BRPI0621077A2 - meio nutritivo para cultivo de leveduras - Google Patents

Abstract

MEIO NUTRITIVO PARA O CULTIVO DE LEVEDURAS. O presente invento se refere a um novo meio nutritivo que foi desenvolvido para a cultura de fungos e em particular para o isolamento seletivo, diferenciação e identificação simultánea de fungos, particularmente de espécies do gênero Cândida de interesse clínico ou ambiental. O presente invento é essencialmente baseado no uso de uma combinação de extrato de batata doce e extrato de levedura ou extrato de tomate a fim de promover o crescimento de espécies fúngicas diferentes. De acordo com o presente invento, o meio nutriente é provido de substratos fluorogênicos e/ou cromogênicos específicos a fim de detectar a atividade enzimática das fosfolipases, aminopeptidases, hexosaminidases e glucosidases, bem como substáncias contendo proteínas a fim de detectar atividade proteolítica presente nas espécies do gênero Cândida. Em adição, o meio também contém fontes de carbono, sais, agentes tamponantes, inibidores de bactérias e ágar. O meio nutriente pode ser usado para diferenciar entre espécies de Cândida com o auxílio da cor das colónias, da emissão de fluorescência sob a luz ultravioleta, da formação de halos e da morfologia das colónias.

Description

Meio nutritivo para o cultivo de leveduras.

Refere-se o presente invento com o campo do diagnóstico microbiológico e mais especificamente com o cultivo e identificação de leveduras de importância clínica e, em particular, de diferentes espécies do gênero Candida.

Na patente americana No. 4144133, é reivindicado o uso de bílis de boi, saponina purificada e um substrato para a detecção da enzima fenol oxidase, que possibilita a identificação de fungos patogênicos, especificamente Candida albicans e Cryptococcus neoformans. Não obstante, este método não permite o crescimento, identificação e diferenciação de todas as espécies de Candida de importância clínica ou ambiental.

Komatsu Osamu, na patente japonesa JP2003310298, descreve um método para discriminar Candida albicans e Candida tropicális de outros fungos, utilizando o substrato X-glc. A especificidade deste substrato não garante a adequada diferenciação de todas as espécies de Candida de interesse clínico e/ou ambiental. Beckford, O. A. e colaboradores, na patente No. 4030980, descrevem um aparato para o isolamento e identificação de leveduras de origem médica que compreende o uso de vários testes bioquímicos e meios de cultivo para a identificação de espécies de Candida, entre outros microorganismos. O aparato e a técnica para seu emprego apresentam como inconvenientes fundamentais: a complexidade para a produção de dito dispositivo, complexidade na inoculação de cada uma das placas e a necessidade de isolamento das colônias, entre outras desvantagens. As desvantagens relevantes consistem em que as placas com os testes bioquímicos não contêm substâncias nutritivas suficientes nem apropriadas para o crescimento das espécies de Candida, e a identificação é realizada tendo em conta múltiplas respostas bioquímicas, pelo que uma resposta atípica em uma das placas pode levar a uma identificação errônea.

Na patente britânica GB 730763, é descrito um meio de cultivo para o isolamento e identificação de espécies do gênero Candida que inclui na formulação um sal inorgânico de bismuto e sulfito de sódio, em conjunto com um agente solidificante. Também são incluídos no meio um carboidrato solúvel, piruvato de sódio, glicina, fosfato orgânico e extrato de levedura: Este meio de cultivo possui uma série de deficiências técnicas, especificamente:

- Não possui os nutrientes necessários para garantir o crescimento abundante e rápido de todas as espécies de Candida de interesse, já que contém uma só fonte de vitaminas, especificamente o extrato de levedura e cujo conteúdo de minerais, em particular de magnésio, não é suficiente para ativar de maneira significativa o complexo sistema enzimático destes microorganismos.

- De maneira similar, o meio compreende uma só fonte de energia - piruvato de sódio - que não é suficiente para garantir por igual o crescimento rápido e abundante das distintas espécies de Candida.

- O meio não permite diferenciação das distintas espécies de Candida entre elas.

- A glicina por sem só não é capaz de garantir o nitrogênio suficiente para a síntese de aminoácidos, proteínas, enzimas e, portanto, para um crescimento rápido e exuberante das espécies de Candida.

Jesús Ruiz-Aragão e colaboradores ("Assessment of a new CHROMOagar Candida médium for presumptive Identification of yeasts"; Revista de Diagnóstico Biológico. V.52(1), 2003), compararam o novo meio CHROM M com os meios CHROM OU e CHROM R (Beckton Dickinson). Na tabela 1 de dito artigo mostra que o CHROM OU não foi capaz de diferenciar todas as espécies de Candida avaliadas entre sem. No caso de CHROM R tampouco todas as espécies de interesse podem ser totalmente diferenciadas e no meio CHROM M várias espécies apresentam igual ou similar coloração. Os autores destacam que os resultados são melhor apreciados só depois de 48 horas de incubação. Além disso, concluem que CHROM M não demonstrou a mesma eficácia para a identificação de espécies de leveduras já que apresenta menor sensibilidade, necessita maior tempo de incubação para que as colônias se desenvolvam e dificulta diferenciação de algumas espécies de interesse clínico como Candida tropicalis e Candida parapsilosis. Na patente americana No. 5449612, é descrito um método de identificação de cepas de Candida albicans e Torulopsis glahrata, utilizando substratos cromogênicos de monoaminoácidos ou peptídeos sem necessidade de isolar a cepa a identificar. Na composição do meio é incorporada a cicloheximida para inibir o crescimento de algumas espécies de Candida diferente de Candida albicans, o que limita as possibilidades diagnosticas desta variante do meio. A adição de substâncias antibacterianás, tais como a gentamicina, diminui a estabilidade do meio preparado e sua conservação não pode ser prolongada. O cloranfenicol, além disso, interfere no desenvolvimento das reações cromogênicas.

As bases nutritivas empregadas como fonte de nitrogênio da invenção (Yeast Nitrogem Base, Neopeptone, Proteose Peptone, Bacto Peptone e Extrato de Levedura) por sem só ou nas combinações entre elas não garantem o conteúdo de vitaminas e minerais, macro e micro elementos, suficientes para o crescimento precoce de todas as espécies de Candida.

Na patente americana No. 5534415, é descrito um meio seletivo e diferencial para o crescimento e detecção de Candida albicans. A essência do meio consiste em possuir uma base nutritiva metabolizada pelas leveduras, um substrato cromogênico ou fluorogênico capaz de ser hidrolisado pela enzima hexosaminidase associada a Candida albicans e áo menos um composto que contém hexosaminidase capaz de ativar a enzima hexosaminidase. Os componentes que proporcionam fonte de nitrogênio ao meio são as peptonas em quantidades de 0,01 até 40 g/L como, por exemplo, a peptona de carne, a peptona de soja e misturas de peptonas, e extrato de levedura, em quantidades de 0,01 até 40 g/L. Estes componentes nitrogenados por sem só não brindam todos os nutrientes nem as vitaminas necessárias para um crescimento profuso e precoce de todas as espécies de Candida e, além disso, não garantem de nenhuma maneira reações cromogênicas bem definidas e de coloração intensa nas primeiras horas de crescimento das espécies de Cândida. A inclusão na formulação de fontes de carbono, nas concentrações assinaladas pelos autores, tais como: glicose, acetato, lactato, amino butirato, entre outros, ou suas misturas só pode ser empregada em combinação com este tipo de substrato cromogênico específico, já que competiria com a atividade enzimática de outras espécies de Candida e limita, por sua vez, a possibilidade de incorporar outros substratos cromogênicos ou fluorogênicos para identificar ou diferenciar outras espécies de Candida. Tal é o caso da glicose que impediria ou debilitaria a atividade da glucosidase. Na composição do meio são incluídos tampões tais como fosfatos, TRIS, HEPES e citratos, os quais encontram-se em quantidades que garantem um pH na região próxima de 7, o que só favorece a Candida albicans, e não a outras espécies do gênero de interesse sanitário ou ambiental.

Outros ativadores podem ser adicionados ao meio como sais de magnésio, manganês e cálcio em quantidades de 0 a 10 mmol/L.

Na formulação também são incluídas substâncias que aumentam a permeabilidade celular tais como sais biliares, desoxicolato de sódio, polioxietilenoglicol e éteres de alquil fenol, sorbitana e ésteres de ácidos graxos em uma concentração de 0 a 5 g/L. Algumas destas substâncias como, por exemplo, os sais biliares resultam inibitórias em extremo para algumas espécies de Candida, incluindo Candida albicans. Também ao meio é adicionada uma mistura de inibidores de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tais como gentamicina, penicilina, entre outros. Estas substâncias, em seu maioria, são instáveis ao calor è devem ser preparadas e utilizadas com rapidez. Além disso, os meios preparados, prontos para o uso em placas de Petri1 devem ser armazenados em refrigeração por períodos de conservação não prolongados variando de 2 a no máximo 30 dias.

É descrita a possibilidade do emprego de telurito e molibdato ou suas misturas que resultam igualmente altamente inibitórias para algumas espécies de Candida. Dentro de outras desvantagens evidentes dos distintos meios descritos na invenção, pode-se mencionar què inclusive depois de 24 horas de incubação nem todas as colônias de Candida albicans desenvolveram uma coloração forte sendo exigido mais de 48 horas para que a maioria de Candida albicans desse uma resposta de cor intensa, outras espécies de Candida não deram resposta (Tabelas Il e Ill do trabalho original).

Vários autores tem relatado o uso de extratos vegetais com diferentes propósitos para o cultivo ou diferenciação de espécies de Candida.

Zia OU. Kham e colaboradores ("Tobacco ágar, a New Médium for Differetiating Candida dubliniensis from Candida albicans", J. Clin. Microb., v. 42(10):4796-4798, 2004), empregaram o ágar de sementes de girassol para cultivar Candida dubliniensis, igualmente descrevem o uso de extrato de folhas de tabaco e nicotina em um meio de cultivo. Nenhum dos extratos empregados aporta as vitaminas e os açúcares suficientes e adequados para o crescimento das espécies de Candida de interesse. Tampouco os meios permitem diferenciar todas as espécies entre elas e, por último, diferenciação e identificação baseia-se não só nas cores diferentes, e sim nas características morfológicas das colônias baseadas na produção de clamidosporas pelo que se exige um pessoal qualificado para a leitura e interpretação dos resultados.

