 0,1 mL de cada preparado a ser testado a cada um de dois tubos de ensaio de vidro estéreis isentos de endotoxina de 10 x 75 mm.
Preparo de soluções-padrão de endotoxina para Curva-padrão
[0001780] Reconstituir o frasco de endotoxina com água isenta de en- dotoxina conforme as instruções do fabricante. Misturar o frasco vigo-rosamente sobre um misturador com turbilhonamento intermitentemente durante 30 minutos. Preservar o concentrado em um refrigerador a 2°-8°C durante não mais do que 4 semanas. Misturar vigorosamente usando um misturador com turbilhonamento durante não menos de 3 minutos antes de uso. Consultar o Certificado de Análise do fabricante para verificar a concentração do estoque de endotoxina e preparar uma série de diluições de padrão de endotoxina, projetados para colocar o endpoint entre faixas, tal como no exemplo a seguir: 0,5 mL (1000 EU/mL) + 9,5 mL de água isenta de endotoxi- na = 50 EU/mL 5,0 mL (50 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxina = 25 EU/mL 1,0 mL (25 EU/mL) + 9,0 mL de água isenta de endotoxina = 2,5 EU/mL 1,0 mL (2,5 EU/mL) + 9,0 mL de água isenta de endotoxina = 0,25 EU/mL 5,0 mL (0,25 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxi- na = 0,125 EU/mL 5,0 mL (0,125 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endoto- xina = 0,06 EU/mL 5,0 mL (0,06 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxi- na = 0,03 EU/mL 5,0 mL (0,03 EU/mL) + 5,0 mL de água isenta de endotoxi- na = 0,015 EU/mL
[0001781] Certifique-se de submeter vigorosamente a turbilhonamento cada diluição durante pelo menos 30 segundos antes prosseguir para a próxima diluição. Incluir um controle negativo de água do diluente usado. Submeter a turbilhonamento e adicionar 0,1 mL de cada uma das concentrações de 0,125 EU/mL, 0,06 EU/mL, 0,03 EU/mL, 0,015 EU/mL (ou curva alternativa) e o controle negativo de água, a cada um de dois tubos de ensaio de vidro estéreis isento de endotoxina de 10 x 75 mm para proporcionar duas curvas repetidas.
Preparo de solução de reagente LAL
[0001782] Remover o reagente LAL liofilizado do congelador. Adicionar assepticamente 5,0 mL de água isenta de endotoxina (a menos que de outro modo orientado pelo método específico, usar um tampão de reconstituição) ao frasco. Agitar ou girar o frasco para dissolver o reagente.
Preparo de controle de produto positivo
[0001783] Todos os produtos devem ser testados com um controle de produto positivo. Refira-se ao método específico aplicável para instruções sobre o preparo do controle positivo. Se nenhuma instrução é proporcionada, preparar o controle de produto positivo para conter en- dotoxina reforçada a 2X o nível da sensibilidade do lisato, em combinação com o produto em seu nível de teste. Quando de testagem de Água para injeção ou água High Quality Process, usar a diluição do padrão de endotoxina reconstituída de modo que, quando adicionado à amostra, a concentração de endotoxina será 2X a sensibilidade da solução LAL. Por exemplo, se a sensibilidade do lisato = 0,06 EU/mL, adicionar 0,1 mL de uma solução de endotoxina a 2,5 EU/mL a 1,9 mL de amostra de teste (na forma conforme adicionado à solução LAL) = 0,125 EU/mL. O volume da solução de endotoxina não é maior do que 0,1 mL e a diluição global não é menor do que 1: 20.
Procedimento de teste
[0001784] 1. Distribuir assepticamente 0,1 mL da solução de reagente LAL em cada uma das amostras de tubos de ensaio e tubos com padrão de endotoxina, tomando cuidado para evitar contaminação cruzada entre os tubos. NOTA: Colocar qualquer reagente restante em um congelador em torno de menos 10°C a menos 25°C.
[0001785] 2. Refira-se à bula do lisato específico para instruções de mistura da mistura de produto-lisato.
[0001786] 3. Colocar cada tubo em um dispositivo de incubação, tal como um banho de água ou bloco de aquecimento mantido a 37° ± 1°C. Registrar o tempo de início de incubação e a temperatura do banho de água ou bloco de aquecimento.
[0001787] 4. Incubar cada tubo, sem perturbar, durante 60 ± 2 minutos.
[0001788] 5. Após a incubação, registrar o ponto final da incubação e observar cada tubo invertendo gentilmente o tubo 180°. Um resultado positivo é denotado por um gel firme, o qual permanece firme quando invertido cuidadosamente, um resultado negativo é caracterizado pela ausência de tal gel ou através da formação de um gel viscoso que não mantém sua integridade. Manipular os tubos cuidadosamente e evitar submeter os mesmos à vibrações, as quais poderiam causar observações falso-negativas.
Avaliação
[0001789] A menor concentração em cada série de réplica para pro-porcionar um resultado positivo é denominada o endpoint. Calcular o endpoint de média geométrica par ao teste através do procedimento a seguir:
[0001790] Média geométrica = o anti-logaritmo da soma logarítmica dos endpoints de gelificação dividido pelo número de ensaios de endpoint repetidos. O teste é válido contanto que o endpoint de média geométrica esteja dentro uma diluição de duas vezes da sensibilidade do lisato rotulado, o controle de produto positivo seja positivo e o controle negativo de água seja negativo. Determinar o nível aproximado de en- dotoxina bacteriana em ou sobre o artigo de teste através de comparação da sensibilidade do lisato rotulado com os resultados positivos ou negativos acoplados aos fatores de diluição do artigo testado. O artigo vai ao encontro dos requisitos do teste se não há formação de um gel firme ao nível de endotoxina especificado nos monográficos individuais ou especificação.
Método para CTLA4A29YL104E-Ig
[0001791] Esse método é usado para quantificar endotoxinas bacteri- anas nas amostras de Substância de Fármaco e produto de fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig usando o método turbidimétrico cinético LAL. Os resultados são reportados como EU/mL e EU/mg de produto de fárma- co equivalente.
[0001792] Termos: LAL - lisato de Limulus Amebocyte CSE - Endotoxina-padrão de controle EU - unidades de endotoxina na Farmacopeia Norte Americana EU/mg - Unidades por miligrama de endotoxina na Farmacopeia Norte Americana EU/mL -Unidades por mililitro de endotoxina na Farmacopeia Norte Americana LRW - LAL Reagent Água
[0001793] Solução turbidimétrica de lisato de Limulus Amebo- cytec (Pyrotell-T®). Deixar os frascos de Pyrotell-T® e PyroSol® aquecer para a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de abrir. Remover a vedação de metal do Pyrotell-T® e remover assepticamente a rolha. Reconstituir Pyrotell-T® com 5,0 mL de tampão de reconstituição PyroSol®. Girar a garrafa gentilmente para misturar até completamente dissolvida. Reconstituir o tampão imediatamente antes de uso. Pyrotell-T® reconstituída pode ser mantida a 2-8°C durante não mais do que 24 horas. Cobrir a parte de cima do recipiente com uma camada de Parafilm®.
[0001794] Solução de endotoxina padrão de controle. Deixar o frasco de CSE (1.2) aquecer para a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de abrir. Remover a vedação metálica do frasco e remover assepticamente a rolha. Levantar cuidadosamente a rolha apenas o bastante para deixar o ar entrar, desse modo, quebrando o vácuo. Reconstituir endotoxina-padrão de controle (CSE) com 5,0 mL de LRW (1.4). Vedar com Parafilm®. Submeter a turbilhonamento vigorosamente durante um minuto, em intervalos de 5-10 minutos durante um intervalo de 30-60 minutos em temperatura ambiente. CSE está, então, pronta para. Refira-se ao Certificado de Análise do fabricante para obter a potência da endotoxina-padrão de controle (CSE) em USP-EU por frasco vs. o lote específico de Pyrotell-T®. Calcular a USP-EU/mL da CSE no frasco. CSE reconstituída pode ser mantida a 2-8°C durante 30 dias. Após cada uso, vedar o recipiente com um novo Parafilm®.
Exemplo:
[0001795] Para um frasco tendo uma potência de 6.000 USPEU/frasco reconstituído com 5,0 mL de LRW, a potência seria 1.200 USP-EU/mL.
Figure img0209
Ajuste de Parâmetros de ensaio no software Pyrosoft-11®
[0001796] Parâmetros gerais. Ajustar parâmetros na aba General Test Information, conforme mostrado na Tabela abaixo. Informação geral de teste
Figure img0210
Opções
Figure img0211
Atribuições de Tubo – Exemplo
Figure img0212
Figure img0213
Preparo de concentrações de Curva-padrão.
[0001797] Preparo de solução de trabalho de estoque-padrão de controle de endotoxina (CSE, 2.2) a 4 USP-EU/mL. Preparar a solução de trabalho de CSE em uma potência de 4 EU/mL. Calcular o volume de LRW necessário para a diluição usando a Equação 1. Adicio- nar 20 μL de solução CSE (2.2) na quantidade apropriada (Equação 1) de LRW (1.4) em um tubo de poliestireno (1.9). Submeter a turbilho- namento a diluição durante 30 segundos.
Exemplo:
[0001798] Para uma solução CSE em uma potência de 1,200 EU/mL, adicionar 20 μL de solução CSE a 5,980 μL de LRW.
Figure img0214
[0001799] Preparo de solução de trabalho de estoque CSE a 0,64 EU/mL. Preparar a solução de trabalho de CSE em uma potência de 0,64 USP-EU/mL através da adição de 1,6 mL de solução de estoque CSE a 4 USP-EU/mL a 8,4 mL de LRW em um tubo de poliestireno. Submeter a turbilhonamento durante 30 segundos.
[0001800] Preparo de Soluções-padrão de estoque. Soluções- padrões de estoque são preparadas a 0,128, 0,064, 0,032, 0,016, 0,008 e 0,004 EU/mL a partir da solução de trabalho de CSE em tubos de poliestireno. Submeter a turbilhonamento cada tubo durante 30 segundos após diluição. Um esquema de diluição é mostrado na tabela abaixo. Esquema de diluição para Soluções-padrão de estoque
Figure img0215
* A diluição final de duas vezes ocorre nos tubos de reação.
Preparo de amostra
[0001801] Preparo de amostra de Substância de Fármaco. Preparar a diluição de amostra para 0,25 mg/mL. Calcular o volume de LRW ne-cessário para a diluição usando a Equação abaixo. Remover cuidado-samente a parte de cima do recipiente de amostra e adicionar 50 μL de amostra na quantidade apropriada (Equação abaixo) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer uma solução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbilhonamento a amostra durante 30 segundos. Cobrir a parte de cima do recipiente de amostra com uma camada de Parafilm®.
Exemplo:
[0001802] Para uma amostra tendo uma concentração de 24,7 mg/mL, adicionar 50 μL (0,05 mL) de amostra a 4,89 mL de água. Equação 2:
Figure img0216
Preparo de amostra de liofilizado de Produto de fármaco. NOTA: Um único lote de Produto de fármaco consiste em três amostras distintas, "início", "meio" e "fim".
[0001803] Reconstituir um frasco de produto de fármaco com água LAL Reagent de acordo com as especificações de Identificação de produto (PI). Diluir a amostra reconstituída para 0,25 mg/mL. Calcular o volume de LRW necessário para a diluição usando a Equação 2. Remover cuidadosamente a parte de cima do recipiente de amostra e adicionar 50 μL de amostra na quantidade apropriada (Equação 2) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer uma solução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbilhonamento a amostra durante 30 segundos. Cobrir a parte de cima do recipiente de amostra com Parafilm®.
[0001804] Preparo de amostra de Produto de fármaco pronta para uso. Diluir a amostra para 0,25 mg/mL. Calcular o volume de LRW necessário para a diluição usando a Equação 3. Remover cuidadosamente a parte de cima do recipiente de amostra e adicionar 10 μL de amostra à quantidade aproriada (Equação 3) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer uma solução a 0,25 mg/mL. Submeter a turbi- lhonamento a amostra durante 30 segundos. Cobrir a parte superior do recipiente de amostra com Parafilm®.
Exemplo:
[0001805] Para uma amostra tendo uma concentração de 125,0 mg/mL, adicionar 10 μL (0,01 mL) de amostra a 4,99 mL de água. Equação 3:
Figure img0217
[0001806] Placebo de Produto de fármaco pronto para uso. Diluir um placebo (conforme se ele estivesse em uma concentração nominal de produto de fármaco de proteína de 125 mg/mL) para 0,25 mg/mL. Isso é equivalente a uma diluição de 1: 500. Calcular o volume de LRW ne-cessário para a diluição usando a Equação 3. Remover cuidadosamente a parte superior do recombinante de amostra e adicionar 10 μL de amostra até a quantidade apropriada (Equação 3) de LRW em um tubo de poliestireno para fazer uma solução equivalente a 0,25 mg/mL.
[0001807] Controle positivo água. O controle positivo é preparado a partir da Curva-padrão através da adição de 100 μL de 0,032 EU/mL de padrão a 100 μL de LRW nos tubos de reação. Ajuste do tubo de reação – Exemplo
Figure img0218
[0001808] Adição de reagente Pyrotell-T®. Adicionar 50 μL de solução de Pyrotell-T® a cada tubo de reação (controle negativo, padrões, amostras, amostras reforçadas e controle positivo água) com uma pipeta de repetição. Submeter a turbilhonamento cada tubo durante 1-2 segundos e inserir os mesmos na cavidade atribuída (Tabela 1) no instrumento Pyros Kinetix.
ANÁLISE DE DADOS
[0001809] Análise. O software PyroSoft®-11 realizará uma autoanáli- se de todos os padrões, controles e amostras e reportará os resultados para a amostra em EU/mL ao término da operação. Cada amostra em duplicata é reportada como um valor médio de das duas. Se um dos tubos do valor com par em duplicata não é detectados pelo software PyroSoft®-11, esse tubo pode ser excluído de análise de dados adicional e os resultados re-calculados. Recuperação (controle de amostra positivo) será calculada baseado na quantidade de endotoxina na amostra mais a quantidade endotoxina reforçada na amostra (0,016 EU/mL).
[0001810] Converter o valor de EU/mL para o valor de EU/mg de amostra diluída de Substância de Fármaco ou Produto de fármaco.
[0001811] Os dados brutos são gerados como EU/mL e reportados como EU/mg de proteína. Para converter EU/mL para EU/mg, dividir o valor de endotoxina (EU/mL) pela concentração de proteína (0,125 mg/mL). Os resultados são reportados em um quadro significativo.
Exemplo:
[0001812] Para a amostra tendo 0,23 EU/mL no ensaio, o valor de re- portável EU/mg será de 2 EU/mg (1,8 arredondado para um quadro significativo).
Figure img0219
[0001813] Resultados para amostra de Substância de Fármaco. Os resultados são determinados como um quadro significativo. O QL do ensaio é 0,02 EU/mg. Se a amostra é <0,02 EU/mg, o resultado re- portável é [<QL, (QL = 0,02 EU/mg)].
[0001814] Resultados para amostra de Produto de fármaco. A média das três amostras para cada Lote de produto de fármaco ("começo", "meio" e "final") em EU/mg é o resultado reportável para amostras de produto de fármaco em um quadro significativo. Para o caso onde uma ou mais das amostras para um Lote são <QL (0,02 EU/mg), o valor de 0,02 EU/mg será usado para cálculo da média. Se o resultado médio reportável é <0,02 EU/mg, o resultado reportável é [<QL, (QL = 0,02 EU/mg)]. Exemplo:
Figure img0220
[0001815] Para esse Exemplo, o placebo de produto de fármaco seria reportado como: 3 EU/mL, equivalente a 0,02 EU/mg em uma concen-tração nominal de produto de fármaco de 125 mg/mL.
[0001816] Adequabilidade de sistema. A amostra de Substância de Fármaco deverá ser recebida em recipientes de poliestireno a 2-8°C. Se as amostras são recebidas em diferentes recipientes em uma temperatura diferente, elas não podem ser usadas no ensaio. O coeficiente de determinação para a Curva-padrão (r2) deve ser >0,99. Se o valor de r2 é <0,99, o ensaio não é válido e deve ser repetido. A concentração média de endotoxina para o controle negativo deve ser <0,002 EU/mL. Se o controle negativo é >0,002 EU/mL, o ensaio não é válido e deve ser repetido. O valor de amostra reforçada deve cair dentro da faixa de 50 - 200% do valor esperado. Se o valor de amostra reforçada é <49 % ou >201% do valor esperado, o ensaio não é válido e deve ser repetido. A concentração média de endotoxina para o controle po- sitivo água deve cair dentro da faixa de 50-200% da mesma concentração na Curva-padrão. Se o valor do controle positivo, água, é <49 % ou >201% do valor esperado, o ensaio não é válido e deve ser repetido. Valores de endotoxina para as amostras deve cair dentro da faixa da Curva-padrão de endotoxina (entre 0,002 e 0,064 USP-EU/mL). Se as amostras são <0,002 EU/mL, elas estão abaixo do QL do ensaio e reportar-se à seção 5.4. Se amostras são >0,064 USP-EU/mL, as amostras devem ser ainda diluídas para a faixa do ensaio.
Exemplo 49 - Testes de limites microbianos (Bioburden) para CTLA4-Ig
[0001817] Esse método proporciona procedimentos de teste para es-timativa do número de microorganismos aeróbicos viáveis presentes e para isenção de espécies microbianas designadas. Em uma modalidade, a composição de CTLA4-Ig deverá ter a bioburden em um nível de <1 CFU/10 mL. No preparo para e na aplicação dos testes, observar precauções assépticas ao manipular os espécimes. O termo "Cresci-mento" é definido como a presença e proliferação presumida de mi-croorganismos viáveis. A validade dos resultados do teste repousa grandemente sobre a demonstração de que os espécimes de teste aos quais eles são aplicados não inibem, em si, o crescimento, sob as condições de teste, de microorganismos que possam estar presentes. Essa demonstração incluirá estimulação de espécimes apropriadamente preparados do material a ser testado com culturas viáveis distintas de organismos de estimulação apropriados para assegurar que o teste não inibe o crescimento dessas classes de organismo, por que elas estariam presentes no material testado. Qualquer parte de qualquer produto de beta lactame o qual é usado para testagem deve ser tratada com uma quantidade adequada de penicilinase de acordo com os procedimentos validados.
Fluidos de diluição e Meios
[0001818] 1. Preparo de meio de cultura e fluidos de diluição. Meios de cultura e fluidos de diluição podem ser preparados ou meios de cultura desidratados podem ser usados contanto que, quando reconstituídos diretamente pelo fabricante ou distribuidor, eles tenham ingredientes similares e/ou proporcionem meios comparáveis àqueles obtidos de uma formulação fornecida aqui. No preparo de meios através das fórmulas, dissolver os sólidos solúveis na água, usando calor se necessário, para obter dissolução completa e adicionar soluções de ácido clorídrico ou hidróxido de sódio em quantidades suficientes para proporcionar o pH desejado no meio quando ele está pronto para uso. Os meios têm de ser esterilizados em uma autoclave usando um procedimento de esterilização validado. Determinar o pH após esterilização a 25° ± 2°C.
Promoção de Crescimento
[0001819] a) Cada batelada de meio submetido à autoclave é testado com relação à sua capacidade de promover o crescimento através de inoculação de recipientes de teste em duplicata de cada meio com menos de 100 microorganismos e incubação de acordo com as condições especificadas abaixo. Os organismos não podem ter mais de 5 passagens da cultura de semeaduramente recebida da ATCC.
[0001820] b) O meio de teste é satisfatório se evidência de crescimento aparece dentro de 48-72 horas para bactérias e 5 dias para fungos. O teste de promoção de crescimento pode ser conduzido simultaneamente com o uso do meio de teste para testagem de materiais. Contudo, a testagem de materiais é considerada inválida se esse teste de promoção de crescimento não tem sucesso. Microorganismos de teste para uso em testagem de meio que promove o crescimento
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Figure img0222
*Outras espécies Salmonella não patogênicas também podem ser adequadas.
Procedimento para contagem de micróbios aeróbicos totais ou contagem combinada total de mofos e levedos
[0001821] a) Preparo de amostra. A menos que de outro modo orientado pelo método específico, preparar o espécime para testagem como segue. Refira-se à seção apropriada abaixo para informação adicional com relação aos meios e procedimentos de incubação, dependendo de qual teste está sendo realizado. i) Pós brutos e matérias primas - Dissolver ou suspender 10 gramas ou 10 mL de amostra em 90 mL de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2. Misturar bem e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. ii) Cápsulas - Transferir assepticamente 2 envoltórios de cápsula e seus conteúdos para 20 mL de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2. Aquecer em um banho de água (aproximadamente 45°C) durante cerca de 10 minutos. Agitar vigorosamente até que a suspensão se torne uniforme e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. iii) Pós para suspensão - Reconstituir a amostra de acordo com as orientações no rótulo usando tampão de fosfato estéril, pH de 7,2 como o diluente. Agitar bem e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. iv) Soluções/Suspensões - Transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. v) Comprimidos - Transferir 4 comprimidos (comprimidos duros deverão primeiro ser pulverizados com um pilão estéril) para 20 mL de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2. Agitar tem até que os comprimidos desintegrem ou dissolvam completamente e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. vi) Envoltórios de cápsula - Transferir 25 envoltórios de cápsula para 100 mL de tampão de fosfato estéril, pH de 7,2 e aquecer em um banho de água (aproximadamente 45°C) durante cerca de 15 minutos, agitando intermitentemente para dissolver. Agitar bem e transferir 1,0 mL para cada um de dois discos de Petri estéreis. vii) Pomadas - Em um recipiente estéril, empoçar aproxi-madamente 5 mL de cada uma de 3 amostras tomadas através do lote e misturar. Transferir 0,1 mL dessa amostra empoçada para cada um de dois discos de Petri estéreis. Dispersar a amostra sobre a superfície do meio com o auxílio de uma haste de vidro curvada estéril ("hockey stick"). Usando uma haste estéril separada para cada lâmina, incubar conforme descrito em "Contagem Aeróbica Total". b) Filtração em membrana. Como uma alternativa aos procedimentos em lâmina, um procedimento de teste de filtração em membrana adequado validado pode ser usado. Esse pode ser especi-almente útil para produtos contendo substâncias inibitórias. c) Retestagem. Para fins de confirmar um resultado duvidoso através de qualquer um dos procedimentos a seguir, um reteste pode ser realizado usando duas vezes e meia (mínimo) do tamanho da amostra inicial, com ajustes de diluente apropriados. Teste com relação à contagem de micróbios aeróbicos totais 1. Preparar as amostras a serem testadas conforme descrito. A cada lâmina, adicionar 15-20 mL de TSA estéril o qual tenha sido fundido e esfriado para aproximadamente 45°C. Cobrir cada gen- tilmente inclinar ou agitar o disco para misturar a amostra com o ágar e deixar os conteúdos solidificar em temperatura ambiente. Inverter as lâminas e incubar durante 48 a 72 horas a 30°-35°C. 2. Após incubação, examinar as lâminas com relação ao crescimento usando um dispositivo de ampliação, tal como um Quebec Colony Counter, contar o número de colônias e calcular os resultados em uma base unitária (por comprimido, cápsula, mL, gram, etc.) conforme designado na especificação dos materiais e avaliar a aceitabilidade contra a especificação dos materiais. 3. Caracterizar adicionalmente a contaminação bacteriana através de coloração de gram e morfologia microscópica. Submeter bactérias gram-negativas e cocos gram-positivos à testagem bioquímica (ou meios alternativos adequados de identificação).
[0001822] Nota: Quando de contagem das colônias, de forma a facilitar a diferenciação de crescimento de colônias do Material que está sendo testado, algumas vezes é aconselhável usar uma solução a 2% de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) como um agente de intensificação para observar o crescimento microbiano. TTC é um indicador de oxidação-redução incolor que se torna vermelho quando é hidrogena- do através dos açúcares de redução encontrados em células vivas, desse modo, tornando a colônia de uma cor vermelho profundo. Usar TTC, inundar a lâmina de Petri com aproximadamente l mL da solução a 2% e incubar a lâmina a 30°-35°C durante aproximadamente 2 horas. Colônias microbianas corarão diferentemente de outro material presente sobre a lâmina e podem ser mais facilmente contadas. C. Teste para contagem total combinada de mofos e levedos 1. Preparar as amostras a serem testadas conforme descrito. A cada lâmina, adicionar 15-20 mL de SDA estéril o qual tenha sido fundido e esfriado para aproximadamente 45°C. Cobrir cada disco e gentilmente inclinar ou agitar o disco para misturar a amostra com o ágar e deixar os conteúdos solidificar em temperatura ambiente. Inverter as lâminas e incubar durante 5 a 7 dias a 20°-25°C. [NOTA: Não mexer nas lâminas durante incubação, porque a dispersão de mofo dentro da lâmina proporcionaria uma contagem maior do que aquela realmente presente.] 2. Após incubação, examinar as lâminas com relação ao crescimento usando um dispositivo de ampliação, tal como um Quebec Colony Counter, contar o número de colônias e calcular os resultados em uma base unitária (por comprimido, cápsula, mL, gram, etc.) conforme designado na especificação dos materiais e avaliar a aceitabilidade contra a especificação dos materiais. 3. Caracterizar adicionalmente a contaminação fúngica através da morfologia macroscópica e microscópica. Onde apropriado, submeter os levedos à testagem bioquímica (ou meios alternativos adequados de identificação). Procedimento para Testagem da ausência de organismos indesejáveis a) Preparo de amostra - A menos que de outro modo espe-cificado pelo Método específico, preparar a amostra para testagem conforme descrito acima na seção preparo de amostra para os mofos e levedos aeróbicos totais e totais combinados. Refira-se à seção apropriada abaixo para informação adicional, dependendo de qual teste está sendo realizado. b) Filtração em Membrana - Como uma alternativa aos pro-cedimentos de pré-enriquecimento, um procedimento de teste de filtração em membrana validado pode ser usado. Esse pode ser especialmente útil para produtos contendo substâncias inibitórias. c) Retestagem - Para fins de confirmar um resultado duvidoso através de qualquer um dos procedimentos a seguir, um reteste pode ser realizado usando duas vezes e meia (mínimo) do tamanho da amostra inicial, com ajustes de diluente apropriados.
[0001823] B. Teste com relação à ausência de Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa. A uma amostra, adicionar TSB para fazer 100 mL, misturar e incubar durante 24-48 horas a 30°-35°C. Examinar o meio com relação ao crescimento e, se presente, usando um loop de inoculação, colocar uma porção em um meio seletivo, incubar e examinar com relação às características listadas abaixo (kits de identificação comercialmente disponíveis podem substituir os testes de reação individuais): Características de Staphylococcus aureus
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[0001824] *Transferir colônias suspeitas represent tativas do ágar sele- tivo para tubos individuais contendo 0,5 mL de plasma de mamífero (de preferência coelho ou cavalo), incubar a 37°C, examinar a 3-4 horas e, substancialmente, em intervalos adequados durante até 24 horas com relação à coagulação. Características de Pseudomonas aeruginosa
Figure img0224
*Para o teste de pigmento, colocar colônias suspeitas representativas do Centrimide Ágar em discos de PSF e PSP. Cobrir e incubar a 35°C ± 2°C durante um mínimo de três dias. Examinar as lâminas sob luz UV.
[0001825] **Para o teste de oxidase, confirmar quaisquer colônias suspeitas transferindo para tiras ou discos impregnados com dicloridra- to de N,N-dimetil-o-fenilenodiamina; se não há desenvolvimento de uma cor rosa mudando para púrpura, a amostra vai ao encontro dos requisitos com relação à ausência de Pseudomonas aeruginosa. Note que kits de teste comercialmente disponíveis os quais foi demonstrado ter um bom desempenho de um modo aceitável também podem ser usados.
[0001826] Se nenhum crescimento é observado ou se nenhuma das colônias se conforma ao conjunto de características listadas nas tabelas acima, a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à ausência desse organismo.
Teste com relação à ausência de espécies Salmonella e Escherichia coli
[0001827] Transferir a amostra para um recipiente estéril para conter um total 100 mL de meio Fluido de Lactose e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas. Agitar gentilmente e examinar com relação ao crescimento. (Kits de identificação comercialmente disponíveis podem substituir os testes de reação individuais). a) Salmonella - se crescimento está presente em meio Fluido de Lactose: 1. Transferir porções de 1,0 mL para tubos de 10 mL com meio Fluido de Selenita-Cistina e meio Fluido de Tetrationato, misturar e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas. 2. Por meio de um loop de inoculação, colocar porções de ambos os meios sobre meio de ágar Brilliant Green, meio de ágar Xilo- se-Lisina-Deóxicolato e meio de ágar de sulfito de bismuto. Cobrir, inverter e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas e examinar com relação às características morfológicas listadas abaixo:
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3. Identificação adicional pode ser conduzida transferindo colônias suspeitas para um tubo com ponta/declive com meio triplo de açúcar-ferro-ágar primeiro riscando a superfície do declive e, então, colocando o fio por baixo da superfície. Incubar a 30°-35°C durante 2448 horas e examinar. Se nenhum tubo mostra evidência de declives alcalinos (vermelhos) e pontas ácidos (amarelo) (com ou sem formação concomitante da cor preta da ponta), a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à ausência do gênero Salmonella. b) Escherichia coli - se crescimento está presente no meio de lactose fluido: 1. Por meio de um loop de inoculação, colocar uma porção em meio de ágar MacConkey. Cobrir, inverter e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas. 2. Se nenhuma das colônias resultantes mostra uma aparência vermelho-tijolo (com uma possível zona circundante de bile precipitada) e são bastonetes gram negativos (Cocos-Bacilos), a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à ausência de Escherichia coli. 3. Se as colônias combinam com essa descrição, transferir as mesmas para meio de ágar Levine-Eosin-Methylene Blue. Cobrir os discos, inverter e incubar a 30°-35°C durante 24-48 horas. Se nenhuma das colônias exibe as características de um brilho metálico sob a luz refletida e aparência azul-preta sob luz transmitida, a amostra vai ao encontro dos requisitos do teste com relação à ausência de Escherichia coli. Fórmulas de meio 1. Tampão de fosfato, pH de 7,2 a) Solução de estoque: fosfato de potássio monobásico 34,0 g; Água (destilada ou desionizada) 1000 mL; Hidróxido de sódio TS 175 mL. Dissolver 34 gramas de potássio monobásico; fosfato em cerca de 500 mL de água contido em um frasco volumétrico de 1000 mL. Ajustar para pH de 7,1-7,3 através da adição de Hidróxido de sódio TS (cerca de 175 mL), adicionar água até volume e misturar. Esterilizar e armazenar sob refrigeração (2°-8°C) até uso. b) Solução de trabalho. Para uso, diluir a solução de estoque com água em uma proporção de 1 a 800 e esterilizar. 2. TSA (Ágar de tripticase de soja/ágar de digestão de soja com caseína). Digestão pancreática de caseína 15,0 g; digestão com papaína de farinha de soja 5,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; Ágar 15,0 g; Água 1000 mL; pH após esterilização: 7,3 ± 0,2. 3. TSB (Caldo de tripticase de soja/caldo de digestão de caseína de soja). Digestão pancreática de caseína 17,0 g; digestão com papaína de farinha de soja 5,0 g; Cloreto de sódio 5,0 g; fosfato de sódio dibásico 2,5 g; Dextrose 2,5 g; Água 1000 mL; pH após esterilização: 7,3 ± 0,2; 4. SDA (Ágar de dextrose de Sabouraud); Dextrose 40 g; Mistura de partes iguais de digestão péptica de tecido animal e digestão pancreática de caseína 10,0 g; Ágar 15,0 g; Água 1000 mL; misturar e levar à ebulição para obter uma solução; pH após esterilização: 5,6 ± 0,2, 5. FLM (meio de lactose fluido). Extrato de carne 3,0 g; digestão pancreática de Gelatina 5,0 g; Lactose 5,0 g; Água 1000 mL; Esfriar tão rapidamente quanto possível após esterilização. pH após esterilização: 7,1 ± 0,2.
