BRPI0620867A2 - formulações farmacêuticas que contêm a proteìna nma0939 - Google Patents
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Abstract
FORMULAçõES FARMACêUTICAS QUE CONTêM A PROTEìNA NMA0939. A presente invenção refere-se ao campo da medicina, particularmente ao desenvolvimento de formulações farmacêuticas que contêm a proteína NMA0939. As formulações descritas nesta invenção são capazes de conferir proteção contra diferentes doenças causadas ou não por agentes patogênicos. A proteína NMA0939 foi identificada como componente de vesículas da membrana externa de Neisseria meningitidis, e ela foi obtida através de tecnologia de DNA recombinante, sendo sua imunogenicidade e atividade protetora avaliadas em modelos animais. Devido ao alto nível de conservação que o gene codificador de NMA0939 demonstrou, as composições farmacêuticas que contêm esta proteína têm um alto valor como indutores de uma resposta imunológica com reação cruzada. As formulações apresentadas nesta invenção são aplicáveis ao campo de medicina humana.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS QUE CONTÊM A PROTEÍNA NMA0939".
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao campo da medicina, particu- larmente ao desenvolvimento de novas formulações de vacinas com aplica- ção preventiva ou terapêutica, que permite um aumento na qualidade da resposta imunológica contra antígenos de vacinas de doenças de diferentes origens.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
Neisseria meningitidis, um diplococo gram-negativo cujo único hospedeiro é o Homem, é o agente causador da meningite meningocócica. Usualmente, esta bactéria é encontrada em portadores assintomáticos entre a população normal, sendo este nicho a fonte mais comum para seu isola- mento microbiológico.
Mundialmente, as crianças pequenas com menos de dois anos de idade são a população mais suscetível para contrair meningite meningo- cócica; entretanto, adultos jovens e a população adulta normal também po- dem ser afetados.
A doença meningocócica não tratada tem um curso fatal para a maioria dos indivíduos afetados, e a vacinação poderia prevenir esta situa- ção, detendo os episódios precocemente na fase da colonização bacteriana.
Várias estratégias foram desenvolvidas com o objetivo de obter uma vacina capaz de atender aos requisitos necessários para induzir prote- ção contra essa doença na população em geral. Com este propósito, antíge- nos capsulares foram levados em consideração, pois sua especificidade i- munológica permitiu a classificação em sorogrupos deste microorganismo. Cinco destes sorogrupos foram definidos como responsáveis pela maioria dos casos clínicos da doença meningocócica no mundo inteiro. O sorogrupo A é a causa principal de epidemia na África subsaariana. Os sorogrupos B e C estão associados, na maioria dos casos, às ocorrências em nações de- senvolvidas. Os sorogrupos Y e W135 são comuns na maioria dos casos recorrentes da doença, e eles são prevalentes em algumas áreas dos Estados Unidos da América do Norte, com um aumento acentuado nos últimos anos. A partir destes dados, fica óbvia a razão do uso, estudo e avaliação de polis- sacarídeos capsulares como candidatos a vacinas. Uma vacina tetravalente, baseada em polissacarídeos capsulares, que confere proteção contra os sorogrupos A, C, Y e W-135, foi aprovada nos Estados Unidos. Os anticorpos eliciados depois da vacinação são específicos dos sorogrupos (Rosenstein, N. et ai, "Meningococcal Disease", N.-EngU. Med. 344:1378-1388 (2001)).
O sorogrupo B, que é diferente do resto, continua a ser uma causa significativa da doença meningocócica endêmica e epidêmica, e isto se deve principalmente à falta completa de vacinas eficientes contra ele. No- tou-se que o polissacarídeo capsular B é deficientemente imunogênico, mais a existência do risco teórico de uma vacina baseada neste composto induzir imunotolerância ê auto-imunidade por causa da sua similaridade estrutural com cadeias de oligossacarídeos que estão presentes em estruturas fetais neurais humanas ((Finne, J. et al., "An IgG monoclonal antibody to group B glycoproteins in neural and extraneural tissues", J. Immunol. 138:4402-4407 (1987)). Portanto, o desenvolvimento de vacinas contra sorogrupos B está concentrado no uso de antígenos subcapsulares. Proteínas de Membrana Externa e Vacinas Vesiculares
As tentativas iniciais, na década de 70, para produzir vacinas baseadas em proteínas de membrana externa se basearam na depleção de LPS de preparações de proteínas da membrana externa por detergente (Frasch, C.E. e Robbins, J.D., "Protection against group B meningococcal disease. III. Immunogenicity of serotype 2 vaccines and specificity of protec- tion in a guinea pig model", J. Exp. Med. 147(3):629-44 (1978)). As proteínas da membrana externa, OMPs, foram então precipitadas para produzir agre- gados em suspensão em cloreto de sódio. Apesar dos resultados promisso- res em estudos animais, estas vacinas deixaram de induzir anticorpo bacte- ricida em adultos ou crianças (Zollinger, W.D. et al., "Safety and immunoge- nicity of a Neisseria mengitidis type 2 protein vaccine in animais and hu- mans", J. Infect. Dis. 137(6):728-39 (1978)), o desempenho deficiente destas vacinas foi amplamente atribuído à perda da estrutura terciária que acompa- nha a precipitação. A próxima etapa lógica foi, portanto, produzir uma vacina com proteínas apresentadas na sua conformação nativa na forma de vesículas de membrana externa (Zollinger, W.D. et al., "Complexo of meningococcal group B polysaccharide and type 2 outer membrane protein immunogenic in man", J. Clin. Invest. 63(5):836-48 (1979); Wang, LY. e Frasch, C.E., "Develop- ment of a Neissseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and eva- Iuation in a mouse model", Infect. Immun. 46(2):408-14136(1984)).
Estas vacinas vesiculares de membrana externa foram significa- tivamente mais imunogênicas do que os agregados de OMPs e a imunoge- nicidade demonstrou ser ainda mais intensificada por adsorção ao hidróxido de alumínio adjuvante Wang, L.Y. e Frasch, C.E., "Neissseria meningitidis group B serotype 2b protein vaccine and evaluation in a mouse model", In- fect. Immun. 46(2):408-14136 1984)).
Inúmeros testes de eficácia foram conduzidos usando vacinas vesiculares de membrana externa solúveis de diferentes formulações. As duas vacinas mais extensivamente estudadas foram desenvolvidas na déca- da de 80 em resposta a surgimentos da doença em Cuba (Sierra, GM. et al., "Vaccine against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccination results in Cuba", NIPH Ann. Dis. 14(2): 195-210(1991)); e na No- ruega (Bjune, G. et al., "Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway", Lancet 338(8775): 1093-6 (1991)). A vacina OMV produzida pelo Instituto Finlay em Cuba (comerciali- zada como VA-MENGOC-BC) é produzida a partir da cepa B:4:P1.19,15 com polissacarídeo do sorogrupo Cea preparação de OMPs com alto peso molecular e é adsorvida ao hidróxido de alumínio (Sierra, G.V. et al., "Vacci- ne against group B Neisseria meningitidis: protection trial and mass vaccina- tion results in Cuba", NIPH Ann. Dis. 14(2):195-210(1991)). Esta vacina con- tribuiu para o rápido declínio da epidemia em Cuba (Rodriguez, A.P. et al., "The epidemiological impact of antimeningococcal B vaccination in Cuba", Mem. Inst. Oswaldo Cruz 94(4):433-40(1999)).
