BRPI0621181A2

BRPI0621181A2 - substáncias imunogênicas que compreendem um adjuvante a base de ácido poliinosìnico - ácido policitidìlico

Info

Publication number: BRPI0621181A2
Application number: BRPI0621181-0A
Authority: BR
Inventors: Haixiang Lin; Victor Lie Tao Li
Original assignee: Newbiomed Pika Pte Ltd
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2006-06-27
Publication date: 2011-11-22
Also published as: WO2007081287A1; RU2462264C2; CN101166559B; RU2008133217A; ZA200806339B; WO2007081287A9; CN101166559A; TW200800258A; KR20080091106A; IL192746A0; EP1971402A1; JP2009523721A; US20130115244A1; US20070166800A1; BRPI0621181A8; AU2006335367A1; EP1971402A4; US20110212123A1; CU23810A3; CA2632415A1

Abstract

SUBSTáNCIAS IMUNOGêNICAS QUE COMPREENDEM UM ADJUVANTE A BASE DE áCIDO POLIINOSìNICO - áCIDO POLICITIDìLICO, onde é prevista uma composição de adjuvante polinucleotídico (PICKCa) e métodos de uso para provocar uma resposta imunológica, em particular uma resposta imunológica da mucosa, sendo que o adjuvante polinucleotídico compreende um ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico (PJC), pelo menos um antibiótico e pelo menos um ion positivo; prevendo-se também uma composição imunogênica que compreende a composição de adjuvante polinucleotídico com outras composições imunogénicas como um antígeno (por ex., como em uma vacina) selecionadas de antígenos virais, bacterianos, fúngicos, parasíticos e/ou de câncer; e, ainda, contempla métodos de uso de tais composições adjuvantes, particularmente para provocar uma resposta imunológica, em especial uma resposta imunológica da mucosa a um composto antigênico.

Description

SUBSTÂNCIAS IMUNOGÊNICAS QUE COMPREENDEM UM ADJUVANTE A BASE DE ÁCIDO POLIINOSÍNICO - ÁCIDO POLICITIDÍLICO

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção geralmente se refere a composições imunogênicas e seus métodos de uso. Mais especificamente, a invenção se refere a uma composição imunogênica que compreende um adjuvante polinucleotídico em combinação com uma ou mais substâncias antigênicas a serem usadas para produzir uma resposta imunológica específica da doença em um hospedeiro.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

O sistema imunológico pode exibir imunidade específica e não específica. A imunidade não específica engloba várias células e mecanismos como a fagocitose (a tomada de partículas estranhas ou antígenos) pelos macrófagos ou granulócitos, e atividade celular exterminadora natural (NK), entre outras. A imunidade não específica se apóia em mecanismos menos avançados evolucionariamente e não exibe a natureza adquirida de especificidade e de memória, que são marcos exemplares de uma resposta imunológica específica. As principais diferenças entre a imunidade específica e a não específica se baseiam na especificidade celular BeT. Essas células adquirem predominantemente suas responsividades após a ativação com um antígeno específico e possuem mecanismos para exibir a memória ria eventualidade de uma exposição futura àquele antígeno específico. Como resultado, a vacinação (envolvendo especificidade e memória) se trata de um protocolo efetivo para proteção contra patógenos prejudiciais.

Em geral, os linfócitos BeT, que demonstram receptores específicos em suas superfícies celulares para um dado antígeno, produzem imunidade específica. O sistema imunológico específico pode responder a diferentes antígenos de duas maneiras: 1) imunidade humoral mediada, que inclui a estimulação celular Bea produção de anticorpos ou imunoglobulinas, células antigênicas e helper T (predominantemente Th2), e 2) imunidade celular mediada, que geralmente envolve células T incluindo linfócitos citotóxicos T (CTLs), apesar de outras células também estarem envolvidas na geração de uma resposta CTL (por ex., células apresentando antígenos e células Thl).

Com o continuado objetivo de obter vacinas mais seguras e mais efetivas, novas tecnologias, incluindo métodos recombinantes sintéticos e de purificação têm sido usados para melhorar a qualidade e a especificidade dos antígenos utilizados. Os antígenos purificados, subunitários e sintetizados demonstram maior segurança, porém reduzida imunogenicidade, que tem sido uma orientação para a identificação do adjuvante efetivo. Assim, um adjuvante efetivo é um componente cada vez mais essencial das modernas vacinas. Os adjuvantes são geralmente compostos, que quando administrados com um antígeno (seja em conjunto, ou administrado anteriormente ao antígeno) aumentam e/ou modificam a resposta imunológica àquele antígeno em particular.

Os adjuvantes exemplares que foram usados para aumentarem uma resposta imunológica incluem os compostos de alumínio (todos em geral denominados como "Alum"), emulsões óleo em água (o adjuvante completo de Freund (CFA) é uma emulsão óleo em água que contém organismos de tuberculose Mycobacterium secos e exterminados por calor), Saponina (isolados da casca da Quillaja Saponoria, o componente adjuvante ativo conhecido como Quile A), CpG ODN (oligodeoxinucleotídeo sintético contendo dinucleotídeos CpG não metilados), monofosforil lipídeo A (MPL) derivado do lipopolissacarídeo da Salmonella minnesota Re595, Lipossomos (normalmente produzidos a partir de materiais biodegradáveis como os fosfolipídeos) e microesferas poliméricas biodegradáveis (produzidas a partir de uma variedade de polímeros como o polifosfazeno e polianidridos). As propriedades adjuvantes desses compostos foram avaliadas com cada adjuvante mostrando vantagens e desvantagens.

Foram investigados os complexos polinucleotídeos com relação às suas várias aplicações, incluindo a ação como adjuvantes. Os RNAs de dupla fita (dsRNAs) são modificadores biológicos muito potentes que podem exercer uma profunda influência nas células em concentrações nanomolares. Os efeitos moduladores do dsRNA incluem um amplo espectro de ações nos níveis molecular e celular.

No nível molecular, os dsRNAs podem provocar efeitos biológicos como da síntese do interferon, indução de proteína quinase, aumento do antígeno de histocompatibilidade e a inibição do metabolismo. E no nível celular, o dsRNA pode provocar efeitos biológicos como a pirogenicidade, mitogenicidade, ativação de macrófagos, ativação de imunidade humoral, ativação de imunidade celular mediada e a indução de estado antiviral. Os efeitos imunomoduladores dos dsRNAs foram revelados. A U.S. N2 4.124.702 revelou que polinucleotídeos com dupla fita induziram a indução do interferon em células de animais vivos. A U.S. N2 3.906.092 revelou que a resposta de anticorpos a uma vacina do tipo adjuvante era aumentada pela incorporação na vacina de um polinucleotídeo ou de um complexo de polinucleotídeos. Houston et ai. estabeleceram o PICLC (complexo ácido poliinosínico ácido policitidílico poli-L-lisinocarboxi-metilcelulose) como um potente adjuvante pelo aumento da resposta primária de anticorpos sem a ajuda de um adjuvante adicional.

O ácido poliinosínico-ácido policitidílico (PIC), um dos complexos polinucleotídeos mais estudados, não foi efetivo quando usado em macacos e humanos, devido à sua instabilidade no corpo após a administração. Assim, o PIC foi modificado de várias formas para superar uma ou outra deficiência. Por exemplo, um complexo de ácido polirriboinosínico - polirribocitidílico com bromidrato poli-L-lisina é cerca de 5 a 15 vezes tão resistente à hidrólise pela ribonuclease pancreática como o PIC precursor. Lin et al. descreveram que um medicamento antiviral que compreenda ácido poliinosínico policitidílico, canamicina e cálcio pode ser usado como adjuvante {Lin, et ai, A new immunostimulatory complex (PICKCa) in experimental rabies: antiviral and adjuvant effects, Arch Virol, 131: 307-19, 1993; e Patente Chinesa No. 93105862.7). A patente Chinesa No. 93105862.7 provê o uso da composição geral de Poli I:C, canamicina e cálcio (PICKCa) como adjuvante em uma vacina para humanos e com aplicação em mamíferos. Entretanto, Lin descobriu que a forma de PICKCa originalmente identificada não proporciona um perfil de eficácia/segurança ideal para uso como adjuvante como também induz efeitos colaterais adversos inaceitáveis sob certas condições.

A presente invenção provê novas composições imunogênicas que exibem melhores perfis de segurança e eficácia; e os métodos de uso dessas composições. As composições imunogênicas apresentadas incluem um adjuvante polinucleotídico e um antígeno.

LITERATURA

As seguintes referências podem ser de interesse:

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RESUMO DA INVENÇÃO

Em geral, a presente invenção se refere a novas composições imunogênicas compreendendo uma composição de adjuvante polinucleotídico em conjunto com uma substância imunogênica ou antigênica, e métodos de uso para provocar uma resposta imunológica.

Assim, é provida uma composição imunogênica compreendendo:

(a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno; em que a composição é formulada para administração de liberação sustentada.

A composição imunogênica de acordo com a invenção pode compreender moléculas de composição adjuvante polinucleotídico heterogêneas em peso molecular, onde o peso molecular é de pelo menos 66.000 Daltons.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 — Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw.

Figura 2 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw.

Figura 3 - Detecção ELISPOT de IL-4 produzido pelos esplenócitos murídeos após imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw.

Figura 4 - Detecção ELISA de títulos específicos IgG de soro murídeo (diluído 400x) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw.

Figura 5 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-gama (γ) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno inativado fracionado da gripe.

Figura 6 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno inativado fracionado da gripe.

Figura 7 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-4 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno inativado fracionado da gripe.

Figura 8 - Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo (diluído 900x) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno inativado fracionado da gripe.

Figura 9 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HIV gpl20.

Figura 10 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HIV gpl20.

Figura 11 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-4 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HIV gp 120.

Figura 12 - Análise FACS de esplenócitos murídeos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HIV gp 120, porcentagem de células CD4+ que expressam o interferon-γ.

Figura 13 Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

Figura 14 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

Figura 15 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-4 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

Figura 16 — Análise FACS de esplenócitos murídeos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA, porcentagem de células CD4+ que expressam o interferon-γ.

Figura 17 — Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo (diluído 400x) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

Figura 18 - Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo 16 semanas após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

Figura 19 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HSV2-gD.

Figura 20 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HSV2-gD.

Figura 21 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-4 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HSV2-gD.

Figura 22 - Análise FACS de esplenócitos murídeos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HSV 2gD, porcentagem de células CD4+ expressando o interferon-γ.

Figura 23 - Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo (diluído 2.700x) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno HSV2-gD.

Figura 24 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado.

Figura 25 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-2 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado.

Figura 26 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo IL-4 após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado.

Figura 27 — Análise FACS de esplenócitos murídeos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado, porcentagem de células CD4+ve expressando o interferon-γ.

Figura 28 - Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo (diluído 900x) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado.

Figura 29 - Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo (diluído 16.000) após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno SARS completo inativado.

Figura 30 - Detecção ELISA de títulos do anticorpo H5 específico de soro de frangos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 inativado.

Figura 31 - Detecção ELISA de títulos do anticorpo H9 específico de soro de frangos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H9N2 inativado.

Figura 32 - Taxa de sobrevivência de camundongos expostos ao vírus da raiva selvagem e subseqüente tratamento com a vacina da raiva.

Figura 33 - Detecção ELISA de títulos do anticorpo específico de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw.

Figura 34 - Detecção ELISA de títulos do anticorpo específico de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou do antígeno inativado fracionado da gripe. Figura 35 - Detecção ELISA de títulos IgGl específicos de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg.

Figura 36 - Detecção ELISA de títulos IgG2a específicos de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg.

Figura 37 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg.

Figura 38 - Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos (pós- reestimulação de 6 dias com 2ug/ml de peptídeo IPQ) produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg.

Tabela 1 provê uma tabela de patógenos virais exemplares que podem servir como fonte de antígeno e doenças associadas com esses organismos.

Tabela 2 provê uma tabela de patógenos bacterianos exemplares que podem servir como fonte de antígeno e doenças associadas com esses organismos.

Tabela 3 provê uma tabela de patógenos fungicos exemplares que podem servir como fonte de antígeno e doenças associadas com esses organismos.

Tabela 4 provê uma tabela de parasitas exemplares que podem servir como fonte de antígeno e doenças associadas com esses organismos.

Tabela 5 provê uma tabela de cânceres exemplares (por ex., por tipo de tecido) que servem como uma fonte de antígenos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONFIGURAÇÕES EXEMPLARES DA INVENÇÃO

A presente invenção pode ser compreendida mais prontamente por referência à seguinte descrição detalhada de determinadas configurações da invenção e dos Exemplos nela incluídos.

Por esse pedido, em que as publicações estão referenciadas, as revelações dessas publicações estão ora incorporadas por referência, em suas totalidades neste pedido, de maneira a descrever mais completamente o estado da técnica à qual pertence esta invenção.

Antes que a presente invenção seja descrita em mais detalhes, deve ser compreendido que esta invenção não se limita às configurações particulares descritas, já que estas podem, evidentemente, variar. Deve também ser compreendido que a terminologia usada na presente serve para o propósito de descrever somente determinadas configurações, não pretendendo ser limitativa, já que o escopo da presente invenção somente será limitado pelas reivindicações anexas.

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos ora usados têm o mesmo significado dos comumente entendidos pelos técnicos no assunto, aos quais pertence esta invenção. Apesar de também poderem ser usados quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos na presente, na prática ou nos testes da presente invenção, os métodos e os materiais preferidos serão agora descritos. Todas as publicações mencionadas na presente estão incorporadas a esta por referência de maneira a revelar e descrever os métodos e/ou materiais em conexão com os quais as publicações são citadas.

Deve ser notado que, como usadas na presente e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/uma", "e", e "o/a" incluem os referentes plurais, a menos que o contexto indique claramente de outra forma. Assim, por exemplo, a referência a "uma composição imunogênica" inclui uma pluralidades dessas composições, e a referência a "o antígeno" inclui a referência a um ou mais antígenos e seus equivalentes conhecidos pelos peritos na técnica, e assim por diante. Nota-se ainda que as reivindicações podem ser minutadas para excluírem qualquer elemento opcional. Como tal, esta declaração pretende servir como base antecedente para uso de tal terminologia exclusiva como "unicamente," "somente" e similares em conexão com a recitação dos elementos das reivindicações, ou do uso de uma limitação "negativa".

DEFINIÇÕES DE TERMOS

Antes do estabelecimento dos detalhes da presente invenção, pode vir a ser útil para seu entendimento estabelecer as definições dos vários termos que são ora usados.

O termo "adjuvante" como usado na presente, se refere a qualquer substância ou mistura de substâncias que aumente ou diversifique a resposta imunológica de um hospedeiro a um composto antigênico. Especificamente:

1. O termo "PICKCa" se refere em geral a uma composição de poli I:C, canamicina e cálcio, independente de suas propriedades físicas e imunogênicas em particular.

2. "Av-PICKCa" se refere a uma forma de PICKCa usada comercialmente como medicamento antiviral.

3. PIKA" se refere a uma composição da invenção que compreende poli I:C, um antibiótico (por ex., canamicina), e um íon positivo (por ex., cálcio), onde o PIKA se caracteriza por características físicas (por ex., peso molecular, dimensão e similares) de maneira que na administração, o PIKA exibe as características de um adjuvante com efeitos colaterais adversos reduzidos (por ex., toxicidade reduzida) com relação a, por exemplo, PICKCa e maior potência (por ex., estimula uma melhor resposta imunológica) relativa a, por exemplo, Av-PICKCa.

O termo "Poli I:C" ou PIC" se refere a uma composição que compreende os ácidos nucléicos polirriboinosínico e polirribocitidílico, que também podem ser denominados de ácido poliinosínico ácido policitidílico, respectivamente.

