BRPI0621065A2

BRPI0621065A2 - anticorpo anti-ox40l, anticorpos isolados, polinucleotìdeo, vetor, célula hospedeira, método para fabricar um anticorpo anti-ox40l, método para tratar ou previnir uma disfunção imune, composição e uso de um anticorpo anti-ox40l

Info

Publication number: BRPI0621065A2
Application number: BRPI0621065-1A
Authority: BR
Inventors: Flavius Martin
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2005-12-16
Filing date: 2006-12-15
Publication date: 2011-11-29
Also published as: IL191820A0; RU2008129111A; CN101374865A; NO20083147L; AU2006343459A1; WO2007133290A3; ZA200804868B; WO2007133290A8; ECSP088543A; US20090053230A1; KR20080080639A; CR10069A; US7812133B2; WO2007133290A2; CA2633602A1; EP1973949A2; MA30153B1; AR057253A1; TW200732349A; RU2426744C2

Abstract

ANTICORPO ANTI-OX4OL, ANTICORPOS ISOLADOS, POLINUCLEOTìDEO, VETOR, CéLULA HOSPEDEIRA, MéTODO PARA FABRICAR UM ANTICORPO ANTI-OX4OL, MéTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DISFUNçãO IMUNE, COMPOSIçãO E USO DE UM ANTICORPO ANTI-OX4OL. A presente invenção fornece anticorpos anti-OX4OL, composições que compreendem o mesmo e métodos de uso destes anticorpos.

Description

"ANTICORPO ANTI-OX40L, ANTICORPOS ISOLADOS, POLINUCLEOTÍDEO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA FABRICAR UM ANTICORPO ANTI-OX40L, MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DISFUNÇÃO IMUNE, COMPOSIÇÃO E USO DE UM ANTICORPO ANTI-OX40L"

Este pedido reivindica prioridade com base em 35 USC §119 para o pedido de patente US provisório 60/671.902 depositado em 16 de dezembro de 2005, cujo conteúdo é integralmente incorporado ao presente como referência.

Campo Da Invenção

A presente invenção relaciona-se de modo geral aos campos da biologia molecular. Mais especificamente, a invenção relaciona-se aos anticorpos anti-OX40L e usos do mesmo.

Antecedentes Da Invenção

O ligante 0X40 humano (OX40L), um membro ligado à membrana, da superfamília do fator de necrose tumoral, é primeiramente expresso em células apresentadoras de antígenos, como células dendríticas e a um grau menor, células B. Ver Sugamura1 K et ai, Nature Reviews Immunology 4:420 (2004); Weinberg AD, Trends Immunol. 23(2): 102 (2002). OX40L, também conhecido como receptor ACT-4, TNF4 humano, GP34 e CD134L, se liga ao receptor 0X40 (0X40), que é também chamado de CD134, ACT-4, antígeno CD134, antígeno ACT35 e TNR4 humano. 0X40 é uma proteína de ativação de célula que é expressa após o engajamento do receptor de célula T (TCR). O engajamento do CD40 pelas células apresentadoras de antígenos aumenta a expressão do OX40L. O engajamento do 0X40 pelo OX4ÜL é co-estimulatório para células T, e a co-estimulação supra-regula a produção de citocinas pelas células T auxiliares 1 e células T auxiliares 2. As interações 0X40-0X401 são também importantes para a geração de células T de memória, que promovem a sobrevivência de células T efetoras após o funcionamento pelo antígeno. O bloqueio de OX40L in vivo reduziu a severidade da artrite reumatóide, doença auto-imune experimental (EAE)1 doença aguda do enxerto contra hospedeiro (GVHD)1 doença inflamatória do intestino, Ieishmaniose experimental e artrite induzida por colágeno em modelos animais. Ver Sugamura1 K et al., Nature Reviews Immunology 4:420 (2004); Weinberg AD1 Trends Immunoi 23(2): 102 (2002).

Anticorpos anti-OX40L e anticorpos que reconhecem OX40L são mencionados, por exemplo, no documento WO 95/12673; documento WO 95/21915; documento WO 99/15200; Baum1 P.R., et al., EMBO J. 13 (1994) 3992-4001; Imura, A., et al., Blood 89 (1997) 2951-2958; Imura1 A., et al., J. Exp. Med. 183 (1996) 2185-2195; Kjaergaard1 J., et al., J. Immunol. 167 (2001) 6669-6677; Lane, P., J. Exp. Med. 191 (2000) 201-206; Mallett1 S., e Barclay, A.N., Immunol. Today 12 (1991) 220-223; Mallett, S., et al., EMBO J. 9 (1990) 1063-1068; Ndhlovu, L.C., et al., J. Immunol. 167 (2001) 2991-2999; Oyhshima1 Y .,et al., J. Immunol. 159 (1997) 3838-3848; Rogers1 P.R., et al., Immunity 15 (2001) 445-455; Stüber, E., e Strober, W., J. Exp. Med. 183 (1996) 979-989; Stüber, E., et al., Gastroenterology 115 (1998) 1205-1215; Takahashi, &., et al., J. Virol. 75 (2001) 6748-6757; Takasawa, N., et al., Jpn. J. Câncer Res. 92 (2001) 377-382; Taylor, L., e Schwarz1 H., J. Immunol. Meth. 255 (2001) 67-72; Weinberg, A.D., et al., Nature Medicine 2 (1996) 183-189; Weinberg, A.D., et al., Semin. Immunol. 10 (1998) 471-480; Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23 (202) 102-109; Wu, T., et al., Transplant. Proc. 33 (2001) 217-218; Higgins, L.M., et al., J.lmmunol. 162 (1999) 486-493; Yoshioka1 T., et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 2815-2823; e Wang, Q., et al. Tissue Antigens 64:566-574 (2004). Anticorpos OX40L anti-humanos de camundongo são comercialmente disponíveis pela MBL International Corp. (TAG-34) e R e D Corp (clones 159403 e 159408).

Está claro que continua a existir uma necessidade para agentes que tenham atributos clínicos que sejam mais eficientes para o desenvolvimento como agentes terapêuticos. A invenção descrita no presente pedido vai de encontro a esta necessidade e fornece outros benefícios.

Todas as referências citadas no presente pedido, incluindo pedidos de patente e publicações, são integralmente incorporadas como referência.

Descrição Resumida Da Invenção A presente invenção está em parte baseada na identificação de uma variedade de agentes de ligação OX40L (como anticorpos e fragmentos destes). OX40L se apresenta como alvo terapêutico importante e vantajoso, e a presente invenção fornece composições e métodos baseados na ligação do OX40L. OX40L que se ligam aos agentes da presente invenção, como descrito no presente pedido, fornecem agentes terapêuticos e diagnósticos importantes para o uso no direcionamento das condições patológicas associadas com a expressão e/ou atividade das vias do OX4C)L-receptor 0X40. Consequentemente, a presente invenção fornece métodos, composições, kits e artigos de fabricação relacionados à ligação do OX40L.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX4ÜL isolado, sendo que uma forma IgG completa do anticorpo especificamente se liga ao C>X40L humano com uma afinidade de ligação de cerca de 10 pM ou mais. Como bem estabelecido na técnica, a afinidade de ligação de um Iigante ao seu receptor pode ser determinada usando-se qualquer um de uma diversidade de testes, e expressa em termos de uma diversidade de valores quantitativos. Consequentemente, em uma realização, a afinidade de ligação é expressa como valores Kd e reflete afinidade de ligação intrínseca (por exemplo, com efeitos de avidez minimizados). Geralmente e preferivelmente, a afinidade de ligação é medida in vitro, tanto em um ambiente associado à célula ou livre de célula. Qualquer um de inúmeros testes conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente pedido, pode ser usado para se obter medidas de afinidade de ligação, incluindo, por exemplo, Biacore, radioimunoensaio (RIA) e ELISA.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo isolado que liga um 0X40 a uma região de ligação do receptor do OX40L. Em algumas realizações, o anticorpo isolado se liga a um polipeptídeo que compreende ou que consiste de domínio extracelular OX40L humano.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L isolado que compete com o receptor 0X40 para ligação do OX40L.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L isolado que inibe, reduz e/ou bloqueia a atividade do OX40L.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX4CIL que inibe, reduz e/ou bloqueia a proliferação de células T.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que inibe, reduz e/ou bloqueia a sobrevida de células T ativadas.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que inibe, reduz e/ou bloqueia a secreção de IL-2 a partir de células T de memória.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1), RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2), RVSNRFS (SEQ ID NO:3), KVSNRFS (SEQ ID NO:4), FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5), SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6), SYWLN (SEQ ID NO:7), SYWMH (SEQ ID NO:8), MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9), EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10), GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11), e ERSPRYFDV (SEQ ID NO: 12).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1) ou RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência RVSNRFS (SEQ ID NO:3) ou KVSNRFS (SEQ ID NO:4); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5) ou SQSTHIPWT (SEQ ID N0:6); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWLN (SEQ ID N0:7) ou SYWMH (SEQ ID N0:8); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9) ou EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11) ou ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia leve que tem a seqüência: DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGG TKVEIKR (SEQ ID NO: 13) ou

DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPWTFGG GTKVEIKR (SEQ ID NO: 14); e compreende um domínio variável da cadeia pesada que tem a seqüência:

QVQLQQPGAELVRPGASVkLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWIVMI DPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRGRGNF YGGSHAMEYWGQGTLLTVSS (SEQ ID NO: 15) ou QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWIGEI DPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRERSPRY FDVWGAGTTLTVSS (SEQ ID NO:16).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1) ou HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência RVSNRFS (SEQ ID NO:3) ou HVR-L2 que compreende a seqüência KVSNRFS (SEQ ID NO:4); (c) HVR- L3 que compreende a seqüência FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5) ou HVR-L3 que compreende a seqüência SQSTHIPWT (SEQ ID N0:6); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWLN (SEQ ID N0:7) ou HVR-H1 que compreende a seqüência SYWMH (SEQ ID N0:8); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9) ou HVR-H2 que compreende a seqüência EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11) ou HVR-H3 que compreende a seqüência ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência RVSNRFS (SEQ ID NO:3); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWLN (SEQ ID NO:7); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO: 11).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1), RVSNRFS (SEQ ID NO:3), e FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve HVR-L1 que tem a seqüência de aminoácido RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve da HVR-L2 que tem a seqüência de aminoácido RVSNRFS (SEQ ID NO:3). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve da HVR-L3 que tem a seqüência de aminoácido FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5). Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWLN (SEQ ID NO:7), MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9), e GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H1 que tem a seqüência de aminoácido SYWLN (SEQ ID NO:7). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H2 que tem a seqüência de aminoácido MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H3 que tem a seqüência de aminoácido GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11). Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada em pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWLN (SEQ ID NO:7), MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9), e GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11) e uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID ΝΟ.Ί), RVSNRFS (SEQ ID NO:3), e FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia leve que tem a seqüência: DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGG TKVEIKR (SEQ ID NO:13).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia pesada que tem a seqüência: QVQLQQPGAELVRPGASVkLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWIVMI DPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRGRGNF YGGSHAMEYWGQGTLLTVSS (SEQ ID NO: 15).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção

compreende um domínio variável da cadeia leve que tem a seqüência: DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGG TKVEIKR (SEQ ID NO: 13); e compreende um domínio variável de cadeia pesada que tem a seqüência:

QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWIVMI DPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRGRGNF YGGSHAMEYWGQGTLLTVSS (SEQ ID NO: 15).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um anticorpo anti- OX40L que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência KVSNRFS (SEQ ID NO:4); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWMH (SEQ ID NO:8); (e) HVR- H2 que compreende a seqüência EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência ERSPRYFDV (SEQ ID NO: 12).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2), KVSNRFS (SEQ ID NO:4), e SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve da HVR-L1 que tem a seqüência de aminoácido RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID N0:2). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve da HVR-L2 que tem a seqüência de aminoácido KVSNRFS (SEQ ID NO:4). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia leve da HVR-L3 que tem a seqüência de aminoácido SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6). Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWMH (SEQ ID NO:8), EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10), e ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H1 que tem a seqüência de aminoácido SYWMH (SEQ ID NO:8). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H2 que tem a seqüência de aminoácido EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID N0:10). Em uma realização, o anticorpo compreende a cadeia pesada da HVR-H3 que tem a seqüência de aminoácido ERSPRYFDV (SEQ ID NO: 12). Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende uma cadeia pesada em pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWMH (SEQ ID NO:8), EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID N0:10), e ERSPRYFDV (SEQ ID NO: 12) e uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2), KVSNRFS (SEQ ID NO:4), e SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia leve que tem a seqüência: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPWTFGG GTKVEIKR (SEQ ID NO:14).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia pesada que tem a seqüência: QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWIGEI DPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRERSPRY FDVWGAGTTLTVSS (SEQ ID NO: 16).

Em uma realização, um anticorpo da presente invenção compreende um domínio variável da cadeia leve que tem a seqüência: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPWTFGG GTKVEIKR (SEQ ID NO:14); e compreende um domínio variável da cadeia pesada que tem a seqüência:

QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWIGEI DPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRERSPRY FDVWGAGTTLTVSS (SEQ ID NO: 16).

Como conhecido na técnica e como descrito em maiores detalhes a seguir, a posição de aminoácido/limite que delineia uma região hipervariável de um anticorpo pode variar, dependendo do contexto a das várias definições conhecidas na técnica (como descrito abaixo). Algumas posições em um domínio variável podem ser vistas como posições hipervariáveis híbridas, com isso, estas posições podem ser consideradas estando dentro de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios, enquanto sendo consideradas fora de uma região hipervariável sob um conjunto de critérios diferentes. Uma ou mais destas posições podem também ser encontradas em regiões hipervariáveis extendidas (como ainda definido abaixo).

Em algumas realizações, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas realizações, o anticorpo é um anticorpo policlonal. Em algumas realizações, o anticorpo é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo quimérico, um anticorpo de afinidade madura, um anticorpo humanizado e um anticorpo humano. Em algumas realizações, o anticorpo é um fragmento de anticorpo. Em algumas realizações, o anticorpo é um Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, ou scFv.

Em uma realização, um anticorpo é um anticorpo quimérico, por exemplo, um anticorpo que compreende seqüências de ligação de antígeno de um doador não-humano enxertado com uma seqüência heteróloga não- humana, humana ou humanizada (por exemplo, estruturas e/ou seqüências de domínio constante). Em uma realização, o doador não-humano é um camundongo. Em uma realização, uma seqüência de ligação de antígeno é sintética, por exemplo, obtida por mutagênese (por exemplo, seleção de exibição por fago, etc.). Em uma realização, um anticorpo quimérico da presente invenção possui regiões V de murino e regiões C humanas. Em uma realização, a região V da cadeia leve de murino é ligada à cadeia leve kappa humana. Em uma realização, a região V da cadeia leve de murino é ligada à região C da IgG1 humana.

Anticorpos humanizados da presente invenção incluem aqueles que possuem substituições de aminoácido na FR e variantes de maturação de afinidade com alterações nas CDRs enxertadas. Os aminoácidos substituídos na CDR ou FR não estão limitados àqueles presentes no anticorpo doador ou receptor. Em outras realizações, os anticorpos da presente invenção compreendem ainda trocas nos resíduos de aminoácidos na região Fc que levam à melhora na função efetora, incluindo aumento das funções CDC e/ou ADCC e destruição de célula B. Outros anticorpos da presente invenção incluem aqueles que possuem trocas específicas que melhoram a estabilidade. Em outras realizações, os anticorpos da presente invenção compreendem ainda trocas nos resíduos de aminoácidos na região Fc que levam à diminuição na função efetora, por exemplo, diminuição das funções CDC e/ou ADCC e/ou destruição de célula B. Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são caracterizados pela ligação diminuída (como ausência de ligação) a um fator de complemento humano C1q e/ou receptor Fc humano nas células natural killer (NK). Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são caracterizados pela ligação diminuída (como ausência de ligação) ao FcyRI, FcyRIIA e/ou FeyRIIIA. Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são da classe IgG (por exemplo, IgGI ou lgG4) e compreendem pelo menos uma mutação no E233, L234, G236, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 e/ou P329 (numeração de acordo com o índice EU). Em algumas realizações, os anticorpos compreendem a mutação L234A/L235A ou D265A/N297A.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece polipeptídeos anti- OX40L que compreendem qualquer uma das seqüências de ligação de antígeno fornecida no presente pedido, sendo que os polipeptídeos anti-OX40L especificamente se ligam ao OX40L.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um imunoconjugado (alternativamante chamado de "conjugado anticorpo-droga" ou "ADC") que compreende qualquer um dos anticorpos anti-OX40L divulgados no presente pedido conjugados a um agente, como uma droga.

Os anticorpos da presente invenção se ligam (em algumas realizações, se ligam especificamente) ao OX40L, e em algumas realizações podem modular um ou mais aspectos dos efeitos associados ao OX40-L, incluindo mas não limitado à ativação do OX40L, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do OX40L, ativação do receptor 0X40, sinalização molecular a jusante do 0X40, ruptura do receptor 0X40 de ligação ao OX40L, multimerização OX40L, e/ou ruptura de qualquer OX40L relevante biologicamente e/ou via biológica do receptor 0X40, e/ou tratamento e/ou prevenção de uma disfunção imune (como, asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, doença do enxerto contra hospedeiro (GVHF), e/ou lúpus eritematoso sistêmico); e/ou tratamento e/ou prevenção de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade do OX40L (como expressão e/ou atividade aumentada do OX40L). Em algumas realizações, o anticorpo da presente invenção se liga especificamente ao OX4ÜL. Em algumas realizações, o anticorpo se liga especificamente a um receptor 0X40 da região de ligação do OX40L. Em algumas realizações, o anticorpo isolado se liga a um polipeptídeo que compreende ou que consiste essencialmente do domínio extracelular OX40L humano. Em algumas realizações, o anticorpo se liga especificamente ao OX40L com Kd de cerca de 1nM ou mais forte. Em algumas realizações, o anticorpo se liga especificamente ao OX4ÜL com Kd de cerca de 10nM ou mais forte. Em algumas realizações, o anticorpo da presente invenção reduz, inibe e/ou bloqueia a atividade OX40L in vivo e/ou in vitro. Em algumas realizações, o anticorpo compete com OX40L para ligação com o receptor 0X40 (reduz e/ou bloqueia a ligação do receptor 0X40 ao OX4C1L).

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico. Em algumas realizações, a disfunção é uma doença associada com vírus, bactéria ou outro agente infeccioso, por exemplo, imunopatologia induzida por vírus, por exemplo, patologia induzida pela infecção com influenza ou RSV ou vírus relacionados, por exemplo, no pulmão. Ver, em geral, patente US 2005/0069548 A1. Em algumas realizações, a disfunção é artrite (aguda e crônica, artrite reumatóide incluindo artrite reumatóide de princípio juvenil e estágios como sinovite reumatóide, gota ou artrite de gota, artrite imunológica aguda, artrite inflamatória crônica, artrite degenerativa, artrite induzida por colágeno tipo II, artrite infecciosa, artrite de Lyme, artrite proliferativa, artrite psoriática, doença de Still, artrite vertebral, osteoartrite, artrite crônica progressiva, artrite deformante, poliartrite crônica primária, artrite reativa, artrite da menopausa, artrite de depleção de estrógeno, e espondilite anquilosante/espondilite reumatóide), doença linfoproliferativa auto-imune, doença de pele hiperproliferativa inflamatória, psoríases como psoríase de placa, psoríase gutata, psoríase postular e psoríase das unhas, atopias incluindo doenças atópicas como febre de feno e síndrome de Job, dermatites incluindo dermatite de contato, dermatite de contato crônica, dermatite esfoliante, dermatite alérgica, dermatite alérgica de contato, urticária, dermatite herpetiforme, dermatite numular, dermatite seborreica, dermatite não especifica, dermatite de contato irritante primária, e dermatite atópica, síndrome de hiper-IgM ligado a X, doença inflamatória intraocular alérgica, urticária como urticária alérgica crônica e urticária idiopática crônica, incluindo urticária auto-imune, miosite, polimiosite/dermatomiosite, dermatomiosite juvenil, necrólise epidermal tóxica, escleroderma (incluindo escleroderma sistêmico), esclerose como esclerose sistêmica, esclerose múltipla (MS) como MS ótica-espinhal, MS progressiva primária (PPMS) e MS remitente-recorrente (RRMS), esclerose sistêmica progressiva, arterioesclerose, esclerose disseminada, esclerose atáxica, neuromielite óptica (NMO), doença inflamatória de intestino (IBD) (por exemplo, doença de Crohn, doenças gastrointestinais auto-imunes mediadas, inflamação gastrointestinal, colite como colite ulcerativa, colite ulcerosa, colite microscópica, colite colagenosa, colite poliposa, enterocolite necrosante e colite transmural, e doença inflamatória de intestino auto-imune), inflamação do intestino, pioderma gangrenoso, eritema nodoso, colangite esclerosante primária, síndrome de angústia respiratória, incluindo síndrome de angústia respiratória adulta (ARDS), meningite, inflamação de todas as partes da úvea, irite, coroidite, e disfunção hematológica auto-imune, doença do enxerto contra hospedeiro, angioderma como angioderma hereditário, dano do nervo craniano como em meningite, herpes gestacional, penfigóide gestacional, prurido escroto, falência do ovário prematuro auto-imune, perda repentina da audição devido à condição auto- imune, doenças mediadas por IgE como anafilaxia e rinite alérgica e rinite atópica, encefalite como encefalite de Rasmussen e límbica e/ou encefalite da haste do cérebro, uveíte como uveíte anterior, uveíte anterior aguda, uveíte granulomatosa, uveíte não granulomatosa, uveíte facoantigênica, uveíte posterior ou uveíte auto-imune, glomerulonefrite (GN) com ou sem síndrome nefrótica como glomerulonefrite crônica ou aguda como GN primária, GN imune-mediada, GN membranosa (neupatia membranosa), GN membranosa idiopática ou neuropatia membranosa idiopática, GN proliferativa membranosa (MPGN), incluindo Tipo I e Tipo II, e GN de progressão rápida (RPGN), nefrite proliferativa, falência endócrina poliglandular auto-imune, balanite incluindo balanite circunscrita plasmaceluiar, balanopostite, eritema anular centrífugo, eritema discrômico perstans, eritema multiforme, granuloma anular, líquen niditus, líquen escleroso, líquen simplex crônico, líquen espinuloso, líquen planus, ictiose lamelar, hiperqueratose epidermolítica, queratose pré-maligna, pioderma gangrenoso, condições e respostas alérgicas, alergia a alimento, alergia a drogas, alergia a insetos, disfunções lérgicas raras como mastocitose, reação alérgicas, eczema incluindo eczema alérgico ou eczema atópico, eczema asteatótico, eczema disidrótico, e eczema palmoplantar vesicular, asma como asma bronquial, asma auto-imune, asma alérgica, asma pediátrica, condições envolvendo infiltração de células T e respostas inflamatórias crônicas, reações imune contra antígenos estranhos, tal como fetal dos grupos sangüíneos A-B-O durante a gravidez, doença inflamatória pulmonar crônica, miocardite auto-imune, deficiência de adesão de leucócito, lúpus incluindo lúpus nefrítico, lúpus cerebrite, lúpus pediátrico, lúpus não-renal, lúpus extra- renal, lúpus discóide e lúpus eritematoso discóide, lúpus de alopecia, SLE como SLE cutâneo ou SLE cutâneo subagudo, síndrome de lúpus neonatal (NLE)1 e lúpus eritematoso disseminado, diabetes melitus (Tipo I) de princípio juvenil, incluindo diabetes melitus dependente de insulina pediátrica (IDDM), diabetes melitus de princípio adulta (diabetes Tipo II), diabetes auto-imune, diabetes insipidus idiopática, retinopatia diabética, colite diabética, disfunção diabética de artéria grande, respostas imunes associadas com hipersensibilidade aguda e retardada mediada por citocina e linfócitos T, tuberculose, sarcoidose, granulomatose incluindo granulomatose linfomatóide, granulomatose de Wegener, agranulocitose, vasculite (incluindo vasculite de grandes vasos (incluindo polimialgia reumática e arterite de célula Gigante (de Takayasu)), vasculite de vaso médio (incluindo doença de Kawasaki e poliarterite nodosa), poliarterite microscópica, imunovasculite, vasculite do CNS, vasculite cutânea, vasculite de hipersensibilidade, vasculite necrosante, como vasculite necrosante sistêmica, e vasculite associada ao ANCA, como vasculite ou síndrome de Churg-Strauss (CSS) e vasculitede vasos pequenos associada ao ANCA, arterite temporal, anemia aplástica, anemia aplástica, anemia positiva Coombs, anemia Diamond Blackfan, anemia hemolítica ou anemia hemolítica imune incluindo anemia hemolítica auto-imune (AIHA), anemia perniciosa, doença de Addison, aplasia de célula vermelha pura (PRCA), deficiência de Fator VIII, hemofilia A, neutropenia auto-imune, citopenia como pancitopenia, leucopenia, doenças envolvendo diapedese de leucócito, disfunções inflamatórias do CNS, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, síndrome de lesão de órgão múltipla como aquelas resultantes a septicemia, trauma ou hemorragia, doenças mediadas por complexo antígeno- anticorpo, doença da membrana basal anti-glomerular, síndrome de anticorpo antifosfolipídico, motoneurite, neurite alérgica, doença de Bechet, síndrome de Castleman, Síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjorgen, síndrome de Stevens-Johnson, penfigóide como penfigóide vesicular e penfigóide de pele, pênfigo (incluindo pênfigo comum, pênfigo foliáceo, pênfigo penfigóide muco-membranoso e pênfigo eritematoso), poliendocrinopatias auto-imune, doença ou síndrome de Reiter, dano térmico devido a uma condição imune, pré-eclampsia, nefrite de complexo imune, nefrite mediada por anticorpo, disfunções neuroinflamatórias, polineuropatia, neuropatia crônica como polineuropatias por IgM ou neuropatia mediada por IgM, trombocitopenia (como desenvolvida por pacientes com infarto do miocardio, por exemplo), incluindo púrpura trombocitopênica trombótica (TTP)1 púrpura pós-transfusão (PTP), trombocitopenia induzida por heparina e trombocitopênica auto-imune ou imune mediada, incluindo, por exemplo púrpura idiopática (ITP) incluindo ITP crônica ou aguda, esclerite como esclerite cerato idiopática, episclerite, doença auto-imune dos testículos e ovário incluindo orquite auto-imune e ooforite, hipotiroidismo primário, hipoparatiroidismo, doenças endócrinas auto- imune incluindo tireoidite como tireoidite auto-imune, doença de Hashimoto, tireoidite crônica (tireoidite de Hashimoto), ou tireoidite sub-aguda, doença de tireóide auto-imune, hipotiroidismo idiopático, doença de Grave, síndrome poliglandular como síndrome poliglandular auto-imune, por exemplo, tipo I (ou síndrome endocrinopática poliglandular), síndrome paraneoplásica, incluindo síndrome paraneoplásicas neurológicas como síndrome miastênica Lambert- Eaton ou síndrome Eaton-Lambert, síndrome do homem rígido ou pessoa rígida, encefalomielite tal como encefalomielite alérgica e encefalomielite alérgica experimental (EAE), miastenia gravis tal como miastenia gravis associada a thymoma, degeneração cerebelar, neuromiotonia, síndrome de mioclono opsoclono ou opsoclono (OMS), neuropatia sensorial, neuropatia motor multifocal, síndrome de Sheehan, hepatite auto-imune, hepatite crônica, hepatite lupóide, hepatite ativa crônica, pneumonite intersticial linfóide (LIP), bronquiolite obliterante (sem-transplante) contra NSIP, Síndrome de Guillain- Barré, Doença de Berger (nefropatia por IgA), nefropatia por IgA idiopática, dermatose por IgA linear, dermatose nutrofílica febril aguda, dermatose pustular subcorneal, dermatose acantolítica transitória, cirrose como cirrose biliar primária, pneumocirrose, síndrome de enteropatia auto-imune, doença celíaca, psilose celíaca (enteropatia de glúten), psilose refratária, psilose idiopática, crioglobulinemia como crioglobulinemia mista, esclerose lateral amilotrófica (ALS; doença de Lou Gehrig), doença de artéria coronária, doença de orelha interna como doença de orelha interna auto-imune (AIED), perda de audição auto-imune, policondrite como policondrite refratária ou recidivada, proteinose alveolar pulmonar, síndrome de Cogan/queratite intersticial não- sifilítica, paralisia de Bell, doença/síndrome de Sweet, rosácea auto-imune, dor associada a zoster, amiloidose, Iinfocitose não cancerosa, uma Iinfocitose primária, que inclui Iinfocitose de célula B monoclonal (por exemplo, gamopatia monoclonal benigna e gamopatia monoclonal de significância indeterminada, MGUS), neuropatia periférica, síndrome paraneoplásica, canalopatias como epilepsia, migraina, arritmia, disfunções musculares, surdez, cegueira, paralisia periódica, e canalopatia do CNS, autismo, miopatia inflamatória, glomeruloesclerose segmentai focai (FSGS), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, disfunção hepatológica auto-imune, fibromialgia, falha endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, atrofia gástrica, demência pré-senil, doenças demielinizantes tal como doenças demielinizantes auto-imune e polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, neuropatia diabética, síndrome de Dressler, alopecia areata, síndrome CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismobilite esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), infertilidade auto-imune masculina e feminina, por exemplo, devido aos anticorpos anti-espermatozóide, doença do tecido conjuntivo misto, doença de Chagas, febre reumática, aborto recorrente, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós- cardiotomia, síndrome de Cushing, pulmão de criador de pássaro, angite granulomatosa alérgica, angite lifocítica benigna, síndrome de Alport, alveolite como alveolite alérgica e alveolite fibrosante, doença de pulmão intersticial, reação de transfusão, leprose, malária, doenças parasíticas como Ieishmaniose1 quipanossomiose, esquistossomose, ascaridíase, aspergilose, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocardite, fibrose endomiocardial, fibrose pulmonar intersticial difusa, fibrose pulmonar intersticial, fibrose mediastínica, fibrose pulmonar, fibrose pulmonar idiopática, fibrose cística, endoftalmite, eritema elevado e reduzido, eritoblastose fetal, faciite eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, flariase, ciclite tal como ciclite crônica, ciclite heterocrônica, iridociclite ou ciclite de Fuch, púrpura Henoch-Schonlein, infecção por vírus de imunodeficiência humana (HIV), SCID, síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), infecção por ecovírus, sepsia, síndrome da resposta inflamatória sistêmica (SIRS)), endotoxemia, pancreatite, tiroxocose, infecção por parvovírus, infecção por vírus de rubéola, síndrome pós-vacinação, infecção de rubéola congênita, infecção por vírus Epstein-Barr, caxumba, síndrome de Evan, falência gonadal auto-imune, coréia de Sydenham, nefrite pós-streptocóccica, tromboangite obliterante, tirotoxicose, tabes dorsalis, corioidite, polimialgia de célula gigante, oftamopatia endócrina, pneumonite de hipersensibilidade crônica, conjuntivite como catarro vernal, queratoconjuntivite seca, queratoconjuntivite epidêmica, síndrome nefrítica idiopática, neuropatia de troca mínima, lesão benigna hereditária e reperfusão e isquemia, reperfusão de transplante de órgão, auto imunidade da retina, inflamação nas articulações, bronquite, doença obstrutiva crônica das vias áreas, silicose, afta, estomatite aftosa, doenças arteroescleróticas, insuficiência vascular cerebral) como encefalopatia arterioesclerótica e retinopatia arterioesclerótica, aspermiogênese, hemólie auto-imune, doença de Boeck, crioglobulinemia, contratura de Dupuytren, endoftalmia facoanafilática, enterite alérgica, eritema nodoso leproso, paralisia facial idiopática, síndrome de fadiga crônica, febre reumática, doença de Hamman-Rich1 perda da audição sensorial, hemoglobinúria paroxismática, hipogonadismo, ileíte regional, leucopenia, mononucleose infecciosa, mielite transversa, mixedema idiopático primário, nefrose, aftalmia simpática, orquite granulomatosa, pancreatite, poliradiculite aguda, pioderma gangrenoso, tireoidite de Quervain, atrofia do baço adquirida, timoma não-maligno, timite linfofolicular, vitiligo, síndrome do choque tóxico, envenenamento por alimento, condições envolvendo infiltração de células T1 deficiência de adesão de leucócitos, respostas imune associadas com hipersensibilidade aguda ou retardada mediada por citocinas e linfócitos T, doenças envolvendo diapedese de leucócitos, síndrome da lesão múltipla de órgãos, doenças mediadas pelo complexo antígeno-anticorpo, doença da membrana de base antiglomerular, poliendocrinopatia auto-imune, ooforite, mixedema primário, gastrite atrófica auto-imunes, oftalmia simpatética, doenças reumáticas, doença do tecido conjuntivo misto, síndrome nefrótica, insulite, falência poliendócrina, síndrome poliglanduiar auto-imune, incluindo síndrome poliglandular auto-imune tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de princípio adulto (AOIH), alopecia total, cardiomiopatia cOmo cardiomiopatia dilatada, epidermólise bolhosa acquisita (EBA)1 hemocromatose, miocardite, síndrome nefrótica, colangite esclerosante primária ou sinusite purulenta e não purulenta, sinusite aguda e crônica, etmóide, frontal, maxilar, ou sinusite esfenóide, sinusite alérgica, e disfunção relacionada a eosinófilos como eosinofilia, infiltração pulmonar eosinofílica, síndrome de mialgia eosinofílica, síndrome de Loffler, pneumonia eosinofílica crônica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilose broncopneumônica, aspergiloma ou granuloma contendo eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritite, espondiloartritite soronegativo , doença auto-imune poliendócrina, colangite esclerosante, esclera, episclera, candidíase mucocutânea crônica, síndrome de Bruton, hipogamaglobulinemia transitória da infância, síndrome de Wiskott-Aldrich, telangiectasia ataxia , angiectasia, disfunções auto-imune associadas com colágeno, reumatismo como reumatismo crônico, linfadenite, redução na resposta de pressão sangüínea, disfunção vascular, lesão no tecido, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, e doença que acompanha vascularização, disfunção de hipersensibilidade aérea, glomerulonefrites, lesão de reperfusão, lesão de reperfusão isquêmica, lesão de reperfusão do i miocárdio ou outros tecidos, traqueobronquite linfomatosa, dermatose inflamatória, dermatose com componentes inflamatórios agudos, falha múltipla dos órgãos, doença vesicular, necrose cortical renal, meningite purulenta aguda, ou outras doenças inflamatórias do sistema nervoso central, disfunções inflamatórias, disfunções ocular e orbital, síndromes associadas a transfusão de granulócito, toxicidade induzida por citocina, narcolepsia, inflamação intratável aguda, inflamação antratável crônica, pielite, hiperplasia endarterial, úlcera péptica, valvulites e endometriose. Outros exemplos, que em alguns casos englobam essas listadas acima, incluem, mas não estão limitadas a disfunção reumatológica auto-imune (como, por exemplo, artrite reumatóide, síndrome de Sjõgren, escleroderma, lúpus como SLE e lúpus nefrítico, polimiosite/dermatomiosite, crioglobulinemia, síndrome de anticorpo anti- fosfolípide, e artrite psoriática), disfunções auto-imunes gastrointestinais e do fígado (como, por exemplo, doenças inflamatórias do intestino (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), gastrite auto-imune e anemia perniciosa, hepatite auto-imune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária e doença celíaca), vasculite (como, por exemplo, vasculite associada ao ANCA, incluindo vasculite de Churg-Strauss, granulomatose de Wegener e poliarterite), disfunções neurológicas auto-imunes (como, por exemplo, esclerose múltipla, síndrome de opsoclono-mioclono, miastenia grave, neuromielite óptica, doença de Parkinson, doença de Alzheimer e polineuropatias auto-imunes), disfunções renais (como, por exemplo, glomerulonefrite, síndrome de Goodpasture, e doença de Berger), disfunções dermatológicas auto-imunes (como, por exemplo, psoríase, urticária, pênfigo vulgar, pênfigo bolhoso, , bullous pemphigoid e lúpus eritematoso cutâneo), disfunções hematológicas (como, por exemplo, púrpura trombocitopênica, púrpura trombocitopênica trombótica, púrpura pós-transfusãoe anemia hemolítica auto-imune), arterioesclerose, uveíte, doenças auto-imunes da orelha (como, por exemplo, doença da orelha interna e perda da audição), doença de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órgão. GVHD e disfunções endócrinas auto-imunes (como, por exemplo, doenças auto-imunes relacionadas à diabetes como diabetes mellitus dependente de insulina (IDDM), doença de Addison e doença da tireóide auto-imune (por exemplo, doença de Grave e tireoidite)).

