BRPI0620318A2 - enzimas - Google Patents

Abstract

ENZIMAS. A presente invenção refere-se a novas enzimas celulase, especialmente novas endoglicanases incluindo proteínas de fusão de endoglicanase, preparações e composições contendo estas enzimas endoglicanases e proteínas de fusão, vetores de expressão, células hospedeiras e processos para sua preparação e usos das celulases, preparações e composições em indústrias texteis, de detergente e polpa e papel.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ENZIMAS". Campo da Invenção

A presente invenção refere-se a novas enzimas celulase, espe- cialmente novas endoglicanases incluindo proteínas de fusão endoglicana- ses, preparações e composições contendo estas enzimas endoglicanases e proteínas de fusão, vetores de expressão, células hospedeiras e processos para sua preparação e usos das celulases, preparações e composições nas indústrias têxteis, de detergentes, e polpa e papel.

Antecedentes da Invenção

Celulose é o principal componente estrutural de plantas superio- res e ocorre naturalmente em forma quase pura somente em fibra de algo- dão. Ela provê células de plantas com alta resistência à tração auxiliando as mesmas a resistirem à tensão mecânica e pressão osmótica. Celulose é um polissacarídeo linear de resíduos de glicose conectados por ligações β-1,4. Na natureza, celulose está usualmente associada com Iignina junto com he- miceluloses, tais como xilanos e glicomananos. Enzimas celulolíticas hidroli- sam celulose e são produzidas por uma ampla variedade de bactérias e fun- gos. Celulases são enzimas industrialmente importantes com um atual valor de mercado de cerca de 190 milhões de dólares. Na indústria têxtil, celula- ses são usadas em acabamento de denim para criar uma aparência lavada com pedra da moda em roupas de denim em um processo biorretificação à pedra, e elas também são usadas, por exemplo, para limpar flocos e preve- nir formação de pills sobre a superfície de peças de roupas de algodão. Na indústria de detergentes celulases são usadas para intensificar cores e para prevenir acinzentamento e pilling de peças de roupas. Celulases são ainda usadas na indústria de alimentos e fabricação de alimentação animal, e elas têm um grande potencial na indústria de polpa e papel, por exemplo, em reti- rada de tinta para liberar tinta de superfícies de fibra e em aperfeiçoamento de drenagem de polpa. O amplo espectro de usos industriais para celulases estabeleceu uma necessidade de produtos de celulase comerciais contendo diferentes componentes celulase e funcionando otimamente em diferentes faixas de pH e temperatura. O uso prático de celulases é dificultado pela natureza das com- posições de celulase conhecidas, que são freqüentemente misturas de en- zimas tendo uma variedade de atividades e especificidades de substrato. Por esta razão, foram feitos esforços para obtenção de celulases tendo so- mente as atividades desejadas. As únicas propriedades de cada celulase tornam algumas mais apropriadas para certos propósitos que outras. Embo- ra as enzimas difiram em um número de maneiras, uma das mais importan- tes diferenças é o pH ótimo. Celulases neutras são mais ativas na faixa de pH 6-8 e celulases alcalinas na faixa de pH 7,5-10, enquanto celulases áci- das, tendo o pH ótimo em 4,5-5,5, mostram níveis muito baixos de atividade em maiores valores de pH. Celulases neutras e ácidas são especialmente úteis na indústria têxtil. Em tratamento de tecido celulases atacam as cadei- as de moléculas de celulose que formam as fibras de algodão, pelo que afe- tando as características do tecido.

Em indústria têxtil visual "lavado à pedra" ou um visual abrasiva- do tem sido interesse de produtores de denim em anos recentes. Tradicional lavagem com pedra com pedra-pomes reduz a resistência de tecido e sobre- carregam aparelhos. A tendência tem sido na direção de processos enzimá- ticos de acabamento de denim e celulases substituíram ou estão sendo usa- das junto com pedra-pomes para render ao tecido seu desejado visual "usa- do". Tratamentos controlados com enzima resultam em menos dano para as peças de roupa e máquinas e eliminam a necessidade de disposição de pe- dras.

Adicionalmente, indústria têxtil usa celulases em bioacabamento, isto é, para criação de permanente aperfeiçoamento de retirada de felpa e aperfeiçoada resistência a formação de felpa, estrutura de superfície limpada através de reduzidos flocos, aperfeiçoado manuseio têxtil, tal como maciez, suavidade e uma sensação sedosa, aperfeiçoada capacidade de ornar e cores mais brilhantes do têxtil e aperfeiçoada capacidade de absorção de umidade.

Celulases aplicadas em tratamento de denim são usualmente divididas em dois grupos principais: celulases ácidas e neutras. Celulases ácidas tipicamente operam em pH 4,0-5,5 e as celulase neutras na faixa de pH 6-8. Celulases ácidas usadas em biorretificação à pedra originam-se principalmente de Trichoderma reesei (forma sexual Hypocrea jecorina) e as celulase neutras originam-se de uma variedade de fungos, incluindo gêneros de Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium Acremonium, e C- hrysosporium (Haakana et al. 2004). Enzimas T.reesei incluem, por exmeplo, celulases da família glicosídeo 5 (endoglicanase II, EGII), família 7 (celobioi- drolase I, CBHI) e família 12 (endoglicanase III, EGIII; Ward et al. 1993), e as celulases neutras, mais freqüentemente endoglicanases, da família 45 e fa- mília 7 (Henrissdat, 1991; Henrissat and Bairoch, 1993, 1996).

Celulases compreendem um domínio / núcleo catalítico (CD) expressando atividade celulase. Em adição ao domínio catalítico a molécula de celulase pode compreender um ou mais domínios de ligação de celulose (CBDs), também chamados como domínios / módulos de ligação de carboi- drato (CBD/CBM), que podem estar localizados tanto no término N- como C do domínio catalítico. CBDs têm atividade de ligação de carboidrato e eles mediam a ligação da celulase a celulose cristalina mas têm pequeno ou ne- nhum efeito sobre atividade hidrolítica de celulase da enzima sobre substra- tos solúveis. Estes dois domínios estão tipicamente conectados via uma re- gião ligante flexível e altamente glicosilada.

Celulases que atacam primariamente sobre a superfície da fibra são especialmente úteis em lavagem com pedras de denim tingido com co- rantes índigo, à medida que o corante está localizado sobre a superfície da fibra. Quando usadas para tratamento de tecido de algodão, celulases áci- das geralmente requerem um tempo de lavagem mais curto que celulases neutras. Celulases ácidas são especialmente usadas em bioacabamento (retirada de felpa) e também em tratamento de denim (biorretificação à pe- dra).

Endoglicanases (Egs) em conexão à presente invenção signifi- cam enzimas classificadas como E.C. 3.2.1.4 e são um dos três tipos de ce- lulases geralmente necessários para a conversão biológica de celulose a glicose. Endoglicanases cortam ligações beta-1,4-glicosídicas internas, en- quanto celobioidrolases cortam o dissacarídeo celobiose da extremidade da cadeia de polímero celulose e beta-1,4-glicosídases hidrolisam a celobiose e outros celooligossacarídeos à glicose. Algumas endoglicanases ocorrendo naturalmente têm um domínio de ligação de celulose (CBD), enquanto outras não.

Também endoglicanases são amplamente usadas em indústria têxtil, de detergente, e polpa e papel. Por exemplo, endoglicanases da famí- lia cel45 (Egs fam 45) são descritas, por exemplo, na Patente US 6 001 639, que descreve enzimas tendo atividades endoglicanase e tendo duas se- qüências de aminoácidos conservadas. Usos em aplicações têxteis, deter- gentes, de polpa e papel são genericamente discutidos e tratamento de ma- terial ligno-celulósico é mencionado. WO 2004/053039 é direcionado a apli- cações detergentes de endoglicanases. A Patente US 5 958 082 mostra o uso de endoglicanase, especialmente de Thielavia terrestris em aplicações têxteis provendo visual lavado com pedra ou abrasivado de jeans de sarja. EP 0495258 refere-se a composições detergentes contendo Humicola cellu- lase. A Patente U.S. 5 948 672 descreve uma preparação de celulase con- tendo endoglicanase, especialmente de Humicola e seu uso em aplicações têxteis e de polpa.

EG:s e composições enriquecidas com EG e concentrados são também comercialmente disponíveis.

Entretanto, há uma contínua necessidade de celulases aperfei- çoadas, incluindo endoglicanases que são mais eficientes em tratamento de tecido e em outros campos, onde celulases são tradicionalmente usadas.

Em particular, há uma contínua necessidade de celulases mais eficientes para aperfeiçoamento de economias de processo.

A presente invenção objetiva satisfazer esta necessidade.

Breve Descrição da Invenção

Um objetivo da presente invenção é prover novas endoglicana- ses e proteínas de fusão endoglicanases tendo aperfeiçoadas propriedades hidrolíticas para uso em indústria têxtil, especialmente em processos de a- cabamento de algodão, tal como em retirada de felpa, e lavagem com pe- dras de denim, e para uso em composições detergentes assim como em outros campos. As novas endoglicanases e proteínas de fusão de endogli- canases da invenção têm a vantagem de serem ativas em valores de pH ácido e neutro, elas têm performance altamente aperfeiçoada em aplicações têxteis de bioacabamento e biorretificação à pedra e em aplicações deter- gentes. Quando usadas no tratamento de materiais têxteis contendo celulo- se, as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases propor- cionam uma sensação suave, aperfeiçoada aparência a maciez assim como permanente retirada de felpa do têxtil. Com a aperfeiçoada eficiência das endoglicanases da invenção, o uso das enzimas é significantemente mais econômico. Adicionais vantagens também são obtidas em termos de logísti- ca e a estocagem dos produtos de enzima, quando menores quantidades do produto enzima são necessárias. Além disso, as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção, quando sendo ácidas, atuam mais rapidamente, rendendo procedimentos de tratamento de custo e tempo efetivos e economias em equipamento assim como instala- ções de tratamento.

Ainda um objetivo da presente invenção é prover polinucleotí- deos codificando as novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglica- nases da presente invenção.

Ainda um objetivo da presente invenção é prover nos plasmí- deos ou vetores de expressão contendo tais polinucleotídeos, úteis para a produção das novas endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase da presente invenção, assim como novos hospedeiros transformados com os ditos plasmídeos dse expressão.

Ainda um objetivo da presente invenção é prover preparações de enzima, que contêm uma ou mais novas endloglicanases e proteínas de fusão endoglicanases tendo aperfeiçoadas propriedades hidrolíticas.

Ainda um objetivo da presente invenção é prover processos de uso de preparações de enzima e as endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase para acabamento de têxteis, especialmente para bioacaba- mento e biorretificação à pedra de denim. Ainda um objetivo da presente invenção é prover meios para uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

A presente invenção refere-se a um polipeptídeo endoglicanase compreendendo um fragmento tendo atividade celulolítica e sendo selecio- nado do grupo consistindo em:

a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoiácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 4;

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento tendo ativi- dade celulolítica; e

c) um fragmento de a) ou b) tendo uma atividade celulolítica.

A presente invenção ainda refere-se a uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo um fragmento ativo celuloliticamente ativo de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência de SEQ ID NO 2 ligada a um domínio de ligação de carboidrato heterólogo (CBD).

A presente invenção também refere-se a uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo uma seqüência de aminoácidos derivada de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID NO:4 ligada a um domínio de ligação de carboidrato. A proteína de fusão adicionalmente pode compre- ender uma região ligante.

A presente invenção ainda refere-se a um polinucleotídeo isola- do codificando o polipeptídeo ou proteína de fusão endoglicanase definida acima. Especialmente a invenção refere-se a um polipeptídeo selecionado do grupo consistindo em:

a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs.: 1,3, 16, 18, 20, 36, 37 ou 38;

b) uma fita complementar de a);

c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nu- cleotídeos; e d) uma seqüência que é degenerada como um resultado do có- digo genético para qualquer uma das seqüências como definidas em a), b) ou c).

A presente invenção ainda refere-se a um vetor de expressão compreendendo a seqüência de polinucleotídeo definida acima.

A presente invenção ainda refere-se a novos hospedeiros trans- formados com os vetores da invenção, especialmente hospedeiros que são capazes de alto nível de expressão da endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção.

A presente invenção ainda refere-se a uma preparação de enzi- ma, que contem uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endo- glicanases da invenção.

A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para bioacabamento de têxteis, especi- almente para retirada de felpa.

A presente invenção inda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para o acabamento de têxteis, especi- almente para biorretificação à pedra de denim.

A presente invenção ainda refere-se ao uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

A presente invenção ainda refere-se a uma cepa de Escherichia coli tendo número de acesso DSM 17324 DSM 17323, DSM 18813, DSM 18814, DSM 18815, DSM 18816, ou DSM 18817.

Breve Descrição dos Desenhos

A Figura 1 ilustra o quadro esquemático dos cassetes de ex- pressão usados na transformação de protoplastos de Trichoderma reesei para produção de de celulases Acremonium thermophilum da invenção. Os genes recombinantes estavam sob controle de promotor cbhl/cel7A de T. reesei (cbhl prom) e terminação de transrição foi assegurada com a adição do terminador cbhl de T. reesei. O gene amdS (amdS) foi incluído para sele- ção dos transformantes.

A Figura 2 ilustra a dependência de pH das celulases EG_40 e semelhantes a EG_40 de A. thermophilum produzidas heterologamente a- través de determinação a partir de sobrenadante de cultura usando CMC como substrato em uma reação de 10 minutos a 50°C (A). A temperatura ótima de celulases EG_40 e semelhantes a EG_40 foi determinada em pH 5,5 e 5, respectivamente. A reação com CMC como um substrato foi realiza- da por 60 minutos. BSA (100 μg/mL) foi adicionado como um estabilizador(B).

A Figura 3 mostra a performance de celulase EG_40 em biorreti- ficação à pedra em diferentes temperaturas avaliada através de medição decor.

A Figura 4 mostra o efeito de biorretificação à pedra de uma mis- tura de EGI enriquecida e concentrados de EG_40 comparada a um concen- trado enriquecido com EGII da técnica anterior.

A Figura 5 mostra séries de fotografias mostrando o efeito de retirada de felpa de uma endoglicanase da invenção.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção é baseada em esforços para encontrar ce- lulases ainda aperfeiçoadas para uso em indústria têxtil. Surpreendentemen- te foi verificado que, partindo de uma espécie Acremonium, novas endogli- canases podem ser isoladas e enzimas recombinantes podem ser produzi- das, cujas endoglicanases não somente têm um aceitável perfil de tempera- tura mas também mostram inesperada performance favorável de retirada de felpa e são pelo menos quatro vezes tão eficientes como uma preparação contendo EG comercial. Adicionalmente, as novas endoglicanases mostra- ram excelentes propriedades de biorretificação à pedra comparadas a celu- lases da técnica anterior.

Da mesma maneira, a presente invenção refere-se a um polipep- tídeo endoglicanase compreendendo um fragmento tendo atividade celulolí- tica e sendo selecionado do grupo consistindo em:

a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência a SEQ ID N0:4,

b) uma variante de a) compreendendo um fragmento tendo ativi- dade celulolítica; e

c) um fragmento de a) ou b) tendo atividade celulolítica.

Em uma modalidade preferida da invenção o dito aminoácido tem pelo menos 80%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 98% de identidade de se- qüência a SEQ ID NO: 2.

Em uma outra modalidade preferida da invenção o dito aminoá- cido tem pelo menos 70%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 85%, ainda mais preferivelmente 90%, mais pre- ferivelmente 95% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 4.

Ainda em uma modalidade preferida da invenção o dito aminoá- cido tem SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4.

Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção o dito fragmento tem a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19.

Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção os poli- peptídeos são obteníveis ou originam-se de uma Acremonium sp., preferi- velmente de Acremonium thermophilum.

Os polipeptídeos endoglicanase da presente invenção são prefe- rivelmente polipeptídeos recombinantes. Os polipeptídeos recombinantes podem ser produzidos em um hospedeiro heterólogo ou em um hospedeiro homólogo geneticamente modificado.