"Molécula contendo PIC" ou "Composto contendo PIC" se refere ao, sem limitações, PIC, que pode ser opcionalmente complexado ou então combinado com pelo menos um ou ambos antibióticos (por ex., canamicina) e um íon positivo (por ex., cálcio) presentes em uma composição que compreende a molécula contendo PIC. Em uma configuração, a molécula contendo PIC não inclui a poli-L-lisina ou seu derivado no complexo.

"Heterogêneo(a)" como usado na presente no contexto das composições adjuvantes da invenção, indica que componentes da composição, por ex., as moléculas contendo PIC, não são uniformes com relação à característica física de peso molecular, dimensão ou ambos. Quando uma composição é descrita como heterogênea com relação a uma determinada característica física, sendo ainda descrita por uma faixa de valores para aquela característica física, a composição é dita como sendo substancialmente composta por moléculas caracterizadas pelas moléculas terem uma característica física que é distribuída dentro e através da faixa mencionada. Apesar de a composição poder não conter uma molécula representativa de cada valor físico característico dentro dos limites superior e inferior de uma faixa mencionada, a composição incluirá, geralmente, pelò menos uma molécula com a característica física do valor superior e do valor inferior. Em determinadas configurações, a composição pode incluir moléculas fora da faixa mencionada de características físicas usadas para descrever a composição. As moléculas que estão presentes na composição fora da faixa indicada não afetam materialmente as características básicas e novas da composição.

O termo "individual" usado de maneira intercambiável na presente com "hospedeiro," "sujeito," e "animal," inclui humanos e, por ex., todos os animais e animais de estimação, mamíferos e aves selvagens, incluindo, sem limitações, gado, cavalos, vacas, porcos, ovelhas, cabras, cães, gatos, coelhos, veados, minks, galinhas, patos, gansos, perus, frangos e similares.

O termo "anticorpo" inclui anticorpos policlonais e monoclonais, assim como fragmentos de ligação de compostos antigênicos desses anticorpos, incluindo fragmentos Fab, F(ab')2, Fd, Fv, e seus derivados de cadeia simples. Além disso, o termo "anticorpo" inclui os anticorpos de ocorrência natural, assim como os anticorpos de ocorrência não natural, incluindo, por exemplo, anticorpos quiméricos, bifuncionais e humanizados e suas isoformas sintéticas relacionadas. O termo "anticorpo" é usado de forma intercambiável com "imunoglobulina".

Como usado na presente, o termo "composto antigênico" se refere a qualquer substância que possa ser reconhecida pelo sistema imunológico (por ex., ligado a um anticorpo ou processado de maneira a produzir uma resposta celular imune) nas condições adequadas.

Um "antígeno" como usado na presente, inclui sem limitações as células; extratos celulares; proteínas; lipoproteínas; glicoproteínas; nucleoproteínas; polipeptídeos; peptídeos; polissacarídeos; conjugados polissacarídeos; cópias peptídeas de polissacarídeos; lipídeos; glicolipídeos; carboidratos; vírus; extratos virais; bactérias; extratos bacterianos; fungos; extratos fungicos; organismos multicelulares como parasitas; e alérgenos. Os antígenos podem ser exógenos (por ex., de uma fonte que não de um indivíduo a quem o antígeno é administrado, por ex., de uma espécie diferente) ou endógenos (por ex., originados no interior do hospedeiro, por ex., um elemento de doença do corpo, um antígeno do câncer, uma célula infectada por vírus produzindo um antígeno, e similares). Os antígenos podem ser nativos (por ex., de ocorrência natural); sintéticos; ou recombinantes. Os antígenos incluem os extratos brutos; células inteiras; e os antígenos purificados, onde "purificado" indica que o antígeno está sob uma forma que é enriquecida com relação ao ambiente em que o antígeno ocorre normalmente e/ou relativo ao extrato bruto, por exemplo, uma forma em cultura do antígeno.

Uma "composição imunogênica" como usada na presente se refere a uma combinação de duas ou mais substâncias (por ex., um antígeno e um adjuvante) que, em conjunto, produzem uma resposta imunológica quando administradas a um hospedeiro. Os termos "polipeptídeo," "peptídeo," "oligopeptídeo" e "proteína," são usados de forma intercambiável na presente, e se referem a uma forma polimérica de aminoácidos de qualquer comprimento, que pode incluir aminoácidos codificados e não codificados, química ou bioquimicamente modificados ou aminoácidos derivados e polipeptídeos tendo backbones peptídeos modificados.

Uma "quantidade efetiva de um composto antigênico" se refere a uma quantidade de composto antigênico que, em combinação opcional com um adjuvante, fará o indivíduo produzir uma resposta imunológica específica ao composto antigênico.

O termo "resposta imunológica" se refere a qualquer resposta a um composto antigênico ou imunogênico pelo sistema imunológico de um indivíduo vertebrado. Respostas imunes exemplares incluem, sem limitações, imunidade local e celular sistêmica, assim como imunidade humoral, como respostas dos linfócitos T citotóxicos (CTL), incluindo indução antígeno específica de CD8+ CTLs, respostas das células T helper, incluindo respostas proliferativas das células T e liberação de citoquina, e respostas das células B, incluindo respostas de anticorpos.

O termo "produzindo uma resposta imunológica" é, em geral usado na presente para englobar a indução e/ou a potenciação de uma resposta imunológica.

O termo "induzindo uma resposta imunológica" se refere a uma resposta imunológica que seja estimulada, iniciada ou induzida.

O termo "potenciando uma resposta imunológica" se refere a uma resposta imunológica preexistente que é melhorada, aperfeiçoada, suplementada, amplificada, aumentada, dilatada ou prolongada.

A expressão "resposta imunológica aumentada" ou similar significa que a resposta imunológica é elevada, melhorada ou ampliada para beneficiar o hospedeiro com relação à condição anterior da resposta imunológica, por exemplo, antes da administração de uma composição imunogênica da invenção.

Os termos "imunidade humoral" e "resposta humoral imune" se referem à forma de imunidade em que moléculas do anticorpo são produzidas em resposta à estimulação antigênica.

Os termos "imunidade celular mediada" e "resposta imunológica celular mediada" se referem à defesa imunológica proporcionada pelos linfócitos, como a defesa proporcionada pelos linfócitos de células T quando se situam próximos às suas células vítimas. A resposta imunológica celular mediada normalmente inclui a proliferação de linfócitos. Quando é medida a "proliferação de linfócitos", é medida a capacidade de proliferação dos linfócitos em resposta a um antígeno específico. A proliferação de linfócitos se refere à proliferação das células B, células helper T ou à proliferação celular de linfócitos T citotóxicos (CTL).

O termo "quantidade imunogênica" se refere a uma quantidade de composto antigênico suficiente para estimular uma resposta imunológica, quando administrada com uma composição imunogênica indicada, quando comparada com a resposta imunológica produzida pelo antígeno na ausência do adjuvante polinucleotídico.

O termo "quantidade imunopotenciadora" se refere à quantidade necessária do adjuvante para realizar um aumento no título de anticorpo e/ou imunidade celular mediada quando administrada com um composto antigênico em uma composição da invenção, quando comparada com o aumento no nível de imunidade do anticorpo e/ou de imunidade celular mediada observada na ausência do adjuvante polinucleotídico.

Os termos "tratamento", "tratando", "tratar" e similares são usados na presente para se referir geralmente à obtenção de um desejado efeito farmacológico e/ou fisiológico. O efeito pode ser profilático em termos de evitar completa ou parcialmente uma doença ou um sintoma e/ou pode ser terapêutico em termos de uma estabilização parcial ou completa ou cura de uma doença e/ou efeito adverso atribuível à doença. "Tratamento", como usado na presente, cobre qualquer tratamento de uma doença em um indivíduo, particularmente em um mamífero, mais particularmente em humanos e inclui: (a) evitar que a doença ou sintoma ocorra em um indivíduo que possa estar predisposto à doença ou ao sintoma, mas que ainda não tenha sido diagnosticado; (b) inibir o sintoma da doença, por ex., parando seu desenvolvimento; ou aliviando o sintoma da doença, isto é, fazendo a regressão da doença ou do sintoma (c) redução de um nível de um produto produzido pelo agente infeccioso de uma doença (por ex., uma toxina, um antígeno e similares); e (d) reduzir uma resposta fisiológica indesejada do agente infeccioso de uma doença (por ex., febre, edema de tecido e similares).

Como usado na presente, o termo "mistura" inclui qualquer método para a combinação de componentes de uma composição; esses métodos incluem, sem limitações, a agitação, dosagem, dissolução, emulsificação, coagulação, suspensão ou combinar fisicamente os componentes da composição.

Um "sal farmaceuticamente aceitável" de um composto significa um sal que seja farmaceuticamente aceitável e que possua a atividade farmacológica desejada do composto precursor. Esses sais incluem: (1) sais de adição ácida, formados por ácidos inorgânicos como o ácido clorídrico, ácido hidrobrômico, ácido sulfurico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares; ou formados por ácidos orgânicos como o ácido acético, ácido propiônico, ácido hexanóico, ácido ciclopentanopropiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido lático, ácido malônico, ácido succínico, ácido málico, ácido malêico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanosulfônico, ácido etanosulfônico, ácido 1,2-etanodisulfônico, ácido 2- hidroxietanosulfônico, ácido benzenosulfônico, ácido 4- clorobenzenosulfônico, ácido 2- naftalenosulfônico, ácido 4- toluenosulfônico, ácido canforosulfônico, ácido glucoheptônico, 4,4'- metilenobis-( ácido 3-hidroxi-2-ene-l-carboxílico), ácido 3-fenilpropiônico, ácido trimetilacético, ácido butilacético terciário, ácido lauril sulfurico, ácido glucônico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucônico e similares; ou (2) sais formados quando um próton acídico presente no composto precursor ou é substituído por um íon metálico, por ex., um íon metálico alcalino, um íon terroso alcalino ou um íon de alumínio; ou coordena com uma base orgânica como a etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamino e similares.

O termo "forma farmacêutica unitária" como usado na presente se refere a unidades fisicamente discretas adequadas para dosagens unitárias para indivíduos humanos e animais, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada de compostos da presente invenção calculados em quantidade suficiente para a produção do efeito desejado em associação com um diluente, portador ou veículo farmacêutica/fisiologicamente aceitável.

CONFIGURAÇÕES EXEMPLARES DA INVENÇÃO

A presente invenção é direcionada a composições imunogênicas e métodos úteis para a indução e/ou ampliação de uma resposta imunológica, que pode ser por mediação humoral e/ou celular, em um humano, em um animal não humano ou cultura celular. Em geral, uma composição imunogênica individual compreende um antígeno (uma "composição antigênica") e um adjuvante. A presença do adjuvante aumenta ou modifica a resposta imunológica ao antígeno. O adjuvante pode alterar a qualidade da resposta imunológica afetando as subclasses (isotipos) das imunoglobulinas, quimioquinas e/ou citoquinas produzidas. Como resultado da imunidade inata, as respostas imunes humorais e/ou celular mediadas são mais efetivas com a presença do adjuvante.

Uma particular vantagem é a efetividade do adjuvante PIKA em combinação com uma substância antigênica para a indução de uma resposta imunológica humoral específica, aumentando assim a imunidade protetora.

Uma outra importante vantagem é que o adjuvante PIKA, em combinação com um antígeno pode induzir uma resposta imunológica específica celular mediada que é essencial para uma vacina terapêutica para a limitação e o tratamento de infecções virais, bacterianas e parasitárias intracelulares, assim como para terapias de doenças crônicas, como para o tratamento de cânceres ou de doenças auto-imunes.

Assim, estão incluídas na invenção as composições tendo atributos exclusivos de produto que as tornam mais adequadas para uso como vacinas a serem administradas em animais e/ou humanos, que visam a necessidade de um adjuvante seguro, que produza uma resposta imunológica benéfica.

Assim, a presente invenção provê um adjuvante e composições imunogênicas que podem ser usadas com segurança em humanos e animais.

Além disso, é provida uma composição imunogênica que compreende: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno; em que a composição é formulada para administração de liberação sustentada.

A composição imunogênica de acordo com a invenção pode compreender moléculas de composição adjuvante polinucleotídico heterogêneas em peso molecular, onde o peso molecular é pelo menos 66.000 Daltons. O valor de 66.000 Daltons corresponde a um tamanho cerca de 6,4 Svedbergs. Assim, uma faixa de peso molecular de 66.000 a 1.200.000 Daltons corresponde ao tamanho entre cerca de 6,4 e 24,0 Svedbergs.

Em algumas configurações, uma composição adjuvante PIKA compreendendo um polinucleotídeo, um antibiótico e um íon positivo, onde o polinucleotídeo pode ser um ácido poliriboinosínico-poliribocitidílico (PIC); o antibiótico pode ser canamicina, e o íon pode ser cálcio. Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê uma composição imunogênica para ampliar a antígenicidade de um composto antigênico compreendendo a composição de adjuvante polinucleotídico que é capaz de produzir uma resposta imunológica celular mediada antígeno específica.

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê uma composição imunogênica para ampliar a antígenicidade de um composto antigênico, compreendendo a composição adjuvante polinucleotídico que é capaz de produzir uma resposta humoral imune antígeno específica.

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê uma composição imunogênica para ampliar a antígenicidade de um composto antigênico compreendendo a composição adjuvante polinucleotídico que é capaz de produzir uma resposta humoral imune e celular mediada específica combinadas.

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê uma composição adjuvante ou uma composição imunogênica compreendendo uma composição adjuvante em que a composição adjuvante ou a composição imunogênica é liofilizada.

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê o uso de uma composição adjuvante polinucleotídico para a preparação de um medicamento para ampliar a resposta imunogênica de um hospedeiro.

Adjuvante polinucleotídico

Uma composição imunogênica individual compreende um adjuvante polinucleotídico contendo PIC, por ex., uma composição PIKA, sendo geralmente composta por um ácido poliinosínico, ácido policitidílico, um antibiótico (por ex., canamicina), e por um cátion divalente (por ex., cálcio). Será compreendido que a referência ao PIKA na presente é exemplar desses adjuvantes contendo PIC.

Os adjuvantes contendo PIC de interesse podem ser fabricados usando os métodos disponíveis na técnica. A composição adjuvante contendo PIC pode ser fabricada por qualquer processo adequado. Por exemplo, a composição adjuvante polinucleotídico pode ser fabricada misturando o ácido poliinosínico, ácido policitidílico, um antibiótico e a fonte de um íon positivo em uma solução tampão de cloreto/fosfato de sódio com pH entre pH6 e pH8. O ácido poliinosínico e o ácido policitidílico são geralmente providos em concentração de 0,1 a 10 mg/ml, normalmente de 0,5 a 5 mg/ml e mais normalmente de 0,5 a 2,5 mg/ml. O valor de hipercromicidade deve ser maior que 10%, maior que 15%, maior que 20%, ou maior que 50%. A preparação do PIC e a combinação com o antibiótico (por ex., canamicina) e do íon positivo (por ex., cálcio) é geralmente feita em padrões de qualidade consistentes com o Processo de Boas Práticas de Fabricação internacional.

Em certas configurações da presente invenção, o componente antibiótico do adjuvante é a canamicina. Quando o antibiótico é a canamicina, em algumas configurações, a canamicina na composição adjuvante polinucleotídico é usada em conjunto còm, ou substituída por um ou mais antibióticos selecionados do grupo incluindo tobramicina, antraciclinas, butirosin sulfato, gentamicinas, higromicina, amicacina, dibecacina, nebramicina, metrzamida, neomicina, puromicina, estreptomicina e estreptozocina. O antibiótico (por ex., canamicina ou similar) na composição adjuvante polinucleotídico da invenção é geralmente provido em concentração de cerca de 10 unidades/ml a 100.000 unidades/ml, de cerca de 100 unidades/ml a 10.000 unidades/ml, ou de cerca de 500 unidades/ml a 5.000 unidades/ml.

