BRPI0620199A2

BRPI0620199A2 - alfa - galactosidase de bifidobacterium bifidum e seu uso

Info

Publication number: BRPI0620199A2
Application number: BRPI0620199-7A
Authority: BR
Inventors: Georgios Tzortzis; Theodoros Goulas; Athanasios K Goulas
Original assignee: Clasado Inc
Priority date: 2005-12-20
Filing date: 2006-12-19
Publication date: 2011-11-01
Also published as: UA97353C2; NO20082802L; AU2006328108B2; MY144029A; CA2634273A1; PL1974028T3; DK1974028T3; US20090285933A1; WO2007071987A2; GB0525857D0; GB2447003A; PT1974028E; KR101335396B1; NO341747B1; KR20080093102A; CN101370935B; CY1114173T1; WO2007071987A3; IL192342A; US8058047B2

Abstract

ALFA-GALACTOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM E SEU USO A presente invenção diz respeito a uma nova <244>-galactosidase com atividade de transgalactosilaçào isolada de Bifidobacterium bifidum. A <244>galactosidase é capaz de converter melibiose em dissacarídeos de <244>-galactobiose, que podem ser incorporados em numerosos produtos alimentícios ou alimentos de animal para melhorar a saúde do intestino promovendo o crescimento de bifidobactéria no intestino, e reprimindo o crescimento da microflora patogênica.

Description

"ALFA-GALACTOSIDASE DE BIFIDOBACTERIUM BIFIDUM E SEU USO"

A presente invenção se refere a uma nova a- galactosidase com atividade de transgalactosilação capaz de converter melibiose para dissacarideos de α-galactobiose.

Em particular se refere a uma α-galactosidase isolada de uma cepa recentemente descoberta de Bifidobacterium bifidum.

A invenção se refere particularmente às seqüências de DNA que codificam a enzima oí-galactosidase isolada, para a enzima codificada por uma tal seqüência de DNA e para uma célula hospedeira compreendendo uma seqüência de DNA ou con- tendo um vetor recombinante que incorpora a seqüência de DNA. A invenção também se refere ao uso da enzima codifica- da por seqüência de DNA, ou da célula hospedeira que contém uma seqüência de DNA ou vetor recombinante, para produzir a- galactobiose.

Bifidobactérias naturalmente colonizam a área in- testinal mais baixa, um ambiente que é pobre em mono e dis- sacarideos uma vez que tais açúcares são consumidos prefe- rencialmente pelo hospedeiro e micróbios presentes no trato intestinal superior. Para sobreviver no trato intestinal mais baixo as bifidobactérias produzem vários tipos de exo- e endoglicosidases na superfície ligada e/ou formas extrace- lulares, pelas quais elas podem utilizar diversos carboidrato.

Além de atividade de hidrolase, algumas enzimas de bifidobactérias mostram atividade de transferase. Esta ati- vidade de transglicosilação de glicosidases é extensivamente usada para a síntese enzimática de vários oligossacarídeos, que provou agir como fatores de promoção de crescimento de bifidobactérias.

Sabe-se que os membros de bifidobactéria produzem enzimas de β-galactosidase que estão envolvidas no metabo- lismo bacteriano de lactose. Moller, P.L. e outros em Appl & Environ. Microbial., (2001), 62, (5), 2276-2283 descrevem o isolamento e caracterização de três genes de β- galactosidase de uma cepa de Bifidobacterium bifidum. Des- cobriu-se que todas as três β-galactosidases eram capazes a catalisar a formação de galactooligossacarideos beta-ligados através de transgalactosilação.

Sabe-se que algumas espécies de bifidobactéria, porém não o B. bifidum produzem α-galactosidases como também β-galactosidases. α-Galactosidases pertence ao grupo de glicosila hidrolases e pode ser classificado em dois grupos com base na sua especificidade de substrato, isto é, um gru- po é especifico para sacarideos pequenos tal como p- nitrofenil-α-D- alactopiranosídeo, melibiose e rafmose, e o outro grupo pode liberar galactose de galactomanans tal como goma guar, além de substratos pequenos.

Descobriu-se que uma cepa Bifidobacterium bifidum é capaz de produzir uma atividade de enzima de galactosidase que converte lactose para uma nova mistura de galactooligos- sacarideos que inesperadamente contém até 35% de dissacarí- deos incluindo galabiose (Gal (α 1-6)-Gal). Este dissacarí- deo é conhecido (veja Paton, J.C. & Paton, A., W. (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350) por ser um antiadesivo capaz de prevenir a adesão de toxinas, por exemplo, toxina de Shiga e patógenos tal como E. coli, à parede do intesti- no.

Esta cepa de B.bifidum foi depositada sob o número de acessão NCIMB 41171 na National Collection of Industrial & Marine Bactéria, Aberdeen, UK no dia 31 de março de 2003. Também é descrito na Patente do REINO UNIDO No. 2 412 380.

Descobriu-se que esta cepa de B. bifidum produz uma α-galactosidase que é capaz de converter mellibiose para dissacarideos de α-galactobiose.

De acordo com a invenção, é fornecida uma seqüên- cia de DNA que codifica uma proteína com uma seqüência de aminoácido como determinado na SEQ. ID NO: 2 ou hibridiza sob condições rigorosas para a seqüência de DNA que codifica esta proteína. A seqüência de DNA é determinada em SEQ. ID NO: 1 ou pode compreender um fragmento ou degenerativo des- ta.

A frase "degenerativo" é interpretado significar uma seqüência de DNA que é pelo menos 50% homóloga a SEQ. ID NO: 1, preferivelmente de 50 a 98% homóloga, preferivelmente de 75 a 95% homóloga.