Dostál e colaboradores, em 2003, descreveram o emprego de um meio que contém hemoglobina bovina, extrato de levedura e azul de bromofenol para detectar atividade proteolítica de Candida. (Dostál J., Hamal P., Pavlicková L., Soucek M., Ruml T., Pichova I., Huskova-H O., "Simple Method for Screening Candida Species Isolates for the Presenee of Secreted Prótèinàses: A Tool for the Prediction of Successful Inhibitory Treatment",J. Clin. MicrobiOl:, 2003, Fev., 41 (2):712-716). Os inconvenientes fundamentais são que a hemoglobina só detecta a atividade asparto- protease presente em todas as espécies, pelo que não é útil para diferenciá-las entre elas. Além disso, é preciso filtrar a hemoglobina e adiciona-la como suplemento em condições de assepsia, o que dificulta o procedimento. Outras deficiências consistem na necessidade de dissolver o indicador em etanol, o pH do meio é excessivamente baixo (4-4,5) e não é o ótimo para a promoção do crescimento de leveduras, a temperatura de incubação é a 30 graus e não resulta ótima e a detecção da atividade proteolítica pode se estender até 5 a 7 dias. Bramono K. é colaboradores, no 2006, estudaram diferentes atividades enzimáticas em espécies de Candida, especificamente proteinase, Iipase e alfa-glucosidase em meios mínimos que estavam deficientes em nutrientes. (Bramono K., Yamazaki M., Tsuboi R., Ogawa H., "Comparison of Proteinase, Lipase and a- Glucosidase Activities from the Clinicai Isolates of Candida Species", Jpn J. Infect. Dis., v. 59, 73-76, 2006). Os autores encontraram atividade proteinase extracelular significativa em Candida albicans, Candida parapsilosis e Candida tropicalis. Não obstante, esta atividade estava associada à hidrólise dê proteínas dó soro bovino (albumina) como fonte de nutrientes para o crescimento e nãó desempenhou um papel como ferramenta de identificação ou diferenciação, já que outras espécies também apresentaram dita atividade, ainda que em menor grau. A adição de albumina como marcador da atividade proteolítica reduz a estabilidade do meio. A atividade lipolítica foi induzida com Tween 80, sendo esta substância a única fonte de carbono empregada, e dita atividade foi significativamente maior em Candida tropicalis, Candida albicans e Candida parapsilosis. A atividade alfa-glucosidase foi estudada incorporando, em um meio minimo 0,6% de maltose e foi empregado p-nitrofenil alfa-D-glucopiranosideo, lendo a densidade óptica em espectrofotômetro. Os resultados demonstraram que Candida tropicalis, Candida albicans e Candida parapsilosis possuíam a maior atividade enzimática em um meio líquido mínimo. A reação não é observável a olho nu, e é preciso equipamento para a leitura e interpretação dos resultados. O objetivo do trabalho mencionado foi executar estudos básicos da atividade enzimática de Candida em condições de baixos nutrientes e não com fins de identificação ou diferenciação de espécies.

Asmaa Ao Mosaid e colaboradores ("Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on Staib Agaf and Caffeic -Citrate Agar", J. Clin. Microb., v. 39(1), 323-327, 2001), descreveu a identificação de Candida dubliniensis patogênica em dois meios de cultivo. Em um deles emprega-se um extrato aquoso de semente de Guizotia abyssinica com a adição de glicose e creatinina. Outro emprega extrato de levedura, glicose, sulfato de amônio, citrato férrico e ácido caféico. Nenhum dos meios mencionados é capaz de garantir o crescimento de Candida de maneira precoce devido, fundamentalmente, a não possuírem o conteúdo de vitaminas, substâncias nitrogenadas e carboidratos suficientes para promover o crescimento rápido e abundante de todas as espécies de Candida.

Esse mesmo autor em seu artigo "Differentiation of Candida dubliniensis from Candida albicans on PaI1S Agar" (J. Clin. Microb., v. 41(10): 4787-4789, 2003), comparou o emprego do ágar Pal utilizando extrato de sementes de girassol dessalinizado com o ágar Staib. Em ambos casos a identificação e diferenciação de Candida foi obtida depois de 48-72 horas de incubação. Deste trabalho pode-se chegar às mesmas conclusões anteriormente citadas, com respeito às deficiências dos meios comparados.

Venitia M. C. e colaboradores ("New Chromogenic Agar Médium for the Identification of Candida ερρΛ J. of Virology, v.68(7): 3622-3627, 2002), descrevem um novo meio de cultivo para a identificação de espécies de Candida baseado no uso do ágar Dextrose de Sabouraud com a adição de um substrato cromogênico para a detecção da atividade glicosaminidase de Candida albicans e Candida dubliniensis. Este meio foi comparado com o meio ágar Candida ID (BioMérieux) e CHROMagar Candida (CHROMOagar Company Ltd.). O resultado da comparação indicou que ágar Candida ID não foi capaz de diferenciar cepas de Candida tropicalis de Candida kefyr. Tampouco diferenciou Candida guilliermondii das mencionadas espécies. Chromogenic ágar Médium só foi capaz de identificar Candida albicans.

O novo meio é deficiente em vitaminas e micro elementos necessários para o crescimento abundante de todas as espécies de Candida. A glicose é a única fonte de carboidrato e de energia no meio, a peptona micológica, por sem só, não garante os demais nutrientes necessários para a maioria das espécies a cultivar. Tampouco os meios CLED, ágar nutriente, ágar LAB Lemco1 ágar para contagem em placas e ágar extrato de levedura, chegaram a resultados satisfatórios pelas razões antes mencionadas.

Uma desvantagem importante a mencionar em todos os meios estudados no mencionado trabalho, incluindo o novo meio, consiste na pouca estabilidade dos mesmos na sua forma pronta para uso em placas de Petri que durou no máximo só 6 semanas, devido fundamentalmente à natureza lábil de alguns substratos e reagentes empregados, destacando-se especialmente o caso do Candida ID ágar que deve ser incubado em ausência de luz segundo as instruções do fabricante.

Finalmente, pode-se mencionar que nem o CDA ágar, nem Candida ID ágar, nem CHROMOagar Candida foram capazes de diferenciar eficientemente as cepas e/ou espécies de Candida entre sem, particularmente a espécie Candida albicans varia a cor de verde a azul púrpura e azul turquesa, confundindo-se com Candida glabrata, Candida guillermondii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaneae, Candida parapsilosis, Candida peiliculosas, Candida rugosa e Candida tropicaiis. No meio Candida ID ágar há espécies de Candida que se confundem segundo seu coloração com outras espécies de leveduras.

As tentativas de incorporar o novo substrato cromogênico ao ágar farinha de milho, ágar batata e dextrose, ágar extrato de arroz, não beneficiaram a identificação e diferenciação das diferentes espécies de Cancf/cfa. Esta conclusão dos autores confirma que nenhuma das fontes de origem vegetal empregadas tradicionalmente nestes meios foi capaz de proporcionar os metabólitos promotores que interferem nos diferentes ciclos metabólicos das espécies de Candida estudadas, nem as reações cromogénicas ou fluorogênicas que foram empregadas conjuntamente com ditos nutrientes possibilitaram o isolamento, diferenciação e identificação de todas as espécies de Candida de interesse clínico ou ambiental.

O objetivo da presente invenção consiste em prover uma composição de um meio de cultivo para o isolamento seletivo, diferenciação e a identificação simultânea de espécies fúngicas, em especial, do gênero Candida^

A novidade da presente invenção consiste na inclusão na composição do meio nutritivo, de uma mistura de extrato de batata-doce e extrato de levedura ou extrato de tomate, em quantidade de 20 a 30 g/L. Dita mistura é composta de 50 a 67% de extrato de batata-doce e de 33 a 50% de extrato de levedura ou de 33 a 50% de extrato de tomate.

Não existem relatos anteriores do uso do extrato de batata- doce para o cultivo de espécies de Candida, que, surpreendentemente, viu-se favorecido pela inclusão desta base nutritiva no meio de cultivo.

Outro aspecto novo da invenção consiste em combinar a mistura que contém extrato de batata-doce e extrato de levedura ou de tomate com outras fontes de nitrogênio, preferencialmente à glicina de 0 a 3 g/L, peptona bacteriológica de 0 a 5 g/L, hidrolisado enzimático de caseína de 0 a 5 g/L, encontrando- se ditas fontes em um total de 0 a 13 g/L na composição do meio nutritivo, obtendo desta maneira uma nova combinação de fontes de nitrogênio anteriormente não refletidas na literatura científica.

A combinação dos ditos nutrientes com inibidores dos microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos, que se encontram no meio nutritivo resulta diferente de todos os relatos encontrados no estado da técnica para o cultivo de espécies de Candida. Ditos inibidores encontram-se no protótipo que constitui objeto da presente invenção em quantidade de 0 a 10 g/L e são preferencialmente selecionados entre o ácido nalidíxico em quantidades de 0 a 0,05 g/L, a rosa de bengala de 0 a 0,05 g/L, desoxicolato de sódio de 0 a 0,5 g/L, sulfito de sódio de 0 a 3 g/L, ou citrato de amônio e bismuto de 0 a 5 g/L, o cloreto de tètrafeniltètrazol de 0 a 0,05 g/L.

Esta combinação resulta nova, além disso porque nunca antes foram combinadas substâncias promotoras do crescimento microbiano a partir de batata-doce com os inibidores mencionados, nem se conseguiu a inibição sem o emprego de substâncias lábiles e sem afetar o crescimento de Candida.

Nesta composição, pela primeira vez em um meio de cultivo, adiciona-se ácido nalidíxico em quantidades de 0 a 0,05 g/L para inibir o crescimento de bactérias Gram-negativas na presença de Candida. Isto não foi feito antes por causa do efeito inibitório comprovado deste antibiótico sobre esta espécie fúngica. Isto foi possível, graças a sua combinação com uma sal de magnésio (sulfato de magnésio), que de maneira inesperada suprimiu o efeito inibidor sobre Candida. Outro aspecto original da presente invenção consiste na combinação de substâncias que propiciam a identificação das diferentes espécies de Candida baseadas na troca de cor e/ou fluorescência, aparição de halos e morfologia das colônias, e na troca das características do meio, com os nutrientes que o extrato de batata-doce fornece.

Estas substâncias a combinar com a mistura de extrato de batata-doce e levedura são selecionadas entre os substratos cromogênicos e fluorogênicos para detectar as atividades enzimátícas.

São combinados, pela primeira vez, um grupo de substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos e marcadores de atividade proteolítica para a detecção simultânea das atividades enzimáticas presentes nas espécies do gênero Candida conjuntamente com a fase de isolamento seletivo das amostras de origem clínica ou ambiental, na presença de ativadores de ditas reações, que anteriormente não haviam sido relatados para ditos propósitos, tais como a trehalose ou a maltose em quantidades de 0 a 10 g/L. Pela primeira vez é previsto empregar a detecção da atividade a- glucosidase em uma composição de um meio de cultivo agarizado para diferenciar ou identificar espécies de Candida por reações cromogênicas ou fluorogênicas, em especial de Candida aibicans, Candida tropicalis e Candida parapsilosis. Para este propósito é incorporado o metil-umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo em quantidades de até 0,1 g/L. De maneira similar, o estado da técnica não descreve a inclusão em meiós de cultivo para leveduras e em especial do gênero Candida, de substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos na composição de meios de cultivo cromogênicos ou fluorogênicos para identificar a atividade fosfolipase presente em espécies tais como Candida aibicans, Candida tropicalis e Candida parapsilosis, neste caso, o sal de amônio do 5-bromo-4- cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfatõ, em quantidades de até 0,1 g/L.

Resultou inesperado o efeito de combinar um conjunto de substratos para conseguir, pela primeira vez, diferenciar todas as espécies de Candida de interesse clínico, especificamente, Candida aibicans é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio do 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato), alfa- glucosidase (metil-umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo), das hexosaminidases (metil- umbeliferil-N-acetil-beta-D-galactopiranosídeo e 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-beta- D-glicosaminida) e L-prolina aminopeptidase (hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil- coumarina e L-prolina-paranitroalinina); Candida tropicalis, é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio do 5-bròmo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato) e alfa- e beta- glucosidases (metil-umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo, 5-bromo-4-cloro-3- indoxil-beta-D-glucopiranosídeo e 6-clóro-3-indoxil-beta-D-glucopiranosídeo); Candida kefyr, é identificada por sua atividade beta-glucosidase (5-bromo-4-cloro-3-indoxil-beta-D- glucopiranosídeo e 6-cloro-3-indoxil-beta-D-glucópiranosídeo), além disso, de sua atividade proteolítica; Candida parapsilosis é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio do 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato), alfa-glucosidase (metil- umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo) e L-prolina aminopeptidase (hidrobrometo de L- prolina-7-amido-4-metil-coumarina e L-prolina-paranitroalinina) e Candida krusei e Candida glabrata por sua cor branca (opaca e brilhante, respectivamente) devido à ausência, nestas duas últimas espécies, das mencionadas atividades enzimáticas.