Em certas configurações da presente invenção, a composição adjuvante polinucleotídico ainda compreende um íon positivo (cátion), normalmente um cátion divalente, normalmente um cátion de um metal alcalino. O íon positivo é geralmente provido na composição da invenção como uma fonte de íons positivos, como um sal ou um complexo, por ex., um sal ou complexo orgânico ou inorgânico, normalmente um sal inorgânico ou um complexo orgânico. Os íons positivos exemplares incluem, sem estarem necessariamente limitados, o cálcio, cádmio, lítio, magnésio, cério, césio, cromo, cobalto, deutério, gálio, iodo, ferro ou zinco.

O íon positivo pode ser provido sob a forma de qualquer sal adequado ou complexo orgânico, incluindo, sem estar necessariamente limitado aos sais de cloreto, fluoreto, hidróxidos, fosfatos ou de sulfatos. Por exemplo, onde o íon positivo for cálcio, o íon pode estar sob a forma de carbonato de cálcio, cloreto de cálcio, fluoreto de cálcio, hidróxido de cálcio, fosfatos de cálcio ou sulfato de cálcio.

O íon positivo (por ex. cálcio) pode ser provido na composição da invenção em uma concentração na faixa de cerca de 10 umol a 10 mmol/ml, normalmente de cerca de 50 umol a 5 mmol/ml, e mais normalmente de cerca de 100 umol a 1 mmol/ml. O termo "umol" é amplamente usado para designar micromole.

Quando o íon positivo na composição adjuvante da invenção é o cálcio, pode estar em combinação com, ou substituído por outros íons positivos, incluindo o cádmio, lítio, magnésio, cério, césio, cromo, cobalto, deutério, gálio, iodo, ferro e zinco, onde os íons podem estar sob a forma de sais inorgânicos ou de complexos orgânicos.

A composição resultante é um adjuvante contendo PIC que ainda contém um antibiótico e um íon positivo. Em uma configuração particular, quando o antibiótico é a canamicina e o íon é cálcio, o produto pode ser descrito como PICKCa. Em uma configuração relacionada, a composição PICKCa pode conter moléculas sem restrição de diferentes características físicas.

Composição adjuvante PIKA

Em determinadas configurações exemplares, o adjuvante contendo PIC é PIKA. PIKA pode ser produzido de várias maneiras, com a produção de PICKCa sendo de particular interesse. PIKA pode ser produzido a partir de PICKCa por meio de outros processos de fabricação que envolvem o isolamento e/ou a concentração de moléculas de uma determinada dimensão e/ou peso molecular. A separação e a concentração das moléculas polinucleotídeo de determinadas características usando filtração, cromatografia, tratamento térmico, separação centrífuga, eletroforese e métodos similares que são processos padrão e que são conhecidos pelos técnicos do assunto.

Em configurações de particular interesse, a invenção apresenta um adjuvante geralmente denominado de PIKA, compreendendo um ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico (PIC)5 um antibiótico (por ex., canamicina), e um íon positivamente carregado (por ex., um íon de cálcio), em que a composição contém moléculas do adjuvante heterogêneo com relação ao peso molecular, tendo peso molecular entre cerca de 66.000 a 1.200.000 Daltons. Isto é a composição adjuvante compreende moléculas com uma distribuição de peso na faixa de cerca de 66.000 a 1.200.000 Daltons.

Em configurações relacionadas, as moléculas da composição adjuvante PIKA polinucleotídeo na composição são heterogêneas, isto é, o peso das moléculas adjuvantes está distribuído em uma faixa de peso molecular, em que o peso molecular é de cerca de 300.000 a 1.200.000 Daltons, ou de cerca de 66.000 a 660.000 Daltons, ou de cerca de 300.000 a 660.000 Daltons, ou de cerca de 300.000 a 2.000.000 Daltons, ou de cerca de 66.000 Daltons a cerca de 100.000 Daltons, 100.000 a 200.000 Daltons, de cerca de 300.000 Daltons a cerca de 4.000.000 Daltons, ou de cerca de 500.000 Daltons a 1.000.000 Daltons, ou de cerca de 1.000.000 Daltons a 1.500.000 Daltons, ou de cerca de 1.500.000 Daltons a 2.000.000 Daltons, ou de cerca de 2.000.000 Daltons a 2.500.000 Daltons, ou de cerca de 2.500.000 Daltons a 3.000.000 Daltons, ou de cerca de 3.000.000 Daltons a 3.500.000 Daltons, ou de cerca de 3.500.000 Daltons a 4.000.000 Daltons, ou de cerca de 4.000.000 Daltons a 4.500.000 Daltons, ou de cerca de 4.500.000 Daltons a 5.000.000 Daltons.

Em configurações relacionadas, as moléculas da composição adjuvante PIKA polinucleotídeo na composição têm um peso molecular médio igual ou igual ou maior que 66.000 Daltons, maior que 150.000 Daltons, ou igual ou maior que 250.000 Daltons, ou igual ou maior que 350.000 Daltons, ou igual ou maior que 500.000 Daltons, ou igual ou maior que 650.000 Daltons, ou igual ou maior que 750.000 Daltons, ou igual ou maior que 1.000.000 Daltons, ou igual ou maior que 1.200.000 Daltons, ou igual ou maior que 1.500.000 Daltons, ou igual ou maior que 2.000.000 Daltons.

Em configurações de particular interesse, a invenção apresenta um adjuvante geralmente denominado de PIKA, compreendendo um ácido polirriboinosínico-polirribocitidílico (PIC), um antibiótico, e um íon positivo em que a composição contém moléculas do adjuvante heterogêneas, isto é, a dimensão das moléculas adjuvantes é distribuída em uma faixa de tamanho molecular, com o tamanho molecular tendo um coeficiente de sedimentação em Svedbergs (S) de cerca de 6,43 S to 24,03 S.

Em configurações relacionadas, as moléculas da composição adjuvante PIKA polinucleotídeo na composição são heterogêneas, isto é, a dimensão das moléculas adjuvantes é distribuída em uma faixa de tamanho molecular, onde o tamanho molecular é de cerca de 12,8S a 24,03S, ou de cerca de 3S a 12S ou de cerca de 6,43 a 18,31S, ou de cerca de 12,8 a 18,31S, ou de cerca de 12,8S a 30,31S, ou de cerca de 12,8S a 41,54S, ou de cerca de 13,5S, a 18,31S, ou de cerca de 13,5S a 24,03S, ou de cerca de 16,14 a 22,12S, ou de cerca de 22,12S a 26,6S, ou de cerca de 26,6S a 30,31S, ou de cerca de 30,3IS a 33,55S, ou de cerca de 33,55S a 36,45S, ou de cerca de 36,45S a 39,1S, ou de cerca de 39,IS a 41,54S, ou de cerca de 41,54S a 43,83S, ou de cerca de 43,83S a 45,95S.

Em outras configurações relacionadas, a composição adjuvante PIKA polinucleotídeo tem um coeficiente de sedimentação médio, (Svedbergs) maior que 9, ou maior que 12, ou maior que 13,5, ou maior que 15, ou maior que 16, ou maior que 17, ou maior que 18, ou maior que 19, ou maior que 20, ou maior que 21, ou maior que 22 ou maior que 25, ou maior que 30.

Propriedades Imunogênicas

Uma composição imunogênica, incluindo PIKA é um antígeno, pode geralmente induzir uma resposta imunológica antígeno-específica em pelo menos duas maneiras: i) imunidade humoral mediada, que inclui estimulação de células Bea produção de anticorpos ou imunoglobulinas (outras células estão também envolvidas na geração de um resposta de anticorpo, por ex. células que apresentam antígenos, incluindo macrófagos e células helper T (Thl e Th2), e ii) imunidade celular mediada, que geralmente envolve células T incluindo linfócitos T citotóxicos, apesar de outras células também estarem envolvidas na geração de uma resposta do linfócito T citotóxico (por ex., células Thl e/ou Th2 e células apresentando antígenos).

Além disso, a composição adjuvante polinucleotídico pode alterar a qualidade da resposta imunológica, afetando as subclasses (isotipos) de imunoglobulinas produzidas, assim como de suas afinidades.

Portanto, o grau e a natureza da resposta imunogênica induzida por uma composição imunogênica individual pode ser avaliado medindo a presença de moléculas incluindo citoquinas, quimioquinas e anticorpos produzidos por células do sistema imunológico.

A interleucina-4 é principalmente produzida pelas células Th2 ativadas. A produção da Interleucina-4 (IL-4) induz a ativação das células B e assim a produção das imunoglobulinas IgGl e IgE (anticorpos) que pode ser medida nas amostras séricas de sangue. A IL-4 é considerada como indicadora e a citoquina típica da resposta imunológica Th2. As células Th2 tendem a promover a resposta do anticorpo.

A Interleucina-2 (IL-2) é principalmente produzida pela célula Thl ativada, assim como pelas células NK e pelas células assassinas ativadas pela linfoquina (LAK). A IL-2 é instrumental na proliferação e no amadurecimento das células T, um estágio essencial para uma efetiva resposta imunológica adaptativa mediada por células.

O Interferon-γ (INF-γ), que pode ser produzido por uma variedade de células, incluindo as células assassinas naturais, assim como pelas células T CD4+ e CD8+, desempenha um papel essencial da resposta imunológica adaptativa, incluindo a ativação de macrófagos para se tornarem altamente microbicidas. Além disso, o INF-γ é um fator influenciador no direcionamento do desenvolvimento específico das células T Thl, regulando assim para cima uma resposta imunológica adaptativa mediada por células.

A invenção contempla métodos de uso do adjuvante polinucleotídico da invenção com um antígeno, por exemplo, para produzir uma resposta humoral antígeno-específica e/ou uma resposta celular- específica (por ex., célula T) em um indivíduo. A resposta imunológica produzida pode ser uma resposta a um antígeno em um indivíduo não tratado, ou pode servir para ampliar uma resposta imunológica existente (por ex., como em um reforço). Foi descoberto que as composições imunogênicas de acordo com a invenção compreendendo PIKA possuem as propriedades particularmente vantajosas descritas na presente.

Foi testada uma variedade de diferentes antígenos in vivo com relação à capacidade de induzir uma resposta imunológica com ou sem o adjuvante PIKA. Os antígenos testados incluem: um antígeno de superfície tipo adw da proteína recombinante da hepatite B, uma vacina inativada fracionada da gripe (VAXIGRIP da Sanofi Pasteur), um antígeno sintetizado do peptídeo HIV, um antígeno tipo 2 gD do vírus do herpes simplex de proteína recombinante, um antígeno da proteína recombinante protetor do antraz, um antígeno do vírus inteiro inativado da gripe aviária da cepa H5N1 e um antígeno inativado do vírus inteiro inativado da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS).

Em cada caso, a presença do adjuvante PIKA em conjunto com o antígeno ampliou a expressão das citoquinas quando comparado com o antígeno ou com o PIKA individualmente. Em particular, as expressões ampliadas das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 (ver Exemplos 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 e 1.6) indicam que a estimulação de uma imunidade adaptativa específica foi maior com a presença do adjuvante PIKA e mais especificamente as expressões ampliadas das citoquinas INF-γ, IL-2 indicam que a imunidade da célula Thl predominante foi significativamente melhor com a presença do adjuvante PIKA. A atividade de uma resposta imunológica mediada por células é uma característica principal essencial para o tratamento das infecções intracelulares virais, bacterianas e parasitárias e um fator particularmente importante para o desenvolvimento de uma vacina terapêutica.

Além disso, a composição contendo PIKA estimula a produção do INF-γ pelas células CD4+ T (Exemplos 1.3, 1.4, 1.5 e 1.6). Esta característica valida que o PIKA amplia a resposta imunológica adaptativa do hospedeiro.

A proliferação observada de anticorpos no soro sangüíneo demonstra que o adjuvante PIKA induz uma resposta humoral benéfica. Foram observados títulos IgG aumentados de anticorpo específico com a adição de PIKA a uma composição imunogênica (ver Exemplos 1.1, 1.2, 1.4, 1.5, 1.6, 2, 3, 5 e 6).

O adjuvante PIKA amplia a resposta imunológica em um hospedeiro quando combinado com um antígeno inativado (Exemplos 1.2, 1.6, 2, 3, 4 e 6), com um antígeno peptídeo (Exemplo 1.3) e com um antígeno recombinante (Exemplos 1.1, 1.4, 1.5, 5 e 7).

Uma característica particular do adjuvante PIKA é prover proteção adequada tanto para limitar e/ou erradicar a infecção de um hospedeiro, e/ou reduzir o risco de sintomas de uma doença que possa resultar de uma infecção por um patógeno. A VAXIGRIP (Sanofi Pasteur) usada como antígeno nos Exemplos 1.2 e 6 é uma vacina de gripe humana que produz um grau de atividade imune considerada suficiente para dar proteção contra uma infecção real de gripe. A adição de PIKA à VAXIGRIP ainda ampliou a resposta imunológica como demonstrada pelo grau de citoquinas benéficas (IL-2, INF-γ e IL-4) e de IgG específico expressos pelo sistema imunológico. Em uma outra demonstração das propriedades protetoras do PIKA, 24 frangos de dez dias foram inoculados com uma composição compreendendo PIKA e antígenos inativados de gripe aviária, incluindo as cepas H5N1 e H9N2 (Exemplo 3). Os frangos foram depois desafiados com o vírus vivo H5N1 e observados por um período de duas semanas. No final do programa, a taxa de sobrevivência dos frangos inoculados com a composição de antígeno PIKA/ foi de 83% quando comparada com somente 17% no grupo de controle de 24 frangos que foram expostos ao vírus vivo, sem prévia inoculação com a composição de antígeno PIKA.

Em um experimento relacionado para demonstrar as propriedades terapêuticas ampliadas do adjuvante PIKA, camundongos Balb/c foram desafiados com uma cepa de vírus selvagem da raiva (Exemplo 4). Depois da infecção, os três diferentes grupos de animais foram inoculados com um regime de tratamentos com diferentes vacinas da raiva. A taxa de sobrevivência do grupo de camundongos inoculados com uma combinação de antígeno inativado da raiva de células de rim purificadas de criceto mais PIKA alcançou 80%. A taxa de sobrevivência do segundo grupo de camundongos que recebeu um antígeno da raiva de células de rim purificadas de criceto com um adjuvante alum foi de 15%.

Depois, o terceiro grupo de camundongos que recebeu a vacina da raiva inativada de células vero - Sanofi-Aventis1 "Verorab" - teve uma taxa de sobrevivência de 20%.

Em uma outra demonstração das propriedades do adjuvante PIKA, o Exemplo 7 demonstra que a presença de PIKA em conjunto com HBsAg tipo adw aumenta a produção de títulos de IgGl específico (Tabela 26 Figura 35) e mais significativamente de IgG2a (Tabela 27 Figura 36) no soro murídeo. A conclusão desta observação é que o PIKA aumenta a resposta imunológica terapêutica, em particular uma resposta imunológica direcionada a Thl.

Em um experimento relacionado (Exemplo 7), a presença de PIKA em formulações de vacinas compreendendo HBsAG tipo adw demonstrou aumentar a produção de interferon-γ pelos esplenócitos estimulados por um epítopo peptídeo celular CD8 T. Este resultado demonstra que o PIKA induz uma resposta imunológica celular CD8+ T (Tabela 28 Figura 37).

Depois, (Exemplo 7) a presença de PIKA nas formulações de vacinas compreendendo HBsAg demonstrou ampliar a produção do interferon-γ pelos esplenócitos em cultura ex-vivo por seis dias com 2ug/ml do epítopo peptídeo celular CD8 T. Este resultado demonstra que o PIKA induz uma resposta celular T na memória central.

Outras Características

Em uma outra configuração, uma composição imunogênica individual é ainda definida pela presença relativa do adjuvante PIKA e o antígeno ou antígenos em que a presença é medida em termos de uma ou mais características de quantidade, concentração, volume, número de moléculas ou de outra medida reconhecida.