Tal seqüência de DNA pode compreender substitui- ções de nucleotídeo, adições ou deleções que resultam em me- nos do que 60%, preferivelmente menos do que 45%, mais pre- ferivelmente menos do que 25% de mudança na seqüência de a- minoácido mostrada na SEQ. ID NO: 2. As substituições de nucleotídeo podem resultar em substituições de aminoácido conservadoras. De acordo com um segundo aspecto da invenção, é fornecida uma enzima codificada por uma seqüência de DNA co- mo definido acima. Tal enzima pode compreender a seqüência de aminoácido determinada na SEQ. ID NO: 2 ou um fragmento desta.

De acordo com um terceiro aspecto da invenção, é fornecido um vetor recombinante, preferivelmente um vetor de expressão, compreendendo uma seqüência de DNA como definido acima.. Tal vetor pode ser incorporado em uma célula hospe- deira tal como uma célula bacteriana, levedura ou fúngica.

Alternativamente, a seqüência de DNA pode ser in- corporada em tal célula hospedeira. Uma célula hospedeira adequada pode ser selecionada de Bifidobacterium, Lactococ- cus, Lactobacillus, Baeillus, por exemplo, Baeillus subtilis ou Baeillus eireulans, Eseheriehia e Aspergillus, por exem- plo, Aspergillus niger.

Usando melibiose como um substrato, a enzima codi- ficada pela seqüência de DNA como definido acima produz uma mistura de oligossacarideos, em particular dissacarídeos de α-galactobiose.

A enzima ou a célula hospedeira como descrito aci- ma pode ser usado para produzir dissacarídeos de a- galactobiose que pode formar parte de um produto para melho- rar a saúde do intestino. Tal produto pode ser selecionado do grupo que consiste em produtos de leiteria (por exemplo, leite líquido, pó de leite seco, tal como pó de leite inte- gral, pó de leite desnatado, pós de leite carregado de gor- dura, pó de soro, leites de bebê, fórmula de bebê, sorvete, iogurte, queijo, produtos de leiteria fermentados), bebidas tal como suco de fruta, comidas infantis, cereais, pão, bis- coitos, confeitaria, bolos, suplementos de comida, suplemen- tos dietéticos, produtos comestíveis pró-bióticos, produtos comestíveis pré-bióticos, alimentos animais, alimentos de aves domésticas ou de fato qualquer outra comida ou bebida.

Alternativamente, os dissacarídeos então produzi- dos podem ser usados para a preparação de um medicamento, por exemplo, na forma de comprimido ou cápsula para prevenir a adesão de patógenos ou toxinas produzidas para patógenos à parede do intestino. 0 medicamento pode ser administrado a um paciente, por exemplo, seguindo um curso de tratamento antibiótico, que freqüentemente altera ou até mesmo destrói a flora intestinal saudável normal.

De acordo com ainda um outro aspecto da invenção é fornecido um processo para produzir uma enzima como definido acima que compreende cultivar uma célula hospedeira como de- finido acima em um meio de cultura adequado sob condições permitindo a expressão da enzima e recuperando a enzima ou produtos de enzima resultantes da cultura.

A invenção também está voltada a um processo para produzir o dissacarídeo de galactobiose que compreende con- tatar a enzima como definido acima ou uma célula hospedeira como definido acima com um material contendo melibiose sob condições que levam à formação dos dissacarídeos.

O material contendo melibiose adequado pode ser selecionado de melibiose, rafinose, estaquiose comercialmen- te disponíveis ou como um extrato de soja. Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra a seqüência de nucleotideo (SEQ. ID NO: 1) de oí-galactosidase de Bifidobacterium bifidum de com os códons de partida e interrupção indicados em letras em negrito;

Figura 2 mostra a seqüência de nucleotideo da Fi- gura 1 com a seqüência de aminoácido (SEQ. ID NO: 2) da en- z ima ;

Figura 3 mostra os primeiros 540 aminoácidos da seqüência de aminoácido (SEQ. ID NO: 2) da Figura 2;

Figura 4 é um gráfico que mostra a reação de curso de tempo durante a síntese de α-galactooligossacarídeo com a α-galactosidase e 40% (peso/peso) de meliboise em 0,1 M de tampão de fosfato em pH 6,0 como substrato; e

Figura 5 mostra um croraatograma de permuta de íon de alto desempenho da mistura de a-galactooligossacarídeo sintetizada pelo α-galactosidase de B.bifidum NCIMB 41171 usando 40% (peso/peso) de melibiose em 0,1 M de tampão de fosfato em pH 6,0 como substrato. (Glc = glicose, Gal = ga- lactose, Mel = melibiose, DP = grau de polimerização) . As setas tracejadas significam os produtos de galactooligossa- carídeo.

O DNA genômico foi isolado da cepa de Bifidobacte- rium bifidum (NCIMB 41171) usando o método de Lawson e outro (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. 0 DNA foi digerido com enzimas de restrição e os fragmentos tendo um tamanho máximo de 15 kbp foram ligados com vetor pBluescript KS( + ) . As células de E. coli foram transformadas com um ve- tor que contém inserções que consistem em DNA cromossômico digerido Pstl do B.bifidum. Os clones com atividade de a- galactosidase foram selecionados em placas de agar Luria Bertani contendo α-D-galactopironosideo de p-nitrofenila e isopropil-β-D-tiogalactosideo (IPTG). Dois clones positivos de a-galactosidase (pMelA1 e pMelA2) foram identificados.

Os dois clones positivos foram digeridos com E- croRl, Pstl e Bam HI e mostraram um padrão de restrição se- melhante que indica que ambos contiveram o mesmo fragmento de DNA inserido. 0 seqüenciamento de DNA do fragmento de DNA inserido MeIAl foi realizado usando o método de termina- ção de cadeia de dideoxy de Sanger (Russel P., 2002 iGene- tics, Pearson Education, Inc., São Francisco, 187-189) usan- do o kit de seqüenciamento de ciclo BigDye Terminator V.3.0 (Biosystems Aplicado, USA). A seqüência de DNA de MelAl é mostrada na Figura 1 (SEQ. ID NO: 1).

