BRPI0620212A2 - mÉtodo de discriminaÇço e de contagem de pelo menos duas populaÇÕes de elementos biolàgicos portadoras de caracterÍsticas especÍficas, e, utilizaÇço do mÉtodo - Google Patents

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Abstract

MÉTODO DE DISCRIMINAÇçO E DE CONTAGEM DE PELO MENOS DUAS POPULAÇÕES DE ELEMENTOS BIOLàGICOS PORTADORAS DE CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS, E, UTILIZAÇçO DO MÉTODO. A invenção tem como objeto um método de discriminação e de contagem de pelo menos duas populações de elementos biológicos portadoras de características específicas, eventualmente presentes em uma amostra. A invenção permite a detecção sem ambiquidade de pelo menos três populações de elementos biológicos pela utilização de somente dois meios de detecção, o que implica que pelo menos duas populações de elementos biológicos sejam detectadas por um único e mesmo meio de detecção. A invenção pode ser realizada se são utilizadas três sondas diferentes, cada uma delas reconhecendo e se fixando a uma das populações de elementos biológicos a detectar, cada uma das sondas sendo ela própria tornada detectável por um marcador diferente, dois dos ditos marcadores diferentes apresentado dois espectros de emissão que têm pelo menos uma parte comum (espectros de emissão superpostos) e o terceiro aparesentando um espectro de emissão que não tem essencialmente nenhuma parte comum com os dois outros (espectro não superposto).

Description

<Ρ "MÉTODO DE DISCRIMINAÇÃO E DE CONTAGEM DE PELO MENOS DUAS POPULAÇÕES DE ELEMENTOS BIOLÓGICOS PORTADORAS DE CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS, E5 UTILIZAÇÃO DO MÉTODO"
A presente invenção se refere a um método de detecção, de
discriminação e de contagem de elementos biológicos presentes em um líquido, que utiliza os princípios da citometria em fluxo, adaptável aos aparelhos utilizados em rotina em hematologia.
Os analisadores automáticos em hematologia (autômatos de hematologia), presentes no mercado trazem cada vez mais possibilidade de análise e de classificações dos elementos analisados.
A medição de fluorescência, já amplamente difundida em citometria em fluxo, é principalmente utilizada para a classificação dos elementos por imunofenotipagem. Nos autômatos de hematologia utilizados em rotina, ela é sobretudo dedicada à colocação em evidência de corantes supravitais utilizados como sondas moleculares para a quantificação dos ácidos nucléicos ou outros componentes celulares.
A utilização de sondas imunológicas em hematologia de rotina ainda não está generalizada embora alguns ensaios embrionários já tenham sido feitos em diferentes construtores.
Por exemplo, a sociedade BAYER (Bayer Diagnostics, Tarrytown, New York, USA), através do BAYER-TECHNICON H*1 foi a primeira a propor, na tipagem linfocitária, a utilização de coquetéis de anticorpos para a determinação dos diferentes tipos de linfócitos. Nesse caso, a medição das expressões antigênicas era feita não por fluorescência mas sim pela medição de absorvência luminosa gerada por um composto de avidina- peroxidase que apresenta uma grande afinidade para a biotina, ela própria acoplada em um anticorpo. O dito anticorpo é específico dos antígenos alvos das moléculas de superfície específicas dos tipos celulares caracterizados (CD4, CD8, CD2, CD19). O ABBOTT CD400, da sociedade ABBOTT (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois, USA), propõe uma análise que utiliza dois comprimentos de onda de fluorescência para a realização, entre outras coisas, de imunofenotipagens. A patente WO 98/02727 da sociedade Abbott Laboratories descreve uma aparelhagem desse tipo, que permite realizar a marcação com um anticorpo em uma amostra de sangue total. ABBOTT descreve de modo detalhado na patente uma aparelhagem destinada à realização de reações anticorpo-antígeno em uma amostra de sangue total.
Um método de fenotipagem simples, rápido, eficaz e específico deve poder ser utilizado em autômatos muito simples, de tipo autômatos de hematologia, permitindo trabalhar com um número limitado de detectores. Mesmo se as tecnologias são substancialmente as mesmas, os autômatos de rotina utilizados em hematologia apresentam características diferentes dos citômetros em fluxo, notadamente em termo de número de parâmetros de medição que são reduzidos ao estrito necessário, especialmente nas medições de rotina. Além disso, o custo sendo um fator limitante muito importante, a simplificação dos aparelhos e das análises que eles permitem efetuar só pode ir no sentido da economia global.
A citometria em fluxo é uma tecnologia que permite medir simultaneamente múltiplos parâmetros correspondentes a diferentes características físicas de um elemento biológico como por exemplo uma célula ou um organito celular. Os elementos biológicos são arrastados em um fluxo líquido e o aparelho registra o comportamento de cada um deles quando eles passam na cuba de medição diante de uma fonte luminosa.
Essa tecnologia é de fato a combinação de três sistemas:
1) Sistema fluídico: Fluxo laminar que permite que os elementos biológicos em suspensão passem um a uma diante da luz dentro da cuba de medição. 2) Sistema óptico: Raio laser ou outra fonte luminosa e diferentes filtros que permitem selecionar os comprimentos de ondas apropriados tanto em excitação quanto em emissão.
3) Sistema eletrônico: PMT (fotomultiplicador) ou fotodiodo, que capta a luz emitida, permitindo sua transformação em sinal elétrico e
depois em sinal digital.
Em resumo, a fonte luminosa permite gerar uma luz que vai passar através das lentes e iluminar os elementos biológicos que se deslocam dentro de uma cuba de medição. Em contato com o elemento biológico, uma parte da luz é difundida. Essa luz passa através de várias lentes e outros diafragmas e é focalizada em um sensor de tipo fotodiodo para gerar a medição de FSC (Forward Scatter). Essa medição, dentro da gama de ângulos escolhida, dá uma indicação sobre o tamanho do elemento biológico.