Em um aspecto, a presente invenção fornece composições que compreendem um ou mais anticorpos da presente invenção e um veículo. Em uma realização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a presente invenção fornece ácidos nucléicos que codificam um anticorpo anti-OX40L da presente invenção.

Em um aspecto, a presente invenção fornece vetores que compreendem um ácido nucléico da presente invenção.

Em um aspecto, a presente invenção fornece composições que compreendem um ou mais ácidos nucléicos da presente invenção e um veículo. Em uma realização, o veículo é farmaceuticamente aceitável.

Em um aspecto, a presente invenção fornece células hospedeiras que compreendem um ácido nucléico ou um vetor da presente invenção. Um vetor pode ser de qualquer tipo, por exemplo, um vetor recombinante como um vetor de expressão. Qualquer uma de uma variedade de células hospedeiras pode ser utilizada. Em uma realização, uma célula hospedeira é uma célula procarionte, por exemplo, E.coli. Em uma realização, uma célula hospedeira é uma célula eucarionte, por exemplo, uma célula de mamífero como célula Ovariana de Hamster Chinês (CHO).

Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos para fazer um anticorpo da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção fornece métodos para fabricar um anticorpo anti-0X4C)L. (o qual, como definido no presente pedido inclui o anticorpo completo e fragmentos deste), dito método que compreende expressar em uma célula hospedeira adequada, um vetor recombinante da presente invenção que codifica dito anticorpo e recuperação de dito anticorpo.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um artigo de fabricação que compreende um recipiente; e uma composição contida dentro do recipiente, sendo que a composição compreende um ou mais anticorpos anti-C)X40L da presente invenção. Em uma realização, a composição compreende um ácido nucléico da presente invenção. Em uma realização, uma composição que compreende um anticorpo, além disso, compreende um veículo, que em algumas realizações é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um artigo de fabricação da presente invenção, além disso, compreende instruções para administrar a composição (por exemplo, o anticorpo) para um sujeito (como instruções para qualquer um dos métodos descritos no presente pedido).

Em um aspecto, a presente invenção fornece um kit que compreende um primeiro recipiente que compreende uma composição que compreende um ou mais anticorpos anti-OX40L da presente invenção; e um segundo recipiente que compreende um tampão. Em uma realização, o tampão é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, uma composição que compreende um anticorpo, além disso, compreende um veículo, que em algumas realizações é farmaceuticamente aceitável. Em uma realização, um kit, além disso, compreende instruções para a composição (por exemplo, o anticorpo) para um sujeito.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um anticorpo anti-OX40L da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto- imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um ácido nucléico da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um vetor de expressão da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma célula hospedeira da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um artigo de fabricação na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

Em um aspecto, a presente invenção fornece o uso de um kit da presente invenção na preparação de um medicamento para o tratamento terapêutico e/ou profilático de uma disfunção, como uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVDH, e/ou lúpus eritematoso sistêmico.

A presente invenção fornece métodos e composições úteis para modular estados da doença associados com a expressão e/ou atividade do OX40L, como aumento da expressão e/ou atividade ou expressão e/ou atividade indesejadas.

Métodos da presente invenção podem ser usados para afetar qualquer estado patológico. Disfunções exemplares estão descritas no presente pedido e incluem disfunções imunes.

Os métodos da presente invenção podem, além disso, compreender etapas adicionais de tratamento. Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos que compreendem administração de uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-OX4ÜL em combinação com uma quantidade efetiva de outro agente terapêutico. Por exemplo, em uma realização, um método, além disso, compreende uma etapa em que uma célula e/ou tecido alvo é exposta ao tratamento com esteróide. O anticorpo anti- OX40L pode ser administrado em série ou em combinação com o agente terapêutico que é efetivo para aqueles propósitos, tanto na mesma composição como em composições separadas. A administração do anticorpo anti-OX40L e o outro agente terapêutico pode ser feita simultaneamente, por exemplo, como uma composição única ou como duas ou mais composições diferentes, usando-se as mesmas ou diferentes rotas de administração. Alternativamente, ou adicionalmente, a administração pode ser feita de modo seqüencial, em qualquer ordem. Alternativamente, ou adicionalmente, as etapas podem ser realizadas como uma combinação seqüencial ou simultânea, em qualquer ordem. Em certas realizações, os intervalos variando de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições. Por exemplo, o outro agente terapêutico pode ser administrado primeiro, seguido pelo anticorpo anti-OX40L. No entanto, a administração simultânea ou administração do anticorpo anti-OX40L primeiro é também contemplada. Em certas realizações, os intervalos variando de minutos a dias, de semanas a meses, podem estar presentes entre as administrações de duas ou mais composições.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para detecção do OX40L, os métodos que compreendem detectar o complexo OX40L-anticorpo anti-OX40L na amostra. O termo "detecção", como usado no presente pedido, inclui detecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis de medidas) com ou sem referência para um controle.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para diagnóstico de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade do OX40L, os métodos que compreendem detectar o complexo OX40L-anticorpo anti-OX40L na amostra de um paciente que tem ou suspeita-se que tenha a disfunção. Em algumas realizações, a expressão do OX40L é expressão aumentada ou anormal. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos anti-OX40L descritos no presente pedido, em que o anticorpo anti- OX4ÜL compreende um marcador detectável.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um complexo com qualquer um dos anticorpos anti-OX40L descritos no presente pedido e OX40L. Em algumas realizações, o complexo está in vivo ou in vitro. Em algumas realizações, o anticorpo anti-OX40L é detectável marcado.

Breve Descrição Das Figuras

FIGURAS 1A e 1B: descrevem as seqüências de aminoácidos das regiões variáveis 8E12 do anticorpo monoclonal OX40L anti-humano de camundongo. A, região variável 8E12 da cadeia leve (SEQ ID NO:13). B, região variável 8E12 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 15). Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat.

FIGURAS 2A e 2B: descrevem as seqüências de aminoácidos das regiões variáveis 13G5 do anticorpo monoclonal OX40L anti-humano de camundongo. A, região variável 13G5 da cadeia leve (SEQ ID N0:14). B, região variável 13g5 da cadeia pesada (SEQ ID NO: 16). Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat.

FIGURA 3: descreve graficamente que a administração de 8E12 e 13G5 dos anticorpos monoclonais anti-OX40L inibiram competitivamente a ligação do receptor 0X40 humano ao OX40L humano.

FIGURA 4: descreve graficamente que a administração de 8E12 e 13G5 dos anticorpos monoclonais anti-OX40L inibiram proliferação de célula T em um teste baseado em célula.

FIGURA 5: descreve graficamente que a administração de 8E12 e 13G5 dos anticorpos monoclonais anti-OX40L inibiram a produção de IL-2 pelas células T de memória. FIGURA 6: descreve graficamente que a administração de 8E12 e 13G5 dos anticorpos monoclonais anti-OX4ÜL inibiram de células T ativadas.

DESCRICAO DETALHADA DA INVENCAO

A presente invenção no presente pedido fornece anticorpos anti- OX40L, que são úteis, por exemplo, no tratamento ou prevenção de estados da doença associados com a expressão e/ou atividade do OX4ÜL, como aumento da expressão e/ou atividade ou expressão e/ou atividade indesejadas. Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são usados para tratar uma disfunção imune (como asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD e/ou lúpus eritematoso sistêmico).

Em outro aspecto, os anticorpos anti-C)X40L da presente invenção encontram utilidade como reagentes para detecção e/ou isolamento do OX40L, como detecção do OX40L em vários tecido e tipos celulares.

A presente invenção ainda fornece métodos para fabricação de anticorpos anti-OX40L, polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-OX40L e células que compreendem polinucleotídeos que codificam anticorpos anti-OX40L.

Técnicas Gerais As técnicas e procedimentos descritos ou com referência no presente pedido são geralmente bem conhecidos e comumente empregados usando-se metodologia convencional por aqueles técnicos no assunto, como, por exemplo, as metodologias de clonagem molecular amplamente utilizadas descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a. edição (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (2003)); a série METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hamese G. R. Taylor eds. (1995)), Harlowe Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, e ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987)). DEFINICOES

Um anticorpo "isolado" é aquele que foi identificado e separado e/ou recuperado a partir de um componente de seu ambiente natural. Componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que poderiam interferir no uso diagnóstico ou terapêutico do anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em realizações preferidas, o anticorpo será purificado (1) para mais que 95% em peso de anticorpo como determinado pelo método Lowry, e mais preferivelmente mais que 99% em peso, (2) até um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de N-terminal ou seqüência de aminoácido interna pelo uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até homogeneidade por FAGO-SDS sob condições de redução ou não redução usando-se Coomassie blue ou, preferivelmente, silverstain. Anticorpo isolado inclui o anticorpo in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente naturai do anticorpo não esteja presente. Normalmente, no entanto, o anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

Uma molécula de ácido nucléico "isolada" é uma molécula de ácido nucléico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucléico contaminante com que ela está geralmente associada na fonte natural de ácido nucléico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucléico isolada é diferente da forma ou configuração na qual é encontrada na natureza. Moléculas de ácido nucléico são então distintas das moléculas de ácido nucléico que existem nas células naturais. No entanto, uma molécula de ácido nucléico isolada inclui uma molécula de ácido nucléico contida nas células que normalmente expressam o anticorpo onde, por exemplo, a molécula de ácido nucléico está em um sítio do cromossomo diferente daquele das células naturais.

O termo "numeração do resíduo de domínio variável como em kabat" ou "numeração da posição do aminoácido como em Kabat", e variações destes, refere-se ao sistema de numeração usado para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve da coleção de anticorpos em kabat et. al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991). Usando-se este sistema de numeração, a seqüência de aminoácido linear atual pode conter menos ou mais aminoácidos que correspondem a um encurtamento ou inserção em uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir uma única inserção de aminoácido (resíduo 52a de acordo com Kabat) após resíduo 52 deH2 e resíduos inseridos (por exemplo, resíduos 82a, 82b e 82c, etc. de acordo com kabat) após resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de resíduos de Kabat pode ser determinada por um dado anticorpo pelo alinhamento das regiões de homologia da seqüência do anticorpo com uma seqüência numerada de Kabat "padrão".

"Afinidade de ligação" geralmente refere-se à soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado no presente, "afinidade de ligação" refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo esses descritos no presente pedido! Anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam lentamente aos antígenos e tendem a se dissociar facilmente, enquanto que anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam mais rapidamente aos antígenos e tendem a permanecer ligados por mais tempo. Vários métodos para medir afinidade de ligação são conhecidos na técnica e qualquer um destes pode ser usado para os propósitos da presente invenção. Realizações ilustrativas específicas estão descritas a seguir.

Em uma realização, o "Kd" ou "valor Kd" de acordo com a presente invenção é medido por um teste de ligação de antígeno radiomarcado (RIA) realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno como descrito pelo teste a seguir, que mede afinidade de ligação da solução de Fabs para o antígeno, pelo equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com I125 na presença de uma série de titulações de antígeno não marcado, capturando então o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (Chen, et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865-881). Para estabelecer as condições para o teste, placas de microtítulo (Dynex) são revestidas durante a noite com 5 ug/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em 50 mM de carbonato de sódio (pH 9,6), e subseqüentemente bloqueado com 2% (w/v) de albumina de soro bovino em PBS por duas a cinco horas em temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não absorvente (Nunc #269620), 100 pM ou 26 pM de antígeno maracdo como 125I são misturados com uma série de diluições de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação de um anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et ai, (1997) Câncer Res. 57:4593-4599). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar por um período maior (por exemplo, 65 horas) para garantir que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com 0,1% de Tween- 20 em PBS. Quando as placas estiverem secas, 150 ul/poço de cintilante (MicroScint-20; Packard) é adicionado, e as placas são contadas em um contador Topcount gamma (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab menor ou igual a 20% de ligação máxima são escolhidas para uso em testes de ligação competitiva. De acordo com outra realização Kd ou valor Kd é medido pelo uso de testes de ressonância de plasmon de superfície usando-se um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BlAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado a -10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biosensor de dextrana carboximetilada (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com hidrocloreto de A/-etil-/V- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 ug/ml (~ 0,2 uM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, 1M de etanolamina foi injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medidas cinéticas, duas diluições consecutivas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 ul/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadas usando-se um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Avaliação BIAcore versão 3.2) por ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (kd) é calculada como a razão Wkon- Ver, por exemplo, Chen, Y., et al, (1999) J. Mol Biol 293:865-881. Se a on-rate exceder 106 M1 S1 pelo teste de ressonância de plásmons de superfície acima, então a on-rate pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão fluorescente (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm band-pass) a 25°C de 20nM de um anticorpo anti-antígeno (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medido em um espectrômetro, como um espectrômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho vermelho de mistura.

Uma "on-rate" ou "taxa de associação" ou "Kon" de acordo com a presente invenção pode também ser determinada com a mesma de ressonância de plásmons de superfície descrita acima usando-se um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore1 Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado a ~10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biosensor de dextrana carboximetilada (CM5, BIAcore Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-et\\-N'- (3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e A/-hidroxisuccinimida (NHS) de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com 10mM de acetato de sódio, pH 4,8, em 5 ug/ml (~ 0,2 uM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 ul/minuto para atingir aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Seguindo a injeção de antígeno, 1M de etanolamina foi injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medidas cinéticas, duas diluições consecutivas de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com 0,05% de Tween 20 (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 ul/min. Taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (k0ff) são calculadas usando-se um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Avaliação BIAcore versão 3.2) por ajuste simultâneo do sensorgrama de associação e dissociação. A constante de equilíbrio de dissociação (kd) foi calculada como a razão Wkon- Ver, por exemplo, Chen, Y., et ai, (1999) J. Mol Biol 293:865- 881. No entanto, se a on-rate exceder 106 M"1 S"1 pelo teste de ressonância de plásmons de superfície acima, então a on-rate é preferivelmente determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão fluorescente (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm band-pass) a 25°C de 20nM de um anticorpo anti- antígeno (forma Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno como medido em um espectrômetro, tal como um espectrômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-Aminco série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho vermelho de mistura.

O termo "vetor", como utilizado no presente, tem a intenção de se referir a uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor fago. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem de replicação bacteriana e vetores episomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não-episomais de mamíferos) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira pela introdução em uma célula hospedeira, e através disso serem replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes para o qual eles são ligados operativamente. Tais vetores são referidos no presente como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente, "vetores recombinantes"). Em geral, vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão freqüentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados alternadamente enquanto que o plasmídeo é a forma de vetor mais comumente utilizada.

"Polinucleotídeo" ou "ácido nucléico", como usado alternadamente no presente, referem-se a polímeros de nucleotídeos de qualquer comprimento, e incluem DNA e RNA. Os nucleotídeos podem ser desoxirribonucleotídeos, ribonucleotídeos, nucleotídeos modificados ou bases, e/ou seus análogos, ou qualquer substrato que possa ser incorporado em um polímero por DNA ou RNA polimerase, ou por uma reação sintética. Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e seus análogos. Se presente, modificações na estrutura do nucleotídeo podem ser transmitidas antes ou depois da montagem do polímero. A seqüência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado depois da síntese, como pela conjugação com um marcador. Outros tipos de modificações incluem, por exemplo, "caps", substituições de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeos como, por exemplo, aquelas com ligações não carregadas (como, fosfonato de metila, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e com ligações carregadas (como, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aqueles contendo unidades pendentes, como, por exemplo, proteínas (como, nucleases, toxinas, anticorpos, peptídeos sinais, ply-L-lisina, etc.), aqueles com intercaladores (como, acridina, psoraien, etc.), aqueles contendo quelatos (como, metais, metais radioativos, boro, metais oxidantes, etc.), aqueles contendo alquiladores, aqueles com ligações modificadas (como, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc.), assim como formas não modificadas de polinucleotídeo(s). Além disto, qualquer um dos grupos hidroxila geralmente presentes nos açúcares podem ser substituídos, por exemplo, por grupos fosfonato, grupos fosfato, protegidos por grupos de proteção padrão, ou ativados para preparar ligações adicionais para nucleotídeos adicionais, ou podem ser conjugados a suportes sólidos ou semi-sólidos. As terminações OH 5' e 3' podem ser fosforiladas ou substituídas por grupo amina ou componentes do grupo de revestimento orgânico com 1 a 20 átomos de carbono. Outras hidroxilas podem também ser derivadas para grupos de proteção padrão. Polinucleotídeos podem também conter formas análogas de ribose ou açúcares desoxirribose que são geralmente conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-flúor- ou 2'-azido-ribose; açúcares carbocíclicos análogos, açúcares alfa-anoméricos, açúcares epiméricos, como arabinose, xiloses ou lixoses, açúcares piranose, açúcares furanose, sedoheptuloses, análogos dos acíclicos e análogos dos nucleosídeos não básicos, como metil ribosídeo. Uma ou mais ligações fosfodiéster podem ser substituídas por grupos de ligações alternativas. Estes grupos de ligações alternativas incluem, mas não são limitados a, realizações em que o fosfato é substituído por P(O)SCtioato"), P(S)S ("ditioato"), "(O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetol"), no qual cada R ou R' é independente de H ou substituído ou não substituído por alquil (1-20 C) opcionalmente contendo uma ligação éter (-O-) ligado, aril, alquenil, cicloalquil, cicloalquenil ou araldil. Nem todas as ligações em um polinucleotídeo precisam ser idênticas. A descrição anterior aplica-se para todos os polinucleotídeos referidos no presente, incluindo RNA e DNA.

"Oligonucleotídeo", como utilizado no presente, geralmente refere- se à fita curta simples, geralmente polinucleotídeos sintéticos que são geralmente, mas não necessariamente, menor que aproximadamente 200 nucleotídeos em comprimento. Os termos "oligonucleotídeo" e "polinucleotídeo" não são mutuamente exclusivos. A descrição acima para polinucleotídeos é igualmente e completamente aplicável para oligonucleotídeos.

O termo "ligante OX40" (alternadamente chamado de OX40L"), como usado no presente pedido, refere-se, a menos que especificamente ou contextualmente indicado de outra forma, a qualquer polipeptídeo OX40L nativo ou variante (nativo ou sintético). O termo "seqüência nativa" especificamente inclui formas removidas ou secretadas de ocorrência natural (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas ligadas alternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural. O termo OX40L tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de uma proteína OX40L de ocorrência natural. O termo "seqüência OX40L tipo selvagem" geralmente refere-se a uma seqüência de aminoácido encontrada em um OX40L de ocorrência natural.

O termo "receptor 0X40" (alternadamente chamado de "0X40"), como usado no presente pedido, refere-se, a menos que especificamente ou contextualmente indicado de outra forma, a qualquer polipeptídeo 0X40 nativo ou variante (nativo ou sintético). O termo "seqüência nativa" especificamente inclui formas removidas ou secretadas de ocorrência natural (por exemplo, uma seqüência de domínio extracelular), formas variantes de ocorrência natural (por exemplo, formas ligadas alternativamente) e variantes alélicas de ocorrência natural. O termo "0X40 tipo selvagem" geralmente refere-se a um polipeptídeo que compreende a seqüência de aminoácido de uma proteína 0X40 de ocorrência natural. O termo "seqüência 0X40 tipo selvagem" geralmente refere-se a uma seqüência de aminoácido encontrada em um 0X40 de ocorrência natural.

Os termos "anticorpo" e "imunoglobulina" são usados alternadamente no mais amplo sentido e incluem anticorpos monoclonais (por exemplo, anticorpos monoclonais completos ou intactos), anticorpos policlonais, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos desde que eles exibam a atividade biológica desejada) e podem também incluir certos fragmentos de anticorpos (como descrito em maior detalhe no presente pedido). Um anticorpo pode ser humano, humanizado e/ou de afinidade madura.

O termo "variável" refere-se ao fato de que certas porções do domínio variável diferenciam-se extensivamente na seqüência entre anticorpos e são usadas na ligação e especificidade de cada anticorpo específico para seu antígeno específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída uniformemente por todos os domínios variáveis dos anticorpos. Ela está concentrada em três segmentos chamados regiões determinadas por complementaridade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, ambas nos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. As porções mais altamente conservadas de domínios variáveis são chamadas de regiões de estrutura (FR). Os domínios variáveis das cadeias leves e pesadas nativas compreendem cada um, quatro regiões FR adotando amplamente uma configuração folha dobrada β, conectada por três CDRs, na qual formam alças que se conectam, e em alguns casos formam parte da estrutura folha dobrada β. As CDRs em cada cadeia são mantidas bem juntas pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do sítio de ligação do antígeno dos anticorpos, (ver, Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest1 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras, como participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete sua habilidade para cristalizar de imediato. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que possui dois sítios de combinação de antígeno e é ainda capaz de reticulação com o antígeno.

"Fv" é um fragmento mínimo de anticorpo que contém um reconhecimento de antígeno completo e sítio de ligação. Nos tipos de Fv de cadeias duplas, esta região consiste de um dímero de uma cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve em estreita associação não covalente. Nos tipos de Fv de cadeia simples, um domínio variável de cadeia leve e um de cadeia pesada podem ser ligados covalentemente por um Iigante peptídico flexível, como aquele em que as cadeias leve e pesada podem se associar em uma estrutura análoga "dimérica" àquela de tipo de Fv de cadeia dupla. É nesta configuração que as três CDRs de cada domínio variável interage para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. No entanto, até um único domínio variável (ou metade de um Fv que compreende somente três CDRs específicas para um antígeno) possui a habilidade de reconhecer e se ligar a um antígeno, embora com afinidade mais baixa do que o sítio de ligação completo.

O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Fragmentos Fab' diferem de fragmentos Fab pela adição de poucos resíduos na terminação carboxila de um domínio CH1 de cadeia pesada, incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. Fab-SH é a designação no presente pedido para Fab' na qual o(s) resíduo(s) cisteína dos domínios constantes produzem pelo menos um grupo tiol livre. Fragmentos do anticorpo F(ab')2 originalmente foram produzidos como pares de fragmentos Fab' que possuem dobradiça de cisteínas entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos são também conhecidos.

As "cadeias leves" de anticorpos (imunoglobulinas) de qualquer espécie de vertebrado podem ser designadas para um ou dois tipos claramente distintos, chamados kappa (κ) e Iambda (λ), baseados na seqüência de aminoácidos de seus domínios constantes.

Dependendo da seqüência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser designadas para diferentes "classes". Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, e várias destas podem também ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGi, lgG2, lgG3, IgG4, IgA, e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, γ, e μ, respectivamente. As subunidades de estruturas e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

"Fragmentos de anticorpos" compreendem somente uma porção

de um anticorpo intacto, em que a porção mantém preferivelmente pelo menos uma, preferivelmente a maioria ou todas as funções normalmente associadas com a porção quando presente em um anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e fragmentos Fv; diacorpos, anticorpos lineares; moléculas de anticorpo de cadeia única e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpos. Em uma realização, um fragmento de anticorpo compreende um sítio ligação de antígeno do anticorpo intacto e dessa forma mantém a capacidade de se ligar ao antígeno. Em outra realização, um fragmento de anticorpo, por exemplo, aquele que compreende a região Fc, mantém pelo menos uma das funções biológicas normalmente associadas com a região Fc quando presente em um anticorpo intacto, tal como ligação FcRn, modulação de meia vida do anticorpo, função ADCC e ligação complementar. Em uma realização, um fragmento de anticorpo é um anticorpo monovalente que tem uma meia vida in vivo substancialmente similar a um anticorpo intacto. Por exemplo, tal como um fragmento de anticorpo pode compreender um braço de ligação de antígeno ligado a uma seqüência Fc capaz de conferir in vivo estabilidade para o fragmento.