A vacina produzida pelo Norwegian National Institute for Public Health (NIPH) foi intencionada similarmente no início para uso durante um período de doença hiperendêmica causada por outro organismo a partir do clo- ne ET-5 (B:15:P1.7,16). Ela também era uma vacina monovalente produzida a partir de vesículas da membrana externa purificadas adsorvidas sobre hidróxido de alumínio (Bjune, G. et ai, "Effect of outer membrane vesicle vaccine against group B meningococcal disease in Norway", Lancet338(8775): 1093-6 (1991)).
As vacinas vesiculares da membrana externa parecem apresen- tar eficazmente proteínas da membrana externa em uma conformação sufi- cientemente natural, para permitir a geração de anticorpos bactericidas fun- cionais, pelo menos em adolescentes e adultos. As respostas geradas pelo an- ticorpo demonstraram também aumentar a opsonofagocitose de meningoco- cos. A formulação precisa das vacinas (isto é, o teor de OMP1 o teor de LPS e a presença ou ausência de adjuvante) tem um impacto significativo sobre a imunogenicidade (Lehmann, A.K. et ai, "Immunization against serogroup B meningococci. Opsonin response in vaccinees as measured by chemilumines- cence", APMIS 99(8):769-72 (1991); Gomez, J.A. et ai, "Effect of adjuvants in the isotypes and bactericidal activity of antibodies against the transferrin- binding proteins of Neisseria meningitidis", Vaccine 16(17):1633-9 (1998); Steeghs et ai, "Immunogenicity of Outer Membrane Proteins in a Lipopoly- saccharide-Deficient Mutant of Neisseria meningitidis: Influence of Adjuvants on the Immune Response", Infect. Immun. 67(10):4988-93 (1999)).
O perfil antigênico isolados de doença também muda rapida- mente e uma vacina com cobertura de apenas um número limitado de cepas selecionadas possivelmente se torna ineficaz dentro de poucos anos, a menos que a composição da vacina seja alterada para espelhar a epidemiologia local.
Atualmente, as vacinas OMV foram usadas mais amplamente do que qualquer outra vacina de sorogrupo B e são potencialmente úteis no contexto de surgimentos da doença causados por um único tipo de PorA.
Os imunógenos que geram reatividade cruzada entre cepas de- vem ser ainda definidos. Estudos de soros pós-vacinação de testes de vaci- nas do Instituto Finlay e do NIPH sugerem que os anticorpos contra PorA (P1, a proteína sorossubtipo classe 1) e OpcA (outra OMP importante, co- nhecida anteriormente como Opc) (Wedege, E. et al., "Immune Responses against Major Outer Membrane Antigens of Neisseria meningitidis in Vacci- nes and Controls Who Contracted Meningococcal Disease during the Nor- wegian Serogroup B Proteetion Trial", Infect. Imunn. 66(7):3223-31 (1998)), foram ambos importantes na mediação da atividade bactericida sérica (sen- do PorA mais imunogênico), e estes dois antígenos apresentam variabilida- de acentuada de cepa para cepa.
A proeminência da proteína PorA, e o nível significativo de vari- abilidade nesta proteína que parece sofrer variação contínua entre e durante surgimentos em epítopos para os quais a maior parte da atividade bacterici- da na pós-vacinação (e pós-doença) está direcionada aumentou a as preo- cupações que a proteção oferecida por vacinas baseadas em OMV de cepa única (monovalentes) poderia ser restrita ao sorossubtipo (Jelfs, J. et al., "Sequence Variation in the PorA Gene of a Clone of Neisseria meningitidis during Epidemic Spread", Clin. Diagn. Lab. Immunol. 7(3):390-5 (2000)).
Em uma tentativa de superar este problema potencial, uma vaci- na OMV foi desenvolvida na Holanda em RIVM, que continha proteínas PorA de seis isolados patogênicos prevalentes diferentes (Van Der Ley, P. e Po- olman, J.T., "Construction of a multivalent meningococcal vaccine strain ba- sed on the class 1 outer membrane protein", Infect. Immun. 60(8):3156-61 (1992); Claassen, I. et al., "Production, characterization and control of a Neisseria meningitidis hexavalent class 1 outer membrane protein containing vesicle vaccine", Vaccine 14(10):1001-8 (1996)). Neste caso, as vesículas de vacina forma extraídas de duas variantes da cepa H44/76 bem caracteri- zada que tinha sido geneticamente manipulada para expressar três proteí- nas PorA separadas.
Pesquisa de um Antígeno Universal
É evidente que as proteínas de membrana externa (OMP) po- dem induzir uma resposta imunológica funcional contra doença do sorogrupo B, mas que nenhuma das vacinas desenvolvidas até agora é universalmente protetora devido à grande heterogeneidade das regiões expostas da superfí- cie das proteínas de membrana externa. A modesta imunidade com reação cruzada induzida pelas vacinas de vesículas da membrana externa (OMV) abasteceu as pesquisas por um antígeno (ou grupo de antígenos) de mem- brana externa, que induz anticorpos funcionais e que está presente em todas cepas meningocócicas. Tais antígenos, caso eles estivessem presentes em todas cepas independentemente do sorogrupo, poderiam formar a base de um vacina meningocócica verdadeiramente universal, que eliminaria o pro- blema potencial de permutação capsular em cepas patogênicas após a vaci- nação com polissacarídeos.
Depois que ficou evidente que a variabilidade da proteína PorA imunodominante limitaria seu uso como uma vacina universal, inúmeras ou- tras proteínas de membrana externa importantes foram consideradas quanto ao seu potencial de vacina e várias delas estão em desenvolvimento adicio- nal. Aquelas que foram consideradas incluem as proteínas classe 5 (OpcA), NspA e proteínas reguladas por ferro (TbpA e B, FbpA, FetA). TbpB faz par- te do complexo Iigante de transferrina com TbpA. Um trabalho recente suge- re que TbpA tem um maior papel funcional na ligação do ferro (Pintor, M. et ai, "Analysis of TbpA and TbpB funccionality in defective mutants of Neisse- ria meningitidis", J. Med. Microbiol. 47(9):757-60 (1998)), e é um imunógeno mais eficaz do que TbpB.
Uma proteína de membrana externa pequena altamente conser- vada foi descoberta por intermédio de uma técnica inovadora, usando com- binações de preparações de proteínas de membrana externa de diferentes cepas meningocócicas para imunizar camundongos (Martin, D. et ai, "Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection", J. Exp. Med. 185(7): 1173-83 (1997)). As células B dos camundongos foram usadas para produzir hibridomas que foram triados quanto à reatividade cruzada contra múltiplas cepas de meningococos. Um anticorpo monoclonal altamente reativo de forma cruzada demonstrou se ligar a uma proteína de membrana externa de 22 kDa que foi designada Ns- pA. A imunização com a proteína NspA recombinante demonstrou induzir uma resposta bactericida com reação cruzada em camundongos contra ce- pas dos sorogrupos Α-C. A vacinação também protege os camundongos contra infecção meningocócica letal (Martin, D. et al., "Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experi- mental Infection", J. Exp. Med. 185(7):1173-83 (1997)). Uma comparação de seqüência sde NspA entre cepas meningocócicas geneticamente divergen- tes demonstra que a proteína é altamente conservada (97% de homologia) (Cadieux, N. et al., "Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Mono- clonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Mem- brane Protein", Infect. Immun. 67(9):4955-9 (1999)).
