JPH04337459A - 尿中の細胞分析用試薬及び方法 - Google Patents

尿中の細胞分析用試薬及び方法

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JPH04337459A
JPH04337459A JP3109267A JP10926791A JPH04337459A JP H04337459 A JPH04337459 A JP H04337459A JP 3109267 A JP3109267 A JP 3109267A JP 10926791 A JP10926791 A JP 10926791A JP H04337459 A JPH04337459 A JP H04337459A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はフローサイトメトリーを
応用した尿中の細胞の光学的分析方法に関するものであ
り、より詳しくは試薬を用いて尿検体のｐＨ、浸透圧の
高低に関係なく測定試料のｐＨ、浸透圧を一定に保つこ
とにより、安定した蛍光信号波形を得られる染料を用い
て尿中の細胞を検出し、分類する尿中の細胞分析方法に
関するものである。
【０００２】
【従来の技術】尿中の細胞を検出することは、腎・尿路
系の感染症、炎症性病変、変性病変、結石症、腫瘍など
さまざまな疾患の情報を知ることができるのであらゆる
診療施設あるいは検査所でも実施されている基本的かつ
重要な検査である。
【０００３】尿中の含有物を検査することはかなり以前
から煩雑に行われ、今なお重要な検査でもある。例えば
、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱などの存在により腎
障害をスクリーニング検査することができる。赤血球の
測定は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血
の有無を判定する上で重要であり、白血球の出現は、腎
孟腎炎などの腎疾患の疑いが考えられ、炎症、感染症の
早期発見に重要である。また、円柱や赤血球形態を調べ
ることによりそれらの由来部位、すなわち異常部位の推
定も可能である。
【０００４】従来技術として、 ａ）．顕微鏡による目視検査。
【０００５】ｂ）．フラットシースフローと画像処理技
術の組み合わせによる自動測定装置。（特開昭５７−５
００９９５号あるいは米国特許第４，３３８，０２４号
など）があった。
【０００６】ａ）は尿を遠心分離し、その沈渣物のスラ
イド標本を作成し、顕微鏡下で有形成分の観察及び分類
・計数を行うものである。
【０００７】ａ）では遠心分離や染色などの前処理の手
間がかかったり、また、遠心分離工程において細胞など
が破壊されたり、濃縮程度にばらつきが生じたりするな
どの問題があった。実際の顕微鏡観察においては検査技
師に大きな負担をかけることになり、しかも観察できる
細胞数も少なく分類・計数結果も精度が低かった。検査
の自動化が要望されていた。
【０００８】ｂ）で示した公報にはシース液を外層とし
、極めて扁平な流れにされた尿試料液をビデオカメラで
撮像し、この静止画像を画像処理することにより、試料
液中の有形成分の像を切り出して表示する装置が開示さ
れている。
【０００９】尿沈渣において存在頻度は低いものの、そ
の存在を発見することが重要なものとして例えば円柱が
ある。円柱は通常１ｍｌ当たり数十個しか含まれていな
い。よって、全体としての検出数が少ないとその重要な
成分が発見できないという問題がある。このことはａ）
、ｂ）とも言えることである。さらに、ｂ）の場合、画
像処理によるため装置自体が非常に高価である、処理速
度が遅いという問題もある。また、自動化されていると
いっても、撮像された成分をその大きさにより単に粗分
類して画像表示するだけであり、分類処理はその表示を
