BRPI0620551A2 - levedura recombinante e método para produzir ácido málico - Google Patents

Abstract

LEVEDURA RECOMBINANTE E MéTODO PARA PRODUZIR áCIDO MáLICO. Divulgamos uma levedura recombinante onde a levedura é a enzima piruvato decarboxilase (PDC0) de atividade negativa (PDC-negativa) e é funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) onde a PEP carboxilase seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose; e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE). Também divulgamos um método para produzir ácido málico cultivando tal levedura em um meio compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de diáxido de carbono e isolando o ácido malico do meio.

Description

"LEVEDURA RECOMBINANTE E MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO MÁLICO".

Antecedentes da invenção

A presente invenção refere-se geralmente ao uso industrial de microorganismos. Mais particularmente, ela se refere à produção de ácido málico a partir de ácido succínico por levedura.

O uso de microorganismos, tais como leveduras, para realizar processos industriais tem ocorrido incidentalmente durante milhares de anos e tem sido submetido a questionamento técnica há décadas. Leveduras, tais como a S. cerevisiae têm sido usadas para produzir diferentes pequenas moléculas, incluindo ácidos orgânicos.

Entretanto, um ácido orgânico que tem sido difícil de produzir a partir de leveduras, particularmente da S. cerevisiae, é o ácido málico. O ácido málico, C4Hi2O5, é um ácido orgânico dicarboxílico que confere um sabor acídulo a muitos alimentos ácidos ou acídulos, tais como maçãs verdes e vinhos. 0 ácido málico é útil para a indústria de processamento de alimentos como uma fonte de acidulidade para uso em diversos alimentos. Presentemente, não temos ciência de nenhuma produção de ácido málico em grande escala a partir de leveduras.

Sumário da invenção

Em uma concretização, a presente invenção refere-se a uma levedura recombinante, onde a levedura é a enzima piruvato decarboxilase (PDCO) de atividade negativa (PDC- negativa) e é funcionalmente transformada com uma região codificadora, codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) onde a carboxilase PEP seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose, e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Em uma outra concretização, a presente invenção refere-se a um método para produzir ácido málico ou ácido succínico incluindo cultivar uma levedura recombinante onde a levedura é a enzima piruvato decarboxilase (PDC) de atividade negativa (PDC-negativa) e é funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) onde a carboxilase PEP seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose, e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE), em um meio compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de dióxido de carbono, e isolar ácido málico ou ácido succínico do meio.

Breve descrição dos desenhos

Os seguintes desenhos formam parte do presente descritivo, e estão incluídos para adicionalmente demonstrar certos aspectos da presente invenção. A invenção poderá ser melhor entendida com referência a um ou mais destes desenhos, em combinação com a descrição detalhada de concretizações específicas apresentadas aqui.

A figura 1 mostra concentrações de glicose e piruvirato como uma função do tempo de cultura conforme descrito no exemplo 1.

A figura 2 mostra concentrações de maleato, glicerol e succinato como uma função do tempo de cultura conforme descrito no exemplo 1.

A figura 3 é um mapa do plasmídeo p426GPDMDH3, conforme descrito no exemplo 1.

A figura 4 é um mapa do plasmídeo pRS2, conforme descrito no exemplo 1. A figura 5 é um mapa do plasmídeo pRS2AMDH3, conforme descrito no exemplo 1.

A figura 6 é um mapa do plasmídeo YEplacll2SpMAEl, conforme descrito no exemplo 1.

A figura 7 mostra a biomassa de partida, o consumo de glicose, e a produção de piruvato na batelada A, exemplo 2.

A figura 8 mostra a produção de malato, glicerol e succinato na batelada A, exemplo 2.

A figura 9 mostra a biomassa de partida, o consumo de glicose, e a produção de piruvato na batelada B, exemplo 2.

A figura 10 mostra a produção de malato, glicerol e succinato na batelada B, exemplo 2.

A figura 11 mostra a biomassa de partida, o consumo de glicose, e a produção de piruvato na batelada C, exemplo 2.

A figura 12 mostra a produção de malato, glicerol e succinato na batelada C, exemplo 2.

Descrição de concretizações ilustrativas

Em uma concretização, a presente invenção refere-se a uma levedura recombinante, onde a levedura é a enzima piruvato decarboxilase (PDC) de atividade negativa (PDC- negativa) e é funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) onde a carboxilase PEP seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose, e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE).

Qualquer levedura conhecida na técnica para uso e processos industriais poderá ser usada no método como uma questão de experimentação rotineira por aquele entendido no assunto tendo o benefício do presente descritivo. A levedura a ser transformada poderá ser selecionada de qualquer gênero e espécie de levedura. Leveduras são descritas por N. J. W. Kreger-van Rij, "The Yeasts", Vol.

1 de Biology of Yeasts, Cap. 2, A H. Rose e J. S. Harrison, Ee., Academic Press, Londres, 1987. Em uma concretização, o gênero de levedura poderá ser Saccharomyces, Zygosaeeharomyees, Candidaf Hansenular Kluyveromyces, Debaromyees, Nadsonia, Lipomyees, Torulopsis, Kloeekera, Piehia, Schizosaceharomyees, Trigonopsis, Brettanomyees, Cryptococcus, Triehosporon, Aureobasidium, Phaffia, Rhodotorula, Yarrowia, ou Schwanniomyees, dentre outras. Em uma concretização adicional, a levedura poderá ser Saccharomyees, Zygosaeeharomyees, Kluyveromyces, ou Piehia spp. Em ainda uma outra concretização, a levedura poderá ser Saceharomyces eerevisiae. A Saccharomyees eerevisiae é uma levedura comumente usada em processos industriais, mas a invenção não está limitada a esta. Uma levedura "recombinante" é uma levedura que contenha uma seqüência de ácido nucléico não naturalmente ocorrente na levedura ou uma cópia ou copias original(is) de uma seqüência de ácido nucléico endógena, onde a seqüência do ácido nucléico é introduzida na levedura ou numa célula ancestral desta por ação humana. As técnicas de DNA recombinantes são bem conhecidas, tais como de Sambrook et al., Molecular Geneties: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, que provê informações adicionais com relação a diversas técnicas conhecidas na arte e discutidas aqui. Nesta concretização, uma região codificadora do gene homólogo ou heterólogo é isolada de um organismo, que possua o gene. O organismo poderá ser uma bactéria, um procariote, um eucariote, um microorganismo, um fungo, uma planta, um animal.

O material genético compreendendo a região codificadora poderá ser extraído de células do organismo por qualquer técnica conhecida. Em seguida, a região codificadora poderá ser isolada por qualquer técnica apropriada. Em uma técnica conhecida, a região codificadora poderá ser isolada primeiramente preparando uma biblioteca de DNA genômica ou uma biblioteca de cDNA genômica e, em segundo lugar, identificando a região na biblioteca genômica de DNA ou de cDNA, tal como sondando a biblioteca com uma sonda de nucleotídeo rotulada selecionada para ser ou presumida ser pelo menos parcialmente homóloga com a região codificadora, determinando se a expressão da região codificadora confere um fenótipo detectável a um microorganismo de biblioteca compreendendo a região codificadora, ou amplificando a desejada seqüência por PCR. Outras técnicas conhecidas para isolar a região codificadora também poderão ser usadas.

"PDC-negativa" é usado aqui para descrever uma levedura que tenha uma atividade de piruvato decarboxilase de menos que 0,005 micromol/min mg de proteína"1 quando usando os métodos anteriormente descritos por van Maris, AJ. A, M. Ah. Luttik, A. A. Winkler, J. P. van Dijken, e J. T. Pronk, 20034. Uma tal levedura poderá ser referida como não tendo "nenhuma atividade de PDC". A Superprodução de Treonina Aldolase Engana o Papel Biossintético da Piruvato decarboxilase em Saccharomyces cerevisiae Cultivado em Glicose, Appl. Environ. Microbiol. 69:2094-2099. Uma tal levedura poderá ser referida aqui como não tendo "nenhuma atividade de PDC".

Uma levedura que seja PDC-negativa poderá ser isolada ou trabalhada por qualquer técnica apropriada. Uma população de partida grande de leveduras geneticamente diversas poderá conter mutantes naturais que sejam PDC-negativos.

Uma população de partida poderá ser submetida a mutagênese ou a seleção baseada em quemostáticos. Uma cepa de levedura tipicamente PDC-positiva compreende (A) pelo menos um gene estrutural de PDC que seja capaz de ser expressado na cepa da levedura; (B) pelo menos um gene regulador de PDC que seja capaz de ser expressado na cepa da levedura; (C) um promotor do gene estrutural de PDC; e (D) um promotor do gene regulador de PDC. Em uma levedura PDC-negativa, uma ou mais dentre (A)-(D) poderá ser (i) mutada, (ii) desmontada, ou (iii) deletada. A mutação, desmontagem ou deleção de qualquer uma dentre (A) - (D) poderá, em certas concretizações, contribuir para uma falta de atividade de piruvato decarboxilase. Em uma concretização, a levedura PDC-negativa é S. cerevisiae cepa TAM de levedura ("MAta pdcl(-6,-2) ::loxP pdc5(-6,-2)::IoxP pdc6(-6,-2) ::loxP ura3-52" não tendo nenhuma atividade depiruvato decarboxilase detectável, fonte de C2 independente, tolerante a glicose. A piruvato carboxilase (PYC) poderá ser qualquer enzima capaz de catalisar a conversão de piruvato a oxaloacetato (EC 6.4.1.1) onde a PYC seja ativa no citossol. Uma enzima não necessita ser identificada na literatura como uma piruvato carboxilase na época do depósito do presente pedido de patente para ser enquadrada na definição de uma PYC. Uma PYC de qualquer organismo fonte poderá ser usada e a PYC poderá ser do tipo selvagem ou modificada a partir do tipo selvagem. A PYC poderá ser uma piruvato carboxilase de S. cerevisiae. Em uma concretização, a PYC poderá ter pelo menos 75% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID N0:1. Em uma concretização, a PYC terá pelo menos 80% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em uma concretização, a PYC terá pelo menos 85% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em uma concretização, a PYC terá pelo menos 90% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em uma concretização, a PYC terá pelo menos 95% de identidade a seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em uma outra concretização, a PYC terá pelo menos 96% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID N0:1. Em uma concretização adicional, a PYC terá pelo menos 97% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID N0:1. Em ainda uma outra concretização, a PYC terá pelo menos 98% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em ainda uma outra concretização, a PYC terá pelo menos 99% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 1. Em uma concretização, a PYC terá a seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:1.

A identidade poderá ser determinada por um alinhamento de seqüências realizado usando o programa ClustalW e seus valores de default, a saber: Gap Open Penalty de DNA = 15,0, Gap Extension Penalty = 6,66, Matriz de DNA = Identidade, Protein Gap Open Penalty = 10,0, Protein Gap Extension Penalty = 0,2, matriz de Proteína = Gonnet. A identidade poderá ser calculada de acordo com o procedimento descrito pela documentação do ClustalW: "Uma contagem em pares é calculada para cada par de seqüências que estejam sendo alinhadas. Estas contagens são apresentadas como uma tabela nos resultados. As contagens em pares são calculadas como o número de identidades no melhor alinhamento dividido pelo número de resíduos comparados (posições de espaço são excluídos). Ambas estas contagens são inicialmente calculadas como contagens de identidade percentuais e são convertidas em distâncias dividindo por 100 e subtraindo de 1,0 para dar o número de diferenças por sítio. Nós não corrigimos para substituições múltiplas nestas distâncias iniciais. Como a contagem em pares é calculada independentemente da matriz e das espaços escolhidas, ela terá sempre o mesmo valor para um par de seqüências em particular.

Deverá ser notado que uma região codificadora é considerada como sendo de um organismo se ela codificar uma seqüência de proteína substancialmente idêntica àquela da mesma proteína purificada das células do organismo.

Em uma concretização, a levedura poderá ser transformada com uma região codificadora codificando uma fosfoenolpiruvato carboxilase (PEP) , ou como uma alternativa ou adicionalmente à PYC (EC 4.1.1.38). A PEP carboxilase poderá ser qualquer enzima que seja capaz de catalisar a conversão do fosfoenolpiruvato para oxaloacetato. Uma enzima não necessita ser identificada na literatura como uma PEP carboxilase ao tempo em que o presente pedido de patente foi depositado para estar dentro da definição de uma PEP carboxilase. Uma PEP carboxilase de qualquer organismo fonte poderá ser usado e a PEP carboxilase poderá ser do tipo selvagem ou dotipo selvagem modificado. A PEP carboxilase deverá ser insensível à inibição por malato, aspartato, e oxaloacetato. Observou-se que a PEP carboxilase da E. colli é inibida por malato.

A enzima de desidrogenase de malato (MDH) poderá ser qualquer enzima capaz de catalisaro a conversão do oxaloacetato a malato (EC 1.1.1.37), onde a MDH é ativa no citossol e não é inativada na presença de glicose. (Os termos "malato" e "ácido málico" poderão ser usados intercambiavelmente, aqui exceto em contextos onde for indicada uma espécie iônica em particular). Uma enzima não necessita ser identificada na literatura como uma desidrogenase de malato ao tempo em que o presente pedido de patente foi depositado para estar dentro da definição de uma carboxilase de MDH. "Ativa no citossol" significa que uma forma cataliticamente ativa da enzima está presente no citossol. "Não inativada na presença de glicose" significa que a atividade catalítica da enzima não é reduzida quando exposta à glicose relativamente a quando a glicose está ausente. Uma MDH de qualquer fonte de organismo poderá ser usada e a MDH poderá ser do tipo selvagem ou do tipo selvagem modificado. Em uma concretização, a MDH poderá ser MDHl de S. cerevisiae ou MDH# de S. cerevisiae. A MDH2 de S. cerevisiae do tipo selvagem é ativa no citossol, mas é inativada na presença de glicose. Em uma concretização, a MDH poderá ser uma MDH2 de S. cerevisiae modificada (por engenharia genética, modificação pós-translacional, ou qualquer outra técnica conhecida na arte) para ser ativa no citossol e não inativada na presença de glicose. Em uma concretização, a MDH contém uma seqüência ou seqüências sinalizadora(s) capaz(es) de direcionar a MDH ao citossol da levedura ou a MDH carece de uma seqüência ou seqüências de sinalização capaz(es) de direcionar a MDH para uma região intracelular da levedura outra que não o citossol. Em uma concretização, a MDH poderá ser S. cerevisiae MDH3ÁSKL, na qual a região codficadora codificando a MDH tenha sido alterada para deletar os resíduos SKL terminados por carbóxi do MDH3 da S. cerevisiae do tipo selvagem, que normalmente direcionam a MDH 3 para o peroxissoma. Em uma concretização, a MDH poderá ter pelo menos 75% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, a MDH terá pelo menos 80% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, a MDH terá pelo menos 85% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, a MDH terá pelo menos 90% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, a MDH terá pelo menos 95% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma outra concretização, a MDH terá pelo menos 96% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização adicional, a MDH terá pelo menos 97% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID N0:2. Em ainda uma outra concretização, a MDH terá pelo menos 98% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em ainda uma outra concretização, a MDH terá pelo menos 99% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 2. Em uma concretização, a PYC terá a seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:2.

A proteína transportadora de ácido málico poderá ser qualquer proteína capaz de transportar malato do citossol de uma levedura através da membrana celular e para dentro do espaço extracelular. Uma proteína não necessita ser identificada na literatura como uma proteína transportadora de ácido málico na época do depósito do presente pedido de patente para ser enquadrada na definição de uma MAE. Uma MAE de qualquer organismo fonte poderá ser usada e a MAE poderá ser do tipo selvagem ou modificada a partir do tipo selvagem. A MAE poderá ser uma piruvato carboxilase de Schizosaccharomyces pombe SpMAE1. Em uma concretização, a MAE poderá ter pelo menos 75% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em uma concretização, a MAE terá pelo menos 80% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em uma concretização, a MAE terá pelo menos 85% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em uma concretização, a MAE terá pelo menos 90% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em uma concretização, a MAE terá pelo menos 95% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID N0:3. Em uma outra concretização, a MAE terá pelo menos 96% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em uma concretização adicional, a MAE terá pelo menos 97% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 3. Em ainda uma outra concretização, a MAE terá pelo menos 98% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Em ainda uma outra concretização, a MAE terá pelo menos 99% de identidade à seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO: 3. Em uma concretização, a MAE terá a seqüência de aminoácido dada em SEQ ID NO:3. Preferivelmente, uma região codificadora codificando a enzima ou proteína foi extraída de um ácido nucléico de um organismo ou sintetizada por meios químicos, ela poderá ser preparada por transformação em uma expressão na levedura. No mínimo, isto envolve a inserção da região codificadora em um vetor e ligação operável a um promotor encontrado no vetor e ativo na levedura. Qualquer vetor (integrativo, cromossômico, ou epissômico) poderá ser usado.

Qualquer promotor ativo no hospedeiro alvo (homólogo ou heterólogo; constitutivo, induzível ou repressível) poderá ser usado. Tal inserção poderá envolver o uso de endonucleases de restrição para "abrir" o vetor em um ponto desejado onde seja possível a ligação ao promotor, seguida de ligação da região codificadora no ponto desejado. Caso desejado, antes da inserção no vetor, a região codificadora poderá ser preparada para uso no organismo alvo. Isto poderá envolver alterar os códons usados na região codificadora para combinar mais plenamente o uso do códon do organismo alvo; mudar seqüências na região codificadora que poderia prejudicar a transcrição ou tradução da região codificadora ou a estabilidade de um transcrito mRNA da região codificadora; ou adicionar ou remover porções codificando peptídeos sinalizadores (regiões da proteína codificadas pela região codificadora que direcionam a proteína para locais específicos (p. ex. , uma organela, a membrana da célula o uma organela, ou secreções extracelulares)), dentre outras preparações possíveis conhecidas na técnica.

Independentemente de a região codificadora estar modificada, quando a região codificadora é inserida no vetor, ela é operavelmente ligada ao promotor ativo na levedura. Um promotor, como é conhecido, é uma seqüência de DNA que poderá direcionar a transcrição de uma região codificadora vizinha. Conforme já descrito, o promotor poderá ser constitutivo, induzível ou repressível. Promotores constitutivos poderão ser induzidos pela adição ao meio de uma molécula indutora apropriada, que será determinada pela identidade do promotor. Promotores repressíveis poderão ser reprimidos pela adição ao meio de uma molécula repressora apropriada, que será determinada pela identidade do promotor. Em uma concretização, o promotor é constitutivo. Por exemplo, em uma concretização adicional, o promotor constitutivo é o promotor triosefosfateisomerase de S. cerevisiae (TPI).

Outro exemplo, em uma concretização adicional, o promotor é gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase de S. cerevisiae THD3 . Uma região terminadora poderá ser usada, caso desejado. Uma região terminadora exemplificativa é S. cerevisiae CYC1.

O vetor compreendendo a região codificadora operavelmente ligada ao promotor poderá ser um plasmideo, um cosmídeo, um ou cromossomo artificial de levedura, dentre outros conhecidos na técnica como sendo apropriados para uso com leveduras. Adicionalmente à região codificadora operavelmente ligada ao promotor, o vetor também poderá compreender outros elementos genéticos. Por exemplo, se não for esperado que o vetor se integre ao genoma da levedura, o vetor poderá compreender uma origem de replicação, que permita que o vetor seja passado para as células progênies de uma levedura compreendendo o vetor. Caso seja desejada a integração do vetor ao genoma da levedura, o vetor poderá compreender seqüências homólogas a seqüências encontradas no genoma da levedura, e também poderá compreender regiões codificadoras que possam facilitar a integração. Para determinar quais células da levedura serão transformadas, o vetor poderá compreender um marcador selecionável ou um marcador localizável que confira um fenotipo à levedura que a distinga de uma levedura não transformada, p. ex., ela sobreviva em um meio compreendendo um antibiótico fatal a leveduras não transformadas ou que metabolize um componente do meio em um produto que a levedura não transformada não seja capaz, dentre outros fenotipos. Adicionalmente, o vetor poderá compreender outros elementos genéticos, tais como sítios de endonuclease de restrição detectável ou selecionável e outros tipicamente encontrados em vetores. Após o vetor ter sido preparado, com a região codificadora operavelmente ligada ao promotor, a levedura poderá ser transformada com o vetor (i. é, o vetor poderá ser introduzido em pelo menos uma das células de uma população de leveduras). Técnicas para a transformação estão bem estabelecidas, e incluem eletroporação, bombardeio com microprojéteis, e o método de LiAc/ssDNA/PEG, dentre outros. Células de leveduras, que estejam transformadas, poderão então ser detectadas pelo mesmo marcador detectável ou selecionável no vetor. Deverá ser notado que a frase "levedura transformada" tem essencialmente o mesmo significado de "levedura recombinante", conforme definido acima. A levedura transformada poderá ser uma que tenha recebido o vetor em uma técnica de transformação, ou poderá ser uma progênie de uma tal levedura.

Com relação a PYC, MDH e MAE, aquele entendido no assunto tendo o benefício do presente descritivo entenderá, à luz da redundância do código genético, que um grande número de regiões codificadoras potenciais poderão existir que codificarão uma seqüência de PYC, seqüência de MDH, ou seqüência de MAE particular. Uma região exemplificativa de PYC é dada como SEQ ID NO: 4; uma região exemplif icativa de MDH é dada com SEQ ID NO: 5; e uma região exemplif icativa de MAE ê dada como SEQ ID NO: 6. Qualquer região codificadora que codifique uma desejada seqüência de proteína poderá ser usada como uma questão de experimentação de rotina. Aquele entendido no assunto entenderá que códons particulares ("códons polarizados") poderão ter maiores poços de tRNA correspondentes na levedura que códons redundantes diferentes e assim poderão permitir uma tradução de proteína mais rápida na levedura.

Aquele entendido no assunto também entenderá que diversas seqüências reguladoras, dente outras conhecidas na técnica, poderão ser usadas como uma questão de experimentação de rotina na preparação e no uso da levedura funcionalmente transformada.

A presente invenção não está imitada a enzimas dos trajetos conhecidos para a produção de intermediários de ácido málico ou plantas em ácido málico, leveduras, ou outros organismos.

Em uma outra concretização, a presente invenção refere-se a um método para produzir ácido málico ou ácido succínico compreendendo cultivar uma levedura recombinante, onde a levedura é uma enzima de piruvato decarboxilase (PDC) de atividade negativa (PDC-negativa) e é funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando uma enzima de piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC é ativa no citossol, uma região codificadora codificando uma enzima de mal ato dehidrogenase (MDH) onde a MDH é ativa no citossol e não é inativada na presença de glicose, e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE) , em um meio compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de dióxido de carbono; e isolar ácido málico ou ácido succínico do meio.

A levedura e as regiões codificadoras desta poderão ser conforme descrito acima.

Após ter sido obtida uma levedura recombinante, a levedura poderá ser cultivada em um meio. 0 meio no qual a levedura pode ser cultivada poderá ser qualquer meio conhecido na técnica como sendo adequado para este propósito. Técnicas e meios de cultura são bem conhecidos na arte. Em uma concretização, o cultivo poderá ser realizado por fermentação aquosa em um recipiente apropriado. Exemplos de um recipiente típico para a fermentação de leveduras compreendem um frasco de agitação ou um biorreator.

O meio poderá compreender uma fonte de carbono tal como glicose, sacarose, frutose, lactose, galactose, ou hidrolisados de matéria vegetal, dentre outras. Em uma concretização, o meio poderá também compreender uma fonte de nitrogênio tal como uma molécula orgânica ou inorgânica. Em uma concretização adicional, o meio poderá também compreender componentes tais como aminoácidos; purinas; pirimidinas; licor de infusão de milho; extrato de levedo; hidrolisados de proteína; vitaminas solúveis em água, tais como complexos de vitamina B; ou sais inorgânicos tais como cloretos, hidrocloretos, fosfatos, ou sul fatos de Ca, Mg, Na, K, Fe, Ni, Co, Cu, Mn, Mo, ou Zn, dentre outros. Componentes adicionais conhecidos daqueles entendidos no assunto como sendo úteis no cultivo ou fermentação de leveduras também poderão ser incluídos. 0 meio também poderá ser tamponado, mas não necessita ser.

A fonte de dióxido de carbono poderá ser dióxido de carbono gasoso (que poderá ser introduzido em um espaço de cabeça sobre o meio ou aspergido através do meio) ou um sal de carbonato (por exemplo, carbonato de cálcio).

Durante o decurso da fermentação, a fonte de carbono é internalizada pela levedura e convertida, através de um número de etapas, em ácido málico. A expressão da MAE permite que o ácido málico seja produzido para ser secretado pela levedura para dentro do meio. Tipicamente, alguma quantidade da fonte de carbono é convertida em ácido succínico e alguma quantidade do ácido succínico é secretada pela levedura para dentro do leito.

Um meio exemplificativo é um meio mineral contendo 50 g/L de CaCO3, e 1 g/L de uréia.

Após a cultura ter progredido durante uma extensão de tempo suficiente para produzir uma concentração de ácido málico ou succínico no meio, o ácido málico ou ácido succínico poderá ser isolado. "Isolado" conforme usado aqui para se referir a um ácido orgânico, significa ser trazido a um estado de maior pureza por separação do ácido orgânico de pelo menos um outro componente (quer outro orgânico, quer um composto não daquela categoria) da levedura no meio. Em uma concretização, o ácido orgânico isolado tem pelo menos cerca de 95% de pureza, tal como pelo menos cerca de 99% de pureza.

Para isolar ácido málico acumulado no meio, o isolamento poderá compreender purificar o ácido málico do meio por técnicas conhecidas, tais como o uso de uma resina trocadora de íons, carbono ativado, microfiltração, ultrafiltração, nanofiltração, extração líquido-líquido, cristalização, ou cromatografia, dentre outras.

0 isolamento, do ácido succínico poderá ser realizado da mesma maneira.

Observamos que cultivar uma levedura recombinante da presente invenção em meio mineral compreendendo 50 g/L de CaCO3 e 1 g/L de uréia poderá conduzir a níveis de ácido málico (como ácido) de pelo menos 1 g/L. Em uma concretização, poderá conduzir a níveis de ácido málico (como ácido) no meio de pelo menos 10 g/L. Em uma concretização adicional, poderá conduzir a níveis de ácido málico (como ácido) de pelo menos 3 0 g/L. Se a levedura acumular ácido málico no meio durante a etapa de cultura, preferivelmente a concentração de ácido málico é estabilizada ou deixada aumentar. As seguintes definições são providas para ajudar aqueles entendidos no assunto a entenderem a descrição detalhada da presente invenção.

O termo "acumulação de ácido málico acima de níveis básicos" refere-se à acumulação de ácido málico acima de níveis indetectáveis conforme determinados usando os procedimentos descritos aqui.

"Amplificação" refere-se a aumentar o número de cópias de uma desejada molécula de ácido nucléico ou para aumentar a atividade de uma enzima, por qualquer meio. "Códon" refere-se a uma seqüência de três nucleotídeos que especifiquem um aminoácido em particular. "DNA Ligase" refere-se a uma enzima que una covalentemente duas peças de DNA de cordões duplos. "Eletroporação" refere-se a um método para introduzir células externas de DNA, que usa uma breve carga de CC de alta tensão para permeabilizar células hospedeiras, causando que elas captem DNA extra-cromossômico.

"Endonuclease" refere-se a uma enzima que hidrolisa um DNA de cordão duplo em locais internos.

O termo "expressão" refere-se à transcrição de um gene para produzir o correspondente mRNA e tradução deste mRNA para produzir o correspondente produto de gene, i. é, um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína.

A frase "funcionalmente ligado" ou "operavelmente ligado" refere-se a um promotor ou uma região promotora e uma codificação ou seqüência estrutural em uma orientação e distância tais que a transcrição da codificação ou seqüência estrutural possa ser direcionada ao promotor ou a região promotora.

O termo "gene" refere-se a DNA cromossômico, DNA de plasmídeo, cDNA, DNA sintético, ou outros DNAs que codifiquem um peptídeo, polipeptídeo, proteína, ou molécula de RNA, e regiões flanqueando a seqüência de codificação envolvida na regulação da expressão.

O termo "genoma" abrange tanto os cromossomos quanto as plasmídeos em uma célula hospedeira. DNAs codificadores da presente invenção introduzidos em células hospedeiras podem daí ser cromossomicamente integrados ou plasmídeo- localizadas.

"DNA heterólogo" refere-se ao DNA de uma fonte diferente daquela da célula recipiente.

DNA homólogo" refere-se ao DNA da mesma fonte daquela da célula recipiente.

"Hibridização" refere-se à habilidade de uma cadeia de ácido nucléico de se unir a uma cadeia complementar via emparelhamento básico. A hibridização ocorre quando seqüências complementares em duas cadeias de ácidos nucléicos ligam-se uma à outra.

O termo "meio" refere-se ao ambiente químico da levedura compreendendo qualquer componente requerido para o crescimento da levedura ou da levedura recombinante e um ou mais precursores para a produção de ácido ascórbico. Os componentes para o crescimento da levedura e os precursores para a produção de ácido ascórbico poderão ou não ser idênticos.

"Janela de leitura aberta" ("Open Reading Frame" (ORF)) refere-se a uma região do DNA ou RNA que codifica um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína.

"Plasmídeo" refere-se a uma peça replicável, extra cromossômica, circular de DNA.

"Reação de cadeia de polimerase (PCR)" refere-se a uma técnica enzimática para criar múltiplas cópias de uma seqüência de ácido nucléico. Cópias se seqüências de ácido nucléico são preparadas transladando uma DNA polimerase entre dois amplímeros. A base deste método de amplificação são múltiplos ciclos de mudanças de temperatura para desnaturar, então re-temperar amplímeros, seguido de extensão para sintetizar novos cordões de DNA na região localizada entre os amplímeros de flanqueamento.

O termo "promotor" ou "região promotora" refere-se a uma seqüência de DNA, geralmente encontrada a montante (5") de uma seqüência codificadora, que controle a expressão da seqüência codificadora controlando a produção de RNA mensageiro (mRNA) provendo o sítio de reconhecimento no sítio correto.

Uma "célula recombinante" ou "célula transformada" é uma célula que contenha uma seqüência de ácido nucléico não naturalmente ocorrente na célula ou uma cópia ou cópias adicional(is) de uma seqüência de ácido nucléico endógena, onde a seqüência de ácido nucléico é introduzida na célula ou um ancestral desta por ação humana.

O termo "vetor recombinante" ou "construto de DNA ou RNA recombinante" refere-se a qualquer agente tal como um plasmídeo, cosmídeo, vírus, seqüência autonomamente replicante, fago, seqüência de nucleotídeo de DNA ou RNA de cordão único ou cordão duplo linear ou circular, derivado de qualquer fonte capaz de integração genômica ou replicação autônoma, compreendendo uma molécula de ácido nucléico na qual uma ou mais seqüências foram ligadas de uma maneira funcionalmente operativa. Tais construtos ou vetores recombinantes são capazes de introduzir uma seqüência ou região promotora reguladora 5' e uma seqüência de DNA para um produto de gene selecionado em uma célula de uma maneira tal que a seqüência de DNA seja transcrita para um mRNA funcional, que poderá ou não ser traduzido e daí expressado. "Enzima de restrição" refere-se a uma enzima que reconheça uma seqüência específica de nucleotídeos em um DNA de cordões duplos e clive ambos os cordões; também chamada de uma endonuclease de restrição. A clivagem ocorre tipicamente dentro do sítio de restrição ou próximo a este.

"Marcador selecionável" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico cuja expressão confira um fenotipo facilitando a identificação de células contendo a seqüência de ácido nucléico. Marcadores selecionáveis incluem aqueles que confiram resistência a químicos tóxicos (p. ex., ampicilina, canamicina) ou complementam uma deficiência nutricional (p. ex., uracila, histidina, leucina).

"Marcador localizável" refere-se a uma seqüência de ácido nucléico cuja expressão confere uma característica visualmente distinguível (p. ex., mudanças de cor, fluroescência).

"Transcrição" refere-se ao processo para produzir uma cópia de RNA a partir de um gabarito de DNA.

"Transformação" refere-se a um processo para introduzir uma seqüência de ácido nucléico exógeno (p. ex., um vetor, plasmídeo, ou molécula de ácido nucléico recombinante) em uma célula na qual aquele ácido nucléico exógeno é incorporado a um cromossomo ou é capaz de replicação autônoma. Uma célula que sofreu transformação, ou uma descendente de tal célula, é "transformada" ou "recombinante". Se o ácido nucléico exógeno compreender uma região codificadora codificando uma proteína desejada, e a proteína desejada for transformada em levedura e for substancialmente funcional, uma tal levedura transformada é "funcionalmente transformada". "Tradução" refere-se à produção de proteína a partir de um RNA mensageiro.

O termo "Rendimento" refere-se à quantidade de ácido málico produzida (molar ou peso/volume) dividida pela quantidade de fonte de carbono consumida (molar ou peso/volume) multiplicada por 100.

"Unidade" de enzima refere-se à atividade enzimática e indica a quantidade de micromoles de substrato convertida por mg de proteínas celulares totais por minuto. "Vetor" refere-se a uma molécula de DNA ou RNA (tal como um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial de levedura, ou vírus, dentre outros) que carregue seqüências de ácido nucléico para dentro de uma célula hospedeira. O vetor ou uma porção deste poderá ser inserido(a) no genoma da célula hospedeira.

Os seguintes exemplos estão incluídos para demonstrar concretizações preferidas da invenção. Deverá ser apreciado por aqueles entendidos no assunto que as técnicas divulgadas nos exemplos a seguir representam técnicas descobertas pelo inventor para funcionar bem na prática da invenção, e assim deverão ser considerados como constituindo modos preferidos para sua prática. Entretanto, aqueles entendidos no assunto deverão, à luz do presente descritivo, apreciar que muitas modificações poderão ser feitas nas concretizações específicas que são divulgadas e ainda assim obter um resultado igual ou semelhante sem partir do espírito e da abrangência da invenção.

Exemplo 1

Duas cepas de leveduras foram construídas partindo da cepa de S. cerevisiae TAM(MATapdcl(-6,-2)::loxP pdc5(-6,- 2)::loxP pdc (-6,-2)::loxP ura3-52 (PDC-negativa), que foi transformada com genes codificando uma piruvato carboxilase (PYC), uma malato dehidrogenase (MDH), e uma proteína transportadora de malato (MAE).

Uma vez que a cepa de TAM tem apenas um marcador auxotrópico, desmontmos o local TRP1 de maneira a possibilitar a introdução de mais que um plasmídeo com um marcador auxotrópico, resultando em R WB961 (MATa pdcl(- 6,-2)::loxP pdc5(-6,-2)::loxP pdc6(-6,-2)::loxP mutx ura3-52 trp::Kanlox).

Os genes MDH e PYC que usamos tinham sido clonados anteriormente a plasmidas p42 6GPDMDH3 (plasmida 2μ com marcador URA3, contendo o gene MDH3ASKL entre o promotor THD3 de S. cerevisiae e o terminador CYCl de S. cerevisiae, figura 3) e pRS2 (plasmida 2μ com marcador URA3, contendo o gene PYC2, figura 4) .

Um cassete PTdh3 -SpMAEl carregando a MAE S. powbe foi reclonado a YEpiac112 (2μ, TRPl e Ypiac204 (integração, TRP1) , resultando em YEplac112SpMAEl (figura 6) e YIplac204SpMAEl (não mostrado) .

Um vetor de PYC e MDH foi preparado: pRS2MDH3ASKL (2μ, URA3, PYC2, MDH3ASKL) (figura 5).

RWB 961 foi transformado com pRS2MDH3ASKL e YEplac112SpMAEl (cepa 1) ou pRS52MDH3ASKL e YIplac204SpMAEl (cepa 2) . Ambas a cepa Iea cepa 2 sobreexpressaram PYC2 e MDH3ASKL, mas tinham diferentes níveis de expressão para a MAEI1, assumindo níveis de expressão eram proporcionais ao número de cópias de plasmídeo, cerca de 10-40 por célula para YEplac112SpMAEl (baseado em 2μ) e cerca de 1-2 por célula para YIplac2 04SpMAEl (integrado) .

Após isolamento da cepa 1 e da cepa 2,0,04 g/L ou 0,4 g/L de cada cepa foi introduzido em um frasco de agitação contendo 100 mL de meio mineral, 50g/L de CaCO3, e 1 g/L de uréia. Os frascos foram agitados a 200 rpm durante o tempo de cada experimento. Amostras de cada cultura foram isoladas a diversos tempos e a concentrações de glicose, piruvato, glicerol, succinato, e malato foram determinadas. Foram observadas concentrações de malato extracelular de cerca de 250mM após cerca de 90-160 h. Os resultados são mostrados nas figuras 1-2.

Os resultados indicam que as seguintes modificações nos trajetos metabólicos da levedura permitem a acumulação de altos níveis de malato extracelular por leveduras recombinantes;

1. Direcionar o fluxo de piruvato para piruvato carboxilase (reduzindo a atividade de PDC).

2. Aumentar o fluxo através da piruvato carboxilase sobreexpressando a PYC>

3. Introduzir altas atividades de malato dehidrogenase no citossol para capturar oxaloacetato formado pela PYC.

4. Introduzir um transportador de ácido málico heterólogo para facilitar a exportação de malato.

A figura 2 também mostra que concentrações de succinato extracelular de cerca de 50 mM poderiam ser produzidas simultaneamente com a produção de malato descrita acima.

Exemplo 2

O efeito de dióxido de carbono na produção de malato em um sistema fermentador foi estudado usando uma cepa TAM sobreexpressando PYC2, MDH3 citossólico, e um transportador S. pombe MAEl (YEplacll2SpMAEl), conforme descrito no exemplo 1.Foram realizados três experimentos em fermentador:

A: Cultivos em batelada sob condições plenamente aeróbicas.

B: Cultivos em batelada sob condições plenamente aeróbicas com uma mistura de N2/02/C02 de 70%/20%/l0%.

C: Cultivos em batelada sob condições plenamente aeróbicas com uma mistura de N2/02/C02 de 65%/20%/15%.

Protocolo

Meios

O meio mineral continha 100 g de glicose, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de MgSO2. 7H20 e 1 mL de solução de elementos traço de acordo com Verduyn et al. (Yeast 8: 501-517, 1992) por litro de água desmineralizada. Após esterilização térmica do meio durante 20 min a IlO0C, 1 mL vitaminas esterilizadas em filtro de acordo com Verduyn et al. (Yeast 8: 501-517, 1992) e uma solução contendo 1 g de uréia adicionado por litro. Foi também realizada a adição de 0,2 mL por litro de antiespumante (BDH) . Nenhum CaCO3 foi adicionado.

Cultivos em fermentador

Os cultivos em fermentador foram realizados em biorreatores com um volume de trabalho de 1 litro (Applikon Dependable Instruments, Schiedam, Países Baixos). 0 pH foi automaticamente controlado em pH 5,0 por titulação com hidróxido de potássio 2 Μ. A temperatura, mantida a 30°C, foi medida com um sensor Pt100 e controlada por meio de água circulante através de um ponteiro de aquecimento. A velocidade do agitador, usando dois impulsores rushton, foi mantida constante a 800 rpm. Para condições aeróbicas, foi mantido um fluxo de ar de 0,5 L.min"-1, usando um controlador de fluxo de massa Brooks 5876 (Brooks BV, Veenendaal, Países Baixos), para manter a concentração de oxigênio dissolvido de 60% acima da saturação no ar ã pressão atmosférica. Nas bateladas B e C, foi alcançada uma concentração de dióxido de carbono aumentada de 10% ou 15% enquanto que mantendo uma boa oxigenação misturando ar pressurizado 79% de N2 + 21% de O2 e uma mistura gasosa contendo 79% de CO2 + 21% de O2 (Hoekloos, Schiedam, Países Baixos). A percentagem desejada de 10% ou 15% de CO2 suprida pelo controlador de fluxo de massa Brooks foi encimada por ar comprimido até uma taxa de fluxo total de 0,5 L/min. 0 pH, DOT e alimentações de K0H/H2S04 foram monitorados continuamente usando um sistema de aquisição de dados & controle em-linha (MFCS/Win, Sartorius BBI Systems). Análise dos gases de escape

Os gases de escape dos cultivos em fermentador foram resfriados em um condensador (2°C) e secados com um secador Perma Pure (tipo PD-625-12P). As concentrações de oxigênio de dióxido de carbono foram determinadas com um analisador de gás Rosemount NGA 2000. A taxa de fluxo de gás de escape foi medida com um fluxômetro Saga Digital Flow Meter (Ion Science, Cambridge). Taxas específicas de produção de dióxido de carbono e consumo de oxigênio foram calculados conforme descrito por van Urk et al. , (1988, Yeast: 501-517).

Preparação de amostras

Amostras para análises de biomassa, substrato e produto foram coletadas sobre gelo. Amostras de caldo de fermentação e amostras livres de células (preparadas por centrifugação a 10,000 χ g durante 10 minutos) foram armazenadas a -20°C para análise posterior.

Determinação de metabólitos

Determinações por HPLC

Determinação de açúcares, ácidos orgânicos e polióis foram determinados simultaneamente usando um sistema Waters HPLC 2690 com uma coluna de exclusão de ions Aminex HPX-87H (300 X 7,8 mm, BioRad) (60°C, 0,6 mL/mini H2SO4 5 mM) acoplada a um detector de UV Waters 2487 e um detector de índice de refração Waters 2410.

Determinação de metabólitos enzimáticos

Para verificar as medições de HPLC e/ou excluir erros de separação, ácido L-málico foi determinado com um kit enzimático (Boehringer-Mannheim, n° de Catálogo 0 139 068).

Determinação de peso seco

O peso seco de levedura nas culturas foi determinado filtrando 5 mL de uma cultura em um papel de filtro de 0,4 5 μm (Gelman Sciences). Quando necessário, a amostra foi diluída a uma concentração final entre 5 e 10 g.L"1. Os filtros foram mantidos em uma incubadora a 80°C durante pelo menos 24 horas antes do uso de maneira a determinar seu peso seco antes do uso. As células de levedura na amostra foram retidas no filtro no filtro e lavadas com 10 mL de água desmineralizada. O filtro com as células foi então secado em um forno de microondas (Amana Raderrange, 1500 Watts) durante 20 minutos a uma capacidade de 50%. O filtro secado, com as células, foram pesados após resfriar durante 2 minutos. O peso seco foi calculado subtraindo o peso do filtro do peso do filtro com células.

Determinação de densidade ótica (OD660)

A densidade ótica das culturas de levedura foi determinada a 660 nm com um espectrofotômetro; Novaspec II (Amersham Pharmasia Biotech, Buckinghamshire, Reino Unido) em cuvetas de 4 mL. Quando necessário, as amostras foram diluídas para produzir uma densidade ótica entre 0,1 e 0,3.

Batelada A: plenamente aerado 21% de O2 ( +79% de N2)

As figuras 7 e 8 mostram a formação de metabólitos contra o tempo. É mostrado o resultado de um experimento de batelada representativa por cepa. Experimentos replicados produziram essencialmente os mesmos resultados. A figura 7 denota a biomassa de partida (retângulos), o consumo de glicose (triângulos) e a produção de piruvato (estrelas).

A figura 8 denota a produção de malato (quadrados), glicerol (semi-círculos superiores), e succinato (octógonos). Conforme mostrado na figura 8, a levedura produziu cerca de 25 mM de malato após 24 h e cerca de 20 mM de succinato após 48 h.

Batelada B: 10% de CO2 + 21% de O2 ( + 69% de N2)

As figuras 9 e 10 mostram a formação de metabólitos contra o tempo. A figura 9 denota a biomassa de partida (retângulos), o consumo de glicose (triângulos) e a produção de piruvato (estrelas). A figura 10 denota a produção de malato (quadrados), glicerol (semi-círculos superiores), e succinato (octógonos). Conforme mostrado na figura 10, a levedura produziu cerca de 100 mM de malato após 24 h e cerca de 150 mM após 96 h, bem como cerca de 60 mM de succinato após 96 h.

Batelada C: 15% de CO2 + 21% de O2 ( + 64% de N2)

As figuras 11 e 12 mostram a formação de metabólitos contra o tempo. A figura 11 denota a biomassa de partida (retângulos), o consumo de glicose (triângulos) e a produção de piruvato (estrelas). A figura 12 denota a produção de malato (quadrados), glicerol (semi-círculos superiores), e succinato (octógonos). Conforme mostrado na figura 10, a levedura produziu cerca de 45 mM de malato após 24 h e cerca de 100 mM após 96 h, bem como cerca de 60 mM de succinato após 96 h.

Todas as composições e os métodos divulgados aqui e reivindicados aqui poderão ser feitos e executados sem experimentação indevida a luz do presente descritivo. Conquanto as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de concretizações preferidas, tornar-se-á aparente àqueles entendidos no assunto que variações poderão ser aplicadas às composições e métodos e nas etapas e na seqüência das etapas do método descrito aqui sem partir do conceito, espírito e abrangência da invenção. Mais especificamente, ficará aparente que certos agentes que sejam tanto quimicamente quanto fisiologicamente relacionados poderão ser substituídos pelos agentes descritos aqui enquanto resultados iguais ou semelhantes poderão ser alcançados. Todos os tais substitutos e modificações aparentes àqueles entendidos no assunto deverão ser considerados como estando dentro do espírito, da abrangência e do conceito da invenção conforme definido pelas reivindicações apensas. Listagem de Seqüências

<110> Tate & Lyle Ingredients Américas, INC Winkler, Aaron A. de Hulster, Erik van Dijken, Johannes Pieter Pronk, Jacobus T.

<120> "LEVEDURA RECOMBINANTE E MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO MÁLICO".

<130> 2027.709000, 2007090

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1180

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 1

Met Ser Ser Ser Lys Lys Leu Ala Gly Leu Arg Asp Asn Phe Ser Leu 1 5 10 15 Leu Gly Glu Lys Asn Lys Ile Leu Val Ala Asn Arg Gly Glu Ile Pro 20 25 30 Ile Arg Ile Phe Arg Ser Ala His Glu Leu Ser Met Arg Thr Ile Ala 35 40 45 Ile Tyr Ser His Glu Asp Arg Leu Ser Met His Arg Leu Lys Ala Asp 50 55 60 Glu Ala Tyr Val Ile Gly Glu Glu Gly Gln Tyr Thr Pro Val Gly Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ala Met Asp Glu Ile Ile Glu Ile Ala Lys Lys His Lys Val 85 90 95 Asp Phe Ile His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Ser Glu Phe 100 105 110 Ala Asp Lys Val Val Lys Ala Gly Ile Thr Trp Ile Gly Pro Pro Ala 115 120 125 Glu Val Ile Asp Ser Val Gly Asp Lys Val Ser Ala Arg His Leu Ala 130 135 140 Ala Arg Ala Asn Val Pro Thr Val Pro Gly Thr Pro Gly Pro Ile Glu 145 150 155 160 Thr Val Gln Glu Ala Leu Asp Phe Val Asn Glu Tyr Gly Tyr Pro Val 165 170 175 Ile Ile Lys Ala Ala Phe Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg Val Val 180 185 190 Arg Glu Gly Asp Asp Val Ala Asp Ala Phe Gln Arg Ala Thr Ser Glu 195 200 205 Ala Arg Thr Ala Phe Gly Asn Gly Thr Cys Phe Val Glu Arg Phe Leu

210 215 220

Asp Lys Pro Lys His Ile Glu Val Gln Leu Leu Ala Asp Asn His Gly 225 230 235 240

Asn Val Val His Leu Phe Glu Arg Asp Cys Ser Val Gln Arg Arg His

245 250 255

Gln Lys Val Val Glu Val Ala Pro Ala Lys Thr Leu Pro Arg Glu Val

260 265 270

Arg Asp Ala Ile Leu Thr Asp Ala Val Lys Leu Ala Lys Val Cys Gly

275 280 285

Tyr Arg Asn Ala Gly Thr Ala Glu Phe Leu Val Asp Asn Gln Asn Arg

290 295 300

His Tyr Phe Ile Glu Ile Asn Pro Arg Ile Gln Val Glu His Thr Ile 305 310 315 320

Thr Glu Glu Ile Thr Gly Ile Asp Ile Val Ser Ala Gln Ile Gln Ile

325 330 335

Ala Ala Gly Ala Thr Leu Thr Gln Leu Gly Leu Leu Gln Asp Lys Ile

340 345 350

Thr Thr Arg Gly Phe Ser Ile Gln Cys Arg Ile Thr Thr Glu Asp Pro

355 360 365

Ser Lys Asn Phe Gln Pro Asp Thr Gly Arg Leu Glu Val Tyr Arg Ser

370 375 380

Ala Gly Gly Asn Gly Val Arg Leu Asp Gly Gly Asn Ala Tyr Ala Gly 385 390 395 400

Ala Thr Ile Ser Pro His Tyr Asp Ser Met Leu Val Lys Cys Ser Cys

405 410 415

Ser Gly Ser Thr Tyr Glu Ile Val Arg Arg Lys Met Ile Arg Ala Leu

420 425 430

Ile Glu Phe Arg Ile Arg Gly Val Lys Thr Asn Ile Pro Phe Leu Leu

435 440 445

Thr Leu Leu Thr Asn Pro Val Phe Ile Glu Gly Thr Tyr Trp Thr Thr

450 455 460

Phe Ile Asp Asp Thr Pro Gln Leu Phe Gln Met Val Ser Ser Gln Asn 465 470 475 480

Arg Ala Gln Lys Leu Leu His Tyr Leu Ala Asp Leu Ala Val Asn Gly

485 490 495

Ser Ser Ile Lys Gly Gln Ile Gly Leu Pro Lys Leu Lys Ser Asn Pro

500 505 510

Ser Val Pro His Leu His Asp Ala Gln Gly Asn Val Ile Asn Val Thr

515 520 525

Lys Ser Ala Pro Pro Ser Gly Trp Arg Gln Val Leu Leu Glu Lys Gly

530 535 540

Pro Ser Glu Phe Ala Lys Gln Val Arg Gln Phe Asn Gly Thr Leu Leu 545 550 555 560

Met Asp Thr Thr Trp Arg Asp Ala His Gln Ser Leu Leu Ala Thr Arg

565 570 575

Val Arg Thr His Asp Leu Ala Thr Ile Ala Pro Thr Thr Ala His Ala

580 585 590

Leu Ala Gly Ala Phe Ala Leu Glu Cys Trp Gly Gly Ala Thr Phe Asp

595 600 605

Val Ala Met Arg Phe Leu His Glu Asp Pro Trp Glu Arg Leu Arg Lys 610 615 620 Leu Arg Ser Leu Val Pro Asn Ile Pro Phe Gln Met Leu Leu Arg Gly 625 630 635 640

Ala Asn Gly Val Ala Tyr Ser Ser Leu Pro Asp Asn Ala Ile Asp His

645 650 655

Phe Val Lys Gln Ala Lys Asp Asn Gly Val Asp Ile Phe Arg Val Phe

660 665 670

Asp Ala Leu Asn Asp Leu Glu Gln Leu Lys Val Gly Val Asn Ala Val

675 680 685

Lys Lys Ala Gly Gly Val Val Glu Ala Thr Val Cys Tyr Ser Gly Asp

690 695 700

Met Leu Gln Pro Gly Lys Lys Tyr Asn Leu Asp Tyr Tyr Leu Glu Val 705 710 715 720

Val Glu Lys Ile Val Gln Met Gly Thr His Ile Leu Gly Ile Lys Asp

725 730 735

Met Ala Gly Thr Met Lys Pro Ala Ala Ala Lys Leu Leu Ile Gly Ser

740 745 750

Leu Arg Thr Arg Tyr Pro Asp Leu Pro Ile His Val His Ser His Asp

755 760 765

Ser Ala Gly Thr Ala Val Ala Ser Met Thr Ala Cys Ala Leu Ala Gly

770 775 780

Ala Asp Val Val Asp Val Ala Ile Asn Ser Met Ser Gly Leu Thr Ser 785 790 795 800

Gln Pro Ser Ile Asn Ala Leu Leu Ala Ser Leu Glu Gly Asn Ile Asp

805 810 815

Thr Gly Ile Asn Val Glu His Val Arg Glu Leu Asp Ala Tyr Trp Ala

820 825 830

Glu Met Arg Leu Leu Tyr Ser Cys Phe Glu Ala Asp Leu Lys Gly Pro

835 840 845

Asp Pro Glu Val Tyr Gln His Glu Ile Pro Gly Gly Gln Leu Thr Asn

850 855 860

Leu Leu Phe Gln Ala Gln Gln Leu Gly Leu Gly Glu Gln Trp Ala Glu 865 870 875 880

Thr Lys Arg Ala Tyr Arg Glu Ala Asn Tyr Leu Leu Gly Asp Ile Val

885 890 895

Lys Val Thr Pro Thr Ser Lys Val Val Gly Asp Leu Ala Gln Phe Met

900 905 910

Val Ser Asn Lys Leu Thr Ser Asp Asp Ile Arg Arg Leu Ala Asn Ser

915 920 925

Leu Asp Phe Pro Asp Ser Val Met Asp Phe Phe Glu Gly Leu Ile Gly

930 935 940

Gln Pro Tyr Gly Gly Phe Pro Glu Pro Leu Arg Ser Asp Val Leu Arg 945 950 955 960

Asn Lys Arg Arg Lys Leu Thr Cys Arg Pro Gly Leu Glu Leu Glu Pro

965 970 975

Phe Asp Leu Glu Lys Ile Arg Glu Asp Leu Gln Asn Arg Phe Gly Asp

980 985 990

Ile Asp Glu Cys Asp Val Ala Ser Tyr Asn Met Tyr Pro Arg Val Tyr

995 1000 1005

Glu Asp Phe Gln Lys Ile Arg Glu Thr Tyr Gly Asp Leu Ser Val

1010 1015 1020

Leu Pro Thr Lys Asn Phe Leu Ala Pro Ala Glu Pro Asp Glu Glu 1025 1030 1035 Ile Glu Val Thr Ile Glu Gln Gly Lys Thr Leu Ile Ile Lys Leu

1040 1045 1050

Gln Ala Val Gly Asp Leu Asn Lys Lys Thr Gly Gln Arg Glu Val

1055 1060 1065

Tyr Phe Glu Leu Asn Gly Glu Leu Arg Lys Ile Arg Val Ala Asp

1070 1075 1080

Lys Ser Gln Asn Ile Gln Ser Val Ala Lys Pro Lys Ala Asp Val

1085 1090 1095

His Asp Thr His Gln Ile Gly Ala Pro Met Ala Gly Val Ile Ile

1100 1105 1110

Glu Val Lys Val His Lys Gly Ser Leu Val Lys Lys Gly Glu Ser

1115 1120 1125

Ile Ala Val Leu Ser Ala Met Lys Met Glu Met Val Val Ser Ser

1130 1135 1140

Pro Ala Asp Gly Gln Val Lys Asp Val Phe Ile Lys Asp Gly Glu

1145 1150 1155

Ser Val Asp Ala Ser Asp Leu Leu Val Val Leu Glu Glu Glu Thr

1160 1165 1170

Leu Pro Pro Ser Gln Lys Lys

1175 1180

<210> 2 <211> 340 <212> PRT

<213> S cerevisiae <400> 2

Met Val Lys Val Ala Ile Leu Gly Ala Ser Gly Gly Val Gly Gln Pro 1 5 10 15

Leu Ser Leu Leu Leu Lys Leu Ser Pro Tyr Val Ser Glu Leu Ala Leu

20 25 30

Tyr Asp Ile Arg Ala Ala Glu Gly Ile Gly Lys Asp Leu Ser His Ile

35 40 45

Asn Thr Asn Ser Ser Cys Val Gly Tyr Asp Lys Asp Ser Ile Glu Asn

50 55 60

Thr Leu Ser Asn Ala Gln Val Val Leu Ile Pro Ala Gly Val Pro Arg 65 70 75 80

Lys Pro Gly Leu Thr Arg Asp Asp Leu Phe Lys Met Asn Ala Gly Ile

85 90 95

Val Lys Ser Leu Val Thr Ala Val Gly Lys Phe Ala Pro Asn Ala Arg

100 105 110

Ile Leu Val Ile Ser Asn Pro Val Asn Ser Leu Val Pro Ile Ala Val

115 120 125

Glu Thr Leu Lys Lys Met Gly Lys Phe Lys Pro Gly Asn Val Met Gly

130 135 140

Val Thr Asn Leu Asp Leu Val Arg Ala Glu Thr Phe Leu Val Asp Tyr 145 150 155 160

Leu Met Leu Lys Asn Pro Lys Ile Gly Gln Glu Gln Asp Lys Thr Thr

165 170 175

Met His Arg Lys Val Thr Val Ile Gly Gly His Ser Gly Glu Thr Ile 180 185 190 Ile Pro Ile Ile 195

Tyr Glu His Phe 210

Lys Ala Lys Gln 225

Gly Ala Lys Phe

Pro Glu Thr Glu 260

Asn Gly Lys Lys 275

Phe Ser Leu Pro 290

Thr Ser Val Leu 305

Thr Ala Val Lys

Ile Leu Asp Ser 340

Thr Asp Lys Ser 200

Ile His Arg Val 215

Gly Ala Gly Ser 230

Ala Glu Glu Val 245

Ser Leu Ser Ala

Ala Gln Gln Leu 280

Ile Val Leu Arg 295

Glu Lys Leu Ser 310

Glu Leu Arg Lys 325

Leu Val Phe Gln

Gln Phe Gly Gly 220

Ala Thr Leu Ser 235

Leu Arg Ser Phe 250

Phe Val Tyr Leu 265

Val Gly Asp Asn

Asn Gly Ser Val 300

Pro Arg Glu Glu 315

Asn Ile Glu Lys 330

Leu Asp Lys Gln 205

Asp Glu Ile Val

Met Ala Phe Ala 240

His Asn Glu Lys 255

Pro Gly Leu Lys 270

Ser Ile Glu Tyr 285

Val Ser Ile Asp

Gln Leu Val Asn 320

Gly Lys Ser Phe 335

<210> 3 <211> 438 <212> PRT

<213> Schizosaccharomyces pombe <400> 3

Met Gly Glu Leu Lys Glu Ile Leu Lys Gln Arg Tyr His Glu Leu Leu 15 10 15

Asp Trp Asn Val Lys Ala Pro His Val Pro Leu Ser Gln Arg Leu Lys

20 25 30

His Phe Thr Trp Ser Trp Phe Ala Cys Thr Met Ala Thr Gly Gly Val

35 40 45

Gly Leu Ile Ile Gly Ser Phe Pro Phe Arg Phe Tyr Gly Leu Asn Thr

50 55 60

Ile Gly Lys Ile Val Tyr Ile Leu Gln Ile Phe Leu Phe Ser Leu Phe 65 70 75 80

Gly Ser Cys Met Leu Phe Arg Phe Ile Lys Tyr Pro Ser Thr Ile Lys

85 90 95

Asp Ser Trp Asn His His Leu Glu Lys Leu Phe Ile Ala Thr Cys Leu

100 105 110

Leu Ser Ile Ser Thr Phe Ile Asp Met Leu Ala Ile Tyr Ala Tyr Pro

115 120 125

Asp Thr Gly Glu Trp Met Val Trp Val Ile Arg Ile Leu Tyr Tyr Ile

130 135 140

Tyr Val Ala Val Ser Phe Ile Tyr Cys Val Met Ala Phe Phe Thr Ile 145 150 155 160

Phe Asn Asn His Val Tyr Thr Ile Glu Thr Ala Ser Pro Ala Trp Ile

165 170 175

Leu Pro Ile Phe Pro Pro Met Ile Cys Gly Val Ile Ala Gly Ala Val 180 185 190 Asn Ser Thr Gln Pro Ala His Gln Leu Lys Asn Met Val Ile Phe Gly

195 200 205

Ile Leu Phe Gln Gly Leu Gly Phe Trp Val Tyr Leu Leu Leu Phe Ala

210 215 220

Val Asn Val Leu Arg Phe Phe Thr Val Gly Leu Ala Lys Pro Gln Asp 225 230 235 240

Arg Pro Gly Met Phe Met Phe Val Gly Pro Pro Ala Phe Ser Gly Leu

245 250 255

Ala Leu Ile Asn Ile Ala Arg Gly Ala Met Gly Ser Arg Pro Tyr Ile

260 265 270

Phe Val Gly Ala Asn Ser Ser Glu Tyr Leu Gly Phe Val Ser Thr Phe

275 280 285

Met Ala Ile Phe Ile Trp Gly Leu Ala Ala Trp Cys Tyr Cys Leu Ala

290 295 300

Met Val Ser Phe Leu Ala Gly Phe Phe Thr Arg Ala Pro Leu Lys Phe 305 310 315 320

Ala Cys Gly Trp Phe Ala Phe Ile Phe Pro Asn Val Gly Phe Val Asn

325 330 335

Cys Thr Ile Glu Ile Gly Lys Met Ile Asp Ser Lys Ala Phe Gln Met

340 345 350

Phe Gly His Ile Ile Gly Val Ile Leu Cys Ile Gln Trp Ile Leu Leu

355 360 365

Met Tyr Leu Met Val Arg Ala Phe Leu Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro

370 375 380

Gly Lys Asp Glu Asp Ala His Pro Pro Pro Lys Pro Asn Thr Gly Val 385 390 395 400

Leu Asn Pro Thr Phe Pro Pro Glu Lys Ala Pro Ala Ser Leu Glu Lys

405 410 415

Val Asp Thr His Val Thr Ser Thr Gly Gly Glu Ser Asp Pro Pro Ser

420 425 430

Ser Glu His Glu Ser Val 435

<210> 4

<211> 4144

<212> DNA

<213> S. cerevisiae

<400> 4

tcgagctatt tattataaga gtcagaattg ccatcggata tttcctattg tgtttctgtg ttcggtatcc ttacttgatt acatacataa agcttactat ctgtggcccg tcatttgagt aataaaggac agttactagg agagaaaata cagtagcaag aaattggccg gtcttaggga gatcttggtc gccaatagag gtgaaattcc gtctatgaga accatcgcca tatactccca ggcggacgaa gcgtatgtta tcggggagga ggcaatggac gagatcatcg aaattgcaaa ttatgggttc ttgtctgaaa attcggaatt ttggatcggc cctccagctg aagttattga cttggcagca agagctaacg ttcctaccgt

gcgcagggag tgttaagtaa gaagtactcc 60 atttttagtc cttttttctt ttctcttact 120 acaagcccct cttttcttcc aaactcttgt 180 ttgatttttt tgccaattac tatattgcaa 240 agggacatag agaacaaaat aaaatatgag 300 caatttcagt ttgctcggcg aaaagaataa 360 gattagaatt tttagatctg ctcatgagct 420 tgaggaccgt ctttcaatgc acaggttgaa 480 gggccagtat acacctgtgg gtgcttactt 540 gaagcataag gtggatttca tccatccagg 600 tgccgacaaa gtagtgaagg ccggtatcac 660 ctctgtgggt gacaaagtct ctgccagaca 720 tcccggtact ccaggaccta tcgaaactgt 780 gcaagaggca tggtggtggt tcaacgtgct attcttggac ggttcatctt cgctccagca attagctaag aaacagacac agaaatcacc gactcaacta tattaccact tcgttctgcc tatctcgcct aatcgtccgt caacattccc gacgactttt gcaaaaactg aattggcttg caatgtcatc aaagggacca caccacctgg ggctacaatc gggtggtgct gagaaaatta cggtgtggct ggataatggt agttggtgtg tggtgacatg aaaaatagtt accggccgct tcatgttcac agcaggtgct atcaattaat gcatgttcgt ggccgacttg gactaacttg aagagcttac taaggttgtc tagacgttta aattggtcaa gagaagaaag tagagaagac tatgtatcca agttctacca catcgaacaa aactgggcaa agacaagtca ccaaatcggt ggtgaaaaag ttcaccagca atcagatttg tttactcgtt tattttatct

cttgacttcg ggtagaggta acctccgaag aagccaaagc ttcgaaagag aagactttgc gtatgtggtt tatttcattg ggtattgaca ggtctattac gaagatccct ggtggtaatg cactacgact aggaagatga ttcctattga attgacgaca ttacactatt ccaaaactaa aacgttacaa tctgaatttg agagacgctc gctccaacaa acattcgacg agatctctgg tactcttcat gttgatatat aatgctgtca cttcagccag caaatgggta gccaaattat agtcatgact gatgttgtcg gcactgttgg gaattagatg aagggaccag ttattccaag agagaagcca ggtgatttag gctaattctt ccatacggtg ttgacgtgcc ttgcagaaca agggtctatg accaaaaatt ggtaagactt agagaagtgt caaaacatac gcaccaatgg ggcgaatcga gatggtcaag ttggttgtcc aattatattt agttatgttc

ttaatgaata tgagagtcgt cccgtactgc atattgaagt actgttctgt cccgtgaagt acagaaacgc aaattaatcc ttgtttctgc aggataaaat ctaagaattt gtgtgagatt caatgctggt ttcgtgccct ctcttttgac ccccacaact tggcagactt aatcaaatcc agtctgcacc ccaagcaagt atcaatctct ccgcacatgc ttgcaatgag tgcctaatat tacctgacaa ttagagtttt agaaggccgg gtaagaaata cacatatctt taattggctc ccgcaggtac atgtagctat cttcattaga catactgggc atccagaagt ctcaacaact attacctact ctcaattcat tggactttcc ggttcccaga gtccaggttt gattcggtga aagatttcca tcctagcacc tgattatcaa attttgaatt aatctgttgc ctggtgttat ttgctgtttt ttaaagacgt tagaagaaga tatgacatct ccatgtatat

cggctacccg tagagaaggt cttcggtaat tcaattgttg gcaaagaaga tcgtgacgct aggtaccgcc aagaattcaa ccaaatccag caccacccgt ccaaccggat ggacggtggt caaatgttca gatcgaattc caatccagtt gttccaaatg ggcagttaac aagtgtcccc accatccgga cagacagttc acttgcaaca ccttgcaggt attcttgcat tccattccaa tgctattgac tgatgccttg tggtgttgtc caacttagac gggtattaag cctaagaacc tgctgttgcg caattcaatg aggtaacatt cgaaatgaga ttaccaacat gggtcttggt gggagatatt ggtttctaac tgactctgtt accattaaga agaattagaa tattgatgaa aaagatcaga agcagaacct attgcaagct gaacggtgaa taaaccaaag catagaagtt gagtgccatg tttcattaag aaccctaccc gaaaatacta ttaaatgcca

gtgatcatta gacgacgtgg ggtacctgct gctgataacc caccaaaaag attttgacag gaattcttgg gtggagcata attgccgcag gggttttcca accggtcgcc aacgcttatg tgctctggtt agaatcagag tttattgagg gtatcgtcac ggttcttcta catttgcacg tggagacaag aatggtactc agagtcagaa gctttcgctt gaggatccat atgttattac cattttgtca aatgatttag gaagctactg tactacctag gatatggcag agatatccgg tctatgactg tcgggcttaa gatactggga ctgttgtatt gaaatcccag gaacaatggg gttaaagtta aaactgactt atggactttt tctgatgtat ccatttgatc tgcgatgttg gaaacatacg gatgaagaaa gttggtgact ttaagaaaga gctgatgtcc aaagtacata aaaatggaaa gatggtgaaa ccatcccaaa gctgtactat aatagaaagt

aggccgcctt cagatgcctt ttgtggaaag acggaaacgt ttgtcgaagt atgctgttaa ttgacaacca ccatcactga gtgccacttt tccaatgtcg tggaggtcta caggtgctac ctacttatga gtgttaagac gtacatactg aaaacagagc ttaagggtca atgctcaggg tgctactgga tactgatgga cccacgattt tagaatgttg gggaacgtct gtggtgccaa agcaagccaa aacaattaaa tttgttactc aagttgttga gtactatgaa atttaccaat catgtgccct cttcccaacc ttaacgttga cttgtttcga gtggtcaatt ctgaaactaa ccccaacttc ccgacgatat ttgaaggttt tgagaaacaa tcgaaaaaat cttcttacaa gtgatttatc tcgaagtcac taaataagaa tcagagttgc acgatactca aagggtcttt tggttgtctc gtgttgacgc aaaagtaatt atatggcgta aatcaaacac

840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 tttcgatgaa atacgtgcta actgtgtttc attctccatt ttcttcttga gtgaaaatgt tctatttaat atcgtacggg atttttgatc gcgc

ttccttaatg ctttcactta ccatgtctcc 4020 gagtttataa cgctcaagta cgttaactac 4080 gactgtaggt tttcttctta gaccattcca 4140

4144

<210> 5

<211> 1044

<212> DNA

<213> S. cerevisiae

<400> 5

gctctagaaa catggtcaaa gtcgcaattc ttggcgcttc tggtggcgtg ggacaaccgc 60

tatcattact gctaaaatta agcccttacg tttccgagct ggcgttgtac gatatccgag 120

ctgcggaagg cattggtaag gatttatctc acatcaacac caactcaagt tgtgtcggtt 180

atgataagga tagtattgag aacaccttgt caaatgctca ggtggtgcta ataccggctg 240

gtgttcccag aaagcccggt ttaactagag atgatttgtt caagatgaac gccggtattg 300

tcaaaagcct ggtaaccgct gttggaaagt tcgcaccaaa tgcgaggatt ttagtcattt 360

caaaccctgt aaacagtttg gtccctattg ctgtggaaac tttgaagaaa atgggtaagt 420

tcaaacctgg aaacgttatg ggtgtgacga accttgacct ggtacgtgca gaaacctttt 480

tggtagatta tttgatgcta aaaaacccca aaattggaca agaacaagac aaaactacaa 540

tgcacagaaa ggtcactgtt attgggggtc attcagggga aaccattatc ccaataatca 600

ccgacaaatc gctggtattt caacttgata agcagtacga gcacttcatt catagggtcc 660

agttcggagg tgatgaaatt gtcaaagcta aacagggcgc cggttccgcc acgttgtcca 720

tggcgttcgc gggggccaag tttgctgaag aagttttgag gagcttccat aatgagaaac 780

cagaaacgga gtcactttcc gcattcgttt atttaccagg cttaaaaaac ggtaagaaag 840

cgcagcaatt agttggcgac aactctattg agtatttttc cttgccaatt gttttgagaa 900

atggtagcgt agtatccatc gataccagtg ttctggaaaa actgtctccg agagaggaac 960

aactcgttaa tactgcggtc aaagagctac gcaagaatat tgaaaaaggc aagagtttca 1020

tcctagactc ttgagtcgac agct 1044

<210> 6 <211> 1336 <212> DNA

<213> Schizosaccharomyces pombe

<400> 6

gctctagaca tgggtgaact caaggaaatc ttgaaacaga ggtatcatga gttgcttgac 60

tggaatgtca aagcccctca tgtccctctc agtcaacgac tgaagcattt tacatggtct 120

tggtttgcat gtactatggc aactggtggt gttggtttga ttattggttc tttccccttt 180

cgattttatg gtcttaatac aattggcaaa attgtttata ttcttcaaat ctttttgttt 240

tctctctttg gatcatgcat gctttttcgc tttattaaat atccttcaac tatcaaggat 300

tcctggaacc atcatttgga aaagcttttc attgctactt gtcttctttc aatatccacg 360

ttcatcgaca tgcttgccat atacgcctat cctgataccg gcgagtggat ggtgtgggtc 420

attcgaatcc tttattacat ttacgttgca gtatccttta tatactgcgt aatggctttt 480

tttacaattt tcaacaacca tgtatatacc attgaaaccg catctcctgc ttggattctt 540

cctattttcc ctcctatgat ttgtggtgtc attgctggcg ccgtcaattc tacacaaccc 600

gctcatcaat taaaaaatat ggttatcttt ggtatcctct ttcaaggact tggtttttgg 660

gtttatcttt tactgtttgc cgtcaatgtc ttacggtttt ttactgtagg cctggcaaaa 720

ccccaagatc gacctggtat gtttatgttt gtcggtccac cagctttctc aggtttggcc 780

ttaattaata ttgcgcgtgg tgctatgggc agtcgccctt atatttttgt tggcgccaac 840 tcatccgagt atcttggttt tgtttctacc tttatggcta tttttatttg gggtcttgct 900 gcttggtgtt actgtctcgc catggttagc tttttagcgg gctttttcac tcgagcccct 960 ctcaagtttg cttgtggatg gtttgcattc attttcccca acgtgggttt tgttaattgt 1020 accattgaga taggtaaaat gatagattcc aaagctttcc aaatgtttgg acatatcatt 1080 ggggtcattc tttgtattca gtggatcctc ctaatgtatt taatggtccg tgcgtttctc 1140 gtcaatgatc tttgctatcc tggcaaagac gaagatgccc atcctccacc aaaaccaaat 1200 acaggtgtcc ttaaccctac cttcccacct gaaaaagcac ctgcatcttt ggaaaaagtc 1260 gatacacatg tcacatctac tggtggtgaa tcggatcctc ctagtagtga acatgaaagc 1320 gtttaagtcg acgcgt 1336

Claims (18)

1. Levedura recombinante, caracterizada pelo fato de a levedura ser a enzima piruvato decarboxilase (PDCO) de atividade negativa (PDC-negativa) e ser funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma carbozxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) onde a carboxilase PEP seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose; e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE).

2. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de a levedura ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.

3. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -2,caracterizada pelo fato de a levedura ser S. cerevisiae cepa ΤΑΜ.

4. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de a PYC ser piruvato carboxilase de S. cerevisiae, a MDH ser MDHl de S. cerevisiae ou MDH3 de S. cerevisiae, e a MAE ser SpMAEl de Schizosaccharomyces pombe.

5. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -4, caracterizada pelo fato de a MDH ser direcionada ao citossol da levedura por modificação da região codificadora codificando a MDH relativamente à região codificadora codificando a MDH tipo selvagem.

6. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -1, caracterizada pelo fato de a PYC ter pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO:l, a MDH tendo pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO:2, e a MAE tendo pelo menos -75% de identidade com a SEQ ID NO:3.

7. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação -6, caracterizada pelo fato de a PYC ter pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:1, a MDH tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:2, e a MAE tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:3.

8. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de a PYC ter a seqüência mostrada em SEQ ID NO:1, a MDH tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:2, e a MAE tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:3.

9. Método para produzir ácido málico, caracterizado pelo fato de compreender: cultivar uma levedura recombinante onde a levedura seja a enzima piruvato decarboxilase (PDC) de atividade negativa (PDC-negativa) e seja funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando ou uma enzima piruvato carboxilase (PYC) onde a PYC seja ativa no citossol ou uma carbozxilase de fosfoenolpiruvato (PEP) onde a carboxilase PEP seja insensível à inibição por malato, aspartato, e oxoloacetato, uma região codificadora codificando uma enzima malato dehidrogenase (MDH) onde a MDH seja ativa no citossol e não seja inativada na presença de glicose, e uma região codificadora codificando uma proteína transportadora de ácido málico (MAE), em um meio compreendendo uma fonte de carbono e uma fonte de dióxido de carbono; e isolar ácido málico ou ácido succínico do meio.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a fonte de carbono ser glicose.

11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a levedura ser da espécie Saccharomyces cerevisiae.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a levedura ser S. cerevisiae cepa ΤΑΜ.

13. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de a levedura ser funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando piruvato carboxilase de S. cerevisiae, uma região codificadora codificando MDHl de S. cerevisiae ou MDH3 de S. cerevisiae, e uma região codificadora codificando SpMAEl de Schizosaccharomyces pombe.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de a MDH ser direcionada para o citossol da levedura.

15. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando uma PYC tendo pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID N0:1, uma região codificadora codificando uma MDH tendo pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO: 2, e uma região codificadora codificando uma MAE tendo pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO:3.

16. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser funcionalmente transformada com uma região codificadora codificando uma PYC tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO:1, uma região codificadora codificando uma MDH tendo pelo menos 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, e uma região codificadora codificando uma MAE tendo pelo menos 75% de identidade com a SEQ ID NO:3.

17. Levedura recombinante, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de a PYC ter a seqüência mostrada em SEQ ID NO:1, a MDH tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:2, e a MAE tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:3.

18. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de compreender ainda isolar ácido succínico do meio.