Uma outra parte da luz é desviada de modo ortogonal e passa através de um outro conjunto de lentes, e de um jogo de espelhos semi- refletores, para ser medida ao nível de um sensor para gerar o sinal SSC (Side Scatter). Essa mediação de luz ortogonal, dá uma indicação sobre a densidade do elemento biológico assim como sobre sua granularidade (estrutura).
Finalmente, medições da intensidade luminosa podem ser realizadas graças a tantos tubos fotomultiplicadores ou de fotodiodos quanto de comprimentos de onda e de sinais ópticos a analisar.
A passagem dos elementos biológicos em um citômetro necessita previamente uma etapa no decorrer da qual o elemento biológico é tornado detectável, e portanto marcado, por uma sonda, específica de uma estrutura ou de uma função do dito elemento biológico, a dita sonda tendo sido ela própria previamente tornada detectável.
Quando o marcador da sonda é uma molécula fluorescente, essa última pode absorver um fóton em uma gama de comprimento de onda que lhe é específica (espectro de excitação). Assim excitada, a molécula
fluorescente, vai retornar a seu estado fundamental, e restituir um fóton com uma energia menor. Uma molécula fluorescente possui portanto um espectro de comprimentos de onda de excitação que lhe é próprio e no qual ela vai absorver energia para reemití-la sob a forma de fluorescência (fluorescência emitida), de acordo com um espectro de emissão também característico. O comprimento de onda da fluorescência emitida é sempre maior (freqüência menor) do que o comprimento de onda de excitação.
Os sinais de difusão (FSC, SSC) e de fluorescência vão ser transformados em sinais elétricos pelos detectores adaptados, e depois analisados por um sistema informático.
Assim em citometria em fluxo, é comumente associada uma faixa de comprimentos de onda de fluorescência a cada sonda ou coquetel de sondas utilizado(s). Cada sonda é portanto acoplada com um fluorocromo (marcador fluorescente), cujos sinais são medidos em um só canal de fluorescência, que o dito fluorocromo seja inserido em um ou vários tipos de sondas.
A diminuição dos custos poderia passar pela colocação em rotina de parâmetros de imunofenotipagem com um número restrito de canais de medição de fluorescência além dos parâmetros físicos clássicos escolhidos entre a difusão no eixo (Forward Scatter ou FSC), a difusão ortogonal (Side Scatter ou SSC), o volume por medição de impedância, etc.
A possibilidade de somar as respostas de fluorescência permitiria exprimir várias marcações diferentes em um mesmo canal de medição e assim multiplicar as capacidades de análise de um sistema e portanto sua relação preço/desempenho, sem por isso aumentar a complexidade do aparelho por adição de canais de medição.
A dificuldade quando várias sondas são conjugadas ao mesmo fluorocromo, é que a expressão das características biológicas reconhecidas respectivamente pelas diferentes sondas, vai diretamente influenciar a Ao
quantidade de fluorescência total emitida.
Assim, por exemplo, se uma característica biológica está bastante presente (por exemplo um antígeno na superfície de uma célula) a quantidade de sondas marcadas e fixadas, será proporcional à quantidade da dita característica biológica. Em conseqüência disso a quantidade de fluorescência emitida pela dita sonda, ela própria proporcional à quantidade de características biológicas que fixaram a dita sonda marcada, será elevada.
Paralelamente, se uma outra característica biológica da mesma amostra está pouco representada, a quantidade de fluorescência emitida pela sonda correspondente, conjugada ao mesmo fluorocromo, será pequena demais e poderá passar despercebida pois mascarada pela fluorescência da primeira sonda.
Naturalmente, as mesmas dificuldades são encontradas por ocasião da utilização de outros tipos de marcações. Um dos objetivos da presente invenção é precisamente
permitir a detecção nítida e sem ambigüidade de pelo menos três sondas pela utilização de somente dois meios de detecção. Isso implica portanto que pelo menos duas sondas sejam detectadas por um único e mesmo meio de detecção. Isso pode ser realizado se são utilizadas três sondas diferentes, cada uma delas reconhecendo e se fixando a um dos elementos biológicos a detectar ou a uma das características do (ou dos) elemento(s) biológico(s), cada uma das sondas sendo ela própria tornada detectável por um marcador diferente, dois dos ditos marcadores apresentando dois espectros de emissão que têm pelo menos uma parte comum (espectros de emissão superpostos) e o terceiro apresentando um espectro de emissão que não tem essencialmente nenhuma parte comum com os dois outros (espectro não superposto). Os dois (ou n) marcadores que têm um espectro de emissão superposto são medidos por um primeiro meio de detecção, o marcador que tem o espectro de emissão não superposto sendo ele medido por um segundo meio de detecção. Assim, a presente invenção consiste: (1) - em equilibrar as diferenças de expressão antigênica ou de característica celular pelo rendimento de emissão de η sondas acopladas a η marcadores medidos em uma só e mesma faixa de detecção;
(2) - em criar uma relação entre os sinais provenientes do segundo meio de detecção por um lado, e os sinais provenientes do primeiro meio de detecção por outro lado, a fim de utilizá-la como eixo constitutivo de uma matriz;
(3) - em combinar em duas dimensões a relação proveniente do item (2) por um lado, e os sinais provenientes do primeiro meio de detecção por outro lado, com o objetivo de melhorar a representação gráfica, e portanto de melhorar a caracterização e a quantificação dos elementos biológicos de interesse.
Por "elemento biológico" entende-se de acordo com a invenção por exemplo uma célula eucariótica ou procariótica, um grupo de células, um fragmento celular.
Por "característica biológica", entende-se um componente específico do elemento biológico estudado, por exemplo, um componente biológico da célula tal como um organito celular, uma proteína, um lipídio, um glicídio, ou ainda um ácido nucléico (RNA ou DNA).