Os termos "região hipervariável", "HVR" ou "HV", quando usados no presente pedido referem-se às regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na seqüência e/ou formas estruturalmente definidas como alças. Geralmente, anticorpos compreendem seis regiões hipervariáveis, três na VH (H1, H2, H3), e três na VL (L1, L2, L3). Uma série de delineamentos de regiões hipervariáveis está em uso e são englobadas no presente. As Regiões Determinadas por Complementaridade de Kabat (CDRs) são baseadas na variabilidade da seqüência e são mais comumente utilizadas (Kabat et ai., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Chothia, ao contrário, refere-se à localização das alças estruturais (Chothia e Lesk J. Mol. Bioi 196:901-917 (1987)). As regiões hipervariáveis AbM representam um acordo entre as CDRs de Kabat e alças estruturais de Chothia, e são usadas pelo programa de modelação de anticorpo AbM da Oxford Molecular. As regiões hipervariáveis de "contato" são baseadas em uma análise das estruturas cristalinas complexas disponíveis.

Regiões hipervariáveis podem compreender "regiões hipervariáveis extendidas" como a seguir: 24-36 (L1), 46-56 (L2) e 89-97 (L3) na VL e 26-35 (H1), 47-66 ou 49-66 ou 50 até 66 (H2) e 93-101 ou 93-102 (H3) na VH. Os resíduos do domínio variável são numerados de acordo com Kabat et ai., acima, para cada uma destas definições.

"Região de estrutura" ou resíduos "FR" são aqueles resíduos de domínio variável, exceto os resíduos de região hipervariável como definido no presente pedido.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murino) são anticorpos quiméricos que contêm seqüência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não humano tendo especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns exemplos, resíduos da região de estrutura (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos correspondentes não humanos. Além disto, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para, além disto, refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são aquelas de uma seqüência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente irá também compreender pelo menos uma porção de uma região constante (Fc) da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para detalhes adicionais, ver Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al, Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver também os seguintes artigos de revisão e referências citadas nestes: Vaswani e Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle e Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994).

Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) possuem uma porção da cadeia pesada e/ou leve idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica ou pertencente a uma classe ou subclasse específica de anticorpo, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntica ou homóloga às seqüências correspondentes nos anticorpos derivados de outra espécie ou pertencentes à outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et al, Proc. Nati Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpo humanizado, como usado no presente pedido, é um subconjunto de anticorpos quiméricos.

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo, em que estes domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. Geralmente, o polipeptídeo scFv também compreende um polipeptídeo ligante entre os domínios VH e VL que permite ao scFv formar a estrutura desejada para a ligação do antígeno. Para uma revisão de scFv ver Pluckthun, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, páginas 269-315 (1994).

Um "antígeno" é um antígeno pré-determinado ao qual um anticorpo pode se ligar seletivamente. O antígeno alvo pode ser um polipeptídeo, carboidrato, ácido nucléico, lipídeo, hapteno ou outros compostos de ocorrência natural ou sintéticos. Preferivelmente, o antígeno alvo é um polipeptídeo.

O termo "diacorpos" refere-se a fragmentos de anticorpos pequenos com dois sítios de ligação de antígeno, cujos fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) na mesma cadeia de polipeptídeo (VH - VL). Pelo uso de um ligante que é muito curto para permitir pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois sítios de ligação de antígeno. Diacorpos estão descritos mais completamente em, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 93/11161; e Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma seqüência de aminoácido que corresponde àquela de um anticorpo produzido por um humano e/ou foi produzido usando-se qualquer uma das técnicas para se fazer anticorpos humanos como divulgado no presente pedido. Esta definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

Um anticorpo de "afinidade madura" é aquele com uma ou mais alterações em uma ou mais CDRs deste, o que resulta em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno, comparado com um anticorpo parental que não possui aquela(s) alteração(ões). Anticorpos de afinidade madura preferidos terão afinidades nanomolar ou até afinidades picomolar para o antígeno alvo. Anticorpos de afinidade madura são produzidos por processos conhecidos na técnica. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) descreve maturação de afinidade por mistura de domínio VH e VL. Mutagênese randômica de CDR e/ou resíduos de estrutura é descrita por: Barbas et ai Proc Nat. Acad. Sei, USA 91:3809-3813 (1994); Schier et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al. J. Immunoi 155:1994-2004 (1995); Jackson et ai, J. Immunoi 154(7):3310-9 (1995); e Hawkins et al, J. Mol. Biol. 226:889- 896 (1992).

"Funções efetoras" do anticorpo referem-se àquelas atividades biológicas atribuíveis à região Fc (uma região Fc de seqüência nativa ou uma região Fc de seqüência de aminoácido variante) de um anticorpo, e variam com o isótipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpo incluem: ligação C1q e citotoxicidade dependente de complemento; ligação do receptor Fc; citoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose, infra- regulação, controle de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de célula B); e ativação de célula B.

"Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo" ou "ADCC" refere-se a uma forma de citotoxicidade na qual Ig secretada ligada aos receptores Fc (FcRs) presentes em certas células citotóxicas (por exemplo, células Natural Killer (NK), neutrófilos e macrófagos) permitem que estas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a uma célula alvo que produz antígeno e subseqüentemente destroem a célula alvo com citotoxinas. Os anticorpos "armam" as células citotóxicas e são absolutamente necessários para tal destruição. As células primárias para mediação de ADCC1 células NK1 expressam somente FcyRIII1 enquanto que monócitos expressam FcyRI1 FcyRII e FcyRIII- A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet1 Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse, pode ser realizado um teste ADCC in vitro, como descrito nas patentes US 5.500.362 ou 5.821.337 ou Presta, patente US 6.737.056. Células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como divulgado em Clynes et ai PNAS (USA) 95:652-656 (1998).

"Células efetoras humanas" são leucócitos que expressam um ou mais FcRs e desempenham funções efetoras. Preferencialmente, as células expressam pelo menos FcyRIII e desempenham função efetora ADCC. Exemplos de leucócitos humanos que mediam ADCC incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC), células natural killer (NK)1 monócitos, células T citotóxicas e neutrófilos; com PBMCs e células NK sendo preferidas. As células efetoras podem ser isoladas de uma fonte nativa, por exemplo, do sangue.

"Receptor Fc" ou "FcR" descreve um receptor que se liga à região Fc de um anticorpo. O FcR preferido é um FcR humano de seqüência nativa. Além disso, um FcR preferido é aquele que se liga a um anticorpo IgG (um receptor gama) e inclui subclasses dos receptores FcyRI, FcyRII, e FcyRIII, incluindo variantes alélicas e alternativamente formas ligadas destes receptores. Receptores FcyRII incluem FcyRIIA (um "receptor de ativação") e FcyRIIB (um "receptor de inibição"), que têm seqüências similares de aminoácidos que diferem primeiramente nos domínios citoplasmáticos destes. Receptor de ativação FcyRIIA contém um motivo de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM) em seu domínio citoplasmático. Receptor de inibição FcyRIIB contém um motivo de inibição de imuno-receptor baseado em tirosina (ITIM) em seu domínio citoplasmático. (ver revisão M. em Daèron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs foram revisados em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capei et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); e de Haas et ai, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Outros FcRs1 incluindo aqueles a serem identificados no futuro, são englobados pelo termo "FcR" no presente. O termo também inclui o receptor neonatal, FcRn1 que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) e regula homeostase de imunoglobulinas. O documento WO 00/42072 (Presta) descreve anticorpos variantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo desta publicação de patente está especificamente incorporado ao presente pela referência. Ver, também, Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

Métodos para medir ligação a FcRn são conhecidos (ver, por exemplo, Ghetie 1997, Hinton 2004). Ligação a FcRn humano in vivo e meia- vida do soro de polipeptídeos de ligação de alta afinidade a FcRn podem ser testados, por exemplo, em camundongos transgênicos ou linhagens de células humanas transfectadas que expressam FcRn humano, ou em primatas administrados com polipeptídeos Fc variantes.

"Citotoxicidade dependente de complemento" ou "CDC" refere-se à Iise de uma célula alvo na presença de complemento. Ativação da via de complemento tradicional é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema de complemento (C1q) aos anticorpos (da subclasse apropriada) que são ligados aos seus antígenos cognatos. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC pode ser realizado, por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro etal., J. Immunol. Methods 202:163 (1996).

Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácido da região Fc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída estão descritos na patente US 6.194.551B1 e documento WO 99/511642. O conteúdo desta publicação de patente está especificamente incorporado ao presente como referência. Ver também, Idusogie et ai J. Immunol. 164: 4178- 4184 (2000).

Um anticorpo "de bloqueio" ou um anticorpo "antagonista" é aquele que inibe ou reduz as atividades biológicas do antígeno ao qual se liga. Anticorpos de bloqueio ou anticorpos antagonistas preferidos inibem substancialmente ou completamente a atividade biológica do antígeno.

Uma "disfunção" ou "doença" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com uma substância/molécula ou método da presente invenção. Isto inclui disfunções ou doenças crônicas e agudas incluindo aquelas condições patológicas que predispõe o mamífero para a disfunção em questão. Exemplos não Iimitantes de disfunções a serem tratadas no presente pedido incluem asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla e lúpus eritematoso sistêmico.

Uma "doença auto-imune" no presente pedido é uma doença ou disfunção que surge e está dirigida contra os próprios tecidos ou órgãos do indivíduo ou uma co-segregada ou manifestação desta ou resultante de condições a partir destas. Em muitas destas disfunções auto-imunes e inflamatórias, podem existir inúmeros marcadores clínicos e de laboratório, incluindo, mas não limitados a, hipergamaglobulinemia, altos níveis de auto- anticorpos, depósitos de complexos antígeno-anticorpo nos tecidos, tratamentos benéficos com corticosteróides ou imunossupressores e agregados celulares linfóides nos tecidos afetados.

Como usado no presente, "tratamento" refere-se à intervenção clínica em uma tentativa para alterar o curso natural do indivíduo ou célula sendo tratada, e pode ser apresentado também por profilaxia ou durante o curso da patologia clínica.

Efeitos desejáveis de tratamento incluem prevenção de ocorrência ou recidiva da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer conseqüências patológicas diretas ou indiretas da doença, redução da taxa de progressão da doença, melhora ou estados de alívio da doença, e remissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, anticorpos da presente invenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou disfunção.

Um "indivíduo" é um vertebrado, preferivelmente um mamífero, mais preferivelmente um humano. Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais de criação (como vacas), animais para esporte, animais domésticos (como gatos, cachorros e cavalos), primatas, camundongos e ratos.

"Mamífero" para os propósitos do tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, de zoológico, para esportes, ou animais de estimação, como cachorros, cavalos, gatos, vacas, etc. Preferivelmente, o mamífero é um humano.

Uma "quantidade efetiva" refere-se a uma quantidade efetiva, nas dosagens e pelo período de tempo necessário para atingir o resultado terapêutico ou profilático desejado.

Uma "quantidade terapeuticamente efetiva" de uma substância/molécula da presente invenção, agonista ou antagonista pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a capacidade da substância/molécula, agonista ou antagonista obter uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial da substância/molécula, agonista ou antagonista é excedido pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente efetiva" refere- se a uma quantidade efetiva, na dosagem e pelo período de tempo necessário para atingir o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, desde que uma dose profilática seja usada em sujeitos, anterior à doença ou em um estágio inicial, a quantidade profilaticamente efetiva será menor que a quantidade terapeuticamente efetiva.

O termo "agente citotóxico" como usado no presente refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou causa destruição de células. O termo tem a intenção de incluir isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterápícos, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcalóides vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), Doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorubicina ou outros agentes intercalantes, enzimas e fragmentos destes, como enzimas nucleolíticas, antibióticos e toxinas, tais como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes destes, e os vários agentes antitumorais ou anti-câncer divulgados abaixo. Outros agentes citotóxicos estão descritos abaixo. Um agente tumoricida causa destruição de células tumorais.

Um "agente quimioterápico" é um componente químico útil no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápícos incluem agentes alquiladores tais como tiotepa e ciclosfosfamida CYTOXAN®; alquil sulfonados tais como busulfan, improsulfan e piposulfan; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida e trimetilolomelamina; acetogeninas (especialmente bulatacin e bulatacinona); delta-9-tetraidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®); beta-lapacona; lapacol; colchicinas; ácido betulínico; uma camptotecina (incluindo a sintética análoga topotecan (H YC AMTIN®), CPT-11 (irinotecan, CAMPTOSAR®), acetilcamptotecina, scopolectina, e 9-aminocamptotecina); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo adozelesina, carzelesina e bizelesina sintética análogas); podofilotoxina; ácido podofilínico; teniposida; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo as sintéticas análogas, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; uma sarcodictina; espongistatina; mostardas de nitrogênio tais como clorambucila, clornafazina, clolofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloreto óxido de mecloretamina, melfalan, novembiquin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureas tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos tais como os antibióticos enedina (por exemplo, caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicina omega 11 (ver, por exemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluindo dinemicina A; uma esperamicina; assim como cromóforos de neocarzinostatina e cromóforos de antiobióticos enedina cromoproteínas relacionadas), aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L- norleucina, Doxorrubicina ADRIAMYCIN® (incluindo morfolino-Doxorrubicina, cianomorfolino-Doxorrubicina, 2-pirrolino-Doxorrubicina e deoxiDoxorrubicina), epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti- adrenais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; ácido fólico restabelecedor como ácido frolínico; aceglatona; glicosídeo de aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; ansacrina; bestrabucila; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; uma epotilona; etoglucídeo; nitrato de gálio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; 2-etil hidrazida; procarbazina; complexos polissacarídeos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR); razoxana; rizoxina; sizofirana; spirogermanio; ácido tenuazonico; triaziquona; 2,2',2"-tricloro trietil amina; tricotecenos (especialmente toxina T2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®); dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromana; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel TAXOL® (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ livre de Cremofor, formulação de paclitaxel de nanopartículas de albumina modificada (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) e doxetaxel TAXOTERE® (Rhône-Poulenc Rorer, Antony1 France); cloranbucila; gencitabina (GEMZAR®); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos da platina como cisplatina e carboplatina; vinblastina (VELBAN®); platina; etoposide (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina (ONCOVIN®); oxaliplatina; leucovovina; vinorelbina (NAVELBINE®); novantrona; edatrexato; daunomicina; aminopterina; ibandronato; inibidor topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinóides como ácido retinóico; capecitabina (XELODA®); sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer dos acima; assim como combinações de dois ou mais dos acima tais como CHOP1 uma abreviação para uma terapia combinada de ciclofosfamida, Doxorrubicina, vincristina e prednisolona, e FOLFOX, uma abreviação para um regime de tratamento com oxaliplatina (ELOXATIN™) combinado com 5-FU e leucovorina.

Também incluídos nesta definição estão os agentes anti- hormonais que agem para regular, reduzir, bloquear, ou inibir os efeitos de hormônios que podem promover o crescimento de câncer, e estão freqüentemente na forma de tratamento sistêmico ou do corpo inteiro. Eles podem ser os próprios hormônios. Exemplos incluem anti-estrógenos e moduladores seletivos do receptor de estrógeno (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo tamoxifen NOLVADEX®), raloxifeno EVISTA®, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona e toremifene FARESTON®; anti-progesteronas; infra-reguladores de receptores de estrógeno (ERDs); agentes de função de supressão ou bloqueio dos ovários, por exemplo, agonistas de hormônios que liberam hormônio luteinizante (LHRH) como acetato de Ieuprolida LUPRON® e ELIGARD®, acetato de goserelina, acetato de buserelina e tripterelina; outros anti- androgênicos como flutamida, nilutamida e bicalutamida; e inibidores aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrógeno nas glândulas adrenais como, por exemplo, 4(5)-imidazolas, aminoglutetimida, acetato de megestrol MEGASE®, exemestano (AROMAS IN®), formestano, fadrozola, vorozola RIVISOR®, Ietrozola FEMARA®, e anastrozola ARIMIDEX®. Além disso, tal definição de agentes quimioterápicos inclui bisfosfonatos tais como clodronato (por exemplo, BONEFOS® ou O STAC®), etidronato DIDROCAL®, NE-58095, ácido zoledrônico/zoledronato ZOMETA®, alendronato FOSAMAX®, pamidronato AREDIA®, tiludronato SKELID®, ou risedronato ACTONEL®; assim como troxacitabina (uma 1,3-dioxolana nucleosídeo citosina análoga); oligonucleotídeos anti-sentido, em específico aqueles que inibem expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular anormal, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Raf, H-Ras1 e receptor do fator de crescimento epidermal (EGF-R); vacinas tais como vacina THERATOPE®e vacinas de terapia de gene, por exemplo, vacina ALLOVECTIN®, vacina LEUVECTIN®, e vacina VAXID®; inibidor topoisomerase 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; lapatinib ditosilato (um duplo inibidor de molécula pequena de tirosina quinase EGFR e ErbB2 também conhecido como GW572016); e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

Um "agente inibitório de crescimento" quando usado no presente refere-se a um componente ou composição que inibe o crescimento de uma célula, (como uma célula que expressa OX40L) tanto in vitro como in vivo. Dessa forma, o agente inibitório de crescimento pode ser aquele que reduz significativamente a porcentagem de células (como células que expressam OX40L) na fase S. Exemplos de agentes inibitórios de crescimento incluem agentes que bloqueiam a progressão do ciclo celular (em um local, exceto na fase S), como agentes que induzem a interrupção de G1 e interrupção da fase M. Bloqueadores clássicos da fase M incluem as vincas (vincristina e vinblastina), taxanos e inibidores topoisomerase Il tais como Doxorrubicina, epirubicina, daunorubicina, etoposido e bleomicina. Aqueles agentes que capturam G1 também se espalham na captura da fase S, por exemplo, agentes alcalinizantes de DNA tais como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexato, 5-fluor uracila, e ara-C. Informações adicionais podem ser encontradas em The Molecular Basis of Câncer, Mendelsohn e Israel, eds., Capítulo 1, intitulado "Cell cycle regulation, oncogenes, e antineoplastic drugs" por Murakami et ai. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), especialmente pág. 13. Os taxanos (paclitaxel e docetaxel) são drogas anti-câncer, ambas derivadas do teixo. Docetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer), derivado do teixo europeu, é um análogo semi-sintético do paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). Paclitaxel e docetaxel promovem a montagem de microtúbulos de dímeros de tubulina e estabilizam microtúbulos pela prevenção da despolimerização, que resulta na inibição de mitose nas células.

"Doxorrubicina" é um antibiótico antraciclina. A nomenclatura química completa de Doxorrubicina é (8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxi-a-L- lixo-hexapiranosil)oxi]-7,8,9,10-tetrahidro-6,8,11 -trihidroxi-8-(hidroxiacetil)-1 - metoxi-5,12-naftacenediona.

O termo "polipeptídeo que contém região Fc" refere-se a um polipeptídeo, como um anticorpo ou imunoadesina (ver definições abaixo), que compreende uma região Fe. A Iisina C-terminal (resíduo 447 de acordo com o sistema de numeração EU) da região Fc pode ser removida, por exemplo, durante a purificação do polipeptídeo ou pela modificação recombinante do ácido nucléico engenheirado que codifica o polipeptídeo. Consequentemente, a composição que compreende um polipeptídeo que tem uma região Fc de acordo com a presente invenção pode compreender os polipeptídeos com K447, com todo K447 removido ou uma mistura dos polipeptídeos com ou sem o resíduo K447.

Composições Da Invenção E Métodos Para Fabricar A Mesma

A presente invenção abrange composições, incluindo composições farmacêuticas, que compreendem um anticorpo anti-OX40L; e polinucleotídeos que compreendem seqüências que codificam um anticorpo anti-OX40L. Como usado no presente pedido, composições compreendem um ou mais anticorpos que se ligam ao OX40L, e/ou um ou mais polinucleotídeos que compreendem seqüências que codificam um ou mais anticorpos que se ligam ao QX40L. Estas composições podem também compreender veículos adequados, como excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluindo tampões, que são bem conhecidos na técnica.

A presente invenção também inclui realizações de anticorpo isolado e polinucleotídeo. A presente invenção também inclui realizações de anticorpo isolado e polinucleotídeo.

Os anticorpos anti-OX40L da presente invenção são preferivelmente monoclonais. Também incluídos dentro do escopo da presente invenção estão os fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH e F(ab')2, dos anticorpos anti-0X4C)L fornecidos no presente pedido. Estes fragmentos de anticorpos podem ser criados por meios tradicionais, tais como digestão enzimática, ou podem ser gerados por técnicas recombinantes. Tais fragmentos de anticorpos podem ser quiméricos ou humanizados. Estes fragmentos são úteis para o diagnóstico e propósitos terapêuticos apresentados abaixo.

Anticorpos monoclonais são obtidos de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos exceto pela possível ocorrência natural de mutações que podem estar presentes em menores quantidades. Dessa forma, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como não sendo uma mistura de anticorpos distintos.

Anticorpos monoclonais anti-OX40L da presente invenção podem ser fabricados usando-se o método de hibridoma descrito pela primeira vez por Kohler et ai, Nature 256: 495 (1975) ou podem ser fabricados pelos métodos de DNA recombinante (Patente US 4.816.567).

No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, como hamster, é imunizado para gerar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que irão se ligar especificamente à proteína usada para imunização. Anticorpos para OX40L geralmente são cultivados em animais por múltiplas injeções subcutâneas (sc) ou intraperitoniais (ip) do OX40L e um adjuvante. OX40L pode ser preparado usando-se métodos bem conhecidos na técnica, alguns destes estão também descritos no presente pedido. Por exemplo, a produção recombinante de OX40L está descrita abaixo. Em uma realização, os animais são imunizados com um derivado de OX40L que contém o domínio extracelular (ECD) de OX40L ligado à porção Fc de uma cadeia pesada da imunoglobulina. Em uma realização preferida, os animais são imunizados com uma proteína de fusão OX40L-lgG1. Os animais geralmente são imunizados contra conjugados imunogênicos ou derivados do OX40L com lipídeo monofosforil A (MPL)/trehalose dicrinomicolato (TDM) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT) e a solução é injetada de forma intradérmica em múltiplos locais. Duas semanas depois os animais são estimulados. Sete a catorze dias depois os animais são sangrados e o soro é analisado para titulação do anti-OX40L. Os animais são estimulados até a titulação platô.

Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Linfócitos são então fundidos com uma linhagem de células de mieloma, utilizando-se um agente de fusão apropriado, como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas. 59-103 (Academic Press, 1986)).

As células de hibridoma preparadas desta forma são semeadas e cultivadas em meio de cultura adequado que contém preferivelmente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou a sobrevivência das células de mieloma parentais não fundidas. Por exemplo, se as células de mieloma parentais não contêm a enzima hipoxantino guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura selecionado para os hibridomas irá incluir tipicamente hipoxantina, aminopterina e timidina (meio HAT), substâncias que evitam o crescimento de células com deficiência de HGPRT.

Células de mieloma preferidas são aquelas que se fundem eficientemente, apoiam a produção de anticorpos estáveis em alto nível pelas células produtoras de anticorpos selecionadas e são sensíveis a um meio tal como meio HAT. Entre estas, linhagens celulares de mieloma preferidas estão as linhagens de mieloma murino, tais como aquelas derivadas de tumores de camundongos MOPC-21 e MPC-11 disponíveis por meio do Salk Institute Cell Distribution Center1 San Diego, Califórnia, Estados Unidos, e SP-2 ou células X63-Ag8-653 disponíveis por meio da Coleção Americana de Tipos de Cultura, Rockville, Maryland, Estados Unidos. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongos também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); e Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)).

O meio de cultura no qual as células de hibridoma estão crescendo é testado para a produção de anticorpos monoclonais dirigidos contra OX40L. Preferivelmente, a especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos por células de hibridoma é determinada por meio de imunoprecipitação ou por um teste de ligação in vitro, como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA).

A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode, por exemplo, ser determinada por meio da análise Scatchard de Munson et ai, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Após células de hibridoma serem identificadas para produção de anticorpos de especificidade desejada, afinidade e/ou atividade, os clones podem ser subclonados por procedimentos de diluição Iimitantes e cultivados por métodos padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, páginas. 59-103 (Academic Press, 1986)). O meio de cultura adequado para este propósito inclui, por exemplo, meio D-MEM ou RPMI-1640. Além disso, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são adequadamente separados do meio de cultura, fluido de ascite ou soro, por procedimentos de purificação de imunuglobulina convencionais, como por exemplo, proteína A Sefarose, cromatografia sobre hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálises ou cromatografia de afinidade.

Os anticorpos anti-0X4üL da presente invenção podem ser feitos pelo uso de bibliotecas combinatórias para seleção de clones de anticorpos sintéticos com a desejada atividade ou atividades. Em princípio, clones de anticorpos sintéticos são selecionados pela separação de bibliotecas de fago contendo fago que expõem vários fragmentos de região variável do anticorpo (Fv) ligada à proteína de revestimento do fago. Tais bibliotecas de fago são agrupadas por cromatografia de afinidade contra o antígeno desejado. Clones que expressam fragmentos Fv capazes de se ligar ao antígeno desejado são adsorvidos ao antígeno e então separados dos clones sem ligação na biblioteca. Os clones de ligação são então eluídos do antígeno, e podem ser também aprimorados por ciclos adicionais de adsorção/eluição de antígeno. Qualquer um dos anticorpos anti-OX40L da presente invenção pode ser obtidos pelo projeto de um procedimento de seleção de antígeno adequado para selecionar o clone de fago de interesse seguido pela construção de um clone do anticorpo anti-OX40L completo usando-se as seqüências Fv do clone de fago de interesse e seqüências de região constante adequadas (Fc) descritas em Kabat et ai, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publicação 91-3242, Bethesda MD (1991), volumes.

O domínio de ligação de antígeno de um anticorpo é formado por duas regiões variáveis (V) de cerca de 110 aminoácidos, cada uma das cadeias leve (VL) e pesada (VH)1 que apresentam tanto três alças hipervariáveis ou regiões determinadas por complementaridade (CDRs). Domínios variáveis podem ser exibidos de forma funcional no fago, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv), nos quais VH e VL estão ligadas covalentemente através de um peptídeo curto e flexível, ou como fragmentos Fab1 nos quais eles estão ligados a um domínio constante e interagem de forma não covalente, como descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Como usado no presente pedido, scFv que codificam clones de fago e Fab que codificam clones de fago são coletivamente chamados de "clones de fago Fv" ou "clones Fv".

Repertórios de genes VH e VL podem se clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem então ser escolhidas para clones de ligação de antígeno como descrito em Winter et ai, Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade ao imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. Alternativamente, o repertório nativo pode ser clonado como uma fonte única de anticorpos humanos para uma variedade de antígenos próprios e não-próprios sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et ai, EMBO J, 12: 725-734 (1993). Finalmente, bibliotecas virgens podem também ser feitas sinteticamente pela clonagem dos segmentos V-gene rearranjados a partir de células-tronco, e usando-se primers de PCR que contém seqüência aleatória para codificar as regiões altamente variáveis de CDR3 e para realizar o rearranjo in vitro como descrito Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Fago filamentoso é usado para exibir fragmentos de anticorpos pela fusão à proteína de revestimento plll. Os fragmentos de anticorpos podem ser exibidos como fragmentos Fv de cadeia única, nos quais os domínios VH e VL estão conectados na mesma cadeia polipeptídica por um espaçador polipeptídico flexível, por exemplo, como descrito por Marks et al., J. Moi Biol., 222: 581-597 (1991), ou como fragmentos Fab1 nos quais uma cadeia está ligada a plll e a outra é secretada no periplasma da célula hospedeira bacteriana onde o conjunto de uma estrutura de proteína de revestimento de Fab que torna-se exibida na superfície do fago pelo deslocamento de algumas proteínas de revestimento tipo selvagem, por exemplo, como descrito em Hoogenboom et ai, Nucl. Acids Res., 19: 4133^137 (1991).

Em geral, ácidos nucléicos que codificam fragmentos de gene do anticorpo são obtidos a partir de células imunes colhidas de humanos o u animais. Se uma biblioteca induzida em favor de clones anti-OX40L é desejada, o sujeito é imunizado com OX40L para gerar uma resposta do anticorpo, e as células do baço e/ou células B de circulação e outros linfócitos do sangue periférico (PBLs) são recuperados a partir da construção da biblioteca. Em uma realização preferida, uma biblioteca de fragmento de gene de anticorpo humano induzida em favor de clones OX40L anti-humanos é obtida pela geração da resposta do anticorpo OX40L anti-humano em camundongos transgênicos que carregam um arranjo do gene imunoglobulina humano funcional (e sem um sistema de produção de anticorpo endógeno funcional) como aquela imunização OX40L que ativa células B para produção de anticorpos humanos contra OX40L. A geração de camundongos transgênicos que produzem anticorpos humanos está descrita abaixo.

Aprimoramentos adicionais para populações de células reativas anti-OX40L podem ser obtidos pelo uso de um procedimento adequado para isolar células B que expressam anticorpo ligado à membrana específico para OX40L, por exemplo, pela separação celular com cromatografia de afinidade OX4ÜL ou adsorção de células para OX40L marcadas com fluorcromo seguido pela seleção celular ativada por fluxo (FACS).

Alternativamente, o uso de células do baço e/ou células B ou outras PBLs de um doador imunizado fornece uma melhor representação do possível repertório do anticorpo, e também permite a construção de uma biblioteca de anticorpo usando-se qualquer espécie animal (humana ou não-humana) em que OX40L não é antigênico. Para bibliotecas que incorporam a construção do gene do anticorpo in vitro, células-tronco são colhidas do sujeito para fornecer ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene de anticorpo não rearranjados. As células imunes de interesse podem ser obtidas de uma variedade de espécies animais, como humanos, camundongos, ratos, lagomorfos, caprinos, caninos, felinos, porcinos, bovinos, eqüinos e espécies de aves, etc.