Exemplo 50 - Análise de Gel de Focalização Isoelétrica de CTLA4- Ig
[0001828] A finalidade desse exemplo é determinar o ponto isoelétri- co, número de isoformas e micro heterogeneidade de CTLA4-Ig.
Materiais
[0001829] Kit de Calibração IEF (pH de 3 a 10), (Amersham Pharma- cia, Catálogo N° 17-0471-01) ou (pH de 2,5 a 6,5), (Amersham Phar- macia, Catálogo No. 17-0472-01).
[0001830] Ampholine PAGplate gel: pH de 4,0 a 6,5, (Amersham Pharmacia, Catálogo N° 80-1124-81).
[0001831] Aplicadores de amostra de IEF (Amersham Pharmacia, Catálogo N° 80-1129-46).
[0001832] Tiras de eletrodo de IEF (Amersham Pharmacia, Catálogo N° 80-1104-40).
[0001833] Ácido fosfórico (85%), (EMD, Catálogo N°. PX0995-6).
Equipamento
[0001834] Multiphor II Electrophoresis System, (GE Healthcare, Catálogo N° 18-1018-06).
Preparo de Reagentes
[0001835] Solução Tampão de Anodo (ácido glutâmico a 0,1 M em ácido fosfórico a 0,5 M) (pavios embebidos com a mesma são colocados sobre o lado (+) do esfregaço). Exemplo: 3,4 mL de ácido fosfórico a 85% 1,47 g de ácido glutâmico a ±0,02 g Água com grau para HPLC Combinar os reagentes acima em um cilindro graduado de 100 mL, compondo até 100 mL com água com grau para HPLC, tampar e inverter várias vezes para misturar. Armazenar a solução a 2-8°C durante até seis meses. Solução Tampão de Catodo (β-alanina a 0,1 M) (pavios embebidos com a mesma são colocados sobre o lado (-) do esfregaço). Exemplo: 0,9 g de β-alanina a ± 0,02 g Água com grau para HPLC. Combinar os reagentes acima em um cilindro graduado de 100 mL, compondo até 100 mL com água com grau para HPLC, tampar e inverter várias vezes para misturar. Armazenar a solução a 2-8°C durante seis meses. Solução de Fixação (ácido 5-sulfo-salicílico a 3,5% em ácido tri- cloroacético a 12%). Exemplo: 240 g de ácido tricloroático a ± 5,0 g 70 g de ácido 5-sulfo-salicílico a ±2,0 g 2000 mL de água para HPLC Combinar os reagentes acima para compor um volume de 2000 mL. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até três meses.
Solução de coloração:
[0001836] Misturar a solução GelCode Blue Reagent imediatamente antes de uso invertendo gentilmente e agitando a garrafa várias vezes. Nota: É importante misturar o reagente de coloração antes de entornar ou distribuir para assegurar que uma amostra de reagente homogênea de usada.
Preparo de Controle de Coloração:
[0001837] Reconstituir a Anidrase Carbônica II com água com grau para HPLC para fazer uma solução de estoque a 1,0 mg/mL.
[0001838] 10 μL de solução de estoque são combinados com 90 μL de água com grau para HPLC para proporcionar uma solução de trabalho a 0,10 μg/μL.
[0001839] carregar 10 μL da solução a 0,10 μg/μL sobre o gel (carga de 1,0 μg).
Procedimento Diluição de amostra
[0001840] Preparar uma solução de amostra a 20 μg/μL e material de referência em água para HPLC.
[0001841] Concentração desejada
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Exemplo:
Figure img0227
Aparelho e Preparo de Gel
[0001842] Conectar a placa de resfriamento da unidade de eletroforese Multiphore II ao Circulador Termostático e ajustar a temperatura a 10°C ± 2°C. Nota: Deixar o circulador pelo menos 20 minutos para atingir a tempe-ratura acima.
[0001843] Remover o gel do refrigerador. Cortar cuidadosamente ao longo dos lados do envelope, certificando-se de não cortar o gel/suporte de gel.
[0001844] Adicionar aproximadamente 1,0 mL de água com grau para HPLC a uma borda da plataforma de resfriamento.
[0001845] Colocar uma borda do gel/suporte de gel na água de modo que a ação capilar transporte a água através de toda a borda do gel. Lentamente, certificar-se de que bolhas de ar não estão encerradas, aplicar o gel através da plataforma de resfriamento. Água com grau para HPLC adicional pode ser aplicada se necessário.
[0001846] Remover o filme transparente da superfície do gel.
[0001847] Embeber um eletrodo com Solução Tampão de Anodo e colocar sobre a borda do gel mais próxima das marcações (+) da plataforma de resfriamento.
[0001848] Embeber um eletrodo na Solução Tampão de Catodo e colocar sobre o outro lado do gel, o qual está mais próximo das marca- ções (-) sobre a placa de resfriamento.
[0001849] Após as tiras de eletrodo terem sido aplicadas, cortar cui-dadosamente o excesso usando uma lâmina de barbear nova, de modo que as tirar terminam na borda do gel e não no suporte de gel.
[0001850] Aplicar pedaços de aplicação de amostra sobre as marcações (-) do lado mais próximo sobre a plataforma de resfriamento, certificando-se de que há bom contato entre os pedaços de aplicação de amostra e o gel.
[0001851] Nota: Certificar-se de que os aplicadores de amostra de IEF não tocam a tira embebida com tampão de catodo, não vazam para o tampão de catodo e estejam suficientemente separadas para assegurar que cada amostra ocorre separadamente. Um aplicador de amostra deverá estar firmemente colocado sobre o pedaço de gel.
[0001852] Colocar o prendedor de eletrodo da unidade Multiphor II e alinhar os eletrodos ao longo do centro dos cabos de eletrodo sobre o gel. Conectar os dois eletrodos do prendedor de eletrodo à unidade de base e colocar a tampa de segurança em posição. Usando fita adesiva, cobrir os orifícios na tampa de segurança para impedir o gel de secar. Conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Pré-focalizar o gel com o conjunto de suprimento de energia nos ajustes abaixo, até a tensão atingir >300V. Tabela 1. Ajustes de suprimento de energia para géis de IEF pré- foco
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Carregamento de gel
[0001853] Após o gel ter sido pré-focalizado, desligar o suprimento de energia, remover a tampa de segurança, desconectar os eletrodos e remover o prendedor de eletrodo da unidade Multiphor II.
[0001854] Carregar as amostras sobre aplicadores de amostra em uma sequência específica. Para esse procedimento, certifique-se de que a tira de tampão de catodo (-) está próxima do analista.
[0001855] As amostras são carregadas da direita para a esquerda. Primeiro, fazer duas ou mais aplicações dos padrões de calibração de IEF (fileiras 1 & 2), uma do material de referência (fileira 3), uma da amostra de teste N° 1 (fileira 4), uma do preparado de controle de cali- bração (fileira 5), uma de amostra de teste N° 2 (fileira 6), uma do material de referência (fileira 7) e uma do padrao de calibração de IEF (fileira 8).
[0001856] Adicionar as terceira e quarta amostras aplicando uma apli-cação de material de referência (fileira 9), uma aplicação de amostra de teste N° 3 (fileira 10), uma aplicação do reparo de controle de coloração (fileira 11), uma aplicação de amostra de teste N° 4 (fileira 12), uma aplicação de material de referência (fileira 13) e uma aplicação de padrão de calibração de IEF (fileira 14). As quinta e sexta amostras são aplicadas repetindo o mesmo padrão que as amostras 3 e 4, usando as fileiras 15 a 20. O padrão de carregamento de amostra é mostrado na Tabela 2. Tabela 2. Dilução de amostra e padrão de carregamento de gel
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[0001857] Eletroforese. Quando o gel es tá carregado, colocar o prendedor de eletrodo da unidade Multiphor II e alinhar os eletrodos ao longo do centro dos cabos de eletrodo sobre o gel. Conectar os dois eletrodos do prendedor de eletrodo à unidade de base e colocar a tampa de segurança em posição. Usando uma fita adesiva, cobrir os orifícios na tampa de segurança para impedir o gel de secar. Conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Ajustar tensão, corrente e energia apropriados e começar a operação. Tabela 3. Ajustes de suprimento de energia para operação dos géis de IEF
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[0001858] Após o gel ter sido operado, des igar o suprimento de ener- gia, remover a tampa de segurança, desconectar os eletrodos e remover o prendedor de eletrodo da unidade Multiphor II. Remover cuidadosamente os cabos de eletrodo e aplicadores de amostra do gel. Nota: Você pode colocar o gel de esfregaço diretamente em solução de fixação e deixar os cabos de eletrodo e peças de aplicação flutuar do gel.
[0001859] Remover o gel/suporte de gel da lâmina de resfriamento e colocar em um disco plano contendo um volume suficiente de solução de fixação (etapa 3.3) para manter o gel úmido. Cobrir com um envoltório plástico e colocar sobre uma plataforma orbital e incubar 20 - 60 minutos. Registrar os tempos inicial e final sobre a planilha de IEF. NOTA: Géis de IEF deixados em fixador muito tempo algumas vezes delaminam. Isso é evitado limitando o tempo de fixação para aproxi-madamente uma hora.
4.5Coloração do gel
[0001860] Após fixação, enxaguar o gel 3 x 5 minutos com um volume suficiente de água com grau para HPLC para manter o gel úmido. Re-gistrar os tempos inicial e final sobre a planilha de IEF.
[0001861] Após mistura da solução de Reagente de Coloração GelCode Blue antes de uso (etapa 3.4), colocar o gel em um volume suficiente de corante para manter o gel úmido. Incubar 15 - 24 horas em um recipiente hermeticamente vedado para impedir evaporação de reagente. Registrar os tempos inicial e final sobre a planilha de IEF.
[0001862] Géis corados são descorados substituindo a Solução de Coloração por água com grau para HPLC. Enxaguar o gel com pelo menos três trocas de água durante um período de 1-2 horas. Registrar os tempos inicial e final sobre a planilha de IEF. Após descoloração, o gel está pronto para exploração. Nota: Lavagens adicionais podem ser requeridas para reduzira coloração de base sobre o gel de IEF.
Adequabilidade de sistema
[0001863] Padrões de focalização isoelétrica deverão ser facilmente distinguidos da base. Padrões de proteína que migram para valores de pI entre 4,0 e 6,5 são visíveis sobre o gel. Padrões de proteína com pIs que estão fora dessa faixa não são visíveis sobre o gel. Os marcadores de pI a 3,50, 4,55, 5,20 e 5,85 são identificados e rotulados sobre a imagem do gel. Tabela 4: Componentes dos padrões de calibração IEF
Figure img0232
[0001864] Um controle de coloração-padrão de anidrase carbônica II (pI de 5,4) em um baixo nivel de carregamento de proteína (1,0 μg) é usado para visualização da consistencia de coloração do gel. Essa banda deve ser facilmente distinguida da base através de inspeção visual da imagem de gel explorada.
[0001865] O material de referência de CTLA4-Ig deverá ser enumerado a 10-22 bandas dentro da faixa de pI de 4,3 a 5,6.
[0001866] A intensidade cumulativa percentual das principais bandas proeminentes de material de referência de CTLA4-Ig deverá estar >90% dentro da faixa de pI de 4,3 a 5,3.
[0001867] Para o material de referência, confirmar através de inspeção visual que existem três bandas principais focalizadas entre os marcadores de pI de 4,5 - 5,2 (veja figura para o padrão das bandas principais).
Exploração e análise de gel
[0001868] Após eletroforese e coloração, todos os géis são explorados usando um densitômetro. Os arquivos de imagem são armazenados sobre o disco rígido/network local do computador e arquivados via a network de área local. A análise das imagens de gel exploradas é realizada usando o software ImageQuant TL (v2003.03). Os parametros de exploração e análise são listados na Tabela 5. As explorações são geradas e quantificadas usando os procedimentos do departamento. Tabela 5 - Parametros de exploração e análise de gel
Figure img0233
[0001869] Nota: Os procedimentos acima proporcionam etapas básicas para a análise de imagens de gel. Os parametros de exploração na Tabela são definidos. Os parametros de detecção de banda na Tabela são ajustes iniciais sugeridos. Ajuste dos parametros de detecção de banda pode ser necessário para identificar precisamente bandas em virtude de alterações físicas do gel (tal como encolhimento do gel após coloração/descoloração) e alteração do formato e desvio de banda do gel. Corrigir manualmente quaisquer bandas que faltam ou que foram erroneamente identificadas.
[0001870] Explorar os géis usando os parametros de exploração definidos na Tabela. Toda a análise e avaliações do gel deverão ser feitas a partir da imagem explorada. Abrir um arquivo de imagem (dados brutos explorados) de <1D Gel Analysis> no ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra de ferramentas e diminuir o parâmetro <Image Histogram> até que todas as bandas estejam claramente visíveis. Selecionar <Lane Creation> e ecolher <Manual> para ajustar <Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane % Width> para 100% para cobrir as fileiras de gel. Alinhar apropriadamente fileiras únicas se ne- cessario. Usar o metodo <Rolling Ball> para subtrair a base. Detectar bandas usando os ajustes iniciais <Minimum Slope>, <Noise Reduc tion>, <%Maximum Peak> listados na Tabela 3. Ajuste desses valores é necessário para identificar precisamente as bandas. Computar o valor de pI de banda usando o marcador de pI padrão dos marcadores rotulados listados na Seção Adequabilidade de Sistema para o gel com pH/pI de 4,0-6,5. Pular as etapas de calibração e normalização. Enumerar o número de bandas dentro da faixa de pI de 4,3 a 5,6. Exportar os resultados na planilha do Excel para documentação e relatório adicionais.
Cálculo da Intensidade Cumulativa Percentual de Amostras Com relação ao Material de referência.
[0001871] Nota: A intensidade cumulativa percentual para a amostra é o percentual de bandas que migram dentro da faixa de pI de 4,3-5,3, quando comparado com 100% de todas as bandas presentes na fileira. A seguinte equação deverá ser usada para o cálculo da intensidade cumulativa percentual de amostras com relação ao material de referência:
Figure img0234
[0001872] Nota: Refira-se ao padrão de carregamento de gel; o material de referência próximo a uma amostra deverá ser usado para o cálculo. Se o material de referência tem um valor cumulativo de 100% e a amostra tem um valor de 95%, o percentual relativo da amostra é 95/100*100 = 95%. Se a referência tem um valor cumulativo de 95% e a amostra tem um valor de 100%, o percentual relativo da amostra é 100/95*100 = 105%.
Reportagem de resultados
[0001873] Reportar o número de bandas enumerados dentro da faixa de pI de 4,3 - 5,6. Reportar a intensidade cumulativa percentual com relação àquela do material de referência de CTLA4-Ig dentro da faixa de pI de 4,3 - 5,3 (veja figura para um exemplo de como reportar a análise de gel IEF quantitativa definida nesse método). Confirmar através de inspeção visual que existem três bandas principais focalizadas entre os marcadores de pI 4,5 - 5,2 com relação ao material de referência (veja figura 1 para o padrão de bandas principais) e reportar o número de bandas principais observado dentro dos marcadores de pI 4,5 - 5,2. Confirmar, através de inspeção visual, que nao existem mais novas bandas significativas entre os marcadores de pI 4,5 - 5,2 com relação ao material de referência.
[0001874] Em determinadas modalidades, os resultados desse método mostrarão bandas em uma faixa de pI de 4,3- 5,6 ou 4,3 - 5,3, sendo identificadas de 10 a 22 bandas, com a intensidade de banda cumulativa de 90 - 110%. Em outra modalidade, a faixa de pI é de 4,5 - 5,2 com 3 bandas principais. Em outra modalidade, a faixa de pI é 4,35,6 com 10 a 22 bandas. Em outra modalidade, a faixa de pI é 4,3 - 5,3 com uma intensidade de banda cumulativa de 95 - 105%. Em outra modalidade, a faixa de pI é de 4,5 - 5,2 com 2 bandas proeminentes.
Exemplo 51: SDS-PAGE de CTLA4-Ig
[0001875] O exemplo mostra o exame de CTLA4-Ig sob condições reduzidas e não-reduzidas através de SDS-PAGE.
Materiais
[0001876] 2X Tampão de Amostra de Tris-Glicina (Tris-Gly) SDS (Invi- trogen, Catálogo N° LC2676).
[0001877] 10X Agente de Redução de Amostra "NuPAGE" (Invitrogen, Catálogo N° NP0004).
[0001878] Gel de Tris-glicina a 4-20% - cavidades de 1,0 mm x 12 (In- vitrogen, Catálogo N° EC60252BOX).
[0001879] 10X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS (Invitrogen, Catálogo N° LC2675).
[0001880] Padrão Não Corado de Faixa Ampla Mark12TM (Invitrogen, Catálogo N° LC5677).
[0001881] Reagente de Coloração GelCode Blue (Azul Coomassie), (Pierce, Catálogo N° 24590: 500 mL; Catálogo No. 24592: 3,5 L).
[0001882] Kit SilverSnap® Stain II (coloração com prata) (Pierce, Catálogo N° 24612). Instrumentação: Xcell SureLock Mini Cell (Invitrogen, Catálogo No. EI0001).
[0001883] Suprimento de energia para eletroforese (OWL Separation Systems, Catálogo N° OSP-300).
Reagentes:
[0001884] Solução de fixação para corante Azul Coomassie (metanol a 50% e ácido acético a 7% em água com grau para HPLC).
Exemplo:
[0001885] A um recipiente graduado de tamanho apropriado contendo uma barra de agitação:
[0001886] Adicionar 500 mL de Metanol.
[0001887] Adicionar 70 mL de Ácido acético.
[0001888] Ajustar o volume para 1000 mL com água com grau para HPLC.
[0001889] Armazenar em temperatura ambiente durante até seis meses.
[0001890] Corante azul Coomassie (GelCode Blue). Usar retificação do recipiente. Adicionar quantidade suficiente para cobrir o gel, apro-ximadamente 50 mL para um mini gel (10 x 10 cm) em uma pequena bandeja. Armazenar a 2-8°C durante até um ano.
[0001891] Solução de Fixação de Corante de Prata (etanol a 30% e ácido acético a 10% em água com grau para HPLC).
[0001892] A um recipiente graduado de tamanho apropriado contendo uma barra de agitação: Adicionar 300 mL de Etanol. Adicionar 100 mL de Ácido acético. Ajustar o volume para 1000 mL com água com grau para HPLC. Misturar solução e armazenar a solução em temperatura ambiente durante até seis meses. Solução de Lavagem de gel (etanol a 10%).
[0001893] A um tubo para centrífuga de 50 mL: Adicionar 1,0 mL de Intensificador (Kit de Coloração com Prata). Adicionar 50 mL de Corante de Prata (Kit de Coloração com Prata). Tampar o tubo e misturar através de leve turbilhonamento durante 3 a 5 segundos. Solução de Trabalho de Revelador. Preparar imediatamente antes de uso.
[0001894] A um tubo para centrífuga de 50 mL: Adicionar 1 mL de In- tensificador (Kit de Coloração com Prata). Adicionar 50 mL de Revelador (Kit de Coloração com Prata). Tampar o tubo e misturar através de leve turbilhonamento durante 3 a 5 segundos. 1X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS. Preparar no dia de uso. A um cilindro graduado: Adicionar 900 mL de água com grau para HPLC. Adicionar 100 mL de 10X tampão de Operação de Tris-Glicina-SDS. Combinar os reagentes acima, cobrir com parafilme e inverter várias vezes para misturar.
[0001895] Controle de Coloração. Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC a um frasco contendo 2 mg de inibidor de Tripsina (controle de coloração). Isso proporcionará uma solução de estoque a 2 μg/μL estável durante seis meses a -200 C. Para impedir degradação em virtude numerosos ciclos de congelamento/descongelamento, transferir alíquotas de 50 μL para pequenos tubos e armazenar a -200 C. Adicionar 25 μL de solução de estoque a 75 μL de água com grau para HPLC a fim de pro-porcionar uma solução a 0,5 μg/μL. Adicionar 40 μL da solução a 0,5 μg/μL a 160 μL de água com grau para HPLC a fim de proporcionar uma concentração de 0,1 μg/μL. Adicionar 10 μL da solução a 0,1 μg/μL, 50 μL de 2X tampão de Amostra de TrisGly e 40 μL de água com grau para HPLC a um tubo para microcentrífuga. A concentração final do controle de coloração de inibidor de Tripsina é de 0,01 μg/μL. Amostras analisa- das quanto à liberação e coradas com Azul Coomassie são carregadas em uma concentração de 10 mg por 10 μL.
[0001896] Para géis com Azul Coomassie, diluir o Material de referência e amostra em água com grau para HPLC para uma concentração de 10 μg/μL. Exemplo: Adicionar 80 μL de uma solução de amostra de Material de Referência a 50 μg/μL + 320 μL de água com grau para HPLC. Para Amostras não-reduzidas, adicionar 10 μL da solução concentrada a 10 μg/μL a 50 μL de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly e 40 μL de água com grau para HPLC em um tubo para microcentrífu- ga. Para as Amostras reduzidas, adicionar 10 μL da solução a 10 μg/μL a 50 μL de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly, 30 μL de água com grau para HPLC e 10 μL de 10X Agente de Redução. Para géis corados com prata, diluir ainda uma solução a 10 μg/μL para 1 μg/μL em água com grau para HPLC. Exemplo: Adicionar 40 μL de solução a 10 μg/μL + 360 μL de água com grau para HPLC. Para Amostras não-reduzidas, adicionar 10 μL da solução a 1 μg/μL a 50 μL de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly e 40 μL de água com grau para HPLC em um tubo para microcentrífuga. Para as Amostras reduzidas, adicionar 10 μL da solução a 1 μg/μL, 50 μL de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly, 30 μL de água com grau para HPLC e 10 μL de 10X Agente de Redução a um tubo para microcentrífuga. Para o placebo, combinar 50 μL de 2X tampão de Amostra de Tris-Gly e 50 μL de água com grau para HPLC em um tubo para microcentrífuga. Tabela 6: A faixa de peso molecular (kDa) para bandas esperadas de proteína mínima que podem estar presentes em amostras de abatacept reduzidas e não-reduzidas
Figure img0235
[0001897] Remover o(s) gel(éis) de sua embalagem e enxaguar o exterior com água com grau para HPLC para remover pedaços de polia- crilamida. Remover cuidadosamente o pente da cavidade certificando- se de que as cavidades estão retificadas com uma ponteira de carregamento de gel se necessário. Encher as cavidades com água com grau para HPLC e sacudir de modo que a água seja removida das cavidades. Repetir o enxágue das cavidades mais duas vezes. 5.2 Inserir os géis no aparelho XCell de modo que a face curta da lâmina faceia a câmara interna. Se apenas um gel está sendo usado, inserir uma lâmina de Plexiglass sobre o lado oposto. Cunhar o(s) gel(éis) hermeticamente, formando uma câmara interna e uma externa. Encher a câmara interna com 1X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS. Verificar quanto a vazamentos, então, encher a câmara externa com 1X tampão de Operação de Tris-Glicina SDS. Todos os géis devem conter pelo menos uma fileira com Placebo e uma fileira com marcador de peso molecular. Adicionar um Controle de Coloração para géis corados com Azul Coomassie apenas. Usar ponteiras de carregamento de gel. Carregar pelo menos um "Placebo" entre as amostras reduzidas e não- reduzidas. Tratar os marcadores de peso molecular como amostra reduzida. Isso ajudará a prevenir a redução das amostras não-reduzidas em virtude de carregamento de agente de redução. Prender a parte de cima do aparelho Xcell e conectar os eletrodos ao suprimento de energia. Ajustar a corrente para 25 mAmps por gel e ajustar a tensão (v) e energia (w) para o máximo. Se operando dois géis, ajustar a corrente para 50 mAmps. Ajustar a corrente quando operando dois géis em um aparelho ou múltiplos aparelhos Xcell sobre o mesmo suprimento de energia. Submeter à eletroforese durante 60 ± 5 minutos ou até que a frente de tampão se mova pelo menos 80% da distância de migração disponível. Registrar o tempo de início e tempo de término sobre a planilha. Separar cuidadosamente duas lâminas plásticas contendo o gel separando com uma faca para gel. Após separação do gel, seguir o procedimento para coloração.
[0001898] Coloração com Azul Coomassie - Colocar o gel em 50 mL de solução de Fixação Azul Coomassie (metanol a 50% e ácido acético a 7%) durante 15 minutos. Enxaguar o gel 3 vezes com ~100 mL de água com grau para HPLC durante 5 minutos, durante um total de 15 minutos. Adicionar o corante Azul Coomassie diretamente ao(s) gel(éis) e incubar durante 15 a 24 horas. Os géis corados são descorados substituindo o reagente de coloração Azul Coomassie por 100 mL de água com grau para HPLC. Após 1 hora de descoloração, o gel está pronto para exploração.
[0001899] Exploração e análise de gel. Após eletroforese e coloração, os géis são explorados usando um densitômetro. Os arquivos de imagem são armazenados no disco rígido do computador e/ou rede e arquivados via a network de área local. A análise das imagens de gel exploradas é realizada usando o software ImageQuant TL (v2003.03). As explorações são geradas e quantificadas usando os procedimentos do departamento. Tabela 4: Parâmetros de exploração e análise de gel
Figure img0236
[0001900] Através de inspeção visual, a principal banda de CTLA4-Ig reduzida deve aparecer como uma banda ampla que migra para uma posição proximal ao marcador de peso molecular de 55.400 Da (dehi- drogenase glutâmica).
Exemplo 52 - DETERMINAÇÃO DE IMPUREZAS DE PROTEÍNA EM CÉLULAS HOSPEDEIRAS DE OVÁRIO DE HAMSTER CHINÊS (CHO) EM SUBSTÂNCIA DE FÁRMACO DE CTLA4A29YL104E-Ig ATRAVÉS DE ELISA
[0001901] Esse exemplo descreve um ensaio imunoabsorvente enzi- ma-ligado (ELISA) para quantificar os níveis de contaminação de proteína residual CD-CHO1 de células hospedeiras (HCP) em amostras de teste. Uma IgG anti-CD CHO1 HCP policlonal de coelho é primeiro revestida sobre a lâmina de microtitulação. Amostras-padrão de referência de HCP, controles de qualidade e Substância de Fármaco CTLA4A29YL104E-Ig são incubadas com a IgG anti-CD CHO1 HCP de coelho ligada. Após lavagem das lâminas de microtitulação, o anticorpo de IgG anti-CD CHO1 HCP de coelho policlonal/Biotina é adicionado, o qual se liga ao HCP capturado durante a etapa inicial. As lâminas de microtitulação são lavadas para remover quaisquer anticorpos poli- clonais não ligados. Estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre é adicionada e as lâminas de microtitulação são novamente lavadas para remover quaisquer anticorpos conjugados não ligados. Cromogênio TMB é, então, adicionado para proporcionar uma reação colorimétrica. A reação é terminada com ácido sulfúrico e a absorbância é medida a 450 nm em um leitor para microlâmina com 96 cavidades. A cor se desenvolve em proporção à quantidade HCP capturado. As concentrações de amostra são determinadas baseado em uma curva-padrão gerada através de plotagem da absorbância versus concentração de HCP na faixa de 4,11 ng/mL a 3000 ng/mL.
[0001902] A linhagem de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) (DG44) é usada na produção de CTLA4A29YL104E-Ig. Para a produção de proteína CD-CHO1 (HCP), células DG44 foram estavelmente trans- fectadas com o vetor recombinante pD16 e desenvolvidas em meio CD-CHO1 suplementado com galactose e Recombulina. Os anticorpos policlonais para essa versão do ELISA foram gerados em coelhos brancos New Zealand imunizados com um concentrado de material CD-CHO1 HCP. Anticorpos de coelho foram purificados por afinidade (Proteína A), então, submetidos à diálise em solução salina tamponada com fosfato e concentrados. Aproximadamente 50 mg da fração de IgG de anticorpo anti-CD-CHO1 de coelho foi biotinilado usando química com N-hidróxi-sulfo-succinimida éster. O anticorpo anti-CHO1 de coelho não modificado é usado para revestir lâminas de microtitulação com 96 cavidades. Ele captura CD-CHO1 HCP, o qual é detectado pelos anticorpos anti-CD-CHO1 de coelho biotinilado. O conjugado de Estreptavidina/Peroxidase de Rábano-silvestre se liga à biotina e uma reação colorimétrica com cromogênio TMB é usada para quantificar CD-CHO1 HCP.
[0001903] Esse método é projetado para determinar quantitativamente os níveis residuais de proteína CD-CHO1 em células hospedeiras através de ELISA para testagem de liberação de material de Substância de Fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig. ESBOÇO DO MÉTODO
Figure img0237
Figure img0238
[0001904] Anticorpo anti-CD-CHO1 de coelho é biotinilado usando um kit de biotinilação com hexanoato de sulfo-succinimidila-6 (biotinamido) como reagente de biotinilação. O reagente de biotinilação da PIERCE (produto N° 21335) com Sulfo-NHS-LC-Biotina pode ser usado. O anticorpo é rotulado de acordo com as recomendações do fabricante no manual fornecido com o reagente de biotinilação. Após rotulação e separação sobre a coluna de exclusão de tamanho, a incorporação de biotina é determinada e a amostra é congelada em alíquotas de 50 μL em ou abaixo de -70°C. A proporção de biotina/IgG do produto final deverá estar entre 2 e 4. Armazenar em ou abaixo de -70°C.
[0001905] Revestimento da lâmina. Preparar uma solução a 8 μg/mL de anti-CD-CHO1 HCP purificada de coelho em Tampão de Carbonato a ser usado para o revestimento de lâminas de microtitulação (12 mL de solução são requeridos por lâmina de microtitulação). Adicionar 100 μL dessa solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon 4 usando uma pipeta com múltiplos canais calibrada. Cobrir a lâmina de microtitulação com parafilme e incubar a 4°C durante 18 + 2 horas.
[0001906] Lavagem e Bloqueio de lâmina. Lavar a lâmina três vezes com Tampão de Lavagem usando um instrumento para lavagem de lâminas. Adicionar 300 μL de SeaBlock a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais calibrada. Incubar a lâmina durante 1 hora a 22,5 ± 5°C. Preparar concentrações-Padrão de referência de proteína CD-CHO1 e Amostras de controle de qualidade em tubos de poli- propileno estéreis graduados de 15 mL. Diluir as amostras de Material de referência e controle de qualidade usando Diluente Teknova (1,21). A concentração-padrão é preparada no dia do experimento nas concentrações listadas no exemplo abaixo: Diluições para Amostras de Curva-padrão (Exemplo para Preparo Diário) A concentração de estoque de proteína CD-CHO1 é de 5,7 mg/mL.
