BRPI0620695A2 - método para tratar um tumor do tipo glioma, métodos de prognóstico e/ou diagnóstico de glioma, método de monitoramento ou diagnóstico, método para inibir o tamanho ou crescimento de um tumor do tipo glioma, métodos para tratar terapeuticamente, método para determinar o nìvel de expressão de marcadores determinantes de glioma ("gdm") de pn, prolif ou mes, método para prognosticar o tempo de sobrevida, método para diagnosticar a severidade de um tumor do tipo glioma e uso - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA TRATAR UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, MéTODOS DE PROGNóSTICO E/OU DIAGNóSTICO DE GLIOMA, MéTODO DE MONITORAMENTO OU DIAGNóSTICO, MéTODO PARA INIBIR O TAMANHO OU CRESCIMENTO DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, MéTODOS PARA TRATAR TERAPEUTICAMENTE, MéTODO PARA DETERMINAR O NìVEL DE EXPRESSãO DE MARCADORES DETERMINANTES DE GLIOMA ("GDM") DE PN, PROLIFOU MES, MéTODO PARA PROGNOSTICAR O TEMPO DE SOBREVIDA, MéTODO PARA DIAGNOSTICAR A SEVERIDADE DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA E USO. A invenção em geral fornece um método de monitoramento diagnóstico, prognóstico e tratamento de glioma. Especificamente, a invenção estabelece três (3) subcíasses prognósticas de glioma, as quais estão diferentemente associadas com a ativação das vias de sinalização akt e Notch. Tumor que exibe marcadores de linhagem neural ou proneural PN (incluindo elementos da via notch) mostra média de sobrevida do paciente mais longa, enquanto os dois marcadores de tumor remanescentes Prolif e Mes estãoassociados com sobrevida curta. Tumores classificados desta maneira também podem ser tratados com terapêuticos de PN Prolif ou Mes que correspondem à subclassificação, em combinação com agentes anti-mitóticos, agentes anti-angiogênicos, antagonistas de Akt e agentes de diferenciação neural. Alternativamente, a invenção também estabelece método de prognóstico e diagnóstico de glioma com um modelo de duplo gene baseado nos níveis de expressão de PTEN e DLL3.

Description

"MÉTODO PARA TRATAR UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, MÉTODOS DE PROGNÓSTICO E/OU DIAGNÓSTICO DE GLIOMA, MÉTODO DE MONITORAMENTO OU DIAGNÓSTICO, MÉTODO PARA INIBIR O TAMANHO OU CRESCIMENTO DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, MÉTODOS PARA TRATAR TERAPEUTICAMENTE, MÉTODO PARA DETERMINAR O NÍVEL DE EXPRESSÃO DE MARCADORES DETERMINANTES DE GLIOMA ("GDM") DE PN, PROLIF OU MES, MÉTODO PARA PROGNOSTICAR O TEMPO DE SOBREVIDA, MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR A SEVERIDADE DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA E USO"

O presente pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) para patente USSN 60/750.944 depositada em 16 de dezembro de 2005.

Campo Da Invenção

A presente invenção é dirigida aos métodos para diagnosticar, prognosticar e tratar o câncer, especialmente, glioma.

Antecedentes Da Invenção

Tumores malignos (cânceres) são a segunda causa principal de morte nos Estados Unidos, depois de doenças do coração (Boring et al., CA Câncer J. Clin. 43:7 (1993)). O câncer é caracterizado pelo aumento no número de células anormais ou neoplásicas, células derivadas de um tecido normal que se proliferam para formar uma massa tumoral, a invasão de tecidos adjacentes por estas células tumorais neoplásicas e a geração de células malignas que eventualmente se espalham via sistema sangüíneo ou linfático para linfonodos regionais e para locais distantes via um processo chamado metástase. Em um estado canceroso, uma célula se prolifera sob condições nas quais as células normais não cresceriam. O câncer se manifesta de diversas formas, caracterizado por diferentes graus de invasão e agressividade. Gliomas são o tipo mais comum de tumores primários do cérebro e estão tipicamente associados com prognóstico grave. Astrocitomas de alto grau, que incluem glioblastomas (GBM) e astrocitona anaplásico (AA)1 são os tumors cerebrais intrínsecos mais comuns em adultos. Enquanto houve um progresso no entendimento da genética molecular dos astrocitomas de alto grau (Kitange et al., Curr. Opin. Oncoi 15: 197-203 (2003), os tipos celulares de origem são ainda duvidosos e os determinantes moleculares da agressividade da doença não são bem entendidos. Um melhor entendimento da origem celular e patogênse molecular destes tumores pode identificar novos alvos para tratamento destes neoplasmas que são quase que uniformemente fatais.

A graduação dos tumores é freqüentemente crítica para um diagnóstico e prognóstico exato de progressão da doença, e gliomas não são exceção. Décadas de experiência levaram a um sistema de diagnóstico de gliomas baseado na histologia. Gliomas são histologicamente definidos baseados primeiramente na exibição da morfologia astrocítica ou oligodendroglial, e são graduados pela celularidade, atipia nuclear, necrose, figuras mitóticas e proliferação microvascular - todas as características associadas com comportamento biologicamente agressivo. O sistema de diagnóstico foi desenvolvido durante décadas de experiência clínica com gliomas e tornou-se agora a base da oncologia. Kleihues, P. et al., World Health Organization ("WHO") classification of tumors, Câncer 88: 2887 (2000). O esquema de classificação WHO de gliomas astrocíticos é dividido em quatro (4) graus. Tumores menos malignos são incluídos no grau I (astrocitoma pilocítico) e II (glioma astrocítico), enquanto que tumores mais malignos são definidos como de grau Ill (astrocitoma anaplásico) e grau IV (glioblastoma multiforme). Oligodendrogliomas e gliomas mistos (com ambos os componentes, oligodendroglial e astrocíticos) ocorrem em baixo grau (WHO grau II) e variantes mais malignos (WHO grau III). Até recentemente, presumia-se que astrocitomas e outros gliomas surgiam das células gliais que se instalam dentro do parênquima cerebral. No entanto, novas evidências em estudos humanos e animais sugerem células- tronco neurais como uma origem celular alternativa de gliomas (Caussinus e Gonzalez, Nat. Genet. 37: 1125 (2005); Singh et al., Câncer Res. 63: 5821- 5828 (2003); Zhu et al., Câncer Cell 8: 119 (2005). Modelos de camundongo demonstram que astrócitos ou células- tronco/progenitoras podem causar neoplasmas que exibem a marca histopatológica de gliomas humanos (Bachoo et al., Câncer Cell 1: 269-277 (2002); Uhrbom et al., Câncer Res. 62: 5551- 5558 (2002)). A demonstração de que o prosencéfalo humano adulto contém uma fonte abundante de células-tronco neurais (Sanai et al., Nature 427: 740- 744 (2004) e que células similares às tronco neurais tumorigênicas contém GBMs (Galli et al., CancerRes. 64: 7011-7021 (2004); Ignatova et al., GLIA 39: 193-206 (2002); Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004) indica que células- tronco/progenitoras neurais são de origem plausível para gliomas humanos e originaram especulação de que terapias mais eficientes resultariam em abordagens com o objetivo de atingir o componente de GBM similar ao da célula tronco (Berger et al., Lancet Oncoi 5: 511-514 (2004); Fomchenko e Holland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005); Ignatova et al., acima; Oliver e Wechsler-Reya, Neuron 42: 885-888 (2004). De modo importante, no entanto, a contribuição de células similares às tronco para progressão da doença ou resposta terapêutica não foi estabelecida, nem é claro que a proporção de células tumorais exibem propriedades similares às tronco.

Enquanto o prognóstico do paciente e decisões terapêuticas são feitas com confiança na graduação patológica exata, consistência é um atributo crítico. Enquanto para a maior parte reproduzível, o presente sistema histológico pode resultar em desacordo substancial entre neuropatologistas em relação tanto ao tipo quanto ao grau. Louis, DN et al., Am J. Pathol. 159: 779- 86 (2001); Prayson RA et al., J. Neuroi Sei. 175: 33-9 (2000); Coons et al., Câncer 79:1381-93 (1997). Além disso, o método preciso de alterações de graduação ao longo do tempo. Finalmente, porque está baseado na morfologia [Burger, Brain Pathol. 12:257-9 (2002)], biológica, ao invés do estado molecular final, a abordagem é limitada na habilidade para identificar novos compostos potenciais.

Atualmente, a graduação baseada na histologia de gliomas infiltrativos difusos é o melhor indicador de tempo de sobrevida evidente. No entanto, a histologia não é ilustrativa da patologia de gliomas nem muito útil para identificar novos marcadores e seus usos para desenvolvimento de novos terapêuticos. Além disso, aumentam cada vez mais as evidências ds a presença de subclasses relevantes clinicamente não reconhecidas de gliomas difusos tanto com respeito à expressão do maracador celular como da resposta terapêutica. Mischel PS et al., CancerBioi. Ther. 2:242-7 (2003). Foi também apontado a partir de uma variedade de regimes de tratamento que as respostas clínicas para tumores histologicamente idênticos podem ser altamente variadas. Mischel et al., acima ; Cloughesy, TF et al., Câncer 97: 2381-6 (2003). Isto ressalta como a avaliação histopatológica não é reveladora com base na biologia. Como os oncologistas mudaram para terapias-alvo molecular, a identificação de diferentes subgrupos definidos molecularmente torna-se progressivamente importante. No entanto, enquanto os genes associados a tumores específicos foram estudados, testes para gene/proteína individuais sozinhos ou até em combinação com características histológicas não foram até agora preditivos de sobrevida ou úteis na orientação de decisões terapêuticas. Tortosa, A. et al., Câncer 97: 1063-71 (2003); Reavey-Cantwell, JF et al., J. Neurooncoi. 55: 195-204 (2001); Bouvier-Labit, C. et al., Neuropathoi. Appl. Neurobioi. 24:381-8 (1998); Stark, AM et al., Zentralbi Neurochir. 64: 30-6 (2003); Li, J. et al., Science 275: 1943-7 (1997).

Diversos estudos investigaram correlações moleculares de prognóstico e subclasses clínicas em AA e GBM (também conhecidos como astrocitoma grau Ill e IV1 respectivamente). Grau de tumor é o indicador mais forte e bem estabelecido do resultado da doença (Prados e Levin, Semin Oncol. 27: 1-10 (2000). A perda da heterozigisidade do cromossomo (chr) 10q é uma ocorrência mais freqüente em GBM do que AA e foi associada com sobrevida curta em GBM (Balesaria et al., Br. J. Can. 81: 1371-1377 (1999); Schmidt et al., J. Neuropathoi Exp. Neuroi 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat. Can. Inst. 93: 1246-1256 (2001). A velhice no diagnóstico é um fator prognóstico negativo para GBM (Curran et al., J. Nati Câncer Inst. 85; 704-710 (1993), e marcadores moleculares de resultados diferentes em pacientes mais velhos e mais novos (Batchelor et al., Clin. Câncer Res. 10: 228-233 (2004); Smith et al., J. Natl. Câncer Inst. 93: 1246-1256 (2001), sugerindo a existência de subclasses moleculares associadas à idade. Enquanto a mutação p53 e amplificação EGFR supostamente define subgrupos GBM mutuamente exclusivos [von Deimling et al., Glia 15, 328-338 (1995); Watanabe et al., Brain Pathology 6, 217-223 (1996)], um estudo recente desafia a validade deste esquema de classificação [Okada et al., Câncer Research 63, 413-416 (2003)] e o valor de prognóstico tanto da mutação p53 como alterações do Iocus EGFR não é claro (Heimberger et al., Clinicai Câncer Research 11: 1462-1466 (2005); Ushio et al., Frontiers in Bioscience 8; e281-288 (2003). Está claro que um melhor entendimento da base biológica destes tumores é necessária com o obejtivo de tratar mais efetivamente esta doença.

Análise de microarranjo foi identificada como uma ferramenta que fornece avaliação do tumor imparcial e reproduzível porque pode avaliar simultaneamente a expressão de milhares de genes individuais. Esta aboradagem foi aplicada a muitos cânceres diferentes incluindo gliomas. Mischel, P.S. et al., Oncogene 22: 2361-73 (2003); Kim, S. et al., Moi Câncer Ther. 1:1229-36 (2002); Ljubimova et al., CancerRes. 61: 5601-10 (2001); Nutt, CL et al., CancerRes. 63: 1602-7 (2003); Rickman1 D.S. et al., CancerRes. 61: 6885-91 (2001); Sallinen1 S.L. et al., CancerRes. 60: 6617-22 (2000); Shai1 R. et al., Oncogene 22: 4918-23 (2003). Diferente da avaliação histológica, análise de microarranjo pode identificar a base das variações genéticas nos tumores, melhorando a classificação do tumor, como também, prognóstico do paciente. Análise de microarranjo de gliomas resultou em uma classificação de grupos mais homogêneos. Freije et al., Câncer Res. 64: 6503-6510 (2004).

Além disso, foi também descoberto ser um indicador superior de prognóstico de sobrevida do que graduação histológica. Freije et al., acima.

O perfil de expressão de gliomas malignos identificou subtipos moleculares, como também, genes associados com grau de progressão e sobrevida de pacientes (Godard et al., Câncer Res. 63: 6613-6625 (2003); Rickman et al., Can. Res. 61: 6885-6891 (2001); van den Boom et al., Am. J. Pathoi 163: 1033-1043 (2003). Enquanto GBM e AA continuam a ser definidos com base na aparência histológica, a descoberta de que o perfil de expressão prevê o resultado melhor do que características histológicas (Freije et al., acima; Nutt et al., Clin. Can. Res. 11: 2258-2264 (2003) fornece suporte para a hipóstese de que neoplasmas definidos como AA e GBM em uma base morfológica representa uma mistura de subtipos genéticos. Dado que a possibilidade desta realidade molecular distinta da doença pode exibir diferentes respostas clínicas para agentes anti-câncer dirigidos, um maior entendimento do comportamento de subgrupos de tumores molecularmente definidos pode ajudar no desenvolvimento de terapêuticos mais efetivos.

Acredita-se que gliomas malignos se desenvolvem como um resultado do acúmulo gradativo de lesões genéticas. Por exemplo, astrocitoma anaplásico tipicamente exibe: (1) perda de uma via p53 funcional, usualmente por mutação p53; (2) perda de uma via p16/pRb funcional, tipicamente pela deleção do Iocus p16/ARF; e (3) ativação da via ras por meios, exceto mutação ras; e (4) reativação da telomerase, que é raramente vista em astrócitos humanos normais (NHAs) ou glioma de grau II. Kleihues e Cavenee et al., "Diffuse infiltrating astrocytomas," em Pathology and Genetics of Tumors ofthe Nervous System, W.K. Cavnee e P. Kleihues, Eds., páginas. 9-21. Lyon:IRAC Press (2000). Lyon:IRAC Press (2000); Ichimura et al., Câncer Res. 60: 417- 424 (2000); Feldkamp et al., Neurosurgery 45: 1442-1453 (1999). Glioblastoma multiforme (GBM)1 em adição à alteração nas vias p53 e p16/pRb apontadas acima, também contêm com freqüência rupturas PTEN que levam à ativação da via Akt. Hass-Kogan et al., Curr. Biol. 8: 1195-1198 (2000), Holland et al., Nat. Genet. 25: 55-57 (2000). Através do efeito nos alvos a jusante, Akt pode levar à redução dos níveis do inibidor do ciclo celular [Datta et al., Cell 91: 231- 241 (1997); Pap et al., J. Biol. Chem. 273: 19929-19932 (1998); Brunet et al., Cell 96: 857-868 (1999); Kops et al., Nature, 398: 630-634 (1999); Medema et al., Nature 404: 782-787 (2000)], como também aumento nos níveis do fator de crescimento endotelial vascular sob condições hipóxicas. Mazure et al., Blood 90: 3322-3331 (1997). Akt pode suprimir apoptose, desregular o ciclo celular e alterar potencial angiogênico. Além disso, observa-se que 80% dos tumores GBM expressam níveis elevados de Akt. Em consideração aos efeitos conhecidos de Akt na psicologia celular e expressão elevada em GBM, ativação de Akt é fortemente comprometida com o desenvolvimento de GBM. Hass-Kogan, acima; Holland, acima.

O gene supressor de tumor Pten codifica uma fosfatase que é freqüentemente mutada, deletada ou de outra forma inativada somaticamente em vários cânceres humanos, incluindo glioblastoma. Li et al., Science 275: 1943 (1997). Além da carcinogênese, Pten pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento cerebral, como sugerido pelo seu padrão de expressão onipresente no sistema nervoso central (CNS) no embrião. Gimm et al., Hum. Mol. Genet. 9: 1633 (2000); Luukko et al., Mech. Dev. 83: 187 (1999), como também por disfunções neurológicas associadas com mutações nas linhagens de origem em humanos. Enquanto a Ietalidade embrionária inicial de camundongos knock out Pten''" convencionais impediu estudos na função de Pten no desenvolvimento cerebral inicial, [Di Cristofano et al., Nature Genet. 19: 348 (1998) e Stambolic et al., Cell 95: 29 (1998)] o promotor dirigido a animais knockout transgênicos, como aquele resultante dos transgenes Cre e loxp nos animais parentais resultou na sugestão de que Pten regula negativamente a produção de células-tronco. Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001).

A via de sinalização Notch foi envolvida na carcinogênese de muitos cânceres, incluindo doença de Hodgkin, Iinfoma de célula T e câncer de mama, cervical, pancreático e de cólon. 40-44 Jundt, F. et al., Blood 99:3398- 403 (2002); Pear1 W.S. et al., J. Exp. Med. 183: 2283-91 (1996); Weijzen S., et al., Nat. Med. 8: 979-86 (2002); Weijzen et al., J. Cell Physiol. 194: 356-62 (2003); Miyamoto7 Y., et al., CancerCeII 3: 565-76 (2003); Nickoloff, BJ. et al., Oncogene 22: 6598-608 (2003). A família de receptores notch consiste de proteínas de transmembrana intimamente envolvidas na determinação do destino celular. Dependendo do tipo celular, a sinalização notch pode influenciar a proliferação, diferenciação e apoptose, positivamente ou negativamente, Artavanis-Tsakonas, S. et al., Science 284: 770-6 (1999); Weijzen et al., J. Cell Physiol. 181·' 393-409 (1999). Até hoje, quatro receptores notch foram identificados em humanos (isto é, notch 1-4) com cinco Iigantes correspondentes, incluindo similar a delta 1 (dll-1), similar a delta 3 (dll-3), similar a delta 4 (dll-4), jagged-1 e jagged-2. A via notch interage e se sobrepões a outras vias de câncer críticas, como hedgehog (Hallahan et al., CancerRes. 64: 7794-7800 (2004) e Ras. Fitzgerald, K. et al., Oncogene 19: 4191-8 (2000); Ruiz-Hidalgo, R.J. et al., J. Oncoi 14: 777-83 (1999). No entanto, o papel de notch nos cânceres parece ser complexo, baseado em fatores como tipo de tecido. Enquanto a atividade de notch-1 é necessária para manter um fenótipo canceroso em células humanas transformadas por ras (Weijzen, S. et al., Nat. Med. 8: 979-86 (2002), descobriu-se que a sinalização de notch-1 tem um efeito supressivo em tumores de pele de murino e células de câncer de pulmão não pequenas. Nicolas et al., Nat. Genet. 33: 416-21 (2003Sriuranpong, V. et al., Câncer Res. 61: 3200-5 (2001). As descobertas sugerem um papel variável para sinalização notch em câncer.

A sinalização Notch tanto inibe diferenciação como promove proliferação no desenvolvimento do cerebelo. Solecki1 DJ. et al., Neuron 31: 557-68 (2001). Além disso, a sinalização notch foi especificamente associada com gliomas. Especificamente, a expressão dos ligantes notch similares a delta-1 e jagged-1 e receptor notch-1 é aumentada tanto em linhagens celulares de glioma como tumores gliomas humanos, e sua infra-regulação induziu apoptose e inibiu proliferação em linhagens celulares de glioma múltiplos e prolongou a sobrevida em modelos animais. Purow et al., Câncer Res. 65(6): 2353-2363 (2005).

No entanto, o papel da sinalização notch em tumorgênese pode variar. Por exemplo, foi observado que a atividade de Notch-1 inibe a proliferação de células de meduloblastoma, enquanto que a atividade de Notch- 2 promove seu crescimento. Fan et al., Câncer Res. 64: 7787-7793 (2004). Ainda para complicar nosso entendimento da via de sinalização notch, foi recentemente sugerido que o Iigante notch Dl 13 está associado com a inativação de notch. Ladi et al., J. Cell Biol. 170: 983-992 (2005). Dessa forma, atualmente, o entendimento do papel de notch na tumorgênese é na melhor das hipóteses incompleto.

Enquanto o perfil de expressão gênica, como aquele fornecido por análise de microarranjo pode identificar um painel de expressão gênica em gliomas que é preditivo de sobrevida, nenhuma análise até agora já identificou expressão gênica individual como sendo indicadora efetiva de prognóstico de sobrevida. Por exemplo, em uma análise de microarranjo de estágio III e IV do tecido removido do tumor tipo glioma de 74 pacientes, identificaram 595 genes expressos de maneira diferente associados com sobrevida. Freije et al., Câncer Res. 64: 6503-6510 (2004). Deste grupo, foram identificados 44 genes expressos de maneira mais forte e mais consistente. Este grupo foi também reduzido para 16 genes individuais, que foram também avaliados por transcrição reversa por PCR. Modelagem adicional identificou aumento de expressão do Iigante DLL3 notch como um dos 6 genes associados com aumento de sobrevida. No entanto, enquanto este estudo demonstrou valor para prognóstico e diagnóstico do perfil genético resultante da análise de microarranjo, não resultou na identificação de qualquer um dos genes individuais como tendo valor para prognóstico.

A Depositante identifica no presente pedido três (3) novas subclasses de glioma e mostram estar associadas de forma diferente com a ativação das vias de sinalização akt e Notch (ProlifMes). Uma classe de tumor, que exibe marcadores de linhagem neural ou proneural (PN) e elementos da via Notch, mostram média de sobrevida mais longa. Ao contrário, as duas classes remanescentes (2) de tumor, caracterizadas por marcadores de proliferação ou de mesênquima, estão associadas com sobrevida mais curta.

A Depositante também identifica no presente pedido um modelo de gene duplo, e revela que a expressão mais alta, tanto de PTEN como de DLL3 tem correlação com a sobrevida mais longa, demonstrando o impacto das vias de sinalização Akt e Notch na agressividade do tumor. Além disso, sob recorrência da doença, alguns tumores que originalmente apresentaram fenótipos proneural ou proliferativo mudaram para classe mesenquimal, sugerindo com isso que estes grupos molecularmente definidos podem respresentar estados ou estágios de diferenciação alternados de progressão do tumor. Este modelo de gene duplo é diferente do valor preditivo divulgado em Freije et al., porque a valor para prognóstico de DLL3 mais PTEN em um modelo de gene duplo de sobrevida, mostrou ser estatisticamente significante em dois conjuntos de dados independentes. BMP2 é um marcador identificado por Freije et al. como um marcador da mesma subclasse de tumor como DLL3. Quando BMP2 é substituído por DLL3 no modelo de gene duplo, falha em reproduzir as descobertas vistas com DLL3.

A Depositante também descobriu que o estado de ativação da via Notch ou Akt é um determinante principal de agressividade de tumor e pode predizer resposta às terapias-alvo.

Finalmente, a Depositante identificou que o prognóstico desfavorável de tumores são caracterizados por marcadores de célula-tronco neurais e via de sinalização Akt e angiogênese ou proliferação. A via de sinalização Notch e marcadores de precursores neuronais comprometidos caracterizam melhor prognóstico de tumores. O cérebro normal tem pouca proliferação, angiogênese ou sinalização Notch e Akt, mas é caracterizado pela alta expressão de marcadores neuronais. O prognóstico favorável de tumores PN pode mostrar manchas de células com prognóstico desfavorável de marcadores de Mes e tumores PN podem retornar com fenótipo Mes1 sugerindo dessa forma que tumores de prognóstico desfavorável podem ser convertidos em melhores prognósticos de tumores similares a PN pelo bloqueio dos processos biológicos apropriados, como sinalização Akt1 angiogênese ou proliferação. Estas descobertas sugerem que o bloqueio de sinalização Akt1 angiogênese ou proliferação em combinação com bloqueio de sinalização Notch ou outros tratamentos que induzem diferenciação neuronal podem retardar o crescimento de tumores glioma. Descrição Resumida Da Invenção

A presente invenção em geral estabelece um método de monitoramento, diagnóstico, prognóstico e tratamento de glioma. Em uma realização, a invenção estabelece três (3) subclasses prognósticas de glioma, as quais estão diferentemente associadas com a ativação das vias de sinalização akt e Notch. A classe de tumor, que exibe marcadores de linhagem neural ou proneural (PN) e elementos da via Notch, mostram média de sobrevida do paciente mais longa. Ao contrário, os marcadores de proliferação (Prolif) ou de mesênquima (Mes), estão associadas com sobrevida mais curta. Em outra realização, a invenção estabelece um modelo de gene duplo de glioma, em que níveis de expressão relativamente altos tanto para PTEN como DLL3 são indicativos de sobrevida alongada e uma baixa expressão de PTEN (sem levar em consideração DLL3) é indicativo de sobrevida reduzida.

Em outra realização, a presente invenção estabelece um método de tratamento de glioma que compreende: (i) medir a expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em uma amostra de tumor, (ii) determinar a subclassificação da assinatura de expressão do conjunto proneural (PN), proliferativo (Prolity ou mesenquimal (Mes), em que: (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolifelou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada com quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PN e/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) agente anti-mitótico, e (5) antagonista de Mes e/ou agente anti-angiogênico. Em um aspecto específico, o antagonista de Akt é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de domínio regulatório ou catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR, e ativadores, estimuladores ou restauradores de PTEN, INPP5D ou INPPL1. Em um aspecto específico, o antagonista de Prolif é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Prolif indicados na Tabela A. Em um aspecto específico adicional, o agente anti-mitótico é selecionado do grupo que consiste de: temozolamida, BCNU1 CCNU1 lomustina, gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides. Ainda em um aspecto específico, o antagonista de Mes é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Mes indicados na Tabela A.

Em um aspecto específico adicional, o agente anti-angiogênico é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas do VEGF, antagonistas do anticorpo anti-VEGF, VEGFR1 e VEGFR2. Ainda em um aspecto adicional, o antagonista de PN é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de PN indicados na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog, Oligl, Olig2, THR e ASCL1. Em um aspecto específico adicional, o agente de diferenciação neural é selecionado do grupo que consiste de: MAP2, beta-tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF1 NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, OLIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de molécula pequena de nicastrina, AphIA, AphIB, Psenl, Psen2 e PSENEN, antagonista de delta similar ao ligante (DII)-1, similar ao ligante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb.

Em outra realização, a presente invenção estabelece um método para tratamento de glioma que compreende contatar quantidades efetivas de um (1) agente de diferenciação neural em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) agente anti-mitótico, e (5) antagonista de Mes e/ou agente anti-angiogênico. Em um aspecto específico, o antagonista de Akt é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de domínio regulatório ou catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK1 EGFR1 IGFR1 e ativadores, estimuladores ou restauradores de PTEN1 INPP5D ou INPPL1. Em um aspecto específico, o antagonista de Prolif é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Prolif indicados na Tabela A. Em um aspecto específico adicional, o agente anti-mitótico é selecionado do grupo que consiste de: temozolamida, BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides. Ainda em um aspecto específico, o antagonista de Mes é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Mes indicados na Tabela A. Em um aspecto específico adicional, o agente anti-angiogênico é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas do VEGF, antagonistas do anticorpo anti-VEGF, VEGFR1 e VEGFR2. Ainda em um aspecto adicional, o antagonista de PN é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de PN indicados na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog1 Oligl, 0lig2, THR e ASCL1 Em um aspecto específico adicional, o agente de diferenciação neural é selecionado do grupo que consiste de: MAP2, beta-tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF1 NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, 0LIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de nicastrina de molécula pequena , AphIA1 AphlB, Psenl, Psen2 e PSENEN1 antagonista de delta similar ao Iigante (DII)-I1 similar ao Iigante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb.

Em outra realização, a presente invenção fornece um método de prognóstico e/ou diagnóstico de glioma que compreende (i) medir a expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em uma amostra de tumor, (ii) determinar a subclassificação da assinatura de expressão no conjunto proneural (ΡΛ/). proliferativo (Pro//7) ou mesenquimal (Mes), seguido por (iii) prognóstico ou diagnóstico do resultado da doença, em que uma subclassificação de Prolif ou Mes é indicativa de um prognóstico mais desfavorável ou chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida menor do que a média da amostra da população de referência e uma subclassificação de PN é indicativa de um prognóstico favorável ou chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida maior do que amostra da população de referência. Em um aspecto específico, a subclassificação é realizada usando-se agrupamentos hierárquicos. Em um aspecto específico, a subclassificação é realizada usando-se agrupamento k-médias. Ainda em outro aspecto específico, a subclassificação é realizada usando-se um esquema de votação. Ainda em um aspecto específico adicional, a subclassificação é realizada por uma comparação de GDMs no tumor para GDMs em um conjunto de referência de tumores.

Ainda em uma realização adicional, a invenção estabelece um método de monitoramento ou diagnóstico que compreende comparar a assinatura de expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em pelo menos duas amostras de tumor de um paciente:

(i) medir a expressão de GDM em uma primeira amostra de tumor em um primeiro ponto no tempo;

(ii) medir a expressão de GDM em uma segunda amostra de tumor em um segundo ponto no tempo posterior;

(iii) determinar a subclassificação morfológica da assinatura de expressão do GDM como proneural (PN)1 proliferativa (ProHf) ou mesenquimática (Mes), nas amostras de tumor;

em que uma transição da subclassificação PN para Prolif para Mes da primeira para a segunda amostra de tumor é indicativa do aumento de severidade ou progressão de dito tumor.

Em outra realização, a presente invenção estabelece um método de inibição de crescimento de tumores glioma que compreende: (i) medir a expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em uma amostra de tumor, (ii) determinar a subclassificação da assinatura de expressão do conjunto proneural (PN), proliferativo (ΡΓοΙΐή ou mesenquimal (Mes), em que: (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolife/ou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada com quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PNe/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) um agente anti-mitótico, e (5) um antagonista de Mes e/ou agente anti-angiogênico; em que o resultado é o tamanho ou crescimento reduzido do tumor. Em um aspecto específico, o antagonista de Akt é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de domínio regulatório ou catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR1 e ativadores, estimuladores ou restauradores de PTEN1 INPP5D ou INPPL1. Em um aspecto específico, o antagonista de Prolif é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Prolif indicados na Tabela A. Em um aspecto específico adicional, o agente anti-mitótico é selecionado do grupo que consiste de: temozolamida, BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides. Ainda em um aspecto específico, o antagonista de Mes é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Mes indicados na Tabela A. Em um aspecto específico adicional, o agente anti-angiogênico é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas do VEGF1 antagonistas do anticorpo anti-VEGF, VEGFR1 e VEGFR2. Ainda em um aspecto adicional, o antagonista de PN é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de PN indicados na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog, Oligl, Olig2, THR e ASCL1 Em um aspecto específico adicional, o agente de diferenciação neural é selecionado do grupo que consiste de: MAP2, beta-tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF, NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, OLIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de nicastrina de molécula pequena , AphIA1 AphIB1 Psenl1 Psen2 e PSENEN1 antagonista de delta similar ao ligante (DII)-I1 similar ao ligante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb. Em um aspecto específico, o resultado de tal contato é a proliferação diminuída ou morte da célula tumoral. Em outro aspecto, o antagonista é um anticorpo ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno. Ainda em outro aspecto específico, o anticorpo antagonista é um anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de cadeia única. Ainda em um aspecto específico adicional, o anticorpo antagonista ou fragmento de anticorpo de ligação de antígeno é conjugado a um agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinoide ou caliqueamicina, uma auristatina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares.

Em outra realização, a presente invenção estabelece um método para tratar terapeuticamente um mamífero que tem um tumor do tipo glioma, em que o método compreende: (i) medir a expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em uma amostra de tumor, (ii) determinar a subclassificação da assinatura de expressão do conjunto proneural (PN), proliferativo (Prolif) ou mesenquimal (Mes), em que: (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende administrar ao mamífero quantidades terapeuticamente efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolif e/ou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PN e/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) um agente anti-mitótico, e (5) um antagonista de Mes e/ou agente anti- angiogênico; em que o resultado é o tratamento terapêutico do tumor. Em um aspecto específico, o antagonista é um anticorpo, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um oligopeptídeo, um antagonista de molécula pequena, ou um oligonucleotídeo antisense. Em outro aspecto específico, o anticorpo é um anticorpo monoclonal, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo de cadeia única.

Ainda em outro aspecto, os antagonistas ou agentes adequados para uso com os presentes métodos, podem opcionalmente ser conjugados a um agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico tal como uma toxina, incluindo, por exemplo, um maitansinoide ou caliqueamicina, um antibiótico, um isótopo radioativo, uma enzima nucleolítica ou similares.

Ainda em uma realização adicional, a presente invenção é dirigida a um método de determinação do nível de expressão de um GDM de PN, Prolif ou Mes em uma amostra, em que o método compreende expor a amostra aos agentes de ligação de PN1 Prolif ou Mes e determinar a quantidade de ligação de cada respectivo agente de ligação na amostra, em que tal quantidade de ligação é indicativa no nível de expressão do respectivo GDM de PN1 Prolifou Mes na amostra. Em um aspecto específico, o agente de ligação de PN, Prolif ou Mes é (1) um anticorpo anti-PN, -anti-Pro///ou anti-Mes, (2) um fragmento de anticorpo de ligação PN, Prolifou Mes, (3) um oligopeptídeo de ligação PN, Prolif ou Mes, (4) um antagonista de molécula pequena de PN, Prolif ou Mes, ou (5) um oligonucleotídeo antisense de PN, Prolif ou Mes. Em outro aspecto específico, os anticorpos anteriores são: (a) um anticorpo monoclonal, (b) um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, (c) um anticorpo quimérico, (d) um anticorpo humanizado, ou (e) um anticorpo de cadeia única. Ainda em outro aspecto específico, tais anticorpos são marcados de maneira detectável com uma molécula de composto que é útil para determinar qualitativamente e/ou quantitativamente a localização e/ou quantidade de ligação do GDM de PN, Prolifou Mes.

Ainda em uma realização adicional da presente invenção é dirigida a um método de prognóstico da probabilidade de sobrevida em um mamífero que tem um tumor do tipo glioma, em que o método compreende (a) remover uma amostra de teste do tumor, (b) medir o nível de expressão do produto do gene PTEN e DLL3 na amostra de teste e em um conjunto de não menos do que trinta (30) gliomas de alto grau para cada tempo de sobrevida do paciente conhecido, em que um nível de expressão mais alto tanto de PTEN como DLL3 da amostra de teste é indicativo de uma chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida maior do que da média da amostra da população de referência e um nível de expressão mais baixo tanto de PTEN como DLL3 na amostra de teste é indicativo de uma chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida menor do que da média da amostra da população de referência.

Ainda uma realização adicional da presente invenção é dirigida a um método de diagnóstico da severidade de um tumor do tipo glioma em um mamífero, em que o método compreende: (a) contatar uma amostra de teste que compreende célula de tumor do tipo glioma ou extratos de DNA, RNA, proteína ou outros produtos do gene obtidos a partir do mamífero com (i) um primeiro reagente que é um anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se liga a PTEN GDM e (ii) um segundo reagente que é um anticorpo, fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se liga a DLL3 GDM; (b) medir a quantidade de formação de complexo entre o primeiro e o segundo reagente com PTEN GDM e DLL3 GDM na amostra de teste, respectivamente, em que a formação de um nível alto de formação de complexo PTEN GDM e nível alto de formação de complexo DLL3 GDM é indicativo de um tumor brando e a formação de um nível baixo tanto do complexo PTEN GDM como DLL3 GDM é indicativo de tumor severo. Em um aspecto específico, o primeiro e/ou segundo reagentes são marcados de forma detectável, unidos a um suporte sólido ou simiilar. Em um outro aspecto específico, o primeiro reagente é um anticorpo anti-PTEN, fragmento de anticorpo de ligação PTEN, ou oligopeptídeo de ligação PTEN, molécula pequena, oligonucleotídeo antisense. Ainda em outro aspecto específico, o segundo reagente pode ser um anticorpo anti-DLL3, fragmento de anticorpo de ligação DLL3, ou oligopeptídeo de ligação DLL3, molécula pequena, oligonucleotídeo antisense. Ainda em um aspecto específico adicional, o anticorpo anti-PTEN ou anticorpo anti-DLL3 pode ser um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de cadeia única. Ainda em outro aspecto específico, tais anticorpos são marcados com uma molécula ou composto que é útil para determinar qualitativamente e/ou quantitativamente a localização e/ou quantidade de ligação do agente de ligação de PTEN ou DLL3 à célula.

Ainda em uma realização adicional, a invenção é dirigida ao uso de: (a) PTEN, ou polipeptídeo DLL3, ou (b) um ácido nucléico codificador (a), na preparação de um medicamento útil para a detecção do diagnóstico de um tumor do tipo glioma. Em um aspecto específico, o medicamento pode ser um agente de ligação de PTEN ou um agente de ligação de DLL3. Em outro aspecto específico, o agente de ligação de PTEN pode ser um anticorpo anti- PTEN, fragmento de anticorpo de ligação de PTEN, ou oligopeptídeo de ligação de PTEN, antagonista de molécula pequena, oligonucleotídeo antisense, enquanto que o agente de ligação de DLL3 pode ser um anticorpo anti-DLL3, fragmento de anticorpo de ligação DLL3, ou oligopeptídeo de ligação de DLL3, molécula pequena, oligonucleotídeo antisense. Ainda em outro aspecto específico, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de cadeia única. Ainda em outro aspecto específico, tais agentes de ligação de PTEN ou DLL3 são marcados com uma molécula ou composto que é útil para determinar qualitativamente e/ou quantitativamente a localização e/ou quantidade de ligação do agente de ligação de PTEN ou DLL3 à célula.

Ainda em uma realização adicional, a invenção é dirigida ao uso de: (a) GDM de PN, Prolifou Mes, ou (b) um ácido nucléico codificador (a), na preparação de um medicamento útil para a detecção do diagnóstico de um tumor do tipo glioma. Em um aspecto específico, o medicamento pode ser um agente de ligação de PN, Prolif ou Mes. Em um aspecto específico, o agente de ligação de PN, Prolifou Mes pode ser: (1) um anticorpo anti-PN1 anti-Prolif ou anticorpo anti-Mes, (2) um fragmento de anticorpo de ligação de PN, Prolif ou Mes, (3) um oligopeptídeo de ligação de PN, Prolif ou Mes, (4) uma molécula pequena de ligação de PN, Prolifou Mes, ou (5) um oligonucleotídeo antisense de PN, Prolifou Mes. Em ainda outro aspecto específico, o anticorpo anti-PN-, anti-Prolif- ou anti-Mes pode ser um anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de cadeia única. Ainda em outro aspecto específico adicional, tais agentes de ligação de PN Prolif ou Mes são marcados com uma molécula ou composto que é útil para determinar qualitativamente e/ou quantitativamente a localização e/ou quantidade de ligação do agente de ligação de PN, Prolifou Mes à célula. Breve Descrição Das Figuras

Figura 1. Revela o perfil de expressão de três padrões principais de expressão gênica relacionada à sobrevida em glioma de alto grau Figs. 1A- 1 e 1A-2. Agrupamento sem supervisão de astrocitomas 76 MDA de grau Ill & IV primário pela expressão dos 108 genes correlacionados positivamente ou negativamente com a sobrevida (grupos de genes marcados positivo ou negativo) três grupos de amostra (apontados com retângulos abertos na parte superior da figura). Figs. 1B-1 e 1B-2. Subconjuntos de tumor PN, Prolife Mes (como indicado) das mesmas 76 amostras são identificados usando-se 35 genes de assinaturas. Centróides de agrupamento k-médias estão descritos usando-se valores de expressão de gene normalizado por pontuação ζ (escala de -1 a +1). Fig. 1B-2. Plots de sobrevida Kaplan-Meier de dados de amostra de populações de MDA1 UCSF, e UCLA . valores ρ de testes de posição em log descritos. Linhas preta, cinza e pontilhada corresponde à subclasse PN, Prolife Mes respectivamente. Marcas verticais indicam observações de sobrevida checadas. F. & G. Forte expressão de marcadores PN e Mes é mutuamente exclusiva. Cada barra descreve determinações de mRNA por microarranjo (F) ou PCR em tempo real Taqman (G)1 de quatro genes marcadores em uma amostra individual. Genes incluem BCAN, DLL3, CHI3I1/YKL40 (YKL40) e CD44, como indicado. Valores apresentados representam pontuação Z para expressão gênica de amostras individuais relativas ao conjunto completo de amostras. H. Hibridização in situ de BCAN e CHI3L1/YKL40 (YKL40) no centro do microarranjo de tecido de 5 casos de glioma. Setas indicam expressão de CHI3L1/YKL40 focai em centros positivos BCAN.

Figure 2. A maioria dos gliomas de alto grau é caracterizada pela forte similaridade a um ou três padrões de assinatura de expressão do gene e as mudanças de subclasses sob progressão da doença são em direção ao fenótipo Mes. Α-C. Três representações gráficas tridimensionais em que a posição ocupada por cada ponto representa a similaridade (Spearman r) entre uma amostra individual e cada um dos três centróides definidos por agrupamento k-médias do conjunto de amostra de referência (MDA). A. Perto de todos os tumores de grau III tanto de morfologia astrocítica (pontos pretos) como oligodendrogliais (branco) são mais similares ao centróide PN, enquanto que a população de tumores de grau IV (hachura cruzada) é mais uniformemente dividida pela similaridade para os centróides. B. Conjuntos diferentes de células ou tecidos se assemelham a cada um dos três centróides. Amostras são como segue: Cérebro fetal, cérebro adulto (cérebro), duas linhagens de célula-tronco neural derivadas de tecido fetal (NSC1, NSC2), Jurkat, células tronco hematopoiéticas (HSC), músculatura lisa (SmoMusc), células endoteliais (endothel), líquido sinovial (synov), e osso. Linhagens de célula tronco neural tratadas pela exposição à remoção do fator de crescimento BDNF são designadas NSC1* & NSC2*. C. 26 pares de astrocitomas primários compatíveis e astrocitomas recorrentes (cinza = grau IV, preto = grau III) estão representados. Cada par de espécimes compatíveis é conectado por uma seta que é uniforme e em negrito para exemplos de mudança de classe de assinatura. D. Genes significativamente supra-regulados nos casos de mudança da subclasse Mes sob recorrência. FC= troca de vezes E. IHC de CHI3L1/YKL40 e OLIG2 nos tumores primários compatíveis e recorrentes de um caso que passa por mudança do fenótipo PN para Mes.

Figura 3. Subclasses de tumor são diferenciadas pela expressão de marcadores para proliferação, angiogênese e neurogênese. Α-E. círculos abertos = cérebro, círculos em cinza ou barras abertas = PN, triângulos pretos ou barras com hachura cruzada = Prolif., quadrados abertos ou barras uniformes = Mes. Fig 3A. Tumores Prolif são aprimorados para expressão de PCNA e TOP2A, p< 1 x 10"6 por comparação com todos os outros grupos. Fig. 3B. Tumores Mes são diferenciados pelo aumento de expressão de PECAM, VEGF, VEGFR1 e VEGFR2, ρ <.05 por comparação com todos os outros grupos. Figs. 3C1-6 & Figs. 3D1-6. Relativo a tumores PN, Prolif e/ou tumores Mes mostram forte expressão de tronco neural e transmitem amplificação de marcadores VIM1 NES1 TLX1 CD133, MELK e DLX2 (C1-6) e expressão mais fraca dos marcadores neuroblasto e neural OLIG2, MAP2, DCX1 NeuN1 ERBB4 e GAD2 (D1-6). Estrelas indicam diferenças significantes de PN (p <.05 Bonferroni após o fato ANOVA). Fig. 3E. Expressão de GFAP é significativamente diminuída em tumores Prolif relativo tanto a tumores PN como MES.

Figura 4. Alterações no número de cópias no cromossomo 7, 10 e 19 diferem nas subclasses de tumor e estas diferenças são refletidas nas assinaturas de expressão.

A. Freqüências das alterações do número de cópias dos cromossomos 10, 7 e 19q como uma função da subclasse da assinatura do tumor. Para o cromossomo 10, são relatados tumores exibindo tanto nenhuma perda, perda confinada a 10q que inclui o locus PTEN, como essencialmente perda de todos os loci. Para o cromossomo 7, os casos são classificados como nenhum ganho, ganhos das porções do chr 7, ou ganho de todos os loci. Para o cromossomo 19q, os casos são classificados como ganhos ou perdas se acima da metade dos loci mostrarem alterações no número de cópias. B O número de conjuntos de listas de marcadores de tumor em PN, Prolif ou Mes (como marcado) comparado a todos os subconjuntos U133 A&B plotados como uma função da localização no cromossomo.

Figure 5. Tumores Prolif e Mes exibem ativações diferentes de cascatas de sinalização em Akt e Notch. Tumores PN, Prolife Mes denotados por (i) círculos abertos ou barras abertas, (ii) triângulos pretos ou barras uniformes e (iii) quadrados abertos ou barras abertas, respectivamente. (A.) perda de PTEN e (B.) amplificação de EGFR são associadas negativamente com a assinatura de PN, enquanto (C.) ganho do Iocus PIK3R3 é positivamente associado com assinatura de ProHf. A-C Para cada amostra, o eixo χ exibe a razão CGH log2 que denota ganhos ou perdas no locus da amostra, enquanto o eixo y indica correlação tanto ao centróide PN como Prolif, como indicado, valores r indicam coeficientes de correlação de Pearson e Spearman entre razões CGH e as similaridades centróides de assinatura de expressão. D. Níveis de mRNA de PTEN normalizados ou mais baixo em subtipos de tumor de prognóstico desfavorável comparado à subclassse de tumor PN. Linhas horizontais denotam médias de grupos. E.-H. Tumores PN mostram forte superexpressão de elementos da via Notch DLL3, DLL1, HEY2 e ASCL1. I. & J. Subclasses de tumor diferem na coloração para p-Akt e Notch nuclear. Para cada subtipo de tumor, a fração das amostras classificadas como O, 1, ou 2 para p-Akt (I) ou imunohistoquímica nuclear de Notch (J) está descrita. Subtipos PN, Proli, e Mes estão indicados por gráficos de três barras, respectivamente.

Figura 6. Expressão de PTEN e DLL3 prevê sobrevida do astrocitoma de alto grau em dois conjuntos de amostra independentes (A & B). Plots nos painéis esquerdo e direito descrevem funções de sobrevida estimadas de cada amostra dé população (n= 76 para A, n=34 para B) como modelo para a ocorrência da expressão de nos 20° e 80° percentis (%-il), respectivamente. Linhas uniformes e abertas mostram sobrevida estimada para amostras com expressão de DLL3 no 20° e 80° percentil de expressão, respectivamente.

Figura 7. Assinatura de expressão de linhagens celulares de glioma predizem crescimento de neuroesfera independente de EGF/FGF. A. Exemplos de culturas de neuroesfera derivadas de 5 linhagens celulares e mantidas na presença ou ausência de EGF+FGF. Exemplos de linhagens classificadas de 0 a 4 (como indicado) para crescimento na ausência de EGF+FGF 4. B. Classificações do crescimento de neuroesfera para 16 linhagens celulares como uma função da correlação da assinatura de expressão para os centróides Mes ou Prolif.

Figura 8. Resumo dos subtipos de tumor (A) características principais dos subtipos de tumor e (B) modelo que descreve comparação entre os subtipos de tumor e estágios na neurogênese.

Descrição Detalhada Da Invenção

I. Definições

O termo "glioma" refere-se a um tumor que surge a partir das células gliais ou de suas precursoras do cérebro e da medula espinhal. Gliomas são histologicamente definidos baseados primeiramente na exibição da morfologia astrocítica ou oligodendroglial, e são classificados pela celularidade, atipia nuclear, necrose, figuras mitóticas e proliferação microvascular - todas as características associadas com comportamento biologicamente agressivo. Astricitomas são principalmente de dois tipos - alto grau e baixo grau. Tumores de alto grau crescem rapidamente, são bem vascularizados e podem se espalhar facilmente pelo cérebro. Astrocitomas de baixo grau são usualmente localizados e crescem lentamente por um longo período de tempo. Tumores de alto grau são muito mais agressivos, exigem terapia muito intensa, e estão associados com tempo de sobrevida mais curtos do que tumores de baixo grau. A maioria dos tumores astrocíticos em crianças são de baixo grau, enquanto que na maioria dos adultos são de alto grau. Estes tumores podem ocorrer em qualquer Iugardo cérebro e da medula espinhal. Alguns dos astrocitomas de baixo grau mais comuns são: Astrocitoma Pilocítico Juvenil (JPA), Xantroastrocitoma Pleomórfico Astrocitoma Fibrilar (PXA) e Tumor Neuroepitelial Desembrioplástico (DNET). Os dois astrocitomas de alto grau mais comuns são Astrocitoma Anaplástico (AA) e Glioblastoma Multiforme (GBM).

Os termos "marcador ou marcadores determinantes de glioma" ("GDM") como usados no presente pedido referem-se aos marcadores celulares que são comumente associados aos gliomas. Este termo engloba tanto o gene que codifica o marcador (por exemplo, DNA1 amplicação gênica) como também produtos do gene resultantes da transcrição deste (por exemplo, mRNA, polipeptídeos codificados). Marcadores GDM podem ser diferentes das subclassificações proneural (PN)1 proliferativo (ProIif) ou mesenquimático (Mes), como mostrado na Tabela A. TABELA A

<table>table see original document page 30</column></row><table> <table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table> <table>table see original document page 33</column></row><table> <table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> <table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table> <table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table> <table>table see original document page 47</column></row><table> <table>table see original document page 48</column></row><table> <table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table> <table>table see original document page 53</column></row><table> <table>table see original document page 54</column></row><table> Um "polipeptídeo GDM de seqüência nativa" compreende um polipeptídeo que tem a mesma seqüência de aminoácido daquela do correspondente polipeptídeo GDM derivado da natureza. Tais polipeptídeos GDM de seqüência nativa podem ser isolado da natureza ou podem ser produzidos por meios recombinantes ou sintéticos. O termo "polipeptídeo GDM de seqüência nativa" especificamente engloba formas incompletas ou secretadas do polipeptídeo GDM específico que ocorrem naturalmente (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes que ocorrem nauralmente (por exemplo, formas unidas alternativamente) e variantes alélicas do polipeptídeo que ocorrem naturalmente. Em certas realizações da invenção, os polipeptídeos GDM de seqüência nativa divulgados no presente pedido são polipeptídios de seqüência nativa de comprimento total ou maduros, que correspondem aos polipeptídeos citados na Tabela A.

"Polipeptídeo GDM variante" significa um polipeptídeo GDM1 preferivelmente formas ativas deste, como definido no presente pedido, que tem pelo menos aproximadamente 80% de identidade de seqüência de aminoácido em relação a uma seqüência nativa de comprimento total da seqüência do polipeptídeo GDM como divulgado no presente pedido, e formas variantes deste desprovidas de peptídeo sinal, um domínio extracelular ou qualquer fragmento de um polipeptídeo GDM de seqüência nativa de comprimento total como esses referenciados no presente pedido. Tais variantes do polipeptídeo incluem, por exemplo, polipeptídeos em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados, ou deletados, no N- ou C- terminal de uma seqüência de aminoácido nativa de comprimento total. Em um aspecto específico, tais polipeptídeos variantes terão pelo menos aproximadamente 80% de identidade de seqüência de aminoácido, alternativamente pelo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência de aminoácido em relação a um polipeptídeo GDM de seqüência nativa de comprimento total, como divulgado no presente pedido, e formas variantes deste desprovidas de peptídeo sinal, um domínio extracelular ou qualquer fragmento de um polipeptídeo GDM de seqüência nativa de comprimento total como esses divulgados no presente pedido. Em um aspecto específico, tais polipeptídeos variantes terão variações em pelos menos aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 200, 250, 300 ou mais resíduos de aminoácidos no comprimento do polipeptídeo de seqüência nativa correspondente.

Alternativamente, tais polipeptídeos variantes terão não mais do que uma substituição conservativa de aminoácido quando comparado à seqüência do polipeptídeo nativo correspondente, alternativamente não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 substituições conservativas de aminoácido quando comparado à seqüência do polipeptídeo nativo correspondente.

"Porcentagem (%) de identidade de seqüência idêntica de aminoácido" com respeito às seqüências do polipeptídeo GDM identificadas no presente pedido é definido como a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma seqüência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácido na seqüência do polipeptídeo GDM específico, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de seqüência. Alinhamento para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de seqüência de aminoácido pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando-se programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Esses técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para medir o alinhamento, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o máximo alinhamento sobre o comprimento total das seqüências sendo comparadas. Para os propósitos no presente, valores de % de identidade de seqüência de aminoácido são gerados usando-se o programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2, em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de seqüência, ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech1 Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 foi depositado com documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos E.U.A, Washington, DC1 20559, registrado sob o Registro de Direitos Autorais No.TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de seqüência são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

"Polinucleotídeo GDM variante" ou "seqüência de ácido nucléico GDM variante" significa uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GDM, preferivelmente formas ativas deste, como definido no presente pedido, e que tem pelo menos aproximadamente 80% de identidade de seqüência de ácido nucléico em relação a uma seqüência de nucleotídeos que codifica uma seqüência do polipeptídeo GDM de seqüência nativa de comprimento total identificada no presente pedido, ou qualquer outro fragmento da respectiva seqüência do polipeptídeo GDM de comprimento total como identificada no presente pedido (tal como aquela codificada por um ácido nucléico que representa apenas uma porção da seqüência codificadora completa para um polipeptídeo GDM de comprimento total). De forma geral, tais polinucleotídeos variantes terão pelo menos aproximadamente 80% de identidade de seqüência de aminoácido, alternativamente pelo menos aproximadamente 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência de ácido nucléico em relação a uma seqüência de ácido nucléico que codifica a seqüência do polipeptídeo GDM de seqüência nativa de comprimento total respectiva ou qualquer outro fragmento da seqüência do polipeptídeo GDM de comprimento total respectivo, identificado no presente pedido. Tais polinucleotídeos variantes não englobam a seqüência de nucleotídeo nativa.

Em geral, tais polinucleotídeos variantes variam em pelo menos aproximadamente 50 nucleotídeos no comprimento do polipeptídeo de seqüência nativa, alternativamente a variação pode ser de pelo menos 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ou 1000 nucleotídeos no comprimento, em que neste contexto o termo aproximadamente significa o comprimento da seqüência de nucleotídeo referenciado mais ou menos 10% desse comprimento referenciado.

"Porcentagem (%) de identidade de seqüência de ácido nucléico" com respeito às seqüências de ácido nucléico que codificam o polipeptídeo GDM identificadas no presente pedido é definida como a porcentagem de nucleotídeos em uma seqüência candidata que são idênticos aos nucleotídeos na seqüência de interesse de ácido nucléico de GDM, respectivamente, após alinhamento das seqüências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar a porcentagem máxima de identidade de seqüência. Alinhamento para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de seqüência de ácido nucleico pode ser alcançado de várias maneiras que estão dentro da habilidade na técnica, por exemplo, usando-se programas de computador disponíveis publicamente tais como os programas BLAST, BLAST- 2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Para os propósitos no presente, valores de % de identidade de seqüência de ácido nucleico são gerados usando-se o programa de computador de comparação de seqüência ALIGN-2 em que o código fonte completo para o programa ALIGN-2 é fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa de computador de comparação de seqüência, ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte mostrado na Tabela 1 foi depositado com documentação de usuário no Escritório de Direitos Autorais dos E.U.A, Washington, DC, 20559, registrado sob o Registro de Direitos Autorais No.TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível através da Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia ou pode ser compilado a partir do código fonte fornecido na Tabela 1 abaixo. O programa ALIGN-2 deveria ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, preferivelmente UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de seqüência são estabelecidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

Nas situações onde o ALIGN-2 é empregado para comparações de seqüência de ácido nucleico, a % de identidade de seqüência de ácido nucleico de uma dada seqüência de ácido nucléico C em relação ou em oposição a uma dada seqüência de ácido nucléico D (que pode alternativamente ser formulada como uma dada seqüência de ácido nucléico C que tem ou compreende certa % de identidade de seqüência de aminoácido em relação ou em oposição a uma dada seqüência de ácido nucléico D) é calculada como segue:

100 vezes a fração W/Z

onde W é o número de nucleotídeos conseguidos como partidas idênticas pelo programa de alinhamento de seqüência ALIGN-2 nesse alinhamento do programa de C e D1 e onde Z é o número total de nucleotídeos em D. Será apreciado que onde o comprimento da seqüência de ácido nucléico C não é igual ao comprimento da seqüência de ácido nucléico D1 a % de identidade de seqüência de ácido nucléico de C para D não seja igual a % de identidade de seqüência de ácido nucléico de D para C. Como exemplos de cálculos de % de identidade de seqüência de ácido nucléico, as Tabelas 4 e 5 demonstram como calcular a % de identidade de seqüência de ácido nucléico designada Comparação de DNA em relação a seqüência de ácido nucléico designada REF-DNA, em que "REF-DNA" representa uma seqüência hipotética de interesse de ácido nucléico que codifica GDM1 "Comparação de DNA" representa a seqüência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucléico em oposição à qual a molécula de ácido nucléico "REF-DNA" de interesse está sendo comparada, e "N", "L" e "V" cada um representando diferentes nucleotídeos hipotéticos. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de seqüência de aminoácido usados no presente são obtidos como descrito no parágrafo imediatamente anterior usando-se o programa de computador ALIGN-2.

Em outras realizações, polinucleotídeos variantes GDM são moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos GDM, e que são capazes de hibridizar, preferivelmente sob hidridização e condições de lavagem estringentes, com seqüências de nucleotídeo que codificam um polipeptídeo GDM de comprimento total, como divulgado no presente pedido. Tais polipeptídeos variantes podem ser esses que são codificados por tais polinucleotídeos variantes.

"Isolado", quando usado para descrever vários polipeptídeos GDM divulgados no presente pedido, significa poplipeptídeo que foi identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu meio natural. Componentes contaminantes de seu meio natural são materiais que poderiam tipicamente interferir no diagnóstico ou usos terapêuticos para o polipeptídeo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não- proteináceos. Em realizações preferidas, tais polipeptídeos serão purificados (1) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de seqüência de aminoácido N-terminal ou interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (2) para homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de não redução ou redução usando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silver stain. Tais polipeptídeos isolados incluem o polipeptídeo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do polipeptídeo GDM não esteja presente. De forma geral, no entanto, tais polipeptídeos isolados serão preparados por pelo menos uma etapa de purificação.

Um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo GDM "isolado" é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com que ela está geralmente associada à fonte natural do ácido nucléico que codifica o polipeptídeo. Qualquer uma das tais moléculas de ácido nucléico isolada é diferente na forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Qualquer uma de tais moléculas de ácido nucléico são então distintas da molécula de ácido nucléico que codifica o polipeptídeo como a que existe nas células naturais.

O termo "seqüências controle" refere-se à seqüências de DNA necessárias para a expressão de uma seqüência codificadora operacionalmente ligada em um organismo hospedeiro específico. As seqüências controle que são adequadas para procariontes, por exemplo, incluem um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossomo. Células eucariontes são conhecidas por utilizar promotores, sinais de poliadenilação, e enhancers.

Ácido nucléico está "operacionalmente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou líder secretório está operacionalmente ligado ao DNA para um polipeptídeo se este é expresso como uma pré-proteína que participa da secreção do polipeptídeo; um promotor ou enhancer está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se afeta a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo está operacionalmente ligado a uma seqüência codificadora se está posicionado de forma a facilitar a tradução. Geralmente, "operacionalmente ligado" significa que as seqüências de DNA sendo ligadas são adjacentes, e, no caso de um líder secretório, adjacentes e na fase de leitura. No entanto, enhancers não têm que ser adjacentes. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existem, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são usados de acordo com as práticas convencionais.

"Estringência" de reações de hibridização é facilmente determinada por um técnico no assunto, e geralmente é um cálculo empírico dependendo do comprimento da sonda, temperatura de lavagem e concentração de sal. Em geral, sondas mais longas exigem temperaturas mais altas para anelamento apropriado, enquanto que sondas mais curtas precisam de temperaturas mais baixas. A hibridização geralmente depende da habilidade do DNA denaturado anelar quando fitas complementares estão presentes em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto maior o grau de desejada homologia entre a sonda e seqüência hibridizável, maior a temperatura relativa que pode ser usada. Como resultado, conclui-se que temperaturas relativas mais altas tenderiam a fazer as condições da reação mais estringentes, enquanto temperaturas mais baixas, menos estringentes. Para detalhes adicionais e explicações de estringência de reações de hibridização, ver Ausubel et ai, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condições de estringência" ou "condições de alta estringência", como definido no presente, podem ser identificadas por aquelas que: (1) empregam baixa força iônica e alta temperatura para lavagem, por exemplo, 0,015 M de cloreto de sódio/0,0015 M de citrato de sódio/0.1% de dodecil sulfato de sódio a 50°C; (2) empregam durante a hibridização um agente denaturante, tal como formamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% albumina de soro bovino/0,1% de Ficoll/0,1% de polivinilpirrolidona/50mM de tampão fosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citrato de sódio a 42°C; ou (3) hibridização durante a noite em uma solução que emprega 50% de formamida, 5 χ SSC (0,75 M de NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8), 0,1% de pirofosfato de sódio, 5 χ solução de Denhardt, DNA de esperma de salmão sonicado (50 pg/ml), 0.1% de SDS, e 10% de sulfato de dextrano a 42°C, com uma lavagem de 10 minutos a 42°C em 0,2 χ SSC (cloreto de sódio/citrato de sódio) seguido por uma lavagem de alta estringência de 10 minutos consistindo de 0,1 χ SSC contendo EDTA a 55°C.

"Condições de estringência moderada" podem ser identificadas como descrito por Sambrook et ai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nova York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e inclui o uso de solução de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, força iônica e %SDS) menos estringente que aquela descrita acima. Um exemplo de condições de estringência moderadas é a incubação durante a noite a 37°C em uma solução que compreende: 20% de formamida, 5 χ SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5 χ solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, e 20 mg/ml de DNA de esperma de salmão cortado denaturado, seguido por lavagem dos filtros em 1 χ SSC a aproximadamente 37-50°C. O técnico no assunto irá reconhecer como ajustar temperatura, força iônica, etc., conforme necessário para acomodar fatores tais como comprimento da sonda e similares.

O termo "epitopo tag" quando usado no presente refere-se a um polipeptídeo quimérico que compreende um polipeptídio GDM ou agente de ligação GDM unido a um "polipeptídeo tag". O polipeptídeo tag possui resíduos suficientes para fornecer um epitopo em oposição ao qual um anticorpo pode ser feito, ainda é curto o bastante para que não interfira na atividade do polipeptídeo ao qual está unido. O polipeptídeo tag preferivelmente é também suficientemente único de forma que o anticorpo não interaja substancialmente com outros epitopos. Polipeptídeos tag adequados geralmente possuem pelo menos seis resíduos de aminoácidos e usualmente entre aproximadamente 8 e 50 resíduos de aminoácido (preferivelmente, entre aproximadamente 10 e 20 resíduos de aminoácido).

"Ativo" ou "atividade" para os propósitos no presente refere-se a forma(s) de um polipeptídeo GDM que retém uma atividade biológica e/ou imunológica do GDM de ocorrência natural ou nativo, em que atividade "biológica" refere-se a uma função biológica (tanto initória como estimulatória) causada por um GDM de ocorrência natural ou nativo exceto a habilidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um GDM de ocorrência natural ou nativo e uma atividade "imunológica" refere- se a habilidade para induzir a produção de um anticorpo contra um epitopo antigênico possuído por um GDM de ocorrência natural ou nativo. Um polipeptídeo GDM ativo, como usado no presente pedido, é um antígeno que é expresso de forma diferente, tanto por uma perspectiva qualitativa como quantitativa, em um tumor do tipo glioma, relativo à sua expressão no tecido similar que não é atingido pelo glioma.

O termo "antagonista" é usado no mais amplo senso, e inclui qualquer molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe, ou neutraliza uma atividade biológica de um polipeptídeo GDM nativo divulgado no presente pedido. Moléculas antagonistas adequadas incluem anticorpos antagonistas ou fragmentos de anticorpo, fragmentos ou seqüências de aminoácido variantes dos polipeptídeos GDM nativos, peptídios, oligonucleotídeos antisense, moléculas orgânicas pequenas, etc. Métodos para identificação de antagonistas de GDM podem compreender contatar um polipeptídeo GDM, incluindo uma célula que o expressa, com uma molécula candidata agonista ou antagonista e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o polipeptídeo GDM.

"Tratar" ou "tratamento" ou "alívio" refere-se tanto ao tratamento terapêutico e profilático como medidas preventivas, em que o objetivo é "prevenir ou desacelerar (diminuir) a progressão do glioma. "Prognóstico" refere-se a determinação ou predição do curso e conseqüências prováveis de um tumor do tipo glioma. "Diagnóstico" refere-se ao processo de identificação ou determinação das características diferenciadas de um tumor do tipo glioma. O processo de diagnóstico é algumas vezes expresso também como estágio ou classificação do tumor baseado na severidade ou progressão da doença.

Sujeitos com necessidade de tratamento, prognóstico ou diagnóstico incluem aqueles já com glioma, como também aqueles que tendem a ter o glioma ou aqueles em que o glioma deve ser prevenido. Um sujeito ou mamífero é sucessivamente "tratado" para um glioma que expressa polipeptídeo GDM se, de acordo com o método da presente invenção, após receber uma quantidade terapêutica de um antagonista de GDM (por exemplo, antagonista PN, Antagonista Prolif ou antagonista Mes), o paciente mostra redução observável e/ou mensurável, ou ausência de um ou mais dos seguintes: redução no número de células tumorais de glioma ou ausência de tais; redução no tamanho do tumor; inibição (isto é, redução até certo ponto e preferivelmente parada) de infiltração de células tumorais de glioma nos órgãos periféricos incluindo a dispersão do câncer no tecido mole e ossos; inibição (isto é, redução até certo ponto e preferivelmente parada) de metástases de tumor; inibição, até certo ponto, do crescimento do tumor; e/ou alívio até certo ponto de um ou mais dos sintomas associados com o câncer específico;

morbidez e mortalidade reduzidas, e aprimoramento nas questões de qualidade de vida. Até certo ponto tais antagonistas de GDM podem prevenir crescimento e/ou destruição de células cancerosas existentes, podendo ser citostática e/ou citotóxica. A redução destes sinais ou sintomas pode também ser sentida pelo paciente.

Os parâmetros acima para avaliação de tratamento bem sucedido e melhora na doença são facilmente mensuráveis por procedimentos de rotina conhecidos para um médico técnico no assunto. Para terapia de câncer, a eficácia pode ser medida, por exemplo, pela avaliação do tempo para progressão da doença (TTP) e/ou determinação da taxa de resposta (RR). As metástases podem ser determinadas por testes de estágio e teste para o nível de cálcio e outras enzimas para determinar a extensão de metástases. Tomografia computadorizada pode também ser realizada para observar a dispersão nas regiões externas da glia. A invenção descrita no presente pedido relaciona-se ao processo de prognóstico, diagnóstico e/ou tratamento que envolve a determinação e avaliação amplificação e expressão do GDM (por exemplo, PN, Prolif, Mes, Pten e DLL3).

"Mamífero" para os propósitos do tratamento, alívio dos sintomas ou diagnóstico do câncer refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos, de criação, de zoológico, esportes, ou animais de estimação, tais como cachorros, gatos, gado, cavalos, ovelhas, porcos, cabras, coelhos, etc. Prefererivelmente, o mamífero é humano.

Administração "em combinação com" um ou mais agentes terapêuticos adicionais inclui simultânea (concorrente) e administração consecutiva, em qualquer ordem.

"Veículos" como usados no presente incluem veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes que sejam atóxicos para a célula ou mamífero sendo exposto a estas dosagens e concentrações empregadas. Freqüentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução aquosa tamponada em pH. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico; polipeptídeo de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; álcool de açúcares, tal como manitol ou sorbitol; contra-íon de formação de sal tal como sódio; e/ou surfactantes não iônicos tal como TWEENpolietileno glicol (PEG), e PLURONICS™.

Por "fase sólida" ou suporte sólido entende-se uma matriz não aquosa para a qual um antagonista GDM ou agente de ligação de GDM da presente invenção pode unir-se ou juntar-se. Exemplos de fases sólidas englobadas no presente pediso incluem aquelas formadas parcialmente ou inteiramente de vidro (por exemplo, vidro poroso controlado), polissacarídeos (por exemplo, agarose), poliacrilamidas, poliestireno, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas realizações, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de teste, em outras é uma coluna de purificação (por exemplo, uma coluna de cromatografia por afinidade). Este termo também inclui uma fase sólida descontínua de partículas distintas, tais como aquelas descritas na patente US 4.275.149.

Um "lipossomo" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipidios1 fosfolipídeos e/ou surfactante que é útil para a entrega de uma droga (tal como um antagonista de GDM) para um mamífero. Os componentes do lipossomo estão comumente dispostos em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas.

Uma "molécula pequena" ou "molécula orgânica pequena" é

definido no presente pedido como tendo um peso molecular abaixo de aproximadamente 500 Daltons.

Uma "quantidade efetiva" de um antagonista de GDM ou agente de ligação de GDM é uma quantidade suficiente para cumprir um propósito especificamente determinado. Uma "quantidade efetiva" pode ser determinada empiricamente e de uma forma rotineira em relação ao propósito determinado.

O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" refere-se a um antagonista de GDM ou outra droga efetiva para "tratar" uma doença ou disfunção em um sujeito ou mamífero. No caso de glioma, a quantidade terapeuticamente efetiva da droga pode reduzir o número de células de glioma; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente parar) infiltração de células de tumor de glioma em órgãos periféricos; inibir (isto é, diminuir até certo ponto e preferivelmente parar) metástases de tumor; inibir, até certo ponto, crescimento do tumor; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados com o glioma. Ver a definição no presente pedido de "tratamento". Até certo ponto a droga pode prevenir crescimento e/ou destruir células cancerosas existentes, podendo ser citostática e/ou citotóxica.

Uma "quantidade inibitória de crescimento" de um antagonista de GDM é uma quantidade capaz de inibir o crescimento de uma célula, especialmente um tumor, por exemplo, célula cancerosa, tanto in vitro como in vivo. Para os propósitos de inibição de crescimento celular neoplástico, tal quantidade pode ser determinada empiricamente e de uma maneira rotineira. Uma "quantidade citotóxica" de um antagonista de GDM é uma quantidade capaz de causar a destruição de uma célula, especialmente uma célula de glioma, por exemplo, célula cancerosa, tanto in vitro como in vivo. Para os propósitos de inibição de crescimento celular neoplástico, tal quantidade pode ser determinada empiricamente e de uma maneira rotineira.

O termo "anticorpo" é usado no senso mais amplo e especificamente cobre, por exemplo, anticorpos monoclonais GDM, anti-PN, anti-ProIif e anti-Mes, (incluindo anticorpos antagonistas e neutralizantes), composições do anticorpo GDM anti-PN1 anti-Pro//7 e anti-Mês com especificidade poliepitópica, anticorpos policlonais, anticorpos anti-GDM de cadeia simples, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos) e fragmentos de ligação de antígeno (ver abaixo) de todos os anticorpos enumerados acima, desde que eles exibam a atividade biológica ou imunológica desejada. O termo imunoglobulina (Ig) é usado alternadamente com anticorpo no presente pedido.

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico para o anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios, e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% por peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais que 99% por peso, (2) para um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) para homogeneidade por FAGO-SDS sob condições de redução ou não redução utilizando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silver stain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

A unidade básica de 4 cadeias do anticorpo é uma glicoproteína heterotetramérica composta de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste de 5 unidades heterotetraméricas básicas com um polipeptídeo adicional chamado de cadeia J, e portanto contém 10 sítios de ligação de antígeno, enquanto anticorpos IgA secretados podem polimerizar para formar conjuntos polivalentes que compreendem 2 a 5 das unidades de 4 cadeias básicas junto com a cadeia J). No caso de IgGs1 a unidade de 4 cadeias é geralmente de aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ponte bissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais pontes bissulfeto dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L pode também ter pontes bissulfeto entre cadeias espaçadas regularmente. Cada cadeia H tem no N-terminal, um domínio variável (Vh) seguido por três domínios constantes (Ch) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios Ch para os isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem no N-terminal, um domínio variável (Vl) seguido por um domínio constante (Cl) em sua outra terminação. O Vl está alinhado com o Vh e o Cl está alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1). Acredita-se que resíduos de aminoácidos específicos formem uma interface entre os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. O pareamento de um Vh e um Vl forma um sítio de ligação de antígeno único. Para a estrutura e propriedades das diferentes classes de anticorpos, ver, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, 8a edição, Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, páginas 71 e Capítulo 6.

A cadeia leve de qualquer espécie de vertebrado pode ser designada para um dos dois tipos claramente distintos, chamados kappa e lambda, baseado nas seqüências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH), imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes classes ou isotipos. Existem cinco classes de imunoglobulinas: IgA1 IgD1 IgE1 IgG, e IgM, que têm cadeias pesadas designadas α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As classes γ e α são também divididas em subclasses com base em diferenças relativamente menores na seqüência e função da Ch, por exemplo, humanos expressam as seguintes subclasses: IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certos segmentos dos domínios variáveis diferem extensivamente na seqüência entre os anticorpos. O domínio V media ligação de antígeno e define especificidade de um anticorpo específico para seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente através da amplitude de aproximadamente 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de trechos relativamente invariáveis chamados regiões de estrutura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade chamadas "regiões hipervariáveis" que são de 9 a12 aminoácidos em comprimento cada uma. Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas, compreendem cada um quatro FRs adotando amplamente uma configuração folha dobrada β, conectada por três regiões hipervariáveis, as quais formam alças que se conectam, e em alguns casos formando parte da estrutura folha dobrada β. As regiões hipervariáveis em cada cadeia são mantidas juntas em proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos, (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, tal como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).

O termo "região hipervariável" quando usado no presente refere- se aos resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis por ligação de antígeno. A região hipervariável geralmente compreende resíduos de aminoácido de uma "região determinada por complementaridade" ou "CDR" (por exemplo, resíduos Kabat por volta de aproximadamente 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) em VL, e resíduos Kabat por volta de aproximadamente 31 a 35B (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) em Vh (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (por exemplo, resíduos Clothia por volta de aproximadamente 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no VL, e 26 a 32 (H1), 52A a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no Vh (Chothia e Lesk J. Moi Biol. 196:901-917 (1987)).

O termo "anticorpo monoclonal" como usado no presente refere- se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao(s) mesmo(s) epitopo(s), exceto por possíveis variantes que podem aparecer durante a produção do anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Tal anticorpo monoclonal tipicamente inclui um anticorpo que compreende uma seqüência de polipeptídeo que se liga a um alvo, em que a seqüência de polipeptídeo de ligação alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma seqüência de polipeptídeo de ligação alvo única de uma pluralidade de seqüências de poplipepídeos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma pluralidade de clones, tais comò um grupo de clones de hibridoma, clones de fago ou clones de DNA recombinantes. Deve ser entendido que a seqüência de ligação alvo selecionada pode ser também alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade para este alvo, para humanizar a seqüência de ligação alvo, para melhorar sua produção na cultura celular, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar anticorpo multiespecífico, etc., e que um anticorpo que compreende a seqüência de ligação alvo alterada é também um anticorpo monoclonal desta invenção. Em contraste com preparações de anticorpo policlonal que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no antígeno. Além disso, para suas especificidades, as preparações de anticorpos monoclonais são vantajosas, pois elas são tipicamente descontaminadas de outras imunoglobulinas. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não sendo construído como produção requerida do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo., patente US 4.816.567), tecnologias de exposição por fago (ver, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mo/.B/o/.340(5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al. J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou similares a humanos em animais que têm partes ou todos os loci ou genes de imunoglobulina que codificam seqüências de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, documento WO 1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO 1996/33735; documento WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90:2551 (1993);

Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); patentes US 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm), 5.545.807, documento WO 1997/17852, patentes US 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126; 5.633.425 e 5.661.016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, lntern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) têm uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) ou homóloga(s) às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. No. 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpo humanizado, como usado no presente pedido, é um subconjunto de anticorpos quiméricos.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Para a maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo aceitante ou receptor) em que resíduos da região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos da região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em algumas ocorrências, resíduos (FR) da região de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar o desempenho do anticorpo, como afinidade de ligação. Geralmente, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todos ou substancialmente todos as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e toda ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana, embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. Os números destas substituições de aminoácidos na FR são tipicamente não mais do que 6 na cadeia H, e na cadeia L não mais do que 3. O anticorpo humanizado, opcionalmente irá compreender pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Bioi 2:593-596 (1992).

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo intacto, preferivelmente o antígeno de ligação ou região variável do anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares (ver patente US 5.641.870, Exemplo 2, Zapata et al., Protein Eng 8(10): 1057-1062 [1995]); moléculas de anticorpo de cadeia simples; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.

Digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", e um fragmento "Fc" residual, uma designação que reflete a habilidade para cristalizar facilmente. O fragmento Fab consiste de uma cadeia L inteira junto com o domínio de região variável da cadeia H (VH), e o primeiro domínio constante de uma cadeia pesada (Ch1). Cada fragmento Fab é monovalente em relação ao sítio de ligação de antígeno, isto é, tem um único sítio de ligação de antígeno. Tratamento por pepsina de um anticorpo produz um fragmento F(ab')2 que corresponde, em termos gerais, a dois bissulfetos ligados aos fragmentos Fab que têm atividade de ligação de antígeno bivalente e é ainda capaz de interligar-se ao antígeno. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab por terem poucos resíduos adicionais na terminação carboxila de um domínio Ch1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab1-SH é a designação no presente pedido para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes produzem pelo menos um grupo tiol livre. 15 Fragmentos do anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiça de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos.

O fragmento Fc compreende as porções da terminação carboxila de ambas as cadeias H mantidas juntas por bissulfetos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas pelas seqüências na região Fc, cuja região também é a parte reconhecida pelos receptores Fc (FcR) encontrados em certos tipos de células.

"Fv" é o fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno e sítio de ligação de antígeno completos. Este fragmento consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente. Do dobramento destes dois domínios originam-se seis alças hipervariáveis (3 alças da cadeia H e 3 alças da cadeia L) que contribuem com resíduos de aminoácidos para ligação de antígeno e conferem especificidade de ligação de antígeno para o anticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) possui a habilidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora com afinidade mais baixa do que o sítio de ligação completo.

"Fv de cadeia simples" também abreviado como "sFv" ou "scFv" são fragmentos de anticorpo que compreendem os domínios Vh e VL do anticorpo, conectados a uma única cadeia de polipeptídeo. Preferivelmente1 o polipeptídeo sFv também compreende um polipeptídeo Iigante entre os domínios Vh e VL que permite ao sFv formar a estrutura desejada para a ligação de antígeno. Para uma revisão de sFv, ver Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal_Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, abaixo.

Um "agente de ligação GDM" é uma molécula que se liga a um polipeptídeo GDM (por exemplo, PN, Prolif, Mes, Pten e DLL3). Exemplos de moléculas incluem anticorpos anti-GDM, fragmentos de anticorpo de ligação GDM, oligopeptídeos de ligação GDM, ácido nucléico sense e antisense de GDM e antagonistas de GDM de molécula pequena.

Um "antagonista de GDM" é uma molécula que antagonisa (por exemplo, neutraliza ou impede) a ativação ou habilidade de transdução de sinal de um polipeptídeo GDM, incluindo, por exemplo, bloqueio da habilidade de um GDM para transduzir um sinal, como pelo bloqueio de um ligante nativo a partir da ligação ou pelo bloqueio do GDM a partir da transmissão de um ligante nativo a um componente a jusante em um tumor do tipo glioma. Exemplos de moléculas incluem anticorpos anti-GDM, fragmentos de anticorpo de ligação GDM, oligopeptídeos de ligação GDM, ácido nucléico sense e antisense de GDM e antagonistas de GDM de molécula pequena.

Um "oligopeptídeo de ligação GDM" é um oligopeptídeo que se liga, preferivelmente, especificamente a um polipeptídeo GDM1 incluindo um receptor, Iigante ou componente de sinalização, respectivamente, como descrito no presente pedido. Tal oligopeptídeo pode ser sintetizado quimicamente usando-se metodologias de síntese de oligopeptídeo conhecidas, ou pode ser preparado e purificado usando-se tecnologia recombinante. Tais oligopeptídeos têm usualmente pelo menos aproximadamente 5 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos em comprimento, ou mais. Tais oligopeptídeos podem ser identificados sem experimentação exagerada usando-se técnicas conhecidas.

Com este propósito, é apontado que técnicas para seleção de bibliotecas de oligopeptídeo para oligopeptídeos que são capazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo alvo são bem conhecidas (ver, por exemplo, patentes US 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; publicações PCT documento WO 84/03506 e documento W084/03564; Geysen et al„ Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Nati Acad. Sei. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., em Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. Immunol. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378 (1990); Lowman, H.B. et al. Biochemistry, 30:10832 (1991); Clackson, T. et al. Nature 352: 624 (1991); Marks, J. D. et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991); Kang, A.S. et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363 (1991), e Smith1 G. P., Current Opin._Biotechnoi, 2:668 (1991). Um "antagonista de molécula pequena de GDM" é uma molécula orgânica, exceto um oligopeptídeo ou anticorpo como definido no presente pedido, que inibe, preferivelmente, especificamente, uma via de sinalização de GDM de um polipeptídeo GDM como descrito no presente pedido. Tal via de sinalização de GDM inibe preferivelmente o crescimento de células tumorais de glioma que expressam um polipeptídeo GDM. Tais moléculas orgânicas podem ser identificadas e quimicamente sintetizadas usando-se metodologia conhecida (ver, por exemplo, publicações PCT documento WO 2000/00823 e documento WO 2000/39585). Tais moléculas orgânicas são usualmente menores que aproximadamente 2000 daltons em tamanho, alternativamente menores que aproximadamente 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons em tamanho, são capazes de se ligar, e preferivelmente com exclusividade, a um polipeptídeo GDM como descrito no presente pedido, e podem ser identificadas sem exagerada experimentação usando-se técnicas bem conhecidas. Com este propósito, é apontado que técnicas para seleção de bibliotecas de moléculas orgânicas para moléculas que são capazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo alvo são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, publicação PCT documento WO 00/00823 e documento WO 00/39585).

Um antagonista de GDM ou agente de ligação de GDM (por exemplo, anticorpo, polipeptídeo, oligopeptídeo ou molécula pequena) "que se liga" a um antígeno alvo de interesse, por exemplo, um GDM, é aquele que se liga ao alvo com afinidade suficiente, de forma que seja um agente útil para diagnóstico prognóstico e/ou terapêutico no tratamento de uma célula ou tecido que expressa o antígeno, e não interaja significativamente com outras proteínas. A extensão de ligação a um polipeptídeo marcador desejado será menor do que aproximadamente 10% da ligação do alvo específico desejado, como determinado por técnicas comuns, tal como análise de separação celular ativada por fluorescência (FACS) ou radioimunoprecipitação (RIA). Além disso, o termo "ligação específica" ou "especificamente se liga a" ou é "específico para" um polipeptídeo GDM específico ou um epitopo em um polipeptídeo alvo específico significa ligação que é diferente de forma mensurável de uma interação não-específica. A ligação específica pode ser medida, por exemplo, pela determinação da ligação de uma molécula comparada à ligação de uma molécula controle, que geralmente é uma molécula de estrutura similar que não tem atividade de ligação. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada pela competição com uma molécula controle que é similar ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado.

Neste caso, a ligação específica indica se a ligação do alvo marcado a uma sonda é inibida de forma competitiva pelo excesso de alvo não marcado. Em uma realização, tais termos se referem a ligação onde uma molécula se liga a um polipeptídeo ou epitopo específico em um polipeptídeo particular sem se ligar substancialmente a qualquer outro polipeptídeo ou epitopo polipeptídico.

Alternativamente, tais termos podem ser descritos por uma molécula que tem um Kd para o alvo de aproximadamente 10"4 Μ, 10"5 Μ, 10"6 Μ, 10"7 Μ, 10~8 M, KT9 M, 1(T10 Μ, 10"11 Μ, 10"12 M, ou maior.

Um antagonista de GDM (por exemplo, antagonista de PN, Prolif ou Mes) que "inibe o crescimento de células tumorais que expressam um polipeptídeo GDM" ou uma quantidade "inibitória de crescimento" de qualquer tal molécula é aquela que resulta na inibição de crescimento mensurável de células cancerosas que expressam ou superexpressam o polipeptídeo GDM apropriado. Composições preferidas para uso no tratamento compreendem quantidades inibitórias do crescimento de pelo menos um tipo de antagonista de GDM (por exemplo, anticorpo anti-GDM, fragmento de anticorpo de ligação GDM, oligopeptídeos ou moléculas pequenas), de forma a inibir o crescimento das células tumorais de glioma em mais de 20%, preferivelmente em aproximadamente 20% a aproximadamente 50%, e até mais preferivelmente, em mais que 50% (por exemplo, em aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) quando comparado ao controle apropriado. Em uma realização, a inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração molecular de aproximadamente 0,5 a 30 pg/ml ou aproximadamente 0,5 nM a 200 nM na cultura celular, onde a inibição do crescimento é determinada em 1 a 10 dias após exposição das células tumorais ao anticorpo. A inibição do crescimento de células de tumor do tipo glioma in vivo pode ser determinada de várias maneiras, tal como este descrito na parte de Exemplos Experimentais abaixo. Uma quantidade de qualquer uma das moléculas acima deste parágrafo é inibitória do crescimento in vivo se a administração de tal molécula a aproximadamente 1 pg/kg para aproximadamente 100 mg/kg por peso corporal resultar na redução do tamanho do tumor ou redução da proliferação de célula tumoral dentro de aproximadamente 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de aproximadamente 5 a 30 dias.

Um antagonista de GDM que "induz apoptose" é aquele que induz morte celular programada de uma célula de tumor do tipo glioma como determinado pela ligação de anexina V, fragmentação do DNA, redução celular, dilatação do retículo endoplasmático, fragmentação celular, e/ou formação de vesículas na membrana (chamados corpos apoptóticos). A célula é usualmente aquela que superexpressa o polipeptídeo GDM. Vários métodos estão disponíveis para avaliação de eventos celulares associados com apoptose. Por exemplo, a translocação de fosfatidil serina (PS) pode ser medida por ligação anexina; a fragmentação de DNA pode ser avaliada através da escada do DNA; e a condensação nuclear/cromatina junto com fragmentação de DNA pode ser avaliada por qualquer aumento nas células hipodiplóides. Preferivelmente, o anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica que induz apoptose é aquele que resulta em aproximadamente 2 a 50 vezes, preferivelmente cerca de 5 a 50 vezes, e mais preferivelmente cerca de 10 a 50 vezes, indução de ligação de anexina relativo às células não tratadas em um teste de ligação de anexina.

Um antagonista de GDM que "induz morte celular" é aquele que faz com que uma célula de tumor do tipo glioma não seja viável. Tal célula de tumor do tipo glioma é aquela que expressa um polipeptídeo GDM1 preferivelmente aquela que o superexpressa, quando comparada a uma célula não doente. O polipeptídeo GDM pode ser um polipeptídeo de transmembrana expresso na superfície de tal célula cancerosa, ou pode ser um polipeptídeo que é produzido e secretado por tal célula. Morte celular in vitro pode ser determinada na ausência de célula efetoras de complemento e imunes para distinguir morte celular induzida por citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Dessa forma, o teste para morte celular pode ser realizado na ausência de soro inativado pelo calor (isto é, na ausência de complemento) e na ausência de células efetoras imunes. A habilidade para induzir morte celular pode ser avaliada em relação às células não tratadas por técnicas adequadas, como perda de integridade de membrana como avaliado pela absorção de iodeto de propídio (PI), azul de tripan (ver Moore et al. Cytotechnology 17:1-11 (1995)) ou 7AAD. Antagonistas GDM preferidos que induzem morte celular são aqueles que induzem absorção de Pl no teste de absorção de Pl nas células BT474.

Um "antagonista de Prolif' e um "antagonista de Mes" são antagonistas de GDM que se ligam especificamente, ou de outra forma inibem especificamente, a atividade de um marcador GDM de Prolif ou Mes citados na Tabela A, respectivamente. Um "antagonista de PN" é um antagonista de GDM que se liga especificamente, ou de outra forma inibe especificamente, a atividade de um marcador GDM de PN citado na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog1 Oligl, Olig2, THR e ASCL1.

Um antagonista de Akt é qualquer molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe, ou neutraliza uma atividade biológica da via de sinalização de Akt. Antagonistas de Akt adequados incluem anticorpos ou fragmentos de anticorpo, fragmentos ou seqüências de aminoácido variantes de componentes nativos da via de sinalização de Akt ("Polipeptídeo Akt"), oligonucleotídeos antisense de peptídeos, moléculas orgânicas pequenas, etc. Métodos para identificação de antagonistas de Akt podem compreender contatar um Polipeptídeo Akt com uma molécula candidata e medir uma alteração detectável em uma ou mais atividades biológicas normalmente associadas com o Polipeptídeo Akt. Exemplos adicionais de antagonistas de Akt incluem: antagonistas especificamente dirigidos ao aktl, akt2 ou akt3; antagonistas dirigidos ao domínio catalítico ou regulatório (incluindo a interação com cada um) se a quinase PIK3 como PIK3CA, PIK3CB, PIK3CD, PIK3CG, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R4; PDK1; FRAP (por exemplo, rapamicina); RPS6KB1; SGK; EGFR (por exemplo, erlotinib TARCEVA®, IGFR. Alternativamente, antagonistas de Akt incluem moléculas que são agonistas, estimulam ou restabelecem a atividade de PTEN, INPP5D ou INPPL1.

Um "agente anti-mitótico" inclui uma molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe, ou de outra forma, interfere na mitose que ocorre durante a divisão celular. Exemplos de tais agentes incluem: temozolamida, BCNU, CCNU, lomustina, gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides.

Um "agente anti-angiogênico" é uma molécula que bloqueia parcialmente ou completamente, inibe, ou de outra forma, neutraliza o processo de angiogênese ou formação do sistema de vasos sangüíneos, especialmente aquela que está associada com uma doença ou disfunção. Muitos antagonistas da angiogênese foram identificados e são conhecidos na técnica, incluindo aqueles relacionados por Brem, Câncer Control 6(5): 436-458 (1999).

Geralmente, antagonista de angiogênese compreende uma molécula direcionada a um fator angiogênico específico ou uma via de angiogênese. Em certos aspectos, o antagonista de angiogênese é uma composição de proteína, como um anticorpo direcionado a um fator angiogênico. Um exemplo de fator angiogênico é "VEGF" (também conhecido algumas vezes como "VEGF-A"), um fator de crescimento celular endotelial vascular de 165 aminoácidos e fatores de crescimento celular endotelial vascular relacionados de 121, 189 e 206 aminoácidos, como descrito por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), e Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991), junto com as forma alélicas que ocorrem naturalmente e formas processadas destes. O termo "VEGF" é também usado para se referir a formas retiradas do polipetídio que compreende 8 a 109 ou 1 a 109 aminoácidos do fator de crescimento celular endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. Tais versões retiradas do VEGF nativo têm afinidade de ligação para os receptores Flt-1 (VEGF-R1) e KDR (VEGF-R2) comparável ao VEGF nativo.

Um exemplo de fator anti-angiogênico é um anticorpo que neutraliza anti-VEGF. Um "anticorpo anti-VEGF" é um anticorpo que se liga especificamente ao VEGF. Preferivelmente, o anticorpo anti-VEGF da invenção pode ser usado como um agente terapêutico no direcionamento e interferência em doenças ou condições em que a atividade VEGF está envolvida. Tal anticorpo anti-VEGF usualmente não irá se ligar a outro VEGF homólogo como VEGF-B ou VEGF-C, nem a outros fatores de crescimento como P1GF, PDGF ou bFGF. Um anticorpo anti-VEGF preferido é um anticorpo monoclonal que se liga ao mesmo epitopo do anticorpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 produzido pelo hibridoma ATCC HB 10709. Mais preferivelmente o anticorpo anti-VEGF é um anticorpo monoclonal humanizado recombinante anti-VEGF que compreende regiões de estrutura IgGI humana mutada e regiões determinantes de complementariedade de ligação de antígeno do anticorpo monoclonal A.4.6.1 anti-hVEGF murino, e gerado de acordo com Presta et al. (1997) Câncer Res. 57:4593-4599 (1997), incluindo mas não limitado ao anticorpo conhecido como bevacizumab (BV; Avastin™).

Alternativamente, um agente anti-angiogênico pode ser qualquer molécula pequena capaz de neutralizar, bloquear, inibir, anular, reduzir ou interferir nas atividades de VEGF incluindo sua ligação a um ou mais receptores VEGF (por exemplo, VEGFR1 e VEGFR2).

Um "agente de diferenciação neural" é uma molécula que promove, motiva, estimula ou, de outra forma, induz precursores neuronais (por exemplo, células-tronco neurais, células de amplificação transitória, neuroblastos, etc.) a se diferenciarem em neurônios. Precursores neuronais são células derivadas do sistema nervoso fetal, cérebro adulto ou crista neural e são capazes de ambas, divisão celular e criação de neurônios. Neurônios são células pós-mitóticas (que não se dividem) que expressam proteínas envolvidas nas projeções do axônio, propagação do potencial de ação e transmissão sináptica. Um agente de diferenciação neuronal é uma molécula que induz precursores neuronais a diminuir suas taxas de proliferação e aumentar sua expressão de proteínas envolvidas no crescimento do axônio, geração do potencial de ação e transmissão sináptica. Exemplos de marcadores de diferenciação neuronal incluem, mas não estão limitados a, MAP2, beta-tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF, NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, OLIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de nicastrina de molécula pequena , AphIA1 AphIB1 Psenl1 Psen2 e PSENEN, antagonista de delta similar ao ligante (DII)-I1 similar ao Iigante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb.

"Funções efetoras" do anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc de seqüência de aminoácido variante) de um anticorpo, e variam com o isotipo de anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citoxicidade dependente de complemento; ligação do receptor Fc; citoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose, baixo controle de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.

"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretado ligado aos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK)1 neutrófilos, e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo que produz antígeno e subseqüentemente destróem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal destruição. As células primárias para mediação de ADCC1 células NK1 expressam apenas FcyRIII, enquanto que monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividade de ADCC de uma molécula de interesse, um ensaio in vitro de ADCC, tal como descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337 pode ser realizado. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como divulgado em Clynes et al. (EUA) 95:652-656 (1998).

"Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRI, FcyRII e FcyRIIIi incluindo variantes alélicas e alternativamente formas unidas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências de aminoácido similares que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes. Receptor de ativação FcyRIIA contém uma seqüência de ativação de imunoreceptor baseada em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de ativação FcyRIIA contém uma seqüência de inibição de imunoreceptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver revisão M. em Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-492 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 1 26:330-41 (1995). Outros FcRs, incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" no presente pedido. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn, que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferivelmente1 as células expressam pelo menos FcyRIII e realizam função efetora de ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC)1 células natural killer (NK)1 monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à lise de uma célula alvo na presença de complemento. Ativação da via de complemento tradicional é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC, por exemplo, como descrito em Gazzano- Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado.

Um "glioma que expressa GDM" opcionalmente produz níveis suficientes de polipeptídeo GDM na superfície das células deste, de forma que um polipeptídeo antagonista de GDM possa se ligar a este ou um antagonista de GDM de molécula pequena possa, de outra forma, direcionar e ter um efeito um efeito terapêutico com relação ao glioma.

Em outra realização, um "glioma que expressa GDM" opcionalmente produz e secreta níveis suficientes de polipeptídeo GDM, de forma que um polipeptídeo antagonista de GDM possa se ligar a este ou um antagonista de GDM de molécula pequena possa, de outra forma, direcionar e ter um efeito um efeito terapêutico com relação ao câncer. Com relação aos antagonistas, tais moléculas podem ser um oligonucleotídeo antisense que reduz, inibe ou previne produção e secreção do polipeptídeo GDM secretado pelas células tumorais.

Um tumor do tipo glioma que "superexpressa" um polipeptídeo GDM é aquele que tem níveis significativamente mais altos de GDM na superfície celular deste, ou que produz e secreta, comparado a uma célula não cancerosa do mesmo tipo de tecido. Tal superexpressão pode resultar da amplificação gênica ou por aumento de transcrição ou tradução. Vários testes de disgnóstico ou prognóstico medem expressão aumentada de GDM que resulta em níveis aumentados na superfície celular ou aquele que é secretado, como teste imunohistoquímico usando-se anticorpos anti-GDM, análise FACS1 etc. Alternativamente, os níveis de ácido nucléico ou mRNA que codificam o polipeptídeo GDM podem ser medidos na célula, por exemplo, via hibridização in situ fluorescente usando-se um ácido nucléico baseado em sonda que corresponde a um ácido nucléico que codifica GDM ou o complemento deste; (FISH; ver documento WO 98/45479 publicado em outubro de 1998), Southern blotting, ou técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR), tal como PCR quantitativa em tempo real (RT-PCR). Alternativamente, a superexpressão do polipeptídeo GDM é determinável pela medida do antígeno derramado em um fluido biológico como soro, por exemplo, usando-se testes baseados em anticorpo (ver também, por exemplo, patente US 4.933.294 emitida em 12 de junho de 1990, documento WO 91/05264 publicado em 18 de abril de 1991, patente US emitida em 28 de março de 1995, e Sias et a\.J.Immunol.Methods 132:73-80 (1990)). Além dos testes acima, vários testes in vivo estão disponíves para os médicos técnicos no assunto. Por exemplo, pode-se expor as células do corpo do paciente a um anticorpo que é opcionalmente marcado com uma marca detectável, por exemplo, um isótopo radioativo, e a ligação do anticorpo às células no paciente pode ser avaliada, por exemplo, por varredura externa por radioatividade ou por análise de uma biópsia tirada de um paciente previamente exposto ao agente terapêutico.

Como usado no presente, o termo "imunoadesina" designa moléculas similares ao anticorpo que combinam a especificidade de ligação de uma proteína heteróloga (uma "adesina") com as funções efetoras de domínios constantes de imunoglobulina. Estruturalmente, as imunoadesinas compreendem uma fusão de uma seqüência de aminoácido com a especificidade de ligação desejada, que é exceto o antígeno de reconhecimento e sítio de ligação de um anticorpo (isto é, é "heterólogo"), e uma seqüência de domínio constante de imunoglobulina. A adesina que parte de uma molécula de imunoadesina tipicamente é uma seqüência de aminoácido contínua que compreende pelo menos o sítio de ligação de um receptor ou um ligante. O seqüência de domínio constante de imunoglobulina na imunoadesina pode ser obtida de qualquer imunoglobulina, como subtipos lgG-1, lgG-2, lgG-3, ou lgG-4, IgA (incluindo lgA-1 e lgA-2), IgE, IgD ou IgM.

A palavra "marcador" quando usada no presente pedido refere-se a um composto ou composição detectável que é conjugada diretamente ou indiretamente ao anticorpo, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica para que gere um anticorpo "marcado", oligopeptídeo ou outra molécula orgânica. O marcador pode ser detectável por si mesmo (por exemplo, marcadores radioisotopos ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar alteração química de um composto do substrato ou composição que seja detectável.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente pedido refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos, enzimas e fragmentos destes como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, e vários agentes anti-tumor ou anti-câncer divulgados no presente pedido. Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de células tumorais.

Um "agente quimioterapêutico" é um componente químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem hidroxiurea taxanos (como paclitaxel e doxetaxel) e/ou antraciclina; agentes alquilantes como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas como benzodopa, carboquona, meturedopa e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan (H YC AMTIN®), CPT11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC1065 (incluindo adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética análogas); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio como clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gamaiI e caliqueamicina omegall (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforos de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo5-oxo-L- norleucina, doxorubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina e deoxidoxorubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tal como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti- adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico restabelecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene1 OR); razoxana; rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2,,2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®) (Bristol-Myers Squibb Oncology1 Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremofor1 formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina modificada (American Pharmaceutical Partners1 Schaumberg1 Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer1 Antony1 France); cloranbucila; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti- hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento do câncer, e estão freqüentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifene FARESTON®; anti-progesteronas; baixos reguladores de receptores de estrógeno (ERDs); agentes de função de supressão ou bloqueio dos ovários, por exemplo, agonistas de hormônio que liberam hormônio luteinizante (LHRH) como acetato de Ieuprolida (LUPRON® e ELIGARD®), acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti- androgênicos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de ν estrógeno nas glândulas adrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol (MEGASE®), exemestano (AROMASIN®), formestano, fadrozola, vorozola (RIVISOR®), Ietrozola (FEMARA®), e anastrozola (ARIMIDEX®). Além disso, tal definição de agentes quimioterapêuticos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou OSTAC®), etidronato (DIDROCAL®), NE58095, ácido zoledrônico/zoledronato (ZOMETA®), alendronato (FOSAMAX®), pamidronato (AREDIA®), tiludronato (SKELID®), ou risedronato (ACTONEL®); assim como troxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga); oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf1 H-Ras, e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE® e vacinas de terapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; Iapatinib ditosilato (uma ErbB2 e inibidor de molécula pequena de tirosina quinase EGFR duplo também conhecido como GW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um "agente inibitório de crescimento" quando usado no presente pedido refere-se a um componente ou composição que inibe o crescimento de uma célula, especialmente uma célula de glioma que expressa GDM tanto in vitro como in vivo. Dessa forma, o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduz significantemente a porcentagem de células que expressam GDM na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local, exceto na fase S), como agentes que induzem a interrupção de G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores topoisomerase II tais como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido e bleomicina. Esses agentes que capturam G1 também se espalham na interrupção da fase S1 por exemplo, agentes alcalinizantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluor- uracil, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, designada "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" por Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia1 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos ou hidroxiurea- taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anti-câncer, ambas derivadas do teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Estas moléculas promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos pela prevenção da despolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células.

"Doxorubicina" é um antibiótico antraciclina. A nomenclatura química completa de doxorubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L- lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11-trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1- metoxi-5,12-naftacenediona.

O termo "citocina" é um termo genérico para proteínas liberadas por uma população de células que agem em outra célula como mediadoras intercelulares. Exemplos de tais citocinas são linfocinas, monocinas, e hormônios polipeptídicos tradicionais. Incluído entre as citocinas estão hormônios de crescimento tais como hormônio de crescimento humano, hormônio de crescimento humano N-metionil, e hormônio de crescimento bovino; hormônio paratiróide; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; prorelaxina; hormônios de glicoproteína tais como hormônio estimulante do folículo (FSH), hormônio estimulante da tireóide (TSH), hormônio Iuteinizante (LH); fator de crescimento hepático; fator de crescimento do fibroblasto; prolactina; lactogênio placentário; fator-α e -β de necrose tumoral; substância inibidora de mulleriana; peptídeo associado a gonadotropina de camundongo; inhibina; activina; fator de crescimento endotelial vascular; integrina; trombopoietina (TPO); fatores de crescimento do nervo tal como NGF-β; fator de crescimento de plaqueta; fatores transformantes do crescimento (TGFs) tais como TGF-α e TGF-β; fator-l e -II de crescimento de similar a insulina;

eritropoietina (EPO); fatores osteoindutivo; interferons tais como interferon-α, - β, e -γ; fatores de estimulação de colônia (CSFs) tal como macrófago-CSF (M- CSF); granulocito-macrófago-CSF (GM-CSF); e granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (ILs) tais como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-11, IL-12; um fator de necrose tumoral tais comoTNF-α ou TNF-β; e outros fatores de polipeptídeos incluindo LIF e Iigante kit (KL). Como usado no presente pedido, o termo citocina inclui proteínas de fontes naturais ou de cultura celular recombinante e equivalentes ativos biologicamente de citocinas de seqüência nativa.

O termo "bula" é usado para se referir a instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos que contêm infomações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, contra indicações e/ou advertências referentes ao uso de tais produtos terapêuticos.

O termo "agrupamento hierárquico" significa um método de agrupar conjuntos de amostras baseado em suas similaridades de expressão gênica. O algoritmo padrão usado de modo repetitivo calcula um dendrograma que reúne todos os elementos em uma árvore, iniciando a partir de uma matriz de correlação. Eisen, M.B. et al., P.N.A.S. 95:14863-14868 (1998).

O termo "agrupamento k-médias" significa que é um método de agrupar conjuntos de amostras baseado em suas similaridades de expressão gênica. No agrupamento k-médias, todas as amostras são inicialmente designadas ao acaso para um de vários agrupamentos. O valor representativo ou médio da expressão gênica em cada agrupamento de amostra é então calculado e cada amostra é novamente designada para o agrupamento ao qual ela mostra a similiradidade mais próxima. O procedimento é reiterado até uma estrutura estável ser alcançada. Duda1 R.O. e Hart1 P.E., Pattern Classification and Scene Analysis, Wiley, Nova York (1973).

O termo "esquema de votação" significa que é um método de alocação de tumores em grupos baseado na comparação do número de GDMs para cada subtipo de tumor que são expressos em um certo nível de expressão ou acima deste. Freije et al., acima.

Tabela 1

<table>table see original document page 97</column></row><table> /* K */ {-1, 0,-5, 0, 0,-5,-2, 0,-2, 0, 5,-3, 0, 1 ,_Μ,-1,1,3,0,0, 0,-2,-3, 0,-4, 0},

/* L */ {-2,-3,-6,-4,-3, 2,-4,-2, 2, 0,-3, 6, 4,-3,_Μ,-3,-2,-3,-3,-1, 0, 2,-2, 0,-1 ,-2},

/* M */ {-1,-2,-5,-3,-2, 0,-3,-2, 2, 0, 0, 4, 6,-2,_Μ,-2,-1, 0,-2,-1, 0, 2,-4, 0,-2,-1),

/* N */ { 0, 2,-4, 2, 1,-4, 0, 2,-2, 0, 1,-3,-2, 2,_Μ,-1, 1, 0, 1, 0, 0,-2,-4, 0,-2, 1),

/* O */ {_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,_Μ,

0 ,_Μ ,_Μ, _Μ ,_Μ ,_Μ, _Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ ,_Μ},

/* P */ {1 ,-1 ,-3,-1 ,-1 ,-5,-1, 0,-2, 0,-1 ,-3,-2,-1 ,_Μ, 6, 0,0,1, 0, 0,-1 ,-6, 0,-5, 0},

/* Q */ { 0, 1 ,-5, 2, 2,-5,-1, 3,-2, 0, 1 ,-2,-1, 1 ,_Μ, 0, 4, 1 ,-1 ,-1, 0,-2,-5, 0,-4, 3},

/* R */ {-2, 0,-4,-1 ,-1 ,-4,-3, 2,-2, 0, 3,-3, 0, 0,_Μ, 0,1,6, 0,-1, 0,-2, 2, 0,-4, 0},

/* S */ {1,0,0, 0, 0,-3, 1 ,-1 ,-1, 0, 0,-3,-2, 1 ,_Μ, 1 ,-1,0,2,1, 0,-1 ,-2, 0,-3, 0},

/* T */ { 1, 0,-2, 0, 0,-3, 0,-1, 0, 0, 0,-1 ,-1, 0,_Μ, 0,-1 ,-1,1, 3, 0, 0,-5, 0,-3, 0},

/* U */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},

/* V */ { 0,-2,-2,-2,-2,-1 ,-1 ,-2, 4, 0,-2, 2, 2,-2,_Μ,-1 ,-2,-2,-1, 0, 0, 4,-6, 0,-2,-2},

/* W */ {-6,-5,-8,-7,-7, 0,-7,-3,-5, 0,-3,-2,-4,-4,_Μ,-6,-5, 2,-2,-5, 0,-6,17, 0, 0,-6},

/* X */ { 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0,_Μ, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0},

/* Y */ {-3,-3, 0,-4,-4, 7,-5, 0,-1, 0,-4,-1,-2,-2,_Μ,-5,-4,-4,-3,-3, 0,-2, 0, 0,10,-4},

/* Z */ {0,1 ,-5, 2, 3,-5, 0, 2,-2, 0, 0,-2,-1, 1 ,_Μ, 0, 3, 0, 0, 0, 0,-2,-6, 0,-4, 4} };

Page 1 of day.h

Tabela 1 (Continuação 1)

<table>table see original document page 98</column></row><table> <table>table see original document page 99</column></row><table> <table>table see original document page 100</column></row><table>

Page 1 of nw.h

Tabela 1 (Continuação 2)

Γ Needleman-Wunsch alignment program *

* usage: progs filei file2

* where file 1 and file 2 are two dna or two protein sequences.

* The sequences can be in upper- or lower-case an may contain ambiguity

* Any Iines beginning with ';'. or '<' are ignored

* Max file Iength is 65535 (limited by unsigned short χ in the jmp struct)

* A sequence with 1/3 or more of its elements ACGTU is assumed to be DNA

* Output is in the file "align.out"

* The program may create a tmp file in /tmp to hold info about traceback.

* Original version developed under BSD 4.3 on a vax 8650 #include "nw.h" #include "day.h" static _dbval[26] = {

1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0

};

static _pbval[26] = {

1,2|(1 «(,D'-,A'))|(1 «('Ν'-'Α·», 4, 8, 16, 32, 64,

128, 256, 0xFFFFFFF, 1«10, 1«11, 1«12, 1«13, 1«14,

1«15, 1«16, 1 <<17, 1«18, 1«19, 1«20, 1«21, 1«22,

1 <<23, 1«24, 1 «25|(1 «('E-'A'))|(1«('Q'-'Ά1))

};

main(ac, av) main

int ac; char *av[];

{

prog = av[0]; if (ac != 3) {

fprintf(stderr,"usage: %s filei file2\n", prog); fprintf(stderr,"where filei and file2 are two dna or two protein sequences.\n");

fprintf(stderr,"The sequences can be in upper- or lower-case\n"); fprintf(stderr,"Any Iines beginning with ';' or '<' are ignored\n"); fprintf(stderr,"Output is in the file \"align.out\"\n"); exit(1);

}

namex[0] = av[1]; namex[1] = av[2];

seqx[0] = getseq(namex[0], &len0); seqx[1] = getseq(namex[1], &len1); xbm = (dna)? _dbval: _pbval;

endgaps = 0;

Γ 1 to penalize endgaps 7

ofile = "align.out"; /* output file 7

nw(); /* fill in the matrix, get the possible jmps 7

readjmps(); /* get the actual jmps 7

print();

/* print stats, alignment 7

/* do the alignment, return best score: main()

* dna: values in Fitch and Smith1 PNAS1 80, 1382-1386, 1983

* pro: PAM 250 values

* When scores are equal, we prefer mismatches to any gap, prefer

* a new gap to extending an ongoing gap, and prefer a gap in seqx

* to a gap in seq y.

7

nw()

{

char *px, *py; Γ seqs and ptrs 7

int *ndely, *dely;/* keep track of dely 7

int ndelx, delx; /* keep track of delx 7

int *tmp; Γ for swapping rowO, rowl 7

int mis; /* score for each type 7

int insO, ins1; /* insertion penalties 7

register id; /* diagonal index 7

register ij; /*jmpindex7 102

register *col0, *col1; Γ score for curr, Iast row 7

register xx, yy; /* index into seqs 7

dx = (struct diag *)g_calloc("to get diags", Ien0+len1+1, sizeof(struct

diag));

ndely = (int *)g_calloc("to get ndely", Ien1+1, sizeof(int));

dely = (int *)g_calloc("to get dely", Ien1+1, sizeof(int)); colO = (int *)g_calloc("to get colO", Ien1+1, sizeof(int)); col1 = (int *)g_calloc("to get coM", Ien1+1, sizeof(int)); insO = (dna)? DINSO : PINSO;

ins1 = (dna)? DINS1 : PINS1;

smax = -10000; if (endgaps) {

for (col0[0] = dely[0] = -insO, yy = 1; yy <= Ien 1; yy++) { colO[yy] = dely[yy] = col0[yy-1] - ins1;

ndely[yy] = yy;

}

col0[0] = 0; /* Waterman Bull Math Biol 84 7

>

else

for (yy = 1; yy <= Ien 1; yy++)

dely[yy] = -insO; /* fill in match matrix 7

for (px = seqx[0], xx = 1; xx <= IenO; px++, xx++) {

/* initialize first entry in col

7

if (endgaps) {

if (xx == 1) <table>table see original document page 104</column></row><table> <table>table see original document page 105</column></row><table> <table>table see original document page 106</column></row><table>

Tabela 1 (Continuação 5)

<table>table see original document page 106</column></row><table> <table>table see original document page 107</column></row><table> }

}

if (endgaps && xx < lenO) col1[yy-1] -= ins0+ins1*(len0-xx);

if (col1[yy-1] > smax) {

smax = col1 [yy-1]; dmax = id;

}

tmp = col0; col0 = col1; col1 = tmp;

}

(void) free((char *)ndely); (void) free((char *)dely); (void) free((char *)col0); (*)col1);

} Page 4 of nw.c

Tabela 1 (Continuação 6)

/* *

* print() -- only routine visible outside this module

*

* static:

* getmat() -- trace back best path, count matches: print()

* pr_align() -- print alignment of described in array p[]: print()

* dumpblock() - dump a block of lines with numbers, stars: pr_align()

* nums() -- put out a number line: dumpblock()

* putline() -- put out a line (name, [num], seq, [num]): dumpblock()

* stars() -- put a Iine of stars: dumpblock()

* stripname() -- strip any path and prefix from a seqname */

#include "nw.h" #define SPC3 #define P_LINE 256 /* maximum output line */ #define P_SPC 3 /* space between name or num and seq */ extern _day[26][26]; int olen; /* set output line length */ FILE *fx; /* output file */ print() print

{

int Ix, Iy, firstgap, lastgap; /* overlap */ if ((fx = fopen(ofile, "w")) == 0) {

fprintf(stderr,"%s: can't write %s\n", prog, ofile); cleanup(1);

}

fprintf(fx, "<first sequence: %s (length = %d)\n", namex[0], lenO); fprintf(fx, "<second sequence: %s (length = %d)\n", namex[1], len1); olen = 60; Ix = lenO; Iy = len1;

firstgap = lastgap = 0;

if (dmax < len 1 -1) { /* ;eading gap in χ */ pp[0].spc = firstgap = len1 - dmax -1; Iy -= pp[0].spc;

}

else if (dmax > len1 -1) { /* leading gap in y */ pp[1].spc = firstgap = dmax - (len1 -1); Ix -= pp[1].spc; <table>table see original document page 110</column></row><table>

Tabela 1 (Continuação 7)

<table>table see original document page 110</column></row><table> */

i0 = i1 = sizO = sizl = 0; p0 = seqx[0] + pp[1].spc; p1 = seqx[1] + pp[0].spc; n0 = pp[1].spc + 1; n1 = pp[0].spc + 1; nm = 0;

while ( *p0 && *p1 ) {

if (siz0) {

p1++; n1++; siz0--;

}

else if (siz1) { p0++; n0++; siz1--;

}

else {

if (xbm[*p0-'A']&xbm[*p1 -'A'])

nm++; if (n0++ == pp[0].x[i0])

siz0 = pp[0].n[i0++]; if (n1++ == pp[1].x[i1])

sizl = pp[1].n[i1++];

p0++; p1++;

} }

Γ pct homology:

* if penalizing endgaps, base is the shorter seq

* else, knock off overhangs and take shorter core

*/

if (endgaps)

Ix = (lenO < lenl)? IenO : Ien1;

else

Ix = (Ix < ly)? Ix : ly; pct = 100,*(double)nm/(double)lx; fprintf(fx, M\nH);

fprintf(fx, "<%d match%s in an overlap of %d: %.2f percent similarity\n nm, (nm == 1)? ""!"es", Ix1 pct); Page 2 of nwprint.c

Tabela 1 (Continuação 8)

fprintf(fx, "<gaps in first sequence: %d", gapx); if (gapx) {

(void) sprintf(outx," (%d %s%s)",

ngapx, (dna)? "base^Yesidue", (ngapx == 1)? "":"s"); fprintf(fx,"%s", outx); fprintf(fx,", gaps in second sequence: %d", gapy);

if (gapy) {

(void) sprintf(outx," (%d %s%s)",

ngapy, (dna)? "base^residue", (ngapy == 1)? "":"sH); fprintf(fx,"%s", outx);

}

if (dna)

fprintf(fx, "\n<score: %d (match = %d, mismatch = %d, gap penalty = %d + %d per base)\n",

smax, DMAT, DMIS, DINSO1 DINS1);

else

fprintf(fx,

"\n<score: %d (Dayhoff PAM 250 matrix, gap penalty = %d + %d per residue)\n",

smax, PINSO, PINS1); if (endgaps)

fprintf(fx,

"<endgaps penalized. Ieft endgap: %d %s%s, right endgap: %d

%s%s\n",

else

firstgap, (dna)? "base": "residue", (firstgap == 1)? "": "s", lastgap, (dna)? "base": "residue", (lastgap == 1)? "": "s");

fprintf(fx, "<endgaps not penalized\n");

>

static static static static static static

nm;

Imax;

Ü[2];

nc[2];

ni[2];

siz[2];

static char *ps[2]; static char *po[2];

/* matches in core - for checking 7 /* Iengths of stripped file names */ /* jmp index for a path */ /* number at start of current Iine */ Γ current elem number - for gapping */

/* ptr to current element 7 /* ptr to next output char slot 7

staticchar out[2][P_LINE]; /* output Iine 7 staticchar star[P_LINE]; /* set by stars() 7

/* * print alignment of described in struct path ρρ[] 7

static

pr_align() {

int nn; /* char count */

int more;

register i;

for (i = O1 Imax = 0; i < 2; i++) { nn = stripname(namex[i]);

if (nn > Imax)

Imax = nn; nc[i] = 1; ni[i] = 1;

siz[i] = ij[i] = 0;

ps[i] = seqx[i]; = outli]; }

Tabela 1 (Continuacao 9)

for (nn = nm = O1 more = 1; more;) { for (i = more = 0; i < 2; i++) {

/*

* do we have more of this sequence? */

if (!*ps[i])

continue;

more++;

if (pp[i].spc) { /* Ieading space */ *po[i]++ = 1';

pr_align

Page 3 of nwprint.c

...pr_align pp[i].spc~;

}

else if (siz[i]) { /* in a gap 7 *po[i]++ = siz[i]--;

}

else { /* we're putting a seq element 7

*po[i] = *ps[i]; if (islower(*ps[i]))

*ps[i] = toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /*

* are we at next gap for this seq? 7

if (ni[i] == pp[i].x[ij[i]]) { /*

* we need to merge ali gaps

* at this Iocation 7

siz[i] = pp[i]n[ij[i]++]; while (ni[i] == pp[i].x[ij[i]])

siz[i] += pp[i].n[ij[i]++];

}

ni[i]++;

} if (++nn == olen || !more && ηη) { dumpblock(); for (i = 0; i < 2; i++) po[i] = out[i];

nn = 0;

}

}

}

/*

* dump a block of lines, including numbers, stars: pr_align() */

static

dumpblock() dumpblock

{

register i;

for (i = 0; i < 2; i++) *po[i]-- = '\0'; Page 4 of nwprint.c

Tabela 1 (Continuação 10)

...dumpblock

(void) putcCXn', fx); for (i = 0; i < 2; i++) {

if (*out[i] && (*out[i] I= * * Il *(po[i]) != '')) { if (i == 0)

nums(i);

if (i == 0&& *out[1])

stars(); putline(i); if (j == O && *out[1])

fprintf(fx, star); if(i ==1)

nums(i);

}

}

}

/*

* put out a number line: dumpblock()

Ί

sta ti c

nums(ix)

int ix; /* index in out[] holding seq Iine */

{

char nline[P_LINE];

register i, j;

register char *pn, *px, *py; for (pn = nline, i = 0; i < lmax+P_SPC; i++, pn++) *pn ='

for (i = nc[ix], py = outfixj; *py; py++, pn++) {

•f Cpy =='' Il *py == -) *pn ='';

else {

if (i%10 == 0 II (i == 1 && nc[ix] != 1)) j = (i < 0)? -i: i; for (px = pn; j; j /= 10, px~)

*px = j%10 + Ό'; if (i < 0) *ρχ =

}

else

*ρη = 1

i++;

}

>

*ρη = '\0'; nc[ix] = i;

for (ρη = nline; *ρη; ρη++) (void) putc(*pn, fx); (void) putc('\n\ fx);

}

/*

* put out a Iine (name, [num], seq, [num]): dumpblock() 7

static

putline(ix) putline

ix;

{ Page 5 of nwprint.c

Tabela 1 (Continuação 11)

...putline

int i;

register char *px;

for (px = namex[ix], i = 0; *px && *px != ':'; px++, i++)

(void) putc(*px, fx); for (; i < lmax+P_SPC; i++) (void) putc('', fx); Γ these count from 1:

* ni[] is current element (from 1)

* nc[] is number at start of current Iine 7

<table>table see original document page 119</column></row><table> else If (!dna && jJayrpO-Wjrpl-W] cx = ·.';

else

cx = '';

}

else

cx = ''; *px++ = cx;

}

*px++ = '\n'; *px = ·\0·;

}

Page 6 of nwprint.c

Tabela 1 (Continuação 12)

/*

* strip path or prefix from pn, return len: pr_align() Ί

static

stripname(pn)

char *pn; /* file name (may be path) */

{

register char *px, *py; py = 0;

for (px = pn; *px; px++) if (*px == '/')

py = px + 1;

if (PY) <table>table see original document page 121</column></row><table>

Tabela 1 (Continuação 13)

<table>table see original document page 121</column></row><table> /*

* read, return ptr to seq, set dna, Ien1 maxlen

* skip Iines starting with ';', '<', or '>'

* seq in upper or Iower case */

char *

getseq(file, len) getseq

char *file; /* file name */ int *len; /* seq Ien */

{

char line[1024], *pseq;

register char *px, *py; int natgc, tlen;

FILE *fp;

if ((fp = fopen(file,"r")) == 0) {

fprintf(stderr,"%s: can't read %s\n", prog, file); exit(1);

}

tlen = natgc = 0;

while (fgets(line, 1024, fp)) {

if (*line == || *line == '<' || *line == '>')

continue; for (px = line; *px != W; px++)

if (isupper(*px) || islower(*px)) tlen++;

}

if ((pseq = malloc((unsigned)(tlen+6))) == 0) {

fprintf(stderr,"%s: malloc() failed to get %d bytes for %s\n", prog, tlen+6, file);

exit(1);

>

pseq[0] = pseq[1] = pseq[2] = pseq[3] = '\0';

Page 1 of nwsubr.c

Tabela 1 (Continuação 14)

...getseq

py = pseq + 4; *len = tlen; rewind(fp);

while (fgets(line, 1024, fp)) {

if (*|jne == || *line == '<' || Ίίηβ == '>')

continue; for (px = line; *px != *\n'; px++) { if (isupper(*px))

*py++ = *px; else if (islower(*px))

*py++ = toupper(*px); if (index("ATGCU",*(py-1)))

natgc++;

}

}

*py++ = '\0'; *py = '\0·; (void) fclose(fp);

dna = natgc > (tlen/3); return(pseq+4); char *

g_calloc(msg, nx, sz) g calloc

char *msg; /* program, calling routine */

int nx, sz; /* number and size of elements 7

{

char *px, *calloc();

if ((px = calloc((unsigned)nx, (unsigned)sz)) == 0) { if (*msg) {

fprintf(stderr, "%s: g_calloc() failed %s (n=%d, sz=%d)\n",

prog, msg, nx, sz);

exit(1);

}

}

return(px);

}

/*

* get final jmps from dx[] or tmp file, set pp[], reset dmax: main() 7

readjmps() readjmps

{

int fd = -1;

int siz, iO, i1;

register i, j, xx; if (fi) {

(void) fclose(fj);

if ((fd = openGname, O RDONLY1 O)) < 0) {

fprintf(stderr, "%s: can't open() %s\n", prog, jname); cleanup(1); TABELA 1 (CONTINUACAO 15)

<table>table see original document page 125</column></row><table> <table>table see original document page 126</column></row><table> <table>table see original document page 127</column></row><table>

Tabela 1 (Continuação 16)

<table>table see original document page 127</column></row><table> fprintf(stderr, "%s: can't write %s\n", prog, jname);

exit(1);

}

}

(void) fwrite((char *)&dx[ix].jp, sizeof(struct jmp), 1, fj);

(void) fwrite((char *)&dx[ix].offset, sizeof(dx[ix].offset), 1, fj);

}

Page 4 of nwsubr.c

Tabela 2

<table>table see original document page 128</column></row><table>

% de identidade de seqüência de aminoácido = (ao número de partidas idênticas de resíduos de aminoácidos entre as duas seqüências de polipeptídeo como determinado pelo ALIGN-2) dividido pelo (número total de resíduos de aminoácido do polipeptídeo de referência) = 5 dividido por 15 = 33,3%

TABELA 3

<table>table see original document page 128</column></row><table>

% de identidade de seqüência de aminoácido = (ao número de partidas idênticas de resíduos de aminoácidos entre as duas seqüências de polipeptídeo como determinado pelo ALIGN-2) dividido pelo (número total de resíduos de aminoácido do polipeptídeo de referência) = 5 dividido por 10 = 50% Tabela 4

DNAde Referência NNNNNNNNNNNNNN (Comprimento = 14 nucleotídeos)

DNA de Comparação NNNNNNLLLLLLLLLL (Comprimento = 16 nucleotídeos)

% de identidade de seqüência de ácido nucleico = (ao número de partidas idênticas de nucleotídeos entre as duas seqüências de ácido nucléico como determinado pelo ALIGN-2) dividido pelo (número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico do DNA de referência) =6 dividido por 14 = 42,9%

Tabela 5

DNA de Referência NNNNNNNNNNNN (Comprimento = 12 nucleotídeos)

NNNNLLLVV (Comprimento = 9 nucleotídeos)

% de identidade de seqüência de ácido nucleico = (ao número de partidas idênticas de nucleotídeos entre as duas seqüências de ácido nucléico como determinado pelo ALIGN-2) dividido pelo (número total de nucleotídeos da seqüência de ácido nucléico do DNA de referência) = 4 dividido por 12 = 33,3%

II. Composições ε Métodos Da Invenção

Métodos E Significados

No momento, gliomas de alto grau são diagnosticados por critérios histopatológicos, e fatores fortes de prognóstico conhecidos para a maioria destes tumores estão limitados ao grau do tumor e idade do paciente. A aceitação comum de que as perdas dos chrs 1p e 19q são de valor para prognóstico em oligodendroglioma (Cairncross et al., J. Natl Câncer Inst. 90: 1473-1479 (1998) estimulou o interesse no desenvolvimento de marcadores moleculares para prever o resultado e a resposta ao tratamento através de uma ampla população de gliomas. Enquanto numerosas alterações genéticas foram descritas em GBM1 e algumas, como amplificação de EGFR e mutação de p53, parecem distinguir entre GBMs primário e secundário (von Deimling et al., Glia 15: 328-338 (1995); Watanabe et al., Brain Pathoi 6: 217-223 (1996), tais marcadores são de utilidade marginal para prever o resultado ou guiar decisões sobre o gerenciamento da doença. De forma importante, os estudos de perfil de expressão recentes revelaram que a classificação molecular de gliomas pode ter valor prognóstico (Freije et al., Câncer Res. 64: 6503-6510 (2004); Nutt et al., Câncer Res. 63: 1602-1607 (2003). No atual estudo, nós identificamos alterações moleculares associadas com a agressividade do tumor, como também com a progressão da doença e fornecemos evidências para sugerir que a classificação molecular pode ser usada para prever respostas às terapias-alvo.

Subclasses De Tumor Que Possuem Valor Para Prognóstico E Delineiam Um Padrão De Progressão Da Doença

A Depositante descreve no presente pedido um novo esquema de classificação de prognóstico para astrocitoma de alto grau que designa tumores em subtipos baseados na similaridade para definir assinatura de expressão. Cada um dos três subtipos moleculares de glioma lembra um conjunto de tecidos diferentes e é aprimorado para marcadores de diferentes aspectos de crescimento de tecido. Enquanto as análises atuais utilizam um conjunto de 35 assinaturas de genes, estes marcadores são representativos de listas de marcadores muito mais longas que podem ser usadas para identificar cada subtipo de tumor. Um subtipo de tumor que nós chamamos de proneural (PN), é diferenciado pelo melhor prognóstico de marcação e expressa genes associados com o cérebro normal e o processo de neurogênese. Dois subtipos de prognóstico fraco que são caracterizados por uma semelhança tanto para linhagens celulares altamente proliferativas ou tecidos de origem mesenquimal mostram ativação de programas de expressão gênica indicativos de proliferação celular ou angiogênese, respectivamente. Nós especulamos que a pobre sobrevida associada com os tipos de tumor Mes e Prolif está relacionada com um crescimento vantajoso conferido tanto pela rápida taxa de divisão celular como sobrevida aumentada de células tumorais fornecida pela neovascularização. Enquanto a mera presença ou ausência ou vascularização ou figuras mitóticas não distinguem subclasses, isto é esperado, já que estas características são marcas de quase todos os glioblastomas multiformes. Estudos prévios sugeriram o valor prognóstico de marcadores de proliferação ou angiogênese em glioma (Ho et al., Am. J. Clin. Pathol. 119: 715-722 (2003); Hsu et ai, Câncer Res. 56: 5684-5691 (1996); Osada et ai, Anticancer Res. 24: 547-552 (2004), mas não identificaram a existência de subconjuntos diferentes de tumor que estão associados de forma diferente com estes processos. Com importância, nossos subtipos Prolif e Mes são caracterizados pela expressão de subconjuntos de marcadores de uma assinatura de cicatrização que foi associada com resultado fraco em diversos tipos de tumores epiteliais. Ver Tabela A; (Chan g et ai, P.N.A.S. (USA) 85: 704-710 (2005).

Os subtipos de tumor identificados no atual estudo revelam semelhanças com os subtipos de prognóstico relatados previamente, identificados pelo perfil de expressão. Em específico, três estudos previamente publicados relatam fenótipos que lembram intimamente os subtipos de tumor PN e Mes que nós descrevemos (Freije et al., acima; Liang et al., P.N.A.S. (USA) 102: 5814-5819 (2005); Nigro et al., CancerRes. 65: 1678-1686 (2005) Além disso, trabalho anterior (Godard et al., CancerRes. 63: 6613-6625 (2003) destaca um agrupamento de genes angiogênicos que definem uma subpopulação de tumor que parece similar ao nosso subtipo de tumor Mes. Nossa observação de um padrão mutuamente exclusivo de expressão de maracadores de PN versus Mes ajuda a explicar o consenso relativo à existência destes dois subtipos de tumor. Mesmo dentro das espécimes de tumor que expressam tanto marcadores PN como Mes, nós descobrimos uma distribuição de expressão não sobreposta. A forte associação entre LOH10 e a distinção entre assinaturas Mes e PN é consistente com as descobertas anteriores que ligam LOH10 a assinaturas de expressão prognósticas (Nigro et al., Câncer Res. 65: 1678-1686 (2005) e a associação entre um fenótipo angiogênico e LOHIO é consistente com a demonstração de ações anti- angiogênicas da introdução no cromossomo 10 nas linhagens GBM (Hsu et al., CancerRes. 56: 5684-5691 (1996).

A existência de um subtipo de tumor diferente que seja aprimorado para marcadores de proliferação foi apontada por um relatório anterior (Freije et al., supra.), mas não descrita em outros estudos. Nossas descobertas indicam que a assinatura de Prolif é menos exclusiva do que as assinaturas de PN ou Mes e que a proporção de gliomas que ocorre com uma assinatura de Prolif varia através de amostras de populações obtidas de diferentes instituições. Apoiando nossa categorização da subclasse de tumor Prolif como um subtipo molecular de tumor diferente, nós apontamos para a existência nos tumores Prolif de um padrão de alterações genômicas que distingue este subtipo de tumor. Mais notavelmente, ganhos do locus PIK3R3 no cromossomo 1 parecem ser uma caracetrística única para tumores da classe Prolif. A existência de uma alteração genômica exclusiva para tumores que produzem a assinatura Prolif argumenta em favor da designação destes tumores como uma subclasse diferente e sugere que fatores epidemiológicos pode ter influenciado a incidência desta subclasse nas populações investigadas.

A impressionante exclusividade mútua das assinaturas dos tumores PN e Mes sugere a possibilidade de que estes subtipos de tumor reflitam realidades distintas da doença, talvez sugerindo de alguma forma tipos celulares de origem diferente. Pelo estudo de pares compatíveis de tumores primários e recorrentes dos mesmos pacientes, no entanto, nós observamos que alguns tumores que originalmente surgem como subtipo PN ou Prolif retornam com uma assinatura Mes. Expressão focal de CHI3L1/YKL40, um marcador do fenótipo Mes, é vista em tumores primários, incluindo aqueles que mudam para classe Mes sob recorrência. Notavelmente, nenhum exemplo de tumore que recebe caráter PN apreciável é visto entre a apresentação inicial e recorrência. Junto com a habilidade das linhagens de célula tronco neural mudar da assinatura PN para Mes, a habilidade de mudar de subclasse sugere que os subtipos de tumor podem representar estados de diferenciação alternados da doença. Nós não podemos, no entanto, tirar de qualquer possibilidade que algumas mudanças aparentes podem refletir heterogenidade de tumor ao invés de mudanças temporais no caráter do tumor. Além disso, nosso projeto experimental não nos permite distinguir entre alterações na expressão gênica que reflita progressão da doença daquelas que são obtidas pelos efeitos do tratamento. Todavia, nossa descoberta de mudança unidirecional de subclasse de tumor sugere a possibilidade de que células tumorais adquirem o fenótipo Mes como um resulltado do acúmulo de anormalidades genéticas ou epigenéticas. A idade avançada de pacientes com tumores de subtipo Mes é consistente com tal hipótese.

Enquanto nós não temos evidências diretas para eventos moleculares que sustentam a aparente mudança na assinatura da célula tumoral, a forte correlação entre perdas do cromossomo e a assinatura Mes pode oferecer uma importante percepção da biologia de progressão da doença. Considerando a base do mecanismo, mudanças em direção ao fenótipo Mes parecem ser um padrão comum de progressão da doença e são reminiscentes de transições epiteliais para mesenquimais (EMT) que estão associadas com o aumento do comportamento maligno de tumores epiteliais. Consistentes com o papel central da ativação de Akt em EMT [Larue e Bellacosa1 Oncogene 24: 7443 (2005)], nossos dados sugerem que Akt atua na indução de uma transição mesenquimal em gliomas.

MARCADORES NA SINALIZACAO NOTCH E AKT PREVEEM AGRESSIVIDADE DE GLIOMA

Nossas descobertas demonstram evidência genômica, níveis de mRNA e proteína que ativam alterações de sinalização Akt em tumores de subtipos de prognóstico desfavorável. Uma abundância de dados anteriores apóia uma função para sinalização akt na promoção de formação e crescimento de malignidades gliais de alto grau (Knobbe et al., Neuro-Oncology 4: 196-211 (2002); Sonoda et al., Câncer Res. 61: 6674-6678 (2001). Uma série de diferentes estudos em modelos de camundongo modificados geneticamente demonstrou de forma convincente uma função para akt na promoção da formação e crescimento de malignidades gliais (Holland et al., Nature Genetics 25: 55-57 (2000); Rajasekhar et al., Mol. Cell 12: 889-901 (2003); Uhrbom et al., Câncer Res. 62: 5551-5558 (2002); Xiao et al., Câncer Res. 65: 5172-5180 (2005). Em tumores humanos, tanto amplificação de EGFR como deleção de PTEN são alterações bem conhecidas que ativam akt e estão especificamente associadas com a distinção entre GBM versus lesões de baixo grau (Stiles et al., Mol. Cell Bioi 22: 3842-3851 (2002). Mais recentemente, ambas as mutações em PIK3CA e número de cópia equlibrado em PIK3CA e PIK3CD foram descritos em AA e GBM (Broderick et al., Câncer Res. 64: 5048-5050 (2004); Mizoguchi et al., Brain Pathol. 14: 372-377 (2004); Samuels et al., Science 304: 554 (2004). Enquanto o valor prognóstico da amplificação EGFR ou alterações genéticas nas subunidades PI3K não é claro, diversos estudos mostraram que a perda no cromossomo 10, perda do locus PTEN, ou sinalização aumentada de PI3K estão todos associados com o resultado desfavorável no GBM (Chakravarti et al., J. Clin. Oncol. 22: 1926- 1933 (2004); Lin et al., Clin. CancerRes. 4: 2447-2454 (1998); Schmidt et al., J. Neur. Exp. NeuroL 61: 321-328 (2002); Smith et al., J. Nat. Câncer Inst. 93: 1246-1256 (2001); Tada et al., J. Neurosurg. 95: 651-659 (2001). A ativação da sinalização de PI3K/akt está envolvida em diversos processos biológicos que conferem vantagem no crescimento, incluindo proliferação, sobrevivência e angiogênese (Abe et al., Câncer Res. 63: 2300-2305 (2003); Pore et al., CancerRes. 63: 236-241 (2003); Su et al., CancerRes. 63: 3585-3592 (2003). Dessa forma, nós especulamos que o resultado desfavorável de tumores de subtipos Prolife Mes resulta das ações de sinalização PI3K/akt para promover padrões de crescimento mais agressivo caracterizados pela alta taxa de proliferação ou neoangiogênese, respectivamente. Descobertas atuais não proporcionam hipóteses claras para explicar a divergência entre as manifestações proliferativa versus angiogênica de sinalização akt nos dois tipos de prognóstico desfavorável, mas uma possibilidade é que perdas mais freqüentes do Ioci no cromossomo 10 ou ganhos no cromossomo 7 nos tumores Mes podem contribuir para esta distinção. A alta freqüência de marcadores codificados no ch19 é interessante sob esse aspecto.

A ativação de sinalização Notchl foi recentemente ligada a diversas malignidades, incluindo glioma (Fan et al., Câncer Res. 64: 7787-7793 (2004); Purow et al., Câncer Res. 65: 2353-2363 (2005); Radtke e Clevers, Science 307: 1904-1909 (2005); Weng et al., Science 306: 269-271 (2004). Nossas observações demonstram valor prognóstico de marcadores da via Notch nos gliomas de alto grau. Especificamente, nós descobrimos que a coloração nuclear Notchl e mRNA para diversos elementos da via Notch são aprimorados de modo significante com melhor resultado no subtipo de tumor PN quando comparado aos subtipos de prognóstico desfavorável. Ainda, nós descobrimos nas duas amostras de população independentes que a expressão de mRNA para DLL3 está correlacionada com sobrevivência mais longa, particularmente nos casos onde a expressão de PTEN é alta. Enquanto diversas interpretações são possíveis, uma possibilidade interessante é que na presença de PTEN intacto, a atividade inibitória de DLL3 na sinalização notch [Ladi et al., J. Cell Bioi 170: 983-992 (2005)] pode limitar o crescimento do tumor pela promoção de um fenótipo mais diferenciado. Apesar da função precisa da sinalização Notch, o valor prognóstico de nosso modelo de duplo gene PTEN & DLL3 Cox apontam claramente para sinalização akt e Notch como principais determinantes do crescimento do tumor. Paralelos Entre Regulação De Crescimento De Glioma E Neurogênese Do

Prosencéfalo

A atual investigação liga prognóstico de subtipos de tumor a diferenças na expressão relativa de célula tronco versus marcadores de neuroblastoma, como também a diferenças nos elementos de sinalização Akt e Notch. Um modelo para gliomas humanos é aquele que todos os subtipos definidos molecularmente surgem de forma similar a partir do tipo celular de origem, mas alguns tumores são mantidos em mais fenótipos não diferenciados de células neurais similares à célula tronco (Mes) ou similares às de amplificação transitória (ProIif)j enquanto outros (PN) adotam um fenótipo mais próximo daquele de neuroblastos ou neurônios imaturos. Este modelo, mantido por estudos animais [Bachoo et al., Câncer Cell 1: 269-277 (2002); Fomchenko e Holland, Exp. Cell Res. 306: 323-329 (2005)], não faz previsão específica tal para qual(is) estágio(s) junto com o eixo de diferenciação a partir da célula tronco neural para linhagem neuronal ou glial os tipos celulares de origem para gliomas de alto grau residem e diminuem tal que o fenótipo do tumor possa ser ditado por alterações moleculares na via de sinalização. Em consideração às funções críticas de que especialista em PTEN e notch garantem a neurogênese do prosencéfalo para manter células-tronco neurais ou progenitoras em um estado de proliferação não diferenciado (Groszer et al., Science 294: 2186-2189 (2001); Sakamoto et al., J. Bioi Chem. 278: 44808- 44815 (2003); Yoon e Gaiano, Nature Neurosci. 8: 709-715 (2005), nossas descobertas sugerem que a agressividade do crescimento do glioma pode ser amplamente governada por processos que regulam escolhas do destino da célula durante a neurogênese.

O fenótipo dos subtipos de tumor recém-definidos se compara aos estágios na neurog6enese no cérebro humano. Similar aos precursores neuronais comprometidos (ou neuronal-oligodendroglial), tumores do subtipo PN parecem ter uma taxa baixa de proliferação, e expressam marcadores associados com neuroblastos e neurônios imaturos. A transcrição de fatores OLIG2 e AscM junto com outros marcadores de linhagem neuronal. Ao contrário, tumores do subtipo Mes e Prolif são desprovidos de marcadores de linhagem neuronal, mas repetem aspectos de células-tronco neurais e/ou células de amplificação. O paralelo entre a taxa aparentemente rápida de proliferação de tumores Prolif e das células de amplificação transitória é aparente de imediato. Além disso, nós descobrimos que alguns tumores do subtipo Prolif, mas nanhuma outra classe, são caracterizados pela forte expressão de MELK, um marcador de células precursoras mulripotencial de rápida proliferação no prosencéfalo de roedores. Nakano et al., J. Cell Biol. 170: 413 (2005). Ainda, as amplificações EGFR em tumores tanto da subclasse Prolif como Mes se comparam em responsividade tanto das células- tronco neurais como células de amplificação transitória para EGF (Doetsch et al., Neuron 36: 1021-1034 (2002). A expressão do músculo liso, células endoteliais e marcadores de cartilagem pelos tumores Mes é reminiscente da multipotencialidade relatada das células- tronco neurais do prosencéfalo adulto. Bani-Yaghoub et al., Development 131: 4287-4298 (2004); Rietze et al., Nature 412: 736-739 (2001); Sieber-BIum, Developmental Neuroscience 25:273-278 (2003); Wurmser et al., Nature 430: 350-356 (2004). Uma advertência na interpretação, no entanto, refere-se à possibilidade de que os perfis de expressão do tumor podem ser confundidos pelo recrutamento das populações de células similares às células-tronco para a massa tumoral.

De maneira intrigante, os paralelos entre o fenótipo de tumor Mes e extensões de células-tronco neurais incluem uma recaptulação da ássociaçãp próxima vista entre células-tronco neurais e células endoteliais. Ao contrário de outros subtipos de tumor, tumores Mes exibem forte expressão de VEGF, seus receptores e marcadores de células endoteliais. Recentes descobertas indicam que promotores VEGF promovem proliferação e sobrevida de células-tronco neurais do prosencéfalo adulto e demonstram que fatores secretados a partir de células endoteliais também promovem proliferação de célula tronco neural (Cao et al., Nature Genetics 36: 827-835 (2004); Fabel et al., Eur. J. Neurosci. 18: 2803-2812 (2003); Jin et al., P.N.A.S. (USA) 99: 11946-11950 (2002); Maurer et al., Neurosci. Lett. 344: 165-168 (2003); Schanzer et al., Brain Patho!. 14: 237-248 (2004); Shen et al., Science 304: 1338-1340 (2004); Yasuhara et al., Reviews Neurosci. 15: 293-307 (2004); Zhu et al., FASEB J. 17: 186-193 (2003). É interessante especular que o crescimento de células tumorais do fenótipo de tumor Mes pode ser apoiado pelas ações de níveis aumentados de VEGF e/ou fatores derivados endoteliais. Sob esse aspecto, terapias que se direcionam ao VEGF ou seus receptores podem ser benéficas não somente no direcionamento da neovasculatura, mas também inibindo diretamente o crescimento de células tumorais que manifestam uma biologia similar à célula tronco neural. Inativação direcionada de VEGF no tubo neural demonstrou recentemente produzir tanto defeitos vasculares como um grau profundo de apoptose neuronal no prosencéfalo murino (Raab et al., Thrombosis Haemostasis 91: 595-605 (2004).

Implicações Terapêuticas

As presentes descobertas oferecem diversas implicações para o desenvolvimento de terapias efetivas para glioma. Primeiro, a atual investigação adiciona ao crescimento consenso de que o tratamento mais eficiente de malignidades gliais pode contar com regimes de tratamento em categorias moleculares de tumor distintas (Mischel et ai., Câncer Biol. Therapy 2: 242-247 (2003); Newton, Expert Rev. Antican. Ther. 4: 105-128 (2004); Rao et al., Frontier Biosci. 8: e270-280 (2003). Nossas descobertas in vitro sugerem que as assinaturas moleculares que nós definimos podem prever respostas aos agentes que se direcionam às vias de sinalização específicas. Segundo, nossas descobertas apoiam o valor de direcionamento tanto das vias Akt como Notch no desenvolvimento de novos regimes terapêuticos para glioma de alto grau. Terceiro, a sugestão de que a recorrência de tumor após terapias padrão pode ser acompanhada por uma mudança fenotípica em um estado mesenquimal, angiogênico ressalta o valor de direcionamento deste estado fenotípico de agressividade, mesmo em tumores com um fenótipo de agressividade menor. Finalmente, correlações entre a biologia de célula tronco e fenótipos agressivos de glioma sugere que o maior entendimento de neurogênese do prosencéfalo pode levar à novas percepções para intervenções terapêuticas em malignidades gliais.

A. Anticorpos Anti-GDM

Em uma realização, a invenção fornece o uso de anticorpos anti- GDM que podem encontrar um uso no presente pedido como agentes terapêuticos, de diagnóstico e/ou de prognóstico na determinação da severidade efou prognóstico do curso da doença de glioma. Anticorpos exemplares que podem ser usados para tais propósitos incluem anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados, biespecíficos e heteroconjugados.

1. Anticorpos Policlonais

Anticorpos policlonais são preferivelmente cultivados em animais por múltiplas injeções subcutânea (sc) ou intraperitonial (ip) do antígeno relevante e um adjuvante. Pode ser útil conjugar o antígeno relevante (especialmente quando peptídeos sintéticos são usados) a uma proteína que seja imunogênica para a espécie a ser imunizada. Por exemplo, o antígeno pode ser conjugado pode ser útil conjugar o antígeno relevante a uma proteína que é imunogênica na espécie a ser imunizada, por exemplo, hemocianina de lapa californiana, albumina do soro, tiroglobulina bovina, ou inibidor de tripsina de soja, usando-se um agente bifuncional ou de derivação, por exemplo, éster sulfosuccinimida maleimidobenzoil (conjugação através de resíduos cisteína), N-hidroxisuccinimida (através de resíduos lisina), glutaraldeído, anidrido succínico, SOCl2, ou R1N=C=NR, onde R e R1 são grupos alquil diferentes.

Os animais são imunizados contra o antígeno, conjugados imunogênicos, ou derivados por combinação, por exemplo, 100 pg ou 5 pg de proteína ou conjugado (para coelhos ou camundongos, respectivamente) com 3 volumes de adjuvante completo de Freund e injetando a solução por via intradérmica em múltiplos locais. Um mês depois, os animais são estimulados com 1/5 a 1/10 da quantidade original do peptídeo ou conjugado em adjuvante completo de Freund por injeção subcutânea em múltiplos locais. Sete a 14 dias depois, os animais são sangrados e o soro é analisado por titulação de anticorpo. Animais são estimulados até a titulação platô. Conjugados também podem ser feitos na cultura celular recombinante como proteína de fusão. Além disso, agentes de agregação tal como alúmen são usados adequadamente para aprimorar a resposta imune.

2. Anticorpos Monoclonais

Anticorpos monoclonais podem ser fabricados usando-se o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et al., Nature 256: 495 (1975) ou podem ser fabricados por métodos de DNA recombinante (patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como hamster, é imunizado como descrito acima para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão ligar-se especificamente à proteína utilizada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Após imunização, os linfócitos são isolados e então fundidos com uma linhagem celular de mieloma, usando-se um agente de fusão apropriado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies:_Principles and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura apropriado, que preferivelmente contenha uma ou mais substâncias que inibam o crescimento ou a sobrevida das células de mieloma parentais não fundidas (também chamadas de parceiro de fusão). Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contêm a enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura seletivo para os hibridomas irá incluir tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que previnem o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma parceiras de fusão preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio seletivo que seleciona contra as células parentais não fundidas. Linhagens celulares de mieloma preferidas são as linhagens de mieloma de murino, como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 e derivadas, por exemplo, células X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultivo, Manassas1 Virgínia, EUA. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, págs. 51-63 (Mareei Dekker1 Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para determinar a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra o antígeno. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por meio da análise Scatchard descrita em Munson et al., Anal._Biochem., 107:220 (1980).

Uma vez que as células de hibridoma que produzem anticorpos de especificidade, afinidade e/ou atividade desejadas são identificadas, os clones podem ser subclonados por meio da limitação de procedimentos de diluição e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas. 59-103 (Academic Press, 1986)). Meio de cultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como ascite tumoral em um animal, por exemplo, por injeção i.p das células nos camundongos.

Os anticorpos monoclonais secretados por subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro, por procedimentos convencionais de purificação de anticorpo, tais como, por exemplo, cromatografia de afinidade (por exemplo, usando-se Sefarose de proteína A ou proteína G) ou cromatografia de troca iônica, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, etc.

O DNA que codifica os anticorpos monoclonais é facilmente isolado e sequenciado utilizando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias leve e pesada de anticorpos de murinos). As células de hibridoma servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são transfectados em seguida em células hospedeiras como células E. coli, células COS de símios, células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína do anticorpo, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de análise sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica o anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262 (1993) and Plückthun, Immunol. Revs. 130:151-188 (1992).

Em uma realização adicional, anticorpos monoclonais ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature1 352:624-628 (1991) e Marks et al., J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991) descrevem o isolamento de anticorpos murinos e humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fago. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de alta afinidade (faixa de nM) pela mistura de cadeias (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), assim como infecções combinatórias e recombinação in vivo, como estratégia para a construção de bibliotecas de fago muito grandes (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Dessa forma, essas técnicas são alternativas viáveis para técnicas de hibridoma de anticorpos monoclonais tradicionais para o isolamento de anticorpos monoclonais.

O DNA que codifica o anticorpo pode ser também modificado para produzir polipeptídeos do anticorpo quimérico ou de fusão, por exemplo, pela substituição das seqüências de domínio constante de cadeia pesada e de cadeia leve humanas (Ch e CL) por seqüências homólogas de murino (patente US 4.816.567; e Morrison1 et al„ Proc._Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)), ou por fusão da seqüência que codifica imunoglobulina com toda ou parte da seqüência de codificação por um polipeptídeo não-imunoglobulina (polipeptídeo heterólogo). As seqüências de polipeptídeos não imunoglobulina podem substituir os domínios constantes de um anticorpo, ou eles são substituídos pelos domínios variáveis de um sítio de combinação de antígeno de um anticorpo para criar um anticorpo bivalente quimérico que compreende um sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno e outro sítio de combinação de antígeno que tem especificidade para um antígeno diferente.

3. Anticorpos Humanos ε Humanizados Os anticorpos anti-GDM úteis na prática da invenção podem também compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos destes (tais como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outros antígenos que se ligam a subsequências de anticorpos) que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região determinada por complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato ou coelho que têm a especificidade, afinidade, e capacidade desejada. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura Fv da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Anticorpos humanizados podem também compreender resíduos que não são encontrados nem no anticorpo receptor nem nas seqüências de estrutura ou CDR importada. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos das regiões CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas das regiões FR são aquelas de uma seqüência consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado, de modo mais eficiente, irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc)1 tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].

Métodos para humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidos na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos a partir de uma fonte não humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente chamados de resíduos "importados", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)], pela substituição de CDRs de roedores ou seqüências CDR pelas seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores.

A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leve como pesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade e resposta HAMA (anticorpo anti- camundongo humano) quando o anticorpo é programado para usos terapêuticos humanos. De acordo com o método também conhecido como "melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em oposição à biblioteca completa das seqüências de domínio variável humana conhecidas. A seqüência humana de domínio V, que é a mais próxima da do roedor é então identificada e a região de estrutura humana (FR) dentro desta é aceita para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Moi Biol., 196:901 (1987)). Outro método utiliza uma região de estrutura específica derivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser utilizada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., Proc. Nati Acad. Sei. U. S. A., 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151:2623 (1993)).

É também importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade de ligação para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método preferido, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise das seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais que usam modelos tridimensionais das seqüências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles técnicos no assunto. Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional das seqüências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam na habilidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados das seqüências do receptor e importada de forma que a característica do anticorpo desejada, tal como aumento de afinidade para o antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação do antígeno.

Várias formas de um anticorpo humanizado anti-GDM são contempladas. Por exemplo, o anticorpo humanizado pode ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab, que é opcionalmente conjugado com um ou mais agente(s) citotóxico(s) para gerar um imunoconjugado. Alternativamente, o anticorpo humanizado pode ser um anticorpo intacto, como um anticorpo IgGI.

Como uma alternativa para humanização, podem ser gerados anticorpos humanos. Por exemplo, agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (Jh) da região de união da cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes e quiméricos da linhagem de origem resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da linhagem de origem humana do conjunto de gene de imunoglobulina em tais camundongos mutantes de linhagem de origem irá resultar na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7:33 (1993); patentes US 5.545.806, 5.569.825, 5.591.669 (todas da GenPharm), 5.545.807, e documento WO 97/17852.

Alternativamente, tecnologia de exibição por fago (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) pode ser utilizada para produzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro a partir de repertórios de genes de domínio variável (V) de imunoglobulina de doadores não imunizados. De acordo com esta técnica, os genes do domínio V do anticorpo são clonados em quadro tanto em um gene de proteína de revestimento maior como menor de um bacteriófago filamentoso, tal como M13 ou fd, e exibidos na forma de fragmentos de anticorpos funcionais sobre a superfície da partícula de fago. Como a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de fita única do genoma de fago, as seleções baseadas nas propriedades funcionais do anticorpo também resultam na seleção do gene que codifica o anticorpo que exibe aquelas propriedades. Dessa forma, o fago imita algumas das propriedades da célula Β. A exibição por fago pode ser realizada em uma série de formatos; revisadas em, por exemplo, Johnson, Kevin S. e Chiswell1 David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Diversas fontes de segmentos de gene V podem ser utilizadas para exibição por fago. Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) isolaram um conjunto diverso de anticorpos anti-oxazolona a partir de uma pequena biblioteca combinatória aleatória de genes V derivados de baços de camundongo imunizado. Um repertório de genes V de doadores humanos não imunizados pode ser construído e anticorpos para um conjunto diverso de antígenos (incluindo auto-antígenos) podem ser isolados seguindo-se essencialmente as técnicas descritas por Marks et al., J. MoL Biol. 222:581-597 (1991), ou Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver, também, patentes US 5.565.332 e 5.573.905.

Como discutido acima, anticorpos humanos podem também ser gerados por células B ativadas in vitro (ver patentes US 5.567.610 e 5.229.275).

4. Fragmentos De Anticorpo

Em certas circunstâncias existem vantagens em usar fragmentos de anticorpo ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida liberação, ao mesmo tempo que retém especificidade de ligação de antígeno similar da molécula de comprimento total correspondente, e pode levar à melhora ao acesso de tumores sólidos.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e scFv podem todos ser expressados em e secretados por E. coli, permitindo dessa forma a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos de Fab1-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos de F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com meia-vida aumentada in vivo que compreendem resíduos do epitopo de ligação do receptor de resgate estão descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo da seleção é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/07378, patente US 5.571.894 e patente US 5.587.458. Fv e sFv são os únicos tipos com sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes, então, eles são adequados para reduzir ligação não específica durante o uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para render fusão de uma proteína efetora tanto na terminação amino como carboxi de um sFv. Ver Antibody Engineeringl ed. Borrebaeck,acima. Os fragmentos de anticorpo podem também ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descritos na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

5. Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois epitopos diferentes. Anticorpos biespecíficos exemplares podem ligar-se a dois antígenos PDM separadamente ou a dois epitopos diferentes em um polipeptídeo GDM específico descrito no presente pedido. Outros tais anticorpos podem combinar um sítio de ligação de GDM com um sítio de ligação para outra proteína. Alternativamente, um braço do anti-GDM pode ser combinado com um braço que se liga a uma molécula acionadora em um leucócito como uma molécula receptora de célula T (por exemplo, CD3), ou receptores Fc para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) e FcyRIII (CD16) assim como focalizar o mecanismo de defesa celular para a célula que expressa GDM. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam GDM. Estes anticorpos possuem um braço de ligação GDM e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, ricina de cadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Documento WO 96/16673 descreve um anticorpo anti-ErbB2/anti- FcyRIII e a patente US 5.837.234 divulga um anticorpo biespecífico anti- ErbB2/anti-FcYRI. Um anticorpo HER2/Fca biespecífico é mostrado no documento WO 98/02463. A patente US 5.821.337 ensina um anticorpo anti- ErbB2/anti-CD3 biespecífico.

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. A produção tradicional de anticorpos biespecíficos de comprimento total é baseada na coexpressão de dois pares de cadeia leve e cadeia pesada de imunoglobulina, em que as duas cadeias possuem especificidades diferentes (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Devido à seleção aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 e em Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de anticorpos e antígenos) são fundidos a seqüências de domínio constante de imunoglobulina. Prefererivelmente, a fusão é com um domínio constante de cadeia pesada de lg1 que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, Ch2 e Ch3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação de cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em uma célula hospedeira apropriada. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos de polipeptídeos em realizações quando razões desiguais das três cadeias de polipeptídeos utilizadas na construção fornecem os rendimentos ótimos do desejado anticorpo biespecífico. É, no entanto, possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um único vetor de expressão quando a expressão de pelo menos duas cadeias de polipeptídeos em razões iguais resultarem altos rendimentos ou quando as razões não forem de efeito significante no rendimento da combinação de cadeia desejada.

Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada de imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias leve e cadeia pesada de imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia de imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve de imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem está divulgada no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração de anticorpos biespecíficos ver, por exemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986).

De acordo com outra abordagem descrita na patente US 5.731.168, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser construída para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula de anticorpo são substituídas com cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula de anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos com cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo de aumento do rendimento do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, tais como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico a células indesejadas (patente US 4.676.980) e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/200373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados utilizando-se qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes reticulantes apropriados são bem conhecidos na técnica e descritos na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados utilizando-se ligações químicas. Brennan et al., Science 229:81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são clivados de forma proteolítica para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação bissulfeto intermolecular. Os fragmentos Fab' gerados são então convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fabt-TNB é então reconvertido para o Fab-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar do outro derivado do Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a imobilização seletiva de enzimas.

Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos de Fab-SH de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula do anticorpo F(ab')2 biespecífico humanizado em sua totalidade. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado de E. coli e sujeito a acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de ligar-se a células que superexpressam o receptor ErbB2 e células T humanas normais, assim como acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos utilizando-se fechos de leucina. Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Os peptídeos de fecho de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão de gene. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros de anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros de anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. O fragmento compreende um Vh conectado a um Vl por um Iigante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear-se com os domínios Vl e Vh complementares de outro fragmento, através disto, formando dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991).

6. Anticorpos Heteroconjugados

Anticorpos heteroconjugados estão também dentro do escopo da presente invenção. Anticorpos heteroconjugados são compostos de dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico a células indesejadas [patente US 4.676.980], e para o tratamento de infecções por HIV [documento WO 91/00360, documento WO 92/200373 e patente EP 03089], É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro usando-se métodos conhecidos na química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes reticulantes. Por exemplo, imunotoxinas podem ser construídas usando-se uma reação de troca de bissulfeto ou pela formação de um tioéter ligado. Exemplos de reagentes adequados para este propósito incluem iminotiolatos e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles divulgados, por exemplo, na patente US 4.676.980.

7. Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalent pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por meio de uma célula que expressa um antígeno aos quais os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucléico que codificam as cadeias de polipeptídeos do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo irá compreender uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminal para a região Fc. O anticorpo multivalente preferido no presente compreende (ou consiste de) três a cerca de oito, mais preferivelmente quatro, sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferivelmente duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, em que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc, X1 e X2 representa um aminoácido ou polipeptídeo, e η é 0 ou 1. Por exemplo, a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender: região de cadeia VH-CH1-flexível ligante-VH-CHI-Fc ; ou região de cadeia VH-CH1-VH-CH1-Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente, além disso, compreende pelo menos dois (e preferivelmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente preferido pode, por exemplo, compreender aproximadamente dois a oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos variáveis de cadeia leve aqui contemplados compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, também compreendem um domínio CL.

8. Engenharia De Função Efetora

Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção com respeito à função efetora, por exemplo, para aumentar citotoxicidade mediada por célula dependente de antígeno (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) de anticorpo. Isto pode ser alcançado pela introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos em uma região Fc do anticorpo. Alternativamente ou adicionalmente, resíduo(s) de cisteína pode ser introduzido na região Fc, através disso permitindo formação de ponte bissulfeto entre cadeias nesta região. O anticorpo homodimérico dessa forma gerado pode ter melhorado a capacidade de internalização e/ou aumento de morte celular mediada por complemento e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). Ver Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) e Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Anticorpos homodiméricos com atividade anti-tumor aumentada podem também ser preparados usando-se reticulantes heterobifuncionais como descrito em Wolff et al, Câncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, um anticorpo que possui regiões Fc dupla pode ser modificado e pode através disso ter aumento de capacidades de Iise de complemento e de ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para aumentar a meia vida do soro do anticorpo, pode-se incorporar um epitopo de ligação do receptor de resgate no anticorpo (especialmente um fragmento de anticorpo) como descrito na patente US 5.739.277, por exemplo. Como usado no presente, o termo "epitopo de ligação do receptor de resgate" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula IgG (por exemplo, IgGi, IgG2, lgG3, ou IgG4) que é responsável por aumentar in vivo a meia vida do soro da molécula de IgG.

9. Imunoconjugados

A invenção também está ligada a imunoconjugados que compreendem um anticorpo conjugado a um agente citotóxico como um agente quimioterapêutico, um agente inibítório do crescimento, toxina (por exemplo, uma toxina ativa enzimaticamente origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos disto), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

a. Agentes Quimioterapêuticos

Agentes quimioterapêuticos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII1 e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y e 186Re. Conjugados do anticorpo e agente citotóxico são feitos usando-se uma variedade de agentes de proteína de acoplamento bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP)1 iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (tal como dimetil adipimidato HCL), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), componentes bis-azido (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônio derivados (tal como bis-(p- diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6- diisocianato), e bis-ativos flúor combinados (tal como 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026.

Conjugação de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, tais como uma caliqueamicina, maitansinoides, um tricoteceno, e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem toxina ativa, são também contemplados no presente pedido.

b. Maitansina E Maitansinoides

Em uma realização preferida, um anticorpo anti-GDM (comprimento total ou fragmentos) da invenção é conjugado com uma ou mais moléculas maitansinoides.

Maitansinoides são inibidores mitóticos que agem por inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez do arbusto do Leste Africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Subseqüentemente foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinoides, tais como maitansinol e ésteres C-3 maitansinol (patente US 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos destes estão divulgados, por exemplo, nas patentes US 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663; e 4.371.533, cujos relatórios descritivos são integralmente incorporarados ao presente pela referência.

Na tentativa de aprimorar seus índices terapêuticos, maitansina e maitansinoides foram conjugados aos anticorpos especificamente para ligação aos antígenos de célula de tumor. Imunoconjugados que contêm maitansinoides e seus usos terapêuticos são divulgados, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente Européia EP 0 425 235 B1, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência. Liu et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinoide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 diretamente contra câncer coloretal humano. Foi descoberto que o conjugado é altamente citotóxico dirigido à cultura de células cancerosas de cólon, e foi mostrado ter atividade anti-tumor em testes de crescimento de tumor in vivo. Chari et ai, Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados no qual um maitansinoide foi conjugado via um Iigante bisulfeto a um anticorpo murino A7 que se liga a um antígeno de linhagem celular de câncer no cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que liga-se ao oncogene HER-2/neu. A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinoide foi testada in vitro em linhagem celular SK-BR-3 de câncer de mama humano, a qual expressa antígenos de superfície 3 χ 105 HER-2 por célula. A droga conjugada atingiu um grau de citotoxicidade similar à droga maitansinoide livre, a qual poderia ser aumentada para elevar o número de moléculas maitansinoide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinoide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo anti-GDM-maitansinoides ou fragmento de anticorpo de ligação de GDM-maitansinoide podem ser preparadas por ligações químicas em um anticorpo anti-GDM ou fragmento de anticorpo de ligação de GDM a uma molécula maitansinoide sem diminuição significativa da atividade biológica tanto do anticorpo ou da molécula maitansinoide. Em média de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade das células alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, no entanto poderia ser esperado que até uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade acima do uso do anticorpo nu. Maitansinoides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinoides adequados são divulgados, por exemplo, na patente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentes referidas no presente acima. Maitansinoides preferidos são maitansinol e análogos do maitansinol modificados em um anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, tal como vários ésteres maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fazer conjugados anticorpo-maitansinóide ou fragmento de anticorpo- maitansinóide, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1, e Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992). Os grupos de ligação incluem grupos bissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábil, grupos lábil peptidase, ou grupos lábil esterase, como divulgado nas patentes acima identificadas, grupos bissulfeto e tioéter são preferidos.

Conjugados do anticorpo ou fragmento do anticorpo e maitansinóide podem ser feitos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2- piridilditio) propionato (SPDP)1 succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1- carboxilato, iminotiolano (IT)1 derivados de imidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), bis-azido combinados (tal como bis (p- azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p- diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6- diisocianato), e bis-ativo flúor combinados (tal como 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos incluem N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et a!., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP) para fornecer uma ligação bissulfeto.

O ligante pode ser anexado à molécula maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, um éster de ligação pode ser formado por reação com um grupo hidroxil usando-se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 tendo um grupo hidroxil, na posição C-14 modificada com hidroximetil, na posição Ο- 15 modificada com um grupo hidroxil, e na posição C-20 tendo um grupo hidroxil. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou um maitansinol análogo.

c. Caliqueamicina

Outro imunoconjugado de interesse compreende um anticorpo anti-GDM ou fragmento de anticorpo de ligação de GDM conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fita dupla de DNA em concentrações sub- picomolar. Para a preparação de conjugação da família caliqueamicina, ver patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Estruturas análogas de caliqueamicina que podem ser usadas incluem, mas não são limitadas para, γ1, aj, 03', N-acetil-γ-ι1, PSAG e θ'ι (Hinman et ai, Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et a/., Câncer Research 58:2925- 2928 (1998) e as supracitadas patentes US para American Cyanamid). Outra droga anti-tumor que o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Ambas caliqueamicina e QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessam de imediato a membrana plasmática. Então, a percepção celular destes agentes através da internalização mediada pelo anticorpo aumenta muito seus efeitos citotóxicos.

d. Outros Agentes Citotóxicos Outros agentes anti-tumor que podem ser conjugados com os anticorpos antiGDM da invenção incluem BCNU1 estreptozoicina, vincristina e 5-flúor uracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL- E33288 descrita nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamicinas (patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteína de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina, e os tricotecenos. Ver, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção também contempla um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease tal como uma desoxirribonuclease; DNase).

Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. As variedades de isótopos radioativos estão disponíveis para a produção de anticorpos anti-GDM radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321 Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando a conjugação é usada para diagnóstico, pode compreender um átomo radioativo por estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I1231 ou um spin Iabel para imagem de ressonância nuclear (NMR) (também conhecido como imagem de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolinio, manganês ou ferro.

O radio ou outros marcadores podem ser incorporarados na conjugação de maneiras conhecidas. Por exemplo, o pepitídeo pode ser biosintetizado ou podem ser sintetizados por síntese química de aminoácido usando-se aminoácidos precursores adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tal como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In^111 podem ser anexados via um resíduo de cisteína no pepitídeo. ítrio-90 pode ser anexado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.

A conjugação do anticorpo e agente citotóxico pode ser feita usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionais tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), bis-azido combinados (tal como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenediamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e bis-ativo flúor combinados (tal como 1,5-dif!úor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, pode ser usado um ligante ácido lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et al., CancerResearch 52:127-131 (1992); patente US 5.208.020).

Alternativamente, uma fusão de proteína que compreende o anticorpo anti-GDM ou fragmento de anticorpo de ligação de GDM e agente citotóxico podem ser feitos, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de pepitídeo. O comprimento do DNA pode compreender respectivas regiões que codificam as duas porções da conjugação tanto adjacente uma a outra como separada por uma região que codifica um pepitídeo ligante o qual não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (como estreptavidina) para utilização no tumor pré- direcionado em que a conjugação anticorpo receptor é administrada ao paciente, seguido por remoção de conjugação não ligada da circulação usando-se um agente de limpeza e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). 10. Imunolipossomos

Os anticorpos anti-GDM ou fragmento de anticorpo de ligação de GDM divulgados no presente também podem ser formulados como imunolipossomos. Um "lipossomo" é uma vesícula pequena composta de vários tipos de lipídeos, fosfolipídeos e/ou surfactante que é útil para a entrega de uma droga para um mamífero. Os componentes do lipossomo estão comumente dispostos em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico de membranas biológicas. Lipossomos que contêm o anticorpo são preparados pelos métodos conhecidos na técnica tal como descrito em Epstein et al., Proc. NatL Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985); Hwang et ai, Proc.Nati Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980); patentes US 4.485.045 e 4.544.545; e documento WO 97/38731 publicado em 23 de outubro de 1997. Lipossomos com tempo de circulação aumentada estão divulgados na patente US 5.013.556.

Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação de fase reversa com uma composição de lipídeo que compreende fosfatidicolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Lipossomos são retirados através de filtros com tamanho de poro definido para produzir Iipossomos com o diâmetro desejado. Fragmentos Fab1 do anticorpo da presente invenção podem ser conjugados aos Iipossomos como descrito em Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) via uma reação entre cadeia de bissulfeto. Um agente quimioterapêutico está opcionalmente contido dentro do lipossomo. Ver Gabizon et al. J. National Câncer /nsí.81 (19)1484 (1989).

B. Oligopeptídeos De Ligação De GDM

Oligopeptídeos de ligação de GDM da presente invenção são oligopeptídeos que se ligam, preferivelmente com exclusividade, ao polipeptídeo GDM como descrito no presente pedido. Oligopeptídeos de ligação de GDM podem ser sintetizados quimicamente usando-se metodologias de síntese de oligopeptídeo conhecidas, ou podem ser preparados e purificados usando-se tecnologia recombinante. Oligopeptídeos de ligação de GDM têm usualmente pelo menos aproximadamente 5 aminoácidos em comprimento, alternativamente pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, ou 100 aminoácidos em comprimento, ou mais. Oligopeptídeos de ligação de GDM podem ser identificados sem experimentação exagerada usando-se técnicas conhecidas. Com este propósito, é apontado que técnicas para seleção de bibliotecas de oligopeptídeo para oligopeptídeos que são capazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo alvo são bem conhecidas (ver, por exemplo, patentes US 5.556.762, 5.750.373, 4.708.871, 4.833.092, 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689, 5.663.143; publicações PCT documento WO 84/03506 e documento WO 84/03564; Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:178-182 (1985); Geysen et al., em Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986); Geysen et al., J. immunoi. Meth., 102:259-274 (1987); Schoofs et al., J. Immunol., 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378; Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature, 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang, A.S. et ai. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8363, e Smith, G. P. (1991) Current Opin._Biotechnol., 2:668).

Sob esse aspecto, exibição por bacteriófago (fago) é uma técnica bem conhecida que permite selecionar almplas bibliotecas de oiligopeptídeos para identificar membro(s) daquelas bibliotecas que são capazes de especificamente se ligar a um alvo popilpeptídico. Exibição por fago é uma técnica pela qual polipeptídeos variantes são exibidos como proteínas de fusão para a proteína de revestimento na superfície das partículas de bacteriófagos (Scott1 J.K. e Smith, G. P. (1990) Science, 249: 386). A utilidade da exibição por fago permanece no fato de que bibliotecsa de seletividade randomizada de proteínas variantes (ou cDNAs clonados randômicos) podem ser rapidamente e eficientemente classificadas para aqielas seqüências que se ligam a uma molécula alvo com alta afinidade. Exibição de peptídeo (Cwirla, S. E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6378) ou proteína (Lowman, H.B. et al. (1991) Biochemistry, 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature1 352: 624; Marks1 J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol., 222:581; Kang1 A.S. et al. (1991) Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 88:8363) bibliotecas em fago foram usadas para selecionar milhões de polipeptídeos ou oligopeptídeos para aquelas com propriedades de ligação específicas (Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol., 2:668). A escolha de bibliotecas de fago de mutantes randômicos requer uma estratégia para construção e propagação de um grande número de variantes, um procedimento para purificação de afinidade usando-se o receptor alvo e meios para avaliação de resultados de aprimoramento de ligação, patentes US 5.223.409, 5.403.484, 5.571.689 e 5.663.143.

Embora a maioria dos métodos de exibição por fago usou fago filamentoso, sistemas de exibição por fago lambdóide (documento WO 95/34683; patente US 5.627.024), sistemas de exibição por fago T4 (Ren et al., Gene, 215: 439 (1998); Zhu et al., Câncer Research, 58(15): 32093214 (1998); Jiang et al., Infection & Immunity, 65(11): 47704777 (1997); Ren et al., Gene, 195(2):303311 (1997); Ren, Protein Sci., 5: 1833 (1996); Efimov et al., Virus Genes, 10: 173 (1995)) e sistemas de exibição por fago T7 (Smith e Scott, Methods in Enzymology, 217: 228257 (1993); patente US 5.766.905) são também conhecidos.

Muitos outros aprimoramentos e variações do conceito de exibição por fago básica foram agora desenvolvidos. Estes aprimoramentos aumentam a habilidade dos sistemas de exibição para seleção de bibliotecas de peptídeos para ligação a moléculas alvo selecionadas e para exibir proteínas funcionais com o potencial de seleção destas proteínas para propriedades desejadas. Dispositivos de reação combinatória para reações de exposição por fago foram desenvolvidos (documento WO 98/14277) e bibliotecas de exibição por fago foram usadas para analisar e controlar interações biomoleculares (documento WO 98/20169; documento WO 98/20159) e propriedades de peptídeos helicoidais constritos (WO 98/20036).

O documento WO 97/35196 descreve um método de isolamento de um Iigante de afinidade na qual uma biblioteca de exibição por fago é contatada com uma solução em que o Iigante irá se ligar a uma molécula alvo e uma seguna solução na qual o Iigante de afinidade não irá se ligar à molécula alvo, para isolar seletivamente ligações de ligantes. O documento WO 97/46251 descreve um método de ciclo de seleção de uma biblioteca aleatória de exposição por fago com um anticorpo de afinidade purificada e então isolamento de ligação de fago, seguido por um processo de microciclo de seleção usando-se microplacas com poços para isolar fagos com alta afinidade de ligação. O uso de proteína A de Staphlylococcus aureus como um tag de afinidade foi também relatado (Li et al. (1998) Mol Biotech., 9:187). O documento WO 97/47314 descreve o uso de bibliotecas de subtração de substrato para distinguir especificidades de enzimas usando-se uma biblioteca combinatória que pode ser uma biblioteca de exibição por fago. Um método para seleção de enzimas adequadas para uso em detergentes usando-se exposição por fago está descrito no documento WO 97/09446. Métodos adicionais de seleção de proteínas de ligação específicas estão descritos nas patentes US 5.498.538, 5.432.018 e documento WO 98/15833.

Métodos para geração de bibliotecas de peptídeos e seleção destas bibliotecas estão também divulgados nas patentes US 5.723.286, 5.432.018, 5.580.717, 5.427.908, 5.498.530, 5.770.434, 5.734.018, 5.698.426, 5.763.192 e 5.723.323.

C. Antagonistas De Molécula Pequena De GDM

Antagonistas de GDM de molécula pequena são moléculas orgânicas, exceto oligopeptídeos ou anticorpos (ou fragmentos destes) como definido no presente pedido, que se ligam, preferivelmente, com exclusividade, a um componente de sinalização (por exemplo, receptor, ligante, componente intracelular, etc.) de um polipeptídeo GDM como descrito no presente pedido. Tais moléculas orgânicas podem ser identificadas e quimicamente sintetizadas usando-se metodologia conhecida (ver, por exemplo, publicações PCT documento WO 00/00823 e documento WO 00/39585). Tais moléculas orgânicas são usualmente menores que aproximadamente 2000 daltons em tamanho, alternativamente menores que aproximadamente 1500, 750, 500, 250 ou 200 daltons em tamanho, sendo que tais moléculas são capazes de se ligar, e preferivelmente com exclusividade, a um polipeptídeo GDM como descrito no presente pedido, e podem ser identificadas sem exagerada experimentação usando-se técnicas bem conhecidas. Com este propósito, é apontado que técnicas para seleção de bibliotecas de moléculas orgânicas para moléculas que são capazes de especificamente se ligar a um polipeptídeo alvo são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, publicação PCT documento WO 00/00823 e documento WO 00/39585). Moléculas antagonistas de GDM podem ser, por exemplo, aldeídos, cetonas, oximas, hidrazonas, semicarbazonas, carbazidas, aminas primárias, aminas secundárias, aminas terciárias, hidrazidas N-substituídas, álcoois, éteres, tióis, tioéteres, bissulfetos, ácidos carboxílicos, ésteres, amidas, uréias, carbamatos, carbonatos, cetais, tiocetais, acetaiss, tioacetais, aril halidos, aril sulfonatos, alquil halidos, alquil sulfonatos, compostos aromáticos, compostos heterocíclicos, anilinas, alquenos, alcinos, dióis, amino álcoois, oxazolidinas, oxazolinas, tiazolidinas, tiazolinas, enaminas, sulfonamidas, epóxido, aziridinas, isocianatos, sulfonil cloretos, compostos diazo, ácido clorídrico, ou similares.

d. Seleção De Antagonistas De GDM

Técnicas para geração de anticorpos, polipeptídeos, oligopeptídeos e moléculas orgânicas da invenção foram descritas acima. Pode-se também selecionar anticorpos (e fragmentos de ligação de antígeno destes), oligopeptídeos ou outras moléculas orgânicas com certas características biológicas, como desejado.

Os efeitos inibitórios de crescimento de vários antagonistas de GDM úteis na invenção podem ser avaliados por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando-se células que expressam um polipeptídeo GDM tanto de forma endógena como seguindo transfecção com o gene GDM. Por exemplo, linhagens celulares de tumor e células transfectadas com ácido nucléico que codifica GDM1 podem ser tratadas com antagonistas de GDM da invenção em várias concentrações por alguns dias (por exemplo, 2 a 7) e coradas com cristal de violeta ou MTT ou analisadas por outros testes colorimétricos. Outro método para medir proliferação seria por comparação da absorção de 3H-timidina pelas células tratadas na presença ou ausência de tais antagonistas de GDM. Após tratamento, as células são coletadas e a quantidade de radioatividade incorporada no DNA é quantificada em um medidor de cintilação. Controles positivos apropriados incluem tratamento de uma linhagem celular selecionada com um anticorpo inibitório do crescimento conhecido por inibir crescimento dessa linhagem celular. A inibição do crescimento de células tumorais in vivo pode ser detrminada de várias maneiras conhecidas na técnica. Preferivelmente1 a célula tumoral é aquela que superexpressa um polipeptídeo GDM. Preferivelmente, tais antagonistas de GDM irão inibir a proliferação celular de uma célula tumoral que expressa GDM in vitro ou in vivo por aproximadamente 25 a 100% comparado à célula tumoral não tratada, mais preferivelmente, por aproximadamente 30 a 100%, e até mais preferivelmente por aproximadamente 50 a 100% ou 70 a 100%, em uma realização, em uma concentração de anticorpo de aproximadamente 0,5 a 30 pg/ml. A inibição do crescimento pode ser medida a uma concentração de antagonista de GDM de aproximadamente 0,5 a 30 pg/ml ou aproximadamente 0,5 nM a 200 nM na cultura celular, onde a inibição do crescimento é determinada em 1 a 10 dias após exposição das células tumorais ao anticorpo. O anticorpo é inibitório do crescimento in vivo se a administração do antagonista e/ou agonista a aproximadamente 1 pg/kg a aproximadamente 100 mg/kg por peso corporal resultar na redução do tamanho do tumor ou redução da proliferação da célula tumoral dentro de aproximadamente 5 dias a 3 meses a partir da primeira administração do anticorpo, preferivelmente dentro de aproximadamente 5 a 30 dias.

Para selecionar antagonistas de GDM que induzem morte celular, perda da integridade da membrane como indicado por, por exemplo, absorção de iodeto de propídeo (PI), tripan azul ou 7AAD, pode ser avaliada em relação ao controle. O teste de absorção de Pl pode ser realizado na ausência de complemento e células efetoras imunes. Células tumorais que expressam polipeptídeo GDM são incubadas com meio sozinho ou meio contendo o antagonista de GDM apropriado. As células são incubadas por um período de 3 dias. Seguindo cada tratamento, as células são lavadas e aliquotadas em tubos de 12 χ 75 recobertos com peneiras de 35 mm (1 ml por tubo, 3 tubos por grupo de tratamento) para remoção da massa de células. Os tubos então recebem Pl (10 μ/ml). As amostras podem ser analisadas usando-se um citômetro de fluxo FACSCAN™ e programa CeIIQuest FACSCONVERT™ (Becton Dickinson). Esses antagonistas de GDM que induzem níveis estatisticamente significantes de morte celular como determinado pela absorção de PI1 podem então ser selecionados.

Para selecionar antagonistas de GDM que se ligam a um epitopo em um polipeptídeo GDM ligado por um anticorpo de interesse, uma rotina de teste de interbloqueio como aquele descrito em Antibodies:_A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow e David Lane (1988), pode ser realizada. Este teste pode ser usado para determinar se um anticorpo de teste, oligopeptídeo ou outra molécula orgânica se ligam ao mesmo sítio ou epitopo como um anticorpo anti-GDM da invenção. Alternativamente, ou adicionalmente, o mapeamento do epitopo pode ser realizado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a seqüência do anticorpo pode sofrer mutagênese por varredura de alanina, para identificar resíduos de contato. O anticorpo mutante é inicialmente testado para ligação com anticorpo policlonal para assegurar dobra apropriada. Em um método diferente, peptídeos que correspondem a diferentes regiões de um polipeptídeo GDM podem ser usados em testes de competição com o anticorpo de teste ou com um anticorpo de teste e um anticorpo com um epitopo conhecido ou caracterizado.

E. Terapia Pró-droga Mediada Por Enzima Dependente De Anticorpo (ADEPT).

Os anticorpos antagonistas de GDM da presente invenção podem também ser usados em ADEPT pela conjugação do anticorpo com uma enzima de ativação pró-droga que converte uma pró-droga (por exemplo, um agente quimioterapêutico peptidil, ver documento WO 81/01145) a uma droga ativa anti-câncer. Ver, por exemplo, documento WO 88/07378 e patente US 4.975.278.

A enzima componente de tais imunoconjugados úteis para ADEPT inclui qualquer enzima capaz de agir sobre uma pró-droga de tal maneira que a converta em formas citotóxicas mais ativas.

Enzimas que são úteis no método desta invenção incluem, mas não são limitadas a, fosfatase alcalina útil para converter pró-drogas que contém fosfato em drogas livres; arilsulfatase útil para converter pró-drogas que contém sulfato em drogas livres; citosina deaminase útil para converter 5-fluorocitosina não tóxica na droga anti-câncer, 5-fluorouracil; proteases, tal como protease serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases e catepsinas (tal como catepsinas B e L), que são úteis para converter pró- drogas que contêm peptídeo em drogas livres; D-alanilcarboxipeptidases, útil para converter pró-drogas que contêm D-aminoácido substituídos; enzimas de clivagem de carboidrato tal como β-galactosidase e neuraminidase útil para converter pró-drogas glicosiladas em drogas livres; β-lactamase útil para converter drogas derivadas com β-lactams em drogas livres; e penicilina amidases, tal como penicilina V amidase ou penicilina G amidase, úteis para converter drogas derivadas de seus amino nitrogênios com grupos fenoxiacetil ou fenilacetil, respectivamente, em drogas livres. Alternativamente, anticorpos com atividade enzimática, também conhecidos na técnica como "abzimas", podem ser usados para converter as pró-drogas da invenção em drogas ativas livres (ver, por exemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Conjugados anticorpo-abzima podem ser preparados como descrito no presente por meio de distribuição de abzima para uma população de células tumorais.

As enzimas desta invenção podem ser ligadas covalentemente aos anticorpos anti-GDM por técnicas bem conhecidas como o uso de reagentes de reticulação heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, fusão de proteínas que compreendem pelo menos a região de ligação de antígeno de um anticorpo ligado a pelo menos uma porção funcionalmente ativa de uma enzima da invenção pode ser construída utilizando-se técnicas de DNA recombinante bem conhecidas (ver, por exemplo, Neubergeretal., Nature, 312:604-608 (1984). F. POLIPEPTÍDEOS GDM VARIANTES

Além dos polipeptídeos GDM descritos no presente pedido, é contemplado que variantes de tais moléculas podem ser preparados para uso com a invenção do presente pedido. Tais variantes podem ser preparados pela introdução apropriada de trocas de nucleotídeos no DNA codificador, e/ou por síntese do desejado anticorpo ou polipepitídeo. Esses técnicos no assunto irão apreciar que trocas de aminoácidos podem alterar os processos de pós- tradução destas moléculas, como troca do número ou posição dos sítios de glicolisação ou alteração das características de ancoragem da membrana.

Variações na seqüência de aminoácidos podem ser feitas, por exemplo, usando-se qualquer uma das técnicas e guia para mutações conservativas e não conservativas estabelecidas, por exemplo, na patente US 5.364.934. Variações podem ser uma substituição, deleção ou inserção de um ou mais códons que codificam a seqüência de aminoácido que resulta em uma troca na seqüência de aminoácido quando comparada com a seqüência nativa.

Opcionalmente, a variação é pela substituição de pelo menos um aminoácido por qualquer outro aminoácido em um ou mais dos domínios da seqüência de aminoácido de interesse. Guia na determinação de qual resíduo de aminoácido pode ser inserido, substituído ou deletado sem afetar adversamente a atividade desejada pode ser encontrado pela comparação da seqüência de aminoácido de interesse com moléculas de proteína homóloga conhecida e que minimizam o número de alterações da seqüência de aminoácido feitas nas regiões de alta homologia. Substituições de aminoácidos podem ser o resultado da troca de um aminoácido por aminoácido que tem estrutura e/ou propriedades químicas similares, tal como a troca de uma Ieucina por uma serina, isto é, trocas de aminoácidos conservativas. Inserções ou deleções podem opcionalmente estar na faixa de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. A variação permitida pode ser determinada por inserções feitas sistematicamente, deleções ou substituições de aminoácidos na seqüência e teste das variantes resultantes para atividade exibida pela seqüência de comprimento total ou nativa madura.

Fragmentos de vários polipeptídeos PDM são fornecidos no presente pedido. Tais fragmentos podem ser retirados do N-terminal ou C- terminal, ou podem ser desprovidos de resíduos internos, por exemplo, quando comparado com um anticorpo ou proteína nativa de comprimento total. Tais fragmentos que são desprovidos de resíduos de aminoácidos que não são essenciais para uma atividade biológica desejada são também úteis para os métodos divulgados.

Fragmentos do polipeptídeo acima podem ser preparados por qualquer uma das muitas técnicas convencionais. Fragmentos de peptídeo desejados podem ser sintetizados quimicamente. Uma abordagem alternativa envolve geração de tais fragmentos pela digestão enzimática, por exemplo, pelo tratamento da proteína com uma enzima conhecida para clivar proteínas em sítios definidos por resíduos de aminoácidos específicos, ou por digestão de DNA com enzimas de restrição e isolamento do fragmento desejado. Ainda outra técnica adequada envolve o isolamento e amplificação de um fragmento de DNA que codifica o fragmento do polipeptídeo desejado, por reação em cadeia da polimerase (PCR). Oligonucleotídeos que definem as terminações desejadas do fragmento de DNA são empregadas nos primers 5' e 3' no PCR. Preferivelmente, tais fragmentos compartilham pelo menos uma atividade biológica e/ou imunológica com a molécula de comprimento total correspondente.

Em realizações específicas, substituições conservativas de interesse são mostradas na Tabela 6 sob o título de substituições preferidas. Se tais substituições resultam em uma troca na atividade biológica, então mais trocas substanciais, denominadas substituições exemplares na Tabela 6, ou como também descritas abaixo na referência para classes de aminoácidos, são introduzidas e os produtos selecionados com o objetivo de identificar o variante desejado.

Tabela 6

<table>table see original document page 176</column></row><table> Modificações substanciais na função ou identidade imunológica dos polipeptídeos GDM podem ser realizadas por seleção de substituições que diferem significantemente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: Norleucina, Met, Ala, Vai, Leu, Ile;

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácida: Asp, Glu;

(4) básica: His, Lys, Arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; e

(6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membro de uma destas classes por outra classe. Tais resíduos substituídos também podem ser introduzidos nos sítios de substituições conservativas ou mais preferivelmente, nos sítios remanescentes (não conservados).

As variações podem ser feitas usando-se métodos conhecidos na técnica tais como mutegênese mediada por oligonucleotídeos (sítio dirigida), varredura de alanina, e mutagênese PCR. Mutagênese sítio dirigida [Carter et al„ Nucl._Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al. Nucl._Acids Res., 10:6487 (1987)], mutagênese cassette [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)], mutagênese por seleção de restrição [Wells et al., Philos. Trans. R. Soe. London SerA, 317:415 (1986)] ou outras técnicas conhecidas podem ser realizadas no DNA clonado para produzir a molécula anti-GDM.

Análises de varredura de aminoácidos podem também ser empregadas para identificar um ou mais aminoácidos ao longo da seqüência adjacente. Entre as varreduras de aminoácido preferidas estão aminoácidos neutros, relativamente pequenos. Tais aminoácidos incluem alanina, glicina, serina e cisteína. Alanina é tipicamente um aminoácido de varredura preferido entre este grupo porque elimina a cadeia lateral além do carbono beta e é menos provável para alterar a conformação da cadeia principal da variante [Cunningham e Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]. Alanina é também tipicamente preferida porque é o aminoácido mais comum. Além disto, é freqüentemente encontrada e ambas posições, interna e enterrada [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol Biol., 150:1 (1976)]. Se a substituição de alanina não produz quantidades adequadas da variante, um aminoácido isotérico pode ser usado.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção da conformação apropriada dos polipeptídeos GDM também pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e prevenir interligação anormal. De modo oposto, ligação(ões) cisteína pode(m) ser adicionada(s) a tal molécula para melhorar sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo é um fragmento de anticorpo como um fragmento Fv).

Um tipo de variante substitucional particularmente preferida envolve substituição de um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpo parental a partir do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando-se exibição por fago. Resumidamente, diversos sítios de região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7 7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácido em cada sítio. Os anticorpos variantes dessa forma gerados são exibidos em uma forma monovalente a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o gene Ill produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes exibidas por fago são então selecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, afinidade de ligação), como divulgado no presente pedido. Com o objetivo de identificar candidatos para sítios de região hipervariável para modificações, pode ser realizada mutagênese de varredura de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significantemente para ligação do antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o polipeptídeo alvo. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicas elaboradas no presente pedido. Uma vez que tais variantes são geradas, as variantes do painel são sujeitas à seleção como descrito no presente e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências de aminoácido variantes dos polipeptídeos GDM são preparadas por uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não são limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso seqüência de aminoácido variante que ocorre naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio dirigida), mutagênese de PCR e mutagênese cassette de uma seqüência nativa ou uma variante preparada anteriormente.

G. Modificações De Polipeptídeos Gdm

O GDM que foi modificado covalentemente pode também ser adequado para uso dentro do escopo desta invenção. Um tipo de modificação covalente inclui reação direcionada a tais anticorpos e polipeptídeos com um agente orgânico de derivatização que é capaz de reagir com as cadeias laterais selecionadas ou com os resíduos N-terminal ou C- terminal de tais anticorpos e polipeptídeos. A derivatização com agentes bifuncionais é útil, por exemplo, para reticulação das moléculas anteriores em uma matriz ou superfície de suporte insolúvel para uso na purificação. Agentes reticulantes comumente usados incluem, por exemplo, 1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano, glutaraldeído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por exemplo, ésteres com ácido 4-azidosalicílico, imidoésteres bifuncionais, incluindo ésteres disuccinimidil como 3,3'- ditiobis(succinimidilpropionato), maleimidos bifuncionais como bis-N-maleimido- 1,8-octano e agentes como metil-3-[(p-azidofenil)ditio]propioimidato.

Outras modificações incluem deamidação de resíduos glutaminil e asparaginil nos resíduos glutamil e aspartil correspondents, respectivamente, hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxil de resíduos seril ou treonil, metilação dos grupos α-amino de lisina, arginina, e cadeias laterais de histidina [T.E. Creighton, Proteins:_Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., São Francisco, páginas. 79-86 (1983)], acetilação da amina N- terminal, e amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente dos polipeptídeos GDM compreende alteração do padrão de glicosilação nativa do anticorpo ou polipeptídeo. "Alteração do padrão de glicosilação nativa" tem a intenção para os propósitos no presente pedido de significar deleção em um ou mais componentes carboidratos encontrados na seqüência (tanto por remoção do sítio de glicosilação da base ou por deleção de glicosilação por meios químicos e/ou enzimáticos), e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes na seqüência nativa respectiva. Além disso, a expressão inclui mudanças qualitativas na glicosilação de proteínas nativas, envolvendo uma troca na natureza e proporções de vários carboidratos componentes presentes.

A glicosilação de anticorpos e outros polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado como O-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídio asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambas seqüências de tripeptídios em um polipeptídio cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-Iigado refere- se à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5- hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação pode ser realizada pela alteração da seqüência de aminoácido, como aquela que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N- ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência de tal anticorpo ou polipeptídeo original (para sítios de glicosilação O-ligado). A seqüência de tal anticorpo ou polipeptídeo pode opcionalmente ser alterada através de trocas ao nível do DNA, particularmente por mutação do DNA que codifica as seqüências de aminoácidos anteriores em bases pré-selecionadas de forma que códons sejam gerados para traduzir os aminoácidos desejados.

Outro meio para aumentar o número de componentes é por acoplamento químico ou enzimático de glicosídeos ao polipeptídeo. Tais métodos estão descritos na técnica, por exemplo, no documento WO 87/05330 publicado em 11 de setembro de 1987, e em Aplin e Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., páginas. 259-306 (1981).

A remoção de componentes pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente ou pela substituição de códons que codificam resíduos de aminoácidos que servem como alvos para glicosilação. Técnicas de desglicosilação são conhecidas e descritas, por exemplo, por Hakimuddin, et a!., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) e por Edge et al., Anal._Biochem., 118:131 (1981). Clivagem enzimática de componentes carboidratos nos polipeptídeos pode ser alcançada pelo uso de uma variedade de endo e exoglicosidases como descrito por Thotakura et al., Meth.Enzymol., 138:350 (1987).

Outro tipo de modificação covalente compreende ligação a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol (PEG)1 polipropileno glicol ou polioxialquilenos das maneiras apresentadas nas Patentes US 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ou 4.179.337. Os polipeptídeos GDM também podem ser capturados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial (por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente), em sistemas coloidais de distribuição de droga (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences 16a edição, Oslo, A., Ed., (1980).

Modificações que formam moléculas quiméricas resultam de fusões de polipeptídeos GDM a outros, polipeptídeo heterólogo ou seqüência de aminoácido são contemplados para uso com os presentes métodos.

Em uma realização, tal molécula quimérica compreende uma fusão dos polipeptídeos GDM a um polipeptídeo tag que fornece um epitopo ao qual um anticorpo tag pode se ligar seletivamente. O epitopo tag é geralmente colocado na terminação amino ou carboxil de tal anticorpo ou polipeptídeo. A presença de tais formas de epitopo tag de tais anticorpos ou polipeptídeos pode ser detectada usando-se um anticorpo contra o polipeptídeo tag. Também, o fornecimento do epitopo tag permite que tal anticorpo ou polipeptídeo possa ser facilmente purificado por purificação por afinidade usando-se um anticorpo anti-tag ou outro tipo de matriz de afinidade que se liga ao epitopo tag. Vários polipeptídeos tag e seus respectivos anticorpos são bem conhecidos na técnica. Exemplos incluem poli-histidina (poli-his) ou poli- histidina-glicina tags (poli-his-gli); o polipeptídeo tag flu HA e seus anticorpos 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc tag e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 destes e anticorpos 9E10 destes [Evan et al., Molecularand CellularBiology, 5:3610-3616 (1985)]; e a glicoproteína D tag do vírus Herpes Simplex (gD) e seus anticorpos [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]. Outros polipeptídeos tag incluem o peptídeo Flag [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]; o epitopo peptídico KT3 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)]; um epitopo peptídico α-tubulina [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]; e o peptídeo tag da proteína 10 gene T7 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)].

Em uma realização alternativa, a molécula quimérica pode compreender uma fusão dos polipeptídeos GDM com uma imunoglobulina ou uma região específica de uma imunoglobulina. Para uma forma bivalente da molécula quimérica (também chamada de "imunoadesina"), tal fusão poderia ser à região Fc de uma molécula IgG. As fusões de Ig preferivelmente incluem a substituição de uma forma solúvel (domínio de transmembrana deletado ou inativo) de um anticorpo anterior ou polipeptídeo no lugar de pelo menos uma região variável dentro de uma molécula lg. Em uma realização particularmente preferida, a fusão na imunoglobulina inclui a dobradiça, CH2 e CH3, ou a dobradiça, regiões CH1, CH2 e CH3 de uma molécula IgGI. Para a produção de fusões na imunoglobulina ver também patente US 5.428.130 emitida em 27 de junho de 1995.

H. Preparação De Polipeptídeos GDM

A descrição abaixo relata primeiramente a produção de polipeptídeos GDM por cultura celular transformada ou transfectada com um vetor que contém ácido nucléico de tais anticorpos, polipeptídeos e oligopeptídeos. É certamente contemplado que métodos alternativos, que são bem conhecidos na técnica, podem ser empregados para preparar tais anticorpos, polipeptídeos e oligopeptídeos. Por exemplo, a seqüência de aminoácido apropriada, ou porções desta, pode ser produzida pela síntese de peptídeo direta usando-se técnicas de fase sólida [ver, por exemplo, Stewart et ai., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., São Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)]. A síntese de proteína in vitro pode ser realizada usando-se técnicas manuais ou por automação. A síntese automatizada pode ser realizada, por exemplo, usando- se um Sintetizador de Peptídeo Aplicado a Biosistemas (Foster City, CA) usando-se as instruções do fabricante. Várias porções de tais anticorpos, polipeptídeos ou oligopeptídeos podem ser quimicamente sintetizadas de forma separada e combinadas usando-se métodos químicos ou enzimáticos para produzir o produto desejado.

1. Isolamento De DNA Que Codifica Polipeptídeos GDM

O DNA que codifica um polipeptídeo GDM pode ser obtido de uma biblioteca de cDNA preparada a partir do tecido que acredita-se possuir tal anticorpo, polipeptídeo ou mRNA do olipeptídeo e expressá-lo em um nível detectável. Consequentemente, o DNA que codifica tais polipeptídeos pode ser convenientemente obtido a partir de uma biblioteca de cDNA preparada a partir de tecido humano, uma biblioteca genômica ou por procedimentos sintéticos conhecidos (por exemplo, síntese de ácido nucléico automatizada).

Bibliotecas podem ser selecionadas com sondas (tal como oligonucleotídeos de pelo menos aproximadamente 20-80 bases) projetadas para identificar o gene de interesse ou a proteína codificada pelo mesmo. Seleção de cDNA ou biblioteca genômica com a sonda selecionada pode ser conduzida usando-se procedimentos padrão, como descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning:_A Laboratory Manual (Nova York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Alternativamente, metodologia PCR pode ser usada. [Sambrook et al., acima; Dieffenbach et al., PCR Primer:_ A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].

Técnicas para a seleção de uma biblioteca de cDNA são bem conhecidas. As seqüências de oligonucleotídeos selecionadas como sondas devem ter comprimento suficiente e suficientemente não ambíguas de forma que falsos positivos sejam minimizados. O oligonucçeotídeo é preferivelmente marcado, tal que possa ser detectado sob hibridização ao DNA na biblioteca sendo selecionada. Métodos para marcação são bem conhecidos na técnica, e incluem o uso de radiomarcadores como ATP 32P-marcado, biotinilação ou enzimas marcadoras. As condições de hibridização, incluindo estringência moderada e alta estringência são fornecidas em Sambrook et al., acima.

Seqüências identificadas em tais métodos de seleção de bibliotecas podem ser comparadas e alinhadas a outras seqüências conhecidas depositadas e disponíveis em bancos de dados públicos tal como GenBank ou outros bancos de dados de seqüências privadas. Identidade de seqüência (tanto em nível do aminoácido ou nucleotídeo) dentro de regiões definidas da molécula ou através da seqüência de comprimento total pode ser determinada usando-se métodos conhecidos na técnica e como descritos no presente pedido.

O ácido nucléico que possui a seqüência codificadora de proteína pode ser obtido por seleção de bibliotecas genômicas ou de cDNA selecionadas usando-se a seqüência de aminoácido deduzida divulgada no presente pedido pela primeira vez, e, se necessário, usando-se procedimentos de extensão primer convencionais como descritos em Sambrook et al., acima, para detectar precursores e processos intermediários de mRNA que podem não ter sido transcritos reversamente no cDNA.

2. Seleção E Transformação De Células Hospedeiras Células hospedeiras são transfectadas ou transformadas com vetores de expressão ou clonagem descritos no presente pedido para produção do polipeptídeo GDM e cultivadas em meio convencional de nutrientes modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

As condições de cultura, tais como o meio, temperature, pH e similares, podem ser selecionadas pelo técnico no assunto sem indevida experimentação. Em geral, princípios, protocolos, e práticas técnicas para maximizar a produtividade de culturas celulares podem ser encontrados em Mammalian Cell

Biotechnology:_a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) e Sambrook et al., acima.

Métodos de transfecção de células eucariontes e transformação de células procariontes são conhecidos para os técnicos no assunto, por exemplo, CaC^, CaPO4, mediada por Iipossomo e eletroporação. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é realizada usando-se técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento de cálcio que emprega cloreto de cálcio, como descrito em Sambrook et al., acima, ou eletroporação são geralmente usados para procariontes. Infecção com Agrobacterium tumefaciens é usada para transformação de certas células vegetais, como descrito, por Shaw et al., Gene, 23:315 (1983) e documento WO 89/05859 publicado em 29 de junho de 1989. Para células de mamíferos sem tais paredes celulares, o método de precipitação de fosfato de cálcio de Graham e van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) pode ser empregado. Aspectos gerais de sistemas de transfecção de célula hospedeira foram descritos na patente US 4.399.216. Tranformações em levedura são tipicamente realizadas de acordo com o método Van Solingen et al., J. Bact., 130:946 (1977) e Hsiao et al., Proc. Nati Acad.Sci (USA), 76:3829 (1979). No entanto, outros métodos para introdução de DNA em células, como por microinjeção nuclear, eletroporação, fusão protoplástica bacteriana com células intactas, ou policátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, podem também ser usados.

Para várias técnicas de transformação de células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) e Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de DNA nos vetores no presente pedido incluem células procariontes, leveduras ou eucariontes superiores. Células hospedeiras procariontes incluídas, mas não limitadas a eurobacteria, como organismos Gram negativos ou Gram positivos, por exemplo, Enterobactérias como E.coli. Várias linhagens de E. coli estão publicamente disponíveis, como E. coli K12 linhagem MM294 (ATCC 31.446); E. co//'X1776 (ATCC 31.537); E. coli linhagem W3110 (ATCC 27.325) e K5 772 (ATCC 53.635). Outras células hospedeiras procariontes adequadas incluem Enterobacteriaceae tal como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo., Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo., Serratia marcescans, e Shigella, como também Bacilli tais como B. subtilis e B. Hcheniformis (por exemplo., B. Iicheniformis 41P divulgadas em DD 266,710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces. Estes exemplos são mais ilustrativos do que limitantes. Linhagem W3110 é aquela particularmente hospedeira preferida ou hospedeira parental porque é uma linhagem hospedeira comum para DNA recombinante produto de fermentações. Preferivelmente, a célula hospedeira secreta quantidades mínimas de enzimas proteolíticas. Por exemplo, a linhagem W3110 pode ser modificada para efetuar uma modificação genética nos genes que codificam proteínas endógenas para o hospedeiro, com exemplos de tais hospedeiros incluindo Ε. coli W3110 linhagem 1A2, que possui o genótipo completo tonA ; E. coli W3110 linhagem 9E4, que possui o genótipo completo tonA ptr3; E. coli W3110 linhagem 27C7 (ATCC 55.244), que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP OmpTkanr; E. coli W3110 linhagem 37D6, que possui o genótipo completo tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kar; E. coli W3110 linhagem 40B4, que é linhagem 37D6 com uma mutação deleção degP não resistente a canamicina; e uma linhagem E. coli tendo protease periplasmática mutante divulgada na Patente US 4.946.783 emitida em 7 de agosto de 1990. Alternativamente, métodos de clonagem in vitro, por exemplo, PCR ou outras reações de polimerase de ácido nucléico, são adequados.

Anticorpo de comprimento total, fragmentos de anticorpos e proteínas de fusão de anticorpo podem ser produzidos na bactéria, em específico quando a glicosilação e a função efetora Fc não são necessárias, como quando o anticorpo terapêutico é conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, uma toxina) e o imunoconjugado por si mesmo mostra efetividade na destruição do tumor celular. Anticorpos de comprimento total possuem maior meia vida na circulação. A produção de E.coli é mais rápida e o custo é mais eficiente. Para expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, ver, por exemplo, patente US 5.648.237 (Carter et al.), US 5.789.199 (Joly et al.), e US 5.840.523 (Simmons et al) que descreve a região de iniciação de tradução (TIR) e seqüências sinal para otimização de expressão e secreção, estas patentes estão incorporadas ao presente como referência. Após expressão, o anticorpo é isolado da pasta celular de E.coli em uma fração solúvel e pode ser purificado através, por exemplo, de uma coluna de proteína A ou G dependendo do isotipo. A purificação final pode ser realizada de modo similar ao processo de purificação do anticorpo expresso em células adequadas (por exemplo, células CHO). Além disso, para procariontes, micróbios eucariontes como fungo filamentoso ou levedura são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam os polipeptídeos GDM. Saccharomyces cerevisiae é um microorganismo hospedeiro eucarionte inferior comumente usado. Outros incluem Schizosaccharomyces pombe (Beach e Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; patente EP 139.383 publicada em 2 de maio de 1985); hospedeiros Kluyveromyces (Patente U.S. 4.943.529; Fleer et al, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) como, por exemplo, K. Iaetis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al, J. Baeterioi, 154(2):737-742 [1983]), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaríeus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al, Bio/Teehnology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (patente EP 402.226); Piehia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna et al, J. Basic Mierobioi, 28:265-278 [1988]); Candida; Triehoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:5259- 5263 [1979]); Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occidentalis (patente EP 394.538 publicada em 31 de outubro de 1990); e fungo filamentoso como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado em 10 de janeiro de 1991), e hospedeiros Aspergillus como A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res._Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 81: 1470-1474 [1984]) e A. niger (Kelly e Hynes, EMBO J., 4:475-479 [1985]). Leveduras metilotróficas são adequadas no presente e incluem, mas não são limitadas a, leveduras capazes de crescimento em metanol selecionadas do gênero que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis e Rhodotorula. Uma lista de espécies específicas que são exemplares nesta classe de leveduras pode ser encontrada em C. Anthony1 The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982). Células hospedeiras adequadas para a expressão da produção do polipeptídeo GDM glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células de insetos como Drosófila S2 e Spodoptera Sf9, como também células vegetais, como cultura celular de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate e tabaco. Muitas linhagens baculovirais e variantes, e células hospedeiras de inseto permissivas correspondentes de hospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori foram identificadas. Uma variedade de linhagens virais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, variante L-1 de Autographa Califórnia NPV e linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV e tais vírus podem ser usados como o vírus no presente pedido de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

No entanto, o interesse em células de vertebrados tem aumentado, e a propagação de células na cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células ovarianas de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção do polipeptídeo GDM e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

3. Seleção E Uso De Um Vetor Replicável

O ácido nucléico (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) que codifica o respectivo polipeptídeo GDM pode ser inserido em um vetor replicável para clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. Vários vetores estão publicamente disponíveis. O vetor pode, por exemplo, estar na forma de um plasmídio, cosmídio, partícula viral ou fago. A seqüência de ácido nucléico apropriada pode estar inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, o DNA é inserido em um sítio de restrição da endonuclease apropriado usando-se técnicas conhecidas. Componentes de vetores geralmente incluem, mas não estão limitados a, uma ou mais de uma seqüência sinal, uma replicação de origem, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, um promotor e uma seqüência de terminação de transcrição. A construção de vetores adequados contendo um ou mais destes componentes emprega técnicas de ligação padrão que são conhecidas pelos técnicos no assunto.

O polipeptídeo GDM pode ser produzido de forma recombinante não somente diretamente, mas também como uma fusão do polipeptídeo com um polipeptídeo heterólogo, que pode ser uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que possui um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou esta pode ser uma parte do DNA que codifica a sequ6encia madura que é inserida no vetor. A seqüência sinal pode ser uma seqüência sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo da fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes enterotoxina Il estáveis ao calor. Para a secreção da levedura a seqüência sinal pode ser, por exemplo, a líder invertase da levedura, líder fator alfa (incluindo Saccharomyces e líderes fator α-Kluyveromyces, o último descrito na patente U.S. 5.010.182), ou líder fosfatase ácida, o líder glucoamilase C. albicans (patente EP 362.179 publicada em 4 de abril de 1990), ou o sinal descrito no documento WO 90/13646 publicado em 15 de novembro de 1990. Na expressão de célula de mamífero, seqüências sinal de mamífero podem ser usadas para secreção direta na proteína, como seqüências sinal dos polipeptídeos secretados da mesma espécie ou espécie relacionada, assim como líderes virais secretórios.

Ambos, vetores de expressão e vetores de clonagem contêm uma seqüência de ácido nucléico que permite ao vetor replicar-se em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Tais seqüências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras e vírus. A origem da replicação do plasmídio pBR322 é adequada para a maioria das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídio 2μ é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV ou BPV) são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos.

Vetores de expressão e clonagem irão tipicamente conter um gene de seleção, também designado um marcador selecionável. Genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) suprem nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos, por exemplo, o gene que codifica D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de marcadores de seleção adequados para células de mamíferos são aqueles capazes de identificar células competentes para ocupar o ácido nucléico que codifica a proteína desejada, como DHFR ou timidina quinase. Uma célula hospedeira adequada quando o DHFR tipo selvagem é empregado na linhagem celular ovariana de hamster chinês (CHO) deficiente na atividade de DHFR1 preparada e propagada como descrito por Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Uma seleção de gene adequada para uso em leveduras é o gene trp1, presente no plasmídio de levedura YRp7 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. O gene trp1 fornece um marcador de seleção para uma linhagem mutante desprovida da habilidade de crescimento em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].

Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucleico que codifica o aminoácido desejado para dirigir síntese de mRNA. Promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. Promotores adequados para uso em hospedeiros procariontes incluem os sistemas promotores Iactose e β-lactamase [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], fosfatase alcalina, um sistema promotor triptofano (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); patente EP 36,776], e promotores híbridos como o promotor tac [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)]. Promotores para uso em sistemas bacterianos também irão conter uma seqüência Shine-Dalgamo (S.D) operacionalmente ligada ao DNA que codifica a seqüência de proteína desejada.

Exemplos de seqüências promotoras adequadas para uso com leveduras hospedeiras para 3-fosfoglicerato quinase [Hitzeman et al., J. Bioi Chem., 255:2073 (1980)] ou outras enzimas glicolíticas [Hess et al., J. Adv. Enzyme_Reg., 7:149 (1968); Holland1 Biochemistry, 17:4900 (1978)], como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofrutoquinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3-fosfogIicerato mutase, piruvato quinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicoquinase.

Outros promotores de levedura, que são promotores induzíveis que possuem vantagens adicionais de transcrição controlada pelas condições de crescimento, são as regiões promotoras para álcool dehidrogenase 2, iso- citocromo C, fosfatase ácida, enzimas degradativa associada com metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose . Vetores e promotores adequados para uso na expressão em levedura estão também descritos na patente EP 73.657.

Transcrição de DNA a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos a partir de genomas de vírus como vírus polioma, vírus fowlpox (UK 2.211.504 publicado em 5 de julho de 1989), adenovírus (tal como Adenovirus 2), vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Simian 40 (SV40), a partir de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor imunoglobulina, de promotores de choque de calor, tais promotores fornecidos são compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

A transcrição de um DNA que codifica o polipeptídeo GDM pode ser melhorada pela pela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Enhancers são elementos do DNA que agem em eis, usualmente de aproximadamente 10 a 300 bp, que agem em um promotor para aumentar sua transcrição. Muitas seqüências enhancer são agora conhecidas por meio de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, poderá ser usado um enhancer de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotor inicial citomegalovírus, o enhancer polioma no último lado da replicação de origem e enhancers adenovírus. O enhancer pode ser unido no vetor em uma posição 5' ou 3' da seqüência codificadora das seqüências de aminoácidos anteriores, mas está preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor.

Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes (leveduras, fungos, insetos, vegetais, animais, humanas ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) irão também conter seqüências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas 5' e, ocasionalmente 3' de eucariontes ou DNAs virais ou cDNAs Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica o respectivo anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo descrito nesta seção.

Ainda outros métodos, vetores e células hospedeiras adequadas para adaptação à síntese do respectivo anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo em cultura celular recombinante de vertebrados estão descritos em Gething et al„ Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al„ Nature, 281:40-46 (1979); patente EP 117.060 e patente EP 117.058.

4. Cultura De Células Hospedeiras As células hospedeiras usadas para produzir polipeptídeos GDM podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disto, qualquer um dos meios descritos em Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal._BiochemA02:255 (1980), patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ou 5.122.469; documentos WO 90/03430; WO 87/00195; ou na patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermal), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tal como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definido como componentes inorgânicos usualmente presentes na concentração final na taxa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído na concentração apropriada que seriam conhecidas para aqueles técnicos no assunto. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto.

5. Detecção Da Amplificação/Expressão Gênica

Amplificação e/ou expressão gênica pode ser medida em uma amostra diretamente, por exemplo, por Southern blotting convencional, Northern blotting para quantificar a transcrição do mRNA [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], dot blotting (análise de DNA), ou hibridização in situ, usando-se apropriadamente uma sonda marcada, baseada nas seqüências fornecidas no presente pedido. Alternativamente, anticorpos que podem reconhecer duplex específicos, incluindo duplex de DNA, duplex de RNA, e duplex híbridos de DNA-RNA ou duplex DNA-proteína, podem ser empregados. Os anticorpos, um após o outro podem ser marcados e o teste pode ser realizado onde o duplex está ligado a uma superfície, de forma que sob a formação do duplex na superfície, a presença do anticorpo ligado ao duplex possa ser detectada.

A expressão gênica, alternativamente, pode ser medida por métodos imunológicos, tal como coloração imunohistoquímica de células ou seção de tecidos e testes de cultura celular ou fluidos corporais, para quantificar diretamente a expressão do produto do gene. Anticorpos úteis para coloração imunohistoquímica e/ou teste de amostra de fluidos pode ser tanto monoclonal como policlonal, e pode ser preparado em qualquer mamífero. Convenientemente, os anticorpos adequados para o presente método podem ser preparados contra um polipeptídeo ou oligopeptídeo de seqüência nativa ou contra uma seqüência exógena unida ao DNA e que codifica o epitopo do anticorpo específico de tal polipeptídeo ou oligopeptídeo.

6. Purificação De Proteína Polipeptídeos GDM podem ser recuperados do meio de cultura ou de células hospedeiras lisadas. Se ligado à membrana, pode ser liberado da membrana usando-se uma solução detergente adequada (por exemplo, Triton- X100) ou por clivagem enzimática. Células empregadas na expressão do polipeptídeo anterior podem ser rompidas por vários meios físicos ou químicos, tal como ciclo de congelamento-descongelamento, sonicação, rompimento mecânico ou agentes de Iise celular.

Pode ser desejável purificar o polipeptídeo anterior a partir de proteínas celulares recombinantes ou polipeptídeos. Os procedimentos a seguir são procedimentos de purificação adequados exemplares: por fracionamento em uma coluna de troca iônica; precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em resina de troca catiônica, tal como DEAE, chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônio, filtração em gel usando-se, por exemplo, Sephadex G-75, colunas de proteínas A-sefarose para remover contaminantes tal como IgG, e colunas de metais quelados para ligar formas de epitopo tag das moléculas desejadas. Vários métodos de purificação de proteína podem ser empregados e tais métodos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, em Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purífication:_Principles and Practice, Springer-Verlag, Nova York (1982). As etapas de purificação selecionadas irão depender, por exemplo, da natureza do processo de produção usado e o anticorpo, polipeptídeo ou oligopeptídeo específico produzido para os métodos reivindicados.

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o polipeptídeo pode ser produzido intracelularmente, no espaço periplasma ou diretamente secretado em um meio. Se tais moléculas são produzidas intracelularmente, como um primeiro passo, o fragmento particulado, tanto das células hospedeiras como fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou uItrafiItração. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos que são secretados no espaço periplasma de E.coli. Resumidamente, a pasta celular é derretida na presence de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) por cerca de 30 minutos. Fragmentos celulares podem ser removidos por centrifugação. Onde o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando-se um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de uItrafiItração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer dos passos antecedentes para inibir proteólises e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes imprevistos.

A purificação pode ocorrer usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e isótopos de qualquer imunoglobulina de domínio Fc que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2 ou γ4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de camundongo e para γ3 humano (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz para a qual o Iigante de afinidade é anexado é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro poroso contolado ou poli(estireno- divinil)benzeno permitem velocidades de fluxo mais rápidas e tempos de processo mais curtos do que pode ser atingido com agarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para purificação. Outras técnicas para purificação de proteína tais como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca aniônica ou catiônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), chromatofocusing, SDS-PAGE1 precipitação em sulfato de amônia estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Seguindo qualquer passo de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser sujeita a cromatografia de interação hidrofóbica em baixo pH usando-se uma elução de tampão a um pH entre aproximadamente 2,5 a 4,5, preferivelmente apresentada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de aproximadamente 0 a 0,25M de sal).

I. Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas dos antagonistas de GDM ("agente terapêutico") usadas de acordo com a presente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura do agente terapêutico(s) que tem o grau desejado de purificação com veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Remington:_The Science of Practice of Pharmacy, 20a edição, Gennaro1 A. et al., Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000)), na forma de formulações Iiofilizadas ou soluções aquosas.. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem tampões como acetato, Tris, fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; agentes de tonicidade tais como trealose e cloreto de sódio, açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; surfactantes como polisorbato, formação de sais de contra íons tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexo Zn-proteína); e/ou surfactantes não- iônicos como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG). O anticorpo prefererivelmente compreende o anticorpo a uma concentração entre 5 a 200 mg/ml, preferivelmente entre 10 a 100 mg/ml.

As formulações no presente pedido podem também conter mais que um componente ativo como necessário para a indicação específica sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetem contrariamente um ao outro. Por exemplo, em adição a um agente(s) terapêutico(s) anterior(es), pode ser desejável incluir em uma formulação, um modulador adicional, por exemplo, um segundo anticorpo como agente terapêutico, ou um anticorpo para algum outro alvo como um fator de crescimento que afete o crescimento do glioma. Alternativamente ou adicionalmente, a composição pode também compreender um agente quimioterapêutico, agente citotóxico, agente inibitório do crescimento, agente anti-hormonal e/ou de cardioproteção. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação nas quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

Os ingredientes ativos podem também ser colocados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de acumulação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição coloidal de droga (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington:_The Science of Practice of Pharmacy, acima.

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L- glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)- 3-hidroxibutírico.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membrana de filtração estéril.

J. Diagnóstico E Tratamento Com Antagonistas De GDM

Para determinar a expressão de GDM no glioma, vários testes diagnósticos estão disponíveis. Em uma realização, a superexpressão do polipeptídeo GDM pode ser analisada por imunohistoquímica (IHC). Cortes de tecido de uma biópsia de tumor embebidos em parafina podem ser sujeitos ao teste IHC e de acordo com um critério de intensidade de coloração de proteína GDM como segue:

Pontuação O - nenhuma coloração ou coloração de membrana é observada em menos de 10% das células tumorais.

Pontuação 1+ - Coloração de membrana fraca/dificilmente perceptível é detectada em mais de 10% das células tumorais. As células são apenas coradas em parte de suas membranas. Pontuação 2+ - Coloração de membrana fraca a moderada é observada em mais de 10% das células tumorais.

Pontuação 3+ - Coloração de membrana moderada a forte é observada em mais de 10% das células tumorais.

Esses tumores com pontuações 0 ou 1+ para expressão do polipeptídeo GDM podem ser caracterizados como os que não superexpressam GDM1 enquanto que aqueles tumores com pontuações 2+ ou 3+ podem ser caracterizados como os que superexpressam GDM.

Alternativamente, ou adicionalmente, testes FISH como o INFORM™ (vendido pela Ventana, Arizona) ou PATHVISION™ (Vysis, Illinois) pode ser realizado em tecidos tumorais fixados em formalina, embebidos em parafina para determinar a extensão (se existe) de superexpressão de GDM no tumor.

A superexpressão ou amplificação de GDM pode ser avaliada usando-se um teste diagnóstico in vivo, por exemplo, pela administração de uma molécula (como um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica) que se liga à molécula a ser detectada e é ligada ao marcador detectável (por exemplo, um isótopo radioativo ou um marcador fluorescente) e com varredura externa do paciente para localização do marcador.

Atualmente, dependendo do estágio do câncer, o tratamento do câncer envolve uma ou uma combinação das seguintes terapias: cirurgia para remover tecido canceroso, radioterapia e quimioterapia. A terapia que compreende administração de antagonistas de GDM pode ser especialmente desejável em pacientes idosos que não toleram bem a toxicidade e os efeitos colaterais da quimioterapia e na doença metastática onde a radioterapia tem utilidade limitada. Os antagonistas de GDM dirigidos ao tumor do presente método inventivo podem também ser usados para aliviar cânceres que expressam GDM sob diagnóstico inicial da doença ou durante recidiva. Para aplicações terapêuticas, tais antagonistas de GDM podem ser usados em combinação com outros agentes convencionais, antes ou depois da aplicação e/ou métodos para tratamento do glioma, por exemplo, hormônios, antiangiogênicos ou compostos radiomarcados, ou com cirurgia, crioterapia, radioterapia e/ou quimioterapia. Drogas quimioterapêuticas tais como TAXOTERE® (docetaxel), TAXOL® (palictaxel), estramustina e mitoxantrona são usadas para tratar câncer, em específico, em pacientes de baixo risco.

Em específico, a combinação da terapia com palictaxel e derivados modificados (ver, por exemplo, patente EP 0600517) é contemplada. O anticorpo anterior, polipeptídeo, oligopeptídeo ou molécula orgânica serão administrados com uma dose terapeuticamente efetiva do agente quimioterapêutico. Em outra realização, tal anticorpo anterior, polipeptídeo, oligopeptídeo ou molécula orgânica é administrada em conjunto com quimioterapia para aumentar a atividade e eficácia do agente quimioterapêutico, por exemplo, paclitaxel. A Referência de Mesa dos Médicos (PDR) divulga dosagens destes agentes que foram usadas no tratamento de vários cânceres. O regime de dosagem destas drogas quimioterapêuticas anteriormente mencionadas que são efetivas terapeuticamente irá depender do câncer específico sendo tratado, a extensão da doença e outros fatores familiares para o médico técnico no assunto, e pode ser determinado pelo médico.

Em uma realização específica, um imunoconjugado que compreende tal antagonista de GDM conjugado com um agente citotóxico é administrado ao paciente. Preferivelmente, tal imunoconjugado é internalizado pela célula, resultando em um aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado em destruir a célula cancerosa para qual se liga. Em uma realização preferida, o agente citotóxico atinge ou interfere no ácido nucléico pa célula cancerosa. Exemplos de tais agentes citotóxicos estão descritos acima e incluem maitansinoides, caliqueamicinas, ribonucleases e DNA endonucleases.

Os antagonistas de GDM ou toxinas conjugadas deste são administrados a um paciente humano de acordo com métodos conhecidos, como administração intravenosa, por exemplo, como um bolus ou por infusão contínua por um período de tempo, por rota intracranial, intracérobro-espinhal, intra-articular, intratecal, intravenosa, intrarterial, subcutânea, oral, tópica, ou inalação.

Outros regimes terapêuticos podem ser combinados com a administração do antagonista de GDM precedente. A administração combinada inclui co-administração, usando-se formulações separadas ou uma formulação farmacêutica única, e a administração consecutiva em qualquer ordem, em que preferivelmente exista um período de tempo enquanto ambos (ou todos) os agentes ativos simultaneamente exerçam suas atividades biológicas. Preferivelmente tal terapia combinada resulta em um efeito terapêutico sinérgico.

Em outra realização, os métodos terapêuticos de tratamento da presente invenção envolvem a administração combinada do antagonista de GDM acima e um ou mais agentes quimioterapêuticos ou agentes inibitórios do crescimento, incluindo co-administração de coquetéis de diferentes agentes quimioterapêuticos. Exemplos de agentes quimioterapêuticos foram fornecidos previamente. Preparação e programação de dosagens para tais agentes quimioterapêuticos podem ser usadas de acordo com instruções do fabricante ou como determinado empiricamente por um técnico no assunto. Preparação e programação de dosagens para tal quimioterapia estão também descritas em Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry1 Williams & Wilkins1 Baltimore1 MD (1992).

Para prevenção ou tratamento da doença, a dosagem e modo de administração serão escolhidos pelo médico de acordo com critérios conhecidos. A dosagem apropriada de antagonista de GDM irá depender do tipo de doença a ser tratada, a severidade e curso da doença, se a administração é para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias (inclusive), o histórico clínico do paciente e resposta ao antagonista de c-met, e a discrição do médico. O antagonista de GDM anterior é adequadamente administrado ao paciente uma única vez ou em uma série de tratamentos. A administração pode ocorrer por infusão intravenosa ou por injeções subcutâneas. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 pg/kg a aproximadamente 50 mg/kg (por exemplo, 0,1 a 15 mg/kg) de antagonista de GDM pode ser uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, para uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Um regime de dosagem pode compreender administração de uma carga de dose inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por uma manutenção de dose de aproximadamente 2 mg/kg de tal antagonista de GDM. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. Uma dosagem diária típica pode variar de aproximadamente 1pg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até ocorrer uma desejada supressão dos sintomas da doença O progresso desta terapia pode ser rapidamente monitorado por métodos convenientes e testes, baseados em critérios conhecidos para o médico ou outras pessoas técnicas no assunto.

Com exceção da administração da proteína do anticorpo ao paciente, o presente pedido contempla administração do anticorpo por terapia gênica. Tal administração de ácido nucléico que codifica o antagonista do polipeptídeo GDM é englobada pela expressão, administração de uma quantidade terapeuticamente de um anticorpo. Ver, por exemplo, documento WO 96/07321 publicado em 14 de março de 1996 com respeito ao uso de terapia gênica para gerar anticorpos intracelulares.

Existem duas abordagens principais para se obter tal ácido nucléico (opcionalmente contido no vetor) nas células do paciente, in vivo e ex vivo. Para entrega in vivo o ácido nucléico é injetado diretamente no paciente, usualmente no local onde o anticorpo é necessário. Para o tratamento ex vivo, as células do paciente são removidas, o ácido nucléico é introduzido nestas células isoladas, e as células modificadas são administradas ao paciente, tanto diretamente ou, por exemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que são implantadas no paciente (ver, por exemplo, patentes US 4.892.538 e 5.283.187). Existe uma variedade de técnicas disponíveis para introdução de ácidos nucléicos em células viáveis. As técnicas variam dependendo se o ácido nucléico é transferido em células cultivadas in vitro ou in vivo nas células do hospedeiro pretendido. Técnicas adequadas para a transferência de ácido nucléico em células de mamíferos in vitro incluem o uso de lipossomos, eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, método de precipitação de fosfato de cálcio, etc. Um vetor comumente usado para entrega do gene ex vivo é um vetor retroviral. As técnicas atualmente preferidas de transferência de ácido nucléico incluem transfecção com vetores virais (tais como adenovírus, vírus Herpes simplex I, ou vírus associado a adeno) e sistemas baseados em lipídeos (lipídeos úteis para transferência de gene mediada por lipídeo são DOTMA, DOPE e DC-ChoI1 por exemplo). Para revisão de marcação de gene e terapia gênica atualmente conhecida ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver também documento WO 93/25673 e as referências citadas nestes.

K. Artigos De Fabricação E Kits Para as aplicações terapêuticas, o artigo de fabricação compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula no recipiente ou associada com o recipiente indicando um uso para o tratamento do glioma. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados por uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para tratar a condição de câncer e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que possui uma rolha perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é o antagonista de GDM. A etiqueta ou bula indica que a composição é usada para tratamento do glioma. A etiqueta ou bula irá também compreender instruções para administração do antagonista de GDM. Adicionalmente, o artigo de fabricação pode, além disso, compreender um segundo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato salino tamponado, solução de Ringer e solução dextrose. Pode, além disso, incluir outros materiais comerciais desejáveis do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

Kits que são úteis para vários outros propósitos também podem ser fornecidos, por exemplo, para testes de morte de célula que expressa GDM1 para purificação ou imunoprecipitação de polipeptídeo GDM das células. Para isolamento e purificação do polipeptídeo GDM1 o kit pode também conter o reagente que se liga ao GDM acoplado a esferas (por exemplo, esferas de sefarose). Kits que contêm os anticorpos para detecção e quantificação do polipeptídeo GDM in vitro, podem ser fornecidos, por exemplo, em um ELISA ou um Western blot. Como o artigo de fabricação, o kit compreende um recipiente e uma etiqueta ou bula norecipiente ou associada a este. O recipiente contém uma composição que compreende pelo menos um anticorpo que se liga ao GDM, oligopeptídeo ou molécula orgânica útil da invenção. Recipientes adicionais que contêm, por exemplo, diluentes e tampões, controle de anticorpos, podem ser incluídos. A etiqueta ou bula pode fornecer uma descrição da composição, assim como instruções para o planejado in vitro ou uso diagnóstico.

L. Ácidos Nucléicos Que Codificam GDM Sense E Antisense

Antagonistas de GDM incluem fragmentos dos ácidos nucléicos que codificam GDM como oligonucleotídeos antisense que compreendem uma seqüência única de ácido nucléico (tanto RNA como DNA) capazes de se ligar às seqüências do mRNA de GDM (sense) ou do DNA de GDM (antisense). Oligonucleotídeos antisense ou sense, de acordo com a presente invenção, compreendem um fragmento da região codificadora do respectivo DNA de GDM. A habilidade para derivar um oligonucleotídeo antisense ou sense, baseado em uma seqüência de cDNA que codifica uma dada proteína está descrita em, por exemplo, Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988).

A ligação de oligonucleotídeos antisense ou sense para atingir seqüências de ácido nucléico resulta na formação de duplex que bloqueiam transcrição ou tradução da sequêncua alvo por um ou mais meios, incluindo aumento da degradação de duplex, terminação prematura de transcrição ou tradução ou por outros meios. Tais métodos são englobados pela presente invenção. Os oligonucleotídeos antisense podem, dessa forma, ser usados para bloquear a expressão de proteínas GDM, sendo que estas proteínas podem atuar na indução do câncer em memíferos. Oligonucleotídeos antisense ou sense também compreendem oligonucleotídeos que possuem estruturas de açúcar-fosfodiéster (ou outras ligações de açúcar, como aquelas descritas no documento WO 91/06629) e em que tais ligações de açúcar são resistentes às nucleases endógenas. Tais oligonucleotídeos com ligações de açúcar resistentes são estáveis in vivo (isto é, capazes de resistirem à degradação enzimática), mas retêm a especificidade de seqüência para serem capazes de se ligar às seqüências do nucleotídeo alvo.

Os compostos antisense usados de acordo com esta invenção podem ser feitos convenientemente e de forma rotineira por meio de técnicas bem conhecidas de síntese de fase sólida. Equipamento para tal síntese é vendido por diversos fornecedores incluindo, por exemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Qualquer outro meio para tal síntese conhecida na técnica pode adicionalmente ou alternativamente ser empregado. É bem conhecido o uso de técnicas similares para preparar oligonucleotídeos tais como derivados fosforotioatos e alquilados. Os compostos da invenção podem também ser misturados, encapsulados, conjugados ou de outra forma associados com outras moléculas, estruturas moleculares ou misturas de compostos, como por exemplo, lipossomos, moléculas alvo de receptores, formulações orais, retais, tópicas ou outras, para ajudar na absorção, distribuição e/ou concentração. Patentes que ensinam a preparação de tal processo, distribuição e/ou absorção, que auxiliam formulações incluem, mas não estão limitadas a, patentes US 5.108.921; 5.354.844; 5.416.016; 5.459.127; 5.521.291; 5.543.158; 5.547.932; 5.583.020; 5.591.721; 4.426.330; 4.534.899; 5.013.556; 5.108.921; 5.213.804; 5.227.170; 5.264.221; 5.356.633; 5.395.619; 5.416.016; 5.417.978; 5.462.854; 5.469.854; 5.512.295; 5.527.528; 5.534.259; 5.543.152; 5.556.948; 5.580.575; e 5.595.756, cada umas destas está incorporada ao presente como referência.

Outros exemplos de oligonucleotídeos sense ou antisense incluem aqueles oligonucleotídeos que estão covelentemente ligados a componentes orgânicos, tal como aqueles descritos no documento WO 90/10048 e outros componentes que aumentam a afinidade do oligonucleotídeo para uma seqüência de ácido nucléico alvo, tal como poli- (L-lisina). Ainda, agentes intercaladores adicionais, tal como elipticina, e agentes alquilantes ou complexos metálicos podem ser anexados aos oligonucleotídeos sense o u antisense para modificar especificidades de ligação do oligonucleotídeo sense ou antisense para a seqüência de nucleotídeo alvo.

Oligonucleotídeos antisense ou sense podem ser introduzidos em uma célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo por qualquer método de transferência de gene, incluindo, por exemplo, transfecção de DNA mediada por CaPO4, eletroporação, ou pelo uso de vetores de transferência de gene, como vírus Epstein-Barr. Em um procedimento exemplar, um oligonucleotídeo antisense ou sense é inserido em um vetor retroviral adequado. Uma célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo é contatada com o vetor retroviral recombinante, tanto in vivo como ex vivo. Vetores retrovirais adequados incluem, mas não são limitados àqueles derivados de retrovírus murino M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M- MuLV), ou os vetores de cópia dupla designados DCT5A, DCT5B e DCT5C (ver documento WO 90/13641).

Oligonucleotídeos sense ou antisense também podem ser introduzidos em uma célula que contém a seqüência de nucleotídeo alvo pela formação de um conjugado com uma molécula de ligação de ligante, como descrito no documento WO 91/04753. Moléculas de ligação do Iigante adequadas incluem, mas não estão limitadas a, receptores de superfície celular, fatores de crescimento, outras citocinas, ou outros Iigantes que se ligam aos receptores de superfície celular. Preferivelmente, a conjugação da molécula de ligação do Iigante não interfere substancialmente com a habilidade da molécula de ligação do Iigante para se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, ou bloquear a entrada do oligonucleotídeo sense ou antisense ou sua versão conjugada na célula.

Alternativamente, um oligonucleotídeos sense ou antisense pode ser introduzido em uma célula que contém a seqüência de ácido nucléico alvo pela formação de um complexo oligonucleotídeo-lipídeo, como descrito no documento WO 90/10448. O complexo oligonucleotídeo sense ou antisense- lipídeo está preferivelmente dissociado dentro da célula por uma Iipase endógena.

Moléculas de RNA ou DNA antisense ou sense têm geralmente pelo menos aproximadamente 5 nucleotídeos em comprimento, alternativamente pelo menos aproximadamente 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, 450, 460, 470, 480, 490, 500, 510, 520, 530, 540, 550, 560, 570, 580, 590, 600, 610, 620, 630, 640, 650, 660, 670, 680, 690, 700, 710, 720, 730, 740, 750, 760, 770, 780, 790, 800, 810, 820, 830, 840, 850, 860, 870, 880, 890, 900, 910, 920, 930, 940, 950, 960, 970, 980, 990, ou 1000 nucleotídeos no comprimento, em que neste contexto o termo aproximadamente significa o comprimento da seqüência de nucleotídeo referenciado mais ou menos 10% desse comprimento referenciado. Μ. Testes De Seleção Para Uso E Identificação De Antagonistas De GDM:

Os testes podem ser realizados em uma variedade de formatos, incluindo testes de ligação proteína-proteína, testes de seleção bioquímica, imunoensaios e testes baseados em célula, que são bem caracterizados na técnica.

Todos os testes para antagonistas são comuns porque eles requerem contato da droga candidata com um polipeptídeo GDM codificado por um ácido nucleico identificado no presente pedido sob condições e por um tempo suficiente para permitir que estes dois componentes interajam.

Nos testes de ligação, a interação é de ligação e o complexo formado pode ser isolado ou detectado na mistura de reação. Em uma realização particular, o polipeptídeo GDM codificado pelo gene identificado no presente ou a droga candidata é imobilizado em uma fase sólida, tal como, em uma placa de microtítulo, pelas ligações covalentes e não-covalentes. Ligação não-covalente geralmente é realizada pelo revestimento da superfície sólida com uma solução do polipeptídeo GDM e seca. Alternativamente, um anticorpo imobilizado, por exemplo, um anticopo monoclonal, específico para o polipeptídeo GDM a ser imobilizado pode ser usado para ancorá-lo a uma superfície sólida. O teste é realizado pela adição do componente não- imobilizado, que pode ser marcado por um marcador detectável ao componente imobilizado, por exemplo, a superfície de revestimento contendo o componente ancorado. Quando a reação está completa, os componentes não reagidos são removidos, por exemplo, por lavagem, e os complexos ancorados na fase sólida são detectados. Quando o componente originalmente carrega um marcador detectável, a detecção do marcador imobilizada na superfície indica que ocorreu a complexação. Onde o componente não imobilizado originalmente não carrega um marcador detectável, a complexação pode ser detectada, por exemplo, pelo uso de um anticorpo marcado especificamente ligando o complexo imobilizado.

Se o composto candidato interage, mas não se liga a um polipeptídeo GDM específico codificado por um gene identificado no presente pedido, sua interação com esse polipeptídeo pode ser testada por métodos bem conhecidos para detecção de interações proteína-proteína. Tais testes incluem abordagens tradicionais, como, por exemplo, reticulação, co- imunoprecipitação e co-purificação através de gradientes ou colunas cromatográficas. Além disso, interações proteína-proteína podem ser monitoradas pelo uso de um sistema genético baseado em levedura descrito por Fields e colaboradores [Fields e Song, Nature (London) 340, 245-246 (1989); Chien et al„ Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)] como divulgado por Chevray e Nathans, Proc. Nati Acad. Sci. USA 89. 5789-5793 (1991). Muitos ativadores de transcrição, como levedura GAL4, consistem de dois domínios modulares distintos fisicamente, um agindo como o domínio de ligação de DNA1 e o outro funcionando como o domínio de ativação da transcrição. O sistema de expressão de levedura descrito nas publicações precedentes (geralmente chamado de "sistema di-híbrido") leva vantagem nesta propriedade, e emprega duas proteínas híbridas, uma em que a proteína alvo está unida ao domínio de ligação de DNA do GAL4, e outra, em que o candidato que ativa proteínas está unido ao domínio de ativação. A expressão de um gene repórter GAL1-lacZ sob controle de um promotor ativado por GAL4 depende da reconstituição da atividade de GAL4 via interação proteína- proteína. Colônias contendo interação de polipeptídeos são detectadas com um substrato cromogênico para β-galactosidase. Um kit completo (MATCHMAKER™) para identificação de interações proteína-proteína entre duas proteínas específicas usando-se técnica di-híbrida está comercialmente disponível por meio da Clontech. Este sistema pode também ser estendido para mapear domínios de proteínas envolvidos em interações específicas de proteínas, assim como para apontar resíduos de aminoácidos que são cruciais para estas interações.

Compostos que interferem na interação de um gene que codifca um polipeptídeo GDM identificado no presente pedido e outros componentes intra ou extracelular podem ser testados como segue: Usualmente uma mistura de reação é preparada contendo o produto do gene e o componente intra ou extracelular sob condições e por um tempo que permita a interação e ligação dos dois produtos. Para testar a habilidade de um composto candidato para inibir ligação, a reação é conduzida na ausência e na presença do composto de teste. Além disso, um placebo pode ser adicionado a uma terceira mistura de reação, para servir como controle positivo. A ligação (formação do complexo) entre o composto de teste e o componente intra ou extracelular presente na mistura é monitorada como descrito acima. A formação de um complexo na(s) reação(ões) de controle, mas não na mistura de reação contendo o composto de teste indica que o composto de teste interfere na interação do composto de teste e seu parceiro de reação.

Para testar antagonistas, o polipeptídeo GDM pode ser adicionado a uma célula junto com o composto a ser selecionado para uma atividade específica e a habilidade do composto para inibir a atividade de interesse na presença do polipeptídeo GDM indica que o composto é um antagonista do polipeptídeo GDM. Alternativamente, antagonistas podem ser detectados pela combinação do polipeptídeo GDM e um antagonista potencial com receptores do polipeptídeo GDM ligados à membrana ou receptores recombinantes sob condições apropriadas para um teste competitivo de inibição. O polipeptídeo GDM pode ser marcado, como por radioatividade, de forma que o número de moléculas de polipeptídeo GDM presentes na célula possa ser usado para determinar a efetividade do antagonista potencial. O gene que codifica o receptor pode ser identificado por diversos métodos conhecidos pelos técnicos no assunto, por exemplo, panorama de Iigante e seleção FACS. Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Capítulo 5 (1991). Preferivelmente1 a expressão de clonagem é empregada sendo que o RNA poliadenilado é preprado a partir de uma célula responsiva ao polipeptídeo GDM e uma biblioteca de cDNA criada a partir deste RNA é dividida em agrupamentos para transfectar células COS ou outras células que não são responsivas ao polipeptídeo GDM. Células transfectadas que são cultivadas em placas de vidro são expostas ao polipeptídeo GDM marcado. O polipeptídeo GDM pode ser maracado por diversos meios, incluindo iodinação ou inclusão de um sítio de reconhecimento para uma proteína quinase específica do sítio. Após fixação e incubação, as placas são sujeitas à análise autoradiográfica. Agrupamentos positivos são identificados e os sub- agrupamentos são preparados e novamente transfectados usando-se um processo interativo de sub-agrupamento e reseleção, eventualmente produzindo um único clone que codifica o suposto receptor.

Como uma abordagem alternativa para identificação do receptor, o polipeptídeo GDM marcado pode ser ligado por fotoafinidade com a membrana celular ou preparações de extrato que expressam a molécula receptora. O material de reticulação é separado por PAGE e exposto ao filme de raio X. O complexo marcado contendo o receptor pode ser removido, separado em fragmentos peptídicos e sujeitos a microsequenciamento de proteína. A seqüência de aminoácido obtida a partir do microsequenciamento seria útil para projetar um conjunto de sondas de oligonucleotídeos degeneradas para selecionar uma biblioteca de cDNA para identificar o gene que codifica o suposto receptor.

Em outro teste para antagonistas, células de mamíferos ou uma preparação de membrana que expressa o receptor seria incubado com o polipeptídeo GDM marcado na presença do composto candidato. A habilidade do composto para aumentar ou bloquear esta interação poderia então ser medida.

Exemplos mais específicos de antagonistas potenciais incluem um oligonucleotídeo que se liga às fusões de imunoglobulina com o polipeptídeo GDM1 e, em específico, incluindo, sem limitação, anticorpos poli e monoclonais e fragmentos de anticorpos, anticorpos de cadeia única, anticorpos anti-idiotípicos, e versões quiméricas ou humanizadas de tais anticorpos ou fragmentos, assim como anticorpos humanos e fragmentos de anticorpo. Alternativamente, um antagonista potencial pode ser uma proteína relativamente próxima, por exemplo, uma forma mutada do polipeptídeo GDM que reconhece o receptor, mas não tem efeito, através disso inibindo de forma competitiva a ação do polipeptídeo GDM.

Outro polipeptídeo GDM potencial é uma construção de RNA ou DNA antisense preparada usando-se tecnologia antisense, onde, por exemplo, uma molécula de RNA ou DNA antisense age para bloquear diretamente a tradução do mRNA por hibridização para atingir o mRNA prevenir tradução da proteína.

Antagonistas potenciais incluem moléculas pequenas que se ligam ao sítio ativo, o sítio de ligação do receptor, ou fator de crescimento ou outro sítio de ligação relevante do polipeptídeo GDM, através disso bloqueando a atividade biológica normal do polipeptídeo GDM. Exemplos de moléculas pequenas incluem, mas não estão limitadas a, peptídeos pequenos ou moléculas similares a peptídeos, preferivelmente peptídeos solúveis e peptidil orgânico não sintético ou compostos inorgânicos.

Ribozimas são moléculas de RNA enzimáticos capazes de catalisar a clivagem do RNA específico. Ribozimas agem por hibridização específica da seqüência para o RNA alvo complementar, seguido por clivagem endonucleolítica. Sítios de clivagem de ribozimas específicos com um alvo RNA potencial podem ser identificados por técnicas conhecidas. Para mais detalhes ver, por exemplo, Rossi, Current Biology 4, 469-471 (1994), e publicação PCT documento WO 97/33551 (publicado em 18 de setembro de 1997).

Moléculas de ácido nucléico na formação de tripla hélice usadas para inibir transcrição devem ser de fita única e compostas de desoxinucleotídeos. A composição da base destes oligonucleotídeos é projetada de forma que promova formação de tripla hélice via regra de pareamento de base de Hoogsteen, que geralmente requer extensões consideráveis de purinas ou pirimidinas em uma fita de um dúplex. Para mais detalhes ver, por exemplo, publicação PCT documento WO 97/33551, acima.

Estas moléculas pequenas podem ser identificadas por qualquer um ou mais dos testes de seleção discutidos acima e/ou por qualquer outra técnica de seleção bem conhecida para aqueles técnicos no assunto.

Os seguintes exemplos são oferecidos somente para propósitos ilustrativos, e não têm a intenção de limitar o escopo da presente invenção em qualquer modo.

Todas as referências de patente e literatura citadas na presente especificação são integralmente incorporadas ao presente como referência.

Exemplos

Exemplo 1:

Procedimentos Experimentais Amostras Tumorais E Características Dos Pacientes

Um resumo de todos os casos de tumores estudados está apresentado na Figura 8A. Para a análise de sobrevida, foram examinados três conjuntos de dados do perfil de expressão. Nós obtivemos amostras de tecido congelado de 76 casos no MDA, RNA de 39 casos da UCSF (Nigro et al., Câncer Res. 65: 1678-1686 (2005), e dados de um estudo previamente publicado pela UCLA (Freije et al., acima). Os casos analisados nos dois primeiros conjuntos de dados preenchiam os seguintes critérios: amostras frescas congeladas foram obtidas durante o procedimento inicial de ressecção cirúrgica de pacientes (acima de 21 anos de idade) que não receberam rádio ou quimioterapia prévia. As informações referentes ao acompanhamento clínico foram disponibilizadas por um período de pelo menos 2 anos após a cirurgia ou até o óbito do paciente. A aprovação do Conselho de Revisão Institucional para Experimentos Humanos foi obtida para estes estudos laboratoriais retrospectivos na UCSF e no MDA. Os casos foram classificados como astrocitoma anaplásico (AA) ou glioblastoma (GBM) de acordo com os critérios da OMS e cortes de todos os tecidos foram examinados por um neuropatologista (KA) para assegurar que ≥90% da amostra representasse o tumor. Variações histológicas atípicas foram excluídas. Para o conjunto de dados obtido da UCLA1 utilizamos dados de todos os casos que faziam parte do estudo previamente publicado e se enquadravam em nossos critérios quanto à idade do paciente e aos parâmetros de controle de qualidade de microarranjo. Este conjunto de dados inclui casos com morfologia oligodendroglial ou mista, como também casos com tempo observado de sobrevida inferior a 2 anos.

O tecido cerebral adulto normal consistiu de amostras obtidas por necrópsia do córtex cerebral de doadores sem história de tumor cerebral ou disfunções neurológicas, retiradas do Banco Americano de Pesquisa Neurológica e Cerebral (National Neurological Research Brain Bank) em Los Angeles, CA.

Para comparações do grau do tumor versus assinatura de classe (Fig 2A), incluímos amostras adicionais para as quais não há histórico clínico disponível. O tecido cerebral adulto normal consistiu em amostras obtidas por necrópsia do córtex cerebral de doadores sem história de tumor cerebral ou distúrbios neurológicos, retiradas do Banco Americano de Pesquisa Neurológica e Cerebral (National Neurological Research Brain Bank) em Los Angeles, CA. Com exceção das amostras de tecido cerebral e astrócitos fetais, os dados das amostras analisadas na Fig 2B foram obtidos através da subscrição ao Gene Logic (Gaithersburgh, MD), banco de dados da Affymetrix de amostras humanas.

Perfil De Expressão Gênica. Hibridização Genômica Comparativa E PCR Quantitativo

Para amostras não incluídas em publicações anteriores (Freije et al., acima; Nigro et ai., acima), o RNA celular total do tumor e das amostras de tecido cerebral normal foi extraído com kit de isolamento de RNA da Qiagen, de acordo com o protocolo do fabricante. A contaminação de DNA genômico foi removida através da etapa de digestão por DNase na coluna. Chips Affymetrix U133A e B chips foram empregados para gerar o perfil de expressão de acordo com uma técnica previamente publicada (Melhores Práticas de Análise Tumoral, 2004). Os parâmetros de controle de qualidade foram os descritos nesta publicação, com exceção de que foi permitido que as amostras mostrassem índices de proporção 375' de >3 para actina, ficando estabelecido que a proporção para GAPDH fosse <3. Foi realizado PCR quantitativo em duplicata para cada amostra no detector de seqüência ABI Prism7700 (Applied Biosystems, Foster, CA) com reagentes Taqman PCR Core (Applied Biosystems, Foster, CA). Foram utilizadas 25 ng de RNA total em cada reação de 50 μΙ. Para normalização, utilizou-se Rab 14, que exibe muito pouca variação de expressão em um número grande de amostras. Todos os pares de primer foram criados para gerar amplicons de 67-79 bp. A extração do DNA e o arranjo CGH foram realizados como anteriormente descrito. Misra et al., Clin. Câncer Res. 11(8): 2907-18 (2005). Das 96 amostras analisadas por CGH1 dados de 43 amostras são provenientes de um estudo já publicado (Nigro et al., acima). Análise Dos Dados De Microarranjo

Os valores de intensidade de sinal da versão do Conjunto de Análise de Microarranjo foram utilizados com um fator de escala de 500 para todas as análises de dados de microarranjo. Foram realizados agrupamentos k'médias e agrupamento aglomerativo com o programa Spotfire Decision Site versão 7.3, utilizando-se correlação de Pearson como medida de similaridade. Para cada gene, os dados foram normalizados na pontuação Z antes do agrupamento. As 35 assinaturas genéticas utilizadas para classificação dos tumores representam os marcadores mais fortes para cada um dos subgrupos tumorais no conjunto de amostras de sobrevida do MDA. Os marcadores de cada subgrupo são identificados a seguir: cada uma das 76 amostras é colocada em um de três grupos por agrupamento k-médias da expressão de 108 genes mais fortemente correlacionados à sobrevida. Utilizando-se um valor p de corte de 1 x 10"4, foram utilizados testes t para identificar todos os genes cuja expressão diferia entre as amostras em cada subclasse, comparado aos tumores de outras subclasses (ver Tabela A1 GDM). Para cada comparação, ordenamos em categorias os 500 conjuntos de sonda com os menores valores de p, por faixas. Os conjuntos de sonda usados como assinatura genética para cada subtipo de tumor foram aqueles que correspondem a seqüências completas identificadas, mostrando as alterações mais intensas e com de expressão mínimo (intensidade média de 400 dentro do grupo de interesse). Determinações empíricas feitas por agrupamento k-médias revelaram a formação de grupos de amostras estáveis quando da realização do agrupamento utilizando-se 30-60 conjuntos de sonda, ficando estabelecido que a lista de genes para agrupamento é balanceada para incluir menos marcadores de um dos três subtipos de tumor. Os últimos 35 genes de assinatura contêm 15 marcadores PN, 15 marcadores Mes e 5 marcadores Prolif. As pontuações de similaridade para centróides PN, Prolif e Mes representam coeficientes de correlação de Pearson para cada um dos centróides gerados em agrupamentos k-médias das 76 amostras de sobrevida do MDA. Para comparações estatísticas dos dados apresentados na Fig 4 F-I e Fig 7, dados transformados em Iog foram analisados por testes t corrigidos para comparações de múltiplos grupos. Os dados de expressão transformados em Iog também foram utilizados para a análise estatística realizada para a Fig. 5.

Hibridização In Situ E Imunohistoquímica Ribosondas antisense marcadas com 33P-UTP foram transcritas usando-se um sistema de transcrição in vitro da Promega (Promega1 Madison1 W1) e hibridizadas para microarranjos de tecido de glioma humano fixado em parafina a partir de fontes diversas, utilizando-se um método já descrito anteriormente (Phillips et al., Science 250: 290-294 (1990). As imagens mostradas na Fig 1 constituem a parte central do tecido incluído em um microarranjo obtido da Petagen1 Inc. A sonda para BCAN representa um fragmento de 668 bp (939 a 1606) e para CHI3L1/YKL40, um fragmento de 1158 bp (121 a 1278).

A análise imunohistoquímica foi realizada em cortes embebidos em parafina como previamente descrito (Simmons et al., Câncer Res. 61: 1122- 1128 (2001). Os anticorpos primários foram anti-p-akt (ser473) a partir da Tecnologia de Sinalização Celular (Beverly1 MA) e anti-Notch da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). As avaliações foram realizadas por um neuropatologista, sob cegamento para o grupo de assinatura das amostras analisadas.

Estudos In Vitro

Linhagens celulares de GBM previamente descritas foram utilizadas para os estudos in vitro (Hartmann et al., Internat. J. Oncoi 15: 975- 982 (1999). Para as culturas de neuroesferas, células selecionadas com positividade para esferas CD133 foram mantidas em cultura conforme descrito para amostras de GBM primário (Singh et al., Nature 432 396-401 (2004). Todas as culturas de neuroesferas são mantidas em meio neurobasal (Invitrogen) com suplementação de N2 (Invitrogen) e NSF1 (Cambrex). Quando presentes, EGF e FGF foram adicionados na concentração de 20 ng/ml. Cada linhagem celular é avaliada quanto ao crescimento das neuroesferas na ausência de EGF+FGF por um observador sob cegamento para a assinatura molecular das linhagens celulares. A escala de graduação é a seguinte: 0 = sem neuroesferas viáveis, 1 = neuroesferas em lenta expansão, 2 = taxa de crescimento moderado, 3 = crescimento moderado a rápido, mas mais lento em comparação ao observado com EGF+FGF, 4 = crescimento rápido não acelerado por EGF+FGF.

Os testes de inibição do crescimento foram conduzidos em 96 placas em condições padrão de cultura celular em meio DMEM com 10% de soro bovino fetal. Para tratamento com rapamicina, LY294002, ou inibidores de gama-secretase GSI-1 ou S-2188, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços (Dia 0), com densidade celular de 1500 ou 2000 por poço, tratadas no Dia 1 com a droga e avaliadas quanto à viabilidade no Dia 4 através da leitura com Alamar Blue. Cada condição de tratamento foi avaliada em pelo menos três experimentos com exceção do S-2188, que produziu resultados quase idênticos em dois testes. Os resultados mostrados na figura 6 referem-se a um experimento representativo.

RESULTADOS

ASSINATURAS MOLECULARES DEFINEM SUBCLASSES DE PROGNOSTICO DO ASTROCITOMA DE ALTO GRAU

Setenta e seis amostras de casos recentemente diagnosticados de GBM (n=55) e AA (n=21) foram obtidos do MD Anderson Câncer Center (MDA) e analisados por microarranjos de DNA para identificação de padrões de expressão gênica que classificam tumores em grupos com diferentes prognósticos (Fig 1 Α-C). A demografia destes e de todos os casos de tumores analisados neste estudo estão descritos na Figura 8A. Primeiramente, identificamos conjuntos de sonda cuja expressão se correlacionava mais fortemente à sobrevida (Spearman r dos valores de intensidade de expressão transformados em Iog versus tempos de sobrevida >0,45 ou <-0,45), seguido por dois agrupamentos aglomerativos bidirecionais dos 108 conjuntos de sondas resultantes e 76 amostras. Essa análise identificou três grupos distintos de conjuntos de amostras que diferem notadamente na expressão dos genes relacionados à sobrevida (Fig 1A).

A fim de desenvolver um conjunto de marcadores para cada uma das três subclasses tumorais, nós identificamos os conjuntos de sondas com superexpressão mais intensa pelos tumores dentro de cada subgrupo, comparado aos tumores nas subclasses restantes (ver Tabela A: Marcadores Determinantes de Glioma). Utilizando os marcadores mais fortes para cada um dos três subgrupos tumorais, chegou-se a um grupo de 35 genes, chamados de genes de assinatura, que podem ser usados tanto no agrupamento hierárquico (Fig. 1B) como no agrupamento k-médias para determinar a que subclasse pertence cada tumor. As subclasses de tumor definidas por agrupamento k-médias são designadas: pró-neural (PN), proliferativa (Prolif) e mesenquimal (Mes) para reconhecimento da característica dominante da lista do gene marcador que caracteriza cada subclasse. Para cada subclasse de tumor, foi calculado um centróide a partir da média de valores de expressão dos 35 genes de assinatura (Figura 1B). Um centróide pode ser visualizado como o padrão de expressão prototípica de um subtipo de tumor e as amostras adicionais podem ser classificadas com base na similaridade entre a expressão de seus genes de assinatura para estes centróides. Os gráficos de Kaplan- Meier criados para o grupo MDA mostraram que a sobrevida média da subclasse PN (174,5 semanas) foi notadamente mais longa do que os demais subtipos, Prolif (60,5) ou Mes (65,0 semanas; Fig 1C).

Para demonstrar o valor prognóstico do novo esquema de classificação de tumor, examinamos dois grupos adicionais de dados independentes. Um destes grupos foi gerado a partir de amostras de AA e GBM obtidas de casos tratados na Universidade da Califórnia em São Francisco (UCSF), enquanto o segundo grupo de validação foi obtido de um estudo anteriormente publicado sobre casos de tumores de graus Ill e IV com morfologia astrocítica, oligodendroglial e morfologia mista observados na UCLA (Freije et al., 2004). Em ambos os grupos de validação, os tumores foram classificados como subtipos PN1 Prolif e Mes com base na similaridade da expressão de seus genes de assinatura em relação aos centróides definidos no grupo de dados MDA. As análises de Kaplan-Meier para sobrevida dos subtipos tumorais nos dois grupos de validação mostraram um padrão bastante semelhante ao observado no grupo inicial do conjunto de dados (Fig. 1 D&E). Considerando somente os casos de GBM1 o valor prognóstico da distinção entre PN versus demais classes mostrou-se estatisticamente significativo tanto dentro do grupo de amostras MDA como nos 3 grupos de dados combinadamente (p<0,05, teste t para ambas as comparações de PN versus demais classes).

A seguir, comparamos a expressão de marcadores PN e Mes selecionados por microarranjo e por PCR quantitativo em tempo real. Selecionamos DLL3 (ligante 3 delta-like) e CHI3L1/YKL40 como marcadores para os subtipos PN e Mes, respectivamente, a partir da lista de genes de assinatura, e BCAN e CD44 da lista de marcadores mais gerais (Tabela A) para estas mesmas duas subclasses, respectivamente. Como observado nas Figuras 1F e G, a maioria das amostras de glioma mostrou valores de expressão acima da média da população tanto para o par de marcadores PN como para o par de marcadores Mes, mas raramente para a combinação de maracadores PN e Mes.

A hibridização in situ de um grupo de casos independentes de tumor confirmou um padrão mutuamente exclusivo de expressão para mRNAs de BCAN e CHI3L1/YKL40 (Fig 1H). A maioria das amostras mostrou sinal intenso para BCAN ou CHI3L1/YKL40, mas não para ambos simultaneamente. Contudo, algumas amostras exibiram a expressão focai dos dois marcadores em elementos celulares não-sobrepostos. Mais tipicamente, estas foram amostras com pequenos focos de expressão de CHI3L1 /YKL40 em provas com amplas regiões positivas para BCAN. Nestes casos, a expressão de CHI3L1/YKL40 foi freqüentemente associada a vasos sangüíneos.

Assinaturas PN. Prolif E Mes Definem Subpopulações Tumorais Que Diferem Em Termos De Grau Do Tumor E Idade Do Paciente

Expandindo nossa análise para incluir um total de 256 gliomas de alto grau (tabela suplementar 1), nós observamos que a maioria dos tumores exibiu forte similaridade com um dos centróides, PN1 Prolif ou Mes, e uma correlação neutra ou negativa para com os dois outros centróides (Fig. 2A). Esta descoberta se reflete pela tendência de agrupamento das amostras no ápice de um triângulo no formato tridimensional exibido na Fig. 2A. Enquanto algumas amostras demonstraram um grau intermediário de similaridade com dois centróides, foram muito poucas as amostras que mostraram um grau fraco ou neutro de similaridade com os três centróides. Assim, a maior parte dos gliomas de alto grau tende a consistir em um dos três estados fenotípicos distintos, mas pode, mais raramente, existir em uma condição intermediária entre duas condições.

As subclasses de tumor recém-definidas exibiram forte associação com o grau histológico do tumor. Quase todas as amostras de tumores de classe Ill examinadas (89%) foram classificadas como PN independentemente do fato de exibirem ou não uma morfologia oligodendroglial ou astrocítica. Ao contrário, uma proporção significativa de lesões de grau IV (GBM) foi classificada em uma das três categorias moleculares. Das 184 amostras de GBM examinadas, 32% foram consideradas PN, 20% Prolife 48% Mes.

O exame qualitativo de cortes de casos de GBM incluídos na amostra MDA e corados com H&E não revelou características histológicas que distinguissem de modo uniforme as sublasses moleculares do tumor. A única característica morfológica cuja ocorrência foi estatisticamente associada à subclasse molecular foi a necrose tumoral, menos freqüente no subtipo PN.

Entre os 9 casos de GBM identificados como PN1 4 não apresentavam regiões necróticas. Ao contrário, somente 2 dos 22 GBMs Mes (p<0,05, PN versus Mes, teste exato de Fischer) e 0 dos 24 GBMs Prolif (p=0,005, PN versus Prolif) deixaram de apresentar necrose.

Consistente com correlações bem estabelecidas tanto para o grau do tumor como tempo de sobrevida para a idade do paciente, observamos que a classificação de tumores entre os subtipos de tumor estratifica os pacientes com base na idade. Entre os 185 casos recém diagnosticados em nossa análise de sobrevida, os pacientes com tumores de subclasse PN mostraram- se significativamente mais jovens do que aqueles com tumores Prolif ou Mes (p<0,005 testes t para ambas as comparações). A média de idade +/- desvio padrão médio para pacientes portadores de tumores de subclasse PN1 Prolife Mes foi de 40,5 +/- 1,4 anos; 49,0 +/- 2,5 anos; e 50,7 +/- 1,3 anos; respectivamente. Para os GBMs1 os casos de subtipo Mes ocorreram em indivíduos significativamente mais velhos em comparação a PN (p <0,05, teste t), enquanto os casos de tumores Prolif não diferiram significativamente em termos de idade comparado às duas outras subclasses.

As Assinaturas PN. Prolif E Mes Caracterizam Grupos Distintos De

Tecidos Normais Para entender o significado biológico das assinaturas moleculares representadas por centróides PN, Prolif e Mes, examinamos a expressão dos 35 genes de assinatura em diversos tecidos humanos e tipos celulares. Tal análise revelou que conjuntos diferentes de tecidos se assemelham a cada um dos centróides que definem as subclasses de glioma (Fig 2B). Tanto o cérebro fetal como o de um adulto mostraram correlação positiva com o centróide PN (pró-neural). Duas linhagens de células-tronco neurais derivadas de cérebro humano fetal também exibiram uma assinatura PN sob condições normais de cultura (Fig. 2B). Os tecidos que exibiram assinatura Mes (mesenquimal) incluíram ossos, líquido sinovial, musculatura lisa, células endoteliais e células dendríticas. Além disso, uma amostra de astrócitos fetais humanos cultivados exibiu uma associação claramente positiva com o centróide Mes. Tanto as células-tronco hematopoiéticas isoladas da circulação periférica, como a linhagem altamente proliferativa Jurkat mostraram forte associação com o centróide Prolif. É interessante notar que as duas linhagens de células-tronco neurais mudaram de subclasse de assinatura da calassePN para Mes em resposta ao tratamento e à retirada do fator neurotrófico BDNF (Fig. 2B).

Sob Recidiva. Os Tumores Tendem A Se Deslocar Em Direção Ao Fenótipo Mes

Para determinar se a assinatura molecular que define a subclasse tumoral constitui uma característica fixa de cada tumor ou se pode mudar em função do tratamento ou da progressão da doença, comparamos as assinaturas da expressão de 26 pares de amostras equiparadas representando astrocitomas primários e recorrentes dos mesmos pacientes. A mudança média de assinatura nos 26 pares de amostras primárias versus recidivas corresponderam a uma perda da similaridade ao centróide PN de 0,18 +/- 0,06 (deslocamento médio em Pearson r +/- desvio padrão médio), um ganho de similaridade ao centróide Mes de 0,20 +/- 0,09 e pouquíssima alteração em termos de similaridade ao centróide Prolif (ganho de 0,02 +/- 0,08). Dezoito dos vinte e seis casos apresentaram instalação e recorrência na mesma subclasse molecular, enquanto oito tumores exibiram alteração da classe na recidiva (Fig 2C). Destes oito casos de mudança de classe fenotípica, somente um não representou uma mudança para a subclasse Mes; três casos exibiram mudança do subtipo PN para Mes e quatro casos mudaram do fenótipo Prolif para Mes. O último caso de mudança de classe refere-se a uma mudança de similaridade moderada à subclasse Mes para similaridade moderada a Prolif.

Usando-se uma análise pareada, o exame de significância dos microarranjos (SAM) identificou genes que foram significativamente supra- regulados nas recidivas tumorais com mudança para a subclasse Mes (Fig 2D). Os genes supra-regulados incluíram CHI3L1/YKL-40, CD44 e STAT3, genes anteriormente implicados na biologia do GBM1 bem como vimentina (VIM), um marcador clássico de tecidos mesenquimais (Eibl et ai, J. Neuro-Oncol. 26: 165-170 (1995); Nigro et al., acima.; Nutt et al., Câncer Res. 63: 1602-1607 (2005); Rahaman et al., Oncogene 21: 8404-8413 (2002); Tanwar et al., Câncer Res. 62: 4364-4368 (2002). Relatou-se que o CHI3L1/YKL-40 é um fator prognóstico de radio-resistência em tumores humanos (Pelloski et al., Clin. Câncer Res. 11: 3326-3334 (2005)) e que promove sobrevida clonogênica após radiação in vitro (Nigro et al., acima), descobertas consistentes com o aumento relativo da expressão mediante a recidiva do tumor após tratamento. Não foram observados quaisquer genes com infra-regulação significativa nos casos de mudança para a subclasse Mes.

A imunohistoquímica nos tecidos no caso da mudança de PN para outra subclasse na recidiva do tumor sugeriu a perda freqüente da expressão proeminente de OLIG2 nuclear e a supra-regulação de CHI3L1/YKL-40. No exemplo mostrado na Figura 3, um tumor PN exibindo expressão nuclear proeminente de OLIG2, um marcador PN já relatado como preferencialmente associado a lesões de baixo grau (Ligon et al., J. Neuropathoi Exp. Neurol. 63: 499-509 (2004), exibiu a perda relativa da expressão de OLIG2 na recidiva. O tecido cerebral normal exibiu apenas baixo nível de coloração na oligodendroglia, indicando que a supra-regulação deste marcador por tumores PN nos dados de arranjo não é uma manifestação de contaminação do cérebro normal durante o processamento do tecido. Da mesma forma, enquanto o CHI3L1/YKL-40, um marcador Mes, foi expresso somente em raras células tumorais na amostra primária, sua expressão na recidiva do tumor se mostrou abundante. Tais alterações na expressão relativa foram observadas em todos os tumores examinados com mudança para Mes na recorrência.

Subtipos Tumorais Com Prognóstico Desfavorável São Diferenciados Por Marcadores De Proliferação Ou Angiogênese Uma vez que definimos as subclasses prognósticas do tumor, procuramos identificar aspectos da biologia que pudessem contribuir para as diferenças em agressividade da doença. Para examinar os fenótipos das subclasses de tumor, selecionamos grupos de casos de astrocitoma de nossas análises de sobrevida que mostraram uma similaridade mais intensa aos centróides utilizados para classificação (n=12 por subtipo). Incluímos em nossa comparação oito amostras de tecido cerebral normal. Ao examinar os marcadores de proliferação, observamos que tanto o antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) quanto a topoisomerase Il alfa (TOP2A), mostraram superexpressão significativa em tumores Prolifem comparação aos tumores PN e Mes ( Fig 3A). Um mecanismo possível segundo o qual os tumores Mes manifestam um fenótipo agressivo na ausência de um alto índice de divisão celular é através da angiogênese. Como observado na Fig. 3B, os tumores Mes exibiram a superexpressão de fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), flt1 ou receptor 1 do VEGF (VEGFR1), kdr ou receptor 2 do (VEGFR2) e o marcador endotelial PECAM1. Subtipos De Tumor Com Prognóstico Desfavorável Expressam Marcadores De Células-Tronco E/Ou Células Amplificadoras Transitórias Enquanto Os Tumores Com Melhor Prognóstico Expressam Marcadores De Neuroblastos Ou Neurônios

Alguns dos marcadores PN no conjunto de genes de assinatura, como NCAM, GABBR1 e SNAP91, estão associados aos neurônios. Considerando achados recentes de que as células tumorigênicas de G BM expressam o marcador de células-tronco neurais CD133 (Singh et al., Nature 432: 396-401 (2004)), procuramos comparar a expressão de marcadores de células-tronco neurais versus marcadores de linhagens neuronais comprometidas (Fig. 3C-E). Para nossa análise, selecionamos marcadores associados à neurogênese do prosencéfalo adulto (Abrous et al., Physioi Rev. 85: 523-569 (2005); Anton et al., Nature Neurosci. 7: 1319-1328 (2004); Nakano et al., J. Cell Bioi 170: 413 (2005); Shi et ai, Nature 427: 78-83 (2004)). Para cinco de seis marcadores de células-tronco neurais ou células de amplificação transitória multipotentes, descobrimos que uma ou ambas as subclasses de tumor com prognóstico desfavorável mostraram expressão elevada em comparação aos tumores PN (Fig. 3C). Estas diferenças foram observadas com a vimentina (VIM), nestina (NES), TLX, CD133 e MELK. Enquanto o DLX2, um marcador de células amplificadoras transitórias, não mostrou diferenças estatisticamente significantes entre os grupos de tumor, alguns tumores Prolif mostraram forte expressão deste gene. Ao contrário, os marcadores de células-tronco, marcadores de neuroblastos ou neurônios em desenvolvimento apresentaram superexpressão nos tumores PN em comparação às subclasses Prolif e/ou Mes (Fig. 3D). Estes marcadores incluíram OLIG2, MAP2, DCX, ENC1 (NeuN), ERBB4 e GAD2. A expressão de marcadores neuronais em tumores PN não foi explicada pela contaminação das amostras detumor com cérebro normal, pois os níveis de expressão de OLIG2, DCX1 NeuN e GAD2 estavam elevados nos tumores quando comprado às amostras de tecido cerebral normal (dados não revelados, p<0,005 para todas as comparações por teste t de tecido tumoral versus normal, não corrigidas para comparações múltiplas). O GFAP, um marcador tanto de células-tronco neurais como de astrócitos, mostrou expressão mais intensa nos tumores de subclasse Mes e PN quando comparado aos tumores Prolif (Fig. 3E).

Perdas No Cromossomo 10 E Ganhos No Cromossomo 7 Estão Associadas

Aos Subtipos De Tumor Prouf E Mes

Dos casos examinados pela geração do perfil de expressão, o DNA de 96 amostras de AA e GBM estava disponível para análise por hibridização genômica comparativa baseada em arranjo (CGH). Os tumores foram classificados com base na alteração do número de cópias nos cromossomos 1, 7, 10 e 19. Os tumores foram avaliados com base nas mudanças relativas em número de cópias nos cromossomos 1, 7, 10 e 19. A maioria das amostras demonstrou ganhos no cromossomo 7 e perdas no cromossomo 10 (Fig. 4A). Ao examinar as perdas no cromossomo 10, descobrimos diferenças notáveis na freqüência destas alterações genômicas entre as subclasses de tumor (Fig. 4A). Enquanto a maioria dos tumores Prolif e Mes apresentou perdas no cromossomo 10 que incluíram 10q23.3 (78% e 84% respectivamente), uma minoria (20%) dos tumores de subclasse PN apresentou perdas no cromossomo 10. Para tumores Mes, a maioria dos casos mostrou perda essencialmente de todos os Ioci no cromossomo 10, e apenas dois casos apresentaram perdas restritas a 10q. Ao contrário, os tumores Prolif apresentaram perdas mais heterogêneas no cromossomo 10. A associação entre assinaturas prognósticas e situação do cromossomo 10 é altamente significativa (p<0,0001, teste exato de Fisher). Foram observadas associações semelhantes, mas menos intensas, entre a assinatura do tumor e as alterações relativas em número de cópias no cromossomo 7 ou 19q (Fig 4A, ρ < 0,01 para ambos, o cromossomo 7 e 19q por teste exato de Fisher), mas não no cromossomo 1p ou 1q (p > 0,05).

Dada a associação entre as alterações relativas do número de cópias genômicas e subtipos de tumor, procuramos determinar se os genes que definem cada subtipo de tumor foram corrompidos pela localização do cromossomo. A análise de Qui-quadrado das listas ampliadas de marcadores de subclasses de tumor (Tabela A) revelou que para cada uma das três listas, as freqüências observadas de localização cromossômica diferiram significativamente daquela esperada para as freqüências de localização de todos os conjuntos de sondas nos arranjos de expressão (p < 1 χ 10"14 para PN, ρ < 0,001 para Prolif, ρ < 0,0005 para Mes). As listas de marcadores PN e Mes super-representaram marcadores nos cromossomos 10 e 19, respectivamente (P <0,05 para ambas as comparações após correção de Bonferroni para 72 comparações). Tais descobertas corroboram com as diferenças entre subtipos de tumor e alterações relativas do número de cópias do DNA nos cromossomos 10 e 19q.

As Vias Notch E Akt São Ativadas De Forma Diferente Em Subclasses De Tumor Com Prognóstico Favorável Versus Desfavorável

Consistente com a associação entre as perdas no cromossomo e a subclasse de tumor, o exame direto de arranjo dos dados de CGH para clones BAC que incluem o locus PTEN confirmou que uma alta porcentagem de casos Prolif e Mes exibiu perdas no Iocus PTEN. Foi observada uma associação negativa entre as perdas no Iocus PTEN e a similaridade com o centróide PN (Fig. 5A). A maioria dos casos de ganho ou amplificações do locus foi de tumores das subclasses Prolif ou Mes, e foi observada uma correlação negativa entre os ganhos em número de cópias de EGFR e similaridade com o centróide PN (Fig 5B). Não foram observadas amplificações ou remoções óbvias nos Ioci correspondentes a aktl, akt2 ou akt3, ou em subunidades catalíticas de PI3K (não mostrado). Um pequeno número de amostras demonstrou ganhos no número de cópias para PIK3R3, uma subunidade reguladora de PI3K, e as proporções CGH para este Iocus foram positivamente correlacionadas à similaridade com a assinatura Prolif (Fig. 5C).

Uma vez que nossos resultados sugeriram uma forte relação entre a ativação via de akt e os subtipos de tumor, comparamos a expressão de mRNA de PTEN e imunohistoquímica de fosfo-akt (p-akt) nos subtipos de tumor. Descobrimos que os tumores Prolif e Mes expressaram aproximadamente 2 vezes menos mRNA de PTEN e p-akt (ser473) mais intenso quando comprado aos tumores PN (Fig, 5E; Fig. 51). Os resultados foram altamente significativos (p < 5 X 10"5 para mRNA para PTEN; p< 5 X 10"8 para imunohistoquímica de p-akt em testes t de PN versus os demais). Os resultados de PTEN foram validados por um segundo conjunto de amostras independentes (dados não mostrados).

Ao examinar a lista completa de marcadores de tumor PN no grupo de amostras do MDA, nós descobrimos que os conjuntos de sondas correspondentes aos elementos da via Notch DLL3, DLL1, HEY2 e ASCL1 se enquadravam em nossos critérios para marcadores de tumores PN (Fig. 5 E- H). Foi confirmada a superexpressão significativa destes genes nos tumores PN de ambos os grupos de dados de validação. Cada um destes quatro elementos da via Notch foi envolvido na neurogênese do prosencéfalo. (Campos et al., J. Neurosci. Res. 64: 590-598 (2001); Casarosa et al., Development 126: 525-534 (1999); Sakamoto et al., J. BioL Chem. 278: 44808- 44815 (2003)) e o ASCL1 foi recentemente ligado à especificação de neurônios e oligodendroglia no prosencéfalo adulto. (Parras et al., EMBO Journal, 23(22): 4495-505 (2004). Os elementos da via Notch para os quais os dados de microarranjo não mostraram supra-regulação em tumores PN incluem Notch 1- 4, Jagged 1 & 2, e Hes 1, 2, 4, 6, 7 (não mostrado). HEY1 mostrou uma pequena, mas significativa supra-regulação nos tumores PN do MDA (1,4FC, p = 5 X 10-5).

Para examinar evidências diretas de ativação de sinalização Notch, utilizamos uma avaliação de metodologia cega da imunoreatividade nuclear de Notch em todos os casos do MDA com cortes embebidos em parafina disponíveis. Os casos positivos mostraram uma "mancha" no núcleo, comparado aos casos negativos, que mostraram completa ausência de coloração nuclear. A Fig. 5J exibe as freqüências de cada subtipo de tumor classificadas como O, 1 ou 2 para coloração nuclear Notch. Apesar do sinal relativamente fraco exibido por casos positivos, demonstrou-se que a classificação das amostras PN foi significativamente mais alta do que aquelas das subclasses Prolif (p<0,005, teste t) ou Mes (p<0,001, teste t).

Um Modelo De Duplo Gene Da Expressão De DLL3 E PTEN Prevê A Sobrevida De Astrocitomas De Alto Grau

Uma vez que nossos dados sugeriram um papel para as vias Notch e akt na agressividade do tumor, procuramos evidências para uma associação direta entre a expressão dos marcadores da via e a sobrevida. Para esta análise, avaliamos mRNA de PTEN por PCR quantitativo e mRNA de DLL3 através dos dados de microarranjo de todas as amostras no grupo de sobrevida MDA que apresentavam mRNA suficiente disponível (n=65). Um modelo de casualidade proporcional de Cox revelou que os níveis de mRNA de PTEN e DLL3, e sua interação estatística foram todos associados à sobrevida em astrocitomas de alto grau, e combinados para formar um modelo prognóstico altamente significativo (Teste de índice de Probabilidade de 21,6 comparado a uma referência de distribuição por qui-quadrado com 3 graus de liberdade, ρ < 0,0001). As funções prognósticas de sobrevida, descritas na figura Fig. 5A, demonstram que amostras com valores reduzidos de mRNA para PTEN foram associadas a funções desfavoráveis de sobrevida independentemente do nível de expressão de DLL3. Para amostras com alta expressão de PTEN, observou-se que a sobrevida estimada varia em função de DLL3 de modo que as amostras com altos níveis de mRNA tanto para PTEN como para DLL3 mostraram os melhores resultados. Em seguida, ajustamos o mesmo modelo a um conjunto independente menor (n=34) de amostras de astrocitoma de graus Ill e IV. As curvas de sobrevida previstas são notavelmente semelhantes àquelas obtidas no grupo de amostras MDA (Fig. 5B), indicando a força deste modelo de duplo gene (Figura 6B). Assinaturas De Expressão De Linhagens Celulares De GBM Prognosticam

O Crescimento De Neuroesferas Independentes De EGF/FGF E Sensibilidade Para Inibicão Da Via Akt Para examinar o significado terapêutico potencial dos subtipos moleculares de tumor, avaliamos as respostas in vitro de linhagens celulares de glioma com uma função de sua expressão de genes de assinatura. Traçamos o perfil de 16 linhagens celulares de GBM para expressão do mRNA, investigamos sua capacidade de gerar neuroesferas na presença ou ausência de EGF+FGF, e avaliamos suas respostas a agentes que afetam a sinalização das vias Notch e Akt. As 16 linhagens mostraram uma correlação negativa com respeito ao centróide PN1 mas uma ampla gama de similaridades ao centróide Mes. Enquanto 15 das 16 linhagens celulares geraram neuroesferas que podiam ser propagadas em EGF+FGF, a capacidade para gerar neuroesferas que crescessem na ausência de EGF+FGF variou (Fig 6A), e pareceu estar relacionada à assinatura de expressão da linhagem celular parental (Fig. 6B). Ainda mais impressionante foi a observação de que duas linhagens celulares negativamente correlacionadas ao centróide Mes (G112 & G122) geraram neuroesferas que cresceram rapidamente na ausência de EGF+FGF (Fig. 6B), enquanto as linhagens celulares com forte correlação ao centróide Mes não conseguiram gerar neuroesferas que pudessem ser prontamente reproduzidas na ausência de EGF+FGF (Fig. 7B).

Um resumo das principais descobertas, incluindo os paralelos entre subtipos detumor e estágio de desenvolvimento neural do prosencéfalo, está apresentado nas Figuras 8 A & B.

Exemplo 2

Análise De Microarranjo Para Detectar A Supra-Regulação De Polipeptídeos GDM Em Tumores Do Tipo Glioma Os microarranjos de ácido nucléico, que muitas vezes contêm milhares de seqüências genéticas, são úteis para identificar genes expressos diferencialmente em tecidos doentes comparados aos mesmos tecidos saudáveis. Utilizando-se microarranjos de ácido nucléico, amostras de mRNA para teste e tecido controle são transcritas reversamente e marcadas para gerar sondas de cDNA. As sondas de cDNA são então hibridizadas para um arranjo de ácidos nucléicos imobilizados em um suporte sólido. O arranjo é configurado de forma que a seqüência e a posição de cada elemento do arranjo sejam conhecidas. Por exemplo, uma seleção de genes conhecidos por serem expressos em determinadas doenças pode ser disposta como arranjo sobre um suporte sólido. A hibridização de uma sonda marcada com um elemento específico do arranjo indica que a amostra a partir da qual a sonda foi derivada expressa aquele gene. Se o sinal de hibridização de uma sonda a partir de uma amostra de teste (tecido doente) é maior do que o sinal de hibridização de uma sonda da amostra controle (tecido normal), o gene ou genes superexpressos no tecido doente são identificados. A implicação deste resultado é que uma proteína superexpressa em um tecido doente é útil não somente como um marcador diagnóstico para a presença da condição da doença, mas também como um alvo terapêutico para o tratamento da condição da doença.

A metodologia de hibridização de ácidos nucléicos e a tecnologia de microarranjo são bastante conhecidas na técnica. No presente exemplo, a preparação específica de ácidos nucléicos para hibridização e sondas, lâminas e condições de hibridização estão detalhados no pedido de patente PCT N0. de Série PCT/US01/10482, depositado em 30 de março de 2001, incorporado ao presente como referência.

Exemplo 3

Análise Quantitativa Da Expressão De GDM Neste teste, um teste de 5' nuclease (por exemplo, TaqMan®) e um PCR quantitativo em tempo real (por exemplo, ABI Prizm 7700 Sequence Detection System® (Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA)), é usado para encontrar genes que são superexpressos de modo significante em um tumor ou tumores tipo glioma quando comparado a outros tumores ou tecido normal não-canceroso. A reação de 5' nuclease constitui uma técnica de fluorescência baseada em PCR que utiliza a atividade da 5' exonuclease da enzima Taq DNA polimerase para monitorar a expressão gênica em tempo real. Dois primers de oligonucleotídeos (cujas seqüências são baseadas no gene ou seqüência EST de interesse) são usados para gerar um amplicon típico de uma reação de PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ou sonda, é designado para detectar a seqüência de nucleotídeos localizada entre os dois primers de PCR. A sonda não é extensível pela enzima Taq DNA polimerase, e é marcada com um corante repórter fluorescente e um corante fluorescente quencher. Toda emissão induzida por laser a partir do corante repórter é apagada pelo corante quencher quando os dois corantes estão localizados próximos um ao outro, como acontece na sonda. Durante a reação de amplificação por PCR, a enzima Taq DNA polimerase cliva a sonda de maneira dependente do molde. Os fragmentos resultantes da sonda se dissociam em solução, e o sinal liberado pelo corante repórter fica livre da ação quencher do segundo fluoróforo. Uma molécula do corante repórter é liberada para cada nova molécula sintetizada, e a detecção do corante repórter na ausência do quencher fornece a base da interpretação quantitativa e qualitativa dos dados. Este teste é bem conhecido e utilizado rotineiramente na técnica para identificar quantitativamente as diferenças de expressão gênica entre duas amostras diferentes de tecidos humanos; ver, por exemplo, Higuchi et al., Biotechnology 10:413-417 (1992); Livak et al., PCR Methods Appl., 4:357-362 (1995); Heid et al., Genome Res. 6:986-994 (1996); Pennica et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA 95(25): 14717-14722 (1998); Pitti et al., Nature 396(6712):699-703 (1998) e Bieche et al., Int. J. Câncer 78:661-666 (1998).

O procedimento de 5' nuclease é executado em um dispositivo de PCR quantitativo em tempo real como o ABI Prism 7700TM Sequence Detection. O sistema consiste de um ciclador térmico, laser, dispositivo de câmera e computador duplamente carregado (CCD). O sistema amplifica as amostras em um formato de 96 poços em um ciclador térmico. Durante a amplificação, o sinal fluorescente induzido por laser é colhido em tempo real por cabos de fibra óptica de todos os 96 poços, e detectado no CCD. O sistema inclui um programa para executar o instrumento e para analisar os dados.

O material inicial para seleção é o mRNA isolado de uma série de tecidos cancerosos diferentes. O mRNA é quantificado com precisão, por exemplo, fluorometricamente. Como um controle negativo, o RNA é isolado de diversas amostras normais do mesmo tipo de tecido que os tumores em teste. Freqüentemente, a(s) amostra(s) de tumor(es) são comparadas diretamente com amostras normais compatíveis do mesmo tipo de tecido, o que significa que o tumor e a amostra(s) normal(is) são obtidos do mesmo indivíduo.

Os dados do teste de 5' nuclease são inicialmente expressos como Ct1 ou limiar do ciclo. Este é definido como o ciclo em que o sinal repórter se acumula sobre o nível de fluorescência de fundo. Os valores ACt são usados como medida quantitativa do número relativo de cópias iniciais de uma seqüência alvo específica em uma amostra de ácido nucléico ao comparar resultados de mRNA de câncer ao mRNA humano normal. Uma vez que uma unidade de Ct corresponde a um ciclo de PCR ou um aumento relativo aproximado de 2 vezes em relação ao normal, duas unidades correspondem a um aumento relativo de 4 vezes, 3 unidades correspondem a um aumento relativo de 8 vezes e assim por diante, pode-se medir quantitativamente e qualitativamente o aumento relativo da expressão de mRNA entre dois ou mais tecidos diferentes. Sob este aspecto, é bem aceitável na técnica que este teste é suficientemente sensível para detectar de modo passível de reprodução um aumento de pelo menos 2 vezes na expressão de mRNA em uma amostra tumoral humana em relação a um controle normal.

Exemplo 4

Hibridização In Situ

A hibridização in situ constitui uma técnica potente e versátil para a detecção e a localização de seqüências de ácido nucléico em preparações de células ou tecidos. Ela pode ser útil, por exemplo, para identificar sítios de expressão gênica, analisar a distribuição de transcrição no tecido, identificar e localizar infecções virais, acompanhar alterações na síntese específica de mRNA e auxiliar no mapeamento cromossômico.

A hibridização in situ é realizada seguindo uma versão otimizada do protocolo desenvolvido por Lu e Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994), utilizando-se ribosondas marcadas com 33P geradas por PCR. Resumidamente, tecidos humanos fixados em formalina e embebidos em parafina são cortados, desparafinados e desproteinados em proteinase K (20 g/ml) por 15 minutos a 37°C, e então processados para hibridização in situ como descrito por Lu e Gillett, acima. Ribosondas antisense marcadas com [33-P] UTP são geradas como produto de PCR e hibridizados durante a noite a 55°C. As lâminas são mergulhadas em emulsão Kodak NTB2 de rastreamento nuclear e expostas por 4 semanas. Síntese De Ribosonda Com 33P

6.0 μl (125 mCi) de 33P-UTP (Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol) foram desidratados por centrifugação a vácuo. A cada tubo contendo 33P-UTP desidratado, os seguintes ingredientes foram adicionados:

2,0 μl 5x tampão de transcrição

1,0 μl de DTT (100 mM)

2,0 μl de mistura NTP (2,5 mM : 10 μ; de cada 10 mM GTP1 CTP & ATP

+ 10 μl de H2O)

1,0 μl de UTP (50 μΜ)

1,0 de μl Rnasin

1,0 μl de DNA molde (1pg)

1,0 μl de H2O

1,0 μl de RNA polimerase (para produtos de PCR T3 = AS, T7 = S, normalmente)

Os tubos são incubados a 37°C por uma hora. São adicionados 1,0 μl de RQ1 DNase1 seguido por incubação a 37°C durante 15 minutos. São adicionados 90 μΙ de TE (10 mM de Tris pH 7,6/1 mM de EDTA pH 8,0), e a mistura é pipetada sobre papel DE81. A solução restante é carregada em uma unidade de uItrafiItração de Microcon-50, e centrifugada usando-se programa 10 (6 minutos). A unidade de filtração é invertida sobre um segundo tubo e centrifugada usando-se o programa 2 (3 minutos). Após a última centrifugação para recuperação, 100 μΙ de TE são adicionados. 1 μl do produto final é pipetado em papel DE81 e contado em 6 ml de Biofluor II.

A sonda é executada em um gel de TBE/uréia. Adiciona-se 1-3 μl da sonda ou 5 μl de RNA Mrk III a 3 μl do tampão de carregamento. Após aquecer sobre um bloco de aquecimento a 95°C por três minutos, a sonda é imediatamente colocada no gelo. Os poços de gel são descartados, a amostra é carregada e corrida a 180-250 volts por 45 minutos. O gel é embrulhado em saran e exposto a um filme XAR com uma tela intensificadora em freezer a - 70°C, durante uma hora ou durante a noite.

Hibridização Com 33P

A. Pré-Tratamento Dos Cortes Congelados

As lâminas são removidas do freezer, colocadas sobre bandejas de alumínio e descongeladas em temperatura ambiente por 5 minutos. As bandejas são colocadas em incubadora a 55°C por cinco minutos para reduzir a condensação. As lâminas são fixadas por 10 minutos em paraformaldeído a 4% em gelo em uma cobertura com vapor, e lavadas em 0,5 χ SSC por 5 minutos, em temperatura ambiente (25 ml 20 χ SSC + 975 ml SQ H2O). Após a desproteinização em 0,5 pg/ml de proteinase K por 10 minutos a 37°C (12,5 μl de 10 mg/ml de caldo em 250 ml de tampão RNAse pré-aquecido livre de RNase), os cortes são lavados em 0,5 χ SSC por 10 minutos em temperatura ambiente. Os cortes são desidratados em etanol a 70%, 95% e 100%, 2 minutos cada.

B. Pré-Tratamento Dos Cortes Embebidos Em Parafina As lâminas são desparafinadas, colocadas em SQ H2O, e enxaguadas duas vezes em 2 χ SSC a temperatura ambiente, por 5 minutos a cada vez. Os cortes são desproteinados em 20 pg/ml de proteinase K (500 μΙ de 10 mg/ml em 250 ml de tampão RNase livre de RNase; 37°C, 15 minutos) - embrião humano, ou 8 χ proteinase K (100 μΙ in 250 ml de tampão Rnase, 37°C, 30 minutos) - tecidos em formalina. Subsequente enxágue em 0,5 χ SSC e desidratação são realizados conforme descrito acima.

C. Pré-Hibridização

As lâminas são colocadas em uma caixa plástica enfileiradas com papel filtro embebido em solução tampão (4 χ SSC, formamida a 50%).

D. Hibridização

Sondas de 1.0 χ 10® cpm e 1.0 μl de tRNA (50 mg/ml caldo) por lâmina são aquecidos a 95°C por 3 minutos. As lâminas são resfriadas em gelo, e 48 μΙ de tampão de hibridização são adicionados a cada lâmina. Após turbilhonamento, 50 μΙ da mistura com 33P são adicionados a 50 μl de solução de pré-hibridização sobre a lâmina. As lâminas são incubadas durante a noite a 55°C.

E. Lavagens

A lavagem é realizada 2 χ 10 minutos com 2xSSC, EDTA em temperatura ambiente (400 ml 20 χ SSC + 16 ml 0,25M de EDTA1 Vf=4L), seguida pelo tratamento com RNaseA a 37°C por 30 minutos (500 μΙ de 10 mg/ml em 250 ml de tampão Rnase = 20 pg/ml). As lâminas são lavadas 2x10 minutos com 2 χ SSC1 EDTA em temperatura ambiente. A condição de estringência da lavagem pode ser a seguinte: 2 horas a 55°C; 0,1 χ SSC1 EDTA (20 ml 20 χ SSC + 16 ml EDTA, Vf=4L).

F. Oligonucleotídeos

A análise in situ é realizada em uma série de seqüências de DNA divulgadas no presente pedido. Os oligonucleotídeos empregados para estas análises são obtidos de modo complementar aos ácidos nucléicos (ou complementos destes), como mostrado nas figuras anexas.

Exemplo 5

Preparo Dos Anticorpos Que Se LigamAo GDM

As técnicas de produção de anticorpos monoclonais são conhecidas na técnica e estão descritas, por exemplo, por Goding, acima. Imunógenos que podem ser empregados incluem polipeptídeos GDM purificados, proteínas de fusão contendo polipeptídeos GDM e células que expressem polipeptídeos GDM recombinantes na superfície celular. A escolha de imunógenos pode ser feita pelo técnico no assunto sem experimentação excessiva.

Camundongos, como Balb/c, são imunizados com o imunógeno acima, emulsificado em adjuvante de Freund completo e injetado por via subcutânea ou intraperitoneal em uma quantidade de 1-100 microgramas. Alternativamente, o imunógeno é emulsificado em adjuvante MPL-TDM (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) e injetado nos coxins das patas posteriores dos animais. Os camundongos imunizados são então estimulados em 10 a 12 dias depois com uma dose adicional de imunógeno emulsificado no adjuvante selecionado. A partir de então, por várias semanas, os camundongos podem ser estimulados também com injeções de imunização adicionais. As amostras de soro podem ser obtidas periodicamente dos camundongos por sangramento retro-orbital para teste em ensaios ELISA a fim de detectar anticorpos anti-GDM.

Após detecção de título do anticorpo adequado, os animais "positivos" para os anticorpos podem receber uma injeção intravenosa final de polipeptídeos GDM. Três a quatro dias depois, os camundongos são sacrificados e as células do baço são colhidas. As células do baço são então fundidas (utilizando polietilenoglicol a 35%) com uma linhagem celular de mieloma murino selecionada, como P3X63AgU.1, disponível a partir da ATCC, No. CRL 1597. Essas fusões geram células de hibridoma que podem, então, ser colocadas em placas de cultura de 96 poços contendo meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, mielomas híbridos e híbridos de células esplênicas.

As células de hibridoma são tríadas por ELISA para reatividade contra GDM. A determinação de células de hibridoma "positivas" que secretam os anticorpos monoclonais desejados contra GDM está dentro da técnica.

Células de hibridoma positivas podem ser injetadas por via intraperitoneal em camundongos Balb/c singênicos para produzir ascite contendo os anticorpos monoclonais anti-GDM. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas em frascos ou garrafas cilíndricas de cultura de tecido. A purificação dos anticorpos monoclonais produzidos nas ascites pode ser realizada por precipitação com sulfato de amônia, seguida por cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, a cromatografia de afinidade com base na ligação do anticorpo à proteína A ou G pode ser empregada.

Exemplo 6

Preparo De Anticorpos Conjugados A Toxinas Que Se Ligam Ao GDM

O uso de conjugados anticorpo-droga (ADC)1 isto é, imunoconjugados, para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostáticos que são drogas para destruir ou inibir as células de tumor no tratamento do câncer (Payne (2003) Câncer Cell 3:207-212; Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605 - 614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; patente US 4.975.278) permite a entrega direcionada do componente droga aos tumores, e o acúmulo intracelular desta, enquanto a administração sistêmica destas drogas não-conjugadas pode levar a níveis inaceitáveis de toxicidade a células normais, como também às células de tumor que se deseja eliminar (Baldwin et al., (1986) Lancet (15 de março de 1986) páginas 603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinicai Applications, Pinchera et al. (eds.), páginas 475-506). Eficácia máxima com toxicidade mínima é, portanto, buscada. Esforços para criar e refinar ADC foram focados na seletividade dos anticorpos monoclonais (mAbs), como também nas propriedades de ligação e liberação da droga. Tanto os anticorpos policlonais como monoclonais foram relatados como úteis nessas estratégias (Rowland et al., (1986) Câncer Immunol. Immunother., 21:183-87). Drogas usadas nestes métodos incluem adaunomicina, adoxorubicina, metotrexato e vindesina (Rowland et al., (1986) acima). As toxinas usadas em conjugados anticorpo-toxina incluem as de origem bacteriana, como a toxina diftérica, toxinas vegetais como a ricina e toxinas de moléculas pequenas como a geldanamicina (Mandler et al. (2000) J. of the Nat. Câncer Inst. 92(19):1573- 1581; Mandler et al. (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinóides (EP 1391213; Liu et al., (1996) Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et al. (1993) CancerRes. 53:3336-3342).

As técnicas para produzir conjugados anticorpo-droga pela ligação de toxinas a anticorpos purificados são bem conhecidas e empregadas rotineiramente na técnica. Por exemplo, a conjugação de um anticorpo monoclonal purificado com a toxina DM1 pode ser realizada como a seguir. O anticorpo purificado é derivado com o N-succinimidil-4-(2-piridiltio)-pentanoato para a introdução de grupos ditiopiridil. O anticorpo (376,0 mg, 8 mg/mL) em 44,7 ml de 50 mM de solução tampão fosfato de potássio (pH 6,5) contendo NaCl (50 mM) e EDTA (1 mM) é tratado com SPP (5,3 equivalentes molares em 2,3 ml de etanol). Após incubação por 90 minutos com argônio em temperatura ambiente, a mistura de reação é filtrada através da coluna Sephadex G25 equilibrada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM de NaCI e 2 mM de EDTA. Anticorpos contendo frações são então agrupados e avaliados. Anticorpo-SPP-Py (337,0 mg com grupos 2-tiopiridina removíveis) é diluído com 35 mM do tampão citrato de sódio acima; pH 6,5; para uma concentração final de 2,5 mg/ml. DM1 (1,7 equivalentes, 16,1 mois) em 3,0 mM de dimetilacetamida (DMA, 3% v/v na mistura de reação final) é então adicionado à solução de anticorpo. Permite-se que a reação continue em temperatura ambiente sob argônio por 20 horas. A reação é carregada em uma coluna de filtração em gel Sephacryl S300 (5,0 cm χ 90,0 cm, 1,77 L) balanceada com 35 mM de citrato de sódio, 154 mM NaCI, pH 6,5. A taxa de fluxo é de 5,0 ml/min e 65 frações (20,0 ml cada) são colhidas. As frações são agrupadas e avaliadas, sendo que o número de moléculas da droga DM1 por molécula de anticorpo (p') é determinada pela medida de absorbância a 252 nm e 280 nm.

Para fins de ilustração, a conjugação de um anticorpo monoclonal purificado à toxina DM1 também pode ser realizada como a seguir. O anticorpo purificado é derivado com (Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1- carboxilato (SMCC, Pierce Biotechnology, Inc) para introdução do Iigante SMCC. O anticorpo é tratado a 20 mg/ml em 50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA1 pH 6,5 com 7,5 equivalentes molares de SMCC (20 mM em DMSO, 6,7 mg/ml). Após agitação durante 2 horas sob argônio sob temperatura ambiente, a mistura é filtrada em uma coluna Sephadex G25 balanceada com 50mM de fosfato de potássio/ 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, pH 6,5. Anticorpos contendo frações são reunidos e analisados. Anticorpo-SMCC é então diluído com 50mM de fosfato de potássio / 50 mM de cloreto de sódio/ 2 mM de EDTA, pH 6,5, até uma concentração final de 10 mg/ml, e reagido com uma solução de 10 mM de DM1 (1,7 equivalentes assumindo 5 SMCC/anticorpo, 7,37 mg/ml) em dimetilacetamida. A reação é submetida a agitação em temperatura ambiente sob argônio por 16,5 horas. A mistura de reação de conjugação é então filtrada em uma coluna de filtração em gel Sephadex G25 (1,5 x 4,9 cm) com 1 x PBS a pH 6,5. A taxa de DM1/anticorpo (p) é então medida por absorbância a 252 nm e a 280 nm.

Normalmente as drogas citotóxicas são conjugadas a anticorpos através dos freqüentes e numerosos resíduos Iisina do anticorpo. A conjugação através de grupos tiol presentes, ou inseridos por engenharia genética, no anticorpo de interesse também foi realizada. Por exemplo, resíduos de cisteína foram introduzidos em proteínas por técnicas de engenharia genética para formar sítios de ligação covalente para Iigantes (Better et al. (1994) J. Biol. Chem. 13:9644-9650; Bernhard et al. (1994) Bioconjugate Chem. 5:126-132; Greenwood et al. (1994) Therapeutic Immunology 1:247-255; Tu et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci USA 96:4862-4867; Kanno et al. (2000) J. of Biotechnology, 76:207-214; Chmura et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 98(15):8480-8484; patente US 6.248.564). Uma vez que exista um resíduo livre de cisteína no anticorpo, as toxinas podem ser ligadas àquele sítio. Por exemplo, os reagentes acopladores da droga, maleimidocaproil-monometil auristatina E (MMAE), isto é, MC-MMAE, maleimidocaproil-monometil auristatina F (MMAF), isto é, MC-MMAF, MC-val-cit-PAB-MMAE ou MC-val-cit- PAB-MMAF, dissolvidos em DMSO, são diluídos em acetonitrila e água em concentrações conhecidas, e adicionados ao anticorpo resfriado derivado da cisteína em tampão fosfato salino (PBS). Após cerca de uma hora, um excesso de maleimida é adicionado ao quencher da reação e captura quaisquer grupos tiol do anticorpo não reagidos. A mistura de reação é concentrada por ultrafiltração centrífuga e o anticorpo conjugado à toxina é purificado e dessalinizado por eluição através da resina G25 em PBS1 filtrada com filtros de 0,2m sob condições estéreis, e congelada para armazenamento.

Além disso, a cisteína livre em um anticorpo de escolha pode ser modificada pelo reagente bis-maleimido BM(PEO)4 (Pierce Chemical), deixando um grupo maleimido não reagido na superfície do anticorpo. Isto pode ser alcançado dissolvendo-se BM(PEO)4 em uma mistura de etanol/água a 50% até a concentração de 10 mM e adicionando-se um excesso molar de dez vezes a uma solução contendo o anticorpo em tampão fosfato salino a uma concentração de aproximadamente 1,6 mg/ml (10 micromolar) e permitindo que reaja por uma hora. O excesso de BM(PEO)4 é removido por filtração em gel em 30 mM de citrato, pH 6 com 150 mM de tampão NaCl. Um excesso molar de DM1 de aproximadamente 10 vezes é dissolvido em dimetil acetamida (DMA) e adicionado ao intermediário anticorpo-BMPEO. A dimetil formamida (DMF) também pode ser empregada para dissolver o reagente componente droga. Permite-se que a mistura reaja durante a noite antes da filtração em gel ou diálise em PBS para remover a droga não reagida. A filtração em colunas S200 em PBS é usada para remover os agregados de alto peso molecular e fornecer conjugados de anticorpo-BMPEO-DM1 purificados.

Exemplo 7

Ensaios De Destruição Celular In Vitro

Células de mamífero com expressão do polipeptídeo GDM de interesse podem ser obtidas utilizando-se um vetor de expressão padrão e técnicas de clonagem. Alternativamente, diversas linhagens celulares de tumor com expressão de polipeptídeos GDM de interesse estão disponíveis publicamente, por exemplo através da ATCC1 e podem ser identificadas rotineiramente pelo método ELISA ou análise FACS. Anticorpos monoclonais anti-polipeptídeo GDM (e derivados conjugados a toxinas deste) podem então ser empregados em testes para determinar a capacidade do anticorpo em destruir células que expressam polipeptídeo GDM in vitro.

Com respeito exclusivamente a presente invenção, uma linhagem celular derivada de PC3 que expressa de modo estável polipeptídeos GDM na superfície de suas células (denominadas no presente de PC3-gD-MDP) pode ser modificada geneticamente genética usando-se técnicas padrão e a expressão do polipeptídeo GDM pelas células PC3-gD-MDP pode ser confirmada usando-se classificação celular FACS padrão, ELISA e análises imunohistoquímicas. A capacidade de um anticorpo monoclonal anti-GDM conjugado a MMAE provocar a morte das respectivas células que expressam GDM pode ser determinada usando-se um teste de destruição celular in vitro empregando o seguinte protocolo (Promega Corp. Technical Bulletin TB288; Mendoza et al (2002) Câncer Res. 62:5485-5488):

1. Uma alíquota de 50 μl de cultura celular contendo cerca de 104 células (tanto PC3-gD-MDP quanto células PC3 não-transfectadas, que não expressam GDM) em meio de crescimento é depositada em cada um dos 96 poços em uma placa de paredes opacas. Poços adicionais de controle são montados, contendo 50 μΙ do meio de crescimento, sem células.

2. O anticorpo conjugado GDM-MMAE, ou um anticorpo monoclonal controle conjugado a MMAE que não se liga ao GDM1 é adicionado a cada um dos poços no volume de 50 μΙ e em diversas concentrações, que variam de 0,0001 a 100 μg/ml, e as placas são incubadas a 37° C e 5% de CO2 por 3-5 dias.

3. As placas são colocadas em temperatura ambiente por aproximadamente 30 minutos.

4. Um certo volume do Reagente de Viabilidade Celular Luminescente CellTiter-GIo, da Promega Corp., idêntico ao volume do meio de cultura presente em cada poço é adicionado e as placas são agitadas por 2 minutos em um agitador orbital para induzir Iise celular.

5. As placas são incubadas em temperatura ambiente por 10 minutos para estabilizar o sinal de luminescência.

6. A luminescência é registrada em um luminômetro com o programa Tropix Winglow e medida como RLU = unidade relativa de luz.

Os resultados obtidos a partir do teste descrito acima podem demonstrar que o anticorpo GDM-MMAE é capaz de induzir a morte das células que expressam o polipeptídeo GDM correspondente de modo dependente do anticorpo. Isto é, nem o GDM-MMAE nem o controle conjugado a MMAE podem induzir a destruição significativa de células PC3 não- transfectadas em uma concentração de anticorpos de 1 μg/ml ou menor. Nas concentrações de anticorpos acima de 1 μg/ml, a quantidade de células PC3 não-transfectadas destruídas pode aumentar de maneira linear com a concentração do anticorpo de modo independente do mesmo. Dessa forma, parece que a morte de células PC3 não-transfectadas em concentrações de anticorpos acima de 1 μg/ml constitui um resultado inespecífico dos níveis crescentes da toxina MMAE presente na mistura de reação e não é uma função da especificidade de ligação do anticorpo empregado.

Em relação às células PC3-gD-MDP que expressam de modo estável o polipeptídeo GDM, contudo, enquanto o controle conjugado a MMAE induz a morte celular com um padrão idêntico àquela capacidade do anticorpo para destruir células PC3 não-transfectadas, o GDM-MMAE induzirá uma taxa significativa de morte celular em concentrações significativamente inferiores a este nível (por exemplo, a partir de 0,001 pg/ml). De fato, em uma concentração de anticorpos de 1 ug/ml (em que não há destruição celular significativa nos anticorpos controle conjugados a MMAE sem especificidade para GDM), virtualmente todas as células PC3-gD-MDP serão destruídas por GDM-MMAE. Assim, estes dados demonstrarão que o anticorpo monoclonal específico para GDM se liga ao polipeptídeo GDM como se expresso na superfície das células e é capaz de induzir a morte dessas células às quais se liga.

Exemplo 9

Teste De Destruição De Células De Tumor In Vivo

Para testar a eficácia dos anticorpos monoclonais anti- polipeptídeo GDM conjugados ou não conjugados à toxina para a capacidade de induzir a morte de células tumorais in vivo, o seguinte protocolo pode ser empregado.

Inocular um grupo de camundongos nus atímicos com 5 χ 10^6 de células promotoras tumorais com expressão de polipeptídeos GDM por via subcutânea na região do flanco. Quando os tumores alcançarem um volume entre 100-200 mm3, os camundongos são divididos igualmente em 5 grupos e tratados como a seguir:

Grupo 1 - veículo controle PBS administrado uma vez por semana, durante 4 semanas;

Grupo 2 - anticorpo controle não-específico administrado na dose de 1 mg/kg, uma vez por semana, durante 4 semanas; Grupo 3 - anticorpo controle não-específico administrado na dose de 3 mg/kg, uma vez por semana, durante 4 semanas;

Grupo 4 - anticorpo específico anti-polipeptídeo GDM administrado a uma dose de 1 mg/kg, uma vez por semana, durante 4 semanas;

Grupo 5 - anticorpo específico anti-polipeptídeo GDM administrado na dose de 3 mg/kg, uma vez por semana, durante 4 semanas.

A média de volume tumoral pode então ser determinada nos camundongos de cada grupo de tratamento em intervalos periódicos e a eficácia dos anticorpos pode ser determinada.

Exemplo 9

Uso De GDM Como Uma Sonda De Hibridização O método seguinte descreve o uso de uma seqüência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo GDM como uma sonda de hibridização para, por exemplo, diagnóstico da presença de um tumor em mamíferos.

O DNA que compreende a seqüência codificadora do polipeptídeo

GDM inteiro ou maduro, como exibido no presente pedido, também pode ser empregado como uma sonda para seleção de DNAs homólogos (como aqueles que codificam variantes de GDM que ocorrem naturalmente) em bibliotecas de cDNA de tecido humano ou bibliotecas genômicas de tecido humano. Hibridização e lavagem de filtros contendo qualquer biblioteca de

DNA são realizadas sob as seguintes condições de estringência. A hibridização de sondas radiomarcadas derivadas de GDM para os filtros é realizada em uma solução de formamida a 50%, 5x SSC, 0,1% de SDS, pirofosfato de sódio a 0,1%, 50 mM de fosfato de sódio, pH 6,8, 2x solução de Denhardt, e sulfato de dextrano a 10% a 42°C por 20 horas. A lavagem dos filtros é realizada em uma solução aquosa de 0,1 χ SSC e SDS a 0,1% de SDS a 42° C.

Os DNAs que têm identidade de seqüência desejada em relação ao DNA que codifica o polipeptídeo GDM inteiro de seqüência nativa podem então ser identificados usando-se técnicas padrão.

Exemplo 10

Expressão De GDM Em E. Coli

Este exemplo ilustra o preparo de uma forma não-glicosilada de GDM por expressão recombinante em E. coli.

A seqüência de DNA que codifica as seqüências anteriores do polipeptídeo GDM é primeiramente amplificada utilizando-se primers selecionados por PCR. Os primers devem conter sítios de enzimas de restrição que correspondem aos sítios de enzimas de restrição nos vetores de expressão selecionados. Diversos vetores de expressão podem ser empregados. Exemplo de um vetor adequado é o pBR322 (derivado de E. coli] ver Bolívar et al., Gene, 2:95 (1977)) que contém genes de resistência para ampicilina e tetraciclina. O vetor é digerido com enzima de restrição e desfosforilado. As seqüências amplificadas por PCR são então ligadas ao vetor. O vetor preferivelmente incluirá seqüências que codificam um gene de resistência a antibióticos, um promoter trp, um líder poli-his (incluindo os seis primeiros códons STII1 a seqüência poli-his e o sítio de clivagem da enteroquinase), a região codificadora de GDM1 o terminador de transcrição lambda e um gene argU.

A mistura de ligação é então usada para transformar uma determinada linhagem de E. coli utilizando-se os métodos descritos por Sambrook et al., acima. Os transformantes são identificados por sua capacidade de crescer em placas LB1 e colônias de resistentes ao antibiótico são então selecionadas. O DNA plasmídico pode ser isolado e confirmado por análise de restrição e sequenciamento de DNA.

Clones selecionados podem crescer durante a noite em meios líquidos de cultura como caldo LB suplementado com antibióticos. A cultura durante a noite pode ser subseqüentemente usada para inocular uma cultura em larga escala. As células são então cultivadas até a densidade óptica desejada, durante a qual o promotor de expressão é ativado.

Após o cultivo das células por mais algumas horas, as células podem ser colhidas por centrifugação. O pellet de células obtido por centrifugação pode ser solubilizado com diversos agentes conhecidos na medicina, e o polipeptídeo GDM solubilizado pode então ser purificado utilizando-se uma coluna de metal quelante sob condições que permitem uma ligação forte com a proteína.

As seqüências anteriores de polipeptídeo GDM podem ser expressas na E. coli em uma forma com poli-His tag, através do seguinte procedimento. O DNA que codifica GDM é inicialmente amplificado com primers de PCR selecionados. Os primers conterão sítios de enzimas de restrição que correspondem aos sítios de enzimas de restrição no vetor de expressão selecionado, e outras seqüências úteis para o início de uma tradução eficiente e confiável, a rápida purificação em uma coluna de metal quelante e remoção proteolítica com enteroquinase. As seqüências com poli- his tag amplificadas por PCR são então ligadas a um vetor de expressão, que é utilizado para transformação em um hospedeiro E. coli com base na linhagem 52 (W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(laclq). Os transformantes crescem primeiramente em LB contendo 50 mg/ml de carbenicilina a 30°C com agitação até que uma O.D.600 de 3-5 seja alcançado. As culturas são então diluídas 50-100 vezes em meio CRAP (preparado pela mistura de 3,57 g de (NH4)2SO4, 0,71 g de citrato de sódio 2H20, 1,07 g de KCI, 5,36 g de extrato de levedura Difco, 5,36 g de SF hycase Sheffield em 500 ml_ de água, como também 110 mM de MPOS, pH 7,3, glicose a 0,55% (w/v) e 7 mM de MgSO4) e cultivadas por aproximadamente 20-30 horas a 30°C com agitação. As amostras são removidas para verificar a expressão por análise SDS-PAGE, e a cultura em massa é centrifugada para obtenção de pellets de células. Os pellets celulares são congelados até a purificação e redobrados.

A pasta de E. coli com fermentações de 0,5 a 1 L (pellets de 6-10 g) é resuspensa em 10 volumes (w/v) em 7 M de guanidina, 20 mM Tris1 tampão pH 8 . Sulfito de sódio sólido e tetrationato sódico são adicionados para que se possa chegar a concentrações finais de 0,1 M e 0,02 M, respectivamente, e a solução é agitada durante a noite a 4°C. Esta etapa resulta em uma proteína denaturada com todos os resíduos de cisteína bloqueados por sulfitolização. A solução é centrifugada a 40.000 rpm em uma Untracentrífuga Beckman por 30 minutos. O sobrenadante é diluído com 3-5 volumes do tampão da coluna de metal quelante (6 M de guanidina, 20 mM de Tris, pH 7,4) e filtrado com filtros de 0,22 micron para purificação. O extrato purificado é carregado em uma coluna de 5 ml de metal quelante Qiagen Ni- NTA balanceado no tampão de coluna de metal quelante. A coluna é lavada com tampão adicional contendo 50 mM de imidazol (Calbiochem, Utrol grade), pH 7,4. A proteína é eluída com tampão contendo 250 mM de imidazol. Frações contendo a proteína desejada são agrupadas e armazenadas a 4°C. A concentração de proteína é estimada por absorbância a 280 nm utilizando-se o coeficiente de extinção calculado com base na seqüência de aminoácidos.

As proteínas são redobradas pela diluição lenta da amostra em tampões para redobramento recentemente preparados contendo: 20 mM de Tris, pH 8,6, 0,3 M de NaCI1 2,5 M de uréia, 5 mM de cisteína, 20 mM de glicina e 1 mM de EDTA. Os volumes de redobramento são escolhidos de modo que a concentração protéica final se mantenha entre 50 e 100 microorganisms/ml. A solução de redobramento é gentilmente agitada a 4°C por 12-36 horas. A reação de redobramento é suprimida pela inclusão de TFA até uma concentração final de 0,4% (pH de aproximadamente 3). Antes da purificação adicional da proteína, a solução é filtrada com um filtro de 0,22 micron e acetonitrila é adicionada à concentração final de 2-10%. A proteína redobrada é cromatografada em uma coluna de fase reversa Poros R1/H utilizando um tampão móvel de TFA a 0,1% com eluição em um gradiente de acetonitrila de 10 a 80%. As alíquotas de frações com absorbância de A280 são analisadas em géis SDS de poliacrilamida e as proteínas redobradas de forma homogênea são agrupadas. Em geral, as espécies devidamente redobradas da maior parte das proteínas são eluídas a concentrações mais baixas de acetonitrila uma vez que tais espécies são as mais compactas com seus interiores hidrofóbicos protegidos de interações com a resina de fase reversa. Espécies agregadas são normalmente eluídas em concentrações mais altas de acetonitrila. Além de resolver as formas mal-dobradas de proteínas da forma desejada, o passo de fase reversa também remove endotoxina das amostras.

As frações que contêm as proteínas com envoltório desejadas são agrupadas e a acetonitrila é removida com um fluxo suave de nitrogênio direcionado à solução. As proteínas são formuladas como 20 mM de Hepes, pH 6,8 com 0,14 M de cloreto de sódio e manitol a 4% por diálise ou filtração em gel usando-se resinas G25 Superfine (Pharmacia) equilibradas na formulação tampão e filtradas de forma estéril.

Exemplo 11

Expressão De Polipeptídeo GDM Em Células Mamárias

Este exemplo ilustra o preparo de uma forma potencialmente glicosilada de polipeptídeo GDM por expressão recombinante em células de mamífero.

O vetor pRK5 (ver patente EP 307.247, publicada em 15 de março de 1989), é empregado como vetor de expressão. Opcionalmente, o DNA que codifica os polipeptídeos GDM descritos no presente pedido é ligado ao pRK5 com enzimas de restrição selecionadas para permitir a inserção deste DNA utilizando-se métodos de ligação como descritos por Sambrook et al., acima. O vetor resultante é chamado GDM-DNA. Em uma realização, as células hospedeiras selecionadas podem ser células293. Células humanas 293 (ATCC CCL 1573) são cultivadas para confluência em placas de cultura de tecidos em meios como DMEM suplementado com soro bovino fetal e opcionalmente, componentes nutrientes e/ou antibióticos. Cerca de 10 pg de DNA de pRK5-GDM são misturados com cerca de 1 pg de DNA que contém o gene RNA VA [Thimmappaya et al., Cell, 31:543 (1982)] e dissolvidos em 500 μΙ de 1 mM de Tris-HCI, 0,1 mM de EDTA, 0,227 M de CaCI2. Adiciona-se a esta mistura, gota a gota, 500 μl de 50 mM de HEPES (pH 7,35), 280 mM de NaCI, 1,5 mM de NaPO4, permitindo a formação de um precipitado por 10 minutos a 25°C. O precipitado é suspenso e adicionado às células 293, permitindo-se repouso por cerca de quatro horas a 37°C. O meio de cultura é aspirado e 2 ml de glicerol a 20% em PBS são adicionados durante 30 segundos. As células 293 são então lavadas com meio livre de soro, e um meio fresco é adicionado para que as células sejam incubadas por cerca de 5 dias.

Aproximadamente 24 horas após as transfecções, o meio de cultura é removido e substituído com meio de cultura (isolado) ou meio de cultura contendo 200 uCi/ml de 35S-Cisteina e 200 uCi/ml de 35S-metionina. Após um período de incubação de 12 horas, o meio condicionado é coletado, concentrado em um filtro giratório, e carregado em um gel de SDS a 15%. O gel processado pode ser desidratado e exposto a filme por um determinado período de tempo para revelar a presença de polipeptídeos GDM. As culturas contendo células transfectadas podem ser submetidas a incubação adicional (em meio livre de soro) e o meio é testado em bioensaios selecionados.

Em uma técnica alternativa, o DNA que codifica polipeptídeos GDM pode ser introduzido em células 293 de modo transitório através do método de sulfato de dextrano descrito por Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981). As células 293 são cultivadas até densidade máxima em um frasco giratório e 700 pg de DNA de pRK5-GDM são adicionados. As células são primeiramente concentradas no frasco giratório por centrifugação e lavadas em PBS. O precipitado de DNA-dextrano é incubado no pellet celular por quatro horas. As células são tratadas com glicerol a 20% por 90 segundos, lavadas com o meio de cultura de tecido, e novamente introduzidas no frasco giratório contendo meio de cultura de tecido, 5 pg/ml de insulina bovina e 0,1 pg/ml de transferrina bovina. Após cerca de quatro dias, o meio condicionado é centrifugado e filtrado para remover células e fragmentos. A amostra contendo GDM expressos pode então ser concentrada e purificada por qualquer método de escolha, como diálise e/ou cromatografia em coluna.

Em outra realização, o polipeptídeo GDM pode ser expresso em células CHO. pRK5-GDM pode ser transfectado em células CHO utilizando-se reagentes conhecidos como CaPO4 ou DEAE-dextrano. Como descrito acima, as culturas celulares podem ser incubadas, e o meio substituído por meio de cultura (isolado) ou meio contendo um radiomarcador como 35S-metionina. Após determinar a presença do GDM, o meio de cultura pode ser substituído por meio livre de soro. Preferivelmente1 as culturas são incubadas por cerca de 6 dias, e então o meio condicionado é colhido. O meio contendo polipeptídeos GDM expressos pode então ser concentrado e purificado através de qualquer método selecionado.

Polipeptídeos GDM marcados com epitopos também podem ser expressos em células CHO hospedeiras. A seqüência que codifica a porção GDM pode ser subclonada a partir do vetor pRK5. O subclone inserido pode ser submetido a PCR para fundir-se na estrutura com um epitopo tag selecionado como um poli-his tag em um vetor de expressão Baculovirus. Essa inserção de poli-his tag ao GDM pode então ser subclonada em um vetor dirigido por SV40 contendo um marcador de escolha como DHFR para seleção de clones estáveis. Por fim, as células CHO podem ser transfectadas (como descrito acima) com o vetor dirigido por SV40. A marcação pode ser realizada, como descrito acima, para verificar a expressão. O meio de cultura contendo o GDM expresso com a poli-His tag pode então ser concentrado e purificado por de qualquer método selecionado, como cromatografia por afinidade a Ni2+-quelante.

Polipeptídeo GDM também pode ser expresso em células CHO e/ou COS através de um procedimento de expressão transitória ou em células CHO por outro procedimento de expressão estável.

A expressão estável em células CHO é realizada usando-se o seguinte procedimento. As proteínas são expressas como uma construção de IgG (imunoadesina), em que as seqüências codificadoras para as formas solúveis (por exemplo, domínios extracelulares) das respectivas proteínas se fundem à seqüência da região constante de IgGI que contém a dobradiça, CH2 e domínios CH2 e/ou é uma forma com poli-His tag.

Após amplificação por PCR1 os respectivos DNAs são subclonados em um vetor de expressão CHO através de técnicas ^aàrão como descritas por Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Undade 3.16, John Wiley and Sons (1997). Os vetores de expressão de CHO são construídos para apresentar sítios de restrição 5' e 3' do DNA de interesse que permita para permitir a movimentação conveniente de cDNAs. O vetor de expressão utilizado nas células CHO foi descrito por Lucas et al., Nuci Acids Res. 24:9 (1774-1779 (1996), e utiliza o promotor inicial/enhancer SV40 para dirigir a expressão do cDNA de interesse e redutase diidrofolato (DHFR). A expressão de DHFR permite seleção de manutenção estável do plasmídeo após transfecção.

Doze microgramas com o DNA plasmídico desejado são introduzidos em aproximadamente 10 milhões de células CHO utilizando-se reagentes de transfecção SUPERFECT® (Quiagen), DOSPER® ou FUGENE® (Boehringer Mannheim) comercialmente disponíveis. A células são cultivadas como descrito por Lucas et al., acima. Aproximadamente 3 x 107 células são congeladas em uma ampola para novas culturas e produção como descrito abaixo.

As ampolas contendo o DNA plasmídico são descongeladas em banho-maria e misturadas por turbilhonamento. O conteúdo é pipetado para um tubo de centrifugação contendo 10 mL de meio de cultura e centrifugado a 1000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante é aspirado e as células são resuspensas em 10 mL de meio seletivo (0,2 Om de PS20 filtrado com 0,2 Om de soro fetal bovino diafiltrado a 5%). As células são então fracionadas em um tubo giratório de 100 mL contendo 90 mL do meio seletivo. Após 1-2 dias, as células são transferidas para um tubo giratório de 250 mL preenchido com 150 mL de meio de cultura e incubado a 37° C. Após mais 2-3 dias, tubos giratórios de 250 mL, 500 mL e 2000 mL são semeados com 3 x 105 células/mL. O meio celular é substituído por um meio fresco por centrifugação e resuspenso no meio de produção. Embora qualquer meio adequado para CHO possa ser empregado, um meio de produção descrito na patente US 5.122.469, emitida em 16 de junho de 1992 pode na verdade ser utilizado. Uma produção da centrífuga de 3L é semeada com 1,2 x 106 células/mL. No dia 0, o valor de pH das célula é determinado. No dia 1, faz-se a amostragem da centrífuga e a pulverização com ar filtrado é determinada. No dia-2, faz-se a amostragem da centrífuga, a temperatura é alterada para 33°C e 30 mL de glicose a 500 g/L e 0,6 mL de antiespumante a 10% (por exemplo, emulsão de polidimetilsiloxane a 35%, Dow Corning 365 Medicai Grade Emulsion) são adotados. Ao longo da produção, o pH é ajustado conforme necessário para que seja mantido próximo de 7,2. Após 10 dias, ou até que a viabilidade celular caia para níveis inferiores a 70%, a cultura celular é colhida por centrifugação e filtrada com um filtro de 0,22 θm. O filtrado foi armazenado a 4°C ou imediatamente carregado em colunas para purificação.

Para as contruções com poli-His tag, as proteínas são purificadas utilizando-se uma coluna Ni-NTA (Qiagen). Antes da purificação, imidazol é adicionado ao meio condicionado a uma concentração de 5 mM. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de 6 ml de Ni-NTA balanceada em 20 mM Hepes1 com pH 7,4, tampão contendo 0,3 M de NaCI e 5 mM de imidazol em uma taxa de fluxo de 4-5 ml/min. a 4°C. Depois de carregada, a coluna é lavada com um tampão de equilíbrio adicional e a proteína é eluída com tampão de equilíbrio contendo 0,25 M de imidazol. A proteína altamente purificada é subseqüentemente dessalinizada em um tampão de armazenamento contendo 10 mM de Hepes, 0,14 M de NaCI e manitol a 4%, pH 6,8, com uma coluna de 25 ml G25 Superfine (Pharmacia) e armazenada a -80°C.

Construções de imunoadesina (contendo Fc) são purificados a partir do meio condicionado como a seguir. O meio condicionado é bombeado para uma coluna de 5 ml de Proteína A (Pharmacia) que foi balanceada com 20 mM de tampão fosfato de sódio, pH 6,8. Depois de carregada, a coluna é lavada extensivamente com um tampão de equilíbrio antes da eluição com 100 mM de ácido cítrico, pH 3,5. A proteína eluída é imediatamente neutralizada pela coleta de frações de 1 ml em tubos contendo 275 OL de 1 M do tampão Tris, em pH 9. A proteína altamente purificada é então dessalinizada em um tampão de armazenamento como descrito acima para as proteínas com poli- His tag. A homogeneidade é avaliada por géis de poliacrilamida SDS e por sequenciamento de aminoácidos N-terminais por degradação de Edman.

Exemplo 12

Expressão De GDM Em Leveduras

O método seguinte descreve a expressão recombinante de polipeptídeo GDM em leveduras.

Primeiramente, os vetores de expressão das leveduras são construídos para a produção ou secreção intracelular das seqüências de GDM anteriores a partir do promotor ADH2/GAPDH. O DNA que codifica tais seqüências de GDM e o promotor são inseridos em sítios de enzimas de restrição adequadas no plasmídeo selecionado para dirigir expressão intracelular de GDM. Para secreção, o DNA que codifica essas seqüências de GDM pode ser clonado no plasmídeo selecionado, junto com o DNA que codifica o promotor ADH2/GAPDH, um peptídeo sinal de GDM nativo ou outro peptídeo sinal de mamífero, ou, por exemplo, um fator-alfa da levedura ou seqüência líder/sinal secretório de invertase, e seqüências Iigantes (se necessárias) para expressão de GDM.

As células de leveduras, como a linhagem AB110, podem então ser transformadas com os plasmídeos de expressão descritos acima e cultivados no meio de fermentação selecionado. O sobrenadante de leveduras transformadas pode ser analisado por precipitação com ácido tricloroacético a 10% e separado por SDS-PAGE, seguido pela coloração dos géis com corante Coomassie Blue.

O GDM recombinante pode ser subseqüentemente isolado e purificado pela remoção das células de levedura do meio de fermentação por centrifugação e, então, concentrando o meio usando-se filtros específicos em cartucho. O concentrado contendo GDM pode ainda ser purificado através do uso de resinas específicas para cromatografia em coluna.

Exemplo 13

Expressão De GDM Em Células De Insetos Infectadas Com Baculovírus O método seguinte descreve a expressão recombinante de polipeptídeo GDM em células de insetos infectadas por Baculovírus.

A seqüência codificadora para a seqüência de GDM anterior é fundida a montante de um epitopo tag contido dentro de um vetor de expressão de baculovírus. Estes marcadores de epitopos incluem poli-his tags e imunoglobulinas (como as regiões Fc de IgG). Diversos plasmídeos podem ser empregados, inclusive plasmídeos derivados de outros plasmídeos comercialmente disponíveis como o pVL1393 (Novagen). Resumidamente, a seqüência que codifica a seqüência de GDM anterior ou a porção desejada da seqüência codificada, ou seja, a seqüência que codifica um domínio extracelular de uma proteína de transmembrana, ou a seqüência que codifica a proteína madura no caso de proteínas extracelulares, é amplificada por PCR com primers complementares às regiões 5' e 3'. O primer 5' pode incorporar sítios de enzimas de restrição adjacentes (selecionados). O produto é então digerido com aquelas enzimas de restrição e subclonado no vetor de expressão.

O baculovírus recombinante é gerado por co-transfecção do plasmídeo acima e o DNA viral BACULOGOLD™ (Pharmingen) em células de Spodoptera frugiperda ("Sf9") (ATCC CRL 1711) utilizando-se Iipofectina (comercialmente disponível pela GIBCO-BRL). Após 4-5 dias de incubação a 28°C, os vírus liberados são colhidos e utilizados para novas amplificações. A infecção viral e a expressão protéica são realizadas como descrito por 0'Reilley et al., Baculovírus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).

Polipeptídeos GDM expressos com poli-his tag podem então ser purificados, por exemplo, por cromatografia de afinidade com Ni2+ quelante, conforme a seguir. Os extratos são preparados a partir de células Sf9 recombinantes infectadas por vírus como descrito por Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993). Em resumo, as células Sf9 são lavadas, resuspensas em tampão de sonicação (25 mL de Hepes, pH 7,9; 12,5 mM de MgCI2; 0,1 mM de EDTA; glicerol a 10%; NP-40 a 0,1%; 0,4 M de KCI), e sonicados duas vezes por 20 segundos em gelo. Os sonicados são retirados por centrifugação e o sobrenadante é diluído 50 vezes em tampão de carregamento (50 mM de fosfato, 300 mM de NaCl, glicerol a 10%, pH 7,8) e filtrado através de um filtro de 0,45 φm. Uma coluna de agarose Ni2+-NTA (disponível comercialmente pela Qiagen) é preparada sobre um volume de 5 mL, lavado com 25 mL de água e balanceado com 25 mL em tampão de carregamento. O extrato de células filtradas é carregado na coluna a 0,5 mL por minuto. A coluna é lavada até a linha de partida A2eo com um tampão de carregamento, até o ponto de coleta da fração. Depois, a coluna é lavada com uma solução tampão secundária (50 mM de fosfato; 300 mM de NaCI1 glicerol a 10%, pH 6,0), que elui de modo não específico as proteínas ligadas. Após retornar ao ponto de partida de A280, a coluna é revelada com gradiente de 0 a 500 mM de imidazol na lavagem com tampão secundário. Uma fração de 1 mL é coletadas e analisada por SDS-PAGE e silver staining ou Western blot com Ni2+-NTA- conjugado a fosfatase alcalina (Qiagen). Frações contendo polipeptídeos GDM eluídos com His1O tag são agrupadas e dialisadas contra o tampão de carregamento.

Alternativamente, a purificação do polipeptídeo GDM com IgG tag (ou Fc tag) pode ser realizada utilizando-se técnicas de cromatografia conhecidas, incluindo por exemplo, cromatografia em coluna de Proteína A ou Proteína G.

Exemplo 14

Purificação De Polipeptídeo GDM Usando-se Anticorpos Específicos

Polipeptídeos GDM nativos ou recombinantes podem ser purificados por diversas técnicas padrão para a purificação de proteínas. Por exemplo, variantes pró, maduras ou pré-polipeptídeos das seqüências de GDM anteriores são purificadas por cromatografia de imunoafinidade com anticorpos específicos para estas seqüências. Em geral, uma coluna de imunoafinidade é construída por ligações covalentes entre o anticorpo anti-GDM e uma resina cromatográfica ativada.

As imunoglobulinas policlonais são preparadas a partir de soro imune tanto por precipitação com sulfato de amônio como por purificação em Proteína A imobilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Da mesma forma, anticorpos monoclonais são preparados a partir de ascite de camundongos por precipitação com sulfato de amônio ou cromatografia sobre Proteína A imobilizada. Imunoglobulinas parcialmente purificadas são ligadas covalentemente à resina cromatográfica, como a SEPHAROSE™ ativada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). O anticorpo se liga à resina, a resina é bloqueada, e a resina derivada é lavada de acordo com as instruções do fabricante.

Tal coluna de imunoafinidade é utilizada na purificação das seqüências de GDM anteriores pelo preparo de uma fração de células que contêm estas seqüências na forma solúvel. Essa preparação é derivada da solubilização da célula inteira ou de uma fração subcelular obtida por centrifugação diferencial pela inclusão de um detergente ou outros métodos bem conhecidos na técnica. Alternativamente, os polipeptídeos GDM solúveis contendo uma seqüência sinal podem ser secretados em quantidades úteis no meio de cultura em que as células estão crescendo.

Uma preparação contendo os polipeptídeos GDM solúveis é passada pela coluna de imunoafinidade, que é lavada sob condições que permitem a absorbância preferencial destas seqüências (por exemplo, tampões com alta força iônica na presença de detergente). Então, a coluna é eluída sob condições que rompam a ligação entre anticorpo/substrato (por exemplo, um tampão com pH baixo de aproximadamente 2-3, ou alta concentração de um caotropo como uréia ou íon tiocianato), e o polipeptídeo GDM é, assim, coletado.

Claims (55)

1. MÉTODO PARA TRATAR UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, que compreende: (a) medir a expressão de um conjunto de GDM em uma amostra do tumor; (b) determinar a subclassificação, PN, Prolif ou Mes do tumor; e (c) contatar pelo menos uma quantidade efetiva de terapêutico baseado na subclassificação; em que (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolife/ou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada com quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PN e/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) agente anti-mitótico, e (5) um agente anti-angiogênico.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras de glioma usando-se agrupamento hierárquico.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras usando-se agrupamento k-médias.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras usando-se um esquema de votação.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que a subclassificação é realizada pela comparação da similaridade de expressão de um conjunto de marcadores de GDM entre o tumor e um conjunto de amostras de glioma previamente classificada.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de PN é selecionado do grupo que consiste de: marcadores de PN indicados na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog, Oligl, Olig2, THR e ASCL1.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de Prolif é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Prolif indicados na Tabela A.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de Mes é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Mes indicados na Tabela A.

9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o antagonista de Akt é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de domínio regulatório ou catalítico de PIK3, PD1, FRAP1 RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR, e ativadores, estimuladores ou restauradores de PTEN1 INPP5D ou INPPL1.

10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente anti-mitótico é selecionado do grupo que consiste de: temozolamida, BCNU, CCNU1 Iomustina1 gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides.

11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente anti-angiogênico é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas do VEGF, antagonistas do anticorpo anti-VEGF, VEGFR1 e VEGFR2.

12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, em que o agente de diferenciação é selecionado do grupo que consiste de: MAP2, beta- tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF1 NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, OLIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de nicastrina de molécula pequena , AphIA, AphlB, Psenl, Psen2 e PSENEN, antagonista de delta similar ao ligante (DII)-I, similar ao ligante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb.

13. MÉTODO DE PROGNÓSTICO E/OU DIAGNÓSTICO DE GLIOMA, que compreende: (a) medir a expressão de um conjunto de GDM; (b) determinar a subclassificação, PN, Prolif ou Mes do tumor, e (c) prognosticar e/ou diagnosticar a conseqüência da doença; em que uma subclassificação de Prolifou Mes é indicativa de prognóstico mais pobre ou tempo de sobrevida mais curto e uma subclassificação de PN é indicativa de um prognóstico favorável ou tempo de sobrevida prolongado.

14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras usando-se agrupamento hierárquico.

15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras usando-se agrupamento k-médias.

16. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras usando-se um esquema de votação.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 7, em que a subclassificação é realizada pela comparação da similaridade de expressão de um conjunto de marcadores de GDM entre o tumor e um conjunto de amostras de glioma previamente classificada.

18. MÉTODO DE PROGNÓSTICO E/OU DIAGNÓSTICO DE GLIOMA, que compreende: (a) medir a expressão de marcadores de tumor PTEN e DLL3 em uma amostra de tumor, e (b) prognosticar e/ou diagnosticar baseado na expressão de ditos marcadores de tumor, em que um expressão mais alta tanto de PTEN como DLL3 indica um melhor prognóstico ou tempo de sobrevida prolongado, e um nível de expressão mais baixo de PTEN, sem levar em consideração o nível de expressão de DLL3, indica um prognóstico pior ou tempo de sobrevida reduzido.

19. MÉTODO DE MONITORAMENTO OU DIAGNÓSTICO, que compreende comparar a assinatura de expressão de um conjunto de marcadores determinantes de glioma ("GDM") em pelo menos duas amostras de tumor de um paciente, que compreende as etapas de: (a) medir a expressão de GDM em uma primeira amostra de tumor em um primeiro ponto no tempo; (b) medir a expressão de GDM em uma segunda amostra de tumor em um segundo ponto no tempo posterior; e (c) determinar a subclassificação, PN1 Prolif ou Mes, na primeira e segunda amostra; em que uma transição da subclassificação PN ou Prolif para Mes da primeira para a segunda amostra de tumor é indicativa do aumento de severidade ou progressão de dito tumor.

20. MÉTODO PARA INIBIR O TAMANHO OU CRESCIMENTO DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA1 que compreende: (a) medir a expressão de um conjunto de GDM em uma amostra do tumor; (b) determinar a subclassificação, PN, Prolif ou Mes do tumor; e (c) contatar pelo menos uma quantidade efetiva de terapêutico baseado na subclassificação; em que (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolife/ou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada com quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PN e/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt, (4) um agente anti-mitótico, e (5) um agente anti-angiogênico; em que o resultado é o tamanho ou crescimento reduzido do tumor.

21. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras de glioma usando-se agrupamento hierárquico.

22. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras de glioma usando-se agrupamento k-médias.

23. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que a subclassificação é realizada pela comparação do tumor a um conjunto de amostras de glioma usando-se um esquema de votação.

24. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que a subclassificação é realizada pela comparação da similaridade de expressão de um conjunto de marcadores de GDM entre o tumor e um conjunto de amostras de glioma previamente classificada.

25. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de PN é selecionado do grupo que consiste de um antagonista de qualquer um dos: marcadores de PN indicados na Tabela A, com exceção de DLL3, Nog, Olig1, Olig2, THR e ASCL1

26. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de Prolif é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Prolif indicados na Tabela A.

27. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de Mes é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de qualquer um dos marcadores de Mes indicados na Tabela A.

28. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de Akt é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas de aktl, akt2, akt3, antagonistas de domínio regulatório ou catalítico de PIK3, PD1, FRAP, RPS6KB1, SGK, EGFR, IGFR, e ativadores, estimuladores ou restauradores de PTEN, INPP5D ou INPPL1.

29. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o agente anti-angiogênico é selecionado do grupo que consiste de: antagonistas do VEGF, antagonistas do anticorpo anti-VEGF, VEGFR1 e VEGFR2.

30. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o agente anti-mitótico é selecionado do grupo que consiste de: temozolamida, BCNU1 CCNU1 Iomustina1 gliadel, etoposida, carmustina, irinotecana, topotecana, procarbazina, cisplatina, carboplatina, ciclofosfamida, vincristina, doxorubicina, dactinomicina, bleomicina, plicamicina, metotrexato, citarabina, paclitaxel, auristatinas, maitansinoides.

31. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o agente de diferenciação neural é selecionado do grupo que consiste de: MAP2, beta-tubulina, GAD65 e GAP43. Exemplos de agentes de diferenciação neural incluem, mas não estão limitados a: ácido retinóico, ácido valpróico e derivados destes (por exemplo, ésteres, sais, retinóides, retinatos, valproatos, etc.); hormônio da tireóide ou outros agonistas do receptor de hormônio da tireóide; noggin; BDNF, NT 4/5 ou outros agonistas do receptor de NTRK2; agentes com expressão aumentada dos fatores de transcrição de ASCL1, OLIG1; agonistas de dll3, antagonistas de Notch 1, 2, 3 ou 4, inibidores de gama-secretase, incluindo inibidores de nicastrina de molécula pequena , AphIA, AphlB, Psenl, Psen2 e PSENEN, antagonista de delta similar ao Iigante (DII)-I1 similar ao Iigante (DII)- 4, antagonista de jagged 1, antagonista de jagged 2; agonista de numb ou agonista similar a numb.

32. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o contato com o antagonista e/ou agente resulta na morte da célula tumoral.

33. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de PN, Prolifou Mes é (1) um anticorpo anti-PN, anti-Prolif ou anti- Mes, (2) um fragmento de ligação de antígeno de anti-PN, anti-ProIif ou anti- Mes, (3) um oligopeptídeo de ligação de PN, Prolif ou Mes, (4) um antagonista de molécula pequena de PN, Prolif ou Mes, ou (5) um oligonucleotídeo antisense de PN, Prolifou Mes.

34. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o antagonista de PN, Prolif ou Mes é selecionado do grupo que consiste de: (1) um anticorpo anti-PN, anti-Prolif ou anti-Mes, e (2) um fragmento de ligação de antígeno de anti-PN, anti-Prolif ou anti-Mes.

35. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo antagonista é selecionado do grupo que consiste de: anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo de cadeia única.

36. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é conjugado a um agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico.

37. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 20, em que o agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste de: maitansinoide, caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo e enzima núcleolítica.

38. MÉTODO PARA TRATAR TERAPEUTICAMENTE, um mamífero que tem um tumor do tipo glioma em que o método compreende: (a) medir a expressão de um conjunto de GDM em uma amostra do tumor; (b) determinar a subclassificação, PN, Prolif ou Mes do tumor; e (c) contatar pelo menos uma quantidade efetiva de terapêutico baseado na subclassificação; em que (I) tumores que exibem uma subclassificação Prolif são tratados com uma terapia combinada que compreende administrar ao mamífero quantidades terapeuticamente efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou antagonista de Prolif e/ou agente anti-mitótico, e (b) um agente de diferenciação neural; (II) tumores que exibem uma subclassificação Mes são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de (a) um antagonista de Akt e/ou de Mes e/ou agente anti-angiogênico, e (b) um agente de diferenciação neural; e (III) tumores que exibem uma subclassificação PN são tratados com uma terapia combinada que compreende contatar quantidades efetivas de: (1) um antagonista de PN e/ou (2) um agente de diferenciação neural opcionalmente em combinação com um ou mais dos seguintes: (3) um antagonista de Akt1 (4) um agente anti-mitótico, e (5) um agente anti-angiogênico; em que o resultado é o tamanho ou crescimento reduzido do tumor.

39. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, em que a administração do antagonista ou agente resulta na morte do tumor do tipo glioma.

40. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 38, em que o antagonista ou agente é um anticorpo, um fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, um oligopeptídeo, um antagonista de molécula pequena, ou oligonucleotídeo antisense.

41. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, em que o anticorpo antagonista é selecionado do grupo que consiste de: anticorpo monoclonal, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo de cadeia única.

42. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 40, em que o anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno é conjugado a um agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico.

43. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 42, em que o agente inibitório do crescimento ou agente citotóxico é selecionado do grupo que consiste de: maitansinoide, caliqueamicina, antibiótico, isótopo radioativo e enzima núcleolítica.

44. MÉTODO PARA DETERMINAR O NÍVEL DE EXPRESSÃO DE MARCADORES DETERMINANTES DE GLIOMA ("GDM") DE PN, PROLIF OU MES, em uma amostra, em que o método compreende expor a amostra aos agentes de ligação de PN, Prolif ou Mes e determinar a quantidade de ligação de cada um na amostra, em que tal quantidade de ligação é indicativa do nível de expressão do respectivo GDM de PN, Prolifou Mes na amostra.

45. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44, em que o agente de ligação de PN, Prolif ou Mes é selecionado do grupo que consiste de: um anticorpo anti-PN, anti-ProIif ou anti-Mes, fragmento de anticorpo de ligação de PN, Prolif ou Mes, oligopeptídeo de ligação de PN, Prolif ou Mes, antagonista de molécula pequena de PN, Prolif ou Mes, oligonucleotídeo antisense de PN, Prolifou Mes.

46. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 44, em que o anticorpo anti-PN, anü-Prolif ou anti-Mes é selecionado do grupo que consiste de: anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado e anticorpo de cadeia única.

47. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 45, em que o agente de ligação de PN, Prolifou Mes é marcado de forma detectável:

48. MÉTODO PARA PROGNOSTICAR O TEMPO DE SOBREVIDA, em um mamífero que tem um tumor do tipo glioma, em que o método compreende: (a) remover uma amostra de teste do tumor, (b) medir o nível de expressão de PTEN e DLL3 na amostra de teste e no conjunto de não menos que trinta (30) gliomas de alto grau pelo qual tempos de sobrevivência de pacientes são conhecidos. em que um nível mais alto de expressão tanto de PTEN como DLL3 na amostra de teste é indicativo de uma chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida maior do que a média da amostra da população de referência e um nível menor de expressão tanto de PTEN como DLL3 na amostra de teste é indicativo de uma chance estatisticamente elevada de tempo de sobrevida menor do que a média da amostra da população de referência.

49. MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR A SEVERIDADE DE UM TUMOR DO TIPO GLIOMA, em um mamífero, em que o método compreende: (a) contatar uma amostra de teste que compreende tecido obtido do mamífero com: (i) um primeiro reagente que é um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se liga a um polipeptídeo PTEN1 e (ii) um segundo reagente que é um anticorpo, oligopeptídeo ou molécula orgânica pequena que se liga a um polipeptídeo DLL3; (b) medir a quantidade de formação de complexo entre o primeiro e segundo reagente com os polipeptídeos PTEN e DLL3 na amostra de teste, respectivamente, em que a formação de uma alta quantidade tanto de formação de complexo PTEN como DLL3 é indicativa de um tumor brando e a formação de uma baixa quantidade tanto de formação de complexo PTEN como DLL3 é indicativa de um tumor severo.

50. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 49, em que o primeiro e/ou segundo reagente é/são marcado(s) de forma detectável.

51. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 50, em que o primeiro e/ou segundo reagente é/são ligado(s) a um suporte sólido.

52. USO, de: (a) um polipeptídeo GDM de PN1 Prolif ou Mes, ou (b) uma seqüência de ácido nucléico que codifica (a), na preparação de um medicamento útil para (i) tratamento terapêutico ou (ii) detecção do diagnóstico de um tumor do tipo glioma.

53. USO, de acordo com a reivindicação 52, em que o polipeptídeo GDM é um anticorpo, um fragmento de anticorpo de ligação de GDM, um oligopeptídeo de ligação de GDM, um antagonista de molécula pequena, ou um oligonucleotídeo antisense.

54. USO, de acordo com a reivindicação 52 ou 53, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal, fragmento de anticorpo de ligação de antígeno, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado ou anticorpo de cadeia única.

55. MÉTODO PARA TRATAR TERAPEUTICAMENTE, um mamífero que tem um tumor do tipo glioma, em que o método compreende contatar quantidades efetivas de um agente de diferenciação neural em combinação com um ou mais dos seguintes: (1) um antagonista de Akt; (2) um agente anti-mitótico e (3) um agente anti-angiogênico; em que o resultado é o tamanho ou crescimento reduzido do tumor.