Ácidos nucléicos que codificam segmentos de gene variável do anticorpo (incluindo segmentos VH e VL) são recuperados a partir de células de interesse e amplificados. No caso de bibliotecas de gene VH e VL rearranjados, o DNA desejado pode ser obtido pelo isolamento do DNA genômico ou RNA a partir dos linfócitos pela reação em cadeia da polimerase (PCR) com primers que são compatíveis com as terminações 5' e 3' dos genes VH e VL rearranjados como descrito em Orlandi et al., Proc. Nati Acad. Sei. (USA), 86: 3833-3837 (1989), com isso fazendo diversos repertórios do gene V para expressão. Os genes V podem ser amplificados a partir do cDNA e DNA genômico, com primers reversos na terminação 5' do exon que codifica o domínio-V maduro e primers forward apoiados no segmento-J como descrito em Orlandi et al. (1989) and in Ward et ai, Nature, 341: 544-546 (1989). No entanto, para amplificação do cDNA, primers reversos podem também estar apoiados no exon líder como descrito em Jones et al., Biotechnol., 9: 88-89 (1991), e primers forward na região constante como descrito em Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 86: 5728-5732 (1989). Para maximizar a complementaridade, a degeneração pode ser incorporada nos primers, como descrito em Orlandi et ai (1989) ou Sastry et al. (1989). Preferivelmente, a diversidade da biblioteca é maximizada pelo uso de primers de PCR direcionados à família do gene V, a fim de amplificar todas as disposições VH e Vl disponíveis presentes na amostra de ácido nucléico da célula imune, por exemplo, como descrito no método de Marks et ai, J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991) ou como descrito no método de Orum et ai, Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498 (1993). Para clonagem do DNA amplificado nos vetores de expressão, sítios de restrição raros podem ser introduzidos com o primer de PCR como um tag a uma terminação como descrito em Orlandi et al. (1989), ou para posterior amplificação por PCR com um primer tag como descrito em Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991).

Repertórios de genes V rearranjados sinteticamente podem ser derivados in vitro a partir de segmentos do gene V. A maioria dos segmentos do gene VH humano foi clonado e sequenciado (relatado em Tomlinson et al., J. Moi Bioi, 227: 776-798 (1992)), e mapeados (relatado em Matsuda et ai, Nature Genet., 3: 88-94 (1993); estes segmentos clonados (incluindo todas as principais conformações da alça H1 e H2) podem ser usados para gerar repertórios de gene VH diversos com primers de PCR que codificam alças H3 loops da seqüência diversa e comprimento, como descrito em Hoogenboom e Winter, J. Moi Biol., 227: 381-388 (1992). Repertórios VH também podem ser feitos com toda a diversidade de seqüência focada na alça H3 longa de um único comprimento como descrito em Barbas et al., Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89: 4457-4461 (1992). Segmentos humanos Vk e VA foram clonados e sequenciados (relatado em Williams e Winter, Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461 (1993)) e podem ser usados para fazer repertórios de cadeia leve sintéticos. Repertórios do gene V sintético, baseado em uma variação de cópias de VH e VI, e comprimento de L3 e H3, irão codificar anticorpos de diversidade estrutural considerável. Seguindo amplificação dos DNAs que codificam genes V, segmentos do gene V de linhagem germinativa podem ser rearranjados in vitro para os métodos de Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992).

Repertórios de fragmentos de anticorpo podem ser construídos pela combinação de repertórios de genes VH e VL juntos de diversas maneiras. Cada repertório pode ser criado em diferentes vetores, e os vetores recombinados in vitro, por exemplo, como descrito em Hogrefe et ai, Gene, 128: 119-126 (1993), ou in vivo por infecção combinatória, por exemplo, o sistema IoxP descrito em Waterhouse et ai, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266 (1993). A abordagem de recombinação in vivo explora as duas cadeias ' naturais de fragmentos Fab para superar o limite de tamanho da biblioteca imposto pela eficiência de transformação pela E. coli. Repertórios virgens VH e VL são clonados separadamente, um dentro de um fagomídeo e o outro dentro de um vetor fago. As duas bibliotecas são então combinadas pela infecção por fago da bactéria contendo o fagomídeo, de forma que cada célula contenha uma combinação diferente e o tamanho da biblioteca esteja limitado apenas pelo número de células presentes (cerca de 1012 clones). Ambos os vetores contêm sinais de recombinação in vivo, de forma que os genes VH e VL são recombinados em um único replicon e são co-empacotados em fagos vírions. Estas bibliotecas enormes fornecem um grande número de anticorpos diversos com boa afinidade (Kd"1 de aproximadamente 10"8 M).

Alternativamente, os repertórios podem ser clonados seqüencialmente em um mesmo vetor, por exemplo, como descrito em Barbas et al, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou montados juntos por PCR e então clonados, por exemplo, como descrito em Clackson et ai., Nature, 352: 624-628 (1991). A montagem de PCR também pode ser usada para ligar DNAs de VH e VL que codificam um peptídeo espaçador flexível para formar repertórios Fv (scFv) de cadeia única. Ainda outra técnica, "na montagem PCR na célula" é usada para combinar genes VH e VL com linfócitos por PCR e então clonar repertórios de genes ligados como descrito em Embleton et ai, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837 (1992).

Os anticorpos produzidos pelas bibliotecas virgens (tanto natural como sintético) podem ser de afinidade moderada (Kd"1 de cerca de 10"6 até 10"7 M"1), mas a maturação da afinidade pode ser imitada in vitro pela construção e reseleção de bibliotecas secundárias como descrito em Winter et al. (1994), acima por exemplo, a mutação pode ser introduzida aleatoriamente in vitro usando-se polimerase com tendência ao erro (relatado em Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)) no método de Hawkins et al., J. MoL Biol., 226: 889-896 (1992) ou no método de Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, a maturação da afinidade pode ser realizada pela mutação randômica de uma ou mais CDRs, por exemplo, usando-se PCR com primers que carregam seqüência randômica abrangente da CDR de interesse nos clones Fv individuais selecionados e selecionando clones de afinidade mais alta. O documento WO 9607754 (publicado em 14 de março de 1996) descreveu um método para indução de mutagênese em uma região determinada por complementaridade da cadeia leve de uma imunoglobuiina para criar uma biblioteca de genes da cadeia leve. Outra abordagem efetiva é recombinar os domínios VH ou VL selecionados pela exibição por fago com repertórios de domínios V variantes que ocorrem naturalmente, obtidos de doadores não imunizados e selecionar afinidade mais alta em diversos ciclos de mistura de cadeia como descrito em Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite a produção de anticorpos e fragmentos de anticorpos com afinidades na faixa de 10"9 M.

A seqüência de ácido nucléico que codifica o OX40L pode ser designada usando-se a seqüência de aminoácido da região desejada do OX40L, por exemplo, o domínio extracelular. Alternativamente, a seqüência de cDNA (ou fragmentos destes) pode ser usada. Seqüências do OX40L adicionais são ainda divulgadas em, por exemplo, SwissProt Acesso Número P23510. DNAs que codificam OX40L podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, síntese química por qualquer um dos métodos descritos em Engels et ai, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989), como triéster, fosfito, fosforamidito e métodos H-fosfonatos. Em uma realização, os códons preferidos pela expressão de células hospedeiras são usados na criação do DNA que codifica OX40L. Alternativamente, o DNA que codifica OX40L pode ser isolado a partir de uma biblioteca genômica ou cDNA.

Seguindo a construção da molécula de DNA que codifica OX40L, a molécula de DNA é ligada operacionalmente a uma seqüência controle de expressão em um vetor de expressão, como um plasmídeo, sendo que a seqüência controle é reconhecida por uma célula hospedeira transformada com o vetor. Em geral, vetores plasmídeos contêm replicação e seqüências controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira. O vetor geralmente carrega um sítio de replicação, assim como seqüências que codificam proteínas que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Vetores adequados para expressão em células hospedeiras procariontes e eucariontes são conhecidos na técnica e alguns estão também descritos no presente pedido. Organismos eucariontes, como leveduras ou células derivadas de organismos multicelulares, como mamíferos, podem ser usados.

Opcionalmente, o DNA que codifica OX40L está operacionalmente ligado a uma seqüência líder secretória resultando na secreção da expressão do produto pela célula hospedeira no meio de cultura. Exemplos de seqüências líder secretória incluem stll, ecotin, IamB, herpes GD, Ipp, fosfatase alcalina, invertase e fator alfa. A seqüência líder de 36 aminoácidos da proteína A também é adequada para uso no presente pedido (Abrahmsen et ai, EMBO J., 4: 3901 (1985)).

Células hospedeiras são transfectadas e preferivelmente transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem da presente invenção e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

Transfecção refere-se ao recolhimento de um vetor de expressão por uma célula hospedeira se quaisquer seqüências de codificação são ou não expressas. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos para os técnicos no assunto, por exemplo, precipitação e eletroporação por CaPO4. Transfecção de sucesso é geralmente reconhecida quando qualquer indicação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira. Métodos para transfecção são bem conhecidos na técnica, e alguns estão também descritos no presente pedido.

Transformação significa introdução de DNA em um organismo, de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomal como por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando-se técnicas padrão apropriadas para tais células. Métodos para transformação são bem conhecidos na técnica, e alguns estão também descritos no presente pedido.

Células hospedeiras procariontes usadas para produzir OX40L podem ser cultivadas como descrito em Sambrook et al., acima.

As células hospedeiras de mamífero usadas para produzir OX40L podem ser cultivadas em uma variedade de meios, que são bem conhecidos na técnica e alguns destes estão descritos no presente pedido.

As células hospedeiras referidas nesta divulgação incluem células na cultura in vitro, bem como células que estão em um hospedeiro animal.

A purificação do OX40L pode ser realizada usando-se métodos reconhecidos na técnica.

O OX40L purificado pode ser anexado a uma matriz adequada como esferas de agarose, esferas de acrilamida, esferas de vidro, celulose, vários copolímeros acrílicos, géis hidroxil metacrilato, copolímeros poliacrílicos e polimetacrílicos, nylon, veículos neutros e iônicos, e similares, para uso na separação cromatográfica de afinidade dos clones de exibição por fago. A ligação da proteína OX40L à matriz pode ser realizada pelos métodos descritos em Methods in Enzymology, vol. 44 (1976). Uma técnica comumente empregada para anexar proteínas ligantes às matrizes de polissacarídeo, por exemplo, agarose, dextrano ou celulose, envolve ativação do veículo com halóides cianogênicos e subsequente acoplamento das aminas alifáticas ou aromáticas primárias do peptídeo Iigante à matriz ativada.

Alternativamente, OX40L pode ser usado para revestir os poços das placas de adsorção, expressos nas células hospedeiras afixadas às placas de adsorção, ou usado na seleção celular, ou conjugado à biotina para captura com esferas revestidas de estreptavidina, ou usado em qualquer outro método conhecido na técnica para panorama de bibliotecas de exibição por fago.

As amostras de biblioteca de fago são contatadas com OX40L imobilizado sob condições adequadas para ligação de pelo menos uma porção das partículas de fago com o adsorvente. Normalmente, as condições, incluindo pH, força iônica, temperatura e similares são selecionadas para imitar as condições fisiológicas. Os fagos ligados à fase sólida são lavados e então eluídos pelo ácido, por exemplo, como descrito em Barbas et al, Proc. NatL Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982 (1991), ou por base alcalina, por exemplo, como descrito em Marks et aí., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), ou por competição de antígeno OX40L, por exemplo, em um procedimento similar ao método de competição de antígeno de Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991). Fagos podem ser enriquecidos de 20 a 1000 vezes em uma único ciclo de seleção. Além disso, os fagos enriquecidos podem ser cultivados em cultura de bactéria e sujeitos a ciclos posteriores de seleção.

A eficiência de seleção depende de muitos fatores, incluindo a cinética de dissociação durante a lavagem e se fragmentos múltiplos de anticorpos em um único fago podem simultaneamente juntar-se ao antígeno.

Anticorpos com cinética de dissociação rápida (e fraca afinidade de ligação) podem ser mantidos pelo uso de lavagens curtas, exibição por fago multivalente e alta densidade de revestimento de antígeno na fase sólida. A alta densidade não apenas estabiliza o fago através de interações multivalentes, mas favorece a religação do fago que foi dissociado. A seleção de anticorpos com cinética de dissociação lenta (e boa afinidade de ligação) pode ser mantida pelo uso de lavagens longas e exibição por fago monovalente como descrito em Bass et aí., Proteins, 8: 309-314 (1990) e no documento WO 92/09690, e uma baixa densidade de revestimento de antígeno como descrito em Marks et ai, Biotechnol., 10: 779-783 (1992).

É possível selecionar entre anticorpos de fago de diferentes afinidades, mesmo com afinidades que diferem levemente, para OX40L. No entanto, é provável que a mutação randômica de um anticorpo selecionado (por exemplo, como realizado em algumas das técnicas de maturação de afinidade descritas acima) dê origem a muitos mutantes, a maioria para ligação ao antígeno, e poucos com alta afinidade. Com OX40L limitante, fago de afinidade alta rara poderia ser concorrente. Para manter todos os mutantes de afinidade mais alta, os fagos podem ser incubados com excesso de OX40L biotinilado, mas com o OX40L biotinilado a uma concentração de menor molaridade do que a afinidade constante molar alvo para OX40L. Os fagos de alta afinidade de ligação podem então ser capturados pelas esferas paramagnéticas revestidas com estreptavidina. Tal "captura de equilíbrio" permite que os anticorpos sejam selecionados de acordo com suas afinidades de ligação, com sensibilidade que permita isolamento de clones mutantes com a menor afinidade mais possível de duas vezes de um grande excesso de fago com afinidade mais baixa. As condições usadas nas lavagens de fago ligados a uma fase sólida podem ser manipuladas para discriminar baseado na cinética de dissociação. Clones anti-OX40L podem ter atividade selecionada, Em uma realização, a presente invenção fornece anticorpos anti-OX40L que bloqueiam a ligação entre um receptor OX40 e OX40L, mas não bloqueia a ligação entre uma segunda proteína. Clones Fv que correspondem a tais anticorpos anti- OX40L podem ser selecionados por (1) isolamento dos clones anti-OX40L a partir de uma biblioteca de fago como descrito acima, e opcionalmente, amplificação da população isolada de clones de fago pelo crescimento da população em um hospedeiro bacteriano adequado; (2) seleção de OX40L e uma segunda proteína contra atividade de bloqueio e não-bloqueio, respectivamente, é desejado; (3) adsorção dos clones de fago anti-OX4ÜL para OX40L imobilizado; (4) uso de um excesso da segunda proteína para eluir qualquer clone não desejado que reconheça determinantes de ligação de OX40L, que se sobreponha ou compartilhe os determinantes de ligação desta segunda proteína; (5) eluição dos clones que permaneçam adsorvidos após a etapa (4). Opcionalmente, os clones com propriedades desejadas de bloqueio/não-bloqueio podem ser ainda enriquecidos pela repetição dos procedimentos de seleção descritos no presente pedido, uma ou mais vezes.

O DNA que codifica anticorpos monoclonais derivados de hibridoma ou clones de exibição por fago da presente invenção é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeos criadas para amplificar especificamente as regiões de codificação das cadeias leve e pesada de interesse, a partir do hibridoma ou DNA molde de fago). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras como células E. coli, células COS de símios, células de ovário de hamster Chinês (CHO)1 ou células de mieloma que, de outra forma, não produzem proteína da imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais desejados nas células hospedeiras recombinantes. Os artigos de revisão sobre expressão recombinante em bactérias de DNA que codifica anticorpo incluem Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5: 256 (1993) e Pluckthun1 Immunol. Revs, 130: 151 (1992).

O DNA que codifica os clones Fv da presente invenção pode ser combinado com seqüências de DNA conhecidas que codificam regiões constantes da cadeia pesada e/ou leve (por exemplo, as seqüências de DNA apropriadas podem ser obtidas a partir de Kabat et ai, acima) para formar clones que codificam cadeias pesadas e/ou leves, completas ou parciais. Será apreciado que regiões constantes de qualquer isótipo possam ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes IgG1 IgM1 IGA, IgD e IgE1 e tais regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal. O clone Fv derivado do DNA de domínio variável de uma espécie animal (como humana) e então fundido ao DNA de região constante de outra espécie animal para formar seqüências de codificação para cadeias pesadas e/ou leves "híbridas" completas está incluído na definição de anticorpo "quimérico" e "híbrido" como usado no presente pedido. Em uma realização preferida, um clone Fv derivado do DNA variável humano é fundido ao DNA de região constante humana para formar seqüências de codificação para todas as cadeias pesadas e/ou leves humanas, completas ou parciais.

O DNA que codifica um anticorpo anti-OX4üL a partir de um hibridoma da presente invenção pode ser também modificado, por exemplo, pela substituição das seqüências de codificação pelos domínios constantes de cadeias pesada e leve humanas no lugar das seqüências de murino homólogas derivadas a partir do clone de hibridoma (por exemplo, como no método de Morrison, et ai, Proc. Nat.Acad.Sci.USA, 81: 6851-6855 (1984)). O DNA que codifica um hibridoma ou anticorpo derivado do clone ou fragmento Fv pode ser " ainda modificado pela junção covalente à seqüência de codificação da imunoglobulina de toda ou parte da seqüência de codificação para um polipeptídeo não-imunoglobulina. Desta maneira, anticorpos "quiméricos" ou "híbridos" são preparados para ter a especificidade de ligação dos anticorpos derivados dos clone Fv ou clones de hibridoma da presente invenção.

Fragmentos De Anticorpos

A presente invenção inclui fragmentos de anticorpo. Em certas circunstâncias existem vantagens em usar fragmentos de anticorpo ao invés de anticorpos inteiros. O menor tamanho dos fragmentos permite rápida liberação e pode levar à melhora do acesso a tumores sólidos.

Foram desenvolvidas várias técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et ai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) e Brennan et ai, Science, 229:81 (1985)). Entretanto, esses fragmentos podem ser agora produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em e secretados por E. coli, permitindo assim a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpos podem ser isolados a partir de bibliotecas de fago de anticorpos discutidas acima. Alternativamente, fragmentos Fab'-SH podem ser recuperados diretamente de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et ai, Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acordo com outra abordagem, fragmentos de F(ab')2 podem ser isolados diretamente a partir da cultura de células hospedeiras recombinantes. Fragmentos Fab e F(ab')2 com meia-vida aumentada in vivo que compreendem resíduos do epítopo de ligação do receptor de resgate estão descritos na patente US 5.869.046. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão evidentes para os técnicos no assunto. Em outras realizações, o anticorpo da seleção é um fragmento Fv de cadeia única (scFv). Ver documento WO 93/07378 , patentes US 5.571.894 e US 5.587.458. Fv e sFv são os únicos tipos com sítios de combinação intactos que são desprovidos de regiões constantes, então, eles são adequados para reduzir ligação não específica durante o uso in vivo. Proteínas de fusão sFv podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetora tanto na terminação amino como carboxi de um sFv. Ver Antibody Engineering, ed. Borrebaeck,acima. O fragmento de anticorpo pode também ser um "anticorpo linear", por exemplo, como descrito na patente US 5.641.870, por exemplo. Tais fragmentos de anticorpo linear podem ser monoespecíficos ou biespecíficos.

Anticorpos Humanizados

A presente invenção inclui anticorpos humanizados. Vários métodos para humanizar anticorpos não humanos são conhecidos na técnica. Por exemplo, um anticorpo humanizado pode ter um ou mais resíduos de aminoácido introduzidos neste de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são freqüentemente chamados de resíduos "importados", os quais são tipicamente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536), pela substituição de seqüências de região hipervariável para as seqüências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (patente US 4.816.567) em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto foi substituído pela seqüência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos em que alguns resíduos de região hipervariável e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sítios análogos em anticorpos de roedores. A escolha de domínios variáveis humano, tanto leve como pesado, para serem usados na fabricação de anticorpos humanizados é muito importante para reduzir antigenicidade. De acordo com o método também conhecido como "melhor ajuste", a seqüência de domínio variável de um anticorpo de roedor é selecionada em relação à completa biblioteca das seqüências de domínio variável humana conhecida. A seqüência humana que é mais próxima a esta do roedor é então aceita como a estrutura humana para o anticorpo humanizado (Sims et al. (1993) J. Immunol. 151:2296; Chothia et al. (1987) J. Moi S/o/. 196:901. Outro método usa uma estrutura específica derivada da seqüência consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo específico das cadeias leve ou pesada. A mesma estrutura pode ser usada para diversos anticorpos humanizados diferentes (Carter et al. (1992) Proc. Nati Acad. Sei. USA, 89:4285; Presta et ai (1993) J. Immunol., 151:2623.

É ainda importante que anticorpos sejam humanizados com retenção de alta afinidade para o antígeno e outras propriedades biológicas favoráveis. Para atingir este objetivo, de acordo com um método, anticorpos humanizados são preparados por um processo de análise de seqüências parentais e vários produtos humanizados conceituais usando-se modelos tridimensionais das seqüências parental e humanizada. Modelos de imunoglobulina tridimensional estão comumente disponíveis e são familiares para aqueles técnicos no assunto. Programas de computador estão disponíveis, os quais ilustram e exibem possíveis estruturas de conformação tridimensional das seqüências de imunoglobulina candidata selecionada. A inspeção destas exibições permite a análise do papel provável no funcionamento da seqüência de imunoglobulina candidata, isto é, a análise de resíduos que influenciam na habilidade da imunoglobulina candidata ligar-se ao seu antígeno. Desta maneira, resíduos FR podem ser selecionados e combinados das seqüências do receptor e importada de forma que a característica do anticorpo desejada, tal como aumento de afinidade para o antígeno(s) alvo, é atingida. Em geral, resíduos de região hipervariável são diretamente e mais substancialmente envolvidos na influência da ligação do antígeno.

Anticorpos Humanos

Anticorpos anti-OX4C)L humanos da presente invenção podem ser construídos pela combinação de seqüências de domínio variável do clone Fv selecionadas de bibliotecas de exibição por fago com seqüências de domínio constante humanas como descrito acima. Alternativamente, anticorpos anti- OX40L monoclonais humanos da presente invenção podem ser feitos pelo método de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma e heteromieloma camundongo- humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas, por exemplo, por Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et ai, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas. 51-63 (Mareei Dekker, Inc., Nova York, 1987)); e Boerner etal., J. Immunol., 147: 86 (1991).

Agora é possível produzir animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, mediante imunização, de produzir repertório completo de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene (JH) da região de ligação da cadeia pesada do anticorpo em camundongos de linhagem de origem mutante e quimérico resulta na inibição completa da produção de anticorpo endógeno. A transferência da linhagem de origem humana do conjunto de gene de imunoglobulina em tal camundongo de linhagem de origem mutante irá resultar na produção de anticorpos humanos mediante desafio com antígenos. Ver, por exemplo, Marasco et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et ai, Nature, 362: 255 (1993); Bruggermann et al., Yearin Immunoi, 7: 33 (1993).

A mistura de genes pode também ser usada para derivar anticorpos humanos a partir de anticorpos não-humanos de roedores, por exemplo, onde o anticorpo humano possui afinidades similares e especificidades com o anticorpo não-humano. De acordo com este método, que é também chamado de "imprinting do epítopo", a região variável de cadeia leve ou pesada de um fragmento de anticorpo não-humano obtido pelas técnicas de exibição por fago como descrito acima é substituído por um repertório de genes do domínio V humano, criando uma população de cadeias scFv não-humanas/humanas ou FAB quiméricas. A seleção com antígenos resulta no isolamento de uma cadeia não-humana/cadeia quimérica humana scFv ou Fab em que a cadeia humana restaura o sítio de ligação de antígeno destruído pela remoção da cadeia não-humana correspondente no clone primário exibido por fago, isto é, o epítopo governa (imprime) a escolha da cadeia humana parceira. Quando o processo é repetido com o objetivo de substituir o domínio V da cadeia não-humana remanescente, um anticorpo humano é obtido (ver pedido de patente PCT documento WO 93/06213, publicado em 1 de abril de 1993). Diferente da humanização tradicional de anticorpos não-humanos por enxerto de CDR, esta técnica fornece anticorpos completamente humanos, que não possuem estrutura ou resíduos Fr ou CDR de origem não-humana.

Anticorpos Biespecíficos

Os anticorpos biespecíficos são monoclonais, preferivelmente humanos ou humanizados, anticorpos que possuem especificidades de ligação para pelo menos dois antígenos diferentes. No caso presente, uma das especificidades de ligação é para OX40L e a outra é para qualquer outro antígeno. Anticorpos biespecíficos exemplares podem se ligar a dois epítopos diferentes da proteína OX40L. Anticorpos biespecíficos podem também ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam OX40L. Estes anticorpos possuem um braço de ligação de OX4QL e um braço que se liga ao agente citotóxico (por exemplo, saporina, anti-interferon-α, alcalóide da vinca, ricina de cadeia A, metotrexato ou hapteno de isótopo radioativo). Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos de comprimento total ou fragmentos de anticorpos (por exemplo, anticorpos biespecíficos F(ab')2).

Métodos de fabricação de anticorpos biespecíficos são conhecidos na técnica. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos está baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulinas, onde as duas cadeias pesadas possuem especificidades diferentes (Milstein e Cuello, Nature, 305: 537 (1983)). Devido à escolha aleatória de cadeias leve e pesada de imunoglobulina, esses hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpos diferentes, das quais apenas uma possui a estrutura biespecífica correta. A purificação da molécula correta, que é normalmente realizada por meio de etapas de cromatografia de afinidade, é um tanto problemática, e os rendimentos de produto são baixos. Procedimentos similares são divulgados no documento WO 93/08829 publicado em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991).

De acordo com uma abordagem diferente e mais preferida, domínios variáveis de anticorpos com as especificidades de ligação desejadas (sítios de combinação de antígenos-anticorpos) são fundidos a seqüências de domínio constante da imunoglobulina. A fusão é preferencialmente com um domínio constante de cadeia pesada da imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões de dobradiça, CH2 e CH3. É preferível ter a primeira região constante de cadeia pesada (CH1) contendo o sítio necessário para a ligação da cadeia leve, presente em pelo menos uma das fusões. Os DNAs que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são cotransfectados em um organismo hospedeiro adequado. Isso fornece grande flexibilidade no ajuste das proporções mútuas dos três fragmentos do polipeptídeo em realizações onde razões desiguais das três cadeias do polipeptídeo utilizadas na construção fornecerem o máximo de rendimento. É, no entanto, possível inserir as seqüências de codificação para duas ou todas as três cadeias de polipeptídeos em um vetor de expressão único quando a expressão de pelo menos duas cadeias do polipeptídeo em razões iguais resultarem em altos rendimentos ou quando as razões não forem de significância específica.

Em uma realização preferida desta abordagem, os anticorpos biespecíficos são compostos de uma cadeia pesada da imunoglobulina híbrida com primeira especificidade de ligação em um braço e um par de cadeias leve e cadeia pesada da imunoglobulina híbrida (que fornece uma segunda especificidade de ligação) no outro braço. Concluiu-se que essa estrutura assimétrica facilita a separação do composto biespecífico desejado de combinações de cadeia da imunoglobulina indesejadas, pois a presença de cadeia leve da imunoglobulina em apenas uma metade da molécula biespecífica fornece uma maneira fácil de separação. Esta abordagem está descrita no documento WO 94/04690. Para maiores detalhes de geração de anticorpos biespecíficos, ver, por exemplo, Suresh et ai, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acordo com outra abordagem, a interface entre um par de moléculas de anticorpos pode ser modificada geneticamente para maximizar a porcentagem de heterodímeros que são recuperados da cultura de células recombinantes. A interface preferida compreende pelo menos uma parte do domínio Ch3 de um domínio constante do anticorpo. Neste método, uma ou mais cadeias laterais de aminoácidos pequenos da interface da primeira molécula do anticorpo são substituídas por cadeias laterais maiores (por exemplo, tirosina ou triptofano). "Cavidades" compensatórias de tamanho idêntico ou similar à(s) cadeia(s) lateral(is) grande(s) são criadas sobre a interface da segunda molécula do anticorpo, pela substituição de grandes cadeias laterais de aminoácidos por cadeias menores (por exemplo, alanina ou treonina). Isso fornece um mecanismo de aumento de produção do heterodímero sobre outros produtos finais indesejados, como homodímeros.

Anticorpos biespecíficos incluem anticorpos reticulados ou "heteroconjugados". Por exemplo, um dos anticorpos no heteroconjugado pode ser acoplado à avidina e o outro à biotina. Tais anticorpos, por exemplo, foram propostos para atingir células do sistema imunológico para células indesejadas (patente US 4.676.980), e para o tratamento de infecções por HIV (documento WO 91/00360, documento WO 92/00373 e patente EP 03089). Anticorpos heteroconjugados podem ser fabricados usando-se qualquer método de reticulação conveniente. Os agentes de reticulação adequados são bem conhecidos na técnica e estão divulgados na patente US 4.676.980, juntamente com uma série de técnicas de reticulação.

As técnicas de geração de anticorpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticorpos também foram descritas na literatura. Por exemplo, anticorpos biespecíficos podem ser preparados usando-se ligações químicas. Brennan et ai, Science, 229: 81 (1985) descreve um procedimento em que anticorpos intactos são clivados proteolicamente para gerar fragmentos F(ab')2. Estes fragmentos são reduzidos na presença do agente complexante ditiol arsenato de sódio para estabilizar ditióis próximos e prevenir formação intermolecular do bissulfeto. Os fragmentos Fab1 gerados são então convertidos para derivados de tionitrobenzoato (TNB). Um dos derivados do Fab1-TNB é então reconvertido para o Fab-tiol por redução com mercaptoetilamina e é misturado com uma quantidade equimolar de outro derivado do Fab1-TNB para formar o anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos produzidos podem ser usados como agentes para a !'mobilização seletiva de enzimas.