[0001907] Diluição A: 26,3 μL (5,7 mg/mL) + 4,973 mL PTB Diluente = 30 μg/ml Diluição B: 0,6 mL (30 μg/mL) + 5,4 mL de Diluente3000 ng/mL 2 mL (3000 ng/mL) + 4 mL de Diluente1000 ng/mL 2 mL (1000 ng/mL) + 4 mL de Diluente333,3 ng/mL 2 mL (333,3 ng/mL) + 4 mL de Diluente111,1 ng/mL 2 mL (111,1 ng/mL) + 4 mL de Diluente37,0 ng/mL 2 mL (37,0 ng/mL) + 4 mL de Diluente12,3 ng/mL 2 mL (12,3 ng/mL) + 4 mL de Diluente4,11 ng/mL 0 + 4 mL de Diluente0 ng/mL
Análise de Concentração, Armazenamento e Expiração de QC
[0001908] Amostras de Controle de Qualidade (QC) em três concen-trações-alvo diferentes (25, 100 e 700 ng/mL) são preparadas e usadas frescas no dia de análise ou preparadas em maiores quantidades e armazenadas congeladas em alíquotas em ou abaixo -70°C. Alíquotas congeladas são analisadas em três experimentos independentes. O resultado médio calculado dos três experimentos é reportada em um Certificado de Análise (COA) para cada uma das três amostras de QC. No dia do experimento, amostras congeladas de QC são descongeladas e analisadas conforme descrito abaixo. Após descongelamento, cada amostra de QC é submetida a turbilhonamento em velocidade média 2-4 segundos. Amostras congeladas de QC expiram 6 meses após a data de preparo. Elas são usadas em sua concentração nominal reportada sobre o COA. QC recentemente preparada expira 24 horas após preparo.
Diluições para Amostras de Controle de Qualidade (QC) (exemplo)
[0001909] Diluição A: 26,3 μL (5,7 mg/mL) + 4,973 mL de Diluente = 30 μg/mL
[0001910] 233 μL (30 μg/mL) + 9,767 mL de Diluente = 700 ng/mL (QC 1)
[0001911] 1,43 mL (700 ng/mL) + 8,57 mL de Diluente = 100 ng/mL (QC 2)
[0001912] 2,5 mL (100 ng/mL) + 7,5 mL de Diluente = 25 ng/mL (QC 3)
[0001913] Preparo de amostra. Diluir as amostras de Substância de Fármaco para aproximadamente 12,5, 6,25 e 3,125 mg/mL.
[0001914] Diluição A: 400 μL amostra (~25 mg/mL) + 400 μL de dilu- ente = 12,5 mg/mL
[0001915] Diluição B: 400 μL (~12,5 mg/mL) + 400 μL de diluente = 6,25 mg/mL
[0001916] Diluição C: 400 μL (~6,25 mg/mL) + 400 μL de Diluente = 3,125 mg/mL
[0001917] Lavagem de lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Tampão de Lavagem usando um lavador para lâminas. Adicionar 100 μL por cavidade de cada concentração-padrão, amostras e amostras de QC em triplicata à lâmina bloqueada e lavada. Cada concentração de QC é adicionada duas vezes a um total de seis cavidades por lâmina. Veja mapa de lâmina no Método em Anexo para colocação sugerida. Incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5°C. Repetir a etapa lavagem 5 vezes. Diluir anti-CD-CHO1 HCP/Biotina de coelho para 2 μg/mL em Tampão Teknova. Submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade média. Adicionar 100 μL por cavidade. Incubar durante 1 hora a 22,5 ± 5°C. Repetir a etapa lavagem 5 vezes. Diluir Estreptavidina-HRP (SA-HRP) apropriadamente em Tampão Teknova (exemplo: diluição a 1/20.000 usualmente resulta em leituras de absorbância aceitáveis). Adicionar 100 μL de diluição de SA-HRP a cada cavidade e incubar a 22,5 ± 5°C durante 1 hora. Remove o cromogênio TMB do refrigerador e decantar um mínimo de 10 mL por lâmina em um recipiente adequado. Colocar em um local escuro e deixar ir para a temperatura ambiente. Repetir a etapa lavagem 5 vezes. Adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade e incubar a 22,5 ± 5°C durante aproximadamente 2 minutos. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μL de H2SO4 a 1N a cada cavidade. Adicionar Solução de Término às lâminas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cada cavidade. Medir a absorbância a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidades apropriado.
[0001918] ANÁLISE DE DADOS. O modelo "CHO1 Elisa modelo.ppr" do programa Softmax é ajustado para gerar valores médios, desvios- padrão, CVs %, concentrações calculadas, parâmetros de adaptação de curva, etc.
[0001919] Curva-padrão. Dados-Padrão de Referência são adaptados a uma curva-padrão usando uma função de adaptação de curva com quatro parâmetros:
Figure img0239
onde: Y = valor de absorbância (A450-A630) A = valor de absorbância correspondendo ao assíntota mínimo D = valor de absorbância correspondendo ao assíntota máximo C = absorbância correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo (ponto de inflexão). B = o declínio no ponto de inflexão da curva X = concentração de CD-CHO1 HCP
[0001920] O modelo "CHO1 Elisa modelo.ppr" do programa Softmax determina o coeficiente de correlação (R2) da linha de regressão para os padrões usando a média calculada.
[0001921] VALORES EXEMPLIFICATIVOS. Determinar se os resultados-Padrão, QC e amostras vão ao encontro dos valores exemplifi- cativos listados abaixo.
[0001922] Valores exemplificativos para os padrões. O coeficiente de correlação (R2) para a Curva-padrão deve ser > 0,99. A base média para a concentração-padrão de zero ng/mL deve ser <0,2 unidades de absorbância. Se duas ou mais das sete concentrações nominais da curva-padrão, excluindo zero e concentrações abaixo o QL (12,3 ng/mL), não vão ao encontro das condições 6.1.4 e 6.1.5, o ensaio é considerada inválido e deve ser repetido. A média dos valores calculados (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e concentrações abaixo do QL (12,3 ng/mL) deve estar dentro de 20% do valor-alvo (nominal). O coeficiente de variação (CV%) dos valores de absorbância em triplicata em cada concentração-padrão, excluindo zero e concentrações abaixo do QL (12,3 ng/mL) deve ser menor de 20%. Para assegurar que pelo menos dois pontos de dados congruentes estão disponíveis para cálculo; os padrões, controles de qualidade e amostras são carregados em cavidades em triplicata. Analisar cada valor em triplicata separadamente. Reduzir o valor que repousa mais distante do alvo. Recalcular a curva e reanalisar os valores exemplificativos. Exemplo: Valor-alvo (ng/mL)Valor real (ng/mL) 2512 24 26
[0001923] O único valor que está mais distante do valor-alvo de 25 ng/mL é 12 ng/mL. Eliminando o valor de 12 ng/mL da triplicata, a média dos valores restantes irá ao encontro dos valores exemplificativos. Se é mostrado que a média dos dois valores restantes ainda não vão ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ponto único é eliminado e a curva é recalculada. Exemplo: Valor-alvo (ng/mL)Valor real (ng/mL) 255,0 5,5 10
[0001924] O valor médio é > 20% do alvo, a despeito de qual valor é eliminado, portanto, o ponto único cai da curva e a curva será recalculada.
[0001925] Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra de QC é um conjunto de seis cavidades na concentração estabelecida. Pelo menos quatro das seis cavidades para uma amostra de QC devem estar dentro de 20% do nominal para que a amostra de QC seja aceitável. Todas as três amostras de QC devem ser aceitáveis. Se esses valores exemplificativos não são obtidos, o ensaio deve ser repetido.
[0001926] Valores exemplificativos para amostras de teste. O valor de absorbância para a amostra de teste ensaiada deve ser menor do que a maior QC. Se o valor excede aquele da maior amostra de QC, a amostra de teste deve ser diluída suficientemente de modo a obter um valor médio entre 700 e 12,3 ng/mL. Pelo menos uma de três diluições de amostra (12,5, 6,25 e 3,125 mg/mL) deve cair dentro da faixa da curva-padrão para um resultado reportável, a menos que a absorbân- cia para todas as diluições esteja abaixo o QL do ensaio. Nesse caso, as amostras de teste são reportadas como <QL. A média dos valores de absorbância em triplicata da diluições de amostra que são maiores do que o QL e cai dentro da faixa do ensaio deverá exibir uma CV de menos do que 20%.
[0001927] CÁLCULO E REPORTAGEM DE RESULTADOS DE CONCENTRAÇÃO DE CD-CHO1 HCP NAS AMOSTRAS. Cálculo de concentração de CD-CHO1 HCP nas amostras. Multiplicar os resultados médios da amostra pelo fator de diluição apropriado (isto é 2, 4 e 8) para obter a concentração de CD CHO1 HCP na amostra não diluída em ng/mL para cada umas das diluições. Determinar a média para os resultados daquelas diluições que caem dentro da faixa do ensaio. Dividir o resultado pela concentração de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig reportada (mg/mL) para obter a concentração de CD CHO1 HCP em ng/mg de CTLA4A29YL104E-Ig. Cálculo exemplificativo: Resultado médio da amostra:235 ng de CD-CHO1 HCP/mL = 9,4 ng/mg Conc. de proteína: 25,0 mg/mL NOTA: ng de CD-CHO1 HCP/ mg de produto (ng/mg) é equivalente a partes por milhão (ppm).
Exemplo 53: DETERMINAÇÃO DOS NÍVEIS DE PROTEÍNA A EM CTLA4A29YL104E-Ig ATRAVÉS DE ELISA
[0001928] Esse ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) quantifica os níveis de contaminação de Proteína A em amostras de teste de CTLA4A29YL104E-Ig. Antiproteína A de coelho é primeiro revestida sobre uma lâmina de microtitulação. Amostras-padrão de referência de Proteína A, controles de qualidade, controles de recuperação e CTLA4A29YL104E-Ig são incubadas com a IgG antiproteína A de coelho ligada. Após lavagem das lâminas de microtitulação, anticorpo monoclonal antiproteína A de coelho biotinilada é adicionado, o qual se liga à proteína A capturada durante a etapa inicial. As lâminas de microtitu- lação são lavadas para remover quaisquer anticorpos monoclonais não ligados. Estreptavidina-peroxidase de rábano-silvestre é, então, adicionada após uma hora de incubação; a lâmina de microtitulação é novamente lavada para remover quaisquer anticorpos conjugados não ligados. Cromogênio TMB é, então, adicionado para proporcionar uma reação colorimétrica. A reação é terminada com ácido sulfúrico e as densidades ópticas são medidas a 450 nm em um leitor para microlâ- mina com 96 cavidades. A cor se desenvolve em proporção à quantidade de Proteína A capturada. As concentrações de amostra são determinadas baseado sobre uma curva-padrão gerada través de plota- gem da densidade óptica versus a concentração de Proteína A na faixa de 0,188 ng/mL a 12 ng/mL. ESBOÇO DO MÉTODO
Figure img0240
[0001929] Revestimento da lâmina com Anticorpo de captura. Preparar uma solução a 1 g/mL de anticorpo antiproteína A de coelho em Tampão de Revestimento e adicionar 100 L da solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Costar. Incubar a 4°C durante 18 2 horas.
[0001930] Lavagem e Bloqueio de lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando o lavador de lâminas. Adicionar 200 μL de SuperBlock® a cada cavidade. Incubar a lâmina de microti- tulação durante 60 minutos em temperatura ambiente.
[0001931] Preparo de Padrão de Referência. Preparar Padrão de Referência através de mistura da quantidade apropriada de Material de referência Proteína A no volume apropriado de tampão de acetato. Submeter a turbilhonamento solução em velocidade média durante 2-4 segundos. Incubar as amostras de Padrão de referência, Controle de Qualidade e Controle de Recuperação durante 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição à lâmina de microtitulação.
[0001932] Exemplo: Material de referência Proteína A, concentração de estoque de 2,3 mg/mL 1: 20010 μL (2,3 mg/mL) + 1990 μL (Tampão de acetato) = 11500 ng/mL 1: 47910 μL (11500 ng/mL) + 4780 μL (Tampão de acetato) = 24 ng/mL 2 mL (24 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 12 ng/mL 2 mL (12 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 6 ng/mL 2 mL (6 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 3 ng/mL 2 mL (3 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 1,5 ng/mL 2 mL (1,5 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,75 ng/mL 2 mL (0,75 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,375 ng/mL 2 mL (0,375 ng/mL) + 2 mL (Tampão de acetato) = 0,188 ng/mL 0 mL + 2 mL (Tampão de acetato) = 0 ng/mL
[0001933] Cada concentração-padrão é analisada em triplicata. Colocar as amostras sobre lâminas de microtitulação conforme descrito no método em anexo.
[0001934] Preparo de amostras de controle de qualidade. Amostras de Controle de Qualidade (QC) de Proteína A são preparadas em tampão de acetato em três níveis de concentração-alvo de 0,5, 2 e 5 ng/mL. Elas são preparadas frescas no dia do experimento ou em maiores quantidades e congeladas em alíquotas de 750 μL a < -70°C. As concentrações de Proteína A nas amostras de QC congeladas são predeterminadas em três experimentos ELISA de proteína A independentes usando esse método e os resultados da concentração média calculada são reportados como as concentrações "nominais" de QC em um Certificado de Análise para cada amostra de QC.
[0001935] No dia de um experimento, descongelar um frasco de cada uma das três amostras de QC em temperatura ambiente. Analisar cada concentração de QC duas vezes (em duas análises em triplicata por concentração ). Colocar as amostras de QC sobre lâminas de mi- crotitulação conforme descrito no método em anexo.
[0001936] Material de referência Proteína A, 2,3 mg/mL 1: 20010 μL (2,3 mg/mL) + 1990 μL (Tampão de acetato) = 11500 ng/mL 1: 47910 μL (11500 ng/mL) + 4780 μL (Tampão de acetato) = 24 ng/mL 833,3 μL (24 ng/mL) + 3,166 mL (Tampão de acetato) = 5 ng/mL (QC1) 1,600 mL (5 ng/mL) + 2,4 mL (Tampão de acetato) = 2 ng/mL (QC2) 1 mL (2 ng/mL) + 3 mL (Tampão de acetato) = 0,5 ng/mL (QC3)
[0001937] Preparo da amostras de teste. Preparar concentrações de 2,5 mg/mL, 1,25 mg/mL e 0,625 mg/mL das amostras de teste de CTLA4A29YL104E-Ig em tubos de polipropileno usando tampão de acetato (pH de 3,5). Amostras de teste são incubadas durante aproximadamente 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição à lâmina de microtitulação.
[0001938] Lavagem da lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando o lavador de lâminas. O lavador de lâminas deverá ser ajustado para encher as cavidades com 300 μL de tampão de lavagem, tempo de embebimento zero. Adicionar 100 μL de cada de Padrão de Referência, Controle de Qualidade, Controle de Recuperação e amostras de teste a cada cavidade e incubar durante uma hora em temperatura ambiente. Repetir a etapa. Diluir anticorpo antipro- teína A biotinilado com Diluente Teknova para uma concentração desejada, conforme indicado através de otimização para cada novo lote. Por exemplo, fazer uma diluição a 1: 64.000 para o conjugado de anticorpo monoclonal antiproteína A/biotina, submeter a turbilhonamento em velocidade média e adicionar 100 μL a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar em temperatura ambiente durante uma hora.
[0001939] Diluir Estreptavidina-Peroxidase de Rábano-silvestre com Diluente Teknova para uma concentração desejada, conforme indicado através de otimização para cada novo lote. Por exemplo, fazer uma diluição a 1: 80.000 para a Estreptavidina-Peroxidase de Rábano- silvestre. Submeter a turbilhonamento em velocidade média e adicionar 100 μL a cada cavidade e incubar durante 30 minutos em temperatura ambiente. Repetir a etapa, mas lavar cinco vezes. Adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade. Incubar em temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos. A densidade óptica para uma maior concentração para a Curva-padrão deverá estar entre 0,980 e 1.400. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μL/cavidade de H2SO4 a 1N. Adicionar Solução de Término às lâminas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cada cavidade. Medir a absorbância a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidades apropriado.
[0001940] ANÁLISE DE DADOS. Refira-se ao modelo do programa SoftMax para um ELISA de Proteína A uma vez que ele gera a média, desvios-padrão e CV%s, etc. Todos os cálculos realizados nas seções Análise de Dados serão realizados usando um modelo.ppr para ELISA de proteína A no SoftMax Pro.
[0001941] Calcular a média dos valores de absorbância em triplicata (Abs) obtida para cada concentração de referência e amostra ensaiada. Calcular um modelo de dados para um padrão de Proteína A usando uma regressão com quatro parâmetros ponderada da forma:
Figure img0241
[0001942] onde:
[0001943] Abs=absorbância
[0001944] min=valor de absorbância correspondendo ao assíntota mínimo
[0001945] max=valor de absorbância correspondendo ao assíntota máximo
[0001946] ED50=absorbância correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo
[0001947] B=o declínio do ponto de inflexão de adaptação da curva
[0001948] C=Concentração de Proteína A
VALORES EXEMPLIFICATIVOS
[0001949] Valores exemplificativos para os padrões. Os valores exemplificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima do limite quantitativo (QL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas para ajudar a estabelecer os extremos da curva. O coeficiente de determinação (R2) para a Curva-padrão deverá ser > 0,99. A base média para o padrão de zero ng/mL deverá ser < 0,08 unidade de absorção. A média dos valores calculados (ng/mL) em ca- da concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão exceto zero e o QL devem estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal). A média dos valores de absorbância em triplicata do QL da curva-padrão deve exibir um CV% de menos do que 20% e estar dentro de 20% do alvo.
Exemplo 54 - ELISA PARA A DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA SE-MELHANTE A MCP-1 em CTLA4A29YL104E-Ig
[0001950] Esse ELISA é realizado para determinar a concentração de Proteína semelhante a MCP-1 em CTLA4A29YL104E-Ig. As concentrações de uma curva-padrão (0,4 a 25,6 ng/mL), Controle de Qualidade e amostras de teste são aplicadas à lâminas de microtitulação absorvidas com anticorpo anti-MCP-1 de camundongo de cabra e incubadas durante 60 minutos em temperatura ambiente (22,5 ± 5°C). As lâminas são lavadas, anticorpo secundário (IgG anti-MCP-1 de rato de coelho) é adicionado e incubadas durante 60 minutos a 22,5 ± 5°C. As lâminas são lavadas, IgG anticoelho de cabra conjugado com Peroxidase de Rábano-silvestre é adicionada a cada cavidade e incubada durante 30 minutos a 22,5 ± 5°C. As lâminas são lavadas e cromogênio TMB é adicionado para proporcionar uma reação colorimétrica. Após cessar a reação H2SO4 a 1N, as densidades ópticas são medidas a 450 nm em um leitor para microlâmina com 96 cavidades e os dados são modelados usando uma curva de regressão com 4 parâmetros. A concentração de Proteína semelhante a MCP-1 é, então, calculada para cada amostra de teste com relação ao Material de referência MCP-1. A concentração é reportada em ng de proteína semelhante a MCP-1 por mg (partes por milhão, ppm) de amostra dividindo o resultado obtido com relação à Curva-padrão e a concentração de amostra não diluída. Esse método permite a determinação de impurezas semelhantes a MCP- 1 em amostras biológicas derivadas de cultura de células, incluindo em-processo, Substância de Fármaco e produto de fármaco purificado. Proteína semelhante a MCP-1 pode estar presente em amostras biológicas produzidas em cultura de células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Dois anticorpos policlonais foram identificados, os quais se ligam a uma impureza semelhante a MCP-1 purificada de células de CHO. Os anticorpos são dirigidos contra MCP-1 de murino e rato (intacta) e ambos reagem cruzadamente proteína semelhante a MCP-1 de células de CHO, o que é demonstrado nesse relatório.
[0001951] Revestimento da lâmina. Para revestimento, diluir anticorpo anti-MCP-1 de camundongo de cabra para 5 μg/mL com Tampão de Revestimento. Revestir as lâminas com 100 μL/cavidade. Cobrir as lâminas com vedantes para lâmina e incubar a 22,5±5°C durante 12 a 18 horas. Lavar a lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando um lavador de lâminas. O lavador deverá ser ajustado em três lavagens, 300 μL/ cavidade com um tempo de embebimen- to zero. Alternativamente, as lâminas podem ser lavadas manualmente. Adicionar 300 μL de solução a cada cavidade de cada lâmina usando uma pipeta com múltiplos canais calibrada. Esvaziar as cavidades sacudindo em uma pia e secar gentilmente sobre papéis toalha. Repetir três vezes.
[0001952] Bloqueio de lâmina. Adicionar 300 μL Tampão de Bloqueio & Estabilizante de Revestimento a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais calibrada. Incubar as lâminas durante uma a duas horas a 22,5±5°C.
[0001953] Lavagem e armazenamento de lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem conforme descrito sob 4.2. Encher as lâminas com 300 μL Tampão de Revestimento por cavidade, cobrir com vedantes para lâmina e armazenar no escuro a 2-8°C durante até uma semana.
[0001954] Preparo dos padrões. A partir do estoque de Proteína se-melhante a MCP-1, preparar uma solução a 25,6 ng/mL em PTB e dilu- ir daí em etapas de diluição serial (1: 2) para 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 e 0 ng/mL usando PTB como diluente. Alternativamente, padrões congelados podem ser usados através de preparo de uma grande quantidade de padrões. Transformar em alíquotas e armazenar a - 70°C a -80°C. Evitar congelamento/descongelamento repetido. Padrões congelados precisam ser qualificados contra Controles de qualidade em três operações ELISA independentes. Os Padrões congelados e QC devem ser aceitáveis em cada operação. Após término de três operações aceitáveis, um Certificado de Análise é emitido. Padrões congelados serão usados em suas concentrações nominais. Eles expiram 3 meses a partir da data de preparo.
[0001955] Exemplo para uma referência de MCP-1 com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL: a) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em PTB: 13,4 mL de estoque + 2,487 mL de Diluente b) Preparar 160 mL de 25,6 ng/mL em PTB: 788 mL de estoque a +160 mL de Diluente Misturar cada solução através de turbilhonamento do tubo durante aproximadamente 2-3 segundos e, então, invertendo gentilmente 2-3 vezes.
[0001956] Controle de qualidade. Controles de qualidade (QCs) são proteína semelhante a MCP-1 preparada em concentrações nominais de 17,7 ng/mL, 5,3 ng/mL e 1,2 ng/mL em PTB. Preparar uma grande quantidade de QCs, transformar em alíquotas e armazenar a -70°C a - 80°C durante até 3 meses. Evitar congelamento/descongelamento re-petido. Os controles de qualidade são qualificados contra a Curva- padrão em três operações ELISA independentes. O QC deve ser aceitável em cada operação. Após término de três operações aceitáveis, o resultado da média calculada para cada QC aceitável é reportado e um Certificado de Análise é emitido. O QC será usado em suas concentra- ções calculadas. Eles expiram três meses a partir da data de preparo. Exemplo para o preparo de diluições de QC congeladas a partir de uma referência de MCP-1 com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL: a) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em PTB: 13,4 mL de estoque + 2,487 mL de Diluente b) Preparar diluição final de Proteína semelhante a MCP-1s amostras de controle de qualidade como segue:
Figure img0242
[0001957] Misturar cada solução através de turbilhonamento 2-3 segundos e, então, inverter gentilmente 2-3 vezes. Alternativamente, QCs podem ser preparados frescos no dia de análise.
[0001958] Amostras de teste. Amostras de teste são preparadas através da adição de 200 μL da amostra de teste a 200 μL de PTB e sujeição a turbilhonamento durante 2 - 4 segundos. Adicionar padrões de referência, controles de qualidade (x2) e amostras de teste à lâmina, em triplicata, 100 μL por cavidade e incubar durante 1 hora a 22,5±5°C (não usar as cavidades externas). Preparar anticorpo secundário anti-MCP-1 de rato de coelho em tampão de PTB em uma concentração de 2 μg/mL em um volume suficiente para as lâminas usadas no ensaio. Submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2 - 4 segundos. Repetir a lavagem, mas lavar cinco vezes. Adicionar 100 μL da solução de anticorpo secundário a cada cavidade e incubar durante 60 minutos a 22,5±5°C. Preparar solução de anticorpo terciário anti-coelho de cabra conjugado com HRP (por exemplo, diluição a 1:20.000 ou diluição apropriada) usando PTB como diluente. Submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2 - 4 segundos. Repetir a lavagem. Adicionar 100 μL de conjugado de HRP a cada cavidade e incubar a 22,5±5°C no escuro durante 30 minutos. Repetir a lavagem. Adicionar 100 μL de TMB a cada cavidade e incubar a 22,5±5°C no escuro durante 3-6minutos ou até a cor apropriada ter se desenvolvido. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μL de H2SO4 a 1N na mesma ordem conforme a adição de cromogênio foi feita. Ler as densidades ópticas a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâminas com 96 cavidades apropriado.
REDUÇÃO DE DADOS Usar o software Softmax® com o arquivo de protocolo MCP-1.ppr para construir uma curva-padrão usando uma regressão com quatro parâmetros ponderada da forma.
[0001959] onde:
[0001960] A=valor de absorbância450 correspondendo ao assíntota mínimo.
[0001961] D=valor de absorbância450 correspondendo ao assíntota máximo.
[0001962] c=concentração correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo.
[0001963] B=o declínio aproximado da porção linear da curva.
[0001964] x=concentração-padrão de referência.
[0001965] Reportar os resultados apenas para amostras com dados aceitáveis para Curvas-Padrão, controles de qualidade e amostras de teste.
[0001966] Valores exemplificativos para os padrões. Os valores exemplificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima o QL (0,8 ng/mL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas para ajudar a estabelecer os extremos da curva. A base média (o zero ng/mL de padrão) deve ser <0,1 unidade de absorção. A concentração média recalculada de MCP-1 (ng/mL) em cada concen- tração-padrão usada para determinar a curva-padrão deve estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal). O coeficiente de variância (CV%) dos valores de A450 em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão deve ser <15%. A média dos valores de A450 em triplicata no QL da curva-padrão deve exibir uma CV% de < 20% e recalcular para dentro de 20% do alvo (concentração nominal, 0,8 ng/mL). Cada valor da triplicata usado para calcular a média será analisado separadamente. O valor que repousa mais distante da média cairá, a curva recalculada e os valores exemplificativos reanalisa- dos. Se é mostrado que a média dos dois valores restantes ainda não vai ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ponto único é eliminado e a curva é recalculada.
[0001967] Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra de QC é definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabelecida, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC. As concentrações recalculadas de pelo menos duas das três cavidades para uma amostra de QC devem estar dentro de 20% da concentração-alvo previamente determinada (veja COA) para que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos quatro das seis amostras de QC devem ser aceitáveis; duas das seis amostras de QC (não duas na mesma concentração) podem ser inaceitáveis e não mais do que 6 das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% das respectivas concentrações-alvo. Se esses valores exemplificativos não são obtidos, o ensaio deve ser repetido.
[0001968] Valores exemplificativos para amostras de teste. A con-centração média calculada de MCP-1 deve ser menor do que a con-centração da maior QC. Se a concentração média calculada de MCP-1 é > 0,8 ng/mL (o QL), a CV% das determinações em triplicata deve ser < 20%. Se essa condição não é obtida, o resultado da amostra não é válido e deve ser repetido. Se esse critério é obtido, a concentração média calculada de MCP-1 é usada para calcular o resultado final. Se a concentração calculada de MCP-1 é < 0,8 ng/mL (QL), a amostra é reportada como < QL e o valor "< 0,8 ng/mL" é usado no cálculo do resultado final.
Exemplo 55 - DETECÇÃO DE DNA DE CHO EM CTLA4A29YL104E-Ig e CTLA4-Ig ATRAVÉS DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE QUANTITATIVA
[0001969] Esse procedimento foi desenvolvido para detectar DNA de CHO residual nas amostras de Substância de Fármaco usando um ensaio de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). PCR é a replicação de uma mistura de DNA. Esse ensaio usa uma sonda fluorogênica para detectar um produto de PCR de CHO específico à medida que ele se acumula durante o ensaio. A taxa de amplificação do produto de PCR é diretamente proporcional à quantidade DNA de iniciação presente na amostra.
[0001970] Conversão do valor de DNA para picograma / miligrama. O valor de pg/mL é dividido pela concentração da amostra, determinada através da absorbância a 280 nm. Cálculo exemplificativo para a amostra tendo uma concentração de proteína de 50 mg/mL e um valor reportado a partir da Bio-confiança = 0,67 fg/μL. Etapa 1: Conversão para pg/mL = 0,67 pg/mL. Etapa 2: Conversão para pg/mg = (0,67 pg/mL / 50,0 mg/mL) = 0,013 pg/mg.
Exemplo 56: ANÁLISE DE CTLA4A29YL104E-Ig ATRAVÉS DE SDS- PAGE
[0001971] Esse exemplo descreve a análise de CTLA4A29YL104E-Ig para a avaliação da pureza de Substância de Fármaco e produto de fárma- co de CTLA4A29YL104E-Ig. CTLA4A29YL104E-Ig é uma proteína de fusão manipulada consistindo em um domínio de ligação a ligante modificado do antígeno 4 de linfócito T citotóxico (CTLA4) e a região Fcy1 de IgG humana. CTLA4A29YL104E-Ig tem um peso molecular de ~92 kDáltons e um peso molecular evidente de 97 kDáltons (não-reduzida) ou 55 kDál- ton (reduzida). Eletroforese de CTLA4A29YL104E-Ig sobre géis de SDS- poliacrilamida em gradiente de 4-20% separa as espécies monoméri- cas principais de espécies de maior peso molecular (agregados, díme- ros e multímeros de maior ordem), bem como quaisquer espécies de baixo peso molecular (fragmentos de degradação). Exploração densi- tométrica e quantificação por ImageQuantTL® de géis corados com Azul Coomassie proporciona uma medida da pureza de proteína. Os resultados são reportados como pureza percentual de CTLA4A29YL104E- Ig sob condições reduzidas e não-reduzidas.
REAGENTES
[0001972] NOTA: Todos os reagentes podem ser substituídos por al-ternativas equivalentes. 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Adicionar 100 mL de 10X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS a um cilindro graduado de 1 litro. Q.S. para 1 litro com água Milli-Q ou com grau para HPLC. Cobrir, inverter várias vezes para misturar. Esse reagente deverá ser preparado no dia de ensaio.
[0001973] NOTA: Preparar um volume adicional se necessário.
[0001974] Reagente de Coloração Azul Coomassie. Misturar a solução de Reagente GelCode Blue Stain imediatamente antes de uso invertendo gentilmente ou entornando e girando a garrafa várias vezes. Tal mistura é especialmente importante quando usando o recipiente GelCode de 3,5 L com uma bomba manual (Catálogo No. 24592). Não agitar a garrafa para misturar a solução. NOTA: É importante misturar o reagente de coloração antes de distribuição para assegurar que a solução é homogêneo.
[0001975] Solução de Fixação: Metanol a 50% /Ácido acético a 7% em Água. Combinar 500 mL de metanol e 70 mL de ácido acético em um cilindro graduado de 1 litro. Q.S. com água Milli-Q para 1 litro e Misturar. A solução de fixação solução é estável em temperatura ambiente durante até seis meses. NOTA: A solução de fixação deverá ser preparada em uma coifa química.