A presença de NspA foi detectada por ELISA em 99,2% das ce- pas testadas dos sorogrupos Α-C, usando anticorpos monoclonais anti-NspA (Martin, D. et al., "Highly Conserved Neisseria meningitidis Surface Protein Confers Protection against Experimental Infection", J. Exp. Med. 185(7): 1173-83 (1997)). Estes anticorpos monoclonais demonstraram ser bacterici- das contra inúmeras cepas de meningococos e são capazes de reduzir a bacteriemia meningocócica em um modelo de camundongos (Cadieux, N. et al., "Bactericidal and Cross-Protective Activities of a Monoclonal Antibody Directed against Neisseria meningitidis NspA Outer Membrane Protein", Infect. Immun. 67(9):4955-9 (1999)). Embora estes dados pareçam sugerir que NspA é um candidato promissor a vacina, que é capaz de proteger em todos limites de sorogrupos, o soro anti-NspA recombinante policlonal dos camundongos não se liga à superfície de cerca de 35% das cepas meningocócicas patogêni- cas do sorogrupo B, apesar da presença do gene nspA nesses organismos (Moe, G.R. etal., "Differences in surface Expression of NspA among Neisse- ria meningitidis Group B Strains", Infect. Immun. 67(11):5664-75 (1999)).
A Seqüência do Genoma de N. meningitidis e seu Impacto no Desenho de Vacinas
As seqüências do genoma de MC58 (um meningococo do soro- grupo B) (Tettelin, H. et al., "Complete Genome Sequence of Neisseria me- ningitidis Serogroup B Strain MC58", Science 287(5459): 1809-15172 (2000)) e de Z2491 (uma cepa do sorogrupo A) (Parkhill, J. et al., "Complete DNA Sequence of a Serogroup A Strain of Neisseria meningitidis Z2491", Nature 404(6777):502-6173 (2000)) foram elucidadas e publicadas durante 2000. A disponibilidade das seqüências gênicas assinaladas deve ter uma influência dramática sobre a pesquisa de vacinas meningocócicas. Embora o seqüen- ciamento de MC58 estivesse em progresso, Pizza et al. começaram identifi- cando as estruturas de leitura aberta previstas (ORF) de codificar proteínas ligadas à membrana, expostas na superfície ou exportadas. Eles identifica- ram 570 dessas ORFs, ampliaram-nas por intermédio de reação de polime- rase em cadeia e as clonaram em Escherichia coli, para permitir a expressão das proteínas codificadas como proteínas de fusão marcadas com His ou de glutationa S-transferase (Pizza, M. et al., "Identification of Vaccine Candida- tes Against Serogroup B Meningococcus by Whole-Genome Sequencing", Science 287(5459):1816-20 (2000)). Os 61% (350) das ORFs selecionadas foram expressados exitosamente, aquelas que deixaram de expressar foram freqüentemente aquelas que contêm mais do que um domínio transmembra- na hidrofóbico (possivelmente excluindo inúmeras proteínas ligadas à mem- brana externa). As proteínas recombinantes foram purificadas e usadas para vacinar camundongos. Os soros imunes foram então avaliados quanto à li- gação da superfície às múltiplas cepas meningocócicas pelo ensaio imuno- absorvente ligado à enzima (ELISA) e citometria de fluxo e quanto à ativida- de bactericida contra duas cepas, usando o ensaio bactericida do soro. Fi- nalmente, sete proteínas foram selecionadas para estudo adicional na base de uma resposta positiva em todos os três ensaios. Formulações de vacinas para teste, usando inúmeras dessas proteínas em combinação com adjuvan- tes demonstraram induzir títulos bactericidas significativos contra a cepa meningocócica homóloga (MC58) em camundongos, mas nenhuma das pro- teínas induziu títulos de SBA tão altos quanto uma vacina vesicular de mem- brana externa de MC58 (Giuliani, M.M. et ai, 2000 "Proceedings 12th INPC, página 22). Por outro lado, há alguma evidência que combinações dessas proteínas podem apresentar imunogenicidade mais alta em camundongos do que as proteínas individuais (Santini, L. et al., 2000 "Proceedings 12th INPC', página 22). As inúmeras estruturas de leitura aberta que foram exclu- ídas durante este trabalho, talvez por falha de expressão de proteína ou mo- dificação das suas propriedades imunológicas, também podem TR potencial como vacinas e requerem investigação adicional. Os componentes das vacinas podem ser selecionados mais efi- cazmente depois de conseguir uma compreensão da contribuição de antíge- nos individuais para a patogênese de N. meningitidis. Os antígenos em si podem produzir candidatos eficazes a vacinas ou, alternativamente, os mu- tantes atenuados poderiam ser considerados como constituintes de vacinas. Um problema importante da prevenção e/ou terapia da doença meningocócica é que nenhuma vacina disponível até agora confere uma proteção universal devido à heterogeneidade dos antígenos usados como vacinas até agora.
DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
Esta invenção contribui para solucionar o problema mencionado anteriormente, fornecendo formulações farmacêuticas que contêm uma pro- teína cuja seqüência é altamente conservada, mesmo em diferentes gêneros bacterianos patogênicos. O objetivo técnico que esta invenção persegue é o desenvolvimento de formulações com a capacidade de aumentar a resposta imunológica sistêmica e da mucosa do hospedeiro contra diferentes novos patógenos ou um espectro mais amplo dos existentes. No objeto do trabalho da presente invenção relata-se pela primeira vez o uso da proteína NMA0939 co- mo um componente de uma formulação de vacina com caráter terapêutico ou preventivo contra a doença meningocócica ou qualquer infecção causada por um membro do gênero Neisseria. O caráter inovador desta invenção consiste no uso, não relatado anteriormente, da proteína NMA0939 em for- mulações com novas propriedades, capazes de induzir uma resposta imuno- lógica sistêmica e da mucosa de proteção com amplo espectro, devido ao caráter conservado desta proteína em diferentes isolados de Neisseria me- ningitidis e Neisseria gonorrhoeae. Em outra modalidade desta invenção, as composições farmacêuticas poderiam conter um ou vários antígenos de ori- gem sintética, recombinante ou natural. Em outra modalidade desta inven- ção, composições farmacêuticas combinadas poderiam conter antígenos polissacarídeos, incluindo polissacarídeos bacterianos, e mais especifica- mente, polissacarídeos de N. meningitidis. As formulações da presente in- venção podem conter proteína/polissacarídeos conjugados, sendo o polissa- carídeo de origem bacteriana. Em uma modalidade preferida da presente invenção, as formu- lações farmacêuticas que contêm NMA0939 contêm também antígenos de natureza peptídica, com o propósito de expandir o espectro de proteção in- duzido por vacinas derivadas das ditas composições.