Por "sonda", de acordo com a invenção entende-se qualquer meio que permite identificar especificamente uma característica biológica ou química presente dentro ou sobre os elementos biológicos estudados. Os ditos meios utilizáveis de acordo com a invenção são perfeitamente conhecidos em especial nos domínios da biologia celular, da biologia molecular, da imunologia e da citometria em fluxo. Podem ser citados sem ser limitativos, os anticorpos, ao ácidos nucléicos (DNA ou RNA), os compostos químicos, especialmente os compostos químicos intercalares, aqueles reativos ao ambiente iônico (H+, Ca+*, etc.), as lectinas, ligantes ou outros corantes de 42
viabilidade celular.
Por "marcador da sonda" entende-se qualquer composto que devido a sua natureza é diretamente detectável seja visualmente, seja com o auxílio de um aparelho adequado, seja detectável depois de excitação. Um tal composto uma vez que ele é acoplado à sonda torna essa última detectável. Podem ser citadas as moléculas fluorescentes que se trate por exemplo de compostos químicos ou de moléculas biológicas com proteínas. Todos esses produtos estão disponíveis no mercado e são propostos pela maior parte dos distribuidores de produtos químicos de laboratório, como por exemplo as sociedades Sigma, Aldrich, Fluka, Riedel de Haen, etc...
É notável que em uma mesma experiência de discriminação de populações de elementos biológicos que utiliza o método de acordo com a invenção, seja possível utilizar sondas de naturezas diferentes (anticorpos conjugados e ácidos nucléicos marcados ou viabilidade celular por exemplo) desde que a detecção das mesmas possa ser realizada de acordo com os critérios definidos de acordo com a invenção (pelo menos dois espectros de emissão superpostos e um espectro não superposto).
Por "meio de detecção", entende-se de acordo com a invenção qualquer meio de detectar, e mesmo de quantificar, o marcador da sonda. O dito meio de detecção é naturalmente característica do método utilizado para tornar a sonda detectável. O dito meio de detecção é em todos os casos, composto pelo conjunto dos componentes físicos capazes de detectar o marcador de uma sonda especial. Por exemplo, se trata-se de um marcador que emite fluorescência, o meio de detecção será o conjunto compostos pelas lentes ópticas de observação da amostra, pelos filtros espaciais (diafragma, "pin hole", etc), pelos filtros espectroscópicos (dicróicos, interferenciais) especialmente dispostos para só deixar passar na direção do sensor a parte do espectro dita "faixa de detecção" específica do ou dos marcadores a medir e do próprio sensor optoeletrônico (fotodiodo, tubo fotomultiplicador...). Esse sensor será em seguida conectado eletronicamente à cadeia de aquisição eletrônica que realizará o tratamento do sinal em analógico e/ou digital e finalmente o tratamento informático dos dados via um computador.
Pode também se tratar por exemplo de um detector de fluorescência se a sonda é marcada com o auxílio de um marcador fluorescente ou se a sonda é ela própria fluorescente, ou ainda de um espectrômetro se a sonda é um marcador que absorve luz de excitação em uma parte específica do espectro cromático.
Por "espectro de emissão" entende-se de acordo com a invenção a repartição da intensidade de fluorescência em função do comprimento de onda em uma faixa característica do marcador ou de própria sonda. Geralmente um tal espectro apresenta um pico de intensidade que corresponde ao máximo de emissão. A detecção poderá ser feita em uma faixa compreendida entre dois comprimentos de ondas, que enquadra geralmente um comprimento de onda intermediário dado que corresponde ao pico de fluorescência máxima emitida (pico de detecção máxima).
Por "faixa de detecção" entende-se uma gama de comprimentos de onda escolhida no espectro de emissão do ou dos marcadores considerados (Por exemplo, se trata-se de um marcador que emite fluorescência, a faixa de detecção será uma faixa escolhida de preferência em torno do pico máximo de emissão de fluorescência). Essa faixa de detecção é definida pela filtragem espectral incorporada no meio de detecção, por intermédio de pelo menos um filtro interferencial ou passa-faixa eventualmente colocado atrás de um ou vários espelhos dicróicos.
Por "espectros de emissão superpostos", entende-se que, em um mesmo meio de detecção, para dois marcadores diferentes, seus espectros de emissão apresentam uma zona comum. Por exemplo se trata-se de dois marcadores que emitem fluorescência, seus espectros de emissão serão ditos espectros de emissão superpostos quando eles apresentarão uma faixa de emissão comum compreendida entre dois comprimentos de onda comuns a seus dois espectros de emissão. Geralmente tais espectros apresentam picos de emissão máxima distintos.
Por "espectro de emissão essencialmente não superposto", entende-se que para três marcadores diferentes dos quais dois apresentam espectros de emissão superpostos, o terceiro apresenta um espectro de emissão que não tem nenhuma zona de recobrimento significativa com nenhum dos espectros dos dois outros marcadores.
Com a leitura do que precede compreende-se portanto que se são utilizadas três sondas que reconhecem três características biológicas diferentes, marcadas de três marcadores que têm cada um deles um espectro de emissão diferente, mas dos quais dois são superpostos e um não superposto, o método só utiliza dois meios de detecção na medida em que os marcadores com espectros superpostos têm uma faixa de detecção comum.
É isso que faz a grande originalidade do método objeto da invenção em relação aos métodos conhecidos na arte anterior que para detectar três características biológica sutilizam três sondas que apresentam três espectros de emissão independentes que são analisados por três meios de detecção diferentes.
Para os marcadores superpostos, a escolha cuidadosa dos marcadores em seu aspecto detecção, levará a escolher dois marcadores que podem responder, um mais eficazmente do que o outro, na mesma faixa de detecção.
