ES2637008T3 - Enzimas nuevas - Google Patents

Abstract

Un polipéptido endoglucanasa que comprende actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en: a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2; y b) un polipéptido de a) que carece del dominio de unión de carbohidrato, o el dominio de unión de carbohidrato y la región conectora.

Description

Enzimas nuevas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas enzimas celulasa, especialmente nuevas endoglucanasas incluyendo proteínas de fusión de endoglucanasa, preparaciones y composiciones que contienen estas enzimas endoglucanasa y proteínas de fusión, vectores de expresión, células huésped y métodos para su preparación y usos de las celulasas, preparaciones y composiciones en las industrias textil, de detergentes, y de la pulpa y el papel.

Antecedentes de la invención

La celulosa es el componente estructural principal de las plantas superiores y aparece naturalmente en forma casi pura sólo en la fibra de algodón. Proporciona a las células de las plantas una alta resistencia a la tracción ayudándolas a resistir estrés mecánico y presión osmótica. La celulosa es un polisacárido lineal de residuos de glucosa conectados por uniones β-1,4. En la naturaleza, la celulosa está asociada habitualmente con lignina junto con hemicelulosas, tales como xilanos y glucomananos. Las enzimas celulolíticas hidrolizan la celulosa y están producidas por una amplia variedad de bacterias y hongos. Las celulasas son enzimas industrialmente importantes con un valor de mercado anual actual de aproximadamente 190 millones de dólares americanos. En la industria textil, las celulasas se usan en el acabado de tela vaquera para crear una apariencia de lavado a la piedra a la moda en las prendas de tela vaquera en un proceso de biolavado a la piedra ("biostoning"), y también se usan, por ejemplo, para limpiar pelusa y prevenir la formación de bolitas en la superficie de las prendas de algodón. En la industria de detergentes, las celulasas se usan para abrillantar los colores y para prevenir envejecimiento y frisado de las prendas. Las celulasas se usan además en la industria alimentaria y fabricación de alimento animal, y tienen un gran potencial en la industria de la pulpa y el papel, por ejemplo, para desteñir para liberar tinta de las superficies de fibra y para mejorar el drenaje de la pulpa. El amplio espectro de usos industriales para las celulasas ha establecido una necesidad de productos de celulasa comerciales que contienen diferentes componentes celulasa y que funcionan óptimamente en diferentes intervalos de pH y temperatura.

El uso práctico de celulasas está obstaculizado por la naturaleza de las composiciones de celulasa conocidas, que frecuentemente son mezclas de enzimas que tienen una variedad de actividades y especificidades de sustrato. Por esta razón, se han hecho esfuerzos para obtener celulasas que sólo tienen las actividades deseadas. Las propiedades únicas de cada celulasa hacen que algunas sean más adecuadas para determinados propósitos que otras. Aunque las enzimas se diferencian de varias maneras, una de las diferencias más importantes es el pH óptimo. Las celulasas neutras son más activas en el intervalo de pH 6-8 y las celulasas alcalinas en el intervalo de pH 7,5-10, mientras las celulasas ácidas, que tienen el pH óptimo a pH 4,5-5,5, muestran muy bajos niveles de actividad a valores de pH más altos. Las celulasas neutras y ácidas son especialmente útiles en la industria textil. En el tratamiento de telas, las celulasas atacan las cadenas de moléculas de celulosa que forman las fibras de algodón, afectando de esta manera las características de la tela.

En la industria textil, un aspecto "lavado a la piedra" o un aspecto desgastado ha centrado el interés de los productores de tela vaquera en los últimos años. El lavado a la piedra tradicional con piedras pómez reduce la resistencia de la tela y carga los aparatos de lavado. La tendencia ha sido hacia procesos de acabado de tela vaquera enzimáticos y las celulasas han reemplazado o se están usando junto con piedras pómez para proporcionar a la tela su aspecto "raído" deseado. Los tratamientos con enzimas controlados resultan en un menor daño a las prendas y máquinas y eliminan la necesidad de eliminación de las piedras.

Adicionalmente, la industria textil usa celulasas en el bioacabado, es decir, para crear una mejora permanente de desfrisado y resistencia a frisado mejorada, estructura superficial limpia por pelusa reducida, manejo textil mejorado, tal como suavidad, lisura y una sensación de seda, caída mejorada y colores más brillantes del tejido y absorbabilidad de la humedad mejorada.

Las celulasas aplicadas en el tratamiento de tela vaquera se dividen habitualmente en dos grupos principales: celulasas ácidas y neutras. Las celulasas ácidas operan típicamente a pH 4,0-5,5 y las celulasas neutras en el intervalo de pH 6-8. Las celulasas ácidas usadas en el biolavado a la piedra se originan principalmente de Trichoderma reesei (forma sexual Hypocrea jecorina) y las celulasas neutras provienen de una variedad de hongos, incluyendo los géneros de Melanocarpus, Humicola, Myceliophthora, Fusarium, Acremonium, y Chrysosporium (Haakana et al. 2004). Las enzimas de T. reesei incluyen, por ejemplo, celulasas de la familia glicósido 5 (endoglucanasa II, EGII), familia 7 (celobiohidrolasa I, CBHI) y familia 12 (endoglucanasa III, EGIII; Ward et al. 1993), y las celulasas neutras, lo más frecuentemente endoglucanasas, de la familia 45 y familia 7 (Henrissat, 1991; Henrissat y Bairoch, 1993, 1996).

Las celulasas comprenden un dominio/núcleo catalítico (CD) que expresa actividad celulasa. Además del dominio catalítico, la molécula celulasa puede comprender uno o más dominios de unión de celulosa (CBD), también denominados dominios/módulos de unión de carbohidrato (CBD/CBM), que pueden estar localizados bien en el extremo N o C terminal del dominio catalítico. Los CBD tienen actividad de unión de carbohidrato y median la unión de la celulasa a celulosa cristalina, pero tienen poco o ningún efecto en la actividad hidrolítica celulasa de la enzima sobre sustratos solubles. Estos dos dominios están conectados típicamente a través de una región conectora flexible y altamente glicosilada.

Las celulasas que atacan principalmente en la superficie de la fibra son especialmente útiles en el lavado a la piedrade tela vaquera teñida con tinte Índigo, ya que el tinte está localizado en la superficie de la fibra. Cuando se usan para tratar tela de algodón, las celulasas ácidas requieren generalmente un tiempo de lavado más corto que las celulasas neutras. Las celulasas ácidas se usan especialmente en bioacabado (desfrisado) y también en el tratamiento de tela vaquera (biolavado a la piedra).

Las endoglucanasas (EG) en conexión con la presente invención significan enzimas clasificadas como E.C. 3.2.1.4 y son uno de los tres tipos de celulasas necesarias generalmente para la conversión biológica de celulosa a glucosa. Las endoglucanasas cortan enlaces beta-1,4-glucosídicos internos, mientras las celobiohidrolasas cortan el disacárido celobiosa del extremo de la cadena de polímero de celulosa y las beta-1,4-glucosidasas hidrolizan la celobiosa y otros celo-oligosacáridos cortos a glucosa. Algunas endoglucanasas naturales tienen un dominio de unión a celulosa (CBD), mientras otras no.

También, las endoglucanasas se usan ampliamente en la industria textil, de detergentes, de pulpa y papel. Por ejemplo, las endoglucanasas de la familia cel45 (EG fam 45) se describen, por ejemplo, en la Patente U.S. No. 6.001.639, que describe enzimas que tienen actividad endoglucanasa y que tienen dos secuencias de aminoácidos conservadas. Los usos en aplicaciones textiles, de detergentes, y de pulpa y papel se discuten generalmente y se menciona el tratamiento de material lignocelulósico. WO 2004/053039 está dirigido a aplicaciones de detergente de endoglucanasas. La Patente U.S. No. 5.958.082 describe el uso de endoglucanasa, especialmente de Thielavia terrestris en aplicaciones textiles proporcionando un aspecto de lavado a la piedra o desgastado de vaqueros de sarga. EP 0495258 se refiere a composiciones de detergente que contienen celulasa de Humicola. La Patente U.S. No. 5.948.672 describe una preparación de celulasa que contiene endoglucanasa, especialmente de Humicola y su uso en aplicaciones textiles y de pulpa. WO98/12307 proporciona variantes de endoglucanasa, por ejemplo, de Thielavia terrestris y Myceliophora themophila para uso en aplicaciones textiles. También, se describe una endoglucanasa recombinante de Acremonium. No muestra una alta identidad con la de la presente invención.

Las composiciones y concentrados de EG y enriquecidas en EG también están disponibles comercialmente.

Sin embargo, existe una necesidad continua de celulasas mejoradas, incluyendo endoglucanasas, que sean más eficientes en el tratamiento de telas y en otros campos, en los que se usan tradicionalmente celulasas. En particular, existe una necesidad continua de celulasas más eficientes para mejorar los costes de los procesos.

La presente invención tiene como objetivo cumplir con esta necesidad.

Descripción breve de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa que tienen propiedades hidrolíticas mejoradas para uso en la industria textil, especialmente en los procesos de acabado del algodón, tales como en desfrisado, y lavado a la piedra de tela vaquera, y para uso en composiciones de detergente, así como en otros campos. Las nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención tienen la ventaja de ser activas a valores de pH ácidos y neutros, tienen un rendimiento altamente mejorado en aplicaciones de bioacabado y biolavado a la piedra de tejidos y en aplicaciones de detergentes. Cuando se usan en el tratamiento de materiales textiles que contienen celulosa, las nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa proporcionan una sensación de lisura, apariencia y suavidad mejorada, así como desfrisado permanente al tejido. Con la eficiencia mejorada de las endoglucanasas de la invención, el uso de las enzimas es significativamente más económico. Las ventajas adicionales también se consiguen en términos de logística y el almacenamiento de los productos de enzima, cuando son necesarias menores cantidades del producto de enzima. Además, las nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención, al ser ácidas, actúan más rápidamente, rindiendo procedimientos de tratamiento más efectivos en términos de tiempo y coste y ahorros en equipamiento, así como instalaciones de tratamiento.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar polinucleótidos que codifican las nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar nuevos plásmidos o vectores de expresión que contienen dichos polinucleótidos, útiles para la producción de las nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención, así como nuevos huéspedes transformados con dichos plásmidos de expresión.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar preparaciones de enzima, que contienen una o más nuevas endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa que tienen propiedades hidrolíticas mejoradas.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar métodos para el uso de las preparaciones de enzima y las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa para el acabado de tejidos, especialmente para bioacabado y biolavado a la piedra de tela vaquera.

Un objeto adicional más de la presente invención es proporcionar medios para el uso de las preparaciones de enzima de la invención en composiciones de detergente.

La presente invención se refiere a un polipéptido endoglucanasa que comprende actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2;

b) un polipéptido de a) que carece del dominio de unión de carbohidrato, o del dominio de unión de carbohidrato y la región conectora.

La presente invención se refiere además a una proteína de fusión de endoglucanasa que comprende un fragmento celulolíticamente activo de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 78% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, unido a un dominio de unión de carbohidrato (CBD) heterólogo.

La presente invención también se refiere a una proteína de fusión de endoglucanasa que comprende una secuencia de aminoácidos derivada de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2 unido a un dominio de unión de carbohidrato. La proteína de fusión puede comprender adicionalmente una región conectora.

La presente invención se refiere además a un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido endoglucanasa o la proteína de fusión definidas anteriormente. Especialmente, la invención se refiere a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, o SEQ ID NO: 38;

b) una cadena complementaria de a);

y

c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético a una cualquiera de las secuencias como se define en a), o b).

La presente invención se refiere además a un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótidos definida anteriormente.

La presente invención se refiere además a nuevos huéspedes transformados con los vectores de la invención, especialmente huéspedes que son capaces de un alto nivel de expresión de la endoglucanasa o proteína de fusión de endoglucanasa de la invención.

La presente invención se refiere además a una preparación de enzima, que contiene una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención.

La presente invención se refiere además a métodos para usar las preparaciones de enzima de la invención para el bioacabado de tejidos, especialmente para desfrisado.

La presente invención se refiere además a métodos para usar las preparaciones de enzima de la invención para el acabado de tejidos, especialmente para biolavado a la piedra de tela vaquera.

La presente invención se refiere además al uso de las preparaciones de enzima de la invención en composiciones de detergente.

La presente invención se refiere además a una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 17324, DSM 18813, DSM 18814, DSM 18815, DSM 18816 o DSM 18817.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 ilustra el dibujo esquemático de los casetes de expresión usados en la transformación de protoplastos de Trichoderma reesei para la producción de celulasas de Acremonium thermophilum de la invención. Los genes recombinantes estaban bajo el control del promotor cbhI/ceI7A de T. reesei (prom cbhI) y la terminación de la transcripción se aseguró con la adición del terminados cbhI de T. reesei (term cbhI). El gen amdS (amdS) se incluyó para la selección de los transformantes.