A estrutura de leitura aberta (ORF) foi localizada usando o descobridor de ORF de NCBI (National Center of Bio- technology Information). 0 código genético bacteriano foi usado e o comprimento da estrutura foi determinado ser 300 bp. A seqüência de nucleotideo da Figura 1 foi trasladada em todas as seis possíveis estruturas de leitura e uma es- trutura de leitura aberta de 759 aminoácidos que codifica uma α-galactosidase putativa foi identificada. A translação é mostrada na Figura 2 (SEQ. ID NO: 2).

A presente invenção será também descrita por via de referência aos seguintes exemplos.

Exemplo 1 Materiais e Métodos

Todas as substâncias químicas e preparações de meio usadas ao longo deste estudo foram obtidas de Sigma (Dorset, REINO UNIDO), Invitrogen (Paisley, REINO UNIDO), Oxoid (Basingstoke, REINO UNIDO), Qiagen (West Sussex, REINO UNIDO) e Promega (Southampton, REINO UNIDO).

Cepas Bacterianas

A cepa Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) foi mantida em contas criogênicas em tubos de Microbank a -70°C. Para experiências posteriores, a cepa foi reavivada em ágar Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, REINO UNIDO) e meio de TPY (meio de extrato de levedura de fitona tripticase) e cresci- do anaerobiamente (composição de CO2 e N2 80% e 20% respec- tivamente) a 37°C durante 48 horas. A morfologia de colônia e a ausência de contaminação foram testadas por raanchamento em grama.

Cepas de E. coli

As cepas de Escherichia coli RAllr e DH5a usadas neste estudo geralmente foram incubadas sob as condições ae- róbias a 37°C em agar ou caldo Luria Bertani (LB) (Sambrook J. e Russell, W.D., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Nova Iorque) e quando necessário foi suplementado com antibióticos (100 μ- g/ml de ampicilina e/ou 15 pg/ml de cloramfenicol) e 40 μΐ de 2% de X-a-galactopiranosídeo (Χ-α-Gal) , 7 μl de 20% de (isopropil-p-D-tiogalactosídeo) IPTG que foram aplicados na superfície de uma placa de agar de 90mm pré-feita.

A cepa de α-galactosidase deficiente o E. coli RAl Ir (Hanatani e outos, 1983, J., Biol. Chem. 259. (3), 1807- 1812) (genótipo: melA~B+, recA", lacZ"Y~) é um derivado de E. coli K12 e foi usado nas experiências de expressão. A cepa E. coli DH5a (Invitrogen, Paisley, REINO UNIDO) (genótipo: F" φ801άθΖΔΜΔ (lacZYA-argF) U169 recAl endAl hsdR17 (rk", mk") phoA supE44 thi-1 gyrA96 relAlλ") é uma cepa positiva de α- galactosidase e foi usada para todas as outras manipulações genéticas.

A escolha de cepa E. coli RAllr, para experiências de expressão, foi feita de acordo com seu genótipo. Esta cepa não codifica um α-galactosidase ativo devido à mutação de melA em seu DNA cromossômico. Porém, esta cepa tem um transportador de melibiose ativo que é necessário para o transporte de açúcares (melibiose) no citoplasma e conse- qüentemente o metabolismo deles por α-galactosidases ativos. Não se sabe se a α-galactosidase de Bifidobacterium bifidum foi expressa intracelularmente ou extracelularmente. Assim a existência de um transportador de melibiose ativo foi es- sencial para a identificação dos clones positivos α-gal e conseqüentemente o isolamento de genes de codificação de a- galactosidase.

Além disso, esta cepa é um mutante recA que mini- miza a recombinação de DNA introduzido com DNA hospedeiro, desse modo aumentando a estabilidade das inserções.

Extração de DNA Genômico de Bifidobacterium bifi- dum

O DNA genômico foi isolado da cepa de Bifidobacte- rium bifidum (NCIMB 41171) usando o método de Lawson e outro (1989).

De acordo com este método, as células foram colhi- das de placas em 0,5 ml de tampão de TES em 1,5 ml de epen- dorfs. 10 μl de mistura de lisossoma/mutanolisina (4:1, li- sozima 10 mg/ml; mutanolisina 1 mg/ml) foram adicionados e a mistura foi então misturada e incubada durante 30 minutos a 37°C. As células foram então tratadas com 10 μl de protei- nase K (em 20 mg/ml) e 10 μl de RNase (10 mg/ml), misturado e incubado durante 1 hora a 65°C. Após a incubação, 100 μl de 10% de SDS foram adicionados e os lisados de célula foram suavemente misturados por inversão e incubados durante um adicional de 15 minutos a 65°C, seguido por adição de 0,62 ml de f enol/clorofórmio e misturados por inversão até gue uma emulsão se formasse. O lisado de célula foi centrifuga- do a 6.500 rpm durante 10 minutos e a camada aquosa superior foi transferida para um frasco do tipo ependorf limpo usando uma ponta de pipeta azul de furo largo, em chama. A extra- ção (etapa de desproteinação) foi repetida até que os resí- duos de célula fossem completamente removidos. O DNA foi precipitado pela adição de 1 ml de etanol gelado seguido por incubação durante pelo menos 30 minutos em gelo ou armazena- do durante a noite dentro de üm congelador a -20°C. O DNA genômico foi recuperado por centrifugação a 13.000 rpm du- rante 5 minutos e após a secagem foi re-suspenso em 50 μl de 10 mM de Tris-Cl estéril pH 8.

O DNA extraído foi analisado por eletroforese em gel e a concentração medida a 260nm. Ele foi armazenado a - 2°C ou -70°C durante períodos prolongados de tempo e múlti- pios descongelamentos e congelamentos foram evitados para reduzir a possibilidade de degradação.

Vetor Preparação de DNA

0 vetor usado ao longo deste estudo foi o pBlues- cript KS(+) (Stratagene, North Torrey Pines Road). Este ve- iculo de clonagem foi escolhido por causa do promotor de Iac que pBluescript KS(+) codifica que é necessário para a ini- ciação de transcrição de genes que necessitam de seu próprio promotor.