Recente progresso facilitou a recuperação direta de fragmentos Fab1-SH a partir de E. coli, que podem ser acoplados quimicamente para formar anticorpos biespecíficos. Shalaby et ai, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) descreve a produção de uma molécula do anticorpo F(ab')2 biespecífico humanizado completa. Cada fragmento Fab' foi separadamente secretado a partir de E. coli e sujeito ao acoplamento químico direcionado in vitro para formar o anticorpo biespecífico. O anticorpo biespecífico assim formado foi capaz de se ligar a células que superexpressam o receptor HER2 e células T humanas normais, bem como acionar a atividade lítica dos linfócitos citotóxicos humanos contra alvos de tumor de mama humano.

Diversas técnicas de fabricação e isolamento de fragmentos de anticorpos biespecíficos diretamente de cultura celular recombinante também foram descritas. Por exemplo, anticorpos biespecíficos foram produzidos utilizando-se zíperes de leucina. Kostelny et ai, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992). Os peptídeos de zíper de leucina das proteínas Fos e Jun foram ligados às porções Fab' de dois anticorpos diferentes por fusão gênica. Os homodímeros de anticorpos foram reduzidos na região de dobradiça para formarem monômeros e então reoxidados para formarem os heterodímeros do anticorpo. Este método também pode ser utilizado para a produção de homodímeros do anticorpo. A tecnologia de "diacorpos" descrita por Hollinger et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) forneceu um mecanismo alternativo para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos. Os fragmentos compreendem um domínio variável de cadeia pesada (Vh) conectado a um domínio variável de cadeia leve (Vl) por um ligante que é muito curto para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Consequentemente, os domínios Vh e Vl de um fragmento são forçados a parear com os domínios VL e Vh complementares de outro fragmento, através disto, formando dois sítios de ligação de antígenos. Outra estratégia para fabricação de fragmentos de anticorpos biespecíficos pelo uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) também foi relatada. Ver Gruber et ai, J. Immunol., 152:5368 (1994).

Anticorpos com mais de duas valências são contemplados. Por exemplo, anticorpos triespecíficos podem ser preparados. Tutt et ai, J. Immunol. 147: 60 (1991).

Anticorpos Multivalentes

Um anticorpo multivalente pode ser internalizado (e/ou catabolizado) mais rápido do que um anticorpo bivalente por uma célula que expressa um antígeno ao qual os anticorpos se ligam. Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos multivalentes (exceto da classe IgM) com três ou mais sítios de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpos tetravalentes), que podem ser facilmente produzidos por expressão recombinante de ácido nucléico que codifica as cadeias polipeptídicas do anticorpo. O anticorpo multivalente pode compreender um domínio de dimerização e três ou mais sítios de ligação de antígeno. O domínio de dimerização preferido compreende (ou consiste de) uma região Fc ou uma região de dobradiça. Neste cenário, o anticorpo irá compreender uma região Fc e três ou mais sítios de ligação de antígeno amino-terminal para a região Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente compreende (ou consiste de) três a cerca de oito, mais preferivelmente quatro, sítios de ligação de antígeno. O anticorpo multivalente compreende pelo menos uma cadeia polipeptídica (e preferivelmente duas cadeias polipeptídicas), em que a(s) cadeia(s) polipeptídica(s) compreende dois ou mais domínios variáveis. Por exemplo, a cadeia(s) polipeptídica(s) pode(m) compreender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, sendo que VD1 é um primeiro domínio variável, VD2 é um segundo domínio variável, Fc é uma cadeia polipeptídica de uma região Fc , X1 e X2 representa um aminoácido ou polipeptídeo, e η é 0 ou 1. Por exemplo, a cadeia polipeptídica pode compreender: região de cadeia VH-CH1-flexível Iigante-VH- CHI-Fc ; ou região de cadeia VH-CH1-VH-CH1-Fe. O anticorpo multivalente preferido no presente, além disso, compreende pelo menos dois (e preferivelmente quatro) polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. O anticorpo multivalente preferido pode, por exemplo, compreender aproximadamente dois a oito polipeptídeos de domínio variável de cadeia leve. Os polipeptídeos do domínio variável da cadeia leve aqui contempladas compreendem um domínio variável de cadeia leve e, opcionalmente, também compreendem um domínio CL.

Anticorpos Variantes

Em algumas realizações, modificação(ões) de seqüência de aminoácido dos anticorpos descritos no presente estão contempladas. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Seqüências de amino ácidos variantes do anticorpo são preparadas por introdução apropriada de trocas de nucleotídeos no ácido nucléico do anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das seqüências de aminoácido do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção, e substituição são feitas para se chegar à construção final, provendo que a construção final possua as características desejadas. As alterações no aminoácido podem ser introduzidas na seqüência de aminoácido do anticorpo do sujeito no momento que a seqüência é feita.

Um método útil para identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo que são localizações preferidas para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina" como descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos são identificados (por exemplo, resíduos carregados tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (mais preferivelmente alanina ou polialanina) para afetar a interação de aminoácidos com antígeno. Essas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições então são refinadas pela introdução, além disto, de ou outras variantes nos sítios de substituição. Consequentemente, enquanto o sítio para a introdução da variação de seqüência de aminoácido é pré-determinado, a natureza da mutação por si mesma não precisa ser pré-determinada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, varredura de ala ou mutagênese randômica é conduzida no códon ou região alvo e as imunoglobulinas expressas são selecionadas para a atividade desejada.

Inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusões na terminação amina e/ou carboxila, variando em comprimento de um resíduo até polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrasequência de resíduos de aminoácido únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionil N-terminal ou o anticorpo fundido a um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes insercionais da molécula do anticorpo incluem a fusão do N- ou C- terminal do anticorpo a uma enzima (por exemplo, à ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida de soro do anticorpo.

Outro tipo de aminoácido variante do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Tal alteração inclui deleção de um ou mais componentes carboidratos encontrados no anticorpo, e/ou adição de um ou 25 mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo.

Glicosilação de polipeptídeos é tipicamente tanto N-Iigado como O-ligado. N-Iigado refere-se à conexão do componente carboidrato à cadeia lateral de um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídio asparagina-X- serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são seqüências de reconhecimento para conexão enzimática do componente carboidrato para a cadeia lateral asparagina. Dessa forma, a presença de ambas seqüências de tripeptídios em um polipeptídio cria um sítio de glicosilação potencial. Glicosilação O-ligado refere-se à conexão de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxi-aminoácido, mais comumente serina ou treonina, embora 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina possam também ser usadas.

A adição de sítios de glicosilação ao anticorpo é convenientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, como aquela que contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeos descritas acima (para sítios de glicosilação N-ligado). A alteração pode também ser feita por adição de, ou substituição de, um ou mais resíduos de serina ou treonina à seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligado).

Onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato conectado a este pode ser alterado. Por exemplo, anticorpos com uma estrutura de carboidrato madura que é desprovida de fucose conectada a uma região Fc do anticorpo estão descritos no pedido de patente US 2003/0157108 (Presta, L.). Ver também patente US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) Anticorpos com uma N-acetilglucosamina dividida (GIcNAc) no carboidrato conectado a uma região Fc do anticorpo estão referidos no documento WO 2003/011878, Jean-Mairet et al. e patente US 6.602.684 Umana et al. Anticorpos com ao menos um resíduo galactose no oligossacarídeo conectado a uma região Fc do anticorpo estão relatados no documento WO 1997/30087, Patel et al. Ver, também, documento WO 1998/58964 (Raju, S.) e documento WO 1999/22764 (Raju, S.) que relaciona anticorpos com carboidrato alterado inserido à região Fc destes. Ver também patente US 2005/0123546 (Umana et al.) nas moléculas de ligação de antígeno com glicosilação modificada. A variante de glicosilação preferida no presente compreende uma região Fc1 em que uma estrutura de carboidrato é anexada à região Fc desprovida de fucose. Tais variantes possuem função ADCC melhorada. Opcionalmente, a região Fc também compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que também melhoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos Eu). Exemplos de tais publicações relacionadas a anticorpos "defucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: patente US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patente US 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140; patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento W02005/053742; Okazaki et ai. J. Moi. BioL 336:1239-1249 (2004); Yamane- Ohnuki et ai. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Exemplos de linhagens celulares que produzem anticorpos defucosilados incluem células Lecl 3 CHO deficientes em proteína de defucosilação (Ripka et ai. Arch. Biochem. Biophys. 249:533- 545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e docuemtno WO 2004/056312 A1, Adams et ai., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares knockout, tal como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (Yamane-Ohnuki et ai. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)).

Outro tipo de variante é uma variante de substituição do aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula do anticorpo substituído por um resíduo diferente. Os sítios de maior interesse para mutagênese substitucional incluem as regiões hipervariáveis, mas alterações FR também são contempladas. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica, então mais trocas substanciais, denominadas "substituições exemplares" na Tabela 1, ou também como descritas abaixo na referência para classes de aminoácido, podem ser introduzidas e os produtos selecionados.

Tabela 1

<table>table see original document page 86</column></row><table> Modificações substanciais nas propriedades biológicas do anticorpo são realizadas pela seleção de substituições que diferem significantemente em seus efeitos na manutenção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação folha ou helicoidal (b) da carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio alvo ou (c) da massa da cadeia lateral. Resíduos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos baseados em propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbica: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

(2) hidrofílica neutra: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) ácida: asp, glu;

(4) básica: his, Iys1 arg;

(5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: gly, pro; e

(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Substituições não conservativas irão conferir troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

Um tipo de variante substitucional envolve substituição em um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humano ou humanizado). Geralmente, a variante(s) resultante(s) selecionada(s) para posterior desenvolvimento terá propriedades biológicas melhoradas relativas ao anticorpo parental a partir do qual elas são geradas. Uma maneira conveniente para gerar tais variantes substitucionais envolve maturação de afinidade usando-se exibição por fago. Resumidamente, diversos sítios de região hipervariável (por exemplo, sítios 6-7) são mutados para gerar todas as possíveis substituições de aminoácido em cada sítio. Os anticorpos dessa forma gerados são exibidos a partir de partículas de fago filamentoso como fusões para o gene Ill produto de M13 empacotado no interior de cada partícula. As variantes de fago exibidas são então selecionadas para suas atividades biológicas (por exemplo, a finidade de ligação), como divulgado no presente pedido. Com o objetivo de identificar candidatos para sítios de região hipervariável para modificações, pode ser realizada mutagênese de varredura de alanina para identificar resíduos de região hipervariável que contribuem significantemente para ligação do antígeno. Alternativamente, ou adicionalmente, pode ser benéfico analisar uma estrutura cristalina do complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituições de acordo com as técnicas elaboradas no presente pedido. Uma vez que tais variantes são geradas, as variantes do painel são sujeitas à seleção como descrito no presente e anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

Moléculas de ácido nucléico que codificam seqüências variantes de aminoácido do anticorpo são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, mas não estão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de ocorrer seqüência variante de aminoácido naturalmente) ou preparação por mutagênese mediada por oligonucleotídeo (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR e mutagênese cassette de uma variante preparada anteriormente ou uma versão não-variante do anticorpo.

Pode ser desejável introduzir uma ou mais modificações de aminoácido em uma região Fc dos polipeptídeos de imunoglobulina da presente invenção, através disto gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma seqüência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgGI, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácido incluindo a de uma dobradiça de cisteína. Conforme esta descrição e os ensinamentos da técnica,é contemplado que em algumas realizações, um anticorpo usado nos métodos da presente invenção pode compreender uma ou mais alterações quando comparado ao anticorpo correspondente de tipo selvagem, por exemplo, na região Fc. Estes anticorpos, apesar de tudo, manteriam substancialmente as mesmas características necessárias para utilidade terapêutica quando comparados aos seus correspondentes de tipo selvagem. Por exemplo, acredita-se que certas alterações podem ser feitas na região Fc que resultariam em ligação C1q alterada (isto é, ambas melhoradas ou reduzidas) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, como descrito no documento WO 99/51642. Ver também Duncan & Winter Nature 322:738-40 (1988); patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 com respeito a outros exemplos de regiões Fc variantes. O documento WO 00/42072 (Presta) descreve anticorpos variantes com ligação aos FcRs melhoradas ou diminuídas. O conteúdo destas publicações de patentes estão especificamente incorporados ao presente como referência. Ver, também, Shields et ai J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001). Anticorpos com aumento de meia vida e ligação melhorada para o receptor Fc neonatal (FcRn)1 que é responsável por transferir as IgGs maternas para os fetos (Guyer et al, J. Immunoi 117:587 (1976) e Kim et ai, J. Immunoi 24:249 (1994)), estão descritos na patente US 2005/0014934A1 (Hinton et ai). Estes anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesta, que melhoram ligação da região Fc ao FcRn. Polipeptídeos variantes com seqüências de aminoácido da região Fc alteradas e capacidade de ligação C1q aumentada ou diminuída estão descritos na patente US 6.194.551 B1, documento WO 99/511642. O conteúdo destas publicações de patentes está especificamente incorporados ao presente como referência. Ver também, Idusogie et ai J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000). Anticorpos Derivados

Os anticorpos da presente invenção podem ser ainda modificados para conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos na técnica e facilmente disponíveis. Preferivelmente1 os componentes adequados para derivatização do anticorpo são polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinil, pirrolidona polivinil, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilado (por exemplo, glicerol), álcool polivinil, e misturas destes. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ser de qualquer peso molecular, e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros anexados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero for anexado, eles podem ser o mesmo ou moléculas diferentes. Em geral, o número e/ou tipos de polímeros usados para derivação podem ser determinados baseado em considerações incluindo, mas não limitado a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a ser melhorado, se o anticorpo derivado será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

Seleção De Anticorpos Com Propriedades Desejadas

Os anticorpos da presente invenção podem ser caracterizados por suas propriedades físico-químicas e funções biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica. Em algumas realizações, anticorpos são caracterizados para qualquer uma ou mais ligações ao OX40L, redução ou bloqueio da ativação do OX4QL, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do OX40L, redução ou bloqueio da ativação do receptor 0X40, redução ou bloqueio da sinalização molecular a jusante do receptor OX4ÜL, redução ou bloqueio da ligação 0X40 ao OX40L e/ou multimerização OX40L, e/ou tratamento e/ou prevenção de uma disfunção imune (por exemplo, asma, rinite alérgica, dermatite atópica, esclerose múltipla, GVHF, ou lúpus eritematoso sistêmico); e/ou tratamento e/ou prevenção de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade do OX40L (como expressão e/ou atividade aumentada do OX40L).

Os anticorpos purificados podem ser ainda caracterizados por uma série de ensaios incluindo, mas não limitados a, sequenciamento N- terminal, análise de aminoácido, cromatografia líquida de alta eficiência de exclusão por tamanho sem desnaturação (HPLC), espectrometria de massa, cromatografia de troca iônica e digestão por papaína.

Em certas realizações da presente invenção, os anticorpos produzidos no presente pedido são analisados para suas atividades biológicas. Em algumas realizações, os anticorpos da presente invenção são testados para suas atividades de ligação ao antígeno. Os testes de ligação ao antígeno que são conhecidos na técnica e podem ser usados no presente pedido incluem sem limitação, qualquer teste de ligação competitiva usando-se técnicas tais como western blots, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios "sanduíche", testes de imunoprecipitação, imunoensaios fluorescentes e imunoensaios de proteína A. Um teste ilustrativo de ligação ao antígeno é fornecido abaixo na seção de Exemplos.

Em algumas realizações, a presente invenção fornece anticorpos monoclonais anti-OX40L que competem com o anticorpo 8E12 e/ou anticorpo 13G5 para ligação ao OX40L. Tais anticorpos concorrentes que reconhecem um epítopo OX4QL que é o mesmo ou se sobrepõe ao epítopo OX40L reconhecido pelo anticorpo 8E12 e/ou 13G5. Tais anticorpos concorrentes podem ser obtidos pela separação de sobrenadantes dos hibridoma anti- OX40L para ligação ao imobilizado OX40L em competição com o anticorpo 8E12 marcado e/ou 13G5. Um sobrenadante do hibridoma contendo um anticorpo concorrente reduzirá a quantidade do anticorpo marcado ligado, detectado na mistuta de ligação de competição do sujeito quando comparado à quantidade de anticorpo marcado ligado, detectado em uma mistura de ligação controle contendo (ou não) o anticorpo irrelevante. Qualquer um dos testes de ligação de competição descritos no presente pedido é adequado para uso nos procedimentos dispostos acima.

Os anticorpos anti-OX40L da presente invenção que possuem as propriedades descritas no presente pedido podem ser obtidos pela separação dos clones de hibridoma para as propriedades desejadas por qualquer método conveniente. Por exemplo, se um anticorpo monoclonal anti-OX4C)L que bloqueia ou não a ligação do receptor 0X40 ao 0X40 L é desejado, o anticorpo candidato pode ser testado em um teste de competição de ligação, como ELISA de ligação competitiva, em que os poços das placas são revestidos com OX40L, e a solução do anticorpo com excesso de receptor 0X40 é colocada em camadas nas placas revestidas, e o anticorpo ligado é detectado enzimaticamente, por exemplo, contatando o anticorpo ligado com anticorpo anti-lg conjugado com HRP ou anticorpo anti-lg biotinilado, e revelando a reação de cor HRP, por exemplo, pela revelação das placas com estreptavidina-HRP/ou peróxido de hidrogênio e detectando a reação de cor HRP por espectrofotometria a 490 nm com um leitor de placa ELISA.

Se um anticorpo anti-OX4ÜL que inibe a ativação OX40L é desejado, o anticorpo candidato pode ser testado em um ensaio que detecta a sinalização da via OX40L ou sinalização da via 0X40, como um ensaio de sinalização NFkB. Tais testes são conhecidos na técnica. Outros testes funcionais para determinar a capacidade inibitória de anticorpos anti-OX40L são conhecidos na técnica, alguns dos quais estão exemplificados no presente pedido.

Em algumas realizações, a presente invenção contempla anticorpos alterados que possuem algumas, mas não todas as funções efetoras, que fazem deste um candidato desejável para muitas aplicações nas quais a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funções efetoras (como complemento e ADCC) não necessárias ou deletérias. Em certas realizações, as atividades Fc da imunoglobulina produzida são medidas para assegurar que somente as propriedades desejadas sejam mantidas. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, testes de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo seja desprovido de ligação ao FcyR (então provavelmente sendo desprovido de atividade ADCC), mas mantenha capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediação de ADCC, células NK, expressam somente Fc(RIII, enquanto que monócitos expressam Fc(RI, Fc(RII e Fc(RIII. A expressão FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Um exemplo de um ensaio in vitro para avaliar atividade ADCC de uma molécula de interesse está descrito na patente US 5.500.362 ou 5.821.337. Células efetoras úteis para tais testes incluem células mononucleares de sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como divulgado em Clynes et ai. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). Testes de ligação C1q podem também ser - realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e então é desprovido de atividade de CDC. Para avaliar ativação de complemento, um teste CDC1 por exemplo, como descrito em Gazzano-Santoro et ai, J. Immunol. Methods 202:163 (1996), pode ser realizado. Ligação FcRn e determinações de liberação/meia vida in vivo podem também ser realizadas usando-se métodos conhecidos na técnica.

Em algumas realizações, a presente invenção fornece anticorpos alterados que possuem funções efetoras aumentadas e/ou meia-vida aumentada.

Vetores. Células Hospedeiras E Métodos Recombinantes

Para produção de um anticorpo recombinante da presente invenção, o ácido nucléico de codificação é isolado e inserido em um vetor replicante para posterior clonagem (amplificação do DNA) ou para expressão. 0 DNA que codifica o anticorpo é facilmente isolado e sequenciado usando-se procedimentos convencionais (por exemplo, pelo uso de sondas de oligonucleotídeo que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias ieves e pesadas do anticorpo). Muitos vetores estão disponíveis. A escolha do vetor depende em parte da célula hospedeira a ser usada. Geralmente, células hospedeiras preferidas são tanto de origem procarionte como eucarionte (geralmente de mamíferos). Será apreciado que regiões constantes de qualquer isótipo possam ser usadas para este propósito, incluindo regiões constantes IgG, IgM, IGA, IgD e IgE, e tais regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal.

a.Geração De Anticorpos Usando-se Células Hospedeiras Procariontes

I. Construção Do Vetor

Seqüências de polinucleotídeo que codificam componentes polipeptídicos do anticorpo da presente invenção podem ser obtidas usando-se técnicas de recombinação padrão. Seqüências de polinucleotídeos desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células que produzem anticorpo, como células de hibridoma. Alternativamente, polinucleotídeos podem ser sintetizados usando-se sintetizador de nucleotídeo ou técnicas de PCR. Uma vez obtidas, as seqüências que codificam os polipeptídeos são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressar polinucleotídeos heterólogos em hospedeiros procariontes. Muitos vetores que estão disponíveis e conhecidos na técnica podem ser usados para o propósito da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado será principalmente dependente do tamanho dos ácidos nucléicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira específica a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão de polinucleotídeo heterólogo, ou ambas) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira específica na qual reside. Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão limitados a: uma origem de replicação, um gene marcador de seleção, um promotor, um sítio de ligação de ribossomo (RBS)1 uma seqüência sinal, um inserto heterólogo de ácido nucléico e uma seqüência de terminação de transcrição.

Em geral, vetores plasmídeos que contêm replicon e seqüências de controle que são derivadas de espécies compatíveis com a célula hospedeira são usados em conexão com estes hospedeiros. O vetor geralmente carrega um sítio de replicação, assim como seqüências marcadoras que são capazes de fornecer seleção fenotípica em células transformadas. Por exemplo, E. coli é tipicamente transformada usando-se pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie E. coli. pBR322 contém genes que codificam resistência à ampicilina (Amp) e à tetraciclina (Tet) e assim fornece meios fáceis para identificar as células transformadas. pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos ou bacteriófago microbiais também podem conter, ou serem modificados para conter promotores que podem ser usados pelo organismo * microbial para expressão de proteínas endógenas Exemplos de pBR322 derivados usados para expressão de anticorpos específicos estão descritos em detalhes em Carter et ai, patente US 5.648.237.

Além disto, vetores de fago que contêm replicon e seqüências controle que são compatíveis com o microorganismo hospedeiro podem ser usados como vetores de transformação em conexão com estes hospedeiros.

Por exemplo, bacteriófagos como ÀGEM.TM.-11 pode ser utilizado na fabricação de um vetor recombinante que pode ser usado para transformar células hospedeiras suscetíveis como E. coli LE392.

O vetor de expressão da presente invenção pode compreender dois ou mais pares de promotor-cístron, que codificam cada um dos componentes do polipeptídeo. Um promotor é uma seqüência reguladora não traduzida localizado a montante (5') para um cístron que modula sua expressão. Promotores procariontes tipicamente situam-se em duas classes, induzível e constitutivo. Promotor induzível é um promotor que inicia o aumento dos níveis de transcrição do cístron sob seu controle na resposta para mudanças na condição da cultura, por exemplo, a presença ou ausência de um nutriente ou uma mudança na temperatura.

Um amplo número de promotores reconhecidos por uma variedade de células hospedeiras potenciais é bem conhecido. O promotor selecionado pode estar operacionalmente ligado ao cístron do DNA que codifica a cadeia leve ou pesada pela remoção do promotor da fonte de DNA, via enzima de restrição de digestão e inserção da seqüência do promotor isolada no vetor da presente invenção. Ambos, seqüência do promotor nativo e muitos promotores heterólogos, podem ser usados para amplificação e/ou expressão direta dos genes alvo. Em algumas realizações, promotores heterólogos são utilizados, já que eles geralmente permitem maior transcrição e alta produção do gene alvo expresso, quando comparado ao promotor polipeptídico alvo nativo.

Promotores adequados para uso em hospedeiros procariontes incluem o promotor PhoA, os sistemas promotores β-galactamase e lactose, um sistema promotor triptofano (trp) e promotores híbridos como o promotor tac ou o trc. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactéria (como outros promotores bacterianos ou fagos conhecidos) são também adequados. Suas seqüências de nucleotídeo foram publicadas, com isso permitindo a um técnico no assunto ligá-los operacionalmente a cístrons que codificam as cadeias alvo leve e pesada (Siebenlist et ai (1980) Cell 20: 269) usando-se Iigantes ou adaptadores para fornecer qualquer sítio de restrição necessário.

Em um aspecto da presente invenção, cada cístron no vetor recombinante compreende um componente de seqüência sinal de secreção que direciona translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a seqüência sinal pode ser um componente do vetor, ou esta pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo alvo que é inserido no vetor. A seqüência sinal selecionada para o propósito da presente invenção deve ser aquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeiras procariontes que não reconhecem e processam as seqüências sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a seqüência sinal é substituída por uma seqüência sinal procarionte selecionada, por exemplo, do grupo que consiste de fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes enterotoxina Il (STII) estáveis ao calor, LamB, PhoE1 PeIB, OmpA e MBP. Em uma realização da presente invenção, as seqüências sinal usadas em ambos os cístrons do sistema de expressão são seqüências sinal STII ou variantes destas.

Em outro aspecto, a produção das imunoglobulinas de acordo com a presente invenção pode ocorrer no citoplasma da célula hospedeira, e então não necessita da presença das seqüências sinal de secreção em cada cístron. Nesta consideração, imunoglobulinas de cadeias leve e pesada são J expressas, dobradas e montadas para formar imunoglobulinas funcionais no citoplasma. Certas linhagens de hospedeiros (por exemplo, as linhagens E. coli trxB) fornecem condições no citoplasma que são favoráveis para formação de pontes bissulfeto, com isso permitindo a dobra e montagem apropriadas das subunidades de proteína expressa. Proba e Pluckthun Gene, 159:203 (1995).

Células hospedeiras procariontes adequadas para expressar anticorpos da presente invenção incluem Archaebacteria e Eubacteria, como organismos Gram negativos ou Gram positivos. Exemplos de bactérias úteis incluem Escherichia (por exemplo, E. coli), Bacilli (por exemplo, B. subtilis), Enterobacteria, espécie Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa), Salmonella typhimurium, Serratia marcescans, Klebsiella, Proteus, Shigella, Rhizobia, Vitreoscilla, ou Paracoccus. Em uma realização, células gram negativas são usadas. Em uma realização, células de E. coli são usadas como hospedeiros para a presente invenção. Exemplos de linhagens de E. coli incluem linhagem W3110 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), páginas. 1190- 1219; depósito ATCC No. 27.325) e derivadas destas, incluindo linhagem 33D3 tendo genótipo W3110 AfhuA (AtonA) ptr3 Iac Iq lacL8 AompTA(nmpc-fepE) degP41 kanR (patente US 5.639.635). Outras linhagens e derivadas destas, como E. coli 294 (ATCC 31.446), E. coli Β, E. coliX 1776 (ATCC 31.537) e E. coli RV308(ATCC 31.608) são também adequadas. Estes exemplos são mais ilustrativos do que limitantes. Métodos para construção de derivados de qualquer uma das bactérias acima mencionadas que têm genótipos definidos são conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, e Bass et ai, Proteins, 8:309-314 (1990). Geralmente é necessário selecionar a bactéria apropriada levando em consideração a replicabilidade do replicon nas células de uma bactéria. Por exemplo, espécies E coli, Serratia ou Salmonella podem ser adequadas para serem usadas como hospedeiras quando plasmídeos bem J conhecidos tais como pBR322, pBR325, pACYC177, ou pKN410 são usados para suprir o replicon. Tipicamente a célula hospedeira deve secretar quantidades mínimas de enzimas proteolíticas, e inibidores de protease adicionais podem, de forma desejável, ser incorporados na cultura celular.

li. Produção De Anticorpo

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão descritos acima e cultivadas em meio convencional de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

Transformação significa introdução de DNA no hospedeiro procarionte de forma que o DNA seja replicável, tanto como um elemento extracromossomal ou por integrante cromossomal. Dependendo da célula hospedeira usada, a transformação é feita usando-se técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento de cálcio que emprega cloreto de cálcio é geralmente usado para células bacterianas que contêm barreiras substanciais na parede celular. Outro método para transformação emprega polietilenoglicol/DMSO. Ainda outra técnica usada é a eletroporação.

Células procariontes usadas para produzir os polipeptídeos da presente invenção são cultivadas em meio conhecido na técnica e adequado para cultura de células hospedeiras selecionadas. Exemplos de meios adequados incluem caldo Luria (LB) mais suplementos de nutrientes necessários. Em algumas realizações, o meio também contém um agente de seleção, escolhido baseado na construção do vetor de expressão, para seletivamente permitir crescimento de células procariontes que contém o vetor de expressão. Por exemplo, ampicilina é adicionada no meio para crescimento de células com genes que expressam resistência à ampicilina.

Qualquer suplemento necessário além de fontes de carbono, nitrogênio e fosfato inorgânico pode também ser incluído em concentrações s apropriadas, introduzido sozinho ou como uma mistura com outro suplemento ou meio como uma fonte de nitrogênio complexa. Opcionalmente o meio de cultura pode conter um ou mais agentes de redução selecionados do grupo que consiste de glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol.

As células hospedeiras procariontes são cultivadas em temperaturas adequadas. Para o crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia de aproximadamente 20°C até cerca de 39°C, mais preferivelmente de aproximadamente 25°C até cerca de 37°C, até mais preferivelmente aproximadamente 30°C. O pH do meio pode ser qualquer variação de pH de aproximadamente 5 para cerca de 9, dependendo principalmente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é preferivelmente de aproximadamente 6,8 para cerca de 7,4, e mais preferivelmente cerca de 7,0.