La Figura 2 ilustra la dependencia de pH de las celulasas EG_40 y semejantes a EG_40 de A. thermophilum producidas heterólogamente por la determinación del sobrenadante del cultivo usando CMC como sustrato en una reacción de 10 min a 50ºC (A). La temperatura óptima de las celulasas EG_40 y semejantes a EG_40 se determinó a pH 5,5 y 5, respectivamente. La reacción con CMC como sustrato se realizó durante 60 min. Se añadió BSA (100 µg/ml) como un estabilizador. (B).

La Figura 3 muestra el rendimiento de celulasa EG_40 en el biolavado a la piedra a diferentes temperaturas evaluado por medición del color.

La Figura 4 muestra el efecto biolavado a la piedra de una mezcla de concentrados enriquecidos en EGII y de EG_40 comparado con un concentrado enriquecido en EGII de la técnica anterior.

La Figura 5 muestra una serie de fotografías que muestran el efecto de desfrisado de una endoglucanasa de la invención.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en esfuerzos para encontrar celulasas más mejoradas para uso en la industria textil. Sorprendentemente, se encontró que, empezando a partir de especies de Acremonium, podían aislarse nuevas endoglucanasas y podían producirse enzimas recombinantes, endoglucanasas que no sólo tienen un perfil de temperatura aceptable, sino que también muestran un rendimiento de desfrisado favorable inesperado y son al menos cuatro veces más eficientes que la preparación comercial que contiene EG. Adicionalmente, las nuevas endoglucanasas mostraron propiedades de biolavado a la piedra excelentes comparado con las celulasas de la técnica anterior.

De acuerdo con esto, la presente invención se refiere a un polipéptido endoglucanasa que comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica y se selecciona del grupo que consiste en:

a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y

b) un polipéptido de a) o b) que carece del dominio de unión de carbohidrato, o del dominio de unión de carbohidrato y la región conectora.

En una realización preferida de la invención, dicho aminoácido tiene al menos 98% identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

En otra realización preferida de la invención más, dicho aminoácido tiene SEQ ID NO: 2.

En otra realización preferida de la invención más, dicho fragmento tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19.

En otra realización preferida de la invención más, los polipéptidos se pueden obtener u originar de una Acremonium sp., preferiblemente de Acremonium thermophilum.

Los polipéptidos endoglucanasa de la presente invención son preferiblemente polipéptidos recombinantes. Los polipéptidos recombinantes pueden producirse en un huésped heterólogo o en un huésped homólogo genéticamente modificado.

Según una realización particular de la invención, el polipéptido endoglucanasa es una modificación de un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, en el que el dominio de unión de carbohidrato CBD se ha reemplazado por un CBD heterólogo. Además, la región conectora y/o la secuencia señal pueden reemplazarse por una región conectora y/o secuencia señal heteróloga. Estas endoglucanasas modificadas también están englobadas en la presente memoria por el término proteína de fusión de endoglucanasa. En una realización preferida de la invención, la endoglucanasa modificada/fusionada tiene SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.

En una realización particular de la invención, la proteína de fusión es una proteína de fusión de endoglucanasa que comprende un fragmento celulolíticamente activo de un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y un dominio de unión de carbohidrato (CBD) heterólogo, en el que el CBD heterólogo y la región conectora opcional derivan de CBHI de Trichoderma reesei, CBHI de Chaetomium thermophilum, o xilanasa de Acremonium sp. "Heterólogo" como se usa en el presente contexto significa que el CBD y la parte conectora posible de la proteína de fusión de endoglucanasa se obtienen de otro organismo y se unen al núcleo celulolíticamente activo de la endoglucanasa por modificación génica. Especialmente, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 71% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39, al menos 69% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 40, o al menos 69% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 41. Especialmente, la proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 75, 80, 85, 90, 95, ó 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 o SEQ ID NO: 41.

La presente invención se refiere además a un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido endoglucanasa definido anteriormente.

Específicamente, en una realización de la invención, el polinucleótido aislado tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, o SEQ ID NO: 38;

b) una cadena complementaria de a); y

c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético a una cualquiera de las secuencias como se define en a), o b).

La presente invención se refiere además a un vector de expresión que comprende la secuencia de polinucleótido definida anteriormente.

La presente invención se refiere además a nuevos huéspedes transformados con los vectores de la invención, especialmente huéspedes que son capaces de un alto nivel de expresión de la endoglucanasa o proteína de fusión de endoglucanasa de la invención. Según una realización preferida de la invención, las enzimas se pueden obtener de la cepa de Acremonium thermophilum ALKO4245 depositada como CBS 116240.

La presente invención se refiere además a una preparación de enzima, que contiene una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención.

La presente invención se refiere además a métodos para usar las preparaciones de enzima de la invención para el bioacabado de tejidos, especialmente para desfrisado.

La presente invención se refiere además a métodos para usar las preparaciones de enzima de la invención para el acabado de tejidos, especialmente para biolavado a la piedra de tela vaquera.

La presente invención se refiere además al uso de las preparaciones de enzima de la invención en composiciones de detergente.

Las preparaciones de endoglucanasa y proteína de fusión de endoglucanasa de la invención son especialmente útiles en la industria textil y de detergentes. Son especialmente útiles en la industria textil para el bioacabado de telas o prendas, por ejemplo, desfrisado, eliminación de pelusa, aclarado del color, reducción de dureza, creación de diferentes acabados (por ejemplo, un efecto de "piel de melocotón", "desgastado", "lavado a la arena", o "aspecto antiguo") y para el bioacabado de fibra, por ejemplo, reducción de pilosidad y mejora de la lisura. Los usos adicionales incluyen el uso en composiciones de detergentes para mejorar las propiedades de cuidado de las telas por anti-frisado, anti-envejecimiento, aclarado de color y suavidad, y para mejorar el efecto de limpieza textil, por ejemplo, eliminación de suciedad. Los usos adicionales incluyen además el uso en el biolavado a la piedra de tela vaquera.

En las telas de algodón, las pelusas (microfibras) surgen desde la superficie, que pueden enmarañarse durante el procesamiento, formando así bolitas. Las enzimas debilitan las microfibras que suben desde la superficie y las fuerzas de cizalla del tratamiento las eliminan (Nierstrasz y Warmoeskerken, 2003). Tal y como se usa en el presente contexto, la expresión "bioacabado" (también denominado desfrisado, eliminación de pelusas o biopulido) se refiere al uso de enzimas en una hidrólisis controlada de fibras celulósicas con el fin de modificar la superficie de la tela o fibra de una manera tal que previene el frisado permanentemente, mejora el manejo de la tela tal como suavidad y lisura, limpia la estructura de la superficie reduciendo la formación de pelusas, que resulta en el aclarado de colores, mejora la caída de la tela, mejora la absorbabilidad de la humedad, que puede mejorar también la capacidad de teñido. Las enzimas celulasa se usan para el tratamiento o acabado de materiales textiles que contienen celulosa, tales como algodón, lino, ramio, yute, viscosa, modal, lyocell y cupro, o mezclas de éstos.

Tal y como se usa en el presente contexto, la expresión "biolavado a la piedra" de tela o prenda significa el uso de enzimas en lugar de, o además de, piedras pómez para el tratamiento de la tela o prenda, especialmente tela vaquera.

Tal y como se usa en el presente contexto, la expresión "retroteñido" se refiere a la tendencia del tinte liberado de redepositarse en la superficie de las fibras de la tela.

Tal y como se usa en el presente contexto, la expresión "detergente" se refiere a un agente limpiador que puede contener agentes tensioactivos (tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos y anfolíticos), potenciadores y otros ingredientes opcionales tales como agentes anti-redeposición y suspensión de suciedad, abrillantadores ópticos, agentes blanqueadores, tintes y pigmentos e hidrolasas. El listado adecuado de los contenidos de detergentes se proporciona en la Patente U.S. No. 5.433.750, una lista adecuada de tensioactivos se proporciona en la Patente U.S. No. 3.664.961.

La actividad biológica de una endoglucanasa es su actividad catalítica, y/o su capacidad de unirse a material celulósico. La actividad celulolítica de una endoglucanasa es su actividad hidrolítica.

Tal y como se usa en el presente contexto, la expresión "Acremonium sp," se refiere especialmente a un género de hongos filamentosos que tiene las características de la cepa CBS 116240. Esta cepa se clasifica actualmente como

A. thermophilum.

Tal y como se usa en el presente contexto, "polinucleótido" se refiere tanto a ARN como ADN, y puede ser monocatenario o bicatenario. El polinucleótido también puede ser un fragmento de dichos polinucleótidos que comprende al menos 20 nucleótidos, por ejemplo, al menos 25, 30 ó 40 nucleótidos. Según una realización de la invención, tiene una longitud de al menos 100, 200 ó 300 nucleótidos. Además, el polinucleótido puede ser degenerado como resultado del código genético en una cualquiera de las secuencias como se define anteriormente. Esto significa que diferentes codones pueden codificar el mismo aminoácido.

Los nuevos polipéptidos también pueden ser variantes de dichos polipéptidos. Una "variante" puede ser un polipéptido natural, por ejemplo, una variante alélica en la misma cepa, especie o género, o puede haberse generado por mutagénesis. Puede comprender sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, pero aún así funciona de una manera sustancialmente similar a las enzimas definidas anteriormente, es decir, comprende un fragmento que tiene actividad celulolítica.

Un vector de expresión es un plásmido o vector de clonación capaz de expresar ADN que codifica las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención después de transformación en un huésped deseado. Cuando se usa un huésped fúngico, el gen de interés se proporciona preferiblemente a un huésped fúngico como parte de un vehículo de clonación o expresión que se integra en el cromosoma fúngico, o permite que el gen de interés se integre en el cromosoma del huésped, o como un plásmido que se replica autónomamente. Las secuencias que son parte del vehículo de clonación o vehículo de expresión también pueden integrarse con dicho ADN durante el proceso de integración. Además, en hongos, el vector de expresión o partes de éste pueden dirigirse a loci predeterminados.

El ADN que codifica las endoglucanasas y las proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención también se pone preferiblemente bajo el control de (es decir, unido de forma operativa a) determinadas secuencias de control tales como secuencias promotoras proporcionadas por el vector (que se integran con el gen de interés). Alternativamente, las secuencias de control pueden ser las del sitio de inserción.

Las secuencias de control de la expresión de un vector de expresión variarán dependiendo de si el vector se diseña para expresar un determinado gen en un huésped procariota o en uno eucariota (por ejemplo, un vector lanzadera puede proporcionar un gen para la selección en huéspedes bacterianos). Las secuencias de control de la expresión pueden contener elementos reguladores de la transcripción tales como promotores, elementos potenciadores, y secuencias de terminación de la transcripción, y/o elementos reguladores de la traducción, tales como sitios de inicio y terminación de la traducción.

Una molécula de polinucleótido, tal como ADN, se dice que es "capaz de expresar" un polipéptido si contiene secuencias de control de la expresión que contienen información reguladora de la transcripción y dichas secuencias están "unidas de forma operativa" a la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.

Una unión operativa es una unión en la que una secuencia está conectada con una secuencia (o secuencias) reguladora de manera tal que se pone la expresión de la secuencia bajo la influencia o control de la secuencia reguladora. Dos secuencias de ADN (tales como secuencia de región promotora unida al extremo 5' de la secuencia que codifica la proteína) se dice que están unidas de forma operativa si la función del promotor resulta en la transcripción.

Los vectores de la invención pueden comprender además otros elementos reguladores unidos de forma operativa, tales como secuencias potenciadoras.

En una realización preferida, se construyen transformantes genéticamente estables mediante lo cual el ADN que codifica las endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención se integra en el cromosoma del huésped por transformación con un vector, que porta secuencias que promueven la integración de dicho vector en el cromosoma.

Las células que han integrado de forma estable el ADN que codifica las endoglucanasas o las proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención en sus cromosomas se seleccionan introduciendo también uno o más marcadores, homólogos o heterólogos, que permiten la selección de células huésped que contienen el vector de expresión en el cromosoma, por ejemplo, el marcador puede proporcionar resistencia a biocida, por ejemplo, resistencia a antibióticos, o metales pesados, tal como cobre, o marcadores que complementan una mutación auxotrófica en el cromosoma del huésped, y semejantes. El gen del marcador seleccionable puede unirse bien directamente a las secuencias génicas de ADN que se van a expresar, o introducirse en la misma célula por co-transformación.

Una vez el vector o secuencia de ADN de la invención que contiene la o las construcciones está preparado para la expresión, la o las construcciones de ADN se introducen en una célula huésped apropiada por cualquiera de una variedad de medios adecuados, incluyendo transformación como se conoce en la técnica. Después de la introducción del vector, las células receptoras se crecen en un medio selectivo, que selecciona para el crecimiento de células transformadas.