みながら人間が行っていた。成分を自動分類、計数する
までには到っていないのが現状である。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法は、尿検体
の遠心、濃縮等の前処理および染色後の目視算定に多大
の時間と労力を要するうえ、長時間の尿検体の保存が困
難なこともあって検体数の多い場合には不適当なもので
ある。
【００１１】また、現在のところ標準法が制定されてい
ないため、各施設間での検査結果が統一されていない。
【００１２】さらに従来の方法では、目視する尿中の細
胞数が少ないため、精度が悪くなるうえ、その判定には
熟練を要する。
【００１３】すなわち、迅速で精度が良くかつ定量的な
、尿中の細胞測定方法を確立し、この方法に使用する試
薬を提供することが本発明の解決しようとする課題であ
る。
【００１４】
【課題を解決するための手段】本発明は、従来の方法の
上記欠点を解決し、尿中の細胞をフローサイトメトリー
法により自動的に迅速かつ高精度に測定し、尿中の細胞
の分類をも含めて分析を行うための試薬および方法に関
する。
【００１５】より詳しくは、本発明は、充分量の蛍光染
料と光学的測定に際し蛍光強度を安定させるための緩衝
剤および浸透圧補償剤とを含有する試薬、ならびに該試
薬を用いることにより、尿を希釈するとともに尿中の細
胞の核酸を鮮烈かつ強固に蛍光染色し、フローサイトメ
ータにより紫ないし青の波長領域の光を照射し、該細胞
からの蛍光および散乱光を測定することを特徴とするフ
ローサイトメトリーによる尿中の細胞分析方法に関する
。
【００１６】なお、ここで細胞とは、赤血球、白血球、
上皮細胞、円柱、細菌を意味する。尿中に含まれる細胞
のうち、赤血球、白血球の大きさは１０μｍ程度である
。上皮細胞は血球より大きく、分布のばらつきは非常に
大きい。円柱は１００μｍ程度のものもあるが通常数百
μｍに達する。細菌は小さい。
【００１７】このように、尿中の細胞の種類は多く、大
きさもばらばらであり、さらに損傷の程度も大きいと考
えられることなどから、尿中の細胞分析はフローサイト
メトリーでは不可能であると考えられていた。確かに、
円柱を種類別に分類するなどの詳細な分析を行うことは
今のところ難しいものの、本発明者はスクリーニング用
としての可能性に着目し、試行錯誤の後ついに本発明を
完成させるに至ったのである。
【００１８】本発明は、測定試薬に蛍光染料を用いるの
でその蛍光強度を安定させるため、測定試料のｐＨ、浸
透圧を一定に保つ必要がある。尿は、血液と比較すると
第１表に示すようにその正常値に非常な違いがある。フ
ローサイトメトリーによって血液を測定する場合は、含
まれる細胞数が多いため測定試薬によって数百倍の希釈
を行うので測定試料のｐＨ、浸透圧はほとんど変化しな
い。一方、尿を測定する場合には、含まれる細胞数が血
液に比べてはるかに少ないので測定精度を考慮すれば試
薬による希釈倍率を上げることはできない。しかし、尿
のｐＨ、浸透圧が血液に比べて非常に広範囲にわたって
いるので、希釈が不十分だと測定試料のｐＨ、浸透圧が
検体ごとに変動してしまい、結果として安定した蛍光強
度を得られず、測定精度が悪くなることになる。
【００１９】そこで本発明では、低い希釈倍率でも測定
試料のｐＨ、浸透圧が変動しないように測定試薬に緩衝
剤および浸透圧補償剤を添加している。
【００２０】本発明の試薬に含有せしめるに適当な蛍光
染料は、下記から選択される１ないし２種類以上の染料
である。
【００２１】オーラミンＯ アクリジンオレンジ エチジウムブロミド プロピジウムヨージド ニュートラルレッド ベーシックイエロー１１ アクリジンレッド３Ｂ ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ ３，３’−ジメチルチオカルボシアニン３，３’−ジエ
チルチオカルボシアニン３，３’−ジエチル−９−メチ