Se um promotor induzível é usado no vetor de expressão da presente invenção, a expressão de proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Em um aspecto da presente invenção, promotores PhoA são usados para controlar transcrição dos polipeptídeos. Consequentemente, as células hospedeiras transformadas são cultivadas em um meio fosfato limitante para indução. Preferivelmente, o meio de fosfato Iimitante é o meio C.R.A.P (ver, por exemplo, Simmons et a/., J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147). Uma variedade de outros indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregada, como é conhecido na técnica.

Em uma realização, os polipeptídeos expressados da presente invenção são secretados em e recuperados do periplasma das células hospedeiras. A recuperação de proteína tipicamente envolve o rompimento do microorganismo, geralmente por tais meios como choque osmótico, sonicação ou lise. Uma vez que as células são rompidas, fragmentos de células ou células inteiras podem ser removidos por centrifugação ou filtração. As proteínas podem também ser purificadas, por exemplo, por cromatografia de afinidade em resina. Alternativamente, as proteínas podem ser transportadas para o meio de cultura e isolada neste. As células podem ser removidas da cultura e a cultura sobrenadante ser filtrada e concentrada para posterior purificação das proteínas produzidas. Os polipeptídeos expressados podem ser posteriormente isolados e identificados usando-se comumente métodos conhecidos como eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e teste Western blot.

Em um aspecto da presente invenção, a produção de anticorpo é conduzida em ampla quantidade por um processo de fermentação. Vários processos de fermentação de batelada em larga escala estão disponíveis para a produção de proteínas recombinantes. Fermentações em larga escala possuem pelo menos 1.000 litros de capacidade, preferivelmente aproximadamente de 1.000 a 100.000 litros de capacidade. Estes fermentadores usam agitadores de impulsão para distribuir oxigênio e nutrientes, especialmente glicose (a fonte preferida de carbono/energia). Fermentação em pequena escala refere-se geralmente à fermentação em um fermentador que não tem mais do que aproximadamente 100 litros em capacidade de volume, e pode variar de aproximadamente 1 litro para cerca de 100 litros.

Em um processo de fermentação, a indução de expressão de proteína é tipicamente iniciada depois das células terem crescido sob condições adequadas para uma densidade desejada, por exemplo, um OD550 de aproximadamente 180-220, no qual os estágios das células são de fase estacionária primária. Uma variedade de indutores pode ser usada, de acordo com a construção do vetor empregada, como é conhecido na técnica e descrito acima. Células podem ser cultivadas por períodos mais curtos antes da indução. As células são usualmente induzidas por aproximadamente 12-50 horas, no entanto tempos de indução mais longos ou mais curtos podem ser usados.

Para aprimorar o rendimento da produção e a qualidade dos polipeptídeos da presente invenção, várias condições de fermentação podem ser modificadas. Por exemplo, para aprimorar a montagem e dobras apropriadas dos polipeptídeos do anticorpo secretado, vetores adicionais que superexpressam proteínas chaperonas, como proteínas Dsb (DsbA, DsbB1 DsbC1 DsbD e ou DsbG) ou FkpA (um peptidilprolil eis, trans-isomerase com atividade chaperona) podem ser usados para co-transformar a célula procarionte hospedeira. Foi demonstrado que as proteínas chaperonas facilitam a dobra e solubilidade apropriada de proteínas heterólogas produzidas em células bacterianas hospedeiras. Chen et al. (1999) J Bio Chem 274:19601-19605; Georgiou et al., patente US 6.083.715; Georgiou et al., patente US 6.027.888; Bothmann e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100- 17105; Ramm e Pluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113; Arie et al. (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210.

Para minimizar proteólises de proteínas heterólogas expressadas (especialmente aquelas que são proteoiiticamente sensíveis), certas linhagens de células hospedeiras deficientes de enzimas proteolíticas podem ser usadas para a presente invenção. Por exemplo, linhagens de células hospedeiras podem ser modificadas para efetuar mutação(ões) genética(s) em genes que codificam proteases bacterianas conhecidas como Protease III, OmpT, DegP, Tsp, Protease I, Protease Mi, Protease V, Protease Vl e combinações destas. Algumas linhagens d e E. coli de ficientes em protease estão disponíveis e descritas, por exemplo, em Joly et al. (1998), acima; Georgiou et al., patente US 5.264.365, Georgiou et al., patente US 5.508.192; Hara et al., Microbial Drug Resistance, 2:63-72 (1996).

Em uma realização, linhagens de E. coli deficientes em enzimas proteolíticas e transformadas com plasmídeos que superexpressam uma ou mais proteínas chaperonas são usadas como células hospedeiras no sistema de expressão da presente invenção. III. Purificação De Anticorpo

Métodos de purificação de proteína padrão conhecidos na técnica podem ser empregados. Os procedimentos a seguir são procedimentos de purificação adequados exemplares: fracionamento em imunoafinidade ou colunas de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica ou em resina de troca catiônica como DEAE1 chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação com sulfato de amônia, e filtração 1 em gel usando-se, por exemplo, Sephadex G-75.

Em um aspecto, a Proteína A imobilizada em uma fase sólida é usada para purificação de imunoafinidade dos produtos anticorpo completo da presente invenção. A Proteína A é uma proteína com parede celular de 41 kD de Staphylococcus aureus que se liga com uma alta afinidade a uma região Fc dos anticorpos. Lindmark et al (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13. A fase sólida na qual a Proteína A é imobilizada é preferivelmente uma coluna que compreende um vidro ou superfície de sílica, mais preferivelmente uma coluna de vidro poroso controlada ou uma coluna de ácido silícico. Em algumas aplicações, a coluna foi coberta com um reagente, como glicerina, na tentativa de prevenir aderências não específicas de contaminantes.

Como primeiro passo de purificação, a preparação derivada da cultura celular como descrita acima é aplicada na fase sólida imobilizada de Proteína A para permitir ligação específica do anticorpo de interesse à Proteína A. A fase sólida é então lavada para remover contaminantes especificamente não ligados à fase sólida. Finalmente o anticorpo de interesse é recuperado da fase sólida por eluição.

B. Geração De Anticorpos Usando-Se Células Hospedeiras Eucariontes

Os componentes do vetor geralmente incluem, mas não estão - limitados a, um ou mais dos seguintes: uma seqüência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento enhancer, um promotor, e uma seqüência de terminação de transcrição.

(I) Componente Seqüência Sinal

Um vetor para uso em uma célula hospedeira eucarionte pode também conter uma seqüência sinal ou outro polipeptídeo que tem um sítio de clivagem específico no N-terminal da proteína madura ou polipeptídeo de interesse. A seqüência sinal heteróloga selecionada preferivelmente é aquela reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase sinal) pela célula hospedeira. Na expressão em células de mamíferos, a seqüência sinal de mamíferos, bem como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

O DNA para tal região precursora é ligado no quadro de leitura ao DNA que codifica o anticorpo.

(II) Origem De Replicação

Geralmente, um componente origem de replicação não é necessário para vetores de expressão em mamíferos. Por exemplo, a origem SV40 pode tipicamente ser usada somente porque esta contém o promotor primário.

(III) Seleção Do Componente Gene

Vetores de expressão e clonagem podem conter um gene de seleção, também chamado de marcador selecionável. Genes de seleção típicos que codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, quando relevante, ou (c) suprimento de nutrientes críticos não disponíveis a partir de meios complexos.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga para interromper o crescimento de uma célula hospedeira. Essas células que são - sucessivamente transformadas com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência à droga e, dessa forma, sobrevive ao regime de seleção. Exemplos de tal seleção dominante usam as drogas neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Outro exemplo de marcadores de seleção adequados para as células de mamíferos são aqueles capazes de identificar células competentes para ocupar o ácido nucléico do anticorpo, como DHFR1 timidina quinase, metalotioneína-l e -II, preferivelmente genes da metalotioneína de primatas, adenosina desaminase, ornitina decarboxilase, etc.

Por exemplo, células transformadas com a seleção de genes DHFR são as primeiras identificadas por cultura de todos os transformantes em

um meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando o DHFR tipo selvagem é empregado é a linhagem celular ovariana de hamster Chinês (CHO) deficiente na atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmente hospedeiros tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ou co- transformadas com seqüências de DNA que codificam um anticorpo, proteína DHFR tipo selvagem, e outro marcador selecionável como aminoglicosídeo 3'- fosfotransferase (APH) pode ser selecionado pelo crescimento celular em um meio que contém um agente de seleção para o marcador selecionável como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Ver patente US 4.965.199.

(iv) Componente Promotor Vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e é operacionalmente ligado ao ácido nucléico do polipeptídeo do anticorpo. Seqüências promotoras são conhecidas para eucariontes. Virtualmente todos os genes eucariontes - têm uma região rica em AT localizada aproximadamente de 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra seqüência encontrada de 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maioria dos genes eucariontes está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adição da cauda poli A à extremidade 3' da seqüência de codificação. Todas estas seqüências são adequadamente inseridas em vetores de expressão de eucariontes.

A transcrição de polipeptídeo de anticorpo a partir de vetores em células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, por promotores obtidos de genomas de vírus, como vírus polioma, vírus fowlpox, adenovírus (como Adenovirus 2) vírus de papiloma bovino, vírus de sarcoma de aves, citomegalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite-B e Vírus Simian 40 (SV40), de promotores heterólogos de mamíferos, por exemplo, o promotor actina ou um promotora imunoglobulina, de promotores heat-shock, tais promotores fornecidos são compatíveis com os sistemas da célula hospedeira.

Os promotores de início e final do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição SV40 que também contém a origem de replicação viral SV40. O promotor de início imediato de um citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para expressão de DNA em mamíferos hospedeiros usando-se o vírus papiloma bovino como um vetor é divulgado na patente US 4.419.446. Uma modificação deste sistema está descrita na patente US 4.601.978. Alternativamente, a terminação longa repetida do Vírus do Sarcoma de Rous pode ser usada como promotor.

(v) Componente Elemento Enhancer

A transcrição do DNA que codifica o polipeptídeo do anticorpo da presente invenção por eucariontes mais evoluídos é freqüentemente aumentada pela inserção de uma seqüência enhancer no vetor. Muitas seqüências enhancer são agora conhecidas por meio de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, α-fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, poderá ser usado um enhancer de um vírus de célula eucarionte. Exemplos incluem o enhancer SV40 no último lado da origem de replicação (bp 100-270), o enhancer do promotor de início do citomegalovírus, o enhancer polioma no último lado da origem de replicação e enhancers de adenovírus. Ver também Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) nos elementos enhancing para ativação de promotores de eucariontes. O enhancer pode ser ligado no vetor na posição 5' ou 3' à seqüência de codificação do polipeptídeo do anticorpo, mas está preferivelmente localizado em um sítio 5' do promotor.

(vi) Componente Terminação De Transcrição

Vetores de expressão usados em célula hospedeiras eucariontes tipicamente também irão conter seqüências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilização do mRNA. Tais seqüências estão comumente disponíveis nas regiões não traduzidas 5', ocasionalmente 3' de eucariontes ou DNAs virais ou cDNAs Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica um anticorpo. Um componente da terminação de transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio de crescimento bovino. Ver documento WO 94/11026 e o vetor de expressão divulgado no presente pedido.

(vil) Seleção E Transformação De Células Hospedeiras

Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão do DNA nos vetores no presente pedido incluem células eucariontes mais evoluídas descritas no presente pedido, incluindo células hospedeiras de vertebrados. A propagação de células de vertebrados na cultura (cultura de tecido) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linhagens de célula hospedeira de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco - transformadas por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham et ai, J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de rim de filhotes de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células ovarianas de hamster Chinês/-DHFR (CHO, Urlaub et ai, Proc. Nati Acad. Sei. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de camundongo (TM4, Mather1 Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humana (HELA, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou de clonagem descritos acima para produção de anticorpo, e cultivadas em meio convencionai de nutriente modificado como apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes ou amplificar os genes que codificam as seqüências desejadas.

(viu) Cultura De Células Hospedeiras

As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo desta invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Meios comercialmente disponíveis como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM)1 (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Modificado de Eagle de Dulbecco ((DMEM)1 Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disto, qualquer dos meios descritos em Ham et ai, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et ai, Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes US 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; documentos WO - 90/03430; WO 87/00195; ou na patente US Re. 30.985 podem ser usados como meios de cultura para as células hospedeiras. Quaisquer destes meios podem ser suplementados como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidermal), sais (como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (como adenosina e timidina), antibióticos (como droga GENTAMYCIN™), elementos traço (definido como componentes inorgânicos usualmente presentes na concentração final na faixa micromolar) e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento necessário pode também ser incluído na concentração apropriada que seriam conhecidas para aqueles técnicos no assunto. As condições de cultura, como temperatura, pH e similares, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para um técnico no assunto.

(ix) Purificação De Anticorpo

Quando se utilizam técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido intracelularmente, ou diretamente secretado em um meio. Se o anticorpo é produzido intracelularmente, como um primeiro passo, o fragmento particulado, tanto das células hospedeiras como fragmentos lisados, são removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Quando o anticorpo é secretado no meio, sobrenadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiramente concentrados usando-se um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído em qualquer dos passos antecedentes para inibir proteólises e antibióticos podem ser incluídos para prevenir o crescimento de contaminantes imprevistos.

A composição de anticorpo preparada das células pode ser purificada usando-se, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com cromatografia por afinidade sendo a técnica de purificação preferida. A adequação da proteína A como um Iigante de afinidade depende da espécie e isótopos de qualquer imunoglobulina de domínio Fc que está presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados em cadeias pesadas γ1, γ2, ou γ4 humana (Lindmark et ai, J. Immunol. Meth. 62:1- 13 (1983)). A proteína G é recomendada para todos os isótopos de camundongo e para γ3 humano (Guss et ai, EMBO J. 5:15671575 (1986)). A matriz para a qual o Iigante de afinidade é anexado é mais freqüentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis como vidro poroso controlado ou poli(estireno-divinil)benzeno permitem velocidades de fluxo mais rápidas e tempos de processo mais curtos do que pode ser atingido com agarose. Quando o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para purificação de proteína como fracionamento em uma coluna de troca iônica, precipitação em etanol, HPLC Fase Reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™, cromatografia em uma resina de troca de ânion ou cátion (como uma coluna de ácido poliaspártico), chromatofocusing, SDS-PAGE, precipitação em sulfato de amônia estão também disponíveis, dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Seguindo qualquer etapa de purificação preliminar, a mistura que compreende o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser sujeita a cromatografia de interação hidrofóbica em baixo pH usando-se uma eluição de tampão a um pH de aproximadamente 2,5-4,5, preferivelmente apresentada em baixas concentrações de sal (por exemplo, de aproximadamente 0-0,25M de sal).

Imunoconjugados

A invenção também fornece imunoconjugados (alternativamente chamados "conjugados anticorpo-droga" ou "ADC"), que compreendem qualquer um dos anticorpos anti-QX40L descritos no presente pedido, conjugados a qualquer um dos agentes citotóxicos, como um agente quimioterápico, uma droga, um agente inibitório do crescimento, uma toxina (por exemplo, uma toxina ativa enzimaticamente de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos destas) ou um isótopo radioativo (isto é, uma radioconjugação).

O uso de conjugados anticorpo-droga para a entrega local de agentes citotóxicos ou citostáticos, isto é, drogas para destruir ou inibir células tumorais no tratamento de câncer (Syrigos e Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz e Springer (1997) Adv. Drg Del. Acelere. 26:151-172; patente US 4.975.278) permite entrega direcionada do componente droga para tumores, e acumulação intracelular nestes, onde a administração sistêmica destes agentes droga não conjugados podem resultar em um nível inaceitável de toxicidade para células normais,bem como para células de tumor procuradas para serem eliminadas (Baldwin et ai, (1986) Lancet páginas (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) "Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Câncer Therapy: A Review," em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, A. Pinchera et ai (ed.s), páginas 475-506). A máxima eficiência com mínima toxicidade é procurada através disso. Tanto os anticorpos policlonais como anticorpos monoclonais foram relatados como úteis nestas estratégias (Rowle et ai, (1986) Câncer Immunol. Immunother., 21:183-87). As drogas usadas nestes métodos incluem daunomicina, doxorrubicina, metotrexato e vindesina (Rowle et ai, (1986) acima). Toxinas usadas nos conjugados anticorpo-toxina incluem toxinas bacterianas como toxina de difteria, toxinas vegetais tais como rícino, toxinas de molécula pequena como geldanamicina Mandler et al. (2000) Jour. of the Nat. Câncer Inst. 92(19): 1573-1581; Mandler et ai (2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters - 10:1025-1028; Mandler et al. (2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791), maitansinoides (EP 1391213; Liu et ai, (1996) Proc. Nati Acad. Sei. USA 93:8618-8623), e caliqueamicina (Lode et al. (1998) Câncer Res. 58:2928; Hinman et ai (1993) Câncer Res. 53:3336-3342). As toxinas podem realizar seus efeitos citotóxicos e citostáticos por mecanismos que incluem ligação de tubulina, ligação de DNA ou inibição de topoisomerase. Algumas drogas citotóxicas tendem a ser inativas ou menos ativas quando conjugadas com grandes anticorpos ou proteína do receptor ligante.

ZEVALIN® (ibritumomab tiuxetano, Biogen/ldec) é um anticorpo- radioisótopo conjugado composto de um anticorpo monoclonal kappa IgG1 murino direcionado contra o antígeno CD20 encontrado na superfície de linfócitos B normal e maligno e radioisótopos 111In ou 90Y ligados por uma tioureia ligante quelada (Wiseman et al (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766- 77; Wiseman et al (2002) Blood 99(12):4336-42; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63; Witzig et al (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69). Embora ZEVALIN possua atividade contra Linfoma não Hodgkin de célula-B (NHL), a administração resulta em citopenias severas e prolongadas na maioria dos pacientes. MYLOTARG™ (gemtuzumab ozogamicina, Wyeth Pharmaceuticals), um conjugado anticorpo droga composto de um anticorpo hu CD33 ligado à caliqueamicina, foi aprovada em 2000 para o tratamento de leucemia mieloide aguda por injeção (Drugs ofthe Future (2000) 25(7):686; nas patentes US 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001). Cantuzumab mertansina (Immunogen, Inc.), um anticorpo conjugado com droga composto de anticorpo huC242 ligado a uma via ligante SPP bissulfeto ao componente droga maitansinoide, DM1, está avançada nos testes de Fase II para o tratamento de cânceres que expressam CanAg, como de cólon, pancreático, gástrico e outros. MLN-2704 (Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.), um anticorpo conjugado com droga composto de antígeno de membrana específico anti-próstata (PSMA) e anticorpo monoclonal ligado ao componente droga maitansinoide, DM1, está em desenvolvimento para o tratamento potencial de tumores de próstata. Os peptídeos auristatina, auristatina E (AE) e monometilauristatina (MMAE), sintéticos análogos de dolastatina, foram conjugados a anticorpos monoclonais quiméricos cBR96 (específico para Lewis Y em carcinomas) e cAC10 (específico para CD30 em malignidades hematológicas) (Doronina et al (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784) e estão em desenvolvimento terapêutico.

Agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados estão descritos no presente pedido (por exemplo, acima). Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modeccina, alfa-sarcina, proteína Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII1 e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinaiis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem 212Bi, 131I1 131Inl 90Y e 186Re. Conjugados de anticorpo e agente citotóxico são feitos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como N- succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP)1 iminotiolano (IT)1 derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis- azido (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônio derivados (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como tolueno 2,6- diisocianato), e compostos bis-ativos de flúor (como 1,5-diflúor-2,4- - dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026.

Conjugados de um anticorpo e uma ou mais toxinas de molécula pequena, como uma caliqueamicina, maitansinóides, dolastatinas, aurostatinas, um tricoteceno e CC1065, e os derivados destas toxinas que possuem toxina ativa, são também contemplados no presente pedido.

i. Maitansina E Maitansinóides

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção (completo ou fragmentos), conjugado a uma ou mais moléculas maitansinóides.

Maitansinóides são inibidores mitóticos que agem por inibição da polimerização da tubulina. A maitansina foi isolada pela primeira vez do arbusto do Leste Africano Maytenus serrata (patente US 3.896.111). Subseqüentemente foi descoberto que certos micróbios também produzem maitansinóides, como maitansinol e ésteres de maitansinol C-3 (patente US 4.151.042). Maitansinol sintético e derivados e análogos destes estão divulgados, por exemplo, nas patentes US 4.137.230, 4.248.870, 4.256.746, 4.260.608, 4.265.814, 4.294.757, 4.307.016, 4.308.268, 4.308.269, 4.309.428, 4.313.946, 4.315.929, 4.317.821, 4.322.348, 4.331.598, 4.361.650, 4.364.866, 4.424.219, 4.450.254, 4.362.663 e 4.371.533.

Componentes droga maitansinóides são componentes droga atrativos em conjugados anticorpo-droga porque eles são: (i) relativamente acessíveis para preparar por fermentação ou modificação química, derivação de produtos de fermentação (ii) receptivos para derivação com grupos funcionais adequados para conjugação através de Iigantes não bissulfeto para - anticorpos (iii) estáveis no plasma e (iv) efetivos contra uma variedade de linhagens celulares tumorais. Imunoconjugados que contêm maitansinóides, métodos para fazer os mesmos e seus usos terapêuticos são divulgados, por exemplo, nas patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente Européia EP 0 425 235 B1, cujos relatórios descritivos são expressamente incorporados ao presente como referência. Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:8618-8623 (1996) descreveram imunoconjugados que compreendem um maitansinóide designado DM1 ligado ao anticorpo monoclonal C242 diretamente contra câncer coloretal humano. Foi descoberto que o conjugado é altamente citotóxico dirigido à cultura de células cancerosas de cólon, e mostrou ter atividade antitumoral em testes de crescimento de tumor in vivo. Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992) descrevem imunoconjugados no qual um maitansinóide foi conjugado via um ligante bissulfeto a um anticorpo murino A7 que se liga a um antígeno de linhagem celular cancerosa no cólon humano ou a outro anticorpo monoclonal murino TA.1 que se liga ao oncogene HER-2/neu.

A citotoxicidade do conjugado TA.1-maitansinóide foi testada in vitro em linhagem celular SK-BR-3 de câncer de mama humano, a qual expressa antígenos de superfície 3 χ 105 HER-2 por célula. A droga conjugada atingiu um grau de citotoxicidade similar à droga maitansinóide livre, a qual poderia ser aumentada para elevar o número de moléculas maitansinóide por molécula de anticorpo. O conjugado A7-maitansinóide mostrou baixa citotoxicidade sistêmica em camundongos.

Conjugados anticorpo-maitansinóides são preparados por ligações químicas em um anticorpo e uma molécula maitansinóide sem diminuição significante da atividade biológica tanto do anticorpo como da molécula maitansinóide. Ver, por exemplo, patente US 5.208.020 (a divulgação desta está expressamente incorporada ao presente como - referência). Em média de 3-4 moléculas maitansinóides conjugadas por molécula de anticorpo mostrou eficácia no aumento da citotoxicidade das células alvo sem afetar negativamente a função ou a solubilidade do anticorpo, no entanto poderia ser esperado que até uma molécula de toxina/anticorpo aumentasse a citotoxicidade acima daquela do anticorpo nu. Maitansinóides são bem conhecidos na técnica e podem ser sintetizados por técnicas conhecidas ou isolados a partir de fontes naturais. Maitansinóides adequados são divulgados, por exemplo, na patente US 5.208.020 e em outras patentes e publicações não patentes mencionadas acima. Maitansinóides preferidos são maitansinol e análogos do maitansinol modificados em um anel aromático ou em outras posições da molécula de maitansinol, como vários ésteres maitansinol.

Existem muitos grupos de ligação conhecidos na técnica para fazer conjugações anticorpo-maitansinóides, incluindo, por exemplo, aqueles divulgados na patente US 5.208.020 ou na patente EP 0 425 235 B1, e Chari et al., Câncer Research 52:127-131 (1992), e pedido de patente US 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004, as divulgações destas são expressamente incorporadas ao presente como referência. Conjugados anticorpo-maitansinóide que compreendem o componente Iigante SMCC podem ser preparados como divulgado no pedido de patente US 10/960.602, depositado em 8 de outubro de 2004. Os grupos de ligação incluem grupos bissulfeto, grupos tioéter, grupos de ácido lábil, grupos fotolábil, grupos lábil peptidase, ou grupos lábil esterase, como divulgado nas patentes acima identificadas, grupos bissulfeto e tioéter sendo preferidos. Grupos Iigantes adicionais estão descritos e exemplificados no presente pedido.

Conjugados do anticorpo e maitansinóide podem ser feitos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativo (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), bis-azido combinados (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônio derivados (como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato), e bis-ativo flúor combinados (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Agentes de acoplamento particularmente preferidos para fornecer uma ligação bissulfeto incluem N- succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) (Carlsson et ai, Biochem. J. 173:723-737 [1978]) e N-succinimidil-4-(2-piridiltio)pentanoato (SPP).

O ligante pode ser anexado à molécula maitansinóide em várias posições, dependendo do tipo de ligação. Por exemplo, um éster de ligação pode ser formado por reação com um grupo hidroxila usando-se técnicas convencionais de acoplamento. A reação pode ocorrer na posição C-3 que tem um grupo hidroxila, na posição C-14 modificada com hidroximetila, na posição C-15 modificada com um grupo hidroxila, e na posição C-20 que tem um grupo hidroxila. Em uma realização preferida, a ligação é formada na posição C-3 do maitansinol ou um análogo do maitansinol.

II. Auristatinas E Dolastatinas

Em algumas realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado a análogos peptídicos das dolastatinas ou dolostatinas e derivados, as auristatinas (patentes US. 5635483; 5780588). Dolastatinas e auristatinas mostraram não interferir com a dinâmica dos microtúbulos, hidrólise de GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al. (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12):3580-3584) e possuem atividade anticâncer (US 5663149) e antifúngica (Pettit et al (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965). O componente droga dolastatina ou auristatina pode ser anexado ao anticorpo através da terminação N (amina) ou terminação C (carboxila) do componente droga peptídica (documento WO 02/088172).

Realizações de auristatina exemplares incluem os componentes de droga monometilauristatina DE e DF, divulgados em "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US número de série 10/983.340, depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta está expressamente incorporada ao presente como referência.

Tipicamente, componentes de droga baseados em peptídeos podem ser preparados pela formação de uma ligação peptídica entre dois ou mais aminoácidos e/ou fragmentos peptídicos. Tais ligações peptídicas podem ser preparadas, por exemplo, de acordo com o método de síntese de fase líquida (ver E. Schrõder e K. Lübke, "The Peptides", volume 1, páginas 76-136, 1965, Academic Press) que é bem conhecido no campo da química de peptídeos. Os componentes droga auristatina/dolastatina podem ser preparados de acordo com os métodos das: patentes US 5635483, US 5780588; Pettit et al (1989) J. Am. Chem. Soe. 111:5463-5465; Pettit et al (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277; Pettit, G.R., et al. Synthesis, 1996, 719-725; e Pettit et al (1996) J. Chem. Soe. Perkin Trans. 1 5:859-863. Ver também Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7):778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US série número 10/983,340, depositada em 5 de novembro de 2004, incorporada ao presente em sua totalidade (divulgando, por exemplo, Iigantes e métodos de preparação de compostos monometilvalina tais como MMAE e MMAF conjugados a ligantes).

III. CALIQUEAMICINA

Em outras realizações, o imunoconjugado compreende um anticorpo da invenção conjugado a uma ou mais moléculas de caliqueamicina. A família de antibióticos caliqueamicina é capaz de produzir quebra na fita dupla de DNA em concentrações sub-picomolar. Para a preparação de conjugação da família caliqueamicina, ver patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001, 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company). Estruturas análogas de caliqueamicina que podem ser usadas incluem, mas não são limitadas para, y11, α2', a3', N-acetil-yv, PSAG e θ'ι (Hinman et al., Câncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode et ai, Câncer Research 58:2925-2928 (1998) e as patentes US para American Cyanamid supracitadas). Outra droga antitumoral que o anticorpo pode ser conjugado é QFA que é um antifolato. Ambas caliqueamicina e QFA têm sítios intracelulares de ação e não atravessam de imediato a membrana plasmática. j Então, a percepção celular destes agentes através da internalização mediada pelo anticorpo aumenta muito seus efeitos citotóxicos.

iv. Outros Agentes Citotóxicos

Outros agentes antitumorais que podem ser conjugados com os anticorpos da invenção incluem BCNU, estreptozoicina, vincristina e 5-flúor uracil, a família de agentes conhecida coletivamente como complexo LL- E33288 descrita nas patentes US 5.053.394, 5.770.710, assim como esperamicinas (patente US 5.877.296).

Toxinas enzimaticamente ativas e fragmentos destas que podem ser usadas incluem cadeia de difiteria A, fragmentos ativos não Iigantes de toxina de difiteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A da ricina, cadeia A da abrina, cadeia A da modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas da Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor carantia momordica, curcina, crotina, inibidor sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos. Ver, por exemplo, documento WO 93/21232 publicado em 28 de outubro de 1993.

A presente invenção, além disto, contempla um imunoconjugado formado entre um anticorpo e um componente com atividade nucleolítica (por exemplo, uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease, como uma desoxirribonuclease; DNase). Para destruição seletiva do tumor, o anticorpo pode compreender um átomo altamente radioativo. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de anticorpos radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P321,Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o conjugado é usado para detecção, pode compreender um átomo radioativo por estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um spin label para imagem de ressonância nuclear (NMR) (também conhecido como imagem de ressonância magnética, mri), tal como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolinio, manganês ou ferro.

O radio ou outros marcadores podem ser incorporarados no conjugado de maneiras conhecidas. Por exemplo, o peptídeo pode ser biosintetizado, ou pode ser sintetizado por síntese química de aminoácido usando-se aminoácidos precursores adequados envolvendo, por exemplo, flúor-19 no lugar de hidrogênio. Marcadores tal como tc99m ou I123, Re186, Re188 e In111 podem ser anexados via um resíduo de cisteína no peptídeo. ítrio-90 pode ser anexado via um resíduo de lisina. O método IODOGEN (Fraker et al (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80: 49-57 pode ser usado para incorporar iodo-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal1 CRC Press 1989) descreve outros métodos em detalhe.