0 vetor foi digerido com as seguintes enzimas de restrição: PstI, BamUI e EcoRL de acordo com as instruções do fabricante usando um excesso décuplo de enzima sobre DNA (unidades de enzima: pgr de DNA igual a dez unidades de en- zima por um μgr de DNA de plasmideo ou dez unidades de enzi- ma por 0,5 pmol de DNA de plasmideo). Após a inativação térmica da enzima (20 min às 65°C) os padrões de restrição foram analisados através de análise de eletroforese de gel horizontal.

Os vetores foram também desfosforilados com fosfa- tase alcalina intestinal de bezerro CIAP (Promega, Southamp- ton, REINO UNIDO) de acordo com as instruções do fabricante. A eficiência do tratamento foi testada por auto-ligação do vetor (com ligase de DNA de Bacteriófago T4 de acordo com as instruções do fabricante) seguinte à transformação em célu- las de DH5a.

A presença de um único fragmento no gel indicou a digestão de vetor completa e a única digestão de restrição dele. A digestão suficiente do vetor também foi testada transformando moléculas não ligadas em células DH5a de E. coli competente. O número de colônias formadas em placas de agar LB suplementadas com ampicilina (100 pgr/ml) foi um in- dicador das moléculas não digeridas e a base esperada duran- te as experiências subseqüentes.

Construção dé Biblioteca de DNA Genômico O DNA genômico foi digerido parcialmente com três enzimas de restrição que reconhecem a ocorrência freqüente de seqüências de hexa-nucleotideo dentro de DNA prokcarióti- co. EcoRI, BamHI e PstI são endonucleases de restrição tipo II que especificamente reconhecem as seqüências 5'G/AATTC'3, 5'G/GATCC'3 e 5'CTGCA/G'3 respectivamente, e fazem fraturas de filamento duplo dentro destas seqüências gerando saliên- cias 5' de quatro nucleotideos, AATT, GATC para EcoRI e Ba- mHI respectivamente, e saliências 3', ACGT para PstI.

Todas estas enzimas foram ativas e capazes de cli- var DNA somente na presença de ions de magnésio divalentes. Estes ions foi o único co-fator exigido.

Digestão de Restrição de DNA.

Todas as digestões de restrição das amostras de

DNA genômico foram incubadas durante 2 horas a 37°C e final- mente inativadas por calor a 65°C durante 20 minutos. As reações foram então esfriadas a temperatura ambiente e a quantidade apropriada de tampão de carregamento foi adicio- nada, seguido por mistura suave com um capilar de vidro la- crado. As soluções então foram carregadas em cavidades de um gel de agarose a 0,8% (fornecimento de força 4-5 volts/cm durante 14-16 horas) e o tamanho do DNA digerido foi estima- do com aqueles de padrões de DNA de 1kbp (Promega, REINO UNIDO) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)).

Purificação dos fragmentos gerados após a digestão de restrição.

A purificação de fragmento das misturas de reação e dos géis de agarose foi feita usando o kit de extração de gel QIAEX de Qiagen (West Sussex, REINO UNIDO). Os protoco- los são descritos com detalhes no manual do fabricante.

Ligação e Transformação de DNA

Após a purificação dos fragmentos de DNA com o kit de extração de gel Qiaex, eles foram ligados com vetor pBlu- escript KS(+)tratados com CIAP. Para ligação, quantidades apropriadas de DNA foram transferidas para tubos de micro- centrifuga de 0,5 ml como mostrado na Tabela 1.

TuboDNA

AVetor (15 fmoles 29,7 ng])

B Vetor (15 fmoles ~29,7ng de DNA) mais inserções

(15 fmoles estrangeiro ~ 69,3ng)

Ccontrole de pUC (0, 056 fmoles [-100 pg] )

A relação molar de vetor de DNA plasmideo para in- serir fragmento de DNA deveria ser ~1:1 na reação de liga- ção. A concentração de DNA final deveria ser ~10ng/μl.

Tabela 1: Misturas de Ligação. Tubo A mostra o número de DNA de vetor auto-ligado que deve ser subtraído do número total de transformantes após a transformação. 0 tubo B mostra a ligação do vetor com os fragmentos de DNA e o tu- bo C mostra o controle para que a eficiência de transforma- ção seja calculada.

Antes de cada ligação os fragmentos de DNA foram aquecidos a 45°C durante 5 minutos para fundir qualquer ter- minal coesivo que recozeu novamente durante a preparação de fragmento. Uma relação molar de DNA de vetor:inserção de 1: 1 foi escolhida para todas as reações de ligação e a monta- gem da reação foi feita de acordo com as instruções de Pro- mega.

Para os A e B 1,0 μl de tampão de 10x de ligação e 0,5 unidades de Weiss de T4 DNA ligase (Promega, REINO UNIDO) foram adicionados e o volume de ligação foi ajustado para 10 μl com água de grau de biologia molecular. Aos tu- bos C, 1,0 μl de tampão de 10 χ de ligação foi adicionado e o volume de ligação foi ajustado para 10 μl com água de grau de biologia molecular.

Os fragmentos de DNA foram adicionados aos tubos junto com a água e então aquecidos a 45°C durante 5 minutos para fundir qualquer terminal coesivo que recozeu novamente durante a preparação. O DNA foi esfriado a 0°C antes que o resto dos reagentes de ligação fossem adicionados e as mis- turas de reação foram incubadas durante a noite a 16°C (Sam- brook e Russell, 2001).

Após a precipitação e purificação de etanol dos fragmentos ligados (para remover a mistura de ligação que causa redução da eficiência de transformação) foram realiza- das transformações de acordo com as instruções de Hanahan. ~50ng de DNA ligado em 5μl de solução foram adicionados a 100 μl de células RAllr de E. coli competentes. Após o tra- tamento térmico e expressão do gene de resistência a ampici- Iina as células foram espalhadas sobre a superfície das pla- cas de LB contendo ampicilina (100ugr/ml), Χ-α-Gal (40μl de 2% de Χ-α-Gal) e IPTG (7μl de 20% de IPTG).