As formulações farmacêuticas aqui descritas são administradas por via parenteral ou pela mucosa, incluindo a via oral.
Em outra modalidade preferida da presente invenção, a proteína NMA0939 pode ser empregada como adjuvante, ou veículo de peptídeos, polissacarídeos, ou qualquer antígeno com imunogenicidade menor, objeti- vando reforçar á imunogenicidade dos ditos elementos. O Exemplo 11 de- monstra que a proteína NMA0939 é capaz de intensificar os níveis de anti- corpos contra um peptídeo de origem viral quando o dito peptídeo está con- jugado a NMA0939. Está incluído também dentro do âmbito da presente inven- ção cobrir o uso de determinantes protetores para um antígeno protéico, desde que eles estejam inseridos na seqüência de aminoácidos de NMA0939, obje- tivando induzir uma resposta imunológica intensificada contra tais determi- nantes, sendo assim parte de novas proteínas híbridas presentes em uma composição farmacêutica.
Em outra modalidade preferida da preçente invenção, as com- posições farmacêuticas incluídas na presente invenção poderiam conter fragmentos da proteína NMA0939, capazes de induzir uma resposta proteto- ra contra o meningococo ou qualquer outra bactéria do gênero Neisseria. Em uma modalidade específica da presente invenção, as composições farma- cêuticas contêm peptídeos mimótopos de NMA0939 ou miméticos de NMA0939 gerados por síntese ou tecnologia de DNA recombinante. O termo "mimótopo" descreve neste relatório descritivo qualquer peptídeo que é ca- paz de produzir anticorpos, e que estão combinados com a proteína NMA0939, e ao mesmo tempo, sendo capazes de induzir uma resposta imu- nológica protetora contra Neisseria.
Faz também parte da presente invenção a detecção de doença meningocócica através do uso de componentes farmacêuticos que contêm NMA0939, ou o gene codificador de NMA0939, junto com ou em combina- ção com outros componentes.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 representa o vetor de clonagem pM238 empregado na clonagem e expressão da proteína NMA0939.
A figura 2 representa a construção final da seqüência de nucleo- tídeos do gene NMA0939 no vetor pM238.
A figura 3 ilustra a análise SDS-PAGE de frações obtidas a partir do rompimento celular: fileira 1, células integrais; fileira 2, pélete celular após rompimento; fileira 3, sobrenadante após rompimento; PM: Marcadores de Peso Molecular.
A figura 4 ilustra a análise SDS-PAGE das diferentes frações da processo de solubilização do processo de purificação da proteína NMA0939 recombinante partindo do pélete rompido: fileira 1, pélete depois da solubili- zação com uréia 2 M em tampão de carbonato/bicarbonato; fileira 2, sobre- nadante da solubilização; fileira 3, fração não-ligada que sai da matriz de purificação; fileira 4, contaminante de baixo peso molecular liberado a partir da matriz em um pico de eluição diferente; fileira 5, proteína purificada; PM: Marcador de Peso Molecular.
A figura 5 ilustra os níveis de anticorpo (IgG) contra a proteína NMA0939 recombinante, obtidos depois da imunização de camundongos com o mesmo antígeno adjuvado com adjuvante de Freund (Freud)1 hidróxi- do de alumínio (AIum) ou polissacarídeo de N. meningitidis por via intraperi- toneal. Os resultados da ELISA estão representados como o inverso da dilu- ição mais alta que duplica o valor dos soros pré-imunes.
A figura 6 representa o reconhecimento de determinantes anti- gênicos presentes em N. meningitidis, cepa CU385, OMVs usando soros murinos obtidos depois da imunização dos camundongos com o mesmo an- tígeno adjuvado com adjuvante de Freund (Freud), hidróxido de alumínio (AIum) ou polissacarídeo de N. meningitidis por via intraperitoneal. Os resul- tados da ELISA estão representados como o inverso da diluição mais alta que duplica o valor dos soros pré-imunes.
A figura 7 representa os resultados de buscas de homologia entre a proteína NMA0939 ("consulta") e seqüências anotadas em genomas de dife- rentes sorogrupos de N. meningitidis ("Sbjct"), usando o programa BLAST.
A figura 8 representa o reconhecimento da proteína NMA0939 em cinco cepas diferentes de N. meningitidis, por soros eliciados contra o antígeno recombinante adjuvado com polissacarídeo C de N. meningitidis por via intraperitoneal. Os soros eliciados com outros adjuvantes tiveram um perfil similar. Os resultados estão expressos como o inverso da diJuição mais alta que duplica o valor dos soros pré-imunes.
A figura 9 ilustra experimentos de proteção passiva contra infecção meningocócica no modelo do rato lactente, usando soros eliciados contra o antígeno recombinante adjuvado com adjuvante de Freund (Freud), hidróxi- do de alumínio (AIum) ou polissacarídeo C de N. meningitidis (PsC). "A": in- fecção com a cepa CU385; e Έ": infecção com a cepa 233 (C:2a:P1.5); "C-": coleção de animais não-tratados; "C+": soros de camundongos hiperimunes contra vesículas de membrana externa de cepas Esther CU385 ou 233, de- pendendo do experimento. O símbolo "*" representa uma diferença estatísti- ca significante em relação ao controle negativo (C-). Quanto aos níveis de bacteriemia, eles estão expressos como unidades formadoras de colônias por mililitro (cfu/mL).
A figura 10 representa o reconhecimento da proteína NMA0939 e um painel de antígenos não-relacionados por mAbs gerado (mAbs H10/67, 3H3/24 e 7D6/18. P1, proteína Classe 1 da cepa de Neisseria meningitidis B:4:P1.15; P64k, subunidade E3 de piruvato desidrogenase de Neisseria meningitidis; T.T, toxóide do tétano; HBsAg, Antígeno superficial de Hepatite B. Estes resultados estão indicados como valores de absorvância (492 nm) em um ensaio do tipo ELISA.
A figura 11 representa o reconhecimento da proteína NMA0939 por soros convalescentes humanos de sobreviventes de doença meningocó- cica. Foram empregados soros de doadores sadios como controle negativo. Os resultados estão indicados como absorvância (492 nm) em um ensaio do tipo ELISA.
A figura 12 ilustra os títulos anti-peptídeo JY1 a partir dos soros de animais imunizados com peptídeo livre (JY1), proteína recombinante (NMA0939) ou com o conjugado JY1-NMA0939.
A figura 13 ilustra os níveis de anticorpo (IgA) contra a proteína NMA0939 recombinante em amostras de lavagem pulmonar de camundon- gos imunizados por via intranasal com um polissacarídeo C de N. meningiti- dis e NMA0939 recombinante (NMA0939+PsC) ou com a proteína incorpo- rado dentro de Iipossomas (NMA0939_Lip).