De acordo com uma variante da invenção o rendimento de emissão na faixa de detecção poderá ser escolhido para ser inversamente proporcional à expressão das características biológicas consideradas. A escolha da faixa de detecção será também determinada em função dessa expressão para não mascarar uma expressão positiva pequena (é a primeira fase de equilíbrio da invenção). Assim, por exemplo, para um antígeno pouco expresso será escolhido um marcador que apresenta um rendimento de emissão elevado na faixa de detecção escolhida e para um antígeno muito expresso será escolhido um marcador que apresenta um rendimento de emissão pouco elevado na mesma faixa de detecção. Isso permite controlar as quantidades de marcadores medidos a fim de equilibrar as emissões em proporção inversa do nível de expressão dos antígenos ou sonda considerados.
O método de acordo com a invenção permite discriminar e contra elementos biológicos de modo simples, rápido, eficaz. Ele permite por outro lado utilizar aparelhos simples, o que tem como conseqüência uma diminuição dos custos tanto de fabricação quando de utilização e de manutenção. Além disso a análise automatizada é facilitada.
Assim a invenção tem como objeto um método de discriminação de pelo menos duas populações de elementos biológicos portadoras de características específicas, eventualmente presentes em uma amostra, que compreende
- a marcação simultânea das ditas populações de elementos biológicos por três sondas diferentes, detectáveis ou tornadas detectáveis por três marcadores diferentes, dos quais dois dos ditos marcadores (marcadores
superpostos ou MC) apresentam cada um deles um espectro de emissão, os ditos espectros de emissão se recobrindo e o terceiro (marcador não superposto ou MnC) apresenta um espectro de emissão que não recobre essencialmente os espectros dos dois outros marcadores (espectro de emissão não superposto);
- a medição por qualquer meio apropriado, da quantidade total
de marcador não superposto (qMnC), em uma faixa de detecção escolhida no espectro de emissão do dito marcador não superposto;
- a medição por qualquer meio apropriado, da quantidade total de marcador superposto (qMC) em uma faixa de detecção comum aos ilJ
espectros de emissão dos ditos marcadores superpostos,
- o estabelecimento para cada elemento biológico analisado, da relação (R) da quantidade total de marcador não superposto em relação à quantidade total de marcador superposto [R = (qMnC)/(qMC)]
- o estabelecimento por qualquer meio de um diagrama que
apresenta a relação (R) em função da quantidade de elementos biológicos marcados pelos marcadores superpostos [R = f(qMC)] e/ou
- a quantificação por qualquer meio apropriado, geralmente um computador, dos elementos biológicos identificados no ou nos ditos
diagramas e dos dados estatísticos correspondentes.
O método de acordo com a invenção é um método que permite a discriminação e a contagem de elementos biológicos que respondem positivamente ou não a um critério dado. O método não tem como objetivo quantificar o número de sondas fixadas pelo elemento biológico. O método permite colocar em evidência sem ambigüidade, em uma amostra, especialmente uma amostra biológica, populações de elementos biológicos que apresentam a (ou as) característica(s) procurada(s).
De acordo com a última etapa do método de acordo com a invenção, a análise de uma matriz bi-paramétrica de ordenada R e de abscissa qMC permite melhorar a representação gráfica, e portanto melhorar a caracterização e a quantificação dos elementos biológicos de interesse.
De acordo com a invenção, a amostra pode ser uma amostra biológica natural, especialmente uma amostra biológica natural líquida. Ela pode também ser uma suspensão celular não natural, como por exemplo um meio de cultura. É possível citar sem ser limitativo, como líquido biológico natural o sangue, a urina, um tecido dissociado, uma medula óssea, o líquido cefalorraquidiano, líquido pleural ou líquido sinovial, o produto que resulta de um processo de aférese ou como suspensão celular sintética, um meio de cultura de células ou de microorganismos. De acordo com a invenção os elementos biológicos contidos na amostra podem ser células, eucarióticas ou procarióticas, ou uma mistura das duas, ou fragmentos das ditas células, organitos. As sondas utilizáveis de acordo com o método da invenção podem ser, idênticas ou diferentes, anticorpos, ácidos nucléicos (DNA ou RNA), ou ainda qualquer sonda molecular como por exemplo corantes que reconhecem especificamente ácidos nucléicos, os substratos enzimáticos ou ainda marcadores específicos de proteínas, ligantes de receptores, moléculas sensíveis ao ambiente iônico (sondas de pH, Ca44", etc.) ou qualquer outra molécula específica da característica biológica a ser marcada.
Quando as sondas são anticorpos, esses últimos podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais, naturais ou recombinantes, humanos ou animais.
As sondas, se eles não são detectáveis naturalmente, deverão, para ser detectáveis, ser conjugadas a um marcador que pode ser reconhecido pelo meio de detecção, na faixa de detecção escolhida.
De acordo com a invenção, os marcadores que servem para tornar detectável a sonda, podem ser compostos químicos detectáveis próprios para ser enxertados nas sondas, marcadores intercalares ou não dos ácidos nucléicos, ou ainda marcadores específicos de proteínas ou de qualquer outra molécula específica da característica biológica a ser marcada. Com relação a isso podem ser citados corantes fluorescentes ou ainda absorventes tal como: o Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, a aloficocianina, o ácido acético aminometilcoumarina, o Cy 2®, Cy 5.1®, Cy 5®, Cy 5.5®, a diclorofluoresceína (DCFH), a diidrorodamina (DHR), "o enhanced GFP" (EGFP), o Fluo-3, o FluorX®, a fluoresceína, a 5-maleimida fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), o PerCP, a r-Ficoeritrina (PE), a dupla r- Ficoeritrina-Cianina 5 ou SpectralRed® ou CyChrome®, a r-Ficoeritrina- Cianina 5.5 (PE-CY 5.5®), a r-Ficoeritrina-Cianina 7 (PE-CY 7®), a r- Ficoeritrina-Texas Red-x®, o Red 613®, a Rodamina 110, a Rodamina 123, o S65L, o S65T, o Isotiocianato de tetrametilerodamina, o Texas Red-x®, o TruRed®, o indo 1, os nano cristais (Quantum Dots), o Fura 2, o Fura 3, o quin, o DS Red assim como os marcadores específicos notadamente dos ácidos nucléicos (que eles estejam sob a forma de DNA ou de RNA), como por exemplo intercalares ou outros corantes de viabilidade celular tais como o brometo de etídio ou ainda o triazol laranja, o tiazol azul e seus derivados, a tioflavina S, a tioflavina T, a tioflavina TCN®, a dietil-quinolitocianina iódide (DEQTC), o TOTO-1®, o TO-PRO-1®, ou ainda o YOYO-1®, o Hoechst® 33258, o Hoechst® 33342, o Hoechst® 34580, o diamidino fenilindol (DAPI), o iodeto de propídio, a pironina Y, a 7-Aminoactinomicina D (7AAD), a acridina laranja, a auramina O, a calceína, o New Methylene Blue, o olamin- O, a Oxazina 750, o azul astra, o SYTOX® Green, o SYTO 11®, o SYTO 12®, o SYTO 13®, o SYTO 16®, o SYTO 18®, o SYTO 80®, o SYTO 81® ....