[0001976] Preparo de Controle de Coloração. Reconstituir o inibidor de tripsina para fazer uma solução a 2 mg/mL de estoque usando água Milli-Q. Preparar alíquotas de 50 μL e congelar a -30 ± 10°C durante até 6 meses. Usar o seguinte plano de diluição para diluir uma solução de proteína de estoque para uma concentração de trabalho:
[0001977] 25 μL de solução de estoque + 75 μL de água Milli-Q = 0,5 μg/μL
[0001978] 40 μL de 0,5 μg/μL + 160 μL de água Milli-Q = 100 ng/μL
[0001979] Usar a tabela diretamente abaixo para preparar a solução de carregamento de Controle de Coloração. Preparo de amostra para controle de coloração
Figure img0243
[0001980] Carregamento de 10 μL do Preparado de Controle de Coloração proporcionará uma carga de proteína de 100 ng.
PREPARO DE PADRÃO E AMOSTRA
[0001981] Carregamento-Padrão para Processo Fixo, Substância de Fármaco GLP/GMP, Produto de Fármaco ou Amostras de Estabilidade.
[0001982] Diluição para Géis Corados com Azul Coomassie. Diluir os artigos de teste e material de referência para a concentração de trabalho de 1,0 μg/μL e carregar reduzido e não-reduzido com marcadores de peso molecular com peso molecular conforme descrito na Tabela diretamente abaixo. Diluição de amostra e carregamento de gel para gel corado com azul Coomassie
Figure img0244
1 Placebo = Carga de 10 μL de 1 X Tampão de amostra NR
[0001983] NOTA: A banda de controle de coloração é incluída sobre a imagem de gel explorada para inspeção visual a fim de avaliar a Ade- quabilidade de sistema. A banda de controle de coloração está ausenta na imagem de gel derivada para manter a consistência do relatório de gel.
[0001984] Preparo de amostra e Eletroforese. Diluição de amostra para uma carga de proteína de 10 μg/Fileira. Seguir o método abaixo para preparar amostras para uma carga de 10 μg/10 μL. Usando água Milli-Q como o diluente, diluir as amostras de teste e material de referência para 10 mg/mL de CTLA4A29YL104E-Ig. Concentrações aproximadas podem ser usadas para os cálculos. Por exemplo: se a amostra de Substância de Fármaco de CTLA4A29YL104E-Ig tem uma concentração de 25 mg/mL, preparar uma diluição a 1: 2,5 (adicionar 40 μL de amostra a 60 μL de água Milli-Q). Seguir a tabela diretamente abaixo para preparar a amostra final para eletroforese. Usar tubos para microcentrífuga para essas diluições. Diluição de Amostras de teste
Figure img0245
Figure img0246
NOTA: Ajustar o volume da solução de proteína e água Milli-Q conforme necessário para obter um volume final de 100 μL. NOTA: Se a concentração de amostra é < 10 mg/mL, preparar a amostra final de acordo com a tabela acima. Ajustar o volume da solução de proteína e água para maximizar a carga de proteína sobre o gel.
[0001985] Aquecimento de Amostra. Após preparo de diluições de amostra, fechar os tubos para microcentrífuga e submeter o tubo a tur- bilhonamento para misturar a solução. Aquecer a(s) amostra(s) em um banho de água a 80 ± 5°C durante 2,0 ± 0,5 minuto (usar um cronômetro calibrado). Remover a(s) amostra (s) do calor e deixar que a(s) mesma(s) esfrie para a temperatura ambiente. Inverter os tubos várias vezes para remover a condensação de cima e dos lados dos tubos.
[0001986] Aparelho e Preparo de Gel. Remover o gel de sua embalagem e remover cuidadosamente o pente, certificando-se de que as paredes das cavidades estejam retificadas. As cavidades pode ser retificadas com uma ponteira de carregamento de gel, se necessário. Inserir o gel na unidade de eletroforese de modo que a lâmina de vidro curta faceie a câmara interna. Se apenas um único gel tem de ser operado, inserir um espaçador de Plexiglass sobre o lado oposto. Cunhar o(s) gel(éis) hermeticamente para vedar a câmara interna da câmara externa. Encher completamente a câmara interna com 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Verificar quanto a vazamentos, então, encher a câmara externa do fundo das cavidades com 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS. Enxaguar gentilmente as cavidades usando uma pipeta com 1X tampão de operação de Tris-Glicina-SDS para remover qualquer acrilamida residual. Repetir o enxágue da cavidade até que as cavidades estejam completamente limpas e definidas.
[0001987] Carregamento de Amostra. Usando ponteiras de carregamento de gel, carregar cada cavidade com 10 μL de amostra. En- cher todas as fileiras com placebo com 10 μL de 1X Tampão de Amostra de Não-Redução. Isso ajudará a prevenir a redução da amostra em virtude de carregamento do agente de redução e manter uma concentração de sal por todo o gel.
[0001988] Eletroforese. Fixar a caixa de gel, cobrir e conectar os ele-trodos ao suprimento de energia. Ajustar a corrente para 25 mAmps/gel (mA) e ajustar a tensão (v) e energia (w) para o máximo. NOTA: O ajuste do suprimento de energia pode variar de vendedor para vendedor. Ajustar para obter 25 mA/gel. Submeter o gel à eletroforese durante 60 minutos ou até que o corante do tampão de amostra atinja apenas o fundo do gel. Desligar o suprimento de energia, desconectar os condutores e remover o(s) gel(éis) do dispositivo. Separar cuidadosamente as lâminas plásticas. Manter a lâmina plástica com o gel preso sobre a solução de fixação apropriada para a técnica de coloração. Submergir o gel na solução até que o gel se desloque da lâmina plástica.
[0001989] Fixação em Gel. NOTA: Todas as etapas são realizadas em temperatura ambiente com ligeira rotação sobre o agitador orbital. NOTA: Realizar coloração em um recipiente hermeticamente vedado para impedir evaporação de reagente. NOTA: Embora o volume citado possa ser usado, é imperativo que o gel seja completamente coberto em todas as etapas. O tamanho do gel e bandeja de coloração devem ser levados em conta na determinação dos volumes necessários. Após eletroforese, adicionar 50 mL de solução de fixação (solução de metanol a 50%/ácido acético a 7%) durante 15 minutos. Enxaguar o gel 3 vezes durante 5 minutos cada com ~100 mL de água Milli-Q. Misturar a solução de Reagente de Coloração Coomassie antes de uso e adicionar 50 mL para um minigel de 8 x 10 cm. Reagente adicional pode ser requerido se uma bandeja maior for usada. Agitar gentilmente a bandeja usando um Agitador Orbital durante 20 ± 1 hora. Para consis- tência, corar todos os géis no mesmo operador durante o mesmo tempo. Descorar através de substituição do Reagente de Coloração Coo- massie com 100 mL de água Milli-Q. Após 1 hora de descoloração, o gel está pronto para exploração.
EXPLORAÇÃO DE GEL E ANÁLISE
[0001990] Após eletroforese e coloração, todos os géis são explorados usando um densitômetro e analisados usando o software Image- QuantTL®. Os arquivos de imagem são armazenados sobre o disco rígido local do computador e arquivados via a network de área local. Os parâmetros de exploração e análise são listados na tabela diretamente abaixo. Exploração de gel e parâmetros de análise
Figure img0247
[0001991] NOTA: Os Parâmetros de Exploração nessa Tabela não devem ser alterados durante exploração. Os Parâmetros de Detecção de Banda, Largura % de fileira (ajustado a 75%) e Correção de Base (ajustado em um raio de 200), são recomendados para todas as análises de imagem de gel exploradas (quaisquer alterações precisam ser documentadas). Ajuste dos parâmetros Declínio Mínimo, Redução de Interferência e Pico Máxima % pode ser necessário para identificar precisamente bandas em virtude de diferenças nas propriedades físicas do gel, tal como encolhimento do gel após coloração/descoloração ou diferenças no formato da banda de gel. Corrigir quaisquer bandas que faltam ou erroneamente identificadas. Refira-se ao manual do ImageQuantTL (v2003.03) e instruções na tela para informação adicional para parâmetros de detecção de banda.
[0001992] Explorar o gel usando os parâmetros listados na Tabela acima. Todas as análises e avaliações do gel deverão ser feitas na imagem explorada. Abrir um arquivo de imagem de gel (imagem explorada) do <1D Gel Analysis> no software ImageQuantTL. Ir para <Contrast> na barra de ferramentas e ajustar o parâmetro <Image Histogram - High> para 0,3 para intensificar a imagem de gel para visualização clara de todas as bandas.
[0001993] NOTA: Essa etapa é para fácil visualização da imagem de gel para permitir a análise e não tem impacto sobre o resultado quantitativo. Não usar a imagem de gel quantificada para fins de avaliação visual de bandas de gel ou reportagem de gel.
[0001994] Selecionar <Lane Creation> e escolher <Manual> para ajustar <Number of Lanes> a ser analisado. Ajustar <Lane % Widht> para 75%. Alinhar apropriadamente as fileiras únicas se necessário. Usar o método <Rolling Ball> para subtrair a base. Para somar precisamente a base, ajustar <Radius> a 200. Detectar bandas usando os ajustes iniciais <Minimum Slope>, <Noise Reduction> e <%Maximum Peak> listados na Tabela 4. Ajuste desses valores podem ser necessários para identificar precisamente as bandas. Avaliar manualmente quaisquer bandas que faltam ou que foram erroneamente identificadas. Determinar o peso molecular de banda através de uso do marcador de peso molecular listado abaixo. Pular as etapas de calibração e normalização. Exportar os resultados, incluindo pesos moleculares, volume de banda e % de banda em uma planilha no Excel para documentação e relatório adicional. Onze dos doze padrões de peso molecular listados na Tabela 5 deverão ser facilmente distinguidos da base (Figura 79).
[0001995] Nota: A cadeia B de insulina (3,500 Da) e cadeia A de insulina (2,500 Da) podem aparecer como uma única banda ampla ou a cadeia A de insulina pode não ser visualmente identificada sobre o gel. Padrões de peso molecular Mark 12
Figure img0248
[0001996] Nesse exemplo, as bandas principais do artigo de teste, para não-reduzidos (monômero) e reduzidos (cadeia simples), têm de ter as mesmas posições relativas sobre o gel que o material de referência CTLA4A29YL104E-Ig. Vide figura 79. O controle de coloração do padrão inibidor de tripsina de soja (21,500 Da) a 100 ng/carga deve ser visível sobre a imagem de gel explorada (Figura 79, fileira 12). Com a exceção de uma banda mínima sob condição de não-redução que é comumente observada (cadeia simples) proximal ao marcador molecular com peso de 55,400 Da, a intensidade relativa percentual de qualquer banda adicional no gel corado com azul Coomassie deverá ser < 2% para o material de referência.
[0001997] NOTA: Uma estimativa de peso molecular da banda principal não pode ser precisamente determinada em virtude sua distribuição não-gaussiana. Inspeção visual do material de referência reduzido proporciona uma única banda ampla que migra para uma posição proximal ao marcador de peso molecular de 55,400 Da (veja figura 79). A pureza percentual para a principal banda reduzida deve ser > 97%. Inspeção visual da banda principal do material de referência não reduzido proporciona uma única banda ampla que migra para uma posição proximal aos marcadores de peso molecular de 97,400 Da e 116,300 Da (figura 79, fileira 2). A pureza percentual da principal banda de ma- terial de referência deve ser > 97%. Inspeção visual da principal banda de material de referência não-reduzido proporciona uma única banda ampla major que migra para uma posição proximal aos marcadores de peso molecular de 97,400 Da e 116,300 Da (figura 79, fileira 2). A pureza percentual da principal banda de material de referência deve ser > 97%.
Exemplo 57 - UM MÉTODO DE HPLC PARA A DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DE TRITON X-100 EM CTLA4A29YL104E-Ig
[0001998] Triton X-100 é determinado em um baixo nível de partes por milhão (ppm) (<10 ppm) em amostras de proteína de CTLA4A29YL104E-Ig através de HPLC. O método envolve extração de Triton X-100 sobre meios de extração em fase sólida, seguido por lavagem com água para remover a proteína residual e eluição do Triton X-100 com acetonitrila. O eluato de acetonitrila é cromatografado usando uma coluna Phenomenex Hypersil C1 e uma fase móvel consistindo em acetonitrila: água (80: 20). Detecção é através de UV a 225 nm. O método é linear entre 1-22 ppm com o limite de detecção sendo de 0,25 ppm. CTLA4A29YL104E-Ig, um agente imunossupressor em potencial, é uma proteína de fusão de segunda geração, consistindo no domínio de ligação a ligante do antígeno 4 de linfócito T citotóxi- co e da região constante de cadeia pesada de IgG1 humana. Triton X100, um tensoativo não-iônico, é usado para inativação viral na purificação de CTLA4A29YL104E-Ig. Mesmo embora o Triton X-100 seja removido, níveis residuais ou ausência do tensoativo da proteína precisa ser estabelecida para fins de qualidade do produto e regulatórios. Para essa finalidade, um método capaz de detecção e quantificação de ní-veis residuais de Triton X-100 foi desenvolvido. Triton X-100 é extraído da proteína sobre um meio de SPE e eluído com acetonitrila para análise através de HPLC.
Preparo - padrão
[0001999] Placebo. Qualquer amostra ou Padrão de Referência pre-viamente analisado através desse método e verificado como não contendo níveis detectáveis de Triton X-100 pode ser usado como o placebo. A concentração de proteína no placebo e amostra deverá ser similar. O placebo deverá ser operado junto com a(s) amostra(s).
[0002000] Solução - Padrão de Estoque. Pesar precisamente 10,0 V 1,0 mg de Triton X-100 em um frasco volumétrico de 100 mL e diluir o volume com água e misturar.
[0002001] NOTA: Triton X-100 dissolve lentamente em água. Examinar a solução com relação à dissolução completa (tipicamente após 15 minutos) antes de uso. Triton X-100 é mais viscoso do que a água, de modo que quantidades não dissolvidas são visíveis na presença de água.
[0002002] Solução-Padrão de Trabalho. Colocar 25 μL da solução padrão de estoque de Triton X-100 em 0,5 mL do placebo de CTLA4A29YL104E-Ig. Misturar totalmente através de sujeição a turbilho- namento ou outro meio apropriado. Solução-padrão de trabalho contém aproximadamente 5 ppm (ou 5 μg/mL em peso/vol.) de Triton X100. NOTA: As soluções-padrão deverão ser preparadas frescas diariamente.
[0002003] Preparo de amostra. A amostra é usada como está. O placebo deverá ser operado junto com a(s) amostra(s).
[0002004] Extração de Triton X-100 de Soluções-Padrão e Amostra. As etapas de extração descritas abaixo são realizadas sob um vácuo de 0,08-0,13 m (3-5 polegadas) de Hg.
[0002005] Ativação do Meio de Extração de Fase Sólida (SPE). Levantar a tampa do manípulo de vácuo e colocar tubos de ensaio na prateleira dentro do manípulo. Esses são tubos de ensaio de "resíduo". Recolocar a tampa e colocar tubos de SPE sobre o manípulo de vá- cuo, certificando-se de que há um tubo de ensaio de "resíduo" por baixo de cada tubo de SPE. Adicionar um mL de acetonitrila a cada tubo e aplicar vácuo aos tubos até que todo o acetonitrila tenha passado através do leito de meio. Repetir etapa. Concentrar o Triton X-100 sobre o Meio SPE a partir da Matriz-Padrão/Amostra. Em tubos de SPE ativados separados, pipetear 0,50 mL de cada da solução-padrão de trabalho, amostras e placebo. Aplicar vácuo aos tubos de SPE até a solução ter passado completamente através do leito de meio. Remover a proteína residual do Leito de SPE. Adicionar um mL de água a cada tubo de SPE e aplicar vácuo aos tubos até que a água tenha passado através do leito de meio. Repetir etapa. Eluir o Triton X-100 do Leito de SPE. Desligar o vácuo para o manípulo para levar a unidade para a pressão normal. Levantar gentilmente a tampa do manípulo, com os tubos de SPE-padrão e amostra ainda presos. Substituir os tubos de ensaio de "resíduo" por um conjunto de tubos de ensaio pré-rotulados (para padrão, placebo e amostras) para coletar qualquer Triton X-100 que possa ter eluído dos Leitos de SPE nas etapas seguintes. Esses são os tubos de ensaio de eluato. Recolocar a tampa do manípulo, certificando-se de que cada Leito de SPE de amostra, placebo e padrão tem o respectivo tubo de ensaio de eluato por baixo. Adicionar 0,50 mL de acetonitrila a cada tubo de SPE e aplicar vácuo aos tubos até que todo o acetonitrila tenha passado através do leito de meio. Desligar o vácuo para o manípulo e levantar a tampa para recuperar os tubos de ensaio de eluato. Colocar os eluatos de acetonitrila do padrão, amostras e placebo em frascos para amostrador automático para injeção no sistema cromatográfico.
ADEQUABILIDADE DE SISTEMA
[0002006] Equilibrar a coluna/sistema com a fase móvel durante cerca de uma hora antes de iniciar as injeções. Obter o cromatograma da solução-padrão. O tempo de retenção para Triton X-100 deverá ser 5 V 1 minuto. A eficiência da coluna para Triton X-100, avaliada como o número de placas teóricas, N, deve ser > 2000 lâminas/coluna quando calculada de acordo com a seguinte equação:
Figure img0249
[0002007] onde:
[0002008] t é o tempo de retenção do pico de Triton X-100 e w é a largura na linha de base do pico de Triton X-100 obtida através de extrapolação dos lados do pico para a linha de base. Fazer pelo menos três injeções da solução-padrão. O RSD percentual das contagens de área das últimas três injeções não deverá ser mais de 3,0%.
[0002009] Subtrair o cromatograma de placebo dos cromatogramas de padrão e amostra e proceder os seguintes cálculos:
Figure img0250
onde:
Figure img0251
Exemplo 58 - Ensaio para determinação de Teor de DNA celular de CHO em composição de CTLA4-Ig
[0002010] Esse procedimento foi desenvolvido para detectar DNA de CHO residual nas amostras de Substância de Fármaco de CTLA4-Ig usando um ensaio de reação em cadeia de polimerase quantitativa em tempo real (qPCR). PCR é a replicação de uma mistura de DNA. Esse ensaio usou uma sonda fluorogênica para detectar um produto de PCR de CHO específico à medida que ele se acumula durante o ensaio. A taxa de amplificação do produto de PCR é diretamente proporcional à quantidade de DNA de iniciação presente na amostra. O obje- tivo é detectar a quantidade DNA genômico de CHO nas amostras de Composições de CTLA4-Ig.
[0002011] A amostra é analisada através de detecção de DNA de CHO em amostras biológicas através de Análise por Reação em Cadeia de Polimerase Quantitativa. Cálculos são realizadas e os resulta- dos são reportados para duas situações representativas nas unidades de pg/mg. Se os resultados são menores do que o limite de quantificação do ensaio, os resultados são reportados como < Q.L. e o Q.L. do ensaio é registrado. Há uma conversão do valor de DNA para pico- grama/miligrama. O valor de pg/mL é dividido pela concentração da amostra, determinada através da absorbância a 280 nm.
[0002012] Cálculo exemplificativo para a amostra tendo uma concentração de proteína de 50 mg/mL e um valor reportado a partir da Bio- confiança = 0,67 fg/μL. Etapa 1: Conversão para pg/mL = 0,67 pg/mL Etapa 2: Conversão para pg/mg = (0,67 pg/mL / 50,0 mg/mL) = 0,013 pg/mg.
Exemplo 59 - Determinação de proteína MCP-1 em Amostras bio lógicas e em Composições de CTLA4-Ig
[0002013] O exemplo apresenta métodos usados para quantificar proteína semelhante a MCP-1 residual em amostras biológicas e amostras de CTLA4-Ig. Materiais:
Figure img0252
Reagentes
[0002014] Solução salina tamponada com fosfato (PBS, Tampão de Fosfato a 10 mM, NaCl a 137 mM, KCl a 2,7 mM, pH de 7,3 a 7,5). Preparar de acordo as orientações do fabricante sobre a garrafa. A um vaso de tamanho suficiente, adicionar água com grau para HPLC, péletes de PBS e uma barra de agitação. Sobre uma lâmina em agitação, misturar até que os péletes e sal estejam dissolvidos. Ajustar o pH de 7,3 para 7,5 conforme necessário com Hidróxido de sódio ou Ácido clorídrico. Agitar até bem misturado. Filtrar através de uma unidade de filtro descartável de 0,22 μm. Armazenar a solução a 2-8°C durante até 30 dias a partir da data de preparo.
[0002015] MCP-1 (Proteína-1 quimiotática de monócitos) é uma proteína humana a qual exerce um papel no recrutamento de monócitos a locais de lesão e infecção. Uma proteína pode ser considerada semelhante a MCP-1 baseado na homologia e reatividade cruzada com anticorpos contra a MCP-1. Uma vez que os anticorpos usados no ELISA reconhecem apenas uma porção da proteína-alvo, formas truncadas de MCP-1 podem reagir no ensaio mesmo embora elas possam não ser tecnicamente ativas. Assim, qualquer variante de MCP-1 de hamster a qual reage no ensaio será quantificada de modo que o ensaio detecta MCP-1 de comprimento total e quaisquer variantes de MCP-1 as quais contenham os epítopos corretos. Note que, usando uma mistura de anticorpo policlonal, é mais provável que uma série de epítopos sejam representados.
[0002016] Solução de Lavagem (Tampão de Fosfato a 1,0 mM, NaCl a 137 mM, KCl a 0,27 mM, pH de 7,3 a 7,5 contendo Tween 20 a 0,01% v/v). A 4,0 L de água destilada ou com grau para HPLC, adicionar uma barra de agitação, 2 comprimidos de PBS, 28,8 g de NaCl e 0,4 mL de Tween 20. Misturar gentilmente até que todos os conteúdos estejam dissolvidos. Ajustar o pH de 7,3 para 7,5 conforme necessário com Hidróxido de sódio ou Ácido clorídrico. Armazenar a 2-8°C durante até 30 dias a partir da data de preparo.
[0002017] Diluente (PBS, pH de 7,3 a 7,5 contendo BSA a 1% pe- so/v e Tween 20 a 0,05% v/v). (Por favor, note que isso é uma alternativa ao uso de diluente comercialmente disponível). A 4 L de solução salina tamponada com fosfato, adicionar uma barra de agitação, 40 g de BSA e 2 mL de Tween 20. Misturar gentilmente até que todos os conteúdos estejam dissolvidos. Filtrar através de um filtro de 0,22 μm. Armazenar a 2-8°C durante até 30 dias a partir da data de preparo quando armazenado sem abrir ou 7 dias após abrir.
[0002018] Reagente de revestimento de lâmina. Reconstituir vários frascos de anticorpo anti-MCP-1 de camundongo de cabra conforme as instruções do fabricante, misturar invertendo gentilmente várias vezes e combinar. Preparar alíquotas e armazenar a -20°C durante até um ano (não exceder a data de expiração do fabricante). Evitar congelamento e descongelamento repetidos. Alternativamente, os frascos com amostra liofilizada podem ser armazenados a -20°C durante mais de seis meses. Quando de reconstituição, o anticorpo pode ser armazenado a 2-4°C durante um mês.
[0002019] Reagente secundário. Reconstituir um frasco de anticorpo anti-MCP-1 de rato de coelho conforme as instruções do fabricante, misturar invertendo gentilmente várias vezes. A solução é armazenada a 2-8°C durante até quatro semanas. Alternativamente, os frascos com amostra liofilizada são estáveis a -20°C durante mais de um ano.
[0002020] Reagente terciário. Empoçar vários frascos de IgG anticoelho de cabra (H+L) HRP e misturar invertendo gentilmente várias vezes. Preparar alíquotas e armazenar a -20°C durante até 2 anos (não exceder a data de expiração do fabricante). Evitar congelamento e descongelamento repetidos. Uma vez descongelado, o frasco pode ser armazenado a 2 a 8°C durante até 30 dias.
[0002021] Preparo de Padrões. A partir do estoque de Proteína se- melhante a MCP-1, preparar uma solução a 25,6 ng/mL em diluente e diluir a partir daí em etapas de diluição serial (2 vezes) para 12,8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8 e 0,4. 0 ng/mL de padrão é diluente não diluído.
[0002022] Exemplo para o preparo de Padrões usando Material de referência MCP-1 com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL: a) (Solução A) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em diluente: 13,4 uL de estoque + 2,487 mL de Diluente b) (Solução B) Preparar 3,9 mL de 25,6 ng/mL em diluente: 19,2 uL de estoque a + 3,881 mL de Diluente
[0002023] Preparar os padrões restantes usando os volumes definidos abaixo: Diluente Solução deConcentração TrabalhoVolume (mL)Final (mL)(ng/mL) 25,6 ng/mL1 mL025,6 ng/mL 25,6 ng/mL1 mL1 mL12,8 ng/mL 12,8 ng/mL1 mL1 mL6,4 ng/mL 6,4 ng/mL1 mL1 mL3,2 ng/mL 3,2 ng/mL1 mL1 mL1,6 ng/mL 1,6 ng/mL1 mL1 mL0,8 ng/mL 0,8 ng/mL1 mL1 mL0,4 ng/mL
[0002024] Misturar cada solução através de turbilhonamento em ajuste médio durante aproximadamente 2 - 3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2 - 3 vezes.
[0002025] Preparo de Amostras de controle de qualidade. Preparar amostras de Controle de Qualidade (QC) a partir de um frasco de Proteína semelhante a MCP-1 em diluente. Preparar uma concentração de estoque de solução a 520 ng/mL a partir da qual as seguintes amostras de controle de qualidade para congelamento são feitas: 11,0 ng/mL, 5,3 ng/mL e 1,2 ng/mL. Diluir conforme descrito na tabela abai- xo. Exemplo para o preparo de QCs usando Material de referência MCP-1 com uma concentração de estoque de 0,97 mg/mL: a) (Solução A) Preparar 2,5 mL de 5200 ng/mL em diluente: 13,4 uL de estoque + 2,487 mL de Diluente b) (Solução B) Preparar 5,0 mL de 520 ng/mL em diluente: 500 uL de estoque a + 4,500 mL de Diluente c) Preparar diluição final de amostras de QC de proteína semelhante a MCP-1 como segue:
Figure img0253
[0002026] Misturar cada solução através de turbilhonamento em ajuste médio durante aproximadamente 2 - 3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2 - 3 vezes.
[0002027] Preparo de Amostras de teste. Cada amostra de teste consiste em artigo de teste diluído. Amostras de teste são preparadas através da adição de 200 μL da amostra de teste a 200 μL de diluente. Misturar cada solução através de turbilhonamento em velocidade média durante aproximadamente 2 - 3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2 - 3 vezes.
[0002028] Procedimento. Revestir a lâmina. Diluir anticorpo anti- MCP-1 de camundongo de cabra para 5 μg/mL com PBS. Misturar o anticorpo e solução de PBS através de turbilhonamento em ajuste médio durante aproximadamente 2 - 3 segundos e, então, gentilmente invertendo 2 - 3 vezes. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL dessa solução a cada cavidade. Cobrir as lâminas com vedantes para lâmina e incubar em temperatura ambiente durante 12 a 18 horas. Lavar a lâmina. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando um lavador de lâminas. Ajustar o lavador em três la- vagens, 300 μL/cavidade com um tempo de embebimento zero. Alter-nativamente, as lâminas podem ser lavadas manualmente. Adicionar 300 μL de Solução de Lavagem a cada cavidade de cada lâmina usando uma pipeta com múltiplos canais. Esvaziar as cavidades sacudindo em uma pia e blot gentilmente sobre papéis toalha. Repetir três vezes.
[0002029] Bloqueio de lâmina. Adicionar 300 μL de CSBB a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar as lâminas durante aproximadamente 60 ± 10 minutos em temperatura ambiente.
[0002030] Adição de Amostras. Adicionar padrões de referência, controles de qualidade (dois conjuntos de cada concentração ) e amostras de teste à lâmina, em triplicata, 100 μL/cavidade e incubar durante aproximadamente 60 ± 10 minutos em temperatura ambiente. Não usar as cavidades externas. Preparar anticorpo secundário anti- MCP-1 de rato de coelho. Diluir estoque de anticorpo anti-MCP-1 de rato de coelho para 2 μg/mL ou diluição apropriada (conforme testagem de equivalência de lote ou COA) em diluente em um volume suficiente para as lâminas usadas no ensaio. Submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade média. Repetir a lavagem de lâmina, mas lavar cinco vezes. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL da solução de anticorpo secundário a cada cavidade e incubar durante 60 ± 10 minutos em temperatura ambiente. Preparar solução de anticonjugado de HRP terciário de coelho de cabra (0,5 μg/mL ou diluição apropriada) usando dilu- ente. Misturar conjugado de HRP através de turbilhonamento em ajuste médio durante aproximadamente 2 - 3 segundos e, então, gentil-mente invertendo 2 - 3 vezes. Diluir para a concentração estabelecida conforme o SOP do departamento para qualificação de reagente. Repetir a lavagem de lâmina cinco vezes. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL de conjugado de HRP a cada cavidade e incubar em temperatura ambiente no escuro durante aproximadamente 30 □ 5 minutos. Repetir a lavagem de lâmina cinco vezes. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL de TMB a cada cavidade e incubar em temperatura ambiente no escuro durante aproximadamente 2,5 - 4 minutos. Usando uma pipeta com múltiplos canais, parar a reação de TMB através da adição de 100 μL de H2SO4 a 1,0N na mesma ordem conforme a adição de TMB foi feita. Ler as densidades ópticas a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâminas com 96 cavidades.
[0002031] Valores exemplificativos. Os valores exemplificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima do limite quantitativo (QL) (0,8 ng/mL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas para ajudar a estabelecer os extremos da curva. A média, usando o cálculo abaixo, base (o zero ng/mL de padrão) devem ser <0,1 unidade de absorção.
Figure img0254
[0002032] onde:
[0002033] X1,2,3=um valor específico em um conjunto de dados
[0002034] N=número de valores em um conjunto de dados
[0002035] Cada concentração-padrão usada para determinar a curva- padrão, excluindo o zero, 0,4 e o QL (0,8 ng/mL) devem estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal). O coeficiente de variância (CV%) dos valores AB450 em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, com exceção do zero, 0,4 e o QL (0,8 ng/mL), devem ser <15%. A concentração média calculada de MCP-1 para a amostra de teste de composição de CTLA4-Ig deverá ser < 11,0 ng/mL. Se a concentração média calculada de MCP-1 é > 0,8 ng/mL (o QL de ensaio) calcular a CV% das determinações em triplicata e os valores exemplificativos devem ser < 20%. Se os valores exemplificati- vos são reunidos, a concentração média de MCP-1 é usada para computar ppm. Se a concentração calculada de MCP-1 é < 0,8 ng/mL (QL de ensaio), a amostra é reportada como < QL e o valor "< 0,8 ng/mL" é usado na computação de ppm. A CV% da determinação em triplicata não é considerada.
[0002036] A amostra de QC é definida como um conjunto de três ca-vidades na concentração estabelecida, portanto, para as três concen-trações nominais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC. As concentrações de pelo menos duas das três cavi-dades para uma amostra de QC devem deve estar de 20% da concen-tração nominal estabelecida para que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos doze das dezoito determinações de amostra de QC devem estar dentro de 20% de seus respectivos valores-alvo. Seis das dezoito amostras de QC (não três na mesma concentração ) podem se desviar mais de 20% do respectivo valor nominal. Pelo menos quatro das seis amostras de QC devem ser aceitáveis. Duas são permitidas como sendo inaceitáveis, contanto que elas não estejam ambas na mesma concentração.