O número de transformantes de cada reação de liga- ção foi medido. O número de transformantes geralmente obti- do do tubo C foi 2x 10^5-1x10^6 cfu/yg considerando que do tubo A foi 500-600 cfu/μg. O número de transf ormantes no tubo A foi uma indicação do tratamento eficiente do DNA de vetor. O número de transformantes no tubo B foi em uma faixa de 2- 4xl04cfu/ug.

Número de Transformantes

As misturas de ligação com DNA cromossômico PstI deu origem a dois clones positivos de α-galactosidase (pMe- 1A1 e pMelA2) dentre aproximadamente 2500 transformantes a- valiados, considerando que com DNA cromossômico tratado com EcoRI e BamEI não produziu qualquer clone positivo dentre aproximadamente 4000 transformantes total avaliados.

Digestão de Clone Positivo

Os dois clones positivos PstI foram digeridos com enzimas de restrição EcroRI, PstIr BamHI, HindIII, SmaI, e KpnI. As enzimas de restrição EcroRI, PstI e BamHI mostra- ram padrão de restrição similar, um fragmento de ~5kbp (gene de interesse) e um ~3kbp (DNA de plasmídeo) indicando que estas enzimas foram cortadas nas mesmas posições. HindIII produziu um fragmento em 6,5 kbp e um fragmento em 1,5 kbp considerando que as enzimas SmaI e KpnI produziram um frag- mento com tamanho de ~8kbp indicando que eles foram cortados em somente uma posição. Os padrões de restrição similares para ambos os plasmídeos foram uma indicação que ambos con- têm a mesma inserção de fragmento de DNA.

Seqüenciamento de DNA

O seqüenciamento de DNA foi realizado com o método de terminação de cadeia de dideóxi de Sanger usando o kit de seqüenciamento de ciclo BigDye Terminator v.3.0 (Applied Bi- osystems, USA) e analisado com o ABI Prisma 3100, um sistema de análise de DNA com base na fluorescência que incorpora eletroforese capilar.

As terminações 5'- e 3'- dos fragmentos de DNA in- seridos foram seqüenciadas com iniciadores específicos de vetor. As inserções foram também seqüenciadas usando o Ge- nome Priming System (GPS-eu) (New England Biolabs, Uk). GPS-I é um sistema in vitro com base em transposon TN7 que usa TnsABC Transposase para inserir Transposon aleatoriamen- te no alvo de DNA. 0 doador: relação de massa de DNA alvo de 1:4 foi usada de acordo com as instruções do fabricante. O número de plasmídeos isolados para seqüenciamento após a inserção do Transprimer no plasmídeo alvo foi 25. Este nú- mero foi calculado de acordo com as instruções do fabricante e assume uma profundidade de 5 dobras de cobertura.

Os sítios de preparação únicos em ambas as termi- nações do elemento de Transprimer permitiram o seqüenciamen- to de ambos os filamentos do DNA alvo na posição da inser- ção .

A mistura de reação de seqüenciamento conteve a- proximadamente 400-600ng de DNA de plasmídeo, 3,2 pmol de solução de iniciador e 4μ1 de solução de Terminator BigDye.

Identificação da Estrutura de Leitura Aberta

A estrutura de leitura aberta (ORF) foi localizada usando o descobridor de ORF de NCBI. O código genético bac- teriano foi usado e o comprimento da estrutura foi determi- nado ser 300bp. A seqüência de nucleotideo foi trasladado em todas as seis possíveis estruturas e uma estrutura de leitura aberta de 759 aminoácidos codificando um oí- galactosidase putativo foi identificado (A translação é mos- trada na Figura 2). O códon de partida e o códon de inter- rupção foram confirmados.

O gene de α-galactosidase de Bifidobacterium em pMelAl de plasmídeo foi expressado em E. coli sob condições de crescimento que normalmente reprimiriam a expressão do promotor de lacZ de E. coli induzível localizado na região de flanqueamento do vetor de clonagem. Esta observação in- dicou que as seqüências bifidobacterianas endógenas internas a montante do gene de α-galactosidase podem servir como um sinal de iniciação de transcrição em E. coli.

O começo da transcrição é indicado com letra em itálico em negrito. Os resultados anteriores indicam que o gene é controlado de seu próprio promotor para transcrição.

Exemplo 2

Síntese com a enzima clonada de α-galactosidase isolada de Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 em hospedeiro de E. coli (cepa RAl1)

A seguinte síntese descrita, a menos que de outro modo declarado, foi realizada com as células hospedeiras RAll de Ε. coli totais após o tratamento da biomassa de E.coli (coletada através de centrifugação a 10.000 g) com tolueno a uma concentração de 2000 ppm para aumentar a per- meabilidade da célula e também para tornar as células não viáveis destruindo a sua membrana citoplásmica. A biomassa de E-coli foi preparada como descrito no Exemplo 1 sob "ce- pas de E coli".

Síntese com enzima clonada

A síntese com α-galactosidase foi realizada a uma concentração de substrato de 40% (peso/peso) de concentração de melibiose inicial. A solução de síntese foi preparada em 0,1 M de tampão de fosfato a pH 6,0. A síntese foi realiza- da a 40°C em banho de água em agitação a 150 rpm. 0 pH ide- al para a enzima específica foi escolhido com base nas medi- ções da atividade (usando p-nitrofenil-a-D- galactopiranosídeo como substrato) de uma preparação enzimá- tica específica em valores de pH variados.

Para síntese de a-galactosidase, 2 ml de uma sus- pensão de célula RAll de E. coli (com uma atividade de 0,3 U/ml) foram centrifugados (em 10.000 g) para coletar a bio- massa e o sobrenadante foi descartado. Esta biomassa foi re-suspensa com 1 g de 40% (peso/peso) de solução de subs- trato de melibiose para realizar a síntese.