Em uma forma especial de realização da invenção, quando características celulares, por exemplo antígenos, são reconhecidas por sondas tornadas detectáveis por marcadores superpostos, é possível escolher uma primeira característica celular dita genérica, quer dizer presente e característica de todos os elementos biológicos considerados. A expressão dessa característica celular sendo normalmente elevada nos elementos biológicos, o marcador que será enxertado na sonda que o reconhece poderá ser aquele que responderá mais fracamente na faixa de detecção comum aos dois marcadores superpostos (MC). Uma tal sonda permite verificar que há mesmo um interesse nas populações celulares certas.
A segunda característica celular reconhecida por uma sonda tornada detectável pelo outro marcador superposto, poderá ser uma característica celular menos expressa em uma população somente dos elementos biológicos estudados. O marcador que será enxertado na dita sonda deverá ser um marcador que responderá mais fortemente na faixa de detecção comum aos dois marcadores superpostos (MC).
À terceira característica celular estudada, corresponde uma sonda marcada por um terceiro marcador que, ele, é um não superposto (MnC) e que será detectado em uma segunda faixa de detecção, diferente da primeira.
O 'método de acordo com a invenção pode ser executado em qualquer aparelho que permite a detecção dos marcadores. Será citada com relação a isso a título de exemplo a detecção de fluorescência que ela seja emitida por um corante conjugado a uma sonda molecular tal como um anticorpo ou diretamente por um corante supravital fluorescente tal como um corante intercalar ou não, específico dos ácidos nucléicos, ou ainda a detecção de absorvência ou de difusão luminosa notadamente a uma gama de comprimentos de onda definida do espectro, que essas medições sejam feitas por extinção ou difusão da gama de comprimentos de onda ou por espectrometria de uma faixa escolhida do ultravioleta ao infravermelho. Essa absorvência podendo ser aquela gerada ou por um corante conjugado a uma sonda molecular tal como um anticorpo ou diretamente por um corante supravital tal como um corante intercalar ou não, específico dos ácidos nucléicos.
A invenção também tem como objeto a utilização do método descrito precedentemente para discriminar pelo menos duas populações celulares portadoras de características específicas e eventualmente presentes em uma amostra. Uma aplicação do método pode ser considerada no diagnostico médico, como por exemplo no domínio das leucemias linfóides crônicas (LLC) e das leucemias agudas (LA) com o auxílio de anticorpos anti- CD45, anti-CD19 e anti-CD5;no domínio da detecção da doença residual (Minimum Residual Disease, MRD) e da diferenciação leucocitária com o auxílio de anticorpos anti-CD45, anti-CD16 e anti-CDllb; no domínio dos progenitores hematopoiéticos com o auxílio de anticorpos anti-CD45, anti- CD34, anti-CD33 e 7-AAD ou DAPI ou qualquer outro marcador de viabilidade; no domínio da inflamação e da ativação celular como auxílio de anticorpos anti-CD45, anti-CD64 e anti-CD163; no domínio da detecção ou do acompanhamento de infecção com o vírus HIV com o auxílio de anticorpos anti-CD45, anti-CD8 ou anti-CD4 e anti-CD3; no domínio da Leucemia Aguda Linfoblástica de tipo b (LALb) da criança; no domínio da observação da medula óssea com o auxílio de anticorpos anti-CD45, anti- CD19 e anti-CDIO ou ainda no domínio da diferenciação dos precursores dos linfócitos B (hematógenos) com o auxílio de anticorpos anti-CD19, anti- CDIO e anti-CD38. Essas descrições não sendo nem exaustivas nem limitativas visto que elas estão no estado atual dos conhecimentos medicais.
Outras características da invenção aparecerão com a leitura das figuras e dos exemplos que se seguem e que só são dados a título ilustrativo sem limitação da invenção.
Assim a Figura 1 é uma representação esquemática de fenótipos de elementos biológicos na qual AeB são marcadores superpostos e C é um marcador não superposto, que correspondem respectivamente a sondas (SA, SB e SC), tornadas detectáveis que reconhecem características especiais (CPA, CPB e CPC) dos elementos biológicos considerados.
Aparte Ia mostra uma representação gráfica clássica em citometria em fluxo da fluorescência de A+B (qMC) em função da fluorescência de C (qMnC).
A parte IB mostra uma representação gráfica obtida de acordo com a invenção em citometria em fluxo da relação da fluorescência de C (qMnC) relacionada à fluorescência total de A+B (qMC)[qMnC/qMC] em função da fluorescência total de A+B (qMC)[qMnC/qMC = f(qMC)].
A execução da invenção permite uma distinção em um mesmo eixo de fluorescência (o eixo das abscissas) entre os elementos biológicos que exprimem (A+B+) de uma primeira parte, (A-B-) de uma segunda parte, e (A+B-) ou (A-B+) de uma terceira parte.