Conjugados do anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando-se uma variedade de agentes de acoplamento de proteína de bifuncionais, como N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1 -carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (tal como dimetil adipimidato HCI), ésteres ativo (tal como disuccinimidil suberato), aldeídos (tal como glutaraldeído), bis-azido combinados (como bis (p-azidobenzoil) hexanediamina), bis-diazônio derivados (tal como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (tal como tolueno 2,6-diisocianato), e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-diflúor-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada como descrito em Vitetta et ai, Science 238:1098 (1987). Ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triamino pentaacético (MX-DTPA) marcado com carbono-14 é um agente quelante exemplar para conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Ver documento WO 94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável" que facilita a liberação da droga citotóxica na célula. Por exemplo, pode ser usado um ligante ácido lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et ai, Câncer Research 52:127- 131 (1992); patente US 5.208.020).

Os compostos da invenção expressamente contemplam, mas não estão limitados a, ADC preparado com reagentes reticulantes: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB1 SMCC, SMPB1 SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo- SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-viniisuifona)benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, por meio da Pierce Biotecnologia, Inc., Rockford, IL., E.U.A). Ver páginas 467-498, 2003-2004 Applications Handbook and Catalog.

v. Preparação De Conjugados Anticorpo-Droga

Nos conjugados anticorpo-droga (ADC) da invenção, um anticorpo (Ab) é conjugado com um ou mais componentes de droga (D), por exemplo, aproximadamente 1 para cerca de 20 componentes droga por anticorpo, através de um ligante (L). A ADC da Fórmula I pode ser preparada por diversas rotas, empregando reações de química orgânica, condições e reagentes conhecidos para aqueles técnicos no assunto, incluindo: (1) reação de um grupo nucleofílico de um anticorpo com um reagente ligante bivalente, para formar Ab-L, via uma ligação covalente, seguida por reação com um componente drogaD; e (2) reação de um grupo nucleofílico de um componente droga com um reagente Iigante bivalente, para formar D-L1 via uma ligação covalente, seguida por reação com o grupo nucleofílico de um anticorpo. Métodos adicionais para preparar ADC estão descritos no presente.

Ab-(L-D)p I

O Iigante pode ser composto de um ou mais componentes ligantes. Componentes Iigantes exemplares incluem 6-maleimidocaproil ("MC"), maleimidopropanoil ("MP"), valina-citrullina ("val-cit"), alanina- fenilalanina ("ala-phe"), p-aminobenziloxicarbonil ("PAB"), N-Succinimidil 4-(2- piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-Succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano- 1 carboxilato ("SMCC'), e N-Succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB"). Componentes ligantes adicionais são conhecidos na técnica e alguns estão descritos no presente pedido. Ver também "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", patente US número de série 10/983.340, depositada em 5 de novembro 2004, a divulgação desta está expressamente incorporada ao presente pedido como referência.

Em algumas realizações, o Iigante pode compreender resíduos de aminoácido. Componentes ligantes de aminoácido exemplares incluem um dipeptídeo, um tripeptídeo, um tetrapeptídeo ou um pentapeptídeo. Dipeptídeos exemplares incluem: valina-citrulina (vc ou val-cit), alanina- fenilalanina (af ou ala-phe). Tripeptídeos exemplares incluem: glicina-valina- citrulina (gly-val-cit) e glicina-glicina-glicina (gly-gly-gly). Resíduos de aminoácidos que compreendem um componente Iigante aminoácido incluem aqueles de ocorrência natural, bem como aminoácidos menores e análogos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente, como citrulina. Componentes ligantes aminoácido podem ser projetados e otimizados em sua seletividade para clivagem enzimática por uma enzima específica, por exemplo, uma protease associada a tumor, catepsina B, C e D, ou uma protease plasmina.

Grupos nucleofílicos nos anticorpos incluem, mas não estão limitados a: (i) grupos amina N-terminal, (ii) grupos amina de cadeia lateral, por exemplo, lisina, (iii) grupos tiol de cadeia lateral, por exemplo, cisteína, e (iv) grupos de açúcares hidroxila ou amina onde o anticorpo é glicosilado. Amina, tiol e grupos hidroxila são nucleofílicos e capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nos componentes ligantes e ligantes reagentes incluindo: (i) ésteres ativos tais como ésteres NHS, ésteres HOBt1 haloformatos, e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides tal como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxila e grupos maleimida. Certos anticorpos têm bissulfeto redutível entre cadeias, isto é, pontes de cisteína.

Anticorpos podem ser feitos por reação para conjugação com ligantes reagentes por tratamento com um agente de redução como DTT (ditiotreitol). Cada ponte de cisteína irá, dessa forma, teoricamente reagir com dois tióis nucleofílicos reativos. Grupos nucleofílicos adicionais podem ser introduzidos nos anticorpos através de reação de lisinas com 2-iminotiolano (reagente de Traut) que resulta em conversão de uma amina em um tiol. Grupos tiol reativos podem ser introduzidos no anticorpo (ou fragmento deste) pela introdução de um, dois, três, quatro ou mais resíduos cisteína (por exemplo, preparação de anticorpos mutantes que compreendem um ou mais resíduos de aminoácido cisteína não nativos).

Conjugados de droga-anticorpo da invenção podem também ser produzidos por modificações do anticorpo para introduzir componentes eletrofílicos, que podem reagir com o substituinte nucleofílico no reagente ligante ou droga. Os açúcares de anticorpos glicosilados podem ser oxidados, por exemplo, com reagentes oxidantes de periodato, para formar grupos aldeído ou cetona que podem reagir com o grupo amina de reagentes ligantes ou componentes droga. A resultante imina dos grupos de base de Schiff pode formar uma ligação estável, ou pode ser reduzida, por exemplo, por reagentes boroidrido para formar ligações amino estáveis. Em uma realização, a reação da porção carboidrato de um anticorpo glicosilado, tanto com galactose oxidase como metaperiodato de sódio pode produzir grupos carbonil (aldeído e cetona) na proteína que pode reagir com grupos apropriados na droga (Hermanson1 Bioconjugate Techniques). Em outra realização, proteínas que contêm serina N- terminal ou resíduos treonina podem reagir com metaperiodato de sódio, que resulta na produção de um aldeído no lugar do primeiro aminoácido (Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146; patente US 5362852). Tal aldeído pode reagir com um componente droga ou Iigante nucleofílico.

Igualmente, grupos nucleofílicos em um componente droga incluem, mas não estão limitados a: amina, tiol, hidroxila, hidrazido, oximo, hidrazino, tiosemicarbazona, hidrazino carboxilato, e grupos aril hidrazido capazes de reagir para formar ligações covalentes com grupos eletrofílicos nos componentes Iigantes e reagentes Iigantes incluindo: (i) ésteres ativos como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos, e ácidos alóides; (ii) alcila e benzil alóides como haloacetamidas; (iii) aldeídos, cetonas, carboxiia e grupos maleimida.

Alternativamente, uma proteína de fusão que compreende o anticorpo e agente citotóxico pode ser feita, por exemplo, por técnicas recombinantes ou síntese de peptídeo. O comprimento do DNA pode compreender respectivas regiões que codificam as duas porções da conjugação tanto adjacente uma a outra como separada por uma região que codifica um peptídeo Iigante o qual não destrói as propriedades desejadas do conjugado.

Em ainda outra realização, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (como estreptavidina) para utilização no tumor pré-direcionado em que a conjugação anticorpo receptor é administrada ao paciente, seguida por remoção do conjugado não ligado da circulação, usando-se um agente de limpeza e então administração de um "ligante" (por exemplo, avidina) que é conjugada a um agente citotóxico (por exemplo, um radionucleotídeo). Formulações Farmacêuticas

Formulações terapêuticas que compreendem um anticorpo da presente invenção são preparadas para armazenamento pela mistura do anticorpo que tem o grau desejado de purificação com veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizantes (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000)), na forma de formulações liofilizadas ou desidratadas. Veículos aceitáveis, excipientes ou estabilizantes são atóxicos para receptores na dosagem e concentrações empregadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, histidina e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos que aproximadamente 10 resíduos); proteínas, tais como soro de albumina, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons tais como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexo proteína-Zn); e/ou surfactantes não-iônicos tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietileno glicol (PEG).

A formulação no presente pedido pode também conter mais que um componente ativo, de acordo com o necessário para a indicação específica sendo tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não afetem contrariamente um ao outro. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação nas quantidades que são efetivas para o propósito pretendido. Os ingredientes ativos podem também ser capturados na microcápsula preparada, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsula de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas estão divulgadas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20a edição (2000).

As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membrana de filtração estéril.

Preparações de liberação contínua podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação contínua incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm a imunoglobuiina da invenção, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsula. Exemplos de matrizes de liberação contínua incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2- hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (patente US 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinil não degradável, copolímeros de ácido glicólico-ácido lático degradáveis tal como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas de copolímeros ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolido), e ácido poli- D-(-)- 3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros como acetato de etileno-vinil e ácido lático-ácido glicólico permitem liberação de moléculas por mais de 100 dias, certos hidrogéis liberam proteínas por períodos de tempo mais curtos. Imunoglobulinas quando encapsuladas permanecem no corpo por um longo - tempo, elas podem desnaturar ou agregar como um resultado da exposição a umidade a 37°C, que resulta em uma perda de atividade biológica e possíveis mudanças na imunogenicidade. Estratégias racionais podem ser desenvolvidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto como sendo de formação de ligação S-S intermolecular através de intercâmbio tio-bissulfeto, a estabilização pode ser alcançada por modificação de resíduos sulfidril, soluções ácidas de liofilização, controle da umidade do conteúdo, uso apropriado de aditivos, e desenvolvimento de composições de matriz de polímeroespecíficas.

Usos

Um anticorpo da presente invenção pode ser usado, por exemplo, em métodos terapêuticos in vitro, ex vivo e in vivo.

Em um aspecto, a invenção fornece métodos para tratar ou prevenir uma disfunção imune, os métodos que compreendem administração de uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-C)X40L a um sujeito em necessidade de tal tratamento. Em algumas realizações, a disfunção imune é uma disfunção imune. Em algumas realizações, a disfunção é uma disfunção auto-imune. Em algumas realizações, a disfunção é asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, esclerose múltipla, GVHD, e/ou lúpus eritematoso sistêmico. Em algumas realizações, a disfunção é uma doença associada com vírus, bactéria ou outro agente infeccioso. Ver pedido de patente US 2005/0069548 A1.

Além disso, pelo menos alguns dos anticorpos da invenção podem se ligar ao antígeno de outra espécie. Consequentemente, anticorpos da invenção podem ser usados para se ligar a uma atividade específica do antígeno, por exemplo, em uma cultura celular contendo o antígeno, em sujeitos humanos ou em outros sujeitos mamíferos que têm o antígeno com o qual um anticorpo da invenção interage (por exemplo, chimpanzé, babuíno, sagüi, cynomolgus e rhesus, porco ou camundongo). Em uma realização, um anticorpo da invenção pode ser usado para inibir atividades do antígeno pelo contato do anticorpo com o antígeno de forma que a atividade do antígeno seja inibida. Preferivelmente, o antígeno é uma molécula de proteína humana.

Em uma realização, um anticorpo da invenção pode ser usado em um método para se ligar a um antígeno em um sujeito que sofre de uma disfunção associada com o aumento da expressão e/ou atividade do antígeno, que compreende administrar ao sujeito um anticorpo da invenção, de forma que o antígeno no sujeito seja ligado. Preferivelmente, o antígeno é uma molécula de proteína humana e o sujeito é um sujeito humano.

Alternativamente, o sujeito pode ser um mamífero que expressa o antígeno com o qual um anticorpo da invenção se liga. Além disto, o sujeito pode ser ainda um mamífero no qual o antígeno foi introduzido (por exemplo, por administração do antígeno ou por expressão de um antígeno transgene). Um anticorpo da invenção pode ser administrado a um sujeito humano para propósitos terapêuticos. Além disto, um anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero não humano que expressa um antígeno com o qual a imunoglobulina interage (por exemplo, um primata, porco ou camundongo) para propósitos veterinários ou como um modelo animal de doença humana. Relativo ao último citado, tais modelos animais podem ser úteis para avaliar a eficácia terapêutica de anticorpos da invenção (por exemplo, teste de dosagens e períodos de administração).

Os anticorpos da invenção podem ser usados para tratar, inibir, adiar progressão, prevenir/atrasar recidiva, melhorar ou prevenir doenças, disfunções ou condições associadas com a expressão normal e/ou atividade de uma ou mais moléculas de antígeno.

Em certas realizações, um imunoconjugado que compreende um - anticorpo conjugado com um ou mais agentes citotóxicos é administrado ao paciente. Em algumas realizações, o imunoconjugado e/ou antígeno ao qual ele é ligado é/são internalizado(s) pela célula, resultando em um aumento da eficácia terapêutica do imunoconjugado na destruição da célula alvo à qual se liga. Em uma realização, o agente citotóxico atinge ou interfere no ácido nucléico na célula alvo. Em uma realização, o agente citotóxico atinge ou interfere na polimerização dos microtúbulos. Exemplos de tais agentes citotóxicos incluem qualquer um dos agentes quimioterápicos apontados no presente pedido (como um maitansinoide, auristatina, dolastatina ou uma caliqueamicina), um isótopo radioativo, ou uma ribonuclease ou uma DNA endonuclease.

Anticorpos da presente invenção podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outras composições na terapia. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode ser co-administrado com outro anticorpo, esteróides (como um esteróide sistêmico ou cutâneo inalável) agente(s) quimioterápico(s) (incluindo coquetéis de agentes quimioterápicos), outros agente(s) citotóxico(s), agente(s) anti-angiogênico(s), citocinas e/ou agente(s) inibidor(es) do crescimento. Tais terapias combinadas apontadas acima incluem administração combinada (quando dois ou mais agentes estão incluídos na mesma formulação ou separados), e administração separada, neste caso, administração do anticorpo da invenção pode ocorrer antes de, e/ou seguindo a administração da terapia ou terapias adjuntas. As quantidades efetivas dos agentes terapêuticos administrados em combinação com um anticorpo anti-EphB4 será de acordo com a discrição do médico ou veterinário. A administração e ajuste da dosagem são feitos para atingir o gerenciamento máximo das condições a serem tratadas. A dose, adicionalmente dependerá de tais fatores, como o tipo de agente terapêutico a ser usado e o paciente específico sendo tratado. Em certas realizações, a combinação dos inibidores potencializa a eficácia de um único inibidor. O termo "potencializa" refere-se a um aprimoramento na eficácia de um agente terapêutico na sua dose comum ou aprovada.

O anticorpo da ρ resente i nvenção (e agente terapêutico adjunto) é/são administrado(s) por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, subcutâneo, intraperitonial, intrapulmonar, e intranasal, e se desejado por tratamento local e administração intralesional. Infusões parenterais incluem intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitonial ou administração subcutânea. Além disso, o anticorpo é adequadamente administrado por infusão de pulso, especialmente com declínio de doses do anticorpo. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, tais como injeção intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breve ou crônica.

A composição do anticorpo da presente invenção será formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com as boas práticas médicas. Fatores para consideração neste contexto incluem a disfunção específica sendo tratada, o mamífero específico sendo tratado, a condição clínica individual do paciente, a causa da disfunção, o local de entrega do agente, o método de administração, o período de administração e outros fatores conhecidos pelo médico. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpos da invenção presente na formulação, o tipo da disfunção ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes geralmente são usados na mesma dosagem e com rotas de administração como previamente mencionado ou cerca de 1 a 99% das dosagens até agora empregadas.

Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com outros agentes, dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, a severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e resposta ao anticorpo, e a discrição do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 Mg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg-10mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para administração ao paciente, se, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas ou por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de aproximadamente 1 Mg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento é prolongado até ocorrer uma desejada supressão dos sintomas da doença Um dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de aproximadamente 0,05mg/Kg para cerca de 10mg/Kg. Dessa forma, uma ou mais doses de aproximadamente 0,5mg/kg, 2,0mg/kg, 4,0mg/kg ou 10mg/kg (ou qualquer combinação destas) pode ser administrada ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de forma que o paciente receba de duas a cerca de vinte, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Uma dose de carga inicial mais alta pode ser administrada, seguida de uma ou mais doses mais baixas. Um regime de dosagem exemplar compreende administração de uma dose de carga de aproximadamente 4 mg/kg, seguido por uma manutenção de dose semanal de aproximadamente 2 mg/kg do anticorpo. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser funcionais. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por testes e técnicas convencionais.

Os anticorpos anti-OX40L da presente invenção são úteis nos testes para detectar a expressão do OX40L (como testes diagnósticos ou prognósticos) em células ou tecidos específicos, em que os anticorpos são marcados como descrito abaixo e/ou são imobilizados em uma matriz insolúvel.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para detecção do (DX40L, os métodos que compreendem detectar o complexo OX40L-anticorpo anti-OX4ÜL na amostra. O termo "detecção", como usado no presente pedido, inclui detecção qualitativa e/ou quantitativa (níveis de medidas) com ou sem referência para um controle.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece métodos para diagnóstico de uma disfunção associada com a expressão e/ou atividade do OX40L, os métodos que compreendem detectar o complexo OX40L-anticorpo anti-OX40L na amostra de um paciente que tem ou suspeita-se que tenha a disfunção. Em algumas realizações, a expressão do OX40L é expressão aumentada ou anormal (indesejada).

Em outro aspecto, a presente invenção fornece qualquer um dos anticorpos anti-OX40L descritos no presente pedido, em que o anticorpo anti- OX40L compreende um marcador detectável.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece um complexo com qualquer um dos anticorpos anti-OX40L descritos no presente pedido e OX40L. Em algumas realizações, o complexo está in vivo ou in vitro. Em algumas realizações, o complexo compreende uma célula cancerosa. Em algumas realizações, o anticorpo anti-C)X40L é detectável marcado.

Anticorpos anti-C)X40L podem ser usados para a detecção do OX40L em qualquer um dos vários métodos de teste de detecção conhecidos. Por exemplo, uma amostra biológica pode ser analisada para OX40L pela obtenção da amostra de uma fonte desejada, misturando-se a amostra com um anticorpo anti- OX40L para permitir que o anticorpo forme complexo anticorpo/OX4C)L com qualquer OX40-L presente na mistura, e detectar qualquer complexo anticorpo/OX40L presente na mistura. A amostra biológica pode ser preparada para teste pelos métodos conhecidos na técnica que são adequados para a amostra específica. Os métodos de mistura da amostra com anticorpos e os métodos de detecção do complexo anticorpo/OX40L são escolhidos de acordo com o tipo de teste usado. Tais testes incluem imunohistoquímica, testes competitivos ou sanduíche e testes de inibição estérica.

Todos os métodos analíticos para OX4CIL usam um ou mais dos reagentes a seguir: análogo do OX40L marcado, análogo do OX4ÜL imobilizado, anticorpo anti-OX40L marcado, anticorpo anti-OX40L imobilizado e conjugados estéricos. Os reagentes marcados também são conhecidos como"tracers".

O marcador usado é qualquer um de funcionalidade detectável que não interfira na ligação do OX40L e anticorpo anti-OX40L. Muitos marcadores são conhecidos para uso em imunoensaio, exemplos que incluem componentes que podem ser detectados diretamente, como fluorcromo, quimioluminescente e marcadores radioativos, bem como componentes, como enzimas, que devem reagir ou derivar para serem detectadas. Exemplos de tais marcadores incluem:

O marcador usado é qualquer um de funcionalidade detectável que não interfira na ligação do OX40L e anticorpo anti-OX40L. Muitos marcadores são conhecidos para uso em imunoensaio, exemplos que incluem componentes que podem ser detectados diretamente, como fluorcromo, quimioluminescente e marcadores radioativos, bem como componentes, como enzimas, que devem reagir ou derivar para serem detectadas. Exemplos de tais marcadores incluem os radioisótopos 32P, 14C1 125I, 3H1 e 131I1 fluoróforos como quelatos de raro-terra (quelatos európio) ou fluorescina e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, umbeliferona, luceriferases, por exemplo, luciferase de vagalume e Iuciferase bacteriana (patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfate desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina oxidase, acoplamentos com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor como HRP1 Iactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, radicais livres estáveis e similares.

Métodos convencionais estão disponíveis para ligação covalente destes marcadores com proteínas ou polipeptídeos. Por exemplo, agentes de acoplamento como dialdeídos, carbodiimidas, dimaleimidas, bis-imidatos, benzidinas bis-diazotizadas e similares podem ser usados para marcar os anticorpos com marcadores fluorescentes, quimioluminescentes e enzimas. Ver, por exemplo, patente US 3.940.475 (fluorimetria) e 3.645.090 (enzimas); Hunter et al., Nature, 144: 945 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014- 1021 (1974); Pain etal., J. Immunol. Methods, 40: 219-230 (1981); e Nygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412 (1982). Marcadores preferidos no presente pedido são as enzimas como peroxidase de rábano silvestre e fosfatase alcalina. A conjugação de tal marcador ao anticorpo, que inclui as enzimas, é um procedimento de manipulação padrão para uma das técnicas comuns nas técnicas de imunoensaio. Ver, por exemplo, OtSuIIivan et al., "Methods for the Preparation of Enzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay," em Methods in Enzymology, ed. J.J. Langone e H. Van Vunakis, Vol. 73 (Academic Press, New York, New York, 1981), páginas 147-166.

A imobilização de reagentes é necessária para certos métodos de teste. A imobilização confere separação do anticorpo anti-OX4üL de qualquer OX40-L que fique livre na solução. Isto é realizado de modo convencional, tanto pela insolubilização do anticorpo anti-OX40L como análogo do OX40L antes do procedimento de teste, como por adsorção a uma matriz ou superfície insolúvel em água (Bennich et al., patente US 3.720.760), por acoplamento - covalente (por exemplo, usando-se glutaraldeído de reticulação), ou insolubilização do anticorpo anti-QX40L ou análogo do QX40L subsequente, por exemplo, por imunoprecipitação.

A expressão de proteínas em uma amostra pode ser examinada usando-se protocolos de imunohistoquímica e coloração. Coloração imunohistoquímica de cortes de tecido mostrou ser um método confiável de avaliação ou detecção da presença de proteínas em uma amostra. Técnicas imunohistoquímicas ("IHC") utilizam um anticorpo para sondar e visualizar antígenos in situ, geralmente por métodos cromatogênicos ou fluorescentes. Para preparação da amostra, uma amostra de célula ou tecido de um mamífero (tipicamente um paciente humano) pode ser usada. A amostra pode ser obtida por uma variedade de procedimentos conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado a excisão cirúrgica, aspiração ou biópsia. O tecido pode ser fresco ou congelado. Em uma realização, a amostra é fixada e embebida em parafina ou similar. Os cortes de tecido podem ser fixados (isto é, preservados) por diversas metodologias convencionais. Um técnico no assunto irá apreciar que a escolha de um fixador seja determinada para os propósitos para que a amostra seja histologicamente corada ou analisada de outra forma. Um técnico no assunto irá também apreciar que a extensão da fixação dependa do tamanho da amostra de tecido e do fixador utilizado.

IHC pode ser realizado em combinação com técnicas adicionais tais como coloração morfológica e/ou hibridização fluorescente in situ. Dois métodos gerais de IHC estão disponíveis; testes diretos e indiretos. De acordo com o primeiro teste, a ligação do anticorpo ao antígeno alvo (por exemplo, OX40L) é determinada diretamente. Este teste direto usa um reagente marcado, tal como uma tag fluorescente ou um anticorpo primário marcado com enzima, que pode ser visualizado sem interações de anticorpos adicionais. Em um teste indireto típico, o anticorpo primário não conjugado se liga ao antígeno e então um anticorpo secundário marcado se liga ao anticorpo primário. Onde o anticorpo secundário é conjugado a um marcador enzimático, um substrato cromatogênico ou fluorgênico é adicionado para fornecer visualização do antígeno. A amplificação de sinal ocorre porque diversos anticorpos secundários podem reagir com diferentes epítopos no anticorpo primário.

O anticorpo primário e/ou secundário usado para imunohistoquímica tipicamente será marcado com um componente detectável. Diversos marcadores estão disponíveis, as quais podem ser agrupadas nas seguintes categorias:

Com exceção da preparação da amostra dos procedimentos discutidos acima, além disso, tratamento do corte do tecido anterior a, durante ou seguindo IHC pode ser desejado, por exemplo, métodos de recuperação de epítopo, tal como aquecimento da amostra de tecido em tampão citrato pode ser realizada (ver, por exemplo, Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)).

Seguindo uma etapa de bloqueio opcional, o corte de tecido é exposto ao anticorpo primário por um período de tempo suficiente e sob condições adequadas de forma que o anticorpo primário se ligue ao antígeno de proteína alvo na amostra de tecido. Condições apropriadas para alcançar isto podem ser determinadas por experimento de rotina. A extensão de ligação de anticorpo para a amostra é determinada pelo uso de qualquer um dos marcadores detectáveis discutidos acima. Preferivelmente1 o marcador é uma marcador enzimático (por exemplo, HRPO) que catalisa uma alteração química do substrato cromatogênico tal como 3,3"-diaminobenzidina cromogênio. Preferivelmente a marca enzimática é conjugada ao anticorpo que se liga especificamente ao anticorpo primário (por exemplo, o anticorpo primário é anticorpo policlonal de coelho e o anticorpo secundário é anticorpo anti-coelho - de cabra).

Amostras preparadas deste modo podem ser montadas e cobertas com cobertura de vidro. A avaliação da lâmina é então determinada, por exemplo, usando-se um microscópio, e o critério de intensidade de coloração, rotineiramente usado na técnica, pode ser empregado.

Outros métodos de teste, conhecidos como testes competitivos ou sanduíche, são bem estabelecidos e amplamente usados na indústria de diagnósticos comerciais.

Testes competitivos dependem da capacidade de um análogo do OX40L tracer competir com a amostra de teste de OX40L por um número limitado de sítios de ligação de antígeno do anticorpo anti-OX40L. O anticorpo anti-OX40L geralmente está insolúvel antes ou depois da competição e então o tracer e OX4ÜL ligado ao anticorpo antiOX40L são separados de um tracer não ligado e de OX40L. Esta separação é realizada por decantação (quando o parceiro Iigante foi pré- insolubilizado) ou por centrifugação (quando o parceiro Iigante foi precipitado após a reação competitiva). A quantidade da amostra de teste de OX40L é inversamente proporcional à quantidade de tracer ligado como medido pela quantidade da substância marcadora. Curvas dose-resposta com quantidades conhecidas de OX40L são preparadas e comparadas com os resultados do teste para determinar quantitativamente a quantidade de OX40L presente na amostra de teste. Estes testes são chamados sistemas ELISA, quando enzimas são usadas como marcadores detectáveis.

Outros tipos de teste competitivo, chamados de teste "homogêneo", não exigem uma fase de separação. Aqui, um conjugado de uma enzima com o OX40L é preparado e usado de forma que, quando o anticorpo anti-OX4()L se liga ao OX40L, a presença do anticorpo anti-OX4()L modifica a atividade da enzima. Neste caso, o OX40L ou seus fragmentos ativos imunologicamente são conjugados com uma ponte orgânica bifuncional - a uma enzima como uma peroxidase. Conjugados são selecionados para o uso com o anticorpo anti-OX40L, de forma que a ligação do anticorpo anti- OX40L iniba ou potencialize a atividade enzimática do marcador. Este método, por si só, é amplamente praticado com o nome de EMIT.

Conjugados estéricos são usados nos métodos de impedimento estérico para teste homogêneo. Estes conjugados são sintetizados por ligação covalente com um hapteno de baixo peso molecular a um fragmento pequeno do OX40L, de forma que o hapteno seja substancialmente incapaz de se ligar ao conjugado ao mesmo tempo em que o anticorpo anti-OX40L. Sob este procedimento de teste, o OX40L presente na amostra de teste irá se ligar ao anticorpo anti-OX40L, através disso permitindo a um anti-hapteno se ligar ao conjugado, resultando em uma mudança no caráter do hapteno conjugado, por exemplo, uma mudança na fluorescência quando o hapteno é um fluoróforo.

Testes sanduíche são especificamente úteis para a determinação de OX40L ou anticorpos OX40L. Em testes sanduíche seqüenciais, um anticorpo anti-OX40L imobilizado é usado para adsorver a amostra de teste de OX40L, a amostra de teste é removida por lavagem, o OX40L ligado é usado para adsorver um segundo anticorpo anti-OX40L e o material ligado é então separado do tracer residual. A quantidade de tracer ligado é diretamente proporcional às amostras de teste de OX40L. Nos testes sanduíche "simultâneo" a amostra de teste não é separada antes da adição do anti-OX4C)L marcado. Um teste sanduíche seqüencial usando-se um anticorpo monoclonal anti-OX40L como um anticorpo e um anticorpo policlonal anti-OX4C)L como outro, é útil para testar amostras para OX40L.