Exemplos para Realização
Exemplo 1: Detecção da proteína NMA0939 em preparações de vesículas da membrana externa de Neisseria meningitidis do sorogrupo B
Com o objetivo de estudar proteínas que estão presentes em vesículas da membrana externa de Neisseria meningitidis do sorogrupo B (cepa B:4:P1.19,15), foi conduzida uma eletroforese bidimensional de acordo com um método descrito alhures (Gõrg, A. et ai, Electrophoresis 6:599-604 (1985). Subseqüentemente, foi feita uma digestão enzimática em proteínas extraídas com gel usando tripsina (Promega, Madison, Wl, EUA). Os peptí- deos gerados depois da digestão foram extraídos em solução, usando mi- crocolunas (ZipTips, Millipore, MA, EUA). Para a análise por espectrometria de massas, os peptídeos foram eluídos de microcolunas com acetonitrila a 60%, ácido fórmico a 1%, e em seguida, uma aplicação imediata dentro de "Nanotips" (Protana, Dinamarca).
As medições foram conduzidas em um espectrômetro de mas- sas híbrido com quadripolo e temo de vôo (QTof-2®, Manchester, Reino Uni- do), equipado com uma fonte de ionização (nanoESI). Os dados da espec- trometria de massas foram obtidos em uma faixa w/z de 400-2.000 em 0,98 segundo e usando 0,02 segundo entre varreduras. A obtenção de dados e o processamento dos dados foram conduzidos usando o programa MassLynx (versão 3.5, Micromass).
A identificação das proteínas, naseada em dados de espectros de massas, foi conduzida usando o programa ProFound (Zhang, W. e Chait, B.T., "ProFound: an expert system for protein Identification using mass spec- trometric peptide mapping information", Anal. Chem. 72:2482-2489 (2000); HTTP://prowl.rockefeller.edu/cqi-bin/ProFound)· A busca foi subscrita para os ge- nes e seqüências de proteínas derivadas contidas na base de dados SwissProt (HTTP://www.ebi.ac.uk/swissprot/) e NCBI (HTTP://www.ncbi.nim.nih.qov/). considerando a oxidação de metioninas, desamidação e carboxiamidometi- lação de cisteínas como modificações possíveis a serem encontradas.
A identificação de proteínas, baseada nos espectros de massas, foi conduzida com o programa MASCOT (Perkins, D.N. et aí., "Probability-based protein Identification by searching sequence databases using mass spectrometry data", Electrophoresis 20:3551-3567 (1999); http://www.matrixscience.com/). Os parâmetros da busca incluíram modificações de cisteínas, bem como oxida- ções e desamidações.
Partindo da análise dos resultados obtidos a partir da identificação de proteínas presentes em reparações de vesículas da membrana externa, um grupo de peptídeos foi selecionado para seqüenciamento adicional.
A partir dos dados de seqüências obtidos a partir de um peptí- deo, a presença de um homólogo da proteína NMA0939 no sorogrupo B foi confirmada, não estando prevista ou identificada nos genomas publicados anteriores. Este homólogo da proteína do sorogrupo B à NMA0939 é deno- minado NMA0939 neste relatório descritivo inteiro.
Exemplo 2: Análise baseada em homologia da proteína NMA0939 com produtos gênicos relatados em bases de dados
Para a identificação da proteína NMA0939, uma busca de homo- logia de seqüência foi feita na base de dados do NCBI, empregando o pro- grama BLAST (Altschul, S.F. et ai, "Basic local alignment search tool", J. MoL Bioi 215:403-410 (1990); http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/). Este procedimento permitiu identificar o homólogo de N. gonorrhoeae e o gene de N. meningitidis do sorogrupo A, não sendo este caso o mesmo para a cepa do sorogrupo B MC58. Entretanto, a busca realizada usando a seqüência codificadora do DNA de NMA0939, gene nma0939, rendeu a identificação da presença desse gene no genoma relatado de MC58, indicando assim um erro na anotação deste genoma. O gene do sorogrupo B detectado também é homólogo ao homólogo nma0939 de N. gonorrhoeae (NG00306). No so- rogrupo Β, ο gene relatado detectado neste trabalho fica localizado um uma região do DNA entre as posições 761673 e 762295, a jusante do gene nmb0729 e a montante do gene nmb0730. Assim sendo, este é até agora o primeiro relato da existência de um homólogo da proteína NMA0939 em me- ningococos do sorogrupo B. Em microorganismos diferentes, as proteínas homólogas não foram detectadas com sucesso, indicando assim que NMA0939 é um antígeno específico de Neisseria.
Exemplo 3: Clonagem e expressão do gene nma0939, que codi- fica a proteína NMA0939 da N. meningitidis em Escharichia coli
Para clonar e expressar o gene de NMA0939, o vetor de clona- gem PM-100 foi empregado. Este vetor permite que a clonagem seja condu- zida usando diferentes enzimas de restrição e a geração de altos níveis de ex- pressão de proteínas heterólogas na forma de corpos de inclusão em E. coli.
O vetor PM-100 (figura 1) tem os seguintes elementos: promotor de triptofano, segmento gênico que codifica a seqüência estabilizadora de aminoácidos 47 do fragmento Nt de P64 kDa da cepa de N. meningitidis B:4:P1.19,15, a seqüência do terminador transcricional do bacteriófago T4, e a seqüência do gene que confere resistência à ampicilina como marcador de seleção. Este vetor de clonagem permite também a seleção recombinante por meio de uma coloração de cor azul/branca de colônias transformadas, devido à presença da subunidade IacZ alfa de beta-galactosidase.
A partir da seqüência de nucleotídeos do gene que codifica NMA0939 (Exemplo 1), um par de iniciadores oligonucleotídeos (704467U e 704467L) foi desenhado para a ampliação do dito segmento gênico, evitando a região que codifica o peptídeo sinalizador, a partir do DNA genômico da cepa CU385 (B:4:P1.19,15).
Xba-I Bgl-Il
704467U: 5' GTGGTATCTAGATCTGCCAGCCAGAAACTC 3' (SEQ ID NO: 1)
704467L: 5' CAACCCCGGGATCCTTCCTTGTCCAAATC 3' BamH-I
(SEQ ID NO: 2) Para a previsão do peptídeo sinalizador, empregou-se o servidor SignaIP world Wide Web (http://www.cbs.dtu.dk/services/SiqnalP-2.0).
Depois da ampliação por PCR do gene que codifica NMA0939 (Saiki, R.K. et al., "S Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase", Science 239:487-491 (1988)), empregando os iniciadores 7740 e 7741, o produto da PCR foi digerido usando as enzi- mas de restrição Bgl-Il e Bam-Hl1 e clonado no vetor de clonagem pM238 digerido previamente com o vetor. A construção final está indicada na figura 2, e a proteína NMA0939 é expressada como uma proteína de fusão ao segmento Nt dá proteína P64 kDa. O seqüenciamento do gene clonado nma0939 foi conduzido usando o seqüenciador automático ALFexpress Il (Kit Terminador Termo Sequenase® com o Corante Cy® 5, Amersham Bios- ciences) e os oligonucleotídeos 1573 (SEQ ID NO: 8) e 6795 (SEQ ID NO: 9) que se ligam à seqüência do estabilizador P64 e ao terminador transcricional T4, respectivamente. O plasmídeo gerado neste caso foi disignado PM- NMA0939 para uso posterior.