A Figura 2 apresenta o método de acordo com a invenção aplicado na análise dos leucócitos sangüíneos em uma amostra de sangue normal (2a) e em uma amostra de sangue de paciente afetado por leucemia aguda (2b) depois de marcação com um anticorpo anti-CD45 acoplado à r- ficoeritrina (PE), um anticorpo anti-CD5 acoplado à ficoeritrina-cianina 5 (PC5) e um anticorpo anti-CD19 acoplado à FITC. A expressão do CD45 sozinho permite identificar os blastos presentes nessa patologia.
A Figura 3 representa amostras de sangue normal e de sangue de doente afetado por leucemia linfóide crônica (A2 e B2). As figuras 3A1 e 3A2 apresentam os resultados da análise por citometria em fluxo, as Figuras 3B1 e 3B2 apresentam os mesmos resultados depois de aplicação do método de acordo com a invenção.
A Figura 4 apresenta o método de acordo com a invenção aplicado para a análise dos linfócitos T sangüíneos depois de marcação com um anticorpo anti-CD45 acoplado à PE, um anticorpo anti-CD3 acoplado à PC5 e um anticorpo anti-CD8 acoplado à FITC. A Figura 3A apresenta os resultados da análise por citometria em fluxo, a Figura 3B apresenta os mesmos resultados depois de aplicação do método de acordo com a invenção.
Exemplo 1:
As patologias mais freqüentes em onco-hematologia são os diferentes tipos de leucemias agudas (LA) e as hemopatias linfóides B entre as quais a leucemia linfóide crônica (LLC) apresenta uma incidência em constante progressão (30/106).
A leucemia aguda (LA) pode ser caracterizada por uma invasão medular por proliferação de células hematopoiéticas malignas.
A leucemia linfóide crônica (LLC) pode, ela, ser caracterizada por uma proliferação de células linfocitárias monoclonais, células linfóides da linhagem B atípicas.
Os blastos leucêmicos das LA são caracterizados por uma expressão moderada do CD45 comparada com aquela dos linfócitos e monócitos normais do sangue.
Os linfócitos anormais da LLC de tipo B são caracterizados pela co-expressão aberrante dos antígenos CD5 e CD19 na mesma célula enquanto que os linfócitos normais exprimem ou o CD5 (linfócitos da linhagem T) ou o CD19 (linfócitos da linhagem B).
Os fenótipos dessas células podem ser resumidos na tabela
abaixo:
Antígenos CD19 CD45 CD5 Linfócitos T normais -H- ++ Linfócitos B normais + -H- Blastos de LA +/- Linfócitos de B de LLC + -H- +
Até agora, a análise e a identificação dessas diferentes populações em uma amostra sangüínea por citometria em fluxo necessitam o emprego de três anticorpos diferentes dirigidos contra os três antígenos CD5, CD19 e CD45 e da difusão ortogonal SSC. Para essa análise, cada anticorpo é acoplado a um fluorocromo diferente e cada expressão é medida a um comprimento de onda diferente com o auxílio de fotomultiplicadores diferentes.
A aplicação do método de acordo com a invenção permite propor um sistema de marcação e de análise por citometria que permite propor um sistema de marcação e de análise por citometria que permite detectar e quantificar em uma mesma amostra de sangue e por ocasião de uma mesma medição, a presença eventual de células leucêmicas com o auxílio de dois fotomultiplicadores somente e da difusão ortogonal SSC. 13
Em um citômetro em fluxo, a filtragem óptica dos sinais luminosos é otimizada para um fluorocromo dado de modo a medir sua fluorescência em uma faixa de comprimentos de onda centrada em seu máximo de emissão: a fluoresceína (FITC) é geralmente analisada a 525 nm, a r-ficoeritrina (PE) a 575 nm e a dupla r-ficoeritrina-cianina 5 (PC5) a 675 nm, isso para larguras de faixas de cerca de 30 nm.
Os espectros de emissão de PE e de PC5 são superpostos. Eles têm por exemplo em comum o comprimento de onda 675 nm no qual a PE tem um rendimento de fluorescência muito menor do que o PC5. Uma das originalidades do método de acordo com a invenção reside na medição da fluorescência de um dos fluorocromos (PE) a um comprimento de onda diferente daquele de seu máximo de emissão, aqui a medição de PE a 675 nm.
Assim, nesse comprimento de onda, se torna possível, agindo- se sobre eficácias diferentes do sistema de medição em relação a dois fluorocromos escolhidos com essa finalidade, compensar grandes diferenças na expressão dos antígenos analisados.
Esse princípio é aplicado na análise dos leucócitos sangüíneos depois de marcação com um anticorpo anti-CD45 acoplado à PE (Xmax = 575 nm), um anticorpo anti-CD5 acoplado à PC5 (Xmax = 675 nm) e um anticorpo anti-CD19 acoplado à FITC (Xmax = 525 nm).
Essas marcações são analisadas em uma primeira faixa de detecção centrada a 675 nm que é o comprimento de onda de emissão máxima de PC5. O espectro da PE recobre aquele de PC5. A análise a 675 nm determinará portanto a quantidade total de fluorescência emitida por PC5 e PE (qMC).
Por outro lado, analisa-se a quantidade de fluorescência emitida pelo anticorpo CD19 acoplado à FITC a 525 nm (qMnC).
Os polinucleares e os monócitos são excluídos da análise por abertura de janela em suas propriedades de difusão luminosa. Protocolo: 1) Em uma amostra de sangue total periférico, retira-se uma alíquota de sangue de alguns microlitros (5 a 50) que é misturada com uma alíquota de alguns microlitros (3 a 50) da solução dos três anticorpos
conjugados descritos acima.
2) A mistura é colocada em incubação em temperatura ambiente ou em temperatura regulada, protegida da luz, durante um período de alguns minutos (1 a 30).