O descrito acima são testes de detecção meramente exemplares para OX40L. Outros métodos desenvolvidos agora ou no futuro que usam anticorpo anti-OX40L para a determinação do OX40L estão incluídos dentro do escopo deste, incluindo os bioensaios descritos no presente pedido. ARTIGOS DE FABRICACAO

Em outro aspecto da invenção, um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico de disfunções descritas acima é fornecido. O artigo de fabricação compreende um recipiente e uma etiqueta ou instruções de uso no recipiente ou associada a este. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, etc. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é, por si mesmo ou quando combinada com outra(s) composição(ões), efetiva para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição, e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma rolha perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. A etiqueta ou instrução de uso indica que a composição é usada para tratamento da condição da escolha, como asma. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida neste, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida neste. O artigo de fabricação desta realização da invenção pode, ainda, compreender uma instrução de uso indicando que a primeira e segunda composições do anticorpo podem ser usadas para tratar uma condição específica, por exemplo, asma. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), tampão fosfato salino, solução de Ringer e solução dextrose. Pode, além disso, incluir outros materiais comerciais desejáveis do ponto de vista do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

A seguir estão os exemplos dos métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1

PREPARACAO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS DE CAMUNDONGO 8E12 E 13G5 ANTI-OX40L

Anticorpos para a seqüência extracelular do OX4(DL humano foram preparados como a seguir. Cinco camundongos Balb/c (Charles River Laboratories, Wilmington, DE) foram hiperimunizados com o polipeptídio OX40L-flag humano recombinante (domínio extracelular Ligante OX40 humano fundido ao peptídeo flag e expresso a partir de células CHO, Genentech1 Inc., South San Francisco, CA), no adjuvante Ribi (Ribi Immunochem Research, Inc., Hamilton, MO). As células B dos camundongos que demonstram titulações elevadas do anticorpo anti-OX40L foram fundidas com células de mieloma de camundongo (pu1. Anan. 22.4, Genentech, Inc., South San Francisco, CA). Após vários dias, os sobrenadantes foram colhidos e selecionados para a produção do anticorpo diretamente pelo teste imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). IgG do meio condicionado de crescimento dos clones positivos foram purificadas pela cromatografia de afinidade com Proteína A (cromatografia líquida de proteína rápida Pharmcia (Pharmacia, Upsália, Sweden)). As preparações purificadas do anticorpo foram esterilizadas e filtradas (tamanho de poro 0,2-μM; Nalgene, Rochester NY) e armazenadas a 4°C em fosfato salino tamponado (PBS).

Os testes baseados em citometria de fluxo foram realizados com os meios condicionados de crescimento dos clones positivos de ELISA para selecionar os anticorpos monoclonais que competem com o OX40R-Fc recombinante (o receptor OX40 humano fundido ao fragmento Fc do IgG1 expresso a partir das células CHO, Genentech, Inc.) para ligação ao oX4QL humano expresso a partir de células CHO. As células CHO-OX4OL foram pré- incubadas com o OX40R-Fc, seguido pela adição do meio condicionado de crescimento. Após a incubação, as células foram lavadas no tampão fosfato salino e então marcadas com IgG anti-murino conjugado com ficoterina para detectar a quantidade de anticorpos monoclonais OX40L anti-humano de murino ligados . O índice médio de fluorescência (MFI) foi determinado. Os anticorpos monoclonais (Mabs) designados 8E12 e 13G5 tiveram bom desempenho nestes testes.

O RNA total foi extraído das células de hibridoma que produzem os anticorpos 8E12 e 13G5, usando-se métodos padrão. Os domínios variáveis leve (VL) e pesado (VH) foram amplificados usando-se RT-PCR com primers degenerados para as cadeias pesada e leve, como a seguir. Os primers forward eram específicos para a seqüência de aminoácido N-terminal das regiões VL e VH. Os primers reversos LC e HC foram criados para anelar a uma região de domínio leve constante (CL) e de domínio pesado constante 1 (CH1), respectivamente, que são altamente conservadas através das espécies. As regiões amplificadas VL e VH foram clonadas em vetores de expressão de mamíferos, e a seqüência de polinucleotídeo dos insertos foi determinada usando-se métodos de sequenciamento de rotina. As seqüências de aminoácidos VL e VH do 8E12 estão mostradas na Figuras 1. As seqüências de aminoácidos VL e VH do 13G5 estão mostradas na Figura 3.

Exemplo 2

Teste ELISA De Ligação De Mab 8E12 E 13G5 À Proteína QX40L

A análise de competição ELISA foi conduzida como a seguir para examinar a ligação do anti-OX40L Mabs 8E12 e 13G5 à OX40L na solução, e para examinar a ligação do OX40L expresso na superfície celular. Em alguns experimentos, as placas de micropoço de 96 poços maxiSorp (Nunc, Roskilde, Dinamarca) foram revestidas durante a noite a 4°C com 2ug/ml de anticorpo anti-FlagM2 (Sigma) em 50mM de tampão carbonato, pH 9,6. As placas foram lavadas com PBS contendo 0,05% de polissorbato 20 e bloqueadas com 0,5% de albumina de soro bovino, 10 ppm Proclin 300 (Supelco, Bellefonte, PA) em PBS à temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas e 0,5 ug/ml do polipeptídio OX40L ECD-FIag humano foi adicionado. Após incubação de uma hora, as placas foram lavadas. Uma mistura de OX40-lgG -bio e diluições seriais de anticorpos em PBS contendo 0,5% de albumina de soro bovino, 0,05% de polissorbato 20, 10 ppm de Proclin 300 foi adicionada. As placas foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente e lavadas. OX40-lgG-bio humano ligado foi detectado pelo adição de estreptavidina-HRP (Amdex, Copenhagem, Dinamarca) seguido por 3,3', 5,5'-tetrametil benzidina (Kirkegaard & Perry; Laboratories, Gaithersburg, DM) como substrato. As placas foram reveladas e a reação foi interrompida pela adição de 1M de ácido fosfórico. A absorbância foi lida a 450 nM em um leitor Titertek stacker (CIN, Costa Mesa, CA). As curvas de titulação foram ajustadas usando-se um programa de ajuste de curva de regressão com quatro parâmetros (KaleidaGraph Synergy software, Reading, PA). Anti-OX40L Mabs 8E12 e 13G5 se ligaram ao OX40L humano com um EC50 aproximado de 1,4 nM e de 1,1 nM, respectivamente. Em alguns experimentos, o teste foi realizado de modo similar ao acima, exceto que as placas de ELISA foram revestidas com 0,5ug/ml de OX40-lgG humano, uma mistura de OX40-Flag humano e diluições seriais dos anticorpos foram incubadas nas placas, e a ligação ao OX40-Flag foi detectada usando-se anticorpo anti-Flag-bio seguido por estreptavidina-HRP. Anti- - OX4OL Mabs 8E12 e 13G5 se ligaram ao OX40L humano com um EC50 aproximado de 1,9nM e de 0,46 nM, respectivamente. Em outros experimentos, as células CHO que expressam OX40L humano completo foram cultivados em meio F12/DMEM 50:50 suplementado com 2nM de L-glutamina, 100 unidades/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (meio suplementado), e FBS 5% (Gibco BRL1 Life Tecnologies, Gaithersburg, DM) (meio de crescimento) em uma incubadora umidificada com CO2 a 5% a 37°C. As células foram separadas das placas de cultura usando- se Accutase (ICN) e adicionadas às placas de micropoços de 96 poços a 300.000 células/poço. Uma mistura de OX40-lgG humano e diluições em série de anticorpos em meio de crescimento foi adicionada às placas. Após uma de incubação em gelo, as células foram lavadas por centrifugação das placas e remoção do sobrenadante. OX40-lgG humano ligado foi detectado usando-se anti-Fc-HRP. EC50s foram estimados como sendo 20 e 130 nM para 8E12 e 13G5, respectivamente. Em alguns experimentos, OX40-lgG-bio humano foi usado, ao invésdo OX40-lgG humano. O C)X40-lgG-bio foi detectado usando- se estreptavidina-HRP. As placas foram reveladas e lidas como descrito acima. Mabs 8E12 e 13G5 se ligaram ao OX40L humano com um EC50 aproximado de cerca de 11 nM e 60 nM, respectivamente.

Estas análises demonstraram que Mabs 8E12 e 13G5 se ligaram ao OX40L humano na solução e ao OX40L humano expresso nas células CHO.

Para determinar se OX40L de camundongo se ligou ao 8E12 e 13G5, placas ELISA foram revestidas com OX40L de camundongo. Diluições seriais do 8E12 ou do 13G5 (0,004-4 ug/ml) foram adicionadas. O Fc-HRP anti-camundongo de cabra foi usado para a detecção. Nenhuma ligação foi observada. Em um formato diferente, as placas de ELISA foram revestidas com 8E12 ou 13G5. As diluições seriais de OX4ÜL-Flag de camundongo foram adicionadas. Anti-Flag biotinilado seguido pelo estreptavidina-HRP foi usado para a detecção. Nenhuma ligação foi observada. Exemplo 3

Análise Do Mab 8E12 E13G5 Usando-se Ressonância Plasmônica De

Superfície

Cinéticas de ligação de anticorpos anti-OX40L de camundongo para (DX40L humano foram medidas pela ressonância plasmônica de superfície usando-se Pharmacia BlAcore® 3000 (BIAcore AB1 Uppsala, Sweden) em temperatura ambiente (Karlsson et ai, 1994; Morton & Myska1 1998). O anticorpo anti-Flag (anti-FlagM2, Sigma, St Louis1 MO) foi imobilizado no chip sensor (CM5) através de grupos amina primários. Uma taxa de fluxo elevada foi usada a fim de minimizar efeitos do transporte de massa. A matriz da superfície do chip sensor carboximetilado foi ativada pela injeção de 20ul de uma mistura de 0,025 M de N-hidroxisuccinimida e de 0,1 M N-etil-N' (dimetilaminopropil) carbodiimida a 5 ul/min. 7 ul de 50 ug/ml de anti-Flag em 10 mM de acetato do sódio, pH 4,5, foram injetados a 5 ul/min duas vezes. Após o acoplamento, os locais desocupados no chip foram bloqueados pela injeção de 20 ul de etanolamina a 1M, pH 8,5. O tampão de corrida foi PBS contendo 0,05% de polissorbato 20. 5 ul de 4 ug/ml do OX40L-Flag foram injetados a 30 ul/min para ligar OX40-Flag ao anti-Flag no chip. Para medidas cinéticas, duas diluições (6,2-50 nM) dos anticorpos 8E12 0X40 anti-humanos de camundongo (PUR 9333) e 13G5 (PUR 9306) em tampão de corrida foram injetadas sobre o fluxo celular por 2 minutos a uma taxa de fluxo de 30 ul/min e permitiu-se que o anticorpo anti-OX4üL ligado se dissociasse por 20 minutos. A superfície de ligação foi regenerada pela injeção de 30ul de 10 mM de glicina HCl (pH 1,5). Um fluxo celular, que teve anticorpo anti-Flag imobilizado, mas não recebeu OX40L-Flag, foi usado como referência celular. Os dados foram analisados usando-se um modelo de ligação 1:1 que utiliza ajuste global. As taxas constantes de associação e de dissociação foram ajustadas simultaneamente (programa BIAevaIuation). As constantes on-rate aparentes eram 2,6x10® e 4,8x105 (1/Ms) para anticorpos IgG 8E12 e 13G5 , respectivamente. Devido à cinética off-rate muito lenta, as constantes off-rate não puderam ser determinadas (<5x106/s).

Os valores Kd aparentes calculados foram <0,019 nM e <0,010 nM para os anticorpos IgG 8E12 e 13G5, respectivamente.

Exemplo 4

Anticorpos 8E12 E13G5 Anti-QX40L Reconheceram Determinantes De Ligação No OX4QL

Experimentos de ligação Scatchard foram realizados para determinar se os mAbs 8E12 e 13G5 anti-OX40L competiam entre si para ligação similar ou se sobrepõem aos epítopos nas células CHO que expressam OX40L humano, e para determinar a ligação de afinidade dos anticorpos. 50 ug dos anticorpos monoclonais murino 8E12 e 13G5 anti-OX40L foram adicionados usando-se um método Iactoperoxidase padrão. Os anticorpos 8E12 e 13G5 foram serialmente diluídos a 1:4 em meio tampão (Dubeccos F12: DMEM, 1% de albumina de soro bovino, 0,05% de azida de sódio e 25 mM de tampão Hepes pH 7,2) começando em uma concentração inicial de 200 nM. Dois conjuntos de diluições seriais (50 uL) foram realizadas em duplicata em uma placa de 96 micropoços. Os poços de cada conjunto de diluição receberam 50 uL, tanto de 8E12 iodinado como de 13G5 (0,25 nM de concentrações final). A placa foi misturada e então a mistura inteira foi transferida para uma placa de cultura de tecido de 96 poços contendo 30.000 células CHO por poço, que expressavam OX40L e que tinham sido plaqueadas no dia anterior. As placas foram revestidas e incubadas durante a noite a 4°C.

No dia seguinte os poços (contendo as células) foram aspirados e lavados duas vezes com tampão de meio. 200 uL de NaOH a 1N foram adicionados a cada poço para Iisar as células, agitadas por 10 minutos, e transferidas então para um microtubo de 96 poços. Cada tubo foi contado em um contador de cintilação gama Wallac. As contagens ligadas junto com as concentrações de anticorpo foram adicionadas ao programa de análise Scatchard New Ligand para plotar o ligado versus ligado/livre e para determinar a afinidade de ligação e concentração do receptor. Para experimentos de competição, os dados foram coletados e plotados usando Kaleidagraph. As curvas foram desenhadas usando-se um ajuste de 4 parâmetros.

Mab 8E12 ligou-se ao OX4ÜL humano com um Kd de 0,92 nM. Mab 13G5 ligou-se ao OX40L humano com um Kd de 1,09 nM. 8E12 e 13G5 não competiram entre si para ligação ao OX40L expresso nas células CHO1 indicando que os anticorpos monoclonais 8E12 e 13G5 anti-OX40L reconheceram determinantes de ligação diferentes no OX4ÜL humano.

Exemplo 5

Anticorpos Anti-OX4QL Inibiram A Interação De QX40L Humano E OX4Q

Humano

Os experimentos de ligação competitiva foram realizados para determinar se mAbs 8E12 e 13G5 anti-OX4üL competiam com o OX4ü-Fc iodinado (domínio extracelular do receptor 0X40 fundido ao domínio Fc) para ligação ao OX40L expresso em células CHO. 50 ug do Iigante OX4ÜL-Fc foram iodinados usando-se um método Iactoperoxidase padrão. Os anticorpos 8E12 e 13G5 foram serialmente diluídos a 1:4 em meio tampão (Dubeccos F12: DMEM, 1% de albumina de soro bovino, 0,05% de azida de sódio e 25 nM de tampão Hepes pH 7,2) começando em uma concentração inicial de 200 nM. Diluições (50 uL) foram realizadas em duplicidade em uma placa de 96 micropoços. Cada poço recebeu 50 uL de OX40L-Fc iodinado (0,25 nM de concentração final), foi misturado e então a mistura inteira foi transferida então para uma placa de cultura de tecido de 96 poços contendo 30.000 células CHO por poço, que expressavam OX40L e que tinham sido plaqueadas no dia anterior. As placas foram revestidas e incubadas durante a noite a 4°C. No dia seguinte os poços (contendo as células) foram aspirados e lavados duas vezes com tampão de meio. 200 uL de NaOH a 1N foram adicionados a cada poço para Iisar as células, agitadas por 10 minutos, e transferidas então para um microtubo de 96 poços. Cada tubo foi contado em um contador de cintilação gama Wallac. Os dados foram coletados e plotados usando-se Kaleidagraph. As curvas foram desenhadas usando-se um ajuste de 4 parâmetros.

Os resultados deste experimento estão mostrados na Figura3. Mab 8E12 (tri6angulos abertos) e 13G5 (quadrados sólidos) competiram com o receptor 0X40 para ligação ao OX40L expresso nas células CHO, indicando que os anticorpos inibiram a ligação do receptor 0X40 humano ao OX4ÜL humano.

Exemplo 6

Tratamento Com Anticorpos Anti-QX40L Inibiram A Proliferação De Célula T Em Um Teste Baseado Em Célula

Os testes de reação de linfócitos mistos (MLR) foram realizados para determinar se o bloqueio da interação OX40L-OX40 pelos mabs anti- OX40L inibiam a proliferação de célula T. Este experimento baseado em célula testa a capacidade dos anticorpos anti-OX40L inibirem sinalização de OX40L. Resumidamente, células dendríticas plasmocitóides (pDCs) foram isoladas do sangue humano usando-se esferas BDCA-4 MACS de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). As células foram dispostas a 1 χ 106 cel/ml no meio contendo RPMI/10% de soro fetal bovino/2mM de L-glutamina, e estimuladas por 3 dias com 2,5 ug/ml de proteína CD40L humana solúvel (R&D Systems) e 10 ng/ml de proteína IL-3 humana (R&D Systems) a fim de ativar os pDCs. Os ativados (pDC) foram então lavados três vezes com fosfato salino tamponado/3% de soro fetal bovino, e então co-cultivados com CD45RA + células T virgens que foram isoladas a partir do sangue humano usando-se esferas MACS de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). A co-cultura foi disposta a uma razão celular de 1:200, com 1 χ 105 células T por poço em uma placa de 96 poços com fundo U1 por 1 semana na presença dos reagentes indicados. As células foram pulsadas com IuCi de metil timidina tritiada por poço durante as últimas 6 horas da cultura, colhidas em placas de filtro e contadas.

Os resultados dos dois conjuntos de experimentos, denominados "dnrl" e "dnr2", estão mostrados na Figura 4. O tratamento com mab 8E12 anti-OX40L (quadrados abertos) e mab 13G5 (círculos abertos) inibiu proliferação de célula T de forma significativa, indicando que ambos os anticorpos inibem a sinalização de OX40L. Em contrapartida, o IgGI do camundongo controle (X's) não inibiu proliferação de célula T. Os níveis de proliferação de célula T estão mostrados por losangos abertos e aqueles das células T mistas com quadrados contínuos de pico ativado. O valor IC50 do anti-OX40L mab para inibição de proliferação de célula T variou de doador para doador, em uma escala de 0,5 a 10 nM.

Exemplo 7

Tratamento Coivi Anticorpos Anti-OX4QL Inibiram A Produção De IL-2 Por Células T De Memória

A produção de IL-2 pelas células T de memória foi avaliada para determinar se o bloqueio da interação 0X401-0X40 por mabs anti-OX40L inibiam a produção IL-2. Este experimento testa a habilidade dos anticorpos anti-OX40L inibirem a sinalização de OX40L. Resumidamente, células CD45RO + células T de memória foram isoladas do sangue humano usando-se esferas MACS de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). As células foram dispostas a 1 x 106 cel/ml no meio contendo RPMI/10% de soro fetal bovino/2mM de L-glutamina, e estimuladas com 1 ug/ml de anticorpo anti- CD3 (BD Pharmingen) e 10nM de proteína OX40L humana solúvel (R&D - Systems) por 16 horas. Os anticorpos anti-OX40L ou anticorpos mlgG1 controles foram adicionados nas concentrações indicadas. Níveis do IL-2 nos sobrenadantes foram medidos usando-se um kit Elisa de acordo com as instruções do fabricante (R&D Systems).

Os resultados dos dois conjuntos de experimentos, denominados "dnr5" e "dnrô", estão mostrados na Figura 5. O tratamento com mab 8E12 (quadrados abertos) e mab 13G5 (círculos abertos) inibiu de forma significativa a produção de IL-2 pelas células T de memória. Em contrapartida, a adição de IgGI de camundongo controle (X's) não inibiu produção de IL-2. Os níveis de produção de IL-2 pelas células T de memória sob tratamento com anticorpo anti-CD3 sozinho estão mostrados por quadrados hachurados, sob tratamento com anti-CD3 e OX40L humano sozinhos estão mostrados por quadrados contínuos, ou células T de memória sozinhas estão mostrados por losangos abertos.

Exemplo 8

Tratamento Com Anticorpos Anti-OX4QL Inibiram A Sobrevivência De Células T Ativadas

A sobrevida de células T ativadas foi avaliada para determinar se o bloqueio da interação OX40L-OX4C) por mabs anti-OX4ÜL inibiam sobrevida. Este experimento baseado em célula testa a habilidade de anticorpos de anti- 0X4ÜL de inibir a sinalização de OX40L. Resumidamente, células dendríticas plasmocitóides (pDCs) foram isoladas do sangue humano usando-se esferas BDCA-4 MACS de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec). As células foram dispostas a 1 χ 106 cel/ml no meio contendo RPMI/10% de soro fetal bovino/2mM de L-glutamina, e estimuladas por 3 dias com 2,5 ug/ml de proteína CD40L humana solúvel (R&D Systems) e 10 ng/ml de proteína IL-3 humana (R&D Systems). Os pDCs ativados por CD123+BDCA2 foram então selecionados por FACS e co-cultivados com células T ativadas que foram isoladas para seleção negativa a partir do sangue humano usando-se esferas MACS de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec) e ativadas por 3 dias com 0,1 ug/ml de anti-CD3/1 ug/ml de anti-CD28 (BD Pharmingen). A co-cultura foi disposta a uma razão celular pDC:T de 1:50, com 1 χ 106 células T por ml de uma placa de 6 poços na presença dos reagentes indicados (a concentrações de 1 nM ou 10 nM). O número de células foi avaliado ao longo do tempo pela exclusão por trypan azul.

Os resultados dos experimentos estão mostrados na Figura 6. O tratamento com mab 8E12 anti-OX40L (quadrados abertos) e mab 13G5 (círculos abertos) inibiu proliferação de células T de forma significativa. Em contrapartida, a adição do IgG1 do camundongo controle ("mlgG1"; X's) não inibiu sobrevida de célula Τ. O controle de células T sozinho ("unstim") está mostrado por losangos abertos, e o controle de células com pDCs ativados ("ac. pDC") está mostrado por quadrados contínuos.

Embora a invenção antecedente tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para os propósitos de esclarecer o entendimento, as descrições e os exemplos não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção. Listagem de Seqüência

<110> Flavius Martin

<120> ANTICORPOS ANTI-OX40L E MÉTODOS DE USO DOS MESMOS <130> P2214R1

<150> US 60/751,377 <151> 2005-12-16

<160> 16

<210> 1 <211> 16 <212> PRT

<213> mus museu7us

<400> 1

Arq ser Ser Gln Ser Ile Val His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 15 10 15

Glu

<210> 2 <211> 16 <212> PRT

<213> mus museu 7us <400> 2

Arq Ser Ser Gln Ser Pro vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu 15 10 15

HiS

<210> 3

<211> 7 <212> PRT

< 213 > mus museu 7us

<400> 3 Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser

<210> 4 <211> 7 <212> PRT

<213> mus museu 7us

<400> 4 Lys vai Ser Asn Arg Phe Ser

<210> 5 <211> 9 <212> PRT

<213> mus museuTus <400> 5

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr 5

<210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> mus museu 7us <400> 6

Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Trp Thr 5

<210> 7 <211> 5 <212> PRT

<213> mus musculus

<400> 7 Ser Tyr Trp Leu Asn

<210> 8 <211> 5 <212> PRT

<213> mus museu7us

<400> 8 Ser Tyr Trp Met His

<210> 9 <211> 17 <212> PRT

<213> mus museu Jus

<400> 9 π ,

Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Val Phe 1 5 10 15

Lys Asp

<210> 10 <211> 17 <212> PRT

<213> mus museu!us <400> 10

Glu Ile Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 1 5 10 15

Lys ser

<210> 11 <211> 14 <212> PRT

<213> mus museu!us <400> 11

Gly Arg Gly Asn Phe Tyr Gly Gly Ser His Ala Met Glu Tyr

<210> 12 <211> 9 <212> PRT

<213> mus museu!us <400> 12

Glu Arg Ser Pro Arg Tyr Phe Asp Val

<210> 13 <211> 113 <212> PRT

<21Β> Mus musculus <400> 13

Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15

Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln ser Ile vai 20 25 30

His Gly Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp His Leu Gln Lys Pro 35 40 45

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75

Phe Thr Leu Lys Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90

Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly 95 100 105

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 110

<210> 14 <211> 113 <212> PRT

<213> mus musculus <400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 1 5 10 15

Gly Asp Gln Ala Ser Met Tyr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Pro vai 20 25 30

His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 35 40 45

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 65 70 75

Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 80 85 90

Tyr Phe Cys Ser Gln Ser Thr His Ile Pro Trp Thr Phe Gly Gly 95 100 105

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 110

<210> 15 <211> 123 <212> PRT

<213> Mus musculus <400> 15

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 1 5 10 15

Ala ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Trp Leu Asn Trp vai Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Val Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr

50 55 60

Asn Gln vai Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys ser

65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp

80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ile Arg Gly Arg Gly Asn Phe Tyr Gly

95 100 105

Gly Ser His Ala Met Glu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Leu Thr

110 115 120

Val Ser Ser

<210> 16 <211> 118 <212> PRT <213> Mus museuIus

<400> 16

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly

15 10 15

Thr Ser Val Lys Leu ser cys Lys Ala ser Gly Tyr ser Phe Thr

20 25 30

Ser Tyr Trp Met His Gly Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr

50 5 5 60

Asn Glu Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

65 70 75

Ser Ser Thr Ala Tyr Ile Gln Leu Ser ser Leu Thr ser Glu Asp

80 85 90

Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Arg Ser Pro Arg Tyr Phe

95 100 105

Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

110 115

Claims

1. ANTICORPO ANTIOX40L, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1) ou RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência RVSNRFS (SEQ ID NO:3) ou KVSNRFS (SEQ ID N0:4); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência FQGSHVPYT (SEQ ID N0:5) ou SQSTHIPWT (SEQ ID N0:6); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWLN (SEQ ID NO:7) ou SYWMH (SEQ ID NO:8); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9) ou EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO: 10); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11) ou ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12), em que o anticorpo anti-OX40L se liga a OX40L.

2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco e/ou seis seqüências da região hipervariável (HVR) selecionadas do grupo que consiste de: (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência RVSNRFS (SEQ ID NO:3); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência FQGSHVPYT (SEQ ID NO: 5); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWLN (SEQ ID NO:7); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9); (f) HVR-H3 que compreende a seqüência GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO:11), ou (a) HVR-L1 que compreende a seqüência RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2); (b) HVR-L2 que compreende a seqüência KVSNRFS (SEQ ID NO:4); (c) HVR-L3 que compreende a seqüência SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6); (d) HVR-H1 que compreende a seqüência SYWMH (SEQ ID NO:8); (e) HVR-H2 que compreende a seqüência EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID NO:10); e (f) HVR-H3 que compreende a seqüência ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12).

3. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSIVHGNGNTYLE (SEQ ID NO:1), RVSNRFS (SEQ ID NO:3), e FQGSHVPYT (SEQ ID NO:5), e/ou (b) uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWLN (SEQ ID NO:7), MIDPSDSETHYNQVFKD (SEQ ID NO:9), e GRGNFYGGSHAMEY (SEQ ID NO: 11).

4. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma cadeia leve que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de RSSQSPVHSNGNTYLH (SEQ ID NO:2), KVSNRFS (SEQ ID NO:4), e SQSTHIPWT (SEQ ID NO:6), e/ou (b) uma cadeia pesada que compreende pelo menos uma, pelo menos duas ou todas as três seqüências da HVR selecionadas do grupo que consiste de SYWMH (SEQ ID NO:8), EIDPSNGRTNYNEKFKS (SEQ ID N0:10), e ERSPRYFDV (SEQ ID NO:12).

5. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável de cadeia leve que tem a seqüência: DILMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHGNGNTYLEWHLQKPGQSPKLLIY RVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGGG TKVEIKR (SEQ ID NO: 13); e/ou (b) um domínio variável de cadeia pesada que tem a seqüência: QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWLNWVKQRPGQGLEWIVMI DPSDSETHYNQVFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRGRGNF YGGSHAMEYWGQGTLLTVSS (SEQ ID NO: 15).

6. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um domínio variável de cadeia leve que tem a seqüência: DIVMTQTPLSLPVSLGDQASMYCRSSQSPVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHIPWTFGG - GTKVEIKR (SEQ ID NO: 14); e/ou (b) um domínio variável de cadeia pesada que tem a seqüência: QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGYSFTSYWMHGVRQRPGQGLEWIGEI DPSNGRTNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYIQLSSLTSEDSAVYYCTRERSPRY FDVWGAGTTLTVSS (SEQ ID NO: 16).

7. ANTICORPO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que se liga ao mesmo epítopo no OX40L humano que o anticorpo conforme definido na reivindicação 5 compreendendo (a) e (b), ou o anticorpo conforme definido na reivindicação 6 compreendendo (a) e (b).

8. ANTICORPO ISOLADO, caracterizado pelo fato de que compete com um anticorpo conforme definido na reivindicação 5 compreendendo (a) e (b), ou o anticorpo conforme definido na reivindicação 6 compreendendo (a) e (b).

9. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo: (i) é um anticorpo monoclonal, (ii) é selecionado do grupo que consiste de um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, um anticorpo de afinidade madura, um anticorpo humano e um anticorpo biespecífico, ou (iii) um fragmento de anticorpo.

10. POLINUCLEOTÍDEO, caracterizado pelo fato de que codifica um anticorpo conforme definido em uma das reivindicações 1 a 8.

11. VETOR, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 10.

12. VETOR, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que é um vetor de expressão.

13. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor conforme definido na reivindicação 11 ou 12.

14. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é procarionte, eucarionte ou de mamífero.

15. MÉTODO PARA FABRICAR UM ANTICORPO ANTI- OX40L, caracterizado pelo fato de que compreende (a) expressar um vetor conforme definido na reivindicação 12 em uma célula hospedeira adequada conforme definida na reivindicação 14, e (b) recuperar o anticorpo.

16. MÉTODO PARA TRATAR OU PREVENIR UMA DISFUNÇÃO IMUNE, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma quantidade efetiva do anticorpo anti-OX40L conforme definido em uma das reivindicações 1 a 8 a um sujeito em necessidade de tal tratamento.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a disfunção imune é (i) uma disfunção auto-imune (ii) ou asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, doença do enxerto contra hospedeiro, esclerose múltipla ou lúpus eritematoso sistêmico.

18. COMPOSIÇÃO, caracterizada pelo fato de que compreende (i) um anticorpo ANTI-OX40L conforme definido em uma das reivindicações 1 a 8 ou (ii) um polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 10, e opcionalmente um veículo.

19. USO DE UM ANTICORPO ANTI-OX40L, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma disfunção imune.

20. USO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a disfunção imune é (i) uma disfunção auto-imune ou (ii) asma, dermatite atópica, rinite alérgica, doença inflamatória do intestino, doença do enxerto contra hospedeiro, esclerose múltipla ou lúpus eritematoso sistêmico.