Outro elemento novo consiste na inclusão de um marcador de atividade proteolítica presente só em Candida kefyr, e neste caso, de maneira surpreendente, a caseína do leite desnatado em pó em quantidades de até 10 g/L foi hidrolisada por este microorganismo diferentemente do resto das demais espécies. A inclusão de maltose ou trehalose na composição, com presença de outras fontes de carbono, repercutiu surpreendentemente em um marcado aumento da intensidade da reação cromogênica (cor) das colônias. Este efeito é contraditório com a prática geral do mercado, que prevê o emprego de substratos cromogênicos e fluorogênicos, em meios que, em geral, não empregam açúcares ou outras fontes de carbono de natureza similar à dos substratos, para evitar a queda drástica do pH e, em conseqüência, a diminuição da intensidade da reação cromogênica, ou para evitar a ocorrência da diminuição da intensidade do cor das colônias por outros mecanismos competentes, mediante os quais, os microorganismos consomem o açúcar mais disponível e metabolizam em menor grau o substrato cromogênico.

Resulta igualmente original a combinação do grupo de substâncias cromogênicas e/ou fluorogênicas com outros indicadores ou corantes, fontes de carbono e sais orgânicos e inorgânicos que se encontram no meio nutritivo em quantidade de O a 26 g/L, como são o glicerol de O a 25 mL/L, púrpura dè bromocresol de O a 0,04 g/L, azul de bromotimol de 0 a 0,08 g/L e sulfato de magnésio de 0 a 0,5 g/L.

A combinação das substâncias reguladoras de pH, em quantidades de 0 a 5 g/L, dentro das quais algumas atuam como ativadores enzimáticos tais como os fosfatos, preferencialmente o fosfato monopotássico (de 0 a 1 g/L) e o dipotássico (de O a 4 g/L), em um ambiente de pH regulado com o emprego de tampões preferencialmente o ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico (MOPS) (de 0 a 0,5 g/L), resulta singular ao ver-se combinada sua ação com os micro e macro elementos presentes no extrato de batata-doce que surpreendentemente atuam como tampões e mantêm os valores do pH em uma faixa apropriada para todas as espécies de Candida.

Desta maneira, surpreendentemente, observou-se uma maior promoção do crescimento de todas as espécies de Candida com a composição descrita na presente invenção (média de 113%), com respeito aos meios tradicionais formulados sem inibidores, tais como o ágar Dextrose de Sabouraud1 meio por excelência para promover o crescimento dos fungos.

Esta descoberta não resultou evidente a partir do estudo do estado da técnica, que estabelece que os inibidores de bactérias em geral inibem, em certo grau, o crescimento microbiano das espécies de interesse. É assim quei em geral, quando são calculados os índices de recuperação dos meios seletivos contra os meios especiais sem inibidores, as contagens e morfologias das colônias são inferiores em ditos meios seletivos.

O meio nutritivo possui, além disso, de 13 a 15 g/L de ágar para garantir o desenvolvimento das características morfológicas próprias das colônias das diferentes espécies de Candida, assim como a observação de reações cromogênicas ou bioquímicas no meio, como a formação de halos transparentes.

O original meio nutritivo é composto, além disso, de água destilada ou deionizada, na qual são dissolvidos os demais componentes sólidos ou líquidos em quantidades de 35 a 50 g/L, ajustando seu pH de 6,0 a 6,8. Com ajuda deste meio nutritivo, pela primeira vez pode-se isolar seletivamente, identificar e diferenciar de maneira simultânea as espécies de Candida de interesse clínico e ambiental em um período tão curto como de 24 a 48 horas.

É de destacar que o meio nutritivo com a adição dos substratos indicadores possibilita uma nova combinação de critérios morfológicos e bioquímicos das espécies de Candida a identificar.

Com esta composição para o isolamento e diferenciação de espécies fúngicas, obtém-se como principal novidade e vantagem, isolar e identificar simultaneamente o maior número de espécies de Candida, relatadas no estado da técnica, especificamente, consegue-se pela primeira vez diferenciar 94% das espécies de Candida com incidência na clínica, Candida albicans, Candida tropicaiis, Candida kefyre Candida parapsiiosis, além disso, de Candida krusei: As vantagens que oferece o novo meio nutritivo consistem em:

- O meio nutritivo garante o crescimento abundante das diferentes espécies de Candida de interesse clínico ou ambiental, ao possuir uma ampla gama de nutrientes fornecidos pelo extrato de batata-doce e sua combinação com o extrato de leveduras ou de tomate. Este crescimento abundante é observado dentro das 24 horas de incubação, sem a necessidade de esperar mais de 48 ou 76 horas para que as colônias mostrem características morfológicas peculiares.

- A combinação do extrato de batata-doce com o extrato de levedura ou de tomate, garante níveis de macro- e micro- elementos, vitaminas, especialmente C e do complexo B, assim como outras substâncias extrativas solúveis em água, que potencializam as rotas metabólicas das diferentes espécies de Candida e sua atividade enzimática específica, o que por sua vez resulta na aparição de reações cromogênicas, fluorogênicas e de decomposição de substratos convencionais em um máximo de 24 a 36 horas. Esta potencialização permite incluir, na formulação do meio final, vários marcadores bioquímicos para a identificação simultânea, em um só passo, de diferentes espécies de Candida.

- Uma vantagem marcada da presente invenção reside em que se obtém uma recuperação das espécies de Candida de interesse superior a 110% como média, com respeito a meios sem inibidores e projetados especificamente para o cultivo de fungos.

- O meio nutritivo é simples em seu preparação, não necessita de adições complicadas, a técnica de inoculação é a costumeiramente empregada.

- A identificação das diferentes cepas e espécies de Candida é realizada visualmente, pela diversidade de cores das colônias, e do meio, a formação de halo transparente ao redor da colônia e finalmente pelos aspectos fundamentais da morfologia colonial (bordas e superfície) e não necessita de pessoal especialmente treinado, nem qualificado para a preparação do meio ou a interpretação dos resultados. A contribuição de nutrientes da mistura dê extrato de batata-doce e levedura ou de tomate permite contar com um meio nutritivo capaz de isolar, recuperar, diferenciar e identificar as colônias de Candida em um só passo, sem necessidade de contar com um método ou meio de isolamento prévio das colônias.

A sensibilidade e exatidão analíticas do meio resultam elevadas, graças ao quê a identificação não depende de um conjunto de indicadores ou marcadores bioquímicos, e sim de reações enzimáticas próprias das diferentes espécies, e de características morfológicas bem estabelecidas, sem ambigüidades ou diversidades entre as diferentes cepas de uma mesma espécie.

Com os componentes cromogênicos da nòva composição e sua combinação com o leite desnatado, obtém-se novas formas de diferenciação ou identificação das espécies de Candida de interesse com mais de um marcador enzimático, o que incrementa notavelmente a sensibilidade e exatidão diagnostica com respeito às soluções anteriores.

A combinação dos extratos provenientes do batata-doce e da levedura ou do tomate, permitem afirmar que o novo meio, possui um significativo conteúdo de vitaminas, especialmente A, B1, B5, B6, B12 e C, fornecidos pelos extratos, metabólitos todos, que favorecem o crescimento exuberante das diferentes espécies de Cândida. A contribuição de extratos de batata-doce e levedura ou tomate garante, além disso, um conteúdo de diferentes carboidratos que podem suprir todas as necessidades das diferentes espécies, pelo que não é necessário incluir outros carboidratos para suprir as necessidades essenciais das espécies a cultivar. Este fato, além disso, possibilita a identificação e diferenciação das espécies pela capacidade de decompor substratos constituídos por carboidratos ou que contêm grupos que mimetizam ditos carboidratos. O meio nutritivo é favorecido pelo conteúdo de ferro, cálcio, fósforo, magnésio, potássio, entre outros micro elementos, fornecidos pelas fontes de onde se obtém a mistura dos extratos, em especial, pelo de batata-doce e, portanto, não existe a necessidade de incorporar outros sais para suplementar, do ponto de vista nutricional, as espécies de Candida a isolar ou identificar. Tampouco é necessário uma contribuição adicional substancial, para ativar as reações enzimáticas que permitam a diferenciação de espécies de Candida por testes bioquímicos e/ou cromogênicos e fluorogênicos. A adição deste tipo de substâncias ao novo meio nutritivo, só é necessária em aqueles casos, que é necessária uma complementação adicional para obter respostas muito rápidas a partir de inoculações pobres, ou concentrações muito reduzidas das leveduras nas amostras.

A reação cromogênica e/ou fluorogênica de identificação das diferentes espécies é marcadamente superior em intensidade às características de outros meios de cultivo descritos no estado da técnica, graças ao efeito potencializador alcançado ao adicionar trehalose ou maltose nas quantidades anteriormente assinaladas à composição.

A combinação da mistura de extrato de batata-doce com levedura ou tomate em combinação com outras fontes de nitrogênio, tais como glicina, hidrolisado enzimático de caseína, peptona bacteriológica, nas quantidades previstas, possibilita garantir diferentes formas de nitrogênio (amínico, aminoacídico, peptidico, polipeptídico e proteínico) capazes de suprir as diferentes necessidades das distintas espécies dos microorganismos a cultivar nos estágios iniciais de desenvolvimento celular e, portanto, as colônias se desenvolvem em tempo mais curto. Por outro lado, esse suprimento adicional permite manter as colônias nas placas de Petri por períodos ainda mais prolongados de tempo.

O meio nutritivo não contém substâncias que, por sua natureza, prejudiquem as reações bioquímicas, cromogênicas, nem fluorogênicas, como no caso da cicloheximida, cloranfenicol, gentamicina ou rodâmina, seja porque interferem com a rota metabólica da ação específica enzimâ-substrato, ou porque dão cor à colônia e impedem a detecção da formação de cor ou fluorescência.

Na composição do meio não se empregam substâncias antibacterianas termolábiles para inibir o crescimento de microorganismos Gram-negativos ou Gram-positivos ou de outros tipos de leveduras ou mofos, e sim combinações de substâncias mais estáveis, tais como ácido nalidíxico, desoxicolato de sódio, sulfito de sódio, citrato de amônio, rosa de bengala, o que finalmente resulta em uma maior estabilidade do meio nutritivo preparado e pronto para o usó em placas de Petri.

Por outra parte, a não necessidade de incluir estes inibidores, repercute na melhor recuperação das mesmas espécies de Candida que tem seu desenvolvimento afetado por substâncias tais como o telurito que, em concentrações moderadas, inibe e retarda seu crescimento.

A adição de ácido nalidíxico propicia uma inibição mais efetiva das bactérias Gram- negativas em comparação com soluções anteriores, a composição se torna mais estável ao calor e no tempo.

O emprego do ácido nalidíxico como inibidor, permitiu, pela primeira vez em uma composição para a identificação de espécies de Candida, a incorporação dos marcadores enzimáticos cromogênicós ou fluòrogênicos para detectar atividade fosfolipase ou alfa-glucosidase, já que os demais agentes inibidores empregados costumeiramente, proporcionam diferentes reações cromáticas às colônias das espécies de Candida.

Torna-se possível isolar, de maneira seletiva, as espécies de Candida diretamente das amostras clínicas ou ambientais graças á inibição da flora bacteriana acompanhante, que pode encontrar-se incluída ém altas concentrações (3-5 x 10 8 UFC/mL), enquanto que as espécies de Candida mostram, como média, 113% de recuperação com respeito a um meio geral sem inibidores (ágar Dextrose de Sabouraud). Este efeito é obtido graças à nova combinação dos inibidores de microorganismos Gram- negativos e Gram-positivos com os nutrientes e os sais de magnésio.

- A presente invenção não prevê tampouco o emprego de substâncias sensíveis à luz, em tal extremo que a incubação do meio deva ser realizada em ausência de luz.