3) Depois do período de incubação, a mistura é adicionada de um reagente de Iise dos glóbulos vermelhos, para obter uma solução final de
sangue a uma concentração específica desejada (1/40, 1/80,1/100, etc...).
4) A solução de sangue submetido a uma Iise assim obtida é deixada a incubar durante alguns segundos dependentemente do reagente de Iise e da temperatura de incubação (tipicamente 15 a 30 segundos).
5) E depois a solução é injetada em um conjunto de medição
do tipo citômetro em fluxo para medir em cada célula que atravessa um feixe óptico (na maior parte das vezes um laser 488 nm para os cortantes especificados), os parâmetros de difusão no eixo FSC, difusão ortogonal SSC, fluorescência verde a 525 nm (FLl) e fluorescência vermelha a 675 nm (FL2). As etapas 3 a 5 podem ser realizadas automaticamente em um aparelho semi-automático de citometria em fluxo ou um autômato de hematologia especialmente projetado e as etapas 1 a 5 podem ser automatizadas em um aparelho automático de citometria em fluxo especialmente projetado.
A análise da fluorescência a 675 nm (FLl) em função da difusão ortogonal SSC (ver a Figura 2A) permite discriminar:
• uma população muito pouco fluorescente que corresponde aos blastos da LA que exprimem pouco o CD45,
• um população de fluorescência intermediária que corresponde aos linfócitos que exprimem o CD45 mas que não exprimem o 25
CD45 (linfócitos B e células NK) e
• uma população bastante fluorescente que corresponde aos linfócitos que exprimem ainda por cima o CD45 (linfócitos T e células de LLC).
Nessa última população, a análise da fluorescência a 525 nm
permite identificar as células de LLC que exprimem também o CD19.
A aplicação do método de acordo com a invenção permite discriminar os linfócitos não Ts os linfócitos T e as células de LLC levando para isso em consideração, para cada células, a relação da fluorescência a 525 nm sobre a fluorescência a 675 nm (qMnC/qMC). Essa relação é expressa de acordo com a tabela de verdade abaixo:
CD19 CD45 CO5 Relação CD19/CD45+CD5 (qMnc/qMC) - ++ ++ - + ++ - ++ + ++ + +/-
O histograma de distribuição obtido de acordo com a invenção [(qMnC) / (qMC) = f(qMnC)] (ver a Figura 2C) permite identificar, separar e quantificar três populações bastante distintas separadas.
«Os linfócitos T normais (L.T.) não fluorescem a 525 nm mas
fluorescem muito a 675 nm, eles apresentam portanto uma relação muito pequena.
• Os linfócitos B normais (L.B.) fluorescem a 625 nm com uma fluorescência intermediária a 675 nm, eles têm portanto uma relação
grande.
• As células de LLC exprimem ao mesmo tempo o CD5, o CD45 e o CD 19, fluorescem a 525 nm e a 675 nm e sua relação é portanto intermediária (Figura 2).
• As células NK que não exprimem nem o CD5 nem o CD 19
são excluídas da análise com base em sua fluorescência a 675 nm (CD45 +, «L3
CD5- e CD19-).
Assim a partir de uma amostra de sangue, depois de marcação por três anticorpos fluorescentes e Iise das hemácias é possível, em uma só análise, discriminar e contar os linfócitos T, os linfócitos B5 e as células NK pela medição em dois comprimentos de onda de fluorescências somente.
A aplicação do método de acordo com a invenção permite discriminar os linfócitos T e as células LLC (figura 2b) que aparecem sob a forma de uma só nuvem no diagrama obtido de acordo com uma análise convencional (figura 2A). O mesmo acontece para os linfócitos B e as células NK.
Além disso, a presença eventual de blastos de leucemia aguda ou de células de leucemia linfóide crônica pode ser detectada e essas células podem ser enumeradas.
A utilização do método de acordo com a invenção pode se aplicar para o diagnostico e para o acompanhamento das patologias linfóides crônicas B, das leucemias agudas, e para o acompanhamento da doença residual no decorrer do tratamento.
Exemplo 2:
O método de acordo com a invenção pode também ser aplicado para a análise dos linfócitos T sangüíneos depois de marcação com um anti-CD45 acoplado à PE, um anti-CD3 acoplado à PC5 e a um anti-CD8 acoplado à FITC (Figura 3).
1) Em uma amostra de sangue total periférico, retira-se uma alíquota de sangue de alguns microlitros (5 a 50) que é misturada com uma
alíquota de alguns microlitros (3 a 50) da solução dos três anticorpos conjugados descritos acima.
2) A mistura é colocada em incubação em temperatura ambiente ou em temperatura regulada, protegida da luz, durante um período de alguns minutos (1 a 30). 3) Depois do período de incubação, a mistura é adicionada de um reagente de Iise dos glóbulos vermelhos, para obter uma solução fmal de sangue a uma concentração específica desejada (1/40,1/80, 1/100, etc...).
4) A solução de sangue assim obtida é deixada a incubar durante alguns segundos dependentemente do reagente de Iise e da
temperatura de incubação (tipicamente 15 a 30 segundos).
5) E depois a solução é injetada em um conjunto de medição do tipo citômetro em fluxo para medir em cada célula que atravessa um feixe óptico (na maior parte das vezes um laser 488 nm para os cortantes
especificados), os parâmetros de difusão no eixo FSC, difusão lateral SSC, fluorescência verde a 525 nm (FLl) e fluorescência vermelha a 675 nm (FL2).
As etapas 3 a 5 podem ser realizadas automaticamente em um aparelho semi-automático de citometria em fluxo ou um autômato de hematologia especialmente projetado e as etapas 1 a 5 podem ser automatizadas em um aparelho automático de citometria em fluxo especialmente projetado.
As marcações com a PE e com a PC5 são analisadas a 675 nm (qMC). A marcação com a FITC é analisada a 525 nm (qMnC). Os polinucleares e os monócitos são excluídos da análise por
suas propriedades de difusão ortogonal SSC.