As concentrações dos açúcares diferentes presentes na mistura são mostradas durante a síntese na Figura 4. A cromatografia de permuta de íon de alto desempenho acoplada com os cromatogramas de detecção anperométricos pulsados (HPAEC-PAD) de misturas de galactooligossacarídeo sintetiza- do pela α-galactosidase clonada de NCIMB 41171 de B. bifidum são mostrados na Figura 5. As concentrações de açúcar de mistura de galactooligossacarideo no ponto de tempo de sín- tese ideal são mostradas na tabela 1.

Tabela 1. Composição de carboidrato de síntese de a-galactooligossacarídeo em 40% (peso/peso) de concentração de melibiose inicial no ponto de tempo onde a concentração de oligossacarídeo máxima foi observada.

<table>table see original document page 20</column></row><table> Listagem de Seqüência

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Lindsay, clare L

<120> Produto e Processo

<130> P/13587.WO

<150> GB 0525857.9

<151> 2005-12-20

<160> 2

<170> PatentXn versão 3.4

<210> 1

<211> 3129

<212> DNA

<213> Bifidobacterium bifidum

<220> <221> gene <222> CD ·. C6) <400> 1 taaaccttca taaaaggaaa caaaagctgg aagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga 60 actagtggat cccccgggct gcagctcgtg gtgatctacg ttccgttcct caactccgcg 120 ttcggcacca cgccgctcgg accgtgggca tgggtcgagt gcatctgcct cgccgcggtc 180 gtactgatcg cctcggaaat ctacaaggcg atcatgcgcg ccatcgaccg caagcgcggc 240 atcatggcat aacaatgcca taagcctcca ccggcagtca gggctcccgc tctccacatc 300 ggaaaacggg agcccttctc ataccccgga atcgctgaat atgcggtgac atgacggaac 360 gatgtcgtag catcggaggc gaaccatata tcaatggcac gttccgaagg gattcgcaat 420 gtcactcatc gaacaattcc atggcgccgc cgccgatgga acggaactca ccgctattta 480 tgctgagcag ccggctgctg atgtggcgtt cgcgctggtc ttcgccggtc acggtcttcc 540 gcgcttcgtg cáctggggcc gaccgctcgc ggcgccggga accgtactcg ccgcatacga 600 cgccctgcgg ccgcagcgcg tgtccggcgc gctggacgag accgcctggc caagcatcat 660 gcccacgcaa agcgagtcgt ggataggggc accgcgactg gatatccggc gcgccggcgt 720 aacgccgttc tgtgcattca •cggtgaccgg catcgcaatc cgtcaggacg aacgccaagg 780 cgttgacgtg tctgacggcg tggacggtgc cgcgcatacc gtcacgcaac aggtgccggt 840 cgtcaccgtg accgcgtcgg atgccgagca gggcgtggaa ctgtcatgga cggccgaact 900 gttgcccggc ggactgatca gacagcgcac cacgctgcgt aatcttccag ccggtaatct 960 tccgaccggt gacttggaag tcggtaaagt cgaactcggc ttcccgctcc cggcacttgc 1020 cacggagata ctcaccacca ccggccatca tctgcgcgaa cgcagcccgc agcggcagcc 1080 gctgaccgaa ggacgcttcg agaaggtctc gatggcgggg cgcccaggtt ttgacgcctc 1140 tctgttgctt tccgcgggcg agcccggctt cgggttcgag catggcgagg tctattcggt 1200 gcatgtgggc tggagcggca attccgtgct gtcggcagag cgtcagccgt atacgaccgg 1260 Listagem de Seqüência