- A combinação de extrato de batata-doce e de levedura ou tomate com os diferentes sais incluídos na formulação (K2HPO4, KH2PO4, MgSO4), nas concentrações indicadas, garante uma capacidade tamponante adequada em uma ampla faixa de valores de pH (6,0-6,8), adequados para as diferentes èspécies de microorganismos a detectar e impede, por sua vez, a inibição do crescimento por acumulação de metabólitos que aumentam a acidez do meio.

- A mistura de extrato de batata-doce e de levedura permite que as reações de identificação, tanto bioquímicas, como cromogênicas e fluorogênicas transcorram de maneira natural, ativadas pelos micro-, macro- elementos e vitaminas, sem a necessidade de empregar substâncias que aumentam a permeabilidade das células em altas concentrações, tais como os sais biliares, que provocam inibição de algumas espécies de Candida.

- A incorporação de maltose ou trehalose não só potencializa a reação cromogênica das colônias, como também permite um crescimento mais intenso e colônias de maior tamanho que o obtido com os meios de cultivo existentes no estado da técnica.

- A presença de ágar em quantidade de 13 a 15 g/L, na combinação da soma dos demais componentes sólidos e a água adicionada para preparar o meio nutritivo, garante um suporte sólido para que as colônias de Candida desenvolvam suas cores e características morfológicas diferenciais em uma combinação tal, que todas as espécies estudadas possam ser isoladas ou recuperadas e simultaneamente identificadas e/ou diferenciadas umas das outras, sem o emprego de técnicas complexas de inoculação ou pessoal especialmente treinado.

- A concentração de ágar e dos demais componentes sólidos e líquidos, e de água, permite detectar reações cromogênicas e fluorogênicas, assim como bioquímicas e além disso especificidades coloniais ou morfológicas, ou liberação de metabólitos ou aparição de halos na superfície e/ou profundidade do meio, pelo que qualquer reação pode ser visualizada não só pela parte superior da placa, e sim pelo seu fundo.

- As concentrações de meio nutritivo em água variam de 35 a 50 g/L, encontrando-se sempre a concentração de extrato de batata-doce no meio nutritivo final na faixa de 10 a 20 g/L.

A descrição detalhada da invenção consiste em preparar uma mistura de extrato de batata-doce em pó com extrato de levedura, encontrando-se o extrato de batata-doce em quantidade de 50 a 67% com respeito à massa da mistura. De maneira similar, o extrato de batata-doce pode ser misturado com extrato de tomate, encontrando-se o extrato de batata-doce em quantidade de 50 a 67% com respeito à massa da mistura. A mistura de extrato de batata-doce com o extrato de levedura ou com o extrato de tomate, é adicionada ao meio nutritivo em quantidade de 20 a 30 g/L.

A mistura também pode ser elaborada a partir dos extratos em forma líquida, e nesse caso, o cálculo para a mistura é realizado a partir do conteúdo de sólidos totais nos dois tipos de extratos a misturar. Se preparada a partir de algum ingrediente líquido, a quantidade de mistura de extratos líquidos é calculada também a partir do conteúdo de sólidos totais da mistura e o resto de sua massa será subtraído do volume de água a ser usado para preparar o meio nutritivo.

A mistura é adicionada a 1 L de água destilada ou deionizada com um pH de 5 a 7 (o conteúdo de umidade é previamente subtraído como mencionado anteriormente ao misturar um ou ambos extratos em forma liquida).

As demais substâncias que contribuem com nitrogênio são adicionadas em quantidades de 0 a 13 g/L. Estas são especificamente selecionadas dentre glicina em concentração de O a 3 g/L, peptona bacteriológica de 0 a 5 g/L e hidrolisado enzimático de casefna de 0 a 5 g/L. Os inibidores são incorporados em quantidades de 0 a 10 g/L e são preferencialmente selecionados entre o ácido nalidíxico em quantidade de 0 a 0,05 g/L, a rosa de bengala, que é adicionada em quantidade de 0 a 0,05 g/L, o desoxicolato de sódio de 0 a 0,5 g/L, sulfito de sódio de 0 a 3 g/L, o citrato de amônio e bismuto de 0 a 5 g/L e o cloreto de tetrafeniltetrazol de 0 a 0,05 g/L.

São adicionadas, além disso, as substâncias que propiciam a identificação das diferentes espécies de Candida selecionadas entre os substratos cromogênicos e fluorogênicos, indicadores ou corantes que se encontram no meio nutritivo em quantidade de 0 a 26 g/L, preferencialmente o sal de amônio do 5-bromo-4- cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato em quantidade de 0 a 0,1 g/L, metil-umbeliferil-a-D- glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, o 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-glicosaminidina de 0 a 0,1 g/L, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-p-D-glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, o A- metilumbeliferil-N-acetil-p-D-galactosaminida de 0 a 0,15 g/L, o 6-cloro-3-indoxil-p-D- glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, glicerol de 0 a 25 mL/L, púrpura de bromocresol de 0 a 0,04 g/L, azul de bromotimol de 0 a 0,08 g/L, hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil- coumarina de 0 a 0,1 g/L, L-prolina paranitroanilida de 0 a 0,2 g/L.

Os compostos ativadores e potencializadores das reações cromogênicas e fluorogênicas são adicionados, entre eles o glicerol de 0 a 25 mL/L, a maltose de 0 a 10 g/L, a trehalose de 0 a 10 g/L e o sulfato de magnésio de 0 a 0,5 g/L. O leite desnatado em pó é adicionado em concentração de 0 a 10 g/L. São adicionadas, além disso, outras substâncias reguladoras do pH em quantidades de 0 a 5 g/L, preferencialmente o fosfato monopotássico em quantidade de 0 a 1 g/L e o dipotássico de 0 a 4 g/L e o ácido 3-[N-morfolino] propanosulfônico (MOPS) de 0 a 0,5 g/L.

O ágar é adicionado em quantidade de 13 a 15 g/L e o pH do meio nutritivo é ajustado para de 6,0 a 6,8.

O meio de cultura preparado é fundido por meio de qualquer um dos métodos conhecidos.

A seguir, são relacionados alguns exemplos de realização do novo meio nutritivo segundo a presente invenção.

Exemplo 1

Ensaio para avaliar a capacidade nutritiva da mistura de extrato de batata-doce com extrato de levedura ou tomate dentro da formulação do meio de cultivo e o uso de alguns substratos Cromogênicos e/ou fluorogênicos.

Foram ensaiadas duas formulações do meio nutritivo (Meio 1 e Meio 2), em comparação com um meio dê cultivo cuja fonte de nutrientes é o extrato de maIte (RI).

Tabela 1. Composição dos meios

<table>table see original document page 16</column></row><table>

O pH do meio foi ajustado a 6,5 e depois de esterilizar foi estabilizado em 6,0 na variante 1 e na variante 2 foi estabilizado em 6,4 e no meio de comparação RI, foi mantido em 6,3.

O Meio 2 corresponde com a formulação do Meio 1 mas em lugar do extrato de tomate foi utilizado extrato de levedura na mesma concentração de 10 g/L.

O meio de comparação (RI) foi formulado com extrato de malte (Merck), na concentração de 20 g/L.

Os microorganismos ensaiados (cepas isoladas, provenientes da faculdade de Biologia da Universidade da Habana) foram: Candida albicans (2 cepas), Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida kefyr e Candida krusei.

As placas foram incubadas a 30°C por 24 e 48 horas. As colônias foram examinadas visualmente e foram interpretadas da seguinte forma:

- Colônias azuis correspondem àquelas espécies que possuem a enzima β-D- glucosidase, a saber Candida tropicalis e Candida kefyr.

- Colônias com fluorescência azul correspondem àquelas espécies que possuem a enzima N-acetil-p-D-galactosaminidase a saber Candida albicans e cepas de Candida tropicalis.

- Colônias brancas correspondem àquelas cepas que não possuem enzimas (β-D- glucosidase e N-acetil-p-D-galactosaminidase. As espécies são identificadas de acordo com características morfológiças tais como: Candida krusei, Candida glabrata e Candida parapsilosis.

Os resultados do ensaio são apresentados na tabela 2. As espécies de Candida podem ser identificadas de acordo com as características culturais das colônias. A 24 horas de incubação, surpreendentemente, foi observado crescimento característico de Candida albicans e de Candida tropicalis, sobretudo as características coloniais nos meios.

As colônias eram de tamanho característico, bem desenvolvidas, favorecidas pelos nutrientes providos pelo extrato de batata-doce em conjunto com o extrato de levedura ou com o de tomate.

A 48 horas foi mantido o crescimento exuberante das colônias e conservaram sua morfologia.

Observou-se que òs meios 1 e 2, formulados com a mistura de extrato de batata-doce e extrato levedura, possibilitaram a diferenciação das espécies de Candida pela combinação de cores e fluorescência, enquanto que ao empregar extrato de malte (RI) como referência só foi desenvolvida a cor azul erri Candida kefyr. Com a combinação de extrato de batâta-doce e tomate, a concentração do substrato cromogênico não foi suficiente e foi decidido aumentar a concentração nos experimentos subseqüentes.

Foi demonstrado igualmente que a presença de carboidratos no extrato de batata-doce e sua mistura com o extrato de levedura, não só beneficiam o crescimento intenso das espécies estudadas, e também que não interferem e, inclusive, favorecem a aparição de reações cromogênicas e/ou fluorogênicas a partir dos substratos incorporados, confirmando a plena compatibilidade dos extratos mencionados com os substratos. Assim não ocorreu com o extrato de malte, que inibiu a aparição de reações fluorogênicas para Candida tropicalis às 48 horas e a cromogênica para a maioria delas a exceção de Candida kefyr.

Por último, foi verificado que a concentração de ágar resultou adequada e permitiu observar características coloniais muito bem definidas, o meio nutritivo não sofreu rachaduras, ou rupturas em sua superfície, foram observadas muito bem as reações de coloração das colônias na superfície e em toda a profundidade do meio. A reação fluorogênica observou-se no meio, além disso, de maneira muito evidente.

Tabela 2. Identificação das espécies de Candida ensaiadas nos meios analisados

<table>table see original document page 18</column></row><table>

Exemplo 2

Procedeu-se combinar a mistura de extrato de batata-doce e de levedura com substratos cromogênicos é fluorogênicos (5-bromo-4-cloro-3-indolil-N- acetil-p-D-glucopiranosídeo, 4-metilumbeliferil-N-acetil^-D-galactosaminida; em concentrações maiores, foi adicionado L-prolina paranitroanilida) e foi empregado o desoxicolato de sódio como agente bacteriostático (tabela 3).

As cepas foram inoculadas nas cavidades até o esgotamento do inoculador. Os meios foram incubados a 30°C, por um período de 36 horas.

Foi possível observar que em ambos meios foi obtido crescimento exuberante, inclusive às 36 horas, e as características cromogênicas e/ou fluorogênicas, assim como as morfológicas permitiram diferenciar as espécies de Candida (tabela 4).

Tabela 3. Composição dos Meios Nutritivos 3 e 4 <table>table see original document page 19</column></row><table>

Foi igualmente possível estabelecer que os extratos que compõem o meio nutritivo são compatíveis com os substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos, que podem ser visualizados no interior da célula, e aqueles que se difundem no meio. As reações de decomposição de ditos substratos são favorecidas pela presença dos extratos de batata-doce e levedura.

Tabela 4. Identificação das espécies de Candida ensaiadas nos meios 3 e 4

<table>table see original document page 19</column></row><table>

Exemplo 3

O meio nutritivo (Meio 5) foi preparado no laboratório a partir dos ingredientes (tabela 5), foi distribuído nas placas de Petri e foi inoculado.

A inoculação foi realizada por diluições até obter colônias isoladas na faixa entre 30 - 300 UFC/placa.

Foi executada a incubação a 30°C durante 36 a 48 horas.