Para a expressão do gene de NMA0939, a cepa de E. coli GC366 foi transformada pelo método químico com o plasmídeo PM-NMA0939 (figu- ra 2). O experimento de expressão foi conduzido em meio mínimo (M9) (Mil- ler, J.H., "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Labora- tory Press, New York, EUA), suplementado com 1% de glicerina, 1% de ca- seína hidrolisada, CaCI2 0,1 mM, MgSO4 1 mM e 50 ug/mL dé ampicilina. As culturas bacterianas foram incubadas por 12 horas a 37 0C e 250 rpm. As culturas desenvolvidas foram centrifugadas e o rompimento ultra-sônico do pélete celular foi realizado (IKA LABORTECHNIK). As frações do pélete e do sobrenadante foram analisadas por SDS-PAGE (Laemli, U.K., "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 277:680 (1970) mais coloração com Azul Brilhante de Coomassie R- 250. A porcentagem da expressão foi conduzida por densitometria em gel (densitômetro a laser LKB Broma 2202 Ultrascan; Amersham Pharmacia Biotech, Reino Unido). A proteína NMA0939 foi obtida a partir da fração do pélete, sendo cerca de 20% do teor protéico desta fração (figura 3). As a- mostras do pélete celular foram solubilizadas em tampão de carbona- to/bicarbonato (carbonato de sódio 0,1 M1 bicarbonato de sódio 0,1 M), con- tendo uréia em diferentes concentrações molares (2 M, 4 M, 6 M e 8 M). Quando o tampão anterior com uréia 2 M foi empregado, a proteína NMA0939 foi solubilizada. O sobrenadante depois da solubilização passou por uma cromatografia de afinidade com metal para conseguir a purificação da proteína de interesse. Como resultado, obteve-se uma amostra com uma pureza de 80%, como ilustrado na figura 4. Uma última etapa de diálise foi realizada antes de sua avaliação em cobaias.
Exemplo 4: Avaliação da resposta imunológica induzida depois da imunização com a proteína NMA0939 por via intraperitoneal
Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMA0939, foi dese- nhado e conduzido um experimento de imunização em camundongos, onde a proteína NMA0939 foi administrada adjuvada com Hidróxido de Alumínio, Adjuvante de Freund, ou Polissacarídeo C de N. meningitidis.
Com estas preparações, camundongos Balb/C fêmeos (8-10 semanas de idade) foram imunizados, depois de divididos em 4 grupos de 8 camundongos cada um. Três imunizações foram aplicadas por via intraperi- toneal, com 7 dias de intervalo entre elas. Um grupo de controle foi empre- gado, e conseqüentemente, imunizado com PBS; entretanto, similarmente aos outros grupos no experimento, uma dose de reforço com a proteína ad- juvada com hidróxido de alumínio foi dada no dia 45. Na Tabela 1, está des- crita a composição dos grupos: Tabela 1
Grupos de Camundongos Balb/C Empregados no Experimento de Imunização
<table>table see original document page 18</column></row><table>
Os títulos de anticorpo (IgG) contra a proteína recombinante e a proteína homóloga presentes na bactéria foram determinados por ELISA, em amostras de soro retiradas depois da dose de reforço. Na figura 5, estão in- dicados os títulos de anticorpo contra a proteína recombinante de animais individuais. Os níveis específicos do anticorpo foram detectados logo depois da segunda inoculação (dados não ilustrados), embora eles fossem mais altos depois da última inoculação. Além disso, foi feita a imunoidentificação por Western blotting, onde a respectiva banda da proteína foi reconhecida (dados não ilustrados). Os grupos imunizados por via intraperitoneal tiveram títulos significativamente mais altos do que aqueles eliciados por via intrana- sal.
Os soros obtidos depois da imunização com a proteína recombi- nante reconheceram a proteína natural presente em uma preparação de pro- teína de membrana externa (OMP) da cepa CU385. Estes resultados estão representados na figura 6.
Para a análise estatística dos resultados, foi realizada uma transformação logarítmica dos títulos de anticorpo, para obter uma distribui- ção normal da variância e sua homogeneidade. Genericamente, a significân- cia estatística de diferenças registradas entre as médias dos grupos foi reali- zada através de um ANOVA simples, e em seguida, um teste de múltiplas pontuações de Neuman Keuls.
Exemplo 5: Caracterização da seqüência do gene que codifica a proteína NMA0939 em diferentes cepas de N. meningitidis e Neisseria go- norrhoeae
Para analisar a conservação da seqüência do gene que codifica a proteína NMA0939 na espécie patogênica do gênero Neisseria, foi feita uma busca de similaridade com os genomas de Neisseria meningitidis (so- rogrupos A, B e C) e Neisseria gonorrhoeae, anotados na base de dados do NCBI (NC 003116.1, NC003112.1, NC 003221, NC 002946), empregando o programa BLAST (Altschul, S.F. et ai., "Basic local alignment search tool", J. Moi BioL 215:403-410 (1990); http://www.ncbi.nim.nih.gov/BLAST/). A figura 7 ilustra os resultados da comparação de seqüências para as seqüências que produzem um alinhamento significativo em cada um dos genomas anali- sados. Essas seqüências têm 99% de identidade no sorogrupo B, 100% de identidade no sorogrupo A e uma identidade de 96% com eisseria gonorrho- eae, com a seqüência obtida para o gene que codifica a proteína NMA0939 (SEQ ID NO: 3). Além disso, a seqüência do gene referido foi determinada para isolados cubanos (SEQ ID NO: 5-7), que pertencem ao sorogrupo B (B:4:P1.19,15) e um alinhamento de seqüências foi feito usando o programa ClustaIX (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Os resultados do alinhamento indi- cam que há uma grande conservação na seqüência de nucleotídeos do gene NMA0939 entre as cepas analisadas e em geral no gênero Neisseria.
O uso da proteína NMA0939 como um candidato a vacina, le- vando em conta o alto grau de similaridade existente entre as seqüências mencionadas anteriormente, permitiria a geração de uma resposta imunoló- gica eficaz, com uma proteção de amplo espectro (devido à reatividade cru- zada) contra a doença meningocócica.
Exemplo 6: Caracterização da resposta imunológica com ação de amplo espectro, induzida pela imunização de camundongos Balb/C com a proteína NMA0939
Para avaliar se a imunização com a proteína NMA0939 induziu uma resposta amplamente reativa de forma cruzada com outras cepas de Neisseria, foi feito um ensaio ELISA. As placas de poliestireno foram revesti- das com células integrais de 7 cepas de Neisseria, que pertencem a diferen- tes sorotipos e sorossubtipos. As placas foram incubadas com soros cole- cionados obtidos contra a proteína NMA0939, por duas vias de imunização, como descrito no Exemplo 4.
A figura 8 ilustra o reconhecimento de antígenos presentes em cepas dos sorogrupos A, B e C de N. meningitidis pelos soros eliciados de- pois da imunização com a proteína NMA0939 recombinante adjuvada com polissacarídeos C. Como se observa, os soros imunes reconheceram a pro- teína presente em diferentes cepas, com níveis similares ao encontrado na cepa CU385. Os soros restantes tiveram um comportamento comparável neste ensaio.