tctgattggc ggcggcgagg tgctgctcgg cggcgaggcc acgctcgccc gcggcgaaac 1320

gtacaccacc ccgtggctgt acgggtcgta cggtgacggg ctcaacgagg tggctgcgag 1380

attccatgat tacgtacgct cctgtcaccc ggatctcgcc gtcaagccgc gtccggtgat 1440

tctcaacacg tgggaggccg tgtatttcga ccatgactac gacacgttga aggctctggc 1500

cgataaggcc ggggattccg gtgtcgaacg gttcgtggtg gatgacggct ggttcggctc 1560

ccgccgagac tccacatccg ggctcggcga ctggcaaata gcgcaggatg tgtggccgga 1620

cgggccgaag agcctcaagg cgctcgccga ttacgtgcac ggaaaaggca tggagttcgg 1680

cctgtggttc gaaccggaga tggtcaaccc ggattccgac gtggcccgcg cccaccctga 1740

ctgggtgctg cgcccgactg cgaaccgtct gccgatgcag ggacgctcgc agcaagtgct 1800

cgacctgacc aatcccgacg cctaccgata catccatgat tccatcgatg cgctggtcgg 1860

cgagttgggc atcgactaca tcaaatggga ccacaacaaa ttcgtcaccg aggcggtctc 1920

gccacgtac?: ggcaggccgg cggtgcacgg gcagacgctc gccgtgtacc ggatgttccg 1980

tgacctcgaa gtcgcgcatc cgggactgga gattgagagt tgcgcatcgg gcggcggccg 2040

tatcgacctg ggcatactcg aattcgccag ccgcgtgtgg acgtccgact gcgtggaccc 2100

ggtcgagcgg gccgatattc agcggtacac gtcgctgctc gtgccgccct gcatgatggg 2160

cgagcatgtg ggggcgagtc ctgcacattc cacgcatcgc gccacgagcc aggagatgcg 222Q

catggcgatg·gcgt-tGttcg- ggcacatggg cgtcgaatgg aatctgctca-aggagccgga 2280

cgaggcgttg aacaagctcg gcgaatgggt cgccgaatac aagaggcacc gcgcatggtt 2340

cgcgatcgac acgtgcgtgc acgccgatat cgccgatccg gccgtccggg tcgacggcat 2400

ggtcaagccg gatcgttccg cggcgttcrta ccggttcacg caactgacaa cgtcccagac 2460

tctccctgcg gcgccgattc gcgtgcccgg tcttgacccc gatggcacgt accgcataca 2520

gccgttgtgg ctggatctcg atctcgacgg gcttggtctt ggcagcggcc agtcgccgtt 2580

gggctggtgg accaaagacg gcgtgctgat gacgggccgg gcgctgatga cctacgggtt 2640

gcgccctcca tcgctgcatc cggcgcagtc ggtgctgttc accgccattc gccaataagc 2700

cagacggcat cgaacggagc ataacaatgt gccggcggcc cagtcatgga gtcgccggca 2760

cattgcgtca aagaacttgg gtatcggctc tagtcgttga cgtcggcctt gtagaagttc 2820

acgtaggaac ggctgggggt cgggccgcgc tggccctgat aatgggagcc ggtgcccttg 2880

gagccgtaag ggtgctcggc cggagagctg agctggaaga agcacatctg cccgatcttc 2940

atgccgggcc agagcttgac cggaagcgtc gacacgttgc tcaactccag cgtgatatgc 3000

ccctcgaaac cggggtcgat gaagccggcc gtcgaatgtg tgaggatgcc cagacggccc 3060

agcgagcttt tgccttccaa gcgtgccgcc accgtcgcgt cgagcttgac ggtactcccc 3120

acgtcgagc 3129

<210> 2 <211> 759 <212> PRT Listagem de Seqüência

<213> Bifidobacterium bifidum

<400> 2

Met Ser Leu Ile Glu Gln Phe His Gly Ala Ala Ala Asp Gly Thr Glu 1 5 10 15

Leu Thr Ala Ile Tyr Ala Glu Gln Pro Ala Ala Asp Val Ala Phe Ala 20 25 30

Leu Val Phe Ala Gly His Gly Leu Pro Arg Phe Val His Trp Gly Arg 35 40 45

Pro Leu Ala Ala Pro Gly Thr Val Leu Ala Ala Tyr Asp Ala Leu Arg 50 55 60

Pro Gln Arg Val ser Gly Ala Leu Asp Glu Thr Ala Trp Pro ser Ile 65 70 75 80

Met Pro Thr Gln Ser Glu ser Trp Ile Gly Ala Pro Arg Leu Asp Xle 85 90 95

Arg Arg Ala Gly vai Thr Pro Phe Cys Ala Phe Thr Val Thr Gly Ile 100 105 110

Ala lie Arg-Gln Asp Glu Arg Gln Gly Val Asp. Val Ser Asp-Gly yal 115 120 125

Asp Gly Ala Ala His Thr Val Thr Gln Gln Val Pro Val Val Thr vai 130 135 140

Thr Ala Ser Asp Ala Glu Gln Gly Val Glu Leu Ser Trp Thr Ala Glu 145 150 155 160

Leu Leu Pro Gly Gly Leu Ile Arg Gln Arg Thr Thr Leu Arg Asn Leu 165 170 175

Pro Ala Gly Asn Leu Pro Thr Gly Asp Leu Glu Val Gly Lys Val Glu 180 185 190

Leu Gly Phe Pro Leu Pro Ala Leu Ala Thr Glu Ile Leu Thr Thr Thr 195 200 205

Gly His His Leu Arg Glu Arg ser Pro Gln Arg Gln Pro Leu Thr Glu 210 215 220

Gly Arg Phe Glu Lys Val ser Met Ala Gly Arg Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240

Ser Leu Leu Leu ser Ala Gly Glu Pro Gly Phe Gly Phe Glu His Gly 245 250 255 Listagem de Seqüencia

Glu Val Tyr ser Val His Val Gly Trp ser Gly Asn ser Val Leu ser 260 265 270

Ala Glu Arg Gln Pro Tyr Thr Thr Gly Leu Ile Gly Gly Gly Glu Val 275 280 285

Leu Leu Gly Gly Glu Ala Thr Leu Ala Arg Gly Glu Thr Tyr Thr Thr 290 295 300

Pro Trp Leu Tyr Gly ser Tyr Gly Asp Gly Leu Asn Glu Val Ala Ala 305 310 315 320

Arg Phe His Asp Tyr Val Arg Ser Cys His Pro Asp Leu Ala Val Lys 325 330 335

Pro Arg Pro Val Ile Leu Asn Thr Trp Glu Ala vai Tyr Phe Asp His 340. 345 350

Asp Tyr Asp Thr Leu Lys Ala Leu Ala Asp Lys Ala Gly Asp ser Gly 355 360 365

Val Glu Arg Phe Val Val Asp Asp Gly Trp Phe Gly ser Arg Arg Asp 370 375 380

ser Thr Ser Gly Leu Gly Asp Trp Gln Ile Ala Gln Asp vai Trp Prs 385 390 395 4Ò0

Asp Gly Pro Lys ser Leu Lys Ala Leu Ala Asp Tyr Val His Gly Lys 405 410 415

Gly Met Glu Phe Gly Leu Trp Phe Glu Pro Glu Met Val Asn Pro Asp 420 425 430

Ser Asp Val Ala Arg Ala His Pro Asp Trp Val Leu Arg Pro Thr Ala 435 440 445

Asn Arg Leu Pro Met Gln Gly Arg Ser Gln Gln Val Leu Asp Leu Thr 450 455 460

Asn Pro Asp Ala Tyr Arg Tyr Ile His Asp ser Ile Asp Ala Leu vai 465 470 475 480

Gly Glu Leu Gly Ile Asp Tyr Ile Lys Trp Asp His Asn Lys Phe Val 485 490 495

Thr Glu Ala Val ser Pro Arg Thr Gly Arg Pro Ala vai His Gly Gln 500 505 510

Thr Leu Ala Val Tyr Arg Met phe Arg Asp Leu Glu Val Ala His Pro 515 520 525 Listagem de Seqüência