O meio nutritivo (tabela 6) foi capaz de promover o crescimento de todas as espécies ensaiadas, e foi demonstrada a compatibilidade do extrato de batata-doce e sua mistura com o de levedura com concentrações maiores de substratos cromogênicos e fluorogênicos.

De maneira inesperada, observou-se um crescimento abundante em altas diluições (baixa concentração do inóculo), o que demonstrou a alta sensibilidade analítica do meio nutritivo e a contribuição dos nutrientes necessários para a recuperação de espécies de Candida, fundamentalmente do extrato de batata-doce e de sua combinação com o extrato de levedura.

Tabela 5. Formulação do meio nutritivo com concentrações superiores dos substratos cromogênicos e fluorogênicos

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Tabela 6. Resultados do cultivo de espécies de Candida no meio nutritivo em diluição 104

<table>table see original document page 20</column></row><table>

Exemplo 4

Para avaliar a compatibilidade do extrato de batata-doce em sua mistura com o de levedura e corri as substâncias inibidoras dos microorganismos Gram-positivos, foi formulado o meio nutritivo (6) com a adição de desoxicolato de sódio (tabela 7). A formulação não foi esterilizada em autoclave, foi fervida e foi distribuída em placas. A inoculação foi realizada por diluições em série a partir de um inóculo padronizado.

Tabela 7

<table>table see original document page 20</column></row><table> <table>table see original document page 21</column></row><table>

Tabela 8. Crescimento das espécies de Candida no meio nutritivo formulado com desoxicolato de sódio

<table>table see original document page 21</column></row><table>

A presença do desoxicolato permitiu o crescimento das leveduras analisadas (tabela 8), inclusive em altas diluições (10*4), sem inibição alguma, o que corrobora a capacidade promotora do crescimento do extrato de batata-doce em sua combinação com o de levedura que, encontrando-se na presença de um agente permeabilizante da parede celular, favorece a formação de colônias características. Por outro lado, o sulfato de magnésio resultou ser um ajudante da definição das características morfológicas das diferentes cepas de Candida, já que foi observada uma cor branca mais brilhante e intensa nas colônias com as bordas bem definidas.

Exemplo 5

Para corroborar o poder de promoção de crescimento do meio de maneira precoce e comprovar a compatibilidade do extrato de batata-doce com outros substratos bioquímicos que puderam ser empregados para diferenciação das distintas espécies de Candidai foi incluído o gIicerol e o azul de bromotimol (Meios 7 e 8) (tabela. 9).

Tabela 9. Formulação dos Meios 7 e 8

<table>table see original document page 21</column></row><table> Observou-se crescimento intenso de Candida albicans e Candida tropicalis com só 24 horas deincubação.

Por outro lado, com o objetivo de comprovar a estabilidade das reações de identificação e ã manutenção das propriedades nutritivas do meio, foi realizada uma leitura dos resultados às 76 horas de incubação.

Foi mantido o crescimento das espécies assinaladas e foi comprovado que as reações de identificação foram estáveis por esse tempo de incubação (tabela 10).

Tabela 10. Resultado do crescimento microbiano às 76 horas de incubação dos meios nutritivos 7 e 8

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Exemplo 6

Foi realizada a avaliação do emprego dò substrato cromogênico 6-cloro-3-indoxil-p-D-glucopiranosídeo, como componente do meio nutritivo 9 para a diferenciação de algumas espécies de Candida (tabela 11).

Tabela 11. Formulação do meio nutritivo 9

<table>table see original document page 22</column></row><table>

Foi inoculado o meio por incubação da superfície até altas diluições (10"4-10"5). As placas foram incubadas por 48 horas e nesse intervalo de tempo as colônias de Candida tropicalis e Candida kefyr tomaram coloração rosada sendo mais forte em Candida kefyr. Foi demonstrado que a diluições maiores das anteriormente estudadas podem não só recuperar as espécies de Candida como obter respostas cromogênicas características, ao sé observar coloração rosa em ambas espécies. Foi evidenciado o alto poder nutritivo do extrato de batata-doce em sua mistura com o de levedura, tanto como fonte de nitrogênio, como de vitaminas e macro e micro elementos, já que só estas duas bases nutritivas constituíram as fontes de nutrientes na formulação do meio.

Foi demonstrado, uma vez mais, que longe de interferir nas reações cromogênicas, ambos extratos, em combinação, favorecem a aparição das reações cromogênicas a muito baixas concentrações do inóculo.

Foi possível estabelecer o alto poder de recuperação do meio nutritivo, já que à diluição de 10 41 foi impossível fazer a recontagem nas placas das espécies de Candida glabrata e Candida krusei, por serem incontáveis, e só na diluição 10-5, foram obtidas as recontagens que aparecem na tabela 12.

Tabela 12. Crescimento de diferentes espécies de Candida no meio nutritivo 9

<table>table see original document page 23</column></row><table>

INC- incontável

Foi feita a avaliação da capacidade nutritiva de vários componentes ricos em nitrogênio de origem protéica (hidrolisado enzimático de caseína e peptona bacteriológica) com e sem desoxicolato de sódio.

Foram estudadas variantes experimentais do meio nutritivo (de 10 à 15) (tabela 13), adicionando diferentes fontes de nitrogênio e desoxicolato de sódio, em comparação com o meio de referência (R2): ágar Dextrose de Sabouraud (bisem).

Tabela 13. Composição das variantes experimentais do meio nutritivo e do meio de referência

<table>table see original document page 23</column></row><table> <table>table see original document page 24</column></row><table>

Os meios 10, 11, 12 e R2 foram esterilizados em autoclave a 121°C durante 15 minutos e os meios 13, 14 e 15 foram fundidos e fervidos durante 2-3 minutos.

O pH das variantes experimentais do meio nutritivo resultou 6,8 em todos os casos. O pH do meio R2 resultou de 5,6.

A irioculação dos sulcos foi feita até o esgotamento do inóculo.

Ao observar o crescimento é a morfologia das colônias de Candida, concluiu-se que embora a adição de hidrolisado enzimático de caseína e da peptona bacteriológica não tenha provocado uma intensificação do crescimento de maneira significativa, tampouco o prejudicou.

Em comparação com o meio R2, não foi observada diferença entre o meio R2 e as variantes do meio nutritivo para C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis, inclusive nas variantes que empregaram o desoxicolato de sódio como inibidor.

Foi comprovado que embora o crescimento de C. glabrata e C. krusei forneceu colônias de menor tamanho e de menor intensidade de cor, efeitos provocados pela adição do desoxicolato de sódio e pela ausência de fontes alternativas de carboidratos, foi possível detectar e recuperar a estas espécies sem dificuldade. Em comparação com o meio R2, que não possui inibidores e contém um alto nível de açúcar (déxtrose), as variantes do meio nutritivo resultaram satisfatórias. Este efeito inesperado permite concluir que a mistura de extrato de batata-doce e de levedura, fornece ao meio nutritivo o nitrogênio suficiente para o desenvolvimento das espécies distintas de Candida, ainda que o meio possa ser suplementado, com vistas a prover fontes de nitrogênio de origem protéica para manter este microorganismo por períodos mais prolongados de conservação, sem a exaustão dàs fontes provenientes de ambos extratos.

Outro aspecto relevante é dado pelo fato de todas as variantes do meio nutritivo manterem um pH estável de 6,8, o que, junto com os elementos nutritivos assinalados anteriormente, garantiram o crescimento adequado das espécies de Candida, inclusive em condições menos favoráveis quê da variante de controle (R2), e resultou de vital importância para conseguir a expressão morfológica característica das colônias e a boa recuperação obtida.

Exemplo 8

Com o objetivo de estudar a influência da quantidade adicionada de extrato de batata-doce como fonte de nutrientes de todo tipo (carboidratos, nitrogênio, vitaminas e macro- e micro- elementos) e a adição de glicerol, como possível marcador enzimático para a futura diferenciação de espécies de Candida, foram elaboradas novas variantes do meio nutritivo (16-19) (tabela 14), comparando-as com o meio de referência (R2).

Foram inoculados os sulcos das diferentes espécies de Candida até o esgotamento do inóculo.

O pH do meio R2 resultou de 5,6 e o das variantes experimentais foi de 6,8, corroborando-se novamente o comportamento deste indicador já analisado no exemplo anterior.

Em todas as variantes ensaiadas, em um período tão curto como as 24 horas, observou-se crescimento de todas as espécies de leveduras estudadas.

Foi comprovado que a adição de glicerol favoreceu o crescimento de todas as espécies avaliadas, ao obter colônias com melhor desenvolvimento, pelo que pode se afirmar que o glicerol não afeta o crescimento microbiano.

Tabela 14. Composição do meio nutritivo

<table>table see original document page 25</column></row><table>

O incremento dá quantidade de extrato de batata-doce favorece igualmente ao meio nutritivo, pois apesar da presença do desoxicolato de sódio, foi obtido um bom crescimento das espécies de interesse.

A ausência de fosfato monopotássico e de sulfato de magnésio na variante 17 não conduziu à ausência de crescimento, mas sim a uma ligeira diminuição da intensidade de crescimento de C. glabrata e C. krusei às 24 horas. Isto 25 demonstra que ò extrato de batata-doce em sua combinação com o de levedura são suficientes para fornecer as necessidades de macro e micro-elementos mínimos essenciais para promover o crescimento de todas as espécies de Candida.

Exemplo 9

Neste experimento foi avaliada a utilidade de incorporar o glicerol com um indicador de pH para diferenciar espécies de Candida no meio nutritivo, Além disso comparar essa resposta com a adição de dextrose, carboidrato empregado na maioria das soluções descritas no estado da técnica para proporcionar o crescimento destas leveduras.

Em paralelo, foram incorporados dois substratos cromogênicos e fluorogênicos para detectar a possível interferência das fontes de carbono adicionadas com as reações de cromogênese e fluorogênese.

As formulações do meio nutritivo (20-22) aparecem na tabela 15 e são comparadas com o meio de referência R3 formado a partir da formulação R2 com a adição dos substratos cromogênicos e fluorogênicos, indicador de pH e desoxicolato de sódio. O pH de todos os meios foi ajustado a 6,8.

As cepas de diferentes espécies de Cândida e outros microorganismos foram inoculadâs nos sulcos na superfície do meio. O meio foi incubado por de 24 a 48 horas.

Foram inoculadas as espécies de Candida e outros microorganismos tais como: Enterobacter aerdgenes, Salmonella typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecalis e Staphylococcus aureus.

A tabela 16 amostra as respostas obtidas com as variantes do meio nutritivo estudadas, para os diferentes microorganismos.

Tabela 15. Formulações das variantes experimentais do meio proposto e de referência

<table>table see original document page 26</column></row><table> <table>table see original document page 27</column></row><table>

Tabela 16. Resposta dos microorganismos ensaiados em diferentes variantes de meios de cultivo

<table>table see original document page 27</column></row><table>

Tabela 16. Resposta dos microorganismos ensaiados em diferentes variantes de meios de cultivo (continuação)

<table>table see original document page 27</column></row><table> <table>table see original document page 28</column></row><table>

Tabela 16. Resposta dos microorganismos ensaiados em diferentes variantes de meios de cultivo (continuação)

<table>table see original document page 28</column></row><table> <table>table see original document page 29</column></row><table>

NC - não crescimento

Nas variantes 21 e R3, na quais foi incluído a dextrose, o resultado de diferenciação das espécies estudadas não foi satisfatório, porque a hidrólise deste açúcar por várias espécies de Candida e dos demais microorganismos inoculados deu como resultado uma mesma cor comum e uma elevada produção de ácido, com a diminuição do pH e a viragem do indicador, além disso, a inibição da reação cromogênica pela diminuição do pH. Tal é o caso de Enterobacter, Salmonella e Pseudomonas e de quase todas as espécies de Candida, menos Candida tropicalis, Candida krusei e Candida parapsilosis na variante 21. A inclusão deste açúcar não é recomendável.