De acordo com uma modalidade particular da invenção o poli- peptídeo endoglicanase é uma modificação de um polipeptídeo tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2, onde o domínio de ligação de carboidrato CBD foi substituído por um CBD heterólogo. Em adi- ção a região ligante e/ou seqüência sinal podem ser substituídos por uma região ligante heteróloga e/ou seqüência sinal. Estas endoglicanases modifi- cadas também são aqui abrangidas pelo termo proteína de fusão endoglica- nase. Em uma modalidade preferida da invenção, a endoglicanase modifica- da / fundida tem SEQ ID NO: 39, 40 ou 41.

Em uma particular modalidade da invenção a proteína de fusão é uma proteína de fusão endoglicanase compreendendo um fragmento celu- loliticamente ativo de um polipeptídeo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2, e um domínio de ligação de carboidrato heterólogo (CBD), onde o CBD heterólogo e a região Iigante opcional são derivados de CBHI de Trichoderma reesei, CBHI de Chaetomium termophilum, ou Acremonium sp. xilanase. "Heterólo- go" como usado no presente contexto significa que o CBD e possível parte ligante da proteína de fusão endoglicanase são obtidos a partir de um outro organismo e ligados ao núcleo celuloliticamente ativo da endoglicanase atra- vés de modificação de gene. Especialmente a proteína de fusão compreen- de uma seqüência de aminoácidos que tem pelo menos 71% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 39, pelo menos 69% de identidade de seqüên- cia a SEQ ID NO: 40, ou pelo menos 69% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 41. Especialmente a proteína de fusão compreende uma se- qüência de aminoácidos tendo 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 ou SEQ ID NO: 41.

Em uma outra modalidade preferida da invenção a dita proteína de fusão compreende uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 li- gada a um CBD derivado de um polipeptídeo compreendendo uma seqüên- cia de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 2.

Ainda em uma outra modalidade preferida da invenção a dita proteína de fusão endoglicanase tem SEQ ID NO: 21. A presente invenção ainda refere-se a um polinucleotídeo isolado codificando o polipeptídeo en- doglicanase definido acima.

Especificamente em uma modalidade da invenção o polinucleo- tídeo isolado tem uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo con- sistindo em:

a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3, 16, 18, 20, 36, 37 ou 38;

b) uma fita complementar de a); c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nu- cleotídeos; e

d) uma seqüência que é degenerada como um resultado do có- digo genético para qualquer uma das seqüências como definidas em a), b) ou c).

A presente invenção ainda refere-se a um vetor de expressão compreendendo a seqüência de polinucleotídeos definida acima.

A presente invenção ainda refere-se a novos hospedeiros trans- formados com os vetores da invenção, especialmente hospedeiros que são capazes de alto nível de expressão da endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção. De acordo com uma modalidade preferida da invenção as enzimas são obteníveis de Acremonium thermophilum cepa ALK04245 depositada como CBS 116240.

A presente invenção ainda refere-se a uma preparação de enzi- ma, que contém uma ou mais endoglicanadases ou proteínas de fusão endl- glicanases da invenção.

A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzimas da invenção para bioacabamento de têxteis, espe- cialmente para retirada de felpa.

A presente invenção ainda refere-se a processos para uso de preparações de enzima da invenção para o acabamento de têxteis, especi- almente para biorretificação à pedra de denim.

A presente invenção ainda refere-se ao uso das preparações de enzima da invenção em composições detergentes.

As preparações de proteína de fusão endoglicanase e endogli- canase da invenção são úteis especialmente na indústria têxtil e de deter- gente. Elas são especialmente úteis na indústria têxtil para bioacabamento de tecidos ou peças de roupas, por exemplo, retirada de felpa, retirada de cotão, clarificação de cor, redução de aspereza, criação de diferentes aca- bamentos (por exemplo, um efeito de 'pele de pêssego1, 'usado1, 'lavado com areia', ou 'visual antigo') e para bioacabamento de fio, por exemplo, redução de formação de pêlos e aperfeiçoamento de suavidade. Adicionais usos in- cluem o uso de composições detergentes para aperfeiçoamento de proprie- dades de cuidados de tecido através de antiformação de felpa, antiacinzen- tamento, clarificação de cor e amaciamento, e para aperfeiçoar efeito de lim- peza de têxtil, por exemplo, remoção de sujeira. Adicionais usos incluem o uso em biorretificação à pedra de denim.

Em tecido de algodão, cotão (microfibras) emerge a partir da superfície, o qual pode embaraçar durante processamento, assim formando felpas. Enzimas enfraquecem as microfibras elevando-se da superfície e forças de cisalhamento do tratamento então as removem (Nierstrasz and Warmoeskerken, 2003). Como usada na presente invenção a expressão "bi- oacabamento" (também chamada retirada de felpa, retirada de cotão, ou biopolimento) refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo a modificar a superfície de fio ou tecido em uma maneira que previne permanentemente formação de felpa, aperfeiçoa ma- nuseio de tecido como maciez e suavidade, limpa a estrutura de superfície através de redução de formação de cotão, que resulta em clarificação de cores, aperfeiçoa a capacidade do tecido de ornamentar do tecido, aperfei- çoa capacidade de absorção de umidade, que pode aperfeiçoar também a capacidade de fingimento. Enzimas celulases são usadas para tratamento ou acabamento de materiais têxteis contendo celulose, como algodão, linho, rami, juta, viscose, modal, Iiocel e cupro, ou suas combinações.

Como usada no presente contexto a expressão "biorretificação à pedra" de tecido ou peças de roupas significa o uso de enzimas no lugar de, ou em adição a, pedras pomes para o tratamento de tecido ou peça de rou- pa, especialmente denim.

Como usada no presente contexto a expressão "contra- manchamento" refere-se à tendência de corante liberado redepositar sobre a superfície das fibras de tecido.

Como usada no presente contexto a expressão "detergente" re- fere-se a um agente de limpeza que pode conter agentes tensoativos (ten- soativos aniônicos, não-iônicos, catiônicos e anfolíticos), builders e outros ingredientes opcionais tais como agentes anti-redeposição e de suspensão de sujeira, abrilhantadores óticos, agentes intensificadores, corantes e pig- mentos e hidrolases. Apropriada listagem dos conteúdos de detergentes é dada na Patente US 5 433 750, uma lista apropriada de tensoativos é dada na Patente US 3 664 961.

A atividade biológica de uma endoglicanase é sua atividade ca- talítica, e/ou sua habilidade para ligar a material celulósico. Atividade celulo- lítica de uma endoglicanase é sua atividade hidrolítica.

Como usada no presente ocntexto, a expressão "Acremonium sp." refere-se especialmente a um gênero de fungo filamentoso tendo as características da cepa CBS 116240. Esta cepa é presentemente classifica- da como A. thermophilum.

Como usado no presente contexto, "polinucleotídeo" refere-se a ambos RNA e DNA, e pode ser de fita simples ou dupla. O polinucleotídeo também pode ser um fragmento de ditos polinucleotídeos compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos, por exemplo, pelo menos 25, 30 ou 40 nucleo- tídeos, De acordo com uma modalidade da invenção ele é de pelo menos 100, 200 ou 300 nucleotídeos em comprimento. Ainda o polinucleotídeo po- de ser degenerado como um resultado do código genético para qualquer uma das seqüências como definidas acima. Isto significa que diferentes có- dons podem codificar o mesmo aminoácido.

Os novos polipeptídeos também podem ser variantes dos ditos polipeptídeos. Uma "variante" pode ser um polipeptídeo que ocorre natural- mente, por exemplo, como uma variante alélica dentro da mesma cepa, es- pécie ou gênero, ou ela pode ser gerada através de mutagênese. Ela pode compreender substituições, supressões ou inserções de aminoácidos, mas ela ainda funciona em uma maneira substancialmente similar às enzimas definidas acima, isto é, ela compreende um fragmento tendo atividade celu- lolítica.

Um vetor de expressão é um plasmídeo ou vetor de clonagem capaz de expressar DNA codificando as endoglicanases e proteínas de fu- são de endoglicanases da invenção após transformação em um desejado hospedeiro. Quando um hospedeiro fungo é usado, o gene de interesse é preferivelmente provido para um hospedeiro fungo como parte de um veículo de expressão ou clonagem que integra-se no cromossoma de fungo, ou permite o gene de interesse integrar-se no cromossoma hospedeiro, ou co- mo um plasmídeo replicando autonomamente. Seqüências que são parte do veículo de clonagem ou veículo de expressão também podem ser integradas com o dito DNA durante o processo de integração. Em adição, em fungos o vetor de expressão ou suas partes podem ser alvejadas em Ioci predetermi- nados.

O DNA codificando as endoglicanases e as proteínas de fusão de endoglicanases da invenção é também preferivelmente colocado sob o controle de (isto é, operavelmente ligado a) certas seqüências controles tais como seqüências promotoras providas pelo vetor (que integram com o gene de interesse). Alternativamente, as seqüências controles podem ser aquelas no sítio de inserção.

As seqüências de controle de expressão de um vetor de expres- são variarão dependendo de ser o vetor é desenhado para expressão de um certo gene em um hospedeiro procariótico ou em um eucariótico (por exem- plo, um vetor lançador pode prover um gene para seleção em hospedeiros bacterianos). Seqüências de controle de expressão podem conter elementos reguladores transcricionais como promotores, elementos aperfeiçoadores, e seqüências de terminação transcricional, e/ou elementos reguladores trans- ducionais, tais como sítios de iniciação e terminação transducional.

Uma molécula de polinucleotídeo, tal como DNA, é dita ser "ca- paz de expressar" um polipeptídeo se ela contem seqüências de controle de expressão que cotem informação reguladora transcricional e tais seqüências estão "operavelmente ligadas" à seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo.

Uma ligação operável é uma ligação na qual uma seqüência es- tá ligada a uma seqüência reguladora (ou seqüências) em uma maneira tal para colocar expressão da seqüência sob a influência ou controle da se- qüência reguladora. Duas seqüências de DNA (tal como uma seqüência de região promotora ligada à extremidade 5' da seqüência codificando proteína) são ditas estarem operavelmente ligadas se função de promotor resulta na transcrição.

Os vetores da invenção ainda podem compreender outros ele- mentos reguladores ligados operavelmente, tais como seqüências aperfei- çoadoras.

Em uma modalidade preferida, transformantes geneticamente estáveis são construídos pelo que o DNA codificando as endoglicanases ou proteínas de fusão de endoglicanases da invenção é integrado no cromos- soma hospedeiro através de transformação com um vetor, que abriga se- qüências promovendo integração do dito vetor no cromossoma.

Células que integraram estavelmente DNA codificando as endo- glicanases ou as proteínas de fusão de endoglicanases da invenção em seus cromossomas são selecionadas através de também introdução de um ou mais marcadores, homólogos ou heterólogos, que permitem a seleção de células hospedeiras que contêm o vetor de expressão no cromossoma, por exemplo, o marcador pode prover resistência biocida, por exemplo, resistên- cia antióticos, ou metais pesados, como cobre, ou marcadores complemen- tando uma mutação auxotrófica no cromossoma hospedeiro, e semelhantes.

O gene marcador selecionável tanto pode ser diretamente ligado às seqüên- cias de gene de DNA a serem expressas, ou introduzido na mesma célula através de co-transformação.

Uma vez o vetor ou seqüência de DNA da invenção contendo o construto(s) seja preparado para expressão, o constructo(s) de DNA é intro- duzido em uma célula hospedeira apropriada através de qualquer um de uma variedade de meios apropriados, incluindo transformação como conhe- cido na técnica. Após a introdução do vetor, células receptoras são desen- volvidas em um meio seletivo, que seleciona para o crescimento de células transformadas.

Apropriados sistemas hospedeiros de expressão e produção são, por exemplo, o sistema de produção desenvolvido para o hospedeiro fungo Trichoderma (EP 244 234), ou sistema de produção Aspergillus, tal como, A. oryzae ou A. niger (WO 9708325 e WO 9533386, Patente US 5 843 745, Patente US 5 770 418), ou o sistema de produção desenvolvido para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Apropriados sistemas de produção desenvolvidos para bactérias são sistemas de produ- ção desenvolvidos para Bacillus, por exemplo, B. subtilis ou para E. coli, ou para actinomicetes Streptomyces. Apropriados sistemas de produção de- senvolvidos para leveduras são sistemas desenvolvidos para Saccharomy- ces, Shizosaccharomyces ou Pichia pastoris. Sistemas de produção em al- guns micróbios ou em células mamíferas ou em plantas também são possíveis.

Expressão da seqüência(s) de gene clonada resulta na produção da desejada proteína, ou na produção de um fragmento desta proteína. Esta expressão pode ocorrer em uma maneira contínua nas células transforma- das, ou em uma maneira controlada.

Fragmentos são entendidos serem partes de moléculas de ácido nucléico ou polipeptídeo longas o suficiente para terem as desejadas propri- edades enzimáticas ou para codificarem as descritas endoglicanases ou pro- teínas de fusão endoglicanases ou um seu fragmento biologicamente ativo.

O termo "degenera" significa que a seqüência de nucleotídeos pode variar tanto quanto a seqüência de aminoácidos codificada seja a mesma. Isto as- sim porque há mais de um tripleto nucleotídeo que codifica um único amino- ácido.

Como usado no presente contexto o termo "identidade" de se- qüência refere-se à identidade global entre duas seqüências de aminoácidos comparadas uma à outra a partir do primeiro aminoácido codificado pelo cor- respondente gene para o último aminoácido. A identidade das seqüências de inteiro comprimento é medida através de uso de programa de alinhamento global Needleman - Wunsch em EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suíte; Rice et al., 2000) program package, version 3.0.0, com os seguintes parâmetros: EMBLOSUM62, penalidade de folga de 10,0, pe- nalidade de extensão 0,5. O algoritmo é descrito em Needleman and Wuns- ch (1970). Aqueles versados na técnica estão cientes do fato de que resulta- dos usando algoritmo de Needleman-Wunsch são somente comparativos quando alinhando domínios correspondentes da seqüência. Conseqüente- mente comparação de, por exemplo, seqüências de celulase incluindo CBD ou seqüências sinais com seqüências carecendo daqueles elementos não pode ser feita.

Enzimas celulolíticas úteis pára hidrólise de material celulósico são obteníveis ou originadas de Acremonium sp., preferivelmente A. thermo- philum. "Obtenível de" ou "originando de" significa que elas podem ser obti- das a partir das ditas espécies, mas não exclui a possibilidade de obtenção das mesmas a partir de outras fontes. Em outras palavras elas podem se originar de qualquer organismo incluindo plantas. Preferivelmente elas se originam de microorganismos, por exemplo, bactérias ou fungos. As bacté- rias podem ser, por exemplo, de um gênero selecionado de Bacillus, Azospi- rillum e Streptomyces. Mais preferivelmente a enzima se origina de fungos (incluindo fungos e leveduras filamentosas), por exemplo, de um gênero se- lecionado do grupo consistindo em Thermoascus, Acremonium, Chaetomi- um, Achaetomium, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melnaocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes e Trichoderma.

Como usadas no presente contexto as expressões "preparação de enzima", "preparação de celulase" e "preparação de endoglicanase" refe- rem-se a qualquer produto de enzima, que contem pelo menos uma endogli- canase ou proteína de fusão endoglicanase da invenção. Assim, uma tal preparação de enzima pode ser um meio de cultura gasto ou filtrado conten- do uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases ou uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases e outras enzimas, uma endoglicanase ou proteína de fusão endoglicanase isolada ou uma mistura de uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endogli- canases ou uma mistura de uma ou mais endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases e uma ou mais outras enzimas. Em adição à atividade endoglicanase, uma tal preparação pode conter aditivos, como estabilizado- res, tampões, conservantes, tensoativos e/ou componentes de meio de cul- tura. Aditivos preferidos são tais, que são comumente usados em prepara- ções de enzima pretendidas para a aplicação, onde a preparação de enzima é usada. A preparação de enzima pode estar na forma de líquido, pulveriza- do ou granulado.

Por "meio de cultura usado" é aqui pretendido o meio de cultura do hospedeiro compreendendo as enzimas produzidas. Preferivelmente, as células hospedeiras são separadas do dito meio após a produção.