ルチオカルボシアニンブロミド ２−［γー（１’−エチル−４’，５’−ベンゾチアゾ
リリデン）プロペニル］−３−エチル−４，５−ベンゾ
オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチル−４
，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
チルーピリジニウムヨージド アストラゾンオレンジＲ これらの蛍光染料は、細胞中の核酸と特異的に結合する
ことにより細胞を蛍光染色する。
【００２２】本発明の試薬中の浸透圧補償剤は下記塩類
から選択される： 塩化リチウム 塩化ナトリウム 塩化カリウム 塩化アンモニウム プロピオン酸ナトリウム リン酸塩 炭酸塩 本発明の試薬中の緩衝剤は下記から選択される：リン酸
（塩）系緩衝剤 フタル酸（塩）系緩衝剤 クエン酸（塩）系緩衝剤 ホウ酸（塩）系緩衝剤 酢酸（塩）系緩衝剤 マレイン酸（塩）系緩衝剤 トリス系緩衝剤 トライシン系緩衝剤 グリシルグリシン系緩衝剤 ジメチルグリシン系緩衝剤 ジグリコール酸系緩衝剤 タウリン系緩衝剤 バルビタール（塩）系緩衝剤 本発明の試薬は、上記蛍光染料、緩衝剤および浸透圧補
償剤を１液として１つの水溶液とすることもできるが、
これら各成分の保存性、安定性を良好に保つために、２
液あるいは３液として分けることが好ましい。
【００２３】２液の場合、の具体例としては以下の組合
わせが考えられる： （蛍光染料＋緩衝剤）と（浸透圧補償剤）；（蛍光染料
）と（緩衝剤＋浸透圧補償剤）；（蛍光染料＋浸透圧補
償剤）と（緩衝剤）。
【００２４】３液の場合の例としては、（蛍光染料）と
（緩衝剤）と（浸透圧補償剤）；（蛍光染料１）と（蛍
光染料２）と（緩衝剤＋浸透圧補償剤）；などが考えら
れる。
【００２５】本発明の尿中細胞の分析方法においては、
まず被検者からの尿検体（原尿）を希釈するが、その希
釈倍率は、２〜２０倍（尿検体：試薬＝１：１〜１９）
である。
【００２６】上記希釈倍率の下限である２倍というのは
、測定時のｐＨを一定にするための下限の値である。 尿は表１にもあるようにそのｐＨが広範囲に渡っている
。原尿に蛍光染料を直接加えると測定時のｐＨがばらつ
いて安定した蛍光強度を得ることができないので緩衝剤
入りの試薬による希釈が必要になる。下記実施例に記し
た試薬（ｐＨ８．５）では、ｐＨ４．５の尿検体を２倍
希釈でｐＨ８．０に、３倍以上の希釈でｐＨ８．５に調
整するすることができる。緩衝剤の濃度や種類を変えれ
ば、さらに厳密にそれぞれの蛍光染料に合ったｐＨに調
整することが可能である。
【００２７】希釈倍率の上限である２０倍というのは、
測定粒子数から決定した値である。表１に示すように尿
中の細胞数はかなり少ないので、測定精度を下げないた
めには、希釈倍率を極端にあげることができない。機器
の分析容量や処理能力（時間当たりの検体処理数）およ
び再現性等を考慮すると２０倍というのが希釈倍率の上
限の値となる。
【００２８】本発明の方法においては、上述のように希
釈された尿検体を尿試料とし、フローサイトメトリーに
より、各種細胞個々の前方散乱光または側方散乱光を検
出し、その信号のパルス幅を求め、それを細胞の大きさ
と対応付けることにより、パルス幅の違いから血球と他
の成分とを分類し、計数し、分類した血球群に対し、蛍
光強度の違いから赤血球と白血球を分類することによっ
て、尿中の赤血球、白血球及びその他の成分を測定する
ことを特徴とする。
【００２９】なお、蛍光としては、前方蛍光、側方蛍光
いずれも可能である。
【００３０】また、散乱光のピーク数も求め、散乱光強
度、散乱光パルス幅、散乱光ピーク数、蛍光強度のパラ
メータを用いて、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱、細
菌の分類、計数をすることを特徴とする。