A adição de glicerol na variante do meio nutritivo 22, na quantidade prevista, além de não prejudicar o crescimento dos microorganismos de interesse às 24 horas, especialmente Candida krusei e Candida glabrata, permite, conjuntamente com os substratos cromogênicos e fluorogênicos, diferenciar adequadamente as diferentes espécies de Candida, inclusive de outros microorganismos Gram-negativos que puderam crescer e interferir, ao menos em teoria, com a identificação das leveduras estudadas.

Especificamente, foi obtida a diferenciação de Candida albicans pela cor branca da colônia e a fluorescência azul; Candida tropicalis pela cor azul da colônia em massa e fluorescência azul, Candida kefyr pela cor azul, sem fluorescência, Candida glabrata de cor amarela na colônia, Candida krusei de colônia branco-amarelada, mas sua morfologia é de uma colônia opaca, achatada, bordas irregulares, mas arredondadas e Candida parapsilosis da mesmo cor mas sua superfície é irregular.

Os microorganismos Gram-negativos originaram uma cor do meio verde e colônias verdes, exceto Pseudomonas aeruginosa que apresenta colônias amarelas, mas mucóides.

A presença de desoxicolato de sódio permitiu inibir os microorganismos Gram-positivos inoculados, inclusive èm concentrações elevadas (10 UFC/mL).

Exemplo 10

Com o objetivo de avaliar a influência do pH na resposta microbiológica, procedeu-se a variar o pH de 6,1 a 6,8 e adicionar diferentes tampões (meios nutritivos 23-25) (tabela 17).

Tabela 17. Formulação de meios nutritivos com valor do pH de 6,1

<table>table see original document page 29</column></row><table> <table>table see original document page 30</column></row><table>

Os meios 26, 27 e 28 possuem as mesmas formulações que os trés que aparecem na tabela 17, mas o pH dos mesmos foi ajustado a 6,8.

De maneira geral, foi evidenciado que as variantes de meios nutritivos de pH 6,1 demoraram mais para reagir frente ao substrato 5-bromo-4-cloro-3- indolil-N-acetil-p-D-glucosídeo para Candida kefyr. Não obstante, é necessário destacar que o desenvolvimento de Candida aibicans, Candida glabrata e Candida krusei resultou superior neste pH que no pH 6,8.

A incorporação do MOPS não influenciou negativamente no desenvolvimento dos microorganismos estudados, nem interferiu na resposta de identificação.

A adição de fosfato dipotássico, tampouco inibiu a resposta, não obstante provocou a aparição de uma ligeira opalescência que não interferiu na identificação ou diferenciação microbiana.

Por meio da conclusão do experimento, foi possível evidenciar que tanto o pH 6,1 como o pH 6,8 possibilitaram o crescimento e diferenciação das espécies de Candida, mas ele deve ser ajustado dependendo da espécie de interesse a cultivar ou identificar.

Exemplo 11

Para comprovar o efeito que exerce a adição do desoxicolato de sódio sobre o crescimento de Candida e sua identificação em comparação com o emprego de substâncias inibidoras do crescimento dos organismos Gram-negativos de natureza antibiótica relatados no estado da técnica, foi incluído o cloranfenicol na formulação de uma variante de meio.

Foram comparados os meios 26 e 27 que aparecem na tabela 18 com o meio cromogênico CHROMagar Candida (R4) (CHROMagar) e o meio ágar Dextrose de Sabouraud (R2) (bisem). Foram inoculadás em sulco várias cepas de diferentes espécies de Candida até esgotar o inóculo.

Foram inoculadas 4 cepas isoladas de Candida albicans, duas de ATCC (10231 e 17111), e 1 cepa das demais espécies de levedura. Os resultados são mostrados na tabela 19.

Tabela 18. Formulações do meio nutritivo com diferentes inibidores

<table>table see original document page 31</column></row><table>

Tabela 19. Crescimento de espécies de Candida no meio nutritivo e em CHROMagar Candida

<table>table see original document page 31</column></row><table> <table>table see original document page 32</column></row><table>

Como se pode apreciar, a incorporação do cloranfenicol interfere e dificulta a diferenciação das espécies, especificamente das reações cromogênicas, por exemplo, no caso de Candida tropicalis.

Por outro lado, o emprego do cloranfenicol não garante a estabilidade prolongada do meio pronto para o uso, sobretudo à temperatura ambiente.

O meio GHROMagar Candida não pode ser empregado (conservado e incubado) na presença de luz pois o fabricante não o recomenda. Além disso, o meio preparado só foi possível empregar por um dia, pois depois deste período ele sé deteriora.

O meio nutritivo da presente invenção preparado segundo a formulação da variante 26, foi conservado inclusive à temperatura ambiente sem deterioração de suas características promotoras do crescimento e das reações de detecção.

Com esta variante de formulação foi verificado que as colônias de Candida albicans e Cândida tropicalis (as duas espécies de maior importância) apresentaram tamanhos de colônias superiores aos dos meios de referência.

Exemplo 12

No experimento seguinte foi estudada a influência do conteúdo de glicerol na presença de dos indicadores de pH.

Na tabela 20 são apresentadas as formulações das primeiras cinco variantes (28-32), nas outras cinco (33-37) foram mantidos os ingredientes na concentração assinalada, menos o púrpura de bromocresol quê foi substituído por azul de bromotimol.

Todas as formulações foram esterilizadas em autoclave e o pH foi ajustado a 6,8.

Foi executada a inoculação das diferentes cepas por sulcagem da superfície.

Tabela 20. Ingredientes do meio experimental em diferentes composições_

<table>table see original document page 33</column></row><table>

Para Candida albicans não foi detectado efeito depressor do crescimento ao aumentar a concentração de glicerol. Este microorganismo não utiliza este substrato.

O meio não trocou de cor, pelo que não foi detectada atividade enzimática indicadora que de outra forma seria manifestada por uma alteração de pH do meio.

Para Candida tropicalis e Candida parapsilosis tampouco observou-se inibição de crescimento ao aumentar a concentração de glicerol.

Os resultados do crescimento de Candida kefyr evidenciaram que, ao aumentar a concentração de glicerol, foi favorecida a cor, tamanho e brilho das colônias. Este microorganismo tampouco degrada o glicerol como substrato.

O incremento do glicerol possibilita a melhor visualização da troca de cor nas colônias de Candida glabratà (incremento da tonalidade amarela) e do meio (amarelo), Além disso suas características morfológicas melhoram ao observar colônias mais salientes, de maior tamanho e coloração mais acentuada. Neste microorganismo o púrpura de bromocresol melhorou a resposta à alteração de pH. Também foi possível verificar a troca de cor, observando o fundo da placa, unha vez que a reação se estendeu profundamente e foi possível ver a formação de um halo de cor amarela ao redor da colônia.

No caso de Candida krusei, o aumento do conteúdo de glicerol favorece a melhor visualização da troca de cor do meio (amarelo), além disso suas características morfológicas melhoram ao observar colônias de maior tamanho de 1 a 3 mm e coloração branca mais acentuada. Para este microorganismo o azul de bromotimol favoreceu a detecção dá troca de cor no meio (viragem a amarelo) ao aumentar a concentração do substrato.

Em geral, a adição de ágar em concentração de 13 g/L favoreceu o tamanho das colônias, ainda que foi considerado que abaixo desse nível a superfície do meio podia ser quebrada ao inocular pelo método de sulcagem.

Exemplo 13

Vários inibidores dos microorganismos Gram-negativos e Gram-positivos foram analisados e comparados (tabela 21) com vistas a determinar quais podem ser utilizados na composição do meio nutritivo da presente invenção e para comparar a adição daqueles que haviam sido relatados por diferentes autores e que aparecem no estado da técnica.

Foram inoculadas 6 espécies de Candida e 6 cepas de microorganismos Gram-positivos e Gram-negativos (por sulcagem na superfície a partir de um inóculo 108 UFC/mL) a inibir, entre eles Proteus vulgaris, Salmonella typhimuríum, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterococcus faeealis e Staphylococcus aureus.

As placas dos meios foram incubadas a 30°C por 48 horas.

As variantes de meios nutritivos 38 e 39 permitiram a total inibição dos microorganismos Gram-negativos e Gram-positivos ensaiados. As espécies de Candida mostraram bom crescimento. A cor das diferentes espécies foi marrom escuro, a exceção de Candida glabrâta que resultou branca.

A variante 40 inibiu a todos os microorganismos Gram- positivos e Proteus vulgaris. Todas as cepas de Candida mostraram crescimento muito abundante, com morfologia característica e de cor rosada.

O meio nutritivo 41 inibiu Candida krusei e Candida parapsilosis, não se obtendo a total inibição dos microorganismos Gram-negativos.

As variantes 42 e 43 resultaram demasiado inibidoras para os microorganismos a inibir e inclusive para Candida e estas últimas espécies não cresceram no meio.

As variantes de 44 a 48, de maneira similar inibiram totalmente às espécies de Candida.

Como resultado dos ensaios foi possível demonstrar que de maneira inesperada, só o sulfito de sódio, o citrato de amônio e bismuto e a rosa de bengala, em combinação com o extrato de batata-doce e sua mistura com o extrato de levedura, permitiram o crescimento e diferenciação de todas as espécies de Candida e inibiram os microorganismos competidores, evitando que aqueles organismos Gram- negativos que pudessem ter as mesmas reações de identificação resultassem totalmente inibidos, como os Gram-positivos que não cresceram nas variantes dos meios que continham ditos ingredientes. Tabela 21. Formulações do meio nutritivo com diferentes inibidores

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Exemplo 14

Foi feito um experimento com o objetivo de estudar o efeito do leite desnatado na qualidade de agente nutricional como contribuinte de proteínas e açúcares (Iactose) à composição.

Na tabela 22 aparece a composição de um projeto experimental para comparar diferentes composições nutritivas, tendo em conta dois níveis de concentração de leite desnatado em pó. As respostas foram comparadas com uma composição básica da presente invenção sem a inclusão da leite (variante 49 da tabela 22) e com duas formulações (variante 49 e variante 50) que não respondem ao reivindicado na solução proposta, pois só contêm o extrato de batata-doce.

Tabela 22. ingredientes do meio experimental

<table>table see original document page 35</column></row><table>

Ό pH.de trabalho foi definido como 6,8. Todas as variantes ensaiadas da composição foram aquecidas até ebulição durante 2 a 3 min., depois de alcançado o ponto de fusão do ágar e não foram esterilizadas por autoclave.

Foram inoculadas várias espécies do gênero Candida, tais como, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida, kefyr, Candida parapsilosis, Candida glabrata e Saccharomyces cerevisiae.

As placas foram incubadas durante 48 horas a temperatura de 25°C e a leitura mostrou que nas variantes 49 e 50 não foi obtido um desenvolvimento satisfatório das espécies Candida glabrata, Candida krusei e Candida parapsilosis, o que pode ser devido à escassez de elementos essenciais tais como vitaminas e fatores de crescimento presentes no extrato de levedura.

As variantes 51 e 52 mostraram um crescimento satisfatório para todos os microorganismos ensaiados, não obstante, é necessário destacar que na variante 49, as espécies de Cand/da /ce/yr manifestaram, de maneira inesperada, um halo transparente devido ao efeito proteolítico sobre a caseína. Nenhuma outra espécie mostrou atividade proteolítica alguma. Desta maneira, pode-se concluir que o leite desnatado em pó pode constituir um novo marcador de atividade proteolítica de Candida kefyr para identifica-la ou diferencia-la do resto das espécies.

Exemplo 15

Foi avaliado o efeito antibacteriano do ácido nalidíxico em combinação com o desoxicolato de sódio frente a um grupo de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, assim como leveduras pertencentes ao gênero Candida.