O diagrama obtido de acordo com os métodos clássicos (Figura 3A) da fluorescência a 675 nm em função da difusão ortogonal SSC permite colocar em evidência uma nuvem que representa as populações mediamente fluorescentes de linfócitos que exprimem o CD45 mas que não exprimem o CD3 (linfócitos B e células NK) e uma população bastante fluorescente que corresponde aos linfócitos que exprimem ainda por cima o
CD3 (linfócitos T).
A aplicação do método de acordo com a invenção permite
0.1 perfeitamente discriminar as diferentes populações (Figura 3B).
Em especial isso permite identificar, na população bastante fluorescente que corresponde aos linfócitos que exprimem ainda por cima o CD3, os linfócitos CD8+.
Os linfócitos T CD4+ não fluorescem a 525 nm mas fluorescem muito a 675 nm e só apresentam uma relação 525/675 muito pequena.
Os linfócitos T CD8+ fluorescem a 525 nm e a 675 nm, eles têm portanto uma relação maior.
As células NK e as células B que não exprimem o CD3 são identificadas com base em sua fluorescência moderada a 675 nm (Não T).

Claims (9)

1. Método de discriminação e de contagem de pelo menos duas populações de elementos biológicos portadoras de características específicas, eventualmente presentes em uma amostra, caracterizado pelo fato de que ele compreende - a marcação simultânea das ditas populações de elementos biológicos por três sondas diferentes, detectáveis ou tornadas detectáveis por três marcadores diferentes, dos quais dois dos ditos marcadores (marcadores superpostos ou MC) apresentam cada um deles um espectro de emissão, os ditos espectros de emissão se recobrindo e o terceiro (marcador não superposto ou MnC) apresenta um espectro de emissão que não recobre os espectros dos dois outros marcadores (espectro de emissão não superposto); - a medição por qualquer meio apropriado, da quantidade total de marcador não superposto (qMnC), em uma faixa de detecção escolhida no espectro de emissão do dito marcador não superposto; - a medição por qualquer meio apropriado, da quantidade total de marcadores superpostos (qMC) em uma faixa de detecção comum aos espectros de emissão dos ditos marcadores superpostos, - o estabelecimento da relação (R) da quantidade total de marcadores não superpostos com a quantidade total de marcadores superpostos [R = (qMnC)/(qMC)]; - o estabelecimento por qualquer meio de um diagrama que apresenta a relação (R) em função da quantidade total de elementos biológicos marcados pelo marcador superposto [R = f(qMC)] e/ou - a quantificação por qualquer meio das populações dos elementos biológicos presentes no dito diagrama.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o líquido biológico natural é sangue, urina, um tecido dissociado, medula óssea, líquido cefalorraquidiano, líquido pleural, líquido sinovial, produto que resulta de um processo de aférese.
3. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os elementos biológicos eventualmente presentes no líquido são células eucarióticas ou células procarióticas, ou uma mistura das duas, ou fragmentos das ditas células.
4. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as sondas, idênticas ou diferentes, são anticorpos ou ácidos nucléicos (DNA ou RNA) ou corantes específicos dos ácidos nucléicos ou substratos enzimáticos ou ainda marcadores específicos de proteínas, ligantes de receptores, marcadores sensíveis ao ambiente iônico ou qualquer outra molécula característica do elemento biológico a ser marcado.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os anticorpos são anticorpos monoclonais ou policlonais, naturais ou recombinantes, humanos ou animais.
6. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que os marcadores que servem para tornar detectável a sonda, são marcadores, intercalares ou não, dos ácidos nucléicos, ou ainda marcadores específicos de proteínas ou de qualquer outra molécula característica do elemento biológico a ser marcado.
7. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que os marcadores são marcadores fluorescentes ou não.
8. Método de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o marcador é escolhido entre o Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, a aloficocianina, o ácido acético aminometilcoumarina, o Cy 2®, Cy 5.1®, Cy 5®, Cy 5.5®, a diclorofluoresceína (DCFH), a diidrorodamina (DHR), "o enhanced GFP" (EGFP)s o Fluo-3, ο FluorX®, a fluoresceína, a 5-maleimida fluoresceína, o isotiocianato de fluoresceína (FITC), o PerCP, a r-Ficoeritrina (PE)5 a dupla r- Ficoeritrina-Cianina 5 ou SpectralRed® ou CyChrome®, a r-Ficoeritrina- Cianina 5.5 (PE-CY 5.5®), a r-Ficoeritrina-Cianina 7 (PE-CY 7®), a r- Ficoeritrina-Texas Red-x®, o Red 613®, a Rodamina 110, a Rodamina 123, o S65L, o S65T, o Isotiocianato de tetrametilerodamina, o Texas Red-x®, o TruRed®, o indo 1, os nano cristais (Quantum Dots), o Fura 2, o Fura 3, o quin, o DS Red, compostos intercalares tal como o brometo de etídio ou ainda o triazol laranja, o tiazol azul, a tioflavina S, a tioflavina T, a tioflavina TCN®, a dietil-quinolitocianina iódide (DEQTC), o TOTO-1®, o TO-PRO-1®, ou ainda o YOYO-1®, o Hoechst® 33258, o Hoechst® 33342, o Hoechst® 34580, o diamidino fenilindol (DAPI)5 o iodeto de propídio, a pironina Y, a 7- Aminoactinomicina D (7AAD), a acridina laranja, a auramina O, a calceína, o New Methylene Blue, o olamin-O, a Oxazina 750, o azul astra, o SYTOX® Green, o SYTO 11®, o SYTO 12®, o SYTO 13®, o SYTO 16®, o SYTO 18®, o SYTO 80®, o SYTO 81®.
9. Utilização do método de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é para discriminar pelo menos duas populações de elementos biológicos portadoras de características específicas e eventualmente presentes em uma amostra.
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