Los sistemas huésped adecuados para expresión y producción son, por ejemplo, el sistema de producción desarrollado para el huésped fúngico Trichoderma (EP 244 234), o sistema de producción de Aspergillus, tal como

A. oryzae o A. niger (WO 9708325 y WO 9533386, Patente U.S. No. 5.843.745, Patente U.S. No. 5.770.418), o el sistema de producción desarrollado para Fusarium, tal como F. oxysporum (Malardier et al., 1989). Los sistemas de producción adecuados desarrollados para bacterias son un sistema de producción desarrollado para Bacillus, por ejemplo, B. subtilis o para E. coli, o para actinomicete Streptomyces. Los sistemas de producción adecuados desarrollados para levaduras son sistemas desarrollados para Saccharomyces, Schizosaccharomyces o Pichia pastoris. También son posibles los sistemas de producción en algunos otros microbios o en células de mamíferos o en plantas.

La expresión de la o las secuencias de genes clonados resulta en la producción de la proteína deseada, o en la producción de un fragmento de esta proteína. Esta expresión puede tener lugar de una manera continua en las células transformadas, o de una manera controlada.

Se entiende que los fragmentos son partes de moléculas de polipéptido o ácido nucleico lo suficientemente largas como para tener las propiedades enzimáticas deseadas o para codificar las endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa descritas o un fragmento biológicamente activo de éstas. El término "degenerado" significa que la secuencia de nucleótidos puede variar siempre que la secuencia de aminoácidos codificada sea la misma. Esto es así porque hay más de un triplete de nucleótidos que codifica un único aminoácido.

Tal y como se usa en el presente contexto, el término "identidad" de secuencia se refiere a la identidad global entre dos secuencias de aminoácidos comparadas entre sí desde el primer aminoácido codificado por el gen correspondiente hasta el último aminoácido. La identidad de secuencias de longitud completa se mide usando el paquete de programas de programa de alineamiento global de Needleman-Wunsch en EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite; Rice et al., 2000), versión 3.0.0, con los parámetros siguientes: EMBLOSUM62, penalización por hueco 10,0, penalización por extensión 0,5. El algoritmo se describe en Needleman y Wunsch (1970). El experto en la técnica es conocedor del hecho de que los resultados usando el algoritmo de Needleman-Wunsch son comparativos sólo cuando se alinean dominios correspondientes de la secuencia. Consecuentemente, la comparación, por ejemplo, de secuencias de celulasa incluyendo CBD o secuencias señal con secuencias que carecen estos elementos no puede hacerse.

Las enzimas celulolíticas útiles para hidrolizar material celulósico se pueden obtener u originar de Acremonium sp., preferiblemente A. thermophilum. "Que se puede obtener de" o "se puede originar de" significa que pueden obtenerse de dichas especies, pero no excluye la posibilidad de obtenerlas de otras fuentes. En otras palabras, pueden originarse de cualquier organismo incluyendo plantas. Preferiblemente, se originan de microorganismos, por ejemplo, bacterias u hongos. Las bacterias pueden ser, por ejemplo, de un género seleccionado de Bacillus, Azospirillum y Streptomyces. Más preferiblemente, la enzima se origina de hongos (incluyendo hongos filamentosos y levaduras), por ejemplo, de un género seleccionado del grupo que consiste en Thermoascus, Acremonium, Chaetomium, Achaetomium, Aspergillus, Botrytis, Chrysosporium, Collybia, Fomes, Fusarium, Humicola, Hypocrea, Lentinus, Melanocarpus, Myceliophthora, Myriococcum, Neurospora, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Pleurotus, Podospora, Polyporus, Rhizoctonia, Scytalidium, Pycnoporus, Trametes y Trichoderma.

Tal y como se usa en el presente contexto, las expresiones "preparación de enzima", "preparación de celulasa" y "preparación de endoglucanasa" se refieren a cualquier producto de enzima, que contiene al menos una endoglucanasa o proteína de fusión de endoglucanasa de la invención. Así, dicha preparación de enzima puede ser un medio de cultivo usado o filtrado que contiene una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa o una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa y otras enzimas, una endoglucanasa o proteína de fusión de endoglucanasa aislada o una mezcla de una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa o una mezcla de una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa y una o más otras enzimas. Además de la actividad endoglucanasa, dicha preparación puede contener aditivos, tales como estabilizadores, tampones, conservantes, tensioactivos y/o componentes del medio de cultivo. Los aditivos preferidos son tales como los usados comúnmente en las preparaciones de enzima pretendidas para la aplicación, en la que se usa la preparación de enzima. La preparación de enzima puede estar en la forma de líquido, polvo o granulado.

Por "medio de cultivo usado" se quiere decir aquí el medio de cultivo del huésped que comprende las enzimas producidas. Preferiblemente, las células huésped se separan de dicho medio después de la producción.

La preparación de enzima puede comprender una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención u otras enzimas celulasa junto con una o más endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención. Por ejemplo, las endoglucanasas que tienen diferentes propiedades pueden combinarse para hacer que la preparación de enzima sea más útil para diferentes condiciones.

Para obtener las preparaciones de enzima de la invención, los huéspedes que tienen las propiedades deseadas (esto es, huéspedes capaces de expresar cantidades económicamente factibles de las endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención) se cultivan en condiciones adecuadas, las enzimas deseadas se secretan de los huéspedes en el medio de cultivo, y la preparación de enzima se recupera de dicho medio de cultivo por métodos conocidos en la técnica.

La preparación de enzima puede comprender, además de la endoglucanasa o proteína de fusión de endoglucanasa, una o más otras enzimas, que pueden ser, por ejemplo, amilasas, lipasas, proteasas, pectinasas y/o oxidasas, tales como lacasas y peroxidasas. Alternativamente, antes, durante o después del tratamiento con la endoglucanasa o la proteína de fusión de endoglucanasa de la presente invención, puede llevarse a cabo otro tratamiento enzimático. El tratamiento enzimático puede comprender, por ejemplo, uno o más tratamientos con amilasa, uno o más tratamientos con celulasa y/o uno o más tratamientos con peroxidasa y/o lacasa. La elección de las otras enzimas incluidas en la preparación de enzima o usadas en el tratamiento enzimático, depende de la aplicación.

La preparación de enzima puede ser el medio de cultivo con o sin las células huéspedes nativas o trasformadas, o se recupera del mismo por la aplicación de métodos muy conocidos en la técnica. Sin embargo, como las endoglucanasas o las proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención se secretan en el medio de cultivo y presentan actividad en condiciones ambientales del licor celulolítico, es una ventaja de la invención que las preparaciones de enzima de la invención pueden utilizarse directamente del medio de cultivo sin purificación adicional. Si se desea, dichas preparaciones pueden liofilizarse o la actividad enzimática concentrarse y/o estabilizarse de otra manera para almacenamiento. Las preparaciones de enzima de la invención son muy económicas de producir y usar debido a que (1) las enzimas pueden usarse en una forma cruda; el aislamiento de una enzima específica del medio de cultivo es innecesario y (2) como las enzimas se secretan en el medio de cultivo, sólo es necesario recuperar el medio de cultivo para obtener la preparación de enzima deseada; no es necesario extraer una enzima de los huéspedes. Preferiblemente, el huésped para dicha producción es Trichoderma, y especialmente T. reesei.

Las preparaciones de enzima de la invención pueden proporcionarse como un líquido o como un sólido, por ejemplo, en un polvo seco o forma granular o líquida, especialmente, gránulos no pulverulentos, o un líquido estabilizado, o la preparación de enzima puede concentrarse o estabilizarse de otra forma para almacenamiento o uso. Se prevé que las preparaciones de enzima que contienen una o más de las celulasas de la invención pueden enriquecerse adicionalmente o hacerse parcialmente o completamente deficientes en actividades enzimáticas específicas, de manera que se satisfagan los requerimientos de una utilidad específica en varias aplicaciones, por ejemplo, en la industria textil. Una mezcla de actividades enzimáticas secretada por un huésped y especialmente un huésped fúngico, puede elegirse para ser ventajosas en una aplicación industrial particular, por ejemplo, bioacabado y biolavado a la piedra.

Las preparaciones de enzima de la invención pueden ajustarse para satisfacer los requerimientos de necesidades específicas en varias aplicaciones en la industria textil, de detergentes o pulpa y papel.

Pueden prepararse mezclas con otras macromoléculas que no se producen todas necesariamente a partir del mismo huésped (por ejemplo, otras enzimas tales como endoglucanasas, amilasas, lipasas, proteasas, pectinasas y/o oxidasas, tales como lacasas y peroxidasas), o productos químicos que pueden potenciar el rendimiento, estabilidad, o tamponamiento de la preparación de enzima deseada. Los gránulos no pulverulentos pueden estar recubiertos. Las preparaciones de enzima líquidas pueden estabilizarse mediante la adición de un poliol tal como propilen glicol, un azúcar o azúcar alcohol, ácido láctico o ácido bórico, o cloruro de sodio, según métodos establecidos.

Las formas protegidas de las enzimas de la invención pueden prepararse como se describe en EP 238.216.

Las preparaciones de enzima de la invención pueden contener un tensioactivo que puede ser aniónico, no iónico, catiónico, anfotérico o una mezcla de estos tipos, especialmente cuando se usan como una composición de detergente. Las composiciones de detergente útiles se describen, por ejemplo, en WO 94/07998, Patente U.S. No.

5.443.750 y Patente U.S. No. 3.664.961.

Si se requiere, una enzima deseada puede aislarse, y purificarse adicionalmente según condiciones convencionales, tales como extracción, precipitación, cromatografía, cromatografía de afinidad, electroforesis, o semejantes. Un polipéptido aislado en este contexto puede significar simplemente que las células y restos celulares se han eliminado del medio de cultivo que contiene el polipéptido. Convenientemente, los polipéptidos se aíslan, por ejemplo, mediante la adición de polímeros aniónicos y/o catiónicos al medio de cultivo usado para potenciar la precipitación de las células, restos celulares y algunas enzimas que tienen actividades paralelas no deseadas. El medio se filtra entonces usando un agente filtrador inorgánico y un filtro para eliminar los precipitantes formados. Después de esto, el filtrado se procesa adicionalmente usando una membrana semi-permeable para eliminar el exceso de sales, azúcares y productos metabólicos.

Las preparaciones de enzima de esta invención son especialmente útiles en la industria textil, preferiblemente, en bioacabado y en biolavado a la piedra o en la industria de detergentes. Otras áreas útiles con la industria de la pulpa y el papel.

"Bioacabado" se refiere al uso de enzimas en una hidrólisis controlada de fibras celulósicas con el fin de modificar la superficie de la tela o fibra de una manera que previene el frisado permanentemente, mejora el manejo de la tela como suavidad y lisura, limpia la estructura de la superficie reduciendo la formación de pelusas, lo que resulta en el aclarado de los colores, mejora la caída de la tela, mejora la absorbabilidad de la humedad y que también puede mejorar la capacidad de teñido.

El desfrisado enzimático puede llevarse a cabo en cualquier etapa durante el procesamiento húmedo del tejido, preferiblemente después de desaprestado y blanqueamiento. El proceso enzimático requiere un equipo con fuerzas de cizalla suficientes y mezclado tal como cabestrante jet o máquina de lavado (Nierstrasz V.A. y Warmoeskerken M.M.C.G., 2003).

El bioacabado se realiza típicamente a aproximadamente pH 4,0-6,0. La temperatura de la reacción puede variar de aproximadamente 30ºC a 70ºC, y es preferiblemente 50-60ºC. La relación de licor (la relación del volumen de líquido por peso de tela) puede variar de aproximadamente 3:1 a 20:1, preferiblemente, 5:1 a 10:1. El tiempo de incubación es generalmente 15 a 90 minutos, preferiblemente 30 a 60 min. La dosificación de la enzima depende en gran medida del tipo de telas, maquinaria, condiciones del proceso (pH, temperatura, relación de licor, tiempo de tratamiento, carga de tela vaquera, escala del proceso) y tipo de preparación de enzima y semejantes. Un experto en la técnica es capaz de definir dosificaciones y condiciones adecuadas.

Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención son especialmente útiles en la industria textil para el bioacabado de telas o prendas, por ejemplo, desfrisado, eliminación de pelusa, aclarado del color, reducción de dureza, la creación de diferentes acabados (por ejemplo, un efecto de "piel de melocotón", "desgastado", "lavado a la arena", o "aspecto antiguo") y bioacabado de fibra (por ejemplo, reducción de pilosidad, mejora de lisura). Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención pueden usarse en el bioacabado en condiciones ácidas y neutras.

Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención son útiles en composiciones de detergente para mejorar las propiedades del cuidado de las telas por antifrisado, antienvejecimiento, aclarado de colores y suavidad, y para mejorar el efecto de limpieza de los tejidos, por ejemplo, eliminación de suciedad.

El lavado a la piedra tiene tres etapas: desaprestado, abrasión y post-tratamiento. La primera etapa, el proceso de desaprestado, es normalmente el primer tratamiento húmedo de los vaqueros y significa la eliminación de almidón y otros agentes de apresto aplicados habitualmente a las fibras de urdimbre para prevenir el daño durante el proceso de tejido. Se usan alfa-amilasas para eliminar apresto basado en almidón para un procesamiento húmero mejorado y uniforme. Después del desaprestado, los vaqueros se aclaran normalmente con agua o se continúa directamente con la etapa de abrasión.

La segunda etapa, abrasión, puede realizarse con enzimas o piedras pómez o ambas. En todos los casos, es necesaria una acción mecánica para eliminar el tinte, y el tratamiento se lleva a cabo habitualmente en máquinas de lavado, como lavadores de tambor. El término "desgastado" significa en la presente memoria la apariencia de una tela vaquera cuando se ha tratado con enzimas celulasa o piedras, o ambas. Como resultado de la eliminación no uniforme del tinte, existen contrastes entre áreas teñidas y áreas de las que se ha eliminado el tinte. Las expresiones sinónimas son "aspecto lavado a la piedra" o "aspecto desgastado". En el lavado a la piedra enzimático, o biolavado a la piedra, la abrasión con piedras pómez se elimina completamente o parcialmente y se añade celulasa parafacilitar la abrasión del tinte Índigo de la superficie de las fibras. El tratamiento con celulasa puede hacerse usando celulasas neutras o ácidas o ambas.

La abrasión está seguida generalmente por una tercera etapa, post-tratamiento que incluye etapas de lavado y aclarado durante las que pueden usarse detergentes, abrillantadores ópticos o suavizantes. Después del tratamiento enzimático, la reacción debe pararse con el fin de evitar daño a los materiales tratados, por ejemplo, por inactivación con temperatura y/o pH, comprendiendo el último un aclarado concienzudo y/o eliminación de detergente por lavado. Esto asegura que la resistencia mecánica de la tela no se ve comprometida adicionalmente por la presencia continuada de la enzima.

Por "tela vaquera" se quiere decir, en conexión con esta invención, tela vaquera, habitualmente prendas vaqueras,particularmente pantalones vaqueros. Ventajosamente, la tela vaquera es tela vaquera teñida con Índigo. La telavaquera también puede tratarse con Índigo, con derivados de Índigo o tela vaquera teñida con Índigo junto con algúnotro tinte, por ejemplo, tela vaquera teñida con Índigo con fondo de azufre.

El tratamiento con una o unas celulasas puede reemplazar completamente el tratamiento con piedras pómez (por ejemplo, 1 kg de enzima comercial frente a 100 kg de piedras). Sin embargo, el tratamiento con celulasa puede combinarse con tratamiento con piedra pómez cuando se desea producir un acabado fuertemente desgastado. Un efecto de piel de melocotón en el que se crea una fina cubierta semejante a pelo protuberante también se consigue por un lavado que combina una celulasa neutra con piedras pómez. Las celulasas e esta invención son especialmente útiles para proporcionar un aspecto desgastado y para minimizar la retrotinción en biolavado a la piedra.

El biolavado a la piedra se realiza típicamente a aproximadamente pH 3,0-8,0, y preferiblemente a pH 4,0-6,0. La temperatura de la reacción puede variar de aproximadamente 30ºC a 70ºC y es preferiblemente entre 50-60ºC. La relación de licor (la relación del volumen de líquido por peso de tela) puede variar de aproximadamente 3:1 a 20:1, preferiblemente, 5:1 a 10:1. El tiempo de tratamiento puede variar entre 15 min-90 min y preferiblemente 30 min-60 min. Debe enfatizarse que la dosificación de la enzima depende en gran medida del tipo de telas, maquinaria, condiciones del proceso (pH, temperatura, relación de licor, tiempo de tratamiento, carga de tela vaquera, escala del proceso) y tipo de preparación de enzima y semejantes. Si se desea, pueden usarse piedras pómez en combinación con las endoglucanasas o proteínas de fusión de endoglucanasa. La dosificación de la enzima requerida será entonces significativamente menor. Un experto en la técnica es capaz de definir las dosificaciones y condiciones adecuadas.

El material textil que se trata con las preparaciones de enzima de la invención puede fabricarse de fibras que contienen celulosa natural o fibras que contienen celulosa artificial o mezclas de éstas. Los ejemplos de celulósicos naturales son algodón, lino, cáñamo, yute y ramio. Los ejemplos de celulósicos artificiales son viscosa, acetato de celulosa, triacetato de celulosa, rayón, cupro y lyocell. Los celulósicos mencionados anteriormente también pueden emplearse como mezclas de fibras sintéticas tales como poliéster, poliamida o fibras acrílicas. El material textil puede ser fibra o tejido o entrelazado o formado por cualquier otro medio.

Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención, además de ser especialmente útiles para el tratamiento de telas, son útiles en general en cualquier área que requiere actividad celulasa.

En la industria de la pulpa y el papel, las celulasas pueden usarse, por ejemplo, en el desteñido o modificación de fibras de diferentes papeles y cartones reciclados que tienen pH neutro o alcalino, en la mejora de la calidad de las fibras, o en el incremento del drenaje en la fabricación del papel. Otros ejemplos incluyen la eliminación de espesante de pasta de impresión y tinte en exceso después de la impresión textil, y como un tratamiento para el alimento animal. Por ejemplo, si la aplicación pretendida es la mejora de la resistencia de la pulpa mecánica, entonces las preparaciones de enzima de la invención pueden proporcionar una o más de estas proteínas de manera que se potencia o facilita la capacidad de las fibras de celulosa para unirse entre sí. De una manera similar, en la aplicación del refinado de pulpa, las preparaciones de endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la invención pueden proporcionar una o más de estas proteínas a un nivel que potencia o facilita dicho hinchamiento.

Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención proporcionan ventajas inesperadas cuando se usan en la industria textil y especialmente en bioacabado, tal como desfrisado, y en biolavado a la piedra. Las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención son considerablemente más eficientes que las celulasas de la técnica anterior. En el bioacabado se podrían usar dosificaciones al menos cuatro veces menores. En otras palabras, se consigue un mayor rendimiento usando las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención. En desfrisado, las endoglucanasas y proteínas de fusión de endoglucanasa de la presente invención fueron más eficientes y produjeron una superficie lisa estable.

La invención se describe con más detalle en los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse para reducir el alcance de la invención sino sólo para aclarar el uso de la invención.

Ejemplo 1. Cultivo del Acremonium thermophilum ALKO4245

La cepa de Acremonium thermophilum ALKO4245 se creció en un biorreactor de 2 litros (Braun Biostat®, Braun, Melsungen, Alemania) en el medio siguiente, g/l: celulosa Solka Floc 40, polvo de maíz fermentado 15, grano usado de destilador 5, xilano de escanda 3, garrofín 3, (NH4)2SO4 5 y KH2PO4 5. El intervalo de pH fue 5,2±0,2 (NH3/H2SO4), aireación 1 vvm, agitación 300-600 rpm, control antiespuma con Struktol® y la temperatura 42ºC. El tiempo de cultivo fue 4 días. Después del cultivo, las células y otros sólidos se recogieron por centrifugación y se recuperó el sobrenadante.

Ejemplo 2. Purificación de una endoglucanasa de Acremonium thermophilum ALKO4245

El sobrenadante del cultivo de Acremonium thermophilum ALKO4245, crecido como se describe en el Ejemplo 1, se incubó a 70ºC durante 24 horas después de lo cual se concentró por ultrafiltración. La endoglucanasa pura se obtuvo por purificación secuencial con cromatografía de interacción hidrofóbica e intercambio catiónico seguida de filtración en gel. La actividad endoglucanasa de las fracciones recogidas durante la purificación se determinó usando carboximetil celulosa (CMC) como un sustrato (según el procedimiento de IUPAC, 1987).

El sobrenadante del cultivo concentrado se aplicó a la columna de interacción hidrofóbica HiPrep 16/10 Butil FF (GE Healthcare) equilibrada con 20 mM tampón fosfato de potasio, pH 6,0, que contenía 1 M (NH4)2SO4. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal del tampón anterior a 5 mM fosfato de potasio, pH 6,0. Se recogieron fracciones y la actividad endoglucanasa se determinó como se ha descrito anteriormente. La actividad endoglucanasa eluyó en un área de conductividad amplia de 120 a 15 mS/cm.

Las fracciones combinadas se aplicaron a la columna de intercambio catiónico HiTrap SP XL (GE Healthcare) equilibrada con 8 mM acetato de sodio, pH 4,5. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente lineal de 0 a 0,25

5 M NaCl en el tampón de equilibrado. La proteína que contenía actividad endoglucanasa eluyó en el área de conductividad de 3-7 mS/cm. La cromatografía de intercambio catiónico se repitió y el eluato de proteína se concentró por liofilización.

La muestra disuelta se cargó en la columna de filtración en gel Superdex 75 HR10/30 (Pharmacia) equilibrada con 20 mM tampón fosfato de de sodio, pH 7,0, que contenía 0,15 M NaCl. La fracción de proteína principal eluyó de la

10 columna con el volumen de retención de 13,3 ml. El eluato de proteína fue puro según se juzgó por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y el peso molecular se evaluó como 40kDa. La actividad específica de la proteína purificada, designada como EG_40 o At EG_40 de Acremonium thermophilum (SEQ ID NO: 2), a 50ºC, se determinó que era 450 nkat/mg (según el procedimiento de IUPAC, 1987, supra, usando CMC como un sustrato).

La estabilidad térmica de la endoglucanasa purificada se determinó a diferentes temperaturas. La reacción se realizó

15 en presencia de 0,1 mg/ml BSA a pH 5,0 durante 60 min usando CMC como un sustrato. At EG_40 fue estable hasta 80ºC. Las enzimas de referencia de T. reesei EGI (Cel7B) y EGII (Cel5A) retuvieron el 100% de su actividad hasta 60ºC y 65ºC, respectivamente.

Para la secuenciación de aminoácidos interna, la proteína EG_40 de Acremonium thermophilum ALKO4245 (SEQ ID NO: 2) purificada se alquiló en primer lugar y se digirió en péptido trípticos. Los péptidos generados se desalaron y 20 separaron parcialmente por cromatografía nano líquida (fase inversa). Los péptidos internos se secuenciaron por ionización por electropulverización combinada con espectrometría de masa en tándem (ESI-MS/MS) usando el instrumento Q-TOF1 (Waters Micromass®). Las secuencias de péptidos internos así obtenidas se listan en la Tabla

1.

Tabla 1. Secuencias de péptidos internos determinadas a partir de la celulasa EG_40 de Acremonium 25 thermophilum

Péptido

Secuencia SEQ ID NO:

Péptido 1

5

Péptido 2

6

Péptido 3

7

Péptido 4

8

Péptido 5

9

Péptido 6

10

Ejemplo 3. Clonación de los genes cel45A y cel45B de Acremonium thermophilum (ALKO4245)

Se usaron métodos estándar de biología molecular en el aislamiento y tratamientos enzimáticos de ADN (plásmidos, fragmentos de ADN), en transformaciones de E. coli, etc. Los métodos básicos usados se describen en libros

30 estándar de biología molecular, por ejemplo, Sambrook, J., et al., 1989 y Sambrook J. y Russell, D.W., 2001.

La biblioteca genómica de Acremonium thermophilum ALKO4245 se construyó en el vector Lambda DASH®II (Stratagene, EEUU) según las instrucciones del fabricante. El ADN cromosómico, aislado por el método de Raeder y Broda, 1985, se digirió parcialmente con Sau3A. El ADN digerido se fraccionó por tamaño en un gel de agarosa y los fragmentos del tamaño elegido (aproximadamente 5-23 kb) se aislaron, desfosforilaron y ligaron a brazos del vector

35 lambda digerido con BamHI. La mezcla de ligación se empaquetó usando extractos de empaquetamiento Gigapack III Gold según las instrucciones del fabricante (Stratagene, EEUU). La titulación de la biblioteca genómica fue 3,7 x 105 pfu/ml y la de la biblioteca amplificada fue 4,2 x 108 pfu/ml.