O experimento consistiu de um projeto quê inclui uma escala de concentrações de ácido nalidíxico desde 0,01 até 0,05 g. Na tabela 23 são apresentadas as composições para avaliar a capacidade de inibição sobre as bactérias e a promoção do crescimento das espécies fúngicas.

Os meios de cultivo não foram esterilizados em autoclave, foram fundidos até conseguir a completa dissolução do ágar durante 2 a 3 min. Foram distribuídos em placas esterilizadas.

O pH final dos meios preparados foi de 6,8.

Como se vê na tabela 23, as espécies microbianas cultivadas foram:

Escherichia eoli, Enterobacter aerogenes, Shigella flexneri, Salmonella typhimurium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Issachenkia orientalis (Candida krusei), Candida glabrata e Candida parapsilosis.

A inoculação foi realizada a partir de um inóculo padronizado a 50% de transmitãncia pelo método de esgotamento do inóculo na superfície do meio agarizado, com o objetivo de obter colônias isoladas.

As placas foram incubadas durante 48 horas a temperatura de 28 ± 2°C.

A resposta dos ensaios mostrou que o ácido nalidíxico nas três concentrações avaliadas inibiu totalmente as bactérias Gram-negativas, exceto Pseudomonas aeruginosa. Quanto às leveduras do gênero Cândida, foi surpreendentemente verificado que, longe de haver inibição em seu crescimento, esta substância favoreceu o desenvolvimento colonial das espécies, tais como Candida krusei e Candida glabrata, sendo outras espécies do gênero também favorecidas mas com menor evidência.

Tabela 23. Composições projetadas para avaliar o efeito do ácido nalidíxico e do desoxicolato de sódio como agentes inibidores das bactérias

<table>table see original document page 37</column></row><table>

Este efeito é obtido de maneira inesperada. Aprofundando nas possíveis causas, pode-se chegar á conclusão de que os íons magnésio na quantidade adicionada (0,5 g/L como sulfato de magnésio) aumentam a resistência de Candida ao ácido nalidíxico.

O descobrimento da não inibição de Pseudomonas aeruginosa resultou de interesse, pois este microorganismo, longe de constituir um competidor não désejado no diagnóstico de Candida, resulta de interesse sua identificação em conjunto pois, por exemplo, a otomicose tem sido considerada por um grande número de autores como uma etiologia fúngica, apesar de que na realidade são as bactérias as responsáveis da maior parte das otites externas e os fungos só estão envolvidos em um número pequeno destes processos. Estima-se que as otites externas constituem de 5 a 20% das consultas otológicas, a maioria de etiologia bacteriana. As otites externas são causadas principalmente por Pseudomonas, e somente de 15 a 20% destas são atribuídas a fungos.

Exemplo 16

Foiensaiadoumcorijuntodevariantesexperimentaiscom dois níveis de ácido nalidíxico em combinação com desoxicolato de sódio na qualidade de inibidores de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, e sua combinação com glicerol e Tween 80, com o objetivo de definir seu efeito no desenvolvimento das diferentes espécies fúngicas.

Na tabela 24 são apresentadas as composições que correspondem ao projeto experimental avaliado.

Tabela 24. Composições para avaliar dos níveis de ácido nalidíxico em combinação com glicerol e Tween 80

<table>table see original document page 38</column></row><table>

O pH foi ajustado em 6,8 e foram aquecidas até ebulição para conseguir a completa homogeneização do produto. Não foram esterilizadas em autoclave.

As composições foram avaliadas pelo método de sulcagem até o esgotamento do inóculo das espécies: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida glabrata, Isachenkia orientalis (Candida krusei) e Candida parapsiiosis.

As placas foram incubadas durante 48 horas a temperatura de 28 ± 2°C.

Os resultados mostram que o efeito do glicerol (variantes 59, 60 e 61), como suplemento no meio de cultivo, resultou num desenvolvimento colonial superior para todas as espécies avaliadas que ao utilizar o Tween 80 como suplemento.

Esta resposta, desde a leitura às 24 horas, evidenciava os resultados encontrados.

Aquelas variantes com ácido nalidíxico, com ambas concentrações (0,03 e 0,05 g/L), ao serem combinadas com glicerol, manifestaram que longe de suprimir o crescimento e desenvolvimento das colônias de espécies de Candida, este foi favorecido. Com o Tween 80 foi obtido um resultado mais discreto.

Exemplo 17

Vários substratos cromogênicos e fluorogênicos, com diferentes grupos crompgenos e/ou fluorógenos, para as enzimas glicosidases (hexosaminidases e beta-glucosidase), presentes em determinadas espécies do gênero Candida, foram avaliadas seguindo o projeto experimental que se apresenta na tabela 25.

Tabela 25. Composições avaliadas com diferentes substratos cromogênicos e/ou fluorogênicos para glicosidases

<table>table see original document page 39</column></row><table> Legenda:

4-MU-p-D-galactosaminida: 4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D-galactosaminida Χ-β-D-galactosaminida: 5-bromo-4-clòro-3-indoxil-N-acetil^-D-galactosaminida Χ-β-D-glicoseminida: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-p-D-glicoseminida Χ-β-D-glc: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil^-D-glucopiranosídeo Salmon™-p-D-glc: 6-cloro-3-indoxil-N-acetil-p-D-glucopiranosídeo

As composições foram ajustadas a pH 6,8 e foram fundidas durante 2-3 minutos até conseguir a completa dissolução do ágar. Não foram esterilizadas em autoclave.

As espécies inoculadas foram Candida albicans, Candida tropicalis, Candida kefyr, Candida glabrata, Isachenkia orientalis (Candida krusei) e Candida parapsilosis.

A inoculação das espécies foi realizada pelo método de diluições seriadas, com o fim de detectar nas colônias isoladas suas características morfológicas e culturais frente aos substratos distintos utilizados.

As placas foram incubadas a 30°C, durante 48 horas.

Na tabela 26, é destacada a influência favorável da presença do glicerol como agente nutritivo, capaz de favorecer o desenvolvimento das espécies de Candida ensaiadas.

Tabela 26. Crescimento de diferentes espécies de Candida nas composições cromogênicas e/ou fluorogênicas <table>table see original document page 40</column></row><table>

Evidencia-se a aparição de características cromáticas e fluorescentes em todas as variantes avaliadas, destacando-se a capacidade que possui Candida albicans de utilizar os substratos de galactosaminida e glicoseminida, e as espécies de Candida tropicalis de empregar os substratos cromogênicos do tipo glucopiranosídeo. A ação da enzima galactosaminidase, presente em Candida albicans, é vista com maior clareza na variante 65, em que as colônias são identificadas por sua fluorescência ao serem iluminadas com uma lâmpada UV. Não obstante, com o substrato cromogênico para detectar essa mesma atividade enzimática (variante 66) não se obtiveram resultados positivos, ao não colorirem as colônias. Esta resposta negativa não era esperada e resultou surpreendente e muito próprio da composição específica reivindicada na presente invenção.

Na variante 67 foi obtido que as colônias isoladas de Candida albicans adquiriram uma coloração azul devido ao emprego do substrato cromogênico 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-β-D-glicoseminida.

As colônias de Candida tropicalis e Candida kefyr, manifestam uma coloração azul e rosada para as variantes 65 e 66, respectivamente, em dependência da incorporação do componente X ou Rosa ao glucosídeo, este último utilizado por ambas espécies.

Outras espécies avaliadas, tais como, Candida parapsilosis, Candida krusei e Candida glabrata não respondem frente a nenhum dos substratos incorporados, pelo que são identificadas por suas características morfológicas.

Exemplo 18

Procedeu-se à avaliação de uma composição que compreende o uso de agentes antibacterianos de amplo espectro e substratos cromogênicos específicos para a identificação e diferenciação de algumas espécies de Candida.

A avaliação foi realizada com a fórmula que aparece na tabela 27 e foi empregado como meio de referência o Chromagar Candida (Chromagar, Francia).

A preparação da composição foi realizada pesando o total dos ingredientes e empregando água deionizada. Foi ajustado o pH a 6,8 e foram levadas a ebulição até a dissolução completa do ágar durante 2-3 min.

O meio de referência foi preparado segundo o estabelecido na etiqueta do fabricante, sendo seu pH final de 5,9.

Foi ensaiado um grupo de espécies fúngicas e de bactérias visando avaliar a capacidade de inibição e promoção do crescimento da composição experimental, entre elas: Candida albicané ATCC 102321, Candida tropiealis, Candida kefyr, Candida krusei {Isachenkià onentalis) Candida glabrata (Torulopsis), Candida parapsilosis, Saccharomyees eérevisiae ATCC 9763, Saccharomyces uvarum ATCC 9080, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 13315, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Shigella flexneri ATCC 12022, Eseheriehia eoli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Enteroeoeeus faeealis ATCC 19433 e Staphyloeoeeus aureus ATCC 25923.

Os resultados alcançados foram muito satisfatórios, inibindo todas as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas inoculadas no meio de cultivo, exceto Pseudomonas aeruginosa. Foram diferenciadas as espécies Candida albieans, Candida tropiealis e Candida kefyr de acordo com a coloração das colônias isoladas. Não obstante, Candida krusei e Candida parapsilosis, por sua coloração branca, a primeira opaca, e a segunda brilhante, e por sua morfologia colonial, também puderam ser identificadas com a composição da presente invenção. O meio de referência, Chromagar Candida, só permite a identificação das espécies Candida albieans, Candida tropiealis e Candida krusei e consegue a inibição total das bactérias ensaiadas.

Tabela 27. Composição do meio cromogênico segundo a presente invenção

<table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table>

Legenda:

Χ-β-D-glicoseminida: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-β-D-glicoseminida Salmon™-β-D-glc: 6-cloro-3-indoxil-N-acetil-β-D-glucopiranosídeo

Exemplo 19

Para detectar outras atividades enzimáticas dentro das espécies do gênero Candida foi realizado um desafio para definir com qual ou quais dos substratos avaliados é identificado o maior número de espécies fúngicas de interesse. Este experimento se fez imprescindível, já que não era obvio (exemplo 17) que na presente composição diferentes substratos para uma mesma atividade forneceram respostas iguais, obtendo-se inclusive respostas negativas e contraditórias para algumas espécies.

As variantes consistiram em incorporar em concentração de 0,1 g/L os seguintes substratos cromogênicos e fluorogênicos que aparecem na tabela 28. Os ingredientes foram incorporados à composição básica que corresponde à variante 69 da tabela 25, segundo o projeto que se apresenta na tabela 28.

Tabela 28. Avaliação de outros substratos cromogênicos para a detecção de atividades estearase, fosfolipase e glicosidases

<table>table see original document page 42</column></row><table>

Legenda: Caprilato magenta: 5-bromo-6-cloro-3-indoxil-caprilato X-nonanoate: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-nonanoato X-phos-inositol: sal amônio de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-1-fosfato 4-MU-p-D-xyl: 4-metil-umbeliferil-p-D-xilopiranosídeo Χ-α-D-manosido: 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-alfa-D-manopiranosídeo Χ-α-D-gal: 5-Bromo-4-cloro-3-indoxil-alfa-D-galactosídeo X-p-D-glcUA«Na: sal ciclohexilamonio do ácido 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-p-D-glucurônico, Salmon™-p-D-glc: 6-cloro-3-indoxil-N-acetil-p-D-glucopiranosídeo

As composições tiveram o pH ajustado em 6,8 ± 0,1 e foram esterilizadas fervendo durante 2-3 minutos, garantindo a totalidade de dissolução do ágar. Foram inoculadas pelo método de sulçagem até o esgotamento do inóculo as seguintes espécies: 4 espécies isoladas de Candida albicans, Candida albicans ATCC 10231 e Candida albicans ATCC 17111, Candida tropicalis, Candida kefyr, Cândida krusei, Isachenkia orientalis, Candida glabrata, Candida parapsilosis, Saccharomyces uvarum ATCC 9080 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

As placas foram incubadas a 30°C durante 48 horas.