【００３１】以下、図面にもとづいて本発明をより詳し
く説明する。
【００３２】図１は、尿中の細胞を測定するために用い
られる装置の要部（検出部）の側面図である。この装置
はフローサイトメータの一種である。
【００３３】蛍光染色された測定用尿試料はノズル２２
から吐出され、さらにその周囲にシース液を流すことに
よりシースフローが形成される。尿中の細胞２１はフロ
ーセル２０中央部を整列して流れる。
【００３４】アルゴンイオンレーザ１０からの出射光１
２はダイクロイックミラー１４、１６により反射され、
最終的に波長４８８ｎｍの光のみフローセル２０に到達
する。それ以外の波長の光はダイクロイックミラーを透
過する。１８はコンデンサレンズであり、光は流れ方向
には狭く、流れと直交する方向には広い長楕円形で試料
細胞領域に照射される。本発明は尿中の細胞からより詳
細な情報を得るために厚みは有形成分の大きさと比べて
比較的薄く設定されている方がよく、試料細流部分にお
ける照射光の寸法としては、短径が１〜２０μｍが適当
である。なお、長径は試料細流の幅より余裕をもって広
ければよい。細胞からの散乱光、蛍光はそれぞれフォト
ダイオード２４、フォトマルチプライア２６により検出
測光される。下記実施例では、前方散乱光及び前方蛍光
を使用する。
【００３５】表１に示すように、被検試料としての尿と
血液では特性がかなり異なる。
【００３６】
【００３７】尿はｐＨは４．５〜８．０、浸透圧は５０
〜１３００［ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ］というようにかな
りの幅を有している。蛍光染料はｐＨにより蛍光強度が
大きく変化するので、安定した蛍光強度を得るためには
ｐＨを一定にする必要がある。そのために、緩衝剤や浸
透圧補償剤により尿検体（原尿）を希釈するわけである
。
【００３８】例えば、実施例に記した試薬では尿検体の
ｐＨが４．５であっても本発明の試薬で２倍以上に希釈
することにより測定試料のｐＨを８．０〜８．５にする
ことが可能である。
【００３９】本発明では、蛍光染料が尿中の細胞に作用
した場合、特に核酸を鮮明に染色するので図２〜６に示
すような蛍光信号波形が得られる。図２〜６は蛍光染料
としてオーラミンＯを用いた場合の例であるが、赤血球
は核酸を持たないので蛍光染料には染色されない。白血
球、上皮細胞は、核を有しているので特に核の部分が強
く染色される。図２〜６の（ａ）（ｂ）のような２種類
の閾値を設けたり、信号のパルス幅の違いなどにより細
菌、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱を分類することが
可能である。各細胞の解析条件は表２に示すとおりであ
る。
【００４０】
【００４１】また、前方散乱光の信号波形からパルス幅
を測定することにより、細胞の大きさを求め各細胞の蛍
光強度を比較すると図７に示すようなスキャッタグラム
が得られ、各細胞が分類される。
【００４２】本発明の下記実施例により詳細に説明する
が、本発明はそれに限定されるべきものではないことは
明らかであろう。
【００４３】
【実施例】ニュートラルレッド１０００ｐｐｍの水溶液
３０ｍｌ、プロピオン酸ナトリウム９．５ｇｒに、緩衝
剤として、トリス６．１ｇｒとトライシン７．４ｇｒと
を加え、水を加えて１ｌとし、ｐＨ８．５の黄褐色の試
薬を調整した。この試薬は１．６ｍｌに尿検体０．８ｍ
ｌを加えて尿試料とした。これを室温で３０秒間インキ
ュベートした後、蛍光フローサイトメータに送入した。 光源は４８８ｎｍの励起光を発生するアルゴンイオンレ
ーザを用い、５２０ｎｍ以上の蛍光を受光検出した。目
視においては白血球、上皮細胞を認めた尿検体について
測定したところ、図８に示すようなスキャッタグラムが
得られ、白血球、上皮細胞の分類を行うことができた。
【００４４】以上は、染料、緩衝剤、浸透圧補償剤がす