Las secuencias de péptidos internos de la celulasa EG_40 de Acremonium thermophilum purificada obtenidas como se describe en el Ejemplo 2 compartían homología con celulasas de la familia glicosil hidrolasa 45, tal como 40 endoglucanasa de Thielavia terrestris (No. de Acceso de GenBank CQ827970) y celulasa Cel45A de Melanocarpus albomyces (No. de Acceso de GenBank AJ515703). Con el fin de amplificar una sonda para cribar el gen que codifica EG_40 de A. thermophilum (cel45A: SEQ ID NO: 1) de la biblioteca genómica, se diseñaron cebadores degenerados sobre la base de las secuencias peptídicas listadas en la Tabla 1 (Ejemplo 2). El orden de los péptidos en la secuencia de proteína y la naturaleza con sentido o anti-sentido correspondiente de los cebadores se 45 dedujeron de la comparación con la secuencia homóloga de Cel45A de M. albomyces. El cebador con sentido (TAYTGGGAYTGYTGYAARCC, SEQ ID NO: 11) se basa en los aminoácidos 1 a 6 del péptido 5 (SEQ ID NO: 9) y el cebador anti-sentido (RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA, SEQ ID NO: 12) se basa en una secuencia peptídica (WFQNADN; SEQ ID NO: 13) de la proteína homóloga Cel45A de M. albomyces. Las mezclas de reacción de PCR contenían 50 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM (NH4)2SO4, 0,1% Tritón X-100, 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTP, 0,5 µg de

cada cebador, 1 unidad de ADN polimerasa Dynazyme EXT (Finnzymes, Finlandia), y aproximadamente 0,5 µg de ADN de Acremonium. Las condiciones para las reacciones de PCR fueron como sigue: 5 min desnaturalización inicial a 95ºC, seguido de 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min de hibridación a 50-60ºC, 2 min de extensión a 72ºC y una extensión final a 72ºC durante 10 min. Los productos de extensión se examinaron en un gel de agarosa.

5 Se obtuvieron dos productos de PCR de la reacción de PCR de Acremonium. Los fragmentos de ADN de aproximadamente 0,6 kb (SEQ ID NO: 14) y 0,8 kb (SEQ ID NO: 15) se aislaron del gel de agarosa y se clonaron en el vector pCR4-TOPO® TA (Invitrogen, EEUU) resultando en los plásmidos pALK1710 y pALK1711, respectivamente. Los productos de PCR clonados se caracterizaron por secuenciación y realizando hibridaciones de transferencias Southern (como se describe más adelante) con el ADN genómico de Acremonium digerido con varias

10 enzimas de restricción. Los patrones de hibridación obtenidos con los dos fragmentos en condiciones de lavado astringentes sugieren que dos genes de endoglucanasa posibles podrían cribarse a partir de la biblioteca genómica de Acremonium. Las secuencias de aminoácidos deducidas a partir de ambos productos de PCR tienen homología con varias secuencias de endoglucanasa publicadas de la familia glicosil hidrolasa 45 (programa BLAST, National Center for Biotechnology Information; Altschul et al., 1990).

15 El inserto del plásmido pALK1710 y pALK1711 se aisló por digestión con enzimas de restricción y se marcó con digoxigenina según las instrucciones del fabricante (Roche, Alemania). Aproximadamente 1-2 x 105 placas de la biblioteca genómica de Acremonium amplificada se transfirieron a filtros de nitrocelulosa y se cribaron por hibridación usando insertos marcados con digoxigenina. La temperatura para la hibridación fue 68ºC y los filtros se lavaron 2 x 5 min a RT usando 2 x SSC-0,1% SDS seguido de 2 x 15 min a 68ºC usando 0,1 x SSC-0,1% SDS. Se

20 obtuvieron varias placas positivas, de las cuales se purificaron cinco placas con fuerte hibridación de ambos cribados. Los ADN de fago se aislaron y analizaron por hibridación de transferencia Southern. Los fragmentos de restricción de los ADN de fago que hibridaron con las sondas se subclonaron en el vector pBluescript II KS+ (Stratagene, EEUU) y las partes relevantes se secuenciaron. En ambos casos, el fragmento de fago subclonado contiene el gen de interés de longitud completa.

25 La Tabla 2 resume la información de las sondas usadas para el cribado de genes de endoglucanasa, clones de fago de los que se aislaron los genes, fragmentos de restricción elegidos que contienen los genes de longitud completa con sus regiones promotora y terminadora, nombres de los plásmidos que contienen el fragmento de fago subclonado, y los números de depósito en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) para cepas de E. coli que portan estos plásmidos. Los depósitos se hicieron bajo el

30 Tratado de Budapest.

Tabla 2. Sondas usadas para la clonación de los genes de endoglucanasa, clones de fago y los subclones elegidos, nombres de plásmidos y el número de depósito correspondiente de las cepas de E. coli

Gen

Biblioteca genómica Sonda usada en el cribado Clon de fago Fragmento subclonado Plásmido No. de depósito de E. coli

At cel45A

A. thermophilum ALKO4245 pALK1710 P24 5,5 kb SmaI pALK1908 DSM 17324

At cel45B

A. thermophilum ALKO4245 pALK1711 P41 6,0 kb XhoI pALK1904 DSM 17323

La información relevante de los dos genes, designados como At cel45A (SEQ ID NO: 1) y At cel45B (SEQ ID NO: 3)

35 se resume en la Tabla 3 y de las secuencias de proteína deducidas respectivas, At EG_40 (SEQ ID NO: 2) y semejante a At EG_40 (SEQ ID NO: 4), en la Tabla 4. Las secuencias peptídicas de la endoglucanasa EG_40 de Acremonium purificada se encontraron en la secuencia de aminoácidos deducida correspondiente del gen clonado confirmando que se clonó un gen apropiado.

El gen At cel45A de longitud completa (SEQ ID NO: 1) tiene una longitud de 1.076 pb, interrumpido por dos intrones

40 de 59 pb y 123 pb, y codifica un polipéptido de 297 aminoácidos At EG_40 (SEQ ID NO: 2). El sitio posible de escisión del péptido señal es después de Ala21, y el extremo N de la proteína madura empieza con Leu22, la proteína madura (incluyendo CBD) que comprende los aminoácidos 22 a 297 de SEQ ID NO: 2). La celulasa EG_40 tiene un dominio de unión de carbohidrato consenso C-terminal que porta los aminoácidos Lys265 a Leu297 del polipéptido de longitud completa. La proteína madura predicha después de la escisión del péptido señal tiene un

45 peso molecular y pI de 28.625 Da y 4,79, respectivamente (predicción hecha usando la herramienta Compute pI/MW en el servidor ExPASy, Gasteiger et al., 2003). La proteína tiene dos posibles sitios de N-glicosilación N-X-S/T (predicho usando el programa NetNGlyc 1.0, Gupta et al., 2004).

Correspondientemente, el gen At cel45B de longitud completa (SEQ ID NO: 3) tiene una longitud de 1.013 pb, interrumpido por dos intrones de 155 pb y 102 pb, y codifica un polipéptido de 251 aminoácidos semejante a At 50 EG_40 (SEQ ID NO: 4). El sitio posible de escisión del péptido señal es después de Ala20, y el extremo N de la proteína madura empieza con Gln21, la proteína madura que comprende los aminoácidos 21 a 251 de SEQ ID NO: 4). La celulasa semejante a EG_40 no tiene dominio de unión de carbohidrato consenso C-terminal. La proteína

madura predicha después de la escisión del péptido señal tiene un peso molecular y pI de 23.972 Da y 6,11 respectivamente (predicción hecha usando la herramienta Compute pI/MW en el servidor ExPASy, Gasteiger et al., 2003). La proteína tiene dos posibles sitios de N-glicosilación N-X-S/T (predicho usando el programa NetNGlyc 1.0, Gupta et al., 2004).

Tabla 3. Resumen de los genes de endoglucanasa aislados de Acremonium thermophilum ALKO4245

Gen de endoglucanasa

Longitud con intrones (pb)(a Región codificadora (pb)(b No. de intrones Longitudes de los intrones (pb) SEQ ID NO:

At cel45A

1.076 891 2 59, 123 1

At cel45B

1.013 753 2 155, 102 3

(a Se incluye el codón de PARADA. (b No se incluye el codón de PARADA.

Tabla 4. Resumen de las secuencias de endoglucanasas deducidas de Acremonium thermophilum ALKO4245. ss, secuencia señal

Proteína endoglucanasa

No. de aas Longitud de ss NN/HMM(a CBD(b PM predicho (Da, ss no incl)(c pI predicho (ss, no incl) Sitios posibles de Nglicosilación(d SEQ ID NO:

At EG_40

297 21/21 Sí; K265 a L297 28.625 4,79 2 2

Semejante a At EG_40

251 20/20 No 23.972 6,11 2 4

(a La predicción sobre la secuencia señal se hizo usando el programa SignalP V3.0 Nielsen et al., 1997; Bendtsen et al., 2004); el valor NN se obtuvo usando redes neurales y el valor HMM usando modelos ocultos de Markov. (b Presencia de un dominio de unión de carbohidrato en la proteína, los aminoácidos del CBD C-terminal se indican (numeración según el polipéptido de longitud completa) (c La secuencia señal predicha no se incluye. La predicción se hizo usando la herramienta Compute pI/MW en el servidor ExPASy (Gasteiger et al., 2003). (d Los sitios de N-glicosilación posibles N-X-S/T se predijeron usando el programa NetNGlyc 1.0 (Gupta et al., 2004, En preparación; www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/).

Las secuencias de proteína deducidas de las celulasas EG_40 y semejante a EG_40 de A. thermophilum son similares a celulasas de la familia glicosil hidrolasa 45 (Tabla 5). Las homologías de secuencia más cercanas encontradas para EG_40/Cel45A y semejante a EG_40/Cel45B fueron secuencias de endoglucanasa de Thielavia terrestris (No. de Acceso de GenBank CQ827970) y Myceliophthora thermophila (No. de Acceso de GenBank AR094305), respectivamente. Los alineamientos se realizaron usando el programa Needle del paquete de programas EMBOSS.

Tabla 5. Comparación de las secuencias de proteína deducidas de las celulasas EG_40 y semejante a EG_40 de Acremonium thermophilum con sus equivalentes homólogos

Organismo, enzima, y número de acceso

Identidad (%)

Acremonium thermophilum EG_40

Thielavia terrestris EG45, CQ827970

77,3

Melanocarpus albomyces Cel45, AJ515703

75,3

Neurospora crassa, hipotético XM_324477

68,9

Humicola grisea var thermoidea, EGL3, AB003107

67,5

Humicola insolens EG5, A23635

67,3

Myceliophtora thermophila fam 45, AR094305

57,9

Acremonium thermophilum semejante a EG_40

53,7

Acremonium thermophilum semejante a EG_40

Myceliophtora thermophila fam 45, AR094305

66,9

Magnaporthe grisea 70-15 hipotético, XM_363402

61,9

Thielavia terrestris EG45, CQ827970

56,8

Acremonium thermophilum EG_40

53,7

Melanocarpus albomyces Cel45, AJ515703

52,8

10 Ejemplo 4. Producción de celulasas EG_40 y semejante a EG_40 de Acremonium thermophilum en Trichoderma reesei

Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las celulasas recombinantes EG_40/Cel45A y semejante a EG_40/Cel45B de A. thermophilum. Ambos genes (cel45A o cel45B) incluyendo su propia secuencia señal, se fusionaron exactamente con el promotor de cbh1 (cel7A) de T. reesei por PCR (Tabla 6). El promotor de 15 cbh1, el terminador de cbh1 y el gen marcador amdS se incluyeron como se describe en Paloheimo et al. 2003, supra. El casete de expresión lineal (Figura 1) se aisló del núcleo del vector por digestión con enzimas de restricción, se transformó en T. reesei A96 y los transformantes se seleccionaron con acetamida como la única fuente de nitrógeno. La cepa huésped carece de cuatro celulasas endógenas principales: CBHI/Cel7A, CBHII/Cel6A, EGI/Cel7B y EGII/Cel5A. Las transformaciones se realizaron según Penttilä et al, 1987, con las modificaciones

20 descritas en Karhunen et al., 1993. Los transformantes se purificaron en placas de selección a través de conidio único antes de esporularlas en agar de extracto de patata.

Tabla 6. Los casetes de expresión construidos para la producción de las celulasas EG_40 y semejante a EG_40 de Acremonium thermophilum en Trichoderma reesei. La estructura esquemática de los casetes de expresión se describe en la Figura 1

Endoglucanasa

Plásmido de expresión Tamaño del casete de expresión(a Terminador heterólogo(b

At EG_40

pALK1920 10,9 kb NotI 156 pb (HindIII)

Semejante a At EG_40

pALK1921 8,6 kb EcoRI 282 pb (SspI)

(a El casete de expresión para la transformación de T. reesei se aisló del núcleo del vector por digestión con EcoRI y NotI.

(b Se indica el número de nucleótidos después del codón de PARADA del gen clonado que están incluidos en el casete de expresión. El sitio de restricción en la región 3' del gen que se usó en la construcción del casete de 30 expresión se indica entre paréntesis.