A preparação de enzima pode compreender uma ou mais endo- glicanases ou proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção ou outras enzimas celulases junto com uma ou mais endoglicanases ou proteí- nas de fusão endoglicanase da presente invenção. Por exemplo, endoglica- nases tendo diferentes propriedades podem ser combinadas para tornarem a preparação de enzimas mais útil para diferentes condições.

Para obtenção de preparações de enzima da invenção, os hos- pedeiros tendo as desejadas propriedades (ou seja, hospedeiros capazes de expressarem economicamente quantidades exeqüíveis das endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases da invenção) são cultivados sob apro- priadas condições, as desejadas enzimas são secretadas dos hospedeiros no meio de cultura, e a preparação de enzima é recuperada do dito meio de cultura através de processos conhecidos na técnica.

A preparação de enzima pode compreender, em adição à endo- glicanase ou proteína de fusão endoglicanase, uma ou mais outras enzimas, que podem ser, por exemplo, amilases, lipases, proteases, pectinases e/ou oxidases, tais como Iacases e peroxidases. Alternativamente, antes, durante ou após o tratamento com a endoglicanase ou a proteína de fusão endogli- canase da presente invenção, um outro tratamento com enzima pode ser realizado. O tratamento com enzima pode compreender, por exemplo, um ou mais tratamentos com amilase, um ou mais tratamentos com celulase e/ou um ou mais tratamentos com peroxidase e/ou lacase. Quais outras enzimas são incluídas na preparação de enzimas depende da aplicação.

A preparação de enzimas pode ser o meio de cultura com ou sem as células hospedeiras transformadas ou nativas, ou é recuperada do mesmo através de processos bem conhecidos na técnica. Entretanto, devido as endoglucanases ou as proteínas de fusão endoglucanase da invenção serem secretadas nos meios de cultura e mostrarem atividade nas condi- ções ambientes do licor celulolítico, é uma vantagem da invenção que as preparações de enzimas da invenção podem ser utilizadas diretamente do meio de cultura sem ainda nenhuma purificação. Se desejado, tais prepara- ções podem ser Iiofilizadas ou a atividade enzimática de outro modo concen- trada e/ou estabilizada para estocagem. As preparações de enzima da in- venção são muito econômicas para provimento e uso porque (1) as enzimas podem ser usadas em uma forma bruta; isolamento de uma específica enzi- ma do meio de cultura é desnecessário e (2) devido enzimas serem secreta- das no meio de cultura, somente o meio de cultura precisa ser recuperado para obtenção de desejada preparação de enzima; não há necessidade de extrair uma enzima de hospedeiros. Preferivelmente o hospedeiro para uma produção é Trichoderma, e especialmente T. reesei.

As preparações de enzima da invenção podem ser providas co- mo um líquido ou como um sólido, por exemplo, em uma forma líquida, ou granular ou pulverizada seca, especialmente grânulos não-formadores de poeira, ou um líquido estabilizado, ou a preparação de enzima pode ser de outro modo concentrada ou estabilizada para estocagem ou uso. É imagina- do que preparações de enzima contendo uma ou mais das celulases da in- venção podem ser ainda enriquecidas ou feitas parcial ou completamente deficientes em específicas atividades enzimáticas, de modo a satisfazer os requisitos de uma utilidade específica em várias aplicações, por exemplo, na indústria têxtil. Uma mistura de atividades de enzima secretada por um hos- pedeiro e especialmente um hospedeiro fungo, pode ser escolhida para ser vantajosa em uma particular aplicação industrial, por exemplo, bioacaba- mento e biorretificação à pedra.

As preparações de enzima da invenção podem ser ajustadas para satisfazerem os requisitos de específicas necessidades em várias apli- cações na indústria têxtil, de detergente, ou polpa e papel, Combinações podem ser preparadas com outras macro- moléculas que não são necessariamente todas produzidas a partir do mes- mo hospedeiro (por exemplo, outras enzimas tais como endoglucanases, amilases, lipases, proteases, pectinases, e/ou oxidases, tais como Iacases e peroxidases) ou compostos químicos que podem aperfeiçoar a performance, estabilidade, ou tamponamento da desejada preparação de enzima. Grânu- los não-formadores de poeira podem ser revestidos. Preparações de enzima líquidas podem ser estabilizadas através de adição de um poliol tal como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido lático ou ácido bórico, ou cloreto de sódio, de acordo com processos estabelecidos.

Formas protegidas das enzimas da invenção podem ser prepa- radas como descrito na EP 238 216.

As preparações de enzima da invenção podem conter um tenso- ativo que pode ser aniônico, não-iônico, catiônico, anfotérico, ou uma mistu- ra destes tipos, especialmente quando usado como uma composição deter- gente. Composições detergentes úteis são descritas, por exemplo, nos WO 94/07998, Patente US 5 443 750 e Patente US 3 664 961.

Se requerido, uma desejada enzima pode ser isolada, e ainda purificada de acordo com condições convencionais, tal como extração, pre- cipitação, cromatografia, cromatografia de afinidade, eletroforese, ou seme- lhantes. Polipeptídeo isolado neste contexto pode simplesmente significar que as células e restos de células foram removidos do meio de cultura con- tendo o polipeptídeo. Convenientemente os polipeptídeos são isolados, por exemplo, através de adição de polímeros aniônicos e/ou catiônicos ao meio de cultura gasto para aperfeiçoar precipitação de células, restos de células e algumas enzimas que têm indesejadas atividades colaterais. O meio é então filtrado usando um agente de filtração inorgânico e um filtro para remoção de precipitantes formados. Após isto o filtrado é ainda processado usando uma membrana semipermeável para remover excesso de sais, açúcares, e pro- dutos metabólicos.

As preparações de enzima desta invenção são especialmente úteis em indústria têxtil preferivelmente em bioacabamento e em biorretifica- ção à pedra ou em indústria detergente. Outras áreas úteis estão na indús- tria de polpa e papel.

"Bioacabamento" refere-se ao uso de enzimas em uma hidrólise controlada de fibras celulósicas de modo a modificar a superfície de fio ou tecido em uma maneira que previne permanentemente formação de felpa, aperfeiçoa manuseio de tecido como suavidade e maciez, limpa a estrutura de superfície através de redução de formação de cotão, o que resulta em clarificação de cores, aperfeiçoa a capacidade ornamental do tecido, aper- feiçoa capacidade de absorção de umidade e que pode aperfeiçoar também a capacidade de tingimento.

Retirada de felpa enzimática pode ser realizada em qualquer estágio durante processamento úmido têxtil, preferivelmente após retirada de cola e alvejamento. O processo enzimático requer equipamento com sufi- cientes forças de cisalhamento e mistura tal como um guincho de jato ou máquina de lavagem (Nierstrasz V. A. and Warmoeskerken M.M.C.G., 2003).

Bioacabamento é tipicamente realizado em pH de cerca de 4,0- 6,0. A temperatura da reação pode variar de cerca de 30°C a 70°C, e é pre- ferivelmente 50-60°C. A razão de licor (a razão do volume de líquido por pe- so de tecido) pode variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferivelmente de 5:1 a 10:1. O tempo de incubação é genericamente 15 a 90 minutos, preferivel- mente 30 a 60 minutos. A dosagem de enzima depende grandemente do tipo dos tecidos, maquinaria, condições de processo (pH, temperatura, razão de licor, tempo de tratamento, carga de denim, escala de processo) e tipo de preparação de enzima e semelhantes. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir apropriadas dosagens e condições.

As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanase da in- venção são especialmente úteis na indústria têxtil para bioacabamento de tecidos ou peças de roupas, por exemplo, retirada de felpa, retirada de co- tão, clarificação de cor, redução de aspereza, a criação de diferentes aca- bamentos (por exemplo, um efeito de 'pele de pêssego', 'usado', 'lavado com areia', ou 'visual antigo') e bioacabamento de fio (por exemplo, redução de formação de cabelos, aperfeiçoamento de suavidade). As endogiicanases e proteínas de fusão endogiicanases da presente invenção podem ser usadas em bioacabamento em condições ácidas e neutras.

As endogiicanases e proteínas de fusão endogiicanases da pre- sente invenção são úteis em composições detergentes para aperfeiçoamen- to de propriedades de cuidados de tecido através de antiformação de felpa, antiacinzentamento, clarificação de cor e amaciamento, e para aperfeiçoar efeito de limpeza de têxtil, por exemplo, remoção de sujeira.

Lavagem com pedras tem três etapas: retirada de cola, abrasão e pós-tratamento. A primeira etapa, processo de retirada de cola é normal- mente o primeiro tratamento úmido de jeans e significa a remoção de amido ou outros agentes colantes aplicados usualmente aos fios de urdidura para prevenir dano durante o processo de tecedura. Alfa amilases são usadas para remoção de cola baseada em amido para processamento úmido uni- forme e aperfeiçoado. Após retirada de cola os jeans são normalmente rin- sados com água ou continuados diretamente com a etapa de abrasão.

A segunda etapa, abrasão, pode ser realizada com enzimas ou pedras-pomes ou ambos. Em todos os casos ação mecânica é necessária para remover o corante, e o tratamento é usualmente realizado em máqui- nas de lavar, como lavadoras de tambor. O termo "abrasivado" significa aqui a aparência de tecido denim quando ele foi tratado por enzimas celulases ou pedras, ou ambas. Como um resultado de desigual remoção de corante exis- tem contrastes entre áreas tingidas e áreas das quais corante foi removido. Expressões sinônimas são "visual lavado com pedra" ou "visual usado". Em lavagem com pedras enzimática, ou biorretificação à pedra, abrasão com pedras-pomes é completa ou parcialmente eliminada e celulase é adicionada para facilitar a abrasão de corante índigo da superfície de fibra. O tratamento com celulase pode ser feito usando celulases ácidas ou neutras ou ambas.

Abrasão é geralmente seguida pela terceira etapa, pós- tratamento que inclui etapas de lavagem e rinsagem durante as quais deter- gentes, intensificadores óticos ou amaciantes podem ser usados. Após o tratamento enzimático a reação tem de ser interrompida de modo a prevenir dano dos materiais tratados, por exemplo, através de inativação com tempe- ratura e/ou pH, a última compreendendo inteira rinsagem e/ou lavagem de detergente. Isto assegura que a resistência mecânica da fibra não é ainda comprometida pela continuada presença da enzima.

Por "denim" é pretendido, em conexão com esta invenção, teci- do denim, usualmente peças de roupas de denim, particularmente jeans. Vantajosamente o denim é denim tingido com índigo. Denim também pode ser tratado com índigo, com derivados de índigo ou denim tingido com índigo junto com algum outro corante, por exemplo, denim tingido com índigo com fundo de enxofre.

Tratamento com uma celulase(s) pode substituir completamente tratamento com pedras-pomes (por exemplo, 1 kg de enzima comercial vs. 100 kg de pedras). Entretanto, tratamento com celulase pode ser combinado com tratamento com pedras-pomes quando é desejado produzir um acaba- mento pesadamente abrasivado. Um efeito de pele de pêssego no qual uma cobertura fina semelhante a cabelo sobressaindo é criada é também obtido através de uma lavagem combinando uma celulase neutra com pedras- pomes. As celulases desta invenção são especialmente úteis para provimen- to de visual abrasivado e para minimizar contra-manchamento em biorretifi- cação à pedra.

Biorretificação à pedra é tipicamente realizada em pH de cerca de 3,0-8,0, e preferivelmente em pH 4,0-6,0. A temperatura da reação pode variar de cerca de 30 a 70°C e está preferivelmente entre 50-60°C. A razão de licor (a razão do volume de líquido por peso de tecido) pode variar de cerca de 3:1 a 20:1, preferivelmente 5:1 a 10:1. O tempo de tratamento pode variar entre 15-90 minutos e preferivelmente 30-60 minutos. Deve ser enfati- zado que a dosagem de enzima depende grandemente do tipo de tecidos, maquinaria, condições de processo (pH, temperatura, razão de licor, tempo de tratamento, carga de denim, escala de processo) e tipo de preparação de enzima e semelhantes. Se desejado, pedra-pomes podem ser usadas em combinação com as endoglicanases ou proteínas de fusão endoglicanases. A dosagem de enzima requerida então será significantemente menor. Uma pessoa versada na técnica é capaz de definir apropriadas dosagens e condi- ções.

O material têxtil que é tratado com as preparações de enzima da invenção pode ser fabricado de fibras contendo celulose natural ou fibras contendo celulose feitas pelo homem ou suas misturas. Celulósicos naturais são algodão, linho, cânhamo, juta e rami. Exemplos de celulósicos feitos pe- lo homem são viscose, acetato de celulose, triacetato de celulose, raion, cu- pro e lyocell. Os celulósicos mencionados acima também podem ser empre- gados como combinações de fibras sintéticas tais como poliéster, poliamida ou acrílicas. O material têxtil pode ser fio ou malha ou tecido ou formado a- través de quaisquer outros meios.

As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da pre- sente invenção, além de serem especialmente úteis para o tratamento de tecido, são úteis geralmente em qualquer área requerendo atividade celula- se.

Na indústria de polpa e papel, celulases podem ser usadas, por exemplo, em retirada de tinta ou modificação de fibra de diferentes papéis e papelões reciclados tendo pH neutro ou alcalino, no aperfeiçoamento de qualidade de fibra, ou aumento de drenagem em fabricação de papel. Outros exemplos incluem a remoção de espessante de pasta de impressão e ex- cesso de corante após impressão têxtil, e como um tratamento para alimen- tação animal. Por exemplo, se a aplicação pretendida é aperfeiçoamento da resistência da polpa mecânica, então as preparações de enzima da invenção podem prover uma ou mais destas proteínas de modo a aperfeiçoar ou facili- tar a habilidade de fibras de celulose para ligarem-se juntas. Em uma manei- ra similar, na aplicação de refino de polpa, as preparações de endoglicana- ses e proteína de fusão endoglicanase da invenção podem prover uma ou mais destas proteínas em um nível que aperfeiçoa ou facilita tal intumesci- mento.

As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da pre- sente invenção proporcionam inesperadas vantagens quando usadas em indústria têxtil e especialmente em bioacabamento, tal como retirada de fel- pa, e um biorretificação à pedra. As endoglicanases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção são consideravelmente mais eficientes que as celulases da técnica anterior. Em bioacabamento dosagens pelo me- nos quatro vezes menores podem ser usadas. Em outras palavras, maior performance é obtida através de uso de endoglicanases e proteínas de fu- são endoglicanases da presente invenção. Na retirada de felpa as endogli- canases e proteínas de fusão endoglicanases da presente invenção foram mais eficientes e produziram uma superfície uniforme estável.

A invenção é descrita em mais detalhes nos exemplos que se seguem, os quais não são para serem interpretados para estreitamento de escopo da invenção mas somente para clarear o uso da invenção.

Exemplo 1. Cultivo de Acremonium thermophilum ALK04245

A Acremonium thermophilum cepa ALK04245 foi crescida em um bio-reator de 2 litros (Braun Biostat B, Bráun, Melsungen, Germany) no seguinte meio, g/L: Solka Floc cellulose 40, pulverizado de infusão de milho 15, grão usado de destilador 5, xilano usado de aveias 3, goma de feijão al- farroba 3, (NH4)2SO4 5 e KH2PO4 5. A faixa de pH foi 5,2±0,2 (NH3/H2SO4), aeração 1 vvm, agitação 300-600 rpm, controle antiespuma com Struktol e a temperatura 42°C. O tempo de cultivo foi de 4 dias. Após cultivo as células e outros sólidos foram coletados por centrifugação e o sobrenadante foi recu- perado.

Exemplo 2. Purificação de uma endoqlicanase de Acremonium thermophilum ALK04245

O sobrenadante de cultura de Acremonium thermophilum AL- K04245, crescido como descrito no Exemplo 1, foi incubado a 70°C por 24 horas após o que foi concentrado através de ultrafiltração. A endoglicanase pura foi obtida através de purificação seqüencial com interação hidrofóbica e cromatografia de troca de cátions seguida por filtração em gel. A atividade endoglicanase das frações coletadas durante purificação foi determinada usando carboxi metil celulose (CMC) como um substrato (de acordo com o procedimento de IUPAC, 1987).