Exemplo 7: Proteção induzida pelos soros murinos específicos para a proteína NMA0939 contra cepas homólogas e heterólogas, no modelo do rato infante
Para determinar a atividade funcional dos anti-soros obtidos, foi conduzido um ensaio de proteção no modelo do rato infante para infecção meningocócica. Vinte e quatro ratos (5-6 dias de idade) foram divididos em grupos de 6 ratos cada um.
Foi determinado se os soros administrados por via intraperitoneal protegeram os ratos contra a infecção causada por bactérias (cepa CU385), inoculados pela mesma via uma hora depois. Os soros de cada grupo foram colecionados e diluídos 1/10 (em PBS estéril) antes de serem inoculados em ratos infantes. Quatro horas depois, os animais foram amostrados e as bac- térias viáveis no seu sangue foram contadas.
Para interpretar os resultados, foi feito um teste t de Student de cauda única, comparando cada grupo com o grupo de controle negativo (co- leção de animais não-tratados). Como pode ser observado na figura 9A, o grupo que recebeu soros de camundongos imunizados com NMA0939 adju- vada com polissacarídeo C não apresentaram diferenças estatisticamente significantes em comparação com o grupo de controle negativo, e assim sendo, os títulos de anticorpo foram protetores no modelo do rato infante. A resposta de anticorpo, gerada depois da imunização com a proteína adjuva- da com hidróxido de alumínio, também foi protetora neste modelo animal (dados não ilustrados).
Um ensaio similar foi feito infectando os ratos infantes com a cepa 233 (C:2a:P1.5) e os resultados estão indicados na figura 9B, indican- do que, como no experimento anterior, os anticorpos eliciados com a proteí- na-alvo NMA0939 adjuvada com hidróxido de alumínio ou polissacarídeo C foram capazes de proteger os ratos contra infecção meningocócica.
Exemplo 8: Geração de anticorpos monoclonais contra a proteí- na NMA0939 capazes de mediar a atividade bactericida contra Neisseria meningitidis
Para gerar anticorpos monoclonais (mAbs) específicos contra a proteína NMA0939, e estudar a capacidade funcional de mediar a atividade bactericida contra cepas homólogas e heterólogas de N. meningitidis, foi conduzido um programa de imunização com uma preparação da proteína NMA0939 com 80% de pureza (Exemplo 3). A imunização foi feita em Balb/C (H-2d, fêmeas, 5-6 semanas de idade) e 4 doses foram aplicadas da seguinte maneira: nos dias 0, 15 e 30 da rotina de imunização, 10 μg antí- geno NMA0939 por camundongo (volume total 100 μL) foram administrados por via subcutânea, emulsificados com adjuvante de Freund; no dia 50, 10 μg de antígeno por camundongo em solução salina tamponada com fosfato (NaCl 140 mM, KCI 270 mM, KH2PO4 1,5 mM, Na2HPO4.H2O 6,5 mM, pH 7,2) foram administrados por via intraperitoneal. As extrações de sangue foram feitas nos Dias 0 e 45.
Os esplenócitos do animal com o título mais alto, medido por um ensaio ELISA indireto, usando a proteína NMA0939 como antígeno do re- vestimento (Exemplo 3), foram fundidos com células do mieloma do camun- dongo X63 Ag8 653. Os hibridomas resultantes foram isolados e triados de acordo com procedimentos padronizados (Gavilondo, J.V., "Anticuerpos Mo- noclonales: Teoria y Práctica", Elfos Scientiae, La Habana, Cuba).
A reatividade dos anticorpos secretados pelos hibridomas dire- cionados para a proteína NMA0939, bem como seus antígenos não-relaci- onados com reatividade cruzada, foi testada por um ensaio ELISA indireto, empregando 5 μg/mL de cada antígeno, a a mesma concentração de cada mAbs a ser testado. A figura 10 ilustra os resultados obtidos neste experi- mento, foram obtidos 2 clones positivos no total (mAbs H10/67, 3H3/24 e 7D6/18) que reconheceram especificamente a proteína NMA0939, e não reagiram com a seqüência de aminoácidos correspondente ao terminal N de P64k nem com o restante dos antígenos não-relacionados testados.
Para determinar a capacidade de os mAbs gerados contra a pro- teína NMA0939 mediarem uma resposta bactericida contra cepas homólo- gas e heterólogas de Neisseria meningitidis, foi realizado um teste bacterici- da. O título do anticorpo bactericida foi expresso como a recíproca da dilui- ção mais alta dos anticorpos testados, que foi capaz de exterminar 50% ou mais bactérias; dois dos Ambs (3H3/24 e 7D6/18) atingiram títulos bacterici- das mais altos do que 1:128 contra a cepa homóloga B:4:P1.19,15 e um (Η10/67) atingiu um título mais alto do que 1:80. Eles apresentaram também títulos mais altos do que 1:64 contra as cepas heterólogas B:15:P1.7,16 e C:2a:P1.5, respectivamente.
Exemplo 9: Caracterização das regiões-alvo da resposta imuno- lógica murina contra a proteína NMA0939
Para identificar as regiões na proteína, que são mais freqüente- mente reconhecidas pelos anti-soros murinos gerados contra o antígeno re- combinante, foi feito um ensaio SPOTScan. Um conjunto de peptídeos so- brepostos que cobrem a seqüência da proteína foi sintetizado sobre uma membrana de celulose, que foi incubada com soros colecionados diluídos 1:100. A reação antígeno/anticorpo foi detectada pela incubação com um conjugado imunoglobulina G antimurina/fosfatase alcalina, e em seguida, a adição de uma solução que continha o substrato bromo-cloro-indolil-fosfato. Várias regiões antigênicas comuns com a proteína foram observadas, inde- pendentemente da preparação empregada para a imunização. Entretanto, nos grupos imunizados com a proteína adjuvada com adjuvante de Freund, houve um padrão muito mais amplo de reconhecimento.
Exemplo 10: Reconhecimento da proteína NMA0939 por soros
humanos
Uma coleção de soros humanos, advindos de indivíduos conva- lescentes, foi empregada neste estudo, que foi realizado por ELISA. As pla- cas foram revestidas com a proteína NMA0939 obtida por eletroforese pre- paratória (5 μg/mL). Depois de bloquear as placas com leite desnatado em pó a 3% em PBS contendo Tween-20, os soros foram diluídos (1:50) na mesma solução e foram incubados nas placas. O imunoensaio prosseguiu como foi amplamente relatado. Soros de doadores sadios foram emprega- dos como controles negativos. Além disso, os soros colecionados de indiví- duos vacinados com uma vacina recombinante contra hepatite B foram usa- dos como um controle não-relacionado (dados não ilustrados).
A figura 11 ilustra os resultados obtidos com 5 soros dos conva- Iescentes neste ensaio. Pode-se observar que os soros humanos reconhe- ceram a proteína, o que indica que ela é expressada durante a infecção me- ningocócica e ela é imunogênica.