[0002037] Avaliação de dados. Usar o Software Softmax® com o arquivo de protocolo MCP-1.ppr para construir uma curva-padrão usando uma regressão com quatro parâmetros ponderada da forma.
[0002038] onde:
[0002039] A=valor de absorbância450 correspondendo ao assíntota mínimo
[0002040] D=valor de Absorbância450 correspondendo ao assíntota máximo
[0002041] c=Concentração correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo
[0002042] b=o declínio aproximado da porção linear da curva
[0002043] x=concentração-padrão de referência
[0002044] Cálculos para a concentração de Proteína semelhante a MCP-1. A quantidade de Proteína semelhante a MCP-1 na amostra de teste pode ser calculada usando o Software Softmax lâmina Reader. O exemplo abaixo ilustra como os resultados finais podem ser reportados. Uma diluição de duas vezes de cada amostra é ensaiada. A concentração calculada é multiplicada pelo fator de diluição apropriado (2) a fim de proporcionar a concentração no artigo de teste não diluído.
[0002045] Exemplos: 1) Amostra de teste diluída é 10,0 ng/mL. Concentração de proteína semelhante a MCP-1 em um artigo de teste não diluído é: 10 ng/mL x 2 = 20 ng/ml de MCP-1 2) Resultado da amostra diluída é "<0,8 ng/mL". Concentração de proteína semelhante a MCP-1 em um artigo de teste não diluído é: "<0,8 ng/mL" x 2 = "<1,6 ng/mL" de MCP-1 Para reportar o resultado final em ng de proteína semelhante a MCP-1 por mg de amostra (ppm), dividir o resultado obtido acima pela concentração não diluída de amostra. Exemplos: 1) Concentração de teste de amostra de proteína = 50 mg/mL Concentração de proteína semelhante a MCP-1 = 200 ng/mL: 200 ng/ml de MCP-1 / 50 mg/mL = 4 ng/mg A amostra é reportada como 4 ppm (partes por milhão) 2) Concentração de teste de amostra de proteína = 50 mg/mL Concentração de proteína semelhante a MCP-1 = "<1,6 ng/mL": "<1,6 ng/mL" MCP-1 / 50 mg/mL = "<0,032 ng/mg" A amostra é reportada como "<QL,(<0,032 ppm)".
Exemplo 60: Ensaio para determinação de níveis residuais de proteína CD-CHO1 através de ELISA para testagem de liberação de material de Substância de Fármaco de CTLA4-Ig
[0002046] Tampão de Carbonato. A um vaso adequado contendo uma barra de agitação, adicionar: 200 mL com água com grau para HPLC, para fazer 2 cápsulas de Tampão de Carbonato. Usando uma placa de agitação, misturar até o material estar em solução. Usando um medidor de pH, ajustar o pH para 9,6 conforme necessário com NaOH a 1N ou H2SO4. Usando uma placa de agitação, misturar a solução durante um mínimo de 5 minutos. Filtrar a solução através de um filtro de 0,22 μm. Armazenar a solução a 2 - 8°C durante até 30 dias e rotular conforme os procedimentos do departamento.
[0002047] Tampão de Lavagem (PBS contendo Tween 20 a 0,05% v/v, pH de 7,4). A uma garrafa de 4 L de água com grau para HPLC com uma barra de agitação, adicionar 20 comprimidos de PBS. Adicionar 2 mL de Tween 20. Usando uma placa de agitação, misturar até o material estar em solução. Usando um medidor de pH, ajustar o pH para 7,4 conforme necessário com NaOH a 1N ou HCl a 1N. Usando uma placa de agitação, misturar a solução durante um mínimo de 5 minutos. Armazenar a solução a 2 - 8°C durante até 30 dias e rotular conforme os procedimentos do departamento.
[0002048] Estreptavidina-HRP. Adicionar 0,5 mL de água com grau para HPLC a um frasco de Estreptavidina-HRP. Para misturar, tampar o frasco e submeter a turbilhonamento gentilmente durante aproximadamente 10 segundos. Adicionar 0,5 mL de glicerol ao frasco de Es- treptavidina-HRP. Misturar. Verificar a clareza da solução extraindo a solução em uma pipeta de Pasteur limpa. Se a solução não está clara, misturar conforme 3.3.2 e repetir 3.3.5 até que a solução esteja clara. Determinar o esquema de diluição apropriado a ser usado para o lote de Estreptavidina HRP de acordo com os procedimentos do departamento. Transformar em alíquotas volumes de 20 μL em tubos com tampa de rosca de 0,5 mL. Tampar e colocar em uma caixa de arma- zenamento de células. Armazenar a solução a - 20°C durante até 365 dias e rotular conforme os procedimentos do departamento.
[0002049] Solução de Término (H2SO4 a 1 N). Em uma coifa, colocar um recipiente adequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra de agitação. Adicionar 485,6 mL de água com grau para HPLC. Ligar a placa de agitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,4 mL de H2SO4 concentrado. A solução é estável durante 90 dias quando armazenada em temperatura ambiente. Rotular a solução conforme os procedimentos do departamento.
[0002050] Procedimento. Revestir a lâmina. Preparar uma solução a 8 μg/mL de anticorpo anti-CD CHO1 de coelho purificado em Tampão de Carbonato a ser usado para revestimento de lâminas de microtitu- lação (10 mL de solução são requeridos por lâmina de microtitulação). Adicionar 100 μL dessa solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon 4 usando uma pipeta com múltiplos canais. cobrir a lâmina de microtitulação com parafilme e incubar a 2-8°C durante 18 ± 2 horas.
[0002051] Lavagem de lâmina. Lavar a lâmina três vezes com 300 μL de tampão de lavagem usando um instrumento para lavagem de lâminas. (Alternativamente, a lâmina pode ser lavada manualmente usando uma pipeta com múltiplos canais.) Após a última lavagem, a lâmina deverá ser virada para baixo e seca sobre uma toalha de papel colocada sobre uma superfície rígida.
[0002052] Bloqueio de lâmina. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 300 μL de SeaBlock a cada cavidade. Incubar a lâmina no escuro durante 1 hora (± 6 minutos) em temperatura ambiente. As lâminas devem ser enroladas com folha de alumínio ou colocadas em uma câmara ou secador. Preparar amostras de Curva-padrão usando Diluente Teknova em tubos de polipropileno estéreis graduados de 15 mL de acordo com o esquema de diluição abaixo. Nota: O esquema de diluição abaixo é para 5 lâminas. Ajustar os volumes conforme necessário para o número de lâminas no ensaio.
[0002053] Obter a concentração de proteína do Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 (Padrão de Referência) do Certificado de Análise (COA). Preparar uma solução a 30 μg/mL de Padrão de Referência de proteína CD-CHO1. Calcular o volume requerido de Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 para obter uma solução a 30 μg/mL. O volume mínimo de transferência para o Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 deverá ser de 10 μL. Concentração desejada x volume desejado Fórmula: Volume = Concentração de material de referência Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.
Figure img0255
Exemplo:
[0002054] Calcular o volume de Diluente subtraindo o volume requeri- do de Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 do volume desejado. Fórmula: (Volume desejado) - (volume do Padrão de Referência) = (Volume de diluente) Exemplo: 10,0 mL - 0,012 mL = 9,988 mL de Diluente
[0002055] Adicionar o volume calculado de Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 a um tubo estéril de 15 mL o qual contém um volume calculado de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhona- mento em um ajuste entre durante 2 - 4 segundos. Preparar os padrões restantes. A tabela abaixo é mostrada como um exemplo:
Figure img0256
[0002056] Tampar o tubo após cada etapa de diluição e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2 - 4 segundos antes de prosseguir para a próxima etapa de diluição.
[0002057] Preparar Soluções de Controle de Qualidade (QC) usando Diluente Teknova em tubos de polipropileno estéreis graduados de 15 mL de acordo com o esquema de diluição abaixo. Obter a concentração de proteína do Material de referência de proteína CD-CHO1 (Mat ref) do Certificado de Análise (COA). Preparar uma solução a 30 μg/mL de Padrão de Referência de proteína CD-CHO1 (Mat ref). Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento em um ajuste entre durante 2 - 4 segundos. Preparar soluções de QC nas concentrações de 700, 100 e 25 ng/mL. Um esquema de diluição exemplificativo é mostrado abaixo:
Figure img0257
[0002058] Tampar o tubo para cada solução de QC e submeter a tur- bilhonamento gentilmente durante 2 - 4 segundos. Soluções de Controle de Qualidade podem ser preparadas frescas no dia do ensaio ou elas podem ser transformadas em alíquotas e congeladas. Determinar a concentração real das três soluções de QC em três experimentos independentes. Calcular a média dos resultados dos três experimentos para cada solução de QC e emitir um COA para cada uma das três soluções de QC. Essas concentrações de QC experimentalmente de-terminadas têm de ser usadas como valores alvo quando se realiza análise sobre amostras de CTLA4-Ig. Armazenar as soluções de QC em alíquotas prontas para uso a -70°C. Soluções de QC expiram 6 meses após preparo. Remover as soluções de QC do armazenamento no dia de ensaio e descongelar em temperatura ambiente. Submeter a turbilhonamento as soluções de QC descongeladas em velocidade média durante 2-4 segundos antes de uso.
[0002059] Preparo de amostra. Preparar aproximadamente a 12,5 mg/mL de solução para cada amostra de CTLA4-Ig a ser analisada em diluente através da adição de 250 μL de amostra de Substância de Fármaco a 750 μL de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilho- namento gentilmente durante 2 - 4 segundos. Preparar uma solução a 6,25 mg/mL para cada amostra de CTLA4-Ig a ser analisada através da adição de 400 da solução a 12,5 mg/mL a um tubo contendo 400 μL de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2 - 4 segundos. Preparar uma solução a 3,125 mg/mL para cada amostra de CTLA4-Ig a ser analisada através da adição de 400 da solução a 6,25 mg/mL a um tubo contendo 400 μL de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2 - 4 segundos. Lavar a lâmina repetindo a etapa de lavagem. Adicionar 100 μL por cavidade de cada concentração de soluções de padrão, amostras e QC em triplicata à lâmina bloqueada e lavada. Cada solução de QC é adicionada duas vezes a um total de seis cavidades por lâmina. Incubar durante 1 hora no escuro (± 6 minutos) em temperatura ambiente. Repetir a lavagem 5 vezes. Remover a Estreptavidina- HRP do congelador e deixar ir para a temperatura ambiente. Diluir anticorpo anti-CD CHO1-Biotina de coelho para 2 μg/mL em Tampão Teknova. Submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade média. Usando uma pipeta com múltiplos ca- nais, adicionar 100 μL por cavidade. Incubar durante 1 hora (± 6 minutos) no escuro em temperatura ambiente. Diluir a Estreptavidina-HRP para a concentração estabelecida para uso no ensaio baseado na qualificação do lote de reagente conforme o procedimento do departamento. Tampar e submeter a turbilhonamento a solução aproximadamente 2-4 segundos em velocidade média. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL de diluição de Estreptavidina-HRP a cada cavidade. Incubar em temperatura ambiente no escuro durante 1 hora (± 6 minutos). Repetir. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade. Incubar em temperatura ambiente durante 2 minutos (± 12 segundos). Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 100 μL/cavidade de Solução de Término (H2SO4 a 1 N). Adicionar Solução de Término às lâminas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cada cavidade. Usando um leitor para lâmina SpectraMax Plus, medir a absorbância a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm sobre um leitor para lâmina com 96 cavidades apropriado. Avaliação de dados. Refira-se ao modelo do programa SoftMax, uma vez que ele gera a média, desvios-padrão e CVs %, etc. Determinar cada um dos valores exemplificativos usando os valores de absorbân- cia em triplicata obtidos para cada referência, QC e diluições de amostra ensaiada. Gerar a Curva-padrão. Modelar os dados de Padrão de Referência usando uma regressão com quatro parâmetros da forma.
Figure img0258
[0002060] onde:
[0002061] AB=Absorbância a 450 nanômetros
[0002062] A=Valor de absorbância correspondendo ao assíntota mí- nimo
[0002063] D=Valor de absorbância correspondendo ao assíntota máximo
[0002064] c=Concentração correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo
[0002065] B=o declínio aproximado da porção linear da curva x=Concentração de material de referência CD-CHO1
[0002066] Determinar o coeficiente de determinação (R2) da linha de regressão para os padrões usando a média calculada usando a fórmula acima. Calcular a concentração de CD-CHO1 nas amostras. Multiplicar os resultados médios da amostra pelo fator de diluição apropriado (isto é, 4, 8 e 16) para obter a concentração de CD-CHO1 na amostra original em ng/ml. Dividir o resultado pela concentração de proteína de CTLA4-Ig reportada (mg/ml) para obter a concentração de CD- CHO1 em ng/mg de CTLA4-Ig. Determinar a média de todos os resultados, a qual cai dentro da faixa da curva-padrão. Calcular a concentração de proteína CD-CHO1 na amostra não diluída aplicando o fator de diluição. Para determinar a concentração de proteína CD-CHO1 com relação à concentração de amostra de CTLA4-Ig, dividir pela concentração não diluída. Cálculo exemplificativo: Resultado médio da amostra 235 ng de CD CHOP/mL = 4,7 ng/mg BMS - concentração de 188667 50 mg/mL Nota: ng de CD/mg de produto de CHO1 (ng/mg) é equivalente a partes por milhão (ppm).
[0002067] Valores exemplificativos. Valores exemplificativos para os padrões. O coeficiente de determinação (R2) para a Curva-padrão deverá ser >0,99. A base média para o padrão de zero ng/mL deverá ser < 0,10 unidades de absorção. A média dos valores calculados (ng/mL) em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e concentrações abaixo QL (12,3 ng/mL), deve estar dentro de 20% do valor-alvo (nominal), conforme determinado pelo software. O coeficiente de variação (% CV) dos valores de absorbância em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e concentrações abaixo QL (12,3 ng/mL), devem ser menos de 20%, conforme determinado pelo software. Para assegurar que pelo menos dois pontos de dados congruentes estão disponíveis para cálculo, os padrões, controles de qualidade e amostras são carregados em cavidades em triplicata. Analisar cada valor em triplicata separadamente. Reduzir o valor que repousa mais distante do alvo. Exemplo: Valor-alvo (ng/mL)Valor real (ng/mL) 5025 48 49
[0002068] O único valor que está mais distante do valor-alvo de 50 ng/mL é 25 ng/mL. eliminando o valor de 25 ng/mL da triplicata, a média dos valores restantes irá ao encontro dos valores exemplificati- vos.
[0002069] Se é mostrado que a média dos dois valores restantes ainda não vão ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ponto único é eliminado e a curva é recalculada. Exemplo: Valor-alvo (ng/mL)Valor real (ng/mL) 5010 10,5 25
[0002070] O valor médio é >20% do alvo, a despeito de qual valor é eliminado, portanto, o ponto único cai da curva e a curva será recalculada. Apenas 2 pontos sobre a curva-padrão podem ser eliminados.
[0002071] Valores exemplificativos para amostras de QC. A amostra de QC é definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabelecida, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC. Pelo menos duas das três cavidades para uma amostra de QC devem estar dentro de 20% do nominal para que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos quatro das seis amostras de QC devem estar dentro de 20% de suas respectivas concentrações-alvo; duas das seis amostras de QC (não duas na mesma concentração) podem exceder o desvio de 20% do nominal, conforme calculado pelo software. Não mais do que 6 das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% das respectivas concentrações-alvo.
[0002072] Valores exemplificativos para amostras de teste. A ab- sorbância média para a amostra de teste ensaiada deve ser menor do que o maior ponto sobre a curva-padrão. Se a absorbância média da amostra excede a absorbância média de 3000 ng/mL de padrão, a amostra de teste deve ser diluída suficientemente de modo a obter uma absorbância média entre 3000 e 12,3 ng/mL. A absorbância média de pelo menos uma de três diluições de amostra (12,5, 6,25 e 3,125 mg/ml) deve cair dentro da faixa da curva-padrão para um resultado reportável, a menos que a absorbância média para todas as diluições esteja abaixo a absorbância média da QL (12,3 ng/mL de padrão). Nesse caso, as amostras de teste são reportadas como < QL. A média dos valores de absorbância em triplicata da diluições de amostra que é maior do que a QL e cai dentro da faixa da curva-padrão deve exibir uma CV de menos do que 20%, conforme determinado pelo software. Se, quando de eliminação de uma das absorbâncias em tri- plicata e recálculo da CV ainda é > 20% ou se duas diluições de amos- tra têm CV’s para a absorbância maior do que 20% e cai dentro da faixa da curva-padrão, a análise dessa amostra deve ser repetida. Exemplo 61 - Ensaio para quantidade residual de Triton X-100 na composição de CTLA4-Ig
Figure img0259
Preparo de Reagentes
[0002073] Preparo de Fase móvel: Acetonitrila: Água (80: 20). Para 1L, misturar completamente com uma barra de agitação, 800 mL de acetonitrila e 200 mL de água purificada ou com grau para HPLC. Filtrar através de um filtro de náilon de 0,2 μm. Desgasseificar a fase móvel usando um desgasseificador in-line, tal como um Alliance System ou usando purgação com hélio. Preparar fresca diariamente.
[0002074] NaOH a 2N. Pesar e quantitativamente transferir 80 ± 1 g de NaOH sólido para um frasco de 1 L. Compor o volume com água purificada ou com grau para HPLC. Misturar bem com uma barra de agitação e filtrar através de um aparelho com filtro de 0,22 μm. Alternativamente, diluir serialmente o NaOH em uma solução a 10N. Armazenar até 6 meses em temperatura ambiente.
[0002075] Tampão de Substância de Fármaco. Pesar e transferir quantitativamente 3,45 g de NaH2PO4 H20 e 2,92 g de NaCl para um frasco de 1 L. Adicionar aproximadamente 800 mL de água purificada ou com grau para HPLC. Misturar bem com uma barra de agitação e compor o volume com água purificada ou com grau para HPLC. Ajustar o pH para 7,5 com NaOH a 2N. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,22 μm. Armazenar até 4 meses a 4°C.
[0002076] Preparo de Padrão de placebo de amostra. Qualquer amostra ou material de referência de CTLA4-Ig previamente analisado e verificado como não contendo níveis detectáveis de Triton X-100 pode ser usado como o Placebo de Amostra. A proteína de Placebo de Amostra deverá ser operada junto com a(s) amostras(s). Triton X-100 dissolve lentamente em água. Examinar a solução com relação à dissolução completa (tipicamente após 15 minutos) antes de uso. Triton X-100 é mais viscoso do que a água, de modo que quantidades não dissolvidas são visíveis na presença de água.
[0002077] Preparo de Padrão de Estoque de Triton X-100 a 10,0 μg/mL N° 1. Pesar precisamente 10,0 ± 1,0 mg de Triton X-100 em um frasco volumétrico de 100 mL e diluir até o volume com água; e misturar gentilmente com uma barra de agitação. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 A. Tomar 10 mL de Padrão de Estoque de TX100 A em um frasco volumétrico de 100 mL. Diluir até o volume com água. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 N° 1. Preparar fresca diariamente.
[0002078] Preparo de Padrão de Estoque de Triton X-100 a 10,0 μg/mL N° 2. Pesar precisamente 10,0 ± 1,0 mg de Triton X-100 em um frasco volumétrico de 100 mL e diluir até o volume com água; e misturar gentilmente com uma barra de agitação. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 B. Tomar 10 mL de Padrão de Estoque de TX100 em um frasco volumétrico de 100 mL. Diluir até o volume com água. Rotular como Padrão de Estoque de TX100 N° 2. Preparar fresca diariamente.
[0002079] Preparo de Solução de Avaliação de Adequabilidade de sistema de TX100 N° 1 (SS N° 1). A partir do Padrão de Estoque de TX100 N° 1, preparar uma Solução de Avaliação de Adequabilidade de sistema de TX100 a 5,0 μg/mL através de diluição de 300 μL de Padrão de Estoque de TX100 N° 1 com 300 μL de acetonitrila. Misturar bem através de pipeteamento e centrifugação.
[0002080] Preparo de Solução de Avaliação de Adequabilidade de sistema de TX100 N° 2 (SS N° 2). A partir do Padrão de Estoque de TX100 N° 2, preparar a 5,0 μg/mL de Solução de Avaliação de Ade- quabilidade de sistema de TX100 através de diluição de 300 μL de Padrão de Estoque de TX100 N° 1 com 300 μL de acetonitrila. Misturar bem através de pipeteamento e centrifugação.
[0002081] Preparo de Controle de passe de TX100, Padrão de Limite, Controle de falha. A partir do Padrão de Estoque de TX N° 1, preparar a solução identificada na Tabela abaixo.
Figure img0260
[0002082] Preparo de Amostra. A amostra é usada sem concentração ou diluição.
[0002083] Procedimento: Extração de Triton X-100 do Padrão e Solução de amostra. CUIDADO: As etapas de extração descritas abaixo são realizadas sob um vácuo de 0,08 - 0,09 m (3-3,5 polegadas) de Hg.
[0002084] Ativação do meio de Extração em Fase Sólida (SPE). Levantar a tampa do manípulo de vácuo e colocar tubos de ensaio de 12 x 75 mm vazios na prateleira dentro do manípulo. Esses são tubos de ensaio "residuais". Recolocar a tampa e colocar os cartuchos de SPE sobre o manípulo de vácuo, certificando-se de que haja um tubo de ensaio "residual" por baixo de cada tubo de SPE. Adicionar 1000 μL de acetonitrila a cada cartucho de SPE e aplicar vácuo até que toda a acetonitrila tenha passado através do leito de meio. Repetir com mais 1000 μL de acetonitrila. Adicionar 500 μL de água purificada ou com grau para HPLC a cada cartucho de SPE e aplicar vácuo até que toda a água tenha passado através do leito de meio. Repetir com mais 500 μL de água purificada ou com grau para HPLC.
[0002085] Concentração de Triton X-100 sobre o Meio de SPE Media para o Padrão de Limite e Controles. Pipetear 500 μL de cada do Padrão de Limite, Controle de Passe, Placebo de Controle de Falha e amostras separadamente sobre cartuchos de SPE ativados. Aplicar vácuo aos tubos de SPE até que cada solução tenha passado completamente através do leite de meio.
[0002086] Remoção de Proteína residual do glóbulo de SPE. Adicionar 1000 μL de água a cada cartucho de SPE e aplicar vácuo aos tubos até a água tenha passado através de do leito de meio. Repetir etapa com mais 1000 μL de água.
[0002087] Eluição de Triton X-100 do glóbulo de SPE. Desligar o vácuo para o manípulo para liberar a pressão da unidade para zero. Levantar gentilmente a tampa do manípulo, com os cartuchos de SPE ainda presos. Substituir os tubos de ensaio "residuais" por um conjunto de tubos de ensaio de "eluato" pré-rotulado ou frascos para amostra- dor automático (Padrão de Limite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostras pré-rotuladas) para coletar qualquer Triton X-100 que elui dos glóbulos de SPE. Recolocar a tampa do manípulo, certificando-se de que cada Padrão de Limite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostras de cartucho de SPE tenha um respectivo tubo de eluato ou frasco para amostrador automático por baixo. Adicionar 500 μL de acetonitrila a cada cartucho de SPE e aplicar vácuo aos tubos até que todo acetonitrila tenha passado através do leito de meio. Desligar o vácuo para o manípulo e levantar a tampa para recuperar os tubos de ensaio de eluato ou frascos para amostrador automático. Se usando tubos de ensaio de eluato, colocar os eluatos de acetonitrila, Padrão de Limite, controle de passe, controle de falha, placebo e amostras em frascos para amostrador automático para injeção no sistema cromatográfico. Se usando frascos para amostrador automático para coletar o eluato, colocar os frascos diretamente no sistema cromatográfico.
Figure img0261
[0002088] Adequabilidade de sistema. Ajustar o sistema cromato- gráfico; deixar a lâmpada aquecer e equilibrar o sistema com fase móvel durante pelo menos uma hora antes de análise. Injetar SS N° 1 um mínimo de quatro vezes. Usar a segunda injeção SS N° 1 para todas as análises de Adequabilidade de sistema, a menos que de outro modo especificado. O tempo de retenção para Triton X-100 deverá ser de 5,0 ± 1 minutos. A eficiência da coluna para Triton X-100, avaliada como o número de placas teóricas (N), deve ser > 2000 lâminas/ coluna quando calculada de acordo com a seguinte equação:
Figure img0262
[0002089] onde:
[0002090] t=tempo de retenção do pico de Triton X-100 medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição do pico máximo.
[0002091] w=largura do pico de Triton X-100 medido extrapolando os lados do pico para a linha de base.
[0002092] A resolução entre o pico de Triton X-100 e o pico adjacente mais próximo (se presente) deve ser >1.
[0002093] onde:
[0002094] t=tempos de retenção do pico de Triton X-100 e do pico ad-jacente no padrão
[0002095] W=larguras correspondentes das bases dos picos obtidos através de extrapolação dos lados dos picos para a linha de base.
[0002096] Calcular os fatores de resposta das últimas três injeções SS N° 1 usando a seguinte equação:
Figure img0263
[0002097] onde:
[0002098] A=Área de pico de Triton X-100
[0002099] W=Peso de Triton X-100 (em mg) usado no preparo da solução padrão de estoque de TX100 correspondente
[0002100] Os fatores de resposta das últimas três injeções de SS N° 1 deve ter um desvio-padrão relativo (RSD) de < 10%. Calcular o RSD% usando a seguinte equação:
Figure img0264
[0002101] onde:
[0002102] n = número de medições na amostra
[0002103] x = medições individuais
[0002104] Comparar o fator de resposta da única injeção de SS N° 2 com o fator de resposta médio das últimas três injeções de SS N° 1. A diferença percentual entre o fator de resposta de SS N° 2 e o fator de resposta médio das três injeções SS N° 1 deve ser < 10%. Calcular a diferença percentual usando a seguinte equação.
Figure img0265
[0002105] onde:
[0002106] RF1=Fator de resposta médio das três injeções SS N° 1
[0002107] RF2= Fator de resposta de SS N° 2
[0002108] Fazer uma única injeção de Amostra Placebo pós-SPE. Se os níveis de Triton X-100 são encontrados, fazer mais duas injeções da amostra de Placebo. Se Triton X-100 está presente,1 descartar a Substância de fármaco de CTLA4-Ig e fazer novo Padrão de Limite e Controles com um novo lote de Substância de fármaco de CTLA4-Ig previamente analisado e verificar se não contém níveis detectáveis de Triton X-100. Se os valores exemplificativos acima não são obtidos, estender o equilíbrio da coluna durante mais uma hora e reinjetar a solução-padrão. Se os valores exemplificativos ainda não são obtidos, executar as seguintes etapas. Verificar vazamentos certificando-se de que todas as conexões de tubulação estão firmes. Se equilíbrio estendido não funciona, ajustar o teor orgânico da fase móvel e/ou fazer uma nova batelada da fase móvel e re-preparar a SS N° 1 e SS N° 2. Trocar a coluna se equilíbrio estendido e/ou ajuste da fase móvel não resultam nos valores exemplificativos requeridos. Antes de repetir, equilibrar durante pelo menos uma hora.
[0002109] Sequência de Injeção. equilibrar preliminarmente o sistema de HPLC e operar com sucesso o acima. Fazer uma única injeção de tampão para substância de fármaco pós-SPE, referir-se à seção acima, como um placebo de calibração. Observar se não há resposta de Triton X-100. Se um pico está presente no tempo de retenção do pico de Triton X-100, continuar a injetar o placebo até que não haja nenhuma resposta. Fazer uma única injeção de substância de fármaco de CTLA4-Ig pós-SPE, referir-se à seção acima, como uma amostra de placebo. Observar se não há resposta de Triton X-100. Esse cro- matograma deverá ser subtraído dos cromatogramas de padrão, controle e amostra antes que processamento de dados seja realizado. Fazer injeções em duplicata do Controle de Passe, Padrão de Limite e Controle de Falha. Fazer uma única injeção do tampão para substância de fármaco e nenhuma resposta de Triton X-100 deve ser notada. Fazer injeções em duplicata das amostras. As injeções de amostra são colocadas em faixas através de injeções em duplicata de Padrão de Limite e uma injeção do tampão para substância de fármaco, de modo que não hajam mais de 10 injeções de amostra entre as faixas de Padrão de Limite e injeções de substância de fármaco. O final da operação deve ser terminado com injeções em duplicata do Padrão de Limite e uma injeção do placebo de tampão para substância de fármaco.
[0002110] Processamento de dados. Subtrair o cromatograma da injeção de Amostra de Placebo de todos os cromatogramas-padrão, controle e amostra antes de prosseguir com o processamento de dados. Assegurar que os picos de Triton X-100 nos cromatogramas de Padrão de Limite, Controle e amostra são apropriadamente integrados. O pico de Triton X-100 na amostra, se presente, deve estar dentro da mesma janela de tempo de retenção que o Padrão de Limite. Calcular a média da área de pico de cada conjunto de injeções em duplicata. Injeções em duplicata devem ter uma diferença % na área de pico de < 10%. Se a injeção em duplicata do Padrão de Limite, Controle de Passe ou Controle de Falha não vão de encontro a esse critério, toda a operação é considerada inválida e precisará ser repetida. Se as injeções em duplicata da amostra falham em ir de encontro a esse critério, a amostra é considerada invalida e precisa ser repetidas. Todas as outras amostras, controle e padrões são considerados válidos na me- dida em que eles vão ao encontro do critério de < 10%. A área média de pico para o pico de Triton X-100 em todas as faixas de Padrões de Limite, incluindo as injeções finais, deve estar dentro de 10% da área média de pico do Padrão de Limite. Se qualquer Padrão de Limite intermediário falha em ir ao encontro do requisito de comparação de 10%, todas as amostras analisadas após passar o último Padrão de Limite são consideradas inválidas e devem ser re-analisadas.
[0002111] Avaliação de Padrão de Limite, Controle de Passe, Falha de Amostras de Controle. Comparar as áreas médias de pico de Triton X-100 para o Padrão de Limite, Controle de Passe e Controle de Falha. A área de pico da Amostra de Controle de Falha deve ser maior do que aquela do Padrão de Limite. A área de pico da Amostra de Controle de Passe deve ser menor do que aquela do Padrão de Limite. Se ambas as condições não são reunidas, continuar a avaliação das amostras.
[0002112] Avaliação de Amostras. A área média de pico de Triton X100 do Padrão de Limite devem ser corrigida para levar em conta a quantidade de material pesado no preparado de Padrão de Estoque de Triton X-100 N° 1, como segue: AL = ALS X (10,00 mg/peso)
[0002113] onde:
[0002114] AL = Área de pico corrigida para o limite de 0,5 μg/mL
[0002115] ALS = Área de pico média de Triton X-100 das faixas de Padrões de Limite Nota: AL é a área corrigida no limite de 0,5 μg/mL e será usada para comparação de amostras.