O sobrenadante de cultura concentrado foi aplicado coluna de interação hidrofóbica HiPrep 16/10 Butyl FF (GE Healthcare) equilibrada com tampão de fosfato de potássio 20 mM, pH 6,0, contendo (NH4)2SO4 1 M. Pro- teínas ligadas foram eluidas com um gradiente linear a partir do tampão aci- ma para fosfato de potássio 5 mM, pH 6,0. Frações foram coletadas e a ati- vidade endoglicanase foi determinada como descrito acima. A atividade en- doglicanase eluiu em uma ampla área de condutividade de 120 a 150 mS/cm.

Frações combinadas foram aplicadas à coluna de troca de cá- tions HiTrap SP XL (GE Healthcare) equilibrada com acetato de sódio 8 mM, pH 4,5. Proteínas ligadas foram eluidas com um gradiente linear de 0 a 0,25 M de NaCI no tampão de equilíbrio. A proteína contendo atividade endogli- canase eluiu na área de condutividade de 3-7 mS/CM. Cromatografia de tro- ca de cátions foi repetida e o eluato de proteína foi concentrado por seca- gem de congelamento.

A amostra dissolvida foi carregada sobre a coluna de filtração de gel Superdex 75 HR10/30 (Pharmacia) equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0, contendo NaCI 0,15 Μ. A principal fração de proteína eluiu da coluna com o volume de retenção de 13,3 mL. O eluato de proteína foi puro como julgado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS e o pe- so molecular foi avaliado ser 40 kDa. A atividade específica da proteína puri- ficada, designada como Acremonium thermophilum EG_40 ou At EG_40 (SEQ ID NO: 2), a 50°C foi determinada ser 450 nkat/mg (de acordo com o procedimento de IUPAC, 1987, supra, usando CMC como um substrato).

A estabilidade térmica da endoglicanase purificada foi determi- nada em diferentes temperaturas. A reação foi realizada na presença de 0,1 mg/mL BSA em pH 5,0 por 60 minutos usando CMC como substrato. EG_40 foi estável até 80°C. As enzimas referência de T. reesei EGI (Cel7B) e EGII (Cel5A) retiveram 100% de sua atividade até 60°C e 65°C, respectivamente.

Para seqüenciamento de aminoácido interno, a proteína de A- cremonium thermophilum ALK04245 EG_40 (SEQ ID NO:2) foi primeiro al- quilada e digerida em peptídeos trípticos. Peptídeos gerados foram dessali- nizados e parcialmente separados através de nano cromatografia líquida (fase reversa). Os peptídeos internos foram seqüenciados por ionização de eletrospray combinada a espectrometria de massa tandem (ESI-MS/MS) usando o instrumento Q-T0F1 (Waters Micromass). As seqüências de pep- tídeo interno assim obtidas são listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Seqüências de peptídeo internas determinadas a partir de celulase EG 40 de Acremonium thermophilum

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Exemplo 3. Clonagem de genes cel45A e cel45B de Acremonium thermophi- lum

Processos padrão de biologia molecular foram usados no isola- mento e tratamentos com enzima de DNA (plasmídeos, fragmentos de DNA), em transformações de E. coli, etc. Os processos básicos são descri- tos nos manuais padrão de biologia molecular, por exemplo, Sambrook, J., et al., 1989 e Sambrook J. and Russell, D.W., 2001.

A biblioteca genômica de Acremonium thermophilum ALK04245 foi construída em vetor Lambda DASH II (Stratagene, USA) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA cromossômico, isolado pelo processo de Raeder and Broda, 1985, foi parcialmente digerido com sau3A. O DNA dige- rido foi fracionado em tamanho em um gel de agarose e os fragmentos de tamanho escolhido (cerca de 5-23 kb) foram isolados, desfosforilados, e li- gados aos braços de vetor Iambda digerido com BamHI. A mistura de liga- ção foi embalados usando Gigapack III Gold packaging extracts de acordo com as instruções do fabricante (Stratagene, USA). O título da biblioteca genômica foi 3,7 x 105 pfu/mL e aquele da biblioteca amplificada foi 4,2x108 pfu/mL

As seqüências de peptídeo internas de uma EG_40 de Acremo- nium thermophilum purificada obtida como descrito no exemplo 2 comparti- lharam homologia com celulases da família glicosil hidrolase 45, tal como endoglicanase de Thielavia terrestris (GenBank Accession Nq CQ827970) e celulase Cel45A de Melanocarpus albomyces (GenBank Accession No. AJ515703). De modo a amplificar uma sonda para seleção do gene codifi- cando EG_40 de A. thermophilum (cel45A; SEQ ID NO: 1) a partir da biblio- teca genômica, primers degenerados foram desenhados nas bases das se- qüências de peptídeos listadas na Tabela 1 (Exemplo 2). A ordem dos peptí- deos na seqüência de proteína e a correspondente natureza sentido ou anti - sentido dos primers foram deduzidos da comparação com a seqüência de Cel45A de M. albomyces homóloga. O iniciador sentido (TA YTGG- GAYGYTGYAARCC, SEQ ID NO: 11) é baseado em aminoácidos 1 a 6 de peptídeo 5 (SEQ ID NO: 9) e o iniciador anti-sentido (RTTRTCNGCRTTYT- GRAACCA, SEQ ID NO: 12) é baseado em uma seqüência de peptídeo (WFQNADN; SEQ ID NO: 13) da proteína Cel45A de M. albomyces homólo- ga. As misturas de reação PCR contiveram Tris-HCI 50 mM, pH 9,0, (NH4)2SO4 15 mM, Triton X-100 0,1%, MgCI2 1,5 mM, dNTPs 0,1 mM, 0,5 μg de cada iniciador, 1 unidade de Dynazyme EXT DNA polimerase (Finnzy- mes, Finland), e aproximadamente 0,5 μg de DNA genômico de Acremoni- um. As condições para reações PCR foram como se segue: 5 minutos de desnaturação inicial a 95°C, seguida por 30 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 mi- nuto de anelamento a 50-60°C, 2 minutos de extensão em 72°C e uma ex- tensão final a 72°C por 10 minutos. Os produtos de extensão foram exami- nados em um gel de agarose.

Dois produtos de PCR foram obtidos a partir da reação PCR de Acremonium. Fragmentos de DNA de cerca de 0,6 kb (SEQ ID NO: 14) e 0,8 kb (SEQ ID NO: 15) foram isolados do gel de agarose e clonados no vetor pCR4-TOPO TA (Invitrogen, USA) resultando em plasmídeos pALK1710 e pALK1711, respectivamente. Os produtos de PCR clonados foram caracteri- zados por seqüenciamento e através de modalidade de hibridizações de Southern blot (como descrito abaixo) para o DNA genômico de Acremonium digerido com várias enzimas de restrição. Os padrões de hibridização obti- dos com os dois fragmentos em condições rigorosas de lavagem sugerem que dois genes endoglicanase putativos podem ser selecionados da bibliote- ca genômica de Acremonium. As seqüências de aminoácidos deduzidas de ambos produtos de PCR têm homologia a várias seqüências de endoglica- nases publicadas de família glicosil hidrolase 45 (BLAST program, National Centerfor Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).

A inserção a partir de plasmídeo pALK1710 e pALK1711 foi iso- lada através de digestão com enzima de restrição e marcada com digoxige- nina de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Germany). Cerca de 1-2x105 placas da biblioteca genômica de Acremonium amplificada foram transferidas sobre filtros de celulose e selecionadas por hibridização usando inserções marcadas com digoxigenina. A temperatura para hibridização foi 68°C e os filtros foram lavados 2x5 minutos em temperatura ambiente usan- do 2 x SSC-O11% SDS seguido por 2 x 15 minutos a 68°C usando 0,1 x SSC-0,1% SDS. Várias placas positivas foram obtidas, das quais cinco pla- cas hibridizando fortemente foram purificadas de ambas seleções. DNAs fago foram isolados e analisados por hibridização de Southern blot. Frag- mentos de restrição de DNAs fago hibridizando para as sondas foram sub- clonados no vetor pBluescript Il KS+ (Stratagene, USA) e as partes relevan- tes foram seqüenciadas. Em ambos os casos o fragmento de fago subclona- do contem o inteiro comprimento de gene de interesse.

A Tabela 2 resume a informação das sondas usadas para sele- ção dos genes endoglicanases, clones fagos dos quais os genes foram iso- lados, fragmentos de restrição escolhidos contendo os genes de inteiro comprimento com suas regiões promotoras e terminadoras, nomes de plas- mídeos contendo o fragmento de fago subclonado, e os números de depósi- to no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH cul- ture collection (DSM) para cepas de E. coli transportando estes plasmídeos. Os depósitos foram feitos sob o Tratado de Budapeste. Tabela 2. Sondas usadas para clonagem dos genes endoqlicanase, clones de fagos e os subclones escolhidos, nomes de plasmídeos e o correspon- dente número de depósito das cepas de E. coli

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Informação relevante dos dois genes, nomeados como At cel45A (SEQ ID NO: 1) e At cel45B (SEQ ID NO: 3), é resumida na Tabela 3 e das respectivas seqüências de proteína deduzidas, At EG_40 (SEQ ID NO: 2) e semelhantes At EG_40, na Tabela 4. As seqüências de peptídeos da endo- glicanase EG_40 de Acremonium purificada foram verificadas na correspon- dente seqüência de aminoácidos deduzida do gene clonado confirmando que um apropriado gene foi clonado.

O gene At cel45A de inteiro comprimento (SEQ ID NO: 1) é de 1076 pb em comprimento, interrompido por dois introns de 59 pb e 123 pb, e codifica um polipeptídeo de 297 aminoácidos At EG_40 (SEQ ID NO: 2). O sítio de clivagem de peptídeo sinal putativo é após Ala21, e o terminus-N da proteína madura começa com Leu22, a proteína madura (incluindo CBD) compreendendo aminoácidos 22 a 297 de SEQ ID NO: 2). A celulase EG_40 tem um domínio de ligação de carboidrato de consenso terminal-C abrigando aminoácidos Lys265 a Leu297 do polipeptídeo de inteiro comprimento. A proteína madura prevista após clivagem de peptídeo sinal tem um peso mo- lecular e pl de 28625 Da e 4,79, respectivamente (predição feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server, Gasteiger et al., 2003). A proteína tem dois sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T (previstos usando o pro- grama NetNGIyc 1.0, Gupta et al., 2004).

Correspondentemente, o gene At cel45B de inteiro comprimento (SEQ ID NO: 3) é de 1013 pb em comprimento, interrompido por dois introns de 155 pb e 102 pb, e codifica um polipeptídeo de 251 aminoácidos seme- lhante a EG_40 (SEQ ID NO: 4). O sítio de clivagem de peptídeo sinal puta- tivo é após Ala20, e o terminus-N da proteína madura começa com Gln21, a proteína madura compreendendo aminoácidos 21 a 251 de SEQ ID NO: 4).

A celulase semelhante a EG_40 não tem domínio de ligação de carboidrato consenso terminal-C. A proteína madura prevista após clivagem de peptídeo sinal tem um peso molecular e pl de 23972 Da e 6,11, respectivamente (pre- dição feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server, Gasteiger et al., 2003). A proteína tem dois sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T (previs- to usando o programa NetNGIyc 1.0, Gupta et al., 2004).

Tabela 3. Resumo dos genes endoqlicanase isolados de Acremonium ther- mophilum ALK04245

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(a O códon de interrupção é incluído. (b o códon de interrupção não é incluído.

Tabela 4. Resumo das seqüências de endoqlicanases deduzidas de Acre- monium thermbphilum ALK04245. ss, seqüência sinal

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(a O previsão sobre a seqüência sinal foi feita usando o programa SignaIP V3.0 (Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); o valor NN foi obtido usan- do redes neurais e valor HMM usando modelos Markov ocultos. (b Presença de um domínio de ligação de carboidrato na proteína, os amino- ácidos do CBD terminal-C são indicados (numeração de acordo com o poli- peptídeo de inteiro comprimento).

(c A seqüência sinal prevista não é incluída. Predição foi feita usando o Compute pl/MW tool at ExPASy server (Gasteiger et al., 2003).

(d Os sítios de N-glicosilação putativos N-X-S/T foram previstos usando o programa NetNGIyc 1.0 (Gupta et al., 2004, em preparação; www.cbs.dtu.dk/services/NetNGIvc/).

As seqüências de proteínas deduzidas das celulases semelhan- te a EG_40 e EG_40 de A. thermophilum são similares a celulases de glico- sil hidrolase família 45 (Tabela 5). As homologias de seqüências mais próxi- mas encontradas para EG_40/Cel45A e semelhante a EG_40/Cel45B foram seqüências de endoglicanase de Thielavia terrestris (GenBank Accession Ns CQ827970) e Myceliophthora thermophila (GenBank Accession N9 AR094305), respectivamente. Os alinhamentos foram realizados usando o programa Needle do pacote de programas EMBOSS.

Tabela 5. Comparação das seqüências de proteína deduzidas das celulases EG 40 e semelhante a EG 40 de Acremonium thermophilum com suas con- trapartes homólogas

<table>table see original document page 33</column></row><table> Exemplo 4. Produção de celulases semelhante a EG 40 e EG 40 de Acre- monium thermophilum em Trichoderma reesei

Plasmídeos de expressão foram construídos para produção das celulases semelhante EG_40/Cel45B e EG_40/Cel45A de A. thermophilum recombinantes. Ambos os genes (cel45A ou cel45B), incluindo sua própria seqüência sinal, foram exatamente fundidos ao promotor cbh1 (cel7A) de T. reesei através de PCR (Tabela 6). O promotor cbh1, terminador cbh1 e gene marcador amdS foram incluídos como descrito em Paloheimo et al. 2003, supra. O cassete de expressão linear (Figura 1) foi isolado da cadeia princi- pai de vetor através de digestão com enzima de restrição, transformado em T. reesei A96, e transformantes selecionados com acetamida como a única fonte de nitrogênio. A cepa hospedeira carece de quatro principais celulases endógenas: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B e EGII/Cel5A. As trans- formações foram realizadas de acordo com Penttilã et al., 1987, com as mo- dificações descritas em Karhunen et al., 1993. Os transformantes foram puri- ficados sobre placas de seleção através de conidia simples antes de esporu- lação dos mesmos sobre agar extrato de batata.

Tabela 6. Os cassetes de expressão construídos para produção de celulases semelhante EG 40 e EG 40 de Acremonium thermophilum em Trichoderma reesei. A estrutura esquemática dos cassetes de expressão é descrita na Figura 1

<table>table see original document page 34</column></row><table>

(a O cassete de expressão para transformação de T. reesei foi isolado da cadeia principal de vetor através de digestão com EcoRI ou Notl.

(b O número de nucleotídeos após o códon de interrupção do gene clonado que são incluídos no cassete de expressão é indicado. O sítio de restrição na região-31 do gene que foi usado em construção do cassete de expressão é indicado em parênteses.

A produção de endoglicanase dos transformantes foi analisada a partir de sobrenadantes de cultura de cultivos em frascos de agitação (50 mL). Os transformantes foram crescidos por 7 dias em um meio de indução de celulose complexo (Joutsjoki et al., 1993) tamponado com KH2PO4 5% em pH 5,5. A atividade de enzima da proteína recombinante foi medida a partir do sobrenadante de cultura como a liberação de açúcares redutores de carboxi metil celulose (CMC 2%) a 50°C em tampão Sitrate 50 mM pH 4,8 essencialmente como descrito por Bailey, M.J. e Nevalainen, K.M.H., 1981; Haakana, H. et al., 2004. Produção da proteína recombinante também foi detectada a partir do sobrenadante de cultura por eletroforese de gel de po- liacrilamida - SDS. Anticorpos policlonais específicos para EG_40 foram produzidos em coelhos (University of HeIsinki1FinIand). A expressão de ce- Iulase EG_40 foi verificada por análises de Western blot com anticorpos anti- EG_40 usando o sistema ProtoBIot Western blot AP (Promega). Os genóti- pos dos transformantes escolhidos foram analisados por Southern blotting usando o cassete de expressão como uma sonda.

