BRPI0621509A2 - modulação da atividade de fosforil transferase de glutamina sintetase - Google Patents

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Abstract

MODULAçãO DA ATIVIDADE DE FOSFORIL TRANSFERASE DE GLUTAMINA SINTETASE. A presente invenção refere-se a métodos de triar e projetar compostos como inibidores de glutamina sintetase, que incluiem glutamina sintetase adenililada, são fornecidos aqui. Compostos e composições úteis para o tratamento, prevenção, e/ou melhora de infecções bacterianas, incluindo Mycobacterium tuberculosis, são também fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MODULA- ÇÃO DA ATIVIDADE DE FOSFORIL TRANSFERASE DE GLUTAMINA SINTET ASE".
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a materiais e métodos para modu- lar atividade de fosforil transferase enzimática, incluindo atividade de fosforil transferase mediada por meio de um intermediário de carboxifosfato. Por exemplo, materiais e métodos para modular atividade de glutamina sinteta- se, incluindo materiais e métodos para modular um sítio de fosforil transfera- se de glutamina sintetase adenililada, são fornecidos.
Antecedentes
A enzima glutamina sintetase (GS, EC 6.3.1.2) é uma enzima central envolvida no metabolismo de nitrogênio e catalisa a conversão rever- sível de L-glutamato, ATP e amônia em L-glutamina, ADP1 e fosfato inorgâni- co. A reação é mediada por meio de um intermediário de fosfato de γ- glutamila. Três formas distintas de glutamina sintetase ocorrem: GSI1 GSII, e GSIII. A forma de GSI é encontrada apenas em bactérias (eubactérias) e archaea (archaebactérias). GSII ocorre em eucariotos e certas bactérias do solo, enquanto genes de GSIII foram encontrados apenas em algumas es- pécies bacterianas.
Há duas subdivisões de GSI significativas: GSI-α e GSI-β. Os genes de GSI-a são encontrados em bactérias termofílicas, bactérias gram- positivas de G+C baixo, e Euryarchaeota (incluindo metanógenos, halófilos e alguns termófilos), enquanto os genes de GSI-β são encontrados em todas as outras bactérias. A enzima de GSI-β e regulada por meio de uma cascata de adenililação/desadenililação, e também contém uma seqüência de inser- ção de 25 aminoácidos que não ocorre na forma GSI-α. Bactérias tendo um gene de GSI-β incluem Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea- e, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Acti- nomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor. Bactérias que tem o gene de GSI-α incluem Bacillus eereus, Bacillus subtilis, Bacillus anthraeis, Streptoeoceus pneumoniae, Streptoeoceus pyogenes, Staphyloeoeeus aereus, Clostridium botulinum, Clostridium tetani e Clostridi- um perfringens.
Em E. coli e outras bactérias que têm o gene de GSI-β, a ativi- dade de GS é regulada através de adenililação de entre 1 e 12 subunidades de GS. O sítio de adenililação (equivalente a Tyr397 em E. eoli) parece ser altamente conservado em todas as bactérias procarióticas, enquanto a ex- tensão de adenililação é uma função da disponibilidade de fonte de energia de nitrogênio e carbono nos meios de cultura. Glutamina sintetase com 10 a 12 subunidades adenililadas ocorre em células crescidas na presença de um excesso de nitrogênio e limitação de carbono. A adenililação de GS também altera a especificidade da enzima para íon de metal divalente de Mg2+ para Mn2+.
Dada a devastação social e econômica das infecções bacteria- nas tanto no mundo desenvolvido como subdesenvolvido, e o avanço alar- mante em cepas de bactérias resistentes a antibióticos, seria útil ter novas classes de antibióticos para o tratamento, prevenção, e melhoria das infec- ções bacterianas.
Sumário
A menos que do contrário especificamente indicado, todos os números de resíduos de aminoácidos de GS identificados aqui referem-se aos resíduos de GS de E. coli. Dada a homologia entre as seqüências bacte- rianas de polipeptídeo de GS, alguém versado na técnica poderia determinar os resíduos correspondentes de interesse de GS em outras espécies usando métodos tais como alinhamentos de homologia ou modelagem molecular.
Esta descrição é com base na descoberta que a forma adenilila- da de GS emprega um mecanismo de reação único que envolve um comple- xo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP para transferência do grupo γ-fosfato de ATP para o γ-carboxilato de glutamato na formação de um intermediário de fosfa- to de γ-glutamila. Desse modo, informação com relação a este complexo, seu sítio de ligação em GS, e o mecanismo de transferência de fosforila de intermediário de carboxifosfato proposto associado pode ser usada para pro- jetar compostos alvejados para a enzima de GSI-β adenililada. Tais compos- tos podem ser usados para inibir atividade de GS adenililada e por conse- guinte tratar, impedir, ou melhorar infecções bacterianas. Como as enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio de uma cascata de adenilila- ção/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, os com- postos podem ser usados para seletivamente inibir o crescimento de células bacterianas enquanto minimamente impactando de forma negativa as célu- las mamíferas. Métodos assistidos por computador para projetar compostos de inibidor de teste e métodos para triagem in vitro e in vivo da atividade de inibidor das moléculas de teste são desse modo fornecidos. Compostos e composições para inibir a atividade de GS, incluindo atividade de fosforil transferase de GS adenililada; para inibir ou impedir crescimento bacteriano in vitro e in vivo-, e para tratar, impedir, ou melhorar infecções bacterianas em mamíferos, são fornecidos aqui.
Conseqüentemente, em uma modalidade, fornecido aqui é um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase (GS) adenililada, o método usando um computador programado compreen- dendo um processador e um dispositivo de entrada onde o método inclui:
(a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS;
(b) ancorar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e
(c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase, por exemplo, inibindo a formação do intermediário de carboxifosfato. O método pode tam- bém incluir atracar no sítio de fosforil transferase um ou mais motivos estru- turais de um complexo de (Μη2+)3·(ΗC03")12'ΑΤΡ. O método pode incluir de- terminar, com base na atracagem, se a molécula de inibidor de teste inibiria a ligação do um ou mais motivos estruturais do complexo de (Mn2+)3-(HC03- )12. ATP no sítio de fosforil transferase, ou inibiria a formação do intermediário de carboxifosfato.
Em algumas modalidades, um método pode incluir compreende projetar um inibidor de teste determinado pela etapa (c) para inibir a ativida- de do sítio de fosforil transferase e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada in vitro. A avali- ação in vitro pode compreender uso de um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutami- na.
Um método pode também incluir, em algumas modalidades, ava- liar a atividade inibidora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutami- na sintetase desadenililada in vitro para avaliar a atividade inibidora específi- ca do inibidor de teste para o polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada, e/ou produzir o inibidor de teste e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um Gene de glutami- na sintetase de GSI-β, por exemplo, uma bactéria selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Eseheri- chia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemo- philus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronchiseptia, Neisseria me- ningitides, Brucella melitensis, Mycobaeterium tubereulosis, Mycobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Actinomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Ana- baena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees coelicolor.
Em algumas modalidades, o método inclui avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma célula eucariótica, por exemplo, uma célula mamífera.
Em outro aspecto, um método de gerar um composto que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sin- tetase adenililada é fornecido, onde o método inclui as etapas de:
(a) fornecer uma estrutura tridimensional de um polipeptídeo de glutamina sintetase; e
(b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio de fosforil transferase e um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3-(HC03")i2'ATP ou de inibir formação do intermediário de carboxifosfato. A estrutura tridimensional do polipeptídeo de glutamina sintetase pode incluir um ou mais motivos es- truturais de um complexo de (Mn2+)3 (HCCV)I2-ATP ligado no sítio de fosforil transferase.
Em outra modalidade, um método de gerar um composto de tes- te que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é fornecido, que inclui:
(a) fornecer uma estrutura tridimensional de um complexo de (Mn2+)3-(HC03-)i2-ATP; e
(b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste tendo um ou motivos similares em estrutura ao complexo de (Mn2+)3-(HC03")i2-ATP.
Em ainda outro aspecto, um método de triar um composto de teste in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é forneci- do que inclui:
(a) contatar um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada com um composto de teste sob condições eficazes para a atividade de fosfo- ril transferase e/ou formação de intermediário de carboxifosfato; e
(b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase adenililada que não foi contatado com o composto de teste. O método pode também incluir determi- nar se ou não a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de glu- tamina sintetase desadenililada é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de glutamina sintetase desadenililada que não foi contatado com o composto de teste.
Também fornecido é um método in vitro para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada, compreen- dendo contatar um polipeptídeo de GS adenililada com uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl OU Vll como descrito aqui.
Um método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β é também fornecido, onde o método com- preende contatar a bactéria com uma composição compreendendo um com- posto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl ou Vll como descrito aqui.
Em outro aspecto, um método para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sintomas ou distúrbios associados a uma infecção bacteriana em um mamífero, ou em um mamífero em risco de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β, é fornecido. O método pode incluir administrar ao mamífero uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl OU Vll como descrito aqui.
Também fornecido é um método in vivo para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase adeni- lilada, o método compreendendo:
(a) administrar uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, VI, OU Vll como descrito aqui a um mamífero que sofre de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteri- ana é de uma bactéria que compreende um gene de GSI-β.
Compostos, tais como compostos de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, VI, OU Vll são também fornecidos aqui, como seus sais farmaceu- ticamente aceitáveis e derivados, e composições farmacêuticas incluindo os mesmos. Uso dos compostos ou composições farmacêuticas para o trata- mento, prevenção, ou melhora de uma infecção bacteriana em um mamífero é também fornecido. Compostos particulares, por exemplo, tendo números de compostos de identificação particulares, são também fornecidos para uso nos mesmos métodos.
A menos que do contrário definido, todos termos técnicos e cien- tíficos aqui usados têm o mesmo significado que comumente entendido por alguém de habilidade usual na técnica ao qual esta invenção diz respeito. No caso de conflito, o documento presente, incluindo definições, comandará. Os métodos e materiais preferidos são descritos abaixo, embora métodos e ma- teriais similares ou equivalentes aqueles descritos aqui possam também ser usados na prática ou testagem da presente invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporadas por referência em sua totalidade. Os materiais, métodos, e e- xemplos revelados aqui são ilustrativos apenas e não intencionados ser Iimi- tativos.
Outras características e vantagens da invenção, por exemplo, atividade inibidora de GS adenililada e desse modo métodos para tratamento de infecções bacterianas, serão evidentes da descrição a seguir, dos dese- nhos e das reivindicações.
Descrição de Desenhos
Figura 1 expõem o mecanismo catalítico proposto no sítio de fosforil transferase de GS adenililada. As letras minúsculas referem-se às etapas propostas a seguir:
a. Seqüestro de dióxido de carbono;
b. Transposição de carga;
c. Transferência de próton intramolecular;
d. Modelação de metal;
e. Formação de fosfato de carbamoíla;
f. Transferência de fosforila; e
g. Colapso Descrição Detalhada
Entre outras coisas, foi descoberto que um novo mecanismo de reação de transferência de ATP-fosforila de glutamina sintetase ocorre na forma adenililada da enzima de GS na presença de Mn2+, quando compara- da à forma desadenililada da enzima na presença de Mg2+. Este mecanismo de reação parece ter um requerimento pela presença de carbonato e Mn2+, com o funcionamento de ATP na forma de um complexo de (Mn2+)3.(HC03 )i2ATP. Como mostrado mais abaixo, a reação putativa inclui a carboxilação de N7 de ATP, formando uma espécie de imônio que permite a desprotona- ção do próton de Ce por meio de um HCO3" associado, com a formação con- comitante de um carbeno de Mn2+ e o ataque subseqüente do γ-fosfato pelo carboxilato de N7, formando um intermediário de carboxifosfato que depois facilita a transferência de fosforila para glutamato por meio de certas cadeias laterais de GS de aminoácidos fundamentais (a saber, His269 e His271). Vide figura 1.
Desse modo, é proposto aqui que inibidores de GS adenililada específicos podem ser projetados com base na estrutura dos componentes complexos ou estruturais de (Mn2+)3.(HC03')i2.ATP desta estrutura e em uma análise de seus sítios de ligação em GS adenililada, e que estes inibi- dores ligariam a enzima no sítio de ligação de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP para inibir a enzima bacteriana; ou inibiria a ligação do (Mn2+)3.(HC03")i2-ATP no sítio de ligação; ou inibiria a formação do intermediário de carboxifosfato.
Definições
Os termos "polipeptídeo de GS" e "polipeptídeo de glutamina sintetase" são usados alternadamente aqui, e a menos que do contrário indi- cado, referem-se a um polipeptídeo de GSI bacteriana, por exemplo, de uma bactéria de GSI-α ou GSI-β. A menos que do contrário indicado, o termo a- brange o polipeptídeo de comprimento total e fragmentos do mesmo. Além disso, como será reconhecido por aqueles tendo habilidade na técnica, GS funciona como um dodecâmero in vivo e sítios ativos de GS podem ser compostos de aminoácidos mais de um monômero. Conseqüentemente, o termo também abrange multímeros (por exemplo, dímeros, trímeros, tetrâ- meros, pentâmeros, hexâmeros, heptâmeros, octâmeros, nonâmeros, de- câmeros, undecâmeros, e dodecâmeros) de GS de comprimento total, mul- tímeros de fragmentos de GS, um ou mais resíduos que fazem parte de um ou mais dos sítios ativos de GS (por exemplo, uma coletânea de resíduos que podem não ser contíguos na seqüência primária de GS, mas compõem pelo menos uma parte de um sítio ativo de GS), e multímeros de tais coletâ- neas.
"Polipeptídeo" e "proteína" são usados alternadamente e signifi- cam qualquer cadeia de aminoácidos ligada a peptídeo, independente do comprimento ou modificação pós-translacional.
O termo "isolado" pode referir-se a um polipeptídeo que ou não tem nenhuma contraparte de ocorrência natural ou foi separado ou purifica- do dos componentes que podem naturalmente acompanhá-lo, por exemplo, em tecidos tais como pâncreas, fígado, baço, ovário, testículos, músculo, tecido da junta, tecido neural, tecido gastrointestinal ou tecido tumoral (por exemplo, tecido de câncer de mama ou câncer de cólon); ou fluidos do corpo tais como sangue, soro, ou urina, ou culturas bacterianas ou fúngicas. Tipi- camente, um polipeptídeo é considerado "isolado" quando for pelo menos 70 %, em peso seco, livre das proteínas e outras moléculas orgânicas de ocor- rência natural com as quais se associa naturalmente.
Preferivelmente, uma preparação de um polipeptídeo é pelo me- nos 80 %, mais preferivelmente pelo menos 90 %, e o mais preferivelmente pelo menos 99 %, em peso seco, do polipeptídeo. Uma vez que um polipep- tídeo que é sintetizado quimicamente é, por sua natureza, separado dos componentes que naturalmente o acompanham, ele é um polipeptídeo sinté- tico "isolado".
Um polipeptídeo isolado pode ser obtido, por exemplo, por ex- tração de uma fonte natural (por exemplo, de tecidos); por expressão de um ácido nucléico recombinante que codifica o polipeptídeo; ou através de sín- tese química. Um polipeptídeo que é produzido em um sistema celular dife- rente da fonte da qual naturalmente se origina é "isolado", porque estará ne- cessariamente livre dos componentes que naturalmente o acompanham. O grau de isolamento ou pureza pode ser medido por qualquer método apro- priado, por exemplo, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de polia- crilamida, ou análise de HPLC.
Antes de testar, qualquer polipeptídeo pode sofrer modificação, por exemplo, adenililação, fosforilação ou glicosilação, por métodos conheci- dos na técnica e como descritos aqui.
Como aqui usado, "derivados farmaceuticamente aceitáveis" de um composto incluem sais, ésteres, éteres de enol, ésteres de enol, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidra- tos ou pró-fármacos dos mesmos. Tais derivados podem ser facilmente pre- parados por aqueles versados na técnica usando métodos conhecidos para tal derivatização. Os compostos produzidos podem ser administrados em animais ou humanos sem efeitos tóxicos substanciais e ou são farmaceuti- camente ativos ou são pró-fármacos.
Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limita- dos a, sais de amina, tais como mas não limitados a N,N'- dibenziletilenodiamina, cloroprocaína, colina, amônia, dietanolamina e outras hidroxialquilaminas, etilenodiamina, N-metilglucamina, procaína, N- benzilfenetilamina, 1 -para-clorobenzil-2-pirrolidin-1 '-ilmetil-benzimidazol, die- tilamina e outras alquilaminas, piperazina e tris(hidroximetil)aminometano; sais de metal alcalino, tais como mas não limitados a lítio, potássio e sódio; sais de metal alcalino terroso, tais como mas não limitados a bário, cálcio e magnésio; sais de metal de transição, tais como mas não limitados a zinco; e outros sais de metal, tais como mas não limitados a fosfato de hidrogênio de sódio e fosfato de dissódio; e também incluindo, mas não limitados a, nitrato, borato, metanossulfonatos, benzenossulfonatos, toluenossulfonatos, sais de ácidos minerais, tais como mas não limitados a cloridratos, bromidratos, hi- droiodetos e sulfatos; e sais de ácidos orgânicos, tais como mas não limita- dos a acetatos, trifluoroacetatos, maleatos, oxalatos, lactatos, malatos, tarta- ratos, citratos, benzoatos, salicilatos, ascorbatos, succinatos, butiratos, vale- ratos e fumaratos. Ésteres farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, ésteres de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, a- ralquila, heteroaralquila, cicloalquila e heterociclila de grupos acídicos, inclu- indo, mas não limitados a, ácidos carboxílicos, ácidos fosfóricos, ácidos fos- fínicos, ácidos sulfônicos, ácidos sulfínicos e ácidos borônicos. Éteres de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, deri- vados da fórmula C=C(OR) onde R é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquila ou heterociclila. Este- res de enol farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não são limitados a, derivados da fórmula C=C(OC(O)R) onde R é hidrogênio, alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, aralquila, heteroaralquila, cicloalquila ou heteroci- clila. Solvatos e hidratos farmaceuticamente aceitáveis são complexos de um composto com uma ou mais moléculas de solvente ou de água, ou 1 a cerca de 100, ou 1 a cerca de 10, ou uma a cerca de 2, 3 ou 4, moléculas de solvente ou de água.
Como aqui usado, tratamento significa qualquer maneira em que um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana, por exemplo, infecção de Mycobacterium tuberculosis, é melhorada ou do contrário vantajosamente alterada. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das com- posições aqui, tais como usos para tratar doenças, distúrbios, ou doenças em que uma infecção bacteriana é suspeita ou está implicada, por exemplo, em um mamífero tal como um humano.
Como aqui usado, melhora dos sintomas de um distúrbio particu- lar por administração de um composto particular ou composição farmacêuti- ca refere-se a qualquer diminuição, quer permanente quer temporária, dura- doura ou passageira que pode ser atribuída ou associada à administração da composição.
Como aqui usado, IC50 refere-se a uma quantidade, concentra- ção ou dosagem de um composto de teste particular que alcança uma inibi- ção de 50 % de uma resposta máxima em um ensaio medindo tal resposta.
Como aqui usado, o termo Ki representa a constante de dissoci- ação de um complexo de enzima/inibidor. É teoricamente independente do substrato contra o qual o inibidor é testado. K, pode ser calculada de um IC50 usando a equação: Ki=IC5o*Km/(S+Km), onde S é a concentração do substra- to, e Km é a concentração do substrato (na ausência de inibidor) na qual a velocidade da reação é meia-máxima. A K, de um inibidor para inibição de um substrato particular (Km fixa) é constante. Como aqui usado, EC50 refere- se a uma concentração de fármaco que produz 50 % de inibição, e CC50 re- fere-se a uma concentração de fármaco que produz 50 % de toxicidade. Como aqui usado, um pró-fármaco é um composto que, sob ad- ministração in vivo, é metabolizado por uma ou mais etapas ou processos ou do contrário convertido biológica, farmacêutica ou terapeuticamente na for- ma ativa do composto. Para produzir um pró-fármaco, o composto farmaceu- ticamente ativo é modificado de modo que o composto ativo será regenerado através de processos metabólicos. O pró-fármaco pode ser projetado para alterar a estabilidade metabólica ou as características de transporte de um fármaco, para mascarar os efeitos colaterais ou toxicidade, para melhorar o sabor de um fármaco ou alterar outras características ou propriedades de um fármaco. Em virtude do conhecimento dos processos farmacodinâmicos e metabolismo de fármaco in vivo, aqueles de habilidade nesta técnica, uma vez um composto farmaceuticamente ativo é conhecido, podem projetar pró- fármacos do composto (vide, por exemplo, Nogrady (1985) Medicinal Che- mistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, Nova Iorque, pági- nas 388-392).
É para er entendido que os compostos fornecidos aqui podem conter centros de quiral. Tais centros de quiral podem ser da configuração (R) ou (S)1 ou podem ser uma mistura dos mesmos. Desse modo, os com- postos fornecidos aqui podem ser enantiomericamente puros, ou são mistu- ras estereoisoméricas ou diastereoméricas. No caso de resíduos de aminoá- cido, tais resíduos podem ser da forma L ou D. A configuração para os resí- duos de aminoácido ocorrência natural é em geral L. Quando não especifi- cado, o resíduo é a forma L. Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere- se a α-aminoácidos que são racêmicos, ou da configuração D ou L. A desig- nação "d" precedendo uma designação de aminoácido (por exemplo, dAla, dSer, dVal, etc.) refere-se ao isômero D do aminoácido. A designação "dl" precedendo uma designação de aminoácido refere-se a uma mistura dos isômeros L e D do aminoácido. É para ser entendido que os centros de quiral dos compostos fornecidos aqui podem sofrer epimerização in vivo. Como tal, alguém versado na técnica reconhecerá que administração de um composto em sua forma (R) é equivalente, para compostos que sofrem epimerização in vivo, para administração do composto em sua forma (S). Como aqui usado, "substancialmente puro" com respeito a um composto significa suficientemente homogêneo para parecer livre de impu- rezas facilmente detectáveis como determinado por métodos padrões de análise, tais como cromatografia de camada fina (TLC), eletroforese em gel, cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e/ou espectrometria de massa (EM), usados por aqueles de versados na técnica para avaliar tal pu- reza, ou suficientemente puros de modo que purificação adicional de modo não detectável alterará as propriedades físicas e químicas, tais como ativi- dades enzimáticas e biológicas, da substância. Métodos para purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente de forma química pu- ros são conhecidos aqueles versados na técnica. Um composto substanci- almente de forma química puro pode, porém, ser uma mistura de estereoi- sômeros. Em tais circunstâncias, purificação adicional poderia aumentar a atividade específica do composto.
Como aqui usado, "alquila," "alquenila" e "alquinila" referem-se às cadeias de carbono que podem ser retas ou ramificadas. Grupos alquila, alquenila e alquinila exemplares aqui incluem, mas não são limitados a, meti- la, etila, propila, isopropila, isobutila, n-butila, sec-butila, terc-butila, isopenti- la, neopentila, terc-pentila, isoexila, alila (propenila) e propargila (propinila).
Como aqui usado, "cicloalquila" refere-se a um sistema de anel mono ou multicíclico saturado, em certas modalidades de 3 a 10 átomos de carbono, em outras modalidades de 3 a 6 átomos de carbono. Os sistemas de anel dos grupos de cicloalquila podem ser compostos de um anel ou dois ou mais anéis que podem ser unidos em uma maneira fundida, ligada em ponte ou espiro-conectada. Exemplos incluem, mas não são limitados a, ci- clopropila, ciclobutila, ciclopentila, e cicloexila.
Como aqui usado, "arila" refere-se a grupos aromáticos monocí- clicos ou multicíclicos contendo de 6 a 19 átomos de carbono. Grupos arila incluem, mas não é limitados a grupos tais como fluorenila não-substituída ou substituída, fenila não-substituída ou substituída, e naftila não-substituída ou substituída.
Como aqui usado, "heteroarila" refere-se a um sistema de anel aromático monocíclico ou multicíclico, em certas modalidades, de cerca de 5 a cerca de 15 membros onde um ou mais, em uma modalidade 1 a 4, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo que é um elemento diferente de carbono, incluindo mas não limitados a, nitrogênio, oxigênio ou enxofre. O grupo heteroarila pode ser opcionalmente fundido a um anel de benzeno. Grupos heteroarila incluem, mas não são limitados a, furila, imidazolila, piri- midinila, tetrazolila, tienila, piridila, pirrolila, tiazolila, isotiazolila, oxazolila, isoxazolila, triazolila, quinolinila e isoquinolinila.
Como aqui usado, "heterociclila" refere-se a um sistema de anel não-aromático monocíclico ou multicíclico, em uma modalidade de 3 a 10 membros, em outra modalidade de 4 a 7 membros, em uma outra modalida- de de 5 a 6 membros onde um ou mais, em certas modalidades, 1 a 3, dos átomos no sistema de anel é um heteroátomo é um elemento diferente de carbono, incluindo mas não limitados a, nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
Como aqui usado, "halo", "halogênio" ou "haleto" refere-se a F, Cl, Br ou I.
Como aqui usado, pseudo-haletos ou grupos pseudo-halo são grupos que se comportam substancialmente similares aos haletos. Tais compostos podem ser usados da mesma maneira e podem ser tratados da mesma maneira como haletos. Pseudo-haletos incluem, mas não são limita- dos a, cianeto, cianato, tiocianato, selenocianato, trifluorometóxi, e azida.
Como aqui usado, "haloalquila" refere-se a um grupo alquila em que um ou mais dos átomos de hidrogênio são substituídos por halogênio.
Como aqui usado, "carbóxi" refere-se a um radical divalente, - C(O)O-.
Como aqui usado, "aminocarbonila" refere-se a -C(O)NH2.
Como aqui usado, "aminoalquila" refere-se a -RNH2 em que R é
alquila.
Como aqui usado, "alcóxi" e "alquiltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é alquila.
Como aqui usado, "arilóxi" e "ariltio" referem-se a RO- e RS-, em que R é arila. Como aqui usado, "amido" refere-se ao grupo divalente - C(O)NH-.
Como aqui usado, "hidrazida" refere-se ao grupo divalente - C(O)NHNH-.
Onde o número de qualquer substituinte dado não for especifi- cado (por exemplo, haloalquila), pode haver um ou mais substituintes pre- sentes. Por exemplo, "haloalquila" pode incluir um ou mais dos mesmos ha- logênios ou diferentes.
Como aqui usado, as abreviações para qualquer grupo protetor, aminoácidos e outros compostos, é, a menos que do contrário indicado, de acordo com sua prática geral, abreviações reconhecidas, ou Comissão em Nomenclatura de Bioquímica IUPAC-IUB (vide, (1972) Biochem. 11:942- 944).
Métodos de Projetar Inibidores para o SftioAtivo de Fosforil Transferase
Fornecidos aqui são métodos, incluindo métodos com base em computador, para projetar compostos que ligam e/ou inibem o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS, particularmente um polipeptídeo de GS adenililada, e até mesmo mais particularmente um polipeptídeo de GS adenililada de uma bactéria de GSI-β. Como descrito aqui, os inventores postularam que um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP liga ao sítio ativo de transferência de fosforila em GS adenililada, resultando em um mecanismo de reação único para transferência do γ-fosfato de ATP para o γ-carboxilato de glutamato para formar o intermediário de fosfato de γ-glutamila. Analisan- do a interação do complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP com o sítio ativo de transferência de fosforila, alguém versado na técnica saberia usar modela- gem molecular padrão ou outras técnicas para identificar peptídeos, pepti- domiméticos, e pequenas moléculas que ligariam ao sítio de fosforil transfe- rase de um polipeptídeo de GS adenililada para inibir a atividade de fosforil transferase. Por exemplo, uma molécula pequena poderia interagir direta- mente com certos aminoácidos no sítio de fosforil transferase para inibir o mecanismo de reação postulado (por exemplo, impedir formação do inter- mediário de carboxifosfato), ou poderia interagir em um sítio alostérico, isto é, uma região da molécula não diretamente envolvida com a atividade de fosforil transferase mas à qual ligação dos compostos resulta (por exemplo, pela indução em uma alteração conformacional na molécula) na inibição da atividade.
Por "modelagem molecular" é significado análise quantitativa e/ou qualitativa da estrutura e função das interações físicas com base na informação estrutural tridimensional e modelos de interação. Isto inclui mo- delos de minimização de energia e dinâmicos moleculares com base numé- rica e modelos de minimização de energia, modelos gráficos interativos de computador, modelos de mecânicas moleculares modificadas, geometria de distância e outros modelos de restrição baseados em estrutura. Modelagem molecular tipicamente é executada usando um computador e pode ser tam- bém otimizada usando métodos conhecidos.
Métodos de projetar compostos que especificamente ligam (por exemplo, com afinidade alta) ao sítio de fosforil transferase, por exemplo, o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada tal como um polipeptídeo de GSI-β adenililada, tipicamente é também com base em computador, e envolve o uso de um computador tendo um programa capaz de gerar um modelo atômico. Programas de computação que usam dados de cristalografia de raio X são particularmente úteis para projetar tais com- postos. Programas tais como RasMoI, por exemplo, podem ser usados para gerar um modelo tridimensional, por exemplo, GS adenililada, o sítio de fos- foril transferase de GS adenililada, ou o complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP. Programas de computação tais como INSIGHT (Accelrys, Burlington, MA), Auto-Dock (Accelrys), e Discovery Studio 1.5 (Accelrys) permitem manipula- ção adicional e a habilidade para introduzir estruturas novas.
Os compostos podem ser projetados usando, por exemplo, hardware ou software, ou uma combinação de ambos. Porém, projeto é pre- ferivelmente implementado em um ou mais programas de computação que executam em um ou mais computadores programáveis, cada um contendo um processador e pelo menos um dispositivo de entrada. 0(s) computa- dores) preferivelmente também contém(êm) um sistema de armazenamento de dados (incluindo memória volátil e não-volátil e/ou elementos de armaze- namento) e pelo menos um dispositivo de saída. Código de programa é apli- cado para introduzir dados para executar as funções descritas acima e gerar informação de saída. A informação de saída é aplicada a um ou mais dispo- sitivos de saída em uma maneira conhecida. O computador pode ser, por exemplo, um computador pessoal, microcomputador, ou posto de trabalho de projeto convencional.
Cada programa é preferivelmente implementado em um nível alto processual ou linguagem de programação orientada a objeto para co- municar com um sistema de computador. Porém, os programas podem ser implementados em conjunto ou linguagem de máquina, se desejado. Em todo caso, a linguagem pode ser uma linguagem compilada ou interpretada.
Cada programa de computação é preferivelmente armazenado em um meio ou dispositivo de armazenamento (por exemplo, ROM ou dis- quete magnético) legível por um computador programável de propósito geral ou especial. O programa de computação serve para configurar e operar o computador para executar os procedimentos descritos aqui quando o pro- grama é lido pelo computador. O método da invenção pode também ser im- plementado por meio de um meio de armazenamento legível por computa- dor, configurado com um programa de computação onde o meio de armaze- namento assim configurado faz com que um computador opere em uma ma- neira específica e predefinida para executar as funções descritas aqui.
Por exemplo, as etapas requerendo computador em um método de projetar um composto de teste podem envolver:
(a) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo coordenadas atômicas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de uma primeira mo- lécula ou complexo (por exemplo, um polipeptídeo de GS, um polipeptídeo de GS adenililada, um fragmento de um polipeptídeo de GS ou polipeptídeo de GS adenililada, uma coletânea de resíduos que compõem um sítio ativo de um polipeptídeo de GS ou um polipeptídeo de GS adenililada (por exem- plo, o sítio de fosforil transferase), qualquer um destes que poderia incluir uma ou mais moléculas ligadas de ATP, ADP, glutamina, ou glutamato) que liga a uma segunda molécula ou complexo (por exemplo, ATP, ADP, um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP; ou uma porção deste complexo); e
(b) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por e- xemplo, um modelo atômico) do sítio na primeira molécula ou complexo en- volvido na ligação à segunda molécula ou complexo.
Da informação obtida desse modo, alguém versado na técnica poderá projetar e fazer compostos inibidores (por exemplo, peptídeos, molé- culas pequenas não-peptídicas, peptidomiméticos, e aptâmeros (por exem- pio, aptâmeros de ácido nucléico)) com a estrutura 3-D apropriada, por e- xemplo, em certos resíduos e que interajam em certos modos (por exemplo, ligação de hidrogênio, interações estéricas, e/ou interações de van der Wa- ais). Por exemplo, alguém versado na técnica poderia projetar compostos inibidores que poderiam interagir com certos resíduos da primeira molécula. Deveria ser observado que embora a estrutura 3-D original do polipeptídeo de GS possa ser tirada de uma espécie, alguém versado na técnica poderia, através de métodos padrões, por exemplo, alinhamentos de homologia ou modelagem molecular, estabelecer os resíduos correspondentes de interes- se de GS em outras espécies.
Além disso, se os dados 3-D utilizáveis por computador (por e- xemplo, dados cristalográficos de raio X) para um composto candidato esti- verem disponíveis, uma ou mais das etapas baseadas em computador a se- guir podem ser executadas juntamente com as etapas com base em compu- tador (a) e (b) descritas acima:
(c) introduzir em um dispositivo de entrada, por exemplo, através de um teclado, um disquete, ou uma fita, dados (por exemplo coordenadas atômicas) que definem a estrutura tridimensional (3-D) de um composto candidato;
(d) determinar, usando um processador, a estrutura 3-D (por e- xemplo, um modelo atômico) do composto candidato;
(e) determinar, usando o processador, se o composto candidato liga ao sítio na primeira molécula ou complexo, ou inibe a formação de um intermediário de carboxifosfato, ou impede a ligação de por exemplo, um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP; e
(f) identificar o composto candidato como um composto que inibe a interação entre as primeiras e segundas moléculas ou complexos, ou inibe a formação de um intermediário de carboxifosfato, ou impede a ligação de por exemplo, um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP.
O método pode envolver uma etapa adicional de produzir em um dispositivo de saída um modelo da estrutura 3-D do composto. Além disso, os dados 3-D dos compostos candidatos podem ser comparados a uma ba- se de dados de computador, por exemplo, de estruturas 3-D armazenadas em um sistema de armazenamento de dados.
Por exemplo, em algumas modalidades, um método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada pode incluir:
(a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP ligado ao sítio de fosforil transferase de um polipeptí- deo de GS (por exemplo, dados compreendendo a estrutura de uma coletâ- nea de resíduos que compõem o sítio de fosforil transferase);
(b) atracar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e
(c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase.
Compostos da invenção também podem ser interativamente pro- jetados da informação estrutural dos compostos descritos aqui usando ou- tras técnicas de projeto/modelagem baseadas em estrutura (vide, por exem- plo, Jackson (1997) Seminars in Oncology 24:L164-172; e Jones et al. (1996) J. Med. Chem. 39:904-917). Compostos e polipeptídeos da invenção podem também ser identificados, por exemplo, identificando os compostos candidatos através de modelagem de computador como encaixando espaci- almente e de preferência (isto é, com afinidade alta) no sítio de fosforil trans- ferase. Compostos candidatos identificados como descrito acima podem depois ser testados em ensaios padrões de inibição celular, enzimática livre de células ou enzimática familiares aqueles versados na técnica. Ensaios exemplares são descritos aqui.
A estrutura 3-D de macromoléculas biológicas (por exemplo, GS, GS adenililada, ácidos nucléicos, carboidratos, e lipídios) pode ser determi- nada dos dados obtidos por uma variedade de metodologias. Estas metodo- logias que foram eficazmente aplicadas na avaliação da estrutura 3-D de proteínas incluem: (a) cristalografia de raio X; (b) espectroscopia de resso- nância magnética nuclear (RMN); (c) análise de restrições de distância física formadas entre sítios definidos em uma macromolécula, por exemplo, reticu- lações químicas intramoleculares entre resíduos em uma proteína (por e- xemplo, Pedido de Patente Internacional Nq PCT/US00/14667, a revelação desta é incorporada aqui por referência em sua totalidade), e (d) métodos de modelagem molecular com base em um conhecimento da estrutura primária de uma proteína de interesse, por exemplo, técnicas de modelagem de ho- mologia, algoritmos de encadeamento, ou modelagem de estrutura ab initio usando programas de computação tais como MONSSTER (Modeling Of New Structures from Secondary and Tertiary Restraints) (vide, por exemplo, Pedi- do de Patente Internacional N2 PCT/US99/11913, a revelação destes é in- corporada aqui por referência em sua totalidade). Outras técnicas de mode- lagem molecular podem também ser empregadas de acordo com esta in- venção [por exemplo, Cohen et al. (1990) J. Med. Chem. 33: 883-894; Navia et al (1992) Current Opinions in Structural Biology, 2, págs. 202-210, as re- velações desta são incorporadas aqui por referência em sua totalidade]. To- dos estes métodos produzem dados que são tratáveis por análise de compu- tador. Outros métodos espectroscópicos que podem também ser úteis no método da invenção, mas que correntemente não fornecem detalhe estrutu- ral do nível atômico acerca das biomoléculas, incluem espectroscopia por dicroísmo circular e fluorescência e de absorbância de luz ultravioleta/visível. Um método preferido de análise é cristalografia de raio X. Descrições deste procedimento e de espectroscopia de RMN são fornecidas abaixo. Cristalografia de Raio X
Cristalografia de raio X é com base na difração de radiação χ de um comprimento de onda característico através de nuvens de elétrons cir- cundando os núcleos atômicos em um cristal da região de interesse. A técni- ca usa cristais purificados de macromoléculas biológicas (mas estas fre- qüentemente incluem componentes de solvente, co-fatores, substratos, ou outros ligandos) para determinar resolução quase atômica dos átomos que compõem a macromolécula biológica particular. Uma condição prévia para solucionar a estrutura 3-D da macromolécula através de cristalografia de raio X é um cristal bem regulado que difratará raios X fortemente. O método dire- ciona um feixe de raios X sobre um arranjo de repetição habitual de muitas moléculas idênticas de forma que os raios X são difratados do arranjo em um padrão do qual a estrutura de uma molécula individual pode ser recupe- rada. Cristais bem regulados, por exemplo, de moléculas de proteínas globu- lares são grandes, esféricas ou objetivas elipsoidais com superfícies irregu- lares. Os cristais contêm canais grandes entre as moléculas individuais. Es- tes canais, que normalmente ocupam mais que uma metade do volume do cristal, são enchidos com moléculas de solvente desordenadas, e as molé- culas de proteína entram em contato entre si em apenas algumas regiões pequenas. Esta é uma razão por que as estruturas de proteínas em cristais são em geral iguais às das proteínas em solução.
GS desadenililada foi cristalizada muitas vezes, por exemplo, de Salmonella typhimurium, Almassy, R. J. et. al. ( 1986) Nature (Londres) 323: 304-309, Liaw, S-H., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 90: 4996- 5000; com glicina, alanina e serina no sítio ativo, Liaw, S-H e D. Eisenberg (1994) J. Biol. Chem. 33: 675-681; com AMPPNP, glutamato, L-metionina-S- sulfoximina, glutamina e ADP no sítio ativo de 5 estruturas, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1993) Protrein Sciences, 2: 470-471; e com ATP no sítio ativo, Liaw, S-H., Jun, G. e D. Eisenberg (1994) Biochemistry 33: 11184- 11188. Métodos de obter GS ou fragmentos de GS, incluindo GS adenililada, são descritos abaixo ou são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. A formação de cristais é dependente de vários parâmetros diferentes, incluindo pH, temperatura, a concentração da macromolécula biológica, a natureza do solvente e precipitante, como também a presença de íons adicionados ou ligandos da proteína. Muitos experimentos rotineiros de cristalização podem ser necessários para triar todos estes parâmetros para as combinações que dão um cristal adequado para análise de difração de raio X. Robôs de crista- lização podem automatizar e acelerar o trabalho de reprodutibilidade mon- tando um número grande de experimentos de cristalização (vide, por exem- plo, Patente U. S. Nq 5.790.421).
Cristalização de polipeptídeo ocorre em soluções em que a con- centração de polipeptídeo excede sua solubilidade máxima (isto é, a solução de polipeptídeo é supersaturada). Tais soluções podem ser restabelecidas pra equilíbrio reduzindo a concentração de polipeptídeo, preferivelmente a- través de precipitação dos cristais de polipeptídeo. Freqüentemente os poli- peptídeos podem ser induzidos a cristalizar-se de soluções supersaturadas adicionando agentes que alteram a superfície de carga do polipeptídeo ou desordenam a interação entre o polipeptídeo e água de volume para promo- ver associações que levam à cristalização.
Cristalizações são em geral realizadas entre 4eC e 209C. Subs- tâncias conhecidas como "precipitantes" são freqüentemente usadas para diminuir a solubilidade do polipeptídeo em uma solução concentrada for- mando uma camada de precipitação esvaziada energicamente desfavorável ao redor das moléculas de polipeptídeo [Weber (1991) Advances in protein Chemistry, 41:1-36]. Além dos precipitantes, outros materiais são adiciona- dos às vezes à solução de cristalização de polipeptídeo. Estes incluem tam- pões para ajustar o pH da solução e sais para reduzir a solubilidade do poli- peptídeo. Vários precipitantes são conhecidos na técnica e incluem os se- guintes: etanol, 3-etil-2-4 pentanodiol, e muitos do poliglicóis, tais como poli- etileno glicol (PEG). As soluções de precipitação podem incluir, por exemplo, 13-24 % PEG 4000, 5-41 % sulfato de amônio, e 1,0-1,5 M de cloreto de só- dio, e um pH variando de 5-7,5. Outros aditivos podem incluir 0,1 M de He- pes, 2-4 % de butanol, 0,1 M ou 20 mM de acetato de sódio, 50-70 mM de ácido cítrico, 120-130 mM de fosfato de sódio, 1 mM de ácido etileno diami- na tetraacético (EDTA), e 1 mM de ditiotreitol (DTT). Estes agentes são pre- parados em tampões e são adicionados a gotas em várias combinações ao tampão de cristalização.
Métodos de cristalização de polipeptídeo comumente usados incluem as técnicas a seguir: batelada, gota suspensa, iniciação de semente, e diálise. Em cada um destes métodos, é importante promover cristalização continuada após nucleação mantendo uma solução supersaturada. No mé- todo de batelada, polipeptídeo é misturado com precipitantes para alcançar supersaturação, e o vaso é vedado e ajustado aparte até que os cristais apa- reçam. No método de diálise, o polipeptídeo é retido em uma membrana de diálise vedada que é colocada em uma solução contendo precipitante. Equi- libração ao longo da membrana aumenta as concentrações do polipeptídeo e do precipitante, assim fazendo o polipeptídeo alcançar níveis de supersa- turação.
Na técnica preferida de gota suspensa [McPherson (1976) J. Biol. Chem., 251:6300-6306], uma mistura de polipeptídeo inicial é criada acrescentando um precipitante a uma solução de polipeptídeo concentrada. As concentrações do polipeptídeo e precipitantes são tais que desta forma inicial, o polipeptídeo não se cristaliza. Uma gota pequena desta mistura é colocada em uma lâmina de vidro que é invertida e suspensa em um reser- vatório de uma segunda solução. O sistema é depois vedado. Tipicamente, a segunda solução contém uma concentração mais alta de precipitante ou ou- tro agente desidratante. A diferença nas concentrações de precipitante faz com que a solução de proteína tenha uma pressão de vapor mais alta que a segunda solução. Considerando que o sistema contendo as duas soluções é vedado, um equilíbrio é estabelecido, e água da mistura de polipeptídeo se transfere para a segunda solução. Este equilíbrio aumenta a concentração de polipeptídeo e precipitante na solução de polipeptídeo. Na concentração crítica de polipeptídeo e precipitante, um cristal do polipeptídeo pode se for- mar.
Outro método de cristalização introduz um sítio de nucleação em uma solução de polipeptídeo concentrada. Em geral, uma solução de poli- peptídeo concentrada é preparada e um cristal de semente do polipeptídeo é introduzido nesta solução. Se as concentrações do polipeptídeo e quaisquer precipitantes estiverem corretas, o cristal de semente fornecerá um sítio de nucleação ao redor do qual um cristal maior se forma.
Ainda outro método de cristalização é um método de eletrocrista- lização em que uso é feito dos momentos de dipolo das macromoléculas de proteína que se auto-alinham na camada de Helmholtz adjacente a um ele- trodo (vide patente U. S. N° 5.597.457).
Algumas proteínas podem ser recalcitrantes à cristalização. Po- rém, várias técnicas estão disponíveis ao artesão versado pra induzir crista- lização. Por exemplo, a remoção de segmentos de polipeptídeo flexíveis na terminação amino ou carboxila terminal da proteína pode facilitar a produção de amostras de proteínas cristalinas. Remoção de tais segmentos pode ser feita usando técnicas de biologia molecular ou tratamento da proteína com proteases tais como tripsina, quimiotripsina, ou subtilisina.
Em experimentos de difração, um feixe estreito e paralelo de raios X é extraído da fonte de raio X e direcionado sobre o cristal para pro- duzir feixes difratados. Os feixes primários incidentes causam dano à ma- cromolécula e moléculas de solvente. Portanto, o cristal é esfriado (por e- xemplo, para -220°C a -50°C) para prolongar sua vida. O feixe primário tem que incidir o cristal de muitas direções para produzir todos possíveis pontos de difração, assim o cristal é girado no feixe durante o experimento. As man- chas difratadas são registradas em um filme ou por um detector eletrônico. Filme exposto tem que ser digitalizado e quantificado em um dispositivo de varredura, enquanto que os detectores eletrônicos alimentam os sinais que eles detectam diretamente para um computador. Detectores eletrônicos de área reduzem significativamente o tempo requerido para colher e medir os dados de difração. Cada feixe de difração que é registrado como um ponto em filme é definido através de três propriedades: a amplitude, que é medida da intensidade do ponto; o comprimento de onda, que é fixado pela fonte de raio X; e a fase, que é perdido em experimentos de raio X. Todas as três propriedades são necessárias para todos os feixes difratados para determi- nar as posições dos átomos que dão origem aos feixes difratados. Um modo de determinar as fases é chamado Substituição Isomorfa Múltipla (MIR) que requer a introdução de difratores de raio X exógenos (por exemplo, átomos pesados tais átomos de metal) na célula de unidade do cristal. Para uma descrição mais detalhada de MIR, vide patente U. S. N9 6.093.573, coluna 15.
Coordenadas atômicas referem-se às coordenadas cartesianas (posições x, y, e z) derivadas das equações matemáticas que envolvem sín- tese de Fourier de dados derivados dos padrões obtidos por meio de difra- ção de um feixe monocromático de raios X pelos átomos (centros de difra- ção) da macromolécula biológica de interesse em forma de cristal. Os dados de difração são usados para calcular os mapas de densidade de elétron das unidades de repetição no cristal (célula de unidade). São usados mapas de densidade de elétron para estabelecer as posições (coordenadas atômicas) de átomos individuais dentro da célula de unidade de um cristal. Os valores absolutos das coordenadas atômicas portam as relações espaciais entre os átomos porque os valores absolutos designados para as coordenadas atô- micas podem ser alterados por movimento rotacional e/ou translacional ao longo dos eixos x, y, e/ou z, junto ou separadamente, enquanto mantendo as mesmas relações espaciais relativas entre os átomos. Desse modo, uma macromolécula biológica (por exemplo, uma proteína), cujo conjunto de valo- res absolutos das coordenadas atômicas podem ser rotativamente ou de modo translacional ajustados para coincidir com um conjunto de valores an- teriormente determinados de uma análise de outra amostra, são considera- dos tendo as mesmas coordenadas atômicas como aquelas obtidas da outra amostra.
Outros detalhes em cristalografia de raio X podem ser obtidos na patente U. S. de Nq 6.093.573 e Pedidos de Patente Internacionais N9S PCT/US99/18441, PCT/US99/11913, e PCT/US00/03745.
Espectroscopia de RMN
Embora cristalografia de raio X requeira cristais simples de uma macromolécula de interesse, medições de RMN são realizadas em solução sob condições quase fisiológicas. Porém, as estruturas derivadas de RMN não são tão detalhadas quanto às estruturas derivadas de cristal.
Embora o uso de espectroscopia de RMN seja até relativamente de modo recente limitada à elucidação da estrutura 3-D de moléculas relati- vãmente pequenas (por exemplo, proteínas de 100-150 resíduos de aminoá- cido), recentes avanços incluindo marcação isotópica da molécula de inte- resse e espectroscopia otimizada de relaxamento transversal (TROSY) têm permitido estender a metodologia para análise de muitas moléculas maiores, por exemplo, proteínas com um peso molecular de 110 kDa [Wider (2000) BioTechniques, 29:1278-1294].
RMN usa radiação de radiofreqüência para examinar o ambiente dos núcleos atômicos magnéticos em um campo magnético homogêneo pul- sado com uma radiofreqüência específica. Os pulsos desordenam a magne- tização nuclear daqueles átomos com núcleos de giro não-zero. Sinais de domínio de tempo transiente são detectados quando o sistema retorna para o equilíbrio. Transformada de Fourier do sinal transiente em um domínio de freqüência rende um espectro de RMN unidimensional. Picos nestes espec- tros representam deslocamentos químicos dos vários núcleos ativos. O des- locamento químico de um átomo é determinado por seu ambiente eletrônico local. Experimentos de RMN bidimensionais podem fornecer informação a- cerca da proximidade de vários átomos na estrutura e em espaço tridimensi- onal. Estruturas de proteína podem ser determinadas executando vários ex- perimentos de RMN bidimensional (e às vezes 3 ou 4) e usando a informa- ção resultante como restrições em uma série de simulações de dobramento de proteína.
Mais informação sobre espectroscopia de RMN, incluindo des- crições detalhadas de como os dados brutos obtidos de um experimento de RMN podem ser usados para determinar a estrutura 3-D de uma macromo- lécula, podem ser encontradas em: Espectroscopia de RMN de Proteína, Princípios e Prática, J., Protein NMR Spectroscopy, Principies and Practice, J. Cavanagh et al., Academic Press, San Diego, 1996; Gronenborn et al. (1990) Anal. Chem. 62(1):2-15; e Wider (2000), supra. Qualquer método disponível pode ser usado para a construção de um modelo 3-D de uma região de GS de interesse dos dados de raio X cristalográfico e/ou de RMN usando um computador como descrito acima. Um tal modelo construído pode ser de pontos de dados analíticos introduzi- dos no computador por um dispositivo de entrada e por meio de um proces- sador usando pacotes de software conhecidos, por exemplo, CATALYST (Accelrys), INSIGHT (AcceIrys) e Ceriusll1 HKL, MOSFILM, XDS1 CCP4, SHARP, PHASES, HEAVY, XPLOR1 TNT1 NMRCOMPASS, NMRPIPE, DIA- NA, NMRDRAW, FELIX, VNMR, MADIGRAS, QUANTA, BUSTER, SOLVE, O, FRODO, ou CHAIN. O modelo construído destes dados pode ser visuali- zado por meio de um dispositivo de saída de um computador, usando siste- mas disponíveis, por exemplo, Silicon Graphics, Evans e Sutherland, SUN, Hewlett Packard, Apple Macintosh, DEC, IBM, ou Compaq. Projetar Compostos da Invenção
Uma vez a estrutura 3-D de um composto que liga a uma região de interesse de polipeptídeo de GS (por exemplo, um Sítio de fosforil trans- ferase de GS, incluindo um sítio de Fosforil transferase de GS adenililada) foi estabelecida usando qualquer um dos métodos acima, um composto tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D (ou contém um domínio tendo substancialmente a mesma estrutura) como o composto identificado pode ser feito. Neste contexto, "tem substancialmente a mesma estrutura 3-D" significa que o composto possui uma ligação de hidrogênio e caráter hidro- fóbico que é similar ao composto identificado. Em alguns casos, um compos- to tendo substancialmente a mesma estrutura 3-D que o composto identifi- cado pode incluir um sistema de anel heterocíclico e regiões que exibem caráter hidrofóbico em proximidade íntima a uma região de ligação de hidro- gênio, embora as regiões hidrofóbicas possam conter algum caráter de liga- ção de hidrogênio. Compostos desta classe incluiriam, sem limitação, substi- tuintes capazes de dar volume estérico em uma região espacial que do con- trário encapsularia o manganês e característica de cadeia principal de fosfa- to coordenada por carbonato de um composto identificado tal como (Mn2+)3.(HC03-)12ATP. Com os dados 3-D estruturais descritos acima em mão e saben- do a estrutura química (por exemplo, seqüência de aminoácido no caso de uma proteína) da região de interesse, aqueles versados na técnica saberiam fazer compostos com as propriedades acima descritas. Tais métodos inclu- em métodos sintéticos químicos e, no caso de proteínas, métodos recombi- nantes (vide acima). Por exemplo, resíduos de cisteína apropriadamente colocados em um composto para formar ligações de dissulfeto podem ser usados para restringir o composto ou um domínio do composto em uma es- trutura 3-D apropriada. Além disso, em um composto que é um polipeptídeo ou inclui um domínio que é um polipeptídeo, alguém versado na técnica sa- beria quais aminoácidos a incluir e em que seqüência os incluir para gerar, por exemplo, hélices a, estruturas β, ou voltas ou curvas aguçadas na ca- deia principal de polipeptídeo.
Embora não essencial, os métodos com base em computador podem ser usados para projetar os compostos da invenção. Programas de computação apropriados incluem: Insightll (Accelrys), CATALYST (Accelrys), LUDI (Accelrys., San Diego, CA), Aladdin (Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA); e LEGEND [Nishibata et al. (1985) J. Med. Chem. 36(20):2921 -2928].
Compostos da invenção que são peptídeos também incluem a- queles descritos acima, mas modificados para o uso in vivo mediante a adi- ção, nas terminações amino e/ou carboxila-terminais, de um agente de blo- queio para facilitar a sobrevivência do polipeptídeo relevante in vivo. Isto po- de ser útil naquelas situações em que os términos do peptídeo tendem ser degradados através de proteases antes da absorção celular. Tais agentes de bloqueio podem incluir, sem limitação, seqüências de peptídeo relaciona- das ou não relacionadas adicionais que podem ser ligadas aos resíduos terminais de amino e/ou carboxila do peptídeo a ser administrado. Isto pode ser feito ou quimicamente durante a síntese do peptídeo ou por tecnologia de DNA recombinante através de métodos familiares aos artesãos versados.
Alternativamente, agentes de bloqueio tais como ácido piroglu- tâmico ou outras moléculas conhecidas na técnica podem ser ligados aos resíduos terminais de amino e/ou carboxila, ou o grupo amino ao término de amino ou grupo carboxila ao término de carboxila podem ser substituídos com uma metade diferente. Igualmente, os compostos de peptídeo podem ser covalente ou não-covalentemente acoplados às proteínas-veículo farma- ceuticamente aceitáveis antes da administração.
Também de interesse são os compostos peptidomiméticos que são projetados com base nas seqüências de aminoácido dos compostos da invenção que são peptídeos. Compostos peptidomiméticos são compostos sintéticos tendo uma conformação tridimensional (isto é, um "motivo de pep- tídeo") que é substancialmente igual à conformação tridimensional de um peptídeo selecionado. Compostos peptidomiméticos podem ter característi- cas adicionais que intensificam sua utilidade in vivo, tais como permeabilida- de de célula aumentada e meia-vida biológica prolongada.
Os peptidomiméticos tipicamente têm uma cadeia principal que é parcial ou completamente não-peptídica, mas com grupos laterais que são idênticos aos grupos laterais dos resíduos de aminoácido que ocorrem no peptídeo no qual o peptidomimético é com base. Vários tipos de ligações químicas, por exemplo, ligações de éster, tioéster, tiomida, retroamida, car- bonila reduzida, dimetileno e cetometileno, são conhecidas na técnica ser em geral os substitutos úteis para ligações de peptídeo na construção de peptidomiméticos resistentes à protease.
Compostos de molécula pequena que são análogos de um com- plexo de (Mn2+)3.(HC03*)i2ATP e/ou que podem ligar ao sítio de fosforil transferase são de interesse particular. Informação adicional sobre classes particulares de moléculas pequenas é fornecida abaixo, como também me- todologias sintéticas para preparação de tais moléculas.
Ensaios de Triagem
Fornecidos aqui também são os métodos in vitro para identificar compostos que inibem a atividade de GS, incluindo atividade de GS adenili- lada, tal como a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada.
A especificidade da inibição de GS adenililada conta com o fato que os mecanismos de reação, a estrutura do sítio ativo, e a estrutura dos intermediários de reação diferem daqueles da GS desadenililada. Em méto- dos de triar para compostos que inibem a ligação de um complexo de (Mn2+)3.(HCO3-)12ATP, ou uma porção do mesmo, a um polipeptídeo de GS1 por exemplo, um polipeptídeo de GS adenililada, e em particular o sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada por meio de um intermediário de carboxifosfato, um polipeptídeo de GS, incluindo um poli- peptídeo de GS adenililada, pode ser contatado com um composto de teste sob condições de ensaio específicas eficazes para transferência de fosforila de um polipeptídeo de GS adenililada ocorrer.
Ensaios para avaliar atividade para GS adenililada são tipica- mente diferentes daqueles para GS desadenililada. O ensaio de GS adenili- lada pode ser operado em pH 6,3 e uma razão de concentração de HCO3" para Mn2+ para ATP de 12:3:1, enquanto o ensaio de GS desadenililada po- de ser operado em pH 7,2 e uma razão de concentração de Mg2+ para ATP de 1:1. Condições de ensaio típicas para GS adenililada são 20 mM de tam- pão de Imidazol (pH 6,3), 1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaH- CO3, 4 mM de NH4CI e 2 mM de glutamato de sódio; enquanto condições de ensaio típicas para GS desadenililada são 20 mM de tampão de Imidazol (pH 7,2), 1 mM de ATP, 1 mM de MgCI2, 12 mM de NaCI, 4 mM de NH4CI e 2 mM de glutamato de sódio. Os ensaios podem ser operados a 37QC.
Hidrólise de ATP, produção de ADP e/ou utilização de glutamato e produção de glutamina podem ser medidas na presença e ausência do composto de teste. Por exemplo, em uma modalidade, um método de triar um composto de teste in vitro para determinar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GS adenililada inclui:
(a) contatar um polipeptídeo de GS adenililada com um compos- to de teste sob condições eficazes para atividade de fosforil transferase; e
(b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de GS adenililada é reduzida com relação à atividade de um
polipeptídeo de GS adenililada que não foi contatado com um composto de teste. A atividade do sítio de fosforil transferase pode ser mediada por um intermediário de carboxifosfato. Qualquer atividade de inibidor pode ser comparada com a inibição obtida para o composto de teste em um polipeptí- deo de GS desadenililada.
Compostos e Composições Farmacêuticas
Fornecidos aqui também são compostos, por exemplo, compos- tos para inclusão em composições farmacêuticas e/ou para o uso nos méto- dos descritos aqui. Com base na informação estrutural e mecanística sobre o sítio de transferência de fosforila de GS, como demonstrado aqui e nos Exemplos abaixo, vários moléculas semelhantes a pirimidina e purina e aná- logos relacionados foram projetadas e preparadas para avaliar seu efeito inibidor na atividade de GS adenililada do sítio de fosforil transferase. Por exemplo, vários análogos foram considerados com base em adenina, com combinações variadas de características espaciais, redes de ligação de hi- drogênio, e padrões de polaridade ao redor do anel de 6 membros. Estes análogos incluíram tanto os compostos bicíclicos 5,6 fundidos, compostos bicíclicos 6,6 fundidos, compostos bicíclicos 6,6, e análogos de adenina com capacidade de coordenação de metal. Os compostos podem ser usados pa- ra inibir atividade de GS adenililada; inibir o crescimento de bactérias tendo um gene de GSI-β, incluindo Mycobacterium tuberculosis; e tratar, prevenir, ou melhorar mamíferos tendo, em risco de ter, ou suspeitos de ter, uma in- fecção bacteriana (por exemplo, infetado com Mycobacterium tuberculosis).
Conseqüentemente, em algumas modalidades, um composto para o uso nos métodos ou para inclusão em uma composição descrita aqui pode ser de acordo com a fórmula I:
<formula>formula see original document page 32</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7;
R2 é hidrogênio, halo, ou NR7Re;
R3 é hidrogênio, halo, ou NR6Ry', R4 é SR5, NR6R7 ou Η;
R5 é Η, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; e
R6, R7, e R8 são, cada independentemente, selecionados de H; acila; hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substitu- ída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; ou NR7R8 pode ser na forma de N = O,
em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.
Em algumas modalidades, R6 e/ou R7 e/ou R8 podem ser um grupo alquila ou cicloalquila substituídas, por exemplo, um grupo cicloalquila substituída por hidroxila, tal como uma metade de carboidrato. Em algumas modalidades, Ri é cloreto. Em algumas modalidades, R2 é NR7R8. Em algumas modalidades, R4 é H.
Em algumas modalidades, Ri é NR6R7 onde R6 é H e R7 são metila, benzila, 2-hidroxietila, 4-bromofenila ou 2-piridila.
Em algumas modalidades, R2 é nitroso, amino, bromo, aminoal- quila ou aminoarila, tal como benzilamino.
Em algumas modalidades, R3 é cloro, dimetilamino, pirrolidino, morfolino ou 2-(pirrolidin-1-il)carboxilato.
Em uma modalidade, R4 é H, R1 é NR6R7 onde R6 é H e R7 é benzila, R2 é nitroso e R3 é cloro. Em outra modalidade, R4 é H, R1 é NR6R7 onde R6 é H e R7 é 2-hidroxietila, R2 é amino e R3 é pirrolidino. Compostos 97, 105 e 111 como descritos mais abaixo são também modalidades particu- lares da fórmula I.
Compostos de acordo com a fórmula I podem ser preparados usando métodos padrões de química sintética, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Em alguns casos, um composto pode ser de acordo com a fór- mula II:
<formula>formula see original document page 34</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
Ri é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R?;
R4 é hidrogênio, SR5, NR6R?, ou OR5;
R5 é H, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;
R6, R7, e R8 são, cada independentemente, selecionados de H; acila; hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substitu- ída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; ou NR7R8 pode ser na forma de N = O;
Rg é H, halo, ou alquila substituída ou não-substituída, arila, he- terocíclico, heteroarila, OR5, ou NR6R7;
XeY podem ser, independentemente, N ou CH; e em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.
Em algumas modalidades, R1 é OH ou NH2.
Em algumas modalidades, R4 é H, OH ou NH2.
Em algumas modalidades, R6 é H ou alquila. Em algumas modalidades, R9 é alquila substituída, alquenila, alquinila ou arila. Em algumas modalidades, Rg é alquila amino-substituída.
Em uma modalidade, R4 é H, R6 é benzila e R9 é H e R1 é NR6R? onde R6 é metila e R7 é metila. Em outra modalidade, R4 é NH2, R1 é OH, R6 é H e Rg é fenila. Composto 81, descrito mais abaixo, é um exemplo de um composto de acordo com a fórmula II.
Compostos de acordo com a fórmula II podem ser preparados por alguém tendo habilidade usual na técnica usando métodos sintéticos padrões e/ou os protocolos detalhados nos Exemplos, abaixo. Em algumas modalidades, os compostos de acordo com a fórmula II podem ser derivados de compostos da fórmula I, por exemplo, por substituição apropriada e mé- todos de fechamento de anel.
Um composto, por exemplo para o uso nos métodos descritos aqui, pode também ser de acordo com a fórmula III:
<formula>formula see original document page 35</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7;
R4 é hidrogênio, SR5, NR6R7, ou OR5;
R5 é H, C1 -C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;
R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos;
X,Y pode ser independentemente CH ou N;
em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH1 e SO3H.
Em algumas modalidades, R1 é OH ou H.
Em algumas modalidades, R4 é H, OH ou NH2.
Em algumas modalidades, R6 é OH ou H.
Em algumas modalidades, R7 é H ou alquila substituída.
Compostos de acordo com a fórmula III podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em alguns casos, os compostos de acordo com a fórmula I podem ser convertidos em um composto da fórmula III, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula IV:
<formula>formula see original document page 36</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
R11 é hidrogênio ou C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila po- dem ser lineares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não- substituída ou heteroarila; em que 1-3 substituintes são permitidos em qual- quer metade substituída de R11 cujos substituintes podem ser independen- temente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H; e
R12 é alquila não-substituída ou substituída ou alquenila, ou arila não-substituída ou substituída, em que os substituintes de R12 podem ser selecionados de NH2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH2, halo, OR5, CO2R5, e NR6R7, em que:
R5 é H, C1-C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; e
R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; e
em que 1 -3 substituintes são independentemente permitidos em uma metade substituída de R5, R6, ou R7 cujos substituintes podem ser in- dependentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroa- rila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.
Em algumas modalidades, Rn é alquila ou H.
Em algumas modalidades, R12 é arila não-substituída ou substi- tuída ou alquenila, por exemplo, tendo de 1 a 10 átomos de C.
Compostos de acordo com a fórmula IV podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula V:
<formula>formula see original document page 37</formula>
R1 é hidrogênio, halo, OR5, ou NR6R7; R5 é H, C1-C20 alquila substituída ou não-substituída, alquenila,
ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila;
R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos;
R13 é independentemente alquila substituída ou não-substituída, arila, heteroarila, ou cicloalquila; R14 é H ou NHR15 onde R15 é independentemente alquila substi- tuída ou não-substituída, arila, heteroarila, ou cicloalquila;
X e Y podem ser, independentemente, N ou CH; e
em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.
Em algumas modalidades, R1 é H.
Em algumas modalidades, R13 é arila substituída ou não- substituída.
Em algumas modalidades, R14 é arila substituída ou não- substituída, alquila ou cicloalquila.
Em algumas modalidades, X e Y são ambos CH.
Composto 117, como descrito mais abaixo, é um exemplo de um composto de acordo com a fórmula V.
Compostos de acordo com a fórmula V podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em alguns casos, os compostos de acordo com a fórmula V podem ser preparados em uma reação de acoplamento de 3 componentes usando uma amina heteroaromática, um aldeído e um isocianeto, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Em algumas modalidades, um composto pode ser de acordo com a fórmula VI:
<formula>formula see original document page 38</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
R13 é hidrogênio ou C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila po- dem ser lineares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não- substituída ou heteroarila; em que 1-3 substituintes são permitidos em qual- quer metade substituída de R13 cujos substituintes podem ser independen- temente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH1 e SO3H; e
R12 é alquila não-substituída ou substituída ou alquenila, ou arila não-substituída ou substituída, em que os substituintes de R12 podem ser selecionados de NH2, OH, COOH, CHO, NCHO, CONH2, halo, OR5, CO2R5, e NR6R7, em que:
R5 é H, C1-C2O alquila substituída ou não-substituída, alquenila, ou alquinila, em que os grupos alquila, alquenila, ou alquinila podem ser li- neares, ramificados, ou cíclicos; ou arila substituída ou não-substituída ou heteroarila; e
R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; e
em que 1 -3 substituintes são independentemente permitidos em uma metade substituída de R5, R6, ou R7 cujos substituintes podem ser in- dependentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroa- rila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H. Em algumas modalidades, R13 é H.
Em algumas modalidades, R12 é arila substituída ou não- substituída ou alquenila.
Compostos de acordo com a fórmula VI podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca. Em algumas modalidades, os compostos de acordo com a fórmula VI podem ser derivados dos compostos da fórmula IV, por exemplo, através de métodos hidrolíticos apropriados, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Um composto, por exemplo, para o uso nos métodos descritos aqui, pode também ser de acordo com a fórmula VII: <formula>formula see original document page 40</formula>
ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que:
R6 e R7 são, cada independentemente, selecionados de H; acila, hidroxila; e grupos alquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila; ou R6 e R7 podem formar um grupo cicloalquila substituída ou não-substituída, cicloalquila, arila, ou heteroarila juntos; e
Ri4 é H; acila, grupos alquila substituída ou não-substituída, ci- cloalquila, arila, ou heteroarila;
em que 1-3 substituintes são permitidos em qualquer metade substituída cujos substituintes podem ser independentemente selecionados de alquila, alquenila, alquinila, arila, heteroarila, halo, carboxilato, amida, NR7R8, OR5, ceto, SH, e SO3H.
Em algumas modalidades, R6 é H.
Em algumas modalidades, Ri4 é H.
Compostos de acordo com a fórmula Vll podem ser preparados usando métodos padrões de síntese conhecidos aqueles versados na técni- ca, por exemplo, como mostrado nos Exemplos abaixo.
Preparação dos Compostos
Os compostos para uso nas composições e métodos fornecidos aqui podem ser obtido de fontes comerciais (por exemplo, Sigma, Aldrich, Riedel de Hah, Merck, e Acros) ou podem ser preparados por métodos bem- conhecidos aqueles versados na técnica ou pelos métodos mostrados aqui. Alguém versado na técnica poderia preparar todos os compostos para uso aqui através de modificação rotineira destes métodos usando os materiais de partida apropriados.
Formulação das Composições Farmacêuticas
Uma composição farmacêutica fornecida aqui contém quantida- des terapeuticamente eficazes de um ou mais dos compostos fornecidos aqui que são úteis no tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais dos sintomas associados a uma infecção bacteriana (por exemplo, uma bactéria contendo o gene de GSI-β, tal como Mycobacterium tuberculosis), ou um distúrbio, condição, ou doença em que um tal infecção bacteriana está impli- cada ou suspeita, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Veículos far- macêuticos adequados para administração dos compostos fornecidos aqui incluem quaisquer tais veículos conhecidos aqueles versados na técnica se- rem adequados para o modo particular de administração.
Além disso, os compostos podem ser formulados farmaceutica- mente como o único componente ativo na composição ou podem ser combi- nados com outros componentes ativos. Por exemplo, os compostos podem ser formulados ou combinados com compostos antibacterianos conhecidos, compostos antiinflamatórios, esteróides, e/ou antivirais.
As composições contêm um ou mais compostos fornecidos aqui. Os compostos são, em uma modalidade, formulados em preparações farma- cêuticas adequadas tais como soluções, suspensões, tabletes, tabletes dis- persáveis, pílulas, cápsulas, pós, formulações de liberação contínua ou elixi- res, para administração oral ou em soluções ou suspensões estéreis para administração parenteral, como também preparação de emplasto transdér- mico e inaladores de pó seco. Em uma modalidade, os compostos descritos acima são formulados em composições farmacêuticas usando técnicas e procedimentos bem-conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ansel Intro- duction to Pharmaceutical Dosage Forms, Quarta Edição 1985, 126).
Nas composições, concentrações eficazes de um ou mais com- postos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são mistu- radas com um veículo farmacêutico adequado. Os compostos podem ser derivatizados como os sais correspondentes, ésteres, éteres de enol ou és- teres, acetais, cetais, ortoésteres, hemiacetais, hemicetais, ácidos, bases, solvatos, hidratos ou pró-fármacos antes da formulação, como descrito aci- ma. As concentrações dos compostos nas composições são eficazes para liberação de uma quantidade, sob administração, que trata, impede, ou me- lhora um ou mais dos sintomas de uma infecção bacteriana. Em uma modalidade, as composições são formuladas para ad- ministração de dosagem simples. Para formular uma composição, a fração em peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou do contrário mis- turada em um veículo selecionado a uma concentração eficaz de modo que a condição tratada é aliviada ou um ou mais sintomas são melhorados.
O composto ativo é incluído no veículo farmaceuticamente acei- tável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no paciente tratado. A con- centração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente tes- tando os compostos em sistemas in vitro, ex vivo e in vivo, e depois extrapo- lados desta para dosagens em seres humanos.
A concentração do composto ativo na composição farmacêutica dependerá das taxas de absorção, inativação e excreção do composto ativo, as características fisicoquímicas do composto, o horário de dosagem, e quantidade administrada como também outros fatores conhecidos aqueles versados na técnica.
Formas de unidade de dosagem farmacêuticas são preparadas para fornecer de cerca de 0,01 mg, 0,1 mg ou 1 mg a cerca de 500 mg, 1000 mg ou 2000 mg, e em uma modalidade de cerca de 10 mg a cerca de 500 mg do componente ativo ou uma combinação de componentes essenciais para a forma de unidade de dosagem.
O componente ativo pode ser administrado imediatamente, ou pode ser dividido em várias doses menores a serem administradas em inter- valos de tempo. É entendido que a dosagem precisa e duração do tratamen- to são uma função do distúrbio sendo tratado e podem ser determinadas empiricamente usando protocolos de testagem conhecidos ou através de extrapolação de dados de teste in vivo ou in vitro. É para ser observado que as concentrações e valores de dosagem podem também variar com a seve- ridade da condição a ser aliviada. É para ser também entendido que para qualquer sujeito particular, regimes de dosagem específicos deveriam ser ajustados com o passar do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração das composições, e que a faixa de concentração exposta aqui é exemplar apenas e não é intencionado limitar o escopo ou prática das composições reivindicadas.
Em circunstâncias em que os compostos exibe solubilidade insu- ficiente, métodos para solubilizar os compostos podem ser usados. Tais mé- todos são conhecidos aqueles versados na técnica, e incluem, mas não são limitados a, usar co-solventes, tais como dimetilsulfóxido (DMSO), usando tensoativos, tais como TWEEN®, ou dissolução em bicarbonato de sódio aquoso. Derivados dos compostos, tais como pró-fármacos dos compostos, podem também ser usados na formulação de composições farmacêuticas eficazes.
Sob mistura ou adição do(s) composto(s), a mistura resultante pode ser uma solução, suspensão, emulsão ou outras. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de ad- ministração e a solubilidade do composto no carreador ou veículo seleciona- do. A concentração eficaz é suficiente para melhorar os sintomas da doença, distúrbio ou condição tratada e pode ser determinada empiricamente.
As composições farmacêuticas são providas para administração aos seres humanos e animais em formas de dosagem de unidade, tais como tabletes, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parente- rais estéreis, e soluções ou suspensões orais, e emulsões de óleo-água con- tendo quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceutica- mente aceitáveis dos mesmos. O composto farmacêutica e terapeuticamente ativo, e derivados do mesmo, é, em uma modalidade, formulado e adminis- trado em formas de dosagem de unidade ou formas de dosagem múltipla. Forma de dose de unidade como aqui usado refere-se às unidades fisica- mente distintas adequadas para o ser humano e animais e empacotadas individualmente como é conhecido na técnica. Cada dose de unidade con- tém uma quantidade predeterminada do composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo, veículo ou diluente farmacêutico requerido. Exemplos de formas de dose de unidade incluem ampolas e seringas e tabletes ou cápsulas indivi- dualmente empacotados. As formas de dose de unidade podem ser adminis- tradas em frações ou múltiplos destas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem de unidade idênticas empacotadas em um só recipiente a ser administrado em forma de dose de unidade segrega- da. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, garrafas de table- tes ou cápsulas ou garrafas de quartilhos ou galões. Conseqüentemente, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses de unidade que não são se- gregadas no acondicionamento.
Composições líquidas farmaceuticamente administráveis podem, por exemplo, ser preparadas dissolvendo, dispersando, ou do contrário mis- turando um composto ativo como definido acima e adjuvantes farmacêuticos opcionais em um veículo, tais como, por exemplo, água, solução salina de dextrose, aquosa, glicerol, glicóis, etanol, e similares, para assim formar uma solução ou suspensão. Se desejado, a composição farmacêutica a ser ad- ministrada pode também conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes umectantes, agentes emulsifican- tes, agentes solubilizantes, agentes tamponantes de pH e similares, por e- xemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitan, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, e ou- tros tais agentes.
Métodos atuais de preparar tais formas de dosagem são conhe- cidos, ou serão evidentes, aqueles versados na técnica; por exemplo, Re- mington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 15ã Edição, 1975.
Formas de dosagem ou composições contendo componente ati- vo na faixa de 0,005 % a 100 % com o equilíbrio composto de veículo não- tóxico podem ser preparadas. Métodos para preparação destas composições são conhecidos aqueles versados na técnica. As composições contempladas podem conter 0,001 %-100 % de componente ativo, ou em uma modalidade 0,1-95%.
1. Composições para Administração Oral
Formas de dosagem farmacêutica orais são sólidas, em gel ou líquidas. As formas de dosagem sólidas são tabletes, cápsulas, grânulos, e pós de volume. Tipos de tabletes orais incluem pastilhas comprimidas, mas- tigáveis e tabletes que podem ser revestidos entéricos, revestidos com açú- car ou revestidos com filme. Cápsulas podem ser cápsulas de gelatina duras ou macias, enquanto grânulos e pós podem ser fornecidos na forma não- efervescente ou efervescente com a combinação de outros componentes conhecidos aqueles versados na técnica, a. Composições Sólidas para Administração Oral
Em certas modalidades, as formulações são formas de dosagem sólidas, em uma modalidade, cápsulas ou tabletes. Os tabletes, pílulas, cáp- sulas, trociscos e similares pode conter um ou mais dos componentes a se- guir, ou compostos de uma natureza similar: um aglutinante; um lubrificante; um diluente; um deslizante; um agente desintegrante; um agente de colora- ção; um agente adoçante; um agente aromatizante; um agente umectante; um revestimento emético; e um revestimento de filme. Exemplos de agluti- nantes incluem celulose microcristalina, goma tragacanto, solução de glico- se, mucilagem de acácia, solução de gelatina, melados, polvinilpirrolidina, povidona, crospovidonas, sacarose e pasta de amido. Lubrificantes incluem talco, amido, estearato de magnésio ou de cálcio, licopódio e ácido esteári- co. Diluentes incluem, por exemplo, lactose, sacarose, amido, caulim, sal, manitol e fosfato de dicálcio. Deslizantes incluem, mas não são limitados a, dióxido de silício coloidal. Agentes desintegrantes incluem croscarmelose sódica, glicolato de amido de sódio, ácido algínico, amido de milho, amido de batata, bentonita, metilcelulose, ágar e carboximetilcelulose. Agentes de co- loração incluem, por exemplo, quaisquer das tinturas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, misturas das mesmas; e tinturas de FD e C insolúveis em água suspensas em hidrato de alumina. Agentes adoçantes incluem sacarose, lactose, manitol e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina, e qualquer número de agentes aromatizantes secados por pulveri- zação. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraídos de plantas tais como frutas e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sen- sação agradável, tais como, mas não limitados a, hortelã e salicilato de meti- la. Agentes umectantes incluem monoestearato de propileno glicol, monoo- leato de sorbitan, monolaurato de dietileno glicol e éter de polioxietileno lau- ral. Revestimentos eméticos incluem ácidos graxos, gorduras, ceras, goma- laca, goma-laca amoniada e ftalatos de acetato de celulose. Revestimentos de filme incluem hidroxietilcelulose, carboximetilcelulose de sódio, polietileno glicol 4000 e ftalato de acetato de celulose.
O composto, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mes- mo, poderia ser fornecido em uma composição que o protege do ambiente acídico do estômago. Por exemplo, a composição pode ser formulada em um revestimento entérico mantendo sua integridade no estômago e libera o composto ativo no intestino. A composição pode também ser formulada em combinação com um antiácido ou outro tal componente.
Quando a forma de unidade de dosagem for uma cápsula, pode conter, além de material do tipo acima, um veículo líquido tal como um óleo graxo. Além disso, as formas de unidade de dosagem podem conter vários outros materiais que modificam a forma física da unidade de dosagem, por exemplo, revestimentos de açúcar e outros agentes entéricos. Os compostos podem também ser administrados como um componente de um elixir, sus- pensão, xarope, bolacha, chuvisco, chiclete ou similares. Um xarope pode conter, além dos compostos ativos, sacarose como um agente adoçante e certos conservantes, tinturas e colorações e aromas.
Os materiais ativos podem também ser misturados com outros materiais ativos que não prejudicam a ação desejada, ou com materiais que suplementam a ação desejada. O componente ativo é um composto ou deri- vado farmaceuticamente aceitável do mesmo como descrito aqui. Concen- trações mais altas podem ser incluídas, até cerca de 98 % em peso do com- ponente ativo.
Em todas as modalidades, tabletes e formulações de cápsulas podem ser revestidos como conhecido por aqueles versados na técnica a fim de modificar ou sustentar a dissolução do componente ativo. Desse modo, por exemplo, eles podem ser revestidos com um revestimento digestível en- tericamente convencional, tal como fenilsalicilato, ceras e ftalato de acetato de celulose.
Β. Composições Líquidas para Administração Oral
Formas de dosagem orais líquidas incluem soluções aquosas, emulsões, suspensões, soluções e/ou suspensões reconstituídas de grânu- Ios não-efervescentes e preparações efervescentes reconstituídas de grânu- Ios efervescentes. Soluções aquosas incluem, por exemplo, elixires e xaro- pes. Emulsões são óleo-em-água ou água-em-óleo.
Elixires são preparações claras, adocicadas, hidroalcoólicas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em elixires incluem solven- tes. Xaropes são soluções aquosas concentradas de um açúcar, por exem- plo, sacarose, e podem conter um conservante. Uma emulsão é um sistema de duas fases em que um líquido é disperso na forma de glóbulos pequenos em outro líquido. Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados em emul- sões são líquidos não-aquosos, agentes emulsificantes e conservantes. Suspensões usam agentes de suspensão e conservantes farmaceuticamen- te aceitáveis. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânu- Ios não-efervescentes, a serem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem diluentes, adoçantes e agentes umectantes. Substân- cias farmaceuticamente aceitáveis usadas em grânulos efervescentes, a se- rem reconstituídos em uma forma de dosagem oral líquida, incluem ácidos orgânicos e uma fonte de dióxido de carbono. Agentes corantes e aromati- zantes são usados em todas as formas de dosagem acima.
Solventes incluem glicerina, sorbitol, álcool etílico e xarope. E- xemplos de conservante incluem glicerina, metila e propilparabeno, ácido benzóico, benzoato de sódio e álcool. Exemplos de líquidos não-aquosos utilizados em emulsões incluem óleo mineral e óleo de caroço de algodão. Exemplos de agentes emulsificantes incluem gelatina, acácia, tragacanto, bentonita, e tensoativos tais como monooleato de sorbitan de polioxietileno. Agentes de suspensão incluem carboximetilcelulose de sódio, pectina, tra- gacanto, Veegum e acácia. Agentes adoçantes incluem sacarose, xaropes, glicerina e agentes adoçantes artificiais tais como sacarina. Agentes umec- tantes incluem monoestearato de propileno glicol, monooleato de sorbitan, monolaurato de dietileno glicol e éter de Iaurila de polioxietileno. Ácidos or- gânicos incluem ácido cítrico e tartárico. Fontes de dióxido de carbono inclu- em bicarbonato de sódio e carbonato de sódio. Agentes de coloração inclu- em quaisquer das tinturas FD e C solúveis em água certificadas aprovadas, e misturas destas. Agentes aromatizantes incluem sabores naturais extraí- dos de plantas tais frutas, e misturas sintéticas de compostos que produzem uma sensação de gosto agradável.
Para uma forma de dosagem sólida, a solução ou suspensão, por exemplo em carbonato de propileno, óleos vegetais ou triglicerídeos, em uma modalidade é encapsulada em uma cápsula de gelatina. Tais soluções, e a preparação e encapsulação das mesmas, são reveladas nas patentes U. S. NsS 4.328.245; 4.409.239; e 4.410.545. Para uma forma de dosagem lí- quida, a solução, por exemplo, por exemplo, em um polietileno glicol, pode ser diluída com uma quantidade suficiente de um veículo líquido farmaceuti- camente aceitável, por exemplo, água, a ser facilmente medido para admi- nistração.
Alternativamente, formulações orais líquidas ou semi-sólidas po- dem ser preparadas dissolvendo ou dispersando o composto ativo ou sal em óleos vegetais, glicóis, triglicerídeos, ésteres de propileno glicol (por exem- pio, carbonato de propileno) e outros tais veículos, e encapsulando estas soluções ou suspensões em invólucros de cápsula de gelatina dura ou ma- cia. Outras formulações úteis incluem aquelas expostas nas patentes U. S. N9S RE28.819 e 4.358.603. Brevemente, tais formulações incluem, mas não são limitados a, àquelas contendo um composto fornecido aqui, um mono ou polialquileno glicol dialquilado, incluindo, mas não limitados a, 1,2- dimetoximetano, diglima, triglima, tetraglima, polietileno glicol-350-dimetil éter, polietileno glicol-550-dimetil éter, polietileno glicol-750-dimetil éter em que 350, 550 e 750 referem-se ao peso molecular médio aproximado do po- lietileno glicol, e um ou mais antioxidantes, tais como hidroxitolueno butilado (BHT), hidroxianisol butilado (BHA), gaiato de propila, vitamina E, hidroqui- nona, hidroxicumarinas, etanolamina, lecitina, cefalina, ácido ascórbico, áci- do málico, sorbitol, ácido fosfórico, ácido tiodipropiônico e seus ésteres, e ditiocarbamatos.
Outras formulações incluem, mas não são limitadas a, soluções alcoólicas aquosas incluindo um acetal farmaceuticamente aceitável. Alcoóis usados nestas formulações são qualquer solvente miscível em água farma- ceuticamente aceitável tendo um ou mais grupos hidroxila, incluindo, mas não limitados a, propileno glicol e etanol. Acetais incluem, mas não são limi- tados a, acetais de di(alquila inferior) de aldeídos de alquila inferior tais como dietil acetal de acetaldeído.
2. Injectáveis. Soluções e Emulsões
Administração parenteral, em uma modalidade caracterizada por injeção, ou subcutânea, intramuscular ou intravenosamente é também con- templada aqui. Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Os injetáveis, soluções e emulsões também contêm um ou mais excipientes. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol ou etanol. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas a serem administradas podem também conter quantidades secundárias de substâncias auxiliares não-tóxicas tais como agentes intumescentes ou e- mulsificantes, agentes tamponantes de pH, estabilizantes, intensificadores de solubilidade, e outros tais agentes, tais como por exemplo, acetato de sódio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina e ciclodextrinas.
Implantação de um sistema de liberação lenta ou liberação con- tínua, de modo que um nível constante de dosagem seja mantido (vide, por exemplo, Patente U. S. Ng 3.710.795) é também contemplada aqui. Breve- mente, um composto fornecido aqui é disperso em uma matriz interna sólida, por exemplo, polimetilmetacrilato, polibutilmetacrilato, polivinilcloreto plastici- zado ou não-plasticizado, náilon plasticizado, polietilenotereftalato plasticiza- do, borracha natural, poliisopreno, poliisobutileno, polibutadieno, polietileno, copolímeros de etileno-vinilacetato, borrachas de silicone, polidimetilsiloxa- nos, copolímeros de carbonato de silicone, polímeros hidrófilos tais como hidrogéis de ésteres acrílicos e ácido metacrílico, colágeno, polivinilálcool reticulado e acetato de polivinila reticulado parcialmente hidrolisado, que é rodeado por uma membrana polimérica externa por exemplo, polietileno, polipropileno, copolímeros de etileno/propileno, copolímeros de etile- no/acrilato de etila, copolímeros de etileno/vinilacetato, borrachas de silico- ne, siloxanos de polidimetila, borracha de neopreno, polietileno clorado, poli- vinilcloreto, copolímeros de vinilcloreto com acetato de vinila, cloreto de vini- lideno, etileno e propileno, tereftalato de polietileno de ionômero, borrachas de epicloroidrina de borracha de butila, copolímero de etileno/álcool vinílico, terpolímero de etileno/acetato de vinila/álcool vinílico, e copolímero de etile- no/viniloxietanol, que é insolúvel nos fluidos do corpo. O composto difunde através da membrana polimérica externa em uma taxa de controla da taxa de liberação. A porcentagem de composto ativo contida em tais composições parenterais é altamente dependente da natureza específica das mesmas, como também a atividade do composto e as necessidades do sujeito.
Administração parenteral das composições inclui administrações intravenosas, subcutâneas e intramusculares. Preparações para administra- ção parenteral incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos so- lúveis secos estéreis, tais como pós liofilizados, prontos para serem combi- nados com um solvente logo antes do uso, incluindo tabletes hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis secos estéreis prontos para serem combinados com um veículo logos antes do uso e emul- sões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não-aquosas.
Se administrados intravenosamente, os veículos adequados in- cluem solução salina fisiológica ou solução salina tamponada de fosfato (PBS), e soluções contendo agentes de engrossamento e solubilizantes, tais como glicose, polietileno glicol, e polipropileno glicol e misturas dos mesmos.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados nas preparações parenterais incluem veículos aquosos, veículos não-aquosos, agentes anti- microbianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestesias locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsificantes, agentes se- qüestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitá- veis. Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringers, Injeção de Dextrose Isotônica, Injeção de Água Estéril, Injeção de Dextrose e Ringers Lactatada. Veículos parenterais não- aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de caroço de algodão, óleo de milho, óleo de gergelim e óleo de amendoim. Os agentes antimicro- bianos devem ser adicionados em concentrações bacteriostáticas ou fungis- táticas em preparações parenterais empacotadas em recipientes de dose múltipla que incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobu- tanol, ésteres de ácido p-hidroxibenzóico de metila e propila, timerosal, clo- reto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem clo- reto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Anestesias locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersantes incluem carboximetilcelulose sódica, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsificantes inclu- em Polissorbato 80 (TWEEN® 80). Um agente seqüestrante ou quelante de íons de metal inclui EDTA. Veículos farmacêuticos também incluem álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis com água; e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido láctico para ajus- te de pH.
A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajusta- da de forma que uma injeção forneça uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. A dose exata depende da idade, peso e con- dição do paciente ou animal como é conhecido na técnica.
As preparações parenterais de dose de unidade são acondicio- nadas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. Todas as preparações para administração parenteral deveriam ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica.
De modo ilustrativo, infusão intravenosa ou intraarterial de uma solução aquosa estéril contendo um composto ativo é um modo eficaz de administração. Outra modalidade é uma solução ou suspensão aquosa ou oleosa estéril contendo um material ativo injetado quando necessário para produzir o efeito farmacológico desejado. Os injetáveis são projetados para administração local e sistêmi- ca. Em uma modalidade, uma dosagem terapeuticamente eficaz é formulada para conter uma concentração de pelo menos cerca de 0,1 % p/p até cerca de 90 % p/p ou mais, em certas modalidades mais de 1 % p/p do composto ativo para o(s) tecido(s) tratado(s).
O composto pode ser suspenso em forma micronizada ou outra adequada ou pode ser derivatizado para produzir um produto ativo mais so- lúvel ou produzir um pró-fármaco. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo intencionado de administração e a solubili- dade do composto no carreador ou veículo selecionado. A concentração efi- caz é suficiente para melhorar os sintomas da condição e pode ser determi- nada empiricamente.
3. Pós Liofilizados
De interesse aqui são também os pós Iiofilizados que podem ser reconstituídos para administração como soluções, emulsões e outras mistu- ras. Eles podem também ser reconstituídos e formulados como sólidos ou géis.
O pó estéril, Iiofilizado é preparado dissolvendo um composto fornecido aqui, ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, em um solvente adequado. O solvente pode conter um excipiente que melhora a estabilidade ou outro componente farmacológico do pó ou solução reconsti- tuída, preparada do pó. Excipientes que podem ser usados incluem, mas não são limitados a, dextrose, sorbital, frutose, xarope de milho, xilitol, glice- rina, glicose, sacarose ou outro agente adequado. O solvente pode também conter um tampão, tal como citrato, fosfato de sódio ou de potássio ou outro tal tampão conhecido aqueles versados na técnica, em uma modalidade, em cerca de pH neutro. Filtração estéril subseqüente da solução seguida por liofilização sob condições padrões conhecidas aqueles versados na técnica fornece a formulação desejada. Em uma modalidade, a solução resultante será aquinhoada em frascos para liofilização. Cada frasco conterá uma do- sagem simples ou dosagens múltiplas do composto. O pó Iiofilizado pode ser armazenado sob condições apropriadas, tais como em cerca de 49C à tem- peratura ambiente.
Reconstituição deste pó Iiofilizado com água para injeção provê uma formulação para o uso em administração parenteral. Para reconstitui- ção, o pó Iiofilizado é adicionado à água estéril ou outro veículo adequado. A quantidade precisa depende do composto selecionado. Tal quantidade pode ser determinada empiricamente. 4. Administração Tópica
Misturas tópicas são preparadas como descrito para a adminis- tração local e sistêmica. A mistura resultante pode ser uma solução, suspen- são, emulsões ou outras e é formulada como cremes, géis, ungüentos, e- mulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, pulverizações, supositórios, bandagens, emplastos dérmicos ou qualquer outra formulação adequada para administração tópica.
Os compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos podem ser formulados como aerossóis para aplicação tópica, tais como através de inalação (vide, por exemplo, Patentes U. S. N9S 4.044.126, 4.414.209, e 4.364.923 que descrevem aerossóis para liberação de um este- róide útil para o tratamento de doenças inflamatórias particularmente asma). Estas formulações para administração para o trato respiratório podem ser na forma de um aerossol ou solução para um nebulizador, ou como um pó mi- crofino para insuflação, sozinho ou em combinação com um veículo inerte tal como lactose. Em um tal caso, as partículas da formulação, em uma modali- dade, terão diâmetros de menos de 50 mícrons, em uma modalidade menos de 10 mícrons.
Os compostos podem ser formulados para aplicação local ou tópica, tais como para aplicação tópica à pele e membranas mucosas, tais como no olho, na forma de géis, cremes, e loções e para aplicação no olho ou para aplicação intracisternal ou intraespinhal. Administração tópica é con- templada para liberação transdérmica e também para administração para os olhos ou mucosa, ou para terapias de inalação. Soluções nasais do compos- to ativo sozinho ou em combinação com outros excipientes farmaceutica- mente aceitáveis podem também ser administradas. Estas soluções, particularmente aquelas intencionadas para o uso oftálmico, podem ser formuladas como 0,01 % -10 % de soluções isotô- nicas, pH de cerca de 5-7, com sais apropriados.
5. Composições para Outras Rotas de Administração
Outras rotas de administração, tais como emplastos transdérmi- cos, incluindo dispositivos iontoforéticos e eletroforéticos, e administração retal, são também contempladas aqui.
Emplastos transdérmicos, incluindo dispositivos iotoforéticos e eletroforéticos, são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Por e- xemplo, tais emplastos são revelados nas patentes U. S. N-s 6.267.983, 6.261.595, 6.256.533, 6.167.301, 6.024.975, 6.010.715, 5.985.317, 5.983.134, 5.948.433, e 5.860.957.
Por exemplo, formas de dosagem farmacêutica para administra- ção retal são supositórios retais, cápsulas e tabletes para efeito sistêmico. Supositórios retais são aqui usados significam corpos sólidos para inserção no reto que se funde ou amolece em temperatura do corpo liberando um ou mais componentes farmacológica ou terapeuticamente ativos. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis utilizadas em supositórios retais são bases ou veículos e agentes para elevar o ponto de fundição. Exemplos de bases in- cluem manteiga de cacau (óleo de teobroma), glicerina-gelatina, carbocera (polioxietileno glicol) e misturas apropriadas de mono, di e triglicerídeos de ácidos graxos. Combinações podem ser usadas das várias bases. Agentes para elevar o ponto de fundição de supositórios incluem espermacete e cera. Supositórios retais podem ser preparados pelo método comprimido ou mol- dagem. O peso de um supositório retal, em uma modalidade, é cerca de 2 a 3 gm.
Tabletes e cápsulas para administração retal são fabricados u- sando a mesma substância farmaceuticamente aceitável e pelos mesmos métodos como para formulações para administração oral.
6. Formulações Alvejadas
Os compostos fornecidos aqui, ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, podem também ser formulados para serem alvos para um tecido particular, receptor, ou outra área do corpo do sujeito a ser tratado. Muitos tais métodos de alvejamento são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Todos tais métodos de alvejamento são contemplados aqui para o uso nas composições imediatas. Para exemplos não-limitativos de métodos de alvejamento, vide, por exemplo, Patentes U. S. NQs 6.316.652, 6.274.552, 6.271.359, 6.253.872, 6.139.865, 6.131.570, 6.120.751, 6.071.495, 6.060.082, 6.048.736, 6.039.975, 6.004.534, 5.985.307, 5.972.366, 5.900.252, 5.840.674, 5.759.542 e 5.709.874.
Em uma modalidade, suspensões lipossomais, incluindo Iipos- somas alvos para tecido, tais como Iipossomas alvos para tumor, podem também ser adequadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com os métodos conhecidos aqueles ver- sados na técnica. Por exemplo, formulações de Iipossoma podem ser prepa- radas como descrito na patente U. S. N- 4.522.811. Brevemente, Iipossomas tais como vesículas multilamelares (MLVs) podem ser formadas secando a fosfatidil colina de ovo e fosfatidil serina de cérebro (razão molar 7:3) no lado de dentro de um frasco. Uma solução de um composto fornecido aqui em soluções salinas tamponadas de fosfato (PBS) carecendo de cátions diva- lentes é adicionada e o frasco agitado até que o filme de lipídio seja disper- so. As vesículas resultantes são lavadas para remover o composto não- capsulado, empelotadas através de centrifugação, e depois ressuspensas em PBS.
7. Artigos de Fabricação
Os compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis po- dem ser empacotados como artigos de fabricação (por exemplo, kits) con- tendo material de acondicionamento, um composto ou derivado farmaceuti- camente aceitável do mesmo fornecido aqui dentro do material de acondi- cionamento, e uma marcação que indica que o composto ou composição, ou derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo, é útil para tratamento, prevenção, ou melhora de um ou mais sintomas ou distúrbios em que uma infecção bacteriana, incluindo uma infecção de Mycobacterium tuberculosis, está implicada. Os artigos de fabricação fornecidos aqui contêm materiais de acondicionamento. Materiais de acondicionamento para o uso nos produtos farmacêuticos de acondicionamento são bem-conhecidos aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U. S. N°S 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.252. Exemplos de materiais de acondicionamento farmacêuticos in- cluem, mas não são limitados a, pacotes de bolha, garrafas, tubos, inalado- res, bombas, sacos, frascos, recipientes, seringas, garrafas, e qualquer ma- terial de acondicionamento adequado para uma formulação selecionada e modo intencionado de administração e tratamento. 8. Formulações de Liberação Sustentada
Também fornecidas são formulações de liberação contínua para liberar os compostos para o alvo desejado em níveis circulantes altos (entre 10"9 e 10"4 M). Os níveis são circulantes no paciente sistemicamente, ou em uma modalidade, localizados em um local de, por exemplo, paralisia.
É entendido que os níveis compostos são mantidos em um certo período de tempo, conforme for desejado, e podem ser facilmente determi- nados por alguém versado na técnica. Tais formulações de liberação contí- nua e/ou regulada podem ser feitas por meios de liberação contínua de dis- positivos de liberação que são bem-conhecidos aqueles versados na técni- ca, tais como aqueles descritos nas patentes US N9s 3.845.770; 3.916.899; 3.536.809; 3. 598.123; 4.008.719; 4.710.384; 5.674.533; 5.059.595; 5.591.767; 5.120.548; 5.073.543; 5.639.476; 5.354.556 e 5.733.566, as des- crições desta são, cada, incorporadas aqui por referência. Estas composi- ções farmacêuticas podem ser usadas para fornecer liberação lenta ou con- tínua de um ou mais dos compostos ativos usando, por exemplo, hidroxipro- pilmetil celulose, outras matrizes de polímero, géis, membranas permeáveis, sistemas osmóticos, revestimentos de multicamadas, micropartículas, Iipos- somas, microesferas, ou outros. Formulações de liberação contínua ade- quadas conhecidas aqueles versados na técnica, incluindo aquelas descritas aqui, podem ser selecionadas facilmente para o uso com as composições farmacêuticas fornecidas aqui. Desse modo, formas de dosagem de unidade simples adequadas para administração oral, tais como, mas não limitados a, tabletes, cápsulas, cápsulas de gel, microcápsulas, pós e similares, que são adaptadas para liberação contínua são contempladas aqui.
Em uma modalidade, a formulação de liberação contínua contém composto ativo tal como, mas não limitados a, celulose microcristalina, mal- todextrina, etilcelulose, e estearato de magnésio. Como descrito acima, to- dos os métodos conhecidos para encapsulação que são compatíveis com propriedades dos compostos revelados são contemplados aqui. A formula- ção de liberação contínua é encapsulada revestindo as partículas ou grânu- Ios das composições farmacêuticas fornecidas aqui com espessura variada de polímeros lentamente solúveis ou através de microencapsulação. Em uma modalidade, a formulação de liberação contínua é encapsulada com um material de revestimento de espessura variada (por exemplo cerca de 1 mí- cron a 200 mícrons) que permite a dissolução da composição farmacêutica cerca de 48 horas a cerca de 72 horas após administração a um mamífero. Em outra modalidade, o material de revestimento é um aditivo alimentício aprovado.
Em outra modalidade, a formulação de liberação contínua é um dispositivo de dissolução de matriz que é preparado comprimindo o fármaco com um veículo de polímero lentamente solúvel em um tabíete. Em uma modalidade, as partículas revestidas têm uma faixa de tamanho entre cerca de 0,1 a cerca de 300 mícrons, como revelado nas patentes U. S. Nes 4.710.384 e 5.354.556 que são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. Cada uma das partículas são na forma de uma micromatriz, com o componente ativo uniformemente distribuído ao longo do polímero.
Formulações de liberação sustentada tais como aquelas descri- tas na patente U. S. Nq 4.710.384, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade, tendo uma porcentagem relativamente alta de plasticizante no revestimento para permitir flexibilidade suficiente para impedir quebra substancial durante a compressão, são reveladas. A quantidade específica de plasticizante varia, dependendo da natureza do revestimento e do plasti- cizante particular usados. A quantidade pode ser determinada facilmente de modo empírico testando as características de liberação dos tabletes forma- dos. Se o medicamento for liberado muito rapidamente, então mais plastici- zante é usado. Características de liberação são também uma função da es- pessura do revestimento. Quando quantidades substanciais de plasticizante forem usadas, a capacidade de liberação contínua do revestimento diminui.
Desse modo, a espessura do revestimento pode ser aumentada ligeiramente para compensar um aumento na quantidade de plasticizante. Em geral, o plasticizante em uma tal modalidade estará presente em uma quantidade de cerca de 15 a 30 % do material de liberação contínuo no revestimento, em uma modalidade 20 a 25 %, e a quantidade de revestimento será de 10 a 25 % do peso do material ativo, e em outra modalidade, 15 a 20 % do peso de material ativo. Qualquer plasticizante farmaceuticamente aceitável conven- cional pode ser incorporado no revestimento.
Os compostos fornecidos aqui podem ser formulados como uma formulação de liberação contínua e/ou regulada. Toda os produtos farma- cêuticos de liberação contínua têm uma meta comum de melhorar a terapia de fármaco sobre à alcançada por suas contrapartes não-contínuas. Ideal- mente, o uso de uma preparação de liberação contínua otimamente projeta- da em tratamento médico é caracterizado por um mínimo de substância de fármaco, que é empregada para curar ou controlar a condição. Vantagens das formulações de liberação contínua podem incluir: 1) atividade estendida da composição, 2) freqüência de dosagem reduzida, e 3) complacência de paciente aumentada. Além disso, formulações de liberação contínua podem ser usadas para afetar o tempo de princípio de ação ou outras característi- cas, tais como níveis de sangue da composição, e desse modo pode afetar a ocorrência de efeitos colaterais.
As formulações de liberação contínua fornecidas aqui são proje- tadas para inicialmente liberar uma quantidade da composição terapêutica que prontamente produz o efeito terapêutico desejado, e liberação gradual e continuamente de outras quantidades de composições para manter este ní- vel de efeito terapêutico em um período estendido de tempo. Para manter este nível constante no corpo, a composição terapêutica deve ser liberada da forma de dosagem a uma taxa que substituirá a composição que é meta- bolizada e excretar-se-á do corpo.
A liberação contínua de um componente ativo pode ser estimu- lada através de vários indutores, por exemplo pH, temperatura, enzimas, água, ou outras condições fisiológicas ou compostos.
Preparações para administração oral podem ser formuladas a- dequadamente para dar liberação controlada do composto ativo. Em uma modalidade, os compostos são formulados como pós de liberação controla- da de micropartículas distintas que podem ser formuladas facilmente em forma líquida. O pó de liberação contínua compreende partículas contendo um componente ativo e opcionalmente, um excipiente com pelo menos um polímero não-tóxico.
O pó pode ser disperso ou suspenso em um veículo líquido e manterá suas características de liberação contínua durante um período útil de tempo. Estas dispersões ou suspensões têm estabilidade química e esta- bilidade em termos de taxa de dissolução. O pó pode conter um excipiente que compreende um polímero que pode ser solúvel, insolúvel, permeável, impermeável, ou biodegradável. Os polímeros podem ser polímeros ou co- polímeros. O polímero pode ser um polímero natural ou sintético. Polímeros naturais incluem polipeptídeos (por exemplo, zeína), polissacarídeos (por exemplo, celulose), e ácido algínico. Polímeros sintéticos representativos incluem aqueles descritos, mas não limitados a, aqueles descritos na coluna 3, linhas 33-45 da patente U. S. N° 5.354.556, que é incorporada por refe- rência em sua totalidade. Polímeros particularmente adequados incluem a- queles descritos, mas não limitados àqueles descritos na coluna 3, linha 46- coluna 4, linha 8 da patente U. S. N° 5.354.556, que é incorporada por refe- rência em sua totalidade.
As composições de liberação contínua fornecidas aqui podem ser formuladas para administração parenteral, por exemplo, por injeções in- tramusculares ou implantes para tecidos subcutâneos e várias cavidades do corpo e dispositivos transdérmicos. Em uma modalidade, injeções intramus- culares são formuladas como suspensões aquosas ou oleosas. Em uma suspensão aquosa, o efeito de liberação contínua é devido, em parte, a uma redução na solubilidade do composto ativo sob complexação ou uma diminu- ição na taxa de dissolução. Um método similar é tomado com suspensões e soluções de óleo, em que a taxa de liberação de um composto ativo é de- terminada dividindo o composto ativo fora do óleo para o meio aquoso cir- cunvizinho. Apenas compostos ativos que são solúveis em óleo e têm as características de partição desejadas são adequados. Óleos que podem ser usados para injeção intramuscular incluem, mas não são limitados a, gerge- lim, azeitona, araquis, milho, amêndoa, feijão-soja, caroço de algodão e óleo de rícino.
Uma forma altamente desenvolvida de liberação de fármaco que dá liberação contínua em períodos de tempo variando de dias a anos é im- plantar um dispositivo polimérico portando fármaco subcutaneamente ou em várias cavidades de corpo. O material de polímero usado em um implante que deve ser biocompatível e não-tóxico inclui mas não é limitado a hidro- géis, silicones, polietilenos, copolímeros de etileno-acetato de vinila, ou po- límeros biodegradáveis.
Avaliação da Atividade dos Compostos
A atividade dos compostos fornecidos aqui como inibidores de atividade de GS, por exemplo, atividade de GS adenililada, incluindo uma atividade de fosforil transferase de GS adenililada mediada por intermediário de carboxifosfato; e/ou como compostos pra tratar, prevenir, ou melhorar um ou mais sintomas, condições, ou distúrbios associados a uma infecção bac- teriana (por exemplo, infecção de Mycobacterium tuberculosis), pode ser medida ou avaliada em ensaios padrões. Ensaios de inibição enzimática (por exemplo, ensaios de γ-glutamil transferase, ensaios de hidrólise de ATP, produção de ADP1 e utilização de glutamato e ensaios de formação de glu- tamina), inibição de crescimento de bactérias, e ensaios de citoproteção, viabilidade, e citotoxicidade das células, todos estes são bem-conhecidos aqueles versados na técnica e/ou são descritos abaixo, podem ser empre- gados.
Métodos de uso dos Compostos e Composições
Ambos métodos in vitro ou in vivo podem ser executados com os compostos e composições descritos aqui. Aplicação in vitro dos compostos da invenção pode ser útil, por exemplo, em estudos científicos básicos de mecanismos de reação de GS, ou para métodos in vitro de tratar, impedir, reduzir, ou inibir uma contaminação ou infecção bacteriana, ou para inibir uma atividade de fosforil transferase de GS. Os compostos podem também ser usados in vivo como agentes terapêuticos contra infecções bacterianas, incluindo bactérias patogênicas ou oportunísticas. Em particular, os compos- tos podem ser usados como agentes terapêuticos contra infecções de bacté- rias de GSI-β tais como Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoea- e, Escherichia coli, Salmonella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio eholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobae- ter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehisep- tia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema pallidum, Leptospira interrogans, Aeti- nomyees israelii, Noeardia esteroides, Thiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor. Os compostos podem ser úteis na prevenção e/ou terapia de doenças que envolvem microorganismos intracelulares (isto é, agentes infecciosos que replicam dentro de uma célula), por exemplo, bactérias intracelulares tais como M. tubereulosis.
Os métodos da invenção podem ser aplicados a uma gama ex- tensiva de espécies, por exemplo, mamíferos tais como seres humanos, primatas não-humanos (por exemplo, macacos), cavalos, gado, porcos, ove- lhas, cabras, cachorros, gatos, coelhos, cobaias, hamsters, ratos, e camun- dongos. Como enzimas de GSI-β bacterianas são reguladas por meio da cascata de adenililação/desadenililação, mas as enzimas de GSII mamíferas não são, e como os inibidores aqui são postulados seletivamente alvejar GS adenililada, os compostos e composições podem ser usados seletivamente para inibir crescimento de célula bacteriana enquanto minimamente impac- tando de forma negativa as células mamíferas.
Em um método in vivo, um composto ou uma composição far- macêutica descrita(o) aqui (por exemplo, de acordo com a fórmula I, II, III, IV, V, Vl ou VII; ou como exposto nos Exemplos) é administrada(o) ao sujei- to, por exemplo, um mamífero, tal como um mamífero suspeito de sofrer, ou sofrendo, de uma infecção bacteriana. Em geral, os compostos da invenção serão suspensos em um veículo farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina fisiológica) e administrados oral ou transdermicamente ou injetados (ou infusos) intravenosa, subcutânea, intramuscular, intraperitone- al, intrarretal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueana, ou intra- pulmonarmente. Eles podem ser liberados diretamente a um tecido afetado apropriado.
As dosagens dos compostos inibidores e agentes adicionais a serem usados dependem da escolha da rota de administração; da natureza da formulação; da natureza da enfermidade do paciente; do tamanho do su- jeito, peso, área de superfície, idade, e sexo; outros fármacos que são admi- nistrados; e do julgamento do médico assistente. Dosagens adequadas são em geral na faixa de 0,0001-100,0 mg/kg. Amplas variações na dosagem necessária serão esperadas em vista da variedade dos compostos e agen- tes adicionais disponíveis e das eficiências divergentes de várias rotas de administração. Por exemplo, seria esperado que administração oral requeira dosagens mais altas que administração por injeção i.v. Variações nestes níveis de dosagem podem ser ajustadas usando rotinas empíricas padrões para otimização, como é bem entendido na técnica. Administrações de com- postos e/ou agentes adicionais podem ser simples ou múltiplos (por exem- plo, 2-, 3-, 4-, 6-, 8-, 10-, 20-, 50-, 100-, 150-, ou mais vezes).
Exemplos
Exemplo 1 - Elucidação do Mecanismo Catalítico e Estrutura do Complexo de Mn(HCO3)2-ATP
Base Teórica
A conformação de 5'-trifosfato de adenosina (ATP) em um com- plexo de manganês foi determinada usando técnicas de relaxamento magné- tico nuclear (vide abaixo). As distâncias do Mn2+ para os núcleos do ATP foram calculadas do termo de dipolar da equação de Solomon-Bleombergen: (Bloembergen, N., (1957) J. Chem. Phys. 27: (2), 572-596, Mildvan1 A. S. e Eagle1 J. L. (1972) Methods Enzymol. 26: 654-682, e Mildvan, A. S. e Cohn1 M. (1970) Adv. Enzymol. 33: 1-70):
<formula>formula see original document page 63</formula>
Onde:
S = Número quântico do giro do elétron (5/2 para Mn2+)
γΙ = razão giromagnética nuclear (2,675 χ 104 rad.seg"1.gauss"1
g = fator eletrônico "g" (2 para Mn2+) β = magneton de Bohr (8,795 χ 106 rad.seg"1.gauss"1) Xc = tempo de correlação dipolar (= 3,0 χ 10"11 para Mn-(H2O)6) u)| = freqüência de ressonância nuclear (6,28 χ 108 para 1H a 23,487 gauss)
GOs = freqüência de ressonância do giro do elétron (4,13 χ 1011 para 1H a 23,487 gauss)
h = constante de acoplamento hiperfina r = distância elétron-nuclear média (centímetros) T1 = tempo de relaxamento longitudinal do próton T2 = tempo de relaxamento transversal do próton Xe = tempo de correlação do giro do elétron ρ = razão da concentração do íon paramagnético para ligando. A contribuição paramagnética para as taxas de relaxamento lon- gitudinais e transversais, 1/T1p e 1/T2p, é calculado subtraindo as contribui- ções diamagnéticas:
onde 1/T^obs) é a taxa de relaxamento na presença da espécie paramagnéti- ca e IZT1(O) é a taxa de relaxamento na ausência da espécie paramagnética. A contribuição paramagnética para a taxa de relaxamento, 1ZT1p é relaciona- da à taxa de relaxamento na primeira esfera de coordenação, IZT1M, por: <formula>formula see original document page 64</formula>
onde 1/T1(os) é a contribuição de esfera externa para a taxa de relaxamento, ρ é a razão da concentração do íon paramagnético na concentração de li- gando, e q é o número de Iigandos na esfera de coordenação. O valor de q é obtido da taxa de relaxamento de água e é indicado quantas moléculas de água, no íon paramagnético, foram substituídas pela coordenação de ligan- do. O tempo de permanência das espécies nucleares, xm, na primeira esfera de coordenação do íon paramagnético, leva em conta a taxa de permuta entre o ligado e a forma não-ligada. 1/T1p e 1/T2p são normalizados para a concentração multiplicando por ρ. O tempo de relaxamento na primeira esfe- ra de coordenação, T1M, do núcleo magnético de ATP ligado é igual a pqTip no limite de permuta rápida.
Para interpretar a estrutura e propriedades dinâmicas dos com- plexos de metal-molécula orgânica paramagnética, os valores (ou os limites) de q, devem ser determinados r, e xc. O tempo de correlação, xc, caracteriza o processo da taxa que modula a interação dipolar e é definido por:
<formula>formula see original document page 64</formula>
e os parâmetros que contribuem para o tempo de correlação são xr que são a constante de tempo para o movimento rotacional do vetor de raio do nú- cleo do íon internuclear, xs o tempo de relaxamento do giro do elétron, e Xm o tempo de permanência das espécies nucleares na primeira esfera de co- ordenação do íon paramagnético. O valor 1/xm é a taxa de permuta de ligan- do entre a forma ligada e não-ligada. O tempo de correlação, xc, é determi- nado pelo processo de taxa mais rápido, ou quantas vezes for, xr, xs ou xm, é o mais curto. Uma estimação destes tempos é requerida para permitir 1/xc ser calculado.
Os tempos de relaxamento Ti e T2 para os prótons de ATP H8, H2, H1 e H2O foram obtidos para o complexo de Mn(HC03")2-ATP e de Mn- CI2-ATP, a uma faixa de temperaturas de 25 a 46gC. Os valores de T1M e T2M para cada próton foram depois determinados como também as taxas de re- laxamento 1/T1p e 1/T2p. A dependência de freqüência nos tempos de rela- xamento T1 e T2 para os prótons H8, H2, H1 e H2O1 foram determinados a 200, 300, 400 e 500 MHz.
Temperatura e freqüência foram depois usadas para destrinçar as contribuições dos vários tempos de correlação para os valores de 1/pT-ip e os 1/pT2p.
Intensificação da taxa de relaxamento com relação à do aquo- complexo, (Mn(H2O)62"1"), é antecipada. No aquo-complexo, xc é determinado por xr, o tempo rotacional. Se o tempo de permanência na primeira esfera de coordenação, xm, dominar a taxa de relaxamento longitudinal, 1/T1P, xm > T1M, e uma vez que T2M ^ T1M, xm deve também dominar 1/T2p, e 1/T1P ξ 1/T2p. Considerando que xm diminui com temperatura crescente, 1/T1P e 1/T2P têm que aumentar com temperatura crescente. Como xm é indepen- dente da freqüência 1/T1p e 1/T2p é independente da freqüência, portanto um diagrama de T1 ρ como varia-se a freqüência de RMN (ωι2) deveria indicar a dependência de T-1P em freqüência. Se T1P for independente da freqüência (ωI)2 então xm é o fator dominante. No diagrama de T1 versus ω2 a razão do declive para o interseção é xc2, permitindo xc ser calculado. Se as taxas de relaxamento diminuem com as temperaturas crescentes, então T1M e T2M (relaxamento de esfera externo) determinam 1/T-1p e 1/T2p. Além desta de- pendência de temperatura, se as taxas de relaxamento observadas também dependerem da freqüência, o processo de taxa diferente de permuta quími- ca, compõe uma contribuição significativa para T1P.
Quando um diagrama de 1/T1P versus temperatura for positivo, este pode ser um resultado de 3 possibilidades:
1. A taxa de permuta química 1/xm é suficientemente lenta para dominar 1/T1P.
2. Se permuta rápida ocorrer e xs dominar T1m, então xs tem um coeficiente de temperatura positivo sob estas condições.
3. Se xc ≥ 10"8 seg de forma que ω2χ02 (1, e /(xc) é uma função de 1/xc e aumenta à medida que xc fica mais curto com a temperatura cres- cente.
O tempo de correlação, xe que caracteriza a interação de calor que é transmitida através das ligações químicas ao invés de pelo espaço, é dado por:
<formula>formula see original document page 66</formula>
Sob a maioria das condições xs é mais curto que xM. Em tempe- raturas altas para algum íons Xm pode ficar mais curto que xs.
O זc, é obtido da razão de declive para interceptar (= tc2) do dia- grama de T1 versus ωl2. Se o Tc for mais curto que o limite mais baixo de xs, então é improvável que permuta rápida ocorra e Ts domine T1M. Sob estas condições xc não terá um coeficiente de temperatura positivo provavelmente.
Se nenhum efeito de freqüência de RMN em 1/T1P) na região do coeficiente de temperatura positivo de 1/T-ip for observado, então o meca- nismo de relaxamento dominante é devido a 1/TM, a taxa de permuta de li- gando.
As dependências de temperatura e de freqüência de 1/T1P e os espectros de EPR são portanto usados para decidir quais dos processos de taxa ou combinação de processos de taxa (tr, xs ou xm) são responsáveis pelo relaxamento do giro nuclear. Portanto, do espectro de EPR do comple- xo de Mn2+, é obtido um limite mais baixo para o tempo de relaxamento do giro do elétron xs.
A Dissociação de Bicarbonato e seu Efeito em Atp na Presença de íons de
Metal Divalentes
A dissociação do íon de bicarbonato em solução é dependente de pH. O efeito da dissociação de HCCV na atividade de GS foi determinado na presença de Mn2+ e Mg2+. Isto é de importância fisiológica como GS tem duas ótimas de pH para a atividade, a saber pH 6,3 e pH 7,3, dependendo do estado de adenililação da enzima. Com base na teoria de dissociação clássica em pH 6,3, bicarbonato existe em uma razão de 50:50 com CO2 e pH 7,3 existe quase somente como HCO3" com uma quantidade desprezível que está na forma de CO32'. Entre pH 5,0 e pH 8,0, o equilíbrio da dissocia- ção de um sal de bicarbonato tal como NH4HCO3 ou NaHCO3 é: NH4HCO3 + H2O i=i NH4+ + HCO3" * NH4+ + CO2 + OH" i; NH3 + CO2 + H2O NaHCO3 25 Na+ + HCO3" U Na+ + CO2 + OΗ"
Em soluções aquosas de ácidos polibásicos pode ser difícil de obter uma interpretação simples das medições de condutância devido aos equilíbrios de dissociação de sobreposição. Dentro da faixa de pH de inte- resse dentro desta investigação, a saber pH 5,5 a 8,0, as únicas espécies postuladas serem de importância são NH4+, HCO3" e CO2. O C032" repre- senta pequeno papel ou nenhum no mecanismo de reação postulada.
A constante de equilíbrio da reação de dissociação é dada por:
<formula>formula see original document page 67</formula>
Porém, um segundo equilíbrio é fixado depender do pH da solu- ção:
<formula>formula see original document page 67</formula>
onde Fi denota os quocientes dos coeficientes da atividade:
<formula>formula see original document page 67</formula>
As concentrações das várias espécies presentes na solução como definido pelo grau total de dissociação, a, e pelo pH da solução como prognosticado pela equação de Henderson-Hasselbach:
<formula>formula see original document page 67</formula>
Porém, entre as concentrações de 1 mM e 5 mM, em pH 5,5 em pH 8,0, a quantidade de NH4HCO3 não-associado é desprezível. Tipicamen- te
<formula>formula see original document page 67</formula>
Porém, no caso de NH4HCO3 ser postulado em concentrações baixas:
<formula>formula see original document page 67</formula> <formula>formula see original document page 68</formula>
Portanto:
<formula>formula see original document page 68</formula>
À medida que o pH de pH 5,5 aumenta para pH 8,0, a condutivi- dade da solução em uma faixa dos níveis de pH deveria ser indicativa da concentração de HCO3" e pela diferença a concentração de CO2 na solução.
Na presença de 10 mM de tampão de Imidazol.HCI as concentrações relati- vas podem ser diferentes. Esta investigação foi fixa até determinar a exten- são pela qual a presença de Imidazol em uma solução com NH4HCO3 pode realizar a dissociação em HCO3" e CO2. Isto é importante para saber como as concentrações relativas de cada um podem afetar o funcionamento de GS adenililada na presença do complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP. É tam- bém acreditado que HCO3" e CO2 representem um papel na reação mediada por catálise de GS adenililada. Imidazol.HCI tem um pKa de 6.92 a 25SC. Sob solução com NH4HCO3, as espécies de imidazólio podem agir como o contraíon para HCO3". Em pH baixo, a dissociação do NH4HCO3 tende à formação de CO2 solúvel e NH3.
<formula>formula see original document page 68</formula>
A dissociação de Imidazol.HCI em solução aquosa é:
<formula>formula see original document page 68</formula>
Em uma solução de 10 mM de Imidazol.HCI contendo 1 mM de NH4HCO3, em pH mais alto, o excesso de Imidazol na solução pode se tor- nar o contraíon para HCO3" criando uma espécie iônica adicional cuja pre- sença é mensurável por análise de condutividade.
<formula>formula see original document page 68</formula>
Portanto no caso sob consideração as condutividades molares observadas, Λ, para os vários níveis de pH são a soma das contribuições dos íons j que compõe o eletrólito, e Yj é a condutividade específica de cada íon.
<formula>formula see original document page 69</formula>
Análise de condutividade foi usada para determinar se a dissoci- ação deste NH4HCO3, em uma solução de tampão de Imidazol a uma razão de concentração de 10 mM Imidazol para 1 mM de NH4HCO3, ainda poderia ser quantificada. Soluções de Imidazol.HCI foram preparadas a uma faixa de valores de pH às quais foi adicionado 1 mM de NH4HCO3, para dar uma concentração final de Imidazol de 10 mm.
Demonstração do Mecanismo Catalítico - Visão Geral
A análise estrutural e modelagem molecular de um complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP indicou que o complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP re- presenta um papel significativo no mecanismo de reação. Foram usados dois métodos para demonstrar o mecanismo de reação. Mutagênese Ioco- dirigida (SDM) foi usada para demonstrar o papel que os aminoácidos fun- damentais representam no sítio ativo da enzima em um processo de transfe- rência de fosforila. SDM foi realizada em His269, His271, Glu207 e Arg356. Como previamente indicado, todos os números de resíduo de aminoácido correspondem aos resíduos de GS de E. colr, alguém versado na técnica poderia determinar os resíduos correspondentes em GS de outras espécies usando técnicas conhecidas, por exemplo, modelagem molecular ou alinha- mentos de homologia. A atividade da enzima de γ-glutamil transferase foi depois determinada para cada enzima mutada e comparada com à da enzi- ma não-mutada. Para obter enzima completamente desadenililada SDM foi realizada no sítio de adenililação da GS, a saber Tyr397 foi mutado para Val397. GS completamente adenililada ou desadenililada foi também obtida pela cultura contínua de E. coli sob condições de qualquer excesso de nitro- gênio e limitação de carbono ou limitação de nitrogênio e excesso de carbo- no como esboçado por Sênior, P. J. (1975) J. Bact. 123: (2), 407-418. A GS completamente adenililada funciona com uma preferência para Mn2+ en- quanto a GS desadenililada tem uma preferência para Mg2+. O segundo método usado para demonstrar o mecanismo de re- ação foi o uso de espectroscopia de RMN para demonstrar as diferenças funcionais que podem ocorrer em reações de transferência de fosforila cata- lisada por ATP usando Mg2+ ou Mn2+ como o íon de metal divalente. Estas reações foram realizadas na ausência da enzima. Dados de relaxamento de RMN de próton indicaram que no caso de Mn2+, o íon de metal divalente po- de estar em proximidade íntima ao anel de adenina e o postulado original foi que este pode desempenhar um papel na catálise. Foi subseqüentemente observado que sob certas condições o próton de Ce do ATP é lábil e que um mecanismo pelo qual este poderia ocorrer é se as ligações de Mn2+ ao C8 formassem um carbeno de metal. É proposto que possível carboxilação do N7 ou protonação do N7 por um HCO3" coordenado possa surgir durante a ligação enzimática dos substratos que induzem uma espécie de imônio em N7. Esta espécie de imônio também facilita a formação de ligação putativa entre o Mn2+ e C8 que formam um carbeno de metal. É proposto que a carga (próton eficaz) seja translocado de um HCO3" coordenado para N7. O mesmo efeito poderia ser mediado pela carboxilação de N7.
Uma vez o carbeno de metal é formado aquele grupo de carboxi- Ia em N7 poderia depois representar um papel na transferência de fosforila que forma um carbóxi-fosfato com o rompimento concomitante abaixo do carbeno de metal. Durante a catálise da enzima o grupo de fosforila é depois transferido por meio das cadeias laterais dos resíduos de aminoácido, His269 e His271, para o glutamato, formando fosfato de γ-glutamila, com Glu207 e Arg356 também desempenhando um papel na catálise. Para de- monstrar o C8-H lábil, os complexos de Mg-ATP, Mn(HC03)2-ATP e MnCI2- ATP foram preparados em D2O e a presença do C8-H foi monitorada através de 1H RMN. A reação inteira foi realizada em D2O porque se o próton de C8 for lábil, o deslocamento de 1H RMN para o próton de C8 desapareceria du- rante o curso da reação como haveria permuta deste próton do ATP com fase de volume, isto é no D2O. A hidrólise de ATP foi também monitorada durante o curso da reação. O papel do próton de C8 na reação foi também demonstrado usando ATP deuterado em C8 no ensaio de glutamina sinteta- se e determinando o efeito isótopo catalítico suscitado. O efeito de isótopo catalítico foi apenas observado operar na reação mediada pela glutamina sintetase adenililada usando Mn2+ e não a glutamina sintetase desadenililada usando Mg2+.
Demonstração do Mecanismo Catalítico - Materiais e Métodos Preparação dos Complexos de Mn(HCO3)2-ATP E MnCI2-ATP
Na2ATP foi dissolvido em água a uma concentração de ξ 80 mm. Os íons de Na+ foram depois removidos do ATP passando a solução para em resina de permuta de cátion forte Dowex 50 WX2 na forma de ácido. A resina Dowex 50 WX2 foi convertida na forma de ácido passando 3 volumes de leito de 50 mM de HCI na coluna e depois lavando a coluna com 5 volu- mes de leito de H2O. Todas as amostras contendo o ácido-ATP foram agru- padas e reagidas com uma concentração molar equivalente de MnCO3, Mg(0H)2.3MgC03.3H20 ou misturadas com MnCI2. As soluções contendo Mg(0H)2.3MgC03.3H20 e MnCO3 foram agitadas até que fosse dissolvido todo o MnCO3 ou Mg(0H)2.3MgC03.3H20. O pH da solução de Mn(HCO3)- ATP foi depois ajustado para pH 6,3-7,0 com NaHCO3. O pH dos complexos de Mg2+ e MnCI2 de ATP foram ajustados com NaOH. Na4ATP foi preparado ajustando o pH de uma solução de 80 mM com NaOH para pH 7,0. A pre- sença dos complexos foi demonstrada usando espectroscopia de massa de eletropulverização (dados não mostrados). A estoiquimetria correta do Mn2+ foi determinada usando ICP (dados não mostrados). A estoiquimetria apro- ximada do HCO3" no complexo de Mn(HCO3 )2-ATP foi determinado mono- metricamente.
O Efeito da Concentração de ATP na Análise de RMN de Complexos de Na4ATP. MnfHCQ3 VATP. Mg-ATP E MnCIp-ATP
Para determinar o impacto da pilha na 1H RMN de ATP o efeito da concentração de ATP de Na4ATP, Mn(HCO3 )2-ATP, Mg-ATP e MnCI2- ATP nos tempos de relaxamento Ti para os prótons de H8, H2, Ήι e H2O foi determinado. O Mn(HCO3 )2-ATP e MnCI2-ATP foram adicionado a Na4ATP e Mg-ATP em 10"3 a concentração. A ATP foi adicionada a uma faixa de concentrações variando de 5 a 120 mM. Análise de RMN de Complexos de Na4ATP, MN(HCO3-)2- ATP, Mg-ATP E MnCl2-ATP
O efeito do complexo de Mn(HCO3-)2-ATP e o complexo de Mn- Cl2-ATP nos tempos de relaxamento T1 longitudinal e T2 transversal para os prótons H8, H2, 'H1 e H2O foi determinado. O complexo de Mn(HCO3 )2-ATP e o complexo de MnCI2-ATP foram adicionados a 60 mM de solução de Na4ATP ou Mg-ATP, para uma concentração de 60 μΜ. A solução de 60 mM de Na4ATP contendo complexos de Mn(HCO3 )2-ATP ou de MnCl2-ATP foi Iiofilizada e armazenada a -20°C e preparada como requerido dissolvendo em D2O. Experimentos de ressonância magnética nuclear para obter os tempos de relaxamento T1 e T2 foram realizados nos complexos de Na4ATP ou Mg-ATP na presença e ausência de Mn(HCO3 )2-ATP ou MnCl2-ATP em um espectrômetro de RMN Varian UNITYplus de 400 MHz. O complexo de Mn(HC03-)2-ATP é com base nas concentrações relativas de Na2HCO3 para MnCO3 para ATP adicionadas às soluções. Os tempos de relaxamento fo- ram determinados a uma faixa de temperaturas.
O efeito da freqüência de RMN nos tempos de relaxamento T1 e T2 é determinado a 200 MHz, 300 MHz, 400 MHz e 500 MHz. Os instrumen- tos usados foram um Varion Gemini200/2000 (200 MHz), Varion Unity Inova 400 (400 MHz) Brüker ARX 300 (300 MHz) e Advance 500 (500 MHz).
Efeito de pH na Dissociação de NH4HCO3 em Tampão de Imidazol
O efeito de pH na dissociação de NH4HCO3 em tampão de Imi- dazol foi determinado. Soluções de NH4HCO3 (1 mM) foi preparado no tam- pão de Imidazol.HCI (10 mM) a uma faixa de níveis de pH. A condutividade de apenas 10 mM de Imidazol.HCI e 10 mM de Imidazol.HCI mais 1 mM de NH4HCO3 nos vários níveis de pH foi também determinada. Todas as solu- ções foram preparadas em água com uma condutividade específica de 18 pS. A condutividade específica foi depois determinada usando um medidor de condutividade Jenway 4150. A diferença nas condutividades específicas das duas relações obtidas é, portanto, compreendida das contribuições das condutividades específicas dos íons, j, compondo a solução de eletrólito. As condutividades molares observadas, ^, nos vários níveis de pH são a soma das condutividades molares individuais.
<formula>formula see original document page 73</formula>
A Taxa de Hidrólise de ATP e a Deuteração de Complexos de C- H8 em Na4ATP, MN(HCO3 )2-ATP1 Mg-ATP e MnCI2-ATP.
Espectroscopia de RMN foi usada para demonstrar que sob cer- tas condições o próton de C8 do ATP é lábil e que este apenas ocorrerá se Mn2+ ligar ao C8. Para demonstrar o C8-H lábil os complexos de Mg-ATP, Mn(HCO3)2-ATP e MnCl2-ATP foram preparados em D2O e a presença do C8-H foi monitorada com o passar do tempo através de 1H RMN. A reação inteira foi realizada em D2O para determinar o efeito de Mn2+ ou Mg2+ na ta- xa de deuteração do próton de C8, porque o deslocamento de 1H RMN para o próton de C8 desapareceria durante o curso da reação como resultado da permuta deste próton com o D2O. A ATP depois será deuterada na posição de C8. A taxa de hidrólise de ATP foi também determinada durante o curso da reação. As reações foram também realizadas usando H2O como o sol- vente. Todas as reações foram realizadas em tampão de Imidazol em pH 6,3 ou pH 7,3. Os experimentos foram realizados a uma concentração de Imida- zol de 20 mM, e as concentrações de NaHCO3, MnCl2 e MgCl2 usadas foram variadas entre O e 12 mM para NaHCO3, e O e 4 mM para MnCI2 e MgCl2. Nos intervalos de tempo especificados 150 μl amostras foram tirados e diluí- dos a 730 μl com D2O ou H2O. EDTA (20 μl) foi adicionado a uma concen- tração de 2,0 mM e as amostras centrifugadas após 10 minutos para remo- ver o íon de metal divalente. A amostra foi depois analisada por 1H RMN e a concentração de ADP determinada por HPLC. Efeito da Concentração de M2+ na Atividade de GS Adenililada e Desadenili- lada
O efeito da concentração de Mn2+ e Mg2+ na atividade de Gs a- denililada e desadenililada foi determinada a uma faixa de concentrações de ATP e a uma faixa de M2+ para razões de ATP. As concentrações de ATP usadas foram 200 μΜ, 400 μΜ, 600 μΜ, 800 μΜ e 1000 μΜ. Em cada con- centração de ATP usada, ou MnCI2 ou MgCI2 foi adicionado a uma concen- tração de 1, 2, 3 ou 4 vezes a concentração de ATP. Os outros componentes do ensaio eram 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaHCO3, 4 mM de NH4CI e 4 mM de L-glutamato NH4CI. Os ensaios realizados usando a glutamina sintetase adenililada foram executados em pH 6,3 enquanto os ensaios rea- lizado usando a glutamina sintetase desadenililada foram executados em pH 7,2. Soluções de ensaio foram imediatamente preparadas frescas antes do uso com NaHCO3 que é o último composto adicionado e o pH sendo ajusta- do imediatamente na adição.
Efeito da Concentração de HCO3" na Atividade de GS Adenililada e Desade- nililada
O efeito da concentração de HCO3" na atividade de GS adenili- lada foi determinado a uma faixa de concentrações de Mn2+. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 4 mM de NH4CI, 600 μΜ de ATP, 1.8 mM de MnCI2 e 4 mM dê L-glutamato e foram realizados em pH 6,3. A con- centração de NaHCO3 foi variada de 1 a 12 pmols de NaHCO3 por pmole de ATP. Os ensaios não foram realizados usando GS desadenililada visto que a precipitação de concentrações de carbonato alta do Mg2+ ocorreu. Efeito de ATP Deuterada na Posição C-8 e 13C HCO3- na Atividade Específi- ca de GS ADENILILADA
Na2ATP foi deuterada pela adição de 20 mM de Na2ATP para uma solução de 50 mM de trietanloamina em D2O a 60SC durante 96 horas. A amostra foi depois Iiofilizada e armazenada a -202C e dissolvida em água quando requerido. A ATP deuterado foi depois purificada usando uma coluna de fase reversa Luna C18 (250 mm por 25,2 mm) usando acetato de amônio como a fase móvel a uma taxa de fluxo de 7,0 ml/minuto. As amostras foram depois agrupadas e secadas por refrigeração para remover a fase móvel. A ATP resultante foi depois verificada para deuteração completa na posição de C8.
O efeito da concentração de ATP deuterado na posição C-8 na atividade de GS adenililada foi determinado. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de L-glutamato e 4 mM de NH4CI e foram realizados em pH 6,3. Os ensaios não foram realizados u- sando GS desadenililada como nenhum efeito foi observado na atividade específica de GS desadenililada como resultado da deuteração de ATP na posição C-8 (dados não mostrados).
O efeito de Nai3HC03 na atividade específica de glutamina sin- tetase foi também determinado na presença de ATP deuterados e não- deuterada. Os ensaios continham, 20 mM de Imidazol.HCI, 12 mM de NaH- CO3 (ou Nai3HCO3) e 4 mM de L-glutamato e 4 mM de NH4CI e foram reali- zados em pH 6,3. Os ensaios foram operados a 800 mM de ATP comparan- do ATP deuterado na posição Ce com ATP de abundância natural.
Cepas Bacterianas e Meios
As cepas bacterianas e vetores usados são esboçados na TA- BELA 1. Todas as cepas bacterianas foram crio-preservadas a -70-C em uma solução de 38 % m/v de glicerol. Todas as culturas de E. coli foram mantidas em meio de LM (5 g/l de NaCI, 10 g/l de extrato de levedura, 10 g/l de triptona; pH 7,2) a menos que do contrário declarado. Ágar foi adicionado a uma concentração de 15 g/l quando requerido. O meio foi suplementado com 50 pg/ml de ampicilina ou 12,5 pg/ml de tetraciclina para pAlter-1, e com 100 pg/ml de ampicilina para pBluescript Il SK+.
O crescimento das cepas mutantes em meios mínimos foi feito usando meios M9, contendo sais de traço. Os sais de traço foram prepara- dos em 0,1 N de HCI e compreendidos dos seguintes (expressos por litro de solução): 3,5 g de FeS04.7H20, 0,5 g de MnSO4-H2O, 0.11 g de Na2B4O7-IOH2O, 0,13 g de Na2Mo04.2H20, 1,1 g de ZnSO4, 0,1 g de Cu- S04.5H20 e FeCI3.6H20. Antes do uso, os sais de traço foram diluídos em um volume igual de 0,1 N de NaOH e adicionados a uma concentração de 20 mL por litro de meios M9. antibióticos de ampicilina e tetraciclina foram adicionados aos meios onde requerido a uma concentração de 50 pg.mL"1 e 12,5 pg.mL"1, respectivamente.
Tabela 1
<table>table see original document page 75</column></row><table> <table>table see original document page 76</column></row><table>
Isolamento do Gene de glnA e a Construção dos Vetores
DNA foi isolado em uma escala pequena usando QiaPrep Spin Miniprep Kit™ (Qiagen) ou através de Iise alcalina (Sambrook, J. Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2- ed., Cold Spring Habor Laboratory). Amplos isolamentos de DNA foram executa- dos usando o kit de Isolamento de DNA Qiagen Midi (Qiagen). Digestão de DNA foi realizada usando enzimas de restrição compradas de Amersham Biosciences e usadas de acordo com as instruções do fabricante. Fosfatase alcalina foi obtida de Amersham Biosciences. T4 DNA Ligase foi obtida de Promega e usada como pelo protocolo provido com a enzima. Agarose usa- da para eletroforese de DNA foi do tipo de biologia molecular.
Taq polimerase (rTaq) foi obtida de TaKaRa Bio Inc. e foi usada para propósitos de triagem gerais. Taq polimerase de fidelidade alta (ExTaq) foi também obtida de TaKaRa Bio e foi usada para amplificar os genes para clonagem.
Digestão de restrição e eletroforese em gel de agarose foram realizados usando procedimentos padrões (Sambrook, J. Fritsch, E. F. e T. Maniatis (1989) Em: Molecular Cloning: A Laboratory Manual., 2a ed. Cold Spring Habor Laboratory Press). Uma escada de DNA de 1 kb foi usada para toda eletroforese.
Mutagênese loco-dirigida foi realizada usando o Kit de Mutagê- nese in vitro de Sítios Alterados de Promega Corporation, ou o kit de Muta- gênese Loco-Direcionada QuikChange XL de Stratagene, como pelos proto- colos fornecidos com cada kit.
Todas químicas foram de tipo de biologia analítica ou molecular e foram usadas sem outra purificação. Todas as químicas foram obtidas de Merck ou Sigma a menos que do contrário declarado.
Clonagem do Gene de Glutamina Sintetase de E. Coli
Iniciadores foram projetados para a seqüência do gene de glnA de E. coli obtido de Genbank (Número de Acesso X05173). Os iniciadores foram projetados com sítios de restrição Nsil (mostrado em tipo negrito) nas terminações 5'. Os iniciadores são mostrados abaixo:
iniciador 5': 5' - GATATGCATCCGTCAAATGCG -3' (SEQ ID NO: 1) iniciador 3': 5' - GCGATGCATAAAGTTTCCACGG - 3' (SEQ ID N0:2)
PCR foi executada usando o DNA de pGLn6 como o modelo e os iniciadores acima. A mistura de PCR continha 1 μl de DNA de plasmídeo (50 ng), 5 μl de cada iniciador (2,5 pmol/μl), 4 μl de 2,5 mM de dNTP's, 5 μl de 10X tampão contendo 20 mM de MgCI2 e 0,5 μl de Taq polimerase de fidelidade alta (2,5 unidades).
PCR foi conduzida com a desnaturação inicial do DNA modelo a 95°C durante 5 minutos, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 95°C du- rante 5 minutos, anelamento a 55°C durante 1 minuto e alongamento a 72°C durante 2 minutos. Uma etapa de alongamento final de 72QC durante 10 mi- nutos foi também incorporada no perfil. Eletroforese em gel de agarose foi realizada para verificar o tamanho de fragmento produzido por PCR. O pro- duto de PCR foi purificado usando o Kit de Purificação de PCR HighPure (Roche Diagnostics), e submetido à digestão com Nsil.
Para construção do modelo para SDM com o Sistema de Sítios Alterados, pAlter-1 foi Iinearizado com PstI e desfoforilado antes da ligação. Inserção e vetor foram ligados a uma razão de inserção:vetor de 3:1.
A reação de ligação foi transformada em JM109 de E. coli atra- vés de eletroporação usando um Pulsador de Gene Bio-Rad, como pelas instruções do fabricante. Os transformantes foram selecionados em Ágar de LM suplementado com 12,5 pg/ml de tetraciclina, 80 pg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG.
Várias colônias brancas obtidas nas placas de transformação foram depois tríadas isolando o DNA usando Iise alcalina, seguido por diges- tão e eletroforese em gel de agarose. Seqüenciação foi realizada para con- firmar a presença e seqüência do gene de glnA de E. coli. Além do uso dos iniciadores universais M13/F e M13/R, iniciadores internos gene-específicos foram projetados da seqüência conhecida do gene. Estes estão mostrados na TABELA 2.
TABELA 2. INICIADORES SEQÜÊNCIA-ESPECÍFICOS USADOS PARA SEQÜENCIAÇÃO DO GENE CLONADO DE glnA DE E. Coli
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Para construção do modelo para SDM com o Sistema de Quik- Change™, o gene de glutamina sintetase foi subclonado da construção de pAlter como um fragmento de Sad-HincHW. A banda contendo o gene de gl- nA foi excisada do gel usando uma lâmina de escalpelo, e empurrada atra- vés de uma seringa de 2 ml para um tubo de Eppendorf, para esmagar a agarose. 1 ml de fenol (equilibrado em pH 8,0) foi adicionado ao tubo e a suspensão foi depois submetida a vórtice durante 1 minuto. A amostra foi congelada a -70QC durante pelo menos 30 minutos. Uma vez a amostra tinha descongelado, foi centrifugada a 13 000 rpm em um microcentrífuga de Ep- pendorf durante 15 minutos. A fase aquosa foi removida para um tubo limpo e depois extraída uma vez com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), e depois uma vez com clorofórmio:álcool isoamílico (24:1). O DNA foi preci- pitado de etanol e ressuspenso em tampão de TE. Este fragmento foi depois ligado em pBluescript Il SK+, também digerido com Sacl e Hind\II, a uma in- serção para razão de vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada em XL1 -BIue de E. coli através de eletroporação, e banhada em placas de ágar LM contendo 100 pg/ml de ampicilina. Colônias de transformantes simples foram triadas isolando DNA do plasmídeo usando Iise alcalina, digerindo o DNA com SamHI e subseqüentemente analisando os fragmentos através de eletroforese em gel de agarose.
Mutaqênese Loco-Diriqida (SDM)
DNA do gene de glnA do tipo selvagem em pAlter-1 foi isolado de jm109 de E. coli usando o kit Qiagen Midi Prep. Os oligonucleotídeos pro- jetados para realizar a mutagênese do gene de glnA usando este sistema estão listados na TABELA 3. Mutações silenciosas que incorporam um sítio de restrição para facilitar a triagem primária para a mutação foram embutidas nos oligonucleotídeos de SDM. Estas estão também mostradas na TABELA 3.
Tabela 3. Mutações realizadas no gene de glnA de E.coli usando o Sistema de Altered Sites™. As mutações para alterar os resíduos de aminoácido es- tao mostradas em tipo negrito e os sitios de restricao estao sublinhados.
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Seguindo mutagênese, colônias simples foram triadas para a mutação de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e exe- cutando análise de restrição com a enzima para a mutação particular sendo tríada.
Expressão de Gene Mutante
Genes mutantes foram isolados dos clones de pAlter-1 através de digestão com Sacl e HindIII. Os digestos foram depois submetidos à ele- troforese em gel de agarose para separar as bandas de vetor e de inserção. A banda contendo os genes foi excisada do gel e o DNA extraído usando fenol como descrito acima.
pBluescript II SK+ foi digerido com Sacl e HindIII, e cada gene mutante foi depois ligado neste vetor a uma razão de inserção:vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada na cepa auxotrófica de glutamina sinte- tase de YMC11 de E. coli por eletroporação e os transformantes foram sele- cionados em LM Ágar suplementado com 50 Mg/ml de ampicilina.
Colônias simples obtidas nas placas de transformação foram submetidas a um procedimento de triagem usando PCR usando os iniciado- res universais M13/F e M13/R. Neste procedimento, as colônias simples fo- ram ressuspensas em 20 μl de água destilada. 1 μl desta suspensão de co- lônia foi adicionado a uma reação de PCR contendo 2,5 μl de cada iniciador (2,5 pmol/μΙ), 2 μl de 2,5 mM de dNTP's, 2,5 μl de 10X tampão, 2 μl de 25 mM de MgCI2 e 0.1 μl de Taq polimerase (0,5u). Os ciclos de PCR foram realizados como descrito acima. Os produtos de PCR foram subseqüente- mente separados através de eletroforese em gel de agarose, e transforman- tes positivos selecionados em base do tamanho de banda correto. Um con- trole positivo e um controle negativo foram incorporados no processo para verificar os resultados obtidos.
Mutaqênese de Quickchanqe™
DNA dos modelos selecionados (construções de pBluescript) foi isolado de XLI-BIue de E. coli usando o kit de Qiagen MidiPrep. Os oligonu- cleotídeos projetados para realizar a SDM usando este sistema estão lista- dos na TABELA 4. Como este é um sistema baseado em PCR, dois oligonu- cleotídeos (sense e antissense) são requeridos para cada reação. Tabela 4. Mutações Realizadas no Gene de glnA de E.coli Usando o Siste- ma de Quikchange. As Mutações para Alterar os Resíduos de Aminoácido estão Mostradas em Tipo Negrito e Sítios de Restrição estão Sublinhados.
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Seguindo mutagênese, colônias simples foram tríadas para a mutação de escolha isolando o DNA de uma cultura durante a noite, e executando análi- se de restrição com a enzima para a mutação particular sendo triada. Mutan- tes positivos obtidos foram transformados com o Sistema de QuikChange™ em YMC11 de E. coli para propósitos de expressão.
Confirmação de Mutação
Seqüenciação para confirmar cada mutação foi terceirizada. Iniciadores ge- ne-específicos diretos e reveros foram projetados da seqüência conhecida do gene para este propósito. Estes estão mostrados na TABELA 5. Tabela 5. Iniciadores Seqüência-Específicos Usados para Confirmar a Pre- sença das Várias Mutações no Gene de glnA de E.coli_
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Resultados
Clonagem do Gene de Glutamina Sintetase de E. coli
O gene de glnA do tipo selvagem de E. coli foi amplificado como um fragmento de 2,1 kb, codificando uma proteína de 471 aminoácidos em comprimento. O gene de glnA amplificado por PCR de 2124 bp contendo os sítios de restrição de flanqueamento de Nsil foi ligado no vetor de SDM pAl- ter-1 digerido com PstI a uma razão de inserção:vetor de 3:1. O DNA foi iso- lado de vários transformantes e submetido à análise de restrição usando BamHI e EcoRI. De acordo com a seqüência conhecida do gene e o vetor, restrição de uma construção (com o gene de glnA na orientação correta re- querida 5' para 3') com SamHI, deveria produzir fragmentos de 6012 bp e 1797 bp. Uma construção correta foi assim identificada, e nomeada pGln12.
Para construção do modelo do tipo selvagem para a mutagêne- se usando o Sistema de QuikChange™, o gene de glnA foi excisado de p- Gln12 como um fragmento de SacI-HindIII, e ligado em pBluescript similar- mente digerido II SK+ a uma razão de inserção:vetor de 3:1. A reação de ligação foi transformada em XL1 -BIue de E. coli e banhado em LM ágar su- plementado com 100 pg/ml de ampicilina, 80 μg/ml de X-Gal e 1 mM de IPTG. O DNA foi isolado de várias colônias brancas e submetido à análise de restrição com Sacl e HindIII e BamHI para identificar um subclone positi- vo. Uma construção correta foi identificada desse modo e nomeada pBSK- ECgln. Análise de seqüência foi executada em ambos os clones para verifi- car a integridade do gene do tipo selvagem antes de qualquer SDM fosse realizado.
Mutaqênese Loco-Dirigida (SDM)
Sistema de Altered Sites™
A mutagênese dirigida foi realizada como pelo protocolo descrito acima. DNA isolado dos mutantes foi digerido usando a enzima específica para a mutação, e fracionada em tamanho para confirmar a presença da mu- tação.
Em todos os casos, a construção do tipo selvagem (pGln12) foi digerida com a mesma enzima como um controle comparativo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição introduzidos e tamanhos de frag- mento esperados estão esboçadas na TABELA 6.
Tabela 6. Lista de Mutações Introduzidas em PGLN12 com o Sistema de Sitios Alterados, Mostrando os Fragmentos de Restricao Esperados.
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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções, como os tamanhos de fragmento DNA esperados foram obtidos.
Expressão de Gene Mutante
Os genes mutantes (de pAlter) foram subclonados em pBlues- cript II SK+ e transformados em YMC11 de E. coli, para facilitar a purificação da proteína e estudos da enzima. A presença dos genes subclonados no vetor foi confirmada através de triagem de PCR. Colônias de transformantes contendo os genes de glnA mutante foram detectadas como uma banda de 2170 bp em um gel de agarose. Um controle negativo que consiste no vetor transformado em YMC11 de E. coli foi incluído nas triagens de PCR, e apa- receu no gel como uma banda no tamanho do sítio de clonagem de vetor múltiplo. Um controle positivo de DNA de pBSK-ECgln, também em YMC11 de E. coli, foi incluído. Este apareceu no gel como uma banda no mesmo tamanho que qualquer subclones mutantes positivos. O DNA de um subclo- ne simples de cada mutante identificado desse modo foi depois digerido com a enzima de restrição específica para a mutação para confirmar a presença da mutação específica.
Tabela 7. Esboço dos Fragmentos de Restrição Esperados dos Subclones Mutantes de glnA.
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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções nos subclones, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados. Mutaaênese de "Quickchanae"
SDM usando o Sistema de "QuickChange" foi realizada confor- me o protocolo exposto acima. DNA foi isolado dos possíveis mutantes, di- gerido usando a enzima específica para a mutação, e fracionado em tama- nho para confirmar a presença da mutação. Um controle que consiste no modelo de origem foi digerido com a mesma enzima como um controle com- parativo. As mutações com seus respectivos sítios de restrição e tamanhos de fragmento esperados estão esboçadas na TABELA 8. pBSK-ECgln foi usado como o modelo para as mutações de E207T, H269N, H271N e ER355Q. Os mutantes duplos E207T Y397V, H269N Y397V, H271N Y397V e R355Q Y397V foram produzidos em pBSK-Y397V. Tabela 8. Lista de Mutações Introduzidas em Vários Modelos com o Sistema de Quikchange, Mostrando os Fragmentos de Restrição Esperados.
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Eletroforese em gel de agarose confirmou a presença das muta- ções, como os tamanhos de fragmento de DNA esperados foram obtidos. Ensaios da Enzima
A atividade da enzima de γ-glutamil transferase de GS foi deter- minada usando o método padrão como esboçado por Stadtman E. R., et al. (1970) Adv Enzyme Reg: 8: 99-118. Homogeneidade da enzima foi demons- trada usando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). A taxa de rea- ção direta da atividade de GS foi determinada através de Cromatografia Lí- quida de Pressão Alta (HPLC) medindo a taxa de formação de glutamina e ADP. A reação direta de GS continha (a menos que do contrário definido): 11 mM de (NH4)HPO4, 1,0 mM de glutamato e 1,0 mM de complexo de M2+-
ATP (isto é Na2Mn(HCO3)2-ATP, Na2Mg-ATP ou Na2MnCI2-ATP). As reações foram realizadas em pH 6,3 ou pH 7,2. Purificação da Glutamina Sintetase de E. coli.
Todas as construções recombinantes usadas para o isolamento de GS foram cultivadas em um meio de M9 modificado (6 g/l de Na2HPO4, 3 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de NaCI) suplementado com 70 mM de L-glutamato, 5 mM de L-glutamina e 100 Mg/ml de ampicilina. Todas as culturas foram incu- badas a 37-C durante 48 horas com agitação a 220 rpm. As células foram colhidas do meio de cultura através de centrifugação a 10 000 rpm a 4QC. A biomassa foi depois usada fresca ou armazenada a -20gC até requerido. A- lém disso, a glutamina sintetase do tipo selvagem (de pBSK-ECgln de E. coli) foi purificada na forma adenililada e desadenililada, da biomassa obtida de cultura contínua como esboçado por (Sênior, P. J. (1975). J. Bact: 123. (2), 407-418).
Enzima adenililada foi produzida sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono, enquanto a enzima desadenililada foi pro- duzida sob condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbono. As células obtidas foram colhidas através de centrifugação a 10.000 rpm duran- te 10 minutos a 49C, e armazenadas a -209C até requerido.
O método usado para a purificação de glutamina sintetase foi desenvolvido do método de Shapiro e Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922.
A biomassa de 1 litro de cultura, foi ressuspensa em 10 ml de Tampão de Ressuspensão A ou (RBA) (10 mM de Imidazol-HCI, 2 mM de β- mercaptoetanol, 10 mM de MnCI2.4H20; pH 7,0). As células foram sonicadas durante 10 minutos em um ciclo de trabalho de 50 % a 6eC. Esta solução sonicada foi centrifugada durante 10 minutos a 10 000 rpm, e o sobrenadan- te foi retido. Sulfato de estreptomicina foi adicionado (10 % de uns 10 % p/v), e a suspensão foi agitada a 4QC durante 10 minutos. Centrifugação foi de- pois realizada a 10.000 por 10 minutos e o sobrenadante foi retido. O pH do sobrenadante foi ajustado a 5,15 com ácido sulfúrico. Esta mistura foi agita- da a 4ÕC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. Novamente, o sobrenadante foi retido. Sulfato de amônio saturado (30 % em volume) foi adicionado e o pH foi ajustado a 4,6 com ácido sulfúri- co. A suspensão foi agitada a 4QC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O precipitado obtido foi ressuspenso em 2-5 ml de RBA e o pH ajustado para 5,7 com ácido sulfúrico. Esta suspensão foi agitada durante a noite a 49C para permitir a glutamina sintetase ser res- suspensa, e depois centrifugada a 13 000 rpm durante 10 minutos. O sobre- nadante foi retido e o pH das suspensões foi ajustado para 7,0.
Outra purificação do tipo selvagem foi alcançada através do uso de cromatografia de afinidade usando um AKTA Explorer (Amersham Bios- ciences). Separação foi alcançada com resina de 5ΆΜΡ Sepharose 4b (A- mersham Biosciences) com uma coluna de HR10/10 tendo um comprimento de 10 cm e um diâmetro interno de 10 mm. A preparação da enzima de glu- tamina sintetase parcialmente purificada (cerca de 2 ml) foi carregada sobre a coluna preparada que foi equilibrada com 10 mM de Imidazol (pH 7,0), 150 mM de NaCI e 10 mM de MnCI2.4H20. A glutamina sintetase ligada foi eluída da coluna com 2,5 mM de ADP ao longo de uns 40 ml de gradiente linear de 150 a 500 mM de NaCI, e 1 ml de frações foi colhido. As frações contendo glutamina sintetase pura foram depois agrupadas e dialisadas durante a noi- te junto de RBA.
Uma alíquota de cada suspensão de proteína foi submetida à eletroforese em um gel a 7,5 % de SDS PAGE de acordo com os protocolos padrões. Concentração da proteína foi determinada usando o método de determinação de proteína Lowry, e a concentração foi usada determinando todas as atividades específicas da enzima.
Mutaqênese Loco-Dirigida de Glutamina Sintetase (GS) de Escherichia coli Análise de Seqüência de GS e Modelagem Molecular de Proteína
Comparações de homologia de seqüência de proteína foram realizadas usando DNAMAN (Lynnon Biosoft, Quebec, Canadá). O Accelrys Inc., software de modelagem molecular (MSI Inc., San Diego, USA), foi usa- do para toda a modelagem molecular da proteína usando um processador Silicon Graphics Octane.
Demonstração do mecanismo cataiítico - resultados e debate Análise estrutural de ATP
O Efeito da Concentração de ATP na Análise de RMN de Complexos de NajATP. MnfHCO3VATP. Mg-ATP E MnCIp-ATP
Para determinar o impacto do empilhamento de ATP na solução na 1H RMN de ATP, o efeito da concentração de ATP (Na4ATP ou Mg-ATP), na presença de Mn(HCO3)2-ATP ou MnCl2-ATP nos tempos de relaxamento Ti para os prótons de H8, H2, 'H1 e H2O foram determinados. O Mn(HCO3 )2- ATP e MnCI2-ATP foi adicionado a Na4ATP e Mg-ATP a 10"3 de concentra- ção do Na4ATP ou Mg-ATP. A ATP foi adicionada a uma faixa de concentra- ções que variam de 5 a 120 mm. Houve um aumento linear no 1/pT1p como resultado do aumento na concentração até uma concentração de ATP de 60 mmols. Destes dados foi decidido que todas as análises para determinar taxas de relaxamento T1 e T2 deveriam ser realizadas a uma concentração de ATP de 60 μmolarou Na4ATP e Mg-ATP e 60 pmolar de MnCI2-ATP ou Mn(HCO3)2-ATP.
Efeito da Temperatura e Freqüência nas Taxas de Relaxamento de PTip1 e PT2P"
Taxas de relaxamento Ti e T2 para o complexo de Mn(HCO3)2- ATP, o complexo de MnCI2-ATP e Na4ATP a 400 MHz com um espectrôme- tro de RMN Varian UNITYpIus de 400 MHz. Os experimentos foram feitos a uma faixa de temperaturas e as taxas de relaxamento de PT1P"1 e pT2p"1 para os prótons H8, H2, 'H1 e H2O foram representadas em gráfico contra 1000/K. Por definição, se as taxas de relaxamento diminuírem com temperatura crescente, então T1M e T2M ou relaxamento de esfera externa determinam pTip"1 e pT2p"1. Relaxamento de esfera externa pode ser regido pelos pró- tons H2 e H-i, tanto no complexo de Mn(HCO3)2-ATP com no complexo de MnCl2-ATP como a energia de ativação é maior que 4 kcal/mol e T1p > 7/6 T2P. Comportamento do próton de H8 para ambos os complexos de Mn(HCO3)2-ATP e de MnCI2-ATP parece ser diferente.
Pareceu não haver nenhum efeito da temperatura no diagrama de Tip1 versus 1000/K para o próton de H8 do complexo de MnCI2-ATP entre 25°C e 35°C (1000/K entre 3,20 e 3,35). No caso do complexo de Mn(HCO3)2-ATP, o diagrama de H8 de T1P"1 versus 1000/K aumentou entre 25°C e 35°C e depois diminuiu. Para explicar este aumento, se a permuta de ligando dominar as taxas de relaxamento então 1/tm (a taxa de permuta de ligando entre a forma ligada e não-ligada) domina as taxas de relaxamento T1P"1 e T1P"2. Se Xm dominar TiP, então tM > T1M, e uma vez que T2M £ T1M, então Xm deve também dominar T2P, por conseguinte T1P'1 = T2p"1. Este não é o caso como T2P"1 / T1P"1 é significativamente menor que 1. Como Xm diminu- indo com temperatura crescente, T1P"1 e T2p"1 têm que aumentar com a tem- peratura crescente. Considerando que Xm é independente da freqüência em um diagrama de T1P"1 ou T2P'1 versus freqüência, T1P"1 e T2P"1 deveriam ser independentes da freqüência. Se as taxas de relaxamento observadas forem dependentes da freqüência, então os processos de taxa diferentes de per- muta química fazem uma contribuição significativa para T1p. A determinação de T1P e T2p versus freqüência para ambos os complexos de Mn(HCO3)2- ATP e de MnCI2-ATP indicou uma dependência da freqüência. A regressão linear dos dados foi usada para calcular a razão do declive para a interseção para calcular xc2. Processos de taxa diferentes de permuta química, portanto, compõem a contribuição principal para T1p.
Ambos os prótons H2 e Hi no complexo de Mn(HCO3)2-ATP e de MnCI2-ATP exibiu dependência de freqüência como também uma diminuição na taxa de relaxamento T1P"1 com temperatura crescente. Esta dependência negativa do coeficiente de temperaturas indica que 1/xM não pode ser a taxa que limita o processo uma vez que as taxas de permuta química têm coefici- entes de temperatura positivos. Portanto Τ1Ρ'1 é determinado por T-im que por sua vez é determinado por xr, xs ou χμ. Em geral xr e Tm diminuem (1/xr e 1/xm aumentam) porém com a temperatura, xs para complexos de Mn2+ porém pode aumentar ou diminuir.
Como o diagrama de T1P"1 versus temperatura para o próton de H8 foi observado aumentar e depois diminuir e o Tim mostrou uma depen- dência de freqüência positiva, o efeito das temperaturas no tempo de rela- xamento do giro do elétron pelo complexo de Mn(HCO3)2-ATP e complexo de MnCl2-ATP foi determinado (dados não mostrados). Os tempos de rela- xamento do giro de elétron foram observados ser da ordem de 1,5 χ 10"9 seg. Se xc for mais curto que xs, então permuta rápida não está ocorrendo e T1M não é determinado por xs. Uma comparação dos tempos de correlação, calculados da dependência de freqüência de T1P por cada próton e o tempo de relaxamento do giro de elétron é esboçada na TABELA 9. Como T1p"1 é uma função de freqüência xc, q e r podem ser calculados das equações 1 e 3. É acreditado que a dinâmica molecular destes complexos de ATP seja percebida na faixa de temperatura usada e que como a temperatura tende para 35°C o manganês no complexo de Mn(HCO3)2-ATP alcança um ponto de proximidade mais íntima ao carbono de C8 do ATP. Isto é confirmado pe- las distâncias interatômicas que foram calculadas usando a equação de So- lomon-Bloemgergen. A presença de bicarbonato também parece representar um papel significativo na estrutura do complexo de ATP uma vez os dados obtidos para o comportamento do próton de C8 foram diferentes na presença de bicarbonato que na presença de cloreto. Isto é especialmente verdade no caso do pT2p"1. A distância interatômica de C8-H foi também mais próxima na presença de bicarbonato. O valor de T2M tem contribuições significativas de ambas as interações escalares transmitidas através das ligações químicas e das interações bipolares que operam por espaço. T1M apenas tem a contri- buição dipolar. T1M e T2M ficam quase iguais quando a constante hiperfina, A, é pequeno ou nenhuma ligação química existe entre o núcleo sob observa- ção e a espécie paramagnética. No caso do próton de C8 o valor de T2P"1 / Tip"1 é significativamente mais baixo para o complexo de Mn(HC03)2-ATP que o complexo de MnCI2-ATP. É proposto que este seja um resultado da interação íntima do Mn2+ e os orbitais π do anel de adenina no caso do com- plexo de Mn(HCO3)2-ATP.
Dos dados de distância interatômica a presença de Mn2+ e HCO3" parece fazer uma diferença significativa no método do Mn2+ para o próton de Ce em todas as temperaturas testadas.
Tabela 9. O Efeito da Temperatura nos Tempos de Correlação Dipolar para o Complexo de Mn(HCO3)2-ATΡ e ο Complexo de MnCl2-ATP. <table>table see original document page 91</column></row><table>
Tabela 10. O efeito da temperatura nas distâncias interatômicas de próton de Mn2+ para o complexo de Mn(HCO3)2-ATP e o complexo de MnCI2-ATP.
<table>table see original document page 91</column></row><table> A estrutura do complexo de Mn(HCO3)2-ATP é fundamentalmen- te diferente à estrutura do complexo de MgATP; especificamente, a co- ordenação do íon de metal sobre o carbono de C3. Esta estrutura foi usada no programa de projeto de fármaco racional baseado em ligando usando o software de conjunto de Accelrys.
O EFEITO DO [Mn2+], [Mg2+] E [HCO3"] NA DEUTERAÇÃO DO C8 DE ATP E NA HIDRÓLISE DEATP
Em pH 6,3, a taxa de hidrólise de ATP é dependente da concen- tração e presença de Mn2+. O Na2ATP, NaHCO3 e Na2ATP1 NaHCO3, MgCI2 e Na2ATP sozinhos todos pareciam ter as mesmas taxas de hidrólise. Na solução contendo MgCI2 e NaHCO3 um erro nos dados ocorreu ao término do experimento como resultado da precipitação do carbonato de magnésio. A adição de Mn2+ pareceu aumentar a taxa de hidrólise significativamente. A concentração de NaHCO3 também pareceu representar um papel visto que a taxa de hidrólise da solução contendo 2 NaHCO3 e 2 MnCI2 foi mais alta que a solução contendo 1 NaHCO3 e 2 MnCI2.
O efeito de NaHCO3, MnCI2, MgCI2 e D2O na taxa de hidrólise de ATP em pH 6,3 e 7,3 a 37eC foi determinado por 336 horas. A taxa de hidró- lise foi calculada de uma análise de regressão dos dados (TABELAS 11 e 12). Os dados foram calculados de 5 pontos de dados e 4 amostras por pon- to de dados para cada concentração usada durante as 336 horas. Reações K e U em cada pH foram realizadas usando D2O como o solvente.
O dobramento da concentração de Imidazol eficazmente dobrou a taxa de hidrólise. O efeito da concentração de Mn2+ na diferença da taxa de hidrólise é maior em pH 6,3 que em pH 7,3. A taxa de hidrólise na ausên- cia de íons de metal é maior em pH 7,3 que pH 6,3 devido à hidrólise por OH", porém o efeito de HCO3" e Mn2+ é reduzido no pH mais alto. O efeito de Mn2+ é evidente ao comparar as taxas de reação na presença de 3 íons de manganês. A taxa de hidrólise aumenta na presença de Mg2+ em pH 7,3 mais alto que em pH 6,3 na ausência de HCO3". A presença de HCO3" tam- bém aumenta a taxa de hidrólise na presença de Mg2+ em pH 7,3. O efeito de HCO3" na taxa de hidrólise na presença de Mg2+ em pH 6,3 não pôde ser apurado como resultado da precipitação de MgHCO3. A presença de D2O aumenta a taxa de hidrólise em pH 6,3.
O dobramento da concentração de NaHCO3 aumenta a taxa de deuteração em cada concentração de Mn2+ equivalente. Em baixas concen- trações de carbonato, a taxa de hidrólise do ATP é claramente dependente da concentração de Mn2+. Deuteração é portanto dependente da concentração de carbonato. As concentrações de NaHCO3 altas na taxa de hidrólise do ATP não parece ser dependente da concentração de Mn2+; porém na razão de concentração de Mn2+ para ATP de menos que 3 a 1, isto é, 2Mn2+:ATP e 1 Mn2+:ATP, as taxas de hidrólise e taxas de deuteração não foram lineares. A razão de concentração de Mn2+ para ATP claramente tem um efeito.
Tabela 11. O efeito de concentrações de NaHCO3, MnCI2 e MgCI2 e D2O na 1taxa de hidrólise de ATP. Ensaios A-L continham 10 mM de Imidazol e 1 mM de ATP enquanto ensaios M-U continham 20 mM de Imidazol e 1 mM de ATP. Os ensaios foram realizados em pH 6,3 e 379C. Reações KeU conti- nham D2O como o solvente. Reações foram realizadas por 336 horas e os dados calculados em 5 pontos de dados. A cada ponto de dados 4 análises foram feitas por amostra. Precipitação ocorreu na reação J como resultado da presença de Mg2+ e carbonato. Concentrações de NaHCO3, MnCI2 ou MgCI2 usadas são como indicado.
<table>table see original document page 93</column></row><table> <table>table see original document page 94</column></row><table>
Tabela 12. O efeito de NaHCO3, MnCI2, MgCI2 e D2O na taxa de hidrólise de ATP. Ensaio continha 10 mM de Imidazol e 1 mM de ATP e foi realizado em pH 7,3 e 37-C. Reações KeL continham D2O como o solvente. Reações foram realizadas por 336 horas e os dados calculados em 5 pontos de da- dos. A cada ponto de dados 4 análises foram feitas por amostra. Precipita- cao ocorreu em reacao J como resultado da presenca de Mg2+ e carbonato
<table>table see original document page 94</column></row><table> Como resultado dos dados obtidos nos requerimentos da enzima de GS para Mn2+ e HCO3- (vide abaixo) o efeito do [Mn2+] e [HCO3-] na taxa de hidrólise e deuteração do ATP para o C8-H foi determinado em concentrações mais altas. Em uma estoiquiometria de 6 HCO3- para 3 Mn2+ para 1 ATP a taxa de hidrólise foi mais alta que na ausência de íon de metal; porém hidróli- se e deuteração foram ambas observadas não serem lineares. Em uma estoi- quiometria de 12 HCO3- para 3 Mn2+ para 1 ATP a taxa de hidrólise e as taxas de deuteração foram ambas observadas serem lineares. Os dados foram ob- servados não serem lineares a uma estoiquiometria de 12 HCO3- para 1 Mn2+ para 1 ATP novamente. Como esboçado nos dados da enzima de GS1 é a- creditado que um complexo estável pareça ser formado de Mn2+3(HC03-)i2- ATP. Isto foi também observado ser o caso na enzimologia de GS adenililada (vide abaixo). A taxa de deuteração e a taxa de hidrólise na ausência de HCO3- ou Mn2+ são iguais a na presença de HCO3- em si. A hidrólise de ATP ou poderia ser realizada por H2O ou por meio de outro mecanismo envolven- do um CO2 coordenado. É concebível que o CO2 coordenado forme um inter- mediário carboxilado em N7 e este intermediário carboxilado depois ataca o ?- fosfato, hidrolisando-o formando um carboxifosfato.
Uma comparação da taxa de deuteração a 12 HCO3- e 3 Mn2+ e 6 HCO3- e 3 Mn2+ indicou que a taxa de deuteração foi mais alta na presença de 12 HCO3-. Em nenhum dos casos são as taxas de equivalente de hidróli- se equivalentes às taxas de deuteração, e em ambos os casos deuteração é mais rápida que hidrólise. O Mn2+ e HCO3- representam um papel em deute- ração e hidrólise obtendo taxas equivalentes porém depende de obter a es- tereoquímica exata da coordenação do Mn2+ e do HCO3- requerida para hi- drólise e deuteração. É proposto que isto seja facilitado pela presença de cadeias laterais fundamentais em glutamina sintetase. Efeito do pH na Dissociação de NH4HCQ3 em Tampão de Imidazol
O efeito do pH na condutividade específica de 10 mM de Imida- zol.HCl e 10 mM de Imidazol.HCI contendo 1 mM de NH4HCO3 foi determi- nado. A diferença nas condutividades específicas entre os dois conjuntos de dados foi usada para calcular a contribuição da condutividade molar da dis- sociação do NH4HCO3 nos níveis de pH diferentes na condutividade e para determinar o efeito do Imidazol na conversão de HCO3" para CO2 como re- sultado do pH. Isto foi depois comparado às condutividades molares teóricas ou calculadas de:
<formula>formula see original document page 96</formula>
OU
<formula>formula see original document page 96</formula>
na base que a dissociação do NH4HCO3 foi para NH4+ e HCO3" ou NH4+, HCO3" e o íon de imidizólio, e que a dissociação e presença do íon de imidi- zólio não afetaram adversamente a dissociação de NH4CO3 a HCO3" e CO2. Os cálculos foram com base em uma concentração de HCO3" obtida da e- quação de Henderson-Hasselbach usada para gerar o efeito teórico do pH nas proporções relativas de [HCO3"] e [CO2]. As condutâncias molares de NH4"1" e HCO3", como também a formação do íon de imidizólio do NH4+ foram levadas em conta.
<formula>formula see original document page 96</formula>
onde ApH = condutância molar em cada pH específico Yl = condutâncias específicas para cada íon [HCO3"]λ/η4+= concentração de HCO3" com o contraíon de NH4"1" [HCO3"]im/+= concentração de HCO3" com o contraíon de Imida- zólio
Quando o cálculo for realizado em termos assumindo apenas NH4+ como o contraíon para o HCO3", os dados teóricos não igualaram aos dados experimentais. Quando os contraíons para o HCO3" são assumidos para ser NH4"1" e o íon de imidizólio, os dados experimentais e os dados teó- ricos foram iguais. Destes dados, a dissociação do íon de imidizólio é ditada pela concentração do NH4+ e a pKa do Imidazol.HCI, com o contraíon de imi- dazólio de proporção mais alta ocorrendo nos valores de pH mais baixo. A proporção do íon de imidizólio sendo formado é ditada pela concentração de NH4HCO3 e não pela concentração de Imidazol.HCI na solução. A dissocia- ção de NH4HCO3 na presença de Imidazol1 portanto, segue a dissociação teórica e à medida que o pH diminui de pH 7,2 para pH 6,3 a concentração de CO2 da solução aumenta. Isto é de significação no mecanismo de reação de glutamina sintetase proposto como em pH 6,3, sob as condições do en- saio de enzima haveriam concentrações equimolares de HCO3" e CO2. No mecanismo de reação putativo é proposto que CO2 represente um papel in- tegral na transferência de fosforila quando a glutamina sintetase estiver na forma completamente adenililada.
Efeito da Concentração de Mn2+ ou Mg2+ e Concentração de ATP na Ativi- dade de GS Adenililada e Desadenililada.
O efeito do [Mn2+] na atividade específica de GS adenililada, medi- do pela formação de ADP, aumentou para um ótimo de 3 Mn2+ por ATP na fai- xa de concentrações de ATP testada. Todos os ensaios foram realizados na presença de NaHC03 a uma concentração de 12 mmols. A atividade específica do GS adenililada quando medida pela formação de ADP não mostrou nenhum aumento na atividade com o aumento em [Mg2+]. Uma tendência similar foi vista ao comparar a atividade específica de GS adenililada, medida pela formação de glutamina. A atividade da GS adenililada na presença de [Mn2+] aumentou para um ótimo de 3 Mn2+ por ATP na faixa de concentrações de ATP testada, e na presença de [Mg2+] nenhum aumento na atividade da GS ocorreu na faixa de concentrações de ATP testada. Usando os dados para a atividade específica com base em ADP da GS adenililada, e assumindo que a cada concentração de ATP ensaiada um complexo estável de ATP e Mn2+ é formado compreen- dendo 3 íons de manganês a cada ATP. Por via de exemplo o complexo de Mn3-ATP "estável" formou-se ao acrescentar 200 μΜ de ATP a 200 μΜ de Mn- Cl2, seria 66,7 μΜ de Mn3-ATP. O efeito do [Mn2+3-ATP] na atividade específica de GS adenililada indicou, medido pela formação de ADP, que de fato um com- plexo "estável" é formado com o desvio de RMS dos dados sendo aproxima- damente 0,96. A curva resultante também pareceu ser sigmoidal em natureza, indicando cooperatividade (dados não mostrados).
Um diagrama de Eadie-Hofstee dos dados usando a [ATP] em cada [Mn2+] para calcular v/s indicou não-linearidade nos dados. O diagrama de Eadie-Hofstee usando o complexo de [Mn3-ATP] para calcular v/s tam- bém indicou não-linearidade nos dados porém os dados foram agrupados quando comparados ao diagrama usando o [Mn2+] para calcular v/s. A ca- rência de linearidade nos dados também indica o potencial para cooperativi- dade positiva. Os dados usados para calcular o [Mn2+-ATP] quando foram adicionados 1 e 2 equivalentes de Mn2+ por ATP seriam complicados pelas constantes de taxas adicionais para a formação do complexo de Mn2+-ATP. O diferencial para a curva de Eadie-Hofstee que define os dados obtidos para a atividade onde 3 equivalentes de Mn2+ por ATP foram adicionados 10 foram usados para calcular a Km a uma faixa de valores de v/s (TABELA 13). Destes dados parece que a concentração de Mn3-ATP aumenta na solução, a afinidade da enzima pelo Mn3-ATP aumenta, assim também indicando co- operatividade positiva.
Tabela 13. A Km para glutamina sintetase adenililada como calculada do de- clive da curva que define o diagrama de Eadie-Hofstee para a atividade. 3 equivalentes de Mn2+ por ATP foram adicionados.
<table>table see original document page 98</column></row><table>
Como os dados indicaram cooperatividade homotrópica positiva entre os sítios de ligação de Mn3-ATP da enzima, a equação de Hill foi usa- da para representar graficamente os dados.
<formula>formula see original document page 98</formula>
O coeficiente de Hill(h) obtido do declive do diagrama de Hill foi observado ser 2,0 indicando uma interação de 2 subunidades da enzima. Ne- nhuma correlação foi observada para o diagrama de Hill do efeito da atividade da GS adenililada usando Mg2+ como o contraíon para o ATP. Uma avaliação da estrutura de cristal de GS para manualmente adenililar o resíduo de T397 usando técnicas de modelagem moleculares indicaram que o cooperatividade positiva puderam de fato estar ocorrendo como resultado da adenililação da enzima por meio de duas subunidades. A cooperatividade positiva poderia ocorrer diagonalmente por meio dos dois resíduos de AMP na glutamina sinte- tase adenililada entre duas subunidades, por exemplo subunidades A e Η. A cooperatividade positiva poderia também apenas ocorrer entre 2 subunidades do sítio ativo e isto está fora dos dados do diagrama de Hill.
Nenhum efeito significativo foi observado no aumento da razão de [Mg2+] para [ATP] de 1 para 4, na atividade específica de GS desadenili- lada, como medida pela formação de ADP. A atividade específica da GS de- sadenililada quando medida pela formação de ADP também não mostrou nenhum aumento na atividade com o aumento em [Mn2+], porém, as ativida- des específicas da GS desadenililada na presença de [Mn2+] foram significa- tivamente menores que as atividades medidas na presença de Mg2+. Uma tendência similar foi vista ao comparar a atividade específica de GS desade- nililada, medida pela formação de glutamina. Tendências similares foram também encontradas ao representar em gráfico o efeito-da [ATP] nas várias razões de concentração de [Mg2+] para [ATP] para a atividade de GS desa- denililada expressa tanto como atividade específica com base em ADP como também atividade específica com base em glutamina. A uma razão de con- centração de 1 [Mg2+] para [ATP] desvio de linearidade é observado que provavelmente seja devido à constante de equilíbrio para a formação de 1 [Mg2+] para [ATP] não sendo precisamente 1.
O efeito da [ATP] na atividade específica tanto da atividade de GS desadenililada com base em ADP quanto com base em glutamina nas várias razões de concentração de [Mn2+] para [ATP] não mostraram nenhum aumento significativo na atividade com aumento de [ATP]; porém, em ambos os casos como a razão de concentração de [Mn2+] para [ATP] aumentou, a atividade diminuiu. O grau de adenililação da enzima usado foi da ordem de 8 %. A interação alostérica das subunidades não seria possivelmente evi- dente neste grau de adenililação.
Efeito da Concentração de Bicarbonato na Atividade Específica de GS Ade- nililada Como a atividade e grau de adenililação de GS sejam ligados ao fluxo metabólico dentro da célula, o efeito do [NaHCO3] na atividade especí- fica de GS adenililada foi determinado. A atividade específica foi determina- da a uma concentração de ATP de 600 μΜ e uma concentração de Mn2+ de 1800 μΜ. Em uma razão de concentração de 12 NaHC03 para 1 ATP, uma ótima distinta na atividade ocorre. A ótima do complexo de Mn-ATP para a atividade de GS adenililada parece portanto compreender 12 HC03':3 Mn2+: 1 ATP. A uma razão de 8 NaHCOs para ATP e abaixo, a eficiência da reação quando medida pela conversão da razão de atividade de ATP para ADP pa- ra a atividade de glutamato para glutamina, parece ser afetada significativa- mente, como a eficiência da reação caindo de 100 % para 65 %. Em uma razão de 8 NaHCO3 para ATP houve também um aumento de cinco vezes na atividade específica como resultado do bicarbonato.
Efeito de ATP Deuterada na POSIÇÃO Cg e 13C HCQa na Atividade Especí- fica de GS Adenililada
O efeito da concentração de ATP deuterado na posição Ce na atividade de GS adenililada foi determinado e comparado com GS adenilila- da sob as mesmas condições usando ATP não-deuterada. Um efeito signifi- cativo de isótopo catalítico foi observado como resultado da deuteração do ATP na posição Ce- Destes dados é claramente evidente que a deuteração de ATP na posição C8 tem um impacto significativo na atividade catalítica da glutamina sintetase adenililada. A deuteração do ATP em C8 leva a um au- mento na atividade da enzima quando medido pela taxa de formação de ADP. A formação de glutamina é porém menos eficiente como indicado pela eficiência de conversão. É postulado que a reação de transferência de fosfo- rila de glutamina sintetase adenililada, realizada na presença de (Mn2+)3(HC03")i2-ATP, é mediada por meio de um carbeno de metal. Vide FIGURA 1. A primeira etapa na reação é a protonação ou carboxilação de N7 para formar um imônio em N7. A carboxilação de N7 é provavelmente carbo- xilada por um CO2 coordenado em um dos íons de Mn2+. Uma vez a espécie de imônio do ATP foi formada através de seqüestro de dióxido de carbono, o carboxilato coordenado ajuda a desprotonação em C8, gerando uma espécie de carbenóide capaz de Mn2+ ligado. A ligação de Mn2+ é dependente da vida das espécies de carbenóides IV (figura 1). A vida de uma tal espécie é provavelmente dependente da taxa de dissociação da ligação de carbamoíla - hidrogênio formada na etapa de transferência de próton intramolecular. Por conseguinte, substituindo hidrogênio com deutério deveriam resultar em uma estabilização de IV, facilitando a formação de espécies V que permite a transferência de fosforila para o resíduo de carbamoíla proximal. O fato que a enzima adenililada funciona otimamente em pH 6,3, ou seja o pH no qual NaHCO3 é dissociado em concentrações equimolares de HCO3" e CO2, pro- vavelmente ela representa um papel significativo na facilitação desta etapa da catálise mediada pela presença de HCO3" e CO2. Neste momento o grupo carboxila pode depois atacar o γ-fosfato do ATP, formando um carboxifosfa- to que depois fosforila a δ-carboxila de glutamato para fosfato de γ-glutamila.
Para demonstrar o papel de HCO3" na reação mediada pelo efei- to de 13C HCO3" foi determinado; vide TABELA 14. Em cada ponto de dados está claro que ambas as formas isótopas pesadas da glutamina sintetase têm um efeito na atividade específica de glutamina sintetase adenililada. Como um efeito isótopo catalítico é claramente evidente para 13C HCO3", o carbonato tem que estar representando um papel na reação acima e sob os efeitos solutos visto que o aumento em atividade é significativo.
TABELA 14. O efeito de 13C HCO3 e 12C HCO3, e ATP deuterado e não- deuterada na atividade específica de glutamina sintetase adenililada.
<table>table see original document page 101</column></row><table>
Com a proposta que CO2 (ou uma forma hidratada do mesmo) es- teja mecanisticamente implicada na transferência de fosforila, é razoável proje- tar que a taxa de transferência de fosforila deveria estar sujeita a um efeito isó- topo cinético derivado da forma de dióxido de carbono utilizada. É provavel- mente que a taxa de seqüestro de dióxido de carbono que resulta na geração de Il seja lenta e o equilíbrio provavelmente exista em direção à esquerda - pa- ra a taxa de dissociação sendo alta. A montagem deste complexo é, portanto, determinativo da taxa. O uso de um isótopo de dióxido de carbono mais pesado deve, portanto, resultar em um retardamento de ambas as reações diretas ou reversas. Se a desprotonação subseqüente (e reação subseqüente) em Ce a - través das espécies de carbamoíla for rápida, então um isótopo pesado deveria aumentar a vida das espécies - aumentando a probabilidade das reações tam- bém na cascata sendo capaz de prosseguir. Isto foi, de fato observado quando a formação de glutamina e o consumo de ATP foram examinados utilizando a variante de 13C da fonte de dióxido de carbono.
Este efeito da taxa é uma indicação do envolvimento mecanísti- co de dióxido de carbono (ou um equivalente hidratado) no mecanismo de transferência de fosforila.
Demonstração do Intermediário de Carbamato de ATP na Presença de HCOy
Os experimentos foram realizados em tampão de KH2HPO4/K2HPO4 a uma concentração de 20 mM em D2O, e as concentra- ções de ATP, NaHCO3, MnCI2 e MgCI2 usadas foram variadas entre O e 1 mM para ATP, Oe 12 mM para NaHCO3, e O e 3 mM para MnCI2 e MgCI2. Para demonstrar o papel de N7 do anel de adenina, os ensaios de reação foram também operados onde o ATP foi substituído pela adição de adenosina ou tubercidina. Em tubercidina o N7 é substituído por um átomo de carbono. Diti- onita de sódio (Na2S2O2) foi adicionada às amostras a uma concentração de 4 mM e o pD ajustado para pD 6,3. Após 48 horas EDTA foi adicionado a uma concentração de 4,0 mM e as amostras centrifugadas após 10 minutos para remover o íon de metal divalente. Os espectros de 1H RMN foram depois obti- dos porque se o intermediário de carbamato fosse formado, este seria reduzi- do para ácido fórmico que seria identificável através de RMN.
Demonstração do Intermediário de Carbamato de ATP na Presença de HCOr Contanto que HCO3" esteja presente na mistura de reação, ATP na presença de Na2S2O2 produz ácido fórmico. É proposto que este seja pro- duzido de um intermediário de carbamato que é formado na posição N7. A re- dução ocorre por meio de um mecanismo similar como esboçado por Powers e Meister (1976) Proc. Natl. Acad. Sei. 73: (9), 3020-3024), porém a redução do carbamato neste caso ocorre por meio de Na2S2O2 ao invés de KBH4.
Identificação de ATP Ligado ao Intermediário Carbamato de ATP de CO2
A indução das espécies de imônio de ATP como o carbamato em N7 foi demonstrada reagindo ATP, HCO3", Mn2+ ou Mg2+ na presença de Na2S2O2 mostrando a formação de ácido fórmico como resultado da redução do intermediário de carbamato. Todos os ensaios foram executados em D2O em 20 mM de tampão de fosfato ajustado em pD 6,3 e todos os reagentes foram preparados em D2O. Os ensaios realizados são como esboçados na TABELA 15. A mistura de reação continha Na2S2O4 a uma concentração de 4 mm. Metanol foi adicionado a uma concentração de 2 mM como um pa- drão interno. Sob adição do Na2S2O4, o pD foi ajustado para pD 6,3 com 1M de DCI. A reação foi operada durante 48 horas cujo USB EDTA foi adiciona- do a uma concentração final de 4 mM de EDTA. As amostras foram centrifu- gadas a 10000 χ g para remover o Mn2+ e o espectro de 1H RMN foi obtido. A concentração de ácido fórmico produzido foi determinada pelas intensida- des de deslocamento relativo do ácido fórmico para o metanol padrão inter- no. Ensaios: (1)1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (2) 0 mM de ATP, 0 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (3) 1 mM de ATP, 0 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (4) 0 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (5) 1 mM de ATP, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaCI e 4 mM de Na2S2O4; (6) 1 mM de ATP, 3 mM de MgCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (7) 1 mM de Adenosina, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaHCO3 e 4 mM de Na2S2O4; (8) 1 mM de Tubercidina, 3 mM de MnCI2, 12 mM de NaH- CO3 e 4 mM de Na2S2O4; (9) reação 1 com 2 mM de ácido fórmico adiciona- do; e (10) 2 mM de padrão de ácido fórmico. Tabela 15. Condições de ensaio. No ensaio 5, NaHCO3 foi substituído por 12 mM de NaCI; no ensaio 6, MnCI2 foi substituído por 3 mM de MgCI2; no en- saio 7, ATP foi substituída por 1 mM de Adenosina; e no ensaio 8, ATP foi substituída por 1 mM de tubercidina.
<table>table see original document page 104</column></row><table>
O intermediário de carbamato se forma, como demonstrado, por sua redução para ácido fórmico (deslocamento de RMN a 8,55 ppm). A for- mação do ácido fórmico é dependente da presença de bicarbonato, ATP e Mn2+. Ensaios 7 e 8 continham adenosina e Tubercidina, respectivamente. Estes dois ensaios foram fixos até demonstrar a necessidade por nitrogênio na posição 7 para a formação do carbamato e sua redução para formar áci- do. Destes dados, pareceu que a coordenação do Mn2+ no polifosfato de ATP é requerida para a reação ocorrer. Uma quantidade pequena de ácido fórmico pareceu ter sido formada quando o Mn2+ foi substituído por Mg2+.
Exemplo 2 - Modelagem Molecular e Projeto de Fármaco Racional
Análise da Estrutura de Cristal De GS
A estrutura de cristal de GS desadenililada de E. coli(Gill, H., S. e D. Eisenburg (1994) Biochemistry, 40: 1903-1912), foi obtida da Base de Da- dos de Proteína de Brookhaven (número de acesso 1f52.pdb). Esta estrutura foi usada porque a proteína tinha sido cristalizada com um resíduo de ADP em cada sítio ativo. Um tetrâmero de polipeptídeo de GS foi criado desta estrutura para produzir um sítio ativo simples. A forma "fechada" do complexo de (Mn2+)3.(HC03")12ATP foi proposta na análise estrutural de ATP com base na proximidade do Mn2+ dos dados de 1H RMN como também o requerimento de química de coordenação para o Mn2+ para fazer um papel na deuteração do C8. A estrutura de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP foi construída usando o software Insi- ghtll (AcceIrys) e minimizada. A estrutura modelada produziu 2 do Mn2+ acima e abaixo da cauda de fosfato e o terceiro Mn2+ coordenado perto do anel de adenina. A estrutura foi depois inserida no sítio ativo usando o software de Ac- celrys sobrepondo o anel de adenina do complexo de (Mn2+)3(HC03")i2-ATP sobre o anel de adenina da ADP no sítio ativo. O conjunto foi minimizado e as cadeias laterais de aminoácido associadas à ATP foram identificadas para permitir mutagênese loco-dirigida ser realizada nestes resíduos de forma que seu papel na catálise mediada pela glutamina sintetase poderia ser elucidado. Os resíduos de aminoácido identificados foram Glu129, Glu207, His269, His271, Arg224, e Arg355, e Lys47 da subunidade adjacente.
Mutagênese Loco-Diriqida de GS de Echerichia colie Ensaios Enzimáticos
Mutagênese loco-dirigida foi executada na GS da E. coli em Glu207, His269, His271, e Arg355. Quando a GS foi isolada e purificada de cada clone e a atividade da enzima específica determinada usando o ensaio de encima de γ-glutamil transferase de GS, estas mutações foram observa- das para destruir a funcionalidade da enzima. Estes resíduos de aminoácido parecem representar um papel crucial dentro do sítio ativo de GS1 e é postu- lado que os resíduos de His269 e de His271 representam um papel na trans- ferência de fosforila. Um efeito similar foi observado ao medir a atividade da enzima por HPLC em base da formação de ADP e de glutamina.
Foram utilizados dois ensaios de enzima para avaliar a atividade de glutamina sintetase. O primeiro ensaio usado, o ensaio de γ-glutamil transferase, mede a reação "inversa" como atividade de glutamil transferase. Nesta reação reversa, hidroxilamina e glutamina reagem para formar γ- glutamil-hidroxamato e amônia livre na presença de ADP, arsenato e man- ganês ou magnésio (Shapiro e Stadtman (1970) Methods Enzymol. 17A: 910-922). Isto forma a base de um ensaio para a presença de atividade de glutamina sintetase. No pH correto, que é derivado de determinar o ponto de isoatividade da enzima as atividades de transferase da forma adenililada e desadenililada de glutamina sintetase são as mesmas. Porém, as duas for- mas podem ser distinguidas porque completamente no ponto de isoativida- de, glutamina sintetase adenililada é completamente inibida por 60 mM de Mg2+, enquanto que a enzima desadenililada é não afetada (Bender R A, K A Janssen, A D Resnick, M Blumberg, F Foor e B Magasanik, (1977) Journal of Bacteriology 129: 1001-1009). As atividades das duas formas da enzima po- dem ser diferenciadas portanto com base na diferença na atividade na pre- sença de Mn2+ ou Mg2+ em pH 7,15. Atividade de glutamina sintetase é me- dida em duas misturas de ensaio diferentes: uma contendo apenas Mn2+ e uma segunda contendo Mn2+ e Mg2+. Todos os reagentes são preparados em Tampão de Imidazol (pH 7,15). Ambos os ensaios foram operados em um volume total de 600 μΙ. O ensaio de Mn2+ foi estabelecido como mostrado na TABELA 16, e o ensaio de combinação como mostrado na TABELA 17.
Tabela 16. Mistura de ensaio para o ensaio de glutamil transferase com base em Mn2+
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Uma reação em branco foi preparada da mesma maneira que a reação de Mn2+, mas substituindo a ADP e soluções de arsenato com um volume equivalente de água. A mistura de ensaio foi equilibrada por 5 mins a 379C, e depois iniciada pela adição de 50 μΙ de preparação de enzima. A reação foi deixada prosseguir por 30 min, e depois terminada pela adição de 900 μΙ de Mistura de Interrupção (1M de FeCI3.6H20, 0,2 M de ácido tricloro- acético e 7,1 % v/v HCI). As amostras foram depois centrifugadas a 13,000 rpm por 2 mins em um microcentrífuga de Eppendorf para remover qualquer precipitado que possa ter se formado, e a absorbância medida a 540 nm. Todos os resultados apresentaram como atividade específica em termos de μmols de complexo de hidroxamato de glutamila/min/mg de proteína. O grau de adenililação foi calculado da razão da atividade de γ-glutamil transferase desadenililada para a atividade de γ-glutamil transferase total (reação de Mn2+), levando em conta o número de subunidades.
Além disso, a taxa de conversão de ATP, glutamato e amônia para glutamina e ADP foi avaliada usando HPLC. Esta é denominada a rea- ção "direta" ou "biossintética" e é ensaiada em dois ensaios diferentes: um medindo a habilidade da glutamina sintetase para converter glutamato em glutamina ná presença de ATP, e a segunda determina a conversão de ATP na ADP e AMP na mesma mistura de ensaio. Este ensaio foi desenvolvido para medir a reação direta da glutamina sintetase. O ensaio mede a quanti- dade de glutamina formada de L-glutamato na presença de MnHCOa-ATP (a base de uma reação) e MgATP (a base de uma segunda reação), e a quan- tidade de ATP, a ADP e AMP formados são também medidos. A mesma so- lução de mistura de ensaio é operada em 2 métodos de HPLC, um para o ensaio de glutamato/glutamina e um para o ensaio de ATP/ADP/AMP. O en- saio estabelecido é mostrado na TABELA 18.
Tabela 18. Componentes de ensaio para o ensaio de HPLC para determinar
<table>table see original document page 107</column></row><table> O ensaio de Mn2+ foi realizado em um pH de 6,3, e o ensaio de Mg em um pH de 7,3. Todas as preparações da enzima foram adicionadas à mistura de ensaio em um volume de 50 μΙ. A adição da enzima iniciou a reação que foi depois deixada prosseguir durante 1 hora. A reação foi para- da pela adição de 6 μΙ de uma solução de ácido tricloroacético a 50 %. Cada ensaio foi depois aliquotado em 4 frascos de HPLC (150 μΙ por frasco) dois destes foram ensaiados para glutamato e glutamina e para a ADP e ATP, usando uma coluna de C18 de 5 μ Fenomenex Luna em um instrumento de HPLC Agilent 100. Todos os ensaios foram operados em triplicata.
Destes dados, parece que H271 é ligado à forma adenililada da enzima, porque quando a mutação dupla foi incluída, Y397V, criando uma forma da enzima completamente desadenililada, toda a atividade foi eficaz- mente perdida. É proposto portanto que His271 represente um papel pivo- tante na reação de transferência de fosforila putativa na forma adenililada da enzima. Histidina 269 também parece ser crítica, porém o impacto é bem menos definido.
TABELA 19. Resultados do ensaio de glutamil transferase de WT de E. colie mutantes construídos. A enzima de WT refere-se à cepa crescida no meio M9 modificado, e a WT (AD) e a WT (DD) referem-se às enzimas adenilila-
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Tabela 20. Resultados do ensaio mostrando a taxa de conversão de gluta- mato e ATP para glutamina e ADP como determinado usando HPLC. A en- zima WT refere-se à cepa crescida no meio M9 modificado, e a WT (AD) e WT (DD) referem-se às enzimas adenililadas e desadenililadas produzidas em cultura contínua. Os valores apresentados representam a média de três ensaios diferentes em que a diferença nos valores foi menos que 5 %. (1- parte)
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Tabela 20. (2ã parte)
<table>table see original document page 110</column></row><table> Implicações Mecanísticas dos Dados
A uma razão de ATP para enzima dada e concentração em pH 6,3, o conteúdo de manganês e o dióxido de carbono (ou forma hidratada dos mesmos) conteúdo do sistema foi identificado como parâmetros críticos. O efeito destes parâmetros na presença e ausência da enzima foi examina- do. Na ausência da enzima, os efeitos quantitativos associados à variação nos parâmetros cruciais com respeito à geração de ADP de ATP foram do- cumentados, como também os efeitos dos parâmetros em questão na incor- poração de deutério a C8 (onde os efeitos dos parâmetros foram examinados em D2O como a matriz de solvente de volume). Na presença da enzima, o exame da eficiência de transferência de fosforila (que pode ser visto como a probabilidade de formação de glutamina resultante da geração de ADP) po- de ser usado como uma sonda mecanística.
Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise de ATP para ADP é em grande parte dependente da razão de íon de manganês para ATP. Inver- samente, a taxa de geração de ADP (a um nível de manganês constante) é grandemente independente da estoiquiometria de carbonato. Uma tal obser- vação leva à conclusão que carbonato (ou dióxido de carbono) representa um papel insignificante na hidrólise de ATP. Uma vez que o pH é uma cons- tante de 6,3, a concentração absoluta de íon de hidróxido é constante, o úni- co determinante significativo da hidrólise de ATP é concentração de íon de metal - que, por sua vez, determina o nível do complexo de metal-oxo, (pro- vavelmente o Imidazol ligado ao metal neste exemplo), na redondeza da ca- deia principal de fosfato. Quando o estudo da hidrólise é realizado usando D2O como a matriz de solvente, o efeito adicional da incorporação de deuté- rio em Ce é observado. Em contraste com os dados relativos à hidrólise, a taxa de deuteração observada na concentração de íon de manganês cons- tante aumenta com a concentração de carbonato crescente (entradas OeR, P e S, Q e T, TABELA 11) sem aumento concomitante na taxa de hidrólise. Uma tal observação indica que incorporação de deutério é dependente de carbonato.
Quando a transformação catalisada com enzima e mediada com ATP de ácido glutâmico para glutamina é examinada de uma maneira simi- lar, as implicações mecanísticas destas observações ficam evidentes. Gera- ção de ADP é agora derivada tanto de hidrólise (nenhuma glutamina é gera- da) como de transferência de fosforila (resultando em glutamina). A diferen- ça na taxa de formação de glutamina e formação de ADP ilustra a taxa de hidrólise. É evidente que a taxa de formação de glutamina é dependente de íon de manganês e estoiquiometria de carbonato. Por conseguinte, deve ser concluído que carbonato representa um papel crítico na geração de ADP onde a geração de ADP resulta em transferência com sucesso de fosforila (nenhum papel para carbonato tendo sido observado na hidrólise de base). Este fato é também afetado pelo efeito do isótopo catalítico positivo de 13C HCO3- na atividade da forma adenililada de glutamina sintetase. Implicita- mente, uma vez que a deuteração em Ce em uma matriz de D2O na ausên- cia de enzima segue uma tendência similar, é altamente provável que a deu- teração seja o resultado de um estado de transição similar que está implica- do na transferência com sucesso de fosforila. Isto sugeriria um grau de au- tomontagem rudimentar do complexo responsável pela fosforilação antes da incorporação no sítio ativo da enzima.
Considerando que carbonato é mecanisticamente implicado no mecanismo de transferência de fosforila, é razoável que um efeito isótopo cinético deveria ser observado com respeito ao uso de 13C CO2 (ou uma forma hidratada do mesmo). Um tal efeito na formação de glutamina é, de fato, observado. Um aumento correspondente no consumo de ATP, porém, é observado, sugerindo que, sob condições adequadas para transferência de fosforila, a enzima promove a ativação do resíduo de γ-fosforila através de um mecanismo similar àquele observado na ausência da enzima.
Em resumo, pode ser concluído que a concentração de íon de manganês (até a ótima ser alcançada) é grandemente responsável pela ati- vação do resíduo de γ-fosforila de ATP. O mecanismo de transferência de fosforila responsável pela formação de glutamina, porém, mecanisticamente implica carbonato e envolve a clivagem do resíduo de Cs-H. Na ausência do requerimento mecanístico de carbonato (mas com íon de manganês sufici- ente) a enzima é capaz de ativar o resíduo de γ-fosforila, mas carece da ca- pacidade de eficientemente transferir aquele resíduo para o ácido glutâmico.
Debate
O mecanismo de reação novo é postulado para ser mediado por um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP putativo (figura 1). É proposto que uma espécie de imônio ou seja induzida em N7 através de protonação por meio de um HCO3- coordenado ou por carboxilação do N7. É acreditado que a ligação íntima do pH da reação e para a dissociação de HCO3- para CO2, em pH 6,3, que o intermediário carboxilado é mais provável. Os dados da captura de ácido fórmico das reações contendo HCO3" também sugerirão que o intermediário de carbamato crie as espécies de imônio. O seqüestro de dióxido de carbono (ou uma forma hidratada do mesmo tal como bicarbo- nato) em um tal maneira é análogo àquele descrito por Ashman, L. K. e D. B. Keech, (1975) J. Biol. Chem. 250: 14-21, durante um estudo da relação entre hidrólise de ATP e fixação de dióxido de carbono na piruvato carboxilase de rim de ovelha da enzima mediada por biotina em que um carbóxi fosfato foi proposto como um intermediário transitório. A formação das espécies de i- mônio em N7 depois permite a desprotonação de C8 por meio do ácido car- bâmico desprotonado assim formado ou outro HCO3- coordenado (desproto- nado) o intermediário (IV) assim gerado sendo estabilizado pela formação da ligação putativa entre o Mn2+ e C8. As espécies (V) assim formadas resultam no resíduo de fosforila terminal ficando proximal ao grupo carbamoíla e se- qüestro daquele resíduo de fosforila pelo resíduo de carbamoíla, gerando um anidrido de fosforila de carbamoíla ativado (VI) (a proximidade do β-fosfato do ATP original permitindo a reversibilidade desta etapa como sugerido por Kaziro et al. (1962) J. Biol. Chem. 237: (5), 1460-1468) em estudos relativos a propionil carboxilase). O CO2 requerido para carboxilação virá de um CO2 coordenado (ou uma forma hidratada do mesmo). A razão de 50:50 de HCO3- para CO2 em pH 6,3 é crítica para obter taxas de reação otimizadas para a glutamina sintetase adenililada. O pH otimizado de pH 6,3 dita que CO2 e HCO3- são facilmente disponíveis para este processo e que ambas as espécies representam um papel na catálise. O N7 carboxilado pode depois ser usado na formação de carboxifosfato pela hidrólise do γ-fosfato do ATP. O fosfato é depois translocado por meio do His271 e provavelmente His269 para a γ-carboxila do glutamato na reação, formando fosfato de γ-glutamila. O fosfato de γ-glutamila depois sofre ataque nucleofílico em outro mecanis- mo formando glutamina. Os resíduos de E207 e de Arg355 representam um papel na estabilização do intermediário de transferência de fosforila através de ligação de hidrogênio. A possível coordenação que ocorre no complexo de Mn2+3(HCO3-)12ATP poderia ser como segue: 2 dos íons de Mn2+ estão acima e abaixo do plano da cauda de fosfato e um é coordenado para o anel de adenina.
Em suma, o mecanismo catalítico proposto é com base nos se- guintes:
■ Na presença de Mn2+, a cadeia de fosfato de ATP parece coordenar para o Mn2+ que por sua vez coordena para o carbono de C8 do anel de a- denina.
■ A proximidade do Mn2+ ao próton de Ce é mais íntima quando HCCV estiver presente depois quando Cl- estiver presente.
■ Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise do ATP é dependente da concentração e presença de Mn2+ e HCO3-.
■ Na ausência da enzima, a taxa de hidrólise do ATP parece ser ligada ao Mn2+ e HCO3- que estão presente a uma razão de 12 HCO3- para 3 Mn2+ pa- ra 1 ATP.
■ O mecanismo de reação usado para ATP adenililado requer Mn2+ en- quanto ATP desadenililado requer Mg2+ para a reação.
■ A glutamina sintetase adenililada pode usar Mg2+ na reação, porém a eficiência da conversão hidrolisada de ATP para glutamina formada é com- prometida.
■ Glutamina sintetase adenililada requer 3 íons de Mn2+ por ATP para ótima atividade.
■ Glutamina sintetase adenililada requer HCO3- e CO2 para atividade oti- mizada.
O pH de 6,3 define a dissociação de bicarbonato para HCO3- e CO2. ■ A glutamina sintetase adenililada usa Mn2+, HCO3" e ATP a uma razão de 3:12:1.
■ O próton de C8 parece representar um papel catalítico na atividade de glutamina sintetase na forma adenililada.
Exemplo 3 - Síntese e Avaliação dos Inibidores de Teste
Análogos de purina e pirimidina foram preparados e investigados para seu efeito em atividade de GS fosforil transferase, incluindo hidrólise de ATP, formação de ADP, formação de glutamina, atividade de γ-glutamil transferase, e eficiência de conversão.
Metodologias de Reação Sintética para Análogos de Purina e Pirimidina Al- vejando o Sítio de Fosforil Transferase
A ligação de ATP para o sítio ativo de GS é extremamente de- pendente do arranjo de grupos de ligação de hidrogênio ao redor do seg- mento de purina da molécula, junto com várias interações hidrofóbicas. A característica posterior pode ser utilizada para aumentar a especificidade de qualquer molécula pequena dada com base em um esqueleto do tipo purina, uma vez que as regiões hidrofóbicas dos sítios de ligação de ATP conheci- dos são construídos de seqüências de aminoácido únicas. Sintetização de tais moléculas tendo metades hidrofóbicas projetando nestes sítios ou bol- sas tendo as características espaciais e eletrônicas corretas para interagir otimamente com os resíduos de aminoácido nas bolsas permitirá ligação mais firme da molécula pequena naquele sítio ativo da enzima específica, em grande parte para a exclusão de todas as bolsas de ligação de ATP simi- lares diferentes dos membros de família intimamente relacionados. Isto se aplicará igualmente às estruturas com base em não-purina, contanto que os grupos de ligação de hidrogênio possam interagir com os aminoácidos fun- damentais da bolsa de ligação de ATP.
Para gerar tais compostos, vários grupos gerais de compostos foram investigados, o grupo inicial todo envolvendo grupos aromáticos ou heteroaromáticos com uma o/to-diamina característica como parte da substi- tuição do anel. Os sistemas de heteroarila foram todos com base no esque- leto de pirimidina. Foi visado que estes sistemas pudessem depois ser con- vertidos nas espécies de purinas (II, X1Y = N), quinoxalinas (III, X,Y = CH), pteridinas (III, Χ,Υ = N) ou carbenóides (II, Χ,Υ = N), dependendo da diamina particular usada. A espécie posterior foi implicada na inibição de ATPase [E. Piers e J. Y. Roberge, Tetrahedron Letters, 1992, 33, 6923-6926 e referên- cias dentro desta]. Sistemas que carecem de qualquer ligação de hidrogênio ao redor do anel de seis membros são também inclusos na forma de benzi- midazóis (II, Χ,Υ = CH) visto que estes são substâncias conhecidas serem biologicamente ativas apesar da carência de substituição de azo [Vide, por exemplo, V. Klimesová et al., Eur. J. Med. Chem., 2002, 37, 409-418].
<formula>formula see original document page 116</formula>
Outros sistemas também inclusos nesta investigação incluem as imidazo[1,2-a]piridinas relacionadas (V), e as estruturas de pirimidina satu- radas (IV). Ambos destes sistemas têm o padrão de ligação de hidrogênio requerido, como também o potencial de variações extensivas de substituinte necessárias para o projeto dos inibidores requeridos que poderiam potenci- almente ligar de uma maneira a inibir a transferência de fosforila requerida.
<formula>formula see original document page 116</formula>
Moléculas com Base em (HETERO)ARIL-1,2-DIAMINAS
As diaminas requeridas ou foram obtidas comercialmente, tais como 1,2-fenilenodiamina 1 e 6-hidróxi-2,4,5-triaminopirimidina 2, ou sinteti- zadas como detalhado doravante [J. A. Van Allen em Org. Synth. Coll. Voi VI, N. Rabjohn et al. (eds.), John Wiley and Sons, Inc. (Nova Iorque), 1963, págs. 245-246; W. R. Sherman e E. C. Taylor, ibid, págs. 247-249].
<formula>formula see original document page 117</formula>
Uma síntese direta de 5 usando diidrocloreto de malondiamidina como o material de partida falhou em produzir a 4,6-diaminopirimidina 4 re- querida completamente [G. W. Kenner et al., J. Chem. Soc., 1943, 574]. Uma preparação alternativa de 4, envolvendo a reação de tiouréia com ma- lononitrila, forneceu 4,6-diamino-2-mercaptopirimidina 3 (ESQUEMA 1) [A. Bendich, J. F. Tinker e G. B. Brown, J. Chem. Soc., 1948, 3109]. Redução de níquel de Raney de mercaptano 3 provou ser uma alternativa melhor, e 4,6-diaminopirimidina 4 foi isolado em rendimento fino [D. J. Brown, J. Soc.
Chem. Ind., 1950, 69, 353].
<formula>formula see original document page 117</formula>
Esquema 1
Embora nitrozação de pirimidinas em ácido acético tenha sido bem documentada, nitrozação de 4 foi relatada ser rendimento baixo em par- ticular, e requer a presença de ácido mineral [a) B. Lythgoe, A. R. Todd e A. Topham, J. Chem. Soc., 1944, 315; b) J. Baddiley, B. Lythgoe, D. McNeiI e A. R. Todd, J. Chem. Soc., 1943, 383]. Embora nitrozação sob condições acídicas prosseguiram suavemente, produto nitroso 6 foi observado ser ins- tável sob isolamento. Redução de ditionita imediata de 6 úmido produziu tri- amina instável 5, que poderia porém, seja, isolado como o sal de sulfato de hidrogênio estável.
4,5-Diamino-6-hidroxipirimidina 10 foi sintetizada de uma manei- ra similar, desta vez tratando tiouréia com cianoacetato de etila para formar mercaptano 7 [W. Traube, Ann. Chem., 1904, 331, 64], seguido por nitroza- ção para nitrosomercaptano estável 9, redução de ditionita para diamino- mercaptano 8 [A. R. Pagano, W. M. Lajewski e R. A. Jones, J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 11669] e dessulfurização com níquel de Raney em amônia aquosa para fornecer diamina 10. Tentativas para produzir 10 diretamente de mercaptano 9 através de redução de níquel de Raney não tiveram êxito [A. Laxer, D. T. Major, Η. E. Gottlieb e B. Fischer, J. Org. Chem., 2001, 66, 5463]. Similarmente, cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 foi obtido tratando uréia com cianoacetato de etila (fornecendo 6-aminouracila 11), nitrozação (para 12) e redução de ditionita para a diamina 13. A base livre é instável e facilmente oxida as pirimidopteridinas altamente coloridas.
Durante este tempo, 6-amino-1,3-dimetiluracila comercialmente disponível 14 foi usada para testar a reação de fechamento de anel para for- necer xantinas de uracilas N-substituídas, com a meta de aplicar os mesmos princípios depois aos derivados de N-benzila. Nitrozação de 14 com nitrito de sódio para 15, seguido por redução com ditionita de sódio deu 5,6- diamino-1,3-dimetiluracila 16 (ESQUEMA 2).
<formula>formula see original document page 118</formula>
Sistemas Bicíclicos 5.6-Fundidos: a) Derivados de benzimidazol (II, X1Y = CH, RilR4 = H) Vários benzimidazóis substituídos em N1 ou C2 foram preparados como a- nálogos de adenina simplificados com um anel de seis membros não-polar. <formula>formula see original document page 119</formula>
O método sintético mais direto para benzimidazóis substituídos em C-2 envolveu reação de fenilenodiamina 1 com um ácido carboxílico a- dequado (ESQUEMA 3).
<formula>formula see original document page 119</formula>
Esquema 3
Fusão dos dois componentes (fenilenodiamina e o ácido carboxí- lico correspondente) a 150eC em 85 % de ácido fosfórico, seguido por prote- ção apropriada dos grupos de amino para permitir isolamento e purificação dos compostos (excluindo o derivado de ácido 5-bromovalérico) forneceu os compostos 17-20 todos destes são sólidos em temperatura ambiente. Hidró- Iise dos produtos protegidos não foi tentada.
<formula>formula see original document page 119</formula>
Benzimidazóis N1-substituídos foram obtidos, por exemplo, tratando benzi- midazol 21 com hidreto de sódio e alilbrometo em dimetilformamida seca a 60-1 OOqC durante 18h, produzindo alilbenzimidazol 22 (ESQUEMA 4) [K. -L. Yu et al., Bioorg. Meó. Chem. Lettersl 2003, 13, 2141-2144\. Um protocolo similar usando um procedimento de bisalquilação com dibromometano e ál- cool de furfurila forneceu o produto de glicosila 23 [A. Holy et al., J. Med. Chem., 1999, 42, 2064-2086; A. Khalafi-Nezhad et al., Tetrahedron, 2002, 58, 10341-10344],
<formula>formula see original document page 119</formula>
Esquema 4
b) Derivados de purina substituídos: (II, Χ,Υ = N) Substituição de C-8:
Um método geral foi usado para preparar purinas 8-substituídas de diaminas 2, 5, 10 e 13 (ESQUEMA 5). Condições de Schotten-Baumann foram usadas a fim de acilar 2, 5, 10 e 13 no grupo de 5-amino mais básico seletivamente, fornecendo 5-amidopirimidinas 24 usando uma seleção de cloretos de ácido comercialmente obtidos. Em certas circunstâncias, sistemas de solventes modificados foram usados para realizar esta transformação. Ciclização das amidas de 2, 10 e 13 foi alcançada usando oxicloreto de fósforo ou metóxido de sódio, formando quaisquer fenóis (25, X = OH) ou cloretos (25, X = Cl) [G. B. Elion, E., Burgi e G. H. Hitchings, J. Am. Chem. Soc., 1951, 73, 5235- 5239]. Amidas de triamina 5 são apenas ciclizadas com metóxido, dando 6- aminopurinas (25, X = NH2) [B. Lucas, N., Rosen e G. Chiosis, J. Comb. Chem., 2001, 3, 518-520].
<formula>formula see original document page 120</formula>
2 R1 = OH, R2 = NH2 24 25, X=Cl, OH ou NH2 5 R1 = NH2, R2 = H 10 R1 =OH, R2 = H 13 R1 =OH, R2 = OH
Esquema 5
Os resultados para as acilações 2, 5, 10 e 13 e as ciclizações corresponden- tes estão dados na TABELA 21.
Tabela 21: Substituições e Fechamento de Anéis de 4,5-Diaminopirimidinas
<table>table see original document page 120</column></row><table> <table>table see original document page 121</column></row><table>
Tabela 21: (2ã parte)
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Tabela 21: Substituições e Fechamento de Anéis de 4,5-Diaminopirimidinas Substituídas (CONT.) (1a parte)
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Tabela 21: (CONT.) (2a parte)
<table>table see original document page 122</column></row><table> <table>table see original document page 123</column></row><table>
Preparações alternativas de várias purinas 8-substituídas inclu- em a preparação de carbamato 55 da reação de 2 com sulfato de /sotiouréia de S-metila [P. R Shildneck e W. Windus, Org. Syn. Coll. Vol. II, A. H. Blatt (ed.), 1943, John Wiley and Sons (Nova Iorque), 411] (ESQUEMA 6).
<formula>formula see original document page 123</formula>
Esquema 6
Xantina 48 foi também preparada tratando 5-nitroso-6-amino- 1,3-dimetiluracila 15 com benzilamina e ácido clorídrico aquoso concentrado (ESQUEMA 7) [C. E. Müller, M., Thorand, R., Qurishi, M., Diekmann, K. A.
Jacobson, W. L. Padgett e J. W. Daly, J. Med. Chem., 2002, 45, 3440].
<formula>formula see original document page 123</formula>
Esquema 7
Substituição de N-6 e N-9
É bem-conhecido que a 4,6-dicloropirimidina 56 é em particular suscetível ao deslocamento nucleofílico por nucleófilos de nitrogênio e de oxigênio. O deslocamento do primeiro grupo de cloro é fácil, enquanto o se- gundo cloreto requer condições mais forçosas [C.W. Whitehead e J. J. Tra- verso, J. Am. Chem. Soc., 1958, 80, 2185-2189; Μ. H. Norman et al., J. Med. Chem., 2000, 43, 4288-4312]. O anel de pirimidina pode ser ativado, porém. Isto é alcançado introduzindo um grupo de retirada de elétrons em C-5, tal como grupos nitro ou nitrosos através de substituição eletrofílica. O protoco- lo, permitindo mono deslocamento de um substituinte de cloro por uma ami- na, seguido por nitrozação e deslocamento subseqüente do segundo substi- tuinte de cloro, fornece um precursor de triaminopirimidina como resumido no (ESQUEMA 8). Redução do grupo nitroso, seguido por fechamento de anel forneceria os derivados de adenina desejados.
<formula>formula see original document page 124</formula>
Esquema 8
Uma variedade de aminas foi selecionada para substituir os gru- pos de cloro para cobrir tanto quanto possível o "espaço" molecular - incluin- do alquilaminas, arilaminas e heteroarilaminas. Uma combinação de uma amina primária e uma secundária foi usada para assegurar um produto sim- pies na ciclização para os compostos de purina.
As aminas a seguir foram selecionadas: Aminas primárias:
<formula>formula see original document page 124</formula>
A reação de deslocamento inicial envolveu tratamento 56 com um excesso de duas vezes de amina em álcool /sopropílico fervente [C. Temple, C. L. Kussner e J. A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866- 870; M. Israel et al., J. Med. Chem., 1964, 7, 792-799] ou, alternativamente, a reação poderia ser realizada usando apenas um equivalente da amina na presença de um equivalente de trietilamina [N. Baindur, N. Chadha e M. R. Player, J. Comb. Chem., 2003, 5, 653-659]. Nenhum produto dissubstituído foi isolado ou detectado nas misturas brutas ou produtos isolados das mo- noaminas 57-61. Os resultados para monossubstituição de 56 com aminas primárias estão resumidos na TABELA 22. Surpreendentemente, pirimidina
60 derivada de cloridrato de éster de metila de fenilalanina foi apenas forma- da em rendimento pobre, possivelmente devido à formação pobre do clori- drato de éster de intermediário. Como esperado, as arilaminas pobremente básicas requereram condições forçosas. 2-aminopiridina, porém, não reagiu com 56.
Nitrozação das aminas secundárias 57-59 ocorreu facilmente, fornecendo os produtos 62-64 em rendimentos bons [D. E. 0'Brien et al., J. Med. Chem., 1962, 5, 1085-1103]. De forma perplexa, o derivado de fenila- Ianinila 60 não reagiu sob estas condições. Similarmente, derivado de anilina
61 provou muito pobremente ativado para nitrozação sob várias condições (TABELA 22). Os produtos nitrosos 62-64 foram depois tratados com aminas secundárias, sob a suposição que nitrozação tinha suficientemente ativado as pirimidinas. Tentativas para introduzir as aminas aromáticas pobremente reativas nestes compostos neste estágio são malsucedidas.
Tabela 22: Substituição de 56 com Aminas Primárias, Nitrosação e Depois Substituição com Aminas Secundárias (1a parte)
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Tabela 22: (2g parte
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a IPA, trietilamina, refluxo, 18h b Puro, 1509C, 1h
C CH2CI2, temperatura ambiente, 1 h
Os compostos nitrosos 65-71 foram reduzidos na presença de ditionita de sódio e ácido sulfúrico aquoso para fornecer as triaminopirimidi- nas substituídas 72-78 (TABELA 23). Ciclização das pirimidinas 72, 73, 75, 76 e 78 para fornecer as adeninas substituídas 79-83 respectivamente foi executada aquecendo a pirimidina em uma mistura 1:1 de anidrido acético e ortoformato de trietila [C. Templo, C. L. Kussner e J. A. Montgomery, J. Med. Chem., 1962, 5, 866-870]. Porém, pirimidinas 74 e 77, ambos substituídas com uma cadeia de hidroxietila, deu uma mistura complexa de produtos que pareciam conter o produto desejado junto com os intermediários da reação de ciclização.
Tabela 23: Reduções de Ditionita de Compostos Nitrosos 65 - 71, e Forma- cao de Purina (1a parte)
<table>table see original document page 127</column></row><table>
Tabela 23: (2- parte)
<table>table see original document page 127</column></row><table> <table>table see original document page 128</column></row><table>
De um modo similar ao usado para as aminas primárias, 56 foi tratado primeiro com as aminas secundárias, então o mesmo protocolo como antes foi seguido. Os resultados estão resumidos na TABELA 24.
Tabela 24: Reação de 56 com Aminas Secundárias, Tentado Nitrosação e Segundos Deslocamentos com Aminas Primárias sob Condições Forçosas
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Tabela 24: (2ê parte)
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a Obtido de 57 através de fusão
b Obtido de 58 através de fusão d Obtido de 59 através de fusão
Nitrozação das quatro aminas terciárias 84-87 falhou, a reação do mecanismo requerendo uma amina secundária para formar um interme- diário de N-nitroso descarregado para a reação ocorrer com nitrozação na posição orto [J. H. Boyer em The Chemistry of the Nitro and Nitroso Groups, H. Feuer (ed.), John Wiley and Sons (Nova Iorque), 1969, pág. 223-225]. As aminas terciárias favorecem nitrozação direta na posição para que é desati- vada para substituição eletrofílica nestes circunstâncias [R. G. Coombes em Comprehensive Oroganic Chemistry, D. Barton e W. D. Ollis (eds.), Perga- mon Press (Oxford), 1979, págs. 308-309]. Desse modo, condições forçosas foram empregadas para introduzir as aminas primárias diretamente sobre os produtos 84-87, com graus variados de sucesso, como resumido na TABELA 24. Aminação direta do derivado de fenilalaninila 60 foi também com suces- so com pirrolidina e dimetilamina usando estas condições, para fornecer os produtos bisaminados respectivamente 100 e 101.
<formula>formula see original document page 130</formula>
Para usar o derivado de 2-aminopiridina 99, foi nitrado ao invés de fornecer 102. Embora pudesse ser reduzido usando níquel de Raney, o produto provou instável e rapidamente decomposto.
Bromação das diaminas 89-96 foi realizada em diclorometano com um excesso leve de bromo, e forneceu bromopirimidinas 103-110 (TA- BELA 25). Os brometos 105 e 108 foram submetidos em condições de ami- nação de Ullmann usando iodeto cuproso anidro em um excesso da amina para ser usado para inserção, todos dissolvidos em N,N-dimetiletanolamina (um solvente de quelação) contendo hidrato de fosfato de potássio como uma base [F. Y. Kwong e S. L. Buchwald1 Org. Letters, 2003, 5, 793-796, J. P. Wolfe, S. Wagaw, J.- F. Marcoux e S. L. Buchwald, Acc. Chem. Res., 1998, 31, 805-818]. As misturas foram aquecidas para 100°C sob atmosfera inerte por 18h. Das aminas testadas neste deslocamento, apenas benzilami- na teve êxito, fornecendo triaminopirimidinas 111 e 112.
Tabela 25: Derivatisação de Pirimidinas 4,6-diaminadas 89-96. (1g parte)
<table>table see original document page 131</column></row><table> Tabela 25: (2ê parte)
<table>table see original document page 132</column></row><table>
Imidazo[1,2-a]piridinas (V, X, Y = CH, R1=H)
Imidazopiridinas, imidazopirazinas e imidazopirimidinas receberam atenção significativa da indústria farmacêutica devido a suas atividades biológicas interessantes exibidas em uma faixa vasta de classes terapêuticas [A. R. Katritzky, Y.- J Xu e H. Tu, J. Org. Chem., 2003, 68, 4935]. Enquanto houver várias rotas sintéticas para o sistema de anel de imidazo[1,2-a]piridina, o método mais comum envolve o acoplamento de 2-aminopiridinas com com- postos de σ-halocarbonila. Em uma investigação inicial, imidazopiridinas 113 e 114 foram respectivamente preparadas de 2-aminopiridina através de rea- ção com fenacilbrometo e p-bromofenacilbrometo.
<formula>formula see original document page 132</formula>
Um método mais versátil usa um acoplamento de três compo- nentes (3CC) [a) C. Blackburn, B., Guan, P., Fleming, K., Shiosaki e S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635; b) C. Blackburn, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackburn e Β. Guan1 Tetrahedron Lett., 2000, 41, 1495] en- volvendo a condensação de aldeídos, 2-aminopiridina e isocianetos (ES- QUEMA 9).
Esquema 9
A reação de 3CC é realizada na presença de um catalisador de ácido, usualmente triflato de escândio(lll) [a) C. Blackbum, B., Guan, P., Fle- ming, K., Shiosaki e S. Tsai, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 3635; b) C. Black- bum, Tetrahedron Lett., 1998, 39, 5469; c) C. Blackbum e B. Guan, Tetrahe- dron Lett., 2000, 41, 1495; d) S. M. Ireland, H., Tye e M. Whittaker, Tetrahe- dron Lett., 2003, 44, 4369; e) G. S. Mandair, M., Light, A., Russell, M., Hurs- thouse e M. Bradley, Tetrahedron Lett., 2002, 43, 4267], embora ácido glioxí- Iico de excesso [M. A. Lyon e T. S. Kercher, Org. Lett., 2004, 6, 4989] ou argila de montmorilonita [R. S. Varma e D. Kumar, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 7665] sejam também usados. O catalisador de ácido facilita a primeira etapa no 3CC, formação de imina. Reações puderam tipicamente ser feitas em temperatura ambiente em períodos longos de tempo (48 h) usando a- quecimento convencional ou em reatores de microonda.
Várias imidazo[1,2-a]piridinas 115-131 foram preparadas de 2- aminopiridina usando cloreto de zinco ou argila de montmorilonita K10 como o catalisador. Estes resultados estão resumidos na TABELA 26.
Tabela 26: REAÇÃO DE 3CC DE 2-AMINOPIRIDINA (1g parte)
<table>table see original document page 133</column></row><table> <table>table see original document page 134</column></row><table>
Tabela 26: Í2â parte)
<table>table see original document page 134</column></row><table> <table>table see original document page 135</column></row><table>
a Montmorilonita K10, refluxo, 5h
b ZnCl2, microonda, 2h
c Montmorilonita K10, microonda, 2h
Sistemas Bicíclicos 6.6-Fundidos
Um conjunto pequeno de sistemas bicíclicos 6,6-fundidos com base na condensação de sistemas de 1,2-dicarbonila com diaminas 1, 2 e 13 foi alvejado, especificamente usando glioxal (fornecendo 132-134) [Η. B. Gil- lespie, F. Spano e S. Graff, J. Org. Chem., 1960, 25, 942-944; L. G. Frõlich et. al., J. Med. Chem., 1999, 42, 4108-4121] e sal de sódio de oxalacetato de dietila (fornecendo 135-137) [D. Farquhar e T. L. Loo, J. Med. Chem., 1972, 15, 567-568] como o componente de dicarbonila (TABELA 27). As reações com base em 1 provaram não singularmente cooperativas, principalmente devido ao contato pobre entre os reagentes, enquanto a triamina 2 forneceu triciclo interessante 133 em glioxal de excesso.
Tabela 27: Formação de Quinoxalinas e Pteridinas Usando Glioxal ou Oxa- acetato de Dietila (1a parte)
<table>table see original document page 135</column></row><table>
Tabela 27: (2ã parte) <table>table see original document page 136</column></row><table>
aObtido como uma mistura do quinoxalina e o iminodiéster de intermediário
Sistemas 6.6-Bicíclicos
Para alvejar derivados de pirimidina de natureza não-aromática tendo uma rede de ligação de hidrogênio estendida, a reação de três- componentes primeiro descrita por Biginelli para preparar 3,4-diidropirimidin- 2(1H)-onas foi usada [J. C. Bussolari e P. A. McDonneII, J. Org. Chem., 2000, 65, 6777, e referências dentro deesta]. Esta reação de multicompo- nentes consistiu na reação de condensação de um aldeído aromático, uréia, e acetoacetato de etila em uma solução etanólica acídica produzindo pirimi- donas altamente funcionalizadas. Uma modificação da reação de Biginelli, relacionada a Bussolari e McDonneII, usando sal de sódio de oxalacetato de dietila com uréia, vários aldeídos e ácido trifluoroacético em 1,2-dicloroetano anidro foi usada, fornecendo pirimidonas 138-141 (TABELA 28).
Tabela 28: Ciclocondensaçãos de Sal de Sódio de Oxalacetato de Dietila e Hidrólise de 138
<table>table see original document page 136</column></row><table> <table>table see original document page 137</column></row><table>
A hidrólise induzida por hidróxido dos ésteres de etila de 138 foi realizada por tratamento de uma suspensão de 138 em etanol absoluto com uma solução de hidróxido de potássio em etanol absoluto, fornecendo a pi- rimidinona desidratada 142.
Adenosinas com Capacidade de Coordenação de Metal
Em base mecanística e projeções estruturais sobre a natureza de transferência de fosforila de ATP para ácido glutâmico na forma adenilila- da de glutamina sintetase, foi proposto que a proximidade do metal a C-8 da adenina pudesse melhor ser modelada mediante a incorporação de um sítio de ligação de metal nesta região de moléculas potencialmente inibidoras. Foi proposto que um substituinte contendo dois ou mais heteroátomos proxi- mais, por exemplo uma metade de morfolino, nesta posição pudesse satisfa- zer o papel do sítio de coordenação e colocar um segundo heteroátomo em uma região de espaço que poderia ser um análogo ao ocupado pela cadeia principal de fosfato pseudo-cíclico do complexo de ATP. O íon de metal en- capsulado neste complexo depois poderá adquirir água ou dióxido de carbo- no (em forma hidratada) para completar a esfera de coordenação - presumi- velmente de uma maneira similar à ATP de origem.
A síntese das espécies requeridas foi alçancada através de bromação de adenosina 143 (solução de água de bromo) para dar 8- bromoadenosina 144, seguido por proteção como o acetal de 2',3'- /sopropilideno 145 usando uma mistura de 2,2-dimetoxipropano e acetona (volumes iguais) e cinco equivalentes de ácido toluenossulfônico (ESQUE- MA 10). O haleto foi deslocado em um solvente de 1,4-dioxano utilizando irradiação de microonda na presença de morfolina de excesso, fornecendo 146. Desproteção prosseguiu em tetraidrofurano e ácido clorídrico concen- trado em temperatura ambiente para gerar as espécies 147 requeridas que foram submetidas à cromatografia líquida preparativa para obter uma amos- tra autêntica [T. Sasaki, K. Minamoto e H, Itoh, J. Org. Chem., 1978, 43, 2320-2325].
<formula>formula see original document page 138</formula>
Esquema 10
Um protocolo similar poderia ser usado para incorporar substitu- intes alternativos na posição 8 para modificar tanto as características espa- ciais como ligantes.
Materiais e Métodos para Protocolos Sintéticos
Todos os materiais de partida usados comercialmente foram ob- tidos e usados como obtidos do provedor sem outra purificação.
Cromatografia de coluna foi executada usando Kiesel gel 60 de Merck (tamanho de partícula 0,040 - 0,063 mm), enquanto cromatografia de camada fina foi feita em sílica-gel 60 suportado em alumínio de Merck F254.
Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro de RMN Varian Gemini 200 operando a 200 MHz. Dados de deslocamento químico são registrados em ppm, e constantes de acoplamento são citados em Hertz.
Os dados de HPLC foram registrados em um sistema de Croma- tografia Líquida de Waters usando um detector de UV/VIS Varian 9050 ope- rando a 254 nm. Todas as separações foram feitas usando uma coluna de C-18(2) de 5 μ de 150 mm χ 4,60 mm de Fenomenex® Luna™ usando um sistema de elução isocrático. Solventes usados foram misturas de metanol e 25 mM de tampão de acetato de amônio aquoso em pH 4 como indicado, eluindo a uma taxa de fluxo de 1 cm3/min.
Processamento padrão refere-se à extração com um solvente orgânico, seguido secando com sulfato de magnésio, e destilação a vácuo do solvente em um evaporador rotativo.
Pontos de fundição foram registrados em uma Chapa Aquecedo- ra de Reichert e não são corrigidos.
4,6-Diaminopirimidino-2-Tiol (3)
Metal de sódio (1,8 g, 0,078 mol) foi dissolvido em etanol absolu- to (40 cm3) sob atmosfera de nitrogênio. A este foi adicionada tiouréia (6,0 g, 0,079 mol) seguido por malononitrila (5,0 g, 0,076 mol). A mistura heterogê- nea resultante foi aquecida a refluxo por 2h e depois deixada esfriar para temperatura ambiente. Água (120 cm3) foi adicionada para facilitar dissolu- ção completa, e a mistura homogênea foi neutralizada com ácido acético glacial (para pH 6,0). A mistura foi esfriada para OeC e filtrada. O produto colhido foi secado sob vácuo para fornecer 4,6-diaminopirimidino-2-tiol 3 (7,80g, 69 %). <5h (200 MHz, Gf6-DMSO) 5,01 (1H, s, H-6), 6,4-6,7, (4H, br s, NH2); mp > 2809C.
Cloridrato de 4,6-diaminopirimidina (4)
4,6-Diaminopirimidino-2-tiol 3 (4,10 g, 0,029 mol) foi dissolvido em 2M de hidróxido de sódio aquoso (18 cm3) e esfriado para 10eC em um banho de gelo. Peróxido de hidrogênio aquoso (3 %, 62 cm3) foi adicionado a gotas com agitação a uma tal taxa a manter a temperatura abaixo de 15gC. Após adição completa (aprox. 20 min) a reação foi agitada por um adicional de 30 minutos sem esfriar. A mistura de reação ficou opaca durante este tempo, e foi depois acidificada para pH 4,0 com ácido acético glacial. A pas- ta resultante foi esfriada e o produto colhido através de filtração e secado sob vácuo para fornecer ácido 4,6-diaminopirimidino-2-sulfínico (3,48 g, 69 %), mp. 164-1709C (lit. 168-1709C). O ácido (3,40 g, 0,020 mol) foi adiciona- do em etano seco saturado a 59C com gás de cloreto de hidrogênio, e a mis- tura resultante agitada em temperatura ambiente por 30 min durante cujo tempo uma pasta grossa formou-se. Após formação desta pasta, a mistura foi esfriada para O9C e deixada agitar por 1h. O produto foi separado através de filtração, lavado com éter dietílico e secado sob vácuo para fornecer 2,78 g (97 %) de cloridrato de 4,6-diaminopirimidina 4, <5H (200 MHz, cfe- DMSO) 5,60 (1H, s, H-5), 7,40-7,81, (4H, br s, NH2), 8,20 (1H, s, H-2); mp. 194-196eC (lit. 196-1989C).
PREPARAÇÃO ALTERNATIVA DE 4,6-DIAMINOPIRIMIDINA (4)
4,6-Diamino-2-mercaptopirimidina 3 (24,85 g, 0,18 mol) foi sus- pensa em 5 % de amônia aquosa (1,2 L) e aquecida para 85gC para facilitar a dissolução. Níquel de Raney (50 g de pasta úmida) foi adicionado cautelo- samente em porções à mistura quente por 10 minutos. A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 1h. A mistura de reação quente foi filtrada e o bolo de filtro lavado com água quente (200 cm3). O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer 4,6-diaminopirimidina 4 (15,9 g, 83 %). δΗ (200 MHz, D2O) 7,82 (1H, s, H-2) e 5,55 (1H, s, H-5). <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 159,6 (C-4 e C-6), 149,9 (C-2) e 81,2 (C-5).
HIDROGENOSSULFATO DE 4,5,6-TRIAMINOPIRIMIDINA (5)
4,6-Diaminopirimidina 4 (15,90 g, 0,14 mol) foi suspensa em áci- do clorídrico aquoso (1M, 500 cm3) e esfriada para 2eC. Uma solução aquo- sa de nitrito de sódio (14,90 g, 0,22 mol) em água (35 cm3) foi adicionada a gotas à solução esfriada a uma tal taxa para manter a temperatura de rea- ção abaixo de 4eC (30 minutos nesta escala). A mistura foi deixada aquecer para temperatura ambiente em um período de 1h. Após este tempo, a mistu- ra de verde-marrom foi neutralizada para um pH de 7,0 com bicarbonato de sódio, adicionado como um sólido em porções. O precipitado azul-verde que se formou foi separado por filtração, mas não secado completamente. O composto nitroso instável foi empastado imediatamente em água (220 cm3) e tratado com ditionita de sódio (52,80 g, 0,25 mol) que foi adicionado em porções em temperatura ambiente. A mistura amarela foi tratada com 50 % de ácido sulfúrico aquoso (150 cm3, 1,4 mol) e aquecida para 80QC por 3 minutos, então esfriada para temperatura ambiente em um banho de gelo.
O precipitado que se formou foi separado por filtração e lavado com etanol aquoso (30 cm3) e secado para fornecer hidrogenossuIfato de 4,5,6- triaminopirimidina 5 (23,0 g, 71 %). δΗ (200 MHz, D2O) 7,61 (1H, s, H-2); <5C (50 MHz, de-DMSO) 148,1 (C-4 e C-6), 140,4 (C-2) e 105,9 (C-5). A amina livre poderia ser preparada dissolvendo o sal de sulfato de hidrogênio em um mínimo de 2M de hidróxido de sódio aquoso quente. A amina livre precipita ao esfriar, e pode ser recristalizada de água. 4-AMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTOPIRIMIDINA (7)
Metal de sódio (4,60 g, 0,20 mol) foi dissolvido em etanol absolu- to (150 cm3) sob uma atmosfera de nitrogênio, e tratado com cianoacetato de etila (22,0 g, 0,19 mol) e tiouréia (16,0 g, 0,21 mol). A mistura resultante foi aquecida a refluxo sob uma atmosfera de nitrogênio por 2h. Após este tempo, a mistura foi esfriada para temperatura ambiente, e um precipitado branco formou-se, que foi filtrado. O bolo de filtro foi dissolvido em água (150 cm3) e acidificado para pH 4,0 com 50 % de ácido acético aquoso. O precipitado que se formou foi filtrado para render 4-amino-6-hidróxi-2- mercaptopirimidina 7 (28,0 g, 100 %) como um sólido branco, õh (200 MHz, D2O) 5,06 (1H, s, H-5); õc (50 MHz, D2O) 177,4 (C-6)a, 170,0 (C-2)a, 164,9 (C-4)a e 82,1 (C-5).
4,5-DIAMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTOPIRIMIDINA (8)
4-amino-6-hidróxi-2-mercapto-5-nitrosopirimidina 9 (17,60g, 0,10 mol) foi empastada em uma solução de bicarbonato de sódio aquosa saturada (400 cm3) e tratada com ditionita de sódio (42,7 g, 0,25 mol) que foi adicionada em porções por 10 minutos. A mistura amarela pálida foi deixada agitar a 5-C por 7h, e foi depois tratada com ácido acético (24 cm3). Um pre- cipitado branco começou a formar-se com tempo. O precipitado foi filtrado, lavado com etanol aquoso (30 cm3) e secado para fornecer a 4,5-diamino-6- hidróxi-2-mercaptopirimidina 8 (18,3 g, 100 %). õc (50 MHz1 D2O) 168,3 (C- 6)a, 158,7 (C-2)a, 142,3 (C-4)a e 103,1 (C-5). 4-AMINO-6-HIDRÓXI-2-MERCAPTO-5-NITROSOPIRIMIDINA (9)
4-amino-6-hidróxi-2-mercaptopirimidina 7 (16,80 g, 0,12 mol) foi suspensa em água (300 cm3) e tratada com ácido acético (60 cm3). A sus- pensão foi tratada com uma solução de nitrito de sódio (15,0 g, 0,22 mol) em água (35 cm3) que foi adicionado a gotas. A mistura laranja resultante foi deixada agitar para temperatura ambiente durante a noite. Após 16h, a mis- tura foi filtrada e o bolo de filtro lavado seqüencialmente com água (20 cm3) e etanol (20 cm3) e secado para render 4-amino-6-hidróxi-2-mercapto-5- nitrosopirimidina 9 (17,6 g, 87 %) como um tijolo sólido vermelho. O produto bruto foi usado em reações subseqüentes sem caracterização ou outra puri- ficação.
4,5-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDINA (10)
4,5-Diamino-6-hidróxi-2-mercaptopirimidina 8 (16,20 g, 0,10 mol) foi dissolvida em 5 % de amônia aquosa (440 cm3) e tratada com níquel de Raney (45,3g de pasta úmida) que foi adicionado em porções em um perío- do de 5 minutos. A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 1,5h. A mis- tura de reação quente foi filtrada e o filtrado concentrado sob pressão redu- zida para fornecer 4,5-diamino-6-hidroxipirimidina 10 (11,5g, 88 %). <5h (200 MHz, D2O) 7,54 (1H, s, H-2); <5C (50 MHz, D2O) 157,0 (C-6)a, 147,8 (C- 4)a, 138,7 (C-2)e 111,1 (C-5).
CLORIDRATO DE 5,6-DIAMINOURACILA (13)
Sódio (3,9 g, 0,17 mol) foi adicionado em pedaços pequenos a etanol absoluto (100 cm3) em um frasco de fundo redondo de multigargalos. Uma vez todo o sódio tinha desaparecido, cianoacetato de etila (9,8 g, 0,087 mol) e uréia (5,2 g, 0,087 mol) foram adicionados e a reação aquecida sob refluxo por 4h. A mistura de reação ficou bastante sólida nessa hora e água quente (100 cm3) foi adicionada para dissolver o material e a mistura foi aquecida para 80QC por 15 min. A reação foi neutralizada cuidadosamen- te com ácido acético glacial, ácido acético glacial adicional (7,5 cm3) foi adi- cionado e depois nitrito de sódio (6,5 g, 0,094 mol) em água (7 cm3). A solu- ção foi esfriada e o sólido rosa 12 removido através de filtração e lavado com água esfriada em gelo. Este material filtrado foi transferido de volta para o frasco original e água morna (40 cm3) foi adicionada. Enquanto agitando, esta pasta foi aquecida para 10OgC e ditionita de sódio sólido (aproximada- mente 20 g) foi adicionada até a cor vermelha do composto nitroso desapa- recesse. Poucos gramas adicionais de ditionita foram adicionados e aqueci- mento continuou por 15 min. A mistura foi deixada esfriar e o bissulfito de diaminouracila foi filtrado e lavado com água. Ao sal de bissulfito em um frasco cônico foi adicionado ácido clorídrico concentrado (20 cm3) e este foi aquecido em uma chapa elétrica com agitação durante 1h. Este foi filtrado e bem lavado com acetona pra fornecer cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 como um sólido cor de bronze (7,53 g, 49 %). õc (50 MHz, D20/Na0H) 96,0 (C-5), 158,0 (C-6), 159,3 (C-2) e 162,2 (C-4).
6-AMINO-1,3-DIMETIL-5-NITROSOURACILA (15)
6-amino-1,3-dimetiluracila 14 (5,0 g, 32 mmols) foi dissolvida em 50 % de ácido acético aquoso (150 cm3). Nitrito de sódio (4,4 g, 64 mmols) foi adicionado, dissolvido em água (20 cm3). A reação ficou púrpura brilhante quase imediatamente e foi agitada durante 1h em temperatura ambiente. A mistura foi esfriada e o precipitado foi colhido através de filtração e bem la- vado com água fria para render 6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 como um sólido roxo luminoso (5,8 g, 98 %). <5H (200 MHz, CZ6-DMSO) 3,26 (3H, s, CH3N), 3,28 (3H, s, CH3N), 9,05 e 12,97(2H, 2 χ br s, NH2). SULFATO DE HIDROGÊNIO DE 5.6-DIAMINO-1,3-DIMETILURACILA (16)
6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 (3,5 g, 19 mmols) foi sus- penso em água morna e ditionita de sódio foi adicionada até que a cor roxa desaparecesse. Neste estágio, todo o material estava na solução. Água foi removida por evaporação até que uma pasta fosse obtida e o sólido foi filtra- do e lavado com água para fornecer hidrogenossuIfito de 5,6-diamino-1,3- dimetiluracila 16 como um sólido amarelo pálido (2,2 g, 46 %). <5H (200 MHz, de-DMSO) 3,14 (3H, s, CH3N), 3,30 (3H, s, CH3N), 3,36 (2H, br s, NH2) e 6,13 (2H, br s, NH2); <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 28,3 e 30,5 (2 χ CH3), 96,7 (C- 5), 145,6 (C-6), 150,5 (C-2) e 159,7 (C-4).
MÉTODO GERAL PARA A CONDENSAÇÃO DE ÁCIDOS CARBOXÍLICOS PARA O-FENILENO-DIAMINA (1)
o-Fenilenodiamina 1 (1 eq.) e o ácido carboxílico requerido (1,2 eq.) foi introduzido em 2 cm3 de ácido fosfórico a 85 % em um frasco de fundo redondo sem um condensador. Esta mistura foi aquecida para 150- 200°C por um mínimo de 2h, usualmente 18h, fornecendo uma solução azul forte com o passar do tempo. A mistura quente é depois decantada em 100 cm3 de solução de carbonato de potássio aquosa saturada, fornecendo uma solução azul acima de pH 7, Invariavelmente, um volume equivalente de acetato de etila foi adicionado para extrair qualquer componente orgânico insolúvel em água. Procedimentos de processamentos individuais são como indicados abaixo.
(2S)-2-(1 H-BENZIMIDAZOL-2-il)PIRROLIDINO-1 -CARBOXILATO DE TERC-BUTILA (17)
o-Fenilenodiamina 1 (1,00 g, 9,21 mmols) e L-prolina (1,31 g, 11,35 mmols) foram tratados como esboçado no procedimento geral. A fase aquosa foi concentrada em uma pasta granular branca contendo placas vermelhas. A pasta branca foi dissolvida cuidadosamente com três porções de 10 cm3 de água fria, deixando para trás as placas. Esta foi dissolvida em 3:1 (v/v) metanokacetato de etila, qualquer sólido que resultou foi separado por filtração, e a solução vermelha concentrada em uma espuma vermelha. Este resíduo foi dissolvido em água (25 cm3, 0,4M) contendo hidróxido de sódio (1,36 g, 33,88 mmols) e pirocarbonato de di-íerc-butila (4,84 g, 22,19 mmols), e agitado durante 18h em temperatura ambiente. Extração com acetato de etila (2 x 25 cm3), secagem da camada orgânica (MgSO4) e concentração forneceram uma goma clara que triturou com 3:10 (v/v) aceta- to de etila:hexano para fornecer um pó branco fino, (2S)-2-(1H-benzimidazol- 2-il)-pirrolidino-1-carboxilato de terc-butila 17 (0,51 g, 19 % mais de 2 eta- pas). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,49-7,68 (2H, m, arila H-4 e H-7), 7,18-7,30 (2H, m, arila H-5 e H-6), 5,09-5,18 (1H, br dm, pirrol H-2, J 7,2), 3,36-3,57 (2H, br t, pirrol H-5), 2,98-3,21 (1H, br s, pirrol H-3a), 1,95-2,39 (3H, 2 x br m, pirrol H-3a e H-4) e 1,53 [9H, s, OC(CH3)3]; õc (50 MHz, CDCI3) 156,8 (NCO), 155,1 (benzimidazol C-2), 122,7 (arila C-4, C-5, C-6 e C-7), 115,5 (br s, arila quaternária C-3a e C-7a), 80,9 (pirrol C-2), 54,9 [OC(CH3)3], 47,6 (pirrol C-5), 28,8 [OC(CH3)3], 28,4 (pirrol C-3) e 25,2 (pirrol C-4). N-ACETIL-N-[(1-ACETIL-1 H-BENZIMIDAZ0L-2-IL)METIL]ACETAMIDA (18) Glicina (1,68 g, 22,08 mmols) e o-fenilenodiamina 1 (1,96 g, 18,11 mmols) foram tratadas como no procedimento geral por 18h. Após neutralização e adição de acetato de etila, a camada aquosa foi isolada e concentrada em uma goma bege. 0,31 g da goma foi tratado com 1:1 (v/v) anidrido acético em ácido acético (10 cm3) a 160SC por 18h. A solução foi decantada em 100 cm3 de solução de carbonato de potássio aquosa satura- da, extraída com acetato de etila (2 x 100 cm3), secada (MgSO4) e concen- trada em uma goma. Trituração desta em acetato de etila / hexano forneceu um pó branco, N-acetil-N-[(1-acetil-1H-benzimidazol-2-il)-metil]acetamida 18 (0,22 g, 4 %). δh (200 MHz, CDCI3) 7,29-7,80, 7,60-7,68 e 7,35-7,45 (4H, 3 x m, arila H), 5,38 (2H, s, CH2), 2,89 (3H, s, benzimidazol COCH3), 2,52 [6H, s, N(COCH3)2]; δC (50 MHz1 CDCI3) 173,4 [N(COCH3)2], 169,6 (benzimidazol COCH3), 152,8 (benzimidazol C-2), 143,1 (arila quaternária C-3a), 132,8 (ari- la quaternária C-7a), 125,1 e 124,8 (arila C-4 e C-7), 121,4 (arila C-6), 113,3 (arila C-5), 45,9 (CH2), 26,9 (benzimidazol COCH3) e 26,6 [N(COCH3)2].
2-{[(TERC-BUTOXICARBONIL)AMINO]METIL}-1 H-BENZIMIDAZOL-1 - CARBOXILATO DE TERC-BUTILA (19)
Uma porção da goma (1,04g) usada na preparação de 18 foi dissolvida em água (50 cm3) contendo hidróxido de sódio (4,51 g) e pirocar- bonato de diterc-butila (2,43 g, 11,14 mmols), e agitada durante 18h em temperatura ambiente. Extração com acetato de etila (2 x 25 cm3), secagem da camada orgânica (MgSO4) e concentração forneceram uma goma clara. Esta foi purificada através de cromatografia de coluna [1:10-1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] para fornecer um óleo amarelo pálido que se solidificou ao repousar em um sólido bege, 2-{[(ferc-butóxi- carbonil)amino]metil}-1H-benzimidazol-1-carboxilato de terc-butila 19 (1,20 g, 19 % com base em diamina de partida). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,92-7,98, 7,65-7,74 e 7,26-7,39 (4H, 3 x m, arila H), 5,85 (1H, br s, NH), 4,81 (2H, d, CH2, J 5,4), 1,73 [9H, s, benzimidazol OC(CH3)3] e 1,51 [9H, s, OC(CH3)3]. 2-(4-BROMOBUTIL)-1H-BENZIMIDAZOL (20)
o-Fenilenodiamina 1 (1,00 g, 9,27 mmols) e ácido 5- bromovalérico (2,15 g, 11,85 mmols) foi colocado em um frasco de fundo redondo equipado com um condensador, e aquecido puro com agitação a 150°C durante 3h. O sólido roxo resultante foi esmagado e lavado com 10cm3 de acetato de etila para precipitar o pó roxo, 2-(4-bromobutil)-1H- benzimidazol 20 (1,28 g, 73 %). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7,61-7,68 e 7,18-7,32 (4H, arila H), 6,26 (1H, br s, NH), 4,09 (2H, t, = CCH2, J 6,0), 3,11 (2H, t, CH2OH, J 6,3) e 1,95-2,22 [4H, m, (CH2)2CH2Br].
MÉTODO GERAL PARA A ALQUILAÇÃO MEDIADA POR BASE DE BEN- ZIMIDAZOL 21
Uma mistura de benzimidazol 21 (1 eq.) e o(s) agente(s) de al- quilação (1,1-1,3 eq.) em N,N-dimetilformamida seca foi tratada com hidreto de sódio sob atmosfera de nitrogênio. A solução foi depois aquecida para 100°C durante 18h. A solução marrom resultante foi decantada em acetato de etila e extraída três vezes com uma quantidade equivalente de água. A- pós secagem e concentração, o resíduo foi purificado através de cromato- grafia de coluna [1:10 -1:2 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. 1 -ALIL-1H-BENZIMIDAZOL (22)
Uma mistura de benzimidazol 21 (0,49 g, 4,15 mmols) e brometo de alila (0,40 cm3, 4,62 mmols) em N,N-dimetilformamida seca (10 cm3) foi tratada com hidreto de sódio (60 % em óleo, 0,23 g, 5,66 mmols) como pelo procedimento geral. Cromatografia de coluna forneceu um óleo bege, 1-alil- 1 H-benzimidazol 22 (0,56 g, 86 %). δH (200 MHz, CDCl3) 7,92 (1H, br s, H- 2), 7,77-7,89 e 7,24-7,45 (4H, 2 x m, arila H), 6,02 (1H, ddt, CH2CH =, J17,0, 10,0 e 5,8), 5,31 (1H, dq, CH=CHaHb, J 10,2 e 1,8), 5,21 (1H, dq, CH=CHaHb, J17,0 e 1,6) e 4,79 (2H, NCH2, J 5,4 e 1,8). 1 -[(2-FURILMETÓXI)METIL]-1 H-BENZIMIDAZOL (23)
Benzimidazol 21 (0,51 g, 4,24 mmols), dibromometano (0,33 cm3, 4,6 mmols) e álcool de furfurila (0,40 cm3, 4,6 mmols) em N,N- dimetilformamida seca (10 cm3) foram tratados com hidreto de sódio (0,38 g, 9,25 mmols) como pelo procedimento geral. Cromatografia de coluna forne- ceu um óleo amarelo, 1-[(2-furilmetóxi)metil]-1H-benzimidazol 23 (0,39 g, 40 %). δh (200 MHz, CDCI3) 8,00 (1H, s, benzimidazol H-2), 7,79-7,88 e 7,47- 7,59 (2H, 2 χ m, benzimidazol H-4 e H-7), 7,43-7,47 (1H, m, furila H-5), 7,26- 7,40 (2H, m, benzimidazol H-5 e H-6), 6,38 (1H, ~dd, furila H-4, J 3,2 e 1,8), 6,33 (1H, br dd, furila H-3, J 3,0 e 1,8), 5,57 (2H, s, NCH2O) e 4,41 (2H, s, OCH2furila).
PROCEDIMENTO GERAL PARA PREPARAÇÃO DE PIRIMIDINAS ACILA- DAS
N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (26)
2,4,5-Triamino-6-hidroxipirimidina 2 (1,0 g, 4,2 mmols) foi dissol- vida em 2M de solução de hidróxido de sódio (25 cm3) e a solução foi esfria- da até O5C usando um banho de gelo. Cloreto de benzoíla (0,6 g, 4,2 mmols) foi depois adicionado por 5 minutos à solução usando uma seringa. A mistu- ra foi deixada agitar por 15 minutos a 0°C e outra porção de cloreto de ben- zoíla (0,6 g, 4,2 mmols) foi adicionada de uma maneira similar. A mistura foi deixada agitar durante uma hora adicional no banho de gelo. A mistura de reação foi depois removida do banho de gelo e deixada aquecer-se para temperatura ambiente. O pH da solução foi ajustado em 5 com ácido acético glacial em cujo ponto o produto precipitou-se da solução. O precipitado mar- rom claro foi filtrado em um funil de Buchner e lavado com água deionizada (3x10 cm3). O bolo de filtro foi secado inicialmente no funil por 3h e depois transferido para um frasco e secado a vácuo. N-(2,4-Diamino-6- hidroxipirimidin-5-il)benzamida 26 (0,78 g, 56 %) δΗ (200 MHz, D2O) 7,79 (2H, d, J6,6, 2 χ ArCΗ) e 7,35-7,58 (3H, m, 3 χ ArCΗ). Usado como se en- contra para a etapa subseqüente.
Em uma maneira similar foi obtido os seguintes: N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIFENIL)OCTANAMIDA (28) (0,34 g, 35 %). δΗ (200 MHz, D2O) 2,36 (2H, t, J 7,7, COCH2), 1,45-1,70 (2H, m, COCH2CH2), 1,10-1,40 (8H, m, 4 χ CH2) e 0,82 (3H, brs, CH3).
N-(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIFENIL)-2,2-DIMETILPROPANAMIDA (29) (0,38 g, 43 %). <5h (200 MHz, D2O) 1,24 (9H, s, 3 χ CH3).
N-(1-{[(2,4-DIAMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)AMINO]CARBONIL}-2- METILPROPIL)BENZ-AMIDA (30)
Uma solução de L-valina (15,75 g, 0,13 mol) e hidróxido de po- tássio (12,00 g, 0,21 mol) em água (150 cm3) foi tratada com cloreto de ben- zoíla (18,7 cm3, 0,16 mol) em temperatura ambiente, e deixada agitar por 72h. Esta foi extraída com clorofórmio (200 cm3), então lavada com um vo- lume igual de 1M de ácido clorídrico seguido por carbonato de potássio a- quoso saturado. Após secagem (MgSO4) e concentração, o sólido bege foi dissolvido em clorofórmio (200 cm3). A solução foi tratada com cloreto de tionila (14,7 cm3, 0,21 mol) e três gotas de dimetilforrhamida sob atmosfera de nitrogênio. A mistura foi aquecida por 1h, então concentrada em uma massa amarela viscosa. Duas porções deste cloreto de ácido (4,01 g cada) foram adicionadas a uma solução de 13 (2,00 g, 8,38 mmols) em 1M de hi- dróxido de sódio aquoso (50 cm3) a O2C por 2h após as quais o pH foi ajus- tado para ~4 com ácido acético glacial. Um sólido bege, 30, vertido da solu- ção, que foi depois filtrado, secado e usado como se encontra sem caracte- rização.
PROCEDIMENTO GERAL PARA A CICLIZAÇÃO MEDIADA DE METÓXIDO DE SÓDIO DAS PIRIMIDINAS ACILADAS
2-AMINO-8-FENIL-9H-PURIN-6-OL (31)
N-(2,4-diamino-6-hidroxipirimidin-5-il)benzamida 26 (0,3 g, 1,2 mmol) foi adicionada à solução de metóxido de sódio em metanol (10 % m/m, 5 cm3). A mistura resultante foi aquecida a refluxo por 5h em um ba- nho de óleo. A mistura de reação foi depois esfriada para temperatura ambi- ente, água (5 cm3) adicionada, e o metanol foi evaporado no evaporador ro- tativo. A solução aquosa resultante foi acidificada em pH 5 com ácido acético glacial em cujo ponto um sólido precipitou-se da solução. O sólido foi filtrado e lavado com água (3x10 cm3). O bolo de filtro foi secado durante a noite no funil para render 2-amino-8-fenil-9H-purin-6-ol 31 (0,78 g, 60 %) <5H (200 MHz, D2O) 7,96 (2H, d, J7,0, 2 χ ArCΗ) e 7,28-7,46 (3H, m, 3 χ ArCΗ).
Em uma maneira similar, os seguintes foram preparados:
2-AMINO-8-HEPTIL-9H-PURlN-6-OL (33)
(0,12 g, 46 %). <5h (200 MHz, D2O) 2,59 (2H, t, J 7,7, ArCH2), 1,52-1,70 (2Η, m, ArCH2CH2), 1,08-1,35 (8Η, m, 4 χ CH2) e 0,78 (3Η, br s, CH3).
2-AMINO-8-TERC-BUTIL-9H-PURIN-6-OL (34)
(0,11 g, 53 %). δh (200 MHz, D2O) 1,30 (9H, s, 3 χ CH3).
PROCEDIMENTO GERAL PARA A CICLIZAÇÃO MEDIADA POR OXICLO- RETO FOSFOROSO DE PIRIMIDINAS ACILADAS 6-CLORO-8-FENIL-9H-PURIN-2-AMINA (35)
Benzamida 26 (1,66 g, 6,75 mmols) em oxicloreto fosforoso (35 cm3) foi aquecida sob refluxo em atmosfera de nitrogênio por 18h. Sol- vente de excesso foi removido sob vácuo, e gelo esmagado adicionado ao resíduo, fornecendo uma suspensão preta sob agitaçaõ. Os sólidos foram filtrados, e o filtrado basificado com solução de amônia concentrada. Um sólido bege formou-se. O sólido foi separado por filtração, lavado com água, etanol e acetona, então secado para render 6-cloro-8-fenil-9H-purin-2-amina 15 35 (0,39 g, 24 %). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 8,02-7,95 e 7,62-7,38 (5H, 3 χ m, arila H), 7,12 (1H, brs, NH), 6,25 e 6,32 (2H, 2 χ br s, NH2); δC (50 MHz, Cl6- DMSO) 161,2 (C-6), 156,4 (C-4), 154,2 (C-8), 153,4 (C-2), 130,13 (arila qua- ternária C), 129,13, 128,7 e 125,9 (arila CH) e 108,5 (C-5). 6-CLORO-8-HEPTIL-9H-PURIN-2-AMINA (36)
Seguindo o procedimento geral, amida 28 (1,71 g, 6,38 mmols) foi tratada com POCI3 (35 cm3), fornecendo 6-cloro-8-heptil-9H-purin-2- amina 36 (0,19 g, 11 %) como um sólido laranja. δH (200 MHz, d6-DMSO) 6,39 (~1 H, br s, NH), 1,12 (12H, br s, 6 χ CH2) e 0,83 (3H, br m, CH3); δC (50 MHz, GfrDMSO) 160,2 (C-6), 150,6 (C-8), 146,1 (C-4), 144,3 (C-2), 112,7 (C-5), 31,4, 28,9, 28,7, 28,6, 27,6 e 22,3 (6 χ CH2) e 13,8 (CH3).
N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (37)
Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,00 g, 7,93 mmols) em 2M NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de ben- zoíla (1,84 cm3, 15,85 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin-5- il)benzamida 37 (1,35 g, 74 %) como um pó amarelo. Usado como se encon- tra sem caracterização.
N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)OLEILAMIDA (38) Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,00 g, 7,93 mmols) em 2M de NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de oleíla (5,24 cm3, 15,85 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin-5- il)oleilamida 38 (0,33 g, 11 %) como uma goma marrom. Usada como se en- contra sem caracterização.
N-(4-AMINO-6-HIDROXIPIRIMIDIN-5-IL)OCTANAMIDA (39)
Seguindo o procedimento geral por acilação, diamina 10 (1,06 g, 8,43 mmols) em 2M de NaOH aquoso (20 cm3) foi tratada com cloreto de octanoíla (2,71 cm3, 15,88 mmols) para render N-(4-amino-6-hidroxipirimidin- 5-il)octanamida 39 (0,16 g, 8 %) como um pó bege. Usada como se encontra sem caracterização.
8-HEPTIL-9H-PURIN-6-OL (40)
Seguindo o procedimento geral por fechamento de anel mediado por metóxido de sódio, amida 39 (0,18 g, 0,72 mmol) foi tratada com metóxi- do de sódio (1,97 g, 36,53 mmols) em metanol (15 cm3), fornecendo 8-heptil- 9H-purin-6-ol 40 (0,13 g, 77 %) como um pó branco. <5H (200 MHz, afe-DMSO) 8,54 (~1 H, br s, Ntf), 7,74 (~1H, br s, H-2), 6,02 (1H, br s, Otf), 2,17-2,41, 1,01 -1,82 e 0,75-1,12 [15H, 6 χ m, (CH2)5CH3]; õc (50 MHz, GfirDMSO) 171,6 (C-6), 159,2 (C-8), 158,5 (C-4); 146,9 (C-2), 98,9 (C-5), 35,3, 31,2, 28,7, 28,5, 27,4, 25,1 e 22,0 (6 χ CH2) e 13,9 (CH3).
N-(6-AMIN0-2,4-DIIDR0XIPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (41)
Usando o procedimento geral por acilação, cloridrato de 5,6- diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi dissolvido em 10 % de hidróxido de sódio aquoso (12 cm3), esfriado em um banho de gelo e tratado com duas porções de cloreto de benzoíla (0,33 cm3, 2,8 mmols) por 1,5h. O pH foi a- justado para 7-8 com ácido acético, o produto precipitou-se da solução e foi colhido através de filtração e lavado com água para render N-(6-amino-2,4- dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5-il)benzamida 41 como um sólido amarelo (0,68 g, 99 %). δΗ (200 MHz, Gf6-DMSO) 10,37 (1H, s, Ntf), 10,19 (1H, s, Ntf), 8,79 (1H, s, NtfC=O), 7,94-8,00 (2H, m, arila H), 7,41-7,55 (3H, m, arila H) e 6,10 (2H, br s, Ntf2).
6-AMINO-5-{[(1 E,2E)-3-FENILPROP-2-ENILIDENO]AMINO}PIRIMIDINO- 2,4-DIOL (42)
Cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi dis- solvido em metanol (10 cm3), cinamaldeído (0,35 cm3, 2,8 mmols) foi adicio- nado e a reação foi agitada em temperatura ambiente por 2 h. Água foi adi- cionada e um sólido pegajoso resultou que foi triturado com éter e depois colhido através de filtração para render 6-amino-5-{[(1E,2E)-3-fenilprop-2- enilideno]amino}pirimidino-2,4-diol 42 como um sólido laranja luminoso (0,64 g, 89 %). δΗ (200 MHz, Qf6-DMSO) 10,92 (1H, s, NH), 10,76 (1H, s, NH), 9,44 e 9,69 (1H, 2 χ d J 8, N=CH) e 7,10-7,80 (7H, m, arila H, CH=CH); δc (50 MHz, cfe-DMSO) 159,9 153,8, 152,7 e 149,2 (C-2, C-4, C-5 e C-6), 136,3, 130,5 e 131,9 (C=C e C=N), 129,8, 129,4, 129,2 e 128,3 (arila C). XANTINA (43)
Cloridrato de 5,6-diaminouracila 13 (0,50 g, 2,8 mmols) foi aque- cido sob refluxo com trietilortoformato (5 cm3), trietilamina (0,39 cm3, 2,8 mmols) e N,N-dimetil-formamida (2 cm3) por 19h. O material sólido foi filtrado e lavado com éter para fornecer xantina 43 como um sólido bege (0,45 g, 90 %). <5h (200 MHz, CZ6-DMSO) 7,9 (1H, s, H-8); δc (50 MHz, Cl6- DMSO) 156,2 (C-6), 152,1 (C-2), 149,5 (C-4), 141,2 (C-8) e 107,4 (C-5).
6-CLORO-8-FENIL-9H-PURIN-2-OL (44) N-(6-amino-2,4-diidroxipirimidin-5-il)benzamida 41 (0,14 g,
0,057 mmol) foi fervida sob refluxo em POCl3 (5 cm3) por 4h. POCI3 de ex- cesso foi removido por evaporação rotativa em uma capela e ao resíduo foi adicionado gelo esmagado. Um precipitado foi colhido através de filtração e lavado com água para render 6-cloro-8-fenil-9H-purin-2-ol 44 como um sóli- do marrom (0,17 g, produto mais compostos fosforosos externos). Õh (200 MHz, C16-DMSO) 10,85 (1H, s, NH), 8,02-8,10 (2H, m, arila H) e 7,38- 7,60 (3H, m, arila H); õc (50 MHz, ci6-DMSO) 156,0 (C-6), 152,0 (C-2), 150,6 e 150,2 (C-4 e C-8), 130,8, 129,7, 129,5 e 126,9 (arila C) e 108,7 (C-5).
8-[(E)-2-FENILVINIL]-9H-PURINO-2,6-DIOL (45) 6-amino-5-{[(1 E,2£)-3-fenilprop-2-enilideno]amino}pirimidino-2,4- diol 42 (0,27 g, 1,1 mmol) foi dissolvido em cloreto de tionila (10 cm3) e a- quecido sob refluxo por 6,5h, o curso da reação sendo seguida por HPLC. Após desaparecimento do pico do material de partida, a reação foi esfriada e cloreto de tionila de excesso foi removido sob pressão reduzida para render 8-[(E)-2-fenilvinil]-9H-purino-2,6-diol bruto 45, <5C (50 MHz1 Gf6-DMSO) 155,8 e 152,0 (C-6 e C-2), 150,0 (co-incidente C-8 e C-4), 136,1 e 135,6 (CH=CHPh e arila C), 129,8, 129,7 e 127,8 (arila C), 116,4 (CH=CHPh) e 108,1 (C-5). N-(6-AMINO-1,3-DIMETIL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIMIDIN-5- IL)BENZAMIDA (46)
Bissulfito de 5,6-diamino-1,3-dimetiluracila 16 (0,25 g, 0,99 mmol) foi suspenso em 10 % de hidróxido de sódio (4 cm3) e esfriado para O-C em um banho de gelo. Cloreto de benzoíla (1 eq., 0,12 cm3) foi adi- cionado e após 15 min agitando, um equivalente adicional foi adicionado. A reação foi deixada aquecer-se para temperatura ambiente e agitação duran- te a noite. A mistura de reação foi acidificada com ácido acético e o precipi- tado foi colhido através de filtração e lavado com água para render N-(6- amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidro-pirimidin-5-il)benzamida 46 co- mo um sólido amarelo (0,10 g, 37 %). <5H (200 MHz, cfe-DMSO) 8,90 (1H, s, NHC=O), 7,95-8,02 (2H, m, arila H), 7,42-7,55 (3H, m, arila H), 3,35 (3H, s, CH3N) e 3,15 (3H,s, CH3N).
N-(6-AMINO-1,3-DIMETIL-2,4-DIOXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIMIDIN-5- IL)OCTANAMIDA (47)
Bissulfito de 5,6-diamino-1,3-dimetiluracila 16 (0,25 g, 0,99 mmol) foi dissolvido em piridina (2 cm3) e a solução foi esfriada para 0-C. Cloreto de octanoíla (1 eq., 0,17 cm3) foi adicionado e a reação foi dei- xada aquecer-se para temperatura ambiente e agitação durante a noite. Um volume pequeno de ácido acético foi adicionado e a mistura de reação foi dividida entre acetato de etila e água. A camada de água foi removida e a camada orgânica lavada duas vezes com 1M de ácido clorídrico. A camada orgânica foi secada em MgS04 e o solvente removido para render N-(6- amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetra-hidropirimidin-5-il)octanamida bruta 47 como um sólido amarelo (0,05 g, 17 %). <5H (200 MHz, Cf6-DMSO) 8,91 (1H, s, NHC=O), 8,24 e 6,47 (2H, 2 χ s, NH2), 3,31 (3H, s, CH3N), 3,12 (3H, s, CH3N), 2,14-2,30 [2H, m, CH3(CH2)5CH2C=O], 1,40-1,61 e 1,17-1,38 [10H, 2 χ m, CH3(CH2)5CH2C=O], e 0,80-0,92 [3Η, m, CH3(CH2)6].
1,3-DIMETIL-8-FENIL-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2,6-DIONA (48)
N-(6-amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5- il)benzamida 46 (0,10 g, 0,36 mmol) foi suspensa em 2M de hidróxido de sódio (2 cm3) e metanol (1 cm3). A reação foi fervida sob refluxo por 3h. Du- rante o curso da reação todo o material dissolveu, seguido por formação de um precipitado branco. A mistura de reação foi esfriada e água (1 cm3) foi adicionada, seguido por acidificação em pH 5 com ácido acético. O precipi- tado foi colhido através de filtração e lavado com água para render 1,3- dimetil-8-fenil-3,9-diidro-1H-purino-2,6-diona 48 como um sólido branco (0,06 g, 65 %). <5h (200 MHz, cfe-DMSO) 8,12-8,19 (2H, m, arila H), 7,48-7,57 (3H, m, arila H), 7,28 (1H, s, NH), 3,52 (3H, s, CH3N) e 3,28 (3H, s, CH3N). PREPARAÇÃO ALTERNATIVA: 6-amino-1,3-dimetil-5-nitrosouracila 15 (0,50 g, 2,7 mmols) foi aquecido para 1759C por 3h com benzilamina (2 cm3) que tinha sido tratada com ácido clorídrico concentrado (0,16 g, 4,3 mmols). A reação foi esfriada, o material solidificado e suspenso em etanol (5 cm3). Este foi filtrado e o sólido agitado com água (2 cm3) para 2 h. Coletânea do sólido através de filtração e lavagem com água forneceu 48 como um sólido branco (0,12 g, 17 %).
1,3-DIMETIL-8-HEPTIL-3,9-DIIDRO-1 H-PURINO-2.6-DIONA (49)
N-(6-amino-1,3-dimetil-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidropirimidin-5- il)octanamida 47 (0,29 g, 0,99 mmol) foi fervida sob refluxo em 2M de hidró- xido de sódio (3 cm3) e metanol (1,5 cm3) por 4h. Após esfriar, água (1 cm3) foi adicionada seguido por algumas gotas de ácido acético. O precipitado branco resultante foi filtrado e lavado com água e acetona para render 1,3- dimetil-8-heptil-3,9-diidro-1H-purino-2,6-diona 49 como um sólido branco (0,19 g, 70 %). <5h (200 MHz1 Gf6-DMSO) 3,41 (3H, s, CH3N), 3,22 (3H, s, CH3N), 1,60-1,73 e 1,17-1,35 [12H, 2 χ m, CH3(CH2)6] e 0,82-0,90 [3H, m, CH3(CH2)6].
PROCEDIMENTO GERAL PARA AMIDAÇÃO DE 4,5,6- TRIAMINOPIRIMIDINAS:
N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)BENZAMIDA (50) 4,5,6-Triaminopirimidina 5 (0,36 g, 2,88 mmols) foi empastada em tetraidrofurano/água [1:1 (v/v), 30 cm3] e tratada com trietilamina (1,2 μl, 8,63 mmols). A mistura foi esfriada para OqC em um banho de gelo, e cloreto de benzoíla (0,33 cm3, 2,88 mmols) foi adicionado a gotas como uma solu- ção em tetraidrofurano (5 cm3). Após adição completa, a mistura foi aqueci- da para temperatura ambiente durante a noite. Tetraidrofurano foi removido sob pressão reduzida e o precipitado resultante foi filtrado para fornecer N- (4,6-diaminopirimidin-5-il)benzamida 50 (97 mg, 15 %). <5H (200 MHz, Of6- DMSO) 9,20 (1H, br s, NH), 8,03 (2H, dd, J 8,2 e 1,8, 2 χ arila CH), 7,82 (1H, s, H-2), 7,44-7,56 (3H, m, 3 χ arila CH), 6,23 (2H, br s, NH2) e 6,04 (2H, s, NH2); <5C (50 MHz, d^DMSO) 166,3 (PhCONH), 160,5 (C-4 e C-6), 156,1 (C- 2), 135,1 (arila C), 131,8, 128,9 e 128,6 (arila CH) e 96,1 (C-5). ES-EM m/z 230,1 (M+H), 212,1 e 104,9.
Os compostos a seguir foram preparados por este método geral: N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)OLEAMIDA (51)
(0,26 g, 17 %), <5H (200 MHz, Qf6-DMSO) 8,55 (1H, brs, NH), 7,76 (1H, s, H-2), 5,77 (4H, br s, 2 χ NH2), 5,25-5,38 (2H, m, CH=CH), 2,32 (2H, t, J7,5, NHCOCH2), 1,88-2,09 (4H, m, 2 χ CH2CH=C), 1,48-1,63 (2H, m, CH2), 1,15-1,46 (20H, m, 10 χ CH2) e 0,86 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, Gf6- DMSO) 173,0 (CONH), 159,5 (C-4 e C-6), 154,4 (C-2), 130,3 (CH=CH), 96,2 (C-5), 35,9, 32,0, 29,8, 29,6, 29,3, 27,3, e 25,4 (7 χ CH2), 22,8 (CH2CH3) e 14,6 (CH3).
N-(4,6-DIAMINOPIRIMIDIN-5-IL)OCTANAMIDA (52)
(0,37 g, 36 %). δΗ (200 MHz, cfe-DMSO) 8,59 (1H, br s, NH), 7,82 (1H, s, H-2), 5,99 (4H, br s, 2 χ NH2), 2,33 (2H, t, J 7,4, NHCOCH2), 1,50- 1,68 (2H, m, CH2), 1,13-1,40 (8H, m, 4 χ CH2) e 0,84 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, Gf6-DMSO) 173,0 (CONH), 158,2 (C-4 e C-6), 151,8 (C-2), 95,8 (C- 5),36,0 (COCH2), 31,9, 29,6, 29,3, 25,4 e 22,8 (5 χ CH2) e 14,6 (CH3); (ES) m/z 252,2 (M+H), 234,2 e 126,0.
PROCEDIMENTO GERAL PARA FECHAMENTO DE ANEL MEDIADO POR METÓXIDO DE SÓDIO DE 4,5,6-TRIAMINOPIRIMIDINAS:
8-FENIL-9H-PURIN-6-AMINA (53) Uma solução de /V-(4,6-diaminopirimidin-5-il)benzamida 50 (0,17 g, 0,72 mmol) em metanol (0,5 cm3) foi adicionada a uma solução me- tanólica de metóxido de sódio (25 %, 6 cm3). A mistura foi aquecida a reflu- xo, e deixada agitar neste temperatura sob uma atmosfera de nitrogênio por 16h. A mistura foi esfriada para temperatura ambiente e o pH ajustado para 4 com 1M de ácido clorídrico aquoso. Um precipitado formou-se que foi fil- trado e secado para fornecer 8-fenil-9H-purin-6-amina 53 (0,12 g, 77 %). <5H (200 MHz, Gf6-DMSO) 9,13 (2H, br s, NH2), 8,55 (1H, s, H-2), 8,20-8,25 (2H, m, 2 χ arila CH) e 7,60-7,63 (3H, m, 3 χ arila CH). <5C (50 MHz, CfrDMSO) 153,5 (C-6), 152,1 (C-4), 150,8 (C-8), 146,3 (C-2), 132,2 e 130,0 (cada arila CH), 128,7 (arila C), 127,5 (arila CH) e 110,1 (C-5). ES-EM m/z 212,2 (M+H). 8-HEPTIL-9H-PURIN-6-AMINA (54)
Preparado dé acordo com o procedimento geral descrito acima. (82 mg, 65 %). δΗ (200 MHz, ck-DMSO) 8,87 (2H, br s, NH2), 8,46 (1H, s, H- 2), 2,87 (2H, t, J 7,6, CH2(CH2)5CH3), 1,70-1,87 (2H, m, CH2), 1,17-1,23 (8H, m, 4xCH2) e 0,86 (3H, t, J 6,6, CH3); <5C (50 MHz, cfe-DMSO) 157,7 (C-6), 151,3 (C-4), 150,2 (C-8), 145,4 (C-2), 110,0 (C-5), 31,8, 29,3, 29,2, 29,0, 27,7, e 22,8 (6 χ CH2) e 14,6 (CH3).
METIL 2-AMINO-6-HIDRÓXI-9H-PURIN-8-ILCARBAMATO (55)
Uma mistura de sulfato de /'sotiouréia de S-metila (0,97 g, 3,48 mmols) e metilcloroformato (0,36 cm3, 4,7 mmols) em água (2 cm3) foi esfriada para O9C em um banho de gelo, e o pH ajustado para 8,0 pela adi- ção em gotas de uma solução de hidróxido de sódio aquosa a 25 %. A mis- tura foi deixada agitar durante dez minutos nesta temperatura após o qual o pH foi ajustado de volta para 5,0 com ácido acético glacial. Uma pasta de 2,4,5-tri-amino-6-hidroxipirimidina 2 (1,00 g, 4,18 mmols) em água (2 cm3) foi depois adicionada, seguido por acetato de sódio sólido (0,29 g, 4,18 mmols). A mistura de reação foi aquecida para 85QC durante 1,5h. Após este tempo a mistura foi esfriada para temperatura ambiente e o produto filtrado e secado sob vácuo para fornecer 2-amino-6-hidróxi-9H-purin-8-ilcarbamato de metila 55 (0,90 g, 96 %). <5H (200 MHz, D2O) 3,61 (3H, s, CO2CH3). MÉTODO GERAL PARA A MONOAMINAÇÃO DE 4,6- DICLOROPIRIMIDINA (56)
Uma solução de 56 em álcool isopropílico (1,0M) ou contendo a amina (2,1 eq.), ou uma mistura da amina (1,2 eq.) e trietilamina (1,2 eq.) foi fervida sob refluxo por 1-5h, até que todo o material de partida fosse consu- mido. O solvente foi tirado sob vácuo, e a massa viscosa resultante dividida entre água e acetato de etila ou diclorometano. Extração e processamento padrão, seguido por cromatografia de coluna forneceu os produtos puros.
6-CLORO-N-METILPIRIMIDIN-4-AMINA (57)
Seguindo o método geral, 56 (10,03 g, 67,12 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com cloridrato de metilamina (5,06 g, 74,97 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processa- mento e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para fornecer um sólido cristalino branco, 6-cloro-N- metilpirimidin-4-amina 57 (7,26 g, 75,2 %, 99,9 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3) 8,33 (1H, s, H-2), 6,35 (1H, s, H-5), 5,72 (1H, br s, NH) e 2,94 (3H, d, NHMe, J 5,2); <5C (50 MHz, CDCI3) 164,0 (C-6), 160,8 (C-4), 158,2 (C-2), 101,3 (br, C-5) e 28,2 (NH/We); fR 3,10 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 116 (93), 119 (32), 144 (100, M+. C5H635CIN3 requer 144) e 146 (42, M+. C5H637CIN3 requer 146).
N-BENZIL-6-CLOROPIRIMIDIN-4-AMINA (58)
Usando o método geral, 56 (10,04 g, 67,36 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com benzilamina (8,07 cm3, 73,84 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processamento e cromato- grafia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente pa- ra fornecer um sólido laranja, N-benzil-6-cloro-pirimidin-4-amina 58 (12,66 g, 85,5 %, 99,7 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3) 8,09 (1H, s, H-2), 7,19-7,43 (5H, m, arila H), 6,42 (1H, br s, NH), 6,36 (1H, s, H-5) e 4,50 (2H, d, PhCH2, J 5,4); δc (50 MHz, CDCI3) 163,2 (C-6), 159,7 (C-4), 158,2 (C-2), 136,8 (arila quaternária C), 128,8, 127,9 e 127,4 (arila C), 101,9 (br, C-5) e 45,6 (PhCH2); ír 14,28 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 141 (10), 201 (12), 220 (100, M+. ChH1035CIN3 requer 220), 221 (15) e 222 (30, M+. C11H1037CIN3 requer 222). 2-[(6-CLOROPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (59)
Usando o método geral, 56 (10,08 g, 67,64 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com etanolamina (4,25 cm3, 70,48 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols), seguido por processamento e cromato- grafia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente pa- ra fornecer um sólido bege, 2-[(6-cloropirimidin-4-il)amino]etanol 59 (9,19 g, 78,3 %, 98,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3 + d6-DMSO) 8,22 (1H, s, H-2), 6,45 (1H, br s, NH), 6,35 (1H, s, H-5), 3,70 (2H, t, OCH2, J 5,0) e 3,41 (3H, br s, OHe NHCH2); <5C (50 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 163,8 (C-6), 158,4 (C-2 e C-4), 103,3 (br, C-5), 61,1 (OCH2) e 44,2 (NHCH2); fR 2,40 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 110 (64), 128 (100), 129 (43), 130 (32), 132 (17), 156 (100, M+ - H2O), 158 (36, M+ - H2O), 174 (68, M+. C6H835CIN3O requer 174) e 176 (23, M+. C6H837CIN3O requer 176). (2R)-2-[(6-CLOROPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]-3-FENILPROPANOATO DE ME- TILA (60)
Usando o método geral, 56 (10,04 g, 67,38 mmols) em álcool isopropílico (168 cm3) foi tratado com cloridrato de éster de metila de L- fenilalanina [recentemente preparado de L-fenilalanina (12,32 g, 74,57 mmols) em metanol (75 cm3) que foi tratado com gás de cloreto de hidrogênio] e trietilamina (19,6 cm3, 0,14 mol), seguido por processamento e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano como elu- ente para fornecer um óleo laranja, (2R)-2-[(6-cloropirimidin-4-il)amino]-3- fenilpropanoato de metila 60 (2,08 g, 11,0 %, 99,5 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCl3) 8,35 (1H, s, H-2), 7,01-7,35 (5H, m, arila H), 6,36 (1H, s, H-5), 5,79 (1H, br d, NH, J 7,6), 4,68-5,21 (1H, br m, CHCO), 3,75 (3H, s, OCH3) 3,24 (1H, dd, PhCHaHb, J 5,6 e 13,8) e 3,41 (1H, dd, PhCHaHb, J 6,4 e 14,0); <5C (50 MHz, CDCl3) 172,0 (CO), 162,1 (C-6), 159,1 (C-4), 158,3 (C- 2), 135,5 (arila quaternária C), 129,1, 128,5 e 127,1 (arila C), 103,9 (br, C-5), 54,6 (OCH3), 52,3 (PhCH2) e 37,8 (CHCO); fo 1,87 min (metanol); (ES) m/z 120 (13), 169 (17), 205 (21), 232 (100, M+ - CO2Me), 233 (28), 234 (73, M+ - CO2Me), 292 (45, M+. C14H1435CIN3O2 requer 292) e 294 (18, M+. C14H1437CIN3O2 requer 294). N-(4-BROMOFENIL)-6-CLOROPIRIMIDIN-4-AMINA (61)
Usando o método geral, 56 (9,98 g, 67,01 mmols) em álcool iso- propílico (168 cm3) foi tratado com 4-bromoanilina (12,10 g, 69,50 mmols) e trietilamina (10,3 cm3, 73,8 mmols). Após aquecer, foi adicionado um volume igual de água e acetato de etila, e a suspensão resultante filtrada para ren- der um pó bege, /V-(4-bromo-fenil)-6-cloropirimidin-4-amina 61 (12,73 g, 67,0 %, > 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,11 (1H, br s, H-2), 8,05 (1H, s, NH), 7,17 (2H, d, arila H, J 8,8), 7,05 (2H, d, arila H, J 9,0) e 6,40 (1H, s, H-5); <5C (50 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 169,4 (C-6), 161,9 (C-4), 158,1 (Ο- 2), 137,6 (arila quaternária C), 131,7 e 122,7 (arila C), 116,3 (arila quaterná- ria C) e 104,6 (C-5); tR 2,15 min (metanol); (ES) m/z 204 (80), 205 (100, M+ - Br), 206 (42), 207 (35), 210 (10), 213 (10), 259 (10), 284 (78, M+. CioH779Br35CIN3 requer 284), 286 (100, M+. Ci0H78IBr35CIN3 requer 286) e 288 (29).
6-CLORO-N-METIL-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (62)
Seguindo o método geral, cloreto 57 (7,26 g, 50,58 mmols) em ácido acético (25 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (6,31 g, 91,38 mmols) em água (84 cm3) a gotas por 30 minutos. O sólido que formou após 2h foi isolado para fornecer um pó amarelo, 6-cloro-N- metil-5-nitrosopirimidin-4-amina 62 (7,68 g, 88 %, 97,4 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,83 (1H, s, H-2), 8,06 (1H, s, NH) e 3,45 (3H, s, NHMe)] <5C (50 MHz, CDCI3) 161,9 (C-4 e C-6), 158,4 (C-2), 107,9 (C-5) e 27,6 (NH- Me)] íR 9,10 min (50 % de metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 130 (18, C4H435CIN3), 143 (39), 144 (100, M+ -NO), 145 (21), 146 (33, M+ - NO) e 173 (1, M+. C5H535CIZV4O requer 173)
N-BENZIL-6-CLORO-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (63)
Usando o método geral, cloreto 58 (12,48 g, 56,82 mmols) em ácido clorídrico concentrado (28 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (7,11 g, 0,10 mol) em água (95 cm3) a gotas por 30 minutos. O sóli- do que depositou por 18h foi isolado para fornecer um pó bege pálido, N- benzil-6-cloro-5-nitrosopirimidin-4-amina 63 (12,75 g, 90,2 %, 96,3 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,91 (1H, br s, H-2), 8,08 (1H, s, NH), 7,29 (5Η, br s, arila Η) e 5,37 (2H, s, PhCH2); <5C (50 MHz1 CDCI3) 162,1 (C-4 e C- 6), 158,4 (C-2), 134,2 (arila quaternária C), 128,6, 128,3 e 127,9 (arila C), 108,0 (C-5) e 43,6 (PhCH2); fo 2,12 min (metanol); (ES) m/z 106 (12), 218 (80, ChH935CIN3), 219 (65), 220 (100, ChH937CIN3), 221 (26) e 222 (23). No M+ (C11H935CIAfo requer 249).
2-[(6-CLORO-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (64)
Usando o método geral, cloreto 59 (9,19 g, 52,96 mmols) em ácido acético (26 cm3) foi tratado com uma solução de nitrito de sódio (6,65 g, 96,32 mois) em água (132 cm3) a gotas por 30 minutos. Os sólidos que formaram por 18h foram isolados, e a solução extraída com acetato de etila. A fase orgânica foi lavada com 2 M de hidróxido de sódio aquoso e parcialmente concentrada em um óleo laranja. Esta foi semeada, e combi- nada com os sólidos filtrados para fornecer um pó laranja pálido, 2-{(6-cloro- 5-nitroso-pirimidin-4-il)amino]etanol 64 (8,54 g, 79,6 %, 86,0 % puro por H- PLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,86 (1H, br s, H-2), 8,05 (1H, s, NH), 4,36 (2H, t, OCH2, J 5,5), 3,73 (2H, t, NHCH2, J 5,6) e 2,25 (1H, br s, OH)\ õc (50 MHz, CDCI3) 162,5 (C-6), 158,2 (C-2 e C-4), 108,1 (C-5), 59,6 (OCH2) e 42,7 (NH- CH2); /r 4,52 min (metanol); (ES) m/z 130 (24), 142 (95), 143 (100, C5H635CIN3), 144 (36), 145 (32), 156 (10, C6H735CIN3), 172 (29), 174 (64, C6H837CIN3O), 176 (16) e 203 (13, M+. C6H735CIZV4O2 requer 203). MÉTODO GERAL PARA A NITROZAÇÃO DE PIRIMIDINAS
Uma solução da pirimidina em ácido acético ou ácido clorídrico (2M) foi tratada a gotas com uma solução de nitrito de sódio (1,8 eq.) em água (6,3M). Evolução de um gás marrom ocorre durante adição, e um pre- cipitado sólido formou-se com o passar do tempo. O sólido é separado por filtração, lavado com água e secado sob sucção. N,N,N'-TRIMETIL-5-NITROSOPIRIMIDINO-4,6-DIAMINA (65)
Uma mistura de pirimidina 62 (0,97 g, 5,65 mmols) em dicloro- metano (2,9 cm3) foi tratada com dimetilamina (33 % em álcool, 1,74 cm3, 12,75 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante 18h em temperatura ambiente. A solução laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo, N,N,N'-trimetil-5-nitroso-pirimidino-4,6-diamina 65 (0,60 g, 59,0). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,52 (1H, s, H-2), 7,02 (1H, s, NH), 3,47 (3H, s, NCH3) e 3,18 [H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,1 (C-6), 160,1 (C-4), 157,4 (C- 2), 87,4 (C-5), 37,5 [N(CH3)2] e 28,0 (NHCH3).
N-BENZIL-N',N'-DIMETIL-5-NITROSOPIRIMIDIN-4,6-DIAMINA (66)
Em um método similar a 65, uma mistura de pirimidina 63 (0,51 g, 2,04 mmols) em diclorometano (1 cm3) foi tratada com dimetilamina (33 % em álcool, 1,00 cm3, 7,32 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada por 2h em temperatura ambiente. A solu- ção laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna u- sando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo pálido, 4-benzilamino-6-dimetilamino-5-nitrosopirimidina 66 (0,48 g, 90,7 %, 99,6 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,57 (1H, s, H-2), 7,21-7,31 (5H, m, arila H), 7,05 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2) e 3,18 [6H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,2 (C-6), 159,9 (C-4), 157,5 (C-2), 135,1 (arila quaternária C), 128,3, 128,2 e 127,4 (arila C), 87,6 (C-5), 43,7 (PhCH2) e 37,5 [N(CH3)2]; fR 2,17 min (metanol); (ES) m/z 105 (12), 123 (31), 151 (11), 199 (12), 227 (94), 228 (100, C13Hi6ZV*), 229 (83) e 258 (1, MH+. Ci3H16N5O requer 258).
2-{[6-(DIMETILAMINO)-5-NITROSO-PIRIMIDIN-4-IL]AMINO}ETANOL (67)
Em um método similar a 65, uma mistura de pirimidina 64 (1,02 g, 5,03 mmols) em diclorometano (2,5 cm3) foi tratada com dimetilami- na (33 % em álcool, 1,48 cm3, 10,86 mmols) a gotas, resultando em aqueci- mento espontâneo. A mistura foi agitada durante 18h em temperatura ambi- ente. A solução laranja resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo, 2-{[6-(dimetilamino)-5-nitroso-pirimidin-4- il]amino}etanol 67 (0,76 g, 72,0 %, 99,5 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,48 (1H, s, H-2), 6,97 (1H, s, NH), 4,30 (2H, t, OCH2, J 4,9), 3,69 (2H, t, NHCH2, J 4,9) e 3,19 [6H, s, N(CH3)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 163,1 (C- 6), 159,9 (C-4), 157,0 (C-2), 88,0 (C-5), 60,3 (OCH2), 44,1 (NHCH2) e 37,5 [N(CH3)2]; tr 3,87 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 151 (100, C7H11N4), 152 (14), 182 (10, C8H14Afo) e 183 (25). No M+ (C8H13N5O2 requer 211).
N-METIL-5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (68)
Uma mistura de pirimidina pura 62 (0,97 g, 5,61 mmols) e pirroli- dina (1,16 cm3, 13,91 mmols) foi aquecida para 1509C por 1h. A solução pre- ta resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido ama- relo, N-metil-5-nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 68 (0,97 g, 83,1 %, 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,44 (1H, s, H-2), 6,80 (1H, s, NH), 3,48 [4H, br s, N(CH2)2], 3,40 (3H, s, NHCH3) e 1,78-2,13 [4H, br m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 160,7 (C-6), 159,5 (C-4), 157,8 (C-2), 88,1 (C- 5), 46,5 [N(CH2)2], 27,8 (NHCH3) e 25,1 [(CH2)2]; tR 11,57 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 123 (12), 149 (15), 150 (51), 177 (49, M+ -NO), 178 (89, MH+ -NO), 179 (100), 180 (10) e 208 (1, MH+. C9H13N5O requer 208).
N-BENZIL-5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (69)
Uma mistura de pirimidina 63 (0,50 g, 2,00 mmols) em dicloro- metano (1 cm3) foi tratada com pirrolidina (0,34 cm3, 4,02 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante 10 minutos em temperatura ambiente. A solução marrom resultante foi purifi- cada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para render um sólido amarelo pálido, N-benzil-5- nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 69 (0,53 g, 94,1 %, 96,6 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,56 (1H, s, H-2), 7,15-7,31 (5H, m, arila H), 6,90 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2), 3,53 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,87-2,21 [4H, br m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 159,4 (C-4), 157,7 (C-2), 135,1 (arila quaternária C), 128,3, 128,1 e 127,3 (arila C), 88,5 (C-5), 46,7 [N(CH2)2], 43,6 (PhCH2) e 25,2 [(CH2)2]; fR 2,28 min (metanol); (ES) m/z 149 (17), 226 (22), 253 (78, M+ -NO), 254 (100, MH+ -NO), 255 (86), 256 (14) e 284 (1, MH+. C15H18N5O requer 284).
2-[(5-NITROSO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (70) Em um procedimento similar a 68, uma mistura de pirimidina pu- ra 64 (0,96 g, 4,76 mmols) e pirrolidina (0,98 cm3, 11,85 mmols) foi aquecida para 150°C durante 1h. A solução preta resultante foi purificada através de cromatografia de coluna usando 1:10 - 3:10 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente para fornecer um sólido bege, 2-[(5-nitroso-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-il)amino]etanol 70 (0,41 g, 36,6 %, 99,7 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,49 (1H, s, H-2), 6,84 (1H, s, NH), 4,31 (2H, ~t, OCH2, J 4,8), 3,70 (2H, ~t, NHCH2, J 4,9), 3,11-3,85 [4H, br m, N(CH2)2] e 1,82-2,23 [4H, br m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 159,5 (C-4), 157,3 (C-2), 89,0 (C-5), 60,4 (OCH2), 46,8 [br, N(CH2)2], 44,1 (NHCH2) e 25,3 [br, (CH2)2]; ír 6,43 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).
N-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ÍI-5-NITROSOPIRIMIDIN-4-AMINA (71)
Em um método similar a 66, uma mistura de pirimidina 58 (1,46 g, 5,87 mmols) em diclorometano (10 cm3) foi tratada com morfolina (1,23 g, 14,1 mmols) a gotas, resultando em aquecimento espontâneo. A mistura foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. A solução a- marela profunda resultante foi vertida em acetato de etila (20 cm3) e lavada com um volume igual de água. O solvente foi removido para gerar um sólido pegajoso que foi triturado em hexano. N-benzil-6-morfolin-4-il-5- nitrosopirimidin-4-amina 71 foi colhida como um sólido amarelo através de filtração [1,42g, 85 %, Rf 0,43 em 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano]. δH (200 MHz, CDCI3) 8,60 (1H, s, H-2), 7,26 (5H, br s, arila H), 7,14 (1H, s, NH), 5,39 (2H, s, PhCH2), 3,80 (4H, m, 2 χ OCH2) e 3,72 (4H, m, 2 χ NCH2); δC (50 MHz, CDCI3) 163,5 (C-6), 161,0 (C-4), 157,5 (C-2), 135,0 (arila quaterná- ria C), 128,7, 128,5 e 127,7 (arila C), 87,8 (C-5), 66,5 (2 χ OCH2), 45,0 (2 χ NCH2) e 43,5 (PhCH2).
PROCEDIMENTO GERAL PARA REDUÇÃO DE NITROSO: N4-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (76) N-benzil-5-nitroso-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 69 (0,41 g, 1,45 mmol) foi suspensa em água (1,45 cm3) e tratada com ditionita de sódio sólido (0,53 g, 3,04 mmols) que foi adicionada em porções. Ácido sulfúrico aquoso (50 % v/v, 4,08 g) foi adicionado a gotas, e a mistura resultante foi aquecida para 130°C com agitação durante 5 minutos. A mistura de reação ficou incolor de novo nesta hora, e foi esfriada em gelo. O pH da mistura foi ajustado para > 10 com 2M de róxido de sódio aquoso, e extraído com diclorometano (3 χ 50 cm3). Os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzida, e o produto bruto recristalizado de diclorometano/hexano para ren- der A^-benzil-6-pirrolidin-1-ilpirimidino-4,5-diamina 76 (0,34 g, 87 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,10 (1H,s,H-2),7,25-7,35 (5H, m, arila H), 5,35 (1H, br s, NH2), 5,14 (1H, s, NH2), 4,41 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,36 (4H, br s, 2 χ CH2N) e 1,90-1,96 (4H, m, 2 χ CH2CH2N); <5C (50 MHz1 CDCI3) 162,5 (C-4)a, 160,9 (C-6)a, 157,9 (C-2), 138,7 (arila quaternária C), 128,7, 127,6 e 127,5 (arila C), 80,9 (C-5), 46,4 (2 χ CH2N), 46,1 (CH2Ph) e 25,5 (2 χ CH2CH2N); (ES) m/z 255,2 [(M-N)+H], 228,2 163,1 e 138,0.
Os compostos a seguir foram preparados por este método: N4,N4,N6,-TRIMETILPIRIMIDINO-4,5,6-TRIAMINA (72) (31 mg, 81 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 5,28 (1H,
s, NH2), 4,82 (1H, br s, NH2), 3,09 [6H, s, N(CH3)2] e 2,89 [H, d, J 5,4, N(CH3)2].
N6-BENZIL-N4,N4-DIMETILPIRIMIDINO-4,5,6-TRIAMINA (73) (91,9 mg, 80 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,26- 7,35 (5H, m, arila H), 5,30 (1H, s, NH2), 5,10 (1H, br s, NH2), 4,45 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,01 (6H, s, 2 χ NCH3) e 1,78 (1H, br s, NH); õc (50 MHz1 CD- Cl3) 163,0 (C-4 e C-6), 157,6 (C-2), 138,7 (arila quaternária C), 128,8 e 127,5 (arila C), 80,2 (C-5), 46,0 (CH2Ph) e 37,4 (2 χ NCH3); (ES) m/z 229,2 [(M- N)+H], 202,1, 137,1 e 138,0.
2-[5-AMINO-6-(DIMETILAMINO)PIRIMIDIN-4-IL]AMINOETANOL (74) (0,29 g, 54 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 5,36 (1H, s, NH2), 5,00 (1H, br s, NH2), 3,80 (2H, t, J 4,9, CH2OH), 3,42-3,50 (2H, m, CH2NH), 3,05 (6H, s, 2 χ NCH3) e 2,87 (1H, br s, NH); <5C (50 MHz, CDCI3) 162,9 (C-4)a, 162,0 (C-6)a, 157,3 (C-2), 80,9 (C-5), 62,9 (CH2OH), 44,8 (CH2NH) e 37,5 (2 χ NCH3); (ES) m/z 183,1 [(M-N)+H], 165,1, 139,0 e 110,9. -METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (75)
(0,66 g, 86 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,11 (1H, s, H-2), 5,13 (1H, s, NH2), 4,76 (1 x, br s, NH2), 3,36-3,48 (4H, m, 2 x CH2N), 2,85 (3H, d, J 5,4, NCH3) e 1,94-2,00 (4H, m, 2 x CH2CH2N); õc (50 MHz, CDCl3) 163,4 (C-4)a, 161,8 (C-6)a, 157,8 (C-2), 79,9 (C-5), 46,5 (2 x CH2N), 28,7 (NCH3)b e 25,5 (2 x CH2CH2N)b; (ES) m/z 179,1 [(M-N)+H], 137,0 e 120,9.
2-[(5-AMINO-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (77) (0,23 g, 71 %). dx (200 MHz, CDCl3) 8,12 (1H, s, H-2), 5,22 (1x, s, NH2), 5,06 (1H, br s, NH2), 3,79 (2H, t, J 4,9, CH2OH), 3,30-3,48 (7H, m, CH2NH, 2 x CH2N e NH) e 1,94-2,01 (4H, m, 2 x CH2CH2N); <5C (50 MHz, CDCl3) 162,6 (C-4)a, 160,7 (C-6)a, 157,5 (C-2), 81,4 (C-5), 62,5 (CH2OH), 46,5 (2 x CH2N), 44,7 (CH2NH) e 25,5 (2 x CH2CH2N); (ES) m/z 209,1 [(M- N)+H], 191,1, 182,1, 165,1 e 138,0.
N4-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (78)
Em um método similar a 76, composto nitroso 71 (1,35 g, 4,63 mmols) foi suspenso em água (50 cm3) e tratado com ditionita de sódio sólido (1,70 g, 9,74 mmols) que foi adicionado em porções. Ácido sulfúrico aquoso (50 % p/p, 9,09 g) foi adicionado por 3 minutos a gotas, e a mistura resultante foi aquecida para 140eC com agitação durante 5 minutos. A mistu- ra de reação ficou incolor de novo nesta hora, e foi deixada esfriar para 409C. O pH da mistura foi ajustado para > 10 com 2M de hidróxido de sódio aquoso, e a solução resultante foi extraída com acetato de etila (2 x 50 cm3). Os extratos orgânicos combinados foram concentrados sob pressão reduzi- da, e o produto bruto recristalizado de diclorometano/hexano para render N4- benzil-6-morfolin-4-ilpirimidino-4,5-diamina 87 (0,90 g, 70 %) como um sólido branco. dH(200 MHz, CDCl3) 8,20 (1H, s, H-2), 7,35 (5H, br s, arila H), 5,41 (1H, s, NH), 5,35 (br, NH2), 4,48 (2H, d, J 5,8 Hz, CH2Ph), 3,75 (4H, m, 2 x CH2O) e 3,51 (4H, m, 2 x NCH2); õc (50 MHz, CDCl3) 164,5 (C-6), 163,0,0 (C-4), 157,5 (C-2), 138,5 (arila quaternária C), 129,0, 128,0 e 127,5 (arila C), 81,5 (C-5), 66,5 (2 x OCH2), 46,0 (PhCH2) e 44,5 (2 x NCH2).
PROCEDIMENTO GERAL PARA FECHAMENTO DE ANEL DE TRIAMINO- PIRIMIDINAS 72-78:
9-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1-IL-9H-PURINA (82)
5-amino-4-benzilamino-6-(pirrolidin-1-il)pirimidina 76 (39,6 mg, 0,15 mmol) foi suspensa em uma mistura de anidrido acético (5 masseq., 143 mg, 130 μΙ) e ortoformato de trietila (5 mass eq., 143 mg, 160 μΙ) e a - quecida a refluxo com agitação. Todo o material de partida dissolve ao a- quecer. Após 4h a refluxo, a mistura foi esfriada e anidrido acético de exces- so e ortoformato de trietila foram removidos sob pressão reduzida. O resíduo bruto foi purificado através de cromatografia de coluna de sílica-gel (usando acetato de etila como eluente) para render 9-benzil-6-pirrolidin-1 -il-9H-purina 82 (32,8 mg, 80 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,45 (1H, s, H-2), 7,24-7,28 (5H, m, arila H), 6,19 (1H, s, H-8), 5,11 (1H, s, CH2Ph), 3,18-3,62 (4H, br s, 2 χ CH2N) e 1,90-2,06 (4H, m, 2 χ CH2CH2N); <5C (50 MHz1 CDCI3) 171,2 (C-6)a, 161,3 (C-4)a, 158,4 (C-8)a, 158,4 (C-2), 138,0 (arila quaternária C), 128,7, 127,7 e 127,4 (arila C), 98,1 (C-5), 50,5 (2 χ CH2N), 46,7 (CH2Ph) e 25,5 (2 χ CH2CH2N); (ES) m/z 297,2 [M+NH4+], 255,2, 205,1 e 166,1.
Os compostos a seguir foram preparados por este método: N,N,9-TRIMETIL-9H-PURIN-6-AMINA (79)
(0,12 g, 100 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,47 (1H, s, H-2), 6,50, (1H, s, H-8), 3,36 (3H, s, NCH3) e 3,13 [6H, s, N(CH3)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 171,3 (C-6)a, 163,5 (C-4)a, 161,7 (C-8), 157,8 (C-2), 96,1 (C-5), 37,6 (2 x NCH3) e 35,0 (NCH3).
9-BENZIL-N,N-DIMETIL-9H-PURIN-6-AMINA (80) (46,0 mg, 88 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,26- 7,35 (5H, m, arila H), 6,33 (1H, s, H-8), 5,30 (1H, s, NH2), 5,10 (1H, br s, NH2), 4,45 (2H, d, J 5,8, CH2Ph), 3,01 (6H, s, 2 χ NCH3) e 1,78 (1H, br s, NH); (ES) m/z229,2 [(M-N)+H], 202,1, 137,1 e 138,0. 9-METIL-6-PIRROLIDIN-1-IL-9H-PURINA (81)
(47,1 mg, 67 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,41 (1H, s, H-2), 6,29, (1H, s, H-8), 3,34-3,56 (4H, m, 2 χ CH2N), 3,31, (3H, s, NCH3), e 1,92-2,04 (4H, m, 2 χ CH2CH2N). <5C (50 MHz, CDCI3) 171,2 (C-6)a, 161,3 (C-4)a, 158,4 (C-8), 158,1 (C-2), 96,9 (C-5), 46,8 (2 χ CH2N), 35,0 (NCH3) e 25,4 (2 χ CH2CH2N). (ES) m/z 221,2 [M+NH/], 179,1 e 166,1. 9-BENZIL-6-MORFOLIN-4-il-9H-PURINA (83)
(59,7 mg, 68 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,49 (1H, s, H-2), 7,21- 7,35 (5Η, m, arila Η), 6,66 (1Η, s, Η-8), 5,18 (2Η, s, CH2Ph), 3,74-3,80 (4Η, m, 2 χ CH2O), 3,56-3,61 (4Η, π, 2 χ CH2N) e 1,78 (1 Η, br s, NH); <5C (50 MHz, CDCI3) 171,6 (C-6)a, 163,5 (C-4)a, 161,35 (C-8), 158,0 (C-2), 137,9 (arila quaternária C), 128,8, 127,5 e 127,4 (arila C), 96,9 (C-5), 66,6 (2 χ CH2O), 50,4 (CH2Ph) e 44,6 (2 χ CH2N); (ES) m/z 221,2 [M+NH4+], 312,1, 268,9 e 91,1.
6-CLORO-N.N-DIMETILPIRIMIDIN-4-AMINA (84)
Uma solução de 56 (15,03 g, 0,10 mol), dimetilamina (60 % em água, 9,20 cm3, 0,12 mol) e trietilamina (17,07 cm3, 0,12 mol) em álcool iso- propílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [u- sando 1:10-1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu cristais beges de 6-cloro-N,N-dimetilpirimidin-4-amina 84 (16,73 g, quant.; 99,1 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,38 (1H, s, H-2), 6,39 (1H, s, H-5) e 3,14 (6H, s, NMe2); <5C (50 MHz, CDCI3) 159,2 (C-6), 158,9 (C-4), 158,0 (Ο- 2), 101,3 (C-5) e 37,8 (NMe2); fa 4,48 min (50 % de metanol: 25 mM de ace- tato de amônio); (TSP) m/z 158 (100, M+. C6H835CIN3 requer 157,6) e 160 (35, C6H837CIN3).
6-CLORO-4-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDINA (85)
Uma solução de 56 (15,00g, 0,10 mol), pirrolidina (9,37 cm3, 0,112 mol) e trietilamina (17,1 cm3, 0,12 mol) em álcool /'sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [usando 1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu cristais beges de 6- cloro-4-pirrolidin-1-ilpirimidina 85 (17,85 g, 98,3 %; 98 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,36 (1H, s, H-2), 6,25 (1H, s, H-5), 3,58 e 3,31 [4H, 2 so- brepondo br s, N(CH2)2] e 2,12 [4H, br s, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,9 (C-6), 158,9 (C-4), 158,0 (C-2), 101,0 (C-5), 46,3 [N(CH2)2] e 25,3 [(CH2)2]; fR 7,13 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (TSP) m/z 184 (100, M+. C8H1035CIN3 requer 184) e 186 (28, M+. C8H1037CIN3). 1-(6-CLOROPIRIMIDIN-4-il)PIRROLIDINO-2-CARBOXILATO DE METILA(86)
Uma solução de L-prolina (14,26 g, 0,12 mol) em metanol (100 cm3) foi tratada com gás de cloreto de hidrogênio por 30 min, então deixada agitar por 1h. A solução foi depois concentrada até secar, e o clori- drato de éster de metila usado sem caracterização. Uma solução do éster de metila, 56 (15,01 g, 0,10mol) e trietilamina (31,3 cm3, 0,23 mol) em álcool 'sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método geral. Cromatografia [usando 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um óleo laranja viscoso, 1-(6-cloropirimidin-4-il)pirrolidino-2-carboxilato de metila 86 (19,74 g, 81 %; 89,3 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,39 (1H, s, H- 2), 6,39 (1H, br s, H-5), 4,63 (1H, br s, COCH), 3,73 (3H, s, OMe), 3,81-3,28 (2H,2 sobrepondo br s, NCH2) e 2,41-1,95 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,8 (CO), 160,9 (C-6), 159,8 (C-4), 158,0 (C-2), 101,2 (C-5), 59,8 (OMe), 52,2 (COCH), 46,5 (NCH2), 30,1 e 24,1 [(CH2)2]; íR 5,27 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (TSP) m/z 242 (100, M+. C10H1435CIN3O2 requer 241,7), 243 (10) e 244 (25, M+. C10H1437CIN3O2). 4-(6-CLOROPIRIMIDIN-4-il)MORFOLINA (87)
Uma solução de 56 (15,00 g, 0,10 mol) e morfolina (18,00 g, -0,21 mol) em álcool /sopropílico (100 cm3) foi tratada como pelo método ge- ral. Concentração do extrato forneceu um sólido cristalino. Este foi lavado em um funil de Büchner com bicarbonato de sódio aquoso saturado, seguido pelo mínimo de acetato de etila para remover água para render cristais be- ges de 4-(6-cloropirimidin-4-il)morfolina 87 (18,30 g, 92 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,39 (1H, s, H-2), 6,48 (1H, s, H-5), 3,91-3,72 [4H, m, O(CH2)2] e 3,70-3,41 [4H, m, N(CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 162,6 (C-6), 160,2 (C-4), 158,0 (C-2), 101,4 (C-5), 66,3 [O(CH2)2] e 44,2 [N(CH2)2]. N-METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (89)
Cloreto 85 (1,45 g, 10,11 mmols) e pirrolidina (1,86cm3, 22,24 mmols) foi fundido a 250eC durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e concentrado em uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido marrom pálido, N-metil-6-pirrolidin- 1-ilpirimidin-4-amina 89 (0,63 g, 35 %, 99 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz1 CDCI3) 8,11 (1H, s, H-2), 5,13 (1H, s, H-5), 4,89 (1H, br s, NH), 3,52-3,28 [4H, m, O(CH2CH2)2N], 2,85 (3H, d, NHCH3, J 5,2) e 2,09-1,81 [4H, m, O(CH2CH2)2N]; sC (50 MHz, CDGI3) 162,8 e 160,7 (C-4 e C-6), 157,2 (C-2), 79,5 (C-5), 46,3 [(CH2CH2)2N], 28,5 (NHCH3) e 25,3 [(CH2CH2)2N]; fa 2,25 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).
N-METIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (90)
Cloreto 87 (1,45 g, 10,11 mmols) e morfolina (2,28 cm3, 22,23 mmols) foram fundidos a 2509C durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e con- centrado a uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) meta- nol:acetato de etila como eluente] forneceu um pó amarelo, N-metil-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 90 (1,51 g, 77 %, 96 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,14 (1H, s, H-2), 5,37 (1H, s, H-5), 5,05 (1H, br s, NH), 3,77 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9], 3,54 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 2,87 (3H, d, NHCH3, J 5,2); õc (50 MHz, CDCI3) 163,7 e 163,1 (C-4 e C-6), 157,2 (C-2), 79,9 (C-5), 66,5 [O(CH2CH2)2N], 44,5 [O(CH2CH2)2N] e 28,4 (NHCH3); tr 2,11 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).
N-BENZIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (91)
Uma mistura de cloreto 85 (0,98 g, 5,35 mmols), benzilamina (1,24 cm3, 11,4 mmols) e tolueno (5 cm3) foi colocada em um tubo de vidro, vedada e aquecida para 130SC durante 18h. Dentro de 30 min, uma crosta de cristais tinha formado na solução. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e trabalhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, N-benzil-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-amina 91 (0,62 g, 46 %, 97,5 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 7,21-7,40 (5H, m, arila H), 5,30 (1H, brt, NH), 5,18 (1H, s, H-5), 4,46 (2H, d, PhCH2, J 5,6), 3,39 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,90-2,05 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,1 (C-6), 160,6 (C-4), 157,5 (C-2), 138,4 (arila quaternária C), 128,6, 127,3 e 127,2 (arila C), 80,6 (C-5), 46,2 [N(CH2)2], 45,9 (PhCH2) e 25,3 [(CH2)2]; fo 10,13 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (38), 163 (51), 228 (22), 255 (100, MH+. C16H18N^4 requer 255) e 256 (27).
N-BENZIL-1-[6-(BENZILAMINO)PIRIMIDIN-4-il]PIRROLIDINO-2- CARBOXAMIDA (92)
Em um procedimento similar a 91, cloreto 86 (1,67 g, 6,92 mmols), benzilamina (2,17 cm3, 20,0 mmols) e tolueno (20 cm3) foram colocados em um tubo de vidro, vedados e aquecidos para 130gC durante 18h. Dentro de 30 min, uma crosta de cristais tinha se formado na solução. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e traba- lhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, N-benzil-1 -[6-(benzilamino)pirimidin-4-il]pirrolidino-2-carboxamida 92 (1,73 g, 62 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 7,15-7,44 (5H, m, ari- Ia H), 5,30 (2H, br m, H-5 e NH), 4,53-4,66 (1H, m, NCHCO), 5,27-4,52 (4H, m, 2 χ PhCH2), 3,42-3,56 (1H, dd de ~br, NCHaHb, J 6,8 e 9,4), 3,19-3,38 (1H, ~br q, NCHaHb, J 9,0), 2,38-2,52 e 1,94-2,20 [4H, 2 χ m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,2 (CO), 162,7 (C-6), 161,3 (C-4), 157,5 (C-2), 138,3 e 138,1 (2 χ arila quaternária C), 128,7, 128,5, 127,5, 127,4, 127,3 e 127,2 (ari- la C), 81,7 (C-5), 61,1 (NCHCO), 47,5 (PhCH2), 45,8 (NCH2), 43,3 (PhCH2), 29,2 e 24,3 [(CH2)2]; (ES) m/z 201 (19), 205 (13), 253 (100, C11H19N5O2), 254 (52), 281 (100, C13H23N5O2), 282 (22), 361 (18), 388 (80, MH+. C23H25N5O2 requer 388) e 389 (28).
N-BENZIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (93)
Cloreto 87 (2,29 g, 10,44 mmols) e morfolina (2,00 cm3, 23,00 mmols) na presença de íerc-butóxido de potássio (1,28 g, 11,48 mmols) foram fundidas a 250SC durante 1h. Este foi absorvido em acetato de etila (50 cm3), lavado com água (50 cm3), secado (MgSO4) e concentrado em uma goma marrom. Cromatografia de coluna [1:9 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido amarelo brega. Este foi dissolvido em acetona, e o sólido precipitou com hexano para fornecer um pó amarelo, N-benzil-6-morfolin-4-il-pirimidin-4-amina (93) (1,56 g, 55 %, 95 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,16 (1H, s, H-2), 7,48-7,05 (5H, m, arila H), 5,39 (2H, br m, H-5 e NH), 4,46 (2H, d, PhCH2, J 6,0), 3,74 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 3,48 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,9 e 162,8 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2), 138,0 (fenila quaternária C), 128,8, 127,5 e 127,2 (fenila CH), 81,0 (C-5), 66,5 [O(CH2CH2)2N], 45,8 (PhCH2) e 44,5 [O(CH2CH2)2N]; fR 6,82 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amô- nio).
2-[(6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (94)
Uma mistura de cloreto 85 (1,95 g, 5,10mmols), etanolamina (1,89 cm3, 31,37 mmols) e tolueno (20 cm3) foi colocada em um tubo de vi- dro, vedada e aquecida para 1309C durante 18h. Um óleo marrom formou-se ao fundo do tubo enquanto o tempo progredia. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e trabalhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um sólido de bege-marrom, 2-[(6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-il)amino]-etanol 94 (1,10 g, 50,6 %, 94,1 % puro por HPLC). δh (200 MHz, CDCl3) 8,07 (1H, s, H-2), 5,30 (1H, br t, NH), 5,18 (1H, s, H-5), 4,08 (1H, br s, OH), 3,78 (24H, t, CH2OH, J 4,6), 3,22-3,49 [6H, br m, N(CH2)2 e CH2OH], e 1,90-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCl3) 162,2 (C-6), 160,4 (C-4), 157,1 (C-2), 80,8 (C-5), 61,6 (CH2OH), 46,3 [N(CH2)2], 44,3 (CH2NH) e 25,2 [(CH2)2]; íR 2,17 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 110 (15), 121 (13), 165 (15), 191 (85), 209 (100, MH+. C11H16N4O requer 209) e 210 (22).
N-(2-HIDROXIETIL)-1 -{6-[(2-HIDROXIETIL)AMINO]PIRIMIDIN-4- ILJPIRROLIDINO-2-CARBOXAMIDA (95)
Em um procedimento similar a 91, cloreto 86 (1,61 g, 6,67 mmols), etanolamina (1,21 cm3, 20,0 mmols) e tolueno (20 cm3) foram colocados em um tubo de vidro, vedado e aquecido para 130°C durante 18h. Um óleo marrom formou-se ao fundo do tubo enquanto o tempo progredia. Após esfriar, a solução foi extraída de água usando acetato de etila e traba- lhada até fornecer um óleo laranja. Cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] forneceu um óleo mar- rom, N-(2-hidroxietil)-1-{6-[(2-hidroxietil)-amino]pirimidin-4-il}pirrolidino-2- carboxamida 95 (1,02 g, 54 %, 99,9 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCl3) 7,97 (1H, s, H-2), 7,43 (1H, br t, CONH, J 5,0), 5,90 (1H, br t, NH, J 5,6), 5,27 (1H, s, H-5), 4,20-4,35 (1H, br m, NCHCO), 3,18-3,38 e 3,39-3,75 [10H, 2 χ m, 2 χ NH(CH2)2OH e NCH2] e 1,74-2,20 [4Η, m, (CH2)2]; õc (50 MHz1 CDCI3) 172,5 (CO), 162,1 (C-6), 160,1 (C-4), 156,4 (C-2), 81,3 (C-5), 60,4 (NCHCO), 60,2 [2 χ (CH2)2OH], 46,6 (NCH2), 45,0 [NH(CH2)2], 41,3 [NH(CH2)2], 29,4 e 23,2 [(CH2)2]; fa 1,77 min (50 % metanol: 25 mM de ace- tato de amônio); (ES) m/z 207 (10), 235 (52, C11H15A^), 269 (11), 296 (100, MH+. C13H21N5O3 requer 295) e 297 (19). 2-[(6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (96)
Seguindo um procedimento similar a 91, cloreto 59 (1,88 g, 10,84 mmols) e morfolina (2,08 cm3, 23,84 mmols) foram aquecidos para 250°C durante 1h, então extraídos de uma mistura de cloreto de sódio aquo- so saturado (50 cm3) e metanol (10 cm3) com acetato de etila (3 χ 50 cm3). Os extratos foram concentrados e purificados através de cromatografia de coluna [1:9 - 2:8 (v/v) metanohacetato de etila como eluente]. Isto forneceu um sólido bege céreo, 2-[(6-morfolin-4-ilpirimidin-4-il)amino]etanol (96) (1,82 g, 75 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 7,96 (1H, s, H-2), 5,65 (1H, br m, NH), 5,35 (1H, s, H-5), 4,68 (1H, br s, OH), 3,59 [6H, t e obscureceu m, O(CH2CH2)2N, J 4,8 e CH2OH], 3,34 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,9] e 3,24 (2H, q, NHCH2, J 5,0); <5C (50 MHz, CDCI3) 169,2 e 162,4 (C-4 e C-6), 156,8 (C- 2), 81,2 (C-5), 66,1 [O(CH2CH2)2N], 61,0 (CH2OH), 44,1 [O(CH2CH2)2N] e 43,8 (NHCH2).
N-4-BROMOFENIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (97) Uma mistura de cloreto 85 (1,93 g, 10,50 mmols) e 4- bromoanilina (2,73 g, 15,87 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com terc- butóxido de potássio (3,52 g, 31,37 mmols) em temperatura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a formação de um pre- cipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado como para 93, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó marrom. Este foi dissolvido parci- almente em uma pequena acetona e precipitado com hexano. O sólido foi isolado através de filtração para fornecer um pó bege, N-4-bromofenil-6- pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 97 (1,24 g, 37,1 %, 98,2 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 8,15 (1H, s, H-2), 7,58 (1H, br s, NH), 7,31 (2Η, ~d, arila H1 J 6,6), 7,20 (2H, ~d, arila H, J 6,7), 5,55 (1H, s, H-5), 3,32 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,88-1,98 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 160,4 (C- 6), 159,7 (C-4), 157,4 (C-2), 138,8 (arila quaternária C), 131,8 e 122,5 (arila C), 115,2 (arila quaternária C), 82,8 (C-5), 46,1 [N(CH2)2] e 25,0 [(CH2)2]; fo 2,23 min (metanol); (ES) m/z 319 (100, M+. Ci5H16TgBrN4 requer 319), 320 (12), 321 (100, M+. C15H16S1BrN4 requer 321) e 322 (13).
ÁCIDO 1 -{6-[(4-BROMOFENIL)AMINO]PIRIMIDIN-4-IL}PIRROLIDINO-2- CARBOXÍLICO (98)
Em um método similar a 97, uma mistura de cloreto 86 (1,61 g, 6,66 mmols) e 4-bromoanilina (1,75 g, 10,18 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com ferc-butóxido de potássio (2,26 g, 20,14 mmols) em temperatura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a for- mação de um precipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado como para 91, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila - 1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó bege, ácido 1 - {6-[(4-bromofenil)-amino]pirimidin-4-il}pirrolidino-2-carboxílico 98 (0,47 g, 19,5 %, 99,2 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3 + d6-DMSO) 9,73 (1H, br s, NH), 7,67 (~1H, m, H-2), 7,46 (2H, m, arila H), 7,28 (2H, m, arila H), 5,07 (1H, ~d, H-5, J 3,2), 4,23-4,61 (1H, br m, NCHCO), 3,18-3,39 e 3,39- 3,62 (2H, 2 x br m, NCH2) e 1,82-2,25 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 170,3 (CO), 161,6 (C-6), 159,6 (C-4), 147,2 (C-2), 137,0 (arila quaternária C), 130,3 e 120,4 (arila C), 114,6 (arila quaternária C), 85,7 (C-5), 60,3 (N- CHCO), 46,5 (NCH2), 29,4 e 22,7 [(CH2)2]; tR 11,30 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 164 (88), 192 (100), 363 (87, M+. C15H1579BrN402 requer 363), 364 (14), 365 (86, M+. C15H1581BrN4O2 requer 365) e 366 (15).
N-PIRIDIN-2-IL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (99)
Em um método similar a 97, uma mistura de cloreto 85 (1,91 g, 10,40 mmols) e 2-aminopiridina (1,51 g, 16,07 mmols) em tolueno (20 cm3) foi tratada com íerc-butóxido de potássio (3,54 g, 31,51 mmols) em tempera- tura ambiente em um tubo de reação. Aquecimento imediato ocorreu, com a formação de um precipitado marrom denso. O tubo foi vedado e tratado co- mo para 91, seguido por cromatografia de coluna [acetato de etila -1:10 (v/v) metanol em acetato de etila como eluente] para render um pó bege, N- piridin-2-il-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-amina 99 (0,38 g, 15,3 %, 94,0 % puro por HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,35 (1H, s, H-2), 8,30 (1H, dd, piridina H-6, J 2,0 e 7,0), 7,60 (1H, ~ddd, piridina H-4, J 1,8, 6,8 e 7,2), 7,32 (1H, d, piridi- na H-3, J 8,2), 6,87 (1H, dd, piridina H-5, J 6,0 e 7,2), 6,78 (1H, s, H-5), 3,52 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,90-2,18 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 161,0 (C- 6), 158,1 (C-4), 157,5 (C-2), 153,8 (piridina C-2), 147,7 (piridina C-6), 137,6 (piridina C-4), 116,7 (piridina C-3), 112,6 (piridina C-5), 86,7 (C-5), 46,4 [N(CH2)2] e 25,3 [(CH2)2]; fR 5,17 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (65), 146 (11), 171 (15), 242 (100, M+. Ci3H15N5 re- quer 242) e 243 (31).
N-(1 -BENZIL-2-OXO-2-PIRROLIDIN-1 -ILETIL)-6-PIRROLIDIN-1 - ILPIRIMIDIN-4-AMINA (100)
Seguindo um procedimento similar a 97, cloreto 60 (1,00 g, 3,43 mmols) foi aquecido em tolueno (7 cm3) em um tubo de vidro vedado na presença de pirrolidina (0,57 cm3, 6,89 mmols) a 130QC durante 72h. Após concentração, cromatografia de coluna [usando 2:8 (v/v) metanohacetato de etila como eluente] forneceu um sólido laranja, N-(1-benzil-2-oxo-2-pirrolidin- 1 -iletil)-6-pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 100 (0,33 g, 26 %). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,18 (1H, br s, H-2), 7,41-7,09 (5H, m, arila H), 5,45 (1H, br d, NH, J 8,8), 5,25 (1H, s, H-5), 5,03 (1H, dt, NHCH, J 14,2 e 6,0), 3,62-3,19 [3H, m, CONCHaHb(CH2)-], 3,38 [4H, t, N(CH2)2-, J 7,0], 3,13 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,2 e 7,2), 3,02 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,0 e 9,2), 2,80-2,42 [1H, m, CON- CHaHb(CH2)-], 2,13-1,82 e 1,82-1,44 [8h, 2 χ m, 2 χ N(CH2CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 170,6 (CO), 161,2 e 160,2 (C-4 e C-6), 157,5 (C-2), 137,0 (fenila quaternária C), 129,4, 128,2 e 126,7 (fenila CH), 82,9 (C-5), 53,8 (NHCH), 46,3 e 45,7 [CON(CH2)2], 46,2 [N(CH2)2], 39,7 (PhCH2), 25,1 e 24,0 [CON(CH2CH2)2] e 25,3 [N(CH2CH2)2].
2-{[6-(DIMETILAMINO)PIRIMIDIN-4-IL]AMINO}-3-FENILPROPANOATO DE METILA (101)
Seguindo um procedimento similar a 100, cloreto 60 (0,98 g, 3,37 mmols) foi aquecido em tolueno (7 cm3) em um tubo de vidro vedado na presença de dimetilamina (33 % em etanol, 3,0 cm3, 22,0 mmols) a 130°C durante 72h. Após concentração, cromatografia de coluna [usando 1:9 - 2:8 (v/v) metanol:acetato de etila como eluente] forneceu um sólido laranja, 2- {[6-(dimetilamino)pirimidin-4-il]amino}-3-fenilpropanoato de metila 101 (0,21 g, 17 %). <5h (200 MHz1 CDCl3) 8,20 (1H, br s, H-2), 7,38-7,11 (5H, m, arila H), 5,47 (1H, br d, NH1 J 8,4), 5,38 (1H, s, H-5), 5,31 (1H, dt, NHCH, J 8,2 e 6,0), 3,10 (1H, dd, PhCHaHb, J 13,2 e 5,8), 3,08 3H, s, OCH3), 3,02 (1H, obscurecido ?dd, PhCHaHb, J 13,2 e 3,4), 2,08 e 2,73 (6H, 2xs, 2 χ CH3); δC (50 MHz, CDCl3) 172,3 (CO), 162,5 e 161,6 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2), 136,9 (fenila quaternária C), 129,4, 128,3 e 126,7 (fenila CH), 82,5 (C- 5), 51,4 (OCH3), 39,8 (NHCH), 37,1 (PhCH2), 36,9 e 35,6 [N(CH3)2].
MÉTODO GERAL PARA A NITRAÇÃO DE PIRIMIDINAS
Uma suspensão rapidamente agitada da pirimidina em ácido sul- fúrico concentrado (3-4 eq.) em um frasco cônico foi esfriada para -10°C em um banho de gelo-sal. Ácido nítrico (65 %, 1-2 eq.) foi depois adicionado a gotas à mistura, fornecendo uma mistura amarela brilhante com o passar do tempo que gradualmente ficou laranja profunda. Esta foi depois deixada a- quecer-se para temperatura ambiente por 18h. A mistura é depois decantada sobre gelo esmagado, e ou trabalhada por filtração ou extração, como pode ser a necessidade.
5-NITRO-N-PIRIDIN-2-IL-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (102)
Usando o método geral por nitração, pirimidina 99 (0,28 g, 1,16 mmol), ácido nítrico (65 %, 0,24 cm3, 2,4 mmols) e ácido sulfúrico con- centrado (2,3 cm3) foram misturados a O9C, fornecendo uma solução amare- lo-laranja. Após processamento, cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) acetato de etila:hexano forneceu um sólido amarelo, 5-nitro-N-piridin-2-il-6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 102 (0,28 g, 83,1 %). δH (200 MHz, CDCl3) 10,2 (1H, br s, NH), 8,42 (1H, dd, piridina H-6, J 0,8 e 8,4), 8,35 (1H, dt, piri- dina H-4, J 1,0 e 4,8), 8,23 (1H, s, H-2), 7,71 (1H, ddd, H-5, J 1,9, 7,8 e 8,8), 7,04 (1H, dd, H-3, J 4,8 e 7,2), 3,47 [4H, br s, N(CH2)2] e 1,96-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δC (50 MHz, CDCl3) 156,9 (piridina C-2), 153,5 (C-6), 151,5 (C-4), 148,2 (piridina C-6), 137,8 (piridina C-4), 119,6 (C-2), 115,8 (piridina C-5), 109,7 (piridina C-3), 80,2 (C-5), 50,0 [N(CH2)2] e 25,2 [br, (CH2)2]; (ES) m/z 213 (10), 241 (65), 242 (125), 287 (100, MH+. Ci3H15N6O2 requer 287) e 288 (18).
MÉTODO GERAL PARA A BROMAÇÃO DE 4,6-DIAMINOPIRIMIDINAS
Uma solução da pirimidina em diclorometano em temperatura ambiente foi tratada com bromo (1,5-2 eq.), usualmente resultando em um exotérmico e a ebulição rápida concomitante da solução de diclorometano se esta operação for feita muito rapidamente, rendendo uma solução vermelha para preta. A mistura é deixada, parada, por 18h, então decantada em 1M de hidróxido de sódio aquoso e extraída com diclorometano. Processamento padrão e cromatografia de coluna fornecem os brometos como sólidos ou óleos.
5-BROMO-N-METIL-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (103)
Uma solução da pirimidina 89 (0,50 g, 2,78 mmols) em dicloro- metano (7,0 cm3) foi tratada com bromo (0,17 cm3, 3,33 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila.hexano como eluente] forneceu um sólido bege, 5-bromo-N-metil-6- pirrolidin-1 -ilpirimidin-4-amina 103 (0,54 g, 75 %; 100 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,09 (1H, s, H-2), 5,31 (1H, br s, NH), 3,72 [4H, t, (- CH2)2N, J 6,7], 3,01 (3H, d, NHCH3, J 4,8) e 2,02-1,75 [4H, m, O(CH2)2 -]; <5C (50 MHz, CDCI3) 160,0 e 158,1 (C-4 e C-6), 154,8 (C-2), 83,2 (C-5), 50,0 [(CH2CH2)2N], 28,7 (NHCH3) e 25,7 [(CH2CH2)2N]; íR 2,15 min (metanol). 5-BROMO-N-METIL-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (104)
Uma solução da pirimidina 90 (1,51 g, 7,78 mmols) em dicloro- metano (19,5 cm3) foi tratada com bromo (0,48 cm3, 9,34 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um sólido bege, 5-bromo-N-metil-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 104 (1,66 g, 78 %, 99 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCI3) 8,22 (1H, s, H-2),5,39 (1H, br s, NH), 3,79 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J4,6], 3,44 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J4,7] e 3,03 (3H, d, NHCH3, J 5,0); õc (50 MHz, CDCI3) 162,3 e 160,5 (C-4 e C-6), 157,3 (C-2),90,6(C- 5), 66,8 [O(CH2CH2)2N ], 49,1 [O(CH2CH2)2N] e 28,6 (NHCH3); tR 1,97 min (metanol).
N-BENZIL-5-BROMO-6-PIRROLIDIN-1 -ILPIRIMIDIN-4-AMINA (105)
Aplicando o método geral por bromação, pirimidina 91 (0,55 g, 2,17mmols) e bromo (0,17 cm3, 3,26 mmols) em diclorometano (4,4 cm3) renderam, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano], um óleo laranja, N-benzil-5-bromo-6-pirrolidin-1- ilpirimidin-4-amina 105 (0,59 g, 81,8 %, 92,4 % puro por HPLC). <5H (200 MHz1 CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 7,25-7,39 (5H, m, arila H), 5,65 (1H, br m, NH), 4,72 (2H, d, PhCH2, J 5,4), 3,72-3,82 [4H, m, N(CH2)2] e 1,85-1,98 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 159,4 (C-6), 158,2 (C-4), 154,8 (C-2), 139,1 (arila quaternária C), 128,6, 127,5 e 127,5 (arila C), 83,1 (C-5), 50,1 [N(CH2)2], 45,6 (PhCH2) e 25,7 [br, (CH2)2]; fR 2,38 min (metanol); (ES) m/z 241 (41), 243 (42), 333 (100, M+. C15H1779BrN4 requer 333), 334 (14), 335 (100, M+. Ci5Hi78IBrN4 requer 335) e 366 (15).
N-BENZIL-1-[6-(BENZILAMINO)-5-BROMOPIRIMIDIN-4-il]PIRROLIDINO-2- CARBOXAMIDA (106)
Seguindo o procedimento geral por bromação, produto 92 (1,69 g, 4,35 mmols) e bromo (0,27 cm3, 5,2 mmols) em diclorometano (4,5 cm3) renderam, após cromatografia de coluna com 1:10-1:5 (v/v) ace- tato de etila:hexano como eluente, um óleo de amarelo-laranja, N-benzil-1- [6-(benzilamino)-5-bromopirimidin-4-il]pirrolidino-2-carboxamida 106 (1,52 g, 75 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,01 (1H, s, H-2), 7,02-7,34 (10H, m, arila H), 6,65 (1H, br t, CONH, J 5,8), 5,69 (1H, br t, arila NH, J 5,7), 4,88 (1H, dd, NCHCO, J 6,2 e 7,4), 4,63 (2H, d, PhCH2, J 5,8), 4,37 (2H, dd, PhCH2, J 2,0 e 5,8), 4,02 (1H, ddd, NCHaHb, J 7,2, 9,2 e 16,2), 3,68 (1H, ddd, NCHaHb, J 7,6, 10,2 e 13,4) e 1,70-2,31 [4H, m, (CH2)2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 172,8 (CO), 159,6 (C-6), 158,9 (C-4), 154,8 (C-2), 138,6 e 138,3 (arila quaternária C), 128,5, 128,4, 127,3, 127,2, 127,2 e 127,1 (arila C), 85,2 (C-5), 63,1 (N- CHCO), 52,0 (NCH2), 45,4 e 43,0 (2 χ PhCH2), 29,8 e 25,3 [(CH2)2]; (ES) m/z 255 (11), 283 (10), 345 (100, Ci6Hi779BrN4), 346 (15), 347 (98, C16H1781BrN4), 348 (16), 373 (58, C16H1679BrN5O), 375 (58, C16H1681BrN5O), 376(12) e 388(1, M+ - Br). No M+(C23H2479BrN5O requer 466).
N-BENZIL-5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-AMINA (107)
Uma solução da pirimidina 93 (1,37 g, 5,05 mmols) em dicloro- metano (13,0 cm3) foi tratada com bromo (0,31 cm3, 6,06 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 - 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente] forneceu um óleo laranja, N-benzil-5-bromo-6- morfolin-4-ilpirimidin-4-amina 107 (1,07g, 61 %, 99 % puro por HPLC). <5H (200 MHz, CDCl3) 8,23 (1H, s, H-2), 7,48-7,12 (5H, m, arila H), 5,70 (1H, br m, NH), 4,71 (2H, d, PhCH2, J 5,8), 3,81 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,6] e 3,48 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,6]; õc (50 MHz, CDCI3) 162,7 e 159,9 (C-4 e C-6), 155,4 (C-2), 138,5 (fenila quaternária C), 128,7, 127,5 e 127,4 (fenila CH), 90,4 (C-5), 66,8 [O(CH2CH2)2N], 49,1 (PhCH2) e 45,5 [O(CH2CH2)2N]; fR 2,10 min (metanol).
2-[(5-BROMO-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (108)
Usando o método geral por bromação, pirimidina 94 (0,96 g, 4,96 mmols) e bromo (0,26 cm3, 5,1 mmols) em diclorometano (23 cm3) ren- deram, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) ace- tato de etila:hexano como eluente], um óleo amarelo, 2-[(5-bromo-6- pirrolidin-1-ilpirimidin-4-il)amino]etanol 108 (1,04g, 79,0 %, 99 % puro por 20 HPLC). <5h (200 MHz, CDCI3) 7,93 (1H, s, H-2), 5,74 (1H, br m, NH), 4,49 (1H, br s, OH), 3,42-3,76 [8H, 2 χ m, HO(CH2)2NH e N(CH2)2] e 1,82-1,97 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 159,7 (C-6), 158,0 (C-4), 154,1 (C-2), 82,6 (C-5), 62,9 (OCH2), 49,9 [N(CH2)2], 44,7 (CH2NH) e 25,5 [(CH2)2]; tfí 8,40 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 162 (12), 25 189 (79), 190 (18), 207 (27), 269 (47, M+ - H2O), 271 (48, M+ - H2O), 287 (100, M+. Ci0H1SygBrN4O requer 287) e 289 (96, M+. Ci0Hi58IBrN4O requer 289).
N-(2-HIDROXIETIL)-1-{6-[(2-HIDROXIETIL)AMINO]-5-BROMOPIRIMIDIN-4- ILJPIRROLIDINO-2-CARBOXAMIDA (109)
Usando o método geral por bromação, pirimidina 95 (0,968 g, 4,96 mmols) e bromo (0,26 cm3, 5,17 mmols) em diclorometano (23 cm3) renderam, após processamento e cromatografia de coluna [1:10 - 1:5 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente], um óleo amarelo, N-(2-hidroxietil)-1- {6-[(2-hidroxietil)amino]-5-bromopirimidin-4-il}pirrol-idino-2-carboxamida 109 (1,04 g, 79,0 %). <5H (200 MHz1 CDCI3) 7,93 (1H, s, H-2), 5,74 (1H, br m, NH), 4,49 (1H, br s, OH), 3,42-3,76 [8H, 2 x m, HO(CH2)2NH e N(CH2)2] e 1,82- 1,97 [4H, m, (CH2)2]; õc (50 MHz, CDCI3) 159,7 (C-6), 158,0 (C-4), 154,1 (C- 2), 82,6 (C-5), 62,9 (OCH2), 49,9 [N(CH2)2], 44,7 (CH2NH) e 25,5 [(CH2)2]. 2-[(5-BROMO-6-MORFOLIN-4-ILPIRIMIDIN-4-IL)AMINO]ETANOL (110)
Uma solução da pirimidina 96 (1,57 g, 6,98 mmols) em dicloro- metano (17,0 cm3) foi tratada com bromo (0,43 cm3, 8,37 mmols) de acordo com o procedimento geral. Cromatografia de coluna [1:4 (v/v) acetato de eti- la:hexano para 1:9 (v/v) metanokacetato de etila como eluente] forneceu um sólido bege, 2-[(5-bromo-6-morfolin-4-ilpirimidin-4-il)amino]etanol 110 (1,04 g, 49 %, 98 % puro por HPLC). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (1H, s, H-2), 5,81 (1H, br m, NH), 3,90-3,67 (7H, br t e m obscurecido, OH, O(CH2CH2)2N, J 4,0 e CH2OH), 3,63 (2H, ~dt, NHCH2, J 5,5 e 4,2) e 3,46 [4H, t, O(CH2CH2)2N, J 4,2]; <5C (50 MHz, CDCI3) 162,5 e 160,3 (C-4 e C-6), 154,9 (C-2), 90,1 (C-5), 66,8 [O(CH2CH2)2N], 62,8 (CH2OH), 49,0 [O(CH2CH2)2N] e 44,7 (NHCH2); fR 3,87 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio).
MÉTODO GERAL PARA AMINAÇÃO CATALÍTICA DE 5- BROMOPIRIMIDINAS
A 5-bromopirimidina a ser usada foi colocada em um tubo de reação, junto com a amina requerida (4 eq.), hidrato de fosfato de potássio (2 eq.) e N,N-di-metiletanolamina comercial (0,1 M) em temperatura ambien- te. A mistura foi depois purgada com um fluxo de gás de nitrogênio durante cerca de 15 minutos após os quais iodeto cuproso branco anidro (Cul, 1,1 eq.) foi adicionado, em geral fornecendo uma mistura verde. O tubo foi vedado sob atmosfera de nitrogênio, e depois aquecido para 100°C durante 18h. A mistura assume uma cor roxo-preta gradualmente à medida que a reação prossegue. Após esfriar, a mistura é tratada com solução de amônia concentrada para remover os resíduos de cobre, e extraída com diclorome- tano. Concentração e cromatografia de coluna usando 1:10 (v/v) meta- nohacetato de etila como eluente, usando uma pequena amônia conforme necessário, fornece o produto purificado.
N4,N5-DIBENZIL-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDINO-4,5-DIAMINA (111)
Usando o procedimento geral, brometo 105 (0,19 g, 0,58 mmol), benzilamina (0,26 cm3, 2,4 mmols), hidrato de fosfato de potássio (0,29 g, 1,28 mmol), iodeto cuproso (0,15 g, 0,78 mmol) e N,N-dimetiletanolamina (1 cm3) foi fervido junto, resultando em uma solução marrom. Processamen- to e cromatografia forneceram um sólido amarelo, dibenzil-6-pirrolidin- 1-ilpirimidino-4,5-diamina 111 (0,15 g, 69 %, 78,0 % puro por HPLC). δH (200 MHz, CDCI3) 8,15 (1H, s, H-2), 7,12-7,45 (10H, m, arila H), 5,17 e 5,42 (2H, br s e br m, 2 χ NH), 4,44 (2H, d, PhCH2, J4,8), 3,89 (2H, br s, PhCH2), 3,39 [4H, br m, N(CH2)2] e 1,75-2,05 [4H, m, (CH2)2]; δc (50 MHz1 CDCI3) 162,2 (C-6), 160,6 (C-4), 157,6 (C-2), 138,4 (arila quaternária C), 128,6, 128,5, 127,3, 127,2, 127,0 e 126,8 (arila C), 80,6 (C-5), 46,2 [N(CH2)2], 45,8 (2 χ PhCH2) e 25,2 [br, (CH2)2]; tr 9,78 min (50 % metanol: 25 mM de acetato de amônio); (ES) m/z 138 (29), 163 (48, C8H12N4), 228 (21), 255 (100, C15HI8N4) e 256 (25). No M+ (C22H25N5 requer 360).
2-{[5-(BENZILAMINO)-6-PIRROLIDIN-1-ILPIRIMIDIN-4-IL]AMINO}ETANOL (112)
Usando o procedimento geral, brometo 108 (0,30 g, 1,04 mmol), benzilamina (0,47 cm3, 4,32 mmols), hidrato de fosfato de potássio (0,59 g, 2,57 mmols), iodeto cuproso (0,23 g, 1,21 mmol) e N,N-dimetiletanolamina (1,8 cm3) foram fervidos juntos, resultando em uma solução de roxo-marrom. Processamento e cromatografia forneceram um sólido amarelo, 2-{[5- (benzilamino)-6-pirrolidin-1-ilpirimidin-4-il]amino}etanol 112 (0,30 g, 92,3 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,10 (1H, br s, H-2), 7,12-7,40 (5H, m, arila H), 4,41 e 5,13 (4H, 2 χ br s, 2 χ NHe PhCH2), 3,80 (1H, br s, OH), 3,54-3,68 (2H, m, OCH2), 3,19-3,42 [4H, br m, N(CH2)2], 2,05 (2H, s, NHCH2) e 1,86-1,95 [4H, m, (CH2)2]; δc (50 MHz1 CDCI3) 162,3 (C-6), 160,3 (C-4), 157,2 (C-2), 140,1 (arila quaternária C), 128,2, 127,6 e 126,4 (arila C), 80,8 (C-5), 61,1 (OCH2), 55,3 (PhCH2), 46,1 [N(CH2)2], 44,1 (CH2NH) e 25,1 [(CH2)2]. 2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA (113)
Cloreto de fenacila (2,03 g, 13,1 mmols) e 2-aminopiridina (1,24g, 13,1 mmols) foram aquecidos para 1205C em dimetilformamida (25 cm3) durante 5h. A mistura foi depois deixada esfriar e agitada em tem- peratura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em água (50 cm3) e extraída em acetato de etila (2 x 50 cm3). O solvente foi removido da fase orgânica gerando um óleo escuro que foi submetido à cromatografia instan- tânea [1:2 a 2:1 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. Um material cristalino marrom pálido foi isolado [Rf0,23, 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano] que foi identificado como o composto do título 113 (0,79 g, 31 %). δΗ (CDCI3, 200 MHz) 8,13 (1H, d, H-5, J 6,6), 7,98 (2H, d, fenila H, J 6,8), 7,87 (1H, s, H-3), 7,67 (1H, d, H-8, J 9,0), 7,43 (3H, m, fenila H), 7,19 (1H, dd, H-7, J 9,0 e 7,8) e 6,79 (1H, dd, H-6, J 7,8 e 6,6).
2-(4-BROMOFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDINA (114)
Cloreto de 4-bromofenacila (2,44 g, 10,9 mmols) e 2- aminopiridina (1,03 g, 10,9 mmols) foram aquecidas para 1209C em dimetil- formamida (20 cm3) por 5 h. A mistura foi depois deixada esfriar e agitada em temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi vertida em água (40 cm3) e extraída em acetato de etila (2 χ 40 cm3). O solvente foi removido da fase orgânica gerando um óleo escuro que foi submetido à cromatografia instantânea [(2:3 (v/v) acetato de etila:hexano como eluente]. Um material cristalino amarelo foi isolado [R^ 0,35, 1:1 (v/v) acetato de etila:hexano] que foi identificado como o composto do título 114 (2,14 g, 72 %). <5H (CDCI3, 200 MHz) 8,15 (1H, d, H-5, J 6,7), 7,87 (1H, s, H-3), 7,85 (2H, d, fenila H-3 e H-5, J 8,5), 7,66 (1H, d, H-8, J 9,1), 7,57 (2H, d, fenila H-2 e H-6, J 8,5), 7,22 (1H, dd, H-7, J9,1 e 7,1) e 6,80 (1H, dd, H-6, J6,7 e 7,1).
PROCEDIMENTO GERAL PARA A PREPARAÇÃO DE IMIDAZO[1,2- a]PIRIDINAS USANDO CLORETO DE ZINCO
2-Aminopiridina (0,13 mg, 1,33 mmol) foi dissolvida em dioxano, e tratada com cloreto de zinco (5 mois %, 0,07 mmol), aldeído (1,0eq., 1,33 mmol) e isocianeto (1,0 eq., 1,328 mmol) e vedados em um reator de microonda. A mistura foi irradiada a 40 % de potência (de 600W) por 1,5h. Após este tempo, a mistura de reação foi concentrada e a mistura bruta tra- tada com acetato de etila/hexano para fornecer o produto como um precipi- tado.
PROCEDIMENTO GERAL PARA A PREPARAÇÃO DE IMIDAZO[1,2- a]PIRIDINAS USANDO ARGILA DE MONTMORILONITA K10
2-Aminopiridina (0,13 mg, 1,33 mmol) foi dissolvida em dioxano, e tratada com argila de montmorilonita K10 (1 equivalente de massa, 0,13 mg), aldeído (1,0 eq., 1,33 mmol) e isocianeto (1,0 eq., 1,33 mmol) e vedada em um reator de microonda. A mistura foi irradiada a 40 % de potên- cia (de 600W) por 1,5 h. Após este tempo a mistura de reação foi filtrada e a argila lavada várias vezes com metanol ou diclorometano. O filtrado foi con- centrado sob pressão reduzida e a mistura bruta tratada com acetato de eti- la/hexano para fornecer o produto como um precipitado.
Alternativamente, a mistura de reação pode ser aquecida atra- vés de métodos convencionais com agitação durante 5 horas.
Os compostos a seguir foram preparados por um dos dois méto- dos descritos acima, ou usando aquecimento convencional:
N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (115) (0,29 g, 72 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,12 (2H, d, 2 χ arila H), 7,61 (2H, d, 2 χ arila H), 7,24-7,41 (3H, m, 3 χ arila H), 7,16 (1H, m, arila H), 7,00 (2H, d, J 7,6, 2 χ arila H), 6,78-6,86 (2H, m, 2 χ arila H), 6,67-6,74 (2H, m, 2 χ arila H), 5,43 (1H, br s, NH) e 2,02 (6H, s, 2 χ CH3); δ0 (50 MHz, CD- Cl3) 141,5 (C-8)a, 140,5 (C-3)a, 133,8 (C-2), 130,1 (2 χ xilila C-3), 128,6 (2 χ fenila C-2), 127,8 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 125,7 (C-4), 124,5 (C- 5), 122,6 (2 χ xilila C-2), 121,3 (xilila C-4), 117,8 (C-6), 112,5 (C-7) e 18,5 (2 XCH3); (El) m/z 313,2, 220,1, 194,0 e 79,1. N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3- AMINA (116)
(0,20g, 48 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,04 (2H, d, J 8,4, arila H), 7,58 (2H, d, J 1,0, arila H), 7,16-6,63 (7H, m, 7 χ arila H), 5,41 (1H, s, NH), 3,82 (3H, s, OCH3) e 2,01 (6H, s, 2 χ CH3); <5C (50 MHz, CDCI3) 149,2 (piridi- Ia C-2' e C-6'), 141,3 (C-8)a, 140,6 (arila C)a, 138,5 (C-3), 137,5 (piridila C- 4'), 130,1 (2 χ xilila C-3'), 128,5 (2 χ fenila C-2), 125,4 (C-4), 124,3 (C-5), 122,4 (2 χ xilila C-2'), 121,1 (xilila C-4'), 117,3 (C-6), 112,3 (C-7) 55,4 (OCH3) e 18,7 (2 χ CH3); (El) m/z 343,4, 224,9, 210,9, 79,0 e 77,7. N-(TERC-BUTIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (117)
(0,25 g, 60 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,55 (1H, d, J 9,2, arila H), 8,15(1 H, d, J 6,6 arila H), 7,47 (2H, br d, 2 χ arila H), 7,28 (1H, br t, arila H), 6,89-7,04 (4H, m, 4 χ arila H) e 0,79 (9H, s, 3 χ CH3); <5C (50 MHz, CDCI3) 142,0 (C-8)a, 137,9 (C-3)a, 131,4 (C-2), 129,9 (2 χ fenila C-2), 127,7 (fenila C-4), 127,4 (2 x fenila C-3), 127,0 (C-4), 124,7 (fenila C-1), 123,4 (C-5), 118,0 (C-6), 113,5 (C-7), 56,6 [C(CH3)3] e 30,2 [C(CH3)3]; (El) m/z 265,1, 208,1, 181,0 e 78,1.
N-(TERC-BUTIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA(118) (0,14g, 28 %). ÕH (200 MHz, CDCI3) 8,05 (1H, br m, arila H), 7,61 -7,70 (1H, br m, arila H), 7,29 (2H, br d, J 7,2, 2 χ arila H), 7,16 (1H, br t, J 7,1, arila H), 6,72-7,00 (4H, m, 4 χ arila H) ,5,42 (1H, br s, NH), 3,828 (3H, s, OCH3) e 2,01 (9H, s, 3 χ CH3); <5C (50 MHz, DMSO) 159,2 (C-3), 158 (C-2), 148,20 (2 χ fenila C-2), 127,7 (fenila C-4), 137,40 (2 χ fenila C-3), 135,26 (C- 4), 128,49 (fenila C-1), 114,22 (C-5), 113,02 (C-6), 109,11 (C-7), 61,63 [C(CH3)3] e 55,84 (OCH3); (El) m/z 295,0, 238,9, 237,8, 210,9, 212,2, 94,0, 77,9, 66,9, 55,6 e 50,7,.
N-(2-MORFOLIN-4-ILETIL)-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (119) (0,12 g, 14%). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,11 (1H, d, J 7,0, arila H), 8,03 (2H, d, J 8,4 2 χ arila H), 7,56 (2H, d, J 9,2, 2 χ arila H), 7,34-7,48 (3H, m, 3 χ arila H), 7,18 (1H, br t, arila H), 6,79 (1H, br t, arila H), 4,08 (1H, br s, NH), 3,72 (4H, t, J4,5, 2 χ CH2O), 3,07-3,10 (2H, m, CH2NH), 2,52-2,58 (2H, m, CH2N) e 2,44 (4H, t, J 4,5, 2 χ CH2N); <5C (50 MHz, CDCI3) 141,6 (C-8)a, 135,17 (C-3)a, 134,7 (C-2), 128,8 (2x fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 126,7 (fenila C-1), 123,9 (C-4), 122,6 (C-5), 117,8 (C-6), 111,8 (C-7), 67,2 (2 χ CH2O), 58,5 (CH2N), 53,9 (2 χ CH2N) e 44,4 (CH2NH); (El) m/z 322,1, 220,0, 99,9 e 78,1.
N-(2-MORFILIN-4-ILETIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3- AMINA (120)
(0,10 g, 20 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,30 (1H, d, J 6,6, arila H), 8,10 (2Η, d, J 8,4, 2 χ arila Η), 7,60 (2H, d, J 9,2, 2 χ arila Η), 7,14-7,32 (3H, m, 3 χ arila Η), 6,93 (2H, br t, J8,6, arila H), 4,14 (1H, br s, NH), 3, 92 (3H, d, J 8,4, CH3O), 3,76 (4H, t, J 4,1, 2 χ CH2O), 3,07-3,10 (2H, m, CH2NH), 2,52- 2,58 (2H, m, CH2N) e 2,44 (4H, t, J 4,0, 2 χ CH2N); δC (50 MHz, CDCI3) 133,1 (C-8)a, 128,5 (C-3)a, 127,5 (C-2), 122,0 (2 χ fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 126,7 (fenila C-1), 123,9 (C-4), 122,6 (C-5), 118,9 (C-6), 116,4 (C-7), 71,9 (2 χ CH2O), 60,3 (CH2N), 58,7 (2 χ CH2N), 49,1 (OCH3) e 45,0 (CH2NH); (El) m/z 352,2, 251,9, 225,0, 224,0, 211,0, 128,0, 114,0, 113,0, 101,0, 99,7, 78,9, 77,9, 55,7 e 50,6.
N-CICLOEXIL-2-FENILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (121)
(0,60 g, 78 %). õc (50 MHz, CDCI3) 141,7 (C-8)a, 136,7 (C-3)a, 134,6 (C-2), 129,6 (fenila C-1), 128,7 (2 χ fenila C-2), 127,5 (fenila C-4), 127,3 (2 χ fenila C-3), 124,1 (C-4), 122,9 (C-5), 117,6 (C-6), 111,8 (C-7), 57,2 (CHNH), 34,4 (2 χ cicloexila C-2'), 26,0 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (ci- cloexila C-4'); (El) m/z 290,9, 208,0, 180,9 e 78,2.
N-(CICLOEXIL)-2-(4-METOXIFENIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (122) (0,18g, 42 %). <5h (200 MHz, CDCI3) 8,11 (2H, d, J 6,8, arila H), 8,02 (2H, d, J 8,6, arila H), 7,16-7,08 (1H, m, arila H), 7,02-6,98 (2H, d, J 8,6, arila H), 6,80-6,73 (1H, m, arila H), 3,87 (3H, s, OCH3) e 1,80-1,59 (10H, br m, 5 χ cicloexila CH2); δc (50 MHz, CDCI3) 141,6 (C-8), 134,6 (C-2), 128,6 (2 χ fenila C-2), 127,3 (fenila C-4), 124,3 (2 χ fenila C-3), 123,9 (C-4), 122,9 (C- 5), 117,3 (C-6), 111,7 (C-7), 57,1 (CHNH), 55,5 (OCH3), 34,4 (2x cicloexila C-2'), 26,0 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (cicloexila C-4'); (El) m/z 231,2, 237,8, 210,8 e 78,0.
N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (123)
(0,22 g, 54 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,29 (1H, d J 1,6, piridila H- 2'), 8,48 (1H, dd, J 5 e 1,6, piridila H-6'), 8,33 (1H, dt, J 8 e 1,8, H-4), 7,59- 7,69 (2H, m, 2 χ arila H), 7,15-7,30 (2H, m, 2 χ arila H), 6,98 (2H, d, J7,4, 2 χ 30 xilila H-3'), 6,72-6,86 (2H, m, 2 χ arila H), 5,49 (1H, br s, NH) e 2,01 (6H, s, 2 χ CH3); δc (50 MHz, CDCI3) 148,5 (piridila C-2' e C-6'), 141,9 (C-8)a, 140,1 (arila C)a, 134,7 (C-3), 134,5 (piridila C-4'), 130,1 (2 χ xilila C-3'), 129,8 (C-2), 125,9 (C-4), 125,0 (C-5), 123,5 (piridila C-5'), 122,6 (2 χ xilila C-2'), 122,1 (piridila C-3'), 121,8 (xilila C-4'), 117,8 (C-6), 112,9 (C-7) e 18,7 (2 χ CH3); (El) m/z 314,1, 221,0, 194,9 e 78,0.
N-(TERC-BUTIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (124) (0,21 g, 57 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,23 (1H, d J 1,6, piridila H- 2'), 8,56 (1H, dd, J 5 e 1,6, piridila H-6'), 8,31 (1H, dt, J 8 e 1,6, piridila H-4'), 8,23 (1H, dt, J 7,0 e 1,2, H-4), 7,56 (1H, dd, J 9,0 e 1,1, H-7), 7,38 (1H, ddd, J 8,0, 5,0 e 1,0, piridila H-5'), 7,17 (1H, ddd, J 9,0, 7,0 e 1,2, H-6), 6,81 (1H, dt, J 7,0 e 1,1, H-5), 3,09 (1H, br s, NH) e 1,02 (9H, s, 3 χ CH3); δ0 (50 MHz, CDCI3) 149,3 (piridila C-2')a, 148,5 (piridila C-6')a, 142,80 (C-8)a, 135,6 (C-3), 135.5 (piridila C-4'), 131,6 (C-2), 124,7 (C-4), 123,7 (C-5), 123,6 (piridila C- 5'), 122,5 (piridila C-3'), 117,8 (C-6), 111,9 (C-7), 55,7 [C(CH3)3] e 30,7 [C(CH3)3]; (El) m/z266,1, 210,0, 181,9 e 78,0.
N-(2-MORFOLIN-4-ILETIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (125)
(49,5 mg, 11 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,30 (1H, d J 1,0, piridila H-2'), 8,56 (1H, dd, J 5,0 e 1,6, piridila H-6'), 8,38 (1H, dt, J 7,9 e 1,6, piridila H-4'), 8,16 (1H, d, J 6,8, H-4), 7,58 (1H, d, J 9,4, H-7), 7,38 (1H, dd, J 7,9, 5,0, piridila H-5'), 7,18 (1H, br t, J 8,0, H-6), 6,84 (1H, br t, J 6,8, H-5), 4,01 (1H, br s, NH), 3,76 (4H, t, J 4,6, 2 χ CH2O), 3,14 (2H, br d, J 5,7, CH2NH), 2,60 (2H, t, J 5,7, CH2N) e 2,50 (4H, t, J 4,6, 2 χ CH2N); <5C (50 MHz, CDCI3) 148,4 (piridila C-2')a, 148,3 (piridila C-6')a, 142,07 (C-8), 140,4 (C-2)a, 134,5 (piridila C-4')a, 130,7 (C-3)a, 127,1 (piridila C-3'), 124,4 (C-4), 123,8 (C-5),
122.6 (piridila C-5'), 118,0 (C-6), 112,2 (C-7), 67,1 (2 χ CH2O), 58,5 (CH2N), 53,9 (2 χ CH2N) e 44,5 (CH2NH); (El) m/z 323,3, 223,2, 100,0 e 78,2. N-(CICLOEXIL)-2-PIRIDIN-3-ILIMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (126) (0,23 g, 59 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 9,33 (1H, J de dd 1,8 e 0,8, piridila H-2'), 8,55 (1H, dd, J 4,7 e 1,8, piridila H-6'), 8,41 (1H, dt, J 7,9 e 1,8, piridila H-4'), 8,10 (1H, dt, J 6,8 e 1,1, H-4), 7,56 (1H, dt, J 9,1 e 1,1, H-7), 7,38 (1H, ddd, J 7,9, 4,7 e 0,8, piridila H-5'), 7,17 (1H, ddd, J 9,1, 6,8, e 1,1, H-6), 6,82 (1H, dt, J 6,8 e 1,1, H-5), 3,11 (1H, br s, NH), 2,86-3,08 (1H, m, CHNH), 1,46-1,92 e 1,00-1,40 (10H, 2 χ m, 5 x cicloexila CH2); <5C (50 MHz, CDCl3) 148,4 (piridila C-2')a, 148,3 (piridila C-6')a, 142,3 (C-8)a, 134,7 (piridila C-4')a, 134,6 (C-3)a, 130,9 (C-2), 125,6 (piridila C-3'), 124,6 (C-4), 123,7 (C- 5), 122,9 (piridila C-5'), 117,8 (C-6), 112,1 (C-7), 57,2 (CHNH), 34,5 (2 χ ci- cloexila C-2'), 25,9 (2 χ cicloexila C-3') e 25,1 (cicloexila C-4'); (El) m/z 292,1, 209,0, 181,9 e 78,0.
N-(2,6-DIMETILFENIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (127)
(99,4 mg, 25 %). 5H (200 MHz, CDCI3) 7,65 (1H, d, J 7,0, H-4), 7,55 (1H, d, J 9,0, H-7), 7,43 (1H, br s, furila H-5'), 7,06-7,18 (1H, m, H-6), 6,99 (2H, d, J 6,9, 2 χ xilila H-3'), 6,80-6,91 (1H, m, H-5), 6,70 (1H, d, J 6,9, xilila H-4'), 6,59 (1H, d, J3,3, furila H-3'), 6,42 (1H, dd, J3,3 e 1,6, furila H-4') e 2,03 (6H, s, 2 χ CH3).
N-(TERC-BUTIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (128)
(0,20 g, 60 %). δh (200 MHz1 CDCI3) 8,27 (1H1 d, J 6,8, H-4), 7,44-7,58 (2H, m, H-7 e furila H-5'), 7,06-7,22 (1H, m, H-6), 6,93 (1H, d, J 15 3,4, furila H-3'), 6,78 (1H, t, J 6,8, H-5), 6,53 (1H, dd, J 3,4 e 1,6, furila H-4'), 3,54 (1H, br s, NH) e 1,18 [9H, s, C(CH3)3].
N-(CICLOEXIL)-2-(2-FURIL)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-3-AMINA (129)
(0,27 g, 73 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,07 (1H, dd, J 6,7 e 1,2, H- 4), 7,53 (1H, d, J 9,0, H-7), 7,51 (1H, d, J 1,6, furila H-5'), 7,15 (1H, ddd, J 20 9,0, 6,7 e 1,2, H-6), 6,91 (1H, d, J 3,3, furila H-3'), 6,79 (1H, td, J 6,7 e 1,0, H-5), 6,55 (1H, dd, J 3,3 e 1,6, furila H-4'), 3,62 (1H, brs, NH) 2,85-3,10 (1H, m, CHNH), 1,50-2,00 e 1,05-1,45 (1OH, m, 5 χ cicloexila CH2). 4-{3-[(2,6-DIMETILFENIL)AMINO]IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-2-IL}BENZENO- 1,3-DIOL (130)
(0,11 g, 23 %). δH (200 MHz, CDCI3) 8,04 (1H, d, J 8,6, H-4), 7,69 (1H, d, J 7,0, H-6'), 7,56 (1H, d, J 9,4, H-7), 7,15-7,28 (1H, m, H-6), 7,02 (2H, d, J 7,4, 2 χ xilila H-3'), 6,72-6,92 (2H, m, H-5 e xilila H-4'), 6,53 (1H, d, J1,7, H-3'), 6,33 (1H, dd, J 8,2 ei ,7, H-5'), 5,36 (1H, br s, NH) e 2,04 (6H, s, 2 χ CH3).
4-(3-ClCLOEXILAMINO)IMIDAZO[1,2-a]PIRIDIN-2-IL)BENZENO-1,3-DIOL (131)
(0,13 g, 26 %). δh (200 MHz, CDCI3) 8,04 (1H, d, J 6,8, H-4), 7,76 (1H1 d, J 8,0, H-6'), 7,28-7,38 (1H, m, H-7), 6,96-7,10 (1H, m, H-5'), 6,71 (1H, t, J 6,8, H-5), 6,21-6,38 (2H, m, H-6 e H-3'), 3,51 (1H, br s, NH), 2,71- 2,95 (1H, m, CHNH), 1,30-1,75 e 0,85-1,28 (10H, 2 χ m, 5 χ cicloexila CH2).
PROCEDIMENTO GERAL PARA A CONDENSAÇÃO DAS DIAMINAS COM GLIOXAL AQUOSO
A quantidade requerida de 1,2-diamina foi colocada em 3 cm3 de água à qual 40 % de glioxal aquoso (na quantidade indicada) foram adicio- nados. Hidróxido de potássio (2,1-3,1 eq.) foi depois adicionado (com exce- ção de o-fenilenodiamina 1, que não requerer base), causando dissolução imediata da diamina. A mistura foi deixada agitar durante um tempo especifi- cado em temperatura ambiente, durante o qual precipitação ocorreu. O pH foi vertido para cerca de 5 com ácido acético glacial, e os sólidos foram co- lhidos através de filtração de vácuo. Estes foram lavados com água e aceta- to de etila ou acetona, e depois secados a vácuo.
2-AMINO-4-HIDROXIPTERIDINA (132)
Sulfato de 4-hidróxi-2,5,6-triaminopirimidina 2 (1,06 g, 4,43 mmols) foi tratado com glioxal (0,68 cm3, 4,66 mmols) e hidróxido de potássio (0,52 g, 9,31 mmols) de acordo com o procedimento geral. Em adi- ção do glioxal, uma quantidade pequena de sólido marrom caiu fora de solu- ção. Este foi filtrado da solução amarela que gradualmente formou um preci- pitado amarelo fino no período de reação de 18 h. Após acidificação, um pó amarelo foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para render 2-amino-4-hidroxipteridina 132 (0,49 g, 67 %). <5H (200 MHz, D20/Na0D) 8,47 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,4) e 8,27 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,4); <5C (50 MHz, D20/Na0D) 173,4 (C-4), 156,7 (C-2), 148,6 (C-7), 138,7 (C-8) e 129,6 (C-10).
8,9-DIIDRÓXI-8,9-DIIDROIMIDAZO[1,2-a]PTERIDIN-5(7H)-ONA (133)
Sulfato de 4-hidróxi-2,5,6-triaminopirimidina 2 (0,23 g, 0,99 mmol) foi tratado com glioxal (2 cm3) e hidróxido de potássio (0,11 g, 1,97 mmol) de acordo com o procedimento geral. Uma solução rosa persistiu durante a reação de 18h, fornecendo um pó rosa após acidificação. Quando o sólido foi isolado, secado, e submetido à mesma rotina novamente, um pó amarelo foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para fornecer 8,9-diidróxi-8,9-diidroimidazo[1,2-a]pteridin-5(7H)-ona 133 (0,16 g, 77 %). δΗ (200 MHz1 drDMSO) 9,34 (1H, br s, D2O trocável, NH), 8,72 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 1,8), 8,48 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,0), 7,48 [1H, d, D2O trocável, NariIHCHa(OH), J 6,8], 6,59 [1H, d, D2O trocável, NHCHb(OH), J 7,8], 5,58 [1H, d, NariIHCHa(OH), J 6,8] e 4,97 [1H, d, NH- CHb(OH)1 J 8,0]; δC (50 MHz, Gf6-DMSO) 159,1 (C-5), 158,2 (C-6a), 155,2 (C- 4a), 150,1 (C-3), 140,3 (C-2), 130,8 (C-9b), 85,5 (C-8) e 84,1 (C-9).
PTERIDINO-2,4(1 H,3H)-DIONA (134)
Sulfato de 5,6-diaminouracila 13 (0,22 g, 0,91 mmol) foi tratado com glioxal (2 cm3) e hidróxido de potássio (0,11 g, 1,90 mmol) de acordo com o procedimento geral por 18 h. Um precipitado amarelo formou neste tempo. Após a adição de ácido acético, um precipitado amarelo denso foi separado por filtração, lavado com água e acetona e secado a vácuo para fornecer um pó amarelo, pteridino-2,4(1H,3H)-diona 134 (89,0 mg, 60 %). δH (200 MHz, Gf6-DMSO) 11,73 (2H, br s, NH), 8,64 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,2) e 8,52 (1H, d, N=CHaCHb=N, J 2,2).
(2-AMINO-4,7-DIIDROXIPTERIDIN-6-il)ACETATO DE ETILA (136) 6-Hidróxi-2,4,5-triaminopirimidina 2 (0,25 g, 1,03 mmol) foi colo- cada em ácido acético glacial (7 cm3) que tinha sido preaquecido para 90QC, seguido imediatamente pelo sal de sódio de oxalacetato de dietila (0,27 g, 1,27 mmol). A solução foi depois rapidamente aquecida a refluxo, e a mistu- ra fervida por 18 h. Uma suspensão particulada fina resultou. Após esfriar para 5eC, o sólido precipitado foi colhido através de filtração, lavado com água e secado a vácuo para fornecer um pó fino cor de bronze, (2-amino- 4,7-diidróxi-pteridin-6-il)acetato de etila 136 (0,22 g, 79 %). δH (200 MHz, Gf6- DMSO) 7,01 (1H, br s, OH), 6,39 e 6,29 (1H, 2 x br s), 4,09 (2H, q, O- CH2CH3, J 7,0), 3,61 (2H, s, CH2CO) e 1,18 (3H, t, OCH2CH3, J 7,0); δC (50 MHz, CZ6-DMSO) 170,2 (CO), 166,1 e 159,3 (C-4 e C-7), 157,5 (C-6), 155,6 (C-8a), 152,1 (C-4a), 146,0 (C-6), 61,0 (OCH2CH3)1 40,1 (CH2CO) e 14,8 (OCH2CH3).
(7-HIDRÓXI-2,4-DIOXO-1 ^,S^-TETRAIDROPTERIDIN-e-iOACETATO DE ETILA (137)
Sulfato de 4,5-diaminouracila 13 (0,31 g, 1,30 mmol) foi colocado em ácido acético glacial (25 cm3) que tinha sido preaquecido para 90eC, se- guido imediatamente pelo sal de sódio de oxalacetato de dietila (0,35 g, 1,65 mmol). A solução foi depois rapidamente aquecida a refluxo, e a mistu- ra fervida durante 5 h. Uma suspensão particulada fina resultou. Após esfriar para 59C, o sólido precipitado foi colhido através de filtração, lavado com 10 cm3 de etanol quente e secado a vácuo para fornecer um pó fino cor de bronze, (7-hidróxi-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetraidro-pteridin-6-il)acetato de etila 137 (0,21 g, 71 %). <5H (200 MHz, Gf6-DMSO) 11,23 (1H, br s, OH), 4,10 (2H, q, OCH2CH3, J 7,0), 3,72 (2H, s, CH2CO) e 1,19 (3H, t, OCH2CH3, J 7,0); õc (50 MHz, GfrDMSO) 170,2 (CO), 160,9 e 160,7 (C-2 e C-4), 150,8 (C-7), 148,2 (C-6), 61,1 (OCH2CH3), 39,3 (CH2CO) e 14,8 (OCH2CH3). 2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(4-NITROFENIL)-3,4,5,6-
TETRAIDRO-PIRIMIDINA (138)
Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,17 g, 99,37 mmols) e 4-nitrobenzaldeído (7,84 g, 51,91 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (92 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,23 g, 46,24 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 23 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo viscoso marrom. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (150 cm3) e lavado com água (3 x 150 cm3). As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com acetato de etila (200 cm3). Os extratos or- gânicos foram combinados e concentrados a vácuo a ca. 150 cm3 do volume original. A mistura resultante contendo um precipitado insolúvel foi transferi- da para um frasco de Erlenmeyer e aquecida a refluxo até que todas as par- tículas insolúveis tivessem sido dissolvidas. À solução quente hexano sufici- ente foi adicionado para induzir precipitação. A mistura foi deixada esfriar para temperatura ambiente por 15 min. com agitação. O precipitado foi co- lhido através de filtração para fornecer um sólido céreo que foi empastado em hexano. O precipitado foi colhido através de filtração e lavado com hexa- no. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida e ca. 20,31 g pesada. O sólido foi recristalizado das misturas de acetato de etila-hexano para forne- cer um sólido amorfo bege que foi atribuído por análise espectral ser 2,4- diidróxi-4,5-(dietoxicarbonil)-6-(4-nitro-fenil)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 138 (11,61 g, 66 %) como uma mistura 6:1,4:1 de diastereômeros (através de espectroscopia de RMN; vide infra; δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 8,26-8,18 e 8,20 (3 χ 2H, m e d, J ca. 8,5, 6 χ arila H), 7,71-7,57 (3 χ 2H, m e d, J ca. 8,5, 6 χ arila H), 7,37, 7,06, 6,94, 6,71, 6,63 e 6,52 (6 χ 1 Η, 6 χ s, 6 χ NH), 5,20 (1 Η, d, J 5,2, Η-6), 4,95-4,89 e 4,92 (2 χ 1Η, dois sobrepondo d, J 11,5, H-6), 4,28-4,04 (3 χ 2H, dois sobrepondo q, J ca. 7,0, 3 χ OCH2CH3), 4,00-4,62 (3 χ 2H, dois sobrepondo q, J ca. 7,0, 3 χ OCH2CH3), 3,25-3,10 e 3,20 (3 χ 1H, três sobreposição d, J11,5, H-5), 1,30-1,22, 1,27 e 1,26 (2 χ 3H, dois sobre- pondo t, J ca. 7,1, 2 χ OCH2CH3), 1,67 (3H, t, J ca. 7,2, OCH2CH3), 1,02- 0,93, 0,98 e 0,96 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0 e 7,1, 2 χ OCH2CH3), 0,747 (3H, t, J 7,2, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 169,8 (CO2Et), 167,7 (CO2Et), 154,2 (NHCONH), 148,7, 147,8, 130,5 e 124,0 (arila C), 81,7 (C-4), 62,4 (C-5), 61,3 (C-6), 52,9 e 52,7 (OCH2CH3), 14,6 e 14,2 (OCH2CH3). 2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(3,5-DIMETÓXI-4- HIDROXIFENIL)-3,4,5,6-TETRAIDROPIRIMIDINA (139)
Ácido trifluoroacético (2,1 cm3, 27,26 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (2,66 g, 44,29 mmols) e siringaldeído (6,04 g, 32,48 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (62 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 6,53 g, 29,53 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 19 h. Um óleo marrom viscoso insolúvel foi evidente durante o curso do processo de aquecimento. A mistu- ra de reação foi esfriada para temperatura ambiente e o solvente decantado do óleo insolúvel. A mistura de reação decantada foi lavada com água, se- cada (MgSO4) e concentrada a vácuo para fornecer um óleo marrom bruto que consistiu predominantemente em siringaldeído não-reagido conforme estabelecido por análise de TLC. O óleo viscoso marrom restante foi tratado com uma mistura de água (50 cm3) e acetato de etila (50 cm3) e agitado vi- gorosamente por poucos minutos até que o óleo estivesse completamente dissolvido na mistura de água-acetato de etila. A mistura foi transferida para um funil de separação no qual três camadas resultaram. A fase aquosa do fundo foi separada do acetato de etila restante e da fases de emulsão. As duas fases foram transferidas para um frasco de Erlenmeyer ao qual hexano suficiente foi adicionado para induzir precipitação. A pasta foi agitada duran- te alguns minutos após os quais o precipitado foi colhido através de filtração. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida para fornecer 2,4-diidróxi- 4,5-(dietoxicarbonil)-6-(3)5-dimetóxi-4-hidroxifenil)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 139 como uma mistura 6:1 de diastereômeros (3,57 g, 29 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 8,30 (1H, br s, PhOH), 7,81 (1H, br d, J 3,3, NH), 7,46 (1H, br d, J 1,6, NH), 6,73 (1H, s, NH), 6,82 (1H, s, NH), 6,58 (2 χ 1H, s, arila H), 6,54 (2 χ 1H, s, arila H), 6,44 (1H, br s, OH), 5,10 (1H, br d, J 3,0, H-6), 4,70 (1H, d, J 11,5, H-6), 4,28-3,78 (4 χ 2H, quatro sobrepondo q, OCH2CH3), 3,78 e 3,77 (2 χ 3H, 2 χ s, 2 χ arila OCH3), 3,10 (1H, d, J 11,5, H-5), 1,31-1,22, 1,28 e 1,26 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0 e 7,2, OCH2CH3), 1,11 (3H, t, J 7,0, OCH2CH3), 0,98 (3H, t, J 7,2, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 170,1 (CO2Et), 168,3 (CO2Et), 154,4 (NHCONH), 148,3, 136,1, 130,7 e 106,2 (arila C), 81,7 (C-4), 62,3 (C-5), 60,9 (C-6), 56,8 (arila OCH3), 53,4 (OCH2CH3), 14,6 e 14,4 (OCH2CH3).
2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(4-BROMO-FENIL)-3,4,5,6- TETRAIDROPIRIMIDINA (140)
Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,09 g, 68,02 mmols) e 4-bromobenzaldeído (9,32 g, 49,88 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (90 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,03 g, 45,34 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 41 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo laranja viscoso. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (100 cm3) e água (100 cm3) com agitação vigorosa. A mistura foi subse- qüentemente separada em fases e a fase orgânica lavada com água (2 χ 100 cm3). As lavagens aquosas combinadas foram extraídas com acetato de etila (2 χ 100cm3). Os extratos orgânicos foram combinados, secados e concentrados a vácuo para fornecer um sólido laranja bruto que foi dissolvi- do em acetato de etila fervente. A solução foi deixada esfriar para temperatu- ra ambiente seguido por adição de hexano para induzir precipitação. A pasta resultante foi deixada agitar por 15 min. após os quais o precipitado foi filtra- do e lavado com hexano. O bolo de filtro foi secado sob pressão reduzida para fornecer 2,4-diidróxi-4,5-(dietóxi-carbonil)-6-(4-bromofenil)-3,4,5,6- tetraidro-pirimidina 140 como uma mistura 4:1 de diastereômeros (4,92 g, 26 %); δΗ (50 MHz; DMSO-d6) 7,61-7,51 e 7,53 (4 χ 1H, dois sobrepondo m e d, J 8,4, arila H), 7,35-7,20 e 7,33 (4 χ 1H, dois sobrepondo m e d, J 8,4, arila H), 7,09 (1H, s, NH), 6,91 (1H, br d, J 1,4, NH), 6,58 (1H, br d, J 1,0, NH), 6,50 (1H, s, NH), 5,03 (1H, br d, J 4,5, H-6), 4,76 (1H, d, J 11,5, H-6), 4,25- 4,05 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 3,93-3,65 (2 χ 2H, dois sobre- pondo q, OCH2CH3), 3,20-3,10 e 3,13 (2 χ 1H, sobrepondo d e brdd, J 11,5 e 0,8, 2 χ H-5), 1,26 (3H, t, J ca. 7,1, OCH2CH3) 1,16 (3H, t, J 7,0, Ο- CH2CH3), 0,97 (3H, t, J ca. 7,1, OCH2CH3) e 0,78 (3H, t, J ca. 7,1, O- CH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 169,9 (CO2Et), 167,8 (CO2Et), 154,9 (NH- CONH), 154,2 (NHCONH), 140,5, 131,8, 131,1, 129,6 e 121,6 (arila C), 81,7 e 80,3 (C-4), 62,4 (C-5), 61,1 e 60,5 (C-6), 53,0 e 52,8 (OCH2CH3), 14,6 e 14,4 (OCH2CH3).
2,4-DIIDRÓXI-4,5-(DIETOXICARBONIL)-6-(TRANS-2-FENILETENO)- 3,4,5,6-TETRAIDRO-PIRIMIDINA (141)
Ácido trifluoroacético (3,2 cm3, 41,54 mmols) foi adicionado a uma mistura de uréia (4,10 g, 68,31 mmols) e trans-cinamaldeído (6,62 g, 50,09 mmols) em 1,2-dicloroetano anidro (91 cm3). Sal de sódio de oxalace- tato de dietila (95 %, 10,07 g, 45,54 mmols) foi adicionado à mistura de rea- ção, e a reação foi aquecida a refluxo por 22 h. A mistura de reação foi esfri- ada para temperatura ambiente e subseqüentemente concentrada a vácuo para fornecer um óleo laranja viscoso. O resíduo foi absorvido em acetato de etila (150 cm3) e lavado com água (2 χ 100 cm3). As lavagens aquosas com- binadas foram extraídas com acetato de etila (2 χ 150 cm3). Os extratos or- gânicos foram combinados, secados e concentrados a vácuo para fornecer um óleo viscoso laranja bruto que foi submetido à purificação através de cromatografia de coluna uma vez que tentativas de cristalização direta das misturas de acetato de etila-hexano foram malsucedidas. Obteve-se um sóli- do de laranja céreo bruto que foi recristalizado de acetato de etila e um vo- lume mínimo de hexano para dar. um pó branco sujo de 2,4-diidróxi-4,5- (dietoxicarbonil)-6-(trans-2-fenileteno)-3,4,5,6-tetraidropirimidina 141 como uma mistura 4:1 de diastereômeros (1,82 g, 11 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 7,50-7,25 (2 χ 5H, m, arila H), 6,96 (1H, br s, NH), 6,77 (1H, br s, NH), 6,63 (2 χ 1H, d, J ca. 16,0, PhCH=CH), 6,47 (1H, br s, NH), 6,18 (2 χ 1 Η, dd, J ca. 16,0 e 8,0, PhCH=CH), 4,64-4,56 (1H, m, H-6), 4,38 (1H, dd, Jca 11,0 e 8,0, H-6), 4,24-4,07 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 4,07-3,90 (2 χ 2H, dois sobrepondo q, OCH2CH3), 6,05 (1H, br d, J ca. 4,0, H-5), 2,97 (1H, d, J ca. 11,0, H-5), 1,30-1,16, 1,27 e 1,19 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J ca 7,1 e 7,0, OCH2CH3), 1,11-1,07, 1,07 e 1,06 (2 χ 3H, dois sobrepondo t, J 7,0, OCH2CH3); õc (50 MHz; DMSO-d6) 170,0 (CO2Et), 168,2 (CO2Et), 154,2 (NHCONH), 137,0, 133,0, 131,7, 128,4 e 127,4 (arila C), 129,3 (CH=CHPh)1 128,9 (CH=CHPh), 127,1 (CH=CHPh), 127,0 (CH=CHPh), 81,6 (C-4), 62,3 (C-5), 61,1 (C-6), 51,4 e 51,2 (OCH2CH3), 14,6 e 14,5 (OCH2CH3). ÁCIDO 6-(4-NITROFENIL)-2-OXO-1,2,3,4-TETRAIDROPIRIDINO-4,5- DICARBOXIÍLICO (142)
A uma suspensão da dietoxicarbonil-tetraidropirimidina 138 (0,22 g, 0,56 mmol) em etanol absoluto (3 cm3) foi adicionada uma solução de hidróxido de potássio (0,13 g, 2,24 mmols) em etanol absoluto (2 cm3). A mistura de reação foi aquecida a refluxo por 10 min. durante os quais um precipitado quase sempre estava presente. A mistura de reação marrom es- cura foi deixada esfriar para temperatura ambiente e ao esfriar, a mistura foi acidificada com ácido clorídrico aquoso (10 %) para pH ca. 1-2 que resultou em alteração em cor para laranja brilhante. O produto foi simplesmente co- lhido através de filtração e lavado com várias porções pequenas de etanol absoluto seguido secagem sob pressão reduzida para dar ácido 6-(4- nitrofenil)-2-oxo-1,2,3,4-tetraidropiridino-4,5-dicarboxílico 142 (0,16 g, 90 %); δΗ (50 MHz; DMSO-de) 11,26 (2 χ 1 Η, br s, 2 χ CO2H), 8,31 (2H, d, J ca. 8,5, arila H), 8,18 (1H, brs, NH), 7,99 (2H, d, J ca. 8,5, arila H), 5,95 (1H, s, H-6). 8-MORFOLINOADENOSINA (147)
Morfolina (2,0 cm3) foi adicionada a uma solução de dioxano (5 cm3) de 8-bromoadenosina protegido de isopropilideno 145 (0,15 g, 0,43 mmol) e a solução resultante foi submetida à irradiação de microonda (50 % potência de 600W) durante 40 minutos. O precipitado de bromidrato de morfolínio foi removido por filtração e o solvente foi removido do filtrado. A solução resultante foi triturada com éter (2x5 cm3) para gerar a 8- morfolino adenosina protegida de isopropilideno 146 como um sólido cor de creme (0,12 mg, 71 %). δΗ (200 MHz, CDCI3) 8,18 (1H, s, H-2), 5,90 (1H, d, H-1', J 5,6), 5,27 (1H, dd, H-2', J 5,6 e 5,4), 5,08 (1H, d, H-3', J 5,4), 4,42 (1H, s, H-4'), 3,90 (2H, m, H-5'), 3,78 [4H, m, O(CH2CH2)2N], 3,39 [2H, m, 0(CH2CHaHb)2N], 3,15 [2H, m, 0(CH2CHaHb)2N], 1,60 e 1,38 [6H, 2 χ s, C(CH3)2]; (El) m/z 392 (Ci7H24N6O5 requer 392). O material resultante (10 mg) foi desprotegido em tetraidrofurano agitando durante a noite em áci- do clorídrico aquoso (2M, 5 gotas) em cujo tempo nenhum material de parti- da permaneceu por HPLC após neutralização da amostra. Após remoção de solvente, 147 bruto foi usado em estudos de inibição.
EXEMPLO 4 - AVALIAÇÃO DE INIBIDORES IN VITRO
Enzima de GS foi produzida na forma adenililada e desadenilila- da usando cultura contínua de E. coli sob condições de qualquer excesso de nitrogênio e limitação de carbono (forma adenililada) ou condições de limita- ção de nitrogênio e excesso de carbono (desadenililada). As enzimas foram purificadas em ambas as formas usando cromatografia de afinidade de AMP-Sepharose e os ensaios foram operados para testar para a inibição da glutamina sintetase. A atividade da enzima foi medida pela hidrólise de ATP para ADP e pela formação de glutamina de glutamato.
MATERIAIS E MÉTODOS
Ambas as formas da enzima foram produzidas da construção de glutamina sintetase recombinante pBSK-ECgln na cepa hospedeira auxotró- fica de glutamina sintetase YMC11 de E. Coli. O organismo foi crescido em cultura contínua sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de car- bono para a enzima adenililada ou condições de limitação de nitrogênio e excesso de carbono para a enzima desadenililada, como esboçado por (Sê- nior, P. J. (1975). J. Bact: 123, (2), 407-418). As fermentações crescidas sob condições de excesso de nitrogênio e limitação de carbono foram crescidas a uma taxa de crescimento inicial de 0,07 hora"1, após 5 tempos de retenção a taxa de crescimento foi reduzida para 0,01 hora'1 para permitir alcançar estado fixo. Todas as fermentações foram crescidas a 379C, pH 7,15 a uma taxa de fluxo de ar de 1 v/v/m e uma taxa de agitação de 600 rpm em um fermentador New Brunswick 3000 (N.J., USA). A biomassa foi colhida conti- nuamente e mantida em 6-C após o qual foi centrifugada a 10,000 xg duran- te 20 minutos e congelada a -209C. As fermentações foram monitoradas continuamente para assegurar que o estado firme foi mantido determinando a absorbância da cultura (600 nm), viabilidade celular através das contagens de placa com ágar de contagem de placa e determinando a concentração da biomassa. Em intervalos durante o curso da fermentação, isolados de colô- nia simples foram removidos da fermentação e a integridade do plasmídeo contendo o gene de GS foi validada por triagem de PCR e isolamento de plasmídeo.
A biomassa foi ressuspensa em Tampão de ressuspensão A ou RBA (10 mM de Imidazol-HCI, 2 mM de β-mercaptoetanol, 10 mM de Mn- CI2.4H20; pH 7,0). As células foram sonicadas durante 10 minutos em um ciclo de trabalho de 50 %. Esta solução sonicada foi centrifugada durante 10 minutos a 12 000 χ g, e o sobrenadante foi retido. Sulfato de estreptomicina foi adicionado (10 % de uns 10 % p/v), e a suspensão foi agitada a 4eC du- rante 10 minutos. Centrifugação foi depois realizada a 12 000 χ g por 10 mi- nutos e o sobrenadante foi retido. O pH do sobrenadante foi ajustado em 5,15 com ácido sulfúrico. Esta mistura foi agitada a 4QC durante 15 minutos, e depois centrifugada a 20 000 χ g durante 10 minutos. Novamente, o so- brenadante foi retido. Sulfato de amônio saturado (30 % de volume) foi adi- cionado e o pH foi ajustado em 4,6 com ácido sulfúrico. A suspensão foi agi- tada a 4 e C durante 15 minutos, e depois centrifugada a 20 000 χ g durante 10 minutos. O precipitado obtido foi ressuspenso em RBA e o pH ajustado para 5,7 com ácido sulfúrico. Esta suspensão foi agitada durante a noite a 4ºC para permitir a glutamina sintetase ressuspender-se, e depois centrifu- gada a 20,000 χ g durante 10 minutos. O sobrenadante foi retido e o pH das suspensões foi ajustado para 7,0.
Outra purificação das duas formas da enzima foi alcançada atra- vés do uso de cromatografia de afinidade usando um AKTA Explorer (Amer- sham Biosciences). Separação foi alcançada com resina de 5ΆΜΡ Sepha- rose com uma coluna de HR10/10 tendo um comprimento de 10 cm e um diâmetro interno de 10 mm. A preparação da enzima glutamina sintetase (aproximadamente 2 ml) foi carregada para a coluna preparada que foi equi- librada com 10 mM Imidazol (pH 7,0), 150 mM NaCI e 10 mM MnCI2.4H20. A glutamina sintetase ligada foi eluído da coluna com 2,5 mM de ADP ao longo de um gradiente linear de 40 ml de 150 a 500 mM de NaCI, e as frações de 1 ml foram colhidas. As frações contendo glutamina sintetase pura foram depois agrupadas e dialisadas durante a noite contra RBA.
Uma alíquota de cada suspensão de proteína foi submetida à eletroforese em um gel de SDS PAGE a 7,5 % de acordo com os protocolos padrões. Concentração da proteína foi determinada usando o método de determinação de proteína de Lowry e a concentração foi usada determinan- do todas atividades específicas para a enzima.
Cada inibidor foi avaliado por seu efeito na atividade da enzima de glutamina sintetase, usando um ensaio desenvolvido para medir a reação direta da enzima. Em cada circunstância, a forma da enzima adenililada e desadenililada foi testada para cada inibidor. Todos os ensaios foram reali- zados em duplicata. A triagem primária foi realizada a uma concentração de inibidor de 1 mm. Os componentes de ensaio estão mostrados na TABELA 29.
TABELA 29. COMPONENTES DE ENSAIO
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Todos os inibidores foram preparados em Dimetil Sulfóxido (DMSO) como 10 mM de soluções de matéria-prima. O ensaio da enzima adenililada foi realizado a um pH de 6,3, e o ensaio da enzima desadenilila- da a um pH de 7,2. Todas as preparações da enzima foram adicionadas à mistura de ensaio em um volume de 50 μΙ. A adição da enzima iniciou a rea- ção que foi depois deixada prosseguir por 2,5 horas para a enzima adenilila- da e 45 minutos para a enzima desadenililada. A reação foi interrompida pe- la adição de ácido tricloroacético a uma concentração de 0,5 % m/v. Cada ensaio foi depois aliquotado em frascos de HPLC, dois destes foram ensaia- dos para glutamato e glutamina e dois para ADP e ATP, usando uma coluna de C18 de 5 μ Fenomenex Luna em um instrumento de HPLC Agilent 100.
ANÁLISE DE INIBIÇÃO DA ENZIMA
Atividades específicas para enzima foram calculadas para cada ensaio de inibidor em termos de pmols/min/mg de proteína. Cada ensaio de inibidor foi depois comparado a um ensaio de enzima não-inibida, isto é um ensaio de controle não contendo nenhum inibidor, resultando em um cálculo de uma redução na atividade da enzima que foi depois relatado como uma porcentagem. As faixas selecionadas foram 80-100 %, 60-80 %, 30-60 % e 0-30 % de redução na atividade. Estes resultados estão mostrados na TA- BELA 30. TABELA 30. NÍVEIS DE INIBIÇÃO RELATIVA PRODUZIDOS PARA AMBAS AS FORMAS ADENILILADA E DESADENILILADA DA ENZIMA PARA OS COMPOSTOS DE INIBI DOR TESTADOS.
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Com base nos resultados apresentados na TABELA 30, vários compostos de inibidor foram selecionados para outra testagem. Estes estão mostrados, com seus níveis de inibição relativa, na TABELA 31.
TABELA 31. COMPOSTOS DE INIBIDOR SELECIONADOS PARA OUTRA TESTAGEM
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Inibidores úteis podem ser selecionados com base na porcenta- gem de inibição da atividade de GS. Inibição seletiva da atividade de forma- ção de ADP ou de Glutamina de GS adenililada GS com relação à GS desa- denililada pode ser particularmente útil. Além disso, inibidores que demons- tram inibição mais alta da síntese de ADP com relação à Glutamina podem ser úteis.
EXEMPLO 5 - AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DE INIBIDOR COM RESPEITO ÀS CÉLULAS DE M. tuberculosis E Mammalian MATERIAIS E MÉTODOS
O sistema de BACTEC foi inventado para monitorar o cresci- mento micobacteriano de espécies de crescimento lento. As bactérias são crescidas em um substrato radioativo e o dióxido de carbono radioativo pro- duzido é diretamente proporcional à taxa de crescimento micobacteriano (Siddiqi, S. H., sistema de BACTEC 460 TB, Product and procedure manual (1995)). Leitura dos valores é expressa como índice de crescimento (Gl). Cepa de referência de M. tuberculosis H37Rv (ATCC 25618) foi cultivada em meio micobacteriano 7H9 (Difco) enriquecido com ADC (técnica de Biolab C70), com agitação contínua a 37eC. Crescimento de fase de registro foi a- ceito em valores de A600 nm entre 0,4 e 0,6. Quando as culturas alcança- ram uma densidade de aproximadamente 0,16 em A600 nm (um McFar- land), 0,1 ml foi inoculado em um frasco Bactec. Estas culturas primárias foram incubadas a 379C até um índice de crescimento de 500 (+/- 50) fosse alcançado. Estes culturas primárias foram usadas para testagem de inibidor.
Compostos de teste, providos em dimetil sulfóxido (DMSO), fo- ram esterilizados através de um filtro de seringa resistente de solvente orgâ- nico de 13 mm com tamanho de poro de 0,22 mícron (Millex-LG). As amos- tras não diluídas foram testadas para atividade de inibidor de crescimento. Aqueles mostrando atividade foram seqüencialmente diluídos em DMSO estéril para determinar o fator de diluição para atividade de inibidor de cres- cimento continuado. Os inibidores testados estão esboçados na TABELA 32.
TABELA 32. INIBIDORES TESTADOS NO ENSAIO DE BACTEC
<table>table see original document page 201</column></row><table> <table>table see original document page 202</column></row><table>
0,1 ml de cultura primária e composto de inibidor foi adicionado a um frasco BACTEC, os frascos incubados a 379C, e o crescimento monito- rado a cada 24 horas. Controles incluíram culturas com e sem inibidor e com e sem solvente. As leituras de Gl foram continuadas até que os controles alcançassem o valor de Gl máximo de 999.
Para testar as amostras para citotoxicidade in vitro contra uma linha de célula mamífera o ensaio de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difeniltetrazoliobrometo (MTT) em células de Ovário de Hamster Chinês (CHO) foi usado.
Todas as amostras foram testadas em triplicata em uma ocasi- ão. O ensaio de MTT é usado como um ensaio colorimétrico para crescimen- to e sobrevivência celulares, e compara o poço com outros ensaios disponí- veis (Mosman et aí., 1983 e Rubinstein et ai., 1990). O sal de tetrazólio MTT foi usado para medir todo o crescimento e quimiossensibilidade.
Soluções de matéria-prima preparadas a 10 mM em 100 % de DMSO foram recebidas de CSIR. As amostras foram testadas como uma suspensão se não corretamente dissolvida e armazenada a -209C até o uso. Todas as amostras de teste foram triadas a 50 μΜ. Esta concentração foi selecionada para assegurar que a concentração de solvente usada no en- saio não afetaria a viabilidade das células. A concentração mais alta de sol- vente à qual as células foram expostas não teve nenhum efeito mensurável na viabilidade das células (dados não mostrados). Emetina foi usada como o fármaco de referência em todos os experimentos. A concentração de partida de emetina foi 100 pg/ml que foi serialmente diluída em meio completo com diluições de 10 vezes para dar seis concentrações, a mais baixa sendo 0,001 Mg/ml.
Os valores de 50 % de concentração inibidor (IC5o) para estas amostras foram obtidos de curvas de dose-resposta, usando uma análise própria de curva de dose-resposta não-linear por meio de software Graph- Pad Prism v.4.
RESULTADOS E DEBATE
As curvas de resposta de crescimento Bactec de M. tuberculosis na presença dos vários inibidores foram executadas. Aqueles inibidores tes- tados que foram observados inibir M. tuberculosis foram depois testados pa- ra suas concentrações de LC50 determinando o efeito da concentração de inibidor no crescimento Bactec de M. tuberculosis. As concentrações de LC5O estão esboçadas na TABELA 33.
TABELA 33. CONCENTRAÇÕES DE LC50 (μΜ) DE INIBIDORES DE M. tu- berculosis
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Todos os inibidores foram depois testados quanto sua citotoxici- dade para células mamíferas (por exemplo, células CHO). Todas as amos- tras foram inicialmente testadas a uma concentração de 50 μΜ. Dos resulta- dos obtidos, todas as amostras não mostraram nenhuma citotoxicidade sig- nificativa nesta concentração contra a linha de célula CHO (TABELA 34). TABELA 34. PORCENTAGEM DE VIABILIDADE CELULAR A 50 μΜ
<table>table see original document page 204</column></row><table>
Várias modalidades da invenção foram descritas. Não obstante, será entendido que várias modificações podem ser feitas sem divergir do espírito e escopo da invenção. Conseqüentemente, outras modalidades es- tão dentro do escopo das reivindicações a seguir.

Claims (36)

1. Método assistido por computador de gerar um inibidor de teste da atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada (GSI-β) bacteriana, o método usando um computa- dor programado compreendendo um processador e um dispositivo de entra- da, o método compreendendo: (a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI- β adenililada bacteriana; (b) atracar no sítio de fosforil transferase uma molécula de inibi- dor de teste usando o processador; e (c) determinar, com base na atracagem, se a molécula de inibi- dor de teste inibiria a atividade do sítio de fosforil transferase.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo atracar no sítio de fosforil transferase um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP ou um intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato.
3. Método de acordo com a reivindicação 2, adicionalmente compreendendo determinar, com base na atracagem, se a molécula de ini- bidor de teste inibiria a ligação do um ou mais motivos estruturais do com- plexo de (Mn2+)3.(HC03")i2.ATP ou o intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em car- boxifosfato ao sítio de fosforil transferase.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo projetar um inibidor de teste determinado pela etapa (c) pa- ra inibir a atividade do sítio de fosforil transferase e avaliar a atividade inibi- dora do inibidor de teste em um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β ade- nililada bacteriana in vitro.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita avali- ação in vitro compreende uso de um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.
6. Método de acordo com a reivindicação 4, adicionalmente compreendendo avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste em um poli- peptídeo de glutamina sintetase desadenililada in vitro para avaliar a ativida- de inibidora específica do inibidor de teste para o polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana.
7. Método de acordo com a reivindicação 1, adicionalmente compreendendo produzir o inibidor de teste e avaliar a atividade inibidora do inibidor de teste no crescimento de uma bactéria que compreende um gene de glutamina sintetase de GSI-β.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que a dita bac- téria é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Salmoriella typhinurium, Salmonella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigel- la dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes fae- ealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus infIuenzae, Bordetella pertussis, Bor- della bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brucella melitensis, Myeobaete- rium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Actinomyces israelii, Nocardia esteroides, Tiobacillus ferrooxi- dans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Strep- tomyees eoelieolor.
9. Método da reivindicação 5, em que o dito ensaio compreende contatar o dito polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana com o dito inibidor de teste sob condições tendo um pH de cerca de 6,0 a cerca de 6,5.
10. Método de gerar um composto que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenili- lada bacteriana, o método compreendendo: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste capaz de inibir a interação entre o sítio de fosforil transferase e um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP ou um intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de trans- ferência de fosforila com base em carboxifosfato.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a estrutu- ra tridimensional do polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β bacteriana inclui um ou mais motivos estruturais de um complexo de (Μn2+)3.(Η003")ΐ2ΑΤΡ ligado no sítio de fosforil transferase.
12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, adicional- mente compreendendo produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste em um polipeptídeo de GSI-β ade- nililada bacteriana in vitro.
13. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, adicional- mente compreendendo produzir o composto de teste da etapa (b) e avaliar a atividade inibidora do composto de teste no crescimento de uma bactéria compreendendo um gene de glutamina sintetase de GSI-β.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a dita bactéria é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphthe- riae, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coii, Salmonella typhinurium, Sal- monella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faeealis, Helicobaeter pylori, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Bordella bronehiseptia, Neisseria meningitides, Brueella melitensis, Myeo- baeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptos- pira interrogans, Aetinomyees israelii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferro- oxidans, Azospirillum brazilensis, Anabaena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor.
15. Método de gerar um composto de teste que inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana, o método compreendendo: (a) fornecer uma estrutura tridimensional de um complexo de (Mn2+)3.(HC03")i2ATP ou um intermediário de estado de transição de um in- termediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifos- fato; e (b) projetar, com base na estrutura tridimensional, um composto de teste tendo um ou mais motivos similares na estrutura ao complexo de (Mn2+)3.(HC03')i2ATP ou ao intermediário de estado de transição de um in- termediário de estado de transição de um intermediário de reação de trans- ferência de fosforila com base em carboxifosfato.
16. Método de triar um composto de teste in vitro para determi- nar se ou não inibe a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipep- tídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana (GSI-β), o método compreendendo: (a) contatar um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana com um composto de teste sob condições eficazes para atividade de fosforil transferase; e (b) determinar se ou não a atividade de fosforil transferase do polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana é reduzida com relação à ativi- dade de um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana que não foi conta- tado com o composto de teste.
17. Método de acordo com a reivindicação 16, adicionalmente compreendendo determinar se ou não a atividade de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana é reduzida com relação à atividade de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana que não foi contatado com o composto de teste.
18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que a dita atividade de fosforil transferase é medida usando um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ADP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.
19. Método in vitro para inibir a atividade do sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana, compreen- dendo contatar um polipeptídeo de GSI-β adenililada com uma composição compreendendo um composto de acordo com Fórmula 1: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 209</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxii ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Formula IV: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11éalquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 210</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.
21. Método in vitro para inibir crescimento de uma bactéria com- preendendo um gene de GSI-β, o método compreendendo contatar a bacté- ria com uma composição compreendendo um composto de acordo com Fórmula I. <formula>formula see original document page 211</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 212</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 212</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 213</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 213</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou
22. Método de acordo com a reivindicação 21, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.
23. Método para tratar, impedir, ou melhorar um ou mais sinto- mas ou distúrbios associados a uma infecção bacteriana em um mamífero, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β, o método compreendendo administrar ao mamífero uma composi- ção compreendendo um composto de acordo com Fórmula I: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 214</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; XeY são N; ou ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 215</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, Fórmula IV: <formula>formula see original document page 215</formula> R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 215</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou
24. Método de acordo com a reivindicação 23, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.
25. Método in vivo para inibir a atividade do sítio de fosforil trans- ferase de um polipeptídeo de glutamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana, o método compreendendo administrar uma composição compreendendo um composto de acordo com a fórmula I: <formula>formula see original document page 216</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 216</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 217</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 217</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 218</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 218</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou como descrito aqui para um mamífero sofrendo de uma infecção bacteriana, em que a infecção bacteriana é de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o com- posto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, 21, 23, 35, 36, -15 37, 39, 40, 42, 45,48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, -76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, 103, 104, 105, -106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, 142.
27. Método assistido por computador de projetar uma molécula de inibidor de teste que contém um ou mais motivos estruturais similares ao complexo de (Mn2+)3.(HC03-)12ATP ou a um intermediário de estado de tran- sição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato, o método usando um computador programado compre- endendo um processador e um dispositivo de entrada, o método compreen- dendo: (a) introduzir no dispositivo de entrada dados compreendendo uma estrutura de um sítio de fosforil transferase de um polipeptídeo de glu- tamina sintetase Ι-β adenililada bacteriana (GSI-β); (b) projetar a dita molécula de inibidor de teste que contém um ou mais motivos estruturais similares ao complexo de (Mn2+J3l(HCO3 )12ATP ou ao intermediário de estado de transição de um intermediário de reação de transferência de fosforila com base em carboxifosfato usando métodos as- sistidos por computador; (c) usar um protocolo de atracagem assistido por computador para determinar se ou não a molécula de inibidor de teste projetada inibiria uma atividade de fosforil transferase com base em carboxifosfato ou interagi- ria com um ou mais aminoácidos no polipeptídeo de GSI-β adenililada bacte- riana.
28. Método de acordo com a reivindicação 27, em que a intera- ção com o um ou mais aminoácidos é por meio de uma ou mais ligações de hidrogênio ou interações de van Der Waal com um ou mais aminoácidos no sítio ativo.
29. Método de acordo com a reivindicação 27, adicionalmente compreendendo avaliar a atividade inibidora da molécula de inibidor de teste projetada in vitro em um polipeptídeo de GSI-β adenililada bacteriana usan- do um ensaio capaz de medir hidrólise de ATP, formação de ÁDP, utilização de glutamato, ou formação de glutamina.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 29 inclusiva, em que a dita composição compreende um composto sele- cionado dos compostos 97, 105, 111, e 117.
31. Método de acordo com as reivindicações 21 ou 23, em que a bactéria compreendendo um gene de GSI-β é selecionada do grupo que consiste em Corynebacterium diphtheriae, Neisseria gonorrhoeae, Escheri- chia coli, Salmoriella typhinurium, Salmoriella typhi, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Proteus vulgaris, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Alcaligenes faecalis, Helicobacter pylori, Haemo- philus infiuenzae, Bordetella pertussis, Bordeila bronchiseptia, Neisseria me- ningitides, Brucella melitensis, Myeobaeterium tubereulosis, Myeobaeterium leprae, Treponema palidum, Leptospira interrogans, Aetinomyees israeiii, Noeardia esteroides, Tiobacillus ferrooxidans, Azospirillum brazilensis, Ana- baena sp., Fremyella diplosiphon, e Streptomyees eoelieolor.
32. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 23, em que a composição resulta em uma redução da atividade de um polipeptídeo de GSI-β desadenililada bacteriana em uma quantidade de cerca de 0 % a cer- ca de 30%.
33. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 23, em que a bactéria compreendendo um gene de GSI-β é Myeobaeterium tubereulosis.
34. Composição farmacêutica para o tratamento, prevenção ou melhora, em um mamífero, de uma infecção bacteriana de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β, a composição farmacêutica compreen- dendo um composto de acordo com Formula 1: <formula>formula see original document page 220</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ído por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 220</formula> <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou acila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- XeY são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; XeY são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 221</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 222</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; XeY são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 222</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou em combinação com um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.
35. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 34, em que o composto é selecionado dos compostos numerados 5, 8, 17, 18, -21, 23, 35, 36, 37, 39, 40, 42, 45, 48, 53, 54, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 63, 64, -66, 67, 68, 69, 76, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 89, 90, 91, 93, 95, 96, 97, 98, -103, 104, 105, 106, 108, 110, 111, 115, 117, 121, 136, 137, 138, 139, 140, -142.
36. Uso de um composto de acordo com Fórmula I: <formula>formula see original document page 223</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é cloro, amino, aminossubstituído, um heterociclo ligado a nitrogênio e amidas do mesmo, ou hidroxila; R2 é hidrogênio, bromo, nitroso, nitro, amino, ou aminossubstitu- ido por alquila ou acila; R3 é amino, aminossubstituído por alquila ou arila, ou um hete- rociclo ligado a N; R4 é hidrogênio, SH ou OH; ou Fórmula II: <formula>formula see original document page 223</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidrogênio, cloro, hidroxila, amino, um aminossubstituído ou um heterociclo ligado a nitrogênio; R4 é hidrogênio, hidroxila, ou amino; R6 é hidrogênio, alquila ou arila; R9 é hidrogênio, alquila, heterociclo conectado a C ou aminoaci- la; e X e Y são equivalentes e são CH ou N; ou Fórmula III: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R1 é hidroxila; R4 é hidróxi, ou amino; R6 é hidroxila; R7 é metila substituída; X e Y são N; ou Fórmula IV: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R11 é alquila; R12 é arila; ou Fórmula V: <formula>formula see original document page 224</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, R1 é hidrogênio, R13 é arila; R14 é aminossubstituído; X e Y são equivalentes e são CH; ou Fórmula VI: <formula>formula see original document page 225</formula> ou um sal farmaceuticamente aceitável ou derivado do mesmo, em que: R12 é arila substituída; R13 é hidrogênio; ou para a fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção, ou melhora, em um mamífero, de uma infecção bacteriana de uma bactéria compreendendo um gene de GSI-β.
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008023159A1 (en) 2006-08-24 2008-02-28 Astrazeneca Ab Morpholino pyrimidine derivatives useful in the treatment of proliferative disorders
US8232410B2 (en) 2007-04-20 2012-07-31 The Research Foundation Of State University Of New York Benzimidazoles and pharmaceutical compositions thereof
WO2008134553A1 (en) * 2007-04-26 2008-11-06 Xenon Pharmaceuticals Inc. Methods of using bicyclic compounds in treating sodium channel-mediated diseases
EA018708B1 (ru) 2007-07-09 2013-10-30 Астразенека Аб ПРОИЗВОДНЫЕ МОРФОЛИНОПИРИМИДИНА, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ, СВЯЗАННЫХ С mTOR КИНАЗОЙ И/ИЛИ PI3K
US8871751B2 (en) 2008-01-18 2014-10-28 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Compositions and methods relating to nuclear hormone and steroid hormone receptors including inhibitors of estrogen receptor alpha-mediated gene expression and inhibition of breast cancer
US8481740B2 (en) * 2009-04-07 2013-07-09 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Imidazo[1,2 a] pyridine-6-carboxamide derivatives, their use for the treatment of colon cancer and their method of manufacture
CA2778931A1 (en) 2009-06-12 2010-12-16 Marianne Allard Guanine riboswitch binding compounds and their use as antibiotics
SA111320519B1 (ar) 2010-06-11 2014-07-02 Astrazeneca Ab مركبات بيريميدينيل للاستخدام كمثبطات atr
UA115388C2 (uk) 2013-11-21 2017-10-25 Пфайзер Інк. 2,6-заміщені пуринові похідні та їх застосування в лікуванні проліферативних захворювань
CN103709164B (zh) * 2013-12-04 2016-08-24 浙江诚意药业股份有限公司 一种腺嘌呤的合成方法
CN104974098A (zh) * 2015-06-30 2015-10-14 苏州开元民生科技股份有限公司 2,5-二氨基-4,6-二羟基嘧啶盐酸盐的合成方法
WO2019109046A1 (en) 2017-11-30 2019-06-06 Arrakis Therapeutics, Inc. Nucleic acid-binding photoprobes and uses thereof
CN109456329B (zh) * 2018-11-19 2021-03-09 迪嘉药业集团有限公司 一种泛昔洛韦的制备方法
US10702525B1 (en) * 2019-09-04 2020-07-07 United Arab Emirates University Pyrimidine derivatives as anti-diabetic agents
CN111658646B (zh) * 2020-06-28 2021-03-02 河南工业大学 2,6-双(2-苯并咪唑基)吡啶在制备耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌感染药物中的应用
CN113967207B (zh) * 2021-11-22 2023-03-21 重庆医科大学 4-异硫脲基丁腈盐酸盐在治疗分枝杆菌感染中的应用
CN120636511B (zh) * 2025-05-23 2025-12-02 大连大学附属中山医院 基于miR-320a和RAD51的计算机辅助筛选促进非小细胞肺癌放疗敏感性的药物的方法、系统及设备

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4076711A (en) * 1976-04-05 1978-02-28 Schering Corporation Triazolo [4,5-d]-pyrimidines
CH630380A5 (de) * 1977-08-12 1982-06-15 Lonza Ag Verfahren zur herstellung von l-methotrexat.
US4565864A (en) * 1983-06-02 1986-01-21 Riker Laboratories, Inc. Substituted imidazo[1,2-c]pyrimidines
IT1215339B (it) * 1987-01-14 1990-02-08 Co Pharma Corp Srl Procedimento per la preparazione di 9-(idrossialchil)-ipoxantine
IT1212140B (it) * 1987-05-08 1989-11-08 Sig Gla Pharmaceuticals S P A Processo per la preparazione del 2,4-diammino-6-(1-piperidinil)-piri mi-din-n-ossido.
AU2003231231A1 (en) * 2002-05-06 2003-11-11 Bayer Pharmaceuticals Corporation Pyridinyl amino pyrimidine derivatives useful for treating hyper-proliferative disorders
US20060142251A1 (en) * 2002-11-15 2006-06-29 Gunther Harth Anti-microbial agents derived from methionine sulfoximine analogues

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