[0002116] Comparar a área média de pico de Triton X-100 da amostra com AL. Se a área de pico < AL, a amostra passa na especificação. Se a área de pico > AL, a amostra falha na especificação. Reportar os resultados que passaram na especificação como "<0,50 ppm" ou que falharam na especificação como ">0,50 ppm" ou conforme de outro modo requerido pela convenção de relato de dado Exemplo 62 - Ensaio para quantificar a quantidade proteína A residual em material de substância de fármaco de CTLA4-Ig Materiais Anticorpo antiproteína A de coelho Sigma, (Catálogo No. P3775) Anticorpo monoclonal antiproteína A biotinilado Sigma, (Catálogo No. B3150)
Reagentes
[0002117] Tampão de Revestimento de carbonato. A um vaso adequado, adicionar: uma barra de agitação. Adicionar 500 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Adicionar os conteúdos de 5 cápsulas de carbonato. Agitar até bem misturado. Verificar e ajustar o pH para 9,6 ± 0,1. Usar NaOH (1,16) ou HCl (1,23). Entornar a solução em um sistema de esterilização com filtro de 500 mL. Aplicar um vácuo para esterilizar em filtro a solução. Sob condições assépticas, remover a unidade de filtro e tampar a garrafa. A solução é estável durante 30 dias quando armazenada a 2 - 8°C. Rotular a solução como "Tampão de Revestimento de carbonato".
[0002118] Tampão de Lavagem: (PBS + Tween 20 a 0,05%): A uma garrafa de 4 L de água com grau para HPLC ou Millipore, adicionar: uma barra de agitação. Adicionar 20 comprimidos de PBS. Adicionar 2,0 mL de Tween 20. Verificar e ajustar o pH para 7,4 ± 0,1. Usar Na- OH ou HCl. Usando uma placa de agitação, agitar até bem misturado. A solução é estável durante 30 dias quando armazenado a 2 - 8°C. Rotular a solução como "Tampão de Lavagem".
[0002119] Solução de Término (H2SO4 a 1 N) ou usar ácido sulfúrico a 1.000 Normal de VWR sem diluição. Em uma coifa, colocar um recipiente adequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra de agitação. Adicionar 485,6 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Ligar a placa de agitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,4 mL de H2SO4 concentrado. A solução é estável duran- te 30 dias quando armazenada em temperatura ambiente. Rotular o recipiente como "Solução de Término".
[0002120] Tampão de acetato (ácido acético a 0,5M, cloreto de sódio a 0,1M, Tween 20 a 0,1%, pH de 3,5). Em uma coifa, colocar um recipiente adequado sobre uma placa de agitação. Adicionar uma barra de agitação. Adicionar 400 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Ligar a placa de agitação para iniciar a agitação de água. Adicionar lentamente 14,8 mL de ácido acético glacial concentrado. Agitar até bem misturado. Adicionar 2,9 g de cloreto de sódio. Agitar até bem misturado. Verificar e ajustar o pH para 3,5 ± 0,1. Usar NaOH ou HCl. Adicionar 0,5 mL de Tween 20. Agitar até bem misturado. Ajustar para um volume final de 500 mL com água com grau para HPLC ou Millipore. Agitar até bem misturado. A solução é estável durante 30 dias quando armazenada a 2 - 8°C. Rotular o recipiente como "Tampão de acetato".
[0002121] Anticorpo antiproteína A de coelho. Remover o frasco do refrigerador e deixar ir para a temperatura ambiente. Adicionar 2,0 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Transformar em alíquotas volumes de 20 μL em tubos com tampa de rosca de 0,5 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazenamento de células. A solução é estável durante 365 dias quando armazenada a - 20°C.
[0002122] Anticorpo antiproteína A biotinilado. Remover o frasco do refrigerador e deixar ir para a temperatura ambiente. Adicionar 1,0 mL de água com grau para HPLC ou Millipore. Transformar em alíquotas volumes de 60 μL em tubos com tampa de rosca de 2,0 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazenamento de células. A solução é estável durante 365 dias quando armazenada a - 20°C.
[0002123] Estreptavidina-HRP. Adicionar 0,5 mL de água com grau para HPLC ou Millipore a um frasco de Estreptavidina-HRP. Para misturar, tampar o frasco e submeter a turbilhonamento gentilmente du- rante aproximadamente 10 segundos. Adicionar 0,5 mL de glicerol ao frasco de Estreptavidina-HRP. Tampar o frasco e inverter gentilmente o frasco várias vezes. Verificar a clareza da solução extraindo a solução em uma pipeta de Pasteur limpa. Transformar em alíquota volumes de 20 μL em tubos com tampa de rosca de 0,5 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazenamento de células. A solução é estável durante 365 dias quando armazenada a - 20°C.
[0002124] Preparo de Padrão. Obter a concentração de proteína do material de referência Proteína A (mat ref) do Certificado de Análise (COA). Preparar uma solução a 11,500 ng/mL de material de referência Proteína A descongelando a solução de estoque de Proteína A em temperatura ambiente. Calcular o volume requerido de material de re-ferência Proteína A para obter uma solução a 11,500 ng/mL. Volume mínimo de transferência deverá ser 10 μL.
Figure img0266
Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.
Figure img0267
Exemplo: Calcular o volume de Tampão de acetato (3,4) subtraindo o volume requerido de material de referência Proteína A do volume desejado. Fórmula: (Volume desejado) - (volume do Padrão de Referência) = (Volume de diluente) Exemplo: 10,0 mL - 0,920 mL = 9,180 mL de Diluente
[0002125] Adicionar o volume calculado de material de referência Proteína A a um tubo estéril de 15 mL o qual contém um volume calculado de tampão de acetato. Tampar o tubo. Submeter a turbilhonamento gentilmente (ajuste 4 no Aparelho de turbilhonamento Genie 2) durante 2 - 4 segundos. Preparar os padrões restantes usando os volumes de- finidos abaixo:
Figure img0268
[0002126] Tampar o tubo após cada etapa de diluição e submeter a turbilhonamento gentilmente durante 2 - 4 segundos antes de prosseguir para a próxima etapa de diluição. Incubar Padrão de Referência e Amostras de controle de qualidade durante 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição à lâmina de microtitulação. Cada concentração-padrão é analisada em cavidades em triplicata.
[0002127] Preparo de Amostras de teste. Preparar concentrações de 5 mg/mL, 2,5 mg/mL e 1,25 mg/mL das amostras de teste de CTLA4-Ig em tubos de polipropileno usando tampão de acetato. Descongelar a amostra de CTLA4-Ig em temperatura ambiente antes de uso para preparar diluições. Calcular o volume requerido de amostra de teste para obter uma solução a 5,0 mg/mL. Volume mínimo de transferência deverá ser de 10 μL.
Figure img0269
Figure img0270
Exemplo:
[0002128] 5.1.3Calcular o volume de Tampão de acetato subtraindo o volume requerido de amostra de teste do volume desejado. Fórmula: (Volume desejado) - (amostra de teste volume) = (Volume de diluente) Exemplo: 1,0 mL - 0,200 mL = 0,800 mL de Diluente
[0002129] Adicionar o volume calculado de amostra de teste a um tubo estéril de 15 mL o qual contém um volume calculado de tampão de acetato. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentilmente (ajuste 4 no Aparelho de turbilhonamento Genie 2) durante 2 - 4 segundos. As amostras são incubadas durante 10 minutos em temperatura ambiente antes de adição à lâmina de microtitulação.
[0002130] Preparo de Amostras de controle de qualidade. Obter a concentração de proteína do material de referência Proteína A do COA. Preparar uma solução a 11,500 ng/mL de material de referência Proteína A. Preparar amostras de Controle de Qualidade (QC) conforme descrito em a tabela abaixo.
Figure img0271
[0002131] Transformar em alíquotas volumes de 700 μL em tubos com tampa de rosca de 2,0 mL. Tampar e colocar em uma caixa de armazenamento de células. A solução é estável durante 180 dias quando armazenada a - 70°C ou abaixo. As concentrações de Proteína A nas amostras de QC têm de ser predeterminadas através de: Realização de 3 ensaios ELISA de Proteína A independentes usando esse método. A media dos 18 resultados (3 ensaios independentes ve- zes 6 cavidades por ensaio) deverá ser calculada. A concentração de Proteína A para cada amostra de QC será atribuída a cada preparado. No dia de um experimento, descongelar um frasco de cada amostra de QC em temperatura ambiente ou fazer amostras de QC frescas a partir do frasco de estoque de Proteína A. Submeter a turbilhonamento gentilmente (ajuste 4 no Aparelho de turbilhonamento Genie 2) durante 2 - 4 segundos.
[0002132] Procedimento. Revestir a lâmina com Anticorpo de captura. Obter a concentração de proteína do Anticorpo antiproteína A de coelho dos fabricantes COA. Calcular o volume requerido de Anticorpo antiproteína A de coelho para obter 10 mL de uma solução a 100 μg/mL. Volume mínimo de transferência deverá ser de 10 μL.
Figure img0272
Nota: Assegurar que as unidades são compatíveis.
Figure img0273
[0002133] Calcular o volume de Diluente subtraindo o volume requeri- do de Anticorpo antiproteína A de coelho do volume desejado. Fórmula: (Volume desejado) - (Volume de anticorpo) = (Volume de diluente) Exemplo: 3,0 mL - 0,012 mL = 2,988 mL de Diluente
[0002134] Adicionar o volume calculado de Anticorpo antiproteína A de coelho a um tubo estéril de 15 mL, o qual contém um volume calculado de diluente. Tampar o tubo e submeter a turbilhonamento gentil- mente durante 2 - 4 segundos. Preparar uma solução a 1 μg/mL de anticorpo antiproteína A de coelho em Tampão de Revestimento, usando as fórmulas. Adicionar 100 μl da solução a cada cavidade de uma lâmina de microtitulação Immulon IV. Incubar a 2-8°C durante 18 ± 2 horas. Lavar as lâminas três vezes com Solução de Lavagem usando o lavador de lâminas com 300 μL de tampão de lavagem e tempo de embebimento zero. As lâminas podem, alternativamente, ser lavadas usando uma pipeta com múltiplos canais. Usando uma pipeta com múltiplos canais, adicionar 200 μL de SuperBlock® a cada cavidade. Incubar a lâmina de microtitulação no escuro durante 60 minutos em temperatura ambiente. Repetir a lavagem. Adicionar 100 μL de cada de Padrão de Referência, Controle de Qualidade e amostras de teste à lâmina de ensaio. Incubar a lâmina de microtitulação no escuro durante 60 minutos, ± 10 minutos, em temperatura ambiente. Repetir a lavagem. Obter a concentração de proteína do Anticorpo antiproteína A de Biotina dos fabricantes COA. Preparar 1,0 mL de uma solução a 1,0 mg/mL de Anticorpo antiproteína A de Biotina em diluente. Submeter a turbilhonamento em velocidade média. Adicionar 50 μL de solução a 1 mg/mL (7,9,1) a 0,950 mL de diluente. Submeter a turbilhona- mento em velocidade média. Adicionar 150 μL de solução a 50 μg/mL (7,9,3) a 14,850 mL de diluente. Adicionar 100 μL a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar em temperatura ambiente durante 60 minutos ± 10 minutos. Repetir a lavagem. Diluir Es- treptavidina-HRP como segue: Adicionar 10 μL de Estreptavidina-HRP a 0,990 μL de Diluente para proporcionar 0,01 mg/mL de Estreptavidi- na-HRP. Submeter a turbilhonamento em velocidade média. Adicionar 80 μL de 0,01 mg/mL de Estreptavidina-HRP a 39,920 mL de Diluente. Submeter a turbilhonamento em velocidade média. Adicionar 100 μL a cada cavidade usando uma pipeta com múltiplos canais. Incubar durante 30 minutos, ± 5 minutos, em temperatura ambiente. Remover o TMB do refrigerador e decantar um mínimo de 10 mL por lâmina de TMB em um recipiente adequado. Colocar em um local escuro e deixar ir para a temperatura ambiente. Repetir a lavagem, mas lavar cinco vezes. Adicionar 100 μL de cromogênio TMB a cada cavidade. Incubar em temperatura ambiente durante aproximadamente 2 minutos, ± 1 minuto. Cessar a reação com cromogênio através da adição de 100 μL/ cavidade de Solução de Término. Adicionar Solução de Término às lâminas e cavidades na mesma ordem em que o cromogênio foi adicionado para assegurar os mesmos tempos de reação de cromogênio com a enzima em cada cavidade. Medir a absorbância(AB) a 450 nm com um comprimento de onda de referência de 630 nm.
Valores exemplificativos.
[0002135] Valores exemplificativos para a Curva-padrão. Os valores exemplificativos para os padrões se aplicam àqueles valores em ou acima do limite quantitativo (QL), uma vez que valores abaixo do QL são usados apenas para ajudar a estabelecer os extremos da curva. O coeficiente de determinação (R2) para a Curva-padrão deverá ser > 0,99, conforme determinado pelo software SoftMax PRO. A base média para o padrão de zero ng/mL deverá ser <0,08 unidades de absorção. A média dos valores calculados (ng/mL) em cada concentração- padrão usada para determinar a curva-padrão exceto zero e o QL deve estar dentro de 15% do valor-alvo (nominal), conforme determinado pelo software. O coeficiente de variação (CV%) dos valores AB450 em triplicata em cada concentração-padrão usada para determinar a curva-padrão, excluindo zero e QL, deve ser ±15%, conforme determinado pelo software. A média dos valores de absorbância em triplicata do QL da curva-padrão deve exibir um CV% de menos do que 20% e estar dentro de 20% do alvo, conforme determinado pelo software. Para assegurar que pelo menos dois pontos de dados congruentes estão disponíveis para cálculo, os padrões, controles e amostras são carregados em cavidades em triplicata. Cada valor da triplicata usado para calcular a média será analisado separadamente. Por exemplo: Valor-alvo (ng/mL)Valor real (ng/mL) 2,51,2 2,3 2,5
[0002136] O único valor que está mais distante do valor-alvo de 2,5 ng/mL é 1,2 ng/mL. Eliminando o valor de 1,2 ng/mL da triplicata, a média dos valores restantes irá ao encontro dos valores exemplificati- vos. Se, quando de re-cálculo, outro ponto não vai ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ensaio não é válido e deve ser refeito. Se é mostrado que a média dos dois valores restantes ainda não vão ao encontro dos valores exemplificativos, então, o ponto único (todas as 3 cavidades) é eliminado e a curva é re-calculada.
[0002137] Valores exemplificativos para amostras de QC. A QC amostra é definida como um conjunto de três cavidades na concentração estabelecida, portanto, para as três concentrações nominais estabelecidas nesse método, há um total de seis amostras de QC (para um total de 18 cavidades). Pelo menos duas das três cavidades para uma amostra de QC devem estar dentro de 20% do nominal para que a amostra de QC seja aceitável. Pelo menos quatro das seis amostras de QC devem ser aceitáveis; duas das seis amostras de QC (não duas na mesma concentração ) e não mais do que 6 das 18 cavidades com amostra de QC podem se desviar mais de 20% das respectivas concentrações-alvo.
[0002138] Valores exemplificativos para amostras de teste. Cada um dos valores das amostras de teste em triplicata ensaiadas deve estar dentro de 20% do valor médio nessa concentração, conforme determinado pelo software. Se dois ou mais valores AB450 médios não podem ser calculados porque eles estão acima do maior ponto sobre a curva-padrão, então, a amostra devem ser re-ensaiada em diluições maiores até pelo menos dois dos três valores caiam sobre a curva- padrão. A CV% das observações em triplicata obtidas para cada con-centração-alvo de amostra de teste deve ser < 20%, conforme deter-minado pelo software.
[0002139] Cálculos. Refira-se ao modelo do programa SoftMax para um ELISA de Proteína A uma vez que ele gera a média, desvios- padrão e CV%. Calcular a média dos valores de Absorbância (AB) em triplicata obtidos para cada concentração de referência e amostra ensaiada. Calcular um modelo de dados para um padrão de Proteína A usando uma regressão com quatro parâmetros ponderada da forma:
Figure img0274
[0002140] onde:
[0002141] min=valor AB correspondendo ao assíntota mínimo
[0002142] max=valor AB correspondendo ao assíntota máximo
[0002143] ED50=AB correspondendo à metade da diferença absoluta entre os valores assintóticos máximo e mínimo
[0002144] B=o declínio aproximado da porção linear da curva
[0002145] C=Concentração de Proteína A
[0002146] Cálculo de Concentração de Proteína A nas amostras. Multiplicar os resultados médios da amostra pelo fator de diluição apropriado (isto é 2, 4 e 8), para obter a concentração de Proteína A na amostra original em ng/mL. Dividir o resultado pela concentração de proteína de CTLA4-Ig reportada (mg/mL) para obter a concentração de Proteína A, em ng/mg, em CTLA4-Ig.
Figure img0275
Nota: ng de Proteína A/mgde CTLA4-Ig (ng/mg) é equivalente a partes por milhão (ppm).
[0002147] Cálculos para a concentração de Proteína A em Ng/mL de Amostras. A quantidade Proteína A nas amostras de teste é calculada usando o presente software SoftMax usando a equação de regressão. Três diluições de cada amostra são ensaiadas. A concentração calculada é multiplicada pelo fator de diluição apropriado a fim de proporcionar a concentração na amostra de teste inicial.
Exemplo:
[0002148] A concentração da amostra de teste é 50 mg/mL. Diluição de amostraFator de diluição 5 mg/mL10 2,5 mg/mL20 1,25 mg/mL40 5 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam a concentração de Proteína A é 10 ng/mL 10 ng/mL x 10 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A na amostra de teste 2,5 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam a concentração de Proteína A é 5,0 ng/mL 5 ng/mL x 20 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A na amostra de teste 1,25 mg/mL de amostra - Dados por ELISA que determinam a concen-tração de Proteína A é 2,5 ng/mL 2,5 ng/mL x 40 (fator de diluição) = 100 ng/mL de Proteína A na amostra de teste
[0002149] Calcular a concentração média a partir dos três valores.
[0002150] Reportagem de resultados. Os resultados podem ser re-portados em termos de % peso/peso de proteína total, ng de Proteína A/mg de proteína total", de outro modo referido como "ppm" (pe- so/peso). Exemplo: 0,0001% peso/peso = 1 ng/mg = 1 ppm (peso/peso) Cálculo exemplificativo:
Figure img0276
[0002151] Amostras as quais resultam em um valor de AB450 menor do que o AB450 de QL (0,188 ng/mL) deverão ser reportadas como "menos de QL". Amostras as quais resultam em um valor de AB450 maior do que o AB450 de QL (0,188 ng/mL) deverão ser reportadas ao número inteiro mais próximo como partes por milhão (ppm).
Exemplo:
[0002152] A concentração de amostra é 50 mg/mL. A maior concentração de amostra analisada é 5 mg/mL (diluição a 1/10). O AB450 da amostra é menor do que QL. QL = 0,188 ng/mL < 0,188 ng/5 mg < 0,04 ng/mg Reportar como "<, QL = 0,04 ppm"
Exemplo 63: Métodos para obter proporções molares de amino monossacarídeos (N-acetil galactosamina, N-acetil glicosamina) para proteína em amostras de substância de fármaco de CTLA4- Ig Reagentes
[0002153] Solução de hidrólise (solução aquosa de HCl a 4 N). Adicionar 160 mL de HCl a 6 N e 80 mL de água com grau para HPLC a uma garrafa de vidro de 250 mL. Agitar para misturar bem. Armazenar a 2-8o C durante até 6 meses.
[0002154] Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0,1 M). Adicionar 192 μL de água com grau para HPLC a 10 mg de pó de APTS em um frasco de vidro. Submeter o frasco a turbilhonamento 5-10 segundos para dissolver completamente o APTS. Armazenar a - 20oC durante até um ano.
[0002155] Solução de Derivatização II (ácido acético a 1 M e NaBH3CN a 0,25 M). Diluir 20 μL de ácido acético com 320 μL de água com grau para HPLC (diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazer uma solução de ácido acético a 1 M. Pesar 2,0±0,5 mg de NaBH3CN em um frasco criogênico. Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropriado da solução de ácido acético a 1 M para fazer NaBH3CN a 0,25 M: Volume (μL) = 103 x (peso de NaBH3CN em mg)/(62,84 g/mol x 0,25 mol/L)
[0002156] Nota: Preparar imediatamente antes de uso. Cianoborohi- dreto de sódio (NaBH3CN) deverá ser armazenado no escuro em um secador. Sub-divisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0 mL para armazenamento é recomendada para evitar abertura repetida da garrafa de reagente original como segue:
[0002157] Pesar 1,0 g ± 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um criofrasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianoborohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira. Tampar hermeticamente e rotular os criofrascos sequencialmente (1,2,3, etc.) junto com o nome do reagente, número de lote e uma data de expiração de 6 meses. Os frascos deverão ser vedados com parafilme para evitar umidade. Pesar cianoborohidreto de sódio para a Solução de Derivatização II não mais do que três times a partir do mesmo criofras- co. Anotar isso e do número de sequência do criofrasco na folha de dados do laboratório. Um pico de reagente observado no perfil de CE ou pobre rotulação pode ocorrer após abertura repetida do criofrasco ou com esse lote de cianoborohidreto de sódio em particular. Se isso afeta os resultados, descartar o criofrasco que está sendo usado e pesar reagente de um criofrasco com o próximo número de sequência ou de um novo lote de cianoborohidreto de sódio.
[0002158] Tampão de reacetilação (bicarbonato de sódio a 25 mM, pH de 9,5). Pesar 0,210 ± 0,02 g de bicarbonato de sódio em um bé- quer de vidro limpo de 100 mL. Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos. Ajustar o pH para 9,5 ± 0,1 com NaOH a 10 N. Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume final para 100 mL. Filtrar a solução e armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses.
[0002159] Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de 9,25). Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em um bé- quer de vidro limpo de 100 mL. Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos. Ajustar o pH para 9,25 ± 0,10 com NaOH a 10 N. Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume final para 100 mL para uma concentração final de 60 ± 5 mM. Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetraborato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação. Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02) de tetraborato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação. Armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (conforme definido na seção adequabilidade de sistema) é afetada (valor R < 1,0).
[0002160] Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (Micro- Solv) através da adição de 120 mL de água ultra pura a 80 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5 mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1). Para uma solução de tetraborato a 55 mM, diluir 66 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 114 mL de água ultra pura. Titular conforme acima. Para uma solução de tetrabo- rato a 65 mM, diluir 78 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 102 mL de água ultra pura. Titular conforme acima. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante um máximo de 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (conforme definido na seção adequabilidade de sistema) é afetada (valor R < 1,0).
Soluções de enxágue de capilar
[0002161] Solução de NaOH a 1 N: Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 10 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 9 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilho- namento 5-10 seg. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
[0002162] Solução de HCl a 1 N: Adicionar 1 mL de solução de HCl a 6 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 5 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
[0002163] Solução de metanol a 80%: Adicionar 8 mL de metanol com grau para HPLC em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 2 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo:
[0002164] N-Acetil Glicosamina (GalNAc). Pesar precisamente 5 ± 1 mg de Ga1NAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento até dissolvida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
[0002165] N-Acetil Galactosamina (GlcNAc): Pesar precisamente 5 ± 1 mg de GlcNAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhona- mento até dissolvida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
[0002166] N-Acetil Manosamina (ManNAc): Pesar precisamente 5 ± 1 mg de ManNAc em um frasco criogênico de 2,0 mL. Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhona- mento até dissolvida. Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
[0002167] Armazenar soluções de estoque de Padrão de Monossaca- rídeo a -20o C durante até 1 ano:
[0002168] Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno. Diluir solução de estoque de ManNAc 100 vezes com água com grau para HPLC através da adição de 20 μL de solução de estoque de ManNAc em um frasco criogênico de 2 mL, o qual já contém 1980 μL de água com grau para HPLC. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar a solução de trabalho de padrão interno a 2-8oC durante até 6 meses.
[0002169] Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino. Em um frasco criogênico de 2,0 mL contendo 1960 μL de água com grau para HPLC, adicionar 20 μL de soluções de estoque de GalNAc e GlcNAc, respectivamente. Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar a Solução de Trabalho Padrão de Mistura Amino a 2-8oC durante até 6 meses.
[0002170] Soluções de amostra e material de referência. Descongelar a amostra de proteínas a 2-8oC e misturar ligeiramente através de inversão. Diluir as amostras e material de referência com água com grau para HPLC para cerca de 1,0 mg/mL. Anotar a concentração para três situações representativas. Condições de operação CE. Tampão de Operação (etapa 2.5) tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25 Temperatura de cartucho do capilar 25oC Tensão 25-30 kV, modo positivo Condição do detector Detector LIF, Excitação: 488 nm, Emissão: 520 nm. Injeção de amostra Modo de injeção sob pressão, 20 s a 0,5 PSI Tempo de operação 10 minutos Armazenamento de amostra 10°C
Procedimento
[0002171] Hidrólise. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 200 μL de Solução de Hidrólise a 4 N. Isso serve como uma corrente de sistema. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de Solução-Padrão de Mistura Amino. Adicionar ainda 200 μL de Solução de Hidrólise a 4N. Isso serve como padrão de monossacarídeo para quantificação e Adequabilidade de sistema. Preparar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de solução de material de referência de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μL de solução de HCl a 4N. Preparar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de ManNAc e 10 μL de solução de amostra (aproximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μL de solução de HCl a 4N. Preparar em duplicata. Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproximadamente 10 segundos e centrifugar durante aproximadamente 510 segundos. Colocar as amostras em uma prateleira para frasco com 96 posições e incubar em um forno a 95oC durante 6 horas. Após hidrólise, colocar as amostras hidrolisadas a -20oC durante 10 minutos para esfriar. Centrifugar rapidamente as amostras hidrolisadas até que qualquer condensado seja forçado para o fundo do tubo (5-10 segun-dos em alta velocidade). Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau para HPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac.
[0002172] Reacetilação. Reconstituir cada amostra com 10 μL de tampão de reacetilação M6 e submeter a turbilhonamento 5-10 seg. para misturar bem. Adicionar 4 μL de reagente de reacetilação M3 em cada tubo. Submeter a turbilhonamento durante aproximadamente 510 segundos. Incubar sobre gelo durante 30 minutos. Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau para HPLC e submeter a turbilhona- mento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagem em um Speed- Vac.
[0002173] Derivatização. Colocar a microcentrífuga no forno para equilibrar para a temperatura do forno de 55oC. Reconstituir cada amostra com 10 μL de Solução de Derivatização I (solução de APTS a 0,1 M). Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos. Adicionar 5 μL da Solução de Derivatização II (HAc a 1M e NaBH3CN a 0,25 M). Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos e centrifugar. Carregar rapidamente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a centrífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3 horas enquanto centrifuga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de solvente sobre a superfície do frasco.
Preparo de instrumentação
[0002174] 5.4.1Instalar um novo capilar, enxaguar no modo de alta pressão (80 PSI) usando as seguintes etapas: NaOH a 1 N durante 20 minutos; água com grau para HPLC durante 10 minutos; tampão de tetraborato de sódio a 60 mM durante 10 minutos.
Operação diária
[0002175] Antes de cada operação do dia, operar as sequências de lavagem/enxágue para enxaguar o capilar.
[0002176] Então, operar o Padrão de Adequabilidade de sistema (padrão de monossacarídeo) para assegurar que o sistema é adequado.
[0002177] Uso de NaOH a 1N pode causticar o interior de capilares de diferentes vendedores e causa um desvio nos tempos de migração por toda a operação. Se isso faz com que o tempo de migração do último pico (G1cNAc) seja mais de 10,0 minutos, pode ser necessário substituir NaOH a 1N por NaOH a 0,1N ou água com grau para HPLC para o enxágue da etapa 2.
[0002178] Quando uso de um capilar equivalente e do procedimento de lavagem acima não é adequado, uso de metanol a 80% e/ou HCl a 1N pode ser necessário para que o último pico (G1cNAc) esteja dentro dos valores exemplificativos de 10,0 minutos. Preparo para injeção: Após derivatização, deixar as amostras esfriar até a temperatura am-biente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente, até o condensado ser forçado para o fundo do tubo.
[0002179] Adicionar 85 μL de água com grau para HPLC a cada tubo para levar o volume final de cada amostra para 100 μL. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos.
[0002180] Transferir 10 μL de amostra de cada tubo para um micro- frasco para CE e adicionar 190 μL de água com grau para HPLC a cada tubo. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos. Etapas de enxágue e sequência de injeção: Nota: Para cada quatro injeções, trocar o Tampão de Operação de CE por Tampão de Operação de CE recentemente preparado (em virtude do efeito de depleção iônica). Realizar enxágue do capilar a 275,8 kPa (40 psi).
Figure img0277
Figure img0278
Figure img0279
*Nota: Repetir a sequência para até três amostras em duplicata e agrupar com 2 injeções de cada preparado de Padrão de monossaca- rídeo. Usar todas as oito injeções de Padrões de Adequabilidade de sistema para amostras colocadas em grupos de três. Se operando com mais de três amostras, operar as amostras adicionais conforme mostrado na sequência acima começando com a linha 19. Completar a sequência operando a adequabilidade de sistema (Padrão de mono) conforme mostrado nas linhas 47 a 53 na Tabela. **Faixas de amostra com duas injeções de cada preparado de material de referência de CTLA4-Ig.
Adequabilidade de sistema
[0002181] Nota: Valores de Adequabilidade de sistema são determinados usando as primeiras injeções de Padrão de Adequabilidade de sistema, a menos que de outro modo especificado. O eletroferograma do primeira adequabilidade de sistema deverá ser similar àquele mostrado na figura 1, onde o pico 1 é GalNAc; o pico 2 é ManNAc; o pico 3 é GlcNAc. Nota: Quando outros instrumentos de CE que não Beckman PACE MDO têm de ser usados, o comprimento do capilar poderia ser diferente daquele especificado nesse método em virtude de várias configurações de cartuchos contendo o capilar de separação. Isso causaria variações no tempo de migração de analito, bem como intensidade de pico.
[0002182] A resolução entre dois picos vizinhos é calculada para os primeiros Padrões de Adequabilidade de sistema pelo instrumento de acordo com a seguinte equação:
Figure img0280
[0002183] onde:
[0002184] R=resolução
[0002185] t2 , t1=tempos de migração dos dois picos vizinhos respecti-vamente
[0002186] W1, W2=larguras de pico na linha de base dos dois picos vizinhos respectivamente
[0002187] O valor R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar com as sequências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por Tampão de Operação recentemente preparado ou substituir o capilar.
[0002188] Para a última injeção de Adequabilidade de sistema, o último pico (GlcNAc) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula: T=W0,05/2f
[0002189] onde:
[0002190] T=fator de configuração
[0002191] W0,05=largura de pico a 5% de altura
[0002192] f=largura da fronte de pico em pico máximo
[0002193] Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as sequências de lava- gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substituir o capilar. 6.1 As injeções repetidas de Padrões de Adequabilidade de sistema deverão ir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos: • Proporção de área de pico de GlcNAc vs. MaNAc: RSD < 10% (cal-culada na etapa 7,1) • Tempo de migração de GlcNAc deverá ser <10,0 minutos • O perfil deverá ser equivalente à figura 1 onde os três picos são ob-servados e o padrão interno (ManNAc) é o pico de número 2.
[0002194] Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não é obtido antes de testagem das amostras, primeiro aumentar a tensão se o tempo de migração de GlcNAc é mais de 10,0 minutos. Em seguida, se a proporção de área de pico é > 10%, preparar tampão de CE fresco tendo certeza de seu pH ou substituir o capilar. Após ajuste do instrumento, repetir as injeções de Adequabilidade de sistema. Quando de análise do perfil de pico, se uma diminuição significativa na altura de pico de ManNac ocorre, verificar se determinados cabos de fibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados.