Gly Leu Glu Ile Glu ser Cys Ala Ser Gly Gly Gly Arg Ile Asp Leu 530 535 540

Gly Ile Leu Glu Phe Ala ser Arg Val Trp Thr Ser Asp Cys Val Asp 545 550 555 560

Pro vai Glu Arg Ala Asp Ile Gln Arg Tyr Thr ser Leu Leu Val pro 565 570 575

Pro Cys Met Met Gly Glu His Val Gly Ala Ser Pro Ala His ser Thr 580 585 590

His Arg Ala Thr ser Gln Glu Met Arg Met Ala Met Ala Phe Phe Gly 595 600 605

His Met Gly Val Glu Trp Asn Leu Leu Lys Glu pro Asp Glu Ala Leu 610 615 620

Asn Lys Leu Gly Glu Trp Val Ala Glu Tyr Lys Arg His Arg Ala TrD 625 630 635 640

Phe Ala Ile Asp Thr Cys Val His Ala Asp Ile Ala Asp Pro Ala Val 645 650 655

Arg Val Asp Gly Met Val Lys Pro Asp-Arg Ser Ala Ala Phe Tyr Ara 660 665 670

Phe Thr Gln Leu Thr Thr ser Gln Thr Leu Pro Ala Ala Pro Ile Arg 675 680 685

Val Pro Gly Leu Asp Pro Asp Gly Thr Tyr Arg Ile Gln Pro Leu Trp 690 695 700

Leu Asp Leu Asp Leu Asp Gly Leu Gly Leu Gly ser Gly Gln Ser Pro 705 710 715 720

Leu Gly Trp Trp Thr Lys Asp Gly Val Leu Met Thr Gly Arg Ala Leu 725 730 735

Met Thr Tyr Gly Leu Arg Pro Pro Ser Leu His Pro Ala Gln ser Val 740 745 750

Leu Phe Thr Ala Ile Arg Gln 755

Claims

1. Seqüência de DNA, CARACTERIZADO pelo fato de que a) codifica uma proteína com uma seqüência de ami- noácido como determinado na SEQ. ID. NO: 2, ou b) hibridiza sob condições de hibridização rigoro- sas para a seqüência de a), ou c) é um degenerativo da seqüência de a) ou b).

2. Seqüência de DNA, de acordo com a Reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo fato de que a seqüência é determinada na SEQ. ID NO: 1 ou um fragmento deste.

3. Seqüência de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a refe- rida seqüência compreende substituições, adições ou deleções de nucleotídeo que resultam em menos do que 60%, preferivel- mente menos do que 45%, mais preferivelmente menos do que 25% de mudança na seqüência de aminoácido de acordo com SEQ. ID NO: 2 ou um fragmento deste.

4. Seqüência de DNA, de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, CARACTERIZADA pelo fato de que a refe- rida seqüência compreende substituições de nucleotídeo que resultam em substituições de aminoácido conservadoras.

5. Enzima, CARACTERIZADA pelo fato de ser codifi- cada por uma seqüência de DNA, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4.

6. Enzima, CARACTERIZADA pelo fato de que compre- ende uma seqüência de aminoácido de acordo com SEQ. ID NO: 2 ou um fragmento desta.

7. α-galactosidase, CARACTERIZADA pelo fato de ter a seqüência como definido em SEQ. ID NO: 2.

8. Vetor recombinante, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma seqüência de DNA, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4.

9. Vetor, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido vetor é um vetor de expressão.

10. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende uma seqüência de DNA, de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 a 4.

11. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o vetor, de acordo com a reivindicação 8 ou reivindicação 9.

12. Célula hospedeira, de acordo com a reivindica- ção 10 ou reivindicação 11, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula é uma célula bacteriana, uma célula de leve- dura ou uma célula fúngica.

13. Célula hospedeira, de acordo com a reivindica- ção 12, CARACTERIZADA pelo fato de que a referida célula é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacterium, Lacto- coccus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus e Aspergillus.

14. Célula hospedeira, de acordo com a reivindica- ção 13, CARACTERIZADA pelo fato de que a célula é seleciona- da do grupo que consiste em Bifidobacterium bifidum, Bacil- lus subtilis, Bacillus circulans e Aspergillus niger.

15. Uso de uma enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou uma célula de qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de ser para produzir dissacarideos de α-galactobiose.

16. Uso de uma enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, ou uma célula de qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de ser para produzir dissacarideos de α-galactobiose para ser parte de um produto selecionado do grupo que consiste em produtos di- ários, tal como leite liquido, pó de leite seco, leites de bebê, fórmula de bebê, sorvete, iogurte, queijo, produtos diários fermentados, bebidas tal como suco de fruta, comidas infantis, cereais, pão, biscoitos, confeitarias, bolos, su- plementos de comida, suplementos dietéticos, produtos comes- tíveis pró-bióticos, produtos comestíveis pré-bióticos, ali- mentos de animais, alimentos de aves domésticas e medicamen- tos.

17. Uso de uma célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de ser para produzir um produto selecionado do grupo que consiste em produtos de leiteria, tal como leite líqui- do, pó de leite seco, leites de bebê, fórmula de bebê, sor- vete, iogurte, queijo, produtos diários fermentados, bebidas tal como suco de fruta, comidas infantis, cereais, pão, bis- coitos, confeitarias, bolos, suplementos de comida, suple- mento dietético, produto comestível pró-biótico, produto co- mestível pré-biótico, alimentos de animais, alimentos de a- ves domésticas e medicamentos.

18. Processo para produzir uma enzima, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, CARACTERIZADO pe- lo fato de que compreende cultivar uma célula hospedeira de qualquer uma das Reivindicações 10 a 14 em um meio de cultu- ra adequado sob condições permitindo a expressão da referida enzima e recuperação da enzima resultante da cultura.

19. Processo para produzir um dissacarideo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende contatar uma enzi- ma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7 ou uma célula hospedeira, de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 10 a 14 com uma solução de melibiose.