O pH ótimo das celulases semelhante EG_40/Cel45B e EG_40/Cel45A produzidas heterologamente foi determinado no tampão de Mcllvaine universal dentro de uma faixa de pH de 4,0-8,0 usando CMC como um substrato. Como mostrado na Figura 2A, a faixa de pH de celulase EG_40/Cel45A é relativamente ampla (4,5-6,0), o ótimo estando em pH 5,5. O pH ótimo para semelhante a EG_40/Cel45B foi determinado ser pH 5,0- 5,5. A temperatura ótima para atividade enzimática de celulases EG_40/Cel45A e semelhante a EG_40/Cel45B foi determinada ser 75-80°C e 60°C, respectivamente (Figura 2B). A estabilidade térmica da celulase EG_40/Cel45A produzida heterologamente é comparável àquela da proteína purificada.

Os transformantes escolhidos RF6118 (At EG_40) e RF6071 (semelhante a At EG_40) foram cultivados em um bio-reator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação (ver exemplos 8 a 13). Exemplo 5. Construção e produção de celulases EG 40 modificadas de A- cremonium thermophilum

Processos de biologia molecular padrão foram usados como descritos em Exemplo 3. A seqüência sinal de celulase EG_40 foi substituída com aquela de Trichoderma reesei CBHI. O uso da seqüência sinal endóge- na de hospedeiro foi esperado aperfeiçoar a produção de proteína heterólo- ga. De modo a amplificar o fragmento 5' do gene At cel45A dois oligonucleo- tídeos foram desenhados. O iniciador sentido (attaaccgcggactgcgcatcatgtatcggaagttggccgtcatctcgg

CCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCCCTCGACGGAAAGTCGAC, SEQ ID NO: 22)

contém a seqüência sinal de cel7A de T. reesei e o iniciador anti-sentido (TCGACTGCACCACCATGGTC, SEQ ID NO: 23) é específico para At ceí45A. O

gene de inteiro comprimento foi reconstituído por ligação do produto de PCR amplificado como um fragmento Sacll-Ncol com a extremidade 3' do gene At cel45A.

Subseqüentemente, o domínio de ligação de carboidrato de EG_40/Cel45A foi modificado: Três construtos foram preparados contendo o domínio catalítico de EG_40/Cel45A (aminoácidos 22-234 de SEQ ID NO: 2) ligado à região iigante e CBD de Trichoderma reesei CBHI/Cel7A (SEQ ID NO: 24), Acremonium thermophilum ALK04245 XYN60/Xyn10A (SEQ ID NO: 25), ou Chaetomium thermophilum ALK04265 CBHI/Cel7A (SEQ ID NO: 26). O Iigante e região CBD do gene codificando CBHI/Cel7A de T. ree- sei (cel7A, SEQ ID NO: 27), gene codificando ALK04245 XYN60/Xyn10A de A. thermophilum (xynlOA, SEQ ID NO: 28), ou gene codificando CBHI/Cel7A ALK04265 de C. thermophilum (cel7A, SEQ ID NO:29) foi amplificado por PCR usando combinações de oligonucleotídeos de cggcggcaac (seq id no: 30) + taattctgca-

GTTACAGGCACTGAGAGTAG (SEQ ID NO: 31), or TTGGATCCGA- TAATTCTGCAGTCACAGGCAQTGAGAGTACCAGT (SEQ ID NO: 33), ou TAATTTACGTACCTGGCCTTGACGGCAG (SEQ ID NO: 34) + attaactgcagttacaggcactgttgagca (seq id no: 35), respectivamente. Os produtos de PCR amplificados foram ligados ao gene cel45A para criação de genes Atcel45SA_Tr cel7AligadorCBD (SEQ ID NO: 36), At cel45A_At xynl OAIigadorCBD (SEQ ID NO: 37), ou At cel45A_Ct cel7Aligador CBD (SEQ ID NO: 38). Os plasmídeos resultantes foram denominados como pALK2022, pALK2024, e pALK2026. Os números de depósitos das corres- pondentes cepas de E. coli no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH culture collection são DSM 18815, DSM 18816, e DSM 18817, respectivamente. Os depósitos foram sob o Tratado de Buda- peste.

Plasmídeos de expressão para a produção de proteínas EG_40/Cel45A modificadas foram construídos e as proteínas recombinantes EG_40_TrCBD (SEQ ID NO: 39), EG_40_AtCBD(SEQ ID NO: 40), e EG_40_CtCBD (SEQ ID NO: 41) foram produzidos em Trichoderma como descrito no Exemplo 4. A temperatura e pH ótimos das celulases EG_40/Cel45A modificadas foram similares àqueles da proteína tipo selva- gem. Os transformantes escolhidos RF6828 (EG_40_TrCBD), RF6835 (EG_40_AtCBD), e RF6821 (EG_40_CtCBD) foram cultivados em um bio- reator de 2 litros por quatro dias (28°C, pH 4,2) para obter material para os testes de aplicação (Exemplos 9 e 13).

Exemplo 6. Construção e produção de celulases EG 40 ALKQ4245 de A- cremonium thermophilum carecendo de domínio de ligação de carboidrato ou domínio de ligação de carboidrato plus a região Iiqante

Para produzir celulases EG_40 ALK04245 Acremonium thermo- philum carecendo de domínio de ligação de carboidrato (CBD), dois cons- tructos de supressão de cel45A, At cel45A_sem CBD, ou o CBD plus a regi- ão ligante, At cel45A_ligante sem CBD foram feitos; a primeira carecendo de região codificando o CBD e a segunda adicionalmente carecendo de região ligante entre o núcleo catalítico e o domínio de ligação de carboidrato.

Processos padrão de biologia molecular foram usados como descrito no Exemplo 3. Dois fragmentos-3' de diferentes comprimentos do gene cel45A foram amplificados por PCR. Os iniciadores anti-sentido foram desenhados para excluírem o CBD ou a região ligante + CBD a partir do produto. Um produto PCR amplificado com iniciadores GCAGCAAC- CAGTTCGACCTC (SEQ ID NO: 42) e TTAACTGCAGTCACTGGGCAGTG- CAGCCACCGCCTC (SEQ ID NO: 43) foi ligado como um fragmento Saci- Pstl e um outro fragmento de PCR amplificado com iniciadoires ACTGCTG- CAAGCCGTCCTGC (SEQ ID NO: 44) e TTAACTGCAGTCAACCGC- TAGGCGGGTTGAAGACGGGATAG (SE IN NO: 45) como um fragmento Ncol-Pstl para o fragmento 5' do gene cel45A para reconstituir inteiro com- primento de genes At cel45A_sem CBD (SEQ ID NO: 16) e At cel45AJigante sem CBD (SEQ ID NO: 18), respectivamente. Os plasmídeos resultantes foram nomeados como pALK2009 e pALK2014. Os números de depósitos das correspondentes cepas de E. coli no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen BmbH culture collection são DSM 18813, e DSM 18814, respectivamente. Os depósitos foram feitos sob o Tratado de Budapeste.

Plasmídeos de expressão para a produção das versões sem CBD e Iigante sem CBD de celulase EG_40/Cel45A de A. thermophilum fo- ram construídos e as proteínas recombinantes (SEQ ID NO: 17 e 19, respec- tivamente) foram produzidas em Trichoderma como descrito no Exemplo 4. Exemplo 7. Construção e produção da proteína de fusão CBD + semelhante a EG 40 ALK04245 Acremonium thermophilum recombinante

Para produção de uma proteína de fusão CBD + semelhante EG_40 ALK04245 Acremonium thermophilum (SEQ ID NO: 21), o domínio de ligação de carboidrato (CBD) da celulase EG_40/Cel45A é ligado à celu- lase semelhante a EG_40. O constructo contem o domínio catalítico de se- melhante a EG_40 (aminoácidos 1-242 do polipeptídeo de inteiro compri- mento) ligado à região Iigante e CBD de celulase EG_40 (aminoácidos 235- 297 do polipeptídeo de inteiro comprimento).

Processos padrão de biologia molecular são usados como des- crito no Exemplo 3. Primeiro, um sítio de restrição Nrul único próximo de ex- tremidade terminal-C da seqüência semelhante a EG_40 é introduzido por PCR. Isto permite fusão direta de qualquer DNA de extremidade embotada após aminoácido S242 do polipeptídeo semelhante a EG_40. A região Iigan- te + CBD do gene codificando EG_40 (cel45A) é amplificada por PCR e um seu fragmento de restrição ligado ao gene cel45B (após S242) para criar At cel45B_cel45AligadorCBD (SEQ ID NO: 20). Plasmídeo de expressão para produção da celulase semelhante a EG_40CBD é construído e a proteína recombinante (SEQ ID NO: 21) produzida em Trichoderma como descrito no Exemplo 4.

Exemplo 8. Performance de preparação de celulase EG 40 em acabamento de denim em diferentes temperaturas

Celulase EG_40 de Acremonium thermophilum da cepa RF6118 produzida usando Trichoderma reesei como hospedeiro como descrito no exemplo 4 foi testada para sua habilidade para criar visual abrasivado similar àquele provido por pedras-pomes em biorretificação à pedra de denim em diferentes temperaturas. Uma preparação enriquecida com EGII comercial produzido usando Trichoderma como hospedeiro (US 5 874 293) eficiente em acabamento de denim foi usada para comparação a 50°C.

Jeans fabricados de sarja de denim tingido com índigo foram usados como material teste após retirada de cola com alfa amilase ECOS- TONE A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 7.

O concentrado de enzima estabilizado enriquecido com EGII foi dosado em 0,23% sobre o peso do tecido, que é uma dosagem típica para a preparação em aplicações industriais. Uma preparação de EG_40 estabili- zada e concentrada obtida de uma fermentação piloto foi dosada em 0,18%. Quando calculadas [como proteína] em termos do teor de proteína, as dosa- gens foram aproximadamente 0,20 mg e 0,035 mg por g de tecido usando o Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent (BioRad, Hercules, CA1USA) e gama globulina bovina como o padrão. A enzima celulase foi inativada após dre- nagem através de elevação de pH acima de 11 através de uma adição de 5 g de NaOH (10 minutos, 40°C) e rinsagem três vezes. Os jeans foram seca- dos em uma báscula.

O efeito de biorretificação à pedra / nível de abrasão foi avaliado através de medição de cor como valores de refletância com espectrofotôme- tro Minolta CM 2500 usando coordenadas de espaço cor L*a*b* (iluminador D65/20). A cor do lado de face e o lado reverso de denim foi medida após retirada de cola (isto é, antes de tratamento com celulase) e após o trata- mento com celulase. Cada valor de medição sobre o lado de face de denim foi uma média de aproximadamente 40 medições. Dois pares de jeans foram usados em cada teste e o resultado final foi a média dos mesmos. Os resul- tados são mostrados na Tabela 8 e Fig. 3.

Tabela 7. As condições de teste / parâmetros de processo usados em trata- mentos com celulase

<table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> Tratamento com preparação enriquecida com EGII foi usado pa- ra comparação em 50°C. L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarela.

Resultados na Tabela 8 e Fig. 3 mostram que o efeito de biorreti- ficação à pedra de EG_40foi muito bom em uma baixa faixa de dosagem. Com o nível de abrasão similar a preparação de EG_40 (suavidade L*) com- parado à preparação enriquecida com EGII foi obtida a 50°C com uma quan- tidade de proteína 6 vezes menor.

Exemplo 9. Performance de celulases EG 40 modificadas em acabamento de denim

Celulases EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas produzidas em Trichoderma reesei como descrito no Exemplo 5 foram testa- das para sua habilidade para criarem visual abrasivado similar àquele provi- do por pedras pomes em biorretificação à pedra de denim. Proteínas recom- binantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, e EG_40_CtCBD foram compara- das a celulase EG_40 tipo selvagem (Exemplo 4).

Pernas de denim fabricadas de denim tingido com índigo de dife- rente tipo foram usadas como material teste após retirada de cola com alfa amilase ECOSTONE A200. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 9.

Preparações de celulase foram dosadas em 200 nkat/g sobre o peso de tecido. A atividade endoglicanase foi medida como no Exemplo 4, exceto que CMC 3% e 60°C foram usados. A enzima celulase foi inativada após drenagem através de elevação de pH acima de 11 com adição de 4,2 g de NaOH (10 minutos, 40°C) e rinsando três vezes. As pernas de denim fo- ram secadas em um tambor.

O efeito de biorretificação à pedra / nível de abrasão foi avaliado através de medição de cor sobre o lado de face de denim como no Exemplo 8. Cada valor de medição sobre o lado de face de perna de denim foi uma média de aproximadamente 20 medições. O resultado final foi a média de três diferentes denims de Ukos Sport, Belgium (Intrique, Atlanta, Nostalgy). Os resultados são mostrados na Tabela 10.

Tabela 9. As condições de teste / parâmetros de processo usados em trata- mentos com celulase

<table>table see original document page 43</column></row><table> Tabela 10.Melicoes de cor do lado de face de denim tratado com diferentes celulases EG 40 a 60°C e pH5

<table>table see original document page 44</column></row><table> Os resultados na Tabela 10 mostram que o efeito de biorretifica- ção à pedra das preparações de EG_40 modificada foi comparável àquele obtido através do uso de preparação de EG_40 contendo celulase tipo selvagem.

Exemplo 10. Reforço de performance de lavagem de preparação de enzima enriquecida com EGII com celulase EG 40 em acabamento de denim

O efeito da celulase EG-40 com preparação enriquecida com EGII foi testado em biorretificação à pedra de denim. O denim e sistema de teste para biorretificação à pedra foram como no Exemplo 8, exceto a tem- peratura, que foi de 50°C. Também o efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 8. Preparações de enzima foram dosadas em 3-5 gramas resultando em 0,22-0,38% sobre o peso do tecido (Tabela 11).

Os resultados na Tabela 11 e Fig. 4 mostram que EG_40 tam- bém pode ser usada para aperfeiçoar o efeito de abrasão de uma prepara- ção enriquecida com EGII. Com a preparação enriquecida com EGII sozinha níveis de suavidade similares àqueles obtidos pela mistura contendo 70% do concentrado enriquecido com EGII e 30% de concentrado de celulase EG_40 não podem ser obtidos mesmo com uma dosagem aumentada. Tabela 11. Medicoes de cor do lado de face denim tratado a 50°C com mistura de preparacoes de EG 40 e enriquecida com

EGII comparado a enriquecida com EGII sozinha

<table>table see original document page 46</column></row><table>

a) sobre o peso do tecido

b) L* indica a suavidade,-b* e a direcao azul, +b* e a direcao amarelo. Exemplo 11. Performance de preparação de celulase semelhante a EG 40 em acabamento de denim

Líquido de fermentação semelhante a EG_40 de cepa RF6071 produzido como descrito no Exemplo 4 a um concentrado enriquecido de EGII em biorretificação à pedra de denim. O denim e sistema de teste para biorretificação à pedra foram como no Exemplo 8, exceto para a temperatu- ra, que foi de 60°C e a quantidade de denim, que foi nivelada para 1430 g com uma peça extra de denim diferente que não foi incluída nas medições. Também o efeito do tratamento com celulase foi avaliado como no Exemplo 8.

Os resultados na Tabela 12 mostram que o efeito de abrasão de semelhante a EG_40 foi obtido com menos contramanchamento (redeposi- ção de corante índigo) sobre o lado reverso de denim. Especialmente a sua- vidade dos bolsos foi maior e eles foram menos azuis. <table>table see original document page 48</column></row><table> Tratamento com preparação enriquecida de EGII foi usado para comparação. L* indica a suavidade, -b* é a direção azul, +b* é a direção amarelo.

Exemplo 12. Performance de preparação enriquecida de EGII e EG 40 re- forçada com EG 40 em bioacabamento (retirada de felpa)

A habilidade da preparação RF6118 EG_40 concentrada e a ha- bilidade de preparação enriquecida de EGII reforçada com EG_40 em retira- da de felpa de roupa de malha de algodão foram comparadas a uma prepa- ração enriquecida de EGII comercial, tipicamente usada em formulações de bioacabamento. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wacator FOM 71 CLS sob as condições descritas na Tabela 13.