[0002195] Determinar o RSD percentual para o padrão monossacarí- dico através de comparação da proporção de componentes de áreas de pico do padrão interno e padrão de monossacarídeo. Dividir a área de pico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção de padrão de monossacarídeo. Calcular o RSD percentual para Ga1NAc e G1cNAc para as faixas dos dois padrões. O RSD deverá ser < 10%. Se esse valor médio exempli- ficativo não é obtido, então, o capilar deverá ser enxaguado ou substituído conforme acima.
Cálculos
[0002196] Cálculo de Proporção de área de pico de GalNAc e GlcNAc com relação ao padrão interno (ManNAc). Usado sobre injeções repetidas dos primeiros quatro Padrões de Adequabilidade de Sistema de modo a ir ao encontro dos valores exemplificativos e realizar os mesmos cálculos sobre todas as faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema injetados antes e após amostra(s).
[0002197] Proporção de área de pico = Dividir a área de pico para cada componente monossacarídico (GlcNAc, GalNAc) pela área de pico do padrão interno (ManNAc) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade de sistema.
Figure img0281
[0002198] Calcular uma média das proporções de área de pico para GlcNAc e GalNAc nos Padrões de Adequabilidade de Sistema. Também calcular um desvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (%RSD)
[0002199] Valores exemplificativos: RSD para a proporção de área de pico de GlcNAc < 10%. Faixas de dois Padrões de Adequabilidade de Sistema injetados antes e após amostra(s): RSD percentual para a proporção de área de pico de GlcNAc e GalNAc < 10%.
[0002200] Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%), então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxágue e aquelas faixas de amostras e padrões de monossa- carídeo precisam ser operadas novamente. Se o valor exemplificativo médio ainda não é obtido, substituir o capilar e enxaguar conforme estabelecido. operar as faixas de amostras e padrões de monossacarí- deo novamente.
Figure img0282
[0002201] onde:
[0002202] n =número de medições na amostra
[0002203] x =medições individuais
Figure img0283
[0002204] Calcular a proporção molar de GalNAc/Proteína:
Figure img0284
[0002205] onde:
[0002206] RGalNAc=proporção molar de GalNAc vs. proteína
[0002207] AGaiNAc=área de pico (μV^seg) de GalNAc na amostra
[0002208] AManNAc=área de pico (μV^seg) de ManNAc na amostra
[0002209] AManNAc0=área média de pico (μV^seg) de ManNAc no pa drão de monossacarídeo
[0002210] AGaiNAco=área média de pico (μV^seg) de GalNAc no padrão de monossacarídeo
[0002211] VGalNAc0=volume de GalNAc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0002212] CGalNAc0=concentração de GalNAc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002213] Vp=volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0002214] Cp=concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002215] MWCTLA4-Ig=Peso molecular de material de referência de CTLA4-Ig
[0002216] MWGlcNAc=Peso molecular de GalNAc (221,2 dáltons)
[0002217] Agrupamento de padrões. Quando de cálculo das proporções molares de material de referência de CTLA4-Ig e amostras, usar todas as oito faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema. Calcular as médias das áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras três amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar a área média de pico das próximas quatro fai- xas-padrão de monossacarídeo e as quatro faixas-padrão anteriores de monossacarídeo para cálculos da proporção molar.
[0002218] Calcular a proporção molar de GlcNAc/Proteína
Figure img0285
[0002219] onde:
[0002220] RGlcNAc=proporção molar de GlcNAc vs. proteína
[0002221] AGicNAc=área de pico (μV^seg) de GlcNAc na amostra
[0002222] AManNAc=área de pico (μV^seg) de ManNAc na amostra
[0002223] AManNAc0=área média de pico (μV^seg) de ManNAc no padrão de monossacarídeo
[0002224] AGicNAco=área média de pico (μV^seg) de GlcNAc no padrão de monossacarídeo
[0002225] VGlcNAc0=volume de GlcNAc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0002226] CGlcNAc0=concentração de GlcNAc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002227] Vp=volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0002228] Cp=concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002229] MWCTLA4-Ig=Peso molecular de material de referência de CTLA4-Ig as per COA
[0002230] MWGlcNAc=Peso molecular de GlcNAc (221,2 dáltons)
[0002231] Valores exemplificativos. O RSD percentual para as pro-porções de área de pico das duas faixas de Padrão Amino de Ade- quabilidade de Sistema não deverá exceder a 10%. A proporção molar média para amino monossacarídeos no material de referência deve estar dentro da faixas especificadas. Para cada componente, o RSD % para os quatro resultados (injeção em duplicata de preparados em duplicada) devem ser </= 25%. Faixa de proporção molar de material de referência de CTLA4-Ig
Figure img0286
[0002232] Reportagem de resultados. Reportar o resultado médio como o número de moléculas de GalNAc por molécula de CTLA4-Ig e número de moléculas de GlcNAc por molécula de CTLA4-Ig. Reportar os resultados de proporção molar para duas situações representativas. Para cada componente, o RSD % para os quatro resultados (injeção em duplicata de preparados em duplicada) devem ser </= 25%.
Exemplo 64: Métodos para obter proporções molares de monos- sacarídeos neutros (manose, fucose, galactose) para proteína em amostras de substância de fármaco de CTLA4-Ig. Reagentes
[0002233] Solução de hidrólise (solução aquosa de TFA a 2 M). Adicionar 148 μL de TFA e 852 μL de água com grau para HPLC a um tubo para microcentrífuga de 1,7 mL. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos. Escalonar conforme necessário. Preparar a solução imediatamente antes de uso.
[0002234] Solução de Derivatização I (solução aquosa de APTS a 0,1 M). Adicionar 192 μL de água com grau para HPLC a 10 mg de pó de APTS em um frasco de vidro. Submeter a garrafa a turbilhonamento 5-10 segundos para dissolver completamente o APTS. Armazenar a - 20oC durante até um ano.
[0002235] Solução de Derivatização II (ácido acético a 1 M e NaBH3CN a 0,25 M). Diluir 20 μL ácido acético com 320 μL água com grau para HPLC (diluição de 17 vezes) em um tubo para centrífuga a 0,4 mL para fazer uma solução de ácido acético a 1 M. Pesar 2,0±0,5 mg de NaBH3CN em um frasco criogênico. Usando a seguinte fórmula, adicionar um volume apropriado da solução de ácido acético a 1 M para fazer NaBH3CN a 0,25 M. Volume (μL) = 103 x (peso de NaBH3CN em mg)/62,84 g/mol x 0,25 mols/L) • Cianoborohidreto de sódio (NaBH3CN) deverá ser arma-zenado no escuro em um secador. • Subdivisão do reagente em uma série de criofrascos de 2,0 mL para armazenamento é recomendado para evitar abertura repetida da garrafa de reagente original como segue: • Pesar 1 g ± 0,2 mg de cianoborohidreto de sódio em um criofrasco de 2,0 mL. Transformar em alíquota os conteúdos todos de cianoborohidreto de sódio da garrafa original dessa maneira. • Tampar hermeticamente e rotular os criofrascos sequen- cialmente (1,2,3, etc.) junto com o nome do reagente, número de lote e uma data de expiração de 6 meses. • Os frascos deverão ser vedados com parafilme para evitar umidade. • Pesar cianoborohidreto de sódio para a Solução de Deri- vatização II não mais do que três times a partir do mesmo criofrasco. Anotar isso e o número de sequência do criofrasco na folha de dados do laboratório. • Um pico de reagente observado no perfil de CE ou pobre rotulação pode ocorrer após abertura repetida do criofrasco ou com esse lote de cianoborohidreto de sódio em particular. Se isso afeta os resultados, descartar o criofrasco que está sendo usado e pesar reagente de um criofrasco com o próximo número de sequência ou de um novo lote de cianoborohidreto de sódio.
Tampão de Operação (tetraborato de sódio a 60 ± 5 mM, pH de 9,25)
[0002236] Pesar 1,21 ± 0,02 g de tetraborato de sódio em uma garrafa de vidro de 100 mL limpa.
[0002237] Adicionar 90 mL de água com grau para HPLC e misturar sobre uma placa de agitação até os sais estarem completamente dissolvidos.
[0002238] Ajustar o pH para 9,25 ± 0,10 com NaOH a 10 N.
[0002239] Adicionar água com grau para HPLC para levar o volume final para 100 mL para uma concentração final de 60 mM (± 5 mM).
[0002240] Para uma solução a 55 mM, pesar 1,11 g (± 0,02) de tetra- borato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titulação.
[0002241] Para uma solução a 65 mM, pesar 1,31 g (± 0,02 g) de te- traborato de sódio e seguir as instruções acima para dissolução e titu-lação.
[0002242] Armazenar em temperatura ambiente durante até 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (conforme definido na seção adequabilidade de Sistema) é afetada (valor R < 1,0).
[0002243] Opcional: Diluir solução de tampão de tetraborato (Micro- Solv) através da adição de 120 mL de água ultra pura a 80 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM para uma concentração final de 60 mM (± 5 mM). Titular com NaOH a 10N para levar o pH da solução para 9,25 (± 0,1).
[0002244] Para uma solução de tetraborato a 55 mM, diluir 66 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 114 mL de água ultra pura. Titular conforme acima.
[0002245] Para uma solução de tetraborato a 65 mM, diluir 78 mL de tampão de tetraborato de sódio a 150 mM em 102 mL de água ultra pura. Titular conforme acima.
[0002246] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante um máximo de 3 meses. Preparar tampão fresco se a resolução de pico (conforme definido na seção adequabilidade de Sistema) é afetada (valor R < 1,0).
Soluções de enxágue de capilar Solução de NaOH a 1 N
[0002247] Adicionar 1 mL de solução de NaOH a 10 N em um tubo de plástico graduado de 14 mL contendo 9 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002248] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Solução de HCl a 1 N:
[0002249] Adicionar 1 mL de solução de HCl a 6 N em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 5 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002250] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Solução de metanol a 80%:
[0002251] Adicionar 8 mL de metanol com grau para HPLC em um tubo de plástico graduado de 15 mL contendo 2 mL de água com grau para HPLC. Misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002252] Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até 6 meses.
Soluções de estoque de Padrão de Monossacarídeo Manose (Man)
[0002253] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de manose em um frasco cri- ogênico de 2,0 mL.
[0002254] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002255] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
Fucose (Fuc)
[0002256] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de fucose em um frasco crio- gênico de 2,0 mL.
[0002257] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002258] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
Galactose (Gal)
[0002259] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de galactose em um frasco criogênico de 2,0 mL.
[0002260] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002261] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
Xilose (Xyl)
[0002262] Pesar precisamente 5 ± 1 mg de xilose em um frasco crio- gênico de 2,0 mL.
[0002263] Adicionar 1 mL de água com grau para HPLC e misturar bem através de turbilhonamento 5-10 seg.
[0002264] Registrar a concentração precisa da solução (mg/mL).
[0002265] Armazenar as soluções de estoque de Padrão de Monos- sacarídeo a -20oC durante até 1 ano.
[0002266] Solução de trabalho de monossacarídeo I: Solução de trabalho de padrão interno. Para fazer a solução de trabalho de padrão interno, diluir solução de estoque de xilose 100 vezes com água com grau para HPLC através da adição de 20 μL de solução de estoque de xilose (3.6.4) em um frasco criogênico de 2 mL, o qual já contém 1980 μL de água com grau para HPLC. Submeter a turbilhonamento durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar essa solução de trabalho de padrão interno a 2-8oC durante até 6 meses.
[0002267] Solução de trabalho de monossacarídeo II: Solução de trabalho padrão de mistura neutra. Em um frasco criogênico de 2,0 mL contendo 1940 μL de água com grau para HPLC, adicionar 20 μL de soluções de estoque de manose, fucose e galactose, respectivamente. Submeter a turbilhonamento durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Armazenar essa solução de trabalho de padrão interno a 2-8oC durante até 6 meses.
[0002268] Soluções de amostra e material de referência: Descongelar a amostra de proteínas a 2-8oC e misturar ligeiramente através de inversão. Diluir as amostras e material de referência com grau para HPLC para cerca de 1,0 mg/mL. Condições de operação CE Tampão de Operação tetraborato de sódio a 60 mM, pH de 9,25 Temperatura de cartucho do capilar 25oC Tensão 25-30 kV, modo positivo Condição do detector Excitação do detector LIF: 488 nm, Emissão: 520 nm Injeção de amostra Modo de injeção sob pressão, 20 s a 0,5 PSI Tempo de operação 15 minutos Armazenamento de amostra 10°C
Procedimento
[0002269] Hidrólise: Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicio- nar 10 μL de solução de trabalho de xilose e 200 μL de solução de TFA a 2M. Isso serve como uma corrente de sistema. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de xilose e 10 μL de solução de trabalho padrão de mistura neutra. Adicionar ainda 200 μL de solução de TFA a 2M e submeter a turbilhona- mento durante 3-4 seg. Isso serve como padrão de monossacarídeo para quantificação e Adequabilidade de Sistema. Preparar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de xilose e 10 μL de solução de material de referência de CTLA4-Ig (aproximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μL de solução de TFA a 2M e submeter a turbilhonamento durante 3-4 seg. Preparar em duplicata. Em um tubo para centrífuga de 0,65 mL, adicionar 10 μL de solução de trabalho de xilose e 10 μL de solução de amostra (aproximadamente 1 mg/mL). Adicionar ainda 200 μL de solução de TFA a 2M e submeter a turbilhonamento durante 3-4 seg. Preparar em duplicata. Submeter a turbilhonamento as amostras durante aproximadamente 20 segundos e centrifugar durante aproximadamente 5 a 10 segundos. Colocar as amostras em uma prateleira para frasco com 96 posições e incubar em um forno a 95 oC durante 6 horas. Após hidrólise, colocar as amostras a -20 oC durante 10 minutos para esfriar. Centrifugar rapidamente as amostras hidrolisadas até que qualquer condensado seja forçado para o fundo do tubo (5 a 10 segundos em alta velocidade). Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac. Reconstituir cada amostra com 100 μL de água com grau para HPLC e submeter a turbilhonamento 10-15 seg. Evaporar as amostras até secagem em um SpeedVac.
[0002270] Derivatização: Colocar a microcentrífuga no forno para equilibrar para a temperatura do forno de 55°C. Reconstituir cada amostra com 10 μL de Solução de Derivatização I (solução de APTS a 0,1 M). Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos. Adicionar 5 μL da Solução de Derivatização II (HAc a 1M e NaBH3CN 0,25 M). Submeter a turbilhonamento aproximadamente 5-10 segundos e centrifugar. Carregar rapidamente os frascos de amostra na centrífuga pré-aquecida e colocar a centrífuga de volta no forno a 55 °C. Incubar durante 3 horas enquanto centrifuga a 2000 rpm. Isso impede a condensação de solvente sobre a superfície do frasco.
[0002271] Preparo de instrumentação: Instalar um novo capilar, en-xaguar em no modo de alta pressão (80 PSI) usando as seguintes etapas:
[0002272] NaOH a 1 N durante 20 minutos. Água com grau para HPLC durante 10 minutos. Tampão de tetraborato de sódio a 60 mM durante 10 minutos.
[0002273] Operar as sequências de lavagem/enxágue para enxaguar o capilar. Então, operar o Padrão de Adequabilidade de sistema (padrão de monossacarídeo) para assegurar que o sistema é adequado. Uso de NaOH a 1N, pode causticar o interior de capilares de diferentes vendedores e causa um desvio nos tempos de migração por toda a operação. Se isso faz com que o tempo de migração do último pico (galactose) seja mais de 15,0 minutos, podendo ser necessário substituir NaOH a 1N por NaOH a 0,1N ou água com grau para HPLC para o enxágue da etapa 2. Quando uso de um capilar equivalente e do pro-cedimento de lavagem acima não é adequado, uso de metanol a 80% e/ou HCl a 1N pode ser necessário para que o último pico (galactose) esteja dentro dos valores exemplificativos de 15,0 minutos.
[0002274] Preparo para injeção: Após derivatização, deixar as amostras esfriar para a temperatura ambiente. Centrifugar aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente, até o condensado ser forçado para o fundo do tubo. Adicionar 85 μL de água com grau para HPLC a cada tubo para levar o volume final de cada amostra para 100 μL. Submeter a turbilhonamento durante 5-10 segundos. Transferir 10 μL de amostra de cada tubo para um micro frasco para CE e adicionar 190 μL de água com grau para HPLC a cada tubo. Submeter a turbi- lhonamento durante 5-10 segundos.
[0002275] Sequência de etapas de enxágue e injeção:
Figure img0287
Figure img0288
*Repetir a sequência para até três amostras em duplicata e agrupar com 2 injeções de cada preparado de Padrão de monossacarídeo. Usar todas as oito injeções de Padrões de Adequabilidade de sistema para amostras colocadas em grupos de três. Se operando com mais de três amostras, operar as amostras adicionais conforme mostrado na sequência acima começando com a linha 19. **Faixas de amostra com duas injeções de cada preparado de material de referência de CTLA4-Ig.
[0002276] Adequabilidade de Sistema. O eletroferograma da primeira Adequabilidade de Sistema deverá ser similar a um onde o pico 1 é manose; o pico 2 é xilose; o pico 3 é fucose; e o pico 4 é galactose. Nota: Quando outros instrumentos de CE que não o Beckman PACE MDQ têm de ser usados, em virtude das várias configurações de cartuchos contendo o capilar de separação, o comprimento do capilar poderia ser diferente daquele especificado nesse s método. Isso causaria variações no tempo de migração de analito, bem como na intensidade de pico.
[0002277] A resolução entre dois picos vizinhos é calculada para os primeiros Padrões de Adequabilidade de sistema pelo instrumento de acordo com a seguinte equação:
Figure img0289
[0002278] onde:
[0002279] R=resolução
[0002280] t2 , t1=tempos de migração dos dois picos vizinhos, respec-tivamente
[0002281] W1, W2=larguras de pico na linha de base dos dois picos vizinhos, respectivamente
[0002282] O valor de R deve ser > 1,0. Se R < 1,0, enxaguar o capilar com as sequências de lavagem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substituir o capilar.
[0002283] Para a última injeção de Adequabilidade de Sistema, o último pico (galactose) deve ter um fator de configuração <1,4 usando a seguinte fórmula: T=W0,05/2f
[0002284] onde:
[0002285] T=fator de configuração
[0002286] W0,05=largura de pico a 5% de altura
[0002287] f=largura da fronte de pico em pico máximo
[0002288] Se T > 1,4, enxaguar o capilar com as sequências de lava- gem/enxágue; se o problema persiste, substituir o tampão antigo por tampão de operação recentemente preparado ou substituir o capilar.
[0002289] Injeção repetida dos primeiros quatro Padrões de Adequa- bilidade de Sistema deverá ir ao encontro dos seguintes valores exemplificativos: • Proporção de área de pico de galactose vs. xilose: RSD <10%. • Tempo de migração de galactose precisa ser <15,0 minutos • O perfil deverá ser equivalente à figura 1, onde os quatro picos são observados e o padrão interno (Xilose) é o pico de número 2.
[0002290] Se qualquer um dos valores exemplificativos acima não são obtidos, primeiro aumentar a tensão se o tempo de migração de galactose é mais de 15,0 minutos. Em seguida, se a proporção de área de pico é > 10%, então, preparar tampão de CE fresco tendo certeza de seu pH ou substituir o capilar.
[0002291] Após ajustes no instrumento, repetir injeções de adequabi- lidade de sistema. Quando de análise do perfil de pico, se uma diminuição significativa na altura de pico de Xilose ocorre, verificar se determinados cabos de fibra óptica no módulo de LIF não estão mal alinhados. Determinar o RSD percentual para o padrão monossacarídico através de comparação da proporção de áreas de pico dos componentes de padrão interno e padrão de monossacarídeo. Dividir a área de pico para cada componente monossacarídico pela área de pico do padrão interno para cada injeção padrão de monossacarídeo. Calcular o RSD percentual para manose, fucose e galactose para as faixas dos dois padrões. O RSD deverá ser < 10%. Se esse valor médio exempli- ficativo não é met, então, o capilar deverá ser enxaguado ou substituído conforme acima. Faixas de amostras e padrões de monossacarídeo precisam ser repetidas.
[0002292] Cálculos. Cálculo da proporção de área de pico de Man, Fuc e Gal com relação ao padrão interno (Xilose). Usado sobre injeções repetidas dos primeiros quatro Padrões de Adequabilidade de Sistema de modo a ir ao encontro dos valores exemplificativos e realizar os mesmos cálculos sobre todas as faixas de Padrões de Adequa- bilidade de Sistema injetados antes e após amostra(s). Proporção de área de pico = Dividir a área de pico para cada componente monossa- carídico (Man, Fuc e Gal) pela área de pico do padrão interno (Xilose) para cada injeção de Padrão de Adequabilidade de sistema.
Figure img0290
[0002293] Calcular uma média das proporções de área de pico paraMan, Fuc e Gal nos Padrões de Adequabilidade de Sistema. Também calcular o desvio-padrão (S.D.) e desvio-padrão relativo percentual (%RSD).
[0002294] Valores exemplificativos: RSD para a proporção de área de pico de Galactose < 10%. Faixas de dois Padrões de Adequabilida- de de Sistema injetados antes e após amostra(s): RSD percentual para a proporção de área de pico de Man, Fuc e Gal < 10%.
[0002295] Se esse valor exemplificativo médio não é obtido (RSD > 10%), então, o capilar precisa ser re-enxaguado com os procedimentos de enxágue e aquelas faixas de amostras e padrões de monossa- carídeo precisam ser operadas novamente. Se o valor exemplificativo médio é ainda não é obtido, substituir o capilar e enxaguar. Operar as faixas de amostras e padrões de monossacarídeo novamente.
Figure img0291
[0002296] onde:
[0002297] n=número de medições na amostra
[0002298] x=medições individuais
Figure img0292
[0002299] Calcular a proporção molar de Manose/Proteína
Figure img0293
[0002300] onde:
[0002301] RMan=proporção molar de Manose (Man) vs. proteína
[0002302] AMan=área de pico (μV^seg) de Man na amostra
[0002303] Axyi=área de pico (μV^seg) de Xilose (Xyl) na amostra
[0002304] Axyi0=área média de pico (μV^seg) de Xyl no padrão de mo- nossacarídeo
[0002305] AMan0=área média de pico (μV^seg) de Man no padrão de monossacarídeo
[0002306] VMan0=volume de Man contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0002307] CMan0=concentração de Man contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002308] Vp=volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0002309] Cp=concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002310] MWCTLA4-Ig=Peso molecular de material de referência de
[0002311] CTLA4-Ig conforme o Certificado de Análise (COA)
[0002312] MWMan= Peso molecular de Manose (180,2 dáltons)
[0002313] Agrupamento de padrão. Quando de cálculo das proporções molares de material de referência de CTLA4-Ig e amostras, usar todas as oito faixas de Padrões de Adequabilidade de Sistema. Calcular as médias das áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras três amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar a área média de pico das próximas quatro faixas de padrões de monossacarídeo e as quatro faixas de padrões anteriores de monossacarídeo para cálculos da proporção molar.
[0002314] Calcular a proporção molar de Fucose/Proteína:
Figure img0294
[0002315] onde:
[0002316] RFuc=proporção molar de Fucose (Fuc) vs. proteína
[0002317] AFuc=área de pico (μV^seg) de Fuc na amostra
[0002318] Axyi=área de pico (μV^seg) de Xilose (Xyl) na amostra
[0002319] Axyi0=área média de pico (μV^seg) de Xyl no padrão de mo- nossacarídeo
[0002320] AFuc0=área média de pico (μV^seg) de Fuc no padrão de monossacarídeo
[0002321] VFuc0=volume de Fuc contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0002322] CFuc0=concentração de Fuc contida na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002323] Vp=volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0002324] Cp=concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002325] MWCTLA4-Ig= Peso molecular de material de referência de
[0002326] CTLA4-Ig conforme o Certificado de Análise (COA)
[0002327] MWFuc=Peso molecular de Fucose (164,2 dáltons)
[0002328] Calcular a proporção molar de Galactose/Proteína:
Figure img0295
[0002329] onde:
[0002330] RGal=proporção molar de Galactose (Gal) vs. proteína
[0002331] AGai=área de pico (μV^seg) de Gal na amostra
[0002332] Axyi=área de pico (μV^seg) de Xilose (Xyl) na amostra
[0002333] Axyi0=área média de pico (μV^seg) de Xyl no padrão de mo- nossacarídeo
[0002334] AGai0=área de pico (μV^seg) average de Gal no padrão de monossacarídeo
[0002335] VGal0=volume de Gal contido na solução de trabalho de mo- nossacarídeo usada para hidrólise (em μL)
[0002336] CGal0:=concentração de Gal contido na solução de trabalho de monossacarídeo usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002337] Vp=volume de amostra de proteína usada para hidrólise (em μL)
[0002338] Cp=concentração de amostra de proteína usada para hidrólise (em mg/mL)
[0002339] MWCTLA4-Ig = Peso molecular de material de referência de
[0002340] CTLA4-Ig conforme o Certificado de Análise (COA)
[0002341] MWGal=Peso molecular de Gal (180,2 dáltons)
[0002342] Nota: Quando de cálculo de proporções molar de material de referência de CTLA4-Ig e amostras, usar a faixa do último preparado de Padrão de Adequabilidade de Sistema e do próximo preparado de Padrão de Adequabilidade de Sistema. Calcular a média das áreas de pico para inclusão nessa equação. Essa deve ser usada para as primeiras seis amostras. Para todas as outras amostras, sempre usar a área média de pico das duas faixas de padrões de monossacarídeo para cálculos da proporção molar.
[0002343] Valores exemplificativos. O RSD percentual para a proporção de área de pico para as duas faixas de Padrão de Adequabili- dade de Sistema não deverão exceder a 10%. A proporção molar média para monossacarídeos neutros no material de referência pode estar dentro da faixas especificadas na Tabela abaixo. Para cada componente, o RSD% para os quatro resultados (injeções em duplicata de preparados em duplicada) devem ser </= 25 %. Faixa de proporção molar de material de referência de CTLA4-Ig
Figure img0296
[0002344] Reportagem de resultados. Reportar o resultado médio como número de moléculas de manose por molécula de CTLA4-Ig, número de moléculas de fucose por molécula de CTLA4-Ig e número de moléculas de galactose por molécula de CTLA4-Ig. Reportar os re- sultados de proporção molar para duas situações representativas. Para cada componente, o RSD % para os quatro resultados (injeções em duplicata de preparados em duplicada) deve ser </= 25%.
Exemplo 65 - Quantificação por mapeamento tríptico de CTLA4-Ig Oxidação e Deamidação
[0002345] A finalidade do método é monitorar a consistência lote-a- lote de CTLA4-Ig usando um procedimento de mapeamento peptídico tríptico manual com detecção e quantificação específicas de metionina oxidação e asparagina deamidação. Mapeamento peptídico envolve a proteólise ou outra fragmentação de uma proteína para criar um conjunto bem definido de fragmentos peptídicos os quais são, então, analisados, usualmente através de HPLC. O cromatograma ou mapeamento peptídico é muito sensível mesmo à menor alteração na estrutura química da proteína e é, assim, útil para detecção e caracterização de modificações pós-traducionais. A amostra de proteína de CTLA4-Ig é desnaturada em tampão de guanidina a 8 M-HCl e as ligações em ponte de dissulfeto de cisteína reduzidas com ditiotreitol e S-alquiladas com iodoacetamida antes de digestão com a enzima proteolítica, trip- sina. A mistura resultante de peptídeos trípticos é, então, analisada através de cromatografia de líquido de alto desempenho em fase reversa (RP-HPLC) com detecção por UV a 215 e 280 nm. Algumas abreviações são listadas abaixo:
Figure img0297
PRODUTOS QUÍMICOS e REAGENTES Fase móvel A - TFA a 0,1% em água com grau para HPLC
[0002346] Transferir os conteúdos todos de uma ampola de 1 mL de TFA para 1000 mL de água com grau para HPLC e misturar totalmente para preparar TFA a 0,1% (Fase móvel A). O TFA a 0,1% pode ser armazenado em temperatura ambiente durante até dois meses.
Fase móvel B - TFA a 0,1% em 80% de ACN e 20% de água com grau para HPLC
[0002347] Transferir os conteúdos todos de uma ampola de 1 mL de TFA para 800 mL de acetonitrila e 200 mL de água com grau para HPLC e misturar totalmente para preparar TFA a 0,1% em 80% de ACN (Fase móvel B) o qual pode ser armazenado em temperatura ambiente durante até dois meses.
Tampão de diluição - TRIS a 100 mM, NaCl a 25 mM, pH de 7,6
[0002348] Dissolver 14,0 g de Trizma Pre-Set Crystal, pH de 7,6, e 1,46 g de NaCl em 1000 mL de água com grau para HPLC através de agitação da solução sobre uma placa de agitação magnética. Filtrar a solução através de uma unidade de filtro de 0,2 μm. Armazenar a solução a 2 a 8 °C durante até dois meses.
Tampão de desnaturação - guanidina a 8 M, TRIS a 50 mM, pH de 8,0
[0002349] Dissolver 152,8 g de cloridrato de guanidina e 1,4 g de Trizma Pre-Set Crystal, pH de 8, em 90 mL de água com grau para HPLC através de agitação da solução sobre uma placa de agitação magnética. Ajustar o pH para 8,0 com HCl ou NaOH e levar para o volume final de 200 mL com água com grau para HPLC. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até seis meses.
Tampão de Digestão - TRIS a 50 mM, CaCl2 a 10 mM, pH de 7,6
[0002350] Dissolver 7,0 g de Trizma Pre-Set Crystal, pH de 7,6, e 1,47 g de CaCl2 em 1000 mL de água com grau para HPLC através de agi- tação da solução sobre uma placa de agitação magnética. Filtrar a solução através de um filtro de 0,2 μm. Armazenar a solução a 2 a 8 °C durante até dois meses.
Agente de Redução - ditiotreitol a 200 mM (DTT)
[0002351] A 30,8 ± 0,2 mg de DTT, adicionar 1000 μL de água imedia-tamente antes de uso e submeter a turbilhonamento até dissolvida. A solução expira 24 horas a partir do momento de preparo.
Reagente de Alquilação - iodoacetamida a 400 mM (IAM)
[0002352] A 74,0 ± 0,5 mg iodoacetamida, adicionar 1000 μL de água imediatamente antes de uso e submeter a turbilhonamento até dissolvida. A solução expira 24 horas a partir do momento de preparo.
HCl a 1,0 M
[0002353] Diluir 8,7 mL de ácido clorídrico concentrado para 100 mL com água com grau para HPLC. Armazenar a solução em temperatura ambiente durante até dois meses.
PADRÕES E CONTROLES Padrão peptídico T6ox, 30 μM
[0002354] O padrão sintético de peptídeo tríptico T6ox é Ala-Met(O)- Asp-Thr-Gly-Leu-Tyr-Ile-Cys-Lys • 2TFA, FW 1358,4, ~95% de pureza em peso. Armazenar o sólido hermeticamente vedado a -20°C e sempre aquecer até a temperatura ambiente em um secador para impedir a absorção de umidade. Pesar 1,0 ± 0,1 mg de T6ox, registrar o peso exato e dissolver em 1,50 mL de Tampão de Digestão. Adicionar 40 uL de DTT a 200 mM e colocar a 37°C durante 20 min. Esfriar para a temperatura ambiente, adicionar 48 μL de iodoacetamida a 400 mM e alquilar em temperatura ambiente no escuro, durante 30 min. Diluir para um volume final de 24,5 mL com Tampão de Digestão a fim de proporcionar uma solução-padrão a 30 ± 3 μM. Armazenar alíquotas de 1 mL do padrão T6ox a 30 μM a -70°C durante até 24 meses.