La producción de endoglucanasa de los transformantes se analizó a partir de los sobrenadantes del cultivo de cultivos en matraz agitado (50 ml). Los transformantes se crecieron durante 7 días en un medio inductor de celulosa complejo (Joutsjoki et al., 1993) tamponado con 5% KH2PO4 a pH 5,5. La actividad enzimática de la proteína recombinante se midió a partir del sobrenadante del cultivo como la liberación de azúcares reductores de 35 carboximetilcelulosa (2% CMC) a 50ºC en 50 mM Tampón citrato pH 4,8 esencialmente como se describe por Bailey, M. J. y Nevalainen, K.M.H., 1981; Haakana, H., et al, 2004. La producción de la proteína recombinante también se detectó a partir del sobrenadante del cultivo por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se produjeron anticuerpos policlonales específicos de EG_40 en conejos (Universidad de Helsinki, Finlandia). La expresión de celulasa EG_40 se verificó por análisis de transferencia Western con anticuerpos anti-EG_40 usando el

sistema de transferencia Western AP ProtoBlot (Promega). Los genotipos de los transformantes elegidos se analizaron por transferencia Southern usando el casete de expresión como una sonda.

El pH óptimo de las celulasas EG_40/Cel45A y semejante a EG_40/Cel45B producidas de forma heteróloga se determinó en el tampón universal de Mcllvaine con un intervalo de pH de 4,0-8,0 usando CMC como un sustrato. Como se muestra en la Figura 2A, el intervalo de pH de la celulasa EG_40/Cel45A es relativamente amplio (4,5-6,0), siendo el óptimo a pH 5,5. El pH óptimo para semejante a EG_40/Cel45B se determinó que era pH 5,0-5,5. La temperatura óptima para la actividad enzimática de las celulasas EG_40/Cel45A y semejante a EG_40/Cel45B se determinó que era 75-80ºC y 60ºC, respectivamente (Figura 2B). La estabilidad térmica de la celulasa EG_40/Cel45A producida de forma heteróloga es comparable a la de la proteína purificada.

Los transformantes elegidos RF6118 (At EG_40) y RF6071 (semejante a At EG_40) se cultivaron en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28ºC, pH 4,2) para obtener material para los ensayos de aplicación (véanse los Ejemplos 8 a 13).

Ejemplo 5. Construcción y producción de celulasas EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas

Se usaron métodos estándar de biología molecular como se describe en el Ejemplo 3. La secuencia señal de la celulasa EG_40 se reemplazó con la de CBHI de Trichoderma reesei. Se esperaba que el uso de la secuencia señal endógena del huésped mejorara la producción de proteína heteróloga. Con el fin de amplificar el fragmento 5' del gen At cel45A se diseñaron dos oligonucleótidos. El cebador con sentido (ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCCC TCGACGGAAAGTCGAC, SEQ IG NO: 22) contiene la secuencia señal de cel7A de T. reesei y el cebador antisentido (TCGACTGCACCACCATGGTC. SEQ ID NO: 23) es específico para At cel45A. El gen de longitud completa se reconstituyó por ligación del producto de PCR amplificado como un fragmento SacII-NcoI con el extremo 3' del gen At cel45A.

Posteriormente, se modificó el dominio de unión de carbohidrato de EG_40/Cel45A: Se prepararon tres construcciones que contenían el dominio catalítico de EG_40/Cel45A (aminoácidos 22-234 de SEQ ID NO: 2) unidos a la región conectora y CBD bien de CBHI/Cel7A de Trichoderma reesei (SEQ ID NO: 24), XYN60/Xyn10A de Acremonium thermophilum ALKO4245 (SEQ ID NO: 25), o CBHI/Cel7A de Chaetomium thermophilum ALKO4265 (SEQ ID NO: 26). El conector y la región CBD del gen que codifica CBHI/Cel7A de T. reesei (cel7A, SEQ ID NO: 27), el gen que codifica XYN60/Xyn10A de A. thermophilum ALKO4245 (xyn10A, SEQ ID NO: 28) o gen que codifica CBHI/Cel7A de C. thermophilum ALKO4265 (cel7A, SEQ ID NO: 29) se amplificó por PCR usando combinaciones de oligonucleótidos de TTGGATCCGAGTCGCAGCGGCAACCCTAGCGGCGGCAAC (SEQ ID NO: 30) + TAATTCTGCAGTTACAGGCACTGAGAGTAG (SEQ ID NO: 31), o TTGGATCCGAGTCGCAGCGGCGGGAACCCACCCCCCGTCAC (SEQ ID NO: 32) + TAATTCTGCAGTCACAGGCACTGAGAGTACCAGT (SEQ ID NO: 33), o TAATTTACGTACCTGGCCTTGACGGCAG (SEQ ID NO: 34) + ATTAACTGCAGTTACAGGCACTGTTGAGCA (SEQ ID NO; 35), respectivamente. Los productos de PCR amplificados se ligaron en el gen cel45A para crear los genes At cel45A_Tr cel7AconectorCBD (SEQ ID NO: 36), At cel45A_At xyn10AconectorCBD (SEQ ID NO: 37), o At cel45A_Ct cel7AconectorCBD (SEQ ID NO: 38). Los plásmidos resultantes se designaron como pALK2022, pALK2024, y pALK2026. Los números de depósito de las cepas de E. coli correspondientes en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH son DSM 18815, DSM 18816, y DSM 18817, respectivamente. Los depósitos se hicieron bajo el Tratado de Budapest.

Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de proteínas EG_40/Cel45A modificadas y las proteínas recombinantes EG_40_TrCBD (SEQ ID NO: 39), EG_40_AtCBD (SEQ ID NO: 40), y EG_40_CtCBD (SEQ ID NO: 41) se produjeron en Trichoderma como se describe en el Ejemplo 4. La temperatura y pH óptimos de las celulasas EG_40/Cel45A modificadas fue similar a los de la proteína de tipo salvaje. Los transformantes elegidos RF6828 (EG_40_TrCBD), RF6835 (EG_40_AtCBD), y RF6821 (EG_40_CtCBD) se cultivaron en un biorreactor de 2 litros durante cuatro días (28ºC, pH 4,2) para obtener material para los ensayos de aplicación (Ejemplos 9 y 13).

Ejemplo 6. Construcción y producción de celulasas EG_40 de Acremonium thermophilum ALKO4245 que carecen del dominio de unión de carbohidrato o dominio de unión de carbohidrato más la región conectora

Para producir celulasas EG_40 de Acremonium thermophilum ALKO4245 que carecen del dominio de unión de carbohidrato (CBD), At cel45A_CBDmenos, o el CBD más la región conectora, At cel45A_conectorCBDmenos, se hicieron dos construcciones de deleción cel45A; la primera carecía de la región que codifica el CBD y la segunda carecía además de la región conectora entre el núcleo catalítico y el dominio de unión de carbohidrato.

Se usaron métodos estándar de biología molecular como se describe en el Ejemplo 3. Se amplificaron dos fragmentos 3' de diferente longitud del gen cel45A por PCR. Los cebadores antisentido se diseñaron para excluir la región CBD o conector+CBD del producto. Un producto de PCR amplificado con los cebadores GCAGCAACCAGTTCGACCTC (SEQ ID NO: 42) y TTAACTGCAGTCACTGGGCAGTGCAGCCACCGCCTC (SEQ ID NO: 43) se ligó como un fragmento SacI-PstI y otro fragmento de PCR amplificado con los cebadores ACTGCTGCAAGCCGTCCTGC (SEQ ID NO: 44) y TTAACTGCAGTCAACCGCTAGGCGGGTTGAAGACGGGATAG (SEQ ID NO: 45) como un fragmento NcoI-PstI al fragmento 5' del gen cel45A para reconstituir los genes de longitud completa At cel45A_CBDmenos (SEQ ID NO: 16) y At cel45A_conectorCBDmenos (SEQ ID NO: 18), respectivamente. Los plásmidos resultantes se designaron pALK2009 y pALK2014. Los números de depósito de las cepas de E. coli correspondientes en la colección de cultivos Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH son DSM 18813, y DSM 18814, respectivamente. Los depósitos se hicieron bajo el Tratado de

5 Budapest.

Se construyeron plásmidos de expresión para la producción de las versiones CBDmenos y conectorCBDmenos de la celulasa EG_40/Cel45A de A. thermophilum y las proteínas recombinantes (SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente) se produjeron en Trichoderma como se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 7. Construcción y producción de la proteína de fusión recombinante semejante a EG_40+CBD de 10 Acremonium thermophilum ALKO4245

Para producir una proteína de fusión recombinante semejante a EG_40+CBD de Acremonium thermophilum ALKO4245 (SEQ ID NO: 21), el dominio de unión de carbohidrato (CBD) de la celulasa EG_40/Cel45A se une a la celulasa semejante a EG_40. La construcción contiene el dominio catalítico de semejante a EG_40 (aminoácidos 1242 del polipéptido de longitud completa) unidos a la región conectora y CBD de celulasa EG_40 (aminoácidos 235

15 297 del polipéptido de longitud completa).

Se usan métodos estándar de biología molecular como se describe en el Ejemplo 3. En primer lugar, se introduce un único sitio de restricción NruI cerca del extremo C-terminal de la secuencia semejante a EG_40 por PCR. Esto permite la fusión directa de cualquier ADN con extremos romos después del aminoácido S242 del polipéptido semejante a EG_40. La región conector+CBD del gen que codifica EG_40 (cel45A) se amplifica por PCR y un

20 fragmento de restricción de éste se liga al gen cel45B (después de S242) para crear At cel45B_cel45AconectorCBD (SEQ ID NO: 20). Se construye un plásmido de expresión para la producción de la celulasa semejante a EG_40CBD y la proteína recombinante (SEQ ID NO: 21) se produce en Trichoderma como se describe en el Ejemplo 4.

Ejemplo 8. Rendimiento de la preparación de celulasa EG_40 en el acabado de tela vaquera a diferentes temperaturas

25 La celulasa EG_40 de Acremonium thermophilum de la cepa RF6118 producida usando Trichoderma reesei como huésped como se describe en el Ejemplo 4 se ensayó para su capacidad de crear un aspecto desgastado similar al proporcionado por piedras pómez en el biolavado a la piedra de tela vaquera a diferentes temperaturas. Una preparación comercial enriquecida en EGII producida usando Trichoderma como huésped (US 5.874.293) eficiente en acabado de tela vaquera se usó para comparación a 50ºC.

30 Los pantalones vaqueros hechos de tela vaquera de sarga teñida con Índigo se usaron como material de ensayo después de desaprestado con alfa-amilasa ECOSTONE® A200. Los tratamientos con celulasa se realizaron con lavador extractor Wascator FOM 71 CLS de Electrolux bajo las condiciones descritas en la Tabla 7.

El concentrado de enzima estabilizado enriquecido en EGII se dosificó a 0,23% en peso de la tela, que es la dosificación típica para la preparación en aplicaciones industriales. Una preparación de EG_40 concentrada y 35 estabilizada obtenida de fermentación piloto se dosificó a 0,18%. Cuando se calcula [como proteína] en términos del contenido de proteína, las dosificaciones fueron aproximadamente 0,20 mg y 0,035 mg por g de tela usando el Reactivo de Tinción del Ensayo de Proteínas Bio-Rad (BioRad, Hercules, CA; EEUU) y gammaglobulina bovina como el estándar. La enzima celulasa se inactivó después de drenaje elevando el pH por encima de 11 mediante una adición de 5 g de NaOH (10 min, 40ºC) y aclarando tres veces. Los pantalones vaqueros se secaron en una

40 secadora.

El efecto de biolavado a la piedra/nivel de abrasión se evaluó midiendo el color como valores de reflectancia con espectrofotómetro Minolta CM 2500 usando coordinadas espaciales de color L*a*b* (iluminante D65/2º). El color del lado frontal y el lado reverso de la tela vaquera se midió después de desaprestado (es decir, antes del tratamiento con celulasa) y después del tratamiento con celulasa. Cada valor de medida en el lado frontal de la tela vaquera fue

45 un promedio de aproximadamente 40 medidas. Se usaron dos pares de pantalones vaqueros en cada ensayo y el resultado final fue el promedio de éstos. Los resultados se muestran en la Tabla 8 y Fig. 3.