Peças de dois tipos de suéteres de colarinho pólo azuis de baixa qualidade com superfície penugenta, fabricadas de tecido baseado em jérsei de algodão 100% ou fabricadas com nervura de 95% de algodão e 5% de lycra, foram usadas como material teste. Material de enchimento foi adicio- nado até 1 kg. Amostras foram primeiro pré-lavadas por 10 minutos a 60°C com 1 mUL tensoativos / agentes umectantes (Sandoclean PCJ de Sandos and Imacol CN de Clariant) e rinsadas 3 vezes. Após isto as malhas de al- godão foram tratadas com celulase a 60°C por 60 minutos na presença dos mesmos auxiliares têxteis usados em pré-lavagem. A enzima foi inativada como descrito no Exemplo 8, exceto para a temperatura que foi 60°C duran- te a rinsagem alcalina, e as peças de malha foram rinsadas três vezes e se- cadas no tambor.

Tabela 13. As condições de teste / parâmetros de processo usados em tra- tamentos de bioacabamento

<table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table>

O efeito do tratamento com celulase foi avaliado visualmente com o olho nu e com uma lupa. Amostra pré-lavada sem enzima foi usada como controle. Os resultados são mostrados na Tabela 14 e fotos de câmera digital tomadas com uma macroobjetiva são mostradas na Fig. 5.

A preparação de EG_40 e a preparação enriquecida de EGII re- forçada com EG_40 tiveram excelentes propriedades de retirada de felpa comparadas à preparação enriquecida de EGII comercial que foi usada em faixa de dosagem típica para este concentrado de enzima na aplicação de bioacabamento. Com a preparação de EG_40 dosagem pelo menos 8 vezes menor e com a mistura de EG_40 - enriquecida de EGII em dosagens pelo menos 4 vezes menores podem ser usadas que com a preparação de EGII para obter efeito similar.

Os níveis de proteína no sobrenadante de cultura de bio-reator são um pouco menores com a cepa RF6118 que a cepa produtora de Tri- choderma da preparação enriquecida de EGII, quando ensaiados com o en- saio de determinação de proteína usado. A despeito disto, o meio de cultura de EG_40 é volumetricamente pelo menos 4-6 vezes mais efetivo em bioa- cabamento.

Tabela 14. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com prepara- ções enriquecidas de EGII e EG 40 reforçadas com EG 40 comparadas com enriquecida de EGII sozinha

<table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table>

a) sobre o peso de tecido

b) +++++ excelente efeito de retirada de felpa, superfície visualmente muito limpa

+++ efeito de retida de felpa bom, superfície visualmente relativamente limpa - densa formação de cotão de superfície / e/ou severa formação de felpa

Exemplo 13. Performance de celulases EG 40 modificadas em bioacaba- mento (retirada de felpa)

Celulases EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas produzidas em Trichoderma reesei como descrito no exemplo 5 foram testa- das para sua habilidade em retirada de felpa de roupa de malha de algodão. Proteínas recombinantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, e EG_40_CtCBD foram comparadas a celulase EG_40 tipo selvagem. Os tratamentos com celulase foram realizados com extrator lavador Electrolux's Wascator FOM 71 CLS sob as condições descritas no exemplo 12, exceto que a enzima foi dosada em 83 nkat/g de tecido. Atividade endoglicanase foi medida como descrito no Exemplo 9.

Peças de três diferentes roupas de malha com superfície coberta de cotão, fabricadas de 100% algodão ou 95% algodão e 5% lycra, foram usadas como material de teste. Material de enchimento foi adicionado até 1 kg. Amostras foram tratadas como descrito no Exemplo 12. O efeito do tra- tamento com celulase foi avaliado visualmente com o olho nu e com uma lupa. Amostra pré-lavada sem enzima foi usada como controle. Os resulta- dos são mostrados na Tabela 15.

Todas as preparações de EG_40 tiveram excelentes proprieda- des de retirada de felpa conduzindo a extensiva redução em cobertura de cotão e prevenção da formação de felpa. Amostras controles, tratadas sem enzima contiveram densa superfície coberta de cotão e severa formação de felpa.

Os testes preliminares realizados a 50°C e 30 minutos usando dosagem de enzima de 42 nkat/g de tecido mostraram que todas as diferen- tes celulases EG_40 também tiveram considerável efeito de retirada de fel- pa, quando menores dosagens e/ou tempo de reação menor é usado.

Tabela 15. Os resultados de tratamentos de bioacabamento com diferentes celulases EG 40

<table>table see original document page 52</column></row><table>

+++++ excelente efeito de retirada de felpa, superfície visualmente muito limpa

- densa superfície coberta de cotão / e/ou severa formação de felpa

Lista de organismos depositados

Acremonium thermophilum ALK04245 foi depositado no Cen- tralbureau Voor Schimmelcultures at Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, the Netherlands (CBS) em 20 de setembro de 2004 sob CBS 116240.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK1908 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany em 13 de maio de 2005, sobDSM 17324.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK1904 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 13 de maio de 2005, sobDSM 17323.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2009 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novem- bro de 2006, sob DSM 18813.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2014 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novem- bro de 2006, sob DSM 18814.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2022 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novem- brode2006, sobDSM 18815.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2024 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novem- bro de 2006, sob DSM 18816.

Escherichia coli ontendo plasmídeo pALK2026 foi depositado em Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany em 24 de novem- bro de 2006, sob DSM 18817. Referências

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<110> AB Enzymes Oy

<120> Enzimas

<130> 2052060PC

<160> 45

<170> PatentIn versão 3.2

<210> 1

<211> 2334

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> η representa a, t, c, ou g

<220>

<221> CDS

<222> (715)..(797)

<220>

<221> Intron

<222> (798)..(856) <220>

<221> CDS

<222> (857)..(1105)

<220>

<221> Intron

<222> (1106)..(1228) <220>

<221> CDS

<222> (1229)..(1787)

<400> 1

tctgtctctt gtntcagaac agatctcctg gcggcctgct ttgccggtcc gaattgcgat 60 cgatgcaacg tcgattgcat acgagctaag cccgtctcgt gataaccgca aggggtcttc 120 cgagtttctg tctgcgaccc aggcattttc cgatttgtgt gcggggaccc aactgtcttc 180

tggggagtac ctggtgacaa aagcacagat aaacagatgg atgacggtat tgctgtgata 240

tcgccgtggc gctgaatcct ttctcttcgc taccaagata tttattcccc gttgtgaaat 300

cttctattca gcccatccca tccggcaaca cgcatctgct tttcgttccg gcattccgat 360

acctggttcc tggagtgcct accgagcctc gcttcctggg atcgggcgtt gcaccccgcc 420

aaaccctatg ccccaaacgg tacggacaag gatgccggac cccggttttg tccagaaagg 480

ttgcattcct acccacctcg ctggagccac aacatgcaga tcaccgcccg agggaggaca 540

tgtgtggtgc agggacgttg gcaactctgc tgtgtctgaa gtatatgagg ccgatggttc 600

tccttgcaca aagcagagaa tggagtagcc agctcctcct caccagagtc gcctttgcag 660

cgtctcggca ttgcaggctc cccatcgtca gcatttcact tctcagcaac gaac atg 717

Met 1

cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc gct ctg cct ctg 765 Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu

5 10 15

age gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag gtatgccaat cctcgtacct 817 Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg

20 25

ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag a tac tgg gac tgc tgc 872

Tyr Trp Asp Cys Cys

30

aag ccg tcc tgc ggc tgg ccg gga aag gcc tcg gtg aac cag ccc gtc 920

Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val 35 40 45

ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc ate age gac ttc aac gcg aag 968

Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys 50 55 60 65

tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc gcc gac cag acg ccc 1016 Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro

70 75 80

tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc gca gcc acg gcc ate 1064 Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile 85 90 95

gcc ggc ggc tcc gag tcc age tgg tgc tgc gcc tgc tat gc Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala 100 105 110

gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt gcaggccgct tcccccctac ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tçgggcatcc gagctaagtt gcgtgtcgtc cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg ggc aag acc atg gtg gtg Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val 115 120 125

cag tcg acc age acc ggc ggc gac ctg ggc age aác cag ttc gac ctc Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu

130 135 140

gcc ate ccc ggc ggc ggc gtg ggc ate ttc aac ggc tgc gcc tcc cag Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln 145 150 155

ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc ggc ate age gac cgc age Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser

160 165 170

cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag ccg ggc tgc cag tgg cgc Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg 175 180 185 190

ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc acc ttc acc ttc cag cgc Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg 195 200 205

gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc acg ggc tgt aag cgc gac Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp

210 215 220

gac gac gcc age tat ccc gtc ttc aac ccg cct age ggt ggc tcc ccc Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro 225 230 235

age acc acc age acc acc acc age tcc ccg tcc ggt ccc acg ggc aac Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn

1105

1165 1225 1274

1322

1370

1418

1466

1514

1562

1610

1658 240 245 250

cct cct gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag aag tgg gcc cag tgc ggc 1706

Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly 255 260 265 270

ggc act ggc ttc acg ggc tgc acc acc tgc gtc tcg ggc acc acc tgc 1754

Gly Thr Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys

275 280 285

cag gtg cag aac cag tgg tat tcc cag tgt ctg tgagcgggag ggttgttggg 1807 Gln Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295

gtccgtttcc ctagggctga ggctgacgtg aactgggtcc tcttgtccgc cccatcacgg 1867 gttcgtattc gcgcgcttag ggagaggagg atgcagtttg agggggccac attttgaggg 1927 ggacgcagtc tggggtcgaa gcttgtcggt tagggctgcc gtgacgtggt agagcagatg 1987 ggaccaagtg cggagctagg caggtgggtg gttgtggtgg tggcttacct tctgtaacgc 2047 aatggcatct catctcactc gcctgctccc tgattggtgg ctctgttcgg cctggcgctt 2107 tttgggaccg ctggctggaa tggattgctc cggaacgcca ggttgagctg ggctggcgcg 2167 agtagattgg ccgctccgag ctgcaaccat aataaaattt tcggaccctg taagccgcac 2227 ccgaccaggt ctccattggc ggacatgcac gacgtccttc gcaggcacgg cctgcccgcc 2287 tctgatcacc cgcagttttc gtaccgtcag accagataca agccccg 2334

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 2

Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro 1 5 10 15

Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

20 25 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro 35 40 45

Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala 50 55 60 Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr 65 70 75 80

Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu

100 105 110

Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser

115 120 125

Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile

130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly 145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln

195 200 205

Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp

210 215 220

Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr 225 230 235 240

Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr

260 265 270

Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val

275 280 285

Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu

290 295

<210> 3

<211> 2033 DNA

Acremonium thermophilum CDS

(259)..(702)

Intron (703) ..(857)

CDS

(858).. (888)

Intron (889)..(990)

<212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220>

<221> CDS

<222> (991)..(1268)

<400> 3

ctcgaggaga ggaaccgagt ttgaaagatg ctatatatcg cgccctgtcc gctctcttgc attccccctg ttgatgagac aaaagatccg tcgccgagat ttcaccagtg gtaagtcccg caatatgagt gtcaaagcta tgggtcctaa caaagaagga agaataacag cagcaaag atg cgt ctc cca cta ccg

Met Arg Leu Pro Leu Pro

1 5

ttg ccc tac tac ctc gaa gtg tcc gct cag ggg

Leu Pro Tyr Tyr Leu Glu Val Ser Ala Gln Gly

15 20

acg aca aca cgt tac tgg gat tgc tgc aag ccg

Thr Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro 30 35

ctg aag ggc aat tcg ccc age ccg gtg cag act

atagactacc ggcgtcgcct 60 gagacaaaat tcctggttag 120 agaattggtc attcgacgtt 180 agcaagagct ttaaagagac 240 act ctg ctc gcc ctc 291

Thr Leu Leu Ala Leu 10

gea tcc gga acc ggc 339

Ala Ser Gly Thr Gly 25

age tgc gcg tgg cct 387

Ser Cys Ala Trp Pro 40

tgc gac aag aat gac 435 Leu Lys Gly Asn Ser Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp

45 50 55

agg ccg ctg aac gat ggg gga aac acc aag tcc ggc tgc gac aac ggt 483

Arg Pro Leu Asn Asp Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly

60 65 70 75

ggc ggg gcc ttc atg tgc tca tcc cag agt ccc tgg gcc gtc aat gag 531

Gly Gly Ala Phe Met Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu

80 85 90

acc acc age tac ggc tgg gea gcc gtt cgt ate gcc ggc agt acc gag 579

Thr Thr Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu 95 100 105

tcg gcc tgg tgc tgt gcc tgc tac gag ctc acc ttc acc agt ggg ccc 627

Ser Ala Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro 110 115 120

gtc agt gga aag aag ctc ata gtc cag gcc acg aac act ggt gga gac 675

Val Ser Gly Lys Lys Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp

125 130 135

ctt ggg age aac cac ttt gac ctt gcg gtatgtgggg tttttctttc 722

Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Ala

140 145

ttcatcatcg ctctcaccat ggattcctcg gcgcaaggac caagattgag aagcgtcaat 782 gccgggttgg acacgggagc cgggatagga acacagaggc cgtttaagac cgtcagctga 842 cagcagagca attag att ccc gga ggt ggt gtt ggt cag tcc aat g 888

Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn

150 155

gtaggttcct tccctgaagt accggcaaca gcctgtgcgt tgctgtatac cccttttaat 948 catagcatct tcctgctgga tacaagccaa cccattttct ag ct tgc acg aac 1001

Ala Cys Thr Asn 160

cag tat ggt gcg ccc ccg aac ggc tgg ggc gac agg tat ggt ggc gtg 1049 Gln Tyr Gly Ala Pró Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val 165 170 175 - cac tcg cgg age gac tgc gac age ttc ccc gcg gcg ctc aag gcc ggc 1097

His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly

180 185 190

tgc tac tgg cga ttc gac tgg ttc cag ggc gcc gac aac ccg tec gtg 1145

Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro Ser Val

195 200 205 210

age ttc aaa cag gta gcc tgc ccg gea gcc ate aca gct aag age ggc 1193

Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Gly

215 220 225

tgt act cgc cag aac gat gcc ate aac gag act ccg act ggg ccc age 1241

Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly Pro Ser

230 235 240

act gtg cct acc tac acc gcg tca ggc tgaaagtcgg ctggggcacc 1288 Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 245 250

attgcccagg tgatggttgg gcatgtgtta gtctcactca ccagggacat ttgtcgcgac 1348

ctgatcatag gcgccagggg agttgaaagg ggttgccgta cgagaagaca ttttgtcgcc 1408

gtcttactcc cagccacttc tgtacatatt caatgacatt acatagcccg caaatatgtt 1468

catatatcgt ggccgcccaa accgccccgg tttgcttagg ctggagctga agtggctcgc 1528

cgatggctgt caaaggcagt cggaatattc ctcgttgctt cggcaacacg gtagctgctt 1588

gaaccgtacc cagcattaga acaccccccg ccgagggctt gctacgtcaa tggcggggtc 1648

tccaacccct gcgcggcaca aaaccaacca cgccctcgtc ttttatgatg tcctcgctca 1708

aacgtcccgt gacgacactc cgctcatggt ctggtcctct gatgtagaag gggtaggtca 1768

gccgatggtc gtcaccgtcg tcaatgcttc cctcaagctt cttgcggcct ttatcctcca 1828

actcttccca catgagaact ccatctttcc gccttttcac aaagccactg ccctccttgt 1888

caagggccaa aaaccaacgc cgctgatgaa tgcttccgat cgtgtttgac gcgcccgggg 1948

tatgcatttg gttcggcgca cttttttcgt cctccagctc ccttaactcc cgttccatct 2008

gagagggtga ctcgtctact cgact 2033

<210> 4

<211> 251

<212> PRT

<213> Acremonium thermophiIum <400> 4

Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu 1 5 10 15

Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser

35 40 45

Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp

50 55 60

Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met 65 70 75 80

Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly

85 90 95

Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys

100 105 110

Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys

115 120 125

Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His

130 135 140

Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn Ala Cys 145 150 155 160

Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly

165 170 175

Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys

180 185 190

Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro

195 200 205

Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys

210 215 220

Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly 225 230 235 240

Pro Ser Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly 245 250

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 5

Gln Ser Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp

1 5 10 15

Arg

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 6

Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys

15 10

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 7

Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg 15 10

<210> 8 <211> 13

<212> PRT

<213> Aeremonium thermophilum

<400> 8

Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg 1 5 10

<210> 9 <211> 14

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 9

Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys

1

<210> <211> <212> <213> <400>

10

10 4

PRT

Acremonium thermophilum 10

Pro Thr Phe Thr 1

<210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220>

11 20 DNA

Seqüência artificial primer

misc_feature (3)..(3)

y representa c ou t

misc_feature (9)..(9)

y representa c ou t

misc_feature (12)..(12)

y representa c ou t <221> <222> <223> <400> taytgggayt <210> <211> <212> <213> <220> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222>