Padrão peptídico T26deam1, 30 μM
[0002355] O padrão sintético de peptídeo tríptico T26deam1 é Gly- Phe-Tyr-Pro-Ser-Asp-Ile-Ala-Val-Glu-Trp-Glu-Ser-isoAsp-Gly-Gln-Pro- Glu-Asn-Asn-Tyr-Lys • 2TFA, FW 2773,7, ~85% de pureza em peso. Armazenar o sólido hermeticamente vedado a -20°C e sempre aquecer para a temperatura ambiente em um secador para impedir a absorção de umidade. Pesar 1,0 ± 0,1 mg de T26deam1, registrar o peso exato e dissolver em 1 mL de acetonitrila a 30% v:v em Tampão de Digestão. Diluir para um volume final de 10,7 mL a fim de proporcionar uma solução-padrão a 30 ± 3 μM. Armazenar alíquotas de 1 mL do padrão T26deam1 a 30 μM a -70°C durante até 24 meses.
PREPARO DE PADRÕES E AMOSTRAS Redução e Alquilação
[0002356] A faixa de concentração de proteína para mapeamento peptídico é de aproximadamente 20 mg/mL. Se a concentração de proteína é >20 mg/mL, diluir a amostra com tampão de diluição para uma concentração final de aproximadamente 20 mg/mL. Preparar pelo menos 100 μL de solução diluída. Em um tubo para centrífuga de 1,7 mL, adicionar 100 μL de solução de CTLA4-Ig a 20 mg/mL (2 mg) (amostra ou material de referência) a 550 μL de Tampão de desnaturação. Adicionar 35 μL de Reagente de Redução a 200 mM, submeter o tubo a turbilhonamento durante 3-5 segundos, então, centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar os tubos a 37°C durante 20 ± 2 minutos. Adicionar 38,5 μL de Reagente de Alquilação a 400 mM a cada tubo, submeter a turbilhonamento durante 3-5 segundos, então, centrifugar durante aproximadamente 3 segundos. Incubar as amostras em temperatura ambiente no escuro durante 20 ± 2 minutos. Colocar as colunas NAP-5 em a stand. Usar uma coluna por amostra. Enquanto as amostras estão em incubação em IAM, equilibrar as colunas NAP-5 com 7,5 mL de Tampão de Digestão. Descartar o efluente por procedimentos locais. Adicionar 500 μL das misturas reduzidas e alquiladas over as colunas NAP-5, permitindo que o líquido drene através da coluna. Descartar o efluente por procedimentos locais. Adicionar 1,0 mL de Tampão de Digestão às colunas NAP-5 e coletar o efluente em tubos para centrífuga de 1,7 mL e misturar ligeiramente o efluente coletado.
[0002357] Digestão. Reconstituir um frasco de tripsina (20 μg) para cada mL de amostra ou material de referência a ser digerido, mais um frasco de tripsina adicional, com 86 μL cada de tampão de tripsina (fornecido com a enzima) para proporcionar 0,25 μg/μL. Empoçar os conteúdos dos frascos de tripsina juntos em um frasco. Digerir cada amostra com 80 μL da solução de tripsina empoçada acima por mL de amostra a 37 °C durante 120 ± 12 minutos. Quando de término da digestão, acidificar as amostras com 40 μL de HCl a 1,0 M por mL de amostra e submeter a turbilhonamento durante 3-5 segundos. Pipetear 100 μL de cada uma das digestões de amostras e do material de referência em frascos para amostrador automático. Preparar um controle de adequabilidade de sistema adicional contendo 95 μL de material de referência digerido misturado com 5 μL de padrão peptídico T6ox a 30 μM e 5 μL de padrão peptídico T26deam1 a 30 μM a fim de proporcionar uma digestão reforçada com T6ox a 5% e T26deam1 a 5%. Colocar todos os frascos no amostrador automático a 5 ± 5°C para análise por HPLC. Armazenar todas as amostras digeridas restantes a -70°C. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS A tabela abaixo mostra a taxa de fluxo e o gradiente de cromatografia.
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[0002358] Equilibrar a coluna a 55 °C com 100% de fase móvel A du- rante pelo menos 25 minutos antes da primeira injeção. Monitorar a absorbância de UV a 215 nm e 280 nm. A tubulação da coluna para o detector deverá ter um diâmetro interno < 0,01" de forma a minimizar a difusão de ampliação de banda. Manter a temperatura da coluna a 55 ± 2°C. Manter a temperatura do amostrador automático a 5 ± 5°C. A fase móvel A é usada como a injeção de placebo. Faixas de amostra (não mais do que dez a cada vez) são injeções de material de referência. A tabela abaixo mostra a sequência de injeção para a análise cro- matográfica. Note que todos os volumes de injeção são de 25 μL, exceto quanto à amostra de controle consistindo em material de referência reforçado com padrões peptídicos T6ox a 5% e T26deam1 a 5% para a qual 28 μL são injetados:
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VALORES EXEMPLIFICATIVOS
[0002359] Valores exemplificativos. O perfil por mapeamento peptí- dico para o material de referência deve ser visualmente comparável ao cromatograma apresentado na figura 1 com relação ao número, tamanho relativo e ordem de eluição de picos significativos para os traços a 215 nm e 280 nm. As diferenças de tempo de retenção para os picos T4, T25 e T27 no material de referência inicial e nas faixas não deverão exceder a ± 0,5 minuto. O número de placas teóricas (N) deve ser > 100.000. Se N < 100.000, re-equilibrar a coluna. Se o problema persiste, substituir a coluna. A resolução (R) deve ser > 1,5 para os picos T2 e T12. Se R < 1,5, re-equilibrar a coluna. Se o problema persiste, substituir a coluna. O cromatograma a 280 nm do padrão de referência reforçado com T6ox e T6deam1 a 5% deve mostrar um aumento para o pico de T6ox eluindo a ~33,0 min, conforme mostrado na figura 85. O cromatograma a 215 nm do padrão de referência reforçado com T6ox e T6deam1 a 5% deve mostrar um aumento para o pico de T26deam1 eluindo a ~66,5 min, conforme mostrado na figura 87.
[0002360] Valores exemplificativos de amostra. Os cromatogramas de injeção do primeiro material de referência e da amostra deverão ser visualmente equivalentes com relação ao número, tamanho relativo e ordem de eluição de picos significativos para os traços a 215 nm e 280 nm conforme indicado para os picos rotulados na figura 85, com exceção dos picos oxidados e/ou desamidados para T6ox e T26deam, os quais são reportados separadamente. Os tempos de retenção para os picos T4, T25 e T27 na amostra devem estar dentro de ± 0,5 minuto do tempo de retenção para os picos correspondentes de injeção do primeiro material de referência.
[0002361] CÁLCULOS. NOTA: Usar os dados a 215 nm para esses cálculos, a menos que de outro modo especificado. Os tempos de re-tenção de picos T4, T25 e T27 (figura 85) nas operações com faixas de material de referência não diferem em mais de 0,5 min (figura 85).
[0002362] Número de Placas teóricas. A eficiência de coluna, avaliada como o número de placas teóricas (N), é calculada usando o tempo de retenção e a largura de pico T27 a partir da operação de material com referência, (Figura 85), de acordo com a seguinte equação:
Figure img0301
[0002363] onde:
[0002364] w = a largura de pico na linha de base medida através de extrapolação dos lados relativamente retos para a linha de base.
[0002365] t = o tempo de retenção do pico T27 medido a partir do momento de injeção até o momento de eluição do pico máximo.
[0002366] Resolução. A resolução (R) entre o pico T12 e pico T2 (Figura 85) é calculada usando a seguinte equação:
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[0002367] onde:
[0002368] ti, t2 = tempos de retenção do pico Ti2 e pico T2, respecti vamente
[0002369] wi, w2 = largura de pico tangente-definida na linha de base dos picos com tempos de retenção ti e t2, respectivamente.
[0002370] Para todas as amostras e padrões, calcular a oxidação per-centual de Met85 a partir dos dados de área de pico a 280 nm como segue : Oxidação percentual = i00 *AT6ox/ (AT6ox + AT6)
[0002371] onde:
[0002372] AT6 = área de pico para T6, (84-93) no traço a 280 nm
[0002373] AT6ox = área de pico para T6ox, Met(O)85(84-93), no traço a 280 nm
[0002374] Para todas as amostras e padrões, calcular a deamidação percentual de Asn294 para dados da área de pico a 2i5 nm, conforme mostrado na figura 87:
Figure img0303
[0002375] onde:
[0002376] AT26 = área de pico para T26, (28i-302), no traço a 2i5 nm
[0002377] AT26deami = área de pico para T26deami, isoAsp294(28i- 302), no traço a 215 nm
[0002378] AT26deam2 = área de pico para T26deam2, Asp299(281-302), no traço a 215 nm
[0002379] AT26deam3 = área de pico para T26deam3, Asp294(281-302), no traço a 215 nm
[0002380] AT26deam4 = área de pico para T26deam4, Asu294(281-302), no traço a 215 nm
[0002381] Fragmentos teoricamente esperados de digestões trípticas de CTLA4-Ig (refira-se à figura 85)
[0002382] FragmentoResíduoSequência T11-14MHVAQPAVVLASSR T215-28GIASFVCEYASPGK T329-33 ATEVR T434-38 VTVLR T5*39-83 QADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTS SGNQVN- LTIQGLR T684-93AMDTGLYICK T7*94-128VELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDQEPK T8**129-132 SSDK T9**133-158THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPK T10159-165 DTLMISR T11166-184TPEVTCVVVDVSHEDPEVK T12185-198FNWYVDGVEVHNAK T13199-202 TKPR T14*203-211EEQYNSTYR T15212-227VVSVLTVLHQDWLNGK T16228-230EYK T17231-232 CK T18233-236VSNK T19237-244ALPAPIEK T20245-248TISK T21249-250 AK T22251-254GQPR T23255-265EPQVYTLPPSR T24266-270DELTK T25271-280NQVSLTCLVK T26281-302GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK T27303-319TTPPVLDSDGSFFLYSK T28320-324 LTVDK T29325-326 SR T30327-349WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK T31350-356 SLSLSPG 1 Contém carboidrato N-ligado. 2 * Contém carboidrato O-ligado.
Exemplo 66 - Estudo com uma única dose em seres humanos saudáveis
[0002383] Um estudo com uma única dose, randomizado, em um único local foi usado para avaliar a farmacocinética de CTLA4-Ig (produzida através do processo com CD-CHO1) em indivíduos saudáveis. Treze (13) indivíduos que preenchiam os Valores Exemplificativos de Inclusão e Exclusão foram admitidos na unidade de estudo clínico e receberam CTLA4-Ig produzida pela CD-CHO1 de processo como uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg durante 30 minutos. Cada indivíduo foi observado na unidade de estudo clínico durante 24 horas após a infusão. Amostras de sangue foram coletadas em pontos de tempo especificados após dosagem durante até 71 dias para quantificação de CTLA4-Ig. Os indivíduos foram avaliados quanto à farmaco- cinética: Cmax, Tmax, AUC (INF), T-HALF, CLT e Vss para cada indivíduo foram derivados da concentração no soro versus os dados de tempo. CTLA4-Ig foi fornecida como uma formulação a 200 mg/frasco. A indivíduos saudáveis foi administrada uma infusão IV de 30 minutos de 10 mg/kg de CTLA4-Ig. Determinações de PK, segurança e determinação imunogênica foram avaliados em pontos de tempo específicos no Dia 71 após dosagem. MÉTODOS ESTATÍSTICOS: Tamanho de amostra: O tamanho de amostra de 13 indivíduos propor-cionou 90% de confiança de que a estimativa da proporção de média geométrica estaria dentro de 15% do valor verdadeiro para Cmax e dentro de 10% do valor verdadeiro para AUC(INF) para CTLA4-Ig.
[0002384] Análise estatística: Dados demográficos do indivíduo, exames físicos, dados de laboratório e sinais vitais foram resumos. A incidência de eventos adversos foi colocada em uma tabela pelo sistema corporal e gravidade. Para Cmax e AUC(INF) de CTLA4-Ig, intervalos de 90% de confiança para as proporções das médias geométricas de população para a CD-CHO1 de processo foram calculados a partir dos resultados de uma análise de variância sobre log(Cmax) e log(AUC).
[0002385] RESULTADOS FARMACOCINÉTICOS: Os resultados farmacocinéticos foram determinados usando um programa de análise não compartimental validado. Os parâmetros farmacocinéticos foram obtidos de 13 indivíduos dosados com CTLA4-Ig de CD-CHO1 de processo. A tabela a seguir lista os parâmetros farmacocinéticos para CTLA4-Ig em indivíduos saudáveis. A Tabela abaixo mostra uma estatística somatória para os parâmetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig.
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[0002386] CTLA4-Ig tinha valores médios de T-HALF de aproximadamente 17 dias em indivíduos saudáveis, consistente com meias-vidas obtidas em indivíduos com psoríase (10 - 18 dias) e pacientes com ar- trite reumatoide (aproximadamente 13 dias). Os valores médios de Vss observados de 0,09 a 0,10 L/kg indicaram que a CTLA4-Ig estava con-finada primariamente ao sistema vascular e não distribuída significati-vamente nos espaços extravasculares. A tabela a seguir mostra as concentrações no soro (ng/ml) por indivíduo.
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Ensaio no soro para CTLA4-Ig
[0002387] Amostras de soro foram analisadas com relação à CTLA4- Ig através de um ensaio imunoabsorvente enzima-ligado (ELISA) em um total de 25 operações analíticas. Todos os dados analíticos foram ao encontro dos valores exemplificativos estabelecidos antes de análise de amostra, indicando que o método ELISA era preciso e apurado para a quantificação de CTLA4-Ig em amostras de estudo. Um resumo dos parâmetros de curva-padrão e dados médios de QC para CTLA4- Ig no soro são apresentados na Tabela 48. A variabilidade entre e dentre as operações das QCs analíticas para CTLA4-Ig foi de 4,5% e 3,5% CV, respectivamente. As concentrações médias observadas das amostras de QC analíticas desviaram em menos de ± 8,9% dos valores nominais (Tabela 48). Tabela 48: Sumário de dados de controle de qualidade para o ensaio de
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Farmacocinética de CTLA4-Ig
[0002388] A média e desvios-padrão para as concentrações de CTLA4-Ig no soro para todos os indivíduos através do processo são apresentados na Tabela diretamente abaixo. As concentrações médias de CTLA4-Ig no soro versus os perfis do tempo durante 71 dias são apresentadas na figura 44. Concentração média no soro vs. dados de tempo para CTLA4-Ig (ng/ml)
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[0002389] Estatística resumida para os parâmetros farmacocinéticos (Cmax, AUC (INF), CLT, Vss, Tmax e T-HALF) é apresentada na Tabela 50. Os resultados indicaram que CTLA4-Ig produzida através de um processo da invenção tinha um valor de T-HALF médio de aproxi-madamente 17 dias (faixa de 7-25 dias). Os valores de Vss observados de 0,09 a 0,10 L/kg indicaram que CTLA4-Ig estava confinada primariamente ao volume de fluido extracelular. Tabela 50: Estatística resumida para parâmetros farmacocinéticos de CTLA4-Ig produzida através do processo da invenção
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[0002390] Os resultados indicaram que a T-HALF média para CTLA4- Ig produzida através do processo da invenção era de aproximadamente 17 dias. Os valores de clearance e volume de distribuição também são apresentados na Tabela 50.
[0002391] A farmacocinética de CTLA4-Ig em indivíduos adultos saudáveis após uma única infusão intravenosa de 10 mg/kg e em pacientes com RA após múltiplas infusões intravenosas de 10 mg/kg é apresentada na Tabela 47. Tabela 47
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Exemplo 67 - Sequência de DNA do plasmídeo pcSDhuCTLA4Ig
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[0002392] Os Exemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 acima se referem, em particular, à proteína de CTLA4-Ig tendo SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 e os Exemplos 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57 acima se referem, em particular, à proteína de CTLA4-Ig tendo SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16. Conforme descrito na presente especificação, os métodos relativos a e usos dessas proteínas nos Exemplos são ilustrativos de métodos relativos a e usos de outras proteínas de CTLA4-Ig da invenção.
[0002393] Composições exemplificativas e não limitativas compreendendo moléculas de CTLA4-Ig da invenção incluem tais composições em que:
[0002394] (1) as moléculas de CTLA4-Ig compreendem qualquer uma ou mais de SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 18 e as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de menos do que ou igual a cerca de 5,0 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig (ou tetrâ- meros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica (um método de medição para o qual é apresentado no Exemplo 10). Mais particularmente, a invenção proporciona tais composições ainda tendo uma ou mais das seguintes características:
[0002395] não excedendo uma quantidade máxima de endotoxina bacteriana de 0,35 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou 76,8 EU/mL (a qual pode ser uma ausência de endotoxina bacteriana); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 48;
[0002396] não excedendo uma bioburden máxima de 1 CFU/10 mL ou 1 CFU/mL (a qual pode ser uma ausência de bioburden); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 49;
[0002397] fornecimento (como moléculas de CTLA4-Ig ou como a referida composição) de (a) cerca de 10 a 22 bandas com uma faixa de pI de cerca de 4,3 a cerca de 5,6, intensidade de banda cumulativa de 90% - 110% em uma faixa de pI de cerca de 4,3 a cerca de 5,3 e cerca de 3 bandas principais em uma faixa de pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,2 ou (b) isoformas de CTLA4-Ig dominantes tendo um pI que é menos de ou igual a 5,1 e pelo menos 90% das moléculas de CTLA4-Ig exibem um pI menos de ou igual a cerca de 5,3; um método para me- dição dessa característica é apresentado no Exemplo 50;
[0002398] uma área de menos do que ou igual a 3,5 por cento das moléculas de CTLA4-Ig são espécies oxidadas das mesmas e uma área de menos do que ou igual a 2,5 por cento das moléculas de CTLA4-Ig são espécies desamidadas das mesmas; métodos para medição dessas características são apresentados no Exemplo 47;
[0002399] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de mais de ou igual a 95,0 por cento de dímeros de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec- trofotométrica; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 10;
[0002400] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de menos do que 5,0 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig (ou tetrâmeros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromato- grafia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 10;
[0002401] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de menos do que ou igual a 0,5 por cento de espécies de baixo peso molecular (ou mo- nômeros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromatogra- fia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica ou uma área de menos do que 0,5 por cento de espécies de baixo peso molecular (ou monômeros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofotométri- ca; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 10;
[0002402] não excedendo uma quantidade máxima de DNA de 2,5 picograma/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou 2,5 picograma/mg de dí- mero de CTLA4-Ig (a qual pode ser uma ausência de DNA); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 58;
[0002403] não excedendo uma quantidade máxima de MCP-1 de 3,0 ng/mg de moléculas totais de CTLA4-Ig, 5 ppm ou 5 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig (a qual pode ser uma ausência de MCP-1); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 59;
[0002404] não excedendo uma quantidade máxima de proteína de células hospedeiras (também conhecida como proteína celular) de 25 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig ou 50 ng/mg de dímero de CTLA4-Ig (a qual pode ser uma ausência de proteína de células hospedeiras ou proteína celular); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 60;
[0002405] não excedendo uma quantidade máxima de Triton X-100 de 1,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig (a qual pode ser uma ausência de Triton-X); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 61;
[0002406] não excedendo uma quantidade máxima de Proteína A de 5,0 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig (a qual pode ser uma ausência de Proteína A); um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 62;
[0002407] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 15 a cerca de 35; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 63;
[0002408] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 1,7 a cerca de 3,6; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 63;
[0002409] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 8,0 a cerca de 17; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;
[0002410] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 3,5 a cerca de 8,3; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;
[0002411] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 7,7 a cerca de 22; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 64;
[0002412] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 8,0, tal como de cerca de 8,0 a cerca de 12,0; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 16;
[0002413] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 8,0, tal como de cerca de 8,0 a cerca de 12,0; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 16;
[0002414] as moléculas de CTLA4-Ig têm glicosilação N-ligada, de modo que o Domínio I exibe uma área percentual de cerca de 24,5% a cerca de 35,2% ou o Domínio II exibe uma área percentual de cerca de 26,3% a cerca de 34,1% ou o Domínio III exibe uma área percentual de cerca de 21,9% a cerca de 31,5% ou o Domínio IV e Domínio V exibem uma área percentual de cerca de 7,9% a cerca de 18,6%; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 44;
[0002415] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NGNA para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de menos do que ou igual a 1,5; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 16.
[0002416] A invenção proporciona tais composições como isoladas ou substancialmente purificadas. A invenção proporciona tais composições como composições farmacêuticas ou composições farmaceuti- camente aceitáveis. A invenção proporciona composições tendo qualquer permuta ou combinação dessas características.
[0002417] A invenção proporciona tais composições como isoladas ou substancialmente purificadas. A invenção proporciona tais composições como composições farmacêuticas ou composições farmaceuti- camente aceitáveis. A invenção proporciona composições tendo qualquer permuta ou combinação dessas características:
[0002418] (2) as moléculas de CTLA4-Ig compreendem qualquer uma ou mais de SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15, 16 ou 24 (por exemplo CTLA4A29YL104E-Ig), as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de menos do que ou igual a 5,0 por cento de espécies de elevado peso molecular de CTLA4-Ig (ou tetrâmeros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec- trofotométrica (um método de medição para o qual é apresentado no Exemplo 25); . Mais particularmente, a invenção proporciona tais composições ainda tendo uma ou mais das seguintes características:
[0002419] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de mais de ou igual a 95,0 por cento de dímeros de CTLA4-Ig conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espec- trofotométrica; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 25;
[0002420] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma área de menos do que ou igual a 1,0 por cento de espécies de baixo peso molecular de CTLA4-Ig (ou monômeros de CTLA4-Ig) conforme determinado através de cromatografia por exclusão de tamanho e detecção espectrofo- tométrica; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 25;
[0002421] fornecimento (como moléculas de CTLA4-Ig ou como a referida composição) de cerca de 8-15 bandas com uma faixa de pI de cerca de 4,5 a cerca de 5,6 e intensidade de banda cumulativa de 95% - 105% em uma faixa de pI de 4,5 a 5,6; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 22;
[0002422] não excedendo uma quantidade máxima de DNA de cerca de 2,5 pg/mg de moléculas de CTLA4-Ig; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 55;
[0002423] não excedendo uma quantidade máxima de Proteína A de 5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 53;
[0002424] não excedendo uma quantidade máxima de MCP-1 de 5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 54;
[0002425] não excedendo uma quantidade máxima de proteína de células hospedeiras (também conhecida como proteína celular) de 50 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 52;
[0002426] não excedendo uma quantidade máxima de endotoxina bacteriana de 0,42 EU/mg de moléculas de CTLA4-Ig; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 48;
[0002427] não excedendo uma bioburden máxima de 1 CFU/ml; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 49;
[0002428] não excedendo uma quantidade máxima de Triton X-100 de 2 ppm; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 57;
[0002429] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 5,0, tal como de cerca de 5,0 a cerca de 9,0 ou de cerca de 5,0 a cerca de 10,0; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 39;
[0002430] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NANA para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de mais de ou igual a 5,0, tal como de cerca de 5,0 a cerca de 9,0 ou de cerca de 5,0 a cerca de 10,0; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 39;
[0002431] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GalNAc para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 0,8 a cerca de 4,0; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 36;
[0002432] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de GlcNAc para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 14 a cerca de 35; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 36;
[0002433] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4-Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 8,0 a cerca de 14; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35;
[0002434] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 1,7 a cerca de 9,3; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35;
[0002435] as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig (ou para dímeros de CTLA4- Ig), expressa como mols/mol de proteína, de cerca de 9 a cerca de 18; um método para medição dessa característica é apresentado no Exemplo 35.
[0002436] A invenção proporciona tais composições como sendo isoladas ou substancialmente purificadas. A invenção proporciona proteínas e composições tendo qualquer permuta ou combinação dessas características.
[0002437] Os Exemplos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 16, 17, 18, 21, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 42, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67 acima se referem, em particular, à proteína de CTLA4-Ig de (1) acima embora, conforme descrito na presente especificação, os métodos referentes a e usos de tais proteínas nesses Exemplos são ilustrativos de métodos referentes a e usos de outras proteínas de CTLA4-Ig da invenção.
[0002438] Os Exemplos 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 52, 53, 54, 55, 56, 57 acima se referem, em particular, à proteína de CTLA4-Ig de (2) acima embora, conforme descrito na presente especificação, os métodos referentes a e usos de tais proteínas nesses Exemplos são ilustrativos de métodos referentes a e usos de outras proteínas de CTLA4-Ig da invenção.

Claims (27)

1. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende moléculas de CTLA4-Ig, em que as moléculas de CTLA4-Ig exibem um perfil de carboidratos em que: i .a glicosilação de oligossacarídeo a-sialilado com-preende de 24,5% a 35,2% de glicosilação N-ligada; ii .a glicosilação de oligossacarídeo mono-sialilado compreende de 26,3% a 34,1% de glicosilação N-ligada; iv.a glicosilação de oligossacarídeo di-sialilado com-preende de 21,9% a 31,5% de glicosilação N-ligada; e v.a glicosilação de oligossacarídeo tri-sialilado e oli-gossacarídeo tetra-sialilado compreende de 7,9% a 18,6% de glicosilação N-ligada, em que (i) as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um polipeptí- deo possuindo a SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10; ou (ii) as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um polipeptí- deo possuindo a SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que mais do que ou igual a 95,0% em área das moléculas de CTLA4-Ig são de dímeros de CTLA4-Ig.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm < 4,0% de espécies de elevado peso molecular.
4. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm < 0,5% de espécies de baixo peso molecular.
5. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que menos do que ou igual a 3,5% em área das moléculas de CTLA4-Ig são espécies oxidadas das mesmas e menos do que ou igual a 2,5% em área das moléculas de CTLA4-Ig são espécies desamidadas das mesmas.
6. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para as moléculas de CTLA4-Ig maior ou igual a 8.
7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido N-acetil neuramínico (NANA) para as moléculas de CTLA4-Ig de 8 a 12.
8. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido siálico para as moléculas de CTLA4-Ig maior ou igual a 5.
9. Composição de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de NANA para as moléculas de CTLA4-Ig de 5 a 10.
10. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para as moléculas de CTLA4-Ig de menos do que ou igual a 1,5.
11. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de galactose para as moléculas de CTLA4-Ig de 8 a 17.
12. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de galactose para as moléculas de CTLA4-Ig de 11 a 13.
13. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de fucose para as moléculas de CTLA4-Ig de 3,5 a 8,3.
14. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de fucose para as moléculas de CTLA4-Ig de 6,4 a 7,0.
15. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de manose para as moléculas de CTLA4-Ig de 7,7 a 22.
16. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que as moléculas de CTLA4-Ig têm uma proporção molar média de manose para as moléculas de CTLA4-Ig de 14 a 16.
17. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de ser isenta de MCP-1.
18. Composição de acordo com a reivindicação 17, caracte-rizada pelo fato de que possui valores de MCP-1 inferiores ou iguais a 5 ng/mg de moléculas de CTLA4-Ig.
19. Composição de acordo com a reivindicação 19, caracte-rizada pelo fato de que possui valores de MCP-1 inferiores ou iguais a 5 ng/mg de dímeros de CTLA4-Ig.
20. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracte-rizada pelo fato de que, quando administrada a um indivíduo em uma dose intravenosa de 10 mg/kg, as moléculas de CTLA4-Ig são capazes de exibir: (a) uma área sob a curva (ASC) de 44400 μg.h/ml; (b) um volume de distribuição de 0,09 L/kg; (c) um pico de concentração (Cmáx) de 292 μg/ml; e (d) uma taxa de depuração de 0,23 ml/h/kg.
21. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a composição é purificada.
22. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica.
23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi-cações 1 a 22, caracterizada pelo fato de ser para uso no tratamento ou prevenção de doença enxerto versus hospedeiro (GVHD), tratamento ou prevenção de rejeição de um órgão transplantado, tratamento ou prevenção de rejeição de um órgão, tecido ou célula transplanta- do(a), tratamento de um distúrbio imune associado à rejeição a transplante de enxerto, tratamento de psoríase, tratamento de lúpus, tratamento de doença reumática, tratamento de artrite reumatoide ou tratamento de esclerose múltipla.
24. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende moléculas de antígeno de linfócito T citotóxico 4-Ig (CTLA4-Ig) e que compreende: (a) uma razão molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4-Ig de pelo menos 8; (b) uma razão molar média de ácido N-acetil neuramínico (NANA) para moléculas de CTLA4-Ig de 8 a 12; (c) uma razão molar média de ácido N-glicolil neuraminico (NGNA) para moléculas de CTLA4-Ig menor ou igual a 1,5; (d) uma razão molar média de N-Acetilgalactosamina (Gal- NAc) para moléculas de CTLA4-Ig de 1,7 a 3,6; (e) uma razão molar média de N-Acetilglucosamina (Glc- NAc) para moléculas de CTLA4-Ig de 15 a 35; (f) uma razão molar média de galactose para moléculas de CTLA4-Ig de 8,0 a 17; (g) uma razão molar média de fucose para moléculas de CTLA4-Ig de 3,5 a 8,3; (h) uma razão molar média de manose para moléculas de CTLA4-Ig de 7,7 a 22; e (i) menor ou igual a 5,0 por cento de área de espécies de alto peso molecular CTLA4-Ig, conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica, e em que as moléculas de CTLA4-Ig compreendem um poli- peptídeo de CTLA4-Ig com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 2, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10.
25. Composição de acordo com a reivindicação 24, caracte-rizada pelo fato de que a concentração de MCP-1 na composição é menor do que 5ppm.
26. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig e que compreende: (a) uma razão molar média de ácido siálico para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de pelo menos 5; (b) uma razão molar média de ácido N-acetil neuramínico (NANA) para moléculas de CTLA4A29IL104E-Ig de 5 a 10; (c) uma razão molar média de ácido N-glicolil neuramínico (NGNA) para moléculas de CTLA4A29IL104E-Ig menor ou igual a 1,5; (d) uma razão molar média de N-Acetilgalactosamina (Gal- NAc) para moléculas de CTLA4A29IL104E-Ig de 2,7 a 3,6; (e) uma razão molar média de N-Acetilglucosamina (Glc- NAc) para moléculas de CTLA4A29IL104E-Ig de 24 a 28; (f) uma razão molar média de galactose para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de 9,2 a 17; (g) uma razão molar média de fucose para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de 4,2 a 7,0; (h) uma razão molar média de manose para moléculas de CTLA4A29YL104E-Ig de 10 a 20; e (i) menor ou igual a 5,0 por cento de área de espécies de alto peso molecular CTLA4-Ig, conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho e detecção espectrofotométrica, em que as moléculas CTLA4A29YL104E-Ig compreendem um polipeptídeo CTLA4A29YL104E-Ig com a sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO: 4, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16.
27. Composição de CTLA4A29IL104E-Ig, de acordo com a rei-vindicação 26, caracterizada pelo fato de que a concentração de MCP- 1 na composição de CTLA4A29IL104E-Ig é inferior a 5 ppm.
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