べて含有された試薬を用いた例であるが、これら３種類
の成分を複数の溶液に分けて試薬とし、尿検体にこの試
薬を同時にあるいは順番に加えても同様の結果を得るこ
とができる。試薬を２倍以上にした場合は、試薬特に蛍
光染料の安定性をあげることができ、試薬の長期保存が
容易になるという利点がある。例えば、蛍光染料の中に
は酸やアルカリの存在下で加水分解するものがある（例
：特開昭６４−３５３６６に記載）ので水溶液の状態で
保存することは難しい。そこで、染料は有機溶媒に溶か
しておき、測定時に緩衝剤や浸透圧補償剤の入った水溶
液で希釈する２液性にすれば良い。
【００４５】この他、水溶性の低い染料（例：ローダミ
ンＢ）やｐＨまたは塩分濃度によって沈澱したり、変性
したりする染料も同様に２液以上にすることにより試薬
の保存安定性をはかることができる。また、２種類以上
の染料を用いる場合、染料を１つの溶液に一緒にしてお
くと染料の種類によっては染料どうしが反応して性能が
劣化することもあるので、やはり２液以上にすることに
より試薬の保存安定性を向上させることができる。
【００４６】
【効果】以上に述べたように蛍光染料を含有する測定試
薬を尿検体に対して適当量混合して染色し、フローサイ
トメータを用いて測定すると尿中の細胞分析にとって次
のような極めて特有の効果がもたらされる：（１）遠心
、濃縮等の前処理を必要としない。
【００４７】（２）測定が迅速である。
【００４８】（３）測定が定量的であり、精度も高い。
【００４９】（４）蛍光強度が異なるので細菌、赤血球
、白血球、上皮細胞の分類が容易である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用されるフローサイトメータの要部
（検出部）の例の側面図である。
【図２】蛍光染料としてオーラミンＯを用い、緩衝剤に
よってｐＨ８．５として測定試薬を用いたときの尿中の
赤血球の前方散乱光信号波形、前方蛍光信号波形を表す
出力波形図である。
【図３】蛍光染料としてオーラミンＯを用い、緩衝剤に
よってｐＨ８．５として測定試薬を用いたときの尿中の
白血球の前方散乱光信号波形、前方蛍光信号波形を表す
出力波形図である。
【図４】蛍光染料としてオーラミンＯを用い、緩衝剤に
よってｐＨ８．５として測定試薬を用いたときの尿中の
上皮細胞の前方散乱光信号波形、前方蛍光信号波形を表
す出力波形図である。
【図５】蛍光染料としてオーラミンＯを用い、緩衝剤に
よってｐＨ８．５として測定試薬を用いたときの尿中の
細菌の前方散乱光信号波形、前方蛍光信号波形を表す出
力波形図である。
【図６】蛍光染料としてオーラミンＯを用い、緩衝剤に
よってｐＨ８．５として測定試薬を用いたときの尿中の
円柱（白血球もしくは小型の上皮細胞封入）の前方散乱
光信号波形、前方蛍光信号波形を表す出力波形図である
。
【図７】横軸に前方散乱光から得られる各細胞の大きさ
、縦軸に各細胞の蛍光強度をとった場合の各細胞の分布
を表すスキャッタグラムの模式図である。
【図８】蛍光染料としてニュートラルレッドを用い、緩
衝剤によってｐＨ８．５とした測定試薬を用いたときの
尿中の細胞の前方散乱光パルス幅−前方蛍光強度を示す
スキャッタグラムである。
【符号の説明】
１．細菌 ２．赤血球 ３．白血球 ４．上皮細胞 ５．硝子円柱 ６．その他の円柱 １０．アルゴンイオンレーザ １２．出射光 １４．ダイクロイックミラー １６．ダイクロイックミラー １８．コンデンサレンズ ２０．フローセル ２１．細胞 ２２．ノズル ２４．フォトダイオード ２６．フォトマルチプライア （ａ）強蛍光強度閾値 （ｂ）中蛍光強度閾値 （Ａ）白血球 （Ｂ）上皮細胞

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　下記成分を含有する溶液からなる尿中
    の細胞分析用試薬：蛍光染料浸透圧補償剤および緩衝剤
    。