Tabla 7. Las condiciones de ensayo/parámetros del proceso usadas en los tratamientos con celulasa

Parámetro del proceso

Carga de tela vaquera

1,3-1,4 kg

Agua

19 litros

Control de pH (pH 5-5,3)

5 ml de Ácido acético (80%)

Tiempo

45 min

Temperatura

40, 50, 60, ó 70ºC

Dosificación de celulasa

0,18% ó 0,23% en peso de la tela

Tabla 8. Medidas de color del lado frontal de tela vaquera tratada con preparación de EG_40 a diferentes temperaturas

Preparación de enzima

Dosificación, %owfa) Proteína, mg/g de tela Temp., ºC Antes del tratamiento con celulasa Después del tratamiento con celulasa Incremento

L*

b* L* b* de L*

Conc. enriquecido en EGII

0,23 0,20 50 22,24 -15,57 30,08 -17,64 7,84

Conc. de EG_40

0,18 0,035 70 21,88 -15,54 31,07 -16,76 9,20

Conc. de EG_40

0,18 0,035 60 22,21 -15,40 34,16 -16,34 11,95

Conc. de EG_40

0,18 0,035 50 22,00 -15,22 30,10 -17,26 8,10

Conc. de EG_40

0,18 0,035 40 22,13 -14,98 27,26 -17,50 5,13

a) en peso de la tela. El tratamiento con la preparación enriquecida en EGII se usó para comparación a 50ºC. L* indica la claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Los resultados en la Tabla 8 y Fig. 3 muestran que el efecto biolavado a la piedra de EG_40 fue muy bueno a un intervalo bajo de dosificación. Con la preparación EG_40 se obtuvo un nivel de abrasión similar (claridad L*) comparado con la preparación enriquecida en EGII a 50ºC con una cantidad 6 veces menor de proteína.

Ejemplo 9. Rendimiento de celulasas EG_40 modificadas en el acabado de tela vaquera

5 Las celulasas EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas producidas en Trichoderma reesei como se describe en el Ejemplo 5 se ensayaron para su capacidad de crear un aspecto desgastado similar al proporcionado por piedras pómez en biolavado a la piedra de tela vaquera. Las proteínas recombinantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, y EG_40_CtCBD se compararon con celulasa EG_40 de tipo salvaje (Ejemplo 4).

Las perneras de tela vaquera hechas de telas vaqueras teñidas con Índigo de diferente tipo se usaron como material

10 de ensayo después de desaprestado con alfa-amilasa ECOSTONE® A200. Los tratamientos con celulasa se realizaron con lavador extractor Wascator FOM 71 CLS de Electrolux bajo las condiciones descritas en la Tabla 9.

Las preparaciones de celulasa se dosificaron a 200 nkat/g en peso de la tela. La actividad endoglucanasa se midió como en el Ejemplo 4, excepto que se usó 3% CMC y 60ºC. La enzima celulasa se inactivó después de drenaje elevando el pH por encima de 11 mediante una adición de 4,2 g de NaOH (10 min, 40ºC) y aclarando tres veces. Las

15 perneras de tela vaquera se secaron en una secadora.

El efecto de biolavado a la piedra/nivel de abrasión se evaluó midiendo el color en el lado frontal de la tela vaquera como en el Ejemplo 8. Cada valor de medida en el lado frontal de la pernera de tela vaquera fue un promedio de aproximadamente 20 medidas. El resultado final fue el promedio de tres telas vaqueras diferentes de Ukos Sport, Bélgica (Intrique, Atlanta, Nostalgy). Los resultados se muestran en la Tabla 10.

20 Tabla 9. Las condiciones de ensayo/parámetros del proceso usadas en los tratamientos con celulasa

Parámetro del proceso

Carga de tela vaquera

1,1 kg

Agua

17 litros

Control de pH (pH 5)

27 g Na2HPO42H2O + 19 g de ácido cítrico

Tiempo

55 min

Temperatura

60ºC

Dosificación de celulasa

200 nkat/g de tela

Tabla 10. Medidas de color del lado frontal de tela vaquera tratada con diferentes celulasas EG_40 a 60ºC y pH 5

Celulasa

Tela vaquera Dosificación nkat/g a) Antes del tratamiento con celulasa b) Después tratamiento celulasa b) del con Incremento de L*

EG_40_TrCBD

L* b L* b

Intrigue

20,56 -9,88 26,43 -12,22 5,87

Atlanta

21,22 -16,41 25,99 -18,40 4,77

Nostalgy

19,70 -10,26 24,49 -13,11 4,79

Promedio

200 20,49 -12,18 25,64 -14,58 5,14

EG_40_AtCBD

Intrigue 20,63 -10,01 27,08 -12,61 6,45

Atlanta

21,26 -16,6 27,11 -18,41 5,85

Nostalgy

19,56 -10,08 24,18 -13,24 4,62

Promedio

200 20,48 -12,23 26,12 -14,75 5,64

EG_40_CtCBD

Intrigue 20,58 -9,91 26,97 -11,94 6,39

Atlanta

21,19 -16,45 26,61 -18,06 5,42

Nostalgy

19,70 -10,17 23,71 -12,53 4,01

Promedio

200 20,49 -12,18 25,76 -14,18 5,27

EG_40

Intrigue 20,59 -9,76 26,56 -12,24 5,97

Atlanta

21,26 -16,59 16,83 -18,52 5,57

Nostalgy

19,61 -10,12 24,32 -13,09 4,71

Promedio

200 20,49 -12,16 25,90 -14,62 5,42

a) en peso de la tela 25 b) L* indica la claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla. Los resultados en la Tabla 10 muestran que el efecto biolavado a la piedra de las preparaciones de EG_40 modificada fue comparable con el obtenido usando la preparación de EG_40 que contenía celulasa de tipo salvaje.

Ejemplo 10. Refuerzo del rendimiento de lavado de preparación de enzima enriquecida en EGII con celulasa EG_40 en acabado de tela vaquera

El efecto de la celulasa EG_40 con preparación enriquecida en EGII se ensayó en biolavado a la piedra de tela vaquera. La tela vaquera y el sistema de ensayo fueron como en el Ejemplo 8, excepto para la temperatura, que fue 5 50ºC. También se evaluó el efecto del tratamiento con celulasa como en el Ejemplo 8. Las preparaciones de enzima se dosificaron a 3-5 gramos resultando en 0,22-0,38% en peso de la tela (Tabla 11).

Los resultados en la Tabla 11 y Fig. 4 muestran que EG_40 también puede usarse para mejorar el efecto de abrasión de una preparación enriquecida en EGII. Con la preparación enriquecida en EGII solo, no pudieron obtenerse niveles similares de claridad a los obtenidos por la mezcla que contiene 70% del concentrado enriquecido

10 en EGII y 30% de concentrado de celulasa EG_40 incluso con una dosificación incrementada.

Tabla 11. Medidas de color del lado frontal de tela vaquera tratada a 50ºC con mezcla de preparaciones enriquecidas en EGII y de EG_40 comparado con enriquecida en EGII sola

Preparación de enzima

Dosificación, g Dosificación, % owfa) Antes de tratamiento con celulasab) Después de tratamiento con celulasab) Incremento de claridad

L*

b* L* b*

Conc. enriquecido en EGII

5 0,38 22,32 -15,47 31,72 -17,50 9,40

Conc. enriquecido en EGII

3 0,23 22,24 -15,57 30,08 -17,64 7,84

Mezcla EGII+EG_40 70%+30%

4,3 0,33 22,20 -15,53 32,31 -17,46 10,11

Mezcla EGII+EG_40 70%+30%

3 0,22 22,18 -15,74 32,03 -17,55 9,85

a) en peso de la tela b) L* indica la claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Ejemplo 11. Rendimiento de preparación de celulasa semejante a EG_40 en el acabado de tela vaquera

El líquido de fermentación de semejante a EG_40 de la cepa RF6071 producido como se describe en el Ejemplo 4 se comparó con un concentrado enriquecido en EGII en el biolavado a la piedra de tela vaquera. La tela vaquera y el sistema de ensayo para biolavado a la piedra fueron como en el Ejemplo 8, excepto para la temperatura, que fue 60ºC y la cantidad de tela vaquera, que se niveló a 1.430 g con una pieza extra de tela vaquera diferente que no se incluyó en las medidas. También se evaluó el efecto del tratamiento con celulasa como en el Ejemplo 8.

Los resultados en la Tabla 12 muestran que el efecto de abrasión de semejante a EG_40 se obtuvo con menosretro-tinción (re-deposición de tinte Índigo) en el lado reverso de la tela vaquera. Especialmente, la claridad de los bolsillos fue mayor y fueron menos azules.

Tabla 12. Medidas de color del lado frontal y reverso de tela vaquera y bolsillos tratados a 60ºC con preparación semejante a EG_40

Preparación de enzima

Dosificación Prot., mg/g de tela Antes de tratamiento con celulasa Después de tratamiento con celulasa deltaL* deltab*

L*

b* L* b*

Lado frontal:

semejante a EG_40

100 ml 0,32 23,78 -16,20 31,09 -17,36 7,31 -1,16

enriquecido en EGII

1,5 g 0,095 23,64 -16,28 31,09 -17,39 7,45 -1,11

Lado reverso:

semejante a EG_40

100 ml 0,32 49,24 -7,34 47,74 -11,39 -1,50 -4,05

enriquecido en EGII

1,5 g 0,095 49,32 -6,97 47,24 -11,78 -2,09 -4,81

Bolsillos:

semejante a EG_40

100 ml 0,32 75,42 -8,78 66,39 -13,20 -9,03 -4,42

enriquecido en EGII

1,5 g 0,095 76,63 -7,95 64,41 -13,91 -12,22 -5,96

El tratamiento con la preparación enriquecida en EGII se usó para comparación. L* indica la claridad, -b* es la dirección azul, +b* es la dirección amarilla.

Ejemplo 12. Rendimiento de preparación de EG_40 y enriquecida en EGII reforzada con EG_40 en bioacabado (desfrisado)

La capacidad de la preparación concentrada de EG_40 RF6118 y la capacidad de la preparación enriquecida en EGII reforzada con EG_40 en desfrisado de prenda de punto de algodón se compararon con una preparación 5 comercial enriquecida en EGII, usada típicamente en formulaciones de bioacabado. Los tratamientos con celulasa se realizaron con el lavador extractor Wascator FOM 71 CLS de Electrolux bajo las condiciones descritas en la Tabla

13.

Se usaron como material de ensayo piezas de dos clases de suéteres con cuello polo azules de baja calidad con superficie pilosa, hechos de tela basada en jersey 100% algodón o canalé hecho de 95% algodón y 5% licra. El 10 material de relleno se añadió hasta 1 kg. Las muestras se pre-lavaron en primer lugar durante 10 min a 60ºC con 1 ml/l de agentes tensioactivos/humectantes (Sandoclean PCJ de Sandos e Imacol CN de Clariant) y se aclaró 3 veces. Después de esto, las prendas de punto de algodón se trataron con celulasa a 60ºC durante 60 minutos en presencia de los mismos auxiliares textiles que los usados en el pre-lavado. La enzima se inactivó como se describe en el Ejemplo 8, excepto por la temperatura que fue 60ºC durante el aclarado alcalino, y las piezas de prensa de

15 punto se aclararon tres veces y se secaron en la secadora.

Tabla 13. Las condiciones de ensayo/parámetros del proceso usadas en los tratamientos de bioacabado

Parámetro del proceso

Carga de tela

1,0 kg

Agua

15 litros

Sandoclean PCJ e Imacol CN

1 ml/l

Tampón/control de pH (pH 5-5,3)

aproximadamente 3 ml de Ácido acético (80%)

Tiempo

60 min

Temperatura

60ºC

Dosificación de celulasa

0,04% a 0,63% en peso de la tela

El efecto del tratamiento con celulasa se evaluó visualmente a simple vista y con una lupa. La muestra pre-lavada sin enzima se usó como control. Los resultados se muestran en la Tabla 14 y las fotos de cámara digital tomadas

20 con un macroobjetivo se muestran en la Fig. 5.

La preparación EG_40 y la preparación enriquecida en EGII reforzada con EG_40 tuvieron excelentes propiedades de desfrisado comparado con a preparación comercial enriquecida en EGII que se usó a un intervalo de dosificación típico para este concentrado de enzima en la aplicación de bioacabado. Con la preparación EG_40, podía usarse una dosificación al menos 8 veces menor y con la mezcla enriquecida en EGII-EG_40 dosificaciones al menos 4

25 veces menores que con la preparación EGII para obtener un efecto similar.

Los niveles de proteína en el sobrenadante del cultivo en el biorreactor son de alguna manera menores con la cepa RF6118 que la cepa productora Trichoderma de la preparación enriquecida en EGII, cuando se ensaya con el ensayo de determinación de proteínas usado. A pesar de esto, el medio de cultivo de EG_40 es volumétricamente al menos 4-6 veces más efectivo en bioacabado.