De maneira geral, foram detectados quais substratos cromogênicos ou fluorogênicos eram decompostos pelas diferentes espécies de Candida.

Candida albicans é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio do 5-brómo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato) à beta glucosidase, mas em concentração muito alta do substrato (6-cloro-3-indoxil^-D- glucopiranosídeo).

Candida tropicalis é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato), β- glucosidase (6-cloro-3-indoxil-p-D-glucopiranosídeo) e manosidase (5-bromo-4-cloro-3- indoxil-a-D-manopiranosideo).

Candida kefyr é identificada por sua atividade β-glucosidase (6-cloro-3-indoxil-3-D-glucopiranosídeo).

Cândida parapsilosis é identificada por suas atividades fosfolipase (sal de amônio de 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-mio-inositol-fosfato) e xilosidase (metilumbeliferil-p-D-xilopiranosídeo).

Candida krusei, Isachenkia orientalis e Candida glabrata por sua cor branca (opaca e brilhante, respectivamente) devido à ausência das mencionadas atividades enzimáticas.

Saccharomyces uvarum ATCC 9080 por sua atividade fosfolipase e Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 não respondeu a nenhum dos substratos empregados, ainda que mostrou fluorescência esverdeada ao incidir luz UV sobre as colônias. Exemplo 20

À composição descrita na variante 68 da tabela 25, foram adicionados os substratos cromogênicos e fluorogênicos descritos na tabela 29.

Cada variante foi ensaiada em 3 valores diferentes de pH: 6,0-6,4 e 6,8 O resultados foram:

Candida albicans é identificada por suas atividades L-prolina aminopeptidase (hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina) e a-glucosidase (metil-umbeliferil-α-D-glucopiranosídeo); Candida tropicalis e Candida parapsilosis são identificadas por sua atividade α-gíucosidasé (metil-umbeliferil-α-D-glucopiranosídeo). Candida parapsilosis, Além disso, respondeu ao substrato para a L-prolina aminopeptidase (hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina).

Tabela 29. Avaliação de outros substratos cromogênicos para a detecção de atividades aminopeptidase, glicosidases e fosfatase alcalina

<table>table see original document page 44</column></row><table>

Legenda:

H-Pro-AMC-HBr: hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina

ΡΝΡ-β-D-galactosaminida: 4-nitrofenil-N-acetil-beta-D-galactosaminidina

ΡΝΡ-β-D-glicoseminida: 4-nitrofenil-N-acetil-beta-D-glicosaminidina

4-MU-α-D-glc: 4-Metilumbeliferil-alfa-D^glucopiranosícleo

Y-phos.diNa: sal de sódio de 3-lndoxil-fosfato

Candida albicans não mostrou resultados satisfatórios na presente composição, frente aos substratos de hexosaminidases avaliados (ΡΝΡ-β-D- galactosaminida e ΡΝΡ-β-D-glicoseminida) já que ambos se difundem ao meio e não se pode associar a reação cromogênica a uma determinada colônia.

As demais espécies de Candida não decompuseram nenhum dos substratos ensaiados. As composições que possuíam valores de pH de 6,4 e 6,8 foram as que promoveram maior desenvolvimento das colônias (tamanho e morfologia característica) e uma maior intensidade do cor.

Exemplo 21

O experimento teve por objetivo avaliar o efeito da adição de trehalose ou glicerol no crescimento e diferenciação por cromogênese ou fluorogênese de espécies de Candida. A composição ensaiada e suas variantes são mostradas na tabela 30.

Tabela 30. Composição de meios nutritivos para testar diferentes componentes

<table>table see original document page 45</column></row><table>

Na tabela 31 são mostrados os resultados destes experimentos.

Observou-se que a presença de glicerol favoreceu o crescimento de algumas das espécies ensaiadas (Candida albicans, Candida krusei).

Atrehalose1 para algumas espécies, em ausência de glicerol longe de promover o crescimento, diminuiu-o (por exemplo, para Candida krusei).

A adição de trehalose provocou uma intensificação significativa da reação cromogênica para Candida albicans e Candida tropicaiis. Esta descoberta resultou inesperada e não foi relatada no estado da técnica, já que a trehalose tem sido empregada amplamente nos meios de cultivo para promover crescimento e identificar Candida glabrata.

Candida albicans é identificada por suas atividades de hexosaminidase (5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-beta-D-glicosaminida), alfa- glucosidase (metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo) e fosfolipase (sal de amônio do 5- bromo-4-cloro-3-ihdoxil-mio-inositol-fosfato); Candida tropicaiis é identificada por suas atividades alfa- e beta- glucosidases (metilumbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo e 6-cloro-3- indoxil-beta-D-glucopiranosídeo) e fosfolipase (sal de amônio do 5-bromo-4-cloro-3- indoxil-mio-inositol-fosfato); Candida kefyr é identificada por sua atividade beta- glucosidase (6-cloro-3-indoxil-beta-D-glucopiranosídeo); Candida parapsilosis é identificada por sua atividade alfa-glucosidase (metil-umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo). Candida krusei e Candida glabrata por sua cor branca (opaca e brilhante, respectivamente) devido à ausência das mencionadas atividades enzimáticas.

Tabela 31. Características de diferentes espécies de Candida nas composições cromogênicas e/ou fluorogênicas

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Legenda:

X+: elevada intensidade do cor

Exemplo 22

A composição para o cultivo de espécies fúngicas é mostrada na tabela 32.

O pH da composição foi estabelecido em 6,6.

Como resultado destes ensaios foi obtida uma diferenciação muito marcada das espécies fúngicas de interesse clínico, especificamente com as variantes 90 e 93, foram obtidas inténsidades das reações cromáticas muito mais intensas que todas as anteriormente descritas é que as observadas em meios cromogênicos existentes.

Tabela 32. Meio nutritivo para testar a adição de maltose e trehalose na presença de glicerol

<table>table see original document page 46</column></row><table> <table>table see original document page 47</column></row><table>

Em particular Cândida albicans, na presença de trehalose ou maltose combinadas com glicerol, mostrou, de maneira não esperada, uma cor azul esverdeada ou verde (para a variante 90) muito bem diferenciável do resto das espécies; Candida tropicalis resultou de cor azul violáceo intenso e, não obstante, nas variantes 91 e na 92 resultaram rosa-azuladas. Candida kefyr apresentou em todas as variantes uma coloração rosada, enquanto Candida parapsilosis, nas variantes 89, 90 e 91 resultaram brancas e na 92 tomou uma coloração azul pálida. Candida krusei e Candida glabrata resultaram brancas e são identificadas pela opacidade ou brilho como já foi descrito nos exemplos anteriores.

O aumento ao dobro da concentração do extrato de batáta- doce favoreceu a intensidade da reação cromogênica de Candida albicans e Candida tropicalis e de maneira geral a mórfologiá (tamanho) dás colônias de todas as espécies.

Claims (12)

1. "Meio nutritivo para o cultivo de leveduras" caracterizado pelo fato de conter uma mistura de extrato de batata-doce com extrato de levedura ou de tomate, ágar e substâncias que propiciam a identificação das diferentes espécies de Candida selecionadas entre os substratos cromogênicos e fluorogênicos, indicadores ou corantes, fontes de carbono e sais orgânicos e inorgânicos que se encontram no meio nutritivo, preferencialmente o 5-bromo-4-clpro-3-indoxil-mio-lnositol-fosfato, o metil- umbeliferil-alfa-D-glucopiranosídeo, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-3-D- glucopiranosídeo, o 6-cloro-3-indoxil-p-D-glucopiranosídeo, a 4-metilumbeliferil-N-acetil-p- D-galactosaminida, a 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-p-D-glicosaminida, hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina, L-prolina paranitroanilida, púrpura de bromocresol, azul de bromotimol, leite desnatado, glicerol e sulfato de magnésio.

2. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de conter uma mistura de extrato de batata-doce com extrato de levedura ou de tomate, em quantidade de 20 a 30 g/L, encontrando-se o extrato de batata-doce em quantidade de 50 a 67% com respeito à massa da mistura, de 13 a 15 g/L de ágar e as substâncias que propiciam a identificação das diferentes espécies de Candida selecionadas entre os substratos cromogênicos e fluorogênicos, indicadores ou corantes, fontes de carbono e sais orgânicos e inorgânicos que se encontram no meio nutritivo em quantidade de 0 a 26 g/L, preferencialmente o 5-bromo-4-cloro-3-índoxil-mio- inositol-fosfato, em quantidades de 0 á 0,1 g/L, o metil-umbeliferil-a-D-glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, o 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-aceti!-p-D-glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, o -6-cloro-3-indoxil-p-D-glucopiranosídeo de 0 a 0,1 g/L, a 4-metilumbeliferil-N-acetil-p-D- galactosaminida de 0 a 0,15 g/L, a 5-bromo-4-cloro-3-indoxil-N-acetil-p-D-glicosaminida de 0 a 0,1 g/L, hidrobrometo de L-prolina-7-amido-4-metil-coumarina de 0 a 0,5 g/L, L- prolina paranitroanilida de 0 a 0,2 g/L, púrpura de bromocresol de 0 a 0,04 g/L, azul de bromotimol de 0 a 0,08 g/L, leite desnatado de 0 a 5 g/L, glicerol de 0 a 25 g (mL)/L e sulfato de magnésio de 0 a 0,5 g/L.

3. "Meio nutritivo", de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de conter uma combinação de potencializadores da reação cromogênica consistindo de maltose ou trehalose

4. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato que a maltose ou trehalose encontram-se em quantidades de 1 g por cada g (mL) de glicerol.

5. "Meio nutritivo", de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de conter substâncias que fornecem nitrogênio, especificamente aquelas selecionadas entre a glicina, peptona bacteriológica e hidrolisado ehzimático de

6. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato que as substâncias que fornecem nitrogênio encontram-se em quantidades de 0 a 13 g/L, especificamente a glicina em concentração de O a 3 g/L, peptona bacteriológica de 0 a 5 g/L e hidrolisado enzimático de caseína de 0 a 5 g/L.

7. "Meio nutritivo", de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de conter inibidores de bactérias que são preferencialmente selecionados dentre o ácido nalidíxico, a rosa de bengala, o desoxicolato de sódio, sulfito de sódio, o citrato de amônio e bismüto e o cloreto de tetrafeniltetrazol.

8. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato que os inibidores de bactérias encontram-se em uma quantidade de 0 a 10 g/L e mais especificamente o ácido nalidíxico é adicionado em quantidade de 0 a 0,05 g/L, a rosa de bengala em quantidade de 0 a 0,05 g/L, o desoxicolato de sódio de -0 a 0,5 g/L, sulfito de sódio de 0 a 3 g/L, o citrato de amônio e bismuto de 0 a 5 g/L e o cloreto de tetrafeniltetrazol de 0 a 0,05 g/L.

9. "Meio nutritivo", de acordo com as reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de conter substâncias reguladoras do pH e ativadores enzimáticos, em quantidades de 0 até 6 g/L, preferencialmente o fosfato monopótássico, o fosfato dipotássico e o ácido 3-morfolino-propanosulfônico.

10. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato que o fosfato monopotássico encontra-se numa quantidade de 0 a 1 g/L, o fosfato dipotássico de 0 a 4 g/L e o ácido 3-morfolino-propanosulfônico de 0 a -0,5 g/L.

11. "Meio nutritivo", de acordo com as reivindicações de 1 a -10, caracterizado porque a totalidade dos ingredientes a utilizar é adicionada em quantidade de 35 a 50 g em 1 litro de água destilada ou deionizada com um valor de pH de 5 a 7.

12. "Meio nutritivo", de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pêlo fato que o pH é ajustado a valores entre 6,0 e 6,8.