<223> <220>

misc_feature (15)..(15)

r representa a ou g 11

gytgyaarcc 12 21 DNA

Seqüência artificial primer

misc_feature (1)..(1)

r representa a ou g

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r representa a ou g

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η representa a, t, c ou g

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y representa c ou t <221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> r representa a ou g

<400> 12

rttrtcngcr ttytgraacc a 21

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 13

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn 1 5

<210> 14

<211> 636

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 14

tactgggatt gttgcaagcc gtcctgcggc tggccgggaa aggcctcggt gaaccagccc 60 gtcttctcgt gctcggccga ctggcagcgc atcagcgact tcaacgcgaa gtcgggctgc 120 gacggaggct ccgcctactc gtgcgccgac cagacgccct gggcggtcaa cgacaacttc 180 tcgtacggct tcgcagccac ggccatcgcc ggcggctccg agtccagctg gtgctgcgcc 240 tgctatgcgt gagttctctg caagccgctt cccacccccg ctttctgtgc aggccgcttc 300 ccccctaccc acccacttcc ccccccccgc ctctgtgatc gggcatccga gctaagttgc 360 gtgtcgtcca gactcacctt caactcgggc cccgtcgcgg gcaagaccat ggtggtgcag 420 tcgaccagca ccggcggcga cctgggcagc aaccagttcg acctcgccat ccccggcggc 480 ggcgtgggca tcttcaacgg ctgcgcctcc cagttcggcg gcctccccgg cgcccagtac 540 ggcggcatca gcgaccgcag ccagtgctcg tccttccccg cgccgctcca gccgggctgc 600 cagtggcgct tcgactggtt ccagaacgcg gataat 636

<210> 15

<211> 786

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <400>

tactgggatt gtgcagactt tgcgacaacg accaccagct tgtgcctgct caggccacga gtttttcttt gaagcgtcaa ccgtcagctg aggttccttc tagcatcttc gcgcccccga agcttccccg gacaac <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220>

15

gttgcaagcc gcgacaagaa gtggcggggc acggctgggc acgagctcac acactggtgg cttcatcatc tgccgggttg acagcaggag cctgaagtac ctgctggata acggctgggg cggcgctcaa

gagctgcgcg tgacaggccg cttcatgtgc agccgttcgt cttcaccagt agaccttggg gctctcacca gacacgggag caattagatt cggcaacagc caagccaacc cgacaggtat ggccggctgc

tggcctctga ctgaacgatg tcatcccaga atcgccggca gggcccgtca agcaaccact tggattcctc ccgggatagg cccggaggtg ctgtgcgttg cattttctag ggtggcgtgc tactggcgat

agggcaattc ggggaaacac gtccctgggc gtaccgagtc gtggaaagaa ttgaccttgc ggcgcaagga aacacagagg gtgttggtca ctgtataccc cttgcacgaa actcgcggag tcgactggtt

gcccagcccg caagtccggc cgtcaatgag ggcctggtgc gctcatagtc ggtatgtggg ccaagattga ccgtttaaga gttcaatggt cttttaatca çcagtatggt cgactgcgac tcaaaacgcc

16

994

DNA

Acremonium thermophilum CDS

(13)..(95)

Intron (96)..(154)

CDS

(155)..(403)

Intron (404)..(526)

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 786 <221> CDS

<222> (527) . . (986)

<400> 16

ggactgcgca tc atg cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala 1 5 10

gct ctg cct ctg age gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag Ala Leu Pro Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg

15 20 25

gtatgccaat cctcgtacct ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag a tac tgg gac tgc tgc aag ccg tcc tgc ggc tgg gcc gga aag gcc tcg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser 30 35 40

gtg aac cag ccc gtc ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc ate age Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser 45 50 55 60

gac ttc aac gcg aag tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys

65 70 75

gcc gac cag acg ccc tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe

80 85 90

gca gcc acg gcc ate gcc ggc ggc tcc gag tcc age tgg tgc tgc gcc Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala

95 100 105

tgc tat gc gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt Cys Tyr Ala 110

gcaggccgct tcccccctac ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc gagctaagtt gcgtgtcgtc cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg

Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala 115 120 ggc aag acc atg gtg gtg cag tcg acc age acc ggc ggc gac ctg ggc Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly

125 130 135

age aac cag ttc gac ctc gcc ate ccc ggc ggc ggc gtg ggc ate ttc Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe

140 145 150

aac ggc tgc gcc tcc cag ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly

155 160 165

ggc ate age gac cgc age cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln

170 175 180

ccg ggc tgc cag tgg cgc ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro 185 190 195 200

acc ttc acc ttc cag cgc gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg

205 210 215

acg ggc tgt aag cgc gac gac gac gcc age tat ccc gtc ttc aac ccg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro

220 225 230

cct age ggt ggc tcc ccc age acc acc age acc acc acc age tcc ccg Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro

235 240 245

tcc ggt ccc acg ggc aac cct cct gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln

250 255 260

tgactgca <210> 17

<211> 264

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum <400> 17

Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro 1 5 10 15

Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys

20 25 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro

35 40 45

Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala

50 55 60

Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr 65 70 75 80

Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala

85 90 95

Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu

100 105 110

Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser

115 120 125

Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile

130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly 145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln

195 200 205

Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp

210 215 220

Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr 225 230 235 240

Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro 245

Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln 260 18 907 DNA

Acremonixim thermophilum

250

255

<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <400>

CDS

(13)..(95)

Intron (96)..(154)

CDS

(155)..(403)

Intron (404)..(526)

CDS

(527).. (899) 18

ggactgcgca tc atg cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc 51

Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala 1 5 10

gct ctg cct ctg age gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag 95

Ala Leu Pro Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg

15 20 25

gtatgccaat cctcgtacct ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag 154 a tac tgg gac tgc tgc aag ccg tcc tgc ggc tgg gcc gga aag gcc tcg 203 Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser 30 35 40

gtg aac cag ccc gtc ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc ate age 251

Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser

45 50 55 60

gac ttc aac gcg aag tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc 299

Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys

65 70 75

gcc gac cag acg ccc tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc 347

Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe

80 85 90

gea gcc acg gcc ate gcc ggc ggc tcc gag tcc age tgg tgc tgc gcc 395

Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala

95 100 105

tgc tat gc gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt 443

Cys Tyr Ala 110

gcaggccgct tcccccctac ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc 503 gagctaagtt gcgtgtcgtc cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg 554

Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala 115 120

ggc aag acc atg gtg gtg cag tcg acc age acc ggc ggc gac ctg ggc 602

Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly

125 130 135

age aac cag ttc gac ctc gcc ate ccc ggc ggc ggc gtg ggc ate ttc 650

Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe 140 145 150

aac ggc tgc gcc tcc cag ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc 698

Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly 155 160 165

ggc ate age gac cgc age cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag 746

Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln 170 175 180 ccg ggc tgc cag tgg cgc ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc 794

Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro 185 190 195 200

acc ttc acc ttc cag cgc gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc 842

Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg

205 210 215

acg ggc tgt aag cgc gac gac -gac gcc age tat ccc gtc ttc aac ccg 890

Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro 220 225 230

cct age ggt tgactgca 907

Pro Ser Gly 235

<210> 19

<211> 235

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 19

Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro 1 5 10 15

Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys 20 25 30

Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro

35 40 45

Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala

50 55 60

Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ald Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr 65 70 75 80

Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala 85 90 95

Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu 100 105 110

Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser 115 120 125

Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile

130 135 140

Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly 145 150 155 160

Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys

165 170 175

Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp

180 185 190

Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln

195 200 205

Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp

210 215 220

Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly

225 <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220>

230 235

20

1175 DNA

Acremonium thermophilum CDS

(1)..(444)

Intron (445).. (599)

CDS

(600)..(630)

Intron (631).. (732) <221> CDS

<222> (733)..(1172)

<400> 20

atg cgt ctc cca cta ccg act ctg ctc gcc ctc ttg ccc tac tac ctc 48

Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu 1 5 10 15

gaa gtg tcc gct cag ggg gca tcc gga acc ggc acg aca aca cgt tac 96

Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr 20 25 30

tgg gat tgc tgc aag ccg age tgc gcg tgg cct ctg aag ggc aat tcg 144

Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser

35 40 45

ccc age ccg gtg cag act tgc gac aag aat gac agg ccg ctg aac gat 192

Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp

50 55 60

999 gga aac acc aag tcc ggc tgc gac aac ggt ggc ggg gcc ttc atg 240

Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met 65 70 75 80

tgc tca tcc cag agt ccc tgg gcc gtc aat gag acc acc age tac ggc 288

20 Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly

85 90 95

tgg gca gcc gtt cgt ate gcc ggc agt acc gag tcg gcc tgg tgc tgt 336

Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys 100 105 110

gcc tgc tac gag ctc acc ttc acc agt ggg ccc gtc agt gga aag aag 384

Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys

115 120 125

ctc ata gtc cag gcc acg aac act ggt gga gac ctt ggg age aac cac 432

Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His 130 135 140

ttt gac ctt gcg gtatgtgggg tttttctttc ttcatcatcg ctctcaccat 484

Phe Asp Leu Ala 145

ggattcctcg gcgcaaggac caagattgag aagcgtcaat gccgggttgg acacgggagc 544 cgggatagga acacagaggc cgtttaagac cgtcagctga cagcagagca attag att 602

Ile

ccc gga ggt ggt gtt ggt cag tcc aat g gtaggttcct tccctgaagt 650

Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn 150 155

accggcaaca gcctgtgcgt tgctgtatac cccttttaat catagcatct tcctgctgga 710 tacaagccaa cccattttct ag ct tgc acg aac cag tat ggt gcg ccc ccg 761

Ala Cys Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro 160 165

aac ggc tgg ggc gac agg tat ggt ggc gtg cac tcg cgg age gac tgc 809

Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys

170 175 180

gac age ttc ccc gcg gcg ctc aag gcc ggc tgc tac tgg cga ttc gac 857

Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp 185 190 195 200

tgg ttc cag ggc gcc gac aac ccg tcc gtg age ttc aaa cag gta gcc 905

Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala

205 210 215

tgc ccg gea gcc ate aca gct aag age ggc tgt act cgc cag aac gat 953

Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp 220 225 230

gcc ate aac gag act ccg act ggg ccc age ggt ggc tcc ccc age acc 1001 Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr

235 240 245

acc age acc acc acc age tcc ccg tcc ggt ccc acg ggc aac cct cct 1049 Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro

250 255 260

gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag aag tgg gcc cag tgc ggc ggc act 1097 Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr 265 270 275 280

ggc ttc acg ggc tgc acc acc tgc gtc tcg ggc acc acc tgc cag gtg Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val

285 290 295

cag aac cag tgg tat tcc cag tgt ctg tga Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 300 305

<210> 21 <211> 305

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 21

Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu 1 5 10 15

Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr

20 25 30

Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser

35 40 45

Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp

50 55 60

Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met 65 70 75 80

Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly

85 90 95

Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys

100 105 110

Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly. Lys Lys

115 120 125

Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His

130 135 140

Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn Ala Cys 145 150 155 160 Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly

165 170 175

Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys 180 185 190

Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro 195 200 205

Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys

210 215 220

Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly 225 230 235 240

Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro

245 250 255

Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln 260 265 270

Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys 275 280 285

Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys 290 295 300

Leu

305

<210> 22 <211> 89

<212> DNA

I

<213> Acremonium thermophilum

<400> 22

attaaccgcg gactgcgcat catgtatcgg aagttggccg tcatctcggc cttcttggcc 60

acagctcgtg ccctcgacgg aaagtcgac 89

<210> 23

<211> 20 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 23 tcgactgcaç caccatggtc <210> 24

<211> 68 <212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 24

Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr 1 5 10 15

Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro

20 25 30

Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro

35 40 45

Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr

50 55 60

Ser Gln Cys Leu 65

<210> 25

<211> 70

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 25

Gly Gly Asn Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr 1 5 10 15

Ser Lys Pro Ser Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Pro Gln

20 25 30

Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr

35 40 45

Gly Pro Gln Ser Cys Gln Ser Pro Trp Thr Cys Gln Lys Gln Asn Asp

50 55 60

Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 65 70

<210> 26 <211> 81 <212> PRT

<213> ChaetomiUm thermophilum

<400> 26

Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly Asn 1 5 10

Val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro

20 25

Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly

35 40

Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr

50 55

Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn Pro

65 Leu <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <400>

70

27

1675 DNA

Trichoderma reesei

Intron (462)..(528)

75

Pro Thr Thr Thr Val 15

Thr Ser Ser Thr Ser 30

Gly Cys Thr Thr Gln 45

Gly Cys Thr Asn Cys 60

Trp Tyr Ser Gln Cys 80

Intron (1226).. (1288) 27

atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca tgcactctcc aatcggagàc tcacccgcct ctgacatggc acttgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca

cagctcgtgc agaaatgctc actggcgctg gctcgaccct cctacgcgtc cccagtctgc

tcagtcggcc gtctggtggc gactcacgct atgtcctgac cacgtacgga gcagaagaac

60 120 180 240 300 360 gttggcgctc gcctttacct tatgggcagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt 420

ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtaagtgac ttaccatgaa 480

cccctgacgt atcttcttgt gggctcccag ctgactggcc aatttaaggt gcggcttgaa 540

cggagctctc tacttcgtgt ccatggacgc ggatggtggc gtgagcaagt atcccaccaa 600

caccgctggc gccaagtacg gcacggggta ctgtgacagc cagtgtcccc gcgatctgaa 660

gttcatcaat ggccaggcca acgttgaggg ctgggagccg tcatccaaca acgcaaacac 720

gggcattgga ggacacggaa gctgctgctc tgagatggat atctgggagg ccaactccat 780

ctccgaggct cttacccccc acccttgcac gactgtcggc caggagatct gcgagggtga 840

tgggtgcggc ggaacttact ccgataacag atatggcggc acttgcgatc ccgatggctg 900

cgactggaac ccataccgcc tgggcaacac cagcttctac ggccçtggct caagctttac 960

cctcgatacc accaagaaat tgaccgttgt cacccagtcc gagacgtcgg gtgccatcaa 1020

ccgatactat gtccagaatg gcgtcacttt ccagcagccc aacgccgagc ttggtagtta 1080

ctctggcaac gagctcaacg atgattàctg cacagctgag gaggcagaat tcggcggatc 1140

ctctttctca gacaagggcg gcctgactca gttcaagaag gctacctctg gcggcatggt 1200

tctggtcatg agtctgtggg atgatgtgag tttgatggac aaacatgcgc gttgacaaag 1260

agtcaagcag ctgactgaga tgttacagta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac 1320

ctacccgaca aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag 1380

ctccggtgtc cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa 1440

catcaagttc ggacccattg gcagcaccgg caaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg 1500

aaacccgcct ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg 1560

acctacccag tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg 1620

cgccagcggc acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa 1675

<210> 28

<211> 1471

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> Intron

<222> (338)..(472)

<220>

<221> Intron

<222> (699)..(783) <400> 28

atgcgcgcca agcaactcct ggcggccggc ctgctggccc ccgcgtccgt ctcggcccag 60

ctcaacagcc tcgccgtggc ggctggcctc aagtacttcg gcacggccgt gcgggaggcc 120

aacgtcaacg gcgacgccac ctacatgtcg tacgtcaaca acaagtccga gttcggccag 180

gtgacgcccg agaacggcca gaagtgggat tccaccgagc ccagccaggg ccagttcagc 240

tacagccagg gcgacatcgt ccccggcgtc gcgaagaaga acggccaggt gctgcgctgc 300

cacaccctgg tgtggtacag ccagctcccc agctggggtc agtgactctc tctttctctc 360

tgtctttctc tttgtctttc tctctttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 420

tctcccatcc agcatcgact gctgatcttg ctgaccagaa gctcgtgtgc agtgtcatcc 480

ggaagttgga cccgcgcgac gcttcagtcc gtcatcgaga cgcacatctc gaacgtgatg 540

ggccactaca agggccagtg ctacgcctgg gacgtggtca acgaggccat caacgacgaç 600

ggcacgtggc ggaccagcgt cttctacaac accttcaaca ccgactacct ggccattgcc 660

ttcaacgccg cgaagaaggc cgatgcgggc gcgaagctgt aggtgtcggc ctttàcgttg 720

ccgcagcgca cctccgcgac atgagcccca gagcgcgtgg ctaatagttc ctcacgcacg 780

caggtactac aacgactaca atctcgagta caacggcgcc aagaccaaca cggccgtgca 840

gctggtgcag atcgtgcagc aggccggcgc gcccatcgac ggggtgggct tccagggcca 900

cctgatcgtg gggtcaacgc cgtcgcgcag ctccctggcç acggcgctga agcgcttcac 960

ggcgcttggc ctggaggtgg cgtacacgga gctggacatc cggcactcga gcctgccgcc 1020

gtcgtcggcg gcgctggcga cgcagggcaa cgacttcgcc agcgtggtgg gctcgtgcct 1080

cgacgtggcg ggctgcgtgg gcatcaccat ctgggggttc acggacaagt acagctgggt 1140

gcccgacacg ttccccggct cgggcgcggc gctgctgtac gacgcgaact acagcaagaa 1200

gccggcgtgg acgtcggtct cgtcggtgct ggcggccaag gcgacgaacc cgcccggcgg 1260

cgggaaccca ccccccgtca ccaccacgac cacgaccacg accacgtcga agccgtcgcai 1320

gcccaccacc acgaccacga ccaccagccc gcagggtccg cagcagacgc actggggcca 1380

gtgcggcggg atcggctgga cggggccgca gtcgtgccag agcccgtgga cgtgccagaa 1440

gcagaacgac tggtactctc agtgcctgtg a 1471

<210> 29

<211> 1663

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<220>

<221> Intron <222> (1591)..(1654) <400> 29

atgatgtata agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgcctc cgcccagcag 60

gcttgctccc tcaccgctga gaaccaccct agcctcacct ggaagcgctg cacctctggc 120

ggcagctgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac 180

accgtctccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaaccagt gggatacctc cctctgcact 240

gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgatggcg ctgactactc ttcgacctat 300

ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagtacggc 360

accaacgtcg gctcccgtgt ctatctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag 420

ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcca acctgggctg cggtctcaac 480

ggcgccctct acttcgtttc catggatgct gatggtggca tgagcaaata ctctggcaac 540

aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgacctcaag 600

ttcatcaacg gcgaggccaa cgttgggaac tggaccccct cgaccaacga tgccaacgcc 660

ggcttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggatg tctgggaggc caacaacatg 720

gctactgcct tcactcctca cccttgcacc accgttggcc agagccgctg cgaggccgac 780

acctgcggtg gcacctacag ctctgaccgc tatgctggtg tttgcgaccc tgatggctgc 840

gacttcaacg cctaccgcca aggcgacaag accttctacg gcaagggcat gactgtcgac 900

accaacaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc 960

gagatcaagc gcttctacgt ccaggacggc aagatcattg ccaacgctga gtccaagatc 1020

cccggcaacc ccggaaactc cattacccag gagtattgcg atgcccagaa ggtcgccttc 1080

agtaacaccg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgca 1140

ggccccatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc 1200

gactcgacct accccatcga ccaggccggc gcccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg 1260

accacctccg gtgtccctgc cgagatcgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgtcatcttc 1320

tccaacatcc gtttcggccc catcggctcg accgtccctg gccttgacgg cagcaacccc 1380

ggcaacccga ccaccaccgt cgttcctccc gcttctacct ccacctcccg tccgaccagc 1440

agcactagct ctcccgtttc gaccccgact ggccagcccg gcggctgcac cacccagaag 1500

tggggccagt gcggcggtat cggctacacc ggctgcacta actgcgttgc tggcaccacc 1560

tgcactcagc tcaacccctg gtacagccag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc 1620

ttggatttga cagttgctaa catctgctca acagtgcctg taa 1663 <210> 30 <211> 39 <212> DNA

<213> Trichodenaa reesei

<400> 30

ttggatccga gtcgcagcgg caaccctagc ggcggcaac

<210> 31

<211> 30

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 31

taattctgca gttacaggca ctgagagtag

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilvim

<400> 32

ttggatccga gtcgcagcgg cgggaaccca ccccccgtca

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> Acremonivim thermophilum

<400> 33

taattctgca gtcacaggca ctgagagtac cagt

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 34

taatttacgt acctggcctt gacggcag <210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum <400> 35

attaactgca gttacaggca ctgttgagca 30

<210> 36

<211> 1096

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> gene

<222> (13)..(1091)

<220>

<221> Intron

<222> (84)..(142)

<220>

<221> Intron

<222> (392).. (514)

<400> 36

ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc cacagctcgt 60 gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac 120 aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctgggccg 180 gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg 240 acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc 300 cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct 360 ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc 420 ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg 480 atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg 540 cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt 600 tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg 660 gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720 ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780 ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840 agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcgggcaac cctagcggcg 900 gcaaccctcc cggcggaaac ccgcctggca ccaccaccac ccgccgccca gccactacca 960 ctggaagctc tcccggacct acccagtctc actacggcca gtgcggcggt attggctaca 1020 gcggccccac ggtctgcgcc agcggcacaa cttgccaggt cctgaaccct tactactctc 1080 agtgcctgta actgca 1096

<210> 37

<211> 1102

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum <220>

<221> gene

<222> (13) . . (1097) <220>

<221> Intron

<222> (84)..(142) <220>

<221> Intron

<222> (392)..(514)

<400> 37

ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc cacagctcgt 60

gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac 120

aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctgggccg 180

gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg 240

acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc 300

cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct 360

ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc 420

ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg 480

atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg 540

cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt 600

tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg 660

gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720

ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780

ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840

agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcgggcggg aacccacccc 900 ccgtcaccac cacgaccacg accacgacca cgtcgaagcc ccacgaccac cagcccgcag ggtccgcagc agacgcactg gctggacggg gccgcagtcg tgccagagcc cgtggacgtg actctcagtg cctgtgactg ca <210> 38

1199 DNA

Acremonium thermophilum

gtcgcagccc gggccagtgc ccagaagcag

accaçcacga ggcgggatcg aacgactggt

<211> <212> <213> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <220> <221> <222> <400>

gene

(13)..(1194)

Intron (84)..(142)

Intron (392)..(514)

30

Intron

(1122)(1185) 38

ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtectgc gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacecàct tccccccccc atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc

cacagctcgt ctgtagaaac ggctgggccg cgcatcagcg gaccagacgc gccggcggct cttcccaccc cgcctctgtg ggccccgtcg agcaaccagt tcccagttcg

960 1020 1080 1102

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc 720 ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc 780

ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta 840

agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcggtacct ggccttgacg 900

gcagcaaccc cggcaacccg accaccaccg tcgttcctcc cgcttctacc tccacctccc 960

gtccgaccag cagcactagc tctcccgttt çgaccccgac tggccagccc ggcggctgca 1020

ccacccagaa gtggggccag tgcggcggta tcggctacac cggctgcact aactgcgttg 1080

ctggcaccac ctgcactcag ctcaacccct ggtacagcca ggtatgtttc tcttccccct 1140

tctagactcg cttggatttg acagttgcta acatctgctc aacagtgcct gtaactgca 1199

<210> 39

<211> 298

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 39

Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15

Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser 20 25 30

Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys 20 35 40 45

Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys 50 55 60

Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val 65 70 75 80

Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly 85 90 95

Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser 100 105 110

Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly 115 120 125

Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly 130 135 140 Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro

165 170 175

Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn

180 185 190

Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu

195 200 205

Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro

210 215 220

Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly 225 230 235 240

Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr

245 250 255

Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly

260 265 270

Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln

275 280 285

Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu

290 295

<210> 40

<211> 300

<212> PRT

<213> Acremonixam thermophilum

<400> 40

Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15

Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser

20 25 30

Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys

35 40 45

Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys 50 55 60

Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val 65 70 75 80

Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly

85 90 95

Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser

100 105 110

Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly

115 120 125

Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly

130 135 140

Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro

165 170 175

Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn

180 185 190

Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu

195 200 205

Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro

210 215 220

Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr 225 230 235 240

Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Pro Ser Gln Pro Thr Thr Thr Thr

245 250 255

Thr Thr Thr Ser Pro Gln Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys

260 265 270

Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Gln Ser Cys Gln Ser Pro Trp Thr

275 280 285

Cys Gln Lys Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 290 295 300

<210> 41 <211> 311

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 41

Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg 1 5 10 15

Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser

20 25 30

Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys

35 40 45

Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys

50 55 60

Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val 65 70 75 80

Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly

85 90 95

Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser

100 105 110

Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly

115 120 125

Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly

130 135 140

Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly 145 150 155 160

Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro

165 170 175

Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn

180 185 190

Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu

195 200 205

Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro 210 215 220 Val Phe Asn Pro Pro Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly 225 230 235 240

Asn Pro Thr Thr Thr Val Val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg

245 250 255

Pro Thr Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro

260 265 270

Gly Gly Cys Thr Thr Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr

275 280 285

Thr Gly Cys Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn

290 295 300

Pro Trp Tyr Ser Gln Cys Leu 305 310

<210> 42

<211> 20 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 42

gcagcaacca gttcgacctc

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 43

ttaactgcag tcactgggca gtgcagccac cgcctc <210> 44

<211> 20 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 44

actgctgcaa gccgtcctgc <210> 45

<211> 41 <212> DNA

<213> Acremoniiam thermophilum

<400> 45

ttaactgcag tcaaccgcta ggcgggttga agacgggata g 41

Claims (31)

1. Polipeptídeo endoglicanase, caracterizado pelo fato de que compreende um fragmento tendo atividade celulolítica e sendo selecionado do grupo consistindo em: a) um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoá- cidos tendo pelo menos 78% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2 ou uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4, b) uma variante de a) compreendendo um fragmento tendo ativi- dade celulolítica; e c) um fragmento de a) ou b) tendo atividade celulolítica.

2. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita seqüência de aminoácidos tem pelo menos 80%, preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, ainda mais preferivelmente 95%, mais preferivelmente 98% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 2.

3. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita seqüência de aminoácidos tem pelo menos 70%, preferivelmente 75%, mais preferivelmente 80%, ainda mais preferivelmente 85%, mais preferivelmente 90%, mais preferivelmente 95% de identidade de seqüência a SEQ ID NO: 4.

4. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito fragmento tem a seqüência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 17 ou SEQ ID NO: 19.

5. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é obtenível ou origina-se de Acremonium sp., preferivelmente de Acremonium thermophilum.

6. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a acremonium sp. é CBS 116240.

7. Polipeptídeo endoglicanase de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a Acremonium sp. é CBS 116240.

8. Proteína de fusão endoglicanase caracterizada pelo fato de que compreendendo um fragmento celuloliticamente ativo de um polipeptí- deo tendo uma seqüência de aminoácidos tendo pelo menos 78% de identi- dade de seqüência a SEQ ID NO: 2, ligado a um domínio de ligação de car- boidrato (CBD).

9. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindica- ção 8, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma região de liga- ção heteróloga.

10. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o dito CBD e opcional região ligante são derivados de Trichoderma reesei CBHI', Chaetomium thermophi- lum CBHI, ou Acremonium sp. xilanase.

11. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem uma se- qüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em uma seqüên- cia de aminoácidos tendo pelo menos 71% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 39, pelo menos 69% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 40, e pelo menos 69% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 41.

12. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão tem uma se- qüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: -39, 40 e 41.

13. Proteína de fusão endoglicanase, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos derivada de um polipeptí- deo compreendendo uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 68% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4 ligada a um domínio de liga- ção de carboidrato (CBD).

14. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma região Ii- gante.

15. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizada pelo fato de que compreende uma seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4 ligada ao CBD derivado de um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácidos tendo SEQ ID NO: 2.

16. Proteína de fusão endoglicanase de acordo com a reivindi- cação 13, caracterizada pelo fato de que a dita proteína de fusão endoglica- nase tem SEQ ID NO: 21.

17. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que codi- fica o polipeptídeo endoglicanase, como definido em qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, ou uma proteína de fusão endoglicanase como definida em qualquer uma de reivindicações 8 a 16.

18. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que apresenta uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo consistindo em: a) uma seqüência de nucleotídeos de SEQ ID NOs: 1, 3, 16, 18, -20, 36, 37 ou 38; b) uma fita complementar de a); c) um fragmento de a) ou b) compreendendo pelo menos 20 nu- cleotídeos; e d) uma seqüência que é degenerada como um resultado do có- digo genético para qualquer uma das seqüências como definidas em a), b) ou c).

19. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compre- ende uma seqüência de polinucleotídeos codificando o polipeptídeo endogli- canase, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma proteína de fusão endoglicanase como definida em qualquer uma das reivin- dicações 8 a 16.

20. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compre- ende um vetor de expressão, como definido na reivindicação 19.

21. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que é de origem de fungo.

22. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 21, carac- terizada pelo fato de que é Trichoderma reesei.

23. Processo para a produção de um polipeptídeo endoglicanase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma proteína de fusão endoglicanase como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultura da célula hospedeira como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22.

24. Preparação de enzima, caracterizada pelo fato de que com- preende um polipeptídeo endoglicanase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma proteína de fusão endoglicanase, como definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 16.

25. Processo para biorretificação à pedra, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um polipeptídeo endoglicana- se como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou uma proteína de fusão endoglicanase como defiida na qualquer uma das reivindicações 8 a 16 ou uma preparação como definida na reivindicação 24, a tecido ou pe- ças de roupa contendo algodão, tal como denim.

26. Processo para biorretificação à pedra, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um polipeptídeo endoglicana- se como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma proteí- na de fusão endoglicanase como definida em qualquer uma das reivindica- ções 8 a 16, ou uma preparação como definida na reivindicação 24 a materi- ais têxteis como tecidos ou peças de roupa ou fio.

27. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo endoglicanase como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma proteína de fusão endoglicanase como de- finida em qualquer uma das reivindicações 8 a 16, ou uma preparação como defiida na reivindicação 24, e auxiliares, tais como agentes tensoativos, a- gentes alvejantes ou builders.

28. Processo de tratamento de material têxtil contendo fibra celu- lósica, caracterizado pelo fato de que compreende contato do dito material têxtil com a composição detergente como definida na reivindicação 27.

29. Processo de tratamento de polpa ou fibra derivada de madei- ra, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de adição de um po- lipeptídeo endoglicanase como defiido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uma proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivin- dicações 8 a 16, ou uma preparação como definida na reivindicação 24, a fibra secundária ou polpa química ou mecânica derivada de madeira.

30. Processo para aperfeiçoamento de qualidade de alimentação animal, caracterizado pelo fato de que compreende tratamento de material de planta com um polipeptídeo endoglicanase como definido qualquer uma de reivindicações 1 a 7, ou uma proteína de fusão endoglicanase como defi- nida em qualquer uma de reivindicações 8 a 16 ou uma preparação como definida na reivindicação 24.

31. Cepa de Escherichia coli, caracterizada pelo fato de que a- presenta número de acesso DSM 17324, DSM 17323, DSM 18813, DSM -18814, DSM 18815, DSM 18816 ou DSM 18817.