  2. 【請求項２】　　前記蛍光染料が、下記から選択される
    １種類または２種類以上の染料である請求項１記載の試
    薬： オーラミンＯ アクリジンオレンジ エチジウムブロミド プロピジウムヨージド ニュートラルレッド ベーシックイエロー１１ アクリジンレッド３Ｂ ローダミンＳ ローダミン６Ｇ ローダミンＢ ローダミン１９ペルクロレート ローダミン１２３ エオシンＹ シアノシン クレジルファーストバイオレット ダロウレッド アクロノールフロキシンＦＦＳ ３，３’−ジメチルチオカルボシアニン３，３’−ジエ
    チルチオカルボシアニン３，３’−ジエチル−９−メチ
    ルチオカルボシアニンブロミド ２−［γー（１’−エチル−４’，５’−ベンゾチアゾ
    リリデン）プロペニル］−３−エチル−４，５−ベンゾ
    オキサゾリウムヨージド アストラゾンレッド６Ｂ ベイシックバイオレット１６ ２−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−３−エチル−４
    ，５−ベンゾチアゾリウムヨージド ２，４−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
    チル−ピリジニウムヨージド ２，６−ビス（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１−エ
    チルーピリジニウムヨージド アストラゾンオレンジＲ。
  3. 【請求項３】　　前記浸透圧補償剤が下記塩類から選択
    される請求項１の試薬： 塩化リチウム 塩化ナトリウム 塩化カリウム 塩化アンモニウム プロピオン酸ナトリウム リン酸塩 炭酸塩。
  4. 【請求項４】　　前記緩衝剤が下記から選択される請求
    項１の試薬： リン酸（塩）系緩衝剤 フタル酸（塩）系緩衝剤 クエン酸（塩）系緩衝剤 ホウ酸（塩）系緩衝剤 酢酸（塩）系緩衝剤 マレイン酸（塩）系緩衝剤 トリス系緩衝剤 トライシン系緩衝剤 グリシルグリシン系緩衝剤 ジメチルグリシン系緩衝剤 ジグリコール酸系緩衝剤 タウリン系緩衝剤 バルビタール（塩）系緩衝剤。
  5. 【請求項５】　　１つの溶液として存在する請求項１の
    試薬。
  6. 【請求項６】　　２以上の溶液に分かれていることによ
    り試薬の安定性を確保した請求項１の試薬。
  7. 【請求項７】　　前記試薬を用いて尿を２〜２０倍（尿
    ：試薬＝１：１〜１９）に希釈することによって測定試
    料のｐＨを前記試薬による蛍光染料が最適になるような
    ｐＨおよび浸透圧にすることができる緩衝剤および浸透
    圧補償剤を含む請求項１の試薬。
  8. 【請求項８】　　請求項１の試薬を用いて尿を希釈する
    とともに尿中の細胞を染色し；フローサイトメータを使
    用して、紫ないし青色の波長領域の光を上記細胞に照射
    し、該細胞からの蛍光および散乱光を測光する；ことか
    らなる尿中の細胞分析方法。
  9. 【請求項９】　　尿を２〜２０倍に希釈する請求項８の
    方法。
  10. 【請求項１０】　　特に前方または測方の蛍光信号波形
    により尿中の細菌、赤血球、白血球、上皮細胞、円柱を
    分類することを特徴とする、請求項８の方法。
  11. 【請求項１１】　　散乱光信号のパルス幅の違いにより
    血球とその他の成分とを分類し、蛍光強度の違いにより
    さらに血球を赤血球と白血球とに分類する、請求項８の
    方法。
  12. 【請求項１２】　　散乱光強度、散乱光パルス幅、散乱
    光ピーク数、蛍光強度の違いにより、尿中の細胞を赤血
    球、白血球、上皮細胞、円柱、細菌に分類する、請求項
    ８の方法。
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