Em configurações relacionadas, uma composição imunogênica individual compreende uma composição adjuvante polinucleotídico e um antígeno ou antígenos em que a presença do adjuvante e do antígeno em termos de peso ou número de moléculas está em uma taxa menor que 1 a 1.000, menor que 1 a 900, menor que 1 a 800, menor que 1 a 700, menor que 1 a 500, menor que 1 a 400, menor que 1 a 300, menor que 1 a 200, menor que 1 a 100, menor que 1 a 50, menor que 1 a 10, menor que 1 a 5, menor que 1 a 2, cerca de 1 a 1, maior que 2 a 1, maior que 5 a 1, maior que 10 a 1, maior que 50 a 1, maior que 100 a 1, maior que 200 a 1, maior que 300 a 1, maior que 400 a 1, maior que 500 a 1, maior que 600 a 1, maior que700 a 1, maior que 800 a 1, maior que 900 a 1, maior que 1.000 a 1.

Em uma outra configuração relacionada, uma composição imunogênica individual é definida em termos de dose; que é a quantidade de vacina que deve ser administrada para induzir uma resposta imunológica benéfica ideal ou, de forma alternativa, a faixa de dose que pode ser administrada a partir de um mínimo necessário para produzir uma resposta imunológica até a dose máxima, além da qual a resposta benéfica incrementai não é justificada medicamente no contexto da indução potencial de efeitos colaterais adversos.

Em determinadas configurações de particular interesse, a composição imunogênica compreende a composição adjuvante polinucleotídico e antígeno onde é provida a presença do antígeno em uma dose unitária em uma quantidade que é maior que 0,1 ug, é maior que 0,5ug, é maior que 0,001 mg, é maior que 0,005 mg, é maior que 0,01 mg, é maior que 0,025 mg, é maior que 0,05 mg, é maior que 0,075 mg, 0,1 mg é maior que 0,25 mg, é maior que 0,5 mg, é maior que 1,2 mg, é maior que 1,4 mg, é maior que 1,6 mg, é maior que 1,8 mg, é maior que 2,0 mg é maior que 2,5 mg, é maior que 3 mg, é maior que 3,5mg, é maior que 4 mg, é maior que 5 mg, é maior que 6 mg, é maior que 7 mg, é maior que 8 mg, é maior que 9 mg, é maior que 10 mg, é maior que 15 mg, é maior que 20 mg, é maior que 25 mg, ou é maior que 50 mg.

Uma quantidade ideal de antígeno e a taxa ideal de antígeno do adjuvante PIKA podem ser determinadas pelos estudos padrão que envolvem observações dos títulos de anticorpo e de outras respostas imunogênicas no hospedeiro.

Antígenos

Em uma configuração de particular interesse, a invenção provê a composição adjuvante polinucleotídico em conjunto com um antígeno ou vacina, em que a fonte do antígeno é um antígeno humano, um antígeno animal, um antígeno vegetal, um ou mais agentes de agentes infecciosos de qualquer vírus, bactéria incluindo mycobacterium, fungos ou parasitas, antígeno de câncer, agentes alergênicos e outros antígenos, como para o desenvolvimento das doenças auto-imunes. Em certas configurações, os antígenos podem ser obtidos de uma fonte natural, seja bruta ou purificada, e usados em suas formas viventes originais ou após terem sido mortos ou inativados, truncados, atenuados ou transformados em uma forma sem reversão, ou detoxificados, mudados em uma forma não tóxica, filtrados ou purificados.

Em algumas configurações, o antígeno é um antígeno de microorganismo isolado, por exemplo, um antígeno viral, um antígeno bacteriano, um antígeno fúngico, um antígeno alérgico, um antígeno de câncer ou um antígeno autoimune. Em outras configurações, o antígeno é um antígeno completo inativado. Métodos para a inativação de antígenos completos são bem conhecidos na técnica; qualquer método conhecido pode ser usado para inativar um antígeno e pode ser adequadamente selecionado para o tipo de antígeno de interesse. Esses métodos de inativação de um antígeno incluem, por exemplo, o uso de compostos fotorreativos; agentes oxidantes; irradiação (por ex., irradiação UV; irradiação γ); combinações de riboflavina e irradiação UV; tratamento solvente-detergente (por ex., tratamento com o solvente orgânico tri-N- butil-fosfato com um detergente como o Tween 80); tratamento com polietileno glicol; pasteurização (tratamento térmico); e tratamento com baixo pH; tratamento enzimático suave com pepsina ou tripsina; fototratamento com azul de metileno (MB); tratamento com azul de dimetilmetileno (DMMB) e luz visível; tratamento com S-59, um derivado psoralen e iluminação UVA; e similares.

Em uma configuração relacionada de particular interesse, o antígeno pode ser sintetizado por meio de sintase de fase sólida, ou pode ser obtido por meio de genética recombinante, ou pode ainda ser fabricado artificialmente para imitar as propriedades imunogênicas de um patógeno.

Antígenos polipeptídeos podem ser isolados de fontes naturais usando métodos padrão de purificação protéica conhecidos na técnica, incluindo, sem limitações, a cromatografia líquida (por ex., cromatografía líquida de alto desempenho, cromatografia líquida rápida de proteínas, etc.), cromatografia de exclusão de tamanho, gel eletroforese (incluindo gel eletroforese unidimensional, gel eletroforese bidimensional), cromatografía de afinidade ou outra técnica de purificação. É possível empregar técnicas de síntese de peptídeos de fase sólida, em que essas técnicas são conhecidas pelos peritos na técnica. Ver Jones, The Chemical Synthesis of Peptides (Clarendon Press, Oxford)(1994). Em geral, nesses métodos é produzido um peptídeo pela adição seqüencial de unidades monoméricas ativadas em uma cadeia crescente de peptídeos ligados de fase sólida. As técnicas bem estabelecidas de DNA recombinante podem ser empregadas para a produção de polipeptídeos, esses métodos incluindo, sem limitações, por exemplo, uma construção de expressão compreendendo uma seqüência nucleotídeo que codifica um polipeptídeo é introduzida em uma célula hospedeira adequada (por ex., uma célula hospedeira eucariótica cultivada como uma entidade unicelular em cultura celular in vitro, por ex., uma célula de levedo, uma célula de inseto, uma célula de mamífero, etc.) ou uma célula procariótica (por ex., cultivada em cultura celular in vitro), gerando uma célula hospedeira geneticamente modificada; em determinadas condições de cultura, a proteína é produzida pela célula hospedeira geneticamente modificada.

Em algumas configurações, o antígeno é um antígeno purificado, por ex., de cerca de 25% a 50% puro, de cerca de 50% a cerca de 75% puro, de cerca de 75% a cerca de 85% puro, de cerca de 85% a cerca de 90% puro, de cerca de 90% a cerca de 95% puro, de cerca de 95% a cerca de 98% puro, de cerca de 98% a cerca de 99% puro, ou maior que 99% puro.

O antígeno pode ser acelular, capsular, clone infeccioso, replicon, vectorado, microencapsulado, monovalente, bivalente ou multi valente.

A composição adjuvante polinucleotídico da presente invenção também pode ser utilizada para ampliar a resposta imunológica contra antígenos produzidos pelo uso de vacinas DNA e/ou proteínas de expressão DNA. As seqüências DNA nessas vacinas que codificam o antígeno tanto podem ser "nuas" ou contidas em um sistema de entrega, como os lipossomos.

Em um aspecto de particular interesse a composição imunogênica individual pode ser definida pela seleção de antígeno ou antígenos que são usados em combinação com o adjuvante PIKA.

Mais especificamente, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso, em que a composição imunogênica compreende um adjuvante PIKA em conjunto com um antígeno viral, onde os antígenos exemplares incluem, sem limitações, os antígenos de um ou mais vírus descritos na Tabela 1.

TABELA 1 PATÓGENOS E DOENÇAS VIRAIS

<table>table see original document page 34</column></row><table> <table>table see original document page 35</column></row><table> <table>table see original document page 36</column></row><table> <table>table see original document page 37</column></row><table> <table>table see original document page 38</column></row><table> antígenos exemplares incluem, sem limitações, antígenos de uma ou mais bactérias descritas na Tabela 2.

TABELA 2

PATÓGENOS E DOENÇAS BACTERIANAS

<table>table see original document page 39</column></row><table> <table>table see original document page 40</column></row><table> <table>table see original document page 41</column></row><table> <table>table see original document page 42</column></row><table>

Mais especificamente, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso em que a composição imunogênica compreende um adjuvante PIKA em conjunto com um antígeno fungico, em que os antígenos exemplares incluem, sem limitações, os antígenos de um ou mais fungos descritos na Tabela 3.

<table>table see original document page 43</column></row><table> <table>table see original document page 44</column></row><table>

Mais especificamente, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso, onde a composição imunogênica compreende um adjuvante PIKA em conjunto com um antígeno parasítico, onde os antígenos exemplares incluem, sem limitações, os antígenos de um ou mais parasitas descritos na Tabela 4.

TABELA 4 PATÓGENOS E DOENÇAS PARASÍTICAS

<table>table see original document page 44</column></row><table> <table>table see original document page 45</column></row><table> <table>table see original document page 46</column></row><table> <table>table see original document page 47</column></row><table>

Em uma configuração relacionada, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso, onde a composição imunogênica compreende um adjuvante PIKA em conjunto com um antígeno alérgico ("alérgeno") ou vacina, em que a fonte do antígeno ou da vacina é obtida ou produzida para emular um patógeno de fontes de alergia humanas ou animais, incluindo; plantas, animais, fungos, insetos, alimentos, medicamentos, poeira, ácaros e similares.

Os alérgenos incluem, sem limitações, aeroalérgenos ambientais; pólens de plantas, como plantas daninhas/febre do feno; alérgenos de pólen de ervas daninhas; alérgenos de pólen de grama; grama Johnson; alérgenos de pólen de árvores; azevém; alérgenos aracnídeos, como alérgenos de ácaros do pó caseiro (por ex., Der ρ I, Der f I, etc.); alérgenos de ácaros de armazenagem; pólen de cedro japonês/febre do feno; alérgenos de esporos molde; alérgenos animais (por ex., alérgenos de cães, cobaias, criceto, gerbo, rato, camundongo, etc.); alérgenos alimentares (por ex., alérgenos de crustáceos; nozes, como de amendoim; frutas cítricas); alérgenos de insetos; venenos: (Hymenoptera, zangão dourado, abelha melífera, vespa, marimbondo, formiga do fogo); Outros alérgenos de insetos ambientais de baratas, pulgas, mosquitos, etc.; alérgenos bacterianos, como antígenos estreptocócicos; alérgenos parasitários, como o antígeno Ascaris; antígenos virais; esporos fungicos; alérgenos medicamentosos; antibióticos; penicilinas e compostos relacionados; outros antibióticos; proteínas totais, como os hormônios (insulina), enzimas (estreptoquinase); todos os medicamentos e seus metabólitos capazes de atuarem como antígenos incompletos ou haptenos; produtos químicos industriais e metabólitos capazes de atuarem como haptenos e funcionarem como alérgenos (por ex., os anidridos ácidos (como o anidrido trimelítico) e os isocianatos (como o diisocianato de tolueno)); alérgenos ocupacionais como a farinha (por ex., alérgenos que provocam a asma de Baker), mamona, grãos de café e os produtos químicos industriais acima descritos; alérgenos de pulgas; e proteínas humanas em animais não humanos.

Os alérgenos incluem, sem limitações, células, extratos celulares, proteínas, polipeptídeos, peptídeos, polissacarídeos, conjugados polissacarídeos, cópias de peptídeos e não peptídeos de polissacarídeos e demais moléculas, pequenas moléculas, lipídeos, glicolipídeos e carboidratos.

Exemplos de alérgenos específicos naturais, animais e vegetais incluem, sem limitações, proteínas específicas aos seguintes gêneros: Canino (Cariis familiaris); Dermatofagóides (por ex., Dermatophagoides farinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia (Ambrosia artemiisfolia; Lolium (por ex., Lolium perenne ou Lolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica); Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnus gultinoasa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercus alba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris); Plantago (por ex., Plantago lanceolata); Parietaria (por ex., Parietaria officinalis ou Parietaria judaica); Blattella (por ex., Blattella germanica); Apis (por ex., Apis multiflorum); Cupressus (por ex., Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressus macrocarpa); Juniperus (por ex., Juniperus sabinoides, Juniperus virginiana, Juniperus communis e Juniperus ashei); Thuya (por ex., Thuya orientalis); Chamaecyparis (por ex., Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (por ex., Periplaneta americana); Agropyron (por ex., Agropyron repens); Secale (por ex., Secale cereale); Triticum (por ex., Triticum aestivum); Dactylis (por ex., Dactylis glomerata); Festuca (por ex., Festuca elatior); Poa (por ex., Poapratensis ou Poa compressa); Avena (por ex., Avena sativa); Holcus (por ex., Holcus lanatus); Anthoxanthum (por ex., Anthoxanthum odoratum); Arrhenatherum (por ex., Arrhenatherum elatius); Agrostis (por ex., Agrostis alba); Phleum (por ex., Phleum pratense); Phalaris (por ex., Phalaris arundinacea); Paspalum (por ex., Paspalum notatum); Sorghum (por ex., Sorghum halepensis); e Bromus (por ex., Bromus inermis).

Em uma configuração relacionada, a presente invenção provê uma composição adjuvante polinucleotídico e método de uso onde a composição imunogênica compreende um adjuvante PIKA em conjunto com um antígeno autoimune ou vacina.

Em uma configuração relacionada, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso, onde a composição imunogênica compreende o adjuvante PIKA individualmente ou em conjunto com um antígeno de câncer, onde antígenos exemplares incluem, sem limitações, antígenos de um ou mais cânceres descritos na Tabela 5.

TABELA 5 Cânceres

<table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table> <table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table>

Em uma configuração relacionada, a fonte do antígeno do câncer pode ser: 1) proteínas virais - por exemplo, vírus da hepatite B (HBV), vírus Epstein-Barr (EBV) e papilomavírus humano (HPV) - são importantes no desenvolvimento do carcinoma hepatocelular, linfoma e do câncer cervical, respectivamente; 2). Células totais de câncer que podem ser o extrato inativado e/ou não purificado e/ou semi-purificado dessas células; 3). antígenos associados a tumores (TAAs), como as proteínas oncogênicas específicas de tumores, proteínas glicosiladas, gangliosidas, glicolipídea, mucinas, peptídeas, carboidratos e anticorpos monoclonais anti-idiotipos.

Em uma configuração relacionada, o uso da composição imunogênica compreendendo o adjuvante polinucleotídico pode ser para o tratamento dos tumores de câncer por meio da prevenção de um maior crescimento dos cânceres existentes, a prevenção da recorrência dos cânceres tratados ou da eliminação das células cancerosas não mortas pelos tratamentos anteriores. O tratamento pode ser administrado antes, em conjunto, ou depois de outras terapias administradas ao indivíduo, e assim pode fazer parte de uma terapia de combinação geral para tratar o câncer.

Em uma configuração relacionada, a vacina do câncer fornece terapias capazes de induzir respostas imunes específicas ao tumor, tanto contra um tumor primário como suas metástases. Além disso, a indução de uma forte imunidade pode conduzir ao estabelecimento de uma memória imune, reduzindo ou inibindo assim a recorrência do tumor. A vacina do câncer pode induzir anticorpos específicos contra antígenos de superfície associados ao tumor e, preferivelmente induzir uma resposta celular imune com, de preferência, uma tendência na direção de uma resposta imunológica Thl.

Qualquer variedade de antígenos conhecidos específicos de tumores ou de antígenos associados a tumores (TAA) pode ser incluída em uma composição imunogênica individual. Pode ser usada toda TAA, entretanto, não precisando ser. Ao invés disso, pode ser usada uma porção da TAA, por ex., um epítopo. Os antígenos associados ao tumor (ou seus fragmentos contendo epítopos) que podem ser usados no YFV incluem, sem limitações, MAGE-2, MAGE-3, MUC-1, MUC-2, HER-2, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular MAA, GD2, antígeno carcinoembriônico (CEA), TAG-72, antígenos ovarianos associados OV- TL3 e MOVI 8, TUAN, proteína alfa-feto (AFP), OFP, CA-125, CA-50, CA-19-9, antígeno renal associado ao tumor G250, EGP-40 (também conhecido como EpCAM), SlOO (antígeno maligno associado a melanoma), p53 e p21ras. Pode ser usado um análogo sintético de qualquer TAA (ou de seu epítopo); incluindo quaisquer dos mencionados. Além disso, podem ser incluídas combinações de uma ou mais TAAs (ou de seus epítopos) na composição.

Em algumas configurações, uma composição imunogênica individual compreende um adjuvante polinucleotídico, e pelo menos dois diferentes antígenos, por ex., em algumas configurações, uma composição imunogênica individual compreende dois antígenos, três antígenos, quatro antígenos, cinco antígenos ou mais do que cinco antígenos.

Outros agentes

Em algumas configurações, uma composição imunogênica individual compreende, além de um adjuvante PIKA e um antígeno, um ou mais agentes adicionais, por ex., agentes imunomoduladores, veículos e similares.

Em uma configuração de particular interesse, a presente invenção provê uma composição imunogênica e método de uso, onde a composição imunogênica compreende o adjuvante PIKA, um antígeno ou vacina em conjunto com outra substância imunomoduladora, incluindo adjuvantes, onde substâncias imunomoduladoras adequadas incluem, sem limitação: uma composição de alumínio como o hidróxido de alumínio; composições de emulsões óleo em água ou emulsões compreendendo substâncias imunogênicas, incluindo o Adjuvante Completo de Freund; uma emulsão óleo em água contendo organismos de tuberculose secos, mortos por calor de Mycobacterium; Adjuvante Incompleto de Freund; emulsões incluindo componentes micobacterianos de parede celular; emulsões incluindo esqualeno (MF-59); endotoxinas detoxiflcadas, derivados de lipídeo A, incluindo monofosforil lipídeo A microbiano (MPL); haptenos; proteína absorvida da nitrocelulose; saponinas, incluindo imunomoduladores particulados isolados da casca da Quillaja Saponoria, por exemplo, QS21; imunomoduladores humanos endógenos; adjuvantes derivados bacterianos, incluindo dinucleotídeos CpG não metilados; oligodeoxinucleotídeos (por ex., oligonucleotídeos sintéticos) contendo dinucleotídeos CpG não metilados; lipossomos (por ex., Iipossomos feitos de materiais biodegradáveis como os fosfolipídeos); microesferas poliméricas biodegradáveis (por ex., microesferas feitas de uma variedade de polímeros como o ácido polilático-co-glicólico (PLGA), polifosfazeno e polianidridos); Interleucina-2; Bacillus Calmette Guerin; Fator Estimulador de Colônias Granulócitos Monócitos; Montanide ISA-51; Hemocianina keyhole limpet; DNA; proteínas; antígenos encapsulados; complexos imuno-estimulantes (ISCOM's); toxina do cólera, derivados da toxina colérica; toxina zonula occludens; enterotoxina termo-lábil escherichia coli; toxina lábil, derivados de toxina lábil; toxina da coqueluche, derivados da toxina da coqueluche; derivados muramil-dipeptídeo; séries sépicas de adjuvantes montanide; poli- di(carboxilatofenoxi)fosfazeno e fator de elongamento da leishmania. Quando a composição imunogênica individual é administrada em conjunto com um outro adjuvante, o adjuvante polinucleotídico pode ser administrado antes e/ou depois, e/ou simultaneamente com outro adjuvante. Por exemplo, o adjuvante polinucleotídico pode ser administrado com a administração inicial do antígeno, seguida por uma dose de reforço da vacina, compreendendo um ou ambos os adjuvantes. De maneira alternativa, a dose inicial de vacina administrada pode excluir os adjuvantes polinucleotídicos, mas uma substância imunogênica compreendendo o adjuvante polinucleotídico é subseqüentemente administrada ao paciente.

Em certas configurações, a composição imunogênica individual pode ser administrada com citoquinas ou outras moléculas co-estimuladoras, por exemplo: IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-15

Em uma configuração relacionada, a presente invenção provê uma substância imunogênica compreendendo um adjuvante PIKA, uma substância ou substâncias antigênicas, mais um veículo adequado. O veículo pode ser, por exemplo, uma emulsão óleo e água, uma suspensão, um veículo lipídico, um sal de alumínio, cocleados, ISCOMs, lipossomos, vetores bacterianos vivos, vetores virais vivos, microesferas, vacinas de ácidos nucléicos, polímeros, anéis poliméricos, fluoreto de sódio, plantas transgênicas, virossomos, partículas tipo virais e demais veículos de transporte conhecidos na técnica.

O adjuvante polinucleotídico pode ser administrado diretamente ao indivíduo ou pode ser administrado em conjunto com um complexo de transporte. Quando o complexo de transporte é uma substância associada a um meio visado, por ex., uma molécula que resulte em uma ligação de maior afinidade com a célula alvo, como superfícies de células dendríticas e/ou maior absorção celular pelas células alvo. Exemplos de complexos de transporte incluem, sem limitação; ácidos de transporte do ácido nucléico associados com: um esterol (por ex., colesterol), um lipídeo (por ex., lipídeo catiônico, virossomo ou lipossomo), ou um agente de ligação específico de célula alvo (por ex., um ligando reconhecido por um receptor específico de célula alvo). Os complexos preferidos podem ser suficientemente estáveis in vivo para evitar o desacoplamento significativo antes da internalização pela célula alvo. Entretanto, o complexo pode ser clivável de acordo com condições apropriadas dentro da célula.

Em uma configuração de interesse, a composição compreendendo adjuvante PIKA não inclui poli-L-lisina ou um seu derivado.

Kits

Em certas configurações, a invenção provê um kit compreendendo uma composição imunogênica individual. Em certas configurações, a invenção provê um kit compreendendo um adjuvante PIKA e um antígeno em formulações separadas.

Em uma configuração relacionada, a invenção provê a kit compreendendo o adjuvante polinucleotídico e um composto imunogênico em que a substância imunogênica é um antígeno.

Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica individual em uma formulação de líquido estéril (por ex., aquoso), em que a formulação é estéril e é fornecida em um recipiente estéril, um frasco estéril ou uma seringa estéril.

Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica individual formulada para injeção. Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica individual em uma formulação líquida estéril, contida em uma seringa estéril; e uma agulha. Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica individual em uma formulação liquida estéril em uma quantidade de dosagem unitária (por ex., uma dose única), contida em uma seringa estéril; e uma agulha.

Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica individual, liofilizada e em um recipiente estéril; e um recipiente compreendendo um líquido estéril para reconstituição da composição liofilizada. Em algumas configurações, o kit ainda compreende instruções para a reconstituição da composição liofilizada.

Em algumas configurações, o kit individual compreende uma composição imunogênica formulada para administração retal, vaginal, nasal, oral (incluindo inalação), oftalmicamente, topicamente, pulmonar, ocular ou transdérmica e um adequado dispositivo para a aplicação, por exemplo, um inalador, supositório, aplicador ou similar.

O kit individual, em algumas configurações, ainda incluirá instruções de uso, incluindo por ex., quantidades para dosagens e freqüências de dosagens. As instruções são, em algumas configurações, impressas diretamente no kit. Em outras configurações, as instruções são materiais impressos fornecidos como bulas. As instruções também podem ser fornecidas em outros meios, por ex., eletronicamente sob forma análoga ou digital, por ex., em um áudio cassete, uma fita de áudio, um compact disc, um disco digital versátil e similares.

Formulações

Uma composição imunogênica individual é provida em qualquer variedade de formulações. Por exemplo, uma composição imunogênica individual pode ser preparada como uma solução injetável, pó seco, solução líquida, por exemplo: solução aquosa ou salina ou como: uma suspensão, creme, emulsão, comprimido, comprimido revestido, microcápsula, supositório, gotas, pílulas, grânulos, drágeas, cápsulas, géis, xarope ou pasta. A preparação das formulações de uma composição imunogênica desejada está geralmente descrita em Vaccine 4th Edition by Stanley A Plotkin et al., W.B. Saunders Company; 4th edition 2003. Formulações adequadas também estão descritas em, por ex., A. Gennaro (2000) "Remington: The Science and Practice of Pharmacy," 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H.C. Ansel et al., eds., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; and Handbook of Pharmaceutical Exeipients (2000) A.H. Kibbe et al., eds., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.; Methods in Molecular Medicine, Vol. 87: Vaccine Protocols, 2nd edition (2003), Humana Press; Mucosal Vaccines (1996), Kiyono et al., eds., Academic Press; and Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (2000) D.T. O'Hagan, Humana Press.

Uma composição imunogênica individual pode ser microencapsulada, encocleada, revestida em pilhas microscópicas de ouro, contidas em lipossomos, aerossóis nebulizados, pellets para implantação na pele, ou seca em um objeto pontudo (por ex., uma agulha) para ser raspado na pele.

Em uma outra configuração, a substância imunogênica individual pode ser aplicada individualmente ou em conjunto com um sistema de dispersão. Em algumas configurações, o sistema de dispersão é selecionado do grupo que consiste de, por exemplo: complexos macromoleculares, nanocápsulas, microesferas, contas e sistemas baseados em lipídeos. Os sistemas baseados em lipídeos incluem, opcionalmente, emulsões óleo em água, micelas, micelas mistas ou lipossomos.

Em certas configurações, uma composição imunogênica individual compreendendo o adjuvante PIKA está sob a forma de uma solução farmaceuticamente aceitável, que pode conter rotineiramente concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sal, agentes tampão, preservativos, veículos compatíveis, adjuvantes e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos. A composição pode conter aditivos, por exemplo: desintegrantes, ligantes, agentes de revestimento, agentes de expansão, lubrificantes, saborizantes, adoçantes ou solubilizadores e similares.

Em certas configurações, uma composição imunogênica individual compreendendo o adjuvante PIKA é administrada em sua forma original ou sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

A composição imunogênica da presente invenção pode ser empregada sob essas formas, tanto estéreis como não estéreis, como cápsulas, soluções líquidas, gotas líquidas, emulsões, suspensões, elixires, cremes, supositórios, géis, cápsulas moles, sprays, inalantes, aerossóis, pós, comprimidos, comprimidos revestidos, pastilhas, microcápsulas, supositórios, drágeas, xaropes, pastas, grânulos, enemas ou pílulas. Pode ser usado qualquer veículo inerte, como uma composição salina ou composição salina tamponada de fosfato, estabilizadores, propelentes, envoltos em cápsulas de gelatina ou em uma microcápsula ou vetor que auxilia na administração ou qualquer veículo em que os compostos usados no método da presente invenção tiverem as adequadas propriedades de solubilidade para uso nos métodos da presente invenção.

Em certas configurações, a composição do adjuvante PIKA e uma composição imunogênica compreendendo o adjuvante PIKA e o composto antigênico são freeze-dried (Iiofilizados) para estabilidade e armazenagem de longo prazo em forma sólida. O método freeze-dried é conhecido pelos peritos na técnica.

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê uma composição adjuvante ou uma composição imunogênica em que a composição imunogênica, ou a composição adjuvante contida na composição imunogênica, está sob forma sólida ou líquida ou em solução ou em suspensão ou em emulsão.

Uma composição imunogênica individual pode ser administrada a um indivíduo por meio de um sistema de aplicação farmacêutico com relação à via de inalação (oral, intratraqueal, intranasal). Assim, uma composição imunogênica individual pode ser formulada sob forma adequada para administração por inalação. O sistema de aplicação farmacêutico é adequado para a terapia respiratória por administração tópica de uma composição bacteriana individual nos revestimentos da mucosa dos brônquios. Esta invenção pode usar um sistema que depende da potência de um gás comprimido para expelir as bactérias de um recipiente. Pode ser empregada uma embalagem aerossol ou pressurizada para tanto.

Como usado na presente, o termo "aerossol" é utilizado no sentido convencional, mencionando um líquido muito fino ou partículas sólidas transportadas por um gás propelente sob pressão até o local da aplicação terapêutica. Quando é empregado um aerossol farmacêutico nesta invenção, o aerossol contém a composição imunogênica, que pode ser dissolvida, suspensa ou emulsionada em uma mistura de um veículo fluido e um propelente. O aerossol pode estar sob a forma de uma solução, suspensão, emulsão, pó ou preparação semi-sólida. Os aerossóis empregados na presente invenção se destinam à administração como partículas finas, sólidas ou como névoas líquidas pelo trato respiratório de um indivíduo. São conhecidos vários tipos de propelentes que podem ser usados pelos técnicos no assunto. Os exemplos de propelentes adequados incluem, sem limitação, hidrocarbonetos ou outro gás adequado. No caso do aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada provendo um valor a administrar em quantidade mensurada.

Existem vários tipos de metodologias de inalação que podem ser empregadas em conexão com a presente invenção. Uma composição imunogênica individual pode ser formulada em basicamente três diferentes tipos de formulações para inalação. Primeiro, uma composição imunogênica individual pode ser formulada com propelentes com baixo ponto de fusão. Essas formulações são geralmente administradas por meio de inaladores convencionais com medidor de dose (MDIs). Entretanto, os MDIs convencionais podem ser modificados de maneira a aumentar a capacidade de obter dosagens repetidas, utilizando uma tecnologia que mede o volume de inspiração e a vazão do indivíduo como discutido nas U.S. Ns 5.404.871 e U.S. N2 5.542.410. Alternativamente, uma composição imunogênica individual pode ser formulada em soluções aquosas ou etanólicas e administradas por meio de nebulizadores convencionais. Em algumas configurações, essas formulações de soluções são aerossolizadas usando dispositivos e sistemas como os discutidos nas U.S. Na 5.497.763; U.S. Na 5.544.646; U.S. Ns 5.718.222; e U.S. N-5.660.166.

Além disso, pode ser formulada uma composição imunogênica individual em formulações de pó seco. Essas formulações podem ser administradas pela simples inalação da formulação de pó seco após ter sido criada uma névoa de aerossol do pó. A tecnologia para o transporte está descrita na U.S. Na 5.775.320 e U.S. Na 5.740.794. As formulações adequadas para a administração intranasal incluem sprays nasais, gotas nasais, formulações de aerossol e similares.

Em algumas configurações, é formulada uma composição imunogênica individual como liberação sustentada (por ex., uma formulação de liberação controlada). Por exemplo, em algumas configurações, é formulada uma composição imunogênica individual em pelets ou cilindros e implantada intramuscularmente ou subcutaneamente como injeções depot ou como implantes. Esses implantes geralmente empregam conhecidos materiais inertes como polímeros biodegradáveis. As formas depot injetáveis feitas por formação de matrizes microencapsulam de uma composição imunogênica individual em polímeros biodegradáveis como polilactídeo-poliglicolídeo. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis adequados incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Também são preparadas formulações injetáveis depot prendendo a composição em lipossomos ou microemulsões que sejam compatíveis com o tecido corporal. Os sistemas de liberação para aplicação também incluem os seguintes exemplos: sistemas baseados em polímeros, microcápsulas, lipídeos, sistemas de liberação hidrogel, sistemas silásticos, sistemas peptídeos, sistemas baseados em peptídeos, revestimentos de cera, tabletes comprimidos, implantes parcialmente fundidos. São conhecidas outras formas de liberação sustentada pelos técnicos no assunto.

Métodos

Em um aspecto de particular interesse, a invenção provê um método para a evocar e/ou ampliar a resposta imunológicas de um composto antigênico, compreendendo a administração ao hospedeiro de uma composição imunogênica individual. Em algumas configurações, o hospedeiro é humano. Em outras configurações, o hospedeiro é um animal não humano, por ex., um mamífero não humano, uma espécie aviária, etc.

Em certas configurações, a composição adjuvante polinucleotídico pode ser usada no contexto de uma vacina. Opcionalmente, a composição da vacina contém outros adjuvantes. As classes incluídas de vacinas são de doenças antiifecciosas, anticâncer, antialérgicas e doenças antiautoimunes.

Além disso, a presente invenção provê um método para ampliar as respostas imunes a um composto antigênico, pela administração a um hospedeiro de uma composição imunogênica individual. O hospedeiro pode ser um ser humano ou um animal não humano.

Em certas configurações, o adjuvante é administrado em conjunto com o antígeno. Em outras configurações, o adjuvante é administrado antes ou depois da administração do antígeno.

Uma composição imunogênica individual é, em algumas configurações, administrada de forma precursora por injeção, como por uma injeção intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea ou intradérmica. Em outras configurações, a composição imunogênica é administrada de forma intradérmica, de forma diferente de uma injeção, por exemplo, sem romper a barreira epitelial por meios mecânicos. Em outras configurações, a composição imunogênica é aplicada via retal, vaginal, nasal, oral (incluindo inalação), oftálmica, ocular, tópica, pulmonar ou transdérmica.

O indivíduo pode ser exposto ao antígeno por contato ambiental e, portanto com o risco de desenvolver, por exemplo, uma reação alérgica, uma doença infecciosa, uma doença autoimune ou um câncer. Em outras configurações, o indivíduo tem, por exemplo, uma doença infecciosa, uma doença autoimune, um câncer ou alergia como resultado de uma exposição anterior a um antígeno por contato ambiental.

Em certas configurações, quando um modo de administração da composição imunogênica compreendendo um adjuvante polinucleotídico é para o tratamento de tumores cancerígenos, o tratamento é feito por injeção diretamente no tumor ou adjacente ao tumor. Em algumas configurações, a composição imunogênica é aplicada de forma igual sobre ou internamente ao tumor, para aumentar a biodistribuição e, portanto ampliar o benefício terapêutico.

Para administração parenteral em uma solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser, preferivelmente tamponada, sendo o líquido diluente primeiramente tornado isotônico com suficiente soro salino e glicose. Essas soluções aquosas específicas são especialmente adequadas para administração intravenosa e intra-peritoneal. Com essa conexão, os meios aquosos estéreis que podem ser empregados serão aqueles conhecidos pelos peritos na técnica, à luz da presente revelação. O meio exemplar de injeção que pode ser usado na presente invenção inclui um tampão, com ou sem agentes de dispersão e/ou preservativos e óleo comestível, óleo mineral, óleo de fígado de bacalhau, esqualeno, mono-, di- ou triglicerídeo e uma mistura desses.

Uma composição imunogênica individual é administrada em uma "quantidade efetiva" que é uma quantidade de uma composição imunogênica individual que seja efetiva em uma via selecionada de administração para provocar, induzir ou ampliar uma resposta imunológica. Em algumas configurações, uma resposta imunológica é provocada nos antígenos produzidos por um microorganismo patogênico. Em algumas configurações, a quantidade de uma composição imunogênica individual é efetiva para limitar uma infecção e/ou para erradicar uma infecção e/ou reduzir um sintoma associado com a infecção por um organismo patogênico.

Por exemplo, em algumas configurações, a administração de uma composição imunogênica individual a um indivíduo é efetiva para tratar uma doença infecciosa, em que o tratamento da doença infecciosa inclui uma ou mais reduções do número de agentes patogênicos no indivíduo (por ex., reduzindo a carga viral, reduzindo a carga bacteriana, reduzindo o número de protozoários, reduzindo o número de helmintos) e/ou reduzindo um parâmetro associado com a doença infecciosa, incluindo, sem limitações, a redução do nível de um produto produzido pelo agente infeccioso (por ex., uma toxina, um antígeno e similares); e reduzindo uma resposta fisiológica indesejada do agente infeccioso (por ex., febre, edema tissular e similares).

A exata quantidade dessas composições que são necessárias varia de indivíduo para indivíduo, dependendo da espécie, idade, peso e condições gerais do indivíduo, da severidade da doença, infecção ou da condição que estiver sendo tratada ou prevenida, do composto usado em particular, de seu modo de administração e similares. Pode ser determinada uma quantidade adequada por um técnico no assunto, usando somente uma experimentação rotineira indicada nos ensinamentos da presente. Após uma administração inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.

Em algumas configurações, são administradas doses em série de uma composição imunogênica individual. Nessas configurações, a primeira dose de uma composição imunogênica individual pode ser o resultado da administração de uma vacina. A segunda dose de uma composição imunogênica individual é administrada a um indivíduo depois que o indivíduo tiver sido protegido imunologicamente pela exposição à primeira dose. O reforço pode ser administrado dias, semanas ou meses após a imunização inicial, dependendo da resposta e das condições do paciente. Por exemplo, a dose de reforço é administrada cerca de 2 dias a cerca de 12 meses após a dose inicial, por ex., de cerca de 2 dias a cerca de 7 dias, de cerca de 1 semana a cerca de 2 semanas, de cerca de 2 semanas a cerca de 4 semanas, de cerca de 4 semanas a cerca de 8 semanas, de cerca de 8 semanas a cerca de 6 meses, ou de cerca de 6 meses a cerca de 12 meses após a dose inicial. A presente invenção ainda contempla o uso de uma terceira, quarta, quinta, sexta ou subseqüentes imunizações de reforço, usando, por ex., terceira, quarta, quinta, sexta ou subseqüente dose.

Em certas configurações, os meios de administração podem compreender uma combinação de vias alternativas, por exemplo: a dose administrada sistemicamente (por ex., administração peritoneal, intra- muscular, subcutânea ou intradérmica) pode ser seguida por uma dose de aplicação mucosa (por ex. intranasal, inalação) ou vice versa.

Em certas configurações, o adjuvante polinucleotídico pode ser administrado com a primeira dose de antígeno administrado ou com qualquer das doses subseqüentes administradas ou em todas as doses administradas ao paciente. Pelo menos uma das doses administradas como parte do protocolo totál compreenderia um adjuvante PIKA.

Em certas configurações, a composição da composição imunogênica administrada pode variar entre a administração original e o reforço e/ou entre as doses de reforço. Como exemplo, a dose original administrada pode compreender uma vacina DNA, enquanto a dose de reforço está sob a forma de uma vacina de proteína recombinante. Pelo menos uma das doses administradas como parte do protocolo total compreenderia um adjuvante PIKA.

Se uma resposta de anticorpo a um antígeno tiver sido induzida ou ampliada em um indivíduo, esta será prontamente determinada usando ensaios padrão. Por exemplo, ensaios imunológicos como ensaios imünoabsorventes ligados enzimaticamente (ELISA), radioimunoensaios (RIA), ensaios de imunoprecipitação e ensaios com proteínas borrão (borrão "Ocidental") e ensaios de neutralização (por ex., neutralização de infectividade viral em um ensaio in vitro ou in vivo)\ podem ser usados para detectar a presença de um anticorpo específico de um antígeno microbiano em um fluido corporal ou em outra amostra biológica, por ex., no soro, secreção ou em outro fluido de um indivíduo.

Se uma resposta imunológica CD4 a um antígeno tiver sido induzida em um indivíduo, isto será prontamente determinado com o uso de ensaios padrão, por ex., pelo classificador de células ativadas por fluorescência (FACS) (ver, por ex., Waldrop et al. (1997) J. Clin. Invest. 99:1739-1750); ensaios de citoquinas intracelulares que detectam a produção 10 de citoquinas após a estimulação do antígeno (ver, por ex., Suni et al. (1998) J. Immunol Methods 212:89-98; Nomura et al. (2000) Cytometry 40:60-68; Ghanekar et al. (2001) Clin. Diagnostic Lab. Immunol. 8:628-631); ensaios de marcação MHC-peptide multimer staining, por ex., uso de multímeros peptídeos MHC Classe II solúveis rotulados de maneira detectável (por ex., rotulados por fluorescência) (ver, por ex., Bill and Kotzin (2002) Arthritis Res. 4:261-265; Altman et al. (1996) Science 274:94-96; and Murali-Krishna et ál. (1998) Immunity 8:177-187); ensaios imunospot de ligação enzimática (ELISPOT) (ver, por ex., Hutchings et al. (1989) J. Immunol. Methods 120:1- 8; and Czerkinsky et al. (1983) J. Immunol. Methods 65:109-121); e similares. Como um exemplo não limitador de um ensaio de citoquina intracelular, o sangue total é estimulado por um antígeno e por anticorpos co- estimulantes (por ex., anti-CD28, anti-CD49d) por 2 horas ou mais; é adicionado Brefeldin A para inibir a secreção de citoquinas; e as células são processadas por análise FACS, usando anticorpos marcados por fluorescência ao CD4 e às citoquinas, como TNF-a, IFN-γ e IL-2.

Se uma resposta CD8 antígeno-específica (por ex., célula T citotóxica; "CTL") é induzida em um antígeno (por ex., a um patógeno), isto pode ser determinado usando qualquer número de ensaios conhecidos na técnica, incluindo, sem limitações, a medição de Iise específica por CTL das células alvo que expressam o antígeno em sua superfície, células alvo que tiverem incorporado um rótulo detectável que é liberado das células alvo com a lise e que possa ser medido, usando, por ex., um ensaio de liberação de 51Cr; um ensaio de citolise baseado na fluorescência de lantanídeos; e similares.

Indivíduos adequados para o tratamento

Os indivíduos adequados para o tratamento com um método indicado para induzir uma resposta imunológica a um patógeno microbiano e os métodos para o tratamento ou para a prevenção de uma infecção por patógeno microbiano, incluem indivíduos que tiverem sido infectados por um microorganismo patogênico; indivíduos susceptíveis a infecções por microorganismos patogênicos, mas que ainda não tenham sido infectados; e indivíduos que estejam em risco de tornarem-se infectados por um microorganismo patogênico, mas que ainda não tenham sido infectados. Esses indivíduos incluem recém-nascidos, crianças, adolescentes e adultos.

Os indivíduos adequados para o tratamento pelo método indicado de indução de uma resposta imunológica a um patógeno microbiano, e os métodos para o tratamento ou para a limitação de uma infecção por um patógeno microbiano, incluem a população pediátrica alvo, por ex., indivíduos entre cerca de 1 ano de idade e cerca de 17 anos de idade, incluindo recém-nascidos (por ex., de cerca de 1 mês de idade cerca de 1 ano de idade); crianças (por ex., de cerca de 1 ano de idade a cerca de 12 anos de idade); e adolescentes (por ex., de cerca de 13 anos de idade a cerca de 17 anos de idade).

Os indivíduos adequados para o tratamento pelo método indicado de indução de uma resposta imunológica a um patógeno microbiano, e os métodos para o tratamento ou para a limitação de uma infecção por um patógeno microbiano, incluem os neonatos, por ex., um indivíduo (por ex., um neonato humano) de um dia de idade a cerca de 14 dias de idade, por ex., de cerca de 1 dia a cerca de 2 dias de idade, de cerca de dois dias a cerca de 10 dias de idade, ou de cerca de 10 dias a cerca de 14 dias de idade.

Em uma configuração particular, o indivíduo é uma criança com cerca de dez anos ou menos, por ex., cerca de cinco anos de idade ou menos, e as composições imunogênicas são administradas por qualquer um ou mais dos seguintes períodos: duas semanas, um mês, 2 meses, 3 meses, 4 meses, 5 meses, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses, 15 meses, 18 meses ou 21 meses após o nascimento, ou em 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos, 6 anos, 7 anos, 8 anos, 9 anos ou 10 anos de idade. Em algumas configurações, uma composição imunogênica individual é aplicada a um indivíduo com idade na faixa de cerca de 6 meses a cerca de 6 anos, em que o indivíduo recebe uma primeira dose com cerca de 6 meses de idade, e subseqüentes doses de reforço, por ex., 2-3 subseqüentes doses de reforço com, por ex., 2 anos de idade, 4 anos de idade e 6 anos de idade.

Em uma configuração particular, o indivíduo é um adulto com cerca de 17 anos de idade a 49 anos de idade. Em algumas configurações, o indivíduo é um adulto humano idoso de 50 a 65 anos de idade, 65 a 75 anos de idade, 75 a 85 anos de idade ou mais de 85 anos de idade.

Em algumas configurações, uma composição imunogênica individual é administrada a um indivíduo logo após o contato (por ex., logo depois de um contato confirmado ou suspeito) por uma fonte real ou potencial do patógeno microbiano, por exemplo, um indivíduo sabido como tendo ou suspeito de ter uma infecção por um patógeno microbiano. Por exemplo, em algumas configurações, uma composição imunogênica individual é administrada a um indivíduo em cerca de 1 hora, em cerca de 2 horas, em cerca de 5 horas, em cerca de 8 horas, em cerca de 12 horas, em cerca de 18 horas, em cerca de 24 horas, em cerca de 2 dias, em cerca de 4 dias, em cerca de 7 dias, em cerca de 2 semanas ou em cerca de um mês após o contato com um indivíduo sabido como tendo ou suspeito de ter uma infecção por um patógeno microbiano.

Em algumas configurações, uma composição imunogênica individual é administrada a um indivíduo sabido ou suspeito de ser o portador de um patógeno microbiano, estando ou não demonstrando os sintomas da infecção.

Os indivíduos adequados para o tratamento por um método indicado de indução de uma resposta imunológica a um patógeno microbiano, e os métodos de tratamento ou de limitação de uma infecção por um patógeno microbiano, incluem os indivíduos deficientes de células T CD4+ ("indivíduos deficientes de CD4+"), por ex., indivíduos que tiverem valores inferiores aos normais de linfócitos T CD4+ T funcionais. Como usado na presente, o termo "indivíduo normal" se refere a um indivíduo com níveis de linfócitos T CD4+ e função(ões) dentro da faixa normal da população, para humanos, tipicamente de 600 a 1500 linfócitos T CD4+ por mm3 de sangue. Os indivíduos CD4+-deficientes incluem indivíduos que tenham imunodeflciência adquirida, ou uma imunodefíciência primária. Uma imunodeflciência adquirida pode ser uma deficiência CD4+ temporária, como a causada por terapia de radiação ou quimioterapia.

Também adequado para o tratamento com os métodos da invenção são os indivíduos com sistemas imune saudáveis e intactos, mas que estejam em risco de se tornarem deficientes em CD4+ (indivíduos "em risco"). Os indivíduos em risco incluem, sem limitação, indivíduos que tiverem maior probabilidade que a população geral de se tornarem deficientes de CD4+. Indivíduos em risco de se tornarem deficientes de CD4+ incluem, sem limitação, indivíduos em risco de infecção HIV devido à atividade sexual com indivíduos infectados pelo HIV; usuários de drogas intravenosas; indivíduos que possam ter sido expostos ao sangue infectado pelo HIV, produtos derivados de sangue ou outros fluidos corporais contaminados pelo HIV; um neonato que tenha passado pelo canal de nascimento de um indivíduo infectado pelo HIV; crianças que estiverem sendo alimentadas por mães infectadas pelo HIV; e similares.

Os indivíduos adequados para o tratamento com o método em pauta para o tratamento do câncer incluem indivíduos que tiverem sido infectados por substâncias carcinogênicas, indivíduos que forem susceptíveis ao câncer, mas que ainda não tenham sido diagnosticados com a doença; e indivíduos que estiverem em risco de contrair câncer, mas que ainda não tenham sido diagnosticados com a doença. Os indivíduos adequados incluem recém-nascidos, crianças, adolescentes e adultos.

Os indivíduos adequados para o tratamento com o método em pauta para o tratamento do câncer incluem indivíduos que tiverem sido diagnosticados com câncer; indivíduos que tiverem sido tratados anteriormente de câncer, por ex., por quimioterapia ou radioterapia e que estiverem sendo monitorados com relação à recorrência do câncer do qual tenham sido tratados; e indivíduos que tiverem passado por transplante de medula óssea ou por qualquer outro transplante de órgão.

Os indivíduos adequados para o tratamento com as formulações e métodos da invenção da presente para o tratamento de alergia incluem qualquer indivíduo que tenha sido diagnosticado com alergia. Os indivíduos adequados para o tratamento usando os métodos e agentes ora descritos incluem os indivíduos conhecidos por terem hipersensibilidade alérgica a um ou mais alérgenos. Os indivíduos adequados para o tratamento incluem aqueles que apresentarem quaisquer dos distúrbios alérgicos supramencionados. Também são adequados para o tratamento os indivíduos em risco de apresentarem reações alérgicas a um ou mais alérgenos. Também adequados são os indivíduos que não tiveram sucesso com o tratamento com um ou mais terapias padrão para o tratamento de um distúrbio alérgico.

Os indivíduos adequados para o tratamento incluem indivíduos vivendo em nações industrializadas; indivíduos vivendo em países em desenvolvimento; indivíduos vivendo em áreas rurais; indivíduos vivendo em áreas relativamente isoladas; e similares.

A população alvo de uma composição imunogênica individual poderá variar, dependendo do patógeno microbiano. A revelação acima geralmente descreve a presente invenção. Os exemplos a seguir serão de assistência para o entendimento da presente invenção. Esses exemplos são somente descritos com objetivos de ilustração e não se destinam a limitar o escopo da invenção. São contempladas alterações de forma e substituição de equivalentes como as circunstâncias podem sugerir ou tornar expedientes. Apesar de os termos específicos terem sido empregados na presente, esses termos se destinam a ter um senso descritivo e não como objetivos de limitação.

EXEMPLOS

Exemplo 1: PIKA em combinação com uma variedade de antígenos induz uma resposta imunológica específica

Este exemplo envolve o uso de PIKA em combinação com uma variedade de antígenos para produzir uma resposta imunológica específica in vivo. A pesquisa foi feita em uma série de experimentos independentes com um protocolo comum, apesar de usar a cada vez um antígeno diferente. Os antígenos testados incluem: um antígeno de superfície de proteína recombinante da hepatite B tipo adw, uma vacina inativada fracionada da gripe (VAXIGRIP da Sanofi Pasteur), um antígeno peptídeo sintetizado do HIV, um antígeno da proteína recombinante do vírus do herpes simplex tipo 2 gD, antígeno da proteína recombinante protetora do antraz, vírus inteiro inativado do antígeno da gripe aviária da cepa H5N1 e um vírus inteiro inativado do antígeno inativado da Síndrome Respiratória Aguda Severa (SARS).

O protocolo do experimento individual envolve a inoculação de grupos de camundongos Balb/c, três camundongos por grupo, com composições somente de antígeno, antígeno com adjuvante PIKA (uma composição heterogênea de moléculas PIKA predominantemente dentro de uma distribuição de faixa de peso de cerca de 66kDa a 1.200kDa), PIKA somente, um controle compreendendo solução tampão de fosfato (PBS).

As quantidades de dosagem reais são fornecidas para cada antígeno usado. Os camundongos então recebem uma vacina idêntica de reforço entre dez a quatorze dias após a injeção inicial. É retirada uma amostra de sangue entre dez a quatorze dias depois da injeção de reforço, os camundongos são então sacrificados, sendo retiradas amostras de tecido do baço. Os resultados apresentados são a média dos resultados dos testes de um camundongo individual dentro de cada grupo.

Foi preparada uma suspensão de células do baço e uma amostra da suspensão celular de cada camundongo foi posta em 6-12 poços da placa ELISPOT e feita a cultura. Cada poço da placa ELISPOT continha 200ul de suspensão de esplenócitos, aproximadamente 2 x 10"5 a 1 x 10"6 células/poço (ver detalhes nas tabelas abaixo). Para cada amostra de esplenócitos em cultura de cada camundongo, metade dos poços contendo os esplenócitos foi incubada em meio de cultura e a outra metade dos poços foi estimulada usando uma das duas diferentes concentrações de um antígeno em particular em avaliação. As placas foram incubadas a 37°C por 20 horas em condições ambientalmente controladas antes da preparação final e sendo feita a leitura usando uma leitora de placa

ELISPOT padrão.

Foram usados os testes ELISPOT padrão, conhecidos pelos técnicos no assunto, para detectar o número de células produzindo as citoquinas IL-4, IL-2 e INF-γ.

Foi usada análise de Citometria de Fluxo para detector o INF-γ produzido pelas células T CD4+. O uso do Classificador de Células Ativadas por Fluorescência (FACS) é bem conhecido pelos técnicos no assunto. Em breve, foram preparadas soluções de esplenócitos em uma concentração de 2,5 x 10"6 células/ml e divididas em tubos individuais com 2ml por amostra. As amostras estimuladas com antígeno foram então preparadas e depois da incubação a 37° C em condições ambientalmente controladas por 5 horas. As amostras foram então lavadas e tingidas antes da leitura em uma leitora FACS padrão. Os testes padrão ELISA conhecidos pelos peritos na técnica foram usados para detectar o título de anticorpos específicos no soro sangüíneo retirado do animal antes do sacrifício.

Exemplo 1.1: Antigeno de Superfície Recombinante da Hepatite B (HBsAg) adw

Os resultados na tabela 6 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença do número de células produzindo INF-γ, IL-2 e IL-4 usando um antígeno de superfície da proteína recombinante da hepatite B (HBsAg) tipo adw. Os dados da tabela 6 (ver também Figuras 1, 2 e 3) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spots, isto é, uma medida direta do número de células produzindo citoquinas.

O aumento distinto no número de células formadoras de spots com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno de superfície recombinante da hepatite B aumenta a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células do baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral mediada como celular mediada induzida pela presença do adjuvante PIKA.

tabela 6

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Estimulação com HBsAg 2,0ug/ml Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot.

Os resultados do teste ELISA na amostra de sangue tomada antes do sacrifício (Tabela 7 abaixo e Figura 4) demonstram que a presença de PIKA aumenta significativamente a resposta imunológica e medida pelo título dos anticorpos específicos detectados no soro.

TABELA 7 Detecção ELISA de títulos IgG específicos de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg adw. <table>table see original document page 74</column></row><table>

A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA aumenta a resposta imunológica total ao HBsAg, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa, e mais especificamente da resposta imunológica com tendência Thl predominante e promover a resposta imunológica celular mediada.

Exemplo 1.2: VAXIGRIP (Sanofi Pasteur), antígeno da gripe inativado e purificado compreendendo; Cepas similares a HIN1, H3N2 e cepa b/Shanghai5/361/2002.

Os resultados da tabela 8 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença do número de células produzindo INF- γ, IL-2 e IL-4 usando a vacina VAXIGRIP, uma vacina inativada fracionada da gripe humana produzida pela Sanofi Pasteur. Os dados da tabela 8 (ver também Figuras 5, 6 e 7) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spot, isto é, uma medida direta da produção de citoquinas.

O aumento distinto do número de células formadoras de spot com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno da gripe amplia a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células de baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral como celular mediada induzidas pela presença do adjuvante PIKA.

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Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot.

Os resultados do teste ELISA na amostra de sangue tomada antes sacrifício (Tabela 9 abaixo e Figura 8) demonstram que a presença de PIKA amplia significativamente a resposta imunológica, sendo medidos pelo título dos anticorpos específicos detectados no soro.

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A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA aumenta a resposta imunológica total ao antígeno da gripe, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa, e mais especificamente da resposta imunológica celular mediada.

A VAXIGRIP é uma vacina aprovada da gripe reconhecida como reduzindo significativamente o risco de contrair a gripe. A adição do PIKA aumenta o nível das citoquinas produzidas, indicando assim que a vacina compreendendo VAXIGRIP e PIKA também produz uma resposta imunológica que reduz significativamente o risco de contrair a gripe. Exemplo 1.3: Antígeno do Peptídeo HIV Sintetizado Os resultados da tabela 10 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença do número de células produzindo INF-γ, IL-2 e IL-4 usando um antígeno do peptídeo HIV. Os dados da tabela 10 (ver também Figuras 9, IOe 11) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spots, isto é, uma medida direta da produção de citoquinas.

O aumento distinto do número de células formadoras de spot com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno HIV amplia a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células de baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral como celular mediada induzida pela presença do adjuvante PIKA.

TABELA 10

Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo citoquinas após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou Antígeno HIV gp 120.

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Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot. Os resultados da análise FACS estão apresentados na tabela 11 abaixo (ver também a Figura 12). A presença das células T CD4+ que expressam INF-γ somente nas formulações contendo tanto antígeno PIKA como HIV confirma a observação de que a resposta imunológica adaptativa atingiu o estágio de maturidade e que o PIKA foi instrumental neste processo.

TABELA 11

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A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno HIV aumenta a resposta imunológica total, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa, e mais especificamente da resposta imunológica celular mediada.

Exemplo 1.4: Antígeno Protetor Recombinante do Antraz (rPA) do Bacillus Anthracis

Os resultados da tabela 12 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença de INF-γ, IL-2 e IL-4 usando um antraz recombinante. Os dados da tabela 12 (ver também Figuras 13, 14 e 15) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spots, isto é, uma medida direta da produção de citoquinas.

O aumento distinto do número de células formadoras de spot com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno do antraz amplia a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células de baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral como celular mediada induzida pela presença do adjuvante PIKA.

TABELA 12 Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo citoquinas após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz. rPA.

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Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot.

Os resultados da análise FACS estão apresentados na tabela 13 abaixo (ver também a Figura 16). A presença de células T CD4+ expressando INF-γ somente nas formulações contendo tanto o antígeno PIKA e rPA confirma a observação de que a resposta imunológica adaptativa alcançou um estágio de maturidade e que o PIKA foi instrumental neste processo.

TABELA 13 Análise FACS de esplenócitos murídeos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno do antraz rPA.

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Os resultados do teste ELISA na amostra de sangue tomada anteriormente ao sacrifício (Tabela 14 abaixo e Figuras 16 e 17) demonstram que a presença de PIKA aumenta significativamente a resposta imunológica como medida pelo título dos anticorpos específicos detectados no soro. Foi observado um resultado consistente 16 semanas após a vacinação inicial, quando as amostras do sangue dos camundongos dos grupos originais AeB foram avaliadas com relação à presença de anticorpos específicos usando um teste ELISA padrão. Novamente, a presença de PIKA no antígeno do antraz induziu resposta imunológica significativamente maior como medida pelo título do anticorpo específico no soro.

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A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA aumenta a resposta imunológica total ao rPA, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa e mais especificamente da resposta imunológica celular mediada.

Exemplo 1.5: Antígeno Recombinante do Vírus do Herpes Simplex 2 gD

Os resultados da tabela 15 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença de INF-γ, IL-2 e IL-4 usando um antígeno recombinante do vírus do herpes simplex. Os dados da tabela 15 (ver também Figuras 19, 20 e 21) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spots, isto é, uma medida direta da produção de citoquinas.

O aumento distinto do número de células formadoras de spot com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno do vírus do herpes simplex amplia a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células de baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral como celular mediada induzida pela presença do adjuvante PIKA.

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Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot.

Os resultados da análise FACS estão apresentados na tabela 16 abaixo (ver também a Figura 22). A presença de células T CD4+ expressando INF-γ somente nas formulações contendo tanto o antígeno PIKA e HSV confirma a observação de que a resposta imunológica adaptativa alcançou um estágio de maturidade e que o PIKA foi instrumental neste processo.

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Os resultados do teste ELISA na amostra de sangue tomada anteriormente ao sacrifício (Tabela 17 abaixo e Figura 23) demonstram que a presença de PIKA aumenta significativamente a resposta imunológica como medida pelo título dos anticorpos específicos detectados no soro.

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A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA aumenta a resposta imunológica total ao antígeno HSV, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa e mais especificamente da resposta imunológica celular mediada.

Exemplo 1.6: Antígeno do vírus inteiro H5N1 inativado (Gripe aviaria).

Os resultados da tabela 18 abaixo são os resultados do teste ELISPOT para a detecção da presença de INF-γ, IL-2 e IL-4 usando um antígeno H5N1 inativado não purificado. Os dados da tabela 18 (ver também Figuras 24, 25 e 26) representam a leitura ELISPOT, o número de células formadoras de spots, isto é, uma medida direta da produção de citoquinas.

O aumento distinto do número de células formadoras de spot com a adição do adjuvante PIKA (quando comparado com o antígeno individualmente) demonstra que a adição do adjuvante PIKA ao antígeno H5N1 amplia a expressão das citoquinas INF-γ, IL-2 e IL-4 pelas células de baço em cultura. A expressão observada das citoquinas indica uma resposta imunológica adaptativa ampliada tanto da imunidade humoral como celular mediada induzida pela presença do adjuvante PIKA.

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Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot. Os resultados da análise FACS estão apresentados na tabela 19 abaixo (ver também a Figura 27). A presença de células T CD4+ expressando INF-γ somente nas formulações contendo tanto o antígeno PIKA e H5N1 confirma a observação de que a resposta imunológica adaptativa alcançou um estágio de maturidade e que o PIKA foi instrumental neste processo.

TABELA 19

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Os resultados do teste ELISA na amostra de sangue tomada anteriormente ao sacrifício (Tabela 20 abaixo e Figura 28) demonstram que a presença de PIKA aumenta significativamente a resposta imunológica como medida pelo título dos anticorpos específicos detectados no soro.

TABELA 20 <table>table see original document page 82</column></row><table>

A conclusão obtida é que a adição do adjuvante PIKA aumenta a resposta imunológica total ao antígeno H5N1, em particular, da resposta imunológica específica, mais particularmente da imunidade adaptativa e mais especificamente da resposta imunológica celular mediada.

Exemplo 2: Antígeno do vírus inteiro SARS inativado

O objetivo deste experimento é demonstrar que a adição de PIKA ao antígeno da SARS amplia a resposta imunológica e estimula o sistema imunológico do hospedeiro para produzir anticorpos específicos protetores da SARS.

Neste programa de pesquisas, foram inoculados seis grupos, cada qual compreendendo 4 camundongos Balb/c (injeção peritoneal) com uma combinação de antígeno da SARS, o antígeno mais PIKA (uma composição heterogênea de moléculas PIKA predominantemente dentro de uma faixa de peso de 66kDa a 1.200kDa), PIKA individual ou um controle, ver tabela 21 abaixo (ver também a Figura 29).

Cada grupo recebeu doses idênticas no dia 0, dia 14 e dia 28. Na semana seis, foi colhida uma amostra de sangue, sendo o soro testado com relação à presença de IgG, sendo uma medida da presença de anticorpos específicos da doença. O soro sangüíneo foi diluído em um fator de 16.000 vezes, e depois foi medida a presença de IgG usando uma leitora ELISA, sendo o procedimento familiar aos técnicos no assunto. A vazão sendo uma leitura da densidade ótica (O.D.), onde quanto maior o valor, maior a presença de IgG.

O resultado médio de cada grupo, apresentado na tabela 21, demonstra uma correlação entre a presença do adjuvante PIKA adjuvante e um aumento da expressão de IgG.

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A conclusão obtida é que a adição de PIKA no antígeno da SARS aumenta a expressão de IgG de maneira dose dependente, aumentando assim a resposta imunológica do hospedeiro.

Exemplo 3: A Vacina PIKA Provê Proteção Imune Contra a Infecção pelo H5N1 e H9N2. O objetivo deste experimento é demonstrar que a vacina da gripe aviária compreendendo o adjuvante PIKA pode proteger os frangos contra a infecção pelo vírus vivo da gripe aviária.

A pesquisa foi feita com dois grupos de frangos 24 SPF. Com dez dias de idade, as aves foram inoculadas por via subcutânea no pescoço com uma dose de 700ul da vacina, compreendendo PIKA (uma composição heterogênea de moléculas de PIKA, predominantemente dentro da faixa de peso de 66kDa a 660kDa) e duas cepas de gripe aviária (H5N1 e H9N2). A composição incluiu antígeno e adjuvante PIKA em uma taxa de aproximadamente 2:1 de antígeno para o adjuvante PIKA.

Foram colhidas amostras de sangue sob as asas em 7, 14 e 21 dias. O soro sangüíneo de cada frango foi testado com relação à presença de anticorpos específicos H5 e H9.

Em 21 dias, as aves foram desafiadas com o vírus vivo H5N1 e observadas por mais 14 dias. Foi registrada a taxa de sobrevivência das aves depois de 14 dias de exposição ao vírus vivo H5N1.

O resultado médio de cada grupo (Tabela 22, ver também as Figuras 30 e 31) demonstra que a presença de PIKA induz a produção de anticorpos de antígeno específico.

Tabela 22 - Detecção ELISA de títulos de anticorpo específico do soro de frangos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou antígeno H5N1 e H9N2 inativados.

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Unidades: Leitura da densidade ótica da análise ELISA.

Dos 24 frangos que foram vacinados com a composição antígeno/PIKA, 21 (83%) sobreviveram por 14 dias após a exposição ao vírus H5N1 vivo. No grupo de controle de 24 frangos que não receberam vacina, mas que também estiveram expostos ao vírus H5N1 vivo, somente 4 (17%) estavam vivos após 14 dias.

A conclusão obtida é que a vacina PIKA confere um nível significativo de proteção imune contra o vírus H5N1.

Exemplo 4: A Vacina PIKA Provê Proteção Imune Contra a Infecção da Raiva.

O objetivo deste experimento é demonstrar que a vacina da raiva compreendendo o adjuvante PIKA pode proteger contra a infecção da raiva.

Tabela 22 - Detecção ELISA dos títulos de anticorpo específico do soro de frangos após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/oü antígeno do H5N1 e H9N2 inativados.

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Unidades: Leitura da densidade ótica da análise ELISA

A conclusão obtida é que a vacina PIKA confere um nível =significativo de proteção imune contra o vírus H5N1. Exemplo 4: A Vacina PIKA Provê Proteção Imune Contra a Infecção da Raiva.

Quatro grupos (denominados i, ii, iii e iv) de 20 camundongos Balb/c SPF Kunming foram desafiados com IOOul da cepa do vírus selvagem da raiva CQ92. Cada grupo recebeu inoculações de diferentes tipos de vacinas; i) uma composição de PIKA (uma composição heterogênea de moléculas de PIKA, predominantemente dentro da faixa de peso de 66kDa to 660kDa) e de um antígeno inativado da raiva de células de rim purificadas de criceto em uma proporção de 1:4 em volume, ii) vacina Sanofi-Aventis1 Veroab vero da raiva com células inativadas iii) a vacina da raiva produzida em cultura de rins de criceto inativada purificada com o adjuvante alum e iv) solução de controle de tampão fosfato. A dose de 60ul de vacina foi administrada entre 30 a 40 minutos, 3 dias, 6 dias e 9 dias após a infecção por injeção subcutânea na coxa.

A taxa de sobrevivência de cada um dos grupos está apresentada na tabela 23. (ver também a Figura 32).

TABELA 23 Taxas de sobrevivência de camundongos expostos ao vírus da raiva selvagem e subseqüente tratamento com a vacina da raiva.

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A conclusão obtida é que a presença de PIKA aumenta significativamente a proteção imune provida pelo antígeno inativado da raiva de células de rim purificadas de criceto.

Exemplo 5: A Vacina PIKA da Hepatite B Induz a Produção de 86/91

Anticorpos Específicos no Soro.

O protocolo do experimento envolveu a vacinação por injeção subcutânea de três grupos de camundongos Balb/c (três camundongos por grupo) com composições de, grupo A, 4ug do antígeno de superfície da 5 hepatite B adw individualmente, grupo B, 4ug do antígeno com 75ug de adjuvante PIKA (uma composição heterogênea de moléculas PIKA predominantemente dentro de uma distribuição de pesos entre 66kDa e 1.200kDa) e grupo C, 100ug de PIKA individualmente.

Os camundongos receberam então uma vacina de reforço idêntica por injeção subcutânea, de dez a quatorze dias após a injeção inicial. Foi colhida uma amostra de sangue de dez a quatorze dias após a injeção de reforço e testada com relação ao título de anticorpo específico usando um teste ELISA padrão conhecido pelos técnicos no assunto.

Os resultados médios de cada grupo apresentados na tabela 24 abaixo (e Figura 33) demonstram que a presença de PIKA amplia a resposta imunológica ao antígeno da hepatite B quando medida pelo título dos anticorpos específicos observados na amostra sérica.

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A conclusão obtida é que uma substância imunogênica compreendendo o PIKA e um antígeno da hepatite B induz a produção de uma significativa resposta imunológica quando medida pelo título dos anticorpos específicos no soro sangüíneo.

Exemplo 6: A Vacina PIKA da Gripe Induz a Produção de Anticorpos Específicos no Soro. O protocolo do experimento envolveu a vacinação por injeção subcutânea de dois grupos de camundongos Balb/c (três camundongos por grupo) com composições de, grupo A, 4ug da vacina da gripe da Sanofi VAXIGRIP individualmente, e grupo B, 4ug do antígeno com 100ug de adjuvante PIKA (uma composição heterogênea de moléculas PIKA predominantemente dentro de uma distribuição de pesos entre 66kDa e 1.200kDa).

Os camundongos receberam então uma vacina de reforço idêntica por injeção subcutânea, vinte dias após a injeção inicial. Foi colhida uma amostra de sangue no Dia 35 após a vacinação inicial e testada com relação ao título de anticorpo específico usando um teste ELISA padrão conhecido pelos técnicos no assunto.

Os resultados médios de cada grupo apresentados na tabela 25 abaixo (e Figura 34) demonstram que a presença de PIKA amplia a resposta imunológica aos antígenos da vacina da gripe quando medida pelo título dos anticorpos específicos observados na amostra sérica.

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A conclusão obtida deste exemplo é que uma substância imunogênica compreendendo o PIKA e um antígeno da gripe induz a produção de uma significativa resposta imunológica quando medida pelo título dos anticorpos específicos no soro sangüíneo.

Exemplo 7: A vacina PIKA da Hepatite B (antígeno de superfície tipo adw) Induz uma Resposta Terapêutica Imune.

O protocolo do experimento envolve a inoculação de grupos de 4 camundongos Balb/c com 6 a 10 semanas de idade com composições de um HBsAg tipo adw disponível comercialmente com e sem o adjuvante PIKA (uma composição heterogênea de moléculas PIKA predominantemente dentro de uma distribuição de pesos entre 66kDa e 1.200kDa), de PIKA individualmente e um controle compreendendo uma solução tampão de fosfato (PBS).

Os camundongos receberam uma injeção inicial subcutânea em ambos os lados da parte posterior, IOOul de cada lado. As quantidades reais de dosagem são fornecidas nas tabelas de resultados abaixo. Os camundongos receberam então uma vacina de reforço idêntica vinte dias depois da injeção inicial. No dia quarenta e dois, foi colhida uma amostra de sangue, os camundongos foram então sacrificados e foram retiradas amostras de tecido do baço para testes.

Foram feitos ensaios ELISPOT para enumerar as células T secretoras de interferon-γ específico do antígeno. Foi estimulada uma amostra de esplenócitos de cada camundongo ex-vivo tanto com o peptídeo epítopo das células T CD8 de HBsAg (IPQSLDSWWTSL) em uma concentração de 5ug/ml para medir a presença de células CD8+ específicas de IPQSLDSWWTSL.

Foi reestimulada uma segunda amostra de esplenócitos ex-vivo por seis dias com 2ug/ml do peptídeo HBsAg IPQSLDSWWTSL. Um ensaio ELISPOT, usando 5ug/ml do peptídeo HBsAg IPQSLDSWWTSL como estimulante ex-vivo foi realizado para detectar o interferon-γ. Este ensaio foi feito para identificar e avaliar a memória central da resposta celular após a imunização.

Foi usado um ensaio ELISA para medir a presença de anticorpos específicos do antígeno HBV no soro, especificamente os anticorpos IgGl e IgG2a. Placas Nunc Immunoplate Maxisorp foram cobertas por uma noite a 4 graus Celsius com HBsAg (6ug/ml em PBS/0,01% Tween 20). As placas foram lavadas com PBS/Tween e bloqueadas por 2 horas com 5% FCS em PBS. Após lavagem, foram adicionadas diluições séricas PBS/Tween por 2 horas. Após lavagem, foi adicionada uma diluição de anticorpo monoclonal IgGl anti-camundongo de rato biotina conjugado 1/3000 ou uma diluição de anticorpo monoclonal IgG2 anti-camundongo de rato biotina conjugado 1/1500. Após lavagem, foi adicionada estreptavidina HRP (diluição 1/10.000 em PBS/Tween) por 1 hora. Após lavagem, o substrato ABTS foi adicionado com peróxido de hidrogênio (1000:1) por 20 minutos. A densidade ótica (OD) foi então medida em 405nm e os resultados apresentados são médios para cada grupo.

A resposta IgGl dos camundongos imunizados com HBsAg formulado com o adjuvante PIKA foi aproximadamente 5 vezes maior que a resposta dos camundongos imunizados somente com HBsAg. O título de IgGl aumentou de maneira dose dependente (Tabela 26 Figura 35).

TABELA 26

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Unidade: Valor de densidade ótica média.

A resposta IgG2a dos camundongos imunizados com HBsAg formulado com o adjuvante PIKA foi significativamente maior que a resposta dos camundongos imunizados somente com HBsAg. O título de IgG2a aumentou de maneira dose dependente, indicativo de uma maior resposta imunológica com tendência Thl (Tabela 27 Figura 36). TABELA 27 Detecção ELISA de títulos IgG2a específicos de soro murídeo após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg.

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Unidade: Valor de densidade ótica média.

O ensaio ELISPOT da estimulação do peptídeo epítopo CD8 específico ex-vivo mostrou uma resposta não detectável para os camundongos imunizados somente com HBsAg. Em contraste, as células expressando o interferon-γ foram prontamente detectadas após a imunização com HBsAg formulado com PIKA de maneira dose dependente, indicando que o PIKA amplia a resposta terapêutica imune (Tabela 28 Figura 37).

TABELA 28 Detecção ELISPOT de esplenócitos murídeos produzindo interferon-γ após a imunização com vacinas compreendendo PIKA e/ou HBsAg. <table>table see original document page 91</column></row><table>

Unidade: Células de esplenócitos formadoras de spot. Além disso, o ensaio ELISPOT realizado após o cultivo dos esplenócitos por seis dias demonstrou que o número de esplenócitos produzindo interferon-γ de camundongos vacinados com formulações compreendendo HBsAg e o adjuvante PIKA foi o dobro do número de esplenócitos produzidos pelos camundongos que receberam somente o HBsAg. Os resultados confirmam que a presença de PIKA aumenta a ativação das células de memória central (Tabela 28 Figura 38).

Claims

1. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno; caracterizada pelo fato de que a composição é formulada para liberação sustentada.

2. Composição imunogênica que consiste em: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno viral; caracterizada pelo fato de ser o antígeno de adeniviridae, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, cliciviridae, flaviviridae, vírus da hepatite delta, hepeviridae, herpesviridae, mononegavirales, nidovirales, piconaviridae, orthomyxoviridae, papillomaviridae, parvoviridae, polyomaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae ou togaviridae.

3. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno bacteriano caracterizado pelo fato de que o antígeno é de actinobacteria, chlamydiae, firmicutes, proteobacteria ou spirochaetes.

4. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno fungico caracterizado pelo fato de que o antígeno é um antígeno de ascomycota ou basidiomycota.

5. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno parasítico caracterizado pelo fato de que o antígeno é de phylum sarcomastigophora, phylum apiicomplexa, phylum ciliophora, phylum plathyhelminthes, phylum nematoda ou phylum arthropoda.

6. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) pelo menos um antígeno de câncer caracterizado pelo fato de que o antígeno é de câncer dos ossos, cérebro, mama, digestivo/gastrointestinal, endócrino, ocular, genitourinário, de células germinativas, ginecológico, da cabeça e pescoço, hematológico/sanguíneo, pulmão, musculoesquelético, neurológico, respiratório/torácico ou da pele.

7. Composição imunogênica compreendendo: (a) um adjuvante polinucleotídico compreendendo: um ácido polirriboinosínico- polirribocitidílico (PIC), pelo menos um antibiótico, e pelo menos um íon positivo; e (b) uma combinação de dois ou mais antígenos, caracterizado pelo fato de que os antígenos são de adeniviridae, arenaviridae, astroviridae, bunyaviridae, cliciviridae, flaviviridae, vírus da hepatite delta, hepeviridae, mononegavirales, nidovirales, piconaviridae, orthomyxoviridae, papillomaviridae, parvoviridae, polyomaviridae, poxviridae, reoviridae, retroviridae, togaviridae, actinobacteria, chlamydiae, firmicutes, proteobacteria ou spirochaetes, ascomycotaor basidiomycota, phylum sarcomastigophora, phylum apiicomplexa, phylum ciliophora, phylum plathyhelminthes, phylum nematoda e/ou phylum arthropoda.

8. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a composição compreende moléculas de composição adjuvante polinucleotídico heterogêneas em peso molecular, onde o peso molecular é pelo menos 66.000 Daltons.

9. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a -8, caracterizada pelo fato de que a composição compreende moléculas de composição adjuvante polinucleotídico heterogêneas em peso molecular, caracterizado pelo fato de que o peso molecular é de cerca de 66.000 a 1.200.000 Daltons.

10. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a composição compreende moléculas de composição adjuvante polinucleotídico heterogêneas em peso molecular, caracterizado pelo fato de que o peso molecular é de pelo menos 150.000 Daltons.

11. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, ainda compreendendo pelo menos um imunomodulador.

12. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que o antígeno é um microorganismo inativado, microorganismo atenuado, polipeptídeo recombinante e/ou polipeptídeo sintético.

13. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que a composição imunogênica ou o adjuvante PIKA contido na composição imunogênica, está sob a forma de um líquido, solução líquida, gotas líquidas, um sólido, cápsulas, emulsões, suspensões, elixires, cremes, supositórios, géis, cápsulas moles, sprays, inalantes, aerossóis, comprimidos, comprimidos revestidos, microcápsulas, supositórios, drágeas, xaropes, pastas, enemas, grânulos, pós, tabletes ou pastilhas.

14. Composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma composição adjuvante ou composição imunogênica é liofilizada.

15. Kit compreendendo a composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14.

16. Método para ampliar uma resposta imunológica em um hospedeiro a um antígeno, o método compreendendo a administração ao hospedeiro da composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro tem uma doença infecciosa e a referida administração do composto antigênico produz uma resposta imunológica contra o patógeno que causa a doença infecciosa.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a referida administração é feita por injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, injeção subcutânea, aplicação tópica, aplicação transdérmica ou aplicação intradérmica.

19. Uso da composição imunogênica de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 14 para a preparação de um medicamento para a ampliação da resposta imunológica de um hospedeiro ao antígeno.

20. Uso da reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro tem uma doença infecciosa e a administração do antígeno ao hospedeiro produz uma resposta imunológica contra o patógeno que causa a doença infecciosa.

21. Uso da reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a administração é por injeção parenteral, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, injeção intravenosa, injeção subcutânea, aplicação tópica, aplicação transdérmica ou aplicação intradérmica.

22. Método de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 18, e o uso de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é humano.

23. Método de acordo com qualquer das reivindicações 16 a 18, e o uso de acordo com qualquer das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que o hospedeiro é um animal não humano.