30 Tabla 14. Los resultados de tratamientos de bioacabado con preparaciones de EG_40 y enriquecidas en EGII reforzadas con EG_40 comparado con enriquecida en EGII sola

Muestra

Dosificación, g Dosificación, % owfa) Efecto desfrisadob) Prot mg/g de tela

Conc. enriquecido en EGII

6,3 0,63 +++++ 0,55

Conc. enriquecido en EGII

3,2 0,32 +++ 0,27

Mezcla de enriquecido en EGII+EG_40 70%+13%

3,2 0,32 +++++ 0,21

Mezcla de enriquecido en EGII+EG_40 70%+13%

1,6 0,16 +++++ 0,10

Mezcla de enriquecido en EGII+EG_40 70%+13%

0,8 0,08 +++ 0,052

Conc. EG_40

1,6 0,16 +++++ 0,050

Conc. EG_40

0,8 0,08 +++++ 0,025

Conc. EG_40

0,4 0,04 +++ 0,012

Prelavado sólo, sin enzima

- - - -

a) en peso de la tela.

b) +++++ Excelente efecto desfrisado, visualmente superficie muy limpia

+++ Buen efecto desfrisado, visualmente superficie relativamente limpia

-

Presencia de pelusa densa en la superficie/y o frisado severo.

5 Ejemplo 13. rendimiento de celulasas EG_40 modificadas en bioacabado (desfrisado)

Las celulasas EG_40 de Acremonium thermophilum modificadas producidas en Trichoderma reesei como se describe en el Ejemplo 5 se ensayaron para su capacidad de desfrisado de prendas de punto de algodón. Las proteínas recombinantes EG_40_TrCBD, EG_40_AtCBD, y EG_40_CtCBD se compararon con celulasa EG_40 de tipo salvaje. Los tratamientos con celulasa se realizaron con lavador extractor Wascator FOM 71 CLS de Electrolux

10 bajo las condiciones descritas en el Ejemplo 12, excepto que la enzima se dosificó a 83 nkat/g de tela. La actividad endoglucanasa se midió como se describe en el Ejemplo 9.

Se usaron como material de ensayo piezas de tres diferentes prendas de punto con superficie pilosa, hechas de 100% algodón ó 95% algodón y 5% licra. El material de relleno se añadió hasta 1 kg. Las muestras se trataron como se describe en el Ejemplo 12. El efecto del tratamiento con celulasa se evaluó visualmente a simple vista o con una

15 lupa. La muestra pre-lavada sin enzima se usó como control. Los resultados se muestran en la Tabla 15.

Todas las preparaciones EG_40 tuvieron excelentes propiedades de desfrisado dando lugar a una reducción extensa de pelusa y prevención de la formación de bolitas. Las muestras control, tratadas sin enzima contenían pelusa densa en la superficie y frisado severo.

Los ensayos preliminares realizados a 50ºC y 30 min usando una dosificación de enzima de 42 nkat/g de tela

20 mostraron que todas las diferentes celulasas EG_40 tenían también un efecto desfrisado considerable, cuando se usan dosificaciones menores y/o tiempo de reacción menor.

Tabla 15. Los resultados de tratamientos de bioacabado con diferentes celulasas EG_40

Muestra

Dosificación, nkat/g de tela Efecto desfrisado

EG_40_TrCBD

83 +++++

EG_40_AtCBD

83 +++++

EG_40_CtCBD

83 +++++

EG_40

83 +++++

Lavado sin enzima

- -

+++++ Excelente efecto desfrisado, visualmente superficie muy limpia

-

Presencia de pelusa densa en la superficie/y o frisado severo

Lista de organismos depositados

Acremonium thermophilum ALKO4245 se depositó en el Centralbureau Voor Schimmelcultures en Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, Holanda (CBS) el 20 de sep, 2004 bajo CBS 116240.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK1908 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 13 de mayo, 2005 bajo DSM 17324.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK1904 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 13 de mayo, 2005 bajo DSM 17323.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK2009 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre, 2006 bajo DSM 18813.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK2014 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre, 2006 bajo DSM 18814.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK2022 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre, 2006 bajo DSM 18815.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK2024 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre, 2006 bajo DSM 18816.

Escherichia coli que contiene el plásmido pALK2026 se depositó en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, Alemania el 24 de noviembre, 2006 bajo DSM 18817.

REFERENCIAS

LISTA DE SECUENCIAS

<110> AB Enzymes Oy

<120> Enzimas nuevas

<130> 2052060PC

<160> 45

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 2334

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (13) .. (13)

<223> n significa a, t, c, o g

<220>

<221> CDS

<222> (715)..(797)

<220>

<221> Intrón

<222> (798)..(856)

<220>

<221> CDS

<222> (857)..(1105)

<220>

<221> Intrón

<222> (1106)..(1228)

<220>

<221> CDS

<222> (1229)..(1787)

<400> 1

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 3

<211> 2033

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> CDS

<222> (259)..(702)

<220>

<221> Intrón

<222> (703)..(857)

<220>

<221> CDS

<222> (858)..(888)

<220>

<221> Intrón

<222> (889)..(990)

<220>

<221> CDS

<222> (991)..(1268)

<210> 4

<211> 251

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum 15

<400> 6

<210> 7 20 <211> 10

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 9

<211> 14

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (3)..(3)

<223> y significa c o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (9)..(9)

<223> y significa c o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (12)..(12)

<223> y significa c o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (15)..(15)

<223> r significa a o g

<400> 11 taytgggayt gytgyaarcc 20

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> cebador

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (1)..(1)

<223> r significa a o g

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (4)..(4)

<223> r significa a o g

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (7)..(7)

<223> n significa a, t, c o g

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (10)..(10)

<223> r significa a o g

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (13)..(13)

<223> y significa c o t

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (16)..(16)

<223> r significa a o g

<400> 12 rttrtcngcr ttytgraacc a 21

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> Melanocarpus albomyces

<400> 13

<210> 14

<211> 636

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 14

<210> 15

<211> 786

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<210> 16

<211> 994 15 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> CDS 20 <222> (13)..(95)

<220>

<221> Intrón

<222> (96)..(154)

<220>

<221> CDS

<222> (155)..(403) 5

<220>

<221> Intrón

<222> (404)..(526)

10 <220>

<221> CDS

<222> (527)..(986)

<400> 16

<210> 17

<211> 264

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 17

<210> 18

<211> 907

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> CDS

<222> (13)..(95)

<220>

<221> Intrón

<222> (96)..(154)

<220>

<221> CDS

<222> (155)..(403)

<220>

<221> Intrón

<222> (404)..(526)

<220>

<221> CDS

<222> (527)..(899)

<400> 18

<210> 19

<211> 235

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 19

<210> 20

<211> 1175 5 <212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(444)

<220>

<221> Intrón

<222> (445)..(599) 5

<220>

<221> CDS

<222> (600)..(630)

10 <220>

<221> Intrón

<222> (631)..(732)

<220> 15 <221> CDS

<222> (733)..(1172)

<400> 20

<210> 21

<211> 305

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 21

<210> 22

<211> 89

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

10 15

<210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Acremonium thermophilum <400> 23 tcgactgcac caccatggtc 20

20

<210> 24 <211> 68 <212> PRT <213> Trichoderma reesei

<400> 24

<210> 25 30 <211> 70

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 25

<210> 26

<211> 81

<212> PRT

<213> Chaetomium thermophilum

15 <210> 27

<211> 1675

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

20 <220>

<221> Intrón

<222> (462)..(528)

<220> 25 <221> Intrón

<222> (1226)..(1288)

<400> 27 5 <210> 28

<211> 1471

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

10 <220>

<221> Intrón

<222> (338)..(472)

<220> 15 <221> Intrón

<222> (699)..(783)

<400>

28

<400>

31 taattctgca gttacaggca ctgagagtag 30

5

<210> 29

<211> 1663

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

10

<220>

<221> Intrón

<222> (1591)..(1654)

15

<400> 29

5

<210> 30 <211> 39 <212> DNA <213> Trichoderma reesei

10

<400> 30 ttggatccga gtcgcagcgg caaccctagc ggcggcaac 39

15

<210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Trichoderma reesei

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 32 ttggatccga gtcgcagcgg cgggaaccca ccccccgtca c

<210> 33

<211> 34

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 33 taattctgca gtcacaggca ctgagagtac cagt 34

<210> 34

<211> 28

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 34 taatttacgt acctggcctt gacggcag 28

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> Chaetomium thermophilum

<400> 35 attaactgca gttacaggca ctgttgagca 30

<210> 36

<211> 1096

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> gen

<222> (13)..(1091)

<220>

<221> Intrón

<222> (84)..(142)

<220>

<221> Intrón

<222> (392)..(514)

<400> 36 5 <210> 37

<211> 1102

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

10 <220>

<221> gen

<222> (13)..(1097)

<220> 15 <221> Intrón

<222> (84)..(142)

<220>

<221> Intrón 20 <222> (392)..(514)

<400> 37

<210> 38

<211> 1199

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<220>

<221> gen

<222> (13)..(1194)

<220>

<221> Intrón

<222> (84)..(142)

<220>

<221> Intrón

<222> (392)..(514)

<220>

<221> Intrón

<222> (1122)..(1185)

<400> 38 5 <210> 39

<211> 298

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

10 <400> 39

<210> 40

<211> 300

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<210> 41

<211> 311

<212> PRT

<213> Acremonium thermophilum

<400> 41

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 42 gcagcaacca gttcgacctc 20

<210> 43

<211> 36

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 43 ttaactgcag tcactgggca gtgcagccac cgcctc 36

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 44 actgctgcaa gccgtcctgc 20

<210> 45

<211> 41

<212> DNA

<213> Acremonium thermophilum

<400> 45 ttaactgcag tcaaccgcta ggcgggttga agacgggata g 41

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un polipéptido endoglucanasa que comprende actividad celulolítica y que se selecciona del grupo que consiste en:

   a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2; y

   b) un polipéptido de a) que carece del dominio de unión de carbohidrato, o el dominio de unión de carbohidrato y la región conectora.

2. 2.

   El polipéptido endoglucanasa de la reivindicación 1, en el que dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos 98% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2.

3. 3.

   El polipéptido endoglucanasa de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o SEQ ID NO: 19.

4. 4.

   El polipéptido endoglucanasa de la reivindicación 1, que se puede obtener o se origina de Acremonium sp., preferiblemente de Acremonium thermophilum, lo más preferiblemente de Acremonium sp. CBS 116240.

5. 5.

   Una proteína de fusión de endoglucanasa que comprende el núcleo celulolíticamente activo de un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, unido a un dominio de unión de carbohidrato (CBD) heterólogo.

6. 6.

   La proteína de fusión de endoglucanasa de la reivindicación 5, en el que dicho CBD y una región conectora opcional derivan de CBHI de Trichoderma reesei, CBHI de Chaetomium thermophilum, o xilanasa de Acremonium sp.

7. 7.

   La proteína de fusión de endoglucanasa de la reivindicación 6, en el que la proteína de fusión tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 71% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 39, al menos 69% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 40, y al menos 69% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 41.

8. 8.

   Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. 9.

   El polinucleótido aislado de la reivindicación 8, que tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:

   a) una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, o SEQ ID NO: 38;

   b) una cadena complementaria de a); y

   c) una secuencia que es degenerada como resultado del código genético a una cualquiera de las secuencias como se define en a) o b).

10. 10.

    Un vector de expresión que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

11. 11.

    Una célula huésped que comprende un vector de expresión de la reivindicación 10.

12. 12.

    La célula huésped de la reivindicación 11, que es de origen fúngico.

13. 13.

    La célula huésped de la reivindicación 12, que es Trichoderma reesei.

14. 14.

    Un proceso para la producción de un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4

    o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 que comprende la etapa de cultivar la célula huésped de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

15. 15.

    Una preparación de enzima que comprende un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

16. 16.

    Un proceso para biolavado a la piedra, que comprende la etapa de añadir un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una preparación de la reivindicación 15 a tela o prendas que contienen algodón, tal como tela vaquera.

17. 17.

    Un proceso para bioacabado, que comprende la etapa de añadir un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una preparación de la reivindicación 15 a materiales textiles como telas o prendas o hilo.

18. 18.

    Una composición de detergente que comprende un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las

    5 reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una preparación de la reivindicación 15 y auxiliares, tales como agentes tensioactivos, surfactantes, agentes blanqueantes o potenciadores.
19. 19. Un método para tratar material textil que contiene fibra celulósica, en el que dicho método comprende poner en contacto dicho material textil con la composición de detergente de la reivindicación 18.

    10 20. Un método para tratar pulpa o fibra derivada de madera, que comprende la etapa de añadir un polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una preparación de la reivindicación 15 a pulpa mecánica o química o fibra secundaria derivada de madera.
20. 21. Un método para mejorar la calidad de alimento animal, que comprende tratar material de plantas con un

    15 polipéptido endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una proteína de fusión de endoglucanasa de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7 o una preparación de la reivindicación 15.
21. 22. Una cepa de Escherichia coli que tiene el número de acceso DSM 17324, DSM 18813, DSM 18814, DSM 18815, DSM 18816 o DSM 18817.

    Fig. 1 Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5