Exemplo 11: Proteína NMA0939 como um veículo para um peptídeo
Para demonstrar a capacidade veículo da proteína NMA0939 recombinante, ela foi conjugada a um peptídeo sintético de 15 meros, deri- vado da região V3 da proteína gp120 de HIV-1, o isolado JY1. A conjugação foi feita pelo método de glutaraldeído. O peptídeo JY1, a proteína NMA0939 recombinante e o conjugado JY1/NMA0939, foram administrados a camun- dongos adultos em um programa de 3 doses, onde os imunógenos foram emulsificados com adjuvante de Freund. Duas semanas depois da terceira dose, foram obtidas amostras de soro dos animais imunizados, e as amos- tras foram analisadas por ELISA para determinar os títulos de anticorpo anti- peptídeo. Para fazer isto, as placas foram revestidas com peptídeo livre (20 μg/mL) e o imunoensaio continuou como descrito anteriormente. Os resulta- dos do experimento (figura 12) ilustram a capacidade carreadora da proteína NMA0939, capaz de potencializar significativamente a resposta do anticorpo contra o peptídeo JY1, depois da sua conjugação.
Exemplo 12: Avaliação da resposta imunológica induzida depois da imunização com a proteína NMA0939 por via de mucosa
Para avaliar a imunogenicidade da proteína NMA0939, foi dese- nhado e conduzido um experimento de imunização em camundongos, onde a proteína NMA0939 foi administrada encapsulada dentro de Iiposomas ou adjuvadas com polissacarídeo C de N. meningitidis. Os Iipossomas foram obtidos por desidratação/reidratação como descrito anteriormente (Carmena- te, T. et al., "Recombinant Opc protein from Neisseria meningitidis reconstitu- ted into Iiposomes elicits antibodies following immunization", Biotechnol. Ap- pl. Biochem. 34:63-69 (2001)). Com estas duas preparações, camundongos Balb/C fêmeos (8-10 semanas de idade) foram imunizados. Três doses de 50 μg foram aplicadas por via intranasal, com 15 dias de intervalo entre elas. Para analisar a resposta imunológica no nível da mucosa, os níveis do anti- corpo IgA foram medidos em lavagens pulmonares dos animais imunizados. Na figura 13 estão indicados os níveis do anticorpo IgA detectados para os dois grupos avaliados. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
<110> Center for Genetic Engineering and Biotechnology <120> FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS QUE CONTÊM A PROTEÍNA NMAO939 <130> FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS QUE CONTÊM A PROTEÍNA NMAO939
<140> <141>
<160> 9
<170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 <212> ADN
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 704467U
<400> 1
gtggtatcta gatctgccag ccagaaactc
<210> 2 <211> 28 <212> ADN
<213> Seqüência Artificial
30
<220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial: Oligo 704467L
<400> 2
caacccggga tccttccttg tccaaatc 28
<210> 3 <211> 348 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo B)
<400> 3
atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc
aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348
<210> 4 <211> 115 <212> PRT
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β) <400> 4
Met Pro Ala Arg Asn Ser Lys Ala Trp Trp Asn Thr Thr Met Thr Asn
1 5 10 15
Asn Val Asp Leu Lys Val Pro Ala Lys Arg Tyr Phe Thr Leu Asp Glu
20 25 30
Leu Cys Gly Leu Leu Gln Ile Ser Pro Tyr Gly Phe Ala Gln Trp Gln
35 40 45
His Asp Tyr Gly Val Val Val Gly Tyr Gly Gly Glu Arg Tyr Thr Arg
50 55 60
Leu Asp Val Val Lys Leu Leu Lys Leu Gln Ser Thr Phe Ala Pro Tyr 65 70 75 80
Ala Glu Gly Ala Glu Ser Gly Ser Asp Gly Asn Arg Pro Val Thr Leu
85 90 95
Gln Glu Ile Gly Asp Gly Leu Lys Glu Leu Leu Ala Asp Leu Asp Lys 100 105 110
Glu Leu Cys 115
<210> 5 <211> 348 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β) <400> 5
atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348
<210> 6 <211> 348 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo B) <400> 6
atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180
cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240
gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300
gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348
<210> 7 <211> 348 <212> ADN
<213> Neisseria meningitidis (grupo Β) <400> 7
atgccagcca gaaactcaaa agcatggtgg aacactacta tgacaaacaa cgttgatttg 60 aaggttcccg caaaacgcta tttcacgctg gacgagttgt gcggactgtt gcaaatcagc 120 ccctatggtt ttgcgcaatg gcagcatgat tatggtgtgg ttgtcggtta cggcggcgaa 180 cgctacaccc gtttggatgt ggtgaaactg ttgaaattgc agagcacgtt tgcaccgtat 240 gcagaaggtg cggagtcggg ttcggacggc aaccgtccgg ttacgcttca ggaaatcgga 300 gacggtctga aagagctgtt ggcggatttg gataaggaat tgtgctga 348
<210> 8 <211> 29 <212> ADN
<213> Seqüência Artificial <220>
<223> Descrição da Seqüência Artificial:Oligo 1573
<400> 8
ttccatggta gataaaagaa tggctttag
<210> 9 <211> 27 <212> ADN
<213> Seqüência Artificial
29
<220>
<223> Descrição da SeQüencia Airti fie ia 1 : Oliçfo 6795 <400> 9
aactgcaggc ttgtaaaccg ttttgtg 27
Claims (13)
1. Formulação farmacêutica, caracterizada por conter a proteína NMA0939 identificada como SEQ ID NO: 4.
2. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recebedor uma resposta protetora contra infecções causadas por bactérias do gênero Neisse ria.
3. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser uma vacina capaz de gerar no organismo recebedor uma resposta protetora contra infecções causadas por Neisseria meningitidis ou Neisseria gonorrhoeae.
4. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter ainda um ou vários antígenos de natureza diferente, obtidos por meios recombinantes, sintéticos ou naturais.
5. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por conter antígenos polissacarídeos, incluindo polissacarí- deos bacterianos.
6. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por conter polissacarídeos capsulares de Neisseria meningitidis.
7. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por conter conjugados proteína/polissacarídeo nos quais o componente polissacarídeo é um polissacarídeo bacteriano.
8. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por conter antígenos peptídicos.
9. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, para ser administrada por via parenteral ou pela mucosa.
10. Formulação farmacêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo uso da proteína NMA0939 como um adjuvante ou veículo para antígenos de natureza diferente.
11. Formulação farmacêutica, caracterizada por conter fragmen- tos de peptídeos ou peptídeos miméticos do antígeno proteína NMA0939.
12. Formulação farmacêutica, caracterizada por conter a proteína ΝΜΑ0939 identificada como SEQ ID NO: 4, para ser usada na detecção de doença meningocócica em seres humanos, seja isoladamente ou em combi- nação com outros componentes.
13. Formulação farmacêutica, caracterizada por conter o gene codificador de NMA0939, identificado como SEQ ID NO: 3, para ser usada na detecção de doença meningocócica em seres humanos, seja isoladamen- te ou em